(57)【要約】肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界中で癌死の第４番目の主要な原因である。分子腫瘍学についての増加した知識に由来する新しい治療戦略が、この病気を治療するために絶えず開発されている。ここでは、我々は、ＨＣＣ細胞と特異的に結合する（ＳＰ９４）を含む新しいペプチドを特定するために、ファージディスプレイを使用した。インビトロでファージクローンＰＣ９４は、ＨＣＣ細胞株と結合する。インビボで、ＰＣ９４は、ヒトＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスで、特異的に腫瘍組織に帰巣したが、正常な内臓器官には帰巣しなかった。帰巣能力は、合成ペプチド、ＳＰ９４によって競合的に阻害されることができた。ＰＣ９４は、腫瘍組織に局在したが、ＳＰ９４競合腫瘍組織または正常な器官では検出できなかった。さらにＰＣ９４は、ＨＣＣ患者からの外科的標本において６１．３％（１９／３１）の陽性率で腫瘍組織を認識したが、非腫瘍組織は認識しなかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号；１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２９から選択される配列を具備するポリヌクレオチド、またはその変異体。
【請求項２】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号；１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、および配列番号：３０から選択される配列を具備するポリペプチド、またはその変異体。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号：２を具備する請求項２に記載のポリペプチド、またはその変異体。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号：２を具備する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドを具備し、第２ポリペプチドに融合した第１ポリペプチドを具備する融合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドが１つ以上の薬剤に共役する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
１つ以上の薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリス
チン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項２に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項９】
請求項２に記載の少なくとも１つのポリペプチドを具備するリポソーム。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号：２、またはその変異体を具備する請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号：２を具備する請求項１０に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記リポソームが、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも１つ以上の薬剤をさらに具備する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記薬剤が、ドキソルビシンである請求項１２に記載のリポソーム。  
【請求項１４】
治療を必要とする哺乳動物に、請求項６に記載のポリペプチドの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療を必要とする哺乳動物に、１つ以上の薬剤と請求項２に記載の１つ以上のポリペプチドを具備するポリペプチドとを具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項１７】
前記リポソームが、配列番号：２を具備するポリペプチド、またはそれの変異体を具備する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記リポソームが、配列番号：２を具備するポリペプチドを具備する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の１つ以上の化学療法薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記の化学療法薬剤が、ドキソルビシンである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記病気が、癌である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が、肝臓癌である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肝臓癌が、肝細胞癌である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項２に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
ｂ）請求項８に記載の抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。  
【請求項２６】
ａ）融合ポリペプチドが、肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項５に記載の融合ポリペプチドと接触させるステップ、および
ｂ）前記融合ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いて、融合ポリペプチドを検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。
【請求項２７】
ａ）ポリペプチドと分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物を請求項２に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
ｂ）前記分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する請求項２に記載のポリペプチドに結合する分子を同定する方法。
【請求項２８】
ストリンジェントな条件下で、請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが標識を具備する請求項２に記載のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌に対するポリペプチドの結合を検出するステップを具備する対象での癌を検出する方法。
【請求項３１】
前記標識が、放射性分子を具備する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、ヒトである請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、２００７年１１月２０日に出願された仮出願番号第６０／９９６，４８８号に対する優先権を主張するものであり、その全ては参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
世界的に、肝細胞癌（ＨＣＣ）は、１０番目に致命的な癌関連の死因である。手術、放射線および化学療法の進歩と併用をもってしても、ＨＣＣの予後は依然としてよくない（非特許文献１）。アメリカ合衆国における肝臓癌である個人についての５年生存率は、従来の積極的な療法にもかかわらず、わずか８．９％であり、この悪性腫瘍は、膵管腺癌（５年で４．４％の生存率）に次ぐ２番目に致命的な癌である（非特許文献２）。２００５年には、肝臓癌の新しい症例が世界中で６６７，０００件を超えたが、そのうちアジアとサハラ以南のアフリカで８０％を占めた（非特許文献３）。分子腫瘍学の分野での非常にすばらしい進展とともに、新しい治療戦略が、この病気を治療する試みにおいて絶えず開発されている。
【０００３】
腫瘍細胞とそれに対応する両性細胞との間に改善された区別をする、癌に対する標的治療学の開発は、現在の抗癌研究の主要な目的のうちの１つである。大部分の化学療法剤は、腫瘍部位に優先的に蓄積しない。実際に、腫瘍に達する用量は、正常な器官に蓄積する用量の５〜１０％とわずかである（非特許文献４）。毒性の副作用は、抗癌剤の用量増加をしばしば制限し、不完全な腫瘍応答、疾患の早期再発、そして最後には薬剤耐性の発症をもたらす。抗癌剤を送達系に封入することや（非特許文献５）、癌細胞で過剰発現もしくは特異的に発現される抗原もしくは受容体に結合するモノクローナル抗体（非特許文献６、非特許文献７）またはペプチドリガンド（非特許文献８、非特許文献９）を介して抗癌剤を標的とするなどの抗癌剤の選択的な毒性を改善するいくつかのアプローチが開発された。
【０００４】
脂質または高分子系の抗癌性ナノ医療などの薬物送達系（ＤＤＳ）が、研究されてきた（非特許文献１０）。ＤＤＳは、通常、リポソームや、ミセル、脂質エマルジョン、および脂質−薬剤複合体などの他の脂質系担体を含む２００ｎｍ以下の直径のナノ粒子および微粒子を意味する；また、高分子−薬剤複合体および免疫複合体などの様々なリガンド標的生成物も含まれる（非特許文献１１）。腫瘍脈管構造の透過亢進は、高分子系の癌療法による標的化の成功を左右する鍵となる要因のうちの１つである（非特許文献１２）。静脈内投与の後、１００〜６００ｎｍの平均孔径を有すると推定される血管新生腫瘍脈管構造の「漏出」（非特許文献１３）は、腫瘍組織での複合体の選択的な血管外漏出を許容する。その上、腫瘍組織は、効果的なリンパドレナージをしばしば欠き、それはその後、高分子保持を促進する。これらの要因の組み合わせは、腫瘍組織での複合体の蓄積に至る−Ｍａｅｄａによって「強化された透過性と保持性（ＥＰＲ）効果」として命名された受動的標的化現象（非特許文献１４）。リポソームによるＥＰＲ媒介受動的腫瘍標的化は、薬剤を含まずに得られるものと比較して、固形腫瘍で薬剤濃度の数倍の増加をもたらすことができる（非特許文献１５）。
【０００５】
ＤＤＳの特有の効力は、それらの関連治療剤の薬物動態と生体内分布を変えるそれらの可能性である（非特許文献５）。様々な治療的分子へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の不活性高分子の結合は、腎臓および細網内皮系（ＲＥＳ）による薬物クリアランスを減少させ得る（非特許文献１６）。リポソームや高分子−薬物複合体などのより大きな粒子の担体については、正常な器官に対するより低い悪影響で低、主に血液コンパートメントを制限する。
【０００６】
非経口投与のために現在承認された大多数のＤＤＳは、リポソーム系または脂質系製剤、および例えば、ペグ化リポソームドキソルビシンなどのＰＥＧに連結された治療的分子を含み、それは、４３％と５９％の全体的な応答率で、エイズに関連するカポジ肉腫などの高血管新生の腫瘍を治療するのに用いられた（非特許文献１７、１８）。しかし、粒子のＤＤＳは、肝臓、脾臓、および骨髄の単核性食細胞系の細胞において薬剤の蓄積増加を引き起こし、これらの組織に対して毒性が増加する可能性がある（非特許文献１９）。さらに、粒子ＤＤＳの増加した循環時間と制限により、好中球減少症、血小板減少症、および白血球減少症などの血液学的な毒性も明らかとなった（非特許文献２０）。腫瘍細胞および腫瘍脈管構造表面抗原または受容体を標的とするリガンドとそれらを結合することにより、ＤＤＳの部位特異的作用を増強する努力がなされ、これは、活性型−またはリガンド−媒介標的化と呼ばれるプロセスである（非特許文献８、２１）。さらに、親和性標的化による腫瘍組織への化学療法剤の送達が研究されている（非特許文献２２、２３）。
【０００７】
モノクローナル抗体は、腫瘍標的化剤として臨床的な可能性を示したが、それらのサイズのために抗体の弱い腫瘍透過性、および非特異的抗体取り込みに起因する肝臓／骨髄毒性は、抗体療法の２つの主要な制約である。ペプチド−標的化剤は、抗体癌治療に関連している問題を緩和し得る（非特許文献２４）。微生物上で提示されたコンビナトリアルライブラリーは、腫瘍特異的標的化リガンドを同定するための可能な戦略である。
【０００８】
ファージディスプレイ技術は、Ｂ細胞エピトープ（非特許文献２５〜２７）を同定するために、腫瘍細胞（非特許文献８、２８、２９）および腫瘍脈管構造特異的ペプチド（非特許文献３０〜３３）を発見するために適用された。ＤＤＳと腫瘍特異性ペプチドとの組み合わせは、ほんの少しの標的化リガンド分子を介して腫瘍細胞に送達される数千の抗癌剤分子にまで至らしめる。腫瘍部位での抗癌剤分子の徐放は、また、治療的な利点を有し得る（非特許文献８、３４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ａ．Ｘ．（２００５）Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３，２８９２−２８９９．
【非特許文献２】Ｆａｒａｚｉ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．  Ａ．  （２００６）Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，６７４−６８７．
【非特許文献３】Ｊｅｍａｌ，Ａ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．，  Ｓａｍｕｅｌｓ，Ａ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｒ．Ｃ，Ｇｈａｆｏｏｒ，Ａ．，Ｆｅｕｅｒ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｈｕｎ，Ｍ．Ｊ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００５．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５５，１０−３０．
【非特許文献４】Ｂｏｓｓｌｅｔ，Ｋ．，Ｓｔｒａｕｂ，Ｒ．，Ｂｌｕｍｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｃｚｅｃｈ，Ｊ．，Ｇｅｒｋｅｎ，Ｍ．，Ｓｐｅｒｋｅｒ，Ｂ．，  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｈ．Ｋ．，Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｏｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｎｎｅｒｅｔ，Ｃ．（１９９８）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８，１１９５−１２０１．
【非特許文献５】Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．（２００４）Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１８１８−１８２２．
【非特許文献６】Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｕｍｂｅｎｇｅｇｗｉ，Ｄ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｒｒｏｉｓ，Ｇ．Ｊ．（２００５）Ａｎｔｉ−ＣＤ  １９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｒａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，３５６７−３５７３．
【非特許文献７】ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，Ｍｕｇｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｃ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｂｕｒｎ，Ａ．Ｌ．，Ｐａｕｌｉｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａａｓｄｙｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ，Ｖ．Ｎ．，Ｐａｔｔｉｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｊａｍｅｓ，Ａ．Ｃ，Ａｌ  Ｂａｋｒｉ，Ｇ，，Ｓｔｒａｗ，Ｒ．Ｃ，Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｂ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ，Ｈ．（２００７）Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ４００  ｎｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，４３１−４４５．
【非特許文献８】Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｔｓｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．（２００４）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，８００２−８００８．
【非特許文献９】Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．Ｂ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｗ．Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｎａｇａｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｑ．（２００５）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｂｙ  ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＧＤ  ｍｉｍｅｔｉｃ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７，２６２−２７５．
【非特許文献１０】Ｖａｓｅｙ，Ｐ．Ａ．，Ｋａｙｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．，Ｔｗｅｌｖｅｓ，Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．，  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ｈ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｌ．Ｓ．，Ｈｉｌｄｉｔｃｈ，Ｔ．  Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，Ｂｕｒｔｌｅｓ，Ｓ．，Ｆｒａｉｅｒ，Ｄ．，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｃａｓｓｉｄｙ，Ｊ．（１９９９）Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＫｌ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ］：ｆｉｒｓｔ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ−ｄｒｕｇ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５，  ８３−９４．
【非特許文献１１】Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．（２００３）Ｔｈｅ  ｄａｗｎｉｎｇ  ｅｒａ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２，３４７−３６０．
【非特許文献１２】Ｓａｔｃｈｉ−Ｆａｉｎａｒｏ，Ｒ．，Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．，  Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｏｒｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｎａｇｙ，Ｊ．Ａ．，Ｆｅｎｇ，Ｄ．，  Ｄｖｏｒａｋ，Ａ．Ｍ．，Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，Ｐｕｄｅｒ，Ｍ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（２００５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｓｓｅｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ＴＮＰ−４７０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，  ｃａｐｌｏｓｔａｔｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７，２５１−２６１．
【非特許文献１３】Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｈ．，Ｂａｌｕｋ，Ｐ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｓ．，Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．  （２０００）Ｏｐｅｎｉｎｇｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｌｅａｋｉｎｅｓｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５６，１３６３−１３８０．
【非特許文献１４】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍａｅｄａ，Ｈ．（１９８６）Ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｔｒｏｐｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ  ｓｍａｎｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６，６３８７−６３９２．
【非特許文献１５】Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，  Ｗｏｒｋｉｎｇ，Ｐ．，Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇ，Ｐ．Ａ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．，Ａｍａｎｔｅａ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，Ｌ．Ｄ．（１９９６）Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６，５５−６３．
【非特許文献１６】Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｔ．  Ｍ．，Ｇａｂｉｚｏｎ，Ａ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｅ．，Ｍａｔｔｈａｙ，Ｋ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｗｏｏｄｌｅ，Ｍ．Ｃ，Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．，Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ｃ，  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  ８８，１１４６０−１１４６４．
【非特許文献１７】Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｅｚｕｂｅ，Ｂ．Ｊ．，  Ｔｈｏｍｍｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｆｉｓｃｈｌ，Ｍ．Ａ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ−Ｋｉｅｎ，Ａ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｄｕ  Ｍｏｎｄ，Ｃ，Ｍａｍｅｌｏｋ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ，Ｄ．Ｈ．（１９９８）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ−ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６，２４４５−２４５１．
【非特許文献１８】Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．，Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ，Ｈ．，  Ｇｏｅｂｅｌ，Ｆ．Ｄ．，Ａｒａｓｔｅｈ，Ｋ．，Ｓｐｉｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｒｉｏｓ，Ａ．，Ａｂｏｕｌａｆｉａ，Ｄ．，Ｇａｌｌｅｓｈａｗ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｅｚｕｂｅ，Ｂ．Ｊ．（１９９８）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６，６８３−６９１．
【非特許文献１９】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｔａｇｈｉ，Ｓ．，Ｕｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｇｌａｓｓ，Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｍ．，  Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｂｙ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，２４３−２５４．
【非特許文献２０】Ａｌ−Ｂａｔｒａｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．，  ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ，Ｇ．，Ａｔｍａｃａ，Ａ．，Ｋｌｅｅｂｅｒｇ，  Ｕ．，Ｍｅｕｔｈｅｎ，Ｌ，Ｍｏｒａｃｋ，Ｇ．，Ｌｅｒｂｓ，Ｗ．，Ｈｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｓｅｈｏｕｌｉ，Ｊ．，Ｋｎｕｔｈ，Ａ．，ａｎｄ  Ｊａｇｅｒ，Ｅ．  （２００６）Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｈｒａｃｙｃ  ｌｉｎｅｓ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４，１６１５−１６２０．
【非特許文献２１】Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｃ．Ｔ．（２００６）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ＭｏＩ  ２，５７−６６．
【非特許文献２２】Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．（１９８７）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７，３０３９−３０５１．
【非特許文献２３】Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｃ．Ｇ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｙ．，ｄｉ  Ｔｏｍａｓｏ，Ｅ．，Ｄｕｄａ，Ｄ．Ｇ．，Ｍｕｎｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｔｏｎｇ，Ｒ．Ｔ．，  Ｃｈｕｎｇ，Ｄ．Ｃ，Ｓａｈａｎｉ，Ｄ．Ｖ．，Ｋａｌｖａ，Ｓ．Ｐ．，Ｋｏｚｉｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｍｉｎｏ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．  Ｔ．，Ｈａｒｔｆｏｒｄ，Ａ．Ｃ，Ｆｉｓｃｈｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，  Ｊ．Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｚｈｕ，Ａ．Ｘ．，Ｂｌａｓｚｋｏｗｓｋｙ，Ｌ．  Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｘ．，Ｓｈｅｌｌｉｔｏ，Ｐ．Ｃ，Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｇ．  Ｙ．，ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．（２００４）Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｈａｓ  ａｎｔｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１４５−１４７．
【非特許文献２４】Ｍｏｒｉ，Ｔ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，２３３５−２３４３．
【非特許文献２５】Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｎ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，  Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｆ．，Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｃ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．（２００７）  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，４０４−４１１．
【非特許文献２６】Ｌｉｕ，Ｉ．Ｊ．，Ｈｓｕｅｈ，Ｐ．Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，  Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｋａｏ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｉａｏ，Ｍ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．  Ｃ．（２００４）Ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９０，７９７−８０９．
【非特許文献２７】Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｙ．，  Ｃｈａｏ，Ｔ．Ｔ．，Ｌａｉ，Ｓ．Ｃ，Ｊａｎ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｈａｉｏ，Ｍ．Ｆ．（２００３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２（ＤＥＮ−２）ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＥＮ−２−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４，２７７１−２７７９．
【非特許文献２８】Ｓｈａｄｉｄｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．（２００３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７，２５６−２５８．
【非特許文献２９】Ｚｉｔｚｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｉｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈａｄ，Ａ．，Ｋｉｎｓｃｈｅｒｆ，Ｒ．，Ａｓｋｏｘｙｌａｋｉｓ，Ｖ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｓ．，  Ａｌｔｍａｎｎ，Ａ．，Ｅｉｓｅｎｈｕｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，  Ｕ．（２００５）Ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＤＵＰ−Ｉ）ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，１３９−１４６．
【非特許文献３０】Ａｒａｐ，Ｗ．，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，３７７−３８０．
【非特許文献３１】Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｇｉｒａｕｄｏ，Ｅ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｈｉｏｕｅ，Ｍ．，Ｐｏｒｋｋａ，Ｋ．，Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（２００３）Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３８３−３９１．
【非特許文献３２】Ｊｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（２００３）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３９３−４０３．
【非特許文献３３】Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｋｕｏ，Ｓ．Ｙ．，  Ｋ．，  Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．（２００７）Ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１０９５８−１０９６５．
【非特許文献３４】Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，Ｆ．，Ｂｒｉｇｎｏｌｅ，Ｃ，Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ，Ｄ．，Ｎｉｃｏ，Ｂ．，Ｐｅｚｚｏｌｏ，Ａ．，Ｍａｒｉｍｐｉｅｔｒｉ，Ｄ．，Ｐａｇｎａｎ，Ｇ．，Ｐｉｃｃａｒｄｉ，Ｆ．，Ｃｉｌｌｉ，Ｍ．，Ｌｏｎｇｈｉ，Ｒ．，Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．，Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，Ａｌｌｅｎ，Ｔ．  Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｏｎｚｏｎｉ，Ｍ．（２００６）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｂｏｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，１００７３−１００８２．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、特に以下のものを単独で、あるいは組み合わせて具備する：
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号；１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２９から選択される配列を具備する。
【００１１】
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号；１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、および配列番号：３０から選択される配列を具備する。１つの実施形態では、前記ポリペプチドは、ＳＰ９４（配列番号：２）、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、ＳＰ９４（配列番号：２）を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、隣接するアミノ酸ＰＩＬＰを具備する。
【００１２】
本開示は、第２ポリペプチドに融合した第１ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、前記第１ポリペプチドが肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第２ペプチドを具備する。１つの実施形態では、前記第２ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的な１つ以上のポリペプチドを具備する（例えば、前記ポリペプチドは、ホモ２量体、ヘテロ２量体、または他の多量体である）。別の実施形態では、前記第２ポリペプチドは、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）領域を具備する。別の実施形態では、前記第２ポリペプチドは、ＧＦＰを具備する。別の実施形態では、前記第２ポリペプチドは、免疫学的タグを具備する。別の実施形態では、前記第２ポリペプチドは、抗体ドメインを具備する。別の実施形態では、前記抗体ドメインは、抗体のＦｃ領域である。
【００１３】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドまたはその変異体は、１つ以上の薬剤と共役化されている。１つの実施形態では、前記薬剤は、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される。
【００１４】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と結合する抗体を提供する。
【００１５】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームを提供する。１つの実施形態では、前記リポソームは、ＳＰ９４（配列番号：２）またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ＳＰ９４（配列番号：２）を具備する。別の実施形態では、本開示のリポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。
【００１６】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体の治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供し、前記ポリペプチドまたはその変異体が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子から選択される１つ以上の薬剤と共役化されている。１つの実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトである。
【００１７】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、１つ以上の薬剤と肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、前記リポソームは、配列番号：２を具備するポリペプチド、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号：２を具備するポリペプチドを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含む１つ以上の薬剤を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号：２、またはその変異体、およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号：２およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記病気は癌である。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【００１８】
本開示は、
ａ）ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
ｂ）前記ポリペプチドに結合する抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体での肝臓癌を検出する方法を提供する。１つの実施形態では、ポリペプチドまたはその変異体は、肝細胞癌に特異的なポリペプチドと、エピトープを具備する別の配列とを具備する融合ポリペプチドを具備する。前記融合ポリペプチドの肝細胞癌細胞への結合は、エピトープに結合する抗体を用いて検出され得る。
【００１９】
本開示は、
ａ）ポリペプチドまたはその変異体と分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物をポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
ｂ）細胞分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたは変異体に結合する細胞分子を同定する方法を提供する。
【００２０】
本開示は、変異体のポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号；１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２９から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。１つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２１】
本開示は、変異体のポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号；１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２９から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。１つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２２】
本開示は、ポリペプチドが標識を具備する本開示のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌へのポリペプチドの結合を検出するステップを具備する、対象での癌の検出方法を提供する。１つの実施形態では、前記標識は、放射性分子を具備する。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記対象は哺乳動物である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
特許または出願ファイルは、カラー仕上げされた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数を含む）を有する特許または特許出願刊行物のコピーは、要請と必要な料金の支払いにより特許庁から提供されるであろう。
【図１】図１は、インビトロでのファージディスプレイを用いたＨＣＣ細胞特異的ファージの単離を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｄは、ＨＣＣ細胞株とヒトＨＣＣ生検標本へのＰＣ９４の結合活性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｄは、ＨＣＣ細胞株とヒトＨＣＣ生検標本へのＰＣ９４の結合活性を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｄは、ＨＣＣ細胞株とヒトＨＣＣ生検標本へのＰＣ９４の結合活性を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、ＨＣＣ細胞株とヒトＨＣＣ生検標本へのＰＣ９４の結合活性を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、インビボでのＰＣ９４の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【図４】図４は、標的化ペプチドＳＰ９４の共役は、治療効力を高め、ＨＣＣ異種移植片モデルでのリポソームドキソルビシンの血液学的な毒性を減少させることを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置ＨＣＣ異種移植片の組織病理学的検査を示す。
【図６Ａ】図６は、大きなＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスのＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す。
【図６Ｂ】図６は、大きなＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスのＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す。
【図６Ｃ】図６は、大きなＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスのＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す。
【図６Ｄ】図６は、大きなＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスのＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す。
【図６Ｅ】図６は、大きなＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスのＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す。
【図７】図７は、ＦＡＣＳによる選択されたファージクローンの結合活性の用量依存性分析。
【図８】図８は、インビボでのＰＣ８８および９４の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
表１は、Ｍａｈｌａｖｕ細胞から選択されたファージ由来のファージディスプレイされたポリペプチド配列を提供する。
【００２５】
表２は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
ＨＣＣは５番目に一般的な癌であり、世界中の癌死亡の４番目の主な原因として格付けされる（１）。唯一の治療的処置は、外科的切除または肝臓移植であり、ほんの少しの患者だけがこれらの処置に適している（３６）。進行した段階で現れる大多数のＨＣＣｓは、治療処置が及ばない。進行したＨＣＣｓに対する単剤療法または併用療法としての全身的化学療法は、過去３０年間、広範囲に研究されてきており、無効であることが広く認められている（３６）。全身治療における効果を改善すること、および恩恵を受けるそうした患者を選択することは、依然として大きな挑戦である。我々は、ファージディスプレイ・スクリーニングを介して特定される新しい標的化ペプチド、つまり肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチド、および前記ペプチドを用いたＨＣＣに対する標的薬物送達の開発を報告する。
【００２７】
最初に、我々は、インビトロおよびインビボの両方でＨＣＣ細胞と特異的に結合することができる新規ペプチドを特定するためにファージディスプレイされたペプチドライブラリーを使用した。そのようなペプチドの１つは、ＳＰ９４である。さらに、ＳＰ９４をコードするファージＰＣ９４は、腫瘍組織表面を認識するが、ＨＣＣ患者からの外科的標本での正常な対応する部位は認識しない。標的化ペプチドＳＰ９４およびドキソルビシンを含むリポソームは、ＨＣＣ異種移植片モデルで治療有効性を改善した。このように、ＳＰ９４ペプチドは、進行したＨＣＣｓの全身的な処置を改善することができる。
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される用語は、以下に説明されるように、それらにおける通常の意味を有し、明細書の文脈でさらに理解することができる。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体または誘導体を具備することができる。本明細書で示されるヌクレオチド配列は、５’から３’方向へ記載される。
【００３０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。
【００３１】
「変異体」という用語は、本開示のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列における挿入、付加、欠失、または置換を含み、前記変異体は、肝細胞癌細胞に特異的である。
【００３２】
「実質的に同一な」、「実質的に類似の」という語句は、関連したアミノ酸またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して、同一であるか、あるいは、実質的でない違い（保存されたアミノ酸置換により）を有することを意味する。
【００３３】
ポリペプチドに関して、少なくとも１０、２０、３０、５０、１００、またはそれを超えるアミノ酸が、もとのポリペプチドと実質的に同じである変異体ポリペプチドとの間で比較される。核酸については、少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、３００、またはそれを超えるヌクレオチドが、もとの核酸と実質的に同じである変異体核酸との間で比較される。従って、変異体は、領域または複数の領域で実質的に同一であることができ、「実質的に同一」の定義を依然として満たしながら、他の領域で異なることができる。２つの配列間のパーセント同一性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムにより決定される。
【００３４】
「リポソーム」という用語は、内部の水性スペースを囲む外側の脂質の２層または多層の膜を具備する組成物を意味する。前記用語は、一般に約１〜約１０μｍの範囲の直径を有し、水相である層と交互に２〜数百の同心である範囲で脂質２重層を具備する多層状のリポソームを含む。この用語は、単一の脂質層から構成され、約２０〜約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０〜約３００ｎｍ、約３００〜約４００ｎｍ、または約１００〜約２００ｎｍの範囲の直径を一般に有する単層小胞を含む。前記用語は、また、約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有するリポソームを含む。
【００３５】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片を意味し、抗原結合断片または抗原結合ドメインを具備するどのようなポリペプチドも包含する。前記用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体，およびインビトロ生成抗体を含むが、これらに限定されない。「完全な」という言葉が先行しない限り、「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片などの抗体断片を含む。一般的に、そのような断片は、抗原結合ドメインを具備するであろう。
【００３６】
「抗原結合ドメイン」および「抗原結合断片」という用語は、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を具備する抗体分子の一部を意味する。抗体によって特異的に認識されて、結合する抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれ、これは、ポリペプチドのアミノ酸残基の連続した配列であっても、なくてもよく、他の化学構造を有する糖類および／または分子を具備し得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を具備し得る；しかし、それは両方を具備する必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、完全な抗原結合ドメインのいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例は、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨＩドメインを有する１価の断片であるＦａｂ断片；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つの断片を有する２価の断片であるＦ（ａｂ’）２；（３）２つのＶＨおよびＣＨＩドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦＶ断片；（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは、別々の遺伝子でコード化されるが、それらは、組み換え法を使用して、それらをＶＬとＶＨ領域が１対となり１価の分子を形成する（単一鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）として知られる）単一のタンパク鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーで結合することができる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、断片は、完全な抗体の場合と同様に有用性についてスクリーニングされる。  
【００３７】
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ポリヌクレオチドの文脈において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼ−ションを意味する。ＤＮＡ／ＤＮＡとＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリダイゼ−ション反応のストリンジェンシーを増やす条件は、広く知られており、当技術分野で公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼ−ション条件の例は、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼ−ション、または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼ−ション、次いで、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄を含む。
【００３８】
ペプチドが肝細胞癌細胞と結合または相互作用するが、他の細胞と特異的に結合または相互作用しないとき、ペプチドは、肝細胞癌細胞に対して「特異的」である。
【００３９】
「リガンド」という用語は、受容体を含む別の分子と結合する分子を意味する。  
【００４０】
「宿主細胞」は、任意の組み換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであることができるか、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異または意図的突然変異および／または変化によりもとの親細胞と必ずしも完全に同一（形態学で、または全ＤＮＡ相補体で）であるというわけではない。宿主細胞は、インビトロまたはインビボで、本開示の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドによりトランスフェクションされたか、または感染させられた細胞を含む。本開示の組み換えベクターを具備する宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」と呼ばれる場合がある。
【００４１】
「標本」は、患者に由来する任意の生物学的検体である。前記用語は、生物学的起源の細胞や組織だけでなく、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液，精液、および他の液体サンプルなどの生物学的液体を含むが、これに限定されるものではない。前記用語は、また、細胞またはそれから誘導される細胞とその子孫を含み、それは培養細胞、細胞上澄み液、および細胞溶解物も含む。それは器官または組織培養由来の液体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、検便サンプル、および生理的組織から抽出された液体のみならず、同様に固体組織から分散した細胞、組織切片、および細胞溶解物をさらに含む。この定義は、それらの調達の後で試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドやポリペプチドなどの特定の成分に対する富化などの任意の方法で操作されたサンプルを包含する。この定義は、また、患者のサンプルの派生物および断片もこの用語に含まれる。患者のサンプルは、診断検査、予後検査、または他のモニタリング検査において使うことが可能である。この用語は、また、ヒト以外の哺乳動物からの生物学的検体にもあてはまる。標本は、ヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物由来であることができる。
【００４２】
「治療」は、本明細書で使用されるように、ヒトを含む哺乳動物の病気に対する医薬の任意の投与または適用を含み、例えば、後退させる、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復または修復すること、あるいは能率が悪いプロセスを刺激することによって病気を阻害すること、その進展を抑制すること、または病気を軽減することを含む。前記用語は、ヒトを含む哺乳動物で病的状態または障害のいかなる治療にも及び、望ましい薬理的効果および／または生理的効果を得ることを含む。その効果は、障害またはその徴候を完全に、または部分的に防止する観点から予防する場合があり、病気および／または障害に起因する副作用の部分的または完全な治療に関して治療的である場合がある。従って、本開示は、治療と予防の両方を提供する。それは、（１）障害を患うかもしれないが、まだその徴候が無い対象でその障害の発生または再発を防止すること、（２）その進行を抑えることなどの障害を抑制すること、（３）例えば、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復もしくは修復すること、または能率が悪いプロセスを刺激することによって障害またはその徴候の後退をもたらすことにより、宿主が障害またはその徴候にもはや苦しまないようにするために、障害またはそれに関連した少なくとも徴候を阻止するか終わらせること、または（４）障害またはそれに関連した徴候を緩和すること、軽減すること、または改善すること（ここで、改善することは、広義には、炎症、疼痛および／または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの減少について言及するのに使用される）を含む。
【００４３】
「医薬的に許容される担体」は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材、製剤助剤、または任意の従来タイプの賦形剤を意味する。医薬的に許容される担体は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と相容性である。
【００４４】
本明細書での「組成物」は、当技術分野で慣行の医薬的に許容される担体または賦形剤などの担体を通常含む混合物であり、それは、治療目的、診断目的または予防目的のために対象に投与するのに適している。それは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞または培地に存在する細胞培養物を含み得る。例えば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、口腔内洗浄剤、または散剤を形成することができる。
【００４５】
「病気」は、医学的介入が必要である、または医学的介入が望ましい任意の状態、感染、障害、または徴候をも意味する。そのような医学的介入は治療、診断、および／または、防止を含むことができる。
【００４６】
「癌」は、悪性であるか、前悪性であるか、または非悪性であるかにかかわらず、任意の異常な細胞または組織の増殖、例えば、腫瘍を意味する。それは、周囲組織に侵入するかもしれないし、しないかもしれないため、新しい身体部位に転移するかもしれないし、しないかもしれない細胞の制御されない増殖によって特徴づけられる。癌は、癌腫を包含し、それは上皮細胞癌であり、癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌はまた、肉腫を包含し、それは間葉起源の腫瘍であり、肉腫は、骨原性肉種、白血病、およびリンパ腫を含む。癌は、１つ以上の新生細胞型を含み得る。癌という用語は、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【００４７】
ＩＩ．肝細胞癌細胞に特異的な本開示のポリペプチド
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号；１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２９から選択される配列を具備する。
【００４８】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号；１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、および配列番号：３０から選択される配列を具備する。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＰ９４（配列番号：２）、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＰ９４（配列番号：２）を具備する。
【００４９】
Ａ．変異体
変異体は、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、ここで、構造が実質的に類似であるか、または実質的に同じである変異体を含む。ペプチド配列の変異体は、対象ペプチドと比較して、挿入、付加、欠失、または置換を含み得る。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【００５０】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において同一であるものを含む。
【００５１】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において類似しているものを含む。
【００５２】
本開示のポリペプチドの変異体は、表１の配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を有する変異体を含む。１つの実施形態では、変異体は、表１で提供される配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失、または置換は、その配列に対して表１に太字で示されたアミノ酸を変更しない。別の実施形態では、変異体は、表１に太字で示された単一配列からのアミノ酸を具備する。
【００５３】
本開示のポリヌクレオチドの変異体は、表２で提供される配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の挿入、付加、欠失、または置換を含む。１つの実施形態では、変異体は、表２で提供される配列と比較して、挿入、付加、欠失または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失または置換は、その配列に対して表１に太字で示されたアミノ酸をコードするヌクレオチドを変更しない。別の実施形態では、変異体は、表１に太字で示された単一配列からのアミノ酸をコードするヌクレオチドを具備する。
【００５４】
ペプチド変異体は、コード化された、またはコード化されないアミノ酸、化学的にまたは生化学的に改変された、誘導体化された、または設計されたアミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣体、およびデプシペプチド、ならびに改変された、環状の、２環式の、デプシ環状の、またはデプシ２環式のペプチド骨格を含み得る。変異体は、多量体と同様に、単鎖タンパク質を含む。
【００５５】
本開示のペプチドの変異体は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。変異体は、特別な性質を伝えるために、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−とＬ−アミノ酸の組み合わせ、および様々な「設計」または「合成」のアミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を具備することができる。さらに、変異体は環状であることができる。変異体は、特定の構造モチーフを導入するために、非古典的なアミノ酸を含むことができる。任意の既知の非古典的なアミノ酸を使用することができる。アミノ酸類似体およびペプチド模倣体は、特定の２次構造を誘導または支持するためにペプチドに組み込まれることができ、それらは、ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導ジペプチド類似体、β−シート誘導類似体、β−ターン誘導類似体、α−ヘリックス誘導類似体、γ−ターン誘導類似体、ＧＩｙ−Ａｌａ回転類似体、アミド結合等電子体、またはテトラゾールなどを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
末端アミノまたはカルボキシル基が存在しないように、デスアミノ残基またはデカルボキシ残基を変異体の末端に組み入れて、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、あるいは立体構造を制約することができる。Ｃ端の官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびその低級エステル誘導体、ならびにその医薬的に許容される塩などが挙げられる。
【００５７】
さらに、望まれる場合は、非古典的なアミノ酸または化学的なアミノ酸類似体は、ポリペプチド配列に置換または付加として導入することができる。非古典的なアミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２、４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアミン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、設計アミノ酸、例えば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、およびＮａ−メチルアミノ酸など、ならびに一般的にアミノ酸類似体を含むことができるが、これに限定されない。さらにまた、アミノ酸は、Ｄ型（右旋性の）またはＬ型（左旋性の）であることができる。
【００５８】
変異体は，本開示のペプチドに実質的に類似しているポリヌクレオチド配列を含む。そのような変異体は、本開示のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイする核酸によってコード化され得る。
【００５９】
Ｂ．融合タンパク質
本開示は、第２ポリペプチドに融合した第１ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、ここで、前記第１ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第２ポリペプチドを具備する。前記第２ポリペプチドは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、相同性および非相同性のリーダー配列を有する生物発光性タンパク質などの異種アミノ酸配列、例えば、ルシフェリン、またはイクオリン（緑色蛍光タンパク質）から選択されるが、これに限定されない。前記融合タンパク質は、Ｎ−末端メチオニン残基、ペグ化タンパク質、および免疫学的にタグ化されたタンパク質、またはＨＩＳ−タグ化タンパク質を具備し得る。そのような融合タンパク質は、また、エピトープへの融合を含む。そのような融合タンパク質は、本開示のペプチドの多量体、例えば、ホモダイマーまたはホモ多量体、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロ多量体を具備することができる。
【００６０】
本開示のペプチドは、限定されるものではないが、ＦＩＴＣ、ビオチン、ならびに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍおよび２４４Ｃｍなど（ただしこれらに限定されない）の放射性同位体などの標識、検出可能な生成物（例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）を有する酵素、蛍光剤および蛍光標識、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕまたはランタン系列の別の元素、電気化学発光化合物、化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩、特異的結合分子、例えば、磁性粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアなどと共役され得る。本開示のペプチドは、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（それの水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、ドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、（Ｄｅ  Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００１）に記載された他のものなどの治療薬と共役し得る。また、ペプチドは、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子、または（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）に記載された抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物と共役し得る。
【００６１】
ＩＩＩ．肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドを作製する方法
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて製造することができる。細胞系の方法および無細胞系の方法は、本開示のペプチドの生成に好適である。細胞系の方法は、一般に、核酸を宿主細胞にインビトロで導入すること、および発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、次いでペプチドを培地からもしくは例えば、宿主細胞を破砕することによって宿主細胞から、または両方からペプチドを採取することを含む。好適な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
【００６２】
また、本開示は、当技術分野で周知の無細胞インビトロ転写／翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【００６３】
通常、異種ペプチドは、改変または未改変であろうと、上述したように、それ自体で、または融合タンパク質として発現されることができ、分泌シグナルだけでなく、分泌リーダー配列も含み得る。本開示の分泌リーダー配列は、ある種のタンパク質を小胞体（ＥＲ）に誘導することができる。ＥＲは、膜結合タンパク質を別のタンパク質から分離する。タンパク質は、ＥＲに置かれると、分泌小胞を含めた小胞、原形質膜、リソソームおよび別の細胞小器官への分布のためにさらにゴルジ装置に誘導されることができる。  
【００６４】
さらに、ペプチド部分および／または精製タグをペプチドに付加することが可能である。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去し得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こし、安定性を改善し、および精製を容易化するために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当技術分野ではよく知られたルーチン技術である。好適な精製タグとしては、例えば、Ｖ５、ポリヒスチジン、アビジン、およびビオチンが挙げられる。ビオチンなどの化合物とペプチドの共役は、当技術分野で周知の技術を用いて実施することができる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｄ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて、放射性同位体、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド状金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンと共役することもできる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｄ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｆａｎｏ  ｅｔａｌ．（２００６）。毒素は、免疫毒素を含む。Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．７：１３０１−１１（２００６）。
【００６５】
本開示での使用に好適な融合パートナーとしては、例えば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、および／またはその断片の１個以上が挙げられる。ポリエチレングリコール複合体などの複合タンパク質も提供される。  
【００６６】
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することもできる（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５  １１１（１９８４）、Ｇｒａｎｔ  ｅｄ．（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄＣｏ．；米国特許第６，９７４，８８４号）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置を用いて、または当技術分野で公知の固相方法を使用して合成することができる。
【００６７】
本開示のポリペプチドは、化学合成および組換え細胞培養物から標準方法によって回収および精製することができる。標準方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用する。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性するときには、周知のタンパク質再折りたたみ技術によって、活性な立体構造を再生するために使用され得る。
【００６８】
本開示のペプチドまたはペプチド模倣体は、種々の親水性ポリマーの１種類以上を用いて改変して、または種々の親水性ポリマーの１種類以上と共有結合させて、ペプチドの溶解性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドとのカップリングに好適な非タンパク質親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、そのような親水性ポリマーは、約５００〜約１００，０００ダルトン、約２，０００〜約４０，０００ダルトン、または約５，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。ペプチドは、Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６：１５０−１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：６２−６９；米国特許第４，６４０，８３５号；同４，４９６，６８９号；同４，３０１，１４４号；同４，６７０，４１７号；同４，７９１，１９２号；同４，１７９，３３７号、またはＷＯ９５／３４３２６号に記載の方法のいずれかにより、そのようなポリマーを用いて誘導体化すること、またはそのようなポリマーに結合させることができる。  
【００６９】
ＩＶ．抗体の生成
本開示の単離したタンパク質は、一般に、当技術分野で公知の抗体産生の方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの抗体を生成するために使用することが可能である。従って、本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドに対する抗体も含む。抗体は、活性を妨げる抗体と活性を妨げない抗体の両方を含む。
【００７０】
抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））で作ることができる。様々な抗体生産技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照されたい。
【００７１】
本開示の抗体は、以下に記載される病気の治療に使用し得る。また、抗体は、説明されたアッセイおよび検出方法でも使用できる。
【００７２】
Ｖ．リポソーム調製
リポソームを調製するための様々な方法が、当技術分野で公知であり、それらのいくつかは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３３，３３７−４６２（１９８８）中にＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚにより記述されている。小さな単層小胞（ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）は、先に説明されたように（Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、薄膜水和と繰返し押出しの標準方法の組み合わせにより調製できる。リポソームによるＤＮＡの封入を特に伴う調製法、およびリポソーム媒介移入への直接適用を有する方法は、Ｈｕｇ  ａｎｄ  Ｓｌｅｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）によって記述されている。また、リポソームを作る方法は、米国特許第６，３５５，２６７号および米国特許第６，６６３，８８５号に開示されている。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を具備する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、希望の直径を有するリポソームをもたらすために、確定した孔径のフィルタを通して押出される。
【００７３】
また、リポソームは、Ｔａｉｗａｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（台湾台北）などの供給元から商業的に入手可能である。さらに商業的に入手可能なリポソームとしては、ＴＬＣ−Ｄ９９、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｄｏｘｉｌ、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、ＡＢＥＬＣＥＴ、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎが挙げられる。
【００７４】
本開示のリポソームは、リン脂質から最も頻繁に調製されるが、疎水性部分および親水性部分を有する、類似した分子形状および寸法の他の分子を使用することができる。本開示の目的のために、そのようなすべての好適なリポソーム形成分子は、本明細書では脂質を意味する。１つ以上の天然および／または合成の脂質化合物が、リポソームの調製に使用され得る。
【００７５】
リポソームは、親水性基の選択によって、陰イオン性、陽イオン性または中性であり得る。例えば、ホスファート基またはスルファート基を有する化合物が使用される場合、得られるリポソームは、陰イオン性になる。アミノを含む脂質が使用される場合、リポソームは、陽電荷を有し、陽イオン性リポソームとなる。
【００７６】
本開示で有用な初期リポソームを形成するための代表的で好適なリン脂質または脂質化合物は、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイル−ホスファチジルグリセロールなどの脂質関連材料を含む。さらなる非リン酸含有脂質は、限定されるものではないが、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、パルミチン酸アセチル、リシノレイン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールスクシネートなどを含む。
【００７７】
本開示で使用するためのリポソーム製剤は、陽イオン性（正に帯電）製剤、アニオン性（負に帯電）製剤、および中性製剤を含む。
【００７８】
リポソームへの化合物の遠隔負荷は、膜貫通勾配の形成を利用する（Ｃｅｈ  ａｎｄ  Ｌａｓｉｃ，１９９５）。この方法は、リポソームに負荷すべき化合物  とボロン酸化合物を、懸濁されたリポソームとインキュベーションし、その結果、化合物のリポソーム内への蓄積を達成することを含む（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｃｅｈ  Ｂ．ａｎｄ  Ｌａｓｉｃ  Ｄ．Ｄ．、１９９５；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；米国特許第６，０５１，２５１号）。
【００７９】
リポソーム濃度を決定するためにリン酸アッセイを使用できる。１つのリン酸アッセイは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン染料との相互作用に基づく。主な原理は、酸性条件下で還元されると青色の複合体に変換される無色の未還元のリンモリブデン酸塩複合体を形成するために。無機のリン酸塩をモリブデン酸塩と反応させることを含む。リンモリブデン酸塩は、マラカイトグリーンで共役すると、２０倍または３０倍強い色を与える。最終生成物の還元された緑色の可溶性の複合体は、６２０ｎｍでのその吸光度により測定され、溶液中の無機リン酸塩の直接測定である。
【００８０】
ＶＩ．医薬組成物の調製
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、癌の治療および血管新生の阻害で使われてきた広範囲の１つ以上の薬剤を具備することが可能であり、限定されるものではないが、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（またはそれの水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、およびドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、（Ｄｅ  Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００１）に記載された他のものなどを含む。また、リポソーム、ペプチド、および抗体は、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子を具備することができる。リポソーム、ペプチド、および抗体は、（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に記載された抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物も具備し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、リポソーム、ペプチド、および抗体は、当技術分野で公知である多種多様な医薬的に許容される担体、賦形剤および希釈剤を有する処方で提供される。これらの医薬担体、賦形剤、および希釈剤としては、ＵＳＰ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｌｉｓｔｉｎｇ．ＵＳＰ  ａｎｄ  ＮＦ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ｌｉｓｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ，ｐ．２４０４−２４０６， ＵＳＰ  ２４  ＮＦ  １９， Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＩＳＢＮ  １−８８９７８８−０３−１）に記載のものが挙げられる。ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの医薬的に許容される賦形剤は、一般の人々に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調節／緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤などの医薬的に許容される補助物質も、一般の人々に容易に入手可能である。
【００８２】
好適な担体としては、水、デキストロース、グリセリン、生理食塩水、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または製剤の有効性を高めるアジュバントなどの追加の薬剤を含むことができる。局所用担体としては、液体鉱油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（５％）水溶液、またはラウリル硫酸ナトリウム（５％）水溶液などが挙げられる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤、および類似薬剤などの他の材料も必要に応じて添加することができる。Ａｚｏｎｅなどの皮膚浸透促進剤も含めることができる。
【００８３】
医薬剤形においては、本開示の組成物は、医薬的に許容される塩の形態で投与することができ、または単独でもしくは他の医薬的活性化合物との好適な会合および組合せで使用することもできる。対象の組成物は、可能な投与方法に従って処方される。
【００８４】
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの慣用的添加剤と一緒に、注射剤中に処方することができる。当技術分野で慣行の別の経口または非経口送達用の製剤を使用することもできる。
【００８５】
ＶＩＩ．治療方法
Ａ．投与方法、投与量、および投与頻度
治療薬剤を具備する本開示のペプチドまたはリポソームは、治療を必要とする対象に、静脈注射などの全身的注入により、あるいは腫瘍への直接注入などの関連部位への注入もしくは適用により、あるいは部位が手術で露出している場合の部位への直接的用により、あるいは障害が例えば、皮膚である場合などの局所的用により投与し得る。治療を必要とする対象は、ＨＣＣまたは肝臓癌を含む癌などの病気に罹患している対象を含む。
【００８６】
本開示のペプチドは、治療のために癌に対する抗体を標的とするのに使用され得る。１つの実施形態では、本開示のペプチドは、治療を必要とする対象に投与され、続いてペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。標的抗体は、抗体依存性細胞傷害性または相補体依存性細胞障害性を媒介することが可能であるし、または標的分子の基本的な機能を改変する可能性がある。そのような抗体は、標的組織に対する治療効果を有する薬剤を直接に送達するために、抗体複合体の形態で使用することができる。こうした薬剤としては、放射性核種、毒素、化学療法剤、抗ＶＥＧＦアプタマーおよび抗血管新生化合物が挙げられる。
【００８７】
投与は、経口投与、頬側投与、経鼻投与、経腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、気管内投与、および髄腔内投与、または他に移植もしくは吸入による投与など、種々の方法で投与することができる。従って、対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、またはガス状の形態の製剤中に処方することができる。以下の方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎず、決して限定的なものではない。  
【００８８】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。また、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などのわずかな量の補助的物質を含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかである。投与する組成物または製剤は、いずれにしても、治療対象において所望の状態を得るのに十分な量の薬剤を含む。
【００８９】
一般に、本開示の組成物は、患者に、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。抗体は、患者に抗体を投与後に抗体が患者の身体を循環できる時間の間隔を最大にするために、ボーラス投与量として投与される。また、持続的注入が、初期ボーラス投与後に使用され得る。投与は、単回投与量、または１日に１回、１週間に１回、あるいは１カ月に１回などの間隔を置いてすることが可能である。投与計画は、例えば、肝細胞癌細胞に対するポリペプチドの親和性、ポリペプチドの半減期、および患者の状態の重症度に基づいて調整できる。
【００９０】
Ｂ．併用療法
本開示のペプチドまたはリポソームは、単剤療法として使用できる。あるいはまた、本開示のペプチドまたはリポソームは、癌を治療するために標準の化学療法と放射線療法とを組み合わせて使用することができる。
【００９１】
癌治療で使われる薬剤は、細胞障害性または細胞増殖抑制性の効果を癌細胞に対して有し得るか、または悪性細胞の増殖を低下させ得る。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、放射線療法と併用できる。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、Ｄｅ  Ｖｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１）に記載された治療的なアプローチと共に使用され得る。本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と第２抗癌剤が癌細胞に対して相乗効果を発揮するこうした併用に関しては、第２薬剤の投与量は、単独で投与された場合の第２薬剤の標準的な投与量と比べて、減少させることが可能である。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体を、癌細胞の感受性を高めるのに有効な化学療法抗癌剤の量と併用投与することを具備する。併用投与は、同時投与であってもよく、または、非同時投与であってもよい。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、治療計画の過程で、他の治療薬と共に投与され得る。１つの実施形態では、本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と他の治療剤の投与は、連続的である。好適な時間経過は、患者の病気の性質、および患者の容体などの要因に従って、医師によって選択され得る。
【００９２】
ＶＩＩＩ．診断方法
病気に特異的なバイオマーカーの検出は、効果的なスクリーニング戦略を提供する。早期発見は、早期診断を提供するのみならず、癌の症例では、多型を選別する能力を提供して、腫瘍再発の早期指標である、手術後の残存腫瘍細胞および潜在性転移を検出できる。病気に特異的なバイオマーカーの検出は、治療を受けている患者や癌の寛解期の患者に比べて、診断前の患者の生存率を改善することができる。
【００９３】
本開示のペプチドは、癌を含む病気に対する診断または予後検診に使用できる。ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれに限定されない多くの方法で診断薬として使用できる。  
【００９４】
また、本開示の抗体は、肝臓癌を検出するために、本開示のペプチドと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、肝細胞癌細胞などの肝細胞癌に結合する本開示のペプチドと抗体の結合を検出する結合アッセイである。対象のポリペプチドまたは抗体は、固定されることができ、一方、対象のポリペプチドおよび／または抗体は、検出可能に標識化されることができる。例えば、抗体は、直接標識化することができ、あるいは標識化２次抗体で検出できる。すなわち、抗体のための好適で、検出可能な標識は、目的とするタンパク質に抗体を標識する直接的な標識、および目的とするタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接的な標識を含む。別の実施形態では、ペプチドは、標識を具備し、組織へのペプチドの結合は、標識の存在を分析することによって検出される。
【００９５】
ＩＸ．スクリーニング法
本開示は、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するための方法を提供する。そのような分子は、分子に結合する治療薬または診断薬のための標的として役立ち得る細胞表面分子であり得る。例えば、分子または分子に結合す抗体に特異的なペプチドは、細胞がその分子を産生する患者を治療または診断するために使用され得る。
【００９６】
１つの方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドに結合するか、または本開示のペプチドと相互作用する他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイでの「ベイトタンパク質」として使用することができる（参照：例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；およびＳｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６））。  
【００９７】
別の方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するために、細胞抽出物とインキュベーションされる。１つの方法では、本開示のペプチドは、ＨＰＬＣカラムなどの固形支持体に固定化され、細胞抽出物は、標的分子に本開示のペプチドが結合するのを容易にする条件下で固定化ペプチドに曝される。結合分子は、溶出され、質量分析などの標準的な方法によって同定される。
【実施例】
【００９８】
明細書は、明細書内に引用された参考文献の教示を考慮して最も完全に理解される。明細書の以下の実施例は、本開示の実施形態の説明であり、本開示の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示により包含されることを容易に認識する。
【００９９】
Ｉ．実施例１．ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーとバイオパンニング
Ａ．細胞株と細胞培養
全てヒト肝細胞癌細胞株である５９Ｔ、Ｃｈａｎｇｌｉｖｅｒ、ＨＡ２２Ｔ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｊ５、ＮＴＵＢＬ、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＫＨｅｐｌとヒト初代培養正常鼻粘膜上皮のＮＮＭ（８）を使用した。ＨＣＣ細胞は、Ｄｒ．Ｈｓｉａｏ  Ｍ．（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ，Ｔａｉｗａｎ）博士の好意で入手した。全てのヒトＨＣＣ細胞株とＮＮＭを、空気中５％または１０％ＣＯ２の加湿環境下において３７℃で、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）に維持した。
【０１００】
さらなる有用な細胞株は、ヒト肺扁平上皮癌株Ａ５４９、高転移性ヒト肺腺癌株ＣＬ１−５、ヒト肺腺癌株Ｈ２３、ヒト肺大細胞癌株Ｈ４６０、ヒト肺癌株ＰＣ１３、ヒト鼻咽頭癌株ＮＰＣ−ＴＷ０１、ヒト口腔扁平細胞癌株ＳＡＳ、ヒト膵臓癌ＰａＣａ、結腸（ＨＣＴ１１６）、乳房（ＢＴ４８３）、前立腺（ＰＣ３）、ＮＮＭ、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４６０、ＰＣ１３、ＰａＣａ、ＨＣＴ１１６、ＰＣ３、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＡＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる。ＣＬ１−５とＮＰＣ−ＴＷ０１細胞株は、（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）および（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）により、それぞれ確立した。
【０１０１】
Ｂ．ＨＣＣ細胞に結合するファージの単離
ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーを、ＨＣＣ、Ｍａｈｌａｖｕ、細胞特異的ファージを選別するために使用した。ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリー（ＲＰＬｓ）Ｐｈ．Ｄ．−１２キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を我々の実験に使用した。バイオパンニング手順は、先の研究（３５）に従って、若干修正して実行した。簡潔に述べると、Ｍａｈｌａｖｕ細胞を、７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中５ｍＭのＥＤＴＡで採取し、１％のＢＳＡを含む無血清培地で回収した。細胞懸濁液をファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーの１．５×１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）に添加する前に、４℃で冷却した。反応混合物を４℃で１時間インキュベーションし、非混和性の有機溶媒（フタル酸ジブチル：シクロヘキサン＝９：１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の上層に移し、遠心分離した。ファージ結合細胞ペレットをＬＢ培地で再懸濁し、ファージを増幅し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８培養物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で滴定した。採取されたファージを、Ｍａｈｌａｖｕ細胞によるバイオパニングの追加ラウンドに付した。第５ラウンドのファージ溶出液を、ファージクローン同定のためのＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で滴定した。親和性選択（バイオパニング）の５ラウンド後、第５ラウンドの回収率は、第１ラウンドで観察されたそれに対して３．５倍に増加した（図１）。
【０１０２】
Ｃ．ＥＬＩＳＡによるファージクローンの同定
９６のファージクローンを無作為に分離し、ＥＬＩＳＡアッセイによりＨＣＣ細胞および正常な上皮細胞（ＮＮＭ）と反応させるのに用いた。約１×１０４  Ｍａｈｌａｖｕ細胞とＮＮＭ細胞を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに別々に播種し、一晩増殖させた。プレートを無血清ＤＭＥＭで洗浄し、１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で４℃においてブロッキングした。次いで、個々のファージクローンの１０９ｐｆｕを添加し、４℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を添加し、４℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで洗浄し、続いてペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共にインキュベーションした。反応を３ＮのＨＣｌで終了させ、光学密度をマイクロプレートリーダを使って４９０ｎｍで測定した。  
【０１０３】
ＩＩ．実施例２．フローサイトメトリおよび生検分析
Ａ．ＨＣＣ細胞に特異的に結合するファージクローンの同定
ＨＣＣ細胞に特異的に結合するファージクローンを分析するために、フローサイトメトリ分析が実施された。ＨＣＣ細胞を７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させ、ＰＢＳ中５ｍＭのＥＤＴＡで採取した。ＨＣＣ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳを有するＰＢＳ）に再懸濁し、タンパク質をそれぞれコードしないＰＣ９４または対照ファージと共に４℃で１時間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、ＨＣＣ細胞をモノクローナルの抗Ｍ１３抗体と共に４℃で１時間インキュベーションし、続いてＲ−フィコエリスリンに共役した抗マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）と３０分間インキュベーションした。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使って、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。
【０１０４】
その結果は、ファージクローン９４（ＰＣ９４）が、ＨＣＣ細胞に最も良い反応性を有し、他方、ファージクローンの残りは、ＨＣＣ細胞に対して適度の結合活性を示したことを明らかにした（図２Ａ）。（Ａ）ＨＣＣ細胞へのそれぞれの選択されたファージの表面結合活性は、フローサイトメトリで測定された（２番目：細胞は、Ｒ−フィコエリスリン共役化抗マウスＩｇＧにより染色された。Ｃ：細胞は、対照ファージとインキュベーションされた）。
【０１０５】
ＰＣ９４の結合活性は、ファージの異なる用量をＨＣＣ細胞と共にインキュベーションすることによりさらに確証され、ＦＡＣＳにより分析された。その結果は、ＰＣ９４のＨＣＣ細胞への結合は、用量依存性の様式で起こることを示した（図２Ｂ）。さらに、反応性は、対照ヘルパーファージでは見られなかったし、ＰＣ９４をＮＮＭと共にインキュベーションした際にも見られなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、ＨＣＣのＭａｈｌａｖｕ細胞が、ＰＣ９４に提示されたペプチドにより認識できる未知分子を発現することを明らかにする。
【０１０６】
他のＨＣＣ細胞がＰＣ９４により認識できるか否かを研究するために、９つのＨＣＣ細胞株が、ＰＣ９４と共にインキュベーションされ、ＦＡＣＳによって分析された。その結果は、９つのＨＣＣ細胞株のうちの６つ（Ｍａｈｌａｖｕ、５９Ｔ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＮＴＵＢＬ、およびＳＫＨｅｐｌ）が、強力（４７〜８１．２％）にＰＣ９４と反応し、他方、他のＨＣＣ細胞株（ＣｈａｎｇｌｉｖｅｒおよびＪ５）は、適度の反応性（２５．７〜３１．９％）を有し、ＨＡ２２Ｔ細胞株は、わずかに弱い反応性（１９．１％）であることを示す（図２Ｃ）。各ＨＣＣ細胞株へのＰＣ９４の表面結合活性が分析された（黄色：Ｒ−フィコエリスリン共役化抗マウスＩｇＧで染色；オレンジ：対照ファージとのインキュベーションされた細胞）。その結果は、これらの細胞株のすべてが、ＰＣ９４−提示ペプチドで認識できる標的分子を発現することを示す（図２Ｃ）。
【０１０７】
ＰＣ９４のＨＣＣ細胞に対する結合特異性は、ＨＣＣ患者からの外科的標本を使用して免疫組織化学によりさらに試験された。その結果は、ＰＣ９４がＨＣＣの外科的標本における腫瘍細胞（図２Ｄ、ａおよびｂ）を認識できるが、それらの正常な対応部分（図２Ｄ、ｄ）は認識できないことを示している。対照ファージは、ＨＣＣの外科的標本の腫瘍組織での免疫反応性を何ら示さない（図２Ｄ、ｃ）。ＰＣ９４または対照ファージとインキュベーションされたＨＣＣ患者由来の生検標本は、ＨＲＰ共役化抗Ｍ１３抗体を用いて検出された。ＰＣ９４の免疫反応性は、腫瘍組織（Ｄ、ａおよびｂ）で見られたが、しかし、それらの正常な対応部分（Ｄ、ｄ）では見られなかった。対照ファージは、これらの生検標本（Ｂ、ｃ）（Ｂａｒ、５０μｍ）と結合することができなかった。
【０１０８】
肝臓癌組織におけるペプチド結合能の局在下のために、ヒト肝細胞癌のパラフィン切片を、ファージ提示ペプチドおよびビオチン標識ペプチドと共にルーチンの免疫組織化学的手順を用いてインキュベーションした。外科的標本は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｉｎ  ＮＴＵＨ（ＩＲＢ９４６１７０２０２１）の承認を得て、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＮＴＵＨ）の組織バンクから入手した。
【０１０９】
Ｂ．ＤＮＡ配列とコンピュータ解析
ＥＬＩＳＡとフローサイトメトリ（図２Ａ）による高いＨＣＣ細胞反応性を有する１５のファージクローン（ＰＣ１、２、９、１２、１５、２６、４２、４７、６２、７２、８４、８５、８６、８８、および９４）が選択され、配列決定された。ファージＤＮＡをメーカーの指示に従って抽出した。精製ファージのＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した。配列決定は、−９６ｇＩＩＩ配列決定用プライマー５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号：３１）を用いて実行した。ファージ提示ペプチド配列を、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムを使用して翻訳し、一列に整列した。ファージ提示ペプチド配列を、ＧＣＧソフトウェアによって整列し、異なったコンセンサスモチーフ配列（表１）を明らかにした。対応するＤＮＡ配列は、表２に記載する。
【０１１０】
ＧＣＧアラインメント（表１）に基づいて、モチーフＰｒｏ−Ｉｌｅ／Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（Ｐ−Ｉ／Ｌ−Ｌ−Ｐ）を提示するＰＣ９４およびＰＣ８８の両方が選択された。
【０１１１】
ＩＩＩ．実施例３．インビボでの標的化アッセイとペプチド競合的アッセイのための動物モデル
ＨＣＣに対する標的薬物送達のための薬物送達ディレクターとして、ＰＣ９４によりコードされたポリペプチドＳＰ９４の可能性を評価するために、いくつかの問題が対処された。最初に、我々は、ＳＰ９４がインビボでＨＣＣ細胞を標的とすることができるかどうかを調べた。我々は、ＨＣＣ異種移植モデルでのＰＣ９４の腫瘍帰巣性とＳＰ９４によるその競合的阻害を調べた。インビボの帰巣性実験は、ＰＣ９４が、対照ファージよりも８倍以上高い結合活性を有して腫瘍組織に対して帰巣性を有することを示した（図３Ａ）。そのうえ、ペプチド競合的阻害実験では、ＳＰ９４は、腫瘤に結合するＰＣ９４を阻害するのに対し、同じ濃度の対照ペプチドでは、そのような阻害効果を全く有しなかった（図３Ｂ）。
【０１１２】
Ａ．ＰＣ９４標的化ための動物モデル
インビボでのＰＣ９４の標的化能を確かめるために、ＨＣＣ異種移植片（５００ｍｍ３）由来Ｍａｈｌａｖｕ担持ラットに、尾静脈を通してＰＣ９４または対照ファージを注入した。ファージを循環させ、次いで潅流させた。腫瘍組織と正常な内臓器官に結合したファージ粒子を回収した。その結果は、有意に多くのＰＣ９４ファージ粒子が、正常な器官より脳（２２０倍）、心臓（３２倍）および肺（２３倍）などの腫瘍組織から回収（組織のグラム単位につき標準化）されたことを証明した。しかし、対照ファージは、腫瘍組織でも、正常器官でも何らの帰巣現象を示さなかった（図３Ａ）。
【０１１３】
５×１０６のＭａｈｌａｖｕ細胞をＳＣＩＤマウス（４〜６週齢）の背側外側わき腹に皮下的（ｓ．ｃ．）に注入した。ＰＣ９４の２×１０９ｐｆｕまたは対照ファージをＭａｈｌａｖｕ由来異種移植片（５００ｍｍ３）担持マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。潅流後に、器官（脳、心臓、および肺）と腫瘍組織を摘出し、冷たいＰＢＳで洗浄し、計量した。腫瘍組織および器官に結合したファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８培養物によりレスキューした。溶出されたファージ粒子を、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で滴定した。ペプチド競合的阻害実験では、ＰＣ９４ファージの２×１０９ｐｆｕが、ＳＰ９４ペプチドの１００μｇと対照ペプチドで共注入された。腫瘍担持マウスでの標的化ファージの組織分布を、免疫組織化学的染色によって調べた。組織切片を、マウス抗Ｍ１３抗体と共にインキュベーションし、続いてビオチン化ウマ抗マウス抗体（ＡＢＣキット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ＡＢＣ試薬に浸漬した。切片をＤＡＢ溶液＋０．０１％過酸化水素に浸漬し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の５０％グリセリンを上に乗せた。
【０１１４】
Ｂ．ペプチド競合的アッセイ
ペプチド競合的阻害アッセイ（図３）は、ＨＣＣ細胞へのＰＣ９４の結合活性が、ファージ粒子の他の部分よりむしろＰＣ９４ディスプレイペプチドに依存していることを確認した。これらの結果は、これらのＨＣＣ細胞の原形質膜が、合成ペプチドＳＰ９４およびＰＣ９４ディスプレイペプチドの両方で認識することができ、しかし、ファージの他の部分では認識できないタンパク質などの未知の標的分子を発現することを強く示している。
【０１１５】
１．ペプチド合成および標識化
標的化ＳＰ９４（ＳＦＳＩＩＨＴＰＩＬＰＬ）（配列番号：２）と対照（ＦＰＷＦＰＬＰＳＰＹＧＮ）（配列番号：３２）ペプチドを合成し、ペプチド合成中心設備（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ）での逆相高速液体クロマトグラフィによって＞９５％純度まで精製した。ビオチン標識ペプチド（ビオチン−ＳＰ９４およびビオチン−対照−ペプチド）が、ビオチン分子をペプチドアミノ末端へ共役化することにより合成された。質量分析は、予測された質量を確認した。
【０１１６】
ＨＣＣ異種移植片担持マウスに、ＰＣ９４および同系の合成ペプチドＳＰ９４を共注入した。その結果は、ＳＰ９４が腫瘍組織からのファージ粒子の回収を著しく阻害したことを示した。ＳＰ９４の１００マイクログラムが、腫瘍組織に結合しているＰＣ９４の８８％を阻害したが、対照ペプチド（ｃｏｎ−Ｐ）の同じ濃度は、そのような阻害効果を何ら有しなかった（図３ｂ）。
【０１１７】
ＰＣ９４の組織分布の立証のために、帰巣性実験および競合的実験由来の腫瘍器官と正常器官の組織切片は、抗ファージ抗体によって免疫染色された。腫瘍細胞だけが、免疫反応性（図３Ｃ、ｄ、およびｅ）を明らかにしたが、脳（図３Ｃ、ａ）、心臓（図３Ｃ、ｂ）、および肺（図３Ｃ、ｃ）などの正常な器官は、免疫反応性を示さないことが分かった。しかし、ＰＣ９４を同系の合成ペプチドＳＰ９４と共注入した場合、免疫反応性が全く腫瘍組織でみられなかった（図３Ｃ、ｊ）。腫瘍細胞も正常な器官も対照ファージ（Ｃ、ｆ〜ｉ）（棒、５０μｍ）との免疫反応性を有さないことが分かった。
【０１１８】
ＳＰ９４が標的薬物の治療指数を増加させることができたかどうかを調べるために、我々は、正常器官ではなく、腫瘍組織に対するＳＰ９４の結合特異性を研究した。帰巣性アッセイとペプチド競合的阻害実験の両方では、ＰＣ９４は、脳や、心臓や、肺などの正常な内臓器官ではなく、腫瘍組織に特異的に結合することが分かった（図３ＡおよびＢ）。免疫組織化学的染色は、ＰＣ９４粒子が腫瘍組織のみに局在し、脳、心臓、および肺の組織（図３Ｃ）には局在しないことを証明した。最終的に、我々は、ＳＰ９４ペプチドが、ＨＣＣ患者の腫瘍組織によって産生される標的分子を認識できたかどうかを調べた。ＰＣ９４（図２Ｄ）とビオチン標識ＳＰ９４は、６１．３％（１９／３１）の陽性率でＨＣＣ患者からの外科的標本に発現された標的プロテインを認識した。総合して、我々は、ＳＰ９４が、正常組織ではなくＨＣＣ細胞によって生産された未知の標的分子を特異的に認識すると結論する。従って、この分子は、ＨＣＣに対する標的薬物送達に対して有用であり、ＳＰ９４は、この分子を同定するための試薬を提供する。
【０１１９】
ＩＶ．実施例４．インビボでの腫瘍標的治療試験
ＳＰ９４とペグ化リポソームドキソルビシンの組み合わせ、すなわち活性またはリガンド媒介標的化と呼ばれるプロセスを使用して、この標的ＤＤＳの部位特異的作用は、腫瘍効果（図４および６）を高めて、増加する腫瘍アポトーシス（図５Ａ、５Ｂ、および６Ｅ）を伴い、腫瘍血管新生（図５Ｃおよび６Ｄ）を減少させた。
【０１２０】
ペグ化リポソームドキソルビシン（Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）製剤の臨床試験において、改善された薬物動態学的特性および減少した全身的毒性が観察された（４０）。ここで、我々の結果は、この標的薬物送達系の部位特異的作用により、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、総白血球数（ＷＢＣ）の減少を回避することによって血液毒性をさらに減少させることができることを明らかにした（図４Ｃおよび６Ｃ）。非標的ペグ化リポソームドキソルビシン（Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ）によって観測された総ＷＢＣ数の減少は、増加した循環時間、血管内の監禁状態、および単核性食細胞系細胞による非特異的な取り込みの機会の増加に依る可能性がある。そのような白血球減少症は、進行したＨＣＣ患者に対するペグ化リポソームドキソルビシンの第２相臨床試験で既に報告した（４１、４２）。
【０１２１】
ペグ化リポソームドキソルビシンの第２相臨床試験についての先のいくつかの研究は、薬物が進行したＨＣＣでは、最大で０〜１４％の奏効率でほとんど活性を示さなかったと報告している（４１〜４３）。本明細書で記載されるＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘの増強された治療効果は、従って、進行したＨＣＣ患者の治療におけるこの標的薬物送達系について重要な臨床的可能性を示す。さらに、ＳＰ９４と相互作用する標的分子の同定は、ＨＣＣ腫瘍組織でのその特異的発現の検証を可能にして、ＨＣＣ療法のための標的としてのその使用を認証するであろう。
【０１２２】
標的薬物送達系は、抗癌剤、標的リガンドを具備し、さらに担体を具備し得る。ドキソルビシンがＨＣＣで最も一貫した全奏功率（１８％）を提供すると報告されており（３６）、また、リポソームドキソルビシンが難治療性乳癌および卵巣癌で顕著な活性を有することが証明されたので（３７、３８）、この薬物を、抗癌剤として選択し、ポリエチレングリコールでコーティングしたリポソーム（ペグ化リポソーム）が担体として選択した。ペグ化リポソームドキソルビシンを、ＨＣＣに対する標的薬物送達の有効性を評価するために、ＳＰ９４（ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）と結合した。ヒトＨＣＣ異種移植片モデルでは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、対照ペプチド複合Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）およびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群（図４および６）と比較して、治療効果において改善を示した。
【０１２３】
いかなる特定のメカニズムによっても制約されることなく、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群は、以下の要素によって説明され得る。最初に、血管新生腫瘍脈管系の漏出は、腫瘍組織での薬物複合体の選択的血管外漏出を可能とする。さらに、薬物複合体は、有効なリンパドレナージの不足のため、腫瘍組織内に保持され得る。これらの要因は、腫瘍組織での薬物複合体の受動的標的化および蓄積をもたらし得る（１４）。また、動物試験では、長時間循環するペグ化リポソームドキソルビシンは、腫瘍での受動的な優先的局在化に至り、フリーの薬物により得られる濃度と比べて、腫瘍組織での薬物濃度は、数倍の増加をもたらすことが証明された（１５、３９）。
【０１２４】
Ａ．ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製と投与
ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製のための手順は、記述されている（８）。簡潔に述べると、ペプチドをＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−カルボキシル−ＰＥＧ（分子量３４００）由来ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）］に１：１．５のモル比でカップリングした。カップリング反応は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを生成するために、ペプチドのアミノ末端の遊離アミノ基を用いて実施され、トリニトロベンゼンスルホナート試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）での残存アミノ基の定量化により確認された。ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを、脂質２重層の転移温度より高い温度で共インキュベーションした後に、予備形成されたペグ化リポソームドキソルビシンに変換した。
【０１２５】
ＳＣＩＤマウス（４〜６週齢）に、５×１０６のＭａｈｌａｖｕ細胞を背側外側わき腹に皮下的（ｓ．ｃ．）に注入した。腫瘍担持マウス（１００ｍｍ３）を、異なる処置Ａ：ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＳＰ９４−ＬＤ）；Ｂ：Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＣＰ−ＬＤ）；Ｃ：Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＬＤ）；およびＤ：ＰＢＳのために無作為に４群（１群あたり６匹のマウス）に群分けした。処置は、尾静脈注射により、１週間に２回、１ｍｇ／ｋｇで、連続した４週間、８ｍｇ／ｋｇの総用量を投与した。別の実験では、より大きいＭａｈｌａｖｕ由来異種移植片（５５０ｍｍ３）担持マウスを、記載されたように４群に群分けした。処置は、尾静脈注射により、１週間に１回、５ｍｇ／ｋｇで、連続して２週間、１０ｍｇ／ｋｇの総用量を投与した。体重と腫瘍の大きさは電子天秤とカリパスによって測定した。腫瘍容積は、式：長さ×（幅）２×０．５２を使用して計算した。実験の終わりに、各マウスの腫瘍組織および内臓器官を摘出し、３％のホルムアルデヒドで固定化し、さらなる組織病理学検査のためにＯＣＴ包埋した。動物の取り扱いは、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｔａｉｗａｎのガイドラインに従って行った。
【０１２６】
処置の終わり（２８日目）に、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘとＬｉｐｏ−Ｄｏｘ群の腫瘍の大きさは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のそれより１．５倍大きかった。対照ＰＢＳ群の腫瘍の大きさは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のものより３．３倍大きかった。（Ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。さらに、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘの投与を受けた腫瘍担持マウス群は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘとＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群のそれと比べて、より少ない腫瘍重量、約４０％の阻害を有することが分かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出された。
【０１２７】
１．総ＷＢＣ数
血液を顎下腺の静脈から抜き取って、凝固を防ぐために１５％のＥＤＴＡ溶液と緩やかに混合した。次に、２％酢酸と１％ゲンチアンバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＲＢＣ溶解緩衝液を添加し、室温でインキュベーションした。総ＷＢＣは、血球計を使用して計算された。
【０１２８】
化学療法剤の全身的送達により起こる副作用を評価するために、総ＷＢＣ数が測定された。その結果は、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ治療群の総ＷＢＣ数（１．９×１０３／ｍｍ３）は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（１．６×１０３／ｍｍ３）およびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（１．６×１０３／ｍｍ３）治療群のそれらより高いが、ＰＢＳ群（２．６×１０３／ｍｍ３）のそれより低いことを明らかにした（図４Ｃ）。体重は、各処置群で有意に変わらなかった（図４Ｄ）。  グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって算出された。
【０１２９】
Ｖ．実施例５．ペプチド−リポソームドキソルビシン療法における組織病理学的検査、腫瘍血管の免疫蛍光検出、およびアポトーシス細胞
Ａ．ＴＵＮＥＬ染色
凍結腫瘍組織切片を末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｂａｓｅｌ，ＣＨＥ）と３７℃で１時間インキュベーションした。スライドを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で対比染色し、封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で封入した。次いで、スライドは、蛍光顕微鏡下で視覚化された。
【０１３０】
Ｂ．ＣＤ３１染色
凍結腫瘍組織切片を、メタノール−アセトン（１：１）により固定化し、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）中に浸漬し、続いて、ラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とインキュベーションした。切片をＰＢＳＴ０．１（ＰＢＳ中、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、次いで、ウサギ抗ラット抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）とインキュベーションし、ローダミン標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）に浸漬した。スライドを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で対比染色し、封入剤で封入し、蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【０１３１】
各処置群の腫瘍組織の組織病理をＨ＆Ｅ染色後に調べた。著しく分散した壊死／アポトーシス領域が、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置異種移植片の全切片に存在したのに対し、適度の壊死／アポトーシス領域が、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＣｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置異種移植片で見られた。ＰＢＳ処置群は、正常なＨＣＣ細胞を示した（図５Ａ）。ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＳＰ９４−ＬＤ）処置異種移植片の全切片は、著しく分散した壊死／アポトーシス領域を示すのに対し、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＣＰ−ＬＤ）とＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＬＤ）異種移植片は、適度の壊死／アポトーシス領域を示し、ＰＢＳ群は、正常なＨＣＣ細胞（棒：上側のパネル、５００μｍおよび下側のパネル、５０μｍ）を示す。
【０１３２】
切片を、アポトーシス腫瘍細胞（緑色）を視覚化するためにＴＵＮＥＬ標識した。ＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ群と比較して、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群で、より均等に分布した。アポトーシス腫瘍細胞は、ＰＢＳ処置群では見られなかった（棒、１００μｍ）。（図５Ｂ）。ＴＵＮＥＬを、アポトーシス腫瘍細胞を同定するために使用し、抗ＣＤ３１抗体を、腫瘍血管を検出するために適用した。腫瘍からの代表的な顕微鏡視野は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群よりもＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群において、より多くのアポトーシス腫瘍細胞（図５Ｂ）と、より低密度の血管（図５Ｃ）を示す。
【０１３３】
切片を、腫瘍血管（赤色）を視覚化するために抗ＣＤ３１抗体で染色し、Ｈ３３２５８（青色）（棒、１００μｍ）で対比染色した。（図５Ｃ）。ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域を、低倍率で定量化（ｎ＝６）し、ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域を、低倍率下でも定量化（ｎ＝６）した。ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域は、ＰＢＳ対照群でのそれらと比較して、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＣｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群では、著しく減少した（ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）。ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ群でのそれらと比較して、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群でさらに減少した（ｎ＝６、Ｐ＜０．００１）（図５Ｄ）。ＰＢＳ処置群では、高い腫瘍血管密度が見られ、アポトーシス細胞は見られなかった（図５ＢおよびＣ）。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出した。
【０１３４】
ＶＩ．実施例６．大きいＨＣＣ異種移植片腫瘍の治療のためのペプチド−リポソームドキソルビシン療法
大きい異種移植片が、また、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置に応答することができたかどうかを確認するために、大きいＨＣＣ異種移植片（５５０ｍｍ３）を担持するラットを、異なる処置：Ａ：ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＳＰ９４−ＬＤ）；Ｂ：Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＣＰ−ＬＤ）；Ｃ：Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（ＬＤ）およびＤ：ＰＢＳのために４群に群分けした。処置の終わり（１４日目）に、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘとＬｉｐｏ−Ｄｏｘ群の腫瘍サイズは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のものより１．３倍および１．２倍に徐々に増加した（それぞれＰ＝０．０８９、Ｐ＜０．０５）。対照ＰＢＳ群の腫瘍のサイズは、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のそれより１．９倍大きかった（Ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。さらに、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘの投与を受けた腫瘍担持マウスの群は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、およびＰＢＳ群よりも、小さい腫瘍重量を有することが分かった。Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、およびＰＢＳ群の腫瘍重量は、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のそれよりも、それぞれ１．３倍、１，２倍および２．１倍大きく増加した（Ｐ＜０．０５。）（図６Ｂ）。総ＷＢＣ数は、また、１０日目に分析されて、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群（１１．８×１０３／ｍｍ３）の総ＷＢＣが、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（８．８×１０３／ｍｍ３）およびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ（８．２×１０３／ｍｍ３）処置群のそれらより大きいが、ＰＢＳ群（１３．９×１０３／ｍｍ３）のものより少なかった（図６Ｃ）。
【０１３５】
各処置群における腫瘍組織の組織病理をＨ＆Ｅ染色により調べた。著しい壊死／アポトーシス領域が、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置異種移植片からの全切片に存在したが、他方、適度の壊死／アポトーシス領域が、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＣｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置異種移植片で見られ、ＰＢＳ処置群は、正常なＨＣＣ細胞を示した（図６Ｅ）。各処置群からの腫瘍組織におけるＣＤ３１陽性内皮細胞の領域は、低倍率下でも定量化（ｎ＝６）された。ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域は、ＰＢＳ対照群のそれらと比較して、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＣｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群では、わずかに減少した。しかし、ＣＤ３１陽性内皮細胞の領域は、Ｃｏｎ−Ｐ−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ群でのそれらと比較して、ＳＰ９４−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群で著しく減少した（ｎ＝６、Ｐ＜０．００１）（図６Ｄ）。（棒：上側のパネル、５００μｍおよび下側のパネル、５０μｍ）。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出された。
【０１３６】
本明細書で議論された刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにだけ提供される。本開示が、先願発明によるそのような刊行物に先行する権利を与えられないことを承認するものとして決して理解してはいけない。本明細書での任意の刊行物の引用は、そのような参考文献が本開示に先行するものであることを認めるものではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認される必要があるかもしれない現実の発行日と異なっているかもしれない。
【０１３７】
Ｘ．実施例７：結合におけるＰＣ８８とＰＣ９４の比較
ＦＡＣＳ分析を、ＰＣ８８とＰＣ９４の結合活性を比較するために実施した。Ｍａｈｌａｖｕ細胞を１×１０９、５×１０９、７．５×１０９、および１×１０１０のＴＵでそれぞれインキュベーションし、個々のファージクローンの表面結合活性は、実施例２に記載した手順を使ってＦＡＣＳにより分析した。ＰＣ９４のＭａｈｌａｖｕ細胞結合活性は、ＰＣ８８より良好である（図７）。Ｃｏｎ−ファージは、対照ファージを示す。
【０１３８】
ＸＩ．実施例８：インビボでのＰＣ８８とＰＣ９４の腫瘍帰巣の比較
ＰＣ８８とＰＣ９４の腫瘍帰巣性を、ＳＣＩＤマウスで比較した。ＨＣＣ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスをＰＣ８８、ＰＣ９４および対照ヘルパーファージで静脈注射し、ファージを、実施例３に記載されたように潅流後に回収した。腫瘍や、脳、心臓、肺などの対照器官から回収されたファージの力価は、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で測定された。ＰＣ９４の腫瘍帰巣性は、ＰＣ８８より良好である（図８）。
【０１３９】
ＶＩＩ．刊行物
１．Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ａ．Ｘ．（２００５）Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３，２８９２−２８９９．
２．Ｆａｒａｚｉ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．（２００６）Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，６７４−６８７．
３．Ｊｅｍａｌ，Ａ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．，Ｓａｍｕｅｌｓ，Ａ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｒ．Ｃ，Ｇｈａｆｏｏｒ，Ａ．，Ｆｅｕｅｒ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｈｕｎ，Ｍ．Ｊ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００５．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５５，１０−３０．
４．Ｂｏｓｓｌｅｔ，Ｋ．，Ｓｔｒａｕｂ，Ｒ．，Ｂｌｕｍｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｃｚｅｃｈ，Ｊ．，Ｇｅｒｋｅｎ，Ｍ．，Ｓｐｅｒｋｅｒ，Ｂ．，Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｈ．Ｋ．，Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｏｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｎｎｅｒｅｔ，Ｃ．（１９９８）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８，１１９５−１２０１．
５．Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．（２００４）Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１８１８−１８２２．
６．Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｕｍｂｅｎｇｅｇｗｉ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈａｒｒｏｉｓ，Ｇ．Ｊ．（２００５）Ａｎｔｉ−ＣＤ  １９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｒａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，３５６７−３５７３．
７．ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，Ｍｕｇｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｃ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｂｕｒｎ，Ａ．Ｌ．，Ｐａｕｌｉｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａａｓｄｙｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ，Ｖ．Ｎ．，Ｐａｔｔｉｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｊａｍｅｓ，Ａ．Ｃ，Ａｌ  Ｂａｋｒｉ，Ｇ，，Ｓｔｒａｗ，Ｒ．Ｃ，Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｂ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ，Ｈ．（２００７）Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ４００  ｎｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，４３１−４４５．
８．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｔｓｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．（２００４）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，８００２−８００８．
９．Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．Ｂ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｗ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｎａｇａｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｑ．（２００５）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｂｙ  ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＧＤ  ｍｉｍｅｔｉｃ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７，２６２−２７５．
１０．Ｖａｓｅｙ，Ｐ．Ａ．，Ｋａｙｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．，Ｔｗｅｌｖｅｓ，Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ｈ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｌ．Ｓ．，Ｈｉｌｄｉｔｃｈ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，Ｂｕｒｔｌｅｓ，Ｓ．，Ｆｒａｉｅｒ，Ｄ．，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｃａｓｓｉｄｙ，Ｊ．（１９９９）Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＫｌ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ］：ｆｉｒｓｔ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ−ｄｒｕｇ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５，８３−９４．
１１．Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．（２００３）Ｔｈｅ  ｄａｗｎｉｎｇ  ｅｒａ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２，３４７−３６０．
１２．Ｓａｔｃｈｉ−Ｆａｉｎａｒｏ，Ｒ．，Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｏｒｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｎａｇｙ，Ｊ．Ａ．，Ｆｅｎｇ，Ｄ．，Ｄｖｏｒａｋ，Ａ．Ｍ．，Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，Ｐｕｄｅｒ，Ｍ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（２００５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｓｓｅｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ＴＮＰ−４７０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，  ｃａｐｌｏｓｔａｔｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７，２５１−２６１．
１３．Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｈ．，Ｂａｌｕｋ，Ｐ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｓ．，Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．（２０００）Ｏｐｅｎｉｎｇｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｌｅａｋｉｎｅｓｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５６，１３６３−１３８０．
１４．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍａｅｄａ，Ｈ．（１９８６）Ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｔｒｏｐｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ  ｓｍａｎｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６，６３８７−６３９２．
１５．Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｗｏｒｋｉｎｇ，Ｐ．，Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇ，Ｐ．Ａ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．，Ａｍａｎｔｅａ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，Ｌ．Ｄ．（１９９６）Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６，５５−６３．
１６．Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｇａｂｉｚｏｎ，Ａ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｅ．，Ｍａｔｔｈａｙ，Ｋ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｗｏｏｄｌｅ，Ｍ．Ｃ，Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．，Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ｃ，ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  ８８，１１４６０−１１４６４．
１７．Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｅｚｕｂｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｔｈｏｍｍｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｆｉｓｃｈｌ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ−Ｋｉｅｎ，Ａ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｄｕ  Ｍｏｎｄ，Ｃ，Ｍａｍｅｌｏｋ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ，Ｄ．Ｈ．（１９９８）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ−ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６，２４４５−２４５１．
１８．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．，Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ，Ｈ．，Ｇｏｅｂｅｌ，Ｆ．Ｄ．，Ａｒａｓｔｅｈ，Ｋ．，Ｓｐｉｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｒｉｏｓ，Ａ．，Ａｂｏｕｌａｆｉａ，Ｄ．，Ｇａｌｌｅｓｈａｗ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｅｚｕｂｅ，Ｂ．Ｊ．（１９９８）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６，６８３−６９１．
１９．Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｔａｇｈｉ，Ｓ．，Ｕｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｇｌａｓｓ，Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｍ．，Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｂｙ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，２４３−２５４．
２０．Ａｌ−Ｂａｔｒａｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．，ｖｏｎ  Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚ，Ｇ．，Ａｔｍａｃａ，Ａ．，Ｋｌｅｅｂｅｒｇ，Ｕ．，Ｍｅｕｔｈｅｎ，Ｌ，Ｍｏｒａｃｋ，Ｇ．，Ｌｅｒｂｓ，Ｗ．，Ｈｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｓｅｈｏｕｌｉ，Ｊ．，Ｋｎｕｔｈ，Ａ．，ａｎｄ  Ｊａｇｅｒ，Ｅ．（２００６）Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｈｒａｃｙｃ  ｌｉｎｅｓ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４，１６１５−１６２０．
２１．Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｔ．（２００６）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｌ  ２，５７−６６．
２２．Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．（１９８７）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７，３０３９−３０５１．
２３．Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｃ．Ｇ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｙ．，ｄｉ  Ｔｏｍａｓｏ，Ｅ．，Ｄｕｄａ，Ｄ．Ｇ．，Ｍｕｎｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｔｏｎｇ，Ｒ．Ｔ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｄ．Ｃ，Ｓａｈａｎｉ，Ｄ．Ｖ．，Ｋａｌｖａ，Ｓ．Ｐ．，Ｋｏｚｉｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｍｉｎｏ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｈａｒｔｆｏｒｄ，Ａ．Ｃ，Ｆｉｓｃｈｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｚｈｕ，Ａ．Ｘ．，Ｂｌａｓｚｋｏｗｓｋｙ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｘ．，Ｓｈｅｌｌｉｔｏ，Ｐ．Ｃ，Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｇ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．（２００４）Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｈａｓ  ａｎｔｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１４５−１４７．
２４．Ｍｏｒｉ，Ｔ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，２３３５−２３４３．  
２５．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｎ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｆ．，Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｃ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．（２００７）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，４０４−４１１．
２６．Ｌｉｕ，Ｉ．Ｊ．，Ｈｓｕｅｈ，Ｐ．Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｋａｏ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｉａｏ，Ｍ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．（２００４）Ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９０，７９７−８０９．
２７．Ｗｕ，Ｈ．Ｃ，Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈａｏ，Ｔ．Ｔ．，Ｌａｉ，Ｓ．Ｃ，Ｊａｎ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｈａｉｏ，Ｍ．Ｆ．（２００３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２（ＤＥＮ−２）ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＥＮ−２−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４，２７７１−２７７９．
２８．Ｓｈａｄｉｄｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．（２００３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７，２５６−２５８．
２９．Ｚｉｔｚｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｉｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈａｄ，Ａ．，Ｋｉｎｓｃｈｅｒｆ，Ｒ．，Ａｓｋｏｘｙｌａｋｉｓ，Ｖ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｓ．，Ａｌｔｍａｎｎ，Ａ．，Ｅｉｓｅｎｈｕｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．（２００５）Ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＤＵＰ−Ｉ）ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，１３９−１４６．
３０．Ａｒａｐ，Ｗ．，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，３７７−３８０．
３１．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｇｉｒａｕｄｏ，Ｅ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｈｉｏｕｅ，Ｍ．，Ｐｏｒｋｋａ，Ｋ．，Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（２００３）Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３８３−３９１．
３２．Ｊｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（２００３）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３９３−４０３．
３３．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｋｕｏ，Ｓ．Ｙ．，Ｋ．，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．（２００７）Ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１０９５８−１０９６５．
３４．Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，Ｆ．，Ｂｒｉｇｎｏｌｅ，Ｃ，Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ，Ｄ．，Ｎｉｃｏ，Ｂ．，Ｐｅｚｚｏｌｏ，Ａ．，Ｍａｒｉｍｐｉｅｔｒｉ，Ｄ．，Ｐａｇｎａｎ，Ｇ．，Ｐｉｃｃａｒｄｉ，Ｆ．，Ｃｉｌｌｉ，Ｍ．，Ｌｏｎｇｈｉ，Ｒ．，Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．，Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｏｎｚｏｎｉ，Ｍ．（２００６）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｂｏｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，１００７３−１００８２．
３５．Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ，Ｍ．，Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ，Ｊ．，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｒａｐ，Ｗ．（２００１）Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，１２４９−１２５３．
３６．Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ａ．，Ｈｏｃｈｈａｕｓｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．（２００４）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｔｗｏ  ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５，４０９−４１８．
３７．Ｍｕｇｇｉａ，Ｆ．Ｍ．，Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｓ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．，Ｇｒｏｓｈｅｎ，Ｓ．，Ｔａｎ，Ｍ．，  Ｒｏｍａｎ，Ｌ．，Ｕｚｉｅｌｙ，Ｂ．，Ｍｕｄｅｒｓｐａｃｈ，Ｌ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ａ．，Ｇｒｅｃｏ，Ｆ．Ａ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｃ．Ｐ．，Ｐａｒａｄｉｓｏ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ，Ｌ．Ｊ．  （１９９７）  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５，９８７−９９３．
３８．Ｒａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．，Ｏ’Ｂｙｒｎｅ，Ｋ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．（１９９７）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５，３１８５−３１９１．
３９．Ｈｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．，  Ｐａｎｇ，Ｖ．Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｆ．Ｈ．（１９９９）Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ−２６  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ：ｉｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ？  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５，３６４５−３６５２．
４０．Ｈｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｓｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．（２００１）Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ９１，１８２６−１８３３．
４１．Ｈｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｓｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．（２００３）Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５１，４３３−４３８．
４２．Ｖａｌｌｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｄａｎｇｏｏｒ，Ａ．，Ｂｅｅｃｈ，Ｊ．，  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｃａｒｆｆｅ，Ｊ．Ｈ．，  Ｓｗｉｎｄｅｌｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｒａｎｓｏｎ，Ｍ．（２００５）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＰＬＤ）：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９２，６２８−６３０．
４３．Ｓｃｈｍｉｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｗｅｎｚｅｌ，Ｃ，Ｌｏｃｋｅｒ，  Ｇ．Ｊ．，Ｍｕｅｈｌｂａｃｈｅｒ，Ｆ．，Ｓｔｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｇｎａｎｔ，Ｍ．，Ｃｒｅｖｅｎｎａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｕｄｉｎｓｋｙ，Ａ．  Ｃ．（２００１）Ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８５，１８５０−１８５２．
【０１４０】
【表１】
2011504361.tif 000002
【０１４１】
【表２】
2011504361.tif 000003
【図１】
2011504361.tif 000004
【図２Ａ】
2011504361.tif 000005
【図２Ｂ】
2011504361.tif 000006
【図２Ｃ】
2011504361.tif 000007
【図２Ｄ】
2011504361.tif 000008
【図３】
2011504361.tif 000009
【図４】
2011504361.tif 000010
【図５】
2011504361.tif 000011
【図６Ａ】
2011504361.tif 000012
【図６Ｂ】
2011504361.tif 000013
【図６Ｃ】
2011504361.tif 000014
【図６Ｄ】
2011504361.tif 000015
【図６Ｅ】
2011504361.tif 000016
【図７】
2011504361.tif 000017
【図８】
2011504361.tif 000018
【配列表】
2011504361000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月5日(2010.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011504361000001.app
【国際調査報告】
2011504361.tif 000027
2011504361.tif 000028
2011504361.tif 000029
2011504361.tif 000030
2011504361.tif 000031
2011504361.tif 000032