(57)【要約】ある種の遺伝子の存在をもとに血液型群の正確かつ直接的な判定を可能にする核酸分子が開示される。さらに、血液型群の判定方法も提供される。一実施形態では、本発明は、単離された核酸分子を提供する。この核酸分子は１５〜３３ヌクレオチドを持つ配列を含む。また、この配列は、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％である。実施形態の１つでは、この核酸分子はプローブプライマーなどのＤＮＡである。一実施形態では、この核酸分子を修飾する。この修飾は、たとえば、様々な長さの非ヒト配列を持つ５’末端「テイル」を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５〜３３ヌクレオチドの配列を含み、配列番号１〜配列番号１７からなる群より選択される核酸配列に対する同一性が少なくとも７０パーセントである、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子はＤＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子はプローブプライマーである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸は５’末端に修飾をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記修飾は３ヌクレオチド長〜５４ヌクレオチド長のポリ−Ａテイルまたはポリ−ＧＡＴＣテイルを含む、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子は検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記検出可能な標識は放射性標識、蛍光標識、電子密度の高い標識、酵素、ビオチン、ハプテンおよびタンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
血液サンプルにおける少なくとも１つの血液型群タイプを決定するための方法であって、
患者またはドナーから血液サンプルを採取する工程、
少なくとも１つの核酸フラグメントを該血液から抽出する工程であって、該少なくとも１つの核酸フラグメントの検出によって、一般的な血液型群の対立遺伝子の識別を可能にする、工程、
該核酸フラグメントを増幅する工程、
１５〜３３ヌクレオチドの配列を含み、配列番号１〜配列番号１７からなる群より選択される核酸配列に対する同一性が少なくとも７０パーセントである少なくとも１つの核酸分子と該核酸フラグメントをハイブリダイズすることによって、該核酸フラグメントを検出する工程；および
該血液サンプルの少なくとも１つの血液型群タイプを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
前記プライマープローブは５’末端に修飾をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾は３ヌクレオチド長〜５４ヌクレオチド長のポリ−Ａテイルまたはポリ−ＧＡＴＣテイルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマープローブは検出可能な標識をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な標識は放射性標識、蛍光標識、電子密度の高い標識、酵素、ビオチン、ハプテンおよびタンパク質からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸は一塩基多型を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
複数の核酸フラグメントが同時に検出される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９８１，２８３号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）への利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金援助を受けた研究についての声明
この出願に記載された発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、助成金番号Ｐ５０  ＨＬ５４４５９からの資金によってなされた。スポンサーは、ＳＣＯＲ（ＨＬＢ−ＮＩＨ）である。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、特異的に単離される核酸により血液型群遺伝子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
患者とドナーの両方の血液型群タイプを決定することは輸血医学において最も重要である。一致しない赤血球（ＲＢＣ：ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を患者に輸血すると、重度の溶血反応および炎症反応が起こり、死亡することもある。患者の血流中に循環する抗体がドナーの赤血球上にある抗原に遭遇するときに誘発される有害な輸血反応のリスクを最小限に抑えることで、輸血を安全に行うことができる。
【０００５】
慢性的に輸血されている患者の輸血、特に血友病および鎌状赤血球貧血の患者の輸血には、ＡＢＯおよびＲｈ血液型群抗原に加えて、他の血液型群抗原の知識も重要である。さらに、輸血のために抗原陰性患者または無表現型の患者の抗原陰性赤血球を探すには血液型群抗原の完全なプロファイリングも重要である。
【０００６】
一部の血液型群抗原には血清学的タイピング法および標識法が存在するとはいえ、他の血液型群抗原のタイピングは限られている。その要因として、市販の試薬のコスト上昇、十分な量の適切な抗体が不足していること、および赤血球検査およびデータ入力に大きな労働力が必要になることが挙げられる。このため、大部分のドナーセンターはドナー血液の一部のコホートしかスクリーニングしておらず、より詳細にフェノタイピングまたはジェノタイピングが行われたユニットの在庫の保存は限られている。こうした現状から処置が遅延する可能性があり、そのため患者のケアに多額の追加費用が生じる場合があるうえ、緊急の事態を深刻化する恐れもある。
【０００７】
血液型群抗原のタイピングは通常、特異的アロ抗体を用いた古典的な（抗原−抗体）凝集（ａｇｇｌｕｎｉｔｉｎａｔｉｏｎ）反応により判定される。凝集反応は信頼でき得るものではあるが、その実施および解釈には熟練した技術経験が必要となる。したがって、得られた血液型群抗原のタイピングは技術者の専門的技術に依存した主観的なものにならざるを得ない。さらに、使用するアロ抗体は十分に特異的でないため、結果を誤解釈する場合もある。さらに、こうした試薬および抗体の一部は利用可能性および供給源も限られている。
【０００８】
現在、患者／ドナーに存在する血液型群遺伝子を判定するため、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた技術の様々な方法が開発されている。血液型群変異遺伝子を試験するため、ＳＳ−ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）およびマイクロチップなどＤＮＡを用いた多くのアッセイが記載されてきた。こうしたアッセイの問題の１つは、遺伝子の存在についてアッセイが間接的な証拠に依存していることにある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、単離された核酸分子を提供する。この核酸分子は１５〜３３ヌクレオチドを持つ配列を含む。また、この配列は、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％である。
【００１０】
実施形態の１つでは、核酸分子はプローブプライマーなどのＤＮＡである。一実施形態では、核酸分子を修飾する。この修飾は、たとえば、様々な長さの非ヒト配列を持つ５’末端「テイル（ｔａｉｌ）」を含んでもよい。修飾５’末端テイルを設計し、形成する方法は、当該技術分野において周知である。こうした修飾の例として、様々な長さのポリ−Ａテイルまたはポリ−ＧＡＴＣテイルが挙げられる。
【００１１】
別の実施形態では、核酸分子は検出可能な標識をさらに含む。こうした分子の検出は周知であり、たとえば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段が挙げられる。たとえば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、（ＥＬＩＳＡで繁用されるような）酵素などのレポーター分子、ビオチン、ハプテンまたは抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用できるタンパク質がある。こうした標識は公知の手段により検出可能することができる。
【００１２】
別の実施形態では、少なくとも１つの血液型群を判定する方法を提供する。この方法は、患者またはドナーから血液を採取すること；検出することで一般的な血液型群の対立遺伝子の識別が可能になる核酸フラグメントを血液から抽出すること；核酸フラグメントを増幅すること；およびこのフラグメントを、１５〜３３ヌクレオチドであり、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％であるプローブプライマーとハイブリダイズして核酸フラグメントを検出することを含む。
【００１３】
一般的な血液型群は当該技術分野において公知である。一実施形態では、こうした血液型群として、Ｄｕｆｆｙ、Ｄｕｆｆｙ−ＧＡＴＡ、ＦＹＸ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｉｅｇｏ、Ｋｉｄｄ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、ＭＮＳ、Ｋｅｌｌ、ＭＮＳおよびＳｓがあるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
核酸フラグメントは、たとえば、ゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。一実施形態では、核酸は一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を含む。特定のＳＮＰの存在は既知の血液型群と相関する。
【００１５】
別の実施形態では、複数の核酸フラグメントを同時に検出する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）法の原理を示し、Ｄｕｆｆｙ血液型群遺伝子のＦＹＡおよびＦＹＢを例示している。アスタリスクは伸長反応で付加されたヌクレオチドを表す。取り込まれた各ヌクレオチドの下に代表的な蛍光ピークを示す。
【図２Ａ】図２ＡはサンプルＰ８７６に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＡはマルチプレックスＩである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、サンプルＰ８７６に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＢはマルチプレックスＩＩである。
【図２Ｃ】図２ＣはサンプルＰ８７６に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＣはマルチプレックスＩＩＩである。
【図２Ｄ】図２ＤはサンプルＰ８に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＤはマルチプレックスＩである。
【図２Ｅ】図２ＥはサンプルＰ８に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＥはマルチプレックスＩＩである。
【図２Ｆ】図２ＦはサンプルＰ８に関し１０種の血液型群における全１７個のＳＮＰに対するＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）エレクトロフェログラムの結果を示す。プローブプライマーはグレーの枠の各ｂｉｎの上に表示し、対立遺伝子はｂｉｎ内の各ピークの下に示す。図２ＦはマルチプレックスＩＩＩである。
【図３】図３は血液型群遺伝子の検出のために開示した方法の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
単離された核酸分子
本開示の一態様では、単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、最小数１５ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチドまたは少なくとも２１ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一本鎖オリゴマーである。単離された核酸分子は、最大数３３ヌクレオチド、多くても３１ヌクレオチドまたは多くても２６ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドの最小数および最大数の好適な範囲は、上述の任意の最小値と上述の任意の最大値とを組み合わせれば得られる。一実施形態では、核酸分子は、２４ヌクレオチドを含む。
【００１８】
単離された核酸分子は天然の供給源から採取しても、天然の供給源から公知の方法により得てもよい。あるいは、当該技術分野において公知の方法に従って単離された核酸分子を人工的に作製してもよい。こうした方法には、たとえば、適切な配列のクローニングおよび制限のほか、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｖｍｏｌ  ６８：９０（１９７９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９  （１９７９）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９  （１９８１）のジエチルホスホルアミジット法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接的な化学合成がある。単離された核酸分子は、遺伝子型の判定方法にアーチファクトが入らないように少なくとも実質的に精製することが好ましい。
【００１９】
単離された核酸分子は、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／またはミスマッチを含むことで配列番号１〜１７からなる群より選択される比較配列と異なっても構わない。また、核酸分子は、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％である。
【００２０】
【表１】
2011500062.tif 000002
同様に、核酸プローブは標的ＤＮＡの逆鎖に対して作製すればよい。こうした標的ＤＮＡの相補鎖に対するプローブはセンス鎖の３’末端から５’末端に読む。たとえば、ＦＹの二本鎖ゲノムＤＮＡ配列は以下の通りである：
【００２１】
【化１】
2011500062.tif 000003
Ｄｕｆｆｙ血液型群Ａの核酸プローブプライマーの配列（配列番号１）は上記の上の配列（配列番号１８）の一部の上側の実線矢印で示され、Ｄｕｆｆｙ血液型群Ａ抗原の一部は５’ＧＡＴ  ７ＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  Ｇと読める。相補ＤＮＡ鎖のプローブプライマーは下の配列（配列番号１９）の一部の下側の破線矢印で示されるように作製すればよく、Ｄｕｆｆｙ血液型群Ａ抗原の一部は５’ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  Ａ３’と読める。この場合、ＦＹＡの多型ヌクレオチド（２つのプライマー間のヌクレオチドの重複部分）は、使用するプライマーによって「Ｇ」または「Ｃ」のどちらかと読める。この戦略を用いると、ＦＹＢの多型ヌクレオチドは「Ａ」または「Ｔ」のどちらかと読める。多型ヌクレオチドの位置を確認し、相補ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づけば、各血液型群遺伝子に対して同様のアプローチおよびプローブ合成デザインを用いることができる。
【００２２】
配列番号１〜１７のプライマープローブを用いて、こうした相補鎖に対するプライマープローブの位置を確認してもよい。
【００２３】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列中のヌクレオチド総数と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
配列同一性の割合は、比較対象の２つの配列において同一であるヌクレオチドの割合として計算される。同一性（パーセント）の判定は以下の通り行えばよい：／＝（ｎ÷２４）×１００、この場合、／はパーセント単位の同一性であり、ｎは単離された核酸分子と配列番号１〜１７からなる群より選択される比較配列との間の同一ヌクレオチドの数である。
【００２５】
たとえば、単離された核酸分子が２４ヌクレオチドであり、配列番号１〜１７からなる群より選択される比較配列と比べて１２ヌクレオチドが同一である場合、同一性の割合は５０％（すなわち、｛１２／２４｝×１００）となる。あるいは、単離された核酸分子が２４ヌクレオチドであり、配列番号１〜１７からなる群より選択される比較配列と比べて２０ヌクレオチドが同一である場合、同一性の割合は８３％（すなわち、｛２０／２４｝×１００）となる。
【００２６】
一実施形態では、単離された核酸分子は上述の同一性の割合のほかに、配列番号１〜１７からなる群より選択される各配列の３’末端に対する配列同一性が１００％である。具体的には、各配列の３’末端から各配列の５’末端に向けて順番に読むと、単離された核酸分子は少なくとも３ヌクレオチドに対する配列同一性が１００％である。別の実施形態では、各配列の３’末端から各配列の５’末端に向けて順番に読むと、単離された核酸分子は少なくとも６ヌクレオチドおよび少なくとも９ヌクレオチドに対する配列同一性が１００％である。
【００２７】
一実施形態では、単離された核酸分子はプローブプライマーである。以下に詳述するように、こうしたプローブプライマーは、特定の血液型群遺伝子と関連がある一塩基多型（ＳＮＰ）の同定に有効である場合がある。
【００２８】
このプライマーはＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのフラグメントなどの所望の鋳型とハイブリダイズする。
【００２９】
ハイブリダイゼーションという語は、上記のような２つの核酸間の塩基対形成の程度をいう。当業者には周知のように、アデニン（Ａ）は水素結合、すなわち、チミン（Ｔ）と塩基対を形成することができ、グアニン（Ｇ）は水素結合、すなわち、シトシン（Ｃ）と塩基対を形成することができる。このため、ＡはＴと相補的であり、ＧはＣと相補的である。
【００３０】
プローブプライマー配列は、所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド配列でも他の部分が相補的なプライマーの５’末端に結合する場合がある。あるいは、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に非相補的塩基が散在してもよく、ただし、プライマー配列は、伸長産物を合成するための鋳型−プライマー複合体を機能的に与える所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を持つものとする。
【００３１】
しかしながら、プローブプライマーは、所望の伸長産物の合成を開始させるために、所望の鋳型との十分な相補性がなければならない。たとえば、標的配列とプライマーとの間の塩基対形成を妨害する塩基対ミスマッチはいくらあっても構わないが、突然変異の数が非常に多くて最も低いストリンジェントな塩基対形成条件下でも塩基対形成が起こらない場合、その配列は相補的な標的配列ではない。
【００３２】
この文脈において「ミスマッチ」は相対的な用語であり、本明細書で「検出位置」と呼ぶ２つの配列間の特定の位置の塩基同一性の違いを示すものであることに留意されたい。一般には、野生型配列と異なる配列をミスマッチという。しかしながら、特にＳＮＰの場合、集団内で複数の対立遺伝子が比較的頻繁に認められることがあるため、「野生型」を形成する配列を判定することが困難などの場合がある。したがって、この文脈においては「ミスマッチ」という場合、どうしても１つの配列を基準として採用する必要がある。このため、本開示では、本明細書の各配列を「完全マッチ」およびミスマッチ」という。「ミスマッチ」はさらに「対立遺伝子変異体」と呼ぶこともある。
【００３３】
したがって、プローブプライマーは、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用されるプライマーの３’ヒドロキシル部分が適切に並置される形で、所望の鋳型鎖とアニールできるだけの十分な相補性がなければならない。
【００３４】
上記のような単離された核酸分子は、好ましくは配列番号１〜１７からなる群より選択される各配列の３’末端に対する配列同一性が１００％である。結果として、単離された核酸分子は、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用されるプライマーの３’ヒドロキシル部分が適切に並置される要領で、所望の鋳型鎖とアニールするのに十分な相補性を持つ。
【００３５】
配列特異的プライマーの設計基準は当業者によく知られている。プライマーの配列特異的部分は、ライゲーション産物および増幅産物の相補配列と必要に応じて特異的にアニーリングできるのに十分な長さがある。
【００３６】
さらなる実施形態では、単離された核酸分子は修飾プローブプライマーである。修飾プローブプライマーとは、本明細書で使用する場合、様々な長さの非ヒト配列を持つ５’末端「テイル」を含むプローブプライマーである。修飾５’末端テイルを設計し、形成する方法は、当該技術分野において周知である。こうした修飾の例として、ポリ−Ａテイル、ポリ−Ｇテイル、ポリ−Ｃテイル、ポリ−Ｔテイルもしくはポリ−ＧＡＴＣテイルまたはその組み合わせが挙げられる。修飾により様々な長さのヌクレオチドをプライマーに付加することができる。
【００３７】
テイルの長さはいくつかのヌクレオチド単位で異なってもよく、これは当業者が最適化すればよい。たとえば、テイルの長さは５または４ヌクレオチド単位で異なってもよい。一実施形態では、テイルは３〜５４ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、テイルは６〜４８ヌクレオチド長、１２〜４２ヌクレオチド長、１８〜３６ヌクレオチド長または２４〜３２ヌクレオチド長を含む。さらなる実施形態では、テイルは６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６または５１ヌクレオチドを含む。
【００３８】
こうした修飾プローブプライマーを用いると、特に複数の標的がハイブリダイズされている状態で標的配列を識別しやすくなる。修飾プローブプライマーの例には配列番号４６〜６２がある。
【００３９】
なおさらなる実施形態では、単離された核酸分子は検出可能なプローブプライマーである。「検出可能なプローブプライマー」という語は、検出可能な標識を含むプローブプライマーをいう。標識については、たとえば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出することができる。たとえば、有用な標識として、放射性標識、蛍光標識、電子密度の高い標識（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｎｓｅ  ｌａｂｅｌ）、酵素、ビオチン、ハプテンおよびタンパク質があるが、これに限定されるものではない。非限定的な例として、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、（ＥＬＩＳＡで繁用されるような）酵素などのレポーター分子、ビオチンもしくはハプテンまたは抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用できるタンパク質がある。こうした標識は公知の手段により検出することができる。
【００４０】
血液型群の判定方法
本明細書に開示する一実施形態では、血液型群遺伝子の判定方法であって、患者またはドナーから血液を採取すること、検出することで一般的な血液型群の対立遺伝子の識別が可能になる核酸フラグメントを血液から抽出すること、核酸フラグメントを増幅すること、および１５〜３３ヌクレオチドを持ち、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％であるプローブプライマーと前記フラグメントをハイブリダイズして核酸フラグメントを検出することを含む、方法を提供する。
【００４１】
血液型群抗原は遺伝性かつ多型性であり、赤血球膜の細胞外表面のタンパク質、糖タンパク質または糖脂質に構造上の特徴がある。一般的な血液型群は当該技術分野において公知である。一般的な血液型群には、たとえば、Ｄｕｆｆｙ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｉｅｇｏ、Ｋｉｄｄ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、ＭＮＳ、Ｋｅｌｌ、ＭＮＳおよびＳｓなどの群がある。
【００４２】
血液型群抗原の多型の大部分は血液型群遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。変異体血液型群遺伝子内で同定されるＳＮＰはミスセンス変異、ナンセンス変異、選択的スプライシングおよび遺伝子プロモーターのサイレンシングをコードしている。それぞれの血液型群系におけるＳＮＰの例を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2011500062.tif 000004
上記のＳＮＰを包含する当該ＤＮＡ配列は上述の受託番号でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手することができる。
【００４４】
特許請求の範囲に記載の方法は、患者またはドナーから血液を採取することを含む。血液サンプルは当業者に公知の任意の方法により採取できる。好適な方法として、たとえば、血液サンプルを採取するための静脈の静脈穿刺が挙げられる。血液は患者またはドナーの任意の組織から採取すればよい。
【００４５】
患者またはドナーは任意のヒトとしてもよい。たとえば、患者は輸血が必要な患者、慢性的に輸血されている患者、鎌状赤血球病などの血液関連疾患の患者または血液型群の判定を必要とする任意の人であってもよい。
【００４６】
さらに、この方法は、検出することで一般的な血液型群の対立遺伝子の識別が可能になる核酸フラグメントを血液から抽出することを含む。
【００４７】
核酸フラグメントはＤＮＡ由来でもＲＮＡ由来でもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡについては、当業者に公知の任意の方法により血液サンプルから単離することができる。たとえば、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはビーズによる自動ＤＮＡを抽出するＢｉｏＲｏｂｏｔ  Ｍ９６（Ｑｉａｇｅｎ）（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ，Ｑｉａｇｅｎ）などの市販のキットを用いてＤＮＡを単離してもよいし、またはＴＲＩＺＯＬ（登録商標）全ＲＮＡ単離試薬などを用いてＲＮＡを単離してもよい。
【００４８】
特許請求の範囲に記載の方法は任意に、当該技術分野において周知であるエチジウムブロミドドット定量化法によりＤＮＡ濃度を迅速に推定することをさらに含んでもよい。たとえば、血液サンプルから抽出したＤＮＡ濃度は、エチジウムブロミドで染色された既知濃度のＤＮＡ標準物質の強度と紫外（ＵＶ：ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）線で比較して推定することができる。
【００４９】
抽出核酸フラグメントは、ＤＮＡ、たとえば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡであってもよい。ｍＲＮＡは、網状赤血球または末梢血から単離することができる。また、血液型群抗原を発現する腫瘍細胞株（ｃａｌｌ  ｌｉｎｅｓ）を抽出核酸フラグメントの起源、たとえば、ＲＮＡの起源としてもよい。こうした腫瘍細胞株の例として、ＡＴＣＣに寄託されているヒトＫ５６２がある。
【００５０】
抽出核酸フラグメントの検出により一般的な血液型群の対立遺伝子を識別することができる。この検出には、１５〜３３ヌクレオチドを持ち、配列番号１〜１７からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％であるセンスおよびアンチセンスプライマーと抽出核酸フラグメントをハイブリダイズし、増幅することが含まれる。
【００５１】
抽出核酸フラグメントの検出に関しては、ＤＮＡを任意に当該技術分野において公知の方法により増幅する。好適な方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応に関する内容の全部を参照によって本明細書に援用する米国特許第４，６８３，１９５号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。たとえば、ヌクレオチドのフランキング配列と相補的である、および／または対立遺伝子のＳＮＰ部位に存在するオリゴヌクレオチドプライマーは、対立遺伝子の増幅に使用できる。
【００５２】
抽出核酸フラグメントを用いて、血液サンプル中にＳＮＰを含む対立遺伝子が存在するかどうかを判定する。ＳＮＰを含む対立遺伝子の存在については、オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用など、当業者に公知の任意の方法により判定すればよい。
【００５３】
増幅反応の最適化方法は、当業者によく知られている。たとえば、ＰＣＲは、アニーリング、重合および変性の時間および温度の変更のほか、緩衝液、塩および反応組成の他の領域の変更により最適化できることがよく知られている。また、最適化は使用する増幅プライマーの設計によっても左右される場合がある。たとえば、プライマーの長さ、さらにはＧ−Ｃ／Ａ−Ｔ比によりプライマーのアニーリング効率が変化し、したがって増幅反応も変化する場合がある。
【００５４】
一実施形態では、血液型群遺伝子の増幅に使用できるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、配列番号２０〜４５からなる群より選択される配列に対する配列同一性が少なくとも７０％であるオリゴヌクレオチド（表３）を含む。また、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーはマルチプレックスＰＣＲ反応に使用してもよい。こうしたＰＣＲプライマーも本発明の新規な態様であり、血液型群遺伝子の増幅を強力に促進する。
【００５５】
【表３】
2011500062.tif 000005
この方法はシングル反応で行っても、マルチプレックス反応で行ってもよい。本明細書で使用する場合、「マルチプレックス」という語は、同じ反応容器内で複数の反応が起こることをいう。マルチプレックスＰＣＲを様々に組み合わせれば、それぞれの単位複製配列を確実に増幅することができる。本明細書で使用する場合、「単位複製配列」とは、天然または人為的増幅現象の産物として形成されたＤＮＡの断片をいう。たとえば、単位複製配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）のほか、天然の遺伝子重複によっても形成される場合がある。マルチプレックスＰＣＲ反応には配列番号２０〜４５に記載されたオリゴヌクレオチドを使用しても構わない。
【００５６】
この方法はさらに、核酸フラグメントを上記のような修飾プローブプライマーとハイブリダイズしてフラグメントを検出することを含む。修飾プローブプライマーの例として、配列番号４６〜６２（表４）が挙げられる。配列番号４６〜６２は、配列番号１〜１７にポリ−Ａテイルを付加したものと同一である。その後修飾プローブプライマーを用いて血液型群におけるＳＮＰを検出することができる。配列番号４６〜６２に記載のオリゴヌクレオチドは１つ１つのＳＮＰを検出し、それぞれのＳＮＰ部位の５’位置で停止するプローブとして使用できるように設計した。
【００５７】
以下の表４に、血液型群におけるＳＮＰを検出できるプライマーの配列、マルチプレックスを行う際のそのポリ−Ａテイルの長さ、および特許請求の範囲に記載されている発明の方法に使用できる最適なアニーリング温度を示す。
【００５８】
ハイブリダイゼーションに使用するプライマーは、好ましくは検出用の単位複製配列に検出可能な標識、フルオロフォアなどの光学的標識をさらに含んでもよい。こうしたプライマーに標識を組み込めば、それぞれのＳＮＰ部位で認められるヌクレオチドを直接可視化することでサンプル中の血液型群遺伝子の直接的な検出が可能になる。
【００５９】
上述の核酸分子、より具体的には本プライマーおよびプローブプライマーを用いて、任意の公知の遺伝子を用いた検出系により一般的な血液型群に関連する遺伝子を検出してもよい。遺伝子を用いた検出系の中にはＳＮＰの有無を利用して血液型群遺伝子を検出するものもある。
【００６０】
【表４】
2011500062.tif 000006
ＳＮＰの解析方法は当該技術分野において周知であり、シングルまたはマルチプレックス反応を用いて行うことができる。こうした方法の例として、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長反応、ミニシーケンシング、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（ＭＳ：ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ピロシーケンシング、マイクロアレイおよび蛍光検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドライゲーション、侵入型切断；電気泳動および蛍光検出が挙げられる。たとえば、Ｈａｓｈｍｉ，ｅｔ  ａｌ．「Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ，ｒａｐｉｄ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ＤＮＡ  ｔｙｐｉｎｇ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００５  Ｍａｙ；４５（５）：６８０−８，ａｎｄ  Ｓｏｂｒｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ，「ＳＮＰｓ  ｉｎ  ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ＳＮＰ  ｔｙｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ」，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ．２００５  Ｎｏｖ  ２５；１５４（２−３）：１８１−９４を参照されたい。
【００６１】
好ましくは、マルチプレックスＳＮＰ解析を行う。最も好ましくは、ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）マルチプレックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの市販のキットを用いてマルチプレックスＳＮＰ解析を行う。ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）キットは、ミニシーケンス反応に続く電気泳動および蛍光検出に基づくものである。ミニシーケンスでは、プライマーはＳＮＰに直接隣接する標的ＤＮＡにアニールし、次いで多型部位と相補的な単一のヌクレオチドと一緒にＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００６２】
ＳＮＰ解析に使用するプライマーの５’末端テイルを適切に設計することで、複数のアッセイ反応を同時に行う、すなわち、マルチプレックスを行うことができる。ＳＮＰ解析用に５’末端テイルが適切に設計されたプライマーの例として、上述の修飾プローブプライマー、たとえば、配列番号４６〜６２が挙げられる。こうしたプライマーは、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動により定量を行う際に有用である。
【００６３】
テイルの長さが異なると、対応する産物の配列はゲルまたはキャピラリーにおいて様々な位置でバンドを形成する。異なる位置にこうしたバンドが存在することで、解析対象のＤＮＡにおいて対応するヌクレオチドの相違を特定することができる。また、こうしたプライマーはＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）の最終産物間の重複を回避するのにも有用である。
【００６４】
一実施形態では、プライマーは、マルチプレックス反応条件で使用される様々なサイズのプローブプライマーを形成するため５’末端に異なる長さのポリ−Ａテイルを含む。たとえば、プライマーは、ポリ−Ａテイルを５’末端に付加して５ヌクレオチド単位で異なってもよい。
【００６５】
別の実施形態では、プライマーは、マルチプレックス反応条件で使用される様々なサイズのプローブプライマーを形成するため５’末端に異なる長さのポリ−ＧＡＴＣテイルを含む。たとえば、プライマーは、ポリ−ＧＡＴＣテイルを５’末端に付加して４ヌクレオチド単位で異なってもよい。
【００６６】
次いで自動キャピラリーＤＮＡシーケンサーまたは他の好適なシーケンサーを用いて、この産物を電気泳動的に分離する。
【００６７】
マルチプレックス反応を行うには、ＳＮＰの各組のＰＣＲ反応およびミニシーケンス反応用のプライマーの設計および濃度、ならびに温度サイクルの最適化など多くのステップが必要となる。ＳＮＰの各組のＰＣＲ反応およびミニシーケンス反応用のプライマーの設計および濃度については上記に詳述してきた。温度サイクルの最適化に関しては、本明細書に記載の任意のプライマーと、対応する鋳型との相補領域のアニーリング温度を少なくとも４０℃、少なくとも４５℃または少なくとも５０℃とし、高くても５５℃、高くても６５℃または高くても７２℃とすべきである。
【００６８】
高度のマルチプレックスを行うと、解析対象の対立遺伝子と共に多くのＳＮＰを含む核酸サンプルのスクリーニング費用が劇的に削減される。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
ＤＮＡの調製
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＹＢＣ）で２９個のヒト血液サンプルを献血者から取得した。同意文書は施設内審査委員会の承認を受けた。
【００７０】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を用いて２００μｌの血液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。２００μｌのサンプルおよび２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＬに２０マイクロリットルのプロテイナーゼＫを加え、１５秒間パルスボルテックスして混合し、５６℃で１０分間インキュベートした。チューブを短時間遠心し、各サンプルに２００μｌの無水エタノールを加え、１５秒間パルスボルテックスして混合し、短時間遠心した。この混合物を２ｍｌ収集チューブ内のＱＩＡａｍｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに移し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。このカラムを新しい２ｍｌ収集チューブに入れ、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１を加え、カラムを８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。カラムを新しい収集チューブに入れてから、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２を加え、カラムを１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。カラムを新しい収集チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心し、新しい１．５ｍｌの微小遠心管に入れ、室温で５分間インキュベートしてから８，０００ｒｐｍで１分間遠心して２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥでＤＮＡを溶出させた。次いでＤＮＡサンプルを−２０℃で保温して長期保存した。
【００７１】
（実施例２）
エチジウムブロミドドット定量化によるＤＮＡ濃度の迅速な測定
全血液サンプルから抽出したＤＮＡの濃度を、以下の濃度のエチジウムブロミド染色ＤＮＡ標準物質の強度と比較して推定した：０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ。
【００７２】
１ｐｇ／ｍｌのエチジウムブロミド溶液４マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｌｔｅｒｓ）を４μｌの各標準物質および４μｌの各サンプルに加え、すべての混合物をプラスチックラップに並べてスポットし、ＵＶトランスイルミネータ（ｔｒａｎｓｉｌｈｕｎｉｎａｔｏｒ）（Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ（商標）２２００，Ａｌｐｈａ  ｌｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）に載せた。エチジウムブロミド染色ＤＮＡ標準物質およびサンプルの強度を紫外線下で可視化し、記録保持のため写真を撮った。各サンプルからのシグナル強度を当該技術分野において公知のコンピュータプログラムで定量し、ＤＮＡ標準物質の強度値を用いてＤＮＡ濃度の標準曲線をプロットした。この標準曲線を用いて血液サンプルからの各抽出物のＤＮＡ濃度を個別に判定し、その後の各ＰＣＲ反応で同量のＤＮＡ鋳型が増幅できるようにした。
【００７３】
（実施例３）
ＳＮａＰｓｈｏｔアッセイ用のＰＣＲプライマーおよびプローブプライマーの設計
血液型群抗原の分子基盤に関する知識に基づき、マルチプレックスＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）法を用いて１０種の血液型群系、すなわち、ＭＮＳ、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、Ｄｉｅｇｏ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、ＣｏｌｔｏｎおよびＬａｎｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒの既知位置の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出した。解析対象の１７個のＳＮＰを包含する当該ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手することができ、その受託番号を表２に示す。
【００７４】
１０種の血液型群系の抗原およびアミノ酸変化に関連する１７個のＳＮＰも表２に示す。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、非標識のオリゴヌクレオチドプライマーのジデオキシによる一塩基伸長に基づき、１つのチューブで複数のＳＮＰを検出することができる。始めにマルチプレックスＰＣＲを様々に組み合わせて各単位複製配列の確実な増幅を行った。各遺伝子のフォワードおよびリバースプライマーを表３に示す。
【００７５】
個々のＳＮＰを検出するプローブとして使用するプライマーはＳＮＰ部位それぞれの５’でちょうど停止するように設計した。各プローブプライマーの長さは、遺伝子の配列に対して特異的な２４ヌクレオチドに加えて、マルチプレックス反応条件に使用すべく様々なサイズのプローブを作製するため５’末端に異なる長さのポリ−Ａテイルを含む。本試験の１つのマルチプレックス反応に含まれる各プローブプライマーは、ＳＮａＰｓｈｏｔの最終産物間の重複を回避するためポリ−Ａテイルを５’末端に付加しＳヌクレオチド単位で異なるものであった。任意のプライマーと、対応する鋳型との相補領域のアニーリング温度は少なくとも５０℃にすべきである。各プローブプライマーの配列、そのポリ−Ａテイルの長さおよびアニーリング温度を表４に示す。３つのマルチプレックスＰＣＲ増幅反応は下記のように最適化した。
【００７６】
（実施例４）
鋳型の調製、マルチプレックスＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製
３つのマルチプレックスＰＣＲの反応により、各ＳＮＰ部位の周辺のゲノムＤＮＡ領域を増幅した。マルチプレックスＩにはＤｕｆｆｙおよびＤｏｍｂｒｏｃｋ血液型群のＳＮＰを含有する領域を増幅するためのプライマーを含ませ、マルチプレックスＩＩにはＬａｎｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｅｉｎｅｒ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｓｃｉａｎｎａ、Ｄｉｅｇｏ、Ｋｉｄｄ、ＬｕｔｈｅｒａｎおよびＭＮ血液型群のＳＮＰを含有する領域を増幅するためのプライマーを含ませ、マルチプレックスＩＩＩにはＫｅｌｌおよびＳｓ血液型群のＳＮＰを含有する領域を増幅するためのプライマーを含ませた。マルチプレックスＩ、マルチプレックスＩＩおよびマルチプレックスＩＩＩのＰＣＲ反応のオリゴヌクレオチドプライマー配列を表３に示す。
【００７７】
各マルチプレックス化ＰＣＲ反応では、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび１００ｎｇの保存しておいたフォワードおよびリバースプライマーを含む５０μｌの反応混合物中で５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ，ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）により１００ｎｇのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅は以下の条件によりサーマルサイクラー（９７００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で行った：９４℃で２０秒、５５℃で２０秒および７２℃で３０秒を３５サイクル；続いて７２℃で１０分の最終伸長反応。マルチプレックスＩおよびマルチプレックスＩＩＩのＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲルで解析し、マルチプレックスＩＩのＰＣＲ産物については８％ポリアクリルアミドゲルで解析した。マルチプレックスＩＩのＰＣＲ産物のサイズは他のマルチプレックスよりも互いに似通っていた。したがって、８％ポリアクリルアミドゲルは１．２％アガロースゲルよりも分解能が高いため、マルチプレックスＩＩのＰＣＲ産物の分離には８％ポリアクリルアミドゲルを用いた方が好適であった。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を精製し、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のプロトコルを変更して用いて過剰ｄＮＴＰおよびプライマーを除去した。２マイクロリットルのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを５μｌのＰＣＲ産物に加え、３７℃で１時間インキュベートし、続いて７５℃で１５分間酵素を不活性化し、４℃で保存した。
【００７８】
（実施例５）
ＳＮａＰｓｈｏｔマルチプレックス反応の準備
全サンプルについて、１０ｎｇの精製ＰＣＲ産物とマルチプレックスＳＮＰ反応ごとに保存しておいた１０〜２００ｎｇのプローブプライマーとを組み合わせて、ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＳＮＰ解析反応用にｄｄＨ２Ｏで体積を５μｌとした。ＰＣＲ産物とプローブプライマーとを組み合わせて総体積が５μｌを超える場合もあり、その場合ＳｐｅｅｄＶａｃで十分に乾燥させ、５μｌのｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。付属の２μｌのＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅおよび１μｌのＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを含む陽性対照と、鋳型を含まずに１μｌのＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを含む陰性対照との体積をそれぞれｄｄＨ２Ｏで５μｌとして一連の反応をそれぞれ行った。各サンプルの混合物に、５μｌのＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを氷上で加え、サンプルをＢｉｏ−Ｒｅｄ  ｉＣｙｃｌｅｒに導入し、９６℃で１０秒、５０℃で５秒および６０℃３０秒を２５サイクル行い、続いて４℃まで急速に冷却した。伸長後の処理は、１ユニットのエビ由来アルカリホスファターゼ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を各反応に加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて７５℃で１５分酵素を不活化して行った。
【００７９】
伸長後の処理の後、９μｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および０．５μｌのＧｅｎｅＳｃａｎ−１２０Ｌｉｚサイズスタンダードを含む新しいチューブを氷上で調製した。この混合物に０．５μｌのＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ産物をそれぞれ加え、ＤＮＡを９５℃で５分間変性するように設定し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒに導入するまで氷上保存した。
【００８０】
ＰＯＰ−４ポリマー、５０ｃｍのキャピラリーを用い、注入時間を３０秒、オーブン温度を６０℃としてサンプルの分析を行った。結果を、ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）デフォルトの解析法によりＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．３．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【００８１】
（実施例６）
プローブプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長反応による血液型群ＳＮＰの同定
１７個のＳＮＰのマルチプレックスＰＣＲを行った後、それぞれが異なる蛍光色を持つ蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下で１７個のプローブプライマーをＳＮＰの５’末端とハイブリダイズした。ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを１ヌクレオチド伸長させ、多型ヌクレオチドに対応するｄｄＮＴＰを３’末端に１つだけ付加する。キャピラリー電気泳動におけるオリゴヌクレオチドの移動度をそのサイズ、ヌクレオチド組成および色素によって測定した。
【００８２】
各ＳＮＰプローブプライマーはサイズが分かっており、既知のＳＮＰ部位に１ジデオキシヌクレオチド塩基伸長された。したがって、各プローブプライマーの（塩基対における）移動および各塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）に特異的な蛍光色素を既知のプローブプライマーサイズおよび既知の対立遺伝子の多型とマッチングさせれば、各ＳＮＰをマルチプレックスにおける残りのＳＮＰと区別することができる。たとえば、エクソン２の１２５番目のＤｕｆｆｙ遺伝子における多型を検出するｐＦＹＡ／Ｂプローブプライマーは３０ｂｐ長であり、ホモ接合のＧもしくはＡまたはヘテロ接合のＧ／Ａを検出するはずである。よって、エレクトロフェログラムの約３０ｂｐで移動する青色（Ｇ）または／および緑色（Ａ）のピークを追跡し、既知の対照を用いてｐＦＹＡ／Ｂとしての同一性を判定する。考えられる２つの対立遺伝子それぞれの移動の正確な位置をＳＮＰごとに判定し、そのｂｉｎ位置はあらゆる反応に応用できる。ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いれば、こうしたＳＮＰ部位のｂｉｎに該当する各塩基が「コールされる」。図１にＦｙａ／Ｆｙｂ血液型群多型に基づくＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）法の基本原理を示す。
【００８３】
ピーク高さが少なくとも８００で８０００以下になるように、３つのマルチプレックス反応それぞれにおけるＤＮＡ鋳型およびＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）プローブプライマーの濃度を最適化した（表３）。プローブ濃度は１０ｎＭ〜２００ｎＭまでの幅があった（表３）。一般に、プローブ長さが長いほど、最適なシグナルを得るのに必要なプローブの濃度は高くなる。しかしながら、これはすべてについて当てはまるわけではなく、Ｋ／ｋおよびＳ／ｓの場合のように、プローブ長さがそれぞれ３０ｂｐおよび３５ｂｐであっても、必要とされるプローブ濃度が２００ｎＭおよび１００ｎＭであることもあった。必要とされるプローブ濃度はプローブ長さおよびその塩基組成によって異なる場合がある。約７０００を超えるピークシグナルは「オフ−スケール」として登録され、目的のピークの下に「プル−アップピーク」ノイズが作成される。これが起きてもピークが８０００未満に保たれている限り、通常ベースコーリングを妨害するものではない。８００未満のピークシグナルは真の対立遺伝子コールを行うには強度が不十分と見なされ、各多型を検出するために作製されたｂｉｎに含まれることがなければ、「ノイズ」としてカウントされる。図２はマルチプレックスＩ、ＩＩおよびＩＩＩにおける代表的なサンプルに対して作成されたデータの例を示す。強調表示した領域が各ＳＮＰを検出するために作製されたｂｉｎであり、この個々のサンプルに認められる対立遺伝子がピークの下にコールされる（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）。
【００８４】
血清学的解析あるいはマイクロアレイ解析により以前にフェノタイピングおよび／またはジェノタイピングが行われた２９個の血液サンプルにおける１７個のＳＮＰ部位をそれぞれ対照として用いて、３つのマルチプレックスＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）アッセイの精度および再現性を試験した。マルチプレックスＩ、ＩＩおよびＩＩＩの各ＳＮＰ位置でヘテロ接合である対照を作製して、未知データの解析のための「ｂｉｎ」を設計した。ｂｉｎについては、プローブプライマーに結合した標識ジデオキシヌクレオチド対立遺伝子に対応する各ピークが、３１００ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡシーケンサーで得られたデータからＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）ソフトウェアにより作製されたエレクロフェログラムを移動する塩基対の特異的位置により定義される。
【００８５】
図２に、キャピラリー電気泳動後の３つのマルチプレックス反応のヒストグラムを示す。各遺伝子は、プローブプライマーから伸長したヌクレオチド（ＳＮＰ）に基づきコールされた。同様の反応を２９個のサンプル全部について行った。その結果を以前に判定されたタイプと比較した。ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）の解析結果からは、試験対象の２９個の全サンプルについて１７個のＳＮＰが正確に予測された。シグナルのピーク高さは各ＳＮＰで異なったものの、はっきりと同定することができた。ホモ接合のＳＮＰおよびヘテロ接合のＳＮＰが共に同等の信頼度で検出された。解析対象の４９３（１７×２９）個のＳＮＰのうち４０９個がホモ接合のＳＮＰ、８４個がヘテロ接合のＳＮＰであった（表５）。血液型群ＳＮＰについてはどうのような組み合わせまたは数で用いてもよいが、組み合わせごとに最適化しなければならない。
【００８６】
血液型群抗体を同定し、抗原陰性の血液を供給することは輸血の安全性の拠り所となる。現在の慣行では赤血球凝集によるタイピング、ならびにＡＢＯ抗原およびＲｈ（Ｄ）抗原に対するドナー血液の標識（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｓ，２００３）が行われている一方で、他の血液型群抗原に対するタイピングは多くの要因から限られている。こうした要因として赤血球凝集検査およびデータ入力に大きな労働力が必要になること、さらに市販の試薬のコスト上昇および十分な量の適切な抗体が不足していることが挙げられる。このため、大部分のドナーセンターはドナーの一部のコホートしかスクリーニングしておらず、保存されている抗原陰性産物の在庫は限られている。こうした現状から処置が遅延する可能性があるため、患者のケアに多額の追加費用が生じる恐れがある。マルチプレックスＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）技術は、抗原陰性血液の在庫を増大させる可能性がある。このため、特に慢性的に輸血されている患者の場合、「マイナーな」血液型群抗原の同種抗原を抑制または予防できると考えられる。遺伝子型は表現型を反映しない場合があるが、ＤＮＡ解析を行えば、潜在的な抗原陰性が特定され、赤血球凝集により確認される。
【００８７】
本明細書に示す方法の信頼性にとって重要なのは、酵素を介した検出プローブ伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）のフォーマットを同時に実行して対立遺伝子の明確に識別を維持しつつ、高度なマルチプレックス反応においても他の多型からの干渉を最小限に抑えることである。このため、正常対立遺伝子あるいは変異対立遺伝子に合う様々な３’終端を含むビーズ表示プローブが、ＤＮＡポリメラーゼによるマッチングプローブを同時に伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）するネステッドプライマーとして働く。各ビーズは、ビーズ上に提示される伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）産物に、蛍光標識されたｄＮＴＰが取り込まれたのを反映してアッセイシグナルを発生する。同時に、同じビーズタイプの複数のコピー上にプローブが高度に重複して提示されるため、測定値の統計的信頼性が高まる。
【００８８】
マイクロプレートフォーマットを用いれば、９６個のＤＮＡサンプルを約４時間でタイピングでき、「実際の作業」時間は約１時間に過ぎない。スループット率はアッセイプロトコルのステップを「互いにずらし」て、複数のプレートを並行処理することでさらに高まる。９６個のサンプルをキャピラリー遺伝子シーケンサーに導入してもよい。１回の実験を終了させるには約４時間を要する。プローブの長さと、血液ドナー由来のＤＮＡに存在する血液型群ＳＮＰを「コールする」伸長反応で付加される塩基とに基づき簡便なアルゴリズムを開発してもよい。その結果はソフトウェアによって判定されるため、ドナーのデータベースへのインターフェースがあれば、結果を手入力する必要がなくなる。
【００８９】
Ｂｉｏａｒｒａｙ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ法は、ＳＮＰ部位における検出プローブのヌクレオチドマッチに基づき、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）反応で蛍光ヌクレオチドが組み込まれることによる。また、この方法では各プローブを色素融合ビーズに結合してから、シリコーンマイクロチップ（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｉｐ）を作製する。プローブの明確な伸長または非伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）に基づき、遺伝子の存在を間接判定する。陰性反応については、多くの未知の要因が関係している可能性がある。試験結果は明確でない場合がある。
【００９０】
これに対し、適合させたＳＮａＰｓｈｏｔ法はより簡便で直接的であるうえ、より安価である。この手順で必要なのはプローブプライマーの合成だけである。他の試薬はどれも市販されており、品質管理されている。費用がかかるマイクロビーズ結合プローブおよびＢｌｏｏｄ  Ｃｈｉｐを開発する必要もない。さらに、遺伝子の判定が直接的である。すなわち、ＳＮＰ部位に存在するヌクレオチドをＤＮＡシーケンサーにより直接判定し、可視化することができる。非反応プローブがないため、存在する遺伝子に応じてすべてのプローブがＳＮＰ部位でヌクレオチドを取り込まなければならない。これにより、遺伝子の予測におけるこの方法の信頼性が高まる。ＫｅｌｌおよびＳｓなど一部の血液型群遺伝子の場合、プローブプライマーの長さが長いため、ピーク高さが低くなることがある。前述のように、マルチプレックスＩＩにはＫｅｌｌおよびＳｓ血液型群遺伝子の検出が含まれていた。ＫｅｌｌおよびＳｓ遺伝子多型を検出するプローブプライマーは５５ｂｐ長および７０ｂｐ長であった。この結果から２つの遺伝子のピーク高さが低いことが明らかになった。マルチプレックスＩＩＩでこうした遺伝子を検出し、プローブプライマーの長さをＫｅｌｌで３０ｂｐ、Ｓｓで３５ｂｐまで短くしたところ、得られるピーク高さが高くなった。
【００９１】
【表５】
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ＲＨ遺伝子型、ＨＬＡ遺伝子型およびウイルス遺伝子型などの別の抗原をタイピングするマルチプレックスアッセイの設計およびバリデーションを促進することで、本明細書に記載の方法により、特性が十分に解明された送達可能な血液ユニットの在庫が多様化される可能性がある。
【００９２】
他に記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す数字はみな、いずれの場合も「約」という語で修飾されているものと理解されたい。したがって、異なる記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得ようとする所望の特性によって異なる場合がある。特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするものではないが、最低でも、各数値パラメータは、少なくとも既報告の有効桁数に照らして、通常の丸めの技法を適用して解釈すべきものである。本発明の広範な範囲を記載する数値範囲および数値パラメータは近似値ではあるものの、個々の実施例に記載された数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、どの数値も、それぞれの検査測定値に認められ、標準偏差によりやむを得ず生じる一定の誤差を本質的に含む。
【００９３】
本発明を記載する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用する「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」といった語および同様の語の指示対象は、他に記載がない限り、または文脈に明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数とを共に含むものと解釈するものとする。本明細書の様々な値の範囲に関する記載は、その範囲に包含される１つ１つの値を個々に記載するための単に簡便な方法としての役割を果たすものとする。個々の値は、本明細書で他に記載がない限り、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に含まれる。本明細書に記載の方法はどれも、他に記載がない限り、あるいは、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に記載するあらゆる例または例示表現（たとえば、「など」）の使用は本発明を分かりやすくすることのみを意図するものであり、別に特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる表現も、請求項に記載されていない構成要素が本発明の実施に不可欠であることを示しているものと解釈してはならない。
【００９４】
本明細書では開示した本発明の代替の構成要素または実施形態を群分けしてあるが、この群分けを限定するものとして解釈してはならない。各群のメンバーは個々に記載して特許請求し得るし、あるいは、その群の他のメンバーまたは本明細書に記載の他の構成要素と任意に組み合わせて記載し特許請求し得る。利便性および／または特許性から、ある群の１つまたは複数のメンバーを群に含めることもあれば、群から削除することもあると考えられる。こうした何らかの組み入れまたは削除が行われる場合、本明細書はその群を変形したものとして含むものと見なされ、したがって添付の特許請求の範囲に使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による記載を満たしている。
【００９５】
本明細書には、本発明を実施するに当たり本発明者らが知る最良の形態を含め、本発明のいくつかの実施形態が記載されている。言うまでもなく、明細書本文を読めば、そのように記載した実施形態の変更例が当業者には明らかになるであろう。本発明者は当業者がそうした変更例を適宜利用することを想定しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載した以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法で認められているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載した主題の変形例および等価物を全部含む。さらに、上述の構成要素の可能な限りの変更例におけるその任意の組み合わせも、本明細書に他に記載がない限り、あるいは、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、本発明に包含される。
【００９６】
さらに、本明細書を通じて多くの特許および刊行物を参照してきた。上記の各参考文献および刊行物については参照によって個々にその全体を本明細書に援用する。
【００９７】
最後に、本明細書に開示する本発明の実施形態は本発明の原理を例証するものであることを理解されたい。利用可能な他の変形例も本発明の範囲内である。したがって、あくまで例示であり、限定するものではないが、本明細書の開示内容を踏まえて本発明の別の構成を用いてもよい。よって、本発明は正確に示して説明したものに限定されるものではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月5日(2010.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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