(57)【要約】  磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出するステップは、前記磁化されたか又は磁化可能な成分を結合表面に引き付けるために磁場発生装置（Ｍ１、２８）を使用する。磁場制御装置（Ｃ１）は、前記磁化されたか又は磁化可能な成分を集めて結合表面上でコラムにするために磁場を適用し、後に、磁場を減らして、コラムが崩壊するのを可能にし、より多くの成分が結合表面に達するのを可能にし、さらに、他の成分が結合表面から除去され、前記結合した標的成分に基づきコラムを再形成するように磁場を再適用する。表面感受性センサ（Ｓ１、２６、２９）は、結合された前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出する。磁場の再適用は、不要な非特異的吸着結合を放出し標的を残すための磁気洗浄ステップとして作用し、簡略化されたハードウェア、並びに、抑えられたコスト及び減少されたサイズで感度を改善する。
2011506923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出するためのセンシング装置であって、
前記標的成分に選択的に結合するのに適した結合表面に前記磁化されたか又は磁化可能な成分を引き付けるために磁場を提供するようにされた磁場発生装置、
前記磁化されたか又は磁化可能な成分を集めて前記結合表面上でコラムにするために磁場を適用し、後に、前記磁場を減らして前記コラムが崩壊するのを可能にし、より多くの前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分が前記コラムから前記結合表面に結合するのを可能にし、さらに、他の磁化されたか又は磁化可能な成分が前記結合表面から除去され、前記結合した標的成分に基づきコラムを再形成するよう前記磁場を再度適用するように、前記磁場発生装置を制御するようにされた磁場制御装置、及び、
前記結合表面に結合された前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出するための表面感受性センサ、
を有する、センシング装置。
【請求項２】
前記制御装置が、前記結合表面に対する特異的結合と非特異的結合とを区別するのに十分な強度で前記磁場を再適用するようされる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記センサが光学検出器を含む、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記磁場発生装置が、永久磁石、及び、該永久磁石を動かすための機械的配置を含んだ前記制御装置を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記磁場発生装置が、電磁石、及び、該電磁石を通る電流を制御するための回路を含んだ前記制御装置を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記流体を保持するためのチャンバを含み、前記チャンバは前記結合表面を有する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
多数の結合表面を有し、各結合表面は、異なる標的成分に結合するのに適している、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記センサは、前記結合表面にて前記標的成分により放出された蛍光を検出するよう配置される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記検出器は、異なる時間に多くの読み取りを行うようにされ、前記読み取りから結果を導くプロセッサを有する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出する方法であって、
結合表面に前記磁化されたか又は磁化可能な成分を引き付けるために磁場を適用し、前記磁化されたか又は磁化可能な成分を集めて前記結合表面上でコラムにするステップ、前記磁場を減らして、前記コラムが崩壊するのを可能にし、より多くの前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分が前記コラムから前記結合表面に結合するのを可能にするステップ、及び、他の磁化されたか又は磁化可能な成分が前記結合表面から除去され、前記結合した標的成分に基づきコラムを再形成するよう前記磁場を再度適用するステップ、並びに、
前記結合表面に結合された前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出するステップ、
を有する、方法。
【請求項１１】
前記再適用するステップが、前記結合表面に対する特異的結合と非特異的結合とを区別するのに十分な強度で前記磁場を再適用するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出するセンシング装置、対応する検出方法、そのような装置を制御するのに使用するためのソフトウェア、及び、そのような装置の対応する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス、原生動物、細菌、その細胞小器官、リポソーム等の微生物学的存在物と蛋白質又はＤＮＡ等の生物活性分子との相互作用を決定するために、蛋白質マイクロアレイ又は他の方法等、生化学及び薬物診断アッセイを使用することは既知である。
【０００３】
米国公開特許出願第２００５／００４８５９９  Ａ１号は、（例えば磁気等の）力が及ぼし得るように粒子でタグをつけた微生物の調査方法を開示している。この方法の一実施形態では、光ビームが、透明な材料を通り抜け、光が完全に内部に反射される表面まで向けられている。エバネッセント波として透明な材料を離れるこのビームの光は、表面にて微生物及び／又は他の成分によって拡散され、次に、光検出器によって検出されるか、又は、目視観察のために微生物を照らすよう使用される。
【０００４】
米国公開特許出願第２００６／２０５０９３号によると、バイオセンシングの挑戦は、低濃度の特異的な標的分子（例えば、ｐｍｏｌ／ｌ以下の範囲の腫瘍マーカー）を、高濃度のバックグラウンド材料（例えば、ｍｍｏｌ／ｌのアルブミン）を有した複雑な混合液（例えば血液）において検出することであると記載されている。１つの一般的なバイオセンシング法は、（例えば、抗体、核酸等の）捕獲分子で表面を被覆することである。これらの分子は標的を捕獲し、その標的は後に検出される。標的分子の検出は、ラベルの有無を問わず行うことができる。ラベリングステップは、表面上での捕獲前又は捕獲後に発生し得る。ラベルは、標的に直接、又は、例えば別の生物活性分子を介して間接的に結合することができる。最も頻繁に、例えば蛍光分子等、光学ラベルが検出に使用される。
【０００５】
バイオセンシングにおける重要な問題は、バイオセンサの表面又は捕獲分子に対する検出ラベル又は標的分子の非特異的結合である。これによってバックグラウンド信号が生じ、バイオセンサの分析感度及び特異性が減少する。診断アッセイにおいて、非特異的結合は、ストリンジェンシー処置を利用することによって抑えることができる。ストリンジェンシー処置は、不要な非特異的吸着結合を放出し、捕獲分子と（ラベルされた）標的分子との特異的な相互作用だけを維持することを目的としている。最も一般的なストリンジェンシー法は、洗浄ステップである。洗浄液の組成物及び温度は、所与のアッセイに対するバックグラウンドを抑えるよう注意深く調整される。
【０００６】
バイオチップ又は（マイクロ）アレイと呼ばれる、１つの表面上で多数の異なる分子が同時に測定される多検体検出に対する関心が増してきている。バイオチップ表面は多数のスポット（「捕獲スポット」）から構成され、全てのスポットは、異なる捕獲分子又は複数の捕獲分子を含んでいる。広範囲の異なる特異的相互作用が乱されないまま残り、異なる標的及び捕獲分子の本来の状態が保存されなくてはならない中で多くの生じうるバックグラウンド信号が抑制される必要があるため、多検体センサに対してストリンジェントなチップ全体の洗浄ステップを展開することは困難である。結果、より低い分析感度及びより低い分析特異性が生じる。複数の蛋白質及び蛋白質−蛋白質の相互作用は非常に不均質であるため、多検体ストリンジェンシーの問題は、蛋白質の検出にとって非常に深刻であり、複数の蛋白質の変性及び蛋白質−蛋白質相互作用に対する特定の洗浄ステップの効果は非常に有意であり得る。
【０００７】
この蛋白質アレイ又はマイクロアレイの主要な欠点は、顕微鏡ガラススライドへの未変性蛋白質の適用を記載した論文Ｍａｃｂｅａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，  １７６０−１７６３において認識されてきた。非特異的な蛋白質−蛋白質結合は、標的分子との結合に先立ち捕獲分子上にＢＳＡを添加することによって減らされる。蛋白質マイクロアレイ技術に対する２００２年１２月の評論記事（Ｍａｃｂｅａｔｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２，Ｓ５２６−５３２）には、見込みのある解決策が示唆されることなく蛋白質アレイ技術のキーとなる特徴として特異性を評価する問題が言及されている。これまでに最も好結果を残した蛋白質アレイ技術の適用は、免疫学の分野において達成されている。抗原と抗体との高い結合力により、抗原と抗体との非特異的な相互作用を克服するストリンジェントな洗浄条件が可能である。
【０００８】
ストリンジェンシー問題に取り組む化学的方法は、標的とより強固且つより特異的に相互作用することができる捕獲分子を設計することによる。例として、標的分子の特異的部位にて架橋することができる光反応性の群を担持する光アプタマー（ｐｈｏｔｏ−ａｐｔａｍｅｒ）合成捕獲分子がある（Ｂｒｏｄｙ＆Ｇｏｌｄ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７，５−１３において概説）。光アプタマーを含んだ捕獲表面が試料に曝露され、光励起ステップが適用される場合、アプタマー結合部位に適合する分子は、そこに共有結合的に連結されることになる。後に、厳格な洗浄ステップを適用して、光化学反応しなかった分子を取り除くことができる。光アプタマー法の欠点は、標的ごとに新たな光アプタマーの設計を要すること、光励起ステップが必要とされること、光架橋ステップ自体は特異的及び非特異的に結合された分子を区別しないこと、並びに、終点検出法であることである。
【０００９】
米国公開特許出願第２００６／２０５０９３号は、少なくとも、例えばビーズ等の第１の粒子又はマイクロキャリア、及び、同様に、例えば第２のビーズ等のマイクロキャリアであり得る第２の粒子を使用して生物活性分子間の相互作用を決定するステップを記載している。少なくとも、第１のマイクロキャリアは磁気を帯びている。２つのビーズが使用され且つどちらのビーズも磁気を帯びている場合、ビーズは、その磁気モーメントの大きさにおいて異なっていることが好ましい。ストレスの下、生物活性分子間に結合を配置し、その結果、異なる力の結合を区別するために磁場が提供されている。１つの態様では、（より大きな磁気モーメントを有した）第２のビーズを使用して、捕獲分子（それ自体は、一般的に、可動性又は不動性の表面に結合される）に弱結合されたより小さな磁気モーメントを有したビーズに連結された標的分子を磁気的に取り除く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出するための改善されたセンシング装置、対応する検出方法、そのような装置を制御するのに使用するためのソフトウェア、及び、そのような装置の対応する製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様によると、本発明は、
磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出するためのセンシング装置を提供しており、当該装置は、
前記標的成分に選択的に結合するのに適した結合表面に前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を引き付けるために磁場を提供するようにされた磁場発生装置、
前記磁化されたか又は磁化可能な成分を集めて結合表面上でコラムにするために磁場を適用し、後に、前記磁場を減らして前記コラムが崩壊するのを可能にして、より多くの前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分が前記コラムから前記結合表面に結合するのを可能にし、さらに、他の磁化されたか又は磁化可能な成分が前記結合表面から除去され、前記結合した標的成分に基づきコラムを再形成するよう前記磁場を再度適用するように、前記磁場発生装置を制御するようにされた磁場制御装置、及び、
前記結合表面に結合された前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出するための表面感受性センサ
を有している。
【００１２】
そのような（磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出表面に引き付けるために初めに使用された）磁場の再適用は、不要な弱又は非特異的吸着結合を放出して受容体と標的成分との特異的結合のみを維持する磁気洗浄ステップとして作用するという驚くべき効果を有し得る。以前には、そのような洗浄ステップは、不要な磁化されたか又は磁化可能な成分を反対の方向に引き付けるために、結合表面の反対側にくみ出しステップ又は第２の磁場発生装置を必要とすると考えられた。そのため、ビーズをセンサの表面に引き付けるために初めに使用したのと同じ磁場発生装置によってこれを達成することができるためにハードウェアを単純化することが可能になり、費用を減らし且つ大きさを小さくすることが可能になると発見したことは驚きである。
【００１３】
さらに、磁場の再適用は、検出の読み取りが他よりも速く安定したレベルに達するのを可能にするため、時間の経過に伴った検出の勾配のみに依存するよりも迅速な操作、又は、高感度な濃度の検出が可能になる。
【００１４】
別の態様は、磁化されたか又は磁化可能な標的成分を含有する流体において、前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を他の磁化されたか又は磁化可能な成分が存在する中で検出する方法を提供しており、当該方法は、
結合表面に前記磁化されたか又は磁化可能な成分を引き付けるために磁場を適用し、前記磁化されたか又は磁化可能な成分を集めて前記結合表面上でコラムにするステップ、前記磁場を減らして、前記コラムが崩壊するのを可能にし、より多くの前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分が前記コラムから前記結合表面に結合するのを可能にするステップ、及び、他の磁化されたか又は磁化可能な成分が前記結合表面から除去され、前記結合した標的成分に基づきコラムを再形成するよう前記磁場を再度適用するステップ、並びに、
例えば、表面感受性検出法を介して、前記結合表面に結合された前記磁化されたか又は磁化可能な標的成分を検出するステップ、
を有している。
【００１５】
当該装置又は当該方法の実施形態は、いかなる追加の特徴も有することができ、そのうちの一部は特許請求の範囲に列挙され、以下でより詳しく記載される。そのような追加の特徴の１つは、永久磁石、及び、それと共に作用するか又は永久磁石を動かすための機械的配置を含んだ制御装置を含む磁場発生装置である。別のそのような追加の特徴の１つは、電磁石、及び、該電磁石を通る電流を制御するための回路を含んだ制御装置を含む磁場発生装置である。
【００１６】
別のそのような特徴の１つは、流体を保持するためのチャンバを含む装置であり、前記チャンバは結合表面を有している。前記チャンバは、当該装置の一体部分又は取り除き可能な部分であり得る。別のそのような特徴の１つは、多数の結合表面を有した装置であり、各結合表面は、異なる標的成分に結合するのに適している。別のそのような特徴の１つは、前記異なる標的成分を検出するようにされた装置である。これは、センサに対して結合表面を移動させること、又は、多数のセンサを有することを含み得る。
【００１７】
別のそのような特徴の１つは、光学検出器を含んだ１又は複数のセンサである。他の特徴は、磁化されたか又は磁化可能な標的成分により結合表面にて生じた磁場の量を検出するＧＭＲタイプの検出器等の磁場検出器である。光学検出器は、結合表面の裏側から反射された光の量を検出するようされた反射検出器を含み得る。これは、裏側での全反射に対して配置することができる。光学検出器は、結合表面にて標的成分により放出された蛍光を検出するよう配置することができる。光学検出器は、結合表面を通って透過された光の量を検出するようされた透過検出器（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を含み得る。別のそのような特徴の１つは、異なる時間に多くの読み取りを行うようにされ、その読み取りから結果を導くプロセッサを有した検出器である。別のそのような特徴の１つは、特異的結合と非特異的結合とを区別するのに十分強い磁場の再適用である。別のそのような特徴の１つは、流体を動かす及び制御するマイクロ流体要素である。
【００１８】
追加の特徴のうちどれも、共に組み合わせる、及び、態様のうちどれとも組み合わせることができる。他の利点が、特に、他の従来技術と比べて当業者には明らかになるであろう。数多くの変更及び修正を、本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、本発明の形態は単に例証であり、本発明の範囲を限定するよう意図されないことは明白に理解されなくてはならない。
【００１９】
次に、どのようにして本発明を実行することができるかということが、例えば添付された図面を参考にして記述される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施形態による装置を示している。
【図２】一実施形態による別の装置を示している。
【図３】一実施形態による方法におけるステップを示している。
【図４】作動中の４つのステージでの結合表面付近の磁化されたか又は磁化可能な成分の概略図を示した挿入図ａ）からｄ）と共に、種々の濃度の標的成分に対する時間の経過に伴う検出値のグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、特定の実施形態に関して、及び、特定の図面を参考にして記述されるが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。記述されている図面は、概略的なだけであり、無制限的である。図面においては、要素のうちいくつかのサイズが過大視されている場合があり、例証目的のため尺度で描かれていない。本明細書及び特許請求の範囲において「含む」という用語が使用されている場合、他の要素又はステップを除外しない。単数名詞を言及する際に不定冠詞又は定冠詞が使用されている場合は、何か他に明確に述べられていない限りその名詞の複数形を含む。
【００２２】
特許請求の範囲において使用されている「含む」という用語は、その後に記載されている手段に限定されるとして解釈されるべきではなく、他の要素又はステップを除外しない。従って、「装置は手段Ａ及びＢを含む」という表現の範囲は、Ａ及びＢという要素のみからなる装置に限定されるべきではない。本発明に関しては、該表現は、前記装置の要素のうち本発明に関連する要素はＡ及びＢであるという意味である。
【００２３】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において第１、第２、第３等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることが理解されたい。
【００２４】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において、上、下等の用語は、説明目的のために使用され、必ずしも相対的な位置を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された定位以外の定位で操作できることが理解されたい。
【００２５】
記述される実施形態は、例えば生物活性分子等、微生物学的物質等の物質間での相互作用又は結合を決定するための方法、装置、及びツールを示しており、特異的結合と非特異的結合等の異なる強度の結合を区別することができる方法を示している。特異的結合と非特異的結合との区別は、標的分子等の広範囲な標的成分を同時に検出することができる多検体センサを用いた本発明に従って、特に使用される。緩衝条件を変更して多検体センサに対するストリンジェンシーを改善することは、非常に狭い範囲内でのみ行うことができるため、当該装置及び方法は、例えば、蛋白質多検体センサに対して使用することができる。さらに、当該方法は、感度を落とすことなく小型化することができるため、小型の集積流体及び集積回路装置を使用したマイクロアレイ及びマイクロ流体機構において実用のものであり得る。
【００２６】
本発明によるマイクロ電子工学センシング装置の実施形態は、標的分子に結合したラベル粒子を含んだ標的成分の定性的又は定量的検出に役立ち得る。標的成分は、例えば、生体分子、複合体、細胞分画、又は細胞のような生物学的物質であり得る。その例は、蛋白質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、ゲノム又はゲノムフラグメント、ｃＤＮＡ、酵素、糖、抗体又は抗体の断片、受容体、細胞又は細胞膜若しくは細胞小器官等の細胞成分、細胞可溶化物、ウイルス、細菌、原生動物等である。「ラベル粒子」という用語は、検出することができるある特性（例えば、光学濃度、磁化率、電荷、蛍光性、放射性等）を有し、従って、関連のある標的分子の存在を間接的に暴くことができる粒子（原子、分子、複合体、ナノ粒子、微粒子等）を意味するものとする。場合によっては、「標的分子」は、それ自体が「ラベル粒子」として作用し得る。
【００２７】
センシング装置は、標的成分を収集することができる結合表面を有した、容器若しくはチャンバ等の取りはずし可能なキャリアと共に機能し得るか、又は、キャリア及びその結合表面は、センシング装置の一体部分であり得る。「結合表面」という用語は、本明細書において、流体キャリアの表面のうちの特定部分に対する独特な参照として主に選択され、標的成分は多くの用途において前記表面に実際に結合するけれども、必ずしもそうである必要はない。必要とされるのは、標的成分が結合表面に到達することができ、（一般的に、標的成分、その結合表面との相互作用、その移動性等に関連するパラメータにより決定される濃度で）そこで回収されるということだけである。センサが光学検出を使用する場合、キャリアは、場合によって、所与のスペクトル域の光、特に、以下で定義される光源によって放出される光に対して高い透過性を有することができる。キャリアは、例えば、ガラス又は一部の透明なプラスチックから作製することができる。
【００２８】
有効な生体材料成分の評価に達するために、生体材料はバイオセンサの表面に密着されなければならない。磁気ラベルが使用される場合、これは、磁気引力によって実現することができる。磁気引力は、短期間で所望のレベルの感度を達成するのに有用である場合が多い。結合表面での濃度を高めるに従い、センサ表面での磁気粒子の結合処理は加速される。第二に、磁気洗浄は、従来の湿式洗浄ステップに取って代わることができ、より正確で、操作実行の数を減らす。その他の成分を洗い流すためのこの第二の磁気ステップは、一般的に、結合表面の上で（さらなる／別の）磁石（永久又はコイル）を使用することによって行われる。このステップにおいて、残りの「遊離な」磁気粒子は全て、バイオ測定が行われる液体又は媒体から完全に取り除かれる。
【００２９】
これに付随する問題は、磁気引力及び磁気洗浄を行うために２つの異なる磁気システム、又は、機械的若しくは電気機械的手段を用いて引力と反発作用間で切り替えることができるように設計されたコイルが必要とされることである。この機構は、比較的複雑である。
【００３０】
図１、２本発明の実施形態によるセンシング装置
実施形態によると、表面感受性検出器を有したバイオセンサに対する解決策は、もう１つの磁気洗浄ステップである。
【００３１】
図１は、バルブｖ１（１）及びｖ２（２）によって制御された左側から右側にかかる流体流路、ポンプＰ１（３）、並びに、チャンバ（８）の底部にある結合表面（４）（又は結合表面のアレイ）を有したセンシング装置の例を示している。センサＳ１（５）又はそのようなセンサのアレイが、結合表面付近、一般的にはその下に提供されているが、必ずしもそうであるわけではない。センサは、例えば、光学的、機械的、放射能又は磁場のセンサであり得る。磁石Ｍ１（６）は、流体中の磁化されたか又は磁化可能な成分を結合表面の方へ引き付けるために磁場を生じるよう配置される。磁石は、制御装置Ｃ１（７）によって、図３及び４を参考にして以下で記述されるステップに従うよう制御される。制御装置（７）は、従来の処理回路又は従来のハードウェア上で作動するソフトウェアによって実行することができ、永久磁石と共に使用するために、結合表面に対する永久磁石の移動を生じるか又は可能にする手段を含むことができる。あるいは、１又は複数の電磁石が使用される場合、制御装置はその１又は複数の電磁石を制御し、その結果、磁場の強度、その方向、及び／又は、その位置を制御することができる。磁場を制御するタイミングは、センシングのタイミング、流体要素及び他の部分を制御するタイミングと調和させることができる。
【００３２】
図２は、底部に結合表面を有した、例えばポリスチレンウェル２２等、ポリマー等のウェルの形状で取り外し可能なキャリアを有した別の実施形態を示している。センシング装置は、移動可能な永久磁石２８を担持する基板２１を有し、光源２６の形状でセンサを有しているか又はそのセンサと付随しており、さらに、光検出器２９を有しているか又はその光検出器と付随している。結合表面の裏側にて全反射を可能にするためにガラスの透明な半球体２４が存在し、光源からの光が入り、反射を最小限にするために半球体をその表面とは垂直の方向に離れてより優れた検出精度を可能にするように、半球体２４は、その平らな表面が結合表面の裏側に向かい、その曲線状の側が下に向いて配置される。
【００３３】
このセンサは、例えば、次に記述されることになる磁気引力と組み合わされた、光の内部全反射（Ｆ−ＴＩＲ）に基づいた光学読み取り法を使用する。
【００３４】
図３、４実施形態による方法におけるステップ
図３は、主要な方法におけるステップの一部を示している。ステップ３１では、流体中の磁化されたか又は磁化可能な成分を結合表面の方へ引き付けるために磁場が適用される。これは、既知であるように、磁化されたか又は磁化可能な成分のコラムを構築させる効果を有しているが、通常、妨げとなる生物学的結合及び検出としてみなされ、常磁性成分が好ましい。磁場が適用されると、磁化可能な（例えば常磁性）成分が磁力線に沿って磁化され、コラムになるよう積み重なる。永久磁石等の磁場とは無関係で磁化された成分も、磁力線に沿った好ましい方向でコラムに並べられる。そのような成分は、液体内で群がり、場が切られた場合にそう容易には「崩壊しない」恐れがあるため、むしろ好ましくない。ステップ３３では、コラムが倒れるのを可能にするよう場が十分に減らされる。これを達成するのに適した場の強さ及び減少の継続時間は容易に決定することができ、成分の磁化及び他の特徴、流体の粘性、磁石の位置等に依存する。後に、ステップ３５にて、その他の磁化されたか又は磁化可能な成分を結合表面から除去するが、結合表面に結合した標的成分を残すのに十分な強度で場が再適用される。これによって、結合表面に結合された標的成分に基づき、成分のコラムは再度構築される。これを達成するのに適した場の強さ及び再適用の継続時間は、ここでも、実際には容易に決定することができ、結合の強度、成分の磁化及び他の特徴、流体の粘性、磁石の位置等に依存する。ステップ３７では、結合表面に結合した標的成分を検出するために、センサが使用される。結合表面上の他の磁化されたか又は磁化可能な成分はより少ないため、検出の感度を上げることができる。検出は、所定の時間にわたり実行することができ、再適用中及び再適用後の読み取りだけでなく磁場の再適用前の読み取りも使用することができる。その読み取りを、較正し、平均値を求め、減少及び再適用の時間等と相関させるよう処理することができる。これは、オンボードの集積回路設計によって、又は、パソコン若しくはマイクロコントローラ等外部のコンピュータによって行うことができる。処理された検出出力は、正／負バイナリー結果の形状、又は、例えば濃度の形状であり得る。
【００３５】
磁石が永久磁石である場合、磁場の適用、減少、及び、再適用は、結合表面に相対させて磁石を動かすことを含む。一部の実施形態では、磁石を動かすのではなくキャリアを動かす方がより容易であり得る。磁石が電磁石である場合、場は、磁石内の電流を変えるための例えば制御装置内の回路によって制御することができる。
【００３６】
図４は、いくつかの異なる濃度に対するセンサからの読み取りのグラフを示しており、図２に示されている光学検出及び磁場作動を有したアッセイ実験のための実験的機構に基づいている。作動後、永久磁石は、機械的移動によってウェルの下に配置される。ウェルの底部と磁石との距離は、約２ｍｍである。例えば１ｍｍの桁以下等のより短い距離も好ましい。これらは、未完全な半球を使用することによって達成することができる。この実施形態に記述されたパラメータのうちどれもが無制限的であり、他のパラメータ及び変形も使用することができるということが明らかである。
【００３７】
図４は、１０ｐｇ／ｍｌのＢＳＡ−モルヒネで被覆されたポリスチレンウェルに対する用量反応曲線を示している。ＰＢＳ＋１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＋０．６５％ツイーン−２０内に溶解された確定量の遊離モルヒネを予め混ぜ合わされた抗モルヒネ抗体で機能化された磁気粒子（ＭＰ）の形状の磁化されたか又は磁化可能な成分を、ウェル内に入れた（１：２０の希釈度のＭＰ、溶液の総量は４０μｌであり、最終モルヒネ濃度は１から１０００ｎｇ／ｍｌであった）。１５秒間ウェルの下で永久磁石を使用してＭＰを作動させ、表面付近にＭＰを集中させた。次に、磁石を取り除き、６０秒間ＭＰを表面に結合させた。（図４に示されているように）データによって、すでに２０秒後には、表面への磁気粒子の結合速度が溶液中の有利なモルヒネの濃度の直接測定であることが示されている。意外にも、次の磁気引力ステップにより、信号はこの第２の作動ステップ中増え、ウェル内のモルヒネ濃度に対する優れた測定基準である安定したレベルに達する。
【００３８】
結果は、以下のように理解することができる。第１のビーズが注入され、溶液中均一に分散される（図４の挿入図ａを参照）。磁気の作動後、表面への結合において大きな増加を示すことなくＭＰは表面に集中する（減った信号はなし、図３のステップ３１に対応する図４の挿入図ｂを参照）。磁気ビーズは、表面から垂直に延びてコラム又は柱状に並び、表面上の、従って、当該システムによって検出されるビーズの数は少ない。磁場を除くことによって、信号の降下は表面に結合するＭＰを示す（図３のステップ３３に対応する図４の挿入図ｃ）。自由な結合の６０秒後、磁石が再度ウェルの下に配置される。この磁気引力により、第１のＭＰが表面付近に集中される。次に、全ての磁化されたか又は磁化可能なＭＰは、表面に結合したＭＰから始まり柱状に並ぶ。表面に非特異的に結合したＭＰの少なくとも大部分、及び、溶液中で遊離のＭＰの少なくともそこそこの部分がこれらの柱に集められる（図３のステップ３５に対応した図４の挿入図ｄを参照）。この方法で、非特異的に結合したＭＰは表面から取り除かれ、表面上の結合したＭＰのみで、余分な上部の磁石を必要とすることなく終点測定が行われる（エバネッセント場を使用した光学プロービング法が正当な表面感受性法であり、従って、表面に実際に結合したビーズのみが検出されることに留意されたい）。このように、第２の磁気作動ステップの数秒後に、全ての非結合のＭＰが表面から除去されて信号が安定し、この時点で、使用された光学検出計画において、結合したＭＰのみが検出されるため、結合したＭＰのみが表されている。
【００３９】
読み取り法としての内部全反射（Ｆ−ＴＩＲ）に基づいた、バイオセンサに使用される磁気洗浄ステップとして記述したけれども、（他の表面弾性波測定、光学表面スキャニング又はイメージング法、及び、ＧＭＲのような）他の種類の表面感受性読み取り法を使用することができる。ＧＭＲベースのバイオセンサは、国際公開第２００６０５９２７０  Ａ２号に記載されている。
【００４０】
光学表面センサ
これは、光源及び光検出器を有することができ、その例が、次により詳細に記述される。光源は、以下で「入射光ビーム」と呼ばれる光ビームを、キャリアの結合表面の調査領域において完全に内部に反射されるように、前述のキャリア内に放出するために提供される。光源は、例えば、任意選択で入射光ビームを形作りさらに方向づけるオプティクスがいくつか提供された、レーザー又は発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得る。「調査領域」は、結合表面の小領域であり得るか、又は、完全に結合表面を含み得る。「調査領域」は、一般的に、実質的に円形のスポットの形状を有し、入射光によって照射される。さらに、全反射の発生は、キャリアの屈折率が結合表面に隣接する物質の屈折率よりも大きいということを必要とすることに留意するべきである。これは、例えば、キャリアがガラス（ｎ＝２）又はプラスチック（ｎ＝１．６）から製造され、隣接する物質が水（ｎ＝１．３）である場合の事例である。さらに、「全反射」という用語は、反射処理中に入射光の一部が（吸収される、分散される等）失われる「内部全反射」と呼ばれる事例を含むものとすることに留意するべきである。
【００４１】
反射光ビームにおける光の量を決定するための光検出器において、「反射光ビーム」という用語は、検出器により捕獲された光に対する独特の参照でもありえ、このビームの全ての光が前述の入射光ビームの全反射に由来することも意味し得る。しかし、「反射光ビーム」が完全に内部に反射された光全てを含むということは、この光の一部を、例えば、他の目的に使用するか、又は、単純に失われる場合があるため、（好ましい事例ではあるけれども）必要ではない。
【００４２】
検出器は、例えば、フォトダイオード、ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ、フォトレジスタ、光電セル、若しくは、光電子倍増管、又は、顕微鏡等、いかなる適した１又は複数のセンサも含むことができ、そのセンサによって、所与のスペクトルの光を検出することができる。
【００４３】
マイクロ電子工学センサ装置における一部の実施形態によって、結合表面での調査領域内の標的成分における感度が良く正確な定量的又は定性的検出が可能になり得る。これは、完全に内部に反射される入射光ビームがキャリアの表面から隣接する物質内に短い距離で延びるエバネッセント波を生じるという事実によるものである。結合表面に存在する標的成分若しくはラベル粒子によってこのエバネッセント波の光が分散されるか又は吸収される場合、反射された入射光の中で見失われることになる。反射光ビームにおける光の量（より正確には、入射光ビームと比較された場合の反射光ビーム内で見失った光の量）は、従って、結合表面での標的成分／ラベルの存在及び量の指標である。エバネッセント波は一般的に結合表面から１０から３００ｍｍの厚さという少量のみを探査し、従って、その分量の裏にあるバルク材からの妨害を避けるため、記述された光学検出手順の１つの利点にはその精度が含まれる。さらに、大部分の生物学的試料は、水（ｎ＝１．３）に近い屈折率を有しており、反射は、より大きい屈折率を有したラベルがエバネッセント場の範囲内に来る場合のみ阻止される。高い感度は、完全に内部に反射される光の量を減らす全ての作用が検出された時に反射光が測定された場合に達成される。さらに、光学検出を、離れた所から、すなわち、キャリアと光源又は光検出器とを機械的に接触させることなく任意で行うことができる。
【００４４】
キャリア１１内に透過される入射光ビームは、全反射（ＴＩＲ）の臨界角θＣよりも大きい角度で結合表面に到達し、従って、「反射光ビーム」として完全に内部に反射される。反射光ビームは、別の表面を通ってキャリアを離れ、例えばフォトダイオード等の光検出器２９によって検出される。これによって、反射光ビームの光の量が検出される（例えば、スペクトル全体又はスペクトルの特定部分におけるこの光ビームの光強度で表される）。測定結果は評価され、任意選択で、評価及び検出器に結合された記録モジュールによって観察期間にわたりモニターされる。
【００４５】
任意選択で、さらなる光検出器を代わりに又はさらに使用して、入射光ビームのエバネッセント波により刺激した蛍光粒子によって放出された蛍光を検出することができる。この蛍光は通常全側面に対して等方的に放出されるため、このさらなる検出器は、原則として、例えば結合表面の上でも、どこにでも配置することができる。さらに、蛍光のサンプリングのために検出器を使用することも当然可能であり、後者は、例えば、反射光からスペクトルで区別することができる。以下の記述は反射光の測定に集中しているけれども、本明細書において記述される原理は、必要な変更を加えて、蛍光の検出にも適用することができる。
【００４６】
（例えば唾液、血液等の試料流体の）バックグラウンドの影響を除くか又は少なくとも最小限にするために、検出技術は、表面特異的であるべきである。これは、以下で説明される内部全反射の原理を使用することによって達成することができる。
【００４７】
スネルの屈折の法則によると、２つの媒体ＡとＢとのインターフェースの垂直線に対する角度θＡ及びθＢは、以下の等式
【００４８】
【数１】
2011506923.tif 000003
を満たし、ｎＡ、ｎＢは、それぞれ媒体Ａ及びＢにおける屈折率である。高い屈折率を有した媒体Ａ（例えば、ｎＡ＝２を有したガラス）における光線は、例えば、空気（ｎＢ＝１）又は水（ｎＢ≒１．３）等、より低い屈折率を有した媒体Ｂとのインターフェースで角度θＢの下、垂直線から屈折される。入射光の一部は、入射の角度θＡと同じ角度でインターフェースにて反射される。入射の角度θＡが除々に大きくなる場合、屈折の角度θＢは、９０°に達するまで大きくなる。対応する入射の角度は臨界角θＣと呼ばれ、ｓｉｎθＣ＝ｎＢ／ｎＡによって与えられる。より大きな入射の角度で、全ての光は媒体Ａ（ガラス）の内部に反射され、従って、「全反射」と名付けられる。しかし、媒体Ａ（ガラス）と媒体Ｂ（空気又は水）とのインターフェースの非常に近くで、エバネッセント波は媒体Ｂ内で形成され、表面から離れると急激に減衰する。表面からの距離ｚの関数としての場の大きさは、以下の式、
【００４９】
【数２】
2011506923.tif 000004
として表すことができ、ｋ＝２π／λ、θＡは完全に反射されたビームの入射角であり、ｎＡ及びｎＢは、それぞれ関連する媒体の屈折率である。
【００５０】
例えばλ＝６５０ｎｍ等の典型的な値の波長λ、並びに、ｎＡ＝１．５３及びｎＢ＝１．３３に対して、場の大きさは、約２２８ｎｍの距離ｚの後、その元の値のｅｘｐ（−１）≒０．３７まで低下した。図１又は図２の機構において磁気粒子ＭＰのような別の媒体とこのエバネッセント波が相互作用する場合、入射光の一部は試料流体内につながれ（これは、「内部全反射」と呼ばれる）、反射強度は減らされる（反射強度はきれいなインターフェース及び相互作用がない場合に１００％になる）。結合表面上又はその近辺（約２００ｎｍ内）（サンプルチャンバの残りの領域内ではない）での妨害の量、すなわち、磁気ビーズの量に応じて、反射強度は低下する。この強度の低下は、結合された磁気標的成分の量に対する、従って、標的分子の濃度に対する直接測定である。前述の約２００ｎｍというエバネッセント波の相互作用の距離が典型的な抗体、標的分子、及び磁気ビーズの大きさと比較された場合、バックグラウンドの影響は最小になることが明らかである。より大きな波長λは相互作用の距離を増やすが、バックグラウンド液の影響は、非常に小さいままである。
【００５１】
記述された手順は、適用された磁場とは無関係である。これは、調製、測定、及び洗浄ステップのリアルタイム光学モニタリングを可能にする。モニターされた信号を使用して、測定又は個々の処理ステップを制御することもできる。
【００５２】
典型的な適用材料に対して、キャリアの媒体Ａはガラス、及び／又は、１．５２という典型的な屈折率を有した一部の透明なプラスチックであり得る。試料チャンバにおける媒体Ｂは、水ベースで、１．３に近い屈折率を有し得る。これは、６０°の臨界角θＣに一致する。７０°の入射の角度は、従って、いくぶん大きい屈折率を有した流体媒体を可能にする実用的な選択である（ｎＡ＝１．５２と仮定すると、ｎＢは、１．４３という最大値まで可能である）。ｎＢの値が高くなるに従い、より大きなｎＡ及び／又はより大きな入射の角度が必要とされる。
【００５３】
記述された作動用磁気ラベルと組み合わした光学読み取りの利点は、以下の点を含み得る。
安価なカートリッジ：キャリアのカートリッジは、流体チャネルも含むことができる比較的単純なポリマー材料の射出成形品から成り得る。
多検体検査に対する多重化の大きな可能性：使い捨てのカートリッジ内の結合表面を、任意選択で大面積にわたりスキャンすることができる。あるいは、大きな検出アレイを可能にする大面積イメージングが可能である。そのような（光学透明表面上に位置した）アレイは、例えば、光学表面上への種々の結合分子のインクジェット印刷によって作製することができる。
【００５４】
当該方法は、多数のビーム及び多数の光検出器、並びに、多数の（機械的に動かされるか、又は、電磁的に作動される）作動磁石を使用することによってウェルプレートにおけるハイスループット検査も可能にする。
【００５５】
作動及びセンシングは直交である。（大きな磁場及び磁場勾配による）磁気粒子の磁気作動は、センシング処理に影響を及ぼさない。光学方法は、従って、作動中の信号の継続的なモニタリングを可能にする。これは、アッセイ処理に多くの識見を提供し、信号の勾配に基づく容易な運動検出法を可能にする。
【００５６】
当該システムは、急激に減少するエバネッセント場のため、実際に表面感受性である。
【００５７】
簡易なインターフェース：必要に応じて、カートリッジとリーダーとの間の電気インターコネクト器無しで実行することができる。光学窓が、カートリッジを探索するための唯一の要求物である。従って、非接触読み取りを行うことができる。
【００５８】
低雑音読み取りが可能である。
【００５９】
研究室の環境において、多数の試料チャンバ（「ウェル」）のアレイを含むウェルプレートが一般的に使用され、異なる検査を同時に行うことができる。これらの（おそらく使い捨ての）ウェルの作製は、１回の射出成形ステップで十分であるため非常に単純で費用がかからない。
【００６０】
光源は、臨界角θＣよりも大きい角度でウェルの底面に入射する、平行な光ビームを生成するよう配置することができる。空気からキャリア（例えばガラス又はプラスチック材料）までの第１のインターフェースでのこの入射光ビームの過剰な反射を防ぐために、ウェルの底部は、半径Ｒの半球体の形状２４を含み、その中心は、結合表面の裏側である検出表面と一致している。入射光ビームは、この同じ中心に向けられる。反射側にて、フォトダイオード２９等の光検出器が置かれ、反射光ビームの強度を検出する。ウェルの典型的な直径Ｄは、１から８ｍｍに及ぶ。
【００６１】
光源に対して選択すべきものは、レンズのようなある光学要素（図示せず）を含み、半球体２４の中心に対して実質的に集中させた入射光ビームを生成することである。検出側では、レンズ等の類似の光学要素を使用して、反射され、この時点で発散している光ビームを集めてその強度を検出することができる。
【００６２】
測定手順のさらなる展開において、多数の入射光ビーム及び反射光ビームを使用して、同じウェル内、又は、ウェルのアレイ内の異なる位置の異なる標的分子の存在を同時に検出することができる。ウェルの底部上、又は、ウェルのアレイの底部上に多数の半球体を提供することができ、ウェルの底部上、又は、ウェルのアレイの底部を使用して、多数の入射光ビームからの光をウェルの底部上のそれぞれの調査領域に連結させることができる。多数の光検出器（図示せず）を、この場合、多数の反射光ビームを測定するために使用することができる。
【００６３】
さらなる別の実施形態は、半球体の代わりにプリズム又は角錐台構造を有して、入射光ビームと反射光ビームの光をつなげる。角錐の傾斜された縁は、これらの光線に対して実質的に垂直であるべきである。この設計の利点は、作製するのが簡単で、隣接する領域からのビームをブロックしないということである。ウェルの底部上の全ての検出領域を覆うために大きな直径を有した１つの平行な入射光ビームを使用することが可能である。検出器として、各個々の検出領域と一直線に並べられた多数のフォトダイオードを使用することができる。あるいは、デジタルカメラに使用されるもの等、ＣＣＤ又はＣＭＯＳチップ（図示せず）を使用して、全ての検出領域を含めたウェルの底部全体の反射強度反応を映し出すことができる。適切な信号処理を利用して、全ての信号を、別の検出器を用いるが先立つ整列なしで引き出すことができる。
【００６４】
さらなる別の実施形態において、ウェルの底部は、１又は複数の入射光ビーム及び反射光ビームの光路の外側にその中心を有した開いた穴を含み得る。これによって、以下の有利な特徴が可能になる。
（Ｔの形をした）磁気コイルのフェライト磁心を、改善された場の強さ及び集中度に対して使用することができ、結合表面の近くに配置することができ、小型で低電力の設計を可能にする。
自己整列構造が達成される：オプティクス及び磁場発生装置が固定されている場合に、フェライト磁心上でのウェルの自動整列が生じる。
【００６５】
磁化されたか又は磁化可能な成分は、（例えば酸化鉄の）小さな磁気粒子で満たされたポリスチレン球体等の磁気ビーズの形状であり得る。これによって、ビーズは超常磁性になる。ポリスチレンの屈折率は、ウェルプレートの典型的な基板材料の屈折率にうまく一致する。この方法で、光の光学アウトカップリングが高められる。
【００６６】
上記において、新たな作動法を含んだ表面感受性読み取り法を使用したバイオセンサが記述されてきた。前記新たな作動法では、第２の磁気引力ステップ中に、磁気粒子の積み重ねがセンサ表面上に形成される。第１の磁気作動ステップ（捕獲ステップ）は、センサ表面付近でのＭＰの集中度向上に使用される。積み重なりの上部は検出されないため、実際の検出の表面感度によって、この第２の磁気引力ステップ中に信号は減らされる。各積み重なりの底部のＭＰのみが探索される。底部からのみ作動が必要とされるという事実は、システムをより単純に、従って、より強固にする。他の変更及び追加が、当業者によって特許請求の範囲内で予想され得る。
【図１】
2011506923.tif 000005
【図２】
2011506923.tif 000006
【図３】
2011506923.tif 000007
【図４】
2011506923.tif 000008
【国際調査報告】
2011506923.tif 000009
2011506923.tif 000010