(57)【要約】  望ましくない免疫応答を治療するかまたは防止するための組成物および方法を提供する。組成物は、新規可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）ポリペプチドおよびこうしたポリペプチドをコードする核酸、改善された（ｓＣＤ８３）配合物、ならびにこうしたポリペプチドおよび配合物の、アレルギー、自己免疫疾患および移植片拒絶の治療または防止における使用に関する。配列番号７または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号７のアミノ酸残基１２、２０、８５および９２の１以上がシステイン以外のアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が存在しない、ｓＣＤ８３ポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドであって；配列番号７のアミノ酸残基１２、２０、８５および９２の１以上が存在しないか、またはシステイン以外のアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が存在しない、前記ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸残基８５がシステイン以外のアミノ酸残基である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸残基１２、２０、９２および１１４がシステインである、請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸残基８５がセリンである、請求項３のポリペプチド。
【請求項５】
配列同一性が少なくとも９５％である、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド。
【請求項６】
配列同一性が１００％である、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号７、配列番号７のアミノ酸残基１〜１２９、配列番号７のアミノ酸残基５〜１２９、および配列番号７のアミノ酸残基５〜１３０からなる群より選択される配列からなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸残基１２、２０、９２および１１４がシステインである、請求項７のポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸残基８５がセリンである、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ｓＣＤ８３ポリペプチドであって；場合によってアミノ酸残基１２６が存在しない、前記ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
哺乳動物被験体において、望ましくない免疫応答を治療するかまたは防止する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項のポリペプチドを前記被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
望ましくない免疫応答が、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーからなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己心筋炎（ａｕｔｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、自己免疫網膜ブドウ膜炎、血管炎、慢性炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎、ビヒテレフ病（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ）、強直性脊椎炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群より選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
望ましくない免疫応答が移植片拒絶である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）；抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体を加えたラパマイシン；およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を加えたタクロリムス（ＦＫ５０６）の１以上を投与する工程をさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
哺乳動物被験体において、望ましくない免疫応答を治療するかまたは防止するための薬剤の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項のポリペプチドの使用。
【請求項１９】
望ましくない免疫応答が、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーからなる群より選択される、請求項１８の使用。
【請求項２０】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己心筋炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、自己免疫網膜ブドウ膜炎、血管炎、慢性炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎、ビヒテレフ病、強直性脊椎炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群より選択される、請求項１９の使用。
【請求項２１】
哺乳動物移植レシピエントにおいて、移植転帰を改善する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項のポリペプチドの療法的有効量および１以上の免疫抑制剤を前記レシピエントに投与する工程を含み、免疫抑制剤が前記ポリペプチドと相乗的に働いて、移植転帰を改善する、前記方法。
【請求項２２】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記免疫抑制剤が、抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体を加えたラパマイシン；またはミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を加えたタクロリムス（ＦＫ５０６）である、請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、新規可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）ポリペプチドおよびこうしたポリペプチドをコードする核酸、改善された（ｓＣＤ８３）配合物、ならびにこうしたタンパク質および配合物の、アレルギー、自己免疫疾患および移植片拒絶の治療または防止における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８３は、タンパク質の免疫グロブリン（「Ｉｇ」）スーパーファミリー由来の分子である（例えば、Ｚｈｏｕら（１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：７３５−７４２を参照されたい；また、米国特許第７，１６９，８９８号も参照されたい；概説に関しては、ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（（２００６）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｄｅｎｔ．  Ｓｃｉ．  ５３：８６−９１を参照されたい）。ＣＤ８３は成熟樹状細胞の示差マーカーとして働く。ＣＤ８３の正確な機能はまだ決定されていないが、ＣＤ８３の可溶性型は、未成熟および成熟樹状細胞の両方に結合すると報告されてきている（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：１８１３−１８２１を参照されたい）。著者らはまた、このタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した樹状細胞によるＣＤ８０およびＣＤ８３の発現を減少させ、そして樹状細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を刺激する能力を阻害するとも報告した（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：２７３−２７５もまた参照されたい）。同様に、Ｋｒｕｓｅら（２０００）（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９１：１５８１−１５８９）は、ＧＣ７（Ｎ（１）−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン）が、ＣＤ８３  ｍＲＮＡの核−細胞質転位置に干渉し、ＣＤ８３の表面発現を防止し、そしてこれらのＤＣによるＴリンパ球の活性化を有意に阻害することを報告した。他の研究者らは、ＣＤ８３の可溶性型がｉｎ  ｖｉｖｏで存在することを報告している（例えば、Ｈｏｃｋら（２００２）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：９５９−９６７を参照されたい）。ＨＳＶ−１感染ＤＣを用いた研究によって、ウイルス感染がＣＤ８３の分解およびＣＤ８３  ｍＲＮＡ輸送の阻害を導くことが立証され；ＨＳＶ−１によるエスケープのこのありうる機構が、ＤＣ生物学に対するＣＤ８３の重要性をさらに支持する（例えば、Ｋｒｕｓｅら（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：７１２７−７１３６を参照されたい）。
【０００３】
成熟ＣＤ８３には３つの構造ドメイン：細胞外Ｉｇ様ドメイン；膜貫通ドメイン；および細胞質ドメインが含まれる。ヒトＣＤ８３細胞外ドメイン（ｈＣＤ８３ｅｘｔ、ｓＣＤ８３の１つの型）は、少なくとも２つのエクソンにコードされ（例えば、Ｚｈｏｕら（１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：７３５−７４２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＃Ｚ１１６９７）、そして成熟樹状細胞（「ｍＤＣ」）の細胞表面上で強く発現される単一のＩｇ様（Ｖ型）ドメインを含む。
【０００４】
米国特許第７，１６９，８９８号は、ヒトＣＤ８３（ｈＣＤ８３）ｃＤＮＡ（配列番号１）の核酸配列を開示する。全長ｈＣＤ８３の対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２のアミノ酸残基１−１９は、シグナル配列に対応し、成熟タンパク質（アミノ酸残基２０−２０５）から切断される。ｈＣＤ８３細胞外ドメイン（ｈＣＤ８３ｅｘｔ）は、配列番号３にコードされる。対応するｈＣＤ８３ｅｘｔアミノ酸配列は、配列番号４に示され、そしてまた配列番号２のアミノ酸残基２０−１４４である。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、それぞれ、配列番号２のアミノ酸残基１４５−１６６および配列番号２のアミノ酸残基１６７−２０５に対応する。野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔは、３つのグリコシル化部位（すなわち、配列番号４のアミノ酸残基６０、７７および９８）および５つのシステイン残基（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基２７、３５、１００、１０７、および１２９、これらは、配列番号４のアミノ酸残基８、１６、８１、８８および１１０に対応する）を含有する。
【０００５】
ｈＣＤ８３ｅｘｔは、ＤＣが仲介するＴ細胞刺激を阻害し（Ｌｅｃｈｍａｎｎら  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （２００１）  １９４：１８１３−１８２１）、そして多発性硬化症のマウスモデル（実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）；  Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：３４５−３５１）を治療する際に有効である。これらの研究は、タンパク質のアミノ末端にトロンビン切断部位の４アミノ酸部分（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；配列番号４１）を、ならびに膜貫通ドメインの最初のアミノ酸（Ｉｌｅ）をさらに含むｈＣＤ８３細胞外ドメインを用い、そしてこれを配列番号５に示す。
【０００６】
ＰＣＴ公報ＷＯ２００４／０４６１８２は、配列番号５の五番目のシステイン残基が、システインからセリンに突然変異して、配列番号６を生じる可溶性ＣＤ８３突然変異体（本明細書において、以後、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５）を開示し、そして多発性硬化症などの自己免疫疾患、および移植の治療における、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５および野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの使用を提唱する。Ｚｉｎｓｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）  ２１１：４４９−４５３）は、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔが、ホモ二量体を形成し、ここで、細胞外ドメインの最初の４つのシステイン（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基２７、３５、１００および１０７、これらは、配列番号５および６のアミノ酸残基１２、２０、８５および９２に対応する）が分子内ジスルフィド結合の形成に関与し、そして五番目のシステイン（すなわち、配列番号１のアミノ酸残基１２９または配列番号５および６のアミノ酸残基１１４）がホモ二量体の分子間架橋に関与することを開示する。Ｚｉｎｓｅｒらはさらに、２つのｈＣＤ８３ｅｘｔアイソフォーム、すなわち野生型二量体およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５突然変異体単量体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した際、類似の阻害能を有し、そして２つのｈＣＤ８３ｅｘｔアイソフォームの生物学的（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期が匹敵し、そして２〜３時間の間であったことを開示する。さらに、ＥＡＥモデルを用いて、Ｚｉｎｓｅｒらは、二量体野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔアイソフォームと比較した際に、可溶性ＣＤ８３の単量体突然変異体アイソフォーム（すなわち、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５）がｉｎ  ｖｉｖｏで類似の阻害活性を有することを開示する。
【０００７】
ｓＣＤ８３の療法的適用が重要であることを考慮して、出願者らは、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶などの望ましくない免疫応答の治療または防止のための、改善されたｓＣＤ８３ポリペプチドおよびその配合物に関する必要性を認識した。本発明は、この必要性に取り組み、そしてまたさらなる利点も提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，１６９，８９８号
【特許文献２】ＰＣＴ公報ＷＯ２００４／０４６１８２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｚｈｏｕら（１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：７３５−７４２
【非特許文献２】ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（（２００６）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｄｅｎｔ．  Ｓｃｉ．  ５３：８６−９１）
【非特許文献３】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：１８１３−１８２１
【非特許文献４】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：２７３−２７５
【非特許文献５】Ｋｒｕｓｅら（２０００）（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９１：１５８１−１５８９）
【非特許文献６】Ｈｏｃｋら（２００２）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：９５９−９６７
【非特許文献７】Ｋｒｕｓｅら（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：  ７１２７−７１３６
【非特許文献８】Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：３４５−３５１
【非特許文献９】Ｚｉｎｓｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）  ２１１：４４９−４５３）
【発明の概要】
【００１０】
改善された安定性を有する新規可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）ポリペプチドを提供する。１つの側面において、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドであって；アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が場合によって存在せず、そしてアミノ酸残基１２、２０、８５、９２および１１４が表１の任意の一列に特定されるアミノ酸である、前記ポリペプチドを提供する。好ましくは、アミノ酸残基８５はシステイン以外のアミノ酸残基であり、そして最も好ましくは、アミノ酸残基８５はセリンである。
【００１１】
別の側面において、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドは、配列番号７または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号７のアミノ酸残基１２、２０、８５および９２の１以上は存在しないか、またはシステイン以外のアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上は存在しない。
【００１２】
好ましくは、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；場合によってアミノ酸残基１２６が存在しない。
【００１３】
さらに別の側面において、本発明のポリヌクレオチドをコードする核酸、ならびにこうしたポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞を提供する。ベクターおよび細胞は、本明細書に開示するｓＣＤ８３組成物を産生するのに有用である。
【００１４】
本明細書に提供するｓＣＤ８３ポリペプチドは、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーなどの、被験体における望ましくない免疫応答の治療または防止に有用である。したがって、新規ｓＣＤ８３ポリペプチドを含む薬学的組成物、ならびに自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーの治療のために新規ｓＣＤ８３ポリペプチド組成物を用いる方法を提供する。
【００１５】
さらに別の側面において、哺乳動物移植レシピエントにおいて、移植転帰を改善する方法であって、前述のｓＣＤ８３ポリペプチドおよび１以上の免疫抑制剤の療法的有効量を前記レシピエントに投与する工程を含み、免疫抑制剤が前記ポリペプチドと相乗的に働いて、移植転帰を改善する、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、オプション：−ｍａｘｉｔｉｅｒｓ２を用いて、ＭＵＳＣＬＥバージョン３．６によって生成したタンパク質配列アライメントである（Ｅｄｇａｒ  ＲＣ（２００４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（５）：１７９２−７を参照されたい）。ＮＰ ００４２４．１（配列番号２）は、ヒトＣＤ８３タンパク質である（配列番号２）。ＸＰ ５１８２４８．２は、チンパンジーＣＤ８３タンパク質である（配列番号３５）。ＸＰ ８５２６４７．１は、イヌＣＤ８３タンパク質である（配列番号３７）。ＮＰ ００１０４００５５．１は、ウシＣＤ８３である（配列番号３７）。ＮＰ ０３３９８６．１は、マウスＣＤ８３である（配列番号３８）。ＸＰ ３４１５１０．２は、ラットＣＤ８３である（配列番号３９）。ＸＰ ４１８２９．１は、赤色野鶏ＣＤ８３である（配列番号４０）。下線アミノ酸残基は任意のアミノ酸によって置換可能である。下線および太字のアミノ酸は、好ましくは保存的アミノ酸置換によって置換されてもよい。下線がないアミノ酸残基は、好ましくは置換されない。
【図１Ｂ】図１は、オプション：−ｍａｘｉｔｉｅｒｓ２を用いて、ＭＵＳＣＬＥバージョン３．６によって生成したタンパク質配列アライメントである（Ｅｄｇａｒ  ＲＣ（２００４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（５）：１７９２−７を参照されたい）。ＮＰ ００４２４．１（配列番号２）は、ヒトＣＤ８３タンパク質である（配列番号２）。ＸＰ ５１８２４８．２は、チンパンジーＣＤ８３タンパク質である（配列番号３５）。ＸＰ ８５２６４７．１は、イヌＣＤ８３タンパク質である（配列番号３７）。ＮＰ ００１０４００５５．１は、ウシＣＤ８３である（配列番号３７）。ＮＰ ０３３９８６．１は、マウスＣＤ８３である（配列番号３８）。ＸＰ ３４１５１０．２は、ラットＣＤ８３である（配列番号３９）。ＸＰ ４１８２９．１は、赤色野鶏ＣＤ８３である（配列番号４０）。下線アミノ酸残基は任意のアミノ酸によって置換可能である。下線および太字のアミノ酸は、好ましくは保存的アミノ酸置換によって置換されてもよい。下線がないアミノ酸残基は、好ましくは置換されない。
【図２】図２は、プラスミドｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔの模式図である。
【図３】図３は、８０（レーン２）、４０（レーン３）、２０（レーン４）、１０（レーン５〜８）または５（レーン９〜１３）Ｕ／ｍＬのトロンビンを用いたＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔのカラム上トロンビン切断後に溶出された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解像を示す。レーン７および８は、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン消化およびグルタチオン溶出後に得たＧＳＴ分画を示す。レーン１１〜１３は、５Ｕ／ｍＬのトロンビン消化およびグルタチオン溶出後に得たＧＳＴ分画を示す。レーン１：分子量マーカー。トロンビン（Ｓｉｇｍａ）中に存在する混入タンパク質を破線の囲みで示す。
【図４Ａ】図４Ａは、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたｈＣＤ８３ｅｘｔの精製（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程に関する典型的な２ピーク・クロマトグラムが、２つの主要なピークを含有することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、各精製分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン２〜５は第一のピークに相当し、そしてレーン６〜９は第二のピークに相当する。レーン１は、精製のため、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに装填されたＧＳＴ後試料に相当する。ｈＣＤ８３ｅｘｔが第一のピーク中に位置し、一方、他の混入タンパク質は第二のピーク中に位置することに注目されたい。ゲルを硝酸銀で染色した。
【図５】図５は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を用いた、多様なｈＣＤ８３ｅｘｔ試料ロットの分析を示す。タンパク質試料を−２０℃で保存し、そして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロール中に配合し、レーン３の試料はグリセロールを含まなかった。ロットはいくつかの異なる日付で作製され、そしてしたがって、分析を実行する前に、異なる期間（すなわち、レーン２〜１０に関して、それぞれ、４、３、３、２、１０．５、９．５、６．５、６、６ヶ月）、保存されていた。矢印は、単量体の位置を示す。さらに、おそらく多量体型に対応する、より大きい分子量の種が見られうる。より小さい分子量の型は、分解産物、またはおそらく慣用的でない分子内ジスルフィド結合によって仲介される修飾単量体に対応する。
【図６】図６は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を用いた、多様なｈＣＤ８３ｅｘｔ試料ロットの分析を示し、そして単量体および二量体の移動を強調する。タンパク質試料を−２０℃で保存し、そして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロール中に配合したが、グリセロールを含まないレーン３は例外であった。ロットはいくつかの異なる日付で作製され、したがって、分析を実行する際、異なる「保存時間（ａｇｅ）」（すなわち、レーン２〜１０に関して、それぞれ、４、３、３、２、１０．５、９．５、６．５、６、６ヶ月）を有した。レーン３、６、および７の矢印は、おそらく非慣用的な分子内ジスルフィド結合によって仲介される、いくつかの異常なｈＣＤ８３ｅｘｔ種を強調する。
【図７】図７は、（Ａ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ｂ）非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および（Ｃ）ウェスタンブロッティングを用いた、ｈＣＤ８３ｅｘｔ試料の分析を示す。より高次の多量体種（三量体および四量体など）を可視にするため、ＳＤＳゲルを硝酸銀で染色した。ウェスタンブロッティングによって、これらの種はすべて、ｈＣＤ８３ｅｘｔと関連することが検証された。
【図８】図８は、ｈＣＤ８３ｍ−２，５に関する精製工程からのピークを示すＡＥＣクロマトグラムである。
【図９】図９は、精製ＣＤ８３ｍ−２，５分画の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】図１０は、精製ＣＤ８３ｍ−２，５分画の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１１】図１１は、円二色性（ＣＤ）を用いたＣＤ８３ｍ−２，５の分光光度分析を示す。
【図１２】図１２は、ＣＤ８３ｍ−２，５の分光蛍光分析を示す。
【図１３】図１３は、円二色性を用いたＣＤ８３ｍ−２の分光光度分析を示す。
【図１４】図１４は、ｈＣＤ８３ｍ−３に関する精製工程由来のピークを示すＡＥＣクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１５）、ＣＤ（図１６および１７）、および分光蛍光測定（図１８）を用いた構造的性質決定に供した精製ＣＤ８３ｍ−３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、結果は野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔおよびＣＤ８３ｍ−５に類似している。
【図１６】図１６は、ｐＨ７．５の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に配合されたＣＤ８３ｍ−３および野生型ＣＤ８３（バッチ００４−０４）の、ＣＤを用いた分光光度分析を示す。
【図１７】図１７は、ＣＤ８３ｍ−３（ｐＨ７．０または７．５のいずれかで配合）の、ＣＤを用いた分光光度分析を示す。
【図１８】図１８は、ｐＨ７．０または７．５のいずれかで配合されたＣＤ８３ｍ−３の分光蛍光分析を示す。
【図１９】図１９は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５の単量体型、ならびに野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの単量体および二量体型の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２０】図２０は、ジスルフィド結合スクランブル化を防止するＮＥＭでの前処理を伴うまたは伴わない、単量体型ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（ｍ３）、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５（ｍ５）、ならびに異なる日に作製された野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの３つの調製物（００４−４、００７および０２３）の単量体および二量体型の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２１】図２１は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５、および野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの３つの異なる調製物のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。すべての調製物をＮＥＭで処理して、ジスルフィド結合スクランブル化を防止した。第一（左）のピークは二量体に相当する一方、第二（右）のピークは単量体に相当する。
【図２２】図２２は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（ｍ３）、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５（ｍ５）、および野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの３つの異なる調製物（ｗｔ  ００４−４、ｗｔ  ００７およびｗｔ  ０２３）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２３】図２３は、突然変異体単量体ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５、およびｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型の２つの異なる調製物（００４−４および０２３）のサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す。
【図２４】図２４は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５の２つの異なる調製物（５０１および５０２）および野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの６つの異なる調製物（００７、１００、０２１、０２３、８０および９０）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２５】図２５は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５および野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの異なる調製物の非還元ウェスタンブロット分析を示す。
【図２６】図２６は、ＴＮＦαを産生する単球の割合または細胞あたりで産生されるＴＮＦαの平均量のいずれかによって測定した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５の多様な配合物が、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した霊長類ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力を示す。
【図２７】図２７は、ＴＮＦαを産生する単球の割合または細胞あたりで産生されるＴＮＦαの平均量（ＭＦＵ）のいずれかによって測定した際の、すべてｐＨ７．６で配合された野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５が、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した霊長類ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力を示す。
【図２８】図２８は、ＴＮＦαを産生する単球の割合または細胞あたりで産生されるＴＮＦαの平均量（ＭＦＵ）のいずれかによって測定した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ｐＨ４．５または５．５で配合）およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５（ｐＨ７．６で配合）が、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した霊長類ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力を示す。
【図２９】図２９は、ＴＮＦαを産生する単球の割合または細胞あたりで産生されるＴＮＦαの平均量（ＭＦＵ）のいずれかによって測定した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ｐＨ４．５または５．５で配合）、または突然変異体型ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（ｐＨ５．５で配合）およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５の２つの調製物（ｐＨ７．６で配合）が、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した霊長類ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力を示す。
【図３０】図３０は、ＴＮＦαを産生する単球の割合によって測定した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（バッチＡＲＧ−０２１；ｐＨ７．６で配合）、および単量体突然変異体ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の４つの調製物（ｐＨ４．５または５．５で配合）が、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激したヒトＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力の相違を示す。
【図３１】図３１は、非還元（左レーン）および還元（右レーン）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ロット０２１）に対するｐＨおよび温度の影響を示す。
【図３２】図３２は、非還元（左レーン）および還元（右レーン）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ロット０２１）に対するｐＨおよび温度の影響を示す。
【図３３】図３３は、非還元（左レーン）および還元（右レーン）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ロット０２１）に対するｐＨおよび温度の影響を示す。
【図３４】図３４は、非還元（左レーン）および還元（右レーン）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ロット０２１）に対するｐＨおよび温度の影響を示す。
【図３５】図３５は、非還元（左レーン）および還元（右レーン）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際の、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ロット０２１）に対するｐＨおよび温度の影響を示す。
【図３６】図３６は、ＰＯＤ１４０でのラット腎同種移植片の病理学的等級付けを示すグラフである。中央値スコア：  ０＝正常；  １＝最小変化；  ２＝軽度の変化；  ３＝中程度の変化；  ４＝顕著な変化。
【図３７】図３７は、ＰＯＤ１４０でのラット腎同種移植片の免疫組織化学等級付けを示すグラフである。中央値スコア：  ０＝正常；  １＝最小変化；  ２＝軽度の変化；  ３＝中程度の変化；  ４＝顕著な変化。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）、特に、配列番号５および６に対応するｈＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドが、保存中に安定性を失うことを見出してきている。驚くべきことに、ｈＣＤ８３ｅｘｔの第三のシステイン残基を突然変異させると、安定性および匹敵する生物活性の改善が生じることが見出された。上に論じるように、ｈＣＤ８３ｅｘｔの最初の４つのシステインが分子内ジスルフィド結合の形成に関与してｈＣＤ８３ｅｘｔがホモ二量体を形成することをＺｉｎｓｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）  ２１１：４４９−４５３）が開示するため、この結果は予期せぬものであった。したがって、Ｚｉｎｓｅｒの見方によれば、ｈＣＤ８３ｅｘｔの最初の４つのシステインの各々が細胞外ドメインの適切なコンホメーションを維持するのに非常に重要であると予期されるであろう。予期せぬことに、これらのシステイン残基に対する突然変異は、安定性を改善しうる。さらに、安定性は、低いｐＨ、好ましくはｐＨ４．０〜５．０、最も好ましくは約４．５のｐＨで緩衝された際に、さらに増進することが見出された。野生型ｓＣＤ８３タンパク質は、不安定であり、そして温度、ｐＨ、脱アミド化、および加水分解に影響を及ぼす条件に対して感受性であるようである。
【００１８】
ｈＣＤ８３ｅｘｔにおける５つのシステイン残基の１以上に関するアミノ酸置換を有する本発明の新規ｓＣＤ８３ポリペプチドのいくつかを表１に示す。用語「Ｃｙｓ以外」は、システイン以外の任意の標準的または非標準的アミノ酸を指す。好ましくは、システイン残基に関する置換は、極性非荷電Ｒ基を有するアミノ酸（例えばセリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、および非標準的アミノ酸セレノシステイン）がシステインを置換するように、保存的置換である。あるいは、システイン残基は、置換なしに欠失してもよい。表１は、システイン残基の置換または欠失に関する潜在的な部位である配列番号７中の５つのアミノ酸位を示す。配列番号７は配列番号５の変異体であり、ここで、配列番号５においてシステインである５つの残基（すなわち残基１２、２０、８５、９２および１１４）の１以上は、欠失するか、または別のアミノ酸で置換されてもよい。
【００１９】
表１
配列番号７のＣＤ８３ｅｘｔ変異体の限定されない例
【００２０】
【表１】
2011520959.tif 000002
【００２１】
＊Ｃｙｓ以外＝システイン以外の任意のアミノ酸。
＊＊アミノ酸残基１２、２０、８５、９２および１１４は、配列番号７に示すように、ｈＣＤ８３細胞外ドメインの第一、第二、第三、第四および第五のシステイン残基の位置に相当し、ここでこれらの残基の番号付けは、配列番号７のＮ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４１）残基が付加されているため、配列番号４に比較して、＋４移動する。
【００２２】
表２は、配列番号２および４〜８における５つのシステイン残基（または別のアミノ酸残基がシステイン残基に関して置換されてもよい部位）の番号付けの相関を示す。番号付けは、異なるＮ末端融合部分の存在または非存在のため、多様である。例えば、配列番号２は全長ｈＣＤ８３配列であり、そして配列番号４〜８には存在しない、Ｎ末端１９アミノ酸シグナル配列、ならびに膜貫通および細胞質ドメインを含有する。ｈＣＤ８３細胞外ドメインの最初のアミノ酸残基（Ｔｈｒ）は、配列番号２のアミノ酸残基２０である。配列番号４は、ｈＣＤ８３タンパク質の１２５アミノ酸の細胞外ドメインであり、そして配列番号２のアミノ酸残基２０−１４４に相当する。配列番号５〜７は、ｈＣＤ８３ｅｘｔドメイン（アミノ酸残基５−１２９）に融合した４アミノ酸Ｎ末端配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；配列番号４１）を含み、この後に、膜貫通ドメインの最初のアミノ酸残基（アミノ酸残基１３０のＩｌｅ）が続く。配列番号８は、ｈＣＤ８３ｅｘｔドメイン（アミノ酸残基１４−１３８で始まる）に融合したＮ末端ＧＳＴ−タグおよびトロンビン切断部位（アミノ酸残基１−１３）を含有し、この後に、膜貫通ドメインの最初のアミノ酸残基（アミノ酸残基１３９のＩｌｅ）が続く。
【００２３】
表２
多様な全長または可溶性ＣＤ８３配列のシステインまたはＸａａ残基のアライメント
【００２４】
【表２】
2011520959.tif 000003
【００２５】
図１は、ヒト（ＮＰ ００４２２４．１；配列番号２）、チンパンジー（ＸＰ ５１８２４８．２；配列番号３５）、イヌ（ＸＰ ８５２６４７．１；配列番号３６）、ウシ（ＮＰ ００１０４００５５．１；配列番号３７）、マウス（ＮＰ ０３３９８６．１；配列番号３８）、ラット（ＸＰ ３４１５１０．２；配列番号３９）および赤色野鶏（ＸＰ ４１８９２９．１；配列番号４０）由来のＣＤ８３ポリペプチドのアライメントを示す。図１に示すヒトＣＤ８３配列を参照すると、細胞外ドメインは、アミノ酸残基２０−１４４に相当する。下線残基は、非保存的および保存的アミノ酸置換または欠失が細胞外ドメインで起こる位置、ならびにアライメントされた哺乳動物ＣＤ８３ポリペプチドの膜貫通ドメインの最初のアミノ酸残基を同定する。下線太字の残基は、保存的アミノ酸置換または欠失が起こる位置を同定する。マウスおよびヒトＣＤ８３タンパク質は、６３％配列同一性を有する。ヒトＣＤ８３ｅｘｔポリペプチド（例えば野生型（ｗｔ）またはｍ３）が、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類（例を参照されたい）において、移植片拒絶を抑制する能力を有することは、哺乳動物種間のＣＤ８３構造および機能が保存されていることを示す。
【００２６】
したがって、１つの側面において、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドであって、アミノ酸残基１２、２０、８５、９２および１１４が表１の任意の一列に特定されるアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が存在しない、前記ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドは、前述のアミノ酸配列から本質的になるか、または該配列からなる。好ましくは、アミノ酸８５はセリンであり、そしてアミノ酸１２、２０、９２および１４４はシステインである。
【００２７】
別の側面において、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ｓＣＤ８３ポリペプチドであって、アミノ酸残基１２、２０、８５および９２の１以上が存在しないか、またはシステイン以外のアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が存在しない、前記ポリペプチドを提供する。好ましくは、アミノ酸残基８５はシステイン以外のアミノ酸であり、そしてアミノ酸残基１２、２０、９２および１１４はシステインである。最も好ましくは、アミノ酸残基８５はセリンである。いくつかの態様において、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドは、前述のアミノ酸配列から本質的になるか、または該配列からなる。好ましい態様において、ｓＣＤ８３ポリペプチドは、配列番号７、配列番号７のアミノ酸残基１〜１２９、配列番号７のアミノ酸残基５〜１２９、または配列番号７のアミノ酸残基５〜１３０からなる。
【００２８】
いくつかの態様において、単離ｓＣＤ８３ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；場合によってアミノ酸残基１２６は存在しない。
【００２９】
配列番号７と本発明の新規ｓＣＤ８３ポリペプチドの配列同一性は、７０％〜１００％であってもよい。好ましくは、配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％である。配列番号７中のアミノ酸残基は、保存的にまたは非保存的に置換されていてもよい。好ましくは、置換は保存的である。配列番号７のアミノ酸残基１２、２０、８５、９２および１１４の１以上がシステインでない場合、これらは、好ましくは、小さいおよび／または極性のアミノ酸群、例えば、アラニン、グリシン、バリン、スレオニン、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選択され、そして最も好ましくはセリンである。
【００３０】
他の態様において、本発明は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された、本明細書記載のポリペプチドいずれかを含む、キメラ分子を提供する。こうしたキメラ分子の限定されない例は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで、さらなる官能性、安定性またはホーミング特性を与えるアミノ酸配列に融合した、本明細書記載のポリペプチドいずれかを含む。いくつかの態様において、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで、シグナル配列および／またはタンパク質単離に有用な１以上のアミノ酸配列（例えばアフィニティタグ、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、セルロース結合ドメイン、Ｆｃドメイン、Ｉｇなど）、またはタンパク質のプロセシング後に残ってもよいこうした配列の一部を含む。精製を容易にするために添加されるペプチド部分を、場合によって、ポリペプチドの最終調製前に除去してもよい。限定されない例として、ｓＣＤ８３ポリペプチドは、Ｎ末端の最初にＧＳＴタグ、トロンビン切断部位およびｈＣＤ８３ｅｘｔ配列を含んでもよい（例えば配列番号８を参照されたい）。このＧＳＴタグ化融合ポリペプチドを、固定グルタチオンに結合させることによって単離してもよく、そして次いでトロンビンで切断してもよい。次いで、切断産物は、ｈＣＤ８３ｅｘｔのＮ末端に融合した、トロンビン切断部位（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；配列番号４１）のカルボキシ部分を含有するであろう。多様なアフィニティタグおよびタンパク質精製におけるその使用法は、当業者に知られる。例えば、Ｔｅｒｐｅ（２００３）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６０：５２３−５３３を参照されたい。
【００３１】
キメラｓＣＤ８３ポリペプチドのいくつかの態様において、ｓＣＤ８３ポリペプチドをＮまたはＣ末端で、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＧＡ２）、好ましくはヒト免疫グロブリンのＩｇまたはＦｃドメインに融合させる。こうした融合タンパク質を作製するための方法は、当業者に知られる（例えば、米国特許５，４２８，１３０およびＥＰＡ  ０  ４６４  ５３３を参照されたい）。キメラｓＣＤ８３−ＦｃまたはｓＣＤ８３−Ｉｇ融合タンパク質は、改善された薬物動態学的特性を有しうる（ＥＰＡ  ０  ２３２  ２６２）。
【００３２】
用語「可溶性ＣＤ８３」、「ｓＣＤ８３」、および「ＣＤ８３ｅｘｔ」は、本明細書において、タンパク質のＣＤ８３ファミリー・メンバーの細胞外ドメインの少なくとも一部を含むポリペプチドを指し、そして可溶性ＣＤ８３ポリペプチドは、発現される細胞の膜に前記分子を係留することが可能なＣＤ８３膜貫通ドメインを持たない。しかし、可溶性ＣＤ８３ポリペプチドには、細胞外ドメイン外部である全長天然ＣＤ８３タンパク質のさらなる残基、例えば、発現される細胞の膜に、可溶性ＣＤ８３タンパク質を係留するのに十分でない膜貫通ドメインの一部が含まれてもよい。さらに、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドは、ｓＣＤ８３活性を有する。
【００３３】
ｓＣＤ８３ポリペプチドは、任意の適切なアッセイによって測定した際に、配列番号５のｓＣＤ８３ポリペプチドの少なくとも１つの活性を示すならば、「ｓＣＤ８３活性」を有すると言われる。ｓＣＤ８３ポリペプチドは、こうしたアッセイにおいて、同じアッセイで測定した際の、配列番号５のｓＣＤ８３ポリペプチドの活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより高い活性を有するならば、「ｓＣＤ８３活性」を有すると言われる。好ましくは、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドは、成熟免疫刺激樹状細胞に結合し、そしてこれらの樹状細胞がＴ細胞増殖を刺激する能力を減少させることが可能である。ｓＣＤ８３活性は、直接または間接的に評価可能であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定可能であり；適切なアッセイが当該技術分野に知られる（例えば、Ｔ細胞への樹状細胞の結合および樹状細胞−Ｔ細胞クラスターの形成を決定するための好ましいアッセイを開示する、Ｋｒｕｓｅら（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：７１２７−７１３６；  Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：１８１３−１８２１を参照されたい）。本明細書にその内容が援用される、米国特許公報２００４０１１０６７３は、ｓＣＤ８３活性のためのアッセイ、例えば１）成熟カクテルの存在下での未成熟ＤＣの成熟ＤＣへの成熟の阻害；２）ｓＣＤ８３を含む培養に際しての、成熟ＤＣによるＣＤ８０およびＣＤ８３発現の喪失；３）ＭＬＲアッセイにおける、成熟ＤＣがＴ細胞増殖を刺激する能力の阻害；４）ＤＣによる典型的なクラスター形成およびＴ細胞の増殖の阻害、ならびに５）マウスにおける実験自己免疫脳炎（ＥＡＥ）の阻害を開示する。この出願の実施例４は、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激したＰＢＭＣによるＴＮＦ−α産生を、ｓＣＤ８３が減少させる能力を測定する、ｓＣＤ８３活性に関するアッセイを開示する。
【００３４】
したがって、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドは、適切な対照、例えばｓＣＤ８３の非存在下での成熟免疫刺激樹状細胞およびＴ細胞の間の相互作用に比較して、成熟免疫刺激樹状細胞がＴ細胞増殖を刺激する能力を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％あるいはそれより多く減少させることも可能である。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明のｓＣＤ８３タンパク質は、適切な対照に比較して、成熟プロセスの少なくとも１つの工程中、可溶性ＣＤ８３の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた免疫刺激樹状細胞によるＴＮＦ−α、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の発現を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％あるいはそれより多く減少させることも可能である（例えば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：１８１３−１８２１；  ＷＯ  ２００４／０４６１８２；実施例４を参照されたい）。例えば、ｓＣＤ８３を未成熟樹状細胞に添加すると、ＣＤ８０およびＣＤ８３発現が減少するように、表面発現が改変される。成熟樹状細胞にｓＣＤ８３を添加すると、ＣＤ８３発現が減少し、そしてＤＣをｓＣＤ８３で処理すると、Ｔ細胞増殖を刺激するその能力が失われる。この方式で、ｓＣＤ８３は、処理細胞の免疫表現型を改変したと言うことも可能である。当業者には、細胞表面マーカーの発現分析のために一般的に用いられる技術（例えばＦＡＣＳ分析）は、時に、細胞の混合集団に相当するデータを生じる可能性もあり、そして特定のデータセットにおいて、どの集団が相当しうるかを同定することに注意を払わなければならないことを、当業者は理解する。
【００３６】
本発明にしたがって、ｓＣＤ８３ポリペプチドの誘導体は、改変された側鎖を持つ１以上のアミノ酸を有してもよい。こうした誘導体化ポリペプチドには、例えば、未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カロベンズオキシ（ｃａｒｏｂｅｎｚｏｘｙ）基を形成し；未結合カルボキシ基が、塩、メチルおよびエチルエステルを形成し；未結合ヒドロキシル基が、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体ならびに天然存在アミノ酸誘導体、例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リジンに対する５−ヒドロキシリジン、セリンに対するホモセリン、リジンに対するオルニチンなどを形成するアミノ酸を含むものが含まれる。やはり含まれるのは、共有結合、例えば環状ポリペプチドを生じる２つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド連結を改変しうるアミノ酸誘導体である。可溶性ｓＣＤ８３ポリペプチドまたはその誘導体は、ＣＤ８３分子の天然グリコシル化パターンまたは改変されたグリコシル化パターンを有してもよいし、あるいはグリコシル化されていなくてもよい。
【００３７】
本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドは、ｓＣＤ８３ポリペプチドの単量体、二量体または多量体であってもよい。ｓＣＤ８３タンパク質の単量体型内に存在するシステイン残基（例えば配列番号５の１２、２０、８５、９２および１１４位に存在するもの）間の１以上のジスルフィド結合の形成を通じて、あるいはｓＣＤ８３ポリペプチドの単量体型内の同じまたは異なる官能部分（例えばカルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオ基等）を連結する二重官能性リンカー分子（例えばジアミン、ジカルボン酸化合物等）によって、二量体化または多量体化が達成されてもよい。後者にはまた、組換え技術によって直接産生可能な二量体構造を生じるための、例えば小さい極性アミノ酸残基、例えば−［（Ｇｌｙ）ｘＳｅｒ］ｙ−（式中、ｘは、例えば３または４であり、そしてｙは例えば１〜５である）から作製されるポリペプチドリンカーの使用も含まれる。好ましい態様において、ｓＣＤ８３は単量体である。
【００３８】
融合タンパク質が本明細書に定義するような１以上のｓＣＤ８３活性を保持する限り、ｓＣＤ８３ポリペプチドは、ＣＤ８３および誘導体の細胞外ドメインの少なくとも一部の融合タンパク質であってもよい（例えば、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照されたい）。いくつかの態様において、細胞外ドメイン外部のＣＤ８３のさらなる残基を含むタンパク質が、用語「可溶性ＣＤ８３」に含まれる。したがって、適切な誘導体には、限定されるわけではないが、ＣまたはＮ末端に付着したさらなる配列を有するタンパク質、例えばそのＣ末端に膜貫通ドメインの一部を所持するもの、あるいはＮ末端に、例えば操作された融合タンパク質の産物として、トロンビンによるトロンビン部位切断から生じうる短いペプチド（例えばＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４１））を；または融合タンパク質の切断後のＧＳＴ断片から生じる短いペプチドを所持するもの、ならびにＩｇおよびＦｃ融合体が含まれる。
【００３９】
別の態様において、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。したがって、１つの態様は、配列番号７または配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になってもよいポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって；アミノ酸残基１２、２０、８５および９２の１以上が存在しないかまたはシステイン以外のアミノ酸であり；そして場合によって、アミノ酸残基１、２、３、４および１３０の１以上が存在しない、前記単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、アミノ酸残基８５は、システイン以外のアミノ酸であり；アミノ酸残基１２、２０、９２および１１４はシステインである。最も好ましくは、アミノ酸残基８５はセリンである。好ましくは、配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％である。遺伝暗号を用いると、所定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに相当する核酸すべてが容易に想定されうる。
【００４０】
さらに別の側面において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにこうしたベクターを含む細胞を提供する。ベクターおよび細胞は、本明細書に開示するＣＤ８３ｅｘｔ組成物を産生するのに有用である。
【００４１】
ＣＤ８３タンパク質、核酸配列、および構造は当該技術分野に知られる。ヒトＣＤ８３  ｃＤＮＡの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ１１６９７）を配列番号１に示す。この配列には、配列番号１の１１〜６２８位のコード配列が含まれる（停止コドンを含む）。シグナル配列は、配列番号１の１１〜６７位にコードされる。成熟ＣＤ８３ペプチドをコードする配列は、６８〜６２５位に渡る。制限酵素認識部位は、配列番号１の始めおよび終わりに存在する（１〜６位および１７５５〜１７６０位）。ヒトＣＤ８３のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｑ０１１５１に示すとおりであり、そして配列番号１に示す核酸配列にコードされる）を配列番号２に示す。他のヒトＣＤ８３配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ ００１０３５３７０［ＣＤ８３抗原アイソフォームｂ、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）：配列番号２］；  ＮＰ ００４２２４［ＣＤ８３抗原アイソフォームａ、ホモ・サピエンス］；  ＥＡＷ５５３５３［ＣＤ８３抗原アイソフォームＣＲＡ ｃ  ホモサピエンス］；  ＥＡＷ５５３５２［ＣＤ８３抗原アイソフォームＣＲＡ ｂ  ホモ・サピエンス］；  ＥＡＷ５５３５１［ＣＤ８３抗原アイソフォームＣＲＡ ａ、ホモ・サピエンス］で入手可能である。こうした配列をアライメントして、保存ドメインを決定してもよい。
【００４２】
他の生物由来のＣＤ８３配列が以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号で入手可能である：  ＡＢＣ６８６１９［サルモ・サラー（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）］；  ＣＡＢ６３８４３およびＮＰ ０３３９８６．１（配列番号３８［ムス・ムスクルス］；  ＡＢＭ６７０８５［スパルス・アウラタ（Ｓｐａｒｕｓ  ａｕｒａｔａ）］；  ＡＡＰ９３９１２［オンコルヒンクス・ミキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）］；  ＡＡＯ６２９９３［ギングリモストマ・シラツム（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ）］；  ＮＰ ００１０４００５５［ボス・タウルス；配列番号３７］；  ＸＰ ５１８２４８［パン・トログロディテス；配列番号３５］；  ＸＰ ００１０９３３６４［マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）］；  ＸＰ ４１８９２９［ガルス・ガルス；配列番号４０］；  ＮＰ ００１１０１８８０およびＸＰ ３４１５１０．２［ラトゥス・ノルベギクス；配列番号３９］；  ＡＡＺ０６１３３［メソクリセツス・アウラツス（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）］；  ＡＣＣ６０９９５［マルモタ・モナクス（Ｍａｒｍｏｔａ  ｍｏｎａｘ）］およびＸＰ ８５２６４７［カニス・ファミリアリス；配列番号３６］。
【００４３】
他の動物、例えば哺乳動物由来の、または同じ生物の他の組織由来の、核酸の多様な供給源（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）に、例えば細胞外部分をコードするヒトＣＤ８３コード領域のすべてまたは一部を含む核酸をハイブリダイズさせることによって、タンパク質のＣＤ８３ファミリーの他のメンバーを得てもよい。既知のおよび／または単離されたｓＣＤ８３ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発によって、ｓＣＤ８３ポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドを作製してもよいし、あるいはこうしたポリヌクレオチド配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成してもよい。
【００４４】
天然存在ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸が配列決定されたならば、既知のＣＤ８３分子の細胞外ドメインを、クローニングされたＣＤ８３配列のものと比較することによって、細胞外ドメインを決定してもよい。次いで、本明細書記載の技術を用いて、所定の天然存在ＣＤ８３タンパク質の可溶性型を組換え的に発現してもよい。例えば、本発明の可溶性ＣＤ８３をコードする核酸を産生し、ベクター内に挿入し、そして本明細書に記載され、そして当該技術分野にさらに知られる周知の技術を用いて、原核または真核宿主細胞内に形質転換してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）。
【００４５】
本発明にしたがって使用するためのタンパク質のＣＤ８３ファミリー・メンバーの可溶性型をコードする関心対象の核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現するため、発現ベクター内に挿入してもよい（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイまたは商業的に入手可能なキットを用いる）し、あるいは発現ベクターの適切な細胞内への導入によって、原核生物または真核生物のいずれかにおける転写および／または翻訳を容易にするプロモーター配列を含有する発現ベクター内に挿入してもよい。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、あるいはポリヌクレオチドの挿入または取り込みによって操作可能な当該技術分野に知られる他のビヒクルを指す。こうしたベクターは、遺伝子操作のために用いてもよい（すなわち「クローニングベクター」）し、あるいは挿入されたポリヌクレオチドを転写するかまたは翻訳するために用いてもよい（「発現ベクター」）。ベクターは、一般的に、少なくとも細胞における増殖のための複製起点およびプロモーターを含有する。適切な転写および翻訳を促進するために、発現ベクター内に存在する、本明細書に示すような発現調節要素を含む調節要素（例えばイントロン、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする、遺伝子の正しいリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル、ならびに停止コドンなど）が含まれる。用語「調節要素」は、最低でも、その存在が発現に影響を及ぼす可能性もある１以上の構成要素が含まれるよう意図され、そしてまたさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含んでもよい。
【００４６】
ベクターが増殖し、そしてその核酸が転写されるかまたはコードされるポリペプチドが発現されうる細胞は、本明細書において、「宿主細胞」と呼ばれる。該用語にはまた、対象宿主細胞の任意の子孫も含まれる。さらに、本発明にしたがった関心対象の核酸を、体細胞遺伝子治療のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるために、発現ベクター内に挿入してもよい。これらのベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド発現ベクターを用いると、本発明の核酸は、ＤＣへのベクターの感染／導入に際して発現される。
【００４７】
宿主細胞には、限定されるわけではないが、微生物、例えば細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物生物が含まれる。好ましい態様において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。例えば、関心対象の核酸を含有する組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；関心対象の核酸を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；関心対象の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；関心対象の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；あるいは、関心対象の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系、あるいは安定発現のために操作された形質転換動物細胞系。
【００４８】
宿主細胞におけるタンパク質のＣＤ８３ファミリー・メンバーの可溶性型の長期発現のためには、安定発現が好ましい。したがって、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを用いて、例えば、細胞を、適切な調節要素（例えば、プロモーター／エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって調節される、関心対象の核酸で形質転換してもよい。場合によって、発現ベクターはまた、選択圧に対する抵抗性を与える選択可能または同定可能マーカーをコードする核酸を含有してもよく、それによってベクターを有する細胞が同定され、増殖され、そして拡大されることを可能にしてもよい。あるいは、選択可能マーカーは、本発明のポリヌクレオチドを含有する第一のベクターとともに、宿主細胞内に同時トランスフェクションされる第二のベクター上にあってもよい。
【００４９】
限定されるわけではないが、それぞれ、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞において、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、多くの選択系を用いてもよい。さらに、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子；アミノ配当体Ｇ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン遺伝子；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシン遺伝子に関する選択の基礎として、代謝拮抗剤耐性を用いてもよい。さらなる選択可能遺伝子が記載されてきており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ；およびオルニチン・デカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチン・デカルボキシラーゼ）がある。
【００５０】
本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドをコードする核酸で、原核および真核細胞を形質転換するための方法が、当業者に知られる。形質転換後、慣用法にしたがって、ＣＤ８３の可溶性型を単離し、そして精製してもよい。多様なタンパク質およびその誘導体、ならびにこれらをコードする核酸を産生し、精製し、そして操作するための方法もまた、当該技術分野に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい；また、米国特許第７，１６９，８９８号；米国特許出願第１０／３８２，３９７号；および米国特許出願第１０／５３５，５２２号もまた参照されたい。例えば、発現宿主（例えば細菌）から調製した溶解物を、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製してもよい。実質的に純粋なタンパク質はまた、ペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティー；モデル４３０Ａ等）を用いた化学合成によっても得られうる。
【００５１】
ｓＣＤ８３配合物
ＣＤ８３ｅｘｔ組成物を、適切な薬学的に許容されうるアジュバントおよび／またはキャリアーと一緒にプロセシングして、多様な徴候および投与経路タイプに適した薬剤型を提供してもよい。適切な薬学的組成物には、キャリアー、任意の適切な生理学的溶液または分散剤等、溶解剤、アジュバント、安定化剤、保存剤、持続放出配合物等が含まれてもよい。生理学的溶液は、任意の許容されうる溶液または分散媒体、例えば生理食塩水または緩衝生理食塩水を含む。キャリアーはまた、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸着遅延剤等も含んでもよい。任意の慣用的な媒体、キャリアーまたは剤は、活性成分と不適合である場合を除いて、その使用が意図される。キャリアーは、限定されるわけではないが、例えばインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦ−βなどのサイトカインを含む、１以上のさらなる化合物をさらに含んでもよい。こうした配合物およびその調製法の例が当該技術分野に知られる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版（１９８５）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  米国ペンシルバニア州イーストンを参照されたい）。
【００５２】
ＰＣＴ公報ＷＯ２００４／０４６１８２は、ｐＨ７．６のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に配合された精製ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型およびｈＣＤ８３ｍ−５ポリペプチド（それぞれ、配列番号５および６を有する）を記載する。しかし、本明細書に開示するように、ＣＤ８３ｅｘｔおよびその変異体は、より低いｐＨで配合された際に、より高い安定性を有する。例えば、配列番号５のポリペプチドなどの精製ｈＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドは、実施例１に記載する方法にしたがって最初に精製された際、主に単量体型である。ｐＨ７．３〜７．６のＰＢＳ中で保存した際、タンパク質は次第に二量体化し、そして生物活性を失う。対照的に、より低いｐＨで保存されたｈＣＤ８３ｅｘｔは、活性の同じ喪失にはさらされなかった。驚くべきことに、ＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５（配列番号６）は、野生型同等物（配列番号５）よりも、高いｐＨに対してより感受性でなかった。
【００５３】
したがって：ＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドおよび４．０〜５．０のｐＨを有する生理学的に許容されうる緩衝剤を含む、薬学的組成物を提供する。好ましくはｐＨは４．３〜４．７である。最も好ましくは、ｐＨは約４．５である。好ましい態様において、ＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドは、配列番号４、５、６または７のポリペプチドである。好ましくは、緩衝剤は酢酸緩衝剤であり、最も好ましくは２０ｍＭ酢酸緩衝剤、ｐＨ〜４．５である。
【００５４】
本出願人らはまた、ｈＣＤ８３ｅｘｔの安定性および生物活性が、トレハロースを含む組成物中での配合によって改善されることも発見している。したがって、１〜１５％（ｗ／ｖ）トレハロース中で配合されたｓＣＤ８３ポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましくは、トレハロースは約５〜１２％  ｗ／ｖ、最も好ましくは、約１０％  ｗ／ｖで存在する。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明のｓＣＤ８３組成物は、限定されるわけではないが、緩衝剤、塩、界面活性剤、多価アルコール、多価金属糖、粘性修飾剤、酸化防止剤および凍結保護剤ならびにその組み合わせなどの１以上の賦形剤をさらに含んでもよい。こうした賦形剤には、限定されるわけではないが、グリシン、ヒスチジン、Ｆｅ（３＋）、Ｍｇ（２＋）、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、ＥＤＴＡ、およびアルギニンにグルタミン酸を加えた組み合わせが含まれる。
【００５６】
好ましい態様において、ＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドを、２０ｍＭ酢酸緩衝剤ｐＨ４．５、１０％  ｗ／ｖトレハロース、０．５％  ｗ／ｖアスコルビン酸、および場合によって５０ｍＭアルギニンに加えて５０ｍＭグルタミン酸中で、１．５〜２．５（好ましくは２．０）ｍｇ／ｍＬで配合し、そして凍結（好ましくは約−２０℃で）保存する。こうした配合物は、多数回の凍結融解周期後に安定であり、そして被験体への投与に適している。好ましい賦形剤すべては、不活性成分のＦＤＡリスト中にあるか、または認可された静脈内薬剤製品中に存在する。
【００５７】
限定されるわけではないが、ＣＤ８３ｅｘｔおよびその誘導体の送達のために選択可能な、経皮、皮内（ｉ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、節間（ｉ．ｎ．）等を含む、任意の投与経路を用いてもよい。好ましくは、ＣＤ８３ｅｘｔは、ｉ．ｖ．投与される。当業者は、異なる化合物および／または徴候には、異なる投与型が適切であろうことを認識するであろうし、そして最も適切な投与法を選択可能であろう。例えば、乾癬は、皮膚への投与に適した配合物で局所的に治療されうるし、一方、全身性エリテマトーデスは、腹腔内注射に適した配合物の被験体への投与によって治療されうる。当該技術分野の技術を有する医師は、化合物の投薬および投与の調整のための基準および方法、例えば生化学的および免疫学的アッセイを含む慣用的な臨床および実験室試験からの結果の評価などに精通している。適切な場合、薬剤構成要素を別個に投与してもよい。
【００５８】
療法的または予防的使用のため、本発明の化合物は、単独で、または他の免疫調節化合物（例えば寛容誘導抗原、シクロスポリンＡ、ＭＭＦを加えたＦＫ５０６、ＣＤ４５ＲＢを加えたラパマイシン、コルチコステロイド等）と組み合わせて、被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト患者に、医学的徴候に適した方式で、治療または防止のために投与される。
【００５９】
いくつかの態様においてｓＣＤ８３タンパク質をコードする核酸を被験体に提供することによって、ｓＣＤ８３を被験体に投与する。例えば、配列番号７のｓＣＤ８３ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡとして、ｓＣＤ８３を被験体に投与してもよい。同様に、いくつかの態様において、ｓＣＤ８３タンパク質をコードする核酸で、宿主細胞（すなわち細胞）を形質転換することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞にｓＣＤ８３を提供する；次いで、形質転換された宿主細胞は、ｓＣＤ８３タンパク質を発現して、それによって、他の細胞に、ならびにそれ自体（すなわち形質転換宿主細胞）に、ｓＣＤ８３タンパク質を提供することも可能である。こうした態様において、適切な宿主細胞には、樹状細胞が含まれる。ｓＣＤ８３がＣＤ８３タンパク質をコードする核酸として提供される場合、用語「ｓＣＤ８３」はまた、ｓＣＤ８３タンパク質をコードする核酸も指してもよい。ＣＤ８３タンパク質をコードする限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成核酸を含む、任意の適切な核酸が使用可能である。コードされるタンパク質またはタンパク質断片の発現に適したベクター中で、核酸を提供してもよい。これらを産生するのに適したベクターおよび方法が当該技術分野に知られる。
【００６０】
ｓＣＤ８３の療法的使用
本明細書に開示するｓＣＤ８３組成物は、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状の防止、治癒、減少、および／または軽減に有用である。例えば、配列番号５のｈＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドが、多くの動物モデルにおいて、評価されてきている。実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）マウスモデル（ヒト多発性硬化症のモデル）を用いると、前治療および積極的治療セッティングの両方で、ｓＣＤ８３によって麻痺が阻害可能であった。また最近のデータによって、ｓＣＤ８３がマウスにおいて、心臓および皮膚移植片生存を延長させることが可能であり、そして療法用量未満のよく性質決定された免疫抑制剤と組み合わせて用いた際、ｓＣＤ８３は、ネズミ心臓移植モデルにおいて、長期移植片生存を達成可能であることもまた立証されている。また、実験データによって、ｓＣＤ８３が１型マウスモデルにおいて、糖尿病発症を阻害しうることも示されている。さらに、ｓＣＤ８３での治療が、包括的な免疫抑制を生じないことを示唆する結果も得られている。本明細書の実施例によって、配列番号７（アミノ酸残基１，２、３、４および１３０が存在し、アミノ酸残基８５がＳｅｒであり、そしてアミノ酸残基１２、２０、９２および１１４がＣｙｓである）のＣＤ８３ｅｘｔポリペプチドが、心臓および腎臓移植の哺乳動物モデルにおける移植片拒絶を防止するのに有効であることが立証されている。
【００６１】
したがって、いくつかの態様は、被験体における免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を治療するかまたは防止するための方法であって、本発明のｓＣＤ８３ポリペプチドを前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。免疫応答の機能不全または望ましくない機能には、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病およびアレルギーが含まれる。本発明の新規ｓＣＤ８３ポリペプチドを用いて治療可能である自己免疫疾患には、限定されるわけではないが、全身性エリテマトーデス、自己免疫（Ｉ型）糖尿病、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己心筋炎（ａｕｔｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、自己免疫網膜ブドウ膜炎、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎などの慢性炎症性腸疾患、ビヒテレフ病（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ）などのＨＬＡ  Ｂ２７関連自己免疫病、閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強直性脊椎炎およびＡＩＤＳが含まれる。
【００６２】
したがって、本発明の可溶性ＣＤ８３ポリペプチドおよび／またはこうしたｓＣＤ８３ポリペプチドをコードする核酸を、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または医学的状態の治療または防止のための薬剤の製造に用いてもよい。例えば、望ましくない免疫応答が抑制されるように、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、組織または臓器移植の拒絶、あるいは療法組成物に対する望ましくない免疫応答の防止または治療のために、こうした薬剤を用いてもよい。
【００６３】
いくつかの態様において、望ましくない免疫応答は、療法組成物に対して向けられ、そして本発明の目的は、こうした療法組成物に対して、被験体を寛容化することである。被験体は、これらの目的の少なくとも１つが達成された場合、寛容化されそして／または免疫抑制されていると見なされる（すなわち免疫寛容が誘導されたかまたは獲得されたと見なされる）。
【００６４】
本明細書において、「免疫抑制」を誘導すること、または被験体を「寛容化する」ことは、樹状細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞を伴う免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、（例えば、治療が免疫応答の発展を防止するか、またはその重症度を減少させることを意図する場合には、治療前の症状、あるいは治療を伴わない症状の予期される重症度に比較した際）防止されるか、治癒するか、減少するか、または軽減されることを意味する。当業者は、症状の測定法および評価法の選択および適用、ならびに適切な対照の選択に精通している。
【００６５】
したがって、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、適切な対照に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少しているかまたは軽減されている場合、被験体が寛容化されていると見なされ、そして／または免疫抑制が生じていると見なされる。被験体が自己免疫障害を発展させるリスクを減少させることを、治療が意図する態様において、このリスクは、適切な対照に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少するかまたは軽減される；この評価を、被験体集団に対して統計的に行ってもよい。治療が、療法組成物に対して被験体を寛容化することを意図する態様において、免疫応答の望ましくない機能は、適切な対照に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少する。他の態様において、本発明の目的には、免疫寛容誘発性樹状細胞の産生が含まれる；これらの態様において、「症状」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかでの細胞の振る舞いのパラメータを指す。
【００６６】
本発明の方法は、療法目的に有用であり、そしてしたがって、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を防止し、治癒させ、または軽減することを意図する。適切な対照と比較して、例えば治療前の症状と比較して、または治療が防止的であることを意図される場合、症状の予期される重症度と比較して、適切なように、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、またはそれより多く症状が減少するか、増加するか、または改善される場合、疾患または障害の症状は、減少するかまたは軽減されると見なされる。当業者は、症状の変化を評価するための技術および基準に精通している。免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の症状は、当業者に知られ、そして以下：移植された組織の異常な組織学；移植された組織の異常な機能；例えば診断または移植などの事象後の生存時間が短いこと；血液中の指標タンパク質（単数または複数）または他の化合物（単数または複数）、例えば望ましくない抗体または望ましくない細胞（例えば抗原特異的樹状細胞またはＴ細胞）のレベルまたは数が異常にまたは望ましくなく高いかまたは低いこと；血液中または体の別の箇所の指標細胞のレベルまたは数が異常にまたは望ましくなく高いかまたは低いこと、例えば望ましくない免疫応答が開始されるかまたは維持されるように、制御Ｔ細胞のレベルまたは数が望ましくなく低いことを含む。
【００６７】
適切な場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、例えば被験体から単離された細胞を用いた混合リンパ球反応において、ｉｎ  ｖｉｖｏ寛容化または寛容および／または免疫抑制を測定してもよい。同様に、また、例えば樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞などの多様な細胞タイプを用いたｅｘ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞において達成される寛容化または寛容および／または免疫抑制を測定してもよい。ｅｘ  ｖｉｖｏ法を用いて寛容化または寛容および／または免疫抑制を測定する場合、免疫刺激に対する細胞の応答が、適切な対照に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、またはそれより多く減少している場合、寛容化または寛容が起こったと見なされる。適切なアッセイは、直接または間接的に、免疫応答を測定し、そして当該技術分野に知られる；これらには、限定されるわけではないが：混合リンパ球反応アッセイ；細胞傷害性アッセイ；抗体力価アッセイ；ＩＬ−１０産生に関するアッセイ；ＴＧＦ−β産生に関するアッセイ；細胞表面マーカーの評価；およびＦｏｘｐ３発現に関するアッセイが含まれる。
【００６８】
本発明のｓＣＤ８３タンパク質を、他の免疫抑制化合物と同時投与してもよい。用語「免疫抑制化合物」は、リンパ球のＴおよび／またはＢクローン集団のサイズを枯渇させることが可能な化合物、あるいはその反応性、増殖、または分化を抑制することが可能な化合物を指す。本発明の方法で使用するための免疫抑制化合物には、限定されるわけではないが：シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販される）およびタクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販される）を含むカルシニューリン阻害剤；ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販される）およびアザチオプリン（Ａｚａｓａｎ（登録商標）またはＩｍｕｒａｎ（登録商標）として市販される）などのプリン代謝阻害剤；エベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）として市販される）およびシロリムス（「ラパマイシン」または「ラパ」としても知られ、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販される）などの増殖阻害剤；モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、例えば抗ＣＤ４５および抗ＣＤ４５ＲＢ（例えば米国特許第７，１６０，９８７号を参照されたい）；Ｔ細胞に対して向けられるモノクローナル抗体、例えばＯＫＴ３；ヒト化抗ＴａＴ抗体を含む、ＩＬ−２受容体に対して向けられるモノクローナル抗体、例えばバシリキサマブおよびダクリズマブ；Ｔ細胞共刺激経路を遮断する物質、例えばＣＴＬＡ−４−Ｉｇ１融合タンパク質；キメラ化（すなわち、移植片組織が自己として認識される、ドナーおよびレシピエント免疫細胞の共存）を誘導可能な物質；ならびにシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）として市販される）などの非骨髄破壊的（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｖｅ）移植前治療が含まれる。免疫抑制剤およびそのターゲットの考察に関しては、例えば、Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ（２０００）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｊｕｎｅ  ２１，  ２０００：１−２３を参照されたい。
【００６９】
物質の「有効量」によって、本発明の方法にしたがって被験体に投与された際、その量が、本発明の少なくとも１つの目的を達成するのに少なくとも十分であることが意図される。したがって、例えば、療法的ｓＣＤ８３組成物の「有効量」は、ＣＤ８３とともに被験体に同時投与された場合に、療法組成物に対して被験体を寛容化するか、あるいは免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状に対して、測定可能な効果を生じるのに、少なくとも十分である。個々の被験体が示す症状に関して、免疫抑制ｓＣＤ８３化合物の有効量を決定してもよいし、あるいは臨床研究から有効量を決定してもよいし、またはモデル系における適切な研究から推定してもよい。したがって例えば、免疫抑制ｓＣＤ８３化合物の有効量には、本発明の方法を利用する臨床研究において決定される投薬範囲に基づいて、疾患または障害の少なくとも１つの症状に対する測定可能な効果を生じると期待されるであろう量が含まれる。
【００７０】
１以上の投与、適用または投薬で、有効量を投与してもよい。適切な投与、適用、および投薬は、限定されるわけではないが：組成物の比活性；組成物の配合；治療しようとする被験体の体重、年齢、健康状態、疾患および状態；ならびに被験体内への組成物の投与経路を含む多くの要因に応じて多様であろう。いくつかの例において、有効量であるために必要なｓＣＤ８３の最低量は、患者において、あらかじめ存在する可溶性ＣＤ８３があるために、減少する可能性もあり（例えば、Ｈｏｃｋら（２００６）（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６７：５７−６０）を参照されたい）；当業者は、最適な結果を達成するため、投薬および投与等を容易に調整可能であろう。例えば：０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００、または７００ｍｇ／ｋｇ、あるいは１、２、５、７、１０、２０、５０または１００ｇ／ｋｇの最低端；および０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００、または７００ｍｇ／ｋｇ、あるいは１、２、５、７、１０、２０、５０、１００、または２００ｇ／ｋｇの最高端を有する範囲内で、ｓＣＤ８３を患者に投与してもよい。
【００７１】
被験体は、ＣＤ８３によって外因性化合物に寛容化可能であるため、療法目的のためには、被験体が、少なくとも治療中、または少なくともＣＤ８３の有効性ウィンドウ中、寛容化が望ましくない化合物に曝露されないことが重要である。したがって、例えば、被験体は、腫瘍特異的抗原、およびウイルス、細菌、カビ等を含む疾患を引き起こす微生物に曝露されてはならない。一般的に、本明細書において、「被験体」によって、治療が必要な任意の動物を意図する。したがって、例えば、「被験体」は、ヒト患者または非ヒト哺乳動物患者であってもよいし、あるいは動物である別の患者であってもよい。疾患または医学的状態の防止が望ましい場合、被験体を規則的間隔（例えばおよそ：２年ごと、毎年、６ヶ月ごと、２〜４ヶ月ごと、または毎月）、治療してもよい。しかし、本発明のすべての態様において、本発明の方法および組成物を、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または障害を有すると同定されている被験体に、あるいは特定の疾患または障害を発展させる可能性が高いと同定されている被験体に、投与する。例えば、被験体は、被験体の家族歴の検査、遺伝子検査または被験体の酵素もしくは代謝産物レベルを決定する検査などの医学的検査の結果、あるいは別の疾患または障害と診断された結果、こうした特定の疾患または障害を発展させる可能性が高いと同定されていてもよい。この方式で、例えば、本発明の方法を用いて、自己免疫疾患を治療するか、自己免疫疾患の発展を防止するか、または被験体が自己免疫疾患を発展させるリスクを減少させてもよい。一般的に、被験体がもはや、免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または医学的状態を軽減させるかまたは防止するために治療されなくなると、治療経過が終了する。したがって、本発明は、免疫応答の機能不全、望ましくない免疫応答または免疫応答の望ましくない機能によって引き起こされる疾患または医学的状態の治療法または防止法であって、免疫抑制が達成されるように、ｓＣＤ８３の有効量が被験体に投与される、前記方法を提供する。１つの態様において、望ましくない免疫応答は、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーからなる群より選択される。こうした方法は、さらに、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）；抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体を加えたラパマイシン；およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を加えたタクロリムス（ＦＫ５０６）の１以上を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００７２】
好ましい態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己心筋炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、自己免疫網膜ブドウ膜炎、血管炎、慢性炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎、ビヒテレフ病、強直性脊椎炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群より選択される。
【００７３】
いくつかの態様において、哺乳動物被験体において、望ましくない免疫応答を治療するかまたは防止するための薬剤の製造のため、本発明の新規ｓＣＤ８３ポリペプチドの使用を提供する。
【００７４】
別の側面において、哺乳動物移植レシピエントにおける移植転帰を改善する方法であって、前記レシピエントに療法的有効量の請求項１〜１０のいずれかのポリペプチドおよび１以上の免疫抑制剤を投与する工程を含み、ここで免疫抑制剤が、前記ポリペプチドと相乗的に働いて、移植転帰を改善する、前記方法を提供する。１つの態様において、前記免疫抑制剤はシクロスポリンＡである。他の態様において、前記免疫抑制剤は、抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体を加えたラパマイシン；またはミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を加えたタクロリムス（ＦＫ５０６）である。
【００７５】
免疫応答の機能不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害、例えば：アレルギー；喘息；組織移植片拒絶；長期間投与される物質に対する免疫応答；重症筋無力症、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎などの慢性炎症性腸疾患、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、乾癬などの皮膚疾患、関節リウマチ、およびインスリン依存性糖尿病などの自己免疫疾患；ならびにＡＩＤＳによって影響を受けるかまたは影響を受けるようになる可能性がある被験体を治療するため、本発明の方法を使用してもよい。本発明の方法を用いて、Ｂ細胞またはＢ細胞機能に関与する疾患または障害、例えば：白血病などのＢ細胞過形成（多発性骨髄腫および急性リンパ芽球性白血病を含む）；ＡＩＤＳに関連するＢ細胞機能亢進；毒性ショック症候群；血清病；および歯周病など（例えば、Ｍａｈａｎｏｎｄａら（２００２）  Ｊ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．  ３７：１７７−１８３）に罹患した被験体を治療してもよい。血清病は、特定の薬剤または抗血清に対する望ましくない免疫応答によって引き起こされる症状群である。すなわち、血清病は、受動免疫を誘導する目的で、別の動物またはヒト由来の抗血清が被験体に投与された際に生じうる。いくつかの態様において、本発明の方法は、Ｂ細胞またはＢ細胞機能に関与する疾患または障害のための治療を提供し、ここで治療はＢ細胞枯渇、すなわち被験体におけるＢ細胞の数および／またはサブタイプの減少を生じない。
【００７６】
したがって、いくつかの態様において、本発明の方法を用いて、組織レシピエントにおいて、組織移植の拒絶の少なくとも１つの症状を防止するか、治癒させるかまたは軽減させる。こうした態様において、移植レシピエント（「レシピエント」または被験体）をｓＣＤ８３、および場合によって、移植組織と関連する抗原、例えば移植組織の試料の溶解またはホモジナイズによって、移植組織から調製したかまたは抽出した抗原で治療してもよい。一般的に、本発明の方法にしたがった移植レシピエントの治療には、組織の移植前、移植と併用（すなわち同時）の、および／または移植後の治療が含まれてもよい。いくつかの態様において、本発明の方法は、拒絶を防止するための移植被験体の連続した治療が不要となるように、組織移植の拒絶のすべての不都合な症状を防止するか、治癒させるか、または軽減させ；こうした態様において、被験体において移植片寛容が誘導されていると言われる。
【００７７】
いくつかの態様において、意図されるレシピエントにおける移植のために組織を除去する前に、移植しようとする組織のドナー（「移植ドナー」）をｓＣＤ８３で治療してもよく、ここで治療の目的は、移植レシピエントにおいて、寛容および／または免疫抑制を誘導することである。いくつかの態様において、本発明の方法にしたがって、移植ドナーおよび移植レシピエントの両方を治療してもよい。
【００７８】
本明細書において、「組織」は、個々の臓器および／または特殊化組織（例えば肝臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、膵島等）ならびに「液体」組織（“ｌｉｑｕｉｄ”  ｔｉｓｓｕｅ）（例えば血液、血漿などの血液構成要素、樹状細胞などの細胞等）を含み；用語「組織」はまた、個々の臓器および「液体」組織の一部および下位部分も含む。
【００７９】
当業者は、レシピエントおよびドナーの両方にとってありうる最適な転帰を達成するための、移植レシピエントおよびドナーの評価法および治療法に精通している。したがって、当業者は、ＣＤ８３、少なくとも１つの他の免疫抑制化合物、および場合によって特定の被験体に適切であるような療法組成物の投薬および投与を評価し、そして調整することが容易に可能であろう。上記考察から容易に認識されるように、本発明の方法は、いくつかの工程を含み；本発明の少なくとも１つの目的が達成される限り、これらの工程を、いかなる順序で行ってもよい。方法は、多数の化合物の多数の投与を伴ってもよいため、工程のある程度の重複もまた生じてもよい。
【００８０】
本発明によって提供される治療法には、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験体における寛容および／または免疫抑制を誘導するための、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制化合物の使用が含まれる。被験体に対してこれらの物質を投与する手段には、限定されるわけではないが、慣用的および生理学的に許容されうる経路、例えば経口、肺、非経口（例えば筋内、動脈内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（細粉末配合物または細かい霧（エアロゾル）を通じて）、経皮、皮内、鼻、膣、直腸、または舌下投与経路が含まれる。
【００８１】
薬学的組成物が、動物の特定の種への投与のための核酸を含む場合、本発明で使用するための核酸は、その種に由来してもよい。例えば、ｓＣＤ８３をコードする核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む薬学的組成物をヒトに投与する際、核酸は、配列番号７のｓＣＤ８３または配列番号７に少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしてもよい。本発明で使用するための核酸を、膜浸透性および／または核酸の細胞取り込みを増加させる剤と同時投与してもよい。これらの剤の例は、例えばＡｎｔｏｎｙら（１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１０７７５−１０７８４に記載されるようなポリアミン；例えばＥｓｃｒｉｏｕら（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １３６８：２７６−２８８に記載されるような分枝ポリアミン；例えばＧｕｙ−Ｃａｆｆｅｙら（１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：３１３９１−３１３９６に記載されるようなポリアミノ脂質；  Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７に記載されるようなＤＯＴＭＡ、および例えばＢｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら（１９９８）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６（２３）：５３１０−５３１７に記載されるような陽イオン性ポルフィリンである。
【００８２】
定義
明細書および請求項において用いた際、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明確に別に指示しない限り、複数の言及が含まれる。例えば、用語「（１つの）細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」には、その混合物を含めて、複数の細胞が含まれる。
【００８３】
本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が、列挙する要素を含むが他のものを排除しないことを意味するよう意図される。「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するように用いた際、組み合わせに対していかなる本質的な重要性を持つ他の要素も排除することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義するような要素から本質的になる組成物は、単離法および精製法由来の微量混入物質、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、保存剤等を排除しないであろう。所定のアミノ酸配列「から本質的になる」ポリペプチドまたはタンパク質は、本明細書において、所定のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに０〜１０のさらなるアミノ酸を含有するように定義される。好ましくは、これらは、タンパク質またはポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端に、５より多い、好ましくは２より多い、そして最も好ましくは、１より多いさらなるアミノ酸を含有しない。所定の核酸配列「から本質的になる」核酸またはポリヌクレオチドは、本明細書において、３０より多い、好ましくは６より多い、より好ましくは３より多い、そして最も好ましくは、１より多いさらなるヌクレオチドを、核酸配列の５’または３’末端に含有しないと定義される。「からなる」は、他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程の微量要素を超えるものを排除することを意味するものとする。これらの移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｓ）の各々によって定義される態様。
【００８４】
用語「樹状細胞（ＤＣ）」は、多様なリンパ系および非リンパ系組織で見られる形態学的に類似の細胞タイプの多様な集団を指す、Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：２７１−２９６。樹状細胞は、生物において、最も強力で、そして好ましいＡＰＣを構成する。樹状細胞を単球から分化させることも可能であるが、これらは別個の表現型を所持する。例えば、特定の分化マーカー、ＣＤ１４抗原は、樹状細胞では見られないが、単球によって所持される。また、成熟樹状細胞は貪食性ではないが、単球は非常に貪食性の細胞である。成熟ＤＣは、Ｔ細胞活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供しうることが示されてきている。
【００８５】
「免疫応答」は、広く、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）物質に対するリンパ球の抗原特異的応答を指す。免疫応答を誘発しうる任意の物質は、「免疫原性」と言われ、そして「免疫原」と称される。すべての免疫原は抗原である；が、すべての抗原が免疫原性なのではない。本発明の免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）であってもまたは細胞仲介性（Ｔ細胞活性化を介する）であってもよい。
【００８６】
本明細書において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸の、アミノ酸の同じ群内の別のアミノ酸に対する置換を指す。アミノ酸は、Ｒ基にしたがって、以下のように分類可能である：１）非極性脂肪族Ｒ基；２）極性非荷電Ｒ基；３）芳香族Ｒ基；４）正荷電Ｒ基；および５）負荷電Ｒ基。非極性脂肪族Ｒ基を持つアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン（ｌｕｃｉｎｅ）、イソロイシン、およびプロリンが含まれる。極性非荷電Ｒ基を持つアミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。芳香族Ｒ基を持つアミノ酸には、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。正荷電Ｒ基を持つアミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電Ｒ基を持つアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００８７】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはその類似体を含有してもよい。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、そして既知のまたは未知の任意の機能を行ってもよい。用語「ポリヌクレオチド」には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。天然核酸分子に加えて、本発明の核酸分子はまた、修飾核酸分子も含んでもよい。本明細書において、ｍＲＮＡは、細胞において翻訳可能なＲＮＡを指す。
【００８８】
用語「ペプチド」は、最も広い意味で、２以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すよう用いられる。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の態様において、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテル等によって連結されてもよい。本明細書において、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。３以上のアミノ酸のペプチドは、一般的に、ペプチド鎖が短いならばオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００８９】
「遺伝子送達ビヒクル」は、宿主細胞内に挿入ポリヌクレオチドを運搬可能な任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、生体適合性ポリマーであり、天然ポリマーおよび合成ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工的ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌、またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに多様な真核および原核宿主において発現が記載されており、そして遺伝子治療および単純タンパク質発現に使用可能な他の組換えビヒクルが含まれる。
【００９０】
本明細書において、「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「トランスフェクション」等は、導入に用いる方法に関わらず、宿主細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す用語である。トランスフェクションは、細胞内部への任意の核酸の送達を指す。遺伝子送達は、宿主細胞ゲノム内に組み込まれうるか、または宿主細胞ゲノムと独立に複製可能である核酸の送達を指す。遺伝子送達または遺伝子導入は、細胞内へのｍＲＮＡの導入を指さない。トランスフェクション法には、エレクトロポレーション、タンパク質に基づく、脂質に基づく、および陽イオンに基づく核酸送達複合体、ウイルスベクター、「遺伝子銃」送達などの多様な技術、ならびに当業者に知られる多様な他の技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定に維持されてもよいし、または一過性に発現されてもよい。いくつかの態様において、ｓＣＤ８３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に導入し、そして一過性に発現させる。安定な維持は、典型的には、宿主細胞と適合する複製起点を含有するか、あるいは染色体外レプリコン（例えばプラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞レプリコン内に組み込まれることを必要とする。当該技術分野に知られ、そして本明細書に記載するように、多くのベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子導入を仲介することが可能である。
【００９１】
「ウイルスベクター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで宿主細胞内に送達しようとするポリヌクレオチドを含む、組換え的に産生されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。セムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターなどのアルファウイルスベクターもまた、遺伝子治療および免疫療法で使用するために開発されてきている。ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：４３４−４３９、ならびにＺａｋｓら（１９９９）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：８２３−８２７を参照されたい。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって仲介される側面において、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部、および療法遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書において、「レトロウイルス仲介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味を持ち、そしてウイルスが細胞に進入し、そしてそのゲノムを宿主細胞ゲノム内に組み込むことによって、遺伝子または核酸配列が安定して宿主細胞内に導入されるプロセスを指す。ウイルスは、感染の正常機構を介して宿主細胞に進入してもよく、あるいは、異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して細胞に進入するように修飾されてもよい。本明細書において、「レトロウイルスベクター」は、ウイルスまたはウイルス様進入機構を通じて、細胞内に外因性核酸を導入可能なウイルス粒子を指す。
【００９２】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形で遺伝子情報を所持する；が、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡ型に逆転写されて、感染細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ型はプロウイルスと呼ばれる。遺伝子導入がＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）、偽アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＭＶ）によって仲介される側面において、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的よく性質決定された均質なウイルス群であり、５０を超える血清型が含まれる（例えばＷＯ９５／２７０７１を参照されたい）。Ａｄは、増殖が容易であり、そして宿主細胞ゲノム内への組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成に関する潜在能力が減少したものもまた、構築されている（ＷＯ９５／００６５５およびＷＯ９５／１１９８４を参照されたい）。野生型ＭＶは、高い感染性および特異性を有し、宿主細胞ゲノム内に組み込まれる（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０、ならびにＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：３９８８−３９９６を参照されたい）。
【００９３】
プロモーター、およびポリヌクレオチドが機能可能であるように連結されうるクローニング部位の両方を含有するベクターが、当該技術分野に知られる。こうしたベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡを転写可能であり、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン）などの供給源から商業的に入手可能である。発現および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を最適にするため、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去するか、付加するか、または改変して、転写または翻訳レベルいずれかで、発現に干渉しうるかまたは発現を減少させうる、過剰な潜在的に不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去することが必要である可能性もある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入して発現を増進させてもよい。
【００９４】
遺伝子送達ビヒクルにはまた、いくつかの非ウイルスベクターが含まれ、ＤＮＡ／リポソーム複合体、およびターゲティング化ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体が含まれる。ターゲティング抗体またはその断片もまた含むリポソームを、本発明の方法で用いてもよい。細胞への送達を増進するため、本発明の核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原、例えばＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ４に結合する抗体またはその結合断片にコンジュゲート化してもよい。
【００９５】
「ハイブリダイゼーション」は、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的方式で生じてもよい。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断における一工程を構成してもよい。
【００９６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：関心対象の核酸を含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中、６５℃で８時間〜一晩行われる。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃の好ましいハイブリダイゼーション温度で４８時間ハイブリダイズさせる。続いて、２×ＳＳＣ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中で、フィルター洗浄を３７℃で１時間行い、その後、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。洗浄工程後、ハイブリダイズしたプローブはオートラジオグラフィーによって検出可能である。こうした方法は当該技術分野に周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９に引用される。
【００９７】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が、別の配列に対して、特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有することは、アライメントした際に、２つの配列を比較すると、その割合の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を最適比較目的のためにアライメントする（例えば、最適アライメントのため、第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に、ギャップを導入してもよく、そして非相同配列を、比較目的のため、無視してもよい）。好ましい態様において、比較目的のためアライメントする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位が、第二の配列中の対応する位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位で同一である（本明細書において、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位の数の関数である。
【００９８】
配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成してもよい。好ましい態様において、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに取り込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定する。さらに別の好ましい態様において、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定する。特に好ましいパラメータセット（そして別に明記しない限り、使用すべきであるもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴うＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【００９９】
ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれているＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定してもよい。
【０１００】
本明細書記載の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」として用いて、公的データベースに対して検索を行って、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定しもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて、こうした検索を行ってもよい。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って、本発明のｍＭａｆＡ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得てもよい。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、本発明のｍＭａｆＡタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得てもよい。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２に記載されるようなギャップ化ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いてもよい。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【０１０１】
用語「単離」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が、通常、天然に会合している、細胞性およびその他の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離ポリヌクレオチドは、染色体において通常会合している５’および３’配列から分離されているものである。当業者には明らかであるように、非天然存在ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片（単数または複数）は、天然存在対応物から区別するために「単離」の必要はない。さらに、「濃縮」、「分離」または「希釈」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片（単数または複数）は、体積あたりの分子の濃度または数が、天然存在対応物のものよりも「濃縮されている」より多いか、または「分離されている」より少ない点で、天然存在対応物とは区別可能である。一次配列において、または例えばグリコシル化パターンによって、天然存在対応物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片（単数または複数）は、単離型で存在する必要はなく、これは、一次配列によって、あるいはグリコシル化パターンなどの別の特徴によって、天然存在対応物から区別可能であるためである。本明細書に開示する本発明の各々に関して明白に言及しないが、以下に開示する組成物各々に関する、および適切な条件下での上記態様すべてが本発明によって提供されることが理解されるものとする。したがって、非天然存在ポリヌクレオチドは、単離天然存在ポリヌクレオチドとは別個の態様として提供される。細菌細胞で産生したタンパク質は、天然に産生される真核細胞から単離した天然存在タンパク質とは別個の態様として提供される。樹状細胞などの哺乳動物細胞は、生物において見出される解剖学的部位から取り除かれている場合、単離されている。
【０１０２】
「宿主細胞」、「ターゲット細胞」または「レシピエント細胞」は、外因性核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質のベクターまたは取り込みのためのレシピエントでありうるか、またはレシピエントである、任意の個々の細胞または細胞培養を含むよう意図される。単一細胞の子孫が含まれることもまた意図され、そして子孫は、天然の、偶発的な、または故意の突然変異のため、元来の親細胞に、必ずしも完全に同一（形態学的にまたはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において）でなくてもよい。細胞は、原核または真核であってもよいし、そして限定されるわけではないが、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えば、ネズミ、ラット、サルまたはヒトが含まれる。
【０１０３】
「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定されるわけではないが、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、スポーツ動物、およびペットが含まれる。
【０１０４】
「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば検出可能剤または標識）または活性である別の化合物または組成物、例えばアジュバントとの組み合わせを意味するよう意図される。
「薬学的組成物」は、組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断または療法的使用に適したものにする、不活性または活性であるキャリアーと、活性剤との組み合わせが含まれるよう意図される。
【０１０５】
本明細書において、用語「薬学的に許容されうるキャリアー」は、任意の標準的薬学的キャリアー、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、およびエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、多様なタイプの湿潤剤ならびに本明細書に開示する他の配合物を含む。組成物にはまた、安定化剤および保存剤も含まれてもよい。キャリアー、安定化剤およびアジュバントの例に関しては、Ｍａｒｔｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．  ＳＣＩ．，  第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ（１９９０））を参照されたい。
【０１０６】
「有効量」は、免疫応答抑制、医学的状態（疾患、感染等）の治療、防止または改善などの、有益なまたは望ましい結果を達成するのに十分な量である。有効な量を１以上の投与、適用または投薬で投与してもよい。適切な投薬は、体重、年齢、健康状態、治療しようとする疾患または状態、および投与経路に応じて多様であろう。
【０１０７】
上記説明にしたがって、以下の実施例は、本発明の多様な側面を例示することを意図されるが、限定することを意図されない。常に明白に言及されてはいないが、本明細書に記載する試薬は、単に例示であり、そしてこうしたものの同等物が当該技術分野に知られることを理解しなければならない。
【実施例】
【０１０８】
一般的方法
一般的な技術に関しては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｉｃｏら監修（Ｗｉｌｅｙ、ニュージャージー州ホーボーケン）を参照されたい。ｓＣＤ８３精製法に関しては、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ２４：４４５−４５２を参照されたい。
【０１０９】
実施例１
大腸菌における組換えｈＣＤ８３ｅｘｔ産生のためのバイオプロセスおよび下流精製
プラスミドｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔ（米国特許公報２００７／０１６７６０７に開示され、そして図２に図示する）をｈＣＤ８３ｅｘｔの発現に用いた。このプラスミド中、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターの制御下にある。融合タンパク質の配列を配列番号８に示す。この配列中、アミノ酸残基１〜５は、ＧＳＴタグに相当し、アミノ酸残基６〜１３は、トロンビン切断部位に相当し、アミノ酸残基１４〜１３８は、ヒトＣＤ８３細胞外ドメインに相当し、そしてアミノ酸残基１３９（イソロイシン）は、ヒトＣＤ８３細胞外ドメインの最初の隣接アミノ酸に相当する。ＧＳＴタグは、ＧＳＴアフィニティクロマトグラフィーを用いた融合タンパク質の捕捉を可能にする。次いで、ｈＣＤ８３ｅｘｔ部分を放出させるため、ＧＳＴおよびｈＣＤ８３ｅｘｔ融合体の接合部のトロンビン切断部位（配列番号８のアミノ酸残基９および１０の間）で、トロンビンによって、捕捉されたタンパク質を切断してもよい（カラム上またはカラムからはずれてのいずれかで）。ＧＳＴおよびｈＣＤ８３ｅｘｔ間の接合部にトロンビン切断部位を設計するため、最終ｈＣＤ８３ｅｘｔ産物は、４つの余分なアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；配列番号４１）をアミノ末端に有する。
【０１１０】
ｈＣＤ８３ｅｘｔ発現に最適な宿主を選択するため、ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔを、いくつかの一般的な大腸菌株、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１およびＢＬ２１に形質転換した。大腸菌ＢＬ２１は、他の発現宿主より優れていた（データ未提示）。ＢＬ２１（Ｆ−  ｏｍｐＴ−  ｇａｌ−  ｄｃｍ−  ｌｏｎ−  ｈｓｄＳ（ｒｂ−  ｍｂ−）；  ＡＴＣＣ寄託番号ＢＡＡ−１０２５）は、２つのプロテアーゼ遺伝子（ｌｏｎおよびｏｍｐＴ）が不活性化されており、その結果、外来遺伝子産物のタンパク質分解が減少しているため、組換えタンパク質産生に特に適している。タンパク質分解の軽減は、大腸菌を発現宿主として用いる場合、真核起源を持つ組換えタンパク質、例えばｈＣＤ８３ｅｘｔには特に重要である。
【０１１１】
培地レシピ、誘導条件（すなわち誘導のタイミングおよびＩＰＴＧ濃度）、攪拌速度、および温度を含む、いくつかの培養パラメータを最適化させて、組換えｈＣＤ８３ｅｘｔ収量を増加させた。最適化された方法において、ＢＬ２１／ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔの単離コロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｐ）を加えた１００ｍＬのＬＢ培地に接種し、そして２００ｒｐｍの回転攪拌装置上、３７℃でおよそ１２時間インキュベーションして、シード培養を産生した。シード培養（８０ｍＬ）を用いて、１Ｌ作業体積の培地（５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌグルコース、および１０μＬ／Ｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２８９（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス））を含有するベンチトップバイオリアクター（Ｏｍｎｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ、ＶｉｒＴｉｓ、米国ニューヨーク州ガーディナー）に接種した。細胞密度がＯＤ６００  〜２に到達したら、０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を誘導のために添加した。次いで、通気のため、フィルター滅菌した空気を２Ｌ／分でバイオリアクターにパージした。ｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、スイス）、ｐＨ調節装置（ＰＣ３１０、Ｓｕｎｔｅｘ、台湾・台北）、および２つの蠕動ポンプ（１０１Ｕ／Ｒ、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、英国ファルマス）の組み合わせを用いて、３Ｎ  ＮＨ４ＯＨまたは３Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、培養ｐＨを７．０±０．１で制御した。誘導後およそ６時間、バイオリアクターを２８℃および６５０ｒｐｍで操作した。
【０１１２】
培養後、６０００×ｇおよび２℃で、１０分間遠心分離することによって細胞を採取し、重量測定し、そして後でプロセシングするため、ペレットを−８０℃で保存した。典型的には、およそ２０ｇ湿細胞重量（ｗｃｗ）の細胞ペレットを１Ｌ培養から得ることが可能であった。細胞ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中、０．０５ｇ−ｗｃｗ／ｍＬで再懸濁した。標準的チップを含む超音波プロセッサ−（Ｍｉｓｏｎｉｘ）を用いて、およそ２０  ＯＤ６００のバッチ（２０ｍＬ）の細胞懸濁物を４分間、断続的に超音波処理した（すなわち０．５秒オン／０．５秒オフ）。次いで、超音波処理した細胞溶解物を１５，０００×ｇおよび２℃で１５分間遠心分離して、細胞破片を除いた。総可溶性タンパク質を含有する上清を０．４５μｍフィルターでろ過した後、続いてタンパク質精製のため、クロマトグラフィープロセシングを行い、そしてまた、ＧＳＴアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロッティングによっても分析した。
【０１１３】
上述のように細胞抽出物を調製した後、組換えＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合タンパク質をプロセシングし、そして３つの主な工程によって精製した：１）ＧＳＴ−アフィニティカラムを用いた捕捉、２）液相にｈＣＤ８３部分を放出するための、トロンビンを用いたカラム上切断、ならびに３）トロンビンおよび他の混入タンパク質（例えば内毒素）を除去するための陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製（例えば、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉら（２００５）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  １０８０：８３−９２；およびＤｉａｎら（２００２）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ７６９：１３３−１４４を参照されたい）。より具体的には、捕捉工程において、上記の調製溶解物（すなわち超音波細胞由来のろ過上清、ＰＢＳ中にＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合物を含む総可溶性タンパク質を含有する）をＧＳＴアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カナダ・ケベック州ベーダルフェ）上に装填した。ＧＳＴ−アフィニティカラムは、およそ２００Ｕ  ＧＳＴ／ｍＬ−カラム−媒体で装填されたＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔで飽和すると概算された。典型的な培養試料に関する特異的ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ発現レベルは、２．５Ｕ  ＧＳＴ／ＯＤ６００単位であるため、８０  ＯＤ６００単位細胞／ｍＬ−カラム−媒体から得た溶解物をＧＳＴｒａｐカラム内に装填した。
【０１１４】
結合したＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔのｉｎ−ｓｉｔｕ切断に最適なトロンビン濃度および切断時間を決定した。ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔで飽和させた２つの２０ｍＬ  ＧＳＴ−アフィニティカラムにまず、製造者によって示唆される濃度である８０Ｕトロンビン／ｍＬ−カラム−媒体のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を手動で注入し、室温で２または４時間インキュベーションし、そして次いで、１カラム体積の結合緩衝液を用いて、ｈＣＤ８３ｅｘｔおよびトロンビンを含有するＧＳＴアフィニティクロマトグラフィーカラム中のバルク液体を押し出した。次いで、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭグルタチオン、ｐＨ８．０）を用いて、未消化ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔとともに、ＧＳＴ部分をカラムから溶出させた。２時間のインキュベーションは切断するのに十分に長いことが観察された。切断効率を試験するため、２時間のインキュベーション時間を用いて、多様な濃度（すなわち８０、４０、２０、１０、および５Ｕトロンビン／ｍＬ−カラム−媒体）のトロンビンを５つの飽和ＧＳＴ−アフィニティカラム内に注入し、そして結果を図３に要約する。トロンビン濃度が１０Ｕトロンビン／ｍＬ−カラム−媒体を超えると、９５％より多いＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔが切断され、これがカラム上切断を実行するのに最適なトロンビン濃度であることが決定された。こうした比較的低いトロンビン濃度では、インキュベーション時間を２．５時間に延長して、完全な切断を確実にした。この分画中のｈＣＤ８３ｅｘｔの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば高い（図３中のレーン２〜５）が、このＧＳＴ後分画中のタンパク質は不安定であり、そして分解する傾向があった（データ未提示）。
【０１１５】
ｈＣＤ８３ｅｘｔから内毒素、トロンビンおよび他の混入タンパク質を除去するための精製工程を設計した。精製には、強陰イオン交換カラム（Ｑ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を装備した低圧クロマトグラフィー系（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＬＰ、ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュルス）を用いた。５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）および１Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液を、それぞれ、装填および溶出緩衝液として用いた。純粋なｈＣＤ８３ｅｘｔを含有する分画をプールし、そして高圧攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ、ＹＭ１０ディスクを用いたモデル８０１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｎａｄａ、カナダ・オンタリオ州ケンブリッジ）を用いた限外ろ過で濃縮した。ｈＣＤ８３ｅｘｔ最終産物を保存前にろ過滅菌した。この最終産物分画を用いると、ｈＣＤ８３ｅｘｔの消光係数はおよそ１．１６  ＯＤ２８０−ｍＬ／ｍｇ／ｃｍであると決定された。タンパク質をさらに濃縮し、そしてまたは接線流ろ過（または類似の技術）を用いて、低ｐＨ緩衝液に緩衝液交換してもよい。各分画の典型的なクロマトグラムおよびタンパク質含量ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を含有する結果を、それぞれ、図４Ａおよび４Ｂに要約する。示すように、フロースルーのプールは、精製された低内毒素ｈＣＤ８３ｅｘｔを含有した。
【０１１６】
実施例２
野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの構造的性質決定
精製野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔは、実施例１に記載するように調製され、そして５０％グリセロールの存在下または非存在下のいずれかで配合されると、４℃で保存した際、おそらくこの生体分子に固有の不安定性のため、分解された。したがって、このタンパク質を−２０℃で保存し、この温度では、分解は完全に防止された。にもかかわらず、長期保存中、この凍結条件下でも、二量体化はなお生じる可能性があった。異なるバッチ由来の、そしてしたがって保存時間が異なる、いくつかのｈＣＤ８３ｅｘｔ試料の還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析結果を図５および６に要約する。これらの試料は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際、同一パターンを示した（図５）が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際、二量体組成物に関してまったく異なっていた（図６）。一般的に、二量体組成物は、試料の保存時間とともに、単調に増加し、この保存条件下で単量体から二量体に進行性に変換されていることを示す。多様な試料調製物に由来する少なくとも２つの異なる単量体型（レーン６、図６）および３つの異なる二量体型（レーン３および７、図６）があることに注目されたい。
【０１１７】
Ｌｅｃｈｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００５）  ３２９：１３２−１３９）は、ｈＣＤ８３ｅｘｔ二量体を形成する、分子内ジスルフィド結合を仲介する重要なアミノ酸残基として、ｈＣＤ８３ｅｘｔの五番目のシステインを同定した。しかし、上述の比較的酸性の条件下で保存すると、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、精製ｈＣＤ８３ｅｘｔ調製物が、二量体、三量体、四量体、そしてさらにより大きい多量体さえ形成する傾向があることが明らかになった（図７Ｂ）。抗ＣＤ８３抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、これらのより高い分子量のバンドの同一性を調べた。簡潔には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、標準的プロトコルにしたがい、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質（図７Ｂ）を、ＰＶＤＦ膜に電気ブロッティングした（Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７６：４３５０−４３５４）。１００Ｖの定圧で１時間、電気泳動トランスファーを行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ，  １９８９に記載されるように、タンパク質−抗体ハイブリダイゼーションを行った。マウス・モノクローナル抗ＣＤ８３抗体（ＣＤ８３−１Ｇ１１、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ、カナダ・オンタリオ州ホーンビー）を一次抗体として用いた。二次抗体は、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＧであった。３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸（ＤＡＢ）を基質として用いた比色法によって、ｈＣＤ８３関連ポリペプチド（例えばＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔおよびｈＣＤ８３ｅｘｔ）を検出した。図７Ｃに示すように、二量体、三量体、四量体、およびさらにより高次の多量体に対応するバンドは、実際にｈＣＤ８３ｅｘｔ関連であった。このデータは、ｈＣＤ８３ｅｘｔの最初の４つのシステイン残基の１以上が、分子内および／または分子間ジスルフィド結合の形成に関与することを暗示する。図６および７の単量体および二量体の多数の型は、おそらく、分子内ジスルフィド結合と関連するこれらの５つのシステイン残基の間の異なる対形成から生じうる。したがって、Ｃｙｓ１２９は、二量体化のための分子間ジスルフィド結合の形成を駆動する重要な残基ではあるが、他のシステイン残基も、多量体化のための分子間ジスルフィド結合の広範な形成に関与しうる。
【０１１８】
実施例３
新規ｈＣＤ８３ｅｘｔ（システインからセリン）突然変異体の構築、精製および性質決定
配列番号Ａ（配列番号２に示すｈＣＤ８３のアミノ酸残基２０〜１４４に相当する）に示す野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔには、５つのシステイン残基（すなわち配列番号Ａ（配列番号１）のアミノ酸残基２７（８）、３５（１６）、１００（８１）、１０７（８８）、および１２９（１１０）、本明細書において、それぞれ、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ４、およびＣｙｓ５と明記する）がある。Ｃｙｓ５は、先に、ｈＣＤ８３ｅｘｔ二量体形成に重要であることが立証されている（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００５））が、図６に示すように、より高次の多量体が存在することから、Ｃｙｓ５に加えて、他のシステイン残基が、分子間および分子内ジスルフィド結合形成に関与しうることが示唆される。この可能性を調べるため、ｈＣＤ８３ｅｘｔの他のシステイン残基の機能を研究するために、２つのプラスミドｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔ（上述）およびｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓ（米国特許公報２００７／０１６７６０７に開示され、そしてＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ博士の好意によって提供された）を部位特異的突然変異誘発に用いた。ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔおよびｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓは、アミノ酸残基１２９のコドンを除いて同一である。ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔでは、このコドンは野生型システイン残基を指定し、一方、ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓでは、このコドンはセリン残基をコードするように突然変異されている。
【０１１９】
部位特異的突然変異誘発を用いて、３つの他のシステインコドン（すなわちＣｙｓ２、Ｃｙｓ３、おｙびＣｙｓ４）の１以上をセリンコドンに突然変異させて、ｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔまたはｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓから、１０の新規プラスミドを構築した（注：これらのシステインからセリンへの突然変異を「Ｃ２Ｓ」突然変異と称する）。ＣＤ８３  Ｃ２Ｓ突然変異体は、ＣＤ８３ｍ−Ｘ，Ｙ，Ｚと称され、式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、Ｃ２Ｓ突然変異を伴うシステインの番号（単数または複数）を特定する。用語「ＣＤ８３ｍ−Ｘ，Ｙ，Ｚ」（例えばＣＤ８３ｍ−３）は、用語「ＣＤ８３ｅｘｔ−ｍＸ，Ｙ，Ｚ」（例えば、ＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３）と交換可能に用いられる。例えば、ＣＤ８３ｍ−３，４は、Ｃｙｓ１００（すなわちＣｙｓ３）およびＣｙｓ１０７（すなわちＣｙｓ４）の両方に、Ｃ２Ｓ突然変異を持つＣＤ８３突然変異体であり、一方、ｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓの元来の突然変異体は、ＣＤ８３ｍ−５と明記されうる。表３中のプラスミドは、対応するＣＤ８３突然変異体の前に「ｐ」を付加することによって名付けられる。配列番号によって表３中で言及されるｓＣＤ８３配列は、膜貫通ドメインの最初のアミノ酸（Ｉｌｅ）を加えたＣＤ８３細胞外領域配列に相当する。これらの配列が、細胞外ドメインのＮ末端に融合されたＧＳＴ部分およびトロンビン切断部位を含まず、またベクター配列も含まないことに注目すべきである。
【０１２０】
表３
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
【０１２１】
【表３】
2011520959.tif 000004
【０１２２】
Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３、およびＣｙｓ４コドンをターゲティングすることによる部位特異的突然変異誘発のため、３つのプライマー（すなわち表１中のＣＹＳ２、ＣＹＳ３、およびＣＹＳ４）を用いた。スクリーニング目的のため、サイレント突然変異もまた導入して、新規制限部位（すなわちＣｙｓ２およびＣｙｓ４に関してはＳｃａＩ、そしてＣｙｓ３に関してはＳａｃＩ）を生成した。ＳｃａＩおよびＳａｃＩで多様な突然変異プラスミドを制限消化して、Ｃ２Ｓ突然変異の望ましい組み合わせの存在に関してスクリーニングした（データ未提示）。各変異体ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合タンパク質をコードする領域をＤＮＡ配列決定によって確認し、そしてコード領域に相当する（しかし、ＧＳＴタグおよびトロンビン切断部位を含まない）配列番号を表２に列挙する。本発明者らが得たプラスミドのすべてにおいて（そしておそらくｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔおよびｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔｍｕｔＣ１２９Ｓにおいてもまた）、「ＡＧＧ」のアルギニンコドン（ｈＣＤ８３ｅｘｔのアミノ酸残基番号５０）は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されるＣＤ８３  ｃＤＮＡ配列中の「ＡＧＡ」の対応するアルギニンコドンとは異なるが、この相違は、ＣＤ８３タンパク質配列に影響を及ぼさないことに注目されたい。
【０１２３】
実施例１に記載する発酵および精製プロトコルを用いて、各ＣＤ８３突然変異体の産生および精製を行った。典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）を用いた精製工程のクロマトグラムプロフィール中、２つの主なタンパク質溶出ピークが現れ、そして第一のピークに相当する分画をプールし、そして濃縮して、最終ｈＣＤ８３ｅｘｔ産物を形成する。しかし、ＣＤ８３ｍ−２，５の精製のための精製工程の第一のピークは、通常の実験条件下で有意に減少するようであり、そしてＣＤ８３ｍ−２，５の大部分は、塩勾配を適用した際の第二のピーク中に溶出した（図８）。こうした低収量は、緩衝液ｐＨを６．５に減少させても改善されなかった（データ未提示）。にもかかわらず、ＣＤ８３ｍ−２，５は、小さい第一のピークに相当する分画をプールすることによって、なお精製可能であった。構造的性質決定によって、ＣＤ８３ｍ−２，５のバンドパターンが、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（それぞれ図９および１０）下で、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔに類似であることが明らかになったが、タンパク質は、円二色性（ＣＤ）（図１１）および分光蛍光測定（図１２）を用いた分光分析に際して、極端に異なるプロフィールを示した。ＣＤ８３ｍ−２（図１３）およびＣＤ８３ｍ−２，３，５（データ未提示）の２つの他の突然変異体を精製する際、類似の結果が観察された。ＣＤ８３ｍ−２、ＣＤ８３ｍ−２，５およびＣＤ８３ｍ−２，３，５は、Ｃｙｓ２上のＣ２Ｓ突然変異を共有するため、データは、この突然変異が、タンパク質構造または生化学特性に有意な変化を生じ、これがＡＥＣ樹脂への結合を増進し、そして続いて精製工程中の溶出プロフィールに影響を及ぼしたことを示唆する。タンパク質構造予測に基づくと、Ｃｙｓ２およびＣｙｓ４間で分子内ジスルフィド結合が形成されることも可能であった。この分子内ジスルフィド結合の存在は、タンパク質構造を安定させるのに、または生物活性を改善するのにさえ重要でありうる。
【０１２４】
野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔおよびＣＤ８３ｍ−５に関するものと正確に同じ発酵および下流プロセシングプロトコルを用いて、ＣＤ８３ｍ−３を産生し、そして精製した。ＡＥＣを用いた精製工程中、２つの主なタンパク質溶出ピークが現れ（図１４）、そしてＣＤ８３ｍ−２に関連する上記の産生上の問題はＣＤ８３ｍ−３の産生の際には観察されず、このことから、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ５上のＣ２Ｓ突然変異は、主な構造変化を生じないと暗示された。精製ＣＤ８３ｍ−３を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１５）、ＣＤ（図１６および１７）、および分光蛍光測定（図１８）を用いた構造的性質決定に供し、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔおよびＣＤ８３ｍ−５と類似の結果を得た。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に、明確なそして再生可能なダブレットが観察されることに注目されたい（図１５）。また、ＣＤ８３ｍ−３ダブレットに相当するこれらの２つのバンドはいずれも、ＣＤ８３ｍ−５の単量体種と同一の移動度を持たないようであるが、上部ＣＤ８３ｍ−３バンドは、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの単量体種と同一の移動度を有するようであることに注目されたい（図１９）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための試料調製中、潜在的なジスルフィド結合スクランブル化を回避するため、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で試料を前処理することによって、プロトコルを修飾した。ＮＥＭは、ジスルフィド結合を形成していないシステイン残基上の未結合（ｆｒｅｅ）チオール基をアルキル化し、そしてそれによって、そのシステイン残基による続くジスルフィド結合を防止する。ＮＥＭを用いた修飾プロトコルは、いかなる潜在的なジスルフィド結合スクランブル化も防止することによって、より信頼性があり、そして一貫した、ＣＤ８３二量体の定量化法を提供するようであり、そしてＣＤ８３単量体は、ダブレットではなく、単一のバンドとして観察される（図２０）。
【０１２５】
先に、Ｚｉｎｓｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）  ２１１：４４９−４５３）は、Ｃｙｓ５が、ＣＤ８３二量体化に関与する主なシステインであり、そしてｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５は二量体ではなく単量体を形成すると報告した。しかし、本発明者らは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；図２１）で分析した際、有意なｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５二量体化を観察し、そしてこの結果は、ＮＥＭ前処理を伴う修飾プロトコルを用いた非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致していた（図２０）。驚くべきことに、ＳＥＣ（図２１）および修飾ＮＥＭプロトコルを伴う非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２０）の結果に基づくと、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の二量体化は存在しないかまたは最小限だった。これらの結果によって、Ｃｙｓ３またはさらに他のシステイン残基（すなわちＣｙｓ１、Ｃｙｓ２、およびＣｙｓ４）もまた、ＣＤ８３二量体化に特定の役割を果たしうることが示唆される。ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３分子は、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの単量体種と同一の移動度を有するが、ＣＤ８３ｍ−５よりわずかに高い移動度を有するようであることに注目されたい（図２０）。したがって、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５の単量体型は異なる構造を有する可能性もあるが、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３単量体は、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ単量体と類似のまたはさらに同一のタンパク質構造を有する可能性もある。これらのＣＤ８３変異体はすべて、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）および還元ＳＥＣ（図２３）で分析した際、同一のバンドパターンを有するようであり、この中で、単量体種のみが観察された。
【０１２６】
要約すると、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２４）を用いて、本発明者らは、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５が単量体としてのみ存在する（自分自身に対する注：この刊行物を再検討する）という以前の主張とは対照的に、この突然変異体種中の他のシステイン残基が、二量体、三量体、およびさらに四量体を形成する多量体化に関与しうることを示した。ウェスタンブロッティングを用いて、これらの多量体種は、ＣＤ８３と会合することが示されている（図２５）。
【０１２７】
実施例４
ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型、ｈＣＤ８３ｍ３およびｈＣＤ８３ｍ５生物活性の比較、ならびにタンパク質安定性に対するｐＨの影響
ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦα産生を野生型および突然変異体ｈＣＤ３８ｅｘｔが阻害する能力を、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）由来のＰＢＭＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。具体的には、カニクイザルＰＢＭＣを単離し、そして異なる濃度（０．５、５、２５および１００μｇ／ｍｌ）のｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型（ｐＨ４．５または５．５で配合）、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３またはｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５（５０１−１）で１２時間、前処理した。ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５を、それぞれ、ｐＨ５．５または７．６で配合した。次いで、細胞を、ブレフェルディンＡ（４μｇ／ｍｌ）の存在下、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）を加えたＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で６時間活性化し、そして次いで、商業的に入手可能なＦｉｘ／Ｐｅｒｍキットを用いて、ＴＮＦαに関して細胞内染色した。骨髄性樹状細胞または単球のいずれかを用いて、ＴＮＦα産生量のフローサイトメトリー取得および分析を評価した。結果を、ＴＮＦαを産生するｍＤＣまたは単球の％として、および細胞あたりに基づくＴＮＦαのレベルを示す平均蛍光単位（ＭＦＵ）で表す。図２６に示すように、刺激されたＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する際に、ｈＣＤ８３ｍ−３はｍ５突然変異体より活性であり、ｍ５は野生型ｈＣＤ９３ｅｘｔよりも活性である。さらに、ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型は、ｐＨ５．５で配合された際よりも、ｐＨ４．５で配合された際、より高い活性を保持する。ｐＨ４．５またはｐＨ５．５いずれかでのｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型の配合物は、ｐＨ７．６での配合物よりもより活性である（データ未提示）。
【０１２８】
ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５およびｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型の活性は、野生型およびｍ３突然変異体タンパク質の両方がｐＨ７．６で配合されたことを除いて、上述のものと類似のＴＮＦα阻害アッセイにおいて、匹敵した。図２７に示すように、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激したカニクイザルＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力において、ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型の２つの調製物より優れていた。
【０１２９】
元来、ｐＨ７．６に配合されたｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型タンパク質（図２６および２７にデータを示す）を、ｐＨ４．５または５．５の緩衝液に緩衝液交換し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激したカニクイザルＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力に関して、上述のように再試験した。図２８に示すデータによって、野生型（ＷＴ）タンパク質の生物活性が、酸性緩衝液（ｐＨ４．５または５．５）中に物質を配合することによって増進されうることが立証される。したがって、約４．５〜５．５のｐＨは、環境ストレス（例えば酸化、脱アミン化、温度等）の影響を潜在的に最小限にすることによって、ｈＣＤ８３ｅｘｔを安定化しうる。しかし、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３をｐＨ５．５で配合すると、ｐＨ４．５または５．５のいずれかで配合された野生型よりもより活性が高かった（図２９）。ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３はまた、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５より活性が高かったが、ｐＨ５．５のｈＣＤ８３ｍ−５は、このアッセイでは試験されなかった。興味深いことに、ｈＣＤ３８ｅｘｔ野生型、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ５が移植片拒絶を阻害する能力をｉｎ  ｖｉｖｏマウス心臓移植モデル（１日あたりマウスあたり１００μｇを８日間）で試験した際、移植片生存を延長させる能力にはほとんど違いがないようであった。単一療法として使用すると、各型は、移植片生存の８日間の平均生存時間をおよそ１４日間に延長させることが可能であった。市販の免疫抑制剤（シクロスポリンを含む）と組み合わせると、すべての型は、類似の相乗的長期生存プロフィールを示した。したがって、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｐＨ調整（低いｐＨへの調整）の１つの価値は、改善された全体のタンパク質安定性であるように思われる。
【０１３０】
ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型に比較した際のｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の安定性／活性の改善を、ヒトＰＢＭＣを用いた類似のアッセイで確認した。図３０に示すように、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の４つの異なる調製物（ＰＢＳ、ｐＨ５．５中で配合した−００２−２−３；  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６中で配合した−００２−１；  ＰＢＳ  ｐＨ５．５中で配合した−００３−２−２、およびＰＢＳ、ｐＨ４．５中で配合した−００３−３−２）は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激したヒトＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を阻害する能力において、ｈＣＤ８３ｅｘｔ野生型（ＰＢＳ  ｐＨ７．６中で配合され、ＡＲＧ−０２１と称される）より優れていた。
【０１３１】
実施例５
グリセロールはｈＣＤ８３ｅｘｔ配合物を安定させる
ｈＣＤ８３ｅｘｔを保存のため最終濃度５０％のグリセロール（より低いグリセロール濃度もまた使用可能である）で配合し、そして続いて、Ｃ５７ＢＬ／６からＢＡＬＢ／ｃマウスへの心臓移植モデルにおいて、シクロスポリンと組み合わせて、最終グリセロール濃度８％でｉｎ  ｖｉｖｏで試験すると、長期移植片生存（＞１００日間）が記録される一方、この併用研究からグリセロールを省いた実験では、平均生存は、およそ１４日間に制限された。
【０１３２】
実施例６
野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔの強制的分解（ｆｏｒｃｅ−ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）
野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔストック溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．６中の凍結アリコット、〜６ｍｇ  ＣＤ８３／ｍＬ）のロット０２１を用いた強制的分解研究を以下のように行った。いくつかのアリコットを融解し、そして組み合わせた。以下の表に記載するように、溶液を調製した：
表４
強制的分解研究のためのストレス条件
【０１３３】
【表４】
2011520959.tif 000005
【０１３４】
言及する曝露時間の終了時、酸性および塩基性試料を中和した。ＳＥ−ＨＰＬＣおよび等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを用いて分析するまで、すべての試料を−２０℃で保存した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を表５に提供する。
【０１３５】
表５
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：強制的分解研究の要約
【０１３６】
【表５】
2011520959.tif 000006
【０１３７】
ＳＥ−ＨＰＬＣおよび等電点電気泳動法を用いて生成されたデータ（未提示）によって、ｈＣＤ８３ｅｘｔの分解産物が、出発物質よりもより電気陰性であることが示される。これは主に、多重脱アミド化または加水分解に起因する可能性もあり、そして継続中の前配合（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）研究において評価されるであろう。これらのデータはまた、酸性ｐＨが、ｈＣＤ８３ｅｘｔの凝集状態および電荷状態の両方に関して安定化させることもまた示唆する。電荷状態に関しては、ｐＩは６．９である。別の主なバンドが、室温（ＲＴ）対照中、ｐＩ  〜６．８に現れる。
【０１３８】
分子サイズの側面から、酸性条件（ｐＨ〜２）は、単量体を支持する（〜４％凝集、ＲＴ対照と同じ）。すべての他の条件（塩基、過酸化物、熱、光、ＲＴ）は、凝集増加を示した。ｈＣＤ８３ｅｘｔは、光安定性であるようである。この試料に関して観察される分解は、光よりも周囲条件に対する曝露のためである可能性が最も高い。熱（７０℃）および塩基性条件（ｐＨ〜１２）の両方が、迅速な分解を引き起こすことが明らかであり；４時間後、主要なバンドは存在せず、そして多くの電気陰性バンドが観察される。酸性条件（ｐＨ〜２）は、ｈＣＤ８３ｅｘｔの凝集状態および電荷状態の両方に関して、タンパク質を安定化させるようである。ＩＥＦプロフィールは、ＲＴ対照と比較した際であっても、損なわれていないようである。
【０１３９】
ｐＨの役割およびタンパク質安定性に対する影響をさらに調べるため、野生型ｈＣＤ８３ｅｘｔ（ｐＨ７．６のＰＢＳ中のロット０２１）を新鮮に融解し、そして分析する（表６の第一列）か、または室温および２〜８℃、４、５、６、７、８および９のｐＨで保存した。１、２、４および１０日の保存後に分析するまで、試料を−７０℃で維持した。次いで、ＳＥＣ  ＨＰＬＣ（表６）によって、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（還元および非還元条件下；図３１〜３５）を用いることによって、これらの試料を分析した。
【０１４０】
表６
ｐＨ分解速度研究に関するＳＥ−ＨＰＬＣ結果要約
【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
これらのデータによって、ｓＣＤ８３が低ｐＨ（ｐＨ４〜５）で緩衝された際に、ｓＣＤ８３安定性を支持する条件がより好ましいことが示唆され、これらの条件下では、凝集および電荷状態の変化が最小限であるようである。さらに、塩基、過酸化物、熱、光、または室温条件への曝露は、凝集または断片化およびまたは分解を増加させるようである。
【０１４３】
以下の動物実験はすべて、動物ケアガイドラインに関するカナダ評議会にしたがって行った。以下に記載する実験は、野生型（ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔ；配列番号５）またはｍ３突然変異型（ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３；配列番号７、ここで、アミノ酸１２、２０、９２および１１４はシステイン（Ｃｙｓ）であり、そしてアミノ酸８５はセリン（Ｓｅｒ）である））のいずれかの大腸菌から精製した、組換えヒトｓＣＤ８３を用いた。
【０１４４】
実施例７
ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３は、ネズミ腎臓移植モデルにおいて、長期同種移植片寛容を誘導する
マウス同所性腎臓移植モデル（Ｚｈａｎｇら（２００５）  Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  １６（２）：１０３−１０９を参照されたい）を用いて、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３が同種移植片寛容を誘導する能力を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスドナー由来の腎臓同種移植片を移植した。レシピエントマウスを処置しない（２匹のマウス）か、または移植１日前（第−１日）、移植日（第０日）および術後（ＰＯＤ）７日間、レシピエントマウスにｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（３匹のマウス；１００μｇ／マウス／日、ｉ．ｖ．）を投与するかいずれかを行った。２匹の未処置マウスは、２８日および３５日生存し、３１±４．９日の平均生存時間（ＭＳＴ）を生じた。ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３で処置した３匹のマウスは、各々、１００ＰＯＤを超えて生存した。したがって、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３での単一療法は、マウス同所性腎臓移植モデルにおいて、長期同種移植片許容を導く。別個の実験において、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔでの処置によって類似の結果が得られた。
【０１４５】
実施例８
単独のまたはシクロスポリンＡと組み合わせたＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔまたはＣＤ８３−ｍ３は、ネズミ異所性心臓同種移植片モデルにおいて、移植片拒絶を抑制する
動物モデル：Ｃ５７ＢＬ／６からＢＡＬＢ／ｃマウスへの心臓移植モデル
ネズミ異所性心臓同種移植片モデルを用いて、単独のまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）との組み合わせいずれかのｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３が、異所性心臓移植の拒絶を防止する効果を決定した。雄成体Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）をドナーとして用いて、そしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスをレシピエントとして用いた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州バーハーバー）。先に記載されるように、腹腔内異所性心臓移植を行った（Ｃｏｒｒｙら（１９７３）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １６（４）：３４３−３５０、およびＷａｎｇら（２００７）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９（７）：４４５１−４４６３）。この研究において、移植手術は、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーからＢＡＬＢ／ｃレシピエントへの完全ＭＨＣミスマッチ心臓の移植を伴い、自己の心臓ならびに同種心臓がレシピエントに存在した。
【０１４６】
心臓移植レシピエントを以下のように処置した：第１群（５匹のレシピエント）には処置を行わなかった。第２群（３匹のレシピエント）には、−１〜＋７  ＰＯＤまで、１００μｇ／マウス／日で、ｉ．ｖ．によってｈＣＤ３８ｅｘｔ−ｍ３単一療法を行った。第３群（４匹のレシピエント）には、実験終了まで毎日、ｓ．ｃ．でのＣｓＡ  １５ｍｇ／ｋｇ／日を加えて、−１〜＋７ＰＯＤまで、１００μｇ／マウス／日で、ｉ．ｖ．によってｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３単一療法を行った。移植片の心拍を監視し、そして二重盲検方式で、直接腹部触診によって、毎日評価して、心臓の健康状態／拒絶を検出した。同種心臓が拍動し続けた術後（ＰＯＤ）日数で、心臓移植片生存を測定した。結果を表７に示す。
【０１４７】
表７
【０１４８】
【表７】
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【０１４９】
別個の実験において、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔ単独、ＣｓＡ単独、またはＣｓＡを加えたｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔが心臓移植片拒絶を抑制する能力を、上述のように評価した。心臓移植レシピエントを以下のように処置した：第４群（４匹のレシピエント）には、移植前日から移植片拒絶まで、１００μｇ／マウス／日で、ｉ．ｖ．によってｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔ（配列番号５）単一療法を行った。第５群（６匹のレシピエント）には、ＣｓＡ単一療法（１５ｍｇ／ｋｇ／日、毎日、ｓ．ｃ．）を行った。第６群（４匹のレシピエント）には、移植前日から移植７日後まで、ｓ．ｃ．でのＣｓＡ  １５ｍｇ／ｋｇ／日を加えて、１００μｇ／マウス／日で、ｉ．ｖ．によってｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔを投与した。結果を表８に示す。
【０１５０】
表８
【０１５１】
【表８】
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【０１５２】
†動物は、心臓移植片の強い拍動で死亡した（処置関連とは考えられない）
上記実験によって、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔ単一療法は、未処置対照に比較して、およそ２倍、同種移植片生存を延長することが立証される。さらに、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３およびＣＤ８３ｅｘｔ−ｗｔはＣｓＡと相乗作用して、ＣｓＡ単一療法と比較して、長期同種移植片生存を可能にする。
【０１５３】
さらなる実験において、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（１００μｇ、ｉ．ｖ．、第−１日〜＋７日）を加えたＰＯＤ５０までのＣｓＡでのマウス心臓移植レシピエントの処置によって、第５０日の毎日のＣｓＡ療法の休止後、拒絶の欠如によって立証されるように、完全同種移植片寛容が導かれる（データ未提示）。対照的に、ＣｓＡ単一療法またはｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３単一療法は、約１３〜１７日後に拒絶を導き、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３がＣｓＡと相乗作用することを示す（表７および８を参照されたい）。驚くべきことに、併用療法は、ＣｓＡを第２８日に退薬した際、永続的な同種移植片寛容を導かず、完全に薬剤から独立した寛容を達成するには、予想外に長期の、拒絶を伴わない生存期間が必要であることが示される（データ未提示）。ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の用量がより少ない（すなわち第−１日〜＋１日に３用量）と、ＣｓＡとの完全相乗作用は導かれるが、第５０日にＣｓＡを退薬した際に、迅速に拒絶されることによって立証されるように、免疫寛容（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）は不完全である。したがって、同種移植片寛容の誘導に対する用量反応効果が立証される。
【０１５４】
実施例９
ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３は、ラット腎臓同種移植片の慢性拒絶を防止する
ヒトにおいて、慢性拒絶は、移植の数ヶ月から数年後に起こり、そして移植片喪失の最も一般的な原因である。慢性拒絶は、移植片機能の緩慢な悪化を生じ、尿細管萎縮、間質性線維症および動脈の線維性内膜肥厚によって、腎臓において病理学的に特徴付けられる。
【０１５５】
よく確立されたラット腎移植モデル（本質的に、その内容が本明細書に援用されるＢｅｄａｒｄら（２００６）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８１（６）：９０８−１４および米国特許７，５１４，４０５に記載されるとおり）を用いて、ＣｓＡと組み合わせてｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３が慢性拒絶を抑制可能であるかどうかを評価した。このモデルにおいて、腎移植レシピエントを短期（１１日）用量のシクロスポリン（ＣｓＡ）で処置して、初期の急性拒絶を防止する。こうした移植レシピエントは、確実に、移植後（ＰＯＤ）１４０日までに慢性移植片拒絶に特徴的な病理学的変化を示す。
【０１５６】
Ｆ３４４ラットは、Ｌｅｗｉｓラットの腎ドナーとして働いた。３匹の対照移植レシピエントを療法用量未満のＣｓＡ単独（０．７５ｍｇ／ｋｇ／日；  ＰＯＤ  ０〜１０）で処置した。３匹の移植片レシピエントの第２群をＣｓＡ（０．７５ｍｇ／ｋｇ／日；  ＰＯＤ  ０〜１０）およびｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（１００μｇ／日、ｉ．ｖ．、ＰＯＤ  １〜７）で処置した。移植レシピエントをＰＯＤ  １４０に屠殺し、そして組織学および免疫組織化学によって、慢性拒絶の徴候に関して、移植腎臓を評価した。独立の病理学者によって、尿細管萎縮、糸球体萎縮、間質性線維症、内膜肥厚、細胞浸潤物および皮質瘢痕を０〜４のスケールで評価して腎組織学をスコア付けした、ここで０＝正常、１＝最小限の変化、２＝軽度の変化、３＝中程度の変化および４＝顕著な変化である。図３６に示すように、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３を加えたＣｓＡ処置は、ＣｓＡ単独での処置に比較した際、各カテゴリーにおいて、スコアを有意に（ｐ＜０．０５）改善した。図３７中のデータによって、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３は、糸球体（Ｇ）および尿細管周囲毛細血管（ＰＴＣ）におけるＩｇＧおよびＩｇＭ抗体沈着に関して、腎同種移植片の免疫組織化学等級付けを有意に（ｐ＜０．０５）改善し、そしてＣＤ２、ＣＤ４およびＥＤ−１細胞による細胞浸潤物を減少させることを立証する。要約すると、ＣｓＡと組み合わせたｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３は、ラット腎臓移植モデルにおいて、慢性同種移植片拒絶を防止する。ＣｓＡを加えたｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３処置による慢性拒絶の防止は、移植片内抗体沈着の下方制御および尿細管萎縮／間質性線維症の防止と関連づけられ、これは腎臓移植レシピエントにおける慢性拒絶の組織学的特徴である。これらのデータは、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３の多重機能性を強調する。上記のマウス心臓および腎臓移植研究において立証されるように、急性細胞性拒絶を遮断する能力に加えて、このモデルは、慢性炎症および体液性免疫応答を抑制する能力を例示する（すなわち慢性拒絶病理学は、急性細胞性拒絶からは独立である）。
【０１５７】
実施例１０
シクロスポリンＡを加えたｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３での処置は、非ヒト霊長類における腎移植片生存を延長する
各レシピエント・カニクイザルの１つの腎臓を、別のカニクイザルから取り除いた腎臓で置き換えた。さらに、移植された腎臓が生命を維持するように、レシピエントの移植されていない腎臓を外科的に取り除いた。３頭の移植レシピエントを、５０日までの毎日の療法用量未満ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）とともに、−１〜＋７  ＰＯＤ（９用量）のｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（３ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｖ．で処置した。対照群の３頭の移植レシピエントには、ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）単一療法を行った。尿排出量、血清クレアチニンレベル、ならびに食物および水消費の評価を含む方法によって、同種移植片拒絶に関して、すべての動物を監視した。各群１頭の動物を早期に（急性拒絶に基づかずに）安楽死させる必要があり、研究終点分析のため、各群２頭の動物を残した。結果を表９に示す。
【０１５８】
表９
【０１５９】
【表９】
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【０１６０】
対照動物（ＣｓＡ単一療法を受けた）のどちらもＣｓＡ終結日（第５０日）まで生存せず、一方、ＣｓＡに加えてｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３処置動物はどちらも第５０日に拒絶臨床症状をまったく示さなかった（すなわち正常の食欲、クレアチニン、および尿排出量）。しかし、ＣｓＡ終結に際して、どちらのｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３処置動物も迅速に拒絶し、急性拒絶を調節する寛容誘導が不十分であることが示された。
【０１６１】
次の実験において、腎臓移植レシピエントには、９０日まで毎日ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を加えて、ｈＣＤ８３ｅｘｔ−ｍ３（１０ｇｍ／ｋｇ／２×日、ｉ．ｖ．  第−１日〜＋１３  ＰＯＤ）を投与し、その後、２週間ごとにＣｓＡを５０％減少させて、（１）ＣｓＡとの臨床的に適切な相乗作用を立証し、そして（２）誘導される免疫寛容レベルを評価するであろう。
【配列表フリーテキスト】
【０１６２】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、シグナル配列を含む、全長ヒトＣＤ８３タンパク質をコードするｃＤＮＡを示す。
【０１６３】
配列番号２は、シグナル配列を含む、全長ヒトＣＤ８３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトＣＤ８３細胞外ドメイン（ｈＣＤ８３ｅｘｔ）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを示す。
【０１６４】
配列番号４は、ヒトＣＤ８３細胞外ドメイン（ｈＣＤ８３ｅｘｔ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、アミノ末端に、アミノ酸残基（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；配列番号４１）を、そしてカルボキシ末端に膜貫通ドメインの最初のアミノ酸（Ｉｌｅ）をさらに含む、ヒトＣＤ８３細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０１６５】
配列番号６は、１１４位の五番目のシステイン残基がセリン残基に突然変異している、配列番号５の変異体を示す。
配列番号７は、残基Ｘａａが任意のアミノ酸を示す、配列番号５の変異体を示す。
【０１６６】
配列番号８は、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合タンパク質を示す。ＧＳＴおよびｈＣＤ８３ｅｘｔドメインは、トロンビン切断部位によって分離される。
配列番号９は、膜貫通ドメインの最初のアミノ酸（Ｉｌｅ）をさらに含む、野生型ｈＣＤ８３細胞外ドメインを示す。
【０１６７】
配列番号１０は、配列番号９のｍ５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
配列番号１１は、配列番号９のｍ５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号１２は、配列番号９のｍ２  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１６８】
配列番号１３は、配列番号９のｍ２  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号１４は、配列番号９のｍ３  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
配列番号１５は、配列番号９のｍ３  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
【０１６９】
配列番号１６は、配列番号９のｍ４  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
配列番号１７は、配列番号９のｍ４  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号１８は、配列番号９のｍ２，３  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７０】
配列番号１９は、配列番号９のｍ２，３  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号２０は、配列番号９のｍ３，４  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７１】
配列番号２１は、配列番号９のｍ３，４  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号２２は、配列番号９のｍ２，５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７２】
配列番号２３は、配列番号９のｍ２，５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号２４は、配列番号９のｍ３，５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７３】
配列番号２５は、配列番号９のｍ３，５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号２６は、配列番号９のｍ４，５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７４】
配列番号２７は、配列番号９のｍ４，５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号２８は、配列番号９のｍ２，３，５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７５】
配列番号２９は、配列番号９のｍ２，３，５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号３０は、配列番号９のｍ３，４，５  Ｃ２Ｓ突然変異体をコードするＤＮＡを示す。
【０１７６】
配列番号３１は、配列番号９のｍ３，４，５  Ｃ２Ｓ突然変異体を示す。
配列番号３２は、配列番号９の第二のシステインでのＣ２Ｓ突然変異誘発のためのプライマーを示す。
【０１７７】
配列番号３３は、配列番号９の第三のシステインでのＣ２Ｓ突然変異誘発のためのプライマーを示す。
配列番号３４は、配列番号９の第四のシステインでのＣ２Ｓ突然変異誘発のためのプライマーを示す。
【０１７８】
配列番号３５は、パン・トログロイテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｙｔｅｓ）（チンパンジー）由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＸＰ ５１８２４８．２に相当する。
【０１７９】
配列番号３６は、カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（イヌ）由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＸＰ ８５２６４７．１に相当する。
【０１８０】
配列番号３７は、ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）（ウシ）由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＮＰ ００１０４００５５．１に相当する。
【０１８１】
配列番号３８は、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＮＰ ０３３９８６．１に相当する。
【０１８２】
配列番号３９は、ラトゥス・ノルベギクス（Ｒａｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ノルウェイラット）由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＸＰ ３４１５１０．２に相当する。
【０１８３】
配列番号４０は、ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（赤色野鶏（ｒｅｄ  ｊｕｎｇｌｅ  ｆｏｗｌ））由来のＣＤ８３タンパク質を示し、そしてＮＣＢＩ参照配列：  ＸＰ ４１８２９．１に相当する。
【０１８４】
配列番号４１は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに相当する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2011520959.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2011520959.tif 000027
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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