(57)【要約】  本発明は、フィブロネクチンベースの結合分子、ならびにドナーＣＤＲをフィブロネクチンベースの結合足場、特にＦＮ３に導入する方法を提供する。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、特に哺乳類細胞における半減期および安定性の改善のために、別の部分、例えばＦｃ、抗ＦｃＲｎ、ＨＳＡ、抗ＨＳＡおよびＰＥＧとさらに結合していてもよい。本発明はまた、かかる分子を標的抗原との結合についてスクリーニングして候補結合物質を製造および精製する方法を提供する。
2011507543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非Ｆｎ３部分と結合したフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含む複合体であって、該Ｆｎ３ベースの結合分子が少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、ここで、該ループ領域配列が特定の標的と結合する、複合体。
【請求項２】
非Ｆｎ３部分が第二の標的と結合することができる、請求項１の複合体。
【請求項３】
非Ｆｎ３部分が、インビボで投与したときＦｎベースの結合分子の半減期を延長する、請求項１の複合体。
【請求項４】
非Ｆｎ３部分が抗体Ｆｃ領域を含む、請求項１の複合体。
【請求項５】
抗体Ｆｃ領域が、Ｎ末端領域およびＣ末端領域から成る群から選択される領域で、Ｆｎ３ベースの結合分子と融合している、請求項４の複合体。
【請求項６】
抗体Ｆｃ領域が、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Ｆｎ３ベースの結合分子と融合している、請求項４の複合体。
【請求項７】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、少なくとも２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍または１０００倍長い、請求項４の複合体。
【請求項８】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５〜３０倍長い、請求項４の複合体。
【請求項９】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２〜５時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、１５〜２０時間、２０〜２５時間、２５〜３０時間、３５〜４０時間、４５〜５０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間、６５〜７０時間、７５〜８０時間、８０〜８５時間、８５〜９０時間、９０〜９５時間、９５〜１００時間、１００〜１５０時間、１５０〜２００時間、２００〜２５０時間、２５０〜３００時間、３５０〜４００時間、４００〜４５０時間、４５０〜５００時間、５００〜５５０時間、５５０〜６００時間、６００〜６５０時間、６５０〜７００時間、７００〜７５０時間、７５０〜８００時間、８００〜８５０時間、８５０〜９００時間、９００〜９５０時間、９５０〜１０００時間、１０００〜１０５０時間、１０５０〜１１００時間、１１００〜１１５０時間、１１５０〜１２００時間、１２００〜１２５０時間、１２５０〜１３００時間、１３００〜１３５０時間、１３５０〜１４００時間、１４００〜１４５０時間、１４５０〜１５００時間長い、請求項４の複合体。
【請求項１０】
複合体のインビボでの半減期が、少なくとも９．４時間である、請求項４の複合体。
【請求項１１】
非Ｆｎ３部分が血清アルブミン（ＳＡ）もしくはトランスフェリンまたはその部分を含む、請求項１の複合体。
【請求項１２】
血清アルブミン（ＳＡ）またはその部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項１の複合体。
【請求項１３】
ＨＳＡが、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Ｆｎ３ベースの結合分子と融合している、請求項１２の複合体。
【請求項１４】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、少なくとも２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍または１０００倍長い、請求項１２の複合体。
【請求項１５】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２５〜５０倍長い、請求項１２の複合体。
【請求項１６】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２〜５時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、１５〜２０時間、２０〜２５時間、２５〜３０時間、３５〜４０時間、４５〜５０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間、６５〜７０時間、７５〜８０時間、８０〜８５時間、８５〜９０時間、９０〜９５時間、９５〜１００時間、１００〜１５０時間、１５０〜２００時間、２００〜２５０時間、２５０〜３００時間、３５０〜４００時間、４００〜４５０時間、４５０〜５００時間、５００〜５５０時間、５５０〜６００時間、６００〜６５０時間、６５０〜７００時間、７００〜７５０時間、７５０〜８００時間、８００〜８５０時間、８５０〜９００時間、９００〜９５０時間、９５０〜１０００時間、１０００〜１０５０時間、１０５０〜１１００時間、１１００〜１１５０時間、１１５０〜１２００時間、１２００〜１２５０時間、１２５０〜１３００時間、１３００〜１３５０時間、１３５０〜１４００時間、１４００〜１４５０時間、１４５０〜１５００時間長い、請求項１２の複合体。
【請求項１７】
複合体のインビボでの半減期が、少なくとも１９．６時間である、請求項１２の複合体。
【請求項１８】
血清アルブミン（ＳＡ）もしくはトランスフェリンまたはその部分と結合するポリペプチドが、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドまたは抗トランスフェリンポリペプチドである、請求項１２の複合体。
【請求項１９】
抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドまたは抗トランスフェリンポリペプチドが、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Ｆｎ３ベースの結合分子と結合している、請求項１８の複合体。
【請求項２０】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、少なくとも２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍または１０００倍長い、請求項１８の複合体。
【請求項２１】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも１０〜３５倍長い、請求項１８の複合体。
【請求項２２】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２〜５時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、１５〜２０時間、２０〜２５時間、２５〜３０時間、３５〜４０時間、４５〜５０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間、６５〜７０時間、７５〜８０時間、８０〜８５時間、８５〜９０時間、９０〜９５時間、９５〜１００時間、１００〜１５０時間、１５０〜２００時間、２００〜２５０時間、２５０〜３００時間、３５０〜４００時間、４００〜４５０時間、４５０〜５００時間、５００〜５５０時間、５５０〜６００時間、６００〜６５０時間、６５０〜７００時間、７００〜７５０時間、７５０〜８００時間、８００〜８５０時間、８５０〜９００時間、９００〜９５０時間、９５０〜１０００時間、１０００〜１０５０時間、１０５０〜１１００時間、１１００〜１１５０時間、１１５０〜１２００時間、１２００〜１２５０時間、１２５０〜１３００時間、１３００〜１３５０時間、１３５０〜１４００時間、１４００〜１４５０時間、１４５０〜１５００時間長い、請求項１８の複合体。
【請求項２３】
複合体のインビボでの半減期が、少なくとも７．７時間である、請求項１８の複合体。
【請求項２４】
非Ｆｎ３部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１の複合体。
【請求項２５】
ＰＥＧ部分がチオール基またはアミン基と結合している、請求項２４の複合体。
【請求項２６】
ＰＥＧ部分がペグ化指示部位によってＦｎ３ベースの結合分子と結合している、請求項２４の複合体。
【請求項２７】
ＰＥＧ部分がＣｙｓ残基と結合している、請求項２４の複合体。
【請求項２８】
ＰＥＧ部分が非天然アミノ酸残基と結合している、請求項２４の複合体。
【請求項２９】
ＰＥＧ部分が、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Ｆｎ３ベースの結合分子と融合している、請求項２４の複合体。
【請求項３０】
ＰＥＧ部分が約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項２４の複合体。
【請求項３１】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、少なくとも２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍または１０００倍長い、請求項２４の複合体。
【請求項３２】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５〜２５倍長い、請求項２４の複合体。
【請求項３３】
複合体の半減期が、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２〜５時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、１５〜２０時間、２０〜２５時間、２５〜３０時間、３５〜４０時間、４５〜５０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間、６５〜７０時間、７５〜８０時間、８０〜８５時間、８５〜９０時間、９０〜９５時間、９５〜１００時間、１００〜１５０時間、１５０〜２００時間、２００〜２５０時間、２５０〜３００時間、３５０〜４００時間、４００〜４５０時間、４５０〜５００時間、５００〜５５０時間、５５０〜６００時間、６００〜６５０時間、６５０〜７００時間、７００〜７５０時間、７５０〜８００時間、８００〜８５０時間、８５０〜９００時間、９００〜９５０時間、９５０〜１０００時間、１０００〜１０５０時間、１０５０〜１１００時間、１１００〜１１５０時間、１１５０〜１２００時間、１２００〜１２５０時間、１２５０〜１３００時間、１３００〜１３５０時間、１３５０〜１４００時間、１４００〜１４５０時間、１４５０〜１５００時間長い、請求項２４の複合体。
【請求項３４】
複合体のインビボでの半減期が、少なくとも３．６時間である、請求項２４の複合体。
【請求項３５】
改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗体Ｆｃ領域と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも９．４時間の血清半減期を有する、複合体。
【請求項３６】
改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも１９．６時間の血清半減期を有する、複合体。
【請求項３７】
改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも７．７時間の血清半減期を有する、複合体。
【請求項３８】
改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ＰＥＧ部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも３．６時間の血清半減期を有する、複合体。
【請求項３９】
改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗ＦｃＲｎ部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は、新生児ＦｃＲ受容体と酸性ｐＨで高い親和性で結合し、中性ｐＨで低い親和性で結合する、複合体。
【請求項４０】
酸性ｐＨが約１〜約７の範囲である、請求項３９の複合体。
【請求項４１】
酸性ｐＨが約６である、請求項３９の複合体。
【請求項４２】
中性ｐＨが約７〜約８の範囲である、請求項３９の複合体。
【請求項４３】
中性ｐＨが約７．４である、請求項３９の複合体。
【請求項４４】
Ｆｎ３ドメインが少なくとも２個のフィブロネクチンモジュールに由来する、請求項１〜４３のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体。
【請求項４５】
Ｆｎ３ドメインが少なくとも３個またはそれ以上のフィブロネクチンモジュールに由来する、請求項１〜４４のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む、核酸。
【請求項４７】
プロモーターと作動可能に連結した請求項４６の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４８】
請求項４７の核酸を含む細胞。
【請求項４９】
細胞が哺乳類細胞である、請求項４８の細胞。
【請求項５０】
哺乳類細胞がヒト哺乳類細胞である、請求項４９の細胞。
【請求項５１】
哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４９の細胞。
【請求項５２】
標的と結合する請求項１〜４５のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体を製造する方法であって、標的と結合する請求項１〜４５のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む核酸を発現させることを含む、方法。
【請求項５３】
さらに哺乳類細胞中で核酸を発現させることを含む、請求項５２の方法。
【請求項５４】
哺乳類細胞がヒト哺乳類細胞である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５３の方法。
【請求項５６】
請求項１〜４５のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体と担体を含む組成物。
【請求項５７】
対象の自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患を処置する方法であって、当該対象に請求項１〜５６のいずれかの結合分子、複合体または組成物を投与することを含む方法。
【請求項５８】
サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、請求項１〜４５のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体を標識化し、該標識化結合分子または複合体とサンプルとを接触させ、そして結合分子または複合体とタンパク質間の複合体形成を検出することを含む、方法。
【請求項５９】
自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患を処置するための、複合体を含む組成物の使用であって、該複合体は非Ｆｎ３部分と結合したフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該複合体は特定の標的と結合し、複合体ではないＦｎベースの結合分子のものと比較して少なくとも３．６倍長い半減期を有する、使用。
【請求項６０】
非Ｆｎ３部分がＰＥＧ、ＨＳＡ、抗ＨＳＡおよび抗体Ｆｃ領域から成る群から選択される、請求項５９の使用。
【請求項６１】
自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患の処置用医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物が非Ｆｎ３部分と結合したフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含んでなる複合体を含み、該複合体は特定の標的と結合し、複合体ではないＦｎベースの結合分子のものと比較して少なくとも３．６倍長い半減期を有する、使用。
【請求項６２】
非Ｆｎ３部分がＰＥＧ、ＨＳＡ、抗ＨＳＡおよび抗体Ｆｃ領域から成る群から選択される、請求項６１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連情報
本願は、２００７年１２月２７日に出願した米国仮出願第61/009,361号の優先権の利益を主張する。本明細書を通じて言及されているあらゆる特許、特許出願および文献は、それらの全体について、参照により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
所望の標的エピトープと特異的に結合することができる分子は、治療および医学的診断ツールとして極めて重要である。このクラスの分子の例は、モノクローナル抗体である。ほぼあらゆる構造エピトープと特異的に、そして高い親和性で結合する抗体が、選択され得る。その結果、抗体は研究ツールおよびＦＤＡ承認治療薬として日常的に使用されており、治療用および診断用モノクローナル抗体の世界市場は現在約３０，０００，０００，０００ドルにも上る。
【０００３】
しかし、モノクローナル抗体は、多数の欠点を有する。例えば、標準的な抗体は大きく、複雑な分子である。それらは２本の軽鎖と２本の重鎖を含み、鎖内および鎖間ジスルフィド結合によって結合した、異種四量体構造を有する。この構造的複雑さによって、抗体の容易な発現および２種の異なる分子治療標的に特異的に結合する分子のような多重特異的抗体が妨げられている。抗体のサイズが大きいことによって、しばしば効果的に特定の組織空間に侵入することができないため、それらの治療上有効性も限定される。さらに、治療用抗体は、Ｆｃ領域を有するため、望ましくないエフェクター細胞機能および／または凝固カスケードを惹起することがある。
【０００４】
したがって、当該技術分野において、高い親和性および特異性で所望の標的に特異的に結合することができる代替結合分子が求められている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、フィブロネクチンベースの結合分子、ならびにフィブロネクチンベースの結合足場、特にＦｎ３にドナーＣＤＲを導入する方法を提供することによって、上記課題を解決する。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、半減期および安定性の改善のために、操作されるか、あるいはさらに別の部分、例えばＰＥＧ、Ｆｃ、ＨＳＡ、抗ＨＳＡと結合していてもよい。本発明はまた、かかる分子を標的抗原との結合についてスクリーニングして候補バインダーを製造および精製する方法を提供する。さらに、本発明は、Ｆｎ３ベースの結合分子をインビボで、特に哺乳類細胞、例えばラット、マウス、ハムスター、ヒト細胞またはそれらに由来する細胞系において成功裏に発現することを初めて示している。さらにまた、本発明は、操作されたかあるいは別の部分、例えばＰＥＧ、Ｆｃ、ＨＳＡ、抗ＨＳＡと結合したＦｎ３ベースの結合分子が哺乳類細胞においても成功裏に発現されること、そして該分子の延長された半減期という望ましい生理的効果を示すことを示している。
【０００６】
したがって、本発明は、次のものを含むがそれらに限定されない様々な利点を有する：
−  フィブロネクチンベースの結合分子、例えばサイズが小さく、免疫原性がないために治療薬として好適な修飾フィブロネクチンベースの結合分子を提供すること；
−  延長された半減期を有するフィブロネクチンベースの結合分子を提供すること；
−  ブロッキング部分、検出可能部分、診断部分または治療部分のような望まれる機能的部分と結合するための部位をも提供しつつ、フィブロネクチンベースの結合分子を提供すること；そして
−  診断用または治療用フィブロネクチンベースの結合分子を必要とする対象を処置する方法。
【０００７】
一つの局面において、本発明は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列を結合するループ領域配列を含むフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子であって、該ループ領域配列が特定の標的と結合する非Ｆｎ３結合配列（すなわち異種結合配列）を含む、結合分子を提供する。典型的には、本結合分子はさらに、野生型フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）分子（配列番号１）と比較して、機能的部分を添えるための、修飾アミノ酸残基を含む。
【０００８】
特定の態様において、Ｆｎ３ベースの結合分子内の非Ｆｎ３結合配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば抗体、特に一本鎖抗体、シングルドメイン抗体またはラクダナノ抗体のＣＤＲの全てまたは一部を含む。該ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域およびそれらの組合せから選択され得る。かかる非Ｆｎ３結合配列は、細胞受容体、細胞受容体リガンド、成長因子、インターロイキン、細菌またはウイルスを含むがそれらに限定されない多様な標的と結合するように選択することができる。
【０００９】
Ｆｎ３ベースの結合分子内の修飾アミノ酸残基は、例えば少なくとも１個のシステイン残基または非天然アミノ酸残基による、少なくとも１個のＦｎ３アミノ酸残基の付加および／または置換を含んでいてもよい。一つの態様において、システインまたは非天然アミノ酸残基は、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域および／またはＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間に位置する。特定の態様において、修飾アミノ酸残基は次の残基の１個以上の置換を含む：Ｓｅｒ １７、Ｓｅｒ ２１、Ｓｅｒ ４３、Ｓｅｒ ６０、Ｓｅｒ ８９、Ｖａｌ １１、Ｌｅｕ １９、Ｔｈｒ ５８およびＴｈｒ ７１。別の局面において、本発明は、非Ｆｎ３ポリペプチドと結合したフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含む複合体であって、該Ｆｎ３ベースの結合分子は少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列を結合するループ領域配列を含み、該ループ領域は特定の標的と結合する、複合体を提供する。別の態様において、該ループ領域は、特定の標的と結合する異種結合配列を含む。
【００１０】
一般に、非Ｆｎ３ポリペプチドは、第２の標的と結合することができ、そして／またはインビボで投与したときＦｎ３ベースの結合分子の安定性（すなわち半減期）を上昇させることができる。好適な非Ｆｎ３ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（またはその一部）および／またはＨＳＡもしくは他の血清タンパク質と結合するポリペプチドであって、延長された半減期を有するもの、例えばトランスフェリンを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
非Ｆｎ３部分は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子の半減期よりも長くなるように、複合体の半減期を延長する。本複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも２〜５時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、１５〜２０時間、２０〜２５時間、２５〜３０時間、３５〜４０時間、４５〜５０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間、６５〜７０時間、７５〜８０時間、８０〜８５時間、８５〜９０時間、９０〜９５時間、９５〜１００時間、１００〜１５０時間、１５０〜２００時間、２００〜２５０時間、２５０〜３００時間、３５０〜４００時間、４００〜４５０時間、４５０〜５００時間、５００〜５５０時間、５５０〜６００時間、６００〜６５０時間、６５０〜７００時間、７００〜７５０時間、７５０〜８００時間、８００〜８５０時間、８５０〜９００時間、９００〜９５０時間、９５０〜１０００時間、１０００〜１０５０時間、１０５０〜１１００時間、１１００〜１１５０時間、１１５０〜１２００時間、１２００〜１２５０時間、１２５０〜１３００時間、１３００〜１３５０時間、１３５０〜１４００時間、１４００〜１４５０時間、１４５０〜１５００時間長い。本複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍または１０００倍長い。
【００１２】
一つの態様において、非Ｆｎ３部分はＦｎ３ベースの結合分子と融合した抗体Ｆｃ領域である。この複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも少なくとも５〜３０倍長く、該複合体のインビボでの半減期は少なくとも９．４時間である。別の態様において、非Ｆｎ３部分は、Ｆｎ３ベースの結合分子と結合した血清アルブミンもしくはトランスフェリンまたはその部分である。この複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも少なくとも２５〜５０倍長く、該複合体のインビボでの半減期は少なくとも１９．６時間である。別の態様において、非Ｆｎ３部分は、Ｆｎ３ベースの結合分子と結合した抗血清アルブミンもしくは抗トランスフェリンまたはその部分である。この複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも少なくとも１０〜３５倍長く、該複合体のインビボでの半減期は少なくとも７．７時間である。別の態様において、非Ｆｎ３部分は、Ｆｎ３ベースの結合分子と結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。この複合体の半減期は、複合体ではないＦｎ３ベースの結合分子のものよりも少なくとも５〜２５倍長く、該複合体のインビボでの半減期は少なくとも３．６時間である。
【００１３】
一つの態様において、非Ｆｎ３部分は、Ｎ末端領域またはＣ末端領域でＦｎ３ベースの結合分子と融合されている抗体Ｆｃ領域を含む。抗体Ｆｃ領域は、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域でＦｎ３ベースの結合分子と融合されていてもよい。Ｆｃ複合体の半減期は、インビボで少なくとも約９．４時間延長される。
【００１４】
別の態様において、非Ｆｎ３部分は、血清アルブミン（ＳＡ）、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその部分、あるいはＳＡと結合するポリペプチド、例えば抗ＨＳＡを含む。ＳＡ複合体のインビボでの半減期は少なくとも約１９．６時間であり、抗ＳＡ複合体のインビボでの半減期は少なくとも約７．７時間である。
【００１５】
さらに別の態様において、非Ｆｎ３部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧ部分はチオール基またはアミン基と結合している。ＰＥＧ部分はペグ化指示部位によってＦｎ３ベースの結合分子と、例えばＣｙｓ残基もしくは非天然アミノ酸残基と結合している。ＰＥＧ部分は、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、Ｃ末端領域、Ｃ末端と最もＣ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、Ｎ末端領域およびＮ末端と最もＮ末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される、Ｆｎ３ベースの結合分子内の領域上に結合している。ＰＥＧ部分は分子量約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａを有する。ＰＥＧ複合体の半減期はインビボで、少なくとも約３．６時間延長される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗体Ｆｃ領域と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも９．４時間の血清半減期を有する、複合体に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、血清アルブミン（ＳＡ）部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも１９．６時間の血清半減期を有する、複合体に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、血清アルブミン（ＳＡ）部分と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも７．７時間の血清半減期を有する、複合体に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ＰＥＧ部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも３．６時間の血清半減期を有する、複合体に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗ＦｃＲｎ部分と結合した、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を含み、該Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個のＦｎ３ベータ鎖ドメイン配列と、各Ｆｎ３ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は、新生児ＦｃＲ受容体（ＦｃＲｎ）と酸性ｐＨで高い親和性で結合し、中性ｐＨで低い親和性で結合する、複合体に関する。酸性ｐＨは約１〜約７の範囲であってよく、中性ｐＨは約７．０〜約８．０である。一つの態様において、酸性ｐＨは約ｐＨ６．０であり、中性ｐＨは約ｐＨ７．４である。
【００２１】
Ｆｎ３ベースの結合分子または複合体は、１Ｆｎ〜１７Ｆｎモジュールのいずれかからの少なくとも２個の同一または異なるフィブロネクチンモジュールに由来するＦｎ３ドメインを有していてよく、そのいずれかの組合せ、例えば１０Ｆｎ３−１０Ｆｎ３；１０Ｆｎ３−９Ｆｎ３、１０Ｆｎ３−８Ｆｎ３、９Ｆｎ３−８Ｆｎ３として組み合わせてもよい。１０Ｆｎ３−１０Ｆｎ３−ＨＳＡまたは抗ＨＳＡもしくはＦｃ、またはＰＥＧ；１０Ｆｎ３−９Ｆｎ３−ＨＳＡまたは抗ＨＳＡもしくはＦｃ、またはＰＥＧ、１０Ｆｎ３−８Ｆｎ３−ＨＳＡまたは抗ＨＳＡもしくはＦｃ、またはＰＥＧ、９Ｆｎ３−８Ｆｎ３−ＨＳＡまたは抗ＨＳＡもしくはＦｃ、またはＰＥＧのような複合体も本発明の範囲に含まれると考えられる。
【００２２】
Ｆｎ３ベースの結合分子または複合体は、少なくとも３個またはそれ以上の同一または異なるフィブロネクチンモジュールに由来するＦｎ３ドメイン、例えば１０Ｆｎ３−１０Ｆｎ３（−１０Ｆｎ３）ｎ（ここで、ｎは２〜１０のいずれかの１０Ｆｎ３ドメイン数である）；１０Ｆｎ３−９Ｆｎ３−８Ｆｎ３（−Ｆｎ３）ｎ（ここで、ｎは２〜１０のいずれかのＦｎ３ドメイン数である）；９Ｆｎ３−８Ｆｎ３−７Ｆｎ３（−Ｆｎ３）ｎ（ここで、ｎは２〜１０のいずれかのＦｎ３ドメイン数である）を有していてもよい。これらの分子の複合体も本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
本発明はさらに、Ｆｎ３ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む核酸、プロモーターと作動可能に連結した該核酸を含む発現ベクター、該核酸を含む細胞、そして標的と結合するＦｎ３ベースの結合分子または複合体を製造する方法であって、細胞内、特にインビボで細胞内で、Ｆｎ３ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む核酸を発現させることによる方法に関する。特定の態様において、細胞は哺乳類細胞、例えばラット、マウス、ハムスター、ヒト細胞またはそれらに由来する細胞系である。
【００２４】
本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、例えばヒトの野生型Ｆｎ３配列に基づくものであってよく、本明細書に記載のとおり、この配列の修飾物であってもよい。例えば、Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個の異なるフィブロネクチンモジュールに由来するＦｎ３ベータ鎖を有するキメラであってもよい。可能なキメラの例は、図６に示されている。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＦｎ３ベースの結合分子および複合体を含み、好適な担体で製剤された組成物を提供する。
【００２６】
本発明のＦｎ３ベースの結合分子および複合体は、抗体を使用することができるいずれかの適用を含むが、これに限定されない多様な治療および診断適用に用いることができる。かかる使用は、例えば自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶を含むが、これらに限定されない疾患または障害の処置および診断を含む。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、下記詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】セリン残基のスティック表現（stick representative）を有する野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールを示す。
【図１Ｂ】２次構造構成におけるＦｎ３のアミノ酸配列を示す。ベータ鎖の残基は白丸として示す。側鎖が疎水性コアを形成する残基は太線に含まれる。ループ残基は斜線で示す。矢印はＦｎ３が分離して相補的フラグメントを生じるループの位置を示す。
【図２】修飾に利用可能であると提案したセリン残基（Ｓｅｒ １７−Ｓｅｒ ２１−Ｓｅｒ ４３−Ｓｅｒ ６０−Ｓｅｒ ８９）を有する野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールを示す。
【図３】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールの３個のストランドシート（鎖Ａ−Ｂ−Ｅ）を示す。シートの下部に候補残基Ｓｅｒ １７およびＳｅｒ ６０が位置する。候補残基Ｓｅｒ ２１は上部に位置する。Ｓｅｒ ５５は結合表面に近いため、除外している。他の潜在的候補残基、すなわちＶａＩ １１、Ｌｅｕ １９およびＴｈｒ ５８が示されている。
【図４】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールの４個のストランドシートを示す（足場の他の面）Ｔｈｒ ７１はＳｅｒ ８９の近くに位置し、修飾の潜在的候補でもある。
【図５】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールのＦＧおよびＣＤループを示す。
【図６Ａ】フィブロネクチンベースの結合分子キメラを作成するための野生型フィブロネクチン分子の第７、８、９および１０タイプＩＩＩモジュールのベータ鎖の多様な組合せを示す（ベータ鎖スワッピング）。
【図６Ｂ】フィブロネクチンベースの結合分子キメラを作成するための野生型フィブロネクチン分子の第７、８、９および１０タイプＩＩＩモジュールのベータ鎖の多様な組合せを示す（ベータ鎖スワッピング）。
【図７Ａ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図７Ｂ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図７Ｃ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図８】還元剤なしでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）＿ｃｙｓ（図８ａ）、ならびに還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）＿３０ｋＤａ  ＰＥＧ（図８ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図９】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）のＰＫ（薬物動態）を示す。
【図１０】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＰＥＧのＰＫ（薬物動態）を示す。
【図１１】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＰＥＧの計算上の半減期を示す。
【図１２】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡ（図１２ａ）および還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＨＳＡ（図１２ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１３】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡのＰＫを示す。
【図１４】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＨＳＡのＰＫを示す。
【図１５】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）ならびに野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡおよびＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図１６】還元剤ありでのＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＲＳＡ（図１６ａ）および還元剤ありでのＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＨＳＡ（図１６ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１７】ＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＨＳＡおよびＲＳＡによるＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１８】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおけるＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３のＰＫを示す。
【図１９】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおけるＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡのＰＫを示す。
【図２０】WinNonLin ソフトウェアで分析した、ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡおよびＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図２１】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＲＳＡのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２２】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＲＳＡのＰＫを示す。
【図２３】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図２４】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）ＦｃのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２５】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＦｃのＰＫを示す。
【図２６】WinNonLinソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−Ｆｃの計算上の半減期を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲の理解を明確にするため、次の定義が簡便には提供される。
【００３０】
定義
本明細書において使用するとき、用語「フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン」または「Ｆｎ３ドメイン」は、いずれかの生物由来の野生型Ｆｎ３ドメインならびに２個以上の異なるＦｎ３ドメイン由来のベータ鎖から構築したキメラＦｎ３ドメインを意味する。当該技術分野において知られているとおり、天然に生じるＦｎ３ドメインはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループと称される６個のループで結合した、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと称される７個のベータ鎖から成るベータサンドイッチ構造を有する（例えば、Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:8990, 1992; Bork et al, Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990; Main et al, 1992; Leahy et al., 1992; Dickinson et al., 1994; 米国特許第6,673,901号; ＰＣＴ公報WO/03104418;および米国特許出願第2007/0082365号参照、これらの全教示を参照により本明細書の一部とする）。３個のループはドメインの上部に存在し（ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ）、３個のループはドメインの下部に存在する（ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループ）（図１参照）。本発明の特定の態様において、該Ｆｎ３ドメインはヒトフィブロネクチンの第１０Ｆｎ３ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来する（配列番号１）。
【００３１】
本明細書において使用するとき、用語「Ｆｎ３ベースの結合分子」または「フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子」は、１個以上の非Ｆｎ３結合配列を含むように改変されているＦｎ３ドメインを意味する。
【００３２】
用語「非Ｆｎ３結合配列」は、天然に生じる（例えば野生型）Ｆｎ３ドメイン中には存在せず、特定の標的と結合するアミノ酸配列を意味する。かかる非Ｆｎ３結合配列は典型的には、野生型Ｆｎ３ドメインを修飾して（例えば置換および／または付加によって）導入される。これは例えば、野生型Ｆｎ３ドメイン内のアミノ酸残基のランダムまたは所定の変異によって得ることができる。さらにまたはあるいは、非Ｆｎ３結合配列は、部分的または完全に異種であってよく、すなわち異なる遺伝子源またはアミノ酸源に由来してよい。例えば、異種配列は、抗体の超可変領域、例えば既知の標的抗原に対して既知の結合特異性を有する１個以上のＣＤＲ領域に由来していてよい。かかるＣＤＲは一本の抗体鎖（例えば軽鎖または重鎖の可変領域）または異なる抗体鎖の組合せに由来していてよい。ＣＤＲはまた、２種の異なる抗体（例えば異なる特異性を有する）に由来していてもよい。特定の態様において、ＣＤＲはナノ抗体、例えばラクダ様重鎖に由来している。
【００３３】
用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体可変ドメインまたはＴ細胞受容体由来の超可変ループを意味する。抗体可変領域内のＣＤＲの位置は、正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991およびChothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987参照、これらを参照により本明細書の一部とする）。
【００３４】
用語「シングルドメイン抗体」は、例えばDomantis（Domantis / GSK (Cambridge, UK)）(例えばWard et al., 1989, Nature 341(6242):484-5; WO04058820参照）に記載のヒトドメイン抗体または下記定義のラクダナノ抗体を含む、いずれかの天然に生じる一可変ドメイン抗体または対応する操作された結合フラグメントを意味する。
【００３５】
用語「一本鎖抗体」は、軽鎖可変領域の抗原結合部分と重鎖可変部分の抗原結合部分とが、例えば組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対となって１価の分子を形成する一本のタンパク質鎖に該鎖をさせることができる合成リンカーによって結合している抗体を意味する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:5879-5883参照）。
【００３６】
用語「ラクダナノ抗体」は、軽鎖を含まない小さな１個の可変ドメインであり、標的に対して高い親和性を有する低分子タンパク質を得て、低分子量抗体由来タンパク質を得るために遺伝子操作して得ることができるラクダ抗体の領域を意味する。例えば、WO07042289および１９９８年６月２日取得の米国特許第5,759,808号参照；また、例えばStijlemans, B. et al., 2004, J Biol Chem. 279(2): 1256-61も参照されたい。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作ライブラリーは、例えばAblynx、Ghent、Belgiumから商業的に入手可能である。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換えによって変化させて、ヒト配列により近い配列を得ることができ、すなわちナノ抗体は「ヒト化」してもよい。これは、ヒトに投与したときそもそも低いラクダ抗体の抗原性をさらに低下させる。
【００３７】
用語「標的」は、本発明のＦｎ３ベースの結合分子が認識する（すなわちこれによって結合される）抗原またはエピトープを意味する。標的は、タンパク質に存在するエピトープ、ペプチド、糖および／または脂質を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
用語「複合体」は、１個以上の非Ｆｎ３部分と化学的または遺伝的に結合したＦｎ３ベースの結合分子を意味する。
【００３９】
用語「非Ｆｎ３部分」は、それが結合している分子にさらなる機能性を与える生物学的または化学的要素を意味する。特定の態様において、非Ｆｎ３部分はポリペプチド、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミンまたはそのフラグメントもしくは変異体、抗ＨＳＡまたはそのフラグメントもしくは変異体、抗体Ｆｃまたはそのフラグメントもしくは変異体またはＦｎ３ベースの結合分子のインビボでの半減期を延長する化学的要素、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００４０】
用語「非天然アミノ酸残基」は、天然に生じる（野生型）Ｆｎ３ドメインには存在しないアミノ酸残基を意味し、例えば化学的に修飾されたアミノ酸を含む。かかる非天然アミノ酸残基は、天然に生じるアミノ酸の置換および／または天然に生じるアミノ酸Ｆｎ３配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる（例えば、Sakamoto et al., 2002, Nucleic Acids Research, 30(21) 4692-4699参照）。非天然アミノ酸残基は、Ｆｎ３ベースの結合分子に所望の機能性、例えば機能的部分（例えばＰＥＧ）と結合する能力を付与するように、導入してもよい。
【００４１】
用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、カップリング剤を含むかまたは含まない、あるいはカップリングまたは活性化部分で誘導体化されたかあるいはされていない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。
【００４２】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、表面プラズモン共鳴によって測定したとき、室温で標準的な生理的塩およびｐＨ条件下で、標的と少なくとも１×１０−６Ｍの親和性で結合し、そして／または非特異的抗原についての親和性よりも少なくとも２倍（好ましくは少なくとも１０倍）の親和性で標的と結合する、Ｆｎ３ベースの結合分子の能力を意味する。
【００４３】
概略
本発明は、フィブロネクチンベースの結合分子、ならびにフィブロネクチンベースの結合足場、特にＦｎ３にドナーＣＤＲを導入する方法を提供する。さらに以下に記載のとおり、本発明はまた、フィブロネクチンベースの結合分子または足場に、ある部分に結合するために適しているアミノ酸残基を導入する方法も提供する。この利点によって、本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、他のかかる分子とさらなる複合体を形成して、二重および多重特異的結合分子を構築することができ、そして／または半減期および安定性を改善するために、ＰＥＧのようなある部分と結合することができる。
【００４４】
本発明はまた、かかる結合分子を標的、特にタンパク質抗原への特異的な結合についてスクリーニングして、例えば原核細胞または真核細胞系において、該分子を製造する方法を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、候補結合分子の精製およびその形成のための方法を提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、かかる形成された結合分子を多様な診断および治療適用、特にヒト疾患の診断または処置のために使用する方法を提供する。
【００４７】
フィブロネクチンベースの結合足場およびその修飾
一つの局面において、本発明は、結合分子を作成するための改善された足場を提供する。本発明の使用に好適な足場は、アンキリン反復足場またはイムノグロブリンスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、例えば抗体またはフィブロネクチンドメインを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
一つの態様において、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Ｆｎ３）を足場分子として使用する（米国特許第6,673,901号、ＰＣＴ公報WO/03104418および米国特許出願第20070082365号）。このドメインはタンパク質配列データベースに４００回以上出現し、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞質骨格タンパク質および原核生物の酵素を含む今日まで配列決定されたタンパク質の２％において出現すると見積もられている（Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:8990, 1992; Bork et al., Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990）。Ｆｎ３の３次元構造は、ＮＭＲ（Main et al., 1992）およびＸ線結晶解析（Leahy et al., 1992; Dickinson et al., 1994）によって決定されている。この構造は、抗体ＶＨドメインのものと類似しているベータサンドイッチと記載されており、ただしＦｎ３は９個ではなく７個のベータ鎖を有する。各Ｆｎ３ドメインのそれぞれの末端に３個のループが存在しており；ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの位置は抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３のものとそれぞれほぼ対応している（米国特許第6,673,901号、ＰＣＴ公報WO/03104418）。あらゆる種由来のあらゆるのＦｎ３ドメインが本発明における使用に好適である。
【００４９】
他の態様において、Ｆｎ３足場は９４アミノ酸残基を含むヒトＦｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）である。ＩｇＧ重鎖の抗原結合性ループに対応する１０Ｆｎ３の３個のループは、アミノ酸残基２１−３１（ＢＣ）、５１−５６（ＤＥ）および７６−８８（ＦＧ）間にわたる（米国特許出願第20070082365号）。これらのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、抗体可変領域、特にシングルドメイン抗体のＣＤＲのＣＤＲ１、２および３ループでそれぞれ直接置換されていてもよい。
【００５０】
１０Ｆｎ３はＦｎ３ベースの結合分子の作成のためのＦｎ３足場の一つの態様を示すが、本明細書に記載の分子において１０Ｆｎ３に代えて、他の分子であってもよい。これらは、ヒトフィブロネクチンモジュール１Ｆｎ３〜９Ｆｎ３および１１Ｆｎ３〜１７Ｆｎ３ならびに非ヒト動物および原核生物由来の関連Ｆｎ３モジュールを含むが、これらに限定されない。さらに、１０Ｆｎ３と配列相同性を有する他のタンパク質由来のＦｎ３モジュール、例えばテネイシンおよびウンドゥリン（undulin）を使用してもよい。異なる生物および親タンパク質由来のモジュールは別の適用のために最も適切でありえて；例えば抗体模倣物の設計において、治療用または診断用分子が意図される生物起源のフィブロネクチンまたはフィブロネクチン様分子由来のタンパク質を作成するために最も望まれ得る。
【００５１】
他の態様において、Ｆｎ３はヒト以外の種由来である。非ヒトＦｎ３はヒト患者に投与したとき有害な免疫応答を引き起こし得る。これを防止するため、非ヒトＦｎ３は抗原性アミノ酸またはエピトープを除去するように遺伝子操作されていてもよい。非ヒトＦｎ３の抗原性領域を同定する方法は、米国特許第6,673,580に記載の方法を含むが、これに限定されない。
【００５２】
他の態様において、Ｆｎ３足場は１個以上のＦｎ３、例えば少なくとも２個の異なるＦｎ３、例えば１０Ｆｎ３および９Ｆｎ３の一部から構築したキメラである。Ｆｎ３ドメインの３既知のアミノ酸配列および三次元構造を用いて、当業者は容易に、機能的キメラＦｎ３分子を作成するために組み合わせることができる異なるＦｎ３分子の領域を同定することができる。かかるキメラＦｎ３ドメインは、ＰＣＲ利用もしくは酵素仲介遺伝子操作、最初からのＤＮＡもしくはＲＮＡ合成またはカセット突然変異誘発を含むがこれらに限定されない多様な方法で構築することができる。
【００５３】
上記フィブロネクチンベースの結合足場は、最初から構築するか、あるいはコンピューターによる分子モデリングを用いて情報を得ることができる。コンピューター内またはコンピューター利用モデリングは、例えばRas-Molを用いた単純な核酸またはアミノ酸配列アラインメントまたは３Ｄモデリングを含み得る。足場のモデリングによって、超可変領域が提示されるように足場の領域またはループを選択することができる、合理的なアプローチが可能である。モデリングによって、１個以上の超可変領域の最適な提示のために足場を修飾する最良の方法を知ることができる。
【００５４】
超可変領域／ＣＤＲをフィブロネクチンベースの結合足場に移植する方法
一つの局面において、本発明は、他のＩｇスーパーファミリー分子由来の超可変領域を本発明のフィブロネクチンベースの結合足場に移植する改善された方法を特徴とする。
【００５５】
一つの態様において、抗体可変領域、例えば重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはその両方由来の１個以上のＣＤＲを、上記結合足場の一つの１個以上のループに移植する。いずれかの抗体可変領域のＣＤＲ領域またはその抗原結合フラグメントが移植に好適である。ＣＤＲは、げっ歯類、霊長類、ラクダまたはサメを含むがこれらに限定されないいずれかの動物の抗体レパートリーから得ることができる。特定の態様において、ＣＤＲはシングルドメイン抗体、例えばナノ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３から得られる。より具体的な態様において、ナノ抗体のようなシングルドメイン抗体のＣＤＲ１、２および３がＦｎ３ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに移植されて、それによって元のナノ抗体の標的結合特異性をフィブロネクチンベースの結合分子に付与する。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作ライブラリーは、例えばAblynx、Ghent、Belgiumから商業的に入手可能である。抗体レパートリーは、１種以上の抗原でチャレンジした動物または抗原でチャレンジされていないそのままの動物に由来するものであってよい。さらにまたはあるいは、ＣＤＲはインビトロポリソームまたはリボソームディスプレイ、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ技術を含むがこれらに限定されないインビトロまたはインビボライブラリースクリーニング法によって作成した抗体またはその抗原結合フラグメントから得ることができる。これは、インビトロまたはインビボライブラリースクリーニング法によって当初は作成されないが、次いで突然変異誘発またはインビトロまたはインビボスクリーニング法を用いた１回以上の親和性変異段階を実行した抗体を含む。かかるインビトロまたはインビボライブラリースクリーニング法または親和性変異法の例は、例えば米国特許7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5866344およびＰＣＴ公報WO06023144に記載されている。
【００５６】
抗体ＣＤＲを同定する方法は、当該技術分野において周知である（Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)参照）。特定の抗体をコードする核酸を単離し、配列決定することができ、該ＣＤＲ配列は確立された抗体配列命名法に関してコードされたタンパク質の調査によって演繹される。超可変領域またはＣＤＲを本発明のフィブロネクチンベースの結合足場に移植する方法は、例えば遺伝子操作、デノボ核酸合成またはＰＣＲ利用遺伝子アセンブリを含む（例えば、米国特許第5,225.539号参照）。
【００５７】
改善されたＣＤＲ提示／結合のための修飾に適したフィブロネクチンベースの結合足場残基を同定する方法
上記技術によって、超可変領域またはＣＤＲの選択および提示のために好適な足場ループを同定することができる。しかし、Ｆｎ３ドメインおよびドナー抗体の構造モデリングに基づいた超可変領域のフィットおよび提示をさらに改善するため、さらなる基準が敷かれ得る。
【００５８】
一つの局面において、Ｆｎ３足場のいずれかのベータ鎖における特定のアミノ酸残基を変異させて、抗原との結合性を保持ないし改善する立体配置をＣＤＲループに採用させることができる。この方法は、構造モデリングと配列比較の組合せを用いて、異種抗体フレームワークにＣＤＲを移植する方法と同様に実施することができる。一つの態様において、ＣＤＲと隣接するＦｎ３残基をQueen et al.が実施した方法と同様に変異させる（米国特許6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 7,022,500参照）。他の態様において、ＣＤＲ残基の１ファンデルワールス半径内のＦｎ３残基をWinter et al.が実施した方法と同様に変異させる（米国特許6,548,640; 6,982,321参照）。他の態様において、ＣＤＲ残基と隣接していないが、Ｆｎ３ドメインおよびドナー抗体の構造モデリングに基づいてＣＤＲ残基の立体配置を変更すると予測されるＦｎ３残基を、Carter et al.またはAdair et alが実施した方法と同様に変異させる（米国特許6,407,213; 6,639,055; 5,859,205; 6,632,927参照）。
【００５９】
別の局面において、１個以上の移植抗体ＣＤＲを含むＦｎ３足場は、１回以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟段階に付される。所望の抗原とＦｎ３／ＣＤＲの結合を改善するＦｎ３またはＣＤＲにおけるアミノ酸変化をもたらすあらゆる親和性成熟アプローチを使用することができる。これらのアミノ酸変化は、例えばランダム突然変異誘発、「ウォークスルー突然変異誘発」および「ルックスルー突然変異誘発」によって達成され得る。かかるモノ抗体の突然変異誘発は、例えば謝りがちな（error-prone）ＰＣＲ、酵母または細菌の「ミューテーター」株、モノ抗体の全部または一部の最初からの合成中でのランダムまたは所定の核酸変化の導入を用いて、達成され得る。親和性成熟および／または突然変異誘発を実施する方法は、例えば米国特許7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5866344およびＰＣＴ公報WO06023144に記載されている。最小必須結合決定因子を含む新たなＣＤＲ配列は、US20050255552に記載のとおり、Kalobios技術を用いてスクリーニングしてもよい。
【００６０】
操作または修飾されたフィブロネクチンベースの結合分子
別の局面において、本発明は、元のフィブロネクチンベースの分子と比較して異なる特性を有するように修飾されたフィブロネクチンベースの結合分子を特徴とする。修飾は、別の分子との該分子の結合または融合、ならびに該分子の化学的修飾または該分子構造のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの変化を含む。
【００６１】
フィブロネクチン融合
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、別の分子と融合または結合されていてもよい。かかる複合体は、「Ｆｎ融合体」と本明細書において称する。例えば、Ｆｎ融合体は、結合分子の安定性または半減期を上昇させる分子（例えばＦｃ領域、ＨＳＡまたは抗ＨＳＡ結合分子）と融合したフィブロネクチンベースの結合分子を含む。
【００６２】
例えば、Ｆｎ融合体は、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域と１０Ｆｎ３モジュールを、好ましくは１０Ｆｎ３のＣ末端を介して融合させることによって、ヒト免疫応答で統合することができる。かかる１０Ｆｎ３−Ｆｃ融合分子のＦｃは、免疫応答の補体成分を活性化して、抗体模倣物の治療価値を向上させる。同様に、１０Ｆｎ３とＣ１ｑのような補体タンパク質の融合体は標的細胞に使用することができ、そして１０Ｆｎ３と毒素の融合体は特定の抗原を保有する細胞を特異的に破壊するために使用することができる。さらに、いずれかの形態の１０Ｆｎ３はアルブミンと融合して、血流中での半減期および組織浸透性を向上させることができる。これらの融合体のいずれかは、標準的な技術によって、例えば一般に利用可能な遺伝子配列を用いて構築した組換え融合遺伝子から融合タンパク質を発現させることによって、作成することができる。
【００６３】
Ｆｎ融合体はまた、「Brambell受容体」とも称され、血流中のアルブミンのライフスパンの延長に関与する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を用いて作成してもよい（Chaudhury et al., (2003) J. Exp.Med., 3: 315-322; Vaccarao et al., (2005) Nature Biotech. 23: 1283-1288参照）。ＦｃＲｎ受容体は、３個の細胞外ドメインを有する４３ｋＤａのα鎖と非共有結合したβ−２マイクログロブリン、膜貫通領域および約５０アミノ酸の細胞質テイルから成る複合膜糖タンパク質である。細胞質テイルは該受容体の内在化に関与するジヌクレオチドモチーフ利用エンドサイトーシスシグナルを含む。α鎖はタンパク質の非古典的ＭＨＣＩのメンバーである。α鎖とのβ２ｍ会合は、ＦｃＲｎの正しい折り畳みならびに小胞体を出てエンドソームおよび細胞表面に向かうために、必須である。
【００６４】
ＦｃＲｎの全体的な構造は、クラスＩ分子のものと類似している。α−１およびα−２領域は、ＭＨＣＩ分子のペプチド間隙と極めてよく似ている２個の逆平行αヘリックスによって蓋をされた１個のβシートを形成する、８個の逆平行β鎖から成るプラットフォームと似ている。天然では、ＦｃＲｎはＩｇＧと結合し、母胎循環系由来の胎盤合胞体栄養細胞を介してＩｇＧを胎児循環系に輸送し、成体における分解からＩｇＧを保護する。ホメオスタシスに加えて、ＦｃＲｎは組織におけるＩｇＧのトランスサイトーシスを制御する。ＦｃＲｎは上皮細胞、内皮細胞および肝細胞に局在化している。
【００６５】
研究により、アルブミンがＦｃＲｎと結合してＩｇＧとの３分子複合体を形成することが示されている。アルブミンおよびＩｇＧの両方が、ＦｃＲｎの別々の部位と非共有結合する。ヒトＦｃＲｎとセファロース−ＨＳＡおよびセファロース−ｈＩｇＧの結合はｐＨ依存的であり、ｐＨ５．０で最大であり、ｐＨ７．０〜ｐＨ８で０である。ＦｃＲｎがＩｇＧと結合するのと同様にｐＨ依存的にアルブミンと結合するという観察は、アルブミンがＦｃＲｎと相互作用し、分解から保護されるメカニズムがＩｇＧのものと同一であり、同様のＦｃＲｎとのｐＨ感受性相互作用によって仲介されることを示唆している。ＦｃＲｎとアルブミンはアルブミンのＤ−ＩＩＩドメインを介して、ｐＨ依存的に、ＩｇＧ結合部位とは別の部位で相互作用する。
【００６６】
本発明のＦｎ融合体はまた、Ｆｎ−ＦｃＲｎ融合タンパク質またはＦｎ−抗ＦｃＲｎ融合分子をも含む。一つの態様において、Ｆｎ融合体は、ＦｃＲｎと結合するＩｇＧと同様に、抗ＦｃＲｎ融合分子が新生児ＦｃＲ受容体（ＦｃＲｎ）と酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）で高い親和性で結合し、中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）で低い親和性で結合するＦｎ−抗ＦｃＲｎ融合分子である。Ｆｃ−抗ＦｃＲｎ融合体の半減期はインビボで延長されており、それによって改善された治療的有用性を提供する。
【００６７】
分子とＦｃドメイン、例えばＩｇＧ１のＦｃドメインを融合する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、U.S. 5,428,130参照）。かかる融合体は、ＩｇＧホメオスタシスにおいて重要な機能を提供して、異化からそれと結合する分子を保護するＦｃＲｎと結合するＦｃの能力のため、延長された循環系半減期を有する（例えば、US20070269422参照）。
【００６８】
他の融合体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）と融合したフィブロネクチンベースの結合分子を含む。成熟形態では５８５アミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミンは、血清の浸透圧の大部分に関与しており、内因性および外因性リガンドのキャリヤーとして機能する。キャリヤー分子としてのアルブミンの役割およびその不活性性は、インビボでペプチドのキャリヤーおよびトランスポーターとして使用するために望ましい特性である。多様なタンパク質のキャリヤーとしてのアルブミン融合タンパク質としてのアルブミンの使用は、WO 93/15199、WO 93/15200およびEP 413 622において示唆されている。ポリペプチドと融合するためのＨＳＡのＮ末端フラグメントの使用も提案されている（EP 399 666）。したがって、本発明の分子とアルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）または変異体あるいはタンパク質および／またはその活性を安定化するために十分なＨＳＡと結合することができる分子（抗ＨＳＡバインダー）とを遺伝子的または化学的に融合または結合させることによって、該分子は安定化されて、保存期間が延長され、そして／または溶液中、インビトロおよび／またはインビボで長期間、分子の活性が保持される。
【００６９】
アルブミンと他のタンパク質との融合は、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを、該タンパク質をコードするＤＮＡと結合させるように、遺伝子操作することによって達成することができる。次いで、融合ポリペプチドを発現するように好適なプラスミドを設計した該融合ヌクレオチド配列で、好適な宿主を形質転換またはトランスフェクトする。発現は、例えば原核細胞または真核細胞から、インビトロで、あるいは例えばトランスジェニック生物から、インビボで実施することができる。ＨＳＡ融合に関するさらなる方法は、例えばWO 2001077137およびWO 200306007に見出すことができ、これらを参照により本明細書の一部とする。具体的な態様において、融合タンパク質の発現は、哺乳類細胞系において実施する。哺乳類細胞の例は、ヒト胚腎細胞（例えばＨＥＫ Freestyle、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ）；ハムスター腎細胞（例えばＢＨＫ）；ヒト胚網膜細胞（例えばＰＥＲＣ６）；マウス骨髄腫（Ｓｐ／２０）；ＨＥＫ２９３とヒトＶ細胞系のハイブリッド（例えばＨＫＢ１１）；頸部癌細胞（例えばＨｅＬａ）；およびマウス腎細胞（例えばＣＯＳ）を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。
【００７０】
他の本発明の融合は、フィブロネクチンベースの結合分子と別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば抗体または受容体のリガンド）とを結合させて、「二重特異的分子」を作成することを含む。二重特異的分子は、少なくとも２個の異なる結合部位または少なくとも２個の異なる標的分子、例えばフィブロネクチン分子および抗ＨＳＡバインダーによって標的とされる結合部位と結合する。該抗ＨＳＡバインダーは、フィブロネクチンベースの分子（上記のとおり）または他の非フィブロネクチン足場、および例えばシングルドメイン抗体に由来する（例えば、WO2004041865 (Ablynx)および EP1517921 (Domantis)参照）。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子はまた、誘導体化あるいは１個以上の他の機能的分子と結合して、同一の標的分子上の２個以上の異なる結合部位および／または２個の異なる標的分子上の２個の異なる結合部位と結合する多重特異的分子およびそれらの多様な置換物を作成してもよい。一つの態様において、Ｆｎ３ベースの結合多重特異的分子は、例えばＨＳＡのような半減期延長部分と連結および結合した少なくとも２個のＦｎ３ドメインを含んでいてよく、Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、同一の治療標的の異なる部位、例えばＴＮＦの異なる部位と結合する。別の態様において、Ｆｎ３ベースの結合多重特異的分子は、例えばＨＳＡのような半減期延長部分と連結および結合した少なくとも２個のＦｎ３ドメインを含んでいてよく、Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、異なる治療標的と結合する（例えば、第１のＦｎ３ドメインはＨｅｒ３と結合し、第２のＦｎ３ドメインはＨｅｒ２と結合する）。さらに別の態様において、Ｆｎ３ベースの結合多重特異的分子は、例えばＨＳＡのような半減期延長部分と連結および結合した少なくとも２個のＦｎ３ドメインまたはその多様な置換物を含んでいてよく、Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、異なる治療標的の異なる部位と結合する（例えば、第１のＦｎ３ドメインはＨｅｒ３の部位１と結合し、第２のＦｎ３ドメインはＨｅｒ３の部位２と結合し、第３のＦｎ３ドメインはＨｅｒ２の部位１と結合し、第４のＦｎ３ドメインはＨｅｒ２の部位２と結合する）。かかる多重特異的分子はまた、本明細書において使用されるとき、用語「二重特異的分子」に含まれることを意図する。
【００７１】
本発明の二重特異的分子は、当該技術分野で既知の方法を用いて、構成要素結合特異性を組合せて作製することができる。例えば、二重特異的分子の各結合特異性を別個に生じさせて、次いでそれぞれを組み合わせる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、多様なカップリング剤または架橋剤を共有結合のために使用することができる。架橋剤の例は、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。好ましい結合剤は、ＳＡＴＡおよびｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co.（Rockford, IL）から入手可能である。
【００７２】
結合特異性が１個以上の抗体を含むとき（例えば多重特異的構築物において）、複合体は２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルホヒドリル結合によって得ることができる。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は奇数、好ましくは１個のスルホヒドリル残基を含むように、結合の前に修飾される。
【００７３】
あるいは、両方の結合特異性が同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞において発現および統合されてもよい。二重特異的分子を作成する方法は、例えば米国特許第5,260,203号; 米国特許第5,455,030号; 米国特許第4,881,175号; 米国特許第5,132,405号; 米国特許第5,091,513号; 米国特許第5,476,786号; 米国特許第5,013,653号; 米国特許第5,258,498号; および米国特許第5,482,858号に記載されている。
【００７４】
二重特異的分子とその特異的標的との結合は、多様なアッセイによって確認することができ、例えば融合体をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において、放射活性によって標識し、使用することができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radiolidang Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986参照、これらを参照により本明細書の一部とする）。放射性同位体は、γカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような方法によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【００７５】
本発明の他の融合は、フィブロネクチンベースの結合分子とタグ（例えばビオチン）または化学物質（例えば免疫毒素または化学療法剤）との結合を含む。かかる化学物質は、細胞に有害な（例えば殺す）任意の薬物である細胞傷害剤を含む。例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログを含む。治療薬物はまた、例えば代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣおよびcis-ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（正式にはダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗菌剤（例えばダクチノマイシン（正式にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含む。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子と結合することができる他の治療用細胞傷害剤の例は、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシンおよびアウリスタチンならびにそれらの誘導体を含む。
【００７６】
細胞傷害剤は、当該技術分野において利用可能なリンカー技術を用いて、本発明のフィブロネクチン利用結合分子と結合することができる。細胞傷害剤と結合するために使用されるリンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、例えばリソソーム区画内での低ｐＨによる切断に受容性であるか、あるいは腫瘍組織において優先的に発現されているプロテアソーム、例えばカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のようなプロテアソームによる切断に受容性であるように選択してもよい。
【００７７】
細胞傷害剤のタイプ、リンカーおよび治療薬物を複合化する方法のさらなる説明は、Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。
【００７８】
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、細胞傷害放射性薬物（放射性免疫複合体とも称する）を作成するために、放射性同位体と複合化してもよい。診断または治療に使用するためにフィブロネクチンベースの結合分子と複合化することができる放射性同位体の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射性免疫複合体を作成する方法は、当該技術分野において確立されている。抗体ベースの放射性免疫複合体の例は、イブリツモマブ、チウキセタンおよびトシツモマブを含む商業的に入手可能なものであり、同様の方法を用いて、本発明の分子を使用して放射性免疫複合体を作成することができる。
【００７９】
本発明のＦｎ融合体を使用して、所定の生物学的応答を修飾することができ、そして薬物部分は伝統的な化学治療薬物に限るものとして構成されない。例えば、薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。かかるタンパク質は、例えば酵素的に活性な毒物またはそのフラグメント、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、またはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子またはインターフェロンγのようなタンパク質；または生物学的応答調節剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または他の増殖因子を含み得る。
【００８０】
かかる治療部分を複合化する技術は周知であり、本発明の分子に適用可能である。例えばArnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)および Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照されたい。
【００８１】
化学修飾
別の局面において、本発明は、例えば分子の生物学的（例えば血清）半減期を延長するため、ペグ化によって修飾されたフィブロネクチンベースの結合分子を提供する。分子をペグ化するため、該分子またはそのフラグメントは典型的には、１個以上のＰＥＧ基が該分子に結合する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と反応させる。用語「ペグ化部分」、「ポリエチレングリコール部分」または「ＰＥＧ部分」は、ポリアルキレングリコール化合物、あるいはカップリング剤またはカップリングもしくは活性化部分での誘導体化（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジンまたは好ましくはマレイミド部分と、例えばＰＥＧ−マレイミド）ありまたはなしでのその誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコール、あるいは次のタイプの荷電もしくは中性ポリマーを含むが、これらに限定されない：デキストラン、コロミン酸または他の糖ベースのポリマー、アミノ酸のポリマーおよびビオチン誘導体。
【００８２】
ＰＥＧ誘導体のための好適な官能基の選択は、分子上の利用可能な反応基のタイプまたはＰＥＧと結合させる分子のタイプに基づく。タンパク質について、典型的な反応性アミノ酸は、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシンを含む。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸も使用することができる。
【００８３】
好ましくは、ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において使用するとき、用語「ポリエチレングリコール」は他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含む。タンパク質をペグ化する方法は当該技術分野において既知であり、本発明に適用することができる。例えば、WO 2005056764, U.S.7,045,337, U.S.7,083,970, U.S.6,927,042, Nishimura et al.によるEP 0 154 316およびIshikawa et alによるEP 0 401 384を参照されたい。フィブロネクチンベースの結合分子は、ペグ化を促進するため、少なくとも１個のシステインアミノ酸または少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むように操作されていてもよい。
【００８４】
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、薬物特性を修飾するために、薬物と結合したヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体を用いたＨＥＳ化によって修飾してもよい。ＨＥＳは、体の酵素によって分解される、ロウ様トウモロコシデンプン由来の修飾された天然ポリマーである。この修飾のため、分子の安定性が上昇し、腎クリアランスが低下することによって循環系半減期が延長されて、生物学的活性の上昇がもたらされる。さらにまた、ＨＥＳ化は免疫原性およびアレルゲン性を強力に変化させる。ＨＥＳの分子量のような異なるパラメーターを変化させて、広範なＨＥＳ薬物複合体をカスタマイズすることができる。
【００８５】
DE 196 28 705 および DE 101 29 369は、ヒドロキシエチルデンプンの対応するアルドノラクトンを介して、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でヒドロキシエチルデンプンをヘモグロビンおよびアンホテリシンＢの遊離アミノ基と結合させることができる方法をそれぞれ開示している。特にタンパク質の場合に、溶解性またはタンパク質の変性の理由で、無水非極性溶媒を使用することができないことが多いため、水性媒体中でＨＥＳによるカップリング法も利用可能である。例えば、鎖の還元末端でアルドン酸に選択的に酸化されているヒドロキシエチルデンプンのカップリングは、水溶性カルボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）の仲介によって可能である（PCT/EP 02/02928）。本発明に適用することができるさらなるＨＥＳ化法は、例えばU.S. 20070134197, U.S. 20060258607, U.S. 20060217293, U.S. 20060100176および U.S.20060052342に記載されている。
【００８６】
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子はまた、糖残基によって修飾されていてもよい。タンパク質を糖残基で修飾するかあるいはタンパク質をグリコシル化する方法は、当該技術分野において既知であり（例えば、Borman (2006) Chem.＆Eng. News 84(36):13-22およびBorman (2007) Chem.＆Eng. News 85:19-20参照）、本発明の分子に適用可能である。かかる糖修飾は、例えばフィブロネクチンベースの結合分子配列内の１個以上のグリコシル化部位を変更することによっても達成可能である。例えば、１個以上のアミノ酸置換によって、１箇所以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を欠失させて、それによって当該部位でのグリコシル化を欠失させることができる。かかる非グリコシル化（aglycosylation）は、抗原に対する抗体の親和性を上昇させ得る。かかるアプローチは、Co et alによる米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載されている。
【００８７】
さらにまたはあるいは、フコシル残基の量が少ない低フコシル化パターンのような別のタイプのグリコシル化を有する本発明のフィブロネクチンベースの結合分子、あるいは増加した二分（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有するフィブロネクチンベースの結合分子を作成することができる。かかる糖修飾は、例えば異なるグリコシル化機構を有する宿主細胞中でフィブロネクチンベースの結合分子を発現させることによって実施することができる。異なるグリコシル化機構を有する細胞は当該技術分野において説明されており、これは本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子を発現させて、それによって異なるグリコシル化を有する本発明のフィブロネクチンベースの結合分子を作成する宿主細胞として使用することができる。例えば、Hang et al.によるEP 1,176,195には、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系であって、かかる細胞系において発現された抗体が低フコシル化を示す細胞系が記載されている。PrestaによるＰＣＴ公報WO 03/035835は、フコースとＡｓｎ（２９７）結合糖の結合能が低下しており、また宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらす変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et al.によるＰＣＴ公報WO 99/54342は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作した細胞系であって、当該操作された細胞系で発現された抗体が当該抗体のＡＤＣＣ活性の上昇をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示す細胞系を記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。ヒト様グリコシル化パターンを有するポリペプチドを作成する方法は、GlycofiのEP1297172B1および他のパテントファミリーにも記載されている。
【００８８】
アミノ酸／ヌクレオチド修飾
１個以上のアミノ酸またはヌクレオチド修飾（例えば変化）を有する本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子は、多様な既知の方法によって作成することができる。かかる修飾された分子は、例えば、組換え法によって作成することができる。さらに、遺伝子コードの縮重のため、多様な核酸配列を用いて各々所望の分子をコードすることができる。
【００８９】
出発分子のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を作成するための、当該技術分野において認識されている方法の例は、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド介在）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発および該分子をコードする前に作成されたＤＮＡのカセット突然変異誘発による作成を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
部位特異的突然変異誘発は、置換変異体を作成するための好ましい方法である。この技術は当該技術分野において周知である（例えば、Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985)およびKunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488 (1987)参照）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発の実施において、親ＤＮＡは最初に、かかる親ＤＮＡの一本鎖と所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて変化させる。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマーとして上記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを使用し、そしてテンプレートとして上記親ＤＮＡの一本鎖を使用して、全第二鎖を合成する。かくして、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは、得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
【００９１】
ＰＣＲ突然変異誘発も、出発分子のアミノ酸配列変異体を作成するために好適な方法である。Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990);および Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)を参照されたい。簡潔には、ＰＣＲにおいて少量のテンプレートＤＮＡを出発物質として使用するとき、テンプレートＤＮＡの対応する領域とはわずかに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列と異なる特定のＤＮＡフラグメントを比較的大量に作成することができる。
【００９２】
変異体を作成するための別の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)に記載の技術に基づく。出発物質は、変異される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異される親ＤＮＡのコドンを同定する。同定した変異部位（複数でも可）の両側に、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。かかる制限部位が存在しないとき、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な位置でそれらを導入するため、上記オリゴヌクレオチド介在突然変異誘発方法を用いてそれらを作成することができる。プラスミドＤＮＡを切断して、直線にする。制限部位間のＤＮＡ配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な方法を用いて合成され、ここで該オリゴヌクレオチドの２本の鎖は別個に合成され、次いで標準的な技術を用いて一体にハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと称される。このカセットは、直線化されたプラスミドの末端と適合可能である５’および３’末端を有するように設計され、それはプラスミドと直接ライゲートすることができる。そうしてこのプラスミドは、変異ＤＮＡ配列を含む。
【００９３】
あるいはまたはさらに、本分子のポリペプチド変異体をコードする所望のアミノ酸配列を決定することができ、かかるアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列を合成的に作製することができる。
【００９４】
本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子は、アミノ酸配列が（例えば野生型とは）異なるが、所望の活性には変化がないように、さらに修飾されていてもよいことが、当業者には理解される。例えば、「非本質的な」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くさらなるヌクレオチド置換が該タンパク質に行われていてもよい。例えば、分子中の非本質的なアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換されていてもよい。他の態様において、一連のアミノ酸が、順序および／または側鎖ファミリーメンバーの組成において異なる構造的に類似した一連のもので置換されていてもよく、すなわちあるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された保存的置換を行うことができる。
【００９５】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００９６】
アミノ酸置換に加えて、本発明は、機能的に均等な分枝を作成するための、出発分子アミノ酸配列の他の修飾を意図する。例えば、１個以上のアミノ酸残基を欠失させてもよい。一般に、本発明のこの態様に従って、１〜約１０個以下の残基が欠失される。１個以上のアミノ酸欠失を含むフィブロネクチン分子は、好ましくは出発ポリペプチド分子の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を保持している。
【００９７】
元のフィブロネクチン分子機能を保持したアミノ酸挿入変異体を作成してもよい。例えば、本分子に少なくとも１個のアミノ酸残基（例えば１〜２個のアミノ酸残基、一般に１０残基以下）を導入することができる。他の態様において、アミノ酸修飾は、１個のフィブロネクチン分子内で組み合わせてもよい。
【００９８】
一つの態様において、アミノ酸置換は、システインまたは本フィブロネクチンベースの結合分子と部分の結合に好適な他の非天然アミノ酸を含むように、周知の結合方法を使用して、フィブロネクチンタイプ３ドメインで実施される。特に本発明は、Ｆｎ３足場を有するフィブロネクチンベースの結合分子の特定のアミノ酸変異体であって、１個以上のセリンアミノ酸残基がシステインまたは他の非天然アミノ酸で置換されている変異体に関する。置換され得るセリンアミノ酸残基は、Ｓｅｒ １４３２、Ｓｅｒ １４３６、Ｓｅｒ １４５８、Ｓｅｒ １４７５およびＳｅｒ １５０４を含むが、これらに限定されない。置換され得るＦｎ３足場の他のアミノ酸位置は、Ｖ １４２６、Ｌ １４３４、Ｔ １４７３およびＴ １４８６を含むが、これらに限定されない。天然には生じないアミノ酸は、例えばＡｍｂｒｅｘ技術を用いてＦｎ３足場に置換され得る（例えばUS 7,045,337; 7,083,970参照）。
【００９９】
改善されたフィブロネクチンベースの結合分子を同定するためのスクリーニングアッセイ
多様なスクリーニングアッセイを使用して、改善された本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子を同定することができる。一つの態様において、フィブロネクチンベースの結合分子は所望の抗原に対する改善された結合親和性についてスクリーニングされる。所望の抗原に対する改善された結合について選択するあらゆるインビトロまたはインビボスクリーニング法が意図される。
【０１００】
他の態様において、フィブロネクチンベースの結合分子は細胞、ウイルスまたはバクテリオファージの表面に提示され、固定化抗原を用いた選択に供される。スクリーニングのための好適な方法は、米国特許7,063,943; 6,699,658; 7,063,943および5866344に記載されている。かかる表面ディスプレイ法は、フィブロネクチンベースの結合分子と通常細胞、ウイルスまたはバクテリオファージの外側表面に存在する好適なタンパク質の融合タンパク質の作成を必要とし得る。かかる融合体を作成するための好適なタンパク質は、当該技術分野において周知である。
【０１０１】
他の態様において、フィブロネクチンベースの結合分子は、リボソームまたはポリソームディスプレイのようなインビトロ表現型−遺伝子型連鎖ディスプレイを用いてスクリーニングされる。かかる「分子進化」の方法は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許6,194,550および7,195,880参照）。
【０１０２】
本発明に使用するスクリーニング法は、１個以上のアミノ酸変異がフィブロネクチンベースの結合分子に導入されていることを必要とし得る。あらゆる当該技術分野において既知の変異誘発方法が意図される。一つの態様において、Ｆｎ３足場または移植ＣＤＲの１個以上のアミノ酸がランダムに変異されているフィブロネクチンベースの結合分子のライブラリーを作成する。他の態様において、Ｆｎ３足場または移植ＣＤＲの１個以上のアミノ酸が１個以上の所定のアミノ酸に変異されているフィブロネクチンベースの結合分子のライブラリーを作成する。
【０１０３】
本発明に使用するスクリーニング法はまた、抗原結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーが、改善された抗原に対する親和性を有するフィブロネクチンベースの結合分子を選択するために上昇していることが必要とされていてもよい。タンパク質間相互作用アッセイのストリンジェンシーを上昇させるための当業者に既知の方法が、ここで使用され得る。一つの態様において、所望の抗原に対するフィブロネクチンベースの結合分子の親和性を低下させるために、１種以上のアッセイ条件を変化させる（例えばアッセイバッファーの塩濃度）。他の態様において、フィブロネクチンベースの結合分子が所望の抗原と結合することができる時間の長さを少なくする。他の態様において、タンパク質間相互作用アッセイに競合的結合工程を加える。例えば、フィブロネクチンベースの結合分子は最初に、所望の固定化抗原と結合させる。次いで、固定化抗原と競合して結合する特定の濃度の非固定化抗原を加えて、抗原に対して最も低い親和性を有するフィブロネクチンベースの結合分子を固定化抗原から溶出させて、改善された抗原結合親和性を有するフィブロネクチンベースの結合分子を選択する。該アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに加える非固定化抗原の濃度を上昇させて、さらに上昇させることができる。
【０１０４】
本発明のスクリーニング法はまた、改善された抗原結合性を有する１種以上のフィブロネクチンベースの結合分子を富化するため、複数回の選択を必要としてもよい。一つの態様において、選択のそれぞれの回でさらにアミノ酸変異をフィブロネクチンベースの結合分子に導入する。他の態様において、選択のそれぞれの回で所望の抗原との結合のストリンジェンシーを上昇して、増加した結合親和性を有するフィブロネクチンベースの結合分子を選択する。
【０１０５】
製造方法
本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子は典型的には、組み換え発現によって作成する。該分子をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。該分子をコードするＤＮＡセグメントは、それらの発現を確実に行うため発現ベクターの調節配列と作動可能に連結している。発現調節配列は、プロモーター（例えば天然関連または異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終止配列を含むが、これらに限定されない。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター内の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、該宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、交叉反応するフィブロネクチンベースの結合分子を回収および精製する。
【０１０６】
これらの発現ベクターは典型的には、エピソームとして、あるいは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするため、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Itakura et al., 米国特許4,704,362参照）。
【０１０７】
大腸菌は本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローンかするために特に有用な原核宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、枯草菌のような細菌およびサルモネラ、セラチアおよび多様なシュードモナス属の種のような他の腸内細菌を含む。
【０１０８】
酵母のような他の微生物も発現に有用である。サッカロマイセスおよびピキアは、望ましい発現調節配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列等を有する好適なベクターを有する、例示的な酵母宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。とりわけ誘導可能な酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームＣ、ならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素由来のプロモーターを含む。
【０１０９】
微生物に加えて、哺乳類組織培養物も本発明のポリペプチド（例えば免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を発現し、生産するために使用することができる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照されたい。異種タンパク質（例えばインタクトな免疫グロブリン）を分泌することができる多くの好適な宿主細胞系真核細胞が当該技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞系、多様なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含み得るため、実際には真核細胞が好まれる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーのような発現調節配列（Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)）、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列のような必要なプロセッシング情報部位を含んでいてもよい。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)を参照されたい。
【０１１０】
あるいは、コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および続くトランスジェニック動物の乳における発現のために、トランス遺伝子に組み込まれていてもよい（例えば、Deboer et al.のU.S. 5,741,957、Rosenの U.S. 5,304,489およびMeade et al.のU.S. 5,849,992参照）。好適なトランス遺伝子は、カゼインまたはベータラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に結合した、軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。
【０１１１】
目的のポリヌクレオチド配列および発現調節配列を含むベクターは、細胞宿主のタイプに強く依存して、周知の方法で宿主細胞に移すことができる。例えば、化学的に形質転換受容性のある原核細胞は、短時間に熱ショックを与えることができ、一方でリン酸カルシウム処置、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃またはウイルスを利用したトランスフェクションが、他の細胞宿主には使用され得る（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)参照）。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、プロトブラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションの使用を含む（一般に、Sambrook et al., supra参照）。トランスジェニック動物の作成のために、トランス遺伝子を受精卵母細胞にマイクロインジェクションすることができ、あるいは胚幹細胞のゲノムに組み込んで、かかる細胞の核を除核した卵母細胞に移すことができる。
【０１１２】
発現されると、本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野において標準的な方法に従って精製することができる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))参照）。少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な分子が好ましく、医薬的使用のためには９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【０１１３】
組成物
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子（およびその変異体、融合体および複合体）は、インビトロおよびインビボで診断および治療上有用性を有する。したがって、本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に製剤された、フィブロネクチンベースの結合分子（またはその変異体、融合体および複合体）の１種以上の組合せを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、組合せ療法で、すなわち他の薬物と組み合わせて投与してもよい。例えば、組合せ療法は、本発明の組成物と少なくとも１種以上のさらなる治療薬物、例えば抗炎症剤、抗癌剤および化学療法剤を含んでいてもよい。
【０１１４】
本発明の医薬組成物はまた、放射線療法と組み合わせて投与してもよい。他のフィブロネクチンベースの結合分子との共投与も本発明に含まれる。
【０１１５】
本明細書において使用するとき、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性である、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば注射または輸液による）に好適である。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異的および多重特異的分子は、酸および化合物を不活性化し得る他の天然条件から該化合物を保護するための物質でコーティングしてもよい。
【０１１６】
「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、いずれかの望ましくない毒性効果に関与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。かかる塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族性スルホン酸等に由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等、ならびに非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来するものを含む。
【０１１７】
本発明の組成物は、当該技術分野において既知の多様な方法によって投与することができる。当業者に理解されるとおり、投与経路および／または形態は、望まれる結果に従って変化する。活性化合物は、該化合物を速やかな放出から保護するための担体と共に製剤されていてもよい（例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤）。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用してもよい。かかる製剤の製造のための多様な方法が特許化されているか、あるいは一般に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１１８】
ある投与経路で本発明の化合物を投与するために、その不活性化から保護するための物質で該化合物をコーティングするか、あるいはそれと共に該化合物を投与する必要がある場合がある。例えば、化合物は対象に適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤中で投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水および水性バッファー溶液を含む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョンおよび常套のリポソームを含む（Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27）。
【０１１９】
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散剤および滅菌注射液または分散剤を即時製造するための滅菌粉末を含む。かかる媒体および薬学的に活性な物質の使用は、当該技術分野において既知である。いずれかの常套の媒体または薬物が本活性化合物と非適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物も本組成物に含まれていてよい。
【０１２０】
治療用組成物は典型的には、滅菌されており、製造および貯蔵条件下で安定でなければならない。該組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物含有量に好適な他の秩序構造として製剤することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび脂質ポリエチレングリコール等）およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１２１】
滅菌注射液は、上記成分の１種または組合せと共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を含めて、所望により、次いで滅菌マイクロフィルトレーションして製造することができる。一般に、分散剤は、基礎分散媒および必要な上記の他の成分を含む滅菌ビークルに、活性化合物を含めることによって製造する。滅菌注射液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結−乾燥（凍結乾燥）であり、これによって有効成分とその滅菌濾過した溶液のいずれかのさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０１２２】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）を得るために調節される。例えば、１回ボーラスを投与し、複数回分割用量をゆっくり時間を掛けて投与するか、あるいは用量を治療状況の緊急性によって示されるとおりに比例的に減少または増加することができる。例えば、本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、皮下注射で週に１または２回、あるいは皮下注射で月に１または２回投与することができる。投与の簡便さおよび投与量の均一性のため、非経腸組成物を単位投与形態に製剤することが特に有利である。単位投与形態は、本明細書において使用するとき、処置する対象への単位投与量として好適な物理的に分離した単位を意味し；各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を奏するように計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の単位投与形態についての説明は、（ａ）活性化合物の特異的な特徴および得られるべき具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のための活性化合物のような配合の分野に内在する制限に基づいて説明され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０１２３】
薬学的に許容される抗酸化剤の例は、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガラート、アルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。
【０１２４】
治療用組成物について、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経腸投与に適したものを含む。製剤は、簡便には単位投与形態で存在していてよく、薬学の分野において既知のいずれかの方法によって製造することができる。単剤形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置する対象および具体的な投与形態に従って変化する。単剤形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を奏する組成物の量である。一般に、この量は１００％中、約０．００１％〜約９０％の有効成分、好ましくは約０．００５％〜約７０％、最も好ましくは約０．０１％〜約３０％である。
【０１２５】
膣投与に適している本発明の製剤はまた、適切であると当該技術分野において知られている担体を含んだペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤を含む。本発明の組成物の局所または経皮投与用投与形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。活性化合物は、滅菌条件下で薬学的に許容される担体と、そして必要であり得るいずれかの保存剤、バッファーまたはプロペラントと共に混合することができる。
【０１２６】
用語「非経腸投与」および「非経腸的に投与」は、本明細書において使用するとき経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸液を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明の医薬組成物に使用することができる好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばエチルオレエートを含む。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１２８】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでいてもよい。微生物の存在の防止は、上記滅菌方法ならびに多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることの両方によって、保証され得る。糖、塩化ナトリウム等のような等張化剤を組成物に含めることが望まれることもある。さらに、注射用医薬形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる物質を含めることによってもたらされ得る。
【０１２９】
本発明の化合物が医薬としてヒトおよび動物に投与されるとき、それらは単独で、または例えば０．００１〜９０％（より好ましくは、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の有効成分と薬学的に許容される担体を組み合わせて含む医薬組成物として、投与することができる。
【０１３０】
選択した投与経路に拘わらず、好適な水和物形態で使用されてもよい本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に既知の常套の方法によって薬学的に許容される投与形態に製剤される。
【０１３１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、具体的な患者、組成物および投与形態について、患者に毒性なく、所望の治療応答を得るために有効である有効成分の量を得るように、変化してよい。選択される投与レベルは、使用する具体的な本発明の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する具体的な化合物の排出速度、処置の期間、使用する具体的な組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および薬歴等の医学分野で周知の要因を含む、多様な薬物動態因子に依存する。当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、予測することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物において使用する本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされる量よりも少ないレベルで開始し、所望の効果が得られるまで用量を漸増することができる。一般に、本発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果を奏するために有効な最低用量である化合物の量である。かかる有効用量は、一般に、上記要因に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位の近くに投与する。所望により、治療用組成物の有効１日用量は、１日の適切な間隔で、所望により単位投与形態で、２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として別々に投与することが好ましいこともある。本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、医薬製剤（組成物）として化合物を投与することが好ましい。
【０１３２】
治療用組成物は、当該技術分野において既知の医薬デバイスによって投与することができる。例えば好ましい態様において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射器、例えば米国特許5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824または4,596,556に記載のデバイスによって投与することができる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で医薬を供給するためのインプラント可能なマイクロ輸液ポンプを記載する米国特許4,487,603、皮膚を介して医薬を投与するための治療用デバイスを記載する米国特許4,486,194、正確な輸液速度で医薬を送達するための医薬輸液ポンプを記載する米国特許4,447,233、連続的薬物送達のための、インプラント可能な流速可変型輸液装置を記載する米国特許4,447,224、複数のチャンバー区画を有する浸透薬物送達システムを記載する米国特許4,439,196、ならびに浸透薬物送達システムを記載する米国特許4,475,196を含む。多様な他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に既知である。
【０１３３】
ある態様において、本発明の分子は、インビボでの適切な分散を確実にするために製剤され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を除外する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するため（所望により）、それらは例えばリポソーム中に製剤されていてよい。リポソームを製造する方法に関しては、例えば米国特許4,522,811；5,374,548；および5,399,331を参照されたい。リポソームは特定の細胞または臓器に選択的に移動され、したがって標的薬物送達を向上する１種以上の部分を含んでいてもよい（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的な標的部分は、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許5,416,016参照）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）、本発明の製剤ならびに本発明の分子の成分を含み得る異なる種；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）を含む；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。本発明の一つの態様において、本発明の治療化合物は、リポソームに製剤され；より好ましい態様において、リポソームは標的部分を含む。最も好ましい態様において、リポソーム中の治療化合物は、腫瘍または感染に近い部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射針を通過できる程度に流動的でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。
【０１３４】
さらなる態様において、本発明の分子は、胎盤を通過する輸送を防止または低減するように製剤されていてもよい。これは当該技術分野において既知の方法、例えばフィブロネクチンベースの結合分子のＰＥＧ化によって行うことができる。さらなる参考文献は、Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190; および Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283を挙げることができる。これは、フィブロネクチンベースの結合分子が自然発生的流産の再発を処置または予防するために使用されるとき、特に関係する。
【０１３５】
がんを阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果の予測が可能な動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に既知のインビトロでの阻害アッセイによって、のように、本化合物の阻害能を試験することによって評価することができる。治療上有効量の治療化合物は、腫瘍のサイズを減少させることができ、あるいは対象の症状を緩和することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度および選択した具体的な化合物または投与経路のような要因に基づいて、かかる量を決定することができる。
【０１３６】
組成物は滅菌されており、そして該組成物がシリンジによって送達可能である程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は等張緩衝化食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等）およびそれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールおよび塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１３７】
活性化合物が上記のとおり好適に保護されているとき、該化合物は例えば不活性希釈剤または同化食用担体と共に経口的に投与してもよい。
【０１３８】
治療および診断適用
本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子は、いずれかの目的の抗原に結合するように構築することができ、そして増加した安定性および半減期、ならびにさらなる機能的部分を有するように修飾することができる。したがって、これらの分子は、研究、治療および診断分野を含む、抗体が使用されているあらゆる領域において抗体の代わりに使用することができる。さらに、これらの分子は抗体よりも優れた溶解性および安定性を有するため、本明細書に記載の抗体模倣物はまた、抗体分子を破壊もしくは不活性化する条件下で使用することもできる。
【０１３９】
例えばこれらの分子は、例えばインビトロまたはエクスビボで、培地中の細胞に、あるいは例えばインビボで対象に、多様な傷害の処置、予防または診断のために、投与することができる。用語「対象」は、本明細書において使用するとき、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類およびは虫類を含む。フィブロネクチン分子が別の薬物と共に投与されるとき、これら２つは順次または同時に投与することができる。
【０１４０】
一つの態様において、本発明のフィブロネクチンベースの結合分子（およびその変異体、融合体および複合体）は、該分子によって結合される標的および／または二重特異的／多重特異的フィブロネクチンベースの結合分子によって結合される標的のレベルを検出するために使用することができる。これは、例えばサンプル（例えばインビトロサンプル）と対照サンプルを該分子と、該分子と標的の複合体の形成が可能な条件下で接触させることによって、達成することができる。いずれかの形成された該分子と標的の複合体を検出して、サンプルと対照で比較する。例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびフローサイトメトリー分析のような当該技術分野において周知の標準的な検出方法が、本発明の組成物を用いて実施され得る。
【０１４１】
また、本発明の組成物（例えば、フィブロネクチンベースの結合分子、その変異体、融合体および複合体）と使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲に含まれる。該キットはさらに、少なくとも１種のさらなる試薬または１種以上のさらなる本発明のフィブロネクチン分子（例えば第一の分子床となる標的抗原のエピトープと結合する相補的活性を有する抗体）を含んでいてもよい。キットは典型的には、キットの内容物の意図した使用を記載したラベルを含む。用語ラベルは、キット上またはキットと共に供給されるいずれかの記載されたかあるいは記録された物体か、あるいはそれ以外のキットに伴うものを含む。
【０１４２】
上記のとおり、本発明の分子は、研究、治療および診断分野のあらゆる領域で使用することができる。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子（およびその変異体、融合体および複合体）を使用して処置することができる疾患／障害の例は、自己免疫障害、がん、感染症、心臓血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神病、眼の疾患、過形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、糖尿病、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺性高血圧、乾癬、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、オスラー・ウェーバー症候群、心筋血管新生、プラーク血管新生、再狭窄、血管外傷後の新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症に関連した線維症、肺線維症、アミロイド症、アルツハイマー病、臓器移植拒絶、深部静脈血栓症または創部の肉芽形成を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
一つの態様において、本発明の分子は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、レンサ球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎, グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、ショーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症（すなわちグレーブス病）、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェグナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化性肺胞炎のような自己免疫疾患を処置するために使用することができる。
【０１４４】
別の態様において、本発明の分子は、がんの処置に使用することができる。標的とされ得る腫瘍のタイプの例は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、胆嚢癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣がん、膵臓癌、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、神経膠腫および他の脳および脊髄腫瘍および膀胱癌を含む。
【０１４５】
別の態様において、本発明の分子は、病原体、例えば細菌、ウイルス、真菌または単細胞寄生虫による感染の処置に使用することができる。処置し得る真菌の例は、ミクロスポルム属（Microsporum）、トリコフィトン属（Trichophyton）、エピデルモフィトン属（Epidermophyton）、スポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）またはカンジダ・アルビカンス（Candida albican）を含む。ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器多核体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、またはブルータングウイルスを含む。細菌の例は、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿レンサ球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎レンサ球菌、インフルエンザ菌Ｂ型、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ライ菌、ウシ流産菌、結核菌またはマイコプラズマ属を含む。寄生虫の例は、ランブル鞭毛虫、ジアルジア種、カリニ肺炎菌、トキソプラズマ原虫、クリプト・スポルジウム種（Crypto spordium spp.）、アカントアメーバ種、ネグレリア種、リーシュマニア種、大腸バランチジウム、エバンス・トリパノソーマ、トリパノソーマ種、二核アメーバ、膣トリコモナス、トリコモナス種、エントアメーバ種、二核アメーバ種、バベシア種、熱帯熱マラリア原虫、イソスポーラ種、トキソプラズマ種、エンテロシトゾーン種、ニューモシスチス種およびバランチジウム種を含む。
【０１４６】
治療および診断適用
本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子は、いずれかの目的の抗原または標的と結合するように構成することができる。かかる標的は、クラスタードメイン、細胞受容体、細胞受容体リガンド、成長因子、インターロイキン、タンパク質アレルゲン、細菌またはウイルスを含むが、これらに限定されない（例えば図７Ａ〜Ｃ参照）。本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子はまた、増加した安定性および半減期、ならびにさらなる機能的部分を有するように修飾することができる。したがって、これらの分子は、研究、治療および診断分野を含む抗体が使用されるあらゆる分野において、抗体の代わりに使用することができる。さらに、これらの分子は抗体よりも優れた溶解性および安定性を有するため、本明細書に記載の抗体模倣物はまた、抗体分子を破壊しまたは不活性化する条件下で使用することができる。
【０１４７】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これはさらなる限定を構成するべきではない。全ての図面および本明細書を通じて言及した全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は、明示的に参照により本明細書に引用する。
【実施例】
【０１４８】
実施例
実施例を通じて、特に定めのない限り、次の物質および方法を用いた。
【０１４９】
材料および方法
一般に、特に定めのない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（例えば特に抗体技術）およびポリペプチド調製における標準的な技術を使用する。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999);および Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley＆Sons (1992)を参照されたい。本発明の実施に使用するのに好適な他の方法、技術および配列は、米国特許7,153,661; 7,119,171; 7,078,490; 6,703,199; 6,673,901; および 6,462,189に見出すことができる。
【０１５０】
配列
次の配列を使用した。
野生型Ｆｎ３配列
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
野生型Ｆｎ３配列（ＲＧＤ→ＲＧＡ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号２）
ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号３）
ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８Ｌ＆Ｉ５６Ｔ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号４）
ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３
ＧＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号７６）
【０１５１】
ｄｓｂＡシグナル配列
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号５）
ＣＤ３３シグナル配列＋ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号６）
ＣＤ３３シグナル配列＋ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号７）
ＣＤ３３シグナル配列＋野生型Ｆｎ３
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号８）
ＣＤ３３シグナル配列＋野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号９）
ＣＤ３３シグナル配列＋ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号７７）
【０１５２】
ＴＮＦ結合ナノ抗体
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＳＰＳＧＦＮＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＤＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＬＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＶＷＲＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１１）
抗ＨＳＡバインダー
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
抗ＭＳＡバインダー
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＫＨＬＫＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＡＲＷＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１３）
抗ＲＳＡバインダー
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＮＳＰＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＹＲＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号７８）
【０１５３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４）
【０１５４】
ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）
ＥＡＨＫＳＥＩＡＨＲＦＫＤＬＧＥＱＨＦＫＧＬＶＬＩＡＦＳＱＹＬＱＫＣＰＹＥＥＨＩＫＬＶＱＥＶＴＤＦＡＫＴＣＶＡＤＥＮＡＥＮＣＤＫＳＩＨＴＬＦＧＤＫＬＣＡＩＰＫＬＲＤＮＹＧＥＬＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＰＦＱＲＰＥＡＥＡＭＣＴＳＦＱＥＮＰＴＳＦＬＧＨＹＬＨＥＶＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＹＹＡＥＫＹＮＥＶＬＴＱＣＣＴＥＳＤＫＡＡＣＬＴＰＫＬＤＡＶＫＥＫＡＬＶＡＡＶＲＱＲＭＫＣＳＳＭＱＲＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＭＳＱＲＦＰＮＡＥＦＡＥＩＴＫＬＡＴＤＶＴＫＩＮＫＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＥＬＡＫＹＭＣＥＮＱＡＴＩＳＳＫＬＱＡＣＣＤＫＰＶＬＱＫＳＱＣＬＡＥＩＥＨＤＮＩＰＡＤＬＰＳＩＡＡＤＦＶＥＤＫＥＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＴＦＬＹＥＹＳＲＲＨＰＤＹＳＶＳＬＬＬＲＬＡＫＫＹＥＡＴＬＥＫＣＣＡＥＧＤＰＰＡＣＹＧＴＶＬＡＥＦＱＰＬＶＥＥＰＫＮＬＶＫＴＮＣＥＬＹＥＫＬＧＥＹＧＦＱＮＡＶＬＶＲＹＴＱＫＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲＮＬＧＲＶＧＴＫＣＣＴＬＰＥＡＱＲＬＰＣＶＥＤＹＬＳＡＩＬＮＲＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＥＫＶＴＫＣＣＳＧＳＬＶＥＲＲＰＣＦＳＡＬＴＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＫＡＥＴＦＴＦＨＳＤＩＣＴＬＰＤＫＥＫＱＩＫＫＱＴＡＬＡＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＥＤＱＬＫＴＶＭＧＤＦＡＱＦＶＤＫＣＣＫＡＡＤＫＤＮＣＦＡＴＥＧＰＮＬＶＡＲＳＫＥＡＬＡ（配列番号７９）
ｈＩｇＧ１  Ｆｃ
ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１５）
【０１５５】
プライマー
（１）５’gggcggaccgatgctcataaatctgaagtcgc３’（Ｆ）（配列番号１６）
（２）５’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgcaaaccaagtgcggcctgactggccgc３’（Ｒ）（配列番号１７）
（３）５’cagactagatctgtgagcgatgtgccgcgtgatc３’（Ｆ）（配列番号１８）
（４）５’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctgatcgg３’（Ｒ）（配列番号１９）
（５）５’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctaatcggtttg３’（Ｒ）（配列番号２０）
（６）５’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc３’（Ｆ）（配列番号２１）
【０１５６】
（７）５’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc３’（Ｒ）（配列番号２２）
（８）５’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc３’（Ｒ）（配列番号２３）
（９）５’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc３’（Ｆ）（配列番号２４）
（１０）５’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc３’（Ｒ）（配列番号２５）
（１１）５’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc３’（Ｒ）（配列番号２６）
（１２）５’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc３’（Ｆ）（配列番号２７）
（１３）５’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc３’（Ｒ）（配列番号２８）
（１４）５’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc３’（Ｒ）（配列番号２９）
（１５）５’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc３’（Ｆ）（配列番号３０）
【０１５７】
（１６）５’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc３’（Ｒ）（配列番号３１）
（１７）５’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc３’（Ｒ）（配列番号３２）
（１８）５’gggcggaccggcaaatcttgtgacaaaactcacacatgc３’（Ｆ）（配列番号３３）
（１９）５’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgtttacccggagacagggagaggc３’（Ｒ）（配列番号３４）
（２０）５’cgtgcgagccagagcattagctcttacctgaactggtatcagcagaaaccg３’（Ｆ）（配列番号８０）
（２１）５’cggtttctgctgataccagttcaggtaagagctaatgctctggctcgcacg３’（Ｒ）（配列番号８１）
（２２）５’cgaaactgctgatttatcgcaacagcccgctgcagagcggtgtgcc３’（Ｆ）（配列番号８２）
（２３）５’ggcacaccgctctgcagcgggctgttgcgataaatcagcagtttcg３’（Ｒ）（配列番号８３）
（２４）５’cctattattgccagcagacttaccgtgttccgccgacctttggccagggcacc３’（Ｆ）（配列番号８４）
（２５）５’ggtgccctggccaaaggtcggcggaacacggtaagtctgctggcaataatagg３’（Ｒ）（配列番号８５）
（２６）５’gggcggaccgaagcacacaagagtgagatcgc３’（Ｆ）（配列番号８６）
（２７）５’gggtttaaacgggccctctagatcatcaatgatgatgatgatggtgggctaaggcttctttgcttctagc３’（Ｒ）（配列番号８７）
（２８）５’atggattccaaaacgccgttctggttcgatacacc３’（Ｆ）（配列番号８８）
（２９）５’ggtgtatcgaaccagaacggcgttttggaatccat３’（Ｒ）（配列番号８９）
（３０）５’accaaattggcaacagacgtcaccaaaatcaacaagg３’（Ｆ）（配列番号９０）
（３１）５’ccttgttgattttggtgacgtctgttgccaatttggt３’（Ｒ）（配列番号９１）
【０１５８】
実施例１
ＣＤＲグラフティング
コンピューターモデリングを用いて、ＴＮＦ結合ナノ抗体（配列番号１０）由来のＣＤＲループ１（ＳＧＦＴＦＳＤＹＷＭ−配列番号３５）およびループ３（ＲＳＰＳＧＦＮＲ−配列番号３６）を、ヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩモジュールの野生型第１０ドメインのフレームワーク（１０Ｆｎ３または野生型Ｆｎ３）に移植した。ＴＮＦ結合ナノ抗体および野生型Ｆｎ３分子のアミノ酸配列は次のとおりである：
ＴＮＦ結合ナノ抗体（配列番号１０）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＳＰＳＧＦＮＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
野生型Ｆｎ３（配列番号１）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ
【０１５９】
同じ方法を用いて、ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体（配列番号４０）由来のＣＤＲループ１（ＳＱＡＩＤＳＹ−配列番号３８）およびループ３（ＱＶＶＷＲＰＦＴ−配列番号３９）を、野生型Ｆｎ３に移植した。ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体のアミノ酸配列は次のとおりであった：
ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体（配列番号４０）
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro PheThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
【０１６０】
次いで、次に示すフォーマットのＤＮＡ配列を大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで作成した。得られたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化して、ｐＥＴ９ａの対応する部位にライゲートした（適切な隣接ＤＮＡ配列を次のフォーマットに加えた）。
フォーマット：
１）ＴＮＦ結合ナノ抗体由来のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループを有する野生型Ｆｎ３−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＳＧＦＴＦＳＤＹＷＭＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＲＳＰＳＧＦＮＲＩＳＩＮＹＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号４１）
２）最初の８アミノ酸を除いた、ＴＮＦ結合ナノ抗体由来のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループを有する野生型Ｆｎ３−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＳＧＦＴＦＳＤＹＷＭＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＲＳＰＳＧＦＮＲＩＳＩＮＹＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号４２）
３）ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体由来のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループを有する野生型Ｆｎ３−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＳＱＡＩＤＳＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＱＶＶＷＲＰＦＴＰＩＳＩＮＹＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号４３）
４）最初の８アミノ酸を除いた、ＴＮＦ結合シングルドメイン抗体由来のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループを有する野生型Ｆｎ３−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＳＱＡＩＤＳＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＱＶＶＷＲＰＦＴＰＩＳＩＮＹＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号４４）
【０１６１】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む多様な大腸菌株で構築物を発現させた。誘導および発現の後、細胞ペレットを−２０℃で凍結させ、次いで溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、バッファー５０ｍｌ当たりＥＤＴＡなしのComplete１錠（Roche）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（Merck）［ｐＨ７．４］）に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理して、遠心分離した。上清を濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭのイミダゾールを含む以外は、溶解バッファーと同じ）で洗浄し、次いで溶出バッファー（５００ｍＭまでのイミダゾールである以外は、溶解バッファーと同じ）で溶出した。サンプルをBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、１０ｍＭのＴｒｉｓまたはＰＢＳで溶出した。サンプルをBis-Trisゲルで再度分析した。対応する抗原との結合を、ＥＬＩＳＡまたはBiacoreで確認した。
【０１６２】
実施例２
フィブロネクチン分子内のアミノ酸修飾位置の同定
野生型Ｆｎ３配列のレビューに基づいて、アミノ酸修飾、例えばＰＥＧ化を促進するためのシステインまたは天然には生じないアミノ酸残基による置換の可能性のある位置として、部位を同定した。例えば、セリン残基（合計１１個、次の配列において下線を付した；セリン残基のスティック提示を有する野生型Ｆｎ３分子を示す図１も参照されたい）を次のとおり分析した。
野生型Ｆｎ３
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
【０１６３】
結合表面近くに位置するセリン残基、例えばＮ末端領域に属し、ＦＧおよびＢＣループとも接触するＳｅｒ２は分析から除外した（次の配列で下線を付したＳ）。
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
Ｓｅｒ５３−Ｓｅｒ５５  −  これらの残基はＤＥループに属する（次に下線を付した）。
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
Ｓｅｒ８１−Ｓｅｒ８４−Ｓｅｒ８５  −  これらの残基はＦＧループに属する（次に下線を付した）。
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
【０１６４】
修飾されるセリンの候補は次のものを含む：Ｓｅｒ１７−Ｓｅｒ２１−Ｓｅｒ４３−Ｓｅｒ６０−Ｓｅｒ８９。これらのセリン残基は、全て溶媒に曝されており、Ｓｅｒ４３を除くそれらはβ鎖の一部である（図２参照）。
Ｓｅｒ１７およびＳｅｒ２１は、それぞれＢ鎖の最初および末端に位置する。Ｓｅｒ６０はＥ鎖の末端に位置する。
Ｓｅｒ２１およびＳｅｒ６０は、フィブロネクチンの３鎖シートを形成する２本の隣接鎖に位置する。
Ｓｅｒ８９はＧ鎖の中央に位置し、これはまた、４鎖シートを形成する最後の鎖でもある。したがって、Ｓｅｒ８９は溶媒にも曝されており、外部の分子と接触可能である。
Ｓｅｒ４３は分子の底部に位置し、溶媒に向かって折り曲げられているループの末端でＣＤループに属する（図２参照）。
【０１６５】
修飾される可能性がある部位としての他の残基は、β鎖に位置し、溶媒に曝されている次の残基を含む：Ｖ１１−Ｌ１９−Ｔ５８−Ｔ７１（次の配列で下線を付した）。
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
【０１６６】
図３に関して、３鎖シートが示される（鎖Ａ−Ｂ−Ｅ）。候補残基Ｓｅｒ１７およびＳｅｒ６０はシートの底部に位置する。候補残基Ｓｅｒ２１は上部に位置する。Ｓｅｒ５５は、結合表面に近いため、除外した。
鎖Ａの開始点近くに位置するＶａｌ１１は、フィブロネクチン分子配列において保存されていないと思われる。
鎖Ｂの中央に位置するＬｅｕ１９も保存された位置ではない。
Ｔｈｒ５８は鎖Ｅの末端に位置する。
【０１６７】
図４（足場の他の側面；４鎖シート）に関して、Ｔｈｒ７１はＳｅｒ８９の近くに位置する。この位置も保存されていない。フィブロネクチン分子のこの部分は、ある種の“Ｃ”構造を形成することに注意されたい。ＦＧループおよびＣＤループは互いに向かい合っている（図５参照）。
該分子に結合するＰＥＧ分子のサイズに依存して、該分子のこの側面はＰＥＧ化を受けることができない
【０１６８】
実施例３
Ｆｎ３配列のＰＥＧ化
Ｆｎの半減期を延長するため、ＴＮＦ結合Ｆｎ３（配列番号３）、ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）（配列番号４）、野生型Ｆｎ３（配列番号１）および野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）（配列番号２）のＰＥＧ化を、（１）システインおよび（２）非天然アミノ酸を用いて、次のとおりに実施した。
ＴＮＦ結合Ｆｎ３
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号３）
ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号４）
野生型Ｆｎ３
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号１）
野生型Ｆｎ３配列（ＲＧＤ→ＲＧＡ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号２）
【０１６９】
システインを用いたＰＥＧ化
上記ＴＮＦ結合Ｆｎ３および野生型Ｆｎ３配列に対応するＤＮＡ配列を大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。Ｃ末端システイン残基の挿入のために、プライマー６（配列番号２１）および７（配列番号２２）を用いてＴＮＦ結合配列を増幅し、プライマー６（配列番号２１）および８（配列番号２３）を用いて野生型配列を増幅した（物質および方法の項の上記プライマー参照）。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化して、ｐＥＴ９ａの対応する部位にクローン化した。さらに、プライマー９（配列番号２４）および１０（配列番号２５）を用いてＴＮＦ結合配列を増幅し、プライマー９（配列番号２４）および１１（配列番号２６）を用いて野生型配列を増幅した。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｄｓｂＡシグナル配列を有するｐＱＥ−８０Ｌの対応する部位にクローン化した。
【０１７０】
フォーマット：
１）ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４８）
２）ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）
３）野生型Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）
４）野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５１）
４）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５２）
【０１７１】
５）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５３）
６）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５４）
７）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−３ｘＡリンカー−Ｃ−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡＣＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５５）
８）野生型Ｆｎ３配列−（ＲＧＤ→ＲＧＡ）Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＭＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７）
【０１７２】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンはＤＮＡ配列決定によって確認した。ＫＳ４７４、ＴＧ１（−）およびＢＬ２１（ＤＥ３）を含む多様な大腸菌株で構築物を発現させた。誘導および発現の後、細胞ペレットを−２０℃で凍結し、次いで溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、バッファー５０ｍｌ当たりＥＤＴＡなしのComplete１錠（Roche）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（Merck）［ｐＨ７．４］）中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理し、遠心分離した。上清を濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭのイミダゾールを含む以外は、溶解バッファーと同じ）で洗浄し、次いで溶出バッファー（５００ｍＭまでのイミダゾールである以外は、溶解バッファーと同じ）で溶出した。サンプルをBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、ＰＢＳ［ｐＨ６．５〜７．２］で溶出した（ゲル濾過の前にマイルドな還元を用いることもあった）。サンプルをBis-Trisゲルで再度分析した。精製したタンパク質にＤＴＴ（最終濃度１０μＭ）を補い、次いでAmicon Ultra-4チューブ, 100kで濾過して内毒素を除去した。ＤＴＴ除去のためにHiTrap Desaltingカラムを用いた。ｐＨ５．５でＭＥＳバッファー５０ｍＭ中のサンプルを、５〜１０モル過剰のＰＥＧ−マレイミドと室温で約４時間共役させて、ＰＥＧ化の効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳで分析した。過剰のＰＥＧをHiTrap-SP-FFカラムで除去し、次いでＰＢＳまたはＴｒｉｓに溶解した。対応する抗原との結合はＥＬＩＳＡで確認した。還元、アルキル化およびトリプシン消化によってＰＥＧ化部位を決定した。サンプル１００μｇを乾燥させ、最終体積１００μｌで、６．４Ｍの尿素、０．３２ＭのＮＨ４ＣＯ３および０．０１ＭのＤＴＴと３０分間、５０℃、アルゴン下でインキュベートした。次いでＩＡＡを加え（０．０３Ｍ）、室温、暗所で１５分間インキュベートした。サンプルを開封し、乾燥させ、次いで最終体積５０μｌで、０．８Ｍの尿素、０．０４ＭのＮＨ４ＣＯ３、０．０２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０および１μｇのトリプシンと共にインキュベートし、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１７３】
これらの構築物の半減期をインビボで決定した。１０ｍｇ／ｋｇの各化合物をＬｅｗｉｓラットに静脈内投与し（ｎ＝３）、サンプルをプレドーズ、１、２、４、８、２４、４８、９６、１９２および３８４時間で投与した。標準的なアミンカップリングでＣＭ５チップを用いてBiacore分析を実施した。フローセル１は参照差分のためのブランクであった（ＥＤＣ／ＮＨＳによる表面活性化、次いでエタノールアミンによる不活性化）。フローセル２はＰＫ読み出しのためにＴＨＥ抗ＨＩＳｍＡｂ（GenScript Corp）でコーティングした。フローセル３および４は免疫原性読み出しのために動物に投与した化合物でコーティングした（表面飽和）。ラット血清サンプルをＨＢＳ−ＥＰおよびNBSreducer（Biacore;最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で１：８に希釈した。化合物定量のために標準曲線を作成し、動物に投与した対応する化合物２０ｍｇ／ｌ〜０．０７８ｍｇ／ｌの１：２連続希釈をラット血清（GeneTex）で調製した。ラット血清をＨＢＳ−ＥＰおよび１ｍｇ/ｍｌのNSBreducerで１：８に希釈した。XLfit 4.2を用いて標準曲線データをフィットさせて使用し、血清サンプル中の化合物濃度を計算した（ＰＫ）。化合物の半減期は、WinNonlinソフトウェアを用いて計算した。非コンパートメントモデルを用いてＰＫデータをフィットさせた。
【０１７４】
野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）_cysを大腸菌で発現させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで精製し、分析した（図８ａ）。モノマーに加えて、ダイマーもシステイン変異体について観察された。ＬＣ−ＭＳは非修飾について分子量１０．８５ｋＤａ、システイン変異体について１１．３８ｋＤａを示し、これらの分子量は予期したタンパク質に対応していた（データは示さず）。
【０１７５】
野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）_cysは３０ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドで修飾されていた。図８ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＥＧ化タンパク質の存在を示しており、これはMALDI-TOF_MSでさらに確認された。ＰＥＧ化サンプルは分子量４２．８ｋＤａを示し、広いピークはＰＥＧのためであった。ＰＥＧ化の部位は、還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化したＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプルのＬＣ−ＭＳ分析によって決定した（データは示さず）。ペプチドマップの比較によって、ＲＴ１０．８９分でのピークがペグ化サンプルには存在しないことが示された。このペプチドは、モノアイソトロピックＭＷ１５２７．７Ｄａを有し、予期したタンパク質のＴ［９５−１０８］Ｈ（９９位にシステインを含むペプチド）に対応する（データは示さず）。
【０１７６】
インビボデータによると、非修飾１０Ｆｎ３（図９）と比較したとき、ＰＥＧ化野生型１０Ｆｎ３（図１０）は顕著な半減期の改善が示された。非修飾１０Ｆｎ３の平均半減期は０．５２時間であり、これがペグ化１０Ｆｎ３について３．６時間に増加された（図１１）。動物ＥＶ３でシグナルは検出することができなかった。
【０１７７】
このラット試験の結果は、フィブロネクチン（１０Ｆｎ３）のインビボ血清半減期がＰＥＧ化複合体として調製されたとき顕著に延長され得ることを示している。
【０１７８】
ラット試験からヒトにインビボ半減期を外挿するために、次の式Ｉを用いる：
【数１】
2011507543.tif 000003
（ここで、指数部０．２５は経験上のものであり、同様のクリアランスメカニズムを有する種での外挿について十分な基礎を提供する（例えば、West et al. (1997) Science 276: 122-126; Bazin-Redureau et al. (1998) Toxicology and applied pharmacology 150: 295- 300;および Dedrick (1973) J. Pharmacokinetics and Biopharmaceuticals 5: 435-461参照）。式Ｉを用いて、ヒトに外挿した平均半減期は、約１４．９時間と予測される。
【０１７９】
複合化Ｆｎ３分子の半減期の平均増加倍数は、複合化Ｆｎ３分子の平均半減期を非複合化Ｆｎ３の平均半減期で割って計算することができる。例えば、平均Ｆｎ３−ＰＥＧ複合体（３．６）を平均非複合化Ｆｎ３（０．５２）で割ると、インビボでのＰＥＧ−Ｆｎ３複合体の半減期が約７倍延長されている。
【０１８０】
非天然アミノ酸を用いたＰＥＧ化
ＴＮＦ結合Ｆｎ３（配列番号３および配列番号４）および野生型Ｆｎ３配列（配列番号１および配列番号２）に対応する上記ＤＮＡ配列を大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。Ｃ末端アンバーコドンの挿入のために、プライマー１２（配列番号２７）および１３（配列番号２８）を用いて、ＴＮＦ結合配列（配列番号３および配列番号４）を増幅し、プライマー１２（配列番号２７）および１４（配列番号２９）を用いて野生型配列（配列番号１および配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴ９ａの対応する部位にクローン化した。さらに、プライマー１５（配列番号３０）および１６（配列番号３１）を用いてＴＮＦ結合配列（配列番号３および配列番号４）も増幅し、プライマー１５（配列番号３０）および１７（配列番号３２）を用いて野生型配列（配列番号１および配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｄｓｂＡシグナル配列を有するｐＱＥ−８０Ｌの対応する部位にクローン化した。
【０１８１】
フォーマット：
１）ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５６）
２）ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５７）
３）野生型Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５８）
４）野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＥＴ９ａ）
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号５９）
【０１８２】
５）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６０）
６）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１）
７）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）
８）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−３ｘＡリンカー−アンバーコドン−３ｘＡリンカー−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＡＡＡ＊ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６３）
＊は非天然アミノ酸の位置を示す
【０１８３】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。上記構築物とｐＡｍｂｅｒ−ＡｃＰｈｅＲＳをコトランスフェクトし、ＫＳ４７４、ＴＧ１（−）、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＤＨ１０Ｂを含む多様な大腸菌株で、１ｍＭのｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む培地で発現させた。誘導および発現の後、細胞ペレットを−２０℃で凍結させ、次いで溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、バッファー５０ｍｌ当たりＥＤＴＡなしのComplete１錠（Roche）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（Merck）［ｐＨ７．４］）に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理して、遠心分離した。上清を濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭのイミダゾールを含む以外は、溶解バッファーと同じ）で洗浄し、次いで溶出バッファー（５００ｍＭまでのイミダゾールである以外は、溶解バッファーと同じ）で溶出した。サンプルをBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、１０ｍＭのＴｒｉｓで溶出した。サンプルをBis-Trisゲルで再度分析した。精製したタンパク質を１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に溶解し、５〜１０モル過剰のＰＥＧ−ヒドラジドと約２時間室温で共役させた。ＰＥＧ化の効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣで分析した。次いで濃ＴｒｉｓでｐＨを上昇させ、過剰のＰＥＧをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーで除去し、次いでＰＢＳまたはＴｒｉｓに溶解した。
【０１８４】
実施例４
Ｆｎ３配列のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合体
上記の、ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号３）、ＴＮＦ−結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）（配列番号４）、野生型Ｆｎ３配列（配列番号１）、野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）（配列番号２）またはＶＥＧＦＲ結合ＦＮ３（配列番号７６）を抗ＨＳＡ（配列番号１２）、抗ＭＳＡ（配列番号１３）、抗ＲＳＡ結合分子（配列番号７８）、ＲＳＡ（配列番号７９）またはＨＳＡ（配列番号１４）と組合せて、フィブロネクチン−血清アルブミン融合分子を作成した。
【０１８５】
（ｉ）抗ＨＳＡ、抗ＭＳＡまたは抗ＲＳＡ融合分子
抗ＨＳＡバインダー（配列番号１２）または抗ＭＳＡバインダー（配列番号１３）のＤＮＡ配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｄｓｂＡシグナル配列を有するｐＱＥ−８０Ｌに得られたＤＮＡフラグメントをライゲートした（適切な隣接ＤＮＡ配列を加えた）。ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号３および配列番号４）および野生型Ｆｎ３配列（配列番号１および配列番号２）に対応するＤＮＡ配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号３および配列番号４）について、プライマー３（配列番号１８）および４（配列番号１９）を用いて、野生型Ｆｎ３配列（配列番号１および配列番号２）について、プライマー３（配列番号１８）および５（配列番号２０）を用いて得られたＤＮＡフラグメントフラグメントを増幅して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＱＥ−８０Ｌ−ｄｓｂＡ−抗ＨＳＡまたはｐＱＥ−８０Ｌ−ｄｓｂＡ−抗ＭＳＡのＢａｍＨＩ部位にをライゲートした。野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＧＳリンカー−抗ＲＳＡ  Ｈｉｓ（配列番号９２）は、ｐＱＥ−８０Ｌ中の野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ  Ｈｉｓ（配列番号７１）から部位特異的突然変異誘発によって作成した。ＩＫＨＬＫからＳＳＹＬＮへの第一の突然変異誘発は、プライマー２０（配列番号８０）および２１（配列番号８１）で実施し；ＧＡＳＲからＲＮＳＰへの第二の突然変異誘発は、プライマー２２（配列番号８２）および２３（配列番号８３）で実施し；そしてＧＡＲＷＰＱからＴＹＲＶＰＰへの第三の突然変異誘発は、プライマー２４（配列番号８４）および２５（配列番号８５）を用いて実施した。
【０１８６】
フォーマット：
１）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−ＧＳリンカー−抗−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６４）
２）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−ＧＳリンカー−抗ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６５）
３）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−ＧＳリンカー−抗ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６６）
【０１８７】
４）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−ＧＳリンカー−抗ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６７）
５）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＫＨＬＫＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＡＲＷＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号６８）
６）ｄｓｂＡシグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＫＨＬＫＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＡＲＷＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号６９）
【０１８８】
７）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＫＨＬＫＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＡＲＷＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号７０）
８）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＫＨＬＫＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＡＲＷＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号７１）
９）ｄｓｂＡシグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−ＧＳリンカー−抗ＲＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＱＥ−８０Ｌ）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡＧＳＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＮＳＰＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＹＲＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号９２）
【０１８９】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンはＤＮＡ配列決定によって確認した。ＫＳ４７４およびＴＧ１（−）を含む多様な大腸菌株で構築物を発現させた。誘導および発現の後、細胞ペレットを−２０℃で凍結し、次いで溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、バッファー５０ｍｌ当たりＥＤＴＡなしのComplete１錠（Roche）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（Merck）［ｐＨ７．４］）中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理し、遠心分離した。上清を濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭのイミダゾールを含む以外は、溶解バッファーと同じ）で洗浄し、次いで溶出バッファー（５００ｍＭまでのイミダゾールである以外は、溶解バッファーと同じ）で溶出した。サンプルをBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファーまたはＰＢＳで溶出した。100K Amicon遠心フィルターを内毒素の除去のために使用した。サンプルはBis-TrisゲルおよびＬＣ−ＭＳで再度分析した。対応する抗原との結合はＥＬＩＳＡで確認した。
【０１９０】
これらの構築物の半減期をインビボで決定した。１０ｍｇ／ｋｇの各化合物をＬｅｗｉｓラットに静脈内投与し（ｎ＝３）、サンプルをプレドーズ、１、２、４、８、２４、４８、９６、１９２および３８４時間で投与した。標準的なアミンカップリングでＣＭ５チップを用いてBiacore分析を実施した。フローセル１は参照差分のためのブランクであった（ＥＤＣ／ＮＨＳによる表面活性化、次いでエタノールアミンによる不活性化）。フローセル２はＰＫ読み出しのためにＨＳＡ（Fluka）でコーティングした。フローセル３および４は免疫原性読み出しのために動物に投与した化合物でコーティングした（表面飽和）。ラット血清サンプルをＨＢＳ−ＥＰおよびNBSreducer（Biacore;最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で１：８に希釈した。化合物定量のために標準曲線を作成し、動物に投与した対応する化合物２０ｍｇ／ｌ〜０．０７８ｍｇ／ｌの１：２連続希釈をラット血清（GeneTex）で調製した。ラット血清をＨＢＳ−ＥＰおよび１ｍｇ/ｍｌのNSBreducerで１：８に希釈した。XLfit 4.2を用いて標準曲線データをフィットさせて使用し、血清サンプル中の化合物濃度を計算した（ＰＫ）。化合物の半減期は、WinNonlinソフトウェアを用いて計算した。非コンパートメントモデルを用いてＰＫデータをフィットさせた。該試験の結果を以下に記載する。
【０１９１】
（ｉｉ）血清アルブミン融合分子
ＣＤ３３  ＳＳ−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号６）、ＣＤ３３  ＳＳ−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）（配列番号７）、ＣＤ３３  ＳＳ−野生型Ｆｎ３配列（配列番号８）およびＣＤ３３  ＳＳ−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）（配列番号９）に対応するＤＮＡ配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＢｌｐＩ／ＸｂａＩを用いて、得られたＤＮＡフラグメントをｐＲＳ５ａにライゲートした（適切な隣接ＤＮＡ配列、例えばＫｏｚａｋをベクターに導入した）。プライマー１（配列番号１６）および２（配列番号１７）（プライマー２はＨｉｓタグをコードする）を用いてＨＳＡをＰＣＲで増幅して、ＲｓｒＩＩ／ＸｂａＩを用いてｐＲＳ５ａ（ＣＤ３３−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号６および配列番号７）またはＣＤ３３−野生型Ｆｎ３配列（配列番号８および配列番号９））に挿入した。プライマー２６（配列番号８６）および２７（配列番号８７）を用いてベクターＩＲＢＰｐ９９３ＣＯ３２８Ｄ（ＲＺＰＤ）からＲＳＡをＰＣＲで増幅し、次いでＲｓｒＩＩ／ＸｂａｌでｐＲＳ５ａ−ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＨＳＡ−Ｈｉｓ（配列番号９９）にクローン化した。プライマー２８（配列番号８８）および２９（配列番号８９）を用いて部位特異的突然変異誘発によってＩ４３１Ｖを組み込み、プライマー３０（配列番号９０）および３１（配列番号９１）を用いて部位特異的突然変異誘発によってＬ２６２Ｖを組み込んだ。ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３（配列番号７７）のＤＮＡ配列を哺乳類細胞での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＲｓＲＩＩ／ＣｅｌＩＩでＤＮＡを消化して、ｐＲＳ５ａ−ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＨＳＡ−Ｈｉｓ（配列番号９９）の対応する部位にクローン化した。ベクターｐＲＳ５ａ−ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＲＳＡ−Ｈｉｓ（配列番号１００）からＲＳＡを単離して、ＲｓｒＩＩ／ＸｂａＩでｐＲＳ５ａ−ＣＤ３３シグナル配列−ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡ−Ｈｉｓ（配列番号１０１）にクローン化した。
【０１９２】
フォーマット：
１）ＣＤ３３シグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号９６）
２）ＣＤ３３シグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号９７）
【０１９３】
３）ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号９８）
４）ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号９９）
【０１９４】
５）ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−ＲＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＥＡＨＫＳＥＩＡＨＲＦＫＤＬＧＥＱＨＦＫＧＬＶＬＩＡＦＳＱＹＬＱＫＣＰＹＥＥＨＩＫＬＶＱＥＶＴＤＦＡＫＴＣＶＡＤＥＮＡＥＮＣＤＫＳＩＨＴＬＦＧＤＫＬＣＡＩＰＫＬＲＤＮＹＧＥＬＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＰＦＱＲＰＥＡＥＡＭＣＴＳＦＱＥＮＰＴＳＦＬＧＨＹＬＨＥＶＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＹＹＡＥＫＹＮＥＶＬＴＱＣＣＴＥＳＤＫＡＡＣＬＴＰＫＬＤＡＶＫＥＫＡＬＶＡＡＶＲＱＲＭＫＣＳＳＭＱＲＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＭＳＱＲＦＰＮＡＥＦＡＥＩＴＫＬＡＴＤＶＴＫＩＮＫＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＥＬＡＫＹＭＣＥＮＱＡＴＩＳＳＫＬＱＡＣＣＤＫＰＶＬＱＫＳＱＣＬＡＥＩＥＨＤＮＩＰＡＤＬＰＳＩＡＡＤＦＶＥＤＫＥＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＴＦＬＹＥＹＳＲＲＨＰＤＹＳＶＳＬＬＬＲＬＡＫＫＹＥＡＴＬＥＫＣＣＡＥＧＤＰＰＡＣＹＧＴＶＬＡＥＦＱＰＬＶＥＥＰＫＮＬＶＫＴＮＣＥＬＹＥＫＬＧＥＹＧＦＱＮＡＶＬＶＲＹＴＱＫＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲＮＬＧＲＶＧＴＫＣＣＴＬＰＥＡＱＲＬＰＣＶＥＤＹＬＳＡＩＬＮＲＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＥＫＶＴＫＣＣＳＧＳＬＶＥＲＲＰＣＦＳＡＬＴＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＫＡＥＴＦＴＦＨＳＤＩＣＴＬＰＤＫＥＫＱＩＫＫＱＴＡＬＡＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＥＤＱＬＫＴＶＭＧＤＦＡＱＦＶＤＫＣＣＫＡＡＤＫＤＮＣＦＡＴＥＧＰＮＬＶＡＲＳＫＥＡＬＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１００）
６）ＣＤ３３シグナル配列−ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０１）
７）ＣＤ３３シグナル配列−ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＧＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴＥＡＨＫＳＥＩＡＨＲＦＫＤＬＧＥＱＨＦＫＧＬＶＬＩＡＦＳＱＹＬＱＫＣＰＹＥＥＨＩＫＬＶＱＥＶＴＤＦＡＫＴＣＶＡＤＥＮＡＥＮＣＤＫＳＩＨＴＬＦＧＤＫＬＣＡＩＰＫＬＲＤＮＹＧＥＬＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＰＦＱＲＰＥＡＥＡＭＣＴＳＦＱＥＮＰＴＳＦＬＧＨＹＬＨＥＶＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＹＹＡＥＫＹＮＥＶＬＴＱＣＣＴＥＳＤＫＡＡＣＬＴＰＫＬＤＡＶＫＥＫＡＬＶＡＡＶＲＱＲＭＫＣＳＳＭＱＲＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＭＳＱＲＦＰＮＡＥＦＡＥＩＴＫＬＡＴＤＶＴＫＩＮＫＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＥＬＡＫＹＭＣＥＮＱＡＴＩＳＳＫＬＱＡＣＣＤＫＰＶＬＱＫＳＱＣＬＡＥＩＥＨＤＮＩＰＡＤＬＰＳＩＡＡＤＦＶＥＤＫＥＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＴＦＬＹＥＹＳＲＲＨＰＤＹＳＶＳＬＬＬＲＬＡＫＫＹＥＡＴＬＥＫＣＣＡＥＧＤＰＰＡＣＹＧＴＶＬＡＥＦＱＰＬＶＥＥＰＫＮＬＶＫＴＮＣＥＬＹＥＫＬＧＥＹＧＦＱＮＡＶＬＶＲＹＴＱＫＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲＮＬＧＲＶＧＴＫＣＣＴＬＰＥＡＱＲＬＰＣＶＥＤＹＬＳＡＩＬＮＲＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＥＫＶＴＫＣＣＳＧＳＬＶＥＲＲＰＣＦＳＡＬＴＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＫＡＥＴＦＴＦＨＳＤＩＣＴＬＰＤＫＥＫＱＩＫＫＱＴＡＬＡＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＥＤＱＬＫＴＶＭＧＤＦＡＱＦＶＤＫＣＣＫＡＡＤＫＤＮＣＦＡＴＥＧＰＮＬＶＡＲＳＫＥＡＬＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０２）
【０１９５】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンはＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ、FreeStyle（商標）２９３−Ｆ、ＨＫＢ１１およびＨＥＫＥＢＮＡを含む多様な細胞系で構築物を発現させた。内毒素を含まないバッファーを全ての工程で使用した。培養物の上清を濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、バッファー５０ｍｌ当たりＥＤＴＡなしのComplete１錠（Roche）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（Merck）［ｐＨ７．４］）で洗浄し、次いで溶出バッファー（５００ｍＭまでのイミダゾールである以外は、洗浄バッファーと同じ）で溶出した。サンプルをBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファーまたはＰＢＳで溶出した。サンプルをBis-TrisゲルおよびＬＣ−ＭＳで再度分析した。対応する抗原との結合はＥＬＩＳＡで確認した。
【０１９６】
これらの構築物の半減期をインビボで決定した。１０ｍｇ／ｋｇの各化合物をＬｅｗｉｓラットに静脈内投与し（ｎ＝３）、サンプルをプレドーズ、１、２、４、８、２４、４８、９６、１９２および３８４時間で投与した。標準的なアミンカップリングでＣＭ５チップを用いてBiacore分析を実施した。フローセル１は参照差分のためのブランクであった（ＥＤＣ／ＮＨＳによる表面活性化、次いでエタノールアミンによる不活性化）。フローセル２はＰＫ読み出しのためにＴＨＥ抗ＨＩＳｍＡｂ（GenScript Corp）でコーティングした。フローセル３および４は免疫原性読み出しのために動物に投与した化合物でコーティングした（表面飽和）。ラット血清サンプルをＨＢＳ−ＥＰおよびNBSreducer（Biacore;最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で１：８に希釈した。化合物定量のために標準曲線を作成し、動物に投与した対応する化合物２０ｍｇ／ｌ〜０．０７８ｍｇ／ｌの１：２連続希釈をラット血清（GeneTex）で調製した。ラット血清をＨＢＳ−ＥＰおよび１ｍｇ/ｍｌのNSBreducerで１：８に希釈した。XLfit 4.2を用いて標準曲線データをフィットさせて使用し、血清サンプル中の化合物濃度を計算した（ＰＫ）。化合物の半減期は、WinNonlinソフトウェアを用いて計算した。非コンパートメントモデルを用いてＰＫデータをフィットさせた。
【０１９７】
野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＲＳＡおよびＨＳＡ融合体を哺乳類細胞で発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、分析した（図１２）。還元後、ＬＣ−ＭＳは野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＲＳＡおよび野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＨＳＡについて分子量７６．６２ｋＤａおよび７７．１７ｋＤａをそれぞれ示し、正しいタンパク質に対応していた（データは示さず）。Ｎ末端分析はまた、予期したタンパク質に対応する配列を示した。インビボデータは、非修飾１０Ｆｎ３（図９）と比較したとき、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＲＳＡおよびＨＳＡ融合体の両方について顕著な半減期の改善を示した（図１３および１４）。非修飾１０Ｆｎ３の平均半減期は０．５２時間であり、これが１０Ｆｎ３−ＲＳＡでは１９．６時間に増加し、１０Ｆｎ３−ＨＳＡでは５．９時間に増加した（図１５）。１０Ｆｎ３−ＨＳＡの半減期は、ラットにおいて、１０Ｆｎ３−ＲＳＡと比較して低かった。これはおそらく、ＨＳＡがＬｅｗｉｓラットＦｃＲｎと効果的に結合しないためであろう。
【０１９８】
式Ｉを用いてヒトに外挿した平均半減期は約８０．９時間と予測される。
ＲＳＡ複合化Ｆｎ３分子の半減期の平均増加倍数は、Ｆｎ３−ＲＳＡ複合体の平均（１９．６）を非複合化Ｆｎ３の平均（０．５２）で割って、インビボでのＦｎ３−ＲＳＡ複合体の半減期は約３８倍の増加となる。これはＨＳＡを用いてヒトに外挿して予期される。
【０１９９】
ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡおよびＨＳＡ融合体も哺乳類細胞で発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製して分析した（図１６）。ＬＣ−ＭＳはＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡおよびＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡについて分子量７６．２７ｋＤａおよび７６．８２ｋＤａをそれぞれ示し、これらの分子量は予期したタンパク質に対応している（データは示さず）。ｈＶＥＧＦＲとの特異的結合は、ＨＳＡおよびＲＳＡ融合体のそれぞれについて、ＥＬＩＳＡで確認した（図１７）。ＲＳＡ融合体の平均半期（図１８）およびＨＳＡ融合体の平均半減期（図１９）は、それぞれ４１．６時間および１５．３時間であった（図２０）。
【０２００】
治療用Ｆｎ３、例えばＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡについて、ヒトに外挿した平均半減期は約１７２時間と予測される。
この複合化Ｆｎ３分子の半減期の平均増加倍数は、ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡ複合体の平均（４１．６）を非複合化Ｆｎ３の平均（０．５２）で割って、インビボでのＦｎ３−ＲＳＡ複合体の半減期は約８０倍の増加となる。これはＨＳＡを用いてヒトに外挿して予期される（データは示さず）。
【０２０１】
野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）抗ＲＳＡを大腸菌で発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製して分析した（図２１）。ＬＣ−ＭＳは正しいタンパク質に対応する分子量２３．６８ｋＤａを示した（データは示さず）。インビボデータは、非修飾１０Ｆｎ３（図９）と比較して、抗ＲＳＡ融合体（図２２）の顕著な半減期の改善を示した。非修飾１０Ｆｎ３の平均半減期は０．５２時間であり、１０Ｆｎ３−抗ＲＳＡではこれが７．７時間に増加した（図２３）。
【０２０２】
このラット試験の結果は、血清アルブミンまたは血清アルブミンバインダーとの融合体として作成したとき、１０Ｆｎ３のインビボ血清半減期が顕著に延長され得ることを示している。式Ｉを用いて、ヒトに外挿した平均半減期は、約３１．８時間であると予測される。
抗ＨＳＡ複合化Ｆｎ３分子の半減期の平均増加倍数は、Ｆｎ３−抗ＨＳＡ複合体の平均（７．７）を非複合化Ｆｎ３の平均（０．５２）で割って、インビボでのＦｎ３−抗ＨＳＡ複合体の半減期は約１５倍の増加となる。
【０２０３】
実施例５
Ｆｃ／フィブロネクチン融合体
ＣＤ３３  ＳＳ−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号６）、ＣＤ３３  ＳＳ−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）（配列番号７）、ＣＤ３３  ＳＳ−野生型Ｆｎ３配列（配列番号９）およびＣＤ３３  ＳＳ−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）に対応するＤＮＡ配列を哺乳類細胞での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＢｌｐＩ／ＸｂａＩを用いて得られたＤＮＡフラグメントをｐＲＳ５ａにライゲートした（Ｋｏｚａｋのような適切な隣接ＤＮＡ配列をベクターに加えた）。プライマー１８（配列番号３３）および１９（配列番号３４）（プライマー１９はＨｉｓタグをコードする）を用いて増幅し、ＲｓｒＩＩ／ＸｂａＩを用いてｐＲＳ５ａ（ＣＤ３３−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号６および配列番号７）またはＣＤ３３−野生型Ｆｎ３配列（配列番号８および配列番号９））に挿入した。
【０２０４】
フォーマット：
１）ＣＤ３３シグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列−Ｆｃ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＲＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＩＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号７２）
２）ＣＤ３３シグナル配列−ＴＮＦ結合Ｆｎ３（Ｒ１８ＬおよびＩ５６Ｔ）配列−Ｆｃ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＮＲＳＧＬＱＳＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＰＷＡＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＫＳＤＴＹＫＹＤＤＰＩＳＩＮＹＲＴＧＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号７３）
【０２０５】
３）ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３配列−Ｆｃ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号７４）
４）ＣＤ３３シグナル配列−野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）配列−Ｆｃ−Ｈｉｓタグ（ｐＲＳ５ａ）
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＡＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴＧＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号７５）
【０２０６】
ライゲーション混合物を用いて、ＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブクローンはＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ、FreeStyle（商標）２９３−Ｆ、ＨＫＢ１１およびＨＥＫＥＢＮＡを含む多様な細胞系で構築物を発現させた。内毒素を含まないバッファーを全ての工程で使用した。培養物の上清を濾過し、Protein A Sepharoseカラムにロードした。カラムをＰＢＳで洗浄し、次いで５０ｍＭのクエン酸ｐＨ２．７、１４０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。サンプルを中和してBis-Trisゲル（Invitrogen）で分析し、次いでAmicon Ultra-15チューブ内で濃縮し、Superdex prep gradeカラム（Amersham）にロードし、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファーまたはＰＢＳで溶出した。サンプルをBis-TrisゲルおよびＬＣ−ＭＳで再度分析した。還元およびＮ−脱グリコシル化のために、サンプル（３４μｇ）を最終体積５０μｌで、０．８Ｍの尿素、０．０４ＭのＮＨ４ＣＯ３および０．０１ＭのＤＴＴと共に３０分間、５０℃でインキュベートした。次いで１ｘ反応バッファーＧ７および１μｇのPNGaseFを加え、３７℃で１時間インキュベートした。Protein A 精製に加えて、上記実施例に記載のとおり、Ｎｉ−ＮＴＡ精製も実施した。対応する抗原との結合はＥＬＩＳＡで確認した。
【０２０７】
これらの構築物の半減期をインビボで決定した。１０ｍｇ／ｋｇの各化合物をＬｅｗｉｓラットに静脈内投与し（ｎ＝３）、サンプルをプレドーズ、１、２、４、８、２４、４８、９６、１９２および３８４時間で投与した。標準的なアミンカップリングでＣＭ５チップを用いてBiacore分析を実施した。フローセル１は参照差分のためのブランクであった（ＥＤＣ／ＮＨＳによる表面活性化、次いでエタノールアミンによる不活性化）。フローセル２はＰＫ読み出しのためにＴＨＥ抗ＨＩＳｍＡｂ（GenScript Corp）でコーティングした。フローセル３および４は免疫原性読み出しのために動物に投与した化合物でコーティングした（表面飽和）。ラット血清サンプルをＨＢＳ−ＥＰおよびNBSreducer（Biacore;最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で１：８に希釈した。化合物定量のために標準曲線を作成し、動物に投与した対応する化合物２０ｍｇ／ｌ〜０．０７８ｍｇ／ｌの１：２連続希釈をラット血清（GeneTex）で調製した。ラット血清をＨＢＳ−ＥＰおよび１ｍｇ/ｍｌのNSBreducerで１：８に希釈した。XLfit 4.2を用いて標準曲線データをフィットさせて使用し、血清サンプル中の化合物濃度を計算した（ＰＫ）。化合物の半減期は、WinNonlinソフトウェアを用いて計算した。非コンパートメントモデルを用いてＰＫデータをフィットさせた。
【０２０８】
野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−Ｆｃを哺乳類細胞で発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、分析した（図２４）。ＬＣ−ＭＳは天然野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−Ｆｃについて異なる形態を示し、分子量７６．１２ｋＤａはダイマーに対応し、７６．２８ｋＤａおよび７６．４４ｋＤａ形態はダイマーとヘキソースに対応していた。還元およびＮ−脱グリコシル化の後、分子量３６．６３ｋＤａが得られ、これは予期したモノマータンパク質に対応していた（データは示さず）。タンパク質の分子量は、Ｎ−脱グリコシル化の間のＡｓｎからＡｓｐへの修飾に由来する質量変化のため、脱グリコシル化の後に、増加した。Ｎ末端分析はまた、予期したタンパク質に対応する配列を示した。
【０２０９】
インビボデータは、非修飾１０Ｆｎ３（図９）と比較したとき、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−Ｆｃ（図２５）について顕著な半減期の改善を示した。非修飾１０Ｆｎ３の平均半減期は０．５２時間であり、これが１０Ｆｎ３−Ｆｃでは９．４時間に増加した（図２６）。
【０２１０】
このラット試験の結果は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃとの融合体として作成したとき、１０Ｆｎ３のインビボ血清半減期が顕著に延長され得ることを示している。式Ｉを用いて、ヒトに外挿した平均半減期は、約３８．８時間であると予測される。
Ｆｃが融合したＦｎ３分子の半減期の平均増加倍数は、Ｆｎ３−Ｆｃ融合体の平均（９．４）を非複合化Ｆｎ３の平均（０．５２）で割って、インビボでのＦｎ３−Ｆｃ融合体の半減期は約１８倍の増加となる。
【０２１１】
総括すると、実施例３〜５の結果は、多くの方法、例えばＨＳＡ、Ｆｃ融合体によってＦｎ３分子を修飾して、該分子の半減期を延長できることを示している。全ての修飾Ｆｎ３分子は半減期の顕著な延長を示した。さらに、これらの実施例は、Ｆｎ３およびＦｎ３の修飾形態がインビボで哺乳類細胞で成功裏に発現できること、そしてクリアランスに対する顕著なインビボ効果を有することを初めて示した。
【０２１２】
実施例６
キメラフィブロネクチン分子
フィブロネクチンのタイプＩＩＩモジュールおよびU.S. 6,673,901 B2に記載のβ鎖の配列分析を用いて、キメラＦｎ３分子を作成するためのフィブロネクチン鎖を交換する方法を、ここに説明する。
【０２１３】
第一に、ドメイン７、８、９および１０のβ鎖を同定した。次に疎水性コア相互作用に関与している残基を同定した。次いで、次の基準に従って、類似性を決定した： 
（ａ）鎖の類似性；
（ｂ）疎水性コア相互作用に関与すると定義された位置のみの類似性；および
（ｃ）疎水性相互作用には関与しないが、溶媒に曝される部分の類似性。
【０２１４】
次の表に関して、Ｆｎ３の第１０ドメインと比較した、対応する全ストランド、溶媒に曝される残基のみ、疎水性コア残基のみの％同一性および類似性を示す。
表１
【表１】
2011507543.tif 000004
【表２】
2011507543.tif 000005
上記配列同一性／類似性に基づいて、可能性のあるキメラを図６に示す。
【０２１５】
均等
当業者は、常套未満の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多様な均等を認識し、あるいは確認することができる。かかる均等は、特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図１Ａ】
2011507543.tif 000006
【図１Ｂ】
2011507543.tif 000007
【図２】
2011507543.tif 000008
【図３】
2011507543.tif 000009
【図４】
2011507543.tif 000010
【図５】
2011507543.tif 000011
【図６Ａ】
2011507543.tif 000012
【図６Ｂ】
2011507543.tif 000013
【図７Ａ】
2011507543.tif 000014
【図７Ｂ】
2011507543.tif 000015
【図７Ｃ】
2011507543.tif 000016
【図８】
2011507543.tif 000017
【図９】
2011507543.tif 000018
【図１０】
2011507543.tif 000019
【図１１】
2011507543.tif 000020
【図１２】
2011507543.tif 000021
【図１３】
2011507543.tif 000022
【図１４】
2011507543.tif 000023
【図１５】
2011507543.tif 000024
【図１６】
2011507543.tif 000025
【図１７】
2011507543.tif 000026
【図１８】
2011507543.tif 000027
【図１９】
2011507543.tif 000028
【図２０】
2011507543.tif 000029
【図２１】
2011507543.tif 000030
【図２２】
2011507543.tif 000031
【図２３】
2011507543.tif 000032
【図２４】
2011507543.tif 000033
【図２５】
2011507543.tif 000034
【図２６】
2011507543.tif 000035
【国際調査報告】
2011507543.tif 000036
2011507543.tif 000037
2011507543.tif 000038
2011507543.tif 000039
2011507543.tif 000040