(57)【要約】【課題】肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび／または予防／診断／治療のためのツールを提供する。【解決手段】本発明は、高速移動群Ａ１タンパク質（ＨＭＧＡ１）に対するモノクローナル抗体のパネルおよびそれらを作製するための方法、ならびに生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１の定量のための前記抗体の使用に関する。  本発明はまた、ＨＭＧＡ１タンパク質の発現に関連する危険因子を評価するための診断キットに関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＡ１遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列の発現のための、アデノウイルス構築物Ａｄ−ＹｓまたはＡｄ−Ｙａｓ。
【請求項２】
細胞株の感染のための、請求項１に記載のアデノウイルス構築物Ａｄ−ＹｓまたはＡｄ−Ｙａｓの使用。
【請求項３】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＨＭＧＡ１タンパク質を得るための、請求項１に記載の構築物の使用。
【請求項５】
マウスの免疫のための、請求項４に記載のＨＭＧＡ１タンパク質の使用。
【請求項６】
前記ＨＭＧＡ１タンパク質が精製されていることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記精製タンパク質がＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫のために使用されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＨＭＧＡ１で免疫されたマウスの脾細胞と不死化細胞株の融合工程を含む、ハイブリドーマの作製のための方法。
【請求項９】
前記不死化細胞株が腫瘍性であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞株がマウスであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記マウス腫瘍細胞株が非分泌性骨髄腫であるであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の非分泌性骨髄腫の株がＮＳＯであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリドーマの前記融合工程がＰＥＧ１５００の存在下で実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＭＥＭ培地における前記ハイブリドーマの増殖工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＡＴおよびＨｙｂｒｉｄｉｍａｘが前記ＤＭＥＭ培地に添加されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１０％ＨＡＴおよび２％Ｈｙｂｒｉｄｉｍａｘが前記ＤＭＥＭ培地に添加されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マルチウエルプレートにおける平板培養によって実施されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハイブリドーマの一次および二次選択ならびに同定工程を含み、前記工程がＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ分析によって実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択および同定が間接ＥＬＩＳＡおよびＩｓｏｓｔｒｉｐキットによって得られることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項８〜１９に記載の方法によって得られるクローン集団。
【請求項２１】
クローン２Ｇ１６（ＰＤ  ０８００１）。
【請求項２２】
クローン２Ｇ１６／１８（ＰＤ  ０８００２）。
【請求項２３】
請求項２０に記載の前記クローン集団によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２４】
請求項２１に記載のクローン２Ｇ１６（ＰＤ  ０８００１）によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２５】
請求項２２に記載のクローン２Ｇ１６／１８（ＰＤ  ０８００２）によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２６】
無血清培地（ＳＦＭ）およびハイブリドーマ用完全培地における任意のクローンの接種および増殖工程を含む、請求項２３〜２５に記載のモノクローナル抗体の作製のための方法。
【請求項２７】
バイオリアクターにおいて実施されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオリアクターが、ｍｉｎｉＰｅｒｍまたはＶｉｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクターであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記接種および増殖が７５％ＳＦＭおよび２５％ハイブリドーマ用培地で実施されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
アフィニティークロマトグラフィー工程を含む、請求項２３〜２５に記載のモノクローナル抗体の精製のための方法。
【請求項３１】
生体液中のＨＭＧＡ１の定量のための、請求項２３〜２４に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項３２】
生体液中のＨＭＧＡ１の定量のための、請求項２５に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項３３】
請求項２３〜２５に記載の前記モノクローナル抗体を含む、ＨＭＧＡ１の定量のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速移動群Ａ１タンパク質（ＨＭＧＡ１）に対するモノクローナル抗体のパネルおよびそれらを作製するための方法、ならびにＨＭＧＡ１タンパク質の発現に関連する危険因子を評価するための診断キットの開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＭＧＡ構造タンパク質は、真核生物における遺伝子発現の活性化を調節する核生化学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。増殖および分化過程を調節するうえでのこれらのタンパク質の役割の可能性は、ＨＭＧＡタンパク質がヒトにおいていくつかのタイプの新生物の病因に関与するという所見によって裏付けられる。インスリン受容体（ＩＲ）の遺伝子発現の調節へのこれらのタンパク質の関与の可能性が最近記述され、インスリン作用の生理病理学および、ホルモンシグナルの伝達におけるその役割という仮説が立てられた。
【０００３】
癌および、しばしば腫瘍性疾患に結びつく、インスリン抵抗性の一部の状態（２型糖尿病および肥満）で、ホルモンおよび増殖シグナルの伝達においてＨＭＧＡタンパク質が果たす正確な役割を理解するために、適合された生物学的および分子的試験が実施されてきた。ＨＭＧＡタンパク質によるＩＲの遺伝子発現の調節に関する研究は、インスリン抵抗性症候群の生理病理学的理解において、ならびにＩＲの欠損およびインスリンシグナルの伝達異常を有する個体でのその他の病的状態において適切である。
【０００４】
いくつかの実験証拠は、癌において異常発現されるＨＭＧＡタンパク質が、癌でその変化が頻繁に起こり、形質転換された表現型の発現と維持のために重要であると思われる、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）（ＩＲはその成分の１つである）系の機能的調節において役割を有し得ることを示す。
【０００５】
ＩＧＦ系の調節不全を導く分子的因子の説明は、新しい抗腫瘍治療の開発における重要な支援となり得る。ＩＧＦの変化を引き起こす腫瘍マーカーの同定およびそれらの生物学的機能の理解は、この疾患の診断と治療における重要な要素であり得る。
【０００６】
増殖シグナルの伝達におけるＨＭＧＡタンパク質の分子的役割の理解は、従って、選択的な抗腫瘍治療の創製のために新たな示唆を与えることができるであろう。
【０００７】
ＨＭＧＡ核タンパク質のファミリー（高速移動群Ａ）は、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２として知られる低分子量（約１１ｋＤａ）の３つのタンパク質から成る。これらのタンパク質は一般に転写活性クロマチンに関連する。タンパク質ＨＭＧＡ１ａとＨＭＧＡ１ｂは同じ遺伝子によってコードされ、染色体６ｐ２１に位置しており、選択的スプライシング機構の結果として発現される。タンパク質ＨＭＧＡ１ａとＨＭＧＡ１ｂは、１１アミノ酸の内部領域が異なる。その代わりに、タンパク質ＨＭＧＡ２は、実際上染色体１２ｑ１４．３に位置する異なる遺伝子によってコードされる。タンパク質ＨＭＧＡ１およびＨＭＧＡ２の遺伝子は物理的に異なる染色体上に位置するが、それにもかかわらずそれらは相同である。ＨＭＧＡ遺伝子は胚発生の間に高発現され、反対に、細胞および完全に分化した組織ではそれらの発現レベルは低下する。
【０００８】
ＨＭＧＡタンパク質は約１００アミノ酸残基から成り、互いに高度に相同である。それらは、「ＡＴフック」と呼ばれる３つのＤＮＡ結合ドメインの存在によって特徴づけられる。これらの部位は、二重螺旋の副溝のレベルでアデニンおよびチミンに富むＤＮＡ配列に選択的に結合する。ＨＭＧＡタンパク質は、ＤＮＡの構造修飾の誘導および他の核タンパク質との相互作用を介して遺伝子活性を調節するそれらの能力のゆえに、しばしば「構造転写因子」と定義される。
【０００９】
実際に、それらの固有の柔軟性のために、ＨＭＧＡタンパク質は特異的なタンパク質−ＤＮＡ相互作用またはタンパク質間相互作用に干渉し、クロマチンの構造変化および、数多くの遺伝子の発現を調節する、プロモーター／エンハンサーＤＮＡ配列上の「エンハンセオソーム」と呼ばれる高分子量（高次）の立体特異的複合体の形成の両方を誘導する。
ＨＭＧＡタンパク質はクロマチンタンパク質のネットワークにおける重要な節と見なされるが、それらの役割および生理的／病理学的意味はあまり明らかではない。このため、これらのタンパク質をコードする遺伝子がより高いレベルで発現される（トランスジェニックマウス）かまたは発現されない（ノックアウト）、動物または細胞モデルが実験室において作製されてきた。
【００１０】
実験的細胞および／またはトランスジェニック動物モデルは、いくつかのタイプの腫瘍に関して、腫瘍性形質転換におけるＨＭＧＡタンパク質の役割を明らかにした。この所見は非常に明白であり、認められたＨＭＧＡタンパク質の高濃度は、腫瘍性形質転換およびより高い転移の可能性についての実際のマーカーとみなすことができる。例えば、ＨＭＧＡ１の発現レベルの上昇は、前立腺、甲状腺、子宮頸、結腸−直腸、膵臓、乳房および卵巣腫瘍などの種々のタイプの腫瘍の診断マーカーとして示唆されてきた。全体として、これらの所見は腫瘍性形質転換および腫瘍転移進行におけるＨＭＧＡタンパク質の役割を有効に支持する。
【００１１】
ＨＭＧＡ２タンパク質についての実験的細胞および／またはノックアウト動物モデルは、ＨＭＧＡ２の部分的または完全な欠損を有するマウスが、食餌による肥満の誘導に対して抵抗性であることを明らかにし、脂肪細胞の増殖におけるＨＭＧＡ２タンパク質の役割を示唆し、この遺伝子を肥満の治療における可能性のある標的として提案した。実際に「ピグミー」ノックアウトマウスは、その大きさのかなりの縮小（野生型マウスにおけるよりも約６０％小さい）によって特徴づけられる脂肪組織の病変と表現型異常を呈する。このＨＭＧＡ２タンパク質の完全なまたは部分的欠失は、脂肪組織の重度の欠損に関連する身体寸法の縮小を生じさせる。
【００１２】
ＨＭＧＡ１タンパク質についての実験的ノックアウト動物モデルは、２型糖尿病に関連する心肥大を示し、心筋細胞の増殖およびグリシド代謝の調節におけるＨＭＧＡ１タンパク質の役割を示唆する。
【００１３】
従って、これらのタンパク質が、その構造的および機能的特徴により、いかにして細胞において重要な役割を果たし、ＤＮＡおよび他の核タンパク質の両方と相互作用して、数多くの生理的過程（成長、増殖、分化、アポトーシス）および病的過程（肥満、腫瘍の増殖と進行）に影響を及ぼすかは明らかである。
【００１４】
また、ＨＭＧＡタンパク質が、シスエレメントの立体配座変化を誘導し、他の転写因子と直接相互作用して隣接する核因子を相互に連結する、遺伝子調節に関与することは公知である。
【００１５】
特に、ウイルス感染後のヒトＩＮＦ−βの転写誘導の研究は、ＨＭＧＡ１の２つの分子が協力してこの遺伝子のエンハンサー領域に結合し、二本鎖ＤＮＡのアロステリック立体配座を変化させて、それによりＮＦ−ｋＢおよびＡＴＦ−２／ｃ−Ｊｕｎのハウジングを可能にすることを示した。このようにしてエンハンセオソームの構築が開始し、ＨＭＧＡ１と転写活性化因子の間でのタンパク質間相互作用を介してその形成が完了する。この多タンパク質構造の構築の結果として、様々な転写因子の活性化ドメインが、転写を誘導する、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）ならびにＰ／ＣＡＦおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素などのそれに関連するタンパク質を動員することができる新たな活性化表面を作製する。その後、ＣＢＰによって媒介されるＨＭＧＡ１のアセチル化がＤＮＡに対するＨＭＧＡ１の親和性の低下を生じさせ、その結果としてエンハンセオソームの破壊を引き起こす。従ってＨＭＧＡ１タンパク質は、ヒトＩＮＦ−βの遺伝子発現を調節するうえでの実際の分子スイッチとして挙動する。
【００１６】
ＨＭＧＡ１タンパク質の発現は、免疫系の遺伝子が発現される、リンパ球の活性化の間または炎症応答において一時的に誘導される。
【００１７】
成体組織では、ＨＭＧＡ１タンパク質の発現はサイレントであるかまたは著明に低下する。ヒトインスリン受容体の遺伝子発現の調節へのＨＭＧＡ１タンパク質の関与は完全には説明されていないが、ＨＭＧＡ１タンパク質は、他の転写因子（Ｓｐ１およびＣ／ＥＢＰβ）と結合することにより、ＩＲ遺伝子の転写を制御する核タンパク質複合体の構築を画策することができると思われる。
【００１８】
インスリンの生物学的作用における最初の段階は、標的細胞の細胞質膜上に位置する糖タンパク質、インスリン受容体（ＩＲ）とのその相互作用であり、その役割はインスリン作用の生理病理学において必須である。末梢組織（筋、肝臓および脂肪）のレベルでのインスリン抵抗性は、糖尿病の病因・病態（ａｅｔｉｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）における主要な特徴である。糖尿病の高い罹患率を有する集団に関して実施された研究は、インスリン抵抗性（同じ代謝効果を得るために、どの程度より多くの量のインスリンが必要とされるかを示す、糖代謝の特定の状態）が本格的な糖尿病の発症に先行し、この疾患についての実際の予測マーカーを構成することを示す。多くの糖尿病患者においてＩＲは正常であり、インスリン作用の欠陥は受容体後である。また別の症例（２型糖尿病を有する患者の１０％超）では、機能的異常および／またはＩＲ遺伝子のコード領域のレベルでの特異的な遺伝的欠陥の存在によるＩＲの発現異常が存在する。これらの症例の多くにおいて、異常な受容体タンパク質の合成を決定する点突然変異または欠失が存在する。その代わりに、別の症例では、遺伝子は正常であり、欠陥は、ＩＲ遺伝子の機能調節に関与する他の遺伝子に影響を及ぼす異常（トランスでの欠陥）によるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび／または予防／診断／治療のためのツールを提供することである。
【００２０】
本発明の目的はまた、腫瘍性疾患の診断および／または観測のためのツールを提供することである。
【００２１】
本発明の目的はさらに、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび／または予防／診断／治療のためのツールとして使用されるのに適した生成物のクラスを提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、長期化した高インスリン血症を有する個体における癌の予防としての、インスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび／または予防／診断／治療のための生成物のクラスを提供することである。
【００２３】
本発明の目的はまた、ＨＭＧＡ１の生理的レベルを回復するための方法である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、細胞においてＨＭＧＡ１の生理的レベルを回復するための特異的発現ベクターの使用である。
【００２５】
本発明のもう１つの目的は、生体液中のＨＭＧＡ１タンパク質を認識し、それに結合して、その存在を測定することができる組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体のパネルを提供することである。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体を選択するための方法である。
【００２７】
本発明のさらにもう１つの目的は、組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体の作製と発酵のための方法、ならびにインスリン抵抗性病変の診断および／または予防のためのキットの使用である。
【００２８】
以下でより詳細に説明されるこれらや他の目的およびさらなる利点は、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび／または予防／診断／治療のためのツールの実現ならびにツールとして使用されるのに適した生成物のクラスの実現を通して達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
ＨＭＧＡ１タンパク質がヒトＩＲをコードする遺伝子に関連すること、および特異的調節タンパク質（しばしば、Ｓｐ１およびＣ／ＥＢＰβなどの他の公知の転写因子と共に立体特異的多タンパク質複合体の形態で組織化される）がＨＭＧＡ１タンパク質を含むことの証拠は、ＨＭＧＡ１タンパク質は、ＩＲ遺伝子のプロモーター領域に結合することにより、Ｓｐ１およびＣ／ＥＢＰβのこのレベルで、動員を介してその転写を活性化することができると主張することを可能にする。
【００３０】
高レベルのＩＲを有する細胞（ＩＭ−９ヒトリンパ芽球様細胞およびＨｅｐＧｗヒト肝細胞癌細胞）におけるＨＭＧＡ１の機能的阻害は、これらの細胞の細胞質膜上での受容体の発現を有意に低下させることができる。逆に、低レベルのＩＲを有する細胞におけるＨＭＧＡ１の発現誘導は受容体タンパク質の発現を上昇させ、ＨＭＧＡ１タンパク質がＩＲ遺伝子の転写活性化において重要な役割を果たすことを明らかにする。
【００３１】
ＩＲ発現の欠損が、ＩＲ遺伝子の突然変異不在で、インスリン抵抗性症候群および２型糖尿病を有する患者において報告されている。これらのすべての症例において、受容体異常は、ほとんど常にその後に、インスリン作用によって標的される組織のレベルでのホルモンシグナルの伝達異常が起こり、その結果として正常な生化学的プロセスの変化を伴う。
【００３２】
これらの所見は、低いＩＲレベルを有し、ＩＲ遺伝子の遺伝子突然変異が存在しない個体におけるインスリン抵抗性および２型糖尿病の形態でのＨＭＧＡ１タンパク質の病因的関与の可能性という仮説を可能にする。この仮説は、低いＩＲレベルを有する一部の糖尿病個体の細胞および組織に関して得られた所見に基づくものであり、個体では、ＨＭＧＡ１の発現が極めて低く、Ｓｐ１およびＣ／ＥＢＰβによるＩＲプロモーターのトランス活性化が健常対照被験者の細胞および組織で認められるよりも有意に低かった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】細胞溶解産物からのＨＭＧＡ１の発現のウエスタンブロット分析の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、従ってまた、ＨＭＧＡ１遺伝子のアンチセンス配列をコードすることができる、Ａｄ−Ｙａｓと呼ばれるアデノウイルス構築物に関する。ＨＭＧＡ１のコード化を抑制することができるこのウイルスはまた、ヒトまたはラットの、未分化癌に由来する様々な甲状腺細胞株（ＡＲＯおよびＦＢ−１など）の死を導くことができるが、正常な甲状腺細胞の死は誘導しない。その代わりに、同じ細胞を対照アデノウイルス構築物に感染させた場合には作用は得られなかった。
【００３５】
従って、その態様の１つによれば、本発明は、ＨＭＧＡ１タンパク質のアデノウイルス構築物に関する。
【００３６】
粘着末端を作製するために制限酵素ＨｉｎｄＩＩで切断した後、１，５００塩基対（ｂｐ）の長さを有するＨＭＧＡ１のｃＤＮＡをベクターｐａｃ−ＣＭＶｐＬｐａにセンス（ｓ）およびアンチセンス（ａｓ）方向で挿入し、以下の構築物：Ｐａｃ−ＣＭＶ−ＨＭＧＡｌｓ  ｐａｃ−ＣＭＶ−ＨＭＧＡｌａｓを作製した。両方の構築物をアデノウイルスｐＪＭ１７と共にヒト胚腎２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞株（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に同時トランスフェクトし、細胞内でのベクターの融合により、最終的構築物Ａｄ５ＣＭＶ−ＨＭＧＡ１（Ｙ）ｓ（Ａｄ−Ｙｓ）およびＡｄ５ＣＭＶ−ＨＭＧＡ１（Ｙ）ａｓ（Ａｄ−Ｙａｓ）を作製する。（Ａｄ−Ｙｓ）または（Ａｄ−Ｙａｓ）に感染させた細胞株ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ）を感染の３６〜４０時間後に溶解し、ウイルス力価を測定する。
【００３７】
従って、そのもう１つの態様によれば、本発明は組換えＨＭＧＡ１タンパク質に関する。組換えＨＭＧＡ１は、好ましくはヒスチジンまたはＧＳＴなどの尾部もしくはタグまたは精製のための等価物を提示し得る。
【００３８】
従って、そのもう１つの態様によれば、本発明は精製ＨＭＧＡ１タンパク質に関する。
【００３９】
特に、精製ＨＭＧＡ１タンパク質を、このタンパク質に対する抗体の産生を刺激するためにＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するのに使用した。前記マウスの免疫は、高い抗体力価を得るために、好ましくは３回のサイクルで、好ましくは腹腔内注射を介して実施した。細胞融合操作に使用する脾臓を採取するために前記免疫マウスを犠死させた。
【００４０】
従って、本発明はまた、免疫マウスの脾細胞と不死化細胞株の融合によって得られるハイブリドーマに関し、好ましくは、前記不死化細胞株は腫瘍性であり、好ましくは、前記不死化細胞株はマウスであり、より好ましくは、前記マウス細胞株は免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫であり、さらに一層好ましくは、前記非分泌性骨髄腫のマウス細胞株は、例えばＮＳＯ（免疫グロブリンを分泌しないＢＡＬＢ／ｃマウスのマウス骨髄腫細胞株）である。好ましくは、脾細胞とマウス細胞株の融合の操作はＰＥＧ１５００の存在下で実施される。特に、免疫マウスの脾臓を、均質化後に、骨髄腫細胞と融合し、適切な培養条件下に置く。
【００４１】
前記適切な培養条件は、例えば、前記ハイブリドーマの増殖のための適切な培地の使用、例えばＤＭＥＭ、より好ましくはＨＡＴおよびＨｙｂｒｉｄｉｍａｘを添加したＤＭＥＭ培地の使用から成り、さらに一層好ましくは、添加物を含む前記ＤＭＥＭは、培地の総容量に対して少なくとも１０％のＨＡＴおよび２％のＨｙｂｒｉｄｉｍａｘを含有する。
【００４２】
上述したように作製されたハイブリドーマは、ＨＭＧＡ１タンパク質に対するｍＡｂ（モノクローナル抗体）を産生する。ＨＭＧＡ１タンパク質に対する認識および結合の高い親和性を有するｍＡｂを得るため、ハイブリドーマの細胞を、マルチウエルプレートでの平板培養を介して制限増殖条件下に置いた。前記平板培養操作は、各々のウエルについて、ＨＭＧＡ１に対する１つの種類の抗体だけを特異的に発現するクローン株を産生する。
【００４３】
従って、そのもう１つの態様によれば、本発明はまた、クローン集団および個々のクローンの増殖と選択の方法、ならびに組換え抗ＨＭＧＡ１抗体を精製するための方法に関する。
【００４４】
好ましくは、増殖方法は、特殊なマルチウエルプレートで前記ハイブリドーマを平板培養し、増殖させ、収集することから成る。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、前記増殖方法によって生成された細胞クローンの選択および同定である。好ましくは、前記選択および同定は、間接ＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ分析による、一次および二次の２つの連続工程で達成される。従って、４０クローンを一次工程から陽性として同定し、二次工程から３２クローンを同定する。前記培養方法による安定化後、３２のクローンの群から、表１に列挙する２０クローン、特に１５、詳細には４クローンを選択し、これらの中で特に２Ｇ１６または２１Ｇ６（従って本明細書では２Ｇ１６と２１Ｇ６という用語は正確に同じクローンを指す）として同定されたものを２００８年３月１８日に「Ｃｅｎｔｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｖａｎｚａｔｅ」（ＣＢＡ）ｉｎ  Ｇｅｎｏａ，Ｉｔａｌｙに以下の番号：ＰＤ  ０８００１で寄託した。
【００４６】
【表１】
2011523352.tif 000002
【００４７】
本発明のもう１つの目的は、上述した培養、増殖、選択および同定の前記方法に従って、前記の好ましいクローン２Ｇ１６（ＰＤ  ０８００１）によって産生されたクローンの亜集団、好ましくは、２００８年３月１８日にＣｅｎｔｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｖａｎｚａｔｅ（ＣＢＡ）ｉｎ  Ｇｅｎｏａ，Ｉｔａｌｙに以下の番号：ＰＤ  ０８００２で寄託された、２１Ｇ６／１８としても同定されるクローン２Ｇ１６／１８（従って本明細書では２Ｇ１６／１８と２１Ｇ６／１８という用語は正確に同じクローンを指す）の亜集団である。
【００４８】
特に、本発明のさらなる目的は、あらゆる単一選択クローンによって産生され、かつ精製工程を介してＨＭＧＡ１タンパク質を対象とするモノクローナル抗体である、前記細胞クローンによって産生される抗体のパネルである。前記精製工程は、クロマトグラフィーによって、より好ましくはアフィニティークロマトグラフィーによって、さらに一層好ましくはＨｉＴｒａｐ−Ｐｒｏｔｅｉｎａ  Ｇカラム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって実施される。
【００４９】
本発明に従って生産される抗ＨＭＧＡ１  ｍＡｂはＩｇＧ型である。アイソタイプの評価は、好ましくはＩＳＯＴＲＩＰキットの指示に従って実施される。
【００５０】
さらなる目的は、ＨＭＧＡ１タンパク質に対する前記ｍＡｂの工業的生産の方法であり、好ましくは、前記生産方法はバイオリアクターにおいて、より好ましくは１２．５Ｋｄａのカットオフ値を有するｍｉｎｉＰｅｒｍ／Ｖｉｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクターにおいて実施される。特に、前述した内容に従ってパネルから選択される任意のクローン細胞を、無血清培地（ＳＦＭ）およびハイブリドーマ用完全培地、好ましくは７５％濃度のＳＦＭおよび２５％濃度のハイブリドーマ用完全培地を含む一定容量の培地に接種し、増殖させる。
【００５１】
本発明のさらなる目的は、前述したようなクロマトグラフィーによる、ＨＭＧＡ１タンパク質に対するｍＡｂの精製である。
【００５２】
本発明のもう１つの目的は、前述したクローンパネルからのｍＡｂの任意の１つを使用した生体液中のＨＭＧＡ１の定量であり、好ましくは、定量は精製ｍＡｂ  ２Ｇ１６／１８を用いて実施される。前述した方法に従って得られる前記ｍＡｂ  ２Ｇ１６／１８を、未変性条件および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ならびにウエスタンブロット分析（ＷＢ）によってさらに特徴づけた。分子量はＩｇＧクラスのもの、すなわち約１５０Ｋｄであり、ＷＢは、選択した抗体がＨＭＧＡ１に対して特異的であることを明らかにした。好ましくは、生体液中のＨＭＧＡ１の定量は、競合型のＥＬＩＳＡによって実施される。
【００５３】
精製抗体２１Ｇ６／１８を、生体液中のＨＭＧＡ１を定量するためのアッセイの調製に使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のＨＭＧＡ１と溶液中のＨＭＧＡ１の間での結合の競合に基づく競合的ＥＬＩＳＡである。ＨＭＧＡ１濃度の定量は、精製ＨＭＧＡ１タンパク質を使用して得られる標準曲線に対して試料を定量化して実施する。最初のアッセイは、マルチウエルプレートを被覆するために使用するＨＭＧＡ１の量を決定するためおよび抗体の標準曲線を作成するために実施した。種々のタンパク質濃度を、種々の抗体濃度を有するマイクロタイタープレートに分注し、被覆のために使用すべきＨＭＧＡ１の最適濃度が０．５μｇ／ｍｌ（０．０５ｍｌ／ウエル）であり、最適抗体濃度が０．００２μｇ／ｍｌであることを確認した。ペルオキシダーゼに結合した二次抗体の最良希釈を最適化するため、標準抗体の４つの濃度を研究し、二次抗体の希釈を変化させた。選択した希釈は１：２０００であった。
【００５４】
アッセイおよび結果の再現性と精度を評価するため、マトリックスの等価性に関する検討も実施し、抗体標準曲線の希釈緩衝液への１０％および２０％血清の添加の影響を研究して、好ましくは、適切な条件は１０％である。
【００５５】
アッセイの感受性を定義するため、ＨＭＧＡ１の標準曲線を、ｍＡｂの任意の１つ、例えば２１Ｇ６／１８を１０μｇ／ｍｌから０．００１μｇ／ｍｌの間の様々な濃度のＨＭＧＡ１タンパク質と共にインキュベートすることによって決定した。ＨＭＧＡ１の０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの区間で用量反応曲線を得た。アッセイの感受性は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１の定量を許容するものである。
【００５６】
好ましくは、各々のアッセイは以下の同時分析を企図する：
−種々の濃度（二重／三重盲検評価で８−２−０．５−０．１２５−０．０３１−０．００７８−０．００２−０μｇ／ｍｌ）の精製ＨＭＧＡ１に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ１：２希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料［スパイクは、回復の完全性を明らかにするために溶液に添加する既知量の分析物を意味する］。
生体液を定量するための数値の決定のために、以下を計算するための分析を実施した：
−標準曲線の競合パーセンテージの平均値
−相対濃度の対数
−補間法による線形回帰
−勾配およびｒ2。
【００５７】
アッセイは、０．９６＜ｒ2＜１の間のｒ2値に関しておよび予想される既知の値の２５％未満の変動でＨＭＧＡ１のスパイクの回復を示す分析試料に関して信頼できる。アッセイは、分析する試料、例えば検査し得る生体液の試料、例えばリンパ球成分などの、前記液体の成分中に存在するＨＭＧＡ１の濃度を計算するための曲線を得ることを可能にする。ＨＭＧＡ１の定量のためのアッセイは、約０．０３５μｇ／ｍｌの測定限界の感受性を示す。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１タンパク質の濃度に関してレベル間の関係をアッセイによって確認するための方法である。
【００５９】
本発明はまた、２型糖尿病および肥満などの、インスリン抵抗性に密接に関係する一部の病変の存在（または素因）をアッセイによって確認するための方法に関する。特に、アッセイは、ＨＭＧＡ１タンパク質の低レベルと、多大の社会的および医学的影響を及ぼすインスリン抵抗性病変の発症の素因（または本格的な存在）との間の関係の測定を可能にする。表２に示す結果の場合には、健常被験者についての値は７．５〜１８．７μｇ／ｍｌ（平均±ＳＥＭ、１１．５１±０．７９、ｎ＝１５）にわたる濃度区間内にあり、一方インスリン抵抗性被験者については、同じ値は２．９〜７．５μｇ／ｍｌ（平均±ＳＥＭ、５．９２±０．３１、ｎ＝１７）にわたる濃度区間内にある（Ｐ＜０．０００１）。
【００６０】
本発明はまた、構築物および組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体の使用に関する。
【００６１】
本発明の目的はまた、肥満および糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する病変の予防／診断／治療のためのキットを含む。
【００６２】
前記説明に基づき、本発明は以下の態様および目的から成る：
・ＨＭＧＡ１タンパク質をコードする遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列をコードする組換えアデノウイルス構築物の作製
・作製したアデノウイルス構築物によるＨＥＫ−２９３細胞株の感染
・ＨＥＫ−２９３細胞からの組換えＨＭＧＡ１タンパク質の精製
・ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける精製組換えＨＭＧＡ１タンパク質の接種および免疫
・犠死させた免疫マウスからの脾臓の切除
・採取した脾細胞と腫瘍細胞、好ましくは免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫の細胞との融合を介したハイブリドーマの作製
・適切な増殖および培養条件下での、すなわちマルチウエルプレートでの平板培養を介した、ハイブリッド細胞のプールの増殖
・最良クローンを同定するための、ＥＬＩＳＡによって得たクローンパネルの一次選択（１回目のスクリーニング）
・最良クローンの同定および限界増殖条件でのさらなる選択工程である二次選択（２回目のスクリーニング）
・アイソタイプの評価
・クロマトグラフィーによる抗ＨＭＧＡ１  ｍＡｂの精製
・バイオリアクターでの生産およびその後のクロマトグラフィーによる抗ＨＭＧＡ１  ｍＡｂの精製
先の箇所で述べたようにして得られたｍＡｂの使用を介した、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１の量を測定するためのアッセイ
生体液中およびリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１タンパク質の濃度に関してのレベル間の関係、ならびに糖尿病または肥満などのインスリン抵抗性に関連する病変の存在または何らかの素因を評価するための方法
・肥満、糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する病変の予防／診断／治療のためのキット。
【００６３】
［実施例］
実験部分
【００６４】
［実施例１］
【００６５】
［組換えアデノウイルス構築物の作製］
１，５００塩基対（ｂｐ）の長さを有するＨＭＧＡ１のｃＤＮＡをベクターｐａｃ−ＣＭＶｐＬｐａにセンス（ｓ）およびアンチセンス（ａｓ）方向で挿入し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩで切断した後、粘着末端を利用して組換え構築物：ｐａｃ−ＣＭＶ−ＨＭＧＡｌｓ  およびｐａｃ−ＣＭＶ−ＨＭＧＡｌａｓを作製した。得られたベクターとアデノウイルスｐＪＭ１７をヒト胚腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）に同時トランスフェクトし、組換えウイルス構築物Ａｄ５ＣＭＶ−ＨＭＧＡ１（Ｙ）ｓ（Ａｄ−Ｙｓ）およびＡｄ５ＣＭＶ−ＨＭＧＡ１（Ａｄ−Ｙａｓ）を作製した。ウイルス株をＨＥＫ２９３細胞において増殖させ、注入の３６〜４０時間後に収集した後、溶解した。ウイルス力価を測定し、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラーク形成単位（ｐｆｕ）を評価した。ベクターＡｄＣＭＶ−ｌａｃＺ（Ａｄ−ｌａｃＺ）（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を対照として使用した。
【００６６】
[組換えＨＭＧＡ１タンパク質の作製]
ＨＭＧＡ１ｂのｃＤＮＡをプラスミドｐＥＴ２ｃ／Ｈｉｓにクローニングした。大腸菌ＢＬ２１株の細胞を発現ベクターｐＥＴ２ｃ／Ｈｉｓ−Ｈｍｇａ１ｂで形質転換し、ＬＢ中で増殖させた。１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）２００μｌを添加することによってタンパク質の発現を誘導した。細菌を、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した冷ＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）２０ｍｌ中に最終濃度１％で再懸濁した。フレンチプレスを使用して細菌の溶解を実施した。硫酸ニッケル活性化樹脂を溶解試料の上清に添加した。ＰＢＳ中最終濃度５００ｍＭのイミダゾールから成る溶液で溶出を実施した。
【００６７】
[ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫]
精製組換えＨＭＧＡ１タンパク質を使用して、７週齢の３匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。マウスに、融合の６０日前に腹腔内経路で不完全フロイントアジュバント中のタンパク質５０μｇを注射した。同じ操作を同じ条件で３０日後に実施した。マウス血清中の抗体力価を、処置動物の尾から採取した試料から間接ＥＬＩＳＡによって測定した。タンパク質５０μｇのさらなる注射を、融合の３日前に１：１０，０００より高い抗体力価を示した動物に関して実施した。
【００６８】
[ハイブリドーマの作製および１回目の限界希釈（ＬＤ）]
６０日間の免疫の終了時にマウスを犠死させ、無菌条件下で各々の動物から脾臓を採取して、ハイブリドーマの形成用と凍結用の２つの部分に分けた。凍結する脾臓部分は、ＦＣＳ（９０％）および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に保持する。
【００６９】
脾臓の部分を機械的解離によって均質化し、以下のように処理した：
−ＤＭＥＭ培地５ｍｌ中で１回目の洗浄
−ＤＭＥＭ培地３０〜４０ｍｌ中で２回目の洗浄
−脾細胞と、免疫グロブリンを分泌しないマウスの骨髄腫のＮＳＯマウス細胞株との融合。５×１０7のＮＳＯ細胞の量を、ＰＥＧ１５００を添加した培地２０ｍｌに懸濁した（５個の脾細胞に対して約１個のＮＳＯ細胞）。
−１０％ＨＡＴ、２％Ｈｙｂｒｉｄｉｍａｘを添加したＤＭＥＭへのハイブリドーマの再懸濁
−９６穴を有する１０のプレートへのハイブリドーマの接種
一次スクリーニング、１回目のＬＤ
【００７０】
陽性クローン、すなわちＨＭＧＡ１−ＧＳＴタンパク質に対する組換えモノクローナル抗体を産生するクローンを同定するためにクローン集団に関して間接ＥＬＩＳＡを実施した。
【００７１】
９６穴のプレート（Ｈｙｓｏｒｂ  ＮＵＮＣ）をｐＨ７．２のＰＢＳ  １ｘ中１ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＭＧＡ１溶液で被覆した。溶液５０μｌの容量を各々のウエルに分配し、４℃で約１２時間インキュベートした。
【００７２】
このように操作したプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％中で３〜４回洗浄し、次に室温で１時間、ＰＢＳ−ＢＳＡ  ３％中で飽和させた。この操作により非特異的結合を回避することができる。
【００７３】
プレートから内容物を取り出し、５０μｌ／ウエルの容量のハイブリドーマの上清を室温で１時間半のインキュベーション時間中添加した。
【００７４】
次のプレートを洗浄し、１：１０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体と共に室温で１時間インキュベートした。
【００７５】
３〜４回洗浄した後、プレートを、クエン酸緩衝液、ｐＨ５、１．７ｍＭ  Ｈ2Ｏ2中１ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）の溶液２００μｌ／ウエルと共にインキュベートした。対照条件（抗原なしおよび抗体なし）に関して４９０ｎｍの光学密度で色の発現を観察する。
【００７６】
４０の陽性クローンを同定し、これらの中でクローン２１Ｇ６（ＰＤ  ０８００１）が好ましかった。
【００７７】
[二次スクリーニング、２回目のＬＤ]
ＨＭＧＡ１を認識する特異的組換え抗体を産生する４０の陽性クローンをＬＤ法でさらに選択した。クローンを３０細胞／プレート（９６穴のプレートにおいて）の細胞密度で接種し、３プレート／クローンの三重サンプリングとした。
【００７８】
制限増殖条件は、抗原に対する特異的抗体を産生するモノクローナル細胞株を得ることを可能にする。一次選択についての表１に示すように、それぞれ選択した４０および３２クローンのうちで、および２０クローンの培養での安定化後に、好ましいクローンは２Ｇ１６／１８（ＰＤ  ０８００２）である。
【００７９】
[アイソタイプによるクローンの分類]
[組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体のアイソタイプの決定]
Ｉｓｏｓｔｒｉｐキットを使用して免疫グロブリンのサブクラスを決定した。試験する上清をＰＢＳ中で１／１０希釈し、マウス免疫グロブリンの軽鎖に対する直接抗体で被覆した凍結乾燥ビーズを含む試験管に１５０μｌを分注した。特異的抗マウス抗体が固定化されたストリップを、再懸濁した試薬を含む試験管に挿入した。キットの製造者によって提供される指示に従って、対照レーンの出現後に、特異的抗体クラスの特徴的なレーン、すなわちＩｇＧの存在を認めた。
【００８０】
[ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法]
レムリ緩衝液中の前記ｍＡｂを、適切な対照と共に、均一な密度（２０％ポリアクリルアミド）および勾配（４〜１５％または８〜２５％のポリアクリルアミド）を有する前充填アクリルアミドゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ，ＧＥ）上に置いて、産生された抗体の分子量の正確さを評価する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の緩衝液（ＳＤＳ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｔｒｉｐｓ，ＧＥ）を使用して、電気泳動システム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ，ＧＥ）を用いて１５℃で電気泳動を実施する。次に試料をニトロセルロースに転写するために、図１に示すように別のゲルを調製する。転写装置（ＧＥ）を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜でＥＬＩＳＡを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、その後Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにする。
【００８１】
［実施例２］
【００８２】
[ｍｉｎｉＰＥＲＭバイオリアクターにおけるモノクローナル抗体の生産]
ｍｉｎｉＰＥＲＭバイオリアクターにおいてＳＭＦ（無血清培地）での適応後にモノクローナル抗体の選択生産を実施した。この単回使用の円筒形バイオリアクターは、細胞を接種する培養チャンバー（容積３０ｍｌ）および細胞に栄養を与えるための培地を入れる、培養チャンバーに取り付けられたプラスチック容器（容積３５０ｍｌ）を含んだ。チャンバーと容器は、栄養分だけを培養チャンバーに通過させ、抗体が容器内に拡散して希釈されるのを防ぐ限外ろ過膜によって分離されている。バイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内の回転ローラー上に置く。この方法は、非常に濃縮された容積の抗体を得ることを可能にする。
【００８３】
［実施例３］
【００８４】
[クロマトグラフィーによる精製]
ＨｉＴｒａｐ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）でのアフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＧクラス抗体の精製を実施する。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で再生し、リン酸緩衝液ｐＨ８で再平衡させて、抗体を含む初期試料をカラムに負荷する。同じ緩衝液で洗浄した後、抗体をグリシン緩衝液（再蒸留水中０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７）で溶出し、次に７０％飽和の硫酸アンモニウム中の沈殿で濃縮し、その後６〜８０００Ｄａのカットオフ値を有する膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳに対して透析する。透析した試料を分光光度計によってタンパク質用量に関して定量し（Ｂｉｏｒａｄ）、２８０ｎｍで読み取る。
【００８５】
[ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法]
産生された抗体の分子量の正確さを調べるため、それらを、適切な対照と共に、レムリ緩衝液中で均一な密度（２０％ポリアクリルアミド）および勾配（４〜１５％または８〜２５％のポリアクリルアミド）を有する前充填アクリルアミドゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ，ＧＥ）に負荷する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の緩衝液（ＳＤＳ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｔｒｉｐｓ，ＧＥ）を使用して、電気泳動システム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ，ＧＥ）を用いて１５℃で電気泳動を実施する。試料をニトロセルロースに転写するために別のゲルを調製する。転写装置（ＧＥ）を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜上でＥＬＩＳＡを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、その後Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにした。
【００８６】
[無血清培地への適応および生産速度]
選択した細胞クローンを１×１０4細胞／ｃｍ2の濃度で四重に反復して２４穴のプレートに接種し、２４穴のプレートにおいて、ひとたびそれらが集密に達すれば、漸次、ハイブリドーマ用完全培地中のより高い濃度の無血清培地（ＳＦＭ）（０％、２５％、５０％、７５％、１００％）中に入れた。細胞の適応を、細胞の生存能および組換え抗ＨＭＧＡ１モノクローナル抗体の産生として評価した。適応細胞を６日間、フラスコでの生産速度検査（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃ）に供し、同時に以下のパラメータ：生存能、グルコース消費、乳酸産生、抗ＨＭＧＡ１抗体の産生を制御した。
【００８７】
[実施例４]
【００８８】
[バイオリアクターにおける生産]
少なくとも８０％の生存能を有する選択細胞クローンを計数し、トリパンブルーで着色した。５．５×１０7細胞を、７５％ＳＦＭおよび２５％ハイブリドーマ用完全培地を含む一定容量の培地に接種した。接種は、１２．５Ｋｄａのカットオフ値を有するｍｉｎｉＰｅｒｍ／Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ生産モジュールにおいて滅菌シリンジによって実施した。生産モジュールを供給モジュールに取り付け、バイオリアクター全体をＣＯ2インキュベーター中の回転支持体上で撹拌した。生存能、生産および代謝パラメータを調べるため、生産モジュールにおいて層流フード下で滅菌シリンジを使用して試料を採取した。生産工程の終了時に、約３５ｍｌの容量の抗体を細胞と共に生産モジュールから採取し、次に抗体を遠心分離によって細胞から分離した。実施例３で述べた方法に従って、抗体をＨｉＴｒａｐ−Ｐｒｏｔｅｉｎａ  Ｇカラム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００８９】
[生体液中のＨＭＧＡ１を定量するための競合的ＥＬＩＳＡ]
ＥＬＩＳＡ用の９６穴のプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ−ＮＵＮＣ）をＰＢＳ  ｐＨ７．３中のＨＭＧＡ−ｈｉｓの溶液０．０５ｍｌ／ウエル（１μｇ／ｍｌ）と共に４℃で約１２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳを捨てて満たすという工程によってプレートを洗浄し、その後ＰＢＳ中のＢＳＡの溶液０．１ｍｌ／ウエルにより室温で２時間ブロックした。
【００９０】
プレートを洗浄せずに空にした。あらかじめＰＢＳ中室温で２時間インキュベートした以下の成分：０．３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０の溶液０．０５ｍｌ／ウエルをプレートに添加した。種々の実験条件を試験した：
【００９１】
１）固定量のＨＭＧＡ１と漸減濃度の抗ＨＭＧＡ１抗体（１μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌ）
２）固定濃度の抗ＨＭＧＡ１抗体と漸減濃度のＨＭＧＡ１またはＨＭＧＡ１を含有する生物学的試料
３）対照細胞に関して１）および２）の条件、次に漸減濃度の抗ＨＭＧＡ１抗体および／または緩衝液単独。
プレートを室温で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％で洗浄した。
【００９２】
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％中で１：１０００希釈した二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ抗体Ｆ（ａｂ’）2  ０．０５ｍｌ／ウエルをプレートに添加し、室温で１時間半放置してインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％で洗浄し、その発色基質０．１５ｍｌ（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１ｇ／Ｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）および３．５ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素）を添加した。３０分後に０．０５ｍｌ／ウエルの４．５Ｍ硫酸を添加することによって発色を停止させ、１０分後にＴＥＫＳＣＡＮを用いて４９２ｎｍで吸光度を測定した。ｍＡｂ濃度の関数としてプロットすることによって、すなわち吸光度（１ｍｇ／Ｌでの最大吸光度）の対数変換によって標準曲線を得た。
【００９３】
[ＨＭＧＡ１の定量]
精製抗体２１Ｇ６／１８を、生体液中のＨＭＧＡ１を定量するためのアッセイの調製に使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のＨＭＧＡ１と溶液中のＨＭＧＡ１の間での結合の競合に基づく競合的ＥＬＩＳＡである。ＨＭＧＡ１濃度の定量は、精製ＨＭＧＡ１タンパク質を使用して得られた標準曲線に対して試料を滴定して実施する。最初のアッセイは、マルチウエルプレートを被覆するために使用するＨＭＧＡ１の量を決定するためおよび抗体の標準曲線を作成するために実施した。種々のタンパク質濃度を、種々の抗体濃度を有するマイクロタイタープレートに分注し、被覆のために使用すべきＨＭＧＡ１の最適濃度が０．５μｇ／ｍｌ（０．０５ｍｌ／ウエル）であり、最適抗体濃度が０．００２μｇ／ｍｌであることを確認した。ペルオキシダーゼに結合した二次抗体の最良希釈を最適化するため、標準抗体の４つの濃度を試験し、二次抗体の希釈を変化させた。選択した希釈は１：２０００であった。
【００９４】
アッセイおよび結果の再現性と精度を確実にするため、マトリックスの等価性に関する検討も実施し、抗体標準曲線の希釈緩衝液への１０％および２０％血清の添加の影響を試験した。最適条件は１０％であった。
【００９５】
ひとたび使用する最良抗体濃度が決定されれば、アッセイの感受性を定義するため、抗体を１０μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌの間の様々な濃度のタンパク質と共にインキュベートすることによってＨＭＧＡ１の標準曲線を決定した。ＨＭＧＡ１の０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの区間で用量反応曲線を得た。アッセイの感受性は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のＨＭＧＡ１の定量を許容するものである。
【００９６】
各々のアッセイは以下の同時分析を企図する：
−二重／三重盲検評価で種々の濃度（８−２−０．５−０．１２５−０．０３１−０．００７８−０．００２−０μｇ／ｍｌ）の精製ＨＭＧＡ１に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ１：２希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料。
【００９７】
標準曲線の競合パーセンテージの平均値および相対濃度の対数を計算した。切片、勾配およびｒ2パラメータを、線形回帰関数を用いて計算した。ｒ2値＜０．９６の場合および／またはＨＭＧＡ１スパイクを含む試料が期待値から＞２５％逸脱する場合は、アッセイを反復しなければならない。このようにして得られた曲線から、分析する試料中に存在するＨＭＧＡ１の濃度を計算することが可能である。このようにして調製したアッセイは、０．０３５μｇ／ｍｌの測定限界を示す。
【００９８】
生物学的試料の血清中のＨＭＧＡ１を定量するための競合的ＥＬＩＳＡの結果を表２に示す。
【００９９】
特にシリーズ１とシリーズ２に関する表２では、異なる被験者の試料を異なる時点で定量した。特に、シリーズ１では試料１、２、４、５、６、７、８、１０、１１は健常対照被験者を示し、列挙される残りの試料は、おそらくインスリン抵抗性または糖尿病被験者を示す。特に、シリーズ２では試料１、２、３、４、５、６は健常対照被験者を示し、列挙される残りの試料は、おそらくインスリン抵抗性または糖尿病被験者を示す。μｇ／ｍｌで示す数値は、試料中のＨＭＧＡ１タンパク質の濃度を表す。
【０１００】
【表２】
2011523352.tif 000003
【０１０１】
［実施例５］
【０１０２】
[ＨＭＧＡ１の定量]
精製抗体２１Ｇ６／１８を、リンパ球からの核タンパク質抽出物中のＨＭＧＡ１の量を測定するために使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のＨＭＧＡ１と溶液中のＨＭＧＡ１の間での結合の競合に基づく競合的ＥＬＩＳＡである。ＨＭＧＡ１濃度の定量は、精製ＨＭＧＡ１タンパク質を使用して得られる標準曲線に対して試料を定量化して実施する（実施例４で述べたように）。
【０１０３】
リンパ球からの核タンパク質抽出物中のＨＭＧＡ１を定量するための競合的ＥＬＩＳＡの結果を表３に示す。
【０１０４】
特に、健常被験者と罹患被験者に関する表３において、種々の個体の定量した試料を示す。表に示す値は、実施例４の結果から既に明らかになった内容を確認する、すなわちＨＭＧＡ１の低濃度は糖尿病またはインスリン抵抗性の病的状態に関連する。μｇ／ｍｌで表した表３に示す値は、試料中のＨＭＧＡ１タンパク質の濃度を表す。健常被験者についての欄では、一部の試料（１１、１２、１８、２０、２３、２４、２５、２９）は、ＨＭＧＡ１の高濃度が健常被験者の特徴であるという一般的傾向から逸脱する。試験は、再現性および統計的有意性として理解される、その信頼性を確認する。Ｐ値は、実際に０．０５より低く、詳細にはＰ＜０．００１５である。表３に示すデータは、従って、試験の高い信頼性を確認する。
【０１０５】
また、罹患被験者からの試料中のＨＭＧＡ１タンパク質の濃度の値を分析することにより、タンパク質濃度の検出限界が具体的にどの程度有効であり、非常に低い濃度値でも識別することができ、極めて近い数値範囲でも高い感受性を有するかを確認することも可能である。データは、０．０３５μｇ／ｍｌをアッセイにおけるＨＭＧＡ１の濃度の検出限界として示す、実施例４から既に明らかになった内容を確認する。
【０１０６】
【表３】
2011523352.tif 000004
【図１】
2011523352.tif 000005
【国際調査報告】
2011523352.tif 000006
2011523352.tif 000007