(57)【要約】  カルベジロール、タクロリムス、およびトリメタジジンを含んでなる、組織および臓器の保存のための改良された水性溶液を提供する。この保存溶液には相乗作用が観察され、この保存溶液は脂肪変性肝臓などの辺縁臓器において特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のカルベジロール、有効量のタクロリムス、および有効量のトリメタジジンを含んでなる、組織および臓器の保存のための水性溶液。
【請求項２】
５〜１０μＭのカルベジロールの濃度、５〜１０μＭのタクロリムスの濃度、および０．０１μＭ〜１０μＭのトリメタジジンの濃度を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
ｐＨ６．５〜８およびオスモル濃度２９０〜３２０ミリモル／ｋｇを有し、
０．０１〜５ｍＭの濃度の、１５０００を超える分子量を有するポリエチレングリコールと、
２０〜４０ｍＭの濃度のラフィノースと、
１〜１０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、
１０〜４０ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、
３０〜５０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、
１１０〜１６０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、
７０〜１４０ｍＭの濃度のラクトビオン酸と
をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の溶液。
【請求項４】
ｐＨが７．４であり、オスモル濃度が３２０ミリモル／ｋｇであり、ポリエチレングリコールの濃度が０．０３ｍＭであり、ラフィノースの濃度が３０ｍＭであり、ＭｇＳＯ４の濃度が５ｍＭであり、Ｈ２ＰＯ４−の濃度が２５ｍＭであり、カリウムイオンの濃度が４０ｍＭであり、ナトリウムイオンの濃度が１２０ｍＭであり、ラクトビオン酸の濃度が１００ｍＭであり、タクロリムスの濃度が５μＭであり、カルベジロールの濃度が１０μＭであり、トリメタジジンの濃度が１μＭである、請求項３に記載の溶液。
【請求項５】
０．０３ｍＭの濃度の、約３５０００の分子量を有するポリエチレングリコールと、
３０ｍＭの濃度のラフィノースと、
５ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、
２５ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、
４０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、
１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、
１００ｍＭの濃度のラクトビオン酸と、
５μＭの濃度のタクロリムスと、
１０μＭの濃度のカルベジロールと、
１μＭの濃度のトリメタジジンと
からなる、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
１６ｇ／ｌの濃度のデキサメタゾンと、２００．０００Ｕ／Ｌの濃度のペニシリンとをさらに含んでなる、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
組織または臓器を保存するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の溶液の使用。
【請求項８】
臓器が腹部臓器である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
腹部臓器が辺縁臓器である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
組織および臓器を保存するための方法であって、前記組織または臓器を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の水性保存溶液中に、２〜１０℃の温度で維持することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、組織および臓器を保存するための水性溶液、特に、辺縁臓器を保存するための、その使用、ならびに組織および臓器を保存するための方法に関する。
【０００２】
背景技術
臓器移植は、末期慢性疾患の患者に選択される処置である。移植技術の改善が進展しているにもかかわらず、虚血期間およびその後の再潅流中に起こるグラフトの損傷は、まだ臨床実践において未解決の問題である。
【０００３】
ドナーからの摘出後レシピエントへのグラフト移植まで、そのような臓器（群）および組織群は、固有期間の虚血に曝される。そのため、そのような臓器および組織を保存するために用いる溶液は、ドナーの脱血、臓器を急速冷却、虚血による障害からの効果的な予防および保護の確保など、いくつかの要件を満たすものでなければならない。
【０００４】
静的低温保存は、短時間の虚血時の効果的な臓器保存法である。しかしながら、長時間の虚血は、肝移植における移植肝早期無機能(primary graft non-function)や腎移植におけるグラフト機能不全と関連している。虚血期間を延長する必要性に加えて、ドナー数に限りがあり、その結果として臓器移植待機リスト数が増加したことで、持続性虚血による損傷に十分耐えられない辺縁臓器を容認することに至った。肝移植の場合、辺縁臓器例えば脂肪変性グラフトの使用は、非脂肪変性グラフトと比較して、移植後のグラフトの早期無機能または機能不全の危険性の増大と関連している。加えて、一部の脂肪変性肝臓は、移植に適さないと考えられており、移植用臓器の不足を悪化させている。移植時に辺縁臓器に見られる損傷の大部分が低温保存期間に関するものであることは周知である。これらの観察結果から、臓器保存を最適化しなければならないことが示唆される。よって、臓器保存の主な目的は、虚血に対する臓器の耐性を延ばそうとすることである。
【０００５】
長時間の虚血の間維持される臓器の質にとって保存溶液の組成が決定的な因子であることを示す証拠がある。ウィスコンシン大学(University of Wisconsin)（ＵＷ）の保存溶液は、冷虚血によるダメージを減らすのに有効であると証明されており、保存期限を延ばしたことから、肝臓保存用の標準溶液であると考えられている。この保存溶液は、臓器保存を高めるための種々の成分を含み、それらの成分には、細胞浮腫を防ぐ膠質ヒドロキシエチルデンプン、再潅流時のＡＴＰ源としてのアデノシン、抗酸化作用を有するアロプリノールおよびグルタチオン、ならびに細胞膜非透過性物質例えばラクトビオン酸およびラフィノースが含まれる。しかしながら、この保存溶液、ＵＷは、冷虚血期間が延びたときに（１６時間〜２４時間）移植した臓器において不可逆的損傷が観察されたことから、その効力に関して制限がある。
【０００６】
タクロリムス（ＴＣＲ）は、効果的な免疫抑制活性、抗微生物活性および他の薬理活性を有するマクロライド化合物であり、臓器および組織の移植における拒絶反応の予防だけでなく自己免疫障害および感染症にも価値がある。保存溶液にタクロリムスを添加することにより再潅流損傷を防ぐことができることは知られている。タクロリムスを含有するＵＷ保存溶液は、文献(K. G. Rajesh et al., "Mitochondrial Permeability transition-pore inhibition enhances functional recovery after long-time hypothermic heart preservation", Transplantation, 2003, vol. 76 (9), pp. 1314-20)に記載されている。心臓の保存に対するタクロリムスの作用を評価した。しかし、タクロリムスには保存への効果がないと結論付けられた。
【０００７】
カルベジロール（ＣＶＤ）は、主として選択的α１受容体遮断によって発揮される血管拡張作用と、強い抗酸化作用とを有する親油性の非選択的β−アドレナリン遮断薬である。カルベジロールが脂質過酸化を阻害する能力は、検証した他のβ−アドレナリン遮断薬よりもずっと高く、それが虚血／再潅流モデルにおいてカルベジロールの保護効果が優れていることの理由である。保存溶液に抗酸化剤、例えばカルベジロール、を添加することは、文献(B. Yard et al., "Prevention of cold-preservation injury of cultured endothelial cells by catecholamines and related compounds", American Journal of transplantation, 2004, vol. 4, pp. 22-30参照)に示唆されているが、これまでにカルベジロールを含んでなる特定の保存溶液が開示されたことはない。
【０００８】
最近の研究で、ＵＷ保存溶液にトリメタジジン（ＴＭＺ）を添加することで、長時間の虚血に曝された非脂肪変性肝臓と、特に脂肪変性肝臓との両方においてこの標準保存溶液の保護能力が向上することが明らかになっている(I. Ben Mosbah et al. "Trimetazidine: Is it a promising drug for use in steatotic grafts?", World J Gastroenterol, 2006, vol. 12(6), pp. 908-914参照)。
【０００９】
しかし、ＵＷ液の一部の性質、例えばカリウム濃度が高いこと（レシピエントにおけるグラフト再潅流前に臓器に流すために必要である）および膠質浸透圧維持剤(oncotic support)としてヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が存在すること（これは赤血球凝集に関与し得る）は、臓器保存には不都合である。最近の研究で、どちらの肝臓グラフト（脂肪変性グラフトおよび非脂肪変性グラフト）も、オリジナルのＵＷ液においてＫ＋濃度とＮａ＋濃度を逆にしＨＥＳをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に置き換えたことを特徴とする改変ＵＷ保存溶液（ＩＧＬ−１と呼ばれる）中でより良く保存されることが証明されている(I. Ben Mosbah et al., "Preservation of steatotic livers in IGL-1 solution", Liver Transpl, 2006, vol. 12 (8), pp. 1215-23参照)。その一方で、ＩＧＬ−１液によって改善がもたらされたにもかかわらず、虚血−再潅流（Ｉ／Ｒ）の有害な影響は、依然として未解決のままである。
【００１０】
虚血に対する臓器の耐性を延ばし、移植に供される辺縁臓器の固有の危険性を最小限に抑えることを可能にする保存溶液を見つけることがなお必要である。
【発明の概要】
【００１１】
タクロリムス、カルベジロール、またはトリメタジジンを含有する保存溶液は先行技術において公知であるかまたは示されているが、これら３つの活性医薬品成分の組合せを含んでなる組織および臓器保存用水性溶液はまだ示されていない。本発明者らは、驚くべきことに、タクロリムス、カルベジロール、およびトリメタジジンの組合せを含有する保存溶液が、長時間の虚血に曝された組織および臓器の保存能力を相乗的に向上させることを見出した。特に、この相乗作用は、辺縁臓器、例えば脂肪変性肝臓において特に明白であり、この相乗作用によって、移植に利用できるが不十分な術後結果を伴う辺縁臓器の初期状態が改善され、現在移植では廃棄されている臓器の使用も増えるため移植に利用できる臓器の量が増加することから、前記溶液は特に有利なものとなる。
【００１２】
よって、本発明の一つの態様は、有効量のカルベジロール、有効量のタクロリムス、および有効量のトリメタジジンを含んでなる、組織および臓器の保存のための水性保存溶液に関する。
【００１３】
本発明の水性保存溶液は、他の公知の保存溶液で実現するよりも長い時間組織または臓器を維持することを可能にする。本発明の保存溶液のもう１つの利点は、本発明の保存溶液は組織または臓器が正常に機能する時間を延長することが可能であり、その組織または臓器は他の保存溶液で実現するものと比べて移植に有用であるということである。
【００１４】
本発明の第二の態様は、組織または臓器を保存するための、本発明の水性溶液の使用に関する。その溶液は、ヒトをはじめとする哺乳類の組織または臓器に適用することができる。前記組織の例は、静脈および動脈である。
【００１５】
組織および臓器を保存するための方法であって、前記組織または臓器を本発明の水性溶液中に２〜１０℃の温度で維持することを含む方法もまた本発明の一部をなす。本発明の水性保存溶液に組織または臓器を浸漬することにより、組織または臓器の移植および移植拒絶に関連した再潅流損傷は予防される。
【００１６】
本明細書において、有効成分「の有効濃度」という句は、組織または臓器を保存するために有用である有効成分の量である。
【００１７】
当業者には明らかなように、本明細書において示すいずれの数値範囲も、求められる効果を失うことなく拡大または変更し得る。よって、示す範囲、例えば濃度などは、特に断りのない限り、近似値であると考えるべきである。
【００１８】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含んでなる」という語およびその語の語尾変化型は、他の技術的特徴、添加物、成分または工程を排除するものではない。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明の水性溶液は、ドナーからの摘出時と、それらの保存、輸送およびレシピエントへの最終的な移植の間に、組織または臓器に適用することができる。本発明の水性溶液は、短時間の虚血に用いることができ、また、本質的には長時間の虚血に用いることができる。
【００２０】
本発明の水性溶液の好ましい実施態様において、カルベジロールの濃度は５〜１０μＭであり、タクロリムスの濃度は５〜１０μＭであり、トリメタジジンの濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである。
【００２１】
細胞および組織の浮腫形成を回避するために、本発明の水性溶液は、膠質浸透圧の保証を可能にする、１５０００を超える分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでなる。好ましくは、用いるＰＥＧは分子量３５０００のＰＥＧである。より好ましくは、ＰＥＧは、非線状精製ＰＥＧ、すなわち低分子量のＰＥＧ分子から合成したＰＥＧである。
【００２２】
よって、もう１つの好ましい実施態様において、本発明の水性溶液は、ｐＨ６．５〜８およびオスモル濃度２９０〜３２０ミリモル／ｋｇを有し、０．０１〜５ｍＭの濃度の、１５０００を超える分子量を有するＰＥＧと、２０〜４０ｍＭの濃度のラフィノースと、１〜１０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、１０〜４０ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、３０〜５０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、１１０〜１６０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、７０〜１４０ｍＭの濃度のラクトビオン酸とをさらに含んでなる。
【００２３】
さらにもう１つの好ましい実施態様において、本発明の水性溶液は、ｐＨ７．４、オスモル濃度３２０ミリモル／ｋｇを有し、１５０００を超える分子量を有するＰＥＧの濃度は０．０３ｍＭであり、ラフィノースの濃度は３０ｍＭであり、ＭｇＳＯ４の濃度は５ｍＭであり、Ｈ２ＰＯ４−の濃度は２５ｍＭであり、カリウムイオンの濃度は４０ｍＭであり、ナトリウムイオンの濃度は１２０ｍＭであり、ラクトビオン酸の濃度は１００ｍＭであり、タクロリムスの濃度は５μＭであり、カルベジロールの濃度は１０μＭであり、トリメタジジンの濃度は１μＭである。好ましくは、ＰＥＧは約３５０００の分子量を有する。
【００２４】
移植する臓器が廃棄される主な原因が脂肪変性であることは周知である。本発明の保存溶液の上記の好ましい実施態様は、肝移植に関連した虚血−再潅流損傷に対する脂肪変性肝臓の耐性を高めることを可能にする。この事実によって、脂肪変性グラフトの移植後の機能が改善され、移植に適した臓器の利用可能性が高まる。
【００２５】
本発明の特に好ましい水性溶液は、次の成分：
０．０３ｍＭの濃度の、約３５０００の分子量を有するポリエチレングリコールと、
３０ｍＭの濃度のラフィノースと、
５ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、
２５ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、
４０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、
１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、
１００ｍＭの濃度のラクトビオン酸と、
５μＭの濃度のタクロリムスと、
１０μＭの濃度のカルベジロールと、
１μＭの濃度のトリメタジジンと
からなり、ｐＨ７．４およびオスモル濃度３２０ミリモル／ｋｇを有する。
【００２６】
より好ましくは、この保存溶液は、１６ｇ／ｌの濃度のデキサメタゾンと、２００．０００Ｕ／Ｌの濃度のペニシリンとをさらに含んでなる。
【００２７】
本発明の保存溶液のこれら２つの好ましい実施態様は、他の既知保存溶液（例えばＵＷ保存溶液および／またはＩＧＬ−１保存溶液）に含まれているが効果がないことあるいは保存する臓器に有害な影響があることが証明されている特定の薬物、例えばＧＳＨ、ＨＥＳ、インスリン、アロプリノール、およびアデノシンを含まない。これらの好ましい保存溶液は、他の保存溶液で得られる結果と比較して脂肪変性肝臓と非脂肪変性肝臓の両方に対して保護を与えることから、これら好ましい保存溶液について特に重要な相乗効果が認められている。
【００２８】
上述のとおり、本発明のさらなる態様は、組織または臓器を保存するための、本明細書において記載し主張する水性溶液の使用に関する。好ましい実施態様において、臓器は、腹部臓器、例えば肝臓、腎臓、および膵臓である。好ましくは、腹部臓器は辺縁臓器であり、より好ましくは脂肪変性肝臓である。
【００２９】
本発明の保存溶液は、静的低温保存に適用され、２〜１０℃、好ましくは３〜５℃、より好ましくは４℃の温度で用いられる。
【００３０】
さらに、本発明は、上記の特定の好ましい群のあらゆる可能な組合せを包含する。
【００３１】
本発明のさらなる目的、利点および特徴は、本明細書からある程度は、そして本発明の実施からもある程度は当業者には明らかになるであろう。次の実施例および図面は、例示として示しており、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：水性保存溶液の調製
表１に示す組成の水性溶液を、以下に開示する方法に従って調製した。
【００３３】
【表１】
2011520945.tif 000002
【００３４】
工程１：
１ｇの透析したポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ３５．０００）を含有する溶液に、４．１１ｍｇのタクロリムス（ＴＣＲ）を加え、攪拌して第１の溶液を作製した。
【００３５】
工程２：
室温で８００ｍｌの水（蒸留脱イオン水）が入った１ｌ容器に３５．８３ｇのラクトビオン酸を加え、溶解するまで攪拌した。次いで、０．６０ｇのＭｇＳＯ４、２２．５ｍＬの５Ｎ  ＮａＯＨ、６ｍＬの５Ｎ  ＫＯＨ、３．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、および１７．８３ｇのラフィノースを加えて第２の溶液を作製した。続いて、この第２の溶液に、１ｍＬのストック液のＴＭＺ含有溶液（ストック液：１０ｍｌの水に２．６６ｍｇのＴＭＺが溶解している）と１０ｍｌのストック液のＣＶＤ（ストック液；８ｍｌの酒石酸と８ｍｌの水の中に６．５ｍｇのカルベジロール）を加えた。
【００３６】
工程１で調製した溶液を、工程２で調製した溶液と混合した後、ｐＨを７．４±０．１に調整する必要に応じて５Ｎ  ＮａＯＨを加えた。
【００３７】
最後に、その容器に水を加えて容量を１ｌにした後、その溶液を濾過し、滅菌した。オスモル濃度３２０±１０ｍＯｓｍ／Ｌの溶液を得た。使用前に、デキサメタゾン（１６ｇ／Ｌ）およびペニシリン（２００，０００Ｕ／Ｌ）を加えた。
【００３８】
実施例２
この実施例において、肝臓に対する本発明の水性溶液の効果を、ＵＷ保存溶液およびＩＧＬ−１保存溶液を用いたときに得られる効果と比較した。
【００３９】
肝損傷および機能は、トランスアミナーゼ、胆汁産生、肝クリアランス（％ＢＳＰ）およびＡＴＰ含量を測定することにより評価した。
【００４０】
この実験を実施するために、Iffa-Credo(L'Abresle, France)から購入した１６〜１８週齢の、ホモ接合型（肥満型，Ｏｂ）およびヘテロ接合型（痩せ型，Ｌｎ）のＺｕｃｋｅｒラットを用いた。他の臓器、血漿成分および神経／ホルモンの作用に影響を及ぼさないように、摘出潅流肝を用いて肝損傷および機能を評価した。この実験モデルでは肝臓構造、微小循環および胆汁産生は保存される。用いたこの実験モデルは、文献において、種々の移植用保存溶液の有効性を検証するのに用いられるものとされている。総ての手順はイソフラン吸入麻酔下で行った。この研究では動物実験に関して欧州連合(European Union)の規制（指令８６／６０９／ＣＥＥ）を順守した。
【００４１】
肝臓入手および実験群
先行研究に記載のとおり、外科技術を実施した(I. Ben Mosbah, et al. "Preservation of steatotic livers in IGL-1 solution", Liver Transpl 2006, vol. 12 (8), pp. 1215-23、およびI. Ben Mosbah et al. "Addition of adenosine monophosphate-activated protein kinase activators to University of Wisconsin solution: a way of protecting rat steatotic livers", Liver Transpl., 2007, vol. 13(3), pp. 410-25)。総胆管カニューレ挿入の後、門脈を分離し、脾臓枝および幽門枝を結紮した。以下に示すとおり、総ての動物を以下の実験群に無作為に分けた。
【００４２】
保存溶液および実験群
ＵＷ保存溶液、ＩＧＬ−１保存溶液およびＰ１保存溶液の組成を表２に示す。Ｐ１は本発明による保存溶液である。
【００４３】
【表２】
2011520945.tif 000003
【００４４】
Ａ）研究Ｉ：Ｐ１対ＵＷ液
１）ＵＷ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓をＵＷ液中に４℃で２４時間保存した。
２）ＵＷ＋ＣＶＤ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１０μＭのカルベジロールを含有するＵＷ液中に４℃で２４時間保存した。
３）ＵＷ＋ＴＭＺ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１μＭのトリメタジジンを含有するＵＷ液中に４℃で２４時間保存した。
４）ＵＷ＋ＴＣＲ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、５μＭのタクロリムスを含有するＵＷ液中に４℃で２４時間保存した。
５）ＵＷ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺ＋ＴＣＲ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１０μＭのカルベジロール、１μＭのトリメタジジン、および５μＭのタクロリムスを含有するＵＷ液中に４℃で２４時間保存した。
【００４５】
１〜５群で得られた結果を、１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓をＰ１保存溶液中に４℃で２４時間保存したときに得られた結果と比較した。
【００４６】
Ｂ）研究ＩＩ：Ｐ１対ＩＧＬ−１
１）ＩＧＬ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓をＩＧＬ−１液中に４℃で２４時間保存した。
２）ＩＧＬ＋ＣＶＤ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１０μＭのカルベジロールを含有するＩＧＬ−１液中に４℃で２４時間保存した。
３）ＩＧＬ＋ＴＭＺ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１μＭのトリメタジジンを含有するＩＧＬ−１液中に４℃で２４時間保存した。
４）ＩＧＬ＋ＴＣＲ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、５μＭのタクロリムスを含有するＩＧＬ−１液中に４℃で２４時間保存した。
５）ＩＧＬ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺ＋ＴＣＲ：１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓を、１０μＭのカルベジロール、１μＭのトリメタジジン、および５μＭのタクロリムスを含有するＩＧＬ−１液中に４℃で２４時間保存した。
【００４７】
１〜５群で得られた結果を、１６匹のＺｕｃｋｅｒラット（８匹のＬｎおよび８匹のＯｂ）の肝臓をＰ１保存溶液中に４℃で２４時間保存したときに得られた結果と比較した。
【００４８】
手順
グラフトの２４時間の冷保存後に、長時間虚血後のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の累積レベルを測定した。加えて、グラフトの２４時間の冷保存後に、レシピエントへの移植手術中にそのグラフトが受ける温虚血期間を再現するために、肝臓を２２℃に３０分間曝した。次いで、肝臓を、門脈を通じて再循環潅流システムに連結し、３７℃で１２０分間潅流した。潅流の最初の１５分間、徐々に流量を増加して門脈圧を１２ｍｍＨｇで安定させた(Pression Monitor BP-1, Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)。流量は蠕動ポンプ(Minipuls 3, Gilson, France)を用いて制御した。潅流液は、クレブス−ハインゼライト−アルブミン溶液(the Krebs-Heinseleit-albumin solution)を含む細胞培養培地（ウィリアム培地Ｅ, Bio Whitaker, Spain）からなった。潅流液には９５％Ｏ２および５％ＣＯ２ガス混合物により酸素を送り込み、潅流液の温度を３７℃に維持した。常温再潅流（１２０分）終了時に、潅流液のアリコートを集めてＡＬＴを評価した。胆汁産生および胆汁サンプルにおける肝クリアランス（％ＢＳＰ）ならびに肝臓サンプルにおけるＡＴＰ含量も評価した。
【００４９】
生化学的測定
トランスアミナーゼアッセイ：Boehringer Mannheim(Munich, Germany)社製の市販のキットに提供されている使用説明書に従って、肝損傷のパラメーターとしてトランスアミナーゼを評価した。
【００５０】
胆汁産生：肝機能のパラメーターとして胆汁産生を評価した。胆管を通じて胆汁を集め、１２０分潅流後に得られた胆汁量を測定することにより胆汁産生を評価し、肝臓１ｇ当たりの量（μｌ）として報告した。
【００５１】
ＢＳＰ肝クリアランス：胆汁産生と同様に、ＢＳＰ肝クリアランスはもう１つの信頼できる肝機能パラメーターであると考えられている。潅流開始３０分後、潅流液に１０ｍｇのＢＳＰ（スルホブロモフタレイン）を添加した。５８０ｎｍで吸光度を測定することにより胆汁サンプルにおけるＢＳＰの濃度を決定した。ＢＳＰ肝クリアランスは％ＢＳＰとして表した。
【００５２】
ＡＴＰ：過塩素酸を含有する溶液中で肝臓サンプルをホモジナイズし、高速液体クロマトグラフィーによりＡＴＰレベルを測定した。
【００５３】
統計的研究
データは平均値±標準誤差として表した。得られたデータを分散分析検定による統計的研究に用い、スチューデント・ニューマン・クールズの検定により統計的有意水準を決定した。総ての場合において、それらの結果はｐ＜０．０５の場合に有意差があるとみなされた。
【００５４】
ＡＬＴレベルを評価してグラフト保存期間後の肝損傷を予測した。この方法は、冷保存後の臓器ダメージを予測するための有益な手段である。脂肪変性肝臓では、冷虚血終了時に、ＵＷ液またはＩＧＬ液のいずれかの中で保存した非脂肪変性肝臓と比べて高いレベルのトランスアミナーゼが観察された。これは、冷虚血中に起こる有害な影響に対して脂肪変性肝臓の耐性が低いことを裏付けている。
【００５５】
ＵＷ液中で保存したグラフトについての冷虚血終了時のＡＬＴ値（Ｕ／Ｌ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、３２．８７±２．９１および１５２．２３±２．２１であった。ＩＧＬ液中で保存したグラフトについての冷虚血終了時のＡＬＴ値（Ｕ／Ｌ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、２１．４４±０．６２および８７．４７±３．２０であった。
【００５６】
脂肪変性肝臓では、再潅流終了時に、非脂肪変性肝臓において見られたものと比べて高いトランスアミナーゼレベルが観察された。ＵＷ保存溶液中で保存したグラフトについての再潅流終了時のＡＬＴ値（Ｕ／Ｌ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、４５．０５±３．５３および１５９．１１±３．０１であった。ＩＧＬ保存溶液中で保存したグラフトについての再潅流終了時のＡＬＴ値（Ｕ／Ｌ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、３５．６２±２．３２および１２１．４１±１．２３であった。
【００５７】
胆汁産生および肝クリアランス（％ＢＳＰ）を測定することにより肝機能を評価した。ＵＷ液中またはＩＧＬ液中のいずれかで保存した脂肪変性肝臓では、胆汁産生および％ＢＳＰは非脂肪変性肝臓よりも低かった。ＵＷ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時の胆汁産生値（μｌ／ｇ／１２０分）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、９．５５±０．２５および１．４６±０．１８であった。ＩＧＬ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時の胆汁産生値（μｌ／ｇ／１２０分）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、１４．２５±０，６３および３．４４±０．３８であった。ＵＷ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時の胆汁における％ＢＳＰ値は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、６．１３±１．１３および４．７０±０．６５であった。ＩＧＬ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時の胆汁における％ＢＳＰ値は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、８．０４±０．６１および７．３４±０．５８であった。
【００５８】
ＵＷ液中またはＩＧＬ−１液中のいずれかで保存した脂肪変性肝臓では、再潅流終了時に、非脂肪変性肝臓での記録よりも低いＡＴＰレベルが観察された。ＵＷ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時のＡＴＰ値（μＭ／ｇ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、０．９０±０．０２および０．６１±０．０３であった。ＩＧＬ液中で保存した肝臓についての再潅流終了時のＡＴＰ値（μＭ／ｇ）は、非脂肪変性肝臓および脂肪変性肝臓それぞれでは、１．１９±０．０９および０．７７±０．０６であった。
【００５９】
以下の表３〜６は、公知の保存溶液へのタクロリムス（ＴＣＲ）、カルベジロール（ＣＶＤ）、およびトリメタジジン（ＴＭＺ）の添加についての効果と、脂肪変性肝臓および非脂肪変性肝臓を長時間の虚血に曝したときの実施例１の保存溶液（Ｐ１）の効果を示している。値は、損傷および肝機能のパラメーターについての、ＵＷ保存溶液またはＩＧＬ−１保存溶液からの保護率として表している：２４時間の虚血終了時（０分）のＡＬＴ、１２０分の再潅流終了時（１２０分）のＡＬＴ、再潅流終了時（１２０分）の胆汁産生、％ＢＳＰ、およびＡＴＰ含量。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
【表４】
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【００６２】
【表５】
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【００６３】
【表６】
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【００６４】
肝損傷および肝機能のパラメーターによれば、ＵＷ保存溶液またはＩＧＬ−１保存溶液への、タクロリムス、カルベジロールおよびトリメタジジンの組み合わせた添加（ＵＷ＋ＴＣＲ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺまたはＩＧＬ−１＋ＴＣＲ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺ）は、脂肪変性肝臓と非脂肪変性肝臓に対して、ＵＷ保存溶液（すなわち［ＵＷ＋ＴＣＲ］＋［ＵＷ＋ＣＶＤ］＋［ＵＷ＋ＴＭＺ］）またはＩＧＬ−１（すなわち［ＩＧＬ＋ＴＣＲ］＋［ＩＧＬ＋ＣＶＤ］＋［ＩＧＬ＋ＴＭＺ］）保存溶液へ単独で、タクロリムス、カルベジロールおよびトリメタジジンを添加したときに得られた結果と比べて高い程度の保護をもたらすということを我々の結果は示している。さらに、保存溶液Ｐ１は、脂肪変性肝臓と非脂肪変性肝臓の両方に対して、ＵＷ＋ＴＣＲ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺおよびＩＧＬ−１＋ＴＣＲ＋ＣＶＤ＋ＴＭＺで得られた結果と比べて高い程度の保護を与えた。
【００６５】
要約すると、表３〜６に示した結果から、本発明の溶液では相乗作用が観察され、そしてそれはＰ１保存溶液で特に明白であると言える。この相乗作用は脂肪変性肝臓において特に改善される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
図（１〜１０）は、いくつかの公知の保存溶液へのタクロリムス（ＴＣＲ）、カルベジロール（ＣＶＤ）、およびトリメタジジン（ＴＭＺ）の添加についての効果と、脂肪変性（Ｓ）肝臓および非脂肪変性（ＮＳ）肝臓を長時間の虚血に曝したときの実施例１の保存溶液（Ｐ１）の効果を示している。図において、％Ｐは保護率を表すものである。
【図１】虚血期間終了時（０分）にＡＬＴ値を評価したときのＵＷ保存溶液からの保護率を示す図である。
【図２】再潅流終了時（１２０分）にＡＬＴ値を評価したときのＵＷ保存溶液からの保護率を示す図である。
【図３】再潅流終了時（１２０分）に胆汁産生を評価したときのＵＷ保存溶液からの保護率を示す図である。
【図４】再潅流中に胆汁においてＢＳＰ肝クリアランス％を評価したときのＵＷ保存溶液からの保護率を示す図である。
【図５】再潅流終了時（１２０分）にＡＴＰレベルを評価したときのＵＷ保存溶液からの保護率を示す図である。
【図６】虚血期間終了時（０分）にＡＬＴ値を評価したときのＩＧＬ−１保存溶液からの保護率を示す図である。
【図７】再潅流終了時（１２０分）にＡＬＴ値を評価したときのＩＧＬ−１保存溶液からの保護率を示す図である。
【図８】再潅流終了時（１２０分）に胆汁産生を評価したときのＩＧＬ−１保存溶液からの保護率を示す図である。
【図９】再潅流中に胆汁においてＢＳＰ肝クリアランス％を評価したときのＩＧＬ−１保存溶液からの保護率を示す図である。
【図１０】再潅流終了時（１２０分）にＡＴＰレベルを評価したときのＩＧＬ−１保存溶液からの保護率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月19日(2011.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のカルベジロール、有効量のタクロリムス、および有効量のトリメタジジンを含んでなる、組織および臓器の保存のための水性溶液。
【請求項２】
５〜１０μＭのカルベジロールの濃度、５〜１０μＭのタクロリムスの濃度、および０．０１μＭ〜１０μＭのトリメタジジンの濃度を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
１５０００を超える分子量を有するポリエチレングリコールをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の溶液。
【請求項４】
ｐＨ６．５〜８およびオスモル濃度２９０〜３２０ミリモル／ｋｇを有し、
０．０１〜５ｍＭの濃度の、１５０００を超える分子量を有するポリエチレングリコールと、
２０〜４０ｍＭの濃度のラフィノースと、
１〜１０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、
１０〜４０ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、
３０〜５０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、
１１０〜１６０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、
７０〜１４０ｍＭの濃度のラクトビオン酸と
をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項５】
ｐＨが７．４であり、オスモル濃度が３２０ミリモル／ｋｇであり、ポリエチレングリコールの濃度が０．０３ｍＭであり、ラフィノースの濃度が３０ｍＭであり、ＭｇＳＯ４の濃度が５ｍＭであり、Ｈ２ＰＯ４−の濃度が２５ｍＭであり、カリウムイオンの濃度が４０ｍＭであり、ナトリウムイオンの濃度が１２０ｍＭであり、ラクトビオン酸の濃度が１００ｍＭであり、タクロリムスの濃度が５μＭであり、カルベジロールの濃度が１０μＭであり、トリメタジジンの濃度が１μＭである、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
０．０３ｍＭの濃度の、約３５０００の分子量を有するポリエチレングリコールと、
３０ｍＭの濃度のラフィノースと、
５ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４と、
２５ｍＭの濃度のＨ２ＰＯ４−と、
４０ｍＭの濃度のカリウムイオンと、
１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオンと、
１００ｍＭの濃度のラクトビオン酸と、
５μＭの濃度のタクロリムスと、
１０μＭの濃度のカルベジロールと、
１μＭの濃度のトリメタジジンと
からなる、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
１６ｇ／ｌの濃度のデキサメタゾンと、２００．０００Ｕ／Ｌの濃度のペニシリンとをさらに含んでなる、請求項６に記載の溶液。
【請求項８】
ＧＳＨ、ＨＥＳ、インスリン、アロプリノール、およびアデノシンを含まないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項９】
組織または臓器を保存するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の溶液の使用。
【請求項１０】
臓器が腹部臓器である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
腹部臓器が辺縁臓器である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
辺縁臓器が脂肪変性肝臓である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
組織および臓器を保存するための方法であって、前記組織または臓器を、請求項１〜８のいずれか一項に記載の水性保存溶液中に、２〜１０℃の温度で維持することを含んでなる、方法。
【国際調査報告】
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