(57)【要約】本発明は、止血を妨害せずに血栓症を抑制するための組成物および方法に関するものである。組成物は、ヒトＦＸＩの重鎖のエピトープ、特にヒトＦＸＩの重鎖のＡ３ドメインへ結合可能である抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体（ａＸＩＭａｂ）を含む。組成物はまた、モノクローナル抗体のエピトープ結合断片、変異体、および誘導体、これらの抗体組成物を産生する細胞株、ならびに抗体のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子も含む。本発明は、医薬的に許容され得る担体中に本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む医薬組成物をさらに含む。本発明の方法は、血栓症を抑制する目的でその必要がある対象に上述の組成物を投与すること、血栓症の処置において抗血栓剤の必要な用量を減少させること、転移性癌を処置すること、または急性炎症反応を処置することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるヒトＦＸＩの重鎖上のエピトープに特異的に結合する抗第ＸＩ因子（ＦＸＩ）モノクローナル抗体であって、該抗体は、生物学的に活性である、抗体。
【請求項２】
前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸位置１８２〜２６５に相当するヒトＦＸＩの重鎖のＡ３ドメイン内にある、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記エピトープが：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２０３〜２０４；ｃ）配列番号１のアミノ酸２３４〜２３６；ｄ）配列番号１のアミノ酸２４１〜２４３；ｅ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｆ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記エピトープが：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｃ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号１に記載されるヒトＦＸＩに特異的に結合する抗第ＸＩ因子（ＦＸＩ）抗体であって、該抗体が少なくとも１つの最適化した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、該ＣＤＲ領域が：
ａ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４、または１５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ；および
ｂ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４、または１５で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ；
から成る群より選択される抗体。
【請求項６】
前記抗体が：
ａ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が：
ａ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体の断片であって、該断片は、生物的に活性である、断片。
【請求項９】
血栓症を抑制する必要がある対象において止血を妨害せずに血栓症を抑制する方法であって、該対象に有効用量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記血栓症が心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、脳卒中、腎障害、肺塞栓症、深部静脈血栓症、経皮経管冠動脈形成術、播種性血管内凝固症候群、敗血症、人工臓器、シャントまたはプロテーゼに関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血栓症を処置する必要がある対象の血栓症の処置において必要な用量を減少させるか、または抗血栓剤の効果を補完する方法であって、該対象に該抗血栓剤と組合せて請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記抗血栓剤が直接もしくは間接トロンビン阻害剤、第Ｘ因子阻害剤、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩＩ因子阻害剤、第Ｖ因子阻害剤、第ＶＩＩＩ因子阻害剤、第ＸＩＩＩ因子阻害剤、第ＶＩＩ因子阻害剤、組織因子阻害剤、線維素溶解促進剤、線維素溶解もしくはフィブリノゲン溶解剤、カルボキシペプチダーゼＢ阻害剤、血小板阻害剤、選択的血小板数減少剤、または第ＸＩ因子阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
転移性癌を処置する必要がある対象において転移性癌を処置する方法であって、該対象に治療的有効用量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
炎症反応を処置する必要がある対象において炎症反応を処置する方法であって、該対象に治療的有効用量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記対象が哺乳動物である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が非ヒト霊長類である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体または断片が前記対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与される、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体または断片が前記対象に約２ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体または断片が前記対象に全身投与、局所的投与、非経口投与または経腸投与により投与される、請求項９〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または断片を活性成分として含む製薬組成物。
【請求項２２】
前記抗体または断片の即時放出のために製剤化される、請求項２１に記載の製薬組成物。
【請求項２３】
前記抗体または断片の制御放出のために製剤化される、請求項２１に記載の製薬組成物。
【請求項２４】
ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２０３〜２０４；ｃ）配列番号１のアミノ酸２３４〜２３６；ｄ）配列番号１のアミノ酸２４１〜２４３；ｅ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｆ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のペプチドを免疫原として使用するステップを含む、抗体を調製する方法。
【請求項２６】
単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが免疫グロブリン重鎖を含む抗体をコードする核酸を含み、該免疫グロブリン重鎖が：
ａ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ａ）配列番号２または６で示されるポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２または６で示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが免疫グロブリン軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含み、該免疫グロブリン軽鎖が：
ａ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ａ）配列番号４または８で示されるポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４または８で示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３１】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に結合されている、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３２〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＸＩ因子に結合可能である抗体およびその使用方法、特に止血を妨害しない抗血栓剤としての使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
止血は、出血を停止させて、血液循環の完全性を分子レベルと巨視的レベルの両方で保護する生体機能である。止血は、伝統的に３つの部分：１）第Ｖｌｌａ凝固因子の関与を伴わずに第ＩＸａ凝固因子の生成を引き起こす血液凝固タンパク質の相互作用を含む、内因性経路；２）トロンボプラスチン前駆体（第ＸＩ因子）の関与を伴わずに第Ｘａおよび／または第ＩＸａ凝固因子の生成を引き起こす血液凝固タンパク質の相互作用を含む、外因性経路;および３）トロンビン（第ＩＩａ因子）の生成を引き起こす血液凝固タンパク質ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸの相互作用を含む、共通凝固経路；に分けられる、連続的に活性化可能な酵素の凝固カスケードを含む。トロンビンは血小板を活性化して、フィブリンを生成するが、そのどちらも血管の損傷のシーリングに関与する止血栓の必須構築要素である。トロンビンまたは血小板が全く存在しないと、止血は麻痺状態となり、致死的な出血を引き起こす。
【０００３】
血栓症は、止血と同様に、血小板およびトロンビン依存プロセスである。血栓症は、重合フィブリンおよび活性化血小板の病的な静脈内トロンビン依存性の進行性沈着であり、各種器官での血管の閉塞を引き起こす。健康な哺乳動物では、静脈内凝固は止血部位に局在化している。管腔内での血栓への進行は、活性化タンパク質Ｃ、プラスミン、およびアンチトロンビンなどの天然抗血栓酵素および阻害剤によって効率的に遮断される。血栓症は、抗血栓系が静脈内トロンビンのさらなる生成を制御できないときに発症する。罹患率および死亡率における大血管および／または微小血管血栓症の因果関係は、深部静脈血栓症、肺血栓塞栓症、末梢動脈血栓症および塞栓症、網膜静脈血栓症はもちろんのこと、心筋梗塞（非特許文献１；非特許文献２）、虚血性脳卒中（非特許文献３）、炭疽敗血症および髄膜炎菌性敗血症（非特許文献４）、またはヘパリン起因性血小板減少症（非特許文献５）も含む各種の疾患で直接記録されている。血栓性閉塞および低酸素に起因する器官損傷の証拠は、他の疾患群、たとえば出血熱（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、糖尿病性血管症（非特許文献９；非特許文献１０）、腎臓病（非特許文献１１；非特許文献１２）、および複数の他の状態でも入手できる。
【０００４】
血栓症および止血は同一の分子プロセスではないが、それらは十分に似ているので、今日までに開発された抗血栓薬が意図せずに両方を標的としている。血栓症は抗血小板剤、線維素溶解促進剤、および抗凝固剤によって処置されるが、これらの薬剤の大半は、その最大有効用量で投与されたときに、血栓症と止血の両方を完全に遮断する可能性がある。抗血栓薬は、血栓の構築ブロック（フィブリンおよび血小板）を標的とするか、または分子（凝固因子）および細胞（血小板）が血栓形成プロセスに関与するのを抑制するかのどちらかである。抗血栓剤が止血を遮断できなければ、血栓症で作用しないであろうということが、医師や研究者の間で広く考えられている。
【０００５】
最古の抗凝固抗血栓剤の１つのヘパリンはいまだに、世界で最も広く投与される注射である。十分に高用量のヘパリンは、ほぼ１００％の有効性を達成できるが、ただしこのような用量では止血を無効にすることと引き換えである。都合の悪いことに、分画ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤などのさらに新しい抗血栓剤では、はるかにうまく行くというわけではない。結果として、抗血栓剤、特に抗凝固薬および線維素溶解促進剤は、その最大有効用量未満で投与する必要があり、血栓症は処置不十分な疾患のままである。効力の改善の見込みに基づいているが、止血安全性の改善の見込みのない新たな化合物の導入は筋が通らない。今日までに、抗血栓化合物は安全性の改善の見込みが不十分である。理想的な抗血栓剤は、止血に悪影響を及ぼさずに、循環血の凝固を阻止するであろう。
【０００６】
それゆえ、止血を麻痺させることなく血管内血栓生成を遮断する、安全であるが有効な薬剤の開発に対する差し迫った医療上の要求が、なお存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｅａｄｏｗｓ（１９６５）Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．４：４０９−４１１
【非特許文献２】Ｈａｒｌａｎｄ（１９６６）Ｌａｎｃｅｔ  ２６：１１５８−１１６０
【非特許文献３】Ｃａｒｍｏｎ（１９６６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１１−１１９
【非特許文献４】Ｄａｌｌｄｏｒｆ（１９７７）Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１０１：６−９
【非特許文献５】Ｒｈｏｄｅｓ（１９７３）Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１３６：４０９−４１６
【非特許文献６】Ｄｅｎｎｉｓ（１９６９）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１７：４５５−４６２
【非特許文献７】Ｇｅａｒ（１９７９）Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１：５７１−５９１
【非特許文献８】Ｉｇｎａｔｉｅｖ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７１：１３１−１４０
【非特許文献９】Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ（１９８１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３０：６０１−６０６
【非特許文献１０】Ｂｏｅｒｉ（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：１４３２−１４３９
【非特許文献１１】Ｍｉｌｌｅｒ（１９８０）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１８：４７２−４７９
【非特許文献１２】ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ（１９９３）Ｌｕｐｕｓ  ２：９９−１０３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
止血を妨害せずに血栓症を抑制するための組成物および方法が提供される。組成物は、ヒトＦＸＩの重鎖のエピトープ、特にヒトＦＸＩの重鎖のＡ３ドメインへ結合可能である抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体（ａＸＩＭａｂ）を含む。組成物は、モノクローナル抗体のエピトープ結合断片、変異体、および誘導体、これらの抗体組成物を産生する株化細胞、ならびに抗体のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子も含む。本発明は、製薬的に許容される担体中に本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む製薬組成物をさらに含む。本発明の方法は、上述の組成物を血栓症を抑制する目的で組成物の投与の必要がある対象に投与すること、抗血栓剤の必要な用量を減少させること、転移性癌を処置すること、または急性炎症反応を処置することを含む。抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、もしくは誘導体を作製する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】血栓形成を開始するために使用する局所サンプリングモデルおよび血栓形成デバイス。（Ａ）局所サンプリング法の定性的図（原寸に比例せず）。（Ｂ）未コート、およびコラーゲンコートの走査電子顕微鏡画像。（Ｃ）発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）臨床血管移植材料。
【図２】抗ＦＸＩモノクローナル抗体（ａＸＩＭａｂ）の投与後の、ＦＸＩ凝血促進活性の抑制。ａＸＩＭａｂの単回ｉ．ｖ．ボーラス（２ｍｇ／ｋｇ）を５分間にわたって、別のヒヒ４頭に投与した。血漿サンプルを１／１０ｔｈｖ／ｖ  ３．２％クエン酸抗凝固薬中に収集し、ワンステージ凝固アッセイで試験して、ＦＸＩの抑制を評価した。各時点は別の２〜４頭の動物の平均値を示し、第８日まではそれぞれ９５％抑制を超えた。すべての凝固時間は第１１日によって正規化した。
【図３】ＦＸＩ抑制は、コラーゲンコート血管移植片への血小板およびフィブリン沈着を低減した。コラーゲンコート（内径４ｍｍ）血管移植片への（Ａ）血小板および（Ｂ）フィブリン沈着に対するＦＸＩ抑制の効果。血栓形成移植片を未処置（ｎ＝８）またはａＸＩＭａｂ処置（ｎ＝６）動物内に配置した（＞９５％  ＦＸＩ抑制）。血液を１００ｍｌ／分のクランプ固定速度でデバイス内に流して、２６５ｓ−１の平均壁剪断速度を生じさせた。有意水準は＊＊＊Ｐ＝０．００１である。値は平均±ＳＥＭである。
【図４】ａＸＩＭａｂによるＦＸＩ抑制は、トロンビン生成および血小板活性化を低下させるが、線維素溶解には影響しない。血栓形成中のそれぞれ、（Ａ、Ｃ）局所および（Ｂ、Ｄ）全身トロンビン／アンチトロンビン（ＴＡＴ）およびβ−トロンボグロブリン（β−ＴＧ）レベル。血液サンプルは、線維素溶解生成物ｄダイマー（Ｅ）についても試験した。局所値はその指定時間前１０分間の経過で成長する血栓より遠位の１ｃｍの壁近傍低流量境界層から得た値であるのに対して、全身サンプルは血栓形成デバイスより近位の動静脈シャントから得た。全群のゼロ時点は、各試験直前に全身的に得たサンプルからである。ＦＸＩ抑制は、局所血栓形成および血小板活性化を劇的に低下させて、このことはコラーゲン対照と比較してＴＡＴおよびβ−ＴＧの両方で６０分までに著しい全身的低下に変換された。著しい線維素溶解は、非処置またはａＸＩＭａｂ処置動物のどちらでも検出されなかった。
【図５】ＦＸＩ抑制は、血栓安定性を制限して、高い動脈剪断下での移植血管閉塞を防止する。コラーゲンコート血管移植片（内径２ｍｍ）への血小板沈着に対するＦＸＩ抑制およびＡＳＡの効果を示す。コラーゲンコート血管移植セグメントを、未処置（ｎ＝９）、ＡＳＡ処置（ｎ＝６）、およびａＸＩＭａｂ処置（ｎ＝５）動物の永久動静脈シャントに配置した。血液を１００ｍｌ／分の速度で移植片に流して、２１２０ｓ−１の平均初期壁剪断速度を生じさせた。流量は、移植片が閉塞するまでの拍動動脈圧によって維持された（≦２０ｍｌ／分流量として定義された）。ａＸＩＭａｂ処置動物の移植片で形成された血栓は不安定であり、６０分長試験の間、移植片を閉塞しなかった。有意水準は、調査されている非閉塞デバイスを用いたｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を使用して、非処置対照と比較して＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であった。値は平均±ＳＥＭである。
【図６】テンプレート出血時間は、ＦＸＩ抑制ヒヒで正常である。出血時間は、ａＸＩＭａｂまたはＡＳＡによる処置の前および間に、ＦＤＡによって承認された方法およびデバイス（Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ）によって、前腕の掌面で繰り返し監視した。ＡＳＡ（ｎ＝１０）が出血時間を延長したのに対して、ａＸＩＭａｂ（ｎ＝１８）によるＦＸＩの抑制は、非処置対照（ｎ＝１４）と比較して、止血を明白に弱めなかった。出血時間の平均は、±ＳＥＭで示される。有意水準は＊＊Ｐ≦０．０１である。
【図７】（Ａ）ウェスタンブロットを使用する抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体１Ａ６の第ＸＩ因子への結合。左パネルのバンドは、抗体１Ａ６がヒトおよび非ヒト霊長類血清中に第ＸＩ因子を認識することを示す。同様のバンドは、第ＸＩ因子枯渇または欠失サンプルでは観察されなかった（右パネル）。（Ｂ）ａＸＩＭａｂは、流れているＦＸＩＩ抑制または欠失ヒト血液中で可視フィブリン形成を防止して、血小板蓄積を防止した。
【図８】ａＸＩＭａｂ投与後のＦＸＩ凝血促進活性の抑制。ａＸＩＭａｂの静脈内ボーラス（２ｍｇ／ｋｇ）１個を５分間にわたって１匹のヒヒに投与した。血漿サンプルをクエン酸抗凝固薬中に収集して、（Ａ）ＦＸＩ凝血促進活性、ＦＸＩ抗原（ＦＸＩ：Ａｇ）、および（Ｂ）阻害剤レベルについて４週間にわたって試験を行い、各時点は２回の測定の平均である。ＦＸＩ：Ａｇ  ＥＬＩＳＡは、遊離および複合体化ＦＸＩを検出可能であった。ベセスダアッセイは、遊離ＦＸＩ阻害剤（ａＸＩＭａｂ）のみ検出したので、低阻害剤レベルでのＦＸＩ：ＡｇおよびＦＸＩ活性は、すべての複合体が循環から除去されるまで相関しなかった。（Ｂ）非還元７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画された１μｌ  ＮＨＰおよびＮＢＰサンプルサイズのウェスタンブロット。検出は、ヒトＦＸＩに対するポリクローナル抗体によった。右側の５レーンは、ａＸＩＭａｂ注入前（０）、またはａＸＩＭａｂ注入後１、６、８、および２７日のサンプルを示す。省略形：ＸＩ−精製ヒトＦＸＩ１００ｎｇ；ＮＨＰ−正常ヒト血清；ＮＢＰ−正常ヒヒ血清；ＸＩ−ＤＰ−ＦＸＩ欠失ヒト血清。
【図９】抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体１Ａ６の、ＦＸＩドメインのＰＫドメインによる置換を含むＦＸＩおよびプレカリクレイン（ＰＫ）のキメラタンパク質への結合のウェスタンブロットを示す。右パネルに示すように、モノクローナル抗体１Ａ６は、ＦＸＩのＡ３ドメインがＰＫドメインによって置換されたキメラを除くすべてのＦＸＩ／ＰＫキメラを結合した。
【図１０】抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体１Ａ６の、ＰＫドメインのＦＸＩドメインによる置換を含むＦＸＩおよびＰＫのキメラタンパク質への結合のウェスタンブロットを示す。モノクローナル抗体１Ａ６は、ＦＸＩのＡ３ドメインが挿入されているキメラのみに結合する。
【図１１】抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体１Ａ６の、Ａ３ドメイン内に異なるアミノ酸の突然変異を含む組換えＦＸＩタンパク質への結合のウェスタンブロットを示す。ポリクローナル抗第ＸＩ因子抗体はすべてのＦＸＩ  Ａ３ドメイン突然変異体に結合するが、モノクローナル抗体１Ａ６は、Ａ３ドメイン内のアミノ酸がアラニンによって置換されたいくつかの突然変異体に結合しなかった。
【図１２】モノクローナル抗体１Ａ６のＦＸＩへの結合を防止または低下する、ＦＸＩのＡ３ドメイン内のアラニン置換の位置を示す。
【図１３】（Ａ）Ａｘｉｍａｂ重鎖ヌクレオチド（配列番号２）およびアミノ酸（配列番号３）配列。（Ｂ）Ａｘｉｍａｂ軽鎖ヌクレオチド（配列番号４）およびアミノ酸（配列番号５）配列。（Ｃ）ＣＤＲ移植Ａｘｉｍａｂ重鎖ヌクレオチド（配列番号６）およびアミノ酸（配列番号７）配列。（Ｄ）ＣＤＲ移植Ａｘｉｍａｂ軽鎖ヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸（配列番号９）配列。ＣＤＲ定義およびタンパク質配列ナンバリングはＫａｂａｔによる。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は太字である。（Ｃ）および（Ｄ）のマウス配列からの変化には下線が付けてある。ヒト受容体生殖細胞系フレームワークはＩＧＨＶ２−５である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．概要
本発明は、止血を妨害せずに血栓症を抑制するための、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体（ａＸＩＭａｂ）に関連する組成物および方法に関するものである。より十分に後述するように、認識され、霊長類（特に）ヒト第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の重鎖、特にヒトＦＸＩの重鎖のアップル３（Ａ３）ドメインに結合した１Ａ６と呼ばれるマウス株化細胞からのモノクローナル抗体が調製された。ポリクローナル抗ＦＸＩ抗体は研究および診断用途のために市販されているが、これらのポリクローナル抗体は、制御が不可能であり、その産生は生きている動物の利用可能性に依存しているために、安全に使用できない（たとえばＧｒｕｂｅｒ  ＆  Ｈａｎｓｏｎ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９５３−９５５参照）。対照的に、モノクローナル抗体は、細胞培養物中で一貫して製造され、それらは合成できるか、または真菌から植物、動物に及ぶことがあるトランスジェニック生物の副生成物から精製できる。さらに、マウスモノクローナル抗ＦＸＩ抗体は現在、研究用途で利用できるが、インビボでの安全な抗血栓剤として使用するための特異的な抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は産生されていない。
【００１１】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合断片、変異体、または誘導体の利点の１つは、抗凝固剤としてのその優れた安全性である。本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、ＦＸＩに対して単一特異的であり、そのままの形でまたは分解したときに、必須タンパク質を抑制せず、または重要な分子および経路と相互作用しない。これは他の抗血栓剤と比較したときに、特に安全上の利点である。とりわけ、最大有効用量を著しく超えた（たとえば最大有効用量の数倍の場合）抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、対象においていずれの有害な出血または他の毒性副作用を生じなかった。対照的に、他のすべての抗血栓剤、たとえばビタミンＫアンタゴニスト、必須凝固酵素の間接および直接阻害剤、血小板阻害剤、線維素溶解剤などは、その最大有効用量で投与されるときには、最終的に危険であり、致死性でさえある。
【００１２】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の他の安全性の利点は、他の抗血栓剤、たとえば小型分子酵素阻害剤または血小板阻害剤と比較して、本発明のモノクローナル抗体が毒性代謝中間体を生成することなく代謝および排除され、その代謝が肝臓および腎臓機能の完全性と実質的に無関係であることである。さらに、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、他の抗血栓剤とは対照的に、他の薬理化合物と相互作用せず、他の薬物の活性または代謝に直接影響を及ぼさない。
【００１３】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、強力な薬剤としても有用である。さらに十分に後述するように、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の投与によって、ＦＸＩ活性が病態の原因である疾患を予防または処置することができる。本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、出血を引き起こすことなく血栓形成を抑制して、それゆえ対象、特にヒトにおける血栓閉塞性疾患の安全な処置選択肢を提供する。他の抗血栓剤と比較した抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の別の利点は、単回用量が安全であり、１週間以上にわたって有効であることである。大半の抗血栓剤は、作用期間がより短い。
【００１４】
ＩＩ．定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、その実体の１つ以上を指すことに注意するものとする；たとえば「抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体（ａｎ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は１つ以上の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を表すと理解される。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書で互換的に使用されうる。
【００１５】
「止血」という用語は本明細書で使用するように、血管系の損傷後に血液循環の完全性を維持する協調機構を指す。血管損傷のない正常循環において、血小板は活性化されず、自由に循環する。血管損傷によって、血小板が付着できる内皮下組織が露出される。付着性の血小板は、他の循環中の血小板を誘引して、毛細血管または他の小血管の漏出を閉止するのに特に有用である予備の栓を形成するであろう。このような事象は、１次止血と呼ばれる。この後には、通例、血漿凝固を引き起こして１次血小板栓を補強する一連の連鎖酵素反応を含む、２次止血が迅速に起こる。したがって止血剤は、血管の収縮、形成された血液要素の付着および凝集、および血液または血漿凝固を含む、止血に関与する生理学的プロセスのいずれも促進または強化することによって、出血を低速化または停止させる任意の薬剤である。
【００１６】
「凝固」という用語は本明細書で使用するように、血液または血漿の液体からゲル相への変換を生じる、フィブリンモノマーの重合プロセスを指す。液体血液の凝固は、インビトロで、静脈内で、または露出および損傷した組織表面で起こり得る。インビトロ血液凝固は、フィブリノゲン含量が減少して、フィブリンが対応して増加することを除いて、非凝固血液中に見出されるのと本質的に同じ相対比率で細胞および他の血液成分を保持するゲル化血液を生じる。「血餅」とは、液体血液で見出されるのと同じ相対比率ですべての血液成分で形成される、およびすべての血液成分を含有する粘性ゲルを意味する。
【００１７】
「凝固カスケード」という用語は本明細書で使用するように、たとえば参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｍａｎｏｌｉｎ  ｉｎ  Ｗｉｌｓｏｎら（ｅｄｓ）：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  Ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ＭｃＧｒａｗ−Ｍｉｌｌ，１９９８，ｐ．３４１によって記載されているように、３つの相互関連する酵素経路を指す。内因性凝固経路は、第ＶＩＩＩａ因子および第Ｘ因子、リン脂質およびＣａ２＋と併せて第Ｘａ因子を与える、第ＩＸａ因子の形成を引き起こす。外因性経路は、組織因子および第ＶＩＩ因子の組合せの後に、第Ｘａ因子および第ＩＸａ因子を与える。共通凝固経路は、血液凝固第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子と相互作用して、プロトロンビンを切断してトロンビン（第ＩＩａ因子）にして、トロンビンは次にフィブリノゲンを切断してフィブリンにする。本明細書で使用するように、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」はもちろんのこと、複数形の「ポリペプチド」を含むことを意図して、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直鎖状に結合されたモノマー（アミノ酸）で構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。それゆえペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」の定義、および「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはこれらの用語のいずれとも互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、制限なく、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然発生型アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然生物源から誘導され得るか、または組換え技術によって産生され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方式で産生され得る。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、約３以上の、５以上の、１０以上の、２０以上の、２５以上の、５０以上の、７５以上の、１００以上の、２００以上の、５００以上の、１，０００以上の、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは定義された３次元構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するわけではない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは折畳まれたと呼ばれ、定義された３次元構造を有さずに、多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折畳まれていないと呼ばれる。「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その本来の環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要ない。たとえば単離ポリペプチドは、その発生した環境または本来の環境から除去できる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的では、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された未変性または組換えポリペプチドと同様に、単離されたと見なされる。
【００１９】
本発明のポリペプチドとしては、上述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、ならびにその任意の組合せも含まれる。本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体または抗体ポリペプチドを指すときの「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、対応する抗体または本発明の抗体ポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書の別の箇所で議論する特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片はもちろんのこと、欠失断片も含む。本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上述の断片と、アミノ酸置換、欠失、または挿入のために改変されたアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。変異体は、自然発生型または非自然発生型であり得る。非自然発生型変異体は、当分野で公知の突然変異誘発技法を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、参照抗体または本発明の抗体ポリペプチドには見出されないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例は、融合タンパク質を含む。変異体ポリペプチドは本明細書では、「ポリペプチド類似体」とも呼ばれ得る。本明細書で使用するように、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体および抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。２０の標準アミノ酸の１つ以上の天然発生型アミノ酸誘導体を含有するペプチドも、「誘導体」として含まれる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換し得る；５−ヒドロキシリジンは、リジンを置換し得る；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンを置換し得る；ホモセリンは、セリンを置換し得る；およびオルニチンは、リジンを置換し得る。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸はもちろんのこと、複数の核酸も含むことを意図しており、単離核酸分子または構築物、たとえばメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣習的なホスホジエステル結合または非慣習的な結合（たとえばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドとは、その本来の環境から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。たとえば、ベクターに含有される抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に保持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたこのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素であるか、または調節要素を含み得る。
【００２１】
本明細書で使用するように、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンから成る核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないものの、コード化領域の一部と見なされ得るが、任意のフランキング配列、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード化領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード化領域は、単一のポリヌクレオチド構築物に、たとえば単一のベクターに、または別個のポリヌクレオチド構築物に、たとえば別個の（異なる）ベクターに存在することができる。さらに、任意のベクターは単一のコード化領域を含有し得るか、または２つ以上のコード化領域を含み得る、たとえば単一のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合または非融合のどちらかの異種コード化領域をコードし得る。異種コード化領域は制限なく、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊化要素またはモチーフを含む。
【００２２】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、通常ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、１つ以上のコード化領域と作動可能に結合されたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含み得る。作動可能な結合は、遺伝子産物、たとえばポリペプチドのコード化領域が１つ以上の調節配列と、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に置くような方法で結合されている場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード化領域およびそれに結合したプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を引き起こす場合に、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に結合されている」。それゆえプロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターがその核酸の転写を生じることができる場合に、作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞のみにおいてＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御要素、たとえばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。好適なプロモーターならびに他の転写および翻訳制御領域は、当分野で周知である。
【００２３】
本発明は、ある抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体に関する。天然発生型抗体などのフルサイズ抗体に特に言及しない限り、「抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体」という用語は、フルサイズ抗体はもちろんのこと、このような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、または誘導体、たとえば天然発生型抗体もしくは免疫グロブリン分子または改変抗体分子もしくは抗体分子と同様の方式で抗原を結合する断片を含む。
【００２４】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含む、ならびに通常は重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的に十分に理解されている。たとえばＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。
【００２５】
以下でさらに詳細に議論されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別できる各種の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）と、その中のいくつかのサブクラス（たとえばγ１〜γ４）として分類されることを認識するであろう。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとしてそれぞれ判定することは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、特徴が明らかであり、機能特化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプそれぞれの修飾形は、本開示に照らして当業者によってただちに識別可能であり、したがって本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものであろう。ＩｇＧに関して、標準免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００ダルトンの２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４本の鎖は通例ジスルフィルド結合によって「Ｙ」配置で連結され、そこでは「Ｙ」の入口から開始して、可変領域を通じて続く重鎖を軽鎖が包囲している。
【００２６】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）として分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子改変宿主細胞のいずれかによって産生されるときに、２本の重鎖の「尾」部は共有ジスルフィド結合によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置のフォーク型端部のＮ末端から各鎖下端のＣ末端まで続いている。
【００２７】
軽鎖および重鎖はどちらも、「定常領域」および「可変領域」と呼ばれる構造的および機能的に相同の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点で、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識されるであろう。反対に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物特性を与える。慣習により、定常領域ドメインのナンバリングは、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分では定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端それぞれを実際に含む。
【００２８】
上で指摘したように、可変領域によって、抗体は抗原のエピトープを選択的に認識して、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、またはこれらの可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは結合して、３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この４次抗体構造は、Ｙの各アーム端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに詳細には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲによって定義される。
【００２９】
天然発生型抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその３次元配置をとるときに、抗原結合ドメインを形成するために特異的に位置決めされているアミノ酸の短い非隣接配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りの部分は、より低い分子内可変性を示す。フレームワーク領域は主にβシート立体配座をとり、ＣＤＲはβシート構造を結合するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。それゆえ、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって、正しい向きでのＣＤＲの位置決めを与える足場を形成するように作用する。位置決めされたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的表面は、抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸が、当業者によって任意の重鎖または軽鎖可変領域についてただちに識別可能であるのは、それらが明確に定義されているためである（参照によりその全体が本明細書に組み入れられている“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７を参照）。
【００３０】
当分野で使用されている、および／または受け入れられている用語の定義が２つ以上ある場合、用語の定義は本明細書で使用するように、反対のことが明示的に示されていない限り、すべてのこのような意味を含むことを意図する。詳細な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を説明する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、参照によって本明細書に組み入れられているＫａｂａｔら（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７によって記載されており、その定義は、相互に比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すどちらの定義の利用も、本明細書で定義および使用するような用語の範囲内であることを意図する。当業者は、抗体の可変アミノ酸配列を与えた特定のＣＤＲを含む残基を日常的に判定することができる。
【００３１】
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列のナンバリング系も定義した。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」系を任意の可変ドメイン配列に明確に割当てることができる。本明細書で使用するように、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．”によって記載されたナンバリング形を指す。別途規定しない限り、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体における特異的アミノ酸残基位置のナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリング系に従う。
【００３２】
本発明の抗体または抗体結合断片、変異体、もしくは誘導体は、これに限定されるわけではないが、モノクローナル、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのどちらかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば本明細書で開示される抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体に対する抗Ｉｄ抗体）を含む。ＳｃＦｖ分子は当分野で公知であり、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８９２，０１９に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２など）、またはサブクラスであり得る。
【００３３】
単鎖抗体を含む抗体断片は、単独のまたは次の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部または一部と組合せた可変領域を含み得る。可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せも含む抗原結合断片も、本発明に含まれる。
【００３４】
本明細書で使用するように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、以下で、およびたとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９３９，５９８に記載されたような、ヒト免疫グロブリンライブラリからまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックである動物から単離されて、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。
【００３５】
本明細書で使用するように、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。たとえば、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖;ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（たとえばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠失し得る。上述のように、当業者によって、これらのドメイン（たとえば重鎖部分）が、天然発生型免疫グロブリン分子によるアミノ酸配列とそれらが異なるように修飾され得ることが理解されるであろう。
【００３６】
本明細書で開示する抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、それらが特異的に結合する抗原のエピトープまたは部分、たとえば標的ポリペプチド（配列番号１で記載される、ヒト第ＸＩ因子）について記載または規定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」と呼ばれる。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含み得るが、通例は少なくとも２個のエピトープを含み、抗原のサイズ、立体配座、および種類に応じて任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチドの「エピトープ」が非ポリペプチド要素であり得るか、非ポリペプチド要素を含み得る、たとえばエピトープが炭水化物側鎖を含み得ることに注目すべきである。
【００３７】
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸と考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７の、さらに好ましくは少なくとも９のおよび最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原ペプチドまたはポリペプチドをその３次形で認識できるため、エピトープを含むアミノ酸は隣接している必要はなく、いくつかの場合には、同じペプチド鎖上になくてもよい。本発明において、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドは、ヒト第ＸＩ因子の重鎖に位置して、ヒト第ＸＩ因子の少なくとも４の、少なくとも５の、少なくとも６の、少なくとも７の、さらに好ましくは少なくとも８の、少なくとも９の、少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、少なくとも２５の、または約１５〜約３０の隣接または非隣接アミノ酸の配列（配列番号１）を含有する。
【００３８】
「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することと、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に多少の相補性を含むこととを一般に意味する。この定義に従って、抗体がエピトープに「特異的に結合する」と言われるのは、抗体がそのエピトープにランダムな無関係のエピトープよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して結合するときである。「特異性」という用語は本明細書では、ある抗体があるエピトープに結合する際の相対的親和性を制限するために使用する。たとえば、抗体「Ａ」が所与のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると見なすことができ、または抗体「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００３９】
「優先的に結合する」とは、抗体が関連する、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、抗体がエピトープに特異的に結合することを意味する。それゆえ、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連するエピトープと交差反応することができても、関連するエピトープよりもそのエピトープに結合しやすい。
【００４０】
非制限的な例としては、抗体が第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が前記第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤで結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第１の抗原に優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合である。
【００４１】
別の非制限的な例において、抗体が第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さいｋ（ｏｆｆ）で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合である。別の非制限的な例において、抗体が第１のエピトープに優先的に結合すると見なされ得るのは、抗体が第１のエピトープを、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合である。
【００４２】
本明細書で開示される抗体または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、または１０−３ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言うことができる。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−4ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、または１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、または１０−７ｓｅｃ−１、以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言うことができる。
【００４３】
本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の会合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の会合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。
【００４４】
抗体が参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると言われるのは、抗体がそのエピトープに、抗体が参照抗体のエピトープへの結合をある程度まで遮断する範囲で優先的に結合する場合である。競合的阻害は、当分野で公知の任意の方法、たとえば競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって判定され得る。抗体は、参照抗体の所与のエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
【００４５】
本明細書で使用するように、「親和性」という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強度の尺度を指す。たとえばＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．）２７〜２８頁を参照。本明細書で使用するように、「アビディティ」という用語は、免疫グロブリンの集合と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度を指す。たとえばＨａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照。アビディティは、集合の中の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、および免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関連する。たとえば２価モノクローナル抗体とポリマーなどの高い反復エピトープ構造を備えた抗原との間の相互作用は、アビディティの高い相互作用であろう。
【００４６】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性によっても記載または規定され得る。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを持つ結合親和性を含む。
【００４７】
本明細書で使用するように、「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られまたは由来して、（本発明に従って無処置、部分または修飾であり得る）定常領域が第２の種から得られる任意の抗体を意味すると考えられる。好ましい実施形態において、標的結合領域または部位は非ヒト源（たとえばマウスまたは霊長類）からであり、定常領域はヒトである。
【００４８】
本明細書で使用するように、「改変抗体」という用語は、重鎖もしくは軽鎖どちらかまたは両方の可変ドメインが公知の特異性の抗体からの１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、ならびに必要ならば、部分的なフレームワーク領域の置換および配列変化によって改変された抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスの抗体、またはサブクラスの抗体にさえ由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体から、および好ましくは異なる種による抗体から由来することが考えられる。公知の特異性の非ヒト抗体からの１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域内に移植された改変抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに伝達するために、ＣＤＲのすべてをドナー可変ドメインからの完全ＣＤＲで置換することは必要でないことがある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を転移することのみが必要であり得る。
【００４９】
ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖、または両方の可変ドメイン内のフレームワーク領域がヒト起源の残基のみを含み得ることがさらに認識され、この場合にヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。または、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の１つ以上の残基は、適正な結合を維持するために、またはヒト第ＸＩ抗原への結合を向上させるために必要な場合には、ヒト化領域の重鎖もしくは軽鎖、または両方の可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置内で改変することが可能である。それゆえこの方式で改変されたヒトフレームワーク領域は、ヒトおよびドナーフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書では「部分ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２、および６，１８０，３７０に記載された説明を考えると、所定の実験を実施すること、または機能性改変もしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤試験のどちらかによって、それは当業者の能力の十分に範囲内であろう。
【００５０】
たとえば抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体のヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類または突然変異げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の対応する配列の代わりに使用することによって本質的に実施できる。参照により本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，２２５，５３９；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；５，８５９，２０５も参照。得られたヒト化抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域内に少なくとも１つのげっ歯類または突然変異げっ歯類ＣＤＲを含むであろう。いくつかの例において、ヒト化抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の１つ以上の可変ドメインのフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト（たとえばげっ歯類）残基によって置換され（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；および６，１８０，３７０を参照）、この場合、得られたヒト化抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内に部分ヒトフレームワーク領域を含むであろう。
【００５１】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに向上させるために（たとえば所望の親和性を得るために）行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通例は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでＣＤＲのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応して、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、通例はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細事項については、参照により本明細書に組み入れられている、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無処置ヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されている抗体を含み得る。実際に、ヒト化抗体は通例、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のフレームワーク残基がげっ歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，２２５，５３９；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；５，８５９，２０５を参照。ヒト化抗体および所定の抗原に対して改良された親和性を有するヒト化抗体を産生する技法が開示されている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１８０，３７０、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ０１／２７１６０も参照。
【００５２】
本明細書で使用するように、「適正に折畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを含む機能性ドメインのすべてが明確に活性であるポリペプチド（たとえば抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体）を含む。本明細書で使用するように、「不適正に折畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能性ドメインの少なくとも１つが活性でないポリペプチドを含む。一実施形態において、適正に折畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合されたポリペプチド鎖を含み、反対に、不適正に折畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合されていないポリペプチド鎖を含む。
【００５３】
本明細書で使用するように、「改変された」という用語は、合成手段（たとえば組換え技法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素もしくは化学結合またはこれらの技法のある組合せによる）による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００５４】
「発現」という用語は本明細書で使用するように、遺伝子が生化学物質、たとえばポリペプチドを産生するプロセスを指す。プロセスは、制限なく、遺伝子ノックダウンはもちろんのこと、一過性発現および安定発現も含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の何らかの顕在化を含む。プロセスは制限なく、遺伝子のメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中への制限転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。所望の最終生成物が生化学物質である場合、発現はその生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用するように、遺伝子産物は、核酸、たとえば遺伝子の転写によって産生されたメッセンジャＲＮＡ、または転写物から翻訳されたポリペプチドのどちらかであり得る。本明細書に記載する遺伝子産物は、翻訳後修飾、たとえばポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、たとえばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの結合、タンパク質分解的切断などを有するポリペプチドをさらに含む。
【００５５】
本明細書で使用するように、「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的方策の両方を指し、目的は望ましくない生理学的変化または障害、たとえば疾患状態の進行を予防または減速（減少）することである。有益なまたは所望の臨床結果は、これに限定されるわけではないが、検出可能または検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、安定した（すなわち悪化していない）疾患の状況、疾患進行の遅延または減速、疾患状況の改善または緩和、および寛解（一部または完全にかかわらず）を含む。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存と比較した、延長する生存も意味することができる。処置を必要とする人々は、すでに状態または障害を持つ人々はもちろんのこと、状態または障害を有しやすい人々または状態または障害が予防される人々を含む。
【００５６】
「対象」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、牧畜、ならびに動物園、競技、またはペット用動物、たとえばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、肉牛、乳牛などを含む。
【００５７】
本明細書で使用するように、「抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の投与から恩恵を受けるであろう対象」および「処置が必要な動物」などの句は、たとえば抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体によって血栓症を抑制するために使用された抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の投与から恩恵を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
【００５８】
本発明の常法は、別途指摘しない限り、当分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法を利用するであろう。このような技法は、文献で十分に説明されている。たとえば      
【００５９】
【数１】
2011504371.tif 000002
を参照。
【００６０】
抗体工学の一般原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄら、ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）；およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に記載されている。さらに、当分野で公知であり、特に記載されていない免疫学の標準方法は一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら、ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）にあるように従った。
【００６１】
免疫学の一般原理について記載している標準参考研究は、
【００６２】
【数２】
2011504371.tif 000003
を含む。
【００６３】
ＩＩＩ．ヒト第ＸＩ因子
ヒト第ＸＩ因子は、分子量が約１６０，０００ダルトンの２本鎖糖タンパク質である。２本の鎖は、分子量が約８０，０００ダルトンの同じジスルフィド結合ポリペプチドである。第ＸＩ因子は、第ＸＩＩａ因子によって活性化されて、第ＸＩａ因子となる。ヒト第ＸＩ因子のアミノ酸配列は決定されており（たとえばＦｕｊｉｋａｗａら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４を参照）、配列番号１として与えられている。ヒトでは、ＦＸＩの遺伝子は、染色体４（４ｑ３５．２）の遠位端に位置しており、ゲノムＤＮＡの〜２５ｋｂにわたって広がる１５エキソンを含有する（Ａｓａｋｉら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：７２２１−７２２８；Ｋａｔｏら（１９８９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．５２：７７）。
【００６４】
第ＸＩ因子の第ＸＩＩａ因子による活性化のための切断部位は、各ペプチド鎖のＡｒｇ−３６９とＩｌｅ−３７０との間の内部ペプチド結合である（Ｆｕｊｉｋａｗａら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４）。第ＸＩａ因子の各重鎖（３６９アミノ酸）は、アップルドメインと呼ばれる９０〜９１アミノ酸の４つのタンデム反復（Ａ１〜Ａ４と呼ばれる）に加えて短い接続ペプチドを含有する（Ｆｕｊｉｋａｗａら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４；Ｓｕｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６３７３−３６３７８）。第ＸＩａ因子の軽鎖（それぞれ２３８アミノ酸）は、セリンプロテアーゼのトリプシンファミリに特有である配列を持つ酵素の触媒部分を含有する（Ｆｕｊｉｋａｗａら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４）。ＸＩａは、第ＸＩ因子Ａ３ドメインを必要とする相互作用において、その基質である第ＩＸ因子をタンパク質分解によって切断する（Ｓｕｎ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｇａｉｌａｎｉ，Ｄ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９０２３−２９０２８）。
【００６５】
ＩＶ．抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体
一実施形態において、本発明は、その抗原結合断片、変異体、または誘導体を含む、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体に関する。本明細書で使用するように、「抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体」という用語は、ヒト第ＸＩ因子、特にヒトＦＸＩの重鎖のＡ３ドメイン（配列番号１の位置１８２〜２６５）内のエピトープを特異的に認識する抗体である。一実施形態において、エピトープは、ヒトＦＸＩのＡ３ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸を含む。別の実施形態において、エピトープは：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２０３〜２０４；ｃ）配列番号１のアミノ酸２３４〜２３６；ｄ）配列番号１のアミノ酸２４１〜２４３；ｅ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｆ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択される。詳細な実施形態において、エピトープは：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｃ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択される。
【００６６】
別の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、ヒトＦＸＩの重鎖のＡ３ドメイン（配列番号１の位置１８２〜２６５）からの２以上のアミノ酸を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。また別の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２０３〜２０４；ｃ）配列番号１のアミノ酸２３４〜２３６；ｄ）配列番号１のアミノ酸２４１〜２４３；ｅ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｆ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。詳細な実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は：ａ）配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７；ｂ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２５４；およびｃ）配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである抗原に対して結合特異性を有する。
【００６７】
その抗原結合断片、変異体、または誘導体を含む、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は生物活性である。「生物活性」という用語は本明細書で使用するように、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の抗血栓活性に関連する次の生理学的活性：１）活性化第ＸＩ因子の凝固活性の抑制；２）第ＸＩ因子の活性化の予防；および３）対象の循環系からの第ＸＩ因子のクリアランスの促進の１つ以上を指す。
【００６８】
一実施形態において、「生物活性」という用語は、活性化ヒト第ＸＩ因子の凝固活性を抑制することを指す。「凝固活性を抑制する」という句は本明細書で使用するように、活性化第ＸＩ因子が血餅形成を生じさせる能力を低下させることを指す。凝固活性が抑制されたか否かを判定する方法は、血漿または全血サンプル中での血餅強度および／または血餅形成までの時間の長さを測定するアッセイの使用を含む。したがって、凝固活性の抑制は本明細書で使用するように、少なくとも５％の逆転、少なくとも１０％の逆転、少なくとも２０％の逆転、少なくとも３０％の逆転、少なくとも４０％の逆転、少なくとも５０％の逆転、少なくとも６０％の逆転、少なくとも７０％の逆転、少なくとも８０％の逆転、少なくとも９０％の逆転、および最大１００％の逆転（１００％を含む）を含む、凝固薬の効果を少なくとも部分的に逆転させることを指す。「逆転」という用語は本明細書で使用するように、血餅形成開始までの時間を延長することまたは血餅強度を低下させることを指す。血餅形成開始および血餅強度を測定するアッセイは、当分野で周知であり、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標）、およびＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）システムを使用するトロンビン生成の連続監視（たとえばＢａｎｅｚら（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，７４：５６９−５７４；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｓｓｅｌａａｒら（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６３：１６−２３；Ｋａｗａｓａｋｉら（２００４）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ＆  Ａｎａｌｇｅｓｉａ，９９：１４４０−１４４４；Ｈｅｍｋｅｒら（２００３）Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ＆  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，３３：４−１５を参照）を含む。
【００６９】
一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ株化細胞１Ａ６によって産生される。
【００７０】
本発明は、ヒト第ＸＩ因子に結合するヒト化抗第ＸＩ因子抗体にも関する。いくつかの実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、少なくとも１つの最適化相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。「最適化ＣＤＲ」とは、ＣＤＲが、最適化ＣＤＲを含む抗第ＸＩ因子抗体に与えられている、持続もしくは改善された結合親和性および／または抗第ＸＩ因子活性に基づいて選択された、修飾および最適された配列であったことを意図する。「抗第ＸＩ因子活性」または「第ＸＩ因子遮断活性」は、本明細書の別の箇所で記載するように、次の生理学的活性：１）活性化第ＸＩ因子の凝固活性の抑制；２）第ＸＩ因子の活性化の予防；および３）対象の循環系からの第ＸＩ因子のクリアランスの促進；の１つ以上を含むことができる。
【００７１】
修飾は、抗第ＸＩ因子抗体が第ＸＩ因子抗原に対する特異性を保持して、改善された結合親和性および／または改善された抗第ＸＩ因子活性を有するような、ＣＤＲ内のアミノ酸残基の置換を含む。本発明の抗第ＸＩ因子抗体の抗第ＸＩ因子活性は、本明細書に記載するような機能アッセイにおいて、ａＸＩＭａｂ（１Ａ６）と比較して改善されている。本発明の新規抗第ＸＩ因子抗体およびその好適な抗体結合断片、変異体、および誘導体も、標準アッセイで測定されたように、ａＸＩＭａｂ（１Ａ６）によって示される活性に少なくとも類似した抗第ＸＩ活性を示す。本発明の最適化ＣＤＲは、抗第ＸＩ因子抗体の重鎖および軽鎖それぞれのＶＨおよびＶＬドメインに利用される。本発明の例示的な抗第ＸＩ因子抗体は、配列番号３および７から成る群より選択されるＶＨドメイン、もしく／または配列番号５および９から成る群より選択されるＶＬドメインを含む。
【００７２】
本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、少なくとも１つの最適化相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。「最適化ＣＤＲ」とは、ＣＤＲが、最適化ＣＤＲを含む抗第ＸＩ因子抗体に与えられている改善された結合親和性および／または改善されたＣＤＣ活性に基づいて選択された、修飾および最適化された配列であったことを意図する。修飾は、抗第ＸＩ因子抗体が第ＸＩ因子抗原に対する特異性を保持して、改善もしくは持続された結合親和性および／または抗第ＸＩ因子活性を有するような、ＣＤＲ内のアミノ酸残基の置換を含む。本発明の抗第ＸＩ因子抗体の抗第ＸＩ因子活性は、本明細書に記載するような機能アッセイにおいて、ａＸＩＭａｂ（１Ａ６）と比較して改善または持続されている。本発明の最適化ＣＤＲは、抗ヒト第ＸＩ因子抗体の重鎖および軽鎖それぞれのＶＨおよびＶＬドメインに利用される。本発明の例示的な抗第ＸＩ因子抗体は、配列番号３および７から成る群より選択されるＶＨドメイン、ならびに／または配列番号５および９から成る群より選択されるＶＬドメインを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、最適化ＣＤＲを含む。すなわち、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、配列番号１０〜１５から成る群より選択された少なくとも１つの最適化ＣＤＲアミノ酸配列または配列番号１０〜１５から成る群より選択された配列に少なくとも約６５％の、約７０％の、約７５％の、約８０％の、約８５％の、約９０％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、約９９％の、もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。すなわち、最適化ＣＤＲは、配列番号１０〜１５で示した配列および関与するＣＤＲに応じて、少なくとも１、２、３、４、または５のアミノ酸置換を有する配列番号１０〜１５の配列を含む。
【００７４】
それゆえ、いくつかの実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は：
ａ）配列番号：１０、１１、または１２で示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ；および
ｂ）配列番号：１０、１１、または１２で示すアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ；
から成る群より選択される、少なくとも１つの最適化ＣＤＲを有するＶＨドメインを含む。
【００７５】
他の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は：
ａ）配列番号１３、１４、または１５で示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ；および
ｂ）配列番号１３、１４、または１５で示すアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ；
から成る群より選択される、少なくとも１つの最適化ＣＤＲを有するＶＬドメインを含む。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメインは、配列番号１０、１１、または１２で示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つの最適化ＣＤＲを有し、前記ＶＬドメインは、配列番号１３、１４、または１５で示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つの最適化ＣＤＲを有する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の最適化ＣＤＲの少なくとも１つを含む抗第ＸＩ因子抗体は、ＩｇＧカッパ免疫グロブリンである。このような実施形態において、ＩｇＧカッパ免疫グロブリンは、免疫グロブリンの重鎖内のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域および免疫グロブリンの軽鎖内のヒトカッパ定常領域を含むことができる。詳細な実施形態において、ＩｇＧカッパ免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメイン内および軽鎖の可変ドメイン内に完全または部分ヒトフレームワーク領域を含む。他の実施形態において、ＩｇＧカッパ免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメイン内および軽鎖の可変ドメイン内にマウスフレームワーク領域を含む。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、配列番号３もしくは７で示すアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号５もしくは９で示すアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または配列番号３、５、７、および９で示す配列に少なくとも約８０％、８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
本発明のまた他の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体はＶＨドメインを含み、ＶＨドメインは：
ａ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン;および
ｂ）配列番号３または７で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
から成る群より選択される。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子抗体はＶＬドメインを含み、ＶＬドメインは：
ａ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列を含むＶＬドメイン;および
ｂ）配列番号５または９で示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
から成る群より選択される。
【００８１】
抗第ＸＩ因子抗体結合特異性を測定する方法は、これに限定されるわけではないが、標準競合的結合アッセイ、Ｔ細胞またはＢ細胞による免疫グロブリン分泌を監視するアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなどを含む。たとえばＷＯ  ９３／１４１２５；Ｓｈｉら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：６３３−６４２；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈら（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１１７５−１１８１；Ｗａｔａｎａｂｅら（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：４３２１−４３２８；Ｗａｎｇら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：３４９８−３５０４；およびＧｉｒａｕｄｏｎら（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２（２）：１２４６−１２５５に開示されているようなアッセイを参照、このすべては参照により本明細書に組み入れられている。
【００８２】
抗第ＸＩ因子抗体の好適な生物活性変異体は、本発明の方法で使用できる。このような変異体は、親抗第ＸＩ因子抗体の所望の結合特性を保持するであろう。抗体変異体を作製する方法は、当分野で一般に利用できる。たとえば、第ＸＩ因子抗体、抗体領域、または重鎖もしくは軽鎖の抗体可変ドメインのアミノ酸配列変異体は、興味のあるアミノ酸配列をコードするクローン化ＤＮＡにおける突然変異によって調製できる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列改変の方法は、当分野で周知である。たとえば、参照により本明細書に組み入れられている、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８７３，１９２；およびそこで引用された参考文献を参照。興味のあるポリペプチドの生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する案内は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．），ｐｐ．３４５−３５２におけるＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）のモデルに見出され得る。Ｄａｙｈｏｆｆらのモデルは、受容点突然変異（ＰＡＭ）アミノ酸類似性マトリクス（ＰＡＭ  ２５０マトリクス）を使用して、好適な保存的アミノ酸置換を決定する。保存的置換、たとえば１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換することが好ましいことがある。ＤａｙｈｏｆｆらのモデルのＰＡＭ２５０マトリクスによって教示されるような保存的アミノ酸置換の例は、これに限定されるわけではないが、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒを含む。
【００８３】
興味のある抗第ＸＩ因子抗体ポリペプチドの変異体を構築するには、変異体が所望の特性を持ち続けるように、すなわちヒト細胞の表面で発現されたまたはヒト表面によって分泌されたヒト第ＸＩ因子抗原に特異的に結合可能であり、第ＸＩ因子遮断活性を有することができるように、修飾は本明細書に記載されているように行われる。明らかに、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡにて行われた任意の突然変異は、読み枠からの配列を置換してはならず、好ましくは、第２のｍＲＮＡ構造を産生できる相補領域を生成しないであろう。たとえばＥＰ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．７５，４４４を参照。
【００８４】
さらに、抗第ＸＩ因子抗体の定常領域は、変異されていくつかの方法でエフェクタ機能を改変することができる。たとえば、Ｆｃ受容体に結合する抗体を最適化するＦｃ突然変異を開示する、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，７３７，０５６Ｂ１およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４／０１３２１０１Ａ１を参照。
【００８５】
好ましくは、参照抗第ＸＩ因子抗体の変異体は、参照第ＸＩ因子抗体分子のアミノ酸配列に、または参照抗体分子のより短い部分に少なくとも約８０％の、約８５％の、約８８％の、約９０％の、約９１％の、約９２％の、約９３％の、約９４％の、または約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらに詳細には、分子は、少なくとも約９６％の、約９７％の、約９８％の、または約９９％の配列同一性を共有する。本明細書で議論するとき、本明細書で開示する定常領域、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、およびＶＬドメインを含む、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはなお約１００％同一であるか否かは、当分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、たとえばこれに限定されるわけではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して判定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９の局所的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを発見する。ＢＥＳＴＦＩＴまたはその他の配列アラインメントプログラムを使用して特定の配列がたとえば、本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを判定するときに、パラメータはもちろん、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、および参照配列内のアミノ酸の総数の最大５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【００８６】
本発明の目的では、配列同一性パーセントは、１２のギャップ・オープン・ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスでのアフィンギャップ検索を用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示されている。変異体はたとえば、参照抗第ＸＩ因子抗体とは、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基、たとえば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、またはなお１アミノ酸残基だけ異なり得る。
【００８７】
２つのアミノ酸配列の最適アラインメントに関して、変異体アミノ酸配列の隣接セグメントは、参照アミノ酸配列と比較して付加アミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に使用する隣接セグメントは、少なくとも２０隣接アミノ酸残基を含むであろうし、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップと関連する配列同一性の補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを参照）。
【００８８】
任意の２つのポリペプチド配列が比較のために最適に整列されたとき、アラインメント内で互いに対向して出現する残基が、互いに対応するその各ポリペプチド内の位置を占有することが認識される。このような位置は本明細書で「対応位置」と呼ばれ、対応位置に存在する残基は、「対応残基」または互いに「対応する」残基と呼ばれる。それゆえたとえば、興味のあるポリペプチドが、たとえば１０残基を有する参照ポリペプチド配列に対して最適に整列されている場合、参照配列の残基５に対向して出現する興味のあるポリペプチド内の残基は、参照配列の「残基５に対応する位置における残基」と呼ばれる。
【００８９】
第ＸＩ因子を特異的に結合して、所望の第ＸＩ因子遮断活性を保持することができるポリペプチドの正確な化学構造は、いくつかの因子に依存している。イオン化アミノ基およびカルボキシル基が分子内に存在するとき、特定のポリペプチドは酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形で得ることができる。好適な環境条件に配置されたときにその生物活性を保持する、このようなすべての調製物は、本明細書で使用するような抗第ＸＩ因子抗体の定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの１次アミノ酸配列は、糖部分を使用する誘導体化（グリコシル化）によって、または脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の補助分子によって増大され得る。それはサッカライドとの結合によっても増大され得る。このような増大のある態様は、産生宿主の翻訳後処理系によって達成される；他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。いずれにしても、このような修飾は、抗第ＸＩ因子抗体の所望の特性が破壊されない限り、本明細書で使用する抗第ＸＩ因子抗体の定義に含まれる。このような修飾は、各種のアッセイにおいて、ポリペプチドの活性の増強または低下のどちらかによって、活性に対して定量的または定性的に影響を及ぼし得る。さらに、鎖内の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって修飾することができ、ポリペプチドは切断されて活性を保持する断片を得ることができる。所望の特性（すなわち第ＸＩ因子に対する結合特異性および第ＸＩ因子遮断活性）を破壊しない、このような改変によって、本明細書で使用するような興味のある抗第ＸＩ因子抗体の定義からポリペプチド配列は排除されない。
【００９０】
当分野は、ポリペプチド変異体の調製および使用に関する実質的な指針を提供する。抗第ＸＩ因子抗体変異体の調製において、当業者は、本発明の方法で使用する製薬組成物の治療活性成分として使用するのに好適である変異体を生じるであろう、未変性タンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する修飾をただちに決定できる。
【００９１】
ある抗第ＸＩ因子抗体において、Ｆｃ部分は、当分野で公知の技法を使用して、エフェクタ機能を低下させるために突然変異され得る。たとえば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の手段による）は、循環する修飾抗体のＦｃ受容体結合を減少させて、それにより腫瘍局在化を増加させることがある。他の場合では、本発明と一致する定常領域修飾が補体結合を抑制して、それゆえ結合した細胞毒の血清半減期および非特異的会合を低減するということがあり得る。定常領域のまた他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体柔軟性の上昇のために局在化が増強されるジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分が修飾され得る。修飾の得られた生理学的特性、生物学的利用能および他の生化学的効果、たとえば腫瘍局在化、体内分布および血清半減期は、過度の実験を伴わずに、周知の免疫学的技法を使用して容易に測定および定量され得る。
【００９２】
本発明の抗第ＸＩ因子抗体は、共有結合によって抗体がその同族エピトープに特異的結合することが防止されないように、たとえば任意の種類の分子の抗体への共有結合によって修飾される誘導体も含む。たとえば、しかし制限なく、抗体誘導体は、たとえばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のいずれも、これに限定されるわけではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含む、公知の技法によって実施され得る。さらに、誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【００９３】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷の側鎖を持つアミノ酸残基によって置換されるものである。同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当分野で定義されている。これらのファミリは、塩基性側鎖（たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。または、突然変異は、たとえば飽和突然変異誘発によってコード化配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することが可能であり、得られた突然変異を生物活性についてスクリーニングして、活性（たとえば抗第ＸＩ因子ポリペプチドに結合する能力）を保持する突然変異を同定することができる。
【００９４】
たとえば、抗体分子のフレームワーク領域のみに、またはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することができる。導入された突然変異は、サイレントまたは中立的ミスセンス突然変異であり得る、すなわち抗体が抗原を結合する能力に全くまたはほとんど影響がない。これらの種類の突然変異は、コドン使用頻度を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。または、非中立的ミスセンス突然変異は、抗体が抗原を結合する能力を改変し得る。大半のサイレントおよび中立的ミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内にあると考えられるのに対して、大半の非中立的ミスセンス突然変異の位置はＣＤＲ内にあると考えられるが、このことは絶対要件ではない。当業者は、抗原結合活性の改変なしまたは結合活性の改変（たとえば抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）などの所望の特性を備えた突然変異分子を設計および試験することができるであろう。突然変異誘発の後に、コード化タンパク質が通常発現され得て、コード化タンパク質の機能および／または生物活性（たとえば第ＸＩ因子ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを免疫特異的に結合する能力）は、本明細書に記載した技法を使用して、または当分野で公知の通常の修飾技法によって決定できる。
【００９５】
Ｖ．融合タンパク質および抗体コンジュゲート
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、ＮもしくはＣ末端にて異種ポリペプチドに組換えによって融合され得るか、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合され得る（共有または非共有結合を含む）。たとえば、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクタ分子に組換えによって融合または結合され得る。たとえばＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＷＯ  ９２／０８４９５；ＷＯ  ９１／１４４３８；ＷＯ  ８９／１２６２４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，３１４，９９５；およびＥＰ  ３９６，３８７を参照。
【００９６】
本発明は、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。たとえば、抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能に有用であり、ポリペプチドのインビボ半減期を延長して、または精製もしくは検出を容易にするマーカー配列であり得る（たとえばＬｅｏｎｇら（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２００２）５４：５３１；Ｗｅｉｒら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２；Ｇｅｎｔｚら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７を参照）。
【００９７】
融合タンパク質は、当分野で周知である方法を使用して調製できる（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，１１６，９６４および５，２２５，５３８を参照）。融合が作製される正確な部位は経験的に選択されて、融合タンパク質の結合特徴が最適化され得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは次に、発現のために宿主細胞内にトランスフェクトされる。
【００９８】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、分子の治療特性を改善するために、標的検出を容易にするために、または対象の撮像もしくは治療のために、非結合形で使用され得るか、または各種の分子の少なくとも１つに結合され得る。詳細には、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物応答調節剤、薬剤、またはＰＥＧに結合され得る。各種の部分を抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体に結合する技法は周知であり、たとえば
【００９９】
【数３】
2011504371.tif 000004
を参照。
【０１００】
ＶＩ．抗第ＸＩ因子抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗第ＸＩ因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
【０１０１】
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）をコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供し、該ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号１０〜１２のいずれか１つに少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖ドメイン（ＶLドメイン）をコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供し、該ＶLドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号１３〜１５のいずれか１つに少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号３および７から成る群より選択される参照ＶＨドメインポリペプチド配列に少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインをコードする核酸核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを含み、コード化ＶＨドメインを含む抗第ＸＩ因子抗体は、第ＸＩ因子に特異的または優先的に結合する。
【０１０４】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号５および９から成る群より選択される参照ＶＬドメインポリペプチド配列に少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインをコードする核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを含み、コード化ＶＬドメインを含む抗第ＸＩ因子抗体は、第ＸＩ因子に特異的または優先的に結合する。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２、４、６、および８から成る群より選択される参照ポリヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である核酸を含む、同核酸より本質的に成る、または同核酸より成る単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１０６】
上述のポリヌクレオチドのいずれかはさらに、たとえばコード化ポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載する抗体定常領域、または本明細書に記載する他の異種ポリペプチドをコードするさらなる核酸を含み得る。また、本明細書の別の箇所でさらに詳細に記載するように、本発明は、上述のポリヌクレオチドの１つ以上を含む組成物を含む。一実施形態において、本発明は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む組成物を含み、前記第１のポリヌクレオチドは本明細書に記載するＶＨドメインをコードして、前記第２のポリヌクレオチドは本明細書に記載するＶＬドメインをコードする。特に、配列番号３および７から成る群より選択されるＶＨドメイン、ならびに／または配列番号５および９から成る群より選択されるＶＬドメインを含む、同ドメインから本質的に成る、または同ドメインから成る組成物。
【０１０７】
本発明は、別の箇所で記載されているように、本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、本明細書に記載するように、融合ポリポリペプチド、Ｆａｂ断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明で検討される。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、当分野で公知の任意の方法によって産生または製造され得る。たとえば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから構築されることがあり（たとえばＫｕｔｍｅｉｅｒら（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２に記載されているように）、これは簡潔には、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび結合と、次いで結合したオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅とを含む。
【０１０９】
または、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合は、抗体をコードする核酸は、化学的に合成され得るか、または好適な供給源（たとえば抗体ｃＤＮＡライブラリ、または抗体または他の抗第ＸＩ因子抗体を発現する任意の組織または細胞、たとえば抗体を発現させるために選択されたハイブリドーマから、生成されたｃＤＮＡライブラリ、もしくは単離された核酸、特にポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’端にハイブリダイズ可能な合成プライマを使用するＰＣＲ増幅によって、または抗体もしくは他の抗第ＸＩ因子抗体をコードするｃＤＮＡライブラリから、たとえばｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって入手され得る。ＰＣＲによって産生された増幅核酸は次に、当分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター内にクローニングされ得る。
【０１１０】
抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当分野で周知の方法、たとえば組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（たとえば、どちらもその全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載された技法を参照）を使用して操作されて、たとえばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を形成するために異なるアミノ酸配列を有する抗体が生成され得る。
【０１１１】
第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができる。たとえば、第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、単鎖および２本鎖ＤＮＡ、単鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖または、さらに通例は２本鎖または１本鎖領域および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成することができる。さらに、第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域で構成することができる。第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基または安定性のためにもしくは他の理由で修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖も含有し得る。「修飾」塩基はたとえば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通ではない塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡには、多様な修飾を作製できる；それゆえ「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的修飾形を含む。
【０１１２】
免疫グロブリンに由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離ポリヌクレオチド（たとえば免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失がコード化タンパク質内に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に導入することによって形成できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準技法によって導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基にて作製される。
【０１１３】
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列は、周知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時にまたは個別にのどちらかで作製され得る。ＰＣＲは、公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマによって、またはさらに特異的なプライマによって開始され得る。上述のように、ＰＣＲは、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためも使用され得る。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマまたはマウス定常領域プローブなどのより大きい異種プローブによってスクリーニングされ得る。
【０１１４】
ＤＮＡ、通例プラスミドＤＮＡは、当分野で公知の技法を使用して細胞から単離され、たとえば組換えＤＮＡ技法に関する上述の参考文献で詳細に記載されている標準の周知の技法によって、制限マッピングおよび配列決定が行われ得る。もちろんＤＮＡは、本発明に従って、単離プロセスまたは次の分析の間の任意の時点にて合成され得る。
【０１１５】
本発明の第ＸＩ因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を提供するための単離遺伝物質の操作の後に、抗第ＸＩ因子抗体をコードするポリヌクレオチドは通例、所望の量の抗第ＸＩ因子抗体を産生するのに使用され得る宿主細胞内への導入のために発現ベクターに挿入される。
【０１１６】
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類似体、たとえば本明細書に記載する標的分子、たとえば第ＸＩ因子に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が含まれる。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド、または（好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する）その部分が得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。それゆえ、抗体コード化ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法は、抗体コード化配列ならびに転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法はたとえば、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えを含む。それゆえ本発明は、プロモーターに作動可能に結合された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド範囲を含むことがあり（たとえばＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８６／０５８０７；ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８９／０１０３６；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１２２，４６４を参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。
【０１１７】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は本明細書では、宿主細胞内に導入して所望の遺伝子を発現させるためのビヒクルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスから成る群より容易に選択され得る。一般に、本発明に適合するベクターは、選択部位、所望の遺伝子のクローニングを促進する適切な制限部位ならびに真核生物細胞または原核生物細胞中へ進入および／または同細胞中で複製する能力を含むであろう。
【０１１８】
本発明の目的では、多数の発現ベクター系が利用され得る。たとえば、１つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。その他は、内部リボソーム結合部位のあるポリシストロン系の使用を含む。さらに、その染色体内にＤＮＡを組込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（たとえば抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接結合すること、または同時形質転換によって同じ細胞内に導入されることのどちらかが可能である。ｍＲＮＡの最適合成には、さらなる要素も必要であり得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナルはもちろんのこと、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
【０１１９】
特に好ましい実施形態において、クローン化可変領域遺伝子は、発現ベクター内に上述のように合成された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と共に挿入される。もちろん、真核生物細胞中で発現を誘発することができるいずれの発現ベクターも、本発明で使用され得る。好適なベクターの例は、これに限定されるわけではないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）を含む。一般に、多数の形質転換細胞を、好適な高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現するものに関してスクリーニングすることは、たとえばロボットシステムによって実施可能な日常的な実験である。
【０１２０】
さらに一般に、抗第ＸＩ因子抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは好適な宿主細胞内に導入され得る。プラスミドの宿主細胞内への導入は、当業者に周知の各種の技法によって達成可能である。これらは、これに限定されるわけではないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質体融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、微量注入、および未処置ウイルスによる感染を含む。Ｒｉｄｇｗａｙ（１９８８）“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”ｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ｅｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２を参照。通例、宿主細胞内へのプラスミド導入は、電気穿孔による。発現構築物を持つ宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で培養して、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光標識細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。
【０１２１】
発現ベクターは慣習的な技法によって宿主細胞に移転され、トランスフェクトされた細胞は次に慣習的な技法によって培養されて、本明細書に記載した方法で使用するための抗体を産生する。それゆえ、本発明は、異種プロモーターに作動可能に結合された、本発明の抗体、またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。２本鎖抗体の発現の好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の療法をコードするベクターは、以下で詳説するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。
【０１２２】
本明細書で使用するように、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技法を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを持つ細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するプロセスの説明では、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、別途明確に規定しない限り、抗原の供給源を指すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈させた全細胞から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらかを意味し得る。
【０１２３】
多様な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載した方法で使用するための抗体分子を発現するのに使用され得る。このような宿主発現系は、興味のあるコード化配列がそれによって産生され、続いて精製され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード化配列によって形質転換またはトランスフェクトされたときに、本発明の抗体分子をインサイチューで発現し得る細胞も示す。これらは、これに限定されるわけではないが、微生物、たとえば抗体コード化配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード化配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード化配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくは抗体コード化配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（たとえばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（たとえばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含む。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞、およびさらに好ましくは、特に全組換え抗体分子の発現のための真核生物細胞は、組換え抗体分子の発現に使用される。たとえば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用した、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【０１２４】
タンパク質発現に使用される宿主株化細胞は、哺乳動物起源であることが多い；当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主株化細胞を優先的に決定する能力を備えていると見なされる。例示的な宿主株化細胞は、これに限定されるわけではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＣＶＩのＳＶ４０  Ｔ抗原による誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）を含む。宿主株化細胞は通例、商用サービスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開された文献から入手できる。
【０１２５】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾および処理する宿主株化細胞が選択され得る。タンパク質生成物のこのような修飾（たとえばグリコシル化）および処理（たとえば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。各種の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理および修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現された異種タンパク質の修飾および処理を確実にするために適切な株化細胞または宿主系を選択できる。このために、遺伝子産物の１次転写、グリコシル化、およびホスホリル化の適正な処理のための細胞機械を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。
【０１２６】
組換えタンパク質の長期の高収率での産生のためには、安定な発現が好ましい。たとえば、抗体分子を安定に発現する株化細胞が改変され得る。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御要素（たとえばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能マーカーによって制御されるＤＮＡによって形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、改変細胞は富化培地で１〜２日増殖させることができ、次に選択培地に切替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞にプラスミドをその染色体内に安定に組込んで増殖させ、次に株化細胞へのクローニングおよび増殖を可能にする増殖巣を形成する。この方法は、抗体分子を安定的に発現する株化細胞を改変するために好都合に使用され得る。
【０１２７】
これに限定されるわけではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２）を含むいくつかの選択系が使用され得て、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子はｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞それぞれで利用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、次の遺伝子：メトトレキセートに耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９８０）Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を与えるｎｅｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）；およびハイグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら（１９８４）Ｇｅｎｅ  ３０：１４７  の選択の基準として使用できる。使用可能である組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  ｉｎ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（ｅｄｓ）（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。
【０１２８】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ（１９８７）“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）Ｖｏｌ．３を参照  。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているため、抗体の産生も増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１２９】
インビトロ産生によって、スケールアップが可能となり、大量の所望のポリペプチドが得られる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養の技法は、当分野で公知であり、たとえばエアリフトリアクタもしくは連続撹拌リアクタ内の均質懸濁培養物、またはたとえば中空ファイバ、マイクロカプセル内の、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上の固定化または捕捉細胞培養物を含む。必要および／または所望ならば、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースによるクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィーによって、たとえば合成ヒンジ領域ポリペプチドの生合成の後に、または本明細書に記載するＨＩＣクロマトグラフィーのステップの前、または同ステップに続いて精製することができる。
【０１３０】
本発明の抗第ＸＩ因子抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする遺伝子は、細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞中でも発現できる。核酸をただちに取込む細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバを含む。細菌中で発現されるとき、異種ポリペプチドは通例、封入体の一部となることがさらに認識されるであろう。異種ポリペプチドは単離、精製、および次に機能分子内へ構築する必要がある。抗体の４価形が所望である場合、サブユニットは次に４価抗体内へ自己構築されるであろう（ＷＯ  ０２／０９６９４８Ａ２）。
【０１３１】
細菌系において、発現される抗体分子に意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが好都合に選択され得る。たとえば、抗体分子の医薬組成物の生成のために大量のこのようなタンパク質が産生されるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが所望であり得る。このようなベクターは、これに限定されるわけではないが、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード化配列がベクター中にインフレームでｌａｃＺコード化領域と個別に結合される、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）；などを含む。外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｐＧＥＸベクターも使用され得る。一般に、このようなタンパク質は可溶性であり、マトリクス・グルタチオン−アガロース・ビーズへの吸収および結合と、続いての遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているので、クローン化標的遺伝子産物はＧＳＴ部分から遊離することができる。
【０１３２】
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち通常のパン酵母は、真核生物微生物の中で最も一般に使用されるが、いくつかの他の菌株、たとえばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが一般に使用される。
【０１３３】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現では、たとえばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ７：  １４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １０：１５７）が一般に使用される。このプラスミドはＴＲＰ１遺伝子をすでに含有しており、ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異菌株、たとえばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１病巣の存在は次に、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するのに有効な環境を与える。
【０１３４】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は通例、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。抗体コード化配列は、ウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内に個別にクローニングされて、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１３５】
本発明の抗体分子がいったん組換え発現されると、それは免疫グロブリン分子の精製について当分野で公知の任意の方法によって、たとえばクロマトグラフィー（たとえばイオン交換、特にタンパク質Ａの後の特異的抗原に対する親和性による、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質精製のその他の標準技法によって精製され得る。または、本発明の抗体の親和性を上昇させる好ましい方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００２  ０１２３０５７  Ａｌに開示されている。
【０１３６】
ＶＩＩＩ．抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の使用方法
本発明の方法は、その抗原結合断片、変異体、および誘導体を含む、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の、血栓症の抑制の必要がある対象での血栓症の抑制のための使用に関する。以下の議論は、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体による各種の疾患および障害の方法および処置に言及するが、本明細書に記載する方法は、本発明抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の所望の特性を保持する、すなわちヒト第ＸＩ因子を特異的に結合可能であり、およびヒト第ＸＩ因子の凝固活性を抑制することができる、これらの抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の抗体結合断片、変異体、および誘導体にも適用される。
【０１３７】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、血栓症の抑制が有益であろう任意の対象に投与され得る。特に、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、止血を妨害しない抗血栓剤として、および在来の抗血栓剤の優れた代替物である抗血栓剤として、特に有用である。
【０１３８】
一実施形態において、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体は、血栓形成の結果として発生するものなどの、血管閉塞を特徴とする状態を処置するために使用され得る。血管閉塞を特徴とし、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を使用する処置または予防が正当であるとされる状態は、動脈血管系、毛細血管系、および静脈血管系と関係する状態を含む。
【０１３９】
冠状動脈において、動脈硬化プラークの破裂の後に閉塞性血栓形成が続くことが多い。この閉塞は、急性心筋梗塞および不安定狭心症の主な原因である。冠状動脈閉塞は、感染症、炎症、血栓溶解療法、血管形成術、および移植片配置の後にも発生する可能性がある。同様の原理は、動脈血管系の他の部分にも当てはまり、特に、一時的または永久脳虚血および脳卒中の主な原因である、頸動脈における血栓形成を含む。
【０１４０】
静脈血栓症は、うっ血、感染症、炎症反応、および下肢または腹部の大手術の後に起こることが多い。深部静脈血栓症は、血栓より遠位の部位からの血流低下を引き起こし、肺塞栓症の素因となる。肺塞栓症は、術後死亡の主要な原因である。本発明のモノクローナル抗体が有用である播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）は、細菌性敗血症、たとえば外傷および分娩後の血流への異物の侵入、免疫応答、炎症、あるウイルス感染症、ある血小板障害、および癌の間にあらゆる血管系で一般に発生する。播種性血管内凝固症候群は、多くの疾患状態およびたとえばヘパリンを含む一部の薬物処置の重篤な合併症である。凝固因子および血小板の血栓による消費、および全身性凝固によって、微小血管系に発生する生命を脅かす血栓の形成が引き起こされて、局所的または広汎性の低酸素症および臓器不全につながる。
【０１４１】
それゆえ、一実施形態において、有効量の本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を対象に投与するステップを含む、血栓症を抑制するの必要がある対象の血栓症を抑制する方法が提供され、特にここで血栓症は：１）急性冠症候群、たとえば心筋梗塞、不安定狭心症、難治性狭心症、血栓溶解療法後または冠動脈血管形成術の後に発生する閉塞性冠動脈血栓症；２）塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または一過性脳虚血発作を含む虚血性脳血管症候群；３）肺血栓塞栓症を含む、自発的または悪性腫瘍、外傷、または手術の状況のどちらかで発生する血管系にて発生する血栓症；４）敗血症または他の感染症、手術、妊娠、外傷、または悪性腫瘍の状況での、多臓器不全と関連する、または関連しない、ＡＲＤＳおよびＤＩＣ、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓性血管炎、またはヘパリン誘発性血小板減少症に関連する血栓症を含む凝固障害；５）体外循環に関連する血栓性合併症（たとえば腎臓透析、心肺バイパスまたは他の酸素投与処置、およびプラスマフェレーシス）；６）器具使用に関連する血栓性合併症（たとえば心臓または他の静脈内カテーテル法、大動脈内バルーンポンプ、および冠動脈ステントまたは心臓弁）および７）人工補装具の装着に関連する合併症に関連している。
【０１４２】
本明細書の別の箇所で記載するように、在来の抗血栓剤は、その最大有効用量で投与されるときに危険であるか、または致死的でさえある。したがって、別の実施形態において、対象に有効量の本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、血栓症の処置の必要がある対象の血栓症の処置において必要な用量を減少するまたは抗血栓剤の効果を補完する方法が提供される。在来の抗血栓剤は、直接もしくは間接トロンビン阻害剤、第Ｘ因子阻害剤、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩＩ因子阻害剤、第Ｖ因子阻害剤、第ＶＩＩＩ因子阻害剤、第ＸＩＩＩ因子阻害剤、第ＶＩＩ因子阻害剤、組織因子阻害剤、線維素溶解促進剤、線維素溶解もしくはフィブリノゲン溶解剤、カルボキシペプチダーゼＢ阻害剤、血小板阻害剤、選択的血小板数減少剤、または第ＸＩ因子阻害剤を含む。
【０１４３】
直接トロンビン阻害剤は、アルガトロバンおよびその誘導体または類似体、ヒルジンおよびその組換え体または合成誘導体または類似体、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトランおよびその誘導体、代謝産物または類似体、アニオン結合エキソサイト阻害剤、ならびにＲＮＡ／ＤＮＡアパタマーを含む。
【０１４４】
間接トロンビン阻害剤は、ヘパリン、クマリン、デルマタン、およびトロンボモジュリンを含む。
【０１４５】
第Ｘ因子阻害剤は、直接第Ｘａ因子阻害剤、リバロキサバン、第Ｘ因子に対する抗体、不活性化第Ｘａ因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
【０１４６】
第ＩＸ因子阻害剤は、第ＩＸ因子に対する抗体、直接第ＩＸａ因子阻害剤、または不活性化第ＩＸａ因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
【０１４７】
第ＸＩＩ因子阻害剤は、直接第ＸＩＩ因子阻害剤、トウモロコシトリプシン阻害剤、ＦＸＩＩに対する抗体、または不活性化第ＸＩＩａ因子またはその類似体もしくは誘導体を含む。
【０１４８】
第Ｖ因子阻害剤は、第Ｖ因子に対する抗体、活性化タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、またはその類似体および誘導体を含む。
【０１４９】
第ＶＩＩＩ因子阻害剤は、ＦＶＩＩＩに対する抗体、活性化タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、またはその類似体および誘導体を含む。
【０１５０】
第ＸＩＩＩ因子阻害剤は、第ＸＩＩＩ因子に対する抗体、直接第ＸＩＩＩａ因子阻害剤、または不活性化第ＸＩＩＩａ因子を含む。
【０１５１】
第ＶＩＩ因子阻害剤は、第ＶＩＩ因子に対する抗体、組織因子経路阻害剤、不活性化第ＶＩＩａ因子、または直接第ＶＩＩａ因子阻害剤またはその類似体および誘導体を含む。
【０１５２】
組織因子阻害剤は、組織因子経路阻害剤、組織因子に対する抗体、またはその類似体および誘導体を含む。
【０１５３】
線維素溶解促進剤は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子またはその誘導体を含む。
【０１５４】
線維素溶解またフィブリノゲン溶解剤は、プラスミン、マイクロプラスミン、アンクロド、またはその誘導体を含む。
【０１５５】
血小板阻害剤は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、またはその誘導体を含む。
【０１５６】
選択的血小板数減少剤は、ヒドロキシ尿素、アナグレリド、またはその誘導体を含む。
【０１５７】
第ＸＩ因子阻害剤は、直接第ＸＩａ因子阻害剤、第ＸＩ因子に対する他の抗体、不活性化第ＸＩａ因子、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
【０１５８】
別の実施形態において、対象に有効量の本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、転移癌を処置する必要がある対象の転移癌を処置する方法が提供される。
【０１５９】
また別の実施形態において、対象に本発明の有効量の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体を投与するステップを含む、急性炎症反応を処置する必要がある対象の急性炎症反応を処置する方法が提供される。
【０１６０】
本発明のさらなる実施形態において、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体が主活性剤であり、追加の活性剤と共に投与の必要がある対象に投与される併用療法が提供される。このような併用療法は、単一の組成物中での異なる活性剤の投与によって、異なる組成物中での異なる活性剤の同時投与によって、または異なる活性剤の連続投与によって実施され得る。併用療法は、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体が患者にすでに投与されていて、追加の活性剤が患者の投薬計画に追加される状況はもちろんのこと、異なる個人（たとえば医師または他の医療専門家）が併用の別々の成分を患者に投与している状況も含み得る。
【０１６１】
追加の活性剤は一般に、必ずではないが、血栓症を抑制するのに有効である活性剤であろう。好ましい実施形態において、追加の活性剤は、止血剤、すなわち止血を促進する薬剤である。本発明の併用療法で使用するための特に好ましい止血剤は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）または活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）を含む。ＦＶＩＩａおよびＡＰＣＣはどちらも、阻害剤誘発血友病患者の出血を処置するための止血剤として開発された（Ｓｃｈａｒｒｅｒ（１９９９）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，５：２５３−２５９；Ｓｈａｐｉｒｏら（１９９８）Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．，８０：７７３−７７８；Ｌｕｓｈｅｒら（１９８０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０３：４２１−４２５；Ｓｊａｍｓｏｅｄｉｎら（１９８１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：７１７−２１；Νｅｇｒｉｅｒら（１９９７）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７７：１１１３−１１１９）。ＡＰＣＣの主活性成分は、止血および血栓成長の両方に寄与するプロトロンビンである（Ａｋｈａｖａｎら（２０００）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８４：９８９−９９７；Ｘｉら（１９８９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６２：７８８−７９１）。対照的に、ＦＶＩＩａの血漿濃度を上昇させることは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体が第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化する組織因子（ＴＦ）依存性経路を主に通じて、トロンビンの生成を増加させることと考えられる（Ｈｏｆｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｎｒｏｅ（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８５：９５８−９６５）。
【０１６２】
ＩＸ．製薬組成物および投与方法
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、製薬的に許容される担体ビヒクルとの混合によってなどの、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って製剤することができる。好適なビヒクルおよびその製剤は、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１６ｔｈ  ｅｄ．，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ．），Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９８０））。有効な投与に好適な製薬的に許容される組成物を形成するために、このような組成物は、有効量の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、単独で、または好適な量の担体ビヒクルと共に、のどちらかで含有するであろう。
【０１６３】
「製薬的に許容される」という用語は本明細書で使用するように、生物活性であるが、レシピエントのヒトまたは動物の生理機能を、レシピエントの生存能力が損なわれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）程度までは破壊しない治療剤または化合物を指す。
【０１６４】
製薬組成物は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、たとえば滅菌水、生理食塩水、グルコースなどと混合して投与され得る。組成物は、投与経路および所望の調製物に応じて、補助剤、たとえば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または増粘添加剤、保存料、着香剤、着色料などを含有することができる。
【０１６５】
製薬組成物は、即時放出または制御放出のために製剤され得る。「吸収プール」は、特定の吸収部位にて投与される薬物の溶液を表し、ｋｒ、ｋａ、およびｋｅは１）製剤からの薬物の放出；２）吸収；および３）排出；それぞれの１次反応速度定数である。即時放出投薬形では、薬物放出の反応速度定数ｋｒは、吸収速度定数ｋａよりはるかに大きい。制御放出製剤では反対のことが当てはまり、すなわち、投薬形からの薬物の放出速度が、薬物の標的部位への送達における律速段階であるように、ｋｒ＜＜＜ｋａである。「制御放出」という用語は本明細書で使用するように、これに限定されるわけではないが、持続放出、遅延放出およびパルス放出製剤を含む、任意の非即時放出製剤を含む。
【０１６６】
本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を含む製薬組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路などの因子を考慮して、医学分野または獣医学分野の当業者に周知の投薬形および技法で投与することができる。投与経路は、安全で、かつ治療的に有効な用量の本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体を、動物またはヒトの血液に送達する任意の経路によることができる。投薬の形式は、これに限定されるわけではないが、全身、局所、経腸、および非経口投与経路を含む。経腸経路は、経口および消化管投与を含む。非経口経路は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、および経粘膜投与を含む。他の投与経路は、硬膜外またはくも膜下腔内投与を含む。
【０１６７】
有効投薬量および投与経路は、化合物の治療範囲および性質によって、および公知の因子、たとえば対象の年齢、体重、および状態はもちろんのこと、ＬＤ５０および公知であり、過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によっても決定される。
【０１６８】
「投薬量」という用語は本明細書で使用するように、動物またはヒトに投与される、本発明の抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体の量を指す。治療剤はレシピエントにボーラスとして、または持続（連続的または間欠的）送達によって送達され得る。投薬量の送達が、数分から数日、数週または数ヶ月のオーダーであり得る期間にわたって持続されるときに、または数年の期間にわたって慢性的に投与され得るときに、投薬量は治療剤の重量／ｋｇ患者の体重／送達単位時間として表され得る。
【０１６９】
「治療的有効用量もしくは量」または「有効量」は、投与時に処置の必要な患者の処置に関して、プラスの治療応答を引き起こす抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の量を意図する。本発明のいくつかの実施形態において、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の治療的有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。他の実施形態において、抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の治療的有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内に含まれる他のこのような用量を含む。処置法は治療的有効用量の単回投与または抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体の治療的有効用量の複数回投与を含み得る。
【０１７０】
次の例は、制限のためにではなく、例示のために与える。
【実施例】
【０１７１】
（実施例１）
モノクローナル抗体１Ａ６による第ＸＩ因子の抑制は、霊長類の実験的血栓症において、トロンビン産生を低下させ、血管閉塞を防止する
霊長類での本試験は、血栓形成におけるＦＸＩの役割の解明を補助するために、およびＦＸＩの抑制が血栓増殖を制限するための比較的安全な血栓症特異的手法に相当するか否かを判定するために設計した。局所的な凝血促進マーカーおよび線維素溶解マーカーを測定することによって、局所的トロンビン産生、血小板活性化および線維素溶解の独自の感受性の時間依存測定値を評価した。ＦＸＩの役割を説明するために、ＦＸＩに対する強力な単一特異性抗体を使用する試験も実施した。血栓形成デバイスへの血小板および線維素沈着を評価し、血管移植片閉塞試験を実施して、動脈型剪断の下での比較的大規模な実験的血栓の増殖および安定性におけるＦＸＩの重要性を判定した。これらの結果によって、ＦＸＩは生成する血栓の流動面での堅調なトロンビン生成および血小板活性化を促進可能であり、これが血栓の成長および安定性に寄与することが初めてインビボで証明される。これらの結果は、線維素溶解のＦＸＩに関連する抑制が、急速に増殖する動脈型血栓の分解の制限において、最大限でもわすかな役割しか果たさないことも示している。
【０１７２】
方法
実験動物。合計３９回の非ターミナル試験を、体重９〜１１ｋｇの正常な若年オスヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）１７頭に対して実施した。実験は、別の箇所で記載したように、長期露出された動静脈（ＡＶ）シャントが大腿動脈と静脈との間に以前に配置された非抗凝固剤処置覚醒動物に対して実施した（Ｈａｎｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３−２０１２）。基準シャント血流量が、全実験動物で２５０ｍｌ／分を超えた。不安は低用量のケタミン（＜２ｍｇ／ｋｇ／時）で管理した。血小板数、赤血球数、およびヘマトクリットは毎日、実験の前後に測定した。計算した失血量は、いずれの実験日でも総血液量の４％を超えなかった。
【０１７３】
血栓症モデル。血栓形成は、以前記載されたように、人工血管移植片の血栓形成セグメント（ｅＰＴＦＥ，ＷＬ  Ｇｏｒｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｆｌａｇｓｔａｆｆ，ＡＺ）を挿入することによって、ヒヒＡＶシャント内で開始した（Ｈａｎｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３−２０１２）。血小板依存性血栓形成を常に誘発するために、臨床移植片セグメントには固定化コラーゲンでコーティングした。内径（ｉ．ｄ．）が２ｍｍまたは４ｍｍのどちらかの２０ｍｍ長移植片は、ウマＩ型コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｒｚｅｎｍｉｔｔｅｌ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１５分間充填して、次に滅菌気流下で一晩乾燥させた。この方法は、走査型電子顕微鏡によって決定されたように、移植片管腔内に均一なコラーゲンコーティングを産生した（図１Ｂおよび１Ｃ）。血管形成コラーゲンコート移植片は次に、シリコーンゴムチューブのセグメント間に組み入れて、ＡＶシャント内へ展開させた（図１Ａ）。移植片を血液に最長６０分間曝露した。各実験の間に、近位のシリコーンゴムのシャントセグメントをクランプ固定することによって、移植片を通る血液流量を１００ｍｌ／分に制限して、それにより４ｍｍ移植片では２６５ｓ−１の平均壁剪断速度（ＭＷＳＲ）が生じたのに対して、２ｍｍ移植片では初期ＭＷＳＲは２１２０ｓ−１であった。流量は、超音波流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を使用して常に監視した。血栓形成移植片セグメントを６０分で除去するまで、４ｍｍ移植片は閉塞せず、拍動性流量は１００ｍｌ／分のままであった。永久シャントを通る基準血流量は、各実験後に回復した。２ｍｍ径移植片では、血流量は血栓形成のために次第に減少した。切迫した閉塞を知らせる、流量の１００ｍｌ／分から２０ｍｌ／分以下への低下時に、ＡＶシャントから移植片を除去した。血流開始から移植片除去までの時間（＜２０ｍｌ／分血流）を閉塞時間と見なした。
【０１７４】
血小板沈着の撮像のために、以前に記載されたように、ヒヒ自己血小板を１１１Ｉｎ−オキシン１ｍＣｉで標識した（Ｈａｎｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３−２０１２）。試験を実施する前に、標識血小板を注入して、少なくとも１時間循環させた。血管形成移植片への標識血小板の蓄積は、ガンマ・シンチレーション・カメラを使用して５分間隔で測定した。相同１２５Ｉ−標識ヒヒフィブリノゲン（４μＣｉ、＞９０％血餅形成性）を各試験の１０分前に注入して、血栓への標識フィブリンの包含を、１１１Ｉｎを崩壊させるためにガンマカウンタを使用して３０日後に評価した。沈着した放射能（ｃｐｍ）を、元の試験の時間に採取したサンプルの血餅形成性のフィブリン（フィブリノゲン）放射能（ｃｐｍ／ｍｇ）で割った。
【０１７５】
閉塞試験は、高い動脈剪断速度（１００ｍｌ／分のクランプ固定血流量にて２１２０ｓ−１）を生じる１０ｍｍ長２ｍｍ  ｉ．ｄ．のコラーゲン・コート・デバイスを使用した。２ｍｍ血管形成移植片への標識血小板の蓄積は、ガンマ・シンチレーション・カメラを使用して３分間隔で測定した。血流量は、できるだけ長く近位でクランプ固定することによって１００ｍｌ／分に維持して、次に増殖血栓によりデバイスが閉塞され始めたら減少させた。２０ｍｌ／分の最終血流量を閉塞のカットオフとして使用したのは、血栓による完全な閉塞とデバイスに血流が通らないと、シャントの閉塞と、動物への著しい失血が起きるおそれがあるためであった。
【０１７６】
サンプリング方法。新規の局所サンプリング方法を使用して、増殖実験血栓の表面を灌流する血液をサンプリングすることによって、血栓形成メディエータの局所産生を評価した。血栓マーカーは急速に分解されて循環から排除することができるため、全身サンプリングはより微小な変化を検出する感受性が不足することがあり、このようなマーカー産生の位置を確証することができない。すべての血液サンプルを１／１０ｔｈ体積の３．８％クエン酸抗凝固剤の中に収集した。全身サンプル（各１ｍｌ）を血栓症開始前はもちろんのこと、各試験の３０および６０分にも収集した。合計６つの局所血液サンプルは、末梢血ＩＢＬから１００μｌ／分の速度にて１０分間隔で、増加する血栓の１０ｍｍ遠位側に位置する０．６４ｍｍポートから採取した（図１Ａ）。サンプルポートの開通性を維持するために、トロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、および各種の他のセリンプロテアーゼを直接抑制するＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ、０．５ｍｇ／ｍｌ）抗凝固剤（Ａｎｇｌｉｋｅｒら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２５６：４８１−４８６）を、再度同じ０．６４ｍｍポートを使用して、２０μｌ／分の速度ですぐ上流に注入した。注入およびサンプリングは、注射器ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によって調節した。局所サンプリングは、本試験では４ｍｍ  ｉ．ｄ．デバイスによってのみ実施した。ＰＰＡＣＫも連続血清サンプル中で測定した全身プロトロンビン時間（ＰＴ）または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に影響を及ぼさず、ＰＰＡＣＫを用いた局所サンプリングもこのモデルの歴史的結果と比較してコラーゲンコート移植片への血小板またはフィブリン沈着に影響を及ぼさなかった。
【０１７７】
対照試験では、通常の長さのシリコーンゴム延長チューブを、血栓形成デバイスを挿入せずに使用した。チューブを切断して、同じ移植片挿入位置に再び取り付けた。サンプルおよび抗凝固剤注入ポートを上述のように位置決めして、血液サンプルを同じ手法を使用して収集した。これにより、この方法が血栓形成デバイスとは無関係に血小板および凝固経路の活性化を産生したか否かを判定する局所サンプリング技法の対照が与えられる。以前の研究と一致して（Ｓａｖａｇｅら（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６８：３８６−３９３）、シリコンチューブは測定できるほど血栓形成性ではなかった；シリコーンポリマーも利用したサンプリング技法のどちらも、著しい凝固経路または血小板活性化を生じなかった。
【０１７８】
血液サンプル分析。血液細胞数は、ｍｉｃｒｏ−６０自動セルカウンタ（Ｈｏｒｉｂａ−ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して決定した。血液サンプルを２つの分割量に分けて、特定の試験要件に従って処理した。すべてのサンプルを氷上に１０分間置いて、４℃にて１２，９００ｇの遠心分離に１０分間かけて、血漿を−８０℃で保管した。β−トロンボグロブリン（βＴＧ）の決定では、サンプルに４μｇ／ｍｌプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、４．３ｍｇ／ｍｌアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、および５０μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＣＫを添加した。交差反応ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｄ−ダイマーレベル（ＩＭＵＣＬＯＮＥ（登録商標）Ｄ−Ｄｉｍｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；ＬＯＤ：３５ｎｇ／ｍＬ）、血小板活性化マーカーβＴＧ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ；ＬＯＤ：５ＩＵ／ｍＬ）、およびトロンビン−抗トロンビン複合体（ＴＡＴ，Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ−ＴＡＴ、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ；ＬＯＤ：２ｎｇ／ｍＬ）を決定した。これらの試験に使用したすべてのＥＬＩＳＡ試験キットは以前に、ヒヒマーカーに対する感受性を示していた。
【０１７９】
インビボでの第ＸＩ因子および血小板の抑制。以前の研究によって、ヒヒにおけるＦＸＩの抑制を達成するためには、ヒトＦＸＩに対するポリクローナル抗体の非常に高い用量が必要であることが示されたため（Ｇｒｕｂｅｒら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９５３−９５５）、新たな試薬：ヒヒＦＸＩと交差反応した強力な中和抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体（ａＸＩＭａｂ）が生成された。ハイブリドーマは、標準処置を使用して精製ヒトＦＸＩで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス由来であった（ｄｅ  ＳｔＧｒｏｔｈ  ＆  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１）。ハイブリドーマを固相ＥＬＩＳＡを使用してヒトＦＸＩについてスクリーニングして、結合を示したハイブリドーマを限界希釈によって２回サブクローニングした。ＦＸＩの活性化およびＦＸＩａの活性の両方を抑制する、最も強力な中和抗体を産生したクローンは、細胞培養物上清によってカルシウム再添加正常ヒト血漿（ＮＨＰ）および正常ヒヒ血漿（ＮＢＰ）の凝固時間の延長に基づいて選択した。ａＸＩＭａｂを産生する株化細胞（１Ａ６）をＣＬ１０００バイオリアクタで製造者（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従って増殖させて、カチオン交換およびタンパク質Ａクロマトグラフィーを使用して抗体を培地から精製した。
【０１８０】
血漿中のヒトおよびヒヒＦＸＩは、ａＸＩＭａｂによって、ウェスタンブロットで１６０ｋＤａに１本のバンドとして認識された（図７Ａ）。抗体は、組換えＦＸＩ／プレカリクレインキメラの免疫ブロッティングによって評価されたように、ＦＸＩ重鎖の第３アップル（Ａ３）ドメインを特異的に認識した（下の実施例２を参照；Ｓｕｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９，０２３−２９，０２８も参照）。インビトロのａＸＩＭａｂのＩＣ５０およびＩＣ９９は、ＦＸＩ欠失ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）を標準としてのＮＢＰの段階希釈物と共に使用する凝固アッセイで、それぞれ２．５ｎＭおよび１０ｎＭであった（Ｐｒｏｃｔｏｒら（１９６１）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：２１２−２１９）。濃度範囲０〜４０ｎＭ内で試験した精製ａＸＩＭａｂ（モノクローナル抗体１Ａ６）は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）（ＨｅｍｏｓｉｌＴＭＳｙｎｔｈＡＳｉｌ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をＮＨＰおよびＮＢＰの両方で同様に、プロトロンビン時間（ＰＴ）（Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）に影響を及ぼすことなく濃度依存方式で延長した。
【０１８１】
インビボでのＦＸＩおよび血小板活性の薬理学的抑制。パイロット実験では、ａＸＩＭａｂ（モノクローナル抗体１Ａ６；２ｍｇ／ｋｇ）をヒヒ１匹に投与して、血液サンプルをクエン酸凝固剤中に４週間にわたって収集して、各サンプルの循環ＦＸＩ抗原（ＦＸＩ：Ａｇ）濃度、ＦＸＩ阻害剤、およびＦＸＩ凝血促進活性を測定した。ａＸＩＭａｂのこの用量は、注射後に体重１ｋｇ当り血液量６０ｍｌ中への抗体の初期希釈を前提として、ＦＸＩの持続的およびほぼ完全な抑制を達成する目的で選択した。ａＰＴＴの達成可能な最大延長は約２．５倍であった。ＦＸＩ：Ａｇは、ヒＦＸＩおよびａＸＩＭａｂとのその複合体も認識する、ヤギ抗ヒトＦＸＩポリクローナル捕捉および検出（ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合［ＨＲＰ］）抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。標準曲線はＮＢＰの段階希釈によって作成され、ＦＸＩ濃度はＮＢＰのパーセンテージで決定した。ＦＸＩのウェスタンブロットは、７．５％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルによる非還元条件下での血漿の１μｌサンプルのサイズ分画と、続いてのＰＶＤＦ膜への移行によって実施した。検出は、ＨＲＰに結合したヤギ抗ヒトＦＸＩポリクローナル抗体および化学発光によってであった。同じサンプルで、ベセスダアッセイ（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：８６９−８７２）を使用して過剰な（非複合）循環ＦＸＩ阻害剤（ａＸＩＭａｂ）活性レベルを決定し、ＦＸＩ凝血促進活性は、凝固アッセイを使用してアッセイした（Ｐｒｏｃｔｏｒら（１９６１）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：２１２−２１９）。
【０１８２】
ａＸＩＭａｂは、血栓形成実験の少なくとも２４時間前に単回ボーラス（２ｍｇ／ｋｇ静脈内）として投与した。抗凝固効果（ａＰＴＴ）を毎日監視して、凝固時間をＦＸＩ欠失ヒト血清（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）で作成した標準曲線と比較することによって評価されるように、循環血のＦＸＩ凝血促進活性は≧９９％低下する間に、血栓形成実験を実施した。すべてのヒヒでＰＴも評価して、群間に差は見られなかった。
【０１８３】
我々は以前に、ポリクローナル抗体によるＦＸＩの抑制は、ヒヒにおいて高用量のヘパリンよりも安全であり、それと同じくらい有効であることを示した（Ｇｒｕｂｅｒ  ＆  Ｈａｎｓｏｎ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９５３−９５５）。アスピリンはヘパリンよりも弱い抗止血剤であり、動脈型血小板依存性血栓症の標準処置に含まれることが多いため、閉塞しやすい２ｍｍｉ．ｄ．移植片を用いた現在の試験で、ＡＳＡを長時間作用性の正の対照として使用した。ＡＳＡ（３２ｍｇ／ｋｇ）を、以前に記載されたように、各血栓症実験の２〜４時間前に経口投与した（Ｈａｎｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：１５９１−１５９９）。同じ動物で新たな実験を実施する前に、各ａＸＩＭａｂおよびＡＳＡの休薬のために４週間を与えた。
【０１８４】
止血評価。ヒヒの１次止血に対するＦＸＩ抑制およびアスピリンの効果は、標準テンプレート皮膚出血時間試験（Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐ）を使用して評価した。実験的に、この試験および他の試験（たとえばＳｉｍｐｌａｔｅ出血時間）は、ヒトおよび非ヒト霊長類における治療用凝固剤、抗血小板剤の効果、および凝固異常に感受性であることが示されている（Ｇｒｕｂｅｒら（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：３７３３−３７４０；Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．８３：２１１−２１５；Ｐａｙｎｅら（２００２）Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｓｕｒｇ．３５：１２０４−１２０９）。すべての出血時間測定は、同じ専門技術者が実施した。止血の間接評価のために、ａＰＴＴおよびＰＴ測定も実施した。
【０１８５】
コンピュータによるモデル化。Ｘｕら（（２００４）Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ４１：１１３−１２５）によって紹介されたのと類似の３Ｄコンピュータ流体力学モデルを使用して、生成する血栓を越えて流れ、隣接する血管壁に沿って遠位側にマーカーを輸送する血栓由来巨大分子の濃度を概算した。モデルは、血液密度および粘度の代表的な値を用いて、図１Ａに示す形態に基づいていた（Ｆｕｎｇ（１９９３）“Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅｓ”（ｅｄ  ２ｎｄ）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。局所血液サンプリングのモデルは、有限要素ソフトウェアＡＤＩＮＡ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）を使用して実装した。さらに、Ｍａｒｋｏｕら（（１９９８）Ａｎｎａｌｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２６：５０２−５１１）のモデルに似た２Ｄ軸対称コンピュータモデルを使用して、流動場内の血栓症マーカー分布を概算した。コンピュータモデル化によって、血栓形成部位で放出または産生された興味のある分子（βＴＧ、フィブリンＤ−ダイマー、およびＴＡＴ）は、すぐ遠位側の血管壁に沿った非常に薄い末梢血境界層（〜０．１ｍｍ厚の濃度境界層）内で濃縮される（＞９９％）であろうことが予測された（データは示さず）。それゆえ、ここで利用するように、局所サンプリング法は、血小板および興味のある凝固マーカーについて、生成する血栓のすぐ遠位側の壁付近の濃度境界層領域全体を効果的にサンプリングした。
【０１８６】
フローチャンバ凝固試験。ガラス製毛細管を１００μｇ／ｍｌ  Ｈｏｒｍコラーゲン（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｒｚｅｎｍｉｔｔｅｌ，ミュンヘン、ドイツ）でコーティングした。ヒト全血をトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ、４０μｇ／ｍｌ）中に収集して、コラーゲン経路のいずれの活性化も制限するために最初の１ｍｌを廃棄して、２６５ｓ−１の剪断速度にて１０分間、毛細管を灌流させた。各実験の前に、血液をａＸＩＭａｂ（２０μｇ／ｍｌ）、またはＰＢＳビヒクルによってインキュベートした。別の実験では、洗浄した血小板およびＲＢＣを記載されたように処理して（ＭｃＣａｒｔｙら（２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：１３６７−１３７８）、次にＦＸＩＩ欠失ヒト血漿（＜１％  ＦＸＩＩ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，エセックスジャンクション、バーモント州）と混合して、ヘマトクリット４０％および血小板数３００×ｌ０３／μｌに到達させた。再構成血液をａＸＩＭａｂ（２０μｇ／ｍｌ）またはＣＴＩ（４０μｇ／ｍｌ）によってインキュベートして、７．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２でカルシウム再添加して、次にコラーゲンコート毛細管に直接灌流させた。ＲＢＣまたは血小板を含まないカルシウム再添加ＦＸＩＩ欠失ヒト血漿もコラーゲンに灌流させた。画像は、修飾Ｔｙｒｏｄｅｓ緩衝液による３分間の灌流の後に、ＤＩＣ顕微鏡法によって得た。
【０１８７】
データ解析。平均値は±１ＳＥＭ（平均値の標準誤差）で与えられる。閉塞データはｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を使用して比較した。他のすべての一対比較には、両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。Ｐ値≦０．０５は有意と見なされた。
【０１８８】
結果
ａＸＩＭａｂによるインビトロでのＦＸＩの抑制によって、ＦＸＩＩａとは無関係に、フィブリン形成が防止される。ＦＸＩＩａの機能を遮断するためにＣＴＩによって抗凝固剤処理されたヒト全血を、動脈剪断（２６５ｓ−１）でコラーゲンに灌流させたときに、血小板は大型の凝集体として沈着して、生成するフィブリン鎖によって包囲されるようになった（図７Ｂ）。全く対照的に、ＣＴＩ血液をａＸＩＭａｂで処理してＦＸＩを抑制したときに、フィブリン沈着は、血小板粘着の中程度の低下によって著しく減弱された。ＣＴＩを含む、または含まない再構成ＦＸＩＩ欠失血液を使用したときも、結果は同様であった。再び、フィブリンはＦＸＩＩとは無関係に生成され、ａＸＩＭａｂによるＦＸＩ抑制によりフィブリン形成が妨害された。カルシウム再添加ＦＸＩＩ欠失ヒト血清をコラーゲンに灌流させたときに、フィブリンは形成されなかった。これらの実験では、ＦＸＩＩａを抑制するためにＣＴＩ（４０μｇ／ｍｌ）によって抗凝固剤処理されたヒト全血、または再構成されたＦＸＩＩ欠失ヒト血液を、コラーゲンコート毛細管に２６５ｓ−１の剪断速度で１０分間灌流させた。各実験の前に、血液をａＸＩＭａｂ（２０μｇ／ｍｌ）、ＣＴＩ（４０μｇ／ｍｌ）（指摘された場合には再構成血液用）、またはＰＢＳビヒクルのいずれかでインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ  ６３×油浸１．４０ＮＡプラン・アポクロマート・レンズを使用したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡によるＫｏｈｌｅｒ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ  Ｎｏｍａｒｓｋｉ微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法によって画像を得た。画像は、修飾Ｔｙｒｏｄｅｓ緩衝液による３分間の灌流後に、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ｗｉｔｈ  Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ  ４．０（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳＡ）によって取込んだ。実験はすべて３７℃にて実施した。図７Ｂの各画像は２〜３回の実験の代表値である。
【０１８９】
これらのデータは、生理学的に適切な剪断の下で、ＦＸＩは、細胞血液成分の存在下でＦＸＩＩａとは無関係にフィブリン形成を促進することを示唆している。
【０１９０】
ａＸＩＭａｂによるＦＸＩの抑制。ａＸＩＭａｂ（１Ａ６；２ｍｇ／ｋｇ）を投与したヒヒを、注入後４週間にわたって追跡して、ＦＸＩ抗原（ＦＸＩ：Ａｇ）、抗凝固活性、および抗体阻害剤レベルを評価した。ａＸＩＭａｂ投与の１時間後に測定したＦＸＩ：Ａｇレベルは、ＮＢＰレベルが１１０％から４０％に低下したが、その後は着実に上昇して、注入後第８日には対照の３００％に達した（図８Ａ）。血漿ＦＸＩ抗原は、第１５日まで対照の２００％超にとどまっていたが、その後、第２７日までに１３０％までの低下が見られた。ＦＸＩ活性は、ａＸＩＭａｂ投与１時間後に１２５％から＜１％に低下して、投与後の１０日間は＞９９％が抑制されたままであった。ＦＸＩ活性はその後、ゆっくりと上昇して、第２７日までに正常化して１３６％となった。最高循環ＦＸＩ阻害剤レベルは、ａＸＩＭａｂ注入の１時間後に観察され（７２ベセスダ単位［ＢＵ］）、これは第１５日までに＜０．６ＢＵに低下した（図８Ｂ）。ＦＸＩ：Ａｇ  ＥＬＩＳＡデータと一致して、血漿のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットでＦＸＩホモダイマーを表す１６０ｋＤａバンドは、第０日と第８日の間に強度が増した（図８Ｃ）。これらの結果は、ａＸＩＭａｂの抗凝固効果は、循環中にその存在が持続すること、およびＦＸＩ活性化および／または活性を遮断するその能力によるものであり、血漿からの酵素の排除ではないことを示している。ａＸＩＭａｂはＳＤＳゲル電気泳動の間にＦＸＩから分離するので、ａＸＩＭａｂによるＦＸＩの抑制がリバウンド効果（ＦＸＩ分泌の増加）を引き起こすのか、またはＦＸＩ−ａＸＩＭａｂ免疫複合体が循環からゆっくりと排除されるのかは不明なままである。
【０１９１】
ａＸＩＭａｂ（２ｍｇ／ｋｇ）の単回ｉ．ｖ．ボーラス注入を４匹のヒヒに投与した。ＦＸＩ凝血促進活性は、注入の１時間後に９９．０％（９８．８〜９９．５％）抑制されて、投与後の８日間にわたって、すべての動物で＞９５％抑制されたままであった（図２）。抗体に対する有害反応は観察されなかった。ａＰＴＴ測定は、ａＸＩＭａｂ投与後に、対照動物の３０．５±０．７秒と比較して６５．６±２．０秒まで延長されたのに対して、ＰＴ測定は、同じ動物においてＰＢＳビヒクル処置対照値と同等であった（それぞれ９．１±０．１対９．０±０．１秒、各処置でｎ＝１１）。アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）およびコラーゲンに応答する多血小板血漿中の血小板凝集は、ａＸＩＭａｂ処置動物と対照結果で変わらなかった。
【０１９２】
ａＸＩＭａｂ処置ヒヒは、コラーゲン誘発血栓発生から防御された。以前の研究によって、ポリクローナル抗体によるＦＸＩ抑制が霊長類において組織因子および接触開始表面に対して抗血栓性であることが示された（Ｇｒｕｂｅｒ  ＆  Ｈａｎｓｏｎ（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０２：９５３−９５５）。血管損傷も大量の血小板コラーゲンを流動血に曝露させることができるため、ヒヒにおけるコラーゲン誘発血栓症に対するＦＸＩ抑制について調査した。ａＸＩＭａｂ処置群とビヒクル処置群との間の血小板蓄積の有意差は、移植片の血流への曝露の早くも１０分後に見られた（０．１３±０．０３×１０９対０．２３±０．０３×１０９の血小板、ａＸＩＭａｂ対対照、Ｐ＜０．０５）。差は、血栓増殖の時間経過を通じて統計的に有意なままであった（図３Ａ）。６０分における移植片血小板蓄積は、ａＸＩＭａｂ処置動物でビヒクル対照よりも６３％低かった（１．３８±０．２６×１０９対３．６８±０．５２×１０９の血小板、ａＸＩＭａｂ対対照、それぞれｎ＝６および８、Ｐ＜０．０１；図３Ａ）。血栓症試験前の全身血小板数は、ａＸＩＭａｂおよび対照群の両方で同様であり（それぞれ３４１±２７×１０３／μｌ対３３７±３１×１０３／μｌ）、血栓症実験後に著しく変化しなかった。エンドポイントのフィブリン沈着は、対照と比較して８１％減少した（０．２３±０．０７ｍｇおよび１．１８±０．１９ｍｇ、ａＸＩＭａｂ対対照、Ｐ＝０．００１；図３Ｂ）。ａＸＩＭａｂはＦＸＩのＡ３ドメインに単一特異性であるため、これらのデータによって、ＦＸＩが霊長類の動脈型流動条件下で血栓増殖において重要な役割を果たすことが立証される。
【０１９３】
ＦＸＩ抑制の間のトロンビン生成の低下および血小板活性化。ＦＸＩの抑制は、トロンビン媒介血小板活性化およびフィブリン形成を制限することによって、および／または血栓溶解を増加させることによって、インビボでの血栓形成を低下させるため、βＴＧ、トロンビン（ＴＡＴ）、およびＤ−ダイマーのレベルを測定した。全身前処置βＴＧ、ＴＡＴ、およびＤ−ダイマーのレベルは、ビヒクル処置およびａＸＩＭａｂ処置ヒヒで同程度であった（それぞれ１９．３±２．６対２４．８±３．８ＩＵ／ｍｌ、６．２±０．４対４．６±０．６μｇ／Ｌ、および２．３±０．２対２．４±０．２μｇ／ｍｌ）。驚くべきことに、我々は、ビヒクル処置ヒヒの血栓形成のすぐ下流の壁付近の領域から局所的に採取したサンプル中で測定されたように、移植片血栓部位からの血流中へのＴＡＴ放出で２０倍を超える着実な上昇を観察した。ヒヒのａＸＩＭａｂでの前処置によって、局所ＴＡＴレベルの上昇が防止され、ＦＸＩ活性の非存在下でのトロンビン生成のかなりの低下が示唆された（図４Ａ）。局所サンプリングによって得た血漿中のＴＡＴレベルは、４０分にて９８％まで低下したのに対して、全身ＴＡＴレベルは未処置対照に対して６０分にて８１％低下した（４．３±０．５対２２．１±２．５μｇ／Ｌ、それぞれｎ＝６および７、Ｐ＜０．００１；図４Ｂ）。血小板α顆粒βＴＧの放出によって評価されるように、血栓表面での血小板活性は、ａＸＩＭａｂ処置動物における血栓の遠位で採取したサンプルでは、３０分にて８６％低下した（図４Ｃ）。６０分にて測定した全身βＴＧレベルは、ビヒクル処置対照（３９．５±５．５ＩＵ／ｍｌ、ｎ＝７；図４Ｄ、Ｐ＜０．０５）と比較して、ａＸＩＭａｂ（２３．０±２．１ＩＵ／ｍｌ、ｎ＝６）によって４２％低下した。局所Ｄ−ダイマーレベルは６０分にて、対照（それぞれ２．３±０．２および２．４±０．４μｇ／ｍｌ、ｎ＝７）またはａＸＩＭａｂ処置動物（それぞれ２．４±０．２および２．２±０．２μｇ／ｍｌ、ｎ＝６；図４Ｅ）のどちらにおいても、基準全身値と比較して変化しなかった。６０分にて評価した全身Ｄ−ダイマーレベルも、両方の群（２．４±０．３および２．３±０．２μｇ／ｍｌ、対照対ａＸＩＭａｂ処置動物）で、基準全身値から変化がなかった。このことによって、血栓溶解剤が投与されなければ、全身Ｄ−ダイマーレベルが血栓開始後６０分まで上昇しないことを示す、同様のヒヒ研究による以前の報告書が確認される（Ｓｕｎｄｅｌｌら（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：９４１−９４８；Ｄｉｃｈｅｋら（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：３０１−３０９）。
【０１９４】
凝固および血小板の活性化のための局所サンプリング方法を評価するために、シャントループ内にコラーゲンコート血栓形成デバイスを挿入せずに系を試験した。チューブのみでＴＡＴおよびβ−ＴＧレベルが全身的および局所的に中程度上昇したが（図４Ａ〜Ｃ）、上昇は統計的に有意ではなかった。対照チューブでは、フィブリン形成または血小板沈着は測定されなかった。
【０１９５】
これらのデータによって：１）ＦＸＩは、急性動脈型血栓形成の間にトロンビン生成および血小板活性化で重要な役割を果たすこと、および２）内因性局所血栓溶解は、ＦＸＩ活性とは無関係に、これらの試験の時間経過の間に制限されるように思われることが示唆される。
【０１９６】
ａＸＩＭａｂは、血管移植片閉塞を防止する。巨視的な血栓が４ｍｍ  ｉ．ｄ．血管移植片を急速に形成しても、これらの移植片のいずれも６０分間の血液灌流中に閉塞しなかった。したがって血栓形成および閉塞に対するＦＸＩ活性を抑制することの効果は、より高い剪断条件下（壁剪断速度＝２１２０ｓ−１で血栓を蓄積した、より小径（２ｍｍ  ｉ．ｄ．）のコラーゲンコート血管グラフトを使用して評価した。初期血小板蓄積速度はａＸＩＭａｂ処置およびビヒクル処置ヒヒで同様であったが、血栓安定性はＦＸＩ活性の非存在下で大きく低下した。血液灌流開始後の１２〜１５分以内に、血小板血栓の成長速度はすべてのａＸＩＭａｂ処置動物で低下して、血栓中の血小板の数が突然減少し、血栓安定性の低下と塞栓形成に対する血栓材料の正味の減少が示唆された（図５）。ａＸＩＭａｂによる処置によって、移植片９個中８個が２７．０±３．３分で閉塞したビヒクル処置対照での結果と比較すると、すべての実験で移植片閉塞が６０分にわたって防止された（移植片５個中５個が開通性を維持した）（Ｐ＜０．０１；図５および表１）。フィブリン蓄積もａＸＩＭａｂにより、ビヒクル処置対照に対して減少した（それぞれ０．１８±０．０２対０．３０±０．０４ｍｇ、Ｐ＜０．０１；表１）。予想した通り、正の抗血栓性対照である、高用量ＡＳＡによる処置は、２ｍｍ  ｉ．ｄ．移植片中の血小板沈着を減少させたが、閉塞性血栓形成を完全に妨害しなかった。移植片閉塞までの時間は、アスピリンによって４個の移植片において平均１８分間延長されたが、２個のさらなる移植片は６０分間の試験間隔を通じて開通性を維持した。したがって高用量ＡＳＡは、ａＸＩＭａｂよりも移植片閉塞を防止するのに有効でなかった（Ｐ＜０．０５、ａＸＩＭａｂ対ＡＳＡ）。これらのデータは、小径血管移植片の急性閉塞を引き起こす血栓形成プロセスにおいて、ＦＸＩが重要な役割を果たすことを示唆している。
【０１９７】
【表１】
2011504371.tif 000005
ａＸＩＭａｂによるＦＸＩ抑制の抗止血効果なし。すべてのＦＤＡ承認抗凝固薬および抗血小板薬は望ましくない抗止血効果を生じるので、新たな血栓症特異的療法によって、出血の高いリスクに瀕した患者に対する安全な代替案を提供できるであろう。テンプレート出血は、ヒヒにおいて抗血小板剤と抗凝固薬の両方によって延長されるが（Ｇｒｕｂｅｒら（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：３７３３−３７４０；Ｈａｎｓｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１４９−１５８）、それにもかかわらずａＸＩＭａｂによるＦＸＩ抑制は、ビヒクル処置対照と比較して標準テンプレート出血時間に対して影響がなかった（３．５±０．３対３．４±０．２分、それぞれｎ＝１８および１４）。比較のために、単回用量ＡＳＡ前処理は、出血時間をほぼ２倍の６．４±０．７分とした（ｎ＝１０、Ｐ＜０．０１）。１週間の追跡観察期間の間には、ａＸＩＭａｂまたはＡＳＡ処置動物のいずれにも、再出血現象、点状出血、血腫または他の有害な出血事象は認められなかった。まとめると、これらの結果によって、中和モノクローナル抗体のＦＸＩ活性の抑制は、ヒヒにおいて、アスピリンの抗止血用量よりも１次止血に対する小さな効果で、急性閉塞性動脈型血栓増殖をより効果的に減少させることが示される。
【０１９８】
考察
これらの試験によって、ＦＸＩがコラーゲン誘発および増殖血栓の流動面におけるトロンビンの十分な量の産生促進に不可欠であり、トロンビン産生促進によって高動脈流および低動脈流条件下での血小板活性化、フィブリン形成、および血栓安定性が引き起こされることが証明される。ＦＸＩ抑制の抗血栓／抗閉塞結果は、線維素溶解経路の増加によってではなく、トロンビン産生の実質的な減少によって主に生じた。理論に縛られたくはないが、トロンビンは血小板の最も強力な生理学的アゴニストであるため、ＦＸＩ抑制の間に観察された血小板活性化の著しい低下は、トロンビン生成の下方制御から生じたという可能性が高い。ＦＸＩ抑制は低動脈流でのコラーゲンへの血小板沈着を遅延させるが、高流量での早期血栓成長は対照試験の血小板沈着を反映した。これらの結果は、高剪断下での露出コラーゲンのｖＷＦへの血小板ＧＰＩｂ結合の効率上昇と一致しており（Ｎｉｓｈｉｙａら（２００２）Ｂｌｏｏｄ．１００：１３６−１４２）、これにより早期血栓成長のためのフィブリンへの依存性が、低剪断条件下よりも低くなる。しかし血栓成長の増殖期において、高剪断流に露出された血栓の安定性は、ＦＸＩならびにフィブリン産生および血小板活性化を促進するその能力に強く依存していた。実際に、高動脈流では、遠位血栓塞栓形成の増加が明確に認められ、これによりすべてのａＸＩＭａｂ処置動物における血管移植片閉塞が完全に防止された。これらの発見は、塩化鉄誘発静脈損傷および血栓形成後のＦＸＩ欠失マウスで観察された抗血栓性および抗閉塞性表現型と一致している（Ｒｏｓｅｎら（２００２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８７：７７４−７７６；Ｗａｎｇら（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：６９５−７０２；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：１９８２−１９８８）。しかし、流れ依存性血栓形成の以前のインビボ試験のいずれも、ＦＸＩ抑制の基礎を成す抗血栓機構の証拠を与えていない。
【０１９９】
ＦＸＩは、フィブリンをタンパク質分解的に修飾してこれをプラスミンに対して耐性とする、メタロプロテイナーゼＴＡＦＩのトロンビン媒介活性化により、線維素溶解に対する血餅耐性を促進する（Ｂａｊｚａｒら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６，６０３−１６，６０８；Ｂｒｏｚｅ  ＆  Ｈｉｇｕｃｈｉ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：３８１５−３８２３）。さらに、抗凝固薬によるトロンビン生成の抑制は、より低速で生成し、より低密度のフィブリンネットワークのために、血餅の溶解を促進する（Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：２５４１−２５４８；Ｎｅｎｃｉら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ３：２７９−２８５）。どちらのプロセスも、ウサギのクランプ固定された頸静脈中にて抗凝固抗第ＸＩ因子抗体の存在下で形成された血餅の溶解促進を、少なくとも一部は説明し得る（Ｍｉｎｎｅｍａら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１０−１４）。ヒヒでの本試験の間に、線維素溶解分解生成物Ｄ−ダイマーは、フィブリン、血小板、および白血球が豊富な動脈型血栓の付近での局所血液サンプリングによって測定した（Ｇｒｕｂｅｒら（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：３７３３−３７４０）。ＴＡＴおよびβＴＧのレベルとは異なり、ビヒクルまたはａＸＩＭａｂ処置ヒヒで局所Ｄ−ダイマーの変化は検出されなかった。このような発見により、内因性線維素溶解は、急性動脈血栓形成の間の血栓表面での主要なプロセスでないかもしれないことが示唆され、これは線維素溶解表現型を有することが予想されたＴＡＦＩ欠失マウスが、損傷誘発動脈血栓形成から防護されなかったという観測と一致している（Ｎａｇａｓｈｉｍａら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１０１−１１０）。本試験は、急速な血栓発生における線維素溶解の役割を証明していないが、ＦＸＩ活性の非存在下でのより効果的な内因性線維素溶解が、血栓発生および再構成の後期の段階で役割を果たし得る。
【０２００】
ａＸＩＭａｂによるＦＸＩ抑制の間の局所ＴＡＴの劇的な低下によって、フィブリン形成、血小板活性化、および血栓安定性に直接寄与する、コラーゲン誘発および増殖血栓の表面でのトロンビン産生におけるＦＸＩの重要性が示される。
【０２０１】
ＰＰＡＣＫ−トロンビンは上述の酵素イムノアッセイでは検出できないため、すべての局所ＴＡＴを血栓流動面に、または血栓からＰＰＡＣＫ注入ポートまでの１ｃｍ以内の距離に生成した（全身的寄与を差し引く）。
【０２０２】
他の抗凝固薬に勝るＰＰＡＣＫ使用の利点は、活性化血小板におけるプロトロンビナーゼ複合体の一部として、他の凝固薬から遮蔽されて、トロンビン生成を継続できる第Ｘａ因子を含む、凝固経路のいくつかの活性セリンプロテアーゼを迅速に抑制するその能力である。ＰＰＡＣＫは、ＦＸＩａも抑制して、サンプリング注射器内での望ましくない接触活性化を１０分間のサンプリング間隔にわたって制限する。ＰＰＡＣＫを注入せずに、局所サンプリングポートは２０〜３０分以内に閉塞した。利用したＣＦＤモデルに基づいて、注入したＰＰＡＣＫの大部分はサンプリング注射器に内に捕捉された。全身循環中に漏れた少量のＰＰＡＣＫは、履歴データと比較して、４ｍｍコラーゲンコート移植片への血小板または、フィブリン沈着に影響を及ぼさなかった。また、注入したＰＰＡＣＫの総量は、全身的に投与した場合、以前にヒヒでの凝固時間の延長を示した量よりも１桁少ない（Ｈａｎｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３１８４−１８８）。
【０２０３】
コラーゲン無処置試験での６０分近くの局所ＴＡＴおよびβ−ＴＧレベルの低下は、血小板蓄積速度の低下と関連していた。血栓成長とメディエータ産生との調和をもたらすものは不明であるが、おそらく活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）生成または他の凝固阻害剤の産生の結果である。
【０２０４】
これらの実験による別の興味深い結果によって、循環組織因子（ＴＦ）は、血小板または微粒子のどちらを介しても、血栓発生の促進に重要な役割を果たしていないように思われることが示唆される。理論に縛られたくはないが、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成は、接触経路とは無関係にトロンビン産生およびフィブリン形成を補助するはずであるが、ＦＸＩの抑制は、コラーゲンにおけるフィブリン産生を著しく制限する。考えられるシナリオは、ＦＸＩａがトロンビンの強いフィードバック増幅を促進して、これが循環ＴＦとは無関係にフィブリン形成および血小板活性化を促進するということである（Ｇａｉｌａｎｉら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：９０９−９１２；Ｂｒｏｚｅら（１９９３）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７０：７２−７４；Ｇａｉｌａｎｉら（２００１）Ｂｌｏｏｄ．９７：３１１７−３１２２；Ｙｕｎら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４８：４８１１２−４８１１９；Ｂａｇｌｉａら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４９３２３−４９３２９）。
【０２０５】
第ＸＩＩａ因子によるＦＸＩの活性化も、コラーゲン誘発血栓発生の間の重要なプロセスであり得る。
【０２０６】
ヒヒにおけるＦＸＩ抑制の間の局所ＴＡＴ形成の減少は、より制限された血小板およびフィブリン蓄積と相まって、血栓の増殖におけるＦＸＩ依存性トロンビン産生の継続が重要であることを示している。ＦＸＩ依存性トロンビン産生は、ＦＸＩＩａ、トロンビン、および／または自己活性化によるＦＸＩ活性化の継続によって行うことができた（Ｇａｉｌａｎｉ  ＆  Ｂｒｏｚｅ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：９０９−９１２；Ｂｒｏｚｅ  ＆  Ｇａｉｌａｎｉ（１９９３）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７０：７２−７４）。ＦＸＩＩａは、マウスにおける実験的血栓症で重要な役割を果たすように思われる（Ｒｅｎｎｅら（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：２７１−２８１）。しかし、このインビトロのフローチャンバのデータは、ＦＸＩが、血液細胞の存在下で剪断流条件の間に、ＦＸＩＩａとは無関係に血栓症を促進する機構を示している。インビトロの静止血漿アッセイでのトロンビン媒介ＦＸＩ活性化は疑われたが（Ｐｅｄｉｃｏｒｄら（２００７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４：１２，８５５−１２，８６０）、我々の流動強化血栓症モデルは、ＦＸＩのＦＸＩＩ独立型血栓形成経路を明確に証明している。
【０２０７】
興味深いことに、遊離ＦＸＩ：ＡｇはａＸＩＭａｂ注入後に１週間にわたって１％未満に低下したが、総ＦＸＩ：Ａｇレベルはヒヒ循環中のＦＸＩ活性消失後に、一時的に基準を数倍上回って上昇した。この上昇が循環免疫複合体のより長い半減期またはＦＸＩ合成および／もしくは分泌のどちらによるのかは、まだ調査されていない。
【０２０８】
ＦＸＩの進化的役割は解明するのが困難であったが、これらおよび他の研究は、ＦＸＩが一部は、大量のコラーゲンを流動血に暴露する可能性がある経血管損傷の後の止血を促進するように機能するという仮説を裏付けている。ＦＸＩの非存在下では、止血促進閉塞性血栓を安定化できずに、増加した、潜在的に致死的な失血を引き起こすことがある。組織因子依存性止血プロセスは大半の出血事象の間に優勢であるため、ＦＸＩは、ヒト患者における重篤なＦＸＩ欠失の主な臨床徴候である、手術または外傷の後のみに役割を果たす可能性が高い。その上、ＦＸＩは増殖血栓の流動面に対してその中心的な効果を有するように思われ、ＦＸＩ欠乏患者は軽度の出血傾向を有するため、ＦＸＩは、大規模な外傷または手術とは無関係に深刻な出血事象を引き起こす可能性がある他の既存の抗血栓方法より、より血栓症に特異的な処置方法であると思われる。
【０２０９】
全体的に見て、上で提示した証拠によって、ＦＸＩは、トロンビン産生の局所的増加が相当に促進されて、次に強力な血小板活性化およびフィブリン形成の原因となることによる、コラーゲン誘発血栓増殖に不可欠である。しかしＦＸＩ抑制は、１次止血を実質的に妨害しない。それゆえ、治療的ＦＸＩ抑制は、血栓成長および血栓性血管閉塞（すなわち脳卒中、心臓発作、ＤＶＴ）を制限する例外的に有望な処置方法となり、同時に、他の現在利用可能な抗血栓剤と比較して、類を見ない止血安全性を提供する。
【０２１０】
（実施例２）
ヒト第ＸＩ因子への１Ａ６モノクローナル抗体の結合
抗第ＸＩ因子モノクローナル抗体１Ａ６がヒトおよび非ヒト霊長類血漿における第ＸＩ因子を認識することを裏付けるウェスタンブロット試験からの結果を図７Ａに示す。
【０２１１】
モノクローナル抗体１Ａ６の比較結合試験は、ＦＸＩ、プレカリクレイン（ＰＫ）、およびＰＫドメインによる置換ＦＸＩドメイン（図９）またはＦＸＩドメインによるＰＫドメインの置換（図１０）のどちらかを含むＦＸＩ／ＰＫキメラを使用して実施した。図９の右パネルに示すように、モノクローナル抗体１Ａ６はＦＸＩを結合したが、ＰＫには結合しなかった。さらに、モノクローナル抗体１Ａ６は、ＦＸＩのＡ３ドメインがＰＫドメインによって置換されたキメラを除くすべてのＦＸＩ／ＰＫキメラを結合した（図９）。異なるＦＸＩドメインによるＰＫドメインの置換を含むキメラでは、抗体１Ａ６は、ＦＸＩのＡ３ドメインが挿入されたキメラのみに結合することが示された（図１０）。これらの機能消失（図９）および機能獲得（図１０）試験から、モノクローナル抗体１Ａ６がＦＸＩ  Ａ３ドメインのエピトープに結合することが決定された。
【０２１２】
モノクローナル抗体１Ａ６の結合に重要なアミノ酸を決定するための結合試験も、Ａ３ドメイン内に異なるアミノ酸の突然変異を含む組換えＦＸＩタンパク質を使用して実施した。モノクローナル抗体１Ａ６の２５のパネル、たとえばＡ３ドメイン内の２または３の隣接アミノ酸がアラニンで置換された組換えタンパク質への結合の例を図１１に示す。ポリクローナル抗第ＸＩ因子抗体はすべてのＦＸＩ  Ａ３ドメイン突然変異に結合したが、モノクローナル抗体１Ａ６はいくつかの突然変異に結合しなかった（図１１を参照）。このような試験に基づいて、モノクローナル抗体１Ａ６のＦＸＩ  Ａ３ドメインへの結合に重要であるアミノ酸を決定して、図１２に示す（配列番号１のアミノ酸１８３〜１９７、２０３〜２０４、２３４〜２３６、２４１〜２４３、２５２〜２５４、および２５８〜２６０）。
【０２１３】
（実施例３）
１Ａ６モノクローナル抗体およびコード化配列の配列決定
ｍＲＮＡを、Ａｘｉｍａｂ（１Ａ６）として公知のマウス抗体を発現するハイブリドーマ株化細胞から抽出して、逆転写し、抗体特異的転写物をＰＣＲ増幅した。本抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定するために、ＰＣＲ産物をクローニングした。
【０２１４】
株化細胞を凍結ストックから成功裏に回収した。ｍＲＮＡをハイブリドーマの細胞ペレットから抽出して、縮重プライマプールの系を使用してＲＴ／ＰＣＲを実施した。重鎖可変領域ｍＲＮＡは、６つの縮重プライマプールのセット（ＨＡ〜ＨＦ）を使用して増幅して、軽鎖可変領域ｍＲＮＡは８つの縮重プライマプールのセット（ＬＡ〜ＬＨ）を使用して増幅した。
【０２１５】
Ａｘｉｍａｂ重鎖：ほぼ予想されたサイズの強力なＤＮＡバンドがプライマプールＨＤで観察された。このバンドからのＤＮＡを精製およびクローニングして、８つのクローンを配列決定した。これらのクローンのうち４つを整列して、機能性再配置重鎖を得た（表２、図１３Ａ）
【０２１６】
【表２】
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Ａｘｉｍａｂ軽鎖：予想したサイズの強力なＤＮＡバンドは、プライマプールＬＢ、ＬＣおよびＬＧに見出された。このバンドからのＤＮＡを精製およびクローニングして、各バンドから４つのクローンを配列決定した。プールＬＢおよびＬＣからの８つのクローンは、いくつかのハイブリドーマに見出される、よく説明された異常カッパ転写物と整列することが見出された。プールＬＧからの４つのクローンを整列させて、機能性再配置重鎖を得た（表２、図１３Ｂ）。
【０２１７】
Ａｘｉｍａｂハイブリドーマからの重鎖および軽鎖可変領域配列を決定した。ＡｘｉｍａｂがマウスＩｇＧ／カッパ抗体であることと、本抗体の両方の鎖がフレームワーク領域を通じてヒト抗体データベース内の近接した配列相同体を有することとを確認した（表２）。これによりＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ技術またはＣＤＲ移植のどちらかによる、続いてのヒト化が容易になるはずである。各抗体の重鎖および軽鎖クローンが産生され、したがってヒト化に利用できる。例示的なＣＤＲ移植重鎖および軽鎖可変領域配列を図１３Ｃおよび１３Ｄに示す。
【０２１８】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当該技術分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許は、各刊行物または特許出願が参照により組み入れられることが詳細および個別に指示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられている。
理解を明確にする目的で図解および実施例によって上述の発明を多少詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある変更および修正が実施され得ることが明らかとなるであろう。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１３】
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【図１】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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