(57)【要約】  本発明は、細胞を再プログラムするための方法、組成物、およびキットに関する。１つの態様では、本発明は、細胞が多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発するための方法に関する。さらに別の態様では、この方法は、転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することを含む。さらに別の態様では、本発明は、ＥＳ様細胞の特徴を持つことができる再プログラムされた細胞、または再プログラムされた細胞の濃縮された集団に関し、これらは、分化型細胞へ再分化または分化転換することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を再プログラムするための方法であって、細胞を、制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させること、多能性遺伝子の発現を誘発すること、および細胞を選別すること、を含み、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される、方法。
【請求項２】
前記細胞の前記選別が、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへの接触の前および後に、前記細胞の表現型を比較すること、ならびに回復された潜在的分化能と一致する表現型を有する細胞を識別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選別された細胞を細胞の集団まで増大させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞の前記選別が、多能性遺伝子によってコードされるタンパク質または細胞表面マーカーに指向される抗体を用いて細胞を単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞表面マーカーが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ‐１‐６０、およびＴｒａ‐１‐８１から成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を選別する前に、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させる前の前記多能性遺伝子のクロマチン構造を、ｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させた後に得られたクロマチン構造と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
制御タンパク質をコードする前記遺伝子が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、リジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、リジンデメチラーゼ、サーチュイン、メチル結合ドメインタンパク質、ヒストンメチルトランスフェラーゼから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ‐４、Ｓｏｘ‐２、およびＮａｎｏｇから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞を再プログラムするための方法であって、第一の転写パターンを有する細胞を低分子阻害剤と接触させること、多能性遺伝子の発現を誘発すること；前記細胞の前記第一の転写パターンを前記阻害剤への接触後に得られた転写パターンと比較すること；および細胞を選別することを含み、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される、方法。
【請求項１０】
前記阻害剤への接触後の前記転写パターンが、胚性幹細胞から分析された遺伝子の転写パターンと少なくとも５０％の類似性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記転写パターンを比較する前に、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへの接触の前後での前記細胞の表現型が比較される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記選別された細胞を細胞の集団まで増大させることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の選別が、多能性遺伝子から発現されるタンパク質または多能性マーカーに指向される抗体を用いて細胞を単離することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の選別が、レポーター分子または選別可能マーカーに対する耐性を用いて細胞を単離することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ‐４、Ｓｏｘ‐２、およびＮａｎｏｇから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
細胞を、制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させる工程；多能性遺伝子の発現を誘発する工程、および細胞を選別する工程を含み、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される方法に従って作製された再プログラムされた細胞の濃縮された集団。
【請求項１７】
前記再プログラムされた細胞が、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ‐１‐６０、およびＴｒａ‐１‐８１から成る群より選択される細胞表面マーカーを発現する、請求項１６に記載の再プログラムされた細胞の濃縮された集団。
【請求項１８】
前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ‐２から成る群より選択される、請求項１６に記載の再プログラムされた細胞の濃縮された集団。
【請求項１９】
前記再プログラムされた細胞が前記集団の少なくとも６０％を占める、請求項１６に記載の再プログラムされた細胞の濃縮された集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連特許出願の相互参照］
本願は、２００５年８月１日に出願された米国特許仮出願第６０／７０４，４６５号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて主張し、ならびに２００８年４月７日に出願された米国特許仮出願第６１／０４２，８９０号；２００８年４月７日に出願された米国特許仮出願第６１／０４３，０６６号；２００８年４月７日に出願された米国特許仮出願第６１／０４２，９９５号；および２００８年１１月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／１１３，９７１号の利益も米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて主張する、２００６年８月１日出願の米国特許出願第１１／４９７，０６４号の一部継続出願であり、これらの出願の各々は、その全文が記載されているかのごとく、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［技術分野］
本発明の態様は、細胞生物学、幹細胞、細胞分化、体細胞核移植、および細胞治療学に関する。より詳細には、本発明の態様は、細胞の再プログラミングおよび細胞治療学のための方法、組成物、ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
再生医療は、ヒトの多くの病気に対する治療法として非常に有望であるが、同時に現代科学の研究が遭遇した最も困難な技術的課題のうちのいくつかを伴ってもいる。再生医療に対する技術的課題としては、低いクローン化効率、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）である可能性のある組織の少ない供給、ならびに、細胞分化を制御する方法、および選択された治療法に対して用いることができる胚性幹細胞の種類に関する知識の全般的な不足、が挙げられる。ＥＳ細胞は非常に高い適応性を有するものの、未分化ＥＳ細胞は、様々な組織型を含むテラトーマ（良性腫瘍）を形成し得る。さらに、１つのソースから別のソースへのＥＳ細胞の移植を行う場合、新しい細胞の拒絶を予防するために薬物を投与する必要のある可能性がある。
【０００４】
胎児由来ではない組織から幹細胞を作り出すための新たな手段を見出す試みが行われてきた。１つの手法は、自己成人幹細胞の操作を含む。再生医療に自己成人幹細胞を用いることは、それらが誘導された同一の患者へ戻され、従って免疫性拒絶を起こしにくいという事実に利点がある。欠点は、このような細胞がＥＳ細胞の適応性および多能性に欠けるために、その潜在能が不確定であることである。別の手法は、成人組織からの体細胞を再プログラムして多能性ＥＳ様細胞を作り出すことを目的とするものである。しかし、多細胞生物内の各細胞型が、細胞が分化するかまたは細胞周期からはずれると固定されると考えられる特有のエピジェネティックサイン（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を有することから、この手法は困難である。
【０００５】
細胞ＤＮＡはクロマチンの形態で存在することが一般的であり、これは、核酸およびタンパク質を含む複合体である。実際には、ほとんどの細胞ＲＮＡ分子も核タンパク質複合体の形態で存在している。クロマチンの核タンパク質構造は、当業者に公知であるように、広く研究されてきているテーマである。一般に、染色体ＤＮＡはヌクレオソーム内にパッケージされる。ヌクレオソームはコアおよびリンカーを含む。ヌクレオソームのコアはコアヒストンの八量体（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４が２つずつ）を含み、その周りにおよそ１５０塩基対の染色体ＤＮＡが巻きついている。さらに、およそ５０塩基対のリンカーＤＮＡセグメントが、リンカーヒストンＨ１と会合する。ヌクレオソームは組織化されて高次のクロマチン繊維となり、クロマチン繊維が組織化されて染色体となる。例えば、Ｗｏｌｆｆｅ“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”３ｒｄ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８を参照されたい。
【０００６】
クロマチン構造は固定的なものではなく、集合的にクロマチンリモデリングとして知られるプロセスによる修飾を受けやすい。クロマチンリモデリングは、例えば、ＤＮＡ領域からのヌクレオソームの除去、あるＤＮＡ領域から別の領域へのヌクレオソームの移動、ヌクレオソーム間のスペーシングの変化、または染色体内のＤＮＡ領域へのヌクレオソームの付加といった機能を果たし得る。クロマチンリモデリングはまた、高次構造の変化ももたらし、それによって転写活性クロマチン（オープンクロマチン（ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）またはユークロマチン）と転写不活性クロマチン（クローズドクロマチン（ｃｌｏｓｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）またはヘテロクロマチン）との間のバランスに影響を与え得る。
【０００７】
染色体タンパク質は、数多くの種類の化学修飾を受けやすい。これらのコアヒストンの翻訳後修飾の１つの機構は、保存高塩基性Ｎ末端リジン残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｂａｓｉｃ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）のイプシロン‐アミノ基の可逆的アセチル化である。ヒストンアセチル化の定常状態は、競合する１もしくは複数のヒストンアセチルトランスフェラーゼと、本明細書にてＨＤＡＣと称する１もしくは複数のヒストンデアセチラーゼとの間の動的平衡によって確立される。ヒストンのアセチル化および脱アセチル化は、かなり以前から転写制御と関連付けられている。ヒストンの可逆的アセチル化は、クロマチンのリモデリングをもたらす可能性があり、それ自体は遺伝子転写に対する制御機構として作用し得る。一般に、ヒストンの過剰アセチル化は遺伝子発現を促進し、一方ヒストンの脱アセチル化は転写抑制と相関している。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは転写共役因子として作用することが示され、一方デアセチラーゼは転写抑制経路に属することが見出された。
【０００８】
ヒストンのアセチル化と脱アセチル化との間の動的平衡は、正常な細胞成長に不可欠である。ヒストンの脱アセチル化を阻害すると、細胞周期停止、細胞分化、アポトーシス、および形質転換された表現型の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が発生する。
【０００９】
遺伝子発現の制御に関与する別のグループのタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）であり、これは、転写サイレンシングを誘発するゲノムメチル化パターンの発生を担っている。ＤＮＡメチル化は、胚発生、Ｘ染色体不活性化、ゲノムインプリンティング、および遺伝子発現の制御を含む哺乳類の多くのプロセスの中心を成している。哺乳類におけるＤＮＡメチル化は、Ｓ‐アデノシル‐メチオニンからシトシンのＣ５位へのメチル基の転移によって行われる。この反応はＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒され、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに特異的である。ヒトゲノムにおけるＣｐＧジヌクレオチド中の全シトシンの７０パーセントがメチル化されていて脱アミノ化を起こしやすく、その結果シトシンがチミンへ遷移する。このプロセスにより、グアニンおよびシトシンの頻度が全体として全ヌクレオチドの約４０％まで低下し、さらにＣｐＧジヌクレオチドの頻度が想定される頻度の約４分の１まで低下する。
【００１０】
哺乳類には４種類の活性なＤＮＡメチルトランスフェラーゼが識別されており：ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｂである。さらに、ＤＮＭＴ３Ｌは、ＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂと構造的に密接に関連し、ＤＮＡメチル化に不可欠であるタンパク質であるが、それ単独では不活性であると思われる。ＣｐＧアイランドを含むプロモーター領域におけるシトシンのメチル化は、脊椎動物細胞における下流コード配列の転写不活性化を引き起こす。
【００１１】
メチル化ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ１から４）として知られるタンパク質のファミリーは、メチル化を介する転写サイレンシングにおいて重要な役割を担っていると考えられる。ＭｅＣＰ２は、このファミリーで最初に同定されたメンバーであり、メチル化ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）および転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）を含有し、これは、メチル化ＤＮＡとの相互作用を促進し、およびＳｉｎ３Ａ／ＨＤＡＣ複合体をメチル化ＤＮＡへ標的化する。ＭｅＣＰ２と同様に、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、およびＭＢＤ３は、強力な転写抑制因子であることが示されている。ＭＢＤ４はＤＮＡグリコシラーゼであり、Ｇ：Ｔミスマッチを修復する。このファミリーの各メンバーは、ＭＢＤ３を除いて、哺乳類細胞内にてメチル化ＤＮＡと複合体を形成し、ＭＢＤ１およびＭＢＤ４以外はすべて、公知のクロマチンリモデリング複合体中に配置される。Ｍｉ‐２複合体などのいくつかのタンパク質およびタンパク質複合体は、ＤＮＡメチル化をクロマチンリモデリングおよびヒストン脱アセチル化に連結させる。
【００１２】
エピジェネティック制御に関与するタンパク質の別のグループは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）であり、これは、補助因子Ｓ‐アデノシルメチオニンからヒストンタンパク質のリジンおよびアルギニン残基への１から３個のメチル基の転移を触媒する酵素、ヒストン‐リジンＮ‐メチルトランスフェラーゼおよびヒストン‐アルギニンＮ‐メチルトランスフェラーゼである。メチル化ヒストンは、ＤＮＡとより強く結合し、転写を阻害する。
【００１３】
クロマチンの構造は、クロマチンリモデリング複合体として知られる巨大分子集合体の作用を通しても変化し得る。例えば、Ｃａｉｒｎｓ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：２０  ２５；Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５４５  ５７９；Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．１３：２３３９  ２３５２およびＭｕｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１８５  １９７を参照されたい。クロマチンリモデリング複合体は、ヌクレオソームアレイの分裂および再編成に関与しており、転写、ＤＮＡ複製、およびＤＮＡ修復の調節をもたらす（Ｂｏｃｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７（３）：１０３８  ４３）。これらのクロマチンリモデリング複合体の多くはサブユニット組成が異なるが、リモデリング活性はすべてＡＴＰアーゼに依存している。インビボにおける遺伝子活性化に対するクロマチンリモデリング複合体の活性についての必要条件の例もいくつか存在する。
【００１４】
多能性または全能性細胞の分化し特殊化した表現型への発達は、発達の過程で発現される特定の遺伝子セットによって特定される。遺伝子発現は、正または負の制御を行うことができる遺伝子制御タンパク質の配列特異的結合によって直接媒介される。しかし、これらのいずれの制御タンパク質についても、遺伝子発現を直接媒介するその能力は、少なくとも部分的には、細胞ＤＮＡ中にある結合部位への接近のしやすさに依存する。上記で考察したように、細胞ＤＮＡ中の配列への接近のしやすさは、内部に細胞ＤＮＡがパッケージされている細胞クロマチンの構造に依存する場合が多い。
【００１５】
従って、転写の抑制に関与する遺伝子の活性、発現、または活性と発現の両方を阻害することができる方法、組成物、およびキットを含む多能性のために必要である遺伝子の発現を誘発することができる方法、組成物、およびキットを識別することは有用であろう。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、細胞の再プログラミングのための方法、組成物、およびキットに関する。本発明の態様は、多能性または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）遺伝子の発現を誘発することを含む方法に関する。さらに別の態様では、本発明はさらに、再プログラムされた細胞を作製することを含む方法に関する。なおさらに別の態様では、本発明は、転写抑制に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む方法に関する。この方法は、多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発すること、および細胞を再プログラムすることをさらに含む。
【００１７】
本発明の態様は、細胞、細胞の集団、細胞培養物、細胞培養物からの細胞のサブセット、均一細胞培養物、または不均一細胞培養物を、転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を妨害する剤と接触させること、多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発すること、および細胞を再プログラムすること、を含む、細胞を再プログラムするための方法にも関する。この方法はさらに、再プログラムされた細胞を再分化させることも含む。
【００１８】
転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を妨害する剤としては、これらに限定されないが、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡｍｉｒ分子、ｓｈＲＮＡ分子の組み合わせ、ｓｈＲＮＡｍｉｒ分子の組み合わせ、ならびにｓｈＲＮＡ分子およびｓｈＲＮＡｍｉｒ分子の組み合わせ、が挙げられる。
【００１９】
転写抑制に関与するタンパク質をコードするいずれの遺伝子も、本発明の方法によって阻害することができ、そのような遺伝子としては、これらに限定されないが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、リジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、リジンデメチラーゼ、サーチュイン、サーチュイン活性化因子、メチル結合ドメインタンパク質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成成分、ＮｕＲＤ複合体の構成成分、およびＩＮＯ８０複合体の構成成分、をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の方法によって単一の遺伝子または２個以上の遺伝子を阻害することができ、これらに限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、および５０個超を含む数の遺伝子を阻害することができる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトに細胞を接触させること、多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発すること；および細胞を選別すること、を含む再プログラミングのための方法に関し、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトに第一の表現型を有する細胞を接触させること；この細胞の第一の表現型を、前記のｓｈＲＮＡコンストラクトに細胞を接触後に得られた表現型と比較すること、および再プログラムされた細胞を選別すること、を含む方法に関する。さらに別の態様では、この方法は、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへ細胞を接触させる前の細胞の遺伝子型を、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへ前記細胞を接触させた後に得られた細胞の遺伝子型と比較することを含む。なお、さらに別の態様では、この方法は、ｓｈＲＮＡコンストラクトへ細胞を接触させる前の細胞の表現型および遺伝子型を、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへ細胞を接触させた後の細胞の表現型および遺伝子型と比較することを含む。
【００２２】
さらに別の態様では、この方法は、選別された細胞を培養または増大して細胞の集団とすることを含む。さらに別の態様では、この方法は、多能性もしくは多分化能性遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体、またはＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ‐１‐６０、およびＴｒａ‐１‐８１を含むがこれらに限定されない多分化能性マーカーもしくは多能性マーカーと結合する抗体を用いて細胞を単離することを含む。細胞はまた、細胞の単離に有効であるいかなる方法を用いて単離してもよく、これらに限定されないが、蛍光励起セルソーター、免疫組織化学的検査、およびＥＬＩＳＡが挙げられる。別の態様では、この方法は、元々の細胞よりも分化状態が低い細胞を選別することを含む。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、前記のｓｈＲＮＡコンストラクトに接触させる前の多能性または多分化能性遺伝子のクロマチン構造を、前記の剤に接触させた後に得られたクロマチン構造と比較することをさらに含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、第一の転写パターンを有する細胞をｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させること；多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発すること；細胞の第一の転写パターンを、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトへの接触後に得られた転写パターンと比較すること、および細胞を選別すること、を含む細胞を再プログラムするための方法に関し、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される。
【００２５】
さらに別の態様では、細胞の選別は、胚性幹細胞の分析された転写パターンに対する類似性が少なくとも５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９４％、９５％、または９５〜９９％である転写パターンを有する細胞を識別することを含む。胚性幹細胞の転写パターン全体を比較してもよいが、その必要はない。その代わりに、胚性遺伝子のサブセットを比較してよく、その数としてはこれらに限定されないが、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜５，０００、５，０００〜１０，０００、および１０，０００超の遺伝子が挙げられる。転写パターンは、２元型の比較を行ってよく、すなわち、この比較によって遺伝子が転写されるのか転写されないのかを判定する。別の態様では、各遺伝子もしくは遺伝子のサブセットの転写の割合および／または程度を比較してよい。転写パターンの測定は、本技術分野にて公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、これらに限定されないが、ＲＴ‐ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ、サザンブロット、およびハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００２６】
さらに別の態様では、少なくとも１つのｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒ配列を用いて、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、メチル結合ドメインタンパク質、またはヒストンメチルトランスフェラーゼの発現を阻害することができる。なおさらに別の態様では、２つ以上のｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒを用いて、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、メチル結合ドメインタンパク質、またはヒストンメチルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない転写抑制に関与する２つ以上のタンパク質の発現を阻害することができる。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、第一の制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトへの細胞の接触；第二の制御タンパク質の活性、発現、または発現および活性を阻害する第二の剤への前記細胞の接触であって、ここで、前記第二の制御タンパク質は、第一の制御タンパク質とは異なる機能を有する、接触、多能性または多分化能性遺伝子の発現の誘発、および細胞の選別、を含む、細胞を再プログラムするための方法に関し、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される。別の態様では、細胞または細胞の集団を、第一および第二の剤へ同時にまたは順次に接触させてよい。第二の剤としては、これらに限定されないが、小分子、小分子阻害剤、小分子活性化剤、核酸配列、およびｓｈＲＮＡコンストラクトが挙げられる。
【００２８】
本発明の態様はまた、本明細書にて開示される方法に従って作製された再プログラムされた細胞を用いて種々の疾患を治療するための方法も含む。さらに別の態様では、本発明はまた、再プログラムされた細胞、および再分化された再プログラムされた細胞の治療的使用にも関する。
【００２９】
本発明の態様はまた、細胞の再プログラミングに関与する遺伝子をスクリーニングすることを含む方法にも関する。さらに別の態様では、この方法は、転写を阻害するタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることをさらに含む。なおさらに別の態様では、この方法は、細胞が多能性または多分化能性であることに寄与する遺伝子をスクリーニングすることを含む。このスクリーニングは、ｓｈＲＮＡライブラリまたはｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリを含むがこれらに限定されない適切なスクリーニング試薬を用いて実施することができる。
【００３０】
本発明の態様はまた、本発明の方法によって作製された再プログラムされた細胞にも関する。再プログラムされた細胞は、単一の系列または２種類以上の系列へ再分化することができる。再プログラムされた細胞は、多分化能性または多能性であってよい。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発するｓｈＲＮＡコンストラクトへ細胞を接触させる工程；および細胞を選別する工程であって、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される、工程、および前記の選別された細胞を培養して細胞の集団を作製する工程、を含む方法に従って作製された再プログラムされた細胞の濃縮された集団に関する。さらに別の態様では、再プログラムされた細胞は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ‐１‐６０、およびＴｒａ‐１‐８１から成る群より選択される細胞表面マーカーを発現する。さらに別の態様では、再プログラムされた細胞は、Ｏｃｔ‐３／４、Ｓｏｘ‐２、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ４を含むがこれらに限定されない多能性または多分化能性遺伝子からのタンパク質の発現を通して選別することができる。さらに別の態様では、再プログラムされた細胞は、濃縮された細胞の集団の少なくとも５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９６〜９８％、または少なくとも９９％を占める。
【００３２】
本発明の態様はまた、本発明の方法および組成物を作製するためのキットにも関する。このキットは、中でも、細胞の再プログラミング、ならびにＥＳ様細胞および幹細胞様細胞の作製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。図１Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ｈＥＳ培地中にて培養した細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ  ｂｏｄｙ）の写真である。図２Ｂは、図２Ａに示す胚様体内に存在する細胞内におけるＧＦＰ局在化を示す写真であり、レンチウィルス感染が確認される。図２Ｃは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体の写真である。図２Ｄは、図２Ｃに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＳｏｘ２タンパク質の発現を示す写真である。図２Ｅは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体の写真である。図２Ｆは、図２Ｅに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＯｃｔ４タンパク質の発現を示す写真である。図２Ｇは、培養によって成長する線維芽細胞の写真である。図２Ｈは、図２Ｇに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＳＳＥＡ４タンパク質の発現を示す写真である。
【図３】図３Ａは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。図３Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ピューロマイシンの存在下で培養したヒト胎児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。図３Ｃは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ピューロマイシンおよびｈＥＳ培地の存在下で培養したヒト胎児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト新生児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。図４Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ピューロマイシンの存在下で培養したヒト新生児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。図４Ｃは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ピューロマイシンおよびｈＥＳ培地の存在下で培養したヒト新生児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４の発現の増加とＤＮＭＴ１の発現の減少を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト成人皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。図５Ｂは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト新生児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。図５Ｃは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト胎児皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ‐４  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト成人皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。図６Ｂは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト新生児皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。図６Ｃは、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡの存在下、ヒト胎児皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現の増加を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、ヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｃは、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｄは、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｅは、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｆは、ＨＤＡＣ１１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図７Ｇは、ヒト胚性幹細胞の写真である。
【図８】図８Ａは、ヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｃは、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｄは、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｅは、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｆは、ＨＤＡＣ１１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞の写真である。図８Ｇは、ヒト胚性幹細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［定義］
本開示における数字の範囲はおおよそのものであり、従って、特に断りのない限り、その範囲外の数値も含む。数字の範囲は、低い方の値から高い方の値までの１単位ずつの値を、これらの値自体と共にすべて含むが、ただし、いずれかの低い方の値およびいずれかの高い方の値の間が少なくとも２単位分離れていることが条件である。例えば、分子量、粘度などを例とする、組成、物理的、またはその他の性質が１００から１０００である場合、１００、１０１、１０２などの個々の値すべて、ならびに１００から１４４、１５５から１７０、１９７から２００などのサブ範囲が明確に挙げられることを意図している。１未満の値を含む範囲、または１より大きい小数（例：１．１、１．５など）を含む範囲の場合、１単位は適宜０．０００１、０．００１、０．０１、または０．１と見なされる。１０未満の一桁の数字を含む範囲の場合（例：１から５）、１単位は通常０．１と見なされる。これらは具体的に意図されているものの例に過ぎず、列挙される最小値と最大値との間の数値のすべての可能な組み合わせが、本開示の中で明確に述べられていると見なされるべきである。本開示内の数値の範囲は、中でも、混合物中の成分の相対量、ならびに方法において列挙される種々の温度およびその他のパラメータの範囲に対して提供される。
【００３５】
特にそれに反する限定がされていない限りにおいて、「細胞」または「複数の細胞」は、いずれの体細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成人幹細胞、臓器特異的幹細胞、核移植（ＮＴ）ユニット（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｎｉｔｓ）、および幹様細胞をも含む。１もしくは複数の細胞は、いずれの臓器または組織から入手してもよい。１もしくは複数の細胞は、ヒトのものでもその他の動物のものであってもよい。例えば、細胞は、マウス、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどのものであってよい。細胞はまた、非ヒト霊長類由来であってもよい。
【００３６】
「培地」または「成長培地」とは、細胞の成長を支援する能力を有する適切な媒体を意味する。
【００３７】
「分化」とは、胚発生の過程で細胞が構造的および機能的に特殊化するプロセスを意味する。
【００３８】
「ＤＮＡメチル化」とは、シトシンへのメチル基（−ＣＨ３基）の結合を意味する。これは、外来ＤＮＡを破壊するために産生された酵素および化学物質から自己ＤＮＡを保護するための方法として、ならびにＤＮＡ内の遺伝子の転写を制御するための方法として、日々行なわれているものである。
【００３９】
「エピジェネティックス」とは、ヌクレオチド配列の変化を伴わない機能の遺伝性変化に関するＤＮＡの状態を意味する。エピジェネティック変化は、メチル化および脱メチル化によるものなどのＤＮＡの修飾により、ＤＮＡのヌクレオチド配列がまったく変化しない状態で引き起こすことができる。
【００４０】
「ヒストン」とは、核内に収まるようにＤＮＡを十分に小さくする役目を担う、染色体中に見られるタンパク質分子のクラスを意味する。
【００４１】
「遺伝子の発現を阻害または干渉する」とは、遺伝子の発現を低下させることを意味する。ある態様では、遺伝子発現のこのような低下は、少なくとも約５〜２５％であり、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、そしてなおさらにより好ましくは少なくとも約９０％である。他の態様では、遺伝子発現は少なくとも９５％低下され、さらに別の態様では、遺伝子発現は少なくとも９９％低下される。
【００４２】
「ノックダウン」とは、遺伝子特異的な形で遺伝子の発現を抑制することを意味する。１もしくは２つ以上の「ノックダウン」遺伝子を有する細胞は、ノックダウン生物、または単に「ノックダウン」と称される。
【００４３】
「多能性」とは、三胚葉性の細胞型または一次組織型に分化する能力を有することを意味する。
【００４４】
「多能性遺伝子」とは、細胞が多能性であることに寄与する遺伝子を意味する。
【００４５】
「多能性細胞培養物」は、胎児または成人由来の分化した細胞と明らかに区別されるモルフォロジーを提示する場合、「実質的に未分化」であると考えられる。多能性細胞は、通常、高い核／細胞質比、明瞭な核小体、および認識し難い細胞結合を持つコンパクトなコロニー形成を有し、当業者によって容易に識別される。未分化細胞のコロニーは、分化された隣接する細胞によって囲まれている場合があることが分かっている。しかしながら、適切な条件下で培養すると、実質的に未分化であるコロニーは存続し、未分化細胞は、培養細胞の分割後に増殖する細胞の突出した割合を構成する。本開示で述べる有用な細胞集団には、これらの基準を持つ実質的に未分化である多能性細胞がいかなる割合で含まれていてもよい。実質的に未分化である細胞培養物は、少なくとも約２０％、４０％、６０％、またはさらには８０％の未分化多能性細胞を含んでいてよい（集団中の全細胞に対するパーセントで）。
【００４６】
「制御タンパク質」とは、正および負の方向の制御を含む、生物学的プロセスを制御するいずれのタンパク質をも意味する。制御タンパク質は、生物学的プロセスに対して直接または間接的な影響を有していてよく、直接に、または複合体内での関与を通して影響を及ぼしてよい。
【００４７】
「再プログラミング」とは、核内のエピジェネティック標識を除去し、続いて異なるセットのエピジェネティック標識を確立することを意味する。多細胞生物の発生の過程では、異なる細胞および組織が、遺伝子発現の異なるプログラムを獲得する。このような独特の遺伝子発現パターンは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、およびその他のクロマチン結合タンパク質などのエピジェネティック修飾によって実質的に制御されると考えられる。従って、多細胞生物内の各細胞型は、細胞が分化するかまたは細胞周期からはずれると「固定」されて不変となると従来から考えられている特有のエピジェネティックサインを有する。しかし、細胞の中には、正常な発生または特定の疾患状況の過程で、重要なエピジェネティック「再プログラミング」を起こすものもある。
【００４８】
「全能性」とは、完全な胚または臓器へ発生する能力を有することを意味する。
【００４９】
本発明の態様は、細胞が多能性または多分化能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発することを含む方法に関する。別の態様では、本発明は、細胞が多分化能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発することを含む方法に関する。ある態様では、この方法は、細胞が多能性または多分化能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発すること、および多能性または多分化能性であり、複数の系列への指向された分化を行う能力を有する再プログラムされた細胞を作製することを含む。
【００５０】
本発明の態様はさらに、クロマチン構造を修飾すること、および細胞を再プログラムして多能性または多分化能性とすることを含む方法にも関する。さらに別の態様では、クロマチン構造の修飾は、抑制複合体（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む。
【００５１】
別の態様では、この方法は、転写抑制に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害すること、および細胞が多能性または多分化能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発することを含む。さらに別の態様では、この方法は、転写抑制に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害すること、および再プログラムされた細胞を作製することを含む。本発明の方法は、いずれの種類の抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現も阻害することができ、これらに限定されないが、活性抑制因子（ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）、基礎転写装置を修飾する抑制因子、構造を修飾して抑制因子を補充するタンパク質、抑制因子を補充するタンパク質、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を修飾するタンパク質、ヒストンを修飾するタンパク質、ＤＮＡを修飾するタンパク質、およびクロマチンリモデリング複合体に関与するタンパク質が挙げられる。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は：制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトに細胞を接触させること、多能性または多分化能性遺伝子の発現を誘発すること；および細胞を選別することを含む細胞を再プログラムするための方法に関し、ここで、前記細胞の潜在的分化能が回復される。多能性または多分化能性遺伝子の発現の誘発はいかなる倍率での増加であってもよく、これらに限定されないが、０．２５〜０．５、０．５〜１、１．０〜２．５、２．５〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００倍、および５００倍超が挙げられる。別の態様では、この方法は、分化した細胞を播種すること、制御タンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトに前記分化した細胞を接触させること、前記細胞を培養すること、および再プログラムされた細胞を識別することを含む。制御タンパク質の発現のｓｈＲＮＡコンストラクトによる干渉はいかなる量であってもよく、これらに限定されないが、１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、および９５〜９９％、９９〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、および５００％超が挙げられる。
【００５３】
さらに別の態様では、この方法は多能性もしくは多分化能性遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質の断片、または、多能性もしくは多分化能性表面マーカーに対して指向される抗体を用いて細胞を選別することをさらに含む。いかなる種類の抗体を用いてもよく、これらに限定されないが、モノクローナル、ポリクローナル、抗体の断片、ペプチド模倣体、活性領域に対する抗体、およびタンパク質の保存領域に対する抗体が挙げられる。さらに別の態様では、この方法は、細胞を選別すること、および前記細胞を増大または培養して多能性細胞培養物または多分化能性細胞培養物とすることを含む。
【００５４】
さらに別の態様では、この方法は、多能性もしくは多分化能性遺伝子または多能性もしくは多分化能性表面マーカーによって動かされるレポーターを用いて細胞を選別することをさらに含む。いかなる種類のレポーターを用いてもよく、これらに限定されないが、蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、細菌ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ａｅｑｕｏｒｉｎ）、高感度緑色蛍光タンパク質、ターボＧＦＰ（ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｄｓＲＥＤ、β‐ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが挙げられる。
【００５５】
さらに別の態様では、この方法は、選択可能なマーカーとして耐性を用いて細胞を選別することをさらに含み、これらに限定されないが、抗生物質、殺真菌剤、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンキナーゼに対する耐性、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）、Ｇ４１８耐性、ミコフェノール酸耐性（ｇｐｔ）、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性タンパク質、およびストレプトマイシンが挙げられる。
【００５６】
さらに別の態様では、この方法は、細胞の多能性もしくは多分化能性遺伝子のクロマチン構造を、前記細胞をｓｈＲＮＡコンストラクトへ接触させる前のそれと、前記ｓｈＲＮＡコンストラクトで処理した後に得られた多能性もしくは多分化能性遺伝子のクロマチン構造と比較することをさらに含む。クロマチン構造のいずれの側面を比較してもよく、これらに限定されないが、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンもしくはヒストン成分の存在および非存在、ヒストンの位置、ヒストンの配置、ならびにクロマチンに関連する制御タンパク質の存在もしくは非存在が挙げられる。遺伝子のいずれの領域のクロマチン構造を比較してもよく、これらに限定されないが、エンハンサーエレメント、アクチベーターエレメント（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位の上流領域、転写開始部位の下流領域、エクソン、およびイントロンが挙げられる。
【００５７】
転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害は、適切ないかなる機構によって達成されてもよく、これに限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる。ＲＮＡｉは、配列特異的な形での標的ｍＲＮＡの分解による広範な機構を介して遺伝子の発現を制御する。低分子干渉ＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ）がＲＮＡｉプロセスの基礎となるものであり、これは、標的ＲＮＡ鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。特定のＲＮＡｉ経路タンパク質が、ｓｉＲＮＡによって標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと誘導され、ここで、この標的を「開裂」させ、タンパク質への翻訳が不可能である小部分へ分解する。
【００５８】
さらに別の態様では、この方法は、細胞を低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と接触させること、および転写抑制に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む。さらに別の態様では、この方法は、再プログラムされた細胞を作製することをさらに含む。再プログラムされた細胞は、多能性もしくは多分化能性であってよい。
【００５９】
ｓｈＲＮＡは、遺伝子発現のサイレンシングに用いることができる急なヘアピン型の折り返しを形成するＲＮＡの配列であり；ｓｈＲＮＡの使用は、ＲＮＡ干渉を達成するための１つの手法である。ある態様では、ｓｈＲＮＡは、Ｕ６プロモーターが挙げられるがこれに限定されないプロモーターを有するベクターへ組み込み、確実にｓｈＲＮＡを発現させることができる。ベクターは通常、娘細胞へと伝えられ、それによって遺伝子サイレンシングが受け継がれることが可能となる。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、細胞装置によって低分子干渉ＲＮＡへと開裂され、これは次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ結合される。この複合体は、それに結合したｓｉＲＮＡとマッチするｍＲＮＡと結合し、これを開裂する。
【００６０】
ｓｈＲＮＡは、レンチウィルスコンストラクトに組み込むことができる。レンチウィルスは、レトロウィルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのスローウィルスの属であり、長い潜伏期間を特徴とする。レンチウィルスは、宿主細胞のＤＮＡへ多大な量の遺伝子情報を送達することができ、従って、遺伝子送達ベクターの効率的な方法である。
【００６１】
別の態様では、ｓｈＲＮＡライブラリを本発明の方法と共に用いて、転写抑制に関与する因子、クロマチンリモデリングに関与する因子、および細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与する因子を識別することができる。さらに別の態様では、ｓｈＲＮＡライブラリは、ＲＮＡｉコンソーシアム（Ｔｈｅ  ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ＴＲＣ）からのものであってよく、これは、そのミッションが機能ゲノミクス研究のための包括的なツールを創出してそれを世界中の科学者に対して広く利用可能とすることである、世界的な１１の学術および企業ライフサイエンス研究グループが集まった共同研究グループである。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＭＩＴ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄで開発されたＴＲＣの現時点でのコレクションは、１６，０００のアノテートされたヒト遺伝子を標的とする予めクローン化された１５９，０００のｓｈＲＮＡコンストラクトから構成されている。
【００６２】
ｓｈＲＮＡコンストラクト、ライブラリ、およびベクターは、オーダーメイドのものであっても、または販売元から購入したものであってもよく、これらに限定されないが、ダーマコンＲＮＡｉテクノロジーズ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡｉ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（サーモサイエンティフィック，ラフィエット，コロラド州）より入手可能であるＳＭＡＲＴベクターｓｈＲＮＡレンチウィルステクノロジー、シグマアルドリッチ（セントルイス，ミズーリ州）より入手可能であるＭＩＳＳＩＯＮ（商標）ＴＲＣ  ｓｈＲＮＡ、オープンバイオシステムズ（ハンツビル，アラバマ州）より入手可能であるＴＲＣレンチウィルスｓｈＲＮＡライブラリ、構成的または誘導性プロモーター、種々の選択マーカー、およびウィルス送達オプションを特徴とする、レンチウィルスおよびアデノウィルスベクターと共に入手可能であるＢＬＯＣＫ‐ｉＴ（商標）ＲＮＡｉベクター（インビトロジェン，カールスバッド、カリフォルニア州）が挙げられる。
【００６３】
さらに、特定の標的に対して指向されるｓｈＲＮＡ分子も、オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ）（ロックビル，メリーランド州）およびサンタクルーズバイオテクノロジー（サンタクルーズ，カリフォルニア州）などの販売元から入手可能である。誘導性ｓｈＲＮＡも、クローンテック（マウンテンビュー，カリフォルニア州）から入手可能である。ノックアウト誘導性ＲＮＡｉ系は、哺乳類細胞中の機能性低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現を、標的遺伝子を抑制する目的で強く制御する。ノックアウト誘導性ＲＮＡｉ系は、遺伝子の抑制が致命的である可能性があり、その分析ができなくなる場合に有用である。次のようないくつかのバージョンが入手可能である：Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡｉ  ｓｙｓｔｅｍ、ならびにＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｔｅｔ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨおよびＰ。
【００６４】
別の態様では、この方法は、細胞をｓｈＲＮＡｍｉｒと接触させること、および転写抑制に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む。さらに別の態様では、この方法は、再プログラムされた細胞を作製することをさらに含む。再プログラムされた細胞は、多能性もしくは多分化能性であってよい。
【００６５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であり、遺伝子の発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされるが、タンパク質へは翻訳されず（非コードＲＮＡ）；その代わり、ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写物からｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡと称される低分子ステムループ構造へとプロセッシングされ、最後に機能性ｍｉＲＮＡとなる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は、１もしくは２つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に対して部分的に相補的であり、その主たる機能は、遺伝子の発現を下方制御することである。
【００６６】
哺乳類ＲＮＡｉのｓｈＲＮＡｍｉｒによる誘発は、内在性マイクロＲＮＡバイオジェネシス経路に関する現在の知識に基づいている。ｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクトは、自然のマイクロＲＮＡ一次転写物を模倣するように設計されており、それによって、内在性ＲＮＡｉ経路による特異的なプロセッシングが可能となり、効果的な遺伝子ノックダウンが作出される。ゲノム規模でのｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリには、遺伝子ノックダウンの効率性および特異性を高め、多様なＲＮＡｉアプリケーションに対するソリューションを提供することを目的とするいくつかの特徴が組み込まれている。
【００６７】
ｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリを、本発明の方法と共に用いることができる。さらに別の態様では、ｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリは、ＲＮＡｉコンソーシアム（ＴＲＣ）からのものであってよい。
【００６８】
ｓｈＲＮＡｍｉｒおよびｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリは、オーダーメイドのものであっても、または販売元から購入したものであってもよい。例えば、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒｅｓｔ（商標）マイクロＲＮＡ適合（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ａｄａｐｔｅｄ）ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリ）、レトロウィルスｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリ、レンチウィルスｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリ、ＴＲＩＰｚレンチウィルス誘導性ｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリ、ｐＳＭ２レトロウィルスｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリであり、これらはすべてオープンバイオシステムズ（ハンツビル，アラバマ州）より入手可能である。
【００６９】
別の態様では、本発明の方法は、細胞をｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡライブラリ、ｓｈＲＮＡｍｉｒ、ｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリ、またはｓｈＲＮＡコンストラクトの組み合わせと接触させること、転写抑制に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現または活性を阻害すること、ならびに阻害された前記遺伝子を識別することをさらに含む。
【００７０】
単一のｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒを用いて、単一の遺伝子の阻害を標的としてもよく、または２つ以上のｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒを用いて、単一の遺伝子の阻害を標的としてもよい。さらに別の態様では、単一のｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒを用いて、２つ以上の遺伝子の阻害を標的としてよい。なおさらに別の態様では、２つ以上のｓｈＲＮＡもしくは２つ以上のｓｈＲＮＡｍｉｒを用いて、２つ以上の遺伝子の阻害を標的としてよい。ｓｈＲＮＡコンストラクトおよびｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクトの混合物を用いてもよい。本発明の方法により、単一の遺伝子または２つ以上の遺伝子を阻害することができ、その数はこれらに限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、および５０超の遺伝子が挙げられる。
【００７１】
遺伝子発現の抑制に関与するタンパク質をコードするいずれの遺伝子も、本発明の方法によって阻害することができ、これらに限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ、メチル結合ドメインタンパク質、メチルアデノシルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、およびメチルサイクル酵素（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｃｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）、核内受容体、オーファン核内受容体、Ｅｓｒｒβ、およびＥｓｓＲγが挙げられる。本発明の方法によって阻害することができる代表的な遺伝子のリストを表Ｉに示す。
【００７２】
例えば、ＭｅＣＰ２を例とするメチル結合ドメインタンパク質は、メチル化シトシンと結合し、次にヒストンタンパク質を脱アセチル化するヒストンデアセチラーゼを補充し、その結果、凝縮クロマチン構造が得られ、これが転写を阻害する。本発明の方法は、抑制複合体中のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することができ、それによって、多能性遺伝子の転写を誘発することができる。
【００７３】
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【００７４】
例えば、ｓｈＲＮＡｍｉｒを用いてＭｅＣＰ２の発現を阻害し、それによって、ＨＤＡＣのクロマチン構造への補充を著しく低減させることができる。このことは、細胞が多能性もしくは多分化能性であるために不可欠である遺伝子の上方制御を引き起こし、それによって体細胞の分化能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を高めることができる。同様に、ｓｈＲＮＡｍｉｒを用いてＨＤＡＣを阻害することができ、このことは、同様に、多能性に不可欠である遺伝子の上方制御を引き起こす。さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対して指向されたｓｈＲＮＡｍｉｒ、メチル結合タンパク質に対して指向されたｓｈＲＮＡｍｉｒ、およびＨＤＡＣに対して指向されたｓｈＲＮＡｍｉｒを同時にまたは順次に用いて、抑制複合体中のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することができる。上記の考察は、説明の目的を意図するのみであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００７５】
クロマチンリモデリングに関与するその他の複合体中のタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の方法で阻害することができ、これらに限定されないが、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体、ＮｕＲＤ複合体、Ｍｉ‐２複合体、Ｓｉｎ３複合体、およびＩＮＯ８０が挙げられる。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、クロマチンへの接近のしやすさの制御において重要な役割を果たしていることが公知である多サブユニットタンパク質複合体である。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のいずれの成分も本発明の方法によって阻害することができ、これらに限定されないが、ＳＮＦ５／ＩＮＩ１、ＢＲＧ１、ＢＲＭ、ＢＡＦ１５５、およびＢＡＦ１７０が挙げられる。ＳＷＩ／ＳＮＦは、元々は、種々の遺伝子の活性化に要するものとして、酵母菌から識別された。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、いくつかの発生特異的である（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子発現プログラムの制御にとって極めて重要であることが示されている。
【００７６】
Ｓｉｎ３複合体のいずれの成分も本発明の方法によって阻害することができ、これらに限定されないが、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＲｂＡｐ４６、ＲｂＡｐ４８、Ｓｉｎ３Ａ、ＳＡＰ３０、およびＳＡＰ１８が挙げられる。
【００７７】
ＮｕＲＤ複合体のいずれの成分も本発明の方法によって阻害することができ、これらに限定されないが、Ｍｉ２、ｐ７０、およびｐ３２が挙げられる。
【００７８】
ＩＮＯ８０複合体のいずれの成分も本発明の方法によって阻害することができ、これらに限定されないが、Ｔｉｐ４９Ａ、Ｔｉｐ４９Ｂ、ＳＮＦ２ファミリーヘリカーゼＩｎｏ８０、アクチン関連タンパク質ＡＲＰ４、ＡＲＰ５、およびＡｒｐ８、ＹＥＡＴＳドメインファミリーメンバーＴａｆ１４、ＨＭＧ‐ドメインタンパク質、Ｎｈｐ１０、ならびにＩｅｓ１〜６と称するさらなる６つのタンパク質が挙げられる。
【００７９】
細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与する遺伝子の発現の誘発に用いることができるｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒ配列はいずれの数であってもよく、これらに限定されないが、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、および５０超のｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒ配列が挙げられる。
【００８０】
本発明の方法によって作製された再プログラムされた細胞は、多能性もしくは多分化能性であってよい。本発明の方法によって産生された再プログラムされた細胞は、胚性幹細胞様の性質を含む種々の異なる性質を有することができる。例えば、再プログラムされた細胞は、未分化の状態にて、少なくとも１０、１５、２０、３０、またはこれを超える継代数で増殖する能力を有し得る。他の形態では、再プログラムされた細胞は、分化することなく１年を超える間増殖することができる。再プログラムされた細胞は、増殖および／または分化を行う間、正常な核型を維持することもできる。ある再プログラムされた細胞は、未分化の状態でインビトロにて無限に増殖する能力を有する細胞であり得る。ある再プログラムされた細胞は、長期間の培養を通して正常な核型を維持することができる。ある再プログラムされた細胞は、長期間の培養後であっても、３つすべての胚性胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒｓ）（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体へと分化する潜在能を維持することができる。ある再プログラムされた細胞は、生物内のいずれの細胞型も形成することができる。ある再プログラムされた細胞は、未分化成長を維持しない培地上での成長など、特定の条件下にて胚様体を形成することができる。ある再プログラムされた細胞は、例えば、胚盤胞との融合を介してキメラを形成することができる。
【００８１】
再プログラムされた細胞は、種々のマーカーで同定することができる。例えば、ある再プログラムされた細胞は、アルカリホスファターゼを発現する。ある再プログラムされた細胞は、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ‐１‐６０、および／またはＴＲＡ‐１‐８１を発現する。ある再プログラムされた細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現する。ある再プログラムされた細胞は、これらをｍＲＮＡレベルで発現し、さらに別のものは、例えば細胞表面または細胞内部にて、これらのタンパク質レベルでの発現も行うことは理解される。
【００８２】
再プログラムされた細胞は、本明細書で考察する再プログラムされた細胞のいかなる性質、またはカテゴリー、または複数のカテゴリーおよび性質のいかなる組み合わせを有していてもよい。例えば、再プログラムされた細胞は、アルカリホスファターゼを発現することができるがＳＳＥＡ‐１は発現せず、少なくとも２０継代の間増殖することができ、いかなる細胞型へも分化する能力を持ち得る。例えば、別の再プログラムされた細胞は、細胞表面上でＳＳＥＡ‐１を発現することができ、内胚葉、中胚葉、および外胚葉組織を形成する能力を持ち得、分化することなく１年間を超えて培養することができる。
【００８３】
再プログラムされた細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性、ＳＳＥＡ‐１陽性、およびＳＳＥＡ‐４陰性であってよい。再プログラムされた細胞は、Ｎａｎｏｇ陽性、Ｓｏｘ２陽性、およびＯｃｔ‐４陽性であってもよい。再プログラムされた細胞は、Ｔｃｌ１陽性およびＴｂｘ３陽性であってもよい。再プログラムされた細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ陽性、ステラー（Ｓｔｅｌｌａｒ）陽性、Ｄａｚｌ陽性、またはフラジリス（Ｆｒａｇｉｌｉｓ）陽性であってもよい。再プログラムされた細胞は、モノクローナル抗体ＴＲＡ‐１‐６０（ＡＴＣＣ  ＨＢ‐４７８３）およびＴＲＡ‐１‐８１（ＡＴＣＣ  ＨＢ‐４７８４）の結合特異性を有する抗体と結合する細胞表面抗原を発現することができる。さらに、本明細書で開示されるように、再プログラムされた細胞は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０〜２５、２６〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００継代の間、または１年を超える間、支持細胞層なしに維持することができる。
【００８４】
再プログラムされた細胞は、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋、神経系細胞、造血細胞、膵島、または実質的に身体のいかなる細胞をも含む種々の系列の非常に様々な細胞型へ分化する潜在能を有することができる。再プログラムされた細胞は、１、２、３、４、５、６〜１０、１１〜２０、２１〜３０、および３０超の系列を含むいかなる数の系列へも分化する潜在能を有することができる。
【００８５】
細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与するいずれの遺伝子も、本発明の方法によって誘発することができ、これらに限定されないが、グリシンＮ‐メチルトランスフェラーゼ（Ｇｎｍｔ）、オクタマー‐４（Ｏｃｔ４）、Ｎａｎｏｇ、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）‐ボックス２（Ｓｏｘ２としても知られる）、Ｍｙｃ、ＲＥＸ‐１（Ｚｆｐ‐４２としても知られる）、インテグリンα‐６、Ｒｏｘ‐１、ＬＩＦ‐Ｒ、ＴＤＧＦ１（ＣＲＩＰＴＯ）、フラジリス、ＳＡＬＬ４（ｓａｌ‐様４（ｓａｌ‐ｌｉｋｅ  ４））、ＧＡＢＲＢ３、ＬＥＦＴＢ、ＮＲ６Ａ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＥＮ、白血球由来ケモタキシン１（ＬＥＣＴ１）、ＢＵＢ１、ならびにＫｌｆ４およびＫｌｆ５などのクルッペル様因子（Ｋｌｆ）が挙げられる。細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与するいずれの数の遺伝子も本発明の方法によって誘発することができ、これらに限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、および５０超の数の遺伝子が挙げられる。
【００８６】
さらに、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，５９７（２００２）），Ｉｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，６０１（２００２））、およびＦｏｒｔｕｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，３９３ｂ（２００３））は、各々、３種類の幹細胞を比較し、共通して発現された「幹細胞性」遺伝子のリストを明らかにして、これらが幹細胞への機能的特徴の付与に重要であることを提言した（上記で引用した文献はすべてその全体が参照することで組み入れられる）。上述の研究で識別されたいずれの遺伝子も、本発明の方法で誘発することができる。幹細胞への機能的特徴の付与に関与していると考えられる遺伝子のリストを表ＩＩに示す。表ＩＩに挙げた遺伝子に加えて、既知の遺伝子との相同性がほとんどもしくはまったくない９３の発現配列タグ（ＥＳＴ）クラスターも、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．およびＩｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．によって識別されており、これらは、本発明の方法の範囲内に含まれる。
【００８７】
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【００８８】
本発明の態様はまた、本明細書で開示される方法に従って作製された再プログラムされた細胞を用いた種々の疾患の治療方法も含む。当業者であれば、本明細書で提供される開示事項に基づいて、心疾患、糖尿病、皮膚疾患および皮膚移植、脊髄損傷、パーキンソン病、多発性硬化症、およびアルツハイマー病などを含むがこれらに限定されない非常に多くの疾患の治療において再生医療の持つ価値および可能性が理解されるであろう。本発明は、損傷を受けていない新しい細胞の導入が何らかの形での治療的軽減をもたらす場合に、疾患を治療するためにヒトを含む動物へ再プログラムされた細胞を投与するための方法を包含する。
【００８９】
当業者であれば、再プログラムされた細胞は、ニューロンを例とする再分化した細胞として動物へ投与することができ、動物中の疾患または損傷ニューロンとの置換に有用であることは容易に理解されるであろう。さらに、再プログラムされた細胞は、動物へ投与することができ、周囲環境からのシグナルおよび指令（ｃｕｅｓ）を受けると、近隣の細胞環境によって決定される所望の細胞型へと再分化することができる。別の選択肢として、この細胞はインビトロで再分化することができ、この分化細胞を、それを必要とする哺乳類へ投与することができる。
【００９０】
再プログラムされた細胞は、移植用に作製して、インビボ環境中で長期間生存することを確実にすることができる。例えば、細胞の成長、維持のための前駆細胞用培地（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｍｅｄｉｕｍ）などの適切な培地中で細胞を増殖させ、コンフルーエントまで成長させることができる。この細胞を、例えば、０．０５％のトリプシンを含有して１ｍｇ／ｍｌのグルコース；０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ２が添加されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（完全ＰＢＳ）に５％血清を加えてトリプシンを不活性化したものなどの緩衝溶液を用いて、培養基材から取り出す。この細胞は、遠心分離を用いてＰＢＳで洗浄してよく、次にトリプシンを含まない完全ＰＢＳ中へ選択された密度で再懸濁させて注射液とする。
【００９１】
腹膜投与に適する医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの薬理学的に許容されるキャリアと組み合わせられた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与もしくは連続投与に適する形態で作製、パッケージ、または販売することができる。注射用製剤は、アンプル、もしくは保存剤を含有するマルチドーズ容器（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）などに入った単位剤形として作製、パッケージ、または販売することができる。腹膜投与用の製剤としては、これらに限定されないが、懸濁液、溶液、油性もしくは水性媒体中のエマルジョン、ペースト、および埋め込み型の徐放性もしくは生分解性製剤が挙げられる。そのような製剤は、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含むがこれらに限定されない１もしくは２つ以上の追加の成分をさらに含んでいてよい。
【００９２】
本発明はまた、その他の治療手順と組み合わせて再プログラムされた細胞を移植することによって、ＣＮＳ、ＰＮＳ、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、および膵臓などを含む身体の疾患または外傷を治療することも包含する。従って、本発明の再プログラムされた細胞は、副腎からのクロマフィン細胞、胎児脳組織細胞、および胎盤細胞など、遺伝子組換え細胞および非遺伝子組換え細胞のいずれであっても、患者に有益な効果をもたらすその他の細胞と共に移植してよい。従って、本明細書で提供される教示事項を身につけた当業者であれば理解されるように、本明細書で開示される方法は、その他の治療手順と組み合わせることができる。
【００９３】
本発明の再プログラムされた細胞は、各々が参照することで本明細書に組み入れられる米国特許第５，０８２，６７０号および同第５，６１８，５３１号に記載のものなど本技術分野で公知の技術を用いて、患者へ、または身体の他の適切ないずれの部位へも「単独で（ｎａｋｅｄ）」移植することができる。
【００９４】
再プログラムされた細胞は、単一の細胞を含む混合物／溶液として、または細胞凝集体の懸濁液を含む溶液として移植することができる。そのような凝集体は、直径がおよそ１０〜５００マイクロメートル、より好ましくは直径が約４０〜５０マイクロメートルであってよい。再プログラムされた細胞の凝集体は、一粒子あたり約５〜１００個、より好ましくは約５〜２０個の細胞を含んでいてよい。移植された細胞の密度は、マイクロリットルあたり約１０，０００から１，０００，０００個の細胞、より好ましくはマイクロリットルあたり約２５，０００から５００，０００個の細胞の範囲であってよい。
【００９５】
本発明の再プログラムされた細胞の移植は、本技術分野で公知の技術、ならびに将来開発される技術を用いて達成することができる。本発明は、動物、好ましくはヒトへの再プログラムされた細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）、移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、注入（ｉｎｆｕｓｉｎｇ）、またはそれ以外の導入を行うための方法を含む。
【００９６】
再プログラムされた細胞はまた、マイクロカプセル化（例えば、参照することで本明細書に組み入れられる米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号参照）、またはマクロカプセル化（例えば、すべて参照することで本明細書に組み入れられる米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，９７６，８５９号；および同第４，９６８，７３３号；ならびに国際公開第９２／１９１９５号；同第９５／０５４５２号参照）を含む公知のカプセル化技術に従ってカプセル化し、生物活性分子の送達に用いることもできる。マクロカプセル化に関しては、デバイス内の細胞数は様々であってよく；好ましくは各デバイスが１０３〜１０９個の細胞を含有し、最も好ましくは約１０５から１０７個の細胞である。複数のマクロカプセル化デバイスを患者内に埋め込むことができる。細胞のマクロカプセル化および埋め込みの方法は、本技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，４９８，０１８号に記載されている。
【００９７】
本発明の再プログラムされた細胞はまた、これらを用いて、治療目的のために、またはこれらの患者組織内での一体化および分化を追跡する方法のために、外来性タンパク質または分子を発現させることもできる。従って、本発明は、発現ベクター、ならびに外来性ＤＮＡを再プログラムされた細胞に導入し、同時にこの外来性ＤＮＡを再プログラムされた細胞内で発現させるための方法を包含し、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載のものなどである。
【００９８】
本発明の態様はまた、本発明の方法によって作製された細胞を含む組成物にも関する。別の態様では、本発明は、転写抑制に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することによって再プログラムされた細胞を含む組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘発することによって再プログラムされた細胞を含む組成物に関する。
【００９９】
本発明の態様はまた、細胞を、転写抑制に関与する少なくとも１つの遺伝子に対して指向される少なくとも１つのｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒと接触させることによって作製された再プログラムされた細胞にも関する。
【０１００】
本発明の態様はまた、本発明の方法および組成物を作製するためのキットにも関する。このキットは、中でも、細胞の再プログラミングによる作製ならびにＥＳ様細胞および幹細胞様細胞の作製、細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与する遺伝子の発現の誘発、ならびに転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害、に用いることができる。このキットは、転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子に対して指向される少なくとも１つのｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒを含んでよい。このキットは、複数のｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒの配列またはコンストラクトを含んでよい。ｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクトは、単一の容器内でも、または複数の容器内で提供されてもよい。
【０１０１】
キットはまた、細胞が再プログラムされたかどうかを判定するために必要である試薬も含んでよく、これらに限定されないが、細胞が多能性もしくは多分化能性であることに寄与する遺伝子の誘発を試験するための試薬、転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の阻害を試験するための試薬、およびクロマチン構造のリモデリングを試験するための試薬が挙げられる。
【０１０２】
キットはまた、再プログラムされた細胞を、ニューロン、骨芽細胞、筋肉細胞、上皮細胞、および肝細胞が挙げられるがこれらに限定されない特定の系列または複数の系列へ分化させるために用いることができる試薬も含んでよい。
【０１０３】
キットはまた、キットに備えられている構成成分の使用について述べる説明資料も含んでいてよい。本明細書で用いる「説明資料」には、中でも分化細胞の再プログラミングを行う際のこのキットにおける本発明の方法の有用性を伝えるために用いることができる、刊行物、記録物、図、またはその他のいかなる表現媒体をも含まれる。所望される場合は含んでよいものとして、または別の選択肢として、説明資料は、本発明の細胞を再分化および／または分化転換する１もしくは２つ以上の方法を説明していてもよい。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明のｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒまたはこれらの成分を収容する容器に貼り付けてよい。別の選択肢として、説明資料とｓｈＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡｍｉｒまたはこれらの成分とを、受取った人が協同的に用いることを意図して、説明資料を容器とは別に発送してもよい。
【０１０４】
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、説明のみの目的で提供されるものあり、本発明は、これらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではまったくなく、むしろ、本明細書で提供される教示事項の結果として明らかとなるすべての変形を包含するものと解釈されるべきである。米国特許、許可された米国特許出願、または公開された米国特許出願を含むがこれらに限定されないすべての参考文献は、その全体が参照することで本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１０５】
以下の実施例は、説明のためだけのものであり、請求項によって定められる本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１０６】
ＤＮＡメチル化、ヒストン脱アセチル化、およびヒストンメチル化に寄与するエピジェネティック制御成分のサイレンシングのためのＳＭＡＲＴベクター  ｓｈＲＮＡ‐ＧＦＰ‐レンチウィルスを（表Ｉ参照）、ヒト初代およびＢＪ線維芽細胞培養物へ導入する。しかし、本発明の方法を用いていかなる制御成分も標的とすることができることは理解されるべきである。主たるエピジェネティック制御成分の単一および相乗的な効果を、ｓｈＲＮＡを単独で、ならびに２、３、４、および５を含むがこれらに限定されない組み合わせで導入することによって試験する。ピューロマイシンに基づく選別の後、標的ｓｈＲＮＡを構成的に発現する細胞を回収し、定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲにより標的遺伝子のサイレンシングを確認する。
【０１０７】
方法
細胞培養：  ヒト初代線維芽細胞（継代１）、およびヒトＢＪ線維芽細胞は、それぞれ、セルアプリケーションズ（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（サンディエゴ，カリフォルニア州）、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マナサス，バージニア州）より購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）ならびに０．５％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）中にて、３７℃、湿度９５％、および５％ＣＯ２にて維持する。細胞を成長させ、トリプシン処理し、カウントし、次に上記の標準成長培地中に希釈して、ｓｈＲＮＡを導入する前に適切な播種密度を得る。
【０１０８】
ｓｈＲＮＡレンチウィルスの作製および感染：  表Ｉに概略を示した成分の不活性化のための高タイター（Ｈｉｇｈ  ｔｉｔｔｅｒｅｄ）ＳＭＡＲＴベクターｓｈＲＮＡレンチウィルス（≧１０８トランスフェクションユニット／ｍｌ）は、ダーマコン（サーモフィッシャーサイエンティフィック，ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ）より入手する。ダーマコンからの高機能長期遺伝子サイレンシング技術（ｈｉｇｈｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を利用し、これは、記載の緑色蛍光タンパク質（ｔｕｒｂｏＧＦＰ（商標））可視化およびピューロマイシン選別用に設計されている。ｓｈＲＮＡレンチウィルス感染の前日に、ヒト線維芽細胞を２×１０５細胞／ｍｌの密度で播種する。翌日、培地を、３ｕｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）およびＳＭＡＲＴベクターｓｈＲＮＡレンチウィルス（２５ＭＯＩ）を含有する予め加温した培地に置換する。感染の１８時間後に培地を新しい培地に置換し、蛍光顕微鏡法によってＴｕｒｂｏＧＦＰ発現について細胞を評価し、感染効率を測定する。感染の３日後、ピューロマイシンを培地へ添加し、ピューロマイシン選別を開始する。選別された細胞を回収し、定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを用いて遺伝子発現レベルを測定することにより、標的遺伝子のサイレンシングを確認する。
【０１０９】
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ：  ｓｈＲＮＡが標的とする遺伝子の発現は、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって定量する。簡潔に述べると、トリゾール試薬（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））およびＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用い、製造元のプロトコルに従うデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により、培養物から全ＲＮＡを調製する。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライムド逆転写（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｐｒｉｍｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（インビトロジェン）にかける。ＰＣＲマスターミックスを用い、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム）上にてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルに対して、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして１μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）を添加する。発現レベルを、シクロフィリンに対して、未処理のコントロール細胞における発現と比較する。
【０１１０】
抑制複合体内の成分の発現を阻害するｓｈＲＮＡ配列およびコンストラクトを識別する。上述の方法を用いて、ｓｈＲＮＡ配列およびコンストラクトの様々な組み合わせを試験し、最適化することができる。さらに、ｓｈＲＮＡｍｉｒ配列およびコンストラクトを用いることもできる。ｓｈＲＮＡライブラリおよびｓｈＲＮＡｍｉｒライブラリを用いて、抑制複合体内の成分の発現を阻害する配列をスクリーニングすることができる。
【実施例２】
【０１１１】
多能性遺伝子は、ＤＮＡメチル化、ヒストン脱アセチル化、およびヒストンメチル化に寄与するタンパク質を含むがこれらに限定されない抑制エピジェネティック制御成分（ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）により、体細胞内にて転写サイレンシングを受ける。ｓｈＲＮＡによってこれらの成分を阻害し、ＤＮＡ脱メチル化、ヒストンアセチル化、およびヒストン脱メチル化を誘発することにより、クロマチン構造を変化させ、多能性遺伝子の転写を可能とすることができる。
【０１１２】
実施例１で識別されたものなどのエピジェネティック抑制複合体標的を、クロマチン修飾について分析する。さらに、構成的に標的ｓｈＲＮＡを発現し、標的遺伝子発現の著しいノックダウンまたはサイレンシングを示すヒト体細胞を、多能性遺伝子の上方制御について分析する。
【０１１３】
以下で概説する方法を用いて、全体の、そして多能性転写物特異的（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）なＤＮＡ脱メチル化、ヒストンアセチル化、および／またはヒストン脱メチル化を、未処理コントロール細胞と比較して確認する。さらに、定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを用いて、多能性遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２（およびその他の幹細胞性関連遺伝子）に対する発現の上方制御を、未処理コントロール細胞および連邦政府認可の（ｆｅｄｅｒａｌｌｙ−ａｐｐｒｏｖｅｄ）ヒト胚性幹細胞と比較して確認する。
【０１１４】
全体のＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、およびヒストンメチル化の定量：  全体のＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、およびヒストンメチル化のレベルを、それぞれ、エピジェンテック（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）（ブルックリン，ニューヨーク州）のＭｅｔｈｙｌａｍｐ（商標）全体ＤＮＡメチル化定量（Ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＥｐｉＱｕｉｃｋ（商標）全体ヒストンアセチル化（Ｇｌｏｂａｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、およびＥｐｉＱｕｉｃｋ（商標）全体ヒストンメチル化（Ｇｌｏｂａｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）アッセイキットにより定量する。簡潔に述べると、５‐メチルシトシンのレベルの測定のために、細胞培養物からのゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）を、３７℃で２時間、続いて６０℃で３０分間インキュベートすることによってアッセイウェル上に固定化し、次に、ブロッキングバッファーを添加することによってブロックする。ＤＮＡメチル化の量は、高親和性メチルシトシン抗体およびＨＲＰ結合二次抗体をそれぞれ製造元のプロトコルに従って用いたＥＬＩＳＡに基づく反応からのＯＤ強度によって測定する。
【０１１５】
全体のヒストンアセチル化のレベルの測定のためには、抽出したヒストンを、製造元のプロトコルに従ってアッセイウェル上に安定にスポットする。アセチル化ヒストンＨ３またはＨ４に対する抗体と共にインキュベートした後、アセチル化ヒストンの量を、ＨＲＰ結合二次抗体発色により、ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＲａｄ，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）上で定量する。
【０１１６】
全体のヒストンＨ３‐Ｋ２７メチル化レベルの測定のためには、抽出したヒストンタンパク質を、製造元のプロトコルに従ってアッセイストリップウェル上に安定にスポットする。メチル化Ｈ３‐Ｋ２７に特異的な抗体と共にインキュベートした後、メチル化Ｈ３‐Ｋ２７の量を、ＨＲＰ結合二次抗体発色により、ＥＬＩＳＡリーダー（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ），ハーキュリーズ，カリフォルニア州）上で定量する。
【０１１７】
転写物特異的メチル化の重亜硫酸塩シークエンシング分析：  多能性遺伝子プロモーターのメチル化を、重亜硫酸塩シークエンシングによって分析する。簡潔に述べると、ＤＮＡを、フェノール  クロロホルム‐イソアミルアルコール抽出によって精製する。重亜硫酸塩による変換は、製造元のプロトコルに従ってＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて行い；非ＣｐＧジヌクレオチドの全シトシンのウラシルへの変換率は１００％である。変換されたＤＮＡは、ヒトＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＯＸ２に対するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローン化キット（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）により大腸菌内へクローン化する。各サンプルの１０個のクローンを、ＳＰ６およびおＴ７プライマーによるシークエンシングによって確認する。対象である各プロモーターに対する全体のメチル化パーセント、および任意のＣｐＧに対するメチル化シトシンの数を、対応ｔ検定を用いて細胞集団間で比較する。
【０１１８】
ヒストン修飾のＱ２ＣｈＩＰ分析：  クロマチン免疫沈降を、実質的にＤａｈｌ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｓ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：２５（４）：１０３７−４６，２００７）の記載に従って行う。多能性遺伝子の５’制御領域上でのヒストンＨ３修飾における変化を、Ｑ２ＣｈＩＰを用いてモニタリングする。簡潔に述べると、抗体‐ビーズ複合体を作製するために、常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ；ダイナルバイオテック（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ），オスロ，ノルウェー）を放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファーで洗浄し、その後ＲＩＰＡバッファー中に再懸濁させる。２．４μｇの一次抗体を含有するＲＩＰＡバッファーへビーズを添加し、次に４℃で２時間、ローテーター上にてインキュベートする。ＤＮＡ‐タンパク質架橋のために、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である酪酸ナトリウム２０ｍＭを回収の直前に細胞へ添加する（およびその後のすべての溶液へ）。細胞は、１〜２×１０６細胞／ｍｌにて、１％ホルムアルデヒドにより懸濁液中で固定する。架橋された細胞をＰＢＳ／２０ｍＭ酪酸塩中で洗浄し、酪酸塩を含有する溶解バッファー中に溶解する。アリコートを超音波処理して約５００塩基対のクロマチンフラグメントを作製する。ライセートを沈澱させ、上清を回収し、希釈アリコートからＡ２６０によりクロマチン濃度を測定する。ＲＩＰＡバッファー／酪酸塩中のクロマチンを、抗体‐ビーズ複合体（上記参照）を収容したチューブへ移し、このサンプルを上記のようにしてインキュベートする。免疫複合体をＲＩＰＡバッファー中にて、次にＴＥバッファー中にて洗浄する。このＣｈＩＰ物を、１％ＳＤＳおよび５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有する溶離バッファー中でインキュベートし、１３００ｒｐｍのサーモミキサー上にて、６８℃で２時間インキュベートする。溶離バッファーを回収し、ＣｈＩＰ物を再抽出し、両方の上清をプールする。ＤＮＡを、フェノール‐クロロフォルム  イソアミルアルコールで１回、クロロフォルム  イソアミルアルコールで１回抽出し、次にエタノールで沈澱させる。免疫沈降ＤＮＡを、５μｌのＤＮＡから開始するリアルタイムＰＣＲにより、３つの反復サンプルで分析する。
【０１１９】
多能性遺伝子発現分析のための定量的ＲＴ‐ＰＣＲ：  Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、グリシンＮ‐メチルトランスフェラーゼ（Ｇｎｍｔ）、ＲＥＸ‐１（Ｚｆｐ‐４２としても知られる）、インテグリンα‐６、Ｒｏｘ‐１、ＬＩＦ‐Ｒ、ＴＤＧＦ１（ＣＲＩＰＴＯ）、ＳＡＬＬ４（ｓａｌ‐様４）、ＬＥＣＴ１、ＢＵＢ１、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５などの多能性遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって定量する。発現レベルを、シクロフィリンに対して、未処理のコントロール細胞および連邦政府認可のヒト胚性幹細胞（ＡＴＣＣ）における発現と比較する。
【０１２０】
Ｔａｑｍａｎ低密度アレイ分析（ＴＬＤＡ）：  胚性幹細胞および発生遺伝子を含むＴＬＤＡを用いて定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを行い、多能性およびその他の幹細胞性関連遺伝子に対する相対発現レベルを定量する。９０の胚性幹細胞および発生遺伝子、ならびに６の内在性コントロール遺伝子を含むアプライドバイオシステムズ  ヒト胚Ｔａｑｍａｎ（商標）低密度アレイ（ヒト胚ＴＬＤＡ）を用いて定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを行う。簡潔に述べると、ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ，フォスターシティ，カリフォルニア州）を用いたＲＮＡの逆転写に続いて、５０μｌのヌクレアーゼフリー水および５０μｌのＡＢＩユニバーサルＴａｑｍａｎ２ＸＰＣＲマスターミックス中のサンプルｃＤＮＡ１５０ｎｇをヒト胚ＴＬＤＡマイクロ流体カードの各ポートにピペッティングし、ＡＢＩ  ７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ，フォスターシティ，カリフォルニア州）上にて分析する。ΔΔＣＴ法を用いて、未処理のコントロール細胞および連邦政府認可のヒト胚性幹細胞と比較した、処理細胞中での遺伝子発現レベルの相対量（変化の倍率数）を算出する。
【０１２１】
ウェスタンブロッティング：  多能性遺伝子発現の翻訳は、タンパク質発現に対するウェスタンブロットによって確認する。簡潔に述べると、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したＲＩＰＡバッファー（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）を細胞培養物へ加えることによって、全細胞ライセートを調製する。アブカム（ケンブリッジ，マサチューセッツ州）からのＭＥＬ‐１  ｈＥＳ細胞ライセートをポジティブコントロールとして用いる。細胞ライセート（５０μｇ）を電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ビルリカ，マサチューセッツ州）へ移す。ブロットをブロッキングバッファー（リコーバイオサイエンス（Ｌｉｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），リンカン，ネブラスカ州）で１時間ブロックし、洗浄し、一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートする。Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（リコーバイオサイエンス，リンカン，ネブラスカ州）を用い、ＩＲＤｙｅ８００（商標）またはＣｙ５．５（ロックランド，フィラデルフィア，ペンシルベニア州）などの蛍光標識二次抗体により、製造元のプロトコルに従ってバンドを可視化する。ウェスタンブロッティング用の抗体は、複数の製造元から入手する：Ｏｃｔ３／４（サンタクルーズバイオテクノロジー，サンタクルーズ，カリフォルニア州）；Ｓｏｘ２（ケミコン，テメキュラ，カリフォルニア州）；β‐アクチン、ローディングコントロール（ＢＤバイオサイエンスイズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），サンノゼ，カリフォルニア州）；Ａｌｅｘａ結合抗マウスおよびヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）；ＩＲＤｙｅ８００（商標）結合抗ウサギＩｇＧ（ロックランド，フィラデルフィア，ペンシルベニア州）；およびＮａｎｏｇ（Ｒ＆Ｄシステムズ，ミネアポリス，ミネソタ州）。  
【実施例３】
【０１２２】
抑制エピジェネティック標的は、ヒトＥＳ細胞培養条件下でのコロニーユニット形成能、ならびに、多能性遺伝子（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、および／またはその他の幹細胞性関連遺伝子）の上方制御を示す標的ｓｈＲＮＡを構成的に発現するピューロマイシン選別されたヒト体細胞中におけるインビトロおよびインビボでの分化能を評価することによって分析する。これを達成するために、ヒト（ＥＳ）細胞培養条件下にて細胞を培養し、胚性幹細胞様コロニー形成を定量する。次に細胞を回収し、以下に概説するカクテルを用いて、複数の系列への指向されたインビトロでの分化を行う。さらに、コロニー細胞を免疫欠損ヌードマウスへ注射し、インビボでのテラトーマ形成能を評価する。記載のようにして評価した表現型を、未処理のコントロール細胞および連邦政府認可のヒト胚性幹細胞と比較する。
【０１２３】
コロニーユニット形成のためのヒトＥＳ細胞培養：  抑制複合体の成分へ指向されるｓｈＲＮＡを構成的に発現しピューロマイシン選別された体細胞を、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するヒトＥＳ細胞用培地中（ｈＥＳＣ培地；インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）で樹立し、維持する。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、ＣＦ１株）をＡＴＣＣ（マナサス，バージニア州）より購入し、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ロシェ，バーゼル，スイス）で処理することによって有糸分裂の不活性化を行う。これらの細胞の播種の直前に、ＭＥＦをＰＢＳで２回洗浄する。継代可能な状態となるまで細胞を毎日供給し、それはコロニーのサイズおよび数によって判定される。細胞の継代を行うには、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、フィルター滅菌したＤＭＥＭ／Ｆ１２中の１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶと共に１０分間インキュベートする。コロニーが遊離を始めたところでこれを回収し、適切な体積の培地で洗浄する。細胞の継代は、４日から７日ごとに１：３から１：６の比率で行う。
【０１２４】
インビトロでの指向された分化：
１．ニューロン／グリア分化：  ニューロン分化を誘発するために、本技術分野で公知の誘発剤のカクテルに処理細胞を接触させる。簡潔に述べると、第２〜５継代を例とする継代からの脱分化細胞を８０％コンフルーエンスまで成長させ、ＰＢＳで素早く洗浄した後、ニューロン誘発培地（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）（ＮＩＭ）を添加する。ＮＩＭは、ブチル化ヒドロキシアニソール（２００μＭ）、ＫＣＬ（５ｎＭ）、バルプロ酸（２ｍＭ）、ホルスコリン（１０μＭ）、ヒドロコルチゾン（１μＭ）、およびインスリン（５μｇ／ｍｌ）を添加した血清を含まないアルファ‐ＭＥＭから構成される。実験は、ニューロン誘発培地への接触後５時間から１５日間以内に行う。
【０１２５】
ニューロン分化アッセイ：
Ａ．生存率アッセイ：  脱分化細胞の生存率を測定するために、ニューロン誘発培地への接触後、色素排除アッセイを用いる。誘発後の１〜５日間の毎日の時間点にて、ヘキスト色素（２００μｇ／ｍｌ）（インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）；パーチェス，ニューヨーク州）を培養中の細胞へ添加する。ニューロン誘発細胞との比較のために、コントロール培地で成長した細胞の生存率を測定する。生存率は、位相顕微鏡法を用いて、重ならないフィールド、例えば３つの重ならないフィールドで生存細胞をカウントすることで測定する。コントロール細胞と誘発細胞との間の違いを、スチューデントｔ検定を用いて比較する。これは、すべての分化誘発処理に対する標準となるアッセイである。
【０１２６】
Ｂ．ＮＭＤＡ誘発興奮毒性アッセイ：  脱メチル化細胞のグルタミン酸アンタゴニストＮ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）に対する反応を測定するために、細胞生存率に対するＮＭＤＡの影響を定量する。細胞培養物の３つの反復サンプルをコントロールまたは誘発培地中にて２４時間成長させる。この細胞を５００〜１０００μＭのＮＭＤＡに３０分間接触させる。コントロールとして、細胞の１つのグループを１０００μＭのＮＭＤＡおよびＮＭＤＡアンタゴニスト、ジゾシルピン（ＭＫ‐８０１）（１０μＭ）の両方に３０分間接触させる。細胞の生存率の測定は、ＮＭＤＡとの接触後、細胞をヘキスト色素と共にインキュベートし、位相顕微鏡法を用いて、重ならないフィールド、例えば３つの重ならないフィールドで生存細胞をカウントすることで行い、測定値は±ＳＤとして表す。
【０１２７】
Ｃ．免疫細胞化学分析：  表現型を決定するために、細胞をコントロールまたは誘発条件下にて、チャンバースライド（ラブテック（ＬａｂＴｅｋ），ナパービル，イリノイ州）上で成長させる。ニューロン誘発後の種々の時間点にて（５時間から１５日間）、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定する。固定後、細胞を以下に示すニューロンおよびグリア細胞のマーカーに対して指向される特異的モノクローナル抗体と共にインキュベートする：ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｓ‐１００、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、β‐チューブリンＩＩＩ、タウ、ＮＭＤＡＲ‐１、ｇ‐アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５ＨＴＰ、ＴＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ‐４３、シナプシンＩ、パンα‐１（ｐａｎ  α−１）電位開口型カルシウムチャネル（すべてケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）；テメキュラ，カリフォルニア州、より入手）、およびＮＭＤＡＲ‐２（サンタクルーズバイオテクノロジー）。すべての抗体と共にＡＢＣ増幅キット（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），バーリンゲーム，カリフォルニア州、およびサンタクルーズバイオテクノロジー）を用いる。ＮｅｕＮおよびＧＦＡＰ、またはＭＡＰ２およびタウの共発現を識別するために、細胞を各抗体と共に順にインキュベートする。テキサスレッドおよびフルオレセインアビジン（ベクターラボラトリーズおよびサンタクルーズバイオテクノロジー）と共にアビジン／ビオチンブロッキングキットを用いて抗体の標識を行う。ニューロン誘発後の１〜１５日の間の時間点にて、明視野および位相差顕微鏡法を用いてモルフォロジーを調べ、撮影する。少なくとも３つの異なる実験からの培養物を用い、ランダムな重ならない視野における視野ごとの陽性細胞のパーセントを２人の別々の研究員がカウントする。
【０１２８】
ウェスタンブロット：  ニューロン誘発後のタンパク質発現を確認するために、コントロールおよび実験条件下で成長させた細胞をニューロン誘発後の１〜１５日に回収し、実質的には上述のものと同じ手順に従ってウェスタンブロット分析を行う。マウス脳抽出物をポジティブコントロールとして、アクチンを内部コントロールのタンパク質として用いる。
【０１２９】
リアルタイムＴａｑＭａｎ  ＲＴ‐ＰＣＲ：  さらに、ネスチン、中間径フィラメントＭおよびＮｅｕ  Ｎ、Ｓ‐１００、ＭＡＰ２、β‐ＩＩＩチューブリン、ならびにグルタミン酸受容体サブユニットＮＲ‐１およびＮＲ‐２などのニューロン関連マーカーを、実質的に既述のようにしてリアルタイムＴａｑｍａｎＰＣＲによりスクリーニングする。
【０１３０】
２．骨形成分化：  脱メチル化細胞が骨芽細胞様細胞へ分化する能力を測定するために、コンフルーエントな細胞（コントロールおよび実験用）を、１０％  ＦＢＳ、２００μＭ  アスコルビン酸‐２‐リン酸、１００ｎＭ  デキサメタゾン、７ｍＭ  β‐グリセロリン酸、および１ｎＭ  １α，２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３を添加したＤＭＥＭ‐Ｆ１２中にて２０日間成長させる。インキュベーション後、細胞は細胞外マトリックスのインビトロでのミネラル化の証拠を示し始め、表現型と関連する遺伝子およびタンパク質を発現する。アルファ１（Ｉ）‐プロコラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、ＡＬＰ、およびｃｂｆａ１を含むがこれらに限定されない骨形成分化を示すマーカーを、実質的に既述の方法を用いてリアルタイムＴａｑＭａｎＰＣＲおよび免疫化学分析によって評価する。さらに、細胞を１０％緩衝ホルマリン中にて固定し、Ｓｉｇｍａ診断キット８５を製造元のプロトコル（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）に従って用いてアルカリホスファターゼ組織化学分析を行い、骨芽細胞を検出する。
【０１３１】
３．筋分化：  コントロールおよび実験細胞の筋肉様系列への分化を、１０％ウマ血清添加ＤＭＥＭ‐Ｆ１２で誘発する。筋マーカーであるＭｙｏＤ、ミオゲニン、トロポニンＴ、タイチン、およびミオシンを、実質的に既述の方法を用いて評価する。
【０１３２】
４．肝分化：  肝分化は、Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｓｅｐ  ２８；１２（３６）：５８３４−４５，２００６）に記載のように、成長因子およびサイトカインを順に添加する２段階プロトコルを用いて実施する。簡潔に述べると、肝分化の誘発の前に、細胞（８５％コンフルーエンス）を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した血清除去ＤＭＥＭ中で培養して細胞の増殖を停止させる。２日後、以下に示すように２段階分化プロトコルを実施する：ステップ１として、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、および４．９μＭ／Ｌ  ニコチンアミドを添加したＤＭＥＭから成る分化培地で７日間、続いてステップ２として、２０ｎｇ／ｍｌ  オンコスタチンＭ（ＯＭＳ）、１μＭ／Ｌ  デキサメタゾン、および１０μＬ／ｍｌ  インスリン／トランスフェリン／セレニウム（ＩＴＳ、シグマ，セントルイス，ミズーリ州）＋プレミックス（最終濃度：１００μＭ／Ｌ  インスリン、６．２５μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、３．６μＭ／Ｌ  亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および１９０μＭ／Ｌ  リノール酸）を添加したＤＭＥＭから成る分化培地で細胞を成熟させるために最大２１日間。培地は週２回交換し、肝分化は、肝関連遺伝子（Ｃ／ＥＢＰ、ＨＮＦ４、ＣＹＰ３Ａ４）に対するＲＴ‐ＰＣＲにより既述のようにして評価する。
【０１３３】
インビボでのテラトーマ形成：  標的ｓｈＲＮＡを構成的に発現するピューロマイシン選別されたヒト体細胞から樹立されるコロニー細胞、未処理のコントロール細胞、および連邦政府認可のヒトＥＳ細胞を、２５０μｌの滅菌ＢＤマトリゲル（ＢＤバイオサイエンスイズ，サンノゼ，カリフォルニア州）中へおよそ１０００万細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させ、６週齢のメス免疫欠損胸腺欠損ヌードマウス（チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）；２５体／グループ）へ注射し；マウスのさらなるサブセットにマトリゲルのみを注射して媒体コントロールグループとする。イソフルラン麻酔下の間に、通常の皮下挿入の後に針先を右左に動かして皮下ポケットを形成することでマウスに細胞懸濁液を注射し、次に、製造元の推奨事項に従ってマトリゲル細胞懸濁液をこのポケットへ注射する。注射部位は定期的に検査し、注射後２、４、６、８、および１２週にて、各グループから５体のマウスを安楽死させる。安楽死の後、注射部位およびいずれの明らかな集合体（ｍａｓｓｅｓ）をも切開し、固定して組織学的検査を施し、系列特異的および組織特異的染色によって明示される複数の分化細胞型ならびに系列特異的組織を含有するテラトーマを確認する。
【０１３４】
培養物中の細胞では、１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、および９５〜１００％を含むがこれらに限定されない割合を多能性細胞が占めていてよい。培養物中の細胞では、１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、および９５〜１００％を含むがこれらに限定されない割合を多分化能性細胞が占めていてよい。培養物中の細胞は、様々な細胞集団であってよく、これらに限定されないが、多能性細胞、多分化能性細胞、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜２０、２１〜３０、および３０超の系列へ分化する能力を有する細胞が挙げられる。多能性もしくは多分化能性と関連する細胞表面マーカーの発現に基づいて細胞を分離するＦＡＣＳを用いたプロトコルにより、その潜在能が回復している細胞を濃縮することができる。
【０１３５】
ある態様では、本明細書の方法を用いて、抑制エピジェネティック標的を識別することができる。さらに別の態様では、タンパク質を例とする抑制エピジェネティック成分の阻害により、ＤＮＡ脱メチル化、ヒストンアセチル化、および／またはヒストン脱メチル化を含むがこれらに限定されないエピジェネティック変化を誘発し、細胞が再分化する能力を有するすべての系列の識別へ繋げることができる。さらに別の態様では、本明細書で述べる方法は、クロマチン構造の修飾を可能とし、体細胞への潜在的分化能を回復させることができる。
【実施例４】
【０１３６】
ＤＮＭＴ１へ指向されるｓｈＲＮＡコンストラクトを分析して、多能性遺伝子の発現に対するその影響を測定した。この実験では、ｓｈＲＮＡをＤＮＡメチルトランスフェラーゼへ指向させたが、少なくとも１つの遺伝子の発現を上昇させるものであればいかなるｓｈＲＮＡコンストラクトをも用いることができる。
【０１３７】
方法
細胞培養：  ヒト成人皮膚線維芽細胞をセルアプリケーションズ（サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入し、線維芽細胞成長培地（セルアプリケーションズ，サンディエゴ，カリフォルニア州）中、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２にて維持した。
【０１３８】
レンチウィルス感染：  ヒト成人皮膚線維芽細胞を、ＤＮＭＴ１に指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルスで感染させた。レンチウィルスコンストラクトは、ターボＧＦＰレポーターを含有していた。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ダーマコンより入手し、以下の配列を有していた：
配列番号１：ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡ
【０１３９】
ヒト皮膚線維芽細胞を、製造元の説明書に従ってｓｈＲＮＡに感染させた。ＨＤＦは、ピューロマイシン選別およびｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ培地、ステムセルテクノロジー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州，カナダ）有りならびに無しにてマトリゲル（ＢＤバイオサイエンスイズ，サンノゼ，カリフォルニア州）上で培養した。
【０１４０】
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ：  Ｏｃｔ‐４およびＤＮＭＴ１の発現を、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲで測定した。簡潔に述べると、トリゾール試薬（ライフテクノロジー，ゲイサーズバーグ，メリーランド州）およびＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン；バレンシア，カリフォルニア州）を用い、製造元のプロトコルに従うデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により、培養物から全ＲＮＡを調製した。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライムド逆転写（インビトロジェン；カールスバッド，カリフォルニア州）にかけた。ＰＣＲマスターミックスを用い、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ；フォスターシティ，カリフォルニア州）上にてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルに対して、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして１μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）を添加する。Ｏｃｔ‐４およびＤＮＭＴ１の発現レベルを、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対して標準化した。
【０１４１】
免疫組織化学分析：  免疫組織化学分析に関しては、標的ｓｈＲＮＡ感染細胞およびコントロール細胞をチャンバースライド（ラブテック，ナパービル，イリノイ州）上で成長させた。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、製造元のプロトコルに従って、多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ４、アブカム，ケンブリッジ，マサチューセッツ州より）に対して指向された特異的抗体と共にインキュベートした。細胞は緑色蛍光で顕微鏡観察した（ニコン，東京，日本）。
【０１４２】
結果
図１Ａに示すように、Ｏｃｔ‐４の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦにおいて増加した。逆に、ＤＮＭＴ１の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦにおいて減少した。Ｏｃｔ‐４の発現の増加のピークは、トランスフェクションの５日後であると思われる。
【０１４３】
図１Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させ、ピューロマイシンの存在下で培養したＨＤＦからのデータを示す。Ｏｃｔ‐４の発現は増加し、実験の期間中維持された。ＤＮＭＴ１の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡの存在下で減少した。
【０１４４】
コロニー中でのターボＧＦＰ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ‐２、およびＳＳＥＡ４の発現は、特異的抗体および緑色蛍光顕微鏡観察を用いた免疫組織学的分析によって可視化した。図２Ａは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体の写真である。図２Ｂは、図２Ａに示す胚様体内に存在する細胞内におけるＧＦＰ局在化を示す写真であり、レンチウィルス感染が確認される。図２Ｃは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体の写真である。図２Ｄは、図２Ｃに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＳｏｘ２タンパク質の発現を示す写真である。図２Ｅは、ＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウン後に形成された胚様体の写真である。図２Ｆは、図２Ｅに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＯｃｔ４タンパク質の発現を示す写真である。図２Ｇは、培養によって成長する線維芽細胞の写真である。図２Ｈは、図２Ｇに示す胚様体内におけるＤＮＭＴ１のｓｈＲＮＡノックダウンによって誘発されたＳＳＥＡ４タンパク質の発現を示す写真である。
【０１４５】
これらのデータは、ｓｈＲＮＡレンチウィルス感染を用いたＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡ干渉により、ｏｃｔ‐４、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ４抗体で陽染される胚様体を産生させることができることを示している。ＤＮＭＴ  ｓｈＲＮＡ感染の後、ヒト皮膚線維芽細胞からのいくつかのコロニーが観察された。緑色蛍光タンパク質をｓｈＲＮＡ発現マーカーとして用いた。
【実施例５】
【０１４６】
方法
細胞培養：  ヒト胎児および新生児皮膚線維芽細胞をセルアプリケーションズ（サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入し、線維芽細胞成長培地（セルアプリケーションズ，サンディエゴ，カリフォルニア州）中、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２にて維持した。
【０１４７】
レンチウィルス感染：  ヒト成人皮膚線維芽細胞を、ＤＮＭＴ１に指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルスで感染させた。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ダーマコンより入手し、以下の配列を有していた：
配列番号１：ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡ
【０１４８】
ヒト皮膚線維芽細胞を、製造元の説明書に従ってｓｈＲＮＡに感染させた。ＨＤＦは、ピューロマイシン選別およびｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ培地、ステムセルテクノロジー，バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州，カナダ）有りならびに無しにてマトリゲル（ＢＤバイオサイエンスイズ，サンノゼ，カリフォルニア州）上で培養した。
【０１４９】
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ：  Ｏｃｔ‐４、ＤＮＭＴ１、およびＳｏｘ‐２の発現を、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲで測定した。簡潔に述べると、トリゾール試薬（ライフテクノロジー，ゲイサーズバーグ，メリーランド州）およびＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン；バレンシア，カリフォルニア州）を用い、製造元のプロトコルに従うデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により、培養物から全ＲＮＡを調製した。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライムド逆転写（インビトロジェン；カールスバッド，カリフォルニア州）にかけた。ＰＣＲマスターミックスを用い、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ；フォスターシティ，カリフォルニア州）上にてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルに対して、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして１μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）を添加する。Ｏｃｔ‐４およびＤＮＭＴ１の発現レベルを、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対して標準化した。
【０１５０】
結果
図３Ａに示すように、Ｏｃｔ‐４の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト胎児皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｆ）において増加した。Ｏｃｔ‐４の発現のピークは、およそ第２日であった。ＤＮＭＴ１の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞において減少した。Ｏｃｔ‐４の発現は、ピューロマイシンの存在下で成長させたＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞（図３Ｂ）、およびピューロマイシンおよびｈＥＳ培地中で成長させた細胞（図３Ｃ）において増加した。すべての培養条件下にて、ＤＮＭＴ１の発現は減少した（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１５１】
ｓｈＲＮＡレンチウィルスのヒト皮膚線維芽細胞への最初の感染効率は約７０〜８０％であった。ピューロマイシン含有培地で細胞を培養することにより、ｓｈＲＮＡコンストラクトがピューロマイシン耐性遺伝子を持つことから、ｓｈＲＮＡレンチウィルスに感染した細胞のみを選別することができる。ｈＥＳ細胞培養条件で培養することは、細胞の再プログラミングおよび細胞への潜在的分化能の回復の効率および効力に寄与する。
【０１５２】
Ｏｃｔ‐４の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたその他の細胞型でも増加した。例えば、Ｏｃｔ‐４の発現は、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ）で増加した（図４Ａ〜４Ｃ参照）。Ｏｃｔ‐４の発現の増加は、ピューロマイシンおよびｈＥＳ培地の存在下で培養したＨＤＦｎ細胞においてＯｃｔ‐４発現が中程度に増加したことで示されるように、培養条件によって様々であった。感染ＨＤＦｎ細胞について実験したすべての培養条件下にて、ＤＮＭＴ１の発現は減少した。
【０１５３】
これらの結果は、多能性遺伝子のサイレンシングに関与する、および／または転写抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を干渉するｓｈＲＮＡコンストラクトを用いることで、多能性遺伝子の発現を増加させることができることを示している。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトは、多能性遺伝子の発現を増加させた。この方法を用いて細胞を再プログラムし、潜在的分化能を細胞へ回復させることができる。制御タンパク質をコードする遺伝子の発現を干渉するいずれのｓｈＲＮＡコンストラクトも用いることができる。当業者であれば、本実施例の方法をＤＮＭＴ１を超えて発展させ、いずれの制御タンパク質または制御タンパク質ファミリーメンバーに対しても用いることができることは理解されるであろう。
【実施例６】
【０１５４】
制御タンパク質をコードする遺伝子に対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトの、多能性遺伝子の発現を増加させる能力について調べた。本実施例では、Ｏｃｔ‐４およびＮａｎｏｇについて分析した。当業者であれば、この方法を用いて、再プログラミングおよび／または細胞の潜在的分化能の回復に関与するいずれの遺伝子の発現をも増加させることができることは理解されるであろう。
【０１５５】
方法
細胞培養：  ヒト成人、胎児、および新生児皮膚線維芽細胞をセルアプリケーションズ（サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入し、線維芽細胞成長培地（セルアプリケーションズ，サンディエゴ，カリフォルニア州）中、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２にて維持した。
【０１５６】
レンチウィルス感染：  ヒト成人皮膚線維芽細胞を、ＨＤＡＣ７ａまたはＨＤＡＣ１１に指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルスで感染させた。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ダーマコンより入手した。ＨＤＡＣ７ａに対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトは、以下の配列を有していた：
配列番号２：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡ
【０１５７】
ＨＤＡＣ１１に対して指向されたのは以下の配列を有するｓｈＲＮＡコンストラクトであった：
配列番号３：ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡ
【０１５８】
さらに、ＨＤＡＣ１１に対して指向されたのは以下の配列を有するｓｈＲＮＡコンストラクトであった：
配列番号４：ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧ
【０１５９】
ヒト皮膚線維芽細胞を、製造元の説明書に従ってｓｈＲＮＡで感染させた。ＨＤＦは、ピューロマイシン有りおよび無しで培養した。
【０１６０】
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ：  Ｏｃｔ‐３／４およびＮａｎｏｇの発現を、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲで測定した。簡潔に述べると、トリゾール試薬（ライフテクノロジー，ゲイサーズバーグ，メリーランド州）およびＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン；バレンシア，カリフォルニア州）を用い、製造元のプロトコルに従うデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により、培養物から全ＲＮＡを調製した。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライムド逆転写（インビトロジェン；カールスバッド，カリフォルニア州）にかけた。ＰＣＲマスターミックスを用い、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ；フォスターシティ，カリフォルニア州）上にてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルに対して、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして１μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）を添加する。Ｏｃｔ‐３／４およびＮａｎｏｇの発現レベルを、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対して標準化した。
【０１６１】
結果
２つの異なるヒストンデアセチラーゼに対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトについて調べた。図５Ａに示すように、Ｏｃｔ３／４の発現は、ＨＤＡＣ７またはＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト成人皮膚線維芽細胞において約２倍に増加した。ピューロマイシンの存在下、ＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡと共に培養した細胞では、発現の増加はあまり大きくなかった。ピューロマイシンの存在下および非存在下で培養したヒト新生児皮膚線維芽細胞でも同様の結果が見られた（図５Ｂ）。Ｏｃｔ‐４の発現の増加は、ヒト胎児皮膚線維芽細胞において特にあまり大きくなく（図５Ｃ）、これは、ヒト胎児皮膚線維芽細胞が、ヒト成人および新生児皮膚線維芽細胞と比べて約４倍のＯｃｔ‐４の基底発現を示すことに起因し得る。
【０１６２】
Ｎａｎｏｇの発現は、ＨＤＡＣ７ａまたはＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させたヒト成人皮膚線維芽細胞において増加した（図６Ａ）。発現の増加は、ピューロマイシンの存在下および非存在下で培養した細胞で観察された。ピューロマイシンの存在下および非存在下で培養したヒト新生児皮膚線維芽細胞でも同様の結果が観察された（図６Ｂ）。Ｎａｎｏｇの発現はヒト胎児皮膚線維芽細胞でも増加したが、実験したその他の細胞型ほど劇的ではなかった。ヒト胎児皮膚線維芽細胞では、ＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡおよびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡのいずれもＮａｎｏｇの発現の増加を引き起こしたが、ｓｈＲＮＡ  ＨＤＡＣ１１と比較してＨＤＡＣ７ａに対して指向されたｓｈＲＮＡの方がより強い効果を示した。
【０１６３】
本明細書で示すデータによって裏付けられるように、ＨＤＡＣに対して指向されるｓｈＲＮＡコンストラクトは、多能性遺伝子の発現の増加をもたらす。Ｏｃｔ‐３／４およびＮａｎｏｇは共に、ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１に対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトを感染させた細胞で増加した。これらの結果は、正および負の制御因子いずれであっても、制御タンパク質をコードする遺伝子に対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトを用いて、細胞を再プログラムし、細胞の潜在的分化能を回復させることができることを示している。
【実施例７】
【０１６４】
ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ１１、またはＤＮＭＴ１に対して指向されたレンチウィルスｓｈＲＮＡを感染させた細胞を、多能性遺伝子の発現のために染色し、可視化した。本実施例では、Ｏｃｔ‐４およびＳｏｘ‐２のタンパク質発現について分析したが、当業者であれば、本発明の方法を用いて、再プログラミングまたは細胞の潜在的分化能の回復に関与するいずれの遺伝子の発現をも増加させることができることは理解されるであろう。
【０１６５】
方法
細胞培養：  ヒト胎児皮膚線維芽細胞をセルアプリケーションズ（サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入し、線維芽細胞成長培地（セルアプリケーションズ，サンディエゴ，カリフォルニア州）中、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２にて維持した。
【０１６６】
レンチウィルス感染：  ヒト胎児皮膚線維芽細胞を、以下の組成物のうちの１つで感染させた：（１）ＤＮＭＴ１に指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルス；（２）ＨＤＡＣ７に対して指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルス；（３）ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ７に対して指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルス；ならびに（４）ＨＤＡＣ７ａおよびＨＤＡＣ１１に対して指向されたｓｈＲＮＡレンチウィルス。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎより入手した。ＤＮＭＴ１に対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトは、以下の配列を有していた：
配列番号１：ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡ
【０１６７】
ＨＤＡＣ７ａに対して指向されたｓｈＲＮＡコンストラクトは、以下の配列を有していた：
配列番号２：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡ  
【０１６８】
ＨＤＡＣ１１に対して指向されたのは以下の配列を有するｓｈＲＮＡコンストラクトであった：
配列番号３：ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡ
【０１６９】
さらに、ＨＤＡＣ１１に対して指向されたのは以下の配列を有するｓｈＲＮＡコンストラクトであった：
配列番号４：ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧ
【０１７０】
ヒト皮膚線維芽細胞を、製造元の説明書に従ってｓｈＲＮＡに感染させた。ＨＤＦは、ピューロマイシン選別およびｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ培地、ステムセルテクノロジー，バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州，カナダ）有りならびに無しにてマトリゲル（ＢＤバイオサイエンスイズ，サンノゼ，カリフォルニア州）上で培養した。
【０１７１】
免疫組織化学分析：  免疫組織化学分析に関しては、標的ｓｈＲＮＡ感染細胞およびコントロール細胞をチャンバースライド（ラブテック，ナパービル，イリノイ州）上で成長させた。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、製造元のプロトコルに従って、多能性マーカーＯｃｔ３／４（アブカム，ケンブリッジ，マサチューセッツ州）に対して指向された特異的抗体と共にインキュベートした。Ｏｃｔ３／４の染色は赤色で可視化した。核はＤＡＰＩ染色（Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ）で可視化し、これは青色を発色した。
【０１７２】
結果
Ｏｃｔ‐４タンパク質の発現は、ｓｈＲＮＡ干渉により、ヒト胎児皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｆ）において増加した。図７Ａは、感染なしのＨＤＦｆ（ネガティブコントロール）の写真であり、図７Ｇは、ヒト胚性幹細胞（ポジティブコントロール）の写真である。ネガティブコントロールでは、Ｏｃｔ‐４タンパク質の発現はほとんど検出されなかった。図７Ｂは、ＤＮＭＴ１に対して指向されたｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦｆ細胞の写真である。Ｏｃｔ‐４タンパク質の発現は、細胞をＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡに接触させた場合に、明らかに増加している。ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦｆ細胞が示すＯｃｔ‐４タンパク質の検出は非常に小さい（図７Ｃ）。これは、この特定のサンプルの処理に起因するものであり得る。
【０１７３】
ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞は、Ｏｃｔ‐４タンパク質の発現の劇的な増加を示した（図７Ｄ）。ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡの両方で処理した細胞は、ヒト胚性幹細胞（インビトロジェン，カールスバッド、カリフォルニア州）に非常に類似の発現パターンを見せた（図７Ｇ）。これらのデータは、Ｏｃｔ‐４遺伝子発現の増加がＯｃｔ‐４タンパク質発現の増加を引き起こすという本明細書で示すデータを裏付けるものである。ＤＮＭＴおよびＨＤＡＣ１１は、転写およびクロマチンリモデリングの制御に関して、まったく異なる機能を有する。２つの別々の制御グループからのメンバーを阻害することで、Ｏｃｔ‐４の発現の劇的な増加が見られた。Ｏｃｔ‐４タンパク質発現は、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ１１を感染させた細胞においても増加した（図７Ｅ）。ＤＮＭＴ１および複数のＨＤＡＣを阻害することで、Ｏｃｔ‐４タンパク質の発現が増加した。
【０１７４】
ＨＤＡＣ７およびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞では、Ｏｃｔ‐４の発現の増加は検出されなかった（図７Ｆ）。これは、実験システムの限界によるものであり得る。または別の選択肢として、この結果は、多能性遺伝子の発現の最適な増加を得るには、複数の経路を阻害すべきであることを示唆するものであり得る。まったく異なる制御複合体中で機能するタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することにより、多能性遺伝子の発現レベルが高まり得る。いずれの制御複合体のいずれのメンバーを阻害してもよい。
【０１７５】
Ｓｏｘ‐２タンパク質の発現は、ｓｈＲＮＡ干渉により、ヒト胎児皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｆ）において増加した。図８Ａは、感染なしのＨＤＦｆ（ネガティブコントロール）の写真であり、図８Ｇは、ヒト胚性幹細胞（ポジティブコントロール）の写真である。ネガティブコントロールでは、Ｓｏｘ‐２タンパク質の発現はほとんど検出されなかった。図８Ｂは、ＤＮＭＴ１に対して指向されたｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦｆ細胞の写真である。核染色は視認されたが、比較的少ない量のＳｏｘ‐２タンパク質しか検出されなかった。ＨＤＡＣ７およびＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦｆ細胞が示すＳｏｘ‐２タンパク質の検出は非常に小さかった（図８Ｃ）。これは、この特定のサンプルの処理に起因するものであり得る。
【０１７６】
ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞は、Ｓｏｘ‐２タンパク質の発現の劇的な増加を示した（図８Ｄ）。２つの別々の制御グループからのメンバーを阻害することで、Ｓｏｘ‐２の発現の劇的な増加が見られた。ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞が示すＳｏｘ‐２のタンパク質発現は、非常に小さいものであった（図８Ｅ）。Ｓｏｘ‐２タンパク質発現は、ＨＤＡＣ７およびＨＤＡＣ１１を感染させた細胞においても増加した（図８Ｆ）。ＤＮＭＴ１および複数のＨＤＡＣを阻害することで、Ｓｏｘ‐２タンパク質の発現が増加した。
【０１７７】
特定の態様について本明細書で例証し、説明してきたが、当業者であれば、同一の目的を達成するとことが意図されるいかなる設定も、示した特定の態様と置換することができることは理解されるであろう。本願は、説明した本発明の原理に従って作用するいかなる適応または変形をも包含することを意図している。従って、本発明は、請求項およびその均等物によってのみ限定されることを意図している。本願中で引用した特許、参考文献、および刊行物の開示事項は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【図１】
2011522514.tif 000010
【図２Ａ】
2011522514.tif 000011
【図２Ｂ】
2011522514.tif 000012
【図２Ｃ】
2011522514.tif 000013
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2011522514.tif 000015
【図２Ｆ】
2011522514.tif 000016
【図２Ｇ】
2011522514.tif 000017
【図２Ｈ】
2011522514.tif 000018
【図３】
2011522514.tif 000019
【図４】
2011522514.tif 000020
【図５】
2011522514.tif 000021
【図６】
2011522514.tif 000022
【図７Ａ】
2011522514.tif 000023
【図７Ｂ】
2011522514.tif 000024
【図７Ｃ】
2011522514.tif 000025
【図７Ｄ】
2011522514.tif 000026
【図７Ｅ】
2011522514.tif 000027
【図７Ｆ】
2011522514.tif 000028
【図７Ｇ】
2011522514.tif 000029
【図８Ａ】
2011522514.tif 000030
【図８Ｂ】
2011522514.tif 000031
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2011522514.tif 000034
【図８Ｆ】
2011522514.tif 000035
【図８Ｇ】
2011522514.tif 000036
【国際調査報告】
2011522514.tif 000037
2011522514.tif 000038