(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドを送達するための細胞内遊離可能ジスルフィドリンカーを含むポリマープロドラッグを提供する。前記化合物の製造方法及び前記化合物を用いて核酸を哺乳動物中の腫瘍細胞に対して送達する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して式(I):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化１】
2011520983.tif 000047
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13であり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3であり;
各(b)は独立して0、1、2または3であり;
各(c)は独立して0、1、2または3であり;
各(e)は独立して0または1であり;
各(g)は独立して0または1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数であり、
ただし、(a)及び(g)は同時に0でなく、更にZ1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、哺乳動物中の腫瘍細胞に対してオリゴヌクレオチドを送達する改良方法。
【請求項２】
式(I)を有する化合物が式(I'):
【化２】
2011520983.tif 000048
[式中、
(m1)は約1〜約8の正の整数であり;
(m2)は0または約1〜約7の正の整数であり;
(m1)及び(m2)の合計は約2〜約8の整数である]
を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
すべてのZ1がオリゴヌクレオチドを含有している、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
Z1の1つ以上が葉酸を含有している、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
R12がOHである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
R3-7がすべて水素である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
(b)、(d)及び(e)が0であり、(c)が1である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
Z1が式:
【化３】
2011520983.tif 000049
[式中、
(a)は0または1であり;
(m)は2〜8の整数；および(2、4、8、16または32)であり;
R12はそれぞれ独立してヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
他の可変部はすべて請求項1中の定義と同じである]
を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
式(I)を有する化合物が式
【化４】
2011520983.tif 000050
(式中、(a)は0または1である)
を有する、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
(m2)が0である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
(m1)が1である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
R1がポリアルキレンオキシドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
R1が約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有している、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
【化５】
2011520983.tif 000051
[式中、
各Zは独立して
【化６】
2011520983.tif 000052
-(L4)a1-Rb；または
-(L4)a2-Rc
(ここで、
(a)は0または1であり、
R12はそれぞれ独立してヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐伏アルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択される)
であり;
(n)は正の整数であり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有しており;
他の可変部はすべて請求項1中の定義と同じである]
からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドがデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ロック核酸(LNA)、短鎖干渉性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アプタマー、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、トリシクロ-DNA、二本鎖オリゴヌクレオチド(デコイODN)、触媒RNA(RNAi)、アプタマー、スピエゲルマー(spiegelmer)、CpGオリゴマー及びその組合せからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドがLNA及びホスホロチオエート結合を有している、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが約8〜約30ヌクレオチドを有している、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスbcl-2オリゴヌクレオチド、アンチセンスHIF-1aオリゴヌクレオチド、アンチセンスサバイビン(survivin)オリゴヌクレオチド及びアンチセンスErbβ3オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが配列番号1、配列番号2及び3、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号5、及び配列番号6を有する、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
式(I)を有する化合物が、
【化７】
2011520983.tif 000053
2011520983.tif 000054
[式中、
Oligoはオリゴヌクレオチドであり;
PEGはポリエチレングリコールであり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有しており;
(a1)は1であり;
L4は-NH(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(=O)]r'-または-NH(CH2)3-(ここで、(r')は0または1である)である]
からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍細胞が前立腺または子宮頸癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
投与ステップが哺乳動物の血流を介する投与を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
(a)式:
【化８】
2011520983.tif 000055
2011520983.tif 000056
(式中、
PEGはポリエチレングリコールであり;
Rbは
【化９】
2011520983.tif 000057
であり;
Oligoは約8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、化合物のポリマー部分は約40,000ダルトンの全数平均分子量を有している)
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を用意し;
(b)前記化合物またはその製薬上許容される塩を腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して投与する
ことを含む、オリゴヌクレオチドを哺乳動物中の腫瘍細胞に対して送達するための改良方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドがLNAを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
Oligoが-5'-(CH2)6-TsAsGsCsCsTsGsTsCsAsCsTsTsCsTsCs-3'または-5'-(CH2)6-GsCsTsGsCsCsAsTsGsGsAsTsTsGsAsG-3'
(ここで、5'及び3'末端の最初の3つのヌクレオチドはLNAであり、“s”はホスホロチオエート結合を表す)
である、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍細胞が前立腺または子宮頸癌細胞である、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
(a)式:
【化１０】
2011520983.tif 000058
(式中、
PEGはポリエチレングリコールであり;
Rbは
【化１１】
2011520983.tif 000059
であり;
Oligoは約8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、化合物のポリマー部分は約40,000ダルトンの全数平均分子量を有している)
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を用意し;
(b)前記化合物またはその塩を腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して投与する
ことを含み、前記投与により予選択した遺伝子の腫瘍細胞による発現を低下させる、オリゴヌクレオチドを哺乳動物中の腫瘍細胞に送達するための改良方法。
【請求項３０】
細胞を式(I)を有する化合物と接触させることを含む、オリゴヌクレオチドを細胞へ導入する方法。
【請求項３１】
癌細胞を式(I)を有する化合物と接触させることを含む、癌細胞の成長または増殖を抑制する方法。
【請求項３２】
式(Ia):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化１２】
2011520983.tif 000060
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13であり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3であり;
各(b)は独立して0、1、2または3であり;
各(c)は独立して0、1、2または3であり;
各(e)は独立して0または1であり;
各(g)は独立して0または1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数であり、
ただし、(a)及び(g)は同時に0でなく、更にZ1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有しており、更にZ1の1つ以上は葉酸を含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、2008年5月23日に出願された米国仮特許出願番号第61/055,950号、2008年5月23日に出願された米国仮特許出願番号第61/055,869号、2008年10月19日に出願された米国仮特許出願番号第61/106,578号、および2008年10月19日に出願された米国仮特許出願番号第61/106,576号からの優先権の利益を請求する。これらの内容を参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
治療遺伝子は疾患に関連する遺伝子発現を選択的にモジュレートし得、他の治療アプローチを使用すると被る恐れがある副作用を最小限とし得るので、遺伝子治療は疾患の治療における強力なツールである。
【０００３】
新世代のRNAアンタゴニストであるロック核酸(LNA)アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療が提案されている。各LNAモノマーはリボース糖の2'-酸素と4'-炭素間にメチレン架橋を含有している。これにより、LNA残基が有利なRNA様立体配座で固定され、LNAオリゴヌクレオチドは他の当業界で公知のオリゴヌクレオチドと比較して高い親和性、特異性及び分解に対する耐性を有し得る。LNAオリゴヌクレオチドが(ナノモル以下のレベルで)インビトロで標的遺伝子発現を抑制することは判明している。LNAオリゴヌクレオチドは他の当業界で公知の核酸と比較して向上した治療活性を有しているが、LNAオリゴヌクレオチドの薬物動態学的プロフィール、循環からの速いクリアランス及び限られたインビボ活性を更に改善することがなお必要である。LNAオリゴヌクレオチド及び他の当業界で公知の核酸分子を送達するための改良されたシステム及び方法を提供することが要求され続けている。本発明はこれらの要求に取り組むものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題を解消し、オリゴヌクレオチドを送達するための技術を改良するために、本発明は細胞内で遊離可能なリンカーを含有する新しいポリマーデリバリーシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の1つの態様で、オリゴヌクレオチドを哺乳動物中の腫瘍細胞に対して送達する方法を提供する。この方法は、腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して式(I):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化１】
2011520983.tif 000002
【０００６】
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13であり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3であり;
各(b)は独立して0、1、2または3であり;
各(c)は独立して0、1、2または3であり;
各(e)は独立して0または1であり;
各(g)は独立して0または1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数であり、
ただし(a)及び(g)は同時に0でなく、更にZ1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【０００７】
別の態様で、本発明は、前立腺または子宮頸癌細胞を有する哺乳動物における遺伝子発現の抑制方法を提供する。
【０００８】
1つの実施形態では、本明細書中に記載されている方法で使用される式(I)を有する化合物は、
【化２】
2011520983.tif 000003
【０００９】
[式中、
PEGはポリエチレングリコールであり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有しており;
Rbは
【化３】
2011520983.tif 000004
【００１０】
であり;
Oligoは約8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである]
またはその製薬上許容される塩である。
【００１１】
本発明の更なる態様で、各種疾患(すなわち、前立腺または子宮頸癌)を治療するための哺乳動物における遺伝子発現の抑制方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に記載されている化合物の製造方法を提供する。
【００１３】
本明細書中に記載されているポリマー輸送システムの1つの利点は、遊離可能なPEG-リンカー技術によりLNAを含めた治療用オリゴヌクレオチドをインビボ投与するための方法が提供されることである。この選択的送達技術により、LNAの治療効果を高め、毒性を低下させることができる。
【００１４】
別の利点は、本明細書中に記載されている遊離可能なデリバリーシステムによりオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性をモジュレートすることができることである。治療用オリゴヌクレオチドのポリマーコンジュゲートからの遊離部位はEPR効果及びターゲッティング基(例えば、葉酸)により選択的に標的化され得る。本明細書中に記載されているポリマーに結合されているオリゴヌクレオチド(例えば、LNA)は標的域(例えば、癌細胞)で遊離されるため、当業者は治療用オリゴヌクレオチドの標的域で所望のバイオアベイラビリティーを達成することができる。加えて、オリゴヌクレオチドの遊離部位を修飾することができ、すなわち細胞の異なる区画でオリゴヌクレオチドを遊離させることができる。よって、本明細書中に記載されているポリマーデリバリーシステムにより、十分量のLNAを含めた治療用オリゴヌクレオチドが所望の標的域(例えば、細胞質、ミクロピノソーム及びエンドソーム)で選択的に利用可能となり得る。空間的修飾は疾患の治療のために有利であり得る。本明細書中に記載されている方法は、オリゴヌクレオチド(例えば、LNAオリゴヌクレオチド、siRNA)のインビボでの送達及び向上した効果のためのアプローチを提供する。
【００１５】
本発明の更なる利点は、本明細書中に記載されているコンジュゲートにより、トランスフェクション物質の非存在下で癌細胞における細胞取り込み及び特異的mRNAダウンレギュレーションが可能となることである。このことは従来技術よりも非常に有利であるため、治療計画、すなわちオリゴヌクレオチド薬物のインビボ投与が非常に簡素化される。この技術は治療用オリゴヌクレオチドのインビボ投与に対して適用され得る。
【００１６】
ポリマー化合物はバッファー条件下で安定であり、オリゴヌクレオチドまたは他の治療薬が時期尚早に身体から排泄されることはない。
【００１７】
更なる利点は以下の記載及び図面から明らかとなるであろう。
【００１８】
本発明の目的で、用語「残基」は、別の化合物との置換反応を受けた後も残っている化合物、すなわちPEG、オリゴヌクレオチド等の部分を意味すると理解される。
【００１９】
本発明の目的で、用語「ポリマー残基」または「PEG残基」は各々、他の化合物、部分等と反応を受けた後も残っているポリマーまたはPEGの部分を意味すると理解される。
【００２０】
本発明の目的で、本明細書中で使用されている用語「アルキル」は、直鎖状、分岐鎖状及び環状アルキル基を含めた飽和脂肪族炭化水素を指す。用語「アルキル」は、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6ヒドロカルボニル基をも含む。好ましくは、アルキル基は1〜12個の炭素を有する。より好ましくは、約1〜7個の炭素、更により好ましくは約1〜4個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は置換されていても未置換でもよい。置換されている場合、置換基には好ましくはハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロヒドロカルボニル、アリール及びアミノ基が含まれる。
【００２１】
本発明の目的で、本明細書中で使用されている用語「置換」は、官能基または化合物中に含まれている1個以上の原子を、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール及びアミノ基の群から選択される部分の1つでの付加または置換することを指す。
【００２２】
本明細書中で使用されている用語「アルケニル」は、直鎖状、分岐鎖状及び環状基を含めた少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む基を指す。好ましくは、アルケニル基は約2〜12個の炭素を有する。より好ましくは、約2〜7個の炭素、更により好ましくは約2〜4個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていても未置換でもよい。置換されている場合、置換基には好ましくはハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール及びアミノ基が含まれる。
【００２３】
本明細書中で使用されている用語「アルキニル」は、直鎖状、分岐鎖状及び環状基を含めた少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む基を指す。好ましくは、アルキニル基は約2〜12個の炭素を有する。より好ましくは、約2〜7個の炭素、更により好ましくは約2〜4個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は置換されていても未置換でもよい。置換されている場合、置換基には好ましくはハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール及びアミノ基が含まれる。「アルキニル」の例には、プロパルギル、プロピン及び3-ヘキシンが含まれる。
【００２４】
本明細書中で使用されている用語「アリール」は、少なくとも1つの芳香族環を含む芳香族炭化水素環系を指す。芳香族環が場合により他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環に縮合されていても、または他の方法で結合されていてもよい。アリール基の例には、例えばフェニル、ナフチル、1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン及びビフェニルが含まれる。アリール基の好ましい例にはフェニル及びナフチルが含まれる。
【００２５】
本明細書中で使用されている用語「シクロアルキル」はC3-8環状炭化水素を指す。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが含まれる。
【００２６】
本明細書中で使用されている用語「シクロアルケニル」は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含むC3-8環状炭化水素を指す。シクロアルケニルの例には、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、1,3-シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル及びシクロオクテニルが含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用されている用語「シクロアルキルアルキル」は、C3-8シクロアルキル基で置換されているアルキル基を指す。シクロアルキルアルキル基の例には、シクロプロピルメチル及びシクロペンチルエチルが含まれる。
【００２８】
本明細書中で使用されている用語「アルコキシ」は、親分子部分に酸素架橋を介して結合している指定数の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルコキシ基の例には、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ及びイソプロポキシが含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用されている「アルキルアリール」基は、アルキル基で置換されているアリール基を指す。
【００３０】
本明細書中で使用されている「アラルキル」基は、アリール基で置換されているアルキル基を指す。
【００３１】
本明細書中で使用されている用語「アルコキシアルキル」基は、アルコキシ基で置換されているアルキル基を指す。
【００３２】
本明細書中で使用されている用語「アルキル-チオ-アルキル」は、アルキル-S-アルキルチオエーテル、例えばメチルチオメチルまたはメチルチオエチルを指す。
【００３３】
明細書中で使用されている用語「アミノ」は、1つ以上の水素基を有機基で置換することによりアンモニアから誘導される当業界で公知の窒素含有基を指す。例えば、用語「アシルアミノ」及び「アルキルアミノ」はそれぞれアシル及びアルキル置換基を有する特定のN-置換有機基を指す。
【００３４】
本明細書中で使用されている用語「アルキルカルボニル」は、アルキル基で置換されているカルボニル基を指す。
【００３５】
本明細書中で使用されている用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。
【００３６】
本明細書中で使用されている用語「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含有する非芳香族環系を指す。ヘテロシクロアルキル環が場合により他のヘテロシクロアルキル環及び/または非芳香族炭化水素環に縮合されていても、または他の方法で結合されていてもよい。好ましいヘテロシクロアルキル基は3〜7員を有する。ヘテロシクロアルキル基の例には、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン及びピラゾールが含まれる。好ましいヘテロシクロアルキル基には、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル及びピロリジニルが含まれる。
【００３７】
本明細書中で使用されている用語「ヘテロアリール」は、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含有する芳香族環系を指す。ヘテロアリール環が1つ以上のヘテロアリール環、芳香族または非芳香族炭化水素環またはヘテロシクロアルキル環に縮合されていても、または他の方法で結合されていてもよい。ヘテロアリール基の例には、例えばピリジン、フラン、チオフェン、5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリン及びピリミジンが含まれる。ヘテロアリール基の好ましい例には、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル及びベンゾピラゾリルが含まれる。
【００３８】
本明細書中で使用されている用語「ヘテロ原子」は窒素、酸素及び硫黄を指す。
【００３９】
幾つかの実施形態において、置換アルキルにはカルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル及びメルカプトアルキルが含まれ;置換アルケニルにはカルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル及びメルカプトアルケニルが含まれ;置換アルキニルにはカルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル及びメルカプトアルキニルが含まれ;置換シクロアルキルには4-クロロシクロヘキシルのような部分が含まれ;アリールにはナフチルのような部分が含まれ;置換アリールには3-ブロモフェニルのような部分が含まれ;アラルキルにはトリルのような部分が含まれ;ヘテロアルキルにはエチルチオフェンのような部分が含まれ;置換ヘテロアルキルには3-メトキシ-チオフェンのような部分が含まれ;アルコキシにはメトキシのような部分が含まれ;フェノキシには3-ニトロフェノキシのような部分が含まれる。ハロはフルオロ、クロロ、ヨード及びブロモを含むと理解されたい。
【００４０】
本発明の目的で、「正の整数」は1以上の整数を含むと理解され、当業者が正当な範囲内であると理解している通りであり、すなわち幾つかの実施形態では好ましくは1〜約10であり、より好ましくは1または2である。
【００４１】
本発明の目的で、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、別段に特定されていない限り一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸(「DNA」)及びリボ核酸(「RNA」)、並びにその化学的修飾物を指す。
【００４２】
本発明の目的で、用語「結合」は、化学反応の結果として1つの基の別の基への共有(好ましい)または非共有結合を含むと理解される。
【００４３】
本発明の目的で、用語「有効量」及び「十分量」は、当業者が理解されているような所望効果または治療効果を達成する量を意味する。
【００４４】
本発明の目的で、用語「治療用オリゴヌクレオチド」は、医薬または診断薬として使用されるオリゴヌクレオチドを指す。
【００４５】
本発明の目的で、「遺伝子発現のモジュレーション」は、投与ルートと無関係に、本明細書中に記載されている化合物で治療しないときに観察された遺伝子発現と比較して任意のタイプの遺伝子、好ましくは癌及び炎症に関連する遺伝子のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションを広く含むと理解される。
【００４６】
本発明の目的で、標的遺伝子の「遺伝子発現の抑制」は、本明細書中に記載されている化合物で治療しないときに観察された結果と比較してmRNA発現または翻訳されたタンパク質が低下または減衰されることを意味すると理解される。適当なアッセイは、例えばドットブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能及び当業者に公知の表現型アッセイのような当業者に公知の技術を用いてタンパク質またはmRNAレベルを調べることを含む。治療した状態は、例えば細胞(好ましくは、癌細胞または組織)中のmRNAレベルの低下により確認され得る。
【００４７】
概して、抑制または治療の成功は所望の応答が得られるときに生ずると見なされる。例えば、抑制または治療の成功は、例えば腫瘍増殖抑制に関連する遺伝子の10%以上(すなわち、20%、30%、40%)のダウンレギュレーションが得られることにより定義され得る。或いは、治療の成功は、本明細書中に記載されている化合物で治療しないときに観察された結果と比較したとき、当業者が考える他の臨床マーカーを含めて癌細胞または組織中での癌遺伝子mRNAレベルの少なくとも20%、好ましくは30%、より好ましくは40%またはそれ以上(すなわち、50%または80%)の減少が得られることにより定義され得る。
【００４８】
更に、記載の便宜上単数形を使用することは決して限定的と意図されない。よって、例えば酵素を含む組成物の言及は該酵素の1つ以上の分子を指す。また、本発明は本明細書中に開示されている具体的構成、方法ステップ及び材料をある程度変更することができるので、これらの具体的構成、方法ステップ及び材料に限定されないと理解されたい。
【００４９】
本明細書中に使用されている専門用語は具体的実施形態を記載する目的でのみ使用されており、本発明の範囲は添付されている特許請求の範囲及びその均等物により限定されるので限定的であると意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例7に記載されている化合物1の合成を概略的に示す。
【図２】実施例8〜13に記載されている化合物10の合成を概略的に示す。
【図３】実施例14〜18に記載されている化合物18の合成を概略的に示す。
【図４】実施例19〜23に記載されている化合物25の合成を概略的に示す。
【図５】実施例25〜27に記載されている化合物30の合成を概略的に示す。
【図６】実施例28〜29に記載されている化合物35の合成を概略的に示す。
【図７】実施例32に記載されているPEG-LNAコンジュゲートの細胞取り込みを示す。
【図８】実施例32に記載されているPEG-LNAコンジュゲートの受容体特異的細胞取り込みを示す。
【図９】実施例33に記載されているPEG-LNAコンジュゲートのインビトロ効果を示す。
【図１０】実施例34に記載されている葉酸-PEG-LNAコンジュゲートのインビボ効果及び体内分布を示す。
【図１１】実施例35に記載されているPEG-LNAコンジュゲートの体内分布を示す。
【図１２】実施例36に記載されているPEG-LNAコンジュゲートのインビボ効果を示す。
【図１３】実施例37に記載されているPEG-LNAコンジュゲートのインビボ効果を示す。
【００５１】
記載を限定することなく平易とするために、図中にはマルチアームPEG(例えば、4アームPEG)が「PEG」として記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
A. 概要
本発明の1つの態様で、その必要のある哺乳動物中の腫瘍細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達方法を提供する。この方法は、腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して式(I):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化４】
2011520983.tif 000005
【００５３】
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはO、好ましくはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13、好ましくはNHであり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(b)は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
各(c)は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(e)は独立して0または1、好ましくは0であり;
各(g)は独立して0または1、好ましくは1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数(例えば、2、4、6、8、16、32)であり、
ただし(a)及び(g)は同時に0でなく、更にZ1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を投与することを含む。
【００５４】
別の態様で、式(I):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化５】
2011520983.tif 000006
【００５５】
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはO、好ましくはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13、好ましくはNHであり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(b)は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
各(c)は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(e)は独立して0または1、好ましくは0であり;
各(g)は独立して0または1、好ましくは1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数(例えば、2、4、6、8、16、32)であり、
ただし(a)及び(g)は同時に0でなく、Z1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有しており、Z1の1つ以上は葉酸を含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を提供する。
【００５６】
1つの実施形態において、1つのZ1はオリゴヌクレオチドを含有し、残りのZ1は葉酸を含有している。
【００５７】
本発明の目的で、(m)はポリマーアームの数を指す。各ポリマーアームは線状ポリマー、例えばポリエチレングリコールを含む。好ましくは、(m)は約2〜約32に等しい。例えば、R1が32線状ポリマーアームを有しているときには(m)は32である。(m)が2のときにはビスPEGが本明細書中に記載されているポリマー化合物中に使用される。よって、ポリマー化合物は好ましくは最高32個(すなわち、4、8、16、32個)のポリマーアームを含み得る。1つの実施形態において、ポリマー化合物は4〜8個のポリマーアーム(ここで、(m)は4〜8(例えば、4、6または8)であり得る)を含み得る。好ましくは、ポリマー部分は4個のポリマーアーム(ここで、(m)は4である)を含み得る。
【００５８】
本発明の目的で、(a)が2以上のときにはL1は同一または異なる。
【００５９】
本発明の目的で、(d)が2以上のときにはL2は同一または異なる。
【００６０】
本発明の目的で、(a1)または(a2)が2以上のときにはL4は同一または異なる。
【００６１】
本発明の目的で、(b)が2以上のときにはC(R4)(R5)は同一または異なる。
【００６２】
本発明の目的で、(c)が2以上のときにはC(R6)(R7)は同一または異なる。
【００６３】
1つの実施形態において、腫瘍細胞は前立腺または子宮頸癌細胞である。
【００６４】
別の態様で、本発明は、哺乳動物細胞または組織における遺伝子発現の抑制方法を提供する。この方法は、有効量の式(I)を有する化合物またはその製薬上許容される塩をその必要のある哺乳動物に対して投与することを含む。
【００６５】
1つの実施形態において、本明細書中に記載されている方法は、式(1'):
【化６】
2011520983.tif 000007
【００６６】
[式中、
(m1)は約1〜約8の正の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8)であり;
(m2)は0または約1〜約7の正の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7)であり;
(m1)と(m2)の合計は約2〜約8の整数(例えば、2、4、6、8)である]
を有する化合物を用いて実施される。
【００６７】
1つの特定実施形態において、すべての(Z1)がオリゴヌクレオチドを含有している。この態様で、(m2)は0であり、(m1)は4または8である。或いは、すべての(Z1)が同一または異なる
【化７】
2011520983.tif 000008
【００６８】
である。
【００６９】
別の特定実施形態において、Z1の1つ以上が葉酸を含有している。或いは、1つ以上のZ1が-(L4)a1-Rbである。この態様で、(m)が2より大きいときには1つのZ1がオリゴヌクレオチドを含み、残りのZ1の各々が葉酸を含む。
【００７０】
更なる実施形態において、本明細書中に記載されている化合物は任意の診断薬を含む。
【００７１】
別の実施形態において、各R12はH、NH2、OH、CO2H、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルからなる群から選択される同一または異なる基であり、好ましくはOHである。
【００７２】
なお別の実施形態において、R3-7の各々は水素、メチル、エチル及びイソプロピルからなる群から選択される同一または異なる基である。好ましくは、R3-7はすべて水素である。
【００７３】
1つの好ましい実施形態において、(b)、(d)及び(e)は0であり、(c)は1である。
【００７４】
1つの好ましい実施形態において、本明細書中に記載されている方法において使用される式(I)を有する化合物は、式:
【化８】
2011520983.tif 000009
【００７５】
[式中、
(a)は0または1であり;
(m)は1、2、4、8、16または32であり;
R12はそれぞれ独立してヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
他の可変部はすべて上の定義と同じである]
を有するZ1を含む。
【００７６】
或いは、本明細書に記載されている化合物は、式:
【化９】
2011520983.tif 000010
【００７７】
(式中、(a)は0または1である)
を有する。
【００７８】
この点で、(m2)は0であり、Z1のすべては
【化１０】
2011520983.tif 000011
【００７９】
であり、または(m1)は1であり、1つのZ1は
【化１１】
2011520983.tif 000012
【００８０】
(式中、残りのZ1の各々は葉酸を含む)
である。
【００８１】
更なる実施形態において、1つのZ1は診断薬を含む。
【００８２】
別の態様で、R1はポリアルキレンオキシドを含む。好ましくは、R1は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有している。
【００８３】
本発明の1つの好ましい態様で、本明細書中に記載されている方法は、式:
【化１２】
2011520983.tif 000013
【００８４】
[式中、
各Zは独立して
【化１３】
2011520983.tif 000014
【００８５】
-(L4)a1-Rb；または
-(L4)a2-Rc
(ここで、(a)は0または1であり、R12はそれぞれ独立してヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択される)
であり;
(n)は正の整数であり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有し;
他の可変部はすべて上の定義と同じである]
を有する化合物を用いて実施される。
【００８６】
この点で、すべてのZ基がオリゴヌクレオチドを含む。或いは、1つのZがオリゴヌクレオチドを含み、残りの1つ以上のZ基(例えば、1、2、3、4、5、6または7個のZ基)がターゲッティング物質(例えば、葉酸)を含む。更なる実施形態において、1つのZがオリゴヌクレオチドを含み、別のZが診断薬を含み、残りの1つ以上(例えば、2、3、4、5、6つ)のZが葉酸を含む。
【００８７】
本発明の別の態様で、式(Ia):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化１４】
2011520983.tif 000015
【００８８】
-(L4)a1-Rb；及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13であり;
Raはそれぞれ同一または異なるオリゴヌクレオチドであり;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3であり;
各(b)は独立して0、1、2または3であり;
各(c)は独立して0、1、2または3であり;
各(e)は独立して0または1であり;
各(g)は独立して0または1であり;
(m)は約2〜約32の正の整数であり、
ただし(a)及び(g)は同時に0でなく、Z1の1つ以上はオリゴヌクレオチドを含有しており、Z1の1つ以上は葉酸を含有している]
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を提供する。
【００８９】
ある実施形態において、可変部は式(I)中の定義と同じである。
【００９０】
B. 実質的に非抗原性の水溶性ポリマー
本明細書中に記載されている化合物中に使用されるポリマーは、ポリアルキレンオキシド(PAO)のように好ましくは水溶性ポリマーであり、実質的に非抗原性である。
【００９１】
本発明の1つの態様で、本明細書中に記載されている化合物は線状、末端分岐状またはマルチアームのポリアルキレンオキシドを含む。本発明の幾つかの実施形態において、ポリアルキレンオキシドにはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールが含まれる。
【００９２】
ポリアルキレンオキシドは、約2,000〜約100,000ダルトン、好ましくは約5,000〜約60,000ダルトンの全数平均分子量を有している。ポリアルキレンオキシドは、より好ましくは約5,000〜約25,000または約20,000〜約45,000ダルトンであり得る。幾つかの特定実施形態において、本明細書中に記載されている化合物は約30,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有するポリアルキレンオキシドを含む。1つの特定実施形態において、ポリマー部分は約40,000ダルトンの全数平均分子量を有している。
【００９３】
ポリアルキレンオキシドにはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールが含まれる。より好ましくは、ポリアルキレンオキシドにはポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。PEGは通常、構造:
-O-(CH2CH2O)n-
(式中、(n)はポリマーの重合度を表し、ポリマーの分子量に依存する)
により表される。或いは、本明細書中に記載されている化台物のポリエチレングリコール(PEG)残基部分は、
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-、
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)-Y71-、
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)Y71-C(=Y72)-、
-Y71-C(=Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(=Y72)-Y71-、及び
-Y71-(CR71R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR71R72)a72-Y71-
(式中、
Y71及びY73は独立してO、S、SO、SO2、NR73または結合であり;
Y72はO、SまたはNR74、好ましくはOであり;
R71、R72、R73及びR74は独立してR3に対して使用され得る同一部分から選択され;
(a71)、(a72)及び(b71)は独立して0または正の整数(例えば、0、1、2、3)であり、好ましくは1であり;
(n)は約10〜約2300の整数である)
からなる群から選択され得る:
1つの好ましい態様で、本明細書中に記載されている化合物において有用なポリマーには、その開示内容を参照により本明細書に組み入れるNOF Corp.,Drug Delivery System catalog,Ver.8,April 2006に記載されているようなマルチアームPEG-OHまたは「星型-PEG」製品が含まれる。ポリマーは米国特許第5,122,614号または同5,808,096号に記載されている活性化技術を用いて通常適当に活性された形態に変換され得る。具体的には、そのようなPEGは式:
【化１５】
2011520983.tif 000016
【００９４】
(式中、(u')は約4〜約455の整数である)
を有し得る。
【００９５】
1つの好ましい実施形態において、ポリマー(u')の重合度は、約5,000〜約60,000Daの全数平均分子量を有するポリマーを提供すべく約28〜約341であり、好ましくは約20,000〜約42,000Daの全数平均分子量を有するポリマーを提供すべく約114〜約239である。(u')はポリマー鎖中の反復単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。本発明の1つの特定実施形態において、(u')は約40,000Daの全数平均分子量を有するポリマー部分を提供すべく約227である。
【００９６】
幾つかの好ましい実施形態において、PEGアームの4個すべてがオリゴヌクレオチドまたは葉酸への結合を促進するために適当な活性化基に変換されている。変換前の前記化合物には、
【化１６】
2011520983.tif 000017
【００９７】
が含まれる。
【００９８】
本発明に含まれるポリマー物質が室温で水溶性であることが好ましい。前記ポリマーの非限定的リストには、ブロックコポリマーの水溶性が維持される条件で、ポリアルキレンオキシドホモポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール)、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマー及びそのブロックコポリマーが含まれる。
【００９９】
本発明の目的で、「実質的にまたは事実上で非抗原性」は、哺乳動物において非毒性であり、著しい免疫原性応答を引き出さないとして当業界で理解されているすべての物質を意味する。
【０１００】
幾つかの態様で、末端カルボン酸基を有するポリマーが、本明細書中に記載されているポリマーデリバリーシステムにおいて使用され得る。末端カルボン酸を有するポリマーを高純度で製造する方法は、その内容を参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第2007/0173615号に記載されている。この方法は、まずポリアルキレンオキシドの第3級アルキルエステルを製造した後、そのカルボン酸誘導体に変換することを含む。この方法のPAOカルボン酸を製造する第1ステップは、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のt-ブチルエステルのような中間体を形成することを含む。この中間体は、PAOを塩基(例えば、カリウムt-ブトキシド)の存在下でハロ酢酸t-ブチルと反応させることにより形成される。t-ブチルエステル中間体が形成されたら、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体が92%を超える、好ましくは97%を超える、よりましくは99%を超える、最も好ましくは99.5%を超える純度で容易に提供される。
【０１０１】
代替態様では、末端アミン基を有するポリマーが、本明細書中に記載されている化合物を製造するために使用され得る。末端アミンを含有するポリマーを高純度で製造する方法は、それぞれの内容を参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第2008/0249260号及び同2007/0078219号に記載されている。例えば、アジドを有するポリマーをホスフィンを主成分とする還元剤(例えば、トリフェニルホスフィン)またはアルカリ金属ホウ化水素還元剤(例えば、NaBH4)と反応させる。或いは、離脱基を含むポリマーを保護アミン塩(例えば、メチル-tert-ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩(KNMeBoc)またはジ-tert-ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩(KNBoc2))と反応させた後、保護アミン基を脱保護する。この方法により形成される末端アミンを含有するポリマーの純度は約95%超、好ましくは99%超である。
【０１０２】
C. 二官能性リンカー
二官能性リンカーには、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドが含まれる。アミノ酸
は天然及び非天然のアミノ酸であり得る。疎水性または非疎水性の天然アミノ酸の誘導体及びアナログ、並びに各種の当業界で公知の非天然アミノ酸(DまたはL)も本発明の範囲に入ると考えられる。非天然アミノ酸の適当な非限定的リストには2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、サルコシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン及びオルニチンが含まれる。幾つかのアミノ酸残基はグリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンから選択され、より好ましくはグリシンである。
【０１０３】
本発明の代替態様において、L1-4は
【化１７】
2011520983.tif 000018
【０１０４】
2011520983.tif 000019
【０１０５】
(式中、
R21-29は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ及びC1-6ヘテロアルコキシからなる群から選択される同一または異なる基であり;
(t)及び(t')は独立して0または正の整数、好ましくは0または約1〜約12の整数、より好ましくは約1〜約8の整数、最も好ましくは1または2であり;
(v)及び(v')は独立して0または1である)
からなる群から選択される同一または異なる基である。
【０１０６】
幾つかの好ましい実施形態において、式(I)及び式(Ia)のL1-4(より好ましくは、式(1a)のL4)には、
【化１８】
2011520983.tif 000020
【０１０７】
2011520983.tif 000021
【０１０８】
2011520983.tif 000022
【０１０９】
(式中、(r)及び(r')は独立して0または1であり、(s)及び(s')は独立して1、2または3であり、(r)及び(r')の両方は同時に0でない)
からなる群から選択される同一または異なる基が含まれる。
【０１１０】
本発明の目的で、二官能性リンカーの値が2以上の正の整数のとき、同一または異なる二官能性リンカーを使用してもよい。2つ以上の二官能性リンカー(ここで、(a)、(a1)及び(a2)は2以上である)を含有する1つの実施形態において、二官能性リンカーは同一でも異なっていてもよい。
【０１１１】
D. 診断薬
本発明の更なる態様は、場合により本明細書中に記載されているポリマーデリバリーシステムに結合させた診断用タグを用いて製造される化合物を提供し、前記タグは診断またはイメージング目的のために選択される。
【０１１２】
本明細書中に記載されている化合物は、ビオチニル化化合物、蛍光化合物(例えば、FAM)、放射標識化合物のように標識され得る。適当なタグは、適当な部分(例えば、アミノ酸残基)を当業界で一般的な放射同位体、放射性非透過性標識、磁気共鳴標識、または磁気共鳴イメージングに適した他の非放射性同位体標識、蛍光タイプの標識、手術中腫瘍組織をイメージングできるように目に見える色を示す及び/または紫外、赤外または電気化学的刺激下で蛍光を発し得る標識等に結合させることにより作成される。場合により、診断用タグを、動物またはヒト患者での治療上生物活性物質の分布をモニターできるように、コンジュゲートした治療部分に取り込んだり及び/または結合させる。
【０１１３】
タグ付き化合物は当業界で公知の方法により、例えば放射性同位体標識を含めた適当な標識を用いて容易に作成される。これらには、単なる例としてインビボでの腫瘍細胞への選択的取り込みのための放射免疫シンチグラフィー剤を作成するための131ヨウ素、125ヨウ素、99mテクネチウム及び/または111インジウムが含まれる。例えば、ペプチドをTc-99mに結合させる方法は当業界で多数公知であり、その方法には単なる例として参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,328,679号、第5,888,474号、第5,997,844号及び第5,997,845号に記載されている方法が含まれる。
【０１１４】
E. オリゴヌクレオチド
本明細書中に記載されている化合物は核酸(オリゴヌクレオチド)を細胞または組織に送達するために使用され得る。
【０１１５】
本発明の範囲をより十分に認識するために、以下の用語を定義する。当業者は、用語「核酸」または「ヌクレオチド」が、特段の定めがない限り、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸(「DNA」)及びリボ核酸(「RNA」)、並びにその化学的修飾物を指すことを認識している。「オリゴヌクレオチド」は通常、例えば約2〜約200ヌクレオチド長、より好ましくは約8〜約30ヌクレオチド長のサイズの比較的短いポリヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは通常合成核酸であり、特段の定めがない限り、一本鎖である。用語「ポリヌクレオチド」及び「ポリ核酸」も本明細書中で同義的に使用され得る。
【０１１６】
オリゴヌクレオチド(アナログ)は単一種のオリゴヌクレオチドに限定されず、むしろ各種の部分を用いて働くように設計される。リンカーはヌクレオチドの3'または5'末端の1つ以上、通常ヌクレオチドのPO4またはSO4基に結合され得ると理解される。考えられる核酸分子はホスホロチオエートインターヌクレオチド結合修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び/またはホスフェート骨格修飾を含み得る。オリゴヌクレオチドは、その内容を参照により本明細書に組み入れる2002年5月6〜8日にネバダ州ラスベガスで開催されたTides 2002,Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences及び2003年11月18〜19日に独国ハンブルグで開催されたOligonucleotide ＆ Peptide Technologiesに開示されているような天然のホスホロジエステル骨格、ホスホロチオエート骨格、または他の修飾骨格アナログ、例えばLNA(ロック核酸)、PNA(ペプチド骨格を有する核酸)、CpGオリゴマー等を含み得る。
【０１１７】
本発明で考えられるオリゴヌクレオチドに対する修飾は、例えば選択したヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドを所望ポリマーに共有結合させることができる官能基または部分を付加または置換すること、及び/またはオリゴヌクレオチドに追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用及び官能性を加える官能部分を付加または置換することを含む。前記修飾には、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨードウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジンとイソグアニジンのような塩基対の組合せ、及びアナログの組合せが含まれるが、これらに限定されない。本発明の範囲で考えられるオリゴヌクレオチドは3'及び/または5'キャップ構造をも含み得る。
【０１１８】
本発明の目的で、「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に取り込
まれる化学修飾を意味すると理解される。キャップは5'-末端(5'-キャップ)または3'-末端(3'-キャップ)に存在し得、或いは両方の末端に存在し得る。5'-キャップの非限定例には、逆向き(inverted)脱塩基残基(部分)、4,5'-メチレンヌクレオチド;1-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド;α-ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコ(seco)ヌクレオチド;非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3-3'-逆向きヌクレオチド部分;3'-3'-逆向き脱塩基部分;3'-2'-逆向きヌクレオチド部分;3'-2'-逆向き脱塩基部分;1,4-ブタンジオールホスフェート;3'-ホスホロアミデート;ヘキシルホスフェート;アミノヘキシルホスフェート;3'-ホスフェート;3'-ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;または架橋または非架橋メチルホスホネート部分が含まれる。詳細は、参照により本明細書に組み入れる国際公開第97/26270号に記載されている。3'-キャップには、例えば4',5'-メチレンヌクレオチド;1-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;5'-アミノ-アルキルホスフェート;1,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート;6-アミノヘキシルホスフェート;1,2-アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド;α-ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート;スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4-セコ(seco)ヌクレオチド;3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-5'-逆向きヌクレオチド部分;5'-5'-逆向き脱塩基部分;5'-ホスホロアミデート;5'-ホスホロチオエート;1,4-ブタンジオールホスフェート;5'-アミノ;架橋及び/または非架橋5'-ホスホロアミデート、ホスホロチオエー
ト及び/またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネート及び5'-メルカプト部分が含まれ得る。参照により本明細書に組み入れるBeaucage and Iyer,1993,Tetrahedron,49,1925も参照されたい。
【０１１９】
ヌクレオシドアナログの非限定的リストは構造:
【化１９】
2011520983.tif 000023
【０１２０】
2011520983.tif 000024
【０１２１】
を有する。それぞれの内容を参照により本明細書に組み入れるFreier ＆ Altmann;Nuc1.Acid Res.,1997,25,4429-4443及びUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213に記載されているヌクレオシドアナログの更なる例を参照されたい。
【０１２２】
本明細書中で使用されている用語「アンチセンス」は、遺伝子産物をコードするかまた
は調節配列をコードする特定のDNAまたはRNA配列に対して相補的なヌクレオチド配列を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補的な核酸鎖を指すべく使用される。細胞代謝の通常作用で、DNA分子のセンス鎖はポリペプチド及び/または他の遺伝子産物をコードする鎖である。センス鎖はメッセンジャーRNA(「mRNA」)転写物(アンチセンス鎖)を合成するための鋳型として役立ち、アンチセンス鎖はコード化遺伝子産物の合成を指令する。アンチセンス核酸分子は、当該遺伝子を相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに逆向きに結合することによる合成を含めた公知方法により産生され得る。細胞に導入したら、この転写された鎖は細胞が産生する天然配列と組み合わされて、二重鎖が形成される。次いで、これらの二重鎖は更なる転写または翻訳を阻止する。こうして変異体表現型が生じ得る。「負」または(-)がアンチセンス鎖を指すことは当業界で公知であり、「正」または(+)がセンス鎖を指すことも当業界で公知である。
【０１２３】
本発明の目的で、「相補性」は、核酸配列が別の核酸配列と水素結合を形成することを
意味すると理解される。相補%は、第2核酸配列と水素結合、すなわちワトソン-クリック塩基対を形成し得る核酸分子中の隣接残基の%を示し、すなわち10中の5、6、7、8、9、10は50%、60%、70%、80%、90%及び100%相補性である。「完全に相補性」は、核酸配列のすべての隣接残基が第2核酸配列中の同一数の隣接残基と水素結合を形成することを意味する。
【０１２４】
1つの実施形態において、コンジュゲーションの選択はオリゴヌクレオチド(または「ポリヌクレオチド」)であり、コンジュゲーション後、標的はオリゴヌクレオチドの残基と称される。オリゴヌクレオチドはホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格を有する公知のオリゴヌクレオチド及びオリゴデオキシヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１２５】
本明細書中に記載されている化合物において有用なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド誘導体には、約8〜約1000個の核酸、好ましくは比較的短いポリヌクレオチド、例えば約8〜約30ヌクレオチド長(例えば、約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)のサイズの比較的短いポリヌクレオチドが含まれ得る。
【０１２６】
本明細書中に記載されている方法において使用される有用な核酸の1つの態様で、天然
ホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格、或いは他の修飾骨格アナログを
有するオリゴヌクレオチド及びオリゴデオキシヌクレオチドには、
LNA(ロック核酸);
PNA(ペプチド骨格を有する核酸〉;
短鎖干渉性RNA(siRNA);
マイクロRNA(miRNA);
ペプチド骨格を有する核酸(PNA);
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO);
トリシクロ-DNA;
デコイODN(二本鎖オリゴヌクレオチド);
触媒RNA配列(RNAi);
リボザイム;
アプタマー;
スピエゲルマー(spiegelmer)(L-立体配座オリゴヌクレオチド);
CpGオリゴマー等、例えばその内容を参照により本明細書に組み入れる2002年5月6〜8日にネバダ州ラスベガスで開催されたTides 2002,Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences及び2003年11月18〜19日に独国ハンブルグで開催されたOligonucleotide ＆ Peptide Technologiesに開示されているもの
が含まれる。
【０１２７】
本明細書中に記載されている方法において使用される核酸の別の態様で、オリゴヌクレオチドには、下表1にリストされているものを含めた適当な当業界で公知のヌクレオチドアナログ及び誘導体が含まれ得る。
【表１】
2011520983.tif 000025
【０１２８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは標的腫瘍細胞、または腫瘍細胞の抗癌治療薬に対する耐性に関与するタンパク質のダウンレギュレートに関係する。例えば、癌治療のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーションに関する当業界で公知の細胞タンパク質(例えば、BCL-2)が本発明のために使用され得る。その内容を参照により本明細書に組み入れる2004年4月9日に出願された米国特許出願第10/822,205号を参照されたい。治療用オリゴヌクレオチドの非限定的リストには、アンチセンスHIF-1αオリゴヌクレオチド、アンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド、アンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチド及びβ-カテニンオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１２９】
好ましくは、本明細書中に記載されている方法において有用なオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格及びLNAを含む。
【０１３０】
1つの実施形態において、本明細書中に記載されている方法において有用なオリゴヌク
レオチドには、アンチセンスbcl-2オリゴヌクレオチド、アンチセンスHIF-1αオリゴヌクレオチド、アンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチド及びアンチセンスErbβ3オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１３１】
1つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えばジェナセンス(a/k/aオブリメルセンナトリウム,ニュージャージー州バークレーハイツに所在のGenta Inc.より生産)と同一または実質的に類似のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。ジェナセンスは、ヒトbcl-2 mRNA(ヒトbcl-2 mRNAは当業界で公知であり、例えば参照により本明細書に組み入れる米国特許第6,414,134号に配列番号19として記載されている)の開始配列の最初の6つのコドンに対して相補的な18マーホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドTCTCCCAGCGTGCGCCAT(配列番号4)である。米国食品医薬品局(FDA)は2000年8月にジェナセンスにオーファンドラッグの地位を与えた。好ましい実施形態はを含む。
【０１３２】
考えられる好ましい実施形態には、
(i)アンチセンスサバイビンLNAオリゴヌクレオチド(配列番号1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c
(ここで、大文字はLNAを表し、“s”はホスホロチオエート骨格を表す);
(ii)アンチセンスBcl2 siRNA:
センス5'-gcaugcggccucuguuugadTdT-3'(配列番号2)
アンチンス3'-dTdTcguacgccggagacaaacu-5'(配列番号3)
(ここで、dTはDNAを表す);
(iii)ジェナセンス(ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド):(配列番号4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
(ここで、小文字はDNAを表し、“s”はホスホロチオエート骨格を表す);
(iv)アンチセンスHIFIα LNAオリゴヌクレオチド(配列番号5)
5'-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'
(ここで、大文字はLNAを表し、“s”はホスホロチオエート骨格を表す);
(v)アンチセンスErbB3 LNAオリゴヌクレオチド(配列番号6)
5'-TsAsGscscstsgstscsascststsCsTsCs-3'
(ここで、大文字はLNAを表し、“s”はホスホロチオエート骨格を表す)
が含まれる。
【０１３３】
LNAは、以下
【化２０】
2011520983.tif 000026
【０１３４】
に示すように2'-O,4'-Cメチレンビシクロヌクレオチドを含む。各々の内容を参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第2006/0154888号及び同2005/0014712号に開示されているサバイビンLNAの詳細説明を参照されたい。各々の内容を参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第2004/0096848号及び同2006/0252721号に開示されているHIF-1α LNAの詳細説明を参照されたい。その内容を参照により本明細書に組み入れる国際公開第2008/113832号も参照されたい。
【０１３５】
1つの特定実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号1、配列番号2及び3、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6を有する。
【０１３６】
本明細書中に記載されているポリマーシステムにコンジュゲートする前のオリゴヌクレ
オチドは、オリゴヌクレオチドの5'または3'末端に(CH2)wスルフヒドリルリンカー(チオオリゴヌクレオチド)(ここで、(w)は約1〜約10の正の整数(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、好ましくは4、5、6または7である)を含む。チオオリゴヌクレオチドは構造SH-(CH2)w-オリゴヌクレオチドを有する。本明細書中に記載されている化合物は、ヒンダードエステル含有(CH2〉wスルフヒドリルリンカーで修飾されているオリゴヌクレオチドを含み得る。結合前、オリゴヌクレオチドは構造:
【化２１】
2011520983.tif 000027
【０１３７】
(ここで、(w)は約1〜約10の正の整数(例えば、3、4、5、6)である)
を有する。
【０１３８】
その内容を参照により本明細書に組み入れる国際公開第2008/034119号を参照されたい。ポリマー化合物はチオール尾部を持たないオリゴヌクレオチドを遊離し得る。
【０１３９】
1つの特定実施形態では、siRNAのセンス鎖の5'末端が修飾されている。例えば、ポリマーコンジュゲート中に使用されるsiRNAは5'-C6-SHで修飾されている。本発明の1つの特定実施形態は、
センス 5'-SH-C6-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'
アンチセンス 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'
の配列を有するBc12-siRNAを使用する。
【０１４０】
修飾オリゴヌクレオチドの例には、
(i)C6-SH尾部で修飾されているジェナセンス:
5'-HS-C6-stscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3'
【化２２】
2011520983.tif 000028
【０１４１】
(ii)C6-SH尾部で修飾されているアンチセンスHIF1α LNA
5'-HS-C6-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3';
(iii)C6-SH尾部で修飾されているアンチセンスサバイビンLNA
5'-HS-C6-smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc-3';
(iv)C6-SH尾部で修飾されているアンチセンスErbB3 LNA
5'-HS-C6-TsAsGscscstsgstscsascststsCsTsCs-3';
(v)ヒンダードエステル尾部で修飾されているジェナセンス
【化２３】
2011520983.tif 000029
【０１４２】
が含まれる。
【０１４３】
F. ポリマーデリバリーシステムの合成
通常、本明細書中に記載されている化合物の製造方法は活性化ポリマーをSH基で修飾されているオリゴヌクレオチドと反応させることを含む。本明細書中に記載されている方法において有用な活性化ポリマーには、末端にピリジルジスルフィド基を含有しているポリマーが含まれる。前記方法により、生物学的活性部分が-S-S-結合を介してポリマーに結合されているポリマーコンジュゲートが得られる。
【０１４４】
本発明の1つの態様で、本明細書中に記載されているポリマー化合物の製造方法は、式(I):
R1-{Z1}m
[式中、
R1は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり;
各Z1は同一または異なり、
【化２４】
2011520983.tif 000030
【０１４５】
-(L4)a1-Rb、例えば
【化２５】
2011520983.tif 000031
【０１４６】
及び
-(L4)a2-Rc
からなる群から選択され;
Y1はそれぞれ独立してSまたはO、好ましくはOであり;
Y2はそれぞれ独立してNR13、好ましくはNHであり;
R100はそれぞれ同一または異なり、H、離脱基、活性化基、及び
【化２６】
2011520983.tif 000032
【０１４７】
からなる群から選択され;
L1-4の各々はそれぞれ同一または異なる二官能性リンカーであり;
Rbはそれぞれ葉酸であり;
Rcはそれぞれ同一または異なる診断薬であり;
R3-7の各々は独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
R8-11の各々は置換アミド、アシル、アジド、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、シアノ及びニトロのような電子吸引基であり、好ましくはR8はニトロであり、R9、R10及びR11は水素であり;
R13はそれぞれ独立して水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル及びC3-8シクロアルキルからなる群から選択され;
R12はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐状アルキル、C3-8シクロアルキル及びC1-6アルコキシからなる群から選択され;
(a)及び(d)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
(a1)及び(a2)の各々は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(b)は独立して0、1、2または3、好ましくは0であり;
各(c)は独立して0、1、2または3、好ましくは1であり;
各(e)は独立して0または1、好ましくは0であり;
各(g)は独立して0または1、好ましくは1であり;
(m11)は約2〜約32の正の整数(例えば、2、4、6、8、16、32)であり、
ただし(a)及び(g)は同時に0でなく、Z1の1つ以上は
【化２７】
2011520983.tif 000033
【０１４８】
を含有している]
を有する化合物を形成するのに十分な条件下で式(III):
R1-{Z11}m11
を有するポリマー化合物を、スルフヒドリル基含有部分で修飾されているオリゴヌクレオチドと反応させることを含む。
【０１４９】
好ましくは、反応を不活性溶媒(例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、DMFまたはその混合物)中で実施する。好ましくは、生成される酸を中和するために反応を塩基(例えば、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミン等)の存在下で実施してもよい。反応は約0℃〜約22℃(室温)の範囲の温度で実施され得る。その内容を参照により本明細書に組み入れる国際公開第2009/025669号の詳細説明を参照されたい。
【０１５０】
G. 式(I)を有する化合物
本明細書中に記載されている方法により製造される幾つかの特定実施形態は構造:
【化２８】
2011520983.tif 000034
【０１５１】
2011520983.tif 000035
【０１５２】
[式中、
Oligoはオリゴヌクレオチド、好ましくはC3-C6アルキル(C6アルキル)で修飾されているオリゴヌクレオチドであり;
PEGはポリエチレングリコールであり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有しており;
(a1)は1であり;
L4は-NH(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(=O)]r'-または-NH(CH2)3-(ここで、(r')は0または1である)であり;
他の可変部はすべて上の定義と同じである]
を有している。
【０１５３】
例えば、本明細書中に記載されている方法により製造される化合物には、
【化２９】
2011520983.tif 000036
【０１５４】
2011520983.tif 000037
【０１５５】
[式中、
Oligoはオリゴヌクレオチドであり;
Rbは
【化３０】
2011520983.tif 000038
【０１５６】
であり;
PEGはポリエチレングリコールであり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有している]
が含まれる。
【０１５７】
更なる実施形態において、本明細書中に記載されている方法により製造される化合物には、
【化３１】
2011520983.tif 000039
【０１５８】
2011520983.tif 000040
【０１５９】
〔式中、
Oligoはオリゴヌクレオチド、好ましくはC3-C6アルキル(例えば、C6アルキル)で修飾されているオリゴヌクレオチドであり;
PEGはポリエチレングリコールであり、化合物のポリマー部分は約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンの全数平均分子量を有している]
が含まれる。記載を限定せずに平易とするために、マルチアームPEGを「PEG」として示す。8アームPEGの1〜7アーム(または、4アームPEGの1〜3アーム)が葉酸とコンジュゲートされていてもよい。
【０１６０】
好ましくは、化合物は治療用オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド及びアンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチドを含む。例えば、化合物は以下のように
-5'-(CH2)6-TsAsGsCsCsTsGsTsCsAsCsTsTsCsTsCs-3'、または
-5'-(CH2)6-GsCsTsGsCsCsAsTsGsGsAsTsTsGsAsG-3'
(ここで、“s”はホスホロチオエート結合を表し、5'及び3'末端の最初の3つのヌクレオチドはLNAである)
C6-尾部修飾アンチセンスLNAを含む。
【０１６１】
好ましくは、ポリマー部分の平均分子量は約40,000ダルトンである。
【０１６２】
H. 治療方法
本発明の1つの態様は、オリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入または送達する方法を提供する。本発明の方法は細胞を本明細書中に記載されている式(I)を有する化合物と接触させることを含む。
【０１６３】
本発明は、オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞を有する哺乳動物に導入するために有用である。本明細書中に記載されている化合物は哺乳動物、好ましくはヒトに対して投与され得る。
【０１６４】
本発明によれば、本発明は、好ましくは哺乳動物細胞または組織における遺伝子発現を抑制またはダウンレギュレート(または、モジュレート)する方法を提供する。遺伝子発現のダウンレギュレーションまたは抑制はインビボ及び/またはインビトロでなされ得る。この方法は、ヒト細胞または組織を本明細書中に記載されている式(I)を有する化合物と接触させることを含む。接触させたら、インビボまたはインビトロで測定して、本明細書中に記載されている化合物で治療しないときに観察される結果と比較して少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約20%またはそれ以上が実現したときに、例えばmRNAまたはタンパク質レベルで遺伝子発現の抑制またはダウンレギュレーションが成功したと見なされる。
【０１６５】
本発明の目的で、「抑制」または「ダウンレギュレート」は、標的遺伝子の発現、或いはRNAまたは1つ以上のタンパク質サブユニットをコードする均等RNAのレベル、或いは1つ以上のタンパク質サブユニット(例えば、ErbB3)の活性が、本明細書中に記載されているコンジュゲートで治療しないときに観察される結果よりも低下することを意味すると理解される。
【０１６６】
好ましくは、標的遺伝子の発現は前立腺または子宮頸癌細胞または組織、例えば前立腺または子宮頸癌細胞において抑制される。
【０１６７】
更なる実施形態において、癌細胞または組織は充実性腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、膵臓癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、胃癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌及び脳腫瘍等の1つ以上に由来し得る。
【０１６８】
1つの特定実施形態において、本明細書中に記載されている方法に従う化合物には、例えばアンチセンスbcl-2オリゴヌクレオチド、アンチセンスHIF-1αオリゴヌクレオチド、アンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチド及びアンチセンスErbβ3オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１６９】
好ましくは、投与ステップは哺乳動物の血流を介する。
【０１７０】
本発明の更なる態様は、哺乳動物における各種病的状態の治療方法を提供する。この方法は、治療を要する哺乳動物に対して有効量の式(I)を有する化合物を含有する医薬組成物を投与することを含む。ポリマーコンジュゲート化合物は、特に疾患を治療するために有用であり、前記疾患には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
この態様で、有用な標的遺伝子には、癌遺伝子、血管新生促進経路遺伝子、細胞増殖促進経路遺伝子、ウイルス感染剤遺伝子及び炎症促進経路遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
なお更なる態様で、悪性腫瘍または癌の治療を要する患者に対して有効量の式(I)を有する化合物を含有する医薬組成物を投与することを含む悪性腫瘍または癌を有する患者の治療方法をも提供する。代替態様で、治療対象の癌は充実性腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、膵臓癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌等の1つ以上であり得る。組成物は、標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることにより、哺乳動物において腫瘍性疾患を治療するために、腫瘍量を減少させるために、新生物の転移を予防するために、及ひ腫瘍/新生物増殖の再発を予防するために有用である。
【０１７３】
非コンジュゲート状態で治療効果を有するオリゴヌクレオチド等が本明細書中に記載されているように作成したコンジュゲート形態で使用され得る。
【０１７４】
1つの特定実施形態において、本明細書中に記載されている方法は、ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に対して投与することを含む。この方法は、有効量の本明細書中に記載されているように作成したコンジュゲートを治療対象の状態に対して送達することを含み、前記状態に対するポリヌクレオチドの効果に依存する。
【０１７５】
例えば、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド、アンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチド)が癌または腫瘍性細胞に対して効果を有しているならば、前記方法は、未変性オリゴヌクレオチドに対する感受性を有している細胞に対してオリゴヌクレオチドを含有するポリマーコンジュゲートを送達することを含む。送達は、適当な医薬組成物の一部としてインビボで行われ、またはエキソビボ環境で細胞に対して直接行われる。1つの特定治療では、オリゴヌクレオチド(配列番号1、配列番号2及び3、配列番号4、配列番号5、配列番号6)を含むポリマーコンジュゲートが使用され得る。
【０１７６】
なお別の態様で、本発明は、インビボまたはインビトロでの癌細胞の成長または増殖の抑制方法を提供する。この方法は、癌細胞を本明細書中に記載されている化合物と接触させることを含む。或いは、本発明は、本明細書中に記載されている化合物を癌細胞のアポトーシスのモジュレーションを要する哺乳動物に対して投与することにより癌細胞のアポトーシスをモジュレートする方法を提供する。
【０１７７】
なお別の態様で、インビボまたはインビトロで癌細胞または組織の化学療法剤に対する感受性を高める方法をも提供する。1つの特定態様で、この方法は、癌細胞または組織におけるサバイビン発現を低下させるために本明細書中に記載されているオリゴヌクレオチド(アンチセンスLNA)コンジュゲートを癌細胞に導入することを含み、この場合アンチセンスオリゴヌクレオチドはサバイビン遺伝子から発現されたmRNAに結合し、サバイビン遺伝子発現を低下させる。
【０１７８】
なお別の態様で、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞を死滅させる方法を提供する。この方法は、遺伝子発現(例えば、ErbB3)を低下させるために本明細書中に記載されている化合物を腫瘍細胞に導入し、腫瘍細胞の一部を死滅させるのに十分な量の少なくとも1つの化学療法剤と接触させることを含む。よって、死滅された腫瘍細胞の部分は、本明細書中に記載されている化合物の非存在下で同一量の化学療法剤により死滅された腫瘍細胞の部分よりも大きくなり得る。
【０１７９】
本発明の更なる態様で、化学療法剤は本明細書中に記載されている化合物を用いる方法と一緒に同時にまたは逐次に使用され得る。本明細書中に記載されている化合物を化学療法剤と同時に投与しても、或いは化学療法剤を投与する前またはその後に投与してもよい。よって、本明細書中に記載されている化合物は化学療法剤の治療中またはその後に投与され得る。
【０１８０】
I. 医薬組成物/製剤
本明細書中に記載されている化合物を含む医薬組成物は、活性化合物の医薬的に使用され得る製剤への加工を助ける賦形剤及び助剤からなる1つ以上の生理学的に許容される担体と一緒に製剤化され得る。適切な製剤は選択する投与ルート、すなわち局所または全身治療を行うかに依存する。本発明の多くの態様で非経口ルートが好ましい。
【０１８１】
本明細書中に記載されている式(I)を有する化合物を含有する医薬組成物の投与は、経口;肺;局所、例えば表皮、経皮、眼、及び膣及び直腸送達を含めた粘膜;または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入を含めた非経口であり得る。1つの実施形態では、治療用オリゴヌクレオチドを含有する化合物をIV、IP、またはボーラス注射として投与する。
【０１８２】
非限定的に静脈内、筋肉内及び皮下注射を含めた注射の場合、本明細書中に記載されている化合物を水溶液中、好ましくは生理的に適合し得るバッファー(例えば、生理食塩液バッファー)及び極性溶媒中で製剤化し得る。前記溶媒にはピロリドンまたはジメチルスルホキシドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
化合物は、例えばボーラス注射または連続注入により非経口投与するためにも製剤化され得る。注射用製剤は単位投与形態、例えばアンプルまたはマルチドーズ容器で提供され得る。有用な組成物には、非限定的に油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンが含まれ、添加剤(例えば、懸濁剤、安定化及び/または分散剤)を配合してもよい。非経口投与用医薬組成物には水溶性形態の水性溶液が含まれ、水溶性形態の例には非限定的に活性化合物の塩(好ましい)が含まれる。更に、活性化合物の懸濁液は親油性ビヒクル中で調製され得る。適当な親油性ビヒクルには、脂肪油(例えば、ゴマ油)、合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチル及びトリグリセリド)、または物質(例えば、リポソーム)が含まれる。水性注射用懸濁液に該懸濁液の粘度を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを配合し得る。場合により、懸濁液に適当な安定化剤及び/または濃厚溶液を調製すべく懸濁液に化合物の溶解度を上昇させる物質をも配合し得る。或いは、活性成分が使用前に適当なビヒクル(例えば、無菌の発熱物質非含有水)で構成するための粉末状であってもよい。
【０１８４】
経口投与の場合、化合物は活性化合物を当業界で公知の製薬上許容される担体と組み合わせることにより製剤化され得る。前記担体により、本発明の化合物は患者が経口摂取するための錠剤、ピル剤、トローチ剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、ペースト剤、スラリー剤、溶液剤、懸濁液剤、患者の飲用水で希釈するための濃厚溶液剤及び懸濁液剤、患者の食事で希釈するためのプレミックス等として製剤化することができる。経口用医薬製剤は、固体賦形剤を使用し、場合により生じた混合物を粉砕し、所望により他の適当な助剤を添加した後顆粒の混合物を加工することにより作成され、こうして錠剤または糖衣錠剤のコアが得られる。有用な賦形剤は、特に増量剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖、セルロース材料(例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、コメ澱粉及びジャガイモ澱粉)、及び他の材料(例えば、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び/またはポリビニルピロリドン(PVP))である。所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸を添加してもよい。塩、例えばアルギン酸ナトリウムを使用してもよい。
【０１８５】
吸入により投与する場合、本発明の化合物を加圧パックまたはネブライザー及び適当な噴射剤を用いてエアゾールスプレーの形態で送達することが好都合であり得る。
【０１８６】
化合物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドのような慣用されている座剤基剤を用いて座剤または停留浣腸剤のような直腸組成物中にも製剤化され得る。
【０１８７】
先に挙げた製剤に加えて、化合物はデポー製剤としても製剤化され得る。持効性製剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内に)により、または筋肉内注射により投与され得る。本発明の化合物は適当なポリマーまたは疎水性物質を用いて(例えば、製薬上許容される油を含むエマルジョンの形態で)、イオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として製剤化され得、前記誘導体には難溶性塩が非限定的に挙げられる。
【０１８８】
リポソーム及びエマルジョンのような他のデリバリーシステムも使用し得る。
【０１８９】
加えて、コンジュゲートは徐放性システム、例えば治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを用いて送達され得る。各種徐放性材料が確立されており、当業者に公知である。
【０１９０】
J. 用量
治療有効量の決定は、特に本明細書中の開示内容にてらして当業者の裁量の範囲内である。
【０１９１】
本発明の方法で使用されるコンジュゲートの場合、治療有効量はまずインビトロアッセイから推定され得る。次いで、有効量を含めた循環濃度範囲を得るために動物モデルで使用するために投与量が処方され得る。次いで、この情報を用いて患者において有用な用量をより正確に決定し得る。
【０１９２】
投与される(例えば、プロドラッグとして使用される)組成物の量は組成物中に含まれている親分子(すなわち、非コンジュゲートオリゴヌクレオチドの効果)に依存する。通常、治療方法で使用されるプロドラッグの量は哺乳動物において所望の治療結果を効果的に得る量である。勿論、各種プロドラッグ化合物の用量は親化合物(LNAのようなオリゴヌクレオチド)、インビボ加水分解速度、ポリマーの分子量等に応じてある程度異なる。加えて、用量は勿論剤形及び投与ルートに応じて異なり得る。しかしながら、通常本明細書中に記載されているオリゴヌクレオチドコンジュゲートは約1mg/kg/週〜約1g/kg/週、好ましくは約1〜約500mg/kg/週、より好ましくは1〜約100mg/kg/週(すなわち、約2〜約60mg/kg/週)の範囲の量で投与され得る。上記した範囲は例示であり、当業者は臨床経験及び治療適応に基づいて選択されるプロドラッグの最適用量を決定するであろう。更に、正確な製剤、投与ルート及び用量は患者の状態にてらして個々の医師により選択され得る。加えて、本明細書中に記載されている化合物の毒性及び治療効果は、当業界で公知の方法を用いて細胞培養または実験動物での標準の医薬手順により決定され得る。
【０１９３】
或いは、約0.1〜約140mg/kg体重/日のオーダーの用量レベルが上に挙げた状態の治療において有用である(約0.5mg〜約7g/被験者/日)。単一剤形を作成すべく担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は治療対象の宿主及び具体的投与モードに応じて異なる。投与単位形態は通常約1〜約500mgの活性成分を含有している。
【０１９４】
1つの実施形態において、本発明の治療は、本明細書中に記載されているオリゴヌクレオチドコンジュゲートを哺乳動物に対して約2〜約50mg/kg/投与(例えば、約5〜約30mg/kg/投与)の量で投与することを含む。
【０１９５】
或いは、本明細書中に記載されているオリゴヌクレオチドコンジュゲートの送達は、約0.1〜約1000nM、好ましくは約10〜約1000nMの濃度のオリゴヌクレオチドをインビボまたはインビトロで腫瘍細胞または組織と接触させることを含む。
【０１９６】
組成物は1日1回投与しても、または複数の週の治療プロトコルの一部として投与され得る複数回投与に分割してもよい。正確な用量は、当業者が認識しているように状態のステージ及び重症度、腫瘍のポリマー-プロドラッグ組成物に対する感受性、及び治療対象の患者の個別の特徴に依存する。
【０１９７】
ポリマーコンジュゲートを投与する本発明のすべての態様において、挙げられている投与量は投与するポリマーコンジュゲートの量よりもむしろオリゴヌクレオチド分子の量に基づいている。所望の治療結果が得られるまで治療は1日以上実施されると考えられる。本発明の化合物の投与の正確な量、頻度及び期間は勿論担当医により決定されるように患者の性別、年齢及び医学的状態、並びに疾患の重症度に応じて異なる。
【０１９８】
更なる態様は、相乗または相加効果のために本明細書中に記載されている本発明の化合物を他の抗癌治療との組合せを含む。
【実施例】
【０１９９】
下記実施例は本発明の更なる理解を与えるために役立つが、本発明の有効な範囲を決して限定することを意味しない。実施例中に記載されている太字の番号は図1〜6に示されているものに対応している。
【０２００】
実施例1
一般的実験
すべての合成反応は乾燥窒素またはアルゴンの雰囲気下で実施する。市販の試薬は更に精製することなく使用する。すべてのPEG化合物は使用前に真空中で、またはトルエンと共沸蒸留させることにより乾燥させた。別段の特定がない限り、1H NMRスペクトルは300mHzで得、13C NMRスペクトルは75.46MHzでVarian Mercury 300NMR分光計及び溶媒として重水素クロロホルムを用いて得た。化学シフト(δ)はテトラメチルシラン(TMS)からの百万部あたりの部(ppm)ダウンフィールドで報告する。
【０２０１】
DCM(ジクロロメタン)、DIEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン)、LNA(ロック核酸)、MEM(改変イーグル培地)、TEAA(酢酸テトラエチルアンモニウム)、TFA(トリフルオロ酢酸)及びRT-qPCR(逆転写-定量ポリメラーゼ連鎖反応)のような略号が実施例中で使用されている。
【０２０２】
実施例2
一般的HPLC方法
反応混合物、並びに中間体及び最終生成物の純度をBeckman Coulter System Gold(登録商標)HPLC計器によりモニターする。1mL/分の流速で0.05% TFA中10〜90% アセトニトリルの勾配または1mL/分の流速で50mM TEAAバッファー中25〜35%アセトニトリルの勾配を用いて、168 Diode Array UVデテクタを備えたZORBAX(登録商標)300SB C8逆相カラム(150×4.6mm)またはPhenomenex Jupiter(登録商標)300A C18逆相カラム(150×4.6mm)を使用する。アニオン交換クロマトグラフィーは、GE healthcare(Amersham Biosciences)製AKTAエクスプローラー100AでWaters製AP-Emptyガラスカラムに充填したApplied Biosystems製Poros 50HQ強アニオン交換樹脂を用いて流した。脱塩はAmersham Biosciences製HiPret 26/10脱塩カラムを用いて実施した。
【０２０３】
実施例3
一般的mRNAダウンレギュレーション手順
細胞を完全培地(10% FBSを補充したF-12KまたはDMEM)において維持した。各ウェルに2.5×105個の細胞を含有している12ウェルプレートを37℃で一晩インキュベートした。細胞をOpti-MEM(登録商標)で1回洗浄し、各ウェルに400μLのOpti-MEM(登録商標)を添加した。次いで、オリゴヌクレオチドを含有するポリマーコンジュゲートの溶液を各ウェルに添加した。細胞を4時間インキュベートした後、600μL/ウェルの培地を添加し、24時間インキュベートした。24時間処理した後、標的遺伝子(例えば、ヒトサバイビン)及びハウスキーピング遺伝子(例えば、GAPDH)の細胞内mRNAレベルをRT-qPCRにより定量した。GAPDHの発現レベルに対して正規化したmRNAの発現レベルを比較した。
【０２０４】
実施例4
一般的RNA作成手順
インビトロmRNAダウンレギュレーションのために、全RNAをRNAqueous Kit(登録商標)(Ambion)を用い、製造業者の指示に従って作成した。RNA濃度をNanodropを用いてOD260nmにより測定した。
【０２０５】
実施例5
一般的RT-qPCR手順
すべての試薬、すなわちHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(登録商標)(4368813)、20×PCRマスターミックス(4304437)、並びにヒトGAPDF及びサバイビンに対するTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイキットはApplied Biosystemsから入手した。cDNA合成のために2.0μgの全RNAを50μLの最終容量で使用した。反応はPCRサーモサイクラーにおいて25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間実施した後、4℃で保存した。リアルタイムPCRは50℃-2分間、95℃-10分間及び95℃-15秒間/60℃-1分間のプログラムで40回実施した。各qPCR反応のために、1μLのcDNAを30μLの最終容量で使用した。
【０２０６】
実施例6
オリゴヌクレオチドのPEG化のための一般的手順
活性化PEG(0.35mmo1,約10〜30当量)及びオリゴヌクレオチド(0.03mmol,〜1当量)をPBSバッファー(〜5ml/100mgPEG,pH7.4)中に含む溶液を室温で攪拌し、反応の進行をHPLCによりモニターする。反応物をMilli-Q水(25mL)で希釈し、HQ/10 Poros強アニオン交換カラム(例えば、充填前に100mM TEAAで平衡化したSource 15RPCカラム,10mm×60mm,カラム体積〜6mL)を用いて精製する。画分を1M NaCl、水及び50% CH3CNを用いて溶離させる。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なPEG-Oligoを得る。生成物の分子量を確認するためにMALDIを使用する。
【０２０７】
実施例7
化合物1(葉酸NHS)の製造
葉酸をDOCの存在下でNHSとカップリングして、NHSエステル(化合物1)を得る。
【０２０８】
実施例8
化合物3の製造
ヘテロニ官能性アミノ酸PEG(化合物2)をEDCの存在下でNHSとカップリングして、NHSエステル(化合物3)を得る。
【０２０９】
実施例9
化合物5の製造
4N HClをジオキサン(70mL)中に含む溶液をBocCys(Npys)-OH(化合物4,5g,13.32mmol)に添加した。懸濁液を室温で3時間攪拌した後、エチルエーテル(700mL)に注いだ。最後まで真空にすることなく固体を粗いガラス漏斗を介して濾過した。ケーキをエチルエーテル(3×50mL)で洗浄した後、真空下室温で一晩乾燥させた。1H NMR(300MHz,CD3OD):δ 8.93(1H,dd,J=1.5,4.7Hz),8.66(1H,dd,J=1.5,8.20Hz),7.59(1H,dd,J=4.7,8.2Hz),4.24(1H,dd,J=4.1,9.4Hz),3.58(1H,dd,J=4.1,14.9Hz),3.36(1H,dd,J=9.4,15.2Hz)。13C NMR(75.4MHz,CDCl3):δ 169.40,156.27,154.64,144.13,135.246,123.10,52.77,39.27。
【０２１０】
実施例10
化合物6の製造
化合物3(0.35mmol)を、化合物5(置換する各NHSに対して2当量)をDMF/DCM(25mL/45mL)中に含む溶液に添加した後、DIEA(各化合物5に対して3当量)を添加する。懸濁液を室温で5時間攪拌する。反応混合物を真空下で蒸発させた後、0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させる。固体を濾過した後、DCM(80mL)中に溶解させる。0.1N HCl(20mL)を添加した後、混合物を5分間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、有機層を分離し、再び0.1N HCl(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄する。有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させる。残渣を0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させる。固体を濾過し、真空オーブン中30℃で少なくとも2時間乾燥して、化合物14を得る。
【０２１１】
実施例11
化合物7の製造
化合物6をDCM中に含む溶液(10mL/gの化合物6)を、0℃でTFA(16mL)に添加する(2.5mL/gの化合物6)。反応混合物を0℃〜室温で1時間攪拌する。反応が完了したら、溶媒を真空中で除去し、残渣を0℃で20mL/300mL/gの化合物6のDCM/Et2Oから沈殿させる。固体を濾過し、乾燥して、化合物7を得る。
【０２１２】
実施例12
化合物8の製造
化合物1をDMSO中に含む溶液を、化合物7をDCM中に含む溶液に添加する。反応混合物を攪拌し、粗生成物をDCM中/エーテル中に沈殿させる。固体を濾過し、真空中で乾燥して、化合物8を得る。
【０２１３】
実施例13
化合物10の製造
化合物8を実施例6に記載されている条件でオリゴヌクレオチド(化合物9,HS-5'-(CH2)6-オリゴヌクレオチド)と反応させて、化合物10を得る。
【０２１４】
実施例14
化合物12の製造
化合物11(ビスSC-PEG,0.35mmol)を、化合物5(置換する各NHS毎に対して2当量)をDMF/DCM(25mL/45mL)中に含む溶液に添加した後、DIEA(各化合物5に対して3当量)を添加する。懸濁液を室温で5時間攪拌する。反応混合物を真空下で蒸発させた後、0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させる。固体を濾過した後、DCM(80mL)中に溶解させる。0.1N HCl(20mL)を添加した後、混合物を5分間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、有機層を分離し、再び0.1N HCl(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄する。有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させる。残渣を0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させた。固体を濾過し、真空オーブン中30℃で少なくとも2時間乾燥して、化合物12を得る。
【０２１５】
実施例15
化合物14の製造
化合物13をDCM中、塩基としてのDIEAの存在下で化合物12と反応させて、化合物14を得る。
【０２１６】
実施例16
化合物15の製造
化合物14をDCM中TFAで処理して、化合物15を得る。
【０２１７】
実施例17
化合物16の製造
化合物1をDMSO中に含む溶液を、化合物15をDCM中に含む溶液に添加する。反応混合物を攪拌し、粗生成物をDCM中/エーテル中に沈殿させる。固体を濾過し、真空中で乾燥して、化合物16を得る。
【０２１８】
実施例18
化合物18の製造
化合物16を実施例6に記載されている条件でオリゴヌクレオチド(化合物17,HS-5'-(CH2)6-オリゴヌクレオチド)と反応させて、化合物18を得る。
【０２１９】
実施例19
化合物20((SC)3-PEG-Cys-SS-NPyS)の製造
化合物19(4アームSC-20KPEG,0.35mmol)を、化合物5(置換する各NHSに対して2当量)をDMF/DCM(25mL/45mL)中に含む溶液に添加した後、DIEA(各化合物5に対して3当量)を添加する。懸濁液を室温で5時間攪拌する。反応混合物を真空下で蒸発させた後、0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させた。固体を濾過した後、DCM(80mL)中に溶解させた。0.1N HCl(20mL)を添加した後、混合物を5分間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、有機層を分離し、再び0.1N HCl(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣を0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させた。固体を濾過し、真空オーブン中30℃で少なくとも2時間乾燥して、化合物20を得る。
【０２２０】
実施例20
化合物21((BocNHExtend)3-PEG-Cys-SS-NPyS)の製造
化合物20をDCM中、塩基としてのDIEAの存在下で化合物13と反応させて、化合物21を得る。
【０２２１】
実施例21
化合物22((NHExtend)3-PEG-Cys-SS-NPyS)の製造
化合物21をDCM中TFAで処理して、化合物22を得る。
【０２２２】
実施例22
化合物23((葉酸-NHExtend)3-PEG-Cys-SS-NPyS)の製造
化合物1をDMSO中に含む溶液を、化合物22をDCM中に含む溶液に添加した。反応混合物を攪拌し、粗生成物をDCM中/エーテル中に沈殿させる。固体を濾過し、真空中で乾燥して、化合物23を得た。
【０２２３】
実施例23
化合物25((葉酸-NHExtend)3-20KPEG-Cys-SS-C6-Oligo)の製造
(葉酸)3-20KPEG-NPyS(化合物23,120mg,5.50μmol)をpH6.5リン酸バッファー(3〜4mL)中に溶解し、フォイルを被せ、窒素ガスを10分間パージした。この溶液にオリゴヌクレオチド(化合物24,例えばアンチセンスErbB3 LNAオリゴヌクレオチド,6.0mg,1.10μmo1)を添加し、生じた橙黄色混合物を周囲温度で〜2時間攪拌した。この間に溶液は深い黄色になった。この後、溶液を0.45μmシリンジフィルターを用いて濾過し、予め20mM トリス-HC1バッファー,pH7.0(バッファーA)で平衡化したPoros HQ強アニオン交換カラム(10cm×1.0cm,カラム体積〜8mL)に充填した。カラムを3〜4カラム体積のバッファーAで洗浄して過剰のPEGリンカーを除去した。生成物を20mM トリス-HC1バッファー,pH7.0中1M NaCl(バッファーB)のゆっくりした増加勾配により溶離させた。単離した画分を合わせ、逆相クロマトグラフィー(Source RPC)により脱塩し、生じた溶液を凍結乾燥して、所望のPEG-LNA化合物を綿毛状黄色固体(4.62mg,オリゴに基づいて,77.0%)として得た。
【０２２４】
実施例24
化合物26((葉酸-NHExtend)3-40KPEG-Cys-SS-C6-Oligo-FAM)の製造
(葉酸)3-40KPEG-NPyS(0.35g,8.33μmo1)をpH6.5リン酸バッファー(5mL)中に溶解し、フォイルを被せ、窒素ガスを10分間パージした。この溶液にFAM修飾オリゴヌクレオチド(FAM修飾化合物24,10.0mg,1.67μmo1)を添加し、生じた橙黄色混合物を周囲温度で〜3時間攪拌した。この間に溶液は深い黄色になった。この後、溶液を0.45μmシリンジフィルターを用いて濾過し、予め20mM トリス-HC1バッファー,pH7.0(バッファーA)で平衡化したPoros HQ強アニオン交換カラム(10cm×1.0cm,カラム体積〜8mL)に充填した。カラムを3〜4カラム体積のバッファーAで洗浄して過剰のPEGリンカーを除去した。生成物を20mM トリス-HC1バッファー,pH7.0中1M NaCl(バッファーB)のゆっくりした増加勾配により溶離させた。単離した画分を合わせ、逆相クロマトグラフィー(Source RPC)により脱塩し、生じた溶液を凍結乾燥して、所望のPEG-LNA化合物を綿毛状黄色固体(3.33mg,オリゴに基づいて,33.3%)として得た。
【０２２５】
実施例25
化合物28の製造
化合物22を化合物TAMRA-C(=O)-OSu(化合物27)と反応させて、化合物28を得る。
【０２２６】
実施例26
化合物29の製造
化合物1をDMSO中に含む溶液を、化合物29をDCM中に含む溶液に添加する。反応混合物を攪拌し、粗生成物をDCM/エーテル中に沈殿させる。固体を濾過し、真空中で乾燥して、化合物29を得る。
【０２２７】
実施例27
化合物31(葉酸)2-TAMRA-20KPEG-Cys-SS-C6-Oligoの製造
化合物29を実施例6に記載されている条件でオリゴヌクレオチド(化合物30)と反応させて、化合物31を得る。
【０２２８】
実施例28
化合物33の製造
化合物32(4アームSC-20KPEG,0.35mmo1)を、化合物5(置換する各NHSに対して2当量)をDMF/DCM(25mL/45mL)中に含む溶液に添加した後、DIEA(各化合物5に対して3当量)を添加した。懸濁液を室温で5時間攪拌する。反応混合物を真空下で蒸発させた後、0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させた。固体を濾過した後、DCM(80mL)中に溶解した。0.1N HCl(20mL)を添加した後、混合物を5分間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、有機層を分離し、再び0.1N HC1(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣を0℃でDCM/Et2Oを用いて沈殿させる。固体を濾過し、真空オーブン中30℃で少なくとも2時間乾燥させる。13C NMR(75.4MHz,CDCl3):δ 170.90,156.66,155.68,153.86,142.41,133.85,121.24,72.96-69.30,64.08,53.01,41.82。
【０２２９】
実施例29
化合物35の製造
PEG-LNAコンジュゲートを製造するために各種サイズの活性化PEGポリマーを使用した。通常、化合物33を実施例6に記載されている条件を用いてオリゴヌクレオチド(化合物34)と反応させた。各化合物の説明を図6に示す。オリゴヌクレオチド(化合物34,400mg,0.074mmol)を、化合物33(505mg,0.012mmol)をpH6.5,100mM リン酸ナトリウム(25mL)中に含む溶液に添加した。反応物を窒素下室温で5時間攪拌した。反応混合物をSource 15RPCカラムを用いて精製した。カラムを100mM TEAAで平衡化した。次いで、反応混合物を充填した。カラムを1M NaCl、水及び5% CH3CNで溶離させた。化合物35を集め、凍結乾燥した。収量は150mgであった。MALDIにより62,590の分子量を確認する。
【０２３０】
実施例30
式(I)を有する化合物
実施例31〜37は、式:
【化３２】
2011520983.tif 000041
【０２３１】
(式中、
PEGはポリエチレングリコールであり;
Rbは
【化３３】
2011520983.tif 000042
【０２３２】
であり;
Oligoは一様に5'-(CH2)6-アンチサバイビンLNA(配列番号1,「LNA1」と称される)または5'-(CH2)6-アンチ-erbB3 LNA(配列番号6,「LNA2」と称される)であり、PEGを含有する化合物のポリマー部分の全分子量は約40,000ダルトン、20,000ダルトン、10,000ダルトンまたは5,000ダルトンである)
を有する遊離可能に結合されているPEG分子を用いるオリゴヌクレオチドの改善された腫瘍送達及び標的化腫瘍mRNAの改善されたアンチセンスノックダウンを示す。
【０２３３】
例えば、化合物には、葉酸-40KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物101)、葉酸-5KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物10)、40KPEG-Cys-SS-LNA1(化合物103)、10KPEG-Cys-SS-LNA1(化合物104)及び40KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物105)が含まれる。
【０２３４】
実施例31
インビトロ安定性
本明細書中に記載されているPEG-Cys-SS-LNAコンジュゲート及び葉酸-PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートはバッファー中で良好な安定性を示した。
【０２３５】
実施例32
葉酸-PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートのインビトロ細胞取り込み
葉酸-PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートの細胞取り込み及び葉酸受容体に対する結合特異性をKBヒト子宮頸癌細胞株において評価した.KB細胞を37℃で一晩平板培養した。細胞を1μMの遊離葉酸の存在または非存在下で100nMの葉酸-PEG-Cys-SS-LNA2-FAMコンジュゲート(FAMで標識した化合物101及び10)と37℃で24時間インキュベートした。PEG-Cys-SS-LNA2-FAMコンジュゲートの量はポリマーコンジュゲートの量ではなく、LNA2の量に基づいた。細胞を洗浄し、サンプルを蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡で観察した。葉酸-PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートの細胞取り込みの結果を図7に示す。
【０２３６】
KB細胞を100nMの遊離葉酸の存在または非存在下で葉酸-5KPEG-Cys-SS-LNA2-FAM(FAMで標識した化合物10)に37℃で4時間曝した。細胞を洗浄し、結合の特異性についてFACSにより分析した。結果を図8に示す。
【０２３７】
蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡研究は、葉酸がLNAオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを改善したことを示した。葉酸-PEGコンジュゲートの細胞内送達はリポフェクタミンをトランスフェクトしたものに匹敵していた。葉酸はオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを高めた。
【０２３８】
蛍光顕微鏡像(図7(a))及びFACS分析(図8)は、葉酸-PEGコンジュゲートの葉酸受容体への結合及びその後のKB細胞への内部化が遊離葉酸の存在下で阻止されたことを示した。KB細胞における葉酸-PEGコンジュゲートの葉酸受容体への結合は特異的であった。
【０２３９】
実施例33
腫瘍細胞におけるPEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートのインビトロ効果
PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲート及び裸のLNAオリゴヌクレオチドのインビトロ効果をqRT-PCRを用いて実施した。15PC3ヒト前立腺癌細胞を0.1〜1,000nMの各試験化合物、裸のLNA2または40KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物105)で処理した。投与した40KPEG-Cys-SS-LNA2の量は投与したポリマーコンジュゲートの量ではなく、LNA2の量に基づいた。細胞を収集し、ErbB3 mRNAダウンレギュレーションについてqRT-PCRを用いることにより分析した。qRT-PCRからの結果をリポフェクタミンの存在または非存在下での未処理15PC3細胞と比較した。結果を図9に示す。これらの結果から、PEG-Cys-SS-LNA2コンジュゲートが標的遺伝子ErbB3 mRNAの発現をダウンレギュレートし、効果は裸のLNA2に匹敵していたことが判明した。PEG-Cys-SS-LNA2コンジュゲートのErbB3 mRNAの発現のノックダウンは15PC3細胞において均等な裸のLNA2と同程度に強力であった(それぞれ、IC50=5nM及び8.5nM)。LNAオリゴヌクレオチドに結合されているPEGはLNAオリゴヌクレオチドの効果を妨げなかった。
【０２４０】
実施例34
葉酸-PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートのKB異種移植マウスモデルにおけるインビボ効果
葉酸-PEG-LNAコンジュゲートの効果をKBヒト子宮頸癌移植したマウスにおいて評価した。KB腫瘍(類表皮腫,ヒト子宮頸癌細胞株)を有する無胸腺ヌードBalb/cマウスを35mg/kgの用量の裸LNA2または葉酸-40KPEG-Cys-SS-LNA2、40KPEG-LNA2、葉酸-5KPEG-LNA2または5KPEG-LNA2コンジュゲートでq3d×4で12日間治療した。投与したPEGコンジュゲートの量は、投与したポリマーコンジュゲートの量ではなく、LNA2の量に基づいた。腫瘍及び肝臓サンプルを単離し、ErbB3 mRNAダウンレギュレーションについてqRT-PCRを用いて分析した。
【０２４１】
結果は図10(A)及び(B)に示す通りである。葉酸-PEGコンジュゲートは、腫瘍組織において裸のLNA2と比較してErbB3 mRNAの発現を大きく抑制した。加えて、40K葉酸-PEG-LNAコンジュゲートは5K葉酸-PEG-LNAコンジュゲートと比較して標的mRNAをダウンレギュレートした。これらの結果から、PEG化が腫瘍におけるLNAオリゴヌクレオチドの蓄積を増加させ、葉酸-PEG-コンジュゲートが裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較してmRNAダウンレギュレーションを高めたことが判明した。
【０２４２】
実施例35
PEG-Cys-SS-LNAの腫瘍及び血漿中の体内分布
PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートの血漿中の循環及び腫瘍中の保留をA549ヒト肺腺癌移植したマウスにおいて評価した。
【０２４３】
A549(ヒト肺腺癌上皮細胞株)細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が75mm3の平均体積に達したら、マウスを無作為にグループ分けし、10mg/kgの裸のLNA1、40KPEG-Cys-SS-LNA1(化合物103,10mg/kg等価用量のLNA1)または40KPEG-Cys-SS-LNA1(化合物104,10mg/kg等価用量のLNA1)の1回用量で静脈注射した。血漿サンプルを治療から2及び4時間目に採取した。腫瘍組織を殺した動物から治療後の異なる時点で(2、4、12、24、48及び72時間目に)採取した。腫瘍または血漿サンプル中の均等物-LNA1オリゴヌクレオチドの濃度をELISAハイブリダイゼーションアッセイにより測定した。結果を図11(A)及び(B)に示す。
【０２４４】
これらの結果から、40KPEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートが裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較して血漿中を有意に多く循環し、腫瘍中に有意に多く蓄積することが判明した。PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートで治療したマウスの場合、裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較して治療後2及び4時間目の血漿中の循環LNAオリゴヌクレオチドの濃度は>50倍であった。PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートは裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較してより高い血漿濃度及びより長い循環時間を有していた。PEGコンジュゲートで治療したマウスの場合、裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較して24時間での腫瘍中のLNAオリゴヌチドの蓄積は3倍多かった。これらの結果は、40KPEGコンジュゲートが10KPEGコンジュゲートと比較して12時間目で>3.5倍の腫瘍蓄積を有し、72時間目まで≧1.5倍の蓄積を維持したことを示している。これらの結果は、より高い分子量のPEG(40KDa)コンジュゲートがより低い分子量のPEG(10KDa)PEGコンジュゲートよりもより多くの腫瘍蓄積を有していることを示した。
【０２４５】
実施例36
PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートのKB異種移植マウスモデルにおけるインビボ効果
PEG-LNAコンジュゲートの効果をKBヒト子宮頸癌移植したマウスにおいて評価した。KB細胞(類表皮腫,ヒト子宮頸癌細胞株)をヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が75mm3の平均体積に達したら、マウスを無作為にグループ分けし、10mg/kgの裸のLNA2または40KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物105,10mg/kg等価容量のLNA2)の1回用量でq3d×4で静脈注射した。腫瘍及び肝臓サンプルを最後の投与から24時間目に採取した。サンプル中のErbB3 mRNAダウンレギュレーションをqRT-PCRを用いて調べた。結果を図12に示す。
【０２４６】
これらの結果から、PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートが裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較して腫瘍におけるErbB3 mRNAの発現を大きく抑制したことが判明した。PEGコンジュゲートで治療したマウスは裸のLNAで治療したマウスよりもErbB3 mRNA発現を2倍多く抑制した。加えて、PEGコンジュゲートは、肝臓においてErbB3 mRNA発現を裸のLNAオリゴヌクレオチドによる88%と比較して92%抑制した。
【０２４７】
実施例37
PEG-Cs-SS-LNAコンジュゲートの15PC3異種移植マウスモデルにおけるインビボ効果
PEG-LNAコンジュゲートの効果を15PC3ヒト前立腺癌移植したマウスにおいて評価した。15PC3細胞(ヒト前立腺癌細胞株)をヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が75mm3の平均体積に達したら、マウスを無作為にグループ分けし、10mg/kgの裸のLNA2または40KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物105,10mg/kg等価用量のLNA2)の1回用量でq3d×4で静脈注射した。腫瘍及び肝臓サンプルを最後の投与から24時間目に採取した。サンプル中のErbB mRNAダウンレギュレーションをqRT-PCRを用いて調べた。結果を図13に示す。
【０２４８】
これらの結果から、PEG-Cys-SS-LNAコンジュゲートが裸のLNAオリゴヌクレオチドと比較して腫瘍におけるErbB3 mRNAの発現を大きく抑制したことが判明した。PEGコンジュゲートで治療したマウスは裸のLNAで治療したマウスと比較してErbB3 mRNA発現を2倍多く抑制した。加えて、PEGコンジュゲートは、肝臓におけるErbB3 mRNA発現を裸のLNAオリゴヌクレオチドによる73%と比較して83%抑制した。
【０２４９】
上記にてらして、本発明は有利には、オリゴヌクレオチドを哺乳動物中の腫瘍細胞に対
して送達するためにPEGコンジュゲートを使用する改良方法を提供し、これにより対応する裸のアンチセンス構築物と比較して循環時間は大きく延長し、インビボで腫瘍中のオリゴヌクレオチドの蓄積が増加し、腫瘍における癌遺伝子mRNA発現のダウンレギュレーションも高められる。
【０２５０】
本発明の1つの実施形態は、オリゴヌクレオチドを哺乳動物中の腫瘍細胞に対して送達するための改良方法を提供し、その方法は
(a)式:
【化３４】
2011520983.tif 000043
【０２５１】
(式中、
PEGはポリエチレングリコールであり;
Rbは
【化３５】
2011520983.tif 000044
【０２５２】
であり;
Oligoは約8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、化合物のポリマー部分は約40,000ダルトンの全数平均分子量を有している)
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を用意するステップ;及び
(b)前記化合物またはその製薬上許容される塩を腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して投与するステップ
を含む。
【０２５３】
本発明の関連実施形態は、哺乳動物における腫瘍遺伝子発現をインビボで抑制するため
の改良方法を提供し、その方法は、
(a)式:
【化３６】
2011520983.tif 000045
【０２５４】
(式中、
PEGはポリエチレングリコールであり;
Rbは
【化３７】
2011520983.tif 000046
【０２５５】
であり;
Oligoは約8〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、化合物のポリマー部分は約40,000ダルトンの全数平均分子量を有している)
を有する化合物またはその製薬上許容される塩を用意するステップ;及び
(b)前記化合物またはその塩を腫瘍細胞を有する哺乳動物に対して投与するステップ
を含み、前記投与により予選択した遺伝子の腫瘍細胞による発現を低下させる。
【０２５６】
予選択した遺伝子の発現の抑制はmRNA分子のアンチセンス標的化の結果であり、これによりmRNAのポリペプチドへの翻訳が減少または除去される。上記した方法の実施態様において、投与は哺乳動物の血流により、例えば静脈(i.v.)注射によりなされ得る。オリゴヌクレオチドはLNAを含む。オリゴヌクレオチドは-5'-(CH2)6-アンチセンス-サバイビンLNAオリゴヌクレオチドまたは-5'-(CH2)6-アンチセンス-ErbB3 LNAオリゴヌクレオチドを含む。
【図１】
2011520983.tif 000061
【図２】
2011520983.tif 000062
【図３】
2011520983.tif 000063
【図４】
2011520983.tif 000064
【図５】
2011520983.tif 000065
【図６】
2011520983.tif 000066
【図７】
2011520983.tif 000067
【図８】
2011520983.tif 000068
【図９】
2011520983.tif 000069
【図１０】
2011520983.tif 000070
【図１１】
2011520983.tif 000071
【図１２】
2011520983.tif 000072
【図１３】
2011520983.tif 000073
【配列表】
2011520983000001.app
【国際調査報告】
2011520983.tif 000074
2011520983.tif 000075
2011520983.tif 000076
2011520983.tif 000077