(57)【要約】ＮＦ―κＢが媒介する細胞の増殖および転移を阻害するための組成物および方法が開示される。足場依存性および非依存性の増殖ならびに腫瘍形成を阻害することが可能であり、アポトーシスを引き起こすことが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤もまた開示される。なおさらに、細胞接着依存性様式で起こる、ＮＦ−κＢ阻害によるアポトーシスの誘導を阻害するＮＦ−κＢ阻害剤が本明細書で開示される。細胞の再接着が、ＮＦ−κＢ阻害剤誘導性アポトーシスに対して細胞が感受性になることを引き起こすＮＦ−κＢの顕著な活性化を引き起こす細胞に影響を与えるＮＦ−κＢ阻害剤もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌活性のための化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．化合物または化合物のライブラリーを提供すること；
ｂ．ＮＦ−κＢ阻害活性のための化合物または化合物のライブラリーをアッセイすること；
ｃ．ＪＮＫ活性化活性のための化合物または化合物のライブラリーをアッセイすること；
ｄ．同定される化合物が抗癌活性を有する、ＮＦ−κＢ阻害活性とＪＮＫ活性化活性の両方を有する化合物を同定すること、
を備える、方法。
【請求項２】
前記ＮＦ−κＢアッセイ、前記ＪＮＫアッセイ、または前記ＮＦ−κＢアッセイと前記ＪＮＫアッセイの両方のいずれかが、ＤＬＤ−１癌細胞系統、ＨＴ−２９癌細胞系統、Ｓｕ．８６細胞系統、またはＢｘＰＣ−３細胞系統を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＦ−κＢアッセイおよび前記ＪＮＫアッセイが同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｂのアッセイが直接的ＮＦ−κＢ阻害についてアッセイする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｂのアッセイが間接的ＮＦ−κＢ阻害についてアッセイする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＦＬＩＰ活性化についてアッセイすることをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物または化合物のライブラリーが少なくとも１つの電子求引基を有するオレフィンを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物または化合物のライブラリーが少なくとも２つの電子求引基を有するオレフィンを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電子吸引基が、シアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、非置換芳香族環、または少なくとも１つのシアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン、もしくはニトロ基を有する置換芳香族環を備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスホ−オキシ基が構造
【化９】
2011520096.tif 000016
を有し、ここで、Ｒ１は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スルホ−オキシ基が構造
【化１０】
2011520096.tif 000017
を有し、ここで、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物または化合物のライブラリーがシアノ基および構造
【化１１】
2011520096.tif 000018
を有するスルホ−オキシ基を有するオレフィンを備え、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物または化合物のライブラリーが構造
【化１２】
2011520096.tif 000019
を備え、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族であり、前記化合物がＥ−またはＺ−異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ３およびＲ４が水素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ２がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、置換もしくは非置換フェニル、またはベンジルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２が少なくとも１つのアルキル基を有するフェニル基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がＥ−異性体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物または化合物のライブラリーが構造
【化１３】
2011520096.tif 000020
を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物または化合物のライブラリーが構造
【化１４】
2011520096.tif 000021
を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物または化合物のライブラリーがチアゾリジンジオンを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物または化合物のライブラリーがロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、またはシグリタゾンを備える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物または化合物のライブラリーがアニソマイシンを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞の腹膜接種を予防するための有効量のＪＮＫ活性化因子およびＮＦ−κＢ阻害剤を備える、癌細胞の腹腔内接種を予防するための組成物。
【請求項２４】
前記組成物が少なくとも１つの電子求引基を有するオレフィンを備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が少なくとも２つの電子求引基を有するオレフィンを備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記電子吸引基が、シアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、非置換芳香族環、または少なくとも１つのシアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン、もしくはニトロ基を有する置換芳香族環を備える、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ホスホ−オキシ基が構造
【化１５】
2011520096.tif 000022
を有し、ここで、Ｒ１は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記スルホ−オキシ基が構造
【化１６】
2011520096.tif 000023
を有し、ここで、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物がシアノ基および構造
【化１７】
2011520096.tif 000024
を有するスルホ−オキシ基を有するオレフィンを備え、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が構造
【化１８】
2011520096.tif 000025
を備え、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族であり、前記化合物がＥ−またはＺ−異性体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｒ３およびＲ４が水素である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｒ２がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、置換もしくは非置換フェニル、またはベンジルである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｒ２が少なくとも１つのアルキル基を有するフェニル基である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化合物がＥ−異性体である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が構造
【化１９】
2011520096.tif 000026
を備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が構造
【化２０】
2011520096.tif 000027
を備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物がチアゾリジンジオンを備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物がロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、またはシグリタゾンを備える、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物がアニソマイシンを備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物が
【化２１】
2011520096.tif 000028
および、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン、またはアニソマイシンの１つ以上を備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が
【化２２】
2011520096.tif 000029
および、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン、またはアニソマイシンの１つ以上を備える、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＦ−κＢの阻害剤およびＪＮＫの活性化因子を備える組成物を被験体に投与することを備える、被験体において癌細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢの阻害剤およびＪＮＫの活性化因子を備える組成物を被験体に投与することを備える、被験体において表面への癌細胞の再接着を阻害する方法。
【請求項４４】
ＮＦ−κＢの阻害剤およびＪＮＫの活性化因子を備える組成物を被験体に投与することを備える、被験体において癌細胞の転移を阻害する方法。
【請求項４５】
ＮＦ−κＢの阻害剤およびＪＮＫの活性化因子を備える組成物を被験体に投与することを備える、被験体において癌細胞の腫瘍形成を阻害する方法。
【請求項４６】
前記組成物が静脈内注射または点滴によって投与される、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が腹腔内投与される、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が手術前後に投与される、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が腹内手術の前に投与される、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が腹内手術の後に投与される、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌細胞が、腹部癌細胞、肝癌細胞、腹膜癌細胞、壁癌細胞、直腸癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、または結腸癌細胞である、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌細胞がＤＬＤ−１癌細胞系統またはＨＴ−２９癌細胞系統に関連する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌細胞がＨＴ−Ｓｕ．８６またはＢｘＰＣ−３細胞系統に関連する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＮＦ−κＢを直接的に阻害する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＮＦ−κＢを間接的に阻害する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＮＦ−κＢの発現を阻害する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＮＦ−κＢの翻訳を阻害する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が核へのＮＦ−κＢの輸送を阻害する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が少なくとも１つの電子吸引基を有するオレフィンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が少なくとも２つの電子吸引基を有するオレフィンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記電子吸引基が、シアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、非置換芳香族環、または少なくとも１つのシアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン、もしくはニトロ基を有する置換芳香族環を備える、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ホスホ−オキシ基が構造
【化２３】
2011520096.tif 000030
を有し、ここで、Ｒ１は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記スルホ−オキシ基が構造
【化２４】
2011520096.tif 000031
を有し、ここで、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がシアノ基および構造
【化２５】
2011520096.tif 000032
を有するスルホ−オキシ基を有するオレフィンを備え、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が構造
【化２６】
2011520096.tif 000033
を備え、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族であり、前記化合物がＥ−またはＺ−異性体である、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
Ｒ３およびＲ４が水素である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ｒ２がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、置換もしくは非置換フェニル、またはベンジルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
Ｒ２が少なくとも１つのアルキル基を有するフェニル基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記化合物がＥ−異性体である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が構造
【化２７】
2011520096.tif 000034
を備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤が構造
【化２８】
2011520096.tif 000035
を有する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＪＮＫ活性化因子がチアゾリジンジオンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記チアゾリジンジオンがロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、またはシグリタゾンからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＪＮＫ活性化因子がアニソマイシンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物がＮＦ−κＢ阻害剤
【化２９】
2011520096.tif 000036
およびロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、またはシグリタゾンからなる群より選択されるＪＮＫ活性化因子を備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物がＮＦ−κＢ阻害剤
【化３０】
2011520096.tif 000037
およびＪＮＫ活性化因子アニソマイシンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物がＮＦ−κＢ阻害剤
【化３１】
2011520096.tif 000038
およびロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、またはシグリタゾンからなる群より選択されるＪＮＫ活性化因子を備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記組成物がＮＦ−κＢ阻害剤
【化３２】
2011520096.tif 000039
およびＪＮＫ活性化因子アニソマイシンを備える、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年４月３日に出願された米国仮出願番号６１／０４１，９６６の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
懸濁培養に転換されたとき、または根底にある細胞外マトリックスから脱離されたときに、多くの接着細胞はアポトーシスを受ける（Ｓｔｒａｔｅｒら「Ｒａｐｉｄ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｏｌｌｏｗｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  β１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ／ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃｒｙｐｔ  ｃｅｌｌｓ」  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１０：１７７６−８４，１９９６）。このプロセスは、アノイキスと呼ばれており、組織恒常性の重要なメカニズムであり得る（Ｆｒｉｓｃｈら「Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２４：６１９−２６，１９９４）。一方、癌細胞は、足場非依存性増殖として知られる特徴である、接着の非存在下で増殖するそれらの能力について長い間知られてきた（Ｍａｒｔｉｎ「Ｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．ＢｉｓｈｏｐおよびＲ．Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１３−４０頁，１９９６所収）。癌細胞は、循環またはリンパ系を介して遠くの組織に移動および遊走するときに、接着の非存在下で一時的に生存しなくてはならないので、このことは転移に対して臨床的な関連性がある。転移の存在は、癌患者の生存の唯一の最も重要な予後指標であるので、転移を阻止するための労力は決定的に重要である。原発性腫瘍の転移を予防することは、自然にまたは外科的切除の時点のいずれかで癌細胞が循環系への接近を得る見かけの容易さによって妨げられている（Ｈａｎｓｅｎら「Ｂｌｏｏｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ：ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ」Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３９：６０８−１５，１９９９；Ｈａｎｓｅｎら「Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ」Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  １３０：３８７−９３，１９９５；Ｍｅｈｅｓら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５９：１７−２０，２００１）。最も切除可能な固形腫瘍のための治療の主たる様式が外科手術であるので、癌細胞の医原性接種は特に厄介である。
【０００３】
腹腔内癌接種および腹膜癌腫症は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、および卵巣癌などの腹部腫瘍の内科的および外科的な治療を複雑にしている（Ｄｅ  Ｖｉｔａら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第５版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；２００１）。腫瘍細胞の腹膜接種は、膵頭部癌の治癒的切除後に（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら「Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ２７（４）：８３１−４，１９９３）または腹腔内癌の転移を通して（Ｙｕら「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｏ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２２８（３）：３４７−５４，１９９８）、患者の３５％まで起こり得る。腹腔内癌の切除の間の腹腔内癌細胞の検出は、乏しい生存の前兆である（Ｆｕｊｉｗａｒａ「Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ」Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  ２７  Ｓｕｐｐｌ  ２：３５４−８，２０００；Ｋａｎｅｌｌｏｓら「Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ４６（４）：５３５−９，２００３；Ｎａｋａｔｓｕｋａら「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  ｃｏｎｔｒａｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｙ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  １（４）：３１１−７，１９９９；Ｓａｎｔａｌａら「Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｕｍ  ＣＡ  １２５  ｌｅｖｅｌ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３（３Ｃ）：３０９７−１０３，２００３；Ｔｅｒａｕｃｈｉら「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ  ａｎｄ  ｔｈ���  ｄｉａｐｈｒａｇｍ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７（６）：３５６−６０，２００２；Ｙａｃｈｉｄａら「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ」Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ８９（５）：５７３−８，２００２）。
【０００４】
腹腔内伝播の間の腫瘍移植に関与する因子は十分には理解されていない。しかし、結腸癌細胞の再接着の間、ＮＦ−κＢ活性は一過性かつ強力に増加されることが示されてきた（Ｓｃａｉｆｅら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２３）：６８７０−８，２００２）。ＮＦ−κＢは、癌細胞の生存の決定的な媒介因子であり、悪性細胞中で共通して過剰発現されており、このことがＮＦ−κＢを癌治療の選択的な標的にしている（Ｌｉｎｄら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ｓｕｒｇｅｒｙ  ３０（２）：３６３−９，２００１；Ｓｏｖａｋら「Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ／Ｒｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００（１２）：２９５２−６０，１９９７；Ｍｏｒｉら「Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ」Ｂｌｏｏｄ  ９３（７）：２３６０−８，１９９９；Ｗａｎｇら「Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ＲｅｌＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５（１）：１１９−２７，１９９９；Ｎａｋｓｈａｔｒｉら「Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７（７）：３６２９−３９，１９９７）。
【０００５】
転移、再接着、および癌細胞増殖の阻害を通して、癌に対するＮＦ−κＢの影響を阻害することに関連する組成物および方法が開示される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示される物質、化合物、組成物、物品、および方法の目的に従って、本明細書において具体化されかつ広範に記載されるように、１つの態様において、開示される対象は、組成物ならびにこのような組成物を調製および使用するための方法に関する。さらなる態様において、開示される対象は、癌を治療するため、より具体的には、癌細胞の腹膜接種を予防するためにＮＦ−κＢを阻害する小分子を使用する方法に関する。
【０００７】
さらなる利点は、以下に続く明細書中で部分的に示され、そして部分的には、その明細書から明白であり、または以下に記載される態様の実施によって学習されてもよい。以下に記載される利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現および達成される。前述の一般的記載と以下の詳細な記載の両方は単に典型的かつ説明的であって、制限的ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、本明細書とともに本発明の原理を説明する役目を果たす。
【図１−１】図１は、結腸癌細胞増殖に対するＮＦ−κＢ阻害剤の効果を示す一群のグラフである。ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９は、８日間、ＢＡＹ  １１−７０８２（図１Ａ）またはＢＡＹ  １１−７０８５（図１Ｂ）の存在下または非存在下で９６ウェルプレート上で培養された。細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色され、デオキシコール酸で可溶化され、そして分光光度計で５９０ｎｍにて読み取られた。凡例：対照（ＤＭＳＯ）四角、ＢＡＹ  ０．１μＭひし形、ＢＡＹ  １．０μＭ三角形、ＢＡＹ  １０．０μＭ卵形。データ点は、三連で行われた実験の平均値を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。図１Ｃは、３時間（左のパネル）または６時間（右のパネル）、ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５で処理されたＨＴ−２９細胞からの核溶解物中のＮＦ−κＢ  ＤＮＡコンセンサスオリゴヌクレオチドへのＮＦ−κＢ結合の阻害を示す電気泳動移動度シフトアッセイを示す。この図は、４回の実験の典型的な結果を示す。ゲルのデンシトメトリーデータは、図の下部のグラフ型に示される。過剰の非標識コンペティターＤＮＡオリゴヌクレオチドは、タンパク質−ＤＮＡ結合の特異性を実証するために使用された。
【図１−２】図１は、結腸癌細胞増殖に対するＮＦ−κＢ阻害剤の効果を示す一群のグラフである。ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９は、８日間、ＢＡＹ  １１−７０８２（図１Ａ）またはＢＡＹ  １１−７０８５（図１Ｂ）の存在下または非存在下で９６ウェルプレート上で培養された。細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色され、デオキシコール酸で可溶化され、そして分光光度計で５９０ｎｍにて読み取られた。凡例：対照（ＤＭＳＯ）四角、ＢＡＹ  ０．１μＭひし形、ＢＡＹ  １．０μＭ三角形、ＢＡＹ  １０．０μＭ卵形。データ点は、三連で行われた実験の平均値を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。図１Ｃは、３時間（左のパネル）または６時間（右のパネル）、ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５で処理されたＨＴ−２９細胞からの核溶解物中のＮＦ−κＢ  ＤＮＡコンセンサスオリゴヌクレオチドへのＮＦ−κＢ結合の阻害を示す電気泳動移動度シフトアッセイを示す。この図は、４回の実験の典型的な結果を示す。ゲルのデンシトメトリーデータは、図の下部のグラフ型に示される。過剰の非標識コンペティターＤＮＡオリゴヌクレオチドは、タンパク質−ＤＮＡ結合の特異性を実証するために使用された。
【図２】図２Ａは、ＮＦ−κＢ阻害剤、ＢＡＹ  １１−７０８２、およびＢＡＹ  １１−７０８５が、結腸癌細胞の足場非依存性増殖を減少させることを示すグラフである。ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞は、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８２、または１０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で、軟寒天で６日間培養された。データ点は、培養ディッシュの５つの異なる領域において実施された視野（２０倍）あたりのコロニー計数の平均を表す。示されるデータは、２回の別々の実験の典型的な結果を表す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ＨＴ−２９細胞（図Ｂ）またはＨＣＴ−１１６細胞（図Ｃ）の皮下注射を受け、その後、週に２回、５ｍｇ／ｍＬのＢＡＹ  １１−７０８５（暗いバー）またはＤＭＳＯ（白いバー）を腹腔内に受けた胸腺欠損マウスを示すグラフである。バーは腫瘍体積の２５〜７５％の範囲を表し、バーの中の横線はメジアンである。ＢＡＹ  １１−７０８５とＤＭＳＯの間のメジアン腫瘍体積を比較するためにクラスカル−ワリス統計的検定を使用して、ＨＴ−２９細胞について０．００５のｐ値を得たが、ＨＣＴ−１１６細胞については＞０．０５であった。
【図３−１】図３は、ＮＦ−κＢ阻害剤が結腸癌細胞のアポトーシスを引き起こすことを示す一群のグラフである。図３Ａは、接着細胞またはＨＴ−２９細胞が、２４時間、ＤＭＳＯ単独（対照）、１０および２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５、または２０μＭ  ＭＧ−１３２で処理されたことを示すグラフである。データ点は、三連の実験からのアネキシンＶ陽性、ヨウ化プロピジウム陰性細胞の平均パーセント（計数した全細胞の）を表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図３Ｂは、接着ＨＴ−２９細胞が、２４時間、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後、非接着細胞および接着細胞が別々に収集されたことを示すグラフである。示される結果は、ヨウ化プロピジウムを除外した細胞のうちアネキシンＶ陽性であった細胞のパーセンテージとして表現される個々のフローサイトメトリーの結果のグラフ表示である。図３Ｃは、接着ＨＣＴ−１１６細胞が、２４時間、２０μＭ  ＭＧ−１３２で処理され、その後、これらの細胞が収集されたことを示す。切断されたＰＡＲＰの溶解物のイムノブロットが実施された。各レーンは、等しい総タンパク質濃度を表す。図３Ｄは、ＨＴ−２９細胞のコンフルエントな単層が、３日間、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後、これらがトリプシン−ＰＢＳで分散されたことを示すグラフである。細胞は、１時間、プラスチックディッシュに接着され、その後、これらはＰＢＳ中で穏やかに洗浄され、クリスタルバイオレットで染色された。クリスタルバイオレット染色細胞は、デオキシコール酸で可溶化され、分光光度計で、５９０ｎｍにて吸収が検出された。接着細胞は対照の割合として表現された。各データ点は、三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図３−２】図３は、ＮＦ−κＢ阻害剤が結腸癌細胞のアポトーシスを引き起こすことを示す一群のグラフである。図３Ａは、接着細胞またはＨＴ−２９細胞が、２４時間、ＤＭＳＯ単独（対照）、１０および２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５、または２０μＭ  ＭＧ−１３２で処理されたことを示すグラフである。データ点は、三連の実験からのアネキシンＶ陽性、ヨウ化プロピジウム陰性細胞の平均パーセント（計数した全細胞の）を表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図３Ｂは、接着ＨＴ−２９細胞が、２４時間、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後、非接着細胞および接着細胞が別々に収集されたことを示すグラフである。示される結果は、ヨウ化プロピジウムを除外した細胞のうちアネキシンＶ陽性であった細胞のパーセンテージとして表現される個々のフローサイトメトリーの結果のグラフ表示である。図３Ｃは、接着ＨＣＴ−１１６細胞が、２４時間、２０μＭ  ＭＧ−１３２で処理され、その後、これらの細胞が収集されたことを示す。切断されたＰＡＲＰの溶解物のイムノブロットが実施された。各レーンは、等しい総タンパク質濃度を表す。図３Ｄは、ＨＴ−２９細胞のコンフルエントな単層が、３日間、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後、これらがトリプシン−ＰＢＳで分散されたことを示すグラフである。細胞は、１時間、プラスチックディッシュに接着され、その後、これらはＰＢＳ中で穏やかに洗浄され、クリスタルバイオレットで染色された。クリスタルバイオレット染色細胞は、デオキシコール酸で可溶化され、分光光度計で、５９０ｎｍにて吸収が検出された。接着細胞は対照の割合として表現された。各データ点は、三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図４−１】図４Ａは、結腸癌細胞の一時的懸濁物が、ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下でアポトーシスに対するそれらの感受性を非常に増加させることを示すグラフである。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて一時的に懸濁されたか、または３日間接着されたかのいずれかであったＨＴ−２９細胞は、時間０の時点で、ＤＭＳＯまたは１０〜１００μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。アポトーシス細胞のパーセントは、アネキシンＶフローサイトメトリーアッセイを使用して決定され、ＢＡＹ  １１−７０８５の用量に対してグラフ化された。図４ＢはＤＬＤ−１を示す写真であり、図４ＣはＨＣＴ−１１６を示す写真であり、そして図４Ｄはトリプシン−ＥＤＴＡに一時的に懸濁され、１〜２４時間カバーガラスに再接着されたＨＴ−２９細胞を示す写真である。細胞は固定され、ＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットモノクローナル抗体で免疫染色された。細胞の顕著に減少した核染色に対して、１時間における強力な核染色に注目のこと。
【図４−２】図４Ａは、結腸癌細胞の一時的懸濁物が、ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下でアポトーシスに対するそれらの感受性を非常に増加させることを示すグラフである。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて一時的に懸濁されたか、または３日間接着されたかのいずれかであったＨＴ−２９細胞は、時間０の時点で、ＤＭＳＯまたは１０〜１００μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。アポトーシス細胞のパーセントは、アネキシンＶフローサイトメトリーアッセイを使用して決定され、ＢＡＹ  １１−７０８５の用量に対してグラフ化された。図４ＢはＤＬＤ−１を示す写真であり、図４ＣはＨＣＴ−１１６を示す写真であり、そして図４Ｄはトリプシン−ＥＤＴＡに一時的に懸濁され、１〜２４時間カバーガラスに再接着されたＨＴ−２９細胞を示す写真である。細胞は固定され、ＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットモノクローナル抗体で免疫染色された。細胞の顕著に減少した核染色に対して、１時間における強力な核染色に注目のこと。
【図５−１】図５Ａは、こすりとることによって、またはトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、一時的に懸濁されたＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞のＮＦ−κＢ結合活性アッセイ（ＴｒａｎｓＡＭ）を示すグラフである。一時的に懸濁された細胞は溶解され、９６ウェルプレートに固定化されたＮＦ−κＢコンセンサス結合部位を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合された。オリゴヌクレオチドに結合したＮＦ−κＢタンパク質は、ＤＮＡに結合されるｐ６５のみを認識したｐ６５サブユニットに対する抗体によって検出された。陽性対照は、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞であった。対照は、過剰の遊離のＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（コンペティター）を使用して実施された。図５Ｂは、ＨＴ−２９細胞が一時的に懸濁され、３時間、ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下または非存在下で再接着され、その後、これらが溶解されたことを示すグラフである。ＮＦ−κＢ結合活性は、図５Ａと同様にＴｒａｎｓＡＭアッセイによって決定された。図５Ｃは、一時的に懸濁されたＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞が、８時間、ＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で再接着させられ、その後、アポトーシス細胞のパーセントがフローサイトメトリーアネキシンＶアッセイによって決定されたことを示すグラフである。示されるデータは、３回の別々の実験の典型的な結果を表す。図５Ｄは、４８時間、２９３−ＣＯＸ−２細胞が１μｇ／ｍＬのポナステロンの存在下または非存在下でインキュベートされ、その後、これらは溶解されたことを示す。ＣＯＸ−２のイムノブロットが実施された。図５Ｅは、２９３−ＣＯＸ−２細胞が、４８時間、ポナステロンの存在下または非存在下でインキュベートされ、続いて８時間、ＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５への曝露を行ったことを示すグラフである。ＣＯＸ−２の誘導がＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスへの感受性の増加を生じたことに注目のこと。
【図５−２】図５Ａは、こすりとることによって、またはトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、一時的に懸濁されたＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞のＮＦ−κＢ結合活性アッセイ（ＴｒａｎｓＡＭ）を示すグラフである。一時的に懸濁された細胞は溶解され、９６ウェルプレートに固定化されたＮＦ−κＢコンセンサス結合部位を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合された。オリゴヌクレオチドに結合したＮＦ−κＢタンパク質は、ＤＮＡに結合されるｐ６５のみを認識したｐ６５サブユニットに対する抗体によって検出された。陽性対照は、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞であった。対照は、過剰の遊離のＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（コンペティター）を使用して実施された。図５Ｂは、ＨＴ−２９細胞が一時的に懸濁され、３時間、ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下または非存在下で再接着され、その後、これらが溶解されたことを示すグラフである。ＮＦ−κＢ結合活性は、図５Ａと同様にＴｒａｎｓＡＭアッセイによって決定された。図５Ｃは、一時的に懸濁されたＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞が、８時間、ＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で再接着させられ、その後、アポトーシス細胞のパーセントがフローサイトメトリーアネキシンＶアッセイによって決定されたことを示すグラフである。示されるデータは、３回の別々の実験の典型的な結果を表す。図５Ｄは、４８時間、２９３−ＣＯＸ−２細胞が１μｇ／ｍＬのポナステロンの存在下または非存在下でインキュベートされ、その後、これらは溶解されたことを示す。ＣＯＸ−２のイムノブロットが実施された。図５Ｅは、２９３−ＣＯＸ−２細胞が、４８時間、ポナステロンの存在下または非存在下でインキュベートされ、続いて８時間、ＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５への曝露を行ったことを示すグラフである。ＣＯＸ−２の誘導がＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスへの感受性の増加を生じたことに注目のこと。
【図６】図６は、腹腔内接種モデルを示す一群の写真である。図６Ａ、Ｂ、Ｃは、ＨＴ−２９細胞の腹腔内注射を受容した２１日後の３匹の胸腺欠損マウスの肝臓の腫瘍移植物を示す。これらのマウスは、合計２１日間、１週間に２回、ＤＭＳＯで前処理および処理された。図６Ｄは、ＨＴ−２９細胞の腹腔内注射の２１日後の胸腺欠損マウスの腸腫瘍移植物（矢印）を示す。マウスは、合計２１日間、１週間に２回、ＤＭＳＯで前処理および処理された。図６Ｅは、肝臓被膜を通した腫瘍侵襲を示す顕微鏡写真である。この切片は、図６Ａのマウスからの腫瘍移植物から得られた。図６Ｆは、図６Ａのマウスの腸壁から取られた腹膜腫瘍移植物を示す。図６Ｇ（肝臓）、図６Ｈ（腹壁）、および図６Ｉ（腸）は、ＨＣＴ−１１６細胞の腹腔内注射を受けた２１日後の３匹の胸腺欠損マウスにおける腫瘍移植物を示す。すべてのマウスは、１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇのＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。
【図７−１】図７Ａは、ＤＬＤ−１  ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞が、１０または５０μｇ／ｍＬのｃＡ２の存在下または非存在下で１０日間９６ウェルプレートで培養されたことを示すグラフである。様々な時点において、細胞は、固定され、クリスタルバイオレットで染色され、デオキシコール酸で可溶化され、そして分光光度計で５９０ｎｍにおいて読み取られた。データ点は三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。図７Ｂは、接着ＨＴ−２９細胞が５０μｇ／ｍＬのｃＡ２で４８時間前処理され、続いて、さらに２４時間、ＤＭＳＯまたは２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５の添加を行ったことを示すグラフである。次いで、アポトーシス細胞のパーセントは、アネキシンＶアッセイによって決定された。同様の結果はＤＬＤ−１細胞についても得られた。示される結果は、２回の別々の実験に典型的なものである。図７Ｃは、接着または一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞が、８時間、２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後これらが溶解されたことを示す。イムノブロットは、ｃ−ＩＡＰ−２、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、およびＦＬＩＰについて実施された。全てのレーンは等しい総タンパク質を含有する。図７ＤはＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９溶解物のＦＬＩＰイムノブロットを示す。
【図７−２】図７Ａは、ＤＬＤ−１  ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞が、１０または５０μｇ／ｍＬのｃＡ２の存在下または非存在下で１０日間９６ウェルプレートで培養されたことを示すグラフである。様々な時点において、細胞は、固定され、クリスタルバイオレットで染色され、デオキシコール酸で可溶化され、そして分光光度計で５９０ｎｍにおいて読み取られた。データ点は三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。図７Ｂは、接着ＨＴ−２９細胞が５０μｇ／ｍＬのｃＡ２で４８時間前処理され、続いて、さらに２４時間、ＤＭＳＯまたは２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５の添加を行ったことを示すグラフである。次いで、アポトーシス細胞のパーセントは、アネキシンＶアッセイによって決定された。同様の結果はＤＬＤ−１細胞についても得られた。示される結果は、２回の別々の実験に典型的なものである。図７Ｃは、接着または一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞が、８時間、２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後これらが溶解されたことを示す。イムノブロットは、ｃ−ＩＡＰ−２、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、およびＦＬＩＰについて実施された。全てのレーンは等しい総タンパク質を含有する。図７ＤはＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９溶解物のＦＬＩＰイムノブロットを示す。
【図８】図８は、一時的に懸濁され、かつ様々な濃度のＮＦ−κＢ阻害剤、ＰＤＴＣ、ＢＡＹ  １１−７０８５、およびＭＧ−１３２の存在下または非存在下で、４時間再接着されたＨＴ−２９細胞を示すグラフである。アポトーシス細胞のパーセンテージはアネキシンＶアッセイを使用して決定された。データ点は３回の実験の平均を表し；バーは＋−．ＳＥを表す。Ｅ．ＤＬＤ−１細胞およびＦ．ＨＴ−２９細胞は、ＩκＢスーパーリプレッサー構築物を含有するアデノウイルスで形質導入された。３日後、細胞は一時的に懸濁され、８時間、アポトーシス濃度より下のＢＡＹ  １１−７０８５またはＤＭＳＯ（媒体）の存在下で再接着された。データは、対照（アデノウイルスなし）と比較された生存している細胞の割合として表現され、残存している接着細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって定量的に決定された。
【図９−１】図９Ａ−Ｃは、ＢＡＹ  １１−７０８５がインビトロで膵臓癌および結腸癌の細胞再接着の間にＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示すグラフである。一時的に懸濁された膵臓癌細胞（Ｓｕ．８６、ＰＬ４５、ＢｘＰＣ−３）および結腸癌細胞（ＨＴ−２９）（ウェル（９６ウェルプレート）あたり１０５細胞）は、４時間、媒体または様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で再接着された。核溶解物中のＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのレベルは、ＥＬＩＳＡベースのキットを用いて実施された。データ点は三連の結果の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。ＢＡＹ  １１−７０８５の各濃度の結果は、媒体単独で得られたレベルに対して標準化された。実験は２〜３回実施された。
【図９−２】図９Ａ−Ｃは、ＢＡＹ  １１−７０８５がインビトロで膵臓癌および結腸癌の細胞再接着の間にＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示すグラフである。一時的に懸濁された膵臓癌細胞（Ｓｕ．８６、ＰＬ４５、ＢｘＰＣ−３）および結腸癌細胞（ＨＴ−２９）（ウェル（９６ウェルプレート）あたり１０５細胞）は、４時間、媒体または様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で再接着された。核溶解物中のＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのレベルは、ＥＬＩＳＡベースのキットを用いて実施された。データ点は三連の結果の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。ＢＡＹ  １１−７０８５の各濃度の結果は、媒体単独で得られたレベルに対して標準化された。実験は２〜３回実施された。
【図１０】図１０は、ＢＡＹ  １１−７０８５が再接着の間に膵臓癌細胞および結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することを示すグラフである。膵臓癌細胞（Ｓｕ．８６、ＰＬ―４５）および結腸癌細胞（ＨＴ−２９）は一時的に懸濁され、８時間、媒体または様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５の存在下または非存在下で再接着された。浮遊細胞および接着細胞は収集および溶解された。細胞がアポトーシスを受けていたか否かを決定するために、切断されたＰＡＲＰのウェスタンブロットが実施された（図１０Ａ）。一時的に懸濁された膵臓癌細胞（ウェルあたり１０５細胞）は、２４時間、媒体または様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で再接着された。非接着アポトーシス細胞は洗浄して除かれ、残存する接着細胞はクリスタルバイオレットで染色され、次いで乾燥された。クリスタルバイオレット染色細胞は溶解され、吸収がプレート分光光度計で読み取られた（図１０Ｂ）。各データ点は三連の結果の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。結果は媒体単独と比較された生存している細胞のパーセンテージとして表現される。
【図１１−１】図１１は、ホタルルシフェラーゼを安定に形質移入された膵臓癌細胞の生物発光検出を示す写真である。図１１Ａ−Ｂは、１０６個のＳｕ．８６膵臓癌細胞の腹腔内注射の９日後における５匹の胸腺欠損マウスの画像を示す。腹腔内腫瘍移植物を可視化するために、これらのマウスは、ホタルＤ−ルシフェリンを腹腔内で受容し、次いで、安楽死させられた。腹腔内腫瘍は、マウスを屠殺する前（Ａ）または安楽死後でありかつ腹腔内空洞の曝露後（Ｂ）に可視化された。図１１Ｃは、生物発光画像化によって検出された肝臓の端における辛うじて見える腫瘍移植物の解剖顕微鏡画像である（図１１Ａの矢印）。図１１Ｄは肝臓移植物の拡大画像である。
【図１１−２】図１１は、ホタルルシフェラーゼを安定に形質移入された膵臓癌細胞の生物発光検出を示す写真である。図１１Ａ−Ｂは、１０６個のＳｕ．８６膵臓癌細胞の腹腔内注射の９日後における５匹の胸腺欠損マウスの画像を示す。腹腔内腫瘍移植物を可視化するために、これらのマウスは、ホタルＤ−ルシフェリンを腹腔内で受容し、次いで、安楽死させられた。腹腔内腫瘍は、マウスを屠殺する前（Ａ）または安楽死後でありかつ腹腔内空洞の曝露後（Ｂ）に可視化された。図１１Ｃは、生物発光画像化によって検出された肝臓の端における辛うじて見える腫瘍移植物の解剖顕微鏡画像である（図１１Ａの矢印）。図１１Ｄは肝臓移植物の拡大画像である。
【図１２−１】図１２は、チアゾリジンジオンが、細胞再接着の間にＮＦ−κＢ活性化を阻害し、膵臓癌細胞および結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図１２Ａは、一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞が、３時間、媒体（ＤＭＳＯ）または様々な濃度のロシグリタゾン（暗いバー）の存在下で再接着されたことを示す。未処理接着単層（対照）およびＴＮＦαで処理されたジャーカット細胞（ジャーカット対照）は対照の役目を果たした。細胞は収集され、ＥＬＩＳＡにおいてＮＦ−κＢ活性化について分析された（方法を参照のこと）。図１２Ｂは、一時的に懸濁されたＨＴ−２９癌細胞が、８時間、ＤＭＳＯ、シグリタゾン、ロシグリタゾン、またはトログリタゾンの存在下で再接着されたことを示す。浮遊細胞および再接着細胞は収集され溶解された。細胞溶解物のアリコートは、切断されたＰＡＲＰイムノブロットを生成するために使用された。すべてのレーンは等しい総タンパク質濃度を含み、アクチンブロットはローディング対照の役目を果たした。示されるブロットは二連の実験の代表的なものである。図１２Ｃ−Ｅは、一時的に懸濁されたＢｘＰＣ−３、Ｓｕ．８６、およびＨＴ−２９癌細胞が、８時間、媒体（ＤＭＳＯ）または様々な濃度のシグリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、およびトログリタゾンの存在下で、再接着されたことを示す。浮遊細胞は洗浄して除き、次いで、接着細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色された。細胞はデオキシコール酸で溶解され、染色の強度は分光光度計によって定量された。結果は対照に対して標準化される。各データ点は三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差である。
【図１２−２】図１２は、チアゾリジンジオンが、細胞再接着の間にＮＦ−κＢ活性化を阻害し、膵臓癌細胞および結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図１２Ａは、一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞が、３時間、媒体（ＤＭＳＯ）または様々な濃度のロシグリタゾン（暗いバー）の存在下で再接着されたことを示す。未処理接着単層（対照）およびＴＮＦαで処理されたジャーカット細胞（ジャーカット対照）は対照の役目を果たした。細胞は収集され、ＥＬＩＳＡにおいてＮＦ−κＢ活性化について分析された（方法を参照のこと）。図１２Ｂは、一時的に懸濁されたＨＴ−２９癌細胞が、８時間、ＤＭＳＯ、シグリタゾン、ロシグリタゾン、またはトログリタゾンの存在下で再接着されたことを示す。浮遊細胞および再接着細胞は収集され溶解された。細胞溶解物のアリコートは、切断されたＰＡＲＰイムノブロットを生成するために使用された。すべてのレーンは等しい総タンパク質濃度を含み、アクチンブロットはローディング対照の役目を果たした。示されるブロットは二連の実験の代表的なものである。図１２Ｃ−Ｅは、一時的に懸濁されたＢｘＰＣ−３、Ｓｕ．８６、およびＨＴ−２９癌細胞が、８時間、媒体（ＤＭＳＯ）または様々な濃度のシグリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、およびトログリタゾンの存在下で、再接着されたことを示す。浮遊細胞は洗浄して除き、次いで、接着細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色された。細胞はデオキシコール酸で溶解され、染色の強度は分光光度計によって定量された。結果は対照に対して標準化される。各データ点は三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差である。
【図１３】図１３は、チアゾリジンジオンが、細胞接着の間に、ＰＰＡＲγ非依存性様式で、膵臓癌細胞および結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図１３Ａ−Ｂは、一時的に懸濁されたＳｕ．８６癌細胞（ＰＰＡＲγ陰性）およびＨＴ−２９癌細胞（ＰＰＡＲγ陽性）が、８時間、様々な濃度のシグリタゾンの存在下で再接着されたことを示す。これらの細胞は、再接着の間に、不可逆的ＰＰＡＲγ阻害剤ＧＷ９６６２とともにまたはこの阻害剤なしでもまたインキュベートされた。浮遊細胞は洗浄して除かれ、次いで、接着細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色された。これらの細胞はデオキシコール酸で溶解され、染色の強度は分光光度計によって定量された。結果は対照に対して標準化される。各データ点は三連の実験の平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１４】図１４である。
【図１５】図１５である。
【図１６】図１６である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
本明細書に記載される物質、化合物、組成物、物品、装置、および方法は、開示される対象の特定の態様の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図面への参照によって、より容易に理解されることが可能である。
【００１０】
本発明の物質、化合物、組成物、物品、装置、および方法が開示および記載される前に、以下に記載される態様は、特定の合成方法または特定の試薬に限定されず、当然、それ自体は、変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的のみのためであって、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１１】
また、本明細書を通して、種々の刊行物が引用される。開示されるものが属する技術分野の状態をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示は、それによって、参照によりそれらの全体が本願に組み込まれる。開示される参考文献はまた、その文献が依存する文の中で議論されている、これらに含まれる物質について、参照により個別にかつ具体的に本明細書に組み込まれる。
【００１２】
一般的定義
本明細書および続く特許請求の範囲において、多数の用語に言及が行われ、これらの用語は以下の意味を有すると定義されるべきである。
【００１３】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「備える」という言葉、ならびに「備えていること」および「備えて」などのこの言葉の他の型は、含むがこれに限定されないことを意味しており、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図しない。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」「１個の」および「その」は、文脈が明確に反対の意味を示さない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「１種の組成物」との言及は、２種以上のこのような組成物の混合物を含み、「１種の剤」との言及は、２種以上のこのような剤の混合物を含み、「その成分」との言及は２種以上のこのような成分の混合物を含む、等々である。
【００１５】
範囲は、「約」特定の１つの値から、かつ／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表現できる。このような範囲が表現されるとき、別の態様は、１つの特定の値から、かつ／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって、値が概算として表現されるとき、特定の値が別の態様を形成することが理解される。範囲の各々の終点は、他の終点に関連して、そして他の終点とは独立しての両方で、有意であることがさらに理解される。本明細書に開示される多数の値が存在していること、および各値は、値それ自体に加えて、「約」その特定の値としてもまた本明細書で開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「約１０」もまた開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が開示される場合、その値「以下」、その値「以上」、およびこれらの値の間の可能な範囲もまた開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた開示される。本願を通して、多数の異なる形式でデータが提供されること、およびこのデータが終点および開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた理解される。例えば、「１０」という特定のデータ点および「１５」という特定のデータ点が開示される場合、１０と１５の間と同様に、１０および１５より大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５に等しいが開示されていると見なされることが理解される。２つの特定の単位の間の各単位もまた開示されることもまた理解される。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３、および１４もまた開示されることもまた理解される。
【００１６】
明細書および結論的な特許請求の範囲における、組成物中の特定の要素または成分の重量部への言及は、重量部が表現されている組成物または物品中の要素または成分と、任意の他の要素または成分との間の重量の関連性を示す。従って、２重量部の成分Ｘおよび５重量部の成分Ｙを含む化合物において、ＸおよびＹは２：５の重量比で存在し、そしてさらなる成分がこの化合物中に含有されるか否かに関わらず、このような比率で存在する。
【００１７】
具体的に反対に言及されていない限り、成分の重量パーセント（ｗｔ．％）は、成分が含まれる製剤または組成物の総重量に基づく。
【００１８】
「任意の」または「任意に」とは、続いて記載される事象または状況が存在してもよくまたは存在しなくてもよいこと、その説明が上記事象または状況が存在する場合とそれが存在しない場合を含むことを意味する。
【００１９】
化学的定義
本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、有機化合物のすべての許容できる置換基を含むことが意図される。広い態様において、許容できる置換基は、非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環および複素環、ならびに芳香族および非芳香族の有機化合物の置換基を含む。例証的な置換基は、例えば、以下に記載されるものを含む。許容できる置換基は１つ以上であり得、適切な有機化合物に対して同じかまたは異なる。この開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはヘテロ原子の価数を満足する本明細書に開示される有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。この開示は、いかなる様式においても、有機化合物の許容できる置換基によって限定されることが意図されない。また、「置換」または「で置換される」という用語は、このような置換が置換される原子および置換基の許容できる価数に一致していること、および置換が安定な化合物、例えば、再配列、環化、脱離などによるなどの変換を自発的には受けない化合物を生じることという暗黙の条件を含む。
【００２０】
「Ａ１」、「Ａ２」、「Ａ３」、および「Ａ４」は、種々の特定の置換基を表すための一般的記号として本明細書で使用される。これらの記号は任意の置換基であり得、本明細書に開示されるものに限定されず、これらは１つの例において特定の置換基に限定されるとき、これらは別の例においてある他の置換基として定義され得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどの１〜２４個の炭素原子の分枝または非分枝飽和炭化水素基である。アルキル基はまた、置換可能であり、または非置換であり得る。アルキル基は、以下に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１つ以上の基で置換できる。
【００２２】
本明細書を通して、「アルキル」は、一般的には、非置換アルキル基と置換アルキル基の両方に言及するために使用される；しかし、置換アルキル基はまた、アルキル基上の特定の置換基を同定することによって本明細書において具体的に言及される。例えば、「ハロゲン化アルキル」という用語は、１種以上のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されているアルキル基を具体的にいう。「アルコキシアルキル」という用語は、以下に記載されるような１種以上のアルコキシ基で置換されているアルキル基を具体的にいう。「アルキルアミノ」という用語は、以下に記載されるような１種以上のアミノ基で置換されているアルキル基を具体的にいう。以下同様である。「アルキル」が１つの例において使用され、「アルキルアルコール」などの特定の用語が別の例において使用されるとき、「アルキル」という用語は「アルキルアルコール」などの特定の用語にもまた言及しているわけではないことを暗示することを意味するものではない。以下同様である。
【００２３】
この実務は、本明細書に記載される他の基についてもまた使用される。すなわち、「シクロアルキル」などの用語が非置換と置換の両方のシクロアルキル部分をいうときに、置換部分は、さらに、本明細書で具体的に同定可能である；例えば、特定の置換シクロアルキルが、例えば、「アルキルシクロアルキル」として言及可能である。同様に、置換アルコキシは、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」と具体的に言及可能であり、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」と言及可能であり、以下同様である。再度、「シクロアルキル」などの一般的な用語、および「アルキルシクロアルキル」などの具体的な用語を使用する実務は、一般的な用語が具体的な用語もまた含まないことを暗示することを意味するわけではない。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、単一の末端エーテル結合を通して結合されたアルキル基であり；すなわち、「アルコキシ」基は、Ａ１が上記に定義されるようなアルキルである−ＯＡ１として定義できる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、アルコキシルアルキルは、アルコキシ置換基を含むアルキル基であり、Ａ１およびＡ２がアルキル基である−Ａ１−Ｏ−Ａ２として定義できる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）などの非対称構造は、Ｅ異性体とＺ異性体の両方を含むことが意図される。これは、非対称アルケンが存在する本明細書の構造式にあると推測され得るか、またはこれが結合の記号Ｃ＝Ｃによって明白に示され得る。アルケニル基は、以下に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１種以上の基で置換できる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は、以下に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１種以上の基で置換できる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを含むがこれらに限定されない任意の炭素ベースの芳香族基を含む基である。「アリール」という用語は「ヘテロアリール」もまた含み、これは、芳香族基の環の中に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含む基として定義される。ヘテロ原子の例は、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含むがこれらに限定されない。同様に、「アリール」という用語の中にもまた含まれる「非ヘテロアリール」という用語は、ヘテロ原子を含まない芳香族基を含む基を定義する。アリール基は置換可能であり、非置換でもあり得る。アリール基は、本明細書に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１種以上の基で置換できる。「ビアリール」という用語はアリール基の特別な型であり、アリールの定義の中に含まれる。ビアリールとは、ナフタレンにおけるように、縮合環構造を介して一緒に結合されている２つのアリール基をいい、またはビフェニルにおけるように、１つ以上の炭素−炭素結合を介して接続されている。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、少なくとも３個の炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むがこれらに限定されない。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、環の炭素原子の少なくとも１つが、窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されないヘテロ原子で置換されている、上記に定義されたシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は置換可能であり、または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、本明細書に記載されるように、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１種以上の基で置換できる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも３個の炭素原子から構成され、少なくとも１個の二重結合、すなわち、Ｃ＝Ｃを含む非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルケニル基の例は、シクロプロペニル，シクロブテニル，シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどを含むがこれらに限定されない。「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、上記に定義したようなシクロアルケニル基の１つの型であり、環の少なくとも１つの炭素原子が、窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されないヘテロ原子で置換されている「シクロアルケニル」という用語の意味の中に含まれる。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は置換可能であり、または非置換であり得る。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、本明細書に記載されるように、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを含むがこれらに限定されない１種以上の基で置換できる。
【００３１】
「環状基」という用語は、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、シクロアルケニル基、およびヘテロシクロアルケニル基）、またはその両方のいずれかをいうために本明細書で使用される。環状基は、置換可能であり、または非置換であり得る１つ以上の環系を有する。環状基は、１つ以上のアリール基、１つ以上の非アリール基、または１つ以上のアリール基および１つ以上の非アリール基を含むことができる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「アルデヒド」という用語は式−Ｃ（Ｏ）Ｈによって表される。本明細書を通して、「Ｃ（Ｏ）」はＣ＝Ｏの短縮表記である。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「アミン」または「アミノ」という用語は式ＮＡ１Ａ２Ａ３によって表され、ここで、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、上記の水素、アルキル，ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「カルボン酸」という用語は、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表される。本明細書において使用される場合、「カルボキシレート」は式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって表される。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「エステル」という用語は、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１によって表され、ここで、Ａ１は、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「エーテル」という用語は、式Ａ１ＯＡ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「ケトン」という用語は式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「ハライド」という用語は、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「ヒドロキシル」という用語は式−ＯＨによって表される。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「ニトロ」という用語は式−ＮＯ２によって表される。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「シリル」という用語は、式−ＳｉＡ１Ａ２Ａ３によって表され、ここで、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「スルホ−オキソ」という用語は、式−Ｓ（Ｏ）Ａ１、−Ｓ（Ｏ）２Ａ１、−ＯＳ（Ｏ）２Ａ１、または−ＯＳ（Ｏ）２ＯＡ１によって表され、ここで、Ａ１は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。本明細書を通して、「Ｓ（Ｏ）」はＳ＝Ｏの短縮表記である。
【００４３】
「スルホニル」という用語は、式−Ｓ（Ｏ）２Ａ１によって表されるスルホ−オキソ基をいうために本明細書で使用され、ここで、Ａ１は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」という用語は、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−によって表される。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「スルホン」という用語は、式Ａ１Ｓ（Ｏ）２Ａ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「スルホキシド」という用語は、式Ａ１Ｓ（Ｏ）Ａ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「チオール」という用語は、式−ＳＨによって表される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、ｎが整数である場合の「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」、「Ｒｎ」は、独立して、上記に列挙された１つ以上の基を保有することができる。例えば、Ｒ１が直鎖アルキル基である場合、アルキル基の１つの水素原子は、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、ハライドなどで任意に置換できる。選択される基に依存して、第１の基は第２の基の中に組み込み可能であり、または代替的に、第１の基は第２の基のペンダントとなる（すなわち、取り付けられる）ことが可能である。例えば、「アミノ基を備えるアルキル基」という語句により、アミノ基は、アルキル基の骨格の中に組み込むことができる。代替的に、アミノ基は、アルキル基の骨格に取り付け可能である。選択される基の性質は、第１の基が第２の基に埋め込まれるかまたは取り付けられるかを決定する。
【００４９】
反対に言及しない限り、実線としてのみ示され、くさび形または破線としては示されていない化学結合を有する化学式は、各々の可能な異性体、例えば、各々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ混合物またはスカレミック混合物などの異性体の混合物を意図する。
【００５０】
本明細書に開示される特定の物質、化合物、組成物、および成分は、商業的に入手可能であるか、または当業者に一般的に公知である技術を使用して容易に合成可能である。例えば、開示される化合物および組成物を調製する際に使用される出発物質および試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、もしくはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）などの商業的な供給業者から利用可能であるか、またはＦｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５および補遺（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）などの参考文献に示されている手順に従って、当業者に公知である技術によって調製される。
【００５１】
ここで、開示される物質、化合物、組成物、物品、および方法の科学的態様に対する参照が詳細に行われ、その例は付随する実施例および図面において例証される。
【００５２】
ＮＦ−κＢ阻害
ＮＦ−κＢは、種々のタンパク質サブユニット：ｐ５０／ｐ１０５、ｐ６５／ＲｅｌＡ、ｐ５２／ｐ１００、ｃ−Ｒｅｌ、およびＲｅｌＢから構成されるヘテロ二量体転写因子である。ＮＦ−κＢはＩκＢタンパク質との結合によって細胞質に局在化し、これは、ＮＦ−κＢの核への移行を阻害し、従って、その転写活性を妨害する（Ｂｅｇら「ＩκＢ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１８９９−９１３，１９９２）。サイトカイン、反応性酸素種、成長因子、および他の刺激の影響下で、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）はＩκＢタンパク質を２つの決定的に重要なセリン残基上でリン酸化する（ＤｉＤｏｎａｔｏら「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＩｋａｐｐａＢ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｔｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：１２９５−３０４，１９９６；Ｔｒａｅｎｃｋｎｅｒら「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩκＢ−α  ｏｎ  ｓｅｒｉｎｅｓ  ３２  ａｎｄ  ３６  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＩκＢ−α  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ＮＦ−κＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｔｉｍｕｌｉ」Ｅｍｂｏ  Ｊ  １４：２８７６−８３，１９９５）。次いで、これは、ユビキチン化および引き続くプロテアソームによる分解のためにＩκＢタンパク質を標的とし、このことは、核に移行する遊離のＮＦ−κＢを生じ、それらのプロモーター中にκＢコンセンサスＤＮＡ結合部位を保有する種々の遺伝子の転写を活性化する（Ａｌｋａｌａｙら「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＩκＢ  α−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｓ  ｔｈｅ  ＮＦ−κＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１０５９９−６０３，１９９５；Ｃｈｅｎら「Ｓｉｇｎａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＩκＢ−α  ｔｏ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９：１５８６−９７，１９９５；Ｈｅｎｋｅｌら「Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉ  ｋａｐｐａ  Ｂ−α  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−κＢ」Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：１８２−５，１９９３）。ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子の多くは、ＣＯＸ−２（Ｃｒｏｆｆｏｒｄら「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４０：２２６−３６，１９９７；Ｎｅｗｔｏｎら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＣＯＸ−２  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＩＬ−１β」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７：２８−３２，１９９７；Ｎｅｗｔｏｎら「Ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＮＦ−κＢ  ａｎｄ  ＪＮＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１８：１３５−８，１９９７；Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅら「Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：６０１，１９９７）を含む炎症を促進するタンパク質、およびＶＥＧＦなどの血管新生因子（Ｈｕａｎｇら「Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：４１８８−９７，２００１）をコードする。加えて、ＮＦ−κＢは、いくつかの生存遺伝子、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ｐ５３、ｐ２１、ｃ−ＦＬＩＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＸＩＡＰ、ＩＥＸ−１Ｌ、ＣＯＸ−２、ＴＲＡＦ−１、およびＴＲＡＦ−２の転写を媒介する（Ｋｒｅｕｚら「ＮＦ−κＢ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃＦＬＩＰ，ａ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：３９６４−７３，２００１；Ｓｃｈｗａｒｔｚら「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ／ＩκＢ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１５３，１９９９；Ｓｔｅｈｌｉｋら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＦ）−ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉａｐ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：２１１−６，１９９８；Ｗａｎｇら「ＮＦ−κＢ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＡＦ１  ａｎｄ  ＴＲＡＦ２  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ１  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ２  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６８０−３，１９９８；Ｗｕら「ＩＥＸ−１Ｌ，ａｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＮＦ−κＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：９９８−１００１，１９９８）。
【００５３】
足場非依存性増殖と同様に足場依存性増殖を、および腫瘍形成を阻害可能であり、膵臓癌細胞および結腸癌細胞を含む癌細胞のアポトーシスを引き起こすことが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤が本明細書で開示される。ＮＦ−κＢ阻害による癌細胞のアポトーシスの誘導は、細胞接着依存性様式で起こり得る。細胞系統の一時的懸濁後の再接着は、ＮＦ−κＢの大きな活性化を引き起こし、これは、ＮＦ−κＢ阻害剤で誘導されるアポトーシスに対して細胞を鋭敏に感受性にする。さらに、胸腺欠損マウスのＮＦ−κＢ阻害剤での前処理は、結腸癌細胞系統の腹腔内送達後の肝臓転移を完全に予防した。従って、結腸癌細胞ならびに結腸癌細胞と関連する癌細胞は、有糸分裂誘発のため、および再接着の間の主要な生存因子としてＮＦ−κＢを利用する。
【００５４】
本明細書に示されるように、結腸癌細胞および膵臓癌細胞のような再接着している癌細胞のＮＦ−κＢ阻害剤での処理は、アポトーシスを顕著に誘導した。マウスにおけるインビボ研究は、ＮＦ−κＢ阻害剤であるＢＡＹ  １１−７０８５が、結腸癌細胞の腹腔内注射後のマウスにおいて、腹腔内空洞の結腸癌細胞および膵臓癌細胞の移植を阻害した。さらに、すべてのＮＦ−κＢ阻害剤が再接着している結腸癌細胞および膵臓癌細胞のアポトーシスを誘導するわけではなく、このことは、ＢＡＹ  １１−７０８５のような阻害剤についての作用のさらなるメカニズムを示唆している。例えば、ＢＡＹ  １１−７０８５は、ＦＬＩＰの急速なダウンレギュレーションを媒介していることが最近示されたＪＮＫ／ＳＡＰＫ活性もまた活性化した。ＦＬＩＰ／ＦＬＩＣＥ／ＣＡＳＨ／ＦＬＡＭＥ／ＣＡＳＰＥＲは、ＮＦ−κＢによって調節されている多数の生存促進遺伝子の１つであるＣＦＬＡＲによってコードされている。ＦＬＩＰはカスパーゼ８、従って、死受容体誘導性アポトーシスの重要な阻害剤である。ＢＡＹ  １１−７０８５およびＪＮＫ活性化因子であるアニソマイシンは、ＦＬＩＰの急速なダウンレギュレーションを引き起こすことが示された。ＦＬＩＰ過剰発現は、結腸癌細胞再接着の間に、ＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス促進活性を阻害した。
【００５５】
本明細書に開示されるＮＦ−κＢ阻害剤は、ＮＦ−κＢ機能を阻害し、ＪＮＫを活性化する任意の分子であり得る。ＮＦ−κＢ機能は、多くのやり方でＮＦ−κＢ阻害剤によって阻害または変化されることが可能であることが理解される。例えば、ＮＦ−κＢ機能は、ＮＦ−κＢと直接的に相互作用するＮＦ−κＢ阻害剤によって阻害されることが可能である。ＮＦ−κＢと直接的に相互作用するとは、阻害剤がＮＦ−κＢと接触または結合することを意味する。ＮＦ−κＢ阻害剤は、ＮＦ−κＢ機能を間接的に阻害することもまた可能である。ＮＦ−κＢの機能を間接的に阻害するとは、ＮＦ−κＢ阻害剤がＮＦ−κＢに接触または結合しないことを意味する。分子は、例えば、ＮＦ−κＢの発現または活性化または核輸送を減少させることによって、ＮＦ−κＢ機能を間接的に阻害する。
【００５６】
間接的ＮＦ−κＢ阻害剤の例は、核へのＮＦ−κＢの輸送を阻害するものである。ＮＦ−κＢは、ＩκＢと相互作用する場合、細胞質にとどまっている。ＩκＢがリン酸化されるとき、これは、ＩκＢがユビキチン化され、分解されることを引き起こし、ＮＦ−κＢが核に輸送されることを可能にする。特定の例において、本発明の開示される組成物は、ＩκＢとの相互作用を通して核へのＮＦ−κＢの輸送を阻害でき、このことは、ＩκＢがＮＦ−κＢと相互作用することを阻害する。核へのＮＦ−κＢ輸送を阻害する間接的なＮＦ−κＢ阻害剤の他の例は、ＩκＢリン酸化を阻害するＮＦ−κＢ阻害剤である。間接的ＮＦ−κＢ阻害剤のなお他の例は、ＮＦ−κＢの発現を阻害するＮＦ−κＢ阻害剤である。間接的ＮＦ−κＢ阻害剤のなお他の例は、ＮＦ−κＢの翻訳を阻害するＮＦ−κＢ阻害剤である。
【００５７】
典型的には、開示されるＮＦ−κＢ阻害剤は、ＴＮＦα誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害することが可能である。典型的には、ＴＮＦαはＮＦ−κＢの活性化を引き起こし、開示される阻害剤はこのＴＮＦα誘導性活性化を減少することが可能である。多くのアッセイが、ＮＦ−κＢ阻害剤がＴＮＦα依存性活性化を減少しているか否かを決定するために使用されることが可能である。
【００５８】
足場依存性および非依存性の増殖ならびに腫瘍形成を阻害することが可能であり、アポトーシスを引き起こすことが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤もまた開示される。なおさらに、細胞接着依存性様式で起こる、ＮＦ−κＢ阻害によるアポトーシスの誘導を阻害するＮＦ−κＢ阻害剤が本明細書で開示される。細胞の再接着が、ＮＦ−κＢ阻害剤誘導性アポトーシスに対して細胞が感受性になることを引き起こすＮＦ−κＢの顕著な活性化を引き起こす細胞に影響を与えるＮＦ−κＢ阻害剤もまた開示される。
【００５９】
ＮＦ−κＢ阻害剤のある特定の例はＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５であり、これらは、ＩκＢリン酸化およびＴＮＦα誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。ＢＡＹ  １１−７０８２は、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６の増殖もまた阻害する。ＡＰＣ変異を含む細胞は、ＢＡＹ  １１−７０８５および関連する分子に対して感受性である。例えば、細胞系統ＤＬＤ−２細胞およびＨＴ−２９細胞から得られた細胞はＢＡＹ  １１−７０８５に感受性である。ＤＬＤ−１およびＨＴ−２９はＡＰＣ変異を含む。ＨＣＴ−１１６細胞は、通常、ＡＰＣ産物によって調節されるＢ−カテニン上に活性化変異を有する。また、ＨＣＴ−１１６細胞は、結腸直腸癌の中で共通して過剰発現されているＣＯＸ−２は発現しない。増殖の足場非依存性阻害は、ＤＬＤ−１およびＨＴ−２９の中でＢＡＹ１１−７０８２と７０８５の両方によって阻害されることが可能であり、ＢＡＹ  １１−７０８２とＢＡＹ  １１−７０８５の両方が、ＨＴ−２９腫瘍細胞を注射した胸腺欠損マウスの中でインビボで腫瘍体積を減少する。ＭＣ−１３２およびＰＤＴＣは、接着細胞中でアポトーシスの増加を引き起こし、ＢＡＹ−１１−７０８５およびＢＡＹ−１１−７０８２は、接着していないときでさえ、細胞中でアポトーシスを引き起こす。
組成物を使用する方法
開示される組成物は、研究ツールとして様々な方法で使用されることが可能である。例えば、ＢＡＹ−１１−７０８５およびＢＡＹ−１１−７０８２、ＰＤＴＣ、ならびにＭＣ−１３２などの開示される組成物は、細胞増殖アッセイにおける試薬および標準として、および癌に関連するアッセイのためのＮＦ−κＢ阻害剤として使用されることが可能である。
【００６０】
これらの組成物は、例えば、本明細書に開示される細胞系の癌または転移の阻害に関連する所望の機能的特性を保有する分子を単離するために、コンビナトリアルケミストリーのプロトコールまたは他のスクリーニングのプロトコールにおける競合阻害剤として使用されることが可能である。
【００６１】
癌を治療する方法
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は被験体に与えられることが可能である。本明細書に開示されるようなＮＦ−κＢ阻害剤の必要がある任意の被験体が、ＮＦ−κＢ阻害剤を与えられることができる。ＪＮＫ活性化因子の必要がある任意の被験体が、ＪＮＫ活性化因子を与えられることができる。被験体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、またはサル、ゴリラ、オランウータン、チンパンジー、もしくはヒトなどの霊長類などの哺乳動物であり得る。
【００６２】
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、癌細胞増殖を阻害するために使用されることが可能である。癌細胞増殖を阻害するとは、癌細胞増殖を減少または予防することを意味する。阻害剤は、癌細胞アッセイを使用することによって決定されることが可能である。例えば、細胞系統であるＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、Ｓｕ．８６、またはＢｘＰＣ−３のいずれかの細胞系統が、８日間、阻害剤の存在下または非存在下で９６ウェルプレート上で培養されることが可能である。細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色され、デオキシコール酸で可溶化され、そして分光光度計で５９０ｎｍにて読み取られることが可能である。特定の例において、阻害剤は、分光光度法によって決定されるように、対照と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞増殖を阻害するものである。
【００６３】
特定の例において、開示される阻害剤は、結腸癌細胞または膵臓癌細胞などの癌細胞の足場依存性増殖もまた阻害することが可能である。阻害剤は、軟寒天コロニー形成アッセイを使用してアッセイされることが可能である。例えば、ＤＬＤ−Ｉ、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、Ｓｕ．８６、およびＢｘＰＣ−３細胞は、６日間、ＤＭＳＯ（対照）または阻害剤の存在下にて、軟寒天中で培養されることが可能である。次いで、コロニー計数の数は、例えば、対照と比較して形成された細胞のパーセンテージを取ることによって比較されることが可能である。特定の例において、阻害剤は、形成されたコロニーを計数することによって決定されるように、対照と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞増殖を阻害するものである。
【００６４】
癌細胞のアポトーシスを促進するために使用されることが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤が本明細書で開示される。癌細胞アポトーシスを促進することは、細胞が死滅することを引き起こすことを意味する。アポトーシスアッセイは、阻害剤が癌細胞アポトーシスを促進するか否かを決定するために使用されることが可能である。例えば、実施例１に記載されるようなアポトーシスアッセイが使用されることが可能である。特定の例において、アポトーシスのパーセントは、実施例１において記載されるもののように、アポトーシスアッセイにおいて計数された全細胞のアネキシンＶ陽性、ヨウ化プロピジウム陰性細胞のパーセントとして決定された。阻害剤は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞をアポトーシス性にすることが可能である。
【００６５】
特定の例において、開示される阻害剤のアポトーシス効果は、再接着の前に、血流を通して循環している転移細胞などの一時的に懸濁された細胞中で増強される。この特性を有する阻害剤は、実施例１および２に記載されるように、一時的懸濁アッセイにおいて、例えば、本明細書に記載されるように、それらのアポトーシス効果をアッセイすることによって決定されることが可能である。例えば、細胞は、こすりとることによって懸濁に置かれ、次いで再接着されることが可能である。基材への再接着の際にアポトーシスの増加を引き起こす阻害剤が開示される。基材への再接着の際の増加は、例えば、懸濁中に残存している際にアポトーシス性であった細胞と比較して、基材に再接着する際にアポトーシス性であった細胞の倍数を調べることによって決定されることが可能である。再接着、次いで、細胞のアポトーシス懸濁中に残存する細胞の少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、または１００倍多くのアポトーシスを引き起こす阻害剤が開示される（例えば、図３を参照のこと）。特定の例において、開示される阻害剤は、少なくとも約１７％の細胞をアポトーシス性にすることが可能である。
【００６６】
表面への癌細胞の再接着を阻害するために使用されることが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子が本明細書で開示される。表面への癌細胞の再接着を阻害することとは、本明細書で議論されるように、一時的に懸濁された後で表面に再接着する能力がある細胞の数を減少させることを意味する。
【００６７】
本明細書に開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、癌細胞の転移を阻害するためにもまた使用されることが可能である。癌細胞の転移を阻害することとは、生物の中で生じる転移性腫瘍の量を減少または低下させることを意味する。例えば、インビボアッセイにおいて転移を阻害する阻害剤が開示される。阻害剤が転移を阻害するか否かを決定するためのインビボアッセイを実施する１つの方法は、胸腺欠損マウスの腹腔に、ＨＴ−２９などの癌細胞系統を注射することである。マウスは、例えば、阻害剤または対照で腹腔内前処理される。次いで、マウスは、一定の期間の間、例えば、２１日間、媒体またはＢＡＹ  １１−７０８５で、規則的に、例えば、１週間に２回、処理されることが可能である。次いで、マウスは、屠殺され、転移性腫瘍形成についてアッセイされることが可能である。本明細書に開示されるこの型のアッセイにおいて転移性腫瘍形成を阻害する組成物、ならびに対照化合物と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、転移性腫瘍形成を減少させる組成物が開示される。例えば、ＮＦ−κＢ阻害剤は、例えば、結腸癌または直腸癌から生じる腹腔内転移を阻害することが可能である。ＮＦ−κＢ阻害剤は、例えば、結腸癌または直腸癌から生じる、肝臓、頭骨頭頂部、または腹膜の転移もまた阻害することが可能である。特定の例において、開示される組成物は、転移を治療、予防、および／または阻害するために使用されることが可能である。例えば、同質またはリンパ性の転移である。
【００６８】
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は腫瘍発生を阻害するために使用されることが可能である。腫瘍発生を阻害することとは、生物の中に存在する腫瘍の量を減少または低下させることを意味する。例えば、インビボアッセイにおいて腫瘍発生を阻害する阻害剤が開示される。阻害剤が腫瘍発生を阻害するか否かを決定するためのインビボアッセイを実施する１つの方法は、雌性マウスなどの胸腺欠損マウスに、ＨＴ−２９などの癌細胞系統を皮下注射することである。次いで、マウスは、一定の期間の間、例えば、２１日間または２８日間、媒体またはＢＡＹ  １１−７０８５で、規則的に、例えば、１週間に２回、処理されることが可能である。次いで、マウスは、屠殺され、腫瘍形成およびサイズについてアッセイできる。本明細書に開示されるこの型のアッセイにおいて腫瘍発生を阻害する組成物、ならびに対照化合物と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、腫瘍発生を減少させる組成物が開示される。
【００６９】
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、ＮＦ−κＢおよび／またはＪＮＫを有糸分裂誘発のために利用する細胞に投与されることが可能である。例えば、ＮＦ−κＢ阻害剤は、ＮＦ−κＢを再接着のために利用する細胞に投与できる。一時的懸濁アッセイにおいて、再接着の際に、ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢ活性化を調べる任意のアッセイによって決定されるように活性化される場合、細胞は、再接着のためにＮＦ−κＢを利用することが決定されることが可能である。例えば、実施例１および２において議論されているＴＲＡＮＳ−ＡＭ（商標）アッセイなどのコンセンサス配列へのＮＦ−κＢ結合アッセイが使用されることが可能である。ＮＦ−κＢ活性化が再接着に際してより大きい場合、懸濁において、細胞は再接着のためにＮＦ−κＢを利用することが考慮されることが可能である。
【００７０】
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、ＴＮＦα非依存性様式で細胞のアポトーシスを誘導するために細胞に投与されることも可能である。ＴＮＦαはアポトーシスを活性化できるが、しかし、ＮＦ−κＢ阻害剤はＴＮＦα非依存性様式でアポトーシスを引き起こすために投与されることが可能である。開示される阻害剤は、ＴＮＦαなしで結腸癌細胞などの癌細胞のアポトーシスを促進することが可能である。阻害剤または細胞は、ｃＡ２などのＴＮＦα阻害抗体を使用すること、およびアポトーシスがｃＡ２などのＴＮＦα阻害抗体の存在下でさえ阻害剤によってなお引き起こされることを見ることによって、阻害剤を必要とすることなく、アポトーシス性であることが示されることが可能である。
【００７１】
組成物が投与される場合、これらは、典型的には、抗アポトーシスタンパク質の発現の減少を引き起こす。抗アポトーシスタンパク質の発現は、発現を決定するための任意の手段によって決定することが可能である。例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロットなどの標準的なバイオテクノロジー方法が、抗アポトーシス遺伝子の発現レベルを決定するために使用されることが可能である。減少は、潜在的な阻害剤の存在下で所望の抗アポトーシス遺伝子の発現レベルをアッセイすることと、この発現のレベルを阻害剤の非存在下での発現のレベルに対して比較することによって決定されることが可能である。このようなアッセイにおいて抗アポトーシス遺伝子の発現を減少させる阻害剤が開示される。
【００７２】
本明細書で議論されるように、ＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、例えば、癌細胞の増殖を減少させるため、ならびに癌細胞のアポトーシスを引き起こし、または癌細胞の再接着を阻害し、または癌細胞の転移を阻害するために使用されることが可能である。ＮＦ−κＢ阻害剤は、例えば、生存もしくは転移もしくは接着するためにＮＦ−κＢを使用し、またはその生活環の間にＮＦ−κＢを活性化する、任意の癌細胞に投与されることが可能である。
【００７３】
ＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子に変異を有する癌細胞に投与されることが可能である。ＡＰＣは、例えば、結腸癌における腫瘍抑制因子であることが示されてきた（例えば、少なくともＡＰＣ変異およびそのアッセイに関連する物質について参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｄｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５：１５３１−１５３９，１９９５を参照のこと）。変異ＡＰＣの効果の種々の異なる形態が見られることが可能である。細胞がＡＰＣ変異を含むか否かは、標準的な組換えバイオテクノロジープロトコールを使用して、例えば、配列決定およびＰＣＲ分析もしくはライゲーション媒介連鎖反応（ＬＣＲ）またはＤＮＡ配列をアッセイおよび比較する能力ある他の方法の使用（例えば、チップテクノロジー）を使用して、アッセイされることが可能である。変異は、例えば、細胞中の変異タンパク質を発現させること、および変異タンパク質が発癌性表現型を誘導するか否かを決定することによって、機能的変異であるとして、容易にアッセイされることが可能である。ＡＰＣ変異の効果を決定するためのアッセイもまた、Ｇｒｏｄｅｎらにおいて議論されているように実施されることが可能である。特定の例において、活性化変異は、ＤＬＤ−１細胞またはＨＴ２９細胞において、変異をアッセイする工程、およびＡＰＣ変異の効果に対して効果を比較する工程によって決定されることが可能である。例えば、Ｇｒｏｄｅｎにおけるのと同様に、完全に機能的なＡＰＣ遺伝子は、ＤＬＤ−１細胞またはＨＴ２９細胞にトランスフェクトされることが可能であり、そしてこのことは、非変異型ＡＰＣ遺伝子は正常な表現型をレスキューするので、ＤＬＤ−１細胞またはＨＴ２９細胞の発癌性挙動を減少させる。特定の例において、与えられたＡＰＣ変異は、例えば、ＤＬＤ−１細胞系統またはＨＴ２９細胞系統のいずれかに変異型ＡＰＣをトランスフェクトすること、および変異型ＡＰＣによって提供されたレスキューのレベルを、非変異型ＡＰＣのレスキューのレベルに対して比較することによってアッセイできる。特定の例において、ＤＬＤ−１細胞またはＨＴ２９細胞の発癌表現型を判断するために使用される判断基準のいずれかによって判断されるように、変異型ＡＰＣによってトランスフェクトされた細胞のレスキューは、非変異型ＡＰＣでトランスフェクトされた細胞のレスキューの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％未満である場合、ＡＰＣ変異体は、活性化ＡＰＣ変異体、すなわち、発癌性表現型を引き起こす変異体の中にあると見なされる。
【００７４】
特定の例において、ＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子は、β−カテニン上の活性化変異を有する癌細胞に投与されない。細胞がβ−カテニン変異を含むか否かは、標準的な組換えバイオテクノロジープロトコール、例えば、配列決定およびＰＣＲ分析を使用してアッセイされることが可能である。変異は、本明細書で議論されるような機能についてアッセイされることが可能である。
【００７５】
ＣＯＸ−２遺伝子を発現する癌細胞に投与されることが可能であるＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子が本明細書で開示される。ノーザンブロットもしくは利用可能な任意のチップ型アッセイのいずれかのようなハイブリダイゼーションアッセイ、または、例えば、ＰＣＲもしくは他の増幅方法に基づく増幅ベースのアッセイなどの転写物を検出するためのアッセイを使用して、細胞中のＣＯＸ−２遺伝子の検出可能な転写物が存在する場合に、細胞はＣＯＸ−２遺伝子を発現する。特定の例において、ＮＦ−κＢ阻害剤はＣＯＸ−２遺伝子を過剰発現する癌細胞に投与されることが可能である。ＣＯＸ−２の過剰発現は、ＣＯＸ−２の発現のために議論された方法およびアッセイのいずれかを使用することによって、および発現のレベルを対照集団の細胞の発現のレベルと比較することによって決定されることが可能である。一般的に、基礎量のＣＯＸ−２発現が存在するが、しかし、マイトジェンの添加に際して、例えば、マイトジェンの非存在下での発現と比較してＣＯＸ−２発現が増加する場合でさえ、細胞は活性化されたＣＯＸ−２発現を示さない。従って、与えられた癌細胞または癌細胞系統がＣＯＸ−２発現についてアッセイされることが可能であり、これは、発癌性表現型の非存在下でこの細胞型のＣＯＸ−２発現と比較されることが可能である。特定の例において、関心対象の細胞およびＤＬＤ−１またはＨＴ２９のＣＯＸ−２の発現が並行してアッセイされるときに、発現が、ＤＬＤ−１細胞またはＨＴ２９細胞中のＣＯＸ−２の発現の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％であるならば、与えられる癌細胞系統は、ＣＯＸ−２を過剰発現すると見なされることが可能である。
【００７６】
開示されるＮＦ−κＢ阻害剤は、ＣＯＸ−２遺伝子を発現し、ならびにＡＰＣ遺伝子において変異を有する癌細胞にもまた投与されることが可能である。
【００７７】
特定の癌は癌細胞系統を生じることが可能であることが理解される。典型的には、癌細胞系統は、細胞培養中に維持されているが、しかし、特定の型の癌から生じた細胞である。ＮＦ−κＢ阻害剤は、種々の癌のために使用されることが可能であるが、しかし、例えば、ＤＬＤ−１癌細胞系統およびＨＴ−２９癌細胞系統に関連する癌のために使用されることが可能である。ＤＬＤ−１癌細胞系統およびＨＴ−２９癌細胞系統は、結腸癌細胞から生じた。ＤＬＤ−１癌細胞系統およびＨＴ−２９癌細胞系統の特性を有する癌細胞系統もまた開示される。
【００７８】
開示される組成物は、癌などの調節されない細胞増殖が起こる任意の疾患を治療するために使用されることが可能である。様々な型の癌の非限定的なリストは以下の通りである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、重症神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素性腫瘍、ミエローマ、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性癌、または一般的な癌。
【００７９】
開示された組成物が治療するために使用されることが可能である代表的ではあるが非限定的である癌のリストは以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系の癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／膠芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、のど、喉頭、および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸部癌、乳癌、および上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌；精巣癌、結腸および直腸の癌、前立腺癌、または膵臓癌。
【００８０】
子宮頸部および肛門の異形成、他の異形成、重篤な異形成、過形成、異型過形成、および新生組織形成などの前癌状態の治療のためにもまた使用されてもよい化合物が本明細書に開示される。
【００８１】
組成物
本明細書に開示される方法の中で使用される組成物それ自体と同様に、開示される組成物を調製するために使用される成分が開示される。これらおよび他の物質が本明細書で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個別のおよび集合的な組み合わせおよび順列の具体的な参照が明白に開示されないかもしれないが、各々は本明細書で具体的に意図されかつ記載されることが理解される。例えば、ＢＡＹ  １１−７０８２などの特定の組成物が開示および議論され、ＢＡＹ  １１−７０８２を含む多数の分子にされることが可能である多数の修飾が議論される場合、反対のことが具体的に示されない限り、ＢＡＹ  １１−７０８２の各々のおよびすべての組み合わせおよび順列ならびに可能な修飾が具体的に意図される。従って、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと同様に開示され、そしてＡ−Ｄの分子の組み合わせの１例が開示される場合、たとえ各々が個別に列挙されていないとしても、各々は個別にかつ集合的に組み合わせを意味することが意図され、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが開示されていると見なされる。同様に、これらの任意のサブセットおよび組み合わせもまた開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されていると見なされる。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法における工程を含むがこれに限定されない、本願のすべての態様に適用する。従って、実施されることが可能である様々なさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々が、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施されることが可能であることが理解される。
【００８２】
ＮＦ−κＢ阻害剤およびＪＮＫ活性化因子
開示される方法はＮＦ−κＢ阻害剤を包含する。ＮＦ−κＢ阻害剤は、抗アポトーシスタンパク質の発現の減少を引き起こす任意の組成物であり得る。ＮＦ−κＢ阻害剤は、その組成物がＩκＢリン酸化を阻害する任意の組成物でもまたあり得る。ＮＦ−κＢ阻害剤は、その組成物がＴＮＦαで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害する任意の組成物でもまたあり得る。なおさらに、適切なＮＦ−κＢ阻害剤はＪＮＫの活性化もまた行う。
【００８３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるいずれかの方法において有用な阻害剤はオレフィンである。「オレフィン」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を保有する任意の化合物または分子として本明細書で定義される。炭素−炭素二重結合の各炭素原子は、非置換であるか、または１つもしくは２つの異なる部分で独立して置換されてもよい。
【００８４】
特定の実施形態において、阻害剤は、少なくとも１つの電子吸引基を有するオレフィンである。別の例において、阻害剤は、少なくとも２つの電子吸引基を有するオレフィンである。この場合、２つの電子吸引基が存在する場合、それらの電子吸引基は同じオレフィン性炭素原子上に存在可能であり、または１つの電子吸引基が各オレフィン性原子上にあることが可能である。
【００８５】
「電子吸引基」という用語は、電子密度に対して親和性または吸引力を有する任意の基である。例えば、電子吸引基がオレフィン性炭素原子（Ｃα）に結合されるとき、電子吸引基を保有しないオレフィンと比較して、他のオレフィン性炭素原子（Ｃβ）は求核攻撃に対してより感受性である（すなわち、Ｃβはより陽性である）。一般的に、電子吸引基は、１つ以上の炭素−炭素多重結合、炭素−ヘテロ原子多重結合、またはヘテロ原子−ヘテロ原子多重結合を保有する。電子吸引基の例には、シアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、非置換芳香族環、または少なくとも１つのシアノ基、スルホ−オキシ基、ホスホ−オキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン、もしくはニトロ基を有する置換芳香族環が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
「ホスホ−オキシ基」という用語は以下の構造
【００８７】
【化１】
2011520096.tif 000002
【００８８】
の１つを有する基であり、ここで、Ｒ１は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である。
【００８９】
「スルホ−オキシ基」という用語は以下の構造
【００９０】
【化２】
2011520096.tif 000003
【００９１】
の１つを有する基であり、ここで、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である。１つの例において、この阻害剤は、シアノ基および構造
【００９２】
【化３】
2011520096.tif 000004
【００９３】
を有するスルホ−オキシ基を有するオレフィンであり、ここで、Ｒ２は水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族である。
【００９４】
別の例において、この阻害剤は構造Ｉ
【００９５】
【化４】
2011520096.tif 000005
【００９６】
を有し、ここで、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族であり、この化合物はＥ−またはＺ−異性体である。炭素−炭素二重結合に関する立体化学は、シアノ基（−ＣＮ）およびスルホニル基（−Ｓ（Ｏ２）Ｒ５）の相対位置に依存して変化する。シアノ基およびスルホニル基が互いに対してシスであるとき、化合物はＺ−異性体であり、シアノ基およびスルホニル基が互いに対してトランスであるとき、化合物はＥ−異性体である。１つの例において、構造Ｉを有する阻害剤はＥ−異性体である。
【００９７】
１つの例において、阻害剤が構造Ｉを有するとき、Ｒ３およびＲ４は水素である。別の例において、Ｒ５はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、置換もしくは非置換フェニル、またはベンジルである。さらなる例において、Ｒ５は少なくとも１つのアルキル基を有するフェニル基である。
【００９８】
別の例において、構造Ｉを有する阻害剤は、２−シアノ−３−（メチルスルホニル）−３−（１，２，４，５−テトラヒドロ−３Ｈ−３−ベンズアゼピン−３−イル−２−プロペン酸のエチルエステル；［２，２−ビス［ｐ−（ジメチルアミノ）フェニル］ビニル］（メチルスルホニル）−フマロニトリル；［２，２−ビス［ｐ−ジメチルアミノ）フェニル］ビニル］［（ヒドロキシメチル）スルホニル）−フマロニトリル，ｐ−トルエンスルホン酸塩；［２，２−ビス［ｐ−ジメチルアミノ）フェニル］ビニル］（エチルスルホニル）−フマロニトリル；（ベンジルスルホニル）［２，２−ビス［ｐ−（ジメチルアミノ）フェニル］ビニル］−フマロニトリル；（アリルスルホニル）［２，２−ビス［ｐ−ジメチルアミノ）フェニル］ビニル］−フマロニトリル；ベンジル（ベンジルスルホニル）−フマロニトリル；１，７−ビス（アリルスルホニル）−４−ヒドロキシ−１，３，５−ヘプタトリエン−１，２，６，７−テトラカルボニトリル；２−シアノ−３−（メチルスルホニル）−３−（１，２，４，５−テトラヒドロ−３Ｈ−３−ベンズアゼピン−３−イル）−２−プロペン酸エチルエステル；α−［［［（１Ｅ）−１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エテニル］スルホニル］メチレン］−３，４−ジヒドロキシ−β−オキソ−（αＥ）−ベンゼンプロパンニトリル；３−（メチルスルホニル）−（２Ｅ）−２−プロペンニトリル；４，４，４−トリフルオロ−３−（ヘキシルスルホニル）−（２Ｚ）−２−ブテンニトリル；α−［［［１−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−オキソ−１−プロペニル］スルホニル］メチレン］−３，４−ジヒドロキシ−（Ｅ，Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；２，２’−［１，３−プロパンジイルビス［（シクロヘキシルイミノ）−４，１−フェニレン］］ビス［３−（エチルスルホニル）−２−ブテンジニトリル；α−（メチルスルホニル）メチレン）−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［（１，１−ジメチルエチル）スルホニル］メチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［メチルスルホニル）メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［（フェニルメチル）スルホニル］メチレン］−ベンゼンアセトニトリル；α−［（ブチルスルホニル）メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［（ブチルスルホニル）メチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［（１−メチルエチル）スルホニル］メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［（１−メチルエチル）スルホニル］メチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［（１，１−ジメチルエチル）スルホニル］メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［［４−クロロフェニル）メチル］スルホニル］メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［［４−クロロフェニル）メチル］スルホニル］メチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［３−クロロプロピル）スルホニル］メチレン］−（Ｅ）−ベンゼンアセトニトリル；α−［［３−クロロプロピル）スルホニル］メチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；３−（メチルスルホニル）−（２Ｅ）−２−プロペンニトリル；３−（メ��ルスルホニル）−（Ｚ）−２−プロペンニトリル；α−［（メチルスルホニル）メチレン］−２−ニトロ−ベンゼンアセトニトリル；４−（ジメチルアミノ）−α−［［（トリフルオロメチル）スルホニル］メチレン］−ベンゼンアセトニトリル；２−クロロ−３−（メチルスルホニル）−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−（メチルスルホニル）−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−［（１−メチルエチル）スルホニル］−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−［（１−メチルプロピル）スルホニル］−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−［（３−メチルブチル）スルホニル］−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−（オクチルスルホニル）−２−プロペンニトリル；２，３−ジクロロ−３−（ノニルスルホニル）−２−プロペンニトリル；３−［（２−フェニルエテニル）スルホニル）−２−プロペンニトリル；３−［（２−フェニルエテニル）スルホニル］−２−プロペンニトリル；α−［メチルスルホニル）フェニルメチレン］−（Ｚ）−ベンゼンアセトニトリル；３−（ベンジルスルホニル）−アクリロニトリル；３−（メチルスルホニル）−２−プロペンニトリル；３−（エチルスルホニル）−アクリロニトリル；３，３’−（テトラメチレンジスルホニル）ジ−アクリロニトリル；３−［（２−シアノビニル）スルホニル）−プロピオニトリル；３−（（４−（２，２−ジクロロ−１，１−ジフルオロエトキシ）フェニル）スルホニル）−２−プロペンニトリル；３−（（４−（２，２−ジクロロ−１，１−ジフルオロエトキシ）−２−メチル−５−ニトロフェニル）スルホニル）−２−プロペンニトリル；または３−（（３−トリフルオロメチル）フェニル）スルホニル）−２−プロペンニトリルである。
【００９９】
別の例において、阻害剤は、本明細書でＢＡＹ−７０８２とも呼ばれる（２Ｅ）−３−（トリルスルホニル）−２−プロペンニトリルである。
【０１００】
【化５】
2011520096.tif 000006
【０１０１】
別の例において、阻害剤は、本明細書でＢＡＹ−１１−７０８５とも呼ばれる（２Ｅ）−３−［４−（第三ブチルフェニル）スルホニル］−２−プロペンニトリルである。
【０１０２】
【化６】
2011520096.tif 000007
【０１０３】
代替的な例において、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて有用である阻害剤は、少なくとも１つのアミノ酸残基を備えることが可能である。「アミノ酸残基」は、アミノ酸が、アミノ酸と反応可能である１つ以上の化合物と反応されるときに産生される。例えば、アミノ酸がトリペプチドを産生するように２つの他のアミノ酸と反応されるとき、得られるトリペプチドは３つのアミノ酸残基を含む。代替的には、アミノ酸は、他の非アミノ酸と反応されて、アミノ酸残基を有する化合物を産生することが可能である。
【０１０４】
１つの例において、阻害剤は少なくとも１つのロイシン残基を有する。別の例において、阻害剤は３つのロイシン残基を備える。さらなる例において、この化合物は、構造
【０１０５】
【化７】
2011520096.tif 000008
【０１０６】
を有するＮ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］−Ｌ−ロイシンアミドである。
【０１０７】
この化合物はＳｉｇｍａ  ＭＧ−１３２とも呼ばれる。
【０１０８】
別の例において、阻害剤は構造ＩＩ
【０１０９】
【化８】
2011520096.tif 000009
【０１１０】
を有するピロリジンジチオカルバメートであり、ここで、Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、または置換もしくは非置換芳香族であり、あるいはＲ６およびＲ７は環として窒素原子と一緒になり、ＸおよびＹは、独立して、酸素または硫黄、またはその薬学的に活性な塩である。
【０１１１】
１つの実施形態において、ＸとＹは両方とも酸素である。別の実施形態において、ＸとＹは両方とも硫黄である。さらなる実施形態において、Ｒ６およびＲ７は環系を形成することが可能である。例えば、Ｒ６およびＲ７は集合的に、（ＣＨ２）３などのメチレン基であり得る。得られる環構造は、１つの窒素原子を有する四員環である。Ｒ６およびＲ７が環を形成する場合、その環は三員環〜十員環であり得る。１つの実施形態において、ＸおよびＹは硫黄であり、Ｒ６およびＲ７は（ＣＨ２）４である。この化合物はＰＤＴＣとも呼ばれる。
【０１１２】
式ＩＩは、このような化合物の薬学的に受容可能なエスエル、アミド、および塩もまた包含する。薬学的に受容可能な塩は、遊離酸を適切な量の薬学的に受容可能な塩基で処理することによって調製される。代表的な薬学的に受容可能な塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどである。１つの態様において、反応は、水単独の中で、または不活性の水混和性有機溶媒と合わせて水の中で、約０℃〜約１００℃までの温度で、例えば、室温で実施される。使用される塩基に対する構造式ＩＩの化合物のモル比は、任意の特定の塩のために所望されるモル比を提供するように選択される。例えば、遊離塩の出発物質のアンモニウム塩を調製するために、出発物質は、薬学的に受容可能な塩基の約１当量で処理されて、中性塩を得ることが可能である。
【０１１３】
エステル誘導体は、典型的には、酸性型の化合物−以下の実施例において例証されるようなもの−に対する前駆体として調製され、従って、プロドラッグとしての役目を果たすことができる。一般的には、これらの誘導体は、メチル、エチルなどの低級アルキルエステルである。Ｒが上記に定義されるアルキル基であるアミド誘導体−（ＣＯ）ＮＨ２、−（ＣＯ）ＮＨＲ、および−（ＣＯ）ＮＲ２は、アンモニアまたは置換アミンとのカルボン酸含有化合物の反応によって調製可能である。
【０１１４】
阻害剤のなおさらなる例は、トログリタゾン；ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンなどのグリタゾンまたはチアゾリジンジオンの誘導体を含む。他の有用なチアゾリジンジオンは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ  ９８／０５３３１に開示されているシグリタゾン、エングリタゾン、ダルグリタゾン、およびＢＲＬ  ４９６５３を含む。
【０１１５】
阻害剤のなおさらなる例は、市販のライブラリー、例えば、キナーゼ阻害剤ライブラリー（ＢｉｏＭｏｌ）、合成化合物ライブラリー（例えば、ＢａｙｅｒまたはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、天然化合物ライブラリー（Ｓｐｅｃｓ，ＴｉｍＴｅｃ）、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍａｓｓ．）、Ａｒｑｕｌｅ（Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａ．）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，Ｉｏｗａ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、ＭＤＳ  Ｐａｎｌａｂｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびＴｒｅｇａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの企業からの他のライブラリーから入手可能である。好ましい化合物は低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち、５００ダルトン以下の分子量を有する化合物は、良好な吸収および生物学的系への浸透を有するようであり、結果的に、５００ダルトンよりも上の分子量を有する化合物よりも首尾よい薬物候補である可能性が高い。天然産物、無機化学物質、ならびにタンパク質および毒素などの生物学的に活性な物質を含む化合物もまた、ＮＦ−κＢを阻害する能力についてこれらの方法を使用してアッセイされることが可能である。
【０１１６】
特定のスクリーニング方法が当該分野においておよび統合ロボットシステムとともに公知であり、化学化合物／天然産物のコレクションは高スループットスクリーニングで広範に組み込まれ、その結果、大量の試験化合物が短時間の間にアンタゴニストおよびアゴニスト活性について試験されることが可能である。これらの方法は、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動、シンチレーション近接解析、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光クエンチ酵素基質、発色酵素基質、および電気化学発光などの同種アッセイ形式、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイなどのより従来的な異種アッセイ形式を含む。同種アッセイは、ロボット応用に非常に適している「混合および読み取り」アッセイであるのに対して、異種アッセイは、濾過、遠心分離、または洗浄などのより複雑な単位操作によって、遊離のものから結合した分析物の分離を必要とする。これらのアッセイは、タンパク質−タンパク質、受容体−リガンド、酵素−基質などを含む小さな有機分子による広範な種々の特定の生体分子の相互作用および阻害を検出するために利用される。これらのアッセイ方法および技術は当該分野において周知であり、以下においてより完全に記載されている：Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（編），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７。本発明のスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに適しており、小分子薬物候補、抗体、ペプチド、ならびに他のアンタゴニストおよび／またはアゴニストの同定のために適切である。
【０１１７】
直接的阻害剤
ＮＦ−κＢの直接的阻害剤である阻害剤が開示される。ＮＦ−κＢの直接的阻害剤はＮＦ−κＢと相互作用する阻害剤である。直接的阻害剤は、再接着および転移などのＮＦ−κＢ依存性活性が阻害されるように、何らかの方法でＮＦ−κＢ分子に接触する。
【０１１８】
間接的阻害剤
ＮＦ−κＢの間接的阻害剤である阻害剤が開示される。ＮＦ−κＢの間接的阻害剤はＮＦ−κＢと相互作用しない阻害剤である。間接的阻害剤は、再接着および転移などのＮＦ−κＢ依存性活性が阻害されるように、ＮＦ−κＢが含まれるシグナル伝達経路に含まれる分子に何らかの方法で接触する。
【０１１９】
ＮＦ−κＢの間接的阻害剤の１つの例は、ＮＦ−κＢの発現を阻害し、それによってＮＦ−κＢが機能することを妨害する間接的阻害剤である。ＮＦ−κＢの間接的阻害剤の別の例は、ＮＦ−κＢをコードしている遺伝子の翻訳を阻害する間接的阻害剤である。
【０１２０】
ＮＦ−κＢが含まれるシグナル伝達経路に含まれる分子の例はＩκＢである。ＩκＢがリン酸化することを阻害する分子は間接的阻害剤である。
【０１２１】
相同性／同一性
本明細書に開示される遺伝子およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体、または生じる可能性があるものを定義するための１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性によって改変体および誘導体を定義することを通してであることが理解される。例えば、特定のヒトＮＦ−κＢおよびＩκＢの配列は公知であり、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋなどの配列データベースにおいて容易に入手可能である。これらのタンパク質をコードする核酸もまた容易に利用可能である。これらの配列および任意の公知の対立遺伝子または種改変体は、本明細書に開示されるものと見なされる。言及される配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する、これらの改変体ならびに本明細書に開示される他の遺伝子およびタンパク質が具体的に開示される。当業者は、２つのタンパク質または遺伝子などの核酸の相同性をいかにして決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、その相同性がその最高レベルにあるように、２つの配列をアラインした後で計算されることが可能である。
【０１２２】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施されることが可能である。比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、Ｊ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３，１９７０によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索の方法、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって行われてもよい。
【０１２３】
核酸についての同じ型の相同性が、例えば、少なくとも核酸アラインメントに関する資料について、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって得られることが可能である。
ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブおよび遺伝子などの少なくとも２つの核酸分子間の、配列によって駆動される相互作用を意味する。配列によって駆動される相互作用とは、ヌクレオチド特異的様式で、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列によって駆動される相互作用である。典型的には、配列によって駆動される相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはホーグスティーン面で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知である多数の条件およびパラメーターによって影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応の温度は、すべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響を与える。２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメーターは当業者に周知である。例えば、ある例において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義されることが可能である。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度と、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）よりも約１２〜２５℃下の温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜２０℃下であるように選択された温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄を包含してもよい。これらの温度および塩濃度は、フィルター上に固定化された参照ＤＮＡのサンプルが目的の標識された核酸にハイブリダイズされ、次いで様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄される予備実験において経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについてはより高い。これらの条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記のように、または当該分野において公知であるように、使用されることが可能である（少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連した材料について参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）、続いて６８℃での洗浄であり得る。所望される場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相補性の程度が減少するのに従って、およびさらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−Ｃま��はＡ−Ｔの豊富さに依存して減少されることが可能である。同様に、所望される場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相同性の程度が増加するのに従って、およびさらに、すべて当該分野において公知であるように、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して増加されることが可能である。
【０１２４】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、他の核酸に結合される１つの核酸の量（パーセンテージ）を調べることによる。例えば、ある例において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの限定的な核酸が、非限定的な核酸に結合される場合である。典型的には、非限定的なプライマーは、例えば、約１０、１００、または１０００倍過剰である。この型のアッセイは、限定的なプライマーと非限定的なプライマーの両方が、例えば、約１０、１００、または１０００倍それらのｋｄよりも下であり、またはこれらの核酸分子の一方のみが約１０、１００、または１０００倍であるか、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄよりも上である条件下で実施されることが可能である。
【０１２５】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、所望される酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素的に操作されることを得るプライマーのパーセンテージを調べることによる。例えば、ある例において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントのプライマーが、酵素的操作を促進する条件化で酵素的に操作される場合であり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントのプライマー分子が伸長される場合である。好ましい条件は、操作を実施する酵素のために適切であるように、製造業者によって示唆されるか、または当該分野において示されるようなものもまた含む。
【０１２６】
相同性を用いるものと同様に、本明細書に開示される、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するための種々の方法が存在することが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間の様々なパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供してもよいが、他のことが示されない限り、いずれかの方法のパラメーターを満たすことで十分であることが理解される。例えば、約８０％ハイブリダイゼーションが必要とされた場合、これらの方法のいずれかにおいて必要とされるパラメーターの中でハイブリダイゼーションが起こる限り、これは本明細書に開示されると見なされる。
【０１２７】
当業者は、組成物または方法が、集合的または単独でのいずれかでハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの判断基準のいずれか１つに合致している場合、これは本明細書に開示されている組成物または方法であることを理解することが理解される。
【０１２８】
核酸
種々の機能的核酸と同様に、例えば、ＮＦ−κＢまたはＩκＢをコードする核酸を例えば含む、核酸ベースの本明細書に開示される種々の分子が存在している。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物から作られている。これらのおよび他の分子の非限定的な例は本明細書において議論されている。例えば、ベクターが細胞中で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから作られていることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性の送達を通して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境中でアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから作られることが有利であることが理解される。
【０１２９】
核酸および関連分子
ヌクレオチドは塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分およびヌクレオシド結合を作るための糖部分を通して一緒に連結されることができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０１３０】
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸のいずれかの部分に何らかの型の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当該分野で周知であり、例えば、糖またはリン酸の部分の修飾と同様に、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニンを含む。
【０１３１】
ヌクレオチド代用物は、ヌクレオチドに類似した機能的特性を有する分子であるが、リン酸部分を含まない、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの分子である。ヌクレオチド代用物は、ワトソン−クリックまたはホーグスティーン様式で核酸を認識するが、これはリン酸部分以外の部分を通して一緒に連結されている。ヌクレオチド代用物は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型構造のコンホメーションを取ることが可能である。
【０１３２】
例えば、細胞の取り込みを増強するために、他の型の分子（結合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結することもまた可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結されることが可能である。このような結合体は、コレステロール部分などの脂質部分を含むがこれに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：６５５３−６，１９８９）。
【０１３３】
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物のワトソン−クリック面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物のＣ２位、Ｎ１位、およびＣ６位、ならびにピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物のＣ２位、Ｎ３位、Ｃ４位を含む。
【０１３４】
ホーグスティーン相互作用は、二重鎖ＤＮＡの大きな溝の中で曝露されている、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのホーグスティーン面で起こる相互作用である。ホーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位における反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【０１３５】
配列
Ｇｅｎｂａｎｋなどの配列データベースにおいて見い出される、例えば、ＮＦ−κＢまたはＩκＢ遺伝子に関連する種々の配列が存在している。これらの配列およびその他の配列は、そこに含まれる個々のサブ配列についてと同様に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
当業者は、配列の不一致および違いを以下にして解決するか、そして特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列（すなわち、ＮＦ−κＢまたはＩκＢの配列）に対していかにして調整するかを理解している。本明細書に開示され、当該分野において公知である情報が与えられると、プライマーおよび／またはプローブは、任意のＮＦ−κＢまたはＩκＢ配列のために設計されることが可能である。
【０１３７】
プライマーおよびプローブ
本明細書に開示されるような、例えば、ｍＲＮＡなどのＮＦ−κＢまたはＩκＢ核酸と相互作用することが可能であるプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の例において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を補助するために使用される。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で、伸長されることが可能である。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズされるかまたは他の方法で結び付けられる核酸分子の配列および／または組成が、プライマーの伸長によって産生される生成物の組成または配列を方向付けるかまたはそれに影響を与える、任意の方法を含む。それゆえに、配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写を含むがこれらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の例において、プライマーは、ＰＣＲまたは直接的配列決定などのＤＮＡ増幅反応のために使用される。例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、これらが配列特異的な様式でプライマーを伸長するように化学的に反応するように修飾されている特定の例において、プライマーは、非酵素的技術を使用してもまた伸長されることが可能であることが理解される。典型的には、開示されるプライマーは、例えば、ｍＲＮＡなどのＮＦ−κＢ核酸、またはｍＲＮＡなどのＩκＢ核酸、またはＮＦ−κＢもしくはＩκＢ核酸の領域とハイブリダイズし、あるいはこれらは、ＮＦ−κＢもしくはＩκＢ核酸の相補物、またはＮＦ−κＢもしくはＩκＢ核酸の領域相補物とハイブリダイズする。
【０１３８】
機能的核酸
機能的核酸は、標的分子を結合することまたは特定の反応を触媒するなどの特定の機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、限定であることが意味されない、以下のカテゴリーに分けられることが可能である。例えば、機能的核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列を含む。機能的核酸分子は、標的分子によって保有される特定の活性の影響因子、阻害剤、修飾因子、および刺激因子として作用することが可能であり、または機能的核酸分子は、任意の他の分子から独立しているデノボ活性を浮遊することが可能である。
【０１３９】
機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの任意の高分子と相互作用することが可能である。従って、機能的核酸は、ＮＦ−κＢもしくはＩκＢのｍＲＮＡまたはＮＦ−κＢもしくはＩκＢのゲノムＤＮＡと相互作用することが可能であり、あるいはこれらはＮＦ−κＢもしくはＩκＢのポリペプチドと相互作用することが可能である。しばしば、機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子の間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、機能的核酸分子と標的分子の間の特異的認識は、標的分子と機能的核酸分子の間の配列相同性に基づかないが、むしろ、特異的認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づく。これらの認識モチーフの両方は、同じ機能的核酸分子においてもまた起こることが可能である。
【０１４０】
アンチセンス分子は、標準の塩基対形成または標準でない塩基対形成のいずれかを通して、標的核酸分子を相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を通して、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、通常標的分子上で起こる転写または複製などのプロセシング機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計されることが可能である。標的分子の最も接近可能な領域を見つけることによってアンチセンスの有効性を最適化するための多数の方法が存在している。例示的な方法は、インビトロ選択実験ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ修飾実験である。アンチセンス分子は１０−６未満の解離定数（ｋｄ）で標的分子を結合することが好ましい。アンチセンス分子は１０−８未満のｋｄで標的分子を結合することが好ましい。アンチセンス分子は１０−１０未満のｋｄで標的分子を結合することもまた好ましい。アンチセンス分子は１０−１２未満のｋｄで標的分子を結合することもまた好ましい。アンチセンス分子の設計および使用に役立つ方法および技術の代表的な実例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見い出されることが可能である：５，１３５，９１７、５，２９４，５３３、５，６２７，１５８、５，６４１，７５４、５，６９１，３１７、５，７８０，６０７、５，７８６，１３８、５，８４９，９０３、５，８５６，１０３、５，９１９，７７２、５，９５５，５９０、５，９９０，０８８、５，９９４，３２０、５，９９８，６０２、６，００５，０９５、６，００７，９９５、６，０１３，５２２、６，０１７，８９８、６，０１８，０４２、６，０２５，１９８、６，０３３，９１０、６，０４０，２９６、６，０４６，００４、６，０４６，３１９、および６，０５７，４３７。
【０１４１】
アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、規定された二次構造およびステム−ループまたはＧカルテットなどの三次構造に折りたたまれる１５〜５０塩基長の範囲の小分子である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの巨大分子に結合することが可能である。アプタマーは１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄｓで非常に強固に結合することが可能である。アプタマーは１０−６未満のｋｄで標的分子を結合することが好ましい。アプタマーは１０−８未満のｋｄで標的分子を結合することがより好ましい。アプタマーは１０−１０未満のｋｄで標的分子を結合することもまたより好ましい。アプタマーは１０−１２未満のｋｄで標的分子を結合することもまた好ましい。アプタマーは非常に高い程度の特異性で標的分子を結合することが可能である。例えば、標的分子と、分子上の単一の位置のみで異なる別の分子との間の結合親和性の違いが１００００倍より大きいアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのｋｄよりも少なくとも１０倍低い標的分子とのｋｄを有することが好ましい。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのｋｄよりも少なくとも１００倍低い標的分子とのｋｄを有することがより好ましい。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのｋｄよりも少なくとも１０００倍低い標的分子とのｋｄを有することがより好ましい。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのｋｄよりも少なくとも１００００倍低い標的分子とのｋｄを有することが好ましい。ポリペプチドについての比較を行う場合、例えば、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、ＮＦ−κＢまたはＩκＢアプタマーの特異性を決定する場合に、バックグラウンドタンパク質は血清アルブミンであり得る。様々な標的分子を結合するためにアプタマーをいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見い出すことができる：５，４７６，７６６、５，５０３，９７８、５，６３１，１４６、５，７３１，４２４、５，７８０，２２８、５，７９２，６１３、５，７９５，７２１、５，８４６，７１３、５，８５８，６６０、５，８６１，２５４、５，８６４，０２６、５，８６９，６４１、５，９５８，６９１、６，００１，９８８、６，０１１，０２０、６，０１３，４４３、６，０２０，１３０、６，０２８，１８６、６，０３０，７７６、および６，０５１，６９８。
【０１４２】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することが可能である核酸分子である。従って、リボザイムは触媒性核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイム（例えば、以下の米国特許：５，３３４，７１１、５，４３６，３３０、５，６１６，４６６、５，６３３，１３３、５，６４６，０２０、５，６５２，０９４、５，７１２，３８４、５，７７０，７１５、５，８５６，４６３、５，８６１，２８８、５，８９１，６８３、５，８９１，６８４、５，９８５，６２１、５，９８９，９０８、５，９９８，１９３、５，９９８，２０３、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５７、ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９７１８３１２であるがこれらに限定されない）、ヘアピンリボザイム（例えば、以下の米国特許であるがこれらに限定されない：５，６３１，１１５、５，６４６，０３１、５，６８３，９０２、５，７１２，３８４、５，８５６，１８８、５，８６６，７０１、５，８６９，３３９、および６，０２２，９６２）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、以下の米国特許であるがこれらに限定されない：５，５９５，８７３および５，６５２，１０７）などの天然の系において見い出されるリボザイムに基づいている、ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多数の異なる型のリボザイムが存在している。天然の系において見い出されないが、特定の反応をデノボで触媒するように操作されている多数のリボザイムもまた存在する（例えば、以下の米国特許であるがこれらに限定されない：５，５８０，９６７、５，６８８，６７０、５，８０７，７１８、および５，９１０，４０８）。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、引き続く切断を伴う、標的基質の認識および結合を通して、核酸基質を切断する。この認識は、しばしば、大部分は標準の塩基対形成に、または標準でない塩基対形成に基づく。この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のために特に良好な候補にする。なぜなら、標的基質の認識は標的基質配列に基づくからである。様々な異なる反応を触媒するためにリボザイムをいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見い出されることが可能である：５，６４６，０４２、５，６９３，５３５、５，７３１，２９５、５，８１１，３００、５，８３７，８５５、５，８６９，２５３、５，８７７，０２１、５，８７７，０２２、５，９７２，６９９、５，９７２，７０４、５，９８９，９０６、および６，０１７，７５６。
【０１４３】
三重鎖を形成する機能的核酸分子は、二本鎖または一本鎖のいずれかの核酸と相互作用することが可能である分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、ワトソン−クリックとホーグスティーンの両方の塩基対形成に依存して複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖が存在する三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域を結合することが可能であるので、三重鎖分子が好ましい。三重鎖形成分子は１０−６未満のｋｄで標的分子を結合することが好ましい。三重鎖形成分子は１０−８未満のｋｄで標的分子を結合することがより好ましい。三重鎖形成分子は１０−１０未満のｋｄで標的分子を結合することがより好ましい。三重鎖形成分子は１０−１２未満のｋｄで標的分子を結合することが好ましい。様々な異なる標的分子を結合するために三重鎖形成分子をいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見い出されることが可能である：５，１７６，９９６、５，６４５，９８５、５，６５０，３１６、５，６８３，８７４、５，６９３，７７３、５，８３４，１８５、５，８６９，２４６、５，８７４，５６６、および５，９６２，４２６。
【０１４４】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合し、この複合体が、標的分子を切断するＲＮａｓｅＰによって認識される分子である。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計されることが可能である。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内での転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の処理に役立つ。細菌ＲＮＡｓｅＰは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体が天然のｔＲＮＡ基質を模倣することを引き起こすＥＧＳを使用することによって、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するために補充されることが可能である（ＹａｌｅによるＷＯ  ９２／０３５６６、ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
【０１４５】
同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ  Ｐ指向性ＲＮＡ切断は、真核生物細胞の中で所望される標的を切断するために利用されることが可能である（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８００６−１０，１９９２；ＹａｌｅによるＷＯ  ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ  ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｌｔｍａｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９−６８，１９９５、ならびにＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：２６２７−３１，１９９５）。様々な異なる標的分子の切断を容易にするためにＥＧＳ分子をいかにして作製および使用するかの代表的な例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見い出されることが可能である：５，１６８，０５３、５，６２４，８２４、５，６８３，８７３、５，７２８，５２１、５，８６９，２４８、および５，８７７，１６２。
【０１４６】
ペプチド
タンパク質改変体
本明細書において議論されるように、公知でありかつ本明細書において意図されるＮＦ−κＢタンパク質およびＩκＢタンパク質の多数の改変体が存在している。タンパク質の改変体および誘導体は、当業者に十分に理解されており、これらはアミノ酸配列改変を含むことができる。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、３つのクラス：置換改変体、挿入改変体、および欠失改変体のうちの１つに分類される。挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合物、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合物の挿入よりも小さな挿入、例えば、１個〜４個の残基のオーダーである。実施例に記載されているものなどの免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロで架橋することによってまたは融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するために十分に大きなポリペプチドを融合することによって作製される。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、約２〜６個を超える残基が、タンパク質分子の中の任意の１つの部位において欠失される。通常、これらの改変体は、そのタンパク質をコードしているＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、改変体をコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡにおいて所定の部位において置換変異を作製するための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基の置換であるが、一度に多数の異なる位置に存在することが可能である；挿入は、通常は約１〜１０アミノ酸残基であり；そして欠失は１〜３０残基の範囲である。好ましくは、欠失または挿入は、隣接する対で、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入で作製される。置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせは、組み合わせて最終構築物に到達されてもよい。変異は、読み枠の外に配列を配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生じる可能性がある相補領域を作製しない。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその場所に挿入されているものである。一般的に、このような置換は、以下の表１および２に従って作製され、保存性置換と呼ばれる。
【０１４７】
【表１】
2011520096.tif 000010
【０１４８】
【表２】
2011520096.tif 000011
【０１４９】
機能および免疫学的同一性の実質的な変化は、表２におけるものよりもより保存性が少ない置換を選択すること、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはヘリックスコンホメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに対する残基の効果がより顕著に異なる残基を選択することによって作製される。一般的に、タンパク質の特性の最大変化を生じると予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルの代わりに（またはそれによって）置換されているもの；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基の代わりに（またはそれによって）置換されているもの；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに（またはそれによって）置換されているもの；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンの代わりに（またはそれによって）置換されているもの、この場合において、（ｅ）硫酸化および／もしくはグリコシル化のための部位の数を増加させることによるものである。
【０１５０】
例えば、１つのアミノ酸残基の、生物学的および／または化学的に類似している別のアミノ酸残基での置き換えは、保存性置換として当業者に公知である。例えば、保存性置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基で置き換えること、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ、ＧＩｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。各明白に開示された配列のこのような保存性置換のバリエーションは、本明細書に提供されるモザイクポリペプチドの中に含まれる。
【０１５１】
置換または欠失による変異誘発は、Ｎ−グリコシル化のための部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化のための部位（ＳｅｒまたはＴｈｒ）を挿入するために利用されることが可能である。システインまたは他の不安定な残基の欠失もまた所望されてもよい。潜在的なタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の欠失またはグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基による置換が付随する。
【０１５２】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチド上での組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミル残基およびアスパリル残基まで翻訳後脱アミド化されている。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化されている。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基およびスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに別の例において、Ｃ末端カルボキシルのアミド化を含む。
【０１５３】
抗体
一般的な抗体
「抗体」という用語は広い意味で本明細書で使用され、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子またはそのフラグメントのヒトバージョンまたはヒト化バージョンもまた、これらがＮＦ−κＢまたはＩκＢが本明細書に開示される細胞増殖事象を引き起こすことから阻害されるようにＮＦ−κＢまたはＩκＢと相互作用するそれらの能力について選択される限り、「抗体」という用語の中に含まれる。抗体は、本明細書に記載されているインビトロアッセイを使用して、または類似の方法によって、それらの所望の活性について試験されることが可能であり、その後、それらのインビボでの治療活性および／または予防活性が、既知の臨床試験方法に従って試験される。抗体の機能的等価物もまた開示される。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体をいい、すなわち、その集団の中の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットの中に存在するかもしれない可能性がある天然に存在する変異を除いては同一である。本発明におけるモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体における対応する配列と同一であるかまたはそれと相同であるのに対し、鎖の残りは別の種から誘導されたかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体における対応する配列と同一であるかまたはそれと相同である、「キメラ」抗体、ならびにれらが所望の拮抗活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１：６８５１−５，１９８４を参照のこと）。
【０１５５】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を使用して作製されることが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５によって記載される方法などのハイブリドーマ方法を使用して調製されることが可能である。ハイブリドーマ法において、典型的には、マウスまたは他の適切な宿主動物が免疫剤で免疫され、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球を誘発する。
【０１５６】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法などの組換えＤＮＡ法によってもまた作製されてもよい。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来的な手順を使用して容易に単離および配列決定されることが可能である（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。抗体または活性な抗体フラグメントのライブラリーは、例えば、米国特許第５，８０４，４４０号および同第６，０９６，４４１号に記載されているようなファージディスプレイ技術を使用して生成およびスクリーニングされることもまた可能である。
【０１５７】
インビトロ方法は、一価抗体を調製するためにもまた適切である。抗体のフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該分野において公知である日常的な技術を使用して達成することが可能である。例えば、消化は、パパインを使用して実施することが可能である。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一な抗原結合フラグメント、および残りのＦｃフラグメントを生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有するフラグメントを生じ、なお抗原を架橋する能力がある。
【０１５８】
抗体または抗体フラグメントの活性が、非修飾の抗体または抗体フラグメントと比較して、有意に変化または損なわれることがない限り、他の配列に結合されているか否かに関わらず、これらのフラグメントは、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含むこともまた可能である。これらの修飾は、例えば、ジスルフィド結合が可能であるアミノ酸を除去／付加するため、その生体内寿命を増加するため、その分泌特性を変化させるためなどのために、ある付加的な特性を提供することができる。どのような場合でも、抗体または抗体フラグメントは、そのコグネイト抗原への特異的結合などの生物活性特性を保有しなくてはならない。抗体または抗体フラグメントの機能領域または活性領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発、続いて、発現および発現されたポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当業者には容易に明白であり、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことが可能である（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗体群」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体もまたいうことが可能である。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）は、ヒトにおいて天然に抗原性であり、従って、ヒトに投与されるときに、望ましくない免疫応答を生じる可能性がある。それゆえに、本明細書に開示される方法におけるヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を誘発する機会を減少させる役目を果たす。
【０１６０】
ヒト抗体
ヒト抗体は任意の技術を使用して調製されることが可能である。ヒトモノクローナル抗体産生のための技術の例は、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁，１９８５）によって記載されているもの、およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（ｌ）：８６−９５，１９９１）によって記載されているものが含まれる。ヒト抗体（およびそのフラグメント）は、ファージディスプレイライブラリーを使用して産生することもまた可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１，２２２：５８１，１９９１）。
【０１６１】
ヒト抗体はトランスジェニック動物からもまた得られることが可能である。例えば、免疫に応答したヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能であるトランスジェニック変異体マウスが記載されてきた（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと）。詳細には、これらのキメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じ、このような生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子アレイの首尾よい移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。
【０１６２】
ヒト化抗体
抗体ヒト化技術は、一般的には、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を含む。従って、ヒト化型の非ヒト抗体（またはそのフラグメント）は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部を含む、キメラ抗体または抗体鎖（またはそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１６３】
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原についての特定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。ある場合において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、取り込まれたＣＤＲまたはフレームワークの配列においても見い出されない特定の残基もまた含んでもよい。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。実務上、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般的には、抗体定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト抗体のそれの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１６４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において周知である。例えば、ヒト化抗体は、
Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列を齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって生成されることが可能である。ヒト化抗体を産生するために使用されることが可能である方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、同第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、同第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、同第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、同第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、同第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）、および同第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）においてもまた記載される。
【０１６５】
抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に開示されるように行われることが可能である。抗体送達のための核酸アプローチがもまた存在している。広範に中和する抗ＮＦ−κＢまたはＩκＢ抗体および抗体フラグメントもまた、患者または被験体自身の細胞が核酸を取り込み、コードされている抗体または抗体フラグメントを産生および分泌するように、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として患者または被験体に投与されることが可能である。核酸の送達は、例えば、本明細書に開示されるように、任意の手段によってであり得る。
【０１６６】
細胞への組成物の送達
核酸送達
インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に核酸を送達するために使用することが可能である多数の組成物および方法が存在している。これらの方法および組成物は、２つのクラスに大きく分けられることが可能である：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系である。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの多数の直接送達系を通して、または細胞もしくはカチオン性リポソームなどのキャリアの中の遺伝物質の移動を介して送達されることが可能である。ウイルスベクター、化学形質転換体などのトランスフェクションのための適切な手段、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接的拡散などの物理的機械的方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）によって記載されている。このような方法は当該分野において周知であり、本明細書に記載されている組成物および方法を用いる使用のために容易に適合可能である。特定の場合において、これらの方法は、大きなＤＮＡ分子を用いて特に機能するように修飾される。さらに、これらの方法は、キャリアの標的特性を使用することによって、特定の疾患および細胞集団を標的とするために使用されることが可能である。
【０１６７】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子導入またはトランスフェクション）を含む本明細書に記載される方法において、核酸は、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡの型であり得、または核酸は、細胞への核酸の送達のためのベクターの中にあり得、それによって、ＤＮＡをコードすることまたはＤＮＡもしくはフラグメントは、エンハンサーと同様に当業者によって十分に理解されるように、プロモーターの転写調節下にある。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ））などの商業的に利用可能な調製物であり得る。
【０１６８】
１つの例において、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージング可能であるレトロウイルス系などのウイルス系を介してであり得る（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照のこと）。次いで、組換えアデノウイルスが、感染させるために使用されることが可能であり、それによって、本明細書に開示されている広範に中和する抗体（またはその活性フラグメント）をコードする核酸を感染細胞に送達する。哺乳動物細胞に変化された核酸を導入する正確な方法は、当然、レトロウイルスベクターの使用であるがこれに限定されない。他の技術は、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用を含むこの手順のために広範に利用可能である。リポソーム送達および受容体媒介および他のエンドサイトーシスメカニズムなどの物理的形質導入技術もまた使用されることが可能である（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：４７２−４７８，１９９６を参照のこと）。この開示された対象は、これらのいずれかまたは他の一般的に使用される遺伝子移入方法とともに使用されることが可能である。
【０１６９】
１つの例として、開示される方法において使用される、抗体をコードしている核酸、あるいはＮＦ−κＢもしくはＩκＢタンパク質の阻害剤をコードしているか、またはＮＦ−κＢもしくはＩκＢの遺伝子の特定の改変体をコードしているいくつかの他の核酸が、アデノウイルスベクター中で、被験体の細胞に送達される場合、ヒトへのアデノウイルスの投与の投薬量は、注入あたり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であり得るが、注入あたり１０１２ｐｆｕまでの高さであり得る（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；ＡｌｖａｒｅｚおよびＣｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。被験体は、単回注入を受けることが可能であり、または、さらなる注入が必要である場合、注入は、無期限の間、および／または処理の効力が確立されるまで、６ヶ月間隔で（または、熟練した実務者によって決定されるように、他の適切な間隔で）反復されることが可能である。
【０１７０】
核酸またはベクターの非経口投与は、もしそれが使用される場合、一般的には注射によって特徴付けられる。注射液は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体型、またはエマルジョンとしてのいずれかである従来的な型で調製されることが可能である。非経口投与のためにより最近改良されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるような遅延放出系または持続放出系の使用を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。治療化合物の適切な製剤およびその投与の様々な様々な経路のさらなる議論については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５を参照のこと。
【０１７１】
典型的には、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、細胞に送達される核酸は、組み込み配列を含む。特に、ウイルスベースの系が使用されるとき、しばしば、これらの配列は、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込み系は、送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようになることが可能であるように、リポソームなどの非核酸ベースの送達の系を使用して送達される核酸にもまた取り込まれることが可能である。
【０１７２】
宿主ゲノムへの組み込みのための他の一般的技術は、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系を含む。これらの系は、典型的には、ベクター核酸と標的核酸の間の組換えが起こり、送達された核酸が宿主ゲノムに組み込まれることを引き起こす、宿主ゲノム中の標的配列との十分な相同性を有する発現される核酸に隣接する配列に依存する。相同組換えを促進するために必要であるこれらの系および方法は、当業者に公知である。
【０１７３】
非核酸ベースの系
開示される組成物は、様々な方法で標的細胞に送達されることが可能である。例えば、これらの組成物は、エレクトロポレーションを通して、またはリポフェクションを通して、またはリン酸カルシウム沈殿を通して送達されることが可能である。選択される送達メカニズムは、部分的には、標的とされる細胞の型、および送達が、例えば、インビボまたはインビトロで起こっているかに依存する。
【０１７４】
従って、これらの組成物は、開示される組成物またはベクターに加えて、例えば、リポソームなどの脂質、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームを備えることが可能である。リポソームは、所望される場合、特定の細胞を標的とすることを容易にするためのタンパク質をさらに備えることが可能である。化合物およびカチオン性リポソームを備える組成物の投与は、標的器官に対して救心性である血液に投与され、または呼吸管の細胞を標的とするために呼吸管に吸入されることが可能である。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、化合物は、マクロファージなどの特定の細胞型に標的化されることが可能であるマイクロカプセルの成分として投与されることが可能であり、またはマイクロカプセルからの化合物の核酸または化合物の送達が、特定の速度または投薬量のために設計される。
【０１７５】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子導入またはトランスフェクション）を含む上記の方法において、細胞への組成物の送達は、様々なメカニズムを経由してであり得る。１つの例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のリポソーム調製物、ならびに当該分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用して、リポソームを経由してであり得る。加えて、核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによってインビボで送達されることが可能であり、そのための技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮマシン（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって利用可能である。
【０１７６】
材料は、溶液中、懸濁液中にあってもよい（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型に標的化されてもよい。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。これらの技術は、様々な他の特定の細胞型のために使用されることが可能である。「ステルス」および他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌腫への脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、および高度に特異的なインビボでのマウス神経膠腫の治療的レトロウイルス標的化などの媒体である。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般的に、受容体は、構成的であるかまたはリガンド誘導性のいずれかである、エンドサイトーシスの経路に含まれる。これらの受容体は、クラスリンコートされたピット中でクラスター化し、クラスリンコートされたベシクルを介して細胞に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルでの調節などの様々な機能を発揮する。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、１つより多くの細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子的および細胞的メカニズムは概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０１７７】
インビボ／エキソビボ
上記のように、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で投与されることが可能であり、当該分野において周知である種々のメカニズム（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介しての筋肉内注入、エンドサイトーシスなど）によって、インビボおよび／またはエキソビボで被験体に細胞を送達されることが可能である。
【０１７８】
エキソビボ方法が利用される場合、細胞または組織は、当該分野において周知である標準的な方法に従って、取り出され、身体の外で維持されることが可能である。本発明の組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームなどの任意の遺伝子移入メカニズムを介して、細胞に導入されることが可能である。次いで、形質導入された細胞は、細胞または組織型についての標準的な方法に従って被験体に注入され（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中で）、または被験体に同所に移植して戻されることが可能である。被験体への様々な細胞の移植または注入のための標準的な方法は公知である。
【０１７９】
発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含む。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含んでもよい。
ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、サイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得られてもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本発明において有用である。
【０１８０】
エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から固定された距離で機能するＤＮＡの配列をいい、転写単位に対して、５’（Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３，１９８１）または３’（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８，１９８３）のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、コード配列それ自体の中にあるのと同様に（Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３，１９８４）、イントロンの中であり得る（Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９，１９８３）。これらは、通常、１０〜３００ｂｐ長の間であり、そしてこれらはシスで機能する。エンハンサーはすぐ近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントもまたしばしば含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。現在、多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質、およびインスリン）から公知であるが、典型的には、一般的な発現について真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側の（ｂｐ  １００〜２７０）ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１８１】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能の誘発する光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節されることが可能である。γ照射などの照射、またはアルキル化化学療法薬物への曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強するための方法もまた存在する。
【０１８２】
特定の例において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するために、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして働くことが可能である。特定の構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、たとえ特定の時点で特定の細胞型の中でのみ発現されるとしても、すべての真核生物細胞型において活性である。この型の好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１８３】
すべての特異的調節エレメントは、クローニングされ、黒色腫細胞などの特定の細胞型の中で選択的に発現されている発現ベクターを構築するために使用されることが可能であることが示されてきた。グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞の中で遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
【０１８４】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）の中で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与える可能性がある転写の終結のために必要である配列を含んでもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードしているｍＲＮＡの非翻訳領域の中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位もまた含む。転写単位がポリアデニル化領域もまた含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、これが、転写される単位がｍＲＮＡと同様にプロセシングされ、輸送されるという可能性を増加させることである。発現構築物の中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物の中で使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約４００塩基からなる。転写される単位が、他の標準的な配列を、単独で、または構築物からの発現もしくはその安定性を改善する上記の配列と組み合わせて含むこともまた好ましい。
【０１８５】
マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことが可能である。このマーカー産物は、遺伝子が送達されたか、そして一旦送達されたら発現されるかを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子であり、これは、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質をコードしている。
【０１８６】
ある例において、マーカーは選択マーカーであってもよい。哺乳動物細胞用の適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入されるとき、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に、生存することが可能である。広範に使用されている２つの識別可能なカテゴリーの選択レジメが存在している。第１のカテゴリーは細胞の代謝、および補充される媒体とは独立して増殖する能力を欠いている変異型細胞系統の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なしで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のために必要とされる特定の遺伝子を欠いているので、これらは、欠けているヌクレオチドが補充される培地の中で提供されない限り、生存することは不可能である。培地を補充することに対する代替は、それぞれを欠いている細胞に、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入し、従って、それらの増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地中で生存する能力がない。
【０１８７】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型において使用される選択スキームをいう優性選択であり、変異型細胞系統の使用を必要とはしない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を運ぶタンパク質を発現し、選択で生存する。このような優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を含む。これらの３つのサンプルは、それぞれ、薬物であるＧ４１８もしくはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を運ぶために真核生物制御の下で細菌遺伝子を利用する。その他は、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンを含む。
【０１８８】
薬学的キャリア／薬学的産物の送達
上記のように、本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアの中で、インビボで投与されることもまた可能である。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的ではなくまたはさもなくば望ましくなくはない物質を意味し、すなわち、この物質は、核酸またはベクターとともに、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはこの物質が含まれる薬学的組成物の他のいずれかの成分と有害な様式で相互作用することなく、被験体に投与されてもよい。キャリアは、当然ながら、当業者に周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小化するために、および被験体におけるいかなる有害な副作用も最小化するように選択される。
【０１８９】
局所的鼻内投与または吸入による投与が典型的には好ましいが、これらの組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外で、局所的になどで投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「局所的鼻内投与」は、一方または両方の鼻孔を通しての鼻および鼻腔への組成物の送達を意味し、スプレーメカニズムもしくは液滴メカニズムによる、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を通しての送達を備えることが可能である。後者は、多数の動物が同時に処理されるときに、有効であるかもしれない。吸入剤による組成物の投与は、スプレー化または液滴メカニズムによる送達を介して、鼻または口を通してであり得る。送達は、挿管を介して呼吸系（例えば、肺）の任意の領域に直接的にであり得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的な状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、使用される特定の核酸もしくはベクター、その投与の様式などに依存して、被験体から被験体で変化する。従って、すべての組成物について正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、本発明の教示が与えられれば、日常的な実験のみを使用して、当業者によって検定されることが可能である。
【０１９０】
使用される場合、組成物の非経口投与は、一般的には注射によって特徴付けられる。注射液は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体型、またはエマルジョンとしてのいずれかである従来的な型で調製されることが可能である。非経口投与のためにより最近改良されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるような遅延放出系または持続放出系の使用を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。好ましい態様において、本明細書に開示される組成物は、腹腔内投与されることが可能である。例えば、腹腔内手術の間（例えば、腫瘍の切除に対して）、開示される組成物は、洗浄液として使用されることが可能である。このやり方において、切除されなかった癌細胞、および／または結合していないかもしれないが、しかしなお身体に存在している細胞は、再接着の際に殺傷されることが可能である。あるいは、開示される組成物は、ほぼ手術の時点（手術前後）、手術の前（手術前）、または手術の後（手術後）に投与されることが可能である。本発明の化合物は、腫瘍切除手術の前または後の１週間、２〜５日間、１〜３日間、１〜１８時間、１〜１２時間、１〜６時間、または１時間未満投与されることが可能である。
【０１９１】
別の好ましい例において、開示される組成物は、Ｉ．Ｖ．により、注射により、および／またはＩ．Ｖ．点滴によって投与されることが可能である。
【０１９２】
材料は、溶液中、懸濁液中にあってもよい（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型に標的化されてもよい。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ、Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。「ステルス」および他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌腫への脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、および高度に特異的なインビボでのマウス神経膠腫の治療的レトロウイルス標的化などの媒体である。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般的に、受容体は、構成的であるかまたはリガンド誘導性のいずれかである、エンドサイトーシスの経路に含まれる。これらの受容体は、クラスリンコートされたピット中でクラスター化し、クラスリンコートされたベシクルを介して細胞に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルでの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、１つより多くの細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子的および細胞的メカニズムは概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０１９３】
薬学的に受容可能なキャリア
抗体を含む本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアとともに治療的に使用されることが可能である。
【０１９４】
薬学的キャリアは当業者に公知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物の投与のための標準的なキャリアである。これらの組成物は、筋肉内または皮下に投与されることが可能である。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与される。
【０１９５】
薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、濃厚剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含んでもよい。薬学的組成物は、高微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１種以上の成分を含んでもよい。
【０１９６】
薬学的組成物は、局所的または全身的な治療が望ましいかに依存して、および治療される面積に依存して、多数の方法で投与されてもよい。投与は、局所的（眼科的に、膣に、直腸に、鼻内に）、経口的、吸入によって、または非経口的に、例えば、静脈内点滴によって、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射によってもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与されることが可能である。
【０１９７】
非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性キャリアは、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、これは、生理食塩水および緩衝化媒体を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油を含む。静脈内媒体は、流動体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などを含む。例えば、高微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加剤もまた、存在してもよい。
【０１９８】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、リキッド、および散剤を含んでもよい。従来的な薬学的キャリア、水性、粉末、または油性ベース、濃厚剤などが、必要であるかまたは所望されてもよい。
【０１９９】
経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤を含む。濃厚剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望されてもよい。
【０２００】
ある組成物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として潜在的に投与されてもよい。
【０２０１】
治療的使用
組成物の投与のための投薬量範囲は、徴候の障害がもたらされる所望の効果を生じるために十分大きいものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などのような有害な副作用を引き起こすために十分に大きくなるべきではない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度に伴って変化し、当業者によって決定されることが可能である。投薬量は、任意の対立する表示の事象において個々の医師によって調整されることが可能である。投薬量は変化することが可能であり、１日〜数日間、毎日１回以上の用量投与で投与されることが可能である。
コンビナトリアルケミストリー
開示される組成物は、所望の方法で開示される組成物と相互作用する分子または高分子を同定するために任意のコンビナトリアル技術のための標的として使用されることが可能である。組成物がＮＦ−κＢおよびＩκＢまたはその一部の細胞増殖活性を減少させるように、ＮＦ−κＢまたはＩκＢと相互作用するコンビナトリアル技術またはスクリーニング技術を通して同定される組成物もまた開示され、ここで、組成物は、スクリーニングまたは選択プロトコールにおける標的としてＮＦ−κＢまたはＩκＢを使用して同定される。
【０２０２】
コンビナトリアル技術またはスクリーニング方法において開示される組成物を使用して、阻害または刺激または標的分子の機能などの特定の所望の特性を有する高分子などの分子が同定されることが理解される。開示される組成物を使用して、例えば、ＮＦ−κＢもしくはＩκＢが標的として使用されるとき、またはＢＡＹ−１１−７０８２もしくはＢＡＹ−１１−７０８５のような開示される組成物が競合阻害アッセイにおいて使用されるときに、同定および単離される分子もまた開示される。従って、開示される組成物を含むコンビナトリアルまたはスクリーニングアプローチを使用して産生される生成物もまた、本明細書に開示されると見なされる。
【０２０３】
コンビナトリアルケミストリーは、典型的には、反復プロセスにおいて小分子または別の高分子のいずれかを結合する能力がある小分子または高分子を単離するためのすべての方法を含むがこれらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、および糖類は高分子の例である。例えば、所定の機能、触媒作用、またはリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子は、「インビトロ遺伝学」と呼ばれてきたことの中でランダムオリゴヌクレオチドの複雑な混合物から単離されることが可能である（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ  １９：８９，１９９２）。ランダムな配列および規定された配列を有する分子の大きなプールを合成し、その複雑な混合物、例えば、１００ヌクレオチドＲＮＡ１００μｇの約１０１５個の個々の配列を、何らかの選択プロセスおよび富化プロセスに供する。アフィニティークロマトグラフィーおよびカラムに結合したリガンドに結合する分子のＰＣＲ増幅を通して、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、小分子色素を結合することに関するこのような方法において１０１０ＲＮＡ分子のうちの１個が折りたたまれたと見積もった。このようなリガンド−結合挙動を有するＤＮＡ分子が同様に単離されてきた（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９２；Ｂｏｃｋら、１９９２）。小有機分子、タンパク質、抗体、および当業者に公知である他の高分子について同様の目的を狙っている技術が存在している。所望の活性について分子のセットをスクリーニングすることは、小有機分子ライブラリー、オリゴヌクレオチド、または抗体に基づくかに関わらず、広範にコンビナトリアルケミストリーと呼ばれる。コンビナトリアル技術は、分子間の結合相互作用を規定するため、および高分子が核酸である場合にしばしばアプタマーと呼ばれる、特異的結合活性を有する分子を単離するために、特に適している。
【０２０４】
デノボ活性または修飾活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための多数の方法が存在している。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、特定の標的と相互作用する多数のペプチドを単離するために使用されてきた（例えば、少なくとも、ファージディスプレイに関連する材料およびコンビナトリアルケミストリーに関連する方法のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０３１，０７１号；同第５，８２４，５２０号；同第５，５９６，０７９号；および同第５，５６５，３３２号を参照のこと）。
【０２０５】
所定の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７）によって記載されている。このコンビナトリアルケミストリー方法は、タンパク質の機能的能力と核酸の遺伝的能力を共役させる。ピューロマイシン分子がＲＮＡ分子の３’末端に共有結合されているＲＮＡ分子が生成される。この修飾ＲＮＡ分子のインビトロ翻訳は、ＲＮＡによってコードされている正しいタンパク質が翻訳されることを引き起こす。加えて、伸長されることが不可能なペプチジルアクセプターであるピューロマイシンの付属のために、成長しているペプチド鎖は、ＲＮＡに結合されているピューロマイシンに結合される。従って、タンパク質分子は、それをコードしている遺伝物質に結合される。この段階で、機能的ペプチドを単離するために、通常のインビトロ選択手順が行われることが可能である。一旦、ペプチド機能についての選択手順が完了すると、従来的な核酸操作手順が、選択された機能的ペプチドをコードする核酸を増幅するために実施される。遺伝物質の増幅後、新たなＲＮＡが３’末端のピューロマイシンとともに転写され、新たなペプチドが翻訳され、選択の別の機能的なラウンドが実施される。従って、タンパク質選択は、核酸選択技術と全く同様の反復様式で実施されることが可能である。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに結合されたＲＮＡの配列によって制御される。この配列は、最適な翻訳のために操作されたランダム配列からの何らかのもの（すなわち、ストップコドンがないなど）であり得、またはこれは、既知のペプチドの機能の改善または変化を調べるための既知のＲＮＡ分子の縮重配列であり得る。核酸増幅およびインビトロ翻訳のための条件は当業者に周知であり、好ましくは、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））におけるように実施される。
【０２０６】
ペプチドを単離するために設計されるコンビナトリアル方法のための別の好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎら（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２４）：１４２７２−７，１９９８）において記載されている。この方法はツーハイブリッド技術を利用および改変している。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および分析のための有用である。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて最初に記載されたツーハイブリッド系は、目的のタンパク質に特異的である新たな調節分子を同定するための強力な分子遺伝学的技術である（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−６，１９８９）。Ｃｏｈｅｎらは、選択した分子を結合する、合成または操作されたペプチド配列の間の新規な相互作用が同定できるように、この技術を改変した。この型の技術の利点は、選択が細胞内環境において行われることである。この方法は、産生活性化ドメインに結合されたペプチド分子のライブラリーを利用する。選択したペプチド、例えば、ＮＦ−κＢまたはＩκＢの一部は、Ｇａｌ４などの転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合される。この型の系の上でツーハイブリッド技術を実施することによって、ＮＦ−κＢまたはＩκＢの所望のフラグメントを結合する分子が同定されることが可能である。
【０２０７】
様々なコンビナトリアルライブラリーと組み合わせて、当業者に周知である方法論を使用して、所望の標的に結合するかまたはそれと相互作用する小分子または高分子を単離および特徴付けすることが可能である。これらの化合物の相対的な結合親和性は比較されることが可能であり、当業者に周知である競合結合研究を使用して、最適化合物が同定されることが可能である。
【０２０８】
所望の標的を結合する分子を単離するために、コンビナトリアルライブラリーを作製し、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする技術は当業者に公知である。代表的な技術および方法は、以下の米国特許において見い出されることが可能であるがこれらに限定されない：５，０８４，８２４、５，２８８，５１４、５，４４９，７５４、５，５０６，３３７、５，５３９，０８３、５，５４５，５６８、５，５５６，７６２、５，５６５，３２４、５，５６５，３３２、５，５７３，９０５、５，６１８，８２５、５，６１９，６８０、５，６２７，２１０、５，６４６，２８５、５，６６３，０４６、５，６７０，３２６、５，６７７，１９５、５，６８３，８９９、５，６８８，６９６、５，６８８，９９７、５，６９８，６８５、５，７１２，１４６、５，７２１，０９９、５，７２３，５９８、５，７４１，７１３、５，７９２，４３１、５，８０７，６８３、５，８０７，７５４、５，８２１，１３０、５，８３１，０１４、５，８３４，１９５、５，８３４，３１８、５，８３４，５８８、５，８４０，５００、５，８４７，１５０、５，８５６，１０７、５，８５６，４９６、５，８５９，１９０、５，８６４，０１０、５，８７４，４４３、５，８７７，２１４、５，８８０，９７２、５，８８６，１２６、５，８８６，１２７、５，８９１，７３７、５，９１６，８９９、５，９１９，９５５、５，９２５，５２７、５，９３９，２６８、５，９４２，３８７、５，９４５，０７０、５，９４８，６９６、５，９５８，７０２、５，９５８，７９２、５，９６２，３３７、５，９６５，７１９、５，９７２，７１９、５，９７６，８９４、５，９８０，７０４、５，９８５，３５６、５，９９９，０８６、６，００１，５７９、６，００４，６１７、６，００８，３２１、６，０１７，７６８、６，０２５，３７１、６，０３０，９１７、６，０４０，１９３、６，０４５，６７１、６，０４５，７５５、６，０６０，５９６、および６，０６１，６３６。
【０２０９】
コンビナトリアルライブラリーは、多数の異なる合成技術を使用して広範な分子のアレイから作製されることが可能である。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号），ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、炭化水素（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環状物（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、タグ含有（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含むライブラリー。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、コンビナトリアル方法およびライブラリーは、反復プロセスの中で使用される方法およびライブラリーと同様に、従来的なスクリーニング方法およびライブラリーを含んだ。
【０２１１】
コンピュータで支援される薬物設計
開示される化合物は、開示される組成物の構造を同定するため、または開示される組成物を所望の方法で相互作用する、潜在的なもしくは実際の分子、例えば、小分子を同定するためのいずれかのために、任意の分子モデリング技術のための標的として使用されることが可能である。
【０２１２】
開示される組成物をモデリング技術において使用するとき、阻害または刺激または標的分子の機能などの特に望ましい特性を有する、高分子などの分子が同定されることが理解される。開示される組成物を使用するときに同定および単離される分子もまた開示される。従って、開示される組成物を含む分子モデリングアプローチを使用して産生される生成物もまた、本明細書に開示されると見なされる。
【０２１３】
キット
本明細書に開示される方法を実施する際に使用されることが可能である試薬に至るキットが本明細書で開示される。これらのキットは、本明細書で議論されているかまたは開示される方法の実施において必要とされているかもしくは有益であることが理解されている任意の試薬または試薬の組み合わせを含むことが可能である。例えば、これらのキットは、抗増殖性活性のための標準として、例えば、インビトロ細胞アッセイにおける使用のために、ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５を含む分子を含むことが可能である。
【０２１４】
類似の機能を有する組成物
本明細書に開示されるＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５などの組成物は、抗転移活性または抗増殖性活性などの特定の機能を有することが理解される。開示される機能を実施するための特定の構造的要件が本明細書に開示され、開示される構造に関連する同じ機能を実施することが可能である様々な構造が存在すること、およびこれらの構造は同じ結果、例えば、抗増殖性活性の阻害を最終的に達成することが理解される。
【０２１５】
組成物を作製する方法
本明細書に開示される組成物、および開示される方法を実施するために必要である組成物は、他のことが具体的に注記されない限り、その特定の試薬または化合物について当業者に公知である任意の方法を使用して作製されることが可能である。
【０２１６】
核酸合成
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準的な化学合成方法を使用して作製されることが可能であり、または酵素的方法または任意の他の公知の方法を使用して産生されることが可能である。このような方法は、標準的な酵素消化とそれに続くヌクレオチドフラグメントの単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第５章、第６章を参照のこと）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成装置またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホルアミダイト法による純粋な合成方法までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法は、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：３２３−５６，１９８４（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６５：６１０−６２０，１９８０（ホスホトリエステル法）によってもまた記載されている。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３−７，１９９４によって記載されているものなどの公知の方法を使用して作製されることが可能である。
【０２１７】
ペプチド合成
配列番号２３などの開示されるタンパク質を産生する１つの方法は、タンパク質化学技術によって、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ケミストリーのいずれかを使用する現在利用可能な実験室設備を使用して化学合成されることが可能である（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成されることが可能であることを容易に理解することが可能である。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは合成されることが可能でありかつその合成樹脂から切断されることが不可能であるが、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは、合成されることが可能であり、続いて樹脂から切断されることが可能であり、それによって、他のフラグメント上で機能的にブロックされている末端基を曝露する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それぞれ、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端において、ペプチド結合を介して共有結合されることが可能であり、抗体またはそのフラグメントを形成する（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、少なくともペプチド合成に関連する物質について、参照により本明細書に組み込まれる））。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載されるように、インビボで独立して合成される。一旦単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を経由して、ペプチドまたはそのフラグメントを形成するように連結されてもよい。
【０２１８】
例えば、クローニングされたか、または合成のペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントが結び付けられて、大きなペプチドフラグメント、ポリペプチド、または全体のタンパク質ドメインを生じることを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブ化学ライゲーションは、より短いペプチドフラグメントから、大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用されることが可能である。この方法は、２段階化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−９，１９９４）。第１段階は、初期の共有結合生成物としてのチオエステル連結中間体を得るための、保護されていない合成ペプチド−チオエステルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む保護されていない別のペプチドセグメントとの化学選択的反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は、自発的、迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位にネイティブなペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３０７：９７−１０１，１９９２；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１６０７５，１９９４；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３１２８，１９９１；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０，１９９４）。
【０２１９】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントが化学的に連結され、ここで、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成された結合は、天然でない（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１，１９９２）。この技術は、タンパク質ドメインのアナログ、ならびに完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために使用されてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２５７−２６７頁，１９９２）。
【０２２０】
組成物を作製するためのプロセス
組成物を作製すること、ならびに組成物に導く中間体を作製することのためのプロセスが開示される。合成化学法および標準的な分子生物学法などのこれらの組成物を作製するために使用することが可能である様々な方法が存在している。これらおよび他の開示される組成物を作製する方法が具体的に開示されることが理解される。
【０２２１】
開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。天然には存在しない開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。
【０２２２】
開示される核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生される開示されるペプチドのいずれかが開示される。開示される核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生される天然に存在しない開示されるペプチドのいずれかが開示される。天然に存在しない開示される核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生される開示されるペプチドのいずれかが開示される。
【０２２３】
本明細書に開示される核酸分子のいずれかを用いて、動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示される。本明細書に開示される核酸分子のいずれかで動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生され、哺乳動物である動物が開示される。本明細書に開示される核酸分子のいずれかで動物の中の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生され、哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類である動物もまた開示される。
【０２２４】
本明細書に開示される細胞のいずれかを動物に加えるプロセスによって産生される動物もまた開示される。
【実施例】
【０２２５】
以下の実施例は、本発明で特許請求された化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がいかにして作製されかつ評価されるかの完全な開示および記載を当業者に提供するために出され、本発明の純粋に例示的なものであることが意図され、発明者が彼らの発明であると見なしているものの範囲を限定することは意図されない。数字（例えば、量、温度など）に関する正確性を保証するための努力は行われてきたが、ある程度の誤差および偏差が計上されるはずである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、または周囲温度であり、そして圧力は大気圧またはその近辺である。
【０２２６】
実施例１：
材料：
ＮＦ−κＢ阻害剤、ＢＡＹ  １１−７０８２（ＢｉｏＭｏｌ）、ＢＡＹ  １１−７０８５（ＢｉｏＭｏｌ）、およびＮ−ベンゾイルオキシカルボニル（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ロイシナル（ＭＧ−１３２）（Ｓｉｇｍａ）はＤＭＳＯ中で可溶化された。拮抗性かつキメラＴＮＦαモノクローナル抗体（ｃＡ２）はｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈの臨床薬学から購入され、滅菌水中で再構成された。ＦＬＩＰＳ／Ｌ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＴＲＡＦ−１、およびＴＲＡＦ−２に対するポリクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手された。切断されたポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）に対する抗体はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手された。ｐ６５  ＮＦ−κＢサブユニットを認識するモノクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手された。アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手された。
【０２２７】
細胞培養、増殖、および毒性：
ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９結腸癌細胞系統はＡＴＣＣコレクションから入手され、１０％胎仔ウシ血清、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養された。ポナステロン感受性プロモーターの制御下でＣＯＸ−２（２９３−ＣＯＸ−２）で安定にトランスフェクトされた２９３細胞は、１０％胎仔ウシ血清、４００μｇ／ｍＬのゼオシン、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養された。ＣＯＸ−２タンパク質発現の誘導のために、２９３−ＣＯＸ−２細胞は、１μｇ／ｍｌのポナステロンを補充した培地中で４８時間培養された。全ての細胞は、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２雰囲気で３７℃で培養された。
【０２２８】
細胞増殖アッセイのために、細胞は、９６ウェルディッシュ中、４０，０００細胞／ウェルで分散およびプレートされた。培養中の様々な日数で、細胞は氷冷ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ラジオイムノアッセイグレードＢＳＡ）の１００μＬ／ウェルで２回穏やかに洗浄され、氷冷ＰＢＳの１００μＬ／ウェルで２回洗浄された。細胞は１００％氷冷メタノール（１００μＬ／ウェル）中で１０分間固定され、次いで、空気乾燥された。細胞はＨ２Ｏ中の０．１％クリスタルバイオレットの１００μＬ／ウェルで染色され、次いで、ｄｄＨ２Ｏで４回、そしてＰＢＳで４回、穏やかに洗浄された。次いで、プレートは完全に空気乾燥された。次いで、染色された細胞は、１％デオキシコール酸ナトリウム中に可溶化され、プレートは分光光度計で５９０ｎｍで読み取られた。５９０ｎｍにおける吸収は、付着した細胞の数に比例する。
【０２２９】
細胞毒性アッセイのために、ＰｒｏｍｅｇａからのＣＹＴＯＴＯＸ９６（商標）キットが、製造業者の説明書に従って使用された。手短に述べると、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞は、９６ウェルプレート中で１、２．５、５、７．５、および１０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５とともに２４時間インキュベートされ、次いで、１００μＬの培養培地あたり１５μＬの溶解１０×溶液（水中９％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００）を加えることによって溶解され、続いて、３７℃で４５〜６０分間、インキュベートが行われた。サンプル上清（５０μＬ）は新鮮な９６ウェル酵素アッセイプレートに移され、暗所にて室温で３０分間、再構成された基質ミックス（サンプルあたり５０μＬ）とともにインキュベートされた。次いで、酵素アッセイは、５０μＬ／ウェルの停止溶液を加えることによって停止された。プレートは４９０ｎｍで読み取られ、吸収値は対照（ＤＭＳＯ単独）に対する比率としてプロットされた。
【０２３０】
電気泳動移動度シフトアッセイ
接着細胞単層は冷ＰＢＳで１回洗浄され、その後、２００μＬの冷緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、０．２％  ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および各１μｇ／ｍＬのアプロチニンおよびロイペプチン）が細胞に加えられた。これらの細胞は、微量遠心チューブにこすり取られ、氷上に維持され、そして超音波処理された。溶解物は、４℃にて、５００ｇで５分間遠心分離され、細胞質画分（上清）が除去された。２５〜５０μＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５％グリセロール、０．２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および各１０μｇ／ｍＬのアプロチニンおよびロイペプチン）が核画分（ペレット）に加えられた。この懸濁液はボルテックスされ、氷上に３０分間維持され、そして１３，０００ｇで１０分間遠心分離された。上清は、ＢＣＡアッセイを使用して、総蛋白質濃度について標準化された（Ｐｉｅｒｃｅら「Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩκＢα  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｏｗ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２１０９６−１０３，１９９７）。
【０２３１】
ＮＦ−κＢコンセンサス結合部位（配列番号１）（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）を含む５ｐモルのＤＮＡオリゴヌクレオチド、５μＬ  ５×フォワード反応緩衝液、１０単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２．５μＬ［３２Ｐ］ＡＴＰ（１０μＣｉ／μＬ、３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、および水（総量２５μＬまで）が、３７℃で１０分間、インキュベートされた。反応は６５℃で１０分間、混液を加熱することによって停止され、標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｇ−２５  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム中で、１２，０００〜１６，０００ｇで３０秒間、この混液を遠心分離することによって、未取り込みの［３２Ｐ］ＡＴＰから分離された。標識された核酸は、収集チューブ中、約２５μＬのＴＥ緩衝液中で回収された。
【０２３２】
結合アッセイのために、等量の核抽出物（約２〜５μｇタンパク質）が、４μＬ  ５×ゲルシフト結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、２５％グリセロール、Ｈ２Ｏ（５ｍＬまで調整する量））、１．５μｇポリ（ｄＩ−ｄＣ）、１μＬ  ３２Ｐ標識プローブ、および反応総量を２０μｌにするために十分な量のＨ２Ｏとともに、氷上で１５分間インキュベートされた。２μＬ  １０×ローディング緩衝液（２０％グリセロール、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８、０．２５％  ブロモフェノールブルー、０．２５％  キシレンシアノール）が各サンプルに加えられ、次いで、ネイティブ８％  ポリアクリルアミドゲルにロードされた。ゲルは、０．５×ＴＢＥ緩衝液中で約２時間泳動され、乾燥され、そしてオートラジオグラフィーに供された。ブロット上のバンドはＮＩＨイメージプログラムを使用して定量された。
【０２３３】
ＮＦ−κＢの活性化もまた、製造業者の説明書に従って、ＴＲＡＮＳ−ＡＭ（商標）アッセイ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して決定された（Ｒｅｎａｒｄら「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｅ  ＮＦ−κＢ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９，Ｅ２１，２００１）。手短に述べると、６０ｍｍディッシュ上の細胞単層は、氷冷ＰＢＳで洗浄され、そしてトリプシン−ＰＢＳ中でインキュベートすることまたはこすり取ることによって取り外された。これらの細胞は、４℃にて、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、１００μＬの４℃の溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）、３５０ｍＭ  ＮａＣ１、２０％  グリセロール、１％  Ｉｇｅｐａｌ−ＣＡ６３０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１μＬの１Ｍ  ジチオスレイトール、および溶解緩衝液ｍＬあたり１０μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（独自品））中で１０分間再懸濁された。溶解物は４℃にて１４，０００ｇで２０分間遠心分離された。５μｇの総タンパク質を含む溶解物が、ＮＦ−κＢコンセンサスＤＮＡ結合部位（配列番号２）（５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’）に対応する固定化オリゴヌクレオチドを含む９６ウェルディッシュ中のウェルあたり２０μＬの溶解緩衝液に加えられた。プレートは粘着フィルムで覆われ、振盪器上で室温にて１時間インキュベートされた。次いで、ウェルは、ウェルあたり２００μＬの洗浄緩衝液（１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄された。１００μＬのｐ６５サブユニットモノクローナル抗体（キットとともに供給されるｐ６５抗体は、ＮＦ−κＢコンセンサス結合配列を含むＤＮＡに結合されているｐ６５含有ＮＦ−κＢヘテロダイマーのみを認識する）は、１×抗体結合緩衝液（４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、８％  グリセロール、１％  ウシ血清アルブミン）中で１：１０００希釈され、各ウェルに加えられ、室温で１時間インキュベートされた。ウェルは１００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄された。１×抗体結合緩衝液中で１：１０００希釈された１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体が各ウェルに加えられ、攪拌を伴うことなく、室温で１時間インキュベートされた。ウェルは、ウェルあたり２００μＬの１×洗浄緩衝液で４回洗浄された。１００μＬの展開溶液（１％  ＤＭＳＯ中テトラメチルベンジジン）が各ウェルに加えられ、室温で１０分間インキュベートされた。１００μＬの停止溶液（０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）が各ウェルに加えられ、その後、吸収が、プレート分光光度計で４５０ｎｍにて決定された。結合の特異性は、細胞溶解物がウェルに加えられた時点で加えられた２００倍過剰の野生型ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドを使用して決定された。
【０２３４】
アポトーシスアッセイ
単一細胞懸濁物は、ＤＭＳＯ、ＢＡＹ  １１−７０８２、ＢＡＹ  １１−７０８５、またはＭＧ−１３２を含む培地中で、インキュベーターの中で８〜２４時間、２４ウェルプレートのウェルあたり１００，０００細胞でプレートされた。あるいは、ＤＭＳＯ、ＢＡＹ  １１−７０８２、ＢＡＹ  １１−７０８５、またはＭＧ−１３２は、数日間、コンフルエントかつ接着していた細胞に加えられた。非接着細胞は培地で吸引されて除かれ、１５ｍＬポリプロピレンチューブ中で、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離された。接着細胞はＰＢＳで２回洗浄され、トリプシンで分散され、そして１５ｍＬポリプロピレンチューブ中で、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離で沈殿された。非接着細胞および接着細胞は、１×結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ  ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）に１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁された。１００μＬの細胞溶液が５ｍＬ  培養チューブに移され、５μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ−結合体化モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および１０μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中で作製した５０μｇ／ｍＬストック溶液より）とともに、暗所にて２５℃で１５分間インキュベートされた。４００μＬの結合緩衝液を各チューブに加え、細胞はフローサイトメトリーによってすぐに分析された。アポトーシスのパーセントは、計数されたすべての細胞のアネキシンＶ−陽性、ヨウ化プロピジウム陰性細胞のパーセントとして決定された。
【０２３５】
約６０〜７０％コンフルエントであったＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞は、細胞に１〜５０μＬの精製ウイルスを加えることによって、Ａｄ−ＩκＢスーパーリプレッサーで形質導入された。３日後、Ａｄ−ＩκＢスーパーリプレッサーの発現がイムノブロットによって確認された。並行実験において、形質導入された細胞は再懸濁され、ＢＡＹ  １１−７０８５中で８時間再接着された。生存している（非アポトーシス）細胞のパーセンテージは、クリスタルバイオレット染色を使用して決定された。
【０２３６】
イムノブロッティング
細胞は氷冷ＰＢＳで２回洗浄され、次いで、４℃溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０％  グリセロール、１％  ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、および各ｌμｇ／ｍＬのアプロチニン、ロイペプチン、キモスタチン、ペプスタチン）中で溶解され、そして４℃にて、１２，０００ｒｐｍで１５分間清澄化された。溶解物は総タンパク質濃度について標準化された。次いで、溶解物のアリコートが、サンプル緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２０％  グリセロール、４％  ドデシル硫酸ナトリウム、２％  β−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬ  ブロモフェノールブルー）中で１：１混合され、３分間煮沸された。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（７．５または１０％  アクリルアミド）上にロードされた。タンパク質は、ゲルからニトロセルロースに転写され、ブロッキング緩衝液（１％  ウシ血清アルブミン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．４）、０．９％  ＮａＣｌ、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ）中で、４℃にて一晩インキュベートされた。
【０２３７】
免疫検出のために、ブロックされたブロットは、振盪器上で、４℃にて２時間、一次抗体でプローブされた。ブロットは、ブロッキング緩衝液中で、２回、各１０分間洗浄され、次いで、１：２０００希釈のウサギ−抗−マウス二次抗体とともにインキュベートされた（モノクローナル一次抗体用；ポリクローナル抗体については、この工程は飛ばされる）。ブロッキング緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣ１、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％  ウシ血清アルブミン、および０．２ｇｍ／５００ｍＬ最終濃度のアジ化ナトリウム）中での２回の洗浄後、ブロットは、最終的に、ブロッキング緩衝液中の１：２０００希釈のアルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともにインキュベートされた。アルカリホスファターゼは、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）／ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）キット（Ｚｙｍｅｄ）を使用する比色定量反応によって検出された。
【０２３８】
胸腺欠損マウス結腸癌異種移植片研究
ＨＴ−２９細胞およびＨＣＴ−１１６細胞は、０．２５％  トリプシン−ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中で収集され、培地およびＰＢＳ中で１回洗浄され、そして２００μＬあたり１００万細胞でＰＢＳ中に再懸濁された。１００万細胞は、５週齢雌性ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）の背中に皮下注射または腹腔内注射のいずれかが行われた。皮下腫瘍を有するマウスについては、腫瘍は１０日間それ自体樹立することが許容され、その後、ＢＡＹ  １１−７０８５またはＤＭＳＯにランダムに分けられた。腹腔内腫瘍を有するマウスについては、マウスは、癌細胞が腹腔内に注射される２４時間前にＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５（５ｍｇ／ｋｇ）を受容した。すべてのマウスは、２１〜３２日間、週に２回、ＢＡＹ  １１−７０８５（５ｍｇ／ｋｇ）または等量のＤＭＳＯ（約２００μＬ）を受容した。皮下腫瘍のサイズは、キャリパーを用いて長さおよび幅を測定することによって決定された。これらの研究は、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄおよびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施された。マウスは、それらが体重の１０％より多い体重減少を経験したときか、またはそれらが病気に見えた場合に、安楽死された。死亡後の実験は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された腎臓、肺、および肝臓組織の切片化、続いて、治療に対しては盲検である熟練したマウス病理学者（Ｅ．Ｊ．Ｅ．）による組織毒性／損傷についての検査を含んだ。
【０２３９】
結果
ＮＦ−κＢ阻害剤は結腸癌細胞増殖を減少する
齧歯類モデルにおいてＮＦ−κＢおよび関節炎を阻害することが知られている２つの化合物ＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５（Ｐｉｅｒｃｅら「Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩκＢα  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｏｗ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２１０９６−１０３，１９９７）が結腸癌細胞系統に対して試験された。ＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５は、ＩκＢリン酸化およびＴＮＦα誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する可溶性化合物である（同上）。これらはまた、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーのシグナル伝達タンパク質であるＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８を活性化することもまた見い出されている（同上）。１０μＭのＢＡＹ  １１−７０８５との、結腸癌細胞株、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９のインキュベーションは細胞増殖を大きく阻害したが、ＢＡＹ  １１−７０８２ではそうではなかった（図１ＡおよびＢ）。
【０２４０】
結腸癌細胞増殖に対するＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５の阻害効果の違いが２つの化合物の活性の違いに起因するのか否かを決定するために、ＮＦ−κＢ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施した。１０μＭ濃度の２つの化合物とのＨＴ−２９細胞の３時間および６時間のインキュベーション後、ＢＡＹ  １１−７０８２よりもＢＡＹ  １１−７０８５で、ＮＦ−κＢ活性のより著しい阻害が起こった（図１Ｃ）。様々な癌細胞の以前の報告と一貫して、ＨＴ−２９結腸癌細胞は、ＮＦ−κＢの構成的活性化を実証した。ＤＬＤ−１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞は、ＥＭＳＡによるＮＦ−κＢの構成的活性化を同様に実証した（データ示さず）。
【０２４１】
ＨＴ−２９結腸癌細胞がＮＦ−κＢ阻害剤ＢＡＹ  １１−７０８５またはＭＧ−１３２で２４時間処理されたときに、アポトーシス細胞（アネキシンＶ−陽性かつヨウ化プロピジウム−陰性）のパーセンテージは、ＢＡＹ  １１−７０８５よりもＭＧ−１３２について比較的大きく、浮遊細胞の数に比例していた。このことは、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で２４時間処理されたＨＴ−２９細胞において確認された。ＢＡＹ  １１−７０８５処理後に接着したままであるＨＴ−２９細胞と非接着になった細胞を分離した後、アポトーシス細胞のパーセンテージが各グループについて決定された。非接着細胞の大部分がアポトーシス性であるのに対して、わずかな接着細胞のみがアポトーシス性であった。多くの細胞がアネキシンＶとヨウ化プロピジウムの両方に対して陽性であり、これらが完全なアポトーシス性であり、今や壊死性であったので、非接着性アポトーシス細胞のパーセンテージは、より低い濃度のＢＡＹ  １１−７０８５と比較して、５０および１００μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５での処理後に減少した。別のやり方で示されるように、ＨＴ−２９細胞は２０μＭ  ＭＧ−１３２で８時間処理され、その後、接着細胞および非接着細胞は別々に収集され、次いで、溶解され、カスパーゼ切断の生成物である切断ＰＡＲＰについてイムノブロットが行われた。切断ＰＡＲＰのわずかな増加のみが接着したままである細胞に存在したのに対し、非接着細胞では切断ＰＡＲＰの大きな増加が存在した。結腸癌細胞の接着の喪失は、ＩＦＮおよびＴＮＦαによるアポトーシスの誘導に付随することが示された。結腸癌細胞接着の阻害は、ＮＦ−κＢ阻害剤のアポトーシス効果に関連するようである。
【０２４２】
ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５が顕著な直接的細胞毒性を引き起こしたか否かを決定するために、ＬＤＨベースの細胞毒性アッセイは、ＤＬＤ−Ｉ、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９細胞系統で実施された。２４時間の１〜１０μＭのＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５は、最大で２０％の細胞毒性を生じた。従って、ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５に起因する直接的細胞毒性は、結腸癌細胞増殖の減少を単独では説明できなかった。
【０２４３】
ＮＦ−κＢ阻害剤は結腸癌細胞腫瘍形成を阻害する
足場非依存性細胞増殖は癌細胞の顕著な特徴であり、インビボでの腫瘍形成と良好な相関がある。従って、ＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５の効果は、軟寒天コロニー形成アッセイを使用して結腸癌細胞増殖に対して試験された。１０μＭ濃度のＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５、６日間では、結腸癌細胞ＤＬＤ−１およびＨＴ−２９の足場非依存性増殖が顕著に阻害されたが、ＨＣＴ−１１６ではそうではなかった（図２Ａ）。
【０２４４】
最近の研究は、ＩκＢスーパーリプレッサー変異体を含むアデノウイルスの腫瘍への直接注射による、胸腺欠損マウスにおける結腸癌細胞異種移植片中のＮＦ−κＢの阻害は、単独では腫瘍サイズを減少させることに失敗したことを示した（Ｗａｎｇら「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：４１２−７，１９９９）。しかし、ＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５は、単独で胸腺欠損マウスにおいて結腸癌異種移植片増殖を阻害した。ＨＣＴ−１１６およびＨＴ−２９細胞系統は、胸腺欠損雌性マウスにおいて皮下腫瘍を生成するために使用された。続いて、このマウスは、ランダムにビヒクル（ＤＭＳＯ）単独またはＢＡＹ  １１−７０８５  １ｍｇ／ｋｇで、２８日間、１週間に２回処理された。
【０２４５】
ＨＴ−２９細胞は、胸腺欠損マウスにおいて腫瘍を容易に形成したのに対して、ＨＣＴ−１１６細胞は大部分の場合において、非常に小さな腫瘍のみを形成した。対照と比較して、ＢＡＹ  １１−７０８５処理群の中でのＨＴ−２９異種移植片中の腫瘍体積の統計学的に有意な全体的な減少が存在した（図２Ｂ）。処理群または対照群におけるＨＣＴ−１１６異種移植片の腫瘍体積の統計学的に有意な全体的な違いは存在しなかった（図２Ｃ）。
【０２４６】
ＮＦ−κＢ阻害剤誘導性アポトーシスは細胞接着の喪失および阻害に付随する
２４時間、２０μＭまでの用量のＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５を用いるＨＴ−２９細胞の処理は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイによって測定されるようなアポトーシスのレベルの増加を引き起こし（図３Ａ）、これは、アポトーシスの初期段階の細胞にとって感受性である。しかし、別のＮＦ−κＢ阻害剤である２０μＭのＭＧ−１３２は、アポトーシスのより大きな増加を引き起こした（図３Ａ）。本明細書に開示されるように、アポトーシスのレベルは、浮遊細胞によって明らかにされる細胞接着の喪失の程度と相関した。ＨＴ−２９細胞は、８時間、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、その後、アポトーシス細胞のパーセンテージが、接着したままである細胞と非接着になった細胞について別々に決定された。非接着細胞はアポトーシスが優勢であるのに対して、接着細胞のわずかのみがアポトーシス性であった（図３Ｂ）。非接着細胞画分におけるアポトーシスのパーセンテージは５０および１００μＭ濃度のＢＡＹ  １１−７０８５において減少したことに注目のこと。これは、８時間の処理後、より高用量のＢＡＹ  １１−７０８５の細胞の多くがアネキシンＶ陽性であり、ヨウ化プロピジウムを除外することに失敗し、これらが完全にアポトーシス性であり、今や壊死性であったことを意味したという事実に起因した。同様の結果は、他の結腸癌細胞系統、ＨＣＴ−１１６およびＭＧ−１３２を使用して得られた。２４時間、２０μＭ  ＭＧ−１３２でのＨＣＴ−１１６細胞の処理後、接着を喪失した容易に見られる細胞の集団が存在した。接着したままである細胞においては、カスパーゼ切断および活性化の生成物である切断ＰＡＲＰの少しの増加のみが存在したのに対して、非接着細胞においては、切断ＰＡＲＰの大きな増加が存在した（図３Ｃ）。
【０２４７】
種々の濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で３日間の接着性ＨＴ−２９細胞の前処理、続いて１時間の細胞接着アッセイは、高濃度のＢＡＹ  １１−７０８５における細胞接着の顕著かつ迅速な阻害を実証し（図３Ｄ）、ＮＦ−κＢが細胞接着を促進したことを示唆する。たとえＢＡＹ  １１−７０８５が細胞接着の喪失を誘導したとしても、ＨＴ−２９細胞が実際にアノイキスに対して感受性であったか否かを示すことが重要であった。ＨＴ−２９細胞接着を完全に阻害した基材である、ポリ−ＨＥＭＡでコートされたディッシュ上で、ＨＴ−２９細胞が２４時間、懸濁中で培養されたとき、浮遊細胞のわずかのみ（１７％）がアネキシンＶアッセイによってアポトーシス性であった。懸濁されたＨＴ−２９細胞のわずかな画分のみがアポトーシス性であたという事実は、アノイキスが、ＮＦ−κＢ阻害剤のアポトーシス活性の原因である基本的なメカニズムではなかったことを示唆する。
【０２４８】
結腸癌細胞接着の喪失はＮＦ−κＢを活性化する
様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５が、再プレート前の約１５分間、トリプシン−ＰＢＳ中に一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞に加えられた。これらの一時的に懸濁された細胞は、アノイキスを妨害するために、迅速に再接着された。あるいは、ＢＡＹ−１１−７０８５は、接着ＨＴ−２９細胞単層に加えられた。試験されたすべての濃度のＢＡＹ  １１−７０８５は、一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞のアポトーシスの有意な増加を引き起こした（図４Ａ）。他方、最高用量のＢＡＹ  １１−７０８５さえもが、一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞と比較して、比較的少ない程度の接着細胞のアポトーシスを引き起こした（図５）。同様の結果は、同じ用量のＢＡＹ  １１−７０８２を用いて得られた。
【０２４９】
細胞接着の一時的な喪失がＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス効果を非常に増強するので、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化が細胞接着の喪失によって影響される可能性があるとの仮説を立てた。このことを試験するために、ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、およびＨＴ−２９細胞が、トリプシン−ＰＢＳ中に一時的に懸濁され、次いで、迅速に再接着された。ｐ６５  ＮＦ−κＢサブユニット局在に対する免疫蛍光研究は、一時的に懸濁中にある１時間後に細胞中の核ｐ６５を明示した（図４Ｂ）。この後、再プレートの３〜２４時間核ｐ６５局在の減少が続いた。実際、２４時間までに、多くの細胞質ｐ６５染色が存在したが、わずかな核ｐ６５染色が見られた。同様の結果は、ＤＬＤ−１（図４Ｃ）およびＨＣＴ−１１６（図４Ｄ）結腸癌系統で得られた。これらの結果は、結腸癌細胞の一時的懸濁がＮＦ−κＢの活性化を生じたことを実証した。
【０２５０】
ＮＦ−κＢ結合アッセイは、一時的懸濁によるＮＦ−κＢの活性化を実証するために使用された。ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、およびＨＴ−２９細胞の接着単層は、８時間、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、プレートからこすり取られ、そしてＮＦ−κＢ活性化アッセイに供された。こすり取られた細胞は溶解され、ＮＦ−κＢコンセンサス結合配列に対応する固定化オリゴヌクレオチドを含む９６ウェルプレートに加えられた（ＴＲＡＮＳ−ＡＭ（商標）アッセイ）。固定化オリゴヌクレオチドへのＮＦ−κＢ結合は、ｐ６５モノクローナル一次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗マウス二次抗体を使用して検出された。このアッセイは、陽性対照（ＴＮＦαで処理されたＨｅＬａ細胞）と比較して、比較的わずかなＮＦ−κＢの活性化が存在したことを示した（図５Ａ）。しかし、一時的に懸濁された細胞が再接着するよう許容された場合、大きなＮＦ−κＢの誘導が起こった（図５Ａ）。従って、ＮＦ−κＢ活性化における大きな変化を引き起こす刺激であったのは、単に一時的な懸濁ではなく、再接着であった。
【０２５１】
同じＮＦ−κＢ結合アッセイは、ＮＦ−κＢ阻害剤が再接着によるＮＦ−κＢの活性化を減少できるか否かを決定するために使用された。トリプシンで一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞は、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５と混合され、次いで、８時間、培養ディッシュ上に配置された。あるいは、接着ＨＴ−２９細胞は、８時間、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。細胞はこすり取られ、すべての細胞は収集されかつ溶解された。ＮＦ−κＢ結合アッセイは、一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞の再接着によって引き起こされるＮＦ−κＢの強力な活性化を確認し、そしてＢＡＹ  １１−７０８５によるこのＮＦ−κＢ活性化の用量関連阻害を実証した（図５Ｂ、一時的に懸濁された細胞）。他方、増加濃度のＢＡＹ  １１−７０８５での処理によって比較的影響を受けなかった接着ＨＴ−２９細胞における安定しかつ低いレベルの構成的ＮＦ−κＢ活性化が存在していた（図５Ｂ、接着細胞）。
【０２５２】
トリプシンは結腸癌細胞中のプロテアーゼ活性化受容体−２を活性化することが可能であるので、これは、次いで、細胞増殖の増加を生じる（Ｄａｒｍｏｕｌら「Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ａｃｔｉｎｇ  ａｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２」Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８５：７７２−９，２００１）。ＮＦ−κＢ活性化は、トリプシンまたはこすり取りによってディッシュから取り出された、接着性かつコンフルエントなＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、およびＨＴ−２９細胞中で決定された。細胞のこすり取りはＮＦ−κＢ活性化を生じなかった（図５Ｃ）。加えて、トリプシン−ＰＢＳ中に一時的に懸濁されたが再接着されなかった細胞は、ＴＲＡＮＳ−ＡＭ（商標）アッセイによってＮＦ−κＢの有意により大きな活性化を示さなかった（図５Ｃ）。細胞接着によって引き起こされるＮＦ−κＢの一時的な活性化が、試験されたすべての結腸癌細胞を、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスに対してより感受性にするか否かを決定するために、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、Ｃａｃｏ−２、およびＨＴ−２９結腸癌細胞系統が一時的に懸濁され、ＢＡＹ  １１−７０８５で処理され、そして再接着が許容された。ＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞は、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスについての同じ傾向を示したのに対して、Ｃａｃｏ−２細胞は中程度の増加を示し、一方ＨＣＴ−１１６細胞は増加を示さなかった（図５Ｃ）。
【０２５３】
使用される結腸癌細胞は、それらの起源の違いで選択された。ＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞は変異型ＡＰＣ対立遺伝子を有するが、ＨＣＴ−１１６細胞は有していない（Ｇｒｏｄｅｎら「Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＰＣ，ａ  ｃｏｌｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１５３１−９，１９９５）；しかし、ＨＣＴ−１１６細胞はβカテニン遺伝子中に活性化変異を有している（ＣＴＮＮＢ１）（Ｉｌｙａｓら「β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１０３３０−４，１９９７）その遺伝子産物は通常はＡＰＣ遺伝子産物によって調節されている（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕら「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）  ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：３０４６−５０，１９９５；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら「Ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｆｏｒｍ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｕｔ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  α−ｃａｔｅｎｉｎ，β−ｃａｔｅｎｉｎ，ａｎｄ  ｐｌａｋｏｇｌｏｂｉｎ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：５５４９−５５，１９９５）。加えて、ＨＣＴ−１１６細胞はＣＯＸ−２を発現しないが、ＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞は発現する（Ｈｉｓら「Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＨＴ−２９  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２５６：５６３−７０，２０００；Ｓｈａｏら「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３３９５１−６，２０００；Ｔｓｕｊｉら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ５５：１７９−８３，１９９６）。ＣＯＸ−２は、結腸直腸腫瘍において共通して過剰発現され、結腸直腸癌における生存および転移において役割を果たす。
【０２５４】
ＣＯＸ−２過剰発現は、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスに対する結腸癌細胞の感受性において役割を果たす。ポナステロン誘導性ＣＯＸ−２構築物（２９３−ＣＯＸ−２）でトランスフェクトされた２９３細胞はＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。４８時間、１μｇ／ｍＬのポナステロンでの２９３−ＣＯＸ−２細胞の処理はＣＯＸ−２タンパク質の大きな誘導をもたらしたのに対して、非誘導細胞は、ウェスタンブロットによって測定可能なＣＯＸ−２タンパク質発現を示さなかった（図５Ｅ）。非誘導２９３−ＣＯＸ−２細胞は、ＢＡＹ  １１−７０８５での処理後にアポトーシスの増加を示さなかった（図５Ｆ）。しかし、ポナステロン誘導性２９３−ＣＯＸ−２細胞は、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスの顕著な増加を実証した（図５Ｅ）。このデータは、ＣＯＸ−２発現の違いがＢＡＹ  １１−７０８５がアポトーシスを引き起こす能力に影響を与えることが可能であることを示した。
【０２５５】
２つの他の可溶性ＮＦ−κＢ阻害剤、ＭＧ−１３２およびＰＤＴＣが、再接着の間に結腸癌細胞のアポトーシスの誘導におけるそれらの活性を試験するために使用された。ＢＡＹ  １１−７０８５と比較して、ＭＧ−１３２は、再接着の間にＨＴ−２９結腸癌細胞のアポトーシスをより強力に誘導した。ＰＤＴＣは、同様に、再接着の間にＨＴ−２９細胞のアポトーシスを引き起こした。
【０２５６】
ＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシスのメカニズムにおけるＮＦ−κＢの特定の関与が具体的に試験された。これを達成するために、ＤＬＤ−Ｉ細胞およびＨＴ−２９細胞が、ＮＦ−κＢを特異的に阻害するためにＩＫＢスーパーリプレッサー構築物を含むアデノウイルスで形質導入された。ＩκＢスーパーリプレッサーは、ユビキチン化のために、従って、プロテオソームによる分解のための標的とされる能力がないコードされたＩκＢタンパク質を生じる、ＩｋＢ遺伝子の中の２つの鍵となるセリン残基を変異させることによって、以前に作成された。次いで、形質導入されたＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞は一時的に懸濁され、これらの細胞系統にとってのインビトロアポトーシス閾値（＞２０μＭ）より下のＢＡＹ  １１−７０８５濃度で再接着された。ＤＬＤ−１細胞およびＨＴ−２９細胞におけるＩκＢスーパーリプレッサーの発現は、対照と比較して、ＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス閾値を顕著に低下させた。ＩκＢスーパーリプレッサーの効果は、ＤＬＤ−１ではＨＴ−２９細胞よりもはるかに大きかった。なぜなら、前者は後者の細胞よりもより高いレベルのＩκＢスーパーリプレッサータンパク質を発現したからである。さらに、ＩκＢスーパーリプレッサータンパク質は、両方の細胞系統で機能的であった。それゆえに、ＮＦ−κＢの阻害は、結腸癌細胞再接着の間にＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス効果に対して重要である。
【０２５７】
ＮＦ−κＢ阻害剤はインビボで腹腔内転移を妨害する
ＢＡＹ  １１−７０８５は再接着ＨＴ−２９細胞のアポトーシスを誘導したので、結腸癌細胞での腹腔内組織の接種によって薬物が転移を妨害する能力を試験するためのインビボモデルが使用された。結腸直腸癌の手術の間に、腹膜表面の腫瘍細胞移植を用いる腫瘍細胞による腹腔の接種を行うことが可能である。接種は、癌細胞の一時的懸濁から、天然にまたは外科的置換のためのいずれかでの接着の喪失、続いて他の組織への再接着を通して生じる。ＨＴ−２９およびＨＣＴ−１１６結腸癌細胞系統は、腹腔内媒体単独（ＤＭＳＯ）またはＢＡＹ  １１−７０８５（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで２４時間前に前処理した胸腺欠損マウスの腹腔に注射された。次いで、マウスは、総計２１日間、１週間に２回、媒体またはＢＡＹ  １１−７０８５で処理された。腹腔内への結腸癌細胞の導入の７日後に屠殺されたマウスは、体腔壁または内臓腹膜表面の腫瘍移植の証拠を示さなかった。
【０２５８】
２１日後、マウスが媒体を受容したかまたはＢＡＹ  １１−７０８５を受容したかに関わらず、ＨＣＴ−１１６細胞を注射したマウスの体腔壁または内臓腹膜を含む明確な証拠が存在した（図６ＡおよびＢ）。しかし、ＨＴ−２９細胞を腹腔内注射し、ＢＡＹ  １１−７０８５で処理したマウスで、６匹のマウスの内の２匹のみが体腔壁腹腔転移を実証し、６匹の内で肝臓転移のいかなる証拠も示したものはいなかった（表３）。
【０２５９】
【表３】
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【０２６０】
ＨＴ−２９細胞を腹腔内注射し、媒体で処理したマウスでは、６匹の内の５匹が体腔壁腹腔転移を発症し、６匹すべてが肝臓転移を発症した（図６Ｃおよび表３）。興味深いことに、転移の大部分は、腹部および体腔壁の依存する領域および臓側腹膜を含み、結腸癌細胞がある時点で移植されたことを示唆した。
【０２６１】
ＮＦ−κＢ阻害剤は抗アポトーシスタンパク質の発現を減少する
ＮＦ−κＢの阻害は、他の研究において、ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対する癌細胞の感受性を増加した（Ｈａｎら「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＴＮＦα−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２３：４２０−６，２０００；Ｗａｎｇら「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：４１２−７，１９９９）。さらに、ＴＮＦαは、ＨＴ−２９細胞を含む多数の結腸癌細胞系統によって発現される（Ｊｕｎｇら「Ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：５５−６５，１９９５）。ＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５がＴＮＦα誘導性アポトーシスに対して結腸癌細胞を感作していることがあり得る可能性を探索するために、ＨＴ−２９細胞は、ＴＮＦα受容体へのＴＮＦαの結合を阻害するモノクローナル抗体、ｃＡ２で前処理され（Ｄ’Ｈａｅｎｓら「Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１６：１０２９−３４，１９９９）、続いて、ＢＡＹ  １１−７０８５を用いる処理を行った。以前の研究は、ＨＴ−２９細胞におけるＮＦ−κＢのＴＮＦα誘導性活性化を実証した（Ｙａｍａｍｏｔｏら「Ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＦ−κＢ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２７３０７−１４，１９９９）。ｃＡ２単独が結腸癌細胞、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２に対する任意の測定可能な効果を有したか否かを確かめるために、結腸癌細胞は、細胞増殖アッセイにおいて様々な濃度のｃＡ２で処理された。興味深いことに、１０および５０μｇ／ｍＬのｃＡ２は、処理の数日後に結腸癌細胞増殖の顕著な阻害を引き起こした（図７Ａ）。しかし、４８時間、５０μｇ／ｍＬのｃＡ２での一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞の前処理は、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性の接着細胞のアポトーシスを減少しなかった（図７Ｂ）。このことは、内因性ＴＮＦαがＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスのためには必要とはされていなかったことを示した。
【０２６２】
ＮＦ−κＢは、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＴＲＡＦ−１、およびＴＲＡＦ−２を含む、細胞生存を媒介するタンパク質をコードする多数の遺伝子の発現を調節する（Ｓｔｅｈｌｉｋら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＦ）−κＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉａｐ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：２１１−６，１９９８；Ｗａｎｇら「ＮＦ−κＢ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＡＦ１  ａｎｄ  ＴＲＡＦ２  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ１  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ２  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６８０−３，１９９８；Ｗｕら「ＩＥＸ−１Ｌ，ａｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＮＦ−κＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：９９８−１００１，１９９８）。一時的に懸濁されたかまたは接着性のＨＴ−２９細胞が、８時間、２０μＭのＢＡＹ  １１−７０８５で処理されたときに、ｃ−ＩＡＰ−１タンパク質発現の減少は起こらなかった（図７Ｃ）。ＨＴ−２９細胞は、ウェスタンブロットによって検出可能なレベルのｃ−ＩＡＰ−２を発現しなかった。ＨＴ−２９細胞の同じ処理は、ＴＲＡＦ−１とＴＲＡＦ−２の両方のタンパク質発現の減少を生じた（図７Ｃ）。
【０２６３】
最近、ＴＮＦα媒介性アポトーシスを阻害する抗アポトーシスタンパク質であるＦＬＩＰが、ＮＦ−κＢによって調節され、種々の癌において過剰発現されることが見い出された（Ｅｌｎｅｍｒら「Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓａｂｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｔ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１１−６，２００１；Ｉｒｍｌｅｒら「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＦＬＩＰ」Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：１９０−５，１９９７；Ｋｒｅｕｚら「ＮＦ−κＢ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃＦＬＩＰ，ａ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：３９６４−７３，２００１；Ｒｙｕら「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＦＬＩＰ（Ｌ）  ｉｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ」Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９４：１５−９，２００１；Ｔｅｐｐｅｒら「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ａｎｄ  ＦＬＩＣＥ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ」Ｂｌｏｏｄ  ９４：１７２７−３７，１９９９）。興味深いことに、ＦＬＩＰ発現は、内皮細胞における細胞接着によってアップレギュレートされ、アノイキスを阻害する際に役割を果たす（ＡｏｕｄｊｉｔおよびＶｕｏｒｉ「Ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｆａｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃ−ｆｌｉｐ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｏｉｋｉｓ」Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２：６３３−４３，２００１）。本明細書に開示されるように、ＦＬＩＰはＤＬＤ−１およびＨＴ−２９細胞系統において発現されたが、ＨＣＴ−１１６細胞系統においては発現されなかった。２０μＭのＢＡＹ  １１−７０８５は、接着性のＨＴ−２９細胞においてはＦＬＩＰの５４キロダルトン（長）アイソフォームの発現のわずかな減少のみを引き起こしたが、しかし一時的に懸濁されたＨＴ−２９細胞においてはそうではなかった（図７Ｃ）。ＦＬＩＰ発現の減少はＨＴ−２９細胞のＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスに関与する可能性があったが、ＤＬＤ−１細胞はＦＬＩＰを発現していないので、このことはＤＬＤ−１細胞におけるＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスを説明しない（図７Ｄ）。
【０２６４】
接着性結腸癌細胞のＢＡＹ  １１−７０８２、ＢＡＹ  １１−７０８５、またはＭＧ−１３２での処理は、結腸癌細胞の増殖、腫瘍形成、および接着、ならびに誘導性のアポトーシスを阻害した。これらの効果は、使用された選択された結腸癌細胞系統の中では均一ではなかった。３つすべての細胞系統の細胞増殖はＢＡＹ  １１−７０８５によって容易に阻害されたのに対し、ＢＡＹ  １１−７０８２およびＢＡＹ  １１−７０８５を用いる処理による腫瘍形成の減少およびアポトーシス誘導は、ＤＬＤ−１およびＨＴ−２９細胞系統においてのみ達成された。２９３細胞におけるポナステロン誘導性ＣＯＸ−２導入遺伝子発現を使用して得られた結果は、ＢＡＹ  １１−７０８５に対するアポトーシス性応答におけるＣＯＸ−２タンパク質発現または過剰発現のための役割の可能性を実証した。
【０２６５】
ＮＦ−κＢ阻害剤を用いる処理後に非接着性になった細胞はアポトーシス性であったのに対し、接着性のままであった細胞はアポトーシス性ではなかった。加えて、ＢＡＹ  １１−７０８５でのＨＴ−２９細胞の前処理は、より高い用量での細胞接着の有意な阻害を引き起こした。ＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス誘発性効果は、接着細胞に対して、一時的に懸濁された（すなわち、プレーティングの直前の）ＨＴ−２９細胞およびＤＬＤ−１細胞に加えられたときにより高かった。これらの結果は、結腸癌細胞の一時的懸濁が、ＮＦ−κＢ阻害に起因するアポトーシスに対する細胞の感受性を増加したことを示した。
【０２６６】
接着性ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、およびＨＴ−２９細胞がプラスチックディッシュからこすり取られ、ＮＦ−κＢ活性化についてアッセイされたとき、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合のレベルは陽性対照に比較して低かった（ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞）。一時的に懸濁されたＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、およびＨＴ−２９が再接着されたとき、迅速かつ大きな活性化（陽性対照と同様）、ならびにＮＦ−κＢの核局在の増加が存在した。従って、ＮＦ−κＢを活性化したのは、一時的に懸濁された結腸癌細胞の再接着であった。一時的に懸濁された結腸癌細胞の再接着によって誘導されたＮＦ−κＢのこの大きな活性化は迅速であり、１０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５と同程度まで少ない処理によってほぼ全体的に阻害された。他方、接着性結腸癌細胞は、低いがしかし構成的であるレベルのＮＦ−κＢ活性化を実証し、これは、５０μＭまでのＢＡＹ  １１−７０８５の用量を用いて阻害することができなかった。
【０２６７】
ＮＦ−κＢ阻害剤は２段階プロセスで結腸癌細胞のアポトーシスを引き起こすようである。第１に、ＮＦ−κＢ阻害剤は、インビトロで接着性結腸癌細胞の細胞接着を阻害する。これらの浮遊細胞の再接着は、大きくかつ一時的なＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。このことは、細胞を、ＮＦ−κＢ阻害剤誘導性アポトーシスに対して見事に感受性にする。再接着された、一時的に懸濁されたＨＴ−２９およびＤＬＤ−１細胞の大部分がＢＡＹ  １１−７０８２またはＢＡＹ  １１−７０８５での処理後にアポトーシス性になったという事実は、ＮＦ−κＢが、再接着のプロセスの間に、結腸癌細胞などの特定の癌細胞、特に、ＣＯＸ−２および／または変異型ＡＰＣ遺伝子を発現する癌細胞のための重要な生存因子であることを示す。
【０２６８】
転移性癌は、一時的に懸濁されて循環系を通過し、次いで、再接着して侵襲性にならなくてはならないので、これらの結果は、本明細書に開示された組成物が転移の予防のために使用されることが可能であることを示す。転移のプロセスは、以下の多数の連続的な段階を含むことが提案されている：侵襲、解離、循環系またはリンパ系への異物侵入、播種、微小循環中での拘束、血管外遊出、および遠位の組織への侵襲（Ｅｎｇｅｒｓら「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２６：６８２−９２，２０００）。これらの段階の各々は、播種の間の接着の完全な非存在を含む、細胞接着の動的な変化を包含する。ヒトにおける循環している癌細胞は進行した癌患者の静脈血サンプルの中で豊富に見い出されることが可能であるが（Ｍｅｈｅｓら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５９：１７−２０，２００１）、幸運なことに、転移のプロセスは驚くべきほどに非効率的であり、わずか０．０５％循環している腫瘍細胞が安定な転移を生じるほど少ない（Ｌｉｏｔｔａら「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３４：９９７−１００４，１９７４；Ｎｉｃｏｌｓｏｎ「Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １３：３３７−４２，１９９１；Ｗｅｉｓｓ「Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｌ．ＷｅｉｓｓおよびＨ．Ｇｉｌｂｅｒｔ編（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｈａｌｌ），１２６−１５７頁，１９８５）。多くの循環している腫瘍細胞は微小循環中で拘束されるが、これらの細胞の大部分は生存可能なままであり、インビボで血管外遊出する能力がある（Ｃｈａｍｂｅｒｓら「Ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｖｉｄｅｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  １４：２７９−３０１，１９９５）。従って、転移の律速段階は浸出した腫瘍細胞による遠位の組織への定着である（同上）。
【０２６９】
転移を伴わない初期段階の結腸直腸癌（ＴＮＭ  Ｉ−ＩＩ）の５年生存率は８０％より高いが、転移を伴う後期段階の癌（ＴＮＭ  ＩＩＩ−ＩＶ）では５０％未満である（Ｂｏｌａｎｄ「Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎ」Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ所収，Ｔ．Ｙａｍａｄａ、Ｄ．Ｈ．Ａｌｐｅｒｓ、Ｌ．Ｌａｉｎｅ、Ｃ．Ｏｗｙａｎｇ、およびＤ．Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０２３−２０８２頁，１９９９）。最も新たに診断された結腸直腸癌はＴＮＭ  ＩＩＩ−ＩＶ期であり、これは、大部分の結腸直腸癌患者が、提示の時点で原発性腫瘍の転移をすでに有していることを意味する。実際、リンパ節への微小転移は、現在の段階判定方法によってＴＮＭ  ＩＩ期と見なされた患者の５４％において癌胎児性抗原のＲＴ−ＰＣＲによって検出された（Ｌｉｅｆｅｒｓら「Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：２２３−８，１９９８）。本研究において、リンパ節微小転移を有する患者の５年生存率は、微小転移を有さない患者の９１％に対して、５０％であった。このことは、微小転移を有するＩＩ期患者は、生存に関してはＴＭＮ  ＩＩＩ期患者と臨床的により同様に振る舞ったことを意味している。従って、新たに結腸直腸癌と診断された患者の多くの割合が、以前に考えられていたよりも転移を有している。確かに、進行した乳癌の患者の血液中の乳癌細胞は、しばしば、１０００個の単核細胞中１個の頻度で見い出された（Ｍｅｈｅｓら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５９：１７−２０，２００１）。これらの細胞の大部分はアポトーシス性であったが、少数はそうではなく、顕著な数の癌細胞が循環系に侵襲し、そして生存していることを実証している。
【０２７０】
実施例２：
材料：
ＢＡＹ  １１−７０８５（Ｂｉｏｍｏｌ）、アニソマイシン、シグリタゾン（Ｃａｙｍａｎ）、ピオグリタゾン（Ｃａｙｍａｎ）、トログリタゾン（Ｃａｙｍａｎ）、ロシグリタゾン（Ｃａｙｍａｎ）、ＧＷ９６６２（Ｃａｙｍａｎ）、ＭＣ−５５５（Ｃａｙｍａｎ）はＤＭＳＯ中に可溶化された。切断ＰＡＲＰ  ｐＡｂ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＦＬＩＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、およびアクチン  ｍＡｂ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）はウェスタンブロットのために使用した。Ｄ−ルシフェリンはＸｅｎｏｇｅｎから購入された。ケタミンはｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｐｈａｒｍａｃｙから購入された。
【０２７１】
細胞培養およびトランスフェクション：
ＢｘＰｃ−３、Ｓｕ．８６．８６、およびＰＬ−４５膵臓癌細胞系統およびＨＴ−２９結腸癌細胞系統はＡＴＣＣより購入され、１０％  ウシ胎仔血清、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養された。すべての細胞は、加湿インキュベーター中、５％  ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて培養された。
【０２７２】
癌細胞系統は、構成的ルシフェラーゼレポーター、ｐＬｕｃ−ｐｕｒｏ（Ｄｒ．Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｌｅｓｓｎｉｃｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈより恵与された）で安定にトランスフェクトされ、ピューロマイシン含有培地中で選択された。
【０２７３】
細胞生存および再接着アッセイ
膵臓癌細胞培養物（ＢｘＰｃ−３およびＳｕ．８６．８６）および結腸癌（ＨＴ−２９）細胞は一時的に懸濁され、１０５細胞が９６ウェルプレートに移され、８時間、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５、チアゾリジンジオン、またはＤＭＳＯでインビトロ処理された。非接着細胞を穏やかに取り除くために、ウェルは、注意深くウェルからを２回、１００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％  ＢＳＡ）用いて、そして再度２回、氷冷ＰＢＳで洗浄された。浮遊細胞はアポトーシス性であることは以前に示された（Ｓｃａｉｆｅら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２３）：６８７０−８，２００２）。接着した生存している細胞は、１００μＬ／ウェルの１００％氷冷メタノールで１０分間固定され、次いで、空気乾燥された。細胞は、１００μＬ／ウェルの０．１％クリスタルバイオレットで１０分間染色され、次いで、２００μＬ／ウェルの蒸留Ｈ２Ｏで４回、ＰＢＳで４回穏やかに洗浄された。次いで、プレートは、完全に空気乾燥された。次いで、染色された細胞は、室温で１０〜６０分間、１００μＬ／ウェルの１％デオキシコール酸ナトリウム中に可溶化された。プレートは、分光光度計で５９０ｎｍにて読み取り、ブランクウェルから読み取ったバックグラウンドを減算した。５９０ｎｍにおける吸収は、処理された生存細胞の数に比例している（同上）。
【０２７４】
ＮＦ−κＢアッセイ：
膵臓癌（ＢｘＰｃ−３、Ｓｕ．８６．８６、およびＰＬ−４５）および結腸癌（ＨＴ−２９）の細胞培養物が一時的に懸濁され、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５またはロシグリタゾンで４時間、インビトロで処理された。核溶解物が生成され、総タンパク質濃度について標準化され、そして製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）でＮＦ−κＢ活性を決定するために使用された。
【０２７５】
アポトーシスアッセイ
ＢｘＰｃ−３、ＰＬ−４５、Ｓｕ．８６．８６、およびＨＴ−２９細胞が一時的に懸濁され、様々な濃度のＢＡＹ  １１−７０８５またはＤＭＳＯで、４〜８時間、インビトロで処理された。接着および非接着の処理された細胞が収集され、溶解物が調製され、そしてＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１．）を使用してウェスタンブロット分析の前にタンパク質濃度が標準化された。アポトーシスの程度は、切断ＰＡＲＰについてのウェスタンブロッティングによって決定された。
【０２７６】
胸腺欠損マウス膵臓癌細胞異種移植片研究：
動物研究は、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可され、これに従って実施された。胸腺欠損５週齢雌性ｎｕ／ｎｕマウスは、１０６懸濁Ｓｕ．８６．８６、ＢｘＰｃ−３、またはＨＴ−２９細胞の腹腔内（ＩＰ）注射の２４時間前に、ＢＡＹ  １１−７０８５（５ｍｇ／ｋｇ）または等量の媒体（ＤＭＳＯ）のいずれかを用いるＩＰ処理に対してランダムに割り当てた。マウスは、継続して、ＤＭＳＯまたはＢＡＹ  １１−７０８５（５ｍｇ／ｋｇ）をＩＰで３日毎、９日間、またはＤＭＳＯおよびロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ）をＩＰで毎日９日間受容した。マウスに麻酔をかけるために、およびルシファラーゼ発現癌細胞のための基質を提供するために、１０μＬ／ｇｍのホタルＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）（Ｘｅｎｏｇｅｎ）、２００μＬ  ケタミンＨＣｌ、および２０μＬ  キシラジン（１００ｍｇ／ｍＬ）が生物発光イメージングの直前にＩＰ注射された。剖検の前に、吸入エンフルランの過剰摂取、続いて頸椎脱臼によって、マウスは安楽死された。腹腔は外科的に露出され、腹腔内腫瘍移植物は生物発光イメージングシステムで可視化された。各マウスについての腫瘍移植物は、解剖ズーム顕微鏡を用いて確認された。
【０２７７】
結果：
一時的に懸濁された結腸癌細胞の再接着がインビトロでＮＦ−κＢ活性の一時的（約３〜８時間）かつ大きな（＞１０倍）増加を生じたことが以前に示された（Ｓｃａｉｆｅら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２３）：６８７０−８，２００２）。ＮＦ−κＢの一時的な活性化は、複数の膵臓癌細胞系統の再接着の間にもまた観察され、ＮＦ−κＢ阻害剤ＢＡＹ  １１−７０８５によって阻害された（図９）。
【０２７８】
細胞再接着の間の１０〜２０μＭ  ＢＡＹ  １１−７０８５での膵臓および結腸の癌細胞の処理はアポトーシスを増加した（切断ＰＡＲＰレベル）（図１０Ａ）。細胞再接着の間の癌細胞のアポトーシスの誘導が細胞脱離を生じるので（示さず）、処理で生存した再接着細胞の数（図１０Ｂ）は、アポトーシスの程度に逆比例した。
【０２７９】
腹腔内癌細胞の検出は、これらが一旦腹膜に移植すると、典型的には標準的な治療に対しては抵抗性であるので、非常に乏しい予後の前兆となる（Ｖｏｇｅｌら「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ  ２（２）：７９−８８，２００２）。腹腔内癌細胞は、腹腔に接種することが可能であり、腹腔および組織の裏打ちである堅い結合組織である腹膜に接着することによってこれを行う。ＢＡＹ  １１−７０８５は、再接着している膵臓癌細胞のアポトーシスをインビトロで誘導することが可能であったので、ＢＡＹ  １１−７０８５がヒト膵臓癌細胞系統の腹腔内接種を阻害する能力は、腹膜癌腫症の胸腺欠損マウスモデルで試験された。Ｓｕ．８６およびＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞系統は、インビトロでのＢＡＹ  １１−７８０５に対するそれらの異なる感受性に基づいて選択された（図１０Ｂ）。
【０２８０】
胸腺欠損マウスは、媒体（ＤＭＳＯ）または５ｍｇ／ｋｇのＢＡＹ  １１−７０８５（アームあたり６匹のマウス）で前処理された。２４時間後、１０６個の一時的に懸濁されたＳｕ．８６またはＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞は、腹腔内（ＩＰ）注射によって腹腔に送達された。マウスは、継続してＢＡＹ  １１−７０８５または媒体を３日毎に９日間受容した（合計４用量）。使用された細胞系統は、生物発光イメージャーを使用して、麻酔されたマウスにおける小さな腫瘍移植物の可視化を可能にするために、ホタルルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトされた。小さな動かすことのできない腹腔内腫瘍移植物は、細胞系統の腹腔内送達の３〜４日後まで初期に容易に可視化された（示さず）。膵臓癌細胞のＩＰ送達の９日後、マウスはルシフェリンを注射され、次いで安楽死された。マウスの腹腔は迅速に露出され、腫瘍移植物は可視化され、そして生物発光イメージャーで可視化された（図１１Ａ−Ｄ）。剖検の間の生物発光検出は、さもなくばズーム解剖顕微鏡を用いてのみ見ることができた、小さな腹腔腫瘍移植物（２〜３ｍｍ）の検出を補助した。腫瘍移植物は、腸または脾臓と比較して、肝臓の表面についての傾向を伴って、体腔壁および臓側腹膜で観察された（図１１Ａ−Ｂ）。マウスの肝臓、肺、または脾臓の中での転移の証拠は存在せず（示さず）、血行性散布が起こっていなかったことを示す。Ｓｕ．８６膵臓癌細胞については、対照マウスの１００％が腹腔内および肝臓での腫瘍移植物を実証したのに対して、ＢＡＹ  １１−７０８５処理マウスの３３％および０％（ｐ＜０．０５）が、それぞれ、腹腔内または肝臓腫瘍移植物を示した（表４）。ＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞については、１００％および６７％の対照マウスが腹腔内および肝臓腫瘍移植物をそれぞれ発生したのに対して、ＢＡＹ  １１−７０８５処理マウスの７１％および２９％（ｐ＜０．０５）が腹腔内および肝臓腫瘍移植物をそれぞれ発生した（表４）。死亡したマウスはおらず、毒性の顕性徴候を示したマウスもいなかった。これらの結果は、ＢＡＹ  １１−７０８５が膵臓癌細胞による腹膜播種を減少したことを示した。
【０２８１】
【表４】
2011520096.tif 000013
【０２８２】
ボルテゾミブおよびインフリキシマブなどの他のＮＦ−κＢ阻害剤は、再接着の間の結腸および膵臓の癌細胞のアポトーシスを誘導することに失敗し（示さず）、ＢＡＹ  １１−７０８５は単にＮＦ−κＢ阻害を通して作用したのではなかったことを示唆する。従って、ＢＡＹ  １１−７０８５の作用のメカニズムがより詳細に調べられた。ＢＡＹ  １１−７０８５および密接に関連する化合物であるＢＡＹ  １１−７０８２はＮＦ−κＢを阻害することが知られているが、これらの化合物は、同様に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーであるＪＮＫを活性化することが報告されてきた。ＴＮＦαへの細胞の曝露は、細胞生存またはアポトーシスのいずれかを生じることが可能であり、ＪＮＫは、最近、この決定において中心的な役割を有することが示された。ＪＮＫ活性化は、カスパーゼ８の重要な阻害剤であるＦＬＩＰの分解を生じ、そして死受容体シグナル伝達誘導性カスパーゼ８活性化を可能にする。従って、ＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスにおけるＪＮＫおよびＦＬＩＰの役割が調べられた。
【０２８３】
ＢＡＹ  １１−７０８５またはＪＮＫの既知の活性化因子であるアニソマイシンは、結腸および膵臓の癌細胞系統において、ＪＮＫ活性化（ｃ−ＪＵＮのリン酸化）を容易に誘導した（図１２Ａ）。さらに、ＪＮＫの薬物誘導性活性化は、増加濃度のＪＮＫ特異的阻害剤ＳＰ６００１２５によって阻害され、これらの実験においてＪＮＫがｃ−ＪＵＮのリン酸化を特異的に媒介したことを実証した（図１２Ａ）。
【０２８４】
ＦＬＩＰを発現する、再接着しているＨＴ−２９結腸癌細胞（図１３Ａ）のＢＡＹ  １１−７０８５での処理は、わずか３時間後にＦＬＩＰのダウンレギュレーションを引き起こした（図１３Ｂ）。これは、ＢＡＹ  １１−７０８５がＦＬＩＰのダウンレギュレーションを誘導することが可能であり、アポトーシスが起こる時間枠の中にあることを実証した。ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞は、他の癌細胞系統と比較して、比較的低いレベルのＦＬＩＰを有するので（図１３Ａ）、これらはヒトｃ−ＦＬＩＰでトランスフェクトされた。ヒトｃ−ＦＬＩＰまたは空のベクターでトランスフェクトされたＨＣＴ−１１６細胞は、一時的に懸濁され、ＢＡＹ  １１−７０８５の存在下で、８時間、再接着された。ＢＡＹ  １１−７０８５は対照細胞中でアポトーシス（アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイ）を誘導したのに対して、ＦＬＩＰを過剰発現する細胞は、ＢＡＹ  １１−７０８５に対してはるかにより抵抗性であった（図１３Ｂ）。従って、ＦＬＩＰは、ＢＡＹ  １１−７０８５の重要な標的であるようであり、結腸癌細胞再接着の間にＢＡＹ  １１−７０８５媒介アポトーシスを阻害することが可能である。
【０２８５】
ＦＬＩＰダウンレギュレーションにおけるＪＮＫ活性の役割を決定するために、膵臓および結腸の癌細胞系統が、１．５時間および４時間、アニソマイシンで処理された。アニソマイシンは、試験された膵臓および結腸の細胞系統において、ＦＬＩＰ発現の減少を引き起こした（図１４Ａ）。ＢＡＹ  １１−７０８５と同程度に有効であるわけではないが、アニソマイシンは、細胞再接着の間に、結腸および膵臓の癌細胞系統においてアポトーシスを誘導した（図１４Ｂ）。アニソマイシンは、再接着している結腸および膵臓の癌細胞に対するＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス誘発活性を増加させた（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＪＮＫ活性化が重要であり、これが癌細胞再接着の間のＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス誘発活性に寄与していることを示した。
【０２８６】
しかし、ＴＮＦα受容体それ自体は、結腸癌再接着の間にＮＦ−κＢ活性化を媒介しなかったことが以前に示された（Ｓｃａｉｆｅら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２３）：６８７０−８，２００２）。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のメンバーの中で、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）は消化管の中で高度に発現されている。試験された結腸癌細胞系統の多くは、ＲＡＮＫおよびそのリガンド、ＲＡＮＫＬの発現を示した（図１５Ａ）。リガンド依存性ＲＡＮＫ活性化を阻害する可溶性ＲＡＮＫとの結腸癌細胞系統のインキュベーションは、ＮＦ−κＢの活性化を顕著に減少した（図１５Ｂ）。従って、ＲＡＮＫは、結腸癌細胞再接着の間のＮＦ−κＢの活性化において重要であるらしい。
【０２８７】
これらの研究は、ＢＡＹ  １１−７０８５の二重活性（ＮＦ−κＢの阻害およびＪＮＫの活性化）が、再接着している癌細胞におけるそのアポトーシス誘発活性の原因であったことを示す。研究は、癌細胞系統において、チアゾリジンジオンがＮＦ−κＢを阻害し、ＪＮＫを活性化すること（Ｂａｅら「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨｅｐＧ２  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６３（２）：４０１−８，２００３；Ｙｉｎら「Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＡＤＤ４５  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（２６）：４６１４−２３，２００４）、およびＮＦ−κＢを阻害すること（Ｇｈａｎｉｍら「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｂｙ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｎｄ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｂｅｓｅ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８６（３）：１３０６−１２，２００１；Ｍｏｈａｎｔｙら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８９（６）：２７２８−３５，２００４）、およびｃ−ＦＬＩＰ発現をダウンレギュレートすることによって細胞を死受容体誘導性アポトーシスに感受性にすること（Ｓｃｈｕｌｔｚｅら「Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＩＰ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ」Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １１（９）：１５０３−１２，２００６；Ａｋａｓａｋｉら「Ａ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｔ，ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ａｎｄ  −９  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１Ｂ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１（１０）：６１６５−７４，２００６）を示してきており、そしてトログリタゾンがＦＬＩＰのダウンレギュレーションを介してＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して腫瘍細胞を感作させることが示された。従って、再接着している結腸および膵臓の癌細胞のアポトーシスを誘導するチアゾリジンジオンの能力が試験され���。ＨＴ−２９細胞は、媒体（ＤＭＳＯ）または増加濃度のロシグリタゾンの存在下で再接着された。３時間、プレートに再接着された一時的に懸濁された結腸および膵臓の癌細胞は、ＮＦ−κＢ活性の顕著な増加を示した（図１５Ａ）。３０μＭのロシグリタゾンは、ＢＡＹ  １１−７０８５よりもより少ない程度ではあるが（図９）、３時間以内に再接着誘導性ＮＦ−κＢ活性化を顕著に阻害した（図１５Ａ）。８時間、３０μＭ  ロシグリタゾン、シグリタゾン、またはトログリタゾンの存在下で再接着されたＨＴ−２９細胞は、切断ＰＡＲＰレベルの増加によって実証されるような、アポトーシスの増加を示した（図１５Ｂ）。
【０２８８】
３０μＭ  ロシグリタゾンは、再接着しているＢｘＰｃ３およびＨＴ−２９癌細胞においてＦＬＩＰ発現の減少を引き起こしたが、Ｓｕ．８６膵臓癌細胞ではそうではなかった（図１５Ｃ）。ＢｘＰｃ３、Ｓｕ．８６、およびＨＴ−２９細胞は、一時的に懸濁され、種々の濃度のロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン、およびＭＣＣ−５５５（強力なＰＰＡＲγアゴニスト）の存在下で再接着された。示された３つすべての細胞系統が、種々のチアゾリジンジオンの存在下で生存を減少したが、ＭＣＣ−５５５についてはそうではなく（図１５Ｄ−Ｇ）、ＰＰＡＲγの関与の欠如を示唆した。ロシグリタゾンは、濃度依存的な様式で、再接着しているＢｘＰｃ３およびＨＴ−２９細胞を減少させたのに対して、Ｓｕ．８６細胞はロシグリタゾンに対して抵抗性であった（図１５Ｄ−Ｇ）。従って、ロシグリタゾンがＦＬＩＰのダウンレギュレーションを引き起こす能力は、再接着している結腸および膵臓の癌細胞系統の生存を減少させるその能力と相関した。
【０２８９】
チアゾリジンジオンの細胞型特異的効果が、異なるＰＰＡＲγアゴニスト活性に起因するのか否かを決定するために、それぞれ、ＰＰＡＲγ発現を過剰発現し、およびそれを欠いている、ＨＴ−２９細胞およびＳｕ．８６細胞（ＹａｎｇおよびＦｒｕｃｈｔ「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＰＡＲ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ＣＯＸ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨＴ−２９  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２（９）：１３７９−８３，２００１；Ｇａｌｌｉら「Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」Ｇｕｔ  ５３（１１）：１６８８−９７，２００４）が、不可逆的ＰＰＡＲγ阻害剤ＧＷ９６６２の存在下または非存在下でシグリタゾンで処理された（Ｗｅｂｅｒら「ＰＰＡＲγ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＧＪ２  ｏｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８６（３）：Ｅ３２９−３６，２００４）。シグリタゾンは両方の細胞系統の生存を用量依存的様式で減少させた（図１６Ａ−Ｂ）。しかし、３０μＭ  ＧＷ  ９６６２の添加はこれらのアッセイにおいてシグリタゾンの効力に顕著な効果を与えなかった（図１６Ａ−Ｂ）。これらのデータは、ＰＰＡＲγアゴニスト活性が、癌細胞再接着の間にチアゾリジンジオンのアポトーシス誘発活性のために必要とはされないことを示唆する。
【０２９０】
ロシグリタゾンがＢｘＰｃ−３、ＨＴ−２９、およびＳｕ．８６癌細胞の腹腔内接種を阻害する能力が試験された。胸腺欠損マウス（各アームに６匹のマウス）は、５ｍｇ／ｋｇロシグリタゾンまたは媒体（ＤＭＳＯ）をＩＰで受容した。２４時間後、１０６  ＢｘＰｃ−３、ＨＴ−２９、およびＳｕ．８６癌細胞がＩＰで送達された。ロシグリタゾン（５ｍｇ／ｋｇ）が、その後の８日間、毎日ＩＰで与えられた。ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞については、対照マウスの８３％および５０％が、それぞれ、腹腔内および肝臓の腫瘍移植物を発生したが、ロシグリタゾン処理マウスでは、それぞれ、３３％および１７％のみであった（表５）。胸腺欠損マウスのＨＴ−２９結腸癌細胞でのＩＰ注射後、ロシグリタゾンでの処理は、媒体と比較して、腹腔内腫瘍移植物の５０％の減少を生じた（表５）。Ｓｕ．８６膵臓癌細胞については、対照マウスの８３％および６７％、ならびにロシグリタゾン処理マウスの８３％および８３％が、ぞれぞれ、腹腔内および肝臓の腫瘍移植物を発生した（表５）。死亡したマウスはおらず、毒性の顕性徴候を示したマウスもいなかった。
【０２９１】
【表５】
2011520096.tif 000014
【０２９２】
腹膜癌腫症は治療の選択肢が限られている致死性疾患である（Ｆｕｊｉｗａｒａ「Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ」Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  ２７  Ｓｕｐｐｌ  ２：３５４−８，２０００；Ｋａｎｅｌｌｏｓら「Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ４６（４）：５３５−９，２００３；Ｎａｋａｔｓｕｋａら「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  ｃｏｎｔｒａｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｙ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  １（４）：３１１−７，１９９９；Ｓａｎｔａｌａら「Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｕｍ  ＣＡ  １２５  ｌｅｖｅｌ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３（３Ｃ）：３０９７−１０３，２００３；Ｔｅｒａｕｃｈｉら「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７（６）：３５６−６０，２００２；Ｙａｃｈｉｄａら「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ」Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ８９（５）：５７３−８，２００２）。本研究において、ＢＡＹ  １１−７０８５およびチアゾリジンジオンがインビトロで接着依存性の膵臓および肝臓の癌細胞アポトーシスを誘導すること、ならびにこのことがインビボでの腹腔内腫瘍接種に対する生物学的結果であることが実証された。これらの両方の薬物は、ＮＦκＢを阻害し（Ｓｃａｉｆｅら「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２３）：６８７０−８，２００２；Ｓｕら「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４（４）：３８３−９，１９９９）、そし��再接着の間の生存のためのＮＦ−κＢ活性に対する消化管癌細胞の強い依存性が、腹腔内接種および転移を阻害するための独特な治療標的を提供する。
【０２９３】
一時的に懸濁された結腸癌細胞は、細胞再接着の間のＮＦ−κＢの強力かつ一時的な（３〜８時間）活性化を示すことが示されてきた。今や、ＢＡＹ  １１−７０８５およびチアゾリジンジオンを用いる再接着性の膵臓および結腸の癌細胞の治療は、接着誘導性ＮＦ−κＢ活性を阻害し、アポトーシスを引き起こすことが本明細書に記載されている。再接着している癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、試験されたすべてのＮＦ−κＢ阻害剤に普遍的なわけではない。例えば、ＴＮＦγ拮抗性抗体であるインフリキシマブ、およびＩκＢの分解を妨害することによってＮＦ−κＢを間接的に阻害する２６Ｓプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（ＶｏｏｒｈｅｅｓおよびＯｒｌｏｗｓｋｉ「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４６：１８９−２１３，２００６）は、再接着しているＨＴ−２９結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することに失敗した。
【０２９４】
ＪＮＫは、カスパーゼ８活性の重要な阻害剤であるＦＬＩＰのダウンレギュレーションを引き起こすことによって、ＮＦ−κＢ媒介性の細胞生存シグナル伝達と拮抗する。ＢＡＹ  １１−７０８５およびチアゾリジンジオンはＪＮＫを活性化し、結腸および膵臓の癌細胞におけるＦＬＩＰタンパク質の迅速なダウンレギュレーションを引き起こす。これはおそらく、ＦＬＩＰをコードしている遺伝子であるＣＦＬＡＲの転写を調節する、ＮＦ−κＢに対するこれらの化合物の阻害活性に起因するのではない。ＪＮＫアゴニストであるアニソマイシンがＦＬＩＰのダウンレギュレーションを引き起こす能力は、ＦＬＩＰのダウンレギュレーションを媒介する際のＪＮＫの役割を補助する。再接着している膵臓癌細胞に対するＢＡＹ  １１−７０８５のアポトーシス誘発性効果は、用量依存的様式で、アニソマイシンによるＪＮＫ活性化によって増強されたことが本明細書に示される。さらに、ＢＡＹ  １１−７０８５は、再接着している結腸癌細胞においてＦＬＩＰのダウンレギュレーション引き起こし、そして結腸癌細胞におけるＦＬＩＰの過剰発現は、細胞再接着の間のＢＡＹ  １１−７０８５誘導性アポトーシスに対して大きく増加した抵抗性を引き起こした。最後に、ＢＡＹ  １１−７０８５、およびより少ない程度までは、チアゾリジンジオンが、結腸および膵臓の癌再接着の間にＮＦ−κＢを阻害したことが本明細書で示される。モル濃度ベースでは、ＢＡＹ  １１−７０８５はロシグリタゾンよりも強力なＮＦ−κＢ阻害剤であり、従って、腹膜移植物のより大きな減少が膵臓癌細胞系統で生成されたことを強力に説明する。これらの研究は、ＦＬＩＰをダウンレギュレートするために、癌細胞再接着の間、ＮＦ−κＢとＪＮＫの両方を標的とすることの関連性を示す。
【０２９５】
腹膜接種の阻害剤としてのチアゾリジンジオン  ロシグリタゾンの同定が重要である。なぜなら、この化合物は、臨床用用途があり、比較的低い毒性プロフィールを有するからである。チアゾリジンジオンは、ＮＦ−κＢを阻害することが示されており、このことは、それらのＰＰＡＲγアゴニスト活性と関連があるのかもしれないし、関連がないのかもしれない（Ｓｕら「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４（４）：３８３−９，１９９９）。本発明者らは、複数のチアゾリジンジオンが、再接着の間に、ＮＦ−κＢを阻害し、そして結腸および膵臓の癌細胞のアポトーシスを誘導する際に有効であったことを実証した。さらに、ロシグリタゾンは、結腸および膵臓の癌細胞系統の腹腔内接種を同様に阻害した。
【０２９６】
チアゾリジンジオンのアポトーシス誘発活性は、これらが、どちらもＰＰＡＲγを発現しないＳｕ．８６およびＰＬ４５膵臓癌細胞においてアポトーシス誘発活性を示したので、ＰＰＡＲγアゴニスト活性には依存していない可能性がある（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ「Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」Ｇｕｔ  ５３（１１）：１６８８−９７，２００４）。加えて、不可逆的ＰＰＡＲγ阻害剤ＧＷ９６６２が、癌細胞再接着の間にピオグリタゾンのアポトーシス誘発活性を阻害することに失敗した。最後に、他の研究者らは、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンが、ＰＰＡＲγ非依存性様式で膵臓癌細胞侵襲を阻害したことを示し（同上）、このことは、これらの化合物がＰＰＡＲγ非依存性抗腫瘍形成活性を保有することを示す。
【０２９７】
接種後数日間のみの分散しかつ不動の生物発光性腹膜移植物の出現、および処理の１０日以内のみの化合物の効力は、腹膜の腫瘍移植の初期段階において、これらの薬物の効果が起こることを示す。薬物動態学的研究は、薬物の単回または複数回の経口用量後に、ヒトにおいて、Ｃｍａｘ血液レベルの２．５μＭのピオグリタゾンが測定されたことを示した。
【０２９８】
現在の研究の重要性は、これらが、腹膜癌腫症の縮小において、ＮＦ−κＢを阻害し、かつＪＮＫを同時に活性化する化合物の効力についての証拠を提供することである。さらに、ＦＬＩＰは、これらの薬物の重要な標的であるようであり、再接着の間に癌細胞の生存を促進する。一旦樹立されると、腹部悪性腫瘍からの腹膜癌腫症は、治療することが極度に困難であり、最終的には死に至る。手術前後の設定において再接着している癌細胞のアポトーシスを誘導する薬剤で患者を治療することによって膵臓または結腸の癌接種を予防する可能性は未開拓の分野であり、臨床的な必要性が満たされていない。
【０２９９】
【表６】
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【０３００】
本発明において、本発明の範囲または技術思想から逸脱することなく、種々の改変およびバリエーションが行われることが可能であることが当業者には明らかである。本発明の他の例は、本明細書の考慮および本明細書に開示される本発明の実施から、当業者には明らかである。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の本当の範囲および技術思想は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１−１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図５−１】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７−１】
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【図８】
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【図９−１】
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【図１０】
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【図１１−２】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１−２】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−２】
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【図７−２】
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【図９−２】
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【図１１−１】
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【図１２−１】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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