(57)【要約】本発明は、SIRT3活性レベルの修飾に関する。本発明は、筋細胞中の代謝を調節すると共に、カロリー制限又は運動を模倣するための用途を有する。
2011500810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋細胞中でカロリー制限又は運動の利点を模倣する方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
筋細胞中でミトコンドリア生合成又は代謝を増加させる、あるいは、ミトコンドリア活性／持久性を高める、ための方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項３】
糖取り込みに対して筋細胞を感作する方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項４】
筋細胞中の脂肪酸酸化を増加させる方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項５】
筋細胞中の活性酸素種（ROS）を減少させる方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項６】
筋細胞中のPGC-1α 及び／又は ucp3 及び／又はGLUT4 発現を増加させる、及び／又は、AMP活性化タンパク質キナーゼ (AMPK) を活性化させる方法であって、前記細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項７】
前記筋細胞が骨格筋細胞である、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記筋細胞が遅筋の細胞である、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記筋細胞がヒラメ筋細胞である、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記筋細胞が対象内にあって、前記方法が、前記対象の細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質、これを必要とする対象である対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記作用物質が対象の筋肉に標的決定される又は投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記作用物質がSIRT3タンパク質又はその生物学的に有効なホモログ又はこのようなものをコードする核酸である、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質が、ヒトSIRT3をコードする核酸又はその生物学的に有効なホモログである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的に有効なホモログが、脱アセチル化酵素及び／又はADPリボシルトランスフェラーゼ活性を有するヒトSIRT3の断片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記作用物質が低分子である、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質がSIRT1の活性化剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、タンパク質又は活性レベルでSIRT3の増加を必要とする細胞である、請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、対象の罹患細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法であって、対象においてSIRT3のタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
対象の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法であって、対象においてAMPKのタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
対象の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を増加させる方法であって、対象においてAMPKのタンパク質又は活性レベルを刺激する作用物質を対象に投与するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
筋細胞中のSIRT3のタンパク質レベルを増加させる方法であって、カロリー制限又は絶食に細胞をさらすステップを含む、方法。
【請求項２３】
対象の筋内のSIRT3のタンパク質レベルを増加させる方法であって、前記対象をカロリー制限、絶食又は運動にさらすステップを含む、方法。
【請求項２４】
筋細胞がカロリー制限又は運動から利益を得るであろう対象において疾患又は状態を処置又は防止する方法であって、筋細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記疾患又は状態がミトコンドリア疾患、代謝障害、神経学的障害、筋肉障害、心臓血管疾患、体重過剰又は肥満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患がインシュリン耐性又は糖尿病又は糖尿病関連状態又は障害である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ある対象が、筋肉代謝又は筋肉エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有するかどうか、又は、発症する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、対象の筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルを判定するステップを含み、この場合、コントロールに比較したときに、対象の細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルが統計上低いレベルであることは、前記対象が、筋肉代謝又は筋肉エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有する、又は、発症する可能性が高いことの指標となる、方法。
【請求項２９】
前記コントロールが、ある健康な対象の同様な筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルであるか、あるいは、少なくとも５人の健康な対象の平均のそれである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
筋細胞内でカロリー制限又は運動の利点を模倣する作用物質を同定する方法であって、筋細胞を作用物質に接触させる、又は、筋細胞内に作用物質を投与するステップと、カロリー制限又は運動の利点が細胞内で模倣されたかどうかを判定するステップとを含む、方法。
【請求項３１】
前記作用物質が、筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記作用物質が筋細胞内でのSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させるかどうかを判定するステップを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記作用物質が、筋細胞内でSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用物質が筋細胞内でSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させるかどうかを判定するステップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が真核細胞である、請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、引用をもってその全文をここに援用することとする、２００７年１０月２３日出願の標題「運動を模倣するためのSIRT-3関連方法及び組成物」の米国仮出願番号60/981,960号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦支援による研究
本発明は合衆国国立衛生研究所により付与される助成金RO1GM068072, RO1AG028730 及び PO1AG027916の下で政府支援を受けてなされた。 本政府は本発明に特定の権利を有するものである。
【０００３】
発明の分野
本発明はSIRT3活性を修飾することによりカロリー制限を模倣し、代謝を増加させる方法に関する。
【０００４】
発明の背景
サーチュインはNAD+
を共基質として用いる脱アセチル化酵素及びモノ-ADPリボシルトランスフェラーゼの保存された一ファミリーである (Guarente and Picard, 2005)。クラスI及びII HDACに対して実質的に何の配列相同性も持たない(Denu, 2005; Frye, 2000)、これらの珍しい酵素は、細胞生存及び生物長寿の鍵となる調節物質として出現した (Guarente and Picard, 2005)。サーチュイン・ファミリーの始祖メンバーであるサッカロミセス-セレビジエ（原語：Saccharomyces cerevisiae ）Sir2は、中度のストレス及びカロリー制限による寿命伸長を媒介する NAD+-依存的ヒストン脱アセチル化酵素である (CR) (Imai et al., 2000; Lin et
al., 2000; Rogina and Helfand, 2004; Smith et al., 2000; Tanny et al., 1999)。哺乳動物は七種類のサーチュイン、SIRT1-7を有する。SIRT1は核内脱アセチル化酵素であり、細胞生存、糖恒常性、及び脂肪代謝を含む多様な機能を調節する (Guarente, 2005)。三種類のミトコンドリア内サーチュインSIRT3-5がある。 SIRT3 及びSIRT4 は最近、それぞれアセチル-CoA シンセターゼ 2 (AceCS2) 及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを調節することが示されている(Haigis et al., 2006; Hallows et al., 2006; Schwer et al., 2002)が、それらの生物学的機能については他には何も知られていない。
【０００５】
発明の概要
本発明の数局面は、SIRT3発現及び活性の修飾に関する。SIRT3が、代謝上活性な組織では高レベル発現していることをここで実証する。SIRT3の修飾は、カロリー制限又は運動の模倣、ミトコンドリア生合成又は代謝の増加、糖取り込みに対する細胞の感作、脂肪酸酸化の増加、及び活性酸素種の減少を含め、筋細胞にとって多様な生物学的用途を有する。加えて、SIRT3は遺伝毒性ストレス中の細胞生存促進に関与していることをここで実証する。このように、SIRT3レベルの修飾は細胞生存を媒介する際にも用途を有する。
【０００６】
また本発明の数局面は、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、筋細胞内でカロリー制限又は運動の利点を模倣する方法に関する。いくつかの実施態様では、本発明は、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、筋細胞内でミトコンドリア生合成もしくは代謝を増加させる、あるいは、ミトコンドリア活性／持久性を刺激する、方法に関する。いくつかの実施態様では、本発明は、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、糖取り込みに対して筋細胞を感作する方法に関する。
【０００７】
本発明の更なる実施態様は、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、筋細胞内の脂肪酸酸化を増加させる方法に関する。本発明のいくつかの実施態様は、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、筋細胞内に活性酸素種（ROS）を減少させる方法に関する。
【０００８】
ここで解説するのは、細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に筋細胞を接触させることにより、筋細胞内でPGC-1α 及び／又はucp3 及び／又はGLUT4 発現を増加させる、及び／又は、AMP活性化タンパク質キナーゼ (AMPK) を活性化する方法である。いくつかの実施態様では、ここで解説する方法は、骨格筋細胞などの筋細胞に関する。いくつかの実施態様では、前記筋細胞は遅筋の細胞である。いくつかの実施態様では、前記筋細胞はヒラメ筋細胞である。いくつかの実施態様では、前記筋細胞は対象内にあり、そして本方法は、対象の細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質を、その必要がある対象に投与することを含む。
【０００９】
本発明の数局面は、その必要がある対象の筋内に作用物質を標的化する又は投与することに関する。いくつかの実施態様では、前記作用物質は、SIRTタンパク質又はその生物学的に有効な相同体又はそのようなものをコードする核酸である。いくつかの実施態様では、前記作用物質は、ヒトSIRT3をコードする核酸又はその生物学的に有効な相同体である。前記の生物学的に有効な相同体は、脱アセチル化酵素及び／又はADPリボシルトランスフェラーゼ活性を有するヒトSIRT3の一フラグメントである。前記作用物質は低分子であってもよく、そしていくつかの実施態様では、SIRT1の活性化物質である。ここで解説する方法を、タンパク質又は活性レベルでのSIRT3増加の必要のある細胞に適用することができる。いくつかの実施態様では、前記の細胞は対象の罹患細胞である。
【００１０】
本発明の数局面は、対象内でSIRT3のタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質を、その必要がある対象に投与することにより、対象内の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法に関する。本発明のいくつかの実施態様は、AMPKのタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質を、その必要がある対象に投与することにより、対象内の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法に関する。いくつかの方法は、AMPKのタンパク質又は活性レベルを刺激する作用物質を対象に投与するステップを含む、対象の骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を増加させる方法に関する。
【００１１】
ここで解説するのは、筋細胞をカロリー制限又は絶食に晒すことにより、前記細胞内のSIRT3のタンパク質レベルを増加させる方法である。いくつかの実施態様では、本方法は、対象をカロリー制限、絶食又は運動に晒すステップを含む、対象の筋細胞内でSIRT3のタンパク質レベルを増加させることに関する。本発明の数局面は、筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質を、その必要がある対象に投与することにより、カロリー制限又は運動が筋細胞にとって有益であろう対象において疾患又は状態を処置する又は防止する方法に関する。いくつかの実施態様では、前記疾患又は状態はミトコンドリア疾患、代謝障害、神経障害、筋肉障害、心臓血管疾患、体重過剰又は肥満である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、インシュリン体制又は糖尿病又は糖尿病関連状態又は障害である。いくつかの実施態様では、前記疾患はメタボリック・シンドロームである。
【００１２】
本発明の更なる局面は、対象の筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルを判定することにより、該対象が筋代謝又は筋エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有するかどうか、又は発症する可能性が高いかどうかを判定する方法に関し、このときコントロールに比較したときに、該対象の細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルが統計上低いレベルであることは、該対象が、筋代謝又は筋エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有する、又は発症する可能性が高いことの指標となる。いくつかの実施態様では、前記コントロールは、ある健康な対象の同様な筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルであるか、あるいは、少なくとも５人の健康な対象の平均のそれである。
【００１３】
更にここで解説するのは、筋細胞内でカロリー制限又は運動の利点を模倣する作用物質を同定する方法であり、該方法は、筋細胞を作用物質に接触させる、又は、筋細胞内に作用物質を投与するステップと、カロリー制限又は運動の利点が細胞内で模倣されたかどうかを判定するステップとを含む。いくつかの実施態様では、前記作用物質は、筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させるものである。いくつかの実施態様では、本方法は、当該作用物質が、筋細胞内でのSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させるかどうかを判定するステップを更に含む。いくつかの実施態様では、当該作用物質は、筋細胞内でSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させるものである。
更に本方法には、当該作用物質が、筋細胞内でSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させるかどうかを判定するステップを含めることができる。いくつかの実施態様では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施態様では、前記細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
添付の図面は実寸を描写するものとしては意図されていない。明晰性という目的のために、成分のすべてを図面ごとに記載している訳ではない。図面において：
【図１】図１は、運動訓練マウスにおけるSIRT3及び関連する下流マーカーの骨格筋特異的誘導を示すグラフ及びウェスタン・ブロットを示す。図１Ａは、心臓組織及び上腕三頭筋中のSIRT3発現を示すウェスタン・ブロットを示す。上腕三頭筋及び心臓組織を均質化し、50μgのタンパク質をウェスタン・ブロットにより、抗SIRT3血清（Covance社）及びα-チューブリン・コントロールを用いて分析した；代表的なブロットをここ及び全体を通じて示す。SED = 座位であり、TRD =訓練有りである。図１Ｂは、性別によりグループ分けした動物のブロットにImageQuant を用いたSIRT3バンド輝度の定量を示す。オスは白抜き棒で、そしてメスは塗り潰した棒で表にした。一コホート当たりで用いた、そしてグラフにした動物の総数は以下の通りである：座位オス、N = 7；座位メス、N = 5; 運動有りのオス、N = 8; 運動有りのメス、N = 6。図１Cは、訓練有り、対、座位マウス由来の50μgの上腕三頭筋タンパク質ライセートを用いたホスホ-CREB 及び総CREB タンパク質発現のウェスタン・ブロット分析を示す。ホスホ-CREB/Ser133及びCREBのバンド輝度を定量し、ホスホ-CREB 含有量を総CREB 含有量に対して正規化した；インサートはオスの上腕三頭筋組織の試料ブロットを提供するものである。図１Ｄでは、PGC-1αの誘導が、上腕三頭筋中のSIRT3発現亢進と相関することを示したウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる；試料は上述の通りに処理され、分析された；インサートのブロットはオスの上腕三頭筋組織のものである。図１Ｅでは、前に解説された(52)通りに、同じ上腕三頭筋試料からミトコンドリア・マーカーとして測定されたクエン酸シンターゼ活性のグラフを挙げる。 N = 2, *P < 0.05, **P < 0.01.
【図２】図２は、骨格筋細胞中のSIRT3作用を示す概略図である。まとめると、当該データは、SIRT3が多様な栄養学的及び生理学的シグナルに劇的に応答することで、例えばβ酸化、ROS産生、ミトコンドリア生合成、及び糖取り込みなど、AMPK及び下流のプロセスを解して筋エネルギー恒常性に影響するという作用モデルを裏付けるものである。従ってこの役割を考えると、骨格筋細胞内のSIRT3作用は、ヒトの健康及び疾患に影響を与える重要な診断上及び治療上のターゲットとして役立つかも知れない。
【図３】図３では、Namptが、遺伝毒性物質MMSから細胞を保護するストレス-及び栄養物質応答性遺伝子であることを示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図３Ａ−Ｂでは、10% FBS (A)、 又は、給餌有りもしくは２日間絶食後のスプラーグ・ドーリー・ラット（Ｂ）由来の肝組織抽出物の存在下又は非存在下におけるヒト線維肉腫HT1080細胞中のNamptレベルを示すウェスタン・ブロットを挙げる。アクチン及びチューブリンを装薬コントロールとして用いた。図３Ｃ−Ｄでは、絶食後のラットの肝臓におけるNampt タンパク質 (C) 及びmRNA レベル (D) を示すグラフを挙げる (n = 4; 棒はスチューデントt検定を用いた三つの実験の平均±s.d.を表す)。図３Ｅでは、低酸素下及び／又は血清枯渇下の初代ラット心筋細胞中のNamptのウェスタン・ブロットを挙げる。図３Ｆ−Ｇでは、1.2mMのメチルメタンスルホネート（MMS）による処置後の、ヒト（F）を安定に発現する、又は、マウスNampt（G）を一過性に発現するHT1080細胞の生存を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図３Ｈでは、Fと同様にMMSで処置した、ヒトNamptを安定に発現するヒト腎HEK293細胞の生存を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。
【図４】図４では、トポイソメラーゼ阻害剤により誘導されるアポトーシス性細胞死をNamptが保護することを示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図４Ａでは、MMS暴露後のNAMPTのsiRNA媒介性ノックダウンによるHT1080の感受性を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図４Ｂでは、Namptが安定に過剰発現するとMMS処置後のHEK293細胞の生存が向上し、この効果はNampt阻害剤FK866により遮断されることを示したグラフを挙げる。図４Ｃでは、２２時間の間血清枯渇させた後にMMSに１７時間暴露した野生型又はNamptノックダウンHT1080細胞の生存を示すグラフを挙げる。血清枯渇はNamptを上方調節し、野生型では生存率を向上させるが、NamptノックダウンHT1080細胞では向上させない。図４Ｄ−Ｅでは、エトポシド処置後の、Namptを安定に過剰発現するHEK293（D）、又は、NamptをsiRNAノックダウンしたHT1080(E)の生存を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図４Ｆでは、カンプトテシン処置後のHT1080 Namptノックダウン細胞の生存を示すウェスタン・ブロット及びグラフを示す。アポトーシスは、切断後のカスパーゼ-3のウェスタン・ブロット分析により評価された。棒は三つの実験の平均±s.d.を表す。
【図５】図５では、遺伝毒性に対するNampt媒介性保護にはSIRT3及びSIRT4が必要であることを示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図５Ａでは、SIRT1特異的阻害剤EX-527の存在下又は非存在下における、MMSへの暴露後のNamptを安定に発現するHEK293細胞の生存を示すグラフを挙げる。図５Ｂでは、四種類のsiRNAオリゴのプールを用いたSIRT1のsiRNAノックダウンを、非標的化siRNAコントロールに比較して示したグラフを挙げる。細胞にはFAMタグ付き蛍光性オリゴを同時トランスフェクトし、細胞死亡率を、PI/FAM陽性細胞対総FAM陽性細胞の比としてFACSにより判定した。図５Ｃでは、全サーチュイン阻害剤である100μlのシルチノールで処置したHEK293細胞の生存を示すグラフを挙げる。実験は全て、三重にして三回、行われた。棒は三つの実験の平均±s.d.を表す。図５Ｄ−Ｅでは細胞生存率を示したグラフを挙げる。SIRT3又はSIRT4を、特異的siRNAオリゴのプールを用いて、Namptを安定に過剰発現するHEK293細胞でノックダウンした後、細胞をMMSで処置し、生存したものを計数した。図５Ｆはウェスタン・ブロットを示すが、ここで(D)から採った細胞は、アポトーシスの指標である切断されたカスパーゼ-3についてプローブされた。図５Ｇでは、免疫沈降（IP）実験におけるアセチル化AceCS2のレベルを示すウェスタン・ブロットを挙げる。AceCS2は、コントロールの細胞ライセートと、コントロール・ベクター又はAceCS2-HAを４８時間、トランスフェクトされたNampt過剰発現HEK293細胞の細胞ライセートから免疫沈降させた。
【図６】図６では、Namptが総NAD+を調節することを示した概略的等式及びグラフを挙げる。 図６Ａは、NAD+測定で用いられた基準化合物である、同位体標識済み18O-NAD+の合成を示す概略図を挙げる。3-シアノピリジンを18O-H2Oに加水分解させることにより18O-NAMを合成した後、NAD+ グリコヒドロラーゼであるCD38に触媒させた酵素反応での基質として用いて18O-NAD+を生じさせた。図６Ｂ−Ｃではイオン強度のグラフを挙げる。総内因性16O-NAD+及び圧入されたNAD基準18O-NAD+をHPLCで単離した後、MALDI-MSにかけた。18O-NAD+の基準ピークのイオン強度を全ての場合で100 に正規化した。16O-NAD+ ピークの比は、二つの試料中のNAD+ の相対量を反映している。実験は少なくとも三回、行われた。HEK293由来の総NAD+ スペクトルをベクター・コントロールと、Nampt を安定に過剰発現する細胞について示し(B)、HT1080由来の総 NAD+ スペクトルをベクター・コントロール及びsiRNA-Nampt安定細胞について示す(C)。図６Ｄではイオン強度のグラフを挙げるが、Namptの過剰発現はMMSによる総細胞内NAD+枯渇を妨げることができないことを、HEK293野生型及びNampt過剰発現細胞をMMSで２時間処置した後の内因性16O-NAD 及び基準18O-NAD のMALDI-MSスペクトルで判断して示している。図６Ｅでは、1.2mMのMMS処置後で誘導される細胞死の時間経過を示すグラフを挙げる。細胞死亡率はFACS分析で判定された。図６Ｆでは、(E)の時間経過中、MALDI-MSで測定された総細胞内NAD+を示すグラフを挙げる。
【図７】図７では、哺乳動物ミトコンドリアが遺伝毒性ストレス中にミトコンドリア内NAD+ レベルを維持することを示すグラフ、ウェスタン・ブロット及び概略図を挙げる。図７Ａ−Ｂでは、Namptによるミトコンドリア内NAD+ レベルの調節を示すイオン強度グラフを挙げる。HEK293由来のスペクトルを、ベクター・コントロールと、Namptを安定に発現する細胞について示し（A）、HT1080 をベクター・コントロール及び siRNA-Nampt 安定細胞(B)について示した。図７Ｃでは、イオン強度のグラフを挙げるが、付加的なNamptはMMSによるミトコンドリア内NAD+ 枯渇を大きく減衰させることを、HEK293野生型及びNampt過剰発現細胞をMMSで２時間処置した後にMALDI-MSスペクトルで判断して示している。図７Ｄ−Ｅでは、高度に精製された細胞質ゾル内及びミトコンドリア内画分中のNamptのウェスタン・ブロット分析を挙げる。ミトコンドリア内画分はHEK293細胞から、又は、ラット肝から、二種類の異なるプロトコルを用いて単離され、それらの純度はHsp90、カルレティキュリン、及び／又は、乳酸脱水素酵素（細胞質内タンパク質のみ）、及びCoxIV 又はチトクロームＣ（ミトコンドリア内マトリックス・マーカー）についてプローブすることで評価された。同じブロットをラミニンA/Cについてプローブしてミトコンドリア内画分への核の混入を検査した。実験はHEK293 細胞及び肝組織に対して三回、行われた。同じパターンが各回で観察され、代表的なブロットを示している。図７Ｆでは、ラット肝由来ミトコンドリアがどのように調製され、そして遺伝毒性DNAアルキル化剤であるメチルメタンスルホネート(MMS)、又はNampt阻害剤FK866、あるいは両者、に暴露されたかを示す概略図を挙げる。単離されたミトコンドリア内のNAD+ レベルは上述した通り、MALDI-MSにより判定された。図７Ｇでは、単離されたミトコンドリア内のNAD+ レベルがMMS 及びFK866への暴露により減少したことを示すグラフを挙げる。同様なデータは、異なるミトコンドリア単離プロトコルを用いても得られた。図７Ｈでは、Nmnat-3の発現をノックダウンすると、MMSへの耐性を提供するNamptの能力が低下することを示すグラフを挙げる。図７Ｉでは、推定上のヒトミトコンドリアNAD+ トランスポータであるhMFTの発現をノックダウンしてもMMSで処置したNampt過剰発現細胞の生存に影響がないことを示したグラフを挙げる。
【図８】図８では、絶食が肝ミトコンドリアNAD+及びNampt レベルを増加させることを示したウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図８Ａでは、HEK293細胞内でNamptを過剰発現させると、提示した時間のMMS処置後の核へのAIF局在化が阻害されることを示したウェスタン・ブロット分析を挙げる。図８Ｂでは、不断給餌した又は４８時間絶食させたラット由来のミトコンドリア中のNamptのウェスタン・ブロット分析を挙げる。図８Ｃでは、不断給餌した又は４８時間絶食させたラット由来の肝組織中の相対的ミトコンドリアNAD＋レベルを示すグラフを挙げる。ミトコンドリアNAD+ レベルはMALDI-MSにより測定された。
【図９】図９では、30μM のPARP-1 阻害剤DPQの存在下又は非存在下でMMS処置した後のHEK293細胞の生存を示すグラフを挙げる。MMS誘導性細胞死はPARP-1を阻害することにより減衰される。
【図１０】図１０では、HT1080コントロール細胞、又は、MMSで４時間処置したNampt安定ノックダウン細胞の位相差画像を挙げる。円形の形態を持つ細胞は死につつある細胞であり、Namptノックダウン細胞の培養物中の方が多い。NamptをノックダウンするとHT1080細胞はMMS誘導性細胞死に感作される。
【図１１】図１１では、サーチュイン・ノックダウン実験を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。図１１Ａ−Ｂでは、ウェスタン・ブロット法で評価した内因性SIRT1、2、3、5、7を標的とした４種類のsiRNAオリゴ（60nM）(A)と、定量的RT-PCR法により評価したときのSIRT4、SIRT6 mRNA (B)のプールによるサーチュイン・ノックダウンの有効性を示すウェスタン・ブロット及びグラフを挙げる。相対的mRNAコピー数は、β-アクチンに比較して判定された。図１１Ｃ−Ｆでは、HEK293空ベクター、又は、サーチュインsiRNA又はスクランブルされたsiRNAオリゴを一次的にトランスフェクトしたNampt過剰発現細胞を、MMSで処理した後の生存率を示すグラフを挙げる。
【図１２】図１２では、siRNA-コントロール又はsiRNA-SIRT3オリゴ（60nM）をトランスフェクトした細胞における、エトポシド処理後のHEK293細胞の生存率を示すグラフ及びウェスタン・ブロットを挙げる。siRNAオリゴによるSIRT3のノックダウンの効果はウェスタン・ブロット法により評価された。
【図１３】図１３では、ミトコンドリアNAD+のグラフを挙げる。ミトコンドリアは様々なプロトコル＃２を用いて単離され（実施例２の材料及び方法の項を参照されたい）、メチルメタンスルホネート(MMS)、FK866、又は両者と一緒に３０分間、インキュベートされた。懸濁液を遠心し、NAD+ 含有量についてHPLC-MALDI-MSにより 18O-NAD+ を基準として用いて分析した。
【図１４】図１４では、siRNA処理細胞中のNmnat-3の定量的RT-PCRを示すグラフを挙げる。相対的mRNAコピー数はβ-アクチンに対して判定された。
【図１５】図１５では、配列アライメント及びグラフを挙げる。図１５Ａは、酵母Ndt1 (SEQ ID NO:24として提供) の配列アライメント及び推定上の葉酸トランスポータ hMFT (SEQ ID NO:25として提供)を示す。図１５Ｂは、siRNA処置細胞中のhMFTの定量的RT-PCRのグラフを示す。 相対的mRNA コピー数はβ-アクチンとの比較で判定された。
【図１６】図１６では、ニコチンアミド（NAM）からのNAD+の再利用における一番目の反応を触媒する酵素の系統額的比較を上げる。ニコチナミダーゼPnc1を利用するＳ．セレビジエ（原語：S. cerevisiae）、Ｃ．エレガンス（原語：C. elegans）及びＤ．メラノガスター（原語：D. melanogaster）とは異なり、脊椎動物は、第一ミトコンドリアの類縁であるα-プロテオバクテリアの酵素と高い相同性を持つニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼであるNamptを利用する。これは多様な門の分岐中のミトコンドリアの進化に光を当てるものかも知れない。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、SIRT3が代謝上活性な組織で高レベルに発現し、絶食、カロリー制限及び運動によりSIRT3発現が誘導されるという発見に基づくものである。これらの結果は、SIRT3が、エネルギー恒常性の調節や生理的及び栄養的キューへの応答に関与していることを示している。SIRT3の修飾は、カロリー制限又は運動の効果の模倣、そして代謝の向上を含め、幅広い生理的用途を有する。
【００１６】
本発明の用途は、以下の説明に記載されるか、あるいは図面で描写された構成の詳細及び成分の配置の制限を受けることはない。本発明は、他の実施態様が可能であり、また、多様な方法で実施可能であり、又は行われ得る。更に、ここで用いられる用語及び術語は説明を目的としたものであり、限定的なものと捉えられてはならない。「含む（原語：including）」、「含む（原語：comprising）」又は「有する」、「含有する」、「関与する（原語：involving）」、及びここでのそれらの多様な変形例の使用は、その後に列挙された項目及びその均等物や、付加的な項目を包含することを意図している。
【００１７】
ここに解説した方法はin vitroでも、又はin vivoでも応用できよう。例えば、これらをin vitroの細胞に応用しても、細胞株由来の細胞に応用しても、あるいは対象から得た細胞に応用してもよい。
【００１８】
SIRT3の増加は、例えば平滑筋又は心筋あるいはこれらの筋細胞など、一種類以上の筋肉の代謝活性化を必要とするいずれかの対象で有用であろう。対象は悪液質又は筋疲労を有する対象であってもよい。
【００１９】
更にSIRT3の増加は、例えば低体温の対象など、体温を高める又は維持するためにも用いられよう。代替的には、SIRT3の阻害は、例えば熱又は高体温を有する対象でなど、体温を低下させるために用いられよう。
【００２０】
またSIRT3の増加は、心臓血管疾患を処置又は防止するため、血管拡張により血圧を低下させるため、心臓血管の健康を増すため、（例えば平滑筋に影響するなど）血管及び動脈などの血管組織の収縮機能を増すためにも、用いられよう。
【００２１】
一般的には、SIRT3の活性化は、例えば腸管もしくは消化系もしくは尿管の筋肉など、いずれかの種類の筋肉の代謝を刺激するために用いてもよく、それにより便秘及び失禁などの腸管の運動性を制御するために用いてもよい。更にSIRT3活性化は勃起不全においても有用であろう。更にそれは静止の運動性を刺激するためにも用いてよく、例えば妊孕薬として用いてもよい。
SIRT3の増加が有用であろう他の実施態様には、手術又は事故後などの筋肉の修復、筋肉量の増加；及び運動能力の向上がある。
【００２２】
このように本発明は、一種以上の筋細胞を、細胞中のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質に接触させることにより、有益な効果が生まれる方法を提供するものである。これらの方法は、以下のうちの一つ以上を有効に促す、増加させる又は刺激する：筋細胞内のカロリー制限又は運動の利益を模倣する；ミトコンドリア生合成又は代謝を増加させる；筋細胞内のミトコンドリア活性及び／又は持久性を増加させる、筋細胞を糖取り込みに感作させる、筋細胞内の脂肪酸酸化を増加させる、筋細胞内の活性酸素種（ROS）を減少させる、筋細胞内のPGC-1α 及び／又は ucp3 及び／又は GLUT4 発現を増加させる、及び筋細胞内の
AMP 活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)を活性化させる。
【００２３】
多様な種類の筋細胞を本発明に従って接触させることができる。いくつかの実施態様では、前記筋細胞は骨格筋細胞である。いくつかの実施態様では、前記筋細胞はヒラメ筋細胞などの遅筋の細胞である。
【００２４】
本発明の方法には、いくつかの態様では、対象の細胞内においてSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質を、そのような処置を必要とする対象に投与するステップが含まれる。多様な投与方法が当業で公知であり、ここで解説した方法で用いることができる。いくつかの実施態様では、本作用物質は選択的には対象の筋肉に標的決定される、又は投与される。
上記の方法で有用な作用物質には、SIRT3タンパク質又はその生物学的に有効なホモログ、あるいは、SIRT3タンパク質又はその生物学的に有効なホモログをコードする核酸、が含まれる。いくつかの実施態様では、「生物学的に有効なホモログ」とは、SIRT3脱アセチル化酵素及び／又はSIRT3 ADPリボシルトランスフェラーゼ活性を有するホモログである。例には、脱アセチル化酵素及び／又はADPリボシルトランスフェラーゼ活性を有するヒトSIRT3のフラグメントがある。
上記の方法で有用な他の作用物質には、そのいくつかをここで解説すると共に、いくつかの実施態様ではSIRT1の活性化剤でもあるような低分子が含まれる。
【００２５】
上記の方法で接触させる細胞又は処置する対象は、好ましくは、タンパク質又は活性レベルにおけるSIRT3増加が必要な細胞である。いくつかの実施態様では、前記細胞は対象の罹患細胞である。
【００２６】
更に、対象において骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法も提供される。このような方法においては、対象においてSIRT3のタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質、即ち、ここで解説するSIRT3修飾物質を、これを必要とする対象に投与する。
【００２７】
対象における骨格筋代謝又は骨格筋エネルギー恒常性を調節する方法もここで提供する。これらの方法は、AMPKのタンパク質又は活性レベルを刺激する作用物質など、AMPKのタンパク質又は活性レベルを修飾する作用物質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む。例えば、ストレス及び運動は骨格筋内のAMPK活性を誘導する。チアゾリジンジオン・ファミリー（PPAR-γの活性化剤）又はメトフォルミンのインシュリン増感薬物はAMPKを調節することができる。脂肪細胞が分泌する複数のホルモン（アジポキン）はAMPK活性化を刺激又は阻害するものであり、上述の方法で有用であろう。レプチン及びアジポネクチンはAMPK活性化を刺激することが知られており、他方、レジスチンはAMPK活性化を阻害する。
【００２８】
更に、対象の筋細胞又は筋肉内のSIRT3のタンパク質レベルを増加させる方法も提供する。このような方法は、細胞又は対象をカロリー制限又は絶食に晒すステップ、又は、筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させる作用物質を、これを必要とする対象に投与するステップ、を含む。このような方法が有用である疾患、障害又は状態には、ミトコンドリア疾患、代謝障害、神経障害、筋障害、心臓血管障害、及び過剰な体重即ち肥満が含まれる。具体的な代謝障害、疾患又は状態にはインシュリン耐性、糖尿病、糖尿病関連状態又は障害、又はメタボリック・シンドロームがある。他の代謝障害は当業には公知であろう。
【００２９】
更に、ある対象が、筋肉代謝又は筋肉エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有するかどうか、又は、発症する可能性が高いかどうかを判定する方法も提供する。このような方法においては、対象の筋細胞内のSIRT3の活性レベル又は活性を判定する。コントロールに比較したときに、対象の細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性のレベルが統計上有意に低いことは、この対象が、筋肉代謝又は筋肉エネルギー恒常性の欠陥に関連する疾患又は状態を有する、又は、発症する可能性が高いことの指標となる。ここで用いられる場合の、特定の実施態様におけるコントロールとは、健康な対象の同様な筋細胞におけるSIRT3のタンパク質又は活性のレベルであるか、少なくとも５人の健康な対象の平均のそれである。他の実施態様では、コントロールは、例えばより多数の数の細胞における、より多数のレベルの測定に基づく、SIRT3のタンパク質又は活性のレベルの範囲であってよい。
【００３０】
筋細胞中でカロリー制限又は運動の利点を模倣する作用物質を同定する方法もここで提供する。このような方法においては、筋細胞を作用物質に接触させるか、あるいは、作用物質を筋細胞に、又は筋細胞中（例えばこのような処置を必要とする対象の）に投与し；カロリー制限又は運動の利点が、当該作用物質により筋細胞内で模倣（ここで解説する通り）されたかどうかを判定する。いくつかの実施態様では、当該作用物質は、筋細胞内でSIRT3あるいはSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させるものである。従って、このような方法においては、筋細胞内のSIRT3又はSIRT3及びSIRT1のタンパク質又は活性レベルを増加させるために有効な量を用いて筋細胞に接触させるか、又は、筋細胞へもしくは筋細胞中に投与する。本方法は、いくつかの実施態様では、更に、当該作用物質が筋細胞内のSIRT3のタンパク質又は活性レベルを増加させるかどうかを判定するステップを含む。
【００３１】
前述の方法においては、当該細胞はいくつかの実施態様では真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、そしてより好ましくはヒト細胞である。
【００３２】
更にSIRT3活性化剤を用いて、筋肉に対する特定の薬物効果を補償したり、あるいは一般的には、例えば化学療法薬などによる処置後の対象を再活性化させたりできよう。これらはまた、例えば宇宙飛行士又は軍内の対象など、特定の条件に晒される対象など、健康な対象の能力（例えば身体能力）を高めるためにも用いられよう。
【００３３】
処置することができる心臓血管疾患には、例えば特発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬物誘導性心筋症、虚血性心筋症、及び高血圧性心筋症などの心筋症又は心筋炎がある。更にここで解説された方法を用いて処置可能又は防止可能なものは、大動脈、冠状動脈、頸動脈、脳血管動脈、腎動脈、回腸動脈、大腿動脈、及び膝窩動脈などの主要な血管のアテローム性障害（大血管疾患）である。処置又は防止することができる他の血管疾患には、網膜細小動脈、糸球体細小動脈、神経の脈管、心臓の細小動脈、並びに眼、心臓、及び中枢及び末梢神経系の関連毛細管床に関するものが含まれる。
【００３４】
処置することのできる神経疾患には、神経変性疾患がある。神経変性障害のいくつかの非限定的な例には、脳卒中、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS；ルー・ゲーリッグ病）、びまん性レヴィー小体病、舞踏病‐有棘赤血球症、原発性側索硬化症、多発性硬化症（MS）、及びフリードライヒ失調症、脳室周囲白色軟化症（PVL）、グアムのALS-パーキンソン−痴呆症症候群、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上皮麻痺（スティール−リチャードソン症候群）、延髄及び偽性延髄麻痺、糖尿病性網膜症、多発梗塞性痴呆症、黄斑部変性、ピック病、びまん性レヴィー小体病、クロイツフェルト−ヤコブ病などのプリオン病、ゲルストマン−ストラウスラー−シュラインカー病、クールー及び致死性家族性不眠症、原発性側索硬化症、変性性運動失調症、マチャドー−ジョセフ病／脊髄小脳運動失調症タイプ３及びオリーブ橋小脳変性症、脊髄及び脊髄延髄筋萎縮症（ケネディー病）、家族性痙攣性対麻痺、フォルファルト−クーゲルベルグ−ウェランダー病、テイ−サックス病、複合神経系変性症（シャイ−ドレーガー症候群）、ジル・ド・ラ・ツレット病、家族性自律神経障害（ライリー−デイ症候群）、クーゲルベルグ−ウェランダー病、亜急性硬化性全脳炎、ウェルドニグ−ホフマン病、シヌクレイノパシー（原語：synucleinopathies ）（複合神経系萎縮症を含む）、サンドホフ病、皮質性基底変性、痙攣性不全対麻痺、原発性進行性失語症、進行性多病巣性白質脳症、線条体黒質系変性、家族性痙攣病、神経変性を伴う慢性てんかん性状態、ビンスバンガー病、及び痴呆（痴呆の全ての基礎病因を含む）がある。処置することのできる筋神経疾患を含む筋疾患には筋ジストロフィー及びミオパチーがある。
【００３５】
処置することのできるミトコンドリア疾患には、細胞内のミトコンドリアの機能不全により引き起こされる多種の症状を示す疾患が含まれる。ミトコンドリア疾患は、生化学的異常、臨床上の症状、又はDNA異常の種類により多様な方法で分類される。KSS (慢性進行性外眼筋麻痺)、MERRF （ラグド-レッド繊維に随伴するミオクローヌスてんかん；フクハラ症候群）、MELAS、レーバー病、リー脳症及びピアソン病と命名された種類が広く公知である。中でも、MELASは主に脳卒中様のエピソードを示す種類であり、全体の３０％を占め、ミトコンドリア病の中で最も頻繁な種類と考えられる。
【００３６】
処置できると思われるインシュリン耐性障害には、インシュリン耐性により引き起こされる、又は、インシュリン耐性に寄与する、あらゆる疾患又は状態が含まれる。例には：糖尿病、肥満、メタボリック・シンドローム、インシュリン耐性症候群、Ｘシンドローム、インシュリン耐性、高血圧、緊張亢進症、高血中コレステロール、異脂肪血症、高脂肪血症、異脂肪血症、脳卒中を含むアテローム硬化病、冠状動脈疾患又は心筋梗塞、高血糖症、高インシュリン血症及び／又は高プロインシュリン血症、糖耐性不全、インシュリン放出遅延、冠性心疾患を含む糖尿病合併症、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、痴呆における認識機能、網膜症、末梢ニューロパチー、ネフロパチー、腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症いくつかの種類の癌（例えば子宮内膜、乳房、前立腺、及び結腸）、妊娠の合併症、女性の不妊（例えば月経不順、不妊、排卵不順、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS））、脂肪異栄養、例えば胆石症、胆嚢炎及び胆石病などのコレステロール関連障害、痛風、閉塞性睡眠中無呼吸及び呼吸器の問題、骨関節炎、及び骨粗鬆症などの骨損傷の防止及び処置がある。
【００３７】
SIRT3の減少は、その代謝、特に、筋細胞中のミトコンドリア代謝を鈍化させるのが有利であろう対象において有用であろう。彼らは筋量を増やすのに困難のあるような対象であってもよい。
【００３８】
ここで用いられる場合の用語「SIRT3を増加させる」、「SIRT3を活性化させる」等は、SIRT3の活性を増加させることを意味する。SIRT3の活性は、SIRT3ポリペプチドの活性を増加させる、及び／又は、活性SIRT3 ポリペプチドの量を増加させることにより、増加させることができる。同様に、ここで用いられる場合の用語「SIRT3を減少させる」、「SIRT3を阻害する」等は、SIRT3の活性を減少させることを意味する。SIRT3の活性は、SIRT3ポリペプチドの活性を減少させる、及び／又は、活性SIRT3 ポリペプチドの量を減少させることにより、減少させることができる。SIRT3活性を増加又は減少させる物質は一般に「SIRT3修飾物質」と呼ばれる。SIRT3修飾物質にはSIRT3活性化剤及びSIRT3阻害剤が含まれるが、そのいずれもここでは「薬理学的作用物質」、「活性化合物」、「成分」、「治療薬」等と呼ばれる場合がある。
【００３９】
いくつかの実施態様では、SIRT3などのサーチュインの活性又はタンパク質レベルは、サーチュイン遺伝子又はタンパク質の投与を通じて増加させる。いくつかの実施態様では、SIRT3などのサーチュインの活性又はタンパク質レベルは、サーチュインのタンパク質レベルを増加させる、又は、活性を増加させる化合物の投与を通じて増加させる。いくつかの実施態様では、SIRT3活性化剤は、SIRT3も活性化する、当業で公知のいずれかの活性化剤であってよい。SIRT1活性化剤は、例えば本願の発明者が発明者又は著者であるものなど、数多くの米国出願公報、PCT公報、及び文献に解説されており、それらの全てを引用をもってここに具体的に援用するものとする。サーチュインを活性化する方法や、サーチュインを活性化する化合物の非限定的な例は、特にそれらの教示についてその全文を引用をもってここに援用するものとする、米国特許公報2006/0025337の式１−２５、３０、及び３２−６５に提供されている。サーチュインを修飾するための方法及び化合物は、特にそれらの教示についてその全文を引用をもってここに援用するものとする、米国特許公報：2007/0043050、2007/0037865、2007/0037827、2007/0037809、2007/0014833、2006/0025337、2006/0276416、2006/0276393 及び2006/0229265、2005/0136537、WO 05/002555、WO 2005/065667、WO 2007/084162 及び米国特許第7,345,178号にも紹介されている。他の実施態様では、SIRT3活性化剤はSIRT3に対して特異的である。好ましくは、このようなSIRT3特異的活性化剤は統計上有意な量のSIRT1を活性化しないとよい。SIRT1の活性化を測定する方法は、上記の特許及び特許出願を含め、当業において公知である。
【００４０】
SIRT3修飾物質は、例えば全身又は局所的、局部的、皮内、皮下、筋肉内、又は経口的など、公知の方法のいずれによっても投与できよう。
【００４１】
ヒトSIRT3及びSIRT4核酸及びタンパク質のGenBank受託番号は以下の通りである：
SIRT3  ia  NM_012239       NP_036371 
ib  NM_001017524    NP_001017524
SIRT4      NM_012240       NP_036372
【００４２】
投与
本発明の方法において用いられる薬理学的作用物質は、好ましくは無菌であり、対象への投与に適した単位重量又は体積で所望の応答を生じる、有効量の一種又はそれ以上の作用物質を含有するとよい。対象に投与する薬理学的作用物質の用量は、様々なパラメータで、特に、用いられる投与形態及び対象の状態に従って選ぶことができる。他の因子には、所望の処置期間が含まれる。対象での応答が、適用された当初の用量では不充分である場合、対象の許容が許す程度でより多量を（又は効果的には、違う、より局所的な送達経路により多量を）利用してもよい。薬理学的作用物質の投与量は、個々の担当医又は獣医により、特にいずれかの合併症の場合には、調節されよう。治療上有効量は、典型的には、0.01 mg/kg 乃至約1000 mg/kg、好ましくは約0.1 mg/kg 乃至約 500 mg/kg、そして最も好ましくは約0.2 mg/kg 乃至約250 mg/kgを、一日当り一回又はそれ以上の回数で一日又はそれ以上の日数、の範囲で様々であろう。
【００４３】
本発明に関連する薬理学的作用物質と、選択的に他の治療薬とは、それら自体を投与しても、あるいは、薬学的に許容可能な塩の形で投与してもよい。
【００４４】
本発明の薬理学的作用物質を所望の組織、細胞、又は体液に効果的に送達する多様な投与形態が当業者には公知である。投与方法は本願の他所で論じる。本発明はここで開示する特定の投与形態の限定を受けるものではない。当業での標準的な文献（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, Lippincott, Williams
and Wilkins, Baltimore MD, 2001) が、薬学的担体に入れた多様な薬学的製剤及び調合物の送達のための投与形態及び処方を提供している。本発明の薬理学的作用物質の投与にとって有用である他のプロトコルは当業者に公知であり、その中で用量、投与スケジュール、投与部位、投与形態等はここで紹介するものから変更してもよい。
【００４５】
投与時、本発明の薬学的製剤は薬学的に許容可能な量にして、そして薬学的に許容可能な組成物にして、適用される。用語「薬学的に許容可能な」とは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性物質を意味する。このような製剤は通常、塩類、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、及び選択的に他の治療的作用物質を含有するであろう。医療で用いられる場合、塩類は薬学的に許容可能であるべきだが、便宜上、薬学的に許容可能でない塩類は、その薬学的に許容可能な塩を調製するために用いてもよく、また本発明の範囲から除外されるものでもない。このような薬理学的及び薬学的に許容可能な塩には、限定はしないが、以下の酸から調製されるものがある：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。更に、薬学的に許容可能な塩は、例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム塩など、アルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製することができる。
【００４６】
薬理学的作用物質又は組成物は、所望に応じて、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。用語「薬学的に許容可能な担体」とは、ここで用いられる場合、ヒトへの投与に適した一種異常の適合性の軟質又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。用語「担体」とは、活性成分を組み合わせることで適用を用意とする、有機又は無機、天然又は合成の成分を指す。医薬組成物の成分はまた、所望の薬学的効果を大きく損なうような相互作用のない態様で、本発明の薬理学的作用物質と混合させることも、そして互いに混合させることもできる。
【００４７】
医薬組成物には、酢酸、リン酸、クエン酸、グリシン、ホウ酸、炭酸、重炭酸、水酸（及び他の塩基）及び前述の化合物の薬学的に許容可能な塩類を含む、上述した通りの適した緩衝剤を含めてもよい。医薬組成物にはまた、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールなどの適した保存剤を選択的に含めてもよい。 
【００４８】
医薬組成物は、便利なように単位剤形で提供してもよく、また、製薬業の当業者に公知のいずれの方法で調製してもよい。全ての方法には、活性作用物質を担体と結合させるステップが含まれ、これが一種以上の付属成分を成す。一般的には、本組成物は、活性化合物を液体の担体、微細に分割された固体の担体、又は両者、と均一及び緊密に結合させた後、必要に応じて生成物を成型することにより、調製される。
【００４９】
薬理学的作用物質は、それらを全身投与することが望ましい場合、例えば大量注射又は連続輸注などの注射による非経口投与様に調合してもよい。注射用の調合物は、例えばアンプルに入れて、又は複数回用量用の容器に入れて、添加剤を加えた単位剤形で提供してもよい。組成物は、油性又は水性の賦形剤に入った懸濁液、溶液又は乳濁液などの形を採ってもよく、また懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合用物質を含有してもよい。
【００５０】
非経口投与用の薬学的調合物には、水溶性型の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、活性化合物の懸濁液は適宜、油性の注射用懸濁液として調製してもよい。適した親油性溶媒又は賦形剤には、ごま油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームがある。水性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなど、当該懸濁液の粘性を増加させる物質を含有してもよい。選択的には、当該懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製が可能なよう、適した安定化剤、又は、化合物の可溶性を増す作用物質も含んでよい。
【００５１】
代替的には活性化合物は、使用前に適した賦形剤（例えば生理食塩水、緩衝液、又は無菌の無発熱源水）と一緒に構築するための粉末形であってもよい。
【００５２】
経口投与用の組成物は例えばカプセル、錠剤、丸剤、ロゼンジなど、それぞれが所定量の活性化合物を含む個別の単位として提供してもよい。他の組成物には、シロップ、エリキシル、乳濁液、又はゲルなど、水性の液体又は非水性の液体による懸濁液がある。
【００５３】
経口使用用の薬学的製剤は、固体の医薬品添加物として、選択的には結果として出来る混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工することで得ることができ、その後、必要に応じて適した付属成分を加えることで、状態又は糖衣錠コアを得ることができる。適した医薬品添加物は、具体的には、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトールを含む糖類や、とうもろこしでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん、いもでんぷん、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン (PVP)など、セルロース製剤などの充填剤である。必要に応じ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどの塩などの崩壊剤を加えてもよい。選択的には、経口用調合物を、生理食塩水又は緩衝剤中に、即ち体内の酸条件を中和するEDTAに、調合してもよく、あるいは、いずれの担体もなしで投与してもよい。
【００５４】
更に、上記の一つ又は複数の成分の経口剤形も具体的に考察される。該一つ又は複数の成分は、その誘導体の経口送達が有効であるように化学修飾してもよい。一般的には、考察される化学修飾は、成分分子自体への少なくとも一つの部分の結合であり、この場合、前記部分により、（ａ）タンパク質分解の阻害が可能になる；そして（ｂ）胃又は腸管から血流への取り込みが可能になる。更に、当該の一つ又は複数の成分の全体的安定性の向上や、体内での循環時間の向上があるのも好ましい。このような部分の例には：ポリエチレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンがある。 Abuchowski and Davis,
1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In:  Enzymes as Drugs, Hocenberg and
Roberts, eds., Wiley-Interscience,
New York, NY, pp. 367-383;
Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189。用いることができると思われる他のポリマはポリ-1,3-ジオキソラン及びポリ-1,3,6-チオキソカンである。上述したような薬学的利用に好適なのはポリエチレングリコール部分である。
【００５５】
当該成分（又は誘導体）のためには、放出位置は胃でも、小腸（十二指腸、空腸、又は回腸）でも、又は大腸でもよい。当業者は、胃では溶解しないが十二指腸又は腸内の他の箇所で溶解するような利用可能な調合物を有する。好ましくは、当該作用物質を保護したり、又は、生物学的に活性な物質の放出を腸などの胃の環境を離れたところで行わせたりすることにより、放出が胃の環境の有害な効果を避けるものだとよいであろう。
【００５６】
胃内での耐性が確実に完全であるように、少なくともpH5.0まで不透過性のコーティングが必須である。腸内コーティングとして用いられる、より普通の非活性な成分の例はセルロースアセテートトリメリテート(CAT)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテートフタレート (PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、セルロースアセテートフタレート(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、及びShellacである。これらのコーティングを混合フィルムとして用いてよい。
【００５７】
コーティング又はコーティングの混合物は、胃に対する保護を意図しない錠剤上に用いることもできる。これにはシュガー・コーティング、又は、錠剤を飲み込み易くするコーティングを含めることができる。カプセルは、乾燥治療薬、即ち粉末、の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）から成ってもよく、液体型の場合、軟質ゼラチン・シェルを用いてもよい。カシェ剤のシェル材料は肉厚のでんぷん又は他の食用紙であってもよいであろう。丸剤、ロゼンジ、成型錠剤又は擦り込み錠剤の場合、水分による塊形成技術を用いることができる。
【００５８】
治療薬は約1mmの粒子サイズの顆粒又はペレットの形の微細な多粒子として、調合物中に含めることができる。カプセル投与用の物質の調合物も粉末として軽く圧縮された栓又は更には錠剤になっていてもよいであろう。治療薬は圧縮により調製できよう。
【００５９】
着色剤及び着香料もすべて、含有させてよい。例えば作用物質を調合（例えばリポソーム又はマイクロスフィア封入により）した後、更に、着色剤及び着香料を含有する冷凍飲料など、食用製品内に含有させてもよい。
【００６０】
不活性材料で治療薬を希釈又はその体積を増加させてもよい。これらの希釈剤には、糖、特にマンニトール、乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、調製デキストラン及びでんぷんを含めてよいであろう。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、及び塩化ナトリウムを含むいくつかの無機塩類も充填剤として用いてよい。いくつか市販のものを入手できる希釈剤は Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress 及びAvicellである。
【００６１】
崩壊剤を治療薬の調合物中に含めて固形の剤形としてもよい。崩壊剤として用いられる物質には、限定はしないが、でんぷんベースの市販の崩壊剤であるExplotabを含むでんぷんがある。でんぷんグリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトも、すべて用いてよい。別の形の崩壊剤は不溶性の陽イオン性交換樹脂である。粉末ガムを崩壊剤として、そして結合剤として用いてよく、そしてこれらには寒天、Karaya又はトラガカントなどの粉末ガムを含めることができる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【００６２】
結合剤を用いて治療薬を一緒に保持することで硬質の錠剤を形成してもよく、その中には、アカシアゴム、トラガカントゴム、でんぷん及びゼラチンなどの天然生成物由来の物質がある。他には、メチルセルロース (MC)、エチルセルロース (EC) 及びカルボキシメチルセルロース(CMC)がある。ポリビニルピロリドン(PVP) 及びヒドロキシプロピルメチルセルロース (HPMC) は両者とも、アルコール溶液中に用いて治療薬を顆粒化することができよう。
【００６３】
減摩性の作用物質も本治療薬の調合物に含めることで、形成工程中の粘着を防止してもよい。潤滑剤を治療薬とダイス壁面との間の層として用いてもよく、これらには、限定はしないが；そのマグネシウム及びカルシウム塩を含むステアリン酸；ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液体パラフィン、植物油及びろうを含めることができる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、多様な分子量のポリエチレングリコール、 Carbowax 4000 及び6000などの可溶性の潤滑剤も用いてよい。
【００６４】
調合中の薬物の流動性を高め、圧縮中の再配置に役立つであろう推進剤も加えてよいであろう。推進剤にはでんぷん、タルク、発熱性シリカ及び水和化シリコアルミネートが含まれよう。
【００６５】
水性の環境中への治療薬の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として加えてもよいであろう。界面活性剤には、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルホスクシン酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性の洗剤が含まれよう。陰イオン性の洗剤を用いてもよく、またその中には塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンズエトミウムが含まれよう。界面活性剤として調合物中に含めてもよいと思われる潜在的な非イオン性洗剤のリストはラウロマクロゴル400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油10、50 及び 60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、60、65 及び 80、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、作用物質の調合物中に単独で、又は、様々な比での混合物として、存在してもよいであろう。
【００６６】
経口で用いることのできる薬学的製剤には、ゼラチン製の押込嵌めカプセルや、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤から成る軟質の密封カプセルがある。押込嵌めカプセルには、活性成分を、乳糖、でんぷんなどの結合剤、及び／又は、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤などの充填剤、そして選択的に安定化剤と混合して含めることができる。軟質カプセルにおいては、活性化合物を脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適した液体中に溶解又は懸濁させてよい。加えて、安定化剤を加えてもよい。
【００６７】
経口投与用に調合されたマイクロスフィアも用いてよい。このようなマイクロスフィアは当業でよく定義されている。経口投与用の調合物はすべて、このような投与に適した投与量でなくてはならない。
【００６８】
口腔内投与の場合、組成物は、従来の態様で調合された錠剤又はロゼンジの形を採っていてもよい。
【００６９】
吸入による投与の場合、本発明に従った使用用の化合物は、便利なように、加圧されたパック又はネブライザからのエーロゾル噴霧提供の形で、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適したガスなどの適した推進薬を用いて送達されてもよい。加圧されたエーロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達する弁を提供することにより、決定できよう。吸入器又は注入器での使用用のゼラチンなどのカプセル又はカートリッジを、当該化合物と、乳糖又はでんぷんなどの適した粉末基剤との混合粉末を含有させて、調合してもよい。
【００７０】
更に、肺送達もここでは考察する。作用物質は、吸気中の哺乳動物の肺に送達することで、肺上皮内張りを横切って血流へ移動させることができる。吸気される分子の報告には、Adjei et al., 1990, Pharmaceutical
Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of
Pharmaceutics, 63:135−144 （酢酸ロイプロリド）； Braquet
et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143−146（エンドセリン-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal
Medicine, Vol. III, pp. 206−212 (a1- アンチトリプシン); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145−1146 (a-1-プロテナーゼ); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins",
Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado,
March, (組換えヒト成長ホルモン); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482−3488 (インターフェロン-γ及び腫瘍壊死因子アルファ) 及び Platz et al.の米国特許第5,284,656 号（顆粒球コロニー刺激因子）がある。全身効果に向けて薬物を肺送達するための方法及び組成物は、Wang et al.の１９９５年９月１９日発行の米国特許第5,451,569に解説されている。
【００７１】
本発明の実施での使用に考察されるのは、全て当業者には公知である、ネブライザ、計量用量式吸入器、及び粉末吸入器を含め、しかしこれらに限定はせず、治療用製品の肺送達にデザインされた幅広い機械的器具である。
【００７２】
本発明の実施に適した市販の利用可能な器具のいくつかの具体的な例は、ミズーリ州セントルイス、Mallinckrodt社製造のUltravent ネブライザ；コロラド州エングルウッド、Marquest Medical Products社製造のAcorn IIネブライザ；ノース・カロライナ州リサーチ・トライアングル・パークのGlaxo社製造、Ventolin 計量用量吸入器；及びマサチューセッツ州ベッドフォード、Fisons Corp社製造のSpinhaler粉末吸入器である。
【００７３】
このような器具はすべて、作用物質の分取に適した処方の使用が必要である。典型的には、各処方は、用いる器具の種類に特異的であり、また治療で有用な通常の希釈剤、アジュバント及び／又は担体に加え、適した推進材料の使用を含むであろう。更に、リポソーム、マイクロカプセル又はマイクロスフィア、封入複合体、又は他の種類の担体の使用も考察される。
【００７４】
ジェット式又は超音波式に関係なく、ネブライザと一緒に用いるのに適した調合物は、典型的に、1mLの溶液当り約0.1乃至25mgの生物学的活性物質の濃度で水中用に溶解させた作用物質を含むであろう。更に本調合物は、緩衝剤及び簡単な糖（例えば安定化及び浸透圧の調節のため）も含んでよい。ネブライザ調合物は、更に、エーロゾル形成時の溶液の微粒化により引き起こされる、作用物質の表面誘導性凝集を減らす又は防止するために界面活性剤も含有してよい。
【００７５】
計量用量式吸入器具での使用に向けた調合物は一般に、作用物質を含有する微細に分割された粉末を、界面活性剤の助けにより推進薬中に懸濁させて含むであろう。推進薬は、例えばクロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、又はハイドロカーボンなど、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタン、又はこれらの組合せなど、この目的のために用いられるいずれの従来の材料であってもよい。適した界面活性剤には、三オレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンがある。オレイン酸も界面活性剤として有用であろう。
【００７６】
粉末吸入器から分取される調合物は、作用物質を含有する微細に分割された乾燥粉末を含むであろうが、更に、例えば調合物の重量で５０乃至９０％など、器具からの粉末の分取が容易となる量の乳糖、ソルビトール、ショ糖、又はマンニトールなどの増量剤を含んでいてもよい。当該の作用物質は、遠位の肺への送達が最も効果的となるよう、10mm未満（又はミクロン）、最も好ましくは0.5乃至5mmの平均粒子サイズを持つ微粒子型で調製されると最も有利であろう。
【００７７】
本発明の医薬組成物の鼻腔（又は鼻腔内）送達も考察される。鼻腔送達により、本発明の医薬組成物の血流への通過が、治療製品を鼻に投与した直後に可能であり、肺内に製品を配置する必要もない。鼻腔送達用の調合物には、デキストラン又はシクロデキストランを用いたものがある。
【００７８】
鼻腔投与の場合、有用な器具は、小型の硬いビンであり、これに計量用量式噴霧器を取り付ける。ある実施態様では、計量された用量は、本発明の溶液医薬組成物を規定された容積のチャンバ内に吸い込むことにより送達されるが、このチャンバは噴霧化する大きさとなった孔を有し、このチャンバ内の液体が圧縮されたときに噴霧を形成することによりエーロゾル調合物となる。該チャンバは圧縮されて本発明の医薬組成物を投与する。ある具体的な実施態様では、該チャンバはピストン装置である。このような器具は市販のものを利用できる。
【００７９】
代替的には、噴霧化する大きさの孔又は開口と、スクイーズされたときに噴霧を形成することによるエーロゾル調合物とを持つプラスチック製スクイーズ・ボトルを用いる。該開口は通常、ビンの上部に見られ、この上部は一般に先細りとなることで、エーロゾル調合物の投与が効率的に行われるように鼻腔通路内に部分的に嵌め合う。好ましくは、鼻腔用吸入器は、計量された用量の薬物が投与されるよう、計量された量のエーロゾル調合物を提供するものであろう。また本化合物を、例えばココアバター又は他のグリセリドなどの従来の座薬用基剤を含有するなど、座薬又は停留浣腸薬などの直腸用又は膣用組成物に調合してもよい。
【００８０】
前述した調合物に加え、本化合物をデポー製剤として調合してもよい。このような長時間作用性調合物は、適したポリマ製又は疎水性材料（例えば許容可能な油に溶かした乳濁液としてなど）あるいはイオン交換樹脂と一緒に調合しても、あるいは、節約的に可溶性の塩など、節約的に可溶性の誘導体として、調合してもよい。
【００８１】
本医薬組成物は更に、適した担体又はゲル相の担体又は医薬品添加物を含んでもよい。このような担体又は医薬品添加物の例には、限定はしないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖質、でんぷん、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマがある。
【００８２】
適した液体又は固体の医薬組成物型は、例えば、吸入用の水溶液又は生理食塩水であり、マイクロ封入される、エンコキレート（原語：encochleated）される、顕微鏡的金粒子上に被膜される、リポソーム内に含有させる、噴霧化させろ、エーロゾル、皮膚内への移植に向けてペレットにする、又は、皮膚中に擦り付けられるように鋭利な物体上に乾燥させられる。更に医薬組成物には、顆粒、粉末、錠剤、被膜された錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、乳濁液、懸濁液、クリーム、ドロップ、又は、活性化合物の放出が遅延性の製剤であって、その中の医薬品添加物及び添加剤、及び／又は、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、着香料、甘味料又は可溶化剤などの付属成分、が上述したように慣例的に用いられるような製剤、がある。本医薬組成物は、多種の薬物送達系での使用に適する。薬物送達のための方法の簡単なレビューについては、引用をもってここに援用することとするLanger, Science
249:1527-1533, 1990を参照されたい。
【００８３】
治療剤を粒子にして提供してもよい。ここで用いられる場合の粒子とは、全部又は部分的に、ここで解説する治療薬から成らしめることができるナノ又はマイクロ粒子（又は場合によってはより大型のもの）を意味する。本粒子は、限定はしないが腸溶コーティングを含むコーティングに取り囲まれたコア中に本治療薬を含めてもよい。また治療薬を粒子全体に分散させてもよい。また治療薬を粒子中に吸着させてもよい。更に本粒子は、ゼロ次放出、１次放出、２次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、及びこれらの組合せ等を含め、いずれの次数の放出動態のものでもよい。本粒子には、本治療薬に加え、限定はしないが侵食性、非侵食性、生分解性、又は非生分解性の物質又はこれらの組合せを含め、製薬業及び医業で通常用いられる物質のいずれをも含めてよい。本粒子は、ここで解説する治療薬を溶液中に、又は半固体状で含有するマイクロカプセルであってもよい。また粒子は実質上、いずれの形状であってもよい。
【００８４】
非生分解性及び生分解性のポリマ材料の両者とも、本治療薬を送達する粒子の製造で用いることができる。このようなポリマは天然でも、又は合成ポリマでもよい。ポリマは放出させたい時間長に基づいて選択される。特に興味の持たれる生接着性ポリマには、その教示をここに援用することとするH.S. Sawhney, C.P. Pathak and J.A.
Hubell in Macromolecules, (1993) 26:581-587に解説された生侵食性ヒドロゲルがある。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）がある。
【００８５】
治療薬は制御放出系中に含めてもよい。用語「制御放出」とは、調合物からの薬物放出の態様及びプロファイルが制御されるような、いずれかの薬物含有調合物を言うものと、意図されている。これは即時や非即時放出調合物を言い、非即時放出調合物には、限定はしないが徐放及び遅延放出調合物が含まれる。用語「徐放」（「長時間放出」とも呼ばれる）は、その従来の意味において、長時間にわたって薬物を次第に放出させ、好ましくはその結果、必ずしもではないが、長時間にわたって薬物の血中レベルがほぼ一定になるような調合物をいうために用いられる。用語「遅延放出」は、その従来の意味において、調合物の投与と、そこからの薬物の放出との間に時間的遅れがあるような調合物を言うために用いられる。「遅延放出」は長時間にわたる漸進的放出を含む場合も、含まない場合もあり、従って、「徐放」である場合も、ない場合もある。
【００８６】
長期徐放インプラントの使用は、慢性状態の処置にとって特に好適である場合がある。ここで用いられる場合の「長期」放出とは、当該インプラントが、治療的レベルの活性成分を少なくとも７日間、そして好ましくは３０−６０日間、送達するように構築及び配置されることを意味する。長期徐放インプラントは当業者には公知であり、その中には、上述した放出系のいくつかがある。
【００８７】
眼、鼻腔粘膜、粘膜又は皮膚への局所投与の場合、治療薬を軟膏、クリーム又はローションとして、又は経皮用パッチ又は眼内インサートとして、あるいはイオン注入で調合してもよい。例えば、軟膏及びクリームは水性又は油性の基剤単独で、あるいは、適した増粘剤及び／又はゲル化剤と一緒に、調合することができる。ローションは水性又は油性の基剤で調合することができ、また典型的には更に一種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤又は着色剤を含む。（例えば薬学的に許容可能なゲルベースの局所用担体の解説に関する米国特許第 5,563,153号、標題「Sterile Topical Anesthetic Gel」Mueller, D., et al.に発行、を参照されたい）。
【００８８】
一般的には、治療薬は局所用調合物中、当該組成物の総重量に基づくと重量で約0.01% 乃至約30.0% の範囲の量、存在する。好ましくは、当該作用物質は、重量で約 0.5 乃至約30%の範囲の量、存在するとよく、そして最も好ましくは、当該作用物質は重量で約0.5 乃至約 10% の範囲の量、存在するとよい。ある実施態様では、本発明の組成物は、局所痛の表面との接触を最大にし、この局所痛を軽減するのに必要な容積及び投薬量を最小にするためのゲル混合物を含む。GELFOAM(R)（Upjohn Corporation社製造のメチルセルロース-ベースのゲル）は好適な薬学的に許容可能な局所用担体である。他の薬学的に許容可能な担体には、経皮的薬物送達用のイオン注入法がある。
【００８９】
更に本発明はキットの使用も考察する。本発明のいくつかの局面では、本キットは、医薬製剤バイアル、医薬製剤希釈剤バイアル、及び、一種以上の治療薬を含むことができる。いくつかの実施態様では、本キットは、一種の抗体又は複数種の抗体など、診断目的のための作用物質を容れたものである。医薬製剤用の希釈剤を容れたバイアルは選択的である。該希釈剤のバイアルは、治療薬の濃縮溶液又は凍結粉末であってもよいものを希釈するための生理食塩水などの希釈剤を容れている。指示書には、特定量の希釈剤を特定量の濃縮医薬製剤と混合して最終的な注射又は輸注用調合物を調製するための指示を含めることができる。指示には、有効量の治療薬で対象を処置するための指示を含めてもよい。また指示には、指示には、患者を診断する、ある疾患についての患者のリスクを特徴付ける、又は、ある患者にとってある治療法の有効性を評価する、ための指示を含めてもよい。容器がビン、隔膜付きのバイアル、隔膜付きのアンプル、輸注バッグ等であるに関係なく、当該製剤を容れた容器は、製剤をオートクレーブ又は殺菌したときに色が変わるような従来のマーキングなど、表示を含めることができる。本発明に関連するキットを図１７に挙げる。
【００９０】
本発明の少なくとも一つの実施態様をいくつかの局面をこのように解説したところで、当業者であれば多様な変更、改良、及び向上を想到されると考えられる。このような変更、改良、及び向上は本開示の一部であると意図され、また、本発明の精神及び範囲の範囲内であると意図される。従って、前述の解説及び図面は単に例示である。
【００９１】
更に本発明の以下の実施例で描写することとするが、同実施例を如何なる態様でも限定的なものとして捉えられてはならない。（本願を通じて引用された文献、発行済み特許、公開済み特許出願、及びGenBank受託番号を含め）全ての引例の内容を、引用をもってここに援用することとすることを明示しておく。
【００９２】
実施例
実施例１：  SIRT3はAMPK及びPGC-1アルファを通じて骨格筋代謝を調節する
SIRT3はサーチュイン・ファミリーのNAD＋依存的脱アセチル化酵素の一員であり、主にミトコンドリアに局在し、褐色脂肪組織、心臓、いくつかの骨格筋、及び代謝上活性な組織で濃縮している。我々はここでSIRT3は、栄養的及び生理的シグナルに劇的に応答して筋エネルギー恒常性に影響を与えることを報告する。我々は、マウスSIRT3が、速筋のタイプＩＩ長指伸筋及び腓腹筋に比較して、遅筋の酸性タイプＩヒラメ筋でより高度に発現していることを示す。マウスにおけるSIRT3の筋内タンパク質レベルはカロリー制限、絶食や運動によって増加する。反対に、SIRT3発現は、三ヶ月間の高脂肪食給餌に応答して抑制される。C2C12筋細胞内でSIRT3を強制的に発現させると pgc-1a 及びucp3 発現が上昇し、細胞内過酸化水素産生が減少し、ミトコンドリア含有量が増加する。更に、SIRT3が発現すると細胞内ATP含有量が減少し、AMPK活性化が増加し、糖取り込み及び脂肪酸酸化などの下流のプロセスが刺激されることから、AMPK活性化が筋代謝に対するSIRT3の作用を媒介している可能性が示唆される。
【００９３】
サーチュイン・ファミリーのタンパク質はNAD+-依存的タンパク質脱アセチル化酵素活性及び／又はADPリボシルトランスフェラーゼ活性(1, 2)を持つ。７種類の哺乳動物サーチュイン (SIRT1-SIRT7)は細胞内に示差的に局在し、細胞作用、代謝、及び老化の調節に多様な機能を有する（3, 4）。SIRT3タンパク質はミトコンドリアに主に局在している(5-7)。興味深いことに、SIRT3は、酢酸のアセチルCoAへの転化を触媒するミトコンドリア酵素であるアセチルCoA シンセターゼ 2 (ACS2)を脱アセチル化し、かつ調節することが見出されている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼもまた、SIRT3の基質であることが発見されているが、この相互作用の生物学的意味は未知である(8)。最近の研究では、SIRT3 は核内に常在し、そこでヒストンH4を脱アセチル化している可能性が研究されている(9)。更に、ヒトSIRT3遺伝子の遺伝子的ばらつきが特定の人々の長寿（10）に関係付けられており、SIRT3の異常な発現が臨床生検での節陽性乳癌に相関付けられており（11）、このことは、SIRT3がヒトの健康及び疾患に置いて重要な診断上及び治療上のターゲットとして役立つ可能性を示唆している。
【００９４】
実際のところ、我々は最近、遺伝毒性ストレス後のNampt媒介性細胞生存がミトコンドリアNAD＋レベルの維持を促進すると共に、SIRT3
(そしてSIRT4も) によるアポトーシス遮断を要する (12)ことを示した。更に、他の以前の研究では、我々は、マウス褐色脂肪組織においてSIRT3のRNAレベルは寒冷暴露及びカロリー制限によって増加すること、そして褐色前駆脂肪細胞においてSIRT3が構成的に発現するとPGC-1a、UCP1、及び他のミトコンドリア関連遺伝子の発現が刺激されることを示した。機能的には、褐色脂肪細胞におけるSIRT3の発現は細胞呼吸を促進し、ミトコンドリア膜電位及び活性酸素種(ROS) 産生の両方を減少させる(7)。
【００９５】
PGC-1aは核内受容体コアクチベータであり、代謝調節において複数の役割を果たす (13, 14)。それはミトコンドリア生合成を刺激し(15)、筋線維のタイプ・スイッチを誘導し、骨格筋細胞の酸化能を上昇させる(16)。この研究では、我々は、鍵となる代謝上活発な器官である骨格筋におけるSIRT3遺伝子の効果を調べた。骨格筋はインシュリン媒介性糖廃棄の主要な部位である。更に骨格筋は全身の脂質代謝に強い影響を及ぼす。なぜなら、脂質の異化は静止中の筋肉のエネルギー利用の最高７０％を提供するからである(17)。更にそれは、ジアシルグリセロールなどの筋内脂肪酸代謝産物はインシュリン耐性を引き起こすために、筋肉中の脂肪酸利用能と脂肪酸酸化速度とを平衡させるためにも大変重要でもある。
【００９６】
AMP活性化タンパク質キナーゼ（AMPK）は筋代謝の鍵となる調節物質である。AMPKは遍在性のヘテロ三量体セリン／スレオニンタンパク質キナーゼであり、骨格筋を含め、数多くの組織中の燃料センサーとして機能する（19）。AMPKは主に上流のAMPKキナーゼであるLKB1により、AMPによりアロステリックに、そして触媒性α-サブユニット中のThr172のリン酸化により、活性化する(20, 21)。重要なことに、AMPKはATPを枯渇させたりAMPを上昇させたりする、低血糖症（22）、運動（23）及び筋収縮（24）などの細胞ストレスにより刺激される。活性化AMPKは細胞内糖取り込み及び脂肪酸ベータ-酸化など、ATP産生性異化経路を刺激する。またAMPK活性化は脂質生成などのATP消費プロセスを抑制することで、細胞内エネルギーバランスを回復する（19、25）。AMPKはPGC-1α発現を増加させるだけでなく（26、27）、直接的なリン酸化によりPGC-1αを活性化もする（28）。
【００９７】
この研究は、骨格筋内のSIRT3レベルは高脂肪食給餌では減少し、運動で増加することを示している。更に、C2C12筋細胞における強制的SIRT3発現は、おそらくはAMPKの活性化を通じてミトコンドリア生合成を増加させ、糖取り込みに対して筋細胞を感作させ、β-酸化を増加させる。従ってSIRT3は、重要な栄養的及び生理的シグナルに応答した骨格筋代謝の重要な調節物質である可能性が高い。
【００９８】
方法
動物及び食餌
C57BL/6オスマウスをこの研究に用いた。カロリー制限実験のために、C57BL/6 オスマウスを一匹ずつケージに入れた。８週齢のときにコントロール・マウスには適宜、NIH-31標準食（ウィスコンシン州マジソン、Harlan Teklad社）を与え、食餌消費量を毎日、測定した。カロリー制限マウスにはNIH-31/NIA強化食（ウィスコンシン州マジソン、Harlan Teklad社）を、１週目、２週目、そして３週目のそれぞれにコントロール・マウスの消費した量の９０％、７０％、及び６０％を毎日の食事配給量として与えた。その後、毎日の食事配給量はカロリー制限マウスの不断給餌の６０％で安定させた。１２ヵ月後、マウスを解剖して分析用に組織を採集した。絶食実験では、２４時間の間、食餌を6pmで取り除いた。高脂肪食給餌実験では、８週齢のマウスにコントロール又は３５％脂肪色（ニュージャージー州フレンチタウン、Bio-Serv社）を３ヶ月間、与えた。コントロール色を与えられたマウスからも多様な組織を採集して、SIRT3遺伝子発現をウェスタン・ブロット分析により研究の終了時に調べた。運動研究については（29）、７週齢のオス及びメスのFVB/NJ マウスを車輪付きケージで６週間、訓練させ、PicoLab マウス食20 （ミズーリ州セントルイス、LabDiet/Purina社）を与えた。簡単に説明すると、げっ歯類走行用車輪付き又は無しの個別のケージ（ニューヨーク州ロチェスター、Nalgene社）にマウスを収容し、動物は６週間の訓練期間中、自発的に運動することができた。６週の終わりにマウスを安楽死させ、三頭筋を取り出した後、SIRT3、CREB、ホスホ-CREB/Ser122、及びPGC-1a タンパク質発現について分析した(7)。前に解説された通りにクエン酸シンターゼ活性を運動後の三頭筋試料からのミトコンドリア・マーカーとして測定した(29)。
【００９９】
Sirt3ノックアウト・マウス
遺伝子とラッピングによりSirt3遺伝子を標的としたマウスをテキサス・インスティテュート・フォー・ゲノミック・メディシン（米国テキサス州、ヒューストン）から得た。簡単に説明すると、前に解説された通りにSirt3遺伝子の一つのアレルを機能的に失活させたレトロウィルス・プロモータ・トラップを持つ胚性幹（ES）細胞 (Omnibank no. OST341297) を作製することにより、作出された（30）。配列解析ではレトロウィルスの挿入はコーディング・エキソン1の前のイントロンに起きていることが示された（受託: NM_022433)。標的決定された129/SvEvBrd胚性幹細胞をC57BL/6 アルビノ胚細胞に注射した。次にキメラ (129/SvEvBrd) を C57BL/6 アルビノと交配して異型接合子を作製した。次に異型接合子を交配させ、その仔を、トラッピング・カセット挿入部位 TG0003-5'(ATCTCGCAGATAGGCTATCAGC)
(SEQ ID NO:1) 及びTG0003-3' (AACCACGTAACCTTACCCAAGG)
(SEQ ID NO:2)をフランクする二つのプライマーや、三番目のプライマーとして、とラッピング・カセットの5'側末端に位置する逆プライマーである LTR rev (ATAAACCCTCTTGCAGTTGCATC) (SEQ ID NO:3)を含有するPCRを用いて遺伝子型決定した。プライマー・ペア TG0003-5’ 及びTG0003-3’ は336bp の断片を野生型アレルから増幅するが、プライマー・ペアTG0003-5’ 及びLTR rev は160bp の断片をノックアウト・アレルから増幅する。
【０１００】
細胞培養及び抗体
C2C12 筋細胞及びBOSC23 細胞を、10%ウシ胎児血清を含有するダルベッコの改良イーグル培地で培養した。C2C12 分化については、コンフルエントになった時点で、2%のウシ血清（ユタ州ローガン、Hyclone社製）を加えたダルベッコのイーグル改良培地で３日間、インキュベートした。選択された研究でのAMPKの阻害は、化合物Ｃ(6-[4-(2-ピペリジン-1-イル-エトキシ)-フェニル)]-3-ピリジン-4-イル-ピラゾロ[1,5-a]-ピリミジン、Merck社) (31) を培地に３時間、最終濃度40μMになるように加えることで達成された。ウェスタン・ブロット分析に用いられた抗体には以下のものが含まれた：組織分布及び高脂肪食分析用にはＣ末端を狙った抗SIRT3血清抗体 (DLMQRERGKLDGQDR (SEQ ID NO:4)、テキサス州サンアントニオ、Genemed Synthesis社)；抗SIRT3 血清も当該タンパク質のＣ末端領域に対して生じさせた（ペンシルヴァニア州デンヴァー、Covance社）、これはFred Alt 氏のご厚意により提供されたSIRT3ノックアウト・マウス由来の脳、心臓、及び骨格筋組織を用いて特異性についてバリデートされた後(32)、切除試料の分析に用いられた；抗ホスホCREB/Ser133 （マサチューセッツ州ダンヴァー、Cell Signaling社）；抗CREB（マサチューセッツ州ダンヴァー、Cell Signaling社）；抗GLUT4（ボストン医療大学のPaul F. Pilch氏のご厚意により供与；抗ホスホ-AMPK（マサチューセッツ州ダンヴァー、Cell Signaling社）；AMPK（マサチューセッツ州ダンヴァー、Cell Signaling社）；抗ホスホ-アセチル CoA カルボキシラーゼ（ヴァージニア州シャルロッツヴィル、UpState Inc社）；抗-PGC-1a (カリフォルニア州サンディエゴ、Calbiochem社)；チトクロームC酸化酵素サブユニット IV (COX IV) (カリフォルニア州カールスバッド、Invitrogen社)；β-アクチン抗体（カリフォルニア州サンタクルズ、Santa Cruz Biotechnology社）；及びα-チューブリン（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Abcam社）。
【０１０１】
レトロウィルス感染
pBabe-puroによるレトロウィルス産生のためには、ベクターのみ（ベクター）、野生型マウスSIRT3 (SIRT3)、ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性にG11A変異を持つマウスSIRT3、又は、その脱アセチル化酵素活性にN87A変異を持つマウスSIRT3、を含有するコンストラクトを予めデザインし、我々の研究で特徴付けた(7)。そのウィルス粒子を用いてC2C12 筋細胞を感染させた。次にこの細胞を2 μg/ml ピューロマイシンで選択にかけた。
【０１０２】
ノーザン・ブロット分析
実験は以前に解説された通りに行われた(7)。
【０１０３】
ミトコンドリアDNA（mtDNA）含有量のリアルタイム定量的PCR解析
総DNAをC2C12 細胞から塩析法を用いて単離した(33)。公開された手法と同様に、１０ナノグラムの総DNAをQ-PCR検定で用いた(34)。マウスmtDNA
(GI:34538597) のND1領域を正方向プライマー5’ TCTAATCGCCATAGCCTTCC3’ (SEQ ID
NO:5)及び逆方向プライマー5’GGTTGTTAAAGGGCGTATTGG’
(SEQ ID NO:6)を用いて増幅し、158bpの断片を得た；マウスベータ2マイクログロブリン (B2M) 遺伝子 (GI:149338249) の断片を正方向プライマー 5’
TGATGGTGAGGTCTGGAATG3’ (SEQ ID NO:7) 及び逆方向プライマー5’ GCAGGTTCAAATGAATCTTCAG3’ (SEQ ID NO:8) を用いて増幅し、108bpの断片を得た。mtDNA 含有量(mtDNA/B2M比)を、式： mtDNA 含有量 =1/2DCt, （但し式中、DCt= CtmtDNA-CtB2M）を用いて計算した。
【０１０４】
糖取り込み
ベクター又はSIRT3 を含有するC2C12細胞を2% ウシ血清と一緒に３日間、分化させた後、0.5%アルブミンを含有するDMEM中で一晩、インキュベートした。翌日、細胞を Krebs Ringer Hepes 緩衝液と一緒に100nM のインシュリンの非存在下又は存在下で２０分間、インキュベートした。100μM 2-デオキシ-D-グルコース(plus 0.5μCi 2-デオキシ-D-[3H]グルコース)を添加することで糖輸送検定を開始した。細胞を氷温のKrebs Ringer Hepes緩衝液で洗浄することにより、糖取り込みを終了させた。細胞を溶解緩衝液 (0.1% SDS 及び200mM NaOH) で溶解させ、アリクォートを採取して放射活性及びタンパク質含有量を判定した。糖取り込みを総タンパク質含有量に対して正規化した。
【０１０５】
糖、ロイシン、及びパルミチン酸酸化
ベクター又はSIRT3 を含有するC2C12細胞を2%ウマ血清と一緒に３日間、25-cm2 フラスコ内でインキュベートした。最終日に筋細胞を糖(25mM)、ロイシン (1mM)、及びパルミチン酸 (0.4mM)の存在下で培養した；放射標識トレーサー(200nCi/ml) [1-14C]糖、[1-14C]ロイシン、又は [1-14C]パルミチン酸（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Amersham社）をそれぞれ糖、ロイシン、及びパルミチン酸の酸化の判定のための別々の実験で添加した。フラスコを密封し、一片のWhatmanフィルター紙を容れた中央のウェルを取り付け、キャップに接着させた。６時間後、14CO2 を培養培地から2 ml の6Nの HClによる酸性化で放出させ、フィルター紙を250μlの2N NaOHで飽和させた。ペーパー・フィルターに吸収された14CO2
をシンチレーション計数により測定した。
【０１０６】
過酸化水素生成の測定
ベクター又はSIRT3 を含有するC2C12細胞2%のウマ血清と一緒に３日間、分化させた。細胞をPBS中に採集し、３回の凍結−乾燥サイクルを行って細胞を溶解させた。総過酸化水素(H2O2)レベルをAmplex レッド過酸化水素／ペルオキシダーゼ検定キットをメーカのプロトコル（カリフォルニア州カールスバッド、Invitrogen社）に従って用いて検出した。
【０１０７】
ミトコンドリア膜電位(ΔYm)の判定
蛍光性プローブ5,5’,6,6’-テトラクロロ-1,1’,3,3’-テトラエチルベンズイミダゾールカルボシアニドイオダイド (JC-1; Invitrogen社) を用いて細胞 ΔYmを判定した。簡単に説明すると、C2C12
細胞 (1´106) をトリプシン処理で採集した。PBSでの洗浄後、細胞を３７℃の10μg/ml JC-1 と一緒に１５分間、インキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、100 μl の細胞懸濁液を黒色96-ウェル・プレートのウェルに移した。赤色の蛍光（励起550nm、放出590nm）及び緑色の蛍光（励起 485nm、放出530nm）を蛍光計 (SpectraMAX GEMINIXS、Molecular Devices社)を用いて測定した。データを相対的赤色／緑色（凝集物／単量体）蛍光強度値の比として表した。
【０１０８】
細胞内ATPの測定
ベクター又はSIRT3のいずれかを発現している分化C2C12細胞をPBSで一回、すすぎ、2.5% (w/v)トリクロ酢酸 (TCA)溶液に５分間、溶解させた。１０倍の体積の250mM Tris 塩基 (酢酸を用いてpH 7.75)をTCA細胞スラリ溶液に加えて酸を中和させた。Enliten ATP 検定系生物発光検出キット（ウィスコンシン州マジソン、Promega社）をメーカの指示に従って用いて総細胞内ATPレベルを検出した。
【０１０９】
グリコーゲン合成及び乳酸放出の測定
C2C12細胞を分化させ、細胞を14C グルコース (1μCi/ml) で5μg/ml のインシュリンの存在下で６時間、処置した。グリコーゲン産生を判定するために、細胞ペレットを1M KOHで消化した。飽和Na2SO4、エタノール及びグリコーゲンを加えた。20,000g で１０分間、遠心分離した後、ペレットを70% エタノールで洗浄し、水に溶解させ、シンチレーション・カウンタで計数した。培地に放出される乳酸をイオン交換カラムで測定した。簡単に説明すると、採集された細胞培地を、200-400番メッシュの AG1-X8樹脂（カリフォルニア州ハーキュリース、Bio-Rad社）から調製されたカラムに加えた。5mM の糖による複数回の洗浄後、14C 乳酸を1μM 乳酸及び0.5M ギ酸溶液を用いて溶出させ、シンチレーション・カウンタで計数した。
【０１１０】
結果
我々はまず、多様なマウス組織中のSIRT3のタンパク質発現パターンを、マウスSIRT3の最後の１５アミノ酸Ｃ末端残基に対するウサギホストポリクローナル抗体を用いて調べた。このSIRT3タンパク質組織分布パターンは SIRT3 mRNAのそれを反映していた (7)。SIRT3は興味深い分布パターンを示し、例えば褐色脂肪、肝臓、脳、特定の筋肉及び腎臓など、鍵となる代謝上活性な組織中で高度に発現していた。興味深いことに、SIRT3 タンパク質レベルは速筋（長指伸筋及び腓腹筋）に比較して遅筋ヒラメ筋の方が高かった。ヒラメ筋は主に、脂肪酸酸化代謝に依存するタイプＩ線維型から成る(35)ため、SIRT3 は筋肉内の酸化的代謝において重要な役割を有するのであろう。我々は以前に、カロリー制限は褐色脂肪内のSIRT3の発現を刺激することを示した（7）。この研究で我々は、マウスを１２ヶ月間、不断給餌の６０％にカロリー制限すると、SIRT3たんぱく質量は腓腹筋及び四頭筋内で増加したことを見出した。加えて、２４時間の絶食でも、長指伸筋中のSIRT3発現が誘導された。反対に、３ヶ月間の高脂肪食給餌後には、後肢内のSIRT3タンパク質レベルは著しく減少していた。
【０１１１】
加えて、我々は、６週間の訓練期間後の運動訓練マウスの三頭筋で選択的にSIRT3タンパク質発現が増加していることを見出し、このとき、この同じ動物で検査された心筋試料中では何の有意な変化も観察されなかった（図１Ａ）。我々は心臓組織内でSIRT3が濃縮していることは確かに発見したが、それは運動によって変化することはなかった。驚くべきことに、骨格筋内のSIRT3の誘導を、オスの同腹仔のそれに比較したとき、メスのマウスはより劇的であった（図１Ｂ）。更に、この増加したSIRT3発現は Ser133でのCREB特異的リン酸化亢進と、三頭筋でのPGC-1α誘導とに強く相関していた（それぞれ図１Ｃ及び１Ｄ）。これは、SIRT3上昇を原因とするHIB1B褐色脂肪細胞で我々が以前に観察した現象だった(7)。運動訓練後のミトコンドリア・マーカーとして、クエン酸シンターゼ活性を測定した（図１Ｅ）。興味深いことに、SIRT3の骨格筋特異的誘導も、以前に解説されたトレッドミル・ベースの運動パラダイムでのラットの訓練の２週間という早い段階で観察された(36)
（データは図示せず）。最後に、より明るい露出でより近寄って分析すると、心臓ライセート内のSIRT3のタンパク質バンディング・パターンは、三頭筋中のそれとは著しく異なっており（図１Ａ）、これらの二種の組織内でSIRT3の代替的翻訳後プロセッシングが存在する可能性が示唆され、組織−及び／又は代謝特異的脈絡におけるSIRT3の異なる生物学的役割に寄与している可能性が示唆された。
【０１１２】
これらのデータをまとめると、SIRT3発現と筋代謝の変化との間に関連がある関連が考えられ、この関連はカロリー摂取及び運動に特異的に応答するものだということが示唆された。このように、更に筋代謝に対するSIRT3レベルの下流効果を判定及び検査するために、我々はレトロウィルス発現系を用いてin vitroのマウス筋細胞株C2C12でSIRT3を安定に発現させた。我々は細胞をベクター・コントロール、野生型SIRT3、又は、ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を失活させた変異体(G11A)、あるいは、NAD+-依存的脱アセチル化酵素活性を取り除いた変異体(N87A) に、以前に解説された通りに感染させた
(7)。我々は既にSIRT3がPGC-1α及びUCP1の発現を増加させ得ることを褐色脂肪細胞で示しているため、我々はまず、SIRT3がC2C12筋細胞で同様な効果を有するかどうかを判定した。我々は、C2C12細胞でSIRT3の発現が増加すると、pgc-1a 及びucp3の両方のレベルが上昇することを見出した。筋肉におけるUCP3発現の増加は、ROS損傷に対する防御を提供し、脂肪酸酸化を促すよう働く可能性があることに注目することが重要である(37)。驚くべきことに、糖尿病予備軍及び糖尿病の個体ではUCP3の骨格筋発現が減少している(38)。ucp3 発現の上昇と合致して、我々は、SIRT3発現C2C12細胞におけるミトコンドリア膜電位の減少と、細胞内過酸化素レベル減少を観察した。PGC-1a の増加は骨格筋におけるミトコンドリア生合成増加を引き起こすことが示されている(15)。従って、我々はミトコンドリアDNA含有量を定量的PCR解析を用いて測定し、分化C2C12細胞でSIRT3がミトコンドリアDNA含有量増加を引き起こすことを見出した。加えて、チトクロームCオキシダーゼ・サブユニットIV（COX IV）などのミトコンドリアタンパク質の発現も、SIRT3過剰発現C2C12細胞で増加していた。
【０１１３】
SIRT3はC2C12筋細胞におけるPGC-1a 発現を増加させたため、そしてPGC-1a 発現は筋内の糖取り込み増加に関連付けられているため(39)、我々は糖取り込みもSIRT3によって増加するのではないかと仮説を立てた。我々の結果はSIRT3の構成的発現はC2C12筋細胞における基礎及びインシュリン刺激性の両方の糖取り込みを上昇させることを示している。この観察はまた、SIRT3過剰発現細胞におけるGLUT4タンパク質レベルの上昇にも反映されている。興味深いことに、糖酸化は糖取り込み増加を原因としては亢進しなかった。なぜなら、糖酸化速度はSIRT3を発現する細胞内では変化しなかったからである。加えて、SIRT3の過剰発現は、アミノ酸異化の指標である、C2C12筋管でのロイシン酸化には何の影響も及ぼさなかった。しかしながら、脂肪酸酸化は、ベクター・コントロールに比較して、SIRT3を発現するC2C12筋管で劇的に増加したことから、酸化的脂質代謝におけるSIRT3の固有の役割が更に裏付けられた。SIRT3は糖酸化を増加させることなく糖取り込みを増加させるため、我々はグリコーゲン堆積及び乳酸放出の亢進が糖にとっての行き先ではないかと推論した。この仮説を調べるために、我々は細胞を[14C]-糖と一緒に６時間、インキュベートした後に、14C のグリコーゲン及び乳酸への取り込みを測定した。SIRT3はグリコーゲン合成及び乳酸放出を著しく増加させる。
【０１１４】
PGC1-1a 及びGLUT4発現の誘導並びに糖取り込み及び脂肪酸酸化の速度増加はすべて、AMPK活性化増加に通常観察される現象である(26, 27)。従って我々は、AMPK活性の指標である、アルファ・サブユニットのThr172部位でのAMPKリン酸化に対するSIRT1発現の効果を測定した。結果から、SIRT3は、C2C12細胞におけるAMPK活性の正の調節物質であることが確認された。AMPKはAMP／ATP比の増加により活性化し、またSIRT3は、ATP産生の鍵となる部位であるミトコンドリア内に常在しているため、我々は次にATPの細胞内レベルを測定した。我々はSIRT3の発現が増加すると、総細胞内ATPレベルが減少したことをC2C12細胞内で発見し、SIRT3がAMPKを活性化させる潜在的機序（及び関連する下流プロセス）を提供した。AMPK活性化は糖及び脂質の代謝に対するSIRT3の効果を媒介していることを確認するために、我々はC2C12筋管を、AMPK阻害剤である40
μM 化合物Ｃで処置した(31)。化合物Ｃによる３時間の処置により、ベクター−及びSIRT3−トランスフェクト細胞の両方でAMPKリン酸化が減少した。驚くべきことに、GLUT4タンパク質発現を増加させるSIRT3の能力が化合物Ｃによって完全に損なわれ、SIRT3によるGLUT4発現の増加にはAMPK活性が必要であることが明確に実証された。
【０１１５】
最後に、in vivoでのSIRT3とAMPKとの間の関係を確認するために、我々は、SIRT3タンパク質レベルが増加することを我々が示したカロリー制限マウスの四頭筋でAMPKリン酸化を調べた。C2C12データと合致して、AMPKリン酸化レベルはカロリー制限マウスの筋肉内で相応に増加していた。最も重要なことに、我々はSIRT3ノックアウト・マウスの骨格筋内でAMPK活性化の状態を調べた。我々はSIRT3ノックアウト・マウスをテキサス・インスティテュート・フォー・ゲノミック・メディスンから入手したが、この場合のSIRT3の欠損はウェスタン・ブロット分析により、複数の組織試料を用いて確認された。AMPKリン酸化はSIRT3ノックアウト・マウスのEDL筋内で著しく減少していた。加えて、PGC-1α mRNAの発現はSIRT3
ヘテロ接合型又はホモ接合型欠損マウスの腓腹筋で減少していた。まとめると、これらのデータは、SIRT3はカロリー摂取の減少により誘導されること、そしてSIRT3の誘導は、糖取り込み及びβ-酸化をAMPKの活性化を通じて促進することを強く立証している。
【０１１６】
議論
要約すると、我々は、SIRT3はマウス組織中で示差的に発現し、最も大きな発現はヒラメ筋などの代謝上活性な組織中で観察されることを見出したのである。筋内のSIRT3発現は高脂肪食給餌で減少するが、他方、短期間（２４時間の絶食）又は長期間の栄養枯渇（１２ヶ月間のカロリー制限）及び運動訓練で増加する。C2C12細胞内のSIRT3発現増加は、細胞内ATPレベルを減少させてAMPKを活性化し、ひいてはPGC-1a 及び UCP3 発現の誘導、糖取り込みの速度上昇、並びに脂肪酸酸化（図２）を含め、観察される代謝上及び遺伝子発現上の効果を媒介することが示されている。このように、我々の発見は、骨格筋SIRT3レベルは生理的及び栄養的変化に応答して変化することで筋肉エネルギー恒常性を調節することを示すものである。我々のデータはまた、SIRT3が生理的変化や食餌制限及び運動の健康上の利点を媒介していることとも合致する。
【０１１７】
栄養枯渇及び運動中に我々が観察したSIRT3発現の増加は、糖取り込み及び脂肪酸代謝を促すことで、筋肉の充分な機能を維持し、他方、高脂肪食給餌中のSIRT3タンパク質の減少は、筋肉内の脂質蓄積及びインシュリン耐性に寄与すると考えられる。SIRT3発現の下方調節は、高脂肪食給餌に対する直接的な応答、あるいは、肥満や、三ヶ月間の過剰なエネルギー摂取により誘導される関連代謝異常に対する二次的な応答かも知れない。SIRT3欠損マウスの最近の研究では、標準食及び坐位居住条件下での基礎代謝又は適応的熱発生にいずれの欠陥も見られなかった(8)。我々の発見を鑑みると、これらのマウスが高脂肪食で代謝障害を示すかどうか、あるいは運動に対する応答性が低いかどうかを検査することが興味深いであろう。また、サーチュイン間で機能上の重複があり、その結果、SIRT3の喪失の効果がノックアウト動物で余り明白でないのかも知れない。この場合、筋肉内のSIRT3の発現を増加させたマウス・モデルを作製して、我々の仮説を更に検査することが興味深いであろう。
【０１１８】
筋細胞中でミトコンドリアSIRT3が細胞内ATPレベルを低下させてAMPKを活性化する精確な機序は不明である。現在の知見に基づけば、これが起き得る態様の一つは、アセチルCoAシンセターゼ 2 (ACS2)のSIRT3-媒介性脱アセチル化と、その後の活性化を通じてである(40, 41)。ACS2による酢酸の利用はエネルギー消費プロセスである。アセチルCoAシンセターゼ 2はATP由来の二つの高エネルギーリン酸を利用して酢酸を代謝してアセチル CoAにし、AMPを形成する。従って、SIRT3発現の増加は、アセチル CoA シンセターゼ 2の活性を上昇させ、その後にAMP/ATP比を上昇させている可能性が高い。更にSIRT3は付加的な、未同定のターゲットを通じて作用して、ATPレベルを低下させていると考えられる。SIRT3はミトコンドリア生合成及び脂肪酸酸化は増加させるが、ATPレベルを減少させもすることは興味深い。これは、SIRT3 がUCP3発現を促進すると共にミトコンドリア膜電位を減少させるという事実、そして結果的に酸化的リン酸化を分離し、ATP産生を減少させると考えることで、説明できよう。UCP3の作用については議論があるが、UCP3を過剰発現又はノックアウトすると、骨格筋におけるミトコンドリア共役又はATP合成が変化するという証拠がある (42, 43)。更に、SIRT3に欠陥があると複数のミトコンドリアタンパク質のアセチル化レベルが上昇することを鑑みると(8)、SIRT3は他のATP消費プロセスを活性化するか、あるいは、ATP産生プロセスを抑制するのだと考えられる。
【０１１９】
我々は、SIRT3レベルがレトロウィルス発現により上昇するとAMPKが活性化することを発見した。この観察はAMPKがSIRT3の代謝効果を媒介している可能性を示唆した。AMPKは、両者とも PGC-1αのトランス活性化に関与する PGC-1α (28) 及びCREB (44)を直接、リン酸化することが知られている(45, 46)。加えて、更にAMPKはGLUT4 の発現をPGC-1aを通じて活性化する (28)。SIRT3 がAMPK及びグリコーゲン合成を活性化するという我々の発見は、AMPKがグリコーゲン・シンターゼをリン酸化して失活させるという報告と矛盾するように思える(47,
48)が、AICARによるAMPKの活性化の結果、グリコーゲン含有量が増加したことを示す報告もある(49,
50)。加えて、AMPK活性を増加させたAMPK変異体も、トランスジェニック・マウス(51, 52) 又はヒトの患者
(53)の骨格筋中でグリコーゲン含有量の増加を引き起こしていた。心臓内でこのようなAMPK活性化変異体の一つをトランスジェニック発現させたある研究では、糖取り込み、脂肪酸酸化、及びグリコーゲン合成（54）の増加があり、我々の結果と全く同様だった。従って、AMPKはin vivoでグリコーゲン・シンターゼをリン酸化及び阻害すると思われるが、その効果は糖取り込みの増加と、それに伴うグリコーゲン・シンターゼをアロステリックに活性化するグルコース-6-リン酸の増加とにより無効にされるのかも知れない(55)。加えて、グリコーゲン・シンターゼ活性もまた、他のキナーゼ及びホスファターゼにより調節される。
【０１２０】
AMPK活性化は寿命の伸長を引き起こすと考えられ(56-58)、従って、サーチュインのカロリー制限媒介性活性化が寿命を上昇させる潜在的機序であるかも知れない。SIRT1もまたAMPKを活性化することができるため、AMPKを活性化する能力はSIRT3に特異的ではないのかも知れない (59)。更に、公知のSIRT1活性化剤であるレスベラトロールも、AMPK活性化及びPGC-1a 発現を亢進する(60)。 SIRT3は核内SIRT1と同様な代謝調節機能を骨格筋内で有することは注目に値する(61)。SIRT3及びSIRT1の両者ともミトコンドリア生合成及び脂肪酸酸化を促進する。しかしながら、SIRT3及びSIRT1は様々な態様でPGC-1a 機能を活性化する。SIRT3はPGC-1a 発現を増加させるが、他方、SIRT1 はPGC-1aを脱アセチル化により活性化する (61)；従って、これら二つのタンパク質は特定の生物学的文脈内で協働していると考えられる。
【０１２１】
ミトコンドリア・サーチュインがAMPKや、PGC-1a、糖取り込み、及びβ-酸化などの下流のターゲットを活性化する能力は、メタボリック・シンドローム、肥満、及びタイプ２糖尿病を含むいくつかの治療上の意味合いを有するであろう。筋肉内の酸化能が高いことは、筋肉燃料原の柔軟性を維持する上で重要であり、インシュリン感受性と正に相関付けられてきた(16,
62, 63)。次々と現れる証拠が、ミトコンドリア機能不全が細胞内酸化的代謝機能不全とインシュリン耐性との間の鍵となる媒介物質でありタイプ２糖尿病へとつながるという仮説を裏付けている(64)。最近の研究では、若年及び老年の患者において筋肉内ミトコンドリア酸化的リン酸化の減少がインシュリン耐性に関係付けられている(65, 66)。ミトコンドリア内ROS産生の増加は高脂肪食、インシュリン耐性、及び肥満に関係付けられている(67)。更に、インシュリン耐性の対象はコントロールに比較して低い割合の酸化的タイプＩ筋線維を有することが見出されており、酸化的代謝の低下が示されている。それらはまた、PGC-1a、PGC-1b、及び酸化的リン酸化に関与する関連遺伝子の発現を減少させていた(68, 69)。SIRT3は酸化的代謝に関与する遺伝子の発現を増加させ、活性酸素種形成を減少させ、脂質酸化的代謝を増加させ、そしてインシュリン依存的及びインシュリン非依存的糖取り込みの両者を増加させることができるため、SIRT3の活性化物質は代謝障害、肥満、及びタイプ２糖尿病の将来の処置にとって重要な治療経路となるであろう。最後に、PGC-1aが神経変性疾患の防止にとって重要であるという最近の発見(70, 71) により、SIRT3活性化も神経変性型障害の中で治療的価値を持つであろうという可能性が持ち上がった。
【０１２２】
省略記号：
用いられた省略は：ACS 2、アセチルCoAシンセターゼ 2；AMPK, AMP活性化タンパク質キナーゼ；COX IV、チトクロームＣ酸化酵素サブユニットIV；GLUT4、糖トランスポーター4；PGC-1a、PPARg コアクチベーター1a；ROS、活性酸素種；SIRT3、サーチュイン3；UCP1、非共役タンパク質1；UCP3、非共役タンパク質3。
【０１２３】
実施例１の参考文献
1.             Haigis,
M. C., and Guarente, L. P. (2006) Mammalian sirtuins--emerging roles in
physiology, aging, and calorie restriction. Genes Dev 20, 2913-2921
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【０１２４】
実施例２：  栄養感受性ミトコンドリアNAD+レベルは細胞生存を決定する
遺伝毒性ストレスにより引き起こされる細胞死の主要な原因は、核及び細胞質からのNAD＋の枯渇が原因であると考えられている。ここで我々は、ミトコンドリア内のNAD+レベルは遺伝毒性ストレス後でも生理的レベルに留まると共に、NAD+の核内及び細胞質内プールが枯渇した場合にすら、細胞生存率を維持することができることを示す。４８時間絶食させたげっ歯類はNAD+生合成酵素Namptのレベル増加と、それと同時に、ミトコンドリア内NAD+の増加を示す。Namptの増加は細胞死に対する防御を提供し、インタクト・ミトコンドリア内NAD+ 再利用経路やミトコンドリア内NAD+-依存的脱アセチル化酵素SIRT3及びSIRT4を要する。我々は、栄養がどのように生理機能を調節するかの理解と、アポトーシスの進化とに対するこれらの発見の関連性を議論する。
【０１２５】
ほぼ２０億年前、真核生物は現代のミトコンドリアの細菌型祖先を包摂することにより進化した (Barile et al., 1996; Gray et al., 1999)。ミトコンドリアはそれでも尚、細胞生存を決定する多様な分子を保持しており、それらはかつて、細菌性プロトミトコンドリアの生存にとって重要であったであろう (James et al., 1998)。これらの細胞生存経路の解明は、癌及び神経変性を含め、多種のヒトの疾患を処置する新しいアプローチの開発にとって鍵となると考えられている(Porcu
and Chiarugi, 2005)。
【０１２６】
遺伝毒性ストレスを原因とする細胞死の主要な原因の一つは、NAD+-依存的酵素ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ-1 (PARP-1)の活性化過剰であり、それにより核内及び細胞質側NAD+
が枯渇して、アポトーシス誘導性因子(AIF)がミトコンドリア膜から核へ移動する
(Burkle, 2005; Cipriani et al., 2005; van Wijk and Hageman, 2005; Yu et al.,
2002)。細菌の研究の一つでは、ある割合のPARP-1がミトコンドリアに局在することが報告されており、細胞の運命を決定する上でのミトコンドリア内NAD+ の可能性に関する憶測につながっている (Du et al., 2003)。しかしミトコンドリア内NAD+ 生合成について(Barile et al., 1996; Berger
et al., 2005; Kun et al., 1975)や、ミトコンドリア内のNAD+ の実際の濃度はどれほどか (Di Lisa and Bernardi, 2006)、ミトコンドリアNAD+ レベルは生物学的ストレス又は食事に応答して変化するかどうか、そしてこれが細胞生存及び代謝にどのような影響を有するか(Porcu
and Chiarugi, 2005; Viswanathan et al., 2005)、は、ほとんど知られていない。
【０１２７】
サーチュインはNAD+を共基質として用いる保存された一ファミリーの脱アセチル化酵素及びモノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼである (Guarente and Picard, 2005)。これらの珍しい酵素は実質的に何の配列相同性もクラスＩ及びＩＩHDACs に対して有さず(Denu, 2005; Frye, 2000)、細胞生存及び生物の寿命の鍵となる調節物質として現れた (Guarente and Picard, 2005)。サーチュインの初代メンバーであるサッカロミセス-セレビジエ（原語：Saccharomyces cerevisiae ）Sir2は、軽度のストレス及びカロリー制限（CR）による寿命伸長を媒介するNAD+-依存的 ヒストン 脱アセチル化酵素である (Imai et al., 2000; Lin et al.,
2000; Rogina and Helfand, 2004; Smith et al., 2000; Tanny et al., 1999)。哺乳動物は７種類のサーチュイン、SIRT1-7を有する。SIRT1は核内脱アセチル化酵素であり、細胞生存、糖恒常性、及び脂肪代謝を含め多種の機能を調節する (Guarente, 2005)。三種類のミトコンドリア・サーチュイン、SIRT3-5がある。SIRT3 及びSIRT4 は最近、それぞれアセチル-CoA シンセターゼ 2 (AceCS2) 及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを調節することが示された (Haigis et al., 2006; Hallows et
al., 2006; Schwer et al., 2002)が、それらの生物学的機能についてはほとんど知られていない。
【０１２８】
Sir2の遺伝子供与量増加及び活性亢進はＳ．セレビジエ、Ｃ．エレガンス（原語：C. elegans ）及びＤ．メラノガスター（原語；：D. melanogaster ）において寿命を伸長する(Anderson
et al., 2003; Kaeberlein et al., 1999; Lin et al., 2000; Rogina and Helfand,
2004; Tissenbaum and Guarente, 2001; Wood et al., 2004)。酵母Sir2 は、ニコチンアミド（NAM）からのNAD+生合成で第一及び律速段階を触媒するストレス-及びカロリー-応答性寿命遺伝子であるPNC1により正の調節を受ける(NAM) (Anderson et al., 2003; Gallo
et al., 2004)。哺乳動物がPNC1 遺伝子の機能的均等物を持つかどうかは不明である。明らかに、サーチュイン活性を支配し、寿命を促進する遺伝子の哺乳動物均等物を発見することは、CRが哺乳動物で寿命をどのように伸長するかの我々の理解を含め、数多くの潜在的可能性を有する。
【０１２９】
PNC1 の哺乳動物均等物の探索は、NAMからのNAD+ の合成が簡単な真核生物とは哺乳動物では異なるという事実により複雑であった (Brenner, 2005)。酵母、蠕虫およびハエには、４つのステップが、NAMからNAD+ を合成するのに必要であり、哺乳動物は２つしか要さない (Rongvaux et al., 2002)。酵母では、第一の段階はPnc1によって触媒され、そして哺乳動物では、PBEF又はヴィスファチンとしても公知のNAMホスホリボシルトランスフェラーゼ Namptによって触媒される (Fukuhara et al., 2004; Rongvaux et al., 2002;
Samal et al., 1994)。最近の研究では、 Nampt が過剰発現するとSIRT1活性が増加し (Revollo et al., 2004)、PARP過剰発現による死から細胞を防御することができることが示されており（Pillai et al., 2005)、Namptが哺乳動物におけるPnc1の機能的均等物であるという仮説と合致する。
【０１３０】
本論文で我々はNAMPT をミトコンドリア内NAD+レベルを押し上げるストレス-及び栄養-応答性遺伝子として同定する。質量分析法を用いて哺乳動物ミトコンドリア内のNAD+濃度を精確に測定し、絶食後のin vivoにおけるNAMPT発現及びミトコンドリア内NAD+ レベル増加を示す。ミトコンドリア内NAD+の増加は遺伝毒性ストレス中の細胞生存を促進し、そしてミトコンドリア・サーチュインSIRT3及びSIRT4により防御が提供されるという証拠を提供する。これらのデータは、ミトコンドリアNAD+
はアポトーシスの主要な決定因子であり、器官の生理及び疾患に対する食事の影響について新しい光を投げかけるものである。
【０１３１】
方法
細胞培養
ヒト胚性腎(HEK293) 及びヒト線維芽肉腫HT1080細胞株をATCCから入手し、10% FBS 及び100 μg/ml ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた完全DMEM培地中で成長させた。Nampt過剰発現又は空のベクターの安定なクローンを作るために、hNAMPT/pcDNA 又は pcDNA空ベクターをHEK293又はHT1080 細胞にトランスフェクトし、0.5-1.0 mg/ml ゲネチシンで選抜した。Nampt ノックダウン細胞を作るために、siRNA/NAMPT/pMSCV 又はpMSCV 空ベクターをHT1080細胞にトランスフェクトし、安定なクローンを500 ng/ml ピューロマイシンで選抜した。初代新生仔ラット心筋細胞を以前に解説された通りに調製した (Matsui et al., 1999)。単離された心筋細胞を完全培地(RPMI 1640、5% ウシ胎児血清、10% ウシ血清) 中で８０％コンフルエントまで成長させてから、細胞を低酸素及び／又は血清枯渇状態に置いた。低酸素については、培地を、95% N2/5% CO2 で飽和させた血清を加えた、又は、加えていないRPMI 1640 に取り替え、その後、細胞を、95% N2/5% CO2で飽和させた37°C 気密箱内に１８時間、置いた。O2 濃度は0.1% 未満だった（Ohmeda 酸素モニター、タイプ 5120)。HT1080を血清枯渇させるために、細胞を、血清を含まないDMEM 培地中で成長させた。細胞を２６時間の血清枯渇後に採集し、Nampt 発現をウェスタン・ブロット法で分析した。
【０１３２】
薬物処置及び細胞死検定
８５％コンフルエント未満のHEK293 及びHT1080 細胞をMMS (1.2 mM) でそれぞれ６−８．５時間、及び８−１７時間、処置した。過渡的にトランスフェクトした細胞をPBSで３回、洗浄して残ったトランスフェクション試薬を取り除いてから、MMSで処置した。HEK293細胞及びHT1080細胞をそれぞれ120 又は40 μMのエトポシドにそれぞれ７２時間又は４６時間、暴露した。HT1080 細胞を14 μM のカンプトテシンに２３時間、暴露した。薬物処置後、細胞をトリプシン処置で採集し、遠心分離でペレットにし、3% FBSを含有するPBS中に再懸濁させた。細胞死はFACS によりヨウ化プロピジウム (PI) 染料を用いて分析された。mNAMPT/MSCV、SIRT1-7 siRNA、Nmnat-3、又はhMFT siRNA oligosを過渡的にトランスフェクトされ、FAM-標識スクランブルsiRNA oligosを同時トランスフェクトされた細胞の細胞死率を、PI/GFP又はPI/FAM陽性細胞、対、緑色蛍光のある細胞の総数、の比として判定した。 
【０１３３】
アセチル化AceCS2の検定
コントロール又はNampt過剰発現HEK293細胞にコントロール・ベクタ又はAceCS2-HAをトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後に細胞を洗浄し、IP溶解緩衝液 [50 mM Tris-HCl、pH
7.5、150 mM NaCl、 0.5 mM EDTA、0.5% NP-50、400 nM TSA、5 mM ニコチンアミド、及びプロテアーゼ阻害剤（完全、Roche社）]中に３０分間、４℃で溶解させた。ライセートを清澄させ、抗-HA アフィニティ・ゲル (Roche社) で２時間、４℃で免疫沈降させた。免疫沈降液を３回、それぞれ１５分間、溶解緩衝液で洗浄し、1x SDS-PAGE に再懸濁させ、ウェスタン・ブロット法で分析した。
【０１３４】
細胞分画及びミトコンドリアの薬物処置
そうでないと言明しない限り、培養細胞の分画を、僅かに改変した差次的遠心分離及びショ糖勾配法を用いて行った(Schwer
et al., 2002)。ミトコンドリアの薬物処置のために、新鮮なミトコンドリアを、給餌した若いオスのラットから切り出した肝臓から得た。肝臓ホモジネートの半分を、プロトコル１と指定された、メーカの指示に解説された（イリノイ州ロックフォード、ピアース・ミトコンドリア単離キット）通りに市販のキットを用いたミトコンドリア単離に用いた。元のホモジネートの他の半分を差次的遠心分離プロトコルにかけ、ミトコンドリアを単離した（プロトコル２）。ミトコンドリア(500
μl)
を４８-ウェル・プレートに加え、1:1000の希釈度のメチルメタンスルホネート (MMS) 、及び／又は、 FK866 (10 nM)で３０分間、３７℃で処置した。懸濁液を１分、14,000
rpm で４℃で遠心して沈降させ、ペレットをHPLC-MALDI-MSによるNAD+分析まで−８０℃で保存した。詳細なプロトコルはサプリメンタル・インフォメーションに解説されている。
【０１３５】
NAD+ のHPLC-MALDI-MS 判定
NAD+ を以前に解説された通りに (Sauve and Schramm, 2003)以下の改変を用いて判定した。HEK293 又はHT1080細胞をトリプシン処理で採集し、血球計算器で計数された。NAD+ を全細胞又はミトコンドリア・ペレットから10% 過塩素酸で抽出し、５分間、氷上で音波破砕した。次に、基準標準18O-NAD+
(典型的には613.4 pmol) を試料に加えた。よく混合した後、試料を３分間、遠心分離し、その後NaOHで中和した。上清(100
μL 試料)中のNAD+ を他の細胞成分からHPLCにより分離した。NAD+ピークを標準的な保持時間に従って採集し、凍結乾燥機で乾燥させた。MALDI-MSを用いて、正に帯電した同位体的に別個のイオン同士の間のピーク比を判定し、16O-
及び 18O-ピークの強度の比率を求めて
(664/666)、試料中の16O
NAD+/18O NAD+ を得た。16O 及び18O
NAD+ (それぞれ600 pmol)のみを含有する標準を泳動させて、同位体純度の補正値を判定し、手法の較正を提供した。ミトコンドリア・ペレットの体積を、ミトコンドリア・ペレットの密度を1.0
μL/mgであるとみなすことにより、計算した。細胞一個あたりのNAD+の量を、クールター計数器で測定した、HT1080 は2183.95 fL 、そしてHEK293は1691.04
fLという平均細胞体積（MCV）で除算することにより、総細胞NAD+
濃度を計算した。
【０１３６】
動物実験
in vivoでのNampt発現を評価するために、スプラーグ-ドーリー・ラット (120-150 g) をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社から得、無作為に４匹の動物のコントロール群及び実験群に割り振った。コントロール群にはResearch Diets Inc社で調製された78%ショ糖食を不断給餌し、実験群は４８時間絶食させてからと殺した。RNA抽出用の肝組織を RNAlater試薬 (Qiagen社)中に保存した。他の試料はすべて液体窒素で凍結させ、使用時まで−８０℃で保存した。ミトコンドリアNampt及びNAD+
レベルを評価するために、オスのフィッシャー-344 (F344)ラットを育種し、Gerontology
Research Center （メリーランド州バルチモア、GRC）の動物施設で飼育した。離乳時(2
w)からラットを個別に、ベータ・ウッドの床材を敷いた標準的なプラスチック製ケージに容れた。コントロール動物にはNIH-31標準食を不断給餌した（AL）。肝臓由来のミトコンドリアの調製法は補足情報の欄に解説されている。
【０１３７】
試薬及び抗体
E.coli内で発現させた精製済みヒトNamptタンパク質でウサギを免疫処置することにより、ウサギポリクローナル抗Nampt抗体を作製した。マウス抗-Nampt mAb (14A5) はのアンソニー・ロンヴォー氏及びオバーダン・レオ氏（ベルギー、ゴセリエス、Laboratoire de Physiologie Animale,
Universite Libre de Bruxelles）のご厚意により提供されたものである。抗-SIRT3抗体は、ヒトSIRT3タンパク質のＣ末端の最後の１５アミノ酸残基に相当する合成ペプチドでウサギを免疫処置することにより、作製された。抗-SIRT2、及び抗-アセチル化AceCS2抗体は UCSFのエリック・ヴァーディン氏より贈呈いただいた。抗-SIRT5 抗体はBIOMOL社から購入した。抗-SIRT7抗体はIzumi Horikawa（ラボラトリー・オブ・バイオシステムズ・アンド・カンサー、NIH）氏のご厚意により提供いただいた。抗-V5
抗体はInvitrogen社から購入した。抗切断型カスパーゼ-3 抗体はCell Signaling社から得、ウサギポリクローナルマウス抗-Sir2a 抗体はUpstateから、抗-AIF 及び抗アクチン抗体はSanta Cruz Biotechnology社から、抗-Hsp90及び抗-MnSOD は Stressgenから、抗-CoxIV 及び抗-GAPDH はAbcamから、抗-EZH2はBD Biosciences社から得た。MMS及びサーチノールはSigma社から購入した。DPQ (3,4-ジヒドロ-5-[4-(1-ピペリジニル)ブトキシ]-1(2H)-イソキノリノン)、カンプトテシン、エトポシドはEMDから購入した。FK866 ((E)-[4-(1-ベンゾイルピペリジン-4-イル)ブチル]-3-ピリジン-3-イル)アクリルアミド) はRTI (Research
Triangle Institute)社のご厚意により提供いただいた。EX-527
(6-クロロ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-カルボキシレート) はJill Milne氏（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Sirtris
Pharmaceuticals社）より贈呈いただいた。FuGENE6
トランスフェクション試薬はRoche社から、リポフェクション 2000はInvitrogen社から、そしてヒトSIRT1-7、hNmnat-3 又は hMFT mRNAを狙った低分子干渉性RNA (siRNA) oligos はDharmacon社から得た。
【０１３８】
DNA コンストラクト
ヒトNAMPT/pcDNAはGillian Bryant-Greenwood 氏（ハワイ大学）から贈呈いただいた。mNAMPT/MSCVのプラスミド及び対応する空のベクターはAnthony Rongvaux & Oberdan Leo (ベルギー、ゴッセリース、Laboratoire de Physiologie Animale,
Universite Libre de Bruxelles)から得た。ヒトSIRT1-7-flag/pcDNA コンストラクト、AceCS2-HA 及び対応する空のベクターはEric
Verdin氏（サンフランシスコ、カリフォルニア大学）のご厚意により提供いただいた。pMSCV-U6 はYang Shi氏（ボストン、ハーヴァード・メディカル・スクール）から贈呈いただき、Nampt配列
GGTGAAGATCTAAGACATTTA (SEQ ID NO:9) (siRNA/NAMPT/pMSCV)に対するsiRNAを発現させるためのウィルス性プラスミドを構築するために用いられた。
【０１３９】
RNA法
SIRT4、SIRT6、hMFT 及びhNmant-3を標的としたスクランブルドsiRNA 又は siRNAi oligosを過渡的にトランスフェクトした肝組織又はHEK293細胞由来の全RNAをトリゾール (Invitrogen社)を用いて抽出し、mRNAをsuperscript III (Invitrogen社)と、それぞれラット肝及びHEK293試料に向けたoligo dT 又はランダム六量体プライマーとを用いて逆転写した。逆転写で作製した cDNA をLightCycler and
FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche Molecular Biochemicals社）を用いたリアル・タイムＰＣＲのテンプレートとして用いた。NAMPT、SIRT4、SIRT6、Nmant-3 及びhMFT mRNA の相対的コピー数をβ-アクチンとの比較により、判定した。定量的リアル・タイムＰＣＲ反応ではプライマー・セット：AAATCCGCTCGACACTGTCCTGAA (SEQ ID
NO:10) 及び
TTGGGATCAGCAACTGGGTCCTTA (SEQ ID NO:11) をNAMPTに；
TTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGA (SEQ ID NO:12) 及び TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC (SEQ ID NO:13)をラットβ-アクチンに； ACTTCGTAGGCTGGCCTCAATTCT (SEQ ID NO:14)  及び ACATCTGGTTTCAGATGGCCTCCA (SEQ ID NO:15)をhSIRT4に； AGAGCTCCACGGGAACATGTTTGT (SEQ ID NO:16) 及び
ATGTACCCAGCGTGATGGACAGGT (SEQ ID NO:17)をhSIRT6に； TGGCCAGAGATCACCTACACCAAA (SEQ ID
NO:18) 及び TGATGATGCCTCAGCACCTTCACT (SEQ ID NO:19) をhNmant-3に；
AGGGATTTGTTCCTGGGCTGTTTG (SEQ ID NO:20) 及び AAATCCACCGACGCCTTCTTTCCT
(SEQ ID NO:21)をhMFT; TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCT (SEQ ID NO:22) 及び
TTAATGTCACGCACGATTTCCCGC (SEQ ID NO:23) をヒトβ-アクチンに、用いた。
【０１４０】
細胞分画
そうでないと明示しない限り、培養細胞の分画は、僅かに改良を加えた差次的遠心分離及びショ糖勾配法を用いて行われた(Schwer
et al., 2002)。差次的遠心分離で出た上清を超遠心分離にかけて軽い膜を沈降させ、細胞内S-100画分として採集した。差次的遠心分離で出たペレットを緩衝液で３回、洗浄し、核内画分として用いた。単離されたミトコンドリア試料の数アリクォートを溶解させ、ミトコンドリアタンパク質濃度をブラッドフォード検定法を用いて判定した。S-100からのタンパク質抽出物 (40 μg)、ミトコンドリア画分、及び核内画分をSDS-PAGEで分離し、Nampt、Hsp90
及びCoxIV について、ウェスタン・ブロット法でプローブした。核をHEK293細胞から、以前に公開された手法(Busch
et al., 1963)の変形であるAngus Lamond’s 博士の研究所（School of Life Sciences, Wellcome Trust
Biocentre University of Dundee, UK）のプロトコルを用いて単離した。簡単に説明すると、細胞を採集し、低温のPBSで洗浄し、5 ml の低張性緩衝液Ａ（10 mM HEPES、pH
7.9、10mM
KCl、
1.5 mM MgCl2、0.5 mM DTT）中に再懸濁させ、氷上で５分間、インキュベートした。細胞懸濁液を予め冷却した7 ml のDounce 組織ホモジナイザーに移し、９０％を越える細胞が溶解するまで均質化した。218 x gでの遠心分離により核をペレットにした。核を3 mlのＳ１溶液（0.25 M ショ糖、10
mM MgCl2）中に再懸濁させ、3 ml のＳ２溶液（0.35 M ショ糖、0.5 mM MgCl2）上にこの懸濁液を層にした。1430 x g で５分間、遠心分離することにより、超純粋な核ペレットを得た。
【０１４１】
組織由来の細胞分画を、ミトコンドリアを薬物処置に用いない限り、以下の方法で行った。５匹の動物群を不断給餌又は４８時間の絶食の後の午前９時から１１時の間にと殺した。動物は断頭によりと殺した。肝臓をすぐに取り出し、氷上の単離緩衝液上に置いてからミトコンドリアを単離した。切り出された各肝臓を、の1mMのEGTAを加えた４倍の体積の単離緩衝液（215mMのマンニトール、75mMのショ糖、0.1% BSA、20nMの HEPES、1mMのEGTA、そしてpHはKOHで7.2に調節されている）を含有するガラス製のdounceホモジナイザー上に置いた。組織を均質化し、差次的分離によりミトコンドリアを単離した。簡単に説明すると、ホモジネートを４℃のマイクロ遠心管に入れて1300×gで３分間、遠心分離し、上清を新しい試験管に移した。疎なペレットをEGTAを加えた単離緩衝液中に再懸濁させ、再度、1300×gで３分間、遠心分離した。その結果得られた上清を新しいマイクロ遠心管に移し、EGTAを加えた単離緩衝液を注ぎ足し、13,000×gで１０分間、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをEGTAを加えた500μlの単離緩衝液中に再懸濁させた。試料を更にパーコール密度勾配遠心分離法により、以前に解説された通りに精製した
(Nukala et al., 2006)。この試験管にEGTAを加えない単離緩衝液（215ｍＭのマンニトール、75mMのショ糖、0.1% BSA、20mMのHEPES, pH はKOHで7.2 に調節）を注ぎ足し、13,000×gで１０分間、４℃で遠心分離した。上清慎重に取り除き、ペレットを、EGTAを加えない500μlの単離緩衝液中に再懸濁させた。この試験管にEGTAを加えない単離緩衝液を注ぎ足し、10,000×gで５分間、４℃で遠心分離して、より密なペレットを生じさせた。最終的なミトコンドリア・ペレットを、EGTAを加えない単離緩衝液中に再懸濁させた。タンパク質濃度は562nmでの吸光度をVictor3プレート・リーダーで測定するBCAタンパク質検定キットを用いて判定された。これらのミトコンドリア試料をウェスタン分析及びNAD+判定にかけた。
【０１４２】
ミトコンドリア薬物処置については、新鮮なミトコンドリアを給餌した若いオスのラット由来の肝臓から得た。肝臓をかみそりの刃で挽き、Dounce ホモジナイザーで30mlのPBS中、最高１０回のストロークにして破砕した。ホモジネートの半分を、プロトコル１と指定された、メーカの指示に解説された（イリノイ州ロックフォード、ピアース・ミトコンドリア単離キット）通りに市販のキットを用いたミトコンドリア単離に用いた。簡単に説明すると、ホモジネートを1.5 ml 入り試験管に移し、４℃で３分間、1000 x g (3000 rpm) で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを4mg/ml BSAを含有する600μlの試薬Ａ中に再懸濁させた。試料を５秒間、中速で過流させ、氷上で２分間、インキュベートした。10 μl の試薬Ｂを加えた後、試料を最高速度で５秒間、過流した後、氷上で５分間、各分とも再度過流させながらインキュベートした。試薬Ｃ (600 μl) を加え、反転により混合した。試料を700 g (2600 rpm) で１０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、3000g (5300rpm) で１５分間、４℃で遠心分離した。ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁させ、12,000 g (10,700 rpm) で５分間、遠心分離し、上清を廃棄した。
【０１４３】
元のホモジネートのもう一方の半分を差次的遠心分離プロトコルにかけてミトコンドリアを単離した（プロトコル２）。ホモジネートを２本の50ml入り超遠心分離管に加え、単離緩衝液を加えて最終体積を30 mlとした。溶液を５分間、700 x g で４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移した。目に見えるペレットが無くなるまでこのプロセスを繰り返した。その後、上清を１５分間、6,000g で４℃で遠心した。ミトコンドリアを含有するペレットをPMSFを加えた20 ml の単離緩衝液中に再懸濁させ、もう２回、遠心した。単離後、ミトコンドリア・ペレットを6 mlの呼吸緩衝液（215 mM マンニトール、75 mM ショ糖、2% BSA、2 mM MgCl2、2.5 mM KH2PO4、及び20 mM HEPES、pH 7.4）中に再懸濁させた。
【０１４４】
結果
NAMPT発現は細胞ストレス及び栄養制限により誘導される
他の研究者及び我々は、哺乳動物Namptは酵母Pnc1の機能的均等物であると考えた (Anderson et al., 2002; Anderson et al., 2003;
Bitterman et al., 2003; Revollo et al., 2004; Yang et al., 2006)。この考えはPnc1及びNampt の両者はニコチンアミド（NAM）からのNAD+ 生合成において第一及び律速段階を触媒するという事実に基づくものである(Pillai et al., 2005; Revollo et al., 2004;
Rongvaux et al., 2002)。
【０１４５】
我々は、もしNAMPT が酵母PNC1 遺伝子に相似であれば、その発現も細胞ストレス及び栄養制限で誘導されるであろうと推論した。我々は、無血清条件下で培養したヒト繊維肉腫HT1080
細胞がコントロールに比較して最高１．５乃至２倍のNamptレベルを有することを見出した（図３Ａ）。mRNA及びタンパク質の両方のレベルで同様なNampt増加が、４８時間絶食させたラットの肝臓内で観察された（図３Ｂ−Ｄ）。低酸素又は無血清培地に暴露した初代心筋細胞もまた、最高２倍のNamptレベルを有していた（図３Ｅ）。同様な結果は、無血清培地（データは図示せず）中で成長させた初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）で観察された。このように、NAMPT1は、この点では酵母PNC1遺伝子と同様にストレス-及び栄養-応答性遺伝子である。
【０１４６】
Namptは遺伝毒性ストレスを原因とする細胞死に対して防御する
Namptの上方調節を模倣すると共に、これがストレス耐性にどんな効果を有するかを検査するため、我々はHT1080線維芽肉腫及びHEK293胚性腎細胞からヒトNampt過剰発現性安定細胞株を作製し、ベクター・コントロールに比較して１．５乃至２倍のレベルのNamptを発現する株を選抜した（図３Ｆ、Ｈ）。Nampt発現における同様な変化をHT1080細胞をマウスNampt発現コンストラクトを過渡的にトランスフェクトすることにより得た（図３Ｇ）。安定なNamptノックダウン細胞株もsiRNA法を用いて作製した（図４Ａ）。
【０１４７】
次に細胞株を、PARP-1を過剰活性化することが知られているDNAアルキル化材であるメチルメタンスルホネート（MMS）に対するそれらの感受性について検定した(Horton et al., 2005)。MMS処置の結果、ベクター・コントロール細胞の約半分が死に、細胞死の程度はPARP阻害剤DPQにより大きく減少した（図９）ことから、 PARP-過剰活性化及びNAD+ の枯渇がこれらの条件下での主な態様であったことが示された。Nampt-過剰発現細胞は僅かに高いレベルのNamptタンパク質しか有さなかったが、それらはコントロールよりもMMSに対して実質的により耐性であった（図３Ｆ−Ｈ）。反対に、Namptレベルのより低い細胞はMMSに対してより感受性であった（図４Ａ及び図１０）。効力あるNampt阻害剤であるFK866は活性部位で結合し (Drevs et
al., 2003)、Nampt過剰発現による細胞防御を妨げた（図４Ｂ）ことから、Namptの活性が細胞防御には必要であることが示された。
【０１４８】
Namptレベルが無血清培地で成長させた細胞で増加することを鑑み、我々は無血清培地中の細胞はMMSに対してより耐性であるのかどうか、そしてそうであるのなら、それらの耐性がNamptにより媒介されるのかどうかと疑問を持った。図４Ｃに示すように、血清枯渇させた細胞はMMSに対してより耐性であり、この耐性は完全にNampt依存的であった。
【０１４９】
また我々は、Namptが他の種類のDNA損傷から、細胞死に対する耐性をもたらすのかどうかも調べた。エトポシドはトポイソメラーゼＩＩを阻害する癌化学療法薬であるが、数多くの二本鎖DNAの破断を起こし、アポトーシスを惹起する。Nampt過剰発現細胞はエトポシドに対してより耐性であり、アポトーシスのマーカーである切断型カスパーゼ3のレベルが低かった（図４Ｄ）。反対に、Namptのレベルの低い細胞はエトポシドに対してより感受性であり、切断型カスパーゼ3のレベルが高かった（図４Ｅ）。Namptノックダウン細胞はまた、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテシンに対してもより感受性であったことから（図４Ｆ）、Namptの細胞死からの防御能はMMSに特異的でないことが実証された。
【０１５０】
Nampt媒介性細胞防御には、ミトコンドリアSIRT3及びSIRT4が必要である
PARP-1過剰発現からのNamptの防御能はSIRT1媒介性であることを示す最近の研究(Pillai et
al., 2005)を鑑み、我々は、MMSからの防御もSIRT1依存的であろうと予測した。しかし、SIRT1特異的阻害剤であるEX-527
(Solomon et al., 2006)も、SIRT1のsiRNA媒介性ノックダウンも、Nampt媒介性生存に対して有意な効果を有していなかった（図５Ａ、Ｂ、及び１１Ａ）。しかし興味深いことに、細胞を全サーチュイン阻害剤であるシルチノールで処置すると、Nampt過剰発現の細胞防御能が遮断された（図５Ｃ）ことから、生存は別のサーチュインによって媒介されている可能性が持ち上がった。
【０１５１】
この考えを調べるために、我々は残りのサーチュインであるSIRT2-7のそれぞれをsiRNAを用いてノックダウンし（図１１Ａ−Ｂ）、MMS処置後の生存数を採点した。興味深いことに、ミトコンドリア・サーチュインSIRT3及びSIRT4がMMS誘導性細胞死からNamptによる防御能にとって必要であったが、他のサーチュインは必要ではなかった（図５Ｄ、Ｅ及び１１Ｃ−Ｆ）。加えて、SIRT3をノックダウンすると野生型細胞がMMSに対して感作性となり、切断型カスパーゼ3の相対的豊富度が増加した（図５Ｄ、Ｆ及びデータは図示せず）。この効果はMMS誘導性細胞死に対して相対的に特異的であるようである。なぜなら、エトポシドに対する感受性については何の効果も認められなかったからである（図１２）。
【０１５２】
これらのデータは、Namptの過剰発現が細胞を防御するのは、SIRT3活性を増加させることによる可能性を示した。我々はこれを、SIRT3の基質であるAceCS2のアセチル化状態を観察することにより、調べた。図５Ｇに示すように、Nampt過剰発現により、AceCS2のアセチル化レベルが著しく減少したことから、NamptがSIRT3活性を増加させることが示された。他方、SIRT4をノックダウンしても、野生型細胞の生存に何の有意な影響もなかった（図５Ｅ及びデータは図示せず）。SIRT3又はSIRT4を、あるいはその組合せを発現する細胞の生存に何の有意な増加もなかった（データは図示せず）ことから、付加的なNamptがないと、これらのNAD+依存的高度が機能できる濃度未満まで、MMSはNAD+レベルを降下させるのではないかという、我々が下に調べた可能性が示唆された（図７を参照されたい）。
【０１５３】
Namptは総NAD+の枯渇を妨げない
遺伝毒性ストレスは、核内及び細胞失側NAD+プールを枯渇させることにより細胞を致死させると広く認識されている (Burkle, 2005; Porcu and Chiarugi, 2005)。NamptがNAD+枯渇に対して防御をするかどうかを調べるために、我々は、MMSへの暴露後のHEK293細胞中のNAD+濃度を、定量的HPLC質量分析法(HPLC-MALDI-MS)を用いて測定した (Sauve et
al., 2005)。我々はミトコンドリア中のニコチンアミド・レベルを測定することは試みなかった。なぜなら、NAD+とは異なり、それは膜を通じて拡散するからである。(van Roermund et al., 1995)。
【０１５４】
内側NAD+基準である18O-NAMを3-シアノピリジンから合成した後、組換えNAD+グリコヒドロラーゼCD38を用いて180-NAD+に酵素的に転化させた（図６Ａ）。HPLC-MALDI-MS技術の鍵となる利点は、同位体標識されたNAD+内側基準標準が抽出物に打ち込まれるため、精製中のNAD+の消失が最終的な結果に影響しないためである。
標識された標準の添加後、細胞抽出物中のNAD+ をHPLC精製し、質量分析法で分析したところ、二つのイソトポマー分子イオンに相当する二つのピークが生じた（図６Ｂ）。分子量が高い方の種である18O-NAD+を用いて、分子量が低い方の内因性の種である16O-NAD+の量を判定した。
【０１５５】
我々はHEK293細胞中の総NAD+濃度が365 +/- 30.2
μMであると推定したが、これは、HPLC-MS-エレクトロスプレーイオン化方を用いた、マウス赤血球についての最近の推定値(368 μM)に大変近い(Yamada et al., 2006)。興味深いことに、Nampt-過剰発現細胞はベクター・コントロール細胞の総NAD+濃度のほぼ２倍を有しており、反対にNamptノックダウン細胞はほぼ半分を有していた（図６Ｂ及びＣ）。これらのデータは、Namptが核−細胞質NAD+生合成中の律速段階を触媒することを示す他の研究とも合致する(Pillai et
al., 2005; Revollo et al., 2004)。
【０１５６】
驚くべきことに、Namptの過剰発現は総細胞抽出物中のNAD+のMMS媒介性枯渇にさほど影響しなかった（図６Ｄ）。我々が選んだ時点が単に適当でなかったことを確認するために、Namptによる細胞防御が観察されるちょうど前の時点、及び観察中の時点で、総NAD+ レベルを測定した（２及び４時間）（図６Ｅ）。やはり、総NAD+濃度は、Namptレベルに関係なく、非常に低くなった(総
[NAD+]<100 μM)(図６Ｆ)。
【０１５７】
Nampt調節性ミトコンドリアNAD+レベルは細胞生存を決定する
これらのデータは興味深い疑問を投げかける：総NAD+レベルを維持することによるのでなければ、どうやってNamptは遺伝毒性から細胞を防御しているのか？その重要な鍵は、ミトコンドリア・サーチュインSIRT3及びSIRT4が、Namptが細胞生存を高めるのに必要であるという我々の観察にあった。我々が用いていた細胞株T1080及びHEK293は、肝細胞及び筋細胞など、代謝活性の高い細胞に比較して数少ないミトコンドリアを持つ (Di Lisa and Bernardi, 2006)ため、ミトコンドリアはこれらの細胞の総NAD+プールのごく僅かな成分にしか、寄与していない。MMS処置細胞中に残ったNAD+は主にミトコンドリアであったこと、そしてNampt過剰発現細胞の生存率上昇はミトコンドリア中のNAD+レベル増加の結果であったことが考えられる。
【０１５８】
驚くべきことに、哺乳動物ミトコンドリア中のNAD+の精確な濃度や、ミトコンドリアNAD+レベルの変化が細胞生存に影響をもたらすのかどうかについては、ほとんど知られていない (Porcu and Chiarugi, 2005; Viswanathan et
al., 2005)。この知見の欠如は、部分的には、ミトコンドリアNAD+濃度を測定する強固で正確な方法がないことから来ているようである。実際、ごく２、３の研究しか、何らかの手段でミトコンドリアNAD+レベルを測定しようと試みていない。酵素検定を用いると、オルガネラ内のNAD+の実際の濃度を精確に判定することはできなかった。レベルは典型的にはモル濃度ではなく、nmol NAD+/mg のミトコンドリアタンパク質として表されている
(Di Lisa and Bernardi, 2006; Noack et al., 1992; Tobin et al., 1980)。
【０１５９】
我々は、上記のMALDI-MSの適合を用いて実際のミトコンドリアNAD+濃度を測定することにより開始した（材料及び方法の項を参照されたい）。我々は、HEK293細胞のミトコンドリア内のNAD+の濃度を、2053 pmol NAD+/mg ミトコンドリアタンパク質に相当する245.6μMと推定した。我々の仮説と合致して、付加的なNamptのある細胞はほぼ二倍の濃度のNAD+をミトコンドリア内に有し（図７Ａ）、Namptをノックダウンした細胞では、対応する減少がミトコンドリアNAD+ にあった（図７Ｂ）。重要なことに、Namptはミトコンドリアの大きさ又は数を変化させておらず、NAD+基準の添加後の精製中の NAD+ の消失は結果に影響を与えなかったのであろう。
【０１６０】
次に、我々は、MMS処置後のミトコンドリアNAD+に対するNamptの効果を判定した。驚くべきことに、Nampt過剰発現細胞はMMS処置野生型コントロールに比較して二倍を超える濃度のミトコンドリア NAD+を有していた（図７Ｃ）。実際、Nampt過剰発現細胞中のミトコンドリアNAD+の濃度は、未処置の野生型よりも、MMS暴露中、高かった。このように、Nampt過剰発現細胞のミトコンドリアは、MMS処置後も、残りの細胞にNAD+が枯渇しても、生理的レベルのNAD+ を留めていた。
【０１６１】
ミトコンドリアはどのようにNAD+を維持し、アポトーシスから細胞を防御するか？
次に我々は、遺伝毒性ストレス中、ミトコンドリアはどのようにこのような高レベルのNAD+を維持するかに疑問を持った。二つの考えられる説明があった。つまり、ミトコンドリアが内因性NAD+生合成経路を持つ、および／又は、これらが細胞質ゾルからNAD+を輸入する、である。我々はまず、Namptがミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアNAD+生合成に参与しているという仮説を調べた。既に、ミトコンドリア内のNAD+再利用経路の良い証拠がある。二つの研究で、NAD+前駆体をミトコンドリア標品に加えたところ、NAD+に転化することができ (Barile et al., 1996; Kun et al., 1975) 、そしてより最近では、NAD+再利用経路中、Namptのすぐ下流の酵素であるNmnat3（NAM モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼの意）が、ミトコンドリアにのみ在ることが示されている (Berger et al., 2005)。
【０１６２】
ミトコンドリアがNamptを含有するかどうかを調べるために、我々は、HEK293細胞（図７Ｄ）又は新鮮なラット肝由来の高度に純粋なミトコンドリア画分を単離し、このとき後者の場合には二つの異なるミトコンドリア単離法を用いた（図７Ｅ）。画分の純度は細胞質マーカー（Hsp90、カルレチキュリン、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ミトコンドリア・マトリックスタンパク質（CoxIV 又はチトクロームＣ）、及び核膜タンパク質（ラミニンA/C)をプローブすることにより、評価した。ミトコンドリア・マーカー画分中にはミトコンドリア・マーカーが豊富にあること、これらの画分には細胞質及び核タンパク質が存在しないことから、そのミトコンドリア標品は高度に純粋であることが実証された。Nampt は細胞質及び核画分には観察され、他の報告と合致した
(Kitani et al., 2003; Revollo et al., 2004; Rongvaux et al., 2002)。HEK293細胞由来及び肝組織由来のミトコンドリア標品のすべてにおいて、Namptは明確に検出された。Namptはまた、ヒトリンパ芽球、HepG2 肝癌腫細胞及びHeLa 細胞（図示せず）由来のミトコンドリア標品でも高度の純度で存在した。
【０１６３】
これらの発見に重みを付けるために、我々はミトコンドリア中のNampt活性について機能検定を行った。具体的には我々は、ミトコンドリア中のNampt活性に干渉するとミトコンドリアNAD+レベルに影響するかどうか、そしてミトコンドリアNAD+生合成を遮断すると遺伝毒性ストレスからのNamptによる防御能が低下したかどうかを検査した。我々は、Nampt活性がミトコンドリアNAD+を維持するのに必要であれば、単離されたミトコンドリア中のNamptを阻害すると、ミトコンドリアNAD+レベルが低下するはずだと推論した。他方、ミトコンドリアNAD+が細胞質由来であれば、Nampt活性を阻害しても、精製済みミトコンドリア中のNAD+のレベルには何の影響もないはずである。
【０１６４】
ラット肝由来のミトコンドリアを精製し、in vitro でMMS もしくはFK866又は組合せで処置した（図７Ｆ）。次に、ミトコンドリア中のNAD+ 含有量を、上で全細胞に用いられたHPLC／質量分析法を用いて判定した。単離されたミトコンドリアをMMSで処置すると、MMSで全細胞を処置した場合の効果と同様に、ミトコンドリアNAD+レベルが２分の１に減少し（図７Ｇ）、ミトコンドリア内PARP-1の過剰活性化と合致した(Du et al., 2003)。単離されたミトコンドリアをFK866で、MMS有り又は無しで処置したところ、ミトコンドリアNAD+レベルに更に大きな減少があった。NAD+の同様な減少が、代替的な方法で調製されたミトコンドリアの処置後に観察された（図１３）。これらのデータは、ミトコンドリアがNAD+再利用経路を有すること、そしてこのオルガネラ中のNamptの阻害がNAD+の減少を引き起こすことを示すものである。
【０１６５】
更なる検査として、我々は、Namptにより提供される防御には、インタクトなミトコンドリアNAD+再利用経路が必要であったかどうかを判定した。これらの実験の間中、幸運にも、我々はミトコンドリアNAD+生合成酵素Nmnat-3のみを発見した(Berger et al., 2005)。我々は、Namptが細胞質又は核内ではなくミトコンドリア内のNAD+合成を増加させることにより細胞生存を高めるのであれば、Nmnat-3をノックダウンすると、MMSに対するNampt媒介性防御が減衰するはずだと推論した。そうでなければ、Nmnat-3のノックダウンは細胞防御に対して何の効果も有さないはずである。
【０１６６】
Namptコンストラクトを発現するHEK293細胞で、Nmnat-3を最高40%、siRNAコンストラクト用いてノックダウンした（図１４）。次に細胞をＭＭＳへの耐性について検査した。図７Ｈに示すように、Nmnat-3をノックダウンすると、MMSに対するNampt媒介性防御が著しく減少したことから、完全なミトコンドリアNAD+再利用経路が、NamptがMMSに対する耐性を提供するには必要であることが実証された。MMSからの防御は過剰発現Nmnat-3 では見られず（データは図示せず）、細胞質型のNmnat（Nmnat-1）を過剰発現させてもNAD+レベルには何の効果もないという報告と合致する (Araki et al., 2004; Revollo et
al., 2004)。
【０１６７】
Namptは、細胞質からのNAD+の輸入を促進することによりミトコンドリアNAD+を増加させるという代替的な仮説は、MMS処置中、ミトコンドリアは細胞質よりも高レベルのNAD+レベルを保持しているという我々の観察を見ると、可能性が低いようである。にもかかわらず、我々は、哺乳動物ミトコンドリアNAD+トランスポーターの証拠を探した。ミトコンドリアNAD+輸送は哺乳動物については解説されているが、二つのミトコンドリアNAD+トランスポーターが、最近、Ｓ．セレビジエで発見されている (Todisco et al., 2006)。我々はhMFTと呼ばれる推定上のヒトホモログを同定した (同定 = 酵母Ndt1に対して35%；受託番号 NM_030780; 図１５Ａ)。しかしhMFT をノックダウンしても、 Nampt のMMS からの防御能には影響しなかった（図１５Ｂ及び７Ｉ）。我々は、別のNAD+トランスポーターが存在し、ミトコンドリアがNAD+を細胞質から有することができるという可能性を度外視できないが、まとめると我々は、このデータの最も簡単な説明は、Namptはミトコンドリア内で活性であるというものだと信じる。
【０１６８】
NAD+の枯渇は、外側のミトコンドリア膜から核へのAIFの移動を含め、数多くのアポトーシス誘発経路を刺激することが広く受け容れられている (Di Lisa and Bernardi, 2006; Porcu
and Chiarugi, 2005; Yu et al., 2002)。図８Ａに示すように、Nampt の過剰発現は、MMSに応答したAIFの核への転位を抑制したことから、Namptはこの主要なアポトーシス経路の上流にあることが実証された。
【０１６９】
絶食はin vivoでミトコンドリアNampt及びNAD+を増加させる
最後に我々は、これらのデータがin
vivo での状況に関係するかどうかを調べた。NamptはミトコンドリアNAD+の栄養応答性調節物質であるという仮説を我々が立てるには、我々は、ミトコンドリアNAD+のレベル増加と同時、絶食ラットのミトコンドリアではNamptのレベル増加も観察するはずである。我々の知るところでは、ミトコンドリアNAD+のin vivoでの変化が以前に調べられたことはなかった。ラットを４８時間、絶食させ、それらの肝臓を切り出し、上述したようにミトコンドリアを精製した。ミトコンドリア画分をウェスタン・ブロット法と、HPLC-MSを用いたNAD+判定とに向けて分けた。４８時間の絶食後には、ミトコンドリア画分中のNamptレベルに劇的な上昇があり（図８Ｂ）、と同時に、絶食動物からのミトコンドリア抽出物中のミトコンドリアNAD+レベルにも増加があった（図８Ｃ）。このように、細胞培養における我々の結果は、in vivo での状況に意味のある外挿をするものである。
【０１７０】
議論
癌、糖尿病及び神経変性などの年齢に関係する疾患の進行速度に対するミトコンドリア機能の重要性が近年、ますます明白になってきた
(Lin et al., 2005; St-Pierre et al., 2006)。しかし、ミトコンドリア中のNAD+の細胞内濃度や、それが食事に応答して変動するかどうかや、あるいは、これらの変化がアポトーシスなどの鍵となる細胞機能に影響するかどうかについては、現在のところほとんど知られていない。この研究では、我々は、哺乳動物ミトコンドリア内のNAD+濃度を精確に判定し、ミトコンドリアNAD+を細胞生存の決定因子として特定し、そしてミトコンドリアNAD+レベルは、in vitro 及びin
vivoで栄養制限により劇的に上方調節されることを示した。本研究のより驚くべき発見の一つは、ミトコンドリアは遺伝毒性ストレス中のNAD+の生理的レベルを維持することができ、たとえ細胞質及び核内のNAD+が通常の生理的レベルを遥かに下回っていても、細胞生存を促進することができるという観察である。我々は、ミトコンドリアが細胞生存を決定する能力を「ミトコンドリア・オアシス効果」と呼ぶ。
【０１７１】
この研究は、Namptは哺乳動物細胞中のミトコンドリアNAD+のストレス-及び食事応答性の調節物質であることも示す。本データは、Namptがミトコンドリア内に存在し、かつ機能的である、の両方であり、ミトコンドリアNAD+生合成酵素Nmnat-3のみの上流に直接あることを強く示唆するものである。NAD+の輸入、又は、代替的なNAD+生合成経路など、ミトコンドリアがNAD+を得る他の機序を、我々は度外視することはできず、また度外視するものではないが (Bieganowski and Brenner, 2004)、Nampt活性が、単離去れたミトコンドリア内でNAD+レベルを維持するのに必要であるという事実は、これらのオルガネラ内でのNamptが機能的な役割を果たしている強力な証拠である。NAD+生合成におけるNamptの中心的役割を考えると、Nampt活性は遺伝子発現レベルで単に調節されるだけでなく、基質利用能や、そしておそらくは翻訳後修飾によるものを含め、複数のレベルで調節される可能性が高い。
【０１７２】
それぞれGDH及びAceCS2を調節することが知られているサーチュインSIRT3及びSIRT4を含め、ミトコンドリア内の数多くの酵素がNAD+利用能の制限を受けることを考えると、ミトコンドリアNAD+レベルの代謝や多様な器官の健康に対する潜在的影響を調べることが興味深いであろう。おそらく、ミトコンドリアNAD+の食事誘導性増加は毒素に対するカロリー制限げっ歯類の耐性上昇だけでなく、カロリー摂取減少と共に起きる脂肪酸代謝及び呼吸の変化にも、寄与するものであろう(Ando
et al., 2002; Campisi, 2003; Higami and Shimokawa, 2000; Migliaccio et al.,
1999; Zhang and Herman, 2002)。
【０１７３】
PARP誘導性アポトーシスにつながる事象は理解が進んでいないが、AIFの局在が鍵となる事象であることが知られている(Di
Lisa and Bernardi, 2006; Yu et al., 2002)。この研究で我々は、Namptの過剰発現が、AIF局在の減衰につながることを見出した。NAMPTがAIFの上流にあることを考えると、SIRT3又はSIRT4が、AIFや、又は透過性遷移ポア（PTP）などの他のアポトーシス決定因子に結合する、及び／又は、修飾するかどうかを調べると面白いであろう。
【０１７４】
Namptは細胞生存をSIRT3及びSIRT4を介して促進するストレス-及び栄養-応答性遺伝子であるという我々の観察は、更に、NAMPTは酵母PNC1寿命遺伝子の機能的ホモログであるという仮説の裏付けにもなる (Anderson
et al., 2003; Bitterman et al., 2003)。過剰発現したNAMPTの効果を調べるために、トランスジェニック・マウス実験が進行中である。我々は、これらの動物は細胞ストレスに対する耐性増加、代謝変化、及び疾患耐性を有するのではないかと仮説を立てる(North
and Sinclair, 2007)。
【０１７５】
NAD+はこのような古代の分子であるため、NAD+の生物学的への洞察は地球上の初期の生命進化に関する鍵を提供することができる(Brenner, 2005)。細胞はNAD+を生存を決定する栄養センサーとして長い時間にわたって用いてきており、それはおそらく、真核生物の進化よりも前であろう。Nampt 及びSir2 のホモログはミトコンドリアの細菌性近縁で見られ (Smith et al., 2000) 、NAD+レベルの増加は、理由は余り明らかにはなっていないが、熱、塩ストレス、及び糖制限に対する細菌の耐性を提供する (Foster et al., 1990)。多様な種を由来とするNAM代謝性酵素の系統発生的比較で、脊椎動物は、Ｓ．セレビジエ、Ｃ．エレガンス及びＤ．メラノガスターよりも最初のミトコンドリアを生んだ生物に近い関係のある経路を利用することが示されている(Andersson et al., 2003)(図１６)。このことは、NAD+レベルはミトコンドリアを生んだ細菌において細胞生存を制御してきたと考えられ、これらの生存経路は今日まで、哺乳動物で保存されていることを示すものである。
【０１７６】
要約すると、我々は、ミトコンドリアNAD+レベルが遺伝毒性ストレス後の細胞生存に影響を与えること、そしてこれらのレベルは、栄養枯渇後にはかなり高いことを示してきた。我々は、ミトコンドリアNAD+の重要性に対するこれらの洞察が、癌及び神経変性などの疾患を処置する新規なアプローチの新しい理解を促すと共に、その開発を促すことを切に望むものである。
【０１７７】
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【０１７８】
均等物
本発明の少なくとも一つの実施態様のいくつかの局面を解説してきたところで、当業者であれば、多様な変更、改変、及び向上が容易に想到されるはずである。このような変更、改変、及び向上は、本開示の一部として意図されており、また、本発明の精神及び範囲内にあると意図されている。従って、前述の解説及び図面は単に例示である。
【０１７９】
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求項の包含するところと意図されている。
【図１】
2011500810.tif 000003
【図２】
2011500810.tif 000004
【図３】
2011500810.tif 000005
【図４】
2011500810.tif 000006
【図５】
2011500810.tif 000007
【図６】
2011500810.tif 000008
【図７】
2011500810.tif 000009
【図８】
2011500810.tif 000010
【図９】
2011500810.tif 000011
【図１０】
2011500810.tif 000012
【図１１】
2011500810.tif 000013
【図１２】
2011500810.tif 000014
【図１３】
2011500810.tif 000015
【図１４】
2011500810.tif 000016
【図１５】
2011500810.tif 000017
【図１６】
2011500810.tif 000018
【配列表】
2011500810000001.xml
【国際調査報告】
2011500810.tif 000027
2011500810.tif 000028
2011500810.tif 000029