(57)【要約】電気泳動で分離された種のゲルから転写膜への転写のためのエレクトロブロッティングを、従来の緩衝剤浸潤ろ紙の代わりに緩衝液で浸潤された吸収性ポリエステル、ポリエステル／セルロースブレンドまたはポリウレタン被覆セルロースを用いるセミドライ様式で実施する。その結果が、ろ紙によって得られるものよりもより低い電流レベルにおいて効果的なエレクトロブロッティングであり、それによりゲル、転写膜および転写される種の抵抗加熱がより少ない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルと、
該ゲルに直接隣接し、かつ該ゲルと平面接触している膜と、
一方のシートが、該膜と接触している側とは反対の側で該ゲルに直接隣接し、かつ他方のシートが、該ゲルと接触している側とは反対の側で該膜に直接隣接し、それぞれの該シートが、ポリエステル、ポリエステル／セルロースブレンド、およびポリウレタン被覆セルロースからなる群より選択されるメンバーを含む、緩衝液で浸潤された吸収材料の二つのシートと
を含む、電気泳動で分離された種のゲルから膜への転写のための転写スタック（stack）。
【請求項２】
それぞれの前記シートが、ポリエステルおよびポリエステル／セルロースブレンドからなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の転写スタック。
【請求項３】
それぞれの前記シートが、本質的にポリエステルからなる、請求項1記載の転写スタック。
【請求項４】
それぞれの前記シートが、本質的にポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項1記載の転写スタック。
【請求項５】
それぞれの前記シートが、本質的にポリウレタン被覆セルロースからなる、請求項1記載の転写スタック。
【請求項６】
それぞれの前記シートが、本質的にハイドロエンタングルメント加工（hydroentangled）ポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項1記載の転写スタック。
【請求項７】
それぞれの前記シートが、本質的に不織ポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項1記載の転写スタック。
【請求項８】
前記膜が、ニトロセルロースおよびポリビニリデンジフルオライドからなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の転写スタック。
【請求項９】
前記膜がニトロセルロースである、請求項1記載の転写スタック。
【請求項１０】
前記ゲルがポリアクリルアミドである、請求項1記載の転写スタック。
【請求項１１】
前記ゲルがポリアクリルアミドであり、かつ前記膜がニトロセルロースである、請求項1記載の転写スタック。
【請求項１２】
電気泳動で分離された種をゲルから膜へ転写させる方法であって、
ゲルと、
該ゲルに直接隣接し、かつ該ゲルと平面接触している膜と、
一方のシートが、該膜と接触している側とは反対の側で該ゲルに直接隣接し、かつ他方のシートが、該ゲルと接触している側とは反対の側で該膜に直接隣接し、それぞれの該シートが、ポリエステル、ポリエステル／セルロースブレンドおよびポリウレタン被覆セルロースからなる群より選択されるメンバーを含む、緩衝液で浸潤された吸収材料の二つのシートと
を含む転写スタックに電圧を印加することによって、電流を通す段階を含む、方法。
【請求項１３】
それぞれの前記シートが、ポリエステルおよびポリエステル／セルロースブレンドからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記電圧が約5ボルト〜約25ボルトであり、かつ前記電流が約1mA/cm2〜約2A/cm2である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記電圧が約5ボルト〜約15ボルトであり、かつ前記電流が約1mA/cm2〜約100mA/cm2である、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
前記電圧が約10ボルト〜約30ボルトであり、かつ前記電流が約1A/cm2〜約5mA/cm2である、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
それぞれの前記シートが、本質的にポリエステルからなる、請求項12記載の方法。
【請求項１８】
それぞれの前記シートが、本質的にポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
それぞれの前記シートが、本質的にハイドロエンタングルメント加工ポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
それぞれの前記シートが、本質的に不織ポリエステル／セルロースブレンドからなる、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
前記膜が、ニトロセルロースおよびポリビニリデンジフルオライドからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
前記膜がニトロセルロースである、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
前記ゲルがポリアクリルアミドである、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
前記ゲルがポリアクリルアミドであり、かつ前記膜がニトロセルロースである、請求項12記載の方法。
【請求項２５】
前記種が、タンパク質およびペプチドからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の方法。
【請求項２６】
前記種が、核酸およびオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、ゲル電気泳動の分野に関し、特に、電気泳動で分離された種が分離されたスラブゲルから、該種を検出、同定、かつ場合によっては定量することができるシート形支持マトリックスへの該種の転写に関する。
【背景技術】
【０００２】
2. 先行技術の説明
一般に電気泳動スラブゲルからニトロセルロース、ナイロン、ポリ二フッ化ビニルまたは同様な材料へのタンパク質、核酸または生物学的種のエレクトロブロッティングは、生化学者が、本質的に任意の生物学的混合物について成分を同定およびそうでなければ本質的に任意の生物学的混合物を特性決定することができる一般的な手段である。エレクトロブロッティングにおいては、ゲルおよび膜の平面を完全に直接接触させて配置し、電流をそれらにゲルおよび膜を横切る方向に通して、電流がゲルに対して平行な方向に通された場合に種がゲル内で動かされるのと同じように、種を転写させる。種がDNAフラグメントである場合、転写は、その創始者である英国人生物学者Edwin M. Southernにちなんでサザンブロットと呼ばれる。同様に、RNAフラグメントのエレクトロブロッティングはノーザンブロッティングと呼ばれ、タンパク質またはポリペプチドのエレクトロブロッティングはウエスタンブロッティングと呼ばれる。膜中の種に対して実施される分析手法は、転写される種のタイプに適切である手法である。たとえば、サザンおよびノーザンブロッティングにおいて、分析は、転写膜上の種をハイブリダイゼーションプローブによって処理したのち、蛍光または色素生成染料によって標識することによって開始され、ウエスタンブロッティングにおいては、分析は、標的タンパク質を抗体で処理することによって始まる。
【０００３】
サザン、ノーザンまたはウエスタンタイプのいずれかのエレクトロブロッティングは、ゲルおよび膜のスタック（stack）の両側の電極および電流を運ぶためのイオンの供給源を必要とし、通常、ウェットまたはセミドライ様式で実施される。ウェットブロッティングにおいては、電極とゲルまたは膜との間に配置された緩衝液がイオン供給源として働き、セミドライブロッティングにおいては、緩衝液は、緩衝液で湿潤したろ紙に取って代わられる。したがって、セミドライブロッティングは、「ブロッティングサンドウィッチ」とも呼ばれる、順に、第一の緩衝液湿潤ろ紙シート、ブロッティング膜、ゲルおよび第二の緩衝液湿潤ろ紙シートからなる転写スタックを使用する。「ドライ」エレクトロブロッティングシステムが、特許協力条約の下で国際公開日2006年8月31日に公開された「Electro-blotting Devices, Systems, and Kits, and Methods for Their Use」と題する公開番号WO2006/091525 A2（特許文献1）に開示されている。出願人であるInvitrogen Corporationは、ゲル中に存在するもの以外の液体緩衝剤を使用しない。この「ドライ」システム中のイオンリザーバーは、対応する電極と、電気泳動ゲルおよび膜のみからなる転写スタックとの間に配置された陽極および陰極ゲルマトリックスである。システムは、イオンリザーバーとして働くゲルマトリックス中に存在するもの以外の液体緩衝剤を使用しないため、「ドライ」と呼ばれる。
【０００４】
エレクトロブロッティングで遭遇される危険の一つが電流による発熱である。過度の発熱は、転写されるタンパク質もしくは他の種またはゲルの損傷を生じさせ、不均一な加熱は、不確実または不均一な転写を生じさせるおそれがある。発熱は、低い電流または低いイオン強度の緩衝剤を使用することによって抑えることができるが、それらは、不完全な転写または転写の完了のための過度の時間を生じさせるおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2006/091525 A2
【発明の概要】
【０００６】
現在、従来技術のろ紙の代わりに、ポリエステル、ポリエステル／セルロースブレンド、またはポリウレタン被覆セルロースのシートを用いることにより、セミドライ様式での効果的なエレクトロブロッティングが低い電圧で達成され、比較的短い期間に、低い抵抗を有する高い電流の使用を可能にするということが見いだされている。ポリエステル、ポリエステル／セルロース、およびポリウレタン被覆セルロースのシートは、衛生用の拭きものもしくはクリーンルーム必需品として、または一般的な吸収のために一般に使用されている。これらのシートにより、低い抵抗および相応に低下した発熱率を有する25Vまたはそれ未満、場合によっては20Vまたはそれ未満または15Vまたはそれ未満の電圧で、効果的な転写を約35分で達成することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明および好ましい態様
ポリエステルシートを使用する本発明の態様で使用されるポリエステルは、上述した拭きものに使用される任意の従来のポリエステルであることができる。たとえば、ポリエステルは、水で浸潤させることができ、水性緩衝液を吸収し、保持することができる、ジカルボン酸とジヒドロキシアルコールとの任意の重縮合物であることができる。ジカルボン酸の例は、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、アジピン酸およびテレフタル酸である。二価アルコールの例は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコールおよびジプロピレングリコールである。好ましいポリエステルは、テレフタル酸のエステル少なくとも85重量％および上記の二価アルコールの一つで構成された長鎖ポリマーである。ポリエステルは、架橋していても架橋していなくてもよいが、非架橋ポリエステルが好ましい。親水性ポリエステル組成物が好ましく、親水性は、従来の手段、たとえば親水性組成物によるポリエステルの処理によって、疎水性ポリエステルに付与することができる。一つのそのような組成物は、エトキシ化ポリエステルおよび界面活性剤である。他の処理は当業者には公知である。本発明における使用に適したポリエステル布の例は、商標VWR SPEC-WIPE（登録商標）（VWR International, Leicestershire, United Kingdom）、ANTICON（登録商標）およびANTICON（登録商標）MILLISEAL（登録商標）（Milliken & Company, LaGrange, Georgia, USA）、VECTRA（登録商標）ALPHA（登録商標）、ALPHAWIPE（登録商標）、ALPHASORB（登録商標）、ALPHA10（登録商標）およびMIRACLE WIPE（登録商標）（ITW-Texwipe Company, Mahwah, New Jersey, USA）ならびにULTRASEAL（登録商標）およびVALUSEAL（商標）（Berkshire Corporation, Great Barrington, Massachusetts, USA）の下で販売されているものである。
【０００８】
ポリエステル−セルロースシートを使用する本発明の態様で使用されるセルロースは、天然または改質された任意の形態のセルロースであることができる。例は、木材パルプセルロース、綿セルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。ポリエステル−セルロースブレンドは、好ましくは約10重量％〜約90重量％、もっとも好ましくは約30重量％〜70重量％のポリエステル含量を有する。すべての場合において、ポリエステルであるかポリエステル−セルロースブレンドであるかにかかわらず、材料は織物または不織物であることができる。ポリエステル−セルロースブレンドの場合、不織物材料が好ましい。当技術分野で「ハイドロエンタングルメント加工（hydroentangled）」ポリエステル／セルロースブレンドとして公知の材料を使用することもできる。本発明における使用に適したポリエステル−セルロースブレンドの例は、商標DURX（登録商標）およびMICROFIRST（登録商標）（Berkshire Corporation, Great Barrington, Massachusetts, USA）、C1 WiperおよびPROZORB（登録商標）（Contec, Spartanburg, South Carolina, USA）ならびにTECHNI-CLOTH（登録商標）（ITW-Texwipe Company, Mahwah, New Jersey, USA）の下で販売されているものである。
【０００９】
ポリマー被覆セルロース中のセルロースは、ビスコース、すなわちビスコース法によって形成されたセルロースであることもできる。一例がHYDRA-ZORB（Viking Car Care, St. Lous Missouri, USA）である。
【００１０】
シートの寸法は重要ではなく、異なることができる。それぞれのシートの長さおよび幅、すなわち一般に横方向寸法は、種が転写されるゲルの対応する寸法と少なくとも同じ大きさであるべきである。それぞれのシートの厚さは、シートを横切るイオンの自由な輸送を可能にし、横方向寸法を速やかかつ均一に横切る種の転写を生じさせるのに十分な電位を伝達するのに十分な緩衝液をシートが保持することを可能にするのに少なくとも十分な大きさであるべきである。厚さは、従来のろ紙の厚さと同じであることができる。大部分の用途において、本発明の利点は、約0.1cm〜約3.0cm、好ましくは約0.3cm〜約1.0cmのシート厚さで達成される。
【００１１】
シートの多孔度および水性緩衝液を保持する能力は、衛生用およびクリーンルーム用の拭きものとして使用される従来の公知のシートのそれらと同一ではないとしても同程度である。そのようなシートに典型的な吸収率は約200mL/m2〜約600mL/m2の範囲内である。
【００１２】
シートは、従来技術のろ紙が浸潤されるのと同様に緩衝液で浸潤される。従来の緩衝液、好ましくは水性緩衝液を使用することができる。緩衝剤の例は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スクシネート、シトレート、アスパラギン酸、グルタミン酸、マレエート、カコジレート、2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、ピペラジン-N,N'-2-エタンスルホン酸(PIPES)、2-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス-(ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸(MOPS)、N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(TAPSO)、3-(N,N-ビス［2-ヒドロキシエチル］アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、N-[トリス(ヒドロキシメチル)-メチル]グリシン(トリシン)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(ビシン)、(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ］-1-プロパンスルホン酸(TAPS)、N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(AMPSO)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノ-メタン(トリス)およびビス[2-ヒドロキシエチル]イミノトリス-［ヒドロキシメチル］メタン(ビストリス)である。当技術分野で公知の他の緩衝剤を使用してもよい。
【００１３】
種を転写させることができる電気泳動ゲルは、電気泳動のための媒体として働くことが知られる任意のゲルを含む。例は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲル、尿素ゲル、ホルムアミドゲルおよび任意の他の変性または非変性ゲルである。転写膜もまた、電気泳動で分離された種をエレクトロブロッティングによって転写させることができる任意の材料であることができる。例は、ニトロセルロースおよび他のセルロース誘導体、ナイロンおよびポリ二フッ化ビニルである。
【００１４】
この条件にしたがってエレクトロブロッティングが実施される作業条件は、従来のセミドライエレクトロブロッティングで使用される作業条件に類似している。転写スタックは、様々な浸潤ポリエステルまたはポリエステル／セルロースシート、平面接触している膜およびゲルを任意の順序で、好ましくは互いに直接隣接させて配置することによって調製される。たとえば、転写膜およびゲルを直接接触させて配置して転写スタックの内層を形成し、一つの緩衝剤浸潤ポリエステルまたはポリエステル／セルロースシートを、ゲルの、膜によって占有されない側に配置し、第二の緩衝剤浸潤ポリエステルまたはポリエステル／セルロースシートを、膜の、ゲルによって占有されない側に配置する。介在する、またはさらなるシートまたは層を含めることもできるが、好ましくない。スタックの各側の一つの浸潤シートを二つまたはそれ以上のシートに替えて外層の厚さを増すこともできるが、一般に、各側に一つのシートで十分である。
【００１５】
本明細書ではゲル、転写膜および二つの緩衝剤浸潤吸収シートであると定義される転写スタックを、固い平坦な電極プレートと直接接触させて配置したのち、プレート間およびスタックに電圧を印加する。上記のように、本発明の利点は、本発明の浸潤ポリエステルまたはポリエステル／セルロースシートの代わりにろ紙の使用を伴う従来技術のエレクトロブロッティングに比べて比較的低い電圧でエレクトロブロッティングを実施することができることである。加えて、エレクトロブロッティング中の電圧は実質的に一定のままである。すなわち、実施の過程で電圧の上昇があるとしてもごくわずかである。本発明の特徴を使用する好ましいエレクトロブロッティング転写においては、約5ボルト〜約25ボルトの電圧および約1mA/cm2〜約2A/cm2、より好ましくは約1mA/cm2〜約100mA/cm2、もっとも好ましくは約5mA/cm2〜約20mA/cm2の電流が使用される。本発明の特徴を使用する他の好ましいエレクトロブロッティング転写においては、約10ボルト〜約30ボルトの電圧および約1A/cm2〜約5A/cm2の電流が使用される。電流への暴露時間は、種の完全な転写を達成するのに十分な暴露時間であり、低めの電流は長めの露光時間を要すると考えられる。しかし、大部分の場合において、60分またはそれ未満、好ましくは約3分〜約50分、より好ましくは約5分〜約40分、もっとも好ましくは約10分〜約35分の露光時間で最良の結果が得られる。
【００１６】
エレクトロブロッティングによって転写させることができるいかなる種をも本発明のシステムまたは方法によって転写させることができる。これは、タンパク質、ペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチドを含む。核酸およびオリゴヌクレオチドはRNAおよびDNAを含む。
【００１７】
以下の実施例は例として提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００１８】
それぞれ25kD、50kDおよび75kDの三つの高強度基準バンドを含む、Bio-Rad Laboratories, Inc.（Hercules, California, USA）から商品名「ALL BLUE PRECISION PROTEIN STANDARDS」として販売されている標準タンパク質混合物を、8.5cm×6.7cmのサイズで厚さ1mmの一連の同質12.5％ポリアクリルアミドトリス-HClゲル上でスラブゲル電気泳動によって分離した。各ゲルを15cm×9.5cmのサイズで厚さ0.001cmのニトロセルロース転写膜と重ね合わせ、二つの緩衝剤浸潤吸収シートをゲル／ニトロセルローススタックの各外側に一つずつ設けることにより、転写スタックを調製した。すべて様々な材料の市販の拭きものであり、それぞれ横方向寸法8.5cm×6.7cmであり、厚さ0.5cmである吸収シートを、pH9.6のトリス-CAPS緩衝液で完全に浸潤させた。陽極側の緩衝剤はメタノールをさらに含有し、陰極側の緩衝剤はドデシル硫酸ナトリウムをさらに含有するものであった。本発明の範囲内の吸収シート材料および本発明の範囲外の吸収性シート材料を、従来技術を代表するBio-Rad Laboratories, Inc.（Hercules, California, USA）からの極厚ろ紙（綿由来セルロース）とともに試験した。転写スタックをプレート電極間に配置し、dc電流を、120mA（2.1mA/m2）で35分間、240mA（4.2mA/m2）で17分間、360mA（6.3mA/m2）で9分間、場合によっては480mA（8.4mA/m2）で5分間、スタックに印加した。すべての場合において、転写期間の最初と最後で電圧を計測し、記録し、ブロッティングの質を観測した。得られたブロッティングが明瞭かつ鮮明である場合には「良」とし、得られたブロッティングが明瞭であるが鮮明ではない場合には「OK」とし、得られたブロッティングが明瞭でも鮮明でもない場合には「劣」とした。結果を以下の表1に示す。
【００１９】
（表１）比較データを含む実験結果
2011506968.tif 000002
2011506968.tif 000003
【００２０】
表1にリストした製品の供給元は以下のとおりである。
（1）：VWR International, Leicestershire, United Kingdom
（2）、（3）、（4）、（8）：Milliken & Company, LaGrange, Georgia, USA
（5）、（14）：ITW-Texwipe Company, Mahwah, New jersey, USA
（6）、（7）、（9）、（10）、（11）、（15）：Berkshire Corporation, Great Barrington, Massachusetts, USA
（12）、（13）：Contec, Spartanburg, South Carolina, USA
（16）：Perfex Corporation, Poland, New York, USA
（17）：3M, St. Paul, Minnesota, USA
（18）：Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California USA
【００２１】
表の結果は、一般に、ポリエステルおよびポリエステル／セルロースブレンド材料が、所与の電流レベルで、ポリウレタン、セルロースおよびろ紙のいずれよりも低い電圧でタンパク質の転写を起こさせたことを示す。
【００２２】
本発明をさらに説明するため、異なる作業条件下、一連の転写を実施した。タンパク質混合物およびポリアクリルアミドゲル組成物は、先の実験で使用したものと同じであり、電気泳動条件もまた同じであった。しかし、転写条件が異なった。緩衝剤は、300mMトリス、300mMグリシン、20％メタノールおよび0.1％ドデシル硫酸ナトリウムからなる増強Towbin緩衝剤であったが、吸収材は同じ寸法であり、転写スタックは同様にアセンブルしたものであり、スタックに印加した電流は2.5A/cm2で10分間であった。前記と同様に、転写期間の最初と最後で電圧を計測し、記録し、最後にブロッティングの質を観測した。
【００２３】
結果を表2に示す。表中、格付けシステムは表1で使用したものと同じであるが、ブロットが、「良」と格付けされたブロットと同じくらい明瞭かつ鮮明であり、しかも、「良」と格付けされたブロットよりも濃いことを示す「優」を含む。
【００２４】
（表２）2.5Aでの実験結果
2011506968.tif 000004
【００２５】
表2の最後二つの製品の供給元は以下のとおりである。
（19）：Contec, Inc., Spartanburg, South Carolina, USA
（20）：Viking Car Care, St. Louis, Missouri, USA
【００２６】
表2の結果は、ポリウレタンコーティング付き圧縮ビスコースが、パーフォマンスにおいてポリエステル／セルロースブレンドに相当することを示す。
【００２７】
前記説明は様々な代替態様を記載するが、さらなる代替態様が当業者には自明であり、本発明の範囲に入る。
【００２８】
本明細書に付随する請求の範囲において、「一つの（a）」または「一つの（an）」は「一つまたは複数」を意味する。「含む（comprise）」および「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのその変化形は、ステップまたは要素を目的語とする場合、さらなるステップまたは要素の追加が可能であり、除外されないことを意味する。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願および他の刊行物が参照により本明細書に組み入れられる。そこで引用される参照物と本明細書の明示的教示との間の矛盾は、本明細書の教示を尊重して解決される。これは、当技術分野で理解されている語句の定義と、その同じ語句の本明細書で明示的に提供されている定義との間の矛盾をも含む。
【国際調査報告】
2011506968.tif 000005
2011506968.tif 000006