(57)【要約】  本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて抗原またはワクチンが経時的に劣化したかどうかを評価するための方法を対象とする。本明細書に記載の方法はまた、液体クロマトグラフィーを用いて所与の抗原またはワクチンの相対的な効力を評価することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）抗原の供給源から調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、
ｉｉ）抗原の供給源から調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよび
ｉｉｉ）第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較して第２の液体クロマトグラフィー測定値の変化を定量し、これによって抗原の安定性を測定するステップ
を含む、抗原の安定性を測定する方法。
【請求項２】
内部標準が前記試料に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定値が、抗原および内部標準の吸光または蛍光放射の量を示す記録されたピークから得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の液体クロマトグラフィー測定値が、第１の試料における抗原のピーク下面積の、第１の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であり、前記第２の液体クロマトグラフィー測定値が、第２の試料における抗原のピーク下面積の、第２の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗原の供給源がワクチンバッチである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、ワクチンバッチから採取された試料においてアジュバントから抗原を分離することによって調製される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原を、ワクチンバッチから採取された試料において沈殿させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントを、ワクチンバッチから採取された試料において沈殿させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）参照から調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、
ｉｉ）物質から調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよび
ｉｉｉ）第２の液体クロマトグラフィー測定値を第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較し、これによって対応する参照の効力に対する物質における抗原の効力を決定するステップ
を含む、対応する参照の効力に対する物質における抗原の効力を測定する方法。
【請求項１０】
内部標準が前記試料に添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定値が、抗原および内部標準の吸光または蛍光放射の量を示すピークから得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の液体クロマトグラフィー測定値が、第１の試料における抗原のピーク下面積の、第１の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であり、前記第２の液体クロマトグラフィー測定値が、第２の試料における抗原のピーク下面積の、第２の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記物質がワクチンバッチであり、前記参照が参照ワクチンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の試料および前記第２の試料が、それぞれ参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料においてアジュバントから抗原を分離することによって調製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原が、参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料において沈殿している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アジュバントが、参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料において沈殿している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法を含む、ワクチンバッチを参照ワクチンとして認定する方法であって、前記第２の液体クロマトグラフィー測定値が前記第１の液体クロマトグラフィー測定値と少なくとも同一である場合に前記ワクチンバッチが参照ワクチンとして認定される方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法を含む、参照ワクチンを再認定する方法であって、前記抗原の供給源が以前に認定された参照ワクチンであり、前記第２の液体クロマトグラフィー測定値が前記第１の液体クロマトグラフィー測定値と少なくとも同一である場合に前記参照ワクチンが再認定される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いてワクチンが経時的に劣化したかどうかを評価するための方法を対象とする。本明細書に記載の方法はまた、液体クロマトグラフィーを用いて所与の試料における抗原の効力を評価することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン製造の生産工程において、多くの品質管理上の検討事項が生じる。ウイルス性、細菌性または寄生生物性ワクチンは、バッチ毎に様々な点で異なる可能性のある培養物から製剤されなければならない。品質管理問題の中で生じ得るのは、新規ワクチンバッチが必要とされるレベルの効力を有することの保証に関する問題である。関連する懸案事項は、流通または使用の前に、抗原またはワクチンの在庫バッチまたはロットの蓄蔵が、必要とされるレベルの効力を保っているか、それとも経時的に劣化したかの問題である。
【０００３】
製造されたワクチンの全バッチに対して臨床試験を行うのは実際的ではない。このような試験は時間と費用がかかるだけでなく、不必要なヒトまたは動物の実験を必要とする。その代わりに、ワクチン製造は、新規に生産されたワクチンバッチが比較対象とすることのできる参照ワクチンに頼っている。参照ワクチンは通常、あらゆるワクチン劣化を低減または取り除けるように極低温条件（例えば−７０℃）で保管される。
【０００４】
ひとたび参照ワクチンの有効性がヒトまたは動物の臨床研究によって直接的または間接的に証明されれば、インビトロまたはインビボアッセイを用いてその有効性をその効力と相関させることができる。新規に生産されたワクチンバッチの相対効力は、例えばＥＬＩＳＡアッセイによって参照ワクチンの相対効力と比較することができる。同様に、参照ワクチンまたは新規に生産されたワクチンバッチの安定性の変化も、ＥＬＩＳＡアッセイによって監視することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、参照ワクチンに頼って新規に生産されたワクチンの質を保証することには多くの問題が残る。上に示す通り、参照ワクチンは経時的に劣化する可能性があり、時間のかかる新たなヒトまたは動物の臨床研究によって定期的に再証明する必要がある。参照ワクチンが緩やかに劣化する場合であっても、政府の規制要件によって参照ワクチン材料に対して有効期限が課されることが多い。このように、認定には通常、ワクチンの有効性を証明するためのヒトまたは動物の実験が必要とされるため、ワクチンの定期的な認定または参照ワクチンの再認定は、時間と費用がかかる可能性がある。
【０００６】
更に、免疫学に基づくアッセイを用いて多価ワクチンの効力を評価する場合、抗原間の干渉が生じ得る。このような干渉は、新規に製造された多価ワクチンの相対効力の評価を難しく、または不可能にし得る。
【０００７】
したがって、これらの問題を回避する品質管理方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて抗原またはワクチンの安定性または効力を測定できる方法を提供する。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、ｉ）抗原の供給源から調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、ｉｉ）抗原の供給源から調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよびｉｉｉ）第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較して第２の液体クロマトグラフィー測定値の変化を定量し、これによって抗原の安定性を測定するステップを含む、抗原の安定性を測定する方法を対象とする。内部標準が試料に添加されてもよい。測定値は、抗原および内部標準の吸光または蛍光放射の量を示す記録されたピークから得ることができる。第１の液体クロマトグラフィー測定値は、第１の試料における抗原のピーク下面積の、第１の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であってよい。また第２の液体クロマトグラフィー測定値は、第２の試料における抗原のピーク下面積の、第２の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であってよい。抗原の供給源はワクチンバッチであってよい。試料は、ワクチンバッチから採取された試料においてアジュバントから抗原を分離することによって調製され得る。抗原を、ワクチンバッチから採取された試料において沈殿させることができる。あるいは、アジュバントを、ワクチンバッチから採取された試料において沈殿させてもよい。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ｉ）参照ワクチンから調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、ｉｉ）ワクチンバッチから調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよびｉｉｉ）第２の液体クロマトグラフィー測定値を第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較し、これによって対応する参照ワクチンの効力に対するワクチンバッチの効力を決定するステップを含む、対応する参照ワクチンの効力に対するワクチンバッチの効力を測定する方法を対象とする。内部標準が試料に添加されてもよい。測定値は、抗原および内部標準の吸光または蛍光放射の量を示すピークから得ることができる。第１の液体クロマトグラフィー測定値は、第１の試料における抗原のピーク下面積の、第１の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であってよい。また第２の液体クロマトグラフィー測定値は、第２の試料における抗原のピーク下面積の、第２の試料における内部標準の正規化されたピーク下面積に対する比であってよい。第１の試料および第２の試料は、それぞれ参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料においてアジュバントから抗原を分離することによって調製され得る。抗原を、参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料において沈殿させることができる。あるいは、アジュバントを、参照ワクチンおよびワクチンバッチから採取された試料において沈殿させてもよい。
【００１１】
更に別の実施形態において、本発明は、ｉ）参照ワクチンから調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、ｉｉ）ワクチンバッチから調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよびｉｉｉ）第２の液体クロマトグラフィー測定値を第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較し、これによって対応する参照ワクチンの効力に対するワクチンバッチの効力を決定するステップを含む、ワクチンバッチを参照ワクチンとして認定する方法であって、第２の液体クロマトグラフィー測定値が第１の液体クロマトグラフィー測定値と少なくとも同一である場合にワクチンバッチが参照ワクチンとして認定される方法を対象とする。
【００１２】
更に別の実施形態において、本発明は、ｉ）抗原の供給源から調製された第１の試料に含まれる抗原の第１の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップ、ｉｉ）抗原の供給源から調製された第２の試料に含まれる抗原の第２の液体クロマトグラフィー測定値を収集するステップおよびｉｉｉ）第１の液体クロマトグラフィー測定値と比較した第２の液体クロマトグラフィー測定値の変化を定量し、これによって抗原の安定性を測定するステップを含む、参照ワクチンを再認定する方法であって、抗原の供給源は以前に認定された参照ワクチンであり、第２の液体クロマトグラフィー測定値が第１の液体クロマトグラフィー測定値と少なくとも同一である場合に参照ワクチンが再認定される方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の方法を用いて得られた、フェンベンダゾール内部標準を添加する前のネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）ワクチンから調製されたＨＰＬＣ試料の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】実施例１の方法を用いて得られた、ＥＬＩＳＡアッセイによる反応を示すことが確認されたネオスポラ・カニナム単離画分の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。約３．７分のピークが抗原に相当する。
【図３】実施例１の方法を用いて得られた、フェンベンダゾール内部標準の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。約５分のピークが内部標準に相当する。
【図４】実施例１の方法を用いて得られた、フェンベンダゾール内部標準を含むネオスポラ・カニナムワクチンの代表的なクロマトグラムである。約３．７分の抗原ピークと約５分の内部標準ピークとの間に重複はない。
【図５】濃縮抗原１．０％−５．０％の範囲にわたるネオスポラ・カニナム抗原のピーク面積比対濃度として測定された検出器反応を表すグラフである。
【図６】実施例１のＨＰＬＣ法を用いて決定された正規化ピーク面積比と、それぞれの試料におけるＥＬＩＳＡ効力アッセイとの相関関係を表すグラフである。
【図７】実施例２の方法を用いて得られた、ＤＰＰ内部標準添加前のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンから調製されたＨＰＬＣ試料の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】実施例２の方法を用いて得られた、精製されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原（ｐ４４）の代表的なクロマトグラムである。この試料に用いられているタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離されたバンドから可溶化された。約５分のピークが抗原に相当する。非常に大きい約１５．５分のピークは抗原が含まれているバッファーに相当するが、これは通常ワクチンには存在しない。
【図９】実施例２の方法を用いて得られた、ＤＰＰ内部標準の代表的なクロマトグラムである。ＤＰＰのピークは約１５分で現れる。
【図１０】実施例２の方法を用いて得られた、ＤＰＰ内部標準を含むマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの代表的なクロマトグラムである。約５分の抗原ピークと、約１５（１４．８）分の内部標準ピークとの間に重複はない。
【図１１】濃縮抗原１．０％−２４％の範囲にわたるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原のピーク面積比対濃度として測定された検出器反応を表すグラフである。
【図１２】ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）／マイコプラズマ・ハイオニューモニエ混合ワクチン試料から調製されたＨＰＬＣ試料由来の約６．７分のＰＣＶ抗原ピークを示す代表的なクロマトグラムである。このクロマトグラムはフタル酸内部標準を全く含まない。
【図１３】ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）／マイコプラズマ・ハイオニューモニエ混合ワクチン試料から調製されたＨＰＬＣ試料由来の約６．７分のＰＣＶ抗原ピークを示す代表的なクロマトグラムである。この試料にフタル酸内部標準が添加され、そのピークは約４．３分に生じる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて抗原またはワクチンの安定性または効力を測定できる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて、ある抗原供給源由来の抗原の任意の経時的な劣化を観察または監視する。別の一実施形態において、本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて、ある供給源由来の抗原の効力を別の供給源由来の抗原の効力と比較する。
【００１５】
抗原の供給源は、ワクチン生産工程の任意の段階から得ることができる。したがって、抗原の供給源は培養工程における材料であってよい。抗原の供給源は、培養が完了または最適化されたと考えるのに十分な収量であると判断されるような細胞、寄生生物またはウイルス密度を達成した材料であってもよい。抗原の供給源は、培養物から濃縮または回収され得る。あるいは、抗原の供給源は、培養物からの抽出物または部分的もしくは完全に精製された培養成分であってよい。抗原自体は、生ワクチン、弱毒化された生ワクチンまたは不活化ワクチンであってよい。抗原の供給源はまた、部分的または完全に完成したワクチン製品であってもよい。抗原の供給源は、最終的な形態と組成で生産されたバルクまたは最終容器に入った生物学的製品や、瓶詰めされ、封をされ、包装され、ラベルを貼られた完成製品または市場において発売された最終製品であってよい。
【００１６】
同一の供給源由来の抗原は、その均一性によって一群にまとめることの可能なあらゆる抗原を表す。同一の供給源由来の抗原は、正に培養抗原バッチの単一容器内の材料を含むことができる。あるいは、同一の供給源由来の抗原は、完全に混合した複数バッチの培養抗原または個別包装以前の製剤中に完全に混合した別々のバッチの培養抗原から作製され製剤されたワクチンを含むことができる。培養物の単一で均一なバッチは、分割されて別々のバッチ、ロットまたはシリアルのワクチンを作製することができる。異なる分割区分の培養物から作製された個別包装のワクチンは、その製剤が同一または同様の材料を用いて、同一または同様の方法で調製される場合、依然として同一の供給源由来の抗原を含むと考えることができる。
【００１７】
異なる抗原試料は、同一の供給源から得られるが、異なる加工段階にあるものであってよい。例えば、培養された抗原バッチの半分は回収、保存され、一方残り半分はワクチン最終製品の最終段階まで加工され得る。更に後述する通り、任意の加工段階から得られる抗原の効力または安定性は、本明細書に記載の技法によって測定され得る。ワクチン生産工程の異なる段階から得られる抗原試料は、相対的な抗原効力が測定される場合に用いることができる。確かに、相対的な抗原効力が測定される場合、ある供給源由来の抗原試料は、別の供給源由来の抗原試料と比較することができ、両試料はワクチン生産工程の同一または異なる段階から得ることができる。しかし対照的に、抗原の安定性が測定される場合は、同一供給源の同一生産工程の段階に由来する材料を用いることが好ましい。
【００１８】
液体クロマトグラフィーにおいて、試料は固相上に導入される。試料（すなわち液体クロマトグラフィー試料）は、可能な限り均一に固相に進入できるように通常液体試料として調製される。液体クロマトグラフィー試料は、通常固相のサイズや固相を通過する移動相の量と比べて小容量である。液体クロマトグラフィー試料の容量は、通常固相容量の５％を超えず、多くの場合固相の１％または２％を超えない。本明細書において用いられている「液体」および同様の用語は、非ガス状で非固体状である液状の物質を言う。
【００１９】
液体クロマトグラフィー試料中の成分（抗原または任意の内部標準を含む）は、固相と結合する。固相を通過する液体移動相は、２種類以上の液体の溶媒グラジェントを用いることによって液体クロマトグラフィー法の間に変化する。このグラジェントは、液体クロマトグラフィー試料中の成分の、固相に対する結合親和性を変動的に変化させる。このようなグラジェントは固相において試料を分離させ、これによって試料の構成要素（または画分）を異なる時間で捕集することができる。したがって、液体移動相は、使用されている抗原または任意の内部標準が、試料中の他の成分とは別々に固相を通過できるように最適化することができる。
【００２０】
本発明の一実施形態において、液体クロマトグラフィー技法はカラムクロマトグラフィーの手順を用いる。このような手順は好ましくは、移動相が一定の速度で固相を通過できるようにするポンプ、ならびに固相を通り抜ける試料画分の分光的変化（例えば吸光、蛍光、リン光など）を観察、記録する光源および検出器を含む。本発明の一実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィーとも言う）を用いる。なお、当業者は、本発明を適用できる他のクロマトグラフィー技術にも精通している。液体クロマトグラフィー試料の画分は、溶媒グラジェントによって徐々に変化する移動相の構成のため、異なる時間で固相から出てくる。液体クロマトグラフィー装置に取り付けられた検出器は、任意の所与の時間に固相から出てくる画分が分光的活性（例えば吸光、蛍光、リン光など）を有するか否かを観察する。分光的活性を有する画分は、クロマトグラムのピーク（すなわち、固相から出てくる分光的活性物質の記録。例えば、図１−図４、図７−図１０、図１２および図１３を参照）を生じる。抗原に相当するピークは、本明細書に記載の通りに用いられて、所与の試料における抗原の安定性または効力を評価することができる。
【００２１】
本発明の一態様において、液体クロマトグラフィーは抗原の安定性を測定するために用いられる。抗原の安定性は、抗原の液体クロマトグラフィーから得られる分光クロマトグラムの経時的な変化を観察することによって測定され得る。安定性の測定は、同一供給源の異なる時間から得られる抗原の、少なくとも２つの液体クロマトグラフィー測定を要する。第１の測定は第１の時間に行われ、続く第２の測定は第２の時間に行われる。これらの測定は、数時間、数日間、数カ月間または数年間を置いて行われ得る。しかし、安定性の測定を得るために、液体クロマトグラフィー測定は一定の方法で行わなければならず、また抗原の同一供給源の、好ましくは同一加工段階に由来する液体クロマトグラフィー試料から取得されなければならない。好ましくは、液体クロマトグラフィーの反復測定は、正確な測定が得られるように液体クロマトグラフィー試料毎に行われる。
【００２２】
定量された濃度または量の抗原を有する外部標準を利用できない場合、それに対して抗原の安定性の変化が測定可能な内部標準（Ｉ．Ｓ．）が用いられなければならない。内部標準の利用によって、相対的な安定性の測定ができる。すなわち、ある一時点の試料の供給源における抗原量に対する別の一時点の同一の供給源における抗原量である。このようなプロセスにおいて、第１の液体クロマトグラフィー試料は、内部標準を含む抗原の供給源から調製される。内部標準は、抗原から生じる液体クロマトグラフィーシグナルと干渉しない液体クロマトグラフィーシグナルを生じる。内部標準のピーク面積は、液体クロマトグラフィー試料の作製に用いられた内部標準の重量に基づいて正規化され、抗原の内部標準に対する正規化されたピーク面積比（ＮＰＡＲ）を記録することができる。ＮＰＡＲを計算するための式は次の通りである。
ＮＰＡＲ＝［（抗原のピーク面積）／（Ｉ．Ｓ．のピーク面積）］×（Ｉ．Ｓ．の重量）／（Ｉ．Ｓ．の理想重量）
「Ｉ．Ｓ．の重量」は、試料調製に用いられ実際に測定された内部標準の重量であり、「Ｉ．Ｓ．の理想重量」は、抗原のピーク面積と同様のまたは同程度の規模の不飽和ピーク面積を有するクロマトグラムを生じる内部標準の正規化された重量である。本明細書において、「ＮＰＡＲ」および「重量正規化されたピーク面積比」は同義語である。本明細書に記載のＮＰＡＲや他のあらゆるピーク面積比は、抗原に由来する曲線下面積の、内部標準に由来する重量正規化された曲線下面積に対する比を言う。
【００２３】
好ましくは、正確な測定が得られるよう、抗原の供給源から調製された第１の液体クロマトグラフィー試料のためにＮＰＡＲの反復測定値が記録される。ある一定期間（数時間、数日間、数週間、数カ月間または数年間）の後、正確な測定が得られるよう同一の抗原供給源から調製された第２の液体クロマトグラフィー試料のためにＮＰＡＲの反復測定値が記録される。好ましくは、液体クロマトグラフィー試料は、使用１−２日以内に作製される。抗原ピークは抗原の安定性と直接的に相関関係があるため、２つの液体クロマトグラフィー試料のＮＰＡＲ値は、抗原の供給源が安定であるかどうかを決定するために用いられ得る。経時的に安定なＮＰＡＲ値は、抗原供給源が劣化していないことを示す。対照的に、ＮＰＡＲ値の経時的な低下は、抗原供給源中の抗原が劣化していることを示す。
【００２４】
ワクチン安定性の追跡のためのこのような液体クロマトグラフィー法は、例えば参照ワクチンの抗原またはワクチンの新規に生産されたバッチ（またはロット）の安定性を追跡するために用いられ得る。
【００２５】
本発明はまた、液体クロマトグラフィーを用いてある抗原供給源由来の抗原の効力を測定できる方法を提供する。培養バッチ由来の未完成の回収されたバルク抗原を扱おうと、完成したワクチンを扱おうと、抗原効力を測定することが重要である。前者の場合、より多くの資源（例えば材料、人員、機材または時間）をバルク材料に投じる前にバルク材料の抗原効力を知ることまたは所望の強さすなわち効力の最終製品を生産するために必要な量を計算することが好ましい。後者の場合、完成したワクチン製品は、十分な効力を有することを示さない限り流通や販売のために発売できない。
【００２６】
本出願人らによる本発明によって可能となる液体クロマトグラフィー効力アッセイは、所与の抗原供給源から調製された試料の液体クロマトグラフィー測定値を、参照供給源から得られる液体クロマトグラフィー測定値と比較する。新たにバッチとなったワクチンの効力は、通常参照ワクチンの効力に対して測定される。参照ワクチンは、ヒトまたは動物において有効、すなわち免疫原性であることを直接的または間接的に示したワクチンである。比較による効力測定はまた、まだ最終製品ではないワクチンにおける抗原と参照ワクチンとの間で行われ得る。あるいは、まだ最終製品ではないワクチンにおける抗原は、参照ワクチンの代わりに参照抗原（またはマスター抗原標準）と比較することができる。「参照抗原」は、ワクチン最終製品へと更に加工するのに十分なレベルの抗原の量または質を有することが知られている、生産工程の任意の段階の抗原の供給源を指すことができる。「参照供給源」は、参照ワクチンまたは参照抗原であってよい。
【００２７】
本明細書において、参照ワクチンは、マスター参照または作業参照を言う。マスター参照は、その効力が宿主動物の免疫原性と直接的または間接的に相関関係がある参照である。マスター参照は、相対的な効力のインビトロ試験において作業参照として用いられ得る。マスター参照はまた、再認定試験において用いられるシリアル製品の相対的な効力を確立するため、また作業参照の相対的な効力を確立するために用いられ得る。マスター参照の限定されない実施例として、（１）完成したシリアルのワクチンまたはバクテリン、（２）防御的免疫原または抗原の精製された調製物または（３）非アジュバントの回収された微生物の培養物が挙げられる。作業参照は、シリアル製品の発売のためのインビトロ試験において用いられる参照調製物である。作業参照の限定されない実施例として、（１）マスター参照または（２）参照調製物としての使用のために動植物検疫局（Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）において許容される方法で調製、認定された製品シリアルが挙げられる。
【００２８】
参照ワクチンは通常、ある一定の年数を経た後「参照ワクチン」としての認証を失い、そのため「参照ワクチン」として再確立される必要がある。参照ワクチンの再確立（すなわち再認定）は、例えば有効性を示すことによってなされ得る。しかし本明細書において記述されているように、本発明は、参照ワクチンがこのように再認定されることのできる別の方法を提供する。
【００２９】
上述の安定性測定の場合と同様に、公知の量または濃度を有する外部標準を相対効力測定のために利用できない場合、内部標準が用いられる。相対効力測定は、参照供給源の抗原効力に対する抗原のある供給源における抗原効力を提供する。抗原ピークは抗原供給源に存在する抗原の量と直接的に相関関係があるため、ワクチンバッチの効力は、抗原供給源から調製された液体クロマトグラフィー試料のＮＰＡＲを、参照供給源から調製された液体クロマトグラフィー試料のＮＰＡＲと比較することによって測定され得る。参照供給源と同一またはそれを超えるＮＰＡＲ値を有する抗原供給源は、更なる加工（未完成の製品の場合）または販売／発売（完成した製品の場合）のために必要とされる効力レベルを有する。
【００３０】
定量された量の抗原を有する外部標準が利用可能な場合、任意の抗原の供給源から調製された液体クロマトグラフィー試料の測定は、内部標準を利用せずに抗原の量を定量するために用いられ得る。このような定量は、抗原の供給源の効力または安定性の測定を可能にする。このような場合、異なる濃度の外部標準を用いた回帰分析を行って、抗原の液体クロマトグラフィーのピーク面積を抗原の濃度（または量）と相関させるグラフの曲線を求めることができる。回帰分析を行った後、任意の抗原の供給源から調製された液体クロマトグラフィー試料に存在する抗原の液体クロマトグラフィーピーク面積を測定することによって、抗原のその供給源に存在する抗原の濃度（または量）を決定することができる。試料に存在する抗原の濃度（または量）の実効値は、効力と相関関係がある。試料に存在する抗原の濃度（または量）の実効値の変化は、安定性と相関関係がある。上述の通り、液体クロマトグラフィー試料は、好ましくは使用の約１−２日以内に調製される。
【００３１】
液体クロマトグラフィー試料は、タンパク質化学技術においてよく知られている技法を用いることによって抗原供給源から調製され得る。抗原供給源が物理的処理（例えば遠心分離、超音波処理など）または化学的処理（塩誘導性の沈殿、ｐＨの変化）に付されることによって、液体クロマトグラフィー試料を調製することができる。好ましくは、このような処理は、抗原供給源中の抗原のいかなる劣化も生じないように行われる。超音波処理は、例えば加熱とその後の試料の劣化を防ぐために、ウォーターバスにおいて行うことができる。
【００３２】
様々な内部標準が用いられ得る。好ましくは、内部標準は安定的で、液体クロマトグラフィー試料の調製時から試料の液体クロマトグラフィー装置への注入時までの間にいかなる変化も生じない。内部標準はまた、好ましくは、固有の時間で、抗原ピークのいかなる部分からも離れて（すなわち、他の物質と共溶出せずに）カラムから溶出する。
【００３３】
次の実施例は例示目的のためだけに提供され、決して本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００３４】
（実施例）
【実施例１】
【００３５】
ネオスポラ・カニナムワクチン
次に、不活化されたネオスポラ・カニナムワクチンにおける抗原量を定量化するために開発された逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を記載する。この方法は、２１０ｎｍのＵＶ検出を備えるＣ−１８カラムにおけるグラジェント溶出を利用する。内部標準を用いて抗原量を定量し、ワクチンに存在する抗原の相対量を決定する。この方法は、特異性、線形性、精度および正確性の実験を行うことによって確認された。ＨＰＬＣアッセイによって得られる結果と、ＥＬＩＳＡ相対効力アッセイによって得られる結果との相関関係を実証した。
【００３６】
１．１  フェンベンダゾール（ＦＢＺ）内部標準ストック溶液の調製
抗原タンパク質の定量化のために利用可能な外部標準がないため、内部標準を用いて抗原タンパク質量を定量化した。５０ｍｇのフェンベンダゾール（ＦＢＺ）を正確に秤量して５０ｍＬ容量フラスコに入れることによって、フェンベンダゾール内部標準ストック溶液を調製した。フェンベンダゾールを５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ＨＰＬＣ級）に溶解した。ＦＢＺ／ＤＭＦ溶液をメタノール（ＨＰＬＣ級）で５０ｍＬの容量に希釈し、十分に混合した。
【００３７】
１．２  ＨＰＬＣ試料の調製
ネオスポラ・カニナムワクチン試料（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．、ミルスボロ、デラウェア州）を磁力で攪拌した。攪拌しながら４．０ｍＬのワクチンをピペットで採取して１５ｍＬ遠心分離チューブに入れ、次に２．０ｍＬのメタノール（ＨＰＬＣ級）を入れた。遠心分離チューブの蓋をして内容物を十分に混合した後、混合物を約２０−２５℃に維持したウォーターバス中で１０分間超音波処理し、続いて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００μＬのフェンベンダゾール内部標準ストック溶液を５ｍＬ容量フラスコに添加し、全容量５ｍＬになるように試料上清液で希釈し、十分に混合した。
【００３８】
１．３  ＨＰＬＣ分析の手順
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣオートサンプラー、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ  ＵＶ検出器およびＡｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  ＨＰＬＣデータ収集システムを取り付けたＨＰＬＣ装置においてＨＰＬＣを行った。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムを試料分離のために用いた（１５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．、平均粒径５μｍ）。
【００３９】
カラムを３０℃に維持し、選択的にカラムに１００μＬの試料を注入した後、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂ（１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）をブランク注入することによって前平衡化した。５回反復の試料注入によってピーク面積比（Ｐｅａｋ  Ａｒｅａ  Ｒａｔｉｏ）（ＰＡＲ、ネオスポラ抗原／フェンベンダゾール）の％相対標準偏差（％ＲＳＤ）が＜３％になるまで、試料を前平衡化試料としてランを行った。抗原は２１０ｎｍのＵＶ吸収によって検出する。試料のキャリーオーバーを防ぐために、各試料注入に続いてＭｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂの注入（ラン）を行った。新しいカラムを用いる場合、複数回の平衡化注入が必要であることが分かった。
【００４０】
１００μＬの試料またはブランクをカラムに注入した後（前平衡化試料であれ、カラムが平衡化された後に注入した試料であれ）、表１に従って流速１ｍＬ／分の移動相グラジェント（Ａ：１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉまたは同等品）；Ｂ：１ｍＬ／Ｌ  ＴＦＡを含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）を用いて、試料またはブランクの溶出を得た。トリフルオロ酢酸は、ｐＨを下げ、イオン対試薬として機能するために移動相に添加する。
【００４１】
【表１】
2011522252.tif 000002
【００４２】
ネオスポラ・カニナム抗原の保持時間は、約３．７分間である。フェンベンダゾール内部標準の保持時間は、約５．０分間である。抗原ピークの保持は、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂの初速度を変えることによって調整することができる（例えば、より速い速度は抗原ピークの保持時間を短くする）。フェンベンダゾールピークの保持は、移動相のＴＦＡ濃度を変えることによって調整することができる（例えば、より高濃度のＴＦＡはＦＢＺピークの保持時間を長くする）。
【００４３】
抗原タンパク質ピークの定量化は、内部標準（フェンベンダゾール）の利用によって達成され、その結果はピーク面積比またはフェンベンダゾール当量としての濃度として報告することができる。精製された外部標準が利用できないため、この操作が必要であった。フェンベンダゾール重量正規化ピーク面積比は、次式を用いて計算される。
ピーク面積比＝［（ネオスポラ・カニナム抗原のピーク面積）／（ＦＢＺのピーク面積）］×（ＦＢＺのｍｇ重量／５０）
「ＦＢＺのｍｇ重量」は、ＨＰＬＣ試料を調製するために用いたＦＢＺをｍｇで測定した重量である。あるいは、抗原の定量化は、次式を用いたフェンベンダゾール当量の濃度単位で報告することができる。
ｍｇ／ｍＬ  ＦＢＺ当量＝［（ピーク面積比×１ｍｇ／ｍＬ）×（０．１ｍＬ）］／（５ｍＬ×０．６５）
【００４４】
１．４  抗原およびフェンベンダゾール内部標準のＨＰＬＣ同定
どのピークが抗原に関連するピークであるかを決定するため、予備的グラジェントＨＰＬＣ法を用いてネオスポラ・カニナムワクチンに存在する成分の大部分を分離した。各ピークまたはピーク群の画分をＥＬＩＳＡまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）アッセイのために捕集した。単一画分のみがＥＬＩＳＡ陽性抗原反応を示すことが判明した。
【００４５】
次いで、ＨＰＬＣ条件を上述の表１の通り調整し、このピークの分離および分離能を最適化した。最終的なＨＰＬＣ条件を用いたネオスポラ・カニナムワクチン（ただし、ＦＢＺ標準を含まない）の代表的なクロマトグラムを図１に示す。表１の溶出グラジェントを用いた、ＥＬＩＳＡアッセイによる反応を示す単離ＨＰＬＣ画分の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。したがって、目的のピークは、提示されているＨＰＬＣ条件を用いると約３．７分で溶出する。上述の最終的なＨＰＬＣ条件を用いて得られた、ＦＢＺ内部標準の代表的なクロマトグラムを図３に示す。したがって、ＦＢＺ内部標準は約５分で溶出する。図４は、上述の方法に従って調製され、上述のカラムとグラジェントを用いたＨＰＬＣカラムを通過したＦＢＺ添加Ｎ．カニナムワクチン試料の代表的なクロマトグラムを示す。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  ＨＰＬＣデータ収集システムは、それぞれ約３．７分と約５分の抗原ピークとＦＢＺピークの曲線下面積値を提供する。
【００４６】
これらのクロマトグラムは、ネオスポラ・カニナム抗原および内部標準（フェンベンダゾール）に関連する目的のピークが、ワクチン中の他の成分に関連するピークとは十分に分離していることを示す。したがって、提示されている方法は、その使用目的に対して特異的である。
【００４７】
１．５  ＨＰＬＣピーク面積比と抗原濃度との間の線形相関
様々な濃度のネオスポラ・カニナム抗原を用いて線形性試験を行った。抗原濃度１％、２％、３％、４％および５％（ｖ／ｖ）の水溶液を調製したが、これらはそれぞれワクチンに存在する抗原濃度の約４０−２００％に相当する。溶液を調製し、提示されている方法に従いＨＰＬＣによって分析した。
【００４８】
次の統計値を求めるために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３  ＳＰ２の直線回帰機能を用いて、ピーク面積比対抗原濃度としての検出器反応の直線回帰分析を行った：積率相関係数（ｒ）、ｙ切片、傾きならびにｙ切片の上限および下限９５％信頼区間。
【００４９】
データを表２および図５にまとめる。相関係数（ｒ）を０．９９８に決定した。上限および下限９５％信頼区間は括弧ゼロであり、ｙ切片がゼロと有意差がないことを示した。したがって、本明細書に記載のＨＰＬＣ法は、抗原濃度とピーク面積比との間の直接的な線形相関を提供する。
【００５０】
【表２】
2011522252.tif 000003
【００５１】
１．６  ＨＰＬＣピーク面積比とＥＬＩＳＡ測定抗原効力との間の線形相関
ＨＰＬＣアッセイ法を、ピーク面積比と標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した相対効力値とを相関させることにより相対効力を精密に検出するその能力のために評価した。この試験は、予めストレスを与えて劣化を誘導したネオスポラ・カニナムワクチン試料を用いた。試料は、熱、酸、塩基、超音波処理および凍結／融解サイクルを用いてストレスを与えた。ストレスなしのワクチン試料も比較目的のため分析した。
【００５２】
精度試験の結果を表３にまとめる。提示されているＨＰＬＣ法とＥＬＩＳＡ効力アッセイとの間の相関関係のグラフを図６に表す。提示されている方法は、ストレスを与えられた試料を区別することができ、ＥＬＩＳＡ効力アッセイ（ｒ２＝０．９５）と適切な相関関係を有することが示された。したがって、提示されている方法は、その使用目的に対して十分に精密であると考えられた。
【００５３】
【表３】
2011522252.tif 000004
【００５４】
１．７  ＨＰＬＣ法の正確性
提示されている方法に従ってネオスポラ・カニナムワクチンバッチを分析することによって正確性試験を行った。同一試料溶液をＨＰＬＣに５回反復注入することによって、このシステムにおける分散（システムの正確性）を決定した。同一ワクチンバッチを６回反復して調製、分析することによって、特定のワクチンバッチから試料を調製する際の分散（アッセイ内の正確性）を決定した。２人の分析者が別々の日に異なるＨＰＬＣカラムでアッセイ内正確性試験を行うことによって、操作者間の分散（介在的正確性）を決定した。
【００５５】
システム正確性試験の結果を表４に示す。同一試料溶液反復注入の％ＲＳＤ値は、２人の分析者において１．１％および２．７％であった（ｎ＝５）。
【００５６】
【表４】
2011522252.tif 000005
【００５７】
アッセイ内および介在的正確性試験の結果を表５に示す。同一ワクチンバッチの反復試料調製における％ＲＳＤ値は、分析者１と分析者２においてそれぞれ２．８％および２．５％であった（ｎ＝６）。全試料調製の％ＲＳＤは、５．２％であった（ｎ＝１２）。
【００５８】
【表５】
2011522252.tif 000006
【００５９】
これらのデータは、提示されている方法がその使用目的に対して十分なシステム正確性、アッセイ内正確性および介在的正確性を有することを示す。
【００６０】
１．８  内部標準溶液の安定性
内部標準溶液は、それが使用されている時間経過において安定的である。ワクチン試料は数日から数年の期間凍結または低温で保存され得るが、内部標準溶液だけでなくＨＰＬＣ試料は好ましくは１週間以内、最も好ましくは１−２日以内に調製、使用される。内部標準は、本明細書に記載のＨＰＬＣ分析のためにこの期間において安定的である。
【実施例２】
【００６１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を開発して、不活化されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンであるＭｙｃｏ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｏｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．、ミルスボロ、デラウェア州）における抗原量を定量化するのに有効であることを確認した。この方法は、２１０ｎｍのＵＶ検出を備えるＣ−１８ＨＰＬＣカラムにおけるグラジェント溶出を利用する。抗原の量は、ワクチンに存在する抗原の相対量を決定するため内部標準を用いて定量化する。この方法は、特異性、線形性、精度および正確性試験を行うことによって確認した。ＨＰＬＣアッセイによって得られた結果は、ＥＬＩＳＡ相対効力アッセイから得られた結果と相関関係を示した。
【００６２】
２．１  フタル酸ジプロピル（ＤＰＰ）内部標準溶液の調製
５０ｍｇのフタル酸ジプロピル（ＤＰＰ）を正確に秤量して５０ｍＬ容量フラスコに入れることによって、フタル酸ジプロピル内部標準ストック溶液を調製した。ＤＰＰはメタノールで全容量５０ｍＬになるように溶解し、希釈し、十分に混合した。この溶液のおおよその濃度は１ｍｇ／ｍＬである。ＤＰＰ内部標準ストック溶液の一定分量１０．０ｍＬを５０ｍＬ容量フラスコに移し、それを全容量５０ｍＬになるように水で希釈し十分に混合することによって、フタル酸ジプロピル作業標準溶液を作製した。使用溶液のおおよその濃度は０．２ｍｇ／ｍＬである。
【００６３】
２．２  ＨＰＬＣ試料調製
マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．、ミルスボロ、デラウェア州）を磁力で攪拌した。攪拌しながら２．０ｍＬのワクチンをピペットで採取して１５ｍＬ遠心分離チューブに入れた。次いで、チューブを約１５，０００ｒｐｍ（約２９，０００×ｇ）、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離によって、エマルジョンを２層に分離する。遠心分離の後に、水（下）層を慎重にピペットで採取して別の遠心分離チューブに入れた。
【００６４】
次のものを５ｍＬ容量フラスコにピペットで採取して入れた。すなわち、２ｍＬのトリスバッファー溶液（１２．１ｇのトリス塩基（ＵＳＰ級）を１Ｌの純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）に溶解し、高濃度のＨＰＬＣ級リン酸でｐＨを６．８に調整）、１．０ｍＬの上述の遠心分離後の試料水溶液および１．０ｍＬの上述のＤＰＰ作業標準溶液。この混合液を全容量５ｍＬになるように純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）で希釈し、十分に混合した。
【００６５】
２．３  ＨＰＬＣ分析手順
上述の１．３節と同じＨＰＬＣ装置において同様にカラムを３０℃に維持し、選択的に５０μＬの試料をカラムに注入した後、メタノール／水（１／１、ｖ／ｖ）をブランク注入することによって前平衡化し、ＨＰＬＣを行った。５回反復の試料注入によってピーク面積比（ＰＡＲ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原／ＤＰＰ）の％相対標準偏差（％ＲＳＤ）が＜３％になるまで、試料を前平衡化試料としてランを行った。抗原は２１０ｎｍのＵＶ吸収によって検出する。試料のキャリーオーバーを防ぐために、各試料注入に続いてメタノール／水（１／１、ｖ／ｖ）のブランク注入（ラン）を行った。新しいカラムを用いる場合、複数回の平衡化注入が必要であることが分かった。
【００６６】
各５０μＬの試料またはブランクをカラムに注入した後（前平衡化試料であれ、カラムが平衡化された後に注入した試料であれ）、表６に従って流速１ｍＬ／分の移動相グラジェント（Ａ：１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉまたは同等品）；Ｂ：１ｍＬ／Ｌ  ＨＰＬＣ級ＴＦＡを含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）を用いて、試料またはブランクの溶出を得た。トリフルオロ酢酸はｐＨを低げ、イオン対試薬として機能するために移動相に添加する。
【００６７】
【表６】
2011522252.tif 000007
【００６８】
ＥＬＩＳＡ陽性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原の保持時間は、約５分間である。ＤＰＰ内部標準の保持時間は、約１５分間である。抗原ピークの保持は、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂの初速度を変えることによって調整することができる（例えば、より速い速度は抗原ピークの保持時間を短くする）。
【００６９】
抗原タンパク質ピークの定量化は内部標準（ＤＰＰ）の利用によって達成され、その結果はピーク面積比またはＤＰＰ当量としての濃度として報告することができる。精製された外部標準が利用できないため、この操作が必要であった。ＤＰＰ重量正規化ピーク面積比は、次式を用いて計算される。
ピーク面積比＝［（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原のピーク面積）／（ＤＰＰのピーク面積）］×（ＤＰＰのｍｇ重量／５０）
「ＤＰＰのｍｇ重量」は、ＨＰＬＣ試料を調製するために用いたＤＰＰをｍｇで測定した重量である。あるいは、抗原の定量化は、次式を用いたフェンベンダゾール当量の濃度単位で報告することができる。
ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰ当量＝ピーク面積比×０．２ｍｇ／ｍＬ
【００７０】
２．４  抗原およびＤＰＰ内部標準のＨＰＬＣ同定
どのピークが抗原に関連するピークであるかを決定するため、予備的グラジェントＨＰＬＣ法を用いてマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンに存在する成分の大部分を分離した。各ピークまたはピーク群の画分をＥＬＩＳＡまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）アッセイのために捕集した。単一画分のみがＥＬＩＳＡ陽性抗原反応を示すことが判明した。
【００７１】
次いで、ＨＰＬＣ条件を上述の通りに調整し、このピークの分離および分離能を最適化した。この条件下で目的ピークが約５分間で溶出することが分かった。最終的なＨＰＬＣ条件を用いたマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン（ただし、ＤＰＰ標準を含まない）の代表的なクロマトグラムを図７に示す。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の単離バンドから可溶化した抗原物質試料を同一のＨＰＬＣ条件下で行った別のクロマトグラムは、同じ時間でピークを生じる（図８）。ゲルのバンドから可溶化された物質は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのｐ４４抗原を表すことが知られている。
【００７２】
この抗原タンパク質の定量化に利用可能な外部標準はない。したがって、内部標準を用いてワクチン試料における抗原量を定量化した。ワクチンは、ピークのテーリングを引き起こし、抗原タンパク質の後に溶出する大量のタンパク質物質を含有するため、全タンパク質物質の後に溶出する内部標準を選択した。市販品として容易に入手可能であり、図９および図１０に示すようにクロマトグラムにおいてタンパク質物質の後に溶出するため、フタル酸ジプロピル（ＤＰＰ）を選択した。図９は、上述の２．１−２．３節に記載のＨＰＬＣ装置および移動相グラジェントを用いたＤＰＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０は、上述の２．１−２．３節に記載のＨＰＬＣ装置および移動相グラジェントを用いたＨＰＬＣ試料として調製された、マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００７３】
これらのクロマトグラムは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原および内部標準（ＤＰＰ）に関連する目的のピークが、ワクチン中の他の成分に関連するピークと十分に分離していることを示す。したがって、提示されている方法は、その使用目的に対して特異的である。
【００７４】
２．５  ＨＰＬＣピーク面積比と抗原濃度との間の線形相関
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ濃縮抗原を用いて線形性試験を行った。抗原濃度１％、３％、６％、９％、１２％、１５％、１８％および２４％（ｖ／ｖ）の水溶液（標的濃度の８−２００％）を調製した。溶液を調製し、提示されている方法に従ってＨＰＬＣによって分析した。
【００７５】
次の統計値を求めるために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３  ＳＰ２の直線回帰機能を用いて、ピーク面積比対抗原濃度としての検出器反応の直線回帰分析を行った：積率相関係数（ｒ）、ｙ切片、傾きならびにｙ切片の上限および下限９５％信頼区間。
【００７６】
データを表７および図１１にまとめる。相関係数（ｒ）を０．９９９０に決定した。したがって、提示されている方法は、その使用目的に対して十分に線形であると考えられた。
【００７７】
【表７】
2011522252.tif 000008
【００７８】
２．６  ＨＰＬＣピーク面積比とＥＬＩＳＡによって測定した抗原効力との間の相関関係
２．６．１  劣化した試料を用いた相関関係
予めストレスを与えて劣化を誘導したマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの試料を提示されている方法に従って分析することによって精度試験を行った。ストレスなしのワクチン試料もまた比較目的のために分析した。これらの試料は、ＥＬＩＳＡによって予め分析して、劣化していることを示した。試料は、煮沸および様々な濃度のプロテイナーゼＫを添加することによってストレスを与えた。ストレスなしのワクチン試料もまた比較目的のため分析した。
【００７９】
劣化実験の間に得られた結果を表８にまとめる。この結果は、提示されている方法がマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの変化を劣化として検出できることを示した。
【００８０】
【表８】
2011522252.tif 000009
【００８１】
２．６．２  スパイク試料を用いた相関関係
ワクチンに基づくが抗原を含まない溶液を作製し、ピーク面積比とＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した相対効力との間の相関関係を試験した。溶液は、０％、３．７５％、７．５％および１５％のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ濃縮抗原を含有するように調製した。実施例２に記載のＨＰＬＣ法を用いて、またそれとは独立的にＥＬＩＳＡによって、試料を分析した。
【００８２】
結果を表９に示す。抗原を含む緩衝生理食塩溶液の代表的なクロマトグラムを図１２に示す。その結果は、ＥＬＩＳＡの結果と比較的良好な相関関係（ｒ＝０．９９６）を示し、ワクチンマトリックス中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原濃度の差を正確に決定できることを示した。
【００８３】
【表９】
2011522252.tif 000010
【００８４】
２．６．１節と２．６．２節のデータは、提示されている方法が、本明細書に記載のＨＰＬＣ法によって確定したピーク面積比とＥＬＩＳＡによって測定されたワクチン効力とを正確に相関させることを示す。
【００８５】
２．７  ＨＰＬＣ法の正確性
提示されている方法に従ってマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンバッチを分析することによって正確性試験を行った。同一の試料溶液をＨＰＬＣに少なくとも６回反復注入することによって、このシステムにおける分散（システムの正確性）を決定した。特定のワクチンバッチから試料を調製する際の分散（アッセイ内の正確性）は、ワクチンバッチから６回反復して調製し分析することによって決定した。２人の分析者がアッセイ内の正確性試験を別々の日に異なるＨＰＬＣカラムを用いて行うことによって、操作者間の分散（介在的正確性）を決定した。
【００８６】
システム正確性試験の結果を表１０に示す。同一試料溶液反復注入の％ＲＳＤ値は、２人の分析者において０．７３％および１．７３％であった（ｎ＝６）。
【００８７】
【表１０】
2011522252.tif 000011
【００８８】
アッセイ内および介在的正確性試験の結果を表１１に示す。同一ワクチンバッチの反復試料調製における％ＲＳＤ値は、分析者１と分析者２においてそれぞれ３．３％および２．３％であった（ｎ＝６）。全試料調製の％ＲＳＤは、４．７％であった（ｎ＝１２）。
【００８９】
【表１１】
2011522252.tif 000012
【００９０】
これらのデータは、提示されている方法がその使用目的に対して十分なシステム正確性、アッセイ内正確性および介在的正確性を有することを示す。
【００９１】
２．８  内部標準溶液の安定性
環境条件で標準溶液の安定性を評価した。環境条件で２−８日間保存した後に、提示されている方法に従って標準溶液を調製、分析した。標準溶液は、８日間の保存の後で安定的（最初の濃度の１０１％）であることを示した。ワクチン試料は数日から数年の期間凍結または低温で保存することができるが、内部標準溶液だけでなくＨＰＬＣ試料は好ましくは１週間以内、最も好ましくは１−２日間以内に調製、使用される。内部標準は、本明細書に記載のＨＰＬＣ分析のためにこの期間において安定的である。
２．９：カラムの洗浄手順
カラムにおけるアジュバントやタンパク質残渣の蓄積を避けるために、ＨＰＬＣカラムは定期的（各ＨＰＬＣランの後が推奨される）に洗浄すべきである。カラムにおけるこれら残渣の蓄積は、ピーク形の変質やＨＰＬＣカラムからの抗原回収の変化の原因となり得る。
【００９２】
カラムを洗浄するために、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ／Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂ（５／９５、ｖ／ｖ）、５０℃、２ｍＬ／分で３０分間カラムを洗い流し、あらゆるアジュバント残渣を除去した。次に、カラムを５０℃に維持しながら、表１２の溶出グラジェントを用いて流速１ｍＬ／分で１００μＬのトリスバッファー溶液を注入した（Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ：１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  ｔｙｐｅ  １）；Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂ：１ｍＬ／Ｌ  ＨＰＬＣ級ＴＦＡを含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）。カラムの洗浄手順は、必要に応じて繰り返す。
【００９３】
【表１２】
2011522252.tif 000013
【実施例３】
【００９４】
二価ワクチンにおけるブタサーコウイルス抗原
二価ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）２型不活化バキュロウイルスベクター−マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリン（Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ（登録商標）ＰＣＶワクチンとＭｙｃｏ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｏｎｃｅの組み合わせ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．、ミルスボロ、デラウェア州）におけるＰＣＶ抗原を沈殿によって単離し、可溶化し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。被験物中に存在するＰＣＶ抗原の量を内部標準を用いて定量化し、抗原の相対濃度を得た。結果は、ＰＣＶ抗原ピークと内部標準ピークのピーク面積の比を検査に用いられる内部標準の量に対して正規化した、正規化ピーク面積比（ＮＰＡＲ）として表した。この結果を参照ワクチンを用いた結果と比較し、被験物の相対効力の値を導いた。
【００９５】
３．１  フタル酸（ＰＴＡ）内部標準ストック溶液の調製
約２５ｍｇのフタル酸（ＡＣＳ試薬級、≧９９．５％）を正確に秤量して２５０ｍＬ容量フラスコに入れた。次にＰＴＡをＭｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ（１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉ））に溶解して２５０ｍＬ容量に希釈し、十分に混合し、約０．１ｍｇ／ｍＬ濃度を有する溶液を得た。
【００９６】
３．２  ＨＰＬＣ試料調製
ＨＰＬＣ試料をブタサーコウイルスワクチン２型不活化バキュロウイルスベクター−マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリン参照ワクチンから調製し、３回反復試料をブタサーコウイルスワクチン２型不活化バキュロウイルスベクター−マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンワクチンのワクチン生産バッチから調製した。それぞれのケースにおいて、２０−２５℃のワクチンを反転により十分に混合し、続いて４．０ｍＬをピペットで採取して１５ｍＬ遠心分離チューブに入れた。全試料を２９，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。試料を点検し、２層に分離していることを確認した。遠心分離機とローターを−１０℃に冷却し、試料を２９，０００×ｇ、−１０℃で２０分間遠心分離した。試料を点検し、下（水）層が凍結して固まっていることを確認した。
【００９７】
次に砕いたドライアイス中に試料を置き、凍結状態を維持した。各試料の上層を真空吸引によって除去し、続いてそれぞれを２０−２５℃に戻した。次に試料を少なくとも試料レベルまで浸した状態で約２０−２５℃で５分間超音波処理した。０．５ｍＬの８０％メタノール水溶液（純水と混合したＨＰＬＣ級メタノール）を試料に添加し、各チューブを反転して十分に混合し、２９，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。液体をチューブからデカントで流し、ペレットを崩さないよう注意しながら各チューブの残留水分および油分を清潔な消毒綿を用いてチューブから拭き取った。
【００９８】
ＰＴＡ内部標準希釈溶液の一定分量２．０ｍＬをピペットで採取して各試料チューブに入れた。試料をボルテックスにかけてペレットをチューブ壁面からほぐし、２０−２５℃のウォーターバスに少なくとも試料レベルまで浸して５分間超音波処理した。ペレットが目に見えて崩壊、溶解しなかった場合、この工程を最大で５分間３サイクル繰り返した。ＨＰＬＣ分析まで試料を２０−２５℃に保存したが、分析は通常調製後２４時間以内に行った。
【００９９】
３．３  ＨＰＬＣ分析手順
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣオートサンプラー、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ蛍光検出器、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００カラムヒーターおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＥＺＣＨＲＯＭ  Ｅｌｉｔｅデータ収集システムを取り付けたＨＰＬＣ装置においてＨＰＬＣを行った。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）を試料分離のために用いた。カラムを５０℃に維持し、カラムに１００μＬの試料を注入し、続いてＭｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ（１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉ））でブランクのランを行うことによって前平衡化した。３回連続注入によってピーク面積比（ＰＡＲ）の％相対標準偏差（％ＲＳＤ）が＜５％になるまで、前平衡化試料として試料を連続的にカラムにおいてランを行った。試料のキャリーオーバーを防ぐために、各試料注入に続いてＭｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａの注入（ラン）を行った。新しいカラムを用いる場合、複数回の平衡化注入が必要であることが分かった。
【０１００】
カラムを平衡化した後、試料の一定分量１００μＬをカラムに注入し、表１３に従って、流速１ｍＬ／分の移動相グラジェント（Ａ：１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ  Ｉまたは同等品）；Ｂ：１ｍＬ／Ｌ  ＨＰＬＣ級ＴＦＡを含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）によってその溶出を得た。トリフルオロ酢酸は、ｐＨを低下させ、イオン対試薬として機能させるために移動相に添加する。目的の抗原ピークは、２８０ｎｍの励起波長（λ）と３５０ｎｍの放射波長（λ）の蛍光によって検出される。
【０１０１】
【表１３】
2011522252.tif 000014
【０１０２】
内部標準なしとありのＨＰＬＣ試料に存在するＰＣＶ抗原の分離を示す液体クロマトグラフィーのクロマトグラムの例を、それぞれ図１２と図１３に示す。ブタサーコウイルス抗原の保持時間は、約６．７分である。ＰＴＡ内部標準の保持時間は、約４．３分である。抗原に相当するピークの同定は、ＨＰＬＣカラムから溶出する物質のＰＡＧＥパターンと製品グレードの抗原のＰＡＧＥパターンとを比較することによって確認した。比較を可視化するため、抗原に結合することが知られているモノクローナル抗体を用いてＰＡＧＥゲルを染色した。更に、トリプシンで消化した物質のガスクロマトグラフィー分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって、６．７分でカラムから現れる物質がＰＣＶ抗原ＯＲＦ２に相当するという結論を導くことができた。
【０１０３】
抗原ピークの保持は、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂの初速度を変化させることによって調整することができる（例えば、より速い速度は抗原ピークの保持時間を短くする）。ＰＴＡピークの保持は、移動相中のＴＦＡ濃度を変化させることによって調整することができる（例えば、より高濃度のＴＦＡはＰＴＡピークの保持時間を長くする）。
【０１０４】
抗原タンパク質ピークの定量化は、内部標準（ＰＴＡ）の利用によって達成され、その結果はＰＴＡ重量正規化ピーク面積比またはＰＴＡ当量としての濃度として報告することができる。精製された外部標準が利用できないため、この操作が必要であった。ＰＴＡ重量正規化ピーク面積比は、次式を用いて計算される。
ピーク面積比＝［（ブタサーコウイルス抗原のピーク面積）／（ＰＴＡのピーク面積）］×（ＰＴＡのｍｇ重量／２５）
「ＰＴＡのｍｇ重量」は、ＨＰＬＣ試料を調製するために用いたＰＴＡをｍｇで測定した重量である。
【０１０５】
参照ワクチンのため、また各ワクチン試料のために、３回反復検査試料のＮＰＡＲを平均化し、％ＲＳＤを計算することができる。結果を平均ＮＰＡＲとして記録することができる。被験物の相対効力（ＲＰ）を被験物の平均ＮＰＡＲと参照ワクチンの平均ＮＰＡＲとの比として計算することができる。
３．４  カラムの洗浄手順
カラムにおける残渣の蓄積を避けるため、ＨＰＬＣカラムは定期的（検査試料の各セットの後が推奨される）に洗浄すべきである。カラムにおけるこれら残渣の蓄積は、ピーク形の変質やＨＰＬＣカラムからの抗原回収の変化の原因となり得る。
【０１０６】
カラムを洗浄するために、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ／Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂ（５／９５、ｖ／ｖ）、５０℃、２ｍＬ／分で３０分間カラムを洗い流し、あらゆるアジュバント残渣を除去した。次に、カラムを５０℃に維持しながら、表１４の溶出グラジェントを用いて流速１ｍＬ／分で１００μＬのＭｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａを注入した（Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ａ：１ｍＬ／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣ級）を含む純水（ＡＳＴＭ  ｔｙｐｅ  １）；Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｂ：１ｍＬ／Ｌ  ＨＰＬＣ級ＴＦＡを含むＨＰＬＣ級アセトニトリル）。カラム洗浄の手順は、必要に応じて繰り返す。
【０１０７】
【表１４】
2011522252.tif 000015
【０１０８】
本明細書において特定されているあらゆる米国特許または公開された米国特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【図１】
2011522252.tif 000016
【図２】
2011522252.tif 000017
【図３】
2011522252.tif 000018
【図４】
2011522252.tif 000019
【図５】
2011522252.tif 000020
【図６】
2011522252.tif 000021
【図７】
2011522252.tif 000022
【図８】
2011522252.tif 000023
【図９】
2011522252.tif 000024
【図１０】
2011522252.tif 000025
【図１１】
2011522252.tif 000026
【図１２】
2011522252.tif 000027
【図１３】
2011522252.tif 000028
【国際調査報告】
2011522252.tif 000029
2011522252.tif 000030
2011522252.tif 000031