(57)【要約】  コーヒーの成熟を調整するための単離された核酸が開示される。また、このような遺伝子由来のプロモータも開示される。コーヒーの品質特性を改善するための上記核酸の使用方法が提供される。また、コーヒーなど植物ベースの農産物の品質を評価する方法も提供される。【選択図】  図２９
2011525353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ若しくは複数のＢＵＲＰドメイン、病原性関連タンパク質の１６個の保存システイン残基、又はタウマチンドメインを含むタンパク質をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒーノキ）から単離された核酸分子。
【請求項２】
前記タンパク質がＢＵＲＰドメインを含み、さらに、縦列反復のＴＸＶ若しくはＶＸＴを含む１つ又は複数のモチーフを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記タンパク質が脱水誘導タンパク質（ＤＩＰ）である、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記タンパク質が約３００〜４００個のアミノ酸残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
（ａ）前記タンパク質が、配列番号８若しくは９と５０％以上同一であるアミノ酸配列を有する、又は
（ｂ）前記コード配列が、配列番号１、３、若しくは４に記載されたコード配列と５０％以上同一である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記タンパク質が、病原性関連タンパク質の１６個の保存システイン残基、及びタウマチンドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記タンパク質が病原性関連（ＰＲ）タンパク質である、請求項１又は６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記ＰＲタンパク質が約２００〜２５０個のアミノ酸残基を含む、請求項１、６、及び７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
（ａ）前記タンパク質が、配列番号１０若しくは１１と６５％以上同一であるアミノ酸配列を有する、又は
（ｂ）前記コード配列が、配列番号５若しくは６に記載されたコード配列と５０％以上同一である、
請求項１、及び７〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記コード配列を含むオープンリーディングフレームを有する遺伝子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはその相補体を含む、又は請求項１０に記載の遺伝子の転写により生成されたｍＲＮＡ分子の逆転写により生成されたｃＤＮＡ分子。
【請求項１２】
ＤＩＰ又はＰＲ−５Ａタンパク質をコードする、コーヒー植物遺伝子から単離されたプロモータ。
【請求項１３】
（ａ）前記遺伝子が、約３００〜４００個のアミノ酸残基を含むＤＩＰタンパク質をコードする、
（ｂ）前記遺伝子が、配列番号８又は９と５０％以上同一であるアミノ酸配列を有するＤＩＰタンパク質をコードする、
（ｃ）前記遺伝子が、配列番号１、３、又は４に記載された配列と５０％以上同一であるオープンリーディングフレームを含む、
（ｄ）前記遺伝子が、約２００〜２５０個のアミノ酸残基を含むＰＲ−５Ａタンパク質をコードする、
（ｅ）前記遺伝子が、配列番号１０又は１１と６５％以上同一であるアミノ酸配列を有するＰＲ−５Ａタンパク質をコードする、
（ｆ）前記遺伝子が、配列番号５、又は７に記載された配列と５０％以上同一であるオープンリーディングフレームを含む、
（ｇ）前記プロモータが、配列番号２、３、６、又は７に提供された促進配列を含む、
請求項１６に記載のプロモータ。
【請求項１４】
ＴＡＴＡボックス、Ｅボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）応答エレメント（ＡＢＲＥ）、ジベレリン応答エレメント（ＧＡＲＥ）、ＭＹＢ結合部位モチーフ、ＧＡ−１モチーフ、又はＡＣＧＴコア含有モチーフである調節配列を１つ又は複数含む、請求項１６又は１７に記載のプロモータ。
【請求項１５】
植物において種子成熟後期に主に又は専ら機能する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のプロモータ。
【請求項１６】
１つ又は複数のコード配列に作動可能に連結された、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロモータを含むキメラ遺伝子。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはその相補体、
（ｂ）請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロモータ、又は
（ｃ）請求項１６に記載のキメラ遺伝子
を含むベクターであって、
前記ベクターがプロモータに作動可能に連結された少なくとも１つのコード配列を含む、ベクター。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはその相補体、
（ｂ）請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロモータ、
（ｃ）請求項１６に記載のキメラ遺伝子、又は
（ｄ）請求項１７に記載のベクター
により形質転換された細胞。
【請求項１９】
植物細胞である、請求項１８に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはその相補体、
（ｂ）請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロモータ、
（ｃ）請求項１６に記載のキメラ遺伝子、
（ｄ）請求項１７に記載のベクター、又は
（ｅ）請求項１８若しくは１９に記載の形質転換植物細胞
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［0001］本発明は一般に、農業バイオテクノロジーに関する。特に、本発明は、粒（豆）の発育及び成熟後期に主に発現する、コーヒー植物から単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、植物におけるこれらのポリヌクレオチドの発現を制御するプロモータ及びそれらの使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
［0002］コーヒーの種子（粒／豆）を含む種子の発育及び成熟は、遺伝子及びタンパク質発現における時間的に識別できる変化により駆動される、特異的な、厳重に制御された発育経路を辿る（Ｇｉｒｋｅ，Ｔ．ら、２０００年；Ｆａｉｔ，Ａ．ら、２００６年；Ｈａｊｄｕｃｈ，Ｍ．ら、２００５年；Ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．Ｄ．及びＭａｒｒａｃｃｉｎｉ，Ｐ．、２００６年））。種子の任意の遺伝子改変は、付加された「改変」導入遺伝子（複数可）が、種子において発現を「駆動する」ことができるプロモータ配列により制御される必要がある。導入された導入遺伝子の、植物の他の部分への「干渉」を制限するため、導入遺伝子の発現を駆動するのに使用されるプロモータは、特定の時間、例えば、特定の条件下又は種子発育の特定の段階の間にのみ機能することがしばしば望ましい。
【０００３】
［0003］現在、幾つかのコーヒーＤＮＡプロモータ配列が利用可能である。ｒｂｃＳプロモータなどのものは、葉のような緑色組織では導入遺伝子の強力な発現を、未熟粒では潜在的に極めて弱い発現を駆動することができる（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ，Ｐ．及びＲｏｇｅｒｓ  Ｊ．、２００６年）。コーヒー由来の葉特異的遺伝子プロモータは、内胚乳の形成及び膨張中に主にコーヒー種子において強力な発現を指示することができる。例えば米国特許第７，１５３，９５３号を参照のこと。１１Ｓプロモータ（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ，Ｐ．及びＲｏｇｅｒｓ  Ｊ．、２００３年）、コーヒー貯蔵タンパク質プロモータ（米国特許第６，６１７，４３３号）；オレオシンプロモータ（国際公開第２００７／００５９２８号パンフレット、Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら、２００６年ｂ）、デヒドリン（ｄｅｈｙｄｒｉｎ）プロモータ（国際公開第２００７／００５９８０号パンフレット、Ｔａｎｋｓｌｅｙ，Ｓ．ら、２００７年）及び（Ｈｉｎｎｉｇｅｒ，Ｃ．ら、２００６年）も同様である。
【０００４】
［0004］しかし、現在、専ら又はほぼ専らコーヒー粒成熟後期中に、組換え遺伝子の強力な発現を制御する利用可能なコーヒープロモータはない。この段階は、部分的な種子の脱水を含む成熟期である。どの種子についても文献に記載された、十分に特徴付けられた後期の粒特異的プロモータはほとんどない。コーヒー粒を含む種子の成熟をより良く理解するには、このような遺伝子エレメントを有することが重要と考えられる。このようなプロモータは、消費者のカップ中のコーヒーの品質を改善することを含む、多くの用途を有するであろう。これらのプロモータはまた、種子発育後期で組換え遺伝子を発現する効果のテストなど、実験研究も可能にする。
【０００５】
［0005］例えば、コーヒーの品質又は抽出性を改善する試みでは、内胚乳の発育／膨張中に候補遺伝子を発現することが粒における欠陥の原因になり得る可能性がある。しかし、発育後期に同じ候補遺伝子を発現することは、粒の構造／機能に効果をもたらさない可能性がある。発育後期に候補「コーヒー品質」遺伝子配列を発現する効果をテストすることが重要であるため、粒の発育後期プロモータが必要である。
【０００６】
［0006］現場では、コーヒーの成熟は一般に、レッドチェリー、及び／又はコーヒーチェリーフルーツ（果皮）の軟化に代表されると考えられている。しかし、全て十分に赤いチェリーの粒が、全ての異なる商業品種での完全な成熟に達したことを示す詳細な実験的証拠はほとんどない。事実、チェリーの「赤」色の進行は、少なくとも幾つかの品種では内部のコーヒー粒の最終発育より早く生じ得ると考えられる。さらに、全てのコーヒーはレッドチェリー期で収穫されることが理想であるが、成熟度の低いイエローチェリー及び時にはグリーン／イエローチェリーすら含む収穫（Ｃ．アラビカの機械収穫を含む）がかなりのレベルある。したがって、収穫されたコーヒーの複数のロット又はバッチが、ある程度の未熟粒を含有し得る。さらに、「未熟に関連する」欠陥は目立たないため、悪質な業者は、未熟及び成熟チェリーのバッチを混合して、バイヤーに「許容可能」なコーヒーロットを調製することが知られている。
【０００７】
［0007］このような未熟豆の存在は、グリーンコーヒーの重大な欠陥をもたらし得る（（Ｆａｒａｈ，Ａ．及びＤｏｎａｎｇｅｌｏ，Ｃ．Ｍ．、２００６年）及びその参考文献）。未熟豆に関連した風味品質の低下は、完熟前後の粒構造の違いを含む複数の要因による可能性が高い。未熟粒に存在する特定の成分は、収穫されたコーヒーのロットに未熟豆が存在する場合、風味品質に潜在的に有害となる可能性がある。例えば、ショ糖（Ｇｅｒｏｍｅｌ，Ｃ．ら、２００６年；Ｐｒｉｖａｔ，Ｉ．ら、２００６年）、コーヒーにおけるショ糖蓄積に関連した核酸及びタンパク質（国際公開第２００７／０２２３１８  Ａ２号パンフレット）のレベルの低下、並びにクロロゲン酸レベルの上昇（Ｆａｒａｈ，Ａ．及びＤｏｎａｎｇｅｌｏ，Ｃ．Ｍ．、２００６年）は、いずれもコーヒーの風味及び品質に有害な影響を及ぼし得る。
【０００８】
［0008］上記に示されたように、未熟粒の存在は、品質保証の欠如、適切な収穫慣行の欠如、又は倫理の欠如（例えば、国際的詐欺）によるか否かを問わず、最適以下又は劣ったコーヒーをもたらし、クオリティー又はプレミアムコーヒーのバイヤーにとって問題である。特に収穫慣行、混合、若しくは貯蔵条件がいずれも不明である、又はバイヤーの直接管理下にない場合、現在、コーヒー粒など貯蔵粒の成熟レベルを測定するのに利用可能なテストはない。農業又は工業環境においてコーヒーのロットにおける未熟粒の存在を検出できる方法及び手法が必要である。このような方法は、結果がロットの成熟を反映でき、故にロットの品質、格付け、容認性、又は価値を判定でき、例えば、コーヒー取引において有用となろう。このような方法はまた、トウモロコシ、大豆等を含む他の有益な粒又は種子の特性の判定にも有用となろう。
【０００９】
［0009］したがって、粒の発達及び成熟後期に主に発現される植物由来の遺伝子及びプロモータが依然として必要である。特に、コーヒー由来のそのようなポリヌクレオチド、及び農産物として使用される粒の品質評価におけるこれらのポリペプチドの使用方法が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
［0010］発育後期に粒で主に若しくは専ら発現され、かつ上記期間中に相当量の発現を示す遺伝子の同定及び単離が提示される。候補遺伝子は、Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｓ  ＳＯＬ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）におけるコーヒーＥＳＴデータベース（Ｃｏｆｆｅｅ  ＥＳＴ  Ｄａｔａｂａｓｅ）から最初に選択された。ＳＧＮコーヒーＥＳＴデータベースは、特に発育中の種子を中心に、５つの異なる段階／組織由来の約４７，０００個のｃＤＮＡクローンからの配列に基づき作成された。記載によれば「計算的に構築した場合、これらの配列は、機能アノテーション、発現プロファイル及び進化に関して分析された１３，１７５個のユニジーンに対応する。（Ｌｉｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００５年）Ｎｏｖ  ５；１〜１７頁を参照のこと）。
【００１１】
［0011］選択された候補遺伝子のうち２つ（後にＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａと命名）が、次いでさらなる詳細な試験のために選択された。プロモータが単離され、ＤＮＡ配列が確認された。分析は、ＤＩＰ１が粒特異的であり、ＤＩＰ１のプロモータは、特にコーヒー粒の発育の最終期において組換えタンパク質発現で使用するのに極めて良好な候補プロモータであると考えられることを示した。
【００１２】
［0012］最初の幾つかの態様では、本発明は、コーヒー（コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．））から単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、１つ若しくは複数のＢＵＲＰドメイン、病原性関連タンパク質の１６個の保存システイン残基、又はタウマチンドメインを含むタンパク質をコードするコード配列を有する。好ましい核酸分子は、配列番号１、３、４、５、及び７として添付配列表に提供されている。好ましくは、これらの分子は、配列が配列番号８〜１１として提供されるタンパク質をコードする。また、核酸分子、これらの遺伝子の転写により生成されたｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子の逆転写により生成されたｃＤＮＡ分子、及び本明細書で提供される核酸分子を含むベクターを含む遺伝子も提供される。核酸及びベクターを含む宿主細胞、並びに本明細書で提供される核酸を含む稔性トランスジェニック植物も提供される。
【００１３】
［0013］当業者であれば理解するように、核酸分子の塩基対合特性のため、及び２つの相補的核酸分子の情報内容が同一であり得るため、本明細書に記載された核酸分子の相補体も提供される。同様に本明細書に記載されたいずれかの核酸分子、又はその相補体を含むｃＤＮＡも提供される。
【００１４】
［0014］別の態様では、ＤＩＰ又はＰＲ−５Ａタンパク質をコードするコーヒー植物遺伝子から単離されたプロモータが提供される。好ましくは、プロモータが単離される遺伝子は、約３００〜４００個のアミノ酸残基を含むＤＩＰタンパク質、又は約２００〜２５０個のアミノ酸を含むＰＲ−５Ａタンパク質をコードする。本明細書で提供されるようなさまざまなプロモータは、ＴＡＴＡボックス、Ｅボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）応答エレメント（ＡＢＲＥ）、ジベレリン応答エレメント（ＧＡＲＥ）、ＭＹＢ結合部位モチーフ、ＧＡ−１モチーフ、若しくはＡＣＧＴコア含有モチーフなどの１つ又は複数の調節配列を含む。好ましくは、プロモータは、配列番号２、３、６、又は７のいずれかと高度に関連した配列を有する。また、１つ又は複数のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含むキメラ遺伝子も提供される。核酸、プロモータ、又はキメラ遺伝子を含むベクターも提供される。また、細胞、特に、記載されたベクター、核酸又はプロモータにより形質転換された植物細胞も本明細書で提供される。コーヒーノキの形質転換植物細胞、及びこれから作製された稔性トランスジェニック植物も本明細書で提供される。
【００１５】
［0015］さらに別の態様では、コーヒー豆の１つ又は複数の品質特性を改善する方法が提供される。方法は、主に又は専ら種子成熟後期にコーヒー種子で産生される１つ又は複数のタンパク質の産生を調節することを含む。好ましい方法では、１つ又は複数のタンパク質はＤＩＰ又はＰＲ−５Ａタンパク質であり、品質特性は、本明細書で提供される１つ若しくは複数の核酸、ベクター、宿主細胞、又はプロモータの使用により改善される風味又は香味の側面である。
【００１６】
［0016］別の態様では、本発明は、植物由来の農産物又はそのバッチの少なくとも１つの品質特性を評価する方法を提供する。方法は一般に、
植物由来の農産物又はそのバッチを用意するステップと、
存在が品質形質と正に関連する第１の分析物、及び存在が品質形質と負に関連する第２の分析物を含む少なくとも２つの分析物を選択するステップと、
植物由来の農産物の試料又はそのバッチの代表試料を得るステップと、
試料中の前記第１及び第２の分析物の相対量を、直接又は間接的に判定するステップと、
第１及び第２の分析物の各々の相対量、又はこれらの間の比に基づき品質形質を評価するステップと
を含む。
【００１７】
［0017］分析物の少なくとも１つがＲＮＡ又はタンパク質である方法が一般に使用される。好ましくは、少なくとも第１及び第２の分析物は、独立に、ＲＮＡ又はＤＩＰ若しくはＰＲ−５Ａタンパク質などのタンパク質、及び植物の異なる発育段階で作製された別のタンパク質である。また、好ましくは植物由来の農産物は、種子又は種子由来産物である。品質特性は好ましくは農産物が由来する植物又は植物の部分の成熟に関する。
【００１８】
［0018］本発明の他の及びさらなる態様、特徴、又は利点は、当業者に容易に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ゲノムウォーカー技術（ユニバーサルゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ）（商標）Ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いたコフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  ｃｖ．Ｃａｔｕｒｒａ）Ｔ２３０８からのＤＩＰ１プロモータ配列の単離方策を示す図である。ネステッドプライマーＧＷ１  １２４９５２  ＴＣＧＡＴＡＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＴＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号３０）及びＧＷ２  １２４９５２  ＴＴＣＣＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号３１）は、ｃＤＮＡクローンｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６の５’末端から設計された。これらは、ＰＣＲを用いてＣ．アラビカ・カトゥーラＴ２３０８ゲノムＤＮＡ由来の１１３６ｂｐのゲノムＤＮＡフラグメントを増幅するため、ＧＷキットプライマーＡＰ１及びＡＰ２と共に使用された。このフラグメントは、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯの中にクローン化されてｐＡＳ２２を得た（詳細は方法を参照のこと）。このプラスミドはまた、ｐＣＲ４−ＧＷ１２４９５２  ＃４Ｅとも呼ばれた。ｐＡＣ１におけるゲノムＤＮＡ配列は、ｐＡＳ２２の５末端から設計されたフォワードプライマーＤｉｐＡＣ１  Ｆ  ｇｔｃａｇｃｃａｃａｔｔａａｇａｇｃａｇｇ（配列番号３８）及びｃＤＮＡ（ＣｃＤｉｐ１）の３’非コード領域から設計されたリバースプライマーＤｉｐ１ＡＣ１  Ｒ  ｇｇｇｃａａｇｃａｔｔｔｇｇａｇｔｔｔｃ（配列番号３９）を用いて、ゲノムＤＮＡ（コフィア・アラビカ・カトゥーラＴ２３０８）からのＰＣＲ増幅により得られた。得られたフラグメントのサイズは２２４２ｂｐであり、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローン化された。このゲノム配列は、３つのエクソン及び２つのイントロンを含有した。
【図２】ゲノムウォーカー技術を用いたコフィア・アラビカ（Ｔ２３０８）からのＰＲ−５−Ａプロモータ配列の単離方策を示す図である。ＰＣＲは、プライマーＧＷ１−ｂ  １１９５１１  ＡＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＧ（配列番号３２）及びＧＷ２  １１９５１１  ＴＴＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧ（配列番号３３）を用いて、コフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｔ２３０８）由来のゲノムＤＮＡにより実施した。プライマーは、ｃＤＮＡクローンｐｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９の５’末端並びにＧＷプライマーＡＰ１及びＡＰ２から設計された。得られた１３８０ｂｐフラグメントは、ＰＣＲ増幅によりベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯの中にクローン化されてｐＡＣ７を得た（詳細は方法を参照のこと）。プロモータ及びタンパク質コード領域を含有するｐＡＣ１７−Ａのインサートが、次いで、ｐＡＣ７配列の５’末端から設計されたプライマーＰＲＰ−Ｆ２  ＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＧＡＣＧ（配列番号４２）、及びｃＤＮＡの３’非コード領域から設計されたプライマーＰＲＰ−Ｒ２ａ  ＧＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＴ（配列番号４３）を用いて、ゲノムＤＮＡ（コフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｔ２３０８）からＰＣＲ増幅により得られた。得られたフラグメントは１９８７ｂｐであり、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローン化された。新たな終止コドンＴＡＡがクローンｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９の終止コドンの前に６８塩基を作出したことにより、ＣＤＳ  ３’領域でのｐＡＣ１７−Ａに関する差が顕著である。
【図３Ａ】パネルＡ：ＤＩＰ１遺伝子に関するユニジーン１２４９５２（ＳＧＮ−Ｕ２９９３４５）のためのＥＳＴセットを示す図である。ユニジーン１２４９５２（ＤＩＰ１）のインシリコ配列を作成するために使用されるＥＳＴセットが提示されている。ｃＤＮＡクローンｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６がさらなる試験のため選択された。
【図３Ｂ】パネルＢ：ＤｉＰ２遺伝子に関するユニジーン１２１８８２（ＳＧＮ−Ｕ２９９５８７）のためのＥＳＴセットを示す図である。ユニジーン１２１８８２（ＤｉＰ２）のインシリコ配列を作成するのに使用されるＥＳＴセットが提示されている。ｃＤＮＡクローンｃｃｃｐ２１ｓｇｌがさらなる試験のため選択された。
【図３Ｃ】パネルＣ：ＣｃＰＲ−５Ａ遺伝子に関するユニジーン１１９５１１（ＳＧＮ−Ｕ２９９４０３）のためのＥＳＴセットを示す図である。ユニジーン１１９５１１（ＰＲ−５−Ａ）のインシリコ配列を作成するのに使用されるＥＳＴセットが提示されている。ｃＤＮＡクローンｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９がさらなる試験のため選択された。
【図４】ｃＤＮＡクローンｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６（脱水誘導タンパク質１；ＤＩＰ１）の配列を示す図である。Ａ）ｃＤＮＡクローン、ｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６（配列番号８）の完全長配列。ＯＲＦは通常のフォントで、開始及び終止コドンは下線が引かれている。ＵＴＲ（５’及び３’）はイタリック体で示されている。プライマー及び／又はプローブに対応する配列は、黒又はグレーで囲みされている。Ｂ）ＱＲＴ−ＰＣＲ実験に使用されるＴａｑｍａｎプローブ及びプライマーの配列；配列番号１５、１６、及び１７。Ｃ）「ゲノムウォーキング」を用いてＤＩＰ１プロモータを単離するのに使用されるプライマー、配列番号３０及び３１。
【図５】ｃＤＮＡクローンｐｃｃｃｐ２１ｓｇｌ（脱水誘導タンパク質２；ＤＩＰ２）の配列を示す図である。Ａ）ｃＤＮＡクローン、ｐｃｃｃｐ２１ｓｇｌ（配列番号９）の完全長配列。ＯＲＦは通常のフォントで、開始及び終止コドンは下線が引かれている。ＵＴＲ（５’及び３’）はイタリック体で示されている。プライマー及び／又はプローブに対応する配列は、グレーで囲みされている。Ｂ）ＱＲＴ−ＰＣＲ実験に使用されるＴａｑｍａｎプローブ及びプライマーの配列；配列番号１８、１９、及び２０。
【図６】ｃＤＮＡクローンｐｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９（病原性関連タンパク質群５；ＰＲ−５Ａの配列を示す図である。Ａ）ｃＤＮＡクローン、ｐｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９（配列番号１０）の完全長配列。ＯＲＦは通常のフォントで、開始及び終止コドンは下線が引かれている。ＵＴＲ（５’及び３’）はイタリック体で示されている。プライマー及び／又はプローブに対応する配列は、黒又はグレーで囲みされている。Ｂ）ＱＲＴ−ＰＣＲ実験に使用されるＴａｑｍａｎプローブ及びプライマーの配列；配列番号２１、２２、及び２３。Ｃ）「ゲノムウォーキング」を用いてＰＲ−５−Ａプロモータを単離するのに使用されるプライマー、配列番号５１及び３３。
【図７】ＮＣＢＩタンパク質データベースでの最も近いタンパク質配列による、ＣｃＤＩＰ１（クローンｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６）及びＣｃＤＩＰ２（クローンｃｃｃｐ２１ｓｇｌ；ユニジーンＣＧＮＵ１２１８８２）のアライメントを示す図である。    パネルＡ：配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＷプログラムを用いて整列され、アライメントは次いで手動でさらに最適化された。最も保存されたアミノ酸がグレーで網掛けされている。ＢＵＲＰドメインは２つのＦＦ残基（点線囲み）で始まる黒線で区切られている。４つのＣＨモチーフは二重の黒い実線で囲みされ、保存アミノ酸Ｐ、Ｔ及びＷは黒い単線で囲みされている。縦列反復モチーフＴＸＶ及びＶＸＴは一重破線囲みによりマークされ、ＤＩＰ１特異的モチーフは二重破線囲みによりマークされている。脱水誘導タンパク質ＲＤ２２様相同体のアクセッション番号は、ヴァイティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）ＲＤ２２、ＡＹ６３４２８２（配列番号４４）；ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ）ＲＤ２２（ＲＤＬ２）、ＡＹ６４１９９１（配列番号４５）；ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＲＤ２２、ＡＹ０７２８２１（配列番号４６）；及びアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＲＤ２２、ＡＹ０６０５６０（配列番号４７）である。    パネルＢ：有根系統樹は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて最適化アライメントから作成された（詳細はＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを参照のこと）。
【図８】ＮＣＢＩタンパク質データベースでの最も近いタンパク質配列による、ＣｃＰＲ−５Ａ（クローンｃｃｃｓ４６ｗｌ６ｎｌ９；ユニジーンＣＧＮ−Ｕｌ１９５１１）のアライメントを示す図である。    パネルＡ：配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＷプログラムを用いて整列され、次いでこのアライメントは手動でさらに最適化された。最も保存されたアミノ酸がグレーで網掛けされている。１６個の保存システインの各々が黒で囲みされ、タウマチン関連タンパク質で見出されたモチーフが破線囲みにより区切られている。    パネルＢ：有根系統樹は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて最適化アライメントから作成された（詳細はＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを参照のこと）。ＰＲ−５Ａ様相同体のアクセッション番号は、ＡｄＴＬＰ、アクチニジア・デリシオーサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）（ＡＪ８７１１７５）由来のタウマチン様タンパク質（配列番号４８）；ＨａＰＲＰ、ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ＡＦ３６４８６４）由来の病原性関連タンパク質（配列番号４９）；及びＦａＯＬＰ、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ）（ＡＦ１９９５０８）由来のオスモチン様タンパク質（配列番号５０）である。
【図９】ＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの疎水性プロファイルを示す図である。プロファイルは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）の中のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプログラムの方法を用いて得られた。負の値は疎水性に対応する。３つのタンパク質のＮ末端配列が極めて疎水性であり、おそらくシグナルペプチドに対応する。残りのポリペプチド配列は、主に親水性である。
【図１０】ｐＡＳ２２、ｐＡＣ１、及びｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６の配列から推定される、ＤＩｐ１プロモータのインシリコ配列及びコフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．ｃｖ  Ｃａｔｕｒｒａ）（Ｔ２３０８）由来のコード配列を示す図である。プラスミドｐＡＳ２２でのＤｉｐ１プロモータの５’領域は黒い大文字で囲みされ、プラスミドｐＡＣ１に由来するＤｉｐ１プロモータの３’領域はイタリック体の大文字で示され、ｐＡＣ１の５’及び３’非コード領域は破線囲みにより囲みされ、Ｄｉｐ１タンパク質コード配列及びｐＡＣ１のイントロンは大文字である（タンパク質配列は大文字、イントロン配列は小文字、及び推定スプライスシグナルは下線が引かれている）。３’非コード領域配列の末端はｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６に由来し、イタリック体の大文字で示されている。ＡＳ２２及びｐＡＣ１の配列間のヌクレオチドの差は、太字の大文字であるｐＡＣ１配列で顕著である。ｐＡＣ１プラスミド配列は、フォワードプライマーＤｉｐＡＣ１  Ｆ  ｇｔｃａｇｃｃａｃａｔｔａａｇａｇｃａｇｇ（配列番号３８）及びリバースプライマー  ｇｇｇｃａａｇｃａｔｔｔｇｇａｇｔｔｔｃ（配列番号３９）（グレーの囲み中で網掛けされた、小文字イタリック体）によりコフィア・アラビカＴ２３０８のゲノムＤＮＡから増幅された。タンパク質配列の開始コドン及び終止コドンがアスタリスクでマークされている。注：プライマーフォワードＤｉｐ１Ａ  Ｆ５  ＧＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＴＧ（配列番号３６）及びリバースＤｉｐ１Ａ  Ｒ５  ＴＡＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣ（配列番号３７）（大文字の網掛けグレー囲み）もこの配列に有用であった。
【図１１】ＣｃＤＩＰ１のプロモータ配列を示す図である。ＤＩＰ１プロモータ配列は、コフィア・アラビカ（Ｔ２３０８）ゲノムＤＮＡ由来のプライマーＤｉｐ１Ａ  Ｆ５及びＤｉｐ１Ａ  Ｒ５により増幅され、次いでｐＣＲ４−ＴＯＰＯの中にクローン化されてｐＡＳ２２を得た。この配列は、ＰＬＡＣＥウェブシグナルスキャンプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／ｓｉｇｎａｌｓｃａｎ．ｈｔｍｌ）を用いて分析された。イタリック体大文字の配列は、（下線が引かれたＡＴＧで始まる）ｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６由来のＵＴＲ  ｃＤＮＡ配列に対応し、太字の配列はＣｃＤｉｐ１遺伝子（小文字のイントロン）の５’配列に対応する。イタリック体大文字の上流の大文字の配列は上流プロモータ配列である。推定「ＴＡＴＡボックス」は下線を引かれ、見出されたさまざまな転写因子モチーフが示されている（例えばＥボックス（二重線囲み）、ＭＹＢ（太線囲み）、ＡＢＲＥ（破線囲み）、ＧＡＲＥ（ジグザク囲み）、及びＧＡ−１（黒い単線囲み））。
【図１２Ａ】パネルＡ：ｐＡＣ１７−Ａにクローン化されたｐＰＲ−５Ａプロモータ配列及びコフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．ｃｖ  Ｃａｔｕｒｒａ）（Ｔ２３０８）由来のコード配列を示す図である。ｐＰＲ−５−Ａの残りのプロモータ配列及びコード配列はプラスミドｐＡＣ１７−Ａ由来であり、プロモータ領域は黒い囲み中に普通の大文字で示され、及びコード配列は開始コドン（アスタリスクでマークされた＊ＡＴＧ）の下流に示されている。ｐＡＣ１７−Ａのインサートは、フォワードプライマーＰＲＰ−Ｆ２  ＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＧＡＣＧ（配列番号４２）及びリバースプライマーＰＲＰ−Ｒ２ａ  ＧＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＴ（配列番号４３）（黒に網掛けされた（白抜き））により、コフィア・アラビカＴ２３０８由来のゲノムＤＮＡから増幅された。開始及び終止コドンがアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９のＴＧＡ終止コドンの前に６６塩基を作出したことにより、ＣＤＳ３’領域でｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１２Ｂ−１】パネルＢ：ｐＡＣ７、ｐＡＣ１７−Ａ及びｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の配列のアライメントを示す図である。配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＶプログラムを用いて整列された。プロモータ領域は実線囲み中に示され、コード配列は破線で囲みされ、３’非コード領域は点線で囲みされている。開始及び終止コドンがそれぞれアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（＊ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の終止コドン（＊ＴＧＡ）の前に６６塩基を生成したため、ＣＤＳ３’領域におけるｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１２Ｂ−２】パネルＢ：ｐＡＣ７、ｐＡＣ１７−Ａ及びｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の配列のアライメントを示す図である。配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＶプログラムを用いて整列された。プロモータ領域は実線囲み中に示され、コード配列は破線で囲みされ、３’非コード領域は点線で囲みされている。開始及び終止コドンがそれぞれアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（＊ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の終止コドン（＊ＴＧＡ）の前に６６塩基を生成したため、ＣＤＳ３’領域におけるｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１２Ｂ−３】パネルＢ：ｐＡＣ７、ｐＡＣ１７−Ａ及びｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の配列のアライメントを示す図である。配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＶプログラムを用いて整列された。プロモータ領域は実線囲み中に示され、コード配列は破線で囲みされ、３’非コード領域は点線で囲みされている。開始及び終止コドンがそれぞれアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（＊ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の終止コドン（＊ＴＧＡ）の前に６６塩基を生成したため、ＣＤＳ３’領域におけるｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１２Ｂ−４】パネルＢ：ｐＡＣ７、ｐＡＣ１７−Ａ及びｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の配列のアライメントを示す図である。配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＶプログラムを用いて整列された。プロモータ領域は実線囲み中に示され、コード配列は破線で囲みされ、３’非コード領域は点線で囲みされている。開始及び終止コドンがそれぞれアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（＊ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の終止コドン（＊ＴＧＡ）の前に６６塩基を生成したため、ＣＤＳ３’領域におけるｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１２Ｂ−５】パネルＢ：ｐＡＣ７、ｐＡＣ１７−Ａ及びｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の配列のアライメントを示す図である。配列は、ＤＮＡＳＴＡＲパッケージの中のクラスタルＶプログラムを用いて整列された。プロモータ領域は実線囲み中に示され、コード配列は破線で囲みされ、３’非コード領域は点線で囲みされている。開始及び終止コドンがそれぞれアスタリスクでマークされている。ｐＡＣ１７−Ａ配列は、新たな終止コドン（＊ＴＡＡ）がクローンｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９の終止コドン（＊ＴＧＡ）の前に６６塩基を生成したため、ＣＤＳ３’領域におけるｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９クローン配列との差を示した。
【図１３】ＣｃＰＲ−５−Ａのプロモータ配列を示す図である。ｐＡＣ７プラスミドにおけるｐＰＲ−５−Ａプロモータ配列は、ＰＬＡＣＥウェブシグナルスキャンプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／ｓｉｇｎａｌｓｃａｎ．ｈｔｍｌ）を用いて分析された。普通の大文字中の配列は、（下線が引かれたＡＴＧで始まる）ｐｃｃｃｓ４６ｗ１６ｎｌ９におけるｃＤＮＡ配列の５’ＵＴＲに対応し、太字大文字の配列はＣｃＰＲ−５−Ａ遺伝子に対応する。黒の配列は上流プロモータ配列である。推定「ＴＡＴＡボックス」は太字黒線で囲みされ、見出されたさまざまな転写因子モチーフが前の図のように記述されている。グレーに網掛けされた配列は、使用されたプライマー、５’ＡＰ２  ＧＷ、及びプライマーＧＳＰ２  １１９５１１に対応する。
【図１４】コフィア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）及びコフィア・アラビカの異なる組織におけるＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの相対的発現レベルを示す図である。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、構成的発現遺伝子（リボソームタンパク質ＣｃＲＰＬ３９）の発現に対する各遺伝子の相対的発現（ＲＱ）を判定するための方法に記載された通りに実施された。テストされた組織には：ＳＧ−Ｇ、小グリーン粒；ＬＧ−Ｇ、大グリーン粒；Ｙ−Ｇ、イエロー粒；Ｒ−Ｇレッド粒；ＳＧ−Ｐ、小グリーン果皮；ＬＧ−Ｐ、大グリーン果皮；Ｙ−Ｐ、イエロー果皮；Ｒ−Ｐ、レッド果皮；コフィア・アラビカＴ２３０８及びコフィア・カネフォラＢＰ４０９由来の根、茎、葉、及び花が含まれる。試料ごとに与えられた値は、試料ごとに３つの複製により、同じｃＤＮＡ試料を用いた２つ又は３つの独立した実験の平均である。発現はＣ．カネフォラの花についてはテストされなかった。パネルＡ、ＤＩＰ１；パネルＢ、ＤＩＰ２；パネルＣ、ＰＲ−５Ａ。
【図１５】コフィア・アラビカ（Ｔ−２３０８）の葉の発育の異なる段階でのＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの相対的発現レベルを示す図である。各遺伝子の相対的発現（ＲＱ）レベル対リボソームタンパク質ＣｃＲＰＬ３９を判定するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲが実施された。ＶＹＬ、極めて若い葉；ＹＬ、若葉；ＭＬ、成熟葉；ＯＬ、古い葉。パネルＡ、ＤＩＰ２；パネルＢ、ＰＲ−５Ａ。
【図１６】コフィア・アラビカ（Ｔ−２３０８）の発芽中のＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの相対的発現レベルを示す図である。構成的発現遺伝子ＣｃＲＰＬ３９の発現レベルに対する各遺伝子の発現レベルを判定するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲが実施された。発芽試料が調製され、ＲＮＡは方法に記載された通りに精製された。Ｊ０（水で粒をすすいだ後に採取された）；試料Ｊ２、Ｊ３、Ｊ５、Ｊ３０、及びＪ６０は、発芽２、３、５、３０及び６０日目を表す。パネルＡ、ＤＩＰ１；パネルＢ、ＤＩＰ２；パネルＣ、ＰＲ−５Ａ。
【図１７】水ストレスを受けたコフィア・カネフォラ遺伝子型ＦＲＴ０４及びＦＲＴ２３の２つの小さな木の葉における、ＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの相対的発現レベルを示す図である。異なるレベルの水ストレス中の各遺伝子の相対的発現レベル対遺伝子ＣｃＲＰＬ３９の発現レベルを判定するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲが実施された）。Ｔ０は撒水を停止する前に採取された試料を表す；Ｔ５及びＴ６は、撒水を停止した５及び６週間後に採取された試料を表す。パネルＡ、ＤＩＰ１；パネルＢ、ＤＩＰ２；パネルＣ、ＰＲ−５Ａ。
【図１８】塩ストレス下のコフィア・カネフォラ遺伝子型ＦＲＴ１２のマイクロカッティングにおけるＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５−Ａの相対的発現レベルを示す図である。ＢＱ３培地及び追加の５０ｍＭ  ＮａＣｌに置かれたマイクロカッティングにおける各遺伝子の相対的発現（ＲＱ）を判定するため、定量的ＲＴＰＣＲが実施された。ＲＱ（相対的発現）は、ＣｃＲＰＬ３９発現に対して判定された。試料は、処置の２、７、及び１０日後に採取された。対照マイクロカッティングは同時に育成されたが、ＢＱ３培地（ＮａＣｌなし）に移された。パネルＡ、ＤＩＰ１；パネルＢ、ＤＩＰ２；パネルＣ、ＰＲ−５Ａ。
【図１９】Ｃ．カネフォラ遺伝子型Ｑ１２１の発育中の粒におけるＤＩＰ１、ＬＥＡＰ１、及びＯＬＥ１の相対的発現レベルを示す図である。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて異なる発育段階の粒について、各遺伝子の相対的発現（ＲＱ）が測定された。ＲＱは、ＣｃＲＰＬ３９発現に対して判定された。ＲＮＡは、開花から２２、２６、３０、３４、３６、及び４２週間後に収穫されたチェリーの粒から抽出された。パネルＡ、ＤＩＰ１；パネルＢ、ＤＩＰ２；パネルＣ、ＰＲ−５Ａ。
【図２０】定量的ＰＣＲを用いた予混合ｃＤＮＡ試料におけるＤＩＰ１、ＬＥＡＰ１、及びＯＬＥ１転写産物発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の評価を示す図である。図１８で使用されたように、未熟粒（例えば、２６週又は３０週）及び成熟粒（例えば、４２週）由来のさまざまなパーセンテージのＲＮＡが混合された。ＤＩＰ１、ＬＥＡＰ１及びＯＬＥ１の相対的発現が、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて混合試料で測定された。ＲＱは、ＣｃＲＰＬ３９発現に対して判定された。Ｑ１２１未熟／成熟混合物は、それぞれ５／９５、１０／９０、２０／８０、及び５０／５０パーセントであった。パネルＡ、未熟＝２６週；パネルＢ、未熟＝３０週。
【図２１】成熟Ｃ．カネフォラＦＲＴ０９果実の貯蔵されたグリーンコーヒー粒から抽出された全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す図である。ＲＮＡ抽出は、貯蔵されたＣ．カネフォラＦＲＴ０９グリーン粒の１つのロットの４つの別個の試料から行われ、次いでＲＮＡゲルに流された。レーンは次の試料を含有した：レーンＡ、１１−ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ１、レーンＢ、１３−ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ２、レーンＣ、１２−ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ３、及びレーンＤ、１３−ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−２００５。＊でマークされたレーンＣからの試料は、ｃＤＮＡ産生及びＱＰＣＲ実験用に選択された。
【図２２】１年以上、周囲温度で貯蔵された６つの異なるＣ．カネフォラ変種の乾燥グリーン粒由来の全ＲＮＡを示す図である。成熟したレッド果実は、エクアドルのコーヒー農場で収穫された。果実は乾燥処理され、輸送され、及び図１１で試料について記載された通りに貯蔵された。水（５μｌ）中のＲＮＡ試料は、１０μｌのＲＮＡ試料添加緩衝液（Ｓｉｇｍａ社、Ｒ１３８６）に添加され、及び６５℃で１５分間加熱された。レーンは次の試料を含有した：レーンＥ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ０７（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ０７−Ａ）；レーンＦ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  １７（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ１７−Ａ）；レーンＧ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ２８（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ２８−Ａ）；レーンＨ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ４９（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ４９−Ａ）；レーンＩ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ５３（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ５３−Ａ）；レーンＪ、Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ７２（ＲＮＡ−成熟１−ＦＲＴ７２−Ａ）；レーンＫ、受精から４２週間後に収穫され、及び−８０℃で貯蔵されたＣ．カネフォラＢＰ  ３５８チェリー由来の対照ＲＮＡ（ＲＮＡ−成熟１−ＢＰ  ３５８  ４２Ｗ）試料（ＩＣＣＲＩ農場産）。レーンＨ、Ｉ、及びＫからの試料（それぞれ＊でマークされた）は、ＱＲＴ−ＰＣＲ実験で使用された。
【図２３】Ｃ．アラビカ、及びＣ．カネフォラの成熟コーヒー種子由来の全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す図である。    レーンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、温室で収穫され、及び直ちに処理されたＣ．アラビカＴ２３０８由来の対照新鮮成熟レッドスキン種子である。レーンＡ：収穫時に凍結されたＴ２３０８（脱パルプ凍結された（ｄｅｐｕｌｐｅｄ  ｆｒｏｚｅｎ））；レーンＢ：収穫時に洗浄及び凍結されたＴ２３０８；レーンＣ：洗浄され及び４５℃で１日間乾燥され、次いで凍結されたＴ２３０８；レーンＤ：洗浄され及び４５℃で５日間乾燥され、次いで凍結されたＴ２３０８；レーンＥ：洗浄され及び４５℃で７日間乾燥され、次いで凍結されたＴ２３０８。    レーンＦ、Ｇ、Ｈ、及びＩは、エクアドルで収穫され、処理され、乾燥され、及び実験室で室温にて１年間貯蔵された粒である。レーンＦ：Ｃ．アラビカＣＣＡ  １２；レーンＧ：Ｃ．アラビカＣＣＡ  ２１；レーンＨ：Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ０９；レーンＩ：Ｃ．カネフォラＦＲＴ  ６３。
【図２４】さまざまな粒試料におけるＤＩＰ１及びＯＬＥ１の転写産物レベルの比較。３つの異なる乾燥貯蔵されたＣ．カネフォラグリーン粒試料から単離されたＲＮＡにおける、ＯＬＥ１及びＤＩＰ１遺伝子の相対的転写産物レベルを判定するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲが使用された。比較目的のため、２つの異なる発育段階でＣ．カネフォラＢＰ３５８の新鮮凍結粒試料で見出された転写産物レベルも判定された（−８０℃で凍結貯蔵された全チェリー）。全ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ産生は、材料及び方法に記載されている。相対的発現（ＲＱ）は、ＣｃＲＰＬ３９発現に対して判定された。新鮮凍結試料に対応するＲＮＡ試料は、受精からそれぞれ４２及び４６週間後に収穫されたＣ．カネフォラＢＰ３５８チェリー由来であった。周囲温度で１年間貯蔵された成熟乾燥グリーン粒試料に対応するＲＮＡ試料は、それぞれＣ．カネフォラＦＲＴ  ０９、ＦＲＴ  ４９、及びＦＲＴ  ５３由来であった。
【図２５】ＣｃＤＩＰ１  ｃＤＮＡに関するＱＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブ位置を示す図である。矢印は、フォワード及びリバースプライマー、Ｆｗｄ  １２４５９２、Ｓｏｎｄｅ  ＭＧＢ９５２、Ｒｅｖ．  １２４９５２に対応する配列を示す。
【図２６】ＣｃＲＰＬ３９  ｃＤＮＡに関するＱＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブ位置を示す図である。矢印は、フォワード及びリバースプライマー、Ｒｐｌ  ３９  Ｆ、Ｒｐｌ  ３９  Ｒ、Ｓｏｎｄｅ  ＭＧＢ  Ｒｐｌ３９に対応する配列を示す。
【図２７】ＣｃＯｌｅ１  ｃＤＮＡに関するＱＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブ位置を示す図である。矢印は、フォワード及びリバースプライマー、Ｆｗｄ８５１、Ｓｏｎｄｅ  ＭＧＢ８５１、Ｒｅｖ．  ８５１に対応する配列を示す。
【図２８】ＣｃＬＥＡ−１  ｃＤＮＡに関するＱＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー及びプローブ位置を示す図である。矢印は、フォワード及びリバースプライマー、ＣｃＬＥＡＰ１  Ｆ１、Ｓｏｎｄｅ  ＭＧＢ、ＣｃＬＥＡＰ１  Ｒ１に対応する配列を示す。
【図２９】インビトロでの播種から２カ月後の、コフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｔ２３０８）及びコフィア・カネフォラ・ロブスタ（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ｃｖ  Ｒｏｂｕｓｔａ）（ＦＲＴ０５）の発芽種子の図である。種子発育の不均一のほか、顕著なアラビカ対ロブスタ根発育を見ることができる。発現実験のため、各特定期間に最も発育した苗木のみがＲＮＡ抽出用に採取された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
［0058］生体分子及び他の本発明の態様に関するさまざまな用語が本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される。
【００２１】
［0059］「脱水誘導タンパク質（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」すなわち「ＤＩＰ」は、他のタンパク質群と共通する１つ又は複数の構造的特徴を含むタンパク質群であり、この幾つかは植物における脱水ストレスに関連している。このような構造的特徴には、１つ又は複数のＢＵＲＰドメイン、特にＣ末端ＢＵＲＰドメイン；特にＢＵＲＰドメイン内の保存ＦＦモチーフ、同様に好ましくはＢＵＲＰドメイン内の１つ又は複数の保存ＣＨモチーフ；好ましくは１つ又は複数の反復配列中のモチーフＴＸＶ及び／又はＶＸＴ；シグナルペプチド、及び大部分が親水性の（成熟）タンパク質配列が含まれ得るが、これらに限定されない。ＤＩＰタンパク質は、好ましくは約３００〜４００個のアミノ酸残基長であり、ヴァイティス・ビニフェラＲＤ２２、ゴシピウム・アルボレウムＲＤ２２（ＲＤＬ２）、ゴシピウム・ヒルスツムＲＤ２２、及びアラビドプシス・タリアナＲＤ２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、それぞれＡＹ６３４２８２、ＡＹ６４１９９１、ＡＹ０７２８２１，及びＡＹ０６０５６０）（配列番号、それぞれ４４、４５、４６、４７）を含む脱水誘導タンパク質ＲＤ２２様相同体と系統発生的に関連している。名称「脱水誘導タンパク質」にもかかわらず、水ストレス、干ばつストレス、浸透圧ストレス下で、又はいずれか他の特定のストレス因子若しくは条件により該タンパク質が必ず誘導されることを必要とする、ＤＩＰタンパク質に特有のものはない。
【００２２】
［0060］「病原性関連タンパク質」すなわち「ＰＲ」タンパク質は、他のタンパク質群と共通する１つ又は複数の構造的特徴を含むタンパク質群であり、この幾つかは病原体、例えば、真菌病原体、又は植物における浸透圧ストレスに対する反応に関連している。このような構造的特徴には、タウマチン関連タンパク質で見出される１つ又は複数のタウマチンドメイン（又は「タウマチンモチーフ」）；タンパク質全体の１つ又は複数（最大１６個以上）の保存システイン残基；シグナルペプチド、及び大部分が親水性の（成熟）タンパク質配列が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明のＰＲタンパク質は、好ましくは約２００〜２５０個のアミノ酸残基長であり、並びにＡｄＴＬＰ（アクチニジア・デリシオーサ由来のタウマチン様タンパク質）、ＨａＰＲＰ（ヘリアンサス・アンヌス由来の病原性関連タンパク質）、及びＦａＯＬＰ（フラガリア・アナナッサ由来のオスモチン様タンパク質）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、それぞれＡＪ８７１１７５、ＡＦ３６４８６４，及びＡＦ１９９５０８）（配列番号、それぞれ４８〜５０）を含むＰＲ−５Ａ様相同体と系統発生的に関連している。名称「病原性関連タンパク質」にもかかわらず、病原体の侵入若しくは感染（いずれかの病原体への曝露による）に反応して、又は水、干ばつ、若しくは浸透圧ストレス、又はいずれか他の特定の条件若しくはストレス因子により、該タンパク質が必ず誘導されることを必要とする、ＰＲタンパク質に特有のものはない。
【００２３】
［0061］本明細書では、「成熟後期」とは、種子又は粒の成熟に関連した生物学的変化が生じる期間であって、種子又は粒が「成熟した」とみなされる前の期間を指す。成熟後、種子は典型的には、含水量が低く、呼吸を含む代謝活性が低下し、及び特定の保護化合物の蓄積により厳しい条件を生き抜くのに適応している。種子成熟過程は、貯蔵産物の最終蓄積などの代謝変化、休眠誘導及び／又は早期発芽抑制、並びに他の変化（例えば、Ｂｅｗｌｅｙ及びＢｌａｃｋ、１９９４年を参照のこと）を含む場合が多い。これらの代謝変化はまた、成熟中の種子内での遺伝子発現における多くの変化にも反映される。故に、幾つかの種子では、成熟は、後期胚形成主要遺伝子（ｌａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｇｅｎｅ）又は貯蔵化合物遺伝子などの特定の既知の種子成熟遺伝子の発現を特徴とする。場合により、種子は最終期の間又は後にのみ生殖に適するようになる。実際は複雑な生理学的又は生物学的過程であるが、種子成熟段階は、第１段階（胚の形成を特徴とする形態学的発育）、これに続く第２段階、すなわち細胞増殖段階（食品貯蔵物（ｆｏｏｄ  ｒｅｓｅｒｖｅｓ）が産生及び蓄積される）を含むことが便宜上しばしば記載される。成熟の最終期は、種子の脱水を特徴とし、並びに種子の水重量及び果実重量の減少、及び種子の乾燥重量の着実な増加により特徴付けられる。種子は乾燥で休眠となり、及び場合により生存能力を実質的に失うことなく、以後長時間しばしば貯蔵され得る。適切に乾燥された成熟種は、多くの病原体に耐性がある場合が多い。
【００２４】
［0062］「単離されて」は、自然状態から「人の手により」変化させられたことを意味する。組成物又は物質が自然に生じる場合、元の環境から変化若しくは除去された、又はこの両方である場合に、組成物又は物質は「単離されて」いる。例えば、生きている植物又は動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されて」いないが、自然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、該用語が本明細書で使用される場合、「単離されて」いる。
【００２５】
［0063］「核酸」又は「核酸分子」とも呼ばれる「ポリヌクレオチド」とは、一般に、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得るいずれかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖領域、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドには、１つ又は複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由で骨格修飾を有するＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの珍しい塩基が含まれる。種々の修飾がＤＮＡ及びＲＮＡに行われ得る。故に、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるような化学、酵素又は代謝修飾型のポリヌクレオチド、並びにウイルス及び細胞に特徴的な化学型のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
【００２６】
［0064］「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合により互いに結合された２個以上のアミノ酸、すなわち、ペプチドアイソスターを含むいずれかのペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、通常ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと呼ばれる短い鎖、及び一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスにより、又は当技術分野でよく知られた化学修飾法により修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾は、基本的な教科書及びより詳細なモノグラフ、並びに膨大な研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこででも生じ得る。同じタイプの修飾が、特定のポリペプチドの幾つかの部位に同程度又はさまざまな程度で存在し得ることが理解されよう。また、特定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有することができる。ポリペプチドはユビキチン化の結果分岐され得、及びポリペプチドは分岐の有無にかかわらず環状になり得る。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得、又は合成法により作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化が含まれる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年、及びＷｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３年；Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０年）１８２：６２６〜６４６頁、及びＲａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２年）６６３：４８〜６２頁を参照のこと。
【００２７】
［0065］「変異体」は、該用語が本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、もう１つの、参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても又はさせなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に論じられるように、参照配列によりコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすことができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、もう１つの、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、違いは、参照ポリペプチド及び変異体の配列が全体として密接に類似し、並びに多くの領域で同一であるように限定される。変異体及び参照ポリペプチドは、いずれかの組合せの１つ又は複数の置換、付加又は欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子多型など自然発生であってもよく、又は自然に発生することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの非自然発生変異体は、突然変異誘発法又は直接合成により作製することができる。
【００２８】
［0066］変異植物に関して、用語「ヌル変異」又は「機能喪失突然変異」は、遺伝子産物を非機能的にする又はほとんど消失させる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を指名するのに使用される。このような突然変異は、遺伝子のコード及び／又は調節領域で生じ得、並びに核酸領域の個々の残基の変化、又は挿入若しくは欠失であり得る。これらの突然変異は、タンパク質が非機能的又はほとんど消失するように、遺伝子及び／又はコードされたタンパク質を調節又は制御することができる他の遺伝子のコード及び／又は調節領域でも生じ得る。
【００２９】
［0067］用語「実質的に同じ」とは、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定性の特徴、基質特異性及び／又は生物活性）に著しく影響することがない配列変異を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。特に核酸配列に関して、用語「実質的に同じ」は、コード領域及び発現を支配する保存された配列を指すことを意図し、主に、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、又はコードされたポリペプチド中の保存的置換アミノ酸をコードする代替コドンを指す。アミノ酸配列に関して、用語「実質的に同じ」は一般に、構造又は機能の決定に関与しないポリペプチド領域における保存的置換及び／又は変異を指す。
【００３０】
［0068］用語「パーセント同一である」及び「パーセント類似の」も、アミノ酸及び核酸配列間の比較において本明細書で使用される。アミノ酸配列に言及する場合、「同一性」又は「パーセント同一である」とは、配列分析プログラムにより比較されたアミノ酸配列において、同一のアミノ酸とマッチした対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「パーセント類似の」とは、同一の又は保存されたアミノ酸とマッチした対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存されたアミノ酸は、構造は異なるものの、１つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換が、得られたタンパク質の三次構造を明らかには変化させないほど物理的特性が類似するものである。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ（１９８６年、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９：２０５頁）で定義されている。核酸分子に言及する場合、「パーセント同一の」とは、配列分析プログラムにより同一のヌクレオチドとマッチした対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
【００３１】
［0069］「同一性」及び「類似性」は、既知の方法により容易に計算することができる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似した配列を整列させ、故に違いを明らかにするコンピュータプログラムを用いて比較することができる。好ましい方法では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びこの中で使用されるパラメータが使用され、及びゲノムＤＮＡ配列の配列フラグメントを整列させるのにＤＮＡｓｔａｒシステム（マジソン、ＷＩ）が使用される。しかし、同等のアライメント及び類似性／同一性評価は、任意の標準的なアライメントソフトウェアの使用により得ることができる。例えば、ウィスコンシン州マジソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社から入手可能なＧＣＧウィスコンシンパッケージ第９．１版、及びこのプログラムにより使用される初期設定パラメータ（ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）も、配列同一性及び類似性を比較するのに使用することができる。
【００３２】
［0070］本明細書では「抗体」には、Ｆａｂ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、及びヒト化抗体、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が含まれる。抗体に関して、用語「免疫学的に特異的な」又は「特異的な」とは、目的のタンパク質の１つ又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識及び結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を判定するスクリーニングアッセイは当技術分野でよく知られており、日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８年）、第６章を参照のこと。
【００３３】
［0071］用語「実質的に」は、半分を超える及びより好ましくは、３分の２、又は４分の３を超えることを意味し、より好ましくは該用語は、少なくとも８０又は９０％、９５％、９９％、又は９９％以上を意味する。「実質的に純粋な」とは、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は目的の化合物を少なくとも７５重量％、及び最も好ましくは９０〜９９重量％含む。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフ法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）により測定される。
【００３４】
［0072］一本鎖核酸分子に関して、用語「特異的にハイブリダイズすること」とは、当技術分野で一般に使用される所定の条件下でこのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の関係を指す（時には「実質的に相補的な」と呼ばれる）。特に、該用語は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有された実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指し、非相補的配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な除外を指す。
【００３５】
［0073］「コード配列」又は「コード領域」とは、配列が発現される場合に、アミノ酸又はポリペプチドなどの遺伝子産物を産生するのに必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含んでもよく、又はこのような介在非翻訳配列を欠いてもよい（例えば、ｃＤＮＡでのように）。
【００３６】
［0074］用語「イントロン」とは、タンパク質合成に関する情報をコードしない、核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。このような配列はｍＲＮＡに転写されるが、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳前に除去される。
【００３７】
［0075］用語「作動可能に連結された」又は「作動可能に挿入された」は、コード配列の発現を可能にするように、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列に対して適切な位置で核酸分子に入れられることを意味する。例として、プロモータがコード配列の転写又は発現を制御できる場合、該プロモータはコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス方向でプロモータ又は調節配列に作動可能に連結することができる。用語「作動可能に連結された」は、発現ベクターでの他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に時として適用される。
【００３８】
［0076］転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞でのコード配列の発現をもたらす、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等などのＤＮＡ調節配列である。
【００３９】
［0077］用語「プロモータ」、「プロモータ領域」又は「プロモータ配列」とは一般に、コード領域の５’若しくは３’側、又はコード領域内、又はイントロン内で見出され得る、遺伝子の転写調節領域を指す。典型的には、プロモータは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合すること、及び下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。典型的な５’プロモータ配列は、この３’末端で転写開始部位により結合され、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含む。プロモータ配列内には、（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより便宜的に定義された）転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
【００４０】
［0078］「ベクター」は、別の核酸セグメントが、該セグメントの複製又は発現をもたらすように作動可能に挿入され得るプラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスなどのレプリコンである。
【００４１】
［0079］用語「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」は、適切な調節配列に作動可能に連結され、細胞を形質転換するためのベクターに挿入された１つ又は複数のコード配列を指すのに時として使用される。この用語は、用語「形質転換ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」と同じ意味で使用することができる。このような核酸構築物は、選択可能なマーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子と共に、目的の遺伝子産物のコード配列を含有することができる。
【００４２】
［0080］「マーカー遺伝子」又は「選択可能なマーカー遺伝子」は、コードされた遺伝子産物が、該遺伝子を含有する細胞が該遺伝子を含有しない細胞の中から選択されるようにする特徴を付与する遺伝子である。遺伝子工学に使用されるベクターは、典型的には１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子のタイプには、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤寛容性又は耐性遺伝子、及び（３）形質転換細胞が本来産生することができない必須成分（通常はアミノ酸）を、該細胞が合成できるようにする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子が含まれる。
【００４３】
［0081］「レポーター遺伝子」もまた一種のマーカー遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、標準的実験室手段（例えば、酵素活性、蛍光）によりアッセイ可能又は検出可能な遺伝子産物をコードする。
【００４４】
［0082］用語「発現する」、「発現された」又は遺伝子の「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。この過程は、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写、次いで１つ又は複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含み、及び全ての自然発生翻訳後修飾を含む。
【００４５】
［0083］「内因性」とは、特定生物内で自然に見出すことができるいずれかの構成素、例えば、遺伝子若しくは核酸、又はポリペプチドを指す。
【００４６】
［0084］核酸構築物の「異種」領域とは、自然界のより大きな分子と関連しては見出されない、より大きな分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（複数可）である。故に、異種領域が遺伝子を含む場合、遺伝子は通常、ソース生物のゲノムにおいてはゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡにより隣接されるであろう。別の例では、異種領域は、コード配列自体が自然界では見出されない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、又は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異又は自然発生の突然変異イベントは、本明細書で定義されたＤＮＡの異種領域を生じさせない。上記で定義された用語「ＤＮＡ構築物」は、異種領域、特に細胞の形質転換で使用するために構築されたものを指すのにも使用される。
【００４７】
［0085］外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入されている場合、細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ（共有結合され）ても、又は組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上で維持することができる。真核細胞に関して、安定形質転換細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれた結果、染色体複製を介して形質転換ＤＮＡが娘細胞に受け継がれるものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞集団から成る細胞株又はクローンを確立する真核細胞の能力により実証される。「クローン」は、単一細胞、又は有糸分裂により共通祖先から得られた細胞集団である。「細胞株」は、多世代にわたりインビトロで安定な増殖をすることができる初代細胞のクローンである。
【００４８】
［0086］「粒」、「種子」及び「豆」とは、別の顕花植物へ成長することができる顕花植物の再生単位を指す。本明細書では、特にコーヒー植物に関して、該用語は、同義的に及び同じ意味で使用される。
【００４９】
［0087］本明細書では、用語「植物」には、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、苗条、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官、及びその子孫への言及を含む。トランスジェニック植物の部分は、例えば、トランスジェニック植物又はこの子孫に由来する植物細胞、原形質体、組織、カルス、胚のほか、花、茎、種子、花粉、果実、葉、又は根を含むことが本発明の範囲内で理解されるべきである。
【００５０】
［0088］用語「浸透圧ストレス」とは、植物細胞又は植物全体での水、糖、又は電解質濃度を破壊する、植物へのいずれかのストレスを指す。浸透圧ストレスは、長期の低水分又は干ばつ、低温、霜、氷温、土壌中の高塩含量等の条件など、環境に関連し得る。浸透圧ストレスは、種子の成長及び成熟に期待されるように、自然に発生してもよい。
【００５１】
［0089］本明細書では「アラビカ」は、１つ又は複数のコフィア・アラビカ植物由来の、葉、花、チェリー又は粒などの、発育又は成長の任意の段階にある植物、若しくは任意の部分、挿し木、器官（ｐａｒｔ）、抽出物又はこれらの組織を意味する。同様に、「ロブスタ」は、１つ又は複数のＣ．カネフォラ植物由来の、葉、花、チェリー又は粒を含む、発育又は成長の任意の段階にある植物、若しくは任意の部分、挿し木、器官、抽出物又はこれらの組織を意味する。
【００５２】
［0090］全体に使用されているように、範囲は、範囲内の値を長々と提示及び１つ１つ記載せざるを得ないことを避けるため、本明細書では簡潔に使用される。範囲内の任意の適切な値が、上方値、下方値、又は範囲の終端として、必要に応じて選択され得る。
【００５３】
［0091］本明細書で使用される場合、用語「約」は、プラス又はマイナス１０％である任意の値を意図することを示す。「約」は故に、述べられたリテラル値からの小さな変動は、依然として本発明の範囲内であるという認識を反映するため簡潔に使用される。
【００５４】
［0092］本明細書では及び添付の特許請求の範囲では、文脈がほかに明らかに指示しない限り、単語の単数形は複数形を含み、及び逆もまた同様である。故に、言及「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」は一般に、それぞれの用語の複数を含む。例えば、「１つのプロモータ」、「１つの方法」、又は「１つのレベル」への言及は、複数のこのような「プロモータ」、「方法」、又は「レベル」を含む。本明細書では、例えば「１つの抗酸化剤」への言及が複数のこのような抗酸化剤を含むのに対し、「複数の遺伝子（ｇｅｎｅｓ）」への言及は単一の遺伝子を含む。同様に、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的というより包含的に解釈されるべきである。同様に、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「又は（ｏｒ）」は、全て、このような構文が文脈から明らかに禁止されない限り、包含的であると解釈されるべきである。「例（ｅｘａｍｐｌｅｓ）」又は「例えば」が本明細書で使用される場合、特にこの後に用語の列挙が続く場合、単に例示的及び説明的であり、排他的又は包括的であるとみなされるべきではない。
【００５５】
［0093］本明細書に開示された方法及び組成物及び他の進歩は、本明細書に記載された特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されない。理由は、当業者に明らかとなるようにこれらが変えられる可能性があるためである。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であり、開示又は請求された用語の範囲を限定することを意図するものではなく、及び限定しない。
【００５６】
［0094］特にほかに規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語、専門用語、及び頭字語は、本発明の分野（複数可）、又は用語が使用される分野（複数可）の当業者により通常理解される意味を有する。任意の組成物、方法、製品、又は他の手段若しくは本明細書に記載されたものと類似の又は同等の材料を、本発明の実践において使用することができるが、特定の好ましい組成物、方法、製品、又は他の手段若しくは材料が本明細書に記載されている。
【００５７】
［0095］本明細書に引用又は言及された全ての特許、特許出願、出版物、技術及び／又は学術論文、及び他の参考文献は、この全体が、準拠法により許される範囲で参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献の論述は、この中でなされた主張を単に要約することを意図する。いかなるこのような特許、特許出願、出版物若しくは参考文献、又はこれらの任意の部分も、関連した、材料、又は先行技術であることは認められない。関連した、材料、又は先行技術としてのこのような特許、特許出願、出版物、及び他の参考文献のいかなる主張の正確性及び適切性を疑う権利は特に留保される。本明細書内で完全には引用されていない出版物の完全な引用は、本明細書の終わりに記載される。
説明
【００５８】
［0096］種子発育／成熟後期に種子で、主に、又は好ましくは、専ら発現される幾つかの遺伝子が単離され、同定され、及び特徴付けられた。好ましい遺伝子は、特定期間中に相当量の発現を示した。候補遺伝子は、特に発育中の種子を中心に、５つの異なる段階／組織由来のクローンに関するデータを比較して、Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｓ  ＳＯＬ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）でコーヒーＥＳＴデータベースから選択された。本明細書に提供された２つの遺伝子、ＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａは、現在十分に特徴付けられている。これらの対応するプロモータが単離され、配列を決定され、及び特徴付けられた。ＤＩＰ１は主に又は専ら種子／粒特異的であり、このプロモータは、特にコーヒーノキにおいて、例えば種子発育中、及び特に種子発育／成熟後期に組換えタンパク質を発現するのに有用である。
【００５９】
［0097］故に、本発明の最初の幾つかの態様では、本発明は、コーヒー（コーヒーノキ）から単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、１つ若しくは複数のＢＵＲＰドメイン、病原性関連タンパク質の１６個の保存システイン残基、又はタウマチンドメインを含むタンパク質をコードする。
【００６０】
［0098］本明細書に記載された核酸分子の相補体も提供される。本明細書の目的のため、核酸分子の性質から、核酸分子（例えばコード鎖）又はその相補体（例えば非コード鎖）のいずれかが、当業者が本明細書に記載又は請求されたさまざまな発明の実践に適用することができる同等の情報を含有することを、当業者は理解するであろう。したがって、本明細書で提供する核酸分子の相補体もこの説明に含まれる。
【００６１】
［0099］１つの実施形態では、コードされたタンパク質はＢＵＲＰドメインを含み、及び縦列反復ＴＸＶ又はＶＸＴを含む１つ又は複数のモチーフをさらに含む。好ましくは、ＢＵＲＰドメインはタンパク質のＣ末端部分にある。特定の実施形態では、ＴＸＶ又はＶＸＴモチーフの幾つかの反復、又はこの縦列がある。好ましくは、このようにコードされたタンパク質は脱水誘導タンパク質（「ＤＩＰ」）である。
【００６２】
［00100］現在好ましい実施形態では、コードされたＤＩＰタンパク質は、約３００〜４００個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態では、ＤＩＰタンパク質は、上記のコーヒーＥＳＴデータベースのユニジーン１２４９５２によりコードされたものなど、ＤＩＰ１タンパク質である。さまざまな実施形態では、タンパク質は、図３のパネルＡに示されたいずれかのＥＳＴのオープンリーディングフレームによりコードされた、又はアクセッション番号ＳＧＮ−Ｅ６７２０９０、ＳＧＮ−Ｅ６６８８８、ＳＧＮ−Ｅ６７４０１７、ＳＧＮ−Ｅ６７５２２９、ＳＧＮ−Ｅ６６５６５２、ＳＧＮ−Ｅ６７２６８３、ＳＧＮ−Ｅ６７２９０３、ＳＧＮ−Ｅ６７０１３３、ＳＧＮ−Ｅ６７２９９２、ＳＧＮ−Ｅ６６３５３５、ＳＧＮ−Ｅ６６２８１０、ＳＧＮ−Ｅ６６６０６４、ＳＧＮ−Ｅ６７２９８３、ＳＧＮ−Ｅ６６８８７０、ＳＧＮ−Ｅ６６２８１３、ＳＧＮ−Ｅ６８６９９８、ＳＧＮ−Ｅ６７３６３４、ＳＧＮ−Ｅ６７０１０５、ＳＧＮ−Ｅ６６５８２７、ＳＧＮ−Ｅ６７３１７６、ＳＧＮ−Ｅ６７４０８２、ＳＧＮ−Ｅ６６５８１４、ＳＧＮ−Ｅ６７５２８７、ＳＧＮ−Ｅ６７２０３１、ＳＧＮ−Ｅ６６６０７７、ＳＧＮ−Ｅ６６２９０１、ＳＧＮ−Ｅ６６６０１８、ＳＧＮ−Ｅ６６２８７９、ＳＧＮ−Ｅ６７０２６３、ＳＧＮ−Ｅ６６５６２２、ＳＧＮ−Ｅ６７３５３７、ＳＧＮ−Ｅ６７５３６０、ＳＧＮ−Ｅ６７３３５７、ＳＧＮ−Ｅ６７４８０５、ＳＧＮ−Ｅ６７４９３０、ＳＧＮ−Ｅ６７４８９７、ＳＧＮ−Ｅ６６４９２３、ＳＧＮ−Ｅ６７２２７２、ＳＧＮ−Ｅ６７４７８５、ＳＧＮ−Ｅ６６３０６１、ＳＧＮ−Ｅ６７１２７１、ＳＧＮ−Ｅ６７２９１８、ＳＧＮ−Ｅ６６２８３８、ＳＧＮ−Ｅ６７２００４、ＳＧＮ−Ｅ６６８９８８、ＳＧＮ−Ｅ６８６９１２、ＳＧＮ−Ｅ６７３６２９、ＳＧＮ−Ｅ６７０６２２、若しくはＳＧＮ−Ｅ６７２３３５により同定された配列を有する。別の実施形態では、ＤＩＰタンパク質は、上記のコーヒーＥＳＴデータベースのユニジーン１２１８８２によりコードされたものなど、ＤＩＰ２タンパク質である。さまざまな実施形態では、タンパク質は、図３のパネルＢに示されたいずれかのＥＳＴのオープンリーディングフレームによりコードされた、又はアクセッション番号ＳＧＮ−Ｅ６５８０１５、ＳＧＮ−Ｅ６２５９５５、ＳＧＮ−Ｅ６３５０７１、ＳＧＮ−Ｅ６２８３５８、ＳＧＮ−Ｅ６５１２８８、ＳＧＮ−Ｅ６５３７０５、ＳＧＮ−Ｅ６５３３７１、ＳＧＮ−Ｅ６５３６６５、ＳＧＮ−Ｅ６４２４１９、ＳＧＮ−Ｅ６５３２３７、若しくはＳＧＮ−Ｅ６３８８０８により同定された配列を有する。
【００６３】
［00101］さまざまな好ましい実施形態では、ＤＩＰタンパク質は、配列番号８又は９と５０％以上同一であるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、タンパク質は、配列番号８又は９と６０、６５、７０、７５、８０、又は８５％同一である。さらに他のものでは、タンパク質は８６、８７、８８、８９、又は９０％同一である。配列番号８又は９と９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有するものと同様、９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性を有する実施形態も好ましい。１つの実施形態では、ＤＩＰタンパク質は、配列番号８又は９であるアミノ酸配列を有する。
【００６４】
［00102］他の実施形態では、核酸は配列番号１〜４のいずれかを含む。好ましい実施形態では、核酸は配列番号１、３又は４に記載されたコード配列と５０％以上同一であるコード配列を有する。コード配列が、配列番号１、３、又は４と６０、６５、７０、７５、８０、又は８５％同一であるさらに他の実施形態が提供される。配列番号１、３、又は４と９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性を有するもの、及び９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有する実施形態と同様、コード配列が８６、８７、８８、８９、又は９０％同一である実施形態が提供される。好ましい実施形態では、コード配列は配列番号１、３、又は４のうち１つを含む。正確には配列番号１、３、又は４のコード配列を有する配列がさらにより好ましい。
【００６５】
［00103］別の実施形態では、核酸分子は、病原性関連タンパク質の１６個の保存システイン残基、及びタウマチンドメインを含むタンパク質をコードする。１つの実施形態では、タンパク質は、病原性関連（ＰＲ）タンパク質である。好ましくは、ＰＲタンパク質は約２００〜２５０個のアミノ酸残基を含む。
【００６６】
［00104］１つの実施形態では、ＰＲタンパク質は、上記のコーヒーＥＳＴデータベースのユニジーン１１９５１１によりコードされたものなど、ＰＲ５Ａタンパク質である。さまざまな実施形態では、タンパク質は、図３のパネルＣに示されたいずれかのＥＳＴのオープンリーディングフレームによりコードされた、又はアクセッション番号ＳＧＮ−Ｅ６７１８３２、ＳＧＮ−Ｅ６６４７４７、ＳＧＮ−Ｅ６７３２４５、ＳＧＮ−Ｅ６６５２２３、ＳＧＮ−Ｅ６７５００８、ＳＧＮ−Ｅ６７１１９４、ＳＧＮ−Ｅ６７３７２８、ＳＧＮ−Ｅ６７０６７９、ＳＧＮ−Ｅ６６４８４９、ＳＧＮ−Ｅ６６９７３５、ＳＧＮ−Ｅ６７０７８９、ＳＧＮ−Ｅ６７４１３４、ＳＧＮ−Ｅ６７１６１０、ＳＧＮ−Ｅ６６５８９４、ＳＧＮ−Ｅ６７０６２０、ＳＧＮ−Ｅ６６９５１６、ＳＧＮ−Ｅ６７０２７０、ＳＧＮ−Ｅ６６５７７５、ＳＧＮ−Ｅ６７４５６７、ＳＧＮ−Ｅ６６４８７８、ＳＧＮ−Ｅ６７０１２５、ＳＧＮ−Ｅ６７４３５１、ＳＧＮ−Ｅ６７０７１２、ＳＧＮ−Ｅ６６９９８３、ＳＧＮ−Ｅ６７２５１８、ＳＧＮ−Ｅ６６８４２５、ＳＧＮ−Ｅ６７０４５３、ｏｒＳＧＮ−Ｅ６７１３３０により同定された配列を有する。
【００６７】
［00105］ＰＲタンパク質は、１つの実施形態では配列番号１０又は１１と６５％以上同一であるアミノ酸配列を有する。他のものでは、ＰＲタンパク質は、配列番号１０又は１１と７０、７５、又はさらには８０％同一である。さらに他のものでは、最大８５、８６、８７、８８、８９、又は９０％の同一性が見られるのに対し、さらに他のものでは、９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性が観測される。配列番号１０又は１１と９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有する実施形態も本明細書で提供される。１つの好ましい実施形態では、コード核酸分子は、配列番号１０又は１１であるアミノ酸配列を有するＰＲタンパク質をコードする。
【００６８】
［00106］核酸分子は、さまざまな実施形態では配列番号５又は７に記載されたコード配列と５０％以上同一であるコード配列を有する。配列番号５又は７と６０、６５、７０、７５％以上の同一性を有する核酸も提供される。幾つかの分子は、配列番号５又は７と最大８０、８５、及び８６、８７、８８、８９、又は９０％の同一性を有する。９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又はさらには９９％同一性を有するものなど、配列番号５又は７と９０％を超える同一性を有する配列も提供される。好ましい実施形態では、提供された核酸分子のコード配列は配列番号５又は７を含む。
【００６９】
［00107］他の本発明の態様では、それぞれが、例えば、ＤＩＰ又はＰＲ関連タンパク質のいずれかの、上記のようなコード配列を含むオープンリーディングフレームを有する遺伝子である核酸分子が提供される。インビボであろうとインビトロであろうと、このような遺伝子転写により生成されたｍＲＮＡ分子も提供される。
【００７０】
［00108］本発明の別の態様は、本明細書で提供されるｍＲＮＡ分子の逆転写により生成されるｃＤＮＡ分子を提供する。本発明の単離された核酸分子自体がＲＮＡである場合、これから作製されたｃＤＮＡ分子が提供される。このような分子は、言うまでもなくこれ自体は自然界では見出されず、又はこのようなｃＤＮＡを作製することができる単離されたＲＮＡ分子が見出されることもない。
【００７１】
［00109］本発明の幾つかの態様の別のものでは、本発明はベクターを提供する。ベクターは、本明細書に記載された１つ又は複数の核酸分子を含む。他のベクターは、本明細書に上述及び後述されるような１つ又は複数のプロモータを含む。さらに他のベクターは、本明細書に記載されたような単離された核酸及びプロモータの両方を含む。１つの実施形態では、提供されるベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母、又はウイルスベクターなどの発現ベクターであるが、これらに限定されない。多くのこのようなソース由来の発現ベクターが当技術分野で知られており、当業者は、このようなベクターへの本明細書で提供される新規の核酸の組み込み方を理解するであろう。
【００７２】
［00110］ベクターの１つの実施形態では、核酸分子のコード配列が構成的プロモータに作動可能に連結されているのに対し、他のものでは、これは誘導性プロモータ、又は発育的に調節されたプロモータに作動可能に連結されている。１つの実施形態では、発育的に調節されたプロモータは、植物における種子成熟中に主に又は専ら機能する。好ましくは、発育的に調節されたプロモータは、特にコーヒー植物の種子における種子の脱水中など、植物における種子成熟後期に主に又は専ら機能する。当業者は、種子が、言うまでもなく油糧種子、及び植え付けに有益な種子などの消費用種子を含む、多くの有用な農産物の基礎であることを理解するであろう。コーヒー、トウモロコシ、コムギ、マメ科植物、オオムギ、ライムギ、カラスムギ等などの穀物、ピーナッツ並びにアーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ハシバミ、ヘーゼルナッツ、マカダミア、ペカン、ペピータ、マツノミ、ピスタチオ、及びクルミを含む、ヒト若しくは動物の消費のために、又は油源として使用されるさまざまなタイプの堅果のなる木を含む任意のこのような種子を、消費用であろうとなかろうと本明細書で使用することができるが、これらに限定されない。ヒマワリ、ベニバナ、ヤシ、トウモロコシ、ゴマ、ポピー、ブドウ、ココナッツ、ワタ、ナタネ、アマ、及び主に油脂目的のため使用される他の種子も含まれる。
【００７３】
［00111］他の実施形態では、核酸分子のコード配列は、組織特異的プロモータ、例えば、種子特異的プロモータに作動可能に連結される。１つの実施形態では、種子特異的プロモータは、コーヒーにおける種子特異的プロモータである。
【００７４】
［00112］現在好ましい実施形態では、プロモータは、ＤＩＰ１又はＰＲ−５Ａ遺伝子プロモータである。好ましくは、プロモータは、干ばつ、浸透圧ストレス、又は５０ｍＭでの塩ストレスの条件により実質的に誘導されることはない。プロモータは、本明細書の特定の実施形態では配列番号２、３、６、又は７の非翻訳部分を含む。他の実施形態では、プロモータは、配列番号２、３、６、若しくは７のいずれかと、又はより好ましくはこの非翻訳部分と８０、８５、９０、９５、又は９５を超えるパーセント同一性を有する。配列番号２、３、６、又は７の非翻訳部分、特に開始コドンの上流又は５’であるこれらの部分と少なくとも８０％同一性を有するプロモータがより好ましい。本明細書で提供される現在好ましいプロモータの例は、図１０、１１、１２、及び１３に例示される。これらは、さまざまな調節エレメント、モチーフ、及びプロモータの好ましい実施形態内に置かれた他の特徴も示す。
【００７５】
［00113］さまざまな実施形態では、本明細書で提供されるプロモータは、ＴＡＴＡボックス、Ｅボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）応答エレメント（ＡＢＲＥ）、ジベレリン応答エレメント（ＧＡＲＥ）、ＭＹＢ結合部位モチーフ、ＧＡ−１モチーフ、又はＡＣＧＴコア含有モチーフである１つ又は複数の調節配列を含む。１つの現在好ましい実施形態では、プロモータは配列番号２又は６の配列を含む。
【００７６】
［00114］本明細書で提供される任意の１つ又は複数のベクターにより形質転換された宿主細胞も、本明細書で提供される。１つの現在好ましい実施形態では、宿主細胞は、配列番号２、３、６、又は７を含むベクターにより形質転換される。宿主細胞は、さまざまな実施形態では植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。さまざまな実施形態では、宿主細胞は、アルファルファ、アーモンド、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アスター、バナナ、オオムギ、ベゴニア、ビート、紅茶、ブラジルナッツ、カカオ、キャノーラ、ニンジン、カシュー、キク、クローバー、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、デルフィニウム、ナス、ハシバミ、ヘーゼルナッツ、レタス、マカダミア、トウモロコシ、カラスムギ、エンドウマメ、ピーナッツ、ペカン、コショウ、マツ、ピスタチオ、ジャガイモ、カボチャ、コメ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマティオ、トマト、芝草、クルミ、コムギ、又はジニア由来の植物細胞である。
【００７７】
［00115］稔性トランスジェニック植物も提供される。植物は上記に提供された宿主細胞の再生により産生される。１つの現在好ましい実施形態では、植物はコーヒーノキである。
【００７８】
［00116］本発明の別の態様は、ＤＩＰ又はＰＲ−５Ａタンパク質をコードするコーヒー植物遺伝子から単離されたプロモータを提供する。遺伝子は、１つの実施形態では約３００〜４００個のアミノ酸残基を含むＤＩＰタンパク質をコードする。コードされたＤＩＰタンパク質は、配列番号８又は９と５０％以上同一であるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、タンパク質は、配列番号８又は９と６０、６５、７０、７５、８０、又は８５％同一である。他のものでは、コードされたタンパク質は、これらの配列と８６、８７、８８、８９、又はさらには９０％同一である。配列番号８又は９と９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有するものと同様、コードされたタンパク質が９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性を有する実施形態も好ましい。１つの実施形態では、コードされたＤＩＰタンパク質は配列番号８又は９であるアミノ酸配列を有する。
【００７９】
［00117］他の実施形態では、遺伝子は、配列番号１、３、又は４に記載された配列と５０％以上同一であるオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームが、配列番号１、３、又は４と６０、６５、７０、７５、８０、又は８５％同一である他の実施形態が提供される。配列番号１、３、又は４と９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性を有するもの、及び９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有するオープンリーディングフレームを有する実施形態と同様、オープンリーディングフレームが８６、８７、８８、８９、又は９０％同一である実施形態が提供される。好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは配列番号１、３、又は４を含む。
【００８０】
［00118］本発明の別の態様は、ＰＲ−５Ａタンパク質をコードするコーヒー植物遺伝子から単離されたプロモータを提供する。好ましい実施形態では、ＰＲ−５Ａタンパク質は約２００〜２５０個のアミノ酸残基を含む。
【００８１】
［00119］プロモータが単離される遺伝子は、１つの実施形態では配列番号１０又は１１と６５％以上同一であるアミノ酸配列を有するＰＲ−５Ａタンパク質をコードする。他の実施形態では、コードされたタンパク質は、配列番号１０又は１１と７０、７５、又はさらには８０％同一である。さらに他のものでは、最大８５、８６、８７、８８、８９、又は９０％の同一性が見られる。遺伝子が、これらの特定配列と９１、９２、９３、９４又は９５％もの同一性を有するタンパク質をコードする実施形態も提供される。配列番号１０又は１１と９５、９６、９７、９８又は９９％を超える同一性を有するＰＲ−５Ａをコードする実施形態も本明細書で提供される。１つの好ましい実施形態では、プロモータが単離される遺伝子は、配列番号１０又は１１であるアミノ酸配列を有するＰＲタンパク質をコードする。
【００８２】
［00120］プロモータが由来する遺伝子は、さまざまな実施形態では配列番号５又は７に記載されたコード配列と５０％以上同一であるオープンリーディングフレームを有する。配列番号５又は７と６０、６５、７０、７５又は７５を超える％同一性を有する核酸も提供される。幾つかの分子は、配列番号５又は７と最大８０、８５、及び８６、８７、８８、８９、又は９０％同一性を有することもできる。９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又はさらには９９％同一性を有するものなど、配列番号５又は７と９０％を超える同一性を有する配列も知られている。好ましい実施形態では、提供される核酸分子のコード配列は配列番号５又は７を含む。
【００８３】
［00121］本発明の別の態様では、１つ又は複数のコード配列に作動可能に連結された、本明細書に開示された１つ又は複数のプロモータを含むキメラ遺伝子を提供する。
【００８４】
［00122］上記のようなキメラ遺伝子を含む、細胞を形質転換するためのベクターも本明細書で提供される。ベクターにより形質転換された細胞、特に植物細胞、及びさらにより特別には、コーヒーノキの細胞も、本明細書で提供される。形質転換植物細胞の再生により産生された稔性トランスジェニック植物も提供される。このような植物の１つの実施形態では、植物はコーヒーノキである。
【００８５】
［00123］本発明のさらに別の態様では、コーヒー豆などの種子の１つ又は複数の品質特性を改善する方法が提供される。方法は一般に、主に又は専ら種子成熟後期に、コーヒー種子などの種子で産生される１つ又は複数のタンパク質の産生を調節することを含む。現在好ましい実施形態では、種子は、コーヒー種子又は適切な成熟が農産物の品質にとって重要な他の種子である。
【００８６】
［00124］１つの実施形態では、１つ又は複数のタンパク質は、ＤＩＰ若しくはＰＲ−５Ａタンパク質、又は両方を含む。品質特性は、１つの実施形態では、風味、香味、口当たり、又はコーヒーの場合では、知覚された若しくは測定された「カップクォリティー」の、主観的に判定された（例えば、官能評価パネルによる）又は客観的に測定された側面である。本明細書では、「主観的に判定された」は、値又はパラメータが主観的に判定されることを意味し、及びそのように判定されるものの、値又はパラメータは、使用された対象数及びパラメータが測定された方法のため、統計的有用性を有する。このような主観的分析の妥当な方法は当技術分野で知られており、及び官能評価等の熟練者により理解されるであろう。他の実施形態では、品質特性は、特定の時間での、種子成熟、果実成熟、含水量、タンパク質含量、油、葉緑素、又は他の分析物など、植物、植物部分等の生物学的特性の有用な評価基準である。他の品質特性には、貯蔵中の安定性、病原体（例えば、昆虫、真菌、又は微生物）に対する感受性、貯蔵中の劣化、酸化、呼吸、含水量等が含まれ得る。
【００８７】
［00125］１つの実施形態では、タンパク質の産生は、本明細書で提供される任意の１つ又は複数の核酸、ベクター、宿主細胞、又はプロモータを用いて調節される。
【００８８】
［00126］本発明の幾つかの態様のさらに別のものでは、本発明は、植物由来の農産物の少なくとも１つの品質特性を評価する分析方法を提供する。方法は、
植物由来の農産物又はこのような産物のバッチ若しくはロットを用意するステップと、
存在が品質形質と正に関連する第１の分析物、及び存在が品質形質と負に関連する第２の分析物を含む少なくとも２つの分析物を選択するステップと、
植物由来の農産物の試料、又はそのバッチの代表試料を得るステップと、
試料中の前記第１及び第２の分析物の相対量を、直接又は間接的に判定するステップと、
第１及び第２の分析物の各々の相対量、又はこれらの間の比に基づき品質形質を評価するステップと
を含む。
【００８９】
［00127］植物由来の農産物を評価する特定の方法は当技術分野で知られているが、本方法は、２つの別個の分析物の比を使用する点で区別され、及び分析物の少なくとも１つがＲＮＡ又はタンパク質中であることを必要とする点でさらに区別される。１つの実施形態では、少なくとも第１及び第２の分析物は独立にＲＮＡ又はタンパク質である。
【００９０】
［00128］当業者は、タンパク質分析の迅速な方法が、その場で購入者又は生産者により使用され得る迅速テストに有用であり得ることを理解するであろう。或いは、試料は抽出されてもよく、並びに遺伝子発現を示すｍＲＮＡの定性的及び／又は定量的測定が有用であり得る。タンパク質又はＲＮＡ分析物の測定又は分析方法は当技術分野で知られており、及び当業者によく知られている。１つの実施形態では、ｍＲＮＡを測定するリアルタイムの定量的方法が使用される。別の実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は類似の検出方法がタンパク質の迅速測定から使用される。このような方法のためのタンパク質分析の有用性は、例えば、成熟種子のバッチ又はロットにおける存在が、該バッチ又はロットにおける未熟種子の存在を示すタンパク質の適正な選択を当然ながら必要とするであろう。
【００９１】
［00129］方法の現在好ましい実施形態では、植物由来の農産物は種子又は種子由来産物である。本明細書で上記に論じられているように、このような種子には、穀物、マメ科植物、ナッツ、ココア、及びコーヒーを含む多くの農産物が含まれ得る。多くのこのような産物のため、購入前にロット又はバッチの品質若しくは容認性を適切に評価すること、又は購入される及びその後さらに加工されるロット若しくはバッチの実価を判定することは、購入者にとって大きな価値となり、並びに例えば、正確な収穫時間、又は予想される購入者若しくは加工業者に農産物の品質特性を区別することのより適切な示し方を、このような産物の提供者が知るのに役立つことができる。故に、１つの実施形態では、品質特性は、農産物が由来する植物、又は植物部分の成熟に関する。
【００９２】
［00130］特定の実施形態で理解されるように、産物の成熟は、例えば、風味、香味又は感触の発達に関係付けられる。１つの実施形態では、第１の分析物は十分に成熟した植物又は植物部分を示し、及び第２の分析物は十分に成熟しない植物又は植物部分を示す。他の実施形態では、成熟は植物由来の農産物で望まれない場合があり、故に当業者は、方法が使用されている特定の出願に基づく該方法から回収されたデータの評価方法を理解するであろう。例えば、コーヒーでは、未熟豆が異臭及び不十分な品質をもたらすのに対し、他の産物では、過剰な成熟が異臭、又は固い感触をもたらし得る。故に当業者は、このような方法が、特定の果実及び野菜を含む、植物ベースの他の農産物の品質を評価するうえで極めて価値があることを理解するであろう。
【００９３】
［00131］現在好ましい実施形態では、植物はコーヒーノキであり、農産物はコーヒーチェリーである。好ましくは、方法は、第１及び第２の分析物の相対的存在を基に、コーヒーのバッチの容認性を判定すること、豆の平均的成熟を判定すること、グリーン又はイエローチェリーから豆の存在を検出すること、コーヒーのバッチを格付けること、又はコーヒーのバッチの価格を設定することに使用される。
【００９４】
［00132］１つの実施形態では、第１の分析物はＤＩＰ又はＰＲ−５Ａタンパク質、又はこのコードＲＮＡ、及び第２の分析物はＯＬＥＯ１又はＬＥＡタンパク質又はこのコードＲＮＡである。１つの実施形態では、分析物の１つはタンパク質又は核酸／ポリヌクレオチドではなく、むしろ農産物において成熟（未熟）とよく相関した検出可能な分子である。葉緑素又はジクロロゲン酸の存在は、特定の農産物、例えば、コーヒーにおいて、成熟又はこの欠如とよく相関し得る。方法の１つの実施形態は、ＤＩＰ１若しくはＰＲ−５Ａタンパク質又はこのコードＲＮＡ、ＬＥＡタンパク質又はこのコードＲＮＡ、及びＯＬＥＯ１タンパク質又はこのコードＲＮＡを含む３つの分析物を使用する。
【００９５】
［00133］当業者は、このような方法の適用が、例えば、コーヒー業界における注意及びさらには収穫方法の改善をもたらすことができることを理解するであろう。これらの方法は、コーヒーチェリーに対する品質の客観的測定により、農場から加工業者までサプライチェーンを提供することができるため、生産者は、未熟チェリーの包含により貴重なコーヒーのロットをさもなければ汚染することを回避することができ、及びさもなければ二流又はさらには劣ったロットになる可能性のあるものを、収穫のより良い品質管理により改善することができ、故に生産者及び加工業者の利益になる。
【００９６】
［00134］これら及び他の本発明の態様は、次の例によりさらに説明することができる。これらの例は特定の態様の説明目的のために提供されること、故に、ほかに特に指示のない限り、これらは、全体として本明細書に開示された本発明の範囲を限定しないことが理解されよう。
【実施例】
【００９７】
材料及び方法
植物材料及びＲＮＡの調製
［00135］コフィア・アラビカ・カトゥーラ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．ｃｖ．Ｃａｔｕｒｒａ）Ｔ２３０８由来の果実及び他の組織は温室栽培された木から入手し、使用まで−８０℃で貯蔵した。Ｃ．カネフォラ（ロブスタ）変種ＢＰ４０９、ＢＰ３５８、Ｑ１２１由来の果実は、インドネシアのＩｎｄｏｎｅｓｉａ  Ｃｏｆｆｅｅ  ａｎｄ  Ｃｏｃｏａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（「ＩＣＣＲＩ」）施設で栽培された屋外栽培された木から入手し、現地で−８０℃で凍結した。この材料を、次いで−２０℃で実験室に輸送し、次いで使用まで−８０℃で貯蔵した。ＢＰ４０９の他の組織は、ＩＣＣＲＩから入手し上記のように輸送するか、又は温室栽培された木から入手した。
【００９８】
［00136］全ＲＮＡはフェノール−クロロホルム抽出を用いて得た。別のＤＮａｓｅ処理は、メーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｅｆ：Ｍ６１０１）の指示に従いＲＱｌ−ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅを用いて実施し、続いてＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキットからのカラムを用いてＲＮＡを再精製した。［ＲＮＡ試料コード：それぞれ、ＲＮＡ−Ｔ２３０８−２、ＲＮＡＢＰ４０９  １、ＲＮＡ−ＢＰ３５８−１、ＲＮＡ−Ｑ１２１−１］
【００９９】
［00137］葉成熟試験には、葉を、温室条下で栽培されたＣ．アラビカ・カトゥーラＴ−２３０８の木から回収し、使用まで−８０℃で貯蔵した。葉成熟の４段階は、極めて若い葉（最も新しい、成長中の枝の木質化していない部分の第１葉、〜２ｃｍ）、若葉（新しい枝の第１葉のすぐ後ろ、これらは「柔らかい」組織を有する極めて緑色をしている、〜４ｃｍ）、成熟葉（中年の枝で回収された葉、これらは「蝋様の」組織を有する濃い緑色をしている、〜１２ｃｍ）、及び旧葉（黄変葉、〜１２ｃｍ）である。ＲＮＡは、葉材料（−８０℃で貯蔵された）を乳鉢及び乳棒ですりつぶして抽出した。全ＲＮＡは、メーカーの条件に従いＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキット（＃７４９０４）により抽出した。得られたＲＮＡは、メーカーの指示に従い「Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ」キットを用いてＤＮａｓｅによりさらに処理し、残りのＤＮＡ汚染を除去した。［ＲＮＡ試料コード  ＲＮＡ−Ｔ２３０８−葉−３］
【０１００】
［00138］以前に記載されているようなＤＮａｓｅ処理により発芽粒試料を得、及びＲＮＡを抽出した（（Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら、２００６年ｂ）；［ＲＮＡ試料コード  ＲＮＡ−Ｔ２３０８−Ｇｅｒｍ−１  ３、（Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら、２００６年ａ）も参照のこと］。
【０１０１】
［00139］脱水実験には、Ｃ．カネフォラ変種「ＦＲＴ０４」及び「ＦＲＴ２３」の小さい植物（樹齢約７カ月）を使用した。これらの植物は、温室のポットで体細胞胚から栽培されていた。対照として３つの植物を選択し、及び実験開始から毎日手作業で水やりをした。３つの他の植物は水やりをせず、故に漸進的脱水に供した。各植物由来の２つの葉（大きさ２〜３ｃｍ）の試料採取は、毎週実施した。可能な場合、試料は植物頭頂の成長端（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ）から採取した。全ての試料は液体窒素中で直接凍結させた。ＲＮＡは上述のように調製した。［ＲＮＡ試料コード−  ＲＮＡ−ＤＳ４］。
【０１０２】
［00140］塩ストレス実験には、Ｃ．カネフォラ変種「ＦＲＴ１２」のマイクロカッティングを、ベンジルアミノプリン０．３ｍｇ／ｌ、ショ糖４０ｇ／ｌを含有しゲルライト３ｇ／ｌで固化したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．及びＳｋｏｏｇ  Ｆ．、１９６２年）である培地Ｂ０．３で繁殖させた。実験開始時に、マイクロカッティングを追加の５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＢ０．３培地に移した。
【０１０３】
［00141］塩処理に供したマイクロカッティングは、処理の２、７及び１０日後に試料採取し、液体窒素中で直接凍結させた。同じ材料を、対照の役割をするオリジナルプレートに残し、及び同様にＴ＝Ｏ、Ｔ＝２、Ｔ＝７、及びＴ＝１０日で試料採取した。ＲＮＡは葉発育試料について記載された通りに調製した。［ＲＮＡ試料コード  ＲＮＡ−ＮａＣｌ］
【０１０４】
［00142］貯蔵コーヒー粒を用いた実験には、成熟レッドチェリーを、エクアドルの農場で栽培されたＣ．カネフォラＦＲＴ０９、ＦＲＴ０７、ＦＲＴ１７、ＦＲＴ２８、ＦＲＴ４９、ＦＲＴ５３、ＦＲＴ７２の木から収穫した。これらのチェリーを次いで乾燥法により農場で加工した。簡単には、成熟レッドチェリーを手で摘み、次いで粒の湿度が約１２％になるまでセメント上で天日乾燥した。皮むきはＰｉｎｈａｌｅｎｓｅ社「Ｄｅｓｃａｆｒｉｃａ」マシンで、及びクリーニングは手で行った。グリーンコーヒー粒を次いで、これが周囲条件下で１年以上貯蔵された（非制御貯蔵条件）実験室に運んだ。ＲＮＡは、葉発育試料について記載された通りに試料ごとに１０粒を用いて調製し、及び次いでＲＮＡ抽出のため５０ｍｇの得られた粉末を用いて調製した。ＲＮＡ試料は、ＤＮＡｓｅ処理せずに得て４０μｌのＲＮＡ水で溶出した。この実験で使用した対照ＢＰ３５８ＲＮＡのため、使用した粒は上述の新鮮チェリー由来であり、及び−８０℃で凍結させた［ＲＮＡ試料コード；ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ１、ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ２、ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ３、ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−２００５、ＲＮＡ−ＢＰ  ３５８  ４２Ｗ−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ０７−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ１７−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ２８−Ａ、ＲＮＡＦＲＴ４９−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ５３−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ７２−Ａ］
【０１０５】
［00143］定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いたｃＤＮＡ合成及び遺伝子発現分析
［00144］ｃＤＮＡは、ポリｄＴを用いて（Ｌｅｐｅｌｌｅｙ，Ｍ．ら、２００７年）により記載された通りに調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、使用したｃＤＮＡ希釈が１０倍［試料コード：ｃＤＮＡ２−ＲＮＡ  ＢＰ４０９−２；ｃＤＮＡ２−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−２；ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｔ２３０８  Ｇｅｒｍ−１］、又は１００倍［試料コード：ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＢＰ３５８−１；ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｑ１２１−１；ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−葉−３；ｃＤＮＡ１  −ＲＮＡ−ＤＳ４；ｃＤＮＡ１  −ＲＮＡ−ＮａＣｌ３］のいずれかであったことを除いて、（Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら、２００６年ｂ）に記載されている通りであった。
【０１０６】
［00145］試料ＲＮＡ試料コード  ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ１、ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ２、ＲＮＡ−ＦＲＴ０９−Ｈ３、ＲＮＡＦＲＴ０９−２００５、ＲＮＡ−ＢＰ  ３５８  ４２Ｗ、ＲＮＡ−ＦＲＴ０７−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ１７−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ２８−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ４９−Ａ、ＲＮＡ−ＦＲＴ５３−Ａ、及びＲＮＡ−ＦＲＴ７２−Ａには、プライマーとしてポリｄＴを使用した。
【０１０７】
［00146］注：ＤＮａｓｅ  Ｉ処理は、本明細書に記載された貯蔵コーヒー粒試料由来のＲＮＡ試料については実施されなかった。しかし、ＲＴｃＤＮＡ合成をしないＦＲＴ０９  ＲＮＡ試料（−ＲＴ  ＦＲＴ０９）を用いた対照実験は、ＯＬＥＯ１又はＤＩＰ１遺伝子配列のいずれも著しい増幅を示さず、ＲＮＡ試料中の任意のゲノムＤＮＡが、対応する転写物のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を干渉するには小さすぎることを示した。故に、本明細書に記載されたＲＮＡ試料中に著しいレベルのゲノムＤＮＡ汚染はないように見える。
【０１０８】
［00147］ｃＤＮＡ調製物には、
ｃＤＮＡ２−ＲＮＡ  ＢＰ４０９−２
ｃＤＮＡ２−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−２
ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＢＰ３５８−１
ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｑ１２１−１
ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−葉−３
ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  Ｔ２３０８  Ｇｅｒｍ−１
ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ−ＤＳ４
ｃＤＮＡ１  −ＲＮＡ−ＮａＣｌ３
【０１０９】
［00148］使用したＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを表１に記す。
［00149］
【表１】
2011525353.tif 000003
【０１１０】
［00150］プロモータＤＮＡの単離
［00151］本明細書に記載されたＤＩＰ−１及びＰＲ−５Ａプロモータ配列は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ及び（Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら、２００６年ｂ）により記載された条件を用いて単離した。遺伝子特異的プライマーを表２に提供する。
【０１１１】
［00152］
【表２】
2011525353.tif 000004
【０１１２】
［00153］隣接プロモータ及び遺伝子配列の単離に使用した全体的方策は、ＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａそれぞれについて図１及び２に概説される。
【０１１３】
［00154］他の推定ＤＩＰ  １プロモータ配列：別のゲノムＤＮＡフラグメントもＣ．アラビカゲノムＤＮＡから回収し、及びｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化してｐＣＲ４−ＧＷ１２４９５２  ＃４Ｃ（６００ｂｐ）を作製した。約９００ｂｐの第２のゲノムフラグメントもＣ．カネフォラから回収し、及びｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローン化してｐＣＲ４−ＧＷ１  ２４９５２  ＃３Ｄを作製した。これらの２つのゲノムＤＮＡフラグメント、及びｐＡＳ２２の配列は３’末端で高レベルの相同性を有するが、配列は５’末端では著しく異なる。Ｃ．アラビカゲノム配列ｐＣＲ４−ＧＷ１  ２４９５２  ＃４Ｃ及びＣ．カネフォラ（ロブスタ）ゲノム配列ｐＣＲ４−ＧＷ１  ２４９５２  ＃３Ｄが、他のＤＩＰ遺伝子、又は同じＤＩＰ１遺伝子の他の対立遺伝子を表すかどうかはまだ判定されていない。
【０１１４】
［00155］ＤＮＡ配列決定及びＤＮＡ配列分析：
［00156］プラスミドＤＮＡは、メーカーにより提供された指示に従いＱｉａｇｅｎキットを用いて精製し、このＤＮＡをＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（コンスタンツ、ドイツ）によるジデオキシターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２年）を用いて配列決定した。コンピュータ分析は、Ｌａｓｅｒ  Ｇｅｎｅ  ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用い行った。配列相同性は、ＢＬＡＳＴ［（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年）］を用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較して検証した。
【０１１５】
実施例１
粒発育の終わりに強力に発現される遺伝子に関するｃＤＮＡの単離及び特徴付け
［00157］発育最終期（脱水期）に粒で主に、又は専ら発現される遺伝子を見出すため、本発明者らは、
ａ）４６週の粒ライブラリーでのみ見出される、及び
ｂ）（同様に植物の他のところで発現され得る発現の弱い遺伝子数を減少させるため）５つを超えるＥＳＴを有する
ユニジーン配列について、コーネル大学（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）におけるＳＯＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）でコーヒー発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースをスクリーニングした。
【０１１６】
［00158］相対的に強く発現される、及び成熟粒、例えば、４６週コーヒー粒由来のｃＤＮＡライブラリーでのみ主に、又は好ましくは専ら発現されるようなユニジーンを選択した。ＥＳＴ数及び配列のアノテーション（不図示）を考慮して、５つ以上のコピーを有するユニジーンのみをさらなる試験用に選択した。選択したユニジーンを表１．１に示す。
【０１１７】
［00159］
【表３】
2011525353.tif 000005
【０１１８】
［00160］表１．１：記載されたようなＳＧＮコーヒーＥＳＴデータベースの４６週ライブラリーにおける極めて高い発現を有する２つのユニジーンの概要。提供されたアノテーションは、Ｃｏｒｎｅｌｌインフォマティクスグループにより行われた自動検索を用いて見出されたベストヒットである。
【０１１９】
［00161］４９ＥＳＴを有するユニジーンＣＧＮ−Ｕ１２４９５２（図３、パネルＡ）及び２８ＥＳＴを有するユニジーンＣＧＮ−Ｕ１１９５１１（図３、パネルＣ）による、４６週での粒におけるこれらの遺伝子各々の発現は極めて高かった。各ユニジーンの最長ｃＤＮＡの１つを単離し、配列決定した。ユニジーンＣＧＮＵ１２４９５２の完全な配列をコーヒー遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴ検索した場合、果皮又は葉のいずれかのライブラリーのみからの１１ＥＳＴを有する、第２の極めて密接に関連するユニジーンを見出した（ＣＧＮ−Ｕ１２１８８２）（図３、パネルＢ）。このユニジーンの最長ＥＳＴの１つも単離し、配列決定した。
【０１２０】
［00162］図７は、ＢＬＡＳＴ検索を介して見出されたデータベース中の最も密接に関連する配列による、クローン（ユニジーンＣＧＮ−Ｕ１２４９５２由来のｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６、及びユニジーンＣＧＮ−Ｕ１２１８８２由来の高度に関連したｐｃｃｃｐ２１ｓｇｌ）の最適化アライメントを示す。このアライメントは、両方のコードされたタンパク質が、十分に保存されたＣ末端ＢＵＲＰドメイン（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｊ．ら、１９９８年）を含有することを示す。最も関連したタンパク質の１つは、脱水中に誘導されるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＲＤ２２タンパク質である（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ．、及びＳｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ．  １９９３年）。したがって、本発明者らはコーヒーにおける対応するタンパク質を脱水誘導タンパク質（ＤＩＰ）、すなわち、それぞれコフィア・カネフォラＤＩＰ１及びコフィア・カネフォラＤＩＰ２と命名した。これまでのところ、植物におけるこれらのタンパク質の役割に関する文献での重要な情報はない。コーヒーＤＩＰ  ｃＤＮＡも、他のファミリーメンバーで見出されるモチーフＴＸＶ及びＶＸＴの反復を含有するが、モチーフ数は異なる配列間では異なる（Ｖａｎ  Ｓｏｎ  Ｌｅ  ２００５年）。
【０１２１】
［00163］２つの関連したＤＩＰ配列は、完全なｃＤＮＡ配列に対しクラスタルＷプログラムを用いてＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアにより整列させ、これらが約６３．３％同一であることを明らかにした。コードされたタンパク質配列は５６．１％同一である。ＤＩＰ２は粒では発現されず、幾つかの他の組織（高レベルを示す根、茎、及び葉）で発現される。本発明者らは、分析したアラビカ組織がしばしば、テストした同等のロブスタ組織よりも高い発現レベルを有するように見えたことにも注目している。ＤＩＰ２発現における真の種特異的な差を判定するには、これらの２つの異なる種の他の変種によるさらなる研究が必要である。
【０１２２】
［00164］クローン（ユニジーンＣＧＮ−Ｕ１１９５１１由来のｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９）、及び最も関連したデータベース配列の最適化アライメントの調査は、コードされたタンパク質がグループ５の病原性関連タンパク質と高い類似性を有することを示した。このアライメントも、このコーヒータンパク質配列が、タウマチン様タンパク質及び１６個の高度に保存されたシステイン残基で見出されるモチーフを含有することを示す（図８）。ｐｃｃｃｓ４６Ｗ１６ｎｌ９におけるタンパク質配列の高度の相同性が、本発明者らにこの遺伝子をコフィア・カネフォラ病原性関連タンパク質、ＰＲ−５Ａと命名させた。植物におけるこれらのタンパク質の役割に関する文献での情報は比較的少ないが、異なるメンバーが病原体耐性又は植物の水管理における幾つかの未確定な役割に関与している。ＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２、及びＣｃＰＲ−５Ａの疎水性プロットの調査（図９）は、これらのタンパク質の全てが潜在的リーダーペプチド配列である短いＮ末端疎水性セグメントを有することを示す。リーダー又はシグナルペプチドの存在は、３つのこれらのタンパク質の全てが小胞体から輸出されることになっていることを示唆する。この推定リーダーペプチド部分を別にすれば、３つのタンパク質は全て高度親水性である。この後者の観察の妥当性は、現在分かっていない。
【０１２３】
実施例２
Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラの異なる組織におけるＣｃＤＩＰ１、ＣｃＤＩＰ２及びＣｃＰＲ−５Ａの発現分析
［00165］異なるコーヒー組織における３つの遺伝子の相対的転写産物レベルは、ＱＲＴＰＣＲにより判定した。得られた結果を図１４に示す。低レベルのＤＩＰ１転写物がアラビカの小グリーン粒で検出された（ＲＱ  ０．３１）のに対し、ロブスタでは、極めて低レベルのみがこの段階で検出された（ＲＱ  ０．０３）。内胚乳が形成／膨張し始める大グリーン期で、ＤＩＰ１転写産物レベルが極めて著しく増加した（ＲＱ  ６７．２）。対照的に、ロブスタについては、レベルはこの段階でわずかに上昇した（ＲＱ  ０．０１９）。イエロー期では、アラビカの転写産物レベルは大グリーン期で見られるものと比較的類似していた（ＲＱ  ５９．４）が、ロブスタでは、レベルは著しく上昇した（ＲＱ＝６．６）。レッド粒でのＤＩＰ１転写産物レベルは、アラビカについてはわずかに上昇したが、レッドロブスタ粒で大幅にさらに上昇した（ＲＱ  ３７．２）。全体に、ＤＩＰ１転写物は、これら２つの種のチェリーの発育に関しロブスタ粒に対してアラビカ粒で早期に出現した。極めて少ないＤＩＰ１発現が、調査した他の組織で検出されたが、大グリーン、イエロー、及びレッド果皮では低レベルが検出され、大グリーン期は最も高かった（ロブスタ及びアラビカに対しそれぞれ、ＲＱ  ０．３６及び０．０４３）。ＤＩＰ１転写物がロブスタ根、枝、葉、又は花組織では検出されず、アラビカで３つのこれらの組織について低レベルの転写物が検出されたことに注目するのは興味深い（ＲＱ＝０．０２７枝、０．００５葉、及び０．００８花）。
【０１２４】
［00166］ＤＩＰ２の発現分析は、この遺伝子の組織発現パターンがＤＩＰ１のものと著しく異なることを示す（図１４）。粒では、極めて低い転写産物レベルがアラビカ及びロブスタの両方で小グリーン期に見られた。ＤＩＰ２はロブスタのレッド果皮では検出されなかったが、低レベルの発現が小グリーン〜イエロー期で検出され、ロブスタの小グリーン期が最も高い発現を示した（ＲＱ＝０．２）。しかし、ＤＩＰ２転写物はアラビカ果皮組織ではほとんど検出されなかった。ＤＩＰ２転写物は調査した他の組織でも検出され、アラビカ根、枝、葉及び花のＲＱレベルは、それぞれＲＱ値０．３７、０．７３、０．６５、及び０．０４を示した。興味深いことに、ロブスタでは、はるかに低い転写産物レベルが根、枝、及び葉で検出された（それぞれ、ＲＱ値０．０１２、０．００７、及び０．０１６）。ロブスタ花では発現は検出されなかった。アラビカ対ロブスタの幾つかの組織におけるＣｃＤＩＰ２発現間の変動はやや予想外であったことから、これらの差を確認するには新たなＲＮＡ試料を用いたさらなる実験が必要である。
【０１２５】
［00167］ＰＲ−５Ａの発現分析は、この遺伝子が粒で発現され、アラビカは、アラビカの小グリーン、大グリーン、イエロー及びレッド期に対し、それぞれＲＱ値０．０４、０．５５、１．０、及び１．２３を示した（図１４）。この場合も、ＰＲ−５Ａのような後期遺伝子の発現は、ロブスタ粒発育中に停滞するように見える。転写物は、小グリーン又は大グリーンロブスタ粒では明らかに検出されなかったが、極めて低レベルがイエロー期で検出され、次いでレッド期により上昇した（それぞれＲＱ＝０．００５及び０．７５）。果皮組織では、ロブスタ及びアラビカの小グリーン期に存在する低レベルのＰＲ−５Ａ転写物があり（それぞれＲＱ＝０．０１４及び０．０２６）、このレベルは発育が続いている時に上昇する。
【０１２６】
［00168］アラビカでの転写産物レベルの増加は、ロブスタより早期に開始した。例えば、イエロー期では、ＲＱはロブスタが０．１２、アラビカが２．６２であるのに対し、値はレッド期にはるかに近くなる（それぞれＲＱ＝２．３及び２．５。ＰＲ−５Ａ発現が、ロブスタ果皮に対しアラビカ果皮で早期に検出されたという事実は、粒について以前に観察されたように、ロブスタの果皮がアラビカの果皮より後で成熟するらしいことを示している（赤色発達に関して）。ＰＲ−５Ａタンパク質の機能は分かっていないが、この遺伝子は遺伝子ファミリー病原性関連タンパク質５（ＰＲ−５、タウマチン様タンパク質、ＴＬＰとも呼ばれる）のメンバーである。幾つかのＰＲタンパク質は抗真菌特性（Ｖｉｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．ら  １９９１年）；（Ｈｕ，Ｘ．及びＲｅｄｄｙ，Ａ．Ｓ．  １９９７年）を有することが見出された。
【０１２７】
［00169］ＰＲ−５Ａ転写物は、ロブスタ及びアラビカ両方の根及び枝で検出された（ＲＱ＝０．１７及び０．３６、対ＲＱ＝０．２７及び０．００４２）。転写産物レベルのより著しい差が、葉においてロブスタとアラビカとの間で観察された（ＲＱ＝０．０７６対非検出）。
【０１２８】
実施例３
Ｃ．アラビカ葉発育中のＤＩＰ２及びＰＲ−５Ａの発現分析
［00170］ＤＩＰ２はアラビカ及びロブスタ両方の葉で発現されたが、ＰＲ−５Ａは２つの種の葉発現の著しい差を示している（図１４）。本発明者らは、これらの遺伝子の転写産物レベルがアラビカで葉の発育段階により影響されるかどうかを調べることにした。
【０１２９】
［00171］図１５に示されたデータは、ＤＩＰ２転写産物レベルは葉が発育するにつれて増加し、転写産物レベルが極めて若い葉（ＲＱ＝０．２９）から成熟葉（ＲＱ＝１．３６）まで５倍近く上昇することを示す。転写産物レベルは次いで、旧葉で再び低下するように思われる（ＲＱ＝０．９１）。対照的に、ＰＲ−５Ａ転写物は発育中の葉ではほとんど検出できず（若葉で最大ＲＱは０．００１６であった）、図１４に見られる結果を裏付けた。興味深いことに、ＰＲ−５Ａ転写産物レベルは旧葉において比較的著しい形で上昇するように見える（ＲＱ＝０．０４３）。発育中のアラビカ葉におけるこのタンパク質のレベルは、極めて若い葉から成熟葉ではほとんど検出できなかったが、旧葉で低レベルを示したことから、おそらくこのタンパク質は老化における役割を果たしている。
【０１３０】
実施例４
Ｃ．アラビカ種子発芽中のＤＩＰ１、ＤＩＰ２及びＰＲ−５Ａの発現分析
［00172］発芽中の粒全体における３つの遺伝子の発現を調べた（図１６）。ＤＩＰ１転写産物レベルは、実験開始時に最も高く（ＲＱ＝１．２）、次いで発芽が３０日試料まで続いている時は低下し、ＤＩＰ１発現の急上昇を示した。発芽試験の開始時にＤＩＰ１について見られたＲＱは、成熟粒で見られたものより著しく低く、この転写産物が粒乾燥及び洗浄ステップ中に不安定になった可能性があることを示唆する。ＤＩＰ２転写物は発芽早期には検出できなかったが、発芽して６０日前後に検出可能になる（ＲＱ＝０．０５）。Ｔ＝０でのＰＲ−５Ａ転写産物レベル（ＲＱ＝０．０５３）は、成熟アラビカ粒よりはるかに低く、この場合もさまざまな洗浄及び乾燥ステップ中にこれらの転写物の著しい喪失があるらしいことを示した。ＰＲ−５Ａ転写物レベルは、最初の５日間は比較的安定していたが、次いで３０日目でわずかに上昇した後、再び低下した（６０日試料、ＲＱ＝０．０３）。
【０１３１】
実施例５
浸透圧ストレス条件下のＣ．カネフォラにおけるＤＩＰ１、ＤＩＰ２及びＰＲ−５Ａの発現分析。
［00173］干ばつストレスを受けた植物の葉における発現
［00174］遺伝子ＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａは、粒発育後期の脱水期に強く発現され、故に、細胞が感じる水ストレスのレベルにより制御される可能性がある。発現がこのように制御される可能性をテストするため、６週間脱水ストレスを受けているロブスタ植物の葉におけるこれらの遺伝子の発現を調べた。他の分析が、デハイドリンＣｃＤＨ１遺伝子（Ｈｉｎｎｉｇｅｒ，Ｃ．ら  ２００６年）（ＡＢＡに媒介される可能性のあるストレス遺伝子のファミリーである遺伝子）は、干ばつ条件の５及び６週間中に干ばつストレスを受けた植物の葉で強く誘導されることを証明している（データ不図示）。先に見られたように、ＤＩＰ１転写物は、十分に水やりをしたロブスタ植物の葉では検出されなかった（図１７）。しかし、水ストレスを受けると、低レベルのＤＩＰ１誘導が検出された。ストレスを受けたＦＲＴ０４植物の葉については０．０１及び０．００５のＲＱが、及びストレスを受けたＦＲＴ２３植物の葉については０．０１２及び０．０１のＲＱが観察された。
【０１３２】
［00175］水やりをした対照葉におけるＤＩＰ２転写物の測定は、ＤＩＰ２発現が変種間で著しく異なることを示した（ＦＲＴ０４及びＦＲＴ２３に対しそれぞれ、ＲＱ＝０．３６及び３．１４）。干ばつストレスを受けた試料でのＤＩＰ２転写物レベルは対照と類似しており、干ばつストレスがＤＩＰ２転写産物レベルを増加させないことを示した。観察されたＤＩＰ２レベルの変動が変種特異的であるのか、又は幾つかの他の要因（複数可）によるものかは分かっていない。
【０１３３】
［00176］干ばつストレスを受けた及びストレスを受けない植物の葉におけるＰＲ−５Ａ転写物レベルの一貫性のある変化はなかった。一方の変種は極めてわずかな誘導を示し、他方は対照でのレベルのわずかな上昇、これに続くストレスを受けた試料での低下を示した。全体に、ＰＲ−５Ａはコーヒー葉では干ばつストレスにより誘導されなかったように見える。
【０１３４】
［00177］上昇した塩に供されたマイクロカッティングにおける発現
［00178］上昇した塩レベルに曝露された植物も浸透圧ストレス反応を示す（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ａ．ら、２００７；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．及びＳｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｋ．、２００６年）。したがって、ＤＩＰ１、ＤＩＰ２、及びＰＲ−５Ａ遺伝子発現に与える上昇したＮａＣｌの影響を調べた。このようなストレス実験に利用可能な小木の数が限られるため、これらの実験はマイクロカッティングを用いて実施した。ロブスタ変種ＦＲＴ１２のマイクロカッティングは、Ｂ０．３培地でプレートで育成し（方法を参照のこと）、次いでマイクロカッティングの半分を新たなＢ０．３培地に入れ、及び半分を追加の５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する同培地に入れた。発現分析のため非処理マイクロカッティング試料を２、７、及び１０日後に採取し、処理マイクロカッティング試料は７及び１０日後に採取した。予想通り、ＤＩＰ１転写物は早期対照材料では検出されなかったのに対し、おそらくオリジナルプレートでの試料の加齢により対照での小さな誘導が１０日後に観測された（図１８）。ＤＩＰ１発現の小さな誘導も７及び１０日試料で観察された。ＤＩＰ２の発現分析は、処理と非処理試料との間で発現の差を示さなかった。
【０１３５】
［00179］しかし、ＤＩＰ２について得られたＲＱ値は、ロブスタ葉について見られるより著しく高かった（約１．５）（図１４）が、この実験でアラビカ試料について見られたものに近かった。ＤＩＰ２の誘導は塩処理については見られなかった。同様にＰＲ−５Ａについては、対照材料が、葉で以前に見られた誘導に対しやや高い転写産物レベルを有したが、塩処理材料でのレベルの増加はなかった。水ストレス誘導性遺伝子（ＤＨｌ）は、同じｃＤＮＡ調製物を用いて＋５０ｍＭ塩で誘導されることが以前に示された（Ｓａｙｆｆｅｒ，Ｆ．、未発表データ）。故に、全体に、図１８の結果は、５０ｍＭ  ＮａＣｌにより誘導されたＤＩＰ２又はＰＲ−５Ａ転写物の大幅な増加がなかったことを示している。マイクロカッティングは、おそらくはマイクロカットされた組織の成熟の少ない性質、又はマイクロカッティングでは大量に存在するが葉には大量に存在しない特異的組織のため、葉におけるよりもＤＩＰ２又はＰＲ−５Ａ遺伝子の高いベースライン発現をもたらす可能性がある。
【０１３６】
実施例６
ＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａ遺伝子の５’上流調節領域の単離。
［00180］現在、粒発育後期中に強い組換え遺伝子発現を可能にする利用可能なコーヒープロモータ配列はない。図１４に示されたデータは、遺伝子ＤＩＰ１及びＰＲ−５Ａが粒発育の最終期に粒で誘導されることを示している。ＤＩＰ１のプロモータはＰＲ−５Ａのプロモータより強く、及び粒により特異的であるように見える。強度が異なる後期粒プロモータを得るため、本発明者らは、ゲノムウォーキング法を用いて両方の遺伝子プロモータを単離することにした。
【０１３７】
［00181］ＤＩＰ１プロモータを推定的に含有する１１３６ｂｐフラグメントを得るには、１つの「ゲノムウォーキング」ステップのみが必要であった。このフラグメントをベクターｐＣＲ４−Ｔｏｐｏの中にクローン化してプラスミドｐＡＳ２２を得た（図１を参照のこと）。ｐＡＳ２２のゲノム配列及びＤＩＰ１  ｃＤＮＡ配列の連結性を検証するため、プロモータ領域及びｃＤＮＡ配列の両方を含有するゲノムフラグメントを単離し、及びベクターｐＣＲ４−Ｔｏｐｏにクローン化し、プラスミドｐＡＣ１を産生した。ｐＡＣ１について得られた配列を、次いでｐＡＳ２２及びｐｃｃｃｓ４６ｗ２０ｆｌ６と整列させた。このアライメントは、ＤＩＰ１遺伝子がそれぞれ１０４ｂｐ及び３９６ｂｐの２つのイントロンを含有することを示した（図１０を参照のこと）。該遺伝子の転写領域における２つの重複する配列間には８塩基の変化があり、これらの変化のうち６つは、少なくとも２つが潜在的に重要な変化であるアミノ酸変化をもたらした。ＤＩＰ１  ５’プロモータ領域配列で見出された１０ｂｐの差があり、幾つかの推定プロモータエレメントを同定した（プロモータエレメントの詳細については、図１１を参照のこと）。
【０１３８】
［00182］ＰＲ−５Ａプロモータを推定的に含有する１３８０ｂｐフラグメントをクローン化するには、同様に１つの「ゲノムウォーキング」ステップのみが必要であった。このフラグメントをベクターｐＣＲ４−Ｔｏｐｏの中にクローン化してプラスミドｐＡＣ７を得た（図２を参照のこと）。ｐＡＣ７のゲノム配列及びＰＲ−５Ａ  ｃＤＮＡ配列の連結性を検証するため、プロモータ領域及びｃＤＮＡ配列の両方の大部分を含有するゲノムフラグメントを単離し、及びベクターｐＣＲ４−Ｔｏｐｏにクローン化し、プラスミドｐＡＣ１７−Ａを産生した。ｐＡＣ１７−Ａについて得られた配列を、次いでｐＡＣ７及びｐｃｃｃｓ４６ｗ１６ｎｌ９と整列させた（図１２ｂを参照のこと）。このアライメントは、ＰＲ−５Ａ  ｃＤＮＡがいずれのイントロンも含有しないことを示した（図１２ａ及び１２ｂを参照のこと）。該遺伝子の転写領域における３つの配列間には１５塩基の変化があり、このうち８つがアミノ酸変化をもたらした。配列ｐｃｃｃｓ４６ｗ１６ｎｌ９における終止コドンの前に、新たな終止コドン６６塩基を作出するｃＤＮＡ配列ｐｃｃｃｓ４６ｗ１６ｎｌ９と比較して、コード領域での大きな変化はｐＡＣ１７−Ａ配列で観察された（図１２ａ及び１２ｂを参照のこと）。ＰＲ−５Ａ  ５’プロモータ領域配列で見出された１９ｂｐの差があり、幾つかの推定プロモータエレメントを同定した（図１３を参照のこと）。
【０１３９】
実施例７
粒発育の異なる段階で発現された遺伝子の比較転写産物分析：
ＬＥＡ１、ＯＬＥＯ１及びＤＩＰ１の転写産物蓄積
［00183］ＤＩＰ１遺伝子の単離により、各々が粒発育の限られた期間にのみ発現される、３つの異なる粒特異的コーヒー遺伝子、ＬＥＡ１、ＯＬＥＯ１、及びＤＩＰ１を同定した。ＬＥＡ１は、外胚乳／内胚乳移行期にのみ発現した（Ｈｉｎｎｉｇｅｒ，Ｃ．ら  ２００６；Ｔａｎｋｓｌｅｙ，Ｓ．ら  ２００７年；ＰＣＴ特許公開  国際公開第２００７／００５９８０号パンフレット）。ＯＬＥＯ１は内胚乳発育／膨張期に発現した（Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら  ２００６年ｂ；Ｓｉｍｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ら  ２００６年ａ、ＰＣＴ特許公開  国際公開第２００７／００５９２８号パンフレット）。本明細書で開示された通り、ＤＩＰ１は発育最終期（例えば、脱水期）に発現した。これらの遺伝子の発現重複レベルを調べるため、ロブスタチェリーにおける発育中の粒の幾つかの段階から調製したＲＮＡ／ｃＤＮＡにより、ＱＲＴ−ＰＣＲを用いて各遺伝子の相対的転写産物蓄積を定量的に測定した（変種Ｑ１２１）。
【０１４０】
［00184］図１９に示されたデータは、各遺伝子が異なる発育発現パターンを有することを裏付けている。ＬＥＡ１発現は主に週２６前後の時期に限られ、ＲＱ＝９．８に達する（外胚乳／内胚乳の移行を示す）。ＯＬＥＯ１発現は週２６で最初に検出され、内胚乳がこの時期に形成し始めていることを裏付けている。ＯＬＥＯ１転写産物レベルは、発育が続いている時にさらに増加し、３０−３４週期に最大レベルに達した（ＲＱ約７．５）。レベルは次いで徐々に低下して４２週でＲＱ＝１．６に達した。この時間はこの急速に成熟しているロブスタ変種の成熟粒を表す。この試料セットでは、著しいＤＩＰ１発現が３８週で検出され、次いで最終発育段階に著しく上昇し、成熟した４２週粒でＲＱ＝３２．１に達する。図１９の結果は、これらの３つの遺伝子が、異なるが多少重複する発育段階にコーヒー粒で発現することを裏付けている。
【０１４１】
実施例８
貯蔵グリーンコーヒー粒におけるＬＥＡ１、ＯＬＥＯ１及びＤＩＰ１転写産物レベルの測定
［00185］粒成熟は、劣った「青」臭さを有する成熟の少ないコーヒーにより、最終カップ品質に影響すると考えられる（Ｆａｒａｈ  Ａ．及びＤｏｎａｎｇｅｌｏ  ＣＭ．、２００６年）。故に、貯蔵粒の成熟レベルを正確に判定する方法は、各変種の最適コーヒー品質の原理に関して粒成熟の重要性を理解するのを助ける、又は市販のコーヒー試料における「グリーン」ノートの存在など特異的欠点の潜在的解釈を特定するのに有用となり得る。しかし、このようなアプローチが有用になるには、比較的小量の未熟粒を、成熟粒も含有する混合バッチで検出できることが必要である。ロブスタコーヒーのこの組織を調べるため、本発明者らは、２６週粒（極めて未熟／高いＬＥＡＰ１転写産物レベル）及び成熟４２週粒（高いＤＩＰ１転写産物レベル）の両方、プラス部分的に成熟した３０週粒（高オレオシン）及び成熟４２週粒（高ＤＩＰ１）から作製したｃＤＮＡの混合物から作製したｃＤＮＡの混合物を分析した。
【０１４２】
［00186］上記に示された通り、図１９に示されたデータは、ＬＥＡ１、ＯＬＥＯ１、及びＤＩＰ１の転写産物レベルの定量化が、コーヒー粒の発育段階を判定するのに使用することができることを示している。例えば、単一の粒におけるＬＥＡ１転写物の検出が、これが極めて未熟であることを示すと考えられるのに対し、ＯＬＥＯ１発現と比較して高レベルのＤＩＰ１発現の検出は、この粒が成熟の容認期に近い、又は容認期にあることを示すと考えられる。さらに、図２０に示された結果は、３つの遺伝子の発現比が、容認できない量の未熟粒を有するバッチの検出及び拒否を可能にする、バッチに存在する粒の成熟の有用な指標であることを示している。例えば、５％の２６週ｃＤＮＡプラス９５％の４２週ｃＤＮＡの混合物と関連した発現比は、５０％の各ｃＤＮＡの混合物における発現比と極めて異なる。同様に、５％の３０週ｃＤＮＡプラス９５％の４２週ｃＤＮＡの混合物における３つの遺伝子の発現比は、５０％の各ｃＤＮＡの混合物について観察された比と極めて異なる。
【０１４３】
［00187］結果は、異なる粒成熟段階で主に発現した３つの遺伝子の定量的発現分析が、ａ）極めて低レベルの未熟粒の存在（例えば、ＬＥＡＰ１転写物の検出）、ｂ）成熟粒の存在（例えば、ＤＩＰ１転写物の検出）を粒混合バッチで明らかにし、及び３）全ての３つの遺伝子の相対的転写産物レベルに基づき、バッチにおける平均的粒成熟を推定することができることを示唆する。
【０１４４】
［00188］上記に示された実験は全て、収穫以降−８０℃で貯蔵した粒から抽出した高品質ＲＮＡを使用している。しかし、焙煎及び抽出に使用した市販のグリーンコーヒー粒は、予め、貯蔵前の大規模乾燥（１１〜１２％湿度前後）を含むさまざまな収穫後処理に供した。粒内に含有されたＲＮＡを含む生物材料の条件に著しく影響を与えるには、これらの処理、並びに温度及び湿度の準最適条件下での長期貯蔵が期待されよう。
【０１４５】
［00189］ＲＮＡは特に分解に敏感であることから、ａ）貯蔵されたグリーン粒からＲＮＡが単離されることはほとんどない又はない、ｂ）単離されたＲＮＡは非機能的になる可能性がある（すなわち、ｃＤＮＡ合成に適さない）、又は３）得られたＲＮＡは転写産物レベル測定に使用するには分解されすぎる可能性があることが予想され得る。これらの問題はコーヒーについては、又は本発明者らの知る限りコメ又はトウモロコシなどの他の貯蔵粒については、大方の場合以前に対処されていない。貯蔵粒におけるＲＮＡ状態の第１の問題に対処するため、本発明者らは最初に、エクアドルの実験農場で生産されたグリーンコーヒーの単一ロットの４つの別個の試料からＲＮＡを抽出した。このロットは、農場での乾燥過程収穫後処理を用いて調製し、及び乾燥粒を実験室に船便で輸送し、ここで１年以上周囲条件下で貯蔵した。４つのＲＮＡ試料のゲル分析は図２１に示され、及び高品質ＲＮＡはこの実験で生成されなかったのに対し、相当量の部分的に分解されたＲＮＡを単離することができたことを示している。幾つかの主要なリボソームＲＮＡがインタクトなままであるという事実は、単離された相当量の分解ＲＮＡ分子が、おそらく３〜４より少ない部位で単離されることを示唆する。ＲＮＡの損傷が限られることを考えれば、このＲＮＡはｃＤＮＡ合成反応で機能するであろうことが期待できる。
【０１４６】
［00190］部分的に分解されたＲＮＡのみが、貯蔵され収穫後処理されたグリーンコーヒー粒から単離され得るという、本発明者らの予想外の観察を確認するため、本発明者らは、１年以上貯蔵されたグリーンロブスタコーヒーの６つの他のバッチ由来の試料で第２のＲＮＡ抽出を実施した。得られた結果を図２２に示す。結果は、部分的に分解されたＲＮＡは大部分のテスト試料から単離することができ、試料ＦＲＴ２８のみがＲＮＡをほとんど生成しない又は全く生成しないことを示している。幾つかの場合に、本発明者らは貯蔵粒からより高い品質のＲＮＡを単離することもできたことに注意すべきである（図２３を参照のこと）。単離されたＲＮＡの品質変動性のソースは現在不明であるが、貯蔵条件の違い、及びおそらくはＲＮＡ抽出手順における小さな未確認変数が疑われる。今後の試験は、特に湿度及び温度の著しい変動が抽出されたＲＮＡの品質に与える影響に注目して、及びＲＮＡ精製手順に対する小さな調整により、この可能性を調査することができよう。
【０１４７】
［00191］転写産物定量化を、図２１及び２２に見られるものなど、部分的に分解されたＲＮＡを用いて実施することができるかどうかを判定するため、ポリｄＴをプライマーに用いて幾つかのこれらのＲＮＡ試料からｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを、次いでＯＬＥＯ１及びＤＩＰ１転写産物レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）分析で使用した。比較目的のため、粒発育の２つの後期（４２週及び４６週での完熟粒）にロブスタ変種ＢＰ３５８由来の高品質ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いて、これら２つの遺伝子のＱＲＴ−ＰＣＲ分析も実施した。
【０１４８】
［00192］得られた結果（図２４）は、対照ＢＰ３５８試料が、期待した結果、すなわち、成熟４６週試料での高レベルのＤＩＰ１転写物及び培地レベルのＯＬＥＯ１転写産物対成熟の少ない４２週粒での高レベルのＯＬＥＯ１転写産物及び低レベルのＤＩＰ１転写物、（図２４）を示すことを示している。成熟粒（ＦＲＴ  ０９、ＦＲＴ  ４９、ＦＲＴ  ５３）のみを用いて作製された３つの貯蔵試料のデータは、ａ）ＯＬＥＯ１及びＤＩＰ１転写物が、部分的に分解されたＲＮＡを由比に検出できること、及びｂ）ＯＬＥＯ１対ＤＩＰ１転写物の比がこれらの成熟粒試料について予想されるものであったことを示した。これらの粒試料が、成熟レッド粒のみが確実に収穫されるように手摘みにより実験農場で生産されたことを指摘することは重要である。部分的に分解されたＲＮＡを有する試料を用いて得られたＲＱ値は、インタクトなＲＮＡを有する４６週ＢＰ３５８試料の同等のＲＱ値よりも、ＯＬＥＯ１転写産物については３．９〜５．５倍低く、ＤＩＰ１転写物については３．９〜２．２倍低かったことに注意すべきである。この低下はおそらく、ポリＡ＋ＴａｑＭａｎプローブ配列を有する領域を含有する転写物の減少が原因である（本明細書で論じられた各遺伝子に対するＴａｑＭａｎプライマー及びプローブの位置については図２５〜２８を参照のこと）。しかしながら、本発明者らはまた、転写物レベルの低下にもかかわらず、インタクトな４６週ＲＮＡ由来のＯＬＥＯ１対ＤＩＰ１  ＲＱ値の比（比＝１．１７）が、３つの分解されたＲＮＡ試料について見られる比（試料ＦＲＴ  ０９、ＦＲＴ  ４９、ＦＲＴ  ５３に対し、それぞれ０．４７、０．９１、及び１．１４の比）にほぼ等しいままであることにも注目する。この後者の観察は、ＯＬＥＯ１、ＤＩＰ１及びＲＰＬ３９の転写物が貯蔵中に同様に分解される、及び／又はこれらが単離手順中に同様に分解されることを強く示唆している。
【０１４９】
［00193］本明細書では、本発明の典型的な好ましい実施形態が開示されており及び、特定の用語が使用されているが、これらは一般的及び記述的な意味でのみ使用され、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限する目的ではない。明らかに、本発明の多くの変更及び変形が上記の教示に照らして可能である。したがって、添付特許請求の範囲内で本発明は具体的に記載された通り以外にも実践できることを理解するべきである。
【０１５０】
［00194］参考文献リスト
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【０１５１】
配列表
配列番号：１〜５１を含む配列表が本明細書に添付される。配列表に提供された各配列は、全体があらゆる目的のため参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2011525353.tif 000006
【図２】
2011525353.tif 000007
【図３Ａ】
2011525353.tif 000008
【図３Ｂ】
2011525353.tif 000009
【図３Ｃ】
2011525353.tif 000010
【図４】
2011525353.tif 000011
【図５Ａ】
2011525353.tif 000012
【図５Ｂ】
2011525353.tif 000013
【図６】
2011525353.tif 000014
【図７Ａ】
2011525353.tif 000015
【図７Ｂ】
2011525353.tif 000016
【図８Ａ】
2011525353.tif 000017
【図８Ｂ】
2011525353.tif 000018
【図９】
2011525353.tif 000019
【図１０】
2011525353.tif 000020
【図１１】
2011525353.tif 000021
【図１２Ａ】
2011525353.tif 000022
【図１２Ｂ−１】
2011525353.tif 000023
【図１２Ｂ−２】
2011525353.tif 000024
【図１２Ｂ−３】
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【図１２Ｂ−４】
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【図１２Ｂ−５】
2011525353.tif 000027
【図１３】
2011525353.tif 000028
【図１４】
2011525353.tif 000029
【図１５】
2011525353.tif 000030
【図１６】
2011525353.tif 000031
【図１７】
2011525353.tif 000032
【図１８】
2011525353.tif 000033
【図１９】
2011525353.tif 000034
【図２０】
2011525353.tif 000035
【図２１】
2011525353.tif 000036
【図２２】
2011525353.tif 000037
【図２３】
2011525353.tif 000038
【図２４】
2011525353.tif 000039
【図２５】
2011525353.tif 000040
【図２６】
2011525353.tif 000041
【図２７】
2011525353.tif 000042
【図２８】
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【図２９】
2011525353.tif 000044
【配列表】
2011525353000001.app
【国際調査報告】
2011525353.tif 000045
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