(57)【要約】  本発明は、癌を有する個体においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、該方法は、ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ２とを含む染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中のＤＮＡの異常、又はＴＯＰ２ＡとＥｒｂＢ２タンパク質発現の異常の測定と組合せて、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常／ＴＩＭＰ−１タンパク質異常を測定する工程を含む。さらに、該トポイソメラーゼIIαインヒビター療法を使用して、癌を治療する方法が提供される。本発明はまた、癌を有する個体においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法の応用のためのキットを含む。
2011520456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する個体においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、
ａ．該個体から得られた試料で、該試料に含まれる腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１タンパク質の欠如、又は該試料の腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の存在を測定する工程、
ｂ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡの異常の存在、又は該アンプリコンに含まれる遺伝子の異常タンパク質発現を測定する工程、
ｃ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は該アンプリコン中に含まれる遺伝子のタンパク質発現が、該腫瘍細胞中で異常な場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合、及び／又は該腫瘍細胞が、ＴＩＭＰ−１遺伝子の対立遺伝子の１つ若しくは両方に該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在しないか、又は該アンプリコンに含まれる任意の遺伝子にコードされるどのタンパク質も、腫瘍細胞中で異常に発現されていない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合、及び／又はＴＩＭＰ−１対立遺伝子のいずれも該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含まない場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡの異常が、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常であり、該アンプリコンに含まれる遺伝子のタンパク質発現が、トポイソメラーゼIIα発現であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡの異常が、ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常であり、該アンプリコンに含まれる遺伝子のタンパク質発現が、ＥｒｂＢ２発現であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、
ａ．該個体から得られる試料で、該試料中に含まれる腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在しないことを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる方法。
【請求項５】
ＤＮＡ異常又はタンパク質発現のレベルを測定するために、集団から得られる標準を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該標準は腫瘍組織間質細胞中に存在する正常な二倍体遺伝子バックグランドであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常は、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ増幅、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ欠失、ＴＯＰ２Ａ遺伝子点突然変異、及びＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ転座、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
トポイソメラーゼIIαタンパク質は、標準試料に対して２倍より多く過剰発現され、例えば標準試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く過剰発現されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ＴＯＰ２Ａ遺伝子は、標準試料に対して２倍より多く増幅され、例えば標準試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常又は腫瘍細胞中のトポイソメラーゼIIαタンパク質の増加は、該試料の腫瘍細胞中の異常なＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡレベルと相関することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＥＲ２遺伝子異常は、ＨＥＲ２ 遺伝子増幅、ＨＥＲ２ ＤＮＡ欠失、ＨＥＲ２遺伝子点突然変異、及びＨＥＲ２ ＤＮＡ転座、ＨＥＲ２ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ＥｒＢ２タンパク質は、対照試料に対して２倍より多く過剰発現され、例えば対照試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く過剰発現されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＥＲ２遺伝子は、対照試料に対して２倍より多く増幅され、例えば対照試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＩＭＰ−１遺伝子は、対照試料に対して２倍より多く増幅され、例えば対照試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常、又は腫瘍細胞中のＥｒｂＢ２タンパク質の増加は、該試料の腫瘍細胞中の異常なＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルと相関することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、腫瘍細胞は、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の１つの欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の両方の欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の１つの部分的欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の両方の部分的欠失、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ点突然変異、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ反転、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ転座、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せからなるリストから選択される、少なくとも１つのＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞はＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如していることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ＤＮＡ遺伝子異常のレベルは、特に限定されないが、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、示差的表示、ＤＮＡドットブロッティング、サザンブロッティング、又はこれらの組合せのようなＤＮＡ測定手段により測定されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
インサイチューハイブリダイゼーションは、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）手段により測定されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ＦＩＳＨは、ＴＯＰ２Ａ遺伝子領域の一部、又はＨＥＲ２遺伝子領域、又はＴＩＭＰ−１遺伝子領域の一部を標的とする標識ＤＮＡプローブを含むプローブ混合物、及びそれぞれ染色体１７及びＸ染色体の動原体領域を標的とするフルオレセイン標識プローブを含むプローブ混合物とを使用することを特徴とする方法。
【請求項２１】
ＤＮＡ異常は、試料に含まれる内部標準配列に対する平均比として測定されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
内部標準配列は染色体Ｘ αサテライト（ＣｅｎＸ）であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍細胞は、ＴＩＭＰ−１／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＴＩＭＰ−１遺伝子欠失を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍細胞は、ＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＴＯＰ２Ａ遺伝子欠失を含み、又はＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比が２．０より大きい場合、増幅を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍細胞は、ＨＥＲ２／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＨＥＲ２遺伝子欠失を含み、又はＨＥＲ２／ＣｅｎＸの平均比が２．０より大きい場合、増幅を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子発現のレベルは、特に限定されないがノーザンブロッティング、ＲＮＡドット、及び定量的ＰＣＲ法のようなｍＲＮＡ測定により測定されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
異常タンパク質発現は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学試験、免疫細胞学試験、ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡのようなタンパク質レベル測定手段により測定されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ異常又はタンパク質異常の測定は、個体からの保存物質、例えば腫瘍組織を含むパラフィンブロックについて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
癌は、乳癌、肉腫、卵巣癌、及び非小細胞肺癌よりなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
試料は、腫瘍組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、便試料、唾液試料、及び胸腔及び腹腔からの漿液の試料、及びこれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、アポトーシス又は有糸分裂破局のインデューサーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、術前補助療法、補助治療法、及び転移疾患の治療よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１と３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
トポイソメラーゼIIαインヒビターはアントラサイクリンであることを特徴とする、請求項１及び３１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
アントラサイクリンは、特に限定されないが、４−エピルブリシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、又はこれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
トポイソメラーゼIIαインヒビターは、シクロホスファミド、タキサン類、及び／又は５−フルオロウラシルをさらに含む組成物中に含まれることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
シクロホスファミド、タキサン類、及び／又は５−フルオロウラシルの少なくとも１つは、プロドラッグの形であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は４−エピルブリシンであることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対して応答する可能性は、危険率により測定されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
個体の癌を治療する方法であって、
ａ．前記請求項のいずれかのトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測し、
ｂ．該個体が応答する可能性の高いトポイソメラーゼIIαインヒビター療法を選択し、そして
ｃ．該個体を該トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に付す、
ことを含んでなる方法。
【請求項４０】
トポイソメラーゼIIαインヒビターは、特に限定されないが、４−エピルブリシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、又はこれらの組合せよりなる群から選択されるアントラサイクリン類であることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
トポイソメラーゼIIαインヒビターは、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、及び／又はタキサンをさらに含む組成物中に含まれることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測するためのキットであって、
ａ．生物学的試料中の、ＴＯＰ２Ａ又はＨＥＲ２ ＤＮＡ異常のようなＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡ異常の測定に適した試薬と、
ｂ．生物学的試料中の、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の測定又はＴＩＭＰ−１タンパク質レベルの測定に適した試薬とを、
含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌療法の分野に関する。特に本発明は、様々な種類の抗癌療法に対する応答を予測するための方法に関する。特に本発明は、癌に罹っている個体の治療法の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタロプロテアーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰ−１）
メタロプロテアーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰ−１）は、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）の４つの内因性インヒビターの群の１つであり、その遺伝子はＸ染色体上に存在する。ＴＩＭＰ−１は、ほとんどのＭＭＰに１：１の化学量論比で結合する２５kDaのタンパク質である。ＴＩＭＰ−１は種々の組織や体液中に存在し、血小板のα顆粒中に貯蔵され、活性化により放出される。ＴＩＭＰ−１の主要な機能はＭＭＰ阻害と考えられているが、ＴＩＭＰ−１のいくつかの代替機能（例えばアポトーシスの阻害と細胞増殖や血管形成の制御）が記載されている。さらにいくつかの研究は、ＴＩＭＰ−１が悪性表現型に至る早期プロセスでも役割を果たしていることを示唆している。
【０００３】
本発明者らは、血漿ＴＩＭＰ−１の測定が、早期結腸直腸癌の検出において高い特異性と高い感度を与えることを記載した。さらに本発明者は、術前又は術後試料中の血漿ＴＩＭＰ−１レベルの測定が、早期結腸直腸癌患者において、強くかつステージ非依存性の予後情報を与えることを証明した。原発性乳癌組織中のＴＩＭＰ−１タンパク質を測定することにより、本発明者らは、腫瘍組織の総ＴＩＭＰ−１の高レベルが、患者生存期間の短さに関連していることを証明した。
【０００４】
アポトーシスの制御におけるＴＩＭＰ−１の役割が報告されており、このうち可能性のある２つの方法が示唆されている。これらの両方とも、ＴＩＭＰ−１がアポトーシスを阻害するという考えを支持している。
【０００５】
第１に、細胞外マトリックスのタンパク質分解は、インビトロとインビボの両方で乳房上皮細胞中の分化の喪失とアポトーシスとを引き起こす。これは、細胞外マトリックスの完全性と細胞−マトリックス相互作用の防御とが、乳房上皮の生存を確実にするのに決定的に重要な要因であることを示す。ＭＭＰの阻害を通して、ＴＩＭＰ−１は細胞外マトリックスの分解を阻害することができ、こうしておそらくアポトーシスを阻害する。乳腺中にＭＭＰ−３を過剰発現したマウスとＴＩＭＰ−１トランスジェニックマウスとを交配することにより、Alexanderと共同研究者は、ＭＭＰ−３に誘導される乳房上皮のアポトーシスがＴＩＭＰ−１により低下することを観察して、ＴＩＭＰ−１のそのようなアポトーシス阻害作用を証明した。単なる基底膜の分解が、タンパク質分解活性で誘導されるアポトーシスの原因である可能性もあるが、インテグリン介在シグナル伝達が一翼を担っていることも推測されている。
【０００６】
第２に、ＭＭＰ阻害とは独立に起きるＴＩＭＰ−１のアポトーシス阻害作用も証明されている。ヒトの乳房上皮細胞では、細胞接着の排除により誘導されるアポトーシスを阻害する内因性ＴＩＭＰ−１の能力が証明されている。これはＴＩＭＰ−１が、細胞外マトリックスや細胞−マトリックス相互作用を安定化することなく、アポトーシスから細胞をレスキューできることを示している。アポトーシスの阻害におけるＭＭＰ阻害の独立性は、低下しアルキル化されたＴＩＭＰ−１（これは、すべてのＭＭＰ阻害作用を喪失している）が、バーキットリンパ腫細胞株のアポトーシスをまだ有効に阻害するという事実により支持される。このアポトーシス阻害作用の機序は現在不明であるが、おそらくＴＩＭＰ−１により制御されるシグナル伝達経路に関して、異なる考えが提案されている。ヒト乳房上皮細胞中のＴＩＭＰ−１の過剰発現は、接着斑（focal adhesion）キナーゼ（通常は細胞生存のシグナル伝達に関与しているキナーゼ）のより効率的な活性化と構成性活性に関連している。またバーキットリンパ腫におけるＴＩＭＰ−１タンパク質発現のアップレギュレーションは、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸLの発現を上昇させた。バーキットリンパ腫細胞中のＴＩＭＰ−１の抗アポトーシス作用が、分泌されたＴＩＭＰ−１のモノクローナル抗体による中和により排除されるため、細胞シグナル伝達の調節が、ＴＩＭＰ−１と細胞表面受容体との相互作用を介して仲介されることが推測された。この見解は、乳房上皮細胞の表面に局在化するＣＤ６３へのＴＩＭＰ−１の結合を証明する研究により、さらに支持されている。
【０００７】
従ってＴＩＭＰ−１は、２つの異なる機序によりアポトーシスを阻害することができるようである。ＭＭＰを阻害することにより、ＴＩＭＰ−１は細胞外マトリックスと細胞−マトリックス相互作用とを安定化し、こうして細胞外マトリックスの分解により誘導されるアポトーシスを阻害する。しかしＴＩＭＰ−１はまた、細胞外マトリックスのタンパク質分解を阻害する能力には依存しない機序を介してアポトーシスを阻害する。この後者の機序は、アポトーシスに関与する細胞内シグナル伝達経路を制御する、細胞表面上の受容体とのＴＩＭＰ−１の相互作用により仲介される可能性がある。
【０００８】
本発明者らによる２つの臨床研究は、ＴＩＭＰ−１タンパク質測定の予測的価値を示唆している（Schrohl et al., 2006 and Sorensen et al. 2007）。Schrohl et al.による研究では、ＴＩＭＰ−１タンパク質はＥＬＩＳＡを使用して乳癌抽出物中で測定された。著者らは、ＴＩＭＰ−１タンパク質の高レベルが、転移性乳癌患者における化学療法に対する応答の欠如に関連していることを記載する。Sorensen et al.による研究では、著者らは、ＥＬＩＳＡにより測定される血漿ＴＩＭＰ−１タンパク質レベルの予測的価値を記載している。この試験の結果は、転移性結腸直腸癌を有し高レベルの血漿ＴＩＭＰ−１を有する患者が、血漿中のＴＩＭＰ−１タンパク質レベルが低い患者と比較して、イノテカンに基づく化学療法後に、客観的応答率が低下し生存率が低下していることを示す。これらの２つの研究は、ＴＩＭＰ−１遺伝子を欠乏させた癌細胞での化学療法に対する感受性の上昇を示す本発明者が作成した前臨床データと一致する（Davidsen et al., 2006）。
【０００９】
トポイソメラーゼIIα
ＴＯＰ２Ａ遺伝子は、染色体１７ｑ２１上でＨＥＲ２と同じアンプリコン中に存在し、ここでトポイソメラーゼIIα酵素をコードする。この酵素は、ＤＮＡトポロジーの制御に関与し、転写、複製、及び組換えプロセス中の遺伝物質の完全性に重要である。これらのプロセス中、トポイソメラーゼIIαは２本鎖ＤＮＡの切断と再結合を触媒する。トポイソメラーゼIIαの発現は細胞サイクル依存性であり、静止細胞株中より指数増殖している細胞中で顕著に高レベルである。酵素量は細胞増殖に相関することが、証明されている。癌遺伝子活性化の主要な遺伝機構は遺伝子の増幅を介し、これはタンパク質の過剰発現を引き起こし、腫瘍に選択的増殖の利益を与える。ＴＯＰ２Ａ遺伝子の増幅は、乳癌患者の７〜１４％で報告され、欠失が同様の頻度で報告されている。比較すると、ＨＥＲ２癌遺伝子は、乳癌患者の２０〜３０％で増幅されている（Harris et al. 2002）。
【００１０】
トポイソメラーゼIIαはアントラサイクリン類の薬理学的標的であり、いくつかの研究は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子の異常（特に増幅）が、原発性乳癌患者でアントラサイクリンに基づく化学療法への応答に対して予測的であることを証明している（Park et al. 2003, Press et al. 2005, Tanner et al. 2005, Knoop et al. 2005）。ＴＯＰ２Ａ欠失を有する患者についてはほとんどデータが無いが、この患者群で良好な治療結果も観察されている。しかしＴＯＰ２Ａ増幅又は欠失について分析しても、乳癌患者集団の約２０％しかアントラサイクリン感受性であると同定できない。この数値は、補助アントラサイクリン類が有効であるとされる約５０％の高リスク乳癌患者を考慮して見るべきである。
【００１１】
ある試験で、ＴＯＰ２Ａ増幅とトポイソメラーゼIIαタンパク質との有意な相関が見られた。ＴＯＰ２Ａの増幅を有する症例の９３％で、トポイソメラーゼIIαタンパク質の過剰発現が存在した。しかし反対に、過剰発現を有する症例のわずかに２０％のみが増幅を有した。他の研究は、同様の相関を証明していない（Petit et al. 2004, Mueller et al. 2004, Durbecq et al. 2004）。
【００１２】
Jorgensenらは、ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ−２遺伝子異常の予測的価値を含む乳癌の治療法選択について、薬理診断的可能性の総説を開示している。この総説は、いくつかの臨床研究が、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常（特に増幅）のある腫瘍を有する患者は、正常なＴＯＰ２Ａ遺伝子状態を有する患者より、アントラサイクリンに基づく化学療法から顕著に良好な作用を受けることを証明したと記載している。ＷＯ２００７／１１２７４６は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を使用して、高リスク乳癌患者について予後的評価を行う方法を開示する。予後的評価を行う方法は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子の異常状態を測定し、測定された状態に対応するあらかじめ決められた危険率又はあらかじめ決められたKaplan-Meierプロットに基づいて、後に患者の再発の無い生存又は全生存率の確率を推定することを含んでなる。予後という用語は、未治療患者の疾患の運命を包含し、従って予後的評価は、予測的評価とは同じではなく、後者は、特定の治療から利益を受ける患者の可能性を包含することは公知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
すなわち上記より、当該分野には、アントラサイクリン治療から利益を受ける追加の患者を同定できる追加の予測マーカーに対するニーズがある。
【００１４】
すなわち本発明の目的は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法（例えば、アントラサイクリンを含むトポイソメラーゼIIαインヒビター療法）による治療のための、患者選択の改善に関する。
【００１５】
特に本発明の目的は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法から利益を受ける可能性が高い乳癌患者の適切な比率を同定することを含む、先行技術の上記問題を解決する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち本発明のある態様は、癌を有する個体においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、
【００１７】
ａ．該個体から得られた試料で、該試料に含まれる腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１タンパク質の欠如、又は該試料の腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の存在を測定する工程、
ｂ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡの異常の存在、又は該アンプリコンに含まれる遺伝子の異常タンパク質発現を測定する工程、
ｃ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は該アンプリコン中に含まれる遺伝子のタンパク質発現が、該腫瘍細胞中で異常な場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合、及び／又は該腫瘍細胞が、ＴＩＭＰ−１遺伝子の対立遺伝子の１つ若しくは両方に該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在しないか、又は該アンプリコンに含まれる任意の遺伝子にコードされるどのタンパク質も、腫瘍細胞中で異常に発現されていない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合、及び／又はＴＩＭＰ−１対立遺伝子のいずれも該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含まない場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００１８】
第２の態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、
【００１９】
ａ．該個体から得られる試料で、該試料中に含まれる腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在しないことを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００２０】
ある実施態様において癌は、乳癌、肉腫、卵巣癌、及び肺癌よりなる群から選択される。好適な実施態様において、癌は乳癌である。
【００２１】
本発明の別の態様は、ある個体の癌を治療する方法であって、
ａ．上記請求項のいずれかに従って、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測し、
ｂ．該個体が応答する可能性の高いトポイソメラーゼIIαインヒビター療法を選択し、
ｃ．該個体を該トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に付す、
ことを含んでなる方法に関する。
【００２２】
ある実施態様において、該治療法で使用されるトポイソメラーゼIIαインヒビターは、アントラサイクリン類（例えば４−エピルブリシン）であり、これは、さらなる実施態様において、シクロホスファミド及び５−フルオロウラシル又はタキサンと組合せて使用される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測するためのキットであって、
ａ．生物学的試料中の、ＴＯＰ２Ａ又はＨＥＲ２ ＤＮＡ異常のようなＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡ異常の測定に適した試薬と、
ｂ．生物学的試料中の、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の測定又はＴＩＭＰ−１タンパク質レベルの測定に適した試薬とを、
含んでなるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】補助ＣＥＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、癌細胞中で＋又は−免疫反応性としてスコア化された腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘ軸の下に示される。
【図１Ｂ】補助ＣＭＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、癌細胞中で＋又は−免疫反応性としてスコア化された腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘジクロロの下に示される。
【図１Ｃ】ＣＥＦ又はＣＭＦで治療された癌細胞中にＴＩＭＰ−１免疫反応性の無い患者の無病生存率を示すカプランマイヤー曲線を示す。
【００２５】
【図２Ａ】補助ＣＥＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、腫瘍細胞ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の有無に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘ軸の下に示される。
【図２Ｂ】補助ＣＭＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、腫瘍細胞ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の有無に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘ軸の下に示される。
【図２Ｃ】ＣＥＦ又はＣＭＦで治療された癌細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者の無病生存率を示すカプランマイヤー曲線を示す。
【００２６】
【図３Ａ】補助ＣＥＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、癌細胞中で＋又は−免疫反応性としてスコア化された腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性と、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の有り（Ａｂ）又は無し（正常）に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘ軸の下に示される。
【図３Ｂ】補助ＣＭＦを受けている患者の無病生存率を示すカプランマイヤープロットを示す。患者は、癌細胞中で＋又は−免疫反応性としてスコア化された腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性と、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の有り（Ａｂ）又は無し（正常）に従って層別された。選択された時点でリスクのある患者の数が、ｘ軸の下に示される。
【図３Ｃ】ＣＥＦ又はＣＭＦで治療された癌細胞中に、ＴＩＭＰ−１免疫反応性が無いか及び／又はＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者の無病生存率を示すカプランマイヤー曲線を示す。
【００２７】
【図４Ａ】ＣＭＦ又はＣＥＦによる治療とＨＴ（ＨＥＲ２とＴＩＭＰ−１）状態（パネル４Ａ）、及び２Ｔ（ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１）状態（パネル４Ｂ）の無侵襲性疾患生存率のカプランマイヤー曲線。
【図４Ｂ】ＣＭＦ又はＣＥＦによる治療とＨＴ（ＨＥＲ２とＴＩＭＰ−１）状態（パネル４Ａ）、及び２Ｔ（ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１）状態（パネル４Ｂ）の無侵襲性疾患生存率のカプランマイヤー曲線。
【００２８】
【図５Ａ】ＨＥＲ２陽性腫瘍とＨＥＲ２陰性腫瘍、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常腫瘍とＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常ではない（正常）腫瘍、ＴＩＭＰ−１陽性腫瘍とＴＩＭＰ−１陰性腫瘍、ＨＴ応答性腫瘍と非応答性腫瘍、及び２Ｔ応答性と非応答性腫瘍との、無侵襲性疾患生存率（パネル５Ａ）と全生存率（パネル５Ｂ）比較についての、治療効果の危険率推定を示すフォレストプロット。
【図５Ｂ】ＨＥＲ２陽性腫瘍とＨＥＲ２陰性腫瘍、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常腫瘍とＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常ではない（正常）腫瘍、ＴＩＭＰ−１陽性腫瘍とＴＩＭＰ−１陰性腫瘍、ＨＴ応答性腫瘍と非応答性腫瘍、及び２Ｔ応答性と非応答性腫瘍との、無侵襲性疾患生存率（パネル５Ａ）と全生存率（パネル５Ｂ）比較についての、治療効果の危険率推定を示すフォレストプロット。
【００２９】
【図６】ＴＩＭＰ−１免疫組織化学試験の例を示す。６Ａ：高率の上皮癌細胞がＴＩＭＰ−１陽性である。６Ｂ：上皮癌細胞中の分散した免疫反応性と集中化した免疫反応性。６Ｃ：陰性対照。６Ｄ：繊維芽細胞中の免疫反応性、しかし上皮癌細胞ではない。
【００３０】
【図７Ａ】公知のＴＩＭＰ−１状態を有する乳癌患者の無侵襲性疾患生存率（ＩＤＦＳ）（図７Ａ）と全生存率（ＯＳ）（図７Ｂ）の確率。Ｔ＋とＴ−は、その乳癌細胞中に、それぞれＴＩＭＰ−１免疫反応性が有ること及び無いことを意味する。ＣＥＦとＣＭＦは、受けた補助化学療法を示す。
【図７Ｂ】公知のＴＩＭＰ−１状態を有する乳癌患者の無侵襲性疾患生存率（ＩＤＦＳ）（図７Ａ）と全生存率（ＯＳ）（図７Ｂ）の確率。Ｔ＋とＴ−は、その乳癌細胞中に、それぞれＴＩＭＰ−１免疫反応性が有ること及び無いことを意味する。ＣＥＦとＣＭＦは、受けた補助化学療法を示す。
【００３１】
【図８Ａ】患者のＴＩＭＰ−１亜集団とＥＲ亜集団における、ＣＭＦをベースラインとして有するＣＥＦの効果の、多変量モデルからの危険率を示すフォレストプロット。図８Ａ：ＩＤＦＳ；図８Ｂ：ＯＳ。
【図８Ｂ】患者のＴＩＭＰ−１亜集団とＥＲ亜集団における、ＣＭＦをベースラインとして有するＣＥＦの効果の、多変量モデルからの危険率を示すフォレストプロット。図８Ａ：ＩＤＦＳ；図８Ｂ：ＯＳ。
【００３２】
【図９】上皮乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ増幅を示すＴＩＭＰ−１ ＦＩＳＨ解析。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
乳癌細胞中のＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定は、化学療法剤処方を含む補助アントラサイクリンからの有効性を予測することができることは公知である（Knoop et al. JCO 2005）。しかし、腫瘍細胞中では原発性乳癌患者の約２０％のみしかＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を示さないため、この方法は、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性が高い、乳癌集団の２０％のみしか同定できない。この数値は、原発性乳癌患者の約５０％が、アントラサイクリン治療から利益を受けることがわかっていることを考慮して、見るべきである。
【００３４】
多くの他の可能性のある予測マーカー（例えばＨＥＲ２）がＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定と組合わされているが、同定された亜集団中の無病生存率又は全生存率に関して、これらの２つのバイオマーカーの間に付加的作用は見られない（Knoop et al., JCO 2005）。すなわち、現在ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定単独よりも、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常と組合せた時、アントラサイクリン治療から利益を受けると優れた予測を示すバイオマーカー（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質）は存在しない。これは、ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ ＤＮＡ測定を組合せることが、この２つのマーカーのそれぞれにより得られる価値以上に予測価値を改善することは無いことを示す、O'Malley et al. 2009により支持される。
【００３５】
転移性乳癌患者から得られる原発性腫瘍中のＴＩＭＰ−１タンパク質の高腫瘍抽出タンパク質レベルが、化学療法（アントラサイクリンを含まない場合と、アントラサイクリンを含む薬剤組合せ）に対する客観的応答を得る可能性の低下と関連することが、すでに報告されている。この可能性は、ＴＩＭＰ−１の発現が上昇すると低下する。ＴＩＭＰ−１タンパク質はＥＬＩＳＡにより測定された（Schrohl et al., Clin. Cancer Res. 2006）。
【００３６】
Sorensen et al. Clin Cancer Res 2007は、転移性結腸直腸癌を有する患者に対する化学療法の効果に関する。この研究では、ＴＩＭＰ−１はＣＥＡと組合わされ、ＣＥＡの組合せが付加的効果を与えないことを示している。
【００３７】
本発明者らは、乳癌細胞におけるＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如が、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性に関連するが、アントラサイクリンを含まない化学療法には関連しないことを、初めて開示する。６４９人の高リスク乳癌患者を含む後向き研究において本発明者らは、その腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如しており、アントラサイクリンを含まない化学療法処方（ＣＭＦ）で補助治療を受けている患者、又はその腫瘍細胞がＴＩＭＰ−１免疫反応性を示し、アントラサイクリン含有若しくはアントラサイクリンを含まない化学療法で補助治療を受けている患者と比較して、その腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如している患者が、補助アントラサイクリン治療が最も有益である患者であることを示す。
【００３８】
すなわち、本発明は、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性の高い高リスク乳癌患者の同定を可能にする：乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如は、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性の高い患者の約２０％を同定する。実際には、ＴＩＭＰ−１免疫組織化学試験により、治療から利益を受ける可能性の高い、補助治療を計画されている患者の約２０％を同定することができる。一方、ＴＩＭＰ−１免疫組織化学試験はまた、はるかに毒性の低いＣＭＦによる治療でも同様に有効と考えられる、補助アントラサイクリンを含む治療を計画されている患者の約８０％の同定を可能にする。あるいはこれらの８０％の患者は、乳癌の補助治療で使用されるアントラサイクリン類以外の任意の他の活性薬剤（例えば、タキサン類、メソトレキセート、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、及びゲムシタビン（実施例１））により、治療できるであろう。
【００３９】
本発明者らは、同じ腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１乳癌細胞の免疫反応性測定とＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定の組合せが付加的予測値を与えること、すなわち２つの試験のそれぞれが、補助アントラサイクリン含有化学療法から利益を受ける可能性の高い患者の約２０％を同定し、この２つの患者集団の間には４％の重複しかないため、組合せアッセイの作用は付加的であることを、初めて報告する。
【００４０】
すなわち本発明は、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性の高いほとんど２倍の乳癌患者の同定を可能にする：ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定は、補助アントラサイクリン治療から利益を受ける可能性の高い患者の約２０％を同定し、ＴＩＭＰ−１免疫反応性欠如の測定が約２０％を同定する。実際には、組合せアッセイにより、治療から利益を受ける可能性の高い、補助治療を計画している患者の約４０％を同定することができるであろう。一方、組合せアッセイはまた、はるかに毒性の低いＣＭＦによる治療でも同様に有効と考えられる補助アントラサイクリンを含む治療を計画されている患者の約６０％の同定を可能にする。あるいはこれらの６０％の患者は、乳癌の補助治療で使用されるアントラサイクリン類以外の任意の他の活性薬剤（例えば、タキサン類、メソトレキセート、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、及びゲムシタビン（実施例３））により、治療できるであろう。
【００４１】
本発明者らは最近、乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１遺伝子異常（欠失と増幅）を見つけた。
【００４２】
本出願は、シクロホスファミド、メソトレキセート、及び５−フルオロウラシル（ＣＭＦ）、又はシクロホスファミド、４−エピルブリシン、及び５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）を用いる補助治療を受けるように無作為化した６４１人の乳癌患者における、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常とＴＩＭＰ−１タンパク質腫瘍細胞含量の研究を開示する。終点は、無病生存（ＤＦＳ）であった。この患者群についてすでに報告されたように（Knoop et al.）、ＣＥＦが有効性（ＤＦＳの延長）について予測的であったが、ＣＭＦはそうではなかった。ＶＴ７抗ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体を用いるＴＩＭＰ−１免疫組織化学試験を行うことにより、本発明は、約８０％の患者が腫瘍細胞中でＴＩＭＰ−１免疫反応性を示すことを見いだした。腫瘍の残りの２０％は、ＴＩＭＰ−１腫瘍細胞の免疫反応性がなかった。統計的生存解析を行うと、腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如は、終点（ＤＦＳ：患者のより長いＤＦＳ）と強く関連していた。これに対して、ＣＭＦを投与されている患者では、ＴＩＭＰ−１免疫反応性に関連してＤＦＳの差は観察されなかった。
【００４３】
ＴＯＰ２Ａ分析とＴＩＭＰ−１分析の結果を組合せると、ＣＥＦへの応答を予測するのにこれらの２つのバイオマーカーは付加的であったが、ＣＭＦ治療患者ではこれらの２つのバイオマーカーの組合せの効果は観察されなかった。付加的作用は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を有する患者とその腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如している患者との間にほとんど重複がなかった（４％の重複）という事実に基づく。２つの群はほとんど同じ大きさであり、これらの２つのバイオマーカーの組合せは、それぞれのバイオマーカーの予測的価値の力を失うことなく、ＣＥＦレスポンダーとして予測できる患者の数を２倍にした。
【００４４】
これは、ＴＯＰ２Ａ検査とＴＩＭＰ−１検査の組合せ使用により、補助アントラサイクリン治療が最も有益である患者を同定できることを意味する。一方、組合せ試験はまた、アントラサイクリンを含まない化学療法処方を受けることにより同様に有効と考えられるか、又はおそらく別の薬剤組合せ（例えば、タキサン類を含む組合せ）を受けることによってさらに有効と考えられる約６０％の患者を同定するのに使用することもできる。本発明は、ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ２を組合せた時の付加的作用の欠如（Knoop et al. 2005）、及び結腸直腸癌の薬剤予測でＴＩＭＰとＣＥＡを組合せた時の付加的作用の欠如（Sorensen et al. 2007）を考慮して見るすべきである。
【００４５】
当該分野で現在利用可能な方法以外に、乳癌患者について治療有効性の予測を行うための利用可能な方法を拡張するために、そのような予測を行うための新規方法が本明細書で開示され、ここで予測は、腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１タンパク質又はＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定とともに、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常又はＴＯＰ２Ａタンパク質の測定された状態［ここで「状態」は、異常の有無を意味し、異常が存在するなら、異常の種類（増幅又は欠失）を意味する］に基づく。本発明の実施態様は、患者から採った乳癌組織試料中のＴＩＭＰ−１遺伝子又はタンパク質の状態とともに、ＴＯＰ２Ａ遺伝子の異常の状態を測定する工程を含んでよく、そのような試験の結果に基づいて、アントラサイクリンを含まない化学療法と比較して、アントラサイクリンを含む化学療法から利益を受ける可能性を、個々の患者について推定することができる。
【００４６】
例えば、癌細胞中にＴＯＰ２Ａ異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如している患者は、アントラサイクリンを含む化学療法を受けるべきであり、残りの患者は、アントラサイクリンを投与されてもアントラサイクリン以外を投与されても同様に有効であろう。アントラサイクリンの重い毒性を考えると、患者にはアントラサイクリンを含まない化学療法処方を提供することが正しいであろう。
【００４７】
すなわち本発明の方法は、乳癌患者中のＴＩＭＰ−１腫瘍細胞の反応性の分析を加えることにより、乳癌患者のＴＯＰ２Ａ測定の予測価値をほとんど２倍にすることができるという驚くべき発見に依存する。
【００４８】
本発明は、癌患者の抗癌療法の有効性を予測する方法に基づき、ここで該抗癌療法の効率は、癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如と組合せた腫瘍細胞中の腫瘍組織ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常に依存し、この方法は、患者の腫瘍組織の細胞がＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を有するか、又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如しているかを測定し、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常又はＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如が観察される場合は、患者は特定の抗癌療法から利益を受ける可能性が非常に高いと確定することを含んでなる。
【００４９】
本出願において、抗癌療法は好ましくはトポイソメラーゼIIインヒビター療法を意味する。
【００５０】
本発明の予測法は好ましくは、患者の腫瘍組織の細胞がＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如しているかの測定が、腫瘍組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、便試料、唾液試料、及び胸腔及び腹腔からの漿液の試料よりなる群から選択される試料を測定することにより行われることを含む。この測定法は、ＤＮＡレベル測定、ｍＲＮＡレベル測定（例えば、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ＱＲＴ−ＰＣＲ、及び示差的表示）、及びタンパク質レベル測定（例えば、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学試験、免疫細胞学試験、ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡ）により、便利に行われる。
【００５１】
個々の患者のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する耐性／感受性を決定できるように、ＴＩＭＰ−１タンパク質の閾値レベルを確立するために、後向き／前向き臨床治験を行うことができる。
【００５２】
後向き研究では、癌の再発を経験した患者で特定の抗癌療法にどのように応答したかわかっている患者から、保存された腫瘍組織、血液、尿、唾液、又は任意の他の体液が得られる。腫瘍組織抽出物の場合は、組織はホモジナイズされ、個々の患者試料についてＴＩＭＰ−１タンパク質レベルが測定される。体液の場合、試料は希釈され、次に本明細書に記載のいずれかの方法により、ＴＩＭＰ−１タンパク質の濃度が測定される。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織の場合は、原発性腫瘍又は転移病変から得られる組織について、従来の免疫組織化学試験を行うことができる。
【００５３】
従って本発明のある態様は、癌を有する個体においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、
【００５４】
ａ．該個体から得られた試料で、該試料に含まれる腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１タンパク質の欠如、又は該試料の腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の存在を測定する工程、
ｂ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡの異常の存在、又は該アンプリコンに含まれる遺伝子の異常タンパク質発現を測定する工程、
ｃ．染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は該アンプリコン中に含まれる遺伝子のタンパク質発現が、該腫瘍細胞中で異常な場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合、及び／又は該腫瘍細胞が、ＴＩＭＰ−１遺伝子の対立遺伝子の１つ若しくは両方に該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に染色体ＤＮＡ異常が存在しないか、又は該アンプリコンに含まれる任意の遺伝子にコードされるどのタンパク質も、腫瘍細胞中で異常に発現されていない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合、及び／又はＴＩＭＰ−１対立遺伝子のいずれも該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含まない場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００５５】
上記の染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコンは、ＴＯＰ２Ａ遺伝子とＨＥＲ２遺伝子とを含む。
【００５６】
すなわち本発明のある実施態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡ異常がＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常であり、該アンプリコン中に含まれる遺伝子のタンパク質発現がトポイソメラーゼIIα発現であることを特徴とする方法に関する。
【００５７】
本発明の別の実施態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡ異常がＨＥＲ２ ＤＮＡ異常であり、該アンプリコン中に含まれる遺伝子のタンパク質発現がＥｒｂＢ２発現であることを特徴とする方法に関する。
【００５８】
好適な実施態様において該方法は、
ａ．該個体から得られる試料で、該試料中に含まれる腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在しないことを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる。
【００５９】
本発明のある実施態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、該方法は、
【００６０】
ａ．該個体から得られる試料で、該試料中に含まれる腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在しないことを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如している場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及び腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１タンパク質が存在する場合に、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる。
【００６１】
本発明のある実施態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、該方法は、
【００６２】
ａ．該個体から得られる試料で、該試料の腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又はＴＩＭＰ−１遺伝子の対立遺伝子の１つ若しくは両方に該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及びＴＩＭＰ−１対立遺伝子のいずれも該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含まない場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる。
【００６３】
本発明のある実施態様は、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、該方法は、
【００６４】
ａ．該個体から得られる試料で、該試料の腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｂ．該試料の腫瘍細胞中にＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在することを測定する工程、
ｃ．ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在する場合、及び／又は該腫瘍細胞が、ＴＩＭＰ−１遺伝子の対立遺伝子の１つ若しくは両方に該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が高いと分類する工程、そして
ｄ．ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常が存在しない場合、及びＴＩＭＰ−１対立遺伝子のいずれも該ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含まない場合は、個体がトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に応答する可能性が低いと分類する工程、
を含んでなる。
【００６５】
ＴＯＰ２Ａ遺伝子とＨＥＲ２遺伝子はいずれも、染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中に存在し、ＴＩＭＰ−１遺伝子は染色体Ｘ上に存在する。
【００６６】
本方法は、危険率を低下させることなく、ＣＥＦ治療のような抗癌療法から利益を受ける可能性が高い、従来法と比較してほとんど２倍の数の癌患者を同定する手段を提供する。
【００６７】
本発明のある実施態様において、バイオマーカー（ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、及びＴＩＭＰ−１）を含む試料は、腫瘍組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、便試料、唾液試料、及び胸腔及び腹腔からの漿液の試料よりなる群から選択される。
【００６８】
本発明のある実施態様は、乳癌、肉腫、卵巣癌、及び肺癌よりなる群から選択される癌を有する個体の、抗癌療法に対する応答を予測する方法に関する。
【００６９】
ある実施態様において、肉腫は軟組織肉腫である。
別の実施態様において、肺癌は非小細胞肺癌である。
【００７０】
ある好適な実施態様において本発明は、乳癌を有する個体の、抗癌療法に対する応答を予測する方法に関する。
【００７１】
ＤＮＡ異常を測定する方法
ＤＮＡ異常に関する異常は、特に限定されないが、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、示差的表示、ＤＮＡドットブロッティング、サザンブロッティング、又はこれらの組合せのようなＤＮＡ測定手段により測定される。
【００７２】
すなわちある実施態様において、ＤＮＡ遺伝子異常のレベルは、特に限定されないが、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、示差的表示、ＤＮＡドットブロッティング、サザンブロッティング、又はこれらの組合せのようなＤＮＡ測定手段により測定される。
【００７３】
好適な実施態様において、該インサイチューハイブリダイゼーションは、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）手段により測定される。
【００７４】
さらに好適な実施態様において、ＤＮＡ異常は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子領域の一部、及び／又はＨＥＲ２遺伝子領域、及び／又はＴＩＭＰ−１遺伝子領域の一部を標的とする標識ＤＮＡプローブを含むプローブ混合物と、それぞれ染色体１７及びＸ染色体の動原体領域を標的とするフルオレセイン標識プローブを含むプローブ混合物との、使用を含んでなるＦＩＳＨにより測定される。
【００７５】
タンパク質発現異常に関する異常は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学試験、ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡ手段により測定される。
【００７６】
すなわちある実施態様において、異常タンパク質発現は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学試験、免疫細胞学試験、ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡのようなタンパク質レベル測定手段により測定される。
【００７７】
ＤＮＡ異常及び／又は異常タンパク質発現はまた、問題の遺伝子のｍＲＮＡ転写体のようなＲＮＡレベル（例えば非機能的転写体を与える一次転写体の異常スプライシング）に反映される。
【００７８】
すなわちＲＮＡ異常を引き起こすＤＮＡ異常は、特に限定されないがノーザンブロッティング、ＲＮＡドット法、及び定量的ＰＣＲ法のようなｍＲＮＡ測定のような、ＲＮＡの手段により測定される。
【００７９】
すなわちある実施態様において、腫瘍細胞中のＤＮＡ異常又はタンパク質発現は、該試料の腫瘍細胞中の異常ｍＲＮＡレベルと相関する。
【００８０】
ＤＮＡ異常
ＤＮＡ異常は、染色体の特定の領域（例えばアンプリコン）を含む染色体内のＤＮＡ異常、及び遺伝子又は遺伝子領域内のＤＮＡ異常を意味する。ＤＮＡ異常は、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ欠失、遺伝子点突然変異、及び転座、ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せを含む。ＤＮＡ異常は、該ＤＮＡの下流の異常転写、又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現を引き起こすＤＮＡ異常を含む。欠失又は増幅の意味においてＤＮＡ異常は、全遺伝子又は該遺伝子の一部の欠失又は増幅を意味する。後成的異常は、問題の遺伝子のサイレンス化を引き起こし、該遺伝子によりコードされるタンパク質の欠如、又は少なくとも異常タンパク質発現に反映される。
【００８１】
すなわちある実施態様は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常の測定を含む、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法に関し、ここで該遺伝子異常は、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ増幅、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ欠失、ＴＯＰ２Ａ遺伝子点突然変異、及びＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ転座、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せよりなる群から選択される。
【００８２】
具体的な実施態様において、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常又は腫瘍細胞中のトポイソメラーゼIIαタンパク質の増加は、該試料の腫瘍細胞中の異常なＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡレベルと相関する。
【００８３】
さらなる実施態様は、ＨＥＲ２遺伝子異常の測定を含む、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法に関し、ここでＨＥＲ２遺伝子異常は、ＨＥＲ２遺伝子増幅、ＨＥＲ２ ＤＮＡ欠失、ＨＥＲ２遺伝子点突然変異、及びＨＥＲ２ ＤＮＡ転座、ＨＥＲ２ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せよりなる群から選択される。
【００８４】
具体的な実施態様において、ＨＥＲ２ ＤＮＡ異常又は腫瘍細胞中のＥｒｂＢ２タンパク質の増加は、該試料の腫瘍細胞中の異常なＨＥＲ２ ｍＲＮＡレベルと相関する。
【００８５】
さらなる実施態様は、ＴＩＭＰ−１遺伝子異常の測定を含む、癌を有する個体のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法に関し、ここで腫瘍細胞は、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の１つの欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の両方の欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の１つの部分的欠失、ＴＩＭＰ−１対立遺伝子の両方の部分的欠失、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ点突然変異、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ反転、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ転座、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡの後成的修飾（例えばＤＮＡメチル化）、及びこれらの組合せからなるリストから選択される、ＴＩＭＰ−１タンパク質発現の欠如を引き起こす少なくとも１個のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を含む。
【００８６】
好適な実施態様において、腫瘍細胞中のＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常又はＴＩＭＰ−１タンパク質の欠如は、該試料中のＴＩＭＰ−１ ｍＲＮＡの欠如のような、該試料の腫瘍細胞中の異常ＴＩＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルと相関する。
【００８７】
本文脈において用語「ＴＩＭＰ−１タンパク質の欠如」は、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の完全な欠如であると理解すべきである。しかし、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞中に弱いＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する患者は、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞中に強いＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する患者より、アントラサイクリン類がより有効であり、一方、弱いＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する患者は、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性が完全に欠如した患者より、アントラサイクリン治療が有効ではない。ＴＩＭＰ−１免疫反応性（陽性細胞の数及び／又は強度）の評価は、簡単な顕微鏡観察により評価できるが、デジタル化アナライザーにより客観的に評価することもできる。
【００８８】
細胞は、０、＋１、＋２、及び＋３として分類される。０はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如した癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞であり、＋１は弱いＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞であり、＋２は、ＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞であり、＋３は強いＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞であると理解すべきである。
【００８９】
ＴＩＭＰ−１免疫反応性を分類し区別する方法は、客観的に評価される本発明の実施態様である。評価は、ＴＩＭＰ−１免疫反応性細胞（癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞）、及び／又は免疫反応性の強さに基づく。ＴＩＭＰ−１免疫反応性（陽性細胞の数及び／又は強度）の評価は、簡単な顕微鏡観察により評価できるが、デジタル化アナライザーにより客観的に評価することもできる。
【００９０】
すなわち本発明の好適な実施態様において、免疫反応性が、＋１未満、例えば＋０．９未満、例えば＋０．８未満、例えば＋０．７未満、例えば＋０．６未満、例えば＋０．５未満、例えば＋０．４未満、例えば＋０．３未満、例えば＋０．２未満、例えば＋０．１未満である場合、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞はＴＩＭＰ−１が欠如している。
【００９１】
すなわち本発明の好適な実施態様において、免疫反応性が０である場合、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞はＴＩＭＰ−１が欠如している。
【００９２】
すなわち本発明の好適な実施態様において、ＴＩＭＰ−１免疫反応性のレベルが、＋２未満、例えば＋１．９未満、例えば＋１．８未満、例えば＋１．７未満、例えば＋１．６未満、例えば＋１．５未満、例えば＋１．４未満、例えば＋１．３未満、例えば＋１．２未満、＋１未満、例えば＋０．９未満、例えば＋０．８未満、例えば＋０．７未満、例えば＋０．６未満、例えば＋０．５未満、例えば＋０．４未満、例えば＋０．３未満、例えば＋０．２未満、例えば＋０．１未満である場合、患者は、アントラサイクリン類（例えばトポイソメラーゼIIα）から利益を受ける可能性がある。好ましくは、０〜＋２の範囲、例えば０．１〜＋１．５の範囲、例えば＋０．５〜＋１．２の範囲、例えば０〜＋０．５の範囲、例えば０〜＋１の範囲。
【００９３】
好適な実施態様において、ＴＩＭＰ−１免疫反応性のレベルが、＋１未満、例えば＋０．９未満、例えば＋０．８未満、例えば＋０．７未満、例えば＋０．６未満、例えば＋０．５未満、例えば＋０．４未満、例えば＋０．３未満、例えば＋０．２未満、例えば＋０．１未満である場合、患者は、アントラサイクリン類（例えばトポイソメラーゼIIα）から利益を受ける可能性がある。
【００９４】
好適な実施態様において、ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルが０である場合、患者は、アントラサイクリン類（例えばトポイソメラーゼIIα）から利益を受ける可能性がある。
【００９５】
ＴＩＭＰ−１免疫反応性は、癌細胞及び／又は腫瘍組織間質細胞中に存在するＴＩＭＰ−１タンパク質の量に似ている。
【００９６】
好適な実施態様において、ＴＩＭＰ−１遺伝子は、標準試料に対して、１．１倍より多く増幅され、例えば標準試料の１．２倍より多く、例えば１．３倍より多く、例えば１．４倍より多く、例えば１．５倍より多く、例えば１．６倍より多く、例えば１．７倍より多く、例えば１．８倍より多く、例えば１．９倍より多く、例えば２倍より多く、例えば３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅される。本発明のある実施態様において、ＴＩＭＰ−１遺伝子は、標準試料に対して１．１〜２．０倍増幅され、例えば標準試料に対して、１．２〜１．９倍の範囲、例えば１．３〜１．８倍の範囲、例えば１．４〜１．７倍の範囲、例えば１．５〜１．７倍の範囲、例えば１．７〜１．９倍の範囲、例えば１．８〜１．９倍の範囲で増幅される。
【００９７】
別の実施態様においてＴＯＰ２Ａ遺伝子は、標準試料に対して、１．１倍より多く増幅され、例えば標準試料の１．２倍より多く、例えば１．３倍より多く、例えば１．４倍より多く、例えば１．５倍より多く、例えば１．６倍より多く、例えば１．７倍より多く、例えば１．８倍より多く、例えば１．９倍より多く、例えば２倍より多く、例えば３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅される。本発明のある実施態様において、ＴＯＰ２Ａ遺伝子は、標準試料に対して１．１〜２．０倍増幅され、例えば標準試料に対して、１．２〜１．９倍の範囲、例えば１．３〜１．８倍の範囲、例えば１．４〜１．７倍の範囲、例えば１．５〜１．７倍の範囲、例えば１．７〜１．９倍の範囲、例えば１．８〜１．９倍の範囲で増幅される。
【００９８】
別の実施態様においてＨＥＲ２遺伝子は、標準試料に対して、１．１倍より多く増幅され、例えば標準試料の１．２倍より多く、例えば１．３倍より多く、例えば１．４倍より多く、例えば１．５倍より多く、例えば１．６倍より多く、例えば１．７倍より多く、例えば１．８倍より多く、例えば１．９倍より多く、例えば２倍より多く、例えば３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く増幅される。本発明のある実施態様において、ＨＥＲ２遺伝子は、標準試料に対して１．１〜２．０倍増幅され、例えば標準試料に対して、１．２〜１．９倍の範囲、例えば１．３〜１．８倍の範囲、例えば１．４〜１．７倍の範囲、例えば１．５〜１．７倍の範囲、例えば１．７〜１．９倍の範囲、例えば１．８〜１．９倍の範囲で増幅される。
【００９９】
異常なタンパク質発現
異常タンパク質発現は、例えば該タンパク質レベル、該タンパク質の欠如、非機能性タンパク質を引き起こす突然変異のような機能不全、該タンパク質の細胞局在化の不全のような、タンパク質発現の異常を意味する。
【０１００】
欠如は通常、試料中の又は該試料の腫瘍細胞中の検出可能なタンパク質の欠如を意味する。
【０１０１】
ある実施態様において、異常タンパク質発現は、対照試料の標準レベルに対する倍数として測定される。別の実施態様において異常タンパク質発現は、標準レベルより低い倍数として測定される。
【０１０２】
異常なトポイソメラーゼIIαタンパク質発現に関する第２の実施態様において、トポイソメラーゼIIαタンパク質は、標準試料に対して２倍より多く過剰発現され、例えば標準試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く過剰発現される。
【０１０３】
異常なＥｒｂＢ２タンパク質発現に関する第２の実施態様において、ＥｒｂＢ２タンパク質は、対照試料に対して２倍より多く過剰発現され、例えば対照試料の３倍より多く、例えば４倍より多く、例えば５倍より多く、例えば６倍より多く、例えば７倍より多く、例えば８倍より多く、例えば９倍より多く、例えば１０倍より多く、例えば１５倍より多く、例えば２０倍より多く、例えば３０倍より多く、例えば４０倍より多く、例えば５０倍より多く、例えば１００倍より多く過剰発現される。
【０１０４】
好適な実施態様において本発明は、腫瘍細胞にＴＩＭＰ−１タンパク質が欠如していることを特徴とする、癌を有する個体において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法である。
【０１０５】
標準
「標準」は、非癌個体から腫瘍中の非悪性細胞（例えば腫瘍組織間質細胞）までの、対応する生物学的試料のプールについての対応する測定値のような、任意の適切な標準を意味する。
【０１０６】
集団から得られる標準は、ＤＮＡ異常又はタンパク質発現のレベルを測定するために使用されることを特徴とする、癌を有する個体でトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法。
【０１０７】
該標準は、ＴＩＭＰ−１、ＥｒｂＢ２、又はトポイソメラーゼIIαタンパク質が、試料（例えばＥＬＩＳＡアッセイに適用された試料）中で異常に発現されているかどうかを測定するために、試料中のＴＩＭＰ−１、ＥｒｂＢ２、又はトポイソメラーゼIIαタンパク質免疫反応性のようなシグナルのベースラインを設定するのに使用される。
【０１０８】
具体的な実施態様において標準は、例えばウェスタンブロッティング、免疫組織化学試験、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、又はＲＩＡの手段により、ＴＩＭＰ−１タンパク質の有無を測定するように、試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質の有無を測定するための、ベースライン／カットオフ値を設定するために使用される。
【０１０９】
ある実施態様において標準は、試料内標準、試料間標準、及び内部標準よりなる群から選択される。
【０１１０】
同じ染色体を標的とする標準が含まれることを特徴とする、問題の遺伝子のＤＮＡ異常の測定を含む本発明の方法の１つの例。すなわち染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中のＤＮＡ異常（例えば、ＴＯＰ２Ａ遺伝子又はＨＥＲ２遺伝子中のＤＮＡ異常）について、問題の遺伝子の対立遺伝子が欠失されているか又は増幅されているかを測定するために、染色体１７の領域の動原体を標的とする標準が使用される。
【０１１１】
従ってある実施態様は、ＤＮＡ異常が、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）のようなインサイチューハイブリダイゼーション手段により測定されることを特徴とする、本発明のトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測するための方法に関する。
【０１１２】
別の実施態様において該ＤＮＡ異常は、該試料中に含まれる内部標準配列との平均比率として測定される。ある実施態様において該内部標準は、腫瘍組織試料のような試料中に含まれる二倍体の非悪性細胞である。本発明の好適な実施態様において、腫瘍組織試料は腫瘍組織間質細胞である。
【０１１３】
さらなる実施態様において標準は、染色体１７又はＸ染色体の動原体領域を標的とするフルオレセイン標識又はテキサスレッド５標識のような、標識プローブのシグナルである。具体的な実施態様においてプローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に基づくプローブである。この種の標準は、染色体１７ｑ２１上のＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中のＤＮＡ異常（例えば、ＴＯＰ２Ａ遺伝子又はＨＥＲ２遺伝子中のＤＮＡ異常）を測定するためのＦＩＳＨアッセイのようなＦＩＳＨ応用に適している。別の実施態様において、ＴＩＭＰ−１遺伝子中のＤＮＡ異常を測定するためのＦＩＳＨアッセイで、同様の種類の標準が使用される。
【０１１４】
ＤＮＡ異常は、該試料中に含まれる標準配列に対する平均比率として測定される。
すなわちある実施態様においてＤＮＡ異常は、該試料中に含まれる内部標準配列に対する平均比率として測定される。
【０１１５】
ある実施態様において内部標準配列は、染色体１７の動原体領域上に存在する。
具体的な実施態様において内部標準配列は、染色体Ｘ αサテライト（ＣｅｎＸ）である。
【０１１６】
ＤＮＡ遺伝子の対立遺伝子の欠失又は遺伝子増幅のようなＤＮＡ異常は、遺伝子特異的プローブの結合に対応するシグナルと、標準プローブの動原体領域プローブの結合に対応するシグナルとの比率を使用して測定される。
【０１１７】
従ってある実施態様において試料の腫瘍細胞は、ＴＩＭＰ−１／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＴＩＭＰ−１遺伝子欠失を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。本発明のある実施態様において、ＴＩＭＰ−１／ＣｅｎＸの平均比は、０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満、例えば０．４未満、例えば０．３未満、例えば０．２未満、例えば０．１未満、例えば０．１〜０．８の範囲、例えば０．２〜０．７の範囲、例えば０．３〜０．６の範囲、例えば０．４〜０．５の範囲であり、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。
【０１１８】
別の実施態様において腫瘍細胞は、ＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＴＯＰ２Ａ遺伝子欠失を含み、又はＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比が２．０より大きい場合、増幅を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。本発明のある実施態様において、ＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比は、０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満、例えば０．４未満、例えば０．３未満、例えば０．２未満、例えば０．１未満、例えば０．１〜０．８の範囲、例えば０．２〜０．７の範囲、例えば０．３〜０．６の範囲、例えば０．４〜０．５の範囲であり、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。
【０１１９】
第３の実施態様において腫瘍細胞は、ＴＯＰ２Ａ／ＣｅｎＸの平均比が０．８未満である場合、ＨＥＲ２遺伝子欠失を含み、又はＨＥＲ２／ＣｅｎＸの平均比が２．０より大きい場合、増幅を含み、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。本発明のある実施態様において、ＨＥＲ２／ＣｅｎＸの平均比は、０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満、例えば０．４未満、例えば０．３未満、例えば０．２未満、例えば０．１未満、例えば０．１〜０．８の範囲、例えば０．２〜０．７の範囲、例えば０．３〜０．６の範囲、例えば０．４〜０．５の範囲であり、該比が、０．８より大きく２．０未満である場合、正常である。
【０１２０】
別の実施態様において標準は、ＤＮＡ異常又はタンパク質発現のレベルを測定するために使用される。該標準は、非癌個体の集団、又は癌個体の組合せ群、例えばＣＭＦ治療した癌個体の群のような集団から得られる。
【０１２１】
さらに別の実施態様において、該標準は正常な二倍体遺伝子バックグランドである。
【０１２２】
例えば、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ遺伝子増幅又はＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ遺伝子欠失の意味において、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常レベルを測定するのに適した標準は、非癌個体からの対応する生物学的試料中のＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ対立遺伝子からの平均シグナル、又は該腫瘍試料中の非悪性細胞中の平均シグナルである。
【０１２３】
ある実施態様において、ＤＮＡ異常又はタンパク質異常の測定は、個体からの保存物質、例えば腫瘍組織を含むパラフィンブロックについて行われる。
【０１２４】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法
ある実施態様においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、癌を有する個体への、少なくとも１個のトポイソメラーゼIIαインヒビターを含む組成物の投与を含む。好適な実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に使用される組成物は、４−エピルブリシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンよりなる群から選択される少なくとも１個のアントラサイクリンを含む。
【０１２５】
トポイソメラーゼIIαインヒビターは、単独で、又は少なくとも１個の他の化学療法剤とともに投与される。本発明のある実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法はＣＥＦ治療であり、ここでＣＥＦは、シクロホスファミド、４−エピルブリシン、及び５−フルオロウラシルを意味する。さらに別の実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、トポイソメラーゼIIαインヒビター以外に、シクロホスファミド、タキサン類、及び／又は５−フルオロウラシルを用いる治療である。
【０１２６】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法で使用される任意の化合物が、プロドラッグとして投与される。すなわちある実施態様において、シクロホスファミド、タキサン類、５−フルオロウラシル、トポイソメラーゼIIαインヒビター（例えばアントラサイクリン）よりなる群から選択される少なくとも１個の薬剤は、該薬剤のプロドラッグの形である。
【０１２７】
トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、リポソーム封入してもよい。
【０１２８】
ある実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、アポトーシス又は有糸分裂破局のインデューサーを含む。
【０１２９】
別の実施態様においてトポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、術前補助療法、補助療法、及び転移疾患の治療よりなる群から選択される。
【０１３０】
癌の治療法
本発明の別の態様は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対して応答する可能性の予測に基づく癌の治療に関する。
【０１３１】
該態様は、個体の癌を治療する方法であって、
ａ．前記請求項のいずれかのトポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測し、
ｂ．該個体が応答する可能性の高いトポイソメラーゼIIαインヒビター療法を選択し、そして
ｃ．該個体を該トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に付す、
ことを含んでなる方法に関する。
【０１３２】
該治療法のある実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビターは、特に限定されないが、４−エピルブリシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、又はこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも１個のアントラサイクリンである。
【０１３３】
さらなる実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、シクロホスファミドと５−フルオロウラシルとをさらに含む組成物中に含まれる。
【０１３４】
さらなる実施態様において、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法は、タキサンをさらに含む組成物中に含まれる。
【０１３５】
キット
本発明の第３の態様は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測するためのキットであって、
ａ．生物学的試料中の、ＴＯＰ２Ａ又はＨＥＲ２ ＤＮＡ異常のようなＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２アンプリコン中の染色体ＤＮＡ異常の測定に適した試薬と、
ｂ．生物学的試料中の、ＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常の測定又はＴＩＭＰ−１タンパク質レベルの測定に適した試薬とを、
含んでなるキットに関する。
【０１３６】
本発明の態様の１つの文脈に記載される実施態様と特徴はまた、本発明の他の態様にも適用されることに注意されたい。
【０１３７】
本出願で引用される特許文献及び非特許文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
本発明は、以下の非限定例によりさらに詳細に説明される。
【０１３９】
危険率
「危険率」（ＨＲ）は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法のような治療から、無病生存期間の延長のような利益が得られる可能性に関する。
【０１４０】
本発明のある実施態様において、ＨＲは、標準としてのＣＭＦ治療からの有効性とともに、ＣＥＦ治療からの有効性を有する可能性を記載する。ＨＲが１であることは、治療を受けている群と標準群との間に差が無いことを意味する。従ってＨＲが０．５であることは、ＣＥＦ治療された患者が、ＣＭＦ治療された患者と比較して、再発を経験するリスクが５０％低下していることを意味する。評価の統計的検出力を改善するために、信頼区間が含まれる。
【０１４１】
実施例１の表１は、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法のような治療から利益を受ける可能性を評価するための危険率の使用を例示する。標準群のＨＲ（ＣＭＦ治療患者の場合）は、１に設定される。
【０１４２】
従って、本発明の好適な実施態様は、癌を有する個体で、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対する応答を予測する方法であって、トポイソメラーゼIIαインヒビター療法に対して応答する可能性は、危険率を用いて測定されることを特徴とする方法に関する。
【０１４３】
定義
本発明を詳細に考察する前に、以下の用語と慣習をまず定義する：
【０１４４】
「抗癌療法」は、癌を治療し緩和することを目的とする非手術的治療処方について使用される用語である。以下に例を示すが、抗癌療法は、化学療法、及び／又は放射線療法、及び／又は抗ホルモン療法、及び／又は生物学的療法でもよい。
【０１４５】
「トポイソメラーゼIIαインヒビター療法」は、少なくとも１個のトポイソメラーゼIIαインヒビターの使用を含む化学療法的抗癌療法を意味する。トポイソメラーゼIIαインヒビターは、シクロホスファミド、タキサン類、及び／又は５−フルオロウラシルのような他の化学療法剤と組合せて投与してもよい。
【０１４６】
「アントラサイクリン」は、４−エピルブリシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンの群を意味する。
【０１４７】
以下で本発明を、非限定的図面と実施例により説明する。
【実施例】
【０１４８】
本文脈において、以下の略語が使用される：
ＤＢＣＧ：デンマーク乳癌共同研究グループ（Danish Breast Cancer Cooperative Group）
ＣＭＦ：シクロホスファミド、メソトレキセート、及び５−フルオロウラシル
ＣＥＦ：シクロホスファミド、４．エピ−アドリアマイシン、及び５−フルオロウラシル
ＣＡＦ：シクロホスファミド、４．エピ−アドリアマイシン、及び５−フルオロウラシル
ＴＯＰ２Ａ正常：ＴＯＰ２Ａ遺伝子中にＤＮＡ異常は無し
ＨＥＲ２正常：ＨＥＲ２遺伝子中にＤＮＡ異常は無し
ＨＴ感受性：ＨＥＲ２増幅、又はＨｅｒ２免疫組織化学試験について３＋、及びＴＩＭＰ−１陰性
２Ｔ感受性：ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常、及びＴＩＭＰ−１陰性
ＴＭＡ：組織マイクロアレイ
ＥＲ又はＥＲ免疫染色：エストロゲン又はプロゲステロン受容体についての免疫染色
ＦＩＳＨ：蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
ＩＨＣ：免疫組織化学試験
ＩＤＦＳ：無侵襲性疾患生存率
ＯＳ：全生存率
【実施例１】
【０１４９】
原発性乳癌を有する患者（ｎ＝６４７）においてＴＩＭＰ−１腫瘍細胞免疫反応性の欠如は、補助アントラサイクリンに基づく化学療法の効果を予測する
【０１５０】
方法
患者と方法
簡単に説明すると、ＤＢＣＧ（デンマーク乳癌共同研究グループ（Danish Breast Cancer Cooperative Group））治験８９Ｄは、ＣＥＦ（シクロホスファミド、エピルビシン、及びフルオロウラシル）をＣＭＦ（シクロホスファミド、メソトレキセート、及びフルオロウラシル）に対して比較した非盲検無作為化第III相治験であった。８９Ｄ治験の適格患者は、節陽性（又は腫瘍サイズ≧５cm）でホルモン受容体陰性乳癌の患者と、節陰性で悪性グレードII又はIII腫瘍を有する更年期前患者であった。すべての患者がインフォームドコンセントに同意した。ＤＢＣＧ ８９Ｄ治験は、節陽性でホルモン受容体陽性腫瘍の患者は含まなかった。これらの患者は、内分泌治療の治験に含まれた。ＤＢＣＧは、元々のプロトコールとバイオマーカーの追加を準備し、デンマーク国立生物医学研究倫理委員会（Danish National Committee on Biomedical Research Ethics）は、その実施前に元々のプロトコールとバイオマーカーの追加を認可した。
【０１５１】
病理評価
病理的方法は、ＷＨＯによる組織型の分類、腫瘍境界の観察、皮膚若しくは深在筋膜への浸潤、肉眼的腫瘍サイズの測定、同定された転移節の数とリンパ節の数の測定を含んだ。すべての浸潤性腺管癌を、悪性度についてグレード分類した。次にすべての切片を、免疫組織化学試験によりＥＲについて中央で分析し、これらの中央で得られたＥＲデータを本解析で使用した。染色された腫瘍細胞が１０％以上の腫瘍を、ＥＲ陽性と見なした。
【０１５２】
１９９０年６月〜１９９８年１月に行った保管腫瘍組織の遡及的採取とＴＭＡの作成において、１２２４人の患者をＤＢＣＧ治験８９Ｄで無作為化し、これらのうちの９８０人はデンマークで集めた。治験に参加した８０６人のデンマーク人患者からの保管パラフィン包埋組織ブロックは、２００１年９月〜２００２年８月に試験場所で集め、中央で保存した。Histopathology Ltd (AH-diagnostics, Denmark)のTMA-builderを用いてまだ評価できる７９７ブロックのうちの７０７ブロックから、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）がうまく作成された。ヘマトキシリン染色切片上のドナーブロック中で標的部位を確定し、２つの２mm組織コアを、受容ＴＭＡブロックに移した。配置決めのために、腎組織のコアを使用して、上の角に印を付けた。本試験用に、全部で６５９個の腫瘍がＴＩＭＰ−１分析のために利用できた。腫瘍が無いもの（６５４９〜７０７）は、他の試験ですでに使用されて、本試験用に残りがなかったためである。表７は、試験中の患者の流れを示す。
【０１５３】
ＴＩＭＰ−１免疫染色
組換えヒトＴＩＭＰ−１に対して作成したマウスモノクローナル抗体（クローンＶＴ７）を含めた。本発明者らは、この抗体をすでに免疫染色用に評価してあった。ＶＴ７抗体はＩｇＧ1サブタイプであり、０．２５μg/mlの濃度で使用した。さらにトリニトロフェノールハプテンに対して作成した無関係のＩｇＧ1モノクローナル抗体（抗ＴＮＰ）を対照として使用した。各免疫組織化学実験のために、陽性対照（ＴＩＭＰ−１を含むことがわかっているヒト乳癌）を含めた。ＩＨＣ染色に使用した試薬は、Dako A/Sから得て、製造業者の説明書に従って使用した。
【０１５４】
簡単に説明すると、パラフィン切片（４μm）からキシレンでパラフィンを除去し、連続濃度勾配のエタノールで再水和した。通常の電子レンジで１０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ６．００）中で切片を１０分間沸騰させ、次に室温で熱緩衝液中で３０分間沸騰して、抗原を採取した。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止するために、切片を１％過酸化水素で１０分間処理した。切片を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。モノクローナル抗体をAdvance HRP（Code no K4068）を用いて検出し、切片をDAB+（Code No K5007）と５分間インキュベートさせて、反応物を視覚化した。インキュベーションの間に、０．５％トリトンＸ−１００含有ＴＢＳ（ｐＨ７．６）を用いて洗浄を行った。切片をマイヤー・ヘマトキシリンで対比染色し、すべての染色操作は用手法で行った。
【０１５５】
組織切片の免疫染色は、上皮乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の尺度として＋と−記号を使用して、半定量的に評価した。シグナル強度のスコア化は含めなかった。組織切片のスコア化は、２人の独立した病理学者（ＧＷとＥＢ）によりブラインドで行われた。不一致がある場合は、一緒にスライドを観察して合意に達した。
【０１５６】
統計的方法
免疫染色結果を、統計解析のためにＤＢＣＧに渡した。
【０１５７】
追跡調査時間を、可能な追跡調査のカプランマイヤー推定値により定量化した。ＩＤＦＳ（無侵襲性疾患生存率）が一次終点であり、ＯＳ（全生存率）が２次終点であった。ＩＤＦＳは、何らかの原因による局在化、２回目の原発性侵襲癌、又は死亡には無関係に、無作為化から侵襲性乳癌再発までの経過時間として規定した。ＯＳは、無作為化から、何らかの原因による死亡までの経過時間として規定した。ＩＤＦＳとＯＳは、カプランマイヤー推定値と対数順位検定とを使用して解析した。ＩＤＦＳとＯＳに対する治療処方ならびに中央で評価したＴＩＭＰ−１の効果は、調整せずに推定した危険率、及びＣｏｘ比例ハザードモデル（Cox proportional hazard model）を使用して調整した危険率により、定量化した。多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルはまた、ワルド検定（Wald test）を使用して治療法とＴＩＭＰ−１との交互作用を調べるために応用した。この多変量モデルは、ＴＩＭＰ−１、更年期状態、腫瘍サイズ、陽性リンパ節、組織型とグレード、中央のＥＲホルモン受容体状態、治療処方、及びＴＩＭＰ−１と治療との相互作用項を含んだ。組織型とグレード、及びＥＲ受容体状態については比例ハザード推定を行わず、これらは、層別変数としてモデル中に含めた。バイオマーカーについて情報が有る患者と無い患者との差、治療法間の差、及びＴＩＭＰ−１状態と臨床−病理的変数との相関は、未知数を排除したχ2検定により検定した。Ｐ値は両側検定とした。統計解析は、SAS 9-1プログラムパッケージを使用して行った。
【０１５８】
結果
調べた腫瘍試料の総数は６５９であり、このうち１２はＣＭＦもＣＥＦも投与されておらず、従って最終的な数６４７人の患者について以後の解析を行った。これらの患者のうち３５７人はＣＭＦを投与され、２９０人の患者はＣＥＦを投与された。表７は、ＤＢＣＧ ８９Ｄ試験のデンマーク部分に参加した元々の患者と、最終的に６４７人の患者が最終解析に含まれることになった流れを示す。本解析の時点（２００７年８月１日）で、３０８人（４８％）は死亡しており、３１２人（４８％）は、ＩＤＦＳに対応する症状があった。ＣＥＦを投与されている患者については、１２３人（４２％）が死亡しており、１２９人（４４％）はＩＤＦＳに対応する症状があった。ＣＭＦ治療患者では、１８５人（５２％）が死亡しており、１８３人（５１％）がＩＤＦＳ症状があった。ＩＤＦＳに関して可能な追跡調査時間中央値は９，８年であり、ＯＳについては１３．８年であった。
【０１５９】
表５は、集団を治療する目的のベースライン特性を示す。明らかなように、本試験に含まれた患者は、残りの患者より有意に大きな腫瘍（ｐ＜０．０００１）と有意に高グレードの悪性腫瘍（ｐ＝０．０２）とを有した。他の古典的ベースライン特性については有意差はなかった。６４７人の患者を２群（ＣＭＦ対ＣＥＦ）に分けると、ベースライン特性に差は観察されず、本試験の患者の３分の１は死亡したが、含まれた患者がバランスの取れた分布を保持した。
【０１６０】
腫瘍試料の７５％は、陽性のＴＩＭＰ−１免疫反応性を示した。免疫反応性のパターンは、ＴＩＭＰ−１免疫反応性を示すほとんどすべての上皮癌細胞（図６Ａ）から、分散及び集中したＴＩＭＰ−１免疫反応性（図６Ｂ）（ＴＩＭＰ−１陽性）、そしてＴＩＭＰ−１腫瘍細胞免疫反応性の完全な欠如（示していない）まであった。ある腫瘍では、顕著な腫瘍組織間質細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性が観察されたが、これらの腫瘍に上皮癌細胞ＴＩＭＰ免疫反応性が欠如している場合は、これらはＴＩＭＰ−１陰性とした（図６Ｄ）。図６Ｃは陰性対照である。図６は、ＴＩＭＰ−１陽性腫瘍細胞を有する患者と、ＴＩＭＰ−１陰性腫瘍細胞を有する患者とのベースライン特性を示す。ＴＩＭＰ−１陽性腫瘍細胞を有する患者は、有意に多い腫瘍陽性腋窩リンパ節（ｐ＝０．０２）と、有意に多いＥＲ陽性腫瘍（ｐ＝０．０４）とを有した。ＴＩＭＰ−１陰性腫瘍（ｎ＝１６０）のうちで、大半はＥＲ陰性であった（ｎ＝１０７）。しかしＴＩＭＰ−１陽性腫瘍（ｎ＝４８７）では、高率にＥＲ陰性（ｎ＝２９４）があった。これは、ＴＩＭＰ−１陰性が主にＥＲ陰性腫瘍中にあるが、ＴＩＭＰ−１がＥＲの一般的な代理物ではないことを示す。ＴＩＭＰ−１陰性／陽性患者間のベースライン特性について他の差は、証明されなかった。
【０１６１】
多変量解析（調整済み）は、治療群、更年期状態、腫瘍サイズ、陽性腋窩リンパ節の数、組織型と悪性度グレード、中央測定したＥＲ、及びＴＩＭＰ−１腫瘍細胞免疫反応性を含んだ。上記したように、組織型とグレード及びＥＲ受容体状態については比例ハザード推定を行わず、これらは、層別変数として多変量モデル中に含めた。本発明者らは、まず本試験に含めた６４７人の患者で、ＣＥＦ対ＣＭＦのＩＤＦＳとＯＳに対する効果を解析した。すなわち癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性を考慮した。ＣＥＦを投与された患者は、ＣＭＦを投与された患者（示していない）と比較すると、優れたＩＤＦＳ（調整済みＨＲ：０．７８（９５％ＣＩ：０．６２〜０．９８；ｐ＝０．０３）と優れたＯＳ（調整済みＨＲ：０．７７（９５％ＣＩ：０．６１〜０．９７；ｐ＝０．０３）を有した。これらの数値は、元々の試験の数値（ＩＤＦＳ：ＨＲ＝０．７６、及びＯＳ：ＨＲ＝０．７３）と異ならず、試験した亜集団が全試験群を代表していることを示唆している。
【０１６２】
次に本発明者らは、試験に含めたすべての患者群（ｎ＝６４７）について、ＴＩＭＰ−１癌細胞の免疫反応性と、ＩＤＦＳ及びＯＳとの関連を解析した。ＩＤＦＳについてＴＩＭＰ−１陽性患者とＴＩＭＰ−１陰性患者との間で有意差は見られなかった：未調整ＨＲ＝１．１８（９５％ＣＩ：０．９１〜１．５４；ｐ＝０．２２）、及び調整済みＨＲ＝０．９５（９５％ＣＩ：０．７２〜１．２４；ｐ＝０．６９）。ＯＳについての数値は：未調整ＨＲ＝１．１７（９５％ＣＩ：０．８９〜１．５３；ｐ＝０．２５）、及び調整済みＨＲ＝０．９７（９５％ＣＩ：０．７３〜１．２８；ｐ＝０．８２）であった。
【０１６３】
次に、２つの異なる治療群と腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１の免疫反応性を考慮して、亜集団解析を行った。ＣＥＦ治療患者（ｎ＝２９０）では、ＴＩＭＰ−１陽性腫瘍を有する個体は、ＴＩＭＰ−１陰性腫瘍の患者より有意に短いＩＤＦＳを有した：未調整ＨＲ＝１．５６（９５％ＣＩ：１．０１〜２．４１；ｐ＝０．０４７）（図７Ａ）。これに対して、ＣＭＦ治療患者（ｎ＝３４７）では、ＴＩＭＰ−１陽性患者と陰性患者の間でＩＤＦＳに差は見られなかった：未調整ＨＲ＝０．９７（９５％ＣＩ：０．６９〜１．３５；ｐ＝０．８４）（図７ＡＡ）。ＯＳの対応する数値は：ＣＥＦ：未調整ＨＲ＝１．４１（９５％ＣＩ：０．９１〜２．１８；ｐ＝０．１３）、及びＣＭＦ：未調整ＨＲ＝１．０２（９５％ＣＩ：０．７２〜１．４３；ｐ＝０．９３）（図７Ｂ）。
【０１６４】
多変量解析では、ＣＥＦで治療したＴＩＭＰ−１陽性患者と陰性患者の間で、ＩＤＦＳについて有意差は見られなかった：調整済みＨＲ＝１．３０（９５％ＣＩ：０．８３〜２．０２；ｐ＝０．２５）、及びＯＳ：調整済みＨＲ＝１．２１（９５％ＣＩ：０．７７〜１．９０；ｐ＝０．４２）。ＣＭＦで治療した患者でも有意差は見られなかった；ＩＤＦＳ：調整済みＨＲ＝０．７６（９５％ＣＩ：０．５４〜１．０７；ｐ＝０．１２）、及びＯＳ：調整済みＨＲ＝０．８４（９５％ＣＩ：０．５９〜１．１９；ｐ＝０．３２）。
【０１６５】
ＴＩＭＰ−１免疫反応性癌細胞を有する群でＣＥＦ治療患者とＣＭＦ治療患者のＩＤＦＳを比較すると、２つの治療群の間のＨＲは：調整済みＨＲ＝０．８８（９５％ＣＩ：０．６８〜１．１３；ｐ＝０．３２）（図８Ａ）であった。ＯＳの対応する数値は：調整済みＨＲ＝０．８３（９５％ＣＩ：０．６４〜１．０８；ｐ＝０．１７）（図８Ｂ）であった。これに対して、ＴＩＭＰ−１癌細胞免疫反応性の無いＣＥＦ治療患者とＣＭＦ治療患者のＩＤＦＳを比較すると、調整済みＨＲ＝０．５１（９５％ＣＩ：０．３１〜０．８４；ｐ＝０．００８５）（図８Ａ）、及びＯＳ調整済みＨＲ＝０．５８（９５％ＣＩ：０．３５〜０．９６；ｐ＝０．０３）（図８Ｂ）であり、ＣＥＦで治療した患者の方がよかった。ＩＤＦＳとＯＳについて、治療効果とＴＩＭＰ−１の間の交互作用について、非縮小Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して検定した。ＩＤＦＳ（ｐ＝０．０６）（図８Ａ）とＯＳ（ｐ＝０．２１）（図８Ｂ）について、有意ではないＴＩＭＰ−１プロフィール（陽性又は陰性免疫反応性）対治療法（ＣＥＦ又はＣＭＦ）交互作用が検出された。
【０１６６】
考察
本試験は、ＴＩＭＰ−１癌細胞の免疫反応性の欠如が、ＣＭＦと比較して、原発性乳癌で補助エピルビシン含有補助療法の好適な効果と関連していることを初めて示し、アントラサイクリン類についてＴＩＭＰ−１免疫反応性の予測価値を示唆する。ＣＭＦと比較して、ＴＩＭＰ−１陰性患者のアントラサイクリンに基づく補助療法は、再発リスクを４９％そして死亡率を４２％有意に低下させる。
【０１６７】
免疫染色についてより優れたものとして、抗ＴＩＭＰ−１抗体のパネルの中から、ＶＴ７抗ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体をあらかじめ選択した。ＶＴ７は、アミノ酸１６９〜１７４間に存在する線状のＴＩＭＰ−１エピトープを認識する。ＶＴ７免疫染色は、感度と特異性について完全に検証（ＶＴ７はＴＩＭＰ−２、３、又は４に結合しない）され、染色条件は、抗原採取プロトコール、抗体濃度、及びインキュベーション時間などについて最適化された。さらに固定時間（２４〜７２時間）の影響の可能性も試験した。各ＴＭＡについて、同じＩｇＧ１サブタイプの陰性対照抗体（抗ＴＮＰ）を使用し、既知のＴＩＭＰ−１陽性乳癌のスライドを、陽性対照として各アッセイに含めた。
【０１６８】
元々の８９Ｄ治験に含めた９８０人のデンマーク人患者と比較して、本解析に含めた６４７人の患者の特性には、ほんのわずかの差しか見られず、これは、この６４７人の患者が全ＤＢＣＧ ８９Ｄデンマーク試験群を代表していることを示す。元々の８９Ｄ治験で報告された全体的効果が本サブセットでも再現され、これは、６４７人の患者がＤＢＣＧ治験８９Ｄ中のデンマーク人の全群の代表であることをさらに支持している。
【０１６９】
本発明者らは、ＴＩＭＰ−１遺伝子欠損マウスから得られたマウス線維肉腫細胞が、ＴＩＭＰ−１を発現する野生型マウス線維肉腫細胞より、インビトロでエトポシド（トポイソメラーゼIIインヒビター）に対して、有意に高い感受性を有することをすでに公表した。アポトーシスアッセイを応用して、ＴＩＭＰ−１がアポトーシスに対して線維肉腫細胞を防御することが証明された。ＴＩＭＰ−１が化学療法誘導性アポトーシスを防御できることは、他の研究者によっても証明された。なぜ本試験のＴＩＭＰ−１が、ＣＭＦではなくＣＥＦに対する感受性／耐性を予測するかは現在不明である。ＴＩＭＰ−１により制御される可能性のあるシグナル伝達経路について、提案がされている。ＭＣＦ１０Ａ乳房上皮細胞株ではＴＩＭＰ−１の過剰発現が、チロシンリン酸化を介して焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）の構成性活性化を誘導することが証明された。ＦＡＫは、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）の上流レギュレーターであり、ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの制御（細胞生存に至る詳細に性状解析されたシグナル伝達経路）を引き起こすことが、すでに証明されている。リン酸化ＦＡＫは、ＰＩ−３キナーゼと結合しこうしてこれを活性化し、これが次にＡｋｔキナーゼを活性化する。Ａｋｔはタンパク質Ｂａｄをリン酸化し、その結果これは、捕捉タンパク質１４−３−３により細胞質中に隔離され、従ってもうｂｃｌ−２やｂｃｌ−ＸLと相互作用して阻害することができない。ｂｃｌ−２とｂｃｌ−ＸLは、ミトコンドリア膜中に存在するタンパク質であり、活性化されるとこれらの抗アポトーシスタンパク質はＢａｘを阻害し、従ってミトコンドリアからのチトクロームｃの放出を妨害する。これは次に、カスパーゼカスケードの活性化を妨害し、従ってアポトーシスを妨害する。次にこれは、カスパーゼカスケードの活性化を阻止し、従ってアポトーシスを阻止する。すなわちＴＩＭＰ−１は栄養素のように作用して、ＦＡＫ、ＰＩ−３、Ａｋｔ、及びｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む生存経路を開始させ、カスパーゼ活性化の阻害を引き起こしこうしてアポトーシスの阻害を引き起こすことにより、アポトーシスを阻害する。
【０１７０】
ＤＢＣＧ ８９Ｄ治験に参加した患者から得られた腫瘍組織中のＴＩＭＰ−１免疫反応性を試験することにより、本発明者らは、その乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如しアントラサイクリンを含む併用化学療法で治療されている患者が、ＣＭＦで治療されている患者より有意に優れた結果を有することを証明した。多変量解析では、ＴＩＭＰ−１陰性腫瘍を有する患者は、ＣＭＦで治療するよりＣＥＦで治療すると、４９％低い再発リスクと４２％低い死亡リスクを有した。従ってこれらの臨床結果は、ＴＩＭＰ−１タンパク質がアントラサイクリン治療に対する感受性／耐性に関連しているという、我々の仮説のさらに別の支持である。しかし、補助療法の場でＴＩＭＰ−１免疫反応性とアントラサイクリン感受性／耐性の間の有意な相関を確認する、独立にした研究が待たれる。さらに我々は現在、ＴＩＭＰ−１の結果を、ＨＥＲ２とＴＯＰ２Ａ遺伝子異常アッセイの結果（両方ともアントラサイクリンに対する感受性と関連している）と比較している。
【０１７１】
本発明者らは、原発性乳癌中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルが予知的情報を有することを、すでに公表している。従って、ＩＤＦＳに対するＴＩＭＰ−１免疫反応性の観察された作用が予知的又は予測的であると、推測することができる。ＣＭＦ患者中ではＴＩＭＰ−１免疫反応性の作用は観察されず、ＣＥＦ治療患者中にわずかに観察されたのみであるため、本結果はＴＩＭＰ−１免疫反応性が何らかの予測価値を有することを示唆し、本試験は我々の前臨床観察結果と一致する。以前の予知的試験では、ＴＩＭＰ−１タンパク質は腫瘍全体から抽出され、従って測定されたＴＩＭＰ−１タンパク質は、汚染血液、腫瘍組織間質細胞、細胞外マトリックス、及び癌細胞から得られたものかも知れない。これに対して本試験では、上皮癌細胞中の局在化ＴＩＭＰ−１タンパク質のみが最終解析に含まれ、これが本試験と以前の試験との差のもう１つの理由である。
【０１７２】
結論として本試験は、上皮癌細胞中でＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性の無い腫瘍が、ＣＭＦ治療よりアントラサイクリン治療に対してより感受性であることを初めて証明する。将来の試験は、ＴＩＭＰ−１免疫反応性、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａと、アントラサイクリン類の効果との関係を確立することを目指している。さらに本結果は、独立した患者群で評価されるであろう。
【実施例２】
【０１７３】
ＴＯＰ２Ａ及びＴＩＭＰ−１腫瘍細胞遺伝子異常とＴＩＭＰ−１腫瘍細胞タンパク質免疫反応性との組合せ予測価値の臨床試験
方法
高リスク乳癌患者をＣＭＦ又はＣＥＦによる補助療法に無作為化した、無作為化試験から６４７の患者試料を得た。終点は無侵襲性疾患生存率（ＩＤＦＳ）であった。
【０１７４】
患者試料は、患者の原発性腫瘍からのホルマリン固定パラフィン包埋組織から作成した組織マイクロアレイからなった。すべての試料に識別番号があった。
【０１７５】
ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常は、既に記載されているように試験した（Koop et al. 2005）。
【０１７６】
ＴＩＭＰ−１遺伝子異常は、標準的ＦＩＳＨ技術を使用して試験した。ＵＣＳＣゲノムブラウザー（http://genome.ucsc.edu）を使用してＴＩＭＰ−１遺伝子の周りの４００kb領域を分析することにより、ＢＡＣ（細菌性人工染色体）クローン（RP11-466C12）を同定した。ＢＡＣクローンは、すでに同定された遺伝子を包含している：ＡＲＡＦ野生型対立遺伝子（ＡＲＡＦ）、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ１）、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰ−１）、補体因子プロペルジン（ＣＦＰ）、ＥＬＫ１、遍在発現転写体（ＵＸＴ）、及びＡＫ０９４１０８。このクローンを、１２．５μg/ml クロラムフェニコール（Sigma-Aldrich, Denmark）を補足したＬＢ培地（Sigma-Aldrich, Denmark）中で培養し、ＢＡＣ ＤＮＡのアルカリ精製法に従って精製した（Poulsen 2004）（Poulsen TS, 2004）。このクローンをＵＣＳＣからのＤＮＡ配列のコンピューター内ＢａｍＨＩ消化物を使用して証明し、酵素の製造業者（Invitrogen, Denmark）が薦めるように、精製ＢＡＣクローンのＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ消化と比較した。
【０１７７】
プローブＢＡＣ ＤＮＡをテキサスレッド−５−ｄＣＴＰ（Millipore Corporation, Temecula, California, USA）を用いて、製造業者（Roche Diagnostics GmBH, Mannheim, Germany）が記載したようにニック翻訳により標識した。ＦＩＳＨ用に全部で１０ng/mlの標識ＤＮＡを使用し、特異的ＰＮＡオリゴ（Nielsen, KV et al., 2004）を使用して、反復配列から得られる不要なバックグランド染色の抑制を行った。染色体Ｘ αサテライト配列に特異的なＰＮＡのフルオレセイン標識混合物（ＣｅｎＸ ＰＮＡプローブ）を、染色体Ｘのコピー数の標準として使用した。ＰＮＡはDako A/Sから供給された。図１は、染色体Ｘの略図、ＢＡＣ ＤＮＡに包含される領域Ｘｐ１１の一部の局在化、ならびにＣｅｎＸ ＰＮＡプローブにより包含される動原体Ｘの領域を示す。ＦＩＳＨは、Histology FISH accessoryキットを使用して、製造業者（K5599, Dako A/S, Denmark）の記載を若干変更して行った。前処理工程は、水浴は使用せず、電子レンジ（Whirlpool, Denmark, model JT356 with 6th sense）を使用して行った。スライドを、充分な１×前処理緩衝液中にスライドが完全に覆われるように沈め、スチーム機能（6th sense）を使用して１０分間処理し、次に室温（ＲＴ）で１５分間処理した後、Histology FISH accessoryキットとともに提供されたプロトコールに従って続けた。
【０１７８】
ＦＩＳＨの評価
１００×油浸対物レンズ（開口数）を取り付けたLeica顕微鏡（Leica, Denmark）を使用して、ハイブリダイゼーションシグナルをスコア化した。二重バンドパス蛍光フィルター（Chromotechnology, Brattleboro, VT）を使用して、ＦＩＴＣとテキサスレッドシグナルを同時に視覚化した。ＤＡＰＩ対比染色に基づいて、完全な形態を有する６０個の重複していない中間期核をスコア化して、各ＴＩＭＰ−１とＣｅｎＸプローブについてハイブリダイゼーションシグナルの数を測定した。ＴＩＭＰ−１の増幅は、ＴＩＭＰ−１対ＣｅｎＸシグナルの平均比（＝増幅レベル）が２以上（比≧２）として規定した。この比率が０．８未満（比＜０．８）の場合は、ＴＩＭＰ−１が欠失していると規定した。従って正常なＴＩＭＰ−１遺伝子／ＣｅｎＸ比は、この間（０．８≦比＜２）として規定した。
【０１７９】
ＴＩＭＰ−１免疫反応性の評価
ＴＩＭＰ−１タンパク質の免疫組織化学試験は、ＶＴ７抗ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体（Sorensen et al. 2005）を使用して、すでに公表された方法（Sorensen et al. 2005）に従って行った。組換えヒトＴＩＭＰ−１に対して作成したマウスモノクローナル抗体（クローンＶＴ７、ＩｇＧ1）（Moller Sorensen et al. 2005; Sorensen et al. 2006）を０．４μg/mlの濃度で使用した。
【０１８０】
すべての切片を、患者の病歴を知らされていない２人の独立した病理学者が評価した。各試料を腫瘍細胞免疫反応性の有無について評価し、＋又は−としてスコア化した。
【０１８１】
次にすべてのデータを、統計解析のためにデンマーク乳癌共同研究グループ（Danish Breast Cancer Cooperative Group）に渡した。
【０１８２】
結果
２９０人の患者がＣＥＦを投与され、３５７人がＣＭＦを投与された。これらのうち、２１６／２９０と２７１／３５７はＴＩＭＰ−１免疫反応性が陽性であり、６１／２９０と７８／３５７はＴＯＰ２Ａ遺伝子異常（増幅又は欠失）があった。２４人の患者は、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ状態が不明であった。
【０１８３】
ＴＩＭＰ−１腫瘍細胞免疫反応性に従って層別した患者の無病生存率のカプランマイヤープロットを、図１ＡとＢに示す。図１Ｂは、ＣＭＦを投与されている患者では、ＴＩＭＰ−１腫瘍細胞反応性はＤＦＳに影響がなかったことを示す（ｐ＝０．８４）。これに対して、ＣＥＦを投与されている患者では、腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１免疫反応性の欠如は、ＤＦＳの有意な上昇と関連していた（ｐ＝０．０４７）（図１Ａ）。これに対して、腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する患者は、ＣＭＦで治療した患者に匹敵するＤＦＳを有した（ｐ＝０．４６）。
【０１８４】
ＣＥＦで治療した患者の無病生存率を示す図１Ａから明らかなように、腫瘍細胞中にＴＩＭＰ−１免疫反応性の無い患者は、無病生存率については有意に良好である。例えば５年間の追跡調査で、約７２％のＴＩＭＰ−１陰性患者は疾患の再発を経験していないが、ＴＩＭＰ−１陽性患者の６０％のみが無病であった。
【０１８５】
図１Ｂは、ＣＭＦを投与され、腫瘍細胞がＴＩＭＰ−１免疫反応性を示すかどうかで層別された患者の無病生存率を示す。２つの群間で無病生存率に差はなかった。
【０１８６】
ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常について測定すると、ＣＭＦを投与されている患者では、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常状態はＤＦＳ（図２Ｂ）に影響が無いことがわかった（図２ＡとＢ）。これに対してＣＥＦを投与されている患者では、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常（増幅又は欠失）を有する患者は、ＣＭＦを投与されたＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者と比較して、ＤＦＳが有意に改善された（図２Ａ）。
【０１８７】
ＣＥＦで治療した患者の無病生存率を示す図２Ｂから明らかなように、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者は、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の無い患者よりはるかに悪い。しかし、ＣＥＦを投与されておりＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常について層別された患者の無病生存率を示す図２Ａを見ると、ＣＭＦを投与された患者より曲線（ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者）が良いことがわかる（図２Ｂ）。
【０１８８】
その癌細胞中で陰性ＴＩＭＰ−１免疫反応性を有する患者のうちで、わずかに２４／１６０（１５％）のみがＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を有するようであった。従って我々は、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常を有するか又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如していることの、ＤＦＳに対する組合せ影響を分析した。結果は、ＴＯＰ２Ａ分析単独から確定されるＣＥＦ治療（ＣＭＦ治療と比較して）から利益を受ける可能性が高く、危険率が低下することなく、ほとんど２倍の数の患者を同定することができることを示した。表１は、９５％信頼限界を含む個々に調整した危険率を示す。すべての値は、危険率を１に設定したＣＭＦ群に基づく。
【０１８９】
ＨＲが１であることは、群間に差が無いことを意味する。我々は、組合せたＣＭＦ群を標準として使用した。すなわち表は、亜集団中のＣＭＦを用いる治療と比較して、ＣＥＦ治療から受ける利益を示す。
【０１９０】
表１から、ＣＥＦで治療されたＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有するかＴＩＭＰ−１陰性の患者は、ＨＲが１未満であり、９５％信頼限界が１を超えないことがわかる。これは、これらの患者（ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常及び／又はＴＩＭＰ−１陰性）が、ＣＭＦによる治療と比較してＣＥＦ治療から有意に優れた利益を受けることを意味する。ＨＲが０．５４であることは、これらの患者（ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常及び／又はＴＩＭＰ−１陰性）にとって利益の確率が４６％であることを意味する。また表から、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常（増幅又は欠失）と、その腫瘍細胞がＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如している患者のＨＲは、ほとんど同じＨＲを有することがわかる。本発明では、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者又はＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性が欠如した患者は、必ずしも同じではない。次に、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有する患者及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が無い患者群についてＨＲを見ると、この亜集団内の患者の数が、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常単独で同定される患者の数のほとんど２倍であるにもかかわらず、ＨＲはほとんど同じである（０．４８（９５％信頼限界：０３４〜０６９）。すなわち、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定をＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性測定と組合せることにより、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常の測定単独と比較して、ＣＥＦから利益を受ける可能性の高いほとんど２倍の患者が同定される。
【０１９１】
組合せ法により、ＣＭＦ治療から受ける利益（危険率０．４８）と比較して、ＣＥＦ治療から利益を受ける確率が５０％を超えて増加している患者の４３％を同定することができ、これは、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常単独を分析することにより得られる数のほぼ２倍である。
【０１９２】
図３ＡとＢは、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常とＴＩＭＰ−１免疫反応性を組合せた時の、ＤＦＳのカプランマイヤー曲線を示す。
【０１９３】
図３Ｂを見ると、ＣＭＦで治療した時、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常及び／又は腫瘍細胞ＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性の欠如を有する患者は、腫瘍細胞中にＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常が無くＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性を有する患者より、悪いことがわかる。しかし患者をＣＥＦで治療すると（図３Ａ）、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性が欠如した患者は、ＣＭＦで治療したものよりはるかに良い。すなわち、ＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性が欠如し、ＣＥＦで治療した患者は、ＣＭＦで治療したＴＯＰ２Ａ ＤＮＡ異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１タンパク質免疫反応性が欠如した患者より、良い。
【０１９４】
図９は、上皮乳癌細胞中にＴＩＭＰ−１ ＤＮＡ異常を示すＴＩＭＰ−１ ＦＩＳＨ分析を示す。
【０１９５】
考察
本試験は、ＴＩＭＰ−１タンパク質及び／又はＴＯＰ２Ａ遺伝子異常の欠如又は低下した濃度は、ある種類の化学療法に感受性を付与することを示す。
【０１９６】
本試験は、完全な臨床的追跡調査のある大規模な前向き研究から得られた試料について行われた（Ejlertsen et al., Eur J Cancer 2005）。使用したＴＯＰ２Ａ ＦＩＳＨ分析とＴＩＭＰ−１免疫組織化学技術の両方とも、既に記載されている。
【０１９７】
本試験の結果は、原発性の高リスク乳癌患者で、ＣＥＦを用いる補助治療から受ける利益（ＩＤＦＳの延長）を予測するのに、ＴＯＰ２Ａ遺伝子異常測定とＴＩＭＰ−１免疫組織化学試験の組合せの付加的効果があるが、ＣＭＦで治療された患者では効果が無いことを明瞭に示し、アントラサイクリンを含む化学療法から受ける利益の予測において、組合せ試験の価値を示唆している。
【実施例３】
【０１９８】
高リスク乳癌患者におけるＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、及びＴＩＭＰ−１と、補助アントラサイクリンを含む化学療法に対する応答性
方法
ＤＢＣＧ ８９Ｄ治験とその生物学的サブ研究は、すでに詳細に記載されている（Ejlertsen et al., 2007、及びKnoop et al. 2005）。簡単に説明すると、ＤＢＣＧ治験８９Ｄは、ＣＥＦ（シクロホスファミド  ６００mg/m2、エピルビシン  ６０mg/m2、及びフルオロウラシル  ６００mg/m2）をＣＭＦ（シクロホスファミド  ６００mg/m2、メソトレキセート  ４０mg/m2、及びフルオロウラシル  ６００mg/m2）に対して比較する、いずれも静脈内投与して３週間間隔で９サイクル行う非盲検無作為化第III相治験であった。８９Ｄ治験の適格患者は、ホルモン受容体陰性で節陽性（又は腫瘍サイズ＞５cm）の乳癌患者と、節陰性で悪性グレードII又はIII腫瘍を有する更年期前患者であった。高度にホルモン応答性腫瘍の患者を、一致した適格性標準でＤＢＣＧ治験（８９Ｂと８９Ｃ）に含めた。ＤＢＣＧは、元々のプロトコールとバイオマーカーの追加を準備し、デンマーク国立生物医学研究倫理委員会（Danish National Committee on Biomedical Research Ethics）は、その実施前に元々のプロトコールとバイオマーカーの追加を認可した（V.200.1616/89, KF12295003）。
【０１９９】
ＨＥＲ２、ＥＲ、及びＴＩＭＰ−１免疫反応性の中央評価
ホルマリン固定しパラフィン包埋した腫瘍ブロックから、TMA-builder（Histopathology Ltd, AH-diagnostics)を用いて組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を作成した。ヘマトキシリン染色切片上のドナーブロック中で標的部位を確定し、２つの２mm組織コアを、受容ＴＭＡブロックに移した。ＥＲ免疫染色は、室温で３μ ＴＭＡ切片について、ＥＲ１Ｄ５（Dako）抗体とTech-mate 500（Dako）を用いて行った。ＥＲ発現は、強度は無視して、染色される腫瘍細胞のパーセントとして記録し、結果を陽性（≧１０％の染色細胞）又は陰性（＜１０％）として２群に分けた。ＨＥＲ２の発現は、切片全体についてHercepTest（Dako）を使用して測定し、０、１＋、２＋、又は３＋としてスコア化した。ＴＩＭＰ−１免疫染色は、既に記載されているように（Sorensen et al. 2006）行った。簡単に説明すると、切片を抗ＴＩＭＰ−１マウスモノクローナル抗体ＶＴ７とともにインキュベートした。ＶＴ７はマウス／ウサギEnvision＋（Code No K5007, DAKO A/S）を用いて検出し、切片をDAB+（Code No K5007, DAKO A/S）と２回３分間インキュベートして、反応物を視覚化した。組織切片の免疫染色は、上皮乳癌細胞中のＴＩＭＰ−１免疫反応性の尺度として＋及び−記号を使用して、半定量的に評価した。シグナル強度のスコア化は含めなかった。組織切片のスコア化は、２人に独立した病理学者（ＧＷとＥＢ）によりブラインドで行われた。不一致がある場合は、一緒にスライドを観察して合意に達した。
【０２００】
ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ２ ＦＩＳＨ
ＴＯＰ２ＡとＨＥＲ２コピー数は、ＦＩＳＨ（TOP2A pharmDXとHER2 pharmDX, DAKO A/S）により視覚化した。少なくとも６０個の遺伝子シグナルがスコア化され、核が含まれていた場合は、すべてのシグナルがスコア化された。さらに同じ核中で動原体１７シグナルがスコア化され、動原体１７に対する遺伝子の比を計算した。腫瘍は、比率が＜０．８、０．８〜１．９、及び＞２．０に従って、ＴＯＰ２Ａ／ＨＥＲ２が欠失しているか、正常か、又は増幅されたとしてスコア化した。
【０２０１】
統計的方法
追跡調査時間を、可能な追跡調査のカプランマイヤー推定値により定量化した。無侵襲性疾患生存率（ＩＤＦＳ）が一次終点であり、何らかの原因による局在化、同側若しくは対側の乳房を含む侵襲性乳癌、２回目の原発性非乳房侵襲癌、又は死亡には無関係に、無作為化から侵襲性乳癌再発までの経過時間として規定した。２次終点であるＯＳ（全生存率）は、無作為化から、何らかの原因による死亡までの経過時間として規定した。ＩＤＦＳとＯＳは、カプランマイヤー推定値と対数順位検定とを使用して解析した。ＩＤＦＳとＯＳに対する、ＨＥＲ２又はＴＯＰ２Ａバイオマーカー状態と組合せたＴＩＭＰ−１の効果は、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（Cox proportional hazard model）を使用して調整せずに推定した危険率により定量化した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルはまた、同じ患者材料についてすでに開発されたモデルに基づいて、多変量解析に応用した。この多変量モデルは、ＴＩＭＰ−１、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ２、ＥＲ、腫瘍サイズ、陽性リンパ節、組織型とグレード、更年期状態、およびＣＭＦ若しくはＣＥＦを用いる治療を含んだ。ＩＤＦＳとＯＳに対するＣｏｘ比例ハザードモデルは、適合度（goodness-of-fit）法の結果に従って調整し、及びＥＲホルモン受容体状態ならびに組織型とグレードは、層別変数として含めた。バイオマーカー（ＨＴ、２Ｔ、ＴＩＭＰ−１、ＴＯＰ２Ａ、及びＨＥＲ２）と治療処方（ＣＭＦ又はＣＥＦ）との交互作用は別々のモデルで試験し、ワルド検定（Wald test）を応用した。
【０２０２】
バイオマーカーについて情報が有る患者と無い患者との差、治療法間の差、及びＨＴ（ＨＥＲ２陽性及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性欠如）又は２Ｔバイオマーカー状態と臨床及び病理的変数（ＨＥＲ２状態を含む）との相関は、χ2検定により検定した。Ｐ値は両側検定とした。腫瘍は、ＨＥＲ２陽性及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性欠如がある場合、ＨＴ応答性として分類し、その他の場合はＨＴ非応答性とした。腫瘍は、ＴＯＰ２Ａ異常及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性欠如がある場合、２Ｔ応答性と分類し、その他の場合は２Ｔ非応答性とした。統計解析は、SAS 9-1プログラムパッケージを使用して行った。
【０２０３】
ＤＢＣＧは、試験計画と調整、組織採取、バイオマーカー分析、データ採取、解析、及び報告に関与した。ER1D5抗体、HercepTest、HER2 pharmDXとTOP2A pharmDXキット、及び技術援助は、DAKO A/S（Glostrup, Denmark）から無償で提供された。
【０２０４】
結果
ＤＢＣＧ ８９Ｄ治験は、１９９０年６月〜１９９８年１月の間に１２２４人の患者を集めた。ＩＤＦＳに関して推定される可能な追跡調査時間の中央値は９，８年であり、ＯＳについては１３．８年であった。２００１年にＤＢＣＧは、デンマークで集めた９８０人の参加者のうち８２１人（８４％）から入手できたホルマリン固定パラフィン包埋した原発性乳房腫瘍組織ブロックの遡及的採取を完了し、７０８人（７２％）の患者でＴＭＡの作成に成功した。全部で６２３人の患者について、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、及びＴＩＭＰ−１分析が可能であった。評価可能な６２３人の患者は、更年期状態、腫瘍サイズ、悪性グレード、ＥＲ状態に関して、３５７人の評価不可能者とは有意に異なった（ｐ＜０．０５）。陽性リンパ節の数と組織型は、評価可能患者と評価不可能患者との間で有意差を示さなかった。治療効果は同様であり、危険率は元々の試験で観察された効果（ＩＤＦＳ：危険率０．７６、及びＯＳ：危険率０．７３）（Ejlertsenet al. 2007）に対して、ＩＤＦＳ（調整済み危険率、０．８０（９５％信頼限界（ＣＩ）、０．６３〜１．０１；ｐ＝０．０６）及びＯＳ（調整済み危険率、０．７９；９５％ＣＩ，０．６２〜１．００；ｐ＝０．０５）で、ＣＥＦがよかった。
【０２０５】
評価可能な６２３人の患者のうちで、１８８人（３０％）はＨＥＲ２陽性であり、１３９人（２２％）はＴＯＰ２Ａ異常であり、１５４人（２５％）はＴＩＭＰ−１陰性腫瘍を有した。ＴＯＰ２Ａ異常は、４３５人のＨＥＲ２陰性患者の３３人（８％）にのみ検出された（表２）。これに対してＴＩＭＰ−１免疫反応性は、ＨＥＲ陰性の１２３人（２８％）と、４８４人のＴＯＰ２Ａ正常患者の１３０人（２７％）に検出された。表２は、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、及びＴＩＭＰ−１がうまく実施できる６２３人の患者についての２Ｔ状態に従うベースライン特性を示す。
【０２０６】
ＴＩＭＰ−１をＴＯＰ２Ａ又はＨＥＲ２と組合せる
ＨＥＲ２とＴＩＭＰ−１を用いて、３１１人（５０％）の患者を、ＨＴアントラサイクリン応答性として、例えばＨＥＲ２陽性、ＴＩＭＰ−１陰性、又はＨＥＲ２陽性、及びＴＩＭＰ−１陰性腫瘍プロフィールを有するとして分類した。ＨＴ応答性プロフィールを有する患者は、更年期後である頻度が有意に（ｐ＜０．０５）多く、陽性リンパ節、２cmより大きい腫瘍、及びＥＲ陰性腫瘍を有した。ＨＴ応答性プロフィールを有する患者は、その腫瘍がＨＴ非応答性である患者と比較して、同様のＩＤＦＳ（危険率、１．２２；９５％ＣＩ、０．９７〜１．５２；ｐ＝０．０９）、及び劣ったＯＳ（危険率、１．３３；９５％ＣＩ、１．０６〜１．６７；ｐ＝０．０１）を有した。多変量解析で更年期状態、腫瘍サイズ、陽性リンパ節の数、組織型とグレード、ＥＲとＴＯＰ２Ａ状態について調整すると、ＩＤＦＳ（危険率、１．０３；９５％ＣＩ、０．８０〜１．３３；ｐ＝０．８１）とＯＳ（危険率、１．０５；９５％ＣＩ、０．８１〜１．３６；ｐ＝０．７３）の危険率が変化した。
【０２０７】
ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１を組合せて使用して、２６９人（４３％）の患者は、２Ｔアントラサイクリン応答性、例えばＴＯＰ２Ａ異常を有するか及び／又はＴＩＭＰ−１免疫反応性が欠如すると分類された（表２）。２Ｔ応答性プロフィールは、ＥＲ陰性、ＨＥＲ２陽性、及び大きな腫瘍サイズと相関した（すべてｐ＜０．０１）。２Ｔ応答性プロフィールを有する患者は、２Ｔ非応答性プロフィール患者と比較して、低いＩＤＦＳ（危険率、１．２６；９５％ＣＩ、１．０１〜１．５８；ｐ＝０．０４）とＯＳ（危険率、１．３４；９５％ＣＩ、１．０７〜１．６９；ｐ＝０．０１）を有した。多変量解析で更年期状態、腫瘍サイズ、陽性リンパ節の数、組織型とグレード、ＥＲ発現とＨＥＲ２状態について調整すると、ＩＤＦＳ（危険率、１．１９；９５％ＣＩ、０．９３〜１．５１；ｐ＝０．７１）とＯＳ（危険率、１．１８；９５％ＣＩ、０．９２７〜１．５１；ｐ＝０．１８）の危険率が変化した。
【０２０８】
単一のバイオマーカーとプロフィールに従う治療の不均一性
多変量Ｃｏｘ回帰分析で我々は、ＨＥＲ２状態、ＴＯＰ２Ａ状態、ＴＩＭＰ−１免疫反応性、ＨＴプロフィール、又は２Ｔプロフィールに従う治療効果の不均一性を調べた。統計的に有意な交互作用は無く、ＨＥＲ２及びＴＩＭＰ−１について、ＣＭＦと比較してＣＥＦによるＩＤＦＳとＯＳの改善を示した。すでに報告されているように、ＴＯＰ２Ａ状態と治療効果の間の有意な交互作用が、ＩＤＦＳ（ｐ＝０．００４）とＯＳ（ｐ＝０．０３）について観察された。
【０２０９】
ＣＥＦで治療すると、ＨＴ応答性（ＨＥＲ２陽性又はＴＩＭＰ−１陰性）と分類される腫瘍を有する患者は、ＩＤＦＳで境界の有意な改善（図４Ａ、表４）とＯＳで統計的に有意な改善を有した。これに対して、ＨＴ非応答性プロフィールを有する患者では、ＣＭＦと比較してＣＥＦから有意な利益は無かった。節状態、腫瘍サイズ、組織学、グレード、ＥＲ状態、ＴＯＰ２Ａ状態、ＨＥＲ２状態、ＴＩＭＰ−１発現、及び更年期状態について調整後、ＨＴ応答性プロフィールを有する患者では、ＣＥＦの使用によりさらに好適なＩＤＦＳとＯＳが維持された（それぞれ、ｐ値＝０．０３６と０．０４７；図５）。
【０２１０】
２Ｔ応答性プロフィールを有する患者では、２Ｔ非応答性患者とは反対に、ＣＭＦと比較してＣＥＦは、ＩＤＦＳとＯＳを有意に改善した（図４Ｂ、表４）。患者と腫瘍特性について調整する多変量解析は、２Ｔ応答性プロフィールを有する患者が、ＩＤＦＳ（図５Ａ）とＯＳ（図５Ｂ）に関して、ＣＭＦと比較してＣＥＦから利益を受けることを確認した。これに対して、２Ｔ非応答性プロフィールを有する患者では、ＣＭＦの使用により、さらに好適な結果への有意ではない傾向が存在した（図５）。２Ｔプロフィールと治療効果との間に高度に統計的に有意な交互作用があり、２Ｔ応答性（ＴＯＰ２Ａ異常、又はＴＩＭＰ−１陰性）プロフィールを有する２６９人（４３％）の患者は、ＩＤＦＳ（ワルド検定（Wald test）、ｐ＜０．０００１）とＯＳ（ワルド検定（Wald test）、ｐ＝０．００４）に関して、ＣＭＦと比較してＣＥＦの使用により、さらに好適な結果を経験した（図５）。
【０２１１】
考察
治療法の選択は、可能な場合は、個々の乳癌患者の腫瘍内の特異的標的に対して行われるべきであることは、一般に認められている。しかし、しばしば化学療法の追加が必要であり、化学療法は標的特異性が低いと考えられている。補助療法における有意性が証明されているにもかかわらず、アントラサイクリン類の作用機序はいまだに完全には解明されていない。しかし、提唱された機序のうちで、トポイソメラーゼIIαとアポトーシス誘導との相互作用は、臨床的に適切なアントラサイクリン濃度で起きるようである。本発明者らは、ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１プロフィールの組合せの開発に従事し、ＤＢＣＧ ８９Ｄ治験内で、すでにその予測性を個々に調べた。
【０２１２】
本研究では、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する１８８人の患者のうちで、１０６人（５６％）は、ＨＥＲ２陰性腫瘍を有する８％（４３５人中３３人）と比較して、異常ＴＯＰ２Ａ状態を有した。ＨＥＲ２陽性集団内にはＴＯＰ２Ａ異常腫瘍を有する多くの患者が含まれているため、これらの２つのマーカーを組合せることは現実的ではなかった。ＴＯＰ２Ａ単独を使用して得られる２２％と、ＴＩＭＰ−１単独を使用して得られる２５％と比較して、２Ｔプロフィール中にＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１を取り込むことにより、４３％の患者がアントラサイクリン応答性と分類された。２Ｔ応答性プロフィールを有する４３％の患者について、ＣＥＦの使用は、ＩＤＦＳ事象の５２％の相対的低下と、死亡率の４６％の相対的低下に関連していた。
【０２１３】
これに対して、２Ｔ非応答性プロフィールを有する残りの５７％の患者で、ＣＭＦからの有意ではない利益が見られた。２Ｔ応答性プロフィールと非応答性プロフィールを有する患者内の差の大きさと、これらの推定値の正確度は、臨床的に重要な差を強調するのに充分に高い。治療と２Ｔプロフィールとの高度に統計的に有意な交互作用の知見は、この記載を支持する。ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１応答性プロフィールとを有する４％は、異なる結果は無いようであった。
【０２１４】
ＨＥＲ２は、アントラサイクリン類に対する感受性について、最も頻繁に使用されるバイオマーカーであり、ＴＯＰ２Ａ異常の大半は、ＨＥＲ２陽性腫瘍中で観察される。比較のために、本発明者らはＨＥＲ２とＴＩＭＰ−１とを組合せて、腫瘍がＴＩＭＰ−１免疫反応性を欠如しているか及び／又はＨＥＲ２陽性である場合は、患者はＨＴアントラサイクリン応答性であるとして分類した。
【０２１５】
ＣＭＦと比較してＣＥＦからの利益は、ＨＴ応答性プロフィールを有する５０％の患者で実質的に大きく、この不均一性は、ＨＴプロフィールと治療との統計的に有意な交互作用により確認された。本発明者らは、単一のマーカーとしてのＴＩＭＰ−１又はＨＥＲ２に従う鑑別的治療効果についての証拠は見つけられず、これはバイオマーカーを組合せることの効果を強調している。
【０２１６】
結論として、ＴＯＰ２ＡとＴＩＭＰ−１とに基づく２Ｔプロフィールの組合せ解析は、これらの２つのバイオマーカーを組合せると、ＣＭＦ中でメソトレキセートの代わりにエピルブシンを使用することにより有意に利益を受ける大部分（ほとんどすべてではない）の患者を同定できることを示す。２Ｔプロフィールは、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、及びＴＩＭＰ−１が単独に行うより、より大きなアントラサイクリン応答性亜集団を区別する。
【０２１７】
表
【０２１８】
【表１】
2011520456.tif 000003
【０２１９】
【表２】
2011520456.tif 000004
【０２２０】
【表３】
2011520456.tif 000005
【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
【表５】
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【０２２３】
【表６】
2011520456.tif 000008
【０２２４】
【表７】
2011520456.tif 000009
分析に含まれる
【０２２５】
【化１】
2011520456.tif 000010
【０２２６】
【化２】
2011520456.tif 000011
【０２２７】
【化３】
2011520456.tif 000012
【図１Ａ】
2011520456.tif 000013
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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