(57)【要約】  本発明は、試料中のウイルス標的を検出する感度を増大させる方法に関する。感度は、標的を含む複合体を破壊させることによって、又は試料のより多い容量から標的のレベルを測定することによって増加させ得る。前記方法は、２．５未満のｐＨ、還元剤（例えば、ＤＴＴ又はメルカプトエタノール）及び／又は温度（６５℃＜Ｘ＜１１０℃）を用いて、抗原抗体複合体を破壊することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料を提供すること；
（ｂ）標的／第一の結合対複合体を追放すること；及び
（ｃ）前記試料を第二の結合対と接触させること（標的／第二の結合対複合体の存在は、前記試料中の標的の存在の指標である。）；
を含む、試料中の標的（該標的は第一の結合対に結合されている。）を検出するための方法。
【請求項２】
第一の結合対が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二の結合対が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的／第二の結合対複合体を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）及び（ｃ）及び検出が同時に実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
追放された第一の結合対を試料から除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一の結合対が抗体結合試薬を使用することによって除去される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体結合試薬が抗ヒトＩｇである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体結合試薬が微粒子に付着されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第二の結合対がタンパク質の抗原に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
抗原が直鎖エピトープである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗原がウイルス抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗原が表面抗原である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料が急性又は慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する患者から単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
試料が潜在性Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する患者から単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
試料が少なくとも２０μＬの容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）及び（ｃ）が少なくとも２つ組みの試料に対して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
試料のｐＨを２ないし６に減少させること、試料の温度を６０℃ないし１１０℃に増加させること及びジスルフィド結合を還元することができる因子を添加することからなる群から選択される方法によって追放が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
５０ｍＭから１Ｍの濃度でグリシンを含む溶液を用いて試料のｐＨが減少され、及び溶液のｐＨが１から２である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加した感度でウイルス標的を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界中で、２０億以上の人々に感染してきたと推定されている。ＨＢＶは、軽度の潜伏性の感染から慢性の活動的で、劇症性の肝炎に至るまで、様々な病状を引き起こすことが知られている。４億人以上の人々、特に、子供と高齢者が、ＨＢＶに慢性的に感染している。Ｂ型肝炎ウイルスは、ＡＩＤＳウイルスより１００倍以上感染性が高いが、ワクチン接種によって予防することが可能である。ＨＢＶ感染を管理する上で中心となる戦略は、汎用的なワクチン接種並びに感染個体の早期検出及び治療である。従って、ＨＢＶ診断アッセイは、ＨＢＶウイルス抗原の改善された正確な検出に焦点を当ててきた。
【０００３】
ＨＢＶ検出を改善するために、モノクローナル抗体、組換え抗原及び検出試薬などの試薬が開発されてきた。さらに、さらなるシグナルを生成するために、標識対抗体又は抗原取り込み比率を増加させることができる。しかしながら、これは、高いバックグラウンドレベル、減少した感度、より高い最初の反応速度及び非特異的結合をもたらす。血液スクリーニングイムノアッセイの品質を最大化するためには、特異性を維持すべきであり、偽陽性反応割合を最小化すべきである。核酸検査は、ＨＢＶを検出するための特に感受性が高い方法を与える。しかしながら、市販の検査は試料抽出操作をしばしば取り込み、検出の前に、標的又はＨＢＶＤＮＡを増幅することが必要である。これに対して、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出することを目的としたイムノアッセイは、試料抽出操作には依存せず、標的ＤＮＡ増幅を一切必要としない。ＨＢｓＡｇの低いレベルを含有する試料中のＨＢＶ表面抗体（抗ＨＢ）の存在は、ＨＢＶの検出を困難又は不可能なものにし得る。従って、ＨＢＶ感染症は、急性肝炎、慢性的なＨＢＶ保有者又は潜在的ＨＢＶ感染（ＯＢＩ）を有する患者においては、診断されないことがあり得る。従って、改善された感度を有するＨＢＶイムノアッセイに対する要望が本分野に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第一の結合対に結合され得る、試料中の標的を検出するための方法が本明細書において提供される。この方法は、（ａ）試料を提供すること、（ｂ）標的／第一の結合対複合体を追放すること、及び（ｃ）前記試料を第二の結合対と接触させることを含み得る。標的／第二の結合対複合体の存在は、試料中に標的が存在することの指標であり得る。前記方法は、標的／第二の結合対複合体を検出することをさらに含み得る。工程（ｂ）及び（ｃ）は、同時に行ってもよく、少なくとも２つ組みで、前記試料に対して行ってもよい。
【０００５】
第一及び第二の結合対は、それぞれ、抗体であり得、標的はタンパク質であり得る。第二の結合対は、標的の抗原に結合し得る。抗原は直鎖エピトープであり得、表面抗原又はコア抗原であり得る。抗原は、ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスであり得る。）の抗原であり得る。試料は、急性又は慢性のＢ型肝炎ウイルス感染を有する患者から単離され得、潜在的Ｂ型肝炎ウイルス感染を有する患者からも単離され得る。試料は、少なくとも２５０μＬの容量を有し得る。
【０００６】
追放は、２から６まで試料のｐＨを減少させることによって行うことができ、ｐＨの減少は、５０ｍＭから１Ｍの濃度でグリシンを含む溶液を用いて行うことができ、前記溶液のｐＨは１から２であり得る。追放は、６０℃から１１０℃まで試料の温度を増加させることによって、又はジスルフィド結合を還元することができる因子を添加することによっても行い得る。追放された第一の結合対は試料から除去することができ、試料からの除去は抗体結合試薬を使用することによって行い得る。抗体結合試薬は抗ヒトＩｇであり得、微粒子へ付着させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、非処理（ＰＢＳ）試料と比較して、処理された（低ｐＨ）試料間で、ＨＢｓＡｇに対するＨＢＶ検出アッセイの感度が極めて類似していることを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ウイルス感染は、ウイルスタンパク質の存在を検出することによって診断することができる。しかしながら、患者がウイルスに対する免疫応答を生じた場合には、ウイルスのタンパク質を検出することは困難であり得る。ウイルスタンパク質が免疫複合体中に結合されている場合、本来検出抗体によって結合される抗原が遮蔽され、従って、検出がより困難となる。患者が低レベルの感染を有する場合に、検出の減少は、特により顕著である。このシナリオでは、試料中に存在する僅かなウイルス抗原の多くが、抗体を基礎とする標準的アプローチを用いた結合及び検出のために利用することができない場合があり得る。患者が慢性又は急性の感染を有する場合には、患者の免疫応答由来の抗体も、ウイルス抗原の検出を低下させ得る。
【０００９】
本発明者らは、標的抗原を検出する前に、抗ＨＢＶ表面抗原免疫複合体からＢ型ウイルス標的タンパク質を追放することによって、ＨＢＶの改善された感度及び検出を達成できるという驚くべき発見を行った。検出の感度は、試料の増加した容量を使用し、及び少なくとも２つ組みの試料で標的抗原を検出することによっても増強することができる。これらのアプローチによって、低レベルのウイルス血症又は潜在的ＨＢＶ感染に罹患している患者中などのＨＢＶの低いレベルのよりよい検出が可能となる。潜在的なＨＢＶ感染症は、抗ＨＢ抗体の存在、持続的な低レベルのウイルス血症又はＨＢＶエスケープ変異体の存在などの幾つかの要因から生じ得、これらの感染症は現行のＨＢｓＡｇアッセイを用いて検出することはできない。
【００１０】
標的抗原追放の同じ原理は、複合体中に結合され得る他の標識を検出する感度を向上させるためにも使用することができる。例えば、核酸、核タンパク質及びポリペプチドの検出は、これらを追放することによって改善することができる。
【００１１】
１．定義
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記述することを目的とするものであり、限定を意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の記載がなければ、複数表記を包含する。
【００１２】
本明細書の数的範囲の表記に関して、同じ精度を有するその間に介在するそれぞれの数字が明示的に想定される。例えば、６から９の範囲に関しては、６及び９の他に、７及び８が想定され、６．０から７．０の範囲に関しては、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９及び７．０が明示的に想定される。
【００１３】
ａ．抗体
本明細書において使用される「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及び一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異的抗体、二機能性抗体及びこれらの誘導体を含む、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥの抗体又はこれらの断片若しくは誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープ又は所望のエピトープから得られる配列に対して十分な結合特異性を示す、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製された抗体又はこれらの混合物であり得る。ポリクローナル抗体は、ヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジなどの哺乳類起源のものであり得る。抗体は、キメラ抗体でもあり得る。抗体は、本分野において公知の１つ又はそれ以上の化学的、ペプチド又はポリペプチド部分の付着によって誘導化され得る。抗体は、化学的部分と連結させ得る。抗体は、特異的な結合要素であり得る。
【００１４】
ｂ．付着された
ポリペプチド及び固体支持体を参照するために本明細書において使用される「付着された」又は「固定化された」とは、ポリペプチドと固体支持体間の結合が結合、洗浄、分析及び除去の条件下で安定であるのに十分であることを意味する。結合は、共有又は非共有であり得る。共有結合は、ポリペプチドと固体支持体間で直接形成され得、又は架橋剤によって、又は固体支持体若しくはプローブ若しくは両分子の何れかの上に特異的な反応性基を含めることによって形成され得る。非共有結合は、静電的、親水的又は疎水的相互作用の１つ又はそれ以上であり得る。非共有結合に含まれるのは、ストレプトアビジンなどの分子の支持体への共有的付着及びビオチン化されたポリペプチドのストレプトアビジンへの非共有結合である。固定化は、共有的相互作用と非共有的相互作用の組み合わせも含み得る。
【００１５】
ｃ．エピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「抗原」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し得る。エピトープは、当該エピトープに特有である空間的立体構造中に３つのアミノ酸を含み得る。エピトープは、少なくとも５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含み得る。空間的立体構造を調べる方法は本分野において公知であり、Ｘ線結晶解析及び二次元核磁気共鳴が含まれる。抗原は、直鎖エピトープでもあり得る。抗原は、組換え又は合成であり得る。
【００１６】
ｄ．断片
本明細書において使用される「断片」は、基準ペプチド又はポリペプチドの一部を意味し得る。
【００１７】
ｅ．同一の
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関して本明細書において使用される「同一の」又は「同一性」とは、当該配列が同一である残基の指定されたパーセントを指定された領域上に有することを意味し得る。パーセントは、２つの配列を最適に並置し、指定された領域にわたって２つの配列を比較し、両配列中に同一の残基が存在する位置の数を求めて、合致した位置の数を与え、指定された領域中の位置の総数で合致した位置の数を除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセントを得ることによって計算され得る。２つの配列が異なる長さであり又は並置が１つ若しくはそれ以上のずれた末端をもたらし、及び指定された比較の領域が単一の配列のみを含む場合には、単一の配列の残基は計算の分母に含められるが、分子には含められない。
【００１８】
ｆ．指標試薬
本明細書において使用される「指標試薬」は、外部手段によって検出することができる測定可能なシグナルを生成することができる標識を含み、及び特定のポリペプチドに対する特異的結合要素に連結又は付着され得る組成物であり得る。指標試薬は、特定のポリペプチドに対する特異的な結合対の抗体要素であり得る。指標試薬は、ビオチン若しくは抗ビオチン、アビジン、若しくはビオチン、炭水化物若しくはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター若しくは受容体分子、酵素補因子及び酵素又は酵素阻害剤及び酵素などのハプテン・抗ハプテン系を含むあらゆる特異的結合対の要素でもあり得る。
【００１９】
ｇ．標識
本明細書において使用される「標識」又は「検出可能な標識」は、標識が付着されている分子の定量的な又は相対的な直接又は間接的測定を可能にするシグナルを生成することができる部分を意味し得る。標識は、マイクロタイタープレート、粒子、微粒子又は顕微鏡スライド；酵素；酵素基質；酵素阻害剤；補酵素；酵素前駆体；アポ酵素；蛍光性物質；顔料；化学発光化合物；発光性物質；発色性物質；磁気物質；又は金コロイドなどの金属粒子；１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ又は１４Ｃなどの放射性物質；ニトロフェニルリン酸などのリン酸化されたフェノール誘導体、ルシフェリン誘導体又はジオキセタン誘導体などの固体であり得る。酵素は、脱水素酵素；還元酵素若しくは酸化酵素などの酸化還元酵素；アミノ；カルボキシル、メチル、アシル又はリン酸基などの官能基の転移を触媒する転移酵素；エステル、グリコシド、エーテル若しくはペプチド結合などの結合を加水分解し得る加水分解酵素；脱離酵素；異性化酵素；又は連結酵素であり得る。酵素は、別の酵素にも連結され得る。
【００２０】
酵素は、酵素的サイクルによって検出され得る。例えば、検出可能な標識がアルカリホスファターゼである場合、ウンベリフェロン誘導体などの適切な基質から生成された蛍光又は発光を観察することによって、測定が為され得る。ウンベリフェロン誘導体は、４−メチル−ウンベリフェリルホスファートを含み得る。
【００２１】
蛍光又は化学発光標識は、フルオレセイン・イソチオシアナート；ローダミンＢイソチオシアナート又はテトラメチルローダミンイソチオシアンートなどのローダミン誘導体；ダンシルクロリド（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロリド）；ダンシルフルオリド；フルオレスカミン（４−フェニルスピロ［フラン−２−（３Ｈ）；１ｙ−（３ｙＨ）−イソベンゾフラン］−３；３ｙ−ジオン）；フィコシアニン又はフィコエリトリン（ｐｈｙｓｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）などのフィコビリンタンパク質；アクリジニウム塩；ルミフェリン、ルシフェラーゼメ若しくはエコーリンなどのルミノール化合物；イミダゾール；シュウ酸エステル；ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）若しくはサマリウム（Ｓｍ）などの希土類元素のキレート化合物；又は７−アミノ−４−メチルクマリンなどのクマリン誘導体であり得る。
【００２２】
標識は、アダマンチン、フルオレセイン・イソチオシアナート又はカルバゾールなどのハプテンでもあり得る。ハプテンは、多価抗体又は（ストレプ）アビジン含有部分と接触したときに凝集物を形成させ得る。ハプテンは、固体支持体に付着される分子の簡単な付着も可能にし得る。
【００２３】
標識は、電極の使用；色、光若しくは吸光度の分光学的測定；又は視覚的検査によるなど、検出可能な標識に付着された分子のレベルを定量することによって検出され得る。
【００２４】
ｈ．ペプチド
本明細書において使用される「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成又は天然及び合成の修飾若しくは組み合わせであり得る。
【００２５】
ｉ．組換えポリペプチド
本明細書において使用される「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、その起源若しくは操作のために、自然状態で若しくはライブラリーの形態で伴われるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴わず又は自然状態で結合されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合されている、少なくともゲノム、半合成又は合成起源のポリペプチドを意味し得る。組換えポリペプチドは、ＨＢＶの指定された核酸配列から必ずしも翻訳され得ない。組換えポリペプチドは、組換え発現系の化学的合成若しくは発現を含むあらゆる様式でも作製され得、又はＨＢＶから単離され得る。
【００２６】
ｊ．固体支持体
本明細書において使用される「固体支持体」、「固相」又は「固体基材」は、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子及びその他であり得る。固体支持体は重要でなく、当業者によって選択され得る。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気若しくは非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラス又はシリコンチップ及びヒツジの赤血球は、全て適切な例である。固体支持体上にペプチドを固定化するための適切な方法には、イオン性、疎水性、共有的相互作用などが含まれる。固体支持体は、不溶性である又はその後の反応によって不溶性となり得るあらゆる物質でもあり得る。固体支持体は、捕捉試薬を惹き付け及び固定化するその固有の能力に関して選択され得る。あるいは、固体支持体は、捕捉試薬を惹きつけ及び固定化する能力を有するさらなる受容体を保持し得る。さらなる受容体には、捕捉試薬自体と反対に帯電した帯電物質又は捕捉試薬に連結された帯電物質と反対に帯電した帯電物質が含まれ得る。さらに別の例として、受容体分子は、固体支持体上に固定され（に付着され）、及び特異的な結合反応を通じて捕捉試薬を固定化する能力を有するあらゆる特異的な結合要素であり得る。受容体分子は、アッセイの実行前に又はアッセイの実行の間に、捕捉試薬の固体支持体材料への間接的な結合を可能にする。従って、固体支持体は、プラスチック、誘導化されたプラスチック、磁性又は非磁性金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターのウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び当業者に公知の他の構成であり得る。
【００２７】
固体支持体は、検出抗体による接近を可能にするのに十分な多孔性及び抗原を結合するのに適切な表面親和性を有するあらゆる適切な多孔性材料も含み得ることが想定され、本発明の範囲に属する。微孔性構造が一般に好ましいが、水和された状態のゲル構造を有する材料も使用され得る。このような有用な固体支持体には、天然のポリマー性炭水化物及びそれらの合成的に修飾され、架橋され又は置換された誘導体（寒天、アガロース、架橋されたアルギン酸、置換された及び架橋されたグアルゴム、特に、硝酸及びカルボン酸を有するセルロースエステル、混合されたセルロースエステル及びセルロースエーテル）；架橋された又は修飾されたゼラチンを含む、タンパク質及び誘導体などの含窒素天然ポリマー；ラテックス及びゴムなどの天然の炭化水素ポリマー；ビニルポリマーなどの適切に多孔性の構造を用いて調製され得る合成ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル及び部分的に加水分解されたその誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリラート、ポリエステル、ポリアミドなどの上記重縮合物の共重合体及びターポリマー並びにポリウレタン又はポリエポキシドなどのその他のポリマーなど）；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩を含む、アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩などの多孔性無機材料；並びに粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル又はガラス（これらの材料は、上記ポリマー性材料とともに、フィルターとして使用され得る。）などの、アルミニウム又はケイ素の酸化物又は水和物；並びに既存の天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することによって得られるグラフト共重合体などの、上記クラスの混合物又は共重合体が含まれる。これらの材料の全ては、フィルム、シート若しくはプレートなどの適切な形状で使用され得、又は紙、ガラス、プラスチックフィルム若しくは織物などの適切な不活性担体上に被覆され、又はこれらに結合され、又は薄層化させ得る。
【００２８】
ニトロセルロースの多孔性構造は、モノクローナル抗体などの多様な試薬に対して、優れた吸収及び吸着品質を有する。ナイロンも、類似の特徴を有しており、同じく適切である。本明細書に上記されているこのような多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１から０．５ｍｍ、好ましくは０．１ｍｍの厚さのシートの形態であることが想定される。孔径は、広い限度内で変動し得、好ましくは、約０．０２５から１５ミクロン、特に、約０．１５から１５ミクロンである。このような支持体の表面は、支持体への抗原又は抗体の共有結合を引き起こす化学的プロセスによって活性化され得る。しかしながら、一般に、理解が乏しい疎水的な力による多孔性材料上での吸着によって、抗原又は抗体の不可逆的な結合が得られる。適切な固体支持体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願２２７，２７２号にも記載されている。
【００２９】
ｋ．特異的結合要素
本明細書において使用される「特異的結合要素」は、特異的結合対の様子を意味し得る。特異的結合対は、分子の１つが、化学的又は物理的手段を通じて、第二の分子に特異的に結合する２つの異なる分子であり得る。特異的結合要素は免疫反応性であり得、特定のポリペプチドに結合することができる、抗体、抗原又は抗体／抗原複合体であり得る。
【００３０】
ｌ．実質的に同一な
本明細書において使用される「実質的に同一な」とは、８から１００又はそれ以上の残基の領域にわたって、第一及び第二の配列が５０％から９９％同一であることを意味し得る。
【００３１】
ｍ．変形物
ポリペプチドに関して本明細書において使用される「変形物」は、（ｉ）８から１００又はそれ以上のアミノ酸であり得る参照ポリペプチドの一部；又は（ｉｉ）基準ポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドを意味し得る。変形物は、タンパク分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾などの異なってプロセッシングされたポリペプチドでもあり得る。
【００３２】
２．標的
標的を検出する方法が本明細書において提供される。標的は、タンパク質、核酸又は核タンパク質などのあらゆる検出可能な分子であり得る。標的は、別の分子と複合体を結合することが可能であり得、これは、標的の感度又は検出を減少させ得る。標的を複合体から追放することによって、標的の感度又は検出を増加させることが望ましい場合があり得る。標的は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、植物、動物又はあらゆる他の生物又は癌又はサイトカインであり得る。標的の存在は、生物、癌又はサイトカインの指標であり得る。例えば、標的は、ウイルス又はウイルス感染の指標であり得る。
【００３３】
ウイルスの代表的な例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス若しくはポックスウイルスなどの二本鎖ＤＮＡウイルス；パルボウイルスなどの一本鎖（＋）センスＤＮＡウイルス；レオウイルスなどの二本鎖ＲＮＡウイルス；ピコルナウイルス若しくはトガウイルスなどの一本鎖（＋）センスＲＮＡウイルス；オルソミクソウイルス又はラブドウイルスなどの一本鎖（−）センスＲＮＡウイルス；レトロウイルスなどの生活環においてＤＮＡ中間体を有する一本鎖（＋）センスＲＮＡウイルス；又はヘパドナウイルスなどのＲＮＡ中間体を有する二本鎖ＤＮＡが含まれる。ウイルスは、ヒトパピローマウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＲＳＶ、ＥＢＶ、Ａ型インフルエンザ、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスでもあり得る。ＨＩＶは、ＨＩＶ−１群Ｏ、ＨＩＶ−１群Ｍ及びＨＩＶ−２の単離株であり得る。
【００３４】
細菌の代表的な例には、バチラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシーユ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、マイコバクテリウム・チュバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミコバ（Ｍｙｃｏｂａ）、リゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの（連鎖球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）及びサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）が含まれる。エス・ニューモニアエ標的（ｔａｒｇｅ）は、種特異的なＣ−多糖、型特異的な莢膜多糖又はニューモリシンであり得る。ピー・アエルギノサ標的は、調製されたピー・アエルギノサ抽出物であり得る。
【００３５】
真菌の代表例には、シー・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコッカス及びピー・ブラシリエンシス（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などのパラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）が含まれる。シー・ネオフォルマンス標的は、可溶性の莢膜多糖（ＣＰＳ）抗原であり得る。ピー・ブラシリエンシス標的は、免疫優性抗原又はｇｐ４３であり得る。
【００３６】
寄生生物の代表例には、トリパノソーマ・クルチ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）及びプラスモジウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ピー・ビバックス（Ｐ．  ｖｉｖａｘ）、ピー・マラリアエ（Ｐ．  ｍａｌａｒｉａｅ）及びピー・オバーレ（Ｐ．  ｏｖａｌｅ）などの種が含まれる。ピー・ファルシパラム標的は、１７５ｋＤａの赤血球結合タンパク質、ＥＢＡ−１７５、ヒスチジンリッチタンパク質（ＰｆＨＲＰ−２）、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ１）又はＭＳＰ２であり得る。ティー・クルチ標的は、ティー・クルチ循環抗原（ｃＡｇ）、Ｇｐ９０、Ｇｐ６０／５０、ＬＰＰＧ、ＦＰ１０、ＦＰ６、ＦＰ３若しくはＴｃＦなどの抗原又は米国特許第５，６４５，８３８号、米国特許第５，６２３，０５８号、米国特許第５，５８３，２０４号又は米国特許第５，５５０，０２７号（これらの内容は、参照により、本明細書中に開示される。）開示されている標的であり得る。
【００３７】
癌標的は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）又はＤＦ３決定抗原（ＤＦ３  ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）であり得る。サイトカインは、ＩＬ−８であり得る。
【００３８】
ａ．タンパク質
（１）Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質
タンパク質は、ＨＢＶタンパク質又はその変形物であり得る。ＨＢＶタンパク質は、「Ｋｉｍｕｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；４０（２）：４３９−４５」（その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているように、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢＶコア関連抗原（ＨＢｃｒＡｇ）又はＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）であり得る。ＨＢＶタンパク質は、ＨＢＶ外被の一部を形成することが可能であり得るＨＢＶ表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）でもあり得る。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ粒子の表面上に露出され得る。ＨＢｓＡｇは、エピトープを含み得、エピトープは抗原性であり得又は免疫監視の標的であり得る。エピトープは、変異体エピトープであり得る。また、ＨＢｓＡｇは、グリコシル化され得る。
【００３９】
（ａ）中央Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（Ｍ−ＨＢｓＡｇ）
ＨＢｓＡｇは、中央ＨｂｓＡＧ（Ｍ−ＨＢｓＡｇ）であり得る。Ｍ−ＨＢｓＡｇは第一の部分及び第二の部分を含み得、約２８１アミノ酸の全長を有し得る。第一の部分はｐｒｅＳ２領域を含み得、Ｍ−ＨＢｓＡｇの最初の５５アミノ酸であり得る。第二の部分は２２６アミノ酸の長さであり得、Ｓ−ＨＢｓＡｇの配列を含み得る。Ｍ−ＨＢｓＡｇは表１に記載されている配列又はその変形物を含み得る。Ｍ−ＨＢｓＡｇの第一の部分はエピトープも含み得る。エピトープは、抗体によって結合されることが可能であり得る。抗体は、抗Ｍ−ＨＢｓＡｇ特異的抗体であり得る。
【００４０】
【表１】
2011520124.tif 000002
【００４１】
（ｂ）小Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）
ＨＢｓＡｇは、小ＨｂｓＡＧ（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）でもあり得る。Ｓ−ＨＢｓＡｇは約２２６アミノ酸長であり得、Ｓ領域を含み得る。Ｓ−ＨＢｓＡｇは、野性型Ｓ−ＨＢｓＡｇであり得る。Ｓ−ＨＢｓＡｇは表２に記載されている配列又はその変形物を含み得る。Ｓ−ＨＢｓＡｇはエピトープも含み得、エピトープは米国特許第５，９２５，５１２号又は米国特許第７，１４１，２４２号（これらの内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されている「ａ」決定基の一部であり得る。Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００から１６０はエピトープも含み得る。
【００４２】
【表２】
2011520124.tif 000003
【００４３】
（２）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質
タンパク質は、ＨＣＶタンパク質又はその変形物であり得る。ＨＣＶタンパク質はＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｐ２７９５８に記載されているポリタンパク質を含み得る。ＨＣＶタンパク質はコア又はヌクエオキャプシドタンパク質を含み得、ポリタンパク質の最初の１９１アミノ酸を含み得る。コアタンパク質は抗原を含み得、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５であり得る。
【００４４】
（３）ヒト免疫不全ウイルスタンパク質
タンパク質は、ＨＩＶタンパク質又はその変形物であり得る。ＨＩＶタンパク質は、ｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質又はｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質前駆体（Ｐｒ１８０ｇａｇ−ｐｏｌ）であり得る。ＨＩＶタンパク質は、ｐｏｌ前駆体又はｇａｇ前駆体（Ｐｒ５５ｇａｇ）でもあり得る。ＨＩＶタンパク質は、ｐ１７（ミリスチル化されたｇａｇタンパク質）、ｐ２４（主要な構造タンパク質）、ｐ７（核酸結合タンパク質）又はｐ９（プロリンリッチタンパク質）Ｐｒ５５ｇａｇタンパク質切断産物も含み得る。ＨＩＶタンパク質は、ｇｐ１６０外被ポリタンパク質前駆体又はｇｐ１２０（外被糖タンパク質）若しくはｇｐ４１（膜貫通タンパク質）などのｇｐ１６０切断産物も含み得る。
【００４５】
ｂ．抗体
標的は、ウイルス性であり得るタンパク質、核酸又は核タンパク質に結合ことが可能であり得る抗体でもあり得る。抗体は、タンパク質又は核タンパク質の抗原を結合することが可能であり得る。抗体は、タンパク質、核酸又は核タンパク質に対する対象の免疫反応によって作製され得る。
【００４６】
３．標的を検出する方法
試料中の標的を検出する方法が本明細書において提供される。標的は第一の結合対に結合され得、これは標的を検出する感度を低下させ得る。標的／第一の結合対複合体を追放することは、標的を遊離状態にし、標的の検出を容易にし得る。例えば、第一の結合対は標的タンパク質の抗原を塞ぎ得る。第一の結合対から標的タンパク質を追放することによって、抗原はより容易に検出可能となり得る。標的／第一の結合対複合体を追放すると、第一の結合対は試料から除去され得る。試料は、標的を結合することが可能であり得る第二の結合対と接触させ得る。標的／第二の結合対複合体が検出され得、試料中のこの複合体の存在は標的の存在の指標であり得る。標的／第二の結合対複合体の量は、試料中の標的の量の指標でもあり得る。追放及び検出工程は、少なくとも２つ組みで実施され得る。追放、除去及び検出工程は、少なくとも２つ組みでも実施され得る。
【００４７】
ａ．追放
（１）第一の結合対
標的は、タンパク質、核酸、核タンパク質又は他のこのような分子であり得る第一の結合対に結合され得る。第一の結合対タンパク質は、標的又は標的の抗原に結合することが可能であり得る抗体であり得る。抗体は、標的に対する対象の免疫応答の結果であり得る。
【００４８】
第一の結合対タンパク質は、ウイルス性であり得る抗原でもあり得る。抗原は、第一の結合対抗原に対する対象の免疫応答の結果であり得る抗体へ結合することが可能であり得る。
【００４９】
（２）追放因子
標的／第一の結合対複合体は、低ＰＨであり得る追放因子を使用することによって追放され得る。ｐＨは、２から６であり得る。このｐＨは、１から２のｐＨを有する溶液を使用することによって達成され得る。溶液は、５０ｍＭから１Ｍのグリシン濃度を有するグリシン試薬であり得る。低ｐＨは、塩酸又は酢酸を使用することによっても達成され得る。追放因子による破壊後に、試料は、５００ｍＭから２ＭＴｒｉｓであり得る中和剤を用いて中和され得、７から１２のｐＨを有し得る。追放因子は、１０から１３のｐＨであり得る高いｐＨでもあり得る。高いｐＨは、ボラート、リン酸、ジエチルアミン又はトリエチルアミンを使用することによって達成され得る。
【００５０】
追放因子は熱でもあり得、６０℃から１１０℃の温度であり得る。追放因子は、βメルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン、システイン又はＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などのジスルフィド結合を還元することが可能な因子でもあり得る。追放因子は、１から５Ｍの塩濃度を有し得る濃縮された塩溶液でもあり得、これは、ＭｇＣｌ２又はＬｉＣｌを使用することによって達成され得る。追放因子は尿素、ＳＤＳなどの変性剤又はチオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック剤であり得る。
【００５１】
標的／第一の結合対複合体を追放すると、第一の結合対は除去され得、これは、第一の結合対結合試薬を使用することによって達成され得る。第一の結合対結合試薬は、抗ヒトＩｇであり得る抗体結合試薬であり得る。第一の結合対結合試薬は、第一の結合対へ結合することができる抗原でもあり得る。抗体結合試薬は、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＧ又はプロテインＡでもあり得る。抗体結合試薬は固体支持体に付着され得る。
【００５２】
ｂ．接触
試料中の標的から第一の結合対を追放すると、試料は標的に結合することが可能であり得る第二の結合対と接触させることができる。標的が第一の結合対から追放されると、第二の結合対は標的にさらに容易に結合することが可能であり得る。接触は、標的／第二の結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で行い得る。接触工程は、標的／第一の結合対複合体の追放と同時に行われ得る。
【００５３】
（１）第二の結合対
第二の結合対は標識を含み得、指標試薬の一部であり得る。第二の結合対は固体支持体にも付着され得る。
【００５４】
第二の結合対は、ウイルス反応性抗体へ結合することが可能であり得る抗抗体などの抗体を含み得る。ウイルス反応性抗体は、ウイルスタンパク質又は抗原へ結合することが可能であり得る。
【００５５】
第二の結合対は、標的に結合することが可能であり得る抗原も含み得る。標的は、ウイルス反応性抗体であり得る。第二の結合対抗原は、ウイルス性、組換え又は合成であり得る。
【００５６】
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス第二の結合対
第二の結合対は、ＨＢＶタンパク質の抗原を結合することが可能であり得る。第二の結合対は、５０−８０、１１６−３４、Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ４０、Ｈ５３若しくはＨ３５モノクローナル抗ＨＢ抗体又は類似の抗体であり得る。
【００５７】
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス第二の結合対
第二の結合対はＨＣＶ第二の結合対であり得、ＨＣＶタンパク質の抗原に結合することが可能であり得る。第二の結合対は、１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４、１４−９４５−２１８、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０、１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、ＣＩＩ−３、ＣＩＩ−７、ＣＩＩ−１０、ＣＩＩ−１４若しくはＣＩＩ−１５抗ＨＣＶタンパク質モノクローナル抗体又は類似の抗体であり得る。
【００５８】
ＨＣＶ第二の結合対は、ＨＣＶ反応性抗体へ結合することができる抗原であり得る。抗原はコア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５又はこれらの変形物であり得る。抗原は、米国特許第６，５９６，４７６号（これらの内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているようなｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０．ＬＧ、ｐ３８０−Ｊ又はｐ４０８Ｊでもあり得る。
【００５９】
（ｃ）ＨＩＶタンパク質第二の結合対
第二の結合対はＨＩＶ標的に結合することが可能であり得、米国特許公開２００２／０６０６６３６号Ａ１（その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているような１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０８−３９４、１１５Ｂ−３０３又は１０３−３５０モノクローナル抗体又は他の抗体であり得る。
【００６０】
ｃ．検出
標的を第二の結合対と接触させると、標的／第二の結合対複合体が検出され得る。これは、標的／第二の結合対複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、試料を第二の結合対と接触させ、標的／第二の結合対複合体からの検出可能なシグナルのレベルを測定することによって達成され得る。試料中で検出されたシグナルのレベルは標的の存在の指標となり得、標的の量の指標ともなり得る。シグナルのレベルは、試料中の標的の量に比例し得る。シグナルのレベルは、対照と比較され得る。試料中の標的／第二の結合タンパク質複合体から検出されるシグナルの、対照と比較されたレベルの差は、標的の存在又は量の指標であり得る。検出工程は、一工程の捕捉／検出操作の第一の温置工程など、追放及び接触工程と一緒に実施され得る。
【００６１】
標的が抗ウイルス抗原抗体に結合されたウイルス抗原であれば、試料中のウイルス抗原から抗ウイルス性抗原抗体を追放すると、検出標的ウイルス抗原／検出抗ウイルス抗原抗体複合体を形成させるのに十分な時間及び条件下で、抗ウイルス抗原抗体を含む指標試薬と試料を接触させることによって、標的を検出し得る。標的のレベルは、標識によって生成された測定可能なシグナルを検出することによって測定され得る。
【００６２】
標的がウイルス抗原に結合されている抗ウイルス抗体であれば、試料中の抗ウイルス抗原抗体からウイルス抗原を追放すると、抗ウイルス抗体／検出抗抗ウイルス抗体抗体複合体を形成させるのに十分な時間及び条件下で、抗抗ウイルス抗体抗体を含む指標試薬と試料を接触させることによって、標的を検出し得る。標的のレベルは、標識によって生成された検出可能なシグナルを測定することによって測定され得る。
【００６３】
標的が抗ウイルス抗体であれば、試料中の抗ウイルス抗体からウイルス抗原を追放すると、抗ウイルス抗体／検出ウイルス抗原複合体を形成させるのに十分な時間及び条件下で、ウイルス抗原を含む指標試薬と試料を接触させることによっても、標的を検出し得る。標的のレベルは、標識によって生成された検出可能なシグナルを測定することによって測定され得る。
【００６４】
この方法において、非固相診断アッセイを使用し得る。これらのアッセイは当業者に周知であり、本発明の範囲に属するものと考えられる。このようなアッセイの例には、米国特許第５，９２５，５２１号又は米国特許第７，１４１，２４２号（その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているアッセイが含まれる。
【００６５】
標識は、固体支持体を含み得る検出系を用いて検出され得る。固体支持体は、半自動化された又は完全に自動化された免疫分析装置によって使用されるように改変され得る。検出系は、反応容器に試料及び試薬（抗原、抗体、標識、緩衝液などを含み得る。）を送達し、温置を行い、及び結合された標識されたポリペプチドから結合していない標識されたポリペプチドを場合によって洗浄し得る。試料及び試薬が系内に挿入されると、検出系は使用者の介入なしに自動化され得る。自動化された検出系は、使用者の介入なしに、４８時間の期間に、系が少なくとも８、１６、６４又は１２８アッセイを実行できる点で、手動の系又は自動化の程度が低い系から区別され得る。系は、ヒトの計算又は入力の必要なしに、試料中のポリペプチドの濃度又は量を自動的に計算することも可能であり得る。
【００６６】
検出系は、カートリッジフォーマット又は検査片アッセイも含み得る。検出系は、使い捨て装置中への単位用量を搭載可能なアッセイ試薬を提供し得、単位用量はポリペプチドを検出するためのアッセイに必要な全ての試薬を含有し得る。使い捨て装置は、ナイロン、ニトロセルロース又は他の適切な材料の使い捨て膜様構造を含み得るプラスチック収容部を含み得る。試料は、前処理され得、又は使い捨て装置の搭載ゾーン上に直接搭載され得る。次いで、試料は、膜上に含有される複数のゾーンを通じて、膜様構造を横切って場合によって流動し得る。膜様構造は、変性剤又は側方流補助（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ  ａｉｄ）をさらに含み得る。膜様構造は、過剰な液体を集めるための及び／又は膜を横切る側方流を促進するための吸収剤も含有し得る。検出系は、各パックが１、２、４、８、１０又は１２のアッセイを実行するのに十分な試薬を含み得るマルチパック系を含み得る。
【００６７】
検出系は、μＬ域（例えば、４μＬ、１２μＬ、５０μＬ、２５０μＬ未満）の試料を分析するように設計された微小流体装置も含み得る。微小流体装置を通過する試料若しくはアッセイ試薬又は両者の輸送を補助するために、微小流体装置は、流動補助、（膨張ゲル、ワックス又は気体を含み得る）推進装置、ナノバルブなどを含み得る。
【００６８】
もちろん、本明細書中の例示的なフォーマットの全て及び本発明のあらゆるアッセイ又はキットは、米国特許第５，０８９，４２４号及び米国特許第５，００６，３０９号（これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、例えば、ＡｂｂｏｔｔのＡＴＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍＩＩプラットフォーム及び他のプラットフォームなどの（但し、これらに限定されない。）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）によって市販されているように、自動化及び半自動化された系（微粒子を含む固相がその中に存在するものを含む。）における使用のために改変し、又は最適化することができることは言うまでもない。
【００６９】
さらに、本明細書に記載されているアッセイ及びキットは、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  （ｉ−ＳＴＡＴＴＭ）電気化学的イムノアッセイ系を含む治療地点でのアッセイ系（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）に対して、場合によって改変又は最適化することができる。イムノセンサー並びに使い捨ての検査装置においてイムノセンサーを製造及び操作する方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号及び公開された米国特許公開２００３０１７０８８１号、２００４００１８５７７号、２００５００５４０７８号及び２０６０１６１６４号（これらの内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００７０】
４．試料
標的を含む試料は、患者から単離され得る。試料は、ヒトなどの動物から単離された生物学的組織又は流体であり得る。試料は、生検又は剖検試料、組織学的な目的のために採取された凍結切片などの組織の切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘膜、毛髪又は皮膚でもあり得る。試料は、外植片又は動物若しくは患者の組織に由来する一次細胞培養若しくは形質転換された細胞培養物でもあり得る。試料は、動物から細胞の試料を取り出すことによって提供され得るが、以前に単離された（例えば、別の者によって、別の時点で、及び／又は別の目的のために単離された）細胞を使用することによっても達成され得る。保存組織（治療又は転帰歴を有するものなど）も使用され得る。試料は、血液、血液画分、滲出物、腹水液、唾液、脳脊髄液、子宮頚管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、胃腸分泌物、気管支分泌物、痰、細胞株、組織試料又は乳房からの分泌物でもあり得る。
【００７１】
試料は、２０μＬに等しい又はそれ以上の容量を有し得る。試料は、２５０μＬに等しい又はそれ以上の容量も有し得る。
【００７２】
５．患者
患者は、ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスであり得る。）に感染し得る。感染は、ＨＢＶ潜在型感染などの潜在型感染であり得る。
【００７３】
６．キット
本明細書では、標的を検出するために使用され得るキットが提供される。キットは、追放因子、第二の結合対を含み得、及び第二の結合対を含む指標試薬を含み得る。キットは、第一の結合対結合試薬も含み得る。キットは、試料からのタンパク質を結合するのに適した固体支持体も含み得る。キットは、陽性対照として使用するために既知濃度で標的を含む組成物も含み得る。
【００７４】
キットは、タンパク質−タンパク質相互作用を促進し若しくは抑制するために、又は結合していないタンパク質を固体支持体から除去するために必要とされ得る、緩衝液又は塩などのさらなる試薬も含み得る。キットは、指標試薬上の標識に検出可能なシグナルの生成を誘導させることができる因子をさらに含み得る。キットは、標識がシグナルを生成するのを停止させることができる因子も含み得る。
【００７５】
キットは、各々の容器が別個の試薬を含有する１つ又はそれ以上の容器（バイアル又は瓶など）も含み得る。キットは、本明細書に記載されているアッセイをどのようにして実行し又は解釈するかを記載し得る指示書をさらに含み得る。
【００７６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される複数の態様を有する。
【実施例１】
【００７７】
ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＡ抗体複合体を追放した際に、Ｂ型肝炎表面抗原を検出することは、免疫複合体を有する試料の検出を改善する。
【００７８】
本実施例は、標的／抗体免疫複合体を崩壊させた際に標的タンパク質を検出することが、対照免疫複合体試料中の標的を検出する感度を改善することを示す。抗ＨＢを含有する試料を正常なヒト血漿中に１５０ｐｇ／ｍＬになるように希釈されたＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄ）の溶液と合わせることによって、免疫複合体試料を調製した。１５０ｐｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ溶液中に、抗ＨＢ試料を１０、２５、５０、１００又は２００倍希釈することによって、免疫複合体試料中の抗体の量を変動させた。室温で少なくとも１時間、混合物を温置した後、原型Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）で使用し、又は４℃で保存した。これらの試料は、免疫複合体を解離させる低いｐＨでの処理と比べて、シグナルが増加するかどうかを測定するための免疫複合体対照試料としての役割を果たす。
【００７９】
抗ＨＢｓ／ＨＢｓＡｇ複合体試料中のＨＢｓＡｇを検出する前に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｃ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）中で１５分間、１４，０００ｒｐｍで試料を回転させた。低ｐＨで試料を処理した後、中和するための多数の条件が、最適化の間に試され、これらは、表３に示されている。試料のｐＨを低下させるために、列記されているグリシン試薬は、２５０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５、２５０ｍＭグリシン、０．３％ＢＳＡ、ｐＨ１．５及び５０ｍＭグリシン、０．３％ＢＳＡ、ｐＨ２．０である。処理されていない試料のための対照試薬は、ＰＢＳ、０．３％ＢＳＡであった。列記されている中和剤は、１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ９．０、１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４及び２ＭＴｒｉｓ、ｐＨ１１．５である。
【００８０】
処理された試料に関しては、０から１４のｃｏｌｏｒｐＨａｓｔ片（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定すると、各試料の最終ｐＨは２から６の範囲であった。処理されていない処理に関しては、グリシン試薬の代わりに、ＰＢＳ、０．３％ＢＳＡを添加した。次いで、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＤＩ；  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）上で回転させながら、試料を３７℃で３０から６０分間温置した。次に、ｃｏｌｏｒｐＨａｓｔ片５から１０を用いて測定したときに６から９のｐＨになるように、処理された試料をＴｒｉｓで中和した。処理されていない試料に関しては、中和工程でＰＢＳ又はＴｒｉｓ溶液を添加した。
【００８１】
【表３】
2011520124.tif 000004
【００８２】
免疫複合体を解離するための処理の後に、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中において、試料を１４，０００ｒｐｍで１５分間回転させた。ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇアッセイにおけるように、次いで、３７℃で１８分間、微粒子５０μＬを試料とともに温置した（回転なしのＤＩ）。２つの抗ＨＢモノクローナル抗体Ｈ１６６及び１１６−３４で、微粒子を被覆した。温置後に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中において、１０，０００ｒｐｍで５分間、試料を遠心した。上清を取り除き、ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｗａｓｈ（ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  ３Ａ４７Ｃ）１ｍＬを管に添加した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中において、１０，０００ｒｐｍで５分間、管を遠心した。上清を除去し、ＰＢＳ１００μＬを管に添加した。次いで、管を短時間遠心し、ピペットを用いて、微粒子沈降物を５回再懸濁した。
【００８３】
Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｒａｙ  （Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）の試料壁に、反応された微粒子（１００μＬ）を添加した。Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｗａｓｈステーションまで、装置によって、何もトレイ中に分配されなかった。この時点において、製造業者の指示書（（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）に従って、トレイをＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ免疫分析にかけた。連結物は、１５０ｎｇ／ｍＬのアクリジニウム連結ヤギ抗ＨＢｓポリクローナル及び１３０ｎｇ／ｍＬのアクリジニウム連結抗体ＨＢｓＨ３５から構成された。Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｗａｓｈプロトコールを除き、市販のＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇアッセイのために使用した装置の系列を使用した。この工程は、ホウ酸緩衝化された生理的食塩水（ＢＢＳ）３００μＬの１回の洗浄、その後、ＢＢＳ１００μＬの２回の洗浄を含めるために改変された。シグナル又は相対光単位（ｒｌｕｓ）は、ＰＲＩＳＭ装置上で測定した。
【００８４】
表３に示されているアレイ条件のうち、条件７、９、１３及び１５は、ＨＢＶ陰性血漿試料に対して最も低いバックグラウンドカウント及び微粒子取り付けに伴う問題が最も小さかった。表３から、１５０ｐｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ試料中に、５０倍希釈された（ＤＦ５０）抗ＨＢ試料との免疫複合体試料を検査するために、条件７、９、１３及び１５を使用した。これらの試料の検査結果が、表４に見出される。処理されていない試料のｒｌｕに対する処理された試料の比が、比較のために示されている。条件９は、処理されていない免疫複合体対照試料と比較した処理された免疫複合体試料に対するｒｌｕ値に最大の増加をもたらした。
【００８５】
【表４】
2011520124.tif 000005
【００８６】
処理された（すなわち、低ｐＨで）及び処理されていない（すなわち、ＰＢＳで）試料に対するカットオフ（ＣＯ）値を計算するために、陰性試料から測定された検出可能なシグナルを使用した。実験は、一般的な上記検出方法及びアッセイ条件９（表３）に従って行った。ＣＯ値は、陰性試料の平均＋５標準偏差であった。非処理試料に関しては、ＣＯ値は３７３（平均＝１８７、標準偏差＝３７．１）であり、処理された試料に関しては、ＣＯ値は３５８（平均＝２１８、標準偏差＝２８．１）であった。
【００８７】
抗ＨＢｓの変動する量を有する免疫複合体対照試料を低ｐＨで処理し、値を低ｐＨで処理されなかった試料と比較した（表５）。実験は、一般的な上記検出方法及びアッセイ条件９（表３）に従って行った。抗ＨＢｓが１００倍又は２００倍希釈された処理された試料に関しては、シグナル対カットオフ（Ｓ／ＣＯ）は、１より大きかった。処理：非処理試料のｒｌｕ又はＳ／ＣＯの比は１．５又はそれ以上であり、ＨＢｓＡｇを検出する前に、抗ＨＢで免疫複合体からＨＢｓＡｇを追放することはシグナルを改善することを示唆している。これは、ＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓを解離させるために含められた工程を有するＨＢｓＡｇアッセイは、免疫複合体を有する試料の改善された検出をもたらすことを示す。潜在型試料を検査する場合、これは、ＨＢｓＡｇアッセイの改善された性能をもたらすはずである。
【００８８】
【表５】
2011520124.tif 000006
【実施例２】
【００８９】
試料容量を増加させること、及びＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＡ抗体複合体を追放した際に、Ｂ型肝炎表面抗原を検出することは、潜在的免疫複合体を有する試料の感度及び検出を改善する
本実施例は、標的／免疫複合体を崩壊させた際に標的タンパク質を検出することが標的を検出する感度を増加させることを示し、これらの結果を以前の検査と比較する。処理された試料及び非処理試料中でのレベルを測定するために、実施例１の一般的な検出方法を使用した。免疫複合体を解離させるための処理方法は、表６に見出され、本実施例における全ての検査に対して使用された。免疫複合体の解離を用いるアッセイにおいて使用された試料容量は２５０μＬであった。免疫解離検査結果の分析において、ＨＢｓＡｇを含有する処理された（追放された）試料及び非処理（追放なし）試料から測定されたシグナルのレベルを互いに比較し、それらのそれぞれのＣＯ値とも比較した。
【００９０】
試料容量２５０μＬ及び免疫複合体解離工程を用いるアッセイの分析感度値は、Ａｂｂｏｔｔ  ＨＢｓＡｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙパネルの要素を検査することによって測定した。これは、試料２５０μＬを使用することの影響及び低ｐＨ処理のアッセイ性能に対する影響に関する情報を獲得するために行われた。最終のＨＢｓＡｇアッセイの構成では、免疫複合体を解離するために全ての試料が処理されるので、分析感度を維持することは重要である。ａｄサブタイプに関しては、非処理試料フォーマットの分析感度は０．０４２ｎｇ／ｍＬであり、処理された試料は０．０１８ｎｇ／ｍＬの感度を有していた。従って、ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓ複合体を追放して、ＨＢｓＡｇレベルを測定することは、この実験における分析感度を損なわず、実際には、処理された試料中でのＨＢｓＡｇ検出の増加した感度が存在した。
【００９１】
試料番号４０１及び４０８は、ＨＢＶに関して陽性であることが知られていた。これらの試料は、ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡＧ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ２アッセイにおいて以前に検査された。ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡＧ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ２アッセイでは、実施例１の一般的な方法において試料１０００μＬを使用したが、但し、免疫複合体は追放しなかった。ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ２アッセイの分析感度は、サブタイプａｄ／ａｙに対して０．００８から０．００９ｎｇ／ｍＬである。
【００９２】
追放を用いた試料４０８中では、抗ＨＢｓ−ＨＢｓＡｇ免疫複合体は検出できなかったが（すなわち、処理：非処理の比は、１未満であった。）、試料容量を２５０μＬから１０００μＬにさらに増加させることによってのみ条件を変動させると、４．４０及び４．９０の非処理（追放されていない）の値（表７）から得られるＳ／ＣＯ値は７．９４ないし１０．８２の範囲に変化した。従って、免疫複合体を追放せずに試料容量を増加させることも、ＨＢｓＡｇを検出する感度を向上させる。
【００９３】
試料４０１は、ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  Ａｓｓａｙ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）の標準的な市販バージョンにおいてＨＢｓＡｇに関して陰性であった。しかしながら、免疫複合体の追放を行わない実施例１の一般的な方法（ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ２）において、試料１０００μＬを使用すると、ＨＢｓＡｇは試料４０１から検出可能であった。ＰＲＩＳＭ  ＨＢｓＡｇ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ２アッセイでは、試料４０１に対するＳ／ＣＯ範囲は０．８０から１．５４であり、この試料は、５回のうち３回検出された。従って、免疫複合体を追放せずに試料容量を増加させることは、ＨＢｓＡｇを検出する感度を向上させ、検査の反復も検出を向上させる。
【００９４】
免疫複合体を解離させるための試料４０１の処理は、Ｓ／ＣＯ値を増加させた。表７において、Ｓ／ＣＯ値及び処理：非処理Ｓ／ＣＯ値の比較は、追放なしの値と比較した追放後の上昇したシグナルを示している。従って、標的タンパク質を検出するときに、試料容量を増加させることと一緒に免疫複合体から標的タンパク質を追放することも、標的タンパク質の検出を増加させる。
【００９５】
【表６】
2011520124.tif 000007
【００９６】
【表７】
2011520124.tif 000008
【実施例３】
【００９７】
ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＡ抗体複合体を追放した際に、Ｂ型肝炎表面抗原を検出することは、磁気微粒子アッセイにおける免疫複合体を有する試料の検出を改善する
この実施例は、標的／抗体免疫複合体を破壊した際に標的タンパク質を検出することが、磁気微粒子及びＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（ＫＦ）装置を使用するアッセイフォーマットにおいて、免疫複合体を含有する試料中での標的の検出を向上させることを示す。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒは、９６ウェルプレートのウェルからウェルへ磁気微粒子を移動させるマイクロタイタープレート試料プロセッサである。使い捨てのカバー又はチップコームで覆われた１２の磁石が存在する。コームから磁石を吸引することによって微粒子をウェル中に放出させることができ、コーム中に磁石を挿入することによって微粒子を取り出すことができる。ＫＦ装置上で試料を処理する前に、試料と試薬がプレートに添加される。装置の系列を選択し、ＫＦ上でプレートを処理した。１つのマイクロタイタープレートで、合計１２の試料を検査することができた。列ＡからＨに、試料及び試薬を添加した。アッセイの最後の工程において、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＰｒｅｔｒｉｇｇｅｒ溶液を含有するウェルに、結合された試料及び連結物を有する微粒子を添加した。プレートをマイクロタイタープレートリーダーまで移動され、引き金を引き、シグナルを測定した。
【００９８】
抗ＨＢを含有する試料を正常なヒト血漿中に２５０ｐｇ／ｍＬになるように希釈されたＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄ）の溶液と合わせることによって、免疫複合体試料を調製した。この試料は、ＨＢｓＡｇ２５０ｐｇ／ｍＬと称した。２５０ｐｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ溶液中に抗ＨＢｓを５０倍希釈した。室温で少なくとも１時間、混合物を温置し、次いで、ＨＢｓＡｇアッセイで使用し、又は４℃で保存した。この試料は、免疫複合体を解離させるための低いｐＨでの処理と比べて、シグナルが増加するかどうかを測定するための免疫複合体対照（ＩＣ試料）としての役割を果たす。
【００９９】
低ｐＨで試料を処理した後、中和するための幾つかの条件が試みられ、これらは、表８に示されている。試料のｐＨを低下させるために、変動する濃度の１Ｍグリシン溶液を添加した。処理されていない試料に関しては、グリシン試薬の代わりに、ＰＢＳを添加した。ＰＢＳを含有する対照のための中和剤は１．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４であり、グリシン溶液で処理された試料ための中和剤は、２ＭＴｒｉｓ、ｐＨ１１．５であった。
【０１００】
表９に示されている試薬及び容量をマイクロタイタープレートに添加した。試料を最後に添加し、添加の直後に、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＤＩ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）上で、回転させながら、プレートを３７℃で１５分間温置した。処理された試料に関しては、０から６のｃｏｌｏｒｐＨａｓｔ片（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定すると、各試料の最終ｐＨは２から４の範囲であった（表１０）。１５分の終了時に、試料をＴｒｉｓで中和した。ｃｏｌｏｒｐＨａｓｔ片５から１０を用いて測定したところ、Ｔｒｉｓ添加後の試料のｐＨは、７から８のｐＨであった。
【０１０１】
【表８】
2011520124.tif 000009
【０１０２】
【表９】
2011520124.tif 000010
【０１０３】
【表１０】
2011520124.tif 000011
【０１０４】
免疫複合体の解離のための処理に続いて、中和された試料を有するマイクロタイタープレート及び試薬をＫＦ装置中に配置した。抗ＨＢｓモノクローナル抗体Ｈ１６６で被覆された微粒子を列Ｂから列Ａ、ウェル１から１２へ添加することによって、装置の系列が開始した。試料と微粒子を１８分間温置し、次いで、磁気微粒子を列Ａから列Ｃへ移動させた。洗浄工程後、列Ｄから列Ｄへ微粒子を移動させた。微粒子を連結物とともに８分間温置した後、列Ｅ、Ｆ及びＧ中で連続的な洗浄工程を行った。連結物は、２５０ｎｇ／ｍＬのアクリジニウム連結ヤギ抗ＨＢｓポリクローナル及び１００ｎｇ／ｍＬのアクリジニウム連結抗体ＨＢｓＨ３５を含んだ。。連結物洗浄緩衝液（ＣＷＢ）は、５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．３中に、０．５％ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＳｉｇｍａＤ８６３８）及び１Ｍ塩化ナトリウムを含んだ。洗浄後、列Ｇから列Ｈへ微粒子を移動させた。微粒子及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴＰｒｅｔｒｉｇｇｅｒを２分間温置し、微粒子をウェルＧへ移動させる。装置の系列の終了時に、指定されたウェル（この事例では、列Ｈ）内にＡＲＣＨＩＴＥＣＴＴｒｉｇｇｅｒ１５０μＬが注入されたマイクロタイタープレート読み取り装置に、マイクロタイタープレートを移動させ、３秒間読み取りを行った。
【０１０５】
表１１には、検査した全ての条件に関して、ＩＣ試料に対するシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が示されている。試料のｒｌｕを正常なヒト血漿（ＮＣ）ｒｌｕによって除することによって、Ｓ／Ｎ値を計算した。ＩＣ試料に対する最も高いＳ／Ｎ値は、条件Ｄを用いて得られた。処理：非処理値の比較は、追放なしの値と比較した、追放後の上昇したシグナルを示している。条件Ｄを使用すると、ＩＣ試料に対する処理：非処理の値は、ＨＢｓＡｇ２５０ｐｇ／ｍＬ試料を検査したときに得られた１．０と比べて５．５であり、ＨＢｓＡｇを検出する前に、抗ＨＢを用いて免疫複合体からＨＢｓＡｇを追放することはシグナルを向上させたことを示唆している。これは、ＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓを解離させるために含まれた工程を有するＨＢｓＡｇアッセイは、免疫複合体を有する試料の改善された検出をもたらすことを示す。
【０１０６】
【表１１】
2011520124.tif 000012
【実施例４】
【０１０７】
ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＡｇ抗体複合体を追放した際にＢ型肝炎表面抗原を検出することは、精度又はアッセイ感度を損なわず、磁気微粒子アッセイにおいて潜在的免疫複合体を有する試料の検出を改善する。
【０１０８】
本実施例は、標的／免疫複合体を破壊した際に標的タンパク質を検出することが標的を検出する感度を増加させることを示す。別段の記載がなければ、処理された及び非処理試料中のレベルを測定するために、実施例３の一般的な検出方法及び実施例３において使用された同じ試薬を使用した。免疫複合体を解離させるための処理方法は、表１２に見出され、本実施例における全ての検査に対して使用された。処理されていない試料に関しては、実施例３に論述されている方法に従った。アッセイにおいて使用された試料容量は、１２５から２５０μＬまで増加させた。試料容量を増加させることによって、ＨＢｓＡｇ２５０ｐｇ／ｍＬの試料を検査したときに増加したシグナルがもたらされた。
【０１０９】
【表１２】
2011520124.tif 000013
【０１１０】
【表１３】
2011520124.tif 000014
【０１１１】
処理プロトコールがＫＦＨＢｓＡｇアッセイの精度に対して影響を有するかどうかを測定するために、非処理条件と処理された条件の両方を用いて、４つの反復試料において、試料を検査した。免疫複合体の解離のための処理に続いて、中和された試料を有するマイクロタイタープレート及び試薬をＫＦ装置中に配置した。マイクロタイタープレートのウェル中への試薬の配置及び添加された容量は、表１３に見出される。装置の系列は、列Ｃから列Ａ，ウェル１から１２へ微粒子を添加することによって開始した。試料と微粒子を９分間温置し、次いで、磁気微粒子を列Ａから列Ｂへ移動させた。列Ｂ中の試料と微粒子を９分間温置し、次いで、磁気微粒子を列Ｄへ添加した。洗浄後、列Ｄから列Ｅへ微粒子を移動させた。微粒子を連結物と８分間温置した後、列Ｆ及びＧ中で連続的な洗浄工程を行った。洗浄後、列Ｇから列Ｈへ微粒子を移動させた。
【０１１２】
微粒子及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  Ｐｒｅｔｒｉｇｇｅｒを２分間温置し、微粒子をウェルＧへ移動させる。装置の系列の終了時に、列Ｈ中のウェル内にＡＲＣＨＩＴＥＣＴＴｒｉｇｇｅｒ１５０μＬが注入されたマイクロタイタープレート読み取り装置にマイクロタイタープレートを移動させ、３秒間読み取りを行った。
【０１１３】
この研究では、非処理及び処理試料の平均ｒｌｕ値に関連する標準偏差の比較は、処理がアッセイ精度の喪失をもたらさないことを示唆する（表１４）。さらに、陰性対照及びＨＢｓＡｇ２５０ｐｇ／ｍＬ試料に対する平均値は類似していた。これは、処理がシグナルに対して有害な影響を有していないことを示唆する。
【０１１４】
【表１４】
2011520124.tif 000015
【０１１５】
試料容量２５０μＬ及び免疫複合体解離工程を用いるアッセイの分析感度は、Ａｂｂｏｔｔ  ＨＢｓＡｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙパネルの要素を検査することによって測定した。これは、低ｐＨ処理を用いることのアッセイ性能に対する影響に関する情報を獲得するために行われた。微粒子の容量（７０μＬ対５０μＬ）を除き、上に示されている並びに表１２及び表１３に示されている一般的な検出方法に従った。
【０１１６】
処理された（すなわち、低ｐＨで）及び処理されていない（すなわち、ＰＢＳで）試料に対するカットオフ（ＣＯ）値を計算するために、陰性試料から測定された検出可能なシグナルを使用した。ＣＯ値は、陰性試料の平均＋１０標準偏差であった。非処理試料に関しては、ＣＯ値は４５０（平均＝１７４、標準偏差＝２７．６）であり、処理された試料に関しては、ＣＯ値は３３０（平均＝１７０、標準偏差＝１６．０）であった。
【０１１７】
ａｄサブタイプに関しては、非処理試料フォーマットの分析感度は０．０４４ｎｇ／ｍＬであり、処理された試料の分析感度は０．０１３ｎｇ／ｍＬであった。この実験では、処理された試料に対して計算されたＣＯは、処理されていない試料より低く、これは、処理された試料を検査する場合に、改善された感度に寄与した。計算された感度に基づき、低ｐＨのグリシンでの処理は、ＨＢｓＡＧＫＦアッセイの感度を損なわないように見受けられる。
【０１１８】
シグナル又はｒｌｕ値は、非処理条件と処理された条件間で極めて似通っていた（図１）。従って、ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢ複合体を追放した際に、ＨＢｓＡｇレベルを測定することは、分析感度を損なわなかった。改善された感度及び免疫複合体を有する試料を検出する能力を有するＨＢｓＡＧアッセイは、ＨＢｓＡｇアッセイの改善された性能及びＨＢＶ潜在型試料の増加した検出をもたらすはずである。
【図１】
2011520124.tif 000016
【配列表】
2011520124000001.app
【国際調査報告】
2011520124.tif 000017
2011520124.tif 000018
2011520124.tif 000019