(57)【要約】  本発明は、その製造方法を含めて、新規ＢＭＰ−１２関連タンパク質を提供する。このタンパク質には、置換、切断および置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質が含まれる。置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、１つまたは複数の酸化感受性メチオニン残基の、ノルロイシンなどの非メチオニン残基での置換を含有する。置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、置換されていないタンパク質と比較して正常な生物活性および増強された酸化耐性を示す。切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は増強された活性を示す。【図１】2011522565.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる、配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項３】
配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項４】
配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項５】
配列番号１のメチオニン８４に対応する残基でのアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項６】
配列番号１のメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項７】
配列番号１のメチオニン８４に対応する残基でのアミノ酸置換およびメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項８】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換が、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される残基である、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項９】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換が、ノルロイシン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される残基である、請求項８に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換がノルロイシン残基である、請求項９に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１１】
１〜２７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含む、請求項１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１２】
１〜２２個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含む、請求項１１に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１３】
１〜１８個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含む、請求項１２に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１４】
１〜７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含む、請求項１３に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１５】
腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる、１〜２７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含むＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１６】
切断されたサブユニットが１〜２２個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、請求項１５に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１７】
切断されたサブユニットが１〜１８個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、請求項１６に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１８】
切断されたサブユニットが１〜７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、請求項１７に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項１９】
切断されたサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項２０】
切断されたサブユニットが配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項２１】
切断されたサブユニットが配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１５に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質。
【請求項２３】
ｉ）腱および／または靱帯様組織の誘導活性を有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸配列を含む宿主細胞を培養するステップと、
ｉｉ）腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる、配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を回収するステップと
を含む、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を産生する方法。
【請求項２４】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸が配列番号２のヌクレオチド４〜３９０と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が細菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細菌を、メチオニン制限、ロイシン制限、ノルロイシン過剰、およびその組合せからなる群から選択される条件下で培養する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が１〜２７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
ｉ）腱および／または靱帯様組織の誘導活性を有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、
ｉｉ）腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる、１〜２７個のアミノ酸のＮ末端切断を有する少なくとも１つの切断されたサブユニットを含むＢＭＰ−１２関連タンパク質を回収するステップと
を含む、切断されたサブユニットを含むＢＭＰ−１２関連タンパク質を産生する方法。
【請求項３３】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
核酸が配列番号２のヌクレオチド４〜３９０と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞が細菌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸。
【請求項４０】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基でのアミノ酸置換が、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される残基である、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
請求項１５から２３のいずれか一項に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸。
【請求項４２】
腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる、配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を含む組成物。
【請求項４３】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換が、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４７】
配列番号１のメチオニン８４および／またはメチオニン１２１に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換が、ノルロイシン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される非メチオニン残基である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
細菌の発酵産物である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
細菌が、配列番号２のヌクレオチド４〜３９０と少なくとも９０％同一の配列を含む核酸によってコードされているタンパク質を発現する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
細菌を、メチオニン制限、ロイシン制限、ノルロイシン過剰、およびその組合せからなる群から選択される条件下で増殖させる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含み、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導する能力を有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５３】
配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含み、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導する能力を有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５４】
配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含み、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導する能力を有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５５】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が全ＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約１％を含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が全ＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約５％を含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が全ＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約１０％を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が全ＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約２０％を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質が全ＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約５０％を含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
本質的にＢＭＰ−１２関連タンパク質からなる、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも約１０重量％のＢＭＰ−１２関連タンパク質を含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
発酵産物である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
適切な医薬担体をさらに含む、請求項４２、または５２から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質と適切な医薬担体とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
請求項１５から２３のいずれか一項に記載のＢＭＰ−１２関連タンパク質と適切な医薬担体とを含む医薬組成物。
【請求項６６】
有効量の請求項６４に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象において腱または靱帯様組織の疾患または欠損を治療する方法。
【請求項６７】
有効量の請求項６５に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象において腱または靱帯様組織の疾患または欠損を治療する方法。
【請求項６８】
請求項２３から３８のいずれか一項に記載の方法によって作製する生成物。
【請求項６９】
医薬品の調製における、請求項１から２２のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の核酸、請求項４２から６５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項６８に記載の生成物の使用。
【請求項７０】
医薬品を、対象における腱または靱帯様組織の疾患または欠損の治療に使用する、請求項６９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により組み込まれている、２００８年６月９日に出願の米国仮特許出願第６１／０５９，８７０号の先出願日の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ペプチド成長因子の分野に関する。具体的には、本発明は、腱およびまたは靱帯様組織の誘導活性を有する新規ＢＭＰ−１２関連タンパク質、ならびにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーは、生理的に重要な成長調節および形態形成特性を保有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、８：１３３〜１４６（１９９４）、Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５〜２７２（１９９８））。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長および分化因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである（Ｒｏｓｅｎら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：９１９〜９２８（２００２））。ＢＭＰが存在するという最初の証拠の一部は、筋肉内に移植した際に脱ミネラル化した骨が新しい骨を誘導する能力である（Ｕｒｉｓｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５０：８９３〜９９（１９６５））。続いてＢＭＰを脱ミネラル化した骨から生化学的に精製し（Ｗａｎｇら、ＰＮＡＳ、８５：９４８４〜９４８８（１９８８））、精製したタンパク質のペプチド断片から設計した、放射標識したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによってクローニングした（Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：１５２８〜１５３４（１９８８））。クローニングしたＢＭＰを組換えによって発現させ、その機能を保持させた。たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される、組換え成熟ＢＭＰ−２（アミノ酸２８３〜３９６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３７：２９５〜３０２（１９９６））およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｋｕｂｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２７：３０５〜０９（１９９８））のどちらにおいても骨刺激活性を示す。
【０００４】
既知のＢＭＰの相同体をスクリーニングすることによってさらなるＢＭＰをクローニングし、骨、結合組織、腎臓、心臓、および神経の組織の成長および分化の誘導を含めた、広範囲の活性を保有することが示された（Ｒｅｎｇａｃｈａｒｙ、Ｎｅｕｒｏｓｒｕｇ．Ｆｏｃｕｓ、１３（６）：１〜６（２００２））。
【０００５】
ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ−５２（それぞれＧＤＦ７、６、および５として知られる）が含まれるＢＭＰ−１２関連タンパク質は、腱および／または靱帯形成活性を保有するＢＭＰの亜属である（Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：６３９〜６４３（１９９４）、Ｗｏｌｆｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：３２１〜３３０（１９９７）、および国際公開ＷＯ９５／１６０３５号）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、このタンパク質は大きなプレプロタンパク質として合成され、タンパク質分解によってプロセッシングされて、それぞれ約１２０〜１３０個の残基の長さの２つのサブユニットを含有する、成熟した生物活性のある二量体タンパク質が生じる。ＢＭＰ−１２の成熟型は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞中で組換えによって産生することができる。
【０００６】
腱および／または靱帯の傷害の共通部位には、前十字靱帯（Ｌａｕｒｅｎｃｅｉｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１：１９〜４６（１９９９））、アキレス腱（ＭａｚｚｏｎｅおよびＭｃＣｕｅ、Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ、６５：１８０５〜１０（２００２））、回旋腱板、および手の屈筋腱（Ｂｏｙｅｒら、Ｊ．Ｈａｎｄ  Ｔｈｅｒ．、１８：８０〜８５（２００５））が含まれる。腱または靱帯様組織の他の病源には、身体のほとんどの臓器および組織を貫通、支持および包囲する靱帯様筋膜組織の傷害、不全、または先天性の欠損が含まれる。筋膜組織の損傷は、ヘルニアまたは臓器脱出、たとえば膀胱、子宮、または直腸の脱出をもたらす場合がある。
【０００７】
腱および／または靱帯様組織の異所性成長に影響を与えるＢＭＰ−１２関連タンパク質の能力に加えて（ＷＯ９５／１６０３５号、Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７、およびＨｅｌｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、９５：２９８〜３０７（２００１）を参照）、ＢＭＰ−１２およびその関連タンパク質はこれらの組織の修復を増強することが示されている。たとえば、ＢＭＰ−１２は、回旋腱板（Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔら、５ｔｈ  Ｃｏｍｂ．Ｍｔｇ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｃａｎａｄａ，ＵＳＡ，Ｊａｐａｎ，ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅ、講演番号１２８、（２００４））、膝蓋腱（Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔら、５ｔｈ  Ｃｏｍｂ．Ｍｔｇ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｃａｎａｄａ，ＵＳＡ，Ｊａｐａｎ，ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅ、ポスター番号１９７、（２００４））、および深屈筋腱（ｆｌｅｘｏｒ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ｔｅｎｄｏｎ）（Ｌｏｕら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．、１９：１１９９〜１２０２（２００１））の動物モデルにおける修復を改善させた。同様に、ＭＰ−５２（ＧＤＦ−５）は、アキレス腱欠損において治癒を刺激した（Ｒｉｃｋｅｒｔら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１９：１１５〜２６（２００１））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
天然のｈＢＭＰ−１２は成熟タンパク質の位置８４および１２１にメチオニン残基を含有する。これら２つのメチオインは、ＢＭＰ−１２のほとんどの種で保存され、ヒトＢＭＰ−１２関連タンパク質−ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ−５２間でも保存されており、タンパク質中で重要な機能的役割を果たすことが示唆される。しかし、注意深くプロセス制御を行わなければ、これらのメチオニンはＢＭＰ−１２関連タンパク質の大スケール産生の間に特に酸化されやすく、タンパク質の失活がもたらされる。したがって、大スケール産生を受け入れやすく、かつその腱および／または靱帯様組織の誘導活性を維持するＢＭＰ−１２関連タンパク質が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、酸化失活に対する耐性が増加した新規ＢＭＰ−１２および関連タンパク質を提供する。これらのタンパク質に基づいた治療剤の拡大する必要性を満たすために、本発明のＢＭＰ−１２関連タンパク質は高スループット産生を特に受け入れやすい。本発明は、部分的に、１つまたは複数の天然のメチオニン残基が非メチオニン残基で置換された成熟ＢＭＰ−１２タンパク質（「置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質」）が、酸化による失活に対する耐性の増加を示すだけでなく、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性も維持したという驚くべき発見に基づく。これらの残基が高度に保存されており、したがって、一般にタンパク質の活性に重要であると考えられることに鑑みて、このことは特に驚くべきである。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を提供する。置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、成熟ＢＭＰ−１２関連タンパク質のメチオニンに対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、置換は配列番号１のメチオニン８４に対応する残基であり得る。他の実施形態では、置換は配列番号１のメチオニン１２１に対応する残基であり得る。さらなる実施形態では、配列番号１のメチオニン８４および１２１の両方に対応する残基で置換が存在し得る。
【００１１】
一部の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質のメチオニン残基は、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、またはフェニルアラニンから選択されるアミノ酸で置換されている。より具体的な実施形態では、メチオニン残基はノルロイシン、ロイシン、またはイソロイシンで置換されている。さらにより具体的な実施形態では、メチオニン残基はノルロイシンで置換されている。２つ以上のメチオニンの置換を有する置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、同じ残基でメチオニンのそれぞれが置換されているか、または異なる残基でメチオニンのそれぞれが置換されていてよい。
【００１２】
特定の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、配列番号１、３、または４のいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含み、腱および／または靱帯様組織を誘導することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質はＢＭＰ−１２である。他の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質はＢＭＰ−１３である。さらに他の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質はＭＰ−５２である。一部の実施形態では、本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質には、少なくとも１つの切断されたサブユニット、すなわち、二量体タンパク質のうちの１つの単量体が含まれ、１〜２７個の長さのアミノ酸のＮ末端切断を有する（「置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質」）。特定の実施形態では、Ｎ末端切断は最大２２個、たとえば、１８または７個のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの切断されたサブユニットを有するが、配列番号１のメチオニン８４または１２１に対応する残基でどのような置換も含有しないＢＭＰ−１２関連タンパク質を提供する（「切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質」）。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は組成物の一部である。特定の実施形態では、組成物は、配列番号１のメチオニン８４および１２１に対応する残基にメチオニンを有し、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができるＢＭＰ−１２関連タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は適切な医薬担体をさらに含む。
【００１４】
特定の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、組成物中のＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、またはそれより多くを構成し得る。特定の実施形態では、組成物は細菌中での発酵によって産生する。一部の実施形態では、細菌は、メチオニン制限、ロイシン制限、ノルロイシン過剰、およびその組合せからなる群から選択される条件下で培養する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、対象において腱または靱帯の欠損を治療する方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、配列番号２のヌクレオチド４〜３９０と少なくとも９０％同一の配列を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、核酸は置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしており、メチオニン残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、またはフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。より具体的な実施形態では、メチオニン残基は、ロイシンまたはイソロイシンで置換されている。特定の実施形態では、本発明によって提供される核酸は、ベクターまたは宿主細胞中に含有される。特定の実施形態では、宿主細胞は細菌である。より具体的な実施形態では、細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００１８】
本明細書中に組み込まれており、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、成熟ヒトＢＭＰ−１２のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号２は、成熟ヒトＢＭＰ−１２をコードしている核酸配列である。この配列には、成熟タンパク質中に存在しない残基をコードしている、「ａｔｇ」開始コドンおよび２つの「ｔａａ」終止コドンが含まれる。この配列の翻訳を配列番号９に提供する。
【００２１】
配列番号３は、成熟ヒトＢＭＰ−１３のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号４は、成熟ヒトＭＰ−５２のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号５および６は、ＢＭＰ−１２  Ｔ１０ペプチドの配列である。
【００２４】
配列番号７および８は、ＢＭＰ−１２  Ｔ１２ペプチドの配列である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】置換された種を有する（図１Ｂ）または有さない（図１Ａ）ＢＭＰ−１２単量体の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す図である。図１Ａは、配列番号１の残基１〜４として「ＴＡＬＡ」および配列番号１の残基１２６〜１２９として「ＣＧＣＲ」を開示する。
【図２】置換された種を有する（図２Ｂ、２Ｄ）または有さない（図２Ａ、２Ｃ）バッチの、精製したＢＭＰ−１２単量体（図２Ａ、２Ｂ）および可溶化した封入体（ｓＩＢ）中に存在する未精製のＢＭＰ−１２単量体（図２Ｃ、２Ｄ）の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す図である。「ＤＳ」とは薬原体（精製したＢＭＰ−１２）をいう。
【図３】ロット１７４（図１Ｂ、置換された種を含有）およびロット１４８（図１Ａ、置換された種を含まない）からのＢＭＰ−１２単量体のペプチドマップを示す図である。ロット１７４中の新しいピークを点線によって示す。注記：ｃｂｍ：カルバミル化、ｏｘ：酸化、ｄ：脱アミド化。
【図４】トリプシン消化産物を含めた、成熟ヒトＢＭＰ−１２単量体の配列を示す図である（配列番号１）。すべて大文字またはすべて小文字の残基の交互のストリングは、明白なトリプシンペプチドに対応する。
【図５】置換された種を含有しない（図５Ａ）または含有する（図５Ｂ）ＢＭＰ−１２バッチのＴ１０ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルを示す図である。図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ配列番号５〜６を出現順に開示する。
【図６】置換された種を含有しない（図６Ａ）または含有する（図６Ｂ）ＢＭＰ−１２バッチのＴ１２ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルを示す図である。図６Ａおよび６Ｂは、それぞれ配列番号７〜８を出現順に開示する。
【図７】有意なレベルの置換された種を有する（１７４）および有さない（００２）バッチにおける、細胞に基づいたＢＭＰ−応答エレメントルシフェラーゼ（ＢＲＥ−ｌｕｃ）レポーターからの相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｒｈＢＭＰ−１２濃度の関数として示す、当てはめた片対数プロットの図である。
【図８】様々なレベルの過酢酸（ＰＡＡ）で処理した野生型ＢＭＰ−１２の単量体（部位あたり＜５％の置換）の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す図である。２ｏｘ：両方のメチオニン残基が酸化されている、１ｏｘ：２個のメチオニン残基のうちの１個が酸化されている、０ｏｘ：酸化されていない。
【図９】様々なレベルのＰＡＡで処理したＢＭＰ−１２（二量体、部位あたり＜５％の置換）の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥトリシンゲルを示す写真である。
【図１０】特異的活性（ＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイによって決定）対様々なレベルのＰＡＡで処理した高度に精製したＢＭＰ−１２（二量体、部位あたり＜５％の置換）の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣ（図８）によって測定した酸化された種の合計％（一重および二重酸化された単量体種の合計）を示すプロットである。最小二乗回帰直線をプロット上に含める。
【図１１】高（部位あたり２５〜４０％）および低（＜５％）レベルの置換を有する試料について、二重酸化されたＢＭＰ−１２に対応するＲＰ−ＨＰＬＣプロフィール上の％ピーク面積をＰＡＡ濃度の関数として示すプロットである。
【図１２】低い（＜５％）置換率を有するＢＭＰ−１２のバッチおよび高い（２５〜４０％）置換率を有するＢＭＰ−１２のバッチのプールについて、ＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイで測定されたＢＭＰ−１２の％対照（非処理）活性をＰＡＡ／ＢＭＰ−１２のモル比の関数として示すプロットである。
【図１３】緩衝液単独（図１３Ａ）、切断された二量体ＢＭＰ−１２種を含有するバッチ（図１３Ｃ、１３Ｄ）、および含有しないバッチ（図１３Ｂ）の非還元性ＳＤＳ−ＣＥの結果を示すプロットである。１０ｋＤａの内部標準を注記した。矢印は新しいプレピークを示す（図１３Ｃ、１３Ｄ）。ＩＲＭ＃１は参照物質である。
【図１４】成熟ＢＭＰ−１２の２３ＲＧＲ．．．ＧＣＲ１２９に対応するＢＭＰ−１２の切断された単量体のナノＥＳＩ  ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。図１４は配列番号１を開示する。
【図１５】トリプシンを用いて様々な酵素対基質比で処理したＢＭＰ−１２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。
【図１６】細胞に基づいたＢＭＰ−応答エレメントルシフェラーゼ（ＢＲＥ−ｌｕｃ）レポーターからの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、様々な度合のトリプシン誘導性切断を有する試料のｒｈＢＭＰ−１２濃度の関数として示す、当てはめた片対数プロットである。アッセイで使用した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真の挿入図であり、切断されていない対照と比較した、それぞれの試料中に存在する切断の度合およびそれぞれの試料の推定効力を示す。
【図１７】ヒトＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ−５２の成熟配列の複数の配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
「ＢＭＰ−１２関連タンパク質」とは、腱および／または靱帯様組織の誘導活性を有しており、また、アミノ酸レベルで成熟ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、またはＭＰ−５２（ＧＤＦ７、６、および５としても知られる）タンパク質の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一の配列を含む、２つのジスルフィドで連結された単量体サブユニットを含有する、二量体タンパク質である。本発明は、置換、切断、および置換かつ切断された（「置換−切断された」）ＢＭＰ−１２関連タンパク質、ならびにその製造方法を提供する。これらの新規ＢＭＰ−１２関連タンパク質は正常な生物活性および物理的特徴を示すが、特に大スケール産生中の、酸化による失活に対する耐性の増加を示す。
【００２７】
一部の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質には、たとえばカルバミル化を含めた追加の修飾が含まれる場合がある。したがって、「カルバミル化されたＢＭＰ−１２関連タンパク質」は少なくとも１つのカルバミル化されたサブユニットを含有する。一部の実施形態では、カルバミル化されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は２つのカルバミル化されたサブユニットを含有する。ＢＭＰ−１２関連タンパク質のカルバミル化は、タンパク質を高レベルの尿素と共にインキュベーションする精製際に起こる。尿素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出したＢＭＰ−１２関連タンパク質を含有する封入体の可溶化を支援する。カルバミル化はＢＭＰ−１２関連タンパク質の活性に影響を与えないと考えられる。本明細書中で論じる本発明の置換、切断、または置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質のいずれかもカルバミル化し得る。
【００２８】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質および切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質
「切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質」は、二量体タンパク質の少なくとも１つのサブユニットのＮ末端から、少なくとも１個、３個、５個、７個、１０個、１５個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、またはそれより多くの残基のＮ末端が切断されている。一部の実施形態では、切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、１つの切断されたサブユニットを含有する。他の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質の両方のサブユニットが切断されている。これらの実施形態では、切断されたサブユニットは、必ずしもそうである必要はないが、長さまたは配列が同一であり得る。一部の実施形態では、切断は、ＢＭＰ−１２関連タンパク質サブユニットの成熟型のＮ末端に対応する残基から開始される。特定の実施形態では、切断は、配列番号１、３、または４のアミノ酸番号１に対応する残基から開始される。
【００２９】
したがって、特定の実施形態では、切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２８〜１２８、２８〜１２９、２３〜１２９、２２〜１２９、１９〜１２９、８〜１２９、７〜１２９、もしくは１〜１２９、または、配列番号３もしくは４の２８〜１１９、２８〜１２０、２３〜１２０、１９〜１２０、１４〜１２０、１３〜１２０、８〜１２０、７〜１２０、６〜１２０、もしくは１〜１２０に対応する残基を含むサブユニットを含有する。「に対応する残基」とは、参照残基と同じ機能的およびまたは構造的な役割に最も近い役割を果たす残基を意味する。これは、目視検査、スミス−ウォーターマン、ＢＬＡＳＴ、マルコフモデル、またはＣｌｕｓｔａｌＷなどの配列アラインメントを含めた、当分野で知られている手段によって決定する。２つの配列を相同性によって比較する場合、％相同性はより短い配列の長さにわたるものであることを理解されたい。たとえば、ＢＭＰ−１２関連タンパク質が１０個の残基のＮ末端切断を有し、配列番号１と９０％同一である場合、切断されたタンパク質中の残基の９０％が配列番号１に対応する。特定の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、または１１５個の残基の長さである。本発明によって提供する切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質のいずれかは、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質について以下に記載するメチオニン置換のいずれかを含有し得る。
【００３０】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、たとえば、ヒト、マカク、マウス、およびラットを含めた数々の種において同定されている。当分野で知られているように、これらの配列を、さらなる置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を調製するためのガイドとして使用することができる。ＢＭＰ−１２関連タンパク質間で保存されている残基またはモチーフは、その腱および／または靱帯様組織の形成活性に重要な傾向がある一方で、これらのタンパク質間で異なる残基およびモチーフは、タンパク質の腱および／または靱帯様組織の形成活性を破壊せずに改変できる可能性が高い。たとえば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のＥｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ、およびいくつかの種由来のＢＭＰ−１２関連タンパク質の参照タンパク質の受託番号（ＲｅｆＳｅｑ）を記載する表１を参照されたい。これらのＧｅｎｅＩＤを用いて、公に入手可能な注釈したｍＲＮＡまたはタンパク質の配列を、たとえばユニフォームリソースロケーター（ＵＲＬ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅのＮＣＢＩウェブサイトから検索し得る。参照配列およびその関連する注釈を含めた、これらのＧｅｎｅＩＤに関連する情報は、すべて参照により組み込まれている。
【００３１】
【表１】
2011522565.tif 000003
【００３２】
さらに、図１７は、成熟ヒトＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ−５２タンパク質の複数の配列アラインメントを提供する。シスチンノットモチーフに対応する保存されたシステイン残基をハイライトし、メチオニンに下線を引き太字で示した。示した配列は、完全長プレプロペプチドのＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ識別子である。
【００３３】
置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質
「置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質」は、配列番号１のメチオニン残基８４または１２１に対応する少なくとも１つの残基が非メチオニン残基で置き換えられており、腱および／または靱帯様組織の形成活性を保持している。これらの置換は、ＢＭＰ−１２関連タンパク質二量体の一方または両方のサブユニット中に存在し得る。したがって、特定の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、これらの部位で少なくとも１、２、３、または４個の非メチオニン置換を有する。ＢＭＰ−１２関連タンパク質サブユニットがさらなるメチオニンを含有する場合は、それらは非メチオニン残基で置換されていてもよい。これには、１〜２ｎ個の置換が包含される［ただし、「ｎ」は、成熟タンパク質サブユニット（単量体）中のメチオニンの合計数である］。たとえば、成熟ＢＭＰ−１３単量体は３個の天然のメチオニンを有する：それぞれ配列番号１のＭ８４およびＭ１２１に対応する配列番号３のＭ７５およびＭ１１２、ならびに配列番号１のＬ８１に対応するＭ７２。成熟ＭＰ−５２単量体は４個の天然のメチオニンを有する：それぞれ配列番号１のＭ８４およびＭ１２１に対応する配列番号４のＭ７５およびＭ１１２、ならびに配列番号１のＬ４０およびＬ８１に対応する配列番号４のＭ３１およびＭ７２。本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質中では、これらのメチオニンのいずれかまたはすべてが、非メチオニンアミノ酸残基で置換されていてよい。
【００３４】
置換によりタンパク質の腱および／または靱帯様組織の形成活性が保持される限りは、メチオニンを置換するアミノ酸残基には、１９種の典型的な天然に存在する非メチオニンアミノ酸、任意の非典型的なアミノ酸（たとえば、ノルロイシンまたはノルバリン）、ならびにアミノ酸類似体、誘導体、および修飾体のいずれかが含まれ得る。特定の実施形態では、置換は、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、置換は、ノルロイシン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質中の１つまたは複数のメチオニンはノルロイシンで置換されている。
【００３５】
生物活性
ＢＭＰ−１２関連タンパク質の活性を測定するための様々な方法が当分野で知られている。これらには、ＢＭＰ−１２関連タンパク質が細胞の観察可能な表現型を変化させる、たとえば、適切な宿主細胞における腱および／もしくは靱帯様組織に関連する形態学的変化、またはマウスＬ６細胞における筋芽細胞分化の阻害に影響を与える、細胞に基づいたアッセイが含まれる（ＢＭＰ−１２について示したＩｎａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２２２：３１７〜２２（１９９６））。腱および／または靱帯様組織の誘導活性を検出するための別のモダリティーは異所性移植である。ここでは、ＢＭＰ−１２関連タンパク質を含有するカプセルを宿主動物内に１〜２週間の間移植し、回収し、カプセルの内容物を、たとえば腱および／または靱帯様組織の存在について組織学的に評価する（米国特許第６，１５０，３２８号の実施例ＩＩＩ、ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：６５９１〜６５９５（１９８３））。
【００３６】
ＢＭＰ−１２関連タンパク質の活性は、レポーター分子の発現（すなわち転写または翻訳）を監視することによっても抽出することができる。これには、細胞に基づいたＢＭＰ−応答エレメント−ルシフェラーゼ（ＢＲＥ−ｌｕｃ）レポーターの構築体（ＢＲＥの論述については、Ｋｕｓａｎａｇｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ、１１：５５５〜６５（２０００）を参照）またはＢＭＰ−１２応答性細胞における特徴的なＢＭＰ−１２関連タンパク質誘導性発現プロフィールが含まれる。参照により組み込まれている２００９年２月２６日に出願の米国特許出願第１２／３９３，６２８号は、細胞に基づいたアッセイにおけるＢＭＰ−１２（および関連）タンパク質活性のさらなる検出方法を教示している。この方法には、たとえばＢＭＰ−１２を含有する試験試料に対する用量応答曲線を計算することによって、トロンボスポンジン−４（ＴＨＢＳ４、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＧｅｎｅＩＤ７０６０）を含めたＢＭＰ−１２関連活性マーカーのレベルを検出および／または測定することが含まれる。
【００３７】
新規ＢＭＰ−１２関連タンパク質の産生方法
本発明の置換、切断、または置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、たとえば、タンパク質合成の前および／またはその間に発酵条件を制御して自発性の置換を生じさせること、遺伝子操作、化学合成、ならびに酵素処理によるものを含めた、当分野で知られている様々な手段によって産生することができる。
【００３８】
メチオニン残基での置換に影響を与える発酵条件には、メチオニン制限、ロイシン制限、ノルロイシン過剰（たとえばメチオニンと比較して）、およびその組合せが含まれる。ノルロイシンとは、炭素原子がメチオニンの単一の硫黄原子を置き換えるメチオニン類似体である。ノルロイシンはメチオニルｔＲＮＡ合成酵素の低親和性（メチオニンと比較して）の基質であり、これら２個のアミノ酸の相対的な存在量が質量作用による置換率に影響を与える場合があるという学説が立てられている。たとえば、メチオニンに対するノルロイシンの過剰は、ノルロイシンの置換率を増加させることができる。
【００３９】
したがって、一部の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、ノルロイシンがメチオニンのモル濃度過剰にある条件下において、発酵で産生させることができる。ノルロイシンまたは別の適切な酸化耐性メチオニン類似体は、メチオニンと比較して少なくとも１．１、１．２、１．５、１．８、２、４、８、１０、２０、４０、５０、８０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００倍、またはそれより多くのモル濃度過剰であり得る。ノルロイシンは、タンパク質合成の前またはその間に発酵培地に加え得る。あるいは、またはそれに加えて、１つまたは複数のノルロイシン前駆体をタンパク質合成の前またはその間に発酵培地に加えることができる。
【００４０】
ロイシン合成経路がノルロイシン産生を司っているため、ロイシンの存在量はノルロイシンの合成速度に影響を与える場合がある（Ｋｉｓｕｍｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４：１３５〜１３８（１９７７）およびＫｉｓｕｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８０：３３３〜３３０（１９７６））。たとえば、ロイシンが制限されている場合は、ロイシン生合成経路が活性化され、ノルロイシンが合成される。逆に、ロイシン生合成経路が非活性である場合は（たとえば、増殖培地中の過剰のロイシンが原因）、ノルロイシン合成が低下または中止される。
【００４１】
したがって、一部の実施形態では、細胞は、ロイシン生合成経路の活性化を支持することが知られている条件、たとえば、ロイシンなし、低ロイシン、またはロイシン制限の培地中での増殖の下で増殖させ得る。たとえば、標準の増殖条件下よりも、少なくとも５０％、８０％、９０％、９９％、または少なくとも１、２、５、１０、２０、４０、１００、５００倍少ないロイシンが存在し得る。一部の標準細菌増殖条件におけるロイシン濃度は、約３０〜１２０ｍｇ／Ｌ、たとえば約６０ｍｇ／Ｌであり得る。一部の実施形態では、発酵培地は補充ロイシンを含有しない。一部の実施形態では、細胞を、タンパク質合成の前に遊離ロイシンの利用可能なプールを消失または枯渇させるための期間の間、増殖させる。たとえば、アミノ酸源、たとえば酵母抽出物またはタンパク質加水分解物を含有する増殖培地は、たとえばタンパク質合成を誘導する前の宿主細胞の増殖期を延長することによって、アミノ酸を枯渇させることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、野生型宿主細胞と比較して１つまたは複数のロイシン生合成遺伝子の発現レベルが上昇していてもよく、それにより、たとえば、たとえば抑制解除が原因でロイシン生合成経路の構成的活性化がもたらされる。
【００４２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、メチオニンなし、低メチオニン、またはメチオニン制限の条件下で増殖させ得る。たとえば、標準の増殖条件下よりも、少なくとも５０％、８０％、９０％、９９％、または少なくとも１、２、５、１０、２０、４０、１００、５００倍少ないメチオニンが存在し得る。一部の標準の細菌増殖条件におけるメチオニン濃度は、約１０〜４０ｍｇ／Ｌ、たとえば約２０ｍｇ／Ｌであり得る。一部の実施形態では、発酵培地は補充メチオニンを含有しない。一部の実施形態では、細胞を、タンパク質合成の前に遊離メチオニンの利用可能なプールを消失または枯渇させるための期間の間、増殖させる。一部の実施形態では、宿主細胞はメチオニンを低レベルで産生するか産生しない場合があり、たとえば、細胞はメチオニン栄養要求体である。より具体的な実施形態では、宿主細胞は、野生型宿主細胞と比較して、１つまたは複数のメチオニン生合成遺伝子、たとえばメチオニン合成酵素の発現が低下し、低い、またはない場合がある。
【００４３】
特定の発酵条件は、タンパク質におけるメチオニンのノルロイシンでの自発性の置換に影響を与えることが知られており、本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を産生するために使用することができる。これらには、たとえば、メチオニンに対して１００倍過剰のノルロイシン：２００ｍｇ／Ｌのノルロイシンおよび２ｍｇ／Ｌのメチオニンを有する培地中での発酵が含まれる（ＡｎｆｉｓｅｎおよびＣｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４４：５１４９〜５２（１９６９）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）メチオニン栄養要求体において１５％の完全に置換された組換えブドウ球菌ヌクレアーゼの産生を示す）。変更したメチオニン／ノルロイシン比を有する別の培地は、６ｇ／リットルのＫＨ２ＰＯ４、１８．３ｇ／リットルのＫ２ＨＰＯ４、４ｇ／リットルの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４ｇ／リットルのＭｇＳ０４・７Ｈ２０、５×１０−４ｇ／リットルのＦｅＳＯ４・７Ｈ２０、８ｇ／リットルのグリセロール、０．１ｇ／リットルのアンピシリン、３×１０−３ｇ／リットル（２×１０−５Ｍ）のＬ−メチオニン、０．２ｇ／リットル（１．５×１０−３Ｍの）ＤＬ−ノルロイシンである（Ｇｉｌｌｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：８２０４〜８２０９（１９８８）により、産生されたタンパク質の約２０％でその６個すべてのメチオニンがノルロイシンで置き換えられている、組換えアデニル酸キナーゼが産生された）。米国特許第５，５９９，６９０号に開示されているように、別の方法では、ノルバリンを培地に加えてノルロイシン置換を増加させることができる（ノルロイシン（０．２５ｇ／Ｌのバッチ、１．２５ｇ／Ｌのフィード）またはノルバリン（０．３７ｇ／Ｌのバッチ、１．２５ｇ／Ｌのフィード）の補充により、組換えＩＬ−２において４０％までのノルロイシン置換が生じた）。ノルバリンが脱アミド化されてα−ケトバレレートが形成され、ロイシン生合成経路によってこれをノルロイシンに変換することができるという学説が立てられている。
【００４４】
あるいは、最初にアミノ酸に富んだシード培地、その後、低アミノ酸発酵培地（たとえば、逆浸透水中、１リットルあたり１０．９０ｇのＮａ（ＮＨ４）ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、２．６１ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．９２ｇのクエン酸（無水）、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．００ｇの酵母抽出物、０．７５ｍＬのＳＡＧ４１３０、後に無菌的な微量栄養素混合物およびセレロースを補充）の、２ステップの発酵を用いてメチオニン置換を誘導し得る（Ｂｒｕｎｎｅｒら、米国特許第５，６９８，４１８号および第５，６２２，８４５号、その４つの天然のメチオニンで３６％までのノルロイシン置換を有する組換えウシソマトトロピンを示す）。
【００４５】
一部の実施形態では、本発明の置換、切断、または置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、固相ペプチド合成などの化学合成によって産生する。ペプチド合成は、自動ペプチド合成機の使用を含めた、当分野で知られている手段によって行う。ペプチド合成の論述については、たとえば、Ｊｏｈｎ  Ｈｏｗｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、第１版（２００５）、Ｎ．Ｌｅｏ  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＣＲＣ、第１版（２００５）、および米国特許第７，３２９，７２７号を参照されたい。
【００４６】
本発明の置換、切断、または置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、当分野で知られている遺伝子操作技術を用いて産生することもできる。たとえば、Ｊｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤａｖｉｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版（２００１）を参照されたい。たとえば、それぞれ配列番号１のメチオニン８４および１２１をコードしている配列番号２のヌクレオチド２５３〜２５５および３６４〜３６６に対応するヌクレオチドの「ＡＴＧ」コドンのうちの少なくとも１つを、非メチオニンコドンで置き換え得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸のメチオニンコドンを、ロイシン（ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、ＴＴＧ）、イソロイシン（ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ）、バリン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧ）、アラニン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ）、またはフェニルアラニン（ＴＴＴ、ＴＴＣ）をコードしているコドンで置き換える。より具体的な実施形態では、メチオニンコドンを、ロイシン（ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、ＴＴＧ）またはイソロイシン（ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ）をコードしているコドンで置き換える。一部の実施形態では、配列番号１のメチオニン８４および１２１に対応するメチオニン残基をコードしているコドンのうちの一方のみを置き換える。他の実施形態では、配列番号１のメチオニン８４および１２１に対応するメチオニンをコードしているコドンの両方を置き換える。両方のコドンを置き換える場合、これらは同じコドンまたは異なるコドンで置き換え得る。
【００４７】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、本発明の置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている核酸を提供する。特定の実施形態では、配列番号１のＭ８４もしくはＭ１２１、または配列番号３もしくは４のＭ７５もしくはＭ１１２に対応するアミノ酸のうちの少なくとも１つをコードしているコドンを置き換える。より具体的な実施形態では、配列番号３もしくは４のＭ７２、および／または配列番号４のＭ３１に対応するアミノ酸をコードしているコドンも置き換える。
【００４８】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号２のヌクレオチド４〜３９０の縮重配列を含有する。特定の実施形態では、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（たとえば、少なくとも約６×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳで６５℃、０．１×ＳＳＣ中の約２０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを用いた、１０分間、約４２℃の最初の洗浄、および続いて０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを用いた６５℃の洗浄）で配列番号２とハイブリダイズし、腱および／または靱帯様組織の誘導活性を有する置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている。一部の実施形態では、本発明は、配列番号２のヌクレオチド４〜３９０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一の配列を含有し、腱および／または靱帯様組織の形成活性を有するタンパク質をコードしている核酸を提供する。
【００４９】
他の実施形態では、本発明の核酸は、腱および／または靱帯様組織の形成活性を有する切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質をコードしている。切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質を作製するためには、たとえば、配列番号１のアミノ酸１〜２７および１２９、１〜２７、１〜２２、１〜２１、１〜１８、１〜７、もしくは１〜６、または配列番号３もしくは４の１〜１８および１２０、１〜１８、１〜７、もしくは１〜５に対応するアミノ酸をコードしているヌクレオチドを欠失させる。本発明の核酸は、たとえば部位特異的突然変異誘発による、野生型ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、またはＭＰ−５２の改変によって作製することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、特定の宿主細胞におけるタンパク質の発現レベルを増強させるために最適化し得る。最適化には、たとえば、コドンの最適化、ｍＲＮＡの安定性に影響を与える修飾、ならびに改変された翻訳開始および終結部位が含まれる。組換えタンパク質発現の最適化方法のさらなる論述については、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：３４６〜５３（２００４）ならびにＳｏｒｅｎｓｅｎおよびＭｏｒｔｅｎｓｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１５：１１３〜２８（２００５）を参照されたい。
【００５１】
本発明の核酸はベクター内に含有され得る。一部の実施形態では、ベクターには選択マーカー（たとえば、アンピシリン、テトラサイクリン、シプロフロキサシン、Ｇ４１８、またはプロマイシンなどの抗生物質に対する耐性をコードしている１つまたは複数の遺伝子）が含まれる。一部の実施形態では、ベクターには、本発明の核酸の転写および翻訳を駆動するための制御配列（たとえば、ガラクトース誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター）ならびに１つまたは複数の複製起点が含まれる。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明の核酸およびベクターを適切な宿主細胞に含有させ得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、たとえば、哺乳動物、たとえば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、チンパンジー、もしくはマカク、真菌、たとえば、分裂もしくは出芽酵母、または細菌、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくは蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来であり得る。
【００５３】
一部の実施形態では、切断されたまたは置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質は、ＢＭＰ−１２関連タンパク質または置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質の消化によって産生することができる。たとえば、完全長、成熟ＢＭＰ−１２関連タンパク質または置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質を、プロテアーゼ、たとえばトリプシンと共に、切断されたまたは置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質を産生するために十分な時間インキュベーションすることができる。たとえば、ＢＭＰ−１２関連タンパク質（置換されているまたは置換されていない）を、たとえば緩衝洗剤溶液中のトリプシンと共に、約１：５０、１：１００、１：２００、１：５００、１：１０００、１：２０００、または１：４０００の酵素対基質比で、たとえば、約１、２、４、５、１０、１５、２０、３０分間、またはそれより長い期間インキュベーションすることができる。
【００５４】
組成物および担体
本発明の新規ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、組成物の一部であり得る。一部の実施形態では、組成物は、配列番号１のメチオニン８４および１２１に対応する位置にメチオニン残基を含有するＢＭＰ−１２関連タンパク質をさらに含む（「ｍｅｔ−ＢＭＰ−１２関連タンパク質」）。特定の実施形態では、ｍｅｔ−ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、配列番号１、３、または４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一の配列を含み、腱および／または靱帯様組織の形成を誘導することができる。
【００５５】
一部の実施形態では、組成物は、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質、切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質、置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質、ｍｅｔ−ＢＭＰ−１２関連タンパク質、およびその組合せを含めた、ＢＭＰ−１２関連タンパク質を含む、またはそれから本質的になり得る。ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、組成物の粗乾重量の少なくとも約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより多くを構成することができる。特定の実施形態では、置換ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、組成物中のＢＭＰ−１２関連タンパク質の少なくとも約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、またはそれより多くを構成し得る。特定の実施形態では、組成物中のＢＭＰ−１２関連タンパク質サブユニットのメチオニン残基は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより多くの、残基あたりの置換率を有することができる。特定の実施形態では、組成物には、その組合せおよびヘテロ二量体、ならびにタンパク質が置換、切断、または置換−切断されていてよいものを含めた、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、またはＭＰ−５２が含まれ得る。
【００５６】
一部の実施形態では、組成物は細菌の発酵産物である。特定の実施形態では、細菌は、メチオニン制限、ロイシン制限、ノルロイシン過剰、およびその組合せから選択される条件下で増殖させる。一部の実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、細菌の全タンパク質の少なくとも約１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはそれより多くを構成する。より具体的な実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、細菌の全タンパク質の少なくとも１０％を構成する。さらにより具体的な実施形態では、ＢＭＰ−１２関連タンパク質は、細菌の全タンパク質の約１０〜２４％を構成する。
【００５７】
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の医薬担体をさらに含み得る。適切な医薬担体は、従事者によって所望される特性に基づいて選択される。ＢＭＰ用の医薬担体の一般的な総説には、たとえば、ＳｅｅｈｅｒｍａｎおよびＷｏｚｎｅｙ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、１６（３）：３２９〜４５（２００５）を参照されたい。一般に、担体は、本発明のＢＭＰ−１２関連タンパク質の活性を保持し、かつ生体再吸収可能である必要がある。担体分子は、治療部位におけるＢＭＰ−１２関連タンパク質の保持時間を有利に増加させ得る。さらに、担体は、残留担体が治癒を妨害せずに、細胞の浸潤を可能にすべきである。
【００５８】
適切な担体には、可溶化賦形剤および安定化剤、天然ポリマー、たとえば、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナン、キトサン、絹、フィブリン、アルギネートまたはアガロース、人工ポリマー、たとえば、ポリラクチドまたはポリグリコリドおよびそのコポリマーなどのポリ（α−ヒドロキシ酸）ポリマー、ならびに無機化合物、たとえば、高温や低温のオルトホスフェート（リン酸カルシウムや焼結セラミックなど）および硫酸カルシウムを含む、緩衝液および溶液が含まれる。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の追加の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの追加の成長因子を含有する。ＢＭＰの説明は以下の出版物中に見つけることができる：ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７（たとえば、米国特許第５，１０８，９２２号、第５，０１３，６４９号、第５，１１６，７３８号、第５，１０６，７４８号、第５，１８７，０７６号、および第５，１４１，９０５号に開示）、ＢＭＰ−８（ＰＣＴ  ＷＯ９１／１８０９８号に開示）、ＢＭＰ−９（ＰＣＴ  ＷＯ９３／００４３２号に開示）、ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ  ＷＯ９４／２６８９３号に開示）、ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ  ＷＯ９４／２６８９２号に開示）、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３（ＰＣＴ  ＷＯ９５／１６０３５号に開示）、ＢＭＰ−１５（米国特許第５，６３５，３７２号に開示）、ＢＭＰ−１６（米国特許第６，３３１，６１２号に開示）、ＭＰ−５２（ＰＣＴ  ＷＯ９３／１６０９９号に開示）、ならびにＢＭＰ−１７およびＢＭＰ−１８（米国特許第６，０２７，９１７号に開示）。これらのタンパク質への言及には、ＢＭＰの変異体、対立遺伝子変異体、断片、ならびに、それだけには限定されないが、欠失突然変異体、挿入突然変異体、および置換突然変異体を含めた突然変異体が含まれることを理解されたい。特に、任意の特定のＢＭＰへの言及には、少なくとも１、３、５、７、１０、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、またはそれより多くの残基が成熟タンパク質のＮ末端から除去されているＮ末端切断断片が含まれることを理解されたい。特定の実施形態では、組成物には、本発明の置換、切断、または置換−切断されたＢＭＰ−１２関連タンパク質の１つのサブユニットおよび別のＢＭＰの１つのサブユニットを含有するヘテロ二量体が含まれる。ヘテロ二量体は、たとえば、参照により組み込まれているＷＯ９３／００９２２９号にさらに詳述されている。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
置換ＢＭＰ−１２の発見
組換えＢＭＰ−１２の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生の発酵条件の開発中に、ＢＭＰ−１２の新種が後期に溶出されるＲＰ−ＨＰＬＣのピーク中で同定され、ペプチドマップにおいて確認された。
【００６１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＢＭＰ−１２発酵物からの可溶化した封入体（ｓＩＢ）を、最小希釈係数１０を有する還元緩衝液（５ＭのグアニジンＨＣｌ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．２）で０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０によって推定）に希釈した。１ＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を１０ｍＭの最終濃度まで加えて、ＢＭＰ−１２を単量体サブユニットへと還元した。還元混合物を４０℃で３０分間インキュベーションし、０．３％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の最終濃度となるまで１０％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）で酸性化した。高度に精製した試料を、希釈係数１０を有する還元緩衝液で０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、上述のようにＤＴＴによって還元させた。ルーチン分析およびＬＣ／ＭＳ分析用のＨＰＬＣ方法は以下のとおりである。
【００６２】
【表２】
2011522565.tif 000004
【００６３】
発酵中の迅速なインプロセススクリーニング用のＨＰＬＣ方法は以下のとおりである。
【００６４】
【表３】
2011522565.tif 000005
【００６５】
図１は、典型的なＢＭＰ−１２ピークの直後期に溶出される２つの新しいピークを有する（ロット１７４、図１Ｂ）または有さない（ロット００２、図１Ａ）、高度に精製したＢＭＰ−１２の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。以前の実験室スケールのＢＭＰ−１２調製物も後期に溶出されるピークを欠き、ロット００２に類似のプロフィールを示す。
【００６６】
（実施例２）
精製ではなく発酵により新しいＢＭＰ−１２種が生じた
前出の実施例に記載した新しいＢＭＰ−１２種は、発酵プロセスから生じ、続く精製からではない可能性が非常に高い。図２Ａおよび２Ｃは、新しい種がｓＩＢ段階（図２Ａ）で既に存在していた場合は、これはさらなる精製（図２Ｃ）によって有意に除去されなかったことを示す。逆に、図２Ｂおよび２Ｄは、ｓＩＢ調製物（図２Ｂ）が新しい種を含有しなかった場合は、これはさらに精製した試料（図２Ｄ）中にも存在しなかったことを示す。様々な発酵由来のいくつかのｓＩＢバッチから同様の結果が得られた。したがって、新しいＢＭＰ−１２種は、発酵プロセスの結果であり、続く精製の結果ではない可能性が高い。
【００６７】
（実施例３ａ）
新しいＢＭＰ−１２種はメチオニン残基での置換を含有する
新しいＢＭＰ−１２種を含有する精製したＢＭＰ−１２材料のうちの１つであるロット１７４を選択して、新しい種のさらなる特徴づけおよび同定を行った。還元性ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて新しい種を示さなかった、以前に調製した材料であるロット１４８を対照として使用した。
【００６８】
図２に示す還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを、高分解能のＷａｔｅｒｓ  ＱＴＯＦ質量分析装置（ＭＳ）と連結させることによってさらに分析した。液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）の結果は、最初に主要なピークが観察質量１４０１４．８Ｄａを有することを示しており、これは、ＢＭＰ−１２単量体サブユニットの理論質量１４０１４．９Ｄａと一致している。新しいＢＭＰ−１２種を含有する２つの後期に溶出されるピークは、野生型ＢＭＰ−１２と比較してそれぞれ−１８Ｄａおよび−３６Ｄａの質量差を有する。これらの後期に溶出されるピークは、全単量体種のそれぞれ約３２％および８％を構成する。
【００６９】
図３Ａおよび３Ｂは、アルキル化およびトリプシン処理後の、それぞれロット１４８（新しい種を有さない）および１７４（新しい種を有する）のペプチドマップを示す。ＢＭＰ−１２の理論的なトリプシン−ペプチドマップを図４に示す。２つの新しいピーク（破線）がロット１７４のマップ中に存在する一方で、Ｔ１２およびＴ１０ペプチドは対応する強度の減少を示した。ＬＣ／ＭＳペプチドマッピングでも２つの新しいピークが示され、２つのＭｅｔ含有ペプチド、Ｔ１０およびＴ１２に対する−１８Ｄａの質量差が限局された。高分解能のＱＴＯＦ質量分析装置により、Ｔ１０およびＴ１２由来のペプチドについてそれぞれ−１７．９４９および−１７．９５７Ｄａの正確な質量差が提供された。ＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析装置の質量の正確さにより、新しいＢＭＰ−１２種がロイシン、イソロイシン、またはノルロイシンによるメチオニンの置換を含有するとして特徴づけすることが可能となった。ロット１７４中の「アーチファクト」のピークは、質量分析により試料調製中の不完全な還元によって引き起こされると同定された。
【００７０】
ロイシン、イソロイシン、またはノルロイシンでメチオニンを置換することの正確な質量差は−１７．９５６Ｄａである。質量値ではロイシン、イソロイシン、またはノルロイシンを識別することができないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の過剰発現はメチオニンの代わりにノルロイシンを取り込むことをもたらす場合があるため、置換されたアミノ酸はノルロイシンである可能性が高い（Ｔｓａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１５６：７３３〜７３９（１９８８）、Ｂｏｇｏｓｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：５３１〜５３９、（１９８９））。
【００７１】
メチオニンおよびノルロイシンを含有するＴ１０およびＴ１２ペプチドを収集し、その後、ナノＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによって断片化して、ノルロイシンでのメチオニンの置換を確認した（図５、図６）。ほぼ同じ割合のＴ１０およびＴ１２ペプチドがノルロイシンで置換された形態中に存在していた。これは、メチオニンおよびノルロイシンの置換には部位優先度がないことを示唆している。
【００７２】
ペプチドマッピングの結果に基づいて、還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィール（図１）における２つの後期に溶出されるピークは、一方（−１８Ｄａ）または両方（−３６Ｄａ）のメチオニンがノルロイシンで置換されているＢＭＰ−１２単量体を表す。ジスルフィド結合した二量体の形態では、４個までのメチオニンからノルロイシンへの置換が可能である。それぞれの単量体サブユニット上のそれぞれのメチオニン部位での置換がランダムであり、協同性または部位優先度がない場合、それぞれの部位において２５％の置換率（図３のペプチドマップにおけるメチオニンおよびノルロイシン含有ペプチドの相対ピーク面積に基づく）により、置換された単量体サブユニットの以下の予測される分布がもたらされる：
・約５６％、置換なし（２個のメチオニン）
・約３８％、単一の置換を有する（１個のメチオニンおよび１個のノルロイシン）
・約６％、二重の置換を有する（２個のノルロイシン）
【００７３】
この予想された分布は図１の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールで観察された実際の分布に大雑把に一致し、これは、２つの部位での置換がランダムに分布されていることを示唆している。置換された単量体サブユニットの様々な形態（再折り畳み前）が、再折り畳み中の置換されていないサブユニットと同じように挙動すると仮定すると、以下の二量体種の分布が予測される：
・約３２％、置換なし（４個のメチオニン）
・約４２％、１個の置換を有する（３個のメチオニン、１個のノルロイシン）
・約２１％、２個の置換を有する（２個のメチオニン、２個のノルロイシン）
・約５％、３個の置換を有する（１個のメチオニン、３個のノルロイシン）
・約０．４％、４個の置換を有する（４個のノルロイシン）。
【００７４】
（実施例３ｂ）
置換ＢＭＰ−１２は野生型ＢＭＰ−１２と生物物理学的に類似している
純粋なノルロイシンで置換したＢＭＰ−１２は単離しなかったが、有意な量の置換ＢＭＰ−１２を有するおよび有さないバッチ間の比較により、置換は、１）電気泳動移動度（見かけの大きさ、還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに非還元性ＳＤＳ−ＣＥによる）、２）凝集、３）ジスルフィドノット形成（ペプシン消化に対する耐性）、４）折り畳み（トリプトファン蛍光）、または５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性（実施例４を参照）に有意な影響を与えないことが示された。
【００７５】
（実施例４）
置換ＢＭＰ−１２は正常な生物活性を有する
有意な置換を含有するＢＭＰ−１２のバッチ（ロット１７４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を、低い置換率を有するＢＭＰ−１２の２つのバッチ（ロット００２およびロット１４８（標準）、液体クロマトグラフィー／質量分析によって検出して＜５％）と、たとえば参照により組み込まれているＫｕｓａｎａｇｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ、１１：５５５〜６５（２０００）に詳述されている骨形成タンパク質応答エレメントルシフェラーゼレポーター遺伝子バイオアッセイ（ＢＲＥ−ｌｕｃ）において比較した。アッセイ前に試料を５０ｍＭの酢酸で１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。これらの試料をバイオアッセイの前に滅菌濾過し、濾過した試料の濃度を、Ａ２８０値を用いて確認した。すべての試料はバイオアッセイにおいて比較可能な活性を示した（図７）。
【００７６】
ロット１７４は、単量体中のそれぞれの部位で約２５％のメチオニンからノルロイシンへの置換を含有していた。還元性ＲＰ−ＨＰＬＣに基づいて、単量体サブユニットの約４０％が少なくとも１つの置換されたメチオニンを含有しており、これは、少なくとも１つの置換されたメチオニンを含有する全ＢＭＰ−１２二量体の約７０％に対応する。この置換レベルは、試験したＢＭＰ−１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性または他の物理的特徴に有意な影響は全く与えなかった。
【００７７】
（実施例５ａ）
非置換ＢＭＰ−１２は酸化による失活に感受性である
ＢＭＰ−１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性に対する酸化の効果を調査するために、野生型ＢＭＰ−１２のバッチ（＜５％のノルロイシン置換）を、光から保護して様々な濃度の過酢酸（形成緩衝液で希釈）と共に２時間、室温でインキュベーションした。過酢酸は時間と共に分解されるが、残った可能性がある残留過酢酸はすべて、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（ＭＷＣＯ  ７０００）での緩衝液交換によって除去した。図８は、酸化された試料の還元性ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。還元性ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ジスルフィド還元単量体サブユニットの一重酸化および二重酸化された形態が分離された（ピークが何であるかは、液体クロマトグラフィー／質量分析によって確認した）。過酢酸レベルが増加するにつれて、ＢＭＰ−１２の酸化された形態の割合も増加した。相対ピーク面積を比較することによって、二重酸化された形態は低い過酢酸濃度で初期の遅れを示したが、より高い過酢酸濃度では容易に増加したことが明らかであった。
【００７８】
高レベルの過酢酸は鎖間ジスルフィド結合の酸化切断をもたらす場合があり、ＢＭＰ−１２二量体が不活性の単量体サブユニットへの解離が引き起こされる。しかし、図９は、二量体のほとんどが各試料中でインタクトであったことを示す。最高レベルの過酢酸を有する試料では（一番右のレーン）、単量体およびジスルフィドがスクランブルされた二量体（通常の二量体のバンドの上を移動する小さなバンド）のわずかな増加が観察された。しかし、その試料中でさえも、タンパク質の大多数は予測された二量体の形態であり、対照試料と同じ位置で移動した。したがって、ジスルフィド結合の酸化切断からの最小限の妨害が予測された。
【００７９】
過酢酸処理した試料および未処理の対照試料の生物活性をＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイによって測定した。図１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性と還元性ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した酸化レベルとの間の相関を示す（図８）。メチオニン酸化の程度とｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性との間には直接の負の相関があった。
【００８０】
図１０に示されるように、ＢＭＰ−１２中のどちらのメチオニン残基の酸化も活性の低下をもたらす。酸化により、メチオニンの疎水性側鎖がより親水性のものに変わり、これにより、タンパク質の構造の変化がもたらされ、かつ／またはたとえば受容体もしくは別のＢＭＰ−１２単量体サブユニットとの相互作用に影響が与えられ得る。これは、活性を維持するために８４および１２１の位置での疎水性側鎖が必要であることを示唆している。メチオニンをノルロイシンで置換することで、疎水性の性質および残基のおおよその大きさが維持される。したがって、メチオニンの代わりにノルロイシンを取り込ませることで、ＢＭＰ−１２の構造および生物活性がどちらも維持されると推測することが合理的である。
【００８１】
ｒｈＢＭＰ−２の配列も２つのメチオニン残基を含有し、そのうちの１つはＢＭＰ−１２中で保存されている（Ｍ１２１）。また、過酢酸によるｒｈＢＭＰ−２中のメチオニン残基の酸化は、活性の減少ももたらす。この残基がＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−２の間で保存されていることは、この特定のメチオニン残基の重要性を強調している。
【００８２】
（実施例５ｂ）
置換ＢＭＰ−１２は酸化失活に耐性である
置換ＢＭＰ−１２に対する酸化の効果を調査するために、それぞれのメチオニン部位で２５〜４０％の置換を含有する置換ＢＭＰ−１２のバッチのプールを過酢酸での酸化に供し、検出不可能なレベルの置換を有するバッチと比較した。最高レベルの過酢酸では、通常のＢＭＰ−１２ではどちらのメチオニン残基でも約８０％が酸化された一方で、高度にノルロイシン置換されたプールの約４０％のみが完全に酸化された（図１１）。ノルロイシンの存在は残ったすべてのメチオニン残基の酸化率には影響を与えなかったと考えられるが、完全に置換ＢＭＰ−１２は酸化に完全に耐性であると予測される。
【００８３】
次に、高度にノルロイシン置換されたバッチのプールにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢＭＰ−１２活性に対する酸化の効果（ＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイによって測定）を、有意な置換を有さないＢＭＰ−１２のバッチと比較した。比較的低いレベルの過酢酸では、高度にノルロイシン置換されたＢＭＰ−１２試料は非置換ＢＭＰ−１２に匹敵する活性の損失を示した。しかし、より高いレベルの過酢酸では、高度にノルロイシン置換されたＢＭＰ−１２試料はそれでも有意な活性を維持していた一方で、非置換ＢＭＰ−１２は完全に不活性であった（図１２）。これらの結果は、置換ＢＭＰ−１２が酸化関連失活に対してより耐性であることを示す。
【００８４】
（実施例６）
発酵条件
使用した基本的な発酵条件への改変およびＢＭＰ−１２の様々なロットで観察された置換のレベルを表４に提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の原栄養株をＢＭＰ−１２の産生に使用した。光学密度（ＯＤ）はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ  ２４０１ＰＣ分光光度計で測定した。
【００８５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵（１０Ｌまたは６０Ｌの発酵）プロセスで使用した基本栄養培地には、６．８ｇ／Ｌのリン酸カリウム一塩基性、２．０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、３．０ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｍｌ／Ｌの微量元素混合物（２７．０３ｇ／Ｌの塩化第二鉄、１．２９ｇ／Ｌの塩化亜鉛、２．０ｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム、１．０ｇ／Ｌの塩化カルシウム、１．２７ｇ／Ｌの塩化第二銅、０．５ｇ／Ｌのホウ酸、２．８６ｇ／Ｌの塩化コバルト、１００ｍｌ／ＬのＨＣｌ、蒸留水で最終体積１リットルまで）、および任意選択で２．０〜４．０ｇ／ＬのＡｍｉｓｏｙ（商標）（ダイズタンパク質加水分解物）が含まれていた。Ａｍｉｓｏｙ（商標）（アミノ酸源）はすべての発酵条件には存在させなかった。すべての成分を水に溶かした後、６０分間オートクレーブすることによって発酵槽を滅菌した。滅菌後、培地のｐＨを無菌条件下で７．０に調節し、その後、４０％のグルコースストック溶液（２００〜２５０ｍｌ、最終濃度１．０〜１．２５ｇ／Ｌ）を８Ｌの培地に加えた。さらに、市販のＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）ビタミン混合物（１ｍｌ／Ｌ）またはアミノ酸を含まない酵母窒素ベース（０．１ｇ／Ｌ）のどちらかを滅菌濾過し、オートクレーブした培地に加えた後、成熟ｒｈＢＭＰ−１２遺伝子を発現させるためのプラスミドを保有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と共に播種した。ｐＨは、ｐＨコントローラーによって濃水酸化アンモニウム溶液で制御した。
【００８６】
播種後、培地を通気し、溶存酸素飽和を２０％に維持するために０．８〜１．０ＶＶＭに維持し、攪拌器ＲＰＭにカスケードした。細胞密度（ＯＤ６００）が約１５〜１８に達した際、４０％のグルコースストック溶液の供給を１．０ｍｌ／分（約３．５ｇ／Ｌ／時間）で開始し、細胞密度が所望の値に達するまで続けた。ＯＤ６００が約３０〜６０となった際、トリプトファンを約０．３〜０．６ｇ／Ｌの最終濃度まで加えることによってＢＭＰ−１２タンパク質合成を誘導し、グルコースの供給をさらに４〜２４時間続けた。細胞を遠心分離によって収集し、機械的に壊して開け、ＢＭＰ−１２タンパク質を含有する封入体を単離した。
【００８７】
【表４】
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【００８８】
ロット１４８および００２を生じたバッチを播種した後、ＯＤ６００が８〜１０に達した際に１０ｇ／Ｌ／時間のグルコースの供給を開始した。ＯＤ６００が３０に近づいた際（８．７時間）、誘導培地フィードを施用し、１．５時間で完了した。バッチを１３時間目の最終ＯＤ６００が５５．０となった際に収集した。
【００８９】
他の実施形態では、ＢＭＰ−１２合成の誘導前のグルコース供給の長さは変動する場合がある。たとえば、Ａｍｉｓｏｙ（商標）が初期培地中に存在する発酵バッチでは、細胞密度ＯＤ６００が約３０または６０に達するまでグルコース供給を続けることができ、この場合、Ａｍｉｓｏｙ（商標）中に存在するアミノ酸のほとんどが代謝される。したがって、それに依存するわけではないが、遺伝子発現をこれらの条件下で誘導した場合、メチオニン置換は、たとえば、細胞が利用可能な遊離メチオニンが低レベルであること、および／またはロイシン経路の低いロイシン誘導性活性化から生じるノルロイシン合成が増加することが原因で起こるという学説が立てられている。
【００９０】
ＢＭＰ−１２中にノルロイシン置換が発見された後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の４０％のグルコースフィードにメチオニン（０．１Ｍ）、ロイシン（０．１Ｍ）、またはメチオニンおよびロイシンの組合せ（それぞれ０．０５Ｍ）を補充した。生じたｓＩＢ調製物を部分精製し、ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳと連結させた還元性ＲＰ−ＨＰＬＣおよびペプチドマッピングによって分析した。３つの条件すべてにより、検出不可能または微小レベルのＢＭＰ−１２置換がもたらされた。
【００９１】
（実施例７ａ）
切断されたＢＭＰ−１２種の同定
新しいピークが精製したＢＭＰ−１２の一部のバッチの非還元性ＳＤＳ−ＣＥアッセイで観察された（図１３）。新しいピークがＢＭＰ−１２の２つのバッチで観察されたが（０７Ｌ７８Ｈ００１および０７Ｌ７８Ｈ００２、図１３Ｃ、１３Ｄ）、以前に精製した参照バッチでは観察されなかった（ＩＲＭ＃１、図１３Ｂ）。新しいピークが二量体ピークの直前であるが単量体ピークの後に移動した。したがって、新しい種の見かけの大きさは、２８ｋＤａ未満であるが１４ｋＤａよりも大きい。さらに、新しいより低いバンドがこれらのバッチの還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察されたが、参照バッチ中では観察されなかった。これらのバッチのＲＰ−ＨＰＬＣ分画および液体クロマトグラフィー／質量分析により、非還元性ＳＤＳ−ＣＥにおける新しいピークおよび還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける新しいバンドが、どちらもＢＭＰ−１２の２６ｋＤａのＮ末端が切断された形態に関連していることが明らかとなった。また、液体クロマトグラフィー／質量分析により、特定の調製物においてＢＭＰ−１２の２７ｋＤａのＮ末端が切断された形態も同定された。
【００９２】
切断されたＢＭＰ−１２種をより良好に検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをさらに洗練させた。切断された種を、１０％のトリシンゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって完全長ＢＭＰ−１２種から分離した。非還元の高度に精製した試料はかすかな低分子量（ＬＭＷ）のバンド（より低い移動位置）を示し、これは非還元性ＳＤＳ−ＣＥプロフィールと一致している。試料を還元およびアルキル化した場合、ＬＭＷバンドがより高い全タンパク質ロードで検出された。ＬＭＷバンドの推定分子量は、主バンドよりも約２ｋＤａ低い。
【００９３】
オンラインＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により、切断された種のうちの１つがＢＭＰ−１２ピークの最後の１／３で溶出されたことが示された。さらなる特徴づけのために切断された種を濃縮するために、切断された種を含有する還元またはインタクトな試料をＲＰ−ＨＰＬＣ中の溶出時間によって分画した。ＢＭＰ−１２の単量体サブユニットの分析には還元条件を使用した一方で、二量体ＢＭＰ−１２の分析には非還元条件を使用した。画分の収集に必要なより高いロードを可能にするために、Ｐｏｒｏｓ  Ｒ１／１０カラムを使用した。
【００９４】
ジスルフィドが還元されたＢＭＰ−１２単量体の２つの画分をナノエレクトロスプレーイオン化ＱＴＯＦ−質量分析（ナノＥＳＩ  ＱＴＯＦ−ＭＳ）およびナノＥＳＩ  ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳに供した。ＭＳモードを使用して、後期に溶出される画分が切断された１２０３６．８および１３３４４．１Ｄａ種を含有することを確認した。１２０３６．８Ｄａ種の優勢な荷電状態を選択し、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって断片化して、種を配列決定し、それが２３ＲＧＲ・・・ＧＣＲ１２９であることを確認した（図１４）。配列タグを含むｂ型およびｙ型の断片イオンについて決定した正確な質量は、断片化していない種の正確な質量分析に基づく２３ＲＧＲ・・・ＧＣＲ１２９としてのＮＨ２末端の割当てを支持している。同様の分析により、１３３４４．１Ｄａの種が８ＴＡＱ・・・ＧＣＲ１２９として同定された。
【００９５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳを使用して、精製プロセスの全体にわたって収集された生成物のプールにおける切断された種の存在を検査した。存在量に有意な変化なしに、上述の切断された種が精製プロセス全体にわたって検出された。下流の精製ではこれら２つの切断された種がいかなる有意な度合にも除去されず、これは、これらが完全長ＢＭＰ−１２と構造的に非常に類似していることを示している。
【００９６】
（実施例７ｂ）
酵素的に切断されたＢＭＰ−１２は活性の増強を示す
再折り畳み反応を模倣する緩衝液−洗剤の溶液（２％のＣＨＡＰＳ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．４、５ｍＭのＥＤＴＡ）中での希釈した高度に精製したＢＭＰ−１２のトリプシン消化によって、切断されたＢＭＰ−１２を意図的に生成した。ＢＭＰ−１２を非常に低いレベルのトリプシン（Ｅ：Ｓ＝２０００）と共にインキュベーションすることで、１０分以内に室温で、実施例７ａに記載のものに類似の（図１４）、切断された種が生じた（図１５）。より高いトリプシン濃度（Ｅ：Ｓ＝１００など）またはより長いインキュベーション時間では、さらなる切断を観察することができる。
【００９７】
液体クロマトグラフィー／質量分析を可能にするために、ＣＨＡＰＳの代わりに０．２％のＲａｐｉｇｅｓｔ（商標）を含有する緩衝液−洗剤の溶液中での高度に精製したＢＭＰ−１２のトリプシン消化によって切断された種を生成した。この分析から、トリプシンタンパク質分解により、実施例７ａで同定したものに類似の、Ｒ７、Ｒ２２、およびＲ２３のＮ末端を有するＢＭＰ−１２が生じたことが示された。
【００９８】
トリプシンで切断されたＢＭＰ−１２種をＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイで試験し、上昇したｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性が示された（図１６）。切断された種のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は試験しなかった。
【００９９】
ＢＭＰ−１２のＮ末端が切断された形態（２６ＳＲＣ・・・ＧＣＲ１２９）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生させ、ラット異所性アッセイにおいて腱様組織を誘導することが見い出された。また、完全長ＢＭＰ−１２分子も動物モデルにおいて活性である。ここで観察された切断物は、完全長ＢＭＰ−１２およびより短いＢＭＰ−１２の切断された種（どちらもｉｎ  ｖｉｖｏで生物活性がある）の中間の大きさであったため、切断された種もｉｎ  ｖｉｖｏで生物活性があると予測される。
【０１００】
本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示した本発明の明細および実施を考慮することで、当業者には明らかであろう。明細および実施例は例示的のみとして考慮されることを意図し、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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