(57)【要約】  神経変性を抑制する化合物のスクリーニング方法を示す。ＡＰＰの分断は神経変性の有用なマーカーであり得、ＡＰＰの分断を抑制する化合物は神経変性のインヒビターとして有用である。このような化合物は、様々な神経学的疾患、障害および神経系損傷の治療および／または防止に有用であり得、哺乳類の神経細胞又は組織の成長、再生又は生存を亢進しうる。
2011524523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) 表面上にＡＰＰを発現するニューロンを培養し、そして、
(b) 候補化合物の有無の下で該ニューロンのＡＰＰ分断を刺激することを含み、
このとき、該候補化合物の非存在下で観察されるＡＰＰの分断と比較して該候補化合物の存在下で観察されるＡＰＰの分断が低減していることが、該候補化合物が神経変性のインヒビターであることを示す方法。
【請求項２】
分断が栄養性因子の欠乏によって刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養性因子がＮＧＦである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ニューロンが感覚ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ニューロンが運動ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分断が前記ニューロンの力学的損傷によって刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される分断と比較して観察される分断を１０〜３０％低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される分断と比較して観察される分断を３０〜５０％低減する、請求項１に記載の方法。 
【請求項９】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される分断と比較して観察される分断を５０〜７０％低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される分断と比較して観察される分断を３０〜５０％低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される分断と比較して観察される分断を９０〜１００％低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
神経変性を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) その表面上にＡＰＰを発現するニューロンを培養し、そして、
(b) 候補化合物の有無の下で前記ニューロンの神経変性を刺激することを含み、
このとき、該候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して該候補化合物の存在下で観察される神経変性が低減していることが、該候補化合物が神経変性のインヒビターであることを示す方法。
【請求項１３】
神経変性が栄養性因子欠乏によって刺激される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養性因子がＮＧＦである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ニューロンが感覚ニューロンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニューロンが運動ニューロンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記分断が前記ニューロンの力学的な損傷によって刺激される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して観察される神経変性を１０〜３０％低減する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して観察される神経変性を３０〜５０％低減する、請求項１２に記載の方法。 
【請求項２０】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して観察される神経変性を５０〜７０％低減する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して観察される神経変性を７０〜９０％低減する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記候補化合物が、前記候補化合物の非存在下で観察される神経変性と比較して観察される神経変性を９０〜１００％低減する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００６年１２月２２日出願の米国特許仮出願番号６０／８７１５２８及び、２００７年２月１２日出願の米国特許仮出願番号６０／９００８４８の優先権を主張した、２００７年１２月２１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００７／８８５２１の一部継続出願である。本出願は、２００８年６月１２日出願の米国仮出願番号６１／０６１０６２の優先権を主張する。これらの出願は出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して、ニューロンの変性を抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。さらに具体的には、本方法は、ニューロン変性を引き起こす事象によるニューロンからのＡＰＰの分断(shedding)を抑制する化合物のスクリーニングを伴う。
【０００３】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリに属する様々なリガンドおよびレセプターが当分野で同定されている。そのようなリガンドの中には、腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が含まれる。［例えば、Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002)；AshkenaziおよびDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；AshkenaziおよびDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411；Locksley 等, Cell, 104:487-501 (2001)；GrussおよびDower, Blood, 85:3378-3404 (1995)；Schmid 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtry 等, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pitti 等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)；Wiley 等, Immunity, 3:673-682 (1995)；Browning 等, Cell, 72:847-856 (1993)；Armitage 等 Nature, 357:80-82 (1992)；1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。
【０００４】
このようなＴＮＦファミリリガンドによって媒介される様々な細胞性応答の誘導は、一般的に特定の細胞レセプターへの結合によって開始される。今日までに同定されたＴＮＦレセプタースーパーファミリのメンバーには、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ｐ７５−ＮＧＦＲ、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、Ｆａｓ (Ａｐｏ−１またはＣＤ９５とも称される)、ＤＲ４ (ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とも称される)、ＤＲ５ (Ａｐｏ−２またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２とも称される)、ＤＲ６ (ＴＲ９とも称され、文献においてＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー２１又はＴＮＦＲＳＦ２１としても知られる)、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、破骨細胞分化抑制因子(ＯＰＧ)、ＲＡＮＫおよびＡｐｏ−３ (ＤＲ３またはＴＲＡＭＰとも称される)が含まれる。(例えば、Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002)；AshkenaziおよびDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；AshkenaziおよびDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁；Locksley 等., Cell, 104:487-501 (2001)；Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)；Hohman 等, J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989)；Brockhaus 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990)；１９９１年３月２０日出願の欧州特許第４１７５６３；Loetscher 等, Cell, 61:351 (1990)；Schall 等, Cell, 61:361 (1990)；Smith 等, Science, 248:1019-1023 (1990)；Lewis 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991)；Goodwin 等, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)；Stamenkovic 等, EMBO J., 8:1403-1410 (1989)；Mallett 等, EMBO J., 9:1063-1068 (1990)；Anderson 等, Nature, 390:175-179 (1997)；Chicheportiche 等, J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)；Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；Pan 等, Science, 277:815-818 (1997)；Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)；Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Tsuda 等, BBRC, 234:137-142 (1997)；Nocentini 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997)；vonBulow 等, Science, 278:138-141 (1997)；Johnson等, Cell, 47:545-554 (1986)；Radeke等, Nature, 325:593-597 (1987)；Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998))。
【０００５】
これらＴＮＦレセプターファミリーメンバーの多くは、細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有しており、一方、他のメンバーは膜貫通領域と細胞内ドメインを欠いた可溶性タンパク質として天然にみられる。典型的なＴＮＦＲの細胞外部位には、ＮＨ２-末端から始まる複数のシステインリッチドメイン(ＣＲＤ)の反復性のアミノ酸配列パターンを含有する。
【０００６】
リガンド及びレセプターのＴＮＦファミリーの一般的な参考文献としては、例えば、Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁；Locksley等, Cell, 104:487-501 (2001)；Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003)；Liu等, Immunity, 15(1):23-34 (2001)及びBossen等, J Biol Chem. 281(20):13964-71 (2006)を参照されたい。
【０００７】
ＤＲ６レセプターと呼ばれるＴＮＦＲファミリーメンバー(文献において、「ＴＲ９」とも呼ばれ、またＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー２１又はＴＮＦＲＳＦ２１として知られる)は、４つの細胞外システインリッチモチーフ及び１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターとして紹介されている(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998)；更には米国特許第６３５８５０８号、同第６６６７３９０号、同第６９１９０７８号、同第６９４９３５８号参照のこと)。形質移入された特定の細胞株におけるＤＲ６の過剰発現により、ＮＦ−ｋＢ及びＪＮＫ両方のアポトーシス及び活性化が引き起こされることが報告されている(Pan等, FEBS Letters, 431:351-356 (1998))。ＤＲ６を欠損するマウスモデルでは、Ｔ細胞はＪＮＫ活性化において実質的に正常に機能せず、ＤＲ６(−／−)マウスにタンパク質抗原を投与すると、それらのＴ細胞は過剰増殖し、Ｔｈ２応答への強い偏向を示すことが分かった(一方で、Ｔｈ１分化には同等の影響は無かった)(Zhao等, J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)。更に、ＤＲ６の標的とされた破壊により、インビトロでのＴヘルパー２(Ｔｈ２)の分化が強まった(Zhao等、上掲)。Ｂ細胞によって媒介される状態の調節におけるＤＲＹアゴニスト又はアンタゴニストの様々な使用法は、２００５年３月１日公開の米国特許出願公開第２００５／００６９５４０号に記載されている。
【０００８】
ＤＲ６レセプターは、ＯＶＡによって誘発された喘息のマウスモデルにおける気道炎症の制御に関与していると思われる(Venkataraman等, Immunol. Lett., 106:42-47 (2006))。
【０００９】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(ＭＯＧ(３５−５５))によって誘発された実験的自己免疫性脳脊髄炎のモデルを使用したところ、ＤＲ６−／−マウスは、野生型(ＷＴ)の同腹仔と比較して、ＣＮＳ疾患の発症及び進行の両方に高い耐性を示した。つまり、ＤＲ６は、白血球の浸潤に関与し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発と進行に機能している可能性がある(Schmidt等, J. Immunol., 175:2286-2292 (2005))。
【００１０】
様々なＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーメンバーが逆の生物学的活性及び特性を持つものとして同定されている一方で、神経学に関連する機能に関与するこのようなリガンド及びレセプターはこれまで殆ど報告されていない。例えば、２００４年８月２６日公開の国際公開第２００４／０７１５２８号には、脊髄の傷害を治療するための、マウスモデルにおけるＣＤ９５(Ｆａｓ)リガンド／レセプター複合体の阻害が開示されている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の実施態様では、単離されたデスレセプター６(「ＤＲ６」)アンタゴニストが提供される。ここに開示されるアンタゴニストの特定の実施態様は、ＤＲ６及びその同族リガンドの一又は複数を阻害又は遮断する。好ましい実施態様では、ここに開示されるＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６とその同族リガンドであるアミロイド前駆体タンパク質(「ＡＰＰ」)との相互作用を阻害又は遮断する。ＤＲ６アンタゴニストの実施態様は、ＤＲ６又はＡＰＰ抗体のような抗体を含みうる。このようなＤＲ６拮抗性抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体でよい。本発明の特定の実施態様では、ＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６細胞外ドメインポリペプチド又はその断片に結合する抗ＤＲ６抗体を含むことができ、随意で図１Ａのアミノ酸１−３４９又は４２−３４９を含むＤＲ６ポリペプチドに結合することができる。或いは、ＤＲ６アンタゴニストは、ＡＰＰポリペプチドに結合する抗ＡＰＰ抗体を含むことができ、随意で図１Ｂのアミノ酸６６−８１(配列番号６)を含むＡＰＰポリペプチドに結合することができる。
【００１２】
考慮されるＤＲ６アンタゴニストはまた、ＤＲ６イムノアドヘシン、ＤＲ６変異体、ＤＲ６断片、その共有結合性に変更された形態、又はその融合タンパク質、並びに小分子アンタゴニストを含む。例を挙げると、ＤＲ６アンタゴニストは、エピトープタブ、ヒトＦｃ等の抗体断片、又はロイシンジッパーといった異種配列に融合したＤＲ６の可溶性細胞外ドメイン形態又はペグ化されたＤＲ６を含む。
【００１３】
本発明の例示的な実施態様はまた、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合を阻害又は遮断する方法を含み、本方法は、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合が阻害される条件下で、ＤＲ６ポリペプチド及び／又はＡＰＰポリペプチドを一又は複数のＤＲ６アンタゴニストに曝すことを含む。このような方法において使用される典型的なＤＲ６アンタゴニストには、ＤＲ６又はＡＰＰ、並びに可溶性のＤＲ６ポリペプチドに結合する抗体が含まれる。場合によっては、これらの方法に使用するＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６とＡＰＰとの結合を阻害するそれらの能力を観察することにより選択される。本発明の特定の実施態様では、このような方法は、例えば、インビトロでの組織培養におけるアポトーシスの抑制及び／又は神経細胞の増殖及び／又は生存の強化に使用される。本方法では、一種類のＤＲ６アンタゴニスト分子又は二種類以上のＤＲ６アンタゴニストの組み合わせの使用を考慮する。
【００１４】
本発明の実施態様はまた、哺乳動物における神経細胞又は組織の増殖、再生又は生存を強化する方法を提供し、本方法は、哺乳動物に有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む。任意選択的な実施形態では、ＤＲ６アンタゴニストの投与により、哺乳動物の神経細胞又は組織の増殖が強化され、同細胞又は組織の細胞死及び変性が遮断される。神経細胞又は組織は、例えば、運動神経、感覚神経、交連神経、軸策、ミクログリア、及び／又はオリゴデンドロサイトを含みうる。本発明の一部の実施態様では、このような方法において使用されるＤＲ６アンタゴニストはＡＰＰに結合してＤＲ６に対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。本発明の他の実施態様では、このような方法に使用されるＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６に結合してＡＰＰに対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。或いは、ＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６イムノアドヘシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーに連結するＤＲ６ポリペプチド、又はＤＲ６ポリペプチド変異体を含みうる。本方法において利用されるＤＲ６イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合した可溶性のＤＲ６レセプターを含みうる。また更に、本発明のＤＲ６アンタゴニストは小分子を含むことができる。
【００１５】
本発明の実施態様はまた、神経障害の治療法を提供し、本方法は、哺乳動物に対し、有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む。任意選択的な実施態様では、本方法は、哺乳動物のアルツハイマー病を治療することを含む。このような方法に使用されるＤＲ６アンタゴニストは、ＡＰＰに結合してＤＲ６に対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。ＤＲ６アンタゴニストはＤＲ６抗体も含むことができる。或いは、ＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６イムノアドヘシン、ＤＲ６ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーに連結するＤＲ６ポリペプチド、ＤＲ６抗体又はＤＲ６変異体を含みうる。本方法に利用されるＤＲ６イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合した可溶性のＤＲ６レセプターを含みうる。本方法に利用される抗ＤＲ６抗体は、図１Ａのアミノ酸１−３４９又は４２−３４９を含むＤＲ６レセプターに結合しうる。
【００１６】
本発明の実施態様はまた、神経障害を有する患者又は神経障害を発症しそうな患者の診断方法を提供し、本方法は、患者から試料を採取し、配列番号１のＤＲ６ポリペプチド配列とは異なるポリペプチド配列を有するＤＲ６ポリペプチド変異体の存在について当該試料を試験することを含む。このような方法では、典型的には、ポリペプチド変異体が、配列番号１のＤＲ６ポリペプチド配列に観察される親和性とは異なる親和性をＡＰＰポリペプチドに対して持つことが同定される。
【００１７】
本発明の実施態様はまた、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合を阻害する対象分子を同定する方法を提供する。このような方法は、対象分子の存在下又は不在下においてＤＲ６とＡＰＰとを組み合わせた後、前記対象分子の存在下におけるＡＰＰに対するＤＲ６の結合の阻害を検出することを含むことができる。随意で、このような方法は、細胞表面にＤＲ６を発現する哺乳動物細胞を使用して実行され、更に、ＤＲ６活性又はシグナル伝達の阻害を検出することを含む。本発明の実施態様は更に、このような方法によって同定された分子を含む。随意で、対象分子はＡＰＰに結合する抗体、ＤＲ６に結合する抗体又はＤＲ６ポリペプチドである。
【００１８】
本発明の実施態様はまた、ＡＰＰリガンド、ＤＲ６レセプターに特異的に結合することができる及び／又はＤＲ６及び／又はそのリガンド及び／又は共受容体に関連する生物学的活性を調節することができる、様々な神経障害の治療に有用である抗体を提供する。特定の実施態様では、ＤＲ６ポリペプチドの細胞外ドメイン配列に特異的に結合する抗体が提供される(後述の実施例において更に説明する)。典型的な抗体は、ＡＰＰ又はＤＲ６に結合するものであって、更にはＤＲ６とＡＰＰとの結合を阻害する能力があるとして選択されたものである。随意で、抗体はモノクローナル抗体である。随意で、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマによって分泌される３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７抗体を含む。
【００１９】
更には、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６として寄託されているハイブリドーマ細胞株によって生成される３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体が提供される。一態様において、本発明は、３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７抗体を含む抗ＤＲ６抗体に関し、本抗体は、抗体３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７と同じ生物学的活性及び／又は作用強度を示し、及び／又はＤＲ６に対して同じ親和性を示す。
【００２０】
また別の特定の実施態様では、モノクローナル抗体３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７を生成するハイブリドーマ細胞株であって、ＡＴＣＣにそれぞれ受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６として寄託されているハイブリドーマ細胞株と、ＡＴＣＣにそれぞれ受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６として寄託されているハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７とが提供される。
【００２１】
更には、単離された抗ＤＲ６モノクローナル抗体が提供され、本抗体は、ＤＲ６ポリペプチドに結合し、ＡＴＣＣにそれぞれ受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６で寄託されているハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体の、ＤＲ６ポリペプチドに対する結合を競合的に阻害する抗体を含む。また、キメラ又はヒト化抗ＤＲ６抗体が提供され、本抗体は、ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合し、(ａ)ＡＴＣＣにそれぞれ受託番号ＰＴＡ−８０９５、ＰＴＡ−８０９４、又はＰＴＡ−８０９６で寄託されているハイブリドーマにより分泌される３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７抗体由来の配列を含む。場合によって、このような抗体は、３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７抗体由来の重鎖、軽鎖又は可変領域を含みうる。
【００２２】
また別の態様では、本発明は、本明細書の抗ＤＲ６抗体又は抗体断片をコードする単離された核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、そのような核酸分子を含む宿主細胞、及び本明細書の抗ＤＲ６抗体又は抗体断片を生成する方法に関する。
【００２３】
本発明は更に、ここに定義するＤＲ６アンタゴニストと担体とを含む組成物に関する。担体は、製薬的に許容可能な担体であり、組成物は更に一又は複数の薬剤を追加で含むことができる。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、容器と、前記容器内に収容される組成物を含む製造品に関し、この組成物が本発明のＤＲ６アンタゴニストを含む。製造品は更に、インビトロ又はインビボでＤＲ６アンタゴニストを使用するための指示を含むことができる。好ましい実施態様では、この指示は、神経障害の治療に関するものである。
【００２５】
関連する態様では、本発明の実施態様は、第１の容器、前記容器に貼付されるラベル、及び前記容器内に収容される組成物を含むキットを含む。このようなキットにおいて、組成物は、少なくとも一種類の哺乳動物の神経細胞におけるアポトーシスを阻害するに有効なＤＲ６アンタゴニストを含んでおり、前記容器に貼付されるラベル、又は前記容器内に収容されるパッケージ挿入物は、組成物を使用して、少なくとも一種類の哺乳動物の神経細胞におけるアポトーシスを阻害することができることが示される。場合によって、このキットは、薬学的に許容可能なバッファ、及び／又は少なくとも一種類の哺乳動物の神経細胞におけるアポトーシスを阻害するＤＲ６アンタゴニストの使用のための指示書を含む第二容器といった更なる成分を含む。
【００２６】
本発明は、更に、アルツハイマー病の治療を含む哺乳動物の神経障害の治療に使用される医薬の調製又は製造のための本明細書中に記載のＤＲ６アンタゴニスト及び組成物の使用方法を提供する。
また、本発明は、通常ニューロン表面からのＡＰＰの分断が生じるニューロン変性を引き起こす事象が存在する場合に、細胞ベースのアッセイに候補化合物を添加するといった、ニューロン変性を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。候補化合物の存在下において分断が観察されなければ、この候補化合物はニューロン変性のインヒビターであり、限定するものではないが、アルツハイマー氏病といった神経学的な疾患及び障害、並びに外傷に関連する変性の治療法として用いられうる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、ヒトＤＲ６  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(図１Ａ−１、配列番号２)、それに由来するアミノ酸配列(図１Ａ−２、配列番号１)、並びにそのドメイン構造の概略図(図１Ａ−３)を示す。ＤＲ６の概略図では、推定シグナルペプチドを含むドメイン境界線、システイン・リッチ・ドメイン・モチーフ、膜貫通ドメイン、及びデスドメインを表示する。この概略図では、推定シグナルペプチドの推定ドメイン境界線、システイン・リッチ・ドメイン・モチーフ、膜貫通ドメイン、及びデスドメインを表示する。図１Ｂはヒトアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)ｃＤＮＡの６９５イソフォームのヌクレオチド配列(図１Ｂ−１、配列番号５)、それに由来するアミノ酸配列(図１Ｂ−２、配列番号６)を示す。図１Ｃは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の７５１イソフォームのアミノ酸配列(配列番号７)を示す。図１Ｄは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)ｃＤＮＡの７７０イソフォームのヌクレオチド配列(図１Ｄ−１、配列番号８)、それに由来するアミノ酸配列(図１Ｄ−２、配列番号９)を示す。例えば、それぞれイソフォームID P05067-1, イソフォームID P05067-4 及びイソフォームID P05067-8に関連するものを含むUniProtKB/Swiss-protエントリー P05067及び関連する開示(http://expasy.org/uniprot/P05067)を参照のこと。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＲ６が、発生ステージＥ１０．５−Ｅ１２．５において、脊髄の運動及び交連ニューロン及び後根神経節ニューロンを含む発生中の中枢神経系で強く発現することを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、軸索及び細胞体において発現しているＤＲ６タンパク質を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、分化中のニューロンにおいて発現しているＤＲ６ｍＲＮＡを示す。
【図３】図３は、背側脊髄外殖片生存アッセイにおける軸索変性及び神経細胞死の概略図の表示を示す。エレクトロポレーションによって、ＲＮＡ干渉ｓｉＲＮＡ作用剤をＧＦＰ発現プラスミドと共に、胚の交連ニューロンに導入することが示されている。
【図４】図４Ａは、背側脊髄生存アッセイにおいて、低分子干渉ＲＮＡによるＤＲ６発現の阻害が、交連軸索変性を遮断し、神経細胞死を防ぐことを示す。図４Ｂは、ＤＲ６ｓｉＲＮＡにより遮断された変性表現型を救済するＲＮＡｉ抵抗性ＤＲ６ｃＤＮＡを示す。
【図５】図５は、背側脊髄生存アッセイにおいて、拮抗性ＤＲ６抗体が軸索変性及び神経細胞死の遮断を助けることを示す。
【図６】図６は、外植片生存アッセイにおいて、ｃ-Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)の薬理学的抑制が軸索変性及び神経細胞死を防ぐことによる、ＤＲ６の細胞内シグナル伝達下流の下方制御を示すニューロンの写真及びメカニズム概略図を提供する。
【図７】図７は、エクスビボ全胚培養における、脊髄の運動及び介在ニューロンの生存における拮抗性ＤＲ６抗体の神経保護効果を示す。
【図８】図８は、ＤＲ６の損失が、ＤＲ６ヌル胚の脊髄において及び後根神経節において、神経細胞死の減少に結果としてなることを示す、切断されたカスパーゼ３抗体により免疫染色されたＥ１５．５頸部脊髄切片の写真を提供する。
【図９Ａ】図９Ａは、ＤＲ+/-同腹仔コントロール(ＤＲ６ｈｅｔ)に比較して、ＤＲ６ヌル胚において神経細胞死の約５０％減少を示し切断カスパーゼ３を発現しているＥ１５．５  ＤＲ６  ＫＯ胚における神経細胞の定量化を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、神経栄養成長因子の存在下又は非存在下で、正常マウスとＤＲ６ノックアウトマウスとの比較により証明されたように、ＤＲ６が運動軸索変性に必要であることを示す細胞の写真を提供する。
【図９Ｃ】図９Ｃは、傷害誘導性軸索変性が、ＤＲ６ノックアウトマウスで遅延することを示す細胞の写真を提供する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、抗ＤＲ６抗体が、さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの神経成長因子(ＮＧＦ)離脱から生じる軸索変性を阻害することを示すニューロンの写真を提供する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、さらに、抗ＤＲ６抗体が、さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害することを示す交連、感覚及び運動ニューロンにおける、アポトーシス細胞体のＴＵＮＥＬ染色可視化の写真データを提供する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、交連軸索変性が、ＤＲ６−Ｆｃにより遅延されうることを示す交連ニューロンの写真を提供する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＮＧＦ離脱により誘導された感覚軸索変性がＤＲ６−Ｆｃにより遅延できることを示す感覚ニューロンの写真を提供する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＤＲ６−ＡＰを使用した軸索上のＤＲ６結合部位の可視化を示すニューロンの写真を提供する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＤＲ６リガンド結合部位が、ＮＧＦ欠乏に続いて軸索から失われることを示す、ＮＧＦ存在下および非存在下の写真を提供する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、β分泌酵素(ＢＡＣＥ)インヒビターが、ＮＧＦ離脱に続いて、感覚軸索からのＤＲ６−ＡＰ結合部位の消失を遮断できることを示す、発生ステージＥ１２．５におけるＢＡＸヌル感覚軸索の研究の写真を提供する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、神経細胞からのポリペプチドが、ＤＲ６−ＡＰ(上段左)又は抗-Ｎ-ＡＰＰ抗体(上段右)によりプローブされており、同様に(１)ＤＲ６を結合する能力により選択され；且つ(２)抗-Ｎ-ＡＰＰ抗体によりプローブされたポリペプチド(下段、「ＤＲ６−ＥＣＤプルダウン」)である、さまざまなウエスタンブッロティング手順から得られたデータの写真を提供する。このデータは、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)をＤＲ６外部ドメイン関連リガンドとして確認する。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＤＲ６-ＡＰによりプローブされた軸索条件培地中のＤＲ６リガンド(ＡＰＰポリペプチドを含む)の可視化を可能にするさまざまなブロッティング実験から得られたデータの写真を提供する。このブロッティングデータは、３５ｋＤａにＮ末端ＡＰＰを含む多くのＡＰＰポリペプチド、並びにＣ９９-ＡＰＰおよびＣ８３／Ｃ８９ＡＰＰポリペプチドを確認する。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＮＧＦ欠乏の後から早期に起こるＡＰＰ外部ドメインの分断を示すニューロンの写真を提供する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＤＲ外部ドメインが培養細胞によって作られたＡＰＰに結合することを示す細胞の写真を提供する。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＤＲ６が感覚軸索上のＮ-ＡＰＰの主要なレセプターであり、ＡＰＰ結合部位がＤＲ６ヌルマウスの神経細胞中でかなり減少することを示す細胞の写真を提供する。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＤＲ６機能を遮断する抗体がＤＲ６外部ドメインとＮ-ＡＰＰとの間の相互作用を崩壊させることを示す細胞の写真を提供する。
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ｎ末端ＡＰＰに対するポリクローナル抗体が、交連軸索アッセイにおいて軸索変性を遮断することを示すニューロンの写真を提供する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ｎ末端ＡＰＰに対するポリクローナル抗体、及び２２Ｃ１１抗ＡＰＰモノクローナル抗体がＮＧＦ除去により誘導された局所的軸索変性を抑制することを示すニューロンの写真を提供する。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、β分泌酵素(ＢＡＣＥ)活性の抑制により遮断された軸索変性が、Ｎ-ＡＰＰの添加により回復されうることを示すニューロンの写真を提供する。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＲＮＡｉによるＡＰＰ除去により、神経細胞がＮ-ＡＰＰにより誘導された死に対して感受性が高くなることを示すニューロンの写真を提供する。
【図１６】図１６Ａは、ＤＲ６機能が、Ｎ-ＡＰＰ誘導性軸索変性に必要であるが、Ａβにより引き起された変性には必要でないことを示すニューロンの写真を提供する。図１６Ｂは、機能ブロックＤＲ６抗体がＡβにより引き起された軸索変性をブロックしないことを示すニューロンの写真を提供する。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＪＮＫ及び上流のカスパーゼ８の抑制により軸索変性が遅延されるが、下流のカスパーゼ３により遅延しないことを示すニューロンの写真を提供する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、カスパーゼ３は細胞体において、カスパーゼ６は軸索において機能することを示すＥ１２．５外植片培養の運動ニューロンの写真を提供する。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、カスパーゼ３は軸索変性に必要でないが、ＢＡＸは必要であることを示す感覚ニューロンの写真を提供する。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、カスパーゼ３が細胞体で機能するが、カスパーゼ６が軸索で機能することを示す交連ニューロンの写真を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当分野の技術者による従来の方法論を用いて通常行われるものである。好ましくは、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、プロトコル及び／又はパラメータを定義する製造者に従って一般的に行われる。
本方法やアッセイを開示する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いる用語は特定の実施態様のみを開示するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の権利範囲を限定するものでないことを理解されたい。
【００２９】
本明細書で用いられる及び添付の特許請求の範囲中の単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば「一般的な変更」なる用語には複数の変更が含まれ、「プローブ」なる用語は一ないし複数のプローブ及び当分野の技術者に公知のその等価物などを含む。本明細書及び請求の範囲において引用される数字(例えば、アミノ酸２２−８１、１−３５４等)は全て、語頭に「約」という語が付くものとする。
本明細書中で引用するすべての出版物は、該出版物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で引用する出版物は、本出願の提出日前の開示について言及するものである。発明者等は、早い優先日又はより前の発明日のために先行する出版物に権利が与えられないことが認められると解釈されるものではない。さらに、実際の出版日は明記されているものと異なり、個々に検証が必要であろう。
【００３０】
Ｉ．定義
「アミロイド前駆体タンパク質」又は「ＡＰＰ」なる用語は、ＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体によりコードされているさまざまなポリペプチドイソフォーム、例えばそれぞれ図１Ｂ−１Ｄに記載されているＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０イソフォーム(ＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体の選択的にスプライスされた転写産物から翻訳されたものであるイソフォーム)、及びＡＰＰイソフォームの翻訳後にプロセスされた部分を含む。周知のように、ＡＰＰ遺伝子から転写されたＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体は、選択的エキソン・スプライシングを受けて、たくさんのイソフォームを産生する(例えば、Sandbrink等, Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996); PubMed NCBI protein locus accession P05067に関連する情報を参照) 。この選択的エキソン・スプライシングは、６９５、７５１、及び７７０アミノ酸長の３つの主要なイソフォームを産生する(Kang等, Nature 325: 733-736 (1987); Kitaguchi等, Nature 331: 530-532 (1988); Ponte等, Nature 331: 525-527 (1988)；及びTanzi 等, Nature 331: 528-532 (1988))。これらのイソフォームの２つ(ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０)は、セリンプロテアーゼインヒビター(ＫＰＩ)のクーニッツ(Kunitz)ファミリーと高度に相同的である５６残基の挿入を含み、偏在的に発現する。対照的に、ＫＰＩモチーフを欠いている短いイソフォームＡＰＰ６９５は神経系において、例えばニューロン及びグリア細胞において主に発現し、この理由により「ニューロンのＡＰＰ」と呼ばれる場合が多い(例えば、Tanzi等, Science 235: 880-884 (1988); Neve等, Neuron 1: 669-677 (1988); and Haas等, J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)を参照)。６９５、７５１及び７７０を含むＡＰＰイソフォームは、著しい翻訳後のプロセッシングイベントを受ける(例えば、Esch等、1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等、1990 Science 248:492-495)。例えば、これらのイソフォームの各々は、さまざまな分泌酵素及び／又は分泌酵素複合体により切断され、イベントはＡＰＰ外部ドメインを含むＮ末端分泌ポリペプチドを含むＡＰＰ断片を生じる(ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβ)。α分泌酵素による、あるいはβ分泌酵素による切断は可溶性Ｎ末端ＡＰＰポリペプチド、ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβ、をそれぞれ生成して細胞外放出し、対応する膜アンカーＣ末端断片Ｃ８３及びＣ９９の保持を導く。γ分泌酵素によるＣ８３の次のプロセッシングは、Ｐ３ポリペプチドを産出する。これは、主要な分泌経路であり、非アミロイド形成的である。あるいは、Ｃ９９のプレセニリン/ニカストリン介在性γ分泌酵素プロセッシングは、アミロイドベータポリペプチドであるアミロイドベータ４０(Ａβ４０)及びアミロイドベータ４２(Ａβ４２)、アミロイドプラークの主要成分、及び細胞毒性Ｃ末端断片であるγＣＴＦ(５０)、γＣＴＦ(５７)及びγＣＴＦ(５９)を放出する。エビデンスは、各切断イベントの相対的重要性が細胞型に依存することを示唆する。例えば、非神経細胞は、優先して、α分泌酵素経路によりＡＰＰを処理してＡβ配列内でＡＰＰを切断し、それによりＡβの形成を排除する(例えば、Esch等. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等. 1990 Science 248:492- 495)。これに対して、神経細胞は、β分泌酵素経路によりＡＰＰ６９５の非常に大きな部分を処理し、少なくとも２つの酵素クラスの混合性活性により完全なＡβを生成する。神経細胞では、β分泌酵素は、Ａβドメインのア���ノ末端でＡＰＰ６９５を切断し、独特なＮ末端断片(ｓＡＰＰβ)を放出する。加えて、γ分泌酵素は、カルボキシ末端の選択的部位でＡＰＰを切断し、４０(Ａβ４０)又は４２アミノ酸長(Ａβ４２)のＡβの種を生成する(例えばSeubert等. 1993 Nature 361:260-263; Suzuki 等. 1994 Science 264:1336-1340; 及びTurner等. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970を参照)。
【００３１】
「ＡＰＰ」、「ＡＰＰタンパク質」及び「ＡＰＰポリペプチド」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然ＡＰＰ配列及びＡＰＰ変異体及び処理されたその断片を含む。これらの用語は、ヒトを含めたさまざまな哺乳動物で発現するＡＰＰを含む。ＡＰＰは、さまざまなヒト組織系統で天然に存在する場合は内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列ＡＰＰ」は、天然由来のＡＰＰと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む(例えば、６９５、７５１及び７７０イソフォーム又はその処理された部分)。従って、天然配列ＡＰＰは、ヒトを含む任意の哺乳動物で天然に存在するＡＰＰのアミノ酸配列を有することができる。当該天然配列ＡＰＰは自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段により製造されうる。「天然配列ＡＰＰ」なる用語は、特に、天然に存在する処理された及び／又は分泌された形態(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態及び／又はタンパク質分解で処理された形態)及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。ＡＰＰ変異体は、天然配列ＡＰＰの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
【００３２】
本発明の実施形態で有用なＡＰＰポリペプチドは、上記のもの及び以下の非限定的な例を含む。これらの説明された形態は本発明のさまざまな実施形態に使用されるために選択されうる。本発明のいくつかの実施形態では、ＡＰＰポリペプチドは、図１Ｂ−１Ｄに示すＡＰＰ６９５及び／又はＡＰＰ７５１及び／又はＡＰＰ７７０イソフォーム等の全長ＡＰＰイソフォームを含む。本発明の他の実施形態では、ＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えばα分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素のような分泌酵素により切断を受けたＡＰＰポリペプチドを含む(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβのような可溶性Ｎ末端断片)。本発明の関係する実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、Ｎ末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプＩＩ(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような１又は複数の特異的なドメインを含むように選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、抗体又はＤＲ６イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたＤＲ６アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばＡＰＰ６９５のアミノ酸２２−８１、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体２２Ｃ１１により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態において、例えば特定のＮ末端又はＣ末端アミノ酸を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、実施例１２で開示するヒト組換えＮ-ＡＰＰポリペプチド)、クーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ＡＰＰ６９５)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Ａβ)配列を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ、Ａβ４０及び／又はＡβ４２配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、ＡＰＰポリペプチドは１又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施形態において、本発明の実施形態で使用されるＡＰＰポリペプチドは、１又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Ａβ)配列のような１又は複数の分泌酵素切断部位について、ＡＰＰポリペプチドはＮ末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体２２Ｃ１１のようなＤＲ６アンタゴニストにより結合されることが認められるその部分)を含むが、Ｃ末端であるドメイン又は配列を含まない(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)。
【００３４】
「細胞外ドメイン」「外部ドメイン」又は「ＥＣＤ」なる用語は、ＡＰＰの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ＥＣＤは、１％未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは０．５％未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約５アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施形態において、ＥＣＤは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
【００３５】
「ＡＰＰ変異体」なる用語は、下に定義するように、図１Ｂ−１Ｄに示すアミノ酸配列を有するヒトＡＰＰと、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もっとも好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＡＰＰポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えば図１Ｂ−１Ｄの完全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたＡＰＰポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに１又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたＡＰＰポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含んでいるが天然配列ＡＰＰポリペプチドは除外される。
【００３６】
「ＤＲ６」又は「ＤＲ６レセプター」は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列が図１Ａ-１−図１Ａ-２に示される当分野で引用されるレセプターを含む。Ｐａｎ等は、「ＤＲ６」又は「ＴＲ９」と称されるＴＮＦレセプターファミリーの一員のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を記載した(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); 又、米国特許第6358508号; 6667390号; 6919078号; 6949358号)。ヒトＤＲ６レセプターは、推定シグナル配列(アミノ酸１−４１)、細胞外ドメイン(アミノ酸４２―３４９)、膜貫通ドメイン(アミノ酸３５０−３６９)、続いて細胞質ドメイン(アミノ酸３７０−６５５)を有する６５５アミノ酸タンパク質(図１Ａ-２)である。「ＤＲ６レセプター」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然配列レセプター及びレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む、さまざまな哺乳動物において発現するＤＲ６レセプターを含む。ＤＲ６レセプターは、さまざまなヒト組織系統において天然に存在するとき内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列ＤＲ６レセプター」は、天然由来のＤＲ６レセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列ＤＲ６レセプターは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するＤＲ６レセプターのアミノ酸配列を有しうる。当該天然配列ＤＲ６レセプターは、自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段によって製造されうる。「天然配列ＤＲ６レセプター」なる用語は、特に、レセプターの天然に存在する切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態)及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。レセプター変異体は、天然配列ＤＲ６レセプターの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
【００３７】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」なる用語は、ＤＲ６レセプターの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ＥＣＤは、１％未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは０．５％未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約５アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施形態において、ＥＣＤは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
【００３８】
「ＤＲ６変異体」なる用語は、下に定義するように、図１Ａに示す予測されるアミノ酸配列を有するヒトＤＲ６と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もっとも好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＡＰＰポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えば図１Ａの完全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたＤＲ６ポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに１又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたＤＲ６ポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含むが、天然配列ＤＲ６ポリペプチドは除外される。場合によっては、ＤＲ６変異体は、最高１０までの保存的なアミノ酸置換を有する図１Ａのアミノ酸１−３４９又は４２−３４９を含むＤＲ６レセプターの可溶型を含む。好ましくは、下に定義するように、当該変異体はＤＲ６アンタゴニストとして作動する。
【００３９】
「ＤＲ６アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、インビトロ、インサイツ、インビボ又はエクスビボの何れかで、神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するか、又は同族リガンド、好ましくは同族リガンドＡＰＰを結合するＤＲ６レセプターの能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化する任意の分子を含む。例えば、ＤＲ６アンタゴニストは、神経細胞又は組織のアポトーシス又は細胞死に結果としてなる神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６の能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制又は中和化してもよい。ＤＲ６アンタゴニストは、同族リガンドのＤＲ６への結合の遮断、抑制、又は中和化、ＤＲ６と同族リガンド(例えば、ＡＰＰ)との間の複合体の形成、ＤＲ６レセプターのオリゴマー形成、ＤＲ６レセプターと異種コレセプターとの間の複合体の形成、同族リガンドのＤＲ６レセプター／異種コレセプター複合体への結合、又はＤＲ６レセプターと異種コレセプターとその同族リガンドとの間の複合体の形成を含むがこれに限定されないさまざまな機構によって、ＤＲ６を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化するために作動してもよい。ＤＲ６アンタゴニストは、直接的又は間接的な方法で機能してもよい。本発明により意図されるＤＲ６アンタゴニストは、ＡＰＰ抗体、ＤＲ６抗体、イムノアドヘシン, ＤＲ６イムノアドヘシン、ＤＲ６融合タンパク質、ＤＲ６の共有結合修飾型、ＤＲ６変異体及びその融合タンパク質、又はＤＲ６の高次オリゴマー型(二量体、凝集体)又はＤＲ６のホモ又はヘテロポリマー型、ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼＪＮＫ活性の小分子及びペプチドインヒビター、信号変換経路においてＪＮＫの上流で機能するタンパク質キナーゼＭＬＫｓ及びＭＫＫｓの薬理的インヒビター、ＪＮＫの裏打ちタンパク質ＪＩＰ-１への結合の薬理的インヒビター、ｃ-Ｊｕｎ又はＡＰ-１転写因子複合体のような基質へのＪＮＫの結合の薬理的インヒビター、ＪＮＫ結合性ドメイン(ＪＢＤ)ペプチド及び／又はＪＮＫの基質結合性ドメイン及び／又はＪＮＫ基質リン酸化部位を含むペプチドインヒビターのような基質のＪＮＫ介在性リン酸化の薬理的インヒビター、ＪＮＫへのＡＴＰ結合を遮断する小分子、及びＪＮＫへの基質の結合を遮断する小分子を含むＪＮＫシグナル伝達カスケードの薬理的インヒビターのような小分子を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
ＤＲ６アンタゴニストが、神経細胞又は組織において１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるために、例えば(実施例に記載するように)さまざまな神経細胞又は組織において、及び脳卒中／脳虚血のインビボモデルにおいて、パーキンソン病のマウスモデル；アルツハイマー病のマウスモデル；筋萎縮性側索硬化症ＡＬＳのマウスモデル；脊髄筋肉萎縮症ＳＭＡのマウスモデル等の神経変性疾患のインビボモデルにおいて、局所的脳虚血及び全脳虚血のマウス／ラットモデル、例えば総頚動脈閉塞モデルまたは中大脳動脈閉塞モデルにおいて、又はエクスビボ全胚培養において、ＤＲ６アンタゴニストの効果を評価するためにアッセイを実施してもよい。さまざまなアッセイは、下記のように又は当該分野で知られており文献に記載されているような既知のインビトロ又はインビボアッセイフォーマットで実施されてもよい(例えば、McGowan等, TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006); Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005); Wong等, Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)を参照)。ＤＲ６アンタゴニストが、神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるためのアッセイの一実施形態は、ＤＲ６アンタゴニスト又は潜在的ＤＲ６アンタゴニスト(すなわち、興味がある分子)の存在下又は非存在下においてＤＲ６とＡＰＰとを結合させること；次にこのＤＲ６アンタゴニスト又は潜在的ＤＲ６アンタゴニストの存在下でＤＲ６のＡＰＰへの結合の抑制を検出することを含む。
【００４１】
「核酸」は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡを含むことを意味する。例えば、染色体性核酸、ミトコンドリア核酸、ウイルス核酸及び／又は細菌性核酸が組織試料中に存在する。「核酸」なる用語は、二本鎖の核酸分子の何れか又は両鎖を包含し、原型の核酸分子の任意の断片又は部分を包含する。
【００４２】
「遺伝子」は、タンパク質をコードする又は転写する、あるいは他の遺伝子発現を調節する際に機能的に働く任意の核酸配列又はその一部を意味する。遺伝子は、機能的なタンパク質のコード化を担うすべての核酸又はタンパク質のコードあるいは発現を担う核酸の一部のみを構成してもよい。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始領域又は終末領域、プロモータ配列、他の調節配列又は遺伝子に近接する特定の領域内に遺伝的な異常を含有してもよい。
【００４３】
「アミノ酸」及び「アミノ酸類(amino acids)」なる用語は、すべて天然に存在するＬ-α-アミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを含むと定める。アミノ酸は、１文字又は３文字表記のどちらかで特定される：
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸      Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｔｈｒ    Ｔ    トレオニン          Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン              Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン酸        Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン            Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン            Ｌｙｓ    Ｋ    リシン
Ａｌａ    Ａ    アラニン            Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン          Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン              Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン          Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン酸
図において、いくつかの他の１文字又は３文字表記が、配列中で所定の位置の２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを指すために又は識別するために使用されてもよい。
【００４４】
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００４５】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェント」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より相対的に高い温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェントを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェントの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４７】
ここで定義される「高度のストリンジェント条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる；４２℃で、５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いて、４２℃で０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)及び５５℃の５０％ホルムアミド中にて洗浄、次いでＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにて５５℃で高ストリンジェントな洗浄を行うことによって同定され得る。
【００４８】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にておよそ３７−５０℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させるために必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４９】
「プライマー」又は「複数のプライマー」なる用語は、相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、例えばポリメラーゼ連鎖反応で起こるような、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの働きによってモノヌクレオチドからポリヌクレオチドの段階的な合成の開始点となるオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００５０】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００５１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００５２】
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を示す。 構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(すなわち、「異種」である)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５４】
「ＤＲレセプター抗体」、「ＤＲ６抗体」、又は「抗ＤＲ６抗体」は、ＤＲ６レセプター、好ましくは、図１Ａに示すＤＲ６配列又はその細胞外ドメイン配列等のヒトＤＲ６レセプターの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために広義に使用される。場合によっては、ＤＲ６抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合される。好ましくは、異種性配列は、抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成することを許容又は補助する。「抗ＤＲ６抗体」なる用語及び文法的に相当する言葉は、特に、下の実施例に記載のＤＲ６モノクローナル抗体を含む。場合によっては、ＤＲ６抗体はＤＲ６レセプターに結合するが、腫瘍壊死因子ファミリーの任意の更なるレセプター(例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｆａｓ) と結合又は交差反応をしない。 場合によっては、本発明のＤＲ６抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定した場合、約０．０６７ｎＭから約０．０３３μＭの濃度範囲で、ＤＲ６レセプターに結合する。
【００５５】
「抗ＡＰＰ抗体」、「ＡＰＰ抗体」なる用語及び文法的に相当する言葉は、広義に使用され、本明細書に特に記載するＡＰＰポリペプチドイソフォーム等のＡＰＰ、好ましくはヒトＡＰＰの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために使用される。好ましくは、ＡＰＰ抗体はＤＲ６アンタゴニスト抗体である。例えば、本願明細書に開示するＤＲ６アンタゴニストを作成及び／又は同定する方法において、ＡＰＰ及び／又はそのタンパク質の１又は複数のイソフォームは、動物(例えば、モノクローナル抗体を作成するための方法の一環としてマウス)を免疫化するための免疫原として、及び／又は化合物のライブラリー(例えば、組換え抗体ライブラリー)をスクリーニングするためのプローブとして使用されうる。本発明の実施形態で有用である典型的なＡＰＰポリペプチドは、以下の非限定的な例を含む。これら具体的な形態は、本発明のさまざまな実施形態において使用するために選択されうる。本発明のいくつかの実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、図１に示すＡＰＰ６９５及び／又はＡＰＰ７５１及び／又はＡＰＰ７７０イソフォーム等の全長ＡＰＰイソフォームを含む。本発明の他の実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えば、α分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素等の分泌酵素によって切断を受けたＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ等の可溶性Ｎ末端断片)を含む。本発明の関係する実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、Ｎ末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプＩＩ(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような１又は複数の特異的なドメインを含むように選択されうる。本発明のいくつかの実施形態において、ＡＰＰポリペプチドは、抗体又はＤＲ６イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたＤＲ６アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばＡＰＰ６９５のアミノ酸２２−８１、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体２２Ｃ１１により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、例えば特定のＮ末端又はＣ末端アミノ酸を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、実施例１２で開示するヒト組換えＮ-ＡＰＰポリペプチド)、クーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ＡＰＰ６９５)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Ａβ)配列を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ、Ａβ４０及び／又はＡβ４２配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、ＡＰＰポリペプチドは１又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施形態において、本発明の実施形態で使用されるＡＰＰポリペプチドは、１又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Ａβ)配列(例えば、ｓＡＰＰα又は��ＡＰＰβ)のような１又は複数の分泌酵素切断部位について、ＡＰＰポリペプチドはＮ末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体２２Ｃ１１のようなＤＲ６アンタゴニストにより結合されることが認められるそれらの部分)を含むが、Ｃ末端であるドメイン又は配列を含まない。場合によっては、抗ＡＰＰ抗体はＡＰＰポリペプチドのＤＲ６への結合を阻害し、本明細書に記載のように、及び／又は定量的細胞ベース結合アッセイで測定した場合、１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度でＡＰＰポリぺプチドに結合する。
【００５６】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
【００５７】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００５８】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００５９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００６０】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００６１】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公報９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００６２】
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがＦＲのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００６３】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
【００６４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化(例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような)等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００６５】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。本明細書中のＦｃＲはＦｃγＲIIIａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン(Ｆ)又はバリン(Ｖ)となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｖ)は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ)又はヘテロ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ／Ｖ)レセプターと比較してインビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加し、ヒトＩｇＧ１に対する親和性も高いことが示された。
【００６６】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。ポリオールには当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えばNectar(登録商標) Corporationといった商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合(コンジュゲート)」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
「有効量」という用語は、問題の疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的な薬剤(例えば、ＤＲ６アンタゴニスト)の量を意味する。本発明のＤＲ６アンタゴニストは、神経変性疾患の進行の遅延又は停止、或いは損傷した神経細胞又は組織の修復促進に有用であり、適切な神経機能の回復を助けると考えられる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ本質的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、本明細書に記載のＤＲ６アンタゴニストによる治療により利益を得る任意の症状を指す。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させやすくする病理状態が含まれる。
【００６７】
「神経細胞又は組織」は、通常、運動ニューロン、非限定的に交連ニューロンを含む介在ニューロン、非限定的に後根神経節ニューロンを含む感覚ニューロン、黒質のドーパミン(ＤＡ)ニューロン、線条体ＤＡニューロン、皮質ニューロン、脳幹ニューロン、脊椎介在ニューロン及び運動ニューロン、非限定的に海馬のＣＡＩ錐体ニューロンを含む海馬ニューロン、及び前脳ニューロンを指す。神経細胞又は組織なる用語は、本明細書において細胞体、軸索および樹状突起からなる神経細胞、及び当該神経細胞の一部分を形成してもよい軸索又は樹状突起を指すことを意図する。
【００６８】
「神経疾患」は、本明細書において、神経変性病状、中枢又は末梢神経系の機能不全によって又は神経細胞又組織のネクローシス及び／又はアポトーシスによって特徴付けられる神経細胞又は組織傷害、栄養因子欠乏に関連した神経細胞又組織損傷を含む病状を指すために使用される。神経変性疾患の例には、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、ＦＡＬＳ及びＡＬＳ)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病(ハンチントン舞踏病)、家族性及び特発性アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症 (ＳＭＡ)、緑内障又は網膜変性を伴う関連疾患等の視神経症、糖尿病性神経障害、又は黄斑変性症、内耳感覚細胞又はニューロンの変性による聴力損失、てんかん、顔面麻痺、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(ＦＴＤＰ-１７)、多発性硬化症、びまん性大脳皮質萎縮症, レビー小体型認知症、ピック病、三塩基反復病、プリオン病、及びシャイ・ドレーガー症候群を含まれる。神経細胞又は組織の傷害又は損傷は、神経細胞又は組織の生存又は適切な機能を危険にさらすさまざまな異なる原因から生じてもよく、例えば、全脳虚血及び局所的脳虚血(脳卒中)の場合のような、血流を(一時的に又は恒久的に)制限する虚血状態；脳組織又は脊髄の切開又は切断；神経組織における病変又はプラーク；細胞の成長及び生存のために必要とされる栄養因子の欠乏；化学療法剤等の神経毒への暴露に由来する；及び糖尿病又は腎機能不全などの慢性代謝病のような他の疾患に付随してするものを含む、急性及び非急性傷害を含むがこれらに限定されるものではない。
【００６９】
「被検体」又は「患者」は、ヒトを含む、治療が望まれる任意の単一の被検体を意味する。また、臨床試験に用いられる疾患の臨床的な特徴を全く示さない任意の被検体、又は疫学的な研究に用いられる被検体、又はコントロールとして用いられる被検体も被検体に含まれる。
本明細書中で用いられる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物と分類される任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物がヒトである。
【００７０】
ＩＩ．本発明の例示的方法及び材料
過去の研究は、神経系の発生の間の細胞死の現象を調査している(Hamburger等, J. Neurosci., 1:60-71 (1981); Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991); O’Leary等, J. Neurosci., 6:3692-3705 (1986); Henderson等, Nature, 363:266-270 (1993); Yuen等, Brain Dev., 18:362-368 (1996))。神経細胞の死は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、ＦＡＬＳ及びＡＬＳ)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)等さまざまな神経疾患の発生及び／進行において役割を果たしていると考えられている(Price等, Science, 282:1079-1083 (1998))。
【００７１】
驚くべきことに、出願人は、ＴＮＦＲファミリーの一員であるＤＲ６は、脊髄の大脳皮質、海馬、運動ニューロン及び介在ニューロンを含む胚の及び成体の中枢神経系において、高度に発現することを発見した。下の実施例に記載するように、出願人は、ＤＲ６が神経細胞の生存又は死のレギュレーターとして果たしているその役割を調査するために、さまざまな実験分析を行った。交連ニューロンは、その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存している。出願人は、インビトロでの外植片培養において、ＲＮＡ干渉によるＤＲ６発現の抑制が交連ニューロンの軸索変性を遮断したことを発見した。また、抗ＤＲ６モノクローナル抗体は、背側脊髄生存アッセイにおいて試験され、ＤＲ６特異的抗体３Ｆ４．４．８；４Ｂ６．９．７；及び１Ｅ５．５．７によるＤＲ６レセプターシグナル伝達の抑制が、インビトロでの外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を抑えることが見いだされた。ＤＲ６はＪＮＫの活性化を介してシグナル伝達することが、文献で報告されている(Pan等, 上掲 1998; Zhao等, 上掲 2001)。それ故、軸索変性におけるＤＲ６-ＪＮＫの役割を推定するために、交連ニューロンにおけるＪＮＫシグナル伝達経路がペプチドインヒビターＬ-ＪＮＫ-１により遮断された背側脊髄生存アッセイが実施された。ＪＮＫシグナル伝達のこの抑制は、背側脊髄生存アッセイにおいて、部分的に軸索変性を遮断した。従って、ＤＲ６は、少なくとも一部分ではＪＮＫ経路を介して軸索突起の変性にシグナルを伝達していると考えられる。発生中の神経細胞死の調節におけるＤＲ６の生理学的役割をよりよく理解するために、ＤＲ６シグナル伝達を、全胚培養系において抗ＤＲ６抗体により遮断した。特筆すべきことに、この系において、特定のＤＲ６特異的抗体によるＤＲ６シグナル伝達の抑制は、天然に生じる発生上の細胞死に対して脊髄ニューロンを保護した。そのため、ＤＲ６アンタゴニスト抗体などのＤＲ６アンタゴニストは、神経変性疾患(例えば、ＡＬＳ、ＳＭＡ、アルツハイマー及びパーキンソン病、ＦＴＤＰ-１７、ハンチントン病)および脳卒中などの神経疾患において生じる神経細胞死を減らすために利用されてもよい。ＤＲ６がインビボで本物のプロアポトーシスレセプターとして機能するか否かを調べるために、出願人は発生ステージＥ１５．５におけるＤＲ６ノックアウト胚の表現型を解析した。ＤＲ６の神経細胞生存の負のレギュレータとしての提案された役割と一致して、ＤＲ６ヘテロ接合体同腹仔コントロールに比較して、ＤＲ６ヌル脊髄及び後根神経節では、神経細胞死の約４０％から５０％の減少が検出された。
【００７２】
また、出願人は、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)がＤＲ６レセプターの同族リガンドであること、更にＡＰＰはＤＲ６レセプターを介して軸索変性を引き起す働きをすることを見い出した。アミロイド前駆体タンパク質は、完全にはわかっていないが、アルツハイマー病において何らかの役割を果たしていると、以前に仮説が立てられている(Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996); Scheuner等, Nature Med. 2:864 (1996); Goate等, Nature 349:704 (1991))。
特に、ＤＲ６アンタゴニストはさまざまな神経疾患の治療に有用であると考えられている。従って、本発明はＤＲ６アンタゴニストの有効量の投与を含む、哺乳動物においてＤＲ６活性を抑制、遮断又は中和化するためのＤＲ６アンタゴニスト組成物及び方法を提供する。好ましくは、使用されるＤＲ６アンタゴニストの量は、軸索変性及び神経細胞死を遮断するために効果的な量である。これは、例えば、以下及び実施例に記載の方法によって達成されうる。
【００７３】
この方法に使用されうるＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６及び／又はＡＰＰイムノアドヘシン、ＤＲ６及び／又はＡＰＰを含む融合タンパク質、ＤＲ６及び／ＡＰＰの共有結合修飾形態、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ変異体、その融合タンパク質、及びＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体を含むが、これらに限定されるものではない。アンタゴニストを作成するために使用されうるさまざまな技術は、本明細書に記載される。例えば、ＤＲ６及びＡＰＰポリペプチドを調製するための方法及び技術が記載される。また、ＤＲ６及びＡＰＰポリペプチドの更なる修飾、及びＤＲ６及びＡＰＰに対する抗体も記載される。
本明細書で開示される本発明は、多くの実施形態を有する。本発明は、ＤＲ６のＡＰＰへの結合が阻害される条件下で、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストにＤＲ６ポリペプチド及び／又はＡＰＰポリぺプチドを暴露することを含む、ＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害する方法を提供する。本発明の関係する実施形態は、配列番号１のアミノ酸１−６５５を含むＤＲ６ポリペプチドと配列番号６のアミノ酸６６−８１を含むＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ)との結合を阻害する方法であり、ＤＲ６ポリペプチド及びＡＰＰポリペプチドをＤＲ６又はＡＰＰを結合する単離されたアンタゴニストと組合わせることを含む方法であって、単離されたアンタゴニストはＡＰＰを結合する抗体、ＤＲ６を結合する抗体、及び配列番号１のアミノ酸１−３５４を含むＤＲ６ポリペプチドを含む可溶性ＤＲ６ポリペプチドの少なくとも１つから選択されること；及び単離されたアンタゴニストはＤＲ６とＡＰＰとの結合を阻害する能力により選択されることを含んで成り、それによりＤＲ６のＡＰＰへの結合が阻害される、方法を提供する。
【００７４】
当該方法では、場合によっては、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストが、ＤＲ６を結合する抗体(例えば、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ-８０９５、ＰＴＡ-８０９４、又はＰＴＡ-８０９６として寄託されているハイブリドーマ細胞株により製造される、それぞれ、３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、１Ｅ５．５．７モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害するＤＲ６を結合する抗体)、配列番号１のアミノ酸配列１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチド(例えば、ＤＲ６イムノアドヘシン)、又はＡＰＰを結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体２２Ｃ１１)から選択される。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＲ６アンタゴニストは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される１又は複数の非タンパク性ポリマーに結合されるＤＲ６を結合する抗体、ＡＰＰを結合する抗体又は可溶性ＤＲ６ポリペプチドである。
【００７５】
これらの方法の任意の実施形態において、ＤＲ６ポリペプチドは１又は複数の哺乳動物の細胞(例えば、交連ニューロン細胞、感覚ニューロン細胞又は運動ニューロン細胞)の１又は複数の哺乳動物細胞の細胞表面上で発現し、当該１又は複数のＤＲ６アンタゴニストの結合はＤＲ６活性化又はシグナル伝達を阻害する。本発明の当該実施形態の一つにおいて、方法は、組織培養における神経細胞の成長及び／又は再生及び／又は生存を促進するために、ＤＲ６を発現する１又は複数の哺乳動物の細胞においてアポトーシスを阻害するためにインビトロで実施される。例えば、当該ＤＲ６アンタゴニストは、組織培地へのインビトロ添加物、例えば神経細胞培養を増殖させることを目的とするものとして有用である。特に、当該分野で知られているように、ある神経細胞培養の増殖は、当該細胞がアポトーシスが受ける傾向があるのために問題を有する場合がある。例えば、いくつか神経培養は神経成長因子等の外生因子の非存在下で死ぬ。本明細書で提供する開示は、ＤＲ６アンタゴニストが、当該神経細胞培養において、細胞の成長及び／又は再生及び／又は生存を促進するために、例えば、当該培養における神経成長因子の使用と同種の方法で、使用されうることを示す。
【００７６】
本発明の更なる実施形態において、ＤＲ６のＡＰＰへの結合の阻害の方法は、神経学的病状又は疾患を有する哺乳動物において、インビボで実施されてもよい。場合によっては、神経学的病状又は疾患は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である。あるいは、神経学的病状又は疾患は、脳卒中、脳又は脊髄組織への外傷、又は神経組織の病変に由来する神経細胞又は組織傷害を含む。
本発明の更なる実施形態は、神経学的病状又は疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に１又は複数のＤＲ６アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法を提供する。典型的には、当該方法において、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６を結合する抗体、配列番号１のアミノ酸１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチド、及びＡＰＰを結合する抗体から選択される。本発明の任意の実施形態において、神経学的病状又は疾患は筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である。あるいは、神経学的病状又は疾患は、脳卒中、脳又は脊髄組織への外傷、又は神経組織の病変に由来する神経細胞又は組織傷害を含む。本発明のさまざまな実施形態において、１又は複数の更なる治療薬は上記哺乳動物に投与される。本発明のある例示的な実施形態において、１又は複数の更なる治療剤はＮＧＦ、アポトーシスインヒビター、ＥＧＦＲインヒビター、β分泌酵素インヒビター、γ分泌酵素インヒビター、コリンエステラーゼインヒビター、抗Ａβ抗体及びＮＭＤＡレセプターアンタゴニストから選択される。場合によっては、１又は複数のＤＲ６アンタゴニスト及び／又は更なる治療薬は、哺乳動物に、注射、注入又は灌流を介して投与される。
【００７７】
本発明のまた更なる実施形態において、ＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害する興味のある分子を同定する方法であり、上記興味のある分子の存在下又は非存在下でＤＲ６とＡＰＰとを組合せること；次に上記興味のある分子の存在下でＤＲ６のＡＰＰへの結合の抑制を検出することを含む方法を提供する。本発明の関係する実施形態は、組成物が、配列番号１のアミノ酸１−６５５(場合によっては、配列番号１のアミノ酸１―３５４)を含むＤＲ６ポリペプチドと配列番号６のアミノ酸６６−８１を含むＡＰＰポリペプチド(例えば、ＡＰＰ６９５、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)との間の結合を調節するかどうかを評価する方法であり、組成物をＤＲ６及びＡＰＰに組合わせること；次に組成物の非存在下でのＤＲ６とＡＰＰとの間の結合と、組成物の存在下でのＤＲ６とＡＰＰとの間の結合とを比較すること；それにより組成物がＤＲ６とＡＰＰとの間の結合を調節するかどうかを評価することを含む方法を提供する。場合によっては、当該方法における結合性の違いは、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術を介して測定される(例えば、Biacore Life Sciencesより入手可能である)。本発明の実施形態は、更に、これらの方法により同定された興味のある分子を含む。
【００７８】
本発明の更なる実施形態は、神経疾患を有するか、又は神経疾患が疑われる患者を診断する方法であって、患者から試料を採取すること及び配列番号１のＤＲポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を有するＤＲ６ポリペプチド変異体の存在について試料を試験することを含む。場合によっては、方法は、更に、配列番号１のＤＲ６ポリペプチド配列に対して認められた親和性とは異なるＡＰＰポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチド変異体を同定することを含む。本発明の関係する実施形態は、配列番号１のアミノ酸１−６５５を含むＤＲ６のポリペプチド変異体が哺乳動物に存在するかどうかを調べる方法であり、哺乳動物においてＤＲ６のポリペプチド変異体が存在するかどうかを調べるために、哺乳動物において発現されたＤＲ６ポリペプチドの配列を配列番号１と比較することを含む方法である。これらの方法のいくつかの実施形態は、哺乳動物に存在すると認められたポリペプチド変異体をＡＰＰ結合性変異体として同定する更なる工程であって、ＡＰＰ結合性変異体は、配列番号６のアミノ酸６６−８１を含むアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)(例えば、ＡＰＰ６９５、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)に対する結合親和性を有し、それは配列番号６のアミノ酸６６−８１を含むＡＰＰポリペプチドに対する、配列番号１を含むＤＲ６ポリペプチドの結合性親和性とは異なることを特徴とする工程を含んでもよい。場合によっては、上記方法において結合親和性の違いは、(例えば、Biacore Life Sciencesより入手可能である)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術によって測定される。これらの方法のいくつかの実施形態は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病で認められる症状又は病状を有する者を個々の患者として選択する工程を含んでもよい。
【００７９】
ここに開示される完全長天然配列ＤＲ６及びＡＰＰポリペプチドに加え、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド変異体が調製可能であることも考慮される。ＤＲ６及び／又はＡＰＰ変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入すること、及び／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。本技術分野の当業者が周知のように、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、或いは膜固着特性の変更等のアミノ酸変化により、ＤＲ６及び／又はＡＰＰの翻訳後のプロセスが変化し得る。
ここに開示されるＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載されているような保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする１以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの１以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、ＤＲ６ポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同様の構造及び／又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約１−５のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、ＤＲ６及び／又はＡＰＰアンタゴニスト活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
【００８０】
ここにＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド断片が提供される。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較したとき、例えば、Ｎ末端又はＣ末端で切断されているか、又は内部残基を欠損している。一部の断片は所望のＤＲ６ポリペプチドの生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片の単離と増幅を行う。ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを５'及び３'プライマーが使用される。
【００８１】
特定の実施形態における、対象となる保存的置換を以下の表の好ましい置換の欄に示す。このような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表の例示的置換の欄に示した置換、又はアミノ酸の分類に関して後述するような置換をさらに導入し、産出物をスクリーニングする。
表
2011524523.tif 000003
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(b) 標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c) 側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
(1) 疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性の親水性：cys, ser, thr;
(3) 酸性：asp, glu;
(4) 塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
(6) 芳香族：trp, tyr, phe
【００８２】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このようにして置換された残基も、保存的置換部位、又はさらに好ましくは残りの(非保存的)部位に挿入することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット変異［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択変異［Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術などをクローニングされたＤＮＡに対して行ってＤＲ６ポリペプチド変異ＤＮＡを生産することができる。
【００８３】
また、隣接する配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れた及び露出した位置の両方で頻繁に見いだされる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
また、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
【００８４】
本願明細書で開示される発明の実施形態は、幅広くさまざまなＡＰＰポリペプチドに適用する。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ＡＰＰは図１Ｄ−１Ｄに示す全長６９５、７５０又は７７０ＡＰＰイソフォームである。本発明の他の実施形態において、ＡＰＰは、ＡＰＰ外部ドメインを有するＡＰＰのｎ末端部分を含み、翻訳後のプロセッシングイベントから生成される(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)。例えば、場合によっては、ＡＰＰは、分泌酵素による切断の結果として生じる６９５、７５０又は７７０ＡＰＰイソフォームの一つの可溶型、例えばβ分泌酵素による切断により生じる神経ＡＰＰ６９５の可溶型を含んでもよい。特定の例示的実施形態において、ＡＰＰはＡＰＰ６９５のアミノ酸２０−５９１を含む(例えば、Jin等, J. Neurosci., 14(9): 5461-5470 (1994)を参照)。本発明の別の実施形態において、ＡＰＰはモノクローナル抗体２２Ｃ１１(例えば、Chemicon International Inc., Temecula, CA, U.S.A.より入手可能)により認識されるエピトープを有するポリペプチドを含む。場合によっては、ＡＰＰは、ＡＰＰ６９５の２２Ｃ１１エピトープを含む領域である残基６６−８１を含む(例えば、Hilbrich, J.B.C. Vol. 268, No. 35: 26571-26577 (1993)を参照)。
【００８５】
以下の説明は、主として、ＤＲ６ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの生産に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術を使用することによって又は自動によりインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター  シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドを生成させてもよい。
開示される方法及び技術は、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ変異体、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ及びＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
【００８６】
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成法)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＤＲ６ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1995)］。
【００８７】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸長法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００８８】
宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修正された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又は例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンもまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００８９】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)及びＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス、などの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ−ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ  ５５，２４４)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4946783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＤＲ６ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]；1985年5月2日公開の欧州特許第139383号)；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4943529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ１２４２４)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ１６０４５)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ２４１７８)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６５００)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402226号)；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183070号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244234号)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394538号)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開91/00357)；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]；Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００９０】
グリコシル化ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【００９１】
複製可能なベクターの選択及び使用
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＤＲ６及び／又はＡＰＰは組換え手法によって直接産生されるだけではなく、シグナル配列、あるいは成熟タンパク質ないしポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００９２】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a) アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b) 栄養要求性欠陥を補い、又は(c) 例えばバチルスのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。
【００９３】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282: 39(1979)；Kingsman等, Gene, 7: 141(1979)；Tschemper等, Gene, 10: 157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；欧州特許第36,776号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
【００９４】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73657号に更に記載されている。
【００９５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開の英国特許第2211504号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及びヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドコード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００９６】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＤＲ６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第117060号；及び欧州特許第117058号に記載されている。
【００９７】
宿主細胞の培養
本発明のＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号；同4657866号；同4927762号；同4560655号；又は同5122469号；国際公開第90/03430号；国際公開第87/00195号；又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９８】
遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＤＲ６ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＲ６配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤＲ６ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９９】
ＤＲ６ポリペプチドの精製
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドの様々な形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。ＤＲ６ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドは、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のＤＲ６ポリペプチドの性質に依存する。
【０１００】
ＤＲ６及び／又はＡＰＰの可溶性型を本方法においてＤＲ６アンタゴニストとして使用することができる。このようなＤＲ６及び／又はＡＰＰの可溶性型は、以下に示すような変形を含む(イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど)。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＤＲ６及び／又はＡＰＰイムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びにＤＲ６及び／又はＡＰＰの可溶性の、細胞外ドメイン型又はその断片のような、ＤＲ６及び／又はＡＰＰの様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型)で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
随意的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン(例えばＤＲ６及び／又はＡＰＰ外部ドメイン)の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をＣ末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合は不可能である。
【０１０１】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(a)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(b)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【０１０２】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される： 
(a) ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(b) ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(c) ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(d) ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(e) ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(f) (Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１０３】
簡略化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０１０４】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッドの重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、２つのジスルフィド結合で結合した免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの公開されている配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【０１０５】
他の実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手(例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子)の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988)；米国特許第5,716,805号；国際公開公報94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994)；Maniateis等, Nature, 341:24 (1989)；Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＤＲ６分子の５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【０１０６】
また、本発明のＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【０１０７】
抗ＤＲ６及び抗ＡＰＰ抗体
本発明の他の実施形態において、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体が提供される。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体を含む。これらの抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体は、好ましくはＤＲ６アンタゴニスト抗体である。
【０１０８】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド(例えば、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ  ＥＣＤ)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコルは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。次いで、哺乳動物から採血し、血清のアッセイによりＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体価を求めることができる。必要に応じて、抗体かが増大又は安定するまで哺乳動物を免疫追加することができる。
【０１０９】
モノクローナル抗体
あるいは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＤＲ６及び／又はＡＰＰポリペプチド(例えば、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ  ＥＣＤ)又はその融合タンパク質、例えばＤＲ６  ＥＣＤ−ＩｇＧ及び／又はＡＰＰ ｓＡＰＰ−ＩｇＧ融合タンパク質を含む。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１１０】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。そのようなマウス骨髄腫細胞株の一例は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０)である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＤＲ６及び／又はＡＰＰに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって、又はＢｉａＣｏｒｅ分析によって、測定することができる。
【０１１１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１１２】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このようにして、ここに開示される抗ＤＲ６モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは典型的に、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ＤＲ６の特異性を持つ１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【０１１３】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオラート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダートである。
一本鎖Ｆｖ断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
【０１１４】
ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１１５】
ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【０１１６】
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII(Xenomouse II)」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性ＪＨセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座を生殖系に統合組み込みすることにより達成された。ゼノマウスIIは、約６６ＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域及び３つの異なる定常領域(μ、δ及びχ)を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、また３２Ｖκ遺伝子、Ｊκセグメント及びＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、及びレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性ＪＨセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの、メジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する(体細胞過剰変異)。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体(レパートリー)のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、ｎＭ範囲での親和性を有する抗体及び抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー(「マザーオブオール ライブラリー(the Mother-of-all libraries)」とも呼ばれる)を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が��られる(1993年4月1日公開のPCT特許出願国際公開公報93/06213を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
下記に詳述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、ここに開示されるＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体を用いて、そのような二量体又は多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は削除し、よって架橋結合を防止する。
【０１１７】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＤＲ６レセプターに対してであり、他方は他の任意の抗原に対して、好ましくは別のレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィ工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、及びTraunecker等, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１１８】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開公報94/04690に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１１９】
ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために(国際公開公報91/00360；国際公開公報92/200373；欧州特許第03089号)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０１２０】
抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体(マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してＦ(ａｂ')２を形成し、Ｆ(ａｂ')２分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からＦｖ、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開公報９４／２９３４８及び米国特許第４３４２５６６号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Ｆａｂ断片は単一の抗原結合部位、及び残存性Ｆｃ断片を持つ。ペプシン処理により、２つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるＦ(ａｂ')２が生成される。
抗原消化で生成されるＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてＦａｂ断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'として、ここではＦａｂ'-ＳＨと記載する。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【０１２１】
抗体のグリコシル化変異体
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する(Jefferis及びLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; Wright及びMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; Wittwe及びHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、及び、糖タンパク質の高次構造及び提示される三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用(Hefferis及びLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、非ガラクトシル化ＩｇＧにおいて、オリゴ糖部分はＣＨ２内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている(Malhotra等, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(ヒトリンパ球のＣＤｗ５２抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体)からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解(ＣＭＣＬ)が完全に低減したが(Boyd等, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、ＤＭＣＬの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性(ＡＤＣＣ)に影響することが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(１,４)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII)のテトラサイクリン制御発現を持つＣＨＯ細胞で、ＡＤＣＣ活性が向上したことが報告されている(Umana等, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去し、抗体に１以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、及び/又は付加を行うことにより調製することができる。
【０１２２】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸)は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち１つの付着を指すが、５−ヒロドキシプロリン、又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(Ｎ−結合グリコシル化部位について)上述のトリペプチド配列の１又は複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、(Ｏ−結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列に対して１以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより行ってもよい。
【０１２３】
抗体のグリコシル化(グリコシル化パターンを含む)は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療剤として、抗体などの組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類が、まれに天然の細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される(例えばHse等, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響を与える因子には、増殖形態、媒地組成、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている(米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号及び米国特許第５２７８２９９号)。グリコシル化、又は特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ(Endo H)の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖成分分析、連続酵素消化、及び高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するＨＰＡＥＣ-ＰＡＤなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理(通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う)、主にＯ−結合構造を遊離するための強アルカリ環境を使用しての除去、及びＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
【０１２４】
例示的抗体
下の実施例に記載のとおり、抗ＤＲ６モノクローナル抗体が同定された。任意の実施形態において、本発明のＤＲ６抗体は、本明細書で特に開示された抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体の何れかと同じ生物学的特性を有する。
「生物学的特性」なる用語は、ＤＲ６に特異的に結合する能力又はＤＲ６活性を遮断、抑制又は中和化する能力等の、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボ活性又は特性を指すために使用される。ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体の特性及び活性化は、下の実施例において更に記載される。
場合によっては、本発明のモノクローナル抗体は、下の実施例で具体的に特徴づけられた抗体の何れかと同じ生物学的特性を有し、及び／又はこれらの抗体と同じエピトープに結合する。これは、本明細書及び実施例に記載したようなさまざまなアッセイによって測定することができる。例えば、モノクローナル抗体が特に本明細書で言及したＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体と同じ特異性を有するかどうかを測定するために、競合的結合アッセイでその活性を比較することができる。加えて、特定の抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体が結合するエピトープは、問題のＤＲ６及び／又はＡＰＰと抗体との間の複合体の結晶学的研究によって測定することができる。
【０１２５】
ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体は、本明細書で記載されたとおり、好ましくは所望のＤＲ６アンタゴニスト活性を有する。当該ＤＲ６抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び親和性成熟抗体を含むがこれらに限定されるものではない。上に記載のとおり、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体は、これらの所望の活性又は特性を達成するためにさまざまな技術を使用して構築または設計されてもよい。
本発明の追加の実施形態は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される１又は複数の非タンパクポリマーに結合された、本明細書に開示する抗ＤＲ６レセプター及び／又はＡＰＰリガンド抗体を含む。場合によっては、本明細書に開示する抗ＤＲ６レセプター及び／又はＡＰＰリガンド抗体は、グリコシル化あるいは非グリコシル化される。
【０１２６】
本発明の抗体は、「架橋結合」ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体を含む。「架橋結合」なる用語は本明細書で使用される場合、少なくとも２つのＩｇＧ分子を一つに結合し、一つの(又は単一の)分子を形成することを指す。ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体は、さまざまなリンカー分子を使用して共有結合されてもよく、好ましくはＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体は抗ＩｇＧ分子、補体、化学的修飾又は分子工学を使用して共有結合されてもよい。ひとたび抗体が細胞表面膜に結合すると、補体が抗体分子に比較的高い親和性を有することは当業者に重宝されている。従って、補体は、細胞表面膜に結合する２以上の抗ＤＲ６抗体を結合するための共有結合分子として使用されてもよいと考えられる。
【０１２７】
また、本発明は、本明細書に開示されるＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体を作成するための組換え体技術を提供する。
抗体の組換え体作成のために、それをコードする核酸は単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)のため又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を使用して(例えば、抗体をコードする遺伝子に特に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成は、通常、以下の１つ又は複数を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１２８】
本明細書の方法は、抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体軽鎖又は重鎖(又は軽鎖及び重鎖の両方)をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを提供する工程、宿主細胞にベクターを形質移入又は形質転換する工程、及び組換え体抗ＤＲ６抗体及び／又はＡＰＰ抗体産生物を作成するために十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、キメラ又は組換え体抗ＤＲ６及び／又はＡＰＰ抗体を作製する方法を含む。
【０１２９】
ＤＲ６アンタゴニストの製剤
本明細書の典型的な製剤の調製において、使用される成分の推奨の量又は「グレード」は製剤の最終的使用に依存する。治療的使用のために、医薬品への添加物として、許容可能なグレード(「ＧＲＡＳ」等)の成分が好ましい。
ある実施形態において、ＤＲ６アンタゴニスト及び、ＤＲ６アンタゴニストの溶解性及び／又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する１又は複数の賦形剤を含む組成物であって、ｐＨ６(又は約６)からｐＨ９(又は約９)を有する組成物が提供される。ＤＲ６アンタゴニストは、例えば、上の方法に従って、タンパク質の所望の純度を達成するのに適した任意の方法によって調整されてもよい。いくつかの実施形態において、ＤＲ６アンタゴニストは宿主細胞において組換えにより発現されるか、又は化学的合成により調製される。製剤中のＤＲ６アンタゴニストの濃度は、例えば、製剤の意図する使用に大いに依存してもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、ＤＲ６アンタゴニストの所望の濃度を決定することができる。
【０１３０】
ＤＲ６アンタゴニストの溶解性及び／又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する製剤中の１又は複数の賦形剤は、場合により、多イオン有機又は無機酸、アスパラギン酸、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣａｐｔｉｓｏｌＴＭ、トリス、アルギニン塩又は他のアミノ酸、糖及びトレハロース及びショ糖などのポリオールである。好ましくは、十分なイオン強度を提供する製剤中の１又は複数の賦形剤は塩である。使用されてもよい塩は、ナトリウム塩及びアルギニン塩を含むがこれらに限定されるものではない。使用されてもよい塩の種類及び塩の濃度は、好ましくは、製剤が比較的高いイオン強度を有し、製剤中のＤＲ６アンタゴニストが安定であることを可能にするものである。場合によっては、塩は製剤中に約２０ｍＭから約０．５Ｍの濃度で存在する。
【０１３１】
組成物は、好ましくは、ｐＨ６(又は約６)から９(又は約９)、より好ましくは約６．５から約８．５、さらにより好ましくは約７から約７．５を有する。この実施形態の好ましい態様において、組成物は、組成物のｐＨを少なくとも約６から約８に維持するためのバッファーを更に含む。使用されてもよいバッファーの例は、トリス、ＨＥＰＥＳ、及びヒスチジンを含むがこれらに限定されるものではない。トリスを使用する場合、ｐＨは、場合により、約７から８．５に調節されてもよい。Ｈｅｐｅｓ又はヒスチジンを使用する場合、ｐＨは、場合により、約６．５から７に調節されてもよい。場合によっては、バッファーは製剤中、約５ｍＭから約５０ｍＭの濃度で使用される。
特に液剤(又は、再構成された凍結乾燥製剤)の場合は、組成物中に１又は複数の界面活性剤を含むことが望ましい場合がある。例えば、当該界面活性剤は、ＴＷＥＥＮＴＭ又はＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ等の非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート又はポロキサマー)を含んでもよい。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０(「Ｔｗｅｅｎ２０」)を含む。場合によっては、界面活性剤は約０．００５％から約０．２％の濃度で使用される。
【０１３２】
本発明の製剤は、ＤＲ６アンタゴニスト及び上記の成分に加えて、更にさまざまな他の賦形剤または成分を含んでもよい。場合によっては、製剤は、非経口的投与のために、薬学的に又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される用量及び濃度において受容者に対し非毒性であって製剤の他の材料と適合する物を含んでもよい。場合によっては、担体は、受容者の血液と等浸透圧である溶液等の非経口担体である。当該担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)等の緩衝溶液、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液を含む。さまざまな任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、更にRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編. (1980)に記載されている。
【０１３３】
また、本明細書の製剤は、１又は複数の防腐剤を含んでもよい。例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物)、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤の他の種類には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びｍ-クレゾールを含む。抗酸化剤はアスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；ブチルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール; シクロへキサノール；3-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖類、及び他の炭水化物；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。
【０１３４】
本発明の組成物は、液剤(液体溶液又は液体懸濁液)及び、凍結乾燥製剤、及び懸濁製剤を含む。
最終製剤は、液体ならば、好ましくは、２０℃以下で凍結保存される。あるいは、製剤は凍結乾燥されて、場合によっては２−３０℃で保存されてもよい、注射用の水でもどされる粉末として提供されうる。
治療的投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。無菌性は、除菌膜(例えば、０．２ミクロンの膜)を介して濾過することにより、容易に達成できる。治療用組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
組成物は、通常、水性溶液として又は再構成のための凍結乾燥製剤として、一単位で又は複数回投与容器に、例えば密封されたアンプル又はバイアルに保存される。容器は、当分野で入手可能な何れの容器であってもよく、従来の方法を使用して注入される。場合によっては、製剤は、製剤の治療用送達に適した、当技術分野で入手可能であるような(例えば、米国特許第５３７０６２９号を参照)注射用ペン型装置(又はペン型装置に合うカートリッジ)中に含められる。注射溶液は、例えば注射用の水を使用して、凍結乾燥ＤＲ６アンタゴニスト製剤をもどすことによって調製することができる。
【０１３５】
ＤＲ６アンタゴニストを使用する治療
本発明のＤＲ６アンタゴニストはさまざまな効用を有する。ＤＲ６アンタゴニストは神経疾患の診断及び治療に有用である。本明細書に記載のさまざまな病的状態の哺乳動物の診断は、医師によって行われる。診断技術は、例えば、哺乳動物のさまざまな神経疾患の診断又は検出を可能にする当分野の技術を利用可能である。
本発明により治療が意図される神経疾患は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、ＦＡＬＳ及びＡＬＳ)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)(Price等,上掲)を含む。これらの疾患の多くは、成人期中期に発病し、神経系内のニューロンの特定サブセットの急速な変性につながり、最終的に早死となるという特徴を示す。
筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)は、もっとも多く診断される進行性運動ニューロン疾患である。この疾患は、皮質、脳幹及び脊髄の運動ニューロンの変性を特徴とする(Siddique等, J. Neural Transm. Suppl., 49:219-233 (1997); Siddique等, Neurology, 47: (4 Suppl 2):S27-34; discussion S34-5 (1996); Rosen等, Nature, 362:59-62 (1993); Gurney等, Science, 264:1772-1775 1994))。
【０１３６】
パーキンソン病 (振戦麻痺)は、中年から晩年に現われる一般的な神経変性疾患である。家族性及び特発性の症例があるが、家族性症例は認められた症例のたった１−２パーセントの割合を占める。患者は、高頻度に、黒質及び脳幹の青斑核における反応性神経膠症及びレビー小体を伴う神経細胞消失を有する。クラスとしては、黒質線条体ドーパミンニューロンが最も侵される(Uhl等, Neurology, 35:1215-1218 (1985); Levine等, Trends Neurosci., 27:691-697 (2004); Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005))。
近位型脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)は、脊髄の運動ニューロンの消失及び四肢及び体幹筋肉の萎縮を特徴とするヒトの一般的な常染色体劣性神経変性疾患である(Monani等, Hum. Mol. Genet., 9:2451-2457 (2000); Monani等, J. Cell Biol., 160:41-52 (2003))。１０，０００人に１人の頻度で発病し、乳児死亡率で最も一般的な遺伝的原因である。疾患の表現型の重症度及び発病時の年齢に基づいて、近位型ＳＭＡは１型(急性)、２型(中間型)及び３型(慢性型)ＳＭＡに分類されている。この疾患の全３形態は、運動ニューロン遺伝子(ＳＭＮ１)のテロメア生存の消失又は突然変異によるものである(Monani等, 上掲, 2000; Monani等, 上掲, 2003))。
【０１３７】
神経細胞消失は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、及び脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)を含む多くの神経変性疾患で報告されている。
場合によっては、患者におけるアルツハイマー病の診断は、精神疾患の診断・統計マニュアル第4版(ＤＳＭ-ＩＶ-ＴＲ)(例えば、American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4th Edition- text revised.  Washington, DC: 2000を参照)の診断基準に基づいてもよい。簡単には、ＤＳＭ-ＩＶ-ＴＲ診断基準は、(Ａ)(１)失語症；(２)失行症;(３)失認;又は(４)実行機能の混乱の１つ以上と記憶障害の両方が認められる複数の認知障害の発生；(Ｂ)認知障害が従前の機能の減退を示し、社会的又は職業上の機能に重大な障害を起こす；(Ｃ)進行が漸進的発病及び継続的減退を特徴とする；(Ｄ)認知障害が、記憶及び認知の進行性障害を引き起す他の中枢神経系の、全身性の、又は物質-誘発性の病状によるものではない；及び(Ｅ)混乱が他の神経障害によるものより多くの割合を占めていない、を含む。アルツハイマー病の診断の別の診断基準は、National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer’s Disease and Related Disorder Association(ＮＩＮＤＳ-ＡＤＲＤＡ)研究班のアルツハイマー病の診断基準に基づくものを含んでもよい(例えば、McKhann等, Neurology 1984; 34: 939-944を参照)。簡単に言うとは、アルツハイマー病の可能性についてのＮＩＮＤＳ-ＡＤＲＤＡ診断基準は、非定型の発病、発症、又は進行を有しており、且つ認知症を生じる可能性がある合併疾患の何れもが原因でないと思われる既知の病因を有さない認知症症候群を含む。アルツハイマー病の可能性が高い場合のＮＩＮＤＳ-ＡＤＲＤＡ診断基準は、臨床的及び神経心理学的検査により診断された認知症を含み、(ａ)記憶を含む認知の２以上の領域における進行性障害；(ｂ)年齢４０から９０才の間の発症；(ｃ)幻覚症状を含む認知症症候群を生じる可能性がある全身的な疾患又は他の脳疾患の非存在、を伴う。確定的なアルツハイマー病のＮＩＮＤＳ-ＡＤＲＤＡ診断基準は、アルツハイマー病の可能性が高い場合の診断基準の合致を含み、且つ培検又は生検による病理組織学的エビデンスを有する。
【０１３８】
改訂版ＮＩＮＤＳ-ＡＤＲＤＡ診断基準は、Dubois等(The Lancet Neurology, Volume 6, Issue 8, August 2007, Pages 734-746)によって提案された。下に簡単に概説すると、アルツハイマー病の可能性が高い場合の診断基準に合致するには、罹患者は診断基準Ａ(コアの臨床診断基準)及び少なくとも１又は複数の支持的バイオマーカー診断基準Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＥを満たさなければならない。この場合において、診断基準Ａは以下の特性を含む初期の著しいエピソード記憶障害の存在を特徴とする：(１)６ヶ月以上におよぶ患者又は通知者により報告された記憶機能の段階的及び進行性変化；(２)テストにおける著しく低下したエピソード記憶の客観的証拠：これは、通常、手がかり(cueing)又は再認識テストにより、及び以前は制御されていた情報の効果的なエンコードの後、著しく改善されないか又は正常化されないリコール障害からなる；(３)エピソード記憶障害は、ＡＤの発症時又はＡＤ進行時、他の認知変化から分離されるか又は関連づけられることができる。診断基準Ｂは、例えば、視覚的スコアリングを使用した定性的評価(よく特徴付けられた年齢基準による集団を基準とする)又は興味のある領域の定量的容積測定(よく特徴付けられた年齢基準による集団を基準とする)を伴うＭＲＩにおいて証明された海馬、嗅内皮質、へんとう体の容積減少により示される内側側頭葉萎縮の存在を特徴とする。診断基準Ｃは、異常な脳脊髄液バイオマーカー、例えば低アミロイドβ１−４２濃度、上昇した総タウ濃度、又は上昇したリン酸化タウ濃度、又はその３つの組合せを特徴とする。診断基準Ｃは、ＰＥＴによる機能的神経画像の特異的なパターン、例えば両側の頭頂側頭領域における減少したグルコース代謝を特徴とする。診断基準Ｅは、近親で証明されたＡＤ常染色体優性突然変異を特徴とする。ＡＤは以下が存在するならば、確定的であると考えられる：(１)ＡＤの死後診断のＮＩＡ-Ｒｅａｇａｎ診断基準で要求されるような、疾患の臨床的および組織病理学的(脳の生検又は培検)エビデンス(例えば、Neurobiol Aging 1997; 18: S1-S2を参照)；及び(２)ＡＤの臨床的及び遺伝的エビデンス(第１、１４、又は２１番染色体における突然変異)の両方；診断基準は存在しなければならない。
【０１３９】
本発明の方法において、ＤＲ６アンタゴニストは哺乳動物に、好ましくは担体で；好ましくは薬学的に許容可能な担体で投与される。適した担体及びその製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Osol等編に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容可能な塩が、製剤の等張性を与えるために、製剤中に使用される。担体の例は、生理食塩水、リンガル溶液及びブトウ糖液を含む。溶液のｐＨは好ましくは約５から約８であり、より好ましくは約７から約７．５である。更に担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の除放性製剤を含み、マトリックスは造形品、例えばフィルム、リポソーム又は微粒子である。例えば投与されるＤＲ６アンタゴニストの投与経路及び濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことは当業者にとっては明らかである。
【０１４０】
ＤＲ６アンタゴニストは哺乳動物に注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内)により、経口的に、又は注入のような効率的形態で血流に送達されることが保証される他の方法により、投与することができる。また、ＤＲ６アンタゴニストは、局所的治療効果を発揮させるために、分離組織灌流などの分離灌流技術により、くも膜下腔内に、眼内に、又は腰椎穿刺により投与されてもよい。血液脳関門を容易に渡らないＤＲ６アンタゴニストは直接的に、例えば脳内に又は脊髄腔中に又は他に与えられ、それらを関門を超えて輸送する。ＤＲ６アンタゴニストを投与するための効果的な用量及びスケジュールは実験的に決定されてもよく、当該決定を行うことは当業者の守備範囲である。投与しなければならないＤＲ６アンタゴニストの用量が、例えばアンタゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、使用されるアンタゴニストの特定の種類及び哺乳動物に投与される他の薬物に、大いに依存することを、当業者であれば理解する。適切な用量を選択するための指針は、例えば抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone等編, Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 及びpp. 303-357; Smith等, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber等編, Raven Press, New York (1977) pp. 365-389を参照されたい。単独で使用されるＤＲ６抗体の典型的な１日用量は、上記の要因に応じて、1日あたり体重につき約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。
【０１４１】
また、ＤＲ６アンタゴニストは１又は複数の他の治療薬と組合わせて哺乳動物に投与されてもよい。当該他の治療薬の例は、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)インヒビター、例えばＴａｒｃｅｖａ、Ｃ２２５のような抗体、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ及びＥｒｂｉｔｕx(登録商標)(ImClone Systems Inc.)、完全ヒトＡＢＸ−ＥＧＦ (panitumumab, Abgenix Inc.)、及び米国特許第６２３５８８３号に記載されているＥ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られている完全ヒト抗体等のＥＧＦＲに結合するか又は直接作用してシグナル伝達活性を防ぐか又は減じる化合物；ＭＤＸ−４４７(Medarex Inc)、及び米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５４５７１０５号、米国特許第５４７５００１号、米国特許第５６５４３０７号、米国特許第５６７９６８３号、米国特許第６０８４０９５号、米国特許第６２６５４１０号、米国特許第６４５５５３４号、米国特許第６５２１６２０号、米国特許第６５９６７２６号、米国特許第６７１３４８４号、米国特許第５７７０５９９号、米国特許第６１４０３３２号、米国特許第５８６６５７２号、米国特許第６３９９６０２号、米国特許第６３４４４５９号、米国特許第６６０２８６３号、米国特許第６３９１８７４、国際公開９８１４４５１、国際公開９８５００３８、国際公開９９０９０１６、国際公開９９２４０３７、米国特許第６３４４４５５号、米国特許第５７６００４１号、米国特許第６００２００８号、米国特許第５７４７４９８に記載されているようなＥＧＦＲ小分子インヒビター；ＯＳＩ−７７４(CP-358774, erlotinib,  OSI Pharmaceuticals)を含む特定の小分子ＥＧＦＲインヒビター；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]-、ジハイドロクロリド、ファイザーＩｎｃ.)；Ｉｒｅｓｓａ(ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、アストラゼネカ)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)キナゾリン、ゼネカ)；ＢＩＢＸ−１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、ベーリンガーインゲルハイム)；ＰＫＩ−１６６((Ｒ)-４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ−３８７７８５(Ｎ[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；及びＥＫＢ−５６９(Ｎ[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キナゾリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)を含む。使用されてもよい他の治療薬は、アポトーシスインヒビター、特に細胞内アポトーシスインヒビター、例えばカスパーゼ３、カスパーゼ６、又はカスパーゼ８インヒビター等のカスパーゼインヒビター、Ｂｉｄインヒビター、Ｂａｘインヒビター又はそれらの組合せを含む。適切なインヒビターの例は、通常はカスパーゼインヒビター、ジペプチドインヒビター、カルバミン酸インヒ��ター、置換アスパラギン酸アセタール、ヘテロシクリルジカルバミド、キノリン(ジ-、トリ-、テトラペプチド)誘導体、置換２-アミノベンズアミド・カスパーゼ・インヒビター、置換ａ-ヒドロキシ酸カスパーゼインヒビター、ニトロシル化による阻害；ＣＡＳＰ-１；ＣＡＳＰ-３：タンパク質インヒビター、アンチセンス分子、ニコチニル-アスパルチル-ケトン、y-ケト酸ジペプチド誘導体、ＣＡＳＰ−８：アンチセンス分子、相互作用タンパク質ＣＡＳＰ-９、ＣＡＳＰ２：アンチセンス分子；ＣＡＳＰ-６：アンチセンス分子；ＣＡＳＰ-７：アンチセンス分子；及びＣＡＳＰ-１２インヒビターである。更なる例は、Ｂｃｌ-２調節因子、Ｂａｄ由来ののＢｃｌ-２突然変異ペプチド、Ｂａｄ、ＢＨ３相互作用ドメイン・デス・アゴニスト、Ｂａｘインヒビタータンパク質及びＢＬＫ遺伝子及び遺伝子産物などのミトコンドリアインヒビターである。アポトーシスの適切な細胞内修飾因子は、ＣＡＳＰ９／Ａｐａｆ-１会合、Ａｐａｆ-１発現のアンチセンス修飾因子、アポトーシス阻害用ペプチド、ヘルペス・シンプレクス(Herpes Simplex)ウイルスのＲ１サブセットを含む抗アポトーシス組成物、ＭＥＫＫ１及びその断片、スルビビン修飾因子、アポトーシス及びＨＩＡＰ２のヒンヒビターの修飾因子である。これらの作用剤の更なる例は、ミトコンドリアからのチトクロームＣ放出を抑制し、カスパーゼ３  ｍＲＮＡ上方制御を制御するミノサイクリン(Neuroapoptosis Laboratory)、ｐ５３インヒビターであるピフィスリンα(ＵＩＣ)、ＪＮＫ経路インヒビターであるＣＥＰ-１３４６(Cephalon Inc.)、プロアポトーシスのＧＡＰＤＨシグナル伝達を阻害するＴＣＨ３４６(Novartis)、汎カスパーゼインヒビターであるＩＤＮ６５５６(Idun Pharmaceuticals)；カスパーゼ３インヒビターであるＡＺＱｓ(アストラゼネカ)、カスパーゼ１／４インヒビターであるＨＭＲ-３４８０(Aventis Pharma)、血栓を溶解するＡｃｔｉｖａｓｅ／ＴＰＡ(ジェネンテック)(血栓溶解薬)である。
【０１４２】
ＤＲ６アンタゴニストに加えて投与されてもよい他の適切な作用剤は、コリンエステラーゼインヒビター(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、タクリン等)、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト(メマンチン)Ａβ凝集インヒビター、抗酸化剤、γ分泌酵素修飾因子、ＮＧＦ模倣体又はＮＧＦ遺伝子治療、ＰＰＡＲγアンタゴニスト、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素インヒビター(スタチン)、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡレセプターアンタゴニスト、グリコーゲン合成酵素キナーゼインヒビター、免疫グロブリン静注、ムスカリンレセプターアゴニスト、ニコチン受容体修飾因子、能動的又は受動的Ａβ免疫化、ホスホジエステラーゼインヒビター、セロトニンレセプターアンタゴニスト及び抗Ａβ抗体(例えば、国際公開２００７／０６２８５２；国際公開２００７／０６４９７２；国際公開２００３／０４０１８３；国際公開１９９９／０６０６６；国際公開２００６／０８１１７１；国際公開１９９３／２１５２６；欧州特許０２７６７２３Ｂ１；国際公開２００５／０２８５１１；国際公開２００５／０８２９３９を参照)を含む。
ＤＲ６アンタゴニストは１又は複数の他の治療薬と連続して又は同時に投与されてもよい。ＤＲ６アンタゴニスト及び治療薬の量は、例えば使用される薬剤がどんな種類か、治療される病的状態、及び投与のスケジュール及び経路に依存するが、それぞれを個々に使用する場合よりも通常は少ない。
哺乳動物へのＤＲ６アンタゴニストの投与に続いて、哺乳動物の生理学的状態が臨床医がよく知っているさまざまな方法でモニターされうる。
【０１４３】
本発明のＤＲ６アンタゴニストの治療的効果は、インビトロアッセイで、およびインビボ動物モデルを使用して調べられうる。さまざまな周知のアッセイ及び動物モデルを候補治療薬の効果を試験するために使用することができる。当該モデルのインビボの性質は、特にヒト患者での応答の予測をする。さまざまな神経変性疾患の動物モデル及び神経変性のこれらのモデルに関連する病理学的過程を(例えば、ＤＲ６アンタゴニストの存在下及び非存在下で)検査するための関連技術は、下の実施例１４において議論する。
さまざまな神経疾患の動物モデルは、非組換え体及び組換え体(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え体動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。当該モデルは、標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、及び腎被膜下移植を使用して、同系マウスに細胞を導入することによって作成されうる。インビボモデルは脳卒中／脳虚血のモデル、パーキンソン病のマウスモデル；アルツハイマー病のマウスモデル；筋萎縮性側索硬化症ＡＬＳのマウスモデル；脊髄性筋萎縮症ＳＭＡのマウスモデル等の神経変性疾患のインビボモデル、局所的脳虚血及び全脳虚血マウス／ラットモデル、例えば、一般的な頸動脈閉塞モデル又は中大脳動脈閉塞モデル；又はエキソビボ全胚培養を含む。さまざまなアッセイは、下記のように又は当分野で既知であり文献に記載されている既知のインビトロ又はインビボ形式で実施されてもよい(例えば、McGowan等, TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006)；Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005)；Wong等, Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)を参照)。また、さまざまな当該動物モデルは、Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org参照)等の業者から入手可能である。
【０１４４】
当分野で既知の多くの動物モデルが、ＡＤ等の神経疾患における本明細書で開示されるＤＲ６アンタゴニストの活性を検査するために使用されうる(例えば、Rakover等, Neurodegener Dis. 2007; 4(5): 392-402; Mouri等, FASEB J. 2007 Jul;21(9):2135-48; Minkeviciene等, J Pharmacol Exp Ther. 2004 Nov;311(2):677-82 and Yuede等, Behav Pharmacol. 2007 Sep;18(5-6):347-63を参照)。例えば、マウスの認知機能における本願明細書で開示されるＤＲ６アンタゴニストの効果は、物体再認知テストを使用して検査されうる(例えば、Ennaceur等, Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59を参照)。例えば、脳の炎症における本明細書で開示されるＤＲ６アンタゴニストの活性は、マウスで、例えば組織化学的解析によって、及びマウス血漿分画でＩＬ-１β及びＴＮＦ-α及び抗炎症サイトカインＩＬ-１０等の炎症マーカーのレベルを測定することを目的とするＥＬＩＳＡプロトコルによって、検査されうる(例えば、Rakover等, Neurodegener Dis. 2007;4(5):392-402を参照)。
【０１４５】
アルツハイマー病(ＡＤ)等の神経疾患における本明細書で開示されたＤＲ６アンタゴニストのヒトでの効果は、例えば全体的評価と併せて認知結果判定法の使用を通して検査されうる(例えば、Leber P: Guidelines for the Clinical Evaluation of Antidementia Drugs, 1st draft, Rockville, MD, US Food and Drug Administration, 1990を参照)。ＡＤ等の神経疾患における効果は、例えば、単一又は複数の判断基準を使用して検査されうる。例えば、欧州医薬品審査庁 (ＥＭＥＡ)は、機能的及び全体的活動の両方における認知及び安定の改善の事前に設定した程度に対応する応答者の定義を導入した(例えば、European Medicine Evaluation Agency (EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the Treatment of Alzheimer’s Disease. London, EMEA, 1997)。作用剤への患者の応答性を評価するために、単独で又は組合わせて使用されうる特定の確立された検査の多くは、当分野で既知である(例えば、Van Dyke等, AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)を参照)。例えば、作用剤への反応性は、より重度のＡＤを有する患者での認知の変化を測定する為に使用する試験である、the Severe Impairment Battery(ＳＩＢ)を使用して評価されうる (例えば、Schmitt等, Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11(suppl 2):51-56を参照)。また、作用剤への応答性は、認知症の後期を対象とし且つ有効である、日常生活で行われる活動に独立のレベルを測定する１９項目インベントリーであるthe 19-item Alzheimer’s Disease Cooperative Study Activities of Daily Living inventory (ADCSADL19)を使用して測定されうる(例えば、Galasko等, J Int Neuropsychol Soc 2005; 11:446 453を参照)。また、作用剤へ応答性は、患者と介護士の両方への構造化インタビューに基づいて評価される７ポイントの全体変化である、the Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input (CIBIC-Plus)を使用して測定されうる(例えば、Schneider等, Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11(suppl 2):22 32を参照)。また、作用剤への応答性は、介護士のインタビューに基づいて１２の行動上の症状の頻度及び重症度を評価する、the Neuropsychiatric Inventory (ＮＰＩ)を使用して測定されうる(例えば、Cummings等., Neurology 1994; 44:2308-2314)。
【０１４６】
さまざまなコリンエステラーゼインヒビター(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン及びタクリン、並びにメマンチン、N-メチル-D-アスパレート(ＮＭＤＡ)レセプター・アンタゴニスト)は、アルツハイマー病の治療のための規制認可を受けている(例えば、Roberson等, Science 314: 781-784 (2006)を参照)。軽度から中等度の重症度のＡＤを有する患者におけるコリンエステラーゼ・インヒビターの臨床試験において、治療反応の共通の定義は、６ヶ月を超えるthe Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale (ADAS-cog)における少なくとも４ポイントの改善を含む(例えば、Winblad等, Int J Geriatr Psychiatry 2001; 16: 653-666; Cummings J., Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: 131-145; 及び Lanctot等, CMAJ 2003; 169: 557-564を参照)。また、これらの結果は、それぞれ約６ヶ月又は１年までに、反転する疾患過程と比較される(例えば、Doraiswamy等, Alzheimer Dis Assoc Disord (2001) 15: 174-183を参照)。メマンチンの臨床試験において、治療の応答者は、全体的能力の低下を示さず、且つ機能的能力かまたは認知能力に低下を示さない患者として事前に指定されている (例えば、Reisberg等, N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1333-1341を参照)。コリンエステラーゼ・インヒビター・ドネベジルの安定的用量を摂取した患者におけるメマンチンの別の試験は、メマンチンが、the Severe Impairment Battery (ＳＩＢ)及び修正した19-item AD Cooperative Study-Activities of Daily Living Inventory (ＡＤＣＳ-ＡＤＬ１９)、a Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input (ＣＩＢＩＣ-Ｐｌｕｓ)、the Neuropsychiatric Inventory (ＮＰＩ)、及びthe Behavioral Rating Scale for Geriatric Patients (BGP Care Dependency Subscale)のベースラインからの差を含む結果測定において、ブラセボを超える効果を示すことを特徴とする(例えば、Tariot等, JAMA 2004; 291:317-324)。メマンチンは、更に複数のＳＩＢ、ＡＤＣＳ-ＡＤＬ１９、ＣＩＢＩＣ-Ｐｌｕｓ及びＮＰＩ結果測定にわたって症状の改善及び安定化の両方を生じることによって、効果的であると特徴づけられる(例えば、van Dyck等, AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)を参照)。
【０１４７】
ＤＲ６アンタゴニスト診断的適用
家族性アルツハイマー病 (ＦＡＤ)又は常染色体優性早期発症型アルツハイマー病 (ＡＤＥＯＡＤ)は、常染色体優性形式で遺伝しうる、通常は、６５歳前(通常は、２０歳と６５歳の間)と定義された一生の早期に襲うアルツハイマー病のまれな型を指す。アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)、プレセニリン１(ＰＳＥＮ１)、及びプレセニリン２(ＰＳＥＮ２)遺伝子の研究は、これらの遺伝子における突然変異がＡＤＥＯＡＤが認められた症例の大多数に関与しているというエビデンスを提供する(例えば、Raux等., Journal of Medical Genetics 2005;42:793-795を参照)。しかしながら、この症候群が認められた症例の多くは、説明が付かないままである。本明細書に提示するデータは、デスレセプター６のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド変異体が、ＦＡＤ及び／又は他の神経疾患のいくつかの症例に関与している可能性を示唆する。本発明の実施形態は、配列番号１を含むデスレセプター６(ＤＲ６)ポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定する方法であり、ＤＲ６のポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定するために、個体に存在するＤＲ６ポリペプチドの配列と配列番号１を比較することを含む方法を含む。当該方法において、場合によっては、患者は、ＦＡＤ及び／又は他の神経疾患を有するか、又は有することが疑われている。
【０１４８】
この場合、患者試料のＤＲ６ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、臨床試料および細胞株の組織免疫学的解析、インサイツハイブリダイゼーション、ＲＴ-ＰＣＲ解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって、(例えば、ＤＲ６の天然に存在する変異体を同定するために)解析されてもよい。ＤＲ６遺伝子の配列(例えば、ＤＲ６  ５’及び３’調節配列、イントロン、エキソン及びその類)及びＤＲ６遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ausubel等編集, 2007, Current Protocols In Molecular Biology, 第２部 (ノザンブロット法)、４部(サザンブロット法)、１５部(イムノブロット法)及び１８部(ＰＣＲ解析)を参照することができる。
【０１４９】
当該解析の例示的な実施形態において、ＤＲ６ポリペプチド及び／又はそこで発現するｍＲＮＡ配列を、イムノアッセイ、ノザンブロットアッセイ又はポリヌクレオチド配列解析等の手順によって解析できる(例えば、Lane等, Laryngoscope. 2002; 112(7 Pt 1):1183-9；及びSilani等, Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 200; 2 Suppl 1:S69-76を参照)ように、神経細胞は神経疾患を有する患者又は神経疾患が疑われている患者から採取される。発明のいくつかの実施形態において、患者の神経細胞(場合により、インビトロ培養で継代されうる)から採取されたＤＲ６ポリペプチドは、ウエスタンブロット解析などのイムノアッセイによって解析されうる(例えば、Pettermann等, J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)を参照)。あるいは、ＤＲ６遺伝子のコード領域の部分又は全部が、例えば、患者の神経細胞から抽出したｍＲＮＡ配列の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)によって解析されうる。本発明の他の実施形態において、ＤＲ６ゲノム配列は、神経細胞以外の細胞、例えば線維芽細胞又は末梢血白血球から採取され、次にこれらのゲノム配列がＤＲ６のポリペプチドをコードするか、及び／又はＤＲ６のポリヌクレオチド変異体(例えば、細胞におけるＤＲ６発現のレベルに影響する、５’及び３’調節配列変異体を含む)をもっているかどうかを決定するために解析される。本発明のいくつかの実施形態において、当該解析は、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)、プレセニリン１(ＰＳＥＮ１)、及びプレセニリン２(ＰＳＥＮ２)遺伝子の解析で模倣されうる(例えば、Nagasaka等, Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102(41):14854-9;及びFinckh等, Neurogenetics. 2005;6(2):85-9を参照)。
【０１５０】
ＤＲ６アンタゴニストを同定する為のスクリーニング方法
本発明の実施形態はＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害する興味のある分子を同定する方法であり、興味のある分子の存在下又は非存在下でＤＲ６及びＡＰＰを組合わせること；次に前記興味のある分子の存在下でＤＲ６のＡＰＰへの結合の阻害を検出することを含む方法を含む。特に、本発明で提供される開示を使用して、ＤＲ６及び／又はＡＰＰと相互作用し、ＤＲ６とＡＰＰとの間の相互作用を阻害するタンパク質、小分子、及び他の分子を同定することができる。この方法の例示的な実施形態において、ＤＲ６はマトリックス上に固定化されうる。次に、遊離したＡＰＰ(例えば、発色マーカー、蛍光タグ、放射性標識、磁性タグ、または酵素反応製品などで標識化されたＡＰＰ)の固定化ＤＲ６に結合する能力が、興味のある分子の存在下及び非存在下で観察されうる。ＤＲ６に結合するＡＰＰの減少(例えば、検出可能なマーカーのレベル及び／又は位置の変化を介して認められる)は、次にＤＲ６を結合するＡＰＰの能力を阻害するような分子を同定するために使用されうる。本発明の別の実施形態において、ＡＰＰは、興味のある分子の存在下及び非存在下で、遊離したＤＲ６(例えば、検出可能なマーカーで標識化されたＤＲ６)を結合するＡＰＰの能力を検出する為にマトリックス上に固定化されうる。当該実施形態において、場合によっては、興味のある分子は抗体でありうる。
本発明で提供される開示は、当技術分野で使用されるさまざまなプロトコルにより、ＤＲ６とＡＰＰとの間の結合相互作用を阻害する分子を同定するために使用されるＤＲ６及びＡＰＰのようなポリペプチド間の結合を特徴付けることを可能にする。本発明の当該実施形態は、ＥＬＩＳＡアッセイ(例えば、米国特許第６８５５５０８号；６１１３８９７号及び７２４１８０３号で開示されるような競合的又はサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ)、(例えば、Pettermann等, J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)及び下の実施例１０で開示されるような)ウエスタンブロットアッセイ、(例えば、下の実施例１０で開示されるような)免疫組織学的アッセイ、ＩＡｓｙｓ解析及びＣＭ-５(ＢＩＡｃｏｒｅ)センサーチップ解析(例えば、米国特許第６７２０１５６号及び７１０１８５１号)を使用するものを含む。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害する興味のある分子の同定方法はタンパク質マイクロアレイを使用する。タンパク質マイクロアレイは、典型的には、定義済みの場所で表面上に固定化された興味のあるタンパク質分子(例えば、ＤＲ６及び／又はＡＰＰ)を使用し、小分子結合タンパク質を同定するために使用される(例えば、Wilson等, Curr. Opinion in Chemical Biology 2001, 6, 81-85；及びZhu, H.等, Science 2001, 293, 1201-2105を参照)。
【０１５１】
神経変性を抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法
本発明は、神経変性を抑制する化合物を同定するための細胞ベースのスクリーニング方法を提供する。実施例のアッセイは、神経変性を引き起こす事象により、ＡＰＰがニューロンの表面から分断されることを示す。また、この分断のインヒビターは神経変性を予防する。ゆえに、神経変性の抑制の指標としてこの情報を使用することができる。
この方法は、細胞を候補化合物の有無の下で培養するアッセイを実施することを伴う。神経変性のためのトリガーを与え、候補化合物の存在下でのＡＰＰの分断を、候補化合物の非存在下で観察される分断と比較する。候補化合物が観察される分断を抑制する場合、それは神経変性を抑制する化合物である。神経変性のトリガーは、限定するものではないが、力学的破壊、栄養分又は栄養性因子(例えばＮＧＦ)の欠乏といった神経変性の任意の公知のトリガーでありうる。候補化合物が加えられる培養条件及びアッセイの例を下記の実施例に示す。場合によって、培養物中および／またはＣａｍｐｅｎｏｔチャンバ中で移植片が培養されてよく、変性のトリガー(例えばＮＧＦ欠乏)が候補化合物の有無の下で惹起されてよい。
候補化合物は、少なくとも１０−３０％、３０−５０％、５０−７０％、７０−９０％又は９０−１００％(これらの範囲内のすべての数字を含む)分断を抑制するものである。分断は、以降の実施例に記載のような、ポリクローナル血清又はモノクローナル抗体のようなＡＰＰに対する抗血清を用いて観察されうる。Ｂａｘインヒビターを培地に添加して、軸索変性によるタンパク質の非特異的欠失を抑制してもよい。
このようなアッセイで同定される化合物は、神経学的疾患の予防又は治療に有用である。
【０１５２】
キット及び製造品
本発明の更なる実施形態において、神経疾患を治療する為に有用な材料を含む製造品及びキットが提供される。製造品は、ラベルを有する容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよく、好ましくは滅菌される。容器には、アルツハイマー病を含む神経疾患を治療するために効果的な活性剤を有する組成物が入る。組成物中の活性剤は、ＤＲ６アンタゴニストであり、好ましくは抗ＤＲ６モノクローナル抗体又は抗ＡＰＰモノクローナル抗体である。容器のラベルは、組成物が神経疾患を治療する為に使用されることを表示し、また上記のようなインビボまたはインビトロの使用の指示が表示されてもよい。製造品またはキットは、場合によっては、適応症、用途、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合わされている他の治療用製品、及び／または当該治療用製品の使用に関する警告などについての情報を含む、治療用製品の商業用パッケージに習慣的に含まれる指示を示す添付文書を更に含む。
本発明のキットは、上記の容器及びバッファーを含む第２の容器を含む。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上の及び利用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
【実施例】
【０１５３】
さらに、本発明の様々な態様を以下の実施例によって記載し、例示する。これらは本発明の権利範囲を減縮するためのものではない。
【０１５４】
実施例１：胚の及び成体の中枢神経系におけるＤＲ６発現
マウス胚組織におけるＴＮＦレセプタースーパーファミリー発現パターンのＲＮＡインサイツスクリーニングを実施した。より具体的には、インサイツハイブリダイゼーション実験を、ｍＲＮＡロケーターキット(Ambion, Cat. No.1803)を使用して、製造者のプロトコルに従って行った。以下のＤＲ６  ｃＤＮＡの一次配列は、これらの実験のリボプローブの作成に使用した:
2011524523.tif 000004
リボプローブのインビトロ合成のために、マキシスクリプト(Maxiscript)キット(Ambion, Cat. No. 1308)を、製造者のプロトコルに従って使用した。
【０１５５】
図２Ａに示すように、神経細胞死が起こることがわかっているステージであるＥ１０からＥ１２ステージで、発生中の脊髄及び後根神経節細胞において、ＤＲ６は、成長中の前駆体よりも、分化したニューロンで、ほとんど独占的に発現していた。
図２Ｂに示すように、ＤＲ６タンパク質は、ニューロンの細胞体及び軸索の両方において発現している。
図２Ｂでは、上段の２つの写真は、ＤＲ６(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化した正常なマウスのニューロンを示す。対比して、下段の２つの写真は、ＤＲ６(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化したＤＲ６ノックアウトマウスのニューロンを示す。
この図で示したデータを作成するために使用した材料と方法は以下の通りである。例えば図２Ｂで示したように感覚軸索において、ＤＲ６タンパク質発現の可視化のためには、ＤＲ６特異的マウスモノクローナル抗体を、ヒト組換え体ＤＲ６を免疫原として使用してジェネンテックにおいて作成した(下の実施例３を参照)。さらに、これらの抗体は、細胞表面上で発現する全長マウスＤＲ６及びヒトＤＲ６を認識する能力に関して免疫蛍光によってスクリーニングした。「３Ｆ４．８．８」ｍＡｂとも称され、さらに下の実施例３および実施例７に記載されている上記のある抗体は、ヒト及びマウスＤＲ６ポリペプチドの両方と交差反応するものであり、図２Ｂで示すように軸索におけるＤＲ６発現を可視化するために使用した。免疫蛍光染色手順は、当該分野で既知の標準的プロトコルを使用して実施した(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)。軸索におけるＤＲ６発現を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で写真を撮った。
【０１５６】
図２Ｃで示すように、ＤＲ６  ｍＲＮＡは分化したニューロンで発現している。図２Ｃの左から右において、３枚の写真は、それぞれ、発生ステージＥ１０．５、Ｅ１１．５およびＥ１２．５における正常マウスのニューロンの脳スキャンを示す。
この図で示したデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。発生中のマウス胚におけるＤＲ６  ｍＲＮＡ発現を可視化するために、ＤＲ６  ３’ＵＴＲ特異的放射標識化ＲＮＡプローブによるインサイツｍＲＮＡハイブリダイゼーション(ＩＳＨ)を、Ｅ１０．５−Ｅ１２．５マウス胚の胸部軸レベルで取られた２０μｍ組織横断切片上で実施した。ｍＲＮＡロケーター・インサイツ・ハイブリダイゼーションキットを、ＩＳＨ実験を行うために、ｍＲＮＡロケータ使用説明書に沿って、製造者のプロトコルに従って使用した(Ambion Inc., Cat. No. 1803)。マウスＤＲ６  ３’ＵＴＲのアンチセンス配列に対応する放射標識化ｍＲＮＡプローブは、マキシスクリプトキットを使用して、製造者の指示マニュアルに従って、インビトロ翻訳反応で作成された(Ambion Inc., Cat. No. 1308-1326)。ＤＲ６  ｍＲＮＡ発現データは、肺組織横断切片を有するスライドに塗られたコダック・オートラジオグラフィー乳剤(コダック)を使用して可視化した。写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で暗視野で撮影した。
これらの実験でリボプローブを作成するために使用したＤＲ６  ｃＤＮＡの一次配列は以下のとおりである：
2011524523.tif 000005
Allen Brain Atlas(http://www.brainatlas.org/aba/; the Allen Brain Atlasはマウス脳における約２０，０００遺伝子の発現のマップを提供する公的に利用可能な科学的リソースである)を使用した更なる解析は、ＤＲ６は成体脳の大脳皮質で高度に発現することを明らかにした。ＤＲ６  ｍＲＮＡは、例えば皮質ニューロン、海馬ＣＡ１−ＣＡ４錐体ニューロン及び歯状回で発現する。ＤＲ６タンパク質は、成体の皮質及び海馬のニューロン細胞体で発現する。
このパターンの発現は、発生における役割の他に、ＤＲ６がニューロン細胞消失を伴う神経変性疾患の進行で機能する可能性もあるというエビデンスを提供する。
【０１５７】
実施例２：ＲＮＡ干渉によるＤＲ６発現の阻害は外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を防ぐ
交連ニューロンは、発生ステージＥ９．５からＥ１１．５の間の背側脊髄に生じる長突起脊髄介在ニューロンの群である。交連ニューロンは、その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存していると考えられている。軸索が底板に沿って伸びた時、それらが追加の栄養の要求を起こした後に、この依存は数日間生じる。ついでながら中間軸索標的に由来する栄養支持へのニューロンの依存は、間違って突出したニューロンを急速に除去する機構を提供し、それは神経系の発生の間の異常な神経回路の形成を防ぐことを助ける可能性がある(Wang等, Nature, 401:765-769 (1999)。
交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸索変性におけるＤＲ６の機能的役割を調べるために、ＲＮＡｉに基づく背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, supra, 1999)を実施した(図３参照)。Ｅ１３ラット又はＥ１１．５マウスの胚は、Ｌ１５培地(ギブコ)に置き、緑色蛍光タンパク質(「ＧＦＰ」)をコードするプラスミドと一緒にｓｉＲＮＡ(ＩＤＴ)は神経管中に注入した。そして、ｓｉＲＮＡ及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、３Ｄコラーゲンゲル基質中に埋め、組換え体ネトリン１(R&D Pharmaceuticals)及び５％馬血清(シグマ)を有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地(インビトロジェン)中で、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養した。化学誘因物質ネトリン１に応答して１６時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、ＧＦＰ蛍光で可視化される。
【０１５８】
図４Ａに示すように、底板に由来する栄養因子支持の非存在下での培養の４８時間後、交連ニューロンはプログラム細胞死及び軸索変性を受ける(Wang等, 上掲, 1999を参照)。交連ニューロンにおけるＤＲ６発現がＤＲ６特異的ｓｉＲＮＡ分子により下方制御された場合、当該軸索変性は著しく遮断される(図４、下段パネル参照)。この軸索変性の阻害は、非標的ｓｉＲＮＡ分子によるコントロール実験では観察されなかった。データは、ＤＲ６が、その中間標的である脊髄の底板からの栄養支持の離脱時の、交連ニューロンの軸索変性に必要な重要なプロアポトーシスレセプターであることを示唆する。
図４Ｂに示すように、ＲＮＡｉ抵抗性ＤＲ６  ｃＤＮＡは、ＤＲ６  ｓｉＲＮＡにより遮断された変性表現型を救済する。
図４Ｂの左から右において、上段の４つの写真は、(１)コントロールＲＮＡｉ；(２)ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃３に暴露された野生型ＤＲ６；(３)ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃２に暴露されたミスマッチＤＲ６の存在下でのニューロンを示す。下段の２つの写真は、(１)コントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ＃２、及びｓｉＲＮＡ＃３の存在下での野生型ＤＲ６  ｍＲＮＡ；及び(２)コントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ＃２、及びｓｉＲＮＡ＃３の存在下でのミスマッチＤＲ６  ｍＲＮＡのオートラジオグラムを示す。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸策変性におけるＤＲ６レセプターの生理学的な役割を推定するために、当分野で既知のプロトコルに従った背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))を実施した(データは図４Ｂに示す)。Ｅ１３ラット胚を、Ｌ１５培地(ギブコ)に置き、以下のｓｉＲＮＡコンストラクトをそれらの神経管中に注入した(図４Ｂ)：
5’-AAUCUGUUGAGUUCAUGCCUU-3’  (配列番号:１１)
5’-CAAUAGGUCAGGAAGAUGGCU-3’  (配列番号:１２)
5’-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3’  (配列番号:１３)
野生型又はミスマッチＤＲ６  ｃＤＮＡのどちらか及びＧＦＰをコードするプラスミドと合わせた、コントロール非標的、又は標的ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃２、又は標的ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃３(ＩＤＴ)。ＤＲ６  ｃＤＮＡ及びＧＦＰ  ｃＤＮＡは、ｐＣＡＧＧＳベクター・バックボーン(ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰから市販されている)にサブクローニングした。ｓｉＲＮＡ及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、３Ｄコラーゲン・ゲル・マトリックス中に埋め、組換え体ネトリン１及び５％馬血清(シグマ)を有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地(インビトロジェン)中で、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養した。化学誘因物質ネトリン１に応答して１６時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、ＧＦＰ蛍光で可視化される。底板に由来する栄養因子支持の非存在下での培養の４８時間後、交連ニューロンはプログラム細胞死及び軸索変性を受ける(Wang等., Nature, 401:765-769 (1999)) (図４Ｂ)。しかしながら、軸索変性プログラムは標的ＤＲ６特異的ｓｉＲＮＡ＃３の導入によって、遮断されうる(図４Ｂ)。ＤＲ６特異的ｓｉＲＮＡ＃３の特異的で的確な効果は、軸索変性表現型が、ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃３と一緒のｓｉＲＮＡ＃３抵抗性ミスマッチＤＲ６  ｃＤＮＡコンストラクトの共発現によって回復する救済実験において、さらに確認される(図４Ｂ)。提示した実験のエビデンスは、ＤＲ６レセプター機能が、その中間標的である脊髄の底板からの離脱時に、軸索変性及び交連ニューロンの死に必須であることを立証する。
上記のアッセイで使用したＤＲ６  ｓｉＲＮＡｓ＃２及び＃３の配列(センス鎖)、及びＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃３配列に相補的なＤＲ６  ｃＤＮＡのミスマッチ断片は以下のとおりである：  
ラットＤＲ６  siRNAs #2:5’-AAUCUGUUGAGUUCAUGCCUU-3’ (配列番号１１)
ラットＤＲ６  siRNAs #3:5’-CAAUAGGUCAGGAAGAUGGCU-3’ (配列番号１２)
ＤＲ６  ｓｉＲＮＡ＃３配列に相補的なラットＤＲ６  ｃＤＮＡのミスマッチ断片：5’-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3’ (配列番号１３)
【０１５９】
実施例３：抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６レセプター・シグナル伝達の阻害は外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を防ぐ
(上の実施例２に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを抗ＤＲ６抗体を使用して実施した。(ＧＦＰ用の緑色蛍光チャンネルを使用した)顕微鏡観察を交連軸索を可視化するために使用した。背側脊髄生存アッセイは、上の実施例２に概説した変更を加えて、当分野で既知のプロトコルに従って実施した(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))。Ｅ１３ラット胚は、ＧＦＰ発現プラスミドコンストラクトと共に神経管中に注入した(ＧＦＰ  ｃＤＮＡは、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰから市販されているｐＣＡＧＧＳベクターバックボーン中にサブクローニングした)。ＧＦＰ発現プラスミドは、次にエレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与した。抗ＤＲ６遮断抗体又はコントロール正常マウスＩｇＧを、交連外植片に、プレーティング２４時間後、４０μｇ／ｍｌで加えた。交連外植片の写真を、下に概説するように、プレーティング４８時間後、撮影した。ＧＦＰを発現する交連軸索を可視化するために、写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡(ＧＦＰ用の緑色蛍光チャンネル)で撮影した。
この実験で使用した抗ＤＲ６抗体は以下のように作製した。
Ｆｃに融合したヒトＤＲ６細胞外ドメイン配列(ｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃ)を免疫原として抗ＤＲ６マウスモノクローナル抗体を作製するために使用した。使用したｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃ免疫原は以下のとおりである。
2011524523.tif 000006
【０１６０】
融合ポリペプチドは、前に記載されたイムノアドヘシンプロトコルを使用して作成した(Ashkenazi等, Curr Opin Immunol.,9(2):195-200 (1997); Haak-Frendscho等, J Immunol., 152(3):1347-53 (1994))。
９週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを、約８週間にわたって、１００μｌのｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃの注射により免疫化した。次に、免疫化した全てのマウスのリンパ節(１１×１０６細胞／ｍｌ、５ｍｌ)をＰＵ．１骨髄腫細胞(ＡＴＣＣからのマウス骨髄腫細胞)と、濃度５×１０６細胞／ｍｌ、５ｍｌで融合した。細胞は、２×１０６細胞／ｍｌで４プレートにまいた。
捕捉ＥＬＩＳＡを、上記のｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃポリペプチドに特異的に結合するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。プレートは、４℃で一晩、５０μｌの２μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  specific(Cappel Cat. No. 55071)でコートした。プレートをＢｒｉｊを加えたＰＢＳで３回洗浄し、プレートは２００μｌの２％ＢＳＡで、１時間室温でブロックした。次にプレートはＢｒｉｊを加えたＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌの第１抗体をウェルに入れ、シェーカー上で１時間インキュベートした。再度、プレートをＢｒｉｊを加えたＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌのヒツジ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ(ヒトへの交差なし、Cappel Cat. No. 55569)抗体、１：１０００で１時間。プレートはＢｒｉｊを加えたＰＢＳで３回洗浄した。５０μｌの基質(ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼKPL#50-76-05)を加え、プレートを５分間インキュベートした。反応は５０μｌ／ウェルのストップ溶液(KPL #50-85-05)で止めた。吸光度は４５０ｎｍで読んだ。使用したアッセイ・バッファーはＰＢＳ、５％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいた。
捕捉ＥＬＩＳＡでｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃポリペプチドへの結合性が陽性と検査されたハイブリドーマは、次に限界希釈法によりクローニングした(１０％ＨＣＦ、１０％ＦＣＳを含むＳＣＤＭＥ培地)。１０日後のプレートを取り出し、１つのコロニーを有するウェルを上記の捕捉ＥＬＩＳＡでアッセイした。さまざまな選択されたモノクローナル抗体がイソタイプを検査され、ＩｇＧ１イソタイプであることが示された。
「３Ｂ１１．７．７」；「３Ｆ４．４．８」；「４Ｂ６．９．７」；及び「１Ｅ５．５．７」として同定された４つの抗ＤＲ６ｍＡｂｓは、軸索変性を阻害する能力について、背側脊髄生存アッセイで試験された。
特に、いくつかのこれらの抗ＤＲ６ｍＡｂｓ(３Ｆ４．４．８；４Ｂ６．９．７；及び１Ｅ５．５．７)は、培養において、４８時間の栄養欠乏により誘導された交連ニューロンの軸索変性を部分的に抑制できた(図５参照)。当該抗体は、例えば、推定ＤＲ６リガンドとＤＲ６レセプターとの間の相互作用を遮断することによって、又はリガンド非依存性ＤＲ６シグナル伝達を阻害することによって、ニューロンの生存を促進する可能性があると考えられている。３Ｂ１１．７．７ＤＲ６抗体は、軸索変性の誘導において、わずかな促進作用を有していた。
【０１６１】
実施例４：ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫｉ)の特異的ペプチドインヒビターによるＤＲ６レセプターシグナル伝達の阻害
ＤＲ６レセプターはＪＮＫの活性化を介してシグナル伝達されることが報告されており、ＪＮＫ活性はＤＲ６ヌルマウスモデルで損なわれていることが認められた(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); Zhao等, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001))。軸索変性におけるＤＲ６-ＪＮＫシグナル伝達の役割を調べるために、ＪＮＫシグナル伝達経路が、ペプチドインヒビターであるＬ-ＪＮＫ-Ｉ((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20; Calbiochem)を１μＭ濃度で使用することによって、交連ニューロンにおいて遮断されたことを除いて、(上の実施例２に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを実施した。ＤＭＳＯ(シグマ)及び正常マウスＩｇＧをコントロールとして試験した。
図６に示したように、このＪＮＫシグナル伝達の阻害は背側脊髄生存アッセイで軸索変性を部分的に遮断した。データは、ＤＲ６は、少なくとも一部分においてはＪＮＫ経路を介して軸索突起の変性に信号をおくることを示唆する。 
【０１６２】
実施例５：抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６レセプターシグナル伝達の阻害はマウス胚の脊髄における神経細胞死を防ぐ
ＤＲ６シグナル伝達が全胚培養系において抗ＤＲ６ｍＡｂｓによって遮断されるアッセイを実施した。下に記載するように、この系により、全マウス胚を発生ステージＥ９．５〜Ｅ１１．５から、２日間バイアル中でインビボで培養することができる。Ｅ９．５胚は、胚に付着する卵黄嚢を有する子宮から切り出され、１００％ラット血清(Harlan)中、３７℃で、第一日目は６５％酸素雰囲気で及び第２日目９５％酸素で培養した。(上の実施例に記載の)抗ＤＲ６ｍＡｂｓを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度でアッセイに加え、濃度１０μｇ／ｍｌの正常マウスＩｇＧ抗体をコントロールとして使用した。
切断されたカスパーゼ３を認識する抗体(R&D  Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ３の抗体)による免疫蛍光染色を検出に使用し、顕微鏡によってアポトーシス細胞を観察した。結果は図７に図示する。特に、抗ＤＲ６ｍＡｂｓ  ３Ｆ４．４．８；４Ｂ６．９．７；及び１Ｅ５．５．７によるＤＲ６の阻害は、この系において、天然に生じる発生上の細胞死に対して脊髄ニューロンを保護する。
【０１６３】
実施例６：ＤＲ６ヌルマウスにおける神経細胞死の減少
ＤＲ６ノックアウト胚の表現型(Zhao等., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)を、発生ステージＥ１５．５で解析した。切断されたカスパーゼ３はアポトーシス細胞のマーカーであり、胚の脊髄における神経細胞死の範囲を調べるために、切断されたカスパーゼ３の免疫染色(R&D  Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ３の抗体)を使用した。また、ＤＲ６非相同同腹仔をコントロールとして分析した。パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)固定された胚組織切片を１時間、ブロッキング溶液(２％加熱不活性化ヤギ血清(Sigma)／ＰＢＳ(Gibco)／０．１％トリトン(Sigma))中でブロックし、１次抗体(R&D  Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ３の抗体の１：５００希釈)により、ブロッキング溶液中で、１晩４℃でインキュベートした。切片は、室温で１時間ブロッキング溶液により３回洗浄し、２次抗体(ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８、Molecular Probes, Invitrogen、の１：５００希釈)で室温で１時間、インキュベートした。次に、切片は室温で１時間、ブロッキング溶液により洗浄し、緑色チャネルで免疫蛍光により可視化した。
胚につき脊髄切片ごとのカスパーゼ３陽性の核の数を数値化した(図８及び９Ａ参照)。ＤＲ６ヘテロ接合同腹仔コントロールと比較して、ＤＲ６ヌルマウス脊髄および後根神経節(「ＤＲＧ」)における神経細胞死の約４０から５０％の減少を検出した(図８及び９Ａ参照)。従って、ＤＲ６シグナル伝達は、インビボで、発生中の神経系における神経細胞死を促進する可能性があると考えられる。
【０１６４】
図９Ｂに示すように、ＤＲ６は、ＤＲ６ヌルマウスで証明されたように、運動軸索変性に必要である。発生ステージＥ１３．５における正常及びＤＲ６ノックアウト胚由来の腹側脊髄外植片(運動ニューロン)(Zhao等, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)を、脳由来神経栄養因子(ＢＤＢＦ)及びニューロトロフィン３(ＮＴ３)(Chemiconから得たＢＤＮＦ及びＮＴ-３)の存在下及び非存在下で分析した。
図９Ｂにおいて、上段左パネルは、ＢＤＮＦ及びＮＴ-３の存在下での正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段左パネルはＢＤＮＦ及びＮＴ-３の存在下でのＤＲ６ノックアウト(ＫＯ)マウス由来の腹側脊髄外植片を示す。同様に、上段右パネルはこれらの成長因子の非存在下の正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段右パネルはこれらの成長因子の非存在下のＤＲ６ノックアウト(ＫＯ)マウスの腹側脊髄外植片を示す。
この図９Ｂに示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイを、わずかな変更を加えてHenderson等, Nature, 363:266-270 (1993)に記載のとおり実施した。ＤＲ６ヘテロ接合又はＤＲ６ヌルマウスＥ１３．５胚を、アルコール処理したはさみを使用してばらばらにし、暖かいＬ１５培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋骨を切除し、全脊髄をばらばらにし、取り囲んでいる髄膜組織を鉗子で除去した。蓋板を除去し、脊髄のオープンブックプレップを得た。ＭＭＣ及びＬＭＣ運動柱を含む脊髄の腹側半分を分離し、残りの底板組織を注意深く切除した。腹側脊髄を、更にタングステン針を使用して外植片に切り分けるために、Ｌ１５で覆われているイエローチップで、Ｌ１５＋５％ＦＢＳ(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。
ＰＤＬ／ラミニンで覆われた８ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)をウェルにつき５００μｌのニューロベーサル培地(Invitrogen)＋それぞれ５０ｎｇ／ｍｌの組換えＢＤＮＦ及びＮＴ-３(Chemicon)、＋Ｂ-２７サプリメントＸ５０(Invitrogen)；＋ペンストリップグルタミンＸ１００(Cat. No. 10378-016; ギブコ)＋グルコースＸ１００で満たした。腹側脊髄外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき２-３外植片)、成長のため４８時間３７℃においた。２日後、栄養因子欠乏が、以下の通りに実施された：古い培地を取り除き、ウェルをニューロベーサル培地(栄養因子なし)で、優しく２回洗浄した。
抗ＢＤＮＦ及び抗ＮＴ３ブロッキング抗体(Genentech, Inc.)を加えた、前もって暖めた(栄養因子なしで上記のとおり調製した)ニューロベーサル培地／Ｂ−２７ (Invitrogen) を２０μｇ／ｍｌで加えた。外植片を有するスライドは、次に３７℃で、別に２４−４８時間、インキュベートした。
２日後、外植片を４％ＰＦＡのＰＢＳ中で固定し、０℃で１０分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で０．２％トリトンで浸透し、ネットゲルで２回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは１％ＢＳＡのＰＢＳ中で４℃でインキュベートした。変性した運動軸索を可視化するために、抗ｐ７５ＮＴＲ特異的抗体(１：５００希釈、Chemicon)による免疫染色を、翌日、実施した(１次Ａｂ  １：５００  １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で一晩４℃、２次Ａｂ  １：５００  室温で１時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントＧがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。ｐ７５ＮＴＲ発現運動軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング  ツァイス顕微鏡で撮影した。
【０１６５】
図９Ｃに開示するデータに示すように、傷害誘導性変性はＤＲ６ノックアウトマウスで遅延した。
図９Ｃの左から右において、上段４パネルは、神経成長因子(ＮＧＦ)の存在下；傷害後、それぞれ４、８又は１７時間後の正常マウス由来のニューロンを示す。図９Ｃの左から右において、下段４パネルは、外因性神経成長因子(ＮＧＦ)の存在下；傷害後、それぞれ４、８又は１６時間後のＤＲ６ＫＯマウス由来のニューロンを左から右に示す。
図９Ｃに示すようにインビトロ感覚軸索病変アッセイを以下のように実施した。ＤＲ６ヘテロ接合又はＤＲ６ヌルマウスＥ１２．５胚を切り出し、暖めたＬ１５培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋を切除し、脊髄に付着した後根神経節(ＤＲＧｓ)は鉗子によりばらばらにした。次にＤＲＧは、更にタングステン針を使用して１／４ＤＲＧ外植片に切り分けるために、Ｌ１５で覆われているイエローチップで、Ｌ１５＋５％ＦＢＳ(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。
ＰＤＬ／ラミニンで事前に覆われたプラスチック８ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)を、ウェルにつき５００μｌのニューロベーサル培地(Invitrogen)＋５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ(Roche Molecular Biochemicals)、＋Ｂ-２７サプリメントＸ５０(Invitrogen)；＋ペンストリップグルタミンＸ１００；＋グルコースＸ１００で満たした。ＤＲＧ外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき２-３ＤＲＧ外植片)、成長のため４８時間３７℃においた。２日後、軸索病変アッセイが、以下の通りに実施された：傷害は、マイクロナイフ(Fine Science Tools)によるＤＲＧ外植片の真上と真下の感覚軸索の２つの平行な切れ込みを作ることにより誘導した。ＤＲＧ外植片の右側と左側の切られていない軸索は病変のない内在性コントロールとして保存した。切られたＤＲＧ外植片を有するスライドは、傷害後０、４、８、１６及び２４時間後、４％ＰＦＡのＰＢＳ中、０℃で１０分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で０．２％トリトンで浸透し、ネットゲルで２回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは１％ＢＳＡのＰＢＳ中、４℃でインキュベートした。変性した感覚軸索を可視化するために、神経のクラスＩＩＩβチューブリン (ＴＵＪ１)特異的抗体(１：５００希釈、Covance)による免疫染色を、翌日、実施した(１次Ａｂ  １：５００  １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で一晩４℃、２次Ａｂ  １：５００  室温で１時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントＧがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。免疫蛍光により感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング  ツァイス顕微鏡で撮影した。
【０１６６】
実施例７：抗ＤＲ６抗体アンタゴニストはニューロンの変性を阻害する
図１０Ａに示すように、抗ＤＲ６抗体は、(軸索変性のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。
図１０Ａの左から右において、上段及び下段の最初の２つ写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の４つの写真では、上段の２つの写真はそれぞれコントロールＩｇＧ及び３Ｂ１１.７.７  ＤＲ６抗体の存在下の交連ニューロンを示し、さらに下段の２つの写真はそれぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図１０Ａの上段及び下段の中央の２つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の４つの写真では、上段２つの写真がそれぞれＮＧＦ存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段２つの写真がＮＧＦの非存在下だが、それぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図１０Ａの右側の上段及び下段の２つは、運動ニューロンのデータを示す。これら右の４つの写真では、上段２つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段２つの写真が成長因子の非存在下だが、それぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。マウスモノクローナル４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８、２Ｃ７.３.７及び３Ｂ１１.７.７ ＤＲ６抗体は、上の実施例３で記載の通り、ＤＲ６外部ドメインでマウスを免疫化することによって作製した。
感覚、運動、及び交連外植片培養を、以下の変更を加えて、実施例２及び実施例６に記載のとおり、実施した。交連外植片生存アッセイの場合、ＤＲ６抗体４Ｂ６.９.７又は３Ｆ４.４.８、又はコントロールＩｇＧを、播種２４時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、交連外植片培養に加えた(図１０Ａ)。感覚外植片培養の場合、ＮＧＦ欠乏アッセイを、播種４８時間後、実施した。ＮＧＦ遮断抗体(ジェネンテック、インク)と共に明記のＤＲ６抗体(４Ｂ６.９.７又は３Ｆ４.４.８)又はコントロールＩｇＧを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種４８時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、感覚外植片培養に加えた(図１０Ａ)。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイは播種後４８時間実施した。ＮＴ３／ＢＤＮＦなしで、且つＢＤＮＦ遮断及びＮＴ３遮断抗体(機能遮断栄養因子ｍＡｂｓ、ジェネンテック、インク)と共に明記のＤＲ６抗体(４Ｂ６.９.７又は３Ｆ４.４.８)又はコントロールＩｇＧを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種４８時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、感覚外植片培養に加えた(図１０Ａ)。抗ＴＵＪＩ(Covance)及び抗ｐ７５ＮＴＲ(Chemicon/Millipore)抗体で免疫蛍光染色により標識化された感覚及び運動軸索を然るべく可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。ＧＦＰ発現交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(ＧＦＰ用緑色蛍光チャネルで)撮影した。
図１０Ｂで示すように、抗ＤＲ６抗体は、(ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシス細胞体のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。図１０Ｂの左から順番に、上段及び下段の２つの写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の４つの写真では、上段の２つの写真は、それぞれコントロールＩｇＧ及び３Ｂ１１.７.７  ＤＲ６抗体の存在下の交連ニューロンを示し、更に下段の２つの写真はそれぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図１０Ｂの上段及び下段の中央セットの２つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の４つの写真では、上段２つの写真がそれぞれＮＧＦ存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段２つの写真はＮＧＦの非存在下だが、それぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図１０Ｂの右側の上段及び下段の２つは、運動ニューロンのデータを示す。これら４つの写真では、上段２つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段２つの写真は成長因子の非存在下だが、それぞれ４Ｂ６.９.７  ＤＲ６抗体及び３Ｆ４.４.８  ＤＲ６抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
図１０の開示は、リガンドが軸索変性におけるＤＲ６機能にとって重要な役割を果たす可能性を示唆する。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。上記のとおり、マウスモノクローナル抗体４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８、２Ｃ７.３.７及び３Ｂ１１.７.７ ＤＲ６抗体は、上の実施例３に記載のようにＤＲ６外部ドメインでの免疫化により作成された。感覚、運動及び交連外植片培養は、以下に概説する変更を加えて、上記の実施例２及び実施例６のように実施された。交連外植片生存アッセイの場合には、上の実施例３に記載のように、ＤＲ６抗体４Ｂ６.９.７及び３Ｆ４.４.８、抗体３Ｂ１１.７.７(あるいはコントロールＩｇＧと称される(ジェネンテック、インク))を播種２４時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで、それぞれ加えた(図１０Ｂ、左)。
感覚外植片培養の場合、ＮＧＦ欠乏アッセイを播種４８時間後、実施した。ＮＧＦなしで、且つＤＲ６抗体 ４Ｂ６.９.７又は３Ｆ４.４.８、又はコントロールＩｇＧ(ジェネンテック、インク)と共にＮＧＦ遮断抗体(ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種４８時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで感覚外植片培養に加えた(図１０Ｂ、中央)。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイを播種４８時間後、実施した。ＮＴ３／ＢＤＮＦなしで、 ４Ｂ６.９.７又は３Ｆ４.４.８、又はコントロールＩｇＧ(ジェネンテック、インク)と共にＮＴ３遮断抗体(機能遮断栄養因子ｍＡｂｓ、ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種４８時間後、最終濃度２０μｇ／ｍｌで感覚外植片培養に加えた(図１０Ｂ、右)。
外植片は、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で固定し、インサイツ細胞死検出キット(Cat. No. 11 684 795 910, ロッシュ)を使用して、製造者の指示書(ロッシュ)に従って、ＤＮＡ鎖切断の標識化(ＴＵＮＮＥＬ技術)に基づいて、単一の細胞レベルでアポトーシスを検出するために処理した。運動外植片培養及び交連感覚の細胞体におけるアポトーシスを蛍光顕微鏡で解析した(図１０Ｂ)。蛍光標識化ＴＵＮＮＥＬ陽性アポトーシス細胞体の可視化のために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で(赤色蛍光チャネルで)撮影した。
【０１６７】
実施例８：ＤＲ６イムノアドヘシン・アンタゴニストはニューロンの変性を阻害する
図１１Ａに示すように、交連軸索変性はｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃにより遅延した。このアッセイで使用したｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃイムノアドヘシンタンパク質は上の実施例３に記載されている。
図１１Ａの左から右において、最初の写真は、４８時間時点の交連軸索変性を示すコントロールを提供する。２番目の写真は、４８時間時点の３０μｇ／ｍｌのｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃの存在下の交連軸索変性を示す。３番目の写真は、４８時間時点の１０μｇ／ｍｌのｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃの存在下の交連軸索変性を示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連外植片培養及び生存アッセイを調節し、上の実施例２−６に記載のとおり実施した。このアッセイで使用したｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃイムノアドヘシンタンパク質配列は上の実施例３に記載されている。ＧＦＰ標識化交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(緑色蛍光チャネルで)撮影した。
【０１６８】
図１１Ｂで示すように、ｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃは神経成長因子(ＮＧＦ)離脱により誘導された感覚軸索変性を遅延させる。図１１Ｂの左から右において、上の３つの写真はそれぞれ０、６及び２４時間時点のコントロールＦｃの存在下における、ＮＧＦの欠乏した感覚ニューロンを示し、さらに下段の３つの写真はそれぞれ０、６及び２４時間時点のＤＲ６  Ｆｃコンストラクトの存在下における、ＮＧＦの欠乏した感覚ニューロンを示す。
図１１に提供される開示は、リガンドが軸索変性におけるＤＲ６機能に重要な役割を果たす可能性があるという更なる示唆を提供する。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。リガンドが感覚軸索変性におけるＤＲ６機能に必要であるか否かを調べるために、感覚軸索成長及び変性の区画培養分析を以下のとおりに実施した。Ｃａｍｐｅｎｏｔ神経細胞チャンバー系を、別の区画(別々の液体環境)の細胞体から神経突起(軸索)を単離するために使用し、これは、神経系のある位置の神経細胞体が別の場所の遠位の標的に軸索を突き出すことに似ている。アッセイは、以下の変更を加えて、Campenot (Campenot等, .J Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991))により最初に記載されたとおりに実施された。簡単には、３５-ｍｍ組織培養皿をＰＤＬ／ラミニンでコートし、例えばCampenot等(上掲)の図１及び４で図説されているように、ピンレーキ(Tyler Research)で跡を作成するために引っ掻いた。
培養培地(Ｂ２７サプリメント、２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、及び４ｇ／Ｌのメチルセルロースを有するニューロベーサル培地)の一滴を引っ掻いた基質に置いた。テフロン分割機(Tyler Research)をシリコングリース上に置き、少量のシリコングリースを中央のスロットの口につけた。Ｅ１２．５マウスＤＲＧに由来する解離感覚ニューロンは、メチルセルロースで濃厚化した培地に懸濁し、２２ゲージの針で使い捨て滅菌シリンジ中に入れた。この細胞懸濁は解剖顕微鏡下で、各区画皿の中央スロット中に注入した。ニューロンは、一晩、定着させた。皿の外周辺(細胞体分割)及び内部軸索区画を、メチルセルロース含有培地で充填した。インビトロで３−５日以内に、軸索は、例えばCampenot等,上掲の図１及び４で図説されているように、右及び左区画中に出現し始めた。
局所的軸索変性を誘発するために、軸索区画由来のＮＧＦ含有培地を、ＮＧＦ遮断抗体を有するニューロベーサル培地で置換した(抗ＮＧＦ、ジェネンテック、インク、２０μｇ／ｍｌ)。ＮＧＦ欠乏後ゼロ時間、６時間、又は２４から４８時間で、感覚ニューロンを室温で３０分間、４％ＰＦＡで固定し、蛍光顕微鏡で変性した軸索を可視化するために、軸索マーカーＴＵＪ-１(Covance、１：５００希釈)で免疫蛍光染色のために(上の実施例７に記載のとおり)処理した(図１１Ｂ)。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画中の免疫蛍光的に標識化した感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
リガンドがＮＧＦ離脱により誘発した軸索変性プログラムにおいてＤＲ６機能が必要であるか否かを調べるために、３０μｇ／ｍｌの(上の実施例３に記載の)ｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃイムノアドヘシンタンパク質又は３０μｇ／ｍｌのコントロールＦｃ(ジェネンテック、インク)を、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画中で、抗ＮＧＦ処理と共にインキュベートした。ＮＧＦ欠乏ゼロから２４時間後、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバー中の軸索を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで固定し、蛍光発色基Ａｌｅｘａ４８８(分子プローブ、ＢＤ)にコンジュゲートしたＴＵＪ-１(１：５００、Covance)／二次抗体で免疫蛍光染色により可視化した(図１１Ｂ)。
図１１Ｂに示したように、ＮＧＦ欠乏は軸索変性の著しいパターンを誘発した。ｈＤＲ６-ＥＣＤ-Ｆｃイムノアドヘシンタンパク質の添加は、この系で、有意に、軸索変性の開始を遅らせた(図１１Ｂ、下段パネル)。従って、これらのデータは、可溶性リガンドが、成長因子の離脱によって誘導された局所的軸索変性でのＤＲ６レセプター機能に必要である可能性があることを示唆する。
【０１６９】
実施例９：ＮＧＦ欠乏に続く軸索からのＤＲ６リガンド結合部位の分断
図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ＤＲ６-ＡＰコンストラクトは感覚軸索上のＤＲ６結合部位を可視化するために使用した。
図１２Ａの左から右において、上段の２つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率でこれらの軸索を可視化するために、４８時間時点、ＮＧＦ存在下、発生ステージＥ１２．５における、感覚軸索上のＤＲ６結合部位の可視化を示し、さらに下段２つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率で、ＡＰコントロールコンストラクトを使用した感覚軸索の可視化を示す。
図１２Ｂに示すように、ＤＲ６リガンド結合部位はＮＧＦ欠乏に続いて感覚軸索から消失した。
図１２Ｂの左から右において、上段の２つの写真は感覚軸索上のＤＲ６結合部位の可視化を示しており、最初の写真はＮＧＦ及びＢＡＸインヒビターの存在下の感覚ニューロンを示し、さらに２番目の写真はＮＧＦ存在下でのＢａｘヌル感覚ニューロンを示す。下段の２つの写真は、それぞれＮＧＦ非存在下であるがＢＡＸインヒビターの存在下の感覚ニューロン、及びＮＧＦ非存在下のＢａｘヌル感覚ニューロンを示す。等しい結果が、ニューロトロフィンの存在下及び非存在下の運動軸索で観察された。
図１２Ａ及び図１２Ｂで示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。ＤＲ６-ＡＰコンストラクトは、ｐＲＫ５−ＡＰクローニングベクター (例えばYan等, Nature Immunology 1, 37-41 (2000)を参照)を使用して、ヒト胎盤アルカリホスファターゼにマウスＤＲ６外部ドメインを融合すること(ＤＲ６-ＡＰ)によって作成した。親クローニングベクターＰＲＫ５は、Becton, Dickinson and Company, Pharmingen divisionから入手可能である。ＤＲ６-ＡＰコンストラクト融合タンパク質を作製するために使用したマウスＤＲ６外部ドメイン配列は以下の通りである：
2011524523.tif 000007
Ｂａｘヌルマウス系統(Ｂａｘ-Ｒ１)は以前に記載されており(Deckwerth等, Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)、Jackson Laboratoriesから入手可能である。Ｂａｘ阻害性ペプチドは、神経細胞死を遮断するために１０μＭで使用した(Ｂａｘ-Ｖ５, Tocris Inc)。
【０１７０】
マウスＤＲ外部ドメイン-ＡＰ融合タンパク質(ＤＲ  ｂｖ６-ＡＰ)を作成するために、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ(ギブコ)培地で培養したＣＯＳ-１細胞は、ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬(ロッシュ)を使用して、製造者のプロトコルに従って、１５μｇのＤＲ６-ＡＰ融合発現コンストラクトで形質転換した。 形質転換１２時間後、ＣＯＳ-１細胞培地を、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ(インビトロジェン)に変えた。形質転換４８時間後、ＤＲ６-ＡＰタンパク質を含むＣＯＳ-１条件培地を集めて、濾過した。培地中のＤＲ６-ＡＰタンパク質の量は以下のように定量化した：
１００μｌの２×ＡＰバッファー(１５ｍｌの２ＭジエタノールアミンｐＨ９．８に１００ｍｇのパラニトロフェニルホスフェート(シグマ)及び１５μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２を加えて調節した)を、等量の形質転換したＣＯＳ細胞条件培地又は形質転換していないＣＯＳ-１細胞由来のコントロール条件培地と混合した。反応液の色は１２−１５分の間発色し、Ｏ.Ｄ.は線形範囲(０．１−１)となった。反応液の体積は、８００μｌの蒸留水を加えて調節し、Ｏ.Ｄ.を４０５ｎｍ吸光度波長で測定した。濃度(ｎＭ)は、式(１００μｌに対して)：Ｃ(ｎＭ)＝ Ｏ.Ｄ.×１００×(６０／発現時間)／３０に従って計算した。
インサイツＤＲ６-ＡＰ感覚軸索結合アッセイの場合、野生型か又はＢａｘヌル感覚外植片を上の実施例７−８に概説したようにニューロべーサル培地／Ｂ２７(インビトロジェン)中で、５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ(ロッシュ)と共に、培養した。播種２日後、ＤＲＧ外植片は、上の実施例７−８に記載のように、処理されないままか、あるいはＮＧＦを欠乏させた。Ｂａｘ阻害性ペプチドは、図１２Ｂ(１０μＭ、Ｂａｘ−Ｖ５, Tocris)に明記されている所では、加えた。ＮＧＦ欠乏１２時間後、ＤＲＧ外植片は結合バッファー(０．２％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ３、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０を有するＨＢＳＳ、Gibco Cat. No. 14175-095)で２回洗浄した。次に、ＡＰ結合アッセイは、ＤＲ６-ＡＰ条件培地と結合バッファー(又はコントロールＡＰ条件培地と結合バッファー)の１：１混合液を作成し、８ウェルの培養スライド(Becton, Dickinson and Company)にＤＲＧ外植片を直接注いて、室温で９０分間インキュベートすることによって、実施した。
インキュベートに続いて、非結合ＤＲ６-ＡＰタンパク質を、結合バッファーで５回ＤＲＧ外植片をリンスすることによって洗い流した。次に、ＤＲＧ外植片を、ＰＢＳで希釈した３．７％フォルムアルデヒドで、１２分間室温で、固定した。残存するフォルムアルデヒドをＨＢＳバッファー(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ)で３回ＤＲＧ外植片をリンスすることで除去した。内生的ＡＰ活性は、３０分間、ＨＢＳバッファー中で、６５℃で、熱不活性化して遮断した。次に、ＤＲＧ外植片は、ＡＰ反応バッファー(１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ＝９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２)で３回リンスした。感覚軸索に結合しているＤＲ６-ＡＰ融合タンパク質は、次に、室温で１晩、ＡＰ反応バッファー中で、ＤＲＧ外植片上で、１／５０(体積)のＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液(ロッシュ、Cat. No. 1681451)により、染色を発現させることにより可視化した(図１２Ａ及びＢ)。対応するコントロール実験において、ＡＰ-形質転換したＣＯＳ細胞からの条件培地をＡＰ軸索結合アッセイに使用した(図１２Ａ、下段パネル)。
図１２Ｂから分かるように、ＤＲ６-ＡＰ結合部位は、ＮＧＦ欠乏に続いて感覚軸索表面から消失し、ＤＲ６リガンドが栄養欠乏後軸索条件培地中に放出されることを示唆する。
図１２Ｃに示すように、発生ステージＥ１２．５におけるＢＡＸヌル感覚軸索の研究は、β分泌酵素(ＢＡＣＥ)インヒビターが、ＮＧＦ離脱後、感覚軸索からのＤＲ６-ＡＰ結合部位の消失を遮断できることを示す。図１２Ｃの左から右において、上段の３つの写真は、それぞれＤＭＳＯコントロール；ＯＭ９９−２(ＢＡＣＥ−Ｉインヒビター)及びＴＡＰ１(α分泌酵素−Ｉインヒビター)の存在下のこれらのニューロンを示す。下段の写真は、ＮＧＦ存在下のこれらのニューロンを示す。
このデータを作成する為に使用したマウスＤＲ６外部ドメイン-ＡＰ融合タンパク質は、上に記載する。Ｂａｘヌルマウス系統(Ｂａｘ-Ｒ１)は、以前に記載されており(Deckwerth 等., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996) 、Jackson Laboratoriesから取得した。ＤＲＧ外植片培養及びＤＲ６-ＡＰ軸索結合アッセイは、図１２Ａ及び図１２Ｂで上に記載のとおり実施した。アッセイで使用したＢＡＣＥインヒビターは、最終濃度１μＭである(InSolution OM99-2, Calbiochem/Merck)。α分泌酵素インヒビターＴＡＰ１は、アッセイで、最終濃度１０μＭで使用した(ＴＡＰＩ-１, Calbiochem)。ＤＲ６-ＡＰ陽性感覚軸索(上の実施例９に概説したＡＰ比色分析染色反応により染色した)を可視化するために、明視野の写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
【０１７１】
実施例１０：ＤＲ６の同族リガンドであるアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)
図１３に示すように、Ｎ−ＡＰＰは、ＤＲ６外部ドメイン結合リガンドであることが明らかとなった。
図１３Ａの左から右の順で、最初の２つのブロットは、ＤＲ６−ＡＰコンストラクトを用いて、増殖因子の存在下と非存在下において感覚ニューロンと運動ニューロンから得たタンパク質を探索した実験のデータを示す。これらのブロットでは、およそ３５ｋＤＡに強力なバンドを含むＡＰＰポリペプチドは、増殖因子を除去した(かつバックス(Bax)インヒビターの存在下)感覚ニューロン及び運動ニューロンにおいて観察される。図１３Ａの中央のブロットは、およそ３５ｋＤＡに強力なバンドを有するＡＰＰポリペプチドが、増殖因子を除去した感覚ニューロンから得たポリペプチドの抗Ｎ−ＡＰＰ抗体プローブによって同様に観察されることを示す。１:１００希釈のウエスタンブロット実験のために用いたポリクローナル抗Ｎ−ＡＰＰ抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１)から入手した。バックスインヒビターペプチドＰ５は１０μＭで用いた(Tocris Biosciences、カタログ番号１７８６、ミトコンドリアに対するバックス転座の細胞透過性合成ペプチドインヒビター)。
ＡＰＰがＤＲ６外部ドメイン結合リガンドであるという所見は、図１３Ａの右に示すブロットに表されたデータによってさらに確認された。一般的なプルダウンプロトコール(例えばNikolaev et al., 2004, BBRC, 323, 1216-1222)を用いて、ＮＧＦ欠乏条件下のＣａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画から回収した感覚性軸索条件培地からＤＲ６-ＥＣＤ外部ドメイン結合因子を精製した。ＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓ外部ドメイン(以下に記載のコンストラクト)結合ＮｉＮＴＡビーズ(Sigma)を、以下の条件下で５０ｍｌの感覚軸索条件培地にてインキュベートした。１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＮＰ-４０(Calbiochem)、1×ＰＢＳバッファ、４℃で終夜。次いで、ＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓ外部ドメイン結合ＮｉＮＴＡビーズ(Sigma)を、１０倍量の結合バッファ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＮＰ−４０(Calbiochem)を含む1×ＰＢＳバッファ)にて５回洗浄し、ＤＲ６−ＥＣＤ結合タンパク質複合体を、１×ＳＤＳ試料ローディングバッファ(Invitrogen)にて溶出し、次いでゲル電気泳動にて分離し、抗Ｎ−ＡＰＰ抗体にて探索した。このＤＲ６−ＥＣＤプルダウン実験のデータにより、同様に、およそ３５ｋＤＡに強いバンドを有するＡＰＰポリペプチドが識別される。
軸索条件培地のＤＲ６−ＡＰブロットアッセイは、先に記載された(Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632)プロトコールに従って行った。ウエスタンブロット実験に使用したポリクローナル抗Ｎ−ＡＰＰ抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１)から入手した。使用したマウスＤＲ６外部ドメイン−ＡＰ融合タンパク質は実施例９に記載した。マウス組み換えＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓを発現させ、その後ＣＨＯ細胞培養物から精製した。マウスのＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである。
2011524523.tif 000008
【０１７２】
図１３Ｂは、ＤＲ６-ＡＰブロッティングによる軸索条件培地中のＤＲ６リガンドの他の可視化を示す。このブロッティングデータから、３５ｋＤａのＮ末端ＡＰＰ、並びにＣ９９−ＡＰＰ及びＣ８３／Ｃ８９  ＡＰＰのポリペプチドを含む多くのＡＰＰポリペプチドが識別される。軸索条件培地のＤＲ６−ＡＰブロットアッセイは、先に記載された(Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632)プロトコールに従って実行した。マウスＤＲ６外部ドメイン−ＡＰ融合タンパク質は実施例８に記載した通りに生成した。マウス組み換えＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓを発現させ、その後ＣＨＯ細胞培養から精製した。ＤＲ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓのアミノ酸配列は上に示す。ウエスタンブロット実験に使用したポリクローナル抗Ｎ−ＡＰＰ抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１)から入手した。メンブランに繋留されたＡＰＰ Ｃ末端断片(ＣＴＦ)Ｃ９９−ＡＰＰおよびＣ８３／Ｃ８９−ＡＰＰを可視化するために、Ａβの中心部分内のエピトープを認識する４Ｇ８抗体(モノクローナル４Ｇ８、１:５００、Covance)を用いて、軸索の溶解物のウェスタンブロット分析を行った。
【０１７３】
図１４Ａは、ＡＰＰ外部ドメインの分断(shedding)がＮＧＦ欠乏後の早期に生じることを示す写真である。図１４Ａでは、増殖因子除去後の様々な時間のニューロンを、軸索変性をブロックするために添加したバックスインヒビターの存在下でＮ−ＡＰＰポリクローナル抗体にて染色した。左から右の順に、これらの写真は、０時間並びに、ＮＧＦの除去(かつ抗ＮＧＦ抗体の添加)の３、６、１２および２４時間後の軸索変性を示す。
ＡＰＰ軸索分断実験において表面ＡＰＰ発現を可視化するために用いたポリクローナル抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１)から入手した。上記実施例６及び７のように感覚外植片培養を行った。以下の点を変更して上記の実施例７のように、ＮＧＦ欠乏アッセイを行った。ＮＧＦ欠乏後、０時間、３時間、６時間、１２時間および２４時間の間隔をおいてＤＲＧ外植片培養物を４％ＰＦＡ／ＰＢＳに固定した。表面ＡＰＰ発現を可視化するために、ＤＲＧ軸索を、トリトン透過化処理工程を含まない実施例６及び７の免疫蛍光染色のために、上記の抗−Ｎ−ＡＰＰ一次抗体を用いて処理した。
感覚軸索上で表面ＡＰＰ発現を可視化するために(抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体(Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１)にて標識した免疫蛍光性)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図１４Ｂは、ＤＲ６外部ドメインが培養した細胞によって発現されるＡＰＰを結合することを示す写真である。図１４Ｂの左から右の順に、上の２つの写真は、ＤＲ６−ＡＰＰ(ＤＲ６外部ドメインを有する)にてプローブした、それぞれコントロールＣｏｓ細胞およびＡＰＰ発現細胞を示す。下の２つの写真は、ＤＲ６−ＡＰにてプローブしたｐ７５ＮＴＲレセプター及びＤＲ６レセプターを発現する細胞を示す。ＤＲ６外部ドメインは、ｐ７５ＮＴＲレセプター発現細胞にもＤＲ６レセプター発現細胞にも結合しない。
【０１７４】
この図に示されるデータを生成するために使用した材料と方法は以下の通りである。ＡＰＰがＤＲ６細胞外ドメインと直接相互作用するか否かを試験するために、細胞ベースのＡＰ結合実験を行った(図１４Ｂ)。ＤＲ６外部ドメイン−ＡＰ融合タンパク質(ＤＲ６−ＡＰ)を生成するために、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ(Gibco)培地にて培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧｅｎｅ形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて１５μｇのＤＲ６−ＡＰ融合発現コンストラクトを形質移入した。形質移入の１２時間後に、ＣＯＳ−1細胞培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ(Invitrogen)に変えた。形質移入の４８時間後に、ＤＲ６−ＡＰタンパク質を含むＣＯＳ−１細胞条件培地を回収して濾過した。
培地中のＤＲ６−ＡＰタンパク質の量は、以下の手順に従って定量化した。１００μｌの２×ＡＰバッファ(１００ｍｇのパラ−ニトロフェニルリン酸(Sigma)と１５μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２を１５ｍｌの２Ｍ ジエタノールアミンｐＨ９．８に加えることによって調製する)を、等量の形質移入されたＣＯＳ細胞条件培地又は形質移入されなかったＣＯＳ−１細胞のコントロール条件培地と混合した。反応の色は１２〜１５分間発色し、Ｏ.Ｄ.は線形範囲(０．１−１)となった。次いで、反応量を、８００μｌの蒸留水を加えて調整し、４０５ｎｍの吸光度波長でＯ.Ｄ.を測定した。ｎＭの濃度は、式(１００μｌの場合)：Ｃ(ｎＭ)＝Ｏ.Ｄ. ×１００×(６０／発色時間)／３０に従って算出した。
ＡＰＰ ＡＰ結合アッセイのために、６ウェル培養ディッシュに入れたＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ(Gibco)培地中で培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧｅｎｅ形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて、１ウェル当たり２μｇのＡＰＰ発現ベクターを形質移入した。形質移入の２日後に、結合バッファ(０．２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０を含む、ＨＢＳＳ(Gibcoカタログ番号１４１７５−０９５))にて細胞を２回洗浄した。次いで、ＡＰ結合アッセイは、ＤＲ６−ＡＰ条件培地と結合バッファの１：１混合物を作って行った。この混合物はＡＰＰを過剰発現するＣＯＳ−１細胞に直接用いて室温で９０分間インキュベートしたものである。インキュベートの後に、結合バッファにてＣＯＳ−１細胞を５回すすぐことによって結合していないＤＲ６−ＡＰタンパク質を洗い流した。次いで、細胞を、ＰＢＳにて希釈した３．７％ホルムアルデヒドにて、室温で１２分かけて固定した。残りのホルムアルデヒドは、ＨＢＳバッファ(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ)にて細胞を３回すすぐことによって除去した。内在性ＡＰ活性は、ＨＢＳバッファ中、６５℃で３０分間の熱不活性化によってブロックした。次いで、ＣＯＳ-１細胞をＡＰ反応バッファ(１００ｍＭ トリスｐＨ＝９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２)にて３回すすいだ。次いで、膜貫通ＡＰＰに結合するＤＲ６−ＡＰ融合タンパク質は、室温で終夜をかけて、１／５０(量)のＮＢＴ／ＢＣＩＰ貯蔵溶液を有するＡＰ結合バッファ中のＣＯＳ−１細胞上で呈色反応させることによって可視化した(Roche、カタログ番号１６８１４５１)(図１４Ｂ)。平行コントロール実験では、形質移入されなかったＣＯＳ細胞からの条件培地をＡＰ結合アッセイに用いた。ＣＯＳ−１細胞において発現される膜貫通ｐ７５ＮＴＲおよびＤＲ６レセプターは、同じ実験条件下でＤＲ６−ＡＰ融合タンパク質に特異的な結合を示さなかった(図１４Ｂ)。これは、ＤＲ６外部ドメインとＡＰＰとの間の相互作用が特異的であることを示す。
【０１７５】
図１４Ｃは、ＤＲ６が感覚軸索上のＮ−ＡＰＰの主要なレセプターであること及び、ＡＰＰ結合部位がＤＲ６ヌルマウスの神経細胞において有意に減少することを示している写真である。図１４Ｃの左から右の順に、上の３つの写真は、それぞれ、ＡＰコントロール、Ｎ−ＡＰＰ−ＡＰおよびＳｅｍａ３Ａ−ＡＰにてプローブした、ＤＲ６＋／−(ｈｅｔ)マウスから得たニューロンを示す。下の３つの写真は、同様に、それぞれ、ＡＰコントロール、Ｎ−ＡＰＰ−ＡＰおよびＳｅｍａ３Ａ−ＡＰにてプローブした、ＤＲ６−／−(ＫＯ)マウスから得たニューロンを示す。
図１４Ｃに示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。マウスＤＲ６外部ドメイン−ＡＰ融合タンパク質は、上の実施例９で述べた通りに生成した。先に(Feiner et al., 1997, Neuron, Vol. 19, 539-545)記載されたように、マウスＳｅｍａ３Ａ外部ドメイン−ＡＰ(Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰ)融合タンパク質を生成した。ＤＲ６ヌルマウス系統(ＤＲ６.ＫＯ)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。ＤＲＧ外植片培養およびＤＲ６−ＡＰ軸索結合アッセイは、図１２Ａおよび１２Ｂの実施例９で述べた通りに実行した。
【０１７６】
図１４Ｄは、アンタゴニストＤＲ６抗体がＤＲ６外部ドメインと神経系ＡＰＰとの間の相互作用を崩壊させたことを示す写真である。これらの研究では、Ｎ−ＡＰＰは、ＤＲ６を発現している神経細胞に加え、その後抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体にて可視化した。左から右の順に、始めの４つの写真は、それぞれ、コントロールＩｇＧ；２Ｃ７.３.７抗ＤＲ６抗体；３Ｆ４.４.８抗ＤＲ６抗体；及び４Ｂ６.９.７抗ＤＲ６抗体の存在下におけるニューロン表面上のＤＲ６を結合するＮ−ＡＰＰの能力を示す。右の写真は、コントロールＩｇＧを用いた細胞上のＤＲ６の染色を示す。
この図に示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。図１４Ｄに示すデータを得るために用いた細胞ベースのリガンド結合アッセイは、以下の変更を加えて、先に(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)記載されているように、行った。Ｎ末端増殖因子様ドメインＡＰＰ−Ｈｉｓ融合タンパク質(Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ)を生成するために、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ(Gibco)培地にて培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧｅｎｅ形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて１５μｇのＮ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ融合発現コンストラクトを形質移入した。形質移入の１２時間後に、ＣＯＳ−1細胞培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ(Invitrogen)に変えた。形質移入の４８時間後に、Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓタンパク質を含むＣＯＳ−１細胞条件培地を回収して濾過した。Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓの濃度は、上記の抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって測定した。
この結合アッセイに使用したヒトＮ−ＡＰＰ−Ｈｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである：
2011524523.tif 000009
次いで、Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ結合アッセイは、Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ条件培地と結合バッファの１：１混合物を作って行った。この混合物はＤＲ６レセプターを過剰発現するＣＯＳ−1細胞に直接用いて、室温で９０分間インキュベートしたものである。ここに示すＤＲ６ ｍＡｂ  ４Ｂ６.９.７、３Ｆ４.４.８又は２Ｃ７.３.７(上記の実施例３および７)を、Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ条件培地と結合バッファとともに２０ｕｇ／ｍｌで個々に添加した。コントロール実験では、正常なマウスＩｇＧ (Genentech Inc)を、Ｎ−ＡＰＰ−Ｈｉｓ条件培地と結合バッファとともに２０ｕｇ／ｍｌで添加した。
ＤＲ６レセプター発現細胞に結合するＮ−ＡＰＰは、実施例６および７に記載の公知のプロトコール(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)に従って、抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体(Thermo Scientific  カタログ番号ＲＢ−9023−Ｐ1)を用いた免疫蛍光染色によって可視化した。細胞表面上のＤＲ６レセプターに結合したＮ−ＡＰＰタンパク質を可視化するために(抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体にて標識した免疫蛍光性、Thermo Scientific(カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１))、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
【０１７７】
実施例１１：軸索変性を誘導するためのアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)によるＤＲ６の活性化
図１５Ａは、交連軸索アッセイにおいてＮ末端ＡＰＰに対するポリクローナル抗体が軸索変性をブロックすることを示す写真である。左から右の順に、図１５Ａの写真は、それぞれコントロールＩｇＧ；３０μｇ／ｍｌの抗ＮＡＰＰ抗体；及び、１．１μｇ／ｍｌの抗ＮＡＰＰ抗体の存在下における交連軸索変性を示す。
図１５Ａに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片生存アッセイは、実施例２のプロトコール及び図４Ｂに生成されたデータを示すように、示した量のポリクローナル抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体(Thermo Scientific  カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１、大規模に透析されたもの)又はコントロールＩｇＧ(ウサギＩｇＧ、R&D systems)を用いて行った。ＧＦＰで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(ＧＦＰの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図１５Ｂは、Ｎ末端ＡＰＰ抗体がＮＧＦ除去によって誘導される感覚軸索変性を阻害したことを示す写真である。左から右の順に、図１５Ｂの上の３つの写真は、ＮＧＦと、それぞれコントロール抗体；抗ＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１；及び抗ＡＰＰポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を示す。下の３つの写真は、ＮＧＦ(並びに抗ＮＧＦ抗体)と、それぞれコントロール抗体；抗ＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１；及び抗ＡＰＰポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を同様に示す。
この図１５Ｂに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。ＮＧＦ欠乏アッセイは、実施例８に記載のＣａｍｐｅｎｏｔチャンバーにおいて行った。アッセイにおいて使用したＮ末端ＡＰＰに対する抗体は、ポリクローナル抗−Ｎ−ＡＰＰ抗体(Thermo Scientific  カタログ番号ＲＢ−９０２３−Ｐ１、大規模に透析されたもの)又は２２Ｃ１１モノクローナル抗体(２２Ｃ１１、Chemicon、大規模に透析されたもの)とした。正常なＩｇＧ(ウサギＩｇＧ、R&D systems)をコントロール実験として加えた。ＴＵＪ１抗体(１:５００、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例１、７および８に記載したように行った。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
【０１７８】
図１５Ｃは、β-分泌酵素(ＢＡＣＥ)活性の阻害によってブロックされる軸索変性が、Ｎ−ＡＰＰの添加によって回復しうることを示す写真である。左から右の順に、図１５Ｃの上の３つの写真は、退化が観察したニューロン(培養されたＮＧＦがない場合)および軸索のを示す：それぞれＤＭＳＯコントロール、ＢＡＣＥインヒビターおよびＮ−ＡＰＰ(かつＢＡＣＥ−Ｉ)の存在下で観察される軸索変性とニューロン(ＮＧＦの非存在下で培養したもの)を示す。図１５Ｃの下の３つの写真は、ニューロン(ＮＧＦ存在下で培養したもの)と、それぞれＤＭＳＯコントロール、ＢＡＣＥインヒビターおよびＮ−ＡＰＰ(かつＢＡＣＥ−Ｉ)を同様に示す。
この図１５Ｃに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。ＮＧＦ欠乏アッセイは、実施例８に記載のＣａｍｐｅｎｏｔチャンバーにおいて行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えＮ−ＡＰＰアミノ酸１９−３０６は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号Ｈ０００００３５１−Ｐ０１)から購入した。ＮＧＦ欠乏の時に、３μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰを、ＢＡＣＥインヒビター(１ｕＭ終濃度、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＯＭ９９−２、Calbiochem/Merck)とともに添加した。このアッセイではＢＡＣＥインヒビターを１ｕＭ終濃度で用いた(ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＯＭ９９−２、Calbiochem/Merck)。ＴＵＪ１抗体(１：５００、Covance)による感覚軸索の免疫蛍光標識法を、実施例１、７および８に記載のように行った。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索の区画の免疫蛍光標識された感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図１５Ｄは、ＲＮＡｉによるＡＰＰ除去により、Ｎ−ＡＰＰによって誘導される細胞死に対する、ＢＡＣＥインヒビター存在下で生育させた神経細胞の感受性が高まることを示す写真である。図１５Ｄの左から右の順に、上の３つの写真は、コントロールＲＮＡｉの存在下で培養したニューロンを示す。これらの上の写真は、それぞれ３μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰ又は０．１μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。下の３つの写真は、ＡＰＰ  ＲＮＡｉの存在下で培養したニューロンを示す。これらの下の写真は、それぞれ３μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰ又は０．１μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。
この図１５Ｄに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養物におけるＡＰＰ  ＲＮＡｉは実施例２に記載のように行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えＮ−ＡＰＰアミノ酸１９−３０６は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号Ｈ０００００３５１−Ｐ０１)から購入した。このアッセイでは予め設定したラット特異的ＡＰＰ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ｓｉＲＮＡプールを製造業者の指示に従って使用し、Ｅ１３ラット交連外植片においてＡＰＰ発現を下方制御した(ＡＰＰ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ｓｉＲＮＡプール、ＧｅｎｅＩＤ：５４２２６、カタログ番号０８８１９１、Dharmacon Inc.)。ＧＦＰ標識及びＲＦＰ標識の交連軸索を可視化するために(実施例２および７に記載)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(ＧＦＰの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
【０１７９】
実施例１２：ＡＰＰが誘導する軸索変性には必要であるが、Ａβによって引き起こされる変性には必要でないＤＲ６
図１６Ａに示すように、ＤＲ６活性化は、Ｎ−ＡＰＰが誘導する軸索変性に必要である。
図１６Ａの左から右の順に、上の３つの写真は、ＤＲ６＋／−(ｈｅｔ)マウスから得たニューロンを示す。一つ目の写真はＡβにもＮ−ＡＰＰにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はＡβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はＮ−ＡＰＰに曝されたニューロンを示す。下の３つの写真は、ＤＲ６−／−(ＫＯ)マウスから得たニューロンを示す。左から右の順に下の一つ目の写真はＡβにもＮ−ＡＰＰにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はＡβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はＮ−ＡＰＰに曝されたニューロンを示す。
この図１６Ａに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例２に記載のように行った。ＤＲ６ヌルマウス系統(ＤＲ６.ＫＯ)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。このアッセイに使用したヒトの組み換えＮ−ＡＰＰアミノ酸１９−３０６は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号Ｈ０００００３５１−Ｐ０１)から購入した。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸１−４２は、Chemicon(超高純度ヒＡβ１−４２、カタログ番号ＡＧ９１２、Chemicon)から購入した。プレーティングの２４時間後に、３μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰを、ＢＡＣＥインヒビターとともに交連外植片に添加した。プレーティングの２４時間後に、３μＭの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸１−４２を、ＢＡＣＥインヒビターとともに交連外植片に添加した。このアッセイではＢＡＣＥインヒビターを１ｕＭ終濃度で用いた(ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＯＭ９９−２、Calbiochem/Merck)。さらに２４時間の間、交連外植片を、示した量のＮ−ＡＰＰ又はＡβとともにインキュベートした。交連外植片プレーティングの４８時間後にデータを採取した。交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(明視野)にて写真を撮った。
図１６Ｂに示すように、アンタゴニストＤＲ６抗体は、Ａβによって誘発される軸索変性をブロックしなかった。図１６Ｂの左から右の順に、上の３つの写真は、コントロールニューロン、ＢＡＣＥ−Ｉの存在下でのニューロンと、ＢＡＣＥ−ＩおよびＡβの存在下でのニューロンを示す。図１６Ｂにおいて、下の２つの写真は、ＢＡＣＥ−Ｉ、Ａβおよび抗ＤＲ６抗体４Ｂ６.９.７の存在下でのニューロンと、ＢＡＣＥ−Ｉ、Ａβおよび抗ＤＲ６抗体３Ｆ４.４.８の存在下でのニューロンを示す。
この図１６Ｂに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは、実施例２に記載のように行った。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸１−４２はChemicon(超高純度ヒトＡβ１−４２、カタログ番号ＡＧ９１２、Chemicon)から購入した。このアッセイではＢＡＣＥインヒビターを１ｕＭ終濃度で用いた(ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＯＭ９９−２、Calbiochem/Merck)。プレーティングの２４時間後に、３μＭの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸１−４２を、ＢＡＣＥインヒビターと４０ｕｇ／ｍｌの示した抗ＤＲ６ ｍＡｂとともに交連外植片に添加した。このアッセイではＢＡＣＥインヒビターを１ｕＭ終濃度で用いた(ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＯＭ９９−２、Calbiochem/Merck)。交連外植片は、示した量のＡβとともにさらに２４時間インキュベートした。交連外植片プレーティングの４８時間後にデータを採取した。
マウスモノクローナル４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８、２Ｃ７.３.７及び３Ｂ１１.７.７ ＤＲ６抗体は、上の実施例３に記載したように、ＤＲ６外部ドメインにてマウスを免疫化することによって生成した。上記したように、本明細書中で４Ｂ６.９.７および３Ｆ４.４.８抗体と称するＤＲ６抗体は、実施例３に記載のＤＲ６抗体である。ＧＦＰで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(ＧＦＰの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
【０１８０】
実施例１３：細胞内ＤＲ６シグナル伝達
カスパーゼはプログラムされた細胞死経路の重要な因子であり(例としてGrutter et al., Curr Opin Struct Biol. 10(6): 649-55 (2000)；Kuida et al., Nature 384(6607): 368-72 (1996)：Finn et al., J Neurosci. 20(4): 1333-41 (2000)を参照)、いくつかのカスパーゼは、ハンチントン舞踏病およびＡＤを含む神経変性疾患の細胞内シグナル伝達と関係している(例としてWellington et al., J Neurosci. 22(18): 7862-72 (2002)；Graham et al., Cell 125(6): 1179-91 (2006)；Guo et al., Am J Pathol. (2): 523-31 (2004)；Horowitz et al., J Neurosci. 24(36): 7895-902 (2004)を参照)。
図１７Ａは、５日間培養した後に、様々な異なる培養条件に２４時間曝した感覚ニューロンの写真を示す。図１７Ａに示すように、下流のカスパーゼ−３でなく、ＪＮＫと上流のカスパーゼ−８の阻害によって軸索変性が遅延される。
図１７Ａでは、左の２つの写真は、上から下の順に、それぞれＮＧＦおよび抗ＮＧＦ抗体に曝された感覚ニューロンを示す。図１７Ａでは、右の４つの写真は、上から下の順に、それぞれ、抗ＮＧＦ抗体とＪＮＫインヒビター；抗ＮＧＦ抗体とカスパーゼ−８インヒビター；抗ＮＧＦ抗体とＢＡＸインヒビター；そして、抗ＮＧＦ抗体とカスパーゼ−３インヒビターに曝した感覚ニューロンを示す。
この図１７Ａに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。ＣａｍｐｅｎｏｔチャンバーのＮＧＦ欠失アッセイは実施例８に記載のように行った。小分子ＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５は、１ｕＭ終濃度でこのアッセイに用いた(ＳＰ  ６００１２５、カタログ番号１４９６、Tocris Bioscience)。カスパーゼ-３インヒビターであるＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫは、１０ｕＭでこのアッセイに用いた(Ｚ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ、カタログ番号２６４１５５、Calbiochem)。カスパーゼ−８インヒビターであるＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫは１０ｕＭでこのアッセイに用いた(Ｚ-ＩＥＴＤ-ＦＭＫ、カタログ番号ＦＭＫ００７、R&D Systems)。ＢＡＸインヒビターペプチドは１０ｕＭで用いて神経系細胞死をブロックした(バックス−Ｖ５、Tocris Inc)。バックスヌルマウス系統(Ｂａｘ−Ｒ１)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。ＴＵＪ１抗体(１:５００、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例１、７および８に記載したように行った。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図１７Ｂは、Ｅ１２.５運動ニューロン外植片培養物からの運動ニューロンの写真であり、カスパーゼ−３が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−６が軸索において機能することを示す。
図１７Ｂの左から右の順に、４つの写真は、それぞれ(１) 増殖因子とともに、(２) 増殖因子がなく、カスパーゼインヒビターの非存在下で(コントロール)、(３) 増殖因子がなく、カスパーゼ−３インヒビターの存在下で、そして、(４) 増殖因子がなく、カスパーゼ−６インヒビターの存在下で、培養したニューロンを示す。
この図１７Ｂに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。カスパーゼ-３インヒビターであるＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫは、１０ｕＭでこのアッセイに使用した(Ｚ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ、カタログ番号２６４１５５、Calbiochem)。カスパーゼ-６インヒビターであるＺ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫは、１０ｕＭでこのアッセイに使用した(Ｚ-ＶＥＩＤ-ＦＭＫ、カタログ番号５５０３７９、Becton, Dickinson and Company PHARMINGEN Division)。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイは、上記の実施例６のように行った。ＴＵＪ１抗体(１:５００、Covance)を用いた運動軸索の免疫蛍光標識法は、実施例１、７および８に記載したように行った。免疫蛍光性標識をした運動軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
【０１８１】
図１７Ｃは、５日間培養した後に、様々な異なる培養条件に２４時間曝した感覚ニューロンの写真を示す。図１７Ｃのデータは、カスパーゼ−３が軸索変性に必要であるようではないのに対して、ＢＡＸは必要であることを示す。
図１７Ｃの左から右の順に、上の４つの写真は、ＮＧＦ、そして抗ＮＧＦ抗体(すなわちＮＧＦ欠乏)のそれぞれ１６、２４および４８時間の存在下において培養したＢＡＸ＋／＋ニューロンを示す。下の４つの写真は、同様に、ＮＧＦ、そして抗ＮＧＦ抗体のそれぞれ１６、２４および４８時間の存在下において培養したＢＡＸ−／−ニューロンを示す。
この図１７Ｃに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。ＣａｍｐｅｎｏｔチャンバーのＮＧＦ欠失アッセイは、上の実施例８に記載のように行った。バックスヌルマウス系統(Ｂａｘ−Ｒ１)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。ＮＧＦ抗体は、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画のＮＧＦ欠失アッセイに用いた(モノクローナル機能-ブロッキング抗ＮＧＦ＃９１１、Genentech、２０ｕｇ／ｍｌ)。ＴＵＪ１抗体(１：５００、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例１、７および８に記載したように行った。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図１７Ｄは、異なる培養条件下で２４時間培養したＥ１３ラット外植片交連ニューロンの培養物の写真である。図１７Ｄのデータは、カスパーゼ−３が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−６が軸索において機能することを示す。
図１７Ｄの左から右の順に、上の３つの写真は、カスパーゼ−３又はカスパーゼ−６のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのＧＦＰ分析を示す。下の３つの写真は、同様に、カスパーゼ−３又はカスパーゼ−６のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのＴＵＮＥＬ(細胞死)分析を示す。
この図１７Ｄに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例２に記載のように行った。交連細胞体のプログラムされた細胞死は、上の実施例７に記載のように、ＴＵＮＮＥＬアッセイによって交連外植片培養において可視化した。交連外植片は、４％ＰＦＡ／ＰＢＳにて固定し、インサイツ細胞死検出キット(カタログ番号１１ ６８４ ７９５ ９１０、Roche)を製造業者の指示マニュアル(Roche)に従って使用し、ＤＮＡ鎖遮断(ＴＵＮＮＥＬ技術)の標識に基づいて、単一細胞レベルでプログラムされた細胞死(アポトーシス)の検出のために処理した。交連感覚及び運動の外植片培養物の細胞体におけるアポトーシスは、蛍光電子顕微鏡法によって分析した(図１７Ｄ)。カスパーゼ−３インヒビターであるＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫは、１０ｕＭでこのアッセイに用いた(Ｚ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ、カタログ番号２６４１５５、Calbiochem)。カスパーゼ-６インヒビターであるＺ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫは、１０ｕＭでこのアッセイに用いた(Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ、カタログ番号５５０３７９、Becton, Dickinson and Company, PHARMINGEN Division)。ＧＦＰ標識の交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(ＧＦＰの場合に緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。蛍光標識したＴＵＮＮＥＬポジティブアポトーシスの細胞体を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(ＴＵＮＮＥＬの場合に赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
【０１８２】
実施例１４：動物モデルにおけるＤＲ６アンタゴニスト活性
異なる神経変性疾患と関係する多くの動物モデルは、インビボでのＤＲ６アンタゴニストの効果を調べるために、当業者によって用いられうる。例えば、ＡＰＰ／ＲＫトランスジェニックマウスは、変異アミロイド前駆体タンパク質ポリペプチドを発現し、重症な神経変性およびアポトーシスを表す。したがって、ＡＰＰ／ＲＫトランスジェニックマウスはアルツハイマー病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するＤＲ６アンタゴニストの効果を調べるために用いられる(例としてMoechars et al., Neuroscience 91(3): 819-830 (1999)を参照)。ＡＰＰ２３およびＪＮＰＬ３トランスジェニック系統などの様々な他のトランスジェニックマウス系統は、変異アルツハイマー関連ポリペプチドを発現し、さらに神経細胞消失を表す。ゆえに、ＡＰＰ２３およびＪＮＰＬ３のトランスジェニックマウスは、ＤＲ６アンタゴニストが投与されうるアルツハイマー病の代替モデルとなる(例としてMcGowan et al., TRENDS in Genetics Vol. 22 No. 5 (2006)を参照)。
Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１トランスジェニックマウスは、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ変異型ポリペプチドを発現し、高いレベルのカスパーゼ−３発現と運動ニューロンアポトーシスを表す。Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１トランスジェニックマウスは、ＤＲ６アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる筋萎縮性側索硬化症のモデルとなる(例としてTokuda et al., Brain Res. 1148: 234-242 (2007)；及びWang et al., Eur. J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007)を参照)。Ｒ６／２トランスジェニックマウスは、その天然のプロモーターの制御下に拡張されたＮ末端ポリグルタメートリピートを有するｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎのエキソン−１を発現し、ヒトのハンチントン病によく似た進行性神経病理的変化を表す(例としてMangarini et a1., Cell, 87, 493-506 (1996)；Chen et al., Nat. Med. 6, 797-801 (2000)を参照)。Ｒ６／２トランスジェニックマウスはハンチントン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するＤＲ６アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる(例としてWang et al., European Journal of Neuroscience, 26: 633-641 (2007)を参照)。ＰＫ−ＫＯトランスジェニックマウスは、Ｐａｒｋ−２遺伝子のタンパク質産物を発現せず、パーキンソン病に似ている異常を表し、野生型マウスよりアポトーシスを起こしやすいニューロンを保持する(例としてCasarejos et al., J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006)を参照)。ＰＫ−ＫＯトランスジェニックマウスはパーキンソン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するＤＲ６アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。さらに、多くのトランスジェニックマウス系統、例えばＳｍｎ−／−ＳＭＮ２マウス、ヒトＡＲプロモーター下に純粋な２３９トリヌクレオチドＣＡＧリピートを持つトランスジェニックマウス、並びに、マウスのバックグラウンドにおいて機能するヒトのＳＭＮＣ遺伝子の少なくとも一コピーを有する天然のマウスＳｍｎ遺伝子のトランスジェニックダブルノックアウトのすべては、生存運動ニューロン遺伝子のタンパク質産物を発現しない、もしくはその変更したバージョンを発現し、そのために、脊髄性筋萎縮症に似ている異常を表す(例としてHsiu et al., Nature Genetics 24, 66 - 70 (2000)；Ferri et al., Neuroreport 15(2): 275-280 (2004)；Ferri et al., Curr Biol. 2003 Apr 15;13(8): 669-73；及びRossol et al., Journal of Cell Biology, Volume 163, Number 4, 801-812 (2003)を参照)。結果として、このようなトランスジェニックマウス系統は、脊髄性筋萎縮症のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するＤＲ６アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。
【０１８３】
上記のものを含む神経学的状態又は疾患の動物モデルを用いて、本明細書において開示するＤＲ６アンタゴニスト、例えばＤＲ６を結合する一又は複数の抗体(例えば３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７モノクローナル抗体)、および／またはＡＰＰを結合するＤＲ６の一又は複数の可溶型(例えば、配列番号：１のアミノ酸１−３５４を含むもの)、および／またはＡＰＰを結合する一又は複数の抗体(例えば２２Ｃ１１モノクローナル抗体)、並びに互いに組み合わせた及び／又は当分野で公知の他の治療薬と組み合わせたこれら薬剤の効果を調べることができる。
本明細書において開示するＤＲ６アンタゴニストの一又は複数を実験的に試験するための例示的なプロトコールでは、動物モデルの中から多くの月齢及び性別が一致する動物(例えば６か月齢の雌ＡＰＰ／ＲＫトランスジェニックマウス)を、複数の試験及び／又はコントロール群の一つに割り当ててもよい。次いで、これらの動物の第一実験群に、特定の投与プロトコール(例えば、各注入につき２０ｍｇ／ｋｇ体重のＤＲ６アンタゴニスト抗体を２週間ごとに６か月間腹腔内注入)に従って、選択されたＤＲ６アンタゴニストを投与してもよい。他の実験群の条件は、標準的な方法に従って変更することができる。例えば、異なる用量のＤＲ６アンタゴニストを投与(例えば１、５、１０、１５ｍｇ／ｋｇ体重)、異なる計画のＤＲ６アンタゴニストを投与(例えば、毎週、１２か月間注入)、異なるＤＲ６アンタゴニストを投与(例えば、ＤＲ６イムノアドヘシン)、薬剤を組み合わせて使用(例えば、コリンエステラーゼインヒビターと組み合わせたＤＲ６アンタゴニスト)、異なる投与経路を使用(例えば静脈内投与)など。一又は複数の動物群を、コントロールとして、例えばＤＲ６アンタゴニストを摂取する実験群と同じ投与クールに従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水を摂取する群としてもよい。
その後、ＤＲ６アンタゴニストを摂取した後のいくつかの時点で、これら試験動物群と一致するコントロール動物群を比較して、例えばインビボでのＤＲ６アンタゴニストの効果を調べる、及び／又は特徴付けることができる。例えば、これらの試験動物群及びコントロール動物群の特定の組織又は器官(例えば脳)からの神経細胞を含む試料を、これらの群の神経細胞の状態を比較するために、磁気共鳴電子顕微鏡法および／または免疫組織化学分析のような技術によって評価することができる(例としてPetrik et al., Neuromolecular Med. 9(3): 216-29 (2007)を参照)。あるいは、これらの群から得た試料は、神経突起軌道の変更、樹状突起棘消失又は樹状突起の細線化のような現象を示すために、多光子電子顕微鏡法のような技術によって評価されてもよい(例としてTsai et al., Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004)：及びSpires et al., J. Neurosci. 25, 7278-7287 (2005)を参照)。あるいは、これらの群から採取した血液又は他の組織試料は、炎症及び／又はアポトーシスのマーカー、例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ｐ５３タンパク質、インターフェロン−γ又はＮＦ−κＢのレベルを測定するように設計されたＥＬＩＳＡプロトコールに用いることができる(例としてRakover et al., Neurodegener. Dis. 4(5): 392-402 (2007)；及びMogi et al., Neurosci Lett. 414(1): 94-7 (2007)を参照)。あるいは、試験群及び対応するコントロール群の動物を、当分野で公知の行動試験パラダイム、例えばモーリス水迷路又はオブジェクト認識試験において比較することができる(例としてHsiao et al., Science 274, 99-102 (1996)；Janus et al., Nature 408, 979-982 (2000)；Morgan et al., Nature 408, 982-985 (2000)；及びEnnaceur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59を参照)。試験動物群及び対応するコントロール動物群の比較の結果から、当業者は、動物モデルにおけるＤＲ６アンタゴニストの効果を試験することができるであろう。
実施例１−１３、ここに含まれるデータおよびこのデータの関連する特徴は、ＤＲ６アンタゴニストが例えばインビボで神経細胞のアポトーシスを阻害するということを証明するものである。特に、上の実施例１−１３は、(１) ＤＲ６は多種多様な神経細胞のアポトーシスを誘導する、(２) ＡＰＰはＤＲ６を結合するＤＲ６の同族リガンドであり、ＤＲ６が媒介するアポトーシスを誘発する、そして(３) インビトロのＤＲ６／ＡＰＰ結合相互作用を阻害するＤＲ６アンタゴニストは結果として、インビトロでＤＲ６が媒介するアポトーシスを阻害する、ということを教示する。出願人の所見および開示により、一当業者は、ＤＲ６アンタゴニストがインビボでＤＲ６が媒介するアポトーシスを阻害すると合理的に予測できるであろう。したがって、当業者は、上記のような動物モデル及び、これら動物モデルに観察される様々な病理学的プロセスを調べるための関連技術によって、本明細書に記載のように、ＤＲ６アンタゴニストの生物活性を確認することができると合理的に予測できるであろう。
【０１８４】
実施例１５：脊髄性筋萎縮症の動物モデルにおけるＲａ.１(「１Ｅ５.５.７」)、Ｒａ.２、Ｒａ.３(「３Ｆ４.４.８」) 及びＲａ.４抗体処置
脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)は、脊髄の前角にある運動ニューロンに作用する劣性の運動ニューロン疾患であって、ＳＭＮ(生存運動ニューロン)タンパク質の減少から生じると考えられている。ＳＭＡの動物モデルは、系統名称：ＦＶＢ.Ｃｇ-Ｔｇ(ＳＭＮ２＊ｄｅｌｔａ７)４２９９Ａｈｍｂ Ｔｇ(ＳＭＮ２)８９Ａｈｍｂ  Ｓｍｎ１ｔｍ１Ｍｓｄ／Ｊ(ＪＡＸ５０２５)を有するトランスジェニックマウス系統である(例としてLe et al., Human Molecular Genetics 14(6): 845-857 (2005)を参照)。この３重変異型マウスは、２つのトランスジェニック対立遺伝子と単一の標的変異体を有している。Ｔｇ(ＳＭＮ２＊ｄｅｌｔａ７)４２９９Ａｈｍｂ対立遺伝子はエキソン７を欠いているＳＭＡ ｃＤＮＡからなるのに対して、Ｔｇ(ＳＭＮ２)８９Ａｈｍｂ対立遺伝子はヒトＳＭＮ２遺伝子全長からなる。下記の記載では、この系統もまた、デルタ７ ＳＭＡ ＫＯモデルと称する。
標的とする変異型Ｓｍｎ対立遺伝子のホモ接合体および２つのトランスジェニック対立遺伝子のホモ接合体であるマウスは、近位の脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)に罹患している患者に類似する症状および神経病理学を表す。３重の変異体は、出生時、正常な同腹仔より顕著に小さい。５日までに、筋力低下の徴候が現れ、週を経るにつれ次第に顕著になり、マウスは異常歩行、後四肢の震えおよび転倒傾向を表す。平均生存率はおよそ１３日である。３重の変異型マウスはさらに、触覚刺激に対する反応は障害されていないが、表面立ち直り、負の走地性および断崖回避に対する反応が障害されていることを表す。自発運動活性および握力もまた、これらのマウスにおいて有意に障害されている(例としてButchbach et al., Neurobiol Dis. 27(2): 207-19 (2007)を参照)。以下のプロトコールは、ＤＲ６アンタゴニスト抗体などの特定の抗体の効果、及びデルタ７ＳＭＡモデルマウス(ＫＯ)の生存率、体重及び緊張力に対する用量を決定するために設定される。
上記したように、この研究において使用したマウスは、デルタ-７ ＳＭＡ(ＪＡ×５０２５) ＫＯモデル(ｓｍｎ−／−；ＳＭＮ２＋／＋；ｄ７＋／＋)であってもよい。出生時に、同腹仔を、例えば雄と雌を等数に分けるなどによってランダムに１０匹(又は他の数)に選別してもよい。このプロトコールに次いで、同腹仔を、第一投薬(Ｐ３)の時間までに８匹のマウスに選別してもよい。６匹未満のいずれかの同腹仔を試験から除いてもよい。月曜日から水曜日に生まれる同腹仔のマウスの尾部を出生時(Ｐ０)に切断してもよい。当分野で公知の様々な方法によって、例えば、Ｔｒａｎｓｎｅｔｙｘ社などの分子診断会社から市販されている、トランスジェニック、ノックアウトおよびノックイン突然変異について生検において自動化した遺伝子タイピングサービススクリーニングを用いて、遺伝子タイピングがなされてもよい。このような遺伝子型データは一般的に出生後の４８時間以内に利用可能である。
例えば月曜日−水曜日に生まれるマウスを例示する実験に用いてもよい。マウスは、Ｐ３にＩＰ投薬を始めてもよい。試験における代表的な数は以下の通りである。(１) 滅菌ＰＢＳなどのベヒクルによる、例えば平均して、１０匹のＫＯ(雄５、雌５)、(２) ２０ｍｇ／ｋｇを含む第一用量のそれぞれの抗体による、例えば平均して、１０匹のＫＯ(雄５、雌５)、そして、(３) ５ｍｇ／ｋｇを含む第二用量のそれぞれのＤＲ６抗体による、例えば平均して、１０匹のＫＯ(雄５、雌５)。各々の動物に、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８及び２Ｃ７.３.７抗体をそれぞれ週２回ＩＰ投与してもよい。２Ｃ７.３.７抗体(Genentech, Inc.)はＤＲ６に結合するが機能をブロックするものではない抗体である。３Ｂ１１.７.７抗体(Genentech, Inc.)はＤＲ６に結合するがＤＲ６活性を亢進又は刺激しうる抗体である。
４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８及び２Ｃ７.３.７抗体は４℃で保存されてもよい。これらの抗体は、必要に応じて投薬の前に室温に暖められてもよい。ＰＢＳのような代表的なベヒクルが使われてもよい。この実施例の４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８及び２Ｃ７.３.７モノクローナル抗体はヒトＤＲ６ポリペプチド配列を免疫原として用いて生成したが、実施例７に記載の軸索変性及びアポトーシスアッセイなどのプロトコールによって示されるように、これらすべての抗体はヒトだけでなくラットやマウスのＤＲ６と反応する。
ある例示的な実施態様では、評価したＤＲ６アンタゴニストは、アンタゴニスト抗体４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８及び２Ｃ７.３.７であり、抗体当たりの治療群の数は２(１群につき１０匹の動物)であってもよく、投与の手段はＩＰであってもよく、そして、用量範囲は５〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。場合によって、群は以下の通りでもよい。(１) ４Ｂ６.９.７：５ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(２) ４Ｂ６.９.７：２０ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(３) １Ｅ５.５.７：５ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(４) １Ｅ５.５.７：２０ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(５) ３Ｆ４.４.８：５ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(６) ３Ｆ４.４.８：２０ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(７) ２Ｃ７.３.７：５ｍｇ／ｋｇのＩＰ、(８) ２Ｃ７.３.７：２０ｍｇ／ｋｇのＩＰ、そして、(９) ベヒクル(ＰＢＳ)のＩＰ。このプロトコールでは、マウスを毎日計測してもよい。出生後日数(ＰＮＤ)１０、１２および１４に、同腹仔中の各仔の体重を測定してもよい。ＰＮＤ６、８、１０、１２、１４および１６に、試験中の各動物について筋張力評価を行ってもよい。(例として以下に示す例示的な表現型タイピングプロトコールを参照)。
出生時(Ｐ０)に、仔の皮下に毒性のないインクを用いて刻印してもよく、遺伝子タイピングのために尾部切断試料を採取する(結果は、通常４８時間以内に利用可能である)。試験日(Ｐ３)に、新生仔を有する母マウスを毎日同じ時間に実験室に連れて行き、試験を始める前の少なくとも１０分の間そっとしておいてもよい。仔は、まず走地性試験、その後チューブ試験(チューブ試験の２つの連続的な実験)を行ってもよい。同腹仔のすべての仔を試験してその後すべての仔を母マウスに戻すまで、仔を温めたパッドに置いてもよい(子犬は、ケージ寝具と混合して扱い後に母マウスによる拒絶を最小限にしてもよい)。生存および体重は出生から離乳まで毎日点検してもよい。新生仔軸体温に対する薬剤の作用は通常、既に行われた慢性ＭＴＤ試験の間に評価される。体温：特定の月齢時に軸体温を読み取ってもよい。
試験群およびコントロール群のマウスは、Ｇｅｏｔａｘｉｓを含む試験プロトコールによって、相違について調べられてもよい。走地性は、傾斜した台上に伏臥位に置いて正しい方向に向く動物の能力を試験する。この試験は運動協調性および前庭系を測定する。
事後試験(post-hoc test)として、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘを有するカプラン・マイヤー分析を使用して生存率評価を行ってもよい。
経時的に測定を繰り返したデータを分析するために、Ｍｉｘｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｍｏｄｅｌｓ(混合ＡＮＯＶＡモデルとしても知られる)を用いてもよい。この手法は、代表的な繰り返し計測ＡＮＯＶＡ分析法などの瞬間評価よりむしろ可能性評価に基づいているが、経時的なマウス死亡による値の欠落にも強い。すべてのモデルは、ＳＡＳ ９.１.３. (SAS Institute, Cary, NC)のＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ手順を用いて合わせて(fit)もよい。処置はモデルにおいて最も重要な因子である。性別及び日数、並びに処置との相互作用を考慮してもよい。 
試験エンドポイントは死であってもよい。
動物は、実施例１４、例えば組織学的分析に記載のような方法によって、さらに評価されてもよい。さらに、血清／血液を評価して、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、３Ｆ４.４.８及び２Ｃ７.３.７の血清中濃度を決定してもよい。
【０１８５】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA(ATCC)に寄託した：
材料                ＡＴＣＣ寄託番号        寄託日
３Ｆ４.４.８        ＰＴＡ−８０９５        ２００６年１２月２１日
４Ｂ６.９.７        ＰＴＡ−８０９４        ２００６年１２月２１日
１Ｅ５.５.７        ＰＴＡ−８０９６        ２００６年１２月２１日
【０１８６】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886 OG 638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による開示は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。ここに例示した実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、請求の範囲内に入るものである。
【図１Ａ−１】
2011524523.tif 000010
【図１Ａ−２】
2011524523.tif 000011
【図１Ａ−３】
2011524523.tif 000012
【図１Ｂ−１】
2011524523.tif 000013
【図１Ｂ−２】
2011524523.tif 000014
【図１Ｃ】
2011524523.tif 000015
【図１Ｄ−１】
2011524523.tif 000016
【図１Ｄ−２】
2011524523.tif 000017
【図３】
2011524523.tif 000018
【図９Ａ】
2011524523.tif 000019
【図２Ａ】
2011524523.tif 000020
【図２Ｂ】
2011524523.tif 000021
【図２Ｃ】
2011524523.tif 000022
【図４】
2011524523.tif 000023
【図５】
2011524523.tif 000024
【図６】
2011524523.tif 000025
【図７】
2011524523.tif 000026
【図８】
2011524523.tif 000027
【図９Ｂ】
2011524523.tif 000028
【図９Ｃ】
2011524523.tif 000029
【図１０Ａ】
2011524523.tif 000030
【図１０Ｂ】
2011524523.tif 000031
【図１１Ａ】
2011524523.tif 000032
【図１１Ｂ】
2011524523.tif 000033
【図１２Ａ】
2011524523.tif 000034
【図１２Ｂ】
2011524523.tif 000035
【図１２Ｃ】
2011524523.tif 000036
【図１３Ａ】
2011524523.tif 000037
【図１３Ｂ】
2011524523.tif 000038
【図１４Ａ】
2011524523.tif 000039
【図１４Ｂ】
2011524523.tif 000040
【図１４Ｃ】
2011524523.tif 000041
【図１４Ｄ】
2011524523.tif 000042
【図１５Ａ】
2011524523.tif 000043
【図１５Ｂ】
2011524523.tif 000044
【図１５Ｃ】
2011524523.tif 000045
【図１５Ｄ】
2011524523.tif 000046
【図１６】
2011524523.tif 000047
【図１７Ａ】
2011524523.tif 000048
【図１７Ｂ】
2011524523.tif 000049
【図１７Ｃ】
2011524523.tif 000050
【図１７Ｄ】
2011524523.tif 000051
【配列表】
2011524523000001.app
【国際調査報告】
2011524523.tif 000052
2011524523.tif 000053