(57)【要約】  本発明は有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増強用組成物に関し、より一層詳しくはＴＬＲ受容体を介してＴｈ１細胞性免疫増進を誘導して、抗原提示活性を増進させて、増進された活性を持続させる効果を有するポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物に関する。本発明によるポリ−γ−グルタミン酸を有効性分として含む組成物は毒性及び副作用が殆どなく、ウィルス及び細菌性感染症、癌に対するヒト用、または動物用予防及び治療用ワクチンに添加されて、細胞性免疫増進を示すことができる効果がある。
2011500554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物。
【請求項２】
前記細胞性免疫増進はＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）により媒介されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリ−γ−グルタミン酸の分子量は、１００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含むウィルスまたは細菌性感染症に対する予防または治療用ワクチン組成物。
【請求項６】
前記ウィルスまたは細菌性感染症がヒトまたは動物の感染症であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物を含む癌に対する予防または治療用ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物に関し、より一層詳しくは、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）を介してＴｈ１細胞性免疫増強を誘導して、抗原提示活性を増進させ、増進された活性を持続させる効果を有するポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性免疫は体液性免疫と比較される概念であり、抗原特異的なＴ細胞または抗原非特異的なナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ；ＮＫ細胞）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）により誘導される免疫反応である。
【０００３】
体液性免疫反応は細胞と関連していない抗体によって誘導されるため、抗原も、細胞と関連することなく独立して作用する細菌のような抗原の除去に適している。しかし、抗原の中には細胞の外に存在せず、宿主細胞と係わりを持ったり、細胞中に存在する抗原がある。例えば、ウィルスの場合、宿主細胞の中に入って増殖する代表的な場合であり、癌細胞などは細胞自体が変形されたものであるため、殆どの抗原が細胞と係わりを持ったり、または細胞の内部に存在する。このような場合、抗原を効果的に除去するためには、抗原が存在する細胞内部の問題を解決すべきであるが、抗体は直接細胞を通過して入ることができないため、このような細胞内部抗原と反応することは困難である。たとえ細胞表面抗原に対する抗体は細胞表面と結合してＮＫ細胞やマクロファージなどによって、抗原を有している細胞を死滅させるＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）や補体介在性溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）などの一種の細胞毒性反応を示したとしても、より効果的に細胞内部と係わる抗原を除去するためには、細胞性免疫反応（Ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の誘導が必要である。即ち、特異的に抗原を有している細胞を除去する細胞性免疫反応を利用することによって、効果的に細胞関連抗原を除去できるようになる。
【０００４】
細胞性免疫反応は作用細胞の特性により二つのグループに分けられる。一つは抗原特異的なＴ細胞による反応であり、他の一つは抗原非特異的なナチュラルキラー細胞やマクロファージによる反応である。細胞障害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ：ＣＴＬ）による反応は、抗原特異的なＣＴＬが直接抗原を有している細胞に作用して細胞を殺す免疫反応であり、代表的な特異的免疫反応の一つである。Ｔ細胞の中の遅延性型過敏反応（Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｔｙｐｅ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）に関与するＣＤ４Ｔ細胞は直接細胞を殺すことはないが、細胞性免疫反応の作用細胞（ＣＤ４エフェクターＴ細胞）として、マクロファージを活性化して細胞性免疫反応を促進する。また、ＮＫ細胞やマクロファージも細胞性免疫反応において重要な細胞であり、この細胞はたとえ抗原非特異的な細胞であっても、他の個体の細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｅｌｌｓ）、腫瘍細胞、ウィルスに感染した細胞などを認識して破壊することができる。
【０００５】
しかし、既に報告されて使用されている殆どの免疫補強剤は、安全性が確保できなかったり、体液性免疫増進に主に効果を有しているもので、ウィルス感染疾患、癌疾患などの予防及び治療においては効果的ではない。
グラクソ・スミスクライン（ＧＳＫ）の子宮頸部癌予防ワクチンに使用された免疫補強剤であるＡＳ０４の場合、細胞性免疫増進の部分的効果を示していると報告されているが、現在は注射用ワクチンとしての使用が限定されているため、経口、又は粘膜への投与などの経路に使われない。
【０００６】
殆どの病原体の侵入経路は粘膜表面であり、多くの感染が粘膜及び粘膜下組織において第一に引き起こされる。従って、通常の非経口ワクチンは粘膜免疫反応の誘導に極めて効果がなく、最適の粘膜免疫システムの開発に格段の努力が払われてきた。このような努力の中で粘膜下の組織の免疫細胞に対する抗原の伝達を向上させる免疫補強剤（リポソーム、免疫刺激複合体、中心体など）の開発も併せて行われ、それを使用した実験例が報告されている（Sjolander et al, J. Leukocyte Biol. 64:713, 1998）。しかし、粘膜免疫が多様な状況で効果的であるとしても、多くの感染で効果的な免疫反応の誘発のためには、粘膜及び非粘膜免疫システムの２つの結合が必要である。
【０００７】
前記の技術内容を考慮すると、商業的に競争力があって有効な医薬組成物を開発するためには、選択された抗原性物質の大規模生産をはじめ、この効果を極大化しながら、安全に伝達できる免疫増強補助剤がコスト面で効果的でなければならない。また、経皮、経口、粘膜、または全身投与が可能で、かつ免疫反応を適切に調節及び集中できる免疫補強剤が必要となる。
【０００８】
そこで、本発明者らはより効果的で安全な免疫補強剤を開発するために鋭意努力した結果、バチルス菌が産生するポリ−γ−グルタミン酸がＴＬＲ４受容体を介したＴｈ１細胞性免疫増進効果を有すること、及び抗原提示活性を増加させてこれを持続させる効果を有することを立証することによって、ポリ−γ−グルタミン酸が細胞性免疫増進用組成物（ＣＭＩ−ａｄｊｕｖａｎｔ）として有用であることを確認し、さらに経口投与にも安全性を有することを立証することによって本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第０５１７１１４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sjolander et al, J. Leukocyte Biol. 64:713, 1998
【非特許文献２】Giannini S. L. et al, Vaccine. 14:5937, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進作用によるヒト用ウィルス及び細菌性感染症および癌に対する予防、及び治療用ワクチン組成物、あるいは動物用ウィルス、及び細菌性感染症の予防及び治療用ワクチン組成物を提供することである。
【課題を達成するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進作用によるヒト用ウィルス又は細菌性感染症、癌に対する予防及び治療用ワクチン組成物を提供する。
さらに、本発明は有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進作用による動物用ウィルス又は細菌性感染症の予防、及び治療用ワクチン組成物を提供する。
【００１５】
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ポリ−γ−グルタミン酸がＴｏｌｌ様受容体４（Ｔｏｌｌ  Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４：ＴＬＲ４）細胞信号伝達によって、骨髄由来マクロファージの活性化に及ぼす影響を確認した結果を示した。
【図２】ポリ−γ−グルタミン酸が樹状細胞の活性化に及ぼす影響を確認した結果を示した。
【図３】ポリ−γ−グルタミン酸で処理された野生型Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス及び変異型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄細胞から分化した樹状細胞が分泌するＩＬ−１２ｐ７０の量を測定した結果を示した。
【図４】樹状細胞とＴ細胞との混合比により活性化したＴ細胞を確認するためにＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の分布をＦＡＣＳで分析した結果を示した。
【図５】樹状細胞とＴ細胞との混合比により活性化するＴ細胞を分析することによって抗原提示活性を確認した結果を示した。
【図６】ＳｉＲＮＡを利用したＴＬＲ４遺伝子発現抑制によるポリ−γ−グルタミン酸処理時ＴＬＲ４受容体依存的な細胞信号伝達減少効果を確認した結果を示した。
【図７】ポリ−γ−グルタミン酸を細胞性免疫増進剤として使用したＥ７表面発現乳酸菌ワクチン組成物の抗癌効果を確認した結果を示した。
【図８】ＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物によって、ヒトＣＥＡに対する体液性免疫反応がマウスにおいて誘導されることを確認した結果を示した。
【図９】ＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物によって、ヒトＣＥＡに対する細胞性免疫反応が誘導されることを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを通して確認した結果を示した。
【図１０】ＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物によって、ヒトＣＥＡに対する細胞性免疫反応が誘導されるのを、ＦＡＣＳアッセイを通して確認した結果を示した。
【図１１】ＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物投与による抗癌効果（癌の大きさの減少効果）を確認した結果を示した。
【図１２】ＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物投与による抗癌効果（生存率増加効果）を確認した結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一つの側面は、有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進用組成物に関する。
【００１８】
本発明において前記細胞性免疫増進用組成物に使用されるポリ−γ−グルタミン酸の分子量は、望ましくは１００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａであり、さらに望ましくは１，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸を含有する。
【００１９】
本発明において、前記ポリ−γ−グルタミン酸はＴＬＲ受容体を介して、骨髄由来マクロファージ及び樹状細胞のＴｈ１細胞性免疫増進を誘導し、樹状細胞の抗原提示活性を増進させ、増進された活性を持続させる効果を有することが確認された。
【００２０】
本発明において、前記免疫増進用組成物はヒト用または動物用ウィルス及び細菌性感染症の予防及び治療用ワクチンなどに添加されて、免疫増進効果を現わすことを特徴とする。
【００２１】
本発明によるポリ−γ−グルタミン酸を有効性分として含有する免疫増進用組成物は、各々通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用される。
【００２２】
前記免疫増強用組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油が挙げられる。
【００２３】
製剤化する場合には、通常使用される充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単なる賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、油剤、及びシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、及び座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルなどの注射が可能なエステールなどが使用される。坐剤の基剤としてはウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、及びゼラチンなどが使用される。
【００２４】
本発明のポリ−γ−グルタミン酸を有効性分に含有する免疫増進用組成物を含む医薬組成物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適切に選択でき、望ましくは０．００１〜１０ｇ（ＰＧＡ）／ｋｇ（個体重量）で使用され、さらに望ましくは０．０１〜２ｇ（ＰＧＡ）／ｋｇ（個体重量）で使用される。
【００２５】
０．００１ｇ（ＰＧＡ）／ｋｇ（個体重量）未満で投与される時には免疫増強効果を期待し難く、１０ｇ（ＰＧＡ）／ｋｇ（個体重量）を超えて投与される時には粘度上昇によって注射剤などで投与し難いだけでなく、濃度増加による上昇効果を期待できないため経済的とはいえない。
【００２６】
本発明の組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路を介して投与される。全ての投与方式は予想され、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与される。
【００２７】
本発明のポリ−γ−グルタミン酸を有効成分として含有する免疫増進用組成物を含む健康機能食品及び飼料添加剤は、各々通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液状などの形態で剤形化して使用され、望ましい投与量は当業者によって適切に選択される。
【００２８】
本発明の他の側面は、有効量のポリ−γ−グルタミン酸を含有する細胞性免疫増進作用による病気予防及び治療用ワクチン組成物に関する。
本発明のポリ−γ−グルタミン酸はＴＬＲ受容体を介してＴｈ１細胞性免疫増進を誘導して、抗原提示活性を増進させて、増進された活性を持続させるように作用する。従って、細胞内部のウィルス感染及び細菌性疾患及び細胞変異を原因とする癌に対する予防及び治療効果を増進させる役割を期待できる。
【００２９】
最近、細胞性免疫増進能を有すると示されたＨＰＶワクチン用免疫増強剤ＡＳ０４（Giannini S. L. et al, Vaccine. 14:5937, 2006）が注射剤としてのみ使用されるが、本発明のワクチン組成物は注射用のみならず、経口用、鼻腔用、噴霧用などの多様な方式で投与できる長所がある。
【００３０】
本発明者らは、ポリ−γ−グルタミン酸を含有するアジュバント組成物に対する特許（韓国登録特許第０５１７１１４号）を登録させた。それは前記特許に記載されたアジュバント組成物による体液性免疫反応誘導を通して、抗原に対する免疫反応を増加させて、免疫原性が不良な抗原を使用した場合も高い抗体価が得られる組成物に関する。
【００３１】
本発明は、抗体誘導を通して体液性免疫反応では効果のない、宿主細胞と関連するか、又は細胞中に存在する抗原に対してより効果的な細胞性免疫反応を誘導できる有効量の高分子量ポリ−γ−グルタミン酸含有細胞性免疫増進用組成物を提供する。体液性免疫によって誘導された抗体は、直接細胞侵入できないため、細胞内部抗原と反応できないが、本発明の細胞性免疫増進用組成物は宿主細胞と関連するか、又は細胞内部に存在する抗原、例えば、宿主細胞中に入って増殖する代表例であるウィルス、細胞自体が変異した癌細胞のような抗原を効果的に除去できる細胞性免疫の増進が可能である。このような特徴により死菌ワクチン及びサブユニットワクチンのように細胞性免疫誘導能が不良の抗原を利用したワクチン組成物に添加されて、より増進された効果を示すことができる。
【実施例】
【００３２】
以下本発明を実施例によって、より詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは当業界においては通常の知識を有する者にとっては自明であろう。
【００３３】
［実施例１］ポリ−γ−グルタミン酸の生産及び分子量測定
ポリ−γ−グルタミン酸生産用基本培地（５％のＬ−グルタミン酸が添加されたＧＳ培地；Ｇｌｕｃｏｓｅ５％、（ＮＨ４）２ＳＯ４１％、ＫＨ２ＰＯ４０．２７％、Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ  ０．４２％、ＮａＣｌ０．０５％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．３％、Ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ１ｍＬ／Ｌ、ｐＨ６．８）を３Ｌ含む５Ｌ容量の醗酵器に、枯草菌チョングッチャン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ  ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、ＫＣＴＣ  ０６９７ＢＰ）菌株の培養液を１％接種し、攪拌速度１５０ｒｐｍ、空気注入速度１ｖｖｍにして、３７℃で７２時間培養する。培養終了後フィルタープレスを使用して、菌体を除去してポリ−γ−グルタミン酸含有試料液を取得した。
【００３４】
前記試料液に２Ｎ硫酸溶液を添加後、１０℃で１２時間静置させてポリ−γ−グルタミン酸沈殿物を取得した。前記沈殿物を十分量の蒸留水で洗浄した後、ヌッチェフィルタで濾過してポリ−γ−グルタミン酸を取得した。前記取得したポリ−γ−グルタミン酸は適切な方法で切断して、一定の分子量を有するポリ−γ−グルタミン酸に調製して使用したり、適切な方法で一定の分子量毎に分離して回収して使用可能であり、分子量はＧＰＣ（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）を利用して測定した。下記実施例では１０ｋＤａ、２，０００ｋＤａの平均分子量を有するポリ−γ−グルタミン酸を利用して実験を遂行した。
【００３５】
［実施例２］ポリ−γ−グルタミン酸の経口投与毒性試験結果
ポリ−γ−グルタミン酸の経口投与時の安全性を確認するためにＧＬＰ（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）認証を受けた安全性評価研究機関である（株）バイオトックステク（Ｂｉｏｔｏｘｔｅｃｈ）にポリ−γ−グルタミン酸のラットを利用した単回経口投与毒性試験を依頼した。試験はグッドラボラトリープラクティス（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＬＰ）規定及び試験基準と（株）バイオトックステクの標準作業手順（ＳＯＰｓ）を遵守して遂行された。
【００３６】
ラットは６週齢、雄１０匹（１５９．７６〜１７７．２７ｇ）と雌１０匹（１２１．６０〜１３８．８０ｇ）を使用し、個体毎のポリ−γ−グルタミン酸の投与液量は絶食後、投与当日の体重を基準に算出した。全てのラットは投与前に飲水は自由にさせ、約１６時間絶食させた後、経口投与用ゾンデを付けた使い捨て注射器（５ｍＬ）を利用して、胃内に強制経口投与し、投与してから約４時間後餌を与えた。
【００３７】
予備試験において１００ｍｇ／ｍＬ濃度のポリ−γ−グルタミン酸を２０ｍＬ／ｋｇの投与容量でラット雄・雌各２匹に単回経口投与した結果、死亡例が観察されなかったため、２，０００ｍｇ／２０ｍＬ／ｋｇの単一容量を設定した。対照群には試験物質投与群と同じ液量の賦形剤を投与した。投与液量は２０ｍＬ／ｋｇにした。
【００３８】
その結果、表１に示したように、観察期間の間、ポリ−γ−グルタミン酸経口投与に起因した死亡例及び一般症状は観察されなかった。観察期間の間、ラットの体重は雄・雌対照群及び試験物質投与群において順調な増加が観察された。解剖検査結果、雄・雌対照群と試験物質投与群において肉眼による異常所見は認められなかった。以上、ポリ−γ−グルタミン酸をラットに単回経口投与した結果、試験物質による一般症状及び死亡例が観察されなかったため、ポリ−γ−グルタミン酸の致死量は雄・雌各２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であると判断された。
【００３９】
【表１】
2011500554.tif 000003
【００４０】
［実施例３］ポリ−γ−グルタミン酸のＴＬＲ４細胞信号伝達による骨髄マクロファージのＴＮＦ−α及びＩＰ−１０サイトカイン誘導
ポリ−γ−グルタミン酸がＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ  Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）細胞信号伝達によって、骨髄由来マクロファージ（Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｉｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ＢＭＤＭｓ）の活性化に及ぼす影響を調べるために正常な野生型マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．）とＴＬＲ４変異マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．）から分離したマクロファージを利用して、活性化したマクロファージが分泌するサイトカインであるＴＮＦ−αとＩＰ−１０（ＩＦＮ−γ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分泌誘導能をＥＬＩＳＡキットを利用して測定した。
【００４１】
まず、骨髄由来マクロファージの培養のために６〜８週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの長骨と短骨を摘出して、骨の関節両側の部分を切断してＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）培養液で２７Ｇ、５ｍＬ注射器を利用して、骨髄を抽出した。以後ＴＡＣバッファー（８．３ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）を利用して、赤血球を除去し、２４ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェル／５００μＬの濃度で分株し、マクロファージに分化させるためにＲＰＭＩ１６４０（１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ添加）とＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を添加して、６日間、３７℃のＣＯ２培養器において分化させた。培養３日目に同量のＭ−ＣＳＦをさらに添加培養した。
６日後、分化されたマクロファージにポリ−γ−グルタミン酸（１０ｋＤａ及び２，０００ｋＤａ）１ｍｇ／ｍＬを、ＲＰＭＩ１６４０を使用して、濃度別に希釈し添加した後、２４時間培養した。この時陽性対照群としてＴＮＦ−α及びＩＰ−１０誘導を促進すると知られるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を１００ｎｇ／ｍＬ濃度で処理した。
【００４２】
培養終了後、各ウェルの培養上清を回収して、培養液内に存在するＴＮＦ−αの濃度をマウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いて測定し、ＩＰ−１０の濃度をマウスＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
具体的には測定は、以下のように行った。ＴＮＦ−αまたはＩＰ−１０抗マウス単クローン抗体でコーティングされた９６ウェルプレートにＴＮＦ−αまたはＩＰ−１０標準溶液１００μＬと培養上清１００μＬを入れて常温で各々１時間反応させた。その後、洗浄緩衝液（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で５回洗浄した後、１次抗体であるビオチン化抗マウスＴＮＦ−αまたはＩＰ−１０抗体１００μＬを添加して、常温で１時間反応させて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。以後、２次抗体であるアビジン−西洋わさびパーオキシダーゼ複合体を１００μＬ入れて常温で３０分反応させた後、５回洗浄させて、ＴＭＢ発色溶液で２０分反応させた後、５０μＬの停止液で発色を停止させて、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで吸光度を測定して、標準溶液を使用した結果によって製作された標準曲線を用いて、ＴＮＦ−αまたはＩＰ−１０の濃度を分析した。図１のＡはＴＮＦ−αの分泌量を測定した結果であり、図１のＢはＩＰ−１０の分泌量を測定した結果である。
【００４３】
図１に示したように、野生型マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）の骨髄マクロファージにおいて分子量が小さい１０ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した場合、サイトカインが分泌されない一方、２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸及びＬＰＳで処理した骨髄マクロファージではＴＮＦ−α及びＩＰ−１０の分泌増加が観察され、ＴＮＦ−α及びＩＰ−１０の分泌量は分子量２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸の濃度に依存する傾向を示した。前記ＴＮＦ−αの分泌増加は炎症性の先天性免疫の亢進が、ＴＬＲ４受容体を介して行われることを示す。
【００４４】
一方、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）変異Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来マクロファージにおいては２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した時、野生型マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）と比べて、分泌されるサイトカインの量が減少することが明らかになった。このような結果は、ポリ−γ−グルタミン酸がＴＬＲ４細胞信号伝達を通して骨髄由来マクロファージを活性化させることを示す。
【００４５】
［実施例４］ポリ−γ−グルタミン酸のＴＬＲ４を介する骨髄由来樹状細胞の活性化誘導
樹状細胞はマクロファージと共に１次免疫反応だけでなくＴリンパ球の分化及び活性化に主要な役割を果たすため、ポリ−γ−グルタミン酸が樹状細胞の活性化に及ぼす影響を調べた。また、ポリ−γ−グルタミン酸による骨髄由来樹状細胞（Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）の活性化誘導にＴＬＲ４が及ぼす影響を調べるため野生型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスと変異型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから骨髄細胞を分離して、樹状細胞に分化させて使用した。
【００４６】
樹状細胞分化のためには１２ウェルプレートに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で骨髄細胞を分株してＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、２０ｎｇ／ｍＬ）とインターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）（ＩＬ）−４（１０ｎｇ／ｍＬ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ添加）培地で７日間培養した後使用した。
【００４７】
前記培養された骨髄由来樹状細胞にポリ−γ−グルタミン酸（ポリ−γ−グルタミン酸：１０ｋＤａ、２，０００ｋＤａ）を各々０．１％濃度で希釈して、１２時間培養した。この時、陽性対照群にはＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。培養終了後、各ウェルの樹状細胞を回収して、細胞表面の活性化表面マーカー（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ）の発現を確認した。
【００４８】
活性化表面マーカーの発現確認のためにマウス樹状細胞の代表的な活性化表面マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を各々の蛍光染色物質で標識された抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、ａｎｔｉ−ＣＤ８０−ＰＥ及びａｎｔｉ−ＣＤ８６−ＰＥ）を用いて、４℃で１時間染色した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーターを用いて測定した。
【００４９】
その結果、図２に示したように、野生型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス骨髄由来の樹状細胞を利用した実験で陽性対照群であるＬＰＳと分子量が大きい２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した群において高い活性化表面マーカーの発現を確認することができた。しかし、変異型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス骨髄由来樹状細胞を利用した実験ではその発現量が顕著に減ることが確認された。
【００５０】
［実施例５］ポリ−γ−グルタミン酸のＴＬＲ４を介する骨髄由来樹状細胞におけるＩＬ−１２分泌誘導
実施例３と同様に野生型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス及び変異型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから骨髄細胞を分離して、樹状細胞に分化させた後、ポリ−γ−グルタミン酸（ポリ−γ−グルタミン酸：１０ｋＤａ、２，０００ｋＤａ）を各々０．１％濃度で希釈して、２４時間培養した後、各培養上清を回収して、培養上清に存在するＩＬ−１２ｐ７０の濃度をマウスＩＬ−１２ｐ７０  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【００５１】
ＩＬ−１２ｐ７０抗マウスモノクローナル抗体でコーティングされた９６ウェルプレートに各々ＩＬ−１２ｐ７０標準溶液と培養上清１００μＬを入れて常温で２時間反応させた。その後、洗浄緩衝液（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した後、１次抗体であるビオチン化抗マウスＩＬ−１２ｐ７０ポリクローナル抗体１００μＬを添加して、２時間常温で反応させて、洗浄緩衝液（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。以後２次抗体であるストレプトアビジン−西洋わさびパーオキシダーゼ複合体を１００μＬずつ入れて常温で１時間反応させて、５回洗浄させた。さらにＴＭＢ発色溶液で３０分反応させた後、５０μＬの停止液で発色を停止してＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍで測定してＩＬ−１２ｐ７０量を分析した。
【００５２】
その結果、図３に示したように、２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸は陽性対照群ＬＰＳと同様に野生型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス骨髄由来樹状細胞で高いＩＬ−１２ｐ７０の分泌を誘導した。しかし、変異型ＴＬＲ４を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス骨髄由来樹状細胞ではその分泌量が顕著に減少することが分かった。
【００５３】
図２及び図３に示したように、ポリ−γ−グルタミン酸が樹状細胞を活性化させて、細胞性免疫を増加に関与するＩＬ−１２サイトカインを誘導できることが確認でき、マクロファージと同様に樹状細胞の活性化においても分子量に依存する傾向を見せた。また、野生型マウスにおいて明確に増加した樹状細胞の活性化因子が、突然変異型マウスにおいては顕著に減少することから、ポリ−γ−グルタミン酸は陽性対照群であるＬＰＳと同様にＴＬＲ４細胞信号伝達を通して樹状細胞を活性化させることが分かった。
【００５４】
［実施例６］ポリ−γ−グルタミン酸の樹状細胞における抗原提示活性の増進
樹状細胞は特殊化した抗原提示細胞であり、細胞表面のＭＨＣ分子に抗原を提示することでＴ細胞を活性化させる。ポリ−γ−グルタミン酸が樹状細胞の抗原提示活性を増加させるか否かを評価するために免疫細胞混合培養（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通して確認した。
【００５５】
マウス骨髄細胞から分化させた樹状細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように接種後、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍＬ）または２，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸（１ｍｇ／ｍＬ）で１２時間刺激した。その後、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｅ７ペプチド（ａａ  ４９−５７、ＡｎｉＧｅｎ、Ｋｏｒｅａ）を１μｇ／ｍＬの濃度で１時間処理し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。このように得られた樹状細胞を１μｇ／ｍＬ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを含んだ培地で、ＨＰＶ１６  Ｅ７  ａａ  ４９−５７ペプチド特異的Ｔ細胞と、図４に示されて割合で、３７℃で一夜混合培養した。
【００５６】
活性化したＴ細胞を確認するためにＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の分布をＦＡＣＳ分析した。特に、細胞を洗浄した後、Ｔ細胞の表面分子であるＣＤ８に対する特異的抗体（ＰＥ−標識抗マウスＣＤ８）を用いて、４℃で１時間染色した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてＩＦＮ−γ特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ）で細胞内部のＩＦＮ−γを染色した。
【００５７】
図４に示したように、刺激を与えない細胞の場合、Ｔ細胞に対する樹状細胞の比を増加させてもＴ細胞の活性を増加させることができない反面、２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した樹状細胞の場合、Ｔ細胞に対する樹状細胞の比を増加させるに従ってＴ細胞の活性が顕著に増加することを確認することができた。特に、樹状細胞とＴ細胞との比を１：１００で混合培養した時、活性化したＴ細胞が８．６８±０．４％と高くなり、これは陽性対照群であるＬＰＳによって現れた８．３９±０．６％と同様の結果を示す。これにより、ポリ−γ−グルタミン酸が樹状細胞の抗原提示能力を増加させることでＴ細胞の活性を誘導する可能性があることを確認した（図５）。
【００５８】
［実施例７］ｓｉＲＮＡを利用したＴＬＲ４遺伝子発現抑制によるポリ−γ−グルタミン酸のＴＬＲ４受容体依存的な細胞信号伝達減少効果確認
対照ｓｉＲＮＡ（ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．  Ｄ−００１２１０−０、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＵＳＡ）及びｓｉＴＬＲ４（ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．  Ｍ−０４７４８７−００、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＵＳＡ）を５ｘｓｉＲＮＡバッファー５００μＬに各々希釈し、５０μＬずつ分株し−２０℃に保管した。一過性トランスフェクションを行うためＲＡＷ２６４．７細胞（ＫＣＬＢ  ４００７１）を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬになるよう１００φ培養皿に培養した。培養された細胞を０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収して、ＰＢＳで３回水洗した。回収された細胞はエレクトロポレーション方法でｓｉＴＬＲ４または対照ｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションを実施した。細胞をエレクトロポレーションバッファー２０μＬに懸濁し、２個のチューブに１０μＬずつ分株した。１０μＬずつ分株された細胞に対照ｓｉＲＮＡとｓｉＴＬＲ４  １０μＬを各々添加して氷に５分間放置した。５分間放置後エレクトロポレーション（１２３０ｖｏｌｔａｇｅで２回パルス）を実施した。一過性トランスフェクションされた細胞は１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培養液に懸濁させた。
【００５９】
まずｓｉＴＬＲ４によるＴＬＲ４のｍＲＮＡ発現抑制をＲＴ−ＰＣＲで確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞に対照ｓｉＲＮＡ及びｓｉＴＬＲ４を一過性トランスフェクションし４８時間培養後、細胞を回収した。回収された細胞はＰＢＳで２回洗浄して、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トータルＲＮＡを取得した。取得したＲＮＡ２μｇをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡに合成した。合成されたｃＤＮＡはＴＬＲ４を特異的に認識するプライマー（センス；５’−ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＴ−３（配列番号１）’、アンチセンス；５’−ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴ−３（配列番号２）’）を使用して、９５℃で６０秒、６５℃で６０秒、７２℃で８０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。陽性対照群としてβ−アクチンを認識するプライマー（センス；５−ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡ−３（配列番号３）’、アンチセンス；５’−ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧ−３’（配列番号４））を使用して、９４℃で４５秒、５６℃で４５秒、７２℃で４５秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。増幅されたＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲルで電気泳動してＴＬＲ４（９５０ｂｐ）及びβ−アクチン（４５０ｂｐ）発現を確認した。
【００６０】
その結果、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてはＴＬＲ４  ｍＲＮＡが正常に発現するのに対してｓｉＴＬＲ４をトランスフェクションした細胞においてはＴＬＲ４のｍＲＮＡ発現が顕著に減少することが分かった（図６）。
【００６１】
蛋白質発現抑制を確認するために免疫蛍光分析法と自動細胞解析分取装置（ＦＡＣＳ）を用いて分析した。免疫蛍光分析法のためにＲＡＷ２６４．７細胞に対照ｓｉＲＮＡとｓｉＴＬＲ４を一過性トランスフェクションし４８時間培養後、細胞を回収した。回収された細胞をカバーグラス上に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞数になるよう付着させた。カバーグラスに付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれた緩衝溶液）に溶解した２％ＢＳＡ希釈液を加えて、常温で１時間放置した。抗ＴＬＲ４抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）を２％ＢＳＡ希釈液で１／１００に希釈し、常温で２時間反応させて、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。洗浄後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を２％ＢＳＡ希釈液で１／２００に希釈し、常温で３０分間放置後ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄して、Ａｘｉｏｓｋｏｐ逆像蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎ）を用いて、細胞の蛍光を観察した。免疫蛍光分析の結果、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においては顕微鏡像に見られる全ての細胞の表面に蛍光が感知されるのに対して、ｓｉＴＬＲ４をトランスフェクションした細胞は蛍光が顕著に減少することが分かった。従って、ｓｉＴＬＲ４がＴＬＲ４の蛋白質発現を抑制させることが確認された（図６）。
【００６２】
ＦＡＣＳ分析のためにＲＡＷ２６４．７細胞に対照ｓｉＲＮＡとｓｉＴＬＲ４を一過性トランスフェクションし４８時間培養後、細胞を回収した。回収された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれた緩衝溶液）に溶解した２％ＢＳＡ希釈液を加え、常温で１時間放置した。抗−ＴＬＲ４抗体を２％  ＢＳＡ希釈液で１／１００に希釈し４℃で１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄した。洗浄後、ＦＩＴＣ標識ＩｇＧ抗体を２％ＢＳＡ希釈液で１／２００に希釈し、４℃で３０分間放置後ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で３回洗浄後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で発光の強度を分析した。その結果、蛍光顕微鏡分析と同様に、ＴＬＲ４受容体の発現がｓｉＴＬＲ４によって減少することが確認された（図６）。
【００６３】
ポリ−γ−グルタミン酸が細胞内のＴＬＲ４依存の信号伝達を誘導するのか否かをｓｉＲＮＡでＴＬＲ４遺伝子発現を抑制して、ＴＬＲ４依存サイトカインであるＴＮＦ−αの細胞内分泌を測定した。
【００６４】
ＲＡＷ２６４．７細胞に対照ｓｉＲＮＡ及びｓｉＴＬＲ４を一過性トランスフェクションし４８時間培養し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、１０ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸（１ｍｇ／ｍＬ）、２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸（１ｍｇ／ｍＬ）刺激後、２４時間培養した。２４時間刺激後、培養液を回収して、分泌されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で測定した。
【００６５】
まず、９６−ウェルプレートにＴＮＦ−α捕捉抗体を１／２５０に希釈し、４℃で１６時間放置させた。ＴＮＦ−α捕捉抗体がコーティングされたプレートにアッセイ希釈液を追加し、常温で１時間放置して、非特異的な反応を抑制させた。非特異的な反応抑制後、洗浄液で３回洗浄して、細胞培養液１００μＬずつウェルに添加し、３７℃で２時間放置した。細胞培養液添加後、ＴＮＦ−α検出抗体とアビジンＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ標識）抗体を各々１／２５０に希釈した混合液を１００μＬずつウェルに追加し、３７℃で２時間放置し、洗浄溶液で３回洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ基質（発色試薬）をウェルに１００μＬずつ追加し、常温で３０分間放置して発色させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
その結果、図６に示されたように、対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、ＬＰＳ及び２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した細胞培養液でＴＮＦ−α濃度が対照群（ＰＢＳ処理細胞）より顕著に増加したが、ｓｉＴＬＲ４をトランスフェクション後、ＬＰＳ、２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した細胞培養液では対照ｓｉＲＮＡトランスフェクションされた細胞培養液よりＴＮＦ−α濃度が顕著に減少することが確認された。しかし、１０ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸で処理した細胞培養液は対照群と比べてＴＮＦ−α濃度が増加したが、ｓｉＴＬＲ４をトランスフェクションした場合ＴＮＦ−α濃度差がなかった。従って、ｓｉＴＬＲ４でＴＬＲ４遺伝子発現を抑制させた細胞においてＴＬＲ４リガンドと知られるＬＰＳと２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸とがＴＬＲ４に依存的なサイトカインであるＴＮＦ−α分泌において、類似する結果が得られたことによって２，０００ｋＤａポリ−γ−グルタミン酸がＴＬＲ４に依存的な細胞信号伝達を誘導することが確認された。
【００６７】
［実施例８］ポリ−γ−グルタミン酸によるＨＰＶ抗原蛋白質が表面発現された乳酸菌の癌細胞治療能の増進に関する研究
抗原性蛋白質を発現する微生物をワクチンの用に使用する場合、巨大分子量ポリ−γ−グルタミン酸が細胞性免疫増進剤（ＣＭＩ−ａｄｊｕｖａｎｔ）の役割をして、抗原に対する特異的抗癌効果の増進を示すことを確認した。
【００６８】
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）により誘発される子宮頸部癌の動物モデルを用いて、抗原蛋白質であるＥ７が表面発現された乳酸菌を治療用ワクチンの主要抗原成分として使用し、ポリ−γ−グルタミン酸の混合投与の有無による二つの実験群によって、細胞性免疫増進効果を比較した。
【００６９】
バシラス属菌株から由来した、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ）の中でｐｇｓＡを利用してグラム陰性微生物及びグラム陽性微生物を宿主として、ヒトパピローマウィルス特異的抗原であるＥ７を表面発現できるベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ−Ｅ７を製作し、これをラクトバシラスカセイに形質転換してＥ７表面発現乳酸菌を得た。
【００７０】
抗原蛋白質Ｅ７が表面発現するｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ−Ｅ７の構築物は次のように製造された。
Ｅ７コーディング遺伝子を含むヒトパピローマウィルスゲノム塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｋ０２７１８）を有するＤＮＡ中ＨＰＶ−Ｅ７をコーディングする部分を鋳型（配列番号５）にして配列番号６（５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｔｇｇａｇａｔａｃａｃｃ−３’）及び配列番号７（５’−ｃｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｔｇｇｔｔｔｃｔｇａｇａａｃａｇ−３’）のプライマーを利用したＰＣＲ反応を通して、３１５ｂｐのＤＮＡ断片を取得し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素で切断して、挿入断片を得た。前記挿入断片をｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１（ＫＣＴＣ  １０３４９ＢＰ：ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１で形質転換された大腸菌）のＨＰＶＬ１部分をＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素サイトを利用して入れ替えてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ−Ｅ７を製造した。
【００７１】
Ｅ７蛋白質を細胞表面に発現させるために表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ−Ｅ７をラクトバシラスカセイに形質転換させて、Ｅ７を表面発現する形質転換体を製作して、前記形質転換体をＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＭＲＳ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃で静置培養して表面発現を誘導した。
【００７２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（大韓バイオリンク、韓国）にＥ７抗原を発現する癌細胞ＴＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７８５）を移植して、前記製造されたＥ７抗原を表面発現する乳酸菌とポリ−γ−グルタミン酸を共に経口投与した実験群とＥ７抗原を表面発現する乳酸菌だけを投与した実験群との間の生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）の変化を観察した。
【００７３】
まず６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを各集団毎に１０匹ずつ準備して、２×１０４個のＴＣ−１癌細胞を左側内腿に皮下注射（ｓ．ｃ．）して癌を誘導した。癌細胞を注入した３日後から２週間の間Ｅ７抗原が表面発現された乳酸菌（２×１０９個）、または乳酸菌と共に２，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸４００μｇを混合して、週５回経口投与し、１週間の休止間を置いた後、再び１週間の間最初のブースティングを行って、さらに１週間の休止期間を置いた後、１週間の間２回目のブースティングを行った。
【００７４】
その結果、図７に示したように、Ｅ７抗原を表面発現する乳酸菌だけを経口投与したグループの場合、癌細胞の注入後約９０日頃に全ての個体が死んだが、ポリ−γ−グルタミン酸を混合して投与したグループの場合、生存率が増加し、約１５０日頃に全ての個体が死んだことが確認された。これにより、ポリ−γ−グルタミン酸が経口用ワクチンの細胞性免疫補強剤（ＣＭＩ−ａｄｊｕｖａｎｔ）の役割をすることで特定抗原に対する抗癌効果の増進させることが確認された。
【００７５】
［実施例９］ポリ−γ−グルタミン酸と大腸癌特異抗原であるＣＥＡが表面発現された乳酸菌含有組成物の癌細胞治療能
大腸癌特異抗原蛋白質であるＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）を表面発現する乳酸菌をワクチンの主要抗原成分として使用して、巨大分子量ポリ−γ−グルタミン酸を細胞性免疫増進剤（ＣＭＩ−ａｄｊｕｖａｎｔ）で混合して抗癌効果を確認した。
【００７６】
ＣＥＡを表面発現できる構築物を取得するためにヒトＣＥＡ遺伝子含有１６８３ｂｐのＤＮＡ（配列番号８）を鋳型として、配列番号９（５’−ｃｇｃａｇａｔｃｔｃｃｇｇａｇｃｔｇｃｃｃａａｇｃｃｃ−３’）と配列番号１０（５’−ｃｇｃｔｃｔａｇａｔｃａｔａｔｃａｇａｇｃａａｃｃｃｃａａｃｃ−３’）のプライマーを利用したＰＣＲ反応によって、１７０４ｂｐのＤＮＡ断片を取得し、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩ制限酵素で切断して、挿入断片を得た。前記挿入断片を実施例８と同様な方法で、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１（ＫＣＴＣ  １０３４９ＢＰ：ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１で形質転換された大腸菌）のＨＰＶＬ１部分をＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素サイトを利用して入れ替えてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ｈＣＥＡを製造した。
【００７７】
ＣＥＡ蛋白質を細胞表面に発現させるために表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ｈＣＥＡをラクトバシラスカセイに形質転換させて、ｈＣＥＡを表面発現する形質転換体を製作して、前記形質転換体をＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＭＲＳ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃で静置培養して表面発現を誘導した。
【００７８】
１）体液性免疫反応
ＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ菌株とポリ−γ−グルタミン酸をマウスに一定期間の間経口及び鼻腔へ投与した後、ＣＥＡを過剰発現する細胞を皮下注射する前マウス血液内ＣＥＡに対する体液性免疫反応を調べた。
【００７９】
実験群及び対照群として各々１５匹ずつ構成された二つのグループのＣ５７ＢＬ／６マウス（大韓バイオリンク、韓国）雌、５週齢を準備して、実験群のマウスにＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ１×１０１１と１％ポリ−γ−グルタミン酸（分子量７，０００ｋＤａ）１００μＬを混合したものを一日１回の投与容量として使用し、１週目に５日、２週目に５日合わせて１０日間経口投与し、４週目と６週目にブースターで各々５日間経口投与した。鼻腔投与の場合にはＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ１×１０１０と１％ポリ−γ−グルタミン酸（分子量７，０００ｋＤａ）１０μＬを混合したものを１日１回投与容量として使用し、１週目に２日おき、２週目に２日おきに合わせて４日間経口投与し、４週目と６週目にブースターで各々２日間鼻腔投与した。
【００８０】
前記マウスはＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイを投与する前に免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清を採取し、３週目（１次血清）、５週目（２次血清）、及び７週目（３次血清）に各々血清を採取して、体液性免疫能を分析した。対照群のマウスにはＣＥＡを表面発現しないラクトバシラスカセイ菌を１×１０１１／日の容量で実験群と同じ期間に投与した。
【００８１】
前記実験群マウスと対照群マウスにおけるＣＥＡに対する体液性免疫形成の有無をＥＬＩＳＡ方法で測定した。まずＣＥＡ抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、米国）を９６ウエルＮｕｎｃ−イムノプレートにコーティングした。各ウェル当たり抗原が１００ｎｇ／１００μＬになるように０．１Ｍバイカーボネートコーティングバッファー（ｐＨ９．６）で希釈し、４℃で一夜静置してＣＥＡをコーティングした。ＣＥＡがコーティングされたプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳに溶かした１０％スキムミルク（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて、２時間ブロッキングして、３７℃で１次抗体（マウス血清）と２時間反応させて、パーオキシダーゼ標識２次抗体と１時間反応させた。各工程毎にＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて、室温で２０分間反応した後、０．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４停止液で反応を停止し、ＥＬＩＳＡ測定機を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定して、マウス血清内ＡＦＰに対する特異的ＩｇＧ抗体価を測定した（図８）。
【００８２】
その結果、図８に示したように、対照群の血清内ＣＥＡに対するＩｇＧ抗体価は投与期間の間大きい変化がなかったが、実験群においては投与期間の間抗体価の上昇が確認された。これを通して、ヒトＣＥＡを表面発現する乳酸菌及びポリ−γ−グルタミン酸含有組成物によって、ヒトＣＥＡに対する体液性免疫反応がマウスにおいて誘導されることが確認された。
【００８３】
２）細胞性免疫反応
ＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ菌株とＰＧＡをマウスに一定期間経口及び鼻腔投与した後、マウス脾臓内Ｔ細胞のＣＥＡに対する細胞性免疫反応を調べた。
【００８４】
ラクトバシラスカセイ菌株に表面発現されたＣＥＡに対する細胞性免疫反応を測定するために、まず前記１）のマウスグループ１５匹の中から５匹ずつを選択して、各々のマウスから脾臓を摘出して、１５ｍＬ  ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＵＳＡ）が含まれたチューブに各々移した。滅菌されたシャーレに前記脾臓組織を移し、滅菌された２枚のスライドグラスを用いて前記脾臓と胸腺を各々取り替えて、組織皮膜から各々の細胞を分離した。前記シャーレ内の全ての内容物を５０ｍＬチューブに移してＲＰＭＩ培地で満たした後、前記チューブを氷に１５−２０分間放置した後、上層液４０−４５ｍＬを新しい５０ｍＬチューブに移した。各チューブを１，６００〜２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上層液を除去したペレットに３７℃で予め暖めたＴＡＣバッファー［１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）］１０ｍＬを添加して、細胞を浮遊させて、３７℃水槽で１０分間放置して赤血球を溶血させた。前記チューブをガラスピペットでかき混ぜて溶血された赤血球をガラスピペットに吸着させて除去した後、ＲＰＭＩ培地でチューブを満たした。前記チューブに含まれた細胞をＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させて、脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を分離した。
【００８５】
前記分離したＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ菌株とＰＧＡで免疫したマウス及びＣＥＡ非処理群マウスの脾臓細胞を用いて、下記の二つの方法でＣＥＡに対する細胞性免疫反応を確認した。
【００８６】
（１）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
細胞性免疫反応の測定方法のうち、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイが最初に行われた。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γＳｅｔ、ＵＳＡ）にＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）を用いて、１：２００の割合で希釈したＩＦＮ−γ特異抗体をコーティングし、一夜静置させた。前記分離した脾臓細胞及び胸腺細胞を２×１０６／ｍＬの濃度にして、１００μＬずつ各ウェルに分株して、２時間反応させた後、ＣＥＡペプチド［ＥＡＱＮＴＴＹＬ］（Ａｎｙｇｅｎ、韓国）を７μｇ／ｍＬずつ各ウェルに入れて、３７℃、５％  ＣＯ２条件で４８時間反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄して、１：２５０の割合で希釈したビオチン化２次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を１００μＬ／ウェルずつ分株し、常温で２時間反応させた。以後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、１：２００の割合で希釈された酵素コンジュゲート（ストレプトアビジンＨＲＰ）試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を１００μＬ／ウェルずつ入れて１時間反応させた後、さらにＰＢＳＴとＰＢＳで５回洗浄して基質溶液（ＢＤ  ＡＥＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ、ＵＳＡ）で発色を誘導した後、現れるスポットの数をＥＬＩＳＰＯＴプレート測定機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した（図９）。
【００８７】
その結果、図９に示したように、対照群と比べて、実験群のスポットの数が顕著に増加していることが確認された。これにより、ＣＥＡが表面発現されたラクトバシラスカセイ菌株とＰＧＡを摂取したマウスの脾臓内のＴ細胞がＣＥＡに対する細胞性免疫を活性化させたことが確認された。
【００８８】
（２）細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ−γ染色）
前記より分離した脾臓細胞を３×１０６／ウェルずつ２４ウェルプレートに分株して２時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で反応させた後、ＣＥＡペプチド［ＥＡＱＮＴＴＹＬ］（Ａｎｙｇｅｎ、韓国）を７μｇ／ｍＬずつ各ウェルに分株して、２時間反応させた。反応後、ゴルジ停止試薬（ＢＤ  Ｇｏｌｇｉ  ＳＴＯＰ、ＵＳＡ）を４μＬ／ウェルずつ入れた後、３７℃、５％ＣＯ２条件で９時間反応させた。ペプチドで刺激させた各ウェルの細胞を１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ染色バッファー（ＤＰＢＳ、１％  ＦＢＳ、０．０９％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）で１：２００の割合でＣＤ８−ＰＥ抗体（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を希釈した後、各細胞と混合した後、４℃で３０分間反応させた。各ウェルをＦＡＣＳ染色バッファーで２回洗浄した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎキット（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＵＳＡ）を２００μＬずつ入れて、４℃で２０分間反応させた後、ＢＤ  ｐｅｒｍ洗浄バッファー（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＵＳＡ）で２回洗浄した後、ＢＤ  ｐｅｒｍ洗浄バッファーで１：２００の割合でＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を希釈した後、各細胞と混合した後、４℃で３０分間反応させ、２回洗浄した後、ＦＡＣＳ染色バッファー３００μＬに細胞を浮遊させた後ＦＡＣＳ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて分析を行った（図１０）。
【００８９】
その結果、図１０に示したように、全ての脾臓細胞において、対照群より実験群の細胞性免疫に関与するＣＤ８＋Ｔ細胞において抗癌作用に関与するサイトカインであるＩＦＮ−γをより多く発現することが確認された。
【００９０】
前記のように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイと細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ−γ染色）の二つの方法によってＣＥＡが表面発現されたラクトバシルロス菌株とポリ−γ−グルタミン酸混合組成物がマウスの脾臓細胞内Ｔ細胞を刺激してＣＥＡに対する細胞性免疫反応を誘導する可能性があることが確認された。
【００９１】
３）ＣＥＡが表面発現された微生物とポリ−γ−グルタミン酸混合組成物の大腸癌細胞皮下感染防御効果
前記１）の実験群マウスと対照群マウス各々１０匹の左側大腿部の皮下にＣＥＡを過剰発現する細胞であるＭＣ３８  ＣＥＡ２細胞（Robbins PF et al. Cancer research 51:3657, 1991）５×１０６個を、３０Ｇ注射器を用いて注入した。注入後８週間の間、対照群及び実験群マウスの癌の形成及び致死率を調べた（図１１及び図１２）。
【００９２】
その結果、図１１に示したように、癌細胞注入後５週目に対照群のマウスは平均的に左側大腿部に癌細胞が３，５００ｍｍ３以上増殖していたが、ＣＥＡが表面発現されたラクトバシルロス菌株とＰＧＡを経口及び鼻腔から投与した実験群マウスにおいては約１，５００ｍｍ３しか増殖していないことが確認された。
【００９３】
また、図１２に示したように、癌細胞接種後５０日以上致死率を測定した結果、対照群のマウスは投与後３０日頃から初めて斃死が確認され、その以後斃死が急激に進められた。実験群の場合は４０日頃から初めての斃死が確認され、斃死進行が対照群と比べては比較的緩やかに進行したことが確認された。さらに４３日頃に対照群マウスは１００％の致死率を示す一方、実験群マウスは４０％以上生存率を示した。これはＣＥＡ表面発現乳酸菌とポリ−γ−グルタミン酸混合ワクチン組成物によって生きているマウス内において癌細胞の増殖が抑制されたことを立証する結果である。
【産業上利用の可能性】
【００９４】
以上、詳細に説明して立証したように、本発明によるポリ−γ−グルタミン酸を有効性分として含む組成物は毒性及び副作用が殆どなく、ウィルス及び細菌性感染症、癌に対するヒト用または動物用予防及び治療用ワクチンに添加されて、細胞性免疫増進を示すことができる効果がある。
以上、本発明内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に望ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるのではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項それらの等価物によって定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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