(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートによるハイブリダイゼーションによって試料中の標的核酸を操作する、単離する、検出するまたは増幅させる方法であって、前記核酸が、直接にまたはリンカーを介して一緒に結び付けられた少なくともＡ１およびＢｊを含むオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートと反応することを可能にする工程を含み、Ａはｉ−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ｉ＝３〜５０であり、Ａｉは、天然または非天然の核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または天然のホスホジエステル結合を有し、場合によってはマーカー基を含むオリゴマー方法に関する。Ｂｊは、ｊ−ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、Ｂは、−ＨＰＯ３−Ｒ１−（ＮＨ−Ｒ２）ｎ−ＮＨ−Ｒ３−Ｏ−であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、低級アルキレンであり、同一または異なっており、ＮＨ−Ｒ２部分は、同一または異なって、ｎ＞１である場合；ＨＰＯ３−Ｒ１−ＣＨ（Ｘ）−Ｒ３−Ｏ−であり、ここで、ＲｉおよびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘは、プトレシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である。
2011507542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を操作する、単離する、検出するまたは増幅させる方法であって、
少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートＡｉ−Ｂｊを含み、
−  テンプレートとして前記標的核酸を有する構造I〜IIIのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートＡｉ−Ｂｊを伸長させる工程と、
−  構造I〜Xのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートＡｉ−Ｂｊにより前記標的核酸を検出する工程と
を含み、
前記コンジュゲートＡｉ−Ｂｊにおいて、
・Ａｉはｉ−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ｉ＝３〜５０であり、Ａｉは天然または非天然の核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または天然のホスホジエステル結合を有するオリゴマーであり、場合によってはマーカー基を含み、
・Ｂｊ部分は、Ａｉ部分に、またはホスホジエステル結合を介してＡｉへのリンカーに付着され、
Ｂｊは、ｊ−ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、Ｂは、
−  −ＨＰＯ３Ｒ１−（ＮＨ−Ｒ２）ｎ−ＮＨ−Ｒ３−Ｏ−（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基であり、ＮＨ−Ｒ２部分は、ｎが＞１である場合に同一または異なる）；
−  −ＨＰＯ３−Ｒ１−ＣＨ（Ｘ）−Ｒ３−Ｏ−（Ｒ１およびＲ３は同一または異なって、Ｃ１〜Ｃ６のアルキレン基であり、Ｘはプトレシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）
であり、
前記構造I〜Xは以下の通りであり：
構造Ｉ
ＨＯ−３’Ａｉ５’−Ｂｊ−Ｒ４
構造II
ＨＯ−３’Ａｉ５’−Ｒ５−Ｂｊ−Ｒ４
構造III
ＨＯ−３Ａｉ１５’−Ｂｊ−Ａｉ２−Ｒ４
構造IV
Ｒ４−Ｂｊ−３’Ａｉ５’−Ｒ６
構造V
Ｒ４−Ｂｊ−Ｒ５−３’Ａｉ５’−Ｒ６
構造VI
Ｒ７−３’Ａｉ５’−Ｂｊ−Ｒ４
構造VII
Ｒ７−３’Ａｉ５’−Ｒ５−Ｂｊ−Ｒ４
構造VIII
Ｒ７−３’Ａｉ１５’−Ｂｊ−３’Ａｉ２５’−Ｒ４
構造IX
Ｒ７−３’Ａｉ１５’−Ｂｊ−５’Ａｉ２３’−Ｒ８
構造X
Ｒ４−Ｂｊ１−３’Ａｉ５’−Ｂｊ２−Ｒ６
であり、ここで、
−  Ａｉ１およびＡｉ２は、同一または異なって、Ａｉについての上記定義の通りであり；
−  Ｒ４およびＲ６は、同一または異なって、Ｈまたはリンカー、クエンチャー、マーカー、例えば、発色団またはフルオロフォア基、あるいは化学部分、例えば、ビオチン、疎水性鎖、コレステロール誘導体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖またはホスファート基であり；
−  Ｒ５は、Ｈ、ＡｉおよびＢｊとは異なって、ＡｉとＢｊとの間の化学的に安定なまたは切断可能なリンカーであり、
−  Ｂｊ１およびＢｊ２は、同一または異なって、Ｂｊについての上記定義の通りであり；
−  Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、Ｈとは異なり、リンカー、クエンチャー、マーカー、例えば、発色団またはフルオロフォア基、または化学部分、例えば、ビオチン、疎水性鎖、コレステロール誘導体、抗原、タンパク質、ペプチド、ホスファート基または糖からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
Ａｉは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および非天然核酸塩基（例えば、ロックド（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ＰＮＡ）、ならびにそれらの化学的修飾体または置換体（例えば、ホスホロチオアート、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−アルキル基）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造I〜IIIの前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのプライマーとして使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
構造I、IIまたはIIIの少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートを用いた核酸増幅を可能にする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートが逆転写用のプライマーとして使用される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
構造IV〜Xのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートＡｉ−Ｂｊは、少なくとも１回のプライマー伸長工程を含むアッセイにおいて前記標的核酸を検出するためのプローブとして使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、核酸増幅アッセイにおいて標的核酸を検出するためのプローブとして使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、ＰＣＲアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイまたは逆転写アッセイにおいてプローブとして使用される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、核酸合成工程を含むアッセイにおいてプローブとして使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
構造IV〜Xの少なくとも１種は、標的核酸の検出または増幅を阻害するクランプとして使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸を増幅させおよび検出する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
構造I〜Xの少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、核酸合成工程を含むアッセイにおいて標的を検出するのに使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
構造I〜Xの少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、核酸合成工程を含むアッセイにおいて野生型標的核酸と突然変異標的核酸とを識別するのに使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
構造I〜Xの少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、マルチプレックスアッセイに使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
構造I〜Xの少なくとも１種のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、少なくとも１回の核酸合成工程を含むアッセイにおいて使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
構造I〜Xの少なくとも１種の分子を用いて、前記標的核酸を精製、捕捉および修飾するような操作工程を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
構造I〜Xの少なくとも１種の分子は、野生型標的核酸と突然変異標的核酸とを識別するのに使用される、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を操作する、単離する、検出するまたは増幅させるために使用されるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートによる核酸のハイブリダイゼーションならびに分子生物学および診断分野におけるその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を基礎にした技術は、細胞および分子の研究ならびに診断において広く用いられている。この技術は合成オリゴヌクレオチドとその相補的核酸鎖との間の配列認識に依存する。親和性および特異性が、あらゆる核酸ハイブリダイゼーションに基づいたアッセイの効率を決定する２つの大きな特徴である。
【０００３】
核酸ハイブリダイゼーションを改善するために種々のアプローチが開発されてきた。その中で、１つのアプローチは負電荷の核酸鎖間の静電反発力を低減させることである。近年、カチオン性基をオリゴヌクレオチドにグラフトすることから成り、オリゴヌクレオチド合成に用いられるホスホラミダイト化学に全体的に基づく自動固相合成が、特許文献１に開示されている。その結果得られるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、鎖間ホスファートの反発を低減させることによって短い相補的配列とのハイブリダイゼーションを安定化させることが明らかとなった（非特許文献１）。
【０００４】
干し草の山の中で一本の針を探すように、全ゲノムのような複雑な核酸の生物学的試料における固有配列の特異的検出を改善することは、さらに難しい課題である。このような状況では、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートのカチオン性部分がゲノムＤＮＡのホスファート基に非特異的に結合し、これにより標的配列の特異的認識が低減することが想定される。特許文献１および非特許文献１に例示されているように、この懸念はポリカチオンがポリアミンである場合に深刻になることがある。実際、スペルミンまたはスペルミジンのようなポリアミンは原核細胞および真核細胞中のゲノムＤＮＡと自然に相互作用する（非特許文献２および３に概説されている）。さらに、核酸塩基対相互作用を支配する機構に起因して、結合親和性および配列特異性が概ね負に相関することが確立されている（非特許文献４）。したがって、全ゲノム中の特異的配列を標的にするのに使用されるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、結果的に特異性を低下させるミスマッチに耐えるものと予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０７／０６９０９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ポンズ・ビー（Pons B）、コテラ・エム（Kotera M）、ツバー・ジー（Zuber G）、ベール・ジェイ・ピー（Behr JP）著、「オンライン・シンセシス・オフ・ジブロック・化チオニック・オリゴヌクレオデズ・フォー・エンハンスド・ハイブリダイゼーション・ツー・ゼア・コンプリメンタリー・シーケンス（Online synthesis of diblock cationic oligonucleotides for enhanced hybridization to their complementary sequence）」、Chembiochem、. 2006年８月、第７巻、第８号、ｐ．1 173-6.
【非特許文献２】タボル・シー・ダブリュー（Tabor CW）、タボル・エイチ（Tabor H）著、「ポリアミンズ（Polyamines.）」、Annu Rev Biochem、1984年、第５３巻、ｐ．749-90
【非特許文献３】ペグ・エイ・イー（Pegg AE）、「リースント・アドバンシズ・イン・ザ・バイオケミストリ・オフ・ポリアミンズ・イン・ユーカロテズ（Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes）、 Biochem J.、1986年３月１日、第234巻、第2号、ｐ．249-62..
【非特許文献４】デミドフ・ブイ・ブイ（Demidov VV）、フランク・カメネタキ・エム・ディー（Frank-Kamenetskii MD）著、「ツー・サイズ・オフ・コイン・アフィニティ・アンド・スペシフィシティ・オフ・ヌクレイック・アシッド・インタラクション（Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions）、Trends Biochem Sci.、2004年２月、第29巻、第2号、ｐ．62-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、WO 2007/069092に記載された分子からのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの特定の選択が、それらの標的配列に対して非常に高い親和性と驚くほど厳格な特異性を示し、その結果としてハイブリダイゼーションに基づく方法が全体的に改善されるという予想外の発見を開示する。前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、特に、ポリメラーゼ連鎖反応を改善することが示された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
有利には、前記オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、標準的なオリゴヌクレオチドに比してプライマーおよびプローブとして特に効率的である。「標準的なオリゴヌクレオチド」とは天然核酸塩基を含んだ未修飾オリゴヌクレオチドを指す。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、核酸ターゲティングを考慮して、特異的オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートを用いたハイブリダイゼーション法を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、プライマーまたはプローブとしてオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートを使用することに関する。
【００１１】
更に別の目的によれば、本発明は、前記コンジュゲートの生物学的適用に関する。
【００１２】
オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートとのハイブリダイゼーションによって試料中の標的核酸の検出、単離、増幅または操作を行う本方法は、直接またはリンカーを介して共に結合した少なくともＡｉおよびＢｊ部分を含むオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートと前記核酸を反応させる工程を含み、
ここで、
Ａｉはｉ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドであり（ｉ＝３〜５０）、Ａｉは天然または非天然核酸塩基および／またはペンタフラノシル（pentafuranosyl）基および／または天然のホスホジエステル結合を有するオリゴマーであり、場合によってはマーカー基を含み、
Ｂｊはｊ−ｍｅｒ有機オリゴカチオン部分であり（ｊ＝１〜５０）、
Ｂは
−ＨＰＯ３Ｒ１−（ＮＨ−Ｒ２）ｎ−ＮＨ−Ｒ３−Ｏ−（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は低級アルキレンであり、同一または異なり、ｎ＞１の場合にＮＨ−Ｒ２部分は同一または異なる）、
−ＨＰＯ３−Ｒ１−ＣＨ（Ｘ）−Ｒ３−Ｏ−（Ｒ１およびＲ３は同一または異なって低級アルキレンであり、Ｘはプトレシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）
である。
【００１３】
本明細書ならびに本特許請求の範囲において用いられる場合、「低級アルキレン」とは、置換されてもよいＣ１−Ｃ６の線状（linear）、分枝または環状のアルキレン基を指す。
【００１４】
Ａｉは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および非天然核酸塩基（例えば、ロックド（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ＰＮＡ、ならびにそれらの化学的修飾体または置換体（例えば、ホスホロチオアート（チオホスファートとしても示される）、２’−フルオロ基または２’−Ｏ−アルキル基）を含む群から選択される。
【００１５】
Ａｉは、発色団／フルオロフォア基および／またはクエンチャー基、または化学部分、例えば、アミノまたはチオール修飾因子、スペーサー基、ビオチン、疎水性鎖、コレステロール誘導体、抗原、タンパク質、ペプチド、ホスファート基または糖を含み得る。
【００１６】
第１の実施形態では、フリーのＯＨ基がＡｉの３’位に存在する。したがって、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのための基質として有用である。
【００１７】
この第１実施形態では、したがって、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは核酸合成のためのプライマーとして有用である。
【００１８】
前記第１の実施形態による混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、
構造I
ＨＯ−３’Ａｉ５’−Ｂｊ−Ｒ４
または構造II
ＨＯ−３’Ａｉ５’−Ｒ５−Ｂｊ−Ｒ４
または構造III
ＨＯ−３’Ａｉ１５’−Ｂｊ−Ａｉ２−Ｒ４
を有し、
ここで、
−  Ａｉ１およびＡｉ２は、同一または異なって、Ａｉについて上記に定義した通りであり；Ａｉ２は３’−５’または５’−３’に方向付けられ；
−  Ｒ４は、Ｈまたはリンカー、クエンチャー、マーカー、例えば、発色団またはフルオロフォア基、あるいは化学部分、例えば、ビオチン、疎水性鎖、コレステロール誘導体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖質またはホスファート基であり；
−  Ｒ５は、Ｈ、ＡｉおよびＢｊとは異なって、ＡｉとＢｊとの間のリンカーであり、化学的に安定なまたは切断可能なリンカーからなる。
【００１９】
したがって、本発明は、上記に定義されたような方法であって、標的の核酸に結合した後に、構造I、IIまたはIIIの分子がプライマーとして用いられる、方法に関する。
【００２０】
このような方法は、有利には、
−  上記で定義したプライマーを標的核酸分子と共に、プライマー分子を前記標的核酸分子に結合させる条件下にインキュベートする工程と、
−  前記標的核酸分子を有する前記プライマーをテンプレートとして伸長させる工程と
を含む。
【００２１】
前記実施形態では、前記分子は核酸合成を触媒するＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのための基質である。
【００２２】
実施例に示されるように、天然核酸塩基を含む標準的な未修飾オリゴヌクレオチドに比して、前記分子に相当するプライマーは、それらの標的核酸分子との親和性を顕著に改善することが可能であり、予想外の高い配列特異性がある。
【００２３】
特に、前記分子は、逆転写および核酸増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応の強力なツールである。
【００２４】
実際、前記プライマーはＰＣＲのような非常に効率的で、特異的かつ高感度の増幅反応を実行することができる。
【００２５】
本発明のプライマーは、それらの標的とずばぬけた親和性があるために、標準的なプライマー（未修飾オリゴヌクレオチド）に比して最大で１０倍低減させられた非常に低い濃度で使用され得る。さらに、本発明のプライマーは、低い塩濃度、更に具体的にはＭｇＣｌ２濃度で効率的に機能する。
【００２６】
ハイブリダイゼーション温度は、標準的なプライマーに比して数度上げられ得る。ハイブリダイゼーション温度はオリゴカチオンの長さに従って調節され得る。
【００２７】
したがって、ハイブリダイゼーション温度および塩濃度、更に具体的にはＭｇＣｌ２濃度の調節を制限することから脱することが可能である。
【００２８】
前記プライマーはマルチプレックスＰＣＲまたはハイスループットＰＣＲのような用途に有用である。
【００２９】
前記プライマーはまた、ＰＣＲによる増幅が困難であることが知られているＡＴリッチな領域における増幅の改善も可能にする。
【００３０】
特に、本発明の分子により短いプライマー設計が可能となり、変異性が高いゲノムの保存領域における増幅のような特定の用途に有用である。
【００３１】
実施例に示されるように、前記プライマーは逆転写のような用途においてオリゴ（ｄＴ）、六量体または特異的プライマーとしても有用である。前記プライマーにはずばぬけた親和性があるため、低発現の遺伝子を検出するのに特に有用であり得る。
【００３２】
前記プライマーはＤＮＡ配列決定にも使用され得る。
【００３３】
場合によっては、オリゴヌクレオチドとオリゴカチオン部分との間で切断可能なリンカーを有する本発明の分子を使用することが有用であり得る。増幅産物の電気泳動による分離を必要とする方法の場合、分離前に、ポリカチオンの増幅後の切断が有用である場合がある。
【００３４】
第２の実施形態において、Ａｉの３’位にあるＯＨ基がブロックされるので、ポリメラーゼの存在下ではＡｉは伸長させられ得ない。
【００３５】
前記第２群の分子は、
構造IV
Ｒ４−Ｂｊ−３’Ａｉ５’−Ｒ６
または構造V
Ｒ４−Ｂｊ−Ｒ５−３’Ａｉ５’−Ｒ６
または構造VI
Ｒ７−３’Ａｉ５’−Ｂｊ−Ｒ４
または構造VII
Ｒ７−３’Ａｉ５’−Ｒ５−Ｂｊ−Ｒ４
または構造VIII
Ｒ７−３’Ａｉ１５’−Ｂｊ−３’Ａｉ２５’−Ｒ４
または構造IX
Ｒ７−３’Ａｉ１５’−Ｂｊ−５’Ａｉ２３’−Ｒ８
または構造X
Ｒ４−Ｂｊ１−３’Ａｉ５’−Ｂｊ２−Ｒ６
を有し、
ここで、
−Ａｉ１およびＡｉ２は同一または異なって、Ａｉについて上記に定義した通りであり；
−Ｂｊ１およびＢｊ２は同一または異なって、Ｂｊについて上記に定義した通りであり；
−Ｒ４およびＲ６は同一または異なって、Ｒ４は上記に定義した通りであり、Ｒ６はＲ４について上記に定義した通りであり、
−Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、Ｈとは異なり、かつ、リンカー、クエンチャー、マーカー（例えば、発色団またはフルオロフォア基）、または化学部分（例えば、ビオチン、疎水性鎖、コレステロール誘導体、抗原、タンパク質、ペプチド、ホスファート基または糖）を含む群より選択される。
【００３６】
前記第２の実施形態の分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを含むアッセイにおいて標的核酸を検出するのに使用される。前記第２の実施形態の分子は、より具体的には、in vitroの核酸増幅法（例えばＰＣＲ）によって生じた相補的核酸を検出するためのプローブとして有用である。
【００３７】
前記第２実施形態の分子は、より具体的には、リアルタイム核酸増幅をモニタリングするためのプローブとして有用である。
【００３８】
本発明は、構造IV〜Xの分子が標的核酸とハイブリダイズするプローブとして使用され得る、標的核酸の検出方法に関する。
【００３９】
したがって、本発明は、標的核酸を検出するための上記定義のような方法であって、
−  前記標的核酸を上記定義のようなプローブと共に、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼの存在下、前記プローブが前記核酸分子とハイブリダイズすることを可能にする条件下にインキュベートする工程と、
−  前記ハイブリダイゼーションを検出する工程と
を包含する、方法に関する。
【００４０】
有利には、前記分子は、リアルタイムＰＣＲのための高価な（valuable）ハイブリダイゼーションプローブおよび二重標識プローブである。実施例に示されるように、本発明のプローブは蛍光バックグラウンドを低減させ、これにより、アンプリコン検出の性能が改善される。
【００４１】
特に、標準的なプローブ（天然核酸塩基を含む二重標識プローブ）と比較して、本発明の二重標識プローブは、増幅の非存在下に蛍光放射のより大きいクエンチングを示す。さらに、実施例に示されるように、接合プローブはより高い感度で標的を検出する。
【００４２】
したがって、本発明は、野生型標的核酸と突然変異標的核酸とを識別するための上記定義のような方法に関する。
【００４３】
有利には、前記分子によってより短いプローブの設計が可能となり、プライマー／プローブセットの設計を促進することによって増幅プロセス（例えばＰＣＲ）において有用である。短いプローブはより高い識別能力を有している。特に、前記分子はまた対立遺伝子識別のための強力なツールである。
【００４４】
実施例に示されるように、標準的なオリゴヌクレオチドに比して、本発明の分子に相当するプローブは、ＳＮＰ（SingleNucleotide polymorphism：一塩基多型）のような突然変異を検出および分析するのに特に有用である。
【００４５】
別の態様では、前記第２の実施形態の分子は有利には、標的核酸の増幅および／または検出を阻害する方法を提供するクランプとして使用される。
【００４６】
第３の実施形態において、本発明の分子は、より一般的には、標的核酸がポリメラーゼのテンプレートではないハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて使用される。
【００４７】
本発明は、上記で定義した構造I〜Xの分子が標的核酸との結合後に１以上の酵素の基質として使用される核酸操作法に関する。
【００４８】
本発明は、上記で定義した構造I〜Xの分子が、１以上の酵素の存在下、前記酵素が前記標的核酸を修飾することを可能にする条件下に標的核酸と結合する核酸操作法に関する。
【００４９】
本発明は、標的核酸とハイブリダイズする上記で定義した構造Ｉ〜Ｘの分子を含む標的核酸を操作、検出、捕捉する方法に関する。
【００５０】
したがって、本発明は、標的核酸を検出するための上記で定義した方法であって、
−  前記標的核酸を、上記定義のような本発明のプローブと共に、前記プローブが前記標的核酸分子にハイブリダイズすることを可能にする条件下インキュベートする工程と、
−  前記ハイブリダイゼーションを検出する工程と
を包含する方法に関する。
【００５１】
前記第３の実施形態の分子は、より具体的には、例えば固体支持体または固定化された組織上に固定化された標的核酸を検出するためのプローブとして有用である。前記プローブはin situハイブリダイゼーション法に有用である。
【００５２】
実施例に示されるように、本発明の短いプローブは、標準的なプローブには許容されないストリンジェント条件下で、支持体上に固定化された標的核酸を高い特異性で検出することができる。
【００５３】
修飾されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオアートヌクレオチドを含むＡｉを有する分子は、それらの生物学的適用を考慮して特に有利である。これは、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、細胞溶解液または生体液中で加水分解されないからである。
【００５４】
上記で定義した混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは有利には、前記WO 2007/069092の方法によるホスホラミダイト経路を介して、オリゴヌクレオチド合成器で段階的に合成される。
【００５５】
活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢは有利には、ポリアミンのアミノ基を保護し、次にα、ω−ビスヒドロキシアルキル化することによって得られ、オリゴヌクレオチド合成に適合するジオールがもたらされる。
【００５６】
従来のＤＭＴおよびホスホラミダイト伸長化学（elongation chemistry）は有利には、塩基不安定なＴＦＡ保護基と一緒に実行される。
【００５７】
本発明の他の特徴および利点は、図１〜９を参照した以下の実施例に与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの構造。
【図２】従来の勾配ＰＣＲにおいて本発明のプライマーを用いて得られた結果。
【図３】リアルタイムＰＣＲ実験において高いアニーリング温度および低塩（ＭｇＣｌ２）で、本発明のプライマーを用いて得られた結果。
【図４】リアルタイムＰＣＲ実験において低い濃度で、前記プライマーを用いて得られた結果。
【図５】リアルタイムＰＣＲ実験においてＡＴリッチな状況で、前記プライマーを用いて得られた結果。
【図６】本発明のプライマーで刺激されたｃＤＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲにおいて得られた結果。
【図７】５’ヌクレアーゼアッセイにおいて本発明の二重標識蛍光発生プローブを用いて得られた蛍光特性および結果。
【図８】リアルタイムＰＣＲにおいて本発明の蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いて得られた結果。
【図９】固体支持体上に固定化された標的核酸を検出するのに使用される本発明の蛍光プローブを用いて得られた結果。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下の実施例において、「Ｓ」は、構造：−  ＨＰＯ３−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−Ｏ−のスペルミン残渣を指し、Ｓｎはスペルミン残基数を表す（ｎ＝１〜５０）。
【００６０】
−「Ｎｍ」はｍ−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを指す。
【００６１】
（実施例１：本発明のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの構造）
WO 2007/069092に従って合成を実施し、当該オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの構造を図１に示す。
【００６２】
（実施例２：ＰＣＲプライマーとしてのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの使用）
ヒトパピローマウイルス型１６（human papillomavirus type 16：HPV16）のE7およびL1遺伝子に特異的な２対のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンプライマーをそれらの標準的対応物（非接合オリゴヌクレオチド）と比較した。本発明の分子をロックド核酸（ＬＮＡ）修飾プライマーとも比較した。
【００６３】
E7プライマーの配列はHesselink et al., 2005からのものである。L1プライマーの配列はRoda Husman et al., 1995を出典とする。
【００６４】
E7プライマー対（４６％および４８％ＧＣ）およびL1プライマー対（３０％および２０％ＧＣ）は異なる２つのＧＣ含量を示す。
【００６５】
１〜２コピーの組み込まれたHPV16を含んだSiHa細胞（子宮頸癌、ATCC HTB35）のゲノムＤＮＡを標的ゲノムＤＮＡとして用いた。ウイルスを含まないA549細胞（肺癌、ATCC CCL185）のゲノムＤＮＡをネガティブコントロールとして用いた。
【００６６】
本発明のプライマーは構造Ｉの例である。
【００６７】
・標準的なオリゴヌクレオチド（E7プライマー）の配列
フォワードプライマー配列番号１（E7F）：5'- GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT- 3'
リバースプライマー配列番号２（E7R）：5'- GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA- 3'
・本発明によるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲート（S4-E7プライマー）の配列
フォワードプライマー配列番号３（S4-E7F）：5'- S4 - GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT- 3'
リバースプライマー配列番号４（S4-E7R）： 5'- S4 - GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA- 3'
・オリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ（LNA-E7プライマー）の配列
フォワードプライマー配列番号５（LNA-E7F）：5'- GaG GAg_GAG GAT GAA ATA GAT GGT- 3'
リバースプライマー配列番号６（LNA-E7R）：5'- GCc CAT tAA CAG GTC TTC CAA- 3'
ＬＮＡヌクレオチドには小文字に下線を付している。
【００６８】
Ｓ４＝４個のスペルミン部分
・標準的なオリゴヌクレオチド（L1プライマー）の配列
フォワードプライマー配列番号７（LlF）：5'- TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT AC- 3'
リバースプライマー配列番号８（LIR）：5'- GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C- 3'
・本発明によるプライマーの配列（Sn-L1プライマー）
フォワードプライマー配列番号９（Sn-L1F）：5'- Sn - TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT ACS'
リバースプライマー配列番号１０（Sn-L1R）：5'-Sn-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C- 3'
Ｓｎ＝ｎ個のスペルミン部分；ｎ＝４および５
・オリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ（LNA-L1プライマー）の配列
フォワードプライマー配列番号１１（L1F）：5’- TTtGTT aCT GTT GTT GAT ACT AC- 3’
リバースプライマー配列番号１２（L1R）：5’- GAa AAA tAA ACT GTA AAT CAT ATT C- 3’
ＬＮＡヌクレオチドには小文字に下線を付している。
【００６９】
図２は従来のＰＣＲにおける本発明のプライマーの使用を描写する。増幅性能は、ＰＣＲの終点においてアニーリング温度の関数として勾配ＰＣＲ手順を用いて評価された。
【００７０】
標的およびコントロールのゲノムＤＮＡを反応容積２５μｌにおいて増幅させた。各サンプルを、０．４ｍＭのＤＮＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のTriton（登録商標） X-100、２００μＭのｄＮＴＰ（それぞれ）、０．０４Ｕ／μｌのEconoTaq DNA Polymerase（Lucigen）および以下のプライマー対の存在下に増幅させた。
【００７１】
−  １００ｎＭのＥ７標準プライマー（図２ａ：上のパネル）またはS4-E7プライマー（図２ａ：下のパネル）、または、
−  ５００ｎＭのＬ１標準プライマー（図２ｂ：上のパネル）；LNA-L1プライマー（図２ｂ：中間のパネル）；および５個のスペルミン部分を有するS5-L1プライマー（図２ｂ：下のパネル）、
−  ５００ｎＭのL1標準プライマー（図２ｃ：上のパネル）：４個のスペルミン部分を有するS4-L1プライマー（図２ｃ：中間部分）；および５個のスペルミン部分を有するS5-L1プライマー（図２ｃ：下のパネル）。
【００７２】
勾配増幅はiCyclerサーマルサイクラー（Biorad）を用いて次の通り行われた：初期変性：９５℃で３分間、サイクリング：３５サイクル（ａ，ｃ）および３０サイクル（ｂ）：９４℃で２０秒間、６０〜６９℃で２０秒間（ａ）または５２〜６１℃で２０秒間（ｂ、ｃ）、７２℃で１５秒間；最終伸長：７２℃で５分。最終ＰＣＲ反応物を４％アガロースゲルで分析した。E7およびL1産物の大きさそれぞれ１５９ｂｐおよび１４２ｂｐである。
【００７３】
図２ａに示されるように、５’末端に４個のスペルミン残基を有する本発明に従って選択されたコンジュゲートは、それらの標的を特異的に増幅させる。標準的なプライマーと同様、コンジュゲートは実際に、想定されるサイズである１５９ｂｐを有するウイルス性配列フラグメントを、標的SiHa細胞のゲノムＤＮＡから増幅させる。他方、増幅は、同一の増幅条件下、A549細胞のゲノムＤＮＡから得られない。
【００７４】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いることによって、より高い温度（プライマー対に応じて４〜７℃）でハイブリダイゼーション反応を行うことができる（図２ａおよび２ｂ）。
【００７５】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いることによって、プライマーを含むＬＮＡよりも高い温度（４〜５℃、図２ｂを参照）でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
【００７６】
図２ｃに与えられた結果から、温度の上昇はオリゴヌクレオチドに接合されたスペルミンの数により調節され得ることがわかる。
【００７７】
本発明の分子をリアルタイムＰＣＲ実験におけるプライマーとしての使用について評価した。プライマーコンジュゲートをそれらの未修飾の標準的対応物およびＬＮＡ含有プライマーと比較した。
【００７８】
Rotor-gene 6000装置（Corbett）を用いて最終量１０μｌで全ての反応を実施した。反応はSensimix NoRef ＤＮＡキット（Quantace）を用いて最終濃度０．５Ｘで行った。
【００７９】
効率および感度は、１０ｎｇのコントロールゲノムＤＮＡ、すなわちHPV陰性細胞（A549細胞）の３０００個のゲノムにスパイクされた標的HPV16陽性細胞（SiHa細胞）のゲノムＤＮＡの連続的希釈液を増幅させることによって評価された。
【００８０】
ハイブリダイゼーション温度、ＭｇＣｌ２濃度またはプライマー濃度の種々の条件下に、検出用のSYBR Green Iを用いて試料を増幅させた。
【００８１】
図３：ＭｇＣｌ２濃度およびアニーリング温度のリアルタイム増幅への効果。
【００８２】
１０ｎｇの標的ゲノムＤＮＡを１００ｎＭの各プライマーと共に用いて反応を行った。示されるように、最終ＭｇＣｌ２濃度は１．５ｍＭまたは３ｍＭであった。９５℃で１０分間の高温スタートの後、９４℃で２０秒間、６３℃（ａ）または６６℃（ｂ）で２０秒間および７２℃で１５秒間を４５サイクル行った。
【００８３】
図３ａに示されるように、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中６３℃でアニーリングされたときに本発明の分子（S4-E7）は最適である。対照的に、標準プライマーおよびＬＮＡ含有プライマーは、サイクル閾値において示されるように効率的ではない（本発明のコンジュゲートについて１６、標準プライマーについて３３およびＬＮＡ含有プライマーについて２４）。ＭｇＣｌ２濃度を上げれば、標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーの性能は向上する。前記図３からは、標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーにはより低いアニーリング温度が必要であるが、前記S4-E7コンジュゲートは６３℃で効率的に機能することもわかる。
【００８４】
図３ｂおよび３ｃに示されるように、固定された濃度のプライマー（１００ｎＭ）および低濃度のＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）では、最大３コピーの標的が前記S4-E7コンジュゲートにより検出可能であり、６６℃のハイブリダイゼーション温度で高い再現性、特異性および効果がある。
【００８５】
特異的、効率的かつ高感度の増幅は、本発明のプライマーコンジュゲートを用いて、標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーにとって概ね準最適な温度またはＭｇＣｌ２条件下に得られる。
【００８６】
プライマー濃度の効果を図４に示す。
【００８７】
図４ａ：標的ゲノムＤＮＡの１０倍の連続的希釈液を、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中１０ｎＭの本発明のプライマーコンジュゲートにより増幅させた。
【００８８】
図４ｂ：１０ｎｇのコントロールゲノムＤＮＡにスパイクされた２ｎｇの標的ゲノムＤＮＡを、可変量のプライマー：１０、２０および３０ｎＭの本発明のプライマーコンジュゲート（上のパネル）；１０、２５および５０ｎＭの標準的なプライマー（真中のパネル）およびＬＮＡ含有プライマー（下のパネル）を用いて増幅させた。ＭｇＣｌ２濃度は、本発明のコンジュゲートについては１．５ｍＭおよび標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーについては３ｍＭであった。
【００８９】
増幅は以下の通りに行われた：９５℃で１０分間の後、９５℃で１０秒間、６０℃で１分間の４５サイクル。
【００９０】
図４ａは、１０ｎＭの本発明のプライマー分子により二段階のＰＣＲ反応において効率的且つ高感度の増幅が行われることを示す。実際、３コピーの標的が定量的に検出される。図４ｂに示されるように、プライマー濃度が低下すると、Ｃｔ値の上昇が誘起されない。反応終点におけるアンプリコンの最終量が低減するだけである。対照的に、３ｍＭのＭｇＣｌ２中５０ｎＭの標準的なオリゴヌクレオチドまたはＬＮＡを含有するプライマーは、接合されたプライマーのように最適に標的を増幅させるのに十分ではない。
【００９１】
有利には、本発明のプライマーコンジュゲートはそれらの標的により大きい親和性を示し、標準的なオリゴヌクレオチドおよびＬＮＡ含有プライマーに比して低いＭｇＣｌ２濃度で使用可能である。前記分子によって標準的なオリゴヌクレオチドおよびＬＮＡ含有プライマーに比してプライマー濃度を最大１０倍低減させることが可能になり、感度、効率、特異性および再現性の損失がない。
【００９２】
図５に示されるように、本発明のプライマー分子により、ＡＴリッチな配列においてＰＣＲが改善される。有利には、前記分子によって、標準的な条件（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、６０℃でのアニーリング）において効率的な反応を実行することが可能になる。
【００９３】
図５ａでは、標的ゲノムＤＮＡの５倍の連続的希釈液を、１００ｎＭの本発明のコンジュゲートにより増幅させた。最終ＭｇＣｌ２濃度は１．５ｍＭであった。反応物を９５℃で１０分間にわたりインキュベートした後、９４℃で２０秒間、６０℃で２０秒間および７２℃で１５秒間を４５サイクル行った。これらの条件下では、本発明のコンジュゲートは、１コピーの標的の検出によって示されるように効率的（標準曲線（Ｅ＝０．８９；Ｒ２＝０．９９２）を参照）且つ高感度の増幅を行う。
【００９４】
対照的に（図５ｂ）、６００コピーの標的が、標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーによって非効率的に増幅させられる。条件は次の通りであった：１０ｎｇのコントロールゲノムＤＮＡにおいてスパイクされた２ｎｇの標的ゲノムＤＮＡ（６００コピーの標的を示す）が、二段階増幅手順（９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１０秒、６０℃で１分の４５サイクル）を用いて、１５０ｎＭの本発明のコンジュゲート（４または５個のスペルミンを有する）（上のパネル）；標準プライマーについて１５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭ（中央パネル）およびＬＮＡ含有プライマー（下のパネル）により増幅させられた。ＭｇＣｌ２濃度は、本発明のコンジュゲートについて１．５ｍＭおよび標準的なプライマーおよびＬＮＡ含有プライマーについて３ｍＭであった。
【００９５】
（実施例３：逆転写用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの使用）
本発明の分子を逆転写用プライマーとしてのそれらの使用について評価した。全ＲＮＡからのｃＤＮＡは、４個のスペルミン部分と接合された２０残基を含むポリデオキシリボチミジン（Ｓ４−オリゴ（ｄＴ）２０）またはその非接合対応物（オリゴ（ｄＴ）２０）のいずれかを用いて合成された。サイクリンＢ１転写物の増幅のための次のＲＴ−ｑＰＣＲ反応を行って逆転写効率を比較した。
【００９６】
・プライマーの配列
オリゴ（ｄＴ）２０配列番号１３：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
Ｓ４−オリゴ（ｄＴ）２０配列番号１４：5’-S4-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
Ｓ４＝４個のスペルミン部分
サイクリンＢ１のフォワードプライマー配列番号１５：5'- TCTGG AT AATGGTG AATGGAC A -3'
サイクリンＢ１のリバースプライマー配列番号１６：5'- CGATGTGGCATACTTGTTCTTG -3'
（ATCC CCL-247からの）HCT116細胞からの全ＲＮＡが、SV Total RNA Isolationキット（Promega）を用いて抽出された。全ＲＮＡ１μｇは、ＲＴ−ＰＣＲ用のSuperscript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて、供給者によって記載されたようにして逆転写された。反応物（ＲＴ＋）は、５０μＭの本発明の分子（Ｓ４−オリゴ（ｄＴ）２０）またはその非接合対応物（オリゴ（ｄＴ）２０）のいずれかを用いて刺激された。逆転写酵素（ＲＴ−）を用いない反応をコントロールとして行った。
【００９７】
図６は、５ｎｇの全ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ合成反応（ＲＴ＋およびＲＴ−）を用いて実行されたサイクリンＢ１転写物のＲＴ−ｑＰＣＲ増幅を示す。ＰＣＲ反応はRotor-gene 6000装置（Corbett）を用いて最終量１０μｌで行われた。最終反応混合物は、２．５μｌのSensimix NoRef  ＰＣＲキット（Quantace）、SYBR Green 0.5x、１００ｎＭの各サイクリンＢ１特異的プライマーおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。
【００９８】
反応物を９５℃で１０分間にわたりインキュベートした後、９５℃で１０秒間、６０℃で１分間を４５サイクル行った。
【００９９】
ＰＣＲ産物は４％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によって分析された（図６ｂ）。
【０１００】
図６ａは、本発明の分子またはその標準的対応物で刺激されたｃＤＮＡ試料からの同じサイクリンＢ１増幅曲線を示す。想定されたサイズ（１５７ｂｐ）の同一のＰＣＲ産物が合成された（図６ｂ）。全ての試料中に逆転写酵素の非存在下に、遅れた標的外産物が生じた。
【０１０１】
本発明の接合オリゴ（ｄＴ）−ＯＨ分子は逆転写用プライマーとして使用されるときに、効率的なｃＤＮＡ合成を可能にする。
【０１０２】
（実施例４：リアルタイムＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの二重標識ＰＣＲプローブとしての使用）
二重標識プローブはリアルタイムＰＣＲにおける増幅をモニタリングするために最も広く用いられているプローブである。TaqMan（登録商標）プローブとも呼ばれ、それらは、５’端に付着されたフルオロフォアおよび３’に付着されたクエンチャーを、アンプリコン内部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列からなる（Livak et al., 1995）。両方の標識が溶液中で十分に接近している場合、励起されたフルオロフォアによって放出されたエネルギーはＦＲＥＴ（fluorescence energy transfer：蛍光エネルギー移動）の過程を通して、クエンチャーによって吸収されて、蛍光シグナルは低くなる。５’ヌクレアーゼ法（Holland et al., 1991）に基づくＰＣＲ反応の間、プローブは各アニーリング工程でアンプリコンに結合する。プライマーの１つがTaq ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されると、プローブはテンプレート鎖から外れて、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって加水分解される。この切断によって、蛍光レポーターの放出が引き起こされ、生じたＰＣＲ産物の量に比例して蛍光強度が増大することとなる。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートを、リアルタイムＰＣＲ検出プローブとしてのそれらの使用について、ヒト第Ｖ因子遺伝子を増幅させるように設計された５’ヌクレアーゼアッセイにおいて評価した。ヒト第Ｖ因子遺伝子におけるLeiden G1691A突然変異体を、ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism：一塩基多型）遺伝子型同定に対する前記プローブの能力を評価するためのモデルとして用いた。
【０１０４】
プローブ配列およびプライマー配列は、Luderer et al., 2004を出典とした。
【０１０５】
１７個および２２個のヌクレオチド残基を含む２つのオリゴヌクレオチドは、４個のスペルミン部分とそれらの３’末端において接合された。前記コンジュゲートは、６カルボキシフルオセイン（６−ＦＡＭ、Sigma）およびオリゴカチオンに結合されたBlack Hole Quencher（登録商標）（ＢＨＱ−１（登録商標）、Glen Research）により５’位でラベリングされた。本発明のこれらの二重標識蛍光発生プローブをそれらの非オリゴカチオン接合対応物と比較した。
【０１０６】
プローブはすべて野生型対立遺伝子を検出するように設計された。第Ｖ因子野生型ＤＮＡおよびLeiden ＤＮＡを細胞系A549細胞系（ATCC CCL-185）およびGM14899細胞系（Coriell Institute）からそれぞれ抽出した。
【０１０７】
本発明の二重標識プローブは構造IVの例である。
【０１０８】
・プライマーの配列
フォワードプライマー配列番号１５：5'-GCC TCT GGG CTA ATA GGA CTA CTT-3'
リバースプライマー配列番号１６：5'-TT CTG AAA GGT TAC TTC AAG GAC AA-3'
・プローブの配列
−本発明によるプローブの配列：
配列番号１５（F-N17S4）：5' 6-FAM - ACC TGT ATT CCT CGC CT -S4 BHQ-I
Ｓ４＝４個のスペルミン部分
−標準的なプローブの配列
配列番号１７（F-N17）：5' 6-FAM -ACC TGT ATT CCT CGC CT -BHQ-I
配列番号１８（F-N22）：5'6-FAM - ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCC A- BHQ-I
ＳＮＰサイトには下線を付している。
【０１０９】
ＰＣＲ反応はRotor-gene 6000装置（Corbett）において最終量１０μｌで実施された。野生型ゲノムＤＮＡ１０ｎｇ（ｂ）、コントロールＤＮＡ１０ｎｇにスパイクされた野生型ゲノムＤＮＡの１０倍の連続的希釈液（ｃ）および野生型または突然変異ゲノムＤＮＡ１０ｎｇ（ｄ）をテンプレートとして用いた。最終反応混合物は、２．５μｌのSensimix NoRef ＰＣＲキット（Quantace）、２００ｎＭの各プライマーおよび２００ｎＭのプローブを含有していた。最終ＭｇＣｌ２濃度は３ｍＭであった。ネガティブコントロール（非標的ＤＮＡ）としてサケ精子ＤＮＡを用いた。
【０１１０】
前記装置によるＰＣＲ反応開始時に測定された未加工バックグラウンド蛍光は、二重標識プローブの自己クエンチング効率を示す。図７ａに示されるように、本発明の接合プローブ（F-N22S4）は、その標準的対応物（F-N22）より良好な蛍光クエンチングを示す（バックグラウンド蛍光値４．８対２４単位）。クエンチングは２つの色素の物理的近接性に依存する。静電相互作用に起因するオリゴヌクレオチド上での折り畳みによって、ポリカチオンは末端に付着されたフルオロフォア／クエンチャーの対を接近させる。本発明の分子は有用な二重標識プローブであり、クエンチング特性が改善されている。
【０１１１】
図７ｂは本発明によるプローブおよびその標準的対応物の５’ヌクレアーゼアッセイにおける比較性能を示す。接合プローブはより高いシグナル対雑音比を示し、検出がより早く（２．５サイクル）、終点蛍光がより大きくなる。
【０１１２】
したがって、本発明によるプローブは、それらの標的を検出するためにより高い感度を示す。次いで、短い接合プローブ（１７−ｍｅｒ、F-N17）を長い標準的なプローブ（２２−ｍｅｒ、F-N22）と比較した。図７ｃに示されるように、本発明の短いプローブ（F-N17S4）は、長い標準的なプローブ（F-N22）が検出するのと同じ効率および感度で野生型アンプリコンを検出する。実際、サイクル閾値および最終蛍光値は同程度である。同じ条件下では、短い標準的なプローブ（F-N17）の性能は劣る（図７ｄ）。
【０１１３】
図７ｄは対立遺伝子識別の問題に対処する。第Ｖ因子Leiden ＤＮＡをテンプレートとして含む試料では、突然変異したアンプリコンが標準的な長い野生型プローブにより依然として検出されるが、接合されたプローブおよび標準的な短いプローブについてはシグナルが観察されない。
【０１１４】
このように、本発明による短いプローブは従来の標準的なより長いプローブと同等の能力を示す。さらに、それらは、より大きい識別能力を有する。
【０１１５】
（実施例５：リアルタイムＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの蛍光ハイブリダイゼーションプローブとしての使用）
本発明の分子は、リアルタイムＰＣＲにおいて隣接する蛍光プローブとしてのそれらの使用について評価された（Bernard et al., 1998）。その検出態様は、アンプリコン上で一方から他方へ隣接する２つのプローブのハイブリダイゼーションに依存する。一方のプローブは３’ドナー標識を有し、他方のプローブは５’アクセプター標識を有する。両方のプローブが特定のアンプリコンと結合されると、励起させられた３’ドナー標識はＦＲＥＴ機構によってそのエネルギーをアクセプター標識に移動させ、次に蛍光を放出する。ドナーが放出する蛍光の増大はＰＣＲ産物の増大に比例する。
【０１１６】
２つの隣接するプローブは、ｑＰＣＲのアニーリング工程の間に、先述のヒトパピローマウイルスのタイプ１６（HPV16）E7アンプリコンと結合するように設計された。ドナープローブは、３’末端において６−ＦＡＭにより標識され、アクセプタープローブは、５’末端においてＲＯＸ色素（カルボキシ−ｘ−ローダミン）により標識された。
【０１１７】
標準的なドナープローブを本発明の分子と比較した。
【０１１８】
ドナープローブは構造VIIの一例である。
【０１１９】
１０ｎｇのコントロールゲノムＤＮＡ（A549細胞からの）にスパイクされた標的ゲノムＤＮＡ（SiHa細胞からの）の３００コピー（ａ）または連続的希釈液（３０００〜３０コピー）（ｂ）が、Rotor-gene 6000装置（Corbett）において、最終容積１０μｌで増幅させられた。最終反応混合物は、２．５μｌのSensimix NoRef ＰＣＲキット（Quantace）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭのフォワードプライマー、３００ｎＭのリバースプライマー、２００ｎＭのプローブE7-ROXプローブ（Eurogentec）を含有していた。プローブE7-N25F、E7-S4N25FおよびE7-S4N20Fは２００ｎＭ（ａ）および５０ｎＭ（ｂ）であった。
【０１２０】
反応物を９５℃で１０分間にわたりインキュベートした後、９５℃で５秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で１０秒間を４５サイクル行った。
【０１２１】
図８ａに示されるように、接合プローブはアンプリコンの効率的な検出を可能にする。
【０１２２】
両方の標識にはスペクトルのオーバーラップがあるため、アンプリコンが存在しない場合には高いバックグラウンドシグナルが観察される。それらの高い親和性に起因して、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは低濃度で効率的な検出を行うことによって、蛍光バックグラウンドレベルを低減させることが予想される。さらに、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートは、効率的な短いプローブの設計を可能にしてミスマッチの識別を改善することが予想される。図８ｂに示されるように、本発明のより短いプローブ（E7-S4N20F）は実際、低い濃度で、標準的なプローブ（E7-N25F）よりも良好な性能を示す。
【０１２３】
本発明の分子はリアルタイムＰＣＲに有用なハイブリダイゼーションプローブである。
【０１２４】
・Ｅ７プライマーの配列
フォワードプライマー配列番号１（E7F）：5'- GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT- 3'
リバースプライマー配列番号２（E7R）：5'- GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA- 3'
・プローブの配列
配列番号１９（E7-ROX）：5'- ROX -TGCGT AC AAAGC AC AC ACGTAGAC AT 3'
配列番号２０（E7N25F）：5' - GCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-6-FAM 3'
配列番号２１（E7N25F）：5' -S4-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-6-FAM 3'
配列番号２２（E7S4N20F）：5' -S4-TGTGACTCTACGCTTCGGTT -6-FAM 3'
Ｓ４＝４個のスペルミン残基
（実施例６：固体支持体上に固定化された標的核酸を検出する蛍光プローブとしてのオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンコンジュゲートの使用）
本発明の分子は、固定化された標的核酸を検出および／または遺伝子型解析するためのハイブリダイゼーションプローブとしてのそれらの使用について評価された。
【０１２５】
図９はドットブロットＤＮＡハイブリダイゼーション実験の結果を示す。標的核酸はpGL2およびpGL3ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega）であった。pGL3ベクターと完全にマッチするように短いプローブ（１４−ｍｅｒ）を設計した。pGL2とハイブリダイズすることによって前記配列はミスマッチを形成する。本発明のプローブをその標準的対応物と比較した。両方のプローブはフルオレセインにより５’で標識された。
【０１２６】
１μｇのpGL2およびpGL3ベクターを８０℃で６０分間にわたりベーキングすることによって正電荷のナイロン膜（Roche）上に固定化し、０．４ＭのＮａＯＨ中で５分間にわたりその膜をインキュベートすることによって変性させた。次いで、2X SSC（Sodium Salt Citrate buffer：クエン酸ナトリウム緩衝液）中で膜を簡単に洗浄し、空気乾燥させた。プレハイブリダイゼーション工程を5X SSC、５Ｘデンハルト液中で５５℃で６０分間にわたって行った。1XSSC中１０ｎＭのプローブと共に膜を５５℃で１２０分間にわたりインキュベートした。1X SSC中５５℃で５分間、３回洗浄後、Typhoon画像化システム（Amersham Bioscience）を用いて膜をスキャンした。
【０１２７】
図９に示されるように、本発明のプローブはストリンジェントな条件（５５℃および低塩）下で標的核酸の検出を可能にするが、標準的なプローブは検出することができない。ミスマッチ標的ではシグナルが検出されないことから、本発明のプローブに高い特異性があることがわかる。
【０１２８】
・プローブの配列
配列番号２３（N14）：5'-フルオレセイン-AAG ATG GAA CCG CT-3'
配列番号２５（S4N14）：5'-フルオレセイン-S4-AAG ATG GAA CCG CT-3'
Ｓ４＝４個のスペルミン残基。
【０１２９】
ミスマッチ部位には下線を付している。
【０１３０】
（参照）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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