(57)【要約】  フィブロイン溶液から骨の修復、補強、又は置換のための移植可能な材料を調製する方法であって、前記方法は前記フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、ゲルを１つ以上の凍結及び解凍ステップにさらす事によって材料を調製するステップを含み、前記フィブロイン溶液から前記ゲルを調製するステップは、リン酸イオンの存在下で実施されることを特徴とする。本材料は、フィブロイン−アパタイトを形成するためにカルシウムイオンで処理しても良い。更なる方法として、本材料をイソシアン酸塩で処理するステップを含む。本発明はまた、再生フィブロイン溶液を使用した移植可能な材料を調製するための方法にまで拡大適用する。また、移植可能材料及び移植片も存在する。【選択図】  図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロイン溶液から骨の修復、補強、又は置換のための移植可能な材料を調製する方法であって、
−フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、
−ゲルを１つ以上のステップの凍結及び解凍にさらす事によって材料を調製するステップと
を含み、
前記フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、リン酸イオンの存在下で実施される方法。
【請求項２】
前記材料を、引き続き架橋剤を用いて処理するさらなるステップを含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
フィブロイン溶液から骨の修復、補強、又は置換のための移植可能な材料を調製する方法であって、
−フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、
−ゲルを１ステップ以上の凍結及び解凍にさらす事によって材料を調製するステップと
を含み、
前記方法が、引き続いてイソシアン酸塩を用いて処理するさらなるステップを含む方法。
【請求項４】
前記ゲルを、リン酸を用いて処理し、若しくは前記フィブロイン溶液から前記ゲルを調製するステップをリン酸イオンの存在下で実施する、請求項３に記載の前記方法
【請求項５】
前記フィブロイン溶液から前記ゲルを調製するステップが、前記フィブロイン溶液をアルカリン溶液で処理するステップを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
前記フィブロイン溶液から前記ゲルを調製するステップが、リン酸イオンを含有するゲル化試薬を含む、請求項１乃至請求項２並びに請求項４乃至請求項５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項７】
前記材料は、前記材料を架橋剤で処理する前にフィブロイン−アパタイトを形成するため、前記材料をカルシウムイオンで処理する、請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項８】
前記材料が、略pH７．０及び略pH１０．０の溶液中でカルシウムイオンを用いて処理される、請求項７に記載の前記方法。
【請求項９】
前記カルシウムイオンが、塩化カルシウム溶液によって提供される、請求項７及び請求項８に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記材料を、余分な塩化カルシウムを除去するためエタノールで洗浄し、且つ前記フィブロインをシルク第ＩＩ状態へと変換する、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記材料が、洗浄ステップ後に乾燥される、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記架橋剤が、イソシアン酸ヘキシル（ＨＭＩ）、イソシアン酸メチル（ＭＩＣ）、  ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）、トルエンジイソシアネート酸（ＴＤＩ）、及びイソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）を含む、請求項２乃至請求項１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記架橋剤による処理が、実質的にフィブロイン非膨張剤を用いて実施される、請求項２乃至請求項１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記方法は、前記フィブロイン溶液からゲルを調製するステップの前に、骨固定具の一方の端部を前記フィブロイン溶液へ挿入するステップをさらに含む、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記方法は、１回以上の濯ぐステップで、前記材料から過剰な架橋剤を除去するさらなるステップを含む、請求項２から請求項１４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記方法は、過剰なＣＮＯ基を加水分解するため水で前記材料を濯ぐさらなるステップを含む、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記方法は、前記材料を乾燥するさらなるステップを含む、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記材料を殺菌する、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィブロイン溶液が再生フィブロイン溶液である、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２０】
前記再生フィブロイン溶液が、絹又は絹繭を、一価カチオン及び一価アニオン水溶液を含むイオン試薬を用いて処理するステップを含む方法によって調製される、請求項１９に記載の方法であって、前記カチオン及びアニオンが、少なくとも１．０５オングストロームのイオン半径を有し、２５℃で、０．００１乃至−０．０５のＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数を有する前記方法。
【請求項２１】
再生フィブロイン溶液から骨の修復、補強、又は置換のための移植可能な材料を調製する方法であって、前記再生フィブロイン溶液は、一価カチオン及び一価アニオンの水溶液を含むイオン試薬を用いて、絹又は絹繭を処理するステップを含む方法によって調製され、前記カチオン及び前記アニオンが、少なくとも１．０５オングストロームのイオン半径を有し、２５℃で、０．００１乃至−０．０５のＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数を有する方法。
【請求項２２】
前記イオン性試薬が、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硝酸カリウム、水酸化ルビジウム、塩化ルビジウム、臭化ルビジウム、又は硝酸ルビジウムのうち、１つ以上の水溶液を含む、請求項２０乃至請求項２１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記絹又は絹繭が精練される、請求項２０乃至請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記絹又は絹繭の精練は、前記絹又は絹繭のセリシンを選択的に除去し、セリシンを開裂するが、フィブロインをほとんど又は全く開裂しないタンパク質分解酵素を使用する、請求項２３に記載の前記方法。
【請求項２５】
前記絹又は絹繭を乾燥するさらなるステップを含む、請求項２０乃至２４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２６】
前記乾燥ステップが、イオン試薬処理及び精練の両ステップが実施された後に実施される、請求項２３又は請求項２４に従属した場合、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
前記方法が、カオトロピック剤中で、前記精練された絹及び絹繭を溶解するさらなるステップを含む、請求項２３乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記絹及び絹繭を溶解するステップが、
温度が、６０℃未満；
カオトロピック剤の濃度が、９．５Ｍ未満；
期間が、２４時間未満、
のいずれか１つの条件またはこれらを組み合わせた条件下で実施することができる、請求項２７に記載の前記方法。
【請求項２９】
前記カオトロピック剤が、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、又はチオシアン酸グアニジンのうち１つ以上を含む、請求項２７又は請求項２８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３０】
前記カオトロピック剤が、透析によって、前記溶液から除去される、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３１】
前記再生フィブロイン溶液が、略１０ｗ／ｖ  ％の濃度に濃縮される、請求項１９乃至請求項３０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３２】
請求項１乃至請求項３１のいずれか１項に記載の方法で得られる、移植可能な修復、骨の補強、又は骨の置換材料。
【請求項３３】
前記材料は、
−Ｊ−積分法によって測定された６％歪みで略１ｋＪｍ−３乃至略２０ｋＪm−３間の圧縮靭性と、
−５％歪みで略０．１ＭＰａ乃至略２０ＭＰａ間の圧縮強度と、
−５％歪みで略１００ＭＰａ乃至略５００ＭＰａ間の平均圧縮弾性率
の特性を有し、骨修復、補強又は置換材料として使用する移植可能なフィブロイン材料。
【請求項３４】
フィブロイン−アパタイトを含む、請求項３３に記載の前記材料。
【請求項３５】
前記アパタイトが、フィブロイン−アパタイトナノ複合材料として前記材料全体に一様に分布している、請求項３４に記載の前記材料。
【請求項３６】
前記アパタイトが前記フィブロイン材料表面に塗布面として存在する、請求項３４又は請求項３５のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項３７】
前記材料が、相互に接続した微細孔を含む、請求項３３乃至請求項３６のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項３８】
前記平均微細孔径が、略１００μｍ乃至略３００μｍの間である、請求項３７に記載の前記材料。
【請求項３９】
少なくとも前記アパタイトの一部が、前記微細孔の壁内に存在する、請求項３７又は請求項３８のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項４０】
前記材料が、略１５ｗ／ｖ％乃至略７０ｗ／ｖ％のリン酸カルシウム成分を含む、請求項３３乃至請求項３９のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項４１】
前記材料が、フィブロイン−フィブロイン架橋結合を含む、請求項３３乃至請求項４０のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項４２】
前記材料が、付着性の粗面を含む、請求項３５乃至請求項４１のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項４３】
前記材料が、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、骨形成性細胞株からの細胞、血液細胞、若しくは対象患者から採取した細胞を含む、組織培養細胞で播種される、請求項３３乃至請求項４２のいずれか１項に記載の前記材料。
【請求項４４】
１つ以上の骨の実質的に全体又は一部の骨を修復、補強、若しくは置換する、若しくは請求項３２乃至請求項４３のいずれか１項に記載の移植可能な前記材料を含む整形外科的用途の骨移植代用品としての移植片。
【請求項４５】
前記移植片が、前記材料に埋め込まれた骨固定具を含む、請求項４４に記載の移植。
【請求項４６】
前記骨固定具が、前記材料に埋め込まれた複数の糸又はフィラメントを含む、請求項４４に記載の前記移植片。
【請求項４７】
請求項３２乃至請求項４３のいずれか１項に記載の移植可能な材料の使用、あるいは、１つ以上の骨の実質的に全体又は一部の骨を修復、補強、若しくは置換する、若しくは、骨移植代用品、又は整形外科的用途における固定具として、請求項４４乃至請求項４６のいずれか１項に記載の移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広く一般に移植材料及びその調製方法に関する。この材料は、例えば、１個以上の骨の実質的に全て又は部分的な修復、増強、置換、若しくは整形外科用途における骨移植片の代用物として有用である。
【背景技術】
【０００２】
以下に特記される場合を除き、「フィブロイン」という用語は、家畜化されたＭｕｌｂｅｒｒｙ  Ｓｉｌｋｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）に由来する、遺伝子組み換え蚕に由来する、若しくはムガシルク、エリシルクまたはタッサー・シルクを産生する蚕を含むが、それに限定されない、任意の野生蚕に由来するか否かにかかわらず、繭糸の主要な構造タンパク質を総称して使用される。
【０００３】
さらに、「絹」という用語は、蚕が分泌する天然の微細繊維を指すのに使用され、主にセリシン及びフィブロインという２種類のタンパク質を含む。フィブロインは、絹において主要な構造材料であり、他方セリシンは、フィブロインの周囲にあって、繭の繊維成分を互いに接着させている材料である。
【０００４】
「絹の繭」とは、蛹の期間中、蚕の幼虫の保護のため、幼虫が紡ぎ出す絹紡糸を指す用語として使用される。
【０００５】
「骨の修復」とは、骨移植代用物として使用する材料を含め、骨を修復させるため、全ての処置を指す用語として使用される。
【０００６】
「骨の補強」とは、骨を補充する又は形成する全ての処置を指す用語として使用される。
【０００７】
「骨の置換」とは、既存の骨を置換するための全ての処置指す用語として使用される。
【０００８】
「ポリマー」とは、１種類またはそれ以上のモノマー単量体の鎖から構成される大型の分子を指す用語として使用され、高分子タンパク質を含む。
【０００９】
実質的に、全ての又は部分的に一部の骨を修復、補強若しくは置換するため、外科的処置が必要な損傷と状況が、幾つか存在する。これらの状況は、例えば、外傷性骨折、癒着不能、骨嚢腫、致命的な骨欠陥、骨と人工関節の界面で人工関節の緩み及び骨の悪性腫瘍をふくむ。
【００１０】
歴史的にこのようなこれらの状況の多くは、骨から派生した材料を使用する自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）（この方法では、同一人物の身体中のある部位から別の部位へ組織が移植される。Ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔとも称する）若しくは、同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）（この方法では、同種であって異なる遺伝子型を有する個人から別の個人へ器官又は組織が移植される。ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｇｒａｆｔ又はｈｏｍｏｇｒａｆｔとも称する）による方法でのみ修復できた。
【００１１】
自家移植は、現在骨修復法として好まれている選択肢である。しかし、自家移植は、外科的手段による移植片採取の高コストと、採取部位で体験する痛み及び疾病状態を含む、いくつか関連する問題点がある。例えば、患者の隆起した臀部の骨切片である腸骨稜からの移植片の採取は、採取手術１回当たり１０００米ドル乃至９０００米ドルの費用と入院費用が追加される可能性がある。移植片採取部位の疾病状態には、症状として、痛み、感染、神経障害及び失血などが含まれる。失血の場合には、血液由来感染症のリスクを伴う輸血を必要とする。移植片採取可能な骨組織の量は限定されており、品質も低く、骨粗鬆症患者においては、特別に低品質の可能性がある。
【００１２】
死体から採取した同種移植材料は、Ｍｅｄｓｃａｐｅ  ｔｏｄａｙ    （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗａｒｔｉｃｌｅ／４４３９０２）に記載されたＢｕｒｋｕｓｓ，  Ｊ．  Ｋ．  の論文「Ｎｅｗ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ」（２００２年）によって教えられたように、ドナー部位の病的状態及び限定された供給問題を排除することで、同種移植の短所のいくつかを回避する。しかしながら、同種移植の使用は、自家移植では見られないさらなるリスクと問題を提起する。同種移植においては、組織は臓器提供者から得られるため、臓器提供者から被提供者へ感染症の伝染というリスクがあり、ＨＩＶと肝炎は、同種移植により感染し得ることが立証されている。さらに、同種移植及び同種異系移植は、無細胞であり、免疫原性及び骨芽細胞となる生存細胞の欠如に起因する理由で、自家移植に比べ成功率も低く且つ予測しにくい。
【００１３】
同種移植及び同種異系移植の短所故に、自家移植及び同種移植に代わる手段として使用するため、適切な骨修復材料  （ＢＲＭｓ）  ）を探す努力がなされてきた。しかしながら、ＢＲＭは、過去に主要な５つの評価基準、すなわち、耐荷重能性、骨伝導性、骨誘導性、吸収性（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９２，  １−７に公表されたＲｏｓｅ，  Ｆ．  Ｒ．  Ａ．  Ｊ．及びＯｒｅｆｆｏ，  Ｒ．  Ｏ．  Ｃ．による論文「Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｈｏｐｅ  ｖｓ  Ｈｙｐｅ」（２００２年））並びに手術室での使いやすさについて適切に対応しなかったので、未だ自家移植に置き換わるものになっていない。手術室での使いやすさは、少なからず重要であるが、多くの人工ＢＲＭはこれを満たしていない。
【００１４】
理想的には、ＢＲＭは、１００％の、且つ直ちに耐荷重性を有することが可能となる必要がある。この様な状況において、耐荷重性は、ピン、プレート、創外固定装置及びギプスなどの補助的な支持構造体に頼らずに、通常の日常生活の中でＢＲＭが外力を受けた場合、過度に変形せずに機械的完全性を維持するＢＲＭの能力として定義できる。さらに、迅速な耐荷重性とは、患者が麻酔から覚めた時までに100％の荷重に耐えられる修復能力として定義することができる。
【００１５】
ＢＲＭの迅速な耐荷重性を可能にする材料の特性は、ＢＲＭの移植場所に依存するが、優れた圧縮靭性、優れた圧縮強度、優れた圧縮弾性率、及び存在する骨との優れた界面特性も含まれる。迅速な耐荷重性の最低必要要件は、移植部位の健康な骨材料に匹敵する材料の強度及び靭性であるのは明らかである。さらに、当然ながら、ＢＲＭは、極度の局所的応力の集中又は応力遮へいを防ぐために骨特性を相当厳密に再現する必要があると理解されている。局所的な応力集中及び応力遮へいは、両方とも、移植したＢＲＭに隣接する自然骨に悪影響を与える可能がある。  従って、耐荷重性ＢＲＭの目標値として、正常骨の機械的特性値を使用することが非常に望ましい。
【００１６】
靭性は、骨折に対する抵抗力を与え、靭性は骨にとって極めて重要である。靭性は、１立方メートルあたりのジュール単位（Jｍ−３）として測定する。骨の靭性を測定するための方法はいくつか存在し、得られた値は、使用される方法及び試料への正確な負荷条件にある程度依存する。しかしながら、健康な３５歳の大腿骨幹中央部の、骨折（固定）法、骨の切痕埋伏法及びＪ-積分法は、全てそれぞれ３．９ｋＪｍ−３、２．０ｋＪｍ−３、１．３ｋＪｍ−３、と類似な結果を示した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （ａｐｐｌｉｅｄ）  （２００１）  １５，  １８７−２３１に公表されたの論文「Ａｇｅｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ：  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｉｔｓ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ」の中で、Ｚｉｏｕｐｏｓ，  Ｊ．により発表された）。さらに、約１ｋＪｍ−３の骨の靭性値は、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９５），  ４５０，  １２３−１４０で公表されたメタアナリシスを用いたＡｓｈｂｙ，  ＭＦ；  Ｇｉｂｓｏｎ，  ＬＪ；  Ｗｅｇｓｔ，  Ｕ；  ａｎｄ  Ｏｌｖｅ，  Ｒ．の研究論文に提示された。従って、Ｊ-積分法によって測定された１．３ｋＪｍ−３の圧縮靭性目標値は、耐荷重性ＢＲＭにとって適切である。
【００１７】
正常な人の網状骨の圧縮強度は、かなりの変動巾を示すが、典型的には約５ＭＰａであり、骨粗鬆症の骨では２ＭＰａまで低下する場合もある（出典：Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １，  （２），  ｈｔｔｐ  ：／／ｗｗｗ．ｉｓｐｕｂ．ｃｏｍ／ｏｓｔｉａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｘｍｌＦｉｌｅＰａｔｈ＝ｊ  ｏｕｒｎａｌｓ／ｉｊ  ｓｓ／ｖｏｌ  １  ｎ２／ｖｅｒｔｅｂｒａｌ．ｘｍｌ中のＴｏｇａｗａ，  Ｄ．  Ｋａｙａｎｊａ，  Ｍ．  Ｍ．及び  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｉ．  Ｈ．  （２００５年）による  「Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」）。
【００１８】
約１０乃至１６０ＭＰａの圧縮強度を有する皮質骨は、網状骨よりも大幅に強度を有する（Ｃｏｗｉｎ，  Ｓ．  Ｅｄ  （１９８９年）  「Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ」  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  、及びＤｕｃｋ，  Ｆ．Ａ．  （１９９０年）  「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ：  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋ」，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）。皮質骨は、しばしば直下にある骨梁よりもずっと薄いが、骨全体の機械的特性へ顕著に貢献し、大腿骨頸部の略６０％の曲げ強度と、椎体で約１０％の圧縮強度を占める(Wernerら、1988年)。従い、約２０ＭＰａの目標圧縮強度は、耐荷重性ＢＲＭにとって適切である。
【００１９】
ＢＲＭと骨の対応する圧縮弾性率もまた、高い応力の蓄積と遮蔽を防ぐために重要である。皮質骨は、１２乃至１８ＧＰａの弾性率を有する一方で、網状骨は、０．１乃至０．５ＧＰａの弾力係数を有する（Ｒｅｚｗａｎａ，  Ｋ．；  Ｃｈｅｎａ，  Ｑ．  Ｚ．；  Ｂｌａｋｅｒａ，  Ｊ．  Ｊ．；  Ｂｏｃｃａｃｃｉｎｉ，  Ａ．  Ｒ．，（２００６年），  「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｏｒｏｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒ／ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，    Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２７  ３４１３−３４３１）。ＢＲＭの移植のほとんどは、皮質骨よりむしろ網状骨に接触するので、０．１乃至０．５ＧＰａの圧縮弾性率は、ＢＲＭにとって適切な目標値である。
【００２０】
前述のＲｅｚｗａｎａ，  Ｋ  （２００６年の）  によって開示されたように、固体のヒドリキシアパタイト、バイオガラス、又は硝子‐セラミックの混合物は、骨よりもかなり硬く、他方多孔性ヒドロキシアパタイトはかなり柔らかい。
【００２１】
当然のことながら、ミネラル成分の密度は、無機質化複合材料の圧縮強度及び圧縮弾性率の決定因子として理解されている。従って、骨梁の圧縮強度及び圧縮弾性率は、ミネラル成分密度の約２乗で増加する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９４，  １１７４−１１７６に発表されたＣａｒｔｅｒ，  Ｄ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ，  Ｗ．Ｃ．，  （１９７６年）の論文、「Ｂｏｎｅ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ：  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｒａｔｅ」）。これは、セラミック及び無機物を含んだBRM複合材料にも同じ事が言えるだろう。従って、力学的観点から、ＢＲＭ複合材料は大量に無機質化することが大いに望まれる。
【００２２】
ＢＲＭの機械的特性は骨の機械的特性に対応する必要があるという要件に加えて、ＢＲＭは、骨伝導性を有する必要がある。骨伝導性は、一般的にＢＲＭの移植後ただちに形成されるフィブリン血餅を経由して、骨形成細胞が材料の表面へと移動するプロセスとして定義される。この血餅を経由した骨形成細胞の移動は、一時的なフィブリン・マトリックスの収縮の原因となる。従って、フィブリン・マトリックスが材料へ十分に固定されることは、非常に重要である。なぜなら、もし十分に固定されないと、フィブリン・マトリックスに沿って骨形成細胞が移動を開始した時に、傷の収縮によりフィブリンが複合材料から引き離される可能性があるからである。既に示した様にフィブリン・マトリックスは滑面より粗面に良く結合し、従って複合材料表面への骨形成細胞の移動を容易にする。
【００２３】
従って、骨伝導性にとって重要な要因は、以下の通りであることは一般に認められている。
（ｉ）十分な大きさの孔のある開いた孔構造が骨形成細胞の移動を可能にする十分なサイズであるが、その他の組織や好ましくない種類の細胞の移動を阻止できるサイズの孔を有する開放微細孔構造、
（ｉｉ）血管が内部へ移動することを可能にする十分なサイズの微細孔をある程度準備、
（ｉｉｉ）骨細胞分化に適切な血管新生環境の維持、
（ｖｉ）  骨細胞の付着と機能できる適切な表面の準備、並びに
（ｖ）  フィブリン・マトリックスを結合させる粗面。
【００２４】
このように、微細孔構造は、多孔質ＢＲＭの内部で細胞及び新血管がコロニー形成できるようにするため非常に望ましい。細胞の進入が可能な最小の微細孔サイズは、１００μｍと考えられるが、３００μｍの微細孔サイズは、血管新生と新しい骨形成を強化し、より小さい微細孔は、骨形成前の低酸素性条件と軟骨形成に対して有利に働く（Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｖ．；  Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．  （２００５年），  「Ｐｏｒｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ３Ｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ」，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２６，  （２７），  ４７４５４９１）。しかしながら、より大きな微細孔サイズと孔隙率は、ＢＲＭの圧縮強度、圧縮弾性率、及び圧縮靭性にマイナスの作用を与える。
【００２５】
熱誘起相分離法、冷凍、溶媒キャスト法、粒子洗脱法、超臨界ガス形成法、吸収性モノフィラメントの混入、微粒子焼結法、及び固体自由形状コーティング法を含む、一連の方法が複合材料内部に相互に往来できる微細孔を形成する使用されてきた。多くのこれまで提唱されたＢＲＭは、孔が完全不足しているか、若しくは最適骨伝導には不適な大きさの微細孔を有した。
【００２６】
骨誘導性は、一般的未分化の幹細胞又は骨前駆細胞を誘導して骨芽細胞を産生する能力として定義される。骨誘導性の最もシンプルな試験は、例えば、通常骨を形成しない筋肉などの組織部位において骨形成を誘導する能力（異所性骨成長）を試験することである。いくつかの同種移植代用片は、おそらく結合成長因子が理由で骨誘導性を有する。いくつかのリン酸カルシウム無機物は、おそらく組織液からの骨成長因子を吸着、濃縮するので骨伝導性を有する。一般的に様々なＢＲＭは、ｒｈＢＭＰ−２などの成長因子を加えることで骨伝導性を有することができると理解されている。
【００２７】
一般的にＢＲＭ全体が内因性組織と置換出来る様に、BRMは十分な吸収能力を有することが非常に望ましいと理解されている。又、一般的に耐荷重性ＢＲＭにおいては、ＢＲＭが負担する荷重を肩代わりする時間を与えるため、50％吸収時間はおそらく約9ヶ月とかなり遅いことが必要である。乳酸、グリコール酸、ジオキサノン、炭酸トリメチレン及びカプロラクトンのモノマー、若しくはこれらモノマーの組み合わせた合成ポリマーの吸収速度は、あまりに速く、刺激物質となり得る酸性分解産物を生成する。
【００２８】
前述のＲｏｓｅ及びＯｒｅｆｆｏ（２００２年）で述べられているように、現在、理想的なＢＲＭに求められるための主な基準を満たす既存の製品は、市場に存在しない。無機質と樹脂を含む耐荷重性BRM、バイオガラス又は金属は、吸収されず、永久に移植部位に留まる。この状況は、高い応力集中へ導く係数の不一致と骨吸収へ導く応力発散という結果をもたらし得ると一般的に認められている。このことは、移植片の緩みの原因となり、結果として内因性組織と完全に一体化する移植の失敗に寄与する。非吸収性移植材料はまた、感染及び刺激物の病巣として作用するであろう。最終的な非吸収性骨移植片のメカニカルな故障は外科手術で置き換えることが必要となり、それに伴う痛み、感染のリスク、及びさらなる費用が要求される。
【００２９】
リン酸カルシウムを含有する材料は、Ｔａｓ，  Ａ．  Ｃが「Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ：  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ」，  Ｅｕｒｏ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ  Ｖｉｉｉ，  Ｐｔｓ  １−３，  ２００４；  Ｖｏｌ．  ２６４−２６８，  ｐｐ  １９６９−１９７２で述べている許容できる同種移植基準に達するには、依然として程遠い。
【００３０】
非耐荷重性ＢＲＭは、治癒期間全体、場合によっては６カ月間超にわたって、移植片と骨折面の結合を成功させるために補助的な支持メカニズムを必要とする。非耐荷重性ＢＲＭ材料は、耐荷重性が要求されない比較的数少ない症例でのみ使用される。
【００３１】
ＷＯ  ２００５／０９４９１１Ａ２は、アクリル又は架橋たんぱく質マトリックスに一つ以上の絹の構成要素を含む複合体材料について開示する。この絹の構成要素は、一群の絹から作られ、その構成要素は国産カイコの絹、野生型カイコの絹、蜘蛛糸の絹及び遺伝子組換え蚕タンパク質又はタンパク質類似体を紡いだフィラメントから成る。この複合体材料は、外科的手段による移植用としてとりわけ有用である。開示されたフィブロイン・マトリックスは、文献（  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｓｈａｏ，  Ｚ．  Ｚ．，  及びＶｏｌｌｒａｔｈ，  Ｆ．  （２００１年）  「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｓｉｌｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ＦＴＩＲ」  Ｐｏｌｙｍｅｒ，  ４２，  ９９６９−９９７４）に開示される、再生絹フィブロインを調製する「標準プロトコル」として広く認められる手順に従い作られた再生絹フィブロインから調製された。再生フィブロイン溶液の調製に必要な標準プロトコルは、熱した（典型的には１００℃）アルカリ性溶液中での精練、及び熱した９モル乃至９．５モルの臭化リチウム溶液中で２４時間以上の溶解作業を含む。再生絹フィブロインを調製用の標準プロトコルは、結果として迅速な且つ100％耐加重性を与える十分な強度、靭性及び剛性を与えないことが判明している。
【００３２】
ＷＯ  ２００７／０２０４４９  Ａ２は、患者の骨にしっかりと固定させる一体化した方法の有無を問わず、生体適合性及び生体吸収性の絹又はその他の三次元繊維層と前述の繊維層の間隙を部分的に又は実質上満たす、生体適合性及び生体吸収性で且つ実質的に多孔性の絹を主成分とした又はその他のヒドロゲルを有する軟骨組織修復装置について開示する。本明細書は、材料の疎水性を高めるため、脂肪族｛しぼうぞく｝及び二官能性イソシアネート、イソシアン酸ドデシル又はジイソシアン酸ヘキサメチレンを含むアシル化剤の使用について開示する。
【００３３】
ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１７７５は、最適化した再生フィブロイン溶液から調製された材料であることを特徴とする移植可能な材料並びにその調製方法を開示する。本移植可能材料は、ヒトの軟骨の置換、部分置換、修復又は補強に使用する事ができる。本移植可能材料は、１０％の歪み一軸圧縮接線係数が０．３乃至０．５ＭＰａ並びに、最大２０ＭＰａまでの極限一軸圧縮強度（降伏点に至る応力）を有し、十分に弾力性があり、２０乃至１０００μｍの微細孔サイズの開放孔隙率を有し、徐々に吸収性を示す。
【００３４】
絹フィブロイン糸の束を含むタンパク質を架橋するため、乾いたピリジン中の芳香族イソシアネート溶液の使用は、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ，  Ｈ．；  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍ．；  Ｏｌｃｏｔｔ，  Ｈ．  Ｓ．  １９４５年，  「Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ６７，  ３１４によって、最初に開示された。この開示は、Ｆａｒｎｗｏｒｔｈ，  Ａ．  （１９５５年）の研究結果，  ‘Ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｗｏｏｌ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  ｉｓｏＣｙａｎａｔｅ’Ｂｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ５９，  ５２９を基礎とし、前述の研究結果では、乾いたピリジン中のフェニルイソシアネートの使用によってウールを広範囲にわたって架橋することを開示した。
【００３５】
さらに最近になって、様々なイソシアン酸塩による天然の絹フィブロイン糸束の架橋結合効果について、Ａｒａｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｆｒｅｄｄｉ，  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  ＧＳ及びＴｓｕｋａｄａ，  Ｍ  （２００１年），  「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｓｉｌｋ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ７９，  １７５６−  １７６３が調査した。この繊維は、最初にジメチルスルホキシド又はジメチルホルムアミド中で膨潤し、その後同じ溶媒中で、イソシアン酸塩で処理された。異なるイソシアン酸塩は、異なる線維マス（塊）の増加を引き起こし、且つ引張強度｛こうちょうりょく｝は繊維マス（塊）の増加に比例してわずかに低下した。ジメチルスルホキシド中のフェニルイソシアネートによる線維束処理時間の違いは、現実に引張強度と｛こうちょうりょく｝破壊点までの伸びについて、顕著な且つ漸進的な低下を引き起こした。従って、当業者にとって、絹繊維の引っ張り強度と｛こうちょうりょく｝剛性を実際に低下させた試薬は、再生絹フィブロインから調製された多孔性材料の圧縮強度と剛性を増加させるのに有用であると期待することは出来ない。
【００３６】
ＵＳ  ６，９０２，９３２は、移植を必要とする患者へ移植するため靱帯及び腱、とりわけ前十字靱帯、を生体外で形成するのに使用するワイヤーロープ様表面形状を有する絹繊維ベースのマトリックスについて開示する。ＵＳ  ６，９０２，９３２は更に、生体外で靭帯及び腱を形成するため、マトリックス上で増殖及び分化する多能性細胞を播種した絹繊維ベースのマトリックスについて開示する。又、靭帯及び腱を形成するため、マトリックス上で増殖及び分化する多能性細胞を播種した絹繊維ベースのマトリックスを含む生物工学に基づく靱帯も開示する。最後に、絹繊維ベースのマトリックスを含む生体外で靱帯及び腱を形成する方法もまた開示する。本材料は、細胞の骨格として使用するために設計されており、骨修復に使用する場合は耐荷重性を目的としてない。
【００３７】
ＵＳ  ２００６／００９５１３７は、セラミックの含有可能な絹フィブロイン不織繊維の使用について開示する。この材料は、誘導骨組織再生に使用できる。本材料は、骨組織再生の誘導のみを意図し、耐荷重性ＢＲＭ用として使用するためではない。本材料は、移植時に耐荷重性を有する可能性は非常に低く、耐荷重性能力を示す証拠はない。
【００３８】
ＵＳ  ２００７／０１８７８６２は、吸湿性ポリマーの逆透析法により濃縮したフィブロイン溶液の使用と塩粒子使用並びに／若しくは、溶液を通過する発泡するガスによる発泡体の形成について開示する。
【００３９】
ＵＳ  ２００７／０１８７８６２，ＷＯ２００５／０１２６０６，ＥＰ１６１３７９６  及びＣＡ２５６２４１５は、骨形態形成タンパク質を含む適切なシグナル因子を含有できる多孔性フィブロイン骨格について開示する。前述の多孔性フィブロイン骨格には、骨間質細胞を播種できる。本発明の一態様において、三次元多孔性絹骨格は、それ自体を生体内に移植でき、且つ、骨代用組織として機能する。しかしながら、本材料は、移植時に耐荷重性を示すと見なすことはできず、耐荷重性を示す証拠はない。
【００４０】
したがって、本発明の目的は、改善された機械的特性を有する、移植可能な骨の修復、補強、又は置換用材料、並びに本材料を調製する方法を提供することである。
【００４１】
本発明のさらなる目的は、骨の全体または部分的な置換、補強または修復用移植物を提供することである。
【発明の概要】
【００４２】
本発明の第１の態様によれば、フィブロイン溶液から骨の修復、補強、又は置換用の移植可能材料を調製する方法が提供され、本方法は、
‐フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、
‐ゲルを１つ以上の凍結及び解凍ステップを受けさせる事で材料を調製するステップと
を含み、
リン酸イオンの存在下で本フィブロイン溶液からゲルを調製するステップを特徴とする。
本フィブロイン溶液は、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップの前にフィブロイン溶液にリン酸イオンを分散させる。フィブロイン溶液からゲルを調製するステップには、アルカリ性溶液でフィブロイン溶液を処理することを含める。フィブロイン溶液へのリン酸イオンの分散は、中性のｐＨで水性緩衝液中のリン酸イオンの分散が好ましい。
【００４３】
最も好ましくは、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、リン酸イオンを含有するゲル化試薬を含む。とりわけ、フィブロイン溶液を、アルカリ性ｐＨに調節したリン酸二水素ナトリウムの水性緩衝溶液を使用してゲル化した場合に良好な結果が得られている。
【００４４】
フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、例えば、溶液をマイクロ波や、音波、可聴下音又は超音波、レーザー照射、機械的剪断、又は急激な伸長流、又は酸性溶液もしくは蒸気にさらす事を含んでもよい。
【００４５】
フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、例えば、略２時間で任意の最適な温度、例えば、略０℃乃至略３０℃の範囲内で実施することができ、且つフィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、ヴィスキングバッグ（Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｂａｇ）を０．９Ｍのリン酸二水素ナトリウムの溶液が取り囲むバッグ中の２０ｍｌフィブロイン溶液に対して実施される。
【００４６】
ゲル化時間は、要求されたゲル化の浸透度を基にして決定することができる。
【００４７】
この方法は、フィブロイン溶液からゲルを調製するステップの前に、骨固定装置の一端をフィブロイン溶液に挿入することを含んでもよい。骨固定装置は、複数の編んだ又はねじった繊維又は束ねた繊維若しくはケーブルを含んでもよい。
【００４８】
ゲルの凍結は、任意の最適な温度、例えば、略−１℃乃至略−１２０℃の範囲内で実施することができる。好ましくは、凍結は、略−１０℃乃至略−３０℃の温度の範囲内で実施する。例えば、凍結を略−１３℃で実施された場合に良好な結果が得られている。
【００４９】
微細孔の直径を拡げるため、複数回の凍結及び解凍サイクルを実施してよい。−１３℃で、最大５回の凍結と解凍サイクルにより、適切な微細孔のサイズが観察されている。
【００５０】
本材料は、材料をイソシアネートで処理する前にフィブロイン-アパタイト複合体を形成するため、カルシウムイオンで処理することができる。フィブロイン-アパタイト複合体の形成は、フィブロイン‐塩化アパタイト、フィブロイン‐ヒドロキシアパタイト、又はフィブロイン‐塩化アパタイト、フィブロイン‐ヒドロキシアパタイトの混合物を形成するため、塩化カルシウムと硝酸カルシウムのどちらか若しくはこれら混合物で材料を処理する工程を含むことができる。
【００５１】
好ましくは、カルシウムイオンを塩化カルシウムの水溶液で提供しても良い。その他適切な水溶液として、例えば、硝酸カルシウムを含むことができる。その他の水溶液には、例えば、硝酸カルシウムを含むことができる。
【００５２】
好ましくは、材料は塩基性ｐＨの条件下のカルシウムイオンで処理する。最も好ましくは、材料は略pH ７．０乃至略pH １０．０の間のカルシウムイオンで処理する。材料を略pH ９．０でカルシウムイオンを用いて処理した時に良好な結果が得られてきた。
【００５３】
過剰な塩化カルシウム、若しくはその他適切なカルシウムイオン含有塩は、材料から除去できる。本材料はまた、フィブロインを絹の第ＩＩ状態へと変化させるため処理できる。例えば、本材料は過剰な塩化カルシウムを除去し且つフィブロインを絹の第ＩＩ状態へと変化させる、エタノールで洗浄しても良い。
【００５４】
本材料は、洗浄ステップの後に乾燥させることができる。乾燥は、熱による乾燥、空気乾燥、又はその他任意の適切な方法を選択できる。真空乾燥を用いた良好な結果が観察されている。
【００５５】
材料は、架橋剤で処理することができる。材料を架橋剤で処理することによって、本材料中のフィブロインポリマー間で架橋結合が形成される。フィブロインポリマー間での架橋結合は、共有架橋結合の可能性がある。
【００５６】
材料は、任意の適切な架橋剤で処理することができる。適切な架橋剤は、例えば、イソシアネート、カルボジイミド、又はシアノアクリル酸を含んでもよい。
【００５７】
適切なカルボジイミドは、ＥＤＣ（ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、又はＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミドを含むことができる。適切なシアノアクリル酸塩は、メチル２−シアノアクリル酸塩、エチル−２−シアノアクリル酸塩、ｎ−ブチルシアノアクリル酸塩、及び２−オクチルシアノアクリル酸塩を含んでもよい。シアノアクリル酸塩を使用した場合、固化を阻止するために架橋結合は不活性大気条件下で実施することができる。
【００５８】
本架橋剤は、イソシアン酸塩であることが好ましい。本イソシアン酸塩は、ジイソシアン酸塩であることが好ましい。適切なジイソシアン酸塩は、ヘキサメチレンイソシアン酸塩（ＨＤＩ）、メチレンジフェニルジイソシアン酸塩（ＭＤＩ）、トルエンジイソシアン酸塩（ＴＤＩ）、及びイソホロンジイソシアン酸塩（ＩＰＤＩ）を含んでもよい。例えば、ヘキサメチレンイソシアン酸塩を使用して良好な結果が得られている。
【００５９】
あるいは、イソシアン酸塩は、官能基を追加したモノイソシアン酸塩を含むことができる。適切な追加の管能基は、例えば、グルタルアルデヒド基を含む。
【００６０】
とりわけ、水、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムアミドの様な実質的にフィブロインの非膨張剤中で、架橋剤処理が実施された場合に良好な結果が得られている。架橋剤処理は、フィブロイン膨張剤なしで実施することが好ましい。
【００６１】
本材料を、フィブロイン膨張剤なし若しくは実質的にフィブロイン非膨張剤で、架橋剤処理すると、フィブロインからカルシウム及びリン酸の分離を減少又は阻止される。
【００６２】
本材料を、乾燥窒素を用いて、略８０℃で、希釈していない乾いたヘキサメチレンジイソシアン酸塩で処理された場合、良好な結果が得られている。
【００６３】
本方法は、架橋の密度を調節し、従って、移植可能な材料が必要とする剛性及び吸収性を得るため、本材料の架橋剤への暴露時間を変化させるステップ含むことができる。
【００６４】
本法は、本材料から過剰な架橋剤を除去するさらなるステップを含めて良い。従って本法は、例えば、無水アセトンを用いた１回以上の洗浄ステップを含むことができる。
【００６５】
本法はまた、過剰なＣＮＯ基を加水分解するため、１つ以上のステップを含むことができる。これは、水中で本材料を洗浄することで達成できる。
【００６６】
本法はさらに、任意の乾燥方法によって、好ましくは加熱乾燥によって、本材料を乾燥するステップを含むことができる。
【００６７】
本材料は、例えば、加圧滅菌器の使用｛かあつ めっきんき｝、ガンマ線照射又は二酸化エチレン処理を含む、任意の適切な方法で滅菌できる。
【００６８】
フィブロイン溶液は、再生フィブロイン溶液で良い。
【００６９】
再生フィブロイン溶液は、絹または絹繭を一価カチオン及び一価アニオンの水溶液を含むイオン性試薬で処理する工程を含む方法によって調製することができ、前述のカチオン及びアニオンは、少なくとも１．０５オングストロームのイオン半径であり、且つＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数は２５℃で−０．００１乃至−０．０５である。
【００７０】
当業者にとって容易に理解される様に、Ｊｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ式のＢ係数（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｄｏｌｅ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  １９２９，  ５１，  ２９５０）は、イオンと水との相互作用に関係しており、水溶液中の電解質の構造形成と破壊能力の尺度として解釈される。
【００７１】
好ましくはカチオン及びアニオンのＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数は、２５℃で−０．００１乃至−０．４６である。さらに好ましくは、カチオン及びアニオンのＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数は、２５℃で−０．００１乃至−０．００７である。
【００７２】
本再生フィブロイン溶液を調製する方法は、絹及び絹繭のイオン性試薬による処理前、処理後、若しくは処理と同時に、処理済みの絹又は絹繭を精練する工程を含むことができる。
【００７３】
本法は、絹及び絹繭をイオン性試薬で処理した後に、絹又は絹繭を乾燥させるさらなるステップを含む。乾燥ステップは、イオン性試薬での処理ステップの後に引き続き実施されることが好ましい。最も好ましくは、乾燥ステップを、イオン性試薬での処理及び精練の両方を実施した後に実施する。
【００７４】
乾燥ステップの狙いは、処理済みの絹又は絹繭からできるだけ多くの水を抽出することにある。理想的には、実質的にすべての水が、処理済みの絹又は絹繭から除去する。
【００７５】
絹又は絹繭を乾燥させるプロセスには、例えば、空気乾燥、冷凍乾燥、または加熱して乾燥することで実施できる。好ましくは、絹又は絹繭の乾燥のステップには空気乾燥が含まれる。
【００７６】
絹又は絹繭は、任意の適切な温度で乾燥することができる。例えば、室温（２１℃）で絹又は絹繭を乾燥させることで、良好な結果が観察されている。
【００７７】
絹又は絹繭は、任意の適切な期間で乾燥して良い。典型的には、絹又は絹繭は、数時間、例えば１２乃至１６時間乾燥してもよい。
【００７８】
いくつかの態様において、絹又は絹繭は、湿度２０％未満の条件で空気乾燥できる。好ましくは、絹又は絹繭の乾燥は、無水塩化カルシウム又はその他の適切な乾燥剤を含む、乾燥剤の存在下で実施する。その他の適切な乾燥剤として、シリカゲル、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、及びモンモリロナイト粘土を含んでもよい。分子篩はまた、乾燥剤として使用できる。
【００７９】
本  イオン性試薬に、水酸化物溶液を含んでもよい。水酸化物溶液は、そのままで形成される。例えば、絹及び絹繭は、すでに絹又は絹繭内に存在する水と組合せて水酸化アンモニウムを形成するため、アンモニアガス又はその蒸気で処理して良い。さらに、アンモニアガス又は蒸気による処理前、アンモニアガス又は蒸気と一緒に、若しくはアンモニアガス又は蒸気による処理に引き続いてのいずれかの時点で、絹又は絹繭に水蒸気を添加できる。
【００８０】
適切なイオン試薬は、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硝酸カリウム、水酸化ルビジウム、塩化ルビジウム、臭化ルビジウム、及び硝酸ルビジウムの水溶液を含む。
【００８１】
イオン性試薬は、タンパク質表面電荷密度を増加させることによって絹中のタンパク質の溶解度を増加させるように機能する（塩溶）。
【００８２】
本方法は、カオトロピック剤中で精練された絹又は絹繭を溶解するという次のステップ（ｃ）を含むことができる。
【００８３】
カオトロピック剤中での絹又は絹繭の溶解のステップは、
温度が、６０℃未満；
カオトロピック剤の濃度が、９．５Ｍ以下；
期間が、２４時間未満、
のいずれか１つの条件下、またはこれらを組み合わせた条件下で実施することができる。
【００８４】
精練された絹又は絹繭は、任意の適度な温度、例えば、略１０℃乃至略６０℃の範囲の温度内のカオトロピック剤中で溶解させることができる。例えば、精練された絹又は絹繭は、略１５℃乃至略４０℃の温度範囲内のカオトロピック剤中で溶解される。略３７℃の温度のカオトロピック剤中で、精練された絹又は絹繭を溶解することによって、良好な結果が達成されている。
【００８５】
精練された絹又は絹繭は、任意の適切な濃度、例えば、９．３Ｍの濃度での、カオトロピック剤で溶解することができる。例えば、精練された絹又は絹繭は、９Ｍ未満のカオトロピック剤の濃度で溶解してもよい。精練された絹又は絹繭は、略６Ｍ乃至９Ｍの範囲内（例えば７Ｍ）の濃度での、カオトロピック剤中で溶解してもよい。
【００８６】
精練された絹又は絹繭は、任意の適切な時間、例えば２４時間未満、カオトロピック剤中で溶解してもよい。精練した絹又は絹繭は、１２時間未満、カオトロピック剤中で溶解してもよい。精練された絹又は絹繭は、４乃至５時間、カオトロピック剤中で溶解するのが好ましく、４時間未満が最も好ましい。
【００８７】
カオトロピック剤は、適切なカオトロピック剤又は適切なカオトロピック剤を組み見合わせたものを含むことができる。適切なカオトロピック剤には、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、又はチオシアン酸グアニジンが含まれる。好適なカオトロピック剤は、臭化リチウム水溶液である。
【００８８】
精練された絹又は絹繭は、絹又は絹繭からのセリシンの選択的除去を含むことができ、さらに、セリシンを切断するがフィブロインの切断はほとんど又は全く起こさないタンパク質分解酵素を使用することができる。タンパク質分解酵素は、トリプシンを含むことができる。若しくは、タンパク質分解酵素は、プロリンエンドペプチダーゼを含んでもよい。精練は、水酸化アンモニウムを含有する緩衝液中で酵素溶液を使用してもよい。
【００８９】
精練は、任意の適切な温度、例えば１００℃未満の温度で実施することができる。精練は、略２０℃乃至４０℃の温度範囲で実施されることが好ましい。精練が３７℃の温度で実施される際に、良好な結果が観察されている。
【００９０】
再生フィブロイン溶液を作製するため、透析によって  カオトロピック剤を除去することができる。例えば、透析はハイグレードＩＩ型脱イオン水を使用して実施してもよく、典型的には超純水Ｉ型の超純水を使用して実施される。
【００９１】
透析は、任意の適切な温度、例えば略０℃乃至４０℃の温度範囲内で実施することができる。透析は、略２℃乃至１０℃の温度範囲で実施されることがさらに好ましい。略４℃乃至５℃の温度で、良好な結果が達成されている。
【００９２】
本法は、再生フィブロイン溶液を濃縮するステップを含むことができる。この溶液は、封管した透析管、又はその他の透析容器を真空へ露出することによって、濃縮することができる。再生フィブロイン溶液は、略５乃至２５ｗ／ｖ％の濃度へ濃縮してよい。再生フィブロイン溶液は、略８乃至２２ｗ／ｖ％の濃度へ濃縮されるのが好ましい。再生フィブロイン溶液は、略８乃至１２ｗ／ｖ％の濃度で濃縮されるのがより好ましい。例証として、再生フィブロイン溶液は、略１０ｗ／ｖ％の濃度へ濃縮された場合に、とりわけ良好な結果が達成されている。
【００９３】
透析管は又はその他の容器は、ゲルが凍結する前に除去される。
【００９４】
本発明の第２の態様に従って、フィブロイン溶液から、骨の修復、補強、又は置換のため移植可能な材料の調製の方法が提供される。この方法は、
−フィブロイン溶液からゲルを調製するステップと、
−ゲルを１つ以上の凍結と解凍ステップにさらすことによって材料を調製するステップと
を含み、
この方法は、引き続いて材料をイソシアネートで処理するステップをさらに含む。
【００９５】
ゲルは、リン酸イオンで処理することができる。
【００９６】
フィブロイン溶液からゲルを調製するステップは、リン酸イオンの存在下で実施されることが最も好ましい。
【００９７】
当然のことながら、本発明の第１の態様に関連して記述される好ましい特徴は、本発明の第２の態様に適用できる。
【００９８】
第３の態様に従って、再生フィブロイン溶液から、骨の修復、補強、又は置換のため移植可能な材料の調製方法が提供される。ここで再生フィブロイン溶液は、絹又は絹繭を、
１．０５オングストローム以上のイオン半径を有し、２５℃で、−０．００１乃至＋０．５のＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数を有する一価カチオン及び一価アニオンの水溶液を含むイオン性試薬で処理するステップを含む方法によって調製される。
【００９９】
当然のことながら、本発明の第１及び第２の態様に関連して記述される好ましい特徴は、本発明の第３の態様に適用できる。
【０１００】
本発明の第４の態様に従って、本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られる移植可能な材料を提供する。
【０１０１】
本発明の第５の態様に従って、骨の修復、補強、又は置換材料として使用するため移植可能なフィブロイン材料を提供することができる。ここで材料は、
−Ｊ−積分法で測定した６％の歪で略１ｋＪｍ−３乃至略２０ｋＪ−３間の圧縮靭性と、
−５％の歪で略０．１ＭＰａ乃至略２０ＭＰａ間の圧縮強度と、
−５％の歪で略１００ＭＰａ乃至略５００ＭＰａ平均圧縮弾性率
の特性を有する。
【０１０２】
本材料は、６％の歪で、略１ｋＪｍ−３乃至略５ｋＪ−３の圧縮靭性を含むことができる。本材料は、健康な骨の圧縮靭性に近い、略１．３ｋＪ−３の圧縮靭性を有することが好ましい。
【０１０３】
本材料の極限圧縮靭性は、目標とする移植部位に依存するであろう。例えば、この材料は、骨粗鬆症の網状骨の隣に配置することを目的とする場合、高い応力蓄積及び応力遮蔽を回避するため、材料は、略０．１ＭＰａ乃至略２ＭＰａの圧縮強度（降伏点に対する応力）に設定できる。本材料が健康な網状骨の隣に配置するよう意図される場合、その材料は、略５ＭＰａの極限圧縮強度（降伏点に対する応力）に設定できる。あるいは、本材料が皮質骨の隣に位置することを目標とした場合、本材料は、１０ＭＰａの極限圧縮強度（降伏点に対する応力）に設定してもよい。
【０１０４】
本材料は、略５ＭＰａ乃至略１４ＭＰａの極限圧縮強度（降伏点に対する応力）に設定できる。本材料は、１２ＭＰａ以上の極限圧縮強度（降伏点に対する応力）を有することが好ましい。材料は、略１４ＭＰａの極限圧縮強度（降伏点に対する応力）を有することが最も好ましい。
【０１０５】
本材料は、５％の歪で略１００ＭＰａ乃至略４００ＭＰａの圧縮弾性率を有するであろう。本材料は、５％の歪みで略１７５ＭＰａの圧縮弾性係数を有することが最も好ましい。
【０１０６】
本材料は、フィブロイン−アパタイト複合体を含む。アパタイトは、フィブロイン−アパタイトナノ複合材料として、本材料全体に普く分布していることが好ましい。これは、リン酸イオンの存在下でフィブロイン溶液からゲルを調製することによって達成することができる。フィブロイン−アパタイトナノ複合材料は、フィブロインヒドロキシアパタイト及びフィブロイン塩化アパタイトのうちいずれか又は両者の組み合わせを含むであろう。
【０１０７】
さらに、若しくはあるいは、本アパタイトは、フィブロイン材料表面の塗膜として存在することができ、その塗膜はフィブロイン溶液からゲルを調製し、その後続けてゲルをリン酸イオンにさらすことで、得られる。
【０１０８】
アパタイトは、本材料全体に普く分散されたナノ複合材料として並びに本材料表面のコーティングとして、存在するのが最も好ましい。
【０１０９】
本材料はさらに、通過可能な微細孔を有する。この微細孔は、本材料断面の略１０％から略８０％を覆っている。好ましい実施例において、この微細孔は、本材料断面の略７５％を覆う。
【０１１０】
この微細孔は、直径で略１０μｍ乃至１０００μｍの範囲であって良い。平均的な微細孔の直径は、略２５μｍ乃至略４００μｍの範囲であって良い。微細孔の平均直径は、略１００μｍ乃至略４００μｍの間であるのが好ましい。
【０１１１】
好ましくは、アパタイトの少なくとも一部は、微細孔の壁中に存在する。
【０１１２】
本材料は、略１５ｗ／ｖ％乃至略７０ｗ／ｖ％のリン酸カルシウム成分を含むことができる。本材料は、略３０ｗ／ｖ％のリン酸カルシウム成分を含むことが好ましい。
【０１１３】
本材料は、共有結合によるフィブロイン−フィブロイン架橋結合を有する。本材料の意図された用途に対応して、例えば、本材料における架橋結合量を増やすことで本材料の剛性を増加させ且つ吸収性を低下させることによって、架橋結合の量を調整できる。
【０１１４】
本材料は、生体適合性であり、少なくとも部分的に生体吸収性であって良い。本材料は、略６カ月乃至略１２カ月の吸収半減期を有するであろう。本材料は、略９カ月の吸収半減期を有することが好ましい。本材料は、略１２カ月乃至略２４カ月で完全に吸収されるであろう。本材料は、略１２か月で完全に吸収されることが好ましい。
【０１１５】
本材料は、生体内へ移植された際に、免疫反応の誘発がごくわずか又は全くないことが好ましい。本材料の発熱物質成分は、ごくわずかであることが好ましい。
【０１１６】
本材料は、骨形成能力を有し、生体内へ移植後に新たな骨の形成を示すことが好ましい。本材料は、生体内移植から６カ月以内に新しい骨形成を示すであろう。本材料は、生体内移植から８週間以内に新しい骨の形成を示すことが好ましい。
【０１１７】
本材料は、材料表面へ骨形成細胞の移動を促進するため、フィブリン・マトリックスが結合するために付着性粗面を有する。
【０１１８】
本材料には、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、骨形成細胞株の細胞、血液細胞、若しくは対象患者から採取した細胞を含む、組織培養細胞を播種できる。
【０１１９】
本発明の第６の態様に従って、１つ以上の骨の実質的に全体又は一部を修復、補強、又は置換するため、若しくは、本明細書に記載の移植可能な材料を含む整形外科用途の骨移植代用品として、移植片が提供される。
【０１２０】
この移植片は、本材料に埋め込まれた骨固定具を備える。この骨固定具には、本材料に埋め込まれた複数の糸束又はフィラメントが含まれる。
【０１２１】
本発明の第７の態様に従って、１つ以上の骨の実質的に全体又は一部を修復、補強、又は置換するため、又は骨移植代用品として、若しくは整形外科用途の固定具として、本明細書に記載される移植可能材料の使用について提供される。
【０１２２】
本発明の他の目的、特徴、利点は、添付の図面と連動することで以下の詳細な開示から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
本発明はここで、例証のみ及び以下の添付図面に準拠して更に説明を加える。  添付図面は；
【図１】本発明に基づく多孔性の移植可能な骨修復材料断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、
【図２】図１に示す本材料のリン酸カルシウム成分を示すエネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＥＤＸ）、
【図３】図１に示す多孔性の移植可能な骨修復材料の微細孔の骨格の壁の高倍率SＥＭ画像,
【図４】本発明に基づく多孔性の移植可能な骨修復材料断面の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ）、
【図５】図４に示す多孔性の移植可能な骨修復材料の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ）のカルシウムマップ、
【図６】図４に示す多孔性の移植可能な骨修復材料の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ）のリン酸マップ、
【図７】図４に示す多孔性の移植可能な骨修復材料のリン酸カルシウム成分を示すエネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＥＤＸ）、
【図８】本発明に基づく多孔性の移植可能な骨修復材料の曲げられている及び伸びている形態を示すフーリエ変換赤外線スペクトル、
【図９】本発明に基づく多孔性の移植可能な骨修復材料の粉末Ｘ線回折パターン、
【図１０】多孔性焼結セラミック−リン酸カルシウム骨修復材料の対照サンプルであるＥｎｄｏｂｏｎ（登録商標）（Ａ）と、それぞれ３０  ％ｗｔのミネラルを含有する本発明に基づく多孔性の移植可能な骨修復材料の３つのサンプル（Ｂ乃至Ｄ）の圧縮歪みと圧縮応力の関係示すプロット、
【図１１】大腸菌リポ多糖対照サンプルと本発明に基づく多孔性の移植可能骨修復材料の対照サンプルに対するヒト血液（（ｐｇ  ｍＬ−１）中のＩＬ−１６の反応を示す棒グラフ、
【図１２】骨髄間質細胞を播種した、本発明による多孔性移植可能な骨修復材料を免疫不全マウスへ移植後８週間目のヘマトキシリン及びエオシンで染色したグリコールメタクリル酸樹脂切片である。
【図１３】類骨表面及び疎性結合組織(CT)上の柵状骨芽細胞（矢印）を示す,図１２の本発明による多孔性移植可能な骨修復材料の切片の高倍率画像,
【図１４】破骨細胞の再形成（矢印）と新しく形成された骨を示す、本発明による多孔性移植可能な骨修復材料の切片の高倍率画像、
【図１５】破骨細胞の浸潤と多核性破骨細胞（矢印）により新しく合成された骨の再形成を示す、図１４の多孔性移植可能な骨修復材料の切片の高倍率画像。
【０１２４】
本発明による、骨の修復、補強、又は置換用移植可能な材料はフィブロインを含む。本材料は、通常の身体活動によって骨に外力を受けた時に、過度の歪みなく、機械的完全性を維持できるように、移植部位の骨に略略匹敵する圧縮強度及び圧縮靭性を有する耐荷重性能力を有する。
【０１２５】
フィブロインは、Ｍｕｌｂｅｒｒｙ絹、天然の絹、遺伝子組み換え絹、またはこれらの絹の組み合わせから調製される。
【０１２６】
耐荷重性
本材料の圧縮強度、圧縮靭性、及び圧縮弾性率の数値は、健常者の骨の数値に近く、迅速な耐荷重性が得られる。この耐荷重性はまた、高い局所応力濃度または応力遮へいによる結果として好ましからざる隣接する骨の融食作用を阻止する。
【０１２７】
圧縮強度は、軸方向の押す力に耐える材料の能力である。定義により、材料の圧縮強度は、材料が完全に破壊される際に到達した一軸圧縮応力の値である。応力−歪み曲線は、（ＭＰａで測定される）サンプルに与えた負荷を測定して得た応力と、サンプルの圧縮量を測定して得た歪みの相互関係をグラフで表示したものである。図１０に見られるように、本材料のサンプルが濡れた状態で試験された場合、この材料は１４ＭＰａ（ｎ＝５）以下の極限一軸圧縮強度（降伏点に対する応力）を有する。
【０１２８】
圧縮靭性は、軸方向の押す力にさらされた際に骨折に耐える材料の能力である。定義により、材料の圧縮靭性は、破壊点に達するまでの機械的（又は動力学）エネルギーを吸収する能力である。靭性は、１立方メートルあたりのジュール単位（ｍ−３）で測定され、応力−歪み曲線下の領域として測定できる。故に、図１０から計算できるように、本材料のサンプルを濡れた状態で試験する場合、本材料は、最大１１．９３±８．４０ｋＪｍ−３，ｎ＝６（Ｊ−積分法を用いて得られた）の平均一軸圧縮靭性を有する。
【０１２９】
圧縮弾力係数は、材料に負荷を与えた際に材料が弾力的（すなわち、非永久的）に変形する傾向の数学的記述である。Ｙｏｕｎｇ率（Ｅ）は、引張弾性率若しくは逆方向の力が軸に沿ってかかった際に、材料が又は張力｛ちょう軸に沿って変形する傾向を表現する。それは、引張歪みに対する引張応力の比率（ＭＰａで測定）として定義され、そうでなければ本材料の剛性を示す尺度として知られる。対象物の弾性率は、弾性変形域の応力−歪み曲線の勾配として定義できる。圧縮弾性率は、図１０から算出することができ、図１０では、本材料のサンプルが濡れた状態で試験される際、本材料は１７５ＭＰａ（ｎ＝５）の一軸圧縮弾性率を有することを示す。フィブロインの共有架橋結合は、本材料の剛性の制御を可能にする。ジイソシアン酸塩架橋剤を用いて、フィブロインの共有架橋結合密度は、材料の剛性を変えるため、本材料のジイソシアン酸塩架橋剤浸漬時間を変えることで調整できる。
【０１３０】
図１０に見られるように、移植可能な骨修復材料（サンプルＢ、Ｃ、及びＤ）の圧縮強度、圧縮靭性及び圧縮弾性率（弾性変形フェーズで測定）は、試験されたＢＩＯＭＥＴ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  Ｓｗｉｔｚｗｅｌａｎｄ  ＧｍｂＨによって製造されたＥｎｄｏｂｏｎ（登録商標）（サンプルＡ）として知られる多孔性焼結セラミック−リン酸カルシウム骨修復材料に比べ著しく高い。サンプルＢ、Ｃ、及びＤ間の変動は、主として採取したサンプルを滑らかで正確に平行な面に仕上げることの困難さによるものと考えられる。
【０１３１】
ミネラル化
ミネラルの密度は、ミネラル化複合材料の圧縮強度及び圧縮弾性率の決定因子である。従って、ミネラル化は、本材料の耐荷重性に影響を及ぼす。
【０１３２】
図１乃至３に関して、本発明による材料のサンプルは、リン酸カルシウムの微結晶の高含有多孔性ミネラル化構造を示す。図３は、微細孔壁が微結晶を有し、実質的に壁の面を覆い、これら壁の２つの亀裂面まで延びており、このことは、微結晶が微細孔壁に堅固に付着していることを示唆する。
【０１３３】
図５及び６は、本発明による材料の追加サンプルのカルシウム及びリン酸のマップを示す。図７のエネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＥＤＸ）は、本材料の同じサンプルのリン酸カルシウム成分を示す。図５乃至７に示す材料は、主としてフィブロイン及びアパタイト（リン酸カルシウムセラミック）を含むと見られる。フィブロイン−アパタイト複合材料は、ある程度自然骨の様な真のアパタイト−タンパク質ナノ複合材料であり、部分的にアパタイトは確かにフィブロインにしっかり接着したコーティングとして存在しているが、単なるアパタイトでコーティングしたフィブロインというわけではない。
【０１３４】
（骨形成性）
骨形成は、骨芽細胞を使用して新しい骨材料を植え込む過程である。骨形成は、主にＩ型コラーゲンで構成される類骨マトリックスを形成する類骨を産生することで骨を構築する。骨組織は、カルシウムヒドロキシアパタイトと呼ばれる化学配列を形成する類骨マトリックス及びミネラル（ほとんどはリン酸カルシウム）を含む。骨芽細胞は、一般的に骨組織を形成する類骨マトリックスのミネラル化に関与する。ミネラルの骨伝導性及び骨誘導性は、骨形成に影響を及ぼす。
【０１３５】
（骨伝導性）
骨伝導性は、一般的に本材料の移植後直ちに定着するフィブリン血餅を経由して骨格表面へ骨形成細胞の移動を促進する材料の能力として定義される。材料の多孔性は、その材料の骨伝導性に影響する。
【０１３６】
図１における走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（スケールバー＝２００μｍ）では、本材料のサンプルの断面が採取された場合、本発明による材料が多孔性ミネラル化構造を含むことを示す。この材料は、相互に接続した微細孔を含む。さらに、図３（スケールバー＝１０μｍ）は、本材料の同じサンプルの微細孔壁を示す。
【０１３７】
（骨誘導性）
骨誘導性は、骨細胞前駆細胞（骨芽細胞）の分化を促進する本材料の能力として定義され、骨細胞前駆細胞は、骨組織の構成要素である。ミネラル化及び成長因子の添加は、材料の骨誘導性に影響する。
【０１３８】
本発明による材料は、骨形成性が高く、移植から８週間以内に生体内で骨の配置と再形成の証拠がある（図12〜図15）。この点において、図１２乃至１５は、免疫不全マウスへ骨髄間質細胞で播種した材料を移植後８週目の段階でヘマトキシリン及びエオシンで染色したグリコールメタクリル樹脂切片を示す。
【０１３９】
図１２（スケールバー＝１００μｍ）は、本材料表面(SB)上の骨芽細胞によって分泌された新しい類骨マトリックス（矢印）の形成を示す。図１３は、（スケールバー＝２０μｍ）は、図１２に見られる類骨マトリックスの拡大部分を示し、ここには、柵状の骨芽細胞（矢印）が類骨表面及び疎性結合組織(CT)上に観察できる。
【０１４０】
図１４（スケールバー＝１００μｍ）は、本材料で破骨細胞の再形成（矢印）を示し、移植片内に新しく形成された骨が見られる。図１５（スケールバー＝２０μｍ）は、図１４の切片の拡大部分を示し、ここでは、破骨細胞の浸潤と多核性破骨細胞（矢印）によって新しく合成された骨の再形成が観察できる。本材料はまた、追加して吸収性バイオポリマー、薬物、成長因子、ろ過粒子、及びミネラルを含むことができる。
【０１４１】
吸収性
吸収性は、材料が分解される能力である。ＢＲＭの目的は、ＢＲＭが内在性骨組織に置き換えられる様に、本材料が徐々に分解することである。
【０１４２】
本発明による材料は、緩やかな吸収性を実証し、導入された架橋度に依存するが、１２週間乃至９カ月以内に一軸圧縮弾性率が半減したことを示す。本材料は、移植から８週間以内に生体内でフィブロインの吸収の証拠を示す（図１４及び１５）。
【０１４３】
フィブロインの共有架橋結合は、本材料の吸収性の制御を可能にする。とりわけ、フィブロインの共有架橋結合は、親水性を低下させ且つ酵素の攻撃に対しより抵抗力のあるフィブロインに変え、吸収時間を長くする。ジイソシアン酸塩架橋剤を用いて、材料の疎水性及び吸収性を変えるため、フィブロインの共有架橋結合密度を制御することが可能である。
【０１４４】
カルシウムを材料に導入するため塩化カルシウム剤を使用した場合、本材料は、アパタイトの一部は塩素で置換され、一部が塩化アパタイト、一部がヒドロキシアパタイトである材料を形成する。  塩素による置換は、置換されていないヒドロキシアパタイトと比較してアパタイトの吸収を速めると考えられている。
【０１４５】
（材料の使用）
置換する骨の形状又はその一部に似せるため、材料を鋭利な外科用のメスで削り、鋳込み成形し、および／もしくはロッド又はプリズム又は任意の三次元形状に機械加工できる。材料は、圧迫充填移植用若しくは骨折又砕けた骨の間に挿入するため、平均寸法が１ｍｍ乃至５０ｍｍの細片へと容易に加工することが可能である。本材料は、容易に穿孔され、吸収性又は非吸収性のネジ、ピン、又はプレートで所定位置に固定することが可能である。さらに、材料は、縫われ、編まれ又はねじれ繊維又は糸束、又は本材料に埋め込まれたケーブルの錨で、その場に固定できる。
【０１４６】
材料はまた、そこに存在している骨に固定するスクリューまたはピンなどの固定用具に整形するため、鋳込み成形、切削若しくはその他の方法で加工できた。
【０１４７】
移植可能な骨修復材料製造法の概略
移植可能な材料は、以下に記載する最適化された方法によって調製される。
【０１４８】
絹又は絹繭は、アンモニア、又はアンモニアイオンを含有する水溶液で処理される。
【０１４９】
絹又は絹繭は、セリシンを選択的に除去することによって精錬される。これは、セリシンを開裂させるが、フィブロインをほとんど、または全く開裂させない適切な酵素を用い、セリシンを酵素によって切断し、除去することによって行われる。
【０１５０】
絹又は絹繭は、水を抽出することによって乾燥する。
【０１５１】
絹または絹繭を、６０℃未満の複数の温度で、及び／または９．５Ｍ未満の臭化リチウムの濃度で、及び／または２４時間未満の時間で、臭化リチウム水溶液中で溶解する。
【０１５２】
カオトロピック剤は、超純水を用い、略４℃乃至５℃の低い温度で透析によって除去する。得られた溶液を濃縮し、最適化された再生フィブロイン溶液を得る。
【０１５３】
フィブロイン溶液は、濃縮することができる。
【０１５４】
溶液は、ゲル化するために鋳型に移すか、もしくは、この溶液を、透析容器に残しておく。リン酸イオンを含む濃縮した緩衝液で処理することによって、リン酸イオンをフィブロイン溶液に導入する間にこの溶液はゲル化する。好ましい実施例において、リン酸緩衝液は、アルカリ性ｐＨに調節された、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−ｌ，３−ジオール（トリス）緩衝液で緩衝した、リン酸二水素ナトリウムを含む。
【０１５５】
このゲルは、凍結前に鋳型又は透析容器から除去される。
【０１５６】
このゲルは、１回以上の凍結サイクルを受ける。各凍結サイクルは、凍結ステップ及び解凍ステップを含む。ゲルを凍結することによって、水滴は氷晶になり、ゲル内にポケット又はポアを形成する。従って、ゲルを１回以上の凍結サイクルにさらすことで、往来可能な微細孔を導入する。
【０１５７】
フィブロインゲルは、フィブロイン−アパタイト複合材料を形成するため、カルシウムイオンを含有する濃縮緩衝液で処理される。このアパタイトは、微細孔の壁内および壁表面にナノ複合材料として存在する。カルシウム緩衝液は、これもＴｒｉｓでアルカリ性ｐＨに緩衝した塩化カルシウムを含む。
【０１５８】
材料は、過剰な塩を除去し、フィブロインの絹第ＩＩ状態（βシート）形状の形成を促進するため、エタノールの水溶液中で洗浄する。
【０１５９】
例えば、真空乾燥によって、材料から可能な限り遊離水を除去する。
【０１６０】
本材料中のフィブロインは、希釈していないイソシアン酸塩またはジメチルスルホキシドもしくはその他の有機溶媒中の高度に濃縮されたイソシアン酸塩溶液を用いて随意に架橋結合している。過剰なイソシアン酸塩は、材料を乾いた溶媒で処理することで除去する。
【０１６１】
結果として得られる材料は、骨の修復、補強又は置換のための移植可能な材料として使用される。
【０１６２】
（アンモニア、又はアンモニアイオンによる処理）
絹のアンモニアガス、アンモニアの希釈溶液又はアンモニア塩での処理は、絹を臭化リチウム溶液又はその他のカオトロピック剤への溶解性を大きく向上させることがわかった。このステップにおいては、アンモニウムイオンが「塩溶」剤として作用し、これは、タンパク質鎖を取り囲む内部の水シェルの除去を補助し、フィブロインの帯電したアミノ酸側鎖へ結合させることで、引き続くタンパク質のカオトロピック剤への溶解度を増加させると信じられている。
【０１６３】
この処理は、直接未精練の繭、未加工の絹繊維及び従来の工業的精練法によるのかそれとも酵素による精練かに係らず精練又は部分的に精練された絹の３段階の１つ又は全てに適用される場合、効果的であったことがわかった。アンモニア又はアンモニウムイオンもまた、酵素精練に使用される緩衝剤の構成成分として含まれる場合効果的であった。故に、アンモニア又はアンモニウムイオンを使用したこれら任意の絹の処理方法は、絹の溶解に必要な、温度、時間、又はカオトロピック剤の濃度を減らすために使用でき、結果としてフィブロインへの損傷を減らし且つ加工コストを抑えた。
【０１６４】
Ｂ．ｍｏｒｉ絹をアンモニア又はアンモニウムイオンで処理することで、６０℃、９．３Ｍの臭化リチウム溶液中への絹の溶解時間を、数時間から１５分まで削減できた。若しくは、アンモニア又はアンモニウムイオン処理は、６０度、９．３Ｍの臭化リチウムの代わりに７Ｍで使用できた。アンモニア又はアンモニウムイオン処理はまた、絹を２４時間以内に２０℃で９．３Ｍの臭化リチウム溶液中で完全に溶解できた。アンモニア又はアンモニウムイオン処理はさらに、絹を３７℃で９．３Ｍの臭化リチウムで４〜５時間以内に完全に溶解できた。
【０１６５】
従って、アンモニア又はアンモニウムイオンでの処理でより穏和なさまざまな処理を可能にすることがわかった。そこでは温度、カオトロピック剤の濃度、又は溶解に必要な時間を単独又は組み合せて変えられる。これらの処理は、フィブロイン溶液がゲル化する時間をより速くし且つゲル化プロセスの終了時にはより強くて剛性の高い材料ができる結果をもたらした。
【０１６６】
同じサイズのイオン対（例えば、塩化カリウム）もまた同じ効果を有し、アンモニアに代わって使用できるだろう。これは、（１）カリウム及び塩素イオンのＪｏｈｎｓ−Ｄｏｌｅ粘度（カオトロピック効果の尺度）は、イオン電荷密度が、イオン対を形成し、タンパク質の内部水シェルの除去を促進する点で類似する（塩化アンモニウムと共有する特性）、並びに（２）塩化カリウムは、一般に５０ｍＭ乃至６００ｍＭの範囲の塩濃度で、タンパク質の「塩溶」に使用されている、
という２つの証拠によって支持される。
【０１６７】
さらに、一価のカチオン及び一価のアニオンの水溶液を含むその他の特定のイオン試薬は、同じ効果を提供するだろう。とりわけ、一価のカチオン及び一価のアニオンの水溶液を含み、少なくとも１．０５オングストロームのイオン半径を有し、２５℃で、０．００１〜−０．０５のＪｏｎｅｓ−Ｄｏｌｅ  Ｂ係数を有する、イオン試薬はアンモニウムイオンに関連して記述された効果と同じ効果を提供すると考えられている。
【０１６８】
適切なイオン試薬は、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、硝酸アンモニウム、水酸化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硝酸カリウム、水酸化ルビジウム、塩化ルビジウム、臭化ルビジウム、及び硝酸ルビジウムの水溶液を含むことができる。
【０１６９】
（精練）
精練方法の選択は、フィブロインのゲル化時間、及び最終的な材料の剛性及び強度にとって決定的に重要であることがわかった。商業的な巻き取りプロセス及び精錬プロセスは、両方とも、１００℃付近の温度を用い、炭酸ナトリウム及び／またはマルセイユ石鹸を用いるが、巻き取られた未処理の絹及び精錬された絹は、多分この処理の結果としてう繭の絹よりも溶解しにくいことがわかった。
【０１７０】
市販のアルカラーゼ（細菌のスブチリシン）を用いて精錬すると、精錬温度を６０℃まで下げることができた。アルカラーゼは、セリンＳ８エンドプロテアーゼファミリーのメンバーであり、Ｐ１位置の大きな非荷電残基を優先する巾広い選択性を有するため、フィブロインをひどく分解してしまう可能性がある。Ｂ．ｍｏｒｉ及びＡｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉの重鎖フィブロインは、この酵素に関し、多くの予想される開裂部位を有する。アルカラーゼにＢ．ｍｏｒｉのフィブロインが開裂される感受性は、アルカラーゼで精錬した絹から調製した再生フィブロイン溶液のポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動によって確認した。
【０１７１】
トリプシンを用いて精錬する場合、精錬温度を２０〜４０℃まで下げることができ、従来の高温での精錬手順と比較して、ゲル化時間が短く、剛性及び強度が改善されたゲルが得られた。アルカラーゼとは対照的に、ＰｅｐｔｉｄｅＣｌｅａｖｅｒというツールは、Ｂ．ｍｏｒｉのフィブロイン重鎖フィブロインの繰り返し結晶領域のコンセンサス配列中及び親水性スペーサーのコンセンサス配列中に、予想されるトリプシン開裂部位はほとんどなく、Ａ．ｐｅｒｎｙｉの重鎖フィブロインのコンセンサス配列または親水性スペーサー中には、予想されるトリプシン開裂部位がなかったことを示した。このことから、再生フィブロイン溶液を調製するためには、絹をトリプシンで精錬することが有益であると示唆された。トリプシンは、実際に、改善された再生フィブロイン溶液を作成するために絹を精錬するのに非常に有利であることがわかった。
【０１７２】
トリプシンで精錬された絹は、より短いゲル化時間で再生絹溶液を与え、アルカラーゼで精錬した絹から調製した再生絹から得られるものよりも、剛性のあるゲルを作成することができた。トリプシンで精錬すると、ゲル化剤の１つである氷酢酸の蒸気にさらした場合に、ゲル化時間が５分未満となり、さらに、最大な剛性及び強度の材料が得られ、このことは、上述の条件下でトリプシンは、アルカラーゼで処理した場合よりも鎖の開裂が大巾に少ないことを示唆している。
【０１７３】
当然のことながら、フィブロインをほとんど開裂させないか、または全く開裂させない他のタンパク質分解酵素もまた、改善された再生フィブロイン溶液を調製するために絹を精錬する場合、有利であり得る。Ｂ．ｍｏｒｉの重鎖フィブロインはプロリンをほとんど含有せず、一方でこのアミノ酸はセリシンを比較的豊富に含んでいる、という観察結果は、プロリンエンドペプチダーゼは、フィブロインをほとんど開裂させないか、または全く開裂させずに、セリシンを選択的に除去するのに理想的な候補物質であることを示唆している。
【０１７４】
（乾燥）
絹または絹繭を、湿度２０％未満で、無水塩化カリウム存在下、室温で一晩空気乾燥する。
【０１７５】
乾燥中に実質的にすべての水を除去すると、溶液中のイオン濃度が高くなり、これが、イオンの効果を高め、得られる材料を向上させると考えられた。
【０１７６】
凍結乾燥や、熱を加えることによる乾燥のような、他の既知の乾燥方法によっても、同じ効果を達成することができるであろう。加熱乾燥を用いる場合、１００℃未満の温度で、改善されたフィブロイン材料が得られると考えられる。
【０１７７】
（透析）
絹溶液からカオトロピック剤を除去するため、Ｉ型のｍｉｌｌｉＱ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、２９０  Ｃｏｎｃｏｒｄ  Ｒｏａｄ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ０１８２１，ＵＳから入手可能）、もしくは超純水として知られている、を使用して再生フィブロイン溶液を透析することはきわめて有益であることがわかった。
【０１７８】
ＰＩＰＥＳ緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤、または脱イオン水中の不純物は、透析剤として使用する場合、最終生成物の剛性及び強度に悪い影響を与えることは注目に値した。ＰＩＰＥＳ緩衝剤又はＴｒｉｓ緩衝剤若しくは透析剤中の不純物の混入は、おそらくフィブロイン鎖に結合することでフィブロイン鎖の凝集を促す能力の結果として、再生絹溶液の粘度を増加させることは注目に値した。このことは、強度及び剛性を有するフィブロインゲルの形成に不利に働くと考えられた。
【０１７９】
４０℃の炭酸アンモニウム緩衝剤中のトリプシンで精錬された繭または絹原料を用いることは、さらに有利に働くであると考えられる。
【０１８０】
（ゲルの調製）
最適化された再生フィブロイン溶液は、リン酸二水素ナトリウムを含有する、緩衝水溶液に浸漬することによってゲル化した。リン酸二水素ナトリウムの濃度は、1%Ｔｒｉｓ緩衝剤中で０．９Ｍであり、ｐＨ９．０に調節された。リン酸二水素ナトリウムの濃度、及び、本材料のリン酸二水素ナトリウム浸漬時間は、微細孔のサイズ、並びに結果として得られるゲルの強度及び剛性に決定的なファクターであった。リン酸イオンの存在下で溶液をゲル化することによって、リン酸イオンは溶液中で一様に分散され、またそれ故に、ゲルに取り込まれることができるようになることがわかった。これは、後の段階でカルシウムイオンを添加する際に、フィブロインアパタイトのナノ複合材料の形成を促進する。ゲルが続いてリン酸イオンで処理されると、後の段階でカルシウムイオンを添加した時にアパタイトコーティングが達成されたことがわかった。
【０１８１】
さらに、不十分なゲル化フィブロインの凍結は、微細孔のサイズ縮小及びより脆弱な材料を形成し、他方、過剰なゲル化は、低密度の大きな氷晶によって生成される大きな裂け目を有する微細孔のないゲルを得ることがわかった。最適なゲル化に必要な、緩衝材又は蒸気の暴露時間と濃度は、フィブロイン鋳形物の形状及び大きさによって異なることがわかった。従って、直径１０ｍｍの透析チューブと比較して、直径２０ｍｍの透析チューブから作られた鋳型の中では、より長い処理時間が、フィブロインを最適にゲル化するために必要であった。
【０１８２】
直径２０ｍｍの透析バッグを使用し、トリプシンで精錬した絹から調製した１０ｗ／ｖ％の最適化した再生フィブロイン溶液を、４℃で２時間、ゲル化することが有利であることがわかった。
【０１８３】
好ましい実施例は、１つのステップでリン酸イオンの導入とフィブロイン溶液のゲル化とを組み合わせるが、ほんの一例として熱、マイクロ波放射、超音波処理、レーザー照射、酸性溶液、及び酸性の蒸気を含めて、その他のゲル化剤又は方法を、リン酸イオンの導入前にフィブロイン溶液をゲル化するために使用することができる。
【０１８４】
（凍結）
多孔性の移植可能な材料を調製するためには、ゲルは、凍結によって多孔性にすること差し支えない。凍結によって、フィブロインを豊富に含む相が、フィブロインをあまり含まない相から相分離し、フィブロインをあまり含まない相では氷晶が形成されると考えられている。これらの２つのメカニズムがあわさることで、ゲル中に高密度の相互につながった微細孔を生じると考えられる。
【０１８５】
透析管又は型の除去は、多孔性の密度及び大量の相互につながった微細孔をもたらすことがわかった。
【０１８６】
また、凍結工程によって、微細孔壁のフィブロイン及びその他の水系溶媒で不溶性となり、このことは、フィブロインが不溶性の第ＩＩ状態の絹に部分的に変換され、この状態では、分子内及び分子間で結合したβシートが優勢となることを示唆している。この第ＩＩ状態の絹への転移は、相分離とタンパク質鎖の配列と集合（両方とも、氷の結晶生成の結果とにより生じる）によって生じるタンパク質鎖からの水の除去が原因であろう。したがって、不溶性の第ＩＩ状態の絹の形成は、蚕から絹が押出される自然界のプロセスを忠実に模倣しており、自然界のプロセスも相分離、フィブロインを豊富に含む相からの水の消失、歪みに依存する配向、及び第ＩＩ状態の絹の形成に依存する。
【０１８７】
凍結サイクルが１回の場合、凍結ステップの温度は、微細孔の大きさに及ぼす影響は小さく、−１２℃乃至−１６℃で凍結することによって、最も大きな微細孔が得られた。この温度を変えること、さらに再生タンパク質溶液に低濃度の不凍液または糖類を含有させることによって、氷晶の大きさ及び形態を変えることができ、さらにそれにより、本材料中の微細孔の大きさ及び形状を変えることができる。
【０１８８】
凍結サイクルの数を増やすと、氷晶による損傷の結果、微細孔の大きさが増大した。これにより、最終的に材料の剛性及び強度がいくらか失われることとなった。
【０１８９】
当然のことながら、ゲル化や凍結以外の方法でも、最適化した再生フィブロイン溶液中で相互につながった微細孔を導入するために使用できる。ほんの一例として、これらには、塩洗脱法及びガス形成法を含む。
【０１９０】
（カルシウムイオンの導入）
カルシウムイオンは、リン酸イオンを有するアパタイトを形成する。リン酸イオンがゲル化の前にフィブロイン溶液中に一様に分散されると、その後でフィブロイン−アパタイトナノ複合材料ができる。しかしながら、フィブロイン溶液が、最初にゲル化され、次にリン酸イオンで処理されると、アパタイトコーティングは観察されるが、ナノ複合材料ではない。
【０１９１】
塩化カルシウムの使用により、アパタイトの一部を塩化物に置換える。これは、置換されていないヒドロキシアパタイトに比べてアパタイトの吸収を速めると考えられているので、望ましいことである。さらなる実施例では、塩化カルシウム溶液の代わりに硝酸カルシウム溶液を用いる。硝酸カルシウム溶液は、アパタイトにおいて塩化物イオンの存在を回避し、部分的に塩化物に置換されたヒドロキシアパタイト（すなわち、一部は塩化アパタイト、一部はヒドロキシアパタイト）ではなく、結果的に純粋なヒドロキシアパタイトの形成をもたらす。
【０１９２】
材料は、塩基性ｐＨのカルシウムイオンで処理され、酸性又は非結晶性アパタイトの形成を回避する。本材料が略９．０のｐＨで、カルシウムイオンで処理された場合に、良好な結果が得られている。
【０１９３】
その他の成分を、ゲルをフィブロイン−アパタイト材料に変換する前に、フィブロイン溶液中のフィブロインに導入することは可能である。これらには、ほんの一例として、短繊維、充填用粒子、骨促進因子及び薬物、抗新生薬、抗生物質、その他の生体ポリマー、並びにその他の薬物の活性成分を含む。
【０１９４】
移植可能な骨修復材料においては、３０％乾燥重量のミネラルの濃度が好ましい。これは、０．９Ｍのリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液、及び１．５Ｍの塩化カルシウム緩衝溶液を使用することによって得られる。移植可能な骨修復材料中の７０％以下のより高いミネラル含有率は、リン酸イオン及びカルシウムイオン溶液中のリン酸イオン及びカルシウムイオン濃度を化学量論的に高めることによって得られる。しかしながら、４０％を超えるミネラル含有率の移植可能な骨修復材料は、３０％のミネラル含有率の材料より脆弱であることがわかった。
【０１９５】
（エタノール溶液での処理）
凍結の後に材料をエタノール水溶液で処理することは、第ＩＩ状態の絹（βシート）の分子間及び分子内の水素結合の形成を促進すると考えられる。これにより、ゲルの機械的安定性が改善され、不溶性が増し、且つ酵素攻撃に対する抵抗力を増す。
【０１９６】
（さらなる乾燥）
材料は、例えばエタノールで２日間にわたって乾燥させ、さらに４０℃で真空乾燥させることで、実質的に全ての（全部ではないにしても）遊離水が除去される。
【０１９７】
凍結乾燥や、熱を加えることによる乾燥のような、他の既知の乾燥方法によっても、同じ効果を達成することができるであろう。加熱乾燥を用いる場合、１００℃未満の温度で、改善された材料が得られると考えられる。
【０１９８】
（架橋結合）
フィブロインアパタイトは、架橋結合されている。
【０１９９】
好適な実施例においては、フィブロイン−アパタイトは、水又は他の膨潤剤がない状態で、ヘキサメチレンジイソシアン酸の様な希釈していないイソシアン酸塩と架橋結合している。このステップは、移植可能な骨修復材料の剛性を増加させ、移植可能な骨修復材料の酵素攻撃に対する抵抗力を増し、これにより吸収を遅くする。
【０２００】
膨潤剤が使用されると、フィブロインを膨潤させる原因となり、フィブロインをアパタイトから分離する結果をもたらすことがわかった。必然的に、これは材料の剛性を低下させる原因となり、さらにこれが、材料が屈曲する傾向を結果としてもたらし、アパタイトが本材料から剥がれる原因となる。
【０２０１】
イソシアン酸塩架橋剤に対しフィブロイン−アパタイトの露出時間を変化させることは、共有架橋結合の密度を調節し、ひいては移植可能な骨修復材料の剛性の調節に使用できることもわかった。
【０２０２】
共有架橋結合の密度が変わることで、フィブロインゲルの酵素攻撃に対する抵抗力も変わり、それによって制御された方法で吸収時間を延ばすのに使用できることもわかった。Ａｒａｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｆｒｅｄｄｉ，  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  ＧＳ及びＴｓｕｋａｄａ，  Ｍ  （２００１年）による前述の同文献により公開されたプロトコルを用いて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で２０％のヘキサメチレンジイソシアネートの水溶液で、本材料中のフィブロインを架橋結合させる試みで満足のいく様な移植可能な骨修復材料を作り出せなかった。前記の公開されたプロトコルでは、ＤＭＳＯ中のフィブロイン−アパタイトの膨潤が、結果的にフィブロインからミネラルを分離させたと考えられる。
【０２０３】
従って、本方法は、水又はジメチルスルホキシドといったその他の膨潤剤がない条件で、イソシアネート架橋結合剤を用いている。イソシアン酸塩による架橋結合は、過剰な架橋剤が徹底的な洗浄で除去されることを前提に、本材料の生体適合性を妨げることはないと思われる。これは、生体外の多孔性フィブロイン−アパタイト複合材料の内外で成長する間質細胞によって、並びにマウスの皮下に移植後生体内で成長する間質細胞によって立証された（以下のプロトコルを参照）。
【０２０４】
当然のことながら、その他の架橋結合も使用することができる。
【０２０５】
移植可能な骨修復材料を移植する方法の概略
好適な実施例においては、本材料は、組織培養細胞が播種されない状態で、骨内に直接移植される。
【０２０６】
あるいは、本材料は、組織培養細胞を移植直前に、または血液細胞、もしくは移植の直前に対象患者から採取した細胞を播種させることができる。
【０２０７】
ほんの一例として、そのような組織培養細胞には、骨髄間質細胞、又は間葉系幹細胞、又は骨形成細胞株が含まれる。
【０２０８】
さらに別の選択肢としては、本材料へしっかりとした固着点は、細胞を播種し、その後組織培養に周期的細胞伸縮刺激を適用し、または適用しないで、移植前の本材料に骨の形成を促進することが可能である。
【０２０９】
材料の大きさ及び形状は、骨修復において様々な用途で変えることが可能である。従って、身体構造に沿った形状モノリスは、適切な形状の型で本材料を鋳込成形、若しくは本材料のより大きな塊を研磨、切断又は機械加工することによって、作成することが可能である。若しくは、円柱状ロッド又は矩形のプリズム状のロッドは、鋳込成形、機械加工若しくはこれらの過程を組み合わせることによって作成することが可能である。
【０２１０】
本材料はまた、移植片を、上手く填め込めるように所望のスペース又はキャビティーに近づける為外科用メス又はその他の道具を用いて手術室で加工することも可能である。小さな断片に要求される圧縮充填移植のような用途については、細片が要求される、本材料を切断及び粉砕することで所望のサイズにする。
【０２１１】
いくつかの応用例については、本材料は、典型的な直径１乃至１０ｍｍの小片へと切断、破壊、又は粉砕することが可能である。材料の多孔性小粒子は、多孔性の構造を損なうことなく粗目のペースト又はパテに調整することが可能である。生理食塩水、又は１つ以上の吸収性生体適合ポリマーを含む溶液は、材料の小片をペースト又はパテ内に結合させるため使用することが可能である。ほんの一例として、適切な吸収性生体適合ポリマーには、フィブロイン、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸塩、若しくは、乳酸、グリコール酸、ジオキサノン、炭酸トリメチレン、及びカプロラクトン単量体をベースとした合成ポリマーを含む。材料粒子を含有するペースト又はパテはまた、ほんの一例として、リン脂質、リゾレシチン、又はレシチンを含む、天然界面活性剤も含んで良い。
【０２１２】
本材料は、圧縮充填移植、ペースト又はパテで導入されたかに係らず、材料の多孔性小片又は多孔性粒子の移植を伴う用途に非常に適していることを理解すべきである。これは、粒子の極端な靭性が、移植中に生じる中程度の応力が本材料の開口型多孔性構造の崩壊を防ぎ、中胚葉幹細胞又は他の骨形成細胞の移植材料内部への進入のためのルートを維持しているからである。
【０２１３】
さらなる実施態様においては、濃縮再生フィブロイン溶液を、再生フィブロインの全部又は一部がゲル化されフィブロイン−アパタイト複合材料に変換される前に、吸収可能な生体適合性繊維から成る繊維層の中へ又は繊維間へと浸潤させる。このことは、本材料へさらなる強度及び靭性を与える手段を提供する。本実施態様の繊維は、ほんの一例として絹、コラーゲン、又は、乳酸、グリコール酸、ジオキサノン、炭酸トリメチレン、及びカプロラクトンの単量体をベースとした合成ポリマーを含むことが可能である。絹繊維を使用した場合、まず短時間（臭化リチウムなどの）カオトロピック剤に浸漬し、さらに再生フィブロインを添加する前にカオトロピック剤を洗浄して取り除くことによって、絹繊維の表面を膨潤させることは、有利である。この方式は、繊維と再生フィブロインとの間に優れた界面を提供し、それによって両者の相互作用を向上し、ゲル化すると材料を強化する。
【０２１４】
人工の靱帯、腱および半月板の固定具は、ねじった、編んだまたはブレード状の糸、ケーブルまたは繊維、若しくは複数の糸、繊維又はケーブルを形づくることによって、並びに、これらの端部を濃縮したフィブロイン溶液に挿入することによって、形成可能である。次にフィブロイン溶液はゲル化され、さらに上記で開示しているように、フィブロイン−アパタイト複合材料へと変換される。これは、１本以上の糸、ケーブル、又は繊維が、フィブロイン−アパタイト複合材料の塊にしっかりと固定されていることを保証する。頑丈な固定具は、フィブロイン−アパタイト複合材料の小片を円錐台に成形し、円錐台の狭くなった端部を前記糸、繊維又はケーブル取り付けることによって、作成することが可能である。固定具を挿入するためには、円錐台に取り付けたケーブル又は繊維を、まず骨若しくは骨と軟骨をドリルで穿孔した穴へ通す。穴径が切断された円錐台広い方の端面より幾分小さいことを条件に、円錐台を穿孔した穴に詰め込むことでしっかりとした固定点ができる。ほんの一例としてメサ又はくさびを含む、他の形状も、このようにしてしっかりとした固定具を作るために用いることが可能である。主たる繊維又は主たるケーブルから伸びた複数の補助繊維は、固定具のフィブロイン−アパタイト複合材料部分に主たる繊維とケーブルを固定するため、より広い表面積を提供する。
【０２１５】
ほんの一例として、上記の固定具のために用いた複数の繊維は、子供服の飾りとして用いられるようなポンポンを作るために使用するテクニックを修正して作ることが可能である。典型的な直径５ｍｍ乃至１０ｍｍの小さなワッシャー型ディスクは、薄くて堅いシート材料から切り出せる。生体適合性で吸収性糸又はフィラメントを多数回ディスクの中心穴を通すことで、この糸とフィラメントはディスク上を放射状に並ぶ。糸又はフィラメントが、十分な回数放射状に並べられた時点で、ディスクの縁に沿って円周切断してディスクを取り外すことで、中心にある糸から放射状に拡がり、放射状に配向した繊維の配列を提供する。この方法で作成された１乃至複数のポンポンは、フィブロインで浸潤し、フィブロインがフィブロインアパタイト複合材料へと変換される前に、鋳型に置くことが出来る。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２１６】
（実施例１）
最適化された繰生糸又は絹繭再生フィブロイン溶液を調製するための手順
１．新鮮なＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの絹繭または繰生糸を、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で、室温（２１℃）で１時間処理した。
２．次いで、この絹繭または繰生糸を、同じ溶液ですすぎ、さらに超純水で十分に洗浄した。
３．次いで、この絹繭または繰生糸をアンモニウム塩またはアンモニアを含有する緩衝剤中で、ｐＨ８．５乃至９．３および３０乃至４０℃のトリプシン溶液を用いて精錬した。
４．この絹繭または繰生糸を超純水で十分に洗浄した。
５．搾って水を出し、この絹繭または繰生糸を、アンモニウムイオンを含む０．１乃至０．００１Ｍの塩化アンモニウム水溶液または水酸化アンモニウム水溶液を用いて、２０℃、１時間処理した。
６．この絹繭または繰生糸を、湿度２０％未満の条件で、無水塩化カルシウム存在下、室温（２１℃）で一晩乾燥させた。
７．この絹繭または繰生糸を、９．３Ｍの臭化リチウム水溶液中で、絹１ｇに対し臭化リチウム溶液５ｍｌの比率で、常に撹拌しながら３７℃、４乃至５時間かけて溶解した。
８．得られたフィブロイン溶液をＶｉｓｋｉｎｇ管（カットオフ分子量：１２乃至１５ｋＤａ）に移し、覆いをしたビーカー中で常に撹拌しながら、５℃で、超純水を用いて最短で５時間、最長で３日間、透析した。均等な間隔で、大量の過剰な超純水を５回取り替えた。
９．透析の後、再生絹溶液中のフィブロイン濃度は、重量法及び／または屈折率測定法によって８乃至１０ｗ／ｖ％と決定された。開封していない透析管を真空中に放置することによって、フィブロインの濃度が高くなり、８乃至３０ｗ／ｖ％の濃度を得た。
【０２１７】
（実施例２）
最適化された再生フィブロイン溶液から移植可能な骨修復材料を調製するためのプロトコル
１．    １０ｗ／ｖ％のＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ水溶液で最適化した再生フィブロイン溶液は、実施例１で記載に従い調整した。
２．  本溶液から２０ｍｌの一定分量を、Ｖｉｓｋｉｎｇバッグ中（カットオフ分子量：１２乃至１４ｋＤａ）で、透析液として最終濃度０．９Ｍノリン酸二水素ナトリウム、及び、１０ｗ／ｖ％の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−ｌ，３−ジオール（Tris）緩衝液を含有する緩衝水溶液を５Ｍの水酸化ナトリウムを９．０ｐＨまで調整して、４℃で２時間透析した。このステップでは、フィブロイン溶液を軽くゲル化し、結果として得られたゲルにリン酸イオンを導入する。
３．  ステップ２のゲルのサンプルを、−１３℃で２４時間、冷凍槽に移し、相互に連結した微細孔を本材料へ導入した。
４．  凍結状態で、本材料のサンプルを鋭利な外科用メスで小片に切断し、そして透析バッグを除去した。
５．  フィブロイン材料を形成するために凍結したゲルのサンプルを、３７℃で、最終濃度１．５Ｍの塩化カルシウム溶液及び１ｗ／ｖ％のＴｒｉｓを含有する緩衝水溶液に移し、５Ｍの水酸化ナトリウムで９．０ｐＨへ調整した。
６．  過剰な塩を除去し、タンパク質をシルク第ＩＩ状態の絹に変換するため、本サンプルを１日かけて５０％のエタノールにゆっくりと移した。
７．  サンプルは、２日にわたって乾燥エタノールへ移した。
８．  サンプルは、４０℃で真空乾燥させ、さらに、乾燥窒素下で２日間、８０℃で、乾燥した純ヘキサメチレンジイソシアネートへ移した。
９．  過剰なヘキサメチレンジイソシアネートを、以下の手順で除去した。
ａ）低温の無水アセトンで４回リンスし、次に、６０℃で、無水アセトンを１晩還流した。
ｂ）水を添加し、残存する全てのＣＮＯ基を加水分解した。
ｃ）本材料を、オートクレーブで処理する前に、オーブンで、最初は４０℃、最終的に６０℃で乾燥させた（匂いを嗅いだ限りアセトンの痕跡は検知されなかった）。
ｄ）フーリエ変換赤外線（ＦＴ−ＩＲ）分光法を用いて、本材料中にＣＮＯピークがないことを確認した。
【０２１８】
（実施例３）
フィブロイン−アパタイト材料試験のプロトコル：ミネラル化
ミネラル充填量は、本材料を空気中で５００℃にまで加熱し、重量測定法で決定された。好適な実施例では、３０ｗ／ｗ％ミネラル含有率の充填率を得たが、上述のプロトコルの修正によって、最大７０ｗ／ｗ％までミネラル含有率の充填量を得た。
【０２１９】
本材料のサンプルは、さらに、エネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分析機器を取り付けた走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ６３３０）で調査した。Ｘ線エネルギースペクトルは、微細孔壁内にカルシウム及びリン酸が同時に局在し（図５及び図６）並びに、リン酸カルシウムによる高レベルのミネラル化の存在を立証した。Ｘ線エネルギースペクトル中の少量の塩化物イオンの存在は、ヒドロキシアパタイトの塩素置換によって説明できる（以下を参照）
【０２２０】
ＦＴ−ＩＲ分光法（ＫＢｒディスク、Perkin−Ｅｌｍｅｒ  Spectrum１）は、本複合材料内に大量のリン酸塩の存在を確認した（図８ではＥ及びＦでピークに達している）。粉末Ｘ線回析法（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８）では、複合材料内に塩素で置換されたヒドロキシアパタイトの存在が立証された（図９）。
【０２２１】
（実施例４）
フィブロイン−アパタイト材料を試験するためのプロトコル：耐荷重性
ミネラル試験（Ｚｗｉｃｋ  １４７８）は、本材料が完全に水和させたサンプルで実施された。サンプルは、円柱形状に切断し、破壊するまで２ｍｍ  ｍｉｎ−１のクロスヘッド速度で圧縮した。
【０２２２】
応力／歪み曲線（図１０）は、本材料が伸長したプラスチック変形段階にあることを有することを示す。
【０２２３】
ジイソシアン酸塩で架橋した本材料の平均一軸圧縮靭性は、１１．９３±８．４０ｋＪｍ−２、ｎ＝６（Ｊ−積分法を用いて得た）。
【０２２４】
本材料の最終一軸圧縮強度（降伏点に対する応力）は、１４ＭＰａ（ｎ＝５）であった。
【０２２５】
本材料の一軸圧縮弾性率は、１７５ＭＰａ（ｎ＝５）であった。
【０２２６】
圧縮強度及び圧縮弾性率について、測定値は、ＢＲＭの目標値にかなり近く、それぞれ、目標値の圧縮強度は２０ＭＰａ、圧縮弾性係数１００−５００ＭＰａであった。
【０２２７】
靭性については、測定値は、ＢＲＭの目標値、１．３ｋＪ  ｍ−３、を超え、それはＢＲＭにとって有利であると理解された。
【０２２８】
（実施例５）
フィブロイン−アパタイト材料を試験するためのプロトコル：発熱性
５ｍの本材料サンプルを、熱消毒した鉗子で、１０００ｍｌの等張生理食塩水溶液（Ｂｅｒｌｉｎ−Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ）、並びに、生理食塩水で希釈した１００μｌのＬＰＳ（グラム陰性桿菌由来リポ多糖類）スパイク（（ＮＩＢＳＣ，  ＵＫ；  ＷＨＯ  参考文献，大腸菌，  ０１１３：Ｈ１０）及び対照サンプルとして１００μｌの生理食塩水のいずれかを、発熱物質のない１．５ｍｌのプロプロピレン反応バイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に挿入した。
【０２２９】
ＬＰＳ（１又は４ＥＵ／ｍｌ）でサンプルをスパイクさせたのは、例えば毒性又は免疫調節サンプルなど血中単球の活性による干渉を除外するために使用された。５０乃至２００％のスパイク回復率は、干渉を除外するうえで許容されるとみなされた。
【０２３０】
発熱性の閾値濃度として０．５ＥＵ／ｍｌの生理食塩水で希釈したエンドトキシンについての標準曲線は、全ての試験に含まれた。
【０２３１】
ボランティアの健常人から採取しプールした血液１００μｌを、白血球百分率数（Ｐｅｎｔｒａ  ６０，  ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）で感染してないか検査してから各反応用バイアルに添加し、最終的に培養量１２００μｌを３７℃、ＣＯ２５％の濃度下に放置した。
【０２３２】
１３，０００ｒｐｍでの、２分間の遠心分離によって無細胞上澄みを得、直ちに分析にかけるか、又は測定が実施されるまで−８０℃で保存した。
【０２３３】
ＩＬ−１の放出は、抗体ペア及び組換え型標準物質（（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定［吸着］法）によって検出された。ＥＬＩＳＡの検出限界は、３．５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βであった。この分析値は、本材料の発熱性は無視できる値であることを実証した（図１１）。
【０２３４】
（実施例６）
フィブロイン−アパタイト材料を試験するためのプロトコル：骨形成性
成人ヒト骨髄サンプルを、骨関節炎のため定期的に人工股関節置換手術を実施している血液学的には正常な患者から採取した。Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ
Ｗｅｓｔ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て、廃棄用の組織のみを使用した。全部で４つのサンプル（男女２名ずつ、平均年齢７０±１３歳）を準備した。
【０２３５】
ＳＴＲＯ−１抗体ハイブリドーマの上澄み（Ｄｒ  Ｊ  Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｔｈ，  ＵＫからの寄贈）を使用して、ＳＴＲＯ−１（ＣＤ３４＋分画から得た多分化能のマーカー、）の選択による増菌培養後に、骨髄細胞の第1代培養株を確立、これは、移植前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養細胞の迅速な拡大を促進する（（Ｓ．  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，  Ｓ．  Ｅ．  Ｇｒａｖｅｓ，  Ｓ．  Ｏｈｔａ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｂｌｏｏｄ  ８４，  ４１６４−４１７３  （１９９４年））。
【０２３６】
５％のＣＯ２を含有する加湿空気中、３７℃の、基礎培地（10%FCS含有MEM培地、１％のペニシリン／ストレプトマイシン）中で、維持された。
【０２３７】
細胞密度が７０％コンフルーエンスの時点で、骨形成媒体（基礎培地に、１０ｎｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン及び１００ｎｍｏｌ／Ｌのアスコルビン酸−２−リン酸を加えたもの）を置換し、さらに２４時間後に、細胞を穏やかにトリプシン処理し、数を数えて、本材料サンプル上に播種するための調製に備えて骨形成媒体に再懸濁させた。
【０２３８】
組織培養用試薬は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手した（Ｐａｉｓｌｅｙ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。試薬は、その他特筆されていなければ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  （Ｐｏｏｌｅ，  ＵＫ）の分析グレードである。
【０２３９】
完全に水和した加圧滅菌処理材料の３ｍｍ立方体を、２４時間、基礎培地に浸し、２４個のウェルの組織培養プレートに移した。
【０２４０】
移植の４８時間前、成人ヒト骨髄間質細胞の１０μｌの細胞懸濁液［１  ｘ  １０４  細胞］は、各立方体上にピペットで移し、１ｍｌの骨形成培地が各ウェルに添加される前に、３０℃で３０分間培養した。
【０２４１】
播種されていない材料サンプルは、対照サンプルとして使用された。
【０２４２】
指定された間隔で、材料を、ホルムアルデヒド緩衝液に固定し、メタクリル酸樹脂に埋め込んだ。１０μｍ切片を、タングステンナイフで切断した。
【０２４３】
セルトラッカーグリーンおよびエチジウム−ホモダイマー１を用いた蛍光染色、並びに、ヘマトキシリン及びエオシンを用いた組織学用染色は、本フィブロイン−アパタイト材料の微細孔内及び表面に、生存細胞、ＨＢＭＳＣ（ヒト骨髄間質細胞）の存在を示唆した。内側に向けた本細胞の増殖は、３日後までに目に見えるようになり、また、７日後に多孔性モノリスの完全にコロニー化が観察した。
【０２４４】
ＨＢＭＳＣは、Ｉ型コラーゲン及びアルカリ性ホスファターゼ免疫細胞化学によって証明されるように、本材料内で骨芽細胞表現型を維持した状態で、培養株において３週間以上にわたって生存した。
【０２４５】
（実施例７）
フィブロイン−アパタイト材料のを試験するためのプロトコル：ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
完全に水和した加圧滅菌した材料の３ｍｍ立方体へ、ヒト骨髄間質細胞を用いて播種した。前述の立方体は、麻酔下で事前の培養処理なしに８匹の免疫不全ＭＦＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに皮下に移植した。
【０２４６】
各マウスにおいては、播種されたサンプルを左側腹部に配置し、未播種の対照サンプルを右側腹部に配置した。マウスは、屠殺前に４週間、８週間、１２週間放置された。
【０２４７】
ヘマトキシリン及びエオシンで染色した、マウスから採取した細胞を播種した材料のメタクリル酸グリコール樹脂切片を観察した（図１２乃至１５）。８週間後、この切片は、多孔性の材料の表面で、骨芽細胞によって分泌された新しく形成された骨の存在を示した。柵状の骨芽細胞は、類骨表面及び結合組織の薄片で観察された。多核性破骨細胞による新しく形成された骨の再形成の証拠が、類骨マトリックスの表面で観察された。播種した及び、未播種の対照サンプルには、細胞又は組織の有害反応の証拠は観察されなかった。
【０２４８】
前記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の観察と合わせて、これらの観察はジイソシアン酸塩で架橋した材料の優れた生体適合性を明らかにした。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の観察は更に、本材料が高度に骨形成を有し、ゆっくりと吸収され、並びに本材料中に新生骨が再形成することを、強く示唆する。
【０２４９】
（所見）
前述の、多孔性、生体適合性、非発熱性で移植可能な材料は、多くの利点がある。なぜならば、本材料は、適切な吸収速度及び優れた組織再生特性を有する予め定義された目標値に近い圧縮強度、圧縮弾性係数及び圧縮靭性の特性を合わせ持つからである。これらの特性は、本材料を全ての迅速な及び迅速でない耐荷重性用途、非耐荷重性用途並びに同種移植及び自家移植骨の代用品の用途に適合させる。
【０２５０】
自然の骨との本移植材料の機械的特性の類似性は、本材料を通常の動作で生じる骨の負荷応力に直ちに耐えることができるようにし、それによりベッド安静時間の延長を回避し、内外部の支持体の使用を最小限に抑える。従って、移植可能な本材料は、骨の全体又は一部を置換するため、若しくは、骨と金属、セラミック又はプラスチックの人工器官との隙間に挿入するため、耐荷重性を有する移植部位に使用可能である。
【０２５１】
移植可能な材料の例外的に高い靭性は、圧縮充填移植にとりわけ適している。なぜならば、圧縮充填の間、微細孔は崩壊から保護されており、細胞及び血管の迅速な進入を可能にしているからである。従って、移植可能な本材料はまた、骨中の空隙を満たすためにも使用可能である。
【０２５２】
移植材料の、高密度で開口した多孔性並びに大きな平均微細孔サイズは、間葉系幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞及び発達中の毛細血管が材料の中へと移動し、本材料を自然骨への変換開始を可能にする。このことは、移植可能な本材料の優れた生体適合性及び細胞への接着性と併せて、本材料の微細孔の中で細胞が付着、成長及び分化するのを可能にし、新しい骨の迅速な形成を可能にする。
【０２５３】
移植可能な本材料のゆっくりとした吸収性は、本材料が、徐々に且つ完全に、機能性内在骨への置換を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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