(57)【要約】本発明は、血管新生誘発性、透過性誘発性、血管拡張性のアゴニストＶＥＧＦアイソフォームに対する抗体、ならびに該抗体の少なくとも抗原結合部分を有する分子を提供する。開示する抗体および抗体断片は、血管新生誘発性形態のＶＥＧＦに結合して中和することができるが、抗血管新生性であるＶＥＧＦアイソフォームには影響しないことを特徴とする。また、かかる抗体および抗体断片の作製方法ならびに治療および診断における使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに結合し得るが、抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォームに結合し得ない、ＶＥＧＦに特異的な抗体または少なくともその抗原結合部分を含む断片。
【請求項２】
エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）、ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：３）、ＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：４）およびＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：５）からなる群より選択される抗原決定基を認識するものである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
抗原決定基がＤＲＡＲＱＥＫ（配列番号：７）を含まない、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
エピトープＳＬＴＲＫＤ（配列番号：２）を含むＶＥＧＦアイソフォームを中和することができない、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦアイソフォームがＶＥＧＦ１６５ｂおよびＶＥＧＦ１２１ｂからなる群より選択される、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−８受託番号０８１０１４０１；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−１０受託番号０８１０１４０２；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−３受託番号０８１０１４０３からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−８受託番号０８１０１４０１；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−１０受託番号０８１０１４０２；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−３受託番号０８１０１４０３からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離されたＣＤＲ領域および単鎖抗体からなる群より選択される請求項１に記載の抗体断片。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体またはその抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
活性成分として、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片；および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
処置を必要としている被検体に、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片を投与することを含み、それにより、ＶＥＧＦの過剰発現と関連している障害または疾患に罹患している被検体が処置される、ＶＥＧＦの過剰発現と関連している障害または疾患に罹患している被検体の処置方法。
【請求項１８】
前記障害または疾患が、細胞増殖性疾患または障害、過剰透過性疾患または障害、および血管新生に関連している疾患または障害からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記障害または疾患が、血管新生、ネフローゼ症候群、急性呼吸窮迫症候群、癌、増殖性眼疾患、網膜障害、関節リウマチ、および乾癬からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の抗体を、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームとともに投与することを含む、処置を必要としている被検体の処置方法。
【請求項２１】
前記ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームがＶＥＧＦ１６５ｂである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームが、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂおよびＶＥＧＦ２０６ｂからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦと関連している障害または疾患の処置のための医薬の調製のための、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の使用。
【請求項２４】
ＶＥＧＦと関連している障害または疾患の処置のための、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の使用。
【請求項２５】
血管新生誘発性形態のＶＥＧＦと抗血管新生性形態のＶＥＧＦの比を測定するための、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の使用。
【請求項２６】
ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片を使用することを含む、試料中の血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームの存在を検出または定量するための方法。
【請求項２７】
ｉ．試料を、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片とともにインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて、結合されたアゴニストＶＥＧＦを検出する工程；
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を、既知量の血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームを含む参照試料で得られた標準曲線と比較する工程；および
ｉｖ．体液試料中の該血管新生誘発性抗体の量を、該標準曲線から計算する工程
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＶＥＧＦに対する抗体であって、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片を使用することを含む、血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームが関連している疾患または障害を診断するための方法。
【請求項２９】
ｉ．生物学的試料を、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片とともにインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて、結合されたアゴニストＶＥＧＦを検出する工程；
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を、既知量の血管新生誘発性ＶＥＧＦを含む参照試料で得られた標準曲線と比較する工程；
ｉｖ．体液試料中の該血管新生誘発性抗体の量を、該標準曲線から計算する工程；および
ｖ．（ｉｖ）の量を、通常量の血管新生誘発性ＶＥＧＦ量と比較する工程
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
処置を必要としている被検体に、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームを投与することを含む、腎障害の処置方法。
【請求項３１】
前記ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームがＶＥＧＦ１６５ｂである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームが、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂおよびＶＥＧＦ２０６ｂからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血管新生を伴う疾患、例えば、腫瘍および網膜障害の処置に有用な治療用および診断用抗体に関する。特に、本発明は、ＶＥＧＦの血管新生誘発性アイソフォームに特異的な抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管新生
血管新生は、血管内皮細胞が増殖し、余分なものを取り除き、再編成して、既存の血管網から新たな血管を形成する重要な細胞性事象である。血管分布の発達は、正常な増殖性プロセスおよび病理学的増殖性プロセスに不可欠であるという説得力のある証拠がある（非特許文献１）。酸素および栄養分の送達、ならびに異化生成物の除去は、多細胞生物体において起こる増殖プロセスの大部分において律速段階である。したがって、血管区画は、胚発生中の器官の発生と分化だけでなく、成体の創傷治癒および生殖機能にも必要である。
【０００３】
また、血管新生は、さまざまな障害、例えば限定されないが、腫瘍、増殖網膜症、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、および乾癬の病因にも関与している。血管新生は、ほとんどの原発腫瘍の増殖およびその後の転移に不可欠である。腫瘍は、単に１〜２ｍｍの大きさまで拡散することによって充分な栄養分と酸素を吸収することができ、この大きさの時点では、さらなる増殖に血管分布の同化が必要となる。このプロセスは、近接宿主成熟脈管構造の漸増によって新たな毛細血管の発生が開始され、腫瘍塊に向かって成長し、続いて浸潤することを伴うと考えられる。また、腫瘍血管新生は、骨髄からの循環内皮前駆細胞の漸増によって新生血管形成が促進されることを伴う（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
血管新生の注目すべき生理学的および病理学的重要性に鑑み、このプロセスの調節能を有する因子の解明のために、多大な研究が注力されている。血管新生プロセスは、血管新生誘発性分子と抗血管新生性分子との均衡によって調節され、種々の疾患、特に癌では逸脱していることが示唆されている（非特許文献４）。
【０００５】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、正常な血管新生と異常な血管新生の両方の枢要な調節因子であると報告されており、その最も一般的な形態は、ＶＥＧＦ−Ａすなわち血管透過性因子（ＶＰＦ）である（非特許文献５）。血管の形成プロセスに寄与している他の増殖因子と比べ、ＶＥＧＦは、血管系内の内皮細胞に対する特異性が高い点で特殊である。ＶＥＧＦは、胚の脈管形成および血管新生に不可欠である（非特許文献６；非特許文献７）。さらに、ＶＥＧＦは、雌の生殖器系における周期的血管増殖ならびに骨の成長および軟骨形成に必要である（非特許文献８；非特許文献９）。ヒトＶＥＧＦは、血管拡張、血管透過性の増大および内皮細胞の有糸分裂誘発を媒介する３２〜４２ｋＤａの二量体糖タンパク質である。
【０００６】
また、相当な証拠によって、病理学的血管新生を伴う病状または疾患の発生におけるＶＥＧＦの非常に重要な役割が示されている。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、調査されたヒト腫瘍のほとんどで過剰発現されている。腫瘍増殖の促進における中心的な役割を考慮すると、ＶＥＧＦによって、治療的介入のための魅力的な標的がもたらされる。実際、ＶＥＧＦまたはその受容体シグナル伝達系のブロックを目的としたさまざまな治療ストラテジーが、現在、新生物性疾患の処置のために開発中である。これまで、モノクローナル抗体によるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体のブロックおよびチロシンキナーゼインヒビターによる受容体シグナル伝達の阻害が、最も充分に研究され、臨床的に認められたアプローチである。ＶＥＧＦＲ−１リボザイム、ＶＥＧＦ毒素コンジュゲート、および可溶性ＶＥＧＦ受容体もまた研究されている。
【０００７】
ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害するためのいくつかの異なるストラテジーが治療的に使用されているか、または開発中であり、そのようなものとしては、ヒト化中和モノクローナル抗体、可溶性受容体、アンタゴニストＶＥＧＦ変異型およびペプチド、ならびにＶＥＧＦ受容体機能のインヒビターが挙げられる。ＶＥＧＦ阻害の概説は、最近、非特許文献１０によって公開された。
【０００８】
ＶＥＧＦ遺伝子の識別的エキソンスプライシングによって、２つのアイソフォームファミリーがもたらされる：第１のファミリーは、刺激性、アゴニストまたは血管新生誘発性と称されており、第２のものは、阻害性、アンタゴニストまたは抗血管新生性のファミリーであることが知られている。これらの２つのファミリーは構造的に非常に類似しているが、機能的には相違する。ｍＲＮＡ種は主に３種類あり、これらには、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１２１で表される５種類のアゴニスト分泌型アイソフォームがコードされている。したがって、血管新生誘発性ＶＥＧＦファミリーは、選択的スプライシングのため、１２１、１４５、１６５、１８９および２０６個のアミノ酸を有する５種類の異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１  ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５は可溶性であり、血管新生を促進し得るものであるが、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は、細胞表面のヘパリン含有プロテオグリカンに結合されている。少数派のスプライスバリアントがいくつか報告されているが、その重要性は未だ不確定である。各アイソフォームは、相違する性質および発現パターンを有する。ＶＥＧＦの種々の分子形態が特許文献１に開示されており、これらは、エキソン１〜５の１１０個のアミノ酸からなる共通のアミノ末端ドメインを共有しているが、カルボキシ末端部分の長さが異なっている（図１参照）。
【０００９】
抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォーム
ＶＥＧＦスプライスバリアント（本明細書においてＶＥＧＦｘｘｘｂとも表示する）のファミリーの一例は、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームのものであり、限定されないが、ＶＥＧＦ１６５ｂ  ＶＥＧＦ１４５ｂ  ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ２０６ｂ（特許文献１に開示）およびＶＥＧＦ１２１ｂが含まれ、ＢａｔｅｓおよびＨａｒｐｅｒによって同定された。このバリアントは、識別的にスプライシングされたものであり、エキソン６と８ａ（以前はエキソン８と称されていた）が欠失しており、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ＳＬＴＲＫＤ、配列番号：２）をコードするこれまで未知であったエキソン８ｂ（以前はエキソン９と称されていた）を含む。ＶＥＧＦ１６５ｂ、および他のアゴニストＶＥＧＦ種（本明細書においてＶＥＧＦｘｘｘｂとも表示する）は、従来からのＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニストであり、ＢａｔｅｓおよびＨａｒｐｅｒによって、抗血管新生活性、抗血管拡張活性、抗透過活性および抗増殖活性を有することが示された（非特許文献１１および非特許文献１２）。ＨａｒｐｅｒおよびＢａｔｅｓの最近の刊行物（非特許文献１３）において、著者らは、ＶＥＧＦ１６５ｂは結腸直腸腫瘍の増殖を阻害すると結論づけている。さらに、ＶＥＧＦ１６５ｂは、腫瘍の増殖に対するベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の効果を低下させる。
【００１０】
非特許文献１４には、ＶＥＧＦ１６５のエキソン７コード化ドメインに対応し、ＶＥＧＦ誘導性内皮細胞増殖を阻害するペプチドが記載されている。
【００１１】
特許文献２は、一般に、天然のＶＥＧＦ応答を誘発することなくＶＥＧＦ受容体に結合して占有することができるＶＥＧＦアンタゴニストに関するものである。このＶＥＧＦバリアントは、ＶＥＧＦ単量体単位が適正に二量体化する能力に影響を及ぼすアミノ酸修飾を有する。具体的に開示されたバリアントは、該バリアントがジスルフィド結合の形成によって二量体化する能力を阻害する少なくとも１つの修飾システイン残基を有する。
【００１２】
特許文献３は、ＶＥＧＦヘテロ二量体を形成することを含む、疾患の処置または予防方法、およびかかるヘテロ二量体を形成し得る新規なＶＥＧＦアイソフォームに関する。
【００１３】
特許文献４には、ループＩ内に、野生型二量体の存在下でＶＥＧＦ受容体の活性化の有意な低減を可能にする配列などの変異を有するＶＥＧＦ由来分子であるＶＥＧＦアンタゴニストが開示されている。
【００１４】
特許文献５には、患者に、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を、化学療法剤を含む抗新生物組成物と一緒に投与することを含む、癌の処置方法が開示されている。
【００１５】
ＵＳ２００６／１６６８７８には、ＶＥＧＦ１６５の第７エキソンの一部分が開示されており、この部分は、あらゆるＶＥＧＦアイソフォームに対するアンタゴニストとして作用すると主張されている。ＵＳ２００６／１６６８７８に開示された抗体は、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームならびにアンタゴニストアイソフォームの両方に結合する。
【００１６】
抗ＶＥＧＦ抗体
抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られており、非特許文献１５に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、治療用途に承認されており、種々の癌の処置について、さらに臨床的に研究されている。
【００１７】
ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性いずれの場合も、あらゆるＶＥＧＦアイソフォームにおいて高度に保存されたエキソン３／エキソン４接合部配列に対するものである。
【００１８】
特許文献６には、抗ＶＥＧＦ抗体ならびにその診断的および治療用途が開示されており、一方、ＷＯ９８／４５３３２には、ヒトＶＥＧＦ抗体ならびにその作製および使用のための方法が開示されている。
【００１９】
特許文献７には、ＶＥＧＦの異なるエピトープに対するモノクローナル抗体を用いてＶＥＧＦを検出するためのＥＬＩＳＡ法が開示されている。記載の方法により、１回のアッセイで、ＶＥＧＦのあらゆるアイソフォームを一緒に検出することが可能になる。
【００２０】
特許文献８には、高い親和性と特異性を有する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化抗体または完全ヒト抗体を設計および選択するための方法が開示されている。特に、高親和性でヒトＶＥＧＦに結合し、インビトロで内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害し、インビボでＶＥＧＦ誘導性血管新生を阻害する能力を有するヒト化またはヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が提供されている。このような抗体およびその誘導体は、多種多様な適用用途、例えば、癌、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症などの疾患、および病理学的血管新生によって生じる他の疾患の診断、予防および処置などにおいて使用され得る。
【００２１】
特許文献９には、タンパク質のアイソフォームと関連している疾患の診断および処置に特異的な抗体の作製およびスクリーニングのための方法が記載されている。この開示内容には、疾患状態と関連している種々のポリペプチドのアイソフォームに特異的な、とりわけＶＥＧＦアイソフォームに特異的なエキソンのスプライス接合部のアミノ酸を認識する抗体の作製およびスクリーニングが教示されている。ＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧＦ１６５いずれかのアイソフォームを認識し得る提案された抗ＶＥＧＦ抗体が開示されており、ここで、抗ＶＥＧＦ１２１特異的抗体は、エキソン５と８間の接合部のペプチド配列（配列番号：６）に対して生成されるものであり得、抗ＶＥＧＦ１６５特異的抗体は、エキソン５と７との間の接合部のペプチドドメインに対して生成されるものであり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第０３／０１２１０５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／１６５５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／５３３４５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／１２８０９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０００９００号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９８／４５３３１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００１／０３６９７２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００５／０５４２７３号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００５／００７１９８号パンフレット
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ  １９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，４４２−４４７
【非特許文献２】Ｋｅｒｂｅｌ  ２０００，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２１，５０５−５１５
【非特許文献３】Ｌｙｎｄｅｎら，２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１１９４−１２０１
【非特許文献４】ＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＪａｉｎ  ２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，２４９−２５７
【非特許文献５】ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８，４−２５
【非特許文献６】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，４３５−４３９
【非特許文献７】Ｆｅｒｒａｒａら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，４３９−４４２
【非特許文献８】Ｆｅｒｒａｒａら  １９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４，３３６−３４０
【非特許文献９】Ｇｅｒｂｅｒら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５，６２３−６２８
【非特許文献１０】Ｍｏｒｅｉｒａら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００７，７，２２３−２４５
【非特許文献１１】Ｗｏｏｌａｒｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，６２，４１２３−４１３１
【非特許文献１２】Ｗｏｏｌａｒｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，６４，７８２２−７８３５
【非特許文献１３】Ｖａｒｅｙら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，１−１４
【非特許文献１４】Ｓｏｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，５０，３１５８２−３１５８８
【非特許文献１５】Ｐｒｅｓｔａら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態が共有しているアミノ酸配列を認識する既知の抗体では、いずれも、この増殖因子の血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態が識別され得ない。したがって、血管新生誘発性アイソフォームと抗血管新生性アイソフォームを識別するために診断的に使用され得、血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームのみを阻害するために治療的に使用され得る、ＶＥＧＦに対する抗体の提供という、まだ対処されていない必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の概要
本発明は、ＶＥＧＦに対する現在利用可能な抗体は、ＶＥＧＦのアゴニスト形態を中和するだけでなく、ＶＥＧＦのアンタゴニスト（抗血管新生性）形態も中和し、したがって、組織中に存在するＶＥＧＦアイソフォームのバランスに応じて臨床応答を伴って混合型アンタゴニスト−アゴニストとして作用するという概念に基づくものである。したがって、本発明は、血管新生誘発性バリアントと抗血管新生性バリアントとを識別することができ、前者のアイソフォームのみを中和することができる、血管新生誘発性ＶＥＧＦに特異的な抗体を初めて提供するものである。また、本発明は、かかる抗体を得るための方法、その作製方法、ならびにその治療的および診断的使用を提供する。
【００２６】
ＶＥＧＦの特定のペプチド配列、例えばエキソン８ａにコードされた配列、例えば配列ＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）は、ほとんどの血管新生誘発性ＶＥＧＦバリアントに存在しているが、ＶＥＧＦアンタゴニストバリアントには存在せず、これは、エキソン８ｂにコードされた配列ＳＬＴＲＫＤ（配列番号：２）を含む。本発明により、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態を識別することができる、エキソン８ａにコードされた配列を含む抗原決定基に対する抗体が提供される。
【００２７】
一態様によれば、本発明は、血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに結合し得るが、抗血管新生性のＶＥＧＦの形態には結合し得ない、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに対する抗体（本明細書において抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体とも表示する）を提供する。
【００２８】
一実施形態によれば、該抗体は、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片である。
【００２９】
具体的な実施形態によれは、該抗体は、ＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）、ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：３）、ＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：４）、およびＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：５）からなる群より選択される抗原決定基を認識するものである。
【００３０】
また別の実施形態によれば、該抗体は、配列ＳＬＴＲＫＤ（配列番号：２）を含むＶＥＧＦアイソフォームに結合しない。具体的な実施形態によれば、配列ＳＬＴＲＫＤを含むＶＥＧＦアイソフォームは、ＶＥＧＦ１６５ｂおよびＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ  ＶＥＧＦ２０６ｂである。
【００３１】
別の実施形態によれば、該抗体は、配列ＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含むＶＥＧＦアイソフォームに結合し得るものであり、前記抗体の抗原決定基はＤＲＡＲＱＥＫ（配列番号：７）を含まない。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、該抗体はモノクローナル抗体である。具体的な一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、および抗体の少なくとも抗原結合部分を含む抗体断片からなる群より選択される。具体的な一実施形態によれば、該抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離されたＣＤＲ領域、単鎖抗体、「ダイアボディ」および「線状抗体」からなる群より選択される。
【００３３】
具体的な一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−８受託番号０８１０１４０１；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−１０受託番号０８１０１４０２；ＭＲ９３  Ａ２６クローン１３−８−３受託番号０８１０１４０３からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるものである。
【００３４】
別の実施形態によれば、該抗体はポリクローナル抗体である。
【００３５】
また、アゴニストＶＥＧＦアイソフォームに対する親和性と特異性を有する本発明による抗体をコードする核酸分子も本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
この態様により、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体またはその抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。具体的な一実施形態によれば、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体、または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片は、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する。
【００３７】
別の態様によれば、本発明は、ＶＥＧＦと関連している疾患または障害の予防、減弱または処置に有用な医薬組成物に関する。本発明による医薬組成物は、血管新生誘発性のＶＥＧＦの形態に結合し得るが抗血管新生性のＶＥＧＦの形態には結合し得ない抗体の治療有効量；および薬学的に許容され得る担体を含む。
【００３８】
一実施形態によれば、医薬組成物は、アゴニストＶＥＧＦに特異的な抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の治療有効量を含む。具体的な一実施形態によれば、アゴニストＶＥＧＦに特異的な抗体、または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片は、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する。
【００３９】
具体的な一実施形態によれば、医薬組成物は、ＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）、ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：３）、ＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：４）、およびＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号：５）からなる群より選択される抗原決定基を認識し、アゴニストＶＥＧＦに特異的な抗体またはその抗体断片の治療有効量を含む。
【００４０】
一部の特定の実施形態によれば、アゴニストＶＥＧＦと関連している疾患または障害は、細胞増殖性、過剰透過性であるか、または血管新生に関連している疾患または障害（例えば、限定されないが、ネフローゼ症候群および急性呼吸窮迫症候群、ＡＲＤＳ）である。他の実施形態によれば、細胞増殖性疾患または障害は、限定されないが、癌、目の細胞増殖性疾患（眼疾患）、網膜障害、関節リウマチ、および乾癬を含む群から選択される。
【００４１】
網膜障害としては、例えば、脈絡膜新生血管膜（Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＣＮＶＭ）、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、血管閉塞、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げられる。
【００４２】
また別の態様において、本発明は、処置を必要としている被検体に、アゴニストのＶＥＧＦアイソフォームに特異的な抗体の治療有効量；および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、血管新生または血管内皮細胞増殖と関連している疾患または障害の予防、減弱または処置方法に関する。
【００４３】
一部の実施形態によれば、アゴニストＶＥＧＦの過剰発現と関連している疾患または障害は、血管新生性または細胞増殖性の疾患または障害である。
【００４４】
本発明による医薬組成物は、単独の処置剤として、または任意のＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、限定されないが、抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォーム）での処置に加えて投与され得る。具体的な一実施形態によれば、本発明による抗体は、処置を必要としている被検体に、処置レジメンの一部として、少なくとも１種類の抗血管新生性アイソフォームとともに投与される。具体的な一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストアイソフォームは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ  ＶＥＧＦ１８９ｂまたはＶＥＧＦ２０６ｂ、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される。本発明による医薬組成物は、ＶＥＧＦアンタゴニストと一緒に、または別々に投与され得る。
【００４５】
本発明による医薬組成物は、抗新生物組成物と一緒に投与され得る。具体的な一実施形態によれば、抗新生物組成物は少なくとも１種類の化学療法剤を含むものである。本発明による抗体と一緒に、または別々に投与され得る化学療法剤は、抗癌活性を示す当該技術分野で知られた任意のかかる薬剤、例えば限定されないが：ミトザントロン、トポイソメラーゼインヒビター、紡錘体毒ビンカ：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセル；アルキル化剤：メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド；メトトレキサート；６−メルカプトプリン；５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン；ポドフィロトキシン：エトポシド、イリノテカン、トポテカン、ダカルバジン；抗生物質：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン；ニトロソ尿素：カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン；無機イオン：シスプラチン、カルボプラチン；インターフェロン、アスパラギナーゼ；ホルモン：タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、および酢酸メゲストロールを含むものであり得る。
【００４６】
具体的な一実施形態によれば、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連インヒビター、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼインヒビター、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）、腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体からなる群より選択される。別の実施形態によれば、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イレノテカン（ｉｒｅｎｏｔｅｃａｎ）、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセルおよびドキセタキセルからなる群より選択される。２種類以上の化学療法剤をカクテルにて使用し、抗ＶＥＧＦ抗体の投与と併用して投与してもよい。好ましい併用化学療法剤の一例は、フルオロウラシルを主成分とし、５−ＦＵと１種類以上の他の化学療法剤を含むものである。
【００４７】
具体的な一実施形態によれば、本発明は、被検体に、有効量の抗アゴニストＶＥＧＦ抗体を抗新生物組成物と一緒に投与することを含む、被検体の癌の処置方法を提供する。
【００４８】
本発明による処置で修正可能な（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）癌としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性腫瘍が挙げられる。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ／ｓｔｏｍａｃｈ）癌（例えば、胃腸の癌）、膵臓癌、グリア芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌および種々の型の頭頸部癌、ならびにＢ−細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連している異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連しているものなど）、およびメグズ症候群が挙げられる。好ましくは、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、類癌腫、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群より選択される。より好ましくは、癌は結腸直腸癌である。本発明による処置で修正可能な癌性状態としては転移性癌が挙げられる。本発明の方法は、血管新生した腫瘍の処置に特に好適である。
【００４９】
別の態様において、本発明は、被検体に、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体を含む組成物の有効量と、抗新生物組成物を投与することを含み、前記抗新生物組成物が少なくとも１種類の化学療法剤を含み、それにより、抗ＶＥＧＦ抗体と抗新生物組成物の共投与によって  生存期間が有効に長くなる、癌を有する被検体の生存期間を長くするための方法を提供する。
【００５０】
また別の態様において、本発明は、被検体に、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体を含む組成物の有効量と、抗新生物組成物を投与することを含み、前記抗新生物組成物が少なくとも１種類の化学療法剤を含み、それにより、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体と抗新生物組成物の共投与によって進行なしの生存期間が有効に長くなる、癌を有する被検体の進行なしの生存を延ばすための方法を提供する。
【００５１】
さらに、本発明は、被検体に、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体を含む組成物の有効量と、抗新生物組成物を投与することを含み、それにより、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体と抗新生物組成物の共投与によって被検体群において応答発生数が有効に増加する、癌を有する被検体の処置方法を提供する。
【００５２】
また別の態様において、本発明は、被検体に、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに対する抗体を含む組成物の有効量と、抗新生物組成物を投与することを含み、前記抗新生物組成物が少なくとも１種類の化学療法剤を含み、それにより、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに対する抗体と抗新生物組成物の共投与によって応答期間が有効に長くなる、癌を有する被検体の応答期間を長くするための方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、細胞増殖性であるか、または血管新生に関連している疾患または障害の処置のための治療用組成物の製造のための、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体またはその抗体断片の使用に関する。
【００５４】
一実施形態によれば、本発明によれば、ＶＥＧＦの血管新生性形態の過剰発現と関連している障害または疾患、例えば限定されないが、血管新生に関連している疾患または障害の処置のための医薬の調製のための、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の使用が提供される。
【００５５】
別の態様によれば、本発明により、ＶＥＧＦの血管新生性形態と関連している障害または疾患の処置のための、ＶＥＧＦに特異的であり、エピトープＣＤＫＰＲＲ（配列番号：１）を含む抗原決定基を認識する抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片の使用が提供される。一実施形態によれば、該疾患または障害は血管新生性または細胞増殖性の疾患または障害である。
【００５６】
血管新生誘発性ＶＥＧＦ（本明細書においてＶＥＧＦｘｘｘと表示する）は、有足突起生存因子であり、血管新生誘発性であり、腎臓の糸球体の透過性を増大させて糸球体漏出性となる。
【００５７】
ＶＥＧＦの抗血管新生性形態（本明細書においてＶＥＧＦｘｘｘｂと表示、ＶＥＧＦ１６５ｂが例示される）は、有足突起生存因子であり、抗血管新生性であり、ヒト糸球体の透過性を低下させる。
【００５８】
ＶＥＧＦスカベンジャー（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）など）、およびＶＥＧＲ遮断薬（チロシンキナーゼインヒビター、ＴＫＩ）（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）など）は、蛋白尿および腎臓障害を誘発する。
【００５９】
本発明の原理によると、ＴＫＩ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）など）または抗体（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）など）によって誘発される腎炎性障害および／または糸球体損傷が、血管新生誘発性ＶＥＧＦｘｘｘのみに特異的な抗体での処置によって回避または改善され得ることが想定される。
【００６０】
本発明の原理によると、ＴＫＩ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）など）または抗体（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）など）によって誘発される腎炎性障害および／または糸球体損傷が、ＶＥＧＦ１６５ｂでの処置によって減弱され得ることが想定される。したがって、本発明の別の態様によれば、ＶＥＧＦ１６５ｂにより、既知のＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ遮断薬によって誘発される損傷が減弱され得る。
【００６１】
別の態様によれば、本発明により、本発明による血管新生誘発性のＶＥＧＦの形態に特異的な抗体を、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームとともに投与することを含む、処置を必要としている被検体の処置方法が提供される。
【００６２】
具体的な一実施形態によれば、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームはＶＥＧＦ１６５ｂである。他の実施形態によれば、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームは、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂおよびＶＥＧＦ２０６ｂからなる群より選択される。
【００６３】
また別の態様によれば、本発明により、処置を必要としている被検体に、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームを投与することを含む、腎障害の処置方法が提供される。
【００６４】
具体的な一実施形態によれば、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームはＶＥＧＦ１６５ｂである。他の実施形態によれば、ＶＥＧＦの抗血管新生性アイソフォームは、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂおよびＶＥＧＦ２０６ｂからなる群より選択される。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、血管新生誘発性のＶＥＧＦの形態の存在を検出または定量するための方法が提供される。したがって、本発明により、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに対する抗体を用いて、アゴニストＶＥＧＦアイソフォームのレベルの上昇と関連している病状を診断するための方法もまた提供される。本発明による診断方法は、具体的な実施形態により、インビトロまたはエキソビボで行なわれ得る。本発明による抗体はまた、スクリーニング方法を構成するためにも使用され得る。例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用し、当該技術分野で知られた標準的な方法により、分泌された、または細胞と会合したポリペプチドレベルを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイが構築され得る。
【００６６】
一実施形態によれば、
ｉ．試料を、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片とともにインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて、結合されたアゴニストＶＥＧＦを検出する工程；
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を、既知量の血管新生誘発性ＶＥＧＦを含む参照試料で得られた標準曲線と比較する工程；および
ｉｖ．体液試料中の該血管新生誘発性抗体の量を、該標準曲線から計算する工程
を含む、血管新生誘発性のＶＥＧＦの形態の存在を検出または定量するための方法が提供される（ｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ）。
【００６７】
別の実施形態によれば、
ｉ．生物学的試料を、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片とともにインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて、結合されたアゴニストＶＥＧＦを検出する工程；
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を、既知量の血管新生誘発性ＶＥＧＦを含む参照試料で得られた標準曲線と比較する工程；
ｉｖ．体液試料中の該血管新生誘発性抗体の量を、該標準曲線から計算する工程；および
ｖ．（ｉｖ）の量を、通常量の血管新生誘発性ＶＥＧＦ量と比較する工程
を含む、血管新生誘発性のＶＥＧＦの形態と関連している疾患または障害の診断方法が提供される。
【００６８】
本発明の抗体はまた、患者の血管新生誘発性／抗血管新生性の比率の評価のため、および抗ＶＥＧＦ療法剤（既知の抗ＶＥＧＦ抗体など）での処置（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）での処置）の有効性の予測のためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。本発明の抗体を用いたスクリーニングアッセイにより、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態の比率の測定が可能となり、したがって、処置の結果の予測および適切な処置レジメンの計画が可能となり得る。特異的抗体によって測定されるＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態の比率は、どの患者がＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）または他の抗ｐａｎ  ＶＥＧＦ処置（例えばＶＥＧＦ−トラップ）の恩恵を被り得るかを評価するための予測ツールとして使用され得る。
【００６９】
本質的に、抗血管新生性／アンタゴニストＶＥＧＦに関する先行技術において既知または想定される使用はすべて、本発明の抗体を用いて行われ得る。このような使用としては、診断的、予防的および治療的手法が挙げられる。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態および充分な適用範囲は、本明細書において以下に示す詳細な説明から自明となろう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、Ａ）ヒトＶＥＧＦ遺伝子のエキソンマップ、およびＢ）異なるＶＥＧＦアイソフォームをもたらすエキソンスプライシングパターンの概略図である。
【図２】図２は、エキソン８ａまたはエキソン８ｂに対するアフィニティ精製された単一特異性ポリクローナル抗体を用いた組換えＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１６５ｂのウエスタンブロット解析を示す。
【図３】図３は、エキソン８ａに対する単一特異性ポリクローナル抗体の濃度を増大させることによるＶＥＧＦ１６５媒介性ＨＵＶＥＣ遊走の阻害を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、エキソン８ａに対する単一特異性ポリクローナル抗体または両者の組合せの存在下で測定されたＨＵＶＥＣ遊走を示す。
【図５】図５は、ＶＥＧＦ１６５、エキソン８ａに対する単一特異性ポリクローナル抗体またはＬｕｃｅｎｔｉｓ、またはエキソン８ａに対するポリクローナル抗体とＶＥＧＦ１６５ｂの組合せの存在下で、上記のようにして測定されたＨＵＶＥＣ遊走を示す。
【図６】図６は、ＶＥＧＦのエキソン８ａに対して生成させたモノクローナル抗体が、ＶＥＧＦ１６５による刺激に応答したＥＣＶ３０４内皮細胞の遊走を阻害することを示す。
【図７】図７は、アゴニストＶＥＧＦアイソフォーム（ｉｓｆｏｒｍ）ＶＥＧＦ１６５に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を試験した内皮細胞遊走アッセイの結果を示す。
【図８】図８は、ＶＥＧＦ１６５ｂが血清飢餓状態のヒト有足突起の生存因子であることを示す。
【図９】図９は、１００μｇのＶＥＧＦ１６５ｂの全身投与を受けた後、糸球体の有足突起においてＶＥＧＦ１６５ｂを過剰発現するトランスジェニックマウスの尿中クレアチニン／タンパク質比を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＶＥＧＦ１６Ｓｂにより慢性糸球体の透過性が低下することを示す。ヒト条件的不死化糸球体内皮細胞を２時間血清飢餓状態にし、次いで、何もなし（対照）、１ｎＭのＶＥＧＦ１６５、１ｎＭのＶＥＧＦ１６５ｂまたは１ｎＭのＶＥＧＦ１６５と１ｎＭのＶＥＧＦ１６５ｂの組合せのいずれかに応答した培養単層状態の糸球体内経内皮電気抵抗を測定した。結果は、対照と比べた平均増加倍数である（すなわち、時間点０分、ＳＥＭ）。ｎ＝５、プリズムによるデータ解析：ｐ±＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、反復測定、ボンフェローニポストテストによる。対照対ＶＥＧＦ１６５  ｐ＜０．００１、対照対ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｐ，０．０１、対照対両者ｐ＞０．０５、ＶＥＧＦ１６５対ＶＥＧＦ１６５ｂと両者ｐ＜０．００１、ＶＥＧＦ１６５ｂ対両者ｐ＜０．０１。ＳＳＰＳを用いたデータ解析、全般的なｐ値＞０．０００５  一元配置ＡＮＯＶＡ、反復測定、ポストホックボンフェローニ対照対ＶＥＧＦ  ０．００１、対他のＮＳＶＥＧＦ対他の３つの群  すべて有意  １６５対両者  ０．０３７。
【図１１】図１１は、ネフリンＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるインタクトなエキソビボ糸球体のＬｐＡ／Ｖｉを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＶＥＧＦの有害な形態に特異的であるが、該タンパク質の有益なアンタゴニスト形態は中和することができない抗体を初めて提供するものである。これは、ＶＥＧＦの抗血管新生性／アンタゴニスト形態と血管新生誘発性／アゴニスト形態の構造の違いにより可能となった。例えば、天然のＶＥＧＦである抗血管新生性／アンタゴニストＶＥＧＦ１６５ｂは、エキソン８ａにコードされた配列が欠損しているが、該配列は、ほとんどのＶＥＧＦの血管新生誘発性形態には存在している。
【００７３】
エキソン８ａに対して生成される抗体は、血管新生誘発性アイソフォームＶＥＧＦ１６５に結合して阻害するが、抗血管新生性形態ＶＥＧＦ１６５ｂに対してはそうでないことが示された。また、このような抗体は、ＶＥＧＦ１６５媒介性ＨＵＶＥＣ遊走を用量依存的に阻害する。
【００７４】
ＶＥＧＦは、多面的因子として作用することがわかっている。これは、血管新生を調節するだけでなく、体内の多くの細胞および組織（ニューロン、網膜色素細胞、腎臓内の有足突起または正常および成熟血管など）に対して生存因子としての機能も果たす。ＶＥＧＦが完全に欠損すると（例えば、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態を識別しない抗体およびＶＥＧＦＲ遮断薬によってもたらされる）により、患者は、網膜損傷、出血および蛋白尿および腎臓障害、ならびにさらなる重篤な有害事象に曝露され得る。
【００７５】
ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に対して標的化される抗体は、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態を排除してＶＥＧＦの抗血管新生性形態がＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２に結合して抗血管新生と細胞保護をもたらすことを可能にするため、より安全でより有効であることが予測される。
【００７６】
ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、現在治療に使用されている抗ＶＥＧＦ抗体であるが、これは、ＶＥＧＦの両方（血管新生誘発性および抗血管新生性）の形態に、同じ親和性で無差別に結合する。これにより、有効性の限界と低安全性プロフィールが説明され得る。有意なレベルのＶＥＧＦ１６５ｂを発現している腫瘍を有する患者をＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）で処置することは、この抗ＶＥＧＦ抗体の効果がＶＥＧＦ１６５ｂによって阻害されるため、有効でないことがあり得る。本発明による特異的抗体によって測定されるＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態の比率は、どの患者がＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）または他の抗ｐａｎ  ＶＥＧＦ処置（ＶＥＧＦ−トラップなど）の恩恵を被り得るかを予測するための予測ツールとして使用され得る。
【００７７】
定義
用語「ＶＥＧＦ」は、（限定されないが）１２１−、１４５−、１６５−、１８９−、および２０６−アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子（Ｌｅｕｎｇら  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４６，１３０６，およびＨｏｕｃｋら  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，１９９１，５，１８０６に記載）ならびにその天然に存在する対立遺伝子形態およびプロセッシングされた形態をいうために用いる。用語「ＶＥＧＦ」は、あらゆる形態のＶＥＧＦ−Ａ、例えば、ＶＥＧＦファミリーである１６５−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの切断型形態、ならびに抗血管新生性形態ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１２１ｂおよび一連の全ＶＥＧＦｘｘｘｂをいうために用いる。
【００７８】
用語「ＶＥＧＦアゴニスト」、「アゴニストＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦのアゴニスト」は、ＶＥＧＦの血管新生誘発活性、すなわち、血管新生および／または透過性が促進または加速され得るＶＥＧＦの形態をいう。例示的なアゴニストＶＥＧＦの形態は、エキソン８ａにコードされた配列ＣＤＫＰＲＲを含むものである。
【００７９】
用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」または「ＶＥＧＦのアンタゴニスト」は、抗血管新生性分子として作用するが、血管新生の促進能はないＶＥＧＦの形態をいう。例示的なアゴニストＶＥＧＦの形態は、エキソン８ａにコードされた配列ＣＤＫＰＲＲではなく、エキソン８ｂにコードされた配列ＳＬＴＲＫＤを含むものである。
【００８０】
ＶＥＧＦのアゴニスト形態およびアンタゴニスト形態は、典型的には、エキソン８ａによって発現される配列を有すること（アゴニストＶＥＧＦの形態）またはエキソン８ａが欠失し、エキソン８ｂ発現配列を有することによって識別されるが、それでもなお、他の形態のアゴニストＶＥＧＦおよびアンタゴニストＶＥＧＦが存在し得、このようなアゴニスト形態とアンタゴニスト形態とを識別する抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、ＶＥＧＦに充分な親和性と特異性で結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患または病状の標的化および介入において治療用薬剤として使用され得る。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、他のＶＥＧＦホモログ（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤもしくはＶＥＧＦ−Ｅなど）または他の増殖因子（ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦもしくはｂＦＧＦなど）には結合しない。抗ＶＥＧＦ抗体は、組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり得る。
【００８１】
「抗原」は、抗体形成が誘発され得、抗体に結合される分子または分子の一部分である。抗原は、１つまたは１つより多くのエピトープを有するものであり得る。上記の特異的反応は、抗原が、その対応する抗体と高度に選択的な様式で反応するが、他の抗原によって誘発され得る他の抗体群とは結合しないことを示すものとする。本発明による抗原は、ＶＥＧＦのアゴニスト形態またはその断片である。
【００８２】
本発明による用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域をいう。
【００８３】
抗体または免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの重鎖と、２つの軽鎖を含み、各軽鎖がそれぞれの重鎖に、ジスルフィド結合によって「Ｙ」字型形状の構造に連結されている。抗体のタンパク質分解性消化により、Ｆｖ（可変部断片）とＦｃ（結晶性断片）ドメインが得られる。抗原結合ドメインであるＦａｂは、ポリペプチド配列が種々である領域を含む。Ｆ（ａｂ’）２という用語は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸はＦｃ断片と称される。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでおり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並んでいる。軽鎖と重鎖の各ペアの可変ドメインは抗原結合部位を形成している。軽鎖および重鎖上のドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは４つのフレームワーク領域を含み、その配列は、比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られている３つの超可変ドメインによって接合されている。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性と親和性に寄与している。重鎖のアイソタイプ（γ、α、δ、εまたはμ）によって、免疫グロブリンのクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）が決定される。軽鎖は、すべての抗体クラスに見られる２つのアイソタイプ（カッパ、κまたはラムダ、λ）のいずれかである。
【００８４】
用語「抗体」は、は最も広い意味で用いており、モノクローナル抗体（例えば、完全長またはインタクトなモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片（所望の生物学的活性を示すものである限り）を包含する。
【００８５】
本発明による抗体は、抗体の少なくとも抗原結合部分を含む分子である。本発明による抗体（１種類ならびに複数種）としては、インタクトな抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）など）、ならびにそのタンパク質分解断片（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片など）が挙げられる。さらに、本発明の範囲には、キメラ抗体；ヒト抗体およびヒト化抗体；組換え抗体および遺伝子操作抗体、ならびにその断片が含まれる。さらに、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、他の抗体をコードするＤＮＡに挿入してキメラ抗体を作製してもよい。単鎖抗体もまた本発明の範囲に含まれる。
【００８６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみ、一般的には、例えば、インタクトな抗体の抗原結合部位のみを含み、したがって抗原との結合能を保持しているものである。本定義に包含される抗体断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有する）；（ｉｉ）Ｆａｂ’断片（これは、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片である；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有する）；（ｉｖ）Ｆｄ’断片（ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有する）；（ｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有する）；（ｖｉ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４１，５４４−５４６）（これはＶＨドメインからなる）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片）；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２４２、４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１９８８，８５，５８７９−５８８３）；（ｘ）「ダイアボディ」（２つの抗原結合部位を有し、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む）（例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３、９０、６４４４−６４４８参照）；（ｘｉ）「線状抗体」（１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む、これは、相補軽鎖ポリペプチドと一緒に１対の抗原結合領域を形成する）（Ｚａｐａｔａら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９５，８，１０５７−１０６２；および米国特許第５，６４１，８７０号）が挙げられる。
【００８７】
単鎖抗体は、抗原結合能を有し、免疫グロブリン軽鎖および重鎖、すなわち、連結ＶＨ−ＶＬまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の可変領域に相同または相似なアミノ酸配列を含む単鎖複合型ポリペプチドであり得る。
【００８８】
「中和抗体」は、本明細書で用いる場合、特異的受容体またはリガンド標的に対する抗原結合部位を有する分子であって、受容体を介して活性またはシグナル伝達を低減または阻害（ブロック）し得る（本明細書どおりに、インビボまたはインビトロアッセイによって判定）ものをいう。
【００８９】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る起こり得る天然変異以外同一である）から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、典型的には種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の作製が必要とされるものでないと解釈されたい。ｍＡｂは、当業者にわかる方法によって得られ得る。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（最初にＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９７５，２５６，４９５により報告）によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製され得る。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５２，６２４−６２８またはＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１−５９７に記載の手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離したものであってもよい。
【００９０】
本発明のｍＡｂは、任意の免疫グロブリンクラスのもの（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）、およびその任意のサブクラスのものであり得る。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂはインビボ生成にて得られ得、この場合、個々のハイブリドーマ由来の細胞を、初回抗原刺激した（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を得る。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者には充分わかるカラムクロマトグラフィー法を使用し、かかる腹水または培養上清から精製され得る。
【００９１】
本明細書におけるモノクローナル抗体としては、具体的には「キメラ」抗体が挙げられ、これは、重鎖および／または軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同であるが、該鎖（１つまたは複数）の残部は別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同な抗体、ならびにかかる抗体の断片（ただし、所望の生物学的活性を示すものとする）である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５７：６８５１−６８５５（１９８４））。また、抗体分子の特定の性質（例えば、親和性または特異性）を改変するために、補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングを行なってもよい。ＣＤＲグラフティングの非限定的な一例は、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されている。
【００９２】
キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（マウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなど）である。実質的にヒト抗体（アクセプター抗体という）に由来する可変領域フレームワーク残基と、実質的にマウス抗体（ドナー抗体という）に由来する相補性決定領域とを有する抗体は、ヒト化抗体とも称される。キメラ抗体は、主に、適用時の免疫原性を低減するため、および産生収率を増大させるために使用され、例えば、マウスｍＡｂの方がハイブリドーマからの収率が高いが、ヒトにおいて免疫原性が高い場合、結果としてヒト／マウスキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体およびその作製方法は当該技術分野で知られている（例えば、ＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ８６／０１５３３、ＷＯ９７／０２６７１、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９２／２２６５３ならびに米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，２２５，５３９号）。
【００９３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。たいてい、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むものであり得る。このような修飾は、抗体の性能をさらに精密化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含むものである。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８６，３２１，５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｒｎａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８，３３２，３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２  ２，５９３−５９６を参照のこと。
【００９４】
「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体および／または本明細書に開示した任意のヒト抗体作製手法を用いて作製された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、当該技術分野で知られた種々の手法を用いて作製され得る。一実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択されるものである（Ｖａｕｇｈａｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４，３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），１９９８，９５，６１５７−６１６２）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９１，２２７，３８１；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２，５８１）。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物に、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が一部または完全に不活化されたマウスに導入することにより作製され得る。抗原刺激すると、あらゆる点で（例えば、遺伝子再編成、集合、および抗体レパートリー）、ヒトにおいて見られるものと非常によく似たヒト抗体の生成が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、ならびに以下の科学系刊行物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。あるいはまた、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によって調製され得る（かかるＢリンパ球は、個体から収集したものであってもよく、インビトロで免疫化処理したものであってもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
【００９５】
用語「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」により、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域が短鎖（通常、セリン、グリシン）リンカーによって一緒に連結された融合体を意図する。単鎖抗体は、抗原結合能を有し、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域に相同または相似なアミノ酸配列を含む単鎖複合ポリペプチドであり得る（連結ＶＨ−ＶＬまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））。ＶＨとＶＬがともに、天然モノクローナル抗体の配列をコピーしてもよく、該鎖の一方または両方が、米国特許第５，０９１，５１３号（その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）に記載の型のＣＤＲ−ＦＲ構築物を含むものであってもよい。軽鎖および重鎖の可変領域に相似な個々のポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって結合されている。かかる単鎖抗体の作製方法は、特に、ＶＨ鎖とＶＬ鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが既知である場合、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，０９１，５１３号および同第５，０９６，８１５号（各々の全内容は引用により本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って行なわれ得る。
【００９６】
「抗体の抗原結合部分を有する分子」は、本明細書で用いる場合、任意のアイソタイプであって、任意の動物細胞株または微生物によって生成されるインタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、その抗原結合性の反応性画分、例えば限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、該分子の重鎖および／または軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（ＷＯ９３／１５２１０、米国特許出願第０８／２５６，７９０号、ＷＯ９６／１３５８３、米国特許出願第０８／８１７，７８８号、ＷＯ９６／３７６２１、米国特許出願第０８／９９９，５５４号（その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）参照）、二量体の二重特異性ミニ抗体（Ｍｕｌｌｅｒら，１９９８参照）ならびにかかる反応性画分が組み込まれたキメラまたは単鎖抗体、ならびにかかる抗体反応性画分が物理的に挿入された任意の他の型の分子または細胞（キメラＴ細胞受容体もしくはかかる受容体を有するＴ細胞、またはかかる反応性画分を含む一部分によって治療用部分が送達されるように開発された分子など）も包含することを意図する。かかる分子は、任意の既知の手法、例えば限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え手法によって得られ得る。
【００９７】
本発明による抗体は、アゴニストＶＥＧＦもしくはエピトープを有する断片、類似体、または発現細胞を、動物（好ましくは非ヒト）に、常套的なプロトコルを用いて投与することにより得られ得る。モノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞株培養によって生成される抗体を得る当該技術分野で知られた任意の手法が使用され得る。例としては、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹの第７７〜９６頁，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）のものなどの種々の手法が挙げられる。
【００９８】
抗体をインビボで生成させる慣用的な方法以外に、抗体は、ファージディスプレイ手法を用いてインビトロで生成させることができる。かかる組換え抗体の生成は、慣用的な抗体生成と比べるとずっと速く、膨大な数の抗原に対して生成させることができる。さらに、慣用的な方法を用いた場合、多くの抗原は非免疫原性であるか、または極めて毒性であることが示され、したがって、動物での抗体生成に使用することができない。さらに、組換え抗体の親和性の成熟（すなわち、親和性と特異性の増大）は非常に単純で比較的高速である。最終的に、特異的抗原に対して多数の異なる抗体が１回の選択手順で生成され得る。組換えモノクローナル抗体の生成には、すべて、異なる抗原認識部位を有する抗体の大量プールを得るためのディスプレイライブラリーに基づいた種々の方法が使用され得る。かかるライブラリーは、いくつかの様式で作製され得る。一例では、重鎖生殖細胞系遺伝子プールの合成ＣＤＲ３領域をクローニングし、したがって大型の抗体レパートリーを作製すること（この中から種々の特異性を有する組換え抗体断片が選択され得る）により合成レパートリーが作製され得る。一例では、抗体ライブラリーの構築の出発材料としてヒトリンパ球プールが使用され得る。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築することが可能であり、したがって、多様性の大きなヒトライブラリーを作出することが可能である。この方法は、種々の抗原に対して多数の抗体を選択するために成功裡に広く使用されている。バクテリオファージライブラリーの構築および組換え抗体の選択のためのプロトコルは、よく知られた参考文献である教科書Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２−２０００），第１７章、セクション１７．１に示されている。
【００９９】
非ヒト抗体は、当該技術分野で知られた任意の方法によってヒト化されたものであり得る。一例の方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体またはコンセンサス抗体のフレームワーク配列内に挿入される。次いで、親和性または免疫原性をモジュレートするため、さらなる変更を抗体フレームワーク内に導入してもよい。
【０１００】
例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号には、ヒト化免疫グロブリンおよびその作製方法が開示されており、該ヒト化免疫グロブリンは、ドナー免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒトアクセプター免疫グロブリンの重鎖と軽鎖に由来する重鎖と軽鎖の可変領域フレームワークとを含むものであり、前記ヒト化免疫グロブリンは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側のドナー免疫グロブリンフレームワーク由来のアミノ酸を含み、該ドナーアミノ酸は、アクセプター免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のフレームワークの対応するアミノ酸で置き換えられている。
【０１０１】
また、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号には、改変型抗体またはその抗原結合断片およびその作製方法が開示されており、該抗体または抗原結合断片の可変ドメインは、第１の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域と、第２の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインの相補性決定領域とを有し、前記第２の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインは、前記第１の免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインと、抗原結合特異性、抗原結合親和性、種、クラスまたはサブクラスが異なる。
【０１０２】
また、本発明の抗体と特異的免疫反応性である抗イディオタイプ抗体も包含される。
【０１０３】
単鎖抗体の作製のための手法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する単鎖抗体の作製に適合させてもよい。また、トランスジェニックマウス、または他の生物体（他の哺乳動物）を使用し、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して免疫特異的なヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１０４】
あるいはまた、ファージディスプレイ手法を使用し、本発明のポリペプチドに対して結合活性を有する抗体遺伝子を、抗ＶＥＧＦを有することについてスクリーニングされたヒト由来リンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパートリーまたはライブラリーのいずれかから選択してもよい（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，５５２−５５４；Ｍａｒｋｓら，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３）。また、このような抗体の親和性は、例えば、鎖シャッフリングによって改善され得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２８）。
【０１０５】
上記の抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定し、該ポリペプチドを、例えばアフィニティクロマトグラフィーによって精製するために使用され得る。
【０１０６】
本発明はまた、本発明による抗体分子の同類アミノ酸バリアントを提供する。また、コードされたタンパク質の分子構造全体が保存されている本発明によるバリアントも作製され得る。開示したタンパク質産物を含有する個々のアミノ酸の性質を考慮すると、当業者には、いくつかの合理的な置換が認識されよう。アミノ酸の置換、すなわち「同類置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。
【０１０７】
「障害」は、該抗体での処置の恩恵を被り得る任意の状態である。これには、慢性および急性の障害または疾患、例えば、哺乳動物に対して該当する障害の素因を与える病理学的状態が含まれる。本明細書における処置対象の障害の非限定的な例としては、良性および悪性の腫瘍；白血病およびリンパ性腫瘍；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、間質および胞胚腔の障害；ならびに炎症性、血管新生性、免疫性の障害または過剰透過性状態が挙げられる。
【０１０８】
ＶＥＧＦは、さまざまな病態の重要な構成要素である血管内皮細胞増殖および血管新生を促進させることがわかっており、したがって、本発明による抗体は、腫瘍増殖および転移、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化および動脈硬化症、新生内膜増殖、糖尿病性網膜症および糖尿病の他の合併症、トラコーマ、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、トラコーマ  血管腫（ｈａｅｍａｎｇｉｏｍａｔａ）、移植角膜組織の免疫拒絶、目の外傷または感染と関連している角膜血管新生、乾癬、歯肉炎などの病状、ならびに血管新生および／または慢性炎症と関連していることがわかっている他の病状に対して使用され得る。用語「治療有効量」は、哺乳動物の疾患または障害が処置されるのに有効な薬物の量をいう。癌の場合、薬物の治療有効量により、癌細胞の数の減少；腫瘍サイズの減少；周辺器官内への癌細胞浸潤の抑止（すなわち、ある程度の遅滞、好ましくは停止）；腫瘍の転移の抑止（すなわち、ある程度の遅滞、好ましくは停止）；ある程度の腫瘍増殖の抑止；および／または障害と関連している１つ以上の症状のある程度の軽減がもたらされ得る。薬物は、既に存在している癌細胞の増殖が抑制および／または既に存在している癌細胞が死滅され得る限り、細胞増殖抑制性であってもよく、および／または細胞傷害性であってもよい。癌治療のため、インビボでの有効性が、例えば、生存期間、疾患進行までの期間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答持続期間、および／または生活の質を評価することにより測定され得る。
【０１０９】
「処置」は、治療的処置、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要とする対象としては、既に障害を有する対象、ならびに障害が予防されるべき対象が挙げられる。
【０１１０】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態の言及または説明である。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（例えば、胃腸の癌）、膵臓癌、グリア芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌および種々の型の頭頸部癌、ならびにＢ−細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連している異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連しているものなど）、およびメグズ症候群が挙げられる。
【０１１１】
用語「抗新生物組成物」は、腫瘍の増殖もしくは機能を抑止もしくは抑制し得る、および／または腫瘍細胞の破壊をもたらし得る少なくとも１種類の活性治療用薬剤を含む、癌の処置に有用な組成物をいう。癌の処置のための抗新生物組成物に適した治療用薬剤としては、限定されないが、化学療法剤、放射性同位体、毒素、サイトカイン（インターフェロンなど）、およびサイトカイン、サイトカイン受容体または腫瘍細胞と関連している抗原を標的化するアンタゴニスト性薬剤が挙げられる。例えば、本発明に有用な治療用薬剤は、抗体（抗ＨＥＲ２抗体および抗ＣＤ２０抗体など）、または小分子チロシンキナーゼインヒビター（ＶＥＧＦ受容体インヒビターおよびＥＧＦ受容体インヒビターなど）であり得る。好ましくは、治療用薬剤は化学療法剤である。
【０１１２】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学物質化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなど）；スルホン酸アルキル（ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど）；アジリジン（ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパなど）；エチレンイミンおよびメチラメラミン（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（例えば、合成類似体トポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば、合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど）；ニトロソ尿素（カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）など）；抗生物質（エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガムマール（ｇａｍｍａｌｌ）およびカリチアマイシンオメガール（ｏｍｅｇａｌｌ）（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３：１８３−１８６（１９９４）参照）など）；ダイネミシン（例えば、ダイネミシンＡ）；ビスホスホネート（クロドロネートなど）；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素蛋白エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えば、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣなど）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、���ルビシン；代謝拮抗薬（メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；葉酸類似体（デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど）；プリン類似体（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど）；ピリミジン類似体（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど）；アンドロゲン（カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタンなど）；葉酸補給薬（フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デドファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド（マイタンシンおよびアンサマイトシンなど）；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉ１１．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金配位錯体（シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトザントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（レチノイン酸など）；カペシタビン；ならびに上記のものの任意の薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１１３】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する作用を行なう抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；副腎内でエストロゲン生成を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなど）；および抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど）；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与しているシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓなど）；リボザイム（ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビターなど）；ワクチン（遺伝子療法剤ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨなど；ならびに上記のものの任意の薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が含まれる。
【０１１４】
薬理学
本発明ではまた、本明細書において種々に記載の病状の処置または予防のための治療用組成物の製造のための、ＶＥＧＦのアゴニストアイソフォームに特異的な少なくとも１種類の抗体を活性薬剤として含む、ヒトに対する医療的使用のための医薬用製剤が想定される。
【０１１５】
かかる医薬用製剤および医薬製剤では、活性薬剤は、好ましくは１種類以上の薬学的に許容され得る担体および任意選択で任意の他の治療用成分と一緒に使用される。担体（１種類または複数種）は、製剤のその他の成分と適合性であるが、レシピエントに対して過度に有害でないという意味において薬学的に許容され得るものでなければならない。活性薬剤は、上記のような所望の薬理学的効果が得られるのに有効な量で、および所望の日用量が達成されるのに適切な量で提供される。
【０１１６】
典型的には、抗体の抗原結合部分を含む、または別のポリペプチド（例えば、ペプチド模倣物）を含む本発明の分子を、治療用途の滅菌生理食塩水溶液中に懸濁させる。あるいはまた、医薬組成物は、活性成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出が制御されるように、または患者の系内での存在が長期化されるように製剤化され得る。数多くの好適な薬物送達系が知られており、例えば、埋入用薬物放出系、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミクロスフェアなどが挙げられる。制御放出調製物は、本発明による分子を複合体形成させる、または吸着するポリマーの使用によって調製され得る。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス、およびステアリン酸二量体とセバリン（ｓｅｂａｒｉｃ）酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。かかるマトリックスからの本発明による分子、すなわち抗体または抗体断片の放出速度は、該分子の分子量、マトリックス内の該分子の量、および分散粒子のサイズに依存する。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、任意の適当な手段、例えば、経口、経表面、鼻腔内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、病変内または非経口などによって投与され得る。通常、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、経表面または非経口投与が好ましい。
【０１１８】
本発明による分子の治療有効量が、とりわけ、投与計画、投与される分子の単位用量（該分子が他の治療用薬剤と組み合わせて投与されようと、そうでなかろうと）、患者の免疫状態および健康、投与される分子の治療活性、ならびに処置医師の判断に依存することは当業者に自明であろう。本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、処置対象の障害と関連する１つ以上の症状の長期間の軽減に必要とされる該分子の量をいう。
【０１１９】
本発明の分子の適切な投薬量は、投与経路、分子の型（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機分子など）、患者の年齢、体重、性別、または体調に応じて異なり、最終的には医師によって決定されるべきであるが、経口投与の場合、日投薬量は、一般的には体重１ｋｇあたり、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇであり得る。非経口投与の場合では、日投薬量は、一般的には体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇであり得る。日投薬量は、例えば、１日１〜４回個々に投与する典型的なレジメンにて投与され得る。他の  好ましい投与方法としては、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の関節内投与が挙げられる。有効量の達成における種々の考慮事項は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．，１９９０に記載されている。
【０１２０】
併用化学療法剤の好適な投与レジメンは当該技術分野で知られており、例えば、Ｓａｌｔｚら  Ｐｒｏｃ  ＡＳＣＯ  １９９９，１８，２３３ａおよびＤｏｕｉｌｌａｒｄら，Ｌａｎｃｅｔ  ２０００，３５５，１０４１−７に記載されている。
【０１２１】
活性成分としての本発明の分子は、薬学的に許容され得、かつ活性成分と適合性であるよく知られた賦形剤中に溶解、分散または混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。他の好適な担体は当業者には充分わかる。また、所望により、該組成物には、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などが含まれ得る。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明の化合物および方法をどのようにして作製および使用するかを説明することを意図するものであり、なんら限定するものとして解釈されるべきでない。次に、本発明をその具体的な実施形態とともに説明するが、多くの変形例および異形例が当業者に自明であることは明白である。したがって、かかる変形例および異形例はすべて、添付の特許請求の範囲の精神および広義範囲に包含されるものとする。
【実施例】
【０１２３】
実施例
抗体を調製およびキャラクタライズするための手段は、当該技術分野でよく知られている。以下に、本発明による抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体の作製のための手法に関する例示を記載する。抗体の作製に使用されるＶＥＧＦ抗原は、ＶＥＧＦのアゴニスト形態に存在するがアンタゴニスト形態には存在しないＶＥＧＦｘｘｘの任意のペプチド配列である。
【０１２４】
実施例１：ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物において、該当する抗原とアジュバントの反復皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって生成させたものである。これは、該当する抗原を、免疫処置対象の種において免疫原性であるタンパク質（例えば、スカシガイヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）に、二官能性薬剤または誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシニミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせるのに有用であり得る。
【０１２５】
動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して、例えば、１００μｇまたは５μｇの該タンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３容量のフロイント完全アジュバントと合わせ、この溶液を多数の部位に皮内注射することにより免疫処置する。１ヶ月後、元の量の１／５〜１／１０の該ペプチドまたはコンジュゲートをフロイント完全アジュバントとともに多数の部位に皮下注射することによって動物に追加免疫刺激する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。動物には、力価が一定になるまで追加免疫刺激する。好ましくは、動物には、同じ抗原のものであるが、異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、および／または異なる架橋試薬によってコンジュゲートで、追加免疫刺激する。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養物においてタンパク質融合体として産生させたものであってもよい。また、ミョウバンなどの凝集剤も、免疫応答の増強に好適に使用される。
【０１２６】
実施例２：ＶＥＧＦ１６５に対する特異的ポリクローナル抗体の作製
血管新生誘発性アイソフォームＶＥＧＦ１６５に結合して阻害するが、抗血管新生性形態ＶＥＧＦ１６５ｂにはそうでないポリクローナル抗体を設計した。ＶＥＧＦ１６５の７つのＣ末端アミノ酸残基を含むペプチドＲＣＤＫＰＲＲをＫＬＨに、アミノヘキサン酸スペーサーによってカップリングさせ、ウサギの免疫処置に使用した。ポリクローナル抗体を含有する血清を、免疫処置したウサギから収集した。
【０１２７】
免疫処置のためのペプチド−ＫＬＨコンジュゲートの調製
ペプチドのチオール基は、合成後に減少する傾向を有するため、ＫＬＨまたは樹脂いずれかへのカップリング前にペプチドのチオール基を確認した。
【０１２８】
１．５ｍＭのエルマン試薬（ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸）を０．１ＭのＮａＰｉ（ｐＨ７．２）中に含む溶液を調製した。
【０１２９】
２．約１ｍｇのペプチドを褐色チューブ内に量り入れた。
【０１３０】
３．０．５ｍｌの試薬を添加した。溶液は明黄色になった。
【０１３１】
４．混合物をバッファー中で１／５０に希釈した。同じ濃度の試薬に対して、４１２ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０１３２】
５．チオール基に対するペプチドの見かけ分子量を、モル吸光係数１４，０００を用いて計算した。結果を、該ペプチドの予測分子量と比較した。数値は、３桁（ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ）以内は一致するはずであるが、通常、見かけ分子量の方が大きい。チオール濃度が異常に低い場合、すなわち見かけ分子量が非常に大きい場合、ペプチドに何か不具合がある可能性がある。いずれにせよ、おそらくカップリングが充分ではない。チオール基は、次いで、ペプチドを過剰のＤＴＴで還元し、Ｐ２カラムに通すと再生されるはずである。
【０１３３】
ＫＬＨとのペプチドのカップリング（２匹のウサギ用、５回注射／ウサギ）：
１．１００ｍｇのスカシガイヘモシニアン（ＫＬＨ）を２ｍｌの水に溶解させ、超音波処理し、ボルテックスし、４℃で約４時間、回転装置上に置いた。
【０１３４】
２．この溶液を、２リットルの０．１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ７．８）に対して一晩透析した。これは、混入チオールまたはアミノ化合物（あれば）を除去するためである。
【０１３５】
３．この溶液を、微量遠心管内で最高速度で１０分間スピンさせ、凝集物を除去した。
【０１３６】
４．−ＳＨおよび−ＮＨ２カップリングのために、ＫＬＨ溶液を２つのアリコートに分けた。
【０１３７】
５．−ＮＨ２カップリングでは、５ｍｇのペプチドを一方のアリコートに添加した後、グルタルアルデヒドを最終０．１％まで添加した。ペプチドは、固形物として、またはＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍｌのストックから添加した。過剰量（ｇｌｕｔ）を添加した後、ｐＨ紙を用いてｐＨを確認し、ＮａＯＨを用いて７．８に調整した。この溶液を、静かに回転させながら４℃で８〜１２時間インキュベートした。
【０１３８】
６．微量のＮａＢＨ４を添加して、過剰量を死滅させ（起泡（ｆｉｚｚ  ｕｐ）する傾向があるため大型チューブ内で）、溶液を４℃で８〜１２時間インキュベートした（ｗａｓ  ｉｎｃｕｂａｔｅ）。
【０１３９】
７．−ＳＨカップリングでは、ＫＬＨの他方のアリコートを室温まで昇温させた。ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの容量の１／９を添加した（ヨードアセトアミド試薬は、光から保護すべきである）。ＩＡＡ−ＮＨＳエステルもまた、Ｓｉｇｍａから購入され得る。
【０１４０】
８．室温で１０分後、ＫＬＨは少し濁り始める。これを、０．１Ｍのリン酸Ｎａ（ｐＨ７．８）で平衡化したＰ−１０カラム内に負荷した（カラムは、試料の少なくとも１０倍容量である）。ＫＬＨ含有画分を色によってプールした（いくぶん灰色がかった緑色であった）。５ｍｇのペプチドを、上記の工程５の場合のようにして添加した。この溶液を、静かに回転させながら４℃で少なくとも８時間インキュベートした。
【０１４１】
９．この２つの手順でカップリングさせたペプチドをプールし、０．１５ＭのＮａＣｌで５ｍｌに希釈し、激しく超音波処理して分解させた。免疫原を１ｍｌのアリコートに分け（各アリコートは、２匹のウサギの免疫処置のため）、凍結させた。
【０１４２】
免疫処置は、以下のようにして行なった。
【０１４３】
【表１】
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プールした血清を、以下のようにして調製したペプチド−ＫＬＨカラムにおいてアフィニティ精製し、単一特異性ポリクローナル抗体調製物を作製した。
【０１４４】
ＮＨＳ活性化樹脂とのペプチド−ＫＬＨのカップリング
１．ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、予備活性化アガアロースマトリックスである。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド）カップリングにより、第１級アミノ基を含むリガンドとの化学的に安定なアミド結合が形成される。ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによりスペーサーアームが提供され、したがって、低分子タンパク質およびペプチドリガンドの固定化に特に好適である。高い安定性とスペーサーアームが、樹脂の高い流動性と安定性という特性と組み合わされることにより、医薬としての使用に魅力的となる。
【０１４５】
２．カップリングさせたゲルは、特定の物質（例えば、ＫＬＨ−カップリングペプチド抗原）を単離することができる親和性吸着体を調製するために使用され得（ｃａｎ  ｉｓ）、単一の工程で非常に高純度が得られる。
【０１４６】
３．カップリング反応は高速であり、自発的ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは懸濁液として供給される。活性化マトリックスとのリガンドのカップリングは、ゲルの洗浄、その後カップリングを伴う。
【０１４７】
４．カップリングに使用されるバッファーは、カップリングバッファー：０．２ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．３）、酸性化溶液：１ｍＭのＨＣｌ（低温に維持）、ブロックバッファー：０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．３）、洗浄バッファー：０．１Ｍの酢酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）、保存バッファー：２０％エタノール／ＰＢＳ、平衡バッファー：ＰＢＳである。
【０１４８】
アフィニティ精製した血清は、最終的に、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置を用いて限外濾過した。
【０１４９】
抗体の特異性を、抗体精製画分とＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１６５ｂとのインキュベーションにより、ウエスタンブロット解析によって測定した。
【０１５０】
ウエスタンブロットプロトコル：
１０％脱脂粉乳／ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ中で一晩ブロッキング；
一次抗体−２．５％ブロック溶液中で２時間、１：５０に希釈したウサギ全血清；
二次抗体−２．５％ブロック溶液中で１：８０００に希釈し、ｘ線に２０秒間曝露したヤギ抗ウサギ
図２に示されるように、アフィニティ精製したポリクローナル抗体画分（エキソン８ａのＲＣＤＫＰＲＲのエピトープに対して生成）は、ＶＥＧＦ１６５を検出するがＶＥＧＦ１６５ｂは検出せず（左パネル）、一方、ＶＥＧＦ１６５ｂに特異的な抗体（エキソン８ｂのエピトープＳＬＴＲＫＤに対して生成）は、ＶＥＧＦ１６５ｂを認識するがＶＥＧＦ１６５は認識しない（右パネル）。
【０１５１】
この精製抗体は、
ＥＬＩＳＡ（Ｐｅｒｒｉｎら，ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００５，４８，２４２２；Ｖａｒｅｙら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，１；
遊走アッセイ（Ｂａｔｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，６２，４１２３に記載）；
眼血管新生（Ｋｏｎｏｐａｔｓｋａｙａら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  ２００６２６，６２６に記載）；
インビボ腫瘍試験（Ｒｅｎｎｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，４４，１８８３に記載）；
免疫組織化学検査（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ−Ｊｏｎｅｓら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７，Ｂｒ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７，２２３に記載）
によってさらに評価される。
【０１５２】
実施例３：ＶＥＧＦ１６５に対するポリクローナル抗体は内皮細胞遊走を阻害する
遊走の阻害を、Ｂａｔｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，６２，４１２３−４１３１に記載のようにして試験した。アッセイは、コラーゲンコートポリカーボネート製のフィルター挿入体（８ｍ孔径；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む変形型２４ウェルＢｏｙｄｅｎチャンバにて行なった。フィルターを、０．５ｍｌ／ウェルのＶＥＧＦアイソフォームを４〜８０ｎｇ／ｍｌの精製抗体画分とともに、またはなしで入れた２４ウェルプレート内に配置した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を無血清培地中に懸濁させ、２５，０００個の細胞を各ウェルの上側のチャンバに添加した。プレートを６時間インキュベートして遊走させ、培地を除去し、両方のチャンバをＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．２ｍｇ／ｍｌのチアゾリルブルー（ＭＴＴ）を両方のチャンバの培地に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。培地を除去し、チャンバをＰＢＳで２回洗浄した。上側のチャンバ内の非遊走細胞の結晶（青色に染色）を綿棒で取り出し、これを１ｍｌのＤＭＳＯに入れ、ＭＴＴ生成物を溶解させた。また、遊走細胞結晶（該挿入体の裏面上）もＭＴＴに溶解させた。試料を一晩放置し、生成物の完全な溶解に可能にさせた。分光測光器を使用し、５７０ｎｍの波長で可溶性ＭＴＴの吸光度を測定した。次いで、遊走割合を、下側のウェルの強度から両ウェルの全強度に対する割合として計算した。
【０１５３】
図３に示されるように、ポリクローナル抗体の用量の増大によって、ＶＥＧＦ１６５媒介性ＨＵＶＥＣ遊走の用量依存的阻害がもたらされる。
【０１５４】
また、エキソン８ａに対する抗体のＨＵＶＥＣ遊走に対する効果を、ＶＥＧＦ１６５ｂまたはＬｕｃｅｎｔｉｓＴＭ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）のＦａｂ抗体断片）と組み合わせて試験した。図４Ａ、４Ｂおよび５に示されるように、ＶＥＧＦ１６５ｂとＬｕｃｅｎｔｉｓＴＭは、ともに、エキソン８ａに対するポリクローナル抗体の阻害効果を増大させる。さらに、ＶＥＧＦ１６５ｂと組み合わされたエキソン８ａに対するポリクローナル抗体の阻害効果は、ＶＥＧＦ１６５ｂと組み合わされたＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）／ｌｕｃｅｎｔｉｓの阻害効果よりも大きかった。
【０１５５】
実施例４：モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（最初にＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５によって記載）を用いて作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１５６】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターまたはマカクザルなど）を、本明細書において上記のようにして免疫処置し、免疫処置に用いた抗原に特異的に結合する抗体を産生する、または産生能を有するリンパ球を誘発させる。あるいはまた、リンパ球は、インビトロでの免疫処置によるものであってもよい。次いで、リンパ球を骨髄腫細胞と、適当な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を用いて融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１５７】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、適当な培養培地（好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を含むもの）に播種し、培養する。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を補助し、培地（ＨＡＴ培地など）に感受性であるものである。このようなもののうち、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株、例えば、ＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．ＵＳＡから入手可能）ならびにＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．ＵＳＡから入手可能）に由来するものなどである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製に関して報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１５８】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）など）によって測定される。
【０１５９】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、該クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって培養してもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水中で腫瘍としてインビボ培養してもよい。
【０１６０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から、慣用的な免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなど）によって適切に分離される。
【０１６１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、慣用的な手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として有用である。単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、次いで、該ベクターで、トランスフェクトしない場合では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）をトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え作製を以下に、より詳細に記載する。
【０１６２】
さらなる一実施形態において、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて作製した抗体ファージライブラリーから単離したものであってもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，５５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、それぞれ、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離が記載されている。その後の刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしてとしてコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２７：２２６５−２２６６（１９９３））が報告されている。したがって、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に対する実行可能な代替法である。
【０１６３】
また、ＤＮＡは、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有結合させることにより修飾され得る。
【０１６４】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに使用されるか、または抗体の抗原結合部位の１つの可変ドメインの代わりに使用され、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含む二価のキメラ抗体が創製される。
【０１６５】
実施例５：ＶＥＧＦＸＸＸアイソフォームに対する特異的モノクローナル抗体の作製
ＶＥＧＦ１６５の６アミノ酸および９アミノ酸Ｃ末端配列（ＣＤＫＰＲＲ配列番号：１、ＴＣＲＣＤＫＰＲＲ配列番号：５）の合成ペプチド断片を、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）（担体分子としての機能を果たす）にカップリングさせ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、次いで、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫処置に使用した。
【０１６６】
プロトコルの一例に従い、動物に、１００μｇのペプチド−ＫＬＨコンジュゲートをフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とともに第１、２１および４２日に皮下注射し、第６３、６４および６５日に個々にｉ．ｐ注射によって追加免疫刺激した。翌日、マウスを人道的に致死させ、脾臓を収集した。
【０１６７】
さらなる免疫処置プロトコルを以下のようにして行なった：１０匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜８週齢）を注文し、免疫処置の時点までに１週間、動物収容施設内で馴化させた。ＫＬＨにコンジュゲートさせた上記の２種類のＶＥＧＦ１６５ペプチド（ＴＣＲＣＤＫＰＲＲ配列番号：５）およびＣＤＫＰＲＲ配列番号：１）を使用した。
【０１６８】
最初の注射（時間０）−１０匹のマウス（各ペプチドについて５匹）に、１００μｌ（１００μｇ）のペプチド−ＫＨＬコンジュゲートを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とともに皮下注射した。
【０１６９】
２回目の注射（約３週間後）−マウスを、１００μｌ（１００μｇ）のペプチド−ＫＨＬコンジュゲートで不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とともに腹腔内（ＩＰ）にて免疫処置した。
【０１７０】
３回目の注射（約３週間後）−マウスを、１００μｌ（１００μｇ）のペプチド−ＫＨＬコンジュゲート（ＰＢＳ中）でＩＰにて免疫処置した。
【０１７１】
４回目の注射（１日後）−マウスを、１００μｌ（１００μｇ）のペプチド−ＫＨＬコンジュゲート（ＰＢＳ中）でＩＰにて免疫処置した。
【０１７２】
最後の注射（１日後）−マウスを、１００μｌ（１００μｇ）のペプチド−ＫＨＬコンジュゲート（ＰＢＳ中）でＩＰにて免疫処置した。
【０１７３】
収集（最後の注射の１日後）−免疫処置したマウスを致死させ、融合のため、Ｓｏｕｔｈｍｅａｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＮＢＳ）に移した。
【０１７４】
脾細胞をＮＳＯマウス骨髄腫細胞株と、ポリエチレングリコールを用いて融合させた。融合細胞を９６ウェルプレート内で２週間培養した。ＥＬＩＳＡスクリーニングによって決定された陽性ウェルの細胞を、９６ウェルプレート内で連続希釈し、１０％ＤＭＥＭおよびハイブリドーマクローニング増強因子中で培養した。各プレートで１００％陽性が３回連続して得られるまで、同じ手順を繰り返した。スクリーニングは、ヤギ抗ヒトＶＥＧＦ抗体（ＰＢＳ中０．８μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）をコートしたＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ＨＢ  Ｆｌａｔ  ｗｅｌｌの９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｄ．）において行なった。ＰＢＳ／Ｔで洗浄後、１００μｌの２ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５または組換えＶＥＧＦ１６５ｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに添加し、振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、ハイブリドーマ細胞での条件培地１００μｌを添加し、振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００，ＤＡＣＯ）を添加し、振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートした。最終洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を、プレート読取装置を用いて測定した。ＶＥＧＦ１６５について陽性であるがＶＥＧＦ１６５ｂについては陰性である試料を選択した（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ）。モノクローナル抗体を精製および濃縮するため、選択されたハイブリドーマ細胞クローンを、１０％ウシＩｇＧ枯渇ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）を１００単位のペニシリン、１００μｇのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンとともに含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）中で培養した。モノクローナル抗体を、プロテイン−Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）にて精製した。抗体を、ビバスピン２０（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濃縮し、最後にＰＢＳに溶解させた。
【０１７５】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用し、以下のプロトコルを用いて各モノクローナル抗体クローンを試験した。
【０１７６】
抗原コート−６アミノ酸ペプチドおよび９アミノ酸ペプチドの両方に対して：
１．ＶＥＧＦ１６５遊離ペプチド：１０ｍｇ／ｍｌ（ストック濃度）、作業濃度１０μｇ／ｍｌ。
【０１７７】
２．ＶＥＧＦ１６５−ＢＳＡペプチド：５ｍｇ／ｍｌ（ストック濃度）、作業濃度１０μｇ／ｍｌ。
【０１７８】
３．ＶＥＧＦ１６５ｂ（陰性対照）：ＢＳＡ＋ペプチド、ストック濃度、１ｍｇ／ｍｌ；作業濃度、炭酸塩コート溶液中１ｕｇ／ｍｌ（１：１，０００）
４．ＶＥＧＦ１６５ｂ  ６アミノ酸−ＢＳＡ、ストック濃度、２．５ｍｇ／ｍｌ；作業濃度、１ｕｇ／ｍｌ（１：２，５００希釈）
５．ペプチド−ｍｙｃ（骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ）：（陰性対照）ｍｙｃ−ＢＳＡ、ストック濃度、１．４ｍｇ／ｍｌ；作業濃度、炭酸塩コート溶液中１ｕｇ／ｍｌ（１：１，４００）。
【０１７９】
７５μｌ／ウェルを添加し、振とうしながら３７℃で１５分間または１時間放置する。
【０１８０】
ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
【０１８１】
細胞上清の添加（おそらくモノクローナル抗体を含む試料）：
７５μｌ（２４ウェルプレート由来のもの）、または７５μｌの希釈試料（９６ウェルプレート由来のもの）をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ内で添加する（ペプチドは清浄であり、ＢＳＡでのブロックは必要でない）。
【０１８２】
ウェルを振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートする。
【０１８３】
二次抗体の添加：
ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ  Ａ  ０４１２）の１：２，５００希釈物を、低バックグラウンドでのペプチド検出のために使用した）。振とうしながら３７℃で１５分間のインキュベーション。
【０１８４】
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回の洗浄
基質の添加：
クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．０）を室温まで昇温させた。
【０１８５】
このクエン酸リン酸バッファー３０ｍｌに、３０ｍｇのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．−８４１２）を溶解させ、１５μｌのＨ２Ｏ２を使用直前に添加し、室温で１５分間インキュベーションした。
【０１８６】
停止：
停止溶液：１００ｕｌ／ウェルの１ＭのＨＣｌ（４０ｍｌの濃ＨＣｌを、４２４ｍｌのｄＨ２Ｏを入れた瓶に添加）を添加した。
解析：
４９２ｎｍにおける吸光度を、プレート読取装置を用いて測定した。
【０１８７】
実施例６：アゴニストＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体の効力を測定するための遊走アッセイ
ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に対するモノクローナル抗体の効力を測定するため、ＥＣＶ３０４内皮細胞を用いた遊走阻害アッセイを使用した。このアッセイは、抗体が、ＶＥＧＦ１６５および／またはＶＥＧＦ１６５ｂによる刺激に応答したＥＣＶ３０４内皮細胞の遊走を阻害する能力を測定するものであり、以下のようにして行なわれる。
【０１８８】
ＥＣＶ３０４内皮細胞を無血清培地中で１５〜１６時間飢餓状態にする。
【０１８９】
８μｍの挿入体を２００μｌの結合因子でコートし、４℃で一晩または３７℃で１時間超放置する。溶液を除去し、挿入体を細胞培養フード内に放置して風乾させる。
【０１９０】
細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、５分間トリプシン処理する（フラスコを注意深く掌ではたくことにより、すべての細胞が剥離したことを確認する）。
【０１９１】
細胞をスピンダウンし、既知の小容量の培地＋０．１％ＦＣＳ中に懸濁させる。
【０１９２】
細胞を計数し、５００μｌ中１００，０００細胞（２００，０００細胞／ｍｌ）に希釈する。
【０１９３】
化学誘引物質溶液（５００μｌ／ウェル）を調製する。
条件（１ｎＭは４０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５である）：
１．陽性対照（５％ＦＣＳ、すなわち通常の完全培地）
２．陰性対照（０．１％ＦＣＳ、すなわち低血清）
３．０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
４．１０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
５．２０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
６．４０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
７．６０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
８．８０ｎＭの抗体＋１ｎＭのＶＥＧＦ１６５
溶液は、滅菌されたもの、または滅菌濾過したものであるのがよい。
【０１９４】
２４ウェルプレート（懸濁用プレート  浮遊培養用のＧｒｅｉｎｅｒ、６６２１０２であって組織用プラスチック製ではない）を使用し、５００μｌの化学誘引物質溶液（結合因子Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，ｓ−００６−１００）をウェルの底面に添加する。
【０１９５】
挿入体（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＰＣＦ、ＰＩ８ＰＯ１２５０）を風乾させ、５００μｌの細胞懸濁液をウェル内に添加する。挿入体の下方で気泡を発生させずに、注意深く挿入体をウェル内に入れる。
【０１９６】
プレートをインキュベータ内で６時間インキュベートし、遊走を行なわせる。
【０１９７】
両方の層から培地を除去し、上面と底面をＰＢＳで２回洗浄する。
【０１９８】
３００ＵＬの４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを各ウェルに添加し、ウェルを１５分間放置する。
【０１９９】
培地を吸引除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄する。
【０２００】
２００ＵＬのＨｏｅｃｓｔ染料（５ＵＧ／ｍｌ、ストックをＰＢＳ／Ｔ中で１：２０に希釈）を各ウェルに添加し、ウェルを暗所に３０〜４５分間放置する。
【０２０１】
ウェルを０．５％ＰＢＳ／ｔｒｉｔｏｎで３回およびＰＢＳで２回洗浄し、非遊走細胞を綿棒で除去する。
【０２０２】
メスの刃を用いて膜を注意深く切り出し、この膜を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｈ−１０００）を用いてスライド上に載せ、マニキュア液で密封する。
【０２０３】
遊走細胞を、４０倍の倍率を使用し、１０個のランダムな視野において（少なくとも２つの視野は、挿入体の縁から離れている）計数し、挿入体の縁周囲の非遊走細胞および／または非除去細胞の蓄積（あれば）を明らかにする。
【０２０４】
基礎／対照では、１５〜３０細胞／視野を、ＶＥＧＦ１６５では、４０ｎｇ／ｍｌ  ８０〜１５０（対照と比べて４〜５倍）を計数する。ＶＥＧＦ１６５ｂ  ４０ｎｇ／ｍｌそれ自体では、約１．５〜２倍の増大が得られ、ＶＥＧＦ１６５＋１６５ｂでは、遊走が約３倍に低減される。
【０２０５】
ミリポア挿入体では、遊走％の計算は：
［（細胞計数／挿入体／０．００２８６３７）／１×ｌ０５］＊１００
０．００２８６３７＝Ｆａｌｃｏｎの５ｍｍ直径のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ挿入体の場合での視野によって占有される挿入体の面積であり、この値は０．００４７７である。
【０２０６】
図６に示されるように、ＶＥＧＦ１６５のエキソン８ａに対して生成させたモノクローナル抗体は、遊走を用量依存的に阻害する。図７は、アゴニストＶＥＧＦアイソフォーム（ｉｓｆｏｒｍ）ＶＥＧＦ１６５に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を試験した内皮細胞遊走アッセイの結果を示す。
【０２０７】
実施例７：抗ＶＥＧＦｘｘｘの安全性薬理学的プロフィールの特性評価
血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘ）に対する抗体を単独およびＶＥＧＦ１６５ｂとの組み合わせで試験する。動物およびヒトにおけるＶＥＧＦｘｘｘ特異的抗体の安全性プロフィールは、ＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ遮断薬で見られるものよりも良好であると予測される。
【０２０８】
ＶＥＧＦは、多面的因子として作用することがわかっている。これは、血管新生を調節するだけでなく、体内の多くの細胞および組織（ニューロン、網膜色素細胞、腎臓内の有足突起または正常および成熟血管など）に対して生存因子としての機能も果たす。ＶＥＧＦが完全に欠損すると（例えば、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態と抗血管新生性形態を識別しない抗体およびＶＥＧＦＲ遮断薬によってもたらされる）により、患者は、網膜損傷、出血および蛋白尿および腎臓障害、ならびにさらなる重篤な有害事象に曝露され得る。
【０２０９】
ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に対して特異的に標的化される抗体は、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態を排除し、抗血管新生性形態に対して寛容であるため、より安全でより有効であることが予測される。これにより、ＶＥＧＦの抗血管新生性形態がＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２に結合して抗血管新生と細胞保護をもたらすことが可能になる。血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに特異的な抗体の安全性プロフィールは、いくつかのアッセイにて特性評価される。
【０２１０】
心血管安全性プロフィール
ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に対する抗体の心血管安全性プロフィールは、抗ＶＥＧＦｘｘｘまたはＶＥＧＦ１６５ｂまたはＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）で処置した動物の血圧の測定によって特性評価する。現在利用可能な治療アプローチでは血圧が上昇するが、血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに特異的な抗体は、動物およびヒトにおいて、より良好な安全性心血管プロフィールを有すると予測される。
【０２１１】
ＶＥＧＦインヒビターの重篤な副作用としては、有意な蛋白尿が挙げられる。ＶＥＧＦ１６５ｂは蛋白尿を誘発しないことが示されており、したがって、ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体は、上記の薬物で見られるものよりも良好な腎臓安全性プロフィールを有する。ＶＥＧＦの血管新生誘発性アイソフォームに特異的な抗体の効果は、糸球体内皮細胞透過性アッセイによってインビトロおよびインビボで確認される。ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体は、糸球体内皮細胞内のＶＥＧＦ１６５によって誘発される透過性を阻害する。
【０２１２】
血圧の測定は、抗ＶＥＧＦ抗体およびＶＥＧＦＲ  ＴＫＩとの比較において行なわれる。現在利用可能な治療剤では血圧が上昇するが、血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに特異的な抗体は、より良好な安全性心血管プロフィールを有すると予測される。
【０２１３】
内皮細胞に関する細胞傷害性アッセイ
ＶＥＧＦインヒビターは、毛細血管の退縮および内皮細胞死を引き起こすことが示された。ＶＥＧＦ１６５ｂは、培養状態の内皮細胞に対して細胞傷害性ではなく、対照的に細胞保護的であるが、ＶＥＧＦ１６５ｂ抗体は細胞傷害性を増大させる。細胞の生存に対するＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体の効果は、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ遮断薬の比較によって特性評価する。
【０２１４】
網膜色素上皮細胞に関する細胞傷害性アッセイ
細胞保護因子であるＶＥＧＦ１６５ｂは、潜在的な網膜用眼科治療薬である。ＶＥＧＦ１６５ｂが網膜色素上皮細胞に対して毒性であるか保護的であるかを調べるため、ＲＰＥ細胞を血清飢餓状態にし、ＶＥＧＦ１６５ｂまたはＶＥＧＦ１６５ｂに対する抗体で処理し、細胞細胞傷害性をＬＤＨアッセイによって測定した。結果は、ＶＥＧＦ１６５ｂがＲＰＥ細胞の内在性生存因子であることを明白に示す。ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体は、血清枯渇によって誘発される網膜色素上皮細胞死の阻害に関して試験される。
【０２１５】
インビトロでのニューロンに関する細胞傷害性アッセイ
ＶＥＧＦ１６５ｂは、他の細胞型に対しても細胞保護的である。新生仔ラット由来の海馬ニューロンは、グルタミン酸化合物による興奮毒性中、ＶＥＧＦ１６５によって細胞死から救済されることが以前に示された。ＣＡ１またはＣＡ３ニューロンをＶＥＧＦ１６５ｂで処理すると、グルタミン酸化合物誘発性細胞傷害性が低減された。ＶＥＧＦ１６５ｂに再生効果があるかどうかを調べるため、成体ラット由来の後根神経節を、培養状態で解離させた後にＶＥＧＦ１６５ｂに供し、軸索長を測定した。ＶＥＧＦ１６５ｂ処理により軸索長が長くなることが示され、これは、ＶＥＧＦ１６５ｂが、インビトロで細胞保護特性およびニューロン再生特性を有することを示す。
【０２１６】
血管新生誘発性ＶＥＧＦアイソフォームに対する抗体での処置の細胞保護効果は、ＶＥＧＦ１６５ｂでの同時処置ありまたはなしで、適切なモデルにおいて、細胞保護に対する効果を特性評価するためにＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ  ＴＫＩとの比較において試験される。
【０２１７】
実施例８：ヒト化抗体およびヒト抗体
ヒト化抗体は、典型的には、非ヒトＣＤＲがグラフティングされたヒトフレームワークを有する。したがって、ヒト化抗体には、非ヒト供給源由来の１つ以上のアミノ酸配列が内部に導入されている。このような非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、これは、典型的には「輸入」可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従い、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体の配列の代わりに使用することにより行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、実質的にあまりインタクトでないヒト可変ドメインが、対応する非ヒト種由来配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基および場合によっては一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体の相似部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【０２１８】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖ともに）の選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメイン配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として採用される（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３））。
【０２１９】
抗体が、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的特性を保持するようにヒト化することは、さらに重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用し、親配列および種々の概念的ヒト化産物の解析プロセスによって作製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定３次元コンホメーション構造を図示および表示するコンピュータプログラムも利用可能である。このような表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における該残基の考えられ得る役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能となる。このようにして、ＦＲ残基がレシピエント配列および輸入配列から選択されて結合され得、その結果、所望の抗体特性（標的抗原（１つまたは複数）に対する親和性の増大など）が得られる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対する影響に、直接かつ大部分において関与している。
【０２２０】
あるいはまた、現在、免疫処置すると、内因性免疫グロブリン産生なしで、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体生成の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原刺激によってヒト抗体の生成がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーに由来するものであってもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０２２１】
実施例９：抗体断片
抗体断片の作製のための種々の手法が開発されている。従来より、このような断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化によって誘導されるものであった（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、このような断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生させることができる。例えば、抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいはまた、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接に単離することができる。抗体断片の作製のための他の手法は当業者に自明であろう。他の実施形態において、一般的に好まれる抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。
【０２２２】
実施例１０：腎臓安全性プロフィール
本発明は、ＶＥＧＦの血管新生誘発性のアイソフォームに特異的であるが、ＶＥＧＦの抗血管新生性形態に対しては寛容である抗体を提供する。有意な蛋白尿は、ＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ遮断薬での処置と関連している。
【０２２３】
種々の報告によれば、３０％を超えるＡＶＡＳＴＩＮ処置患者は蛋白尿に苦しんでおり、これは、前臨床試験およびヒト臨床試験でも観察された。Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ  Ｆら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；２１：６０−６５；ＮＥＪＭの２００４  ３５０；２３３５−２３４２；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８（１５）：１２６０５。この現象は、おそらく、同様に内皮生存因子でもあるＶＥＧＦが、有足突起のオートクライン生存因子であるためである。抗ＶＥＧＦ抗体は細胞死を増大させるが、これは、ＶＥＧＦ１６５置換により低減される。ここに、ＶＥＧＦ１６５ｂは、血清飢餓状態のヒト有足突起の生存因子であることがわかったことを開示する（図８に図示（ａｓ  ｓｈｏｗｎ  ｉｓ））。
【０２２４】
本明細書に開示のように、ここに、ＶＥＧＦ１６５ｂは蛋白尿を誘発しないこと、およびＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体は、抗血管新生性形態に対して寛容であり得るため、既知の薬物で見られるものよりも良好な腎臓安全性プロフィールを有することは好都合であることを示す。
【０２２５】
腎機能は、実験動物から採取した尿において測定した尿中クレアチニン／タンパク質比によって特性評価した。試験対象動物には、１００ｕｇのＶＥＧＦ１６５ｂの全身投与によって処置したヒト腫瘍を有するマウス；および糸球体の有足突起においてＶＥＧＦ１６５ｂを過剰発現するトランスジェニックマウス（図９）；ならびに高血圧が測定された後に１ｍｇのＶＥＧＦ１６５ｂを注射したラットを含めた。すべてのモデルにおいて、尿中クレアチニン／タンパク質比によって特性評価した腎機能は正常であることがわかった。
【０２２６】
インビトロでの糸球体内皮細胞の透過性に対する効果
ＶＥＧＦ１６５は、血管透過性を増大させることがわかっており、ＶＥＧＦ１６５発現によって水に対する腎臓の高い透過性が維持され、他の組織における透過性が増大すると考えられるのは、この機構のためである。経上皮電気抵抗アッセイを使用すると、ＶＥＧＦ１６５ｂは、糸球体内皮細胞内でＶＥＧＦ１６５によって誘導される透過性を阻害することが示された（図１０）。ヒト条件的不死化糸球体内皮細胞を２時間血清飢餓状態にし、次いで、何もなし（対照）、１ｎＭのＶＥＧＦ１６５、１ｎＭのＶＥＧＦ１６５ｂまたは１ｎＭのＶＥＧＦ１６５＆１ｎＭのＶＥＧＦ１６５ｂの組合せのいずれかに応答した、培養単層状態の糸球体内経内皮電気抵抗を測定した。結果は、対照（すなわち、時間点０分、ＳＥＭ）に対する平均増加倍数である。ｎ＝５、プリズムによるデータ解析：ｐ±＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、反復測定、ボンフェローニポストテストによる。対照対ＶＥＧＦ１６５  ｐ＜０．００１、対照対ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｐ，０．０１、対照対両者ｐ＞０．０５、ＶＥＧＦ１６５対ＶＥＧＦ１６５ｂと両者  ｐ＜０．００１、ＶＥＧＦ１６５ｂ対両者  ｐ＜０．０１。ＳＳＰＳを用いたデータ解析、全般的なｐ値＞０．０００５  一元配置ＡＮＯＶＡ、反復測定、ポストホックボンフェローニ  対照対ＶＥＧＦ  ０．００１、対他のＮＳＶＥＧＦ対他の３つの群  すべて有意  １６５対両者  ０．０３７。ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体が、糸球体内皮細胞内でＶＥＧＦ１６５によって誘導される透過性も阻害することは、好都合である。
【０２２７】
インビボでの糸球体の透過性に対する効果
ＶＥＧＦ１６５は、インビボで、蛋白尿を誘発し、糸球体の透過性を増大させることが示された。ＶＥＧＦアンタゴニストもまた、インビボで蛋白尿および糸球体の透過性を増大させる。しかしながら、有足突起特異的ネフリンプロモーターの制御下でＶＥＧＦ１６５ｂを１８ヶ月発現させているマウスでは、水に対する糸球体の透過性（透水率）の有意な低下がみとめられる（図１１）。インビボでの糸球体におけるＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体での連続的処置の効果を調べるため、ＶＥＧＦ１６５ｂを１８ヶ月発現しているトランスジェニックマウスから単離した糸球体の透過性を測定した。糸球体は、１８ヶ月齢の野生型でヘテロ接合型またはホモ接合型のｐｏｄ−ＶＥＧＦ１６５ｂマウスから単離したものであり、透水率は、単位容積あたりの単位面積あたりで測定されたものである（ＬｐＡ／Ｖｉ）。ホモ接合型マウスは、ヘテロ接合体と比べて低い透過性を有し、これは遺伝子量効果を示す。ＶＥＧＦの血管新生誘発性形態に特異的な抗体での処置の効果は、腎臓安全性プロフィールに対する効果を特性評価するために他のＶＥＧＦスカベンジャーおよびＶＥＧＦＲ  ＴＫＩとの比較において同様に試験される。
【０２２８】
具体的な実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を充分に示したものであるため、第三者は、この知識を応用することにより、必要以上に実験を行なうことなく、および本一般概念から逸脱することなく、種々の適用のために、かかる具体的な実施形態を容易に変形および／または適合させることができよう。したがって、かかる適合および変形は、開示した実施形態の均等の意味および均等範囲に包含されるはずであり、包含されることを意図する。本明細書で用いる語法または専門用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。手段、材料、および開示した種々の機能の実施工程には、本発明から逸脱することなく、さまざまな択一的形態が採用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2011504092.tif 000010
【図９】
2011504092.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011504092.tif 000015
2011504092.tif 000016
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