(57)【要約】  アルコールデヒドロゲナーゼのうちのＧＳＮＯＲを特異的に阻害するｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）の新規な阻害剤を開示する。また、これらおよび関連の分子を使用する方法も開示する。これらの阻害剤は、ＧＳＮＯ結合部位と相互作用し、その動態経路中の複数の場所においてＧＳＮＯＲを阻害することができる。これらの分子は、用量依存的にＧＳＮＯＲを阻害し、ＧＳＮＯＲが、生じる低い分子量のニトロソチオールに対してタンパク質のｓ−ニトロシル化を積極的に調節することを実証する。これらの化合物は、これらに限定されないが、心血管疾患、肺疾患、泌尿生殖器疾患、神経性疾患、炎症性疾患および腫瘍疾患を含めた、種々の状態および疾患、ならびに種々の遺伝的状態を治療、診断および研究する方法において有用である。これらの化合物についての革新的な使用には、それらを使用して、タンパク質のｓ−ニトロシル化に関与する酵素、およびこれらの酵素の活性が関与するまたは関与すると考えられる種々の細胞プロセスを研究することがある。【選択図】図１
2011507811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性を変化させる方法であって、
【化１１】
2011507811.tif 000014
【化１２】
2011507811.tif 000015
【化１３】
2011507811.tif 000016
および
【化１４】
2011507811.tif 000017
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその生理学的に許容できる塩を提供するステップ、および
前記化合物をｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、
を含む方法。
【請求項２】
疾患または状態を治療する方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
治療有効用量の前記化合物を、それを必要とする患者に投与するステップ、および
を含む方法。
【請求項３】
前記疾患または状態が、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患、性交不能および射精異常、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患、血液腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の疾患または状態を治療する方法。
【請求項４】
前記化合物の治療有効量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
疾患または状態を診断する方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
前記化合物を、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、および
ｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項６】
診断される疾患または状態が、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患、性交不能および射精異常、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患、血液腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
タンパク質ニトロシル化を研究する方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
前記化合物を、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、および
ｓ−ニトロシル化の変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項８】
ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの活性を変化させるためのキットであって、請求項１に記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
【請求項９】
疾患または状態を治療する方法であって、
【化１５】
2011507811.tif 000018
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容できる塩もしくはエステルを提供するステップ、および
治療有効用量の前記化合物を、それを必要とする患者に投与するステップ、
を含む方法。
【請求項１０】
前記疾患または状態が、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患、性交不能および射精異常、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患、血液腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項９に記載の疾患または状態を治療する方法。
【請求項１１】
前記化合物の治療有効量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
疾患または状態を診断する方法であって、
請求項９に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
前記化合物を、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、および
ｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項１３】
診断される疾患または状態が、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患、性交不能および射精異常、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患、血液腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１２に記載の診断方法。
【請求項１４】
タンパク質のニトロシル化を研究する方法であって、
請求項９に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
前記化合物を、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、および
ｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項１５】
タンパク質のニトロシル化を研究する方法であって、
請求項９に記載の少なくとも１つの化合物を提供するステップ、
前記化合物を、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、および
ｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項１６】
ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの活性を変化させるためのキットであって、請求項９に記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利についての記載
本発明の開発の間の一部の研究は、ＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ  Ｎｏ．Ｒ２１  ＨＬ０８７８１６の下、米国政府から提供を受けた政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００２】
優先権の主張
本出願は、２００７年１２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／０１３，５２２号および２００８年１月１７日出願の米国仮特許出願第６１／０２１，７８１号の利益を主張し、これらの仮特許出願はどちらも、それぞれ個々にその全体が参照により本明細書に組み込まれているかのごとく、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
種々の態様および実施形態は一般に、酵素Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）を阻害し、この酵素の活性に関係する種々の状態および疾患を診断、研究および治療するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
内在性のＳ−ニトロソチオール（ＳＮＯ）は天然に存在するタンパク質であり、この中では、システインまたはホモシステイン由来の硫黄原子がＮＯと反応して、Ｓ−ＮＯ結合を形成している。哺乳動物細胞内では、ＳＮＯ濃度は、ｎＭからμＭ濃度に及ぶ。チオールのＳ−ニトロシル化反応およびＮＯのトランスフェラーゼ反応は、事実上全てのクラスの細胞シグナル伝達に関与し、これらは、イオンチャネルの制御およびＧタンパク質共役反応から、受容刺激および核の調節タンパク質の活性化に及ぶ。調節性のシグナル伝達が、ＳＮＯの合成、輸送、活性化および代謝のために存在する（Ｇａｓｔｏｎ  ＢＭ、Ｃａｒｖｅｒ  Ｊ、Ｄｏｃｔｏｒ  Ａ、Ｐａｌｍｅｒ  ＬＡ．Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ  ２００３；３：２５３〜６３）。Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）は、内因性に形成される主たる形態のＳＮＯのうちの１つであり、酵素Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）によって異化される。ＧＳＮＯＲ活性の調節は、細胞性ＮＯが調節される機構のうちの１つであると考えられている。ＧＳＮＯＲは、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）を還元することによって、細胞内タンパク質の脱ニトロシル化を触媒する。ＧＳＮＯＲは、細胞内タンパク質のｓ−ニトロシル化の調節におけるその役割から、この酵素を標的にする新しい治療剤の開発のための重要な標的となっている。これは、ＧＳＮＯＲ活性の阻害によって、ＮＯ濃度が増加するはずであり、これは続いて、終末器官の機能に臨床的に顕著な変化をもたらすはずであるからである。
【０００５】
細胞性タンパク質のｓ−ニトロシル化は、ＮＯが体内でその多数の効果を発揮する主要な反応であることが明らかにされている。活性がｓ−ニトロシル化によって調節されるタンパク質のリストが増加しつつあり、それらには、イオンチャネルタンパク質、キナーゼ、タンパク質分解酵素、転写因子、およびエネルギー変換に関与するタンパク質が含まれる（Ｇｅｗａｌｔｉｇ  ＭＴ、Ｋｏｊｄａ  Ｇ．Ｖａｓｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００２；５５：２５０〜６０）。タンパク質のｓ−ニトロシル化に関連して、ＮＯは、アポトーシス、Ｇタンパク質共役受容体に基づいたシグナル伝達、血管緊張、および炎症反応に関与するプロセスおよびタンパク質を調節することが示されている。
【０００６】
ＧＳＮＯ濃度を調整し、続いて、ＮＯの細胞濃度を変化させるＧＳＮＯＲの役割を考えると、ＧＳＮＯＲ活性を阻害する治療用化合物には、共通の病態生理が異常に低いＮＯ濃度である多種多様な疾患を治療する可能性がある。ＧＳＮＯＲ阻害剤は、ＧＳＮＯおよびＮＯの濃度を増加させることができる場合があり、これらの疾患に影響を及ぼす可能性を有する。
【０００７】
一酸化窒素、およびｓ−ニトロシル化／脱ニトロシル化のサイクルは、内皮細胞の機能不全に主として起因する多くの病的な疾患状態において必須の役割を果たす。心臓疾患、心不全、心臓発作、高血圧、アテローム動脈硬化および再狭窄等の種々の血管障害を、異常なＮＯの活性および／または濃度、ならびにそれらの結果生じる標的タンパク質のｓ−ニトロシル化の変化に直接結び付けることができる。また、喘息および性交不能等のその他の状態も、ＮＯの生理活性の異常なレベルに結び付けられている（Ｇａｓｔｏｎ  ＢＭ、Ｃａｒｖｅｒ  Ｊ、Ｄｏｃｔｏｒ  Ａ、Ｐａｌｍｅｒ  ＬＡ．Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ  ２００３；３：２５３〜６３；Ｇｅｗａｌｔｉｇ  ＭＴ、Ｋｏｊｄａ  Ｇ．Ｖａｓｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００２；５５：２５０〜６０；Ｇｅｒａｒｄ  Ｃ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａｓｔｈｍａｔｉｃｓ  ｂｒｅａｔｈｅ  ｅａｓｉｅｒ  ｗｈｅｎ  ｉｔ’ｓ  ＳＮＯ−ｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；３０８：１５６０〜１）。
【０００８】
ＧＳＮＯＲの阻害を介してｓ−ニトロソチオールの分解を阻止することの治療的潜在性が、喘息についてのマウスモデルにおいて実証されている。ＧＳＮＯＲ遺伝子を欠くノックアウトマウスによって、気管支液中のより高いＧＳＮＯ濃度に起因して、気道の過剰応答性に抵抗することが見い出され、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼのｓ−ニトロシル化に起因して、β−アゴニストに対するタキフィラキシーが減少することが実証された（Ｑｕｅ  ＬＧ、Ｌｉｕ  Ｌ、Ｙａｎ  Ｙら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｓｔｈｍａ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；３０８：１６１８〜２１）。また、嚢胞性線維症患者が、この疾患の病態生理において役割を果たしていると考えられる異常に低いレベルのＧＳＮＯを有することも示されている。ＧＳＮＯＲを阻害する療法は、これらの患者に新しい療法の選択肢を提供することができる（Ｚｅｉｔｌｉｎ  ＰＬ．Ｉｓ  ｉｔ  ｇｏ  ｏｒ  ＮＯ  ｇｏ  ｆｏｒ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ？  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００６；７０：１１５５〜８；Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  Ｍ、Ｅｃｋｅｌ  Ｇ、Ｈｉｍｍｅｌ  Ａ、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  Ｊ．Ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌａｃｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ２００７；６８：１０１〜１２）。
【０００９】
また、異常なＮＯ濃度および異常なＧＳＮＯ活性は、その他の疾患においても役割を果たす場合があり、それらには、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、敗血症性ショック、心原性ショック、内毒素ショック、毒素ショック症候群、全身性炎症反応症候群、およびその他の炎症性疾患がある（Ｚｅｉｔｌｉｎ  ＰＬ．Ｉｓ  ｉｔ  ｇｏ  ｏｒ  ＮＯ  ｇｏ  ｆｏｒ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ？  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００６；７０：１１５５〜８；Ｈｅｉｓｓ  Ｃ、Ｌａｕｅｒ  Ｔ、Ｄｅｊａｍ  Ａら、Ｐｌａｓｍａ  ｎｉｔｒｏｓｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｒｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００６；４７：５７３〜９；Ｍｕｒａｄ  Ｆ．Ｓｈａｔｔｕｃｋ  Ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；３５５：２００３〜１１；Ｋｒｏｎｃｋｅ  ＫＤ、Ｆｅｈｓｅｌ  Ｋ、Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  Ｖ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１３：１４７〜５６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの態様は、酵素活性を変化させるための化合物、および／または酵素活性を変化させるための化合物を使用するための方法であり、この方法は、
【００１１】
【化１】
2011507811.tif 000003
【００１２】
【化２】
2011507811.tif 000004
【００１３】
【化３】
2011507811.tif 000005
および
【００１４】
【化４】
2011507811.tif 000006
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその生理学的に許容できる塩を提供するステップ、および前記化合物をｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、を含む。
【００１５】
１つの実施形態は、疾患または状態を治療するための方法であり、この方法は、上記で言及した化合物を含めて、本明細書に提供する化合物のうちのいずれかによる少なくとも１つの化合物を提供するステップ、および治療有効用量の前記化合物を、それを必要とする患者に投与するステップ、を含む。さらに別の実施形態は、上記で概説した疾患を治療するための方法であり、それらの疾患または状態は、心血管疾患、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患；肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患；泌尿生殖器疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常からなる群から選択される。遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血；神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）；炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患；腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方。１つの実施形態では、前記化合物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００１６】
さらに別の実施形態は、疾患または状態を診断または研究するための方法であり、この方法は、上記に開示した少なくとも１つの化合物を提供（providing）し、当該化合物をｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、およびｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、を含む。１つの実施形態では、診断される疾患または状態は、心血管疾患、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患；肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患；泌尿生殖器疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常からなる群から選択される。遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血；神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）；炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患；腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方。さらに別の実施形態は、タンパク質のニトロシル化を研究する方法であり、この方法は、上記で言及した化合物を含めて、本明細書に開示するものによる少なくとも１つの化合物を提供し、前記化合物をｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、およびｓ−ニトロシル化の変化を観察するステップ、を含む。別の実施形態は、少なくとも１つの上記で言及した化合物を含む、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの活性を変化させるためのキットを提供する。
【００１７】
さらに別の実施形態は、疾患または状態を治療するための方法を提供し、この方法は、
【００１８】
【化５】
2011507811.tif 000007
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容できる塩もしくはエステルを提供するステップ、および治療有効用量の前記化合物を、それを必要とする患者に投与するステップ、を含む。１つの実施形態では、その疾患または状態は、心血管疾患、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患；肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患；泌尿生殖器疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常；遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血；神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）；炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患；腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方からなる群から選択される。１つの実施形態では、疾患または状態を治療するために使用する化合物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００１９】
さらに別の実施形態は、疾患、状態または化学反応および／もしくは酵素反応を診断または研究するための方法を提供し、この方法は、
【００２０】
【化６】
2011507811.tif 000008
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容できる塩もしくはエステルを提供するステップ、前記化合物をｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼと接触させるステップ、およびｓ−ニトロシル化の変化に基づく変化を観察するステップ、を含む。１つの実施形態では、診断および／または研究される疾患および／または状態は、心血管疾患、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患；肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患；泌尿生殖器疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常からなる群から選択される。遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血；神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）；炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患；腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方。さらに別の実施形態は、少なくとも１つの上記で記載した化合物を含む、ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの活性を変化させるためのキットである。
【００２１】
本発明の１つの態様は、酵素Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）を阻害するために使用することができる化合物を提供する。これらの化合物は、以下に定義する化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄ、ならびにそれらの生理学的に許容できる塩全てを含む。
【００２２】
１つの実施形態は、ヒトまたは動物の患者を治療する方法であり、この方法は、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄを含む群から選択される少なくとも１つの化合物、またはその生理学的塩を提供するステップ、および治療有効用量の当該化合物をヒトまたは動物の患者に投与するステップ、を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態は、ヒトまたは動物の疾患を診断する方法であり、この方法は、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄを含む群から選択される少なくとも１つの化合物、またはその生理学的塩を提供するステップ、および前記化合物をヒトまたは動物中の少なくとも１つの酵素と接触させるステップ、を含む。
【００２４】
さらに別の実施形態は、酵素ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）の生理機能における機構、化学または役割を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて研究する方法であり、この方法は、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄを含む群から選択される少なくとも１つの化合物、またはその生理学的塩を提供するステップ、および前記化合物を酵素ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）と接触させるステップ、を含む。
【００２５】
１つの実施形態は、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄを含む群から選択される化合物のうちの少なくとも１つ、またはそれらの生理学的塩の治療有効用量を投与することによって、疾患、欠陥または治療されるその他の医学的状態を、治療する、診断する、治癒させる、制御する、またはそれ以外の様式でそれらに影響を及ぼす方法である。１つの実施形態では、影響を受ける状態は、免疫系の要素の活性化、これらに限定されないが、例として、マクロファージ、胸腺細胞、リンパ球の活性化、またはＮＯシグナル伝達ネットワークが関与する細胞間ネットワーク、アポトーシス等の細胞プロセス、内皮細胞の活性、心血管障害、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患を含む群から選択される。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患から選択される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、泌尿生殖器系の疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常から選択される。本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）から選択される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患から選択される。本発明の別の実施形態では、影響を受ける状態は、腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＧＳＮＯＲの動態機構、およびＧＳＮＯ部位に結合する阻害剤がＧＳＮＯＲの動態経路に沿って形成することができる複合体の型を示す略図である。
【図２】図２は、１２−ＨＤＤＡの存在下または非存在下において、ＮＡＤＨに結合しているＧＳＮＯＲの蛍光に対する化合物８の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＲＡＷ２６４．７細胞中における、ＧＳＮＯＲ阻害剤の存在下でのニトロソ種の蓄積の増加と一致するデータを示すグラフである。
【図４】図４は、細胞性タンパク質のニトロシル化に対する化合物８の効果を示す図である。
【図５】図５は、化合物８およびニトロプルシドナトリウムの用量応答関係を示すグラフである。
【図６】図６は、ＧＳＮＯＲの阻害がｃＧＭＰの産生を増加させることを示すグラフである。
【図７】表１は、いくつかのＧＳＮＯＲ阻害剤の構造を示す表である。
【図８】表２は、酵素ＧＳＮＯＲを阻害する化合物による、種々のアルコールデヒドロゲナーゼのアイソザイムの阻害を示すデータの表である。
【図９】表３は、種々の化合物によるＧＳＮＯＲ阻害機構と一致する動態データの概要を示す表である。
【図１０−１】表４は、ＧＳＮＯＲを阻害すると考えられた種々の例示的な化合物について測定した動態学的対比の概要を示すデータの表である。
【図１０−２】表４は、ＧＳＮＯＲを阻害すると考えられた種々の例示的な化合物について測定した動態学的対比の概要を示すデータの表である。
【図１０−３】表４は、ＧＳＮＯＲを阻害すると考えられた種々の例示的な化合物について測定した動態学的対比の概要を示すデータの表である。
【図１０−４】表４は、ＧＳＮＯＲを阻害すると考えられた種々の例示的な化合物について測定した動態学的対比の概要を示すデータの表である。
【図１０−５】表４は、ＧＳＮＯＲを阻害すると考えられた種々の例示的な化合物について測定した動態学的対比の概要を示すデータの表である。
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本新規技術の原理の理解を促進する目的で、以降、その好ましい実施形態を参照し、特異的な言葉を使用して、それらの実施形態を説明する。しかしながら、それらによって、本新規技術の範囲が限定されることはなく、本新規技術が関連する分野の当業者であれば通常思いつく本新規技術の変更形態、改変形態、および本新規技術の原理のさらなる適用例も企図されることを理解されたい。
【００３２】
酵素Ｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＮＯＲ）は、ニトロシル化されているタンパク質からのニトロ基の除去を触媒する。ＧＳＮＯＲは一般に、アルコールデヒドロゲナーゼファミリー酵素のメンバーとして分類される。その生理的な基質は、ニトロシル化されているタンパク質、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）およびＮＡＤＨであると考えられている。ニトロシル化されている細胞間タンパク質がしばしば、ＮＯの生理活性の結果生じ、これらのタンパク質は、ＮＯの生理学的作用のうちの多くを担う。したがって、ＧＳＮＯＲが触媒する脱ニトロシル化反応は、ＮＯの作用およびそれらの結果として伴う作用を調整するサイクルのなくてならない部分として、健常で正常な細胞が、タンパク質のニトロシル化状態と脱ニトロシル化状態との間のバランス、および機能を維持するのに役立つ。
【００３３】
本発明者らは、ＧＳＮＯＲの活性に影響を及ぼし、したがって、ＮＯの、細胞間タンパク質および生理機能に対する効果を調整するために使用することができる、置換されているピロール、インドール、チオフェンおよび芳香族環を含めた、いくつかの化合物を同定するに至った。１つの態様は、一般に化合物Ａと呼ばれる、以下の構造を有する分子、ならびに種々の疾患および／もしくは状態を治療および／もしくは診断するため、または種々の、酵素が触媒する反応を研究するための当該分子の使用を含む。これらの分子は、以下の一般的な構造を有し、それらの薬学的に許容できる塩および／またはエステルを含む。
【００３４】
化合物Ａ
【化７】
2011507811.tif 000009
【００３５】
別の態様は、一般に化合物Ｂと呼ばれる構造を有する分子、ならびに種々の疾患および／もしくは状態を治療および／もしくは診断するため、または種々の、酵素が触媒する反応を研究するための当該分子の使用を含む。これらの分子は、以下の一般的な構造を有し、それらの薬学的に許容できる塩および／またはエステルを含む。
【００３６】
化合物Ｂ
【化８】
2011507811.tif 000010
【００３７】
さらに別の態様は、一般に化合物Ｃと呼ばれる構造を有する分子、ならびに種々の疾患および／もしくは状態を治療および／もしくは診断するため、または種々の、酵素が触媒する反応を研究するための当該分子の使用を含む。これらの分子は、以下の一般的な構造を有し、それらの薬学的に許容できる塩および／またはエステルを含む。
【００３８】
化合物Ｃ
【化９】
2011507811.tif 000011
【００３９】
さらに別の態様は、一般に化合物Ｄと呼ばれる構造を有する分子、ならびに種々の疾患および／もしくは状態を治療および／もしくは診断するため、または種々の、酵素が触媒する反応を研究するための当該分子の使用を含む。これらの分子は、以下の一般的な構造を有し、それらの薬学的に許容できる塩および／またはエステルを含む。
【００４０】
化合物Ｄ
【化１０】
2011507811.tif 000012
【００４１】
表１の化合物６等の化合物の骨格の合成を、スキームＩに、一般的な形態として示す。この分子および関連分子の合成に関する追加の詳細を、刊行物中に見い出すことができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．１１）。
【００４２】
本発明において有用な化合物は、特定の疾患を治療するために、単一の薬剤として経口、吸入または非経口の経路によって送達することができるのみならず、また、その他の適切な化合物の混合物であるカクテルの形態としても送達することができる。喘息、心血管疾患および本発明により治療されるその他の疾患の治療におけるカクテルの使用は日常的に行われる。この実施形態では、通常の投与ビヒクル（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、注射用液剤等）が、本発明の化合物と、少なくとも１つの追加の治療薬および／または補助的な増強物質との両方を含有するであろう。
【００４３】
本明細書に記載する化合物は、単独でまたはカクテルとして使用される場合、治療有効量で投与される。治療有効量は、以下に論じるパラメータによって決定されるが、これは、治療しようとする血流または組織の領域、例として、肺または血管平滑筋において、（１つまたは複数の）薬物のレベルを確立する量であり、こうした量は、治療の利益をもたらすのに有効である。
【００４４】
投与にあたっては、本発明の製剤（formulations）は、薬学的に許容できる量で、薬学的に許容できる組成物中に適用される。そのような調製物は日常的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、および場合によりその他の治療効果を示す成分を含有することができる。医薬品中で使用する場合、塩は、薬学的に許容できなければならないが、好都合なことに、薬学的に許容できない塩を使用して、それらの薬学的に許容できる塩を調製することができ、そうした塩は、本発明の範囲から排除されない。そのような薬理学的および薬学的に許容できる塩として、これらに限定されないが、以下の酸から調製される塩が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に許容できる塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類の塩、例として、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製することもできる。さらに、化合物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに加えて、塩基付加塩を含めた、それらの薬学的に許容できる塩も含まれる。薬学的に許容できる塩という用語は、アルカリ金属塩および遊離塩基の付加塩を形成するために通常使用される塩を含む。塩が薬学的に許容できるのであれば、その性質はそれほど重大ではない。
【００４５】
本発明の化合物の適切な薬学的に許容できる塩基付加塩は、無機塩基または有機塩基から調製することができる。適切な薬学的に許容できる塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される金属塩、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインから作製される有機塩がある。これらの塩は全て、従来の手段により、対応する本発明の化合物から、例えば、適切な塩基を本発明の化合物のうちの１つと反応させることよって調製することができる。
【００４６】
また、本発明には、本発明の化合物の薬学的に許容できるエステルも含まれる。これらのエステルは、本発明の化合物と、アルコール、例として、メタノール、エタノール、イソプロピル、ブタノールならびにその他のアルキルアルコールおよびアリールアルコールとの間の酸触媒反応によって調製することができる。
【００４７】
適切な緩衝剤として、例えば、酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）、クエン酸および塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）、ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）、ならびにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）が挙げられる。
【００４８】
適切な保存剤として、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）が挙げられる。
【００４９】
また、本発明は、医薬組成物および／または製剤、ならびに当該医薬組成物および／または製剤の使用も対象とし、これらは、例えば、以下の化合物６、７または８（表１）等ならびにそれらの薬学的に許容できる塩および／またはエステルのうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む。さらに、本発明は、当該医薬組成物および／または製剤を使用して、状態の種々の疾患を治療または診断するための方法、ならびに種々の化学的および生物学的なプロセスを研究するための方法も対象とする。
【００５０】
本発明の製剤は、液剤、懸濁剤、シロップ剤、錠剤、カプセル剤等であってよい。この組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例として、中鎖トリグリセリド油またはステアリン酸マグネシウムを含有することができる。好ましい製剤では、中鎖トリグリセリド油とステアリン酸マグネシウムとが、およそ１：１の比で存在する。参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８版、１９９０編等の標準的な文献を参考にして、過度の実験をせずとも、適切な調製物を調製することができる。
【００５１】
１つの好ましい担体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。１つのさらに好ましい担体は、例えば、９００超（最も好ましくは、約１，０００）の高い分子量を有するポリエチレングリコールと、例えば、５００未満（好ましくは、約４００）の低い分子量を有するポリエチレングリコールとの混合物である。１つの特に好ましい担体は、約１：２の比で、１００のＭＷをもつＰＥＧと約４００のＭＷをもつＰＥＧとを有するＰＥＧである。
【００５２】
好ましい乳化剤として、ホスファチジルコリン乳化剤、例として、ジラウロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００５３】
この製剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、キサンタンガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等の粉末状の担体を含むことができる。また、この組成物は、浸透促進剤も含むことができる。適切な浸透促進剤として、グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ジメチルスルホキシド、または油、例として、鉱油もしくは中鎖トリグリセリド油が挙げられる。
【００５４】
抗酸化剤、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、重硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、アスコルビン酸等を、単独で、または医薬組成物中で典型に利用される、その他の適切な抗酸化剤もしくは安定化剤と組み合わせてかのいずれかで使用することができる。
【００５５】
また、この製剤は、通常使用される崩壊剤、滑沢剤、可塑剤、着色剤および投与ビヒクルのうちのいずれかを含むこともできる。適切な薬学的担体が、当技術分野の標準的な参照文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。適切な製剤は典型的には、１投与単位当たり約１〜約１０００ｍｇの活性成分を含有する。これらの医薬組成物中では、活性成分は通例、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜約９５重量％の量で存在する。
【００５６】
本発明の化合物の治療用量の程度は、治療しようとする状態の性質および重症度、ならびに特定の投与経路によって変動する。いかなる場合であっても、最も適切な経路は主として、治療される状態の性質および重症度、ならびに活性成分の性質に依存するが、本発明の組成物は、好都合なことに、単位投与剤型として提供することも、薬剤学の分野でよく知られている方法のうちのいずれかによって調製することもできる。
【００５７】
本発明の活性化合物は、場合により薬学的に許容できる担体中に含まれる治療有効量の本発明のコンジュゲートを有する医薬組成物であってよい。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」という用語は、ヒトまたはその他の動物に投与するために適している、１つまたは複数の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または被包物質を意味する。「担体」という用語は、天然または合成の有機または無機の成分を意味し、適用を促進するために、これと活性成分とを組み合わせる。医薬組成物の構成成分は、本発明の分子とも、かつ相互にも、所望の薬学的効能を実質的に損なう相互作用を伴わないようにして混ざり合うことが可能である。
【００５８】
非経口投与のために適している組成物は、好都合には、本発明の化合物の無菌の調製物を含む。この調製物は、既知の方法に従って製剤化することができる。したがって、この無菌の調製物は、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の液剤または懸濁剤であってよい。さらに、無菌の不揮発性油（fixed oils）も従来から、溶媒または懸濁媒体として利用されている。この目的では、合成のモノまたはジ−グリセリドを含めて、任意の無刺激性固定油を利用することができる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も、注射剤を調製する場合に有用である。経口、皮下、静脈内、筋肉内等のために適している担体の処方を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見い出すことができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、対象または患者は、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類等を意味することができる。数で示される値または範囲と併せて使用される「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は一般に、±２０パーセントを意味し、例えば、「約１．０」は、０．８〜１．２の値を含む。
【００６０】
本発明の化合物は、有効量で投与される。有効量は、治療される特定の状態の発症を遅らせる、その進行を阻害する、またはその発症もしくは進行を完全に止める、あるいは治療される特定の状態を診断するために必要な量である。例えば、一般に、喘息を治療するための有効量は、気道を開き、気道の炎症を減少させ、その結果として、治療の利益を得るために必要な量である。対象に投与する場合、もちろん、有効量は、治療される特定の状態；状態の重症度；年齢、健康状態、サイズおよび体重を含めた、個々の患者のパラメータ；併用する治療；治療頻度；ならびに投与の様式に依存する。これらの要因は、当業者にはよく知られており、日常的な実験だけで対処することができる。一般に、最大用量、すなわち、信頼できる医学的判断による最も高い、安全な用量を使用することが好ましい。
【００６１】
投与量を適切に加減して、所望の薬物レベルを、局所的または全身的に達成することができる。一般に、活性化合物の１日当たりの経口用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。約１〜１０００ｍｇ／ｍ２／日の範囲のＩＶ用量が有効であることが予想される。そのような用量における対象の応答が不十分である場合には、患者が許容する程度において、より高い用量（または異なる、より局所的な送達経路による、より高い有効用量）を利用することさえできる。また、化合物の、適切な全身性のレベルを達成することが必要な場合には、例えば、２４時間にわたる連続的なＩＶ投与または１日当たりの複数回投与も企図される。同様に、濃度、投与の長さ等を含めた、好ましい投与スケジュールも本明細書に記載する。
【００６２】
多様な投与経路が利用可能である。もちろん、選択される特定の様式は、選択される特定の薬物、治療される疾患状態の重症度、および治療が効能を示すために必要な投与量に依存する。本発明の方法は一般的にいえば、医学的に許容できる任意の投与様式、すなわち、臨床上許容できない有害作用を引き起こすことなく、有効なレベルの活性化合物をもたらす任意の様式を使用して実行することができる。そのような投与様式として、例えば、経口、直腸、舌下、外用、経鼻、経皮、皮内または非経口の経路が挙げられる。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内または注入を含む。場合によっては、静脈内経路が好ましい場合がある。
【００６３】
この組成物は、好都合なことに、単位投与剤型として提供することも、薬剤学の分野でよく知られている方法のうちのいずれかによって調製することもできる。全ての方法が、本発明のコンジュゲートを、１つまたは複数の補助的成分で構成される場合がある担体と混ぜ合わせるステップを含む。一般に、この組成物は、この化合物を液体の担体、微粉化した固体の担体または両方と一様かつ密接に混ぜ合わせ、次いで、必要であれば、この生成物を成型することによって調製することができる。
【００６４】
経口投与のために適している組成物を、カプセル剤、カシェ剤、錠剤またはドロップ剤等の個別の単位として提供することができ、それぞれが、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。その他の組成物は、例えば、水溶液中または非水性の液体中の懸濁剤、例として、シロップ剤、エリキシル剤または乳剤を含むことができる。
【００６５】
その他の送達システムは、時間放出性、遅延放出性または持続放出性の送達システムを含むことができる。そのようなシステムは、本発明の活性化合物の反復投与を回避し、対象および医師の利便性を高めることができる。多くの型の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。それらには、ポリ乳酸とポリグリコール酸、ポリ酸無水物とポリカプロラクトン等、ポリマーに基づいたシステム；ポリマーではなく、コレステロール、コレステロールエステル等のステロールと、脂肪酸またはモノ、ジおよびトリグリセリド等の中性脂肪とを含む脂質に基づいたシステム；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドに基づいたシステム；ろう被覆、従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的に融合させたインプラント等がある。さらに、ポンプに基づいたハードウエア送達システムも使用することができ、それらの中には、埋込みに適合しているものもある。
【００６６】
また、長期の持続放出性インプラントも使用することができる。本明細書で使用する場合、「長期」放出は、治療レベルの活性成分を少なくとも３０日、場合によっては６０日以上にわたり送達するために、インプラントを構築し、配置することを意味することができる。長期の持続放出性インプラントは、当業者にはよく知られており、上記の放出システムのうちのいくつかを含む。そのようなインプラントは、慢性の医学的状態を治療する場合に特に有用である場合がある。
【００６７】
また、本発明の化合物は一般に、これらに限定されないが、心血管疾患、例として、全身性高血圧、肺動脈性肺高血圧、冠状動脈アテローム動脈硬化、全身性アテローム動脈硬化、冠状動脈再狭窄、心不全、うっ血性心不全、心原性ショック、心筋症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、脳血管発作（ＣＶＡ）、塞栓性疾患；肺疾患、これらに限定されないが、例として、喘息、運動誘発喘息、気管支拡張、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症に起因する肺疾患；泌尿生殖器疾患、これらに限定されないが、例として、性交不能および射精異常；遺伝性疾患、これらに限定されないが、例として、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血；神経性疾患、これらに限定されないが、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）；炎症性疾患、これらに限定されないが、例として、全身性炎症反応症候群、関節リウマチ、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、糸球体腎炎、乾癬、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、皮膚炎、およびその他の炎症性疾患；腫瘍疾患、例として、血液腫瘍および固形腫瘍の両方を含めた、疾患または状態を治療するために有用である。当業者であれば、日常的な実験を超えるものを行うことなく、上記の特異的な生成物およびプロセスの多数の均等物を認識することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に開示する参照文献は全て、それぞれが個々に組み込まれているかのごとく、参照により組み込まれている。
【００６８】
結果および議論
生理的ｐＨにおいてＧＳＮＯＲを阻害する化合物の同定：
ＧＳＮＯＲは、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ＡＤＨファミリーのその他のメンバーと同様、第一級アルコールおよびアルデヒドを、ＮＡＤ（Ｈ）分子の助けを借りて酸化および還元することができる。オクタノールを、最初のスクリーニングアッセイにおける基質として選んだ。これは、オクタノールは、ＧＳＮＯと同様にかさ高いが、ＧＳＮＯよりも２００倍高いＫＭ値（１ｍＭ）および２桁超低いｋｃａｔ値（２００／分）を有するからである。これによって、最初の速度条件が最長１０分までの期間にわたり有効となり（データ示さず）、３８４ウエルプレートフォーマットにおいて、多数のアッセイを同時に実施することが可能となる。化合物の非存在下でオクタノールの顕著な酸化速度を得るために、アッセイのｐＨを加減してｐＨ１０とした。ＧＳＮＯＲ阻害剤についてのスクリーニングを、飽和濃度のＮＡＤ＋および不飽和濃度のオクタノールの存在下で実施し、それによって、ＧＳＮＯＲのＧＳＮＯ結合部位中に限ってまたは主として結合する化合物を同定する確率を増加させた。こうすることが、望ましいとみなされた。これは、細胞の内部には多くのデヒドロゲナーゼがあり、補酵素結合部位中に結合する化合物は、ＧＳＮＯに結合するＧＳＮＯＲ形態に主として結合する化合物よりも、ＧＳＮＯＲの非特異的な阻害剤である可能性がより高いからである。
【００６９】
最初のスクリーニングアッセイにおいてオクタノールの酸化速度を４０％以上阻害した化合物を選択して、その後の解析に供した。最初に同定した化合物のＧＳＮＯＲ阻害活性を、ｐＨ１０およびｐＨ７．５において、１２−ヒドロキシドデカン酸およびｓ−ニトロソグルタチオンをそれぞれ基質として確認した。表１に、最初のスクリーニング実験において同定した８つの異なるクラスの化合物のそれぞれからの代表的な化合物を列挙する。表１中の同定した化合物のそれぞれは、ｐＨ１０におけるＧＳＮＯＲの阻害に関しては、現存するＧＳＮＯＲ阻害剤であるドデカン酸よりも良好なＧＳＮＯＲ阻害剤であった。表１をさらに参照すると、化合物６〜８は、ＧＳＮＯＲを、ｐＨ７．５（１．７〜３５％阻害）においてよりも、ｐＨ１０（５３〜９７％阻害）においてより有効に阻害した。これらの化合物のｐＨ７．５における親和性の減少は、それらの、より低いｐＨにおいてイオン化可能な基のイオン化状態の変化に起因する可能性が高い。化合物１中のイミドアミド基および化合物２中のピリジニル窒素の両方が、ｐＨ１０においてよりも、ｐＨ７．５においてプロトン化される度合いが高く、ＧＳＮＯＲの活性部位中の同様に荷電している残基から反発を受けるであろう。また、化合物８も、ｐＨ７．５においてよりも、ｐＨ１０においてより高いＧＳＮＯＲの阻害を示す。しかし、この化合物は、イオン化状態がｐＨ７．５において顕著に抑制されるであろうフェノール性ヒドロキシル基を有する。理論に縛られる意図はないが、イオン化したフェノール性ヒドロキシル基は、ＧＳＮＯＲの活性部位内部の反対に荷電している残基との重要な相互作用に関与することが可能である。化合物６〜８は、それらのイオン化可能な基上の電荷が逆転されるか、またはそれらのｐＫａ値が顕著に乱されるかして初めて、生理的ｐＨにおいて、有効なＧＳＮＯＲ阻害剤として役立つことができる可能性が高い。したがって、化合物６〜８のさらなる特徴付けは進めなかった。
【００７０】
化合物４〜８は、とりわけ見込みのあるＧＳＮＯＲ阻害剤であると思われる。これは、これらの化合物は、ＧＳＮＯＲの活性部位に対するそれらの親和性を、アッセイしたｐＨの両方において維持するように見えたからである。また、これらの化合物は、生理的ｐＨにおいて測定した場合、ドデカン酸よりも１００倍低いＩＣ５０値を示した。ここで、化合物５（表１）を参照すると、エステル基の除去によって、阻害剤のＧＳＮＯＲに対する親和性が顕著に改善した。これは、３倍高まった、化合物の加水分解された形態によるＧＳＮＯＲ阻害（表１）によって証明されている。化合物４〜８は、小型分子についてのＬｉｐｉｎｓｋｉの５ポイント則を満たし、薬物様の特性を示しており、ＧＳＮＯＲ阻害剤としての、さらなる調査のための良好な候補であると思われた。
【００７１】
ＧＳＮＯＲ阻害の選択性
その他のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）とは対照的な、化合物４〜８の、ＧＳＮＯＲを選択的に阻害する能力は重要であるとみなされた。これは、大部分のＡＤＨは、類似の全体構造を有し、広い基質特異性を示すからである。ＧＳＮＯＲの阻害と併せて、ＡＤＨファミリーの３つの追加のアイソザイム、具体的には、β２β２−ＡＤＨ、π−ＡＤＨ、σ−ＡＤＨの、化合物４〜８の同じ濃度による阻害を調べた。いずれの場合も、阻害アッセイを、飽和濃度またはＫＭ濃度の補酵素およびアルコール基質の存在下で実施した。ここで、表２を参照すると、化合物６〜８は、特異性の高いＧＳＮＯＲ阻害剤である。化合物６〜８を用いて試験した場合には、７０％超のＧＳＮＯＲ活性を阻害する濃度においては、その他のＡＤＨアイソザイムはいずれも顕著には阻害されない。化合物４は、ＧＳＮＯＲよりもπ−ＡＤＨを強く阻害し、この化合物についてはその後の研究は進めなかった。化合物５は、ＧＳＮＯＲ阻害剤としてある程度は良好であるが、また、σ−ＡＤＨの顕著な阻害も示した。したがって、その他のＡＤＨアイソザイムよりもＧＳＮＯＲに対するその選択性を高めるためには、化合物５をさらに修飾する必要があり得る。化合物６〜８は、ＧＳＮＯＲの極めて有効かつ選択的な阻害剤として有望であり、これらを、その後の調査のためのリード化合物として選択した。
【００７２】
化合物６〜８等によるＧＳＮＯＲの阻害機構の決定
デッドエンド阻害研究および蛍光研究を実施して、化合物６〜８の結合部位を同定した。これは、これらの化合物は、既知のＧＳＮＯＲの基質または阻害剤のうちのいずれにもほとんど類似しないように見えたからである。ここで、表３を参照すると、試験した阻害剤は、ＧＳＮＯまたはＮＡＤＨのいずれかの変化させた濃度に対して、非競合的および不競合的な阻害を示した。このことは、これらの基質はいずれも、化合物６〜８がＧＳＮＯＲに結合するのを完全には阻止することができないことを示している可能性がある。これは、例えば、化合物６〜８が、（図１に示す）動態経路中で生じる複数の酵素複合体に結合する場合に起こるであろう。これらの化合物によるＮＡＤＨおよびＧＳＮＯＲに対する阻害の型が類似しているので、ＧＳＮＯＲ中の活性部位の外側の部位に結合することによる阻害の可能性は低い。ドデカン酸が阻害剤として関与する追加のデッドエンド阻害研究を、変化させたＧＳＮＯに対して実施して、基質結合部位中の阻害剤の結合が、ＧＳＮＯ還元の動態経路中で形成する複合体の型を決定した。
【００７３】
ここで、図１を参照すると、ＧＳＮＯＲは、アルデヒドの還元の間に、そのランダム機構においてＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体（ＥＡ）を介する好ましいキネティック  パスウェイ（kinetic pathway）を通ることができる（太線によって示す）。この提案する機構では、アルデヒド（Ｂ）は、ＧＳＮＯＲ（Ｅ）の遊離型、または優先的にＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体（ＥＡ）に結合して、能力のある三元複合体（ＥＡＢ）を形成することができる。ＥＡＢ複合体は、触媒作用を受けて、生成物のＮＡＤ＋（Ｑ）およびアルコール（Ｐ）を形成する。触媒作用の後、生成物のうちのいずれかが、酵素から外れることができる。ＧＳＮＯ阻害剤は、ＧＳＮＯＲの遊離型（ステップ１）、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ（ステップ２）の二元複合体、およびＧＳＮＯＲ・ＮＡＤ＋（ステップ３）の二元複合体に結合して、ＥＩ複合体、ＥＡＩ三元複合体およびＥＱＩ三元複合体をそれぞれ形成することができる。
【００７４】
表３を参照すると、ドデカン酸は、ＧＳＮＯ結合部位において結合するにもかかわらず、変化させたＧＳＮＯ濃度に対する非競合的な阻害剤であることが見い出された。ドデカン酸によるＧＳＮＯＲの非競合的な阻害は、アルデヒドである１２−オキソドデカン酸（１２−ＯＤＤＡ）の還元の間のＧＳＮＯＲの動態機構（図１に示す）に基づいて説明することができる。ＧＳＮＯＲは、１２−ＯＤＤＡの還元の間に、Ｅ・ＮＡＤＨの複合体を介する好ましい動態経路を有する。この機構に従って、ドデカン酸が、ＧＳＮＯＲに、動態経路中の２つ以上の場所において結合するならば、非競合的な阻害剤として、変化させたＧＳＮＯレベルに対して作用するであろう。これらの場所は、例えば、１つは、ドデカン酸がＧＳＮＯと競合して、酵素に結合する場所であり（図１のステップ１および２）、１つは、動態経路中の、ＧＳＮＯが通常であれば結合しない場所（図１のステップ３）である。ＧＳＮＯＲへの結合についての、ＧＳＮＯとの競合には、Ｅ・ＮＡＤＨの複合体（ステップ１）に対する、および若干は遊離の酵素（ステップ２）に対する阻害剤の結合が関与し、二重逆数プロット中に閉包されている傾きの効果が生じるであろう。ＧＳＮＯが通常であれば結合しない、動態経路中のＧＳＮＯＲへの結合には、Ｅ・ＮＡＤ＋の複合体に対する阻害剤の結合が関与し、二重逆数プロット中の切片の効果が生じるであろう。また、ＧＳＮＯの変化させた濃度に対する、化合物６〜８によるＧＳＮＯＲの非競合的な阻害は、それらがＥ・ＮＡＤＨ・ＩおよびＥ・ＮＡＤ＋・Ｉと形成する複合体によっても説明することができる。変化させたＮＡＤＨに対する、化合物６および８による不競合的な阻害ならびに化合物７によるほとんど不競合的な阻害（化合物７による阻害は統計学的には、非競合的な機構により良好に適合するが、Ｋｉｓ値が、Ｋｉｉ値よりも５倍大きく、大きいな標準誤差を示す）は、アルデヒドの還元の間のＧＳＮＯＲのほぼ順序付けられた動態機構中のＥ・ＮＡＤＨの複合体に結合する化合物、およびＮＡＤＨのＧＳＮＯＲに対する高い親和性（ＫＤ＝０．０５μＭ）によって説明することができる。これらの要因の両方によって、実験的条件下ではＥ・Ｉの、酵素阻害における寄与が非常に小さなものとなり、阻害が不競合的となるであろう。化合物６〜８が動態経路中の２つ以上の場所において酵素に結合することによって引き起こされるＧＳＮＯＲの阻害は、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼの、スルホキシド阻害剤およびアミド阻害剤によって示される阻害に類似する。
【００７５】
平衡結合研究（equilibrium binding studies）を実施して、デッドエンド阻害研究、すなわち、化合物６〜８（表Ｉ）が基質（ＧＳＮＯまたは任意のアルコールおよびアルデヒド）結合部位中に結合することを説明するために組み立てられた仮説を試験した。化合物６〜８が、基質結合部位中に結合するならば、これらの化合物は、ＧＳＮＯＲ活性部位から、基質のみを排除し、補酵素は排除しないはずである。
【００７６】
ここで、図２を参照する。（Ａ）ＧＳＮＯＲ（曲線ｂ）および化合物８（曲線ｃ）の逐次添加時のＮＡＤＨ（曲線ａ）の蛍光変化。１．７μＭ  ＮＡＤＨ溶液に、２μＭ  ＧＳＮＯＲおよび５０μＭ化合物８を順に添加し、溶液の蛍光をその都度測定した（λｅｘｃ＝３５０ｎｍ；λｅｍｍ＝３７５〜５５０ｎｍ）；（Ｂ）ＧＳＮＯＲ（曲線ｂ）、１２−ＨＤＤＡ（曲線ｃ）および化合物８（曲線ｄ）の逐次添加時のＮＡＤＨ（曲線ａ）の蛍光変化。１．７μＭ  ＮＡＤＨ溶液に、２μＭ  ＧＳＮＯＲ、８１０μＭ  １２−ＨＤＤＡおよび５０μＭ化合物８を順に添加し、溶液の蛍光をその都度測定した（λｅｘｃ＝３５０ｎｍ；λｅｍｍ＝３７５〜５５０ｎｍ）；（Ｃ）化合物８のＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体への結合。化合物８の濃度を増加させた場合の、１．７μＭ  ＮＡＤＨと２μＭ  ＧＳＮＯＲとの混合物の蛍光変化（λｅｘｃ＝３５０ｎｍ；λｅｍｍ＝４５５ｎｍ）を、単一部位結合モデル（式１；材料および方法を参照されたい）に、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｍ４を使用して適合させた。蛍光研究は全て、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中、室温で実施した。
【００７７】
さらに図２ａを参照すると、ＮＡＤＨが溶媒中の極性環境から、ＧＳＮＯＲ活性部位内部の極性が低下した環境へ移動するにつれて、ＮＡＤＨの蛍光が増加し、より短い波長にシフトしている。化合物８の添加によって、ＮＡＤＨの蛍光が減少したが、興味深いことには発光ピークが青色シフトしており、これは、ＮＡＤＨが依然として、活性部位の非極性環境中にあることを示している（図２ａ中の曲線ａおよびｃを比較されたい）。そのようなジヒドロピリジン環の蛍光の消光が、アミド阻害剤がウマ肝臓ＡＤＨ・ＮＡＤＨの複合体に結合した場合に観察されている。また、化合物６および７も、ＮＡＤＨの蛍光を消光し、かつ発光最大をより短い波長へ動かした（データ示さず）。このことから、化合物６〜８は、その結合部位からＮＡＤＨを排除せず、Ｅ・ＮＡＤＨ・阻害剤の複合体を形成していることが示唆される。
【００７８】
化合物６〜８の基質結合に対する効果を決定するために、結合研究をアルコール基質である１２−ヒドロキシドデカン酸（１２−ＨＤＤＡ）の存在下で実施した。ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ・１２−ＨＤＤＡの三元複合体の形成が失敗に終わったことが以前に報告されている。図２ｂの曲線ｃを参照すると、図に示すように、１２−ＨＤＤＡがＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体に１７０μＭの解離定数で結合し、この三元複合体中のＮＡＤＨの蛍光が増加している。図２ａで報告したアッセイ中で使用したのと同じ量の化合物８を添加すると、ＮＡＤＨの蛍光が消光し、スペクトルが生じた（図２ｂの曲線ｄ）。図２ｂの曲線ｄに示すように、これは、Ｅ・ＮＡＤＨ・化合物８の複合体の形成について記載した結果と類似し、このことから、化合物８が活性部位から１２−ＨＤＤＡを追い出し、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ・化合物８の複合体を形成していること（すなわち、曲線ｃは、図２ａの曲線ｃにおいて観察された蛍光よりも強い蛍光を有する。これは、酵素に結合している１２−ＨＤＤＡの全てが化合物８によって追い出されてしまったわけではないからである）が示唆される。また、化合物６および７も、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ・１２−ＨＤＤＡの複合体の蛍光に対して類似の効果を示している。これらの結合実験は、化合物６〜８が、アルコール／アルデヒドの基質のみを、活性部位中への結合から排除することを実証している。
【００７９】
ここで、図２ａを参照すると、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ・阻害剤の複合体の形成時に観察された蛍光変化を使用して、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体について、阻害剤の平衡解離定数を決定した。化合物６〜８の平衡解離定数は、１０μＭ未満であり、このことから、これらの化合物は、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体に対して高い親和性を示すことが示唆される。ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体に対して、化合物６および８は、化合物７よりも顕著に高い親和性を示し、これは、それらの平衡解離定数が、３〜５倍小さいことによって証明されている。
【００８０】
細胞の内部におけるＧＳＮＯＲの阻害
化合物６〜８（表１）の、細胞の内部においてＧＳＮＯＲを阻害する能力を、ラットマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７細胞）中で試験した。ＲＡＷ細胞は、ＮＯおよびｓ−ニトロソチオールの生化学を調べるためのモデル系として広範に使用されている。手短に述べると、ＲＡＷ細胞を、阻害剤単独を用いてかまたはＧＳＮＯと組み合わせて処理し、細胞内のニトロシル化されている種（species）を、三ヨウ化物に基づいた化学発光法を使用して定量化した。ここで、図３Ａを参照すると、顕著な量のニトロソ種は、未処理の細胞中にも、化合物のみに、これらのアッセイにおいて使用した濃度に暴露した細胞中にも検出されなかった。５００μＭ  ＧＳＮＯを用いて処理した細胞中では、ニトロシル化されている化合物の顕著な蓄積が明らかに認められた。ニトロシル化されている化合物は、ＧＳＮＯへの暴露の１時間以内に平衡レベルに達するように見え、６時間の期間にわたりほとんど一定に維持された。対照的に、ＧＳＮＯと、３３μＭ濃度の、化合物６または化合物８のいずれかとを用いて処理した細胞中には、ニトロシル化されている化合物が蓄積し続けた。６時間目においては、ＧＳＮＯと化合物６または８とを用いて処理した細胞の内部のニトロシル化されている種のレベルは、ＧＳＮＯ単独を用いて処理した細胞中に見い出されるニトロシル化されている種のレベルよりも３〜４倍高かった。細胞を化合物６または８にさらにより長く（最長２４時間まで）暴露すると、ニトロシル化されている種の量が、４時間目において測定した場合には８０％減少した（データ示さず）。（これらの結果は、ＧＳＮＯＲの持続的な阻害ではなく、この酵素の一時的な阻害と一致する。）化合物７（表１）は、化合物６または８ほどには、細胞の内部のＧＳＮＯＲを有効に阻害しなかった。このことは、ニトロシル化されている種のレベルのわずか１．３〜１．７倍の増加、および６時間目において測定した場合のニトロシル化されている種のレベルの顕著な差から判断した、その効果のより短い持続期間によって証明されている。処理した細胞の内部のニトロシル化されている種の分子サイズの解析によって、ニトロシル化されている種の９５％超が、５ｋＤａ超のサイズであることが示された。さらに、処理した細胞中のニトロシル化されている種の２１〜２８％が、水銀による前処理に対して耐性を示し、このことから、Ｎ−ニトロソチオール化されているタンパク質もまた、細胞の内部で形成されていることが示唆される。これらの観察は、化合物６〜８が、細胞の内部においてＧＳＮＯＲを阻害することを示している。また、ＧＳＮＯＲは、細胞内タンパク質のニトロシル化の程度を、外因的に誘発されたニトロシル化を行う種によって調節することも明らかである。
【００８１】
化合物の様々な濃度の、ニトロシル化されている化合物の蓄積に対する効果を調べて、細胞内のＧＳＮＯＲの阻害に関して、化合物６〜８の有効性を比較した。細胞内のニトロシル化のレベルは、媒体中の化合物の濃度が増加すると共に増加した。細胞の内部のＧＳＮＯＲの阻害に関しては、化合物６および８は、化合物７よりも有効である。これは、３３μＭの最初の濃度において観察された、３倍高まったニトロシル化から明らかである。細胞の内部のＧＳＮＯＲの阻害に関しては、化合物７は、化合物６または８のいずれよりも有効性が低いが、にもかかわらず、ニトロソ化合物のレベルを、その他の化合物と同じ程度まで上げることが可能である。
【００８２】
また、ＧＳＮＯＲ阻害の、細胞性タンパク質のニトロシル化に対する効果も、Ｊａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３、１９３〜１９７によって開発され、Ｗａｎｇら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ  ４４、１３６２〜１３７２（２００８）によって改変されたビオチンスイッチアッセイの技法を使用して調べた。ここで図４を参照すると、化合物３は、ＲＡＷ細胞中で、細胞性タンパク質のニトロシル化を時間と共に増加させた。ＧＳＮＯＲ阻害の、細胞性タンパク質のニトロシル化に対する効果は、８時間目付近でピークに達するように見え、その後、２４時間以内に正常レベルまで減少した。細胞を、化合物８とＮＯシンターゼ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥとを用いて同時に処理した場合には、ＳＮＯの蓄積が減少した（図４）。限定するのではなく、説明するために述べると、これらの結果から、ＧＳＮＯＲが阻害されている細胞中のＳＮＯの蓄積が、（ＮＯＳによって）構成的に産生されるＮＯと、細胞性タンパク質との反応から生じることが示唆される。
【００８３】
化合物ｃＧＭＰは、血管の生物学において重要な役割を果たす。ＧＳＮＯＲの阻害が、ｃＧＭＰの産生を増加させるかどうかを試験するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、５０μＭ  ＧＳＮＯ±を用いて、本発明の対象であるＧＳＮＯＲ阻害剤のうちの１つである化合物８の存在下および非存在下の両方においてインキュベートした。次に、ｃＧＭＰの蓄積量を、１０分後に測定した。ここで、図６を参照すると、以前に記載されている（Ｍａｙｅｒら、ｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２７３、Ｉｓｓｕｅ  ６、３２６４〜３２７０、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ６、１９９８）ように、ＧＳＮＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化する。化合物８は、ＧＳＮＯの効果を２．５倍増強する（図中のＧＳＮＯＲｉ）。いずれの特定の説明にも仮説にも限定されないが、これらの結果から、化合物８がその生化学的効果を発揮することができる１つの機構が、化合物８がＧＳＮＯＲを阻害することによって引き起こされ、次いで、これが、ＧＳＮＯのｃＧＭＰ産生に対する効果を増強し、その結果、ｃＧＭＰレベルが高まることが示唆される。これらのデータによって、本明細書の他の箇所で実証するように、ＧＳＮＯＲを阻害するこれらの化合物のうちの少なくともいくつかの、生化学的レベルにおける、単離した大動脈輪（aortic rings）を弛緩させる能力を説明することができる。
【００８４】
ＧＳＮＯＲ阻害時のタンパク質のニトロシル化の増加から、ＧＳＮＯＲ阻害は、臓器中および組織培養細胞中で、細胞性タンパク質のｓ−ニトロシル化に由来するＮＯの生理活性を増加させるはずであることを示唆することができる。この仮説を、化合物８の、マウス大動脈臓器培養物の血管緊張に対する効果を決定することによって試験した。化合物８（５０μＭ）は、１５分以内に血管を完全に弛緩させた。化合物８については、完全な濃度応答曲線から、５μＭのＥＣ５０が明らかになり（図５Ａ）、わずか３００ｎＭで約１０％の弛緩をもたらした。ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）と直接比較することによって、血管平滑筋の弛緩に関しては、化合物８は、ＳＮＰほどには強力ではなく（図５Ａ）、弛緩は、ＳＮＰよりもはるかに緩慢に生じることが明らかになったが、効果の持続期間は、ＳＮＰを用いた場合よりもはるかに長かった。ＳＮＰの血管効果は即時性であり、これによって、高血圧緊急症のためのその臨床上の有用性が説明される。ＧＳＮＯＲｉ媒介性弛緩は、弛緩が始まるまでに約３分を要するが、５０μＭの濃度においては、血管の弛緩を最長２時間まで持続させ、その後、血管調製物の完全性（integrity）が低下し始めた。
【００８５】
大動脈輪を５００μＭ  Ｌ−ＮＡＭＥと共に３０分間プレインキュベートすると、化合物８に対する血管弛緩が約５８％阻害された（図５Ｂ）。化合物８によって引き起こされた大動脈の弛緩がＬ−ＮＡＭＥによって部分的に阻害されることから、ＮＯＳによって産生されたＮＯが、ＧＳＮＯＲ阻害の間に観察される平滑筋弛緩を媒介することが示唆される。したがって、ＧＳＮＯＲは、ＮＯの生理活性を、細胞性タンパク質のニトロシル化を調節することによって積極的に調節し、このことから、ＲＳＮＯが、単離臓器における血管弛緩に関与するという概念が確認される。
【００８６】
したがって、これらの３つの化合物は、ＧＳＮＯＲを阻害する、細胞の効果を定義するのに役立ち、これらの化合物には、ＧＳＮＯＲの活性を完全には無効にせずに、ＧＳＮＯＲ阻害の有益な効果を生かす可能性がある。
【００８７】
ＧＳＮＯＲ阻害によるニトロソチオールの蓄積は、ＧＳＮＯＲが、細胞の内部のｓ−ニトロシル化されているタンパク質レベルの調節に関与する主要な酵素であることを示すＳｔａｍｌｅｒらの研究と一致する。ニトロソチオールの三ヨウ化物に基づいた定量化の感受性に関する議論に照らして、少なくともＮＯシンターゼの刺激がないと、ＧＳＮＯＲ阻害それ自体では細胞性タンパク質のニトロシル化レベルの大きな増加をもたらさないことが結論付けられた。いずれの特定の理論にも説明にも縛られる意図はないが、これらの結果から、ＧＳＮＯＲ活性の抑止ではなく、むしろ部分的な下方調整が、最も効能を示すことが判明し得ることが示唆される。要約すると、これらの教示から、おそらくＧＳＮＯ結合部位内に結合することによって、ＧＳＮＯＲを阻害するであろうｓ−ニトロソグルタチオンレダクターゼの新規な阻害剤および多くの関連化合物が明らかとなっている。これらの化合物のうちの少なくともいくつかは、動態経路中の複数の場所においてＧＳＮＯＲに結合し、それによって、ＧＳＮＯおよびＮＡＤＨの上方調節によっては容易に克服されない型の阻害をもたらす。これらの化合物を使用して収集したデータは、ＧＳＮＯＲが細胞内タンパク質のニトロシル化の調節に関与する主要な酵素のうちの１つであるという主張を支持している。
【００８８】
構造的に多種多様であることに加え、化合物６〜８のそれぞれは、ＧＳＮＯおよび１２−ヒドロキシドデカン酸を含めた、ＧＳＮＯＲの優れた基質のうちの多くと同様に、遊離のカルボキシル基を有する。ＧＳＮＯおよびＨＭＧＳＨの結合におけるＧＳＮＯＲ活性部位の基部となるＡｒｇ１１５の重要性を考えると、化合物６〜８中の遊離のカルボキシル基は、Ａｒｇ１１５と相互作用している可能性が非常に高い。補酵素結合部位中に結合しないことによって、化合物６〜８は、ＮＡＤ（Ｈ）に結合するデヒドロゲナーゼのうちでも、ＧＳＮＯＲを特異的に阻害する高い確率を有するであろう。また、これらの化合物は、その他の非常に強力な細胞透過性のＧＳＮＯＲ阻害剤を得るための良好なリード化合物としても役立つ。
【００８９】
ＧＳＮＯＲを阻害し、診断の研究にあたってまたは療法としての有用性を有する可能性のある追加の化合物を同定するために、元々のアッセイにおいて同定した特定の化合物の類似体を試験した。それらの化合物を、表４に開示する。手短に述べると、化合物１２〜１４、４３〜５３、７２、８４、８６および７２〜８３は、表３の化合物６に関連し；表４の化合物２４、５６、５８、５９、６２、６０〜６２、６４、６６、６７、６９、７０は、表１の化合物７に関連する。
【００９０】
いくつかの説明および実験を、説明のために提供するが、これらは限定するためのものではない。どのように本新規技術が働くかという理論が、記載、比較、説明または実施例によって提示されるいずれの場合であっても、これを限定的なものであるとはみなしてはならない。したがって、以下の実施例および論述は、限定するためではなく、案内および説明として提示される。
【実施例】
【００９１】
材料および方法：
実験に使用した化学薬品は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ＲＡＷ２６４．７細胞、ＤＭＥＭ培地およびウシ胎仔血清は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅから購入した。組換えヒトＧＳＮＯＲ、β２β２−ＡＤＨ、π−ＡＤＨおよびσ−ＡＤＨは、大腸菌中で発現させ、以前に記載したように精製した。
【００９２】
化合物６の合成
置換パターンに応じて、本明細書に開示する１，２−ジアリールピロールを、スキームＩに開示する一般的な方法を使用して合成することができる。一般的な合成戦略では、適切な１，４−ケトンを調製する必要があり、続いて、適切なアミンと共に加熱し、パール−クノール縮合により環化して標的を得た。ピロール環の５位にアルキル基（Ｒ３）、ＭｅまたはＥｔを有する類似体を、スキーム１に従って合成した。チアゾリウム塩触媒を使用する、置換されているベンズアルデヒドのＲ，ａ−不飽和ケトンとのステッター反応１６は、非常に用途が広くかつ高収率であることが判明した（ＮＥｔ３、ＥｔＯＨ、還流、６０〜９０％）。ＶＩＩのアリールアミンとの縮合（スキームＩ）は円滑に進行し、所望のピロールを良好な収率（５０〜８０％）で得た。追加の情報については、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、Ｖｏｌ．４０．４０、Ｎｏ．１１を参照することを読者に案内する。
【００９３】
化合物７の合成
置換パターンに応じて、化合物７を、スキームＩＩに記載する一般的な合成アプローチによって合成することができる。追加の情報については、例えば、Ｔｒｏｆｉｍｏｖ，Ｆ．Ａ．ら、Ｋｈｉｍｉｙａ  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｏｓｋｉｋｈ  Ｓｏｅｄｉｎｅｎｉｉ、（１０）１３４３〜６；１９７５を参照することを読者に案内する。
【００９４】
化合物８の合成
置換パターンに応じて、化合物８を、スキームＩＩＩに記載する一般的な合成アプローチによって合成することができる。追加の情報については、例えば、Ｊ  Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００４、６、５７３〜５８３を参照することを読者に案内する。
【００９５】
ハイスループットスクリーニング：
ここで、図３を参照し、手短に述べると、ＲＡＷ２６４．７細胞を、５００μＭ  ＧＳＮＯ単独と共に（γ）か、または３３μＭの化合物６（○）もしくは化合物７（△）もしくは化合物８（■）の存在下でインキュベートした。表示した時間または４時間目（Ｂの場合）において、細胞を溶解させ、可溶化液を、タンパク質およびニトロソ種の濃度について、それぞれブラッドフォードアッセイおよび化学発光アッセイによって解析した。詳細は、材料および方法を参照されたい。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝３〜１２）で表す。
【００９６】
ここで、図４を参照すると、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％熱不活性化血清を含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、３３μＭ化合物８単独を用いて、０、２、４、８もしくは２４時間処理するか、または１ｍＭ  ＮＡＭＥと組み合わせて、４時間処理した（レーン４＋Ｎ）。表示した時間において、細胞を消光させ、可溶化液を、ｓ−ニトロソチオール含有量について、ビオチンスイッチアッセイによって解析した。各レーン中に、等しい量のタンパク質を添加し、ビオチン化（したがって、ｓ−ニトロシル化）の程度を、抗ビオチン抗体を使用して決定した。
【００９７】
ここで、図５を参照すると、マウスの大動脈セグメントを、酸素化ＰＳＳ（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）中、３７℃で平衡化させた。平衡化に続いて、１μＭフェニレフリンを、各環に、準最大に収縮させるために添加した。安定化した後、化合物８またはニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）のいずれかを、濃度を（１０−９Ｍから１０−４Ｍまで）増加させて環に添加し、環の緊張を決定した。（Ｂ）ＮＯシンターゼ阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥによる、化合物８によって引き起こされた大動脈環の弛緩の阻害。あらかじめ平衡化させ、フェニレフリン（１マイクロモル）を用いて準最大に収縮させた大動脈輪に、Ｌ−ＮＡＭＥ（５００マイクロモル）を浴に添加し、３０分間インキュベートした。３０分後、化合物８（５０マイクロモル）を添加し、環の緊張を、上記の記載に従って決定した。各実験を、３匹の異なるマウス由来の２つの環を使用して実施し、それぞれの応答について、平均（±ＳＥＭ）を決定した。
【００９８】
ここで、図６を参照すると、ＲＡＷ２６４．７細胞を、５０μＭ  ＧＳＮＯ±本発明の対象であるＧＳＮＯＲ阻害剤の化合物８と共にインキュベートし、次いで、１０分後に、ｃＧＭＰの蓄積量を測定した。以前に記載されている（Ｍａｙｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２７３、Ｉｓｓｕｅ  ６、３２６４〜３２７０、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ６、１９９８）ごとく、図に示すように、ＧＳＮＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化する。化合物８がその生化学的効果を発揮する１つの機構が、化合物８がＧＳＮＯＲを阻害することによって引き起こされ、次いで、これが、ＧＳＮＯのｃＧＭＰ産生に対する効果を増強し、その結果、ｃＧＭＰレベルが高まる。これらのデータは、ＧＳＮＯＲを阻害するこれらの化合物全ての、生化学レベルにおける、単離した大動脈輪を弛緩させる能力を説明する可能性が高い。
【００９９】
ここで、表１を参照すると、阻害を、ｐＨ１０において研究した。これらのアッセイを、１ｍＭオクタノール、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０μＭ阻害剤を含有する０．１Ｍグリシンナトリウム中で実施した。ｐＨ７．５における阻害研究を、１５μＭ  ＮＡＤＨ、１０μＭ  ＧＳＮＯ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０μＭ阻害剤を含む５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中で実施した。データは、部分的な阻害と一致する阻害曲線に適合し、このモデルに対するデータの適合から、２．４のヒル係数が出た。
【０１００】
ここで、表２を参照すると、阻害研究を、５μＭ阻害剤の存在下および非存在下で実施した。これらの研究を、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中、２５℃で実施した。酵素の活性を、３４０ｎｍにおける吸光度の変化に従って測定した。値は、阻害剤によって引き起こされた（２つの測定値のうちの最小値からの）酵素活性のパーセント低下を示す。このデータについての標準誤差は、阻害が２０％未満であった場合を除いて、表示した平均の１５％未満である。β２β２−ＡＤＨ、σσ−ＡＤＨ、π−ＡＤＨを用い、化合物５〜８が関与する研究を、０．０５％ＤＭＳＯ中で実施した。ＧＳＮＯＲを用いる研究を、化合物４が阻害剤である場合を除いて、１％ＤＭＳＯの存在下で実施した。化合物４を用いる研究は、０．３６％ＤＭＳＯ中で実施した。ＤＭＳＯは、０．３６％においては、β２β２−ＡＤＨ、σσ−ＡＤＨ、π−ＡＤＨをそれぞれ、２４、１８および９％阻害した。β２β２−ＡＤＨを用いる研究では、３．５μｇの酵素を、２ｍＭ  ＮＡＤ＋、１ｍＭエタノールおよび阻害剤を含むアッセイ混合物に添加した。
【０１０１】
σ−ＡＤＨを用いる研究では、０．５μｇの酵素を、２ｍＭ  ＮＡＤ＋、３０ｍＭエタノールおよび阻害剤を含有するアッセイ混合物に添加した。π−ＡＤＨを用いる研究では、１９．５μｇの酵素を、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、３５ｍＭエタノールおよび阻害剤を含むアッセイ混合物に添加した。ＧＳＮＯＲを用いる研究には、０．１μｇの酵素を、１５μＭ  ＮＡＤＨ、５μＭ  ＧＳＮＯおよび阻害剤を含むアッセイ混合物に添加した。
【０１０２】
ここで、表３を参照すると、阻害実験を、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中、２５℃で実施した。変化させる基質の最低でも５つの濃度および３つの阻害剤濃度を、各実験について使用した。ＮＡＤＨおよびＧＳＮＯの濃度をそれぞれ、アッセイ中に一定の基質として存在させる場合には、１５μＭまたは１０μＭに保った。Ｋｉｓ値およびＫｉｉ値はそれぞれ、阻害定数の傾きおよび切片（slope and intercept inhibition constants）であり、それらを、それらに付随する標準誤差と共に列挙する。全てのデータが、競合的（competitive）（Ｃ）、非競合的（noncompetitive）（ＮＣ）または不競合的（ＵＣ）（uncompetitive）な阻害モデルに適合した。表に示す阻害の型は、Ｆ統計量の解析から判断した場合に所与のモデルに対するデータの最良の適合を示す。ＫＤ値は、阻害剤の添加に伴う、ＮＡＤＨが結合したＧＳＮＯＲの蛍光変化を測定する（λｅｘｅ＝３５０ｎｍ；λｅｍｍ＝４５５ｎｍ）ことによって得た、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨの複合体への結合についての、阻害剤の平衡解離定数である。解離定数を、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中、２５℃で測定した。それぞれのＫＤ値は、３つの独立した実験の平均であり、それに伴う標準誤差と共に示す。
【０１０３】
ＧＳＮＯＲ阻害剤についてのスクリーニングを、Ｉｎｄｉａｎａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙのＣｈｅｍＤｉｖ  Ｉｎｃからの６０，０００個の化合物のライブラリーを使用して実施した。スクリーニングを、３８４ウエルプレート中で実施し、０．１Ｍグリシンナトリウム、ｐＨ１０中で、ＧＳＮＯＲを１２．５μＭ化合物、ＮＡＤ＋およびオクタノールのそれぞれ１ｍＭと共にインキュベートした。酵素活性を、ＮＡＤＨの産生速度を分光光学的に３４０ｎｍにおいて測定することによって決定した。ＧＳＮＯＲの阻害を、化合物の存在下における酵素活性の、同じアッセイプレート上で実施した化合物が存在しない対照中の酵素活性に対する比から計算した。高スループットスクリーニングからそれらを同定した後、最初のヒットのＧＳＮＯＲ阻害特性を、ｐＨ１０においては１２−ヒドロキシドデカン酸を基質として使用し、およびｐＨ７．５においてはＧＳＮＯを基質として使用して確認した。（どのようにアッセイを実施したかについての詳細については、表１の簡潔な記載を参照されたい。）
【０１０４】
種々の化合物によるＡＤＨアイソザイムの阻害：
β２β２−ＡＤＨ、π−ＡＤＨ、σ−ＡＤＨの阻害を、これらＡＤＨアイソザイムのそれぞれによるエタノールの酸化速度に対するＧＳＮＯＲ阻害剤の阻害効果を決定することによって評価した。アッセイ混合物は、それぞれの酵素のそれぞれについて、飽和量のＮＡＤ＋（１〜２ｍＭ）およびそのＫＭ濃度のエタノールを含んでいた。全てのアッセイを、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中、２５℃で実施し、このアッセイでは、ＮＡＤＨの形成速度を分光光学的に３４０ｎｍにおいて決定した。それぞれのアイソザイムについての特定のアッセイ条件を、表２の説明文に記載する。
【０１０５】
デッドエンド（dead-end）阻害研究：
ＧＳＮＯＲ阻害剤を用いる阻害実験を、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する３ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中、２５℃で実施した。ＧＳＮＯまたはＮＡＤＨの５つの異なる濃度を、それらが、変化させる基質である場合に使用し、一定の基質として存在させる場合にはそれぞれ、１０μＭおよび１５μＭに維持した。最低でも３つの阻害剤濃度を、これらのアッセイにおいて使用し、ＮＡＤＨおよびＧＳＮＯの消費速度を、分光光学的に３４０ｎｍにおける吸光度変化を追跡することによって決定した。データは、競合的、非競合的および不競合的な阻害モデルに適合し、それらのデータについてのモデルは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４．０プログラムを使用して実施したＦ統計量に基づいて選ばれた。
【０１０６】
蛍光研究：
蛍光研究を、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５中、室温で、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２蛍光分光計（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を使用して実施した。ＧＳＮＯＲ阻害剤の平衡解離定数を、阻害剤添加時のＮＡＤＨに結合しているＧＳＮＯＲの蛍光変化を測定する（λｅｘｅ＝３５０ｎｍ；λｅｍｍ＝４５５ｎｍ）ことによって決定した。実験の間、阻害剤の量を増加させて、２μＭ  ＧＳＮＯＲおよび１．７μＭ  ＮＡＤＨを含む溶液に添加した。阻害剤を添加する毎に生じる４５５ｎｍにおける蛍光の減少を、阻害剤の最終濃度に対してプロットし、データを、式１に、非線形回帰を使用して適合させて、ＧＳＮＯＲ−ＮＡＤＨの複合体についての阻害剤の解離定数を得た。
【０１０７】
【数１】
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式１中、ΔＦは、阻害剤添加時の４５５ｎｍにおける蛍光変化である。ΔＦＭは、曲線への適合から得た最大蛍光変化である。ＥＴおよびＬＴはそれぞれ、ＧＳＮＯＲおよび阻害剤の濃度である。ＫＤは、ＧＳＮＯＲ・ＮＡＤＨ・阻害剤の複合体の形成についての平衡解離定数である。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４．０を使用して適合させた。
【０１０８】
細胞培養研究：
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する大気中、３７℃でインキュベートした。実験のために、実験の前日に、１〜２×１０６細胞を、６ウエルプレート中に蒔いた。アッセイの当日、培地を、３ｍｌの新鮮な培地で交換し、細胞を、化合物を用いて、あらかじめ決定した長さの時間にわたり処理した。インキュベーション期間後、細胞を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、プレートから２５０μｌの溶解用緩衝液（５０ｍＭ  ＮＥＭおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）中にかき集めた。細胞を、超音波処理により微小先端プローブ（３０％デューティサイクルの３パルス；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ上の出力制御２）を使用して溶解させた。細胞デブリを、遠心分離（１６，０００ｇにおいて１０分間）によってペレット化し、細胞可溶化液を、タンパク質濃度についてＢｉｏ−Ｒａｄ色素結合タンパク質アッセイを使用して解析した。細胞可溶化液中のニトロソ化合物の濃度を、三ヨウ化物に基づいた化学発光法を使用し、Ｓｉｅｖｅｒｓ２８０  ＮＯ解析装置を使用して決定した。細胞可溶化液を、１５％ｖ／ｖのスルファニルアミド溶液（０．２Ｍ  ＨＣｌ中の５％ｗ／ｖ）を用いて処理し、室温に５分間置いて、亜硝酸塩を除去した。三ヨウ化物の混合物は、以前に記載したように、新たに毎日調製し、反応槽中に６０℃で保管した。ニトロソ種の濃度を、ＧＳＮＯを使用して作成した標準曲線から求めた。細胞可溶化液中の小型サイズのニトロソ化合物の量を決定するために、５ｋＤａのカットオフのＡｍｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを、供給元の指示に従って使用した。細胞可溶化液中のｓ−ニトロソチオールの量を、細胞可溶化液をマイクロスピンカラムに最初に通し、溶出液を５ｍＭ  ＨｇＣｌ２を用いて処理してから、ニトロソ化合物濃度を、化学発光を使用して決定することによって決定した。一部の実験のためには、実験日に先立って、細胞を、化合物を用いて１６時間あらかじめ処理した。その後の実験によって、この前処理は、細胞の内部におけるニトロソ種の蓄積速度に対しては効果を示さないことが示された。
【０１０９】
ビオチンスイッチアッセイ法を使用する、ＲＡＷ２６４．７細胞中でのｓ−ニトロソチオールの蓄積の決定：
ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＤＭＥＭを含有する１０％熱不活性化血清中で培養した。細胞を、３３マイクロモルの化合物８単独を用いて、様々な長さの時間処理するか、または１ｍＭ  ＮＡＭＥと組み合わせて、４時間処理した（４＋Ｎ）。表示した時間において、細胞を消光させ、可溶化液を、ｓ−ニトロソチオール含有量について、Ｊａｆｆｒｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９６、１０５〜１１８（２００５）によって記載され、Ｗａｎｇら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４４、１３６２〜１３７２（２００８）およびＺｈａｎｇら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３８、８７４〜８８１（２００５）によって提案されている改変を加えたビオチンスイッチアッセイによって解析した。手短に述べると、約２００μｇの細胞可溶化液中の遊離のスルフィドリル（sulfydriys）を、２％ＳＤＳを含有する、１ｍｌのＨＥＮ緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭネオキュプロニン（Neocupronine）を含有する２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７）中の２０ｍＭ  ＭＭＴＳを用いて５０℃で２０分間ブロックした。遊離のＭＭＴＳを、ゲルろ過スピンカラムによって除去し、ブロックしたタンパク質を、１ｍＭビオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、３０ｍＭアスコルビン酸および２μＭ  ＣｕＣｌの存在下または非存在下で２．５時間標識した。各レーン中に、等しい量のタンパク質を添加し、ビオチン化（したがって、ｓ−ニトロシル化）の程度を、抗ビオチン抗体（ＳＩＧＭＡ）を使用して決定した。
【０１１０】
ワイヤーミオグラフィー（wire myography）：
マウスに、ジエチルエーテルを用いて麻酔を施した。開胸術を実施して、胸部大動脈および腹部大動脈を露出した。２５ゲージのシリンジを、左心室の心尖部中に挿入し、酸素化クレブス−ヘンセレイト緩衝液を用いて灌流して血液を除去した。右心房を切断して、血液の出口を設けた。大動脈を取り出し、脂肪および外膜を清浄除去した。大動脈を２ｍｍ長のセグメントに切断し、４チャネルのワイヤーミオグラフ（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に載せた。血管輪（vessel rings）を、酸素化ＰＳＳ（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）を有する１０ｍ１の臓器浴中に、３７℃でＣ維持した。輪（rings）を、各臓器浴中の緩衝液を２０分毎に交換し、８０分間平衡化させた。１グラムの前張力（以前の実験において決定された、最適な血管運動機能のための適切な出発張力）を、それぞれの大動脈輪上にかけた。８チャネル８進法ブリッジ（Ｐｏｗｅｒｌａｂ）およびデータ収集ソフトウエア（Ｃｈａｒｔ５．２．２版）を使用して、全ての力の測定値を記録した。８０分間の平衡化後、各輪に、１μＭ２７フェニレフリンを準最大に収縮させるために添加した。安定化した後、化合物８またはニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）のいずれかを輪に添加し、環の緊張（tone）を決定した。ＳＮＰおよびＡＣｈの用量応答関係を決定するために、大動脈輪を、１０−６Ｍ  ＰＥを用いてあらかじめ収縮させ、次いで、ＳＮＰまたは化合物８を、１０−９Ｍから１０−４Ｍまで濃度を増加させて添加した。実験のサブセットにおいては、Ｌ−ＮＡＭＥを、浴に添加し（最終的に５００μＭ）、３０分間インキュベートした。３０分後、化合物８を添加して、上記の記載に従って環の緊張を決定した。
【０１１１】
本新規技術を、図および前述の説明において詳細に例証し記載してきたが、これらは、例示のためのものであって、特徴を限定するとみなされるべきではなく、好ましい実施形態のみを示し、説明してきたに過ぎず、本新規技術の趣旨に属する変化形態および改変形態は全て、望ましくは保護されるべきであることを理解されたい。同様に、本新規技術を、特定の実施例、理論的な議論、説明および図面を使用して例証してきたが、これらの例証および付随する論述が、いかなる場合であっても、本新規技術を限定するものであるとみなされてはならない。本明細書において参照する全ての特許、特許出願および文献、科学論文、刊行物等の参照文献は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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