(57)【要約】  細菌のバイオフィルムの形成を阻害又は予防するのに使用の有機化合物について記載する。
2011520958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞による固体表面でのバイオフィルム形成を阻害する方法であって、式１：
【化１】
2011520958.tif 000052
［式中、
Ｘは、イオウ（Ｓ）又は酸素（Ｏ）であり：
Ｙは、イオウ（Ｓ）又は窒素（ＮＨ）であり；
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ基（−ＮＯ２）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯ２ＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯ２ＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ基−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯ２ＮＨ２（スルホンアミジル）；ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有する化合物と該表面を接触させる工程を含んでなり、ここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、前記方法。
【請求項２】
前記化合物が、式２：
【化２】
2011520958.tif 000053
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１に記載の通りである］の構造を有するローダニン化合物であり、そしてここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ローダニン化合物が、３−（３−クロロフェニル）−５−（３−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９７３１）、３−（４−ブロモフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９２９３）、３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表２中のＭＳＬ−６５１９０５６）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４）、（Ｚ）−３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物８）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物２９）、（Ｚ）−３−（３−シアノフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３４）、（Ｚ）−３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３６）、（Ｚ）−３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４０）、及び（Ｚ）−３−（４−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４９）からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が式３：
【化３】
2011520958.tif 000054
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１に記載の通りである］の構造を有するチアゾリジンジオン化合物であり、そしてここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
チアゾリジンジオン化合物が（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６０）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６１）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が式４：
【化４】
2011520958.tif 000055
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１に記載の通りである］の構造を有するヒダントイン化合物であり、そしてここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒダントイン化合物が（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５８）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５９）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が式５：
【化５】
2011520958.tif 000056
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１に記載の通りである］の構造を有するチオヒダントイン化合物であり、そしてここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記チオヒダントイン化合物が（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（表３中の化合物６２）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細菌細胞による表面でのバイオフィルム形成を阻害する方法であって、式６：
【化６】
2011520958.tif 000057
［式中、
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯＯＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯＯＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ基−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯＯＮＨ２（スルホンアミジル）；ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有するフラノン化合物と該表面を接触させる工程を含んでなり、ここで該化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、前記方法。
【請求項１１】
フラノン化合物が３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−５−（２，４−ジメトキシフェニル）フラン−２（３Ｈ）−オン（表２中のＭＳＬ−０５１０９７）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式１：
【化７】
2011520958.tif 000058
［式中、
Ｘは、イオウ（Ｓ）又は酸素（Ｏ）であり：
Ｙは、イオウ（Ｓ）又は窒素（ＮＨ）であり；
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯＯＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯＯＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ基−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯＯＲ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯＯＮＨ２（スルホンアミジル）；ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有する化合物（ここで前記化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する）；
担体；
任意選択的に、抗菌増殖剤；及び
任意選択的に、賦形剤を含んでなる組成物。
【請求項１３】
前記バイオフィルム阻害化合物が式２：
【化８】
2011520958.tif 000059
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１２に記載の通りである］の構造を有するローダニン化合物であり、ここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１２に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１４】
前記ローダニン化合物が：３−（３−クロロフェニル）−５−（３−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９７３１）、３−（４−ブロモフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９２９３）、３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表２中のＭＳＬ−６５１９０５６）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４）、（Ｚ）−３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物８）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物２９）、（Ｚ）−３−（３−シアノフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３４）、（Ｚ）−３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３６）、（Ｚ）−３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４０）、及び（Ｚ）−３−（４−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４９）からなる群より選択される、請求項１３に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１５】
前記バイオフィルム阻害化合物が式３：
【化９】
2011520958.tif 000060
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１２に記載の通りである］の構造を有するチアゾリジンジオン化合物であり、ここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１２に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１６】
前記チアゾリジンジオン化合物がＭＳＬ−６５１９０５６と呼称される３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオンである、請求項１５に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１７】
前記バイオフィルム阻害化合物が式４：
【化１０】
2011520958.tif 000061
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１２に記載の通りである］の構造を有するヒダントイン化合物であり、ここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１２に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１８】
前記ヒダントイン化合物が（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５８）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５９）である、請求項１７に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項１９】
前記バイオフィルム阻害化合物が式５：
【化１１】
2011520958.tif 000062
［式中、Ｒ１とＲ２は、請求項１２に記載の通りである］の構造を有するチオヒダントイン化合物であり、ここで前記化合物は細菌のバイオフィルム形成を阻害する、請求項１２に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項２０】
前記チオヒダントイン化合物が（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（表３中の化合物６２）である、請求項１９に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【請求項２１】
式６：
【化１２】
2011520958.tif 000063
［式中、
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ基（−ＮＯ２）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯ２ＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルホンアミジル基−ＳＯ２ＮＨ２；及び、ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ基−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ残基−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシ基−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯ２ＮＨ２（スルホンアミジル）；ケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＣ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ７は水素又はアルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有するフラノン化合物であるバイオフィルム阻害化合物（ここで前記化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する）；
担体；
任意選択的に、抗菌増殖剤；及び
任意選択的に、賦形剤を含んでなるバイオフィルム阻害組成物。
【請求項２２】
前記フラノン化合物がＭＳＬ−０５１０９７と呼称される３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−５−（２，４−ジメトキシフェニル）フラン−２（３Ｈ）−オンである、請求項２１に記載のバイオフィルム阻害組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮出願番号６１／１２８，０９３（２００８年５月１９日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
米国連邦政府支援研究に関する陳述
本明細書に記載される発明は、米国立衛生研究所からのＳＢＩＲ基金番号：１  Ｒ４３  ＡＩ０７４１６１−０１によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細菌のバイオフィルムの分野にある。特に、本発明は、細菌のバイオフィルムの形成を阻害又は予防する有機化合物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
バイオフィルムは、タンパク質、多糖類、核酸、又はこれら分子の組合せからなり得る水和した細胞外マトリックスに囲まれた細菌の集合体である（Branda et al., Trends Microbiol, 13: 20-26 (2005)）。表面での生物及び無生物のバイオフィルムの発達は、重大な医療問題を提示する。バイオフィルムの成長形式にある細菌は、抗生物質での治療と宿主の免疫系による排除にきわめて抵抗する。故に、一度これらの細菌集合体が形成されると、それらを慣用の治療薬で一掃することはきわめて困難である。従って、バイオフィルムは、慢性の全身感染症をもたらす可能性がある。例えば、尿路感染症、中耳感染症、歯垢、歯肉炎、心内膜炎が含まれる多様な疾患に関連したヒト患者と、嚢胞性線維症患者の気道では、細菌のバイオフィルムが見出されてきた。病原性の細菌は、留置カテーテル、人工心臓弁、及びペースメーカーのような、多様な医療用インプラント上でもバイオフィルムを形成する場合がある（Ada et al., Nutrition, 12: 208-213 (1996)）。現在利用可能な唯一の信頼し得る救済策は、汚染したインプラントを除去することであるが、それは患者の医療コストだけでなく、患者の罹病及び死亡のリスクをさらに高めてしまう。
【０００５】
Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）の病原体としての出現は、留置医療用デバイスの広範な使用と関連付けられてきた。S. epidermidis と Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）は、大多数のデバイス関連感染症の原因である。これらの細菌は、カテーテル関連感染症の５０％〜７０％、人工心臓弁感染症の４０％〜５０％、関節置換感染症の２０％〜５０％、及び中枢神経シャント感染症の４８％〜６７％程の多さで原因生物となっている（例えば、O'Gara et al., J. Med. Microbiol., 50: 582-587 (2001) とその参考文献を参照のこと）。S. epidermidis がバイオフィルム病原体としてのその役割に独自に適しているのは、それが試験したほとんどすべての合成ポリマー材料の表面でコロニー形成することができるからである（「留置医療用デバイスに関連した感染症（Infections Associated with Indwelling Medical Devices）」第３版（Walvogel & Bisno 監修）（ＡＳＭプレス、ワシントンＤ．Ｃ．，2000）中 55-88頁、Gotz et al.「コアグラーゼ陰性ブドウ球菌による医療用デバイスのコロニー形成（Colonization of Medical Devices by Coagulase-Negative Staphylococci）」）。従って、このバイオフィルム表現型は、ブドウ球菌の病原因子であるとみなされている。
【０００６】
幾筋もの証拠が、医療用デバイスの病原体による細菌コロニー形成にバイオフィルムの成長形式が関与することを示している（Costerton et al., Science, 284: 1318-1322 (1999)）。種々の臨床試験は、バイオフィルムの成長形式を採る S. epidermidis 臨床株の能力と病原性の間に相関性があることを立証してきた（Ziebuhr et al., Infect. Immun., 65: 890-896 (1997); Galdbart et al., J. Infect. Dis., 182: 351-355 (2000)）。
【０００７】
ブドウ球菌のバイオフィルムの形成及び維持は、いくつかの遺伝子産物の協奏的な活性を必要とする複雑な発達プロセスを構成する（Gotz, MoI. Microbiol, 43: 1367-1378 (2002) に概説されている）。転写プロファイリング実験は、S. aureus（Beenken et al., J. Bacteriol, 186: 4665-4684 (2004); Resch et al., Appl. Environ. Microbiol, 71: 2663-2676 (2005)）及び S. epidermidis（Yao et al., J. Infect. Dis., 191: 289-298 (2005)）のバイオフィルムの細胞では、自由浮遊性の（即ち、「プランクトンの」）細菌細胞と比較して、多数の遺伝子の発現が改変していることを明らかにした。バイオフィルム細菌の最も臨床的に意義のある特徴は、それらが抗生物質や殺生物剤に対してプランクトン細菌より１０００倍まで抵抗性があることである（Stewart, Int. J. Microbiol, 292: 107-113 (2002)）。さらに、ブドウ球菌のバイオフィルム細菌は、免疫系の免疫監視白血球による食細胞作用に抵抗する（Leid et al., Infect. Immun., 70: 6339-6345 (2002)）。従って、バイオフィルム細菌が慣用の抗生物質処置を生き抜き、宿主の免疫系に侵入して、再発性の慢性感染症を引き起こし得る感染菌のレザバーを提供することができることは明らかである。
【０００８】
バイオフィルム細菌固有の抗生物質抵抗性の機序は、現在知られていないし、排出ポンプのアップレギュレーション、酵素修飾、及び標的の突然変異といった、プランクトン細菌によって利用される抗生物質抵抗性の機序のタイプではないらしい（Costerton et al., Sci. Am., 285: 74-81 (2001)）。抗生物質に対する増加したバイオフィルム抵抗性について、いくつかのあり得る機序が提唱されてきたが、これには、抗生物質のバイオフィルムへの浸透が遅いこと、減少した増殖速度、生理学的な不均質性、「保護化表現型状態」又は「存続体」への分化、バイオフィルム成長によって誘導される一般的なストレス応答、及びバイオフィルム特異的な抵抗性遺伝子の発現が含まれる（Mah et al., Trends Microbiol, 9: 34-39 (2001); Briandet et al., Colloids Surf. B. Biointerfaces, 21: 299-310 (2001); Bollinger et al., J. Bacteriol, 183: 1990-1996 (2001) に概説されている）。
【０００９】
現在、バイオフィルム関連感染症は、プランクトン細菌によって引き起こされる感染症を治療するように最適化された抗生物質又は抗生物質の組合せで治療されている。疑わしいブドウ球菌のバイオフィルム感染症を経験的に治療するために使用される第一線の抗生物質には、（メチシリン感受性株に対して）静脈内投与されるバンコマイシン又はオキサシリンが含まれる。被感染患者が安定状態にあって、感染病原体とその抗生物質感受性が同定されたときは、シプロフロキサシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、リネゾリド、又はキヌプリスチン−ダルフォプリスチンを経口投与することができる（Mermel et al., J. Intraven. Nurs., 24: 180-205 (2001)）。これらの治療薬は、通常、バイオフィルムより放出されるプランクトン細菌を殺すことによって、感染の症状を解消する。しかしながら、抗生物質が治療の血中濃度に達しているという事実にもかかわらず、抗生物質療法によって救済され得るのは、被感染カテーテルの約３２％にすぎない（Saxena et al., Swiss Med. WkIy., 135: 127-138 (2005)）。大多数の場合、バイオフィルム感染症は、被感染表面が取り除かれるまで存続する。被感染表面が静脈へ直接挿入された中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）である場合は、そのデバイスの除去によって引き起こされる外傷は軽微である。しかしながら、トンネル型ＣＶＣ、人工心臓弁、及び心臓ペースメーカーのような、外科的に移植されたカテーテル及び医療用デバイスでは、このデバイスの除去が患者にとって極度に外傷性であり得る。
【００１０】
米国疾病予防管理センター（ジョージア州アトランタ）により発行されたような、血管内デバイス関連感染症の予防用ガイドライン（O'Grady et al., Am. J. Infect. Control, 30: 476-489 (2002)）を遵守することは、数多くの研究において、デバイス関連感染症の発生を減少させることが示されたが、これらの手段を実施する試みにもかかわらず、デバイス関連感染症は、依然として重大な問題である。バイオフィルム感染症のリスクを抑えるために、殺生物剤（クロルヘキシジン−スルファジアジン銀）及び抗生物質（リファンピシン−ミノサイクリン）で含浸したカテーテルが市場へ導入された（Potera, Science, 283: 1837, 1839 (1999)）。これらのデバイスは、臨床試験において有効であることが示されたが、クロルヘキシジン−スルファジアジン銀含浸カテーテルの日本での使用は、重篤なアナフィラキシー反応と関連付けられている（Oda et al., Anesthesiology, 87(5): 1242-1244 (1997); Terazawa et al., Anesthesiology, 89(5): 1296-1298 (1998)）。ミノサイクリン及びリファンピシンで含浸したカテーテルは、リファンピシン抵抗性の S. epidermidis 株でチャレンジされるとき、スルファジアジン銀及びクロルヘキシジンで含浸したカテーテルよりコロニー形成を受けやすいことが示された（Sampath et al., Infect. Control Hosp. Epidemiol, 22: 640-646 (2001)）。ある事例では、カテーテルのバイオフィルム感染症を治療するために、カテーテルの内腔を高濃度の抗生物質溶液で満たしてそのデバイスを滅菌する、抗生物質ロック療法（antibiotic lock therapy）を使用することができる（Carratala, J. Clin. Microbiol. Infect., 8: 282-289 (2002)）。この手技は、カテーテル内腔中のバイオフィルムに対して有効であることが示されている。
【００１１】
バイオフィルム形成への予防療法を開発する最新の研究の焦点となってきたのは、特に２種の化合物である。第一の化合物は、オーストラリアの緑色大型藻類である Delisea pulchra の二次代謝産物の誘導体である、ハロゲン化フラノン（３−（１−ブロモヘキシル）−５−（ジブロモメチレン）フラン−２（５Ｈ）−オン；（５Ｚ）−４−ブロモ−５−（ブロモメチレン）−３−ブチル−２（５Ｈ）−フラノン）である。この化合物は、いくつかのグラム陰性菌種においてＡＩ−２クオラムセンシング（quorum sensing）に干渉して、バイオフィルムの形成を予防する（Hentzer et al., Microbiol., 148: 87-102 (2002)）。さらに、ハロゲン化フラノンは、S. epidermidis（Baveja et al., Biomaterials, 25: 5013-5021 (2004); Baveja et al., Biomaterials, 25: 5003-5012 (2004); Hume et al., Biomaterials, 25: 5023-5030 (2004)）及び枯草菌（Ren et al., Appl. Environ. Microbiol, 70: 4941-4949 (2004)）のようなグラム陽性菌種のバイオフィルム形成を阻害することが報告されてきた。このハロゲン化フラノンには、広い活性スペクトルのあるバイオフィルム阻害剤を提供するポテンシャルがあるように見える。しかしながら、グラム陽性菌に対して観測されるバイオフィルム阻害活性は、抗菌活性による（Ren et al., Appl Environ. Microbiol, 70: 4941-4949 (2004)）のであって、バイオフィルム形成の特異的な阻害によるのではない可能性がある。事実、S. epidermidis（Xu et al., Infect. Immun., 74: 488-496 (2006)）及び S. aureus（Doherty et al., J. Bacteriol, 188: 2885-2897 (2006)）においてＡＩ−２を合成するのに必要とされる遺伝子（ｌｕｘＳ）の欠失は、バイオフィルム形成に悪影響を及ぼさず、ＡＩ−２シグナル伝達経路がこれらの細菌種におけるバイオフィルム形成に必要でないことを示した。研究下にある別の化合物は、カチオン性ペプチドのＲＩＰである（Balaban et al., J. Infect. Dis., 187: 625-630 (2003); Balaban et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 437: 48-54 (2005)）。ＲＩＰは、ブドウ球菌においてクオラムセンシングを阻害して、バイオフィルム形成と病原因子の発現に干渉する（Balaban et al. (2003), op. cit.; Balaban et al. (2005), op. cit.）。
【００１２】
バイオフィルムベースの感染症を治療するために現在利用可能である、承認された少数の治療化合物及び手技は、このような疾患の増加する発生率を逆転させていない。米国疾病予防管理センターは、先進世界において医師が治療する感染症の６５％はバイオフィルム中で増殖する生物が原因であると推定している（Costerton et al., Science, 284: 1318-1322 (1999)）。さらに、米国において毎年配置される５００万本のＣＶＣ及び肺動脈カテーテル（Swan-Ganz）のほぼ１０％が汚染されて、約２００，０００〜４００，０００件のエピソードのカテーテル関連血流感染症をもたらしている。
【００１３】
細菌のバイオフィルム形成を予防又は処置するのに現在利用されている化合物が少数であること、埋込み式カテーテルと他のデバイスが継続的に使用されること、そして上記化合物に対して抵抗性であるバイオフィルム形成菌病原体の株がやがては出現する可能性に照らせば、細菌のバイオフィルム形成を阻害するための新しい手段及び方法へのニーズが明らかに存続している。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、細菌のバイオフィルムの形成を阻害又は予防する有機化合物であるバイオフィルム阻害化合物を提供することによって、上記の問題に対処する。このような化合物は、限定されないが、広く使用されている留置医療用デバイスにおける細菌のバイオフィルム汚染と関連付けられてきた、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus aureus、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカーリス）、及び Enterococcus faecium（エンテロコッカス・フェシウム）が含まれるグラム陽性バイオフィルム形成菌による細菌バイオフィルムの形成を阻害又は予防するのに有用である。本明細書に記載されるバイオフィルム阻害化合物は、バイオフィルムを形成し得る細菌細胞に感受性があるか又はそれとすでに接触している表面でのバイオフィルム形成を阻害又は予防するのに特に有用である。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の組成物及び方法において有用なバイオフィルム阻害化合物を提供し、該化合物は、式１：
【００１６】
【化１】
2011520958.tif 000003
【００１７】
［式中、
Ｘは、Ｓ又はＯであり：
Ｙは、Ｓ又はＮであり；
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシル（−ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、アルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ（−ＮＯ２）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルファモイル、−ＳＯ２ＮＨ２；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及び、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシル（−ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、アルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ（−ＮＯ２）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルファモイル、−ＳＯ２ＮＨ２；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及び、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ、アルキレンオキシ、又はアルキリデンオキシ基、−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ及び置換アミノ基、−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ、アルキレンオキシ、又はアルキリデンオキシ残基、−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；アミノ及び置換アミノ基、−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシル及びカルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯ２ＮＨ２（スルファモイル）；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及びケトン基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有して、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００１８】
好ましい態様において、上記の式１のバイオフィルム阻害化合物は、式２：
【００１９】
【化２】
2011520958.tif 000004
【００２０】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するローダニン化合物であり、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００２１】
好ましくは、式２のローダニンバイオフィルム阻害化合物は、３−（３−クロロフェニル）−５−（３−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９７３１）、３−（４−ブロモフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９２９３）、３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表２中のＭＳＬ−６５１９０５６）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４）、（Ｚ）−３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物８）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物２９）、（Ｚ）−３−（３−シアノフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３４）、（Ｚ）−３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３６）、（Ｚ）−３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４０）、及び（Ｚ）−３−（４−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４９）からなる群より選択される。
【００２２】
別の好ましい態様において、式１のバイオフィルム阻害化合物は、式３：
【００２３】
【化３】
2011520958.tif 000005
【００２４】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するチアゾリジンジオン化合物であり、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００２５】
好ましくは、式３のチアゾリジンジオンバイオフィルム阻害化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６０）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６１）である。
【００２６】
なお別の好ましい態様において、式１のバイオフィルム阻害化合物は、式４：
【００２７】
【化４】
2011520958.tif 000006
【００２８】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するヒダントイン化合物であり、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００２９】
好ましくは、式４のヒダントインバイオフィルム化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５８）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５９）である。
【００３０】
なお別の態様において、式１のバイオフィルム阻害化合物は、式５：
【００３１】
【化５】
2011520958.tif 000007
【００３２】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するチオヒダントイン化合物であり、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００３３】
式５の好ましいチオヒダントインバイオフィルム阻害化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（表３中の化合物６２）である。
【００３４】
本発明の１つの態様において、バイオフィルム阻害化合物は、式６：
【００３５】
【化６】
2011520958.tif 000008
【００３６】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するフラノン化合物であり、
そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００３７】
式６の好ましいフラノンバイオフィルム阻害化合物は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−５−（２，４−ジメトキシフェニル）フラン−２（３Ｈ）−オン（表２中のＭＳＬ−０５１０９７）である。
【００３８】
別の好ましい態様において、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物は、本明細書に記載のバイオフィルム阻害アッセイにおいて、１以上のグラム陽性菌株によるバイオフィルム形成を少なくとも８０％（≧８０％）を阻害する。
【００３９】
なお別の好ましい態様において、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物は、本明細書に定義される、２５μＭ以下（ＭＢＩＣ≦２５μＭ）、より好ましくは１２．５μＭ以下（ＭＢＩＣ≦１２．５μＭ）、及びなおより好ましくは１０μＭ未満（ＭＢＩＣ＜１０μＭ）の最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ）によって示される抗バイオフィルム活性を有する。
【００４０】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、バイオフィルム形成性のグラム陽性菌に曝露されるか又はそれで汚染される場合がある表面での細菌のバイオフィルム形成を予防又は阻害するのに特に有用である。このような表面には、限定されないが、埋込み式医療用デバイス（限定されないが、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）、埋込み式ポンプ、人工心臓弁、及び心臓ペースメーカーが含まれる）；心肺バイパス（ＣＰＢ）ポンプ（心臓−肺機械）；透析機器；人工呼吸器；呼吸装置（酸素及び空気の供給装置）；水パイプ；配管設備；及び、空気ダクトの表面が含まれる。このように、本発明はまた、前記表面を式１の化合物、特に、式２、３、４、５又は６のいずれもの化合物で処置することを含んでなる、表面での細菌バイオフィルム形成を阻害するための方法を提供する。バイオフィルム阻害化合物は、その表面へ、バイオフィルム形成細菌でのその曝露又は感染に先立って、バイオフィルム形成細菌がその表面に接触した後で、又は細菌のバイオフィルムがすでに表面上に形成された後で適用してよい。このように、本明細書に開示する抗バイオフィルム化合物は、有利にも、表面でのバイオフィルム形成を予防するために、又は表面でのバイオフィルム形成を阻止するために利用してよい。好ましくは、表面での細菌バイオフィルム形成に先立って、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物を該表面へ適用する。より好ましくは、バイオフィルム形成細菌が表面に接触する前に、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物を該表面へ適用するか又はその上に提供する。例えば、図１を参照のこと。
【００４１】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、所望の表面へ、限定されないが、コーティング、含浸、及び共有コンジュゲーションが含まれる、多様な方法のいずれによっても適用してよい。本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤はまた、カテーテル又は他の医療用デバイスの内腔を満たすためにロック溶液剤（溶液又は懸濁液）において使用前に利用してよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例５に記載の（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４）で処置した、黄色ブドウ球菌 ATCC 35556 の培養物によるバイオフィルム形成（バイオフィルム成長）の阻害を示す。細菌培養物へ化合物４を４ｘＭＢＩＣ（１２μＭ）の濃度で、２２時間のインキュベーション時間にわたり様々な時点（０、１、２、４、６、８、１０、１２、及び２１時間）で加えた。化合物４の非存在時の並行培養物（未処置対照）においてもバイオフィルム成長を追跡した。クリスタルバイオレットで染色してＯＤ６００を測定することによって、試料中のバイオフィルム成長を定量した。第一（左側）ｙ軸は、化合物４で処置した培養物における経時的な（ｘ軸）バイオフィルム成長の阻害パーセント（バイオフィルム阻害％）を示す。第二（右側）ｙ軸は、並行の未処置対照培養物におけるバイオフィルム成長を示す。詳細については、実施例５を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明がより明瞭に理解され得るために、以下の略語及び用語を以下に定義されるように使用する。
【００４４】
他に示さなければ、「約」及び「ほぼ」という用語が量、数字、又は数値と組み合わせて使用されるとき、その組合せは、引用される量、数字、又は数値だけでなく、その量、数字、又は数値の±１０％の量、数字、又は数値を記載する。例を挙げると、「約４０％」及び「ほぼ４０％」という句は、「４０％」と「３６％〜４４％を含めて」をともに開示する。
【００４５】
有機分子のある位置へ付いた置換基（残基）の略語は、有機化学において通常使用される略語のいずれでもある。そのような略語には、そのような置換基の「簡略」形が含まれる場合がある。例えば、「Ａｃ」は、アセチル基の略語であり、「Ａｒ」は、「アリール」基の略語である。「Ｂｎ」は、ベンジルを示す。「ハロ」又は「ハロゲン」は、ハロゲン残基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を示す。「Ｍｅ」、「Ｅｔ」、及び「Ｐｒ」は、それぞれメチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、及びプロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）基を示すために使用される略語であり；そして「ＯＭｅ」（又は「ＭｅＯ」）と「ＯＥｔ」（又は「ＥｔＯ」）は、それぞれメトキシ（ＣＨ３Ｏ−）とエトキシ（ＣＨ３ＣＨ２Ｏ−）を示す。「ｉＰｒ」は、イソプロピルを示す。「ＮＣＯ」はイソシアネートの略語であり、「ＮＣＳ」はイソチオシアネートの略語である。水素及び炭素の原子は、本明細書に記載の有機分子の構造式における水素及び炭素の原子の存在及び位置が当業者に知られて理解されているので、本明細書に記載される有機分子の構造式に必ずしも示されないか、又はある構造においてのみ選択的に示される場合がある。
【００４６】
「アシル」という用語は、当該技術分野で知られた通常の意味を有する。好ましくは、「アシル」は、「−Ｃ（Ｏ）Ｒ」残基であり、ここで「−Ｃ（Ｏ）」はカルボニル基を示して、Ｒは脂肪族基又はアリール基であるか、又は本明細書において他に特定される通りである。
【００４７】
「アルキル」という用語は、当該技術分野で知られる通常の意味を有して、直鎖又は分岐鎖の炭化水素残基であり得る飽和した炭化水素鎖を意味する。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ１８飽和炭化水素鎖であり、より好ましくはＣ１−Ｃ１０飽和炭化水素鎖、なおより好ましくはＣ１−Ｃ６飽和炭化水素鎖、そしてさらにより好ましくはＣ１−Ｃ４飽和炭化水素鎖である。アルキル残基には、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、アミル、及びｔ−ペンチルが含まれる。他に特定されなければ、「置換アルキル」基は、アミノ、アルキルアミノ（ＣｎＨ２ｎ＋１−ＮＨ−）、アルコキシ、アルキルチオ、オキソ、ハロ、アシル、ニトロ、ヒドロキシル、シアノ、アリール、アルキルアリール、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ（ＡｒＮＨ−）、カルボシクリル、カルボシクリルオキシ、カルボシクリルチオ、カルボシクリルアミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルチオ、等のような、慣用的に使用される１以上の置換基で置換されたアルキル基である。他に特定されなければ、「アルキル」という用語を「カルボシクリルアルキル」又は「アリールアルキル」のような複合語において一緒に使用するとき、そのような複合語に関連して使用される炭素原子の番号又は環番号には、その成分（moiety）のアルキル部分（portion）の原子を含めない（その成分の他の部分がどの炭素原子も含有しないのでなければ）。そのような場合、アルキル部分は、典型的には、他のアルキル成分についての上記の定義で示した鎖の長さを有する。
【００４８】
「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル部分中の炭素原子が酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、又は窒素（Ｎ）に置き換わっている、上記に定義されるようなアルキル残基を意味する。
【００４９】
「アルキルアミノ」という用語は、１又は２のアルキル基（即ち、ジアルキルアミノ残基が含まれる）で置換されたアミノ残基を意味して、ここでアルキル基は、同じであっても異なっていてもよい。
【００５０】
「アラルキル」という用語は、１以上のアルキル置換基で置換されたアリール残基を意味する。
【００５１】
「アルケニル」という用語は、１以上の炭素−炭素二重結合を有する、脂肪族の直鎖又は分岐鎖の炭化水素残基を意味する。３以上の炭素原子を含有するアルケニル基は、直鎖でも分岐鎖でもよい。好ましくは、アルケニル基は、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素鎖、より好ましくはＣ２−Ｃ１０炭化水素鎖、なおより好ましくはＣ２−Ｃ６炭化水素鎖、そしてさらにより好ましくはＣ２−Ｃ４不飽和炭化水素鎖である。好適なアルケニル残基には、限定されないが、ビニル、アリル（２−プロペニル）、イソプロペニル、２−ブテニル、１，３−ブタジエニル、２−ペンテニル、１，３−ペンタジエニル、等が含まれる。
【００５２】
「アルキニル」という用語は、１以上の炭素−炭素三重結合を有する、脂肪族の炭化水素残基を意味する。３以上の炭素原子を含有するアルキニル基は、直鎖でも分岐鎖でもよい。好ましくは、アルキニル基は、Ｃ２−Ｃ１８炭化水素鎖、より好ましくはＣ２−Ｃ１０炭化水素鎖、なおより好ましくはＣ２−Ｃ６炭化水素鎖、そしてさらにより好ましくはＣ２−Ｃ４炭化水素鎖である。
【００５３】
「アリール」という用語は、５〜８員の単環系芳香族環を有する一価の環式炭化水素残基、又は５〜８の環員をその各環に有する多環系芳香族環系を意味する。アリール残基は、未置換であっても、限定されないが、アルキル（例、「低級」又はＣ１−Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ、アルコキシ（例、低級アルコキシ）、アルキルチオ、シアノ、ハロ、アミノ、及びニトロより選択される１以上の置換基で置換されていてもよい。アリール基の例には、限定されないが、フェニル、メチルフェニル（トリル）、ジメチルフェニル、アミノフェニル、ニトロフェニル、ヒドロキシフェニル、及びナフチル（例、１−ナフチル、２−ナフチル）が含まれる。
【００５４】
「ヘテロアリール」は、１以上の環炭素原子が窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、又はイオウ（Ｓ）に置き換わっている、上記に記載されるようなアリール残基を意味する。好ましいヘテロアリール残基には、１又は２の環炭素が窒素（Ｎ）に置き換わっているフェニル基が含まれる。より好ましくは、本明細書に記載の化合物に有用なヘテロアリール残基は、ピロリル、ピリジル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、チアゾリル、及びオキサゾリルである。
【００５５】
「ヘテロシクリル」は、飽和、不飽和、又は芳香族（即ち、ヘテロアリール）であり得る１以上の環を含有する複素環式基を意味し、ここでこの残基の少なくとも１つの環は、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びイオウ（Ｓ）より選択される１以上のヘテロ原子を含有する。さらに、ヘテロシクリル残基は、ヘテロシクリル残基の環員原子へ付いた１以上の置換基、即ち、環置換基（例えば、ハロ残基、アルキル残基、アリール残基）を含有してよい。この定義では、ヘテロシクリル基のすべての安定した異性体が考慮される。
【００５６】
「低級」は、有機化学の文脈において線状分子の基（残基）へ適用されるように使用されるとき、それが適用される基が１〜６の原子、即ち、６員以下の原子を有することを意味する。但し、環（シクロアルキルのような）の場合、その場合「低級」は、３〜６員の原子を有する環を意味する。非限定的な例によれば、「低級」アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、又はヘキシルのようなＣ１−Ｃ６鎖である。より好ましい低級アルキルは、Ｃ１−Ｃ４鎖である。また、非限定的な例によれば、二重結合の存在により、「低級」アルケニルは、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、又はヘキセニルのようなＣ２−Ｃ６基である。より好ましい低級アルケニルは、Ｃ２−Ｃ４鎖である。また、非限定的な例によれば、三重結合の存在により、「低級」アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、又はヘキシニルのようなＣ２−Ｃ６基である。より好ましい低級アルキニルは、Ｃ２−Ｃ４鎖である。
【００５７】
１以上の列挙される要素又は工程を「含んでなる」と本明細書に記載される組成物又は方法は無制限（open-ended）であり、列挙される要素又は工程は必須であるが、他の要素又は工程もその組成物又は方法の範囲内に加えてよいことを意味する。冗長さを避けるために、１以上の列挙される要素又は工程「を含んでなる」（又は「を含む」）と記載されるどの組成物又は方法も、列挙される同じ要素又は工程「から本質的になっている」（又は「から本質的になる」）、対応する、より限定された組成物又は方法を記載するとも理解され、その組成物又は方法には、列挙される本質的な要素又は工程が含まれて、その組成物又は方法の基本的で新規の特徴（複数）に実質的には影響を及ぼさない追加の要素又は工程も含めてよいことを意味する。また、１以上の列挙される要素又は工程「を含んでなる」又は「から本質的になる」と本明細書に記載されるどの組成物又は方法も、列挙される要素又は工程「からなっている」（又は「からなる」）、列挙されない他のどの要素又は工程も含まれない、対応する、より限定されて有限な（closed-ended）組成物又は方法も記載すると理解される。本明細書に開示されるどの組成物又は方法も、列挙されるどの本質的な要素又は工程でも、知られているか又は開示される同等物がその要素又は工程の代用になってよい。
【００５８】
また、要素又は工程のリスト「からなる群より選択される」か又は他のやり方で引用される要素又は工程は、他に述べなければ、収載される要素又は工程のどの２以上の組合せを含めて、以下に続くリスト中の要素又は工程の１以上を意味すると理解される。
【００５９】
他の用語の意味は、有機化学、薬理学、製剤学、及び微生物学の分野が含まれる、当該技術分野の当業者によって理解されるように、文脈によって理解されよう。
【００６０】
本発明は、ある種のヘテロシクリル化合物が、広く使用されている留置医療用デバイスにおける細菌のバイオフィルム汚染と関連付けられてきた、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）、S. aureus（黄色ブドウ球菌）、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカーリス）、及び Enterococcus faecium（エンテロコッカス・フェシウム）の１以上の株が含まれるグラム陽性菌による細菌のバイオフィルム形成を阻害するという発見に基づく。このような化合物を「バイオフィルム阻害化合物」、「バイオフィルム阻害剤」、又は「抗バイオフィルム化合物」と呼ぶ。
【００６１】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、Staphylococcus epidermidis によるバイオフィルム形成を阻害するが、プランクトン増殖にはわずかな効果しか及ぼさない化合物（「ヒット」）を同定するために、８７，０００種を超す有機分子を提供する多数のライブラリーの細胞ベースのハイスループットスクリーニング（以下の表１、実施例１を参照のこと）を実行することより初めて発見された（以下の表２、実施例２を参照のこと）。本明細書に使用する最小バイオフィルム阻害濃度（ＭＢＩＣ）は、バイオフィルム形成を８０％以上（≧８０％）阻害する化合物の最低濃度を意味する。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、本明細書に使用されるように、細菌の増殖を８０％以上（≧８０％）阻害する化合物の最低濃度を意味する。細胞傷害性について、「ＣＣ５０」は、哺乳動物細胞系（例、ヒーラ細胞）の生存能を５０％低下させる化合物の濃度を意味する。最初のライブラリースクリーニングプロトコールより、以下の判定基準：ＭＢＩＣ≦１２．５μＭ及びＭＩＣ≧１００μＭに合致する、１４５個の確定（cofirmed）ヒット（０．１６％）を同定した。これらの化合物を、抗バイオフィルム（バイオフィルム形成の阻害）及び抗菌活性のデータに基づいて、確証（validated）ヒットと命名した。ヒーラヒト細胞系を使用する細胞傷害性データ（ＣＣ５０）を使用して、確証ヒットを優先化した。ＣＣ５０／ＭＢＩＣ＞８である確証ヒットに最高の優先度を与えた。
【００６２】
ライブラリースクリーニングより確証したバイオフィルム阻害剤について、S. epidermidis、S. aureus、及びEnterococcus faecalis に対するその抗バイオフィルム活性、並びにヒト（ヒーラ）細胞系に対する細胞傷害性を評価する一連の二次アッセイにおいて査定して、グラム陽性菌種の１以上の株によるバイオフィルム産生を阻害する化合物を入手した。
【００６３】
このライブラリースクリーニングより確認したバイオフィルム阻害剤の最初の発見は、１以上のグラム陽性菌株による細菌のバイオフィルム形成を阻害する追加の化合物の発見をもたらした。本明細書に記載の好ましいバイオフィルム阻害剤は、S. epidermidis、S. aureus、E. faecalis、E. faecium、及び Enterococcus gallinarum（エンテロコッカス・ガリナルム）の１以上の株について２５μＭ以下のＭＢＩＣを有する。
【００６４】
表面での細菌バイオフィルム形成を阻害又は予防するための本明細書に記載の組成物及び方法に有用なバイオフィルム阻害剤は、式１：
【００６５】
【化７】
2011520958.tif 000009
【００６６】
［式中、
Ｘは、Ｓ又はＯであり：
Ｙは、Ｓ又はＮであり；
Ｒ１は：
ａ）置換フェニル基｛ここで該フェニル基は、３、４、及び５位の１以上で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシル（−ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、アルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ（−ＮＯ２）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルファモイル、−ＳＯ２ＮＨ２；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及び、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群より選択される残基で置換され；
そしてここで前記フェニル基は、２位でも６位でも置換されない｝；又は
ｂ）置換ヘテロアリール基｛ここで該ヘテロアリール基は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、又はピリダジニルであり、そしてここで前記ヘテロアリール基は、１以上の環炭素で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；シアノ（−ＣＮ）；カルボキシル（−ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、アルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；ニトロ（−ＮＯ２）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；スルファモイル、−ＳＯ２ＮＨ２；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及び、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群のいずれでも置換される｝であり；そして
Ｒ２は、置換フェニル基であり、ここで該フェニル基は：
ａ）４位で、ヒドロキシル（−ＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ２）での置換；
ｂ）３位で、ヒドロキシル；アルコキシ、アルキレンオキシ、又はアルキリデンオキシ基、−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；及び、アミノ及び置換アミノ基、−ＮＲ９Ｒ１０（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）からなる群より選択される残基での置換；及び
ｃ）５位で、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシル；アルコキシ、アルキレンオキシ、又はアルキリデンオキシ残基、−ＯＲ８（ここでＲ８は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；シアノ；アミノ及び置換アミノ基、−ＮＲ９Ｒ１０基（ここでＲ９とＲ１０は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである）；カルボキシル及びカルボン酸エステル基、−ＣＯＯＲ５（ここでＲ５は、Ｈ又はアルキルである）；−ＣＦ３（トリフルオロメチル）；スルホニル基、−ＳＯ２Ｒ６（ここでＲ６は、アルキルである）；−ＳＯ２ＮＨ２（スルファモイル）；アルデヒド（−ＣＨＯ）；及びケトン基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（ここでＲ７は、アルキルである）からなる群より選択される残基での置換；
からなる群より選択される１以上の位置で、ある残基で置換され、
そしてここで該フェニル基は、２位にも６位にも置換を有さない］の構造を有する化合物であり；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００６７】
上記の式１のバイオフィルム阻害剤は、式２：
【００６８】
【化８】
2011520958.tif 000010
【００６９】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するローダニン化合物であってよく；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００７０】
本明細書に記載の組成物及び方法に有用な式２の好ましいローダニンバイオフィルム阻害化合物は、３−（３−クロロフェニル）−５−（３−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９７３１）、３−（４−ブロモフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表２中のＭＳＬ−０４９２９３）、３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表２中のＭＳＬ−６５１９０５６）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４）、（Ｚ）−３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物８）、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物２９）、（Ｚ）−３−（３−シアノフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３４）、（Ｚ）−３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物３６）、（Ｚ）−３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４０）、及び（Ｚ）−３−（４−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（表３中の化合物４９）からなる群より選択される。
【００７１】
別の好ましい態様において、式１のバイオフィルム阻害剤は、式３：
【００７２】
【化９】
2011520958.tif 000011
【００７３】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するチアゾリジンジオン化合物であり；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００７４】
本明細書に記載の組成物及び方法に有用な式３の好ましいチアゾリジンジオンバイオフィルム阻害化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６０）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物６１）である。
【００７５】
式１のバイオフィルム阻害剤は、式４：
【００７６】
【化１０】
2011520958.tif 000012
【００７７】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するヒダントイン化合物であってよく；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００７８】
本明細書に記載の組成物及び方法に有用な式４の好ましいヒダントインバイオフィルム阻害化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５８）又は（Ｚ）−３−（４−クロロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（表３中の化合物５９）である。
【００７９】
式１のバイオフィルム阻害剤は、式５：
【００８０】
【化１１】
2011520958.tif 000013
【００８１】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するチオヒダントイン化合物であってよく；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００８２】
本明細書に記載の組成物及び方法に有用な式５の好ましいチオヒダントインバイオフィルム阻害化合物は、（Ｚ）−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−ヒドロキシ−４−エトキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（表３中の化合物６２）である。
【００８３】
細菌のバイオフィルム形成を阻害するための本明細書に記載の組成物及び方法に有用な別のバイオフィルム阻害剤は、式６：
【００８４】
【化１２】
2011520958.tif 000014
【００８５】
［式中、Ｒ１とＲ２は、式１について上記に記載される通りである］の構造を有するフラノン化合物であり；そしてここで該化合物は、細菌のバイオフィルム形成を阻害する。
【００８６】
本明細書に記載の組成物及び方法に有用な式６の好ましいフラノンバイオフィルム阻害剤は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−５−（２，４−ジメトキシフェニル）フラン−２（３Ｈ）−オン（表２中のＭＳＬ−０５１０９７）である。
【００８７】
細菌のバイオフィルム阻害剤の合成
本明細書に記載の細菌バイオフィルム阻害化合物は、当該技術分野で知られた方法を使用して合成することができる。以下に示すように、上記の図２〜６のバイオフィルム阻害剤に好ましい２工程合成スキームは、所望されるバイオフィルム阻害剤の生成物を生成するために、３位置換されたコア環構造のアルデヒドとの一般的な第二工程の縮合を伴う。所望の生成物を入手するための、コア環構造のアルデヒドとの縮合は、よく知られた反応であり、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤の合成へ容易に適用される。例えば、Whitesitt et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 6: 2157- 2162 (1996); Grant et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10: 2179-2182 (2000) (ローダニン); Mustafa et al., J. Am. Chem. Soc, 82: 2597-2602 (1960); Tanaka et al., J. Antibiotics, 47: 297-300 (1994) を参照のこと。
【００８８】
Ａ．ローダニンバイオフィルム阻害剤の合成。
【００８９】
ローダニン化合物のイソチオシアネートからの合成については、すでに記載されている。例えば、Cutshall et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15: 3374-3379 (2005); Sing et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 11 : 91-94 (2001) を参照のこと。このような方法を適用して、以下の合成スキームに従って、本明細書に記載のローダニンバイオフィルム阻害剤（上記の式２）を合成することができる：
【００９０】
【化１３】
2011520958.tif 000015
【００９１】
適切なイソチオシアネート及びアルデヒドからの２工程手順において、３位と５位に置換基（それぞれ、Ｒ１とＲ２）があるローダニンバイオフィルム阻害剤を構築する。第一工程では、塩化メチレン中のトリエチルアミンの存在下にイソチオシアネート（Ｒ１−ＮＣＳ）をチオグリコール酸エチルで処理して、３−置換ローダニンを生成する。得られる３−置換ローダニンを精製してから、酢酸ナトリウム及び酢酸の存在下にアルデヒド（Ｒ２−ＣＨＯ）と縮合して、所望される３，５−二置換ローダニンを生成する。
【００９２】
Ｒ１におけるバリエーションは、対応するイソチオシアネートの選択によって達成される。イソチオシアネートは、市販供給源より入手しても、当該技術分野で知られた手順を使用する、対応するアミンからの合成によって入手してもよい。例えば、Pascal et al., Eur. J. Med. Chem., 25: 81-85 (1990); Goodyer et al., Bioorg. Med. Chem., 11 : 4189-4206 (2003) を参照のこと。Ｒ２におけるバリエーションは、対応するアルデヒドの取込みによって達成される。アルデヒドは、市販供給源より購入しても、当該技術分野で知られた手順を使用して合成してもよい。置換基は、構造中へ取り込んだならば概して修飾されないし、最終の構造が生成されたならば、追加の置換基が付加又は除去されることも概してない。すべてのバリエーションは、イソチオシアネート及びアルデヒドのレベルで概して達成される。
【００９３】
Ｂ．チオヒダントインバイオフィルム阻害剤の合成。
【００９４】
チオヒダントインのイソチオシアネートからの合成については、すでに記載されている。例えば、El-Barbary et al., J. Med. Chem., 37: 73-77 (1994); Khodair, J. Carbohydr. Res., 331 : 445-454 (2001) を参照のこと。このような方法を適用して、以下の合成スキームに従って、本明細書に記載のチオヒダントインバイオフィルム阻害剤（上記の式５）を合成することができる：
【００９５】
【化１４】
2011520958.tif 000016
【００９６】
適切なイソチオシアネート及びアルデヒドからの２工程手順で、３位と５位に置換基（それぞれ、Ｒ１とＲ２）があるチオヒダントインを構築する。第一工程では、塩化メチレン中のトリエチルアミンの存在下にイソチオシアネート（Ｒ１−ＮＣＳ）をグリシンで処理してから、酸性条件で環化させて、３−置換チオヒダントインを生成する。得られる３−置換チオヒダントインを精製してから、酢酸アンモニウム及び酢酸の存在下にアルデヒド（Ｒ２−ＣＨＯ）と縮合して、所望される３，５−二置換チオヒダントインを生成する。
【００９７】
Ｒ１におけるバリエーションは、対応するイソチオシアネートの選択によって達成される。イソチオシアネートは、市販供給源より入手しても、当該技術分野で知られた手順を使用する、対応するアミンからの合成によって入手してもよい。例えば、Pascal et al., Eur. J. Med. Chem., 25: 81-85 (1990); Goodyer et al., Bioorg. Med. Chem., 11 : 4189-4206 (2003) を参照のこと。Ｒ２におけるバリエーションは、対応するアルデヒドの取込みによって達成される。アルデヒドは、市販供給源より購入しても、当該技術分野で知られた手順を使用して合成してもよい。置換基は、構造中へ取り込んだならば概して修飾されないし、最終の構造が生成されたならば、追加の置換基が付加又は除去されることも概してない。すべてのバリエーションは、イソチオシアネート及びアルデヒドのレベルで概して達成される。
【００９８】
Ｃ．ヒダントインバイオフィルム阻害剤の合成。
【００９９】
ヒダントイン化合物のイソシアネートからの合成については、すでに記載されている。例えば、Boeijen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 2375-2380 (1998) を参照のこと。このような方法を適用して、以下の合成スキームに従って、本明細書に記載のヒダントインバイオフィルム阻害剤（上記の式４）を合成することができる：
【０１００】
【化１５】
2011520958.tif 000017
【０１０１】
適切なイソシアネート及びアルデヒドからの２工程手順で、３位と５位に置換基（それぞれ、Ｒ１とＲ２）があるヒダントインを構築する。第一工程では、塩化メチレン中のトリエチルアミンの存在下にイソシアネート（Ｒ１−ＮＣＯ）をグリシンで処理してから、酸性条件で環化させて、３−置換ヒダントインを生成する。得られる３−置換ヒダントインを精製してから、酢酸アンモニウム及び酢酸の存在下にアルデヒドと縮合して、所望される３，５−二置換ヒダントインを生成する。
【０１０２】
Ｒ１におけるバリエーションは、イソシアネートの選択によって達成される。イソシアネートは、市販供給源より誘導しても、当該技術分野で知られた手順を使用する、対応するアミンからの合成によって誘導してもよい。Ｒ２におけるバリエーションは、対応するアルデヒドの取込みによって達成される。アルデヒドは、市販供給源より購入しても、当該技術分野で知られた手順を使用して合成してもよい。置換基は、構造中へ取り込んだならば概して修飾されないし、最終の構造が生成されたならば、追加の置換基が付加又は除去されることも概してない。すべてのバリエーションは、イソチオシアネート及びアルデヒドのレベルで概して達成される。
【０１０３】
Ｄ．チアゾリジンジオンバイオフィルム阻害剤の合成。
【０１０４】
コア構造のアルデヒドとの縮合によるチアゾリジンジオンの合成については、すでに記載されている。例えば、Mustafa et al., J. Am. Chem. Soc, 82: 2597-2602 (1960) を参照のこと。このような方法を適用して、以下の合成スキームに従って、本明細書に記載のようなチアゾリジンジオンバイオフィルム阻害剤（上記の式３）を合成することができる：
【０１０５】
【化１６】
2011520958.tif 000018
【０１０６】
適切なイソシアネート及びアルデヒドからの２工程手順で、３位と５位に置換基（それぞれ、Ｒ１とＲ２）があるチアゾリジンジオンを構築する。第一工程では、塩化メチレン中のトリエチルアミンの存在下にイソシアネート（Ｒ１−ＮＣＯ）をチオグリコール酸エチルで処理してから、酸性条件で環化させて、３−置換チアゾリジンジオンを生成する。得られる３−置換チアゾリジンジオンを精製してから、酢酸アンモニウム及び酢酸の存在下にアルデヒドと縮合して、所望される３，５−二置換チアゾリジンジオンを生成する。
【０１０７】
Ｒ１におけるバリエーションは、イソシアネートの選択によって達成される。イソシアネートは、市販供給源より誘導しても、当該技術分野で知られた手順を使用する、対応するアミンからの合成によって誘導してもよい。Ｒ２におけるバリエーションは、対応するアルデヒドの取込みによって達成される。アルデヒドは、市販供給源より購入しても、当該技術分野で知られた手順を使用して合成してもよい。置換基は、構造中へ取り込んだならば概して修飾されないし、最終の構造が生成されたならば、追加の置換基が付加又は除去されることも概してない。すべてのバリエーションは、イソチオシアネート及びアルデヒドのレベルで概して達成される。
【０１０８】
Ｅ．フラノンバイオフィルム阻害剤の合成。
【０１０９】
フラノンを合成する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Agnihotri et al., J Indian Chem. Soc, 59: 869-876 (1982) を参照のこと。本明細書に記載のフラノンバイオフィルム阻害剤（上記の図６）は、以下の合成スキームに従って合成することができる：
【０１１０】
【化１７】
2011520958.tif 000019
【０１１１】
適切な４−Ｒ’，４−オキソブタン酸及びアルデヒド（Ｒ２−ＣＨＯ）からの２工程手順で、３位と５位に置換基（それぞれ、Ｒ２とＲ１）があるフラノンを構築する。第一工程では、４−オキソブタン酸を無水酢酸及びピリジンで処理して、５−置換フラノンを生成する。得られる５−置換フラノンを精製してから、無水酢酸及びピリジンの存在下にアルデヒドと縮合して、所望される３，５−二置換フラノンを生成する。あるいは、３，５−二置換フラノンは、４−オキソブタン酸とアルデヒドを無水酢酸及びピリジンの存在下に一緒にすることによって、中間体のモノ置換フラノンを単離することのないワンポット手順で生成してよい。
【０１１２】
Ｒ１におけるバリエーションは、４−オキソブタン酸の選択によって達成される。４−オキソブタン酸は、市販供給源より入手しても、当該技術分野で知られた手順を使用する、対応する置換ベンゼンと無水コハク酸からの合成によるか又は他の経路を介して入手してもよい。Ｒ２におけるバリエーションは、対応するアルデヒドの取込みによって達成される。アルデヒドは、市販供給源より購入しても、当該技術分野で知られた手順を使用して合成してもよい。置換基は、構造中へ取り込んだならば概して修飾されないし、最終の構造が生成されたならば、追加の置換基が付加又は除去されることも概してない。すべてのバリエーションは、イソチオシアネート及びアルデヒドのレベルで概して達成される。
【０１１３】
バイオフィルム形成の阻害（抗バイオフィルム活性）のアッセイ
当該技術分野では、細菌のバイオフィルム形成を検出して測定するためのアッセイが知られている。バイオフィルム阻害化合物を検出して特性決定するときに有用なバイオフィルム形成アッセイの例を以下の実施例１に記載する。簡潔に言えば、化合物（既知のバイオフィルム阻害剤又は試験化合物）の存在又は非存在下に、９６ウェルアッセイプレートの個別ウェル中の増殖培地へ細菌細胞を接種する。特定時間のインキュベーションの後で、このウェルのそれぞれより、増殖培地と非バイオフィルム細菌細胞を除去する。ウェルの表面へ付着したあらゆるバイオフィルム中の細菌細胞をエタノールの添加によって固定する。エタノールを除去し、固定したバイオフィルム細菌細胞をクリスタルバイオレット（ＣＶ）で染色する。ＣＶ染色の強度は、細菌のバイオフィルム形成と正に相関していて、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）を読み取ることによってウェル中で測定する。未処置対照と処置培養物の間のバイオフィルム形成の差は、相対的なバイオフィルム阻害活性（抗バイオフィルム活性）の指標を提供する。多数の培養物と、あるいは同一２検体の培養物における異なる濃度の阻害剤の使用により、未処置対照培養物と比較して、バイオフィルム形成を少なくとも８０％（即ち、≧８０％）阻害する化合物の最低濃度として本明細書に定義される、化合物の最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ）の定量が可能になる。
【０１１４】
細菌のバイオフィルム阻害剤の使用及び組成物
本明細書に記載の化合物は、バイオフィルムを形成することが可能であるグラム陽性菌の１以上の種又は株によるバイオフィルム形成を阻害又は予防する活性（「抗バイオフィルム活性」とも呼ばれる）をこれらの化合物が保有するという事実のために、「バイオフィルム阻害化合物」、「バイオフィルム阻害剤」、又は「抗バイオフィルム化合物」と呼ばれる。このような細菌には、限定されないが、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus aureus、及び Enterococcus faecalis が含まれる。このようなバイオフィルム形成性グラム陽性菌の１以上の株は、埋込み式医療用デバイスの表面にバイオフィルムを形成することが報告されてきた。
【０１１５】
本発明による方法において、表面でのバイオフィルム形成の阻害又は予防は、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を表面でバイオフィルムを形成することが可能である細菌細胞と接触させることを含む。好ましくは、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、バイオフィルム形成性細菌との接触に先立って表面と接触しているが、バイオフィルムを形成しているか又はそれを形成することが可能である細菌細胞とすでに接触している表面とバイオフィルム阻害剤を接触させてもよい。バイオフィルム阻害化合物は、表面でのバイオフィルム形成を阻害するときに、表面がバイオフィルム形成性細菌細胞と接触するのに先立つか又は表面とすでに接触した細胞によるバイオフィルムの定着に先立って該化合物を表面と接触させたならば、概してより有効である。
【０１１６】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物は、細菌のバイオフィルム形成を支援する多様な材料のいずれからも構成されるか又はそれを含んでなる固体表面と接触させることができる。このような材料には、限定されないが、プラスチック、ガラス、シリコン、金属、ナイロン、セルロース、ナイロン、ポリマー樹脂、及びこれらの組合せが含まれる。
【０１１７】
理論上、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物は、単離された化合物単独（原化合物）として固体表面へ適用し得るが、該化合物は、少なくとも１つの他の化合物との組成物において利用される可能性がより高い。本発明の組成物は、バイオフィルム阻害化合物を固体表面へ適用するという意図された形式に特に適している多様な形態のいずれであってもよい。担体は、バイオフィルム阻害化合物を使用するための媒体を提供するあらゆる化合物である。担体は、液体、固体、又は半固体であってよい。本明細書に記載の組成物における使用のための担体には、限定されないが、水、水性緩衝液、有機溶媒、及び固体分散剤が含まれる。固体組成物では、慣用の無毒の固体担体が好ましくて、限定されないが、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム、等が含まれる。液体組成物は、例えば、本明細書に記載のようなバイオフィルム阻害化合物を液体担体に溶解又は分散させて溶液剤又は懸濁液剤を生成することによって製造してよい。
【０１１８】
上記のように、組成物には、選択されるバイオフィルム阻害化合物の有効量が許容される担体との組合せにおいて含まれて、１以上の他の薬剤、希釈剤、充填剤、及び賦形剤が含まれてもよい。賦形剤は、バイオフィルム形成の阻害以外の望まれる特性を組成物へ提供する化合物である。本明細書に記載の組成物に有用な賦形剤には、限定されないが、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、分散剤、共溶媒、界面活性剤、ゲル化剤、及び乾燥剤が含まれる。
【０１１９】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、細菌バイオフィルム阻害の利益を特別な組成物へ、又は組成物が適用され得る表面へ提供するために、多様な組成物のいずれへも取り込んでよい。本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を含んでなる組成物には、限定されないが、溶液剤、懸濁液剤、乾燥混合物、ゲル剤、石油製品、有孔膜、有孔フィルター、リポソーム剤、樹脂粒子剤、プラスチック剤、塗料剤、接着剤、ペースト剤、セルロース製品、織物剤（繊維、撚糸、又は布）、及びナノ粒子剤が含まれる。バイオフィルム阻害剤は、標準法によって、微細な固体粒子又は液滴をガスと混合したエアゾール剤での表面への送達用に製剤化してもよい。本明細書に記載の組成物は、抗菌増殖剤（例、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、抗生物質、又は他の微生物の殺生物剤）を、組成物と接触し得る潜在的に汚染性の細菌の１以上の株の増殖を阻害するか又はそれを殺すのに有効な濃度で含んでもよい。
【０１２０】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤は、バイオフィルムを形成するグラム陽性菌との接触を受け易い表面へ塗布、被覆、含浸させるか又は他のやり方で取り込ませることができる。このような表面は、限定されないが、埋込み式医療用デバイス（中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）、埋込み式ポンプ、人工心臓弁、及び心臓ペースメーカーのような）；心肺バイパス（ＣＰＢ）ポンプ（心臓−肺機械）；透析機器；人工呼吸器；呼吸装置（酸素及び空気の供給装置）；水パイプ；空気ダクト、空気濾過器、水濾過器、及び配管設備が含まれる多様な工業製品に見出される。特別な組成物と特別な表面の特性により、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を含有するように表面が処置される好ましい方法が決定される。
【０１２１】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤で処置され得る表面を有する埋込み式医療用デバイスには、限定されないが、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）、埋込み式ポンプ、人工心臓弁、及び心臓ペースメーカーが含まれる。医療用デバイスの表面は、バイオフィルム阻害化合物の特定の化学構造と、そのデバイスが構築される材料の種類に依存したやり方で、バイオフィルム阻害剤で被覆することができる（Zilberman and Eisner, Journal of Controlled Release, 130: 202-215 (2008) に概説されている）。デバイスのプラスチック表面を処置するには、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を重合化に先立って樹脂へ取り込んでも、デバイス又はそのプラスチック成分を、好ましくはバイオフィルム阻害剤をプラスチック表面へ吸着又は吸収させる１以上の膨張剤の存在下に、バイオフィルム阻害剤の溶液剤又は懸濁液剤に浸漬してもよい（例えば、Schierholz et al., Biomaterials, 18: 839-844 (1997); Schierholz and Pulverer, Biomaterials, 19: 2065-2074 (1998); Schierholz et al., J. Antimicrob. Chemother., 46: 45-50 (2000) を参照のこと）。バイオフィルム阻害剤はまた、適正な架橋連結剤を使用して、プラスチックへ共有結合させてよい。あるいは、バイオフィルム阻害剤をヒドロゲル又はポリマーのような材料の中へ含浸させてから、これを使用して医療用デバイスを被覆してよい。抗菌デバイスコーティング剤を生成する、抗菌剤と組み合わせたポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）及びポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）：コグリコリドのような生分解性プラスチック樹脂の使用については、すでに記載されている（Gollwitzer et al., J. Antimicrob Chemother., 51, 585-591 (2003)）。このような技術は、本明細書に記載のバイオフィルム阻害化合物を含んでなる抗バイオフィルムコーティング剤を製造することへ容易に適用することができる。
【０１２２】
本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤はまた、「ロック溶液剤」（溶液剤又は懸濁液剤）において中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）との使用に利用してよい。標準的な医療用デバイスのロック療法では、デバイスの細菌汚染を防ぐための抗菌剤（例、消毒薬、抗生物質）を含んでなるロック溶液剤で医療用デバイスの内腔（複数）を満たす。ロック溶液剤は、デバイスが使用中でないときにデバイスの内腔（複数）へ導入してから、使用直前に排出させる。本発明によるロック溶液剤は、本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を潜在的に汚染性の細菌による細菌のバイオフィルム形成を阻害するのに十分な濃度で含んでなる溶液剤又は懸濁液剤である。本明細書に記載のバイオフィルム阻害剤を含んでなるロック溶液剤は、医療用デバイスにおける細菌の汚染及び感染の予防を強化する他の多様な化合物のいずれもさらに含んでよい。本発明のロック溶液剤を調製するときに使用し得る、このような追加の化合物には、限定されないが、潜在的に汚染性の細菌の１以上の株の増殖を阻害する（又は殺す）のに有効な濃度での１以上の抗菌増殖剤（例、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、抗生物質、微生物の殺生物剤）と、細菌増殖の阻害とバイオフィルム形成の予防以外の追加の望まれる特性をロック溶液剤へ提供する１以上の賦形剤が含まれる。例えば、賦形剤は、デバイスが使用されるか又は埋め込まれるときにデバイス内腔を満たす体液（例、血液）に類似している密度、浸透性、又は粘度をロック溶液剤へ提供することができる。ロック溶液剤の賦形剤はまた、血液凝固及び／又はフィブリン鞘の形成によって引き起こされるカテーテル内腔の閉塞を防ぐ場合がある。
【０１２３】
バイオフィルム形成を阻害又は予防するための方法又は組成物において表面へ適用されるか又は他のやり方で利用されるのに有効なバイオフィルム阻害剤の量は、規制当局の諸基準に一致するか又はそれを超える、抗生物質、消毒薬（殺生物剤）、又は既報のバイオフィルム阻害剤の表面での有効量を評価する方法に知悉している当業者によって決定され得る。例えば、米国疾病予防管理センター（ジョージア州アトランタ）により発行されたような、血管内デバイス関連感染症の予防用ガイドライン（O'Grady et al., Am. J. Infect. Control, 30: 476-489 (2002)）；殺生物剤及び抗生物質含浸カテーテルの例（Potera, Science, 283: 1837, 1839 (1999)）；殺生物剤及び抗生物質含浸カテーテルによる、細菌チャレンジに対する有効性の評価（Sampath et al., Infect. Control Hosp. Epidemiol, 22: 640-646 (2001)）を参照のこと。このようなガイドライン及び手順は、特別な適用（例、表面、デバイス、組成物、又は方法）において細菌のバイオフィルム形成を阻害又は予防するのに本明細書に記載の特別なバイオフィルム阻害剤を使用するための量及び条件を評価して最適化するのに容易に適応される。
【０１２４】
本発明の追加の態様及び特徴は、以下の非限定的な実施例より明らかになろう。
【実施例】
【０１２５】
実施例１．ブドウ球菌バイオフィルム形成の阻害剤のスクリーニング
ブドウ球菌のバイオフィルム形成を特異的に阻害する低分子化合物を同定するために、以下のスクリーニングアッセイを開発した。平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０アッセイプレート、Corning Life Sciences，マサチューセッツ州ローウェル）における使用のためにアッセイをフォーマット化することによって、より高いスループットを達成した。バイオフィルム培養物は、表面付着形式において、各ウェルの底面で増殖した。各アッセイプレートにおいて、カラム１及び１２は、陰性対照（０％バイオフィルム阻害）として役立つ未処置培養物を含有した。カラム２〜１１のアッセイウェルのそれぞれは、Microbiotix Screening Library（ＭＳＬ）由来のユニークな低分子を１００μＭの最終濃度で含有した。グルコースの濃度を０．２５％（ｗ／ｖ）へ調整した０．５Ｘトリプチックソイブロス（Tryptic Soy Broth）（ＴＳＢ；ベクトンディキンソン、ニュージャージー州フランクリンレイクス）中の Staphylococcus epidermidis 18972 培養物の２００μｌ／ウェルでアッセイプレートに接種した。この細菌接種材料は、ＴＳＢにおいて一晩増殖させた培養物の、スクリーニングに使用する培地での１０００倍希釈液を作製することによって調製した。接種後、アッセイプレートをフォイルテープで密封して、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。ＶＩＣＴＯＲ２ＶＴＭマルチプレートリーダー（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して各ウェルについて６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）を測定して、全細菌増殖を定量した。細菌増殖培地と非バイオフィルム細胞を各アッセイウェルの底より除去するようにアッセイプレートを処理した。このことは、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５ＴＭプレート洗浄器（BioTek Instruments 社、バーモント州ウィノースキー）を使用することによって達成した。５０μｌの９５％エタノールの３０分間の添加によって、バイオフィルム細菌を固定した。エタノールを除去して、固定したバイオフィルム培養物を５０μｌの０．０６％クリスタルバイオレット（ＣＶ）で６０分間染色した。ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５ＴＭプレート洗浄器を使用する反復洗浄によって、過剰のＣＶを除去した。ＶＩＣＴＯＲ２ＶＴＭプレートリーダー（パーキンエルマー）を使用してＯＤ６００を測定することによって、各アッセイウェルへ結合したＣＶの量を定量した。
【０１２６】
以下の式を使用して、各化合物によって引き起こされる全増殖の阻害パーセント（％ＩＮＨ−増殖）を計算した：
（１−（ＯＤ６００（化合物）／平均ＯＤ６００（陰性対照）））ｘ１００。
【０１２７】
以下の式を使用して、各化合物によってもたらされるバイオフィルム成長の阻害パーセントを計算した：
（１−（ＣＶ  ＯＤ６００（化合物）／平均ＣＶ  ＯＤ６００（陰性対照）））ｘ１００。
【０１２８】
≧８０％のバイオフィルム阻害と≦４０％の全増殖阻害をもたらす化合物を一次（陽性）ヒットとして記録した。上記のアッセイを使用して、一次ヒットについて同一３検体で再試験した。≧８０％の平均バイオフィルム阻害と≧４０％の全増殖阻害をもたらす一次ヒットを確定ヒットとして記録した。
【０１２９】
上記のアッセイを使用して、Microbiotix Screening Library（ＭＳＬ）全体についてバイオフィルム阻害剤をスクリーニングした。ＭＳＬは、８７，２５０種のユニークな化合物を含有して、いくつかの信頼できるベンダーより購入した市販のスクリーニングコレクションより構成される。表１に、ＭＳＬを含むスクリーニングコレクションの名称、各コレクション中の化合物の数、及びベンダー名称を、それぞれのスクリーニングコレクションについて入手した、一次ヒット、確定ヒット、及び確証ヒットの数の点からのバイオフィルム形成の阻害剤のスクリーニングの結果とともに要約する。
【０１３０】
表１．Microbiotix Screening Library（ＭＳＬ）のブドウ球菌バイオフィルム形成の阻害剤についての一次スクリーニング結果
【０１３１】
【表１】
2011520958.tif 000020
【０１３２】
実施例２．一次スクリーニングより確定したバイオフィルム阻害剤の特性決定
実施例１に記載のＭＳＬスクリーニングからの確定ヒットについて、抗バイオフィルム（形成の阻害）活性、抗菌（増殖の阻害）活性、及び下記に記載のようなヒト細胞系に対する細胞傷害性を用量応答アッセイにおいて評価した。これらのアッセイより入手したデータを使用して、さらなる開発と、構造活性相関（ＳＡＲ）を分析することのために化合物を優先化した。
【０１３３】
最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ）及び最小阻止濃度（ＭＩＣ）の二次アッセイ
二次アッセイにより、最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ）と最小阻止濃度（ＭＩＣ）の点から、それぞれ抗バイオフィルム活性と抗菌活性の両方の定量的な測定値を得た。ＭＢＩＣとＭＩＣは、それぞれバイオフィルム形成と細菌増殖を少なくとも８０％（即ち、≧８０％）阻害する最低の化合物濃度として定義される。ＭＢＩＣ／ＭＩＣアッセイは、臨床検査標準研究所（ＣＬＳＩ；旧名ＮＣＣＬＳ）によるプロトコールＭ７−Ａ７に記載のミクロブロス（Microbroth）希釈アッセイに類似したやり方でフォーマット化する。得られるＣＶ染色が検出の直線範囲内にあるように、９６ウェルアッセイプレート中でのバイオフィルム成長について増殖条件を最適化した。故に、ＭＢＩＣ／ＭＩＣアッセイは、抗バイオフィルム活性の厳密な測定法を提供した。
【０１３４】
このアッセイを、S. epidermidis、S. aureus、Enterococcus faecalis、及び Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）のいくつかのバイオフィルム形成性株に適用した。簡潔に言えば、９６ウェルアッセイプレートは、８種までの化合物（１種の化合物／列）の２倍希釈系列と未処置対照（０．２μＭ〜１００μＭの濃度範囲）を含有した。このアッセイプレートに試験菌種、例えば、S. epidermidis 18972（０．５Ｘ  ＴＳＢ，０．２５％グルコース）又は S. aureus ATCC 35556（０．５Ｘ  ＴＳＢ，１％グルコース）を接種した。この接種材料は、一晩培養物を新鮮培地で１００倍希釈することによって調製したが、これはほぼ５ｘ１０６個の細胞／ウェルに相当する。接種後、アッセイプレートをフォイルテープで密封して、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。アッセイプレートを処理して、増殖の阻害パーセント（％ＩＮＨ−増殖）とバイオフィルム形成の阻害パーセント（％ＩＮＨ−バイオフィルム）を上記の記載のように算出した。これらのデータを使用して、それぞれ≧８０％のバイオフィルム形成と≧８０％の全増殖を阻害する最低の化合物濃度として定義される、ＭＢＩＣとＭＩＣを決定した。S. epidermidis 又は S. aureus のいずれか一方についてＭＢＩＣが≦１０μＭであり、ＭＩＣ／ＭＢＩＣ比が≧８である化合物を確証ヒットと命名した。
【０１３５】
抗バイオフィルム活性のスペクトル
最も蔓延しているブドウ球菌のバイオフィルム病原体に対して化合物が抗バイオフィルム活性を示すかどうかを判定するために、S. epidermidis 18972 と S. aureus ATCC 35556 を使用して、各化合物のＭＢＩＣ／ＭＩＣ比を決定した。これらの試験したブドウ球菌株の両方に対して有効である化合物により高い優先度を付与した。
【０１３６】
in vitro 細胞傷害性アッセイ（ＣＣ５０）
確証ヒットについて、哺乳動物細胞系に対する一般細胞傷害性を試験した。このアッセイでは、アッセイプレートに不死化ヒト細胞系（ヒーラ）を播いて、１０％胎仔ウシ血清を含有する標準培地において、各試験化合物の２倍希釈液の系列へ７２時間曝露した。化合物への曝露後、細胞媒介性の細胞傷害性を定量的に評価するのに有用である酸化−還元指示薬のＡｌａｍａｒ  ＢｌｕｅＴＭ（AccuMed International 社）を使用して、細胞の生存能力を評価した。蛍光測定値を使用してＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ還元を定量して、２変数曲線適合プログラム（Ａｓｓａｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ，エルセヴィエＭＤＬ，カリフォルニア州サンラファエル）を使用してこのデータを解析して、ＣＣ５０値（即ち、細胞の生存能力を５０％減少させる化合物濃度）を決定した。ＣＣ５０／ＭＢＩＣ≧５０である化合物に最高の優先度を付与した。高い優先度の判定基準を満たす確証ヒットを元のベンダーより再注文して、再試験した。
【０１３７】
まとめると、ハイスループットスクリーニングの結果は、プランクトン増殖に影響を及ぼさない（ＭＩＣ≧１００μＭ）、ブドウ球菌のバイオフィルム形成の相対的に強力な阻害剤である（６μＭ〜２５μＭのＭＢＩＣ範囲）アリールローダニン化合物の多数の例を明らかにした。これらの化合物は、初期のバイオフィルム発達を特異的に阻害して、付着、ＰＩＡ／ＰＮＡＧ合成、又は自己溶菌には影響を及ぼさなかった。
【０１３８】
表２は、ライブラリースクリーニング作業（campaign）において同定、特性決定、及び確証した代表的なバイオフィルム阻害剤を示す。表２のバイオフィルム阻害剤のうち３種は、ローダニン化合物、即ち、３−（３−クロロフェニル）−５−（３−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（ＭＳＬ−０４９７３１と命名）、３−（４−ブロモフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（ＭＳＬ−０４９２９３）、及び３−（４−クロロフェニル）−５−（３−クロロ−５−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（ＭＳＬ−６５１９０５６と命名）であり、１つはフラノンのバイオフィルム阻害剤、即ち、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−５−（２，４−ジメトキシフェニル）フラン−２（３Ｈ）−オン（ＭＳＬ−０５１０９７）である。
【０１３９】
表２．ライブラリースクリーニングからのバイオフィルム阻害剤の二次アッセイ結果
【０１４０】
【表２】
2011520958.tif 000021
【０１４１】
実施例３．追加のバイオフィルム阻害剤の合成
上記のライブラリースクリーニングの結果は、追加のバイオフィルム阻害剤の設計、合成、及び特性決定をもたらした。
【０１４２】
実施例３．１．３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４）の合成
【０１４３】
【化１８】
2011520958.tif 000022
【０１４４】
３−（４−フルオロフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
４−フルオロフェニルイソチオシアネート（３．０ｇ，１９．６ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（１．７８ｍＬ，１７．５ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液へトリエチルアミン（０．５９ｇ，５．９ミリモル、０．３当量）を室温で１０分にわたり滴下した。この反応物を室温でさらに１０分間撹拌してから、得られる固形物を濾過し、５０％エーテル／ヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ／ＭｅＯＨｔより再結晶させて、３．２３ｇ（７３％）の生成物を白い薄片として得た。
【０１４５】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.41-7.33 (m, 4H), 4.3 (s, 2H)。
【０１４６】
【化１９】
2011520958.tif 000023
【０１４７】
３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４）
４−フルオロフェニルローダニン（１００ｍｇ，０．４４ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７３ｍｇ，０．４４ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸ナトリウム（１０８ｍｇ，１．３ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液を１３０℃で２．５日間還流させてから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、８５ｍｇ（５１％）の生成物を黄色いふわふわした固形物として得た。
【０１４８】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.13 (b, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.51-7.4 (m, 4H), 7.23 (d, 1H), 7.17 (dd, 1H), 6.9 (d, 1H), 4.11 (q, 2H), 1.38 (t, 3H)。
【０１４９】
実施例３．２．３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物８）の合成
【０１５０】
【化２０】
2011520958.tif 000024
【０１５１】
３−（３−フルオロフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
３−フルオロフェニルイソチオシアネート（３．０ｇ，１９．６ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（１．７８ｍＬ，１７．５ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液へトリエチルアミン（０．５９ｇ，５．９ミリモル、０．３当量）を室温で１０分にわたり滴下した。この反応物を室温でさらに１０分間撹拌してから、得られる固形物を濾過し、５０％エーテル／ヘキサンで洗浄し、ＣＨ３ＣＮより再結晶させて、３．０ｇ（６７％）の生成物をピンク色の結晶性固形物として得た。
【０１５２】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.46-7.39 (q, 1H), 7.16-7.1 (t, 1H), 6.98-6.9 (m, 2H), 2.38 (s, 2H)。
【０１５３】
【化２１】
2011520958.tif 000025
【０１５４】
３−（３−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物８）
３−フルオロフェニルローダニン（１００ｍｇ，０．４４ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７３ｍｇ，０．４４ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１０２ｍｇ，１．３ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液を１３０℃で２日間還流させてから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、３７ｍｇ（２２％）の生成物を黄色い粒状の固形物として得た。
【０１５５】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.20 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.62-7.58 (m, 1H), 7.43-7.37 (m, 2H), 7.20 (dd, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.18 (dd, 1H), 6.99 (d, 1H), 4.11 (q, 2H), 1.38 (t, 3H)。
【０１５６】
実施例３．３．３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物３６）の合成
【０１５７】
【化２２】
2011520958.tif 000026
【０１５８】
３−（３−ピリジル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
３−ピリジルイソチオシアネート（１．０ｇ，７．３ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（０．６７ｍＬ，７．３ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液を氷浴において０℃へ冷やした。トリエチルアミン（０．３１ｍＬ，２．２ミリモル、０．３当量）をその温度で１０分にわたり滴下した。この反応物をさらに３０分間撹拌し、室温へ温めてから、追加のＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄してからＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて、黒ずんだ残渣を得た。この残渣をシリカゲル濾過へ処して、２０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出させた。濾液を蒸発させて、０．５０ｇ（３２％）の生成物をクリーム色の粉末として得た。
【０１５９】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 8.67 (d, 1H), 8.49 (d, 1H), 7.78 (dd, 1H), 7.60 (dd, 1H J), 4.41 (s, 2H)。
【０１６０】
【化２３】
2011520958.tif 000027
【０１６１】
３−（ピリジン−３−イル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物３６）
３−（３−ピリジル）−ローダニン（１００ｍｇ，０．４８ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７９ｍｇ，０．４８ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１１０ｍｇ，１．４ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液を１３０℃で３日間還流させてから、室温へ冷やして、水（５０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１０分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、９９ｍｇ（５８％）の生成物を黄色い結晶性固形物として得た。
【０１６２】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 8.71 (d, 1H), 8.69-8.64 (m, 1H), 7.95-7.93 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.65-7.61 (m, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.19 (dd, 1H), 7.0 (d, 1H), 4.12 (q, 2H), 1.38 (t, 3H)。
【０１６３】
実施例３．４．３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物２９）の合成
【０１６４】
【化２４】
2011520958.tif 000028
【０１６５】
４−ヒドロキシ−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メトキシ）ベンズアルデヒド
３，４−ジメトキシベンズアルデヒド（５．０ｇ，３６．２ミリモル）及びクロロメチルトリメチルシリルエチルエーテル（６．０３ｇ，３６．２ミリモル、１．０当量）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液へジイソプロピルエチルアミン（７．９ｍＬ，４５ミリモル、１．２５当量）を加えた。得られる澄明な溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を真空で除去して、残渣をＨ２ＯとＥｔＯＡｃの間で分配した。有機層を蒸発させて、残渣を７％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーへ処した。生成物を含有する画分をプールして蒸発させて、４．６６ｇ（５１％）の生成物を黄褐色のオイルとして得た。
【０１６６】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 9.66 (s, 1H), 7.41-7.34 (m, 2H), 7.24 (d, 1H), 5.36 (s, 2H), 3.78 (t, 2H), 0.93 (t, 2H), 0.0 (s, 9H)。
【０１６７】
【化２５】
2011520958.tif 000029
【０１６８】
４−アリルオキシ−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メトキシ）ベンズアルデヒド
アセトン（４ｍＬ）中の４−ヒドロキシ−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メトキシ）ベンズアルデヒド（２００ｍｇ，０．７５ミリモル）、臭化アリル（１３５ｍｇ，１．１ミリモル、１．５当量）、及びＫ２ＣＯ３（３０９ｍｇ，２．２ミリモル、３．０当量）の混合物をマイクロ波（６０℃）によって１時間加熱した。この混合物を濾過して、残留固形物をアセトン（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を蒸発させて、残渣を最少量のＥｔＯＡｃに溶かしてから、シリカゲルのパッドに通して濾過して、５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出させた。濾液を蒸発させて、１７７ｍｇ（７７％）の生成物を白い固形物として得た。
【０１６９】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 9.85 (s, 1H), 7.45-7.42 (m, 2H), 7.31 (m, 1H), 6.11-6.03 (m, 1H), 5.47-5.29 (m, 4H), 4.70-4.67 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 2H), 0.99-0.93(m, 2H), 0.00 (s, 9H)。
【０１７０】
【化２６】
2011520958.tif 000030
【０１７１】
４−アリルオキシ−３−ヒドロキシベンズアルデヒド
フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液（１．０Ｍ，３．０ｍＬ，３．０ミリモル）へ４−アリルオキシ−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メトキシ）ベンズアルデヒドを加えた。この澄明な溶液を６０℃まで３日間加熱した。次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を７％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーへ処した。生成物含有画分をプールして蒸発させて、６６ｍｇ（６５％）の生成物を白い固形物として得た。
【０１７２】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 7.45-7.42 (dd, 2H), 7.056 (d, 1H) 6.22 (s, 1H), 6.12-6.02 (m, 1H), 5.47-5.34 (m, 2H), 4.699-4.68 (dt, 2H)。
【０１７３】
【化２７】
2011520958.tif 000031
【０１７４】
３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−アリルオキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物２９）
４−フルオロフェニルローダニン（８４ｍｇ，０．３７ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（６６ｍｇ，０．３７ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（８６ｍｇ，１．１ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで１５分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、８５ｍｇ（５１％）の生成物を黄色いふわふわした固形物として得た。
【０１７５】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.22 (b, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.51-7.37 (m, 4H), 7.25 (d, 1H), 7.19 (dd, 1H), 7.00 (d,lH), 6.13-6.02 (m,lH), 5.49 (dd, 1H), 5.30 (dd, 1H), 4.67 (d, 2H)。
【０１７６】
実施例３．５．３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４０）の合成
【０１７７】
【化２８】
2011520958.tif 000032
【０１７８】
３−（６−フルオロ−３−ピリジル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
６−フルオロ−３−ピリジルイソチオシアネート（２．５ｇ，１６ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（１．５７ｍＬ，１６ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液へトリエチルアミン（０．３１ｍＬ，２．２ミリモル、０．３当量）を２０分にわたり滴下した。この反応物をその温度でさらに２０分間撹拌し、溶媒を除去して、５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーへ処した。生成物を含有する画分をプールして蒸発させてオフホワイトの固形物を得て、これを１０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンより再結晶させて、１．１６ｇ（３１％）の生成物を淡褐色の結晶性固形物として得た。
【０１７９】
1H-NMR (DMSO-cfe): δ 8.22 (t, 1H), 8.03-8.97 (m, 1H), 7.43-7.41 (dd, 1H), 4.40 (s, 2H)。
【０１８０】
【化２９】
2011520958.tif 000033
【０１８１】
３−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４０）
６−フルオロ−３−ピリジルローダニン（１００ｍｇ，０．４４ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（６６ｍｇ，０．４４ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１０２ｍｇ，１．３ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで１５分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、８５ｍｇ（５１％）の生成物を黄色いふわふわした固形物として得た。
【０１８２】
1H-NMR (DMSCW6): δ 10.12 (s, 1H), 8.37 (d, 1H), 8.15 (td, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.50 (dd, 1H), 7.25 (d, 1H), 7.19 (d, 1H ), 6.99 (d, 1H), 4.12 (q, 2H), 1.38 (t, 3H)。
【０１８３】
実施例３．６．３−（３−シアノフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物３４）の合成
【０１８４】
【化３０】
2011520958.tif 000034
【０１８５】
３−（３−シアノフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
３−シアノフェニルイソチオシアネート（１．０ｇ，６．２ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（１．１４ｍＬ，６．２ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液を氷浴において０℃へ冷やした。トリエチルアミン（０．２６ｍＬ，１．９ミリモル、０．３当量）をその温度で１０分にわたり滴下した。この反応物をさらに１時間撹拌し、室温へ温めてから、追加のＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄してから、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて、黒ずんだ残渣を得た。この残渣をシリカゲル濾過へ処して、４０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出させた。濾液を蒸発させて、１．１４ｇ（７８％）の生成物を粒状の黄色い固形物として得た。
【０１８６】
1H-NMR (OMSO-d6): δ 7.99 (dt, 1H), 7.86 (t, 1H), 7.72 (t, 1H), 7.68 (dt, 1H), 4.40 (s, 2H)。
【０１８７】
【化３１】
2011520958.tif 000035
【０１８８】
３−（３−シアノフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物３４）
３−シアノフェニルローダニン（１００ｍｇ，０．６２ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１０３ｍｇ，０．６２ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（３ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１４３ｍｇ，１．８ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで１５分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、１２５ｍｇ（５３％）の生成物を黄色い粉末として得た。
【０１８９】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.12 (s, 1H), 8.02 (d, 2H), 7.80 (d, 3H), 7.25 (s, 1H), 7.19 (d, 1H), 6.99 (d, 1H), 4.12 (q, 2H), 1.38 (t, 3H)。
【０１９０】
実施例３．７．３−（３−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４９）の合成
【０１９１】
【化３２】
2011520958.tif 000036
【０１９２】
４−メトキシカルボニルフェニルイソチオシアネート
４−アミノ安息香酸メチル（５．０ｇ，３３ミリモル）及びＣａＣＯ３（８．６１ｇ，８６ミリモル、２．６当量）の水（２５ｍＬ）及びジクロロメタン（２５ｍＬ）懸濁液へチオホスゲン（３．５５ｍＬ，４６ミリモル）を５分にわたり滴下した。この混合物を１６時間激しく撹拌してから、セライトに通して濾過して、分離させた。水層をジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出して、合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて、やや茶褐色の残渣を得た。この残渣を最少量のジクロロメタンより再結晶させて、４．０ｇ（８０％）の生成物をオフホワイトの結晶性の針状物として得た。
【０１９３】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.9-7.87 (m, 2H), 7.42-7.39 (m, 2H), 3.77 (s, 3H)。
【０１９４】
【化３３】
2011520958.tif 000037
【０１９５】
３−（３−メトキシカルボニルフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン
３−メトキシカルボニルフェニルイソチオシアネート（３．４ｇ，２３ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（２．０８ｍＬ，２３ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を氷浴において０℃へ冷やした。トリエチルアミン（０．６８ｍＬ，６．８ミリモル、０．３当量）をその温度で３０分にわたり滴下した。次いで、この反応物を追加のＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄してからＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて、黒ずんだ残渣を得た。この残渣を、１０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーへ処した。生成物を含有する画分をプールして蒸発させて、２．９２ｇ（４８％）の生成物を淡黄色の固形物として得た。
【０１９６】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 8.11 (d, 2H), 7.46 (d, 2H), 4.4 (s, 2H)。
【０１９７】
【化３４】
2011520958.tif 000038
【０１９８】
３−（３−メトキシカルボニルフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（化合物４９）
３−メトキシカルボニルフェニルローダニン（１００ｍｇ，０．３７ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（６１ｍｇ，０．３７ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（１０ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１０８ｍｇ，１．１ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで１５分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、８５ｍｇ（５１％）の生成物をふわふわした黄色い固形物として得た。
【０１９９】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.10 (b, 1H), 8.13 (d, 2H), 7.77 (s, 1H), 7.6 (d, 2H), 7.24 (d, 1H), 7.18 (dd, 1H), 6.99 (d, 1H), 4.12 (q, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.38 (t, 3H)。
【０２００】
実施例３．８．３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物５８）の合成
【０２０１】
【化３５】
2011520958.tif 000039
【０２０２】
３−（４−フルオロフェニル）イミダゾリジン−２，４−ジオン
グリシン（５４８ｍｇ，７．３ミリモル）のジクロロメタン（１０ｍＬ）懸濁液へトリエチルアミン（１．０ｍＬ，７．３ミリモル、１．０当量）と４−フルオロフェニルイソシアネート（１．０ｇ，７．３ミリモル、１．０当量）の溶液を加えた。得られる混合物を室温で１時間撹拌してから、濾過した。濾液を蒸発させて、残渣を６．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ）とアセトン（１ｍＬ）に溶かした。この混合物を密封管において１００℃で２日間加熱してから、室温へ冷やして、濾過した。得られる固形物を３０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、９０ｍｇ（６％）の生成物を薄白色の固形物として得た。
【０２０３】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 8.31 (s, 1H), 7.42-7.28 (m, 4H), 4.05 (s, 2H)。
【０２０４】
【化３６】
2011520958.tif 000040
【０２０５】
３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物５８）
４−フルオロフェニルヒダントイン（８２ｍｇ，０．４２ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７０ｍｇ，０．４２ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（３ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（９７ｍｇ，１．３ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで３０分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）へ分配した。有機層を分離させ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて黄色い固形物を得て、これをＣＨ３ＣＮより再結晶させて、２２ｍｇ（２７％）の生成物を白色の薄片状の固形物として得た。
【０２０６】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.89 (b, 1H), 9.44 (b, 1H), 7.51-7.48 (m, 2H), 7.38-732 (m, 2H), 7.19-7.14 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 6.57 (s, 1H), 4.13 (q, 2H), 1.35 (t, 3H)。
【０２０７】
実施例３．９．３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（化合物６０）の合成
【０２０８】
【化３７】
2011520958.tif 000041
【０２０９】
３−（４−フルオロフェニル）チアゾリジン−２，４−ジオン
４−フルオロフェニルイソシアネート（１．０ｇ，７．３ミリモル）及びチオグリコール酸メチル（０．６４ｍＬ，７．３ミリモル、１．０当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液へトリエチルアミン（０．３１ｍＬ，２．２ミリモル、０．３当量）を室温で１０分にわたり滴下した。得られる混合物を室温で３０分間撹拌してから、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）とＨ２Ｏ（２５ｍＬ）の間で分配した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて残渣を得て、これを６．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液（１６ｍＬ）とアセトン（４ｍＬ）に溶かした。この混合物を密封管において１００℃で６０分間加熱してから、室温へ冷やして、濾過した。得られる固形物を５０％エチルエーテル／ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、８８０ｍｇ（５７％）の生成物をふわふわとした白い固形物として得た。
【０２１０】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.38-7.35 (m, 4H), 4.29 (s, 2H)。
【０２１１】
【化３８】
2011520958.tif 000042
【０２１２】
３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（化合物６０）
４−フルオロフェニルチアゾリジン−２，４−ジオン（１００ｍｇ，０．４７ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７９ｍｇ，０．４７ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（３ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１０９ｍｇ，１．４ミリモル，３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで１５分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、８４ｍｇ（５０％）の生成物を白い粉末として得た。
【０２１３】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 9.95 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.54-7.49 (m, 2H), 7.41-7.35 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 1H), 6.97 (d, 1H), 4.09 (q, 2H), 1.37 (t, 3H)。
【０２１４】
実施例３．１０．３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（化合物６２）の合成
【０２１５】
【化３９】
2011520958.tif 000043
【０２１６】
３−（４−フルオロフェニル）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン
グリシン（４９０ｍｇ，６．５ミリモル）のジクロロメタン（１０ｍＬ）懸濁液へトリエチルアミン（０．９１ｍＬ，６．５ミリモル、１．０当量）と４−フルオロフェニルイソチオシアネート（１．０ｇ，６．５ミリモル，１．０当量）の溶液を加えた。得られる混合物をマイクロ波により１００℃まで９０分間加熱してから、室温へ冷やして、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）とＨ２Ｏ（５０ｍＬ）へ分配した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて残渣を得て、これを６．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液（１６ｍＬ）とアセトン（４ｍＬ）に溶かした。この混合物をマイクロ波により１００℃まで６０分間加熱してから、室温へ冷やして、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）とＨ２Ｏ（５０ｍＬ）へ分配した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させて、残渣を得た。この粗生成物を、３５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーへ処した。生成物を含有する画分をプールして蒸発させて、２７０ｍｇ（２０％）の生成物を黄褐色の固形物として得た。
【０２１７】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 10.41 (s, 1H), 7.34-7.32 (m, 4H), 4.3 (s, 2H)。
【０２１８】
【化４０】
2011520958.tif 000044
【０２１９】
３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−エトキシ−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン（化合物６２）
４−フルオロフェニルチオヒダントイン（１００ｍｇ，０．４７ミリモル）及び３−エトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（７９ｍｇ，０．４７ミリモル、１．０当量）の氷酢酸（３ｍＬ）溶液へ酢酸アンモニウム（１０９ｍｇ，１．４ミリモル、３．０当量）を加えた。得られる澄明な溶液をマイクロ波により１３０℃まで２０分間加熱してから、室温へ冷やして、水（３０ｍＬ）へ注いだ。この混合物を１５分間撹拌してから、固形物を濾過し、水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄して乾燥させて、黄色い固形物を得た。この固形物をＣＨ３ＣＮより再結晶させて、４４ｍｇ（２６％）の生成物を黄色い粉末として得た。
【０２２０】
1H-NMR (DMSO-d6): δ 12.52 (br, 1H), 9.64 (b, 1H), 7.44-7.36 (m, 6H), 6.87 (d, 1H), 6.63 (s, 1H), 4.15 (q, 2H), 1.37 (t, 3H)。
【０２２１】
追加のバイオフィルム阻害剤も合成して特性決定した。これらの化合物と上記に記載の化合物のリストを以下の表３に提供する。
【０２２２】
表３．合成したバイオフィルム阻害剤
【０２２３】
【表３−１】
2011520958.tif 000045
【０２２４】
【表３−２】
2011520958.tif 000046
【０２２５】
【表３−３】
2011520958.tif 000047
【０２２６】
【表３−４】
2011520958.tif 000048
【０２２７】
実施例４．合成した化合物の抗バイオフィルム活性の特性決定
表３中の化合物の最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ）及び最小阻止濃度（ＭＩＣ）をバイオフィルム形成性細菌の様々な株に対して決定した。
【０２２８】
表３からの７種のローダニン化合物についての、S. epidermidis 株の選択されるバイオフィルム形成株に対する抗バイオフィルム活性データを表４に示す。
【０２２９】
表４．Staphylococcus epidermidis の選択される株に対する抗バイオフィルム活性
【０２３０】
【表４】
2011520958.tif 000049
【０２３１】
以下の表５は、表３からの同じ７種のローダニン化合物についての、メチシリン感受性 S. aureus（ＭＳＳＡ）の株が含まれる、S. aureus の選択されるバイオフィルム形成株に対する抗バイオフィルム活性データを示す。
【０２３２】
表５．Staphylococcus aureus の選択される株に対する抗バイオフィルム活性
【０２３３】
【表５】
2011520958.tif 000050
【０２３４】
バイオフィルム形成性、バンコマイシン抵抗性Enterococcus faecalis 株（ATCC 51299）、グラム陰性、バイオフィルム形成性の日和見病原体、Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）ＰＡＯ１（ATCC 35556）、及びグラム陰性、バイオフィルム形成性 Escherichia coli（大腸菌）株（ATCC 25922）の株に対する抗バイオフィルム活性についても、化合物を試験した。以下の表６は、表３からの７種のローダニン化合物についての、これらの他の細菌株に対する抗バイオフィルム活性データを示す。これらの化合物のいずれも、このアッセイ条件では、この P. aeruginosa 及び E. coli の株のバイオフィルム形成とプランクトン増殖に対して活性を示さなかった。
【０２３５】
表６．グラム陽性及びグラム陰性の菌株に対する抗バイオフィルム活性
【０２３６】
【表６】
2011520958.tif 000051
【０２３７】
表４〜６の化合物はまた、バイオフィルム形成性のグラム陽性病原体である Enterococcus faecium 及び Enterococcus gallinarum の少なくとも１つの株に対する抗バイオフィルム活性（２５μＭ以下のＭＢＩＣ）を示した（データ示さず）。さらに、表３の他の化合物は、表４〜６に収載したバイオフィルム形成性グラム陽性菌の株の少なくとも１つに対して２５μＭ以下のＭＢＩＣを示した（データ示さず）。
【０２３８】
実施例５．抗バイオフィルムローダニンは、バイオフィルム発達の初期段階を阻害する。
【０２３９】
ローダニン抗バイオフィルム化合物がバイオフィルム形成（バイオフィルム成長）を特異的に阻害することを検証するために、化合物４（ＭＢＩＣ＝３．１２５μＭ）のバイオフィルム成長に対する阻害効果をバイオフィルム発達の様々な段階で定量した。この実験では、増殖培地（０．５Ｘ  ＴＳＢ，０．２５％（ｗ／ｖ）グルコース）を含有する９６ウェルアッセイプレートのウェルに S. aureus ATCC 35556 を接種して、３７℃でインキュベートした。このインキュベーション時間の間の選択した時点（０、１、２、４、６、８、１０、１２、２１時間）で、化合物４を４Ｘ  ＭＢＩＣの濃度で個々のウェルへ加えた。アッセイプレート全体（全培養物）を全部で２２時間インキュベートした後で、バイオフィルムを洗浄し、クリスタルバイオレット（ＣＶ）で染色して、バイオフィルム成長を測定した。並行した培養物（未処置対照培養物）において、化合物４の非存在下でのバイオフィルム成長を追跡した。化合物４を阻害培養物へ加えるのと同時に未処置培養物より試料を取って、バイオフィルム成長のレベルをＣＶ染色法によって定量した。この実験の結果を図１のグラフに示すが、ここでは、化合物４で処置した培養物中のバイオフィルム成長と未処置対照培養物中のバイオフィルム成長の阻害パーセントが時間の関数としてプロットされている。図１中の各時点は、８つの培養物の平均である。
【０２４０】
このデータは、化合物４がバイオフィルム形成の初期段階（２時間まで）を阻害した一方で、成熟中のバイオフィルム（８〜１６時間）は抵抗性であったことを示す。これらの結果は、ローダニン化合物がバイオフィルム発達の初期段階を阻害するのに特に有効であることを示す。
【０２４１】
実施例６．抗バイオフィルムのローダニンは、バイオフィルム成長を特異的に阻害する。
【０２４２】
ＭＩＣアッセイの結果は、大多数のローダニンがプランクトン性の細菌細胞増殖を阻害しないことを明瞭に示した。しかしながら、バイオフィルム成長を阻害することについての上記化合物の特異性は、代わりの増殖曲線アッセイを使用して証明された。様々な濃度の化合物４（ＭＢＩＣ＝３．１２５μＭ）の存在下に S. aureus ATCC 35556 のプランクトン培養物を嫌気的に増殖させた。ＯＤ６００を測定することによって、細菌細胞の増殖を経時的にモニタリングした。この結果（データ示さず）は、化合物４がプランクトン性の細菌細胞増殖に８Ｘ  ＭＢＩＣまでの濃度で影響を及ぼさなかったことを示す。
【０２４３】
まとめると、上記試験のデータは、ライブラリースクリーニング由来の化合物と表３中の合成化合物が S. epidermidis 及び S.aureus のバイオフィルム形成の強力な阻害剤として有用であることを示す。このような化合物は、医療用デバイスの表面でのバイオフィルム発達を阻害するための組成物及び方法に、並びに細菌のバイオフィルム形成がヒト又は動物の健康の脅威となる場合の他の応用に使用し得る。
【０２４４】
本明細書に引用されるすべての出版物、特許出願、特許、及び他の文献は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。抵触の場合、諸定義を含めて、本明細書が基準となる。さらに、本明細書の材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定的であることを企図しない。
【０２４５】
当業者には、本発明の範囲と以下の特許請求項の精神より逸脱することなく、本明細書に記載の本発明の他の変形形態及び態様が明らかであろう。
【図１】
2011520958.tif 000064
【国際調査報告】
2011520958.tif 000065