(57)【要約】  好ましくはＸ．デンドロロウスにおける、酵素アスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応に関して電子の供与体としての役目を果たし、ベータカロテンをアスタキサンチンに変換する、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列。【選択図】  無【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ．デンドロロウスから単離されたＤＮＡ配列であって、それがベータカロテンをアスタキサンチンに変換する酵素アスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応における電子供与体の役目を果たす、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有する酵素をコードしていることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列であって、それが以下：
ａ）ＳＥＱ１により表される配列、または
ｂ）ヌクレオチド配列であって、その遺伝子コードが縮重しているため、ａ）において記述されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列、あるいは
ｃ）ａ）および／またはｂ）において記述されたヌクレオチド配列の相補鎖に標準的なストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
に相当することを特徴とする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列であって、それが以下：
ａ）ＳＥＱ２により表されるヌクレオチド配列、または
ｂ）ヌクレオチド配列であって、その遺伝子コードが縮重しているため、ａ）において記述されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列、または
ｃ）ａ）および／またはｂ）において記述されたヌクレオチド配列の相補鎖に標準的なストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
に相当することを特徴とする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項４】
アミノ酸の配列であって、それがシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有し、請求項２および３に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ここでその配列が好ましくはＸ．デンドロロウスのものであるＳＥＱ３を有することを特徴とする、アミノ酸の配列。
【請求項５】
請求項４に記載の単離されたポリペプチドであって、それが以下：
ａ）ＳＥＱ３により表されるアミノ酸配列、または
ｂ）アミノ酸の１個以上の変化を有し、記述されたシトクロムＰ４５０レダクターゼの活性を維持している、ＳＥＱ３に類似のポリペプチド、あるいは
ｃ）化学合成または生合成により合成される、ａ）および／またはｂ）において記述されたポリペプチド；
を有することを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドであって、それがＳＥＱ４〜ＳＥＱ１０６で構成されるグループから選択され、それが請求項１〜３に相当する配列とハイブリダイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の単離されたオリゴヌクレオチドであって、それがＰＣＲまたは他の分子生物学の技法によりＤＮＡ配列を増幅するのに役立つことを特徴とする、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ベクターまたはプラスミドであって、それが請求項１〜３に記載のＤＮＡセグメントを含むことを特徴とする、ベクターまたはプラスミド。
【請求項９】
宿主生物であって、それが請求項１〜３に記載の単離されたＤＮＡにより形質転換またはトランスフェクションされている、宿主生物。
【請求項１０】
宿主生物であって、それが請求項８に記載のベクターまたはプラスミドにより形質転換またはトランスフェクションされている、宿主生物。
【請求項１１】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドを生成するためのプロセスであって、それが請求項９または１０のいずれかにおいて記述されたように形質転換され、この酵素の産生の助けになる条件の下で増殖させた宿主生物を培養することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
アスタキサンチンの生物学的生産のためのプロセスであって、それが請求項１〜３において詳細に記述された１種類以上の単離されたＤＮＡを適切な宿主生物へ導入し、アスタキサンチンの産生の助けになる条件の下で増殖させ、その培養物からアスタキサンチンを回収することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１３】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のためのプロセスであって、それが適切な再構成された膜を含む適切な反応混合物中でのアスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応のために、それぞれ請求項４または５に記載のアミノ酸配列または単離されたポリペプチドからの電子の供与を提供することを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のためのプロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセスであって、前記のアミノ酸配列または前記の単離されたポリペプチドが、ミクロソームまたはミトコンドリア膜のような生物学的な膜から調製された再構成された膜の形で存在することを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセスであって、前記のアミノ酸配列または前記の単離されたポリペプチドが、リポソームのような再構成された人工的な膜の形で存在することを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセス。
【請求項１６】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物であって、それが請求項１〜３に記載のＸ．デンドロロウスから単離されたＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１７】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物であって、それがそれぞれ請求項４または５に記載のアミノ酸配列または単離されたポリペプチドを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１８】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物であって、それが請求項６〜７に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１９】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物であって、それが請求項８に記載のベクターを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項２０】
請求項１６〜２０に記載の組成物の使用であって、それがベータカロテンから始まるアスタキサンチンの製造に有用であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
担子菌酵母キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ  Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）はカロテノイド類、主にキサントフィルアスタキサンチンを合成し、水産養殖産業におけるその栄養補助食品としての用途により非常に商業的に興味深い。
【０００２】
本発明は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有し、ベータカロテンからのアスタキサンチンの合成においてアスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応における電子供与体として働いて参加しているポリペプチドをコードする遺伝物質を記述する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド類は主に植物、酵母および微細藻類により産生される一群の天然の色素である。特に、キサントフィルアスタキサンチンは天然に広く見られる化合物であり、これは、それが水産養殖においてマスおよびサケの肉を着色するための食品添加物として用いられるために大きな商業的重要性を有している（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９７７）。一方、その高い抗酸化活性により、ヒトの健康に対して、例えば心血管疾患の予防、免疫系の支援、ヘリコバクター・ピロリに対する生理活性および目の白内障の予防において有益であった。（Ｈｉｇｕｅｒａ−Ｃｉａｐａｒａ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。
【０００４】
元来、この化合物の調製は甲殻類（この色素が豊富な生物）から直接行われており、現在では生産は主に化学合成によっており、いくつかの例が米国特許第４，２４５，１０９号、米国特許第５，２１０，３１４号、米国特許第５，６２５，０９９号および米国特許第５，６５４，４８８号において記述されている。
【０００５】
アスタキサンチンを得る別の方法は、微生物からの生合成および抽出であり、この意味では微細藻類（ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌ））および酵母（キサントフィロマイセス・デンドロロウス）の使用が最も重要である。微細藻類中でのアスタキサンチンの増殖、産生および抽出は、カナダ特許ＣＮ１，９６６，６６０および日本特許出願ＪＰ２００７／２２２１６８、韓国出願２００５／０００５３４１、およびメキシコ出願ＭＸ／ＰＡ０５／００７８０１を含むいくつかの特許において記述されているが、ヘマトコッカス・プルビアリスにより産生されるアスタキサンチンをキサントフィロマイセス・デンドロロウスにより得られるものと比較すると、重要な違いが存在する。淡水中では、単細胞微小緑藻類であるＨ．プルビアリスは長年の間カロテノイドアスタキサンチンの蓄積者として認識されており、特定のストレス条件、例えば高い光の強度および／または窒素制限の下では、藻の細胞はシストを形成し、高い量のアスタキサンチン（＞１％乾燥重量）を蓄積し（Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，  １９９９）、その色を緑から赤に変える。
【０００６】
この微細藻類は最近、それらの増殖期の間および後に大量のアスタキサンチンを合成して蓄積するそれらの能力により、多くの注目を集めてきた（Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，  １９９９）。しかし、得られたアスタキサンチンの内の高い割合がエステル化されており（Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９１）、色素の産生の質が商業的に要求される質よりも低かったため、Ｈ．プルビアリスのアスタキサンチンの源としての用途は乏しかった。この意味では、酵母キサントフィロマイセス・デンドロロウスにより産生されるアスタキサンチンは１００％遊離型（エステル化されていない）であり、光学異性体の３Ｒ、３Ｒ’および幾何異性体のトランスを含み、それは微細藻類により産生されるものと比べてそれに利点を与えている（Ａｎｄｒｅｗｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｒ，  １９７６）。微細藻類は既知の最も高いアスタキサンチン含有量を有する天然の源であるが、これらの生物の商業的利用に関する興味は、原生動物の混入の高い割合および酵母のような従属栄養生物と比較して低い培養技術の発達のため、十分では無かった。
【０００７】
カロテノイド類色素の生合成経路は酵母において広く研究されており、図１はＸ．デンドロロウスに関して同定された経路および単離、配列決定、特性付けおよび公開されたそれらの遺伝子の詳細を示す（Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｉｋｌｉｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９ａ；Ａｌｃａｉｎｏ，２００２，Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９ｂ；Ｌｅｏｎ，２０００）。ベータカロテンからのアスタキサンチンの形成において、２種類の酵素活性が必要となる：ケト基をその分子の４および４’位に組み込むケトラーゼ（ｋｅｔｏｌａｓｅ）ならびにベータカロテンの３および３’位において水酸基を導入するベータカロテンヒドロキシラーゼ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｎｔｔ  １９９８，  Ｌｉｎｄｅｎ  １９９９）。２種類の独立した遺伝子がこの段階に関わっている他の生物とは異なり、Ｘ．デンドロロウスからは両方の活性を有する酵素アスタキサンチンシンターゼをコードする遺伝子ｃｒｔＳが単離された（ＥＰ１，０３５，２０６；  Ｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。遺伝子ｃｒｔＳの推定されたアミノ酸配列および生物情報学的分析の実行から、我々はＸ．デンドロロウスの酵素アスタキサンチンシンターゼはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼタンパク質のファミリーに属すると決定した。
【０００８】
基質中への酸素の挿入に関して、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ型の酵素は真核生物では電子供与系を必要とし、タンパク質シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。加えて、Ｏｊｉｍａら（２００６）は、大腸菌を互いに共存できる３種類のプラスミドで形質転換し、そのプラスミドの内の１種類はベータカロテンの合成に必要な遺伝子を含み、別のものはＸ．デンドロロウスの遺伝子ｃｒｔＳを含み、３番目は出芽酵母のＰ４５０レダクターゼを含み、この系はベータカロテンの酸化型誘導体を得ることのみ可能であり、アスタキサンチンは得られなかったという研究を記述した。これらの結果から、我々はその系における生合成経路を補完するのに適したシトクロムＰ４５０レダクターゼの配列が必要であると推論することができる。
【０００９】
この点において、Ｘ．デンドロロウスからのシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子はまだ単離および配列決定されておらず、それがアスタキサンチンの合成に関わっていることも示されていない。
【００１０】
この発明は、Ｘ．デンドロロウスのシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするｃｔｒＲ遺伝子の配列を記述する。この発明は、微生物を形質転換してそのアスタキサンチンを産生する天然の能力を増進する、またはこの色素の産生が可能では無い他のカロテノイド合成生物において新しい経路を作り出すための、商業的に魅力的な形の技術的手段を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，２４５，１０９号
【特許文献２】米国特許第５，２１０，３１４号
【特許文献３】米国特許第５，６２５，０９９号
【特許文献４】米国特許第５，６５４，４８８号
【特許文献５】カナダ特許ＣＮ１，９６６，６６０
【特許文献６】日本特許出願ＪＰ２００７／２２２１６８
【特許文献７】韓国出願２００５／０００５３４１
【特許文献８】メキシコ出願ＭＸ／ＰＡ０５／００７８０１
【特許文献９】ＥＰ１，０３５，２０６
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９７７
【非特許文献２】Ｈｉｇｕｅｒａ−Ｃｉａｐａｒａ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６
【非特許文献３】Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，  １９９９
【非特許文献４】Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９１
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅｗｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｒ，  １９７６
【非特許文献６】Ｋａｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７
【非特許文献７】Ｎｉｋｌｉｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８
【非特許文献８】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９ａ
【非特許文献９】Ａｌｃａiｎｏ，  ２００２
【非特許文献１０】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９ｂ
【非特許文献１１】Ｌｅoｎ  ，  ２０００
【非特許文献１２】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｎｔｔ  １９９８，  Ｌｉｎｄｅｎ  １９９９
【非特許文献１３】Ｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１４】Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１５】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする遺伝物質、ならびにＣＰＲ活性を有するポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびそれぞれの対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）のタイプの核酸配列としての遺伝物質が宿主生物の形質転換によるアスタキサンチンの生産に有用であることを理解することに関し、それはこのカロテノイドの天然の生産者であってよく、またはそうで無くてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１、Ｘ．デンドロロウスにおけるアスタキサンチンの生合成経路の主な段階。それはクローン化および配列決定されているその経路の構造遺伝子を示している。それはカロテノイド生合成経路における中間体を蓄積しているコロニーの色を示している。その色は、合成の異なる期において得られる色素のタイプを示すものである。
【図２】図２、Ｘ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列（ＳＥＱ１）。下線が引かれた配列断片は、その遺伝子のエキソンに対応する。太字および下線が引かれた核酸は、連結プロセスに関する供与部分および受容部分として同定された部位を強調している。ＢａｍＨＩ酵素に関する制限部位を示す。
【図３】図３、異なる菌類からのＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼに関する遺伝子のヌクレオチド配列の比較。Ｃ．ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ：クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）（接合菌類）、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ１９５６６０。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（子嚢菌類）、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｄ１３７８８。Ｒ．ｍｉｎｕｔａ：ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）（担子菌類）、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＢ０５５１１９。灰色の線は表１において記述されるプライマーの一部がどこであるかを示す。
【図４】図４、ｃｒｔＲ遺伝子のコード領域に関する相補的ＤＮＡ配列（ＳＥＱ２）およびそれぞれのアミノ酸に関して１文字コードを用いたアミノ酸配列への翻訳（ＳＥＱ３）。イタリック体：ｃｒｔＲ遺伝子エキソン１。黒字：ｃｒｔＲ遺伝子エキソン２。下線が引かれた配列：ｃｒｔＲ遺伝子エキソン３。
【図５】図５、ｃｒｔＲ遺伝子のコード領域から推定されるアミノ酸配列。黒字で強調され、下線が引かれた部分は、ＢｌａｓｔＰプログラムにより同定されたそのタンパク質の保存されたドメインであり、順に膜貫通ドメイン、ＦＭＮ結合ドメイン、ＦＡＤ結合ドメインおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの結合ドメインである。
【図６】図６、Ｘ．デンドロロウスの野生株ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８におけるｃｒｔＲ遺伝子の欠失のために設計されたコンストラクトを得るためのプロセスの概要。
【図７】図７、Ｘ．デンドロロウスの野生株ＵＣＤ６７−３８５（３８５）およびＣＢＳ６９３８（ＣＢＳ）における相同組換えによるｃｒｔＲ遺伝子の変異の事象の図解、ここで、ＡはＵＣＤ６７−３８５株の形質転換を示し、ＢはＣＢＳ６９３８株の形質転換を示す。
【図８】図８、ＹＭ寒天培地を有するペトリ皿中での、野生型の酵母（ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８）および形質転換体（Ｔ１３：ＵＣＤ６７−３８５に由来する、およびＣＢＳＴｒ：ＣＢＳ６９３８に由来する）の培養。
【図９Ａ】図９、野生型（ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８）および形質転換体（Ｔ１３およびＣＢＳＴｒ）の酵母に存在する色素の分析。
【００１５】
（Ａ）ＨＰＬＣクロマトグラム（４６５ｎｍ）。それぞれのピークは対応するカロテノイドを示している、ＮＩ：未同定。
【００１６】
（Ｂ）それぞれの検出された色素のｐｐｍ（百万分率）で表した、野生株およびそれらのそれぞれの変異体により産生される色素の比較を示すグラフ。
【図９Ｂ】図９、野生型（ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８）および形質転換体（Ｔ１３およびＣＢＳＴｒ）の酵母に存在する色素の分析。
【００１７】
（Ａ）ＨＰＬＣクロマトグラム（４６５ｎｍ）。それぞれのピークは対応するカロテノイドを示している、ＮＩ：未同定。
【００１８】
（Ｂ）それぞれの検出された色素のｐｐｍ（百万分率）で表した、野生株およびそれらのそれぞれの変異体により産生される色素の比較を示すグラフ。
【図１０】図１０、野生型および形質転換体のＰＣＲの反応物のゲル。λ：分子の大きさの標準である、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化したバクテリオファージλのＤＮＡ（２３．１、９．４、６．６、４．４、２．３、２．０および０．６ｋｂのバンド）。
【００１９】
Ａ：ＵＣＤ６７−３８５およびＴ１３形質転換体のＰＣＲ。レーン：（１）：ＤＮＡ  ３８５  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ５０、（２）：ＤＮＡ  Ｔ１３  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ５０、（３）：Ｈ２Ｏ  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ５０、（４）：ＤＮＡ  ３８５  ＋  ＳＥＱ１４＋Ｐｅｆ  ｆｗｄ、（５）：ＤＮＡ  Ｔ１３  ＋  ＳＥＱ１４＋Ｐｅｆ  ｆｗｄ、（６）：Ｈ２Ｏ  ＋  ＳＥＱ１４＋Ｐｅｆ  ｆｗｄ、（７）：ＤＮＡ  ３８５  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ５０、（８）：ＤＮＡ  Ｔ１３  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ５０、（９）：Ｈ２Ｏ  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ５０、（１０）：ＤＮＡ  ３８５  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ１５、（１１）：ＤＮＡ  Ｔ１３  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ１５、および（１２）：Ｈ２Ｏ  ＋  ＳＥＱ１４＋ＳＥＱ１５。
【００２０】
Ｂ：ＣＢＳ６９３８およびＣＢＳＴｒ形質転換体のＰＣＲ。レーン：（１）：ＤＮＡ  ＣＢＳ  ＋  Ｐｅｆ  ｆｗｄ＋ＳＥＱ３５、（２）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  Ｐｅｆ  ｆｗｄ＋ＳＥＱ３５、（３）：Ｈ２Ｏ  ＋  Ｐｅｆ  ｆｗｄ＋ＳＥＱ３５、（４）：ＤＮＡ  ＣＢＳ  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ３０、（５）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ３０、および（６）：Ｈ２Ｏ  ＋  ｇｐｄ  ｒｅｖ＋ＳＥＱ３０。
【００２１】
Ｃ：ＣＢＳＴｒ形質転換体のＰＣＲ。レーン：（１）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ＳＥＱ７５＋ｈｙｇＳｅｃＲ、（２）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ＨＦ＋ＳＥＱ３５、（３）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ｈｙｇＳｅｃＦ＋Ｍ１３Ｆ、（４）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  Ｍ１３Ｒ＋ＳＥＱ１５、（５）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ＳＥＱ２０＋ＳＥＱ５０、および（６）：ＤＮＡ  ＣＢＳＴｒ  ＋  ＳＥＱ３０＋ＳＥＱ５０。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ベータカロテンからのアスタキサンチンの合成の最終段階に関わる遺伝子および酵素に関する。
【００２３】
本発明は、アスタキサンチンを得るためのベータカロテンの分子上のケトおよび水酸基の組み込みに必要な電子の送達を担う、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）活性を有する酵素をコードするゲノムＤＮＡ（ｃｒｔＲ遺伝子）および相補的ＤＮＡの配列を提供し、この反応は酵素アスタキサンチンシンターゼにより触媒される。
【００２４】
本発明は、Ｘ．デンドロロウスのＡＣＷＰ遺伝子のＤＮＡ配列に関し、その好ましい態様において、ゲノムおよび相補的ＤＮＡの配列、ならびにその遺伝子の断片、ならびにこれらの半縮重（ｓｅｍｉ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）またはそうでないものに関する。
【００２５】
本発明は、酵素ＣＲＰの活性を有するポリペプチドをコードする、ｃｒｔＲ遺伝子、その相補鎖、それらの対立遺伝子変異体のゲノムＤＮＡ配列、および１個以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失および／または置換により表される配列に関する。
【００２６】
その遺伝子コードは縮重しているため、この発明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００１により記述されたような、標準的なストリンジェントな条件の下でｃｒｔＲ遺伝子とハイブリダイズする核酸配列も提供する。その好ましい態様において、ＳＥＱ１に対応するＤＮＡ配列および特徴はＸ．デンドロロウスから来ており、９，９０３塩基対を有し、その内部で接続（スプライシング）のための供与および受容部位として表される核酸が同定され、その核酸はＳＥＱ１中で黒で目立たせ下線を引いてある（図２）。この遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、ＳＥＱ１中で強調されているエキソンに対応する配列の３個のセグメントにより特徴付けられる。
【００２７】
この発明は、酵素ＣＰＲの活性を有するポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ配列、その相補鎖およびそれが生じるメッセンジャーＲＮＡの配列、それらの対立遺伝子変異体ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失および／または置換により表される配列も考慮する。
【００２８】
その遺伝子コードは縮重しているため、この発明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記述されたような、標準的なストリンジェントな条件の下でｃｒｔＲ遺伝子の相補鎖にハイブリダイズする核酸配列も提供する。その好ましい態様において、そのｃＤＮＡはｃｒｔＲ遺伝子から生じたｍＲＮＡから合成され、これをＳＥＱ２と呼び（図４）、このｃＤＮＡはセグメントをコードするｃｒｔＲ遺伝子を表し、２，２４１塩基対の長さを有する。
【００２９】
本発明は、Ｘ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子のＤＮＡ配列を得るための方法にも関する。第１の方式または段階において、この方法は半縮重断片を用いた興味のある遺伝子のゲノムＤＮＡまたはその一部の同定に相当する。加えて、別の形、または連続した段階において、前の段階から単離された断片の配列により興味のある遺伝子が同定される。好ましくは、第１段階において、興味のあるものに相当する他の種からの遺伝子の間で保存されている断片のコンセンサス配列が用いられる。
【００３０】
好ましい態様において、本発明は生物情報学の技法を用いた他の酵母のシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の既知の配列の比較、保存されたセグメントの同定、およびそれらに従うＤＮＡ配列の同定および増幅に有用な核酸の短い断片（１５および３０ｂｐ）の設計を含む。その好ましい態様において、設計されたＤＮＡ断片を表１において記述する（ＳＥＱ４〜ＳＥＱ９）。これらは半縮重プライマーであり、記号Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｗを次のグループの核酸を表すものとして考え：Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＴまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｙ＝ＴまたはＣ、この設計に関して考えられた種のｃｒｔＲ遺伝子のゲノム配列内のこれらのプライマーの位置を図３において記述する。これらの断片を用いて、Ｘ．デンドロロウスのゲノムＤＮＡからｃｒｔＲ遺伝子の一部をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。第２段階において、表１の縮重ＤＮＡ断片（ＳＥＱ６〜ＳＥＱ１０６）が設計される。
【００３１】
特に、ＳＥＱ１０からＳＥＱ１３までのプライマーを用いて、ｃｒｔＲ遺伝子の断片の保有者であるＸ．デンドロロウスのゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡからＰＣＲの技法によりＤＮＡクローンを同定した。
【００３２】
上記の残りのプライマーは、ｃｒｔＲ遺伝子の完全な配列決定のために用いた。
【００３３】
表１：ｃｒｔＲ遺伝子の同定および増幅に有用なＤＮＡ断片。
【００３４】
【表１−１】
2011522547.tif 000002
【００３５】
【表１−２】
2011522547.tif 000003
【００３６】
【表１−３】
2011522547.tif 000004
【００３７】
【表１−４】
2011522547.tif 000005
【００３８】
【表１−５】
2011522547.tif 000006
【００３９】
【表１−６】
2011522547.tif 000007
【００４０】
【表１−７】
2011522547.tif 000008
【００４１】
【表１−８】
2011522547.tif 000009
【００４２】
一方、この発明はシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するアミノ酸配列に関し、、それはその好ましい態様において、ＳＥＱ３（図５）において記述されているもの、ならびにｃｒｔＲ遺伝子、その遺伝子から生じたメッセンジャーＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ、その相補鎖、対立遺伝子変異体および１個以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失および／または置換を有するＳＥＱ１もしくはＳＥＱ２により表される配列、または標準的なストリンジェントな条件の下でそのゲノム配列または相補的ＤＮＡとハイブリダイズする核酸配列によりコードされるものに相当する（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。その好ましい態様において、ＣＰＲ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ３（図５）の７４６アミノ酸を有し、生物情報学的手段を用いた比較により、我々はＳＥＱ３中で目立たせたいくつかの保存されたドメインを同定し、それは出現の順に膜貫通ドメイン、ＦＭＮ結合ドメイン、ＦＡＤ結合ドメインおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの結合ドメインに対応する。
【００４３】
本発明は、ＳＥＱ３ポリペプチドの変異体にも向けられている。これらの変異体は、それらの配列における１個以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失および／または置換に、これらの誘導体が記述された活性を保持する限り関する。この活性は、当技術で既知の、または本明細書で具体的に記述されるあらゆる試験により測定することができる。その変異体は化学合成により、または入手可能なＤＮＡ配列に基づく組み換えにより、当技術の現状の方法を利用して合成することができる。
【００４４】
本発明は、適切な生物においてアスタキサンチンの産生を増大させる、またはその生物生産（ｂｉｏ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）につながる新規の代謝経路を生じさせるために改変された生物を得るための、ＳＥＱ３の好ましい態様であるＣＰＲポリペプチドの使用に関する。別の態様において、アスタキサンチン産生生物におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼの機能を削除するように改変されたＳＥＱ３の配列をコードするＤＮＡ配列がアスタキサンチンシンターゼと共に用いられ、その提案される用途は研究目的である。
【００４５】
その好ましい態様において、本発明は酵母Ｘ．デンドロロウスにおけるｃｒｔＲ遺伝子の機能の削除ならびに形質転換された株の表現型による、および遺伝型による評価を含む。ｃｒｔＲ遺伝子の削除は、Ｘ．デンドロロウスの野生株中の本来の遺伝子を、選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性遺伝子により妨げられたこの遺伝子の断片を有するモジュールにより置き換えることにより行われる。その好ましい態様において、相同組換えによる本来の遺伝子の置き換えは上記のモジュールを含む適切なベクターを用いて行われ、詳細にはそれは図６において記述されている設計されたベクターであり、それらにより天然のＸ．デンドロロウスの２種類の株を形質転換して、それが由来する天然の株に関して低下したアスタキサンチンの産生に関する能力を有する２種類の形質転換株（ＣＢＳＴｒおよびＴ１３）が得られた。その形質転換株の表現型の評価は、培養状態にある酵母の色の視覚による検査、およびそれが含む色素を好ましくはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の技法を用いて同定することによる別の方法でのそれの天然の株との比較によりなされた。
【００４６】
形質転換された株における遺伝子ｃｒｔＲの欠失のゲノムレベルでの評価において、この発明は、当技術の現状において存在する分子生物学の技法を用いた、好ましくは断片ＳＥＱ１４、ＳＥＱ１５、ＳＥＱ２０、ＳＥＱ３０、ＳＥＱ３５、ＳＥＱ５０、ＳＥＱ７６を含む表１において記述された断片および表３において記述される断片を用いたそれらのＰＣＲでの増幅を通した、この遺伝子に関するゲノム配列の分析および比較を含む。
【００４７】
本発明は、上記で記述されたＤＮＡ配列を含むベクターまたはプラスミドならびに上記で記述されたそのＤＮＡまたはベクターまたはプラスミドを用いて形質転換された、またはトランスフェクションされた宿主細胞にも向けられている。
【００４８】
さらに、この発明は、前記のそのベクターまたはプラスミド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび遺伝子断片を含む組成物、製品および／または配合物を提供する。上記で記述されたその組成物、製品および／または配合物、および配列は、研究、生産、分析または当技術の現状において存在する分子生物学的技法のために用いることができる。好ましくは、改変されたアスタキサンチンの産生を得るための生物の形質転換およびこの形質転換の評価に必要なプロセスにおいて用いられる。
【００４９】
本発明は、ベクターまたはプラスミドおよびそれらが含むＤＮＡで形質転換された組換え生物の製造を意図し、これらの生物の培養は、前記ポリペプチドの産生またはアスタキサンチンの産生につながる条件の下で行われた。
【００５０】
本明細書において言及されるポリペプチドおよびそれをコードする配列は、自然にアスタキサンチンを産生する生物をそれらの生合成の能力を増進するように遺伝学的に操作する、または他の生物において生合成経路を生じさせるのに有用であり、それらの増殖の特性、培養の条件、生物学的利用能および他のものは、出芽酵母の場合のように、その色素を得るために生産的により魅力的である可能性がある。
【００５１】
ここにいくつかの実施例があるが、本発明に対する限定または制限を意図するものでは無い。
【実施例】
【００５２】
実施例１：Ｘ．デンドロロウスからＡＣＷＰ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を得る。
【００５３】
Ｘ．デンドロロウスのＡＣＷＰ遺伝子を単離および特性付けするため、オリゴヌクレオチドを設計してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の技法によりｃｒｔＲ遺伝子の一部を増幅した。この目的のため、我々は酵母クンニンハメラ・エキヌラタ、出芽酵母、およびロドトルラ・ミヌタの酵素ＣＰＲ類の遺伝子のヌクレオチド配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムにより比較し、保存された領域を同定し、これらに基づいて表１において記述した半縮重オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ４〜ＳＥＱ９）を設計し、比較した配列内でのそれらの位置を図３において示す。プライマーＳＥＱ８およびＳＥＱ４のペアを用いて、Ｘ．デンドロロウスの野生株ＵＣＤ６７−３８５のゲノムＤＮＡから、次の条件下でのＰＣＲプロトコルを用いてｃｒｔＲ遺伝子を増幅した：９５℃で３分間の最初の変性、３５サイクルの：９４℃において３０秒間の変性、５５℃において３０秒間のアニーリング、７２℃において３分間の伸長。最後の伸長の後、７２℃において１０分間。得られた増幅産物を０．８％アガロースゲルで泳動し、それから精製し、次いで配列決定した。この技法を用いて、１６４９塩基対の増幅産物を得ることができた。得られた配列をＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて国際データベースと比較する（得られたヌクレオチド配列をアミノ酸に翻訳したものを用いてタンパク質データベースを検索する）ことにより、得られた増幅産物が他の酵母のＣＰＲ類と高い百分率の類似性を有することが分かり、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）ＢＡＢ８３５８８．１（一致：６１％およびＥの値：３×１０−１４２）およびファネロキーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＡＡＧ３１３５１．１（一致：５９％およびＥの値：１×１０−１３７）との一致が最大であった。
【００５４】
得られた配列から、それらの保存されたコーディングセグメントを分析し（ＢｌａｓｔＰプログラムを用いた）、それらに基づいてＸ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子に特異的な新しいプライマーを設計した（ＳＥＱ１０〜ＳＥＱ１３、表１）。これらのプライマーを用いてＸ．デンドロロウスのゲノムライブラリーにおいてクローンを見つけ、コンストラクションしてプラスミドＹＩｐ５のＢａｍＨＩ部位の中に入れ、これをｃｒｔＲ遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ断片を含むＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５α株へのゲストとして用いた。これらのクローンの研究は、そのゲノムライブラリーのクローンの挿入断片のＰＣＲによる増幅により行われた。ｃｒｔＲ遺伝子はそれらの配列の中にＢａｍＨＩ部位を含み、従って用いたゲノムライブラリーから完全なｃｒｔＲ遺伝子を含むクローンを得ることはできなかった。しかし、我々はその遺伝子の一部を含む２種類のクローンを得た。１２８２０ｂｐの挿入断片を有する一方を完全に配列決定し、それはＡＣＷＰ遺伝子をエキソン１のヌクレオチド番号８２の塩基からその遺伝子の終わりまで含んでおり、おおよそ６５００ｂｐの挿入断片を含む他方のクローンを完全に配列決定し、それはＡＣＷＰ遺伝子のプロモーター領域およびエキソン１の８８ｂｐであった。制限酵素による消化およびプライマーＳＥＱ８およびＳＥＱ４により増幅された断片をプローブとして用いたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション試験により、ｃｒｔＲ遺伝子は配列中にＳａｌＩ部位を含まず、おおよそ４９００ｂｐのＳａｌＩ断片はその遺伝子を丸ごと含むことが決定された。基本的に、この実験に関して用いられたプロトコルは次のものであった：Ｘ．デンドロロウスのＵＣＤ６７−３８５のゲノムＤＮＡを異なる制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。次いでそのＤＮＡを変性させ、ナイロン膜に移し、ｃｒｔＲ遺伝子の一部に相当するＤＮＡ断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。膜の準備およびハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１の標準的な方法に従って行った。
【００５５】
この背景に基づき、我々はＸ．デンドロロウスのＳａｌＩ  ＤＮＡ断片を用いておおよそ６４００〜４４００ｂｐの大きさを選択して新しい部分的なゲノムライブラリーを構築し、ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋を用い、宿主として大腸菌のＤＨ５α株を用い、この新規のゲノムライブラリーの開発は製造業者の説明書に従って行われた。この新規のゲノムライブラリーを用いて、挿入断片をプライマーＳＥＱ１３およびＳＥＱ１０のペアを用いたＰＣＲにより増幅した。この方法で、我々は遺伝子ｃｒｔＲ（ＳＥＱ１）を完全に含むクローンを得た。
【００５６】
実施例２：Ｘ．デンドロロウスからのＡＣＷＰ遺伝子の相補的ＤＮＡの配列の獲得。
【００５７】
ｃｒｔＲ遺伝子に相補的なＤＮＡ配列を得るため、我々はＸ．デンドロロウスの相補的ＤＮＡのライブラリーを用い、それからプライマーＳＥＱ１３およびＳＥＱ１０のペアを用いたＰＣＲにより配列を増幅し、それは遺伝子をコードするセグメントとハイブリダイズし、ｃｒｔＲ遺伝子のｃＤＮＡから予想されるその増幅産物の大きさは３３８ｂｐである。そのｃＤＮＡライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの市販のキット“ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＸＲ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を用いて、宿主として大腸菌のＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株を用いて、製造業者の説明書に従って構築した。ＰＣＲ反応に用いた条件は：９５℃において３分間の最初の変性、３５サイクルの：９４℃において３０秒間の変性、５５℃において３０秒間のアニーリング、７２℃において３分間の伸長。最後の伸長の後、７２℃において１０分間。得られた増幅産物を０．８％アガロースゲル上にロードし、ｃｒｔＲ遺伝子のｃＤＮＡの増幅に関して陽性クローンの混合物を同定した。
【００５８】
この技法は、ｃｒｔＲ遺伝子のｃＤＮＡの挿入断片を有するクローンを同定した。この挿入断片を配列決定し、２，２４１塩基対の配列（ＳＥＱ２）を得た。
【００５９】
得られたｃＤＮＡの配列をその遺伝子のゲノムＤＮＡの配列と比較して、エキソンおよびイントロンの構成を決定した（図２）。
【００６０】
その後得られた配列をソフトウェアＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  １０  （Ｉｎｆｏｒｍａｘ）のパッケージを用いてアミノ酸に翻訳し（ＳＥＱ２）、正しい読み枠を決定した後、図５において表されているタンパク質の保存されたドメインを同定し、それらは出現の順に膜貫通ドメイン、ＦＭＮ結合ドメイン、ＦＡＤ結合ドメインおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの結合ドメインである。膜貫通ドメインの同定はＴＭｐｒｅｄプログラム（www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）を用い、２，２８０のスコアが得られ、連続するドメインはＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ  ｐｒｏｇｒａｍプログラム（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）により同定し、Ｅの値はそれぞれ２．５×１０−４１、１．６×１０−６７および７．８×１０−２３であった。
【００６１】
実施例３．ｃｒｔＲ遺伝子によりコードされるＣＰＲポリペプチドの、Ｘ．デンドロロウスのカロテノイド生成経路における機能的重要性の決定。
【００６２】
酵母Ｘ．デンドロロウスにおけるアスタキサンチンの生合成経路におけるｃｒｔＲ遺伝子の重要性を示すため、野性型のＸ．デンドロロウスの株におけるＡＣＷＰ遺伝子の欠失変異体を構築し、その変異体の表現型および遺伝型を元の株と比較した。この目的のため、それを形質転換ベクターの中に挿入し、ｃｒｔＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をハイグロマイシンＢ抗生物質に対する耐性モジュールに置き換えるようなコンストラクションを行った。このモジュールは、ＴＥＦ遺伝子（翻訳伸長因子ＥＦ−１αをコードする）のプロモーターの制御下のハイグロマイシンＢに対する抗生物質耐性遺伝子（ｈｐｈ）およびＸ．デンドロロウスのＧＰＤ遺伝子のターミネーター領域で構成されている。
【００６３】
図６は作製したコンストラクトの詳細を示し、基本的には、Ｘ．デンドロロウスのＤＮＡ断片（ＳＥＱ１のヌクレオチド４５３１〜９９０２を含むセグメント）を有するＣＰＲ１．３ベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩまたはＮｄｅＩにより消化してｃｒｔＲ遺伝子中に欠失を生じさせた。得られた断片（ｃｒｔＲの欠失を含む）の末端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで埋めて、その末端がブラントであるハイグロマイシン耐性のモジュールのライゲーションを可能にした。このようにして、２種類のクローン：ＣＰＲ１．３ΔＢｓｉＷＩ＋ｈｙｇおよびＣＰＲ１．３ΔＮｄｅＩ＋ｈｙｇが得られた。このコンストラクトの、用いた野生株のゲノム中への挿入は、下記で詳しく述べる相同組換えの技法により行われた。これらのベクターを用いてＸ．デンドロロウスの野生株：ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８を形質転換した。
【００６４】
ＵＣＤ６７−３８５株を、ｃｒｔＲ遺伝子の欠失およびハイグロマイシンに対する耐性のモジュールを含む線状ＤＮＡ断片を用いて形質転換した。この断片は、クローンＣＰＲ１．３ΔＢｓｉＷＩ＋ｈｙｇのエンドヌクレアーゼＳｍａＩおよびＳｐｅＩによる消化から得られた。二重の相同組換えの事象により、ＵＣＤ６７−３８５株のＡＣＷＰ遺伝子の対立遺伝子が欠失部分により置き換えられ、その結果Ｔ１３株が得られた。
【００６５】
ＣＢＳ６９３８株を、ｃｒｔＲ遺伝子の欠失およびハイグロマイシンに対する耐性のモジュールを含むクローンＣＰＲ１．３ΔＮｄｅＩ＋ｈｙｇ（環状ＤＮＡ）を用いて形質転換した。相同組換えの事象により、野生型のｃｒｔＲ遺伝子が変異した遺伝子と置き換えられ、ＣＢＳＴｒ株をもたらした。
【００６６】
両方の野生型株の形質転換は電気穿孔法により、Ａｄｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）により記述されたプロトコルに従って行った。手短に書くと、市販のＹＭ培地（１％グルコース、０．３％酵母抽出物、０．３％麦芽抽出物、および０．５％バクトペプトン）２００ｍｌに、４８時間増殖させたＸ．デンドロロウスの培養物１〜２ｍｌを接種し、２２℃において一定の攪拌の下でＯＤ５５０ｎｍ１．２まで培養した。細胞を集めて２５ｍｌのＢＤ緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、２５ｍＭジチオスレイトール[ＤＴＴ]）中で再懸濁し、２２℃で１５分間保温した。細胞を２５ｍｌの冷えたＳＴＭ緩衝液（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、１ｍｌのＳＴＭ緩衝液中で再懸濁した。形質転換のため、６０μｌのエレクトロコンピテントセルを５μｌ体積中の形質転換するＤＮＡ１０〜２０μｇと混合した。電気穿孔法の条件は：１２５ｍＦ、６００Ω、０．４５ｋＶであり、次いで細胞を１ｍｌの液体ＹＭ培地中で再懸濁し、２２℃で５時間保温した。最後に、細胞を１０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを補ったＹＭ培地および２％寒天のプレートにおいて増殖させた。この選択法を用いて、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する挿入断片を有するクローンを同定した。
【００６７】
抗生物質での１次選択で得られたクローンの内で、野生株のそれぞれの形質転換体の２種類のクローンを選んだ。ＣＢＳ６９３８株の形質転換の後、黄色い株（ＣＢＳＴｒ）が得られ、その色はそれがベータカロテンを蓄積しており、アスタキサンチンを合成できないことを示している。ＵＣＤ６７−３８５株の形質転換により、色が薄い形質転換体（Ｔ１３）が得られ、それもアスタキサンチンの合成の経路が影響を受けていることを示している（表現型の証拠を図８において示す）。Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）の方法に基づく次のプロトコルで、２種類の野生株および２種類の形質転換株から全色素を抽出してその組成をＨＰＬＣにより分析した（図９）：５〜２０ｍｌの培養液からの細胞のペレットに、１〜３ｍｌのアセトンおよび１体積のガラスビーズを添加し、次いでそれをボルテックスの最大速度で１分間攪拌した。有機相を４℃における１２，１００×ｇでの遠心分離により回収した。全色素を石油のエーテルで抽出し、次いで窒素ガスで乾燥させ、アセトン中で溶解し、逆相カラムＲＰ−１８  ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ  １２５−４  （Ｍｅｒｃｋ）での、アセトニトリル：メタノール：イソプロパノール（８５：１０：５  ｖ／ｖ）を移動相として用いる、流速１ｍｌ／分での、室温における、均一溶媒条件下でのＨＰＬＣにより分離した。それぞれの溶離のピークのスペクトルを、ダイオードアレイ検出器により回収した。カロテノイド類をその吸収スペクトル、保持時間および特定の標準との比較に従って同定した。形質転換株におけるカロテノイド類の組成は、それらが由来する野生株と完全に異なっていたことを特筆する。形質転換体ＣＢＳＴｒは、それが由来する、アスタキサンチンおよび最小量のベータカロテンを産生する野生株（ＣＢＳ６９３８）とは異なり、ベータカロテンを蓄積し、アスタキサンチンを合成することができない。Ｔ１３形質転換体では、それが由来する、高い量のアスタキサンチンおよび最小量のベータカロテンを産生する野生株（ＵＣＤ６７−３８５）とは異なり、ベータカロテンの産生の増大を犠牲にしてそれらのアスタキサンチンの産生がおおよそ７５％減少していた（図９）。
【００６８】
上記の株のゲノムレベルでの形質転換を確認するため、我々はそれらの挿入断片により影響を受けた遺伝子座をＰＣＲにより、鋳型として形質転換体および野生株からのゲノムＤＮＡを用いて調べた。形質転換株Ｔ１３の分析に関して、次のプライマーのペア：ｇｄｐ  ｒｅｖ  ＋  ＳＥＱ５０、ＳＥＱ１４  ＋  Ｐｅｆ  ｆｗｄ、ＳＥＱ１４  ＋  ＳＥＱ５０を用いてＰＣＲ反応を行い、鋳型として野生株ＵＣＤ６７−３８５、形質転換株Ｔ１３および陰性対照として蒸留水を用いた。形質転換株ＣＢＳＴｒの分析に関して、次のプライマーのペア：Ｐｅｆ  ｆｗｄ  ＋  ＳＥＱ３５、ｇｐｄ  ｒｅｖ  ＋  ＳＥＱ３０を用いてＰＣＲ反応を行い、鋳型として野生株ＣＢＳ６９３８、形質転換株ＣＢＳＴｒおよび陰性対照として蒸留水を用い、また、プライマーペア：ＳＥＱ７５  ＋  ｈｙｇＳｅｃＲ、ＨＦ  ＋  ＳＥＱ３５、ＨｙｇＳｅｃＦ  ＋  Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ  ＋  ＳＥＱ１５、ＳＥＱ２０  ＋  ＳＥＱ５０およびＳＥＱ３０  ＋  ＳＥＱ５０も用い、鋳型として形質転換株ＣＢＳＴｒを用いた。これらのプライマーのいくつかはＡＣＷＰの配列とハイブリダイズせず、それらの配列を表２において詳細に述べ、それらの相対的な位置を図７において示す。ＰＣＲ反応は次のプロトコルに従って行った：９５℃において３分間の最初の変性、３５サイクルの：９４℃において３０秒間の変性、５５℃において３０秒間のアニーリング、７２℃において３分間の伸長。最後の伸長の後、７２℃において１０分間、およびそれを０．８％アガロースゲル上にロードした。得られた結果を図１０において示し、予想される増幅産物の大きさおよび得られた増幅産物の大きさの間の比較を表３において示す。
【００６９】
表２：形質転換株のゲノムの分析において用いた、ＡＣＷＰの配列に相補的で無いプライマー
【００７０】
【表２】
2011522547.tif 000010
【００７１】
表３：形質転換体Ｔ１３およびＣＢＳＴｒの分析における、予想される増幅産物および得られた増幅産物の大きさ
Ａ．形質転換体Ｔ１３に関する結果
【００７２】
【表３】
2011522547.tif 000011
【００７３】
Ｂ．形質転換体ＣＢＳＴｒに関する結果
【００７４】
【表４】
2011522547.tif 000012
【００７５】
形質転換株から得られた増幅産物の大きさは、予想された結果と合っている（表３）。この分析をＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより確認した。ハイブリダイゼーション実験は、野生株（ＵＣＤ６７−３８５およびＣＢＳ６９３８）および形質転換株（Ｔ１３およびＣＢＳＴｒ）からのゲノムＤＮＡを異なる制限エンドヌクレアーゼで消化することにより行った。消化産物を０．８％アガロースゲル上で泳動し、次いでハイブリダイゼーションのために変性させてナイロン膜に移した。その膜を次の２種類のプローブで別々にハイブリダイゼーションした：１）プライマーＳＥＱ４およびＳＥＱ８で増幅させたｃｒｔＲ遺伝子の遺伝子プローブ、２）ハイグロマイシン遺伝子のプローブ。膜の用意およびハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１の標準的な方法に従って行った。
【００７６】
得られた結果は、Ｔ１３形質転換体はｃｒｔＲ遺伝子に関してヘテロ接合性であってそこには野生型および別の変異型の対立遺伝子があり、遺伝子量効果のため、この形質転換体はその親の野生型よりも少ないアスタキサンチンを産生し、より多くベータカロテンを蓄積することを示しており、これらの結果により、ハイグロマイシンＢ耐性を有するｃｒｔＲ遺伝子の欠失部分の挿入は図７の図解に相当することが示される。ＣＢＳＴｒ形質転換体の場合、１コピーのｃｒｔＲ遺伝子が変異しており、従ってそれはアスタキサンチンを産生することができず、ベータカロテンを蓄積する。この結果は、ＣＢＳ６９３８株は少なくともｃｒｔＲ遺伝子に関しては一倍体であることを示している。全ての増幅産物は完全に配列決定され、それらの分析はそれらの由来を確認した。
【００７７】
参考文献：
【００７８】
【表５】
2011522547.tif 000013
【００７９】
【表６】
2011522547.tif 000014
【００８０】
【表７】
2011522547.tif 000015
【００８１】
【表８】
2011522547.tif 000016
【図１】
2011522547.tif 000017
【図２】
2011522547.tif 000018
2011522547.tif 000019
2011522547.tif 000020
2011522547.tif 000021
2011522547.tif 000022
2011522547.tif 000023
2011522547.tif 000024
2011522547.tif 000025
2011522547.tif 000026
【図３】
2011522547.tif 000027
2011522547.tif 000028
2011522547.tif 000029
2011522547.tif 000030
2011522547.tif 000031
【図４】
2011522547.tif 000032
2011522547.tif 000033
2011522547.tif 000034
【図５】
2011522547.tif 000035
【図６】
2011522547.tif 000036
【図７】
2011522547.tif 000037
【図８】
2011522547.tif 000038
【図９Ａ】
2011522547.tif 000039
【図９Ｂ】
2011522547.tif 000040
2011522547.tif 000041
【図１０Ａ】
2011522547.tif 000042
【図１０Ｂ】
2011522547.tif 000043
【図１０Ｃ】
2011522547.tif 000044
【国際調査報告】
2011522547.tif 000045
2011522547.tif 000046
2011522547.tif 000047
2011522547.tif 000048
2011522547.tif 000049
2011522547.tif 000050