(57)【要約】  ペルメトリンのようなピレスロイドを酵素的に解毒するための方法および組成物を提供する。該方法は、ペルメトリンのようなピレスロイドで汚染された表面または物質に、有機リン酸加水分解酵素ＯＰＨを適用することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピレスロイドを分解する方法であって、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む、方法。
【請求項２】
ピレスロイドがサンプル中に存在する請求項１に記載の方法であって、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物とサンプルを接触させることを含む、方法。
【請求項３】
ピレスロイドが完全に分解されるか、あるいは少なくとも部分的に分解される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ピレスロイドがアクリナトリン、アルファ−シペルメトリン、ベータ−シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、デルタメトリン、エスフェンバレレート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリネート、ラムダ−シハロトリン、ペルメトリン、タウフルバリナート、フルバリナート、トラロメトリン、ゼータ−シペルメトリン、シフルトリン、ビフェントリン、シクロプロトリン、エフルシラネート、フブフェンプロックス、ピレトリン、レスメトリン、ガンマ−シハロトリン、アレスリン、テトラメトリン、ｄ−フェノスリン、ビオレスメトリン、シフェノスリンおよびスミスリンから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ピレスロイドがアレスリン、テトラメトリン、レスメトリン、d−フェノスリン、ビオレスメトリンおよびペルメトリンから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ピレスロイドがシペルメトリン、シフルトリン、デルタメトリン、シフェノスリン、フェンバレレートおよびフルバリナートから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ピレスロイドがペルメトリン、レスメトリンおよびスミスリンから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ピレスロイドがペルメトリンである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サンプルが約6.5〜約9.0のｐＨを有する、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨが約8,5である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サンプルのｐＨが8.5に調節される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルの温度が約20℃〜30℃である、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
サンプルの温度が約22℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが製造プロセス廃液である、請求項２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
製造プロセスがピレスロイドによる敷物類の処理を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中のピレスロイドを分解する方法であって、ＯＰＨを発現する微生物を含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む、方法。
【請求項１７】
微生物が細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ピレスロイドを不活性化する方法であって、ＯＰＨを含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
ピレスロイドの活性を低下させる方法であって、ＯＰＨを含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
サンプル中のピレスロイドを不活性化する方法であって、ＯＰＨを含む組成物とサンプルを接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
サンプル中のピレスロイドの活性を低下させる方法であって、ＯＰＨを含む組成物とサンプルを接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
ピレスロイドがペルメトリンである、請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種の単離された酵素を含む、ピレスロイド分解組成物。
【請求項２４】
ＯＰＨを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ピレスロイドがペルメトリンである、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ピレスロイドを分解するための、ＯＰＨの使用。
【請求項２７】
ピレスロイドがペルメトリンである、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の引用
配列番号１〜４を含む配列表を添付し、その全体において参照により組み込む。
発明の分野
ペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法、ならびにとりわけ、かかる分解を実施するための酵素組成物。
【背景技術】
【０００２】
背景
ピレスロイド類は、キクの花によって産生される天然殺虫剤ピレトラム（pyrethrum）に類似した、人工殺虫剤群である。ピレスロイドは多様な昆虫を制御するために広範に使用されている。ピレスロイド類は昆虫の神経系を阻害する。化学構造および曝露時症状において異なる２つのタイプが存在する。タイプＩのピレスロイド類は、アレスリン、テトラメトリン、レスメトリン、d−フェノスリン、ビオレスメトリンおよびペルメトリンを含む。タイプIIのピレスロイド類の例は、シペルメトリン、シフルトリン、デルタメトリン、シフェノスリン、フェンバレレートおよびフルバリナートである。タイプＩとタイプIIのピレスロイド類のいずれも、昆虫の神経系を阻害する。これは神経細胞膜中のナトリウムイオンチャネルで生じる。いくつかのピレスロイド類は、ＧＡＢＡと呼ばれる神経伝達物質の作用にも影響する。ピレスロイド類は、家庭用殺虫剤、ペットスプレーおよびシャンプーを含む、昆虫を制御するために使用される多くの市販製品中に見られる。いくつかのピレスロイド類は、頭部に直接適用されるシラミ処置剤として、そして服に適用可能な防蚊剤としても使用される。
【０００３】
ペルメトリンは殺虫剤のピレスロイド群のメンバーである。それは水性生物に対する高い毒性のために、農作物および広い面積への適用について米国環境保護庁（ＥＰＡ）が使用を規制している殺虫剤である（広い面積での蚊成虫駆除剤としての使用を除く）。しかし、家庭用および工業用については一般に使用される殺虫剤に分類される。ＥＰＡのデータによると、年間およそ２００万ポンドのペルメトリンが農業、家庭および公衆衛生のために使用されている。
【０００４】
ペルメトリンは昆虫／節足動物駆除効果に加えて、ヒトに使用したときの相対的安全性が知られている。したがって、ペルメトリンの別の主要な用途は、敷物類の製造における虫食い防止剤である。製造プロセスの一部として、ペルメトリン含有廃液が生じる。生じた廃液は、その潜在的な毒性のために環境へと単に廃棄することができないため、敷物類製造産業に取り扱いおよび処分の問題を生じる。
【０００５】
したがって、ペルメトリンが河川や水循環中に不注意に流し込まれると、魚類を毒することが知られているため、注意を喚起する必要がある。。哺乳類において、ペルメトリンは、神経膜ナトリウムチャネルの正常な生化学および生理を修飾して、神経機能を変化させる。ヒトにおける毒性症状は、皮膚および眼の炎症、音または刺激に対する過敏性、異常な顔面の感覚、穿痛感、皮膚のうずきまたはムズムズ感、無感覚、頭痛、目眩、悪心、嘔吐、下痢、過剰な唾液分泌および疲労を含む。
【０００６】
したがって、非毒性であり、環境的に安全で、ユーザーフレンドリーであり、廃液ならびに他の溶液および混合物中のペルメトリンを解毒することができる、ピレスロイド除染手段、例えばペルメトリン除染手段が必要とされている。溶液中に存在するのではないペルメトリンに対して作用し得るピレスロイド除染手段、例えばペルメトリン除染手段も必要である。本開示は、これらの必要性を満たし、取り組むものである。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書において、ペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法であって、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む方法を提供する。さらに本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法であって、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物を前記サンプルと接触させることを含む方法を提供する。ある局面において、ペルメトリンのようなピレスロイドは完全に分解される。別の局面において、ペルメトリンのようなピレスロイドは部分的に分解される。
【０００８】
また本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを不活性化する方法であって、ＯＰＨを含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む方法を提供する。
【０００９】
また本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドの活性を低下させる方法であって、ＯＰＨを含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む方法を提供する。ある局面において、サンプルは約6.5〜約9.0のｐＨを有する。別の局面において、ｐＨは約8.5である。別の局面において、サンプルのｐＨが8.5に調節される。ある局面において、サンプルの温度は約20℃〜30℃である。別の局面において、サンプルの温度は約22℃である。
【００１０】
ある局面において、ピレスロイド含有サンプル、例えばペルメトリン含有サンプルは、製造プロセス廃液である。ある局面において、製造プロセスはペルメトリンのようなピレスロイドでの敷物類の処理を含む。
【００１１】
また本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法であって、ＯＰＨを発現する微生物を含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む方法を提供する。ある局面において、微生物は細菌である。
【００１２】
また本明細書において、少なくとも１種の単離された酵素を含む、ピレスロイド分解組成物、例えばペルメトリン分解組成物を提供する。ある局面において、ピレスロイド分解組成物、例えばペルメトリン分解組成物は、ＯＰＨを含む。ある局面において、ピレスロイドを分解するためのＯＰＨの使用が提供される。
【００１３】
添付の図面は本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、多様な態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１５分間でのサンプル中残留ペルメトリン量のグラフである。
【図２】ＯＰＨによるペルメトリン分解についての、温度の関数としてのＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性はＯＰＨ単位／酵素のグラムとして表す。
【図３】ＯＰＨによるペルメトリン分解についての、ｐＨの関数としてのＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性はＯＰＨ単位／酵素のグラムとして表す。
【図４】ＯＰＨによるペルメトリン分解についての、バッファー濃度の関数としてのＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性は相対的活性の百分率として表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書において、ピレスロイドを分解する方法であって、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む方法を提供する。
【００１６】
さらにまた、ペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法であって、該ピレスロイドがサンプル中に存在し、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む組成物とサンプルを接触させることを含む方法を提供する。
【００１７】
ある局面において、ピレスロイドは完全に分解されるか、あるいは少なくとも部分的に分解される。
【００１８】
ピレスロイド類は殺虫特性を有することが知られている（例えばUS 2007/0276013 A1、WO 2005077186、WO 93-22 297、WO 93-10 083、DE-A 2 641 343、EP-A-347 488、EP-A-210 487、米国特許3,264,177 および EP-A-234 045参照）。
【００１９】
ある局面において、ピレスロイドは下記群から選択される：EP-A-048 186より知られるアクリナトリン、EP-A-067 46より知られるアルファ−シペルメトリン、EP-A-206 149より知られるベータ−シフルトリン、DE-A-2 802 962より知られるシハロトリン、DE-A-2 326 077より知られるシペルメトリン、DE-A-2 326 077より知られるデルタメトリン、DE-A-2 737 297より知られるエスフェンバレレート、DE-A-3 117 510より知られるエトフェンプロックス、DE-A-2 231 312より知られるフェンプロパトリン、DE-A-2 335 347より知られるフェンバレレート、DE-A-2 757 066より知られるフルシトリネート、EP-A-106 469より知られるラムダ−シハロトリン、DE-A-2 326 077より知られるペルメトリン、EP-A-038 617より知られるタウフルバリナート、DE-A-2 742 546より知られるトラロメトリン、EP-A-026 542より知られるゼータ−シペルメトリン、DE-A-27 09 264より知られるシフルトリン、EP-A-049 977より知られるビフェントリン、DE-A-2653189より知られるシクロプロトリン、DE-A-36 04 781より知られるエフルシラネート、DE-A-37 08 231より知られるフブフェンプロックス、The Pesticide Manual 1997, issue 11, page 1056より知られるピレトリン、GB-A-1 168 797より知られるレスメトリン、ガンマ−シハロトリン（The British Crop Protection Council の“The Pesticide Manual, 13.th Edition, 2003, entry 197 page 232より知られる）およびスミスリン。
【００２０】
ある局面において、ピレスロイドは下記群から選択される：アクリナトリン、アレスリン（d-cis-trans、d-trans）、ベータ−シフルトリン、ビフェントリン、ビオアレスリン、ビオアレスリン−５−シクロペンチル−アイソマー、ビオエタノメトリン、ビオペルメトリン、ビオレスメトリン、クロバポルトリン、cis-シペルメトリン、cis-レスメトリン、cis-ペルメトリン、クロシトリン、シクロプロトリン、シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン（アルファ−、ベータ−、シータ−、ゼータ−)、シフェノスリン、デルタメトリン、エムペントリン（1R-アイソマー）、エスフェンバレレート、エトフェンプロックス、フェンフルトリン、フェンプロパトリン、フェンピリトリン、フェンバレレート、フルブロシトリネート、フルシトリネート、フルフェンプロックス、フルメトリン、フルバリナート、フブフェンプロックス、ガンマ−シハロトリン、イミプロトリン、カデトリン、ラムダ−シハロトリン、メトフルトリン、ペルメトリン（cis-、trans-）、フェノスリン（1R-transアイソマー）、プラレスリン、プロフルトリン、プロトリフェンブト、ピレスメトリン、レスメトリン、RU 15525、シラフルオフェン、タウフルバリナート、テフルトリン、テラレスリン、テトラメトリン（-1R-アイソマー）、トラロメトリン、トランスフルトリン、ZXI 8901、ピレトリン（ピレトラム）。
【００２１】
ある局面において、ピレスロイドは下記群から選択される：アクリナトリン、アルファ−シペルメトリン、ベータ−シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、デルタメトリン、エスフェンバレレート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリネート、ラムダ−シハロトリン、ペルメトリン、タウフルバリナート、フルバリナート、トラロメトリン、ゼータ−シペルメトリン、シフルトリン、ビフェントリン、シクロプロトリン、エフルシラネート、フブフェンプロックス、ピレトリン、レスメトリン、ガンマ−シハロトリン、アレスリン、テトラメトリン、d−フェノスリン、ビオレスメトリン、シフェノスリンおよびスミスリン。
【００２２】
一つの局面において、ピレスロイドはアレスリン、テトラメトリン、レスメトリン、d−フェノスリン、ビオレスメトリンおよびペルメトリンから成る群から選択される。
一つの局面において、ピレスロイドはシペルメトリン、シフルトリン、デルタメトリン、シフェノスリン、フェンバレレートおよびフルバリナートから成る群から選択される。
一つの局面において、ピレスロイドはペルメトリン、レスメトリンおよびスミスリンから成る群から選択される。
一つの局面において、ピレスロイドはペルメトリンである。
【００２３】
ペルメトリンは、例えば農業ならびに特に物質的生産および処理において、広く使用されている化合物であるピレスロイドの例である。しかし、ペルメトリンおよび他のピレスロイド類は魚類および多様な哺乳類に毒性であり、したがってペルメトリンの工業的および商業的使用に由来するペルメトリン含有廃棄物の取り扱いおよび廃棄には注意を払わなければならない。例えば、敷物類製造プロセスのペルメトリン含有廃液は、取り扱いおよび廃棄の問題を提示する。本明細書において、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）がペルメトリンを分解できることを示す。ペルメトリン廃棄物およびペルメトリン含有組成物を処理するために触媒的に効率的な酵素を用いることで、さらなる毒性化学物質またはコストの高い化学物質を使わなくてよい。
【００２４】
１．定義および略語
この詳細な説明に従って、下記略語および定義が適用される。本明細書において使用するとき、文脈が明らかに異なることを示していない限り、単数形"a"、"an"および"the"は複数の意味を含むことに注意すべきである。したがって例えば、「酵素」なる記載は、複数のかかる酵素を含み、そして「該製剤」なる記載は、１個以上の製剤および当業者に既知のその均等物等を含む。
【００２５】
異なることが定義されていない限り、本明細書において使用されている全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。次の用語は以下に提供される。
【００２６】
１．１．定義
本明細書において使用するとき、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスを意味する。該プロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００２７】
「単離された」は、配列が少なくとも実質的に、該配列が天然に関連しており、天然に見られる少なくとも１つの他の成分、例えばゲノム配列から自由であることを意味する。
【００２８】
「精製された」は、物質が相対的に純粋な状態、例えば少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、または少なくとも約96％、97％、98％または99％の純度であることを意味する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」および／または「タンパク質」と同義である。いくつかの例において、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義であり；いくつかの例において、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義である。
【００３０】
本明細書において使用するとき、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびにその変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を意味する。ヌクレオチド配列はゲノム、合成または組換え起源のものであってよく、二本鎖またはセンスもしくはアンチセンス鎖のいずれかを示す一本鎖であってよい。本明細書において使用するとき、用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００３１】
本明細書において使用するとき、「合成」化合物はインビトロ化学または酵素的合成によって産生される。それは酵母細胞宿主または他の選択した発現宿主のような宿主生物に最適なコドン利用によって、多様な核酸を作成することを含むが、これに限定されない。
本明細書において使用するとき、「ＯＰＨ活性」は、本明細書に記載のペルメトリンの分解を意味する。
「サンプル」は、本明細書において使用するとき、ペルメトリンを含み得る任意の物質である。
【００３２】
１．２．略語
異なることが示されていない限り、下記略語が適用される：
cDNA    相補ＤＮＡ
DEAE    ジエチルアミノエタノール
DNA     デオキシリボ核酸
EC      酵素の分類のための酵素番号
GCMS    ガスクロマトグラフィー質量分析
HPLC    高速液体クロマトグラフィー
mRNA    メッセンジャーリボ核酸
OP      有機リン酸
OPH     有機リン酸加水分解酵素
PCR     ポリメラーゼ連鎖反応
ppm     百万分率
RT−PCR  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SDS−PAGE    ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
1X SSC  0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH 7.0
w/v     重量／体積
w/w     重量／重量
【００３３】
２．ピレスロイドの除染方法および組成物
２．１．組成物
ペルメトリンのようなピレスロイドの除染のための、本明細書に記載の組成物は、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）を含む。ホスホトリエステラーゼとしても知られているＯＰＨは、ペルメトリンを分解することが本明細書において示される。本明細書に記載のとおり、除染の酵素的方法は、他の除染よりも顕著な利点を提供する。触媒的であるため、酵素は極めて効率的であり、数分でまたは数秒でさえ、汚染物質それ自体の重量を何度も解毒できる。
【００３４】
元はパラチオンヒドロラーゼと称されていたＯＰＨは、多数の細菌単離物において見られる酵素である。ＯＰＨは、軍用化学神経ガスを含む多様な有機リン酸（ＯＰ）化合物に対する活性を有する。多くの研究者がＯＰＨを研究しており、その構造および機能についての情報は、文献に見ることができる（例えばMulbry et al., J. Bacteriol. (1989) 171: 6740-6746; Raushel, Curr. Opin. Microbiol. (2002) 5: 288-295）。
【００３５】
一つの局面において、「有機リン酸加水分解酵素」、「OPH」、「ホスホトリエステラーゼ」、「ＰＴＥ」は、本明細書において使用するとき、ホスホン酸およびホスフィン酸のエステルを含む有機リン化合物（例えばパラオキソン）に、例えば有機リン酸（ＯＰ）の加水分解において、作用する能力を有するアリールジアルキルホスファターゼ（E.C. 3.1.8.1）のいずれかを意味する。
【００３６】
ＯＰＨに一般に使用される他の名称は次のものを含む：パラオキソナーゼ；Ａ−エステラーゼ；アリールトリホスファターゼ；有機リン酸エステラーゼ；エステラーゼＢ１；エステラーゼＥ４；パラオキソンエステラーゼ；ピリミフォス−メチルオキソンエステラーゼ；ＯＰＡアンヒドラーゼ；有機リンヒドロラーゼ；パラオキソンヒドロラーゼ；有機リン酸アンヒドラーゼ。
【００３７】
この酵素の遺伝子はクローン化され、配列決定され、多数の原核および真核宿主生物において発現されている。ＯＰＨ酵素の２つの一般的な供給源は、シュードモナスディミヌタMGおよびフラボバクテリウム属株ATCC 27551から単離した同一のｏｐｄ遺伝子である。シュードモナスディミヌタMG ｏｐｄ遺伝子はMcDanielらにより単離された（(1989) J. Bacteriol., 170: 2306-2311; その全体において参照により本明細書に組み込む）。McDanielらのｏｐｄ遺伝子はGenebankにおいて、受託（ascension）番号M20392で以下のとおり言及されており、その全体において参照により本明細書に組み込む: LOCUS PSEPTE 1322 bp DNA BCT Apr. 21, 1996 DEFINITION Plasmid pCMS1 (from P. diminuta) ホスホジエステラーゼ(opd)遺伝子, complete cds. ACCESSION M20392 NID g151517 VERSION M20392.1 GI:151517。シュードモナスディミヌタ配列のアミノ酸配列は、配列番号１に示す。
【００３８】
McDanielらにより報告されたｏｐｄ遺伝子のオープンリーディングフレームは、分子量35 kDaを有する325アミノ酸残基のＯＰＨポリペプチドをコードする975塩基を含む。Mulbryら（J. Bacteriol. (1989) 171: 6740−6746; その全体において参照により本明細書に組み込む）もｏｐｄ遺伝子をクローン化したが、上記ｏｐｄ遺伝子と比較して、該クローンは４アミノ末端残基（Ser-Ile-Gly-ThrまたはSIGT）を欠いていた（配列番号２）。
【００３９】
フラボバクテリウム属 MTCC 2495の有機リン酸ヒドロラーゼのアミノ酸配列は配列番号４に示す。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号４と１アミノ酸が異なっており、末端でセリンを欠く。
【００４０】
さらなる局面において、ＯＰＨは配列番号１のアミノ酸配列を有する。さらなる局面において、ＯＰＨは配列番号３のアミノ酸配列を有する。さらなる局面において、ＯＰＨは配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００４１】
ＯＰＨの三次元結晶構造も決定されており、天然の該酵素はサブユニットあたり２個のZn2+イオンを含むホモダイマーである。Co2+置換酵素は神経ガスならびにＰ−ＦおよびＰ−Ｓ結合を有する基質に対してより優れた活性を有する（Omburo et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 13278-13283）。他の化学物質分解酵素と比較したＯＰＨについてのさらなる研究が実施されているが、その細胞機能および天然基質は不明のままである。
【００４２】
一つの局面において、本明細書に定義のアミノ酸配列または本明細書に定義の特定の特性を有するポリペプチドとある程度の配列同一性または配列相同性を有するポリペプチドの使用が提供される。一つの局面において、配列番号１、配列番号３または配列番号４とある程度の配列同一性を有するペプチドまたはそのホモログが提供される。ここで、用語「ホモログ」は、対象のアミノ酸配列または対象のヌクレオチド配列と配列同一性を有する物質を意味する。ここで、用語「相同性」は、「配列同一性」と等しい。
【００４３】
相同なアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、機能的活性を保持し、そして／またはＯＰＨ酵素の活性を向上するポリペプチドを提供し、そして／またはコードする。
【００４４】
本明細書において、相同な配列は、対象配列と少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であり得るアミノ酸配列を含むことを意味する。典型的には、ホモログは対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。本発明において相同性は類似性なる用語においても考慮され得るが（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、配列同一性なる用語において相同性を表現することが好ましい。
【００４５】
一つの態様において、ＯＰＨ酵素は、配列番号１、３または４に示す配列、あるいはそれと少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の配列同一性を有する配列を有する有機リン酸ヒドロラーゼである。
【００４６】
配列同一性の比較は、目で行うことができ、あるいはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列を整列させて、該２つ以上の配列間の差を導き得る進化的事象を最もよく反映する複雑な比較アルゴリズムを用いる。したがって、これらのアルゴリズムは、同一または類似のアミノ酸のアラインメントに加点し、ギャップの挿入、ギャップ延長および非類似アミノ酸のアラインメントに減点する採点システムによって操作する。比較アルゴリズムの採点システムは次のものを含む：
i)  ギャップ毎に減点割当を挿入する（ギャップ減点）、
ii)  存在するギャップ毎に減点割当は追加位置を付けて延長される（延長減点）、
iii)  同一アミノ酸のアラインメントに対する高得点の割当、および
iv)  非同一アミノ酸のアラインメントに対する多様な得点の割当。
【００４７】
ほとんどのアラインメントプログラムは修飾されるギャップペナルティを許容する。しかし、配列比較にかかるソフトウェアを用いるとき、デフォルト値を用いることが好ましい。
【００４８】
非同一アミノ酸のアラインメントに与えられる配点は、置換マトリックスとも称される配点マトリックスに従って割り当てられる。かかる置換マトリックスにおいて得られる配点は、あるアミノ酸が進化において別のものに置換される可能性によって変化するという事実を反映しており、置換される該アミノ酸の物理的／化学的性質に基づく。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸で置換される可能性は、疎水性アミノ酸で置換される可能性と比較して高い。したがって、配点マトリックスは同一のアミノ酸について最も高い配点を割り当てて、非同一であるが類似のアミノ酸について低い配点を割り当て、そして非同一非類似アミノ酸についてさらに低い配点を割り当てる。最も頻繁に使用される配点マトリックスはＰＡＭマトリックス（Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)）、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992)）およびGonnetマトリックス（Gonnet et al. (1992)）である。
【００４９】
かかるアラインメントを実施するための好適なコンピュータープログラムは、Vector NTI(Invitrogen Corp.)ならびに ClustalV、ClustalW および ClustalW2 プログラム(Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007)）を含むが、これらに限定されない。異なるアラインメントツールの選択は、www.expasy.orgのExPASy Proteomicsサーバーから入手可能である。配列アラインメントを実施可能な別のソフトウェアの例はBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)であり、これは現在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/において発見できるNational Center for Biotechnology Informationのウェブページから入手可能であり、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410において最初に記載された。
【００５０】
ソフトウェアがアラインメントを作成すると、類似性％および配列同一性％を計算することが可能である。該ソフトウェアは典型的には、これを配列比較の一部として行い、数的結果を作成する。
【００５１】
一つの態様において、配列アラインメントを実施するために、ClustalWソフトウェアを用いることが好ましい。好ましくは、ClustalWによるアラインメントは、対合アラインメントのために次のパラメーターで実施される：
置換マトリックス:      Gonnet 250
ギャップオープンペナルティ:    20
ギャップ延長ペナルティ:        0.2
ギャップ終了ペナルティ:        なし。
【００５２】
ClustalW2は、例えばEMBL−EBIのウェブページwww.ebi.ac.ukでEuropean Bioinformatics Instituteによりインターネット上で、ツール−配列分析−ClustalW2から入手可能になっている。現在、ClustalW2ツールの正確なアドレスはwww.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2である。
【００５３】
したがって、本明細書において、本明細書に定義のアミノ酸配列、特に配列番号１、３または４のものの変異体、ホモログおよび誘導体の使用が提供される。
【００５４】
配列、特に配列番号１、３または４のものは、サイレントな変化を生じ、機能的に均等な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有していてもよい。計画的なアミノ酸置換は、該物質の二次的結合活性が保持される限り、該残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸はリシンおよびアルギニンを含み；そして類似の親水性値を有する非荷電極性頭部を有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。
【００５５】
また本明細書において、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性等のような同等置換を生じ得る保存的置換（置換および置き換えは、いずれも本明細書において既存のアミノ酸残基を別の残基で交換することを意味する）も提供される。非保存的置換、すなわちあるクラスの残基から別のものへの置換を生じてもよく、あるいは非天然アミノ酸、例えばオルニチン（以後、Ｚと称する）、ジアミノブチル酸オルニチン（以後、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと称する）、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンを含めてもよい。
【００５６】
行い得る保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、スレオニン）大型アミノ酸（フェニルアラニンおよびトリプトファン）および小型アミノ酸（グリシン、アラニン）のグループ内である。
【００５７】
置換は、次のものを含む非天然アミノ酸によって行ってもよい：アルファ＊およびアルファ−ジ置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハライド誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。上記の目的（相同または非保存的置換に関する）のために使用している記号＊は、該誘導体の疎水的性質を示すが、使用している記号＃は該誘導体の親水的性質を示し、＃＊は両親媒性を示す。
【００５８】
変異アミノ酸配列は、該配列のいずれか２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる好適なスペーサー基、例えばメチル、エチルまたはプロピル基のようなアルキル基あるいはグリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサー基を含んでいてもよい。変異型のさらなる形態は、ペプトイド形態の１個以上のアミノ酸残基の存在を含んでおり、当業者に十分に理解される。疑いを避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素ではなく該残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を意味するものとして使用する。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は、当該技術分野において、例えばSimon RJ et al. (1992)、Horwell DC. (1995)において既知である。
【００５９】
一つの態様において、ＯＰＨ酵素は、配列番号１、３もしくは４に示すアミノ酸配列を有する有機リンヒドロラーゼまたはそれと少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する酵素である。
【００６０】
一つの局面において、本発明において使用される配列は精製された形態である。該成分は組成物中に存在する主たる活性成分であることが望ましい。
【００６１】
当該技術分野において既知のいずれかの手段を用いて、組換えＯＰＨ酵素を精製し、単離することができる。一つの態様において、ＯＰＨは米国特許6,469,145（その全体において、参照により本明細書に組み込む）に記載のとおり、大腸菌宿主内の発現ベクターにおけるクローニングによって調製し、精製する。簡潔には、ＯＰＨは好適な細胞ベースの発現系から発現される。一つの態様において、ＯＰＨは細菌細胞発現系から発現される。細菌タンパク質の水溶液を強いカチオン交換樹脂と接触させる。次いで強いカチオン交換樹脂を洗浄バッファーで洗浄して、非結合タンパク質を除去し、塩濃度を漸増する溶出バッファーを用いてＯＰＨを特異的に溶出する。得られた溶出物をアッセイしてＯＰＨを含むことを確認でき、次いで当該技術分野で既知の方法を用いて貯蔵する。
【００６２】
本明細書に記載の有用なＯＰＨの組成物は、実験例に記載のとおりに調製することができる。ＯＰＨを含む組成物は、ＯＰＨ活性を最大化するために必要に応じて、当業者が理解するとおりに、１種以上のバッファー、塩、安定化剤、保存剤および他の成分を含んでいてよい。「ＯＰＨ」活性は本明細書に記載のとおり、ペルメトリンの分解を意味する。
【００６３】
一つの態様において、ＯＰＨを含む組成物は、ＯＰＨを発現する微生物の培養物または微生物含有培地である。一つの局面において、該微生物はＯＰＨを発現し、周辺培地にＯＰＨを分泌する。別の局面において、発現されたＯＰＨを溶液中に放出させるため、微生物の膜を破壊するか、あるいは損なう。一つの態様において、微生物は大腸菌のような細菌であるが、これに限定されない。
【００６４】
本明細書に記載のＯＰＨ除染組成物が例えばペルメトリンで汚染されているサンプルと接触するとき、該サンプルの物理的および／または化学的特性はＯＰＨの活性を最大化するために必要なとおりに調節することができると理解される。本明細書に記載の実験例は、ペルメトリンのようなピレスロイドの分解に関する改善されたまたは最適なＯＰＨ活性を得る時間、温度、濃度およびｐＨ値についての案内を当業者に与える。
【００６５】
一つの局面において、サンプルは約6.5〜約9.0のｐＨを有する。さらなる局面において、ｐＨは約8.5である。一つの局面において、サンプルの温度は約20℃〜30℃である。さらなる局面において、サンプルの温度は約22℃である。
【００６６】
一つの局面において、ＯＰＨを含む組成物はバッファーを含む。さらなる局面において、バッファー濃度は少なくとも10 mMバッファーである。さらなる局面において、バッファー濃度は少なくとも50 mMバッファーである。さらなる局面において、バッファー濃度は少なくとも90 mMバッファーである。一つの局面において、バッファーは炭酸アンモニウムバッファーである。
【００６７】
本明細書に記載の開示のさらなる利点は、ＯＰＨ酵素利用除染は健康または環境への危険をほとんどまたは全く提起せず、精製を必要とする有害な生成物を生じないことである。ある局面において、本明細書に記載のＯＰＨ含有組成物は、非毒性であり、生物に有害でない。
【００６８】
別の大きな利点は、ＯＰＨ酵素利用除染は、使用者に利用可能ないずれかの入手可能な水ベースのスプレーまたは泡系に加えることができる乾燥粉末として、提供可能なことである。これはペルメトリン除染組成物の使用のための物流負担の顕著な低減を提供する。
【００６９】
２．２．方法
一つの態様において、ＯＰＨはペルメトリンのようなピレスロイドを分解する。本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法が提供される。「サンプル」は、本明細書において使用するとき、ペルメトリンのようなピレスロイドを含むあらゆる物質である。サンプルは該サンプルの外側表面上にペルメトリンのようなピレスロイドを含むか、該サンプルの内部に含むか、あるいは該サンプル中にとけ込んでいる。サンプルは個体サンプル（例えば土、砂利、木、衣類、敷物類等）、半固体サンプルおよび液体サンプル（例えば池、河川または川の水、製造プロセス廃液、下水流出液等）、特に生物を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
サンプルは、ペルメトリンの存在について該サンプルを試験して、例えばペルメトリンを含むと同定できる。本明細書の他の箇所に記載のとおり、ペルメトリンは例えば質量分析および／またはガスクロマトグラフィーを用いて検出できる。しかし当業者は、ペルメトリンのようなピレスロイドを検出する多くの方法が利用可能であり、かかる方法の全てが、現在知られていないかあるいはまだ発見されていなくとも、本発明に含まれると理解する。
【００７１】
同様に、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドの分解または除去の程度は、本明細書の開示に従って処理した後にペルメトリンの存在について該サンプルを試験して、本明細書の方法に従って処理する前の同じサンプル中のペルメトリンの濃度と比較して、モニターできる。
【００７２】
したがって、本明細書において、水溶液、浸出液、流出液、帯水層、地下水、地表水、井戸水、環境サイト、土壌、農業もしくは工業サンプルおよび／または工場保有池、廃水処理施設および蚊排除エリア内の水源における、ペルメトリンのようなピレスロイドの濃度を解毒し、除染し、変化し、除去しまたは低下する方法が提供される。
【００７３】
一つの態様において、製造プロセス廃液のピレスロイド含有サンプル、例えばペルメトリン含有サンプルは、ＯＰＨ含有組成物と接触して、ペルメトリンを分解される。例示的態様において、カーペット製造および処理プロセス廃液のピレスロイド含有サンプル、例えばペルメトリン含有サンプルは、ＯＰＨ含有組成物と接触して、ピレスロイド、例えばペルメトリンを分解される。
【００７４】
液体サンプルを処理する方法は、一つの局面において、該液体サンプルにＯＰＨ含有組成物を加えることを含む。加える組成物は、固体、液体または微生物、あるいはそれらの混合物であってよい。ある局面において、ＯＰＨ含有組成物は、非毒性である。ある態様において、ＯＰＨ含有組成物は非毒性であり得るため、該組成物はサンプルから回収するかさらに修正する必要がない。ある局面において、液体サンプルを処理する方法は、静置液体サンプルを処理することを含む。別の局面において、液体サンプルを処理する方法は、該サンプルをＯＰＨ含有組成物と接触させることによる連続流式サンプル処理を含む。
【００７５】
一つの局面において、固体サンプルを処理する方法は、ＯＰＨ含有組成物を固体サンプルに添加することを含む。ある局面において、ＯＰＨ含有組成物は非毒性である。一つの局面において、ＯＰＨ含有組成物は非毒性であり得るため、該組成物は固体サンプルから回収するか、該固体サンプルをさらに修正する必要がない。ある局面において、固体サンプルを処理する方法は、該固体サンプルへのＯＰＨ含有組成物の添加を含む。組成物は固体、液体または微生物、あるいはそれらの混合物であってよい。
【００７６】
本明細書の他の箇所に記載のとおり、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを分解する方法は、酵素ＯＰＨを含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む。したがって、一つの局面において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドはＯＰＨによって完全に分解される。別の局面において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドはＯＰＨによって部分的に分解される。
【００７７】
また本明細書において、ペルメトリンのようなピレスロイドを不活性化する方法であって、ＯＰＨを含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む方法を開示する。ピレスロイドの活性を低下させる方法であって、ＯＰＨを含む組成物とピレスロイドを接触させることを含む方法を提供する。また本明細書において、サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドを不活性化する方法であって、ＯＰＨを含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む方法を開示する。サンプル中のペルメトリンのようなピレスロイドの活性を低下させる方法であって、ＯＰＨを含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む方法を提供する。
【００７８】
本明細書に具体化したペルメトリンのようなピレスロイドを分解または不活性化するいずれかの方法において、サンプルは6.5〜10.0のｐＨを有する。他の態様において、サンプルは8.0〜9.0のｐＨを有する。例示的態様において、ｐＨは8.5である。サンプルのｐＨは十分または最適な酵素活性に好適であり得る。一つの局面において、サンプルのｐＨを8.5に調節する。
【００７９】
本明細書に具体化したペルメトリンのようなピレスロイドを分解または不活性化するいずれかの方法において、サンプルは十分または最適な酵素活性に好適な温度を有する。しかし、サンプルの温度はＯＰＨ活性を最適化するために調節できると理解される。ある局面において、ピレスロイド、例えばペルメトリンのＯＰＨによる分解に好適な温度は、2℃〜97℃から選択される。例示的温度範囲は、20℃〜30℃を含む。他の態様において、サンプルの温度は22℃である。
【００８０】
一つの態様において、方法はＯＰＨを含む組成物とサンプルを接触させることを含み、ここで該組成物はＯＰＨを発現する微生物を含む。一つの局面において、方法は微生物からサンプルへの発現されたＯＰＨの分泌によって、ペルメトリンのようなピレスロイドを分解することを含む。別の局面において、方法はピレスロイド、例えばペルメトリンを分解するために発現されたＯＰＨを溶液へと放出させるために微生物の膜を破壊し、あるいは損ねることによって、ペルメトリンのようなピレスロイドを分解することを含む。該方法の一つの態様において、微生物は細菌、例えば大腸菌であるが、これに限定されない。
【実施例】
【００８１】
実験例
実施例１：ＯＰＨによるペルメトリンの分解
ＯＰＨをペルメトリン分解能についてアッセイした。その効率は、ＯＰＨのサンプルをペルメトリンのサンプルに加える経時変化実験を行って測定した。分解されたペルメトリンを反応混合物から分離して、ＧＣＭＳで検出する。
【００８２】
実験方法および装置。AOC 20i Auto InjectorおよびShimadzu GCMS QP2010S Quadrapole Mass Spectrometer を備えたShimadzu GC2010 Gas Chromatographを用いて実験サンプルを分析した。Supelco Equity-5カラムをアッセイに用いた（長さ: 30.0 m、厚み: 0.25 μm、直径: 0.25 mm）。しかし同様のカラムに代えてもよい。
【００８３】
装置は次のパラメーターで作動させた：
・カラムオーブン温度：  120℃
・インジェクター温度：  250℃
・注入：  スプリットレス
・実行前リンス：  ３
・実行後リンス：  ３
・サンプルリンス：  ２
・線速度：  30cm/秒
・カラムフロー：  0.64 mL/分
・スプリット比：  10
・ディテクター電圧：  チューニングに関連する
・イオン源温度：  250℃
・インターフェース温度：  270℃
・溶媒カット時間：  3分
・実行時間：  35分
・温度ランプ：  5 ℃/分
・スキャン速度：  833
組換えＯＰＨ（DEFENZ(商標) 130G、ロット102-6181-001; Genencor）を用いて実験アッセイを実行した。試薬は炭酸アンモニウム（Sigma 207861、ロット12919JC）、塩化コバルト（JT Baker 1670-04、ロットY41640）、塩酸 (JT Baker 5620-02、ロットA23506)、プロパノール（Sigma 154970、ロット04242AD）およびペルメトリン（Sigma-Pestanal 45614、ロット7079X）を含めた。
【００８４】
酵素サンプルの調製。ＯＰＨ酵素顆粒（2％タンパク質）を33 mMの炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ 8.5に22℃で溶解させた。反応混合物を30分間撹拌し、まずボルテックスにかけて、次いでゆっくりと温度制御プラットフォーム振盪機でゆっくりと撹拌した。1.5 mLの酵素溶液サンプルを得て、13,000 rpmで1 分間遠心分離した。得られた上清のアリコートを殺虫剤分解反応に用いる。
【００８５】
ペルメトリンサンプルの調製。プロパノールに適量の標準ペルメトリンを溶解させて、濃度100 mg/mLのペルメトリンサンプル原液を調製した。サンプル原液を冷凍庫で貯蔵した。ＧＣＭＳでの標準曲線を作成するため、ペルメトリンサンプル原液のアリコートをプロパノールに希釈してペルメトリン標準を調製し、1 mg/mL および10 mg/mLの濃度を得た。原液のアリコートを具体的な反応に望まれるｐＨおよび室温で、33 mM 炭酸アンモニウムバッファーに希釈して、酵素反応に使用するペルメトリンを調製した。
【００８６】
酵素反応。1.5 mLの試験管に、10 mg/mLのペルメトリンのプロパノール溶液250 μLを33 mMの炭酸アンモニウムバッファー 0.75 mL、pH 8.5に加えた。ペルメトリン溶液のアリコート 995 μL を1.5 mLのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）サンプルバイアルに入れ、これに0.31 mg/mL ＯＰＨ酵素溶液のアリコート5 μLを加えた。いずれかの特定の時点で反応を不活性化するため、反応溶液のアリコート10 μLを除去し、ＧＣサンプルバイアル中のプロパノール 990 μLに加えた。次いで、これらのサンプルをＧＣＭＳオートサンプラーにロードした。
【００８７】
結果および考察。この試験は、ＯＰＨがペルメトリンを分解するかを決定するために実施した。ペルメトリンの量を定量的に測定するため、前の殺虫剤実験におけるように、Quadrapole MSディテクターを備えたShimadzu GC を用いた。プロパノール中1 mg/mL および10 mg/mL原液を用いて標準曲線を作成した。表１は曲線に使用した用量スキームを示す。標準曲線の回帰により 50 ppm以上で0.9997、50 ppm未満で0.998のＲ２値を得た。
【００８８】
表１：標準曲線の作成のためのペルメトリンの用量
【表１】
2011524243.tif 000002
【００８９】
酵素反応の最適濃度を確認するために予備実験を行った。2.5 mg/mLの殺虫剤溶液995 μLに酵素濃度0.31 mg/mLの原液5 μLを加えて反応中でさらに希釈して、測定可能量の未分解殺虫剤が得られた。サンプルを0、1、5、15および30分の時点で10 μLの反応混合物を採取して取り、それをプロパノール990 μLに加えた。表２はディテクターを用いて各時点で定量した殺虫剤の量を記載する。反応開始の1 分以内に発生する、約6 ppm ペルメトリンの初期即時分解が存在することに注意する。その後、反応速度は30 分後にディテクターで12 ppmのペルメトリンの分解量に進む。これらの結果は、1 g のDEFENZ 130GがｐＨ 8.5および室温（約22℃）でペルメトリン790 gを分解することを示す。
【００９０】
しかし、酵素濃度は所望のペルメトリン分解活性が得られる時点で増加または減少することができると理解される。ある局面において、酵素濃度は0.1％ w/v 〜 20％ w/vの範囲であり得る。
【００９１】
表２．様々な時点で測定したペルメトリンの量
【表２】
2011524243.tif 000003
【００９２】
図１は15分間にわたるサンプル中に残留するペルメトリンの量を示すグラフである。約1 グラムのＯＰＨ（DEFENZ130/PestDegrade; Genencor）を用いてアッセイを行った。グラフに示すとおり、約1 グラムのＯＰＨはｐＨ8.5、22℃で、15分で、約445 グラムのペルメトリンを分解する。本明細書に示すデータに基づいて、反応を進行させるための時間は、反応パラメーター（例えば温度、ｐＨ等）を考慮して、望まれる結果（すなわち分解するペルメトリンの量）に基づくと理解される。
【００９３】
図２はＯＰＨによるペルメトリンの分解について、温度の関数としてＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性はＯＰＨ単位／1 グラムの酵素として表す。該アッセイは、ｐＨ8.5で実施した。図２は、特定のアッセイ条件下で80℃が最大ペルメトリン分解活性を与えることを示している。しかし、該酵素は2℃のような低い温度でもなお、活性にペルメトリンを分解する。
【００９４】
図３はＯＰＨによるペルメトリンの分解について、ｐＨの関数としてＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性はＯＰＨ単位／1 グラムの酵素として表す。該アッセイは、22℃で実施した。図３は、ＯＰＨがｐＨ6.5〜ｐＨ9.0の全測定範囲にわたってペルメトリンを活性に分解し、これらのアッセイ条件下ではｐＨ8.5で最大活性を示すことを示している。
【００９５】
図４はＯＰＨによるペルメトリンの分解について、バッファー濃度の関数としてＯＰＨの活性を示す。ＯＰＨ活性は相対的活性の百分率として表す。ここに示すデータから、「100％」のＯＰＨは多くの方法の一つに割り当てられると理解される。例えば、100％活性の決定は、反応パラメーター（例えば温度、ｐＨ等）を考慮した、望まれる結果（すなわち分解されるペルメトリンの量）に基づき得る。100％活性は所定の反応条件群で測定された最も高い活性である。図４に例示した例において、100％活性はバッファー濃度100 mMで生じるが、ペルメトリン分解活性は炭酸アンモニウム 0 mMから炭酸アンモニウム 100mMで検出される。
【００９６】
配列
【表３】
2011524243.tif 000004
【００９７】
本明細書において言及した全ての特許、特許出願および公開文献は、それらの全体において、参照により本明細書に組み込む。本明細書に記載の開示はその好ましい態様に関する文献と共に具体的に示され、記載されており、本開示に包含される範囲から離れることなく、形態および詳細において多様な変化が生じ得ることが当業者に理解される。
【００９８】
本願は2008年4月30日に出願した米国仮出願番号61/125967の利益を主張し、その全体において参照により本明細書に組み込む。
【図１】
2011524243.tif 000005
【図２】
2011524243.tif 000006
【図３】
2011524243.tif 000007
【図４】
2011524243.tif 000008
【配列表】
2011524243000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月4日(2010.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011524243000001.app
【国際調査報告】
2011524243.tif 000014
2011524243.tif 000015
2011524243.tif 000016