(57)【要約】  本発明は、遺伝子配列検出のためにサンプルを回収および処理して、ＤＮＡおよびＲＮＡを遊離および処置するための方法、キットならびにシステムに関する。本明細書に記載の方法は、組織および細胞材料からのＤＮＡおよびＲＮＡの迅速かつ簡便な遊離、ならびに回収を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル由来の標的核酸の回収、処理および分析のための方法であって：
（ａ）核酸を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）前記サンプルを可撓性壁構造容器に移す工程；
（ｃ）抽出液を前記容器に添加する工程；
（ｄ）前記容器において、前記サンプルを前記抽出液および１つ以上の処置試薬で処理して、前記サンプルから核酸を遊離させ、前記核酸を可溶化し、そして回収液を生成する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）由来の前記回収液または産物の一部を前記標的核酸の検出のために適切な検出システムに移す工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルは、固体材料を含み、そして前記処理工程（ｄ）は、前記容器において前記サンプルと前記抽出液および処置試薬とを混合し、そして浸軟させて、前記核酸の遊離を援助することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の処置試薬は、
界面活性剤、酵素、またはそれらの組み合わせを含む溶解試薬；
７〜７．８の範囲のｐＨを有する緩衝液；
塩化マグネシウム；および
塩化カリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルはエビ組織であり、前記核酸はエビ病原体の診断用であって、ここで、前記病原体は、白斑病ウイルス、伝染性皮下造血器壊死症ウイルス、タウラ症候群ウイルス、およびビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
サンプルを調製し、そして診断標的ＤＮＡもしくはＲＮＡを検出または同定する材料および容器を提供するキットであって、
（ａ）サンプルが処理される可撓性壁構造容器、
（ｂ）抽出液、
（ｃ）１つ以上の処置試薬、ならびに
（ｄ）前記容器において、前記サンプルを前記抽出液および処置試薬で処理することによって生成される前記回収液を収集および測定し、そして回収液を適切な検出システムに移すためのピペット
を含む、キット。
【請求項６】
前記容器は、前記容器の頂部に取り付けられた閉止部を有し、ここで、前記容器はポリプロピレンまたはポリエチレンから調製され、１〜８ミル（０．０２５〜０．２０ｍｍ）の間の厚さを有し、そして０．５〜１，０００ｍＬのサイズを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
ろ過媒体またはろ過粒子をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
標的核酸のサンプル調製および検出または同定のための診断システムであって：
（ａ）サンプルが処理される可撓性壁構造容器；
（ｂ）抽出液；
（ｃ）１つ以上の処置試薬；
（ｄ）前記容器において、前記サンプルを前記抽出液および処置試薬で処理することによって生成される前記回収液を収集および測定し、そして回収液を適切な検出システムに移すためのピペット；ならびに
（ｅ）検出媒体と、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術からなる群から選択される技術に基づく装置と、プロセッサとを含む検出システム、
を含む、診断システム。
【請求項９】
前記プロセッサは、サーモサイクラーまたはオーブンヒーターを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
標準的な非変性ゲル電気泳動、変性濃度勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、または蛍光検出である検出方法をさらに含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記検出システムはＰＣＲに基づき、そして前記検出媒体は、ＤＮＡである前記標的核酸に相補的な少なくとも１つのプライマーの組、
耐熱性ポリメラーゼ；
ヌクレオチド；
緩衝液および１つ以上の検出プローブを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記検出システムはＲＴ−ＰＣＲに基づき、そして前記検出媒体は、ＲＮＡである前記標的核酸に相補的な少なくとも１つのプライマー；
熱活性化耐熱性ポリメラーゼ；
逆転写酵素；ヌクレオチド；
緩衝液；
およびＲＮａｓｅインヒビターを含む、請求項８に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、２００８年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２８２３８号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、特定のゲノム材料（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の分析または同定（検出）の目的のために生物学的サンプル（例えば、植物および動物組織など）を収集および処理するための方法に関し、そしてさらに、方法およびそのような材料の検出を実施するためのキットならびにシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
昆虫由来の微生物、細菌およびウイルス病原体は、ヒトおよび動物の健康を脅かす有害な因子であり、そして食料生産の費用および経済的リスクを顕著に増加する。これらは、農場および水産養殖において特に当てはまり、ここで、「家畜」は、高度生産施設において増殖される。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（ここで、ＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応を意味し、そしてＲＴ−ＰＣＲは逆転写ＰＣＲを意味する）および遺伝子配列決定を介するゲノム材料によるこれらの因子の検出および同定は、現在、良好に確立されており、そしてこれらの因子の検出および制御のためのストラテジーにおいて有用であることが証明されている。しかし、水産養殖、農業、環境および臨床サンプルに含有される核酸の直接検出のためのこれらの方法の応用については、しばしば、非効率的であり、そして最も多くの場合、不可能であることが証明されている。
【０００４】
このような検出の非効率性については、多くの理由が公知である。これらには、標的核酸が、微生物の内側および宿主の組織の内側において高頻度でエントラップまたはコンパートメント化されているという事実も含まれている。このコンパートメント化は、微生物のゲノム材料（「標的核酸」）を直接検出のために利用し得ないようにすることができる。結果として、標的核酸を放出および可溶化するための方法が、検出には必要である。既知の方法では、標的核酸を、インヒビター、ならびに細胞および組織に含有される大量の宿主ＤＮＡおよびＲＮＡの両方と混合するため、標的核酸の検出が困難になる。
【０００５】
動物、海産および環境サンプルは、固体の堆積物、コロイド、エマルジョン、可溶性および不溶性の塩、生体高分子、生分解された破砕物、不活な材料ならびにサンプル中に混入した産業および天然の化学物質によってさらに複雑になる。これらのサンプルの不均一性および複雑性は、直接的な核酸検出方法を阻害または無効にし得る。色が分析または検出方法の部分である場合、サンプルの着色もまた、試験結果を妨害し得る。
【０００６】
サンプルが数コピーの標的ゲノム材料しか含有しない場合、微生物および病原体の直接検出は、多くの場合、さらに複雑になる。さらに加えて、これらのサンプルでは、標的ゲノム材料は、高い頻度で、サンプル中に存在する宿主および非標的生物の両方に由来する多数のゲノム材料と共に存在する。低い標的コピー数および高濃度のバックグランドゲノム材料インヒビターのため、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲならびにイムノアッセイのような直接検出アプローチの感度および特異性は、検出における化学的干渉および非効率性に供される。
【０００７】
これらの問題を回避するために、サンプル処置のいくつかの形態は、標的ゲノム材料の濃縮、精製および干渉材料からの除去を必要とする。ゲノムのコンパートメント化、インヒビターおよび非効率的なゲノム検出から生じる感度の消失および損なわれた特異性による不正確および誤った結果を取り除くために、多くのサンプル調製アプローチが開発されている。
【０００８】
一般的に、これらの処置プロセスは、：ｉ）標的ゲノム材料を放出するための組織破壊および細胞溶解、ｉｉ）膜または吸着材料のような固相支持体上へのゲノム材料の吸着、ｉｉｉ）混入物を含まない吸着したゲノム材料を洗浄すること、ならびにｉｖ）検出のために固相支持体からゲノム材料を放出させることに関係する。
【０００９】
上記の方法は、ゲノム材料の検出および検出のための同定に有用であることが証明されているが、それらにはなお、分析の前に、ゲノム材料を精製および単離するための多段階プロセスが必要であるという難点がある。そのようなプロセスは、支持装置および材料、（例えば、遠心分離、膜ろ過および／または化学的沈殿）の使用を伴うだけではなく、それらはまた、ゲノム材料を安定化し、そして固相支持体からのゲノム材料の放出を援助するために、毒性の化学物質および溶媒を必要とし得る。これらの方法は、分析に複雑性、コストおよび時間を追加するだけでなく、検査室において減圧または電気的装置を使用して、実施する必要があり得る。
【００１０】
結果として、研究室での吸引および電気を必要とせずにフィールド内において実施することができ、使用が迅速かつ簡単であり、非毒性の化学物質を必要とせず、そして低コストであり、そして診断的遺伝子配列に基づく病原体の迅速な検出および同定のために使用することができる、細菌およびウイルス性病原体を含む微生物のような有害な因子の検出のための方法の必要性がなお存在する。「フィールド」とは、例えば、養殖場（水産養殖および農業の両方）、食品加工および包装施設などを含むが、これらに限定されない食品の生育または生産または加工のための施設を意味する。
【００１１】
有害な微生物をモニターおよび制御し、そしてそれらが引き起こす疾患を制御するため、微生物の標的核酸の分析のために、微生物が見出されるサンプルからゲノム材料を収集、処理および回収するためのフィールドにおいて使用することができる簡単なサンプル処理技術の必要性がさらに存在する。
【００１２】
本発明はこれらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、可撓性壁構造容器、およびサンプルから核酸を収集し、そして処理するための方法、キットを含む、方法による使用に適した診断システムを提供することによって、上記の問題を取り扱い、ここで、方法は、低コストで実施することができ、使用が簡単であり、そしてフィールドにおいて使用することができる。方法は、サンプルゲノム材料の精製を要しないサンプルからの、核酸である）ゲノム材料の収集および処理を含む。方法は、動物および植物の液体または組織に含有される細菌およびウイルス病原体の低コストの迅速な現場用（フィールド内の）検出を提供するためのキットによって使用することができる。
【００１４】
本発明の目的は、標的核酸、もしくは特定の遺伝子配列の分析または同定のために、サンプルから核酸を収集および回収するための有効で、複雑ではない、迅速かつ安価な容器ならびに方法を提供することである。方法は、フィールド内における使用が可能である。核酸を放出および可溶化し、そしてそれらの検出を阻害または縮小する干渉溶質およびインヒビターからそれらを除去するための方法を提供することがさらなる目的である。上記の目的を達成するための安価なキットおよび診断システムを提供することがさらなる目的である。
【００１５】
本発明は、サンプルからの標的核酸の収集、処理および分析のための方法、キットおよびシステムを提供する。方法は、（ａ）核酸を含むサンプルを提供する工程；（ｂ）サンプルを可撓性壁構造容器に移す工程；（ｃ）容器において、サンプルを抽出液および１つ以上の処置試薬で処理して、サンプルから核酸を放出させ、核酸を可溶化し、そして回収液を生成する工程；ならびに（ｅ）工程（ｄ）由来の回収液または産物の一部を標的核酸の検出に適切な検出システムに移す工程を含む。
【００１６】
工程（ｄ）における「処理」とは、本明細書において、サンプルと抽出液および処置試薬とを混合する工程、場合により、例えば、サンプルを抽出液および処置試薬で浸軟させることによって、混合物を処置することを含むことを意味する。
【００１７】
場合により、サンプルを容器に移す前に、１つ以上の処置試薬を容器に添加してもよい。１つ以上の処置試薬は、核酸の放出および可溶化ならびに／あるいは標的核酸における遺伝子配列の以後の検出を干渉する阻害物質（「インヒビター」）の取り出しまたは不活化を援助し得る。また、可撓性壁構造容器を加熱または冷却して、インヒビターを不活性にする、および／または核酸を保存もしくは安定化してもよい。
【００１８】
場合により、可撓性壁構造容器は、工程（ｄ）の後および工程（ｅ）の前に核酸を放出および可溶化した後、サンプルろ過を容易にして、粒子を排除するためのフィルター媒体を含有してもよい。
【００１９】
適切な検出システムは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術を使用する。
【００２０】
また、サンプルを調製し、そしてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術を介して診断用標的ＤＮＡもしくはＲＮＡを検出または同定するための材料および容器を提供するキットが提供される。キットは、（ａ）サンプルが処理される可撓性壁構造容器、（ｂ）抽出液、（ｃ）１つ以上の処置試薬、ならびに（ｄ）容器においてサンプルを抽出液および処置試薬で処理することによって生成する回収液を収集および測定するため、ならびに回収液を適切な検出システムに移すためのピペットを含む。キットは、固体サンプルの粉砕を援助するための粉砕デバイス、およびろ過デバイスをさらに含んでもよい。
【００２１】
キットは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション産物の検出および同定のための１つ以上の検出試薬を含む検出媒体をさらに含んでもよい。
【００２２】
キットは、典型的に、サンプル調製および診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸の検出のためのキットの成分を使用するための方法を説明する取扱説明書をさらに含む。
【００２３】
また、サンプル調製およびサンプルに含有される標的核酸の検出または同定の両方を提供する診断システムが提供される。システムは、上記のキット、および検出システムをさらに含む。検出システムは、標的核酸が、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはｃＤＮＡ産物であるかどうかに依存する。検出システムまたはキットは、検出媒体を含み得る。検出システムは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはｃＤＮＡ産物の検出のためのプロセスを含む。検出は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術を使用して、達成することができる。検出を達成するためのプロセッサは、サーモサイクラーまたはオーブンヒーターを含む。
【００２４】
検出システムは、検出方法をさらに含む。検出方法は、標準的な非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドもしくはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、または蛍光検出から選択することができる。
【００２５】
用語および略語
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、以下の略語および定義を使用する。
【００２６】
【表１】
2011520467.tif 000002
【００２７】
定義
本明細書において使用するように、微生物という用語は、分析または検出に適切なＤＮＡもしくはＲＮＡを有する任意の細菌、ウイルス、真核または原核生物細胞を意味する。微生物は、生存していても、死んでいても、または損傷を受けていてもよく、即ち、細胞壁または細胞膜が破砕されていてもよい。特に、エビ水産養殖に関しては、病原体である特に注目すべき微生物として、白斑病ウイルス（「ＷＳＳＶ」）、伝染性皮下造血器壊死症ウイルス（「ＩＨＨＮＶ」）、タウラ症候群原因ウイルス（「ＴＳＶ」）、およびビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）（グラム陰性菌）が挙げられる。特定の病原体の診断に役立つ診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡおよび／またはそのフラグメントは公知である。例えば、国際公開第２００８／０２４２９４号パンフレット（ＷＳＳＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９３号パンフレット（ＩＨＨＮＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９２号パンフレット（ＴＳＶについて）、および国際公開第２００８／０４８６７３号パンフレット（ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）について）を参照のこと。エビおよび他の家畜の他の病原体についても、当業者に理解されるように、上記の方法、キットおよび診断システムを使用して、同様に検出することができる。
【００２８】
本明細書において使用する用語「ＤＮＡ」は、リボース糖を有する「ＲＮＡ」とは対照的に、デオキシリボース糖を含む核酸分子を指す。本明細書において使用する用語「ＤＮＡ」および「ＲＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ならびに調節機能を有する小ＲＮＡを含む、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡのすべての種を指す。「小ＲＮＡ種」は、特定の意味を有し、そして細菌においてハウスキーピングまたは調節の役割を伴う翻訳されないＲＮＡを指す。「小ＲＮＡ種」は、ｒＲＮＡでもｔＲＮＡでもない。
【００２９】
本明細書において使用する用語「インヒビター」は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの作用を傷害する能力を有する化学的または他の因子を指す。
【００３０】
本明細書において使用する用語「ＲＮａｓｅインヒビター」は、ほとんどの細菌細胞によって産生される内因性ＲＮａｓｅのようなＲＮａｓｅ酵素の作用を干渉する能力を有する化学的または他の因子を指す。分類のため、ＲＮａｓｅは、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの切断を触媒する酵素であるリボヌクレアーゼである。
【００３１】
用語「標的核酸」は、本発明の方法、キットおよび診断システムにおいてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術を使用する検出のためのＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸またはＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントを指す。標的核酸は、遺伝子配列であり得る。
【００３２】
本明細書において使用する用語「診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡ」は、それぞれ、特定の微生物、病原体または疾患の診断に役立つＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはフラグメントを指す。一般に、標的核酸は診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３３】
本明細書において使用する用語「診断用標的ＤＮＡ産物」は、診断用標的ＲＮＡから転写されるか、またはテンプレートとして診断用標的ＲＮＡの転写されたＤＮＡコピーを使用して合成されるＤＮＡ分子またはフラグメントを指す。
【００３４】
本明細書において使用する用語「逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応」、または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列のコピーである配列でＤＮＡ分子を合成および増幅するための技術を指す。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現の定量分析におけるようなＲＮＡ種の検出、ならびにクローニング、ｃＤＮＡライブラリー構築、プローブ合成、およびシグナル増幅インサイチュハイブリダイゼーションに使用するためのＲＮＡのＤＮＡコピーの産生に有用である。技術は２つの部分：逆転写（ＲＴ）によるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特異的ｃＤＮＡの増幅からなる。逆転写酵素は、テンプレートＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ分子を使用してヌクレオチドの重合を触媒するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。
【００３５】
本明細書において使用する用語「プライマー」は、相補鎖の合成がポリメラーゼによって行われる条件下に置かれる場合、テンプレート鎖に沿った核酸合成または複製の開始点として作用することが可能な合成または天然に存在するオリゴヌクレオチドを指す。逆転写に関して、プライマーは核酸からなり、そしてＲＮＡテンプレート上でプライムする。ＰＣＲに関して、プライマーは核酸からなり、そしてＤＮＡテンプレート上でプライムする。
【００３６】
本明細書において使用する用語「増幅産物」は、プライマーによって指令される増幅反応中に産生される核酸フラグメントを指す。プライマーによって指令される増幅の典型的な方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用する用語「溶解」は、細胞のＲＮＡまたはＤＮＡへのアクセスまたは放出を容易にする細胞壁の擾乱または改変を意味する。細胞壁の完全な破砕も分解も、溶解の概念に必須の要件ではない。
【００３８】
本明細書において使用する用語「溶解因子」は、細胞壁の溶解または開口に適切な任意の薬剤もしくは条件、またはそれらの薬剤もしくは条件の組み合わせを意味する。溶解因子は、酵素（例えば、リゾチーム、もしくはバクテリオファージ溶解酵素）または化学物質（例えば、クロロホルム）、界面活性剤、溶解緩衝液、熱を含み得るか、あるいは音波処理、ビーズミル、フレンチプレスなどの使用のような物理的剪断手段に関係し得る。溶解因子は、当該技術分野において周知である。
【００３９】
本明細書において使用する用語「熱サイクリング」は、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲアッセイ中に使用される変化する温度の全パターンを指す。このプロセスは、一般的であり、そして当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号明細書（Ｍｕｌｌｉｓら）および米国特許第４，６８３，１９５号明細書（Ｍｕｌｌｉｓら）を参照のこと。一般に、ＰＣＲ熱サイクリングは、高温での初期の変性工程、それに続く、温度変性を可能にするように設計された反復系列の温度サイクル、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む。
【００４０】
本明細書において使用する用語「直接検出」は、診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡの単離または精製を伴わない診断用標的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出および／または同定のためのアッセイを指す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、細菌およびウイルス病原体を含む微生物のような有害な因子を検出するための方法、ならびに方法の使用に適したキットおよびシステムを提供する。特に、本発明は、疾患の原因因子であるか、または原因因子であり得る病原体の検出に適用することができる。方法は、サンプルの精製の必要性を伴わずに、標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）の、または有害な因子の存在を表すサンプルにおける収集、処置および検出を含む。方法およびキットおよびシステムは、動物および植物組織に含有されるウイルスおよび細菌病原体の低コストの迅速な現場用（フィールド内の）検出を提供する。
【００４２】
本発明は、サンプルからの標的核酸の収集、分析または同定のための方法、キットおよびシステムを提供する。遺伝子配列は、サンプル中に存在する有害な因子を検出および同定するために使用される。方法は、（ａ）核酸を含むサンプルを提供する工程；（ｂ）サンプルを可撓性壁構造容器に移す工程；（ｃ）抽出液を容器に転化する工程；（ｄ）容器において、サンプルを抽出液および１つ以上の処置試薬で処理して、サンプルから核酸を放出させ、核酸を可溶化し、そして回収液を生成する工程；ならびに（ｅ）工程（ｄ）由来の回収液または産物の一部を標的核酸の検出に適切な検出システムに移す工程を含む。それ故、本発明の方法は、直接検出を提供する。標的核酸を精製する必要はない。
【００４３】
工程（ｄ）における「処理」とは、本明細書において、サンプルと抽出液および処置試薬とを混合することを含むことを意味する。核酸の回収は、混合の部分として容器を振盪することによって、援助され得る。処理は、サンプルを抽出液および処置試薬で浸軟させることのようなさらなる処置工程を含み得る。「浸軟」とは、サンプル中の固体を粉砕または分解して、サンプルからの核酸の放出を援助することを意味する。サンプルが生物学的組織のような固体である場合、浸軟は有用であり得る。例えば、容器の壁に外力を適用することによって、浸軟を達成してもよい。浸軟中、容器の壁を接触させて、サンプルを粉砕してもよく、または容器の壁の間で浸軟させてもよい。組織および細胞膜に含有される標的核酸を抽出液中で利用可能にして、溶解することができるように、組織および細胞膜を改変または破砕することができる。それ故、この随意的工程は、核酸の可溶化および回収を援助する。サンプルが均質な血液または血リンパのような液体である場合、粉砕は必ずしも必要ではないかもしれない。
【００４４】
処置試薬は、酵素または他の試薬を含んでもよい。処置試薬を使用して、インヒビターを処置または分解してもよい。加えて、処置試薬は、標的核酸のその後の検出後にそれらがネガティブな影響を及ぼさないように、工程（ｅ）の前に不活化してもよい。
【００４５】
工程（ｅ）では、工程（ｄ）における回収液の一部を、標的核酸の検出および／または同定に適切な検出システムに移す。適切な検出システムは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術に基づく。
【００４６】
場合により、核酸の回収は、容器中のサンプルおよび抽出液をさらにインキュベートおよび／または加熱することによって、増強することができる。インキュベーションおよび／または加熱の所望される期間は、サンプルに含有されるインヒビターの特性およびタイプに依存する。例えば、インキュベーションおよび／または加熱の程度は、インヒビターを不活化または分解するのに必要な時間および温度に依存する。また、インヒビターを不活化または分解するために使用される酵素のような処置試薬を不活性にするために、加熱を使用してもよい。
【００４７】
標的核酸の検出に好適な検出システムは、ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ、ＴＳＶおよびビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）に対する診断用プライマー配列を使用する標的核酸の増幅のために、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用し、それらは、国際公開第２００８／０２４２９４号パンフレット（ＷＳＳＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９３号パンフレット（ＩＨＨＮＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９２号パンフレット（ＴＳＶについて）、および国際公開第２００８／０４８６７３号パンフレット（ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）について）においてより詳細に記載されている。
【００４８】
本発明のキットは、サンプルを調製し、そしてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術を介して診断用標的ＤＮＡもしくはＲＮＡを検出または同定するための材料および容器を含む。キットは、（ａ）サンプルが処理される可撓性壁構造容器、（ｂ）抽出液、（ｃ）処置試薬、（ｄ）容器においてサンプルを抽出液で処理することによって調製される回収液を収集および測定するため、ならびにまた、容器の内容物を検出システムに移すためのピペットを含む。
【００４９】
サンプル、可撓性壁構造容器、抽出液および検出システムについては、以下に記載されている。ピペットは、１つの容器からもう１つの容器へ液体を移すことが可能な任意のデバイスであり得る。有用なピペットの一例は、Ｐｏｌｙ−Ｐｉｐｅｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ）より市販のような正確な容量のピペットである。
【００５０】
キットは、サンプルの粉砕を援助するための粉砕デバイス、ろ過デバイスおよび／またはろ過媒体ならびに核酸の放出および可溶化および阻害物質の取り出しまたは不活化を援助するための１つ以上の処置試薬をさらに含み得る。
【００５１】
キットは、典型的に、サンプル調製のためのキットの成分を使用する方法を説明する取扱説明書をさらに含む。
【００５２】
標的核酸の検出のためのキットは、標的およびプローブ核酸のハイブリダイゼーションのため、ならびに洗浄による所望されないおよび非ハイブリダイズ形態の取り出しのための乾燥または液体形態のいずれかの検出媒体を含み得る。キットは、単離された診断用プライマー配列から誘導される非標識核酸プローブが固定化される（またはコンジュゲートされる）固相支持体（例えば、ディップスティック、ビーズなど）を含み得る。キットは、非標識核酸プローブがハイブリダイズする同じＤＮＡ鎖の第２のおよび異なる領域に相補的である標識プローブをさらに含み得る。標識プローブはまた、本明細書において開示する単離された診断用プライマー配列から誘導してもよい。
【００５３】
キットは、検出システムと共に使用される検出媒体をさらに含み得る。検出媒体は、酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、蛍光薬剤、少なくとも１対の内部サンプルコントロールプライマー、少なくとも１つ内部テンプレートコントロールおよび少なくとも１対の内部テンプレートコントロールプライマー、ならびにキットに含有される診断用プライマー配列によって増幅することが可能な標的核酸の少なくとも１つの領域の部分に対する相補配列を含むプローブを含み得る。検出媒体は、液体、乾燥した、または錠剤のような様々な形態であり得、そしてバイアル、チューブなどのような任意の適切なコンテナまたは複数のコンテナ中に存在してもよい。
【００５４】
また、サンプル調製およびサンプルに含有される標的核酸の検出または同定の両方を提供する診断システムが提供される。システムは、上記のキット、診断用標的核酸の検出のための１つ以上の検出試薬を含む検出媒体、およびＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはｃＤＮＡ産物の検出のためのプロセッサを含む。検出を達成するためのプロセッサは、サーモサイクラーまたはオーブンヒーターを含む。
【００５５】
増幅後、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用して、増幅されたヌクレオチド配列を、適切なベクターにライゲートし、続いて、上記ベクターで適切な宿主生物体の形質転換を行うことができる。それによって、増幅配列のより容易に利用可能な供給が確実になる。あるいは、増幅後、増幅配列またはその一部を、下記のハイブリダイゼーションアッセイに使用するためのヌクレオチドプローブとしての使用のために、化学的に合成してもよい。いずれの状況においても、可変領域のＤＮＡ配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ７４：５４６３−５４６７（１９７７））のような方法を使用して、確立することができる。得られた配列は、生物体に対するプローブの選択を誘導するために使用され、そして最も適切な配列が選択される。
【００５６】
サンプル
一般的に、サンプルは、食料生産、即ち、食物または食物と接触する液体、水産養殖、農業、食料生産のための産業的プロセス、および環境から提供される。このリストは例示であり、すべてを網羅しているわけではない。養殖された家畜または水産養殖の成長に関連するサンプル由来の標的核酸の回収が特に興味深く、そして応用される。これらには、食料および飼料生産ならびに食物の処理、取り扱いおよび調製が含まれる。病原体の拡大および混入に特にかかわるサンプルは、海面養殖および食物供給に関連する。一般的に、サンプルは、水、飼料、養殖、動物組織、体液および／または生産された食物を含有する。
【００５７】
サンプルは、組織または体液を収集すること、固体または半固体サンプルを抽出すること、表面を拭き取ることによって、提供され得る。他の技術は、当業者に公知である。１つの好適な実施形態では、サンプルは、エビ組織、より詳細には、１つ以上のエビの腹肢である。エビの腹肢は、エビにおける共通の病原体を検出するために、本発明において使用することができる。より詳細には、白斑病ウイルス（ＷＳＳＶ）は、本発明の方法、キットおよび診断システムを使用して、エビ養殖場または他のエビ施設もしくは敷地のエビにおいて、検出することができる。
【００５８】
可撓性壁構造容器
可撓性収集容器は、標的核酸を、それらの検出または同定のために収集、処理および回収するために、使用される。容器は、一方の端部（頂部）において開口している小袋を形成するために密封される壁を有し、そして液密なコンテナを提供する。
【００５９】
容器の主要なおよび本質的な特徴は、壁が可撓性あることである。この可撓性は、以下の機能を提供する。
【００６０】
（ｉ）固体サンプル（例えば、生物学的組織）を壁と壁との間で粉砕することができるように、容器の壁に外力を適用することができる。それ故、標的核酸の回収は、サンプル材料の粒度を減少すること、組織構造を浸軟すること、および生物学的サンプル材料の細胞壁を破砕することによって、可能にされ、そして改善される。
【００６１】
（ｉｉ）容器の可撓性は、サンプル収集の様々な手段を提供する。例えば、外壁が内壁になるように、可撓性の容器を反転させることができる。一旦、壁を反転させると、扱い者は、反転した容器の内側に手を置いて、サンプル材料を拾い出し、次いで、容器の壁をその最初の側に戻し、そのようにして、サンプルを容器にもたらすことができる。それ故、扱い者は、扱い者の手によるサンプルへの混入を回避する。この特定の技術は、海産および農業生物体のサンプリングにおいて、有利に使用することができる。例えば、メスまたはピンセットのような他の収集援助物を使用する必要性を伴わずに、エビの腹肢を、容易に、エビから取り出し、そして容器に配置することができる。
【００６２】
（ｉｉｉ）容器の可撓性はまた、抽出液中でサンプル材料を撹拌し、そして懸濁する手段を提供する。壁に外圧を簡単に適応および解放することによって、サンプル材料を、抽出液中で撹拌および懸濁することができる。
【００６３】
本発明の方法およびキットおよびシステムにおける有用性を増強するため、方法中に、容器を可逆的に開閉することができるように、可撓性の容器は、好ましくは、容器の頂部に取り付けられた閉塞部を有する。閉塞部は、材料を収集すること、サンプルと抽出液とを混合すること、および処置試薬をサンプルに添加すること、ならびに容器の内容物の漏出および混入を防止することを含み得る方法工程を介して、サンプルおよび回収液の封入およびアクセスの両方を可能にする。様々な閉塞機構を使用することができる。細密なリブおよび溝プロファイルタイプおよびジッパーロック（ｚｉｐｐｅｒ  ｌｏｃｋ）バッグが好適である。
【００６４】
容器の壁は、多様な合成高分子および天然由来の高分子（例えば、セロファン）を使用して、調製することができる。一般的に、ポリプロピレンおよびポリエチレンが好適である。可撓性を維持し、そして適切な強度を提供するために、壁の厚さは、一般的に、１〜８ミルの間（０．０２５〜０．２０ｍｍ）であり、壁の厚さは２〜６ミル（０．５１〜０．１５ｍｍ）が好適である。限定することを求めているわけではないが、容器のサイズは、一般的に、０．５〜１，０００ｍＬの間を含有するのに十分に大きく、１〜１５ｍＬの容積が好適である。
【００６５】
抽出液
抽出液は、容器中に存在する任意の処置試薬を溶解するか、または容器に添加するため、かつサンプル中に含有される標的核酸を可溶化するために、添加される。抽出液は、サンプルを可溶化し、かつ化学的に処置して、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｄ）の回収率を増強することができる。抽出液は、核酸の検出を阻害するサンプルの成分（「インヒビター」）を不活化または分解する１つ以上の処置試薬を含み得る。
【００６６】
抽出液は液体である。抽出液は水であってもよい。抽出液は、水および１つ以上の処置試薬を含み得る。抽出液を可撓性の容器に添加して、標的核酸を溶解し、そしてサンプルから回収する。この液体は、検出媒体に移し得るため、その化学組成は、システム中の反応を含む（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、プローブハイブリダイゼーション、または遺伝子配列決定に基づく）検出システムに適合可能であり、そして干渉すべきではない。サンプルと抽出液とを混合して得られる産物を、「回収液」と称する。それ故、回収液は、サンプルから放出され、そして可溶化されている核酸を含む。
【００６７】
好適な実施形態では、回収液は、乾燥または凍結乾燥された検出試薬組成物のような１つ以上の検出試薬を含む検出媒体の単独の希釈剤として役割を果たす。この方法では、個別の検出液体を乾燥検出試薬に添加することによって、以後の工程を伴うことなく、簡単に検出を達成することができる。
【００６８】
抽出液の容積が、サンプルから効率的に標的核酸を抽出するのに十分である一方、同時に、インヒビターが検出を干渉しないように、サンプル中のインヒビターを希釈するのに十分であることもさらに要求される。一般的に、抽出液の容積は、検出反応容積の２５〜５００倍の容積の範囲であるべきである。より好ましくは、抽出液の容積は、検出反応容積の５０〜２００倍の範囲であるべきである。
【００６９】
処置試薬
キットはまた、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定、またはプローブハイブリダイゼーションのそれらの検出および同定のために、核酸を可溶化することを支援するための１つ以上の処置試薬を含み得る。２つの異なる機能を実施するために、１つ以上の処置試薬が添加される。第１に、処置試薬を添加して、サンプルから標的核酸を放出および可溶化する。処置試薬の第２の機能は、標的核酸の増幅を支持することである。
【００７０】
典型的に、２つ以上の処置試薬が添加される。例えば、第１の処置試薬は、細胞壁を破壊開口して、標的核酸にアクセスするのに十分である溶解因子を含む組成物であり得る。溶解因子は、界面活性剤、酵素、またはそれらの組み合わせであり得るか、これらを含み得る。界面活性剤は、標的核酸の可溶化を援助する界面活性剤であり得る。酵素はまた、タンパク質を沈殿させるか、またはそうでなければ、インヒビターを取り出すかもしくは不活化することによって、抽出液を支援し得る。様々な酵素および他の可溶化試薬を支持体上に固定化して、粒子のろ過に役立ててもよい。それ故、サンプルを処置し、そしてサンプルを検出システムに移す前に、処置試薬を取り出すことができる。さらなる溶解因子については、例えば、米国特許第２００５／０２６６４６８Ａ１号明細書に記載されており、その教示内容は、本明細書において参考として援用される。
【００７１】
第２の処置試薬は、７〜７．８の範囲のｐＨを有する緩衝液、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含む組成物であり得る。この組成物は、標的核酸の増幅を援助する。
【００７２】
処置試薬は、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを阻害する安定剤をさらに含み得る。
【００７３】
制限することを意図するものではないが、回収液の有用な組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２８ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）より入手可能な界面活性剤である）である。
【００７４】
サンプルおよび抽出液を添加する前に、１つ以上の処置試薬を可撓性壁構造容器に添加することができる。加えて、または代替的に、処置試薬を抽出液に添加することもできる。
【００７５】
ろ過
場合により、本発明の方法は、この液体を検出システムに添加する前に、回収液をろ過して、不要な粒子を取り出す工程を含む。回収液中の不要な粒子は、インヒビターおよび不均衡な量の標的核酸を含み得る。それ故、ろ過は、インヒビターを取り出し、そして試験の再現性を改善するのに役立ち得る。
【００７６】
ろ過は、ろ過媒体を、キット、例えば、可撓性の容器内に組み入れることによって、容易に達成することができる。方法は、可撓性の容器内のフィルターを介して、回収液を引き出す工程を含み得る。あるいは、キットは、トランスファーピペットを含み得、ここで、トランスファーピペットは、ピペット内にろ過媒体を有する。ろ過は、トランスファーピペット内のろ過媒体を介して回収液を移し、そしてろ過された液体を検出システムに移すことによって、行われる。フィルターは、回収液を検出システムに分配する前に、取り出すべきである。
【００７７】
キットはまた、吸着剤であってもよく、もしくは吸着剤でなくてもよいろ過媒体および／または粒子を含み得る。ろ過媒体および粒子はまた、容器に添加するか、または方法において使用して、インヒビターを取り出す、および／またはろ過プロセスを援助することができる。
【００７８】
ろ過媒体は、加工または非加工天然繊維および不織合成繊維を含む。サンプル適合性および湿潤性を援助するために、これらの材料を処置してもよく、または処置しなくてもよい。例えば、ワタおよびナイロンのような繊維を使用することができる。
【００７９】
ろ過粒子は、不要な材料に吸着し、そして回収液から取り出すために使用され得るか、またはろ過を援助するために使用され得る吸着剤および非吸着性の粒子を含む。吸着性および非吸着性の粒子を、ろ過媒体と組み合わせて使用してもよい。吸着剤は、１ｃｃあたり１．０ｇを超える密度を有するべきである。具体的な吸着剤として、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ珪藻土（カタログ番号１９３９−０１）、ＣＥＬＩＴＥ４／４、ＫＥＮＩＴＥ４／４  ２００、ＣＥＬＡＴＯＭ４／４  ＦＷ６、ＣＵＮＯ４／４  Ｍ−９０１、ＣＵＮＯ４／４  ｍ８０２、ＰＥＲＦＬＯ４／４  ２００、ＰＥＲＦＬＯ４／４  ６３、ＰＥＲＦＬＯ４／４  ３０、ＡＬＩＴＥ４／４  １５０、ＡＬＩＴＥ４／４  １８０、またはそれらの混合物、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ珪藻土（カタログ番号１９３９−０１）、ＣＥＬＩＴＥ４／４、ＫＥＮＩＴＥ４／４  ２００、ＣＥＬＡＴＯＭ４／４ＦＷ６、ＣＵＮＯ４／４Ｍ−９０１、ＣＵＮＯ４／４ｍ８０２、ＰＥＲＦＬＯ４／４  ２００、ＰＥＲＦＬＯ４／４  ６３、およびＰＥＲＦＬＯ４／４  ３０吸着剤が挙げられる。
【００８０】
ろ過媒体または粒子の使用量は、サンプルのサイズに依存する一方、１ｍｌの回収液あたり１０〜１７０ｍｇの吸着剤、好ましくは、１ｍｌの回収液あたり１０〜６０ｍｇが存在すべきである。
【００８１】
検出システム
検出システムは、検出するための装置、および装置と共に使用される検出媒体を含む。装置および検出媒体は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術に基づき得る。検出システムがＰＣＲを使用する場合、検出システムは、標的核酸に相補的な少なくとも１つのプライマーの組を含むプライマー混合物、耐熱性ポリメラーゼ；ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）；緩衝液および１つ以上の検出プローブを含む検出媒体を含む。検出システムがＲＴ−ＰＣＲを使用する場合、検出システムは、標的ＲＮＡに相補的な少なくとも１つのプライマーを含むプライマー混合物；熱活性化耐熱性ポリメラーゼ；逆転写酵素；ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）；緩衝液；およびＲＮａｓｅインヒビターを含む検出媒体を含む。検出システムが等温増幅を使用する場合、検出システムは、ＤＮＡポリメラーゼおよび標的核酸上の合計で異なる６つの配列を認識する４つの特別に設計されたプライマーの組を含む検出媒体を含む。検出システムが遺伝子配列決定を使用する場合、検出システムは、１つ以上のラベリングターミネーター、緩衝液および適切な酵素を含む検出媒体を含む。検出システムがプローブハイブリダイゼーションを使用する場合、検出システムは、標的核酸に有意に相補的であり、そしてそれにハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチド（合成または天然に存在する）を含む検出媒体を含む。検出システムが等温増幅を使用する場合、検出システムは、ＤＮＡポリメラーゼおよび標的核酸上の合計で異なる６つの配列を認識する４つの特別に設計されたプライマーの組を含む検出媒体を含む。
【００８２】
本発明の診断システムは、検出の方法に関して限定されず、そしてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、等温増幅、遺伝子配列決定またはプローブハイブリダイゼーション技術の産物を検出する任意の方法によって使用することができる。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが好適である。
【００８３】
一般に、ＰＣＲ熱サイクリングは、高温での初期の変性工程、それに続く、温度変性を可能にするように設計された反復系列の温度サイクル、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む。一般的に、最初に、サンプルを、約２〜１０分間、約９５℃の温度で加熱して、二本鎖ＤＮＡサンプルを変性する。次いで、各サイクルのはじめに、サンプルおよび使用する機器のタイプに依存して、サンプルを、約１０〜６０秒間、変性する。変性後、プライマーを、標的ＤＮＡに対して、より低い温度（約４０℃〜約６０℃）で、約２０〜６０秒間、アニーリングさせる。ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、しばしば、約６０℃〜約７２℃の範囲の温度で行われる。伸長に使用される時間の量は、アンプリコンのサイズおよび増幅に使用される酵素のタイプに依存し、そして日常的な実験によって容易に決定される。さらに、アニーリング工程を、伸長工程と組み合わせて、２工程のサイクリングを生じることができる。熱サイクリングはまた、ＰＣＲアッセイにおけるさらなる温度シフトを含んでもよい。任意のアッセイにおいて使用されるサイクルの回数は、日常的な実験を使用して、当業者により容易に決定することができる。場合により、最後の伸長工程を、熱サイクリングの完了後に追加して、すべての増幅産物の合成を確実にしてもよい。
【００８４】
増幅後、増幅されたヌクレオチド配列を、適切なベクターにライゲートし、続いて、上記ベクターで適切な宿主生物体の形質転換を行うことができる。それによって、増幅配列のより容易に利用可能な供給が確実になる。あるいは、増幅後、増幅配列またはその一部を、下記のハイブリダイゼーションアッセイに使用するためのヌクレオチドプローブとしての使用のために、化学的に合成してもよい。いずれの状況においても、可変領域のＤＮＡ配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７（１９７７））のような方法を使用して、確立することができる。得られた配列は、生物体に対するプローブの選択を誘導するために使用され、そして最も適切な配列が選択される。
【００８５】
ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写は、典型的に、標的ＲＮＡにハイブリダイズして、コピーＤＮＡの合成をプライムするプライマー、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ）の混合物、ＭｇＣｌ２、逆転写酵素および逆転写酵素緩衝液を含む組成物において、行われる。さらに、組成物は、場合により、ＲＮａｓｅインヒビター、例えば、イソチオシアン酸グアニジン、ピロ炭酸ジエチル、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））、ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、ブタ肝臓ＲＮａｓｅインヒビター（Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、Ａｎｔｉ−ＲＮａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、リボヌクレアーゼＩｎｈｉｂＩＩＩ（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、またはＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を含有してもよい。適切な逆転写酵素は、当該技術分野において周知であり、そしてＨＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
逆転写および増幅が、２工程として行われるかまたは１工程として行われるかにかかわらず、逆転写工程は、最初に行われ、そして典型的に、約３７℃〜約７０℃の間の温度の単一温度インキュベーションからなる。異なる温度が、異なる逆転写酵素および異なるプライマーに適切であり、当業者に公知である。
【００８７】
当該技術分野において周知である多様な検出方法が、本明細書において開示する方法において使用され得る。これらの検出方法として、標準的な非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドもしくはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、または蛍光検出が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
蛍光検出方法は、増幅産物の迅速かつ高感度の検出を提供する。蛍光検出はまた、リアルタイム検出の可能性を提供し、ここで、増幅産物の形成が、熱サイクリングプロセスの間、モニターされる。さらに、初期の標的の量を、蛍光検出を使用して、定量してもよい。熱サイクリングプロセスの前または後のいずれかに、核酸結合性蛍光薬剤を反応混合物に添加することによって、蛍光検出を行ってもよい。好ましくは、核酸結合性蛍光薬剤は、核酸の二重螺旋におけるスタックされた塩基対間の非共有結合的挿入が可能なインターカレーティング染料である。しかし、非インターカレーティング核酸結合性蛍光薬剤もまた、適切である。
【００８９】
本発明の方法において有用な核酸結合性蛍光薬剤の非制限的例には、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）より入手可能である）がある。Ｈｉｇｕｃｈｉ（米国特許第５，９９４，０５６号明細書）に記載のように、熱サイクリングの前に核酸結合性蛍光薬剤を反応混合物に添加すると、リアルタイムで増幅産物の形成をモニターすることが可能である。リアルタイムの蛍光測定が可能な熱サイクラーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような会社から市販されている。増幅後、増幅産物の確認は、当該技術分野において公知の方法を使用して産物の融解温度を決定することによって、例えば、蛍光測定を使用して融解曲線を作成することによって、評価することができる。
【００９０】
増幅産物の蛍光検出はまた、蛍光標識プローブの使用のような当該技術分野において公知の他の方法を使用して、達成してもよい。プローブは、増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。そのようなプローブの非制限的例として、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｇｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９９（３）：４３５−４４２（２００５））が挙げられる。国際公開第２００８／０２４２９２Ａ１号パンフレットの実施例９および１０に詳述されているように、例えば、ＴＳＶプライマーと共に使用される蛍光標識プローブの構築のための遺伝子配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））のような市販の分析ソフトウェアを使用するＴＳＶ遺伝子および試験アンプリコンの分析によって、選択することができる。国際公開第２００８／０２４２９４Ａ２号パンフレットの実施例１１および１２に詳述されているように、本明細書において開示するＷＳＳＶプライマーと共に使用される蛍光標識プローブの構築のための遺伝子配列は、ＷＳＳＶ遺伝子および試験アンプリコンの分析によって、選択することができる。プローブ配列は、特定の試験アンプリコンの近位末端内にあるように選択される。プローブは、ハイブリダイゼーションプローブを標識するための下記の方法のような当該技術分野において公知の方法を使用して、蛍光標識してもよい。リアルタイムの蛍光検出のために、プローブを二重標識することができる。例えば、プローブの５’末端は、６ＦＡＭＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のようなフルオロフォアによって標識することができ、そして３’末端は、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）のようなクエンチャー染料によって標識することができる。副溝結合プローブの場合、３’末端を、クエンチャー染料および副溝結合複合体によって標識することができる。蛍光標識プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのような商業的供給源から入手してもよい。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、サンプル中の標的核酸の量を定量するための方法を提供する。本実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的核酸を含有することが疑われるサンプルから提供され、そして相補的ＤＮＡが作製される。ＤＮＡは、核酸結合性蛍光薬剤または蛍光標識プローブの存在下で、少なくとも変性温度と伸長温度の間での熱サイクリングによって、本明細書において開示するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対によって、増幅される。核酸結合性蛍光薬剤または蛍光標識プローブによって生じる蛍光の量は、熱サイクリングによって測定される。蛍光測定から、核酸結合性蛍光薬剤または蛍光標識プローブによって生じる蛍光の量が、基準値より上の一定の閾値に達する閾値サイクル数が、決定される。サイクル閾値数を、本明細書において、ＣＴ数または値と称する。ＣＴ数は、手動によって決定され得るか、または機器によって自動的に決定され得る。ＣＴ数を決定するために、基準の蛍光が、初期の増幅サイクル中に、各サンプルについて決定される。次いで、数学的アルゴリズムを用いて、蛍光シグナルがバックグランドを超えるには、どんな統計的に有意な蛍光の変化が必要であるかが確立される。蛍光がこの閾値を超えるサイクル数を、ＣＴ数と称する。典型的に、熱サイクリングの開始時にサンプルに存在するＤＮＡが多いほど、閾値に到達するためにかかるサイクル数は少なくなるであろう。
【００９２】
従って、ＣＴ数は、サンプル中の標的核酸の初期量に反比例する。当該技術分野において周知であるように、サンプルのＣＴ数を決定した後、サンプル中の標的核酸について決定されたサイクル閾値数と、そのサイクル閾値数対既知濃度の標準溶液を使用して決定されたテンプレート濃度の対数の標準曲線とを比較することによって、サンプルに本来存在する標的核酸の量を計算することができる。
【００９３】
以下に、ＷＳＳＶおよびＴＳＶの標的核酸配列について説明する。本発明の方法、キットおよび診断システムを使用して、他の標的核酸配列を検出または同定することができることは、当業者によって明らかであろう。
【００９４】
配列の説明
本発明の様々な実施形態は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００９５】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００９６】
配列番号１〜８は、ＷＳＳＶの検出に有用なＷＳＳＶ診断用プライマーのヌクレオチド配列である。
【００９７】
配列番号９〜１２は、実施例の一般的方法のセクションに記載の合成ＷＳＳＶテンプレートのヌクレオチド配列である。これらの配列はまた、本明細書において開示するＷＳＳＶ診断用プライマーの対を使用して得られる増幅産物のヌクレオチド配列である。
【００９８】
配列番号１３〜１８は、ＴＳＶの検出に有用なタウラ症候群原因ウイルス（ＴＳＶ）診断用プライマーのヌクレオチド配列である。
【００９９】
配列番号１９〜２１は、実施例の一般的方法のセクションに記載の合成ＴＳＶテンプレートのヌクレオチド配列である。これらの配列はまた、本明細書において開示するＴＳＶ診断用プライマーの対を使用して得られる増幅産物のヌクレオチド配列である。
【０１００】
配列、増幅産物、および診断用プライマーについては、ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ、ＴＳＶおよびビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）に関して説明しており、それらは、国際公開第２００８／０２４２９４号パンフレット（ＷＳＳＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９３号パンフレット（ＩＨＨＮＶについて）、国際公開第２００８／０２４２９２号パンフレット（ＴＳＶについて）、および国際公開第２００８／０４８６７３号パンフレット（ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）について）においてより詳細に記載されている。
【０１０１】
一般的に、２つのプライマーは、緩衝溶液において、サンプルＤＮＡ、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ）の混合物、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと混合される。次いで、この混合物は、熱サイクラー機器を使用して熱循環されて、所望される標的領域を増幅する。熱サイクラーは、多くの供給源（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））から市販されている。
【０１０２】
ウイルスゲノム
白斑桿状ウイルス（ＷＳＢＶ）として公知の白斑病ウイルス（ＷＳＳＶ）は、高い死亡率および広い宿主域を伴う主なエビ病原体である。ＷＳＳＶの完全なゲノムが配列決定されている（ｖａｎ  Ｈｕｌｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８６：７−２２（２００１）；およびＹａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１８１１−１１８２０（２００１））。ゲノムは、３０５，１０７の塩基対（ｂｐ）および１８１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する二本鎖の環状ＤＮＡからなる（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３３２０９３）。タイ国において見いだされた、ＯＲＦ９４の複数の反復長における差異によって区別される、ＷＳＳＶの少なくとも１２の変異体が存在する（Ｗｏｎｇｔｅｅｒａｓｕｐａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．５４：２５３−２５７（２００３））。
【０１０３】
タウラ症候群原因ウイルス（ＴＳＶ）は、高い死亡率および広い宿主域を伴う主なエビ病原体である。ＴＳＶの完全なゲノムが配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２７７６７５）。ゲノムは、１０，２０５の塩基および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する一本鎖ＲＮＡからなる。
【０１０４】
ＷＳＳＶ診断用プライマー配列
本明細書では、ＷＳＳＶの高感度検出のための多様なアッセイ形式において有用な診断用プライマー配列を開示する。これらのプライマーは、ＷＳＳＶ検出のための診断に役立つＷＳＳＶゲノムの領域に指向されている。
【０１０５】
プライマー配列を、一連の「インシリカ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃａ）」での（即ち、コンピュータに基づく）配列解析ツールを使用して、実験的に同定した。このプロセスでは、すべての既知のＷＳＳＶ配列を含有するデータベースを集成した。これらの配列を、はじめにアラインし、次いで、他のＷＳＳＶ配列、指定されたおよびアンプリコン長、塩濃度、Ｔｍ（融解温度）、Ｃ＋Ｇ含有量ならびにヘアピンおよび２次構造パラメータからの自由度との相同性に基づくＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））を使用して、プライマー部位について分析した。次いで、ＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、予想されるプライマーをスクリーニングした。他の非標的遺伝子配列との相同性を５塩基未満含有することが確立されたそれらのプライマーを、ＰＣＲ増幅効率および最小のプライマーダイマー形成の実験的研究のために選択した。高い増幅効率および最小のプライマーダイマー形成の両方を示すプライマーを、様々なエビ病原体に感染したエビから単離されたＤＮＡのパネルおよび疾患を伴わないことが認定されているエビ由来のＤＮＡによる試験について、選択した。すべてのＷＳＳＶ株を増幅し、そして非ＷＳＳＶ病原体に感染したエビ由来のＤＮＡおよび疾患を伴わないことが認定されている異なる種のエビから単離されたＤＮＡの両方に対して応答を示さないプライマーを、有用なプライマーとして選択した。
【０１０６】
ＷＳＳＶの検出において有用なプライマー配列およびＷＳＳＶゲノムにおけるそれらの局在を、表１に示す。これらのプライマーは、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成したか、またはＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＬＰのような会社から購入し得る。
【０１０７】
【表２】
2011520467.tif 000003
【０１０８】
表１に列挙したＷＳＳＶプライマーの組のそれぞれのアンプリコン配列を、表２に示す。ポジティブコントロールとしての使用のために、標準的な方法を使用して、ＷＳＳＶテンプレートを合成した。合成テンプレート調製物の濃度およびコピー数を、２６０ｎｍにおける分光光度測定（ＯＤ２６０）から決定した。テンプレートを、精製水中の特定のコピー数に希釈し、そしてポジティブコントロールおよびアッセイ定量化の標準物質として使用した。表２は、テンプレート標的のゲノム局在、配列同定、および長さを示す。ＷＳＳＶ検出に有用なプライマーの配列を、配列番号１〜８に示す。
【０１０９】
【表３】
2011520467.tif 000004
【０１１０】
ＴＳＶ診断用プライマー配列
ＴＳＶの高感度検出のための多様なアッセイ形式において有用な診断用プライマー配列を表３に列挙する。これらのプライマーは、ＴＳＶ検出のための診断に役立つＴＳＶゲノムの領域に指向されている。
【０１１１】
プライマー配列を、一連の「インシリカ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃａ）」での（即ち、コンピュータに基づく）配列解析ツールを使用して、実験的に同定した。このプロセスでは、すべての既知のＴＳＶ配列を含有するデータベースを集成した。これらの配列を、はじめにアラインし、次いで、他のＴＳＶ配列、指定されたおよびアンプリコン長、塩濃度、Ｔｍ（融解温度）、Ｃ＋Ｇ含有量ならびにヘアピンおよび２次構造パラメータからの自由度との相同性に基づくＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））を使用して、プライマー部位について分析した。次いで、ＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、予想されるプライマーをスクリーニングした。他の非標的遺伝子配列との相同性を５塩基未満含有することが確立されたそれらのプライマーを、ＰＣＲ増幅効率および最小のプライマーダイマー形成の実験的研究のために選択した。高い増幅効率および最小のプライマーダイマー形成の両方を示すプライマーを、様々なエビ病原体に感染したエビから単離されたＤＮＡのパネルおよび疾患を伴わないことが認定されているエビ由来のＤＮＡによる試験について、選択した。すべてのＴＳＶ株を増幅し、そして非ＴＳＶ病原体に感染したエビ由来のＤＮＡおよび疾患を伴わないことが認定されている異なる種のエビから単離されたＤＮＡの両方に対して応答を示さないプライマーを、有用なプライマーとして選択した。
【０１１２】
ＴＳＶの検出において有用であることが見出されたプライマー配列およびＴＳＶゲノムにおけるそれらの局在を、表３に示す。これらのプライマーは、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成し得るか、またはＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＬＰのような会社から購入し得る。
【０１１３】
【表４】
2011520467.tif 000005
【０１１４】
表３に列挙したＴＳＶプライマーの組のそれぞれのアンプリコン配列を、表４に示す。ポジティブコントロールとしての使用のために、標準的な方法を使用して、ＴＳＶテンプレートを合成した。合成テンプレート調製物の濃度およびコピー数を、２６０ｎｍにおける分光光度測定（ＯＤ２６０）から決定した。テンプレートを、精製水中の特定のコピー数に希釈し、そしてポジティブコントロールおよびアッセイ定量化の標準物質として使用した。表４は、テンプレート標的のゲノム局在、配列同定、および長さを示す。ＷＳＳＶ検出に有用なプライマーの配列を、配列番号１３〜１８に示す。
【０１１５】
【表５】
2011520467.tif 000006
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、ＤＮＡ標的核酸およびＲＮＡ標的核酸の検出のためのサンプル処理方法の全体的な有用性の例示を援助する。これらの実施例は、例示のみとして示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１１７】
略語の意味は次のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈｒ」は時を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「ｎＭ」はナノモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｆｇ」はフェムトグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「ｉｎ．」はインチを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｒｘｎ」は反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ２６０」は２６０ｎｍの波長において測定された光学密度を意味し、「ＯＤ２８０」は２８０ｎｍの波長において測定された光学密度を意味し、「ＯＤ２８０／２６０」はＯＤ２８０値対ＯＤ２６０値の割合を意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「ＣＴ」は検出閾値を超える反応において蛍光を増強するサイクル数を意味し、そして「ＳＰＦ」は特定の病原体を伴わないことが認定されていることを意味する。
【０１１８】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．  Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８７により記載されている。
【０１１９】
ゲノム配列およびプライマー指定物の分析を、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）より入手可能なＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅを使用して、達成した。
【０１２０】
本明細書において使用する酵素および試薬は、以下の業者から購入した：
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：ＡｍｐｌｉＴａｑ（カタログ番号Ｎ８０８−０１６０）；
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）：デオキシヌクレオチド溶液混合物（カタログ番号Ｎ０４４７Ｓ）；
Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＬＰ：オリゴヌクレオチド；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）：４％ＡｇａｒｏｓｅＥ−ｇｅｌｓ（カタログ番号Ｇ６０１８−０２）；
Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．：ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（カタログ番号１９１３１）；およびＲＮａｓｅＡ，ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（カタログ番号１９１０１）。
【０１２１】
Ｋｉｔの要素および試薬は、次の業者から購入した：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号４３０９１５５）；およびＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；カタログ番号５１３０４）。  
【０１２２】
エビサンプル
すべてのエビＤＮＡサンプルを、Ｄｏｎａｌｄ  Ｖ．Ｌｉｇｈｔｎｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ，（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ８５７２１，ＵＳＡ．）から入手した。これらは、疾患を伴わないことが認定されているエビ（ＳＰＦ）ならびにウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ）型バキュロウイルス（ＭＢＶ）、タウラ症候群原因ウイルス（ＴＳＶ）、白斑病ウイルス（ＷＳＳＶ）、ウシエビ（Ｐ．ｍｏｎｏｄｏｎ）のイエローヘッド病原因ウイルス（ＹＨＶ）、伝染性皮下造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）および感染性筋壊死ウイルス（ＩＭＮＶ）を含有する感染したエビ由来のサンプルを含んだ。
【０１２３】
テンプレートおよびプライマー
エビ組織からのＤＮＡウイルス標的核酸の回収および検出を実証する目的のために、白斑病ウイルス（ＷＳＳＶ）ＤＮＡゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３３２０９３、Ｙａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（２３），１１８１１−１１８２０（２００１））のＤＮＡオリゴヌクレオチドゲノムの領域に対するプライマーを開発および合成し、そして標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成するか、または商業的に購入した（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＬＰ）。
【０１２４】
エビからのＲＮＡウイルス標的核酸の回収および検出を実証する目的のために、タウラ症候群原因ウイルス（ＴＳＶ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２７７６７５）；Ｍａｒｉ，Ｊ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｂ．Ｔ．，Ｌｉｇｈｔｎｅｒ，Ｄ．Ｖ．ａｎｄ  Ｂｏｎａｍｉ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３（Ｐｔ４）：９１５−９２６（２００２）のオリゴヌクレオチド配列に対するプライマーを開発および合成した。それらを、それぞれ、４７５〜５９２の塩基および４９５３〜５０７６の塩基および７３７７〜７４９５の塩基から合成した。合成ＴＳＶ標的は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成したか、または商業的に購入した（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＬＰ）。合成ＴＳＶ標的を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるポジティブコントロールおよび定量化のための標準物質として、単一反応において使用した。
【０１２５】
実施例１
本実施例は、エビサンプルの処理および異なるエビ組織におけるＷＳＳＶ標的核酸の検出のための本発明の方法ならびに容器の適用を示す。ＷＳＳＶは、中胚葉および外胚葉由来の組織／器官に感染するため、ウシエビ（Ｐ．ｍｏｎｏｄｏｎ）の多様なエビ組織を、Ｌｉｇｈｔｎｅｒ博士から入手した。組織を、ＷＳＳＶに感染したエビおよびＷＳＳＶを伴わないことが認定されているＳＰＦエビの両方から収集した。サンプルは、（ａ）血リンパ、（ｂ）腹肢、（ｃ）エラ、および（ｄ）尾筋を含んだ。同じサンプルの抽出コントロール部分を、対照サンプル抽出方法（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；カタログ番号５１３０４）で処理した。
【０１２６】
１サンプルあたりのエビ組織の処理量は、サンプル間でばらつきがあった。エビ組織では、処理したサンプルの重量は、５０〜２００ｍｇ／サンプルの範囲であった。血リンパでは、５〜５０μＬ／サンプルを処理した。
【０１２７】
各固体組織および血リンパを、可撓性の容器として使用する３ｉｎ．×３ｉｎ．（７６×７６ｍｍ）４ミル（０．１０ｍｍ）ポリプロピレンジッパーロックバッグ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂａｇ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））に添加することによって、サンプルを処理した。血リンパでは、血リンパを直接バッグに添加した。
【０１２８】
血リンパサンプルでは、粉砕を実施しなかった。腹肢、エラ、および尾筋のサンプルでは、バッグの表面に力を適用するか、またはプラスチック製コンテナの平坦な端部（１ｉｎ．×１ｉｎ．、２５ｍｍ×２５ｍｍ、直径）を使用してバッグを叩くことによって、バッグ内で組織を破砕した。破砕の動作を、約５回、約１０秒間の期間、反復した。
【０１２９】
次いで、５ミリリットルの抽出液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２８ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤）を、室温で各サンプルに添加し、そしてバッグ上のジップロックを閉鎖した。
【０１３０】
次いで、組織サンプルを混合し、そして抽出液に懸濁して、バッグを振盪するか、または反復的に絞ることによって、回収液を提供した。バッグを約５分間、静置した。この期間中、粒子が沈殿するのを観察した。
【０１３１】
検出では、バッグを開放し、そして５０μＬの回収液を、凍結乾燥したＰＣＲ試薬処方物（２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．００５μＬのＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｒ）、０．２４μｇのＢＳＡ、１．８単位ＡｍｐｌｉｔａｇＴＭ、賦形剤および１８ｐｍｏｌｅ／ｒｘｎの順方向および逆方向のＷＳＳＶプライマー（３および４）に移した。次の熱サイクリングプログラムを使用して、ＰＣＲを実施した：９５℃（５分間）の変性、３５サイクルの９５℃（３０秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃（６０秒間）、１サイクルの７２℃（６０秒間）、４℃（無期限）。次いで、試験結果を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）：４％ＡｇａｒｏｓｅＥ−ｇｅｌｓ（カタログ番号Ｇ６０１８−０２）を使用する電気泳動によって分析した。
【０１３２】
この方法によって処理した組織由来と対照サンプル抽出方法（（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；カタログ番号５１３０４）によって処理した同じ組織との検出結果の比較では、匹敵する結果が示された。ＷＳＳＶは、ウイルスを含有する各サンプルにおいて検出された。エラ組織では、いくつかのＰＣＲ阻害が検出された。それ故、本発明の方法は、白斑病ウイルス（ＷＳＳＶ）に対する従来の方法より短期間かつ簡便に、有利に使用することができる。
【０１３３】
実施例２
本実施例は、本発明の方法および容器が、検出のための標的ＲＮＡの処理および回収において効果的に使用することができることを示す。
【０１３４】
実施例１に類似の実験を、ＳＰＦコントロールエビおよびＴＳＶウイルスに感染したエビによって設定する。ＴＳＶは、中胚葉および外胚葉由来の組織／器官に感染するため、ウシエビ（Ｐ．ｍｏｎｏｄｏｎ）の多様なエビ組織を使用する。ＴＳＶサンプルは、Ｌｉｇｈｔｎｅｒ博士から入手する。組織を、ＴＳＶに感染したエビおよびＷＳＳＶを伴わないことが認定されているＳＰＦエビの両方から収集する。
【０１３５】
サンプルは、（ａ）血リンパ、（ｂ）腹肢、（ｃ）エラ、および（ｄ）尾筋を含んだ。同じサンプルの抽出コントロール部分を、対照サンプル抽出方法（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；カタログ番号５１３０４）で処理した。
【０１３６】
１サンプルあたりのエビ組織の処理量は、サンプル間でばらつきがあり得る。エビ組織のサンプルの重量は、５０〜２００ｍｇ／サンプルの範囲である。血リンパでは、５〜５０μＬ／サンプルを処理する。
【０１３７】
各固体組織および血リンパを、３ｉｎ．×３ｉｎ．（７６ｍｍ×７６ｍｍ）、４ミル（０．１０ｍｍ）ポリプロピレンジッパーロックバッグ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂａｇ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））に添加することによって、サンプルを処理する。血リンパでは、血リンパを直接バッグに添加する。粉砕は実施しない。腹肢、エラ、および尾筋では、バッグの表面に力を適用するか、またはプラスチック製コンテナの平坦な端部（１ｉｎ．、直径２５ｍｍ）を使用してバッグを叩くことによって、バッグ内で組織を破砕する。破砕の動作を、約５回、約１０秒間の期間、反復する。次いで、５ミリリットルの抽出液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２８ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を、室温で各サンプルに添加し、そしてジップロックを閉鎖することができる。組織サンプルを混合し、そしてバッグを振盪するか、または反復的に絞ることによって、回収液に懸濁することができる。バッグを約５分間、静置する。この期間中、粒子は沈殿する傾向がある。
【０１３８】
検出では、バッグを開放し、そして５０μＬの回収液を、凍結乾燥したＲＴ−ＰＣＲ試薬処方物に移す。処方物は、２５μＬのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号４３０９１５５）に、３１．３ｎＭのそれぞれの適切なＴＳＶ順方向プライマー１３および６２．５ｎＭの逆方向プライマー１４、１２．５ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、２０ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  ＲＮａｓｅインヒビターを添加することによって、調製する。
【０１３９】
次の熱サイクリングプログラムを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施する：４８℃で３０分間の初期工程、続いて、９５℃で１０分間の初期変性工程、次いで、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の温度プログラムを使用する３５サイクル。９５℃（５分間）での変性、３５サイクルの９５℃（３０秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃（６０秒間）、１サイクルの７２℃（６０秒間）、４℃（無期限）、次いで、４８℃で３０分間の初期工程、続いて、９５℃で１０分間の初期変性工程による熱サイクル、次いで、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の温度プログラムを使用する４０サイクル、ならびに７２℃（６０秒間）、４℃（無期限）の最終サイクル。
【０１４０】
次いで、試験結果を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ）：４％ＡｇａｒｏｓｅＥ−ｇｅｌｓ（カタログ番号Ｇ６０１８−０２）を使用する電気泳動によって分析することができる。
【０１４１】
ＴＳＶを示すサンプル結果の比較により、本発明の方法によって処理した組織、および対照サンプル抽出方法ＲＮｅａｓｙ繊維組織Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．カタログ番号７４７０４）によって処理した同じ組織が、ＴＳＶウイルスを含有する各サンプルにおいて匹敵する結果を示すことが示唆され得る。エラ組織では、いくつかのＰＣＲ阻害が検出される。それ故、本発明の方法は、タウラ症候群原因ウイルス（ＴＳＶ）に対する従来の方法より短期間かつ簡便に、有利に使用することができる。
【国際調査報告】
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