(57)【要約】  本発明は、腫瘍の治療法に関する。特に本発明は、一般的ながんの治療のための、特に黒色腫の治療のための、ハイパーサイトカインで修飾した同種細胞を含むワクチン組成物に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）第１のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第１の細胞、及び
２）第２のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第２の細胞
を含む組成物であって、前記第２の細胞が前記第１の細胞と異なる、組成物。
【請求項２】
該第１のハイパーサイトカイン及び／又は該第２のハイパーサイトカインが、サイトカイン受容体及びサイトカインを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該サイトカイン受容体が、
（ａ）ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１１Ｒ、ＯＳＭ−Ｒ、ＣＮＴＦ−Ｒ及びＣＴ−Ｉ−Ｒから成る群、又は
（ｂ）（ａ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示すポリペプチド
から独立して選択され、
該サイトカインが、
（ｃ）ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ及びＣＴ−Ｉから成る群、又は
（ｄ）（ｃ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示すポリペプチド
から独立して選択され、
該ハイパーサイトカインがハイパーサイトカイン活性を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
該サイトカイン受容体及び該サイトカインが、直接連結されている、又はペプチドリンカーにより連結されている、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
該ハイパーサイトカインが、
（ａ）ヒト可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−６Ｒ部分であって、前記配列同一性は配列番号１のＰ１１３からＡ３２３までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−６Ｒ部分、
（ｂ）ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−６部分であって、前記配列同一性は配列番号２のＰ２９からＭ２１２までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−６部分、及び
（ｃ）必要に応じて、ペプチドリンカー
を含み、ハイパーサイトカイン活性を有する融合タンパク質である、又は
（ａ）ヒト可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−１１Ｒ部分であって、前記配列同一性は配列番号３のＭ１からＱ３６５までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−１１Ｒ部分、
（ｂ）ヒトインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−１１部分であって、前記配列同一性は配列番号４のＡ１９からＬ１９９までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−１１部分、及び
（ｃ）必要に応じて、ペプチドリンカー
を含み、ハイパーサイトカイン活性を有する融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
該ハイパーサイトカインが、
（ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）（ａ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示し、ハイパーサイトカイン活性を有するポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
該第１の細胞及び／又は該第２の細胞が同種細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
該第２の細胞が該第１の細胞と異なるＨＬＡ型を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
該第１の細胞及び／又は該第２の細胞の少なくとも一方が腫瘍細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
該腫瘍細胞が、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、前立腺がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、膵臓がん細胞、肝臓がん細胞、脳がん細胞、頭頚部がん細胞及び肉腫細胞から成る群から該第１の細胞及び該第２の細胞に関して独立して選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
該第１の腫瘍細胞が、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」（ＤＳＭＺ）にアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３７で寄託されたＭｉｃｈ１であり、該第２の腫瘍細胞が、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３８で寄託されたＭｉｃｈ２である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該第１の細胞が、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３９で寄託されたＭｉｃｈ１−Ｈ６である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
該第２の細胞が、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８４０で寄託されたＭｉｃｈ２−Ｈ６である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
該第１の細胞及び／又は該第２の細胞の増殖が阻害されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
該増殖が、放射線又は化学的架橋結合により阻害されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該第１の細胞及び／又は該第２の細胞と異なる１つ又は複数のさらなる細胞を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記１つ又は複数のさらなる細胞が１つ又は複数のさらなる腫瘍細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
該１つ又は複数のさらなる細胞の増殖が阻害されている、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
該１つ又は複数のさらなる細胞の増殖が、放射線又は化学的架橋結合により阻害されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該１つ又は複数のさらなる細胞のうち少なくとも１つの細胞が、サイトカイン、サイトカイン受容体又はハイパーサイトカインを発現するように修飾されている、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
医療における使用のための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤及び／又は保存料をさらに含む請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
がんの治療又は予防のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該がんが、胃腸管又は結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、頭頚部がん、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、眼、黒色腫、異形成口腔粘膜、浸潤性口腔がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、ホルモン依存性乳がん、ホルモン非依存性乳がん、移行上皮がん及び扁平上皮がん、神経芽腫を含む神経性悪性腫瘍、内分泌学的腫瘍、血液学的新生物、上皮内癌、過形成病変、腺腫、並びに線維腫から成る群から選択される、請求項２３に記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項２５】
治療される該患者が、該第１の細胞及び／又は該第２の細胞と部分的に又は完全に異なるＨＬＡ型を有する、請求項２３又は２４に記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項２６】
がんの治療又は予防のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
該がんが、黒色腫若しくは腎細胞癌、前立腺がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、脳がん、頭頚部がん又は肉腫である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
該医薬組成物が、該第１の同種細胞及び／又は該第２の同種細胞と部分的に又は完全に異なるＨＬＡ型を有する患者の治療のためのものである、請求項２６又は２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の治療法（tumour therapy）に関する。特に本発明は、一般的ながんの治療（treatment）のための、特に黒色腫の治療のための、ハイパーサイトカインで修飾した同種（allogenic）細胞を含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン及びサイトカイン受容体
ＩＬ−１１は、ＩＬ−６、白血病抑制（Inhibitor）因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−Ｉ）と共に、造血サイトカインのファミリー（ＩＬ−６型又はｇｐ１３０サイトカイン類と称される）に属し、構造的類似性及び共通の受容体サブユニット（ｇｐ１３０）を共有する（非特許文献１）。ＩＬ−６型サイトカインの各々が特異的な（特有の）受容体複合体を必要とするが、少なくとも１分子のｇｐ１３０が常に結合している。最初にリガンド（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ）は、そのα非シグナル伝達受容体サブユニットと特異的に結合し、次にシグナル伝達受容体鎖を動員する。ＩＬ−６及びＩＬ−１１はシグナルを伝達するためにｇｐ１３０ホモ二量体を使用するが、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−Ｉはヘテロ二量体ｇｐ１３０／ＬＩＦＲを利用する。ＯＳＭは、ｇｐ１３０／ＯＳＭＲ又はｇｐ１３０／ＬＩＦＲヘテロ二量体のいずれかを動員する（非特許文献２、非特許文献３でレビューされている）。
【０００３】
ＩＬ−６型サイトカインの三次構造は、近年力を入れて研究されている。結晶構造が、ＬＩＦ（非特許文献４）、ＣＮＴＦ（非特許文献５）、ＩＬ−６（非特許文献６）及びＯＳＭ（非特許文献７）に関して決定されている。これらの研究により、各リガンドが、長鎖４ヘリックスバンドル位相（four-helix bundle topology）を示し、それは長さが１５個〜２２個のアミノ酸の範囲にある４本の密集したα−ヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと称される）を含むことが明らかにされた。ヘリックスは、ポリペプチドループにより上−上−下−下（up-up-down-down）配置で接続されている。Ａ−Ｂループ及びＣ−Ｄループは平行のヘリックスを接続するので比較的長いが、Ｂ−Ｃループは逆平行のヘリックスの対を接続するのでより短い。ＩＬ−６型サイトカインの詳細な構造解析及び突然変異誘発研究により、３つの受容体結合部位（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと呼ばれる）が同定されており、これらはｇｐ１３０ファミリーの間で保存されているようである（非特許文献３でレビューされている）。リガンドがその非シグナル伝達受容体と結合することを可能とする部位Ｉは、Ａ−ＢループのＣ末端部分とＤヘリックスのＣ末端残基とに由来するアミノ酸により形成される。部位ＩＩは、ＩＬ−６型サイトカインの全メンバーに関する普遍的なｇｐ１３０結合部位であるようであり、ヘリックスＡ及びヘリックスＣ上の露出残基から成る。部位ＩＩＩは、ヘリックスＤのＮ末端半分、Ａ−ＢループのＮ末端部分、及びＣ−Ｄループの終末のアミノ酸残基から構成される。この部位は常に、リガンドの同一性に応じて、第２のシグナル伝達受容体（ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ又はＯＳＭＲ）により占有されている。
【０００４】
ＩＬ−６型サイトカインシグナル伝達に関与する受容体は、Ｉ型膜タンパク質に属する。これらの受容体は、細胞外Ｎ末端と１つの膜貫通ドメインとを保有する（ＣＮＴＦＲは例外であり、それは脂質アンカーにより膜と連結されている）（非特許文献８）。その細胞外領域における共通の構造モチーフのために、これらの受容体はサイトカイン受容体クラスＩファミリーに分類される（非特許文献１）。このファミリーは、Ｄ２及びＤ３と呼ばれる２つのフィブロネクチンＩＩＩ型様ドメイン（ＦＮＩＩＩ）から成る少なくとも１つのサイトカイン結合相同ドメイン（ＣＨＤ）の存在を特徴とする。ＣＨＤは、およそ２００個のアミノ酸から構成され、Ｎ末端ドメインに位置が保存された４つのシステイン残基、及びＣ末端ドメインに保存された特徴的なＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）モチーフを有する。さらに各受容体サブユニットが、Ｉｇ様ドメインを含有し、それは膜近位ＣＨＤのＮ末端に位置する。ＩＬ−６型受容体は、αサブユニット及びβサブユニットという２つの群に分けられる。受容体α（ＩＬ−６、ＩＬ−１１及びＣＮＴＦに関する）は、シグナル伝達に関与しない。シグナル伝達受容体鎖であるサブユニットβは、αサブユニットよりも大幅に大きい細胞質部分を含有し、且つ膜貫通受容体二量体の安定化に及び／又は方向づけ等において何らかの役割を果たし得る３つの膜近位ＦＮＩＩＩドメインを有する（非特許文献３、非特許文献２でレビューされている）。膜結合型ＩＬ−６型受容体サブユニットに加えて、それらの可溶型が生体液中に見出された（非特許文献９でレビューされている）。可溶型サブユニットは、膜結合型受容体の限定的タンパク質分解（脱落）により、又は異なるスプライシングを受けたｍＲＮＡからの翻訳により、形成される。
【０００５】
サイトカイン及びサイトカイン受容体の融合タンパク質
幾つかの分子薬剤の潜在的生物活性を増大させ、修飾するために、２つの可溶性の自然に存在する成分を連結するという考えが想定されている。かかる融合タンパク質は、既に説明されている。別々にコードされているＩＬ−１２のサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）が、ポリペプチドリンカーにより接続されている（非特許文献１０）。ハイパーＩＬ−６は新しいデザイナー薬剤の別の例であり、これはポリペプチドリンカーによりＩＬ−６と接続されたＩＬ−６Ｒα鎖のＤ２ドメイン及びＤ３ドメインから成る（非特許文献１１及び特許文献１）。ＩＬ−６の場合には、膜ＩＬ−６Ｒを欠く細胞の刺激に必要なＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒの有効濃度が非常に高いことが観察された（非特許文献１２）。さらに、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の平均半減期が、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０複合体を集合させるのに必要な時間よりも短いかもしれない（非特許文献１３）。ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の安定性が、融合タンパク質（ハイパーＩＬ−６）を創出するために両方の成分を連結することにより、増強された（特許文献１）。ハイパーＩＬ−６は、そのシグナル伝達受容体サブユニットと直接結合し、ＩＬ−６活性を増強することができる。ハイパーＩＬ−６は十分に活性な融合タンパク質であり、可溶性ＩＬ−６分子及びｓＩＬ−６Ｒ分子の組合せと比較して１００倍〜１０００倍低い用量で、応答を媒介する（非特許文献１１）。同様に、ＩＬ−６型ファミリーに対して、ＩＬ−１１／Ｒ−ＦＰと称される別のスーパーアゴニストが設計されている（非特許文献１４）。ＩＬ−１１／Ｒ−ＦＰは、ＩＬ−１１ＲのＤ２ドメイン及びＤ３ドメイン（位置：Ｌ／１０９〜Ｇ／３１８）とＩＬ−１１（位置：Ｐ／２９〜Ｌ／１９９）とを２１個のアミノ酸のリンカーを使用して共有結合で連結することにより創出され、ＩＬ−１１及びｓＩＬ−１１Ｒの組合せよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性が５０倍高いことが実証された。しかし、この構築物はヒトＩＬ−１１Ｒ及びＩＬ−１１の切断セグメントから構成されていたので、それぞれの受容体及びサイトカインの自然に存在する部分を欠く。さらに、使用した人工リンカーは天然に存在する配列ではなく、このことはヒト患者の治療に使用した場合ＩＬ−１１／Ｒ−ＦＰの免疫原性の一因となる。全長ｓＩＬ−１１の大部分を含む別のｓＩＬ−１１Ｒ−ＩＬ−１１の融合タンパク質は特許文献２で説明されており、ＩＬ−１１／Ｒ−ＦＰと比較して有利な特性を示すものであった。
【０００６】
特許文献３（Yeda Research and Development Co. Ltd.（Revel M.et al.）「キメラのインターロイキン−６可溶性受容体／リガンドタンパク質、その類似体およびその使用（Chimericinterleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof）」、１９９９年１月２１日公開）は、ｓＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６の融合タンパク質生成物を含むキメラタンパク質、並びにかかるタンパク質の生物学的に活性な類似体に関する。これらのキメラタンパク質では、ｓＩＬ−６Ｒは、直接、又は特異的なリンカーペプチドを介して、ＩＬ−６と融合され得る。特許文献３では、がん細胞の阻害剤としての上記キメラタンパク質又は類似体の使用の可能性がさらに論じられている。哺乳動物のがんを治療するための、骨髄移植の増強のための、造血（hematopoeisis）を増大させるための、又は肝障害若しくは神経障害を治療するための、薬物の調製のために上記キメラタンパク質を使用することも意図されている。特許文献３の実施例の節で産出及び試験された特定の融合タンパク質ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６及びｓＩＬ−６ＲδＶａｌ／ＩＬ−６は、非特許文献１５による論文においても研究されている。
【０００７】
総説（非特許文献１６）では、インターロイキン−６ハイパーアゴニスト及びアンタゴニストの治療的用途の可能性が論じられている。上記治療的用途は、血液学的障害、固形悪性腫瘍、心虚血及び心臓移植、骨疾患、糸球体腎炎及びアミロイドーシス、後天性免疫不全症候群、リウマチ性障害、自己免疫、やけど及び大外傷、貧血症、骨髄移植および腫瘍の治療法における未熟造血幹細胞の増殖、血小板新生及び肝再生の誘発を含む。
【０００８】
サイトカイン及びその生理学的受容体を含む、上述したもののような融合タンパク質は、個々のサイトカイン及び／又はサイトカイン及びその可溶性受容体の混合物と比較した場合により低用量で高活性であるために、「ハイパーサイトカイン」と呼ばれることもある。
【０００９】
腫瘍ワクチン
治療的がんワクチンの概念は、獲得免疫が刺激及び活性化されて、腫瘍細胞を特異的に認識し死滅させることができるという知識に基づいている。ここ２５年間、複数のワクチン研究により、例えば腎細胞がんにおいて、選択した患者における免疫学的応答及び臨床的応答が実証されている（非特許文献１７）。組換えサイトカイン及び遺伝子送達系をもたらした、分子生物学及び生命工学において為された進歩に伴う腫瘍関連抗原又は樹状細胞（ＤＣ）の発見に続いて、腫瘍ワクチン投与の複数の戦略が提唱された：特定のアジュバント（例えば、カルメット・ゲラン桿菌、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）又はＩＦＮ）と混和した腫瘍細胞から成る腫瘍細胞ベースのワクチン；免疫刺激因子をコードする遺伝子を発現する腫瘍細胞に基づく遺伝子的に修飾した腫瘍ワクチン；及び腫瘍由来ＲＮＡで修飾した、ペプチド／腫瘍可溶化物を搭載した（loaded）、又は腫瘍細胞と融合したＤＣ。
【００１０】
本出願の発明者らは、大規模生産のために設計された腫瘍ワクチンを研究した。かかる腫瘍ワクチンは、照射され腫瘍保有患者に注入される、樹立同種腫瘍細胞から成る。ハイパーサイトカインを発現するように遺伝子的に修飾した腫瘍細胞での研究では、本発明者らは驚くべきことに、２つの異なる遺伝子的に修飾した腫瘍細胞株を含む組成物が、少なくとも末梢血リンパ球のＩＬ−２及びＩＮＦ−γ産生に対して、相乗効果を有することを見出した。このＩＬ−２及びＩＮＦ−γの産生の増大により、細胞傷害活性に関連するＴｈ１免疫応答への、免疫応答の有益なシフトがもたらされる。したがって、同じ又は異なるハイパーサイトカインを発現するように遺伝子的に修飾した第１の同種細胞株及び第２の同種細胞株を含む本発明の組成物は、従来技術から既知であるような腫瘍の治療のための薬物としてより好適であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９７／３２８９１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／１１３５９１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／０２５５２号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】BazanJF. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptorsuperfamily. Proc Natl AcadSci U S A. 1990 Se; 87(18):6934-8.
【非特許文献２】Heinrich PC, Behrmann I, Haan S, Hermanns HM, Muller-Newen G, Schaper F. Principles ofinterleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem J. 2003 Aug 15;374(Pt 1):1-20.
【非特許文献３】B Bravo J, Heath JK. Receptor recognition by gp130cytokines. EMBO J. 2000 Jun 1;19(11):2399- 411.
【非特許文献４】Robinson RC, Grey LM, Staunton D, VankelecomH, Vernallis AB, Moreau JF, Stuart DI, Heath JK,Jones EY. The crystal structure and biological function of leukemiainhibitory factor: implications for receptor binding. Cell. 1994 Jul 1;77(7): 1101-16.
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【非特許文献１７】Kubler H, Vieweg J. Vaccines inrenal cell carcinoma. Semin. Oncol.(2006) 33(5):614-624.
【発明の概要】
【００１３】
第１の態様によれば、本発明は、（１）第１のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第１の細胞、及び（２）第２のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第２の細胞を含む組成物であって、１つ又は複数の第２の細胞が１つ又は複数の第１の細胞と異なる、組成物に関する。
【００１４】
第２の態様によれば、本発明は、医療（medicine）における使用のための、第１の態様による組成物に関する。
【００１５】
第３の態様によれば、本発明は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤（glidants）、崩壊剤、吸着剤及び／又は保存料をさらに含む第１の態様又は第２の態様による組成物を含む、医薬組成物に関する。
【００１６】
第４の態様によれば、本発明は、がんの治療又は予防のための、第１の態様若しくは第２の態様による組成物、又は第３の態様による医薬組成物に関する。
【００１７】
第５の態様では、本発明は、がんの治療又は予防のための医薬組成物の調製のための、第１の態様又は第２の態様による組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】同種混合腫瘍リンパ球反応（ＡＭＴＬＲ）におけるＴ細胞増殖応答を示す図である。  カラム１：自発的なＴ細胞増殖、すなわち腫瘍細胞なし；  カラム２：ＩＬ−６の存在下における、自発的なＴ細胞増殖（腫瘍細胞なし）；  カラム３：Ｈ６の存在下における、自発的なＴ細胞増殖（腫瘍細胞なし）；  カラム４：同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム５：ＩＬ−６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム６：Ｈ６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖。
【図２】同種混合腫瘍リンパ球反応（ＡＭＴＬＲ）におけるＴ細胞増殖に及ぼす抗ＩＬ−２抗体の効果を示す図である。  カラム１：同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム２：ＩＬ−６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム３：Ｈ６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム４：ＩＬ−２を中和した場合の、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム５：ＩＬ−２を中和した場合の、ＩＬ−６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖；  カラム６：ＩＬ−２を中和した場合の、Ｈ６の存在下における、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖。
【図３】ＭＦＩ及びｐｇ／ｍｌとして表した、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞によるサイトカイン分泌を示す図である。
【図４】ＭＦＩ及びｐｇ／ｍｌとして表した、健常個体から単離したＰＢＬＣによるサイトカイン分泌を示す図である。
【図５】Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞による、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞による、並びにＭｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞の組合せによる、ＰＢＬＣのサイトカイン産生の刺激による結果を示す図である。結果は、ＭＦＩとして、及びｐｇ／ｍｌで表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るため、本発明が以下で詳細に説明されるに先立ち、本発明は、本明細書で説明される特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されないと理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付した特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないとも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００２０】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingualglossary of biotechnological terms:（IUPACRecommendations）", Leuenberger,H. G. W, Nagel, B. and Koelbl,H. eds.（1995）, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel,Switzerland）で説明されているように定義される。
【００２１】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載の整数又は工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数又は工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解されよう。
【００２２】
複数の文献が、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用される各々の文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列寄託（submissions）等を含む）は、上記のもの又は下記のもののいずれかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のいかなる記載事項も、本発明が先願発明に基づくかかる開示に先行する権利を有しないことを承認するものとは解釈されない。
【００２３】
「ハイパーサイトカイン」という用語は、（ａ）サイトカイン受容体の可溶性部分、及び（ｂ）サイトカイン受容体の上記可溶性部分と生理学的条件下で結合することができるサイトカイン、及び可溶性サイトカイン受容体とサイトカインとの間に位置する任意のペプチドリンカーを含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る融合タンパク質を表す。好ましい実施形態では、上記サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、抗ＴＧＦ、ＥＰＯ、インターフェロン、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１である。サイトカインがサイトカイン受容体との関係でＮ末端に位置する場合、サイトカインはその分泌シグナルを依然として含むことが好ましく、それはタンパク質の成熟の過程で切断され、すなわち、成熟ハイパーサイトカインタンパク質は分泌シグナルを含まない。サイトカインがサイトカイン受容体との関係でＣ末端に位置する場合、サイトカインはその分泌シグナルを含まないことが好ましい。「可溶性サイトカイン受容体」という用語は、サイトカイン受容体の可溶性断片を表し、それは、例えばｓＩＬ−６Ｒ及びｓＩＬ−１１Ｒのように、膜貫通部分及び細胞質ゾル部分のほとんど又は全てを欠いており且つサイトカイン受容体の細胞外部分のほとんど又は全てを含む。受容体断片が、受容体断片を発現する哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞の膜に挿入されていない場合、又は本質的に挿入されていない場合、受容体断片は可溶性である。サイトカイン受容体がサイトカインとの関係でＮ末端に位置する場合、サイトカイン受容体は、その分泌シグナルを依然として含むことが好ましく、それはタンパク質の成熟時に切断され、すなわち、成熟ハイパーサイトカインタンパク質は分泌シグナルを含まない。サイトカイン受容体がサイトカインとの関係でＣ末端に位置する場合、サイトカイン受容体はその分泌シグナルを含まないことが好ましい。上で示したように、ハイパーサイトカインは必要に応じて、サイトカイン受容体とサイトカインとの間に位置するペプチドリンカーを含んでいてもよい。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、免疫原性が低い、又は非免疫原性である。より好ましくは、上記ペプチドリンカーは、ヒトに対して非免疫原性である。好ましい実施形態では、可溶性サイトカイン受容体はハイパーサイトカインのアミノ末端部分に位置しており、サイトカインは、ハイパーサイトカインのカルボキシ末端部分に位置している。
【００２４】
「ハイパーサイトカイン活性」という用語は、融合タンパク質の活性を表す。特に好ましいハイパーサイトカインは、該ハイパーサイトカインの基となるサイトカインに対して、又はサイトカイン及びサイトカイン受容体の混合物、すなわちハイパーサイトカインを形成する未融合部分、に対して、同じアッセイで同じモル量に基づき１００倍〜１０００倍高い活性を有するが、全てのハイパーサイトカインがかかる劇的な改善を示すわけではなく、該改善はとりわけ、含まれるサイトカイン及び可溶性サイトカイン受容体の部分の長さと、（存在する場合には）存在するタンパク質リンカーの長さとに依存する。本発明において利用することができるハイパーサイトカインの基礎を形成するそれぞれのサイトカインの活性を評価する、多数のアッセイが知られている。それぞれのハイパーサイトカインが、該ハイパーサイトカインの基となる天然サイトカイン（同じモル量で）、又はサイトカインとサイトカイン受容体の可溶性部分との未融合部分の混合物の少なくとも１０倍の活性を有する場合、本発明の意味の範囲内においてハイパーサイトカイン活性を示すとみなす。好ましくは、ハイパーサイトカインは、該ハイパーサイトカインの基となるサイトカイン、又はサイトカインと可溶性サイトカイン受容体との組合せの、同じモル量で少なくとも２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５０００倍（folde）、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍又は１０００倍の活性を有する。好適なアッセイ系は、例えばＩＬ−６ハイパーサイトカインに関しては、非特許文献１１で説明されているようなＢＡＦ−３／細胞の増殖の誘導を含む。
【００２５】
本明細書を通して使用される「少なくとも９０％の配列同一性」という表現は、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の、それぞれの基準ポリペプチドに対する配列同一性を表す。配列同一性の百分率を算出する比較対象となる基準配列が特定されていない場合、配列同一性は、比較される２つの配列のうち長い方の配列を基準として算出される。基準配列が示されている場合、配列同一性は、配列番号により示される配列の全長に基づいて確定される。例えば、配列番号２による全長ＩＬ−６のアミノ酸と比較して２１個のアミノ酸から成るペプチド配列は９．９％（２１：２１２）という最大の配列同一性の百分率を示すことがあり、１０６個のアミノ酸の長さを有する配列は５０％（１０６：２１２）という最大の配列同一性の百分率を示すことがある。
【００２６】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性の百分率は、配列アライメントにより確定することができる。かかるアライメントは、幾つかの当該技術分野で既知のアルゴリズムにより、好ましくはｈｍｍａｌｉｇｎ（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）により、又はＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. (1994) Nucleic AcidsRes. 22, 4673-80）（例えばhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/で、又はhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlで利用可能である）により、実施することができる。使用する好ましいパラメータは、http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html#で設定されているような初期設定パラメータである。配列同一性の程度（配列一致度）は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ又はＢｌａｓｔＺ（又はＢｌａｓｔＸ）を使用して算出することができる。好ましくは、配列一致度解析を、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Brudno M., Bioinformatics2003, 19 Suppl 1:I54-I62）等の確立された相同性マッピング法、又はマルコフ確率場（Markov random fields）により、追加で行うことができる。配列同一性の百分率が本発明との関連で算出されると、これらの百分率は、他に特に記載がなければ、より長い配列の全長との関連で算出される。
【００２７】
本発明との関連では「ペプチドリンカー」は、１個〜１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を表す。好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個又は３０個のアミノ酸の最小長さを有する。さらに好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーは、１００個、９５個、９０個、８５個、８０個、７５個、７０個、６５個、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個又は１５個のアミノ酸又はそれ以下の最大長さを有する。特に好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーの上述した好ましい最小長さ及び最大長さを組み合わせることができる（かかる組合せが数学的に意味をなすならば）。さらに好ましい実施形態では本発明のペプチドリンカーは非免疫原性であり、特に好ましい実施形態では、ペプチドリンカーはヒトに対して非免疫原性である。
【００２８】
本発明の具体的形態
本発明をここでさらに説明する。以下の節では、本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そうして規定した各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせることができる。
【００２９】
第１の態様では、本発明は、
（１）第１のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第１の細胞、及び
（２）第２のハイパーサイトカインを発現するように修飾した１つ又は複数の第２の細胞
を含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る組成物であって、１つ又は複数の第２の細胞が１つ又は複数の第１の細胞と異なる、組成物を提供する。
【００３０】
第１の細胞及び第２の細胞が異なる細胞株に由来する場合、及び／又は第２の細胞が第１の細胞と異なる遺伝子修飾を保有する場合、例えば第１の細胞及び第２の細胞が異なるハイパーサイトカインを発現するように修飾されている場合、第２の細胞は第１の細胞と異なる。好ましい実施形態では、第１の細胞及び第２の細胞はそれぞれ、２つの異なる個体の組織に、好ましくは２人の異なるヒトに由来する。２つの組織、好ましくは腫瘍組織が同じ型のものであることが好ましい。本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、例えば皮膚、肝臓、脳、腎臓、肺、胃、結腸、膀胱又は精巣のような固形組織と、例えばリンパ球又は幹細胞のような移動性細胞集団との両方を表す。細胞は自家性又は同種であることが考え得るが、第１の細胞及び／又は第２の細胞が同種性であることが特に好ましい。「同種」という用語は、細胞と該細胞を受け入れる患者との間の関係を特徴づける。特定の個体由来の細胞は、任意の他の患者に対して同種であり、その特定の個体に対しては自家性である。同種性は任意の細胞ベースのワクチンの工業的大規模生産の前提条件であるが、これは、そうでなければ各細胞ワクチンを治療されるそれぞれの患者から単離及び培養した細胞から個々に生産しなければならないためである。同種細胞は、自家性細胞より同種細胞の方が患者においてより強い免疫応答を誘発する傾向があるということを含む、さらなる利点をもたらす。
【００３１】
本発明において使用する場合、「１つ又は複数の第１の細胞」及び「１つ又は複数の第２の細胞」という用語は、個々の細胞を、その細胞のクローン集団を、及び類似の細胞の集合体（assortment）を表す。したがって、細胞が一次組織、好ましくは原発性腫瘍に由来する好ましい一実施形態では、細胞の全てがクローン性であるというわけではなく、特定の細胞及び／又は腫瘍型に属する１、２、３以上のクローン性細胞集団から構成される。特に、腫瘍細胞は増殖により高い遺伝子的変動性を示すので、或る樹立細胞株内の細胞が遺伝子的に完全に同一だというわけではないことはよく知られている。これらの細胞は、類似の細胞の集合体の一例である。別の例は、或る腫瘍を起源とする原発性腫瘍細胞であり、該細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回以上継代培養され、該継代培養により、増殖する細胞サブタイプの選択と、それにより細胞集団の不均一性の低減とがもたらされる、すなわち細胞の集合体をより類似したものにする。第１の細胞及び／又は第２の細胞が一次組織、好ましくは同じ型の一次組織、特に腫瘍組織に由来する一実施形態では、第１の細胞及び第２の細胞が２つの異なる個体、好ましくは２人の異なるヒトに由来する場合、それらは異なるとみなす。
【００３２】
「発現するように修飾した」という用語は、それぞれのハイパーサイトカインをコードする遺伝子が、ハイパーサイトカインをコードする遺伝子の安定な発現と、その後のそれぞれのハイパーサイトカインの産生とを可能にする形態で、細胞中に安定に導入されていることを示す。
【００３３】
好ましくはハイパーサイトカインをコードする遺伝子は哺乳動物細胞における使用のための発現ベクター中に導入され、該ベクターは通常、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列と共に、複製起点（必要に応じて。以下を参照されたい）、発現される遺伝子の前に位置するプロモーター、必要に応じてトランスに（in trans）エンハンサーを含む。かかる発現ベクターをその後使用して、それぞれのハイパーサイトカインを発現するように細胞を修飾することができる。
【００３４】
好ましい一実施形態では、本発明の発現ベクターは、プラスミド；ファージミド；ファージ；コスミド；人工染色体、特に人工の哺乳動物染色体、又は人工の酵母染色体；ノックアウト構築物又はノックイン構築物；ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、レンチウイルス（Chang LJ, Gay EE. The molecular genetics of lentiviralvectors--current and future perspectives. Curr Gene Ther. 2001 Sep;l(3):237-51.）、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、Carlezon WA Jr, Nestler EJ, Neve RL. Herpes simplex virus-mediated gene transfer as atool for neuropsychiatric research. Crit Rev Neurobiol. 2000; 14(1):47-67.）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、Carter PJ, Samulski RJ. Adeno-associatedviral vectors as gene delivery vehicles. Int J MoI Med. 2000 Jul;6(l): 17-27.）、ライノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フィロウイルス、及び上述のウイルスの操作版（engineered versions）（例えばKobinger et al, 2001を参照されたい）；ビロソーム；「ネイキッド」ＤＮＡ、リポソーム；ウイルス様粒子；並びに核酸コーティング粒子、特にゴールド・スフェア（gold spheres）を含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る。アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はレトロウイルスベクター（Lindemann D, Patriquin E, Feng S, Mulligan RC.Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro andin vivo. MoI Med. 1997 Jul;3(7):466-76.及びSpringer ML, Chen AS, Kraft PE, BednarskiM, Blau HM. VEGF gene delivery to muscle: potentialrole for vasculogenesis in adults. Mol Cell 1998Nov;2(5):549-58.）等のウイルスベクターが特に好ましい。かかる組換えウイルスベクターの生成を可能にするプラスミドの例は、ｐＦａｓｔＢａｃｌ（Invitrogen Corp., Carlsbad CA）、ｐＤＣＣＭＶ（Wiznerowicz M, Fong AZ, Mackiewicz A, Hawley RG. Double-copy bicistronicretroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: applicationto melanoma vaccine development. GeneTher. 1997Oct;4(10):1061-8.）及びｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ（Q-biogene,Carlsbad, California）を含む。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三部分リーダー配列に連結することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの組換えにより、アデノウイルスのゲノム中にハイパーサイトカイン遺伝子を挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１、Ｅ３又はＥ４）への挿入により、生存可能であり且つ感染した細胞中でそれぞれのハイパーサイトカインを発現することができる組換えウイルスがもたらされる。ハイパーサイトカインを発現するように修飾した第１の細胞及び／又は第２の細胞がウイルス粒子を産生するのを妨げるために、使用するウイルスベクターを複製不能なように修飾することが好ましい。
【００３５】
導入遺伝子の安定な発現を可能にするために、発現ベクターは、細胞のゲノムから独立した複製を可能にする複製起点が与えられる必要がある、又は第１の細胞及び／又は第２の細胞のゲノム中に組み込まれる必要がある。前者の場合は、発現ベクターはエピソームとして維持される。好適な複製起点を、ＳＶ４０又は他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＣＭＶ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源から得ることができる。後者の場合は、発現ベクターがゲノム、例えば染色体中に組み込まれれば、複製起点を与えることは必要ではない。
【００３６】
ハイパーサイトカインを発現させるために、ハイパーサイトカインをコードする遺伝子は、細胞の転写機構により認識されるプロモーター及び／又はエンハンサーと操作可能に連結される。好適なプロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）に、又は哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター若しくはサイトメガロウイルスプロモーター）に由来し得る。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルス複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス複製起点に位置するＢｇｌＩＩ部位までに及ぶおよそ２５０ｂｐの配列が含まれる場合には、より小さい又はより大きいＳＶ４０断片も使用することができる。さらに、ハイパーサイトカインの基となるサイトカイン又はサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドと通常結合しているプロモーター又は制御配列を利用することも可能であり、そのことが望ましい場合がある。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結される」は、発現制御配列が対象のコード配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築物に組み込まれていることを意味する。
【００３８】
ハイパーサイトカインをコードする配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要とされることもある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えることがさらに必要とされることがある。当業者は、容易にこれを確定し、必要なシグナルを与えることができる。開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（又はインフェーズ）でなければならないことが既知である。これらの外来の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方から成る様々な起源のものであり得る。適当な転写エンハンサー要素及び転写ターミネーターを含めることにより、発現効率を向上させることができる。真核性発現では、元のクローニングしたセグメント内にポリアデニル化部位が含有されていなかった場合、通常、転写ユニット中に適当なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を組み込むことも望ましい。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結前の或る位置のタンパク質終結部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」に置かれる。
【００３９】
上で示したように、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御したベクター及び選択性マーカーで、細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を強化培地中で１日間〜２日間成長させることができ、その後選択培地に変更する。組換えプラスミド中の選択性マーカーにより、選択に対する抵抗性がもたらされ、細胞の染色体中に安定にプラスミドを組み込み、細胞を成長させて引き続き細胞株へとクローン化および拡張することができる中心部（foci）を形成することが可能となる。
【００４０】
ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞又はａｐｒｔ細胞におけるそれぞれ単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子を含むがこれらに限定されない多数の選択系を使用することができる。また、抗代謝剤抵抗性を、メトトレキサートに対する抵抗性をもたらすジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）；ミコフェノール酸に対する抵抗性をもたらすｇｐｔ；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性をもたらすネオマイシン（ｎｅｏ）；及びハイグロマイシンに対する抵抗性をもたらすハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）に関する選択の基礎として使用することができる。
【００４１】
好ましい一実施形態では、修飾される細胞を形質転換する、トランスフェクトする又は感染させるのに使用される発現ベクターは、ハイパーサイトカインをコードする遺伝子と共に１つの転写物として選択性マーカーをコードする遺伝子を含む。選択性マーカー及びハイパーサイトカインの個々の発現を確認するために、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が２つのコード配列の間に配置される。
【００４２】
本発明の組成物中に含まれる細胞は、好ましくは別々に増殖させる。好ましくは該細胞は、以下の２つの様式のうち１つでｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる：培養の大半を通して懸濁液中で成長する非足場依存性の細胞として、又はその増殖のために固体基板への付着を必要とする足場依存性の細胞として（すなわち、単層型の細胞成長）。適当な成長条件は、細胞の種類により確定し、当業者が日常的な実験を使用することにより確定することができる。
【００４３】
第１の態様の組成物の好ましい一実施形態では、第１のハイパーサイトカイン及び／又は第２のハイパーサイトカインは、可溶性サイトカイン受容体及びサイトカインを含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る融合タンパク質である。好ましい実施形態では、可溶性サイトカイン受容体が（ａ）ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１１Ｒ、ｓＯＳＭ−Ｒ、ｓＣＮＴＦ−Ｒ及びｓＣＴ−Ｉ−Ｒから成る群；又は（ｂ）（ａ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示すポリペプチドから独立して選択され、かつサイトカインが（ｃ）ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ及びＣＴ−Ｉから成る群；又は（ｄ）（ｃ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示すポリペプチドから独立して選択され、そして必要に応じて可溶性サイトカイン受容体とサイトカインとの間にペプチドリンカーが存在し、得られた融合タンパク質はハイパーサイトカイン活性を有する。好ましくは、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までの配置は以下の通りである：可溶性サイトカイン受容体−任意のペプチドリンカー−サイトカイン。発現されたハイパーサイトカインの分泌を確認するために、ハイパーサイトカインは少なくとも１つの天然又は人工の分泌シグナルを含む。全てのサイトカインが分泌されるので、全てのサイトカインが当然にかかる分泌シグナルを含む。類似のシグナルペプチドが、サイトカイン受容体においても見出される。好ましくはこの分泌シグナルは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。分泌シグナルは、ハイパーサイトカインのプロセッシング時及び／又は分泌時に切断される。
【００４４】
ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１１Ｒ、ｓＯＳＭ−Ｒ、ｓＣＮＴＦ−Ｒ及びｓＣＴ−Ｉ−Ｒについて言及する場合、好ましくはヒト起源のＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＯＳＭ−Ｒ、ＣＮＴＦ−Ｒ及びＣＴ−Ｉ−Ｒのそれぞれの可溶性部分を意味し、本明細書でこれらの配列はＩＬ−６Ｒに関しては配列番号１として、及びＩＬ−１１Ｒに関しては配列番号３として示される。全ての他のサイトカイン受容体の配列は、ＮＩＨのＧｅｎｅｂａｎｋ又はＥＭＢＬのデータバンクで、例えばＯＳＭ−Ｒ（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００３９９０）及びＣＮＴＦ−Ｒ（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１８３３）に関して、得ることができる。ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ及びＣＴ−Ｉについて言及する場合、好ましくはヒト起源のＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ及びＣＴ−Ｉを意味し、本明細書でこれらの配列はＩＬ−６に関しては配列番号２として、及びＩＬ−１１に関しては配列番号４として示される。全ての他のサイトカインの配列は、ＮＩＨ又はＥＭＢＬデータバンクで、例えばＯＳＭ（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ１３７２５）及びＣＮＴＲ（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００６０５）に関して、得ることができる。
【００４５】
第１の態様の組成物の一実施形態では、ハイパーサイトカインは、
（ａ）ヒト可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−６Ｒ部分であって、上記配列同一性は配列番号１のＰ１１３からＡ３２３までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−６Ｒ部分、
（ｂ）ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−６部分であって、上記配列同一性は配列番号２のＰ２９からＭ２１２までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−６部分、及び
（ｃ）任意のペプチドリンカー
を含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る融合タンパク質であり、
ここで融合タンパク質は、ＩＬ−６活性の関連のアッセイ（例えば非特許文献１１に記載のＢＡＦ−３／細胞の増殖の誘導）で試験した場合、配列番号９によるハイパーＩＬ−６融合タンパク質の活性の好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％以上のハイパーサイトカイン活性を有する。
【００４６】
第１の態様の組成物のさらなる一実施形態では、ハイパーサイトカインは、
（ａ）ヒト可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−１１Ｒ部分であって、上記配列同一性は配列番号３のＭ１からＧ３６５までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−１１Ｒ部分、
（ｂ）ヒトインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）と少なくとも９０％の配列同一性を示すＩＬ−１１部分であって、上記配列同一性は配列番号４のＡ１９からＬ１９９までのポリペプチド配列の全長にわたり算出される、ＩＬ−１１部分、及び
（ｃ）任意のペプチドリンカー
を含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る融合タンパク質であり、
ここで融合タンパク質は、ＩＬ−１１活性の関連のアッセイで試験した場合、配列番号１１によるｓＩＬ−１１Ｒ−ＩＬ−１１融合タンパク質の活性の好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％以上のハイパーサイトカイン活性を有する。
【００４７】
第１の態様の組成物のさらに好ましい一実施形態では、ハイパーサイトカインは、
（ａ）配列番号５〜配列番号１１によるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）（ａ）によるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を示し、ハイパーサイトカイン活性を有するポリペプチドを含む、これらから本質的に成る、又はこれらから成る。
【００４８】
配列番号５によるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号１によるＩＬ−６ＲのＰ１１３からＡ３２３までの部分、１３個のアミノ酸の高グリシンリンカー配列、及び配列番号２によるＩＬ−６のＰ２９からＭ２１２までの部分から成る（非特許文献１１）。さらに、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によるアミノ酸配列を有するｓＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６の融合タンパク質がChebath et al.により説明されており、該タンパク質は、配列番号１によるＩＬ−６ＲのＭ１からＶ３５６までの領域、配列番号２によるＩＬ−６のＰ２９からＭ２１２までの領域、及び異なるリンカー配列から成る。配列番号６によるポリペプチドは３個のアミノ酸のリンカー配列（ＥＦＭ）を含み、配列番号７によるポリペプチドは１３個のアミノ酸のリンカー配列（ＥＦＧＡＧＬＶＬＧＧＱＦＭ；配列番号１２）を含み、配列番号８によるポリペプチドはリンカー配列を含有しない。さらに、融合タンパク質が特許文献１で説明されており、配列番号９による１３個のアミノ酸のリンカー配列（ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥ、配列番号１３）、又は配列番号１０による１８個のアミノ酸のリンカー配列（ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥ；配列番号１４）のいずれかにより連結された、配列番号１によるｓＩＬ−６Ｒのアミノ酸Ｍ１〜Ａ３２３と、配列番号２によるＩＬ−６のアミノ酸（amino acids and）Ｐ２９〜Ｍ２１２とを含む。配列番号１１によるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、ｓＩＬ−１１ＲのＭ１からＱ３６５までの領域と、ＩＬ−１１のＡ１９からＬ１９９までの領域とを含む。配列番号９によるｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６融合タンパク質が特に好ましい実施形態であり、本明細書で「ハイパーＩＬ−６」又は「Ｈ６」と称する。共にＣＭＶ即時初期プロモーターの制御下にあるハイパーＩＬ−６及びネオ選択性マーカーを含む好ましい発現カセットは、配列番号１５として提供される。このカセットは、様々なベクター、好ましくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター中に含まれ得る。
【００４９】
第１の態様の好ましい一実施形態では、第２の細胞、好ましくは同種の第２の細胞は、第１の細胞、好ましくは同種の第１の細胞と異なるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有する。ＨＬＡ系は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に関して使用される名称である。この複合体をコードする遺伝子群は染色体６に存在しており、細胞表面抗原提示タンパク質及び多数の他の遺伝子をコードしている。主要なＨＬＡ抗原は免疫機能において必須の要素である。
【００５０】
異なるクラスは異なる機能を有する：
（ａ）クラスＩ抗原（Ａ、Ｂ及びＣ）  −  細胞の内側から、ペプチド（存在する場合には、ウイルスペプチドを含む）を提示する、及び
（ｂ）クラスＩＩ抗原（ＤＲ、ＤＰ及びＤＱ）  −  細胞の外側から、貪食された抗原をＴ−リンパ球に対して提示する。
６つの主要抗原をコードする遺伝子とは別に、多数の他の遺伝子が存在し、その多くがＨＬＡ複合体に位置する免疫機能に関与する。ヒト集団におけるＨＬＡの多様性は疾患防御の一態様であり、結果として、２つの非血縁個体が全ての遺伝子座において同一のＨＬＡ分子を有する可能性は非常に低い。ＨＬＡによりコードされているタンパク質は、その人に（効果的に）特有の体細胞の外側部分におけるタンパク質である。免疫系は、自己細胞と非自己細胞とを区別するためにＨＬＡを使用する。その個体のＨＬＡ型を表示するどの細胞も、その個体に属する（したがって侵入者ではない）。ＰＣＲベースの遺伝子配列決定及び遺伝子同定が利用可能となるかなり前には、ＨＬＡ抗原は、移植（transplantion）の成功を邪魔する、又は時として移植を成功させる因子と認識されていた。レシピエントに移植されたドナー臓器は、そのドナーの組織に対する抗体を誘発し、そのドナーのＨＬＡ受容体をレシピエントの免疫系の抗原にする（したがって「ヒト白血球抗原」という名称である）。受容体の型は、該受容体が誘導した抗体に基づき分類することができた。これらの抗体、特に特定のクラスＩＩハプロタイプのホモ接合体であったドナーに対する抗体は、異なる受容体型及びアイソフォームを同定するために使用することができる。ＨＬＡを分類するのに使用される命名に関する２つの対応する（parallel）システムが存在する。最初のまた最も古いシステムは、血清学的（抗体ベースの）認識に基づいている。このシステムでは抗原は最終的に文字及び数字を割り当てられる（例えばＨＬＡ−Ｂ２７、又は短縮してＢ２７）。対立遺伝子のより精密な定義を可能にする対応するシステムが開発されており、このシステムでは「ＨＬＡ」を文字、アスタリスク（＊）及び４桁以上の数（例えばＨＬＡ−Ｂ＊０８０１、Ａ＊６８０１１、Ａ＊２４０２０１Ｎ  Ｎ＝Ｎｕｌｌ）と共に使用して、所定のＨＬＡ遺伝子座における特定の対立遺伝子を指定する。ＨＬＡ遺伝子座は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ（又はまれにＤ遺伝子座）にさらに分類することができる。この分類は、それぞれのＨＬＡ遺伝子座からの配列情報に基づいている。したがって当業者は、２つの群の細胞が同じ又は異なるＨＬＡ型を有するか否かを確定する方法を十分に認識している。好ましくは、第１の細胞株及び第２の細胞株は、抗体型分類システムに基づき異なるＨＬＡ型を有する。
【００５１】
好ましい実施形態では、１つ又は複数の第１の細胞及び／又は１つ及び複数の第２の細胞は腫瘍細胞である。好ましくは、腫瘍細胞は、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、前立腺がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、膵臓がん細胞、肝臓がん細胞、脳がん細胞、頭頚部がん細胞及び肉腫細胞から成る群から各細胞に関して独立して選択される。好ましくは、第１の細胞及び第２の細胞は、１つの個体内の異なる腫瘍由来か、又は２つの異なる個体由来の、同じ腫瘍細胞型から選択される。
【００５２】
第１の態様の一実施形態では、ハイパーサイトカインを発現するように修飾した第１の細胞は、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」（ＤＳＭＺ）（Inhoffenstr. 7B,38124 Braunschweig, Germany）にアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３７で２００７年４月２４日に寄託されたヒト（ホモ・サピエンス）黒色腫由来細胞Ｍｉｃｈ１であり、及び／又はハイパーサイトカインを発現するように修飾した第２の細胞は、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３８で２００７年４月２４日に寄託されたヒト（ホモ・サピエンス）黒色腫由来細胞Ｍｉｃｈ２である。Ｍｉｃｈ１及びＭｉｃｈ２は異なる患者を起源とする。
【００５３】
好ましい一実施形態では、第１の細胞は、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３９で２００７年４月２４日に寄託されたＭｉｃｈ１−Ｈ６である。好ましい一実施形態では、第２の細胞は、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８４０で２００７年４月２４日に寄託されたＭｉｃｈ２−Ｈ６である。Ｍｉｃｈ１−Ｈ６及びＭｉｃｈ２−Ｈ６はそれぞれ、配列番号１５による発現カセットを含み且つＣＭＶプロモーターの制御下で配列番号９によるハイパーＩＬ−６を発現するレトロウイルスによるＭｉｃｈ１及びＭｉｃｈ２の感染から得られたものである。
【００５４】
ハイパーサイトカインを発現するように修飾した第１の細胞及び第２の細胞、特に腫瘍細胞を含む組成物により発揮されるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果は、第１の細胞及び／又は第２の細胞を、抗原、好ましくは腫瘍抗原、サイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、抗ＴＧＦ、ＥＰＯ、インターフェロン、特にＩＮＦ−α、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、又はそれぞれの細胞中に含まれる第１のハイパーサイトカインと異なるハイパーサイトカインをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドを含むように操作した場合には、さらに増強させることができる。操作は、ベクター、特にハイパーサイトカインに関して上で示した発現ベクターの１つを使用すること、及びこれ（ら）のベクター（複数可）を修飾される第１の細胞及び／又は第２の細胞中にその後又は同時に導入することにより、より早く達成することができる。１つ又は複数のさらなるポリヌクレオチドが、別々のベクター中に含まれてもよく、又はポリヌクレオチドをコードするハイパーサイトカインと同じベクター内に含まれてもよい。宿主細胞が、ハイパーサイトカインと少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのさらなるタンパク質との両方を同時に発現することが好ましい。
【００５５】
「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍に対する免疫応答を誘発する全ての物質を含む。特定の好適な物質は、健常細胞と比較して腫瘍細胞中に豊富なタンパク質又はタンパク質断片である。これらの物質は好ましくは、腫瘍細胞内に存在する、及び／又は腫瘍細胞の外側上で接近可能である。腫瘍抗原が腫瘍細胞内にのみ存在する場合、抗原又はその断片は細胞の表面でＭＨＣ系により提示されるため、腫瘍抗原は免疫系にとって依然として接近可能である。好ましい一態様では腫瘍抗原は、ほとんど排他的に又は排他的に、腫瘍細胞上に及び／又は腫瘍細胞中に存在し、同じ細胞型の健常細胞中には存在しない。
【００５６】
好適な腫瘍抗原は、例えば、マイクロアレイベースのアプローチを使用して同じ細胞型の腫瘍細胞と健常細胞との間でのタンパク質の差示的発現を分析すること（Russo G., Zegar C. and Giordano A.Advantages and limitations of microarray technology in human cancer. Oncogene.2003, 22:6497-507）により、腫瘍特異的突然変異細胞遺伝子に関するＰＣＲベース又はマイクロアレイベースのスクリーニング（Heller M.J. DNA microarray technology: devices, systems, andapplications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2002, 4:129-53）により、又は組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定（ＳＥＲＥＸ、Tureci O., Sahin U. and Pfreundschuh M. Serological analysis of human tumorantigens: molecular definition and implications. Mol Med Today. 1997, 3:342-349）により、同定することができる。当業者は、腫瘍細胞上に及び／又は腫瘍細胞中に優先的に又は排他的に存在する多数の物質、例えば発癌遺伝子のような、例えば切断表皮成長因子、葉酸結合タンパク質、メラノフェリン（melanoferrin）、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、ＨＥＲ２−ｎｅｕ等を含む物質、を認識している。
【００５７】
腫瘍細胞中に及び／又は腫瘍細胞上に優先的に又は排他的に存在する物質の全てが強い免疫応答を誘発するわけではないので、腫瘍抗原は、強い免疫応答を誘発する本発明の組成物の第１の細胞及び／又は第２の細胞中に発現されるように選択されることが好ましい。強い免疫応答を誘発する抗原は、抗原で事前に免疫したマウスから単離したＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ又はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、抗原での負荷により、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、及び最も好ましくは少なくとも１５％誘導し、及び／又は抗原で事前に免疫したマウスから単離したＢ細胞（B-cells cells）の増殖を、抗原での負荷により、好ましくは少なくとも５％、及び最も好ましくは少なくとも１５％誘導する。これらの基準を満たす抗原は、本発明のがんワクチン組成物中に表される候補物質である。
【００５８】
特定の好ましい一実施形態では、腫瘍抗原は、突然変異した又は組み換えた細胞遺伝子の特有の遺伝子生成物に属するＴ細胞に規定されるがん関連抗原、特にサイクリン依存性キナーゼ（例えばＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４）、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ５３、ＡＦＰ、β−カテニン、カスパーゼ８、ｐ５３、ｐ２１Ｒａｓ突然変異、Ｂｃｒ−ａｂｌ融合生成物、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＥＬＦ２Ｍ、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＲＡＧＥ、ミオシン／ｍ、７０７−ＡＰ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＴＥＬ／Ａｍｌ１、デカイン（Dekcain）、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ−ＲＡＲα、ＴＥＬ／ＡＭＬＩ；精巣がん（ＣＴ）抗原、特にＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥファミリーのメンバー（ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１２）、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥファミリーのメンバー（ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＡ−８８Ａ、ＣＡＧ−３、ＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０；腫瘍ウイルス抗原、特にヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来のＥ６又はＥ７腫瘍性タンパク質、エプスタイン・バーウイルスＥＢＮＡ２−６、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２；過剰発現又は組織特異的分化抗原、特にｇｐ７７、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ５３、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ−１及びＴＰＲ−２）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＭＣ１Ｒ；広範に発現した抗原、特にＡＲＴ４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、ＣｙｐＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、ＰＲＡＭＥ  ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、及びＷＴ１；並びにその断片及び誘導体から成る群から選択される。特定の好ましい腫瘍抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質に由来する抗原である。
【００５９】
本発明の組成物を患者に投与する場合、第１の細胞及び／又は第２の細胞と、第１の細胞及び／又は第２の細胞とエピトープ及び／又は腫瘍抗原を共有する任意の腫瘍細胞との両方に対して免疫応答を誘発するように投与する。したがって、組成物の細胞は、本発明の組成物のレシピエント内に限られた時間生残するに過ぎず、その後レシピエントの免疫系によりレシピエント生物から排除されることが期待される。それにも関わらず、これらの細胞を患者に投与する前に、第１の細胞、好ましくは同種細胞及び／又は第２の細胞、好ましくは同種細胞の増殖が阻害されていることが、安全性の理由から好ましい。「阻害」という用語は、増殖速度の低減と、増殖の完全な停止との両方を含む。当業者は、細胞の成長速度に影響を及ぼすより多数の化学的方法及び物理的方法を認識しており、これらの方法は、放射線、例えばγ−照射、又は架橋結合、例えばソラレン若しくはアルデヒドを含むがこれらに限定されない。しかしながら阻害のレベルは好ましくは、第１の細胞及び第２の細胞中に導入された導入遺伝子の転写及び翻訳が完全には停止しない、すなわち導入遺伝子が、阻害前の第１の細胞及び／又は第２の細胞の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％以上のレベルで発現されるようなものであるべきである。好ましくは、細胞は、増殖を阻害する化学的方法又は物理的方法の適用後、１回〜５回、すなわち１回、２回、３回、４回又は５回の複製サイクルを重ね続けることができる。
【００６０】
本発明の組成物の抗腫瘍効果は、自家性又は同種であってもよく第１の細胞及び／又は第２の細胞と異なる１つ又は複数のさらなる細胞も組成物中に含まれる場合には、さらに増強することができる。好ましくはこれらの細胞は、好ましくは第１の細胞型及び／又は第２の細胞型のＨＬＡ型と異なるＨＬＡ型を有するさらなる個体を起源とする。さらに、これらの細胞が、好ましくは第１の細胞及び／又は第２の細胞と同じ腫瘍型由来の腫瘍細胞であることが好ましい。上で概説した理由から、１つ又は複数のさらなる好ましい同種細胞の増殖が、好ましくは上で概説したように、阻害されていることも好ましい。
【００６１】
１つ又は複数のさらなる同種細胞の１つ又は複数の細胞が、サイトカイン、サイトカイン受容体、ハイパーサイトカイン及び／又は腫瘍抗原（antigene）を発現するように修飾されていることが特に好ましい。好ましくは、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、抗ＴＧＦ、ＥＰＯ、インターフェロン、特にＩＮＦ−α、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１から成る群から選択され、サイトカイン受容体又はその可溶性部分は、表示したサイトカインに対応するそれらの受容体である。好ましくは、ハイパーサイトカインは、ハイパーＩＬ−６（例えば配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０による）、ＩＬ−２、ハイパーＩＬ−１１（例えば配列番号１１による）、ハイパーＣＮＴＦ及びハイパーＯＳＭから成る群から選択される。
【００６２】
本発明の組成物は免疫応答を誘発することが意図されるので、組成物はさらに、免疫効果を増強するためにワクチン中に一般に使用されるアジュバントを含み得る。好ましいアジュバントは、非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特にホスホロチオエート（ＰＴＯ）骨格を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）、又はホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）；水酸化アルミニウムのゲル様沈殿物（ミョウバン）；グラム陰性細菌の外膜由来の細菌性生成物、特にモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、及びその誘導体；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ７０；ｄｓＲＮＡ及びその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオン性ペプチド、特にポリ−Ｌ−アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラゲリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−（ＩＬ−）２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１８、Ｉ型及びＩＩ型、インターフェロン、特にインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α；水中油型エマルション、特にスクアレンから成るＭＦ５９；Ｔｗｅｅｎ８０及びＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）及びＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ  Ａのより高精製の誘導体、非イオン性ブロックポリマー、特にポロキサマー４０１、サポニン及びその誘導体、特にサポニン由来の免疫刺激性断片；ポリホスファゼン；Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドハイドロアセテート（ＢＡＹ  Ｒ１００５）、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；ＤＨＥＡ；ムラメチド（murametide）［ＭＤＰ（Ｇｌｎ）−ＯＭｅ］；ムラパルミチン（murapalmitine）；乳酸及び／又はグリコール酸のポリマー；ポリメチルメタクリレート；トリオレイン酸ソルビタン；スクアラン；ステアリルチロシン；スクアレン；テラミド（theramide）、合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩ提示ペプチドから成る群から選択される。本発明の組成物中に含まれ得る特定の好ましいアジュバントは、非メチル化ＤＮＡ、特にＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含む非メチル化ＤＮＡ、特にホスホロチオエート（ＰＴＯ）骨格を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＴＯ  ＯＤＮ）又はホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有するＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ  ＰＯ  ＯＤＮ）、及び合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓの群から選択される。
【００６３】
さらなる一態様では、本発明は、医療における使用のための、本発明の組成物に関する。
【００６４】
さらなる一態様では、本発明は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤及び／又は保存料をさらに含む本発明の組成物を含む、医薬組成物に関する。好ましくは医薬組成物は、好ましくは他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る無菌水溶液の形態で、非経口的使用のために調合される。必要に応じて、水溶液は好適に緩衝化されるべきである（好ましくは３〜９のｐＨに）。特に好ましい水溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【００６５】
好ましくは本発明の組成物の単位用量は、細胞数が少なくとも１×１０５〜１×１０９、好ましくは少なくとも２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７及び１×１０８の、第１の細胞を含む。本発明の組成物の特定の好ましい単位用量は、１×１０７〜１×１０８、好ましくは２．５×１×１０７の、第１の細胞を含む。さらに、本発明の組成物の単位用量は、細胞数が少なくとも１×１０５〜１×１０９、好ましくは少なくとも２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７及び１×１０８の、第２の細胞を含む。本発明の組成物の特定の好ましい単位用量は、１×１０７〜１×１０８、好ましくは２．５×１×１０７の、第２の細胞を含む。好ましくは組成物は、単位用量当たりの細胞数が計２×１０５〜２×１０８の、およそ同数の第１の細胞及び第２の細胞を含む。本発明の組成物の特定の好ましい単位用量は、２×１０７〜２×１０８、好ましくは５×１０７の第１の細胞及び第２の細胞を含む。単位用量の総体積は、好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、好ましくは１ｍｌ〜５ｍｌ、例えば１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ又は５ｍｌである。
【００６６】
さらなる一態様では、本発明は、がんの治療又は予防のための、本発明の組成物、又は本発明の医薬組成物に関する。本発明による組成物による治療又は予防が可能な好ましいがんは、胃腸管又は結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜のがん、頭頚部がん、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、眼、黒色腫、異形成口腔粘膜、浸潤性口腔がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、ホルモン依存性乳がん、ホルモン非依存性乳がん、移行上皮がん及び扁平上皮がん、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫を含む神経性悪性腫瘍、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫、内分泌学的腫瘍、白血病、リンパ腫並びに他の骨髄増殖性疾患及びリンパ球増殖性疾患を含む血液学的新生物、上皮内癌、過形成病変、腺腫並びに線維腫から成る群から選択される。黒色腫、膵臓がん及び腎臓がんの治療又は予防が特に好ましい。
【００６７】
さらなる一態様では、本発明は、がんの治療又は予防のための医薬組成物の調製のための、本発明の組成物の使用に関する。
【００６８】
本発明の組成物は、広範な種々のがんの治療及び／又は予防に使用することができるが、本発明により治療又は予防が可能な好ましいがんは、胃腸管又は結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜のがん、頭頚部がん、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、眼、黒色腫、異形成口腔粘膜、浸潤性口腔のがん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、ホルモン依存性乳がん、ホルモン非依存性乳がん、移行上皮がん及び扁平上皮がん、神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫を含む神経性悪性腫瘍、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫、内分泌学的腫瘍、白血病、リンパ腫並びに他の骨髄増殖性疾患及びリンパ球増殖性疾患を含む血液学的新生物、上皮内癌、過形成病変、腺腫並びに線維腫から成る群から選択される。黒色腫、膵臓がん及び腎臓がんの治療又は予防が特に好ましい。特にがんの治療及び／又は予防との関連では、疾患のいかなる症状も発症する前に患者が「がんワクチン」で免疫される（すなわち、保護的免疫を受ける）こと、又は疾患の症状を発症した後に患者が「がんワクチン」で免疫される（すなわち、治療的ワクチン投与を受ける）ことを考えることができる。
【００６９】
ハイパーサイトカイン、好ましくはハイパーＩＬ−６を発現する第１の細胞及び／又は第２の細胞による少なくとも１つのさらなるサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦの発現は、或る特定の腫瘍、特に黒色腫及び腎臓がんとの関連では、ハイパーサイトカインのみを発現する細胞よりもさらに強いｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答をもたらし得る。したがって好ましい使用においては、ハイパーサイトカインを発現する第１の細胞及び／又は第２の細胞は、少なくとも１つのさらなるサイトカインを発現するように修飾され、増殖性疾患を予防又は治療するための薬物の製造のために使用される。
【００７０】
この意味においては、第１の細胞及び第２の細胞が同じ型の組織、好ましくは腫瘍組織由来であるが第１の細胞及び／又は第２の細胞と部分的に又は完全に異なるＨＬＡ型を有する場合、特に好ましい。
【実施例】
【００７１】
以下で、非限定的な実施例により、本発明をより詳細に説明する：
【００７２】
実施例１：ハイパーＩＬ−６（Ｈ６）は同種混合腫瘍リンパ球反応（ＡＭＴＬＲ）におけるＴ細胞増殖応答を増加させる。
照射した腫瘍細胞を、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）又は精製したＨ６（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、プライミングしていない同種リンパ球と混合した。３日後、Ｔ細胞を、増殖に関して３Ｈ−チミジン取り込みによりアッセイし、１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）として確定した。本実験の結果を、図１に示す。
【００７３】
カラム１〜カラム３は、自発的なＴ細胞増殖、すなわち腫瘍細胞の非存在下での結果を示す。明らかに、有意な程度の自発的なＴ細胞増殖は、ＩＬ−６（カラム２）又はＨ６（カラム３）を混合物に添加するか否かに関わらず、生じない（カラム１〜カラム３）。
【００７４】
カラム４〜カラム６は、同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖の結果を示す。同種腫瘍細胞の存在下では、Ｔ細胞は非常に強い増殖を示す（カラム４）。ＩＬ−６の添加は、Ｔ細胞の増殖に対して明らかな効果を有しない（カラム５）。Ｈ６の添加（カラム６）は、Ｔ細胞増殖のほぼ２倍の増大をもたらす。したがってＨ６は、同種混合腫瘍リンパ球反応（ＡＭＴＬＲ）におけるＴ細胞増殖応答を強力に増強する。
【００７５】
実施例２：同種混合腫瘍リンパ球反応におけるＴ細胞増殖はＩＬ−２に依存している。
照射した腫瘍細胞を、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）、精製したＨ６（１ｎｇ／ｍｌ）、及び抗ＩＬ−２抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、プライミングしていない同種リンパ球と混合した。３日後、Ｔ細胞を、増殖に関して３Ｈ−チミジン取り込みによりアッセイし、ｃｐｍとして確定した。本実験の結果を、図２に示す。
【００７６】
図２のカラム１〜カラム３は、抗ＩＬ−２抗体の非存在下での同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖の結果を示す。この実験からの結果は、図１のカラム４〜カラム６に示した結果とほとんど同一である。実施例１で示したように、Ｔ細胞は、同種腫瘍細胞の存在下で非常に強い増殖を示す（図２のカラム１）。ＩＬ−６の添加は、Ｔ細胞の増殖に明らかな効果を有しない（図２のカラム２）。Ｈ６の添加は、Ｔ細胞増殖のほぼ２倍の増大をもたらす（図２のカラム３）。
【００７７】
図２のカラム４〜カラム６は、ＩＬ−２の効果を中和する抗ＩＬ−２抗体の存在下での同種腫瘍細胞に応答したＴ細胞増殖の結果を示す。抗ＩＬ−２抗体の添加は、Ｔ細胞増殖を大きく低減する（カラム４〜カラム６）。ＩＬ−６（カラム５）又はＨ６（カラム６）の存在は、抗ＩＬ−２抗体が存在する場合には、Ｔ細胞増殖に明らかな効果を有しない。したがって、同種混合腫瘍リンパ球反応（ＡＭＴＬＲ）におけるＴ細胞増殖は、ＩＬ−２に依存している。
【００７８】
実施例３：ハイパーＩＬ−６は、同種混合腫瘍リンパ球反応におけるＴ細胞によるＩＬ２及びＩＦＮ−γの産生を増加させる。
本実施例は、同種混合（mixed allogenic）腫瘍／リンパ球反応におけるハイパーＩＬ−６（Ｈ６）の免疫刺激能の評価を説明する。得られた結果は、ハイパーＩＬ−６が同種黒色腫細胞の免疫刺激能を増大させることを示す。さらに、ハイパーＩＬ−６は、ＩＬ−６より効力が強いだけでなく、質的に異なる生物学的活性も示す。既知のＴｈ２誘導因子である天然ＩＬ−６とは対照的に、ハイパーＩＬ−６は、Ｔｈ１応答の特徴である末梢血リンパ球（ＰＢＬＣ）によるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生を増大させながら、ＩＬ−１０発現を低減するようである。
【００７９】
被験物質：Ａ３７５黒色腫細胞及びその誘導体Ａ３７５−Ｈ６細胞；健常ボランティアから単離したＰＢＬＣ。
【００８０】
培地、成分及び機器：ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）、トリプシンＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）、組織培養フラスコ２５ｃｍ２（Sarstedt）、２４ウェルプレート（Nunc）、リンパ球分離培地（ICN）、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット−ＩＩ（Becton Dickinson）、ＩＬ−６（Pharmingen）、フローサイトメーター（Becton Dickinson）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（BectonDickinson）。
【００８１】
方法：
健常ボランティアから採取したＰＢＬＣは、リンパ球分離培地を媒体として遠心分離により全血液から分離した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血球計での標準的な手順により計測した。リンパ球を、２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培養培地中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。腫瘍細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。０．５ｍｌのリンパ球懸濁液を０．５ｍｌの腫瘍細胞と混合し、２４ウェルプレート上に播種して１ｍｌの混合細胞培養物とした。
【００８２】
実験上の設定：
０．５ｍｌのリンパ球懸濁液＋０．５ｍｌの培養培地（対照）
０．５ｍｌのリンパ球懸濁液＋０．５ｍｌの培養培地＋１０ｎｇのＩＬ−６
０．５ｍｌのリンパ球懸濁液＋０．５ｍｌのＡ３７５腫瘍細胞懸濁液
０．５ｍｌのリンパ球懸濁液＋０．５ｍｌのＡ３７５細胞懸濁液＋１０ｎｇのＩＬ−６
０．５ｍｌのリンパ球懸濁液＋０．５ｍｌのＡ３７５−Ｈ６細胞懸濁液
０．５ｍｌのＡ３７５腫瘍細胞懸濁液＋０．５ｍｌの培養培地
０．５ｍｌのＡ３７５−Ｈ６腫瘍細胞懸濁液＋０．５ｍｌの培養培地
【００８３】
混合した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気で、加湿した細胞インキュベーター中で３日間培養した。３日後、無細胞上清を回収し、サイトカイン含有量に関して分析した。回収した上清を、適切に印を付け、直ぐに、解析まで−２０℃で凍結した。サイトカイン含有量を、ＣＢＡマニュアル中で提供される取扱説明書に従って１ヶ月以内にＣＢＡにより確定した。
【００８４】
本実施例の結果を、以下の表１に要約する。結果は、Ａ３７５腫瘍細胞が同種Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを産生させることを示している。ＩＬ−６ではなくハイパーＩＬ６の存在により、Ｔ細胞でのＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生が有意に増加し、同時にＩＬ−１０の分泌が低減した。
【００８５】
【表１】
2011511772.tif 000002
【００８６】
上の結果から、ハイパーＩＬ−６がＩＬ−６より効力が強いだけでなく質的に異なる生物学的活性を示すことが明らかである。既知のＴｈ２誘導因子である天然ＩＬ−６とは対照的に、ハイパーＩＬ−６は、Ｔｈ１応答の特徴であるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生を増大させながらＩＬ−１０の発現を低減するようである。この型のＴヘルパー応答（すなわちＴｈ１）は、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導及び発生時に極めて重要であり、したがって抗腫瘍ワクチンにおいて望ましい応答である。
【００８７】
単一の説明に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、培養培地中に過剰に添加したＩＬ−６の活性の明らかな欠如は、以下のように説明することができると考えている。上の実験から、同種腫瘍細胞はそれ自身が反応中のＴ細胞における非常に強力なＩＬ−６産生を誘発させるようである。この産生は、非常に高いレベルに到達し、全てのＩＬ−６特異的受容体を飽和させる可能性が極めて高い。結果として、ＩＬ−６の培養系への添加は、Ｔ細胞の挙動に何も影響を有しない。他方、ハイパーＩＬ６は未占有のＩＬ−６受容体を必要とせず、その代わりに共通のｇｐ１３０受容体サブユニットと結合する。さらに、ハイパーＩＬ６は特異的なＩＬ−６受容体を必要としないので、ＩＬ−６と比較して様々な細胞集団に作用し得る。観察された効果は、ＩＬ−６応答性Ｔ細胞の過度の刺激、又はＩＬ−６受容体に関して陰性である独立したＴ細胞の刺激によるものであり得る。
【００８８】
本実施例で示された結果から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下でハイパーＩＬ−６は、免疫応答をＴｈ１型（すなわち細胞性応答）にシフトさせることにより、ヒト同種黒色腫細胞の刺激能を有意に増大させることが明らかである。
【００８９】
実施例４：黒色腫細胞とＨ６修飾黒色腫細胞とによるサイトカイン、成長因子及び血管因子の合成
本実施例の目的は、ワクチン中の成分として使用することができる黒色腫細胞による選択されたサイトカイン、成長因子及び血管因子の合成を評価することであった。さらなる目的は、上記黒色腫細胞による上記因子の合成に及ぼすＨ６遺伝子修飾の効果を評価することであった。具体的な目的は、（ｉ）黒色腫細胞Ｍｉｃｈ１及びＭｉｃｈ２によるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ及びＶＥＧＦ等の可溶性因子の分泌の解析；（ｉｉ）Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞（Ｈ６修飾黒色腫細胞）による上記因子の分泌の解析；（ｉｉｉ）Ｈ６修飾Ｍｉｃｈ１細胞、Ｈ６修飾Ｍｉｃｈ２細胞、並びに親Ｍｉｃｈ１細胞及び親Ｍｉｃｈ２細胞の分泌パターンの比較を含むものであった。
【００９０】
被験物質：Ｍｉｃｈ１細胞、Ｍｉｃｈ２細胞、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞を解凍し、２日間培養し、その次の３日間継代した。その後細胞をトリプシン処理し、凍結した。これらの細胞（継代１−Ｐ１）を、実験で使用した。
【００９１】
【表２】
2011511772.tif 000003
【００９２】
方法論：検討した細胞株は、解凍し、培養フラスコ中に播種した。細胞をコンフルエントまで培養し、その後５％ＣＯ２加湿雰囲気中、無血清（ＦＢＳ）培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間維持した。その後培地を回収し、ＦＣ読み取り（readout）での多重粒子ベースイムノアッセイを使用して上で列挙した因子に関して分析した。
【００９３】
検討した４種類の細胞株による分析した因子の分泌
Ｍｉｃｈ１細胞、Ｍｉｃｈ２細胞及びＭｉｃｈ１−Ｈ６細胞、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞により培養培地中に分泌されたサイトカイン及び成長因子の量の結果を、表３に要約する。
【００９４】
【表３】
2011511772.tif 000004
【００９５】
Ｍｉｃｈ１細胞は、低いレベルのＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＮＦ−γ；並びに中程度のレベルのＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦ；並びに比較的高いレベルのＩＬ−８及びＶＥＧＦを分泌した。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０は、分泌されなかった、又はアッセイの検出限界を下回る極めて低いレベルで分泌された。
【００９６】
Ｍｉｃｈ２細胞は、低いレベルのＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＮＦ−γ；中程度のレベルのＩＬ−６及びＶＥＧＦ；並びに高いレベルのＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦを分泌した。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０はアッセイで検出不可能であった。
【００９７】
Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞は、低いレベルのＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＮＦ−γ；中程度のレベルのＩＬ−２及びＲＡＮＴＥＳ；高いレベルのＩＬ−６及びＶＥＧＦ；並びに非常に高いレベルのＩＬ−８を分泌した。ＩＬ−４はアッセイで検出不可能であった。
【００９８】
Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞は、低いレベルのＩＬ−１０及びＩＬ−１２；中程度のレベルのＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ及びＶＥＧＦ；高いレベルのＩＬ−６、並びに非常に高いレベルのＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦを分泌した。ＩＬ−４及びＩＮＦ−γはアッセイで検出不可能であった。
【００９９】
Ｍｉｃｈ１細胞及びＭｉｃｈ２細胞による検討した因子の分泌パターンの比較
親細胞株Ｍｉｃｈ１及びＭｉｃｈ２による検討した因子の分泌パターンの比較により、有意な質的類似性が実証された（表３を参照されたい）。両細胞株の細胞が、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＶＥＧＦ及びＩＮＦ−γを分泌したが、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０は分泌しなかった。しかしながら、両細胞株の間にＧＭ−ＣＳＦ及びＶＥＧＦの分泌における幾つかの量的な差異が観察された。
【０１００】
Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞による検討した因子の分泌パターンの比較
修飾した細胞株Ｍｉｃｈ１−Ｈ６及びＭｉｃｈ２−Ｈ６による検討した因子の分泌パターンの比較により、概して、質的に類似の分泌パターンが明らかにされた（表３を参照されたい）。両細胞株の細胞がＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ及びＶＥＧＦを分泌した。Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞はＩＮＦ−γを分泌したが、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６は分泌しなかった。いずれの細胞株もＩＬ−４を分泌しなかった。ＧＭ−ＣＳＦ及びＶＥＧＦの分泌に関しては、両細胞株の間に有意な量的差異が見られた（それぞれ３桁及び２桁大きい）。
【０１０１】
黒色腫細胞株による検討した因子の分泌パターンに及ぼすＨ６修飾の効果
Ｍｉｃｈ１細胞：Ｍｉｃｈ１細胞とＭｉｃｈ１−Ｈ６細胞との間に有意な質的差異（ＩＬ−２、ＩＬ−１０）及び量的差異が観察されている。減少したＧＭ−ＣＳＦを除き、検討した全ての他の因子の発現が、Ｈ６修飾細胞で有意に増大した。
【０１０２】
Ｍｉｃｈ２細胞：Ｍｉｃｈ２細胞とＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞との間に有意な質的差異（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ）及び量的差異が観察されている。同じレベルであったＩＬ−１２及びＶＥＧＦを除き、検討した全ての因子の発現が有意に増大した。対照的に、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞はＩＮＦ−γを発現しなかった。
【０１０３】
実施例４からの結果の要約
Ｍｉｃｈ１細胞及びＭｉｃｈ２細胞は、検討した１０種類の因子のうち７種類を分泌した。Ｈ６修飾は、２種類のさらなるタンパク質（ＩＬ−２及びＩＬ−１０）の誘導をもたらし、検討した他の因子のほとんどの産生を増大させた。ＩＬ−８、ＶＥＧＦ又はＧＭ−ＣＳＦ等の幾つかの因子は、ナノグラムの１０分の１で、修飾した細胞により分泌された。ＩＬ−８は、ワクチン注入部位への免疫細胞の動員を増大させる非常に強い化学誘引物質である。ＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞成熟の主要な刺激因子であるので、抗原提示を誘発する。ＶＥＧＦは、脈管形成及び血管新生に関与するシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは、単球／マクロファージ移動を刺激することもできる。ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＮＦ−γは、Ｔ細胞に対する免疫調節機能を示す。修飾した細胞は、免疫抑制因子であると考えられるＩＬ−１０も分泌した。しかしながら、実験検討により、ＩＬ−１０  ｃＤＮＡで修飾したマウス黒色腫細胞が特異的な抗黒色腫性免疫応答を誘発することが実証され、かかる設定においてＩＬ−１０がＴリンパ球に対する刺激性シグナルをもたらすことが示された。さらに、修飾した細胞は、有意な量のＩＬ−６を分泌した。しかしながら、抗ＩＬ−６抗体はＨ６タンパク質と反応し得るので、さらなる同定検討が必要である。したがって、利用した方法により培養培地中で検出された高いＩＬ−６レベルは、遺伝子導入によるＨ６タンパク質の分泌を反映するが、ワクチン細胞による天然ＩＬ−６タンパク質の分泌を必ずしも反映しない可能性がある。
【０１０４】
実施例５：ＡＭＴＬＲにおける２種類のＨ６修飾黒色腫細胞株の混合物のサイトカイン産生
本実施例の目的は、異なるＨＬＡハプロタイプを有する様々な健常個体から単離したＰＢＬＣによるサイトカイン産生に及ぼす２種類の黒色腫細胞株（Ｍｉｃｈ１−Ｈ６及びＭｉｃｈ２−Ｈ６）の混合物の効果の解析を含むものであった。さらに、２種類の細胞株の混合物の効果を、単独で使用した各細胞株と比較した。サイトカイン産生は、培養培地中のサイトカイン含有量をＣＢＡ（サイトメトリービーズアッセイ）により測定することにより評価した。
【０１０５】
細胞：Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞を実施例４で説明されているのと同じ供給源から入手し、照射した；ＰＢＬＣを４人の健常ボランティア（男性３人及び女性１人）から単離した。
【０１０６】
培地、成分及び機器：ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）；ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ／ Invitrogen）；ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）；リンパ球分離培地（ICN）；３Ｈ−チミジン（Amersham Biosciences）；トリプシンＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／Invitrogen）；９６ウェルプレート（Sarstedt）；７５ｍｌ組織培養フラスコ（Corning）；ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット−ＩＩ（BD Biosciences）；ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（BD Biosciences）；シンチレーションカウンター；位相差顕微鏡（Olympus）；ＣＯ２インキュベーター（Sanyo）；遠心分離機（Sorvall）。
【０１０７】
細胞の調製：細胞は、有資格研究員がＧＭＰに準ずる条件下で実験室において標準的な手順により培養した。
【０１０８】
Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞を、培養フラスコ中の１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培養培地に、およそ１．６７×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で、別々にプレーティングした。細胞を培養物中でコンフルエントまで成長させ（３日〜５日）、その後トリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、サイトカイン産生記録のために２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、その後８０Ｇｙ（６０Ｃｏ）で照射した。
【０１０９】
ＰＢＬＣを、リンパ球分離培地を媒体とする遠心分離により、４人の健常個体（Ａ、Ｄ、Ｍ及びＮとコード付けた）から回収した全血液から分離した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血球計での標準的な手順により計測した。その後ＰＢＬＣを、サイトカイン産生記録のために２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培養培地中に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１１０】
サイトカイン産生解析の手順
試験は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γサイトカイン産生パネルについて、１枚の９６ウェルプレート上で行った。
【０１１１】
細胞懸濁液を、４個体の各々に関して１行で、各細胞株当たり１００μｌの体積で、９６ウェルプレート中に移した。各行中に、２×１０５細胞／ウェルの濃度で細胞を移した。各細胞株を４つの異なる列に重複させた（reduplicated）（各細胞株に関して４つの試料）。最後から２番目の１６ウェル（４個体の各々当たり４ウェル）、すなわち行５には黒色腫細胞を添加せず、これらのウェルは自発的なＰＢＬＣ増殖に関する陰性対照（対照−）の役割を果たすものとした（対照ウェルは、１００μｌの量のＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳと、５×１０４細胞／ウェルの濃度のＰＢＬＣとを含有するものとした）。最後の１２ウェル、すなわち行６にはＰＢＬＣを添加せず、これらのウェルは自発的な黒色腫細胞増殖に関する陽性対照（対照＋）の役割を果たすものとした（陽性対照は、１００μｌの量のＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳと、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６、及び両細胞株の混合物のそれぞれに関して２×１０５細胞／ウェルの濃度の黒色腫細胞とを含有する）。
【０１１２】
その後ＰＢＬＣを、１００μｌの体積で、且つ０．５×１０５細胞／ウェルの濃度で、陰性対照ウェルを含む（が陽性対照ウェルは除く）各ウェルに添加した。各ウェル中の総体積は、２００μｌ（すなわち、１００μｌのＰＢＬＣ＋１００μｌの黒色腫細胞溶液）とした。
【０１１３】
【表４】
2011511772.tif 000005
【０１１４】
混合した細胞を、サイトカイン産生解析のために３日間（これはインキュベーションのための最適な期間であるため）、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中で、加湿したインキュベーター中で同時培養した。
【０１１５】
３日の所定の期間後、プレートから無細胞上清を回収し、適切に印を付け、直ぐに、さらなる解析まで−２０℃で凍結した。培地中に蓄積したサイトカインを、１ヶ月以内にＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット−ＩＩアッセイを使用して、ＣＢＡマニュアル中で提供される取扱説明書に従って測定した。
【０１１６】
サイトカイン分泌
図３に示すように、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０及びＩＬ−２を産生しなかった。Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞はＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を産生しなかった。予想した通り、これらのサイトカインは、両細胞株の混合物の培養培地中にも見られなかった。しかしながら、少量のＴＮＦ−α及びＩＬ−１０が、Ｍｉｃｈ２−Ｈ６細胞により分泌された。両細胞株がＩＬ−６及びＩＬ−４を、それぞれ非常に多量及び中程度の量で産生した。これらの２種類のサイトカインが、各細胞株により同等のレベルで産生された。
【０１１７】
図４にＰＢＬＣによるサイトカイン産生の結果を示す。ＰＢＬＣは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０又はＩＬ−２を産生しなかった。検証した残りのサイトカイン、すなわちＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−４は、同等のレベルでＰＢＬＣにより産生された。
【０１１８】
図５は、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞の単独及び組合せでのＰＢＬＣサイトカイン分泌に及ぼす効果の結果を示す。黒色腫細胞株と共にＰＢＬＣをインキュベーションすることにより、検討したサイトカインのほとんどに関してＰＢＬＣによるサイトカイン産生の変調がもたらされた。ＩＬ−４の分泌のみ及びおそらくＩＬ−６の分泌が影響を受けなかった。全ての４人のドナー由来のＰＢＬＣでは、別々に使用した各細胞株と比較して両細胞株の混合物の相乗効果が、ＩＬ−２産生に関して観察された。同様の相乗効果が、ＩＦＮ−γ産生について４人のドナーのうち３人で見られた。別々に使用した細胞を上回る細胞株の混合物の抑制効果が、４人のドナーのうち３人由来のＰＢＬＣでのＴＮＦ−α産生に関して観察された。Ｍｉｃｈ１−Ｈ６及びＭｉｃｈ２−Ｈ６の混合物によりもたらされるＩＬ−１０の産生は、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６又はＭｉｃｈ２−Ｈ６により別々にＰＢＬＣを刺激した場合に観察される値の中間であった。
【０１１９】
実施例５からの結果の要約
得られた結果により、２種類の同種黒色腫細胞株の混合物が、別々に使用した各細胞株と比較して、健常ドナーから単離したＰＢＬＣによるサイトカイン分泌に対して異なる生物学的効果を示すことが実証される。これらの効果は、ＩＬ−２及びＩＮＦ−γの産生の増大に対しては相乗的であり、ＴＮＦ−α分泌に対しては抑制的であることが証明された。ＩＬ−２及びＩＮＦ−γの産生の増大は、Ｔｈ１免疫応答への有益なシフトを示す。ＴＮＦ−α分泌の減少は、検出されたサイトカイン量がアッセイについての低い検出限界付近であったため、さらなる検討が必要である。
【０１２０】
結論としては、Ｍｉｃｈ１−Ｈ６細胞及びＭｉｃｈ２−Ｈ６細胞の組合せにより、ＰＢＬＣによるＩＬ−２及びＩＮＦ−γの産生に及ぼす相乗効果により実証されたように、Ｔｈ１型へと免疫応答をシフトさせることにより、単独で使用した各細胞株と比較して、ワクチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫原性が増大する。したがって、デザイナーサイトカイン、例えばＨ６等のハイパーサイトカインでの腫瘍細胞の遺伝子修飾、及び複数の腫瘍細胞株の組合せにより、同種ワクチンの治療能が増大する。
【図３】
2011511772.tif 000006
【図４】
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【図５】
2011511772.tif 000008
【図１】
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【図２】
2011511772.tif 000010
【配列表】
2011511772000001.app
【国際調査報告】
2011511772.tif 000011