(57)【要約】本発明はＣＨＯ−Ｋ１細胞を報告し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞はＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来し、浮遊状態で増殖し、増殖のために培養培地中にグルタミン、インスリン、及び増殖因子を要求しないことを特徴とし、それにより、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１細胞株と比較して、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されない。また、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を得るための方法及び本発明のそのようなＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した異種ポリペプチドの産生のための方法を報告する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞であって、該細胞が以下：
ａ）ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来し、
ｂ）ポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で浮遊状態で増殖し、
ｃ）増殖のために培養培地中にグルタミン、インスリン、及び増殖因子を要求せず、
それにより、該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１細胞と比較して、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されていない
ことを特徴とする、細胞。
【請求項２】
細胞が増殖のための動物由来成分を要求しないことを特徴とする、該請求項１記載の細胞。
【請求項３】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞の作成のための方法であって、該方法が以下の順番で以下の工程：
ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１を提供すること、
ｃ）該ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、
ｄ）工程ｂ）において適応させた該ＣＨＯ−Ｋ１細胞をポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、それにより該ＣＨＯ−Ｋ１細胞を得ること、
ここで、ポリペプチド不含の化学的に定義された培地が、グルタミン、インスリン、又は増殖因子を含まず、
該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が、分子生物学的方法を介して、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されない、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法により得られるＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞。
【請求項５】
異種ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１又は２記載のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を提供すること、
ｂ）該異種ポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を提供すること、
ｃ）ａ）の該細胞を該１つ又は複数の核酸でトランスフェクトすること、
ｄ）工程ｃ）の該トランスフェクトした細胞を、グルタミンを含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で培養すること、
ｅ）該異種ポリペプチドを該細胞の培養培地から回収すること
を含む、方法。
【請求項６】
該異種ポリペプチドが免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント又は免疫グロブリンコンジュゲート又は非免疫グロブリンの治療的に活性なポリペプチドであることを特徴する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
培養培地中のアンモニウム濃度が培養中に０．１２mmol/L未満であることを特徴する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
該工程ｃ）及びｄ）を同じ培地中で実施することを特徴する、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
該工程ｃ）及びｄ）を、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加された、ポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地中で実施することを特徴する、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法、
ただし、培地は、単離化合物又はペプチドもしくはポリペプチドの一部のいずれかとしてのグルタミンも、インスリンも増殖因子も含まない。
【請求項１０】
該培養を、流加培養として実施することを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法、
ただし、培養において使用されるフィードは単離化合物又はペプチドもしくはポリペプチドの一部のいずれかとしてのグルタミンも、インスリンも増殖因子も、そしてポリペプチドも含まない。
【請求項１１】
親ＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来するＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞であって、該由来する細胞系が、血清及びグルタミンを含む培地中での親細胞系の倍加時間の１２０%までである、由来する細胞系のポリペプチド不含のグルタミンを含まない化学的に定義された培地中での倍加時間を有する、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド産生の分野にある。より正確には、新たなＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）、そのような細胞株の作成、及び、異種ポリペプチドの産生におけるそのような細胞株の使用を報告する。
【０００２】
発明の背景
組換えポリペプチドの産生のための発現システムは、最新技術において周知であり、例えば、Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33；Goeddel, D. V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7；Wurm, F., and Bernard. A., Curro Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159により記載されている。薬学的用途における使用のためのポリペプチドは、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの哺乳動物細胞で産生される。発現プラスミドの必須のエレメントは、例えば大腸菌のための、原核生物の複製起点及び原核生物の選択マーカーを含む、原核生物プラスミドの伝播ユニット、真核生物の選択マーカー、ならびに、プロモーター、構造遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを各々含む、目的の構造遺伝子の発現のための１つ又は複数の発現カセットである。哺乳動物細胞での一過性発現のために、ＳＶ４０  Ｏｒｉ又はＯｒｉＰなどの哺乳動物の複製起点を含めることができる。プロモーターとして、構成的又は誘導的プロモーターを選択できる。最適化された転写のために、Ｋｏｚａｋ配列を５’非翻訳領域中に含めてよい。ｍＲＮＡプロセシング、特にｍＲＮＡスプライシング及び転写終結のために、構造遺伝子の組成（エクソン／イントロン組成）に応じてｍＲＮＡスプライシングシグナルを、ならびにポリアデニル化シグナルを含めてよい。
【０００３】
今日、ＣＨＯ細胞が、実験室での小規模又は産生プロセスでの大規模のいずれかで、薬学的ポリペプチドの発現のために広く使用されている。それらの広い分布及び使用のため、ＣＨＯ細胞の特徴的な特性及び遺伝的背景が周知である。従って、ＣＨＯ細胞は、ヒトへの適用のための治療用タンパク質の産生のために規制当局により認可されている。
【０００４】
しかし、培地に関して依然として多くの条件が存在する。動物由来成分の使用により、ウイルス又はプリオンタンパク質などのヒトに有害な物質での混入の潜在的なリスクが目前にある。高コスト及び下流でのプロセシング問題の他、動物由来成分の別の問題が、一定した産物の量及び質でそれを得ることを困難にする自然産物としてのバッチ間の変動に起因する。
【０００５】
これらの条件を克服するために、それらの培養のためにより少ない動物由来成分を要求する産生細胞株が必要になる。
【０００６】
十分に定義されたタンパク質不含条件下でのオートクリン増殖を可能にするスーパーＣＨＯ細胞株が、Pak. et al.（Pak, S.C.O., et al., Cytotechnology 22 (1996) 139-146）により報告されている。これは、トランスフェリン及びＩＧＦ−Ｉを発現するＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）細胞株である。Morris, A.E., et al.（ＵＳ  ２００５／０１７０４６２）は、ＩＧＦ−Ｉシグナリング経路の調節による細胞培養中での組換えタンパク質産生のための方法を報告している。Belaus et al.は、キメラＥｒｂＢ２Ｖ→Ｅ／ＩＧＦ−Ｉ受容体を伴うＩＬ−３依存性マウスＢａＦ／３細胞にトランスフェクトした（Belaus, A., et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 85 (2003) 105-115）。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）を含み、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が以下：
−  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来し、
−  浮遊状態で増殖し、
−  ポリペプチド不含及び血清不含の培養培地中で増殖し、
−  増殖のために培養培地中にグルタミン、インスリン、及び増殖因子を要求せず、
それにより、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、分子生物学的方法により、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１と比較して、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されていない
であることを特徴とする。
【０００８】
一実施態様において、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、増殖のために動物由来成分を要求しない。
【０００９】
本発明の第２の局面は、本発明のＣＨＯ−Ｋ１細胞の作成のための方法であって、方法が以下の順番の以下の工程：
ａ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１を提供すること、
ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミンが添加された、ならびに、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、
ｃ）工程ｂ）において適応させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、それによりＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を得て、
それによりＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を、グルタミン、インスリン、又は増殖因子を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地である培養培地で増殖させ、及び
それによりＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が、分子生物学的方法を介して、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されない
からなることを特徴とする。
【００１０】
本発明の別の局面は、本発明の方法により得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞である。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、異種ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）本発明のＣＨＯ−Ｋ１細胞を提供すること、
ｂ）異種ポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を提供すること、
ｃ）ａ）のＣＨＯ−Ｋ１細胞を１つ又は複数の核酸でトランスフェクトすること、
ｄ）工程ｃ）のトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミン、インスリン、又は増殖因子を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で培養すること、
ｅ）異種ポリペプチドをＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養培地から回収すること、及び任意に、
ｆ）１つ又は複数のクロマトグラフィー工程により異種ポリペプチドを精製すること
を含む。
【００１２】
一実施態様において、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント又は免疫グロブリンコンジュゲート又は非免疫グロブリンポリペプチド、好ましくは治療的に活性なポリペプチドである。別の実施態様において、培養培地中のアンモニウムイオン濃度は、培養中に０．１２mmol/L未満である。さらなる実施態様は、工程ｃ）及びｄ）を同じ培地中で実施することである。さらなる別の実施態様は、工程ｃ）及びｄ）を、培養培地が、単離化合物又はペプチドもしくはポリペプチドの一部のいずれかとしてのグルタミンを、そしてインスリンも増殖因子も含まない条件で、任意にヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地中で実施することである。別の実施態様において、培養を、培養に使用されるフィードが単離化合物又はペプチドもしくはポリペプチドの一部のいずれかとしてのグルタミンを、そしてインスリンも増殖因子も含まない条件で、流加培養として実施する。
【００１３】
発明の詳細な説明
当業者に公知の方法及び技術は、本発明を行うために有用であるが、例えば、Ausubel, F. M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (1989)に記載されている。
【００１４】
一般的なクロマトグラフィー方法及びその使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York.を参照のこと。
【００１５】
組換え産生された異種免疫グロブリンの精製のために、異なるカラムクロマトグラフィーの工程の組み合わせをしばしば用いる。一実施態様において、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に、１つ又は２つの追加のクロマトグラフィー分離工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。最終精製工程は、凝集免疫グロブリン、残留ＨＣＰ（宿主細胞のタンパク質）、ＤＮＡ（宿主細胞の核酸）、ウイルス、及び／又はエンドトキシンなどの微量の不純物及び混入物の除去のためのいわゆる「ポリッシング工程」である。このポリッシング工程のために、フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィー材料をしばしば使用する。
【００１６】
異なる方法がタンパク質の回収及び精製のために十分に確立され、広く使用されている。例えば、微生物タンパク質でのアフィニティークロマトグラフィー（例、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例、ベータ−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドでの）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）アフィニティー材料）、分子ふるいクロマトグラフィー、及び電気泳動方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）である（Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【００１７】
本出願内で使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシαアミノ酸のグループを示し、直接的に、又は、前駆体の形態で、核酸によりコードされうる。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチド、いわゆるコドン又は塩基トリプレットからなる核酸によりコードされる。各アミノ酸は少なくとも１つのコドンによりコードされる。異なるコドンによる同じアミノ酸のコードは、「遺伝コードの縮重」として公知である。本出願内で使用する「アミノ酸」という用語は、自然発生するカルボキシαアミノ酸を示し、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｖ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００１８】
「核酸」又は「核酸配列」又は「核酸分子」、これらの用語は本出願内で互換的に使用され、個々のヌクレオチド（別名、塩基）ａ、ｃ、ｇ、及びｔ（又はＲＮＡ中のｕ）からなる高分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその改変物を指す。このポリヌクレオチド分子は、自然発生的なポリヌクレオチド分子又は合成ポリヌクレオチド分子又は１つもしくは複数の自然発生的なポリヌクレオチド分子と１つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子の組み合わせでありうる。この定義によって、１つ又は複数のヌクレオチドが変化（例、突然変異誘発により）、欠失、又は付加される自然発生的なポリヌクレオチド分子も包含される。核酸は、単離できる、又は別の核酸、例えば、発現カセット、プラスミド、又は宿主細胞の染色体中に組込むことができる。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により特徴付けられる。当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順及び方法は周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列、及び同様に、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴付けられる。
【００１９】
「ポリペプチド」は、自然に、又は、合成的に産生されるかを問わず、ペプチド結合により連結されるアミノ酸からなる高分子である。約２０未満のアミノ酸残基のポリペプチドは「ペプチド」と呼んでよいが、２つ又はそれ以上のポリペプチドからなる、又は、１００を超えるアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子を「タンパク質」と呼んでよい。ポリペプチドは、炭水化物基、金属イオン、又はカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分も含みうる。非アミノ酸成分は細胞により加えられうるが、そこでポリペプチドが発現され、細胞の型により変動しうる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造又は同をコードする核酸に関して、本明細書で定義される。炭水化物基などの付加基は一般的に定められないが、しかし、それにもかかわらず存在しうる。
【００２０】
「免疫グロブリン」という用語は、完全免疫グロブリン及び免疫グロブリンコンジュゲートを含む、種々の形態の免疫グロブリン構造を包含する。本発明において用いられる免疫グロブリンは、好ましくは、ヒト抗体、又はヒト化抗体、又はキメラ抗体、又はＴ細胞抗原欠損抗体である（例、WO 98/33523、WO 98/52976、及びWO 00/34317を参照のこと）。抗体の遺伝子操作は、例えば、Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；US 5,202,238及びUS 5,204,244；Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270；Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記載されている。免疫グロブリンは種々の型式で存在しうる。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）、二重特異性免疫グロブリン又はディアボディ（diabody）（例、Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883；Birdt R. E., et al., Science 242 (1988) 423-426；一般的に、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)；及びHunkapillert T. and Hoodt L., Nature 323 (1986) 1516）である。
【００２１】
「完全免疫グロブリン」という用語は、２つのいわゆる軽鎖及び２つのいわゆる重鎖を含む免疫グロブリンを示す。完全免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の各々は、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。完全免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の各々は、定常領域（一般的に、カルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、抗体の、ｉ）食細胞などのＦｃガンマ受容体を持つ細胞への、又はｉｉ）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（別名Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体）を持つ細胞への結合を媒介する。それは、また、成分（Ｃ１ｑ）などの古典的補体系の因子を含む一部の因子への結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変ドメインは、次に、様々なセグメント、即ち、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２２】
「免疫グロブリンコンジュゲート」という用語は、ペプチド結合を介して、さらなるポリペプチドに抱合した免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを示す。さらなるポリペプチドは非免疫グロブリンペプチドであり、例えば、ホルモン、又は増殖受容体、又は抗融合ペプチド、又は補体因子などである。例示的な免疫グロブリンコンジュゲートがＷＯ  ２００７／０４５４６３に報告されている。
【００２３】
「異種ポリペプチド」という用語は、自然で哺乳動物細胞又は宿主細胞により産生されないポリペプチドを示す。本発明の方法に従って産生されるポリペプチドは、組換え手段により産生される。そのような方法は最新技術において広く公知であり、真核生物細胞におけるタンパク質発現を含み、続く異種ポリペプチドの回収及び単離、ならびに通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を伴う。ポリペプチドの産生、即ち、発現のために、ポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を、標準的方法により、発現カセット中に各々挿入する。ハイブリドーマ細胞は、例えば、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードするそのような核酸の供給源として役立ちうる。発現カセットを発現プラスミド中に挿入でき、その後に宿主細胞中にトランスフェクトするが、そうしなければ異種ポリペプチドは産生されない。発現を適切な真核生物の宿主細胞中で実施し、ポリペプチドを溶解後の細胞から、又は、培養上清から回収する。
【００２４】
「単離ポリペプチド」は、混入する細胞性成分、例えば、炭水化物、脂質、又は、本来はポリペプチドに関連する他のタンパク性不純物が本質的にないポリペプチドである。典型的に、単離ポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態、即ち、少なくとも約８０%純粋、少なくとも約９０%純粋、少なくとも約９５%純粋、約９５%超純粋、又は約９９%超純粋なポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドを含むことを示すための１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクマシーブリリアントブルー染色後での単一バンドの出現による。しかし、「単離」という用語は、二量体又は代わりにグリコシル化又は誘導体化の形態などの代わりの物理的形態である同じポリペプチドの存在を除外しない。
【００２５】
「異種ＤＮＡ」又は「異種ポリペプチド」は、ＤＮＡ分子もしくはポリペプチド、又はＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を指し、自然では所与の宿主細胞内に存在しない。特定の宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（即ち、外因性ＤＮＡ）と組み合わされる限り、宿主細胞種に由来するＤＮＡ（即ち、内因性ＤＮＡ）を含みうる。例えば、プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに動作可能に連結されたポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子と考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターに動作可能に連結された内因性の構造遺伝子を含みうる。非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは、「異種」ペプチド又はポリペプチドである。
【００２６】
本出願内で使用する「増殖因子」という用語は、培養培地中で哺乳動物細胞の増殖に正の効果を有する化合物を示す。一実施態様において、増殖因子はアミノ酸残基からなり、即ち、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。例示的な増殖因子は、限定されないが、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ又はＦＧＦ−１）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ−２）、表皮性増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アクチビン、骨形態形成タンパク質、ＦＬＴ−３リガンド、インスリン様増殖因子、神経栄養因子、ソニックヘッジホッグタンパク質、血管内皮増殖因子である。
【００２７】
哺乳動物細胞での発現のための任意の適した、又は、所望の治療用タンパク質を、本発明のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を使用して細胞培養において産生できる。そのようなタンパク質の非限定的な例は、受容体、可溶性受容体、インターロイキン、増殖因子、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンコンジュゲートなどを含む。
【００２８】
「細胞培養」という用語は、浮遊状態又は付着状態で、ローラーボトル、フラスコ、ガラス又はステンレススチールの培養容器などで増殖する細胞を指す。バイオリアクターなどの大規模アプローチも「細胞培養」という用語により包含される。ポリペプチドの大規模及び小規模産生のための細胞培養手順が、本発明により包含される。限定はされないが、流動層バイオリアクター、振とうフラスコ培養、又は撹拌タンクバイオリアクターシステムを含む手順を使用し、代わりに、バッチ、分割バッチ、流加、又はかん流モードで操作してよい。
【００２９】
本発明内で互換的に使用される「細胞培地」及び「培地」という用語は、哺乳動物細胞を増殖させるための栄養溶液を示す。そのような栄養溶液は、一般的に、増殖及び細胞環境の維持のために必要な種々の因子を含む。例えば、典型的な栄養溶液は、培養型及び、場合により、選択剤に依存して、基礎培地製剤、種々の補助剤を含んでよい、一般的に、任意の適した細胞培地は、ポリペプチド、グルタミン、インスリン、又は任意の増殖因子を含まない限り、本発明の方法に使用してよい。
【００３０】
本発明の細胞又は本発明の方法で産生できるタンパク質は、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、バソプレッシン、及びその誘導体、例えば、デスモプレシン、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴｈ）、又はそのフラグメント（例、ＰＴＨ（Ｉ−４３））、ガストリン、セクレチン、パンクレオチミン、コレシストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤ラクトゲン、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、カエルリン、及びモチリンなどのホルモン；エンケファリン及びその誘導体（US 4,277,394及びEP 0 031 567を参照のこと）、エンドルフィン、ダイノルフィン及びキョートルフィンなどの鎮痛性物質；例えば、ボンベシン、ニューロテンシン、ブラジキニン、及びサブスタンスＰなどの酵素；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ＥＰＯ、リポタンパク質、アルファ−１−アンチトリプシン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性剤、ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノゲン活性化因子、トロンビン、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（正常Ｔ細胞発現と分泌の活性制御タンパク）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−ｌ−α）、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ミュラー阻害物質、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、アクチビン、レニン、ホルモン又は増殖因子の受容体、インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、骨格由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質（分化タンパク質のクラスター）、骨誘導因子、イムノトキシン、サイトカイン受容体、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマなどのインターフェロン、インターロイキン（ＩＬｓ）、例、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０、スーパーオキサイドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、例えば、ためのウイルス抗原、ＡＩＤＳエンベロープの部分、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、免疫グロブリン、イムノアドヘシンなどのキメラタンパク、及び上に列挙したタンパク質のいずれかのフラグメントである。
【００３１】
「ＣＨＯ−Ｋ１細胞」又は「ＣＨＯ−Ｋ１」という用語及びその文法的な等価物ならびにこの用語を含む組成物は、例えば、異種ポリペプチドなどの核酸をトランスフェクトできる、又は、トランスフェクトするＣＨＯ−Ｋ１細胞を指す。本明細書で使用する「細胞」という表現は、被験細胞及びその子孫を含む。このように、「トランスフェクタント」及び「トランスフェクト細胞」は、細胞継代（スプリット）又は継代培養の数に関係なく、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。全ての子孫が、故意又は偶然の突然変異のため、ＤＮＡ含量において正確に同じでないかもしれないことも理解される。最初にトランスフェクトされた細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用される「発現」という用語は、細胞内で発生する転写及び／又は翻訳のプロセスを指す。細胞中での目的の核酸配列の転写レベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定できる。例えば、目的の配列から転写されるｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、又は、ノーザンハイブリダイゼーションにより定量できる（Sambrook, et al., 1989、上記を参照のこと）。目的の核酸によりコードされるポリペプチドは、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ポリペプチドの生物学的活性のためのアッセイにより、又は、ポリペプチドを認識し、結合する免疫グロブリンを使用したウエスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイなどのそのような活性に非依存的であるアッセイを用いることにより定量化できる（Sambrook, et al., 1989、上記を参照のこと）。
【００３３】
「発現カセット」は、プロモーター及びポリアデニル化部位など、細胞中での少なくとも含まれる核酸の発現のための、必要な調節エレメントを含むコンストラクトを指す。
【００３４】
「トランスフェクションベクター」は、宿主細胞中のコード核酸／構造遺伝子を含むトランスフェクションベクターの発現のための全ての要求されるエレメントを提供する核酸（核酸分子とも示される）である。トランスフェクションベクターは、例えば、大腸菌のための、つまり、原核生物の複製起点、及び原核生物選択剤に対して耐性を与える核酸を含む、原核生物プラスミド伝播ユニットを含み、トランスフェクションベクターは、真核生物の選択剤に対する耐性を与える１つ又は複数の核酸、及び目的のポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸をさらに含む。好ましくは、選択剤に対する耐性を与える核酸及び目的のポリペプチドをコードする核酸の各々が発現カセット内に置かれ、それにより、各々の発現カセットは、プロモーター、コード核酸、及びポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「動作可能に連結されている」と言う。同様に、調節エレメント及びコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、動作可能に連結されている。
【００３５】
「プロモーター」は、遺伝子／構造遺伝子又はそれに動作可能に連結されている核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、宿主細胞の細胞型において動作可能であり、その中で選択された配列の発現が検討される。様々な供給源からの構成的、誘導的、及び抑制的プロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野において周知であり（ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて同定されており）、クローン化されたポリヌクレオチドとして、又は、その内部で（例、ＡＴＣＣなどの受託者ならびに他の市販又は個々の供給源から）利用可能である。「プロモーター」は、動作可能に連結された構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列を含む。典型的に、プロモーターは遺伝子の５’非コード又は非翻訳領域中に位置し、構造遺伝子の転写開始部位に近接する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。これらのプロモーターエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（DSEs；McGehee, R. E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560）、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥｓ）、血清応答エレメント（ＳＲＥｓ；Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥｓ）、ならびに、ＣＲＥ／ＡＴＦ（O'Reilly, M. A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943）、ＡＰ２（Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 2572825734）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264）、及びオクタマー因子などの他の転写因子のための結合部位（一般的に、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987）、及びLemaigre, F. P. and Rousseau, G. G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14を参照のこと）を含む。高レベル発現のための強いプロモーターとして同定されている真核生物のプロモーターの中には、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインＩプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子１アルファ（CHEF-1、例、US 5,888,809を参照のこと）、ヒトＥＦ−１アルファ、ユビキチン、及びヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ  ＩＥ）がある。「プロモーター」は構成的又は誘導的でありうる。エンハンサー（即ち、プロモーターに作用して転写を増加させるシス作用ＤＮＡエレメント）が、プロモーターと共に機能し、プロモーター単独で得られる発現レベルを増加させるために必要であり、転写調節エレメントとして含まれうる。しばしば、プロモーターを含むポリヌクレオチドセグメントはエンハンサー配列（例、ＣＭＶ又はＳＶ４０）も含む。
【００３６】
本明細書で使用する「エンハンサー」は、それに動作可能に連結された遺伝子又はコード配列の転写を増強させるポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターと異なり、エンハンサーは比較的、方向及び位置に非依存的であり、転写ユニットの５’又は３’に見出され（Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio., 3 (1983) 1108-1122）、イントロン内（Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740）ならびにコード配列自体の内にある（Osborne, T. F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305）。従って、エンハンサーは、転写開始部位から上流もしくは下流に、又は、プロモーターから相当な距離に置いてよいが、実際には、エンハンサーはプロモーターと物理的及び動作可能に重複する。種々の異なる供給源からの多数のエンハンサーが当技術分野において周知であり（ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて同定される）、クローン化されたポリヌクレオチド配列（例、ＡＴＣＣなどの受託者ならびに他の市販又は個々の供給源から）として、又は、その内部で利用可能である。プロモーター配列（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む多くのポリヌクレオチドもエンハンサー配列を含む。例えば、上に列挙する強いプロモーターの全ても強いエンハンサーを含みうる（例、Bendig, M., M., Genetic Engineering 7 (Academic Press, 1988) 91-127を参照のこと）。
【００３７】
「選択剤に対する耐性を与える核酸」は、それを運ぶ細胞を、選択剤の存在下で、それについて、又は、それに対して特異的に選択されることを可能にする核酸である。そのような核酸は選択マーカーとも示される。典型的に、選択マーカーは選択剤（薬物）に対する耐性を与え、又は、宿主細胞における代謝又は異化の欠損を代償する。選択マーカーはポジティブ、ネガティブ、又は二機能性でありうる。有用なポジティブ選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーによって、それで形質転換させた細胞を、対応する選択剤の存在下で、即ち、例えば、対応する抗生物質の存在下での選択的増殖下で、ポジティブに選択することが可能になる。非形質転換細胞は、培養中での選択的な増殖条件下で、即ち、選択剤の存在下で、増殖又は生存できない。ポジティブ選択マーカーによって、マーカーを運ぶ細胞についての選択が可能になるのに対して、ネガティブ選択マーカーによってマーカーを運ぶ細胞を選択的に除くことが可能になる。真核生物の選択マーカーは、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシン（ｈｙｇ）、ネオマイシン（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、ｎｅｏ）、及びＧ４１８などの選択剤に対して耐性を与える）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（選択剤メトトレキサートに対して耐性を与える）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（選択剤インドールに対して耐性を与える）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（選択剤ヒスチジノールＤに対して耐性を与える）、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼの遺伝子、ならびに、プロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸に対して耐性を与える核酸が含まれる。さらなる選択マーカー核酸が、例えば、WO 92/08796及びWO 94/28143において報告されている。原核生物の選択マーカーは、例えば、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（選択剤アンピシリンに対して耐性を与える）を含む。
【００３８】
遺伝子の発現は、一過性又は持続性の発現のいずれかとして実施される。目的のポリペプチドは、一般的に、分泌ポリペプチドであり、従って、細胞壁を通じた細胞外培地中へのポリペプチドの輸送／分泌に必要であるＮ末端伸長（別名、シグナル配列）を含む。一般的に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来しうる。異種シグナル配列を使用する場合、それは好ましくは宿主細胞により認識及びプロセシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。酵母中での分泌のために、例えば、発現させるべき異種遺伝子の天然シグナル配列を、分泌遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列（例えば、酵母インベルターゼシグナル配列、アルファ因子リーダー（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、及びハンゼヌラα因子リーダー、US 5,010,182に記載の第２）、酸性ホスファターゼシグナル配列、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼシグナル配列（EP 0 362 179）により置換してよい。哺乳動物細胞での発現において、目的のタンパク質の天然シグナル配列は満足できるが、他の哺乳動物のシグナル配列が適しうる。例えば、同じ、又は、関連する種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列（例、ヒト又はマウス由来の免疫グロブリンのため）、ならびに、ウイルス分泌シグナル配列、例えば、ヘルペス単純糖タンパク質Ｄシグナル配列である。そのようなプレセグメントをコードするＤＮＡフラグメントをインフレームで結合させ、即ち、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントに動作可能に連結させる。
【００３９】
本発明の第１の局面はＣＨＯ−Ｋ１細胞であり、ＣＨＯ−Ｋ１Ｇｌｎ（−）と示され、培養培地中にグルタミン、インスリン、及び増殖因子を要求しない。
【００４０】
本発明のＣＨＯ−Ｋ１細胞を以下：
−  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を提供すること、
−  ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミンが添加され、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、
−  先行する工程において適応させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること
の通りに得る。
【００４１】
「化学的に定義された培地」という用語は、合成化合物だけを含む培地を示し、動物由来成分を含まない。また、「化学的に定義された培地」という用語は、一実施態様において、０．１mM未満のグルタミン、別の実施態様において０．０１mM未満のグルタミン、そして、さらなる実施態様において０．００１mM未満のグルタミンを含む培地を示す。一実施態様において、化学的に定義された培地はグルタミンを含まない。一実施態様において、化学的に定義された培地は、動物由来成分を含まず、また、植物由来の細胞加水分解物を含まない。例示的な化学的に定義された合成培地は、InvitrogenからのＣＤ  ＣＨＯ培地、又は以下で構成されるＷＯ  ０２／０６６６０３において報告された改変バージョンの培地である：塩化ナトリウム、３〜５g/L；塩化カリウム、０．２０．４g/L；ＨＥＰＥＳ、５〜７g/L；グルコース（デキストロース）、３．５〜５．５g/L；ビオチン、０．０００００５〜０．００００２５g/L；アスコルビン酸、０．００２〜０．００４；パントテン酸塩、０．００２〜０．００６g/L；コリン、０．００２〜０．００６g/L；葉酸塩、０．００２〜０．００６g/L；イノシトール、０．００５〜０．０２g/L；ナイアシンアミド、０．００２〜０．００６g/L；ピリドキサル、０．００２〜０．００６g/L；リボフラビン、０．０００２〜０．０００６g/L；チアミン、０．００２〜０．００６g/L；シアノコバラミン、０．０００００５〜０．００００２５g/L；オキザロ酢酸、０．１〜０．４g/L；アラニン、０．０１５〜０．０３５g/L；アスパラギン、０．０１〜０．０３５g/L；アルギニン、０．０６〜０．１０g/L；アスパラギン酸、０．０２〜０．０４g/L；システイン、０．３〜０．５g/L；シスチン、０．０５〜０．２g/L；グルタミン酸、０．０６〜０．０９g/L；グリシン、０．０２〜０．０４g/L；ヒスチジン、０．０３〜０．０５g/L；イソロイシン、０．０５〜０．２５g/L；ロイシン、０．０５〜０．２５g/L；リシン、０．０５〜０．２５g/L；メチオニン、０．０２〜０．０４g/L；フェニルアラニン、０．０５５〜０．０７５g/L；プロリン、０．０３〜０．０５g/L；セリン、０．０３〜０．０５５g/L；トレオニン、０．０７〜０．１５g/L；トリプトファン、０．００５〜０．０２５g/L；チロシン、０．０５〜０．１５g/L；バリン、セレン酸ナトリウム、０．００００００５〜０．００００６０g/L；硫酸マグネシウム、０．０５〜０．２g/L；塩化カリウム、０．１５〜０．４５g/L；リン酸ナトリウム、０．０７５〜０．２g/L；硝酸カリウム、０．００００５〜０．００００９g/L；塩化カルシウム、０．０８〜０．２５g/L；ピルビン酸ナトリウム、０．０５〜０．４g/L；リノール酸、１〜１００mg/L；エタノールアミン、５〜２５μg/L；炭酸水素ナトリウム、１〜５g/L；クエン酸第二鉄、１〜１０mg/L；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、０．２〜２g/L；水酸化ナトリウム、０．３〜０．９g/L；ミコフェノール酸、０．１〜２mg/L；ヒポキサンチン、２〜５mg/L；キサンチン；１０〜２００mg/L；炭酸水素ナトリウム１．５〜４．５g/L、又は、例えば、Sigma／Aldrich（製品番号５２７７２、５２８９７、及び５８２８４（www.sigma-Aldrich.com））、もしくはLife Technologies, Rockville, MD（www.lifetech.com）、もしくはJRH Biosciences, Lenexa, KS（www.jrhbio.com）からの、��発明の条件に従って改変され、本発明のにおいて有用な培地を提供する市販の培地、又は、Ｉｓｃｏｖｅｓ改変培地（Iscove et al., J. Exp. Med. 147 (1978) 923-933；Iscove, et al., Exp. Cell Res. 126 (1980) 121-126）、もしくはダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco and Freeman, Virology 8 (1959) 396-397； Smith et al.., J. D., Freeman, G., Vogt, M. and Dulbecco, R., Virology 12 (1960) 185-196；Morton, In Vitro 6 (1970) 89；Rutzky and Pumper, In Vitro 9 (1974) 468）、もしくはＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２／ダルベッコ改変イーグル培地（Barnes and Sato, Analyt. Biochem. 102 (1980) 255-270）である。
【００４２】
ＡＴＣＣから得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１は、標準的な加湿条件（９５%湿度、３７℃、５%  ＣＯ２）下で、２mMグルタミン及び１０%（v/v）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した、ダルベッコ改変イーグル及びＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）の１：１（w/w）混合液である培養培地中での増殖に適応させた付着性の増殖細胞である。
【００４３】
第１工程において、細胞を浮遊状態での増殖に適応させる。従って、細胞を、トリプシン及びＡｃｃｕｔａｓｅでの酵素処理により剥離させ、遠心分離により回収する。回収した細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンならびに２mM  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地中に播種する。一実施態様におけるこの培養は、小規模で、培養容器の容積５０ml〜２５０mlで実施する。一実施態様において、接種細胞密度は３×１０５個細胞/mlである。一実施態様において、細胞を、３〜４世代ごと、即ち、３〜５日ごとに新鮮培地中に分割する。一実施態様において、細胞を、合計３５〜６０世代又は１２〜２０分割に分割する。一実施態様において、第１工程において適応させた細胞の倍加時間は２５〜３０時間である。
【００４４】
第２工程において、第１工程に由来する細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンが添加され、しかし、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含まない、ポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地における浮遊状態での増殖に適応させた。従って、細胞を、２５〜３０世代又は２３〜３５日にわたり継代する。第２工程のポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地は、グルタミン又はグルタミンを含むペプチドもしくはポリペプチドを含まない。一実施態様において、第２工程において得られた細胞の倍加時間は２２〜２５時間である。一実施態様において、第２工程において得られた細胞の最高生存細胞密度は６〜７×１０６個細胞/mLである。
【００４５】
驚くべきことに、本発明のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が、親細胞株ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１と比較して、改善された特性を有することが見出されている。また、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞の培養培地からのグルタミンの除外により、培養プロセス中でのアンモニウムイオン及びアンモニアの形成が低下する。このように、一実施態様において、培養培地中のアンモニウムイオン濃度は０．１２mmol/L未満であり、さらなる実施態様において０．１mmol/L未満である。培養培地中の乳酸濃度が一定のレベルに維持されることも見出されている。このように、一実施態様において、本発明の細胞の培養中に培養培地中での乳酸生成／蓄積が低下する。別の実施態様において、乳酸濃度は培養培地中で２．５g/L未満である。さらに、本発明の細胞では、産生細胞株の作成のために要求される全ての工程において、即ち、第１のトランスフェクションから大規模発酵まで、同じ培養培地を使用することが今や可能である。用いられるポリペプチド不含の化学的に定義された合成培地は、要求される選択剤を添加するだけでよい。従って、新たな／異なる培地への適応工程が、完全プロセス中で要求されず、時間及び費用が節約される。また、一実施態様において、培養を流加培養として実施する場合、用いられるフィードはグルタミン不含、インスリン不含、増殖因子不含、及びポリペプチド不含である。ここで、また、驚くべきことに、そのような有用な細胞を、一連の適応工程により得ることができ、不要な毒性代謝副産物を無害な化合物に変換するために、例えば、酵素をコードする追加遺伝子の導入による細胞の遺伝子改変が要求されないことが見出された。また、本発明のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞では、培養容器中のｐＨ値がｐＨ６．８〜ｐＨ７．２のｐＨ幅に維持されることが見出されている。
【００４６】
従って、本発明の第２の局面は、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞株の作成のための方法であって、以下の順番で以下の工程：
−  ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１を提供すること、
−  ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミンが添加された、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが追加で添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、
−  先行する工程において適応させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、場合によりヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、そして、それによりＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞株を得ること
を含む。
【００４７】
一実施態様において、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞に要求される培養培地は、グルタミン、インスリン、及び増殖因子を含まず、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が、分子生物学的方法による核酸の導入、欠失、もしくは不活化により、又は、異種ポリペプチドの発現、二次改変、又は分泌に要求されない酵素をコードする核酸の導入、欠失、もしくは不活化により遺伝子改変されない。
【００４８】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法により得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞である。
【００４９】
本発明の別の局面は、異種ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、以下の工程：
−  本発明のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を提供すること、
−  異種ポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を提供すること、
−  ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を１つ又は複数の核酸でトランスフェクトすること、
−  トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を、グルタミン、インスリン、又は増殖因子を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で培養すること、
−  異種ポリペプチドを培養培地又は細胞から回収すること、及び、
−  場合により、１つ又は複数のクロマトグラフィー工程により異種ポリペプチドを精製すること
を含む。
【００５０】
一実施態様において、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント又は免疫グロブリンコンジュゲート又は治療的に活性なポリペプチドである。
【００５１】
本発明の方法は、分泌された異種ポリペプチドの大規模な、即ち、工業的な産生に適する。大規模での所望のポリペプチドの産生のための細胞の培養は、一般的に、一連の個々の培養からなり、ここで、最後の、即ち、大規模での培養、即ち、一連の最後のものを除き、全ての培養が、特定の細胞密度が培養容器において達するまで実施される。事前に決定した細胞密度が完全培養に達する場合、その部分を使用し、より大きな容積を有する、つまり、先行する培養の１００倍までの容積の次の培養容器に接種する。より大きな容積での少なくとも１つのさらなる培養のための基礎として役立つ全ての培養は、「種トレイン（seed train）発酵」として示される。大規模な培養においてだけ、即ち、より大きな容積でのさらなる培養のための基礎として役立つことを意図しない培養（「主発酵」とも示される）において、培養のエンドポイントが、培養培地中の産生、分泌された異種免疫グロブリンの濃度又は培養時間に依存して決定される。本出願内で使用される「大規模」という用語は、工業産生プロセスの最終培養を示す。一実施態様において、大規模培養は、少なくとも１００l、別の実施態様において少なくとも５００lの容積、さらなる実施態様において少なくとも１０００l〜２５，０００lまでの容積で実施される。一実施態様において、最終、即ち、大規模な培養培地は真核生物の選択剤を含まない。
【００５２】
一実施態様において、トランスフェクトされた細胞の培養は、真核生物の選択剤の存在下で、５００リットル未満の容積で実施し、そして、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養は、真核生物の選択剤の非存在下で、５００リットル又はそれ以上の容積で実施し、そして、異種ポリペプチドの回収は、真核生物の選択剤を含まない培養培地からである。さらなる実施態様において、培養は連続培養を含み、培養容積を最終培養容積まで増加させ、それにより、培養は、真核生物の選択剤の存在下で、最終又は主培養の培養容積の１%（v/v）の培養容積まで、及び、全ての真核生物の選択剤の非存在下で、最終培養の培養容積の１%（v/v）を超える培養容積で実施する。さらなる実施態様において、培養は連続種トレイン培養を含み、培養容積を増加させ、それにより、種トレイン培養の各々は真核生物の選択剤の存在下で実施し、主発酵は全ての真核生物の選択剤の非存在下で実施する。一実施態様において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養は、真核生物の選択剤の存在下で、種トレイン発酵において実施し、そして、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養は、真核生物の選択剤の非存在下で、主発酵において実施し、そして、異種ポリペプチドの回収は、真核生物の選択剤を含まない主培養培地からである。これらの実施態様において、真核生物の選択剤は、種トレイン培養中に加えられ、ＣＨＯ細胞の産生段階（主発酵培養）中には省略される。「産生段階」という用語は、大容積でのＣＨＯ細胞の培養、即ち、主発酵を示し、その後に産生された異種ポリペプチドが回収される。
【００５３】
本発明の方法の別の実施態様において、ＣＨＯ細胞の産生能は、４０を超える世代にわたり７０%未満であり、分割バッチ培養としての培養の１０世代後の産生能の１３０%までである。一実施態様において、ＣＨＯ細胞の産生能は、６０を超える世代にわたり５０%未満であり、分割バッチ培養としての培養の１０世代後の産生能の１５０%までである。ＣＨＯ細胞の産生能は、別の実施態様において、加流培養としての２１日以内に、異種免疫グロブリンの少なくとも１．５g/lである。一実施態様において、本発明の方法で得られるＣＨＯ細胞の特異的な産生能は、１μg/１０６個細胞/dを超え、５μg/１０６個細胞/dを超え、又は１０μg/１０６個細胞/dを超えである。一実施態様において、分泌された異種免疫グロブリンは、完全にプロセシングされた分泌された異種免疫グロブリンである。「完全にプロセシングされた分泌された異種免疫グロブリン」という用語は、ｉ）培養培地に分泌され、そのシグナル配列が切断されている、ｉｉ）抗原結合領域を含む、ｉｉｉ）付着サッカライド又はポリサッカライド、及び／又は正確に形成されたジスルフィド結合などの二次修飾を有する免疫グロブリンを示す。
【００５４】
本発明の一実施態様において、異種免疫グロブリンは抗ＣＤ４抗体コンジュゲートである。別の実施態様において、コンジュゲート中の抗ＣＤ４抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号０１、０２、又は０３より選択されるアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３を含む。さらなる実施態様において、コンジュゲート中の抗ＣＤ４抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号０４、０５、又は０６より選択されるアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３を含む。さらなる実施態様において、コンジュゲート中の抗ＣＤ４抗体は、配列番号０７、０８、又は０９より選択されるアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメインを含む。さらなる実施態様において、コンジュゲート中の抗ＣＤ４抗体は、配列番号１０、１１、又は１２より選択されるアミノ酸配列はを伴う軽鎖可変ドメインを含む。
【００５５】
治療薬、即ち、ヒトにおける使用を意図したポリペプチドの大規模産生のために使用可能な哺乳動物細胞は、異なる基準を満たさなければならない。とりわけ、これらは血清不含培地中で培養可能でなければならない。血清は、多数の化合物の混合物である。通常は、ウシ血清が、哺乳動物細胞の培養のために使用されてきた。種から種への伝染性疾患の生じる問題のために、血清及び他の定義されていない哺乳動物由来成分の使用は避けなければならない。本出願内で使用する「定義されていない哺乳動物由来成分」という用語は、哺乳動物、特にウシ、ブタ、ヒツジ、又は子ヒツジに由来する成分を示し、その組成は８０%（w/w）未満、好ましくは９０%（w/w）未満と定めることができる。「定義された哺乳動物由来成分」は、哺乳動物、特にウシ、ブタ、ヒツジ、又は子ヒツジから得られる成分を示し、その組成は９５%（w/w）超、好ましくは９８%（w/w）超、最も好ましくは９９%（w/w）超と定めることができる。定義された哺乳動物由来成分の例は、羊毛からのコレステロール、及び牛乳からのガラクトースである。
【００５６】
一実施態様において、ポリペプチド不含の化学的に定義された培地は、Invitrogen Corp.から入手可能なＣＤ  ＣＨＯ培地、又は、Gibcoから入手可能なＰｒｏＣＨＯ４培地、又は、Hycloneから入手可能なタンパク質不含培地ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯである。一実施態様において、ポリペプチド不含の化学的に定義された培養培地は、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、イスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、又はＮＣＴＣ  １０９培養培地（全てLonza Inc., USAから入手可能）に由来する。
【００５７】
本発明の方法の別の実施態様において、方法は、第１のトランスフェクションで始まり、そして、同じ培地中で実施される異種ポリペプチドの回収で終わる。「同じ培地中」という用語は、本出願内で、第１のトランスフェクションで始まり、そして、主発酵培養培地からの異種ポリペプチドの回収で終わり、同じ培地を使用することを示す。これは、全ての工程において同じ組成の新たな培地を用いることを示す。これは、同じ添加物を全ての工程において培地に加えなければならないことを示さず、即ち、培地に方法の異なる工程において異なる添加物を添加してよい。添加物は、培地に、合計で２０%（w/w）未満、一実施態様において１５%（w/w）未満、別の実施態様において１０%（w/w）未満加えられる化合物である。一実施態様において、本発明の方法に使用される培地は、全ての工程において同じ培地であり、異種ポリペプチドの大規模産生に適した培地である。
【００５８】
異種ポリペプチドは、当業者に公知のクロマトグラフィー方法で培養培地から回収できる。従って、一実施態様において、本発明の方法は、１つ又は複数のクロマトグラフィー方法で異種ポリペプチドを精製する最終工程を含む。
【００５９】
例えば、異種免疫グロブリンの発現のために、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞をトランスフェクトしたベクターは、真核生物の選択剤に耐性を与える核酸を含む、異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする核酸及び／又は異種免疫グロブリンの重鎖をコードする核酸を含む。ベクターが免疫グロブリンの軽鎖又は免疫グロブリンの重鎖のいずれかをコードする核酸だけを含む場合、ＣＨＯ細胞は、各工程において、免疫グロブリンの対応する他の鎖をコードする核酸を含む別のベクターによってもトランスフェクトされる。
【００６０】
本発明は、さらに、ポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で培養されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む。そのような細胞株から発現された異種ポリペプチドも包含される。本発明の別の局面は、本発明のＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を含む組成物である。
【００６１】
一実施態様において、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンコンジュゲート、可溶性受容体、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、可溶性タンパク質、細胞外タンパク質、融合タンパク質、又はそれらの任意のフラグメントもしくは部分より選択される。
【００６２】
一実施態様において、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞の培養を、異種ポリペプチドを発現させるために十分な時間にわたり実施する。別の実施態様において、時間は１４〜２１日である。
【００６３】
本発明の別の局面は、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞、一実施態様においてＣＨＯ−Ｋ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１に由来するＣＨＯ−Ｋ１細胞であり、由来する細胞株のポリペプチド不含のグルタミンを含まない化学的に定義された培地中での倍加時間が、血清及びグルタミンを含む培地中での親細胞株の倍加時間の１２０%までである。
【００６４】
以下の実施例、配列リスト、及び図を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示す。改変を、本発明の精神から逸脱することなく、示した手順において施すことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】３つの培養の各々のａ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地及びｂ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地中で得られる生存細胞密度。
【図２】３つの培養の各々のａ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地及びｂ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地における細胞培養上清中の乳酸濃度。
【図３】３つの培養の各々のａ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地及びｂ）ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地における細胞培養上清中のアンモニウムイオン濃度。
【図４】プラスミド６３１１の注釈付きプラスミドマップ。
【００６６】
実施例
材料及び方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報が以下に与えられる：Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸に、ＥＵナンバリングに従って番号を付ける（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85；Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【００６７】
組換えＤＮＡ技術：
標準的方法を使用し、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される通りに操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。
【００６８】
遺伝子合成：
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により作製したオリゴヌクレオチドから調製した。１００〜６００bp長の遺伝子セグメントが、特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位により隣接され、ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションにより組み立てられ、続いて、Ａオーバーハング又はｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）クローニングベクター（Stratagene Corp., USA）を介してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Stratagene Corp., USA）中にクローン化した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【００６９】
タンパク質の測定：
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づき算出されたモル吸光係数を使用して、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【００７０】
抗体力価の測定：
抗体力価を、参照として精製された自己抗体を使用して、抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡ又はプロテインＡクロマトグラフィーのいずれかにより測定した。
【００７１】
代謝産物の分析：
グルコース、乳酸、グルタミン、及びアンモニウムの濃度を、Bioprofile 100 plus Analyzer（Nova Biomedical）を使用して分析する。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳサンプルバッファー、４倍濃縮液（４×）：４gグリセロール、０．６８２g  ＴＲＩＳ−Ｂａｓｅ、０．６６６g  ＴＲＩＳ−塩酸塩、０．８g/ＬＤＳ（リチウム硫酸ドデシル）、０．００６g  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．７５mlの１重量%（w/w）Ｓｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｇ２５０水溶液、０．７５mlの１重量%（w/w）フェノールレッド溶液、水を加えて全容積を１０mlにする。
【００７３】
分泌抗体を含む培養ブロスを遠心分離し、細胞及び細胞細片を除去した。清澄化された上清の一定分量を、１／４容積（v/v）の４×ＬＤＳサンプルバッファー及び１／１０容積（v/v）の０．５M  １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混ぜた。その後、サンプルを７０℃で１０分間インキュベートし、そして、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Invitrogen Corp.）を、製造業者の指示に従って使用した。特に、１０%  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ泳動バッファーを使用した。
【００７４】
ウエスタンブロット
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mM  ＴＲＩＳ−塩酸塩、０．０４重量%（w/w）ＳＤＳ、及び２０容積%メタノール（v/v）。
【００７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、分離された抗体鎖を、Burnetteの「Ｓｅｍｉｄｒｙ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄ」（Burnette, W. N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に従って、電気泳動的にニトロセルロースフィルターメンブレン（孔径：０．４５μm）にトランスファーした。
【００７６】
実施例２
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞の作成
親ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＡＴＣＣ（Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）から凍結ストックとして得た。このＣＨＯ−Ｋ１細胞の作成は、Puck, T. T., et al., J. Exp. Med. 108 (1958) 945-956、及び、Kao, F. T., and Puck, T. T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60 (1968) 1275-1281により報告されている。
【００７７】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）宿主細胞は、ヒポキサンチン−チミジン−添加剤（11067-030, Invitrogen Corp., USA）を含む、ポリペプチド不含の化学的に定義された動物成分不含、及びグルタミン不含ＣＤ  ＣＨＯ培地（10743-011, Invitrogen Corp., USA）における浮遊培養中での増殖への事前の適応により、寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株から派生した。この培地を、以下において、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地と呼ぶ。
【００７８】
付着性の増殖ＣＨＯ−Ｋ１細胞株ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１を、Ｔ組織培養フラスコ及び標準的な加湿条件（９５%、３７℃及び５%  ＣＯ２）において、２mMグルタミン及び１０%  ＦＣＳ（Gibco；カタログ番号：２６４００；ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen Corp.；ダルベッコ改変＆イーグル培地及びＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の１：１混合液）中で増大させた。
【００７９】
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（無脊椎動物から調製された剥離溶液（エビ、PAA Laboratories；カタログ番号：Ｌ１１−００７））での酵素処理により剥離し、そして、振盪下（１１０〜１３０rpm）の１２５ml三角フラスコにおいて、２mM  ｕｌｔｒａ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン；Cambrex； BE17-605E/UI）を含むＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地中に播種した。この培地を、以下において、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地と指定する。３〜４日毎に細胞を新鮮なＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地中に６０日間の期間にわたり分割した（接種濃度約３×１０５個細胞/ml）。その後に、細胞を、グルタミン不含ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地を使用して、約３０日間の期間にわたり継代した。
【００８０】
得られた細胞を、動物由来成分を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された合成培養培地において、浮遊培養での増殖、及び、グルタミン、インスリン、及び増殖因子の非存在下での増殖に適応させる。
【００８１】
図１には、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地における浮遊状態での増殖への適応後（第１工程）及びＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地における浮遊状態での増殖への適応後（第２工程）の細胞で入手可能な生存細胞密度を示す。グルタミン不含培地（図１ｂ）において、より高い細胞密度を得ることができることが分かる。７日目、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培養培地のｐＨ値は６．７であるが、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地の７日目でのｐＨ値はｐＨ６．８とｐＨ７．０の間である。
【００８２】
図２には、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地への適応後、及び、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地への適応後の細胞での培養からの細胞培養上清における乳酸濃度を示す。グルタミン不含培地（図２ｂ）において、低下した乳酸産生を観察できることが分かる。
【００８３】
図３には、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇｌｎ培地への適応後、及び、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地への適応後の細胞での培養からの細胞培養上清におけるアンモニウムイオン濃度を示す。グルタミン不含培地（図３ｂ）において、低下したアンモニウムイオン濃度を観察できることが分かる。
【００８４】
【表１】
2011500009.tif 000002
【００８５】
実施例３
抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを発現するための発現ベクター
本発明の細胞株を使用して発現できる実施例の（モノクローナル）抗体は、２〜８つの抗融合ペプチドへ抱合させたヒトＣＤ４表面受容体（抗ＣＤ４抗体）に対する抗体である。そのような抗体及び対応する核酸配列は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５８９４又は配列番号：０１〜１２において報告されている。
【００８６】
ゲノムのヒトカッパ−軽鎖定常領域の遺伝子セグメント（Ｃ−カッパ）を、配列番号：１１の抗ＣＤ４抗体の軽鎖可変領域に加えた、一方、ヒトガンマ１−重鎖定常領域遺伝子セグメント（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を配列番号：０８の抗ＣＤ４抗体の重鎖可変領域に加えた。発現プラスミド６３１１は、抗ＣＤ４抗体γ１重鎖を含み、最後の、しかし、１つのＣ末端アミノ酸での結合部であり、即ち、重鎖のＣ末端リジン残基が除去され、配列番号：１４のペプチドグリシン−セリンリンカーを介した配列番号：１３の抗融合ペプチドをコードする核酸、及び抗ＣＤ４抗体κ軽鎖、及び選択可能マーカーネオマイシンに対する耐性を与える核酸を伴う。注釈を付けたプラスミドマップを図４に示す。
【００８７】
ａ）重鎖発現カセット
抗ＣＤ４抗体コンジュゲート重鎖の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター（ＣＭＶ  ＩＥ）、
−  ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）
−  イントロン−エクソン遺伝子構造中のシグナルペプチドを含む抗ＣＤ４抗体ガンマ１−重鎖コンジュゲートのためのコード配列、
−  ＳＶ４０初期ポリＡシグナル配列
で構成される。
【００８８】
ｂ）軽鎖発現カセット
抗ＣＤ４抗体コンジュゲート軽鎖の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター（ＣＭＶ  ＩＥ）、
−  ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）
−  イントロン−エクソン遺伝子構造中の抗ＣＤ４カッパ軽鎖のためのコード配列、
−  ＳＶ４０初期ポリＡシグナル配列
で構成される。
【００８９】
ｃ）発現プラスミド
抗ＣＤ４抗体コンジュゲートの発現及び産生のために、軽鎖及び重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに置いた（重鎖の上流に軽鎖）。３つの同じ発現ベクターを作成し、含まれる選択可能マーカー、特にネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子においてだけ異なる。
【００９０】
発現ベクターは、軽鎖及び重鎖発現カセットの他、以下のエレメント：
−  ｐＵＣ１８から取られた（ｐＵＣ由来）、大腸菌においてプラスミドの複製を可能にする複製起点、
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９１】
実施例４
抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを発現するＣＨＯ細胞株のトランスフェクション及び選択
実施例２において得られた細胞を、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地において、振盪下（１１０〜１３０rpm）の三角フラスコ（５０又は１２５ml）中で、作業容積としての３０〜５０%の名目容積及び標準加湿条件（９５%、３７℃及び５%  ＣＯ２）を使用して増殖させた。３〜４日毎に、細胞を新鮮培地中に分割した（接種細胞密度は約３×１０５個細胞/ml）。細胞を、遠心分離により対数増殖期に回収し、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、そして、無菌ＰＢＳ中に再浮遊した。
【００９２】
トランスフェクション前に、プラスミド６３１１を、β−ラクタマーゼ遺伝子（大腸菌アンピシリン耐性遺伝子）内で、制限エンドヌクレアーゼ酵素ＰｖｕＩを使用して線形化した。切断したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、真空下で乾燥させ、そして、無菌ＰＢＳ中に濃度約１μg  ＤＮＡ/μlで溶解させた。トランスフェクションのために、ＣＨＯ細胞を、全容積２００〜３００μｌの室温のＰＢＳ中で、約０．９×１０７個細胞当たり２０〜５０μgの線形化プラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣｅｌｌエレクトロポレーションデバイス（Bio-Rad Laboratories）により、２mmギャップキュベット中で、方形波プロトコールを使用して、単一の１６０Vパルスで１５分間実施した。トランスフェクション後、細胞をＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地中にプレーティングした（９６ウェル培養プレートの１ウェルごとに１００μl培地当たり１０４個細胞）。２４時間後、２倍濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８：１４００μg/ml）を添加した１００μlのＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ培地を、元の培地及びプレートを交換することなく、各ウェルに加えた。７日毎後、ＣＤ＿ＣＨＯ＿ＨＴ＿Ｇ４１８選択培地を交換した。２〜３週間のインキュベーション後、抗体濃度を、培養上清中でのヒトＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡアッセイで分析した。
【図１】
2011500009.tif 000003
【図２】
2011500009.tif 000004
【図３】
2011500009.tif 000005
【図４】
2011500009.tif 000006
【配列表】
2011500009000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月3日(2009.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）であって、該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞が、以下：
−  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来し、
−  浮遊状態で増殖し、
−  ポリペプチド及び血清を含まない培養培地中で増殖し、
−  増殖のために培養培地中にグルタミン、インスリン及び増殖因子を要求せず、
−  培養操作中のアンモニウムイオン及びアンモニアの形成が、減少し、そして、培養培地中のアンモニウムイオン濃度が、０．１２mmol/L未満であることを特徴とする細胞であって、
該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、異種ポリペプチドの発現、二次修飾、又は分泌に必要ではない酵素をコードする核酸の導入、欠失、又は不活化により、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１細胞と比較して、分子生物学的方法によって遺伝的に改変されていない、細胞。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＨＯ−Ｋ１細胞の作成のための方法であって、該方法が、以下の順番で以下の工程：
ａ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１を提供すること、
ｂ）該ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミン、ヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、
ｃ）工程ｂ）において適応させた該ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンが添加されたポリペプチド不含の化学的に定義された培地における浮遊状態での増殖に適応させること、それにより該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞を得ること、
を含むことを特徴とする方法であって、
該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、グルタミン、インスリン、又は増殖因子を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地である培養培地で増殖し、そして
該ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇｌｎ（−）細胞は、分子生物学的方法を介した、核酸の導入、欠失、又は不活化により遺伝的に改変されていない、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法を用いて得られるＣＨＯ−Ｋ１細胞。
【請求項４】
発明のさらなる局面は、以下の工程：
ａ）請求項１に記載のＣＨＯ−Ｋ１細胞を提供すること、
ｂ）該免疫グロブリンをコードする１つ又は複数の核酸を提供すること、
ｃ）ａ）の該ＣＨＯ−Ｋ１細胞を該１つ又は複数の核酸でトランスフェクトすること、
ｄ）工程ｃ）の該トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グルタミン、インスリン又は成長因子を含まないポリペプチド不含の化学的に定義された培地中で大規模で培養すること、
ｅ）該ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養培地又は該ＣＨＯ−Ｋ１細胞から該異種ポリペプチドを回収すること、そして場合により、
ｆ）１又は複数のクロマトグラフィー工程によって該異種ポリペプチドを精製すること
を含む、大規模での免疫グロブリンの組換え産生のための方法である。
【請求項５】
培養培地中のアンモニウム濃度が、培養中に０．１２mmol/L未満であることを特徴する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該異種ポリペプチドを該精製することが、１又は複数のクロマトグラフィー工程を用いることであることを特徴する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に、１つ又は２つの追加のイオン交換クロマトグラフィー工程が続くことを特徴する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一のトランスフェクションから始まりそして異種ポリペプチドの回収で終わる方法が、同じ培地中で実施されることを特徴する、請求項４〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
大規模培養が、少なくとも５００Lの容積で実施されることを特徴する、請求項４〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
該トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養が、５００リットル未満の容積で真核生物の選択剤の存在下で実施され、そして、該トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養が、５００リットル以上の容積で真核生物の選択剤の非存在下で実施され、そして、異種ポリペプチドの回収が、該真核生物の選択剤を含まない培養培地からであることを特徴する、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2011500009.tif 000007
2011500009.tif 000008
2011500009.tif 000009
2011500009.tif 000010