(57)【要約】  ＦＩＺＺ１（Ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｚｏｎｅ  １）活性を減少させることによって、哺乳動物において気道反応性亢進ならびにその他の炎症性の疾患、障害および状態を低下させるための方法および組成物を提供する。また、気道炎症の調節物質および／またはＦＩＺＺ１阻害剤を同定するための方法および組成物も提供する。本発明は、気道炎症の調節物質および／またはＦＩＺＺ１阻害剤、ならびにそれらの使用を包含する。さらに、本発明は、ＦＩＺＺ１タンパク質に基づく免疫反応を増強するための方法および組成物も提供する。
2011523401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において気道反応性亢進を低下させるための方法であって、Ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｚｏｎｅ（ＦＩＺＺ１）活性を減少させるステップを含む方法。
【請求項２】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、哺乳動物の気管平滑筋中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、気道上皮中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
気道反応性亢進が喘息と関係する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
炎症を治療するための方法であって、治療を必要とする哺乳動物においてＦＩＺＺ１活性を減少させるステップを含む方法。
【請求項６】
炎症が、消化管、肺または生殖器系中にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
炎症が気道炎症である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
炎症がアレルゲンによって誘発される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
炎症が、心血管の疾患または障害；神経変性疾患；感染性疾患；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）／敗血症；成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；関節リウマチ；骨関節炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；気道反応性亢進（ＡＨＲ）；気管支過敏症；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；クローン病；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；炎症性腸疾患；糖尿病の炎症性合併症；メタボリックシンドローム；末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）；筋肉の疲労または炎症および皮膚の状態；細菌感染またはウイルス感染によって引き起こされた炎症状態と関係する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１遺伝子の転写を低下させることを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の翻訳を低下させることを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、干渉ＲＮＡを投与することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
干渉ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡが、ＦＩＺＺ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対して実質的に相補的である配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡが二本鎖である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡが一本鎖である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｓｉＲＮＡが、約２０〜約２５個のヌクレオチド塩基を有する配列を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
抗体またはその断片が、インタクトなＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１結合性タンパク質を投与することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＩＺＺ１結合性タンパク質が単一ドメイン結合性タンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＦＩＺＺ１結合性タンパク質が、ＩｇＮＡＲ、ＶＨＨまたはＳＭＩＰである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１タンパク質に特異的に結合するアプタマーを投与することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
アプタマーがＲＮＡアプタマーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップが、ＦＩＺＺ１活性を阻害する小型分子を投与することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
気道炎症を調節する薬剤の能力を評価するための方法であって、
（１）気管試料を提供するステップと、
（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、
（３）薬剤を培地に提供するステップと、
（４）気管試料の組織像を決定するステップと、
（５）ステップ（４）からの組織像の結果を対照と比較して、気道炎症を調節する薬剤の能力を評価するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
ステップ（４）が、気管試料中の上皮層が組織学的にインタクトであることを決定することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対照が、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料の組織像を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
対照が、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料の組織像を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（５）からの比較結果に基づいて気道炎症の調節物質を同定するステップをさらに含む、請求項２９から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
気道反応性亢進を調節する薬剤の能力を評価するための方法であって、
（１）気管試料を提供するステップと、
（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、
（３）薬剤を培地に提供するステップと、
（４）カルバコールを培地に提供するステップと、
（５）気管試料のカルバコールに対する収縮反応を決定するステップと、
（６）ステップ（５）で決定したカルバコールに対する収縮反応を対照と比較して、気道反応性亢進を調節する薬剤の能力を評価するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
対照が、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対照が、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（６）からの比較結果に基づいて気道反応性亢進の調節物質を同定するステップをさらに含む、請求項３４から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
気管試料がマウスに由来する、請求項２９から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ＦＩＺＺ１阻害剤をスクリーニングする方法であって、
（１）複数の気管試料を提供し、培地中でそれらのそれぞれをＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、
（２）複数の阻害剤候補を提供するステップと、
（３）複数の気管試料のそれぞれにおいて、ＦＩＺＺ１媒介型の気道の炎症または反応性亢進と関係する表現型を決定するステップと、
（４）ステップ（３）で決定した表現型を対照と比較するステップと、
（５）ステップ（４）の比較結果に基づいて、表現型を低下させる１つまたは複数のＦＩＺＺ１阻害剤を同定するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
複数の阻害剤候補が小型分子のライブラリーを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
複数の阻害剤候補が、抗体のライブラリーを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体のライブラリーが、単鎖Ｆｖのライブラリーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
複数の阻害剤候補が、干渉ＲＮＡのライブラリーを含む、請求項３９から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
複数の阻害剤候補が、アプタマーのライブラリーを含む、請求項３９から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（３）が、それぞれの気管試料の組織像を決定することを含む、請求項３９から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（３）が、カルバコールに対する収縮反応を決定することを含む、請求項３９から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
請求項３９から４６のいずれかに記載の方法によって同定したＦＩＺＺ１阻害剤。
【請求項４８】
請求項４０に記載の方法によって同定した小型分子のＦＩＺＺ１阻害剤。
【請求項４９】
哺乳動物において免疫反応を増強するための方法であって、ＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）をコードするポリペプチド、その断片、またはＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す変異体を投与するステップを含む方法。
【請求項５０】
ＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）をコードするポリペプチド、その断片、またはＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す変異体を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００８年４月２９日出願の米国仮特許出願第６１／１２６，１３１号に対する優先権およびその利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、損傷細胞または刺激物質等の有害な刺激に対する、血管組織の複雑な生物学的反応である。例えば、喘息には、気道の慢性炎症が伴う。喘息の顕著な特色は、物理的、化学的および環境的な刺激に対する、気道平滑筋の反応性亢進である。この高まった反応性は、気道の閉塞、ならびに喘息の重症度の増加および薬物療法の必要性と関係する。気管平滑筋（ＴＳＭ）媒介型反応性亢進の分野における実験方法は主として、アレルゲンへの曝露によって誘発された細胞および分子の事象の解析に焦点を合わせている。気道反応性亢進（ＡＨＲ）の実験動物モデルでは、ヒト喘息の場合と同様に、多様な因子が、炎症および気管支収縮の促進に関与している。これらの因子の大部分は、気道の炎症細胞および呼吸上皮細胞から放出され、次いで、これらは、気道に対して作用して、炎症反応を増幅するのみならず、個別のシグナル伝達経路も変化させ、その結果、ＡＨＲにおいて観察されるＴＳＭ機能特性に変化が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、Ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｚｏｎｅ（ＦＩＺＺ１）活性を標的にすることによって、炎症を治療するための新しい方法を提供する。本発明は、ＦＩＺＺ１というレジスチン様分子α（レジスチンファミリーアディポカインのメンバー）が、新しい炎症メディエーターであるという発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様では、本発明は、哺乳動物において気道反応性亢進を低下させるための方法を提供し、この方法は、Ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｚｏｎｅ（ＦＩＺＺ１）活性を減少させるステップを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、哺乳動物の気管平滑筋中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、気道上皮中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明のこの態様の方法によって治療される気道反応性亢進は、喘息と関係する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、炎症を治療するための方法を提供し、この方法は、治療を必要とする哺乳動物においてＦＩＺＺ１活性を減少させるステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって治療される炎症は、消化管、肺または生殖器系中にある。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、消化管、肺または生殖器系の上皮バリア中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって治療される炎症は、気道炎症である。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、気道上皮中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、哺乳動物の気管平滑筋中のＦＩＺＺ１活性を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、治療される気道炎症は、喘息と関係する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって治療される炎症は、アレルゲンによって誘発される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって治療される炎症は、心血管の疾患もしくは障害；アルツハイマー病等の神経変性疾患；例えば、心筋炎、心筋症、急性心内膜炎、心外膜炎等の感染性疾患；アテローム動脈硬化；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）／敗血症；成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；関節リウマチ；骨関節炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；気道反応性亢進（ＡＨＲ）；気管支過敏症；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；クローン病；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；炎症性腸疾患；糖尿病の炎症性合併症；メタボリックシンドローム；末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）；筋肉の疲労もしくは炎症および皮膚の状態；または細菌感染もしくはウイルス感染によって引き起こされた炎症状態と関係する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１遺伝子の転写を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の翻訳を低下させることを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を、干渉ＲＮＡを哺乳動物に投与することによって減少させる。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明に適したｓｉＲＮＡは、ＦＩＺＺ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対して実質的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは一本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｓｉＲＮＡは、約２０〜約２５個のヌクレオチド塩基を有する配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、インタクトなＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明に適した抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本発明に適した抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１結合性タンパク質を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明に適したＦＩＺＺ１結合性タンパク質は、単一ドメイン結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＦＩＺＺ１結合性タンパク質は、ＩｇＮＡＲ、ＶＨＨまたはＳＭＩＰ（商標）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１タンパク質に特異的に結合するアプタマーを哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーはＲＮＡアプタマーである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＦＩＺＺ１活性を減少させるステップは、ＦＩＺＺ１活性を阻害する小型分子を哺乳動物に投与することを含む。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、気道炎症を調節する薬剤の能力を評価するための方法を提供する。この方法は、（１）気管試料を提供するステップと、（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（３）薬剤を培地に提供するステップと、（４）気管試料の組織像を決定するステップと、（５）ステップ（４）からの組織像の結果を対照と比較して、気道炎症を調節する薬剤の能力を評価するステップとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ステップ（４）は、気管試料中の上皮層が組織学的にインタクトであることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料の組織像を含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料の組織像を含む。いくつかの実施形態では、気管試料は、マウスに由来する。いくつかの実施形態では、この方法は、ステップ（５）からの比較結果に基づいて気道炎症の調節物質を同定するステップをさらに含む。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、気道反応性亢進を調節する薬剤の能力を評価するための方法を提供する。この方法は、（１）気管試料を提供するステップと、（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（３）薬剤を培地に提供するステップと、（４）カルバコールを培地に提供するステップと、（５）気管試料のカルバコールに対する収縮反応を決定するステップと、（６）ステップ（５）で決定したカルバコールに対する収縮反応を対照と比較して、気道反応性亢進を調節する薬剤の能力を評価するステップとを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む。いくつかの実施形態では、気管試料は、マウスに由来する。いくつかの実施形態では、この方法は、ステップ（６）からの比較結果に基づいて気道反応性亢進の調節物質を同定するステップをさらに含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ＦＩＺＺ１阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（１）複数の気管試料を提供し、培地中でそれらのそれぞれをＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（２）複数の阻害剤候補を提供するステップと、（３）複数の気管試料のそれぞれにおいて、ＦＩＺＺ１媒介型の気道の炎症または反応性亢進と関係する表現型を決定するステップと、（４）ステップ（３）で決定した表現型を対照と比較するステップと、（５）ステップ（４）の比較結果に基づいて、表現型を低下させる１つまたは複数のＦＩＺＺ１阻害剤を同定するステップとを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、小型分子のライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、抗体のライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のこの態様の方法に適した抗体のライブラリーは、単鎖Ｆｖのライブラリーである。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、候補ＦＩＺＺ１結合性タンパク質（例えば、単一ドメイン結合性タンパク質、ＩｇＮＡＲタンパク質、ＶＨＨタンパク質またはＳＭＩＰ（商標）タンパク質）を含有するペプチドまたはタンパク質のライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、干渉ＲＮＡのライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、アプタマーのライブラリー（例えば、ＲＮＡアプタマーのライブラリー）を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（３）は、複数の気管試料のそれぞれの組織像を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（３）は、カルバコールに対する収縮反応を決定することを含む。
【００２２】
本発明は、上記の種々の実施形態に記載した方法に従って同定したＦＩＺＺ１阻害剤をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記の種々の実施形態に記載した方法に従って同定した小型分子のＦＩＺＺ１阻害剤を提供する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物において、免疫反応を増強するための方法を提供する。この方法は、ＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）をコードするポリペプチド、その断片、またはＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す変異体を投与するステップを含む。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、ＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）をコードするポリペプチド、その断片、またはＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号４）に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す変異体を含有するワクチンを提供する。
【００２５】
本出願では、「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。本出願で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のその用語の変化形には、その他の添加物、構成成分、整数またはステップを排除する意図はない。本出願で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、同義語として使用する。本出願で使用する数はいずれも、約／およそがあってもなくても、関連分野の当業者が理解する任意の通常の変動を網羅することを意味する。
【００２６】
本発明のその他の特色、目的および利点が、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになる。しかし、これらの詳細な説明、図面および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すものであるが、例示のために提供するに過ぎず、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲に属する種々の変化形態および改変形態が、当業者には明らかになるであろう。
【００２７】
定義
薬剤：本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、潜在的な調節物質として試験され得る任意の化合物または組成物を指す。使用することができる薬剤の例として、これらに限定されないが、小型分子、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ペプチド模倣物質等が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬剤を単離してもまたは単離しなくてもよい。非限定的な例として、薬剤は、薬剤のライブラリーである場合がある。薬剤の混合物が調節物質であることが見出される場合、次いで、このプールを別個の構成成分にさらに精製して、どの構成成分が実際に標的活性の調節物質であるかを決定することができる。
【００２８】
気道反応性亢進：本明細書で使用する場合、「気道反応性亢進」（ＡＨＲ）という用語は、気流制限を誘発することができる刺激に反応して、気道が過度に容易にかつ／または過度に大幅に狭まることを可能にする気道の異常を指す。ＡＨＲは、炎症または（例えば、コラーゲンの堆積による等の）気道のリモデリングによって引き起こされた呼吸器系の機能変化である場合がある。気流制限は、不可逆的であり得るまたは可逆的であり得る気道の狭小化を指す。気流制限または気道反応性亢進は、コラーゲンの堆積、気管支けいれん、気道平滑筋肥大、気道平滑筋収縮、粘液分泌、細胞の堆積、上皮破壊、上皮透過性に生じた変化、平滑筋の機能または感受性に生じた変化、肺実質の異常、平滑筋機能の神経調節（アドレナリン作動性調節、コリン作動性調節、および非アドレナリン作動性−非コリン作動性調節を含む）の異常、ならびに気道の中および周りの浸潤性疾患によって引き起こされ得る。ＡＨＲは、誘発剤（すなわち、刺激）に反応した哺乳動物の呼吸器系の機能を測定することを含むストレス試験によって測定することができる。ＡＨＲは、誘発剤の用量に対してプロットした、ベースラインからの呼吸機能の変化として測定することができる。呼吸機能は、例えば、肺活量測定、プレチスモグラフ、最大流量、症状のスコア、身体的徴候（すなわち、呼吸数）、喘鳴、運動負荷、救急薬（すなわち、気管支拡張剤）の使用、および血液ガスによって測定することができる。特に、ＡＨＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肺抵抗（ＲＬ）として、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴＳＭ組織の力応答として測定することができる。
【００２９】
アレルゲン：本明細書で使用する場合、「アレルゲン」という用語は、感受性の対象においてアレルギー反応または喘息反応を誘発することができる物質（抗原を含む）を指す。アレルゲンのリストとして、タンパク質（例えば、卵白アルブミン）、花粉、昆虫毒液、動物のフケの粉塵、菌類胞子および薬物（例えば、ペニシリン）を挙げることができる。アレルゲンの例として、これらに限定されないが、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる：イヌ属（イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））；ダニ属（例えば、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ））；ネコ属（イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））；ブタクサ属（ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））；ドクムギ属（例えば、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）またはイタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；スギ属（スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ））；アルテリナリア属（黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ））；アルダー属；ハンノキ属（セイヨウヤマハンノキ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ））；カバノキ属（ヨーロッパシラカンバ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））；カシ属（ホワイトオーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ））；オリーブ属（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））；ヨモギ属（オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））；オオバコ属（例えば、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））；ヒカゲミズ属（例えば、パリエタリア・オフィチナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）またはカベイラクサ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ））；チャバネゴキブリ属（例えば、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ））；ミツバチ属（例えば、アピス・ムルティフロルム（Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；イトスギ属（例えば、ホソイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、アリゾナイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）およびモントレーイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））；ビャクシン属（例えば、ユニペルス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、エンピツビャクシン（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、セイヨウネズ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびマウンテンシダー（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ））；コノテガシワ属（例えば、コノテガシワ（Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））；ヒノキ属（例えば、ヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ））；ゴキブリ属（例えば、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））；コモジグサ属（例えば、シバムギ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ））；ライムギ属（例えば、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））；コムギ属（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））；カモガヤ属（例えば、オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；ウシノケグサ属（例えば、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ））；イチゴツナギ属（例えば、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）またはコイチゴツナギ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；カラスムギ属（例えば、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））；シラゲガヤ属（例えば、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ））；ハルガヤ属（例えば、ハルガヤ（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ））；アルテナルム属（例えば、オオカニツリ（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ））；コヌカグサ属（例えば、コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ））；アワガエリ属（例えば、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））；クサヨシ属（例えば、シマヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））；スズメノヒエ属（例えば、アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））；モロコシ属（例えば、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））；ならびにスズメノチャヒキ属（例えば、スズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））。
【００３０】
寛解：本明細書で使用する場合、「寛解」という用語は、状況の阻止、低下もしくは緩和、または対象の状況の改善を意味する。寛解は、疾患状態の完全な回復または完全な阻止を含むが、それを必要とするわけではない。例えば、寛解を、炎症もしくは炎症状態と関係する炎症性マーカーのレベルの少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および少なくとも約９０％の低下であるとみなすことも、または例えば、疼痛等の炎症と関係する症状の低下、および／もしくは炎症と関係する浮腫の低下であるとみなすこともできる。
【００３１】
抗体：本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、指定されたタンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片に対して特異的に反応性である免疫グロブリンおよびそれらの断片を含むことを意図する。適切な抗体として、これらに限定されないが、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート化抗体（すなわち、その他のタンパク質、放射標識、細胞毒にコンジュゲートまたは融合させた抗体）、および抗体断片が挙げられる。本明細書で使用する場合、また、「抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片も含む。
【００３２】
抗体断片：本明細書で使用する場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域等、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例として、インタクトな抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片が挙げられる。
【００３３】
結合性タンパク質：本明細書で使用する場合、「結合性タンパク質」という用語は、抗原または標的のタンパク質もしくはペプチドに結合する任意の天然に存在するタンパク質、合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質を含む。結合性タンパク質は、天然に存在する抗体に由来してもよく、または工学的に合成してもよい。結合性タンパク質は、特異的な抗原に結合して、複合体を形成し、生物学的反応を惹起する（例えば、特定の生物学的活性を刺激するまたはそれに拮抗する）ことによって、抗体と同様に機能することができる。結合性タンパク質は、単離された断片、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含むことができる。
【００３４】
カルバコール：本明細書で使用する場合、「カルバコール」（カルバミルコリンとしても知られている）という用語は、アセチルコリン受容体（例えば、ムスカリ受容体およびニコチン受容体）に結合し、それらを刺激することができるカルバコール（コリンエステル）およびその誘導体を含む。
【００３５】
相補性：本明細書で使用する場合、「相補性」または「（１つもしくは複数の）相補体」という用語は、標準的なワトソン−クリック結合、フーグスティーン結合または逆フーグスティーン結合による相補性の法則に従って塩基対形成することが可能である（１つまたは複数の）核酸を指す。
【００３６】
ダイアボディ：本明細書で使用する場合、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短いので同じ鎖上のこれら２つのドメイン間で対形成することができないリンカーを使用することによって、これらのドメインは余儀なく、別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を生み出すことになる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）に、より詳しく記載されている。
【００３７】
ハイブリダイゼーション：本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」という用語は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または鎖が部分的に二本もしくは三本である性質を示す分子を形成することを指す。
【００３８】
炎症：本明細書で使用する場合、「炎症」または「炎症状態」という用語は、血管組織（例えば、消化管、肺または生殖器系）の、病原体、損傷細胞または刺激物質等の有害な刺激に対する生物学的反応を指し、これは、１つまたは複数の生物学的および生理学的な続発症、例として、血管拡張；血管透過性の増加；間質の浮腫に至る血漿の血管外漏出；樹状細胞、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージおよびリンパ球の走化性；サイトカインの産生；急性相反応物質；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；赤血球沈降速度の増加；白血球増多；発熱；代謝率の増加；アルブミン産生の傷害および低アルブミン血症；補体の活性化；肥満細胞の活性化；抗体の刺激等を含む。
【００３９】
炎症性の疾患、障害または状態：本明細書で使用する場合、「炎症性の疾患、障害または状態」という用語は、非限定的な例として、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、狼瘡と関係する関節炎または強直性脊椎炎を含む）；強皮症；全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）；ＨＩＶ；シェーグレン症候群；血管炎；多発性硬化症；自己免疫性甲状腺炎；喘息（例えば、アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息）；皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）；重症筋無力症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；クローン病；大腸炎；糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬）、心血管系（例えば、アテローム動脈硬化）、神経系（例えば、アルツハイマー病）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症状態；サルコイドーシス；強皮症；硬変；好酸球性食道炎；心血管障害（例えば、コレステロール代謝障害、酸素フリーラジカルによる損傷、虚血、肺線維症、特発性肺線維症）；創傷治癒と関係する障害；呼吸障害、例えば、喘息およびＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症状態（例えば、内毒血症、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）および敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、毒素ショック症候群）、および感染性疾患（例えば、心筋炎、心筋症、急性心内膜炎、心外膜炎）；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）／敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）；アトピー性障害、例えば、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎（例えば、慢性アレルギー性副鼻腔炎）、アレルギー性胃腸炎；成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥ）；気道反応性亢進（ＡＨＲ）；気管支過敏症；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；炎症性腸疾患；糖尿病の炎症性合併症；メタボリックシンドローム；末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）；筋肉の疲労または炎症および皮膚の状態；細菌感染またはウイルス感染によって引き起こされた炎症状態；腫瘍または癌（例えば、軟組織腫瘍または固形腫瘍）、例として、白血病（例えば、ホジキンリンパ腫）、神経膠芽腫、星状細胞腫またはリンパ腫；ならびに移植片拒絶を含む。
【００４０】
直鎖抗体：本明細書で使用する場合、「直鎖抗体」という用語は、一対の抗原結合領域を形成する、一対の縦に並んだＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含むこれらの抗体を指す。直鎖抗体は、二重特異性であっても、または単一特異性であってもよい。詳細は、Ｚａｐａｔａら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２（１９９５）に記載されている。
【００４１】
哺乳動物：本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語（「哺乳動物対象」、「個体」または「患者」とも呼ばれている）は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を含み、それらとして、これらに限定されないが、ウシ、ネコ、イヌ、ケナガイタチ、スナネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ウサギ、ラットおよびヒツジが挙げられる。
【００４２】
調節物質：本明細書で使用する場合、「調節物質」という用語は、活性を変化させるまたは惹起する化合物を指す。例えば、調節物質の存在によって、特定の活性の大きさが、その調節物質の非存在下の活性の大きさと比較して、増加または減少する場合がある。特定の実施形態では、調節物質は阻害剤であり、これによって、１つまたは複数の活性の大きさが減少する。特定の実施形態では、阻害剤によって、１つまたは複数の生物学的活性が完全に阻止される。特定の実施形態では、調節物質は活性化剤であり、これによって、少なくとも１つの活性の大きさが増加する。特定の実施形態では、調節物質の存在によって、その調節物質の非存在下では生じない活性が生じる。
【００４３】
単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）：本明細書で使用する場合、「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ＳｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＳｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４）を参照されたい。
【００４４】
単一ドメイン抗体：本明細書で使用する場合、「単一ドメイン抗体」は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例として、これらに限定されないが、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠く抗体、従来の四本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体が挙げられる。単一ドメイン抗体は、当技術分野のいずれであってもよく、または今後出現する単一ドメイン抗体のいずれであってもよい。単一ドメイン抗体は、これらに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含めた、任意の種に由来し得る。
【００４５】
単一ドメイン結合性タンパク質：本明細書で使用する場合、「単一ドメイン結合性タンパク質」は、抗原、タンパク質またはペプチドに結合する任意の単一ドメイン結合骨格であり得る。単一ドメイン結合性タンパク質は、特異的な抗原に結合して、複合体を形成し、生物学的反応を惹起する（例えば、特定の生物学的活性を刺激するまたはそれに拮抗する）ことによって抗体のごとく作用する、天然の、合成のまたは遺伝子操作されたタンパク質骨格を含むことができる。単一ドメイン結合性タンパク質は、天然に存在する抗体に由来してもよく、または工学的に合成してもよい。単一ドメイン結合性タンパク質は、当技術分野のいずれであってもよく、または今後出現する単一ドメイン結合性タンパク質のいずれであってもよく、これらに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含めた、任意の種に由来し得る。本発明のいくつかの実施形態では、単一ドメイン結合性タンパク質骨格は、例えば、サメの血清中に見出される新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプに由来するもの等、魚に見出される免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域（「ＩｇＮＡＲ」）に由来する単一ドメイン結合骨格を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１〜２９０９に記載されている。その他の実施形態では、単一ドメイン結合性タンパク質は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている、天然に存在する単一ドメイン結合性タンパク質である。そのような単一ドメイン結合性タンパク質は、例えば、ＷＯ９４０４６７８に開示されている。明確にするという理由から、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体に由来する可変ドメインは、本明細書では、四本鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨまたは「ナノボディ」として知られている。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ中で産生させた抗体に由来し得る。ラクダ科以外のその他の種が、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する場合があり、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲に属する。
【００４６】
小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）：本明細書で使用する場合、「小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）」という用語は、典型的には、結合ドメイン−免疫グロブリンの融合タンパク質を指し、これらは、免疫グロブリンのヒンジ領域またはヒンジ作用領域のポリペプチドに融合または別の場合には接続している結合ドメインポリペプチドを含み、次いで、この免疫グロブリンのヒンジ領域またはヒンジ作用領域のポリペプチドは、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３領域およびＣＨ４領域由来の１つまたは複数の自然のまたは工学的に作製された定常領域を含む領域に融合または別の場合には接続している（より完全な説明のために、例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．らによるＵ．Ｓ．２００５／０１３６０４９を参照されたい）。この結合ドメイン−免疫グロブリンの融合タンパク質は、自然のまたは工学的に作製された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥの全部もしくは一部に由来する構築物の場合には、ＣＨ３）を含む領域をさらに含むことができ、このＣＨ２またはＣＨ３の定常領域ポリペプチドは、ヒンジ領域ポリペプチドおよび自然のまたは工学的に作製された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥの全部もしくは一部に由来する構築物の場合には、ＣＨ４）に融合または別の場合には接続しており、このＣＨ３またはＣＨ４の定常領域ポリペプチドは、ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥの全部もしくは一部に由来する構築物の場合には、ＣＨ３）に融合または別の場合には接続している。典型的には、そのような結合ドメイン−免疫グロブリンの融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性、補体結合、および／または標的、例えば、標的抗原に対する結合からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的活性を示すことができる。
【００４７】
厳密な条件：本明細書で使用する場合、「（１つまたは複数の）厳密な条件」という用語（「高い厳密度」とも呼ばれている）は、（１つまたは複数の）相補配列を含有する１つまたは複数の核酸鎖の間または内部におけるハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションは妨げる条件を指す。厳密な条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチが仮にあったとしも、それをほとんど許容しない。そのような条件は、当業者には周知であり、高い選択性を必要とする場合に適用されることが好ましい。非限定的な適用例として、少なくとも１つの核酸、例として、遺伝子もしくはその核酸セグメントを単離する場合、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写物もしくはその核酸セグメントを検出する場合等が挙げられる。例示的な厳密な条件として、低い塩および／または高い温度の条件、例として、約５０℃〜約７０℃の温度において約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされる条件を挙げることができる。所望の厳密度の温度およびイオン強度は一部、特定の（１つまたは複数の）核酸の長さ、（１つまたは複数の）標的配列の長さおよび核酸塩基含有量、（１つまたは複数の）核酸の電荷の組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはその他の（１つもしくは複数の）溶媒の存在によって決定されることを理解されたい。一般に、例えば、ホルムアミドの量を増加させて添加する等、条件をより厳密になし得ることが理解されている。
【００４８】
実質的に相補的である：本明細書で使用する場合、「実質的に相補的である」という用語は、連続性の核酸塩基の少なくとも１つの配列、または分子中に１つもしくは複数の核酸塩基部分が存在しない場合には、半連続性の核酸塩基の少なくとも１つの配列を含む核酸が、たとえ全ての核酸塩基が対応する核酸塩基と塩基対形成するとは限らない場合であっても少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることができることを指す。特定の実施形態では、「実質的に相補的である」核酸は、ハイブリダイゼーションの間に、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％まで、およびそれらの中の任意の範囲の核酸塩基配列が、少なくとも１つの一本鎖または二本鎖の核酸分子と塩基対形成することができる、少なくとも１つの配列を含有する。特定の実施形態では、「実質的に相補的である」という用語は、厳密な条件下で、少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸を指す。
【００４９】
テトラボディ：本明細書で使用する場合、「テトラボディ」という用語は、４つの抗原結合ドメインを含む複合体を指し、これら４つの抗原結合ドメインは、同じエピトープを対象としても、または異なるエピトープを対象としてもよい。テトラボディは、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸末端を用いて、すなわち、いずれのリンカー配列も用いることなく構築される。テトラボディは、３つの単鎖抗体の組合せであり得る。
【００５０】
治療有効量：本明細書で使用する場合、医薬品または薬剤の組合せの「治療有効量」という用語は、治療効果を、任意の医学的治療に適用できる合理的な利益／リスクの比で治療対象に付与する、（１つまたは複数の）薬剤の量を指すことを意図する。治療効果は、客観的であってもよく（すなわち、何らかの試験もしくはマーカーによって測定可能である）、または主観的であってもよい（すなわち、対象が、効果があることを示すもしくは効果を感じる）。特に、「治療有効量」は、所望の疾患もしくは状態を治療する、寛解させるもしくは予防する、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すのに有効な治療剤または組成物の量を指す。効果は、例えば、化学マーカー、抗原レベル、または気道抵抗等の生理学的指標における変化によって検出することができる。また、治療効果は、気管支収縮の減少または気道抵抗の減少等の身体症状の低下も含み、対象または対象の介護者が認める健康状態の主観的な改善も含み得る。治療有効量は通常、複数の単位用量を含むことができる投与計画において投与される。任意の特定の医薬品の場合、治療有効量（および／または有効な投与計画の範囲内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、その他の医薬品との組合せに応じて変化し得る。また、任意の特定の患者のための特定の治療に有効な量（および／または単位用量）は、治療される障害および障害の重症度；利用される特定の医薬品の活性；利用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別および食餌；投与の時期、投与経路、および／または利用される特定の医薬品の排泄もしくは代謝の速度；治療の持続時間；ならびに医学分野において周知である同様の要因を含めた、多様な要因に依存し得る。
【００５１】
治療：本明細書で使用する場合、「治療」（また「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）という用語は、特定の疾患、障害および／もしくは状態を部分的または完全に軽減する、寛解させる、和らげる、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、ならびに／またはその１つもしくは複数の症状もしくは特色の発生を低下させる、医薬品の任意の投与を指す。そのような治療の対象は、関連の疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない対象であってもよく、かつ／または疾患、障害および／もしくは状態の早期の徴候のみを示す対象であってもよい。その代わりにまたはそれに加えて、そのような治療の対象は、関連の疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の確立した徴候を示す対象であってもよい。
【００５２】
トリアボディ：本明細書で使用する場合、「トリアボディ」という用語は、３つの単鎖抗体の組合せを指す。また、トリアボディは、「三価の三量体」としても知られている。トリアボディは、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸末端を用いて、すなわち、いずれのリンカー配列も用いることなく構築される。トリアボディは、３つのＦｖ頭部を有し、これらのポリペプチドは、環状に頭部から尾部につながって配置されている。トリアボディの可能な立体構造は、平面内に相互に１２０度の角度で位置する、３つの結合部位を有する平面である。トリアボディは、単一特異性であっても、二重特異性であっても、または三重特異性であってもよい。
【００５３】
図面は、例示のためのものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＯＡ／ＯＡ処置が、気管における炎症細胞の浸潤および収縮の増加を誘発することを示す例示的なデータを示すグラフである。ＴＳＭの収縮（Ａ）、ならびにＢＡＬからの全細胞数、リンパ球数および好酸球数（Ｂ〜Ｄ）を、ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウス、ＯＡ／ＰＢＳ処置マウス、およびＯＡ／ＯＡ処置マウスにおいて調べた。結果を、平均±ＳＥ（Ｎ＝６）として表す。＊：Ｐ＜０．０５、または＊＊：Ｐ＜０．０１、ＯＡ／ＯＡ処置マウス対ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウス、またはＯＡ／ＯＡ処置マウス対ＯＡ／ＰＢＳ処置マウス。
【図２】ＯＡモデルにおけるＦＩＺＺ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を示す例示的なデータを示すグラフである。気管におけるＦＩＺＺ１ｍＲＮＡの発現を、転写プロファイリングによってアッセイした。ＦＩＺＺ１のレベルを、無処置動物に対する、ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＯＡ／ＰＢＳおよびＯＡ／ＯＡを用いて処置したマウス由来の気管からのｍＲＮＡの変化の倍数（Ｆｃ）として示す。さらに、ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウス、ＯＡ／ＰＢＳ処置マウス、およびＯＡ／ＯＡ処置マウスからのＢＡＬ中のＦＩＺＺ１タンパク質のレベルも、抗ＦＩＺＺ１抗体を使用して、ウエスタンブロットにより決定した。
【図３】組換えＦＩＺＺ１（ｒＦＩＺＺ１）または機械的除去により生じた管腔上皮層の喪失を示す例示的なデータを示す図である。気道構造および気道上皮層の状況の組織学的検査を、×４．０および×２０の倍率における光学顕微鏡下で、ＰＢＳおよび１００ｎＭ  ＦＩＺＺ１を用いて処置した、新鮮な気管環または培養した気管環の凍結切片（全体または部分のいずれか）に対して実施した。
【図４】組換えＦＩＺＺ１が、ＣＣｈによって生じた力を増加させることを示す例示的なデータを示す図である。ＰＢＳ処置気管、ＬＰＳ処置気管およびｒＦＩＺＺ１処置気管においてＣＣｈによって生じた力を、元のトレーシングとして記録した（上部パネル）。ＣＣｈ刺激に対する等尺性張力の累積濃度−応答曲線を、ＰＢＳ処置気管、および未変性ｒＦＩＺＺ１処置（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）気管において完成させた。ＭＬＣＫおよびＭＬＣ−２０のタンパク質発現レベルを、ウエスタンブロット解析により、同じ組織中のβ−アクチンの発現レベルと関連させて測定した（Ａの挿入図）。また、ＣＣｈ用量応答曲線を、０．１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００ｎＭ未変性ＦＩＺＺ１、および１００ｎＭ熱不活性化ＦＩＺＺ１を用いて処置した気管においても実施した（Ｂ）。群（Ｎ＝６）の張力の測定値を、平均±ＳＥＭとして表す。＊：Ｐ＜０．０５、ｒＦＩＺＺ１群対ＰＢＳ群または加熱処置ＦＩＺＺ１群。
【図５】ｒＦＩＺＺ１が、ＩＳＯ誘発性弛緩に影響を及ぼさないことを示す例示的なデータを示すグラフである。ＩＳＯ刺激に対する張力の累積濃度−応答曲線を、ｒＦＩＺＺ１（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）、ならびにＰＢＳを用いて処置した気管環において測定した。群（Ｎ＝６）の張力の測定値を、平均±ＳＥＭとして表した。＊：Ｐ＜０．０５、ｒＦＩＺＺ１処置気管対ＰＢＳ処置気管。
【図６】ｒＦＩＺＺ１チャレンジマウスにおいて、ＴＳＭの力応答およびＢＡＬ細胞の浸潤を測定した実験からの例示的なデータを示すグラフである。ＴＳＭの力応答（Ａ）およびＢＡＬ細胞数（Ｂ）を、ＰＢＳ、ＬＰＳ（０．１ｎｇ／ｍｌ）またはｒＦＩＺＺ１（１００ｎＭ）の鼻腔内投与を１日１回、５日間受けたマウスにおいて調べた。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝５）として表す。＊、＊＊：Ｐ＜０．０５、対ＰＢＳ処置マウス、または対ＬＰＳ処置マウスのいずれか。
【図７】ｒＦＩＺＺ１の、ＭＴＥＣおよび上皮が変化した気管に対する作用を解析した実験からの例示的なデータを示すグラフである。ＭＴＥＣのアポトーシス指数（Ａ）および亜硝酸塩濃度（Ｂ）を、処置したＭＴＥＣからの上清において調べた。ＣＣｈ刺激に対する等尺性張力の累積用量−応答曲線を、上皮を有する気管ＥＰ（＋）、およびＰＢＳまたはＦＩＺＺ１を用いて処置した、上皮を機械的に除去した気管ＥＰ（−）において測定した。群（Ｎ＝８〜１９）の張力の測定値を、平均±ＳＥＭとして表す。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、および＃：Ｐ＜０．０７。
【図８】ｃ−Ｒａｆ／ＥＲＫ１／２／ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化が、ｒＦＩＺＺ１−処置気管において増加することを示す例示的なデータを示すグラフである。α−アクチンおよび種々のＧタンパク質の発現レベル（Ａ）、ならびにｃ−Ｒａｆ、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２、リン酸化ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ等のＭＡＰＫ経路に関与するタンパク質の発現レベル（Ｂ、Ｃ）を、１００ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１処置気管またはＰＢＳ−処置気管のいずれかにおいて、ウエスタンブロットにより調べた。個々のリン酸化タンパク質を、同じ試料中のβ−アクチンの発現レベルに対して、表示した時点において測定した（Ｂ）。全タンパク質およびリン酸化タンパク質の発現レベルを、ＰＢＳまたはｒＦＩＺＺ１のいずれかとのインキュベーションの２４時間後に決定した（Ｃ）。２４時間培養物からのタンパク質のバンド強度の定量化を実施した（Ｄ〜Ｆ）。＊、＊＊、Ｐ＜０．０５または０．０１、それぞれ、対ＰＢＳ（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、気道反応性亢進およびその他の炎症性の疾患、障害または状態、特に、消化器系、肺系または生殖器系と関係するものを、ＦＩＺＺ１活性を低下させることによって治療するための方法を提供する。また、本発明は、気道の炎症および反応性亢進の調節物質、ならびにＦＩＺＺ１の調節物質を同定するための方法、さらに、それらの使用も提供する。さらに、本発明は、ＦＩＺＺ１タンパク質、それらの変異体または断片を使用して、免疫反応を増強するための組成物および方法も提供する。
【００５６】
本発明は、ＦＩＺＺ１が、新しい炎症メディエーターであるという発見に基づく。特に、本発明者らは、ＦＩＺＺ１ｍＲＮＡおよびＦＩＺＺ１タンパク質のレベルが、卵白アルブミン（ＯＡ）処置マウス由来の組織中で上方制御されており、ＦＩＺＺ１が、気管平滑筋（ＴＳＭ）の機能性の反応を調節することを見出した。例えば、実施例のセクションに記載するように、ＯＡ処置マウス由来の気管環が、カルバコール（ＣＣｈ）によって生じた力の有意な増強を示し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中への細胞の大規模な浸潤が生じた。この力発生の増加に伴って、気管中ではＦＩＺＺ１ｍＲＮＡの発現が誘導され、ＦＩＺＺ１タンパク質の発現が、ＰＢＳ処置動物と比較して、ＯＡ処置マウス由来のＢＡＬ中で増加した。組織学的には、ＦＩＺＺ１（例えば、１００ｎＭ）処置気管中では、気道上皮層がより薄くなり、不連続となった。本発明者らは、上皮を機械的に除去すると、気管が、ＴＳＭの力応答の増加を示すが、この応答は、ＦＩＺＺ１を用いて処置した剥皮気管中でより顕著であることもさらに観察した。さらに、ＦＩＺＺ１処置気管中では、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）−２０の発現の増加、ならびにリン酸化ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ＥＲＫ１／２およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）等のシグナル伝達分子も検出された。いずれの理論にも縛られる意図はないが、インタクトな収縮筋肉中では、ＦＩＺＺ１が、気道上皮を傷害し、ＭＬＣ−２０の、ｃ−Ｒａｆ−ＥＲＫ１／２−ｐ３８ＭＡＰＫ経路を介するリン酸化を媒介することによって、ＴＳＭ中の力の発生を強化することが予期される。
【００５７】
したがって、本発明は、例えば、抗ＦＩＺＺ１抗体およびアンチセンスＲＮＡを使用してＦＩＺＺ１活性を阻害することによって、炎症性の疾患、障害および状態を治療するための方法および組成物を提供する。また、本発明は、ＦＩＺＺ１タンパク質に基づく免疫反応を増強するための方法および組成物も提供する。
【００５８】
本発明の種々の態様を、以下のセクションに詳細に記載する。セクションの使用には、本発明を限定する意味はない。それぞれのセクションを、本発明の任意の態様に提供することができる。本出願では、「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００５９】
ＦＩＺＺ１
本明細書で使用する場合、（互換的に使用される）「ＦＩＺＺ１ポリペプチド」、「ＦＩＺＺ１タンパク質」および「ＦＩＺＺ１」という用語は、天然に存在するＦＩＺＺ１配列およびＦＩＺＺ１変異体（これらは、本明細書でさらに定義される）の両方を包含する。本発明に適したＦＩＺＺ１ポリペプチドは、ヒトもしくは非ヒト（例えば、マウス）の組織から等、多様な供給源から単離してもよく、または組換えもしくは合成の方法によって調製してもよい。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「天然に存在するＦＩＺＺ１」は、天然の供給源に由来するＦＩＺＺ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然に存在するＦＩＺＺ１は、天然から単離してもよく、または組換えもしくは合成の手段によって産生してもよい。また、「天然に存在するＦＩＺＺ１」という用語は、ＦＩＺＺ１タンパク質の天然に存在する切断型、天然に存在する変異型（例えば、選択的にスプライシングされた形態）、および天然に存在する対立遺伝子変異体も包含する。
【００６１】
非限定的な例として、マウスＦＩＺＺ１のヌクレオチド配列を、表１に示す。開始コドンおよび終止コドンには、下線が引かれている。マウスＦＩＺＺ１のアミノ酸配列を、表２に示す。
【００６２】
表１
マウスＦＩＺＺ１（ｍＦＩＺＺ１）ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２０５０９）（配列番号１）
1   ggtacctagg tcagcaatcc catggcgtat
aaaagcatct catctggcca ggtcctggaa
61  cctttcctga gattctgccc caggatgcca
actttgaata ggatgaagac tacaacttgt
121 tcccttctca tctgcatctc cctgctccag
ctgatggtcc cagtgaatac tgatgagacc
181 atagagatta tcgtggagaa taaggtcaag
gaacttcttg ccaatccagc taactatccc
241 tccactgtaa cgaagactct ctcttgcact
agtgtcaaga ctatgaacag atgggcctcc
301 tgccctgctg ggatgactgc tactgggtgt
gcttgtggct ttgcctgtgg atcttgggag
361 atccagagtg gagatacttg caactgcctg
tgcttactcg ttgactggac cactgcccgc
421 tgctgccaac tgtcctaaga atgaagaggt
ggagaaccca gctttgatat gatgaatcta
481 acaaaaactg cagtctcaat ttggaaatct
gactcatgtg cctttaaatg tgttcatatt
541 gcccatttac cctgcttctt gaaatgcttc
ttgaaaaata aagacaaatt tgcatgtg
【００６３】
表２
ｍＦＩＺＺ１ポリペプチド配列（Ｄａｙｈｏｆｆアクセッション番号：Ｐ＿Ｙ３２３２８）
MKTTTCSLLICISLLQLMVPVNTDETIEIIVENKVKELLANIPANYPSTVTKTLSCTSVKTMNRWASCPAGMTATGCACGFACGSWEIQSGDTCNCLCLLV
(配列番号２)
【００６４】
その他の非限定的な例として、ヒトＦＩＺＺ１のヌクレオチド配列を、表３に示す。開始コドンおよび終止コドンには、下線が引かれている。ヒトＦＩＺＺ１のアミノ酸配列を、表４に示す。
【００６５】
表３
ヒトＦＩＺＺ１（ｈＦＩＺＺ１）ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０３２５７９）（配列番号３）
1   ccacgttgtc ttctttcctt
caccaccacc caggagctca gagatctaag ctgctttcca
61  tcttttctcc cagccccagg acactgactc
tgtacaggat ggggccgtcc tcttgcctcc
121 ttctcatcct aatccccctt ctccagctga
tcaacccggg gagtactcag tgttccttag
181 actccgttat ggataagaag atcaaggatg
ttctcaacag tctagagtac agtccctctc
241 ctataagcaa gaagctctcg tgtgctagtg
tcaaaagcca aggcagaccg tcctcctgcc
301 ctgctgggat ggctgtcact ggctgtgctt
gtggctatgg ctgtggttcg tgggatgttc
361 agctggaaac cacctgccac tgccagtgca
gtgtggtgga ctggaccact gcccgctgct
421 gccacctgac ctgacaggga ggaggctgag
aactcagttt tgtgaccatg acagtaatga
481 aaccagggtc ccaaccaaga aatctaactc
aaacgtccca cttcatttgt tccattcctg
541 attcttgggt aataaagaca aactttgtac
ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa
【００６６】
表４
ｈＦＩＺＺ１ポリペプチド配列（タンパク質配列アクセッション番号：ＮＰ＿１１５９６８）
MGPSSCLLLILIPLLQLINPGSTQCSLDSVMDKKKIKDVLNSLEYSPSPISKKL
SCASVKSQGRPSSCPAGMAVTGCACGYGCGSWDVQLETTCHCQCSVVDW
TTARCCHLT (配列番号４)
【００６７】
しかし、マウスおよびヒトのタンパク質において同じ接尾語（ｓｕｆｆｉｘ）を使用しても、ヒトタンパク質が、マウスタンパク質のヒト相同体であることを必ずしも意味しない。さらなるマウスおよびヒトのＦＩＺＺタンパク質が存在し、それらが同定され得ることは可能であり、そうしたことは予期され、本明細書に開示するヒトタンパク質が、まだ同定されていない、その他のマウスＦＩＺＺタンパク質の相同体である場合がある。
【００６８】
本発明に適したＦＩＺＺ１ポリヌクレオチド配列は、表１もしくは３に提示するポリヌクレオチド配列、またはその断片を含む。また、本発明は、その塩基を表１もしくは３に示す対応する塩基から変化させることができるが、ＦＩＺＺ１タンパク質の活性および生理学的機能を維持するタンパク質を依然としてコードする突然変異体もしくは変異体のＦＩＺＺ１配列、またはそのような核酸の断片を使用することもできる。ＦＩＺＺ１ポリヌクレオチドは、その配列が、相補的な核酸断片を含めて、上記の配列に対して相補的である核酸分子をさらに含む。本発明に適したポリヌクレオチドまたは核酸は、化学的修飾を有することができる。そのような修飾の非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、少なくとも一部には、修飾された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらを、例えば、対象において、治療適用例におけるアンチセンス結合性核酸として使用することができる。いくつかの実施形態では、最大２０％以上の塩基をそのように変化させることができる（例えば、最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％以上の塩基を変化させることができる）。
【００６９】
また、本発明に適したＦＩＺＺ１ポリヌクレオチド配列は、表１および３に示したポリヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１および３）に対して、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％を含めた、７０〜１００％の配列同一性を示すＦＩＺＺ１ポリヌクレオチド変異体も含む。特に、ＦＩＺＺ１ポリヌクレオチド変異体は、本明細書の定義に従う、機能性または活性のＦＩＺＺ１タンパク質をコードする。
【００７０】
本発明に適したＦＩＺＺ１ポリペプチドは、表２（配列番号２）もしくは表４（配列番号４）に提示するポリペプチド配列、またはその断片を含む。また、本発明に適したＦＩＺＺ１ポリペプチドは、ＦＩＺＺ１の突然変異体または変異体のタンパク質も含む。適切なＦＩＺＺ１の突然変異体または変異体は、表２および４に示す対応する残基とは異なる残基を含有することができるが、生物学的活性および生理学的機能を維持するタンパク質またはその機能性断片を依然としてコードする。いくつかの実施形態では、最大３０％以上の残基をそのように変化させることができる（例えば、最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％以上の残基を変化させることができる）。したがって、本発明に適したＦＩＺＺ１ポリペプチドは、配列番号２または４に対して、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％を含めた、少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、適切なＦＩＺＺ１ポリペプチド変異体は、本明細書の定義に従う、機能性または活性のＦＩＺＺ１タンパク質をコードする。
【００７１】
本明細書で使用する場合、（互換的に使用される）「活性」または「機能性」のＦＩＺＺ１タンパク質は、生物学的および／または免疫学的な活性であって、成熟型を含めた、天然に存在する（野生型）ＦＩＺＺ１ポリペプチドの活性に類似するが、それとは必ずしも同一であるとは限らない活性を保持するＦＩＺＺ１ポリペプチドまたはＦＩＺＺ１ポリペプチド断片を指す。特定の生物学的なアッセイを用量依存性の有無にかかわらず使用して、ＦＩＺＺ１活性を決定することができる。例えば、以下の実施例に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＦＩＺＺ１活性を決定することができる。本明細書で使用する場合、免疫学的活性は、自然のＦＩＺＺ１が有する抗原性のエピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指し、生物学的活性は、免疫学的活性を除く、自然のＦＩＺＺ１によって引き起こされる阻害性または刺激性のいずれかの機能を指す。
【００７２】
本明細書で同定されるＦＩＺＺ１配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」を、候補配列を整列させ、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後の、ＦＩＺＺ１配列中のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチドのパーセントと定義する。パーセント核酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当分野の技術に属する種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウエア、例として、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウエアを使用して、アミノ酸配列同一性を決定する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６、４６０〜４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、それらの大部分は、デフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｌｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、最小値は、調整することができ、上記に示したように設定される。
【００７３】
本明細書で同定されるＦＩＺＺ１配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」を、候補配列を整列させ、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後の、ＦＩＺＺ１配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義するが、保存的置換はいずれも、配列同一性の一部であるとはみなさない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当分野の技術に属する種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウエア、例として、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウエアを使用して、アミノ酸配列同一性を決定する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６、４６０〜４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、それらの大部分は、デフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｌｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、最小値は、調整することができ、上記に示したように設定される。
【００７４】
ＦＩＺＺ１の突然変異体または変異体を、ＦＩＺＺ１ＤＮＡ中に、適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のＦＩＺＺ１ポリペプチドを合成することによって調製することができる。当業者であれば、アミノ酸変化によって、グリコシル化部位の数もしくは位置が変化する、または膜をアンカーする特徴が変化する等、ＦＩＺＺ１の翻訳後のプロセスが変化し得ることを理解するであろう。
【００７５】
本明細書に記載するＦＩＺＺ１配列またはＦＩＺＺ１ポリペプチドの種々のドメインにおける変異を、例えば、保存的および非保存的な突然変異についての技法およびガイドラインのうちのいずれか、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号の記載を使用して作製することができる。変異は、天然に存在するＦＩＺＺ１配列と比較して、ＦＩＺＺのアミノ酸配列の変化をもたらす、ＦＩＺＺ１をコードする１つまたは複数のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。場合により、変異は、ＦＩＺＺ１タンパク質のドメインのうちの１つまたは複数において、少なくとも１つのアミノ酸が任意のその他のアミノ酸によって置換されることによる。アミノ酸置換は、例として、ロイシンのセリンによる置換、すなわち、保存的アミノ酸置換等、１つのアミノ酸が類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸によって置換された結果である場合がある。挿入または欠失は、場合により、１〜５個のアミノ酸の範囲であり得る。配列中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作製し、当技術分野で既知または以下の実施例に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、得られた変異体を活性について試験することによって、生じた変異を決定することができる。
【００７６】
変異は、当技術分野で既知の方法、例として、オリゴヌクレオチド媒介型（部位特異的）突然変異生成、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ突然変異生成を使用して作製することができる。部位特異的突然変異生成［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異生成［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異生成（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ、３１７：４１５（１９８６）］、またはその他の既知の技法を、クローン化ＤＮＡに対して実施して、ＦＩＺＺ変異体ＤＮＡを産生することができる。
【００７７】
また、近接配列に沿ってスキャニングアミノ酸解析を利用して、１つまたは複数のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸には、比較的小型の中性アミノ酸がある。そのようなアミノ酸として、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。この群のうち、アラニンが典型的には好ましいスキャニングアミノ酸である。これは、アラニンにはベータ炭素までしか側鎖がなく、変異体の主鎖の立体構造が変化しそうにないことによる。また、アラニンは最も一般的なアミノ酸であることからも、アラニンが通常好まれる。さらに、アラニンは、埋没位置および露出位置の両方で頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６）］。アラニン置換によって、目的にかなう量の変異体が得られない場合には、アイソテリック（isoteric）なアミノ酸を使用することができる。
【００７８】
本明細書に開示する種々のＦＩＺＺ１ポリペプチドを記載するために使用する場合、「単離した」とは、同定され、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）非還元条件もしくは還元条件下で、クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製する。単離したポリペプチドは、ＦＩＺＺの天然の環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないことから、組換え細胞内部のｉｎ  ｓｉｔｕのポリペプチドを含む。しかし通常は、単離したポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００７９】
「単離した」ＦＩＺＺ核酸分子は、同定され、ＦＩＺＺ核酸の天然の供給源中では通常結合している少なくとも１つの混入物質の核酸分子から分離されている核酸分子である。単離したＦＩＺＺ核酸分子は、天然に見出される形態または状況にあるもの以外のものである。したがって、単離したＦＩＺＺ核酸分子は、天然の細胞中に存在する場合のＦＩＺＺ核酸分子とは区別される。しかし、単離したＦＩＺＺ核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞の染色体の場所とは異なる染色体の場所にある場合には、ＦＩＺＺを通常発現する細胞内に含有されるＦＩＺＺ核酸分子を含む。
【００８０】
ＦＩＺＺ１活性を減少させる方法
ＦＩＺＺ１活性を減少させるのに適した方法は、ＦＩＺＺ１の発現またはＦＩＺＺ１タンパク質活性を直接的または間接的に阻害する、破壊する、減少させるまたは低下させる方法であればいずれであってもよい。例示的な方法として、これらに限定されないが、抗体療法、結合性タンパク質療法、ｓｉＲＮＡ療法、アンチセンス療法、リボザイム療法、アプタマー療法、または小型分子を使用する方法を含めた、その他の療法が挙げられる。
【００８１】
抗体療法
本発明に適した抗ＦＩＺＺ１抗体は、任意のＦＩＺＺ１エピトープに免疫特異的に結合する抗体または抗体断片を含む。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、指定されたタンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片に対して特異的に反応性である免疫グロブリンおよびそれらの断片を含むことを意図する。適切な抗体として、これらに限定されないが、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート化抗体（すなわち、その他のタンパク質、放射標識、細胞毒にコンジュゲートまたは融合させた抗体）、タンパク質、および抗体断片が挙げられる。本明細書で使用する場合、また、「抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片も含む。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域等、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片；単一ドメイン抗体；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００８３】
抗ＦＩＺＺ１抗体の例示的な形態を、以下に記載する。
【００８４】
１．ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）
ポリクローナルＡｂを、哺乳動物宿主（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル、ウマ、イヌ、ネコ）中で、例えば、免疫原および所望によりアジュバントを１回または複数回注射することによって産生させることができる。典型的には、免疫原および／またはアジュバントを、哺乳動物に、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって注射する。免疫原は、ＦＩＺＺ１または融合タンパク質を含むことができる。アジュバントの例として、フロイントの完全アジュバントおよびモノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコレ−ト（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。免疫反応を改善するために、免疫原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤等の宿主中で免疫原性を示すタンパク質にコンジュゲートさせることができる。抗体産生のためのプロトコールが、（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）によって記載されている。あるいは、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリ中で作製することもできる（Ｓｃｈａｄｅら、１９９６）。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明に適した抗ＦＩＺＺ１抗体は、類人猿抗体である。例えば、ヒヒ中で治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法を、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開第ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１）、およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）に見出すことができる。
【００８６】
２．モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）
抗ＦＩＺＺ１ｍＡｂを、ハイブリドーマ法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、１９８３）を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法は、少なくとも４つのステップ、すなわち、（１）宿主または宿主由来のリンパ球を免疫化するステップと、（２）ｍＡｂを分泌する（または潜在的に分泌する）リンパ球を収集するステップと、（３）リンパ球を不死化細胞に融合させるステップと、（４）所望の（抗ＦＩＺＺ１）ｍＡｂを分泌する細胞を選択するステップとを含む。
【００８７】
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメまたはその他の適切な宿主を免疫化して、免疫原に特異的に結合するＡｂを、産生するまたは産生することが可能であるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することもできる。ヒト細胞が所望される場合には、抹消血リンパ球（ＰＢＬ）を一般に使用するが、その他の哺乳動物供給源由来の脾臓細胞またはリンパ球が通常は使用される。免疫原は、典型的には、ＦＩＺＺ１ポリペプチド、またはＦＩＺＺ１ポリペプチドもしくはその断片を含有する融合タンパク質を含む。
【００８８】
次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコール等の融合剤によって促進して、不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、１９９６）。形質転換によって不死化させたげっ歯類、ウシまたはヒトの骨髄腫細胞を使用することができる。例えば、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞系を使用することができる。ハイブリドーマ細胞を選択するために、融合後に、未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する適切な培地中で細胞を増殖する。通常の技法では、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く親細胞が使用される。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを、培地（ＨＡＴ培地）に添加して、ＨＧＰＲＴ欠乏未融合細胞の増殖を阻止しながら、ハイブリドーマを増殖させる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能なマウス骨髄腫系を使用する。いくつかの実施形態では、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系を使用して、ヒトｍＡｂを産生させる（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８４；Ｓｃｈｏｏｋ、１９８７）。
【００９０】
ハイブリドーマ細胞は、抗体を細胞外に分泌するので、培地を、ＦＩＺＺ１に対するｍＡｂ（抗ＦＩＺＺ１ｍＡｂ）の存在についてアッセイすることができる。ｍＡｂの結合特異性を測定するために使用することができる適切なアッセイとして、これらに限定されないが、スキャッチャード解析（ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ、１９８０）を含めた、免疫沈降アッセイ、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９９）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイが挙げられる。
【００９１】
抗ＦＩＺＺ１ｍＡｂ分泌ハイブリドーマ細胞を、限界希釈の手順によって、単一クローンとして単離し、継代培養することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、１９９６）。適切な培地には、ダルベッコ変法イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０や、所望により、タンパク質を含有しないもしくは低下させた培地または無血清培地（例えば、Ｕｌｔｒａ  ＤＯＭＡ  ＰＦまたはＨＬ−１；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）がある。また、ハイブリドーマ細胞を、腹水として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖することもできる。
【００９２】
ｍＡｂｓを、培地または腹水から、従来のＩｇ精製手順、例として、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿法または親和性クロマトグラフィーによって単離または精製することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９９）。
【００９３】
また、ｍＡｂは、組換え法によって作製することもできる（米国特許第４，１６６，４５２号、１９７９）。抗ＦＩＺＺ１ｍＡｂをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、例えば、好ましくは、抗ＦＩＺＺ１分泌ｍＡｂハイブリドーマ細胞系から単離されるＤＮＡを探索するための、マウス抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、容易に単離し、配列決定することができる。単離後、単離したＤＮＡ断片を、発現ベクター内にサブクローニングし、次いで、これを、これ以外ではＩｇタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞等の宿主細胞内にトランスフェクトして、ｍＡｂを発現させる。単離したＤＮＡ断片を、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列で、相同なマウス配列に代わって置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８７）、またはＩｇコード配列を、非Ｉｇポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部に融合させることによって改変することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドを、抗体の定常ドメインで置換してもよく、または１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換してキメラの二価の抗体を創出してもよい。
【００９４】
３．一価のＡｂ
Ａｂは、結果的に相互に架橋結合しない一価のＡｂである場合がある。例えば、１つの方法は、Ｉｇ軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。Ｆｃ領域中の任意の点における重鎖の切断は一般に、重鎖の架橋結合を阻止する。あるいは、関連するシステイン残基を、別のアミノ酸残基で置換するかまたは欠失させると、架橋結合が阻止される。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法も、一価のＡｂを調製するのに適している。Ａｂを、消化して、Ｆａｂ断片等の断片を産生することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９９）。
【００９５】
４．単一ドメイン抗体
また、本発明は、単一ドメイン抗体の使用も企図する。単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が、単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例として、これらに限定されないが、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠く抗体、従来の四本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、工学的に作製された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン骨格が挙げられる。単一ドメイン抗体は、当技術分野のいずれであってもよく、または今後出現する単一ドメイン抗体のいずれであってもよい。単一ドメイン抗体は、これらに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含めた、任意の種に由来し得る。
【００９６】
５．ヒト化ＡｂおよびヒトＡｂ
抗ＦＩＺＺ１Ａｂは、ヒト化ＡｂおよびヒトＡｂをさらに含むことができる。非ヒトＡｂのヒト化形態は、非ヒトＩｇに由来する最小配列を含有するキメラのＩｇ、Ｉｇ鎖または断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＡｂのその他の抗原結合サブ配列等）である。
【００９７】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「移入」残基と呼ばれ、これらは、典型的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって達成される（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）。そのような「ヒト化」Ａｂは、キメラＡｂであり（米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９）、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。いくつかの実施形態では、ヒト化Ａｂは、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類Ａｂ中の類似の部位由来の残基によって置換されているヒトＡｂである。ヒト化Ａｂは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を示す、マウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例では、対応する非ヒト残基によって、ヒトＩｇのＦｖフレームワークの残基が置換されている。ヒト化Ａｂは、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲおよびフレームワークの配列中にも見出されない残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのうち、全てでないにしても大部分のＣＤＲ領域が、非ヒトＩｇのＣＤＲ領域に対応し、全てでないにしても大部分のＦＲ領域が、ヒトＩｇコンセンサス配列のＦＲ領域である。また、最適には、ヒト化抗体は、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトＩｇの定常領域の少なくとも一部も含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｐｒｅｓｔａ、１９９２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。
【００９８】
また、ヒトＡｂも、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１）およびヒトｍＡｂの調製（Ｂｏｅｍｅｒら、１９９１；ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ、１９８５）を含めた、種々の技法を使用して産生することができる。同様に、内在性Ｉｇ遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子導入動物内へのヒトＩｇ遺伝子の導入を活用して、ヒトＡｂを合成することもできる。チャレンジ後、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子の再構成、集合および抗体のレパートリーを含めて、全ての点でヒトにおいて見られるものに密接に類似する（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｋａｐｐａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６  Ｊｕｌｙ；１４（７）：８４５〜５１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９４  Ａｐｒｉｌ  ２８；３６８（６４７４）：８５６〜９；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１３（１）：６５〜９３；Ｍａｒｋｓら、Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９２  Ｊｕｌｙ；１０（７）：７７９〜８３）。
【００９９】
６．二重特異性ｍＡｂ
二重特異性Ａｂは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を示すモノクローナル抗体であり、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。例えば、一方の結合特異性は、ＦＩＺＺ１であり、他方は、最適な抗原のいずれか、好ましくは、細胞表面タンパク質、または受容体もしくは受容体サブユニットに対してである。
【０１００】
従来から、二重特異性Ａｂの組換えによる産生は、２つのＩｇ重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づいており、これら２つの重鎖は、異なる特異性を示す（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３）。Ｉｇの重鎖および軽鎖のランダムな取合せのために、得られたハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、このうち、１つのみが、所望の二重特異性構造を有する。所望の抗体を、親和性クロマトグラフィーまたはその他の技法を使用して精製することができる（ＷＯ９３／０８８２９、１９９３；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１）。
【０１０１】
二重特異性抗体を製造するために（Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６）、所望の抗体−抗原結合部位を有する可変ドメインを、Ｉｇ定常ドメイン配列に融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインを有する。好ましくは、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうちの少なくとも１つの中にある。Ｉｇ重鎖融合体および所望によりＩｇ軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター内に導入し、適切な宿主生物体内に同時にトランスフェクトする。
【０１０２】
一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養物から回収するヘテロ二量体のパーセントが最大化するように工学的に作製することができる（ＷＯ９６／２７０１１、１９９６）。好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する１つまたは複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。（１つまたは複数の）こうした大型の側鎖と同一またはそれに類似したサイズの、代償の「空洞」を、第２の抗体分子の界面上に、大型のアミノ酸側鎖をより小型のもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって生み出す。この機構によって、ヘテロ二量体の収率が増加し、ホモ二量体等の望まれない最終産物を上回る。
【０１０３】
二重特異性Ａｂは、完全長のＡｂとして調製しても、または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性Ａｂ）として調製してもよい。二重特異性Ａｂを得るための１つの技法は、化学的な連結を活用する。インタクトなＡｂを、タンパク質分解性に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる（Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５）。断片を、亜ヒ酸ナトリウム等のジチオール錯体化剤を用いて還元して、近接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、得られたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンを用いて還元することによってＦａｂ’−チオールに再転換し、等モルの量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性Ａｂは、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１０４】
Ｆａｂ’断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的にカップルさせて、二重特異性Ａｂを形成することができる。例えば、完全ヒト化二重特異性Ｆ（ａｂ’）２Ａｂを、産生することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、１９９２）。それぞれのＦａｂ’断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から別個に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて直接化学的にカップルさせて、二重特異性抗体を形成する。
【０１０５】
また、二重特異性抗体断片を作製し、組換え細胞培養から直接単離するための種々の技法も記載されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを活用することができる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のペプチドを、２つの異なるＡｂのＦａｂ’部分に、遺伝子融合によって連結する。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで、再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成する。また、この方法は、抗体のホモ二量体も産生することができる。「ダイアボディ」技術（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３）は、二重特異性抗体断片を得るための代替方法をもたらす。これらの断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に、非常に短いので同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないリンカーによって接続している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは余儀なく、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を形成することになる。二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略は、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）二量体の使用である（Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４）。また、三重特異性Ａｂ等の三価以上を有するＡｂも企図される（Ｔｕｔｔら、１９９１）。
【０１０６】
例示的な二重特異性Ａｂは、所与のＦＩＺＺ１上の２つの異なるエピトープに結合することができる。あるいは、細胞性の防御機構を、特定のＦＩＺＺ１を発現している特定の細胞に制限することもできる。すなわち、抗ＦＩＺＺ１腕を、白血球誘発分子、例として、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８もしくはＢ７）に、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例として、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合する腕と組み合わせることができる。また、二重特異性Ａｂを使用して、特定のＦＩＺＺ１を発現する細胞を細胞傷害剤の標的にすることもできる。これらのＡｂは、ＦＩＺＺ１に結合する腕、および細胞傷害剤または放射ヌクレオチドキレート剤に結合する腕を有する。
【０１０７】
７．ヘテロコンジュゲートＡｂ
２つの共有結合したＡｂからなるヘテロコンジュゲートＡｂによって、望まれない細胞を免疫系細胞の標的とすること（米国特許第４，６７６，９８０号、１９８７）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を治療すること（ＷＯ９１／００３６０、１９９１；ＷＯ９２／２０３７３、１９９２）が提案されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、架橋結合剤が関与する方法を含めて、合成タンパク質化学の方法を使用して調製したＡｂが企図される。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。適切な試薬の例として、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる（米国特許第４，６７６，９８０号、１９８７）。
【０１０８】
８．イムノコンジュゲート
イムノコンジュゲートは、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物を起源とする酵素的に活性な毒素もしくは断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）等の細胞傷害剤にコンジュゲートさせた抗体を含むことができる。
【０１０９】
有用な酵素的に活性な毒素および断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテシンが挙げられる。２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅ等の多様な放射性核種が、放射性コンジュゲートＡｂの産生のために利用可能である。
【０１１０】
抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートを、多様な二機能性タンパク質カップリング剤、例として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して作製する。例えば、リシン免疫毒素を調製することができる（Ｖｉｔｅｔｔａら、１９８７）。１４Ｃ−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン５酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６、１９９４）。
【０１１１】
９．エフェクター機能の工学的な作製
抗体を改変して、炎症等の疾患を治療する場合のその有効性を増強することができる。例えば、（１つまたは複数の）システイン残基を、Ｆｃ領域内に導入することができ、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となる。そのようなホモ二量体Ａｂは、内部移行の能力の改善ならびに／または補体媒介型細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を示すことができる（Ｃａｒｏｎら、１９９２；Ｓｈｏｐｅｓ、１９９２）。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体Ａｂを、ヘテロ二機能性クロスリンカーを使用して調製することができる（Ｗｏｌｆｆら、１９９３）。あるいは、二重のＦｃ領域を用いて工学的に作製した抗体は、補体溶解の増強を示すこともできる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９８９）。
【０１１２】
１０．  イムノリポソーム
また、抗体を含有するリポソームも製剤化することができる（米国特許第４，４８５，０４５号、１９８４；米国特許第４，５４４，５４５号、１９８５；米国特許第５，０１３，５５６号、１９９１；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５；Ｈｗａｎｇら、１９８０）。有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって得ることができる。そのような調製物を、規定された孔径のフィルターを通して押出して、所望の直径を有するリポソームを得る。抗体のＦａｂ’断片を、ジスルフィド交換反応によって、リポソームにコンジュゲートすることができる（ＭａｒｔｉｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８２）。また、ドキソルビシン等の化学療法剤も、リポソーム中に含有させることができる（Ｇａｂｉｚｏｎら、１９８９）。異なる組成物を用いるその他の有用なリポソームも企図される。
【０１１３】
結合性タンパク質療法
本発明に適した抗ＦＩＺＺ１結合性タンパク質は、ＦＩＺＺ１に結合し、ＦＩＺＺ１の発現または生物学的活性を、阻害する、破壊する、減少させるまたは低下させる（例えば、それに拮抗する）結合性タンパク質を含む。ＦＩＺＺ１結合性タンパク質は、単一ドメイン結合性タンパク質および単一ドメイン結合骨格を含むことができる。本発明において使用するのに適した結合性タンパク質として、例えば、ＩｇＮＡＲ、ＶＨＨナノボディおよび／またはＳＭＩＰを挙げることができる。
【０１１４】
アプタマー療法
アプタマーは、特異的な分子標的（例えば、ＦＩＺＺ１タンパク質、そのポリペプチドまたはエピトープ）に強固に結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）から構成される巨大分子である。特定のアプタマーは、直鎖のヌクレオチド配列によって記載することができ、典型的には、約１５〜６０ヌクレオチド長である。いずれの理論にも縛られる意図はないが、アプタマー中のヌクレオチド鎖が、この分子を複雑な三次元形状に折畳む分子内相互作用を形成し、この三次元形状によって、アプタマーがその標的分子の表面に強固に結合することが可能になることが予期される。全ての可能なヌクレオチド配列の母集団内に存在する極めて多様な分子形状を考えると、アプタマーを、タンパク質および小型分子を含めた、広範な分子標的のために得ることができる。高い特異性に加えて、アプタマーは、それらの標的に対する非常に高い親和性も示す（例えば、タンパク質に対しては、ピコモルから低ナノモルの範囲の親和性）。アプタマーは、化学的に安定であり、活性を失うことなく、沸騰または凍結させることができる。これらは、合成分子であることから、多様な改変が可能であり、それによって、特定の適用例のためにそれらの機能を最適化することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用例において使用するために、アプタマーを改変して、血中の酵素による分解に対するそれらの感受性を劇的に低下させることができる。さらに、アプタマーを改変して、それらの体内分布または血漿滞留時間を変化させることもできる。
【０１１５】
ＦＩＺＺ１またはその断片に結合することができるアプタマーの選択を、当技術分野で既知の方法によって達成することができる。例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を使用してアプタマーを選択することができる（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．およびＧｏｌｄ，Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５〜５１０（１９９０））。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大型のライブラリー（例えば、１０１５個の異なる分子）を生成し、かつ／または標的分子（例えば、ＦＩＺＺ１タンパク質またはＦＩＺＺ１エピトープ）を用いてスクリーニングする。標的分子を、ヌクレオチド配列のライブラリーと共に一定期間インキュベートする。次いで、当技術分野で既知のいくつかの方法を使用して、混合物中の未結合の分子から、アプタマー標的分子を物理的に単離することができ、これらの未結合の分子を廃棄することができる。次いで、標的分子に対して最も高い親和性を示すアプタマーを、標的分子から精製し分け、酵素により増幅して、標的分子に結合することができるアプタマーが実質的に濃縮されている、分子の新しいライブラリーを生成することができる。次いで、この濃縮ライブラリーを使用して、選択、分離および増幅の新しいサイクルを開始することができる。この選択、分離および増幅のプロセスを５〜１５サイクル反復すると、ライブラリーは、標的分子に強固に結合する少数のアプタマーに縮小される。次いで、混合物中の個々の分子を単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性に関するそれらの特性を測定し、比較することができる。次いで、単離したアプタマーをさらに純化して、標的結合および／またはアプタマー構造に寄与しないヌクレオチドはいずれも排除し、それによって、それらのコア結合ドメインに切り詰められたアプタマーを生成することができる。アプタマー技術の総説については、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．、Ｄ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８〜１６５０（１９９９）を参照されたい。この教示全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１６】
アンチセンスＲＮＡおよび干渉ＲＮＡによる療法
アンチセンス分子は、特異的なｍＲＮＡに対して相補的であるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子である。実験室で調製したアンチセンス分子を、研究下の遺伝子によって転写された正常なｍＲＮＡを含有する細胞内に注入すると、このアンチセンス分子は、このｍＲＮＡと塩基対形成して、このｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻止することができる。得られた二本鎖のＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡは、そのような分子に特異的に結合する酵素によって消化される。したがって、ｍＲＮＡの枯渇が生じて、遺伝子産物の翻訳が遮断され、このことから、アンチセンス分子は、医学において、有害なタンパク質の産生を遮断するのに使用される。アンチセンスＲＮＡを産生および活用する方法は、当業者には周知である（例えば、Ｃ．ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＷ．Ｎｅｌｌｅｎ（編）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、１９９７）；Ｓ．ＡｇｒａｗａｌおよびＳ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  １３１）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（Ａｐｒｉｌ、１９９８）；Ｉ．Ｇｉｂｓｏｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ（Ｊｕｎｅ、１９９７）；Ｊ．Ｎ．Ｍ．ＭｏｌおよびＡ．Ｒ．Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；Ｂ．Ｗｅｉｓｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｎｅ、１９９７）；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｎｅ、１９９３）；Ｃ．Ａ．ＳｔｅｉｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｐｒｉｌ、１９９８）を参照されたい）。
【０１１７】
ＦＩＺＺ１活性を阻害するのに適したアンチセンス分子およびリボザイムを、上記および当技術分野で既知の配列に基づいて設計することができる。アンチセンス分子およびリボザイムを、核酸分子を合成するための当技術分野で既知の任意の方法によって調製することができる。これらには、固相ホスホラミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技法がある。あるいは、ＲＮＡ分子を、ＵＧＧＴをコードするＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて転写することによって得ることもできる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多種多様なベクター内に組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構築物を、細胞系、細胞または組織内に導入することもできる。
【０１１８】
ＲＮＡ分子を改変して、細胞内の安定性および半減期を増加させることができる。可能な改変として、これらに限定されないが、分子の５’末端および／もしくは３’末端における隣接配列の付加、または分子骨格内部のリン酸ジエステル連結に代わる、ホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。この概念を延長して、イノシン、キューオシンおよびワイブトシン等の非従来型の塩基、ならびに内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−の類似の修飾形態を含めることができる。
【０１１９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後の遺伝子発現抑制の機構であり、これは、上記のアンチセンスおよびリボザイムに基づくアプローチとは明確に異なる。ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＩＣＥＲと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３、２００１）によるプロセシングを最初に受けた後、種々の系列の細胞中で、ｍＲＮＡの配列特異的分解を導くと考えられ、このプロセシングによって、２つの２１ｎｔ鎖から構成される小型のｄｓＲＮＡ分子が生じ、それらのそれぞれが、５’リン酸基および３’ヒドロキシルを有し、他方の鎖とぴったり相補的である１９ｎｔ領域を含み、したがって、２ｎｔ−３’オーバーハングが隣接する１９ｎｔの二重鎖領域がある。したがって、ＲＮＡｉは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介され、これは、典型的には、およそ１９ヌクレオチド長の二本鎖領域を含み、典型的には、それぞれの鎖上に１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有し、その結果、全長は、典型的には、およそ２１〜２３ヌクレオチド長となる。
【０１２０】
また、ｓｉＲＮＡは、様々な長さであり得、例えば、二本鎖部分が、１５〜２９ヌクレオチド長に及ぶことができることも理解されるであろう。また、ｓｉＲＮＡは、一方または両方の末端において、平滑末端を有しても、または３’オーバーハングを有してもよいことも理解されるであろう。そのような３’オーバーハングが存在する場合には、１〜５ヌクレオチド長であることが多い。
【０１２１】
ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞内に、トランスフェクション、エレクトロポレーションもしくはマイクロインジェクション等の方法によって導入された場合、または細胞中で、多様な、プラスミドに基づくアプローチのいずれかによって発現させた場合、遺伝子発現を下方制御することが示されている。ｓｉＲＮＡを使用するＲＮＡ干渉は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ、Ｔ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：４４６〜４４８、Ｍａｙ  ２００２に総説されている。また、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（９）、６０４７〜６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（８）、５５１５〜５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１６、９４８〜９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６、５５０〜５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．およびＴａｉｒａ，Ｋ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４９７〜５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、５０５〜５０８（２００２）も参照されたい。
【０１２２】
実際に、特異的な遺伝子の発現の、ＲＮＡｉによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける阻害が、哺乳動物を含めた、種々の生物体中で達成されている。例えば、Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：３４７〜３５１（２００３）は、Ｆａｓ  ｓｉＲＮＡ化合物を、自己免疫性肝炎を有する実験用マウス内に静脈内注射すると、マウス肝臓細胞中のＦａｓ  ｍＲＮＡレベルおよびＦａｓタンパク質の発現が特異的に低下したことを開示している。また、ｓｉＲＮＡを動物内に送達するためのいくつかのその他のアプローチが成功することも証明されている。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８：３８〜３９（２００２）；Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３２：１０７〜１０８（２００２）；およびＸｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：１００６〜１０１０（２００２）を参照されたい。
【０１２３】
これらおよびその他の参考文献に記載されているように、ｓｉＲＮＡは、２つの個々の核酸鎖、またはヘアピン（ステムループ）構造を形成することができる自己相補的な領域を有する一本鎖からなることができる。構造、長さ、ミスマッチの数、ループのサイズ、オーバーハングにおけるヌクレオチドの同一性等をいくつかに変化させても、一貫して、有効なｓｉＲＮＡ誘発性の遺伝子発現抑制が生じる。いずれの理論にも縛られる意図はないが、多様な異なる前駆体が（例えば、ＤＩＣＥＲによって）細胞内プロセシングされ、その結果、遺伝子発現抑制を有効に媒介することができるｓｉＲＮＡが産生することが考えられる。一般に、イントロンではなく、エクソンを標的にすることが望ましく、また、標的転写物の３’部分内部の領域に対して相補的である配列を選択することが特に望ましい。一般に、およそ等モル比の異なるヌクレオチドを含有する配列を選択し、単一の残基が複数回繰り返されるストレッチを回避することが好ましい。
【０１２４】
したがって、ｓｉＲＮＡは、典型的には、およそ１９ヌクレオチド長の二重鎖領域を有し、典型的には、それぞれの鎖上に１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有し、その結果、全長はおよそ２１〜２３ヌクレオチド長となるＲＮＡ分子を含むことができる。また、本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてプロセスされて、そのような分子を生じることができる種々のＲＮＡ構造も含む。そのような構造は、相互にハイブリダイズして、ステム、ループ、および場合によりオーバーハング、好ましくは３’オーバーハングを形成する２つの相補的な要素を含有するＲＮＡ鎖を含む。典型的には、ステムは、およそ１９ｂｐ長であり、ループは、約１〜２０、好ましくは約４〜１０、より好ましくは約６〜８ヌクレオチド長であり、かつ／またはオーバーハングは、典型的には、約１〜２０、好ましくは約２〜１５ヌクレオチド長である。本発明の特定の実施形態では、ステムは、最短１９ヌクレオチド長であり、最長およそ２９ヌクレオチド長であり得る。４ヌクレオチド長以上のループは、より短いループよりも立体的な制約を受けにくく、したがって、好ましい場合がある。オーバーハングは、５’リン酸および３’ヒドロキシルを含むことができる。オーバーハングは、複数のＵ残基、例えば、１〜５個のＵ残基を含むことができるが、そうである必要はない。
【０１２５】
本発明に適したｓｉＲＮＡ化合物を、上記のＦＩＺＺ１配列に基づいて設計することができ、従来のＲＮＡ合成法を使用して合成することができる。例えば、それらを、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して化学的に合成することができる。ＲＮＡ合成のための種々の適用可能な方法が、例えば、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：７８４５〜７８５４（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１８：５４３３〜５４４１（１９９０）に開示されている。ｓｉＲＮＡ合成を注文に応じて提供するサービスが、商業的な供給元、例として、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、米国）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、米国）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）から入手可能である。
【０１２６】
本発明のｓｉＲＮＡは、天然のＲＮＡヌクレオチドから全て構成してもよく、またはその代わりに、アンチセンス分子について上記で言及した１つもしくは複数のヌクレオチドの類似体および／もしくは改変体を含んでもよい。ｓｉＲＮＡ構造を、例えば、エキソヌクレアーゼによる消化を低下させるために、例えば、１つまたは複数の遊離の鎖末端においてヌクレオチド類似体を含めることによって安定化することができる。また、これは、封入によって達成することもできる。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子を、関連分子をコードするＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写することによって得ることもできる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多種多様なベクター内に組み込むことができる。
【０１２７】
また、ｓｉＲＮＡ化合物は、ｓｉＲＮＡ構造の種々の改変均等物であってもよい。本明細書で使用する場合、「改変均等物」とは、同じ標的特異性を示す（すなわち、未改変の特定のｓｉＲＮＡ化合物を補完する同じｍＲＮＡ分子を認識する）、特定のｓｉＲＮＡ化合物の改変形態を意味する。したがって、未改変ｓｉＲＮＡ化合物の改変均等物は、改変リボヌクレオチド、すなわち、未改変ヌクレオチドの塩基、糖および／またはリン酸（もしくはリン酸ジエステル連結）の化学構造中の改変を含有するリボヌクレオチドを有することができる。当技術分野で知られているように、「未改変リボヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのうちの１つを有する。
【０１２８】
改変ｓｉＲＮＡ化合物は、改変骨格または非天然ヌクレオシド間連結、例えば、改変亜リン酸含有骨格、ならびに非亜リン酸骨格、例として、モルホリノ骨格；シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、スルホン酸骨格、スルホンアミド骨格およびスルファミン酸骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；アミド骨格等を含有する。
【０１２９】
改変亜リン酸含有骨格の例として、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、不斉なホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート、チオノアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェート、ならびにそれらの種々の塩の形態が挙げられる。例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号および第５，６２５，０５０号を参照されたい。それらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３０】
上記の亜リン酸非含有骨格の例が、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６７７，４３７号および第５，６７７，４３９号に開示されている。それらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３１】
また、ｓｉＲＮＡ化合物の改変形態は、改変ヌクレオシド（ヌクレオシド類似体）、すなわち、改変されたプリン塩基またはピリミジン塩基、例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メトキシルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、４−アセチルシチジン、３−メチルシチジン、プロピン、キューオシン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、Ｎ−２、Ｎ−６およびＯ−置換プリン、イノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、スレオニン誘導体等も含有することができる。例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６８１，９４１号および第５，７５０，６９２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１８７号；ならびにＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２：２１８３（１９９４）を参照されたい。それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
さらにまた、改変ｓｉＲＮＡ化合物は、置換または改変された糖部分、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を有することもできる。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号を参照されたい。それらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３３】
改変ｓｉＲＮＡ化合物を、例えば、米国特許第５，６５２，０９４号；国際公開第ＷＯ９１／０３１６２号；第ＷＯ９２／０７０６５号および第ＷＯ９３／１５１８７号；欧州特許出願第９２１１０２９８．４号；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：５６５（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：３１４（１９９１）；およびＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、１７：３３４（１９９２）に開示されている方法によって合成することができる。
【０１３４】
ｓｉＲＮＡを、小型ＲＮＡ分子の細胞内転写によって得ることができ、これに、細胞内プロセシングの事象が続くことができる。例えば、細胞内転写を、例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターの制御下のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写単位内に、ｓｉＲＮＡ鋳型をクローニングすることによって達成することができる。１つのアプローチでは、センス鎖およびアンチセンス鎖を、個々のプロモーターから転写する。これらは、同じ構築物上にあってよい。プロモーターが単一の鋳型から転写を推進するように、これらの方向が反対であってもよく、またはこれらが異なる鋳型からの合成を導いてもよい。第２のアプローチでは、ｓｉＲＮＡを、ステムループ構造として発現させる。本発明のｓｉＲＮＡを、細胞内に、多様な方法のいずれかによって導入することができる。例えば、ｓｉＲＮＡまたはそれらをコードするベクターを、細胞内に、従来の形質転換またはトランスフェクションの技法によって導入することができる。本明細書で使用する場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクション、注入またはエレクトロポレーションを含めた、外来核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主細胞内に導入するための多様な当技術分野で認識されている技法を指すことを意図する。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける合成を構成的または誘導的に導くベクターを、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、ｓｉＲＮＡ発現構築物を哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞に送達するのに適した遺伝子治療用ベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、または種々の非ウイルス性遺伝子治療用ベクター）である。したがって、本発明は、例えば、気道（例えば、気道反応性亢進）、消化管、肺または生殖器系中の炎症と関係する疾患または臨床状態を治療するための遺伝子治療アプローチを含む。
【０１３６】
本発明は、例えば、気道、消化管、肺または生殖器系中の炎症と関係する疾患または臨床状態を、ＦＩＺＺ１またはＦＩＺＺ１受容体を標的にするｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を投与することによって治療する方法を含む。これらの組成物は、非経口、経口、吸入等によって投与することができる。
【０１３７】
典型的には、ｓｉＲＮＡ組成物は、標的転写物およびそれがコードするタンパク質のレベルを、少なくとも２分の１、好ましくは、少なくとも４分の１、より好ましくは、少なくとも１０分の１以下まで低下させる。候補ｓｉＲＮＡの、標的転写物および／またはそれがコードするタンパク質の発現を低下させる能力は、これらに限定されないが、転写物の場合には、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、およびコードされたタンパク質の場合には、種々の免疫学的方法、例として、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法等を含めた、当技術分野で周知の方法を使用して容易に試験することができる。有効性を、適切な動物モデルまたはヒト対象において試験することができる。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡ化合物を、哺乳動物に、異なる経路を介する種々の方法によって投与することができる。例えば、これらは、静脈内注射によって投与することができる。Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：３４７〜３５１（２００３）を参照されたい。また、これらを、特定の臓器または組織に、任意の適切な局所投与法によって直接送達することもできる。また、ｓｉＲＮＡを動物内に送達するためのいくつかのその他のアプローチが成功することも証明されている。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８：３８〜３９（２００２）；Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３２：１０７〜１０８（２００２）；およびＸｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：１００６〜１０１０（２００２）を参照されたい。あるいは、それらを、リポソーム中に被包して、イオン泳動によって、またはその他のビヒクル、例として、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性マイクロスフェア中に組み込むことによって送達することもできる。
【０１３９】
さらにまた、遺伝子治療アプローチによって、例えば、そこから小型のヘアピンの形態（ｓｈＲＮＡ）等をとるｓｉＲＮＡ化合物を直接転写することができるＤＮＡベクターを使用して、ｓｉＲＮＡ化合物を送達することもできる。多数の研究によって、二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介するのに非常に有効であり、一方また、おそらく、短い一本鎖のヘアピン形状のＲＮＡは、細胞の酵素によって二本鎖ｓｉＲＮＡにプロセスされる分子内二重鎖に折畳まれることから、それらもＲＮＡｉを媒介することができることが実証されている。Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：５５１５〜５５２０（２００２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：６０４７〜６０５２（２００２）；およびＰａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：５０５〜５０８（２００２）。この発見には、顕著でかつ広範囲に及ぶ意味がある。これは、そのような小型のヘアピンＲＮＡの転写を導く、少数（例えば、３〜９個）のヌクレオチドによって分離されている短い逆方向反復を担持するＤＮＡベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることによって、そのようなｓｈＲＮＡの産生をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて容易に達成することができるからである。さらに、宿主細胞ゲノム内への転写カセットの組込みを導く機構または転写ベクターの安定性を確実にする機構が含まれている場合、コードされたｓｈＲＮＡによって引き起こされるＲＮＡｉを安定かつ遺伝性となすこともできる。そのような技法は、哺乳動物細胞中の特異的な遺伝子の発現を「ノックダウンする」ために使用されているのみならず、今では、外因的に発現させる導入遺伝子および生存マウスの脳および肝臓中の内在性遺伝子の発現をノックダウンするためにも首尾よく利用されるようになった。一般に、Ｈａｎｎｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ．４１８：２４４〜２５１（２００２）およびＳｈｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、１９：９〜１２（２００３）を参照されたい。また、Ｘｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：１００６〜１０１０（２００２）も参照されたい。
【０１４０】
また、本発明において同定された、タンパク質複合体の１つまたは複数の相互作用タンパク質のメンバーをコードする核酸の異なる部位を標的にする追加のｓｉＲＮＡ化合物を、本明細書に提供し、当業者に通常既知の一般的なガイドラインに従って、設計し、合成することもできる。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜４９８（２００１）を参照されたい。例えば、ガイドラインが、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．のウェブサイトで利用可能である「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」に編さんされている。
【０１４１】
ＦＩＺＺ１調節物質の同定
また、本発明は、ＦＩＺＺ１活性の調節物質、またはＦＩＺＺ１が関与する、特に、炎症に関連する生物学的／生理学的な機能を、評価または同定するための方法も提供する。特に、本発明は、翻訳、転写、活性、特に、炎症に関連する生理学的活性（例えば、気道の炎症または反応性亢進）を含めて、ＦＩＺＺ１を調節する（例えば、刺激または阻害する）モダリティー、すなわち、候補または試験の化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣薬、小型分子またはその他の薬物）を同定するための方法（例えば、スクリーニングアッセイ）を提供する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、高スループットスクリーニングを、ＦＩＺＺ１の生物学的／生理学的な機能（例えば、気道炎症または気道反応性亢進）を調節することができる調節物質について検索する場合に活用する。以下に記載するアッセイを、請求に係る発明を実行するのに有用な、多数の薬剤の迅速な自動化スクリーニングを可能にするために設計することができる。高スループットスクリーニングに関する一般的な情報については、例えば、Ｃｏｓｔ−Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、ＩＢＣＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＩＢＣ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ、１９９６）；Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（編）、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｋｅｄｄｅｒ（１９９８）；米国特許第５，７６３，２６３号を参照されたい。
【０１４３】
ＦＩＺＺ１が、気管における力の発生を強化し、気道上皮を損なうという発見に基づいて、アッセイを開発することができる。１つの例示的な方法は、（１）気管試料を提供するステップと、；（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（３）薬剤を培地に提供するステップと、（４）気管試料の組織像を決定するステップと、（５）ステップ（４）からの組織像の結果を対照と比較して、気道炎症を調節する薬剤の能力を評価するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（４）は、気管試料中の上皮層が組織学的にインタクトであることを決定することを含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料の組織像を含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料の組織像を含む。
【０１４４】
別の例示的な方法は、（１）気管試料を提供するステップと、（２）培地中で気管試料をＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（３）薬剤を培地に提供するステップと、（４）カルバコールを培地に提供するステップと、（５）気管試料のカルバコールに対する収縮反応を決定するステップと、（６）ステップ（５）で決定したカルバコールに対する収縮反応を対照と比較して、気道反応性亢進を調節する薬剤の能力を評価するステップとを含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１非存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む。いくつかの実施形態では、対照は、培地中でＦＩＺＺ１存在下で培養した気管試料のカルバコールに対する収縮反応を含む。
【０１４５】
上記のアッセイに適した気管試料は、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ネコ、モルモットまたはその他の動物に由来し得る。好ましくは、気管試料を得る前に、動物を、アレルゲン（例えば、卵白アルブミンもしくはリポ多糖）、またはその他の抗原（例えば、ブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）抗原）を用いて処置する。
【０１４６】
例えば、組織試料（例えば、気管）は、当技術分野で既知の動物モデルに由来し得る（例えば、米国特許第６，１９３，９５７号；第６，０５１，５６６号；第５，０８０，８９９号，第６，１８０，６４３号，第６，０２８，２０８号、および米国特許出願第２００１００００３４１号、第２００１０００６６５６号）。例えば、米国特許第６，１９３，９５７号は、肺の気流抵抗のｉｎ  ｖｉｖｏモデル（ヒツジ）を詳細に記載している。米国特許第５，０８０，８９９号は、肺の炎症を治療するために経口投与した薬物の有効性を研究するためのｉｎ  ｖｉｖｏモルモットモデルを詳述している。米国特許公開第２００１００００３４１号および第２００１０００６６５６号は、マウスにおけるＬＰＳ誘発性の気道炎症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを記載している。米国特許第６，０２８，２０８号は、ハムスターにおけるＬＰＳ誘発性の気道炎症の類似のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを記載している。
【０１４７】
また、ＦＩＺＺ１媒介型表現型に基づくアッセイを使用して、ＦＩＺＺ１調節物質、特に、ＦＩＺＺ１阻害剤を同定することもできる。１つの例示的な方法は、（１）複数の気管試料を提供し、培地中でそれらのそれぞれをＦＩＺＺ１存在下で培養するステップと、（２）複数の阻害剤候補を提供するステップと、（３）複数の気管試料のそれぞれにおいて、ＦＩＺＺ１媒介型の気道の炎症または反応性亢進と関係する表現型を決定するステップと、（４）ステップ（３）で決定した表現型を対照と比較するステップと、（５）ステップ（４）の比較結果に基づいて、表現型を低下させる１つまたは複数のＦＩＺＺ１阻害剤を同定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、小型分子のライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、抗体のライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のこの態様の方法に適した抗体のライブラリーは、単鎖Ｆｖのライブラリーである。いくつかの実施形態では複数の阻害剤候補は、干渉ＲＮＡのライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の阻害剤候補は、アプタマーのライブラリー（例えば、ＲＮＡアプタマーのライブラリー）を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（３）は、複数の気管試料のそれぞれの組織像を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（３）は、カルバコールに対する収縮反応を決定することを含む。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「小型分子」は、約５ｋＤ未満、より好ましくは約４ｋＤ未満、最も好ましくは０．６ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。例示的な小型分子として、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）が挙げられる。また、小型分子は、そのような化合物の塩、エステルおよびその他の薬学的に許容できる形態も含む。分子ライブラリーを合成するための例示的な方法を、Ｃａｒｅｌｌら、１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４ｂ；Ｃｈｏら、１９９３；ＤｅＷｉｔｔら、１９９３；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４に見出すことができる。
【０１４９】
ＦＩＺＺ１調節物質を同定するためのその他の方法が、当技術分野では周知であり、それらとして、これらに限定されないが、ツーハイブリッド系、ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ、酵母ディスプレイ、タンパク質間相互作用をアッセイするためのその他の方法、および合理的薬物設計のための方法を含めた、コンピュータ処理する方法が挙げられる。
【０１５０】
ＦＩＺＺ１調節物質の治療効果の決定
適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアッセイを実施して、特定のＦＩＺＺ１調節物質の治療効果および／またはその投与が罹患組織の治療に適応するかどうかを決定することができる。
【０１５１】
種々の特定の実施形態では、患者の障害に関与する組織に由来する代表的な細胞型を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、所与の調節物質が所望の作用を関連の細胞型に対して発揮するかどうか決定することができる。また、調節物質の治療上の使用を、ヒト対象において試験する前に、これらに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含めた、適切な動物モデル系において試験することもできる。炎症症状、組織の組織像（例えば、気管およびその他の血管組織の組織像）、ならびに例えば、好中球数、ＭＰＯ活性または当技術分野で既知のもしくは本明細書に記載する炎症性バイオマーカー等のその他の炎症性パラメータに対するそれらの作用に基づいて、調節物質の治療効果を評価することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の場合、ヒト対象に投与する前に、当技術分野で既知のまたは今後開発される動物モデル系のいずれかを使用することができる。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「炎症性バイオマーカー」（「炎症と関係するマーカー」とも呼ばれる）として、これらに限定されないが、ＣＲＰ、炎症と関係するサイトカイン、例として、ＩＬ−１〜ＩＬ−１７を含めた、炎症と関係するインターロイキンファミリーのメンバー、ＴＮＦ−アルファ；Ｂ６１；特定の細胞接着分子、例えば、ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭとしても知られる）、ｓＩＣＡＭ、インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＢＬ−ＣＡＭ、ＬＦＡ−２、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭおよびＰＥＣＡＭ等；ネオプテリン；血清プロカルシトニン；ロイコトリエン、トロンボキサンおよびイソプロスタン；ならびにミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）−２０、さらにシグナル伝達分子、例として、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ＥＲＫ１／２およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫが挙げられる。非限定的な例として、ＣＲＰレベルの上昇は、心血管の疾患および障害、感染性疾患、例として、心筋炎、心筋症、急性心内膜炎または心外膜炎；ＳＩＲＳ；糖尿病；メタボリックシンドローム；筋肉の疲労、損傷または炎症；および全身性炎症と関係する。これらに限定されないが、例として、ＩＬ−６、ｓＴＮＦｒ２およびＣＲＰのレベルの上昇は、ＩＩ型糖尿病、筋肉炎症およびＥＳＲＤと関係し、細胞接着分子レベルの上昇は、全身性炎症と関係し、ＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファのレベルの上昇は、ＩＤＤＭおよびＮＤＤＭに伴う炎症と関係し、ＩＬ−１０およびＩＬ−６のレベルの上昇は、ＳＩＲＳと関係し、ネオプテリンレベルの上昇は、ＳＩＲＳと関係し、プロカルシトニンレベルの上昇は、全身性炎症と関係する。炎症と関係するその他のタンパク質またはマーカーには、血清アミロイドＡタンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、レプチン、プロスタグランジンＥ２、血清プロカルシトニン、可溶性ＴＮＦ受容体２、赤血球沈降速度の上昇、さらに、顆粒球（ポリ多形核白血球）のパーセントおよび総数、単核球、リンパ球ならびに好酸球を含めた、白血球数の上昇がある。
【０１５３】
例えば、調節物質を、マウスＡＨＲモデルにおいて試験することができる。ＡＨＲは、気管支喘息の主要な特色であり、炎症促進性メディエーターが、この変化した反応性の主たる発動因子の一部をなす。喘息発作の治療においては、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける肺抵抗（ＲＬ）またはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴＳＭ組織の力応答のいずれかとして測定したＡＨＲが、臨床薬物療法の有効性の主たる指標とみなされている。ＲＬの増加は、気道の狭小化のプロセスに関与する複数の構成成分の総和を示し、一方、気道平滑筋の力応答は、筋肉のアゴニストに対する収縮反応の測定をもっぱら可能にする。マウスＡＨＲモデルは、１０日間のＯＡチャレンジによって、ヒト喘息において見られる、ＴＳＭのＣＣｈに反応した異常な機能性の挙動をモデル化することが可能であるという観察に基づいて確立された［Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１７３：５６〜６３（２００６）］。実施例のセクションで論じるように、本発明者らは、ＯＡチャレンジが、ＣＣｈによって誘起された力の有意な増加をもたらすのみならず、また、リンパ球および好酸球から主に構成された、ＢＡＬ中への大規模な炎症性の浸潤ももたらすことを実証した。これらの知見は、この動物モデルにおいて、臨床における喘息に見られるものに類似する、ＡＨＲと気道炎症との関係を十分に実証している。ＡＨＲマウスモデルを使用する例示的な方法を、実施例のセクションに記載する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、調節物質を、鼻腔内滴下を介してリポ多糖（ＬＰＳ）によって処置したマウスモデルにおいて試験することができる。細菌のＬＰＳは、適用すると、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症反応のネットワークを誘発する、細菌の巨大分子性細胞表面抗原である。このＬＰＳ誘発性炎症モデルの主要な特徴として、これらに限定されないが、マクロファージの活性化、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生、ならびに好中球の浸潤および活性化が挙げられ、これらは、慢性閉塞性肺疾患の特色である。このモデルによって、肺炎症が、気道の内腔において２〜４時間後に発生する急性損傷として引き起こされ、この場合、全ての炎症性パラメータを、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって判定することができる。
【０１５５】
非限定的な例として、試験調節物質を、希釈剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中に所望の濃度で溶解させることができる。動物（例えば、Ｂａｌｂ／Ｃマウス）を、麻酔下、適切な用量（例えば、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ）の試験調節物質または希釈剤単独を用いて鼻腔内から処置し、その後（例えば、３０分後）、アレルゲン（例えば、ＬＰＳまたはＯＡ）を用いて処置することができる。動物は、典型的には、２４℃に空調された部屋においてプラスチック製ケージ中で飼育する。飼料および水は、自由に与える。典型的には、アレルゲンの鼻腔内投与の３時間後に動物を屠殺する。
【０１５６】
気管にカニューレ処置することができ、ＰＢＳを、気管を介して肺中に注入することによって、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施する。次いで、液体を直ちに取り出し、細胞懸濁液を、例えば、氷上に保存する。全細胞数を測定し、サイトスピン調製物を調製する。試験下における調節物質の肺炎症に対する阻害作用を検査および決定することができる。この動物モデルの詳細が、米国特許第      号に記載されている。
【０１５７】
別の非限定的な例として、雄のゴールデンハムスターを吸入チャンバー中に置き、ＬＰＳを一定期間（例えば、３０分間）吸入させて、気道炎症を引き起こす。ＬＰＳを吸入させた直後に、ハロセン麻酔下、試験調節物質を呼吸器内投与または経口によって投与する。典型的には、２４時間後、気管支および肺胞を洗浄し、洗浄液中の好中球数を決定する。試験化合物の非存在下で得られた好中球数を対照として使用し、好中球数の減少する割合を、対照に対するパーセント抑制として表す。調節物質処置マウスおよび対照マウスに由来する気管試料の組織像等、その他の試験でも調べ、比較する。この動物モデルの詳細が、米国特許第６，３８０，２５９号に記載されている。
【０１５８】
医薬組成物
ＦＩＺＺ１のタンパク質もしくはポリペプチド、抗ＦＩＺＺ１抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、干渉ＲＮＡ、または本発明の調節物質およびそれらの誘導体（集合的に、「活性化合物」または「活性成分」）を、医薬組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、薬学的に許容できる担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体または賦形剤」という用語は、無毒性の不活性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材料、または任意の型の製剤化補助物質を意味する。一般に、そのような担体または賦形剤の例として、これらに限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。また、リポソーム、および固定油等の非水性ビヒクルも使用することができる。また、補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
【０１５９】
１．一般的な考察
本発明の医薬組成物を、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、外用）、経粘膜および直腸による投与を含めた、その意図する投与経路に適合性となるように製剤化する。非経口、皮内または皮下による適用のために使用する液剤または懸濁剤は、無菌の希釈液、例として、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗細菌剤、例として、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例として、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例として、酢酸、クエン酸またはリン酸、および浸透圧を調整するための薬剤、例として、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。ｐＨを、酸または塩基、例として、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物を、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数回用量のバイアル中に封入することができる。
【０１６０】
２．注射用製剤
注射に適した医薬組成物は、無菌の液剤（水溶性の場合）または分散剤、および無菌の注射用の液剤もしくは分散剤を即時調製するための無菌の散剤を含む。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌性の水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）がある。全ての場合において、組成物は、無菌である必要があり、シリンジを使用して投与するために流動性でなければならない。そのような組成物は、製造および保存の間は安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物による汚染に対して保存される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびに適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチン等の被覆を使用すること、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持すること、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールは、微生物汚染を食い止めることができる。等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、および塩化ナトリウムを、組成物中に含めることができる。吸収を遅延させることができる組成物は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の薬剤を含む。
【０１６１】
必要量の活性化合物を、１つまたは組み合わせた成分を有する適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて続いて滅菌することによって、無菌の注射用液剤を調製することができる。一般に、活性化合物を、基剤の分散媒体および論述するその他の必要な成分を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことによって、分散剤を調製する。無菌の注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合、調製方法は、無菌の溶液から、活性成分および任意の所望の成分を含有する散剤を得る真空乾燥および凍結乾燥のステップを含む。
【０１６２】
３．経口用組成物
経口用組成物は一般に、不活性な希釈剤または食用の担体を含む。それらを、ゼラチンカプセル剤中に封入してもよく、または錠剤に圧縮してもよい。経口治療投与の目的では、活性化合物を、賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。また、経口用組成物は、口腔洗浄液として使用するために、液体の担体を使用して調製することもでき、液体の担体中の化合物を経口的に適用する。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分または類似の性質の化合物のうちのいずれかを含有することができる：結合剤、例として、結晶セルロース、トラガントガムもしくはゼラチン；賦形剤、例として、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例として、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬもしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例として、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳＴＥＲＯＴＥＳ；流動促進剤、例として、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例として、スクロースもしくはサッカリン；または矯味剤、例として、ハッカ、サリチル酸メチルもしくはオレンジ矯味剤。
【０１６３】
４．吸入用組成物
吸入による投与の場合、化合物を、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有するネブライザーまたは加圧容器からエアロゾルスプレーとして送達する。
【０１６４】
５．全身投与
また、全身投与は経粘膜または経皮によることができる。経粘膜投与または経皮投与の場合、（１つまたは複数の）標的バリアを透過することができる浸透剤を選択する。経粘膜浸透剤には、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体がある。経鼻スプレーまたは坐剤を、経粘膜投与のために使用することができる。経皮投与の場合、活性化合物を、軟膏剤、軟膏、ジェル剤またはクリーム剤に製剤化する。
【０１６５】
また、化合物を、（例えば、カカオバターおよびその他のグリセリド等の基剤を用いて）坐剤、または直腸送達のための滞留浣腸の形態で調製してもよい。
【０１６６】
６．その他の製剤
１つの実施形態では、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含めた、制御放出製剤等、活性化合物を身体からの迅速な排出から保護する担体を用いて、活性化合物を調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。また、リポソーム懸濁剤も、薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、（Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４，５２２，８１１号、１９８５）中等の当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【０１６７】
マイクロカプセル剤を、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルをそれぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンとして、コアセルベーションの技法によって調製してもよく、または界面重合によって調製してもよい。
【０１６８】
また、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックス等の持続放出性調製物も調製することができ、これらのマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態をとる。持続性放出性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（ＢｏｓｗｅｌｌおよびＳｃｒｉｂｎｅｒ、米国特許第３，７７３，９１９号、１９７３）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例として、乳酸−グリコール酸コポリマーから構成された注射用マイクロスフェア、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日超にわたって放出することができ、一方、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間にわたり放出し、これが好ましい場合がある。
【０１６９】
７．単位用量
単位剤型をとる経口用製剤または非経口用組成物を生み出して、投与および投与量の一様性を促進することができる。単位剤型は、必要な薬学的担体を伴う活性化合物の単位用量を含有する、治療すべき対象のための単一の投与量として適した物理的に個別の単位を指す。本明細書で使用する場合、「単位用量」という用語は、典型的には投与計画の状況において、医薬組成物の個別の投与を指す。本発明の単位剤型の仕様は、活性化合物の独特の特徴および特定の所望の治療効果、ならびに活性化合物を作り上げる際に内在する制限によって定まり、それらに直接依存する。
【０１７０】
８．遺伝子治療用組成物
本発明において使用する核酸分子を、ベクター内に挿入し、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与（ＮａｂｅｌおよびＮａｂｅｌ、米国特許第５，３２８，４７０号、１９９４）によって、または定位的な注入（Ｃｈｅｎら、１９９４）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療用ベクターの医薬調製物は、許容できる希釈剤を含んでもよく、またはその中に、遺伝子送達ビヒクルを包埋させた徐放性マトリックスを具備してもよい。あるいは、組換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターをインタクトな状態で産生し得る場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０１７１】
９．治療有効量
典型的には、対象のための正確な治療有効量は、対象のサイズ、体重および健康、対象に影響を及ぼす状態の性質および程度、ならびに投与のために選択された治療剤または治療剤の組合せ、さらに、投与する治療剤の薬物動態に影響を及ぼす肝臓および腎臓の機能等の変数に依存する。しかし、所与の状況について、有効量を日常的な実験によって決定することができ、これは、臨床医の判断の範囲内である。
【０１７２】
一般的に、ＦＩＺＺ１の調節を必要とする炎症状態を治療または阻止する場合、治療有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５００ｍｇ／日であり、これは、単回用量または複数回用量として投与することができる。例えば、治療有効量は、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日、または約５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。経口投与の場合、典型的には、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラムの活性成分を含有する錠剤の形態で組成物を提供して、治療すべき患者の症状に応じて用量を調整する。これらの化合物は、１〜４回／日、好ましくは１または２回／日の投与計画で投与することができる。
【０１７３】
しかし、任意の特定の患者のための特定の用量のレベルおよび投与の頻度は、変化させることができ、利用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食餌、投与の様式および時期、排泄速度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、ならびに療法を受ける宿主を含めた、多様な要因に依存することが理解されるであろう。
【０１７４】
本発明の医薬組成物および方法は、上記で言及した病理学的状態を治療する場合に通常適用されるその他の治療活性化合物をさらに含むことができる。
【０１７５】
１０．ワクチン製剤
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物を、ワクチン組成物として製剤化することができる。例えば、ＦＩＺＺ１タンパク質、またはそれらの変異体もしくは断片を使用して、不十分な免疫反応を増強することができることが企図される。したがって、ＦＩＺＺ１タンパク質、またはそれらの変異体もしくは断片を含有するワクチンを製剤化して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて宿主に投与することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含むことができる。適切なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩があるが、また、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオンや陰イオンに誘導体化された多糖、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁剤であってもよい。
【０１７７】
また、ＴＨ１型反応の優先的な誘発物質となるようにアジュバントを選択して、免疫反応の細胞媒介型の部門を援助することもできる。
【０１７８】
高いレベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞媒介型免疫反応の誘発に有利に働く傾向を示し、一方、高いレベルのＴｈ２型サイトカインはその抗原に対する液性免疫反応の誘発に有利に働く傾向を示す。
【０１７９】
Ｔｈ１反応を圧倒的に促す適切なアジュバント系は、モノホスホリルリピドＡまたはその誘導体、特に、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ、好ましくは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）を、アルミニウム塩と一緒にした組合せを含む。増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３に開示されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているように、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている場合には、反応源性のより低い組成物を含む。水中油型の乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。ワクチンは、サポニン、より好ましくは、ＱＳ２１をさらに含むことができる。また、この製剤は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含むこともできる（ＷＯ９５／１７２１０）。また、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）も、ＴＨ１反応の優先的な誘発物質であり、本発明において使用するのに適している。
【０１８０】
また、本発明は、ワクチン製剤を産生する方法も提供し、この方法は、ワクチンの構成成分を、薬学的に許容できる賦形剤と一緒にして混合するステップを含む。
【０１８１】
本発明を、これまで一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のために提供するものであって、本発明を限定する意図はない。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）
動物および気管の調製
特定の、病原体を含有しない雄のＢＡＬＢ／Ｃマウス（５週齢）を、これらの実験において使用した。実験動物の全てを、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて、病原体を含有しない状態下で、実験の持続期間にわたり飼育した。飼料および水を自由に与えた。全ての研究を、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従い、かつＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのガイドラインに従い、そこから承認を得て実施した。
【０１８３】
動物を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により感作させ、チャレンジしたマウス（ＰＢＳ／ＰＢＳ）、ＯＡにより感作させ、ＰＢＳによりチャレンジしたマウス（ＯＡ／ＰＢＳ）、およびＯＡにより感作させ、チャレンジしたマウス（ＯＡ／ＯＡ）を含む３群に分けた。第０日および第１４日に、マウスに、ＰＢＳまたはＰＢＳ中の２．２５ｍｇＡｌ（ＯＨ）３を有するＯＡ（２０μｇ）の等体積（１００μＬ）を腹腔内注射した。第２５日から第３４日まで、マウスを、ＰＢＳまたはＯＡ（ＰＢＳ中の５％）のエアロゾルを用いて、１日１回３０分間、連続１０日間チャレンジした。
【０１８４】
実験動物を、ＣＯ２による窒息によって屠殺した。気管を外科的に切除し、付着する結合組織を取り除いた。各気管を、長さ３〜４ｍｍの環の切片とし、１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＯＨ、５％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、０．２Ｍグルタミン、１．０Ｍ  ＣａＣｌ２、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン、５μｇ／ｍＬインスリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−５％）中で２４時間培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験のために、これらの気管環を、組換えＦＩＺＺ１（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）の非存在下および１０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかの組換えＦＩＺＺ１の存在下でＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
【０１８５】
いくつかの実験については、新鮮な気管環のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴＳＭ張力、およびＢＡＬ細胞数を、ＰＢＳ、０．１ｎｇ／ｍ：ＬＰＳまたは１００ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１のいずれかの鼻腔内用量を投与する（１日１回×５日）、マウスの最後の処置の２４時間後に測定した。
【０１８６】
（実施例２）
細胞数およびタンパク質の調製
ＰＢＳ処置マウスおよびＯＡ処置マウスを屠殺し、それらの気道を、気管カニューレ処置によって１．０ｍＬのＰＢＳを用いて１回洗浄した。各マウスから、等しい体積のＢＡＬを収集し、遠心分離した（１２００ｒｐｍ、５分）。全ＢＡＬ細胞を、血球計数器を使用して数えた。各試料から収集したＢＡＬ細胞（３．０×１０−４細胞）を、スライドガラスにサイトスピン（８００ｒｐｍ、８分）を使用して塗布し、次いで、このスライドを、細胞を識別して数えるために、Ｈｅｍａ３  Ｓｔａｉｎ  Ｓｅｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色した。各群において、３００細胞／スライドから数えた異なる細胞の相対的な比率を、収集した全ＢＡＬ細胞数に組み入れた。
【０１８７】
ＰＢＳ処置気管およびＦＩＺＺ１処置気管を、ウエスタンブロット解析のために、ＤＭＥＭ中で一晩培養した。処置気管および未処置気管を収集し、２０ｍＭ  ＭＯＳＰ、２．０ｍＭ  ＥＧＴＡ、５．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭフッ化ナトリウム、４０ｍＭ  β−グリセロリン酸、２０ｍＭ正バナジン酸ナトリウム、１．０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、３．０ｍＭベンズアミジン、５μＭペプスタチンＡ、１０μＭロイペプチン、および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶解用緩衝液、ｐＨ７．２（ＫＩＮＥＸＵＳ、カナダ）中で別個にホモジナイズした。組織の上清を、４℃で６０分間遠心分離し（１５，０００×ｇ）、ホモジナイズした気管の清澄な上清およびＢＡＬ中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって調べた。各群からの全タンパク質の吸光度を、５６２ｎｍの光学密度において分光光学的に測定し、異なる濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を検量線として適用した。タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を、ＢＣＡアッセイを使用したＢＳＡの検量線を用いて定量化した。試料を、使用まで−７０℃で保存した。
【０１８８】
（実施例３）
気道上皮の検査
気道の構造および気道上皮層の状況の組織学的検査を、新鮮な気管の全体／部分、ならびに１００ｎＭ  ＦＩＺＺ１のある状態下およびない状態下で一晩培養した気管において実施した。ＴＳＭの収縮の調節における気道上皮の役割を理解するために、本発明者らは、上皮を機械的に除去した後に、気管環の収縮反応を測定した。手短に述べると、腔内表面を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｇｌｉｄｅ針（３０Ｇ１／２）に接続しているポリエチレン製チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＭＤ、米国）を用いて穏やかに擦ることによって、気道上皮細胞を除去し、続いて、１．０ｍｌの気泡、次いで、１．０ｍｌ  Ｋ−Ｈ溶液（ｒｅ）を用いて灌流を行った。実験に用いた気管全てを、Ｈ  ＆  Ｅ溶液（ＣＡＴヘマトキシリン、Ｅｄｇａｒ  Ｄｅｇａｓ  Ｅｏｓｉｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）を用いて染色し、光学顕微鏡下、×４．０および×２０の倍率で写真撮影した。ＳＰＯＴ  ＲＴ  Ｓｌｉｄｅｒカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ、米国）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、米国）からなるコンピュータに基づいた画像解析システムを使用して、気管の形態計測解析を実施した。
【０１８９】
（実施例４）
マウス気管上皮細胞（ＭＴＥＣ）の培養およびアッセイ
Ｙｏｕら（「Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００２、２８３：Ｌ１３１５〜１３２１）のプロトコールに従い、若干の改変を加えて、ＭＴＥＣの培養を実施した。手短に述べると、気管を、１．５ｍｇ／ｍＬプロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中、４℃で１８時間インキュベートした。細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬ粗膵臓デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて氷上で５分間処置した。非付着性細胞を、組織培養プレート中で、５％ＣＯ２中、３７℃で３〜４時間インキュベートした後、Ｉ型ラット尾コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートしたプレート中、１０μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２５ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、５μｇ／ｍｌエピネフリン、および３０μｇ／ｍｌウシ下垂体抽出物、０．５ｎＭヒドロコルチゾン、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、１５ｎＭトリヨードチロニン、０．２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ、および０．０１μＭレチノイン酸を含有する改変ＢＥＢＭ（Ｌｏｎｚａ、ＭＤ、米国）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で、インキュベートした。ＭＴＥＣを、ポリカーボネート製半透過性膜（０．４μＭの孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上に播種し、培地を上部チャンバーから除去して、空気−液体の界面を確立し、下部チャンバーのみに、ＬＰＳおよびｒＦＩＺＺ１の存在下および非存在下、７．５μＬレチノイン酸および７５０μＬ  ＢＳＡを含有するＢＥＢＭ／ＤＭＥＭ（１：１、ｖ／ｖ）を提供した。
【０１９０】
アポトーシス性のＭＴＥＣの死滅を、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造元の指示に従って調べ、対照と比べた変化の倍数の指標として計算した。このアッセイは、ヒストンに結合したＤＮＡ断片に対するマウスモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ−酵素−イムノアッセイの原理に基づく。ＰＢＳ、０．１ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳまたは１００ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１を用いて処置したＭＴＥＣ培養物（５×１０４／ｍＬ）の上清中のヒストンに結合したＤＮＡ断片の定量化を、４０５〜４９０ｎｍの吸光度において実施した。
【０１９１】
最終産物である亜硝酸塩を、Ｇｒｉｅｓｓ反応（Ｘｕら、「Ａｒｇｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３；１１０：１４１〜１４８）を使用して測定することによって、一酸化窒素（ＮＯ）を調べた。手短に述べると、処置されたＭＴＥＣからの一定分量（５０μＬ）の上清を、５０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）と室温で１０分間混合した。吸光度を、自動化マイクロプレートリーダー中で５４０ｎｍにおいて読んだ。亜硝酸塩濃度を、２００、１００、５０、２５、１２．５、３．１２５および０（μＭ）として調製した亜硝酸ナトリウムの検量線を使用して較正した。
【０１９２】
（実施例５）
ＴＳＭの力の測定系
以下の組成のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（Ｋ−Ｈ）溶液（３７°Ｃ）１０ｍＬを満たした、二重に被覆されたガラス製の臓器浴の基部内に、プレキシグラス製のロッドによって、ステンレス鋼製のピンを用いて、気管を長軸方向に支えた：１１８ｍＭ  ＮａＣｌ；４．７ｍＭ  ＫＣｌ；１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；１１．１ｍＭデキストロース；１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４；２．８ｍＭ  ＣａＣ１２；および２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３。この溶液を、ｐＨ７．４０〜７．４５に維持し、５％ＣＯ２と９５％大気との混合物を用いて、各実験の持続期間にわたり連続的にガスを供給した。上部の支持体を、絹糸のループにより、ＴＳＭの張力の変化を測定するＦＴ０３等尺性トランスデューサー（ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｏｌｅｔａ、Ｃａ）につなぎ、濃度−応答曲線を、ＭＰ１５０ＷＳシステム（ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｏｌｅｔａ、Ｃａ）を用いて同期的に記録し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ上に表示した。ＴＳＭの最初の張力を、およそ０．５ｇに設定し、１時間維持した。張力の定常状態が達成された後、アゴニストを与えた。
【０１９３】
（実施例６）
薬力学的研究
３×１０−８〜１０−５Ｍの範囲に及ぶ用量における［ＣＣｈ］−応答曲線を、気管環中、ＦＩＺＺ１またはＬＰＳ（０．１ｎｇ／ｍＬ）のいずれかの非存在下および存在下で完成させた。以前の濃度に対する力応答が安定化した場合に限って、アゴニストの濃度を増加させた。イソプレナリン（ＩＳＯ）に対するＴＳＭの弛緩反応を調べるために、最初に、気管環を、１．０μＭ  ＣＣｈ（Ｓｉｇｍａ、米国）の添加によって収縮させた。収縮が安定化したら、各浴中にＩＳＯ（Ｓｉｇｍａ、米国）を、濃度を増加させて加えた（３×１０−８〜１０−５Ｍ）。気管の完全な弛緩をもたらす、２００μＭパパベリン（リン酸ジエステラーゼ阻害剤）を、実験の終わりに添加して、最大弛緩が、このＩＳＯの最も高い濃度で達成されるかどうかを評価した。追加の実験では、ＦＩＺＺ１タンパク質のＣＣｈ媒介型力応答に対する作用を、１００ｎＭ熱不活性化ＦＩＺＺ１（７０℃で６０分間加熱した天然および組換えのＦＩＺＺ１溶液）を使用して検証した。上記に従って、それらの用量応答曲線を得た。ＣＣｈおよびＩＳＯ等の新鮮な薬物溶液は、実験当日に作製した。上記の薬剤の用量は、最終の浴濃度を指す。
【０１９４】
（実施例７）
タンパク質のゲル電気泳動および定量化ウエスタンブロット
タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロット解析を使用して調べた。手短に述べると、一定分量（１００μｇ／ウエル）のＢＡＬ上清および気管可溶化液を、等しい体積の４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加する。サイズ分画したタンパク質を、ニトロセルロースメンブランに移し、次いで、ＴＢＳ中の５％乾燥脱脂乳を用いて室温で６０分間ブロックした。このメンブランを個々に、ＦＩＺＺ１（ウサギ抗マウスＦＩＺＺ１、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．、米国）、ＭＬＣＫ、ＭＬＣ−２０、α−アクチン、Ｇｉα１，２、Ｇｇαｌｌ、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、米国）、Ｇα１２／１３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国）、ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２、リン酸化ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＭＡＰＫ、またはリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．、米国）のいずれかに対する一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳを用いて３回洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化二次抗体と共に、さらに６０分間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳを用いて３回洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔのＩとＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の混合物を、穏やかに撹拌しながらメンブラン上に室温で１分間注いだ。免疫反応性のバンドを、化学発光によって検出した。タンパク質の発現レベルを、同じ組織中のβ−アクチンの発現に対して評価した。リン酸化シグナル伝達タンパク質についてのウエスタンブロットの定量化を、ＩｍａｇｅＪを使用して実施し、相対的なバンド強度を、β−アクチンタンパク質のバンド強度の％として計算した。
【０１９５】
（実施例８）
遺伝子発現解析のためのＲＮＡの単離、精製、増幅、標識およびハイブリダイゼーション
１群当たり１８匹の動物を用いた３群のマウスを、ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＯＡ／ＰＢＳおよびＯＡ／ＯＡを使用して解析した。１群当たり６匹の動物からの気管環を、複製物として組み合わせて、全ＲＮＡを産生した。全ＲＮＡを、組織ホモジナイザーおよびＱｉａｇｅｎ溶解用緩衝液を使用して抽出し、ＲＮＡの精製を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて実施した。ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を使用して定量化した。複製物１つ当たりの全ＲＮＡの収量は、０．６μｇから２．０μｇまで変動した。４５ｎｇの全ＲＮＡを、増幅し、ＮｕｇｅｎのＯｖａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、製造元（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）の指示に従ってビオチン標識した。Ｏｖａｔｉｏｎキットは、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡプロセスを活用して、リニアに増幅し、標識し、３ステップのプロセス中のｍＲＮＡの限定された量から、マイクログラムの分量が得られる（Ｋｕｒｎら、「Ｎｏｖｅｌ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，Ｌｉｎｅａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｈｇｌｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５；５１：１９７３〜１９８１）。各転写物の量を定量化するために、およそ１．５μｇの精製および断片化されたビオチン化ｃＲＮＡを、対照と一緒にマウス遺伝子チップアレイＭＯＥ４３０＿２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に１６〜１８時間かけてハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーを用いて走査した。得られたシグナルを、Ｇｅｎｅ  ＬｏｇｉｃのＭＡＳ５．０ソフトウエアを使用して正規化し、定量化した。
【０１９６】
（実施例９）
データ解析
各力測定実験の終わりに、気管を、ガーゼパッド上に吸い取り、重量測定した。結果を、ＴＳＭ重量１ミリグラム当たりの張力ミリグラムとして計算し（ｍｇ／ｍｇ）、ＰＢＳ処置気管における１０μＭ  ＣＣｈまたは２００μＭパパベリンによる誘発性張力応答の個々のパーセント（％）として表した。対照群については、ＣＣｈ（パパベリン）媒介型応答を、最大応答の平均値に対して正規化した。
【０１９７】
値を、平均±ＳＥとして表した。群内の異なる収縮／弛緩アゴニスト（ＣＣｈ、ＩＳＯ）の比較を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実施した。スチューデントの対応のないｔ検定を使用して、異なる薬剤（ＰＢＳ、ＬＰＳ、ＦＩＺＺ１）の作用を比較した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。
【０１９８】
（実施例１０）
ＯＡ処置マウスモデルにおけるＴＳＭの収縮反応および気道炎症
この実施例の実験の目的は、気道反応性亢進（ＡＨＲ）のマウスモデルを特徴付けることである。予備的な実験では、１０日間のＯＡチャレンジによって、電場刺激に反応するＴＳＭの異常な機能性の挙動をモデル化することが可能であるという観察に基づいて、ＡＨＲのマウスモデルを確立した。（Ｍａｔｓｕｂａｒａら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｌｅｅｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｉｒｗａｙ  Ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ」、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（２００６）１７３：５６〜６３）。
【０１９９】
ＣＣｈは、強力な収縮反応をもたらし、ＴＳＭの等尺性張力を濃度依存性に増加させる。最初は、ＴＳＭのＣＣｈに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反応性を、ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＯＡ／ＰＢＳまたはＯＡ／ＯＡのいずれかの処置を与えたマウスからの気管において調べた（図１Ａ）。ＯＡ／ＯＡ処置マウスの気管環のＣＣｈに対する収縮反応は、ＰＢＳ／ＰＢＳ処置動物およびＯＡ／ＰＢＳ処置動物の収縮反応と比較して増加した。ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウス、ＯＡ／ＰＢＳ処置マウス、およびＯＡ／ＯＡ処置マウスにおけるＴＳＭの収縮力（％）はそれぞれ、１００±６．７７、１０５．２１±２．７１、および１２７．７５±３．５４を示した。ＰＢＳ／ＰＢＳ対ＯＡ／ＯＡ、またはＯＡ／ＰＢＳ対ＯＡ／ＯＡのいずれかとして比較した場合、ＣＣｈによって誘起された力の発生レベルの差は、統計学的に有意（Ｐ＜０．０５、ｎ＝６）であることを見出した。
【０２００】
ＢＡＬの細胞組成を、ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウス、ＯＡ／ＰＢＳ処置マウス、ＯＡ／ＯＡ処置マウスについて決定した（図１Ｂ〜Ｄ）。全ＢＡＬ細胞数の大幅な増加が、ＯＡ／ＯＡ処置マウスにおいて明らかに観察された。ＯＡ／ＯＡ処置マウスからのＢＡＬ中のリンパ球および好酸球の数が、その他の２群からの数と比較して著しく増加した。ＰＢＳ／ＰＢＳ対ＯＡ／ＯＡ、またはＯＡ／ＰＢＳ対ＯＡ／ＯＡのいずれの間における全細胞数の差も、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０１、ｎ＝６）。
【０２０１】
これらの結果から、この動物モデルは、ＣＣｈによって誘起された力の有意な増加、ならびに喘息を有する患者に見られるものに類似する、ＢＡＬ内への、主にリンパ球および好酸球から構成された大規模な炎症性の浸潤を伴うことが示されている。
【０２０２】
（実施例１１）
ＯＡ処置マウスモデルにおける、ＦＩＺＺ１のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベル
この実施例１１の実験の目的は、気道反応性亢進においてある役割を担うことができるタンパク質を同定することである。ＦＩＺＺ１を、転写プロファイリング実験において同定した。
【０２０３】
気管組織中のＦＩＺＺ１ｍＲＮＡの発現レベルを、転写プロファイリングによって調べた。プロファイリングのデータにフィルターをかけ、ｍＲＮＡの発現レベルの有意差を、一元配置分散分析を使用して決定した（図２）。ＦＩＺＺ１ｍＲＮＡ発現の変化の倍数（Ｆｃ）を、気管について、無処置マウスと、ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＰＢＳ／ＯＡまたはＯＡ／ＯＡのいずれかを用いて処置したマウスとの比較から計算した。ＯＡ／ＯＡを用いて処置したマウスからの気管中のＦＩＺＺ１ｍＲＮＡ発現のＦｃは、ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウスからまたはＯＡ／ＰＢＳ処置マウスからのいずれのものと比べても１０００倍増加した。
【０２０４】
ＦＩＺＺ１ｍＲＮＡ発現データと併せて、ＦＩＺＺ１タンパク質発現のウエスタンブロット解析を、ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＯＡ／ＰＢＳまたはＯＡ／ＯＡのいずれかを用いて処置したマウスからのＢＡＬおよび気管に対して実施した（図２）。ＰＢＳ／ＰＢＳ処置マウスからまたはＯＡ／ＰＢＳ処置マウスからのいずれのＢＡＬ中のＦＩＺＺ１タンパク質も測定不可能であったこととは対照的に、ＯＡ／ＯＡ処置マウスからのＢＡＬ中では、ＦＩＺＺ１タンパク質が容易に検出された。
【０２０５】
これらの結果から、ＦＩＺＺ１は、アレルゲン誘発性の気道炎症の初期段階の間に誘発される初期相の遺伝子産物のうちの１つであると同定される。さらに、ＯＡ／ＯＡ処置マウスのＢＡＬおよび気管中にＦＩＺＺ１タンパク質が検出されたことから、ＦＩＺＺ１は、アレルギー性の炎症を亢進させる炎症促進性メディエーターとしての役割を有し得ることも示唆されている。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、ＦＩＺＺ１タンパク質発現の増加と炎症気管中の反応性亢進の誘発との相関性から、ＦＩＺＺ１は、結果的にＴＳＭ機能不全をもたらす作用のカスケードに寄与することが示唆されている。
【０２０６】
（実施例１２）
気管の環および上皮の組織学的解析
ＦＩＺＺ１は、気道上皮中に見出される多くの炎症促進性タンパク質メディエーターうちの１つであり（Ｈｏｌｃｏｍｂら、「ＦＩＺＺ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ」、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０００）１９：４０４６〜４０５５、およびＴｅｎｇら、「ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭα，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（２００３）９２：１０６５〜１０６７）、このことから、ＦＩＺＺ１タンパク質が、その効果を局所環境に対して発揮することが示唆されている。この実施例では、ＦＩＺＺ１のその局所環境に対する（１つまたは複数の）作用を、気道上皮の組織学的検査によって調べた。
【０２０７】
ＦＩＺＺ１タンパク質（１００ｎＭ）またはＬＰＳ（０．１ｎｇ／ｍＬ）のいずれかの非存在下および存在下に置いた、新鮮な気管およびＤＭＥＭ中で一晩培養した気管を、組織の全体および切片について調べた。×４．０および×２０．０の倍率における光学顕微鏡による検査によって、ＰＢＳ培養気管の管腔側上には、組織の浮腫、通常は見られない上皮の剥皮および／または上皮細胞の斑状の脱落がないことが示された（図３）。ＰＢＳを用いて培養した気管とは対照的に、ＬＰＳ（データ示さず）ではなく、ｒＦＩＺＺ１を用いて処置した気管環中の上皮層は、より薄くなり、気道上皮の一部が、剥皮し、組織学的にインタクトである状態を欠いた。しかし、ＰＢＳ培養群、ＦＩＺＺ１培養群およびＬＰＳ培養群の平滑筋層は、清澄であり、組織学的にインタクトであった。ｒＦＩＺＺ１に対して気管が反応した際の剥皮上皮作用を判定するために、気管環の管腔を裏打ちする上皮細胞を、腔内表面を穏やかに擦ることによって機械的に除去した。上皮の状況を、図３に示す。管腔上皮除去の組織病理学的結果から、ｒＦＩＺＺ１を用いて処置した気管中に見られたものに類似する上皮の剥皮の状況が示された。光学顕微鏡によると、気管中の大部分の上皮には変化があり、上皮細胞の斑状の脱落が観察された。上皮層の一部は、基底膜から単離し、培養した気管の管腔側に放出していた。
【０２０８】
これらの組織学的解析によって、ＦＩＺＺ１処置環においては、上皮層が、顕著に薄くなり、上皮の剥皮が生じ、組織学的にインタクトである状態を欠くことが実証された。培養した気管中に見られる組織学的変化は、新鮮な気管中に見られるものと同一であることから、上皮層の菲薄化は、培地中の血清によって引き起こされるものではない。
【０２０９】
これらの結果から、ＦＩＺＺ１が、気道上皮組織に作用し、上皮バリアの喪失をもたらすことが明らかである。上皮の損傷は、ヒト喘息疾患と臨床的に関係する。上皮の損傷は、喘息の病変形成の特色のうちの１つであるとして受け入れている（Ｌａｉｔｉｎｅｎら、「Ｄａｍａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｓｔｈｍａ」、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ（１９８５）１３：５９９〜６０６、およびＨｏｌｇａｔｅら、「Ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｔａｋｅｓ  ｃｅｎｔｒｅ  ｓｔａｇｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）２８：２４８〜２５０）。喘息における上皮の損傷はしばしば、浸潤性の炎症を示す気道からの主要塩基性タンパク質の放出によって引き起こされることから（Ｍｏｔｉｊｉｍａら、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ（１９８９）１３９：８０１〜８０５）、この実施例からのデータは、ＦＩＺＺ１が、気道上皮に対する損傷を引き起こすこれらの塩基性タンパク質のうちの１つである可能性が高いことを示している。これらの組織学的知見に基づくと、ＦＩＺＺ１曝露気管からの上皮組織中にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて観察された変化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける喘息性の気道の変化を反映している可能性が高い。
【０２１０】
（実施例１３）
ｒＦＩＺＺ１、熱不活性化ｒＦＩＺＺ１およびＬＰＳの、ＣＣｈ誘発性収縮に対する作用
組換えＦＩＺＺ１タンパク質が、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴＳＭのＣＣｈに対する収縮に対してどのような作用を示すかを決定するために、異なる濃度のＦＩＺＺ１を用いて処置したマウス気管環を、ＣＣｈによって誘起された力の発生について調べた。１００ｎＭ  ＦＩＺＺ１を用いて処置したマウス気管環は、ＰＢＳ処置環と比較して、ＣＣｈに対する収縮反応の増加を示した（図４Ａ）。ＰＢＳ処置気管およびｒＦＩＺＺ１処置気管におけるＣＣｈによって誘起された力の発生の元のトレーシングを示す（図４Ａ、上部パネル）。最大張力（％）は、ＰＢＳ処置環においては１００±８．３９、ならびに１０ｎＭおよび１００ｎＭのｒＦＩＺＺ１処置気管においてはそれぞれ、１１７．２１±７．８７および１４４．１６±１５．７７であった（図４Ａ、下部パネル）。ＰＢＳ処置群と１００ｎＭ  ＦＩＺＺ１処置群との間におけるＣＣｈによって誘起された力の発生の差は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。この知見の裏付けとして、ＭＬＣＫの発現レベルおよびＭＬＣＫのリン酸化の産物であるＭＬＣ−２０を、ウエスタンブロット解析によって測定した。ＭＬＣＫおよびＭＬＣ−２０の両方の発現の増加が、ＰＢＳ処置気管と比較した場合、ＦＩＺＺ１処置気管において見出された（図４Ａ）。表５は、ＦＩＺＺ１（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）の存在下または非存在下におけるＴＳＭのアゴニストに対する感受性のＬｏｇＥＣ５０値を示す。スチューデントの対応のないＴ検定によって決定した場合、ＰＢＳ処置群と、１０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのＦＩＺＺ１処置群との間では、ＬｏｇＥＣ５０値には有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５、ｎ＝６）。
【０２１１】
ＦＩＺＺ１の、ＣＣｈによって誘起された力の発生に対する作用が未変性の折畳まれたｒＦＩＺＺ１タンパク質に起因することを検証するために、気管環を、１００ｎＭ熱不活性化ｒＦＩＺＺ１または０．１ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳと共に培養し、ＣＣｈによって誘起されたＴＳＭの収縮反応に対するそれらの作用を測定した（図４Ｂ）。熱不活性化ＦＩＺＺ１は、ＣＣｈによって誘起された力の発生に対して、未変性のｒＦＩＺＺ１タンパク質の作用と比較した場合、観察可能な作用は示さなかった（図４Ｂ、下部パネル）。気管環の最大反応（％）は、熱不活性化ｒＦＩＺＺ１処置群および未変性のｒＦＩＺＺ１処置群においてはそれぞれ、１００．００±４．７７および１３５．６７±９．０２であり（スチューデントの対応のないｔ検定により、Ｐ＜０．０５、ｎ＝６）、ＰＢＳ処置群およびＬＰＳ処置群においてはそれぞれ、１００±４．８２および９６．４０±４．３１であった（スチューデントの対応のないｔ検定により、Ｐ＞０．０５、ｎ＝６）。
【０２１２】
【表１】
2011523401.tif 000003
【０２１３】
これらの結果から、１０ｎＭではなく、１００ｎＭのＦＩＺＺ１を用いて処置した環は、ＣＣｈによって生じた力の有意な増加を示したが、ＴＳＭのアゴニストに対する感受性には影響を及ぼさなかったことが示されている。この結果の裏付けとして、ＭＬＣＫおよびその主要な基質であるＭＬＣ−２０の発現レベルを調べたところ、ＦＩＺＺ１処置気管においては、ＰＢＳ処置気管と比較して、タンパク質発現が有意に増加していたことが見出された。この知見は、ＦＩＺＺ１処置気管において観察された力の発生の根底にある重要な分子基盤を同定し、ＦＩＺＺ１が組織内部の収縮性タンパク質を変化させるという結論を支持している。
【０２１４】
（実施例１４）
ｒＦＩＺＺ１のＩＳＯ誘発性弛緩に対する作用
ＴＳＭの全体的な収縮反応は、組織の収縮反応と弛緩反応との総和である。ＴＳＭにおけるこれら２つの力応答間の不均衡の可能性を提示するために、ＩＳＯ誘発性弛緩を、ｒＦＩＺＺ１と共にインキュベートした気管環中で調べた。ＩＳＯは、β２−ＡＲのアゴニストであり、ＴＳＭの弛緩を、ｒＦＩＺＺ１の存在下または非存在下のいずれにおいても、パパベリンによる弛緩の５０％のレベルで誘発することができる。この実施例の実験は、ｒＦＩＺＺ１と共に培養した後の、ＣＣｈによって誘起されたＴＳＭ力の発生の増加が、平滑筋中の収縮反応の増加または弛緩反応の減少に起因するかどうかを評価するために実施した。
【０２１５】
参照のため、ＩＳＯによって誘発されたＴＳＭの弛緩の程度を、２００μＭパパベリンによって誘発された最大弛緩反応に対して正規化した。１０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのｒＦＩＺＺ１を用いた前処置の、ＩＳＯ媒介型最大弛緩力に対する作用を測定した（図５）。ＴＳＭのＩＳＯ誘発性弛緩は、１０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれのｒＦＩＺＺ１とのプレインキュベーションによっても影響を受けなかった。異なる処置群の最大弛緩力の値（％）は、ＰＢＳ、１０ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１、および１００ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１を用いて処置した環についてそれぞれ、４６．２９±２．８５、４６．５２±２．８０、および４３．３８±０．７５であることが見出された。スチューデントの対応のあるｔ検定によって決定した場合、これらの値の差のうち、統計学的に有意に異なるものはなかった（Ｐ＞０．０５、ｎ＝６）。
【０２１６】
これらの結果から、ｒＦＩＺＺ１は、これらの環におけるＩＳＯ媒介型の弛緩反応には影響を及ぼさなかったことが実証されている。ＩＳＯは、ほとんどどこにでもある系中のｃＡＭＰ依存性のタンパク質リン酸化カスケードを通して、結果的にアデニル酸シクラーゼ活性を増加させる、β２−ＡＲ共役Ｇｓタンパク質（β２−ＡＲ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｇｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の活性化を介して、ＴＳＭを弛緩させることが知られている（Ｋｎｏｘら、「Ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ」、Ｔｈｏｒａｘ（１９９５）５０：８９４〜９０１）。炎症組織においてＦＩＺＺ１のタンパク質発現が上方制御され、ＦＩＺＺ１が収縮装置に対して圧倒的に作用するという観察に基づくと、ＦＩＺＺ１は、喘息患者においてＡＨＲを治療するための有用な治療標的であり得るであろう。
【０２１７】
（実施例１５）
ｒＦＩＺＺ１チャレンジマウスにおける、新鮮な気管の力応答およびＢＡＬ細胞数
この実施例に記載する実験の目的は、マウスＦＩＺＺ１タンパク質の、培養気管に対する観察された作用を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確証することである。
【０２１８】
新鮮な気管環の張力およびＢＡＬ細胞数を、ＰＢＳ、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたは１００ｎＭ  ｒＦＩＺＺ１の、一連の鼻腔内用量を投与した（１日１回×５日）マウスにおいて、最後の処置の２４時間後に調べた。結果を、図６に示す。ＰＢＳチャレンジマウスまたはＬＰＳチャレンジマウスのいずれと比較しても、ｒＦＩＺＺ１チャレンジマウスにおいては、新鮮な気管において測定した、ＣＣｈによって誘起された力応答（Ａ）および洗浄液中のＢＡＬ細胞数（Ｂ）の有意な（Ｐ＜０．０５、Ｎ＝５）増加を検出した。ＴＳＭの最大張力（％）は、ＰＢＳ曝露群、ＬＰＳ曝露群、およびｒＦＩＺＺ１曝露群においてそれぞれ、１００．００±１４．６３、１０８．２８±５．４４、および１４７．７８±１８．５７であった。さらに、ＬＰＳ処置マウスにおいても、ＰＢＳ処置動物と比較して、力応答ではなく、細胞数の明らかな増加が観察された（Ｐ＜０．０５）。
【０２１９】
これらの結果から、ＦＩＺＺ１タンパク質が気道炎症およびＴＳＭ活性の調節に関与することが示されている。ＯＡにより感作させ、チャレンジしたマウスにおけるＦＩＺＺ１タンパク質の大幅な増加がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察され、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達ｒＦＩＺＺ１タンパク質を用いて処置したものからの新鮮な気管において力応答の増加が測定された。そのような観察から、培養気管中に生じた現象の病態生理学的な関連性が強力に支持され、また、疾患組織において気道炎症およびＴＳＭ緊張が調節される際の内在性ＦＩＺＺ１タンパク質の役割も示唆されている。
【０２２０】
（実施例１６）
ｒＦＩＺＺ１の気道上皮に対する作用
気道上皮は、物理的およびアレルギー性の侵襲の標的である。この実施例に記載する実験は、ＦＩＺＺ１処置気管における上皮の剥皮の知見に一部基づき、ｒＦＩＺＺ１の気道上皮に対する作用を確認するために実施した。
【０２２１】
上皮細胞層のＦＩＺＺ１媒介型の喪失の可能な機構を評価するために、アポトーシスおよび硝酸塩濃度を測定した。処置したＭＴＥＣからの上清中のアポトーシス指数および亜硝酸塩濃度を、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓおよびＧｒｉｅｓｓ反応をそれぞれ使用して測定した。培養物上清中のＤＮＡ断片に結合した細胞質ヒストンおよび亜硝酸塩濃度のレベルを、表示した時点において測定した。結果を、図７Ａ、Ｂに示す。ｒＦＩＺＺ１処置後の時点全てにおいて、ＬＰＳ処置と比較した場合、ＭＴＥＣのアポトーシスの有意な増加（Ｐ＜０．０５または０．０１；Ｎ＝３）が検出された。しかし、亜硝酸塩濃度の変化は、これら３群間では、測定した時点のうちのいずれにおいても明らかではなかった（Ｎ＝３）。
【０２２２】
これらの結果は、ＦＩＺＺ１処置細胞において、細胞死が有意に増加し、これは、ＦＩＺＺ１とのインキュベーションの３時間後に始まることを示している。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、ＦＩＺＺ１は気道組織に複雑な様式で作用し、その最初の炎症性の作用が、上皮の機能不全に寄与することが示唆されている。ＮＯは、気道上皮中で合成され、ＴＳＭ細胞に作用することが知られている（ＢａｒｎｅｓおよびＢｅｌｖｉｓｉ、「Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｔｈｏｒａｘ（１９９３）４８：１０３４〜１０４３）。実験群のうちのいずれからも、亜硝酸塩レベルの明らかな変化がなかったことから、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、ＮＯは、ＴＳＭの力応答の観察された変化にも、上皮層の喪失にも関与しないことが予期される。
【０２２３】
上皮の損傷がＦＩＺＺ１曝露気管における力応答の増加に寄与するかどうかを明確にするために、上皮の剥皮を伴う気管におけるＴＳＭ張力をインタクトな上皮を有する気管と比較して調べた。ＴＳＭのＣＣｈ刺激に対する収縮反応および感受性を、図７Ｃおよび表６に示す。最大張力（％）は、インタクトな上皮を有する気管（ＥＰ（＋））、ならびに１００ｎＭ  ＦＩＺＺ１を用いて処置したおよび処置しなかった、剥皮上皮を伴う気管（ＥＰ（−））においてそれぞれ、１００±６．２２、１１９．３０±８．１６、および１４１．４３±６．６５であった。スチューデントの対応のあるｔ検定によって決定した場合、ＥＰ（−）気管およびＥＰ（−）／ＦＩＺＺ１気管（Ｐ＜０．０５）からのＴＳＭの最大収縮反応には有意な差があり（Ｐ＜０．０５、ｎ＝８、１９）、ＥＰ（＋）とＥＰ（−）との間において、使用したＣＣｈの用量における力の発生に有意な差があった（Ｐ＜０．０５）。ＴＳＭのＬｏｇＥＣ５０値を計算したところ、いずれの２群間においても、感受性の明らかな変化は示されなかった。
【０２２４】
【表２】
2011523401.tif 000004
【０２２５】
これらの結果は、上皮の剥皮を伴う気管においては、力応答が増加することを示し、これは、収縮反応において、アゴニストへの直接的な曝露からＴＳＭを保護するには上皮バリアが重要である可能性を示している。ｒＦＩＺＺ１を用いて処置した、上皮の剥皮を伴う気管は、処置しなかった、剥皮を伴う気管の力のレベルと比較して、力のレベルの著しい増加を示し、これは、このタンパク質メディエーターが、上皮組織およびＴＳＭ組織の両方に関与する分離可能な作用を発揮することを示している。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、この二重のＦＩＺＺ１の作用は、異常な平滑筋の力の発生のプロセスには異なる段階があることを意味することが予期される。
【０２２６】
（実施例１７）
ＦＩＺＺ１処置気管におけるタンパク質の発現
炎症促進性タンパク質を含めた、多くのシグナル伝達分子が、受容体／リガンド結合の事象がＴＳＭの収縮に変換される際に関与する。この実施例の実験は、ｒＦＩＺＺ１が、ＴＳＭの収縮に関与する特定のシグナル伝達中間体に対して作用することを決定するために実施した。
【０２２７】
α−アクチン、Ｇｉα１，２、Ｇｑα１１、Ｇα１２／１３等のＧタンパク質、ならびにＭＡＰＫ経路に関与するいくつかのタンパク質（すなわち、ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２、リン酸化ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＭＡＰＫおよびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ）のタンパク質発現レベルを、ＰＢＳ処置気管またはｒＦＩＺＺ１処置気管のいずれかからの組織可溶化液中において、ウエスタンブロット解析を使用して調べた（図８）。試験したα−アクチンおよび全てのＧタンパク質のタンパク質発現レベルは、同じ組織中のβ−アクチンの発現レベルに対して正規化すると、ＰＢＳ処置気管とｒＦＩＺＺ１処置気管との間で類似した（図８Ａ）。これらのタンパク質の発現レベルとは対照的に、ｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２およびｐ３８ＭＡＰＫ等のＭＡＰＫ経路に関与するタンパク質のリン酸化の状態は、ｒＦＩＺＺ１を用いた処置によって、それらのリン酸化レベルの著しい時間依存性の増加を示した（図８Ｂ）。このリン酸化は、緩慢な動態学的プロファイルを示し、ＦＩＺＺ１添加後の第１６時から第３２時の間にのみ大幅に増加した。第２４時において、リン酸化されたｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２およびｐ３８ＭＡＰＫならびにリン酸化されていないｃ−Ｒａｆ、ＥＲＫ１／２およびｐ３８ＭＡＰＫの発現を、ＰＢＳ処置気管とＦＩＺＺ１処置気管との間で比較すると、両方の処置群において、リン酸化されていないタンパク質の大部分は類似の発現レベルを示した（図８Ｃ）。例外はｃ−Ｒａｆであり、ＦＩＺＺ１との培養後のこの発現は、ＰＢＳと共に培養した気管と比較してわずかに増加した。対照的に、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ＥＲＫ１／２およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫは全て、ｒＦＩＺＺ１処置後の第２４時に、ＰＢＳ処置と比較して発現が増加した。第２４時において、リン酸化されたタンパク質のそれぞれの定量化したバンドの、β−アクチンの強度に対する相対強度（％）を計算した（図８Ｄ〜Ｆ）。ｒＦＩＺＺ１処置組織においては、ＰＢＳ処置気管におけるタンパク質発現と比較して、リン酸化ｃ−Ｒａｆ、リン酸化ＥＲＫ１／２およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫの発現レベルが統計学的に有意に（ＰＢＳに対して、Ｐ＜０．０１または０．０５、ｎ＝３）増加した。同様に、ｒＦＩＺＺ１後の第３２時の時点における動態学的プロファイルにおいても、これらのタンパク質のリン酸化の類似の有意な増加が観察された（図８Ｅ）。
【０２２８】
これらの結果から、α−アクチンが、ｒＦＩＺＺ１処置組織およびＰＢＳ処置組織の両方において類似のレベルで発現することが示され、これは、ＦＩＺＺ１が、この系におけるこの収縮要素の発現を直接変化させることによって、その作用を発揮する可能性が低いことを示している。
【０２２９】
さらに、これらの結果から、ＦＩＺＺ１処置によって、気管環においては、高いレベルのリン酸化ＥＲＫ１／２およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫのみならず、また、高いレベルのリン酸化ｃ−Ｒａｆの発現も誘導されることを示し、これは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける気管臓器培養物中では、ＦＩＺＺ１が、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のこの腕の活性化を引き起こすのに十分であることを示唆している。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、ＣＣｈによって誘起された力のＦＩＺＺ１による調節は、ｃ−Ｒａｆが関連するＭＡＰＫシグナル伝達カスケードを通して作用し、これが、収縮したＴＳＭにおけるＭＬＣ−２０のリン酸化の増加をもたらす可能性が高いことが予期される。
【０２３０】
均等物
これまで、本発明の特定の非限定的な実施形態を記載してきた。当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験を使用するだけで究明することができるであろう。当業者であれば、本記載に対する種々の変化形態および改変形態を、以下の特許請求の範囲に定義する本発明の精神または範囲から逸脱することなく作製することができることを理解するであろう。
【０２３１】
請求項において、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」等の冠詞は、別段の記載がないかまたはそれ以外の場合には文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味することができる。あるグループの構成要素の１つ、２つ以上、または全てが、所与の製品またはプロセスの中に存在する、その中で利用される、またはそれ以外の場合にはそれに関連する場合、別段の記載がないかまたはそれ以外の場合には文脈から明らかでない限り、そのグループの１つまたは複数の構成要素の間に「または（ｏｒ）」を含む請求項または記載は、要件を満たしているとみなされる。本発明は、そのグループのまさしく１つの構成要素が、所与の製品またはプロセスの中に存在する、その中で利用される、またはそれ以外の場合にはそれに関連する実施形態を含む。また、本発明は、そのグループのメンバーの２つ以上または全てが、所与の製品またはプロセスの中に存在する、その中で利用される、またはそれ以外の場合にはそれに関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、１つまたは複数の制限、要素、節、記述用語等が、１つもしくは複数の請求項または記載の関連部分から、別の請求項に導入されている全ての変更形態、組合せ形態および置換形態を包含することも理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項を改変して、同じ基になる請求項に従属する任意のその他の請求項中に見出される１つまたは複数の制限を含めることができる。さらに、それらの請求項が、ある組成物に言及する場合には、別段の記載がないかまたは矛盾もしくは一貫性の欠如が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、この組成物を本明細書に開示する目的のいずれかに使用する方法が含まれ、この組成物を本明細書に開示する作製方法のいずれかまたは当技術分野で既知のその他の方法に従って作製する方法が含まれることも理解されたい。さらに、本発明は、本明細書に開示する組成物を調製する方法のいずれかに従って作製された組成物も包含する。
【０２３２】
要素がリスト、例えば、マーカッシュグループフォーマットとして提示されている場合、それらの要素の各サブグループもまた開示され、任意の（１つまたは複数の）要素を、そのグループから除くことができることを理解されたい。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であり、追加の要素またはステップを含むことを可能とすることを意図することにも留意されたい。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特色、ステップ等を含むと言及される場合、本発明または本発明の態様の特定の実施形態は、そのような要素、特色、ステップ等からなるか、またはそれらから本質的になることが理解されなければならない。簡素化の目的で、それらの実施形態は、本明細書では、具体的にこれらの言葉では記載されていない。したがって、１つまたは複数の要素、特色、ステップ等を含む本発明の各実施形態について、本発明はまた、それらの要素、特色、ステップ等からなるかまたはそれらから本質的になる実施形態も提供する。
【０２３３】
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別段の記載がないかまたはそれ以外の場合には文脈および／もしくは当業者の理解するところから明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈から別段に明確に指定されない限り、本発明の異なる実施形態において言及された範囲に属する任意の特定の値を、その範囲の下限の１０分の１の単位までとることができることも理解されたい。また、別段の記載がないかまたはそれ以外の場合には文脈および／もしくは当業者の理解するところから明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲に属する任意の部分的な範囲をとることができ、その部分的な範囲の終点は、その範囲の下限の１０分の１の単位と同じ精度で表されることも理解されたい。
【０２３４】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態を、任意の１つまたは複数の請求項から明確に除外することができることも理解されたい。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特色、適用または態様を、任意の１つまたは複数の請求項から除外することができる。簡潔にするために、１つまたは複数の要素、特色、目的または態様が除外される実施形態の全てが本明細書に明確に記載されているわけではない。
【０２３５】
参考文献の組込み
本出願に引用する全ての刊行物および特許文献の全体が、それぞれの個々の刊行物または特許文献の内容が本明細書に組み込まれているのと同じ程度に、参照により組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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