(57)【要約】  本発明は、加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３）の存在下において、アミノ酸のＣ末端ｔ−アルキルエステルまたはペプチドのＣ末端ｔ−アルキルエステルをアルコール（エステルのｔ−アルキル基に相当するｔ−アルコール以外）でエステル交換するステップを含んでなる、任意にＮ−保護されるアミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを調製する方法に関する。本発明は、ペプチド結合形成を触媒する酵素の存在下において、ペプチド結合を通じて、活性化Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルと、任意にＣ末端が保護されるアミノ酸または任意にＣ末端が保護されるペプチドとをカップリングするステップを含んでなる、ペプチドを調製する方法にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＮ−保護アミノ酸のｔ−アルキルＣ末端エステルまたは第１の任意にＮ−保護されるペプチドのｔ−アルキルＣ末端エステルを活性化アルコールでのエステル交換によって活性化し、活性化が加水分解酵素によって触媒され、それによって第２のＮ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは第２の任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを形成するステップと、
第２のエステルと任意にＣ末端が保護されるアミノ酸または任意にＣ末端が保護されるペプチドとをカップリングしてペプチド結合を形成し、カップリングがペプチド結合形成を触媒する酵素によって触媒され、酵素がエステル交換を触媒するのに使用される酵素と同一でもまたは異なってもよいステップと
を含んでなる、活性化Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは活性化任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルをカップリングするステップを含んでなる、ペプチドを調製する方法。
【請求項２】
アミノ酸またはペプチドのＣ末端ｔ−アルキルエステルが、ｔ−ブチルエステル、ｔ−ペンチルエステル、およびｔ−ヘキシルエステルの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所望のアミノ酸配列のペプチドが得られるまで、連続的に１つ以上のさらなるエステル交換ステップおよびカップリングステップが実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
所望のアミノ酸配列のペプチドが得られるまで、連続的に１つ以上のさらなる活性化ステップおよびカップリングステップが実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各エステル交換活性化が活性化アルコールを含んでなる液相中で起き、液相が液相総重量を基準にして４重量％未満の水、特に２重量％以下の水、より特には１重量％以下の水を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
活性化アルコールが、任意に置換されるｎ−アルキルアルコール、任意に置換されるアラルキルアルコール、および任意に置換されるアリールアルコールの群から、特にＣ１〜Ｃ６ｎ−アルキルアルコール、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルコール、およびＣ７〜Ｃ１８アラルキルアルコールから、好ましくはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、およびベンジルアルコールから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
加水分解酵素の存在下において、Ｎ−保護アミノ酸のＣ末端ｔ−アルキルエステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドのＣ末端ｔ−アルキルエステルを第１のエステルのｔ−アルキル基に対応するｔ−アルキルアルコール以外のアルコールでエステル交換するステップを含んでなる、Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを調製する方法。
【請求項８】
エステル交換がアルコールを含んでなる液相中で実施され、液相が４重量％未満の水、特に２重量％以下の水、より特には１重量％以下の水を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルコールが、一級アルキルアルコール、二級アルキルアルコール、任意に置換されるアリールアルコール、および任意に置換されるアラルキルアルコールの群から、特にＣ１〜Ｃ６一級または二級アルキルアルコール、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルコール、およびＣ７〜Ｃ１８アラルキルアルコールから選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
調製されるＣ末端エステルが、動的ペプチドカップリングによって、別のアミノ酸またはペプチドをアミノ酸またはペプチドにカップリングするのに適した活性化エステルであり、好ましくはメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、任意に置換されるフェニルエステルまたは任意に置換されるベンジルエステルである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エステル交換が、エステル交換されるＣ末端ｔ−アルキルエステルの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％に対して行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
加水分解酵素の存在下において、Ｎ−保護アミノ酸のＣ末端カルボン酸基または任意にＮ−保護されるペプチドのＣ末端カルボン酸基をｔ−アルキルアルコールでエステル化するステップを含んでなる、Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端ｔ−アルキルエステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端ｔ−アルキルエステルを調製する方法。
【請求項１３】
エステル化がアルコールを含んでなる液相を使用して起き、液相が液相の総重量を基準にして４重量％未満の水、特に２重量％以下の水、より特には１重量％以下の水を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｔ−アルキルが、ｔ−ブチル、ｔ−ペンチル、およびｔ−ヘキシルの群から選択される、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
カルボン酸エステル加水分解酵素、チオールエステル加水分解酵素、リパーゼ、およびペプチダーゼの群から、特にリパーゼおよびペプチダーゼから選択される加水分解酵素が使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酵素が、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼの群、特にセリンエンドペプチダーゼから選択されるペプチダーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
セリンエンドペプチダーゼがサブチリシン、好ましくはサブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、活性化Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルをカップリングするステップを含んでなる、ペプチドを調製する方法に関する。本発明は、Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを調製する方法にさらに関する。
【０００２】
ペプチド、特にオリゴペプチドは、例えば医薬品、食品または飼料成分、農薬または美容の成分としての多数の用途を有する。
【０００３】
本発明の目的では、ペプチドとはあらゆる２個以上のアミノ酸の鎖を意味する。本発明の目的では、「オリゴペプチド」とは、２〜２００個のアミノ酸ベースの、特に２〜１００個のベースの、より特に２〜５０個のアミノ酸ベースの、好ましくはあらゆる２〜２００個のアミノ酸の、より好ましくは２〜１００個のまたは２〜５０個のアミノ酸の直鎖ペプチドを意味する。「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチドについて規定されるよりもより多数のアミノ酸をベースとするペプチドについて使用される。
【０００４】
化学酵素的ペプチド合成は、本発明の目的では、ペプチド結合が酵素カップリング反応によって形成されるペプチド合成と定義され、化学ペプチド合成に優るいくつかの利点を有する。例えば大規模生産の場合、アミノ酸側鎖保護が皆無または限定的にしか必要でないという事実のために、原価がより低い。また本方法はより環境に優しい。例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ＥＤＣＩ）などの化学量論量の有毒化学試薬が必要でない。さらにこのような方法は、より少ない有機溶剤を使用して実施されてもよい。さらに酵素触媒カップリングはラセミ化を欠いており（例えば、Ｓｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１ｓｔ  ｒｅｐｒｉｎｔ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００２，ｐ２５０を参照されたい）、より純粋な生成物および／またはより容易な単離につながる。
【０００５】
化学酵素的カップリング法に関して、ペプチド結合を作り出す２つのオプションがある。いわゆる熱力学的（または平衡状態制御）アプローチでは、カルボキシ構成要素が遊離カルボン酸官能基を保持するのに対し、動力学的制御アプローチでは、好ましくはアルキルエステルの形態、例えばメチルエステル形態の活性化カルボキシ構成要素が使用される。
【０００６】
「活性化された」という用語は、アミノ酸またはペプチドがＣ末端カルボキシ基にカップリングされる動的酵素的カップリング反応において、Ｃ末端カルボキシル基がかなりの反応性を示し、特にＣ末端ｔ−アルキルエステルなどのＣ末端保護カルボキシル基と比較してより高い反応性を示すことを意味するのに使用される。活性化エステル基としては、特に任意に置換されるメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステルなどのＣ末端が任意に置換されるｎ−アルキルエステルと、特に任意に置換されるベンジルエステルなどのアラルキルエステルと、特にアミノ酸またはペプチドの任意に置換されるフェニルエステルなどの任意に置換されるアリールエステルとが挙げられる。置換基は、酸素、イオウ、および窒素などの１つ以上のヘテロ原子を含んでなる任意に保護される官能基の群から特に選択されてもよい。その例としては、水酸基、チオール基、およびアミン基が挙げられる。
【０００７】
熱力学的アプローチには３つの主要な不都合な点がある。ｉ）平衡状態は通常、ペプチド結合切断の側にあるのでカップリング収率が低い。ｉｉ）大量の酵素が通常必要とされる。ｉｉｉ）反応速度が通常非常に低い。動力学的制御アプローチでは、出発原料としてアルキルエステルを必要とするが、必要な酵素ははるかに少なく、反応時間が顕著により短く、何よりも最大入手可能収率が通常相当により高い。したがって産業上の利用では、動的アプローチに基づく、すなわち活性化カルボキシ構成要素を用いた酵素的ペプチド合成の概念は最も魅力的である（例えば、Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１ｓｔ  ｒｅｐｒｉｎｔ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ２００２，ｓｅｃｔｉｏｎ  ４．６．２を参照されたい）。
【０００８】
化学酵素的ペプチド合成は、Ｃ→Ｎ末端方向またはＮ→Ｃ末端方向で実施できる。
【０００９】
Ｃ→Ｎ末端方向の化学酵素的ペプチド合成の例をスキーム１に示す。
スキーム１
【化１】
2011500010.tif 000002
【００１０】
スキーム１では、ＰはＮ−末端保護基を表す。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立してアミノ酸側鎖を表す。スキーム１によって示されるように、Ｃ→Ｎ末端方向の酵素的合成は、式ＩＩのＣ末端保護アミノ酸と式ＩａのＮ−保護アミノ酸との酵素的カップリングに始まり、後者はこの場合はメチルエステルによってＣ−活性化される。
【００１１】
本明細書において「Ｃ末端保護」という用語は、Ｃ末端カルボキシル基に保護基を提供して、一般にカルボキシル基が別の分子のアミン基とカップリングされることから実質的に保護することを意味するのに使用される。特にＣ末端保護基は、使用されるペプチド合成条件下において、Ｃ末端カルボキシル基がアミンとカップリングされることから少なくとも実質的に保護する、Ｃ末端エステルであってもよい。一般に本発明に従った方法では、ｔ−アルキルが保護基として使用される。
【００１２】
本明細書において「Ｎ−末端保護」という用語は、Ｎ−末端アミン基に保護基を提供して、一般にＣ末端カルボキシル基のＮ−末端アミン基へのカップリングに、Ｎ−末端アミン基が加わることから少なくとも実質的に保護することを意味するために使用される。
【００１３】
式ＩＩＩの形成されたペプチドは次にＮ−脱保護されてもよく、得られた式ＩＶのペプチドは遊離アミノ官能基を保有して、引き続いて別の式ＩｂのＮ−保護（およびＣ−活性化）アミノ酸構成単位に酵素的にカップリングされて、式Ｖのペプチドの形成をもたらしてもよい。このＮ−脱保護およびカップリングサイクルを所望のペプチド配列が得られるまで反復してもよく、その後ＮおよびＣ末端保護基を除去して、所望の（非保護）ペプチドを得てもよい。もちろん式ＩａのＮ−保護アミノ酸と、式ＩＩのＣ末端保護アミノ酸の代わりに、Ｃ末端保護ペプチドとをカップリングすることも可能である。
【００１４】
Ｃ→Ｎ末端方向のペプチド合成の主な不都合な点は、各サイクル後にＮ−保護基が除去され、さらなるＮ−保護アミノ酸残基が付加されてしまうことである。アミノ酸（エステル）上への（高価な）Ｎ−保護基の導入およびペプチドカップリング後のこの同じ（高価な）Ｎ−保護基の除去、および通常、廃棄により、Ｃ→Ｎ方向のペプチド合成は実用的および経済的観点から魅力的ではない。
【００１５】
Ｎ→Ｃ末端方向の酵素的ペプチド合成の例をスキーム２に示す。
スキーム２
【化２】
2011500010.tif 000003
【００１６】
スキーム２では、ＰはＮ−末端保護基を表す。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立してアミノ酸側鎖を表す。スキーム２によって示されるように、Ｎ→Ｃ末端方向の酵素的合成はまた、式ＩＩａのＣ末端保護アミノ酸と式ＩのＮ−保護アミノ酸との酵素的カップリングに始まり、後者の化合物はこの場合はメチルエステルによってＣ−活性化される。形成された式ＩＩＩのジペプチドは次にＣ−脱保護されてもよい（下記参照）。
【００１７】
遊離カルボン酸官能基を保有する得られた式ＶＩのジペプチドを次に「再活性化」して、スキーム２の場合はメチルＣ末端エステルである、式ＶＩＩのＮ−保護ペプチドＣ末端アルキルエステルを形成してもよい。このエステル化は典型的に、アルコール（例えばメタノール）および硫酸または塩化チオニルなどの試薬を使用して、化学転換によって実施される。式ＶＩＩのＮ−保護ペプチドアルキルエステルは、引き続いて式ＩＩｂの別のＣ末端保護アミノ酸とカップリングしてもよく、これは式ＶＩＩＩのトリペプチドの形成をもたらす。このＣ−脱保護およびカップリングサイクルは、所望のアミノ酸配列が得られるまで反復してもよく、その後、Ｎ−末端およびＣ末端保護基を除去して、所望の（非保護）ペプチドを得てもよい。もちろん式ＩのＮ−保護アミノ酸と、式ＩＩａのＣ末端保護アミノ酸の代わりに、Ｃ末端保護ペプチドとをカップリングすることもできる。
【００１８】
Ｎ→Ｃ末端方向のペプチド合成は、（高価な）Ｎ−保護基の付加と除去の反復を必要としない。しかしさらなるアミノ酸残基を付加できるようにするために、２つの反応ステップが必要である。Ｃ−末端は選択的脱保護を必要とし、その後それは例えば形成されたカルボン酸基のエステル化によって、選択的に活性化されなくてはならない。したがってＮ→Ｃ末端方向のペプチド合成では、Ｎ−保護ペプチドに１個のアミノ酸残基を付加するために、全部で３つの反応ステップ（脱保護、活性化、およびカップリング）が必要である。
【００１９】
式ＩＩＩのペプチドに適したＣ末端脱保護方法は、使用される保護基Ｘ次第で選択されもよい。例えばＸがｔ−ブチルまたは別の三級アルキルである場合、ｔ−アルキル基は典型的に強酸、特にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して化学的に切断される。
【００２０】
ＴＦＡを使用したＣ末端ｔ−アルキル脱保護は、成長するペプチド鎖において、特に微量の水が存在する場合に、様々な副反応をもたらし得る。このような副反応の例は、側鎖基のｔ−アルキル化、側鎖基の脱保護、例えばペプチド結合の加水分解である、酸不安定性官能基のＮ−脱保護および加水分解である。
【００２１】
ＴＦＡの完全なまたはほぼ完全な除去は、面倒（そして高価）であるが、次のＣ末端保護アミノ酸との酵素的カップリングで使用するためなど、Ｃ末端カルボン酸を再活性化する場合、非常に重要である。
【００２２】
したがって当該技術分野で、カルボキシアミドをＣ末端保護基として使用することは有利であると見なされる（スキーム２におけるＸ＝ＮＨ２）。保護基としてのカルボキシアミドがある式ＩＩａのアミノ酸構成単位は、例えば調製が単純で対費用効果の高いワンポット工程におけるアミノ酸のメチルエステル化と、それに続くにアンモニアによるアミド化よって調製してもよい。強鉱酸水溶液を使用した、従来の手段によるカルボキシアミド切断は、ペプチド結合の同時部分的切断を引き起こす。しかしペプチド結合切断なしのペプチドのカルボキシアミド保護Ｃ−末端の選択的脱保護を酵素的に行うことができる。欧州特許出願公開第Ａ０４５６１３８号明細書および欧州特許出願公開第Ａ０７５９０６６号明細書は、それぞれオレンジのフラベドからの、またはキサントモナス（ステノトロホモナス）マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）からのペプチドアミダーゼを使用する酵素的工程を開示し、Ｎ−（非）保護ジペプチドＣ末端カルボキシアミドのカルボキシアミド基は加水分解されて対応するＣ末端カルボン酸が形成され、それによってジペプチドのペプチド結合が無傷のまま残る。
【００２３】
しかし欧州特許出願公開第Ａ０４５６１３８号明細書および欧州特許出願公開第Ａ０７５９０６６号明細書に記載されている方法の不都合な点は、アミノ酸によるペプチド鎖のさらなる各延長のために、（カルボン酸基を活性化するための）形成された対応するカルボン酸の別個のエステル化が必要なことである。別の不都合な点は、硫酸または塩化チオニルなどの試薬の存在下におけるこのカルボン酸のエステル化が本質的に非水性条件を必要とする一方、Ｃ末端カルボキシアミドの酵素的脱保護反応は水溶液中で実施されることである。したがって徹底的な抽出および乾燥操作が必要である。
【００２４】
国際公開第２００７／０４５４７０号パンフレットで開示される改善された方法では、ペプチドアミダーゼの存在下において、ペプチドＣ末端カルボキシアミドとアルキルアルコールとを反応させる特異的酵素を使用することで、このような不都合が克服される。ペプチドアミダーゼは特に柑橘類からのフラベドからのものであってもよく、一般に容易に大量には入手できない。ペプチドアミダーゼが活性であるためには、反応は好ましくは一般に０．５重量％を超え、最も好ましくは少なくとも５重量％の水の存在下において実施される。さらにアンモニアが形成される。アンモニア錯化剤は、主に反応中にアンモニアを除去して、反応の平衡状態をエステル合成側に偏らせるために必要とされる。反応を実施するための追加試薬または助剤の添加は、反応系をより複雑にし、および／または製品に不純物を導入するかもしれない。
【００２５】
ペプチドを合成するための、および／またはペプチド合成のために使用できる中間体化合物を調製するための代案の方法に対する必要性が残る。このような方法は、例えばペプチド合成における柔軟性を増大させ、および／または既知の方法を使用して得られない、または得ることが比較的困難な特定ペプチドの合成を可能にする、追加的方法を提供してもよい。
【００２６】
特に比較的環境に優しい、比較的単純な方法に対する必要性が残る。
【００２７】
転換するＣ末端エステルを化学的に加水分解する必要なしに、アミノ酸またはペプチドのＣ末端ｔ−アルキルエステル、特にそのペプチドＣ末端ｔ−ブチルエステルを別のＣ末端エステルに変換できる、比較的単純な方法を提供することもまた望ましいであろう。
【００２８】
特に調製される各アミノ酸エステルおよびペプチドエステルとは異なるアミノ酸Ｃ末端エステルまたはペプチドＣ末端エステルから、アミノ酸Ｃ末端エステルまたはペプチドＣ末端エステルを（許容可能な反応時間内に）高収率および／または良好な選択性で調製できる方法を提供することが望ましいであろう。特に医薬品、食品または飼料成分、農薬または美容成分として使用されるペプチド、または医薬品、食品または飼料成分、農薬または美容成分の製造において使用されるペプチドの調製において、このような方法を使用することが特に望ましいであろう。
【００２９】
Ｃ末端カルボキシル基がｔ−アルキル基で保護されているＮ−保護アミノ酸または任意にＮ−保護されるペプチドを特異的酵素存在下において反応させることで、Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたはペプチドＣ末端エステル、特にＣ−活性化Ｎ−保護アミノ酸または（任意にＮ−保護される）Ｃ−活性化ペプチドを得ることができることがここで見出された。
【００３０】
アミノ酸またはペプチドと別のアミノ酸またはペプチドとをＮ→Ｃ末端方向にカップリングすることで、化学的Ｃ末端脱保護および引き続くカルボン酸官能基の化学的活性化を必要とせず、ペプチドを合成できることもまたさらに見出された。
【００３１】
したがって本発明は、
加水分解酵素の存在下において、第１のＮ−保護アミノ酸のＣ末端エステルまたは第１の任意にＮ−保護されるペプチドのＣ末端エステルを活性化アルコールでエステル交換し、それによって第２のＮ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは第２の任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを形成するステップと、
エステル交換に使用される酵素と同一であってもまたは異なってもよい、ペプチド結合形成を触媒する加水分解酵素の存在下において第２のエステルと任意にＣ末端が保護されるアミノ酸または任意にＣ末端が保護されるペプチドとをカップリングして、ペプチド結合を形成するステップと
を含んでなる、活性化Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは活性化任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルをカップリングするステップを含んでなる、ペプチドを調製する方法に関する。
【００３２】
通常、第１のアミノ酸または第１のペプチドのＣ末端エステルは、ｔ−アルキルエステルである。
【００３３】
本発明は、加水分解酵素存在下において、活性化アルコールによって、Ｎ−保護アミノ酸のＣ末端カルボン酸基またはその塩、または任意にＮ−保護されるペプチドのＣ末端カルボン酸基またはその塩を活性化するステップと、活性化のために使用される酵素と同一であってもまたは異なってもよい加水分解酵素の存在下において、任意にＣ末端が保護されるアミノ酸または任意にＣ末端が保護されるペプチドと、活性化アミノ酸またはペプチドとをカップリングするステップとを含んでなる、ペプチドを調製する方法にさらに関する。
【００３４】
本明細書において「活性化アルコール」という用語は、エステル化（エステル交換）後に活性化Ｃ末端カルボキシエステル基を提供するアルコールについて使用される。
【００３５】
Ｃ末端保護アミノ酸またはペプチドは通常、ｔ−アルキルエステルであるが、特に最終製品がジペプチドである場合、Ｃ末端基は原則として別の保護基によって保護されてもよい。
【００３６】
ペプチド結合形成を触媒する酵素は、エステル交換のために使用される酵素と異なってもよく、酵素がペプチド結合形成を触媒できれば同一であってもよい。
【００３７】
本発明は、加水分解酵素の存在下において、第１のエステルのｔ−アルキル基に相当するｔ−アルキルアルコール以外のアルコールで、Ｎ−保護アミノ酸のＣ末端ｔ−アルキルエステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドのＣ末端ｔ−アルキルエステルをエステル交換するステップを含んでなる、Ｎ−保護アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端エステルを調製する方法にさらに関する。
【００３８】
特に断りのない限り、酵素的に活性化され、エステル化またはエステル交換される化合物は、下文において「基質」と称されることもある。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】（Ａ）８５：１５ｖ／ｖのＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ、（Ｂ）９：１ｖ／ｖのｔＢｕＯＨ：ＭｅＯＨを使用した、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によるＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＭｅへのエステル交換の反応時間の関数として変換を示す。
【図１Ｂ】（Ａ）８５：１５ｖ／ｖのＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ、（Ｂ）９：１ｖ／ｖのｔＢｕＯＨ：ＭｅＯＨを使用した、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によるＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＭｅへのエステル交換の反応時間の関数として変換を示す。
【図２】Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によるＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＥｔへのエステル交換の反応時間の関数として変換を示す。
【図３】Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によるＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＢｎへのエステル交換の反応時間の関数として変換を示す。
【図４】Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によるモデルジペプチドのエステル化、エステル交換、および加水分解を図示する、反応スキーム、各ペプチド結合切断を示す。
【図５Ａ】Ａ）共沸性水除去によるＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）による、Ｚ−Ｐｈｅ−ＯＨからＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへの経時的変換、およびＢ）対応する反応の経時的含水量を示す。
【図５Ｂ】Ａ）共沸性水除去によるＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）による、Ｚ−Ｐｈｅ−ＯＨからＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへの経時的変換、およびＢ）対応する反応の経時的含水量を示す。
【００４０】
「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，Ｖｏｌ３，Ｎｏ．２６，ｐ４１５７−４１５９」において、ＬｉｕおよびＴａｍは、サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）が、１，３−プロパンジオール中および１，４−ブタンジオール中で、そのＣ末端カルボン酸官能基が保護されていない特定のＢｏｃ−アミノ酸およびペプチドのＣ−αカルボニル３ヒドロキシプロピルまたは４ヒドロキシブチルエステルの形成を触媒できることを報告した。アミノ酸Ｃ末端ｔ−アルキルエステルまたはペプチドＣ末端ｔ−アルキルエステルを活性化し、次に別のアミノ酸またはペプチドとカップリングする方法によって、ペプチドを調製することは開示されていない。
【００４１】
意外にもｔ−アルキルエステル（ｔ−アルキル基はカルボン酸官能基の適切な保護基であり、したがってペプチド合成で特に有用である）を異なるエステル基、特に活性化エステル基でエステル交換するのに、加水分解酵素が使用できることが分かった。
【００４２】
特に活性化エステルへの保護エステルのエステル交換、および活性化アミノ酸またはペプチドと別のアミノ酸またはペプチドとのカップリングの双方で、加水分解酵素、より具体的には単一加水分解酵素を使用してもよいことは意外である。エステル交換収率が、本発明に従って加水分解酵素を利用した、ペプチドの効率的合成を可能にするのに、十分高いことは特に意外である。
【００４３】
したがって本発明に従ったエステル交換は、特に上で述べた理由から不利であるＴＦＡなどの強酸の必要なしに、良好な保護特性がある保護基であるｔ−アルキル保護末端カルボキシル基を脱保護する方法を提供する利点を提供するだけでなく、さらにｔ−アルキル保護末端カルボキシル基のＣ−脱保護とＣ−活性化が、本質的に一段階に組み合わされ、または少なくとも単一酵素によって触媒されて起きる。特に高い収率（すなわち反応終結時の活性化エステルのモル数／初期のＣ末端保護エステルのモル数）で、一段階で脱保護および活性化の双方を実現できることが分かった。
【００４４】
さらに本発明を工業規模で実施できることが分かった。
【００４５】
有利な実施態様では、本発明の方法は、特に少なくとも７０％、より特に少なくとも８０％、なおもより特に少なくとも９０％の高収率で、第１のエステルを第２のエステルにエステル交換できるようにする。
【００４６】
ｔ−アルキルは、原則としてあらゆる保護三級アルキル基であってもよい。好ましくはｔ−アルキルは、ｔ−ブチル（２−メチル−２−プロピル）、ｔ−ペンチル（２−メチル−２−ブチル）、およびｔ−ヘキシル（２，３−ジメチル−２−ブチル）の群から選択される。特にｔ−ブチルで良好な結果が達成されている。
【００４７】
本明細書において「加水分解酵素」という用語は、分類グループＥ．Ｃ．３からの酵素のために使用される。好ましくはカルボン酸エステル加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、チオールエステル加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．２）、およびペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）の群から選択される１つ以上の加水分解酵素が使用される。
【００４８】
特にペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）を使用してもよい。好ましいペプチダーゼは、セリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）、セリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、およびメタロエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）の群から、特にセリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）から選択されるペプチダーゼである。サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）などのサブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）で、特に良好な結果が達成されている。
【００４９】
加水分解酵素はあらゆる形態で使用してもよい。例えば粗製酵素として、市販の酵素として、市販の製剤からさらに精製された酵素として、天然にまたは遺伝子改変を通じて加水分解活性を有する（任意に透過化されるおよび／または固定化される）細胞全体中で、またはこのような活性がある細胞溶解産物中で既知の精製方法の組み合わせによってその原料から得られる酵素として、分散体、エマルジョン、溶液の形態のまたは固定化形態の（例えば微粒子または一体化した担体材料である支持体に装填された）加水分解酵素を使用してもよい。
【００５０】
加水分解酵素は、あらゆる生物から、特に動物、植物、細菌、カビ、酵母または真菌から得られ、またはそれに由来してもよい。
【００５１】
本発明に従った方法において、加水分解活性がある天然（野性型）酵素の変異体もまた利用できることは、平均的な当業者にとって明らかであろう。野生型酵素の変異体は、例えば当業者に知られている変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定方向進化、遺伝子シャフリングなど）を使用して、ＤＮＡが野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように、またはそれが野生型と比較してより短い酵素をコードするように、野生型酵素をコードするＤＮＡを修飾することで、およびこのように修飾されたＤＮＡの発現を適切な（宿主）細胞中でもたらすことで作成できる。加水分解酵素の変異体は、例えば基質選択性、活性、安定性、溶剤抵抗性、ｐＨプロフィール、温度プロフィール、基質プロフィールの側面の１つ以上に関して改善された特性を有してもよい。
【００５２】
特定起源からの酵素について述べる際、第１の生物に源を発するが、第２の（遺伝子改変）生物中で生成される組み換え酵素は、特に第１の生物からの酵素に含めることが意図される。
【００５３】
加水分解酵素を得てもよい生物の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種；リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などのクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種；バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種；ストレプトミセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）またはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）などのストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種；真菌；フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種；リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種；シトファジア（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）；ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種；および動物組織、特にブタ膵臓、ウシ膵臓またはヒツジ膵臓などの膵臓が挙げられる。
【００５４】
上述したように好ましい酵素はサブチリシンである。様々なサブチリシンが当該技術分野で知られており、例えば米国特許第５，３１６，９３５号明細書およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。サブチリシンＡは、ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）から市販されるサブチリシンである。
【００５５】
特に好ましいのはサブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）である。
【００５６】
Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）は、特に本発明の方法で使用するのに適することが分かっている。この製品はデンマーク国バウスベア（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のノボザイムズから入手できる。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）は、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって生成される、安価で工業的に入手できるタンパク質分解酵素混合物である（主要酵素構成要素としてサブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）を含有する）。精製されたサブチリシンを用いた実験では、サブチリシンがエステル交換、活性化、およびペプチド結合形成を触媒することが確認された。
【００５７】
Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）などの市販される酵素は、液体、特に水性液として供給元によって提供され得る。このような場合、酵素は好ましくは、例えば望まれない副反応、特に望まれないエステル交換などを引き起こす過剰な水、アルコールなどの望まれない液体から最初に単離される。これは適切には沈殿によって達成されてもよく、通常の固体の液体からの分離、および／または乾燥がそれに続く。沈殿は、ｔ−ブタノールなどのアルコールまたは本発明の方法で使用されるアルコールを使用して達成されてもよい。別のアルコールを使用する場合、このようなアルコールがＣ末端エステル交換または別の反応ステップを妨げないようにする注意が必要である。
【００５８】
その後、酵素は、ｔ−ブタノールなどのアルコールまたは本発明の方法で使用されるアルコールに溶解されてもおよび／または再懸濁されてもよい。
【００５９】
ペプチドのＣ末端ｔ−ブチルエステルの酵素的加水分解については既知である。例えば国際公開第２００７／０８２８９０号パンフレットは、このようなエステルを加水分解するためのＢｓｕｂｐＮＢＥ、ＣＡＬ−Ａまたはサブチリシンの使用に言及する。しかしｔ−アルキルエステルの一級または二級アルキルエステルまたは任意に置換されるアラルキルエステルまたは任意に置換されるアリールエステルへの、熱力学的に好ましくない逆エステル化反応またはエステル交換が、加水分解活性酵素によって効率的に達成できることは意外である。８０％を超える収率が可能であることは、特に意外である。
【００６０】
その他の適切な加水分解酵素は、以下の市販製品の群、およびこのような酵素の機能的類似体から選択されてもよい。機能的類似体とは、類似体が本発明の方法において、ペプチド結合のエステル交換、活性化、および形成（ペプチドカップリング）機能の少なくとも１つ、好ましくはこれらの機能の２つまたは３つ全部を触媒できることを意味する。
【００６１】
デンマーク国バウスベアのノボザイムズは、ｏｖｏｚｙｍｅ、ｌｉｑｕａｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ａｌｃａｌａｓｅ−ｕｌｔｒａ（登録商標）（特にアルカリ性ｐＨで効果的）、ｄｕｒａｍｙｌ、ｅｓｐｅｒａｓｅ、ｋａｎｎａｓｅ、ｓａｖｉｎａｓｅ、ｓａｖｉｎａｓｅ  ｕｌｔｒａ、ｔｅｒｍａｍｙｌ、ｔｅｒｍａｍｙｌ  ｕｌｔｒａ、ｎｏｖｏｂａｔｅ、ｐｏｌａｒｚｙｍｅ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｎｏｖｏｌｉｎｅ、ｐｙｒａｓｅ、ｎｏｖｏｃｏｒ（細菌アルカリ性プロテアーゼ）を提供する。
【００６２】
プロテイナーゼ−Ｋは、米国マサチューセッツ州イプスウィッチのニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ））から入手できる。
【００６３】
米国ノースカロライナ州フランクリントンのノボ・ノルディスク・バイオテック（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ））は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロテアーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ  ６．０Ｔ；Ｓａｖｉｎａｓｅ  ６．０Ｔ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ  １．５ＭＧ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ  ３．０Ｔ）を提供する。
【００６４】
米国バージニア州トロイのアマノ・インターナショナル・エンザイム株式会社（Ａｍａｎｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏ．（Ｔｒｏｙ，Ｖａ，ＵＳＡ））は、枯草菌プロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｐｒｏｌｅａｔｈｅｒ；プロテアーゼＮ）およびコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）プロテアーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ  ６）を提供する。
【００６５】
エステル化（エステル交換）または活性化のためのアルコール、および任意に例えばアセトニトリル、またはメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテルのような不活性有機溶剤を含んでなる混合物中で、反応を実施することができる。
【００６６】
前記アルコールおよび不活性溶剤を含んでなる混合物中でエステル化（エステル交換）または活性化を実施することは、アルコールが酵素の安定性または活性に悪影響を及ぼす場合に特に有利である。エステル化（エステル交換）または活性化のためのアルコール濃度は、（全液体を基準にして）特に９９．９重量％以下、９９重量％以下、９５重量％以下、７５重量％以下、５０重量％以下、３０重量％以下２０重量％以下または１０重量％以下であってもよい。
【００６７】
特にメタノールについては、良好な酵素安定性のために、すなわち調製されるエステルを所望の収率で得るのに十分な時間にわたって相当な酵素活性を保つために、主要溶剤としての別の（不活性）有機溶剤との混合物中におけるメタノールの使用が有利であることが分かった。
【００６８】
通常、エステル化（エステル交換）または活性化のためのアルコール濃度は、有利な反応速度のために、少なくとも０．１重量％、特に少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、または少なくとも４重量％である。
【００６９】
本発明の方法は、エステル化、エステル交換、または活性化のためのアルコールが主要溶剤である、反応媒体を使用して実施してもよい。主要溶剤として、濃度は全液体を基準にして通常５０〜１００重量％であり、特に最大９９．５重量％である。反応媒体は通常、（前記アルコール、およびエステル交換の場合はＣ末端エステルから置換されたｔ−アルコールを除いて）反応に有害であり得る（反応中のアルコールと競合し得る）その他のアルコールを本質的に含まない。実際には、例えば５重量％未満、特に２重量％未満、より特には０．５重量％未満の少量のその他のアルコールが存在してもよい。
【００７０】
本発明の方法は、通常、実質的に非水性条件下で実施される。当業者は理解するであろうように、酵素次第で、酵素がその触媒作用を適切に果たせるように少量の水が所望され得る。良好な触媒活性のために、例えば液相を基準にして少なくとも０．０１重量％の微量の水の存在が所望され得る。特に水濃度は、少なくとも０．０２重量％または少なくとも０．０５重量％であってもよい。
【００７１】
水濃度の所望の上限は、特定の酵素、ペプチドの性質（例えばサイズ、ペプチドがそれをベースとするアミノ酸）、所望の最終変換、および所望のエステル交換または活性化反応速度に左右される。
【００７２】
反応媒体は、通常、反応媒体中の液体の重量を基準として、少なくとも活性化またはエステル化（エステル交換）の始めに、１０重量％未満の水を含有する。反応媒体は第２の液相中に分散してもよく、または反応媒体中に別の液相が分散してもよい。二相系または多相系の場合、指定される含水量は相中の液体重量を基準とし、エステル化（エステル交換）または活性化反応は（少なくとも大部分は）、その中にアミノ酸またはペプチドが溶解する液相ベースで起きる。
【００７３】
特に水濃度は、少なくとも活性化またはエステル化（エステル交換）の始めには、４重量％未満であってもよい。有利には本方法は、依然として少なくとも相当な所望の酵素活性を保ち、かつ望まれない加水分解が少ないかあるいは検出不能でさえある間、反応の始めには、２重量％未満の水、特に１重量％以下の水、より特には０．５重量％以下の水、例えば約０．２重量％以下の水などを含有する媒体中で実施されてもよい。
【００７４】
有利な方法では、特にエステル化（エステル交換）中に形成されるアルコールまたは水を連続的にまたは断続的に除去してもよい。原則として除去は、当該技術分野で知られている様式で達成されてもよい。良好な結果は、特に分子篩を使用して達成されている。真空または蒸留を使用した共沸性除去などの蒸発もまた、除去に非常に良く適する。
【００７５】
（少なくともエステル交換反応中はＮ−保護される）アミノ酸Ｃ末端エステルまたは任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端アルキルエステルは、特に式ＩＸの化合物によって表してもよい。
【化３】
2011500010.tif 000004
【００７６】
式中、ＰはＨまたはＮ−末端保護基を表し、ｎは少なくとも１の整数である。ｎが１である場合、使用される酵素次第で、Ｎ−末端保護基の不在下では１つのエステルから別のエステルへの転換を達成するのは困難かもしれないので、Ｐは通常、Ｎ−末端保護基である。
【００７７】
ｎは、特に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０であってもよい。ｎは、特に１００以下、７５以下、５０以下、２５以下、２０以下１５以下または１０以下、例えば５以下であってもよい。
【００７８】
各ＲＡおよび各ＲＢは、独立してＨ、または好ましくはアミノ酸側鎖である有機部分を表す。したがってＲＡがｎ個の全アミノ酸単位で同じである必要はない。同様に、ＲＢがｎ個の全アミノ酸単位で同じである必要はない。
【００７９】
式ＩＸがエステル交換されるエステルを表す場合、Ｒは典型的に任意に置換されるｔ−アルキル、好ましくはｔ−ブチルを表す。アルキルは特にヘテロ原子、より特にはＮ、Ｏ、およびＳの群から選択されるヘテロ原子を含有する置換基を含んでなってもよい。例えば置換基は、任意に保護されるヒドロキシル、チオールまたはアミンであってもよい。
【００８０】
適切なＮ−保護基は、（オリゴ）ペプチドの合成のために使用できるＮ−保護基である。このような基は当業者に知られている。適切なＮ−保護基の例としては、例えば「Ｚ」（すなわちベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（すなわちｔ−ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（すなわちホルミル）、および「ＰｈＡｃ」（すなわちフェナセチル）、およびＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）などのカルボニルタイプの保護基が挙げられる。ＦｏｒまたはＰｈＡｃ基を導入して、ペプチド脱ホルミル酵素またはＰｅｎＧアシラーゼ酵素をそれぞれ使用して酵素的に切断してもよい。化学開裂方法は一般に当該技術分野で周知である。
【００８１】
本発明の文脈で「アミノ酸側鎖」とは、あらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸側鎖を意味する。アミノ酸側鎖中の反応性基は、アミノ酸側鎖保護基によって保護されていてもまたは非保護であってもよい。タンパク新生アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸である。タンパク新生アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、プロリン、およびフェニルアラニンが挙げられる。
【００８２】
非タンパク新生アミノ酸の例は、フェニルグリシンおよび４−フルオロ−フェニルアラニンである。
【００８３】
原則として使用されるｐＨは、酵素が十分な活性を示すｐＨを選択しさえすれば、広い範囲内で選択されてもよい。このようなｐＨは通常、使用される酵素について知られており、水溶液中でのその既知の加水分解活性に基づいてもよく、または既知の反応条件下で酵素の既知の基質を利用して慣例的に判定できる。それは特に、ほぼ中性になるように選択されてもよい。所望ならば、酵素次第でアルカリ性または酸性条件を使用してもよい。所望ならば酸および／または塩基を使用してｐＨを調節してもよく、または酸と塩基の適切な組み合わせによって緩衝してもよい。適切な酸および塩基は特に反応媒体に可溶性の例えばアンモニアや、例えば酢酸およびギ酸などのアルコール可溶性酸の群からのものである。反応のｐＨは、自動化ｐＨスタットシステムを使用して制御されてもよい。当業者は通例の実験法を通じて、最適ｐＨ条件を容易に同定できる。
【００８４】
酵素が十分な活性および安定性を示す温度を選択しさえすれば、原則として使用される温度は重要でない。このような温度は、通常、使用される酵素について知られており、または既知の反応条件下で酵素の既知の基質を利用して慣例的に判定できる。一般に温度は、少なくとも０℃、特に少なくとも１５℃または少なくとも２５℃であってもよい。特に好熱性生物起源の酵素が使用されるのならば、温度は好ましくは少なくとも４０℃である。所望の最大温度は酵素に左右される。一般にこのような最大温度は当該技術分野で知られており、例えば市販される酵素の場合は製品データシートに表示され、または一般常識および本明細書で開示される情報に基づいて慣例的に判定できる。温度は通常７０℃以下、特に６０℃以下または４５℃以下である。しかし特に好熱性生物からの酵素を使用するのであれば、温度は例えば最高９０℃などより高くあるように選択されてもよい。
【００８５】
最適温度条件は、一般常識と本明細書で開示される情報に基づき通例の実験法を通じて、当業者によって特定の酵素について容易に同定できる。例えばサブチリシン、特に（例えばＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）中の）サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）では、温度は有利には２５〜６０℃の範囲である。
【００８６】
上述の通り本発明はまた、ペプチドを調製する方法も提供し、このような方法は以下のステップを含んでなる。触媒として加水分解酵素を使用して、アミノ酸またはペプチドを活性化Ｃ末端カルボキシ基を有するアミノ酸エステルまたはペプチドエステルに変換することで、遊離末端カルボン酸基またはＣ末端ｔ−アルキルエステルを含んでなるＮ−保護アミノ酸または任意にＮ−保護されるペプチドを活性化する。その結果、アミノ酸Ｃ末端エステルまたはペプチドＣ末端エステルは、動的ペプチドカップリング（「ペプチドカップリング」という用語はペプチド結合形成によるカップリングを意味する）に加わるのに適するようになる。活性化は、特にメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールなどのｎ−アルキルアルコールや、フェノールなどの任意に置換されるアリールアルコール、またはベンジルアルコールなどの任意に置換されるアラルキルアルコールを用いて実施できる。
【００８７】
その後、通常（活性化のために使用される酵素と同一であってもまたは異なってもよい）ペプチドカップリングを触媒する酵素の存在下において、活性化Ｃ末端カルボキシ基を含んでなるアミノ酸Ｃ末端エステルまたはペプチドＣ末端エステルと、任意にＣ末端が保護されるアミノ酸またはペプチドとを接触させ、それによって任意にＣ末端が保護されるアミノ酸またはペプチドのＮ−末端アミノ基を活性化Ｃ末端カルボキシ基にカップリングさせて、ペプチド結合を形成する。Ｃ末端保護アミノ酸またはペプチドの保護基は、特に得られたペプチドを１つ以上のさらなるアミノ酸またはペプチドによって延長する場合は、好ましくはｔ−アルキル、より好ましくはｔ−ブチルである。所望ならば本明細書で開示されるように、エステル交換によってＣ末端ｔ−アルキルを活性化基によって置換でき、その後さらなる任意にＣ末端が保護されるアミノ酸またはペプチドをカップリングできる。これらの反応は必要に応じて何度でも繰り返して、所望のアミノ酸配列のペプチドを得ることができる。
【００８８】
したがって本発明はまた、Ｃ末端ｔ−アルキル、好ましくはｔ−ブチル保護アミノ酸またはペプチドを使用して、Ｎ→Ｃ末端方向にペプチド合成ができるようにするペプチド合成法も提供する。Ｃ−末端は化学（非酵素的）脱保護工程を要することなく、酵素の存在下において効果的に同時に脱保護および活性化されるので、本方法には、脱保護ステップおよび別個の活性化ステップを要する既知の方法よりも少ない反応ステップが必要である。このような従来の化学工程は、通常、Ｃ末端カルボン酸中間体のための大規模な抽出および脱水手順などの精製をさらに必要とするので、それはさらに不利である。したがって本発明は、有利には、ペプチド鎖伸長およびＮ−末端アミノ官能基の保護と脱保護の双方もまた、完全に酵素的に実施されてもよいことから、Ｎ→Ｃ末端方向のペプチド合成のための完全に酵素的な工程を可能にする。したがって本発明の方法は、例えば手順の簡素化および／または環境保護の観点の理由から、カルボン酸基を保護するのにｔ−アルキルを利用する前述の方法よりもさらに魅力的である。
【００８９】
ペプチド結合形成に関しては、それがペプチド結合形成を触媒しさえすれば、同一加水分解酵素を使用してもよい。カップリングのためにエステル交換と同一の酵素を使用することは、このような酵素がペプチド結合形成を触媒できれば、保護ペプチドを最初に単離する必要なしに、エステル交換を実施してペプチド結合形成後に形成されたペプチドのＣ末端を活性化してもよいので、有利である。これは第１タイプの反応から第２タイプの反応に変わる際に、単に溶剤を変えることで達成される（溶剤交換）。例えば活性化アミノ酸Ｃ末端エステルとＣ末端保護アミノ酸ｔ−アルキルエステルとのカップリングは、ｔ−ブチルアルコールなどの三級アルコール中で起きてもよい。カップリング後、溶剤を水性液によって置換して、保護基の加水分解を容易にしてもよい。得られた遊離酸性団は、溶剤をアルコールに切り替えた後に活性化されてもよく、それはエステル化に際して活性化Ｃ末端エステル基を形成する。好ましくはその中でカップリングが起きた溶剤は直接アルコールによって置換され、それはエステル交換に際して活性化Ｃ末端エステル基を形成する。
【００９０】
しかしペプチド結合形成のために異なる酵素を使用してもよい。ペプチド結合形成を触媒するのに適切な酵素は当業者に知られており、タンパク質分解酵素が挙げられる。タンパク質分解酵素（別名：プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペプチド加水分解酵素、Ｅ．Ｃ．３．４）は、本質的にペプチド結合を加水分解する酵素である。これらの酵素は、タンパク質分解、血液凝固、アポトーシス（細胞死）、および免疫系などの様々な生理学的過程において重要な役割を果たす。これらの酵素はまた、ペプチドホルモンの、および酵素前駆物質の生理学的または触媒的活性形態への加工において、活性化因子としての役割も果たす。
【００９１】
プロテアーゼは、ペプチド末端近辺のみに作用するエキソペプチダーゼと、ペプチド内部で作用するエンドペプチダーゼの２つのサブクラスにさらに分類できる。
【００９２】
エキソペプチダーゼはペプチドのＮ−末端に作用して、単一アミノ酸（アミノペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．１１）またはジペプチド（ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１３）またはジペプチドおよびトリペプチドの双方（ジペプチジル−ペプチダーゼまたはトリペプチジル−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１４）を放出する。ペプチドのＣ末端で作用するペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼと称され、単一アミノ酸（カルボキシペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１６〜１８）またはジペプチド（ペプチジル−ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１５）を解放する。カルボキシペプチダーゼは、例えばセリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）または末端アミノ酸を切断してそれが置換、環化、またはイソペプチド結合（側鎖が関与するペプチド結合）される（ω−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１９）など、それらの触媒機序に従って分類される。
【００９３】
エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１〜２５およびＥ．Ｃ．３．４．９９）は以下のサブクラスに分類できる。セリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、およびメタロエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）。Ｅ．Ｃ．３．４．９９は、触媒機序が未知のプロテアーゼである。
【００９４】
文献でもまた、例えばブタ膵臓（ＰＰＬ）からのリパーゼなどのリパーゼ（トリアシルグリセロール加水分解酵素Ｅ．Ｃ．３．１．１．１）がペプチド結合形成を触媒することが報告されている。
【００９５】
所望ならば、所望のアミノ酸配列の任意にＮ−保護される（オリゴ）ペプチドＣ末端ｔ−アルキル−エステルをＣ−末端および／またはＮ−末端で、および／または（少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基が存在するのならば）アミノ酸側鎖の少なくとも１つで脱保護してもよく、その後保護または非保護ペプチドを回収してもよい。
【００９６】
形成されたＮ−保護ペプチドＣ末端ｔ−アルキルエステルまたはＮ−保護Ｃ末端脱保護ペプチドのＮ−末端保護基の脱保護は、当業者に知られている方法によって実施されてもよい。
【００９７】
実施態様ではＮ−末端保護基が酵素的に除去される。
【００９８】
ペプチドのＮ−末端保護基を導入して除去できる酵素は当業者に知られており、このような酵素の例としては、ｐｅｎＧアシラーゼまたはペプチド脱ホルミル酵素が挙げられる。
【００９９】
例えば炭素水素付加触媒上のＰｄの存在下においてＨ２を使用して水素付加によって、または適切な酸によって、Ｎ−末端保護基を化学的に除去することもまた可能である。適切な条件は当該技術分野で知られている。
【０１００】
Ｃ末端ｔ−アルキルエステル官能基は、原則として例えばＴＦＡなどの強酸によって除去されてもよいが、それは厄介かもしれない（上記参照）。したがって形成された任意にＮ−保護されるペプチドＣ末端ｔ−アルキルエステルのＣ末端ｔ−アルキルエステル官能基の脱保護は、好ましくは例えば上で同定された加水分解酵素などの加水分解酵素を使用して実施されてもよい。
【０１０１】
最後のペプチドカップリングステップ後に得られる、１つまたはいくつかのアミノ酸側鎖保護基を伴うかまたは伴わない、Ｎ−保護ペプチドＣ末端ｔ−アルキル−エステルが所望の最終産物であるならば、これは例えば当業者に知られている抽出または結晶化方法を使用して直接回収できる。部分的に保護されるペプチドが所望の最終産物である場合、１つ以上の所望の脱保護反応を実施でき、任意にワークアップ手順後に、所望の部分的に保護される最終産物を回収できる。
【０１０２】
完全脱保護ペプチドが所望の最終産物である場合、このペプチドは、連続的Ｎ−、Ｃ−、および（最後のペプチドカップリングステップ後に、１つまたはいくつかのアミノ酸側鎖保護基が存在するならば）アミノ酸側鎖脱保護ステップによって得ることができる。完全に脱保護されたペプチドを最終的に回収する手順は、慣例的に当業者によって同定されることができる。例えば抽出、クロマトグラフィー分離、および結晶化の群から選択される１つ以上の精製技術を使用してもよい。
【０１０３】
好ましくはペプチドは、（最終）カップリング反応後に反応混合物から回収される。
【０１０４】
本発明の方法は、直線型合成によってＮ→Ｃ末端方向にペプチドを合成するのに特に適している。直線型合成ではペプチドは段階的な延長によって調製され、所望の長さとアミノ酸組成のペプチドが形成されるまで、段階的に単一アミノ酸がペプチド鎖に付加される（例えば上のスキーム２を参照されたい）。本発明の方法によって生成されるペプチドは、好ましくは２〜５０個のアミノ酸の直鎖、特に２〜２０個のアミノ酸の直鎖、より特には２〜１０個のアミノ酸の直鎖を含んでなる。
【０１０５】
所望ならば、直線型合成によって調製された２個以上のペプチドをその後カップリングしてもよい。カップリングは、化学的手法、酵素的方法またはその組み合わせによって達成されてもよい。例えば天然化学ライゲーションなどの化学ライゲーションを使用してもよい。
【０１０６】
適切な化学ライゲーションの方法については、例えばＤａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６６，ｐ．７７６；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，６９，ｐ．９２３；またはＨａｃｋｅｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，１００６８に記載されている。
【０１０７】
本発明をここで以下の実施例によって例示する。
【０１０８】
［実施例］
［一般］
特に断りのない限り、化学薬品は商業的供給元から得られ、さらなる精製なしに使用した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）Ａｖａｎｃｅ  ３００ＭＨｚ  ＮＭＲ（３００．１ＭＨｚ）分光計上で記録し、化学シフトはＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）またはＤ２Ｏ（４．７９ｐｐｍ）と比較してｐｐｍ（δ）で示す。含水量はカール・フィッシャー滴定によって判定した。
【０１０９】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、メルク（Ｍｅｒｃｋ）からのプレコートされたシリカゲル６０  Ｆ２５４プレート上で実施した。ＵＶ光、ニンヒドリンまたはＣｌ２／ＴＤＭ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン）を使用してスポットを可視化した。
【０１１０】
特に断りのない限り、２００℃、減圧下で、Ａｃｒｏｓからの３Å分子篩（８〜１２メッシュ）を活性化して、ｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）をこれらの分子篩上で保存した。ｔＢｕＯＨは使用前に予熱して液体（４５℃）にした。
【０１１１】
Ｍｅｒｃｋ等級９３８５  ６０Åのシリカゲルを使用して、カラムクロマトグラフィーを実施した。４０℃で逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、Ｃ１８、５μｍ、１５０×４．６ｍｍ内径）を使用して、分析的ＨＰＬＣダイアグラムをＨＰ１０９０液体クロマトグラフ上で記録した。ＵＶ−ＶＩＳ  ２０４線形分光計を使用して、ＵＶ検出を２２０ｎｍで実施した。勾配プログラムは、０〜２５分は５％から９８％の溶出剤Ｂへの、２５．１〜３０分は５％の溶出剤Ｂへの直線濃度勾配であった（溶出剤ＡはＨ２Ｏ中の０．５ｍＬ／Ｌメタンスルホン酸（ＭＳＡ）、溶出剤Ｂはアセトニトリル中の０．５ｍＬ／Ｌ  ＭＳＡ）。流量は０〜２５．１分までは１ｍＬ／分、２５．２〜２９．８分までは２ｍＬ／分、次に３０分で停止するまで１ｍＬ／分に戻した。注入量は２０μＬであった。
【０１１２】
分析的ＨＰＬＣと同一条件下において、同一カラムを装着した陽イオン化モードで操作されるアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズシステム上で、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析法を実施した。
【０１１３】
ｔ−ブタノール中のＡｌｃａｌａｓｅ懸濁液を以下のように調製した。ノボザイムズからの１２．５ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．５Ｌ、タイプＤＸ、ＰＬＮ０４８１０）を１０ｍＬのｔＢｕＯＨで沈殿させ、５分間ボルテックスして４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄して前述の手順を２回繰り返した。最後に５分間ボルテックスして、ペレットを１０ｍＬのｔＢｕＯＨに再懸濁した。ｔＢｕＯＨの代わりにｔＡｍＯＨを使用して、ｔ−アミルアルコール（ｔＡｍＯＨ）中のＡｌｃａｌａｓｅ懸濁液を同様に調製した。
【０１１４】
ｔ−ブタノール中のＥｓｐｅｒａｓｅ、ＥｖｅｒｌａｓｅまたはＳａｖｉｎａｓｅ懸濁液を以下のように調製した。ノボザイムズからの１０．０ｍＬの酵素溶液（Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）８．０Ｌ、ＰＥＮ００１０３またはＥｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、１６Ｌ、タイプＥＸ、ＲＣＮ０００４２またはＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、１６Ｌ、タイプＥＸ、ＰＸＮ０９３２５）を５０ｍＬのｔＢｕＯＨで沈殿させ、５分間ボルテックスして４５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を廃棄して前述の手順を２回繰り返した。最後に５分間ボルテックスして、ペレットを１０ｍＬのｔＢｕＯＨに再懸濁した。
【０１１５】
Ａｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡ懸濁液を次のように調製した。ＣＬＥＡ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの１ｇの架橋Ａｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡ（６５０  ＡＧＥＵ／ｇ、３．５重量％の水）を１０ｍＬのｔＢｕＯＨに懸濁して、スパチュラで粉砕した。濾過後、使用に先だって酵素を１０ｍＬのｔＢｕＯＨに再懸濁した。
【０１１６】
Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ懸濁液を以下のように調製した。ノボザイムズからの１ｇのＰｏｌａｒｚｙｍｅ（Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、１２Ｔ、ＰＧＶＧ０００９０５）を１０ｍＬのｔＢｕＯＨに懸濁した。濾過後、使用に先だって酵素を１０ｍＬのｔＢｕＯＨに再懸濁した。
【０１１７】
［実施例１：対応するＮ−保護アミノ酸カルボン酸からのＮ−保護アミノ酸Ｃ末端ｔＢｕおよびｔＡｍエステルの調製］
以下のプロトコル１〜３の１つを使用して、いくつかのアミノ酸ｔ−ブチル（ｔＢｕ）およびｔ−アミル（ｔＡｍ）エステルを調製した。
【０１１８】
［プロトコル１：Ｚ−保護アミノ酸からのＺ−保護アミノ酸Ｃ末端ｔＢｕエステルの合成］
上述のように調製された３ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ懸濁液を０．１６７ｍｍｏｌのＺ−保護アミノ酸および１ｇの（非活性化）３Å分子篩に添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。引き続いて３ｍＬのＭｅＯＨを添加し、濾過により固形物を除去して１０ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で洗浄した。合わせた有機相を４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を真空内で濃縮した。
【０１１９】
粗生成物を５０ｍＬジクロロメタンに再溶解し、２５ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液（３ｘ）、２５ｍＬの飽和水性ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）真空内で濃縮し、１０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）および１０ｍＬのトルエン（２×）を用いて共蒸発させた。
【０１２０】
［プロトコル２：Ｚ−保護アミノ酸からのＺ−保護アミノ酸Ｃ末端ｔＢｕエステルの合成］
上述のように（しかし活性化分子篩上に保存されたｔＢｕＯＨを用いて）調製された１ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ懸濁液を０．１６７ｍｍｏｌのＺ−保護アミノ酸、０．５ｇの３Å分子篩に添加して、２ｍＬのｔＢｕＯＨで希釈した。この混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。
【０１２１】
［プロトコル３：Ａｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを使用したＮ−保護−ＰｈｅからのＮ−保護−ＰｈｅｔＢｕエステルの合成］
上述のように調製された３ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡ懸濁液を０．１６７ｍｍｏｌのＸ−Ｐｈｅ−ＯＨおよび０．１ｇの活性化３Å分子篩に添加した（ＸはＮ−末端保護基を表す）。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。
【０１２２】
固形物を濾過によって除去した後、濾液を真空内で蒸発させ、粗生成物を２０ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解して、１０ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液、１０ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）真空内で濃縮し、１０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）を用いて共蒸発させた。
【０１２３】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕは、プロトコル２に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に８８％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．２８−７．０５（ｍ，１０Ｈ），５．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），５．０１（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），２．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３０（ｓ，９Ｈ）．
【０１２４】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕは、Ａｌｃａｌａｓｅ懸濁液の代わりにＥｓｐｅｒａｓｅ懸濁液を使用したこと以外は、プロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に３８％のｔＢｕ−エステルへの変換を示した。
【０１２５】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕは、Ａｌｃａｌａｓｅ懸濁液の代わりにＳａｖｉｎａｓｅ懸濁液を使用したこと以外は、プロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に４３％のｔＢｕ−エステルへの変換を示した。
【０１２６】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕはＡｌｃａｌａｓｅ懸濁液の代わりにＥｖｅｒｌａｓｅ懸濁液を使用したこと以外は、プロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に２４％のｔＢｕ−エステルへの変換を示した。
【０１２７】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕは、Ａｌｃａｌａｓｅ懸濁液の代わりにＰｏｌａｒｚｙｍｅ懸濁液を使用したこと以外は、プロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に１７％のｔＢｕ−エステルへの変換を示した。
【０１２８】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＡｍ］
Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＡｍは、ｔＢｕＯＨの代わりにｔＡｍＯＨを使用したこと以外はプロトコル２に従って調製した。ＨＰＬＣ分析は２４時間後に９３％のｔＡｍ−エステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．３０−７．０１（ｍ，１０Ｈ），５．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９２（ｍ，２Ｈ）１．７２−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｓ，３Ｈ），０．７４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
【０１２９】
［Ｚ，Ｚ−Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ］
Ｚ，Ｚ−Ｌｙｓ−ＯｔＢｕはプロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に＞９０％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．２５−７．１６（ｍ，１０Ｈ），５．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．０１（ｓ，４Ｈ），４．８１（ｓ，１Ｈ），４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．０８（ｍ，２Ｈ），１．７２（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）．
【０１３０】
［Ｚ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕはプロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に＞９０％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．２７−７．１９（ｍ，５Ｈ），５．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．０３（ｓ，２Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｍ，１Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｍ，６Ｈ）。
【０１３１】
［Ｚ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ａｌａ−ＯｔＢｕはプロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣは、２４時間後に＞９０％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．３１−７．１８（ｍ，５Ｈ），５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．０３（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３８（ｓ，９Ｈ），１．２９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）．
【０１３２】
［Ｚ−Ｍｅｔ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｍｅｔ−ＯｔＢｕはプロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に＞９０％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．３０−７．１９（ｍ，５Ｈ），５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）．
【０１３３】
［Ｚ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ］
Ｚ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕはプロトコル１に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に８２％のｔＢｕエステルへの変換を示した。最終精製のためには追加的カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１／１）が必要であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．３０−７．１９（ｍ，５Ｈ），５．５７（ｓ，１Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｓ，１Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）．
【０１３４】
［Ｚ−ＤＯＰＡ−ＯｔＢｕ］
上のように調製された１０ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ溶液を３ｇ（９．１ｍｍｏｌ）のＺ−ＤＯＰＡ−ＯＨおよび１０ｇの３Å分子篩に添加して、２０ｍＬのｔＢｕＯＨで希釈した。この混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪し、市販されるＺ−ＤＯＰＡ−ＯｔＢｕを参照として使用してＨＰＬＣによって分析したところ、２４時間後に＞９０％のｔＢｕエステルへの変換を示した。
【０１３５】
［Ｆｏｒ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｆｏｒ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕはプロトコル３に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に９８％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ８．０４（ｓ，１Ｈ），７．２２−７．０７（ｍ，５Ｈ），４．９９（ｄ，１Ｈ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．７５（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．３３（ｓ，９Ｈ）．
【０１３６】
［Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕはプロトコル３に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に９８％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．２８−７．１６（ｍ，５Ｈ），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４５（ｍ，１Ｈ），３．０４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．
【０１３７】
［ＰｈＡｃ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ］
ＰｈＡｃ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕはプロトコル３に従って調製した。ＨＰＬＣは２４時間後に９４％のｔＢｕエステルへの変換を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ７．２９−６．８７（ｍ，１０Ｈ），５．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．６６（ｍ，１Ｈ）３．５３（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．１），１．３０（ｓ，９Ｈ）．
【０１３８】
［実施例２：Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕの対応するメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、およびベンジル（Ｂｎ）エステルへのエステル交換］
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＭｅへのエステル交換］
【化４】
2011500010.tif 000005
【０１３９】
Ａｌｃａｌａｓｅは、ペレットをｔＢｕＯＨでなく１０ｍＬのＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ  ８５：１５ｖ／ｖまたはｔＢｕＯＨ：ＭｅＯＨ  ９：１ｖ／ｖに再懸濁したこと以外は、一般セクションに記載されているようにして調製した。この懸濁液の３ｍＬを５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕおよび０．５ｇの３Å分子篩に添加した。
【０１４０】
混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪し、対応する化学合成基準化合物を使用してＨＰＬＣによって分析した。
【０１４１】
結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。ここで共溶媒としてアセトニトリルでなくｔＢｕＯＨを使用して、より高い収率およびより早い変換が得られることが示される（１２０時間後に７７％の変換）。
【０１４２】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕのＺ−Ｐｈｅ−ＯＥｔへのエステル交換］
【化５】
2011500010.tif 000006
【０１４３】
Ａｌｃａｌａｓｅは、ペレットをｔＢｕＯＨでなく１０ｍＬエタノール（ＥｔＯＨ）に再懸濁したこと以外は、一般セクションに記載されているようにして調製した。この懸濁液の３ｍＬを５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕに添加した（分子篩は使用しなかった）。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪し、対応する化学合成基準化合物を使用してＨＰＬＣによって分析した。
【０１４４】
結果を図２に示す。９６時間の反応時間後に７３％のＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕが対応するエチルエステルに変換された。
【０１４５】
［Ｚ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕからＺ−Ｐｈｅ−ＯＢｎへのエステル交換］
【化６】
2011500010.tif 000007
【０１４６】
Ａｌｃａｌａｓｅは、ペレットをｔＢｕＯＨでなく１０ｍＬベンジルアルコール（ＢｎＯＨ）に再懸濁したこと以外は、一般セクションに記載されているようにして調製した。この懸濁液の３ｍＬを５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕおよび０．５ｇの３Å分子篩に添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪し、対応する化学合成基準化合物を使用してＨＰＬＣによって分析した。
【０１４７】
結果を図３に示す。反応速度は対応するＭｅおよびＥｔエステル（上記参照）へのエステル交換反応と比較して、相当により高かった（７２時間で８７％変換）。
【０１４８】
［実施例３：ジペプチドレベル（Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）に対するエステル交換反応］
特定例では、基質がペプチドである場合、特に加水分解酵素がペプチダーゼである場合に、エステル交換または活性化中に、ペプチド結合の加水分解が同時に起きることが予期される。これが起きるかどうか。したがって下述の実験を実施して、本発明の方法において、この有害な効果が起きるかどうかを調べた。
【０１４９】
サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）はペプチド結合形成によって、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ誘導体の合成を触媒でき、これらのペプチドはまた、あらゆるペプチド結合切断を観察するための良好なモデル基質でもあるので、サブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）と組み合わせて、モデル基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ誘導体を使用した。最初に溶液相化学ペプチド合成によって、全ての基準化合物を合成した。
【０１５０】
反応経路を図４に図示するが、Ｒ１、Ｒ２は図に示すどの反応が実施されるのかに応じて、Ｈ、活性化基またはｔ−アルキルであり、例えばエステル交換の場合はＲ１＝ＨおよびＲ２は活性化基またはｔ−ブチルであり；エステル化の場合はＲ１＝ｔ−ブチルおよびＲ２は活性化基であり；Ｒ１基を加水分解する場合はＲ１は活性化基またはｔ−ブチルでＲ２は水素である。
【０１５１】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（基準化合物の化学合成）］
５００ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＺ−Ｐｈｅ−ＯＨを１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。引き続いて４１５ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド、ＨＣｌ（ＥＤＣＩ、２．２ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ）、２５０ｍｇの７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンザトリアゾール（ＨＯＡｔ、１．８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、４７８μＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、および３４４ｍｇのＨ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（１．８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。反応混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。引き続いて２０ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、有機混合物を１５ｍＬの飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（２×）、１５ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３（２×）、１５ｍＬの鹹水で洗浄して乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮して１０ｍＬトルエン（２×）を用いて共蒸発させ、７６５ｍｇ（９８％）のＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．０９−７．３１（ｍ，１０Ｈ），６．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），５．０１（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｍ，３Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），０．８４（ｍ，６Ｈ）．
【０１５２】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（基準化合物の化学合成）］
１００ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕを１滴の水を添加した５ｍＬのＣＦ３ＣＯＯＨに添加した。混合物を周囲温度で２時間撹拌し、真空内で濃縮して１０ｍＬトルエン（２×）を用いて共蒸発させ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨを定量的収率で得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００  ＭＨｚ）：δ７．３１−７．０４（ｍ，１０Ｈ），６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．９３（ｓ，２Ｈ），４．４４（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，２Ｈ），１．５１（ｍ，３Ｈ），０．７７（ｍ，６Ｈ）．
【０１５３】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（基準化合物の化学合成）］
３６４ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＨＣｌ・Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＭｅを２０ｍＬのＣＨＣｌ３および６９９μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）に溶解した。この溶液を２０ｍＬのＣＨＣｌ３中の５９９ｍｇ（２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）のＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、４０３ｍｇのＥＤＣＩ（２．１ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）、および３００ｍｇのＨＯＡｔ（２．２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の溶液（０℃）に添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶液を真空内で濃縮し、残留物を２０ｍＬのＥｔＯＡｃ中に再溶解し、１５ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ＝３）、１５ｍＬの鹹水、１５ｍＬの飽和水性Ｎａ２ＣＯ３、１５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）真空内で濃縮した。
【０１５４】
追加的カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン、１／１）から６２５ｍｇ（８０％）のＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅが得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．３２−７．１１（ｍ，１０Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ）３．０４（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，３Ｈ），０．８０（ｍ，６Ｈ）．
【０１５５】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（基準化合物の化学合成）］
１．５７ｇ（４ｍｍｏｌ）のｐ−トシレート・Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２および１．４ｍＬのＤＩＰＥＡ（８ｍｍｏｌ、２ｅｑ）に溶解した。この溶液を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の１．２０ｇ（２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）のＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、８０５ｍｇのＥＤＣＩ（４．２ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）、および５９９ｍｇのＨＯＡｔ（４．４ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の溶液（０℃）に添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶液を真空内で濃縮し、残留物を４０ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解して、２５ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ＝３、２×）、２５ｍＬ鹹水、２５ｍＬの飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（２×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）真空内で濃縮した。
【０１５６】
追加的カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン、１／１）から２．０ｇ（１００％）のＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＢｎが得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ７．４２−７．１７（ｍ，１０Ｈ），６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３），５．１４（ｓ，２Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｍ，１Ｈ），３．０７（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ）１．４６（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）．
【０１５７】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨへの加水分解］
３００ｍｇのＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを１．５ｍＬの５０ｍＭ水性Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８）、１．５ｍＬのｔＢｕＯＨ、および１００ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕの混合物に添加した。反応混合物を３７℃、１００ｒｐｍで１６時間振盪し、対応する基準化合物（上述のように調製された）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【０１５８】
ＨＰＬＣ分析は検出可能なペプチド結合切断なしに、９８％のｔＢｕエステルが加水分解されたことを示した。
【０１５９】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅへのエステル化］
酵素を１０ｍＬのＭＴＢＥ中の５容積％ＭｅＯＨに再懸濁したこと以外は、先に述べたようにしてＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを調製した。この懸濁液の３ｍＬを１００ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨおよび０．１ｇの３Å分子篩に添加した。混合物を３７℃、１００ｒｐｍで１６時間振盪し、対応する基準化合物（上述のように調製された）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【０１６０】
ＨＰＬＣ分析は検出可能なペプチド結合切断なしに、エステル化が本質的に完全であった（９８％のＭｅエステル）ことを示した。
【０１６１】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＢｎへのエステル交換］
酵素を１０ｍＬのＢｎＯＨに再懸濁したこと以外は、先に述べたようにしてＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを調製した。この懸濁液の３ｍＬを１００ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅおよび０．１ｇの３Å分子篩に添加した。混合物を３７℃、１００ｒｐｍで２４時間振盪し、対応する基準化合物（上述のように調製された）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【０１６２】
ＨＰＬＣ分析は検出可能なペプチド結合切断なしに、Ｂｎエステル変換が８４％であったことを示した。
【０１６３】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅへのエステル交換
酵素を１０ｍＬのＭＴＢＥ中の５容積％ＭｅＯＨに再懸濁したこと以外は、先に述べたようにしてＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを調製した。この懸濁液の３ｍＬを１００ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕおよび０．１ｇの３Å分子篩に添加した。混合物を３７℃、１００ｒｐｍで２４時間振盪し、対応する基準化合物（上述のように調製された）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【０１６４】
ＨＰＬＣ分析はペプチド結合切断なしに、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕがＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（８１％）に変換されたことを示した。
【０１６５】
［実施例４：水およびアルコールの共沸性除去によるエステル化］
（共沸性水除去を達成するために）減圧下で反応を実施することによって、水を除去しながらＺ−Ｐｈｅ−ＯＨをＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕに変換した。
【０１６６】
したがって丸底フラスコ内で、７．５ｇのＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡ（ｔＢｕＯＨで１回洗浄された）、７５ｍＬのｔＢｕＯＨ、および１．２５ｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨを用いて反応を実施した。１時間おきに（例えばｔ＝２０〜２１時間および２２〜２３時間の間、図５Ｂ）、真空（沸騰するまで、Ｐ約６００ｍｂａｒ）にしながら混合物を５０℃で撹拌した。蒸発した溶剤をガス捕集装置内に収集した。
【０１６７】
毎時間、サンプル（２ｍＬ）を採取し、ＨＰＬＣによってエステル化反応の進行をモニターし（図５Ａ）、反応混合物の含水量を測定した（図５Ｂ）。１時間真空にした後、反応混合物を窒素下で（５０℃で）１時間撹拌し、生成物形成のために含水量が上昇するかどうかを調べた（例えばｔ＝２１〜２２時間および２３〜２４時間の間、図５Ｂ）。蒸発および試料採取のために反応容積が減少したので、新鮮なｔＢｕＯＨを必要に応じて（容積が５０ｍＬになるよう）添加した（例えばｔ＝２４〜２５時間の間、図５Ｂ）。明らかに含水量と真空の間（真空にした際の含水量の低下、図５Ｂ）、また含水量と生成物収率の間にも強い相関があった（含水量低下後の急激な収率上昇、図５Ａ）。
【０１６８】
したがって真空にすることは、水除去のための成功裡の方法であることが立証され、３Å分子篩（９６％）と比較できるＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕエステルの収率が得られた（９２％、図５Ａ）。
【０１６９】
［実施例５：酵素の再利用］
３０ｍＬのｔＢｕＯＨで１回洗浄した１ｇのＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを１０ｍＬのｔＢｕＯＨおよび１５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨに添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。ＨＰＬＣは、Ｚ−ＰｈｅのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへの変換が６０％であることを示した。引き続いて反応混合物を濾過して、Ａｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡを１０ｍＬのｔＢｕＯＨおよび１５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨに再懸濁した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。ＨＰＬＣはＺ−ＰｈｅのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへの変換が７７％であることを示した。この手順を２回繰り返した（それぞれ７７％および７６％のＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへのエステル化）。濾過後、酵素を４℃で２日間保存し、１０ｍＬのｔＢｕＯＨおよび１５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨへの再懸濁がそれに続いた。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪し、２４時間後にＨＰＬＣはＺ−ＰｈｅのＺ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕへの変換が７５％であることを示した。これは再利用中に酵素の不活性化がほとんどなかったことを立証する。
【０１７０】
［実施例６：Ｃ末端ｔ−ブチルエステルエステル交換を使用したトリペプチド合成］
【化７】
2011500010.tif 000008
【０１７１】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ］
ノボザイムズからの１０ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ溶液（Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ、タイプＤＸ）を撹拌によって無水ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（２５ｍＬ）に懸濁した。得られた混合物を遠心分離し、デカンテーションによって溶剤を除去した。ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨを使用して２回、ＭＴＢＥを使用して２回手順を繰り返した。最後に酵素をＭＴＢＥ（３０ｍＬ）に懸濁し、得られた混合物の６ｍＬをＺ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（９４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とＨ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（１６９ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）との混合物に添加した。
【０１７２】
分析的ＨＰＬＣ分析がジペプチドへの変換が完全であることを示すまで、反応混合物を５０℃で３日間撹拌した。酵素を濾過によって除去し、溶剤を真空内で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に再溶解し、引き続いて水性ＨＣｌ（１０ｍＬ、ｐＨ＝３、２×）、鹹水（１０ｍＬ）、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ、２×）、および鹹水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）濃縮した。
【０１７３】
フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出剤は１：１ｖ／ｖのＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン）によって、粗生成物（１１５ｍｇ、８２％）からＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（５５ｍｇ、３９％）を放置すると凝固する透明な油として単離した。
【０１７４】
Ｒｆ＝０．５３（溶出剤は１：１ｖ／ｖのＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン），Ｒｔ＝２４．１７分，１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３０−７．１０（ｍ，１０Ｈ），６．１１（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｍ，３Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），０．８２（ｄｄ，Ｊ＝２．２３Ｈｚ，Ｊ＝３．８２Ｈｚ，６Ｈ）．
【０１７５】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ］
ＭＴＢＥ／ＭｅＯＨ（６ｍＬ、９７：３ｖ／ｖ）中のＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（３０ｍｇ）の溶液に添加する前に、７５０ｍｇのＡｌｃａｌａｓｅ−ＣＬＥＡをｔＢｕＯＨ（２５ｍＬ）で１回洗浄した。ＨＰＬＣ分析が＞９７％のメチルエステルへの変換を示すまで、反応混合物を５０℃で１６時間振盪した。酵素を濾過によって除去し、溶剤を真空内での濃縮によって除去した。
【０１７６】
Ｒｆ＝０．３９（溶出剤は１：１ｖ／ｖのＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン），Ｒｔ＝２０．６７分，１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３２-７．１１（ｍ，１０Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．４９（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，３Ｈ），０．８１（ｍ，６Ｈ）．
【０１７７】
［Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ］
ノボザイムズからの１０ｍＬのＡｌｃａｌａｓｅ溶液（Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ、タイプＤＸ）を撹拌によって無水ｔＢｕＯＨ（２５ｍＬ）に懸濁した。得られた混合物を遠心分離してデカンテーションによって溶剤を除去した。ｔＢｕＯＨを使用して２回、ＭＴＢＥを使用して２回手順を繰り返した。最後に酵素をＭＴＢＥ（３０ｍＬ）に懸濁し、得られた混合物の６ｍＬをＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（１２８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とＨ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ（１１８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）との混合物に添加した。
【０１７８】
反応混合物を５０℃で撹拌した。２日後にＨＰＬＣ分析は、トリペプチドへのおよそ５０％の変換を示し、反応は停止した。酵素を濾過によって除去し、溶液を真空内で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出剤：勾配ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン１：３ｖ／ｖ→ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン１：１ｖ／ｖ）によって、生成物（４３ｍｇ、２８％）を放置すると凝固する透明な油として単離した。Ｒｆ＝０．２８（溶出剤は１：１ｖ／ｖのＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン）、Ｒｔ＝２２．０２分，１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３０−７．１０（ｍ，１０Ｈ），６．４６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．３２（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄ，Ｊ＝７．２７Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｍ，３Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），０．８３（ｍ，６Ｈ）．
【０１７９】
［ＴＦＡ．Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ］
パラジウム（活性炭上に１０％）の存在下において、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ、１：１ｖ／ｖ）中のＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ（５９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液を水素ガス（１ｂａｒ）で処理することにより、最初にＺ−保護基を除去した。反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌し、Ｄｉｃａｌｉｔｅ上での濾過によって触媒を除去した。得られた溶液を真空内で濃縮し、残留物を引き続いてトルエンおよびクロロホルムを用いて共蒸発させた。ＨＰＬＣ分析によって、Ｚ−保護基の完全な除去を確認した。
【０１８０】
引き続いて残留物を周囲温度でＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ、１：１ｖ／ｖ）によって３時間処理して、ｔＢｕエステルを除去した。混合物を真空内で濃縮し、残留物を引き続いてクロロホルムを用いて共蒸発させ、Ｅｔ２Ｏで倍散して白色固体としてトリペプチド生成物を得た（４１ｍｇ、８０％）。
【０１８１】
ＴＦＡ．Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨのアイデンティティは、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって確認された。Ｒｔ＝６．３９分，ＥＳＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ２５Ｎ３Ｏ４３３５．１８，実測値３３６［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．３５−７．２０（ｍ，５Ｈ），４．３４（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｍ，２Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，３Ｈ），０．８２（ｍ，６Ｈ）．
【０１８２】
［実施例７：サブチリシン−ＡによるＮ−保護アミノ酸のエステル化］
ノボザイムズからの凍結乾燥サブチリシン−Ａ（１ｇ）を１０ｍＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８）に溶解し、２０ｍＬのｔＢｕＯＨで沈殿させた。遠心分離（１０分間、４５００ｒｐｍ）後に上清を廃棄し、ペレットを２０ｍＬのｔＢｕＯＨに再懸濁した。この手順を２回繰り返した。最終デカンテーション後、２００ｍｇのペレットを３ｍＬのｔＢｕＯＨおよび５０ｍｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨに再懸濁し、１００ｍｇの３Å分子篩を添加した。この混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪した。１６時間後のＨＰＬＣ分析は、ｔＢｕエステルへの＞６０％の変換を示した。
【図１Ａ】
2011500010.tif 000009
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2011500010.tif 000014
【図５Ｂ】
2011500010.tif 000015
【国際調査報告】
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