(57)【要約】非ラメラ形成脂質を含む新規な音響感受性薬物担持粒子およびその使用および方法が開示される。薬物担持粒子は、罹患標的組織において蓄積し、そして音響エネルギーへの曝露に際してそれらの負荷物を効率的に放出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆構造形成脂質を含む音波感受性粒状物質。
【請求項２】
逆構造形成脂質が１８個の炭素原子またはそれより長いアシル鎖を有する不飽和リン脂質である、請求項１記載の物質。
【請求項３】
前記脂質またはリン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エイコセノイル、エルコイル、またはネルボノイルである、請求項１または２記載の物質。
【請求項４】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の物質。
【請求項５】
前記物質中に少なくとも部分的に包埋されたアルコールをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の物質。
【請求項６】
アルコールが第一級アルコールである、請求項５記載の物質。
【請求項７】
アルコールまたは第一級アルコールが、ヘキサノール、ヘプタノール、またはオクタノール、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５または６記載の物質。
【請求項８】
アルコールまたは第一級アルコールがヘキサノールである、請求項５または６記載の物質。
【請求項９】
コレステロールをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の物質。
【請求項１０】
２０mol％以上のコレステロールを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の物質。
【請求項１１】
粒状物質がリポソームである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の物質。
【請求項１２】
薬物をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の物質。
【請求項１３】
症状または疾患のための医薬の製造のための請求項１〜１２のいずれか１項記載の音波感受性粒状物質の使用であって、前記医薬が音響エネルギーによって活性化または放出される、使用。
【請求項１４】
疾患または症状が、癌、免疫障害、感染症、または炎症性疾患である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
医学的使用のための請求項１〜１２記載の物質。
【請求項１６】
請求項１〜１２に記載の物質を製造するための方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２記載の物質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物における規定された容積での制御された薬物送達および放出のための非ラメラ形成両親媒性脂質を含む粒子に関する。詳細には、本発明は、音響感受性薬物担持粒子、例えばリポソーム、およびその組成物、方法および使用に関する。
【０００２】
発明の背景
標的化薬物送達の欠如は、治療対毒性比を低下させ、従って医学的治療を制限する。この制限は、細胞分裂阻害薬の全身投与が全ての分裂細胞に影響を及ぼして用量制限を強いる腫瘍学内で特に明らかである。従って、健常組織に対する無視できる毒性を有する疾患標的における治療薬物のより効率的な送達に対する明白な必要性が存在する。このチャレンジは、罹患容積への途中で健常組織を保護するシェル中に薬物をカプセル化することによってある程度適応された。そのような保護シェルは、いくつかの異なるコロイド粒子、例えばリポソームまたは他の脂質分散物、およびポリマー粒子を含み得る。しかし、そのような薬物送達粒子の開発は、２つの相反するチャレンジ：健常組織における緩慢な非特異的分解または受動的拡散を維持しながらの、罹患部位でのカプセル化薬物の効率的な放出、に直面した。現在、これは、薬物送達における主要なチャレンジを構成している（Drummond, Meyer et al. 1999）。
【０００３】
超音波（ＵＳ）は、特異的薬物放出を誘発するための方法として示唆された（Pitt, Husseini et al. 2004）。これは、循環中で、罹患容積中に蓄積しそして音響エネルギーへの曝露に際して負荷物（payload）を放出しながら、健常組織を保護する頑強な粒子の加工を可能にし得る。また、ＵＳは、細胞透過性を増加させ、従って、二重の効果：薬物担体破壊および増加した細胞内薬物取り込みを提供することが知られている（Larina, Evers et al. 2005; Larina, Evers et al. 2005）。
【０００４】
現在、４つの主要な型のＵＳ応答性粒子が知られている：ミセル、ガス充填リポソーム、マイクロバブルおよびリポソーム。ミセルは、典型的には、水溶性である１つの部分および脂溶性である１つの部分を含む分子によって形成される、非共有結合的に自己アセンブルされる粒子である。モノマー水性溶解性は、典型的には、mMの範囲にそして臨界濃度にあり；ミセルが形成され、水相から脂溶性部分を遮断する。それゆえ、ミセルの形成および破壊は、濃度によって制御される平衡プロセスであり、このことは、これらの粒子をかなり不安定にそして薬物送達のためにより適切でなくしている。さらに、限定された薬物の型がカプセル化されることができる。ガス充填リポソームおよびマイクロバブルは、高度にＵＳ応答性であるが、例えば腫瘍組織における効率的な蓄積のためには大きすぎる（約１μm）。対照的に、リポソームまたは他の脂質分散物は、広範な水溶性および脂溶性薬物をカプセル化し得、そして例えば腫瘍組織中に効率的に蓄積し得る。しかし、超音波感受性リポソームについての報告は乏しい。
【０００５】
Lin and Thomas（Lin and Thomas 2003）は、リポソーム膜がリン脂質グラフト化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−脂質）または非イオン性界面活性剤の添加によって変化させられた場合に、リポソームがＵＳに対してより応答性であることを報告している。本出願人は最近、ＵＳ感受性に関するリポソームＰＥＧ−脂質含量とリポソームサイズとの間の相乗的相互作用を同定した（ＮＯ２００７１６８８およびＮＯ２００７２８２２（参照により本明細書に組み入れる））。ここで、高いＰＥＧ−脂質含量および小さなサイズの両方を有するリポソームは、相乗的に増加したＵＳ応答性または音波感受性（sonosensitivity）および改善された薬物放出特性を示した。
【０００６】
長鎖アルコールもリン脂質二重層中に取り込まれ得る。アルコールは、水に対する親和性を有する１つの部分（ヒドロキシル基）および油性もしくは脂質性環境に対する親和性を有する別の部分（炭化水素部分）を有する。リポソーム分散物に添加された場合、いくらかのアルコール分子は水相中に残存し、一方、他はリン脂質膜中に取り込まれる。取り込みの程度は、アルコール鎖長に依存する。鎖長が長ければ長い程、多くの分子が膜内に捕捉される（Aagaad, Kristensen et al. 2006）。有機アルコールが膜を透過することができるという事実は、動物における局所および全身麻酔についての含みも有する（Lee 1976）。
【０００７】
リポソーム膜特質に対するアルコールの効果は、アルコール鎖長に依存して顕著に異なる。膜は、短鎖アルコールを含めることによって「より薄く」されることができ（Rowe and Campion 1994；Tierney, Block et al. 2005）、そして膜のゲル−液晶相転移温度は、デカノールの添加によって低下させられることができる（Thewalt and Cushley 1987）。興味深いことに、より短い鎖を有するオクタノールは、相転移温度を低下させるためさらににより効率的である。
【０００８】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は、ｐＨ感受性リポソームの１つの重要なクラスの主要な構成物である（総説については、Drummond et al, Prog Lipid Res 2000; 39(5): 409-460参照）。ｐＨ感受性リポソームは、酸性環境に曝露された場合にその負荷物を放出するように設計される。
【０００９】
本出願人によって行われた最近の研究において、リポソームドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ（登録商標））の抗腫瘍効果が、超音波と組み合わされた場合に増強され得ることが初めて示された（Myhr and Moan 2006）。しかし、リポソームドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ（登録商標）またはＤｏｘｉｌ（登録商標））は、超音波媒介薬物放出用に加工されておらずそしてインビトロにおいてかなり低い薬物放出を示す（例えば、ＷＯ２００８１２０９９８（その全体を参照により本明細書に組み入れる）参照）。
【００１０】
本発明者らは、薬物送達粒子の音波感受性が、驚くべきことに、非ラメラ形成（non-lamellar forming）脂質、より特定すると、逆構造形成（inverted structure forming）脂質（ＩＳＦ脂質）の取り込みによって改善されることを開示する。さらに驚くべきことに、ＩＳＦ脂質とアルコールとの組み合わせは、音波感受性を相乗的にさらに改善した。本発明は、局所化された疾患と戦うために、規定された組織容積中に薬物を効率的に送達するために用いられ得る。そのような粒子は受動的または能動的に標的組織中に蓄積し得、そして薬物負荷物は超音波によって組織中に投げ出され得、それにより治療対毒性比を増加させる。
【００１１】
定義
ＤＳＰＣは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリンまたは、手短に言えば、ジステアロイルホスファチジルコリンを意味する。
ＤＳＰＥは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたはジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを意味する。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧＸＸＸＸは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ（ポリエチレングリコール）−ＸＸＸＸを意味し、ここで、ＸＸＸＸは、ポリエチレングリコール部分の分子量を示す（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００）。
ＩＳＦは、本明細書において、逆構造形成を意味する。
ｎ−アルコールは、ｎ個の炭素原子を有する任意のアルコールを意味する。
ＰＣは、本明細書において任意の組成のアシル鎖を有するホスファチジルコリンを意味する。
ＰＥは、任意の組成のアシル鎖長を有するホスファチジルエタノールアミンを意味する。
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールまたはその誘導体を意味する。
ＰＥＧＸＸＸＸは、ポリエチレングリコールまたはその誘導体を意味し、ここで、ＸＸＸＸはポリエチレングリコール部分の分子量を示す。
「ＵＳ」は、本明細書において超音波を意味する。
「ＵＳ感受性」、「音波感受性」または「音響感受性（acoustically sensitive」は、本明細書において音響エネルギーへの曝露に際してその負荷物を放出する、物体（例えば粒子）の能力を意味する。
名目上の濃度は、リポソーム膜中のまたは水和媒体中の成分の初（所与の容積当たりの秤量された量）濃度を意味する。
逆構造形成脂質（ＩＳＦ脂質）は、本明細書においてＨ＜１の自然曲率（spontaneous curvature）を有する、すなわち円錐様幾何学を有する、両親媒性脂質を意味する。
【００１２】
一般規定
本明細書において言及するリン脂質、コレステロール、ＰＥＧ−脂質およびヘキサノールの濃度は、別段明記しない限り名目上の値である。
【００１３】
本開示において、単数形は、単数または複数を意味する。従って、「粒子（a particle）」は１個または数個の粒子を意味し得る。さらに、本明細書において言及する全ての範囲は終点を含み、すなわち、「１４〜１８」の範囲は１４および１８を含む。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、粒状物質中への逆構造形成（ＩＳＦ）脂質の取り込みが、該物質の音波感受性を、従って、音響エネルギーへの曝露の間にカプセル化された薬物を放出するその能力を、増強することを見出した。さらに、本発明者らは、ＩＳＦ脂質およびアルコールの組み合わせが、該脂質またはアルコール単独に比較して相乗効果を示すことを示した。これは、二重層およびミセル形成リン脂質のみを含む従来のリポソームに匹敵した。
【００１５】
従って、本発明は、ＩＳＦ脂質を含む音波感受性粒状物質に関する。
【００１６】
粒状物質は、所与の内部構造の分散物の任意の形態で配列され得る。好ましい構造の例は、六角形構造（例えばＨｅｘｏｓｏｍｅ（登録商標））、立方体構造（例えば、Ｃｕｂｏｓｏｍｅｓ（登録商標）、エマルション、マイクロエマルション、液晶粒子およびリポソームである。好ましい実施態様によれば、粒状物質は、膜構造、より好ましくはリポソームである。リポソームは、通常、水性の内側を有する脂質二重層からなる。
【００１７】
ＩＳＦ脂質は、いわゆる逆構造を自然に形成する傾向がある任意の両親媒性脂質であり得る。この脂質は、例えば、グリセロールベースのもの（例えばリン脂質）、またはスフィンゴ脂質（例えばセラミド）であり得る。脂質相の挙動は、臨界充填パラメーター（ＣＰＰ）または自然曲率（Ｈ）としても知られる、分子形状の点から理解され得る。Ｈ＞１の自然曲率を有する脂質は通常ミセルを形成し、Ｈ＝０の脂質は二重層を形成し、一方、Ｈ＜１の自然曲率を有する脂質は、例えば逆立方体、逆六角形等のような逆構造を形成する。従って、ＩＳＦ脂質は、好ましくはＨ＜１の自然曲率を有する両親媒性脂質である。典型的には、長いアシル尾部および小さな頭部を有するリン脂質は、逆構造を形成する傾向を有する。ＩＳＦ脂質は、対称または非対称アシル鎖を有し得る。好ましくは、ＩＳＦ脂質のアシル鎖の少なくとも１つは１６個の炭素原子またはそれより長く、より好ましくは該鎖の少なくとも１つは１８個の炭素原子またはそれより長く、最も好ましくはアシル鎖のいずれもが１８個の炭素原子より短くない。粒状物質は音波感受性効果を促進するために十分なＩＳＦ脂質の任意の濃度を保有し得るが、音波感受性は一般にＩＳＦ脂質含量の増加と共に増加する。従って、本発明の粒状物質は、好ましくは１０mol％より多くの、より好ましくは２０mol％より多くの、さらにより好ましくは３０mol％より多くの、さらにより好ましくは４０mol％より多くの、さらにより好ましくは５０mol％より多くの、さらにより好ましくは６０mol％より多くの、なおさらにより好ましくは７０mol％より多くのＩＳＦ脂質を含む。本発明の実施態様において、ＩＳＦ脂質濃度は４７、５２、５４．５、５８、６２、６７、７２または７７mol％である。従って、ＩＳＦ脂質濃度は、好ましくは、言及する実施態様濃度によって構成される任意の可能な範囲内にある。ＩＳＦ脂質は、好ましくはグリセロールベースの両親媒性脂質、より好ましくはリン脂質、さらにより好ましくはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）または長鎖ホスファチジルコリン（ＰＣ）、またはそれらの組み合わせである。
【００１８】
ＩＳＦ  ＰＥは、飽和または不飽和であり得；そして任意の適切な長さであり得る。対称および非対称ＩＳＦ  ＰＥの例をそれぞれ表１および２に示す。ジパルミトレオイル−、ジヘプタデカノイル−、ジステアロイル−、ジオレオイル−、ジエライドイル−、ジリノエオイル、ジリノレノイル−、ジアラキドノイル−、ドコサ−ヘキサエノイル−、１−パルミトイル−２−オレオイル−、１−パルミトイル−２−リノレオイル−、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−、１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−、１−ステアロイル−２−オレオイル−、１−ステアロイル−２−リノレオイル−、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−、または１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ホスファチジルエタノールアミン、またはそれらの任意の組み合わせのように、ＰＥの一方または両方のアシル鎖は、好ましくは１６個の炭素原子またはそれより長くあるべきである。より好ましくは、ＰＥアシル鎖の少なくとも１つは、１８個の炭素原子またはそれより長く、最も好ましくは、アシル鎖のいずもが１８個の炭素原子より短くない。また、アシル鎖の少なくとも１つが不飽和であることが好ましい。より詳細には、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、またはＳＯＰＥが好ましい。本発明の好ましい実施態様において、逆構造形成リン脂質は、ＤＳＰＥおよび／またはＤＯＰＥである。最も好ましい実施態様において、逆構造形成リン脂質は、ＤＯＰＥである。後者のＩＳＦ脂質は、驚くべきことに、高い音波感受性および安定性を示す。
【００１９】
【表１】
2011506432.tif 000002
【００２０】
【表２】
2011506432.tif 000003
【００２１】
ＩＳＦ  ＰＣのアシル鎖の少なくとも１つは好ましくは１８個の炭素原子またはそれより長くあるべきであり、より好ましくは両方のアシル鎖は１８個の炭素原子またはそれより長く、さらにより好ましくはアシル鎖の少なくとも１つは２０個の炭素原子またはそれより長い。さらに、ＩＳＦ  ＰＣアシル鎖の少なくとも１つは、好ましくは不飽和である。好ましい対称および非対称逆構造形成ＰＣの例はそれぞれ表３および４に見出される。より詳細には、エイコセノイル、エルコイル、またはネルボノイルは、単独でまたは組み合わせで、好ましいＩＳＦ  ＰＣである。
【００２２】
本発明の粒状物質は、唯一のリン脂質としてまたは他の脂質もしくはリン脂質との組み合わせで、適切なＩＳＦ  ＰＥおよび／またはＩＳＦ  ＰＣリン脂質を含み得る。本発明の好ましい実施態様において、粒状物質は、４７mol％以上のＩＳＦ  ＰＥおよび／またはＰＣ、より好ましくは５２mol％以上、さらにより好ましくは５４．５mol％以上、さらにより好ましくは５８mol％以上、さらにより好ましくは６２mol％以上、さらにより好ましくは６７mol％以上、なおさらにより好ましくは７７mol％以上のＩＳＦ  ＰＥおよび／またはＰＣ脂質を含む。一般に、より高い濃度のＩＳＦ脂質は、より高い音波感受性を生じる。
【００２３】
ＩＳＦ脂質、例えばＩＳＦ  ＰＥまたはＰＣは、頭部基が修飾される場合、特性、特に自然曲率を変化させることを理解することは重要である。例えばＰＥＧのＰＥへの結合は、それがミセルを形成する傾向があるようにし（Ｈ＞１）、そしてそれは結果として逆構造を形成するその能力を緩和させる。
【００２４】
【表３】
2011506432.tif 000004
【００２５】
【表４】
2011506432.tif 000005
【００２６】
本発明の物質は、さらにアルコールを含み得る。アルコールは、任意のアルコールであり得るが、しかし、第一級アルコールが好ましい。アルコールまたは第一級アルコールは、任意のｎ−アルコール［ここで、ｎ＝２〜２０である］；好ましくは、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、またはオクタノール、またはそれらの任意の組み合わせ；より好ましくは、ヘキサノール、ヘプタノール、またはオクタノール、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の好ましい実施態様において、アルコールまたは第一級アルコールはヘキサノールである。脂質薄膜を水和しそしてリポソームを生成させるために使用される水和液において、任意の濃度のアルコール、例えばヘキサノールを用い得る。一般に、より高いアルコールの濃度は、より高い音波感受性を生じる。従って、名目上のアルコール濃度は、少なくとも１mM、好ましくは少なくとも１０mM、より好ましくは２５mM超、より好ましくは５０mM超、さらにより好ましくは６０mM超、最も好ましくは約７５mMである。本発明者らは、濃度が５０mM〜８０mMの範囲内、より好ましくは６０mM〜７５mMの範囲内にあることを好む。本出願の実施態様において、ヘキサノール濃度は、２５、５０、６０または７５mMである。膜の音波感受性特性を調節するためにアルコールは膜中に取り込まれるべきであり；特に、アルコールのアルキル基は膜の親油性部分中に包埋されるべきである。従って、例えばポリビニルアルコールのようなアルコールでコートされた膜や、例えばラノリンアルコールおよびオクタデカノールのような乳化（emulgating）または可溶化アルコールは、本発明の重要な部分ではない。
【００２７】
音波感受性は、至適なリポソーム処方物の選択における唯一のパラメーターではない。他の重要な局面は、化学的安定性、血液安定性、血液クリアランス、体内分布、標的組織蓄積、および毒性である。最終目標はもちろん高い治療効果および／または低下した毒性である。ＩＳＦ脂質またはアルコールはこれらの局面の調節における唯一のものではなく、そして粒子の他の成分はこの点で重要であり得る。
【００２８】
例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、またはポリマーのような、血液循環時間を改善そして／または音波感受性をさらに調節するための成分が、物質中に含まれ得る。任意の適切な濃度のＰＥＧまたはその誘導体が好ましい。しかし、ＰＥＧ濃度は、好ましくは１５mol％まで、より好ましくは３〜１０mol％の範囲内、さらにより好ましくは３〜８mol％の範囲内、さらにより好ましくは５．５〜８mol％の範囲内にある。本発明の実施態様において、ＰＥＧ濃度は、３、５．５、８または１０mol％である。ＰＥＧ部分は、任意の分子量または型のものであり得るが、しかし、分子量が３５０〜５０００Daの範囲内、より好ましくは１０００〜３０００Daの範囲内にあることが好ましい。好ましい実施態様において、分子量は２０００Daである。ＰＥＧ部分は、それが粒状物質の部分を形成することを可能にする任意の分子と結合し得る。好ましくは、ＰＥＧ部分は、スフィンゴ脂質（例えばセラミド）、グリセロールベースの脂質（例えばリン脂質）、またはステロール（例えばコレステロール）、より好ましくはセラミドおよび／またはＰＥ、さらにより好ましくはＤＭＰＥ、ＤＰＰＥまたはＤＳＰＥのようなＰＥに結合される。アシル鎖長は、膜の主要なリン脂質のものと同じであるべきである。脂質グラフト化ＰＥＧは、好ましくは、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００および／またはＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００である。特に好ましい実施態様において、脂質グラフト化ＰＥＧはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００である。
【００２９】
本発明の粒状物質の音波感受性、インビトロおよびインビボ安定性、毒性、生物学的活性または任意の他の特徴をさらに調節するために、ある範囲の他の分子、例えば、脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質（例えばセラミド）、ステロール、ポリエチレングリコール、ペプチド等を物質中に含め得る。また、粒状物質のサイズを変動させ得る。
【００３０】
従って、粒状物質は、ＩＳＦ脂質に加えて、任意の脂質をさらに含み得る。好ましくは、脂質は、両親媒性脂質、例えばスフィンゴ脂質および／またはリン脂質である。好ましい実施態様において、両親媒性脂質は、任意の型または供給源のリン脂質である。リン脂質は、飽和または不飽和、またはその組み合わせであり得るが、飽和リン脂質が好ましい。典型的には、選択されるリン脂質は、１２個の炭素原子より長い、しばしば１４個の炭素原子より長い、さらにしばしば１６個の炭素原子より長いアシル鎖長を有する。好ましくは、アシル鎖長は、１４〜２４個の炭素原子の範囲内、より好ましくは１６〜２２個、さらにより好ましくは１８〜２２個の炭素原子の範囲内にある。異なる長さのアシル鎖を本発明の物質において混合し得、または全てのアシル鎖は同様なまたは同一の長さを有し得る。本発明の好ましい実施態様において、リン脂質のアシル鎖長は１８個の炭素原子である。
【００３１】
さらに、リン脂質の極性頭部は、任意の型のもの、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）であり得る。結果として、本発明の物質は、異なる極性頭部を有するリン脂質の混合物を含み得る。脂質二重層の中性リン脂質成分は、好ましくはホスファチジルコリンであり、最も好ましくは、ジアラキドリルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から選択される。脂質二重層の負に荷電したリン脂質成分は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはホスファチジルエタノールアミン化合物、好ましくはＤＰＰＧのようなホスファチジルグリセロールであり得る。本発明の好ましい実施態様において、さらなるまたは調節するリン脂質は、ＰＣ、特にＤＳＰＣである。本発明の実施態様において、ＤＳＰＣ濃度は５〜３０mol％の範囲内にある。ＰＣのレベルは、例えば血液クリアランス速度を調節するために重要である。
【００３２】
粒状物質はまたステロールを含み得、ここでステロールは、コレステロール、セコステロールまたはたはその組み合わせであり得る。セコステロールは、好ましくは、ビタミンＤまたはその誘導体、より詳細には、カルシジオールまたはカルシジオール誘導体である。
【００３３】
粒状物質はまたステロールを含み得、ここでステロールは、コレステロール、セコステロールまたはたはその組み合わせであり得る。セコステロールは、好ましくは、ビタミンＤまたはその誘導体、より詳細には、カルシジオールまたはカルシジオール誘導体である。粒状物質は、特定の粒子特性に依存して、任意の適切なステロール濃度、好ましくはコレステロールを含み得る。一般に、５０mol％のステロールは、リポソーム膜における上限濃度と考えられる。しかし、粒状物質は、好ましくは、２０mol％までのコレステロール、より好ましくは３０mol％まで、さらにより好ましくは４０mol％までのコレステロール、最も好ましくは２０〜４０mol％の範囲内を含む。本発明の好ましい実施態様において、粒状物質は、２０、２６、３０、３５または４０mol％のコレステロールを含む。従って、コレステロール濃度は、好ましくは、言及した実施態様濃度によって構成される任意の可能な範囲内にある。しかし、より高い濃度範囲が好ましい。ステロールは、治療効果を有し得、そして安定性を改善しそして血液クリアランス速度を低下させ得る。
【００３４】
本発明の粒状物質は、任意の適切なサイズのものであり得る。しかし、該物質は、好ましくは１０００nm未満、好ましくは５００nm未満、より好ましくは２００nm未満、より好ましくは１５０nm以下であるべきである。好ましい実施態様において、サイズは、５０〜２００nm、より好ましくは５０〜１５０nm、より好ましくは５０〜９５nm、さらにより好ましくは８０〜９０nmの範囲内に入る。１つの実施態様において、サイズは約８５nmまたは８５nmである。本発明者らのデータは、サイズが粒状物質の音波感受性を調節するパラメーターであり得ることを示す。より詳細には、サイズは音波感受性と正に相関するようである。従って、至適サイズ範囲は、８５nm〜１５０nmの範囲内にあると予測される。
【００３５】
さらに、本発明の粒状物質は、典型的には、任意の種類の薬物または機能性分子を含む。薬物は、目的のために適切な任意の薬物であり得る。しかし、抗細菌薬、抗炎症薬、抗癌薬、またはそれらの任意の組み合わせが好ましい。本発明の技術は特に癌の処置に適応するので、抗癌薬が好ましい。抗癌薬は、任意の化学療法薬、細胞分裂阻害薬または放射線療法薬を含む。本発明の粒状物質にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を負荷することを特に目的とし得る。
【００３６】
細胞分裂阻害薬の一般的な群は、アルキル化剤（Ｌ０１Ａ）、代謝拮抗薬（Ｌ０１Ｂ）、植物アルカロイドおよびテルペノイド（Ｌ０１Ｃ）、ビンカアルカロイド（Ｌ０１ＣＡ）、ポドフィロトキシン（Ｌ０１ＣＢ）、タキサン（Ｌ０１ＣＤ）、トポイソメラーゼ阻害剤（Ｌ０１ＣＢおよびＬ０１ＸＸ）、抗腫瘍抗生物質（Ｌ０１Ｄ）、ホルモン治療である。細胞分裂阻害薬の例は、ダウノルビシン、シスプラチン、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、メトトレキサート、シクロホスファミドおよびドキソルビシンである。
【００３７】
従って、薬物は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗有糸分裂剤、エピポドフィロトキシン、抗生物質、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、酵素、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、イミダゾテトラジン誘導体、細胞保護剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、レチノイド、治療抗体、分化剤、免疫調節剤、および血管新生阻害剤を含み得る。
【００３８】
薬物はまた、ラジウム−２２３（２２３Ｒａ）および／またはトリウム−２２７（２２７Ｔｈ）のようなα放射体またはβ放射体であり得る。前臨床および臨床研究において現在使用されている他のα放射同位体は、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）およびアクチニウム−２２５（２２５Ａｃ）を含む。
【００３９】
さらに、薬物は、抗癌ペプチド、例えばテロメラーゼもしくはテロメラーゼのフラグメント、例えばｈＴＥＲＴ；またはタンパク質、例えばモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、テトラボディ（tetrabody）、ワクシボディ（Vaccibody）、トロイボディ（Troybody）等をさらに含み得る。また、本発明の物質は、コラゲナーゼまたは他の酵素を含み得る。特に、標的組織における粒状物質の取り込みおよび分布を改善するタンパク質または分子。
【００４０】
より詳細には、粒状物質中に含まれ得る治療剤は、アバレリックス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生、ベバセイズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シナカルセット、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダウノルビシン、デニロイキンディフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンα、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲフィチニブ、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オブリメルセン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、タルセバ、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツヅマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、およびＥＬＡＣＹＴ（商標）を含む。
【００４１】
薬物は、好ましくは、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル（５−ＦＵ）；アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、またはミトキサントロン；シスプラチン、エトポシド、ビンブラスチン、マイトマイシン、ビンデシン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、カルボプラチン、イホスファミド、エストラムスチン、またはそれらの任意の組み合わせ；さらにより好ましくはドキソルビシン、メトトレキサート、５−ＦＵ、シスプラチン、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである。本発明の好ましい実施態様において、薬物は水溶性薬物である。さらにより好ましい実施態様において、薬物はドキソルビシンである。
【００４２】
さらに、本発明の粒子はまた、追跡およびモニタリングを可能にするように、例えば、ＭＲ、Ｘ線または光学イメ−ジング造影剤のような、イメ−ジング造影剤を含み得る。ＭＲおよびＸ線造影剤、ならびに蛍光および生物発光プローブの例は、文献中に見出され得る。
【００４３】
上記の任意の箇所に記載の粒状物質は、パーフルオロブタンもしくはパーフルオロプロパンガス、または任意の非溶解ガスの気泡を含み得るが、粒状物質は、典型的には、例えば５０〜１５０nm、特に１００nm以下の、小さな粒子サイズを得るように気泡を含まない。小さなサイズは、いわゆるＥＰＲＥ、およびそれにより腫瘍組織における受動的蓄積を達成するために重要である。リポソームの調製は当技術分野内で周知であり、そして本発明の粒子を調製するためにいくつかの方法を使用し得る。
【００４４】
本発明はまた、症状または疾患を処置するための医薬の製造のための上記の音波感受性粒状物質の使用を含む。
【００４５】
本発明の別の局面は、それを必要とする患者に、上記の本発明の粒状物質を投与することを含む、所定の組織容積に薬物を送達するための治療方法である。
【００４６】
さらに別の局面は、それを必要とする患者に、上記の本発明の粒状物質を投与することを含む、疾患または症状を処置するための方法である。
【００４７】
使用または方法は、音響エネルギーまたは超音波によって前記粒状物質を活性化する工程をさらに含む。従って、活性薬物は、音響エネルギーによって粒状物質から放出または投与される。こうして、患者は、標的組織への途中での薬物の潜在的毒性効果に対して保護され、そして薬物の高い局所的濃度が短時間に得られ得る。好ましくは、罹患容積のみが音響エネルギーまたは超音波に曝露されるが、全身曝露も可能である。音響エネルギーまたは超音波は、好ましくは、３MHzより低い、より好ましくは１．５MHzより低い、より好ましくは１MHzより低い、より好ましくは０．５MHzより低い、より好ましくは０．２５MHzより低い、さらにより好ましくは０．１MHzより低い周波数を有するべきである。本発明の好ましい実施態様において、周波数は、１．１７MHz、４０kHzまたは２０kHzである。しかし、収束型超音波振動子は、非収束型振動子よりも有意に高い周波数で駆動され得、そしてなお本発明の音波感受性物質からの効率的な薬物放出を誘導し得ることに留意すべきである。一般的な科学的理論に限定されるものではないが、本発明者らは、標的組織における超音波誘導性キャビテーションのレベルが、本発明の粒状物質からの薬物放出を誘導する主要な物理的因子であると考えている。音響学の当業者は、任意の周波数の超音波がいわゆる慣性（inertial）または過渡（transient）キャビテーションを誘導し得ることを知る。
【００４８】
処置しようとする疾患は、典型的には、局所化された性質のものであるが、散在性疾患も処置され得る。疾患は、腫瘍性疾患、癌、炎症状態、免疫障害、および／または感染、好ましくは局所化異型であり得る。記載した方法は、癌、特に固形腫瘍の処置に特によく適している。例えば、頭頚部、乳、子宮頸、腎臓、肝臓、卵巣、前立腺、皮膚、膵臓の癌、および肉腫のような、超音波エネルギーのために容易に利用可能な癌が好ましい。本発明の音波感受性粒子は、全ての上記の症状の処置によく適している。なぜなら、それらはそのような疾患容積に自然に蓄積するからである。
【００４９】
本発明は、上記の音波感受性粒状物質を含む組成物、および上記の音波感受性粒状物質を含む医薬組成物をさらに含む。
【００５０】
さらに、本発明は、本発明の物質を含むキットを含む。
【００５１】
本発明はまた、本発明の音波感受性粒状物質を製造するプロセスまたは方法を含む。前記方法またはプロセスは、上記の膜の、膜に包埋されたアルコール（例えばヘキサノール）以外の、成分の薄膜を産生する工程、次いで薄膜を適切な水和液で水和する工程を含む。水和液は、例えばヘキササノールのようなアルコールを含み得る。上記の方法またはプロセスは、凍結融解サイクル、続いて押出プロセスをさらに含み得る。薬物は、水和液中に含まれ得るか、またはプロセスまたは方法の終りに能動的に負荷され得る。方法またはプロセスの実施態様を、実施例の節に詳細に記載する。
【００５２】
本発明はまた、上記のプロセスまたは方法によって製造される産物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】４分までの２０kHz超音波への曝露の間のヘキサノール有り（黒丸）および無し（白四角）でのリポソーム（９０mol％ＤＳＰＥ、１０mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）からの％カルセイン放出（実施例４参照）。ヘキサノール含有リポソームは、優れた音波感受性を示す。
【図２】４分までの２０kHz超音波への曝露の間のヘキサノール有り（黒丸）および無し（白四角）でのリポソーム（５０mol％ＤＳＰＣ、１０mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、４０mol％コレステロール）からの％カルセイン放出（実施例５参照）。ヘキサノール含有リポソームは、優れた音響感受性を示す。
【図３】６分までの２０kHz超音波への曝露の間の２つの異なる主要なリン脂質（両方とも７７mol％）：ＤＳＰＣ（白丸）およびＤＳＰＥ（黒四角）を含むリポソーム（３mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、２０mol％コレステロール、５０mMヘキサノール）からの％カルセイン放出（実施例６参照）。ＤＳＰＥベースのリポソームは、優れた音波感受性を示す。
【図４】多変量解析からの回帰係数（実施例７参照）。統計的に有意な放出モジュレーター（ＵＳ６分の後）は、ＤＳＰＥおよびＤＳＰＥ*ヘキサノール相互作用（丸で囲まれた棒）である。
【図５】放出程度（ＵＳ６分の後）対ＤＳＰＥおよびヘキサノールのレベルの２Ｄ表面プロット（実施例７参照）。高レベルのヘキサノールおよびＤＳＰＥは正の相乗作用を示し、一方、低レベルのＤＳＰＥおよび高レベルのヘキサノールは負に相互作用する。
【図６】多変量解析からの回帰係数（実施例７参照）。統計的に有意な放出モジュレーター（ＵＳ０．５分の後）は、ＤＳＰＥ、リポソームサイズおよびＤＳＰＥ*ヘキサノール相互作用（丸で囲まれた棒）である。
【図７】多変量解析からの回帰係数（実施例１１参照）。統計的に有意な放出モジュレーター（ＵＳ６分の後）はＤＳＰＥ（丸で囲まれた棒）である。
【図８】放出程度（ＵＳ６分の後）対ＤＳＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のレベルの３Ｄ表面プロット（実施例１１参照）。
【図９】２０％血清におけるＤＯＰＥベースのリポソームのＵＳ媒介放出。Ｃａｅｌｙｘ（登録商標）についての放出曲線を参照として与える。
【００５４】
実施例
実施例１：蛍光薬物マーカーカルセインを含むリポソームの調製
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、Genzyme Pharmaceuticals（Liestal, Switzerland）から購入した。コレステロール、カルセイン、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ１００（１０％溶液）、アジ化ナトリウムおよびスクロースを、Sigma Aldrichから得た。ヘキサノールは、BDH Chemicals Ltd.（Poole, England）によって供給された。
【００５５】
異なる膜組成のカルセイン担持リポソーム（リポソームカルセイン）を、薄膜水和方法（Lasic 1993）を使用して調製した。名目上の脂質濃度は、１６mg/mlであった。受動的負荷（この方法は当技術分野で周知である）によってリポソームにカルセインを負荷した。水和液は、１０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および５０mMカルセインからなった。ヘキサノールを含むリポソームカルセインの調製のために、水和液に脂質薄膜水和工程における使用の２日前に所与の量のヘキサノールを補充した。
【００５６】
３回の凍結融解サイクルの後に、リポソームを、連続的なより小さなサイズのポリカーボネート（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）フィルターを通した６５℃（ＤＳＰＣリポソーム）、２３℃（ＤＯＰＥリポソーム）および６８℃（ＤＳＰＥリポソーム）での押出（Ｌｉｐｅｘ、Biomembrane Inc. Canada）によって８０〜９０nmに小型化した。
【００５７】
リポソーム外カルセインを徹底的な透析によって除去した。リポソーム分散物を含む使い捨て透析器（分子量カットオフ１０００００Ｄ）を、１０mMＨＥＰＥＳおよび０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液を含む大容積の等張性スクロース溶液中に入れることによって、透析を行った。セットアップは光から保護され、そして透析最小中の微量のカルセインが無視できるまでで透析を終了した。次いでリポソーム分散物を、さらなる使用まで、光から保護された冷蔵庫中で貯蔵した。
【００５８】
実施例２：カルセイン含有リポソームの特徴付け
リポソームを、十分に確立された方法の使用によって、粒子サイズ、ｐＨおよび浸透圧のような重要な物理化学的特性に関して特徴付けた。
【００５９】
平均粒子サイズ（強度重み付き）およびサイズ分布を、１７３°の散乱角および２５℃で光子相関分光法（ＰＣＳ）によって決定した（Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ、Malvern Instruments, Malvern, UK）。サイズ分布の幅を、多分散性指数によって規定する。試料測定の前に、ラテックス標準（６０nm）を流すことによって機器を試験した。ＰＣＳ測定のために、リポソーム分散物１０μLを、１０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む無菌ろ過した等張性スクロース溶液２mLで希釈した。二連を分析した。
【００６０】
浸透圧を、凝固点降下分析（Ｆｉｓｋｅ ２０１０ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ、Advanced Instruments, MA,US）によって非希釈リポソーム分散物について決定した。試料測定の前に、２９０mosmol／kgの浸透圧を有する参照試料を測定し；規格内でない場合、３段階較正を行った。二連のリポソーム試料を分析した。
【００６１】
実施例３：カルセイン含有リポソームについてのＵＳ媒介放出方法および定量
リポソーム試料をHuang and MacDonald（Huang and Macdonald 2004）に開示されるように注文製の試料チャンバー中で６分まで２０または４０kHz超音波に曝露した。ＵＳ動力源および変換器システムは、２つのシステム：（１）６．３５cm直径の振動子を有する「Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ」超音波プロセッサー、ＶＣ７５０、２０kHzユニットまたは（２）１９mmカップホーンプローブを有する「Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ」超音波プロセッサー、ＶＣ７５４、４０kHzユニット（両方ともSonics and Materials, Inc. （USA）から購入した）の１つであった。圧力測定を、Ｂｒｕｅｌ ａｎｄ Ｋｊａｅｒハイドロホン８１０３型を用いて行った。
【００６２】
両方のシステムを最低の可能な振幅、すなわち最大振幅の２０〜２１％で実行した。２０kHzシステムについて、これは、０．９〜１．２W/cm2の振動子入力動力および約４６０kPaのピーク−ピーク振動子圧力（peak-to-peak transducer pressure）になる。
【００６３】
ＵＳ測定のために、リポソーム分散物を、１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む等張性スクロース溶液で、１：５００容積比で希釈した。二連を分析した。
【００６４】
カルセインの放出評価は、以下の十分に確立された方法に基づく：カルセインを含むインタクトなリポソームは、カルセインの高いリポソーム内濃度（ここでは５０mM）によって引き起こされる自己消光に起因して低い蛍光強度を示す。リポソーム外相中へのカルセインの超音波媒介放出を、低下した全体消光効果に起因する蛍光強度の増加によって検出することができる。以下の式を放出定量のために使用する：
【００６５】
【数１】
2011506432.tif 000006
【００６６】
式中、ＦｂおよびＦｕはそれぞれ超音波適用の前および後のリポソームカルセイン試料の蛍光強度である。ＦＴは界面活性剤を用いる可溶化（１００％放出を模倣する）後のリポソームカルセイン試料の蛍光強度である。研究は、カルセイン含有リポソームについて、可溶化工程が、リン脂質混合物の相転移温度より高い、高温で行わなければならないことを示した。
【００６７】
蛍光測定を、光電子増倍管Ｒ３８９６（Hamamatsu, Japan）を備えた発光分光計モデルＬＳ５０Ｂ（Perkin Elmer, Norwalk, CT）または科学グレード検出器を有するＱＥ６５００分光計（Ocean Optics B.V., Duiven, The Netherlands）のいずれかを用いて行った。蛍光測定は、当業者に周知である。
【００６８】
実施例４：ヘキサノールはリポソームの音波感受性を改善する
９０mol％ＤＳＰＣおよび１０mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００から構成され、そしてヘキサノールを含むかまたは含まないかのいずれかの２つのリポソーム処方物を、実施例１に従って調製した。ヘキサノールを含むリポソームについて、カルセイン溶液（水和液）に６０mM濃度のヘキサノールを与えた。ヘキサノール含有リポソームのサイズは８２nmと測定され、一方、非ヘキサノール含有リポソームは９５nmと測定された（サイズ測定方法については実施例２参照）。リポソーム（１：５００ｖ／ｖ希釈）をＵＳチャンバーにおいて２０kHzに曝露し、そしてカルセイン放出の百分率を０．５、１、２および４分の超音波処理の後の蛍光測定によって評価した（ＵＳ放出および定量方法については実施例３参照）。図１は、ヘキサノールを含むリポソーム処方物（黒点）について、音波感受性が改善され、４分の超音波処理の後に、ヘキサノールを含まないリポソーム処方物（白四角）に比較して２０％（絶対値で）のカルセイン放出の増加を与えることを示す。
【００６９】
実施例５：ヘキサノールはコレステロール含有リポソームの音波感受性を改善する
安定なリポソーム処方物の開発は、膜にステロールを含めることをしばしば必要とする。また、リポソームサイズは、超音波感受性に影響を及ぼすことが知られている。それゆえ、音波感受性に対するヘキサノールの取り込みの効果を、５０mol％ＤＳＰＣ、１０mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００および４０mol％コレステロールからなる同様なサイズのリポソームについて評価した。前記のようにリポソームにカルセインを負荷し、そしてヘキサノールおよび非ヘキサノール含有リポソームのサイズはそれぞれ８８nmおよび８９nmと測定された。ヘキサノールを含むリポソームの調製のために、カルセイン溶液（水和液）に６０mM濃度のヘキサノールを与えた。
【００７０】
超音波実験を２０kHzで上記のように行った。結果を図２に示す。ヘキサノールのないリポソーム（白四角）に比較して、ヘキサノール含有リポソーム（黒丸）について少なくとも１５％（絶対値で）のカルセイン放出の増加が観察された。ヘキサノールの有利な効果がＵＳ０．５分の後にすでに見られた。
【００７１】
本発明者らは、コレステロールを含むリポソーム分散物中にヘキサノールを含めることが音波感受性および薬物放出特性を増加させると結論する。
【００７２】
実施例６：ＰＥはリポソームの音波感受性を改善する
ヘキサノールを含むリポソーム処方物に対するＰＥの効果を評価するために、７７mol％ＤＳＰＣまたは７７mol％ＤＳＰＥのいずれかから構成されるリポソームを調べた。両方の処方物はさらに２０mol％コレステロールおよび３mol％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなった。カルセイン溶液（水和液）は５０mMヘキサノールを含んだ。ＤＳＰＣベースのリポソームおよびＤＳＰＥベースのリポソームのサイズはそれぞれ８０nmおよび８４nmであった。超音波実験を２０kHzで行い、そしてカルセイン放出の百分率を、０．５、１、１．５、２および６分の超音波曝露の後の蛍光測定によって評価した。
【００７３】
図３は、ＤＳＰＥベースのリポソーム（黒点）について、音波感受性がＤＳＰＣベースのリポソーム（白四角）に比較して増加したことを示す。
【００７４】
本発明者らは、ＰＥを含めることがリポソームの音波感受性および薬物放出特性を増加させると結論する。
【００７５】
実施例７：ＰＥおよびヘキサノールはリポソームの音波感受性を相乗的に改善する
上記で開示したように、ＵＳに対するリポソーム感受性はヘキサノールおよび／またはＰＥ脂質を含めることによって影響される。リポソーム音波感受性に対するアルコールおよび／またはＰＥ脂質の効果をさらに調べるために、多変量研究デザインを行った。最初の研究デザインは、ＤＳＰＥおよびヘキサノールの量を異なるレベルで変動させた１１個の異なる処方物を含んだ（表５参照）。全ての処方物について、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のレベルをそれぞれ２０mol％および３mol％で一定に保った。
【００７６】
リポソームを、前記のように調製しそして分析した。放出実験を４０kHz超音波で行った。研究からの結果を表６に列挙する。
【００７７】
【表５】
2011506432.tif 000007
【００７８】
【表６】
2011506432.tif 000008
【００７９】
表６におけるデータの多変量解析は、ＤＳＰＥが主要な放出モジュレーターであり；統計的に有意な正の回帰係数によって証明されるように、ＤＳＰＥレベルが高ければ高い程、放出程度は高いことを示した（図４）。ＤＳＰＥおよびヘキサノールを高レベルで合わせた場合に至適音波感受性が達成された。このように、ＤＳＰＥとヘキサノールとの間の統計的に有意な相互作用効果が観察された（図４および５）。リポソームサイズも音波感受性に正に寄与した。サイズ効果は、短いＵＳ持続期間で統計的に有意であり；サイズが大きければ大きい程、放出程度は高い（図６）。
【００８０】
実施例８：ＰＥはリポソームの音波感受性を改善する
実施例７における研究を、ヘキサノールを含まないＤＳＰＥリポソーム処方物を含むように拡張した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびコレステロールのレベルをそれぞれ３mol％および２０mol％で一定に保持し、一方、標的サイズは８５nmであった。ＤＳＰＣはさらなるリン脂質として機能した。リポソームを調製しそして４０kHz超音波で試験した。放出データを表７に列挙する。
【００８１】
【表７】
2011506432.tif 000009
【００８２】
表６および７におけるデータの多変量解析は再び、ＤＳＰＥが音波受性に対する有意な寄与物であることを確認した。
【００８３】
実施例９：高レベルのＰＥＧはＤＳＰＥリポソームの音波感性を低下させない
実施例７および８のさらなる拡張において、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００レベルを３mol％から８mol％に増加させた。コレステロールを２０mol％に保ち、一方、ＤＳＰＥはさらなるリン脂質として機能した。放出データ（４０kHzでの）を表８に列挙する。
【００８４】
【表８】
2011506432.tif 000010
【００８５】
実施例１０：ＤＯＰＥはリポソームの音波感受性を改善する
主要な脂質としてＤＯＰＥを含む２つのリポソームカルセイン処方物を調べた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびコレステロールのレベルをそれぞれ８mol％および２０mol％で一定に保った。ＤＳＰＣはさらなるリン脂質として機能した。放出データ（４０kHzでの）を表９に与える。
【００８６】
【表９】
2011506432.tif 000011
【００８７】
データは、ＤＯＰＥベースのリポソームが、いずれものアルコールの非存在下で良好な音波感受性を有することを示す。所与のコレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＰＥのレベルについて、ＤＯＰＥリポソームは、ＤＳＰＥベースのリポソームと比較してより高い音波感受性を有する（実験２対実験１６）。
【００８８】
実施例１１：ＤＯＰＥベースのリポソームの音波感受性に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびコレステロールのレベルの効果
リポソーム音波感受性に対するコレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の効果をさらに調べるために、多変量研究デザインを行った。研究デザインは、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の量を異なるレベルで変動させた１１個の異なる処方物を含んだ（表１０参照）。
【００８９】
【表１０】
2011506432.tif 000012
【００９０】
リポソームを前記のように調製しそして分析した。放出実験を４０kHz超音波で行った。研究からの結果を表１１に列挙する。
【００９１】
【表１１】
2011506432.tif 000013
【００９２】
結果は、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のレベルの変動がＤＯＰＥベースのリポソームの音波感受性に顕著には影響を及ぼさないことを示す。
【００９３】
実施例１２：ドキソルビシン含有リポソームの調製および特徴付け
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、Genzyme Pharmaceuticals（Liestal, Switzerland）から購入した。ドキソルビシンＨＣｌを、Nycomed, Norwayから得た。コレステロール、クエン酸三ナトリウム塩、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（１０％溶液）、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、アジ化ナトリウム、およびスクロースを、Sigma Aldrichから得た。ヘキサノールは、BDH Chemicals Ltd（Poole, England）によって供給された。
【００９４】
異なる膜組成のリポソームを、薄膜水和方法（Lasic 1993）を使用して調製した。乾燥脂質薄膜を３００mM硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５、非緩衝化）または３００mMクエン酸（ｐＨ４）のいずれかを用いて水和した（表１２参照）。名目上の脂質濃度は、水和後２０mg/mlであった。ヘキサノールを含むリポソームにおいて、水和溶液に所与の量のヘキサノールを与えた。
【００９５】
水和後、リポソーム調製物を、ドライアイス／アセトン／メタノール混合物中での３回の凍結融解サイクルに供した。リポソームを、ポリカーボネート（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）フィルターを通した段階的押出（Ｌｉｐｅｘ. Biomembrane Inc. Canada）によって８０〜９０nmの小さな単ラメラ小胞に小型化した。押出の間、温度をそれぞれのリポソーム処方物についての転移温度付近で一定に保った。
【００９６】
硫酸アンモニウム勾配またはｐＨクエン酸勾配の形成を、徹底的な透析によって得た。リポソーム分散物を含む使い捨て透析器（分子量カットオフ１０００００Ｄ）を配置することによって透析を行った。大容積の等張スクロース溶液（ｐＨ５．５、非緩衝化）または等張２０mM  ＨＥＰＥＳ緩衝化ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）のいずれかに対する３回の連続的透析交換（表１２）。
【００９７】
次いで、リポソーム分散物を、所与の容積のドキソルビシンＨＣｌ溶液と混合して、１：８または１：１６の最終薬物対脂質比および１６mg／mlの最終名目上脂質濃度を得た。２３〜７５℃（膜組成に依存）での１／２〜１時間のインキュベーションの後に、リポソーム試料を室温に冷却した。％薬物負荷を、透析によってまたはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを使用することによって遊離薬物を分離した後に、蛍光測定によって決定した。負荷後に、リポソーム外相を、等張１０mM  ＨＥＰＥＳ緩衝化スクロース溶液（ｐＨ７．４）または２０mM  ＨＥＰＥＳ緩衝化ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）と交換した（表１２）。
【００９８】
【表１２】
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【００９９】
ＵＳ測定および放出定量を、下記の改変を除いて実施例３に記載のように行った：可溶化工程を周囲温度で行った。
【０１００】
種々のドキソルビシン含有リポソーム処方物についての物理化学的データおよび放出データを表１３および１４に要約する。種々のＥＰＩ  ２Ｄリポソーム処方物の多変量解析（表１３）は、ＤＳＰＥが音波感受性に対する主要な寄与物であることを確認した。正の回帰係数は、増加したＤＳＰＥレベルが放出程度を増加させることを意味する（図７）。図８は、放出程度（ＵＳ６分の後）対ＤＳＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のレベルについての応答表面プロットを示す。
【０１０１】
ＤＯＰＥベースのドキソルビシンを含むリポソームについての放出データ（表１４）は、同一の脂質組成およびサイズのカルセイン−リポソームについて得られたデータに対応する（表９）。これらのＤＯＰＥベースの処方物の非常に高い音波感受性は、超音波曝露に際してリポソーム薬物の放出を誘導するＤＯＰＥ脂質の強い非ラメラ特徴に関係すると推定される。
【０１０２】
【表１３】
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*内部相中にヘキサノールを含む
４０kHzおよび２０〜２１％振幅で行ったＵＳ研究；１：５００または１：２５０（太字）希釈を使用する。
【０１０３】
【表１４】
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【０１０４】
実施例１２．血清におけるＤＯＰＥベースのリポソームの安定性および音波感受性
ＤＯＰＥリポソーム（表１４）は、２０％血清において非常に良好な安定性を示し（１：１２５希釈）；３７℃で６時間のインキュベーションの後にドキソルビシンの漏出は検出できなかった。
【０１０５】
ＤＯＰＥベースのリポソーム（１：５００希釈率）の音波感受性はまた、２０％血清において不変であり（４０kHzで）そして商業的リポソームドキソルビシン製品（Ｃａｅｌｙｘ（登録商標）より顕著に優れている。図９参照。
【０１０６】
実施例１３．長鎖不飽和ＰＣを含むリポソームは高い音波感受性を示す
長鎖不飽和ＰＣエイコセノイル、エルコイル、またはネルボノイルを含むリポソームを産生しそして音波感受性およびインビトロ安定性について試験する。データは、上記に開示したＤＯＰＥリポソームに匹敵する音波感受性を示す。
【０１０７】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月11日(2010.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０mol％以上の逆構造形成脂質を含む音波感受性粒状物質。
【請求項２】
逆構造形成脂質が１８個の炭素原子またはそれより長いアシル鎖を有する不飽和リン脂質である、請求項１記載の物質。
【請求項３】
前記脂質またはリン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エイコセノイル、エルコイル、またはネルボノイルである、請求項１または２記載の物質。
【請求項４】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の物質。
【請求項５】
前記物質中に少なくとも部分的に包埋されたアルコールをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の物質。
【請求項６】
アルコールが第一級アルコールである、請求項５記載の物質。
【請求項７】
アルコールまたは第一級アルコールが、ヘキサノール、ヘプタノール、またはオクタノール、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５または６記載の物質。
【請求項８】
アルコールまたは第一級アルコールがヘキサノールである、請求項５または６記載の物質。
【請求項９】
コレステロールをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の物質。
【請求項１０】
２０mol％以上のコレステロールを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の物質。
【請求項１１】
粒状物質がリポソームである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の物質。
【請求項１２】
薬物をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の物質。
【請求項１３】
症状または疾患のための医薬の製造のための請求項１〜１２のいずれか１項記載の音波感受性粒状物質の使用であって、前記医薬が音響エネルギーによって活性化または放出される、使用。
【請求項１４】
疾患または症状が、癌、免疫障害、感染症、または炎症性疾患である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
医学的使用のための請求項１〜１２記載の物質。
【請求項１６】
請求項１〜１２に記載の物質を製造するための方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２記載の物質を含む医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
実施例１３．血清におけるＤＯＰＥベースのリポソームの安定性および音波感受性
ＤＯＰＥリポソーム（表１４）は、２０％血清において非常に良好な安定性を示し（１：１２５希釈）；３７℃で６時間のインキュベーションの後にドキソルビシンの漏出は検出できなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例１４．長鎖不飽和ＰＣを含むリポソームは高い音波感受性を示す
長鎖不飽和ＰＣエイコセノイル、エルコイル、またはネルボノイルを含むリポソームを産生しそして音波感受性およびインビトロ安定性について試験する。データは、上記に開示したＤＯＰＥリポソームに匹敵する音波感受性を示す。
【国際調査報告】
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