(57)【要約】  血液検体を、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍ、又は抗Ｎ血液型の抗体が予め被覆固定化されたテストストリップ上に滴下し、テストストリップの一端に洗浄液を滴下した後、反応スポットにおいて凝集された赤血球が残されているか否かによって検体の血液型を判定する、ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の判定方法。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体を、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍ、又は抗Ｎ血液型の抗体が予め被覆固定化されたテストストリップ上に滴下し、テストストリップの一端に洗浄液を滴下した後、洗浄液の泳動により、抗体との凝集反応が発生していない赤血球を滴下スポットから遠ざける一方、抗体と免疫凝集した赤血球を検体滴下スポットに残し、その後、反応スポットに凝集した赤血球が残されているか否かによって検体の血液型を判定することを含む、ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の判定方法。
【請求項２】
前記血液検体が、赤血球又は全血、或いは生理食塩水または等張のリン酸塩緩衝液で希釈した赤血球又は全血であってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液検体が、一部分の溶血又は高脂質含量の血液試料を含んでもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体は、物理的な吸着又は化学架橋法によりテストストリップに固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
反応スポットに凝集した赤血球が残されているか否かを、肉眼で、或いは光学信号または電気信号の採集機器によって判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法を完成するためのキットであって、判定用テストストリップと、洗浄液と、採血具とからなり、前記テストストリップが、洗浄パッドと、サンプルアプライパッドと、緩衝パッドと、吸水パッドと、透明防水テープと、内張りとしてのポリエステル板とからなる、キット。
【請求項７】
テストストリップを構成する前記洗浄パッドと、サンプルアプライパッドと、緩衝パッドと、吸水パッドとは、一定の孔径を有する多孔質高分子材料により作製され、且つその孔径の大きさは少なくとも１個の赤血球を通過可能である、請求項７に記載のキット。
【請求項８】
血液型抗体が固定されたサンプルアプライパッド上に血液検体を滴下し、洗浄パッド上に等張の洗浄液を滴下し、その後、サンプルアプライパッドに凝集した赤血球が残されているか否かによって血液検体の血液型を判定する、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人類のＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を迅速に判定する方法及びその相応するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液型分型方法は、ヒト血液赤血球をＡ、Ｂ、ＡＢ及びＯの四型、並びにＲｈ血液型系とＭＮ血液型系に分類する一般的な方法である。血液型の判定の一般的な方法としては、検体赤血球と、血液型の抗体を含有する試薬とを混合して両者を反応させた後、赤血球の細胞凝集が発生しているか否かを観察することによって検体赤血球の血液型を判定する方法である。このような方法では、まず患者の血清中から赤血球を分離し、適量の赤血球と、試験管中またはガラス板上に導入された試験溶液（抗Ａ血清、抗Ｂ血清、或いは抗Ｄ血清または抗Ｍ血清、抗Ｎ血清）とを混合し、ここで免疫反応の進行に有利なその他の試薬を添加してもよく、保温、遠心と攪拌を行った後、肉眼で観察し、細胞の凝集が発生しているか否かを確認する。
【０００３】
試料は、抗Ａ試薬の存在下で細胞の凝集が発生し、抗Ｂ試薬の存在下で凝集が発生しない場合には、Ａ型血液と判定される。試料は、抗Ｂ試薬の存在下で細胞の凝集が発生しているが、抗Ａ試薬の存在下で凝集が発生しない場合には、Ｂ型血液と判定される。試料は、抗Ａ試薬と抗Ｂ試薬とともに凝集している場合には、試料がＡＢ型血液と判定される。試料は、抗Ａ試薬と抗Ｂ試薬とともに反応しない場合には、Ｏ型血液と判定される。試料と抗Ｄ試薬とが凝集する場合は、血液試料はＲｈ陽性血液型であり、試料と抗Ｄ試薬とが凝集しない場合は、血液試料はＲｈ陰性血液型である。ＭＮ血液型は対応の凝集反応が発生しているか否かによってＭ、Ｎ及びＭＮの三型に分けられる。
【０００４】
現在、ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の検定技術は二つに分けることができ、一つは細胞膜上に結合した血液型の抗原を検定する技術であり、赤血球の生理食塩水凝集法、中和実験、吸収実験、解離実験および混合凝集反応等を含む。もう一つは遊離の血液型の抗原を直接に検定する技術であり、協同凝集反応、放射免疫反応等を含む。
【０００５】
現在よく使われている赤血球生理食塩水凝集法は、既知のＩｇＭまたはＩｇＧ型抗体を新鮮な赤血球表面の血液型の抗原と結合させることにより、赤血球を凝集させて、血液検体の血液型を判断する。この方法は臨床輸血の前の血液型検査（配型）に広く使用されている。しかし、このような方法では相応の試薬を組合わせて使用する必要があり、且つ試薬の低温保存が必要であり、結果も判断し難い。
【０００６】
その他の血液型検定方法も各自の欠点を有しており、例えば中和実験方法では時間が長くかかり、且つ感度が比較的低い。解離実験と混合凝集反応法では操作に対する要求が高く、毎回の実験において繰り返して条件を確立する必要があり、その感度も高くない。協同凝結反応方法はＩｇＧ型抗体感作の黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）を用いて、ブドウ球菌の凝集の有無を観察することによって検体試料の血液型を判断するが、当該方法では試薬の保存に対する要求が高い。放射免疫と酵素免疫法は感度が高いが、かかる時間が比較的長く、一人分の検定に不適切で、また現場での検定も不可能である。
【０００７】
つまり、現在よく使われている臨床の血液型検定方法は、検定時間が長く、人手による操作の度合いが大きく、さらに結果が主観的な偏差に大きく影響されるとともに汚染される可能性がある等の問題がある。従って、伝統的な血液型の検定方法に対して実質的な改善が必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
本方法の一つの目的は、血液検体を、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍ、又は抗Ｎ血液型の抗体が予め被覆固定化されたテストストリップ上に滴下し、テストストリップの一端に洗浄液を滴下した後、洗浄液の泳動により、抗体との凝集反応が発生していない赤血球を滴下スポットから遠ざける一方、抗体と免疫凝集した赤血球を検体滴下スポットに残させ、その後、反応スポットにおいて凝集された赤血球が残されているか否かによって検体の血液型を判定することを含む、ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の判定方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、テストストリップ上に滴下する血液検体の体積は、１〜１０μｌと微小であってもよい。前記洗浄液は１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水またはその他の等張溶液である。前記血液検体は検査用テストストリップのサンプルアプライパッド上に滴下される。
【００１０】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液型の抗体を固定する方法としては物理的な吸着または化学架橋等の方法であってもよい。
【００１１】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液検体は、赤血球又は全血、或いは生理食塩水、リン酸塩緩衝液等の等張溶液で希釈した赤血球又は全血の懸濁液であってもよい。また、前記血液試料は、一部分の溶血又は高脂質含量の血液試料を含んでいてもよい。
【００１２】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、検定結果の判断は、肉眼で、或いは光学信号または電気信号の採集機器によって判断することができる。
【００１３】
簡単に言うと、血液試料は、相応する血液型の抗体を結合させたサンプルアプライパッドと接触して反応した後、サンプルアプライパッド上において相応する抗体と免疫結合反応が起こる。洗浄液体で洗浄した後、免疫結合反応が発生した試料はサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質として残し、免疫結合反応が発生していない血液試料は洗浄液の洗浄によりサンプルアプライパッドから離され、検体滴下スポットに赤色の物質の残留がない。よって、赤血球と相応する抗体との免疫反応後、サンプルアプライパッド上に赤色の物質の残留が有るか無いかによって赤血球と血液型の抗体とが免疫反応したかどうかを判断し、さらに血液試料のＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を判定する。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、上記検定方法を完成するためのキットを提供することであって、当該キットは、検定用テストストリップ、洗浄液と採血具とからなり、その検定用テストストリップは、洗浄パッド、サンプルアプライパッド、緩衝パッド、吸水パッド、防水テープ及び内張りとしてのポリエステル板とからなる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は本発明の血液型検定キットにおける、ＡＢＯ血液型の迅速判定用テストストリップを示す模式図である。
【図２】図２は本発明の血液型検定キットにおける、ＡＢＯ血液型の迅速判定用テストストリップを示す更なる模式図である。ここで、１は洗浄パッド、２は防水テープ、３は血液型の抗体を含有するサンプルアプライパッド、４は緩衝パッド、５は吸水パッド、６は内張りとしてのポリエステル板である。
【図３】図３は本発明の血液型検定キットにおける、Ｒｈ血液型の迅速判定用テストストリップを示す模式図である。ここで、１は洗浄パッド、２は防水テープ、３は抗Ｄ抗体を含有するサンプルアプライパッド、４は緩衝パッド、５は吸水パッドである。
【図４】図４は本発明の血液型検定キットにおけるＭＮ血液型の迅速判定用テストストリップを示した模式図である。
【図５】図５は血液型の抗体を固定させたガラス繊維パッド上に陽性の血液試料を滴下した後の、反応の概略図である。ここで、１は赤血球、２は血液型の抗体、３はガラス繊維サンプルアプライパッドである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、人類の血液検体のＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を迅速に判定する方法及びその相応するキットに関する。
【００１７】
まず、本発明は人類の血液検体のＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を判定する方法を提供する。前記方法は、血液検体を、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍ、又は抗Ｎ血液型の抗体が予め被覆固定化されたテストストリップ上に滴下し、テストストリップの一端に洗浄液を滴下した後、洗浄液の泳動により、抗体との凝集反応が発生していない赤血球を滴下スポットから遠ざける一方、抗体と免疫凝集した赤血球を検体滴下スポットに残させ、その後、反応スポットにおいて凝集された赤血球が残されているか否かによって検体の血液型を判定することを含む。
【００１８】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液検体は、赤血球又は全血、或いは生理食塩水またはリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）などの等張溶液で希釈した赤血球の懸濁液又は全血の希釈液であってもよい。また、前記血液試料は、溶血試料又は高脂質含量の血液試料を含んでもよい。
【００１９】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記滴下させた血液検体の体積は１０μｌ以下である。前記洗浄液は１０ｍＭリン酸塩緩衝液、生理食塩水またはその他の溶液である。
【００２０】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液型の抗体を固定する方法としては物理的な吸着または化学架橋等の方法であってもよい。
【００２１】
本発明は、さらに上記検定方法を完成するためのキットを提供する。当該キットは、検定用テストストリップ、洗浄液と採血具とからなり、その検定用テストストリップは、洗浄パッド、サンプルアプライパッド、緩衝パッド、吸水パッド、防水テープ及び内張りとしてのポリエステル板とからなる（図１を参照）。
【００２２】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記洗浄パッド、サンプルアプライパッド、緩衝パッド、吸水パッドは、一定の孔径を有する多孔質高分子材料により作製され、且つその孔径の大きさは少なくとも１個の赤血球を通過可能である。その材質の選択により、その洗浄パッド、サンプルアプライパッド、及び緩衝パッドはガラス繊維パッドと総括的に称する場合もある。
【００２３】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液検体はサンプルアプライパッド上に滴下され、また、前記洗浄液体は洗浄パッド上に滴下される。サンプルアプライパッドは血液型の抗体を固定した多孔質キャリアである。
【００２４】
また、血液型の抗体を固定する方法は物理的な吸着または化学架橋法等の方法がある。
【００２５】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液試料は、ある程度の溶血または脂肪含量が比較的高い血液試料を含む。 
【００２６】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、その検定結果の判断は、肉眼で、或いは光学信号または電気信号の採集判定機器によって完成することができる。具体的には、本発明のキットを用いたヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の検定は、以下の操作ステップを含む：
【００２７】
１）ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の抗体を直接または間接的にサンプルアプライパッド３（図２）上に固定する：物理的な吸着または化学架橋手段により、血液型の抗体を一定の孔径を有するガラス繊維パッド上に固定する。ここで、採用した物理的または化学的な固定方法は抗体の生理活性に対してあまり影響しない上、固定化された抗体には抗体タンパク質保存剤が添加されている。保護剤としては、ウシ血清アルブミン、胎児牛血清、ペプトン、蔗糖、ポリビニルピロリドン及びこれらの組み合わせから選択することができる。
【００２８】
高力価のヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型モノクローナル抗体を取り、５ｍＭリン酸塩緩衝液で適当な力価に希釈し、また抗体のガラス繊維パッド上の固定と保存のために抗体固定保護剤を添加する。後継の免疫反応の進行を促進するために希釈後の抗体溶液中に反応増強剤を添加してもよい。希釈後の抗体１．５ｍＬ当たり５ｃｍ×５ｃｍの繊維パッドに広げる比率で、抗体を予め活性化したガラス繊維パッド上に被覆して３７℃で乾燥した後密封して保存する。
【００２９】
２）サンプルアプライパッド３上に検体の滴下を行った後、洗浄パッド２（図３）上に洗浄液体を滴下させる。サンプルを添加して洗浄液を滴下させた後、免疫結合反応が発生するとともに結果が現れる。
【００３０】
３）反応が完成して洗浄した後、サンプルアプライパッド上において赤色の残留物の有無によって、血液検体試料の血液型を判定する。
【００３１】
ＡＢＯ血液型検定用テストストリップにおいて、反応物が洗浄された後、抗Ａ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は相応する抗Ａ抗体に捕らえられ、抗Ａ抗体と凝集反応が発生した（即ち陽性反応）ことを表す。洗浄後、抗Ａ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がない場合、血液検体は抗Ａ抗体と凝集反応が発生していない（即ち陰性反応）ことを表す。反応と洗浄が完了した後に、抗Ｂ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は抗Ｂ抗体と凝集反応が発生したことを表す。洗浄後に、抗Ｂ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がない場合、血液検体は抗Ｂ抗体と凝集反応が発生していないことを表す。従って、検定結果により、抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体とともに凝集反応が発生した血液試料の血液型はＡＢ型で、抗Ａ抗体のみと凝集反応が発生した血液試料の血液型はＡ型で、抗Ｂ抗体のみと凝集反応が発生した血液試料の血液型はＢ型で、抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体のいずれにも凝集反応が発生していない血液試料の血液型はＯ型であると判定できる。
【００３２】
Ｒｈ血液型検定用テストストリップにおいて、反応して洗浄を完了した後に、抗Ｄ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していないことを表す。反応して洗浄を完了した後に、抗Ｄ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がない場合、血液検体は抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していないことを表す。従って、検定結果により、抗Ｄ抗体と凝集反応が発生した血液試料の血液型はＲｈ陽性血液型，抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していない血液試料の血液型はＲｈ陰性血液型であると判定できる。
【００３３】
ＭＮ血液型検定用テストストリップにおいて、反応物が洗浄された後に、抗Ｍ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は相応する抗Ｍ抗体に捕らえられ、抗Ｍ抗体と凝集反応が発生したことを表す。洗浄後に、抗Ｍ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がない場合、血液検体は抗Ｍ抗体と凝集反応が発生していないことを表す。反応して洗浄を完了した後に、抗Ｎ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は抗Ｎ抗体と凝集反応が発生したことを表す。従って、検定結果により、抗Ｍ抗体と抗Ｎ抗体とともに凝集反応が発生した血液試料の血液型はＭＮ型で、抗Ｍ抗体のみと凝集反応が発生した血液試料の血液型はＭ型で、抗Ｎ抗体のみと凝集反応が発生した血液試料の血液型はＮ型であると判定できる。
【００３４】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、その迅速判定用テストストリップは、内張り、洗浄パッド、サンプルアプライパッド、緩衝パッド、吸水パッド、防水テープとからなる。内張りの上に順次に、洗浄パッド、サンプルアプライパッド、緩衝パッド、吸水パッド、及び防水テープを貼り付ける。サンプルアプライパッドの縁部は洗浄パッドの縁部上に重なり、緩衝パッドの縁部はサンプルアプライパッドの縁部上に重なり、吸水パッドの縁部は緩衝パッドの縁部上に重なり、防水テープは洗浄パッドとサンプルアプライパッドとの重なった縁部上に貼り付けられることで、洗浄液体がサンプルアプライパッドの表面から広がることを防止している。内張りはポリエステル材料からなっていてもよいが、これに制限されない。
【００３５】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、ここでいう抗体の固定とは、物理的または化学架橋等の方法を利用して、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍあるいは抗Ｎ等の抗体を、一定の孔径を有するガラス繊維パッドまたはその他の類似する孔径のキャリア上に固定することを指す。固定する前に、抗体の力価に基づいて抗体に対して一定比率の希釈を行って、それを使用に適した濃度にする。浸漬、均一塗布あるいはスプレーの方法を採用して抗体をガラス繊維パッド（サンプルアプライパッド）上に固定することができる、その後、凍結乾燥または加熱乾燥処理を行う。ここで、前記抗体は予め架橋剤であるグルタルアルデヒドで処理したものである。
【００３６】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、前記血液検体は、赤血球または全血、或いは１０ｍＭリン酸塩緩衝液(ＰＢＳ)、生理食塩水等の等張溶液で希釈した赤血球懸濁液(希釈度通常２−５０％)であってもよい。ある程度の溶血または比較的高い脂肪含量の血液試料も、本発明のキットに適している。
【００３７】
適当に希釈したまたは未希釈の検体全血或いは血細胞試料を、血液型の抗体を含有するサンプルアプライパッド上に添加して、免疫結合反応を待った後に洗浄液でサンプルアプライパッドを洗浄する。洗浄液は、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）またはその他の溶液であってもよい。免疫反応後の凝集した赤血球の存在は、肉眼でも容易に観察でき、また、光信号又は電気信号の採集判断機器によって、大量の試料の血液型の検定結果を読み取ることができる。
【００３８】
例えば、ＡＢＯ血液型の検定を行う際に、実際の操作は、一枚のポリエステル板基材上に区分して並列され、それぞれサンプルアプライパッド上に抗Ａまたは抗Ｂ血液型の抗体を固定させた二本の検定用テストストリップ上で完成することができる。
【００３９】
例えば、ＭＮ血液型の検定を行う際に、実際の操作は、一枚のポリエステル板内張り上に区分して並列され、それぞれサンプルアプライパッド上に抗Ｍまたは抗Ｎ血液型の抗体を固定させた二本の検定用テストストリップ上で完成することができる。
【００４０】
本発明のヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を迅速に判定するキットは、血液センターの血液型のスクリーニング、街の採血及び家庭用ＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型自己検査に適用される。迅速な免疫反応及び簡便な結果読み取り手段によって、血液型の迅速且つ簡単正確な検定を達成した。当該方法は、操作が簡単且つ容易で、その他の抗ヒトグロブリン等の試薬の添加を必要としない。本発明の方法において、血液検体試料のサンプル添加量は１０マイクロリットルを超えず、全部の検定過程は２分間を超えない。
【００４１】
本発明のヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型を迅速に判定する方法およびキットは、免疫クロマトグラフィー法の原理に基づいて、血液型物質の抗原と抗体との反応後に、赤血球の凝集により残留した赤色の物質の有無によって、血液型の判断を実現するものである。本発明の方法は、操作が簡単で、従来の通常の血液型検定方法の各種欠陥を避けることができる。本発明の方法は、一人分または複数人分の迅速な判定に適している。特に、採血現場におけるＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の迅速な判定及び家庭用血液型の自己検定に適している。相応する機器と組合わせて使用すれば、当該方法は血液センターに適用して大量の血液試料に対するＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型人群の迅速なスクリーニングを行うことができる。
【００４２】
以下の実施例は本発明に対して更なる例を挙げて説明したものであり、これらの実施例は、本発明に対しいかなる限定もしない。本発明の技術的な解決方案から外れない前提で、本発明に対する当業者が容易に実現できるいかなる変更や変化も、いずれも本発明の特許請求の範囲に該当する。
実施例１：ヒトＡＢＯ血液型キットにおける検定用テストストリップの作製及び検定ステップ
（１）サンプルアプライパッド上における血液型の抗体の固定（抗Ａ、抗Ｂ抗体）：
【００４３】
高力価の血液型モノクローナル抗Ａ抗Ｂ抗体（長春博徳生物技術有限公司製）を取り、５ｍＭリン酸塩緩衝液で１ｍｌになるまで希釈した。最終の力価は６４であった。ガラス繊維パッド上の抗体の固定と保存を促進するために、希釈後の抗体液中に抗体固定保護剤（５％ウシ血清アルブミン、５％蔗糖、５％ＰＶＰ、５％胎児牛血清のリン酸塩緩衝液からなる）を添加した。希釈後の抗体１．５ｍｌ当たりを５ｃｍ×５ｃｍのガラス繊維パッドに広げる比率で、抗体を予め活性化したガラス繊維パッド上に被覆して３７℃で乾燥した後密封して保存した。
（２）迅速判定用テストストリップの実装：
【００４４】
幅が約５−１０ｃｍの長方形のポリエステル板の内張りの中央部に幅が２０ｍｍの洗浄ガラス繊維パッドを貼り付け、その後両辺に幅が１０ｍｍのサンプルアプライパッド、緩衝パッド及び幅が３０ｍｍの吸水パッドを順次に貼り付けて、最後に洗浄パッドとサンプルアプライパッドとの重なる部位に防水テープを貼り付けることで、貼り付けたパッドの剥離及び添加されたサンプルや洗浄液の広がりを防止する。その後、各層の貼り付け済みのポリエステル板を幅５ｍｍのストリップに切って長さが約５−１０ｃｍ，幅が約５ｍｍの検定用テストストリップ（図１と図２を参照）を得た。
（３）試料検定：
【００４５】
テストストリップのサンプルアプライパッド上に、５μｌの全血試料を滴下した。検体試料を滴下した後、洗浄パッド２の上にゆっくりと均速で反応洗浄液を５滴滴下した。洗浄液のクロマトグラフィの後、サンプルアプライパッドの色を観察した。サンプルアプライパッド３の上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、陽性反応とし、サンプルアプライパッド３の上に赤色の物質の残留がない場合、陰性反応とした。ＡＢＯ血液型の抗体と赤血球との反応関係に基づいて、容易に検体試料の血液型を検定できる。また、光信号または電気信号の採集システムによりサンプルアプライパッド上に残留した赤色の物質を採集して、その結果に対し自動的に判断することも可能で、これにより大量の血液試料のＡＢＯ血液型に対する迅速なスクリーニングが実現される。
実施例２：ヒトＲｈ血液型検定キットにおける検定用テストストリップの作製及び検定ステップ
（１）サンプルアプライパッド上における血液型の抗体の固定（抗Ｄ抗体）：
【００４６】
高力価の血液型モノクローナル抗Ｄ抗体（米国MILLIPORE社製）を取り、５ｍＭリン酸塩緩衝液で１ｍｌになるまで希釈した。最終力価は３２であった。ガラス繊維パッド上の抗体の固定と保存を促進するために、希釈後の抗体液中に抗体固定保護剤（５％白蛋白、５％蔗糖、５％ＰＶＰ、５％胎児牛血清のＰＢＳ溶液からなる）を添加し、さらに後継の免疫反応の進行を促進するために反応増強剤（２％Tween20と２％Triton X-100を含むリン酸塩緩衝液)を添加した。希釈後の抗体１．５ｍｌ当たりを５ｃｍ×５ｃｍの繊維パッドに広げる比率で、抗体を予め活性化したガラス繊維パッド上に被覆して３７℃で乾燥させた後密封して保存する（図３を参照）。
【００４７】
その他のステップは、ＡＢＯ血液型キットの迅速判定用テストストリップの作製及び検定ステップと同様にした。
実施例３：ヒトＭＮ血液型検定キットにおける検定用テストストリップの作製及び検定ステップ
【００４８】
ヒトＭＮ血液型検定キットの迅速判定用テストストリップの作製及び検定ステップはヒトＲｈ血液型検定キットの迅速判定用テストストリップの作製及び検定ステップと類似し、異なるのは、判定用テストストリップに固定された抗体を抗Ｍや抗Ｎ抗体に替えたことのみにある（図４を参照）。
実施例４：本発明の血液型検定方法と従来の一般的な方法との比較
【００４９】
我々は、伝統的な血液型検定方法と本発明の方法およびキットとを使用して、同時に、一般の人の１５００例の個体（ドナー）に対し二重盲検法による血液型検定を行ったところ、本方法の検定結果は、既知の血球液体凝集法と比べて、合致率が１００％であった。本発明の検定可能な検体の範囲が比較的広く、部分溶血、高脂質血等の検体に対しても検定可能である。また、本発明のキットの検定方法は、現在よく使われている臨床の血液型検定方法が有する、検定時間が長く、人手による操作の度合いが大きく、さらに結果が操作者の主観的な偏差に大きく影響されるとともに汚染される可能がある等の問題を回避することができる。
【図１】
2011522228.tif 000002
【図２】
2011522228.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月30日(2010.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
２）サンプルアプライパッド３上に検体の滴下を行った後、洗浄パッド１（図３）上に洗浄液体を滴下させる。サンプルを添加して洗浄液を滴下させた後、免疫結合反応が発生するとともに結果が現れる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
Ｒｈ血液型検定用テストストリップにおいて、反応して洗浄を完了した後に、抗Ｄ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、血液検体は抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していることを表す。反応して洗浄を完了した後に、抗Ｄ抗体を含有するサンプルアプライパッド上に顕著な赤色の物質の残留がない場合、血液検体は抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していないことを表す。従って、検定結果により、抗Ｄ抗体と凝集反応が発生した血液試料の血液型はＲｈ陽性血液型，抗Ｄ抗体と凝集反応が発生していない血液試料の血液型はＲｈ陰性血液型であると判定できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
テストストリップのサンプルアプライパッド上に、５μｌの全血試料を滴下した。検体試料を滴下した後、洗浄パッド１の上にゆっくりと均速で反応洗浄液を５滴滴下した。洗浄液のクロマトグラフィの後、サンプルアプライパッドの色を観察した。サンプルアプライパッド３の上に顕著な赤色の物質の残留がある場合、陽性反応とし、サンプルアプライパッド３の上に赤色の物質の残留がない場合、陰性反応とした。ＡＢＯ血液型の抗体と赤血球との反応関係に基づいて、容易に検体試料の血液型を検定できる。また、光信号または電気信号の採集システムによりサンプルアプライパッド上に残留した赤色の物質を採集して、その結果に対し自動的に判断することも可能で、これにより大量の血液試料のＡＢＯ血液型に対する迅速なスクリーニングが実現される。
実施例２：ヒトＲｈ血液型検定キットにおける検定用テストストリップの作製及び検定ステップ
（１）サンプルアプライパッド上における血液型の抗体の固定（抗Ｄ抗体）：
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体を、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ、抗Ｍ、又は抗Ｎ血液型の抗体が予め被覆固定化されたテストストリップ上に滴下し、テストストリップの一端に洗浄液を滴下した後、洗浄液の泳動により、抗体との凝集反応が発生していない赤血球を滴下スポットから遠ざける一方、抗体と免疫凝集した赤血球を検体滴下スポットに残し、その後、反応スポットに凝集した赤血球が残されているか否かによって検体の血液型を判定することを含む、ヒトＡＢＯ／Ｒｈ／ＭＮ血液型の判定方法。
【請求項２】
前記血液検体が、赤血球又は全血、或いは生理食塩水または等張のリン酸塩緩衝液で希釈した赤血球又は全血であってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液検体が、一部分の溶血又は高脂質含量の血液試料を含んでもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体は、物理的な吸着又は化学架橋法によりテストストリップに固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
反応スポットに凝集した赤血球が残されているか否かを、肉眼で、或いは光学信号または電気信号の採集機器によって判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法を完成するためのキット。
【請求項７】
判定用テストストリップと、洗浄液と、採血具とからなり、前記テストストリップが、洗浄パッドと、サンプルアプライパッドと、緩衝パッドと、吸水パッドと、防水テープと、内張りとしてのポリエステル板とからなる、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
テストストリップを構成する前記洗浄パッドと、サンプルアプライパッドと、緩衝パッドと、吸水パッドとは、一定の孔径を有する多孔質高分子材料により作製され、且つその孔径の大きさは少なくとも１個の赤血球を通過可能である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
血液型抗体が固定されたサンプルアプライパッド上に血液検体を滴下し、洗浄パッド上に等張の洗浄液を滴下し、その後、サンプルアプライパッドに凝集した赤血球が残されているか否かによって血液検体の血液型を判定する、請求項７に記載のキット。
【国際調査報告】
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