(57)【要約】本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３に示すアミノ酸配列を含むペプチド、ならびに、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸が置換又は付加された前述のアミノ酸配列の１つを含み、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドを提供し、また、これらのペプチドを含む薬物も提供する。本発明のペプチドは、ワクチンとして用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ抗原と結合し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列又はその断片からなるペプチド。
【請求項２】
前記断片が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
１個、２個、又はいくつかのアミノ酸の置換又は付加を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９又は３０のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンである、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９又は３０のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、請求項３記載のペプチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシン又はメチオニンである、請求項３記載のペプチド。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のＣ末端アミノ酸がバリン又はロイシンである、請求項３記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の１つ又はそれ以上のペプチドを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の１つ又はそれ以上のペプチドを含む、癌を治療又は予防するための薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体をその表面に提示するエキソソーム。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の１つ又はそれ以上のペプチド、あるいは、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、抗原提示細胞と接触させる段階を含む、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞を、請求項１〜７のいずれかに記載の１つ又はそれ以上のペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させる段階を含む、細胞傷害性Ｔ細胞を調製する方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の１つ又はそれ以上のペプチドを含む組成物を投与することにより癌を治療又は予防する方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドにより誘導されるか、又はＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２と関連して請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を移入された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１５】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドとの間で形成された複合体を含む、抗原提示細胞。
【請求項１６】
請求項１１記載の方法により調製される、抗原提示細胞。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドを活性成分として含む、血管新生を阻害するか、又は、制御性Ｔ細胞を制御するためのワクチン。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドを含むワクチンを対象に投与することにより、血管新生を阻害するか、又は、制御性Ｔ細胞を制御する、方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドを活性成分として含む、癌免疫療法の臨床効果を増強するためのワクチン。
【請求項２０】
高いＳＴＡＴ３発現を示す細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドの免疫的に活性な断片、又は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与することにより、癌免疫療法の臨床効果を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月２８日に出願された米国特許出願第６０／９９０，８７７号に関連し、これは、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌療法の分野に関する。特に、本発明は、癌ワクチンとして極めて有効に働く新規なペプチド、ならびにそのようなペプチドを含む、腫瘍を治療及び予防するための薬物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するエピトープペプチドを認識し、腫瘍細胞を死滅させることが実証されている。ＭＡＧＥファミリーがＴＡＡの最初の例として発見されて以来、他の多くのＴＡＡが免疫学的アプローチによって発見されており（Boon T. Int J Cancer 54: 177-180, 1993（非特許文献１）；Boon T, and van der Bruggen P. J Exp Med 183: 725-729, 1996（非特許文献２）；van der Bruggen P, et al. Science 254: 1643-1647, 1991（非特許文献３）；Brichard V, et al. J Exp Med 178: 489-495, 1993（非特許文献４）；Kawakami Y, et al. J Exp Med 180: 347-352, 1994（非特許文献５））、これらのうちいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発中である。
【０００４】
しかし、これまで、その臨床効果は明らかな腫瘍の退縮により測られ、低かった（Rosenberg SA, et al. Nature Med. 10:909-915, 2004（非特許文献６））。主要な理由の１つは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の、進行期の癌患者における低い免疫応答である（Miescher S, et al. J Immunol 136:1899-1907, 1986（非特許文献７））。この腫瘍により誘導される免疫抑制は、腫瘍抗原への低い応答（Young RC, et al. Am J Med 52:63-68, 1972（非特許文献８））、Ｔ細胞の低い増殖（Alexander JP, et al. Cancer Res 53:1380-1387, 1997（非特許文献９））、サイトカイン産生の減少（Horiguchi S, et al. Cancer Res. 59:2950-2956, 1999（非特許文献１０））、及び、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の不完全な信号伝達（Kono K, et al. Clin Cancer Res. 11:1825-1828, 1996（非特許文献１１）；Kiessling R, et al. Cancer Immunol Immunother. 48:353-362, 1999（非特許文献１２））の理由である。腫瘍免疫療法では、腫瘍微小環境における免疫抑制の制御が最重要問題である。
【０００５】
ＳＴＡＴファミリー転写因子のメンバーであるＳＴＡＴ３は、細胞周期進行、浸潤及び転移、腫瘍血管新生並びに免疫系の腫瘍細胞回避を含む腫瘍形成における多くの重要な経路を制御する（Dauer D J, et al. Oncogene. 24: 3397-3408、2005（非特許文献１３）；Niu G、et al. Oncogene. 21:2000-2008, 2002（非特許文献１４）；Huang S. Clin Cancer Res. 13:1362-1366, 2007）。最近、抗腫瘍免疫応答を抑制する機能活性を有する、未成熟ミエロイド細胞及び制御性Ｔ細胞が、ＳＴＡＴ３の活性を上方制御することが報告された（Yu H, et al. Nat Rev Immunol. 7: 41-51, 2007（非特許文献１５）；Kortylewski M, et al..Nature Med. 11:1314-1321, 2005；Jing N and Tweardy D J. Anti-Cancer Drugs. 16: 601-607, 2005（非特許文献１６））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Boon T. Int J Cancer 54: 177-180, 1993
【非特許文献２】Boon T, and van der Bruggen P. J Exp Med 183: 725-729, 1996
【非特許文献３】van der Bruggen P, et al. Science 254: 1643-1647, 1991
【非特許文献４】Brichard V, et al. J Exp Med 178: 489-495, 1993
【非特許文献５】Kawakami Y, et al. J Exp Med 180: 347-352, 1994
【非特許文献６】Rosenberg SA, et al. Nature Med. 10:909-915, 2004
【非特許文献７】Miescher S, et al. J Immunol 136:1899-1907, 1986
【非特許文献８】Young RC, et al. Am J Med 52:63-68, 1972
【非特許文献９】Alexander JP, et al. Cancer Res 53:1380-1387, 1997
【非特許文献１０】Horiguchi S, et al. Cancer Res. 59:2950-2956, 1999
【非特許文献１１】Kono K, et al. Clin Cancer Res. 11:1825-1828, 1996
【非特許文献１２】Kiessling R, et al. Cancer Immunol Immunother. 48:353-362, 1999
【非特許文献１３】Dauer D J, et al. Oncogene. 24: 3397-3408、2005
【非特許文献１４】Niu G、et al. Oncogene. 21:2000-2008, 2002
【非特許文献１５】Yu H, et al. Nat Rev Immunol. 7: 41-51, 2007
【非特許文献１６】Kortylewski M, et al..Nature Med. 11:1314-1321, 2005；Jing N and Tweardy D J. Anti-Cancer Drugs. 16: 601-607, 2005
【発明の概要】
【０００７】
発明の開示
本発明は、少なくとも一部は、それぞれの遺伝子産物に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を有する、ＳＴＡＴ３の遺伝子産物に由来する特異的エピトープペプチドの同定に基づいている。ＳＴＡＴ３に由来するＨＬＡ−Ａ＊２４結合性ペプチド及びＨＬＡ−Ａ＊０２結合性ペプチドを用いて、健常なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激した。これらのペプチドは、ＳＴＡＴ３を発現する未成熟ミエロイド細胞及び制御性Ｔ細胞に対する強力かつ特異的な免疫応答を誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドである。
【０００８】
したがって、本発明は、本発明のＳＴＡＴ３ポリペプチドを投与する段階を含む、免疫抑制を制御（例えば、阻害）するための方法を提供する。免疫抑制は、ＳＴＡＴ３ポリペプチドの投与により制御される。よって、本発明は、ＳＴＡＴ３ポリペプチドを投与する段階を含む、免疫抑制を制御する方法を提供する。本発明はさらに免疫抑制を制御するためのＳＴＡＴ３ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
本発明の前述の概要及び以下の詳細な説明の両方とも、好ましい態様のものであり、本発明も本発明の他の代替の態様も限定しないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、その結果として、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３、−９−９３、−９−３５４、−９−７８、−９−７０、−９−３０８、−９−３４４、−９−１７１、−９−１４０及び−９−６５８が強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。対照と比較して、以下のウェルの細胞は強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３で刺激したウェル２番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３で刺激した５番及び９番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４で刺激した５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８で刺激した４番及び５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０で刺激した３番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４で刺激した１番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１で刺激した６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０で刺激した２番、並びにＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８で刺激した１番（これらは四角で囲む）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、その結果として、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０、−９−１８０、−９−２６２、−９−３７９、−９−２６、−１０−２１、−１０−４４５及び−１０−１３が強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。対照と比較して、以下のウェルの細胞は強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０で刺激した６番及び１３番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２で刺激した１番、６番及び１２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５で刺激した２番、並びに、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３で刺激した３番（これらは四角で囲む）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、その結果として、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１、−１０−２７８及び−１０−２１５が強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。対照と比較して、以下のウェルの細胞は強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１で刺激した１番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８で刺激した４番、並びに、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５で刺激した１番（これらは四角で囲む）。
【図２Ａ】図２Ａは、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、その結果として、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５、−９−３６０、−９−１４３、−９−５７８、−９−２０５、−９−４３１、−９−６５４、−９−３４３、−９−１３６及び−９−４６９が強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。対照と比較して、以下のウェルの細胞は強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５で刺激した４番及び５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０で刺激した２番、３番、４番、５番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３で刺激した１番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８で刺激した５番、６番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５で刺激した１番及び４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１で刺激した６番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３で刺激した４番、５番及び７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６で刺激した６番、並びに、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９で刺激した６番、７番及び８番（これらは四角で囲む）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、その結果として、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４、−１０−１４２、−１０−６５８、−１０−５５４、−１０−５６２、−１０−７５０、−１０−１１４、−１０−２６６、−１０−２６、−１０−３４０及び−１０−３０８が強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。対照と比較して、以下のウェルの細胞は強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４で刺激した４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８で刺激した４番、６番、７番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４で刺激した３番、５番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０で刺激した４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６で刺激した１番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０で刺激した２番、５番、６番及び８番、並びに、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８で刺激した７番及び８番（これらは四角で囲む）。
【図３】図３はＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３及びＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４で刺激したＣＴＬ株の樹立を示す。以下のＣＴＬ株は、強力なＩＦＮ−γ産生能を示した：５番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３の刺激）、７番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０の刺激）、６番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０の刺激）、１番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２の刺激）、８番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６の刺激）、２番（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１の刺激）、４番（ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３の刺激）、及び、２番（ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４の刺激）。ＩＦＮ−γの量は、ＣＴＬ（応答体：Ｒ)−ペプチドパルス細胞(刺激体：Ｓ)比（Ｒ／Ｓ）で表されるＣＴＬ株の比と相関した。一方、対照においては、ＩＦＮ−γはほとんど検出されなかった。図中、“＋”は、ウェルの細胞が適当なペプチドでパルスされたことを示し、“−”は細胞がペプチドでパルスされなかったことを示す。
【図４】図４はＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１で刺激したＣＴＬクローンの樹立を示す。２−１７４番のＣＴＬクローン（ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１の刺激）は、強力なＩＦＮ−γ産生能を示した。ＩＦＮ−γの量は、ＣＴＬ（応答体：Ｒ)−ペプチドパルス細胞(刺激体：Ｓ)比（Ｒ／Ｓ）で表されるＣＴＬ株の比と相関した。一方、Ｉ対照においては、IＦＮ−γはほとんど検出されなかった。図中、“＋”は、ウェルの細胞が適当なペプチドでパルスされたことを示し、“−”は細胞がペプチドでパルスされなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書において使用される単語「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、他で具体的に特定されない限り、「少なくとも１つ」を意味する。
単語「細胞傷害性Ｔ細胞」及び「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）」は、本明細書において、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生能又は細胞傷害能を有するＴリンパ球を示すために互換的に使用される。
【００１２】
細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有するＳＴＡＴ３由来ペプチド
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新しいＴＡＡの同定により、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種法の臨床適用のさらなる発展が保証される（Boon T et al., J Exp Med 183: 725-729, 1996.；van der Bruggen P et al., Science 254: 1643-1647, 1991.；Brichard V et al., J Exp Med 178: 489-495, 1993.；Kawakami Y et al., J Exp Med 180: 347-352, 1994.；Shichijo S et al., J Exp Med 187:277-288, 1998.；Chen Y.T. et al. Proc.Natl.Acd. Sci.USA, 94: 1914-1918, 1997.；Harris CC, J Natl Cancer Inst 88:1442-1445, 1996.；Butterfield LH et al, Cancer Res 59:3134-3142, 1999.；Vissers JLM et al, Cancer Res 59: 5554-5559, 1999.；Van der Burg SH et al, J. Immunol 156:3308-3314, 1996.；Tanaka F et al, Cancer Res 57:4465-4468, 1997.；Fujie T et al. Int J Cancer 80:169-172, 1999.；Kikuchi M et al, Int J Cancer 81: 459-466, 1999.；Oiso M et al, Int J Cancer 81:387-394, 1999.）。
【００１３】
上述のように、様々なタイプの抗原特異的免疫療法が行われてきた；しかし、臨床効果は期待されたほど高くはなかった（Rosenberg SA et al. Nat Med. 10:909-915, 2004）。免疫療法の臨床効果を向上するには、腫瘍により誘導される免疫抑制因子を克服することが重要である。腫瘍浸潤未成熟ミエロイド細胞、未成熟樹状細胞及び抗腫瘍免疫系に対する免疫抑制細胞が、ＳＴＡＴ３の高発現を示すことが報告されている（Yu H, et al. Nat Rev Immunol. 7: 41-51, 2007；Kortylewski M, et al. Nature Med. 11:1314-1321, 2005；Jing N and Tweardy D J. Anti-Cancer Drugs. 16: 601-607, 2005）。最近の研究により、ＳＴＡＴ３信号伝達の阻害により、未成熟ＤＣの数が減少し、ＤＣの機能成熟が亢進したことが示された（Wang T, et al. Nature Med. 10: 48-54, 2004）。よって、ＳＴＡＴ３発現細胞の制御を含む戦略は、癌の免疫療法に高い可能性を有するツールである。
【００１４】
本発明において、ＳＴＡＴ３由来のペプチドが、ヒト集団における一般的なＨＬＡアレルである（Date Y et al. Tissue Antigens, 47: 93-101, 1996.；Kondo A et al. J Immunol, 155: 4307-4312, 1995.；Kubo RT. et al. J Immunol, 152: 3913-3924, 1994.）ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原エピトープであることが示された。ＳＴＡＴ３由来のＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドの候補が、ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２に対する結合親和性に関する情報を用いて同定された。これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激の後、以下のペプチドを用いてCTLを樹立することに成功した：
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６８）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７２）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９８）及び
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０３）。
【００１５】
これらのＣＴＬは、ペプチドでパルスした標的細胞に対して強力で特異的なＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＳＴＡＴ３がＣＴＬにより認識される新規な抗原であること、上記ペプチドを含むその断片がＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープペプチドであること、を強く示唆する。ＳＴＡＴ３はほとんどの癌患者において過剰発現し、免疫抑制及び血管新生に関連していることから、ＳＴＡＴ３は、免疫療法の効果を向上させる、免疫療法の良い標的である。よって、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドを提供する。好ましい実施態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸が、置換又は付加されているペプチドを提供する。例えば、本発明において、置換されるアミノ酸残基の好ましい数は１又は２であり得る。
【００１６】
従って、本発明は、さらに、腫瘍微小環境における免疫抑制及び血管新生を制御する方法を提供し、該方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含む、約４０アミノ酸未満、しばしば約２０アミノ酸未満、通常は約１５アミノ酸未満の免疫原性ペプチドを投与する段階を含む。本発明はさらに、癌を治療又は予防する方法を提供し、該方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含む、約４０アミノ酸未満、しばしば約２０アミノ酸未満、通常は約１５アミノ酸未満の免疫原性ペプチドを投与する段階を含む。あるいは、免疫原性ペプチドは、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸が置換又は付加された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３の配列を含んでもよい。好ましい実施態様において、免疫原性ペプチドは、ノナペプチド又はデカペプチドである。
【００１７】
また、本発明は、抗免疫抑制及び抗血管新生を誘導する方法を提供し、該方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含む、本発明の免疫原性ペプチドを投与する段階を含む。本発明において、ペプチドはインビボ又はエクスビボで対象に投与することができる。さらに、本発明は、また、免疫抑制及び／又は血管新生を制御するための免疫原性組成物の製造のための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドの使用を提供する。あるいは、本発明は、また、免疫抑制及び／又は血管新生を制御するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドに関する。好ましい実施態様において、癌の治療又は予防のための免疫学的又は薬学的組成物の製造又は調製のための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドの使用が提供される。また、免疫原性ペプチドは、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸が、置換又は付加された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３の配列を含み得る。好ましい実施態様において、免疫原性ペプチドは、ノナペプチド又はデカペプチドである。
【００１８】
また、本発明は、さらに、免疫抑制及び／又は血管新生の制御のための免疫原性組成物の製造のための方法又はプロセスを提供し、該方法又はプロセスは薬学的に又は生理学的に許容可能な担体を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドと製剤化する段階を含む。また、本発明は、さらに、免疫抑制及び／又は血管新生を制御するための、免疫原性組成物の製造のための方法又はプロセスを提供し、該方法又はプロセスは活性成分を薬学的に又は生理学的に許容可能な担体と混合する段階を含み、該活性成分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドである。
【００１９】
さらに、本発明は、また、癌の治療のための免疫原性組成物の製造のための方法又はプロセスを提供し、該方法又はプロセスは、薬学的又は生理学的に許容可能な担体を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドと製剤化する段階を含む。あるいは、本発明はさらに、癌の治療又は予防のための免疫原性組成物の製造のための方法又はプロセスを提供し、該方法又はプロセスは、活性成分を薬学的に又は生理学的に許容可能なキャリアと混合する段階を含み、該活性成分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドから選択されるノナペプチド又はデカペプチドである。あるいは、免疫原性ペプチドは、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸が置換又は付加された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３の配列を含み得る。好ましい実施態様において、免疫原性ペプチドは、ノナペプチド又はデカペプチドである。
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列の相同性解析により、これらがいかなる既知のヒト遺伝子産物由来のペプチドとも有意な相同性を有しないことが示された。このことにより、これらの分子に対する免疫療法に伴う、未知の又は好ましくない免疫応答の可能性は低下する。
【００２１】
ＨＬＡ抗原に関して、日本人及び白人において高度に発現されるＡ２４及びＡ２タイプの使用が、効果的な結果を得るために有利であり、Ａ２４０２、Ａ０２０１及びＡ０２０６などのサブタイプの使用がさらにより好ましい。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原のタイプが前もって調査され、それにより、適切なHLA抗原に対する高いレベルの結合親和性、及びＣＴＬ誘導能を有する適切なペプチドを選択することが可能になる。さらに、高いHLA結合親和性及びＣＴＬ誘導能を示すペプチドを得るために、天然に存在するＳＴＡＴ３の部分ペプチドのアミノ酸配列を、１個、２個、又はいくつかのアミノ酸の置換又は付加により改変してもよい。本明細書において、「いくつかの」という用語は、５個以下、より好ましくは３個以下を意味する。
【００２２】
さらに、天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原の結合の際に提示されるペプチドの配列の既知の規則性に基づいて（J. Immunol., 152, 3913, 1994；Immunogenetics. 41:178, 1995；J. Immunol. 155:4307, 1994）、本発明の免疫原性ペプチドを改変してもよい。例えば、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、又はトリプトファンで置換された、及び／又はそのＣ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、又はメチオニンで置換された、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を示すペプチドも、好適に使用され得る。したがって、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、及び  
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）からなる群から選択される本発明のペプチドを、このような様式で改変してもよい。さらに、かかるアミノ酸配列の改変から得られるペプチドは、本発明の方法又は組成物にも用いられる。
【００２３】
これに対して、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニンで置換され、及び/又は、Ｃ末端アミノ酸がバリン又はロイシンで置換されたペプチドが、高いＨＬＡ−Ａ０２０１結合親和性を有するペプチドとして好適に使用され得る。例えば、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、  
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）及び
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）からなる群から選択される本発明のペプチドを、このような様式で改変してもよい。さらに、アミノ酸配列のかかる改変から得られるペプチドは、本発明の方法又は組成物にも用いられる。
さらに、１個〜２個のアミノ酸が、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加されてもよい。
【００２４】
置換は、末端アミノ酸でだけではなく、ペプチドの潜在的なＴＣＲ認識位置でも導入され得る。いくつかの研究により、あるペプチドのアミノ酸置換体が、元のものと等しいか、又はそれより優れている場合があることが実証されている。例えば、ＣＡＰ１、ｐ５３（２６４〜２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９〜３７７）、又はｇｐ１００（２０９〜２１７）（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997；T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002) Feb 1;168 (3):1338-47.；S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52:199-206；及びS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００２５】
高いHLA抗原結合親和性及び保持されたCTL誘導能を有する、かかる改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性タンパク質又は外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部分と同一である場合、自己免疫障害又は特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘導される場合がある。したがって、この配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避することがしばしば好ましい。この状況は、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を実施することによって容易に達成され得る。さらに、１個又は２個、のアミノ酸が異なるペプチドさえ存在しないことが相同性検索によって明らかな場合には、ＨＬＡ抗原との結合親和性を高め、かつ／又はＣＴＬ誘導能を高めるための前述のアミノ酸配列の改変が、かかる問題を引き起こす可能性は低い。
【００２６】
前述のように、ＨＬＡ抗原に対して高い結合親和性を有するペプチドは、極めて効果的であると予想されるが、高い結合親和性の存在を指標として用いて選択される候補ペプチドは、それらの実際のＣＴＬ誘導能に関して検査されなければならない。ＣＴＬ誘導能の確認は、例えば、ヒトＭＨＣ抗原を保持する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、及び樹状細胞）、又はより具体的には、ヒト末梢血単核白血球に由来する樹状細胞を誘導し、該細胞をペプチドで刺激し、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してCTLにより産生及び放出されるIFN−γを測定することによって達成される。
【００２７】
反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61(8):764-79 Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., Diamond DJ.に記載されているもの）を使用してもよい。例えば、標的細胞を５１Ｃｒなどで放射性標識することができ、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保持する抗原提示細胞の存在下でＣＴＬによって産生及び放出されたＩＦＮ−γを測定すること、及び抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって検査することもできる。
【００２８】
前述のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を検査した結果、ＨＬＡ抗原に対して高い結合親和性を有するペプチドが多様なCTL誘導能を示すことが明らかとなった。さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むペプチドより選択されるノナペプチド又はデカペプチドは、特に高いＣＴＬ誘導能を示した。
【００２９】
上記のように、本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有し、かつ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列に、１個、２個、もしくはいくつかのアミノ酸の付加又は置換を含むペプチドを提供する。１個、２個、もしくはいくつかのアミノ酸の置換又は付加を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列に示される９個もしくは１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列は、他のタンパク質のアミノ酸配列と一致しないことが好ましい。特に：ＨＬＡ−Ａ２４に関しては、Ｎ末端から２番目のアミノ酸におけるフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンへのアミノ酸置換、及び／又は、Ｃ末端アミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、又はメチオニンへのアミノ酸置換：ＨＬＡ−Ａ２に関しては、Ｎ末端から２番目のアミノ酸におけるロイシン又はメチオニンへのアミノ酸置換、及び／又はＣ末端アミノ酸におけるバリン又はロイシンへのアミノ酸置換、ならびに／又は、Ｎ末端及び／又はＣ末端への１個もしくは２個のアミノ酸のアミノ酸付加が、好ましい例である。
【００３０】
本発明のペプチドは、周知の技術を用いて調製することができる。例えば、これらのペプチドは、組換えＤＮＡ技術又は化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別に合成してもよく、又は２個もしくはそれ以上のペプチドを含む、より長いポリペプチドとして合成してもよい。ペプチドは、単離されていること、すなわち、天然に存在する他の宿主細胞タンパク質及びそれらの断片を実質的に含まないことが好ましい。
【００３１】
ペプチドは、改変が本明細書で記載するペプチドの生物活性を損なわせない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、又はリン酸化などの改変を含んでよい。他の改変には、例えば、ペプチドの血清半減期を延長させるために使用することができるＤ−アミノ酸又は他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
【００３２】
ワクチンとして抗癌免疫力を高める組成物
本発明のペプチドは、ＣＴＬをインビボで誘導し得るワクチンとして使用するために、２つ又はそれ以上の本発明のペプチドを含む組合せとして調製することができる。これらのペプチドは、カクテル中に含まれてよく、又は標準的な技術を用いて互いに結合されてもよい。例えば、これらのペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができる。組合せのペプチドは、同じでもよく、又は異なってもよい。本発明のペプチドを投与することによって、これらのペプチドは抗原提示細胞のＨＬＡ抗原上に高密度で提示され、その後、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原とで形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、抗原提示細胞は、対象から樹状細胞を取り出すことによって得られる。その後、これらの細胞を、本発明のペプチドによって刺激し、これらの細胞を対象に再投与することによって対象にＣＴＬを誘導する。結果として、標的細胞に対する応答を高めることができる。
【００３３】
より具体的には、本発明は、制御性T細胞（Ｔｒｅｇ）を阻害することにより腫瘍血管新生及び免疫抑制を制御するための、１つまたはそれ以上の本発明のペプチドを含む薬物を提供する。本発明のペプチドは、Ｔｒｅｇ及び血管新生の制御に用いることができる。
「制御性T細胞（Ｔｒｅｇ）」の語は、免疫学的活性のサプレッサーとして働くT細胞の、特定化した亜集団である。
【００３４】
本発明のペプチドは、従来の製剤方法によって製剤化された薬学的組成物として直接投与することができる。このような場合、本発明のペプチドの他に、担体、賦形剤、及び薬物のために通常使用されるそのようなものを、特に制限無く適宜含めることができる。本発明の免疫原性組成物は、Ｔｒｅｇの制御による血管新生の抑制及び癌免疫療法の強化を通じて、癌の治療のために使用され得る。
【００３５】
本発明のペプチドを活性成分として含む、血管新生及びＴｒｅｇの生成の抑制による癌治療及び癌免疫療法の強化のための免疫原性組成物は、細胞免疫が効果的に確立されるようにアジュバントを含むことができ、あるいは、それらを他の活性成分と共に投与してもよく、液形態で投与してもよい。使用可能な適切なアジュバントは、文献に記載されているものを含む（Clin. Microbio1. Rev., 7:277-289, 1994）。このようなアジュバントには、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及びミョウバンが含まれる。さらに、リポソーム製剤、薬物が直径数ｍｍのビーズに結合されている顆粒状の製剤、及び脂質がペプチドに結合されている製剤が都合よく使用され得る。投与方法は、経口、皮内、皮下、又は静脈注射などでよく、全身投与又は標的とされる部位の近傍への局所投与も可能である。本発明のペプチドの用量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、及び投与方法などに応じて適切に調整することができ、通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、好ましくは、数日間〜数ヶ月間に１回投与される。当業者は、適切な用量及び投与方法を適当に選択することができる。
【００３６】
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体を表面に提示する、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば、特表平１１−５１０５０７号及び特表２０００−５１２１６１号において詳細に説明されている方法を用いることによって調製することができ、好ましくは、治療及び／又は予防の標的である対象から得られる抗原提示細胞を用いて調製される。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして使用することができる。すなわち、本発明は、抗原提示細胞の誘導又はCTL誘導のための薬学的組成物の製造のための本発明のエキソソームの使用を提供する。本発明はまた、さらに、抗原提示細胞の誘導又はCTL誘導のための本発明のエキソソームを含む薬学的組成物の製造方法又はプロセスを提供する。
【００３７】
使用するＨＬＡ抗原のタイプは、治療及び／又は予防を必要とする対象のタイプと一致しなければならない。例えば、日本人の場合、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２、特にそれぞれＨＬＡ−Ａ２４０２又はＨＬＡ−Ａ０２０１及びＡ０２０６が適切であることが多い。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明のワクチン組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激することができる作用物質と同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のε−アミノ基及びα−アミノ基に結合させ、次いで本発明の免疫原性ペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子中に入れて直接投与するか、リポソーム中に組み入れて投与するか、又はアジュバント中に乳化して投与することができる。ＣＴＬ応答を刺激する脂質の別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質が、適切なペプチドに共有結合された場合に、ＣＴＬを刺激するのに使用することができる（例えば、Deres, et al., Nature 342:561, 1989を参照されたい）。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物はまた、本明細書において開示する免疫原性ペプチドをコードする核酸も含んでよい（例えば、Wolff et al.,(1990)Science 247:1465-1468；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；及びＷＯ９８／０４７２０を参照されたい）。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「裸のＤＮＡ（naked DNA）」、促進された（ブピビカイン、ポリマー、ペプチドを媒介とした）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子を媒介とした（「遺伝子銃」）および圧力を媒介とした送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００４０】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウイルスベクター又は細菌ベクターによって発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニア又は鶏痘などの弱毒化したウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしてワクシニアウイルスを使用することを含む。宿主中に導入すると、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。ワクシニアベクター及び有用な免疫化方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））である。ＢＣＧベクターは、Stover, et al.,(1991)Nature 351:456-60に記載されている。治療的投与又は免疫化のために有用な多種多様の他のベクター、例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、ならびに無毒化した炭疽毒素ベクターなどが、使用可能であろう（例えば、Shata, et al.,(2000)Mol. Med. Today 6:66-71；Shedlock, et al.,(2000)J. Leukoc. Biol. 68:793-806；ならびにHipp, et al.,(2000)In Vivo 14:571-85を参照されたい）
【００４１】
本発明はまた、本発明のペプチドを用いて抗原提示細胞を誘導する方法も提供する。抗原提示細胞は、末梢血単球から樹状細胞を調製し、次いでそれらをインビトロ、エクスビボ、又はインビボで本発明のペプチドと接触させる（それらで刺激する）ことによって誘導することができる。本発明のペプチドを対象に投与すると、本発明のペプチドがそれらに固定化された抗原提示細胞が、対象の体内で誘導される。あるいは、本発明のペプチドを抗原提示細胞に固定化した後、これらの細胞をワクチンとして対象に投与することもできる。例えば、エクスビボの投与は、以下の段階を含んでもよい：
ａ）対象から抗原提示細胞を採取する段階；及び
ｂ）段階ａの抗原提示細胞をペプチドと接触させる段階。
【００４２】
あるいは、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを含む薬学的組成物の製造方法又はプロセスをさらに提供する。段階ｂによって得られる抗原提示細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。
【００４３】
本発明はまた、高レベルの細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法を提供し、本方法は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロで抗原提示細胞に移入する段階を含む。導入される遺伝子は、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であってもよい。導入の方法については、特に限定されず、当分野で従来通りに実施される様々な方法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、及びリン酸カルシウム法を使用してよい。より具体的には、Cancer Res., 56:5672-7, 1996；J. Immunol., 161:5607-13, 1998；J. Exp. Med., 184:465-72, 1996；特表２０００−５０９２８１号に記載されているように実施してもよい。遺伝子を抗原提示細胞中に移入することにより、遺伝子は細胞中で転写及び翻訳などを経て、次いで、発現されたタンパク質は提示経路を経て部分ペプチドとして、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子と結びついて、細胞表面上に提示される。
【００４４】
本発明はさらに、本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導するための方法も提供する。本発明のペプチドが対象に投与される場合、対象の体内でＣＴＬが誘導される。そのため、Ｔｒｅｇを標的とすることにより免疫系の強さが強化され、腫瘍周辺の血管新生が抑制される。あるいは、本発明のペプチドは、エクスビボの治療方法のために使用されてもよく、その場合、対象に由来する抗原提示細胞及びＣＤ８陽性細胞又は末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（それらで刺激し）、ＣＴＬが誘導された後、それらの細胞を対象に戻す。例えば、この方法は、以下の段階を含んでもよい：
ａ）対象から抗原提示細胞を採取する段階、
ｂ）段階ａの抗原提示細胞をペプチドと接触させる段階、
ｃ）段階ｂの抗原提示細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞と混合しかつ同時培養して、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する段階：及び
ｄ）段階ｃの同時培養物からＣＤ８＋Ｔ細胞を採取する段階。
【００４５】
あるいは、本発明により、ＣＴＬを誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用も提供される。さらに、本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための本発明のペプチドも提供する。あるいは本発明はさらに、ＣＴＬを誘導するための本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物の製造方法又はプロセスを提供する。段階ｄによって得られた細胞傷害活性を有するＣＴＬは、ワクチンとして対象に投与することができる。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のペプチドを用いて誘導された、単離されたＣＴＬも提供する。本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞による刺激によって誘導されたＣＴＬは、好ましくは、治療及び／又は予防の標的である対象に由来し、単独で、又は本発明のペプチド又はエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて、ＣＴＬ誘導を制御することを目的として、投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、又は好ましくは誘導のために使用されるのと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＳＴＡＴ３を内因的に発現する細胞、又はＳＴＡＴ３遺伝子をトランスフェクトした細胞でよく、そして、これらのペプチドによる刺激が原因で細胞表面に本発明のペプチドを提示する細胞もまた、攻撃の標的となることができる。
【００４７】
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を提示する抗原提示細胞も提供する。本発明のペプチド又は本発明のペプチドをコードするヌクレオチドとの接触によって得られる抗原提示細胞は、好ましくは、治療及び／又は予防の標的である対象に由来し、単独で、又は本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００４８】
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、及びそれを使用する方法も提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＳＴＡＴ３を提示する細胞に対するＴ細胞の特異性を与えるＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることによって、本発明の１つ又はそれ以上のペプチドを用いて誘導したＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてα鎖及びβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５及びMorgan et al., J Immunol, 171, 3288(2003)）。誘導体ＴＣＲは、好ましくは、ＳＴＡＴ３ペプチドを提示する標的細胞に高い結合力で結合し、かつ、ＳＴＡＴ３ペプチドを提示する標的細胞のインビボ及びインビトロでの効率的な死滅を媒介する。
【００４９】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸は、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクター中に組み入れることができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。これらの核酸又はそれらを利用可能に含むベクターは、Ｔ細胞、好ましくは患者由来のＴ細胞中に移入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（又は別の哺乳動物のもの）の迅速な改変を可能にして、癌細胞を死滅させる優れた特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に産生させる既製の組成物を提供する。
【００５０】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３ペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２との関連においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３と結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を用いて形質導入することによって調製されるＣＴＬも提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボで癌細胞に誘導する(homing)ことができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖する（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)）。本発明のＴ細胞は、その必要に応じて患者において癌を治療又は予防するのに有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００５１】
本発明において、「ワクチン」（免疫原性組成物とも呼ばれる）という用語は、動物に接種すると、腫瘍が誘導する免疫抑制を阻害する機能を有し、これにより抗腫瘍免疫を亢進する物質を意味する。本発明のワクチンは、Ｔｒｅｇ及び／又は血管新生に関連する細胞に対する免疫を誘導する機能も有し得る。本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ＳＴＡＴ３を発現するＴｒｅｇ及びＳＴＡＴ３を発現する血管新生関連細胞に対する強力かつ特異的な免疫応答を誘導するＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープペプチドの調製に用いることができる。したがって、本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、２９、３０、５９、６１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、７３、７４、７５、７７、８３、９４、９６、９７、９８又は１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生を阻害する方法も包含する。一般に、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生の阻害は以下のような免疫応答を含む：
−  ＳＴＡＴ３発現Ｔｒｅｇ及びＳＴＡＴ３発現血管新生関連細胞に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
−  ＳＴＡＴ３発現Ｔｒｅｇ及びＳＴＡＴ３発現血管新生関連細胞を認識する抗体の誘導、ならびに
−  Ｔｒｅｇ及び／又は血管新生関連細胞を抑制するサイトカイン産生の誘導。
【００５２】
したがって、ある種のタンパク質が、動物に接種された際にこれらの免疫応答のいずれか１つを誘導する場合、そのタンパク質は、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生を阻害すると決定される。タンパク質による、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生の阻害は、そのタンパク質に対する、宿主の免疫系の応答をインビボ又はインビトロで観察することによって検出することができる。
【００５３】
例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を検出するための方法が周知である。生体に侵入する外来物質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作用によって、Ｔ細胞及びＢ細胞に対して提示される。ＡＰＣによって提示される抗原に抗原特異的な様式で応答するＴ細胞は、抗原による刺激により細胞傷害性Ｔ細胞（又は細胞傷害性Ｔリンパ球：ＣＴＬ）に分化し、次いで増殖する（これはＴ細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、ある種のペプチドによるＣＴＬ誘導は、ＡＰＣによってそのペプチドをＴ細胞に提示し、かつＣＴＬの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、ＡＰＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球、及びＮＫ細胞を活性化する効果を有する。ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【００５４】
樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして用いたＣＴＬの誘導を評価するための方法は、当技術分野において周知である。ＤＣは、ＡＰＣのうちで最も強力なＣＴＬ誘導効果を有する代表的なＡＰＣである。この方法では、試験ポリペプチドを最初にＤＣと接触させ、次いでこのＤＣをＴ細胞と接触させる。ＤＣと接触させた後に、関心対象の細胞に対する細胞傷害性効果を有するＴ細胞が検出される場合、その試験ペプチドが、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を有することが示される。Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に対するＣＴＬの活性は、例えば、５１Ｃｒで標識された腫瘍細胞の溶解を指標として用いて、検出することができる。あるいは、３Ｈ−チミジン取り込み活性又はＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いてＴｒｅｇの程度及び血管新生関連細胞の損傷を評価する方法も周知である。
【００５５】
ＤＣ以外では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もまたＡＰＣとして使用してよい。ＣＴＬの誘導は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下でＰＢＭＣを培養することによって亢進されることが報告されている。同様に、ＣＴＬは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びＩＬ−７の存在下でＰＢＭＣを培養することによって誘導されることも示されている。
【００５６】
これらの方法によってＣＴＬ誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、ＤＣ活性化作用及びそれに続くＣＴＬ誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に対するＣＴＬを誘導するポリペプチドは、癌治療及び癌免疫療法の強化のためのワクチンとして有用である。さらに、これらのポリペプチドと接触することにより、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を獲得したＡＰＣも、癌治療及び癌免疫療法の強化のためのワクチンとして有用である。さらに、ＡＰＣによるポリペプチド抗原の提示によって細胞傷害性を獲得したＣＴＬもまた、癌治療及び癌免疫療法の強化のためのワクチンとして使用することができる。ＡＰＣ及びＣＴＬの寄与による免疫を用いた、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に関するこのような制御方法は、細胞性免疫療法と呼ばれる。
【００５７】
一般に、細胞性免疫療法のためにポリペプチドを使用する場合、ＣＴＬ誘導の効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組合せ、かつそれらをＤＣと接触させることによって上昇させることができることが知られている。したがって、ＤＣをタンパク質断片で刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を使用することが有利である。
【００５８】
あるいは、あるポリペプチドによる、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生の阻害は、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することができる。例えば、あるポリペプチドに対する抗体が、そのポリペプチドで免疫された実験動物において誘導される場合であって、かつＴｒｅｇ及び血管新生関連細胞がそれらの抗体によって抑制される場合、そのポリペプチドは、腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生を阻害する能力を有すると判定することができる。
【００５９】
腫瘍が誘導する免疫抑制及び血管新生の阻害は、本発明のワクチンを投与することによって誘導され、該誘導により、免疫抑制及び血管新生の解消が可能になる。このような効果は、好ましくは統計学的に有意である。例えば、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞に対するワクチンの制御効果は、ワクチン投与を伴わない対照と比較される場合、５％以下の有意水準で統計的に有意である。例えば、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーＵ検定、又はＡＮＯＶＡを、統計的分析に使用してもよい。
【００６０】
免疫学的活性を有する前述のタンパク質、又はこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクターは、アジュバントと組み合わせてよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と一緒に（又は連続的に）投与された場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を意味する。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、及びミョウバンなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせてもよい。このような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、及び培養液などである。さらに、ワクチンは、必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、及び界面活性剤なども含んでよい。ワクチンは、全身的又は局所的に投与される。ワクチン投与は、単回投与によって実施するか、又は複数回投与によって追加免疫してよい。
【００６１】
ＡＰＣ又はＣＴＬを本発明のワクチンとして使用する場合、Ｔｒｅｇ及び血管新生関連細胞は、例えばエクスビボの方法によって制御することができる。より具体的には、治療又は予防を受けている対象のＰＢＭＣを採取し、ポリペプチドとエクスビボで接触させ、ＡＰＣ又はＣＴＬの誘導後、それらの細胞を対象に投与してもよい。ＡＰＣは、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでＰＢＭＣ中に導入することによっても、誘導することができる。インビトロで誘導したＡＰＣ又はＣＴＬは、投与に先立ってクローン化してもよい。標的細胞を傷害する活性が高い細胞をクローン化し、増殖させることによって、細胞性免疫療法をより効果的に実施することができる。さらに、この様式で単離されたＡＰＣ及びＣＴＬは、それらの細胞が由来する個体に対してだけでなく、他の個体の同様のタイプの疾患に対しても、細胞性免疫療法のために使用され得る。
【００６２】
以下の実施例は、本発明を例示し、かつ当業者がそれらを作製及び使用するのを補助するために提供される。これらの実施例は、本発明の範囲を別な具合に限定することを決して意図しない。
【００６３】
他に定義しない限り、本明細書中において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野において当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用でき、適した方法及び材料を以下に示す。本明細書中において引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照により組み入れられる。
【００６４】
実施例
本発明を以下の実施例によって詳しく例示するが、これらの実施例に限定はされない。
【００６５】
材料及び方法
細胞株
Ａ２４ＬＣＬ細胞株、ヒトBリンパ芽球様細胞株、及びＴ２細胞株はＡＴＣＣから購入した。
【００６６】
STAT3に由来するペプチドの候補選択
ＮＭ＿１３９２７６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のヌクレオチド配列によりコードされるＳＴＡＴ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＮＰ＿６４４８０５；７７０残基）のアミノ酸配列から、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合する、ＳＴＡＴ３由来の９ｍｅｒ及び１０ｍｅｒのペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準の固相合成法に従ってＳｉｇｍａ（札幌、日本）によって合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。これらのペプチドの純度（＞９０％）及び同一性は、それぞれ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析解析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【００６７】
インビトロＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して、ＨＬＡ上に提示されるペプチドに対するＣＴＬ応答を誘導した。Horiguchi S, et al. Cancer Res. 59:2950-2956, 1999で記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した。簡潔には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液中に健常な対象（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２及び／又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）への接着によって分離して、単球画分にそれらを濃縮した。単球の豊富な集団を、２％の加熱不活性化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で培養した。７日間培養した後、サイトカインを用いて作製したＤＣを、ＡＩＭ−Ｖ中、３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下、２０μｇ／ｍｌの合成ペプチドでパルスした。
【００６８】
次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＭＭＣによって不活性化し（３０μｇ／ｍｌ、３０分間）、かつ、ＣＤ８  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いたポジティブ選択によって得た自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に配置した：各ウェルに、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ中に、ペプチドパルスしたＤＣ  １．５×１０４個、ＣＤ８＋Ｔ細胞３×１０５個、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を入れた。３日後、これらの培養物に、最終濃度が２０ＩＵ／ｍｌになるまでＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を添加した。７日目及び１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに再刺激した。前述したのと同じようにして、ＤＣを調製した。２１日目に３回目のペプチド刺激をした後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞又はＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した。
【００６９】
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（Riddel S R, et al. Nature Med. 2: 216-223, 1996; Walter E A, et al. N Engl J Med. 333: 1038-1044, 1995）によって説明されているのと同様の方法を用いて、ＣＴＬを培養して増殖させた。合計５×１０４個のＣＴＬを、４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下、ＭＭＣによって不活性化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ中に再懸濁した。培養開始後１日目に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を培養物に添加した。５日目、８日目、及び１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮なＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳを培養物に供給した。
【００７０】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中で、ウェル当たり０．３個、１個、及び３個のＣＴＬを有する希釈物を作製した。合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で、細胞１×１０４個／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、及び１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共にＣＴＬを培養した。１０日後、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌになるように、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を培地に添加した。１４日目にＣＴＬのＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた。
【００７１】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を検査するために、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法及びＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを実施した。
簡潔には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞又はＴ２細胞（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェルで培養した細胞又は限界希釈後のＣＴＬクローンを、応答細胞として使用した。製造手順のもとに、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法及びＥＬＩＳＡを実施した。
【００７２】
結果
ＳＴＡＴ３に由来するＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド及びＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドの予測
表１は、ＳＴＡＴ３のＨＬＡ−Ａ＊２４０２結合ペプチドを結合親和性の高い方から低い方へ順に示す。表２は、ＳＴＡＴ３のＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ペプチドを結合親和性の高い方から低い方へ順に示す。強力なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計３２のペプチド、及び、強力なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する７１のペプチドを選択した。
【００７３】
（表１）  ＳＴＡＴ３に由来するＨＬＡ−Ａ２４０２結合ペプチド
2011504875.tif 000002
開始位置はＳＴＡＴ３のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。結合スコアは材料と方法に記載の「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００７４】
（表２）  ＳＴＡＴ３に由来するＨＬＡ−０２０１結合ペプチド
2011504875.tif 000003
2011504875.tif 000004
開始位置はＳＴＡＴ３のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。結合スコアは材料と方法に記載の「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００７５】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束される予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＳＴＡＴ３に由来するこれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料及び方法」で説明したように作製した。図１Ａ〜Ｃ及び２Ａ〜Ｂに示すように、得られたＣＴＬは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法により検出可能な特異的ＣＴＬ活性を示した。図１Ａ〜Ｃ中、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激した２番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した５番及び９番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で刺激した５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）で刺激した４番及び５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で刺激した３番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で刺激した１番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）で刺激した６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）で刺激した１番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した６番及び１３番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）で刺激した１番、６番及び１２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）で刺激した３番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）で刺激した１番、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）で刺激した４番、及び、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）で刺激した１番のウェルの細胞は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらのウェルは図中囲んで示す。
【００７６】
図２Ａ〜Ｂ中、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）で刺激した４番及び５番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）で刺激した２番、３番、４番、５番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）で刺激した１番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）で刺激した５番、６番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）で刺激した１番及び４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）で刺激した６番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）で刺激した４番、５番及び７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）で刺激した６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）で刺激した６番、７番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）で刺激した４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）で刺激した４番、６番、７番及び８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）で刺激した３番、５番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）で刺激した７番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）で刺激した４番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）で刺激した２番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）で刺激した８番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）で刺激した１番及び６番、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）で刺激した２番、５番、６番及び８番、及び、ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）で刺激した７番及び８番のウェルの細胞は、対照と比べて強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらのウェルは、図中、囲んで示す。
【００７７】
ＳＴＡＴ３由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
１次スクリーニングの陽性ウェルから、ＳＴＡＴ３由来ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドで刺激したＣＴＬ株を樹立した。図３中、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）及びＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）ペプチドで刺激したＣＴＬ株由来のＩＦＮ−γ産生比をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。これらのデータは、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）及びＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）ペプチドが特異的ＣＴＬ応答を誘導し得たことを示す。同様に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６８）及びＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９４）、で刺激したＣＴＬ株由来のＩＦＮ−γ産生について、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。これらのデータは、ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）及びＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）ペプチドが特異的ＣＴＬ応答を誘導し得たことを示す。
【００７８】
ＳＴＡＴ３由来ペプチドで刺激したＣＴＬクローンの樹立
「材料及び方法」に記載したように、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからの比率依存的ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。強力なＩＦＮ−γ産生が、図４のＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）で刺激したＣＴＬクローンに判定された。
【００７９】
抗原ペプチドの相同性解析
以下のペプチドで刺激したＣＴＬは、強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）及び
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）。
【００８０】
これらのエピトープペプチドに相同な配列を有する他のタンパク質に対する予期しない反応を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）により、これらのペプチド配列をクエリーとして用いて相同性解析を実施し、既知のタンパク質との有意な配列相同性は明らかにならなかった。
これらの結果から、これらのエピトープペプチドで刺激されたＣＴＬは高い特異性を有し、無関係の分子に対して意図されない免疫学的応答を生じさせる可能性は低いことが示される。
【００８１】
考察
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する、新しいＴＡＡの同定により、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種法の臨床応用のさらなる発展が保証される（Harris CC. J Natl Cancer Inst 88:1442-1445, 1996; Butterfield LH, et al. Cancer Res 59:3134-3142, 1999；Vissers JLM, et al, Cancer Res 59: 5554-5559, 1999；Van den Burg SH, et al. J. Immunol 156:3308-3314, 1996；Tanaka F, et al. Cancer Res 57:4465-4468, 1997；Fujie T, et al. Int J Cancer 80:169-172, 1999；Kikuchi M, et al. Int J Cancer 81 : 459-466, 1999；Oiso M, et al. Int J Cancer 81:387-394, 1999）。様々なタイプの抗原特異的免疫療法が行われてきた。しかし、臨床効果は必ずしも予想されたものほど高くない（Rosenberg SA, et al. Nature Med. 10:909-915, 2004）。
【００８２】
免疫療法の臨床効果を改善するには、腫瘍により誘導される免疫抑制因子を克服することだけでなく、腫瘍に対するCTLを誘発することが重要である。腫瘍が浸潤している未成熟ミエロイド細胞及び未成熟樹状細胞、抗腫瘍免疫系に対する免疫抑制細胞が、STAT3を高発現することが報告されている（Yu H, et al. Nat Rev Immunol. 7: 41-51, 2007；Kortylewski M, et al..Nature Med. 11:1314-1321, 2005；Jing N and Tweardy D J. Anti-Cancer Drugs. 16: 601-607, 2005）。最近の研究は、STAT3の信号伝達の阻害により未成熟DCの数が減少し、DCの機能成熟が亢進されたことを示した（Wang T, et al. Nature Med. 10: 48-54, 2004）。
【００８３】
この問題を克服すべく、抗原エピトープとしてのＳＴＡＴ３由来ペプチドが、ヒト集団において一般的なＨＬＡアレルである（Date Y, et al. Tissue Antigens, 47: 93-101, 1996；Kondo A, et al. J Immunol, 155: 4307-4312, 1995；Kubo RT, et al. J Immunol, 152: 3913-3924, 1994）、ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２に拘束されるか否かについて分析がなされた。本発明において、ＳＴＡＴ３由来のＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドの候補が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合親和性についての情報を用いて予測された。これらのペプチドを負荷したＤＣによるＴ細胞のインビトロでの刺激の後、以下のペプチドを用いてＣＴＬを樹立することに成功した：
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−９３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−１８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−３７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−９−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−４４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２４−１０−２１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−６５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−３４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−１３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−４６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−９−５２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−６５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−５６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−７５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−１１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）、
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）及び
ＳＴＡＴ３−Ａ２−１０−３０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）。
【００８４】
得られたＣＴＬはペプチドパルスした標的細胞に対する特異的で強力なＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＳＴＡＴ３がＣＴＬにより認識される新規抗原であり、これらのＳＴＡＴ３のエピトープペプチドがＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ａ２により拘束されることを示す。ＳＴＡＴ３は腫瘍で発現し、かつ、免疫抑制に関連していることから、したがってＳＴＡＴ３は、臨床効果を上昇させるための、免疫療法のよい標的である。
【００８５】
ＣＴＬを誘導し得るＳＴＡＴ３エピトープペプチドの相同性解析により、これらが任意の他の既知ヒト遺伝子産物由来のペプチドとの有意な相同性を有しないことが示された。結論として、本発明において見出されたＳＴＡＴ３エピトープペプチドは、癌免疫療法のための癌ワクチンとして有用である。
【００８６】
産業上の利用可能性
免疫療法の臨床効果を向上するには、腫瘍が誘導する免疫抑制因子を克服することが重要である。Ｔｒｅｇは様々なタイプの免疫応答を抑制する主要なプレーヤーの１つであると考えられている。腫瘍の成長を阻害するには、腫瘍病変部周辺の血管新生を抑制することも重要である。血管新生関連因子は腫瘍細胞又は炎症細胞により産生される。例えば、本発明は、その進行に血管新生を必要とする固形癌の治療のための新規な治療戦略を提供する。また、その生存について免疫寛容に依存する癌も、本発明によって治療され得る。従って、ＳＴＡＴ３発現細胞を標的とするワクチンの開発は、免疫抑制と血管新生の克服に重要である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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