(57)【要約】  本明細書では、ヒトＶＥＧＦと特異的に結合し、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２への結合を阻害し、それにより、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する完全ヒト抗体およびその抗原結合フラグメントが開示される。本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、in vivoおよびin vitroの双方で脈管形成および脈管形成に関連する疾患を処置するために用い得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号６、配列番号７および配列番号８を含んでなる重鎖可変領域；
ｂ）配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含んでなる軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４を含んでなる軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号６、配列番号７および配列番号１５を含んでなる重鎖可変領域；
ｅ）配列番号６、配列番号７および配列番号１６を含んでなる重鎖可変領域；
ｆ）配列番号６、配列番号７および配列番号１７を含んでなる重鎖可変領域；
ｇ）配列番号６、配列番号７および配列番号１８を含んでなる重鎖可変領域；
ｈ）配列番号６、配列番号７および配列番号１９を含んでなる重鎖可変領域；
ｉ）配列番号３で示されるＸＰＡ．１０．０７２軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなる軽鎖；
ｊ）配列番号５で示されるＸＰＡ．１０．０６４軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなる軽鎖；
ｋ）配列番号２で示されるＸＰＡ．１０．０７２重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｌ）配列番号４で示されるＸＰＡ．１０．０６４重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｍ）配列番号２０で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０３重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｎ）配列番号２１で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０４重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｏ）配列番号２２で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０６重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｐ）配列番号２３で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０７重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
ｑ）配列番号２４で示されるＸＰＡ．１０．０６４．１０重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる重鎖；
からなる群から選択される１または複数のメンバーを含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ａ）配列番号２を含んでなる重鎖；
ｂ）配列番号３を含んでなる軽鎖；
ｃ）配列番号４を含んでなる重鎖；
ｄ）配列番号５を含んでなる軽鎖；
ｅ）配列番号２０を含んでなる重鎖；
ｆ）配列番号２１を含んでなる重鎖；
ｇ）配列番号２２を含んでなる重鎖；
ｈ）配列番号２３を含んでなる重鎖；および
ｉ）配列番号２４を含んでなる重鎖
からなる群から選択される１または複数のメンバーを含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＶＥＧＦと特異的に結合し、かつ、以下の特性：
ａ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のＫＤが約１０−１０Ｍ；
ｂ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋａが約１．８９×１０５；
ｃ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋｄが約１．７３×１０−５；
ｄ）ｈＶＥＧＦ１６５に対するベバシズマブの結合親和性の約４．２５高いｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性；
ｅ）約１５４ｐＭのＩＣ５０でＨＵＶＥＣ細胞増殖を阻害する；
ｆ）ベバシズマブの約５６％のＩＣ５０でＨＵＶＥＣの細胞増殖を阻害する；
ｇ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のＫＤが約１．９７×１０−１０Ｍ〜約３．４９×１０−１１Ｍに範囲；
ｈ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋａが約１．５×１０５〜約２．１６×１０５Ｍの範囲；
ｉ）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋｄが約６．６５×１０−６〜約２．９４×１０−５Ｍの範囲；
ｊ）ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を約１２９ｐＭ〜約１７４ｐＭの範囲のＩＣ５０で阻害する；
ｋ）ｈＶＥＧＦに対する結合親和性が、ｍＶＥＧＦに対する抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性よりも少なくとも約１０倍大きい；
ｉ）ｈＶＥＧＦ１６５との結合をめぐってベバシズマブと競合する；
ｍ）同じ用量またはより低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じか、またはより高い程度まで阻害する；および
ｎ）ベバシズマブと同じ用量またはより低い用量で投与した際に、ベバシズマブよりも長い時間、腫瘍成長を特定の大きさに遅延させる；
の１または複数を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ａ）配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ａ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ａ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ａ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、完全ヒト抗体、標識抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ｄｓＦｖ、  （ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
免疫グロブリン定常領域をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン定常領域がκ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖定常領域である、請求項１２の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ベバシズマブの２倍低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じ程度またはより高い程度まで阻害する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ベバシズマブの３倍低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じ程度またはより高い程度まで阻害する、請求項１４の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ベバシズマブの４倍低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じ程度またはより高い程度まで阻害する、請求項１５の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ベバシズマブの５倍低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じ程度またはより高い程度まで阻害する、請求項１６の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
ベバシズマブと同じ用量またはより低い用量で投与した際にベバシズマブの持続時間の少なくとも２倍の間、腫瘍成長を特定の大きさに阻害する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
ベバシズマブと同じ用量またはより低い用量で投与した際にベバシズマブの持続時間の少なくとも３倍の間、腫瘍成長を特定の大きさに阻害する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
ヒトＶＥＧＦ１６５と≦２００ｐＭのＫＤで結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
ベバシズマブにより結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複する、ヒトＶＥＧＦ１６５上のエピトープと結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ヒトＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２との結合をブロックする、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
ヒトＶＥＧＦ１６５と、ネズミＶＥＧＦ１６５との結合に関する抗体または抗原結合フラグメントのＫＤが数値において少なくとも１０倍低いＫＤで結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
ヒトＶＥＧＦ１６５と、ネズミＶＥＧＦ１６５との結合に関する抗体または抗原結合フラグメントのＫＤが数値において少なくとも５０倍低いＫＤで結合する、請求項２３の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
ヒトＶＥＧＦ１６５と、ネズミＶＥＧＦ１６５との結合に関する抗体または抗原結合フラグメントのＫＤが数値において少なくとも１００倍低いＫＤで結合する、請求項２４の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと１または複数の生理学上許容される成分とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２７】
前記１または複数の生理学上許容される成分が１または複数の薬学上許容される担体を含んでなる、請求項２６の医薬組成物。
【請求項２８】
前記１または複数の生理学上許容される成分が１または複数の抗酸化剤を含んでなる、請求項２７の医薬組成物。
【請求項２９】
前記１または複数の抗酸化剤がメチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルから選択される、請求項２８の医薬組成物。
【請求項３０】
１または複数の付加的化学療法薬と結合された、または組み合わされた請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物。
【請求項３１】
前記付加的化学療法薬がエベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ  ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、プラゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ  ７４４、ＯＮ  ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ  ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ  １１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ−１  モジュレーター、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント−１または２阻害剤、接着斑キナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、ＶＥＧＦ捕捉抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサチニブ、デカタニブ(decatanib)、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキセド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、ゴシポール酢酸、Ｂｉｏ  １１１、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ  １４０、ＣＣ  ８４９０、シレンジチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ  １００１、ＩＰｄＲ、ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ  ３１７６１５、ノイラジアブ(neuradiab)、ビテスパン(vitespan)、Ｒｔａ  ７４４、Ｓｄｘ  １０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ  ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、ＣＧ−７８１、ＣＧ−１５２１、ＳＢ−５５６６２９、クラミドシン、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロマイド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；  ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−、二ナトリウム塩、七水和物、カンプトテシン、イリノテカン；イリノテカンと５−フルオロウラシルとロイコボリンの組合せ、ＰＥＧ標識イリノテカン、ＦＯＬＦＯＸレジメン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ヒトＩＧＦ１Ｒと特異的に結合する単離抗体、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８、３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、パモ酸トリプトレリン、スニチニブ、リンゴ酸スニチニブ、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ(lapatanib)、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、エルビタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファーニブ；アミフォスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、スベロイルアナリドヒドロキサム酸(suberoyl analide hydroxamic acid)、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレライド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、デキサメタゾンと組み合わせたサリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−シス−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプトプリン(6-mecaptopurine)、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シミチジン(cimitidine)、トラスツズマブ、デニロイキン、ディフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテジミブ(bortezimib)、パクリタキセル、クレモフォール不含パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＢ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ  １８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、５−フルオロウラシル、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メゲストロール、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン(ibritgumomab tiuxetan)、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エジトロネート(editronate)、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、Ｅｄｗｉｎａ−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンαおよびダルベポエチンα、
【化１】
2011500086.tif 000157
【化２】
2011500086.tif 000158
【化３】
2011500086.tif 000159
【化４】
2011500086.tif 000160
【化５】
2011500086.tif 000161
【化６】
2011500086.tif 000162
【化７】
2011500086.tif 000163
からなる群から選択される、請求項３０の組成物。
【請求項３２】
ヒトＶＥＧＦまたはヒトＶＥＧＦのフラグメントと結合された請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる複合体。
【請求項３３】
配列番号２〜５および２０〜２４からなる群から選択される１または複数のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド
【請求項３４】
請求項３３のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３４のポリヌクレオチドを含んでなる単離されたベクター。
【請求項３６】
請求項３５のベクターを含んでなる単離された宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３６の単離された宿主細胞を請求項３４のポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む、配列番号２〜５および２０〜２４からなる群から選択される１または複数のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現させる方法。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドがＣＭＶプロモーターと作動可能なように連結され、前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
それを必要とする哺乳類対象において脈管形成を阻害する方法であって、該対象に、所望により１または複数の付加的化学療法薬と結合された、または組み合わされた治療上有効な量の請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項４０】
それを必要とする哺乳類対象において異常な脈管形成に関連する疾患を処置する方法であって、該対象に、所望により１または複数の付加的化学療法薬と結合された、または組み合わされた治療上有効な量の請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法
【請求項４１】
それを必要とする哺乳類対象においてＶＥＧＦシグナル伝達に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、該対象に、所望により１または複数の付加的化学療法薬と結合された、または組み合わされた治療上有効な量の請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記疾患が関節リウマチ、乾癬、硬皮症、慢性閉塞性肺疾患および喘息からなる群から選択される、請求項４１の方法。
【請求項４３】
それを必要とする哺乳類対象において湿潤型急性黄斑変性または糖尿病性網膜症を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法
【請求項４４】
それを必要とする哺乳類対象において増強されたＶＥＧＦシグナル伝達に関連する癌を処置する方法であって、該対象に、所望により１または複数の付加的化学療法薬と結合された、または組み合わされた治療上有効な量の請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法
【請求項４５】
前記癌が癌腫、芽細胞腫、肉腫、生殖細胞腫瘍、白血病、リンパ腫もしくは多発性骨髄腫などの血液またはリンパ系の悪性疾患、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌もしくは肺の扁平上皮癌などの肺癌、腹膜癌、肝細胞癌腫／肝細胞腫などの肝臓癌、胃腸癌などの胃癌、膵臓癌、膠芽腫／多形性膠芽腫、非膠芽腫脳腫瘍もしくは髄膜腫などの脳腫瘍、脳室上衣細胞腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫もしくは乏突起星状細胞腫などの混合神経膠腫などの神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝芽細胞腫、肝細胞癌腫／肝細胞腫もしくは肝臓癌腫などの肝臓癌、尿路上皮癌などの膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓のラブドイド腫瘍などの腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、陰茎癌、肛門扁平上皮癌などの肛門癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌などの頭頸部癌、黒色腫もしくは扁平上皮癌などの皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、繊維肉腫、カポジ肉腫などの軟組織肉腫、カルチノイド癌、網膜芽細胞腫などの眼癌、中皮腫、急性リンパ性／リンパ芽球性白血病などのリンパ性／リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性／リンパ性白血病、急性骨髄性／骨髄芽球性白血病（肥満細胞白血病を含む）、慢性骨髄性／骨髄球性／骨髄芽球性白血病、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄単球性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉腫、セザリー徴候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、肥満細胞新生物、髄芽細胞腫、腎芽細胞腫、孤立性形質細胞腫、骨髄異形成徴候群、慢性および非慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系腫瘍、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、脳室上衣細胞腫、脈絡膜叢乳頭腫、真性赤血球増加症、血小板血症、ならびに特発性骨髄繊維症からなる群から選択される、請求項４４の方法
【請求項４６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと該抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する説明書を含んでなるキット。
【請求項４７】
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２００７年１０月２２日に出願された米国仮出願第６０／９８１，８０８号および２００８年４月１８日に出願された米国仮出願第６１／０４６，３７０号の優先権を主張するものである。これらの出願の開示は、図面を含め、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【背景技術】
【０００２】
背景
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、特に網膜増殖性疾患および腫瘍形成中の内皮細胞の活性化、増殖および生存に関与する脈管形成タンパク質の主要なファミリーである。ＶＥＧＦはＶＥＧＦ−ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）スーパー遺伝子ファミリーに属し、血管およびリンパ内皮細胞で発現される受容体と結合する小型の糖タンパク質二量体である。現在、ＶＥＧＦファミリーには、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ（ウイルス由来）ならびに胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）−１および−２という７つの既知リガンドがある。これらのＶＥＧＦリガンドは、それぞれが受容体チロシンキナーゼ活性を有する３つの既知のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）の１または複数と結合することによってそれらの効果を媒介する。ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）は主として内皮細胞および単球で発現され、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂと結合し、内皮および単球の遊走を媒介する。ＶＥＧＦ−Ｒ２（すなわち、ヒトＫＤＲまたはネズミＦｌｋ−１）は主として内皮細胞で発現され、ＶＥＧＦ（特にＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄのフラグメント）に対して選択性があり、ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の増殖、生存および遊走、ならびに血管の透過性を媒介する。ＶＥＧＦ−Ｒ３（Ｆｌｔ−４）は主としてリンパ内皮細胞で発現され、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄと結合してリンパ脈管形成を促進する。ＶＥＧＦ−Ｒ１、−Ｒ２および−Ｒ３はそれぞれいくつかの腫瘍細胞で発現される。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合は受容体の二量体形成を誘発し、続いて、受容体の活性化およびシグナル伝達をもたらす。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｒ２との結合は脈管形成の促進に有力なシグナル伝達経路を誘発する。この経路は受容体の活性化を含み、続いて細胞内シグナル伝達の誘導伴う。この場合の受容体の活性化は、（ｉ）ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｒ２との結合、（ｉｉ）受容体の二量体形成、および（ｉｉｉ）受容体チロシンキナーゼの受容体自己リン酸化（従って、活性化）を伴う。ホスホリパーゼＣおよびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼなどの細胞内メッセンジャーは自己リン酸化型のＶＥＧＦ−Ｒ２に直接結合し、受容体チロシンキナーゼによりリン酸化されるようになり、次いで、シグナル伝達事象の細胞内カスケードを誘発し、最終的に細胞の増殖、遊走および生存（抗アポトーシス）を誘発し、血管の透過性を増す核シグナルをもたらす。
【０００３】
異常な脈管形成が、癌を含む様々な病態に関連している(Holash 2002)。ＶＥＧＦシグナル伝達は、正常な血管発達と種々の疾患に関連する病的な脈管形成の双方に役割を果たすことが証明されている(Erikkson 1999; Ferrara 1999; Yancopoulos 2000)。ＶＥＧＦは血管内皮細胞の増殖を促進し、血管の透過性を増す(Ferrara 2004)。
【０００４】
これまでの研究では、大多数の腫瘍種における高いＶＥＧＦ発現レベルが明らかにされている(Berkman 1993; Brown 1993; Brown 1995; Dvorak 1995; Mattern 1996)。また、湿潤型ＡＭＤなどの眼の脈管形成性疾患を有する患者における高いＶＥＧＦレベルを明らかにした研究もある。湿潤型ＡＭＤは全ＡＭＤ症例の１０％前後を占めるに過ぎないが、ＡＭＤから生じる失明のおよそ９０％を引き起こす。湿潤型ＡＭＤは、網膜の網膜色素上皮層直下の異常な血管の発生である脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）を特徴とする。ＶＥＧＦ−Ａは、黄斑の下に漏出し、網膜の変形や視力低下を引き起こすこれらの血管の形成に主要な役割を果たしていると考えられる。
【０００５】
治療用抗ＶＥＧＦ抗体が現在利用可能である。例えば、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体ベバシズマブ（Genentech， San Francisco， CAにより販売されているａ．ｋ．ａ．、アバスチン(Avastin)（登録商標）、ＢＭ−１とも呼ばれる）はヒトＶＥＧＦと、およそ５００ｐＭの親和性（ＫＤ）で結合する。ベバシズマブは様々な癌の処置に用いられているが、当技術分野ではより大きなin vivo有効性を有する抗体の必要がある。このような抗体は大きな技術的挑戦を呈し、単にＶＥＧＦ抗体の結合親和性を高めることが必ずしもそのin vivo有効性を高めないので、極めてとらえどころがない(Liang 2006)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Holash， J.， et al. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99:11393-11398
【非特許文献２】Erikkson， U.， Alitalo， K. 1999. Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57
【非特許文献３】Ferrara， N. 1999. Curr Top Microbiol Immunol 237:1-30
【非特許文献４】Yancopoulos， G.D.， et al. 2000. Nature (London) 407:242-248
【非特許文献５】Ferrara， N.， et al. 2004. Nat Rev Drug Discov 3:391-395
【非特許文献６】Berkman， R.A.， et al. 1993. J Clin Invest 91:153-159
【非特許文献７】Brown， L.F.， et al. 1993. Cancer Res 53:4727-4735
【非特許文献８】Brown， L.F.， et al. 1995. Human Pathol 26:86-91
【非特許文献９】Dvorak， H.F.， et al. 1995. Am J Pathol 146:1029-1039
【非特許文献１０】Mattern， J.， Koomaqi， R.， Volm， M. 1996. Brit J Cancer 73:931-934
【非特許文献１１】Liang， W-C， et al. 2006. J Biol Chem 281:951-961
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
概要
本願は、優れた有効性を有するＶＥＧＦ抗体の必要に取り組む。本明細書では、治療用抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに癌などの身体症状を処置するための組成物および使用方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある特定の実施形態では、ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２、ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０のＨＣＤＲ３からなる群から選択されるＨＣＤＲ３領域を含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＸＰＡ．１０．０６４またはＸＰＡ．１０．０７２のＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２をさらに含んでなる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、ＸＰＡ．１０．０７２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４．０３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４．０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４．０６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ＸＰＡ．１０．０６４．０７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；および／またはＸＰＡ．１０．０６４．１０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＸＰＡ．１０．０７２、ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７またはＸＰＡ．１０．０６４．１０の重鎖を含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＸＰＡ．１０．０６４またはＸＰＡ．１０．０７２の軽鎖を含んでなる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、重鎖可変領域は、配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列の１または複数をさらに含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域をさらに含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは配列番号５または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、この抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列をさらに含んでなり、これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、この抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列をさらに含んでなり、これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、この抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列をさらに含んでなり、これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００１４】
ある特定の実施形態では、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、この抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列をさらに含んでなり、これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１または複数を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、この抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列をさらに含んでなり、これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦと特異的に結合し、かつ、以下の特性：１）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のＫＤが約１０−１０Ｍ；２）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋａが約１．８９×１０５；３）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋｄが約１．７３×１０−５；４）ｈＶＥＧＦ１６５に対するベバシズマブの結合親和性の約４．２５高いｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性；５）約１５４ｐＭのＩＣ５０でＨＵＶＥＣ細胞増殖を阻害する；６）ベバシズマブの約５６％のＩＣ５０でＨＵＶＥＣの細胞増殖を阻害する；７）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のＫＤが約１．９７×１０−１０Ｍ〜約３．４９×１０−１１Ｍに範囲；８）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋａが約１．５×１０５〜約２．１６×１０５Ｍの範囲；９）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋｄが約６．６５×１０−６〜約２．９４×１０−５Ｍの範囲；１０）ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を約１２９ｐＭ〜約１７４ｐＭの範囲のＩＣ５０で阻害する；１１）ｈＶＥＧＦに対する結合親和性が、ｍＶＥＧＦに対する抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性よりも少なくとも約１０倍大きい；１２）ｈＶＥＧＦ１６５との結合をめぐってベバシズマブと競合する；１３）同じ用量またはより低い用量で投与した際に、腫瘍成長を腫瘍成長阻害率％の関数としてベバシズマブと同じか、またはより高い程度まで阻害する；および１４）ベバシズマブと同じ用量またはより低い用量で投与した際に、ベバシズマブよりも長い時間、腫瘍成長を特定の大きさに遅延させる、の１または複数を有する抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、配列番号８、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体と同じ、ｈＶＥＧＦ１６５上のエピトープと結合する抗体または抗原結合フラグメントが提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５上の、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる抗体と同じエピトープと結合する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５と≦２００ｐＭのＫＤで結合する。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５と≦１５０ｐＭ、他の実施形態では≦１００ｐＭ、さらに他の実施形態では≦５０ｐＭのＫＤで結合する。ある特定の実施形態では、本明細書において、ベバシズマブにより結合されるエピトープとと少なくとも部分的に重複する、ｈＶＥＧＦ１６５上のエピトープと結合する抗体または抗原結合フラグメントが提供される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本明細書において、ｈＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ受容体（ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２である）との結合をブロックする抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５により誘導される、ＶＥＧＦ受容体のリン酸化を阻害する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、それがｍＶＥＧＦ１６５と結合するＫＤよりも少なくとも１０倍大きいＫＤ（すなわち、少なくとも１０倍大きい親和性、数値において少なくとも１０倍低いこと意味する）でｈＶＥＧＦ１６５と結合する。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、それがｍＶＥＧＦ１６５と結合するＫＤよりも少なくとも５０倍大きい、ある特定の実施形態では少なくとも１００倍大きいＫＤでｈＶＥＧＦ１６５と結合する。
【００１９】
上記の実施形態のある特定のものでは、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、κ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖定常領域を含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２定常領域を含んでなる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は完全抗体である。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、標識抗体、二価抗体、抗イディオタイプ抗体または完全ヒト抗体であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ｄｓＦｖ、  （ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体であり得る。
【００２０】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象において脈管形成を阻害するための方法であって、該対象に治療上有効な量の本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを投与することをによる方法が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき１ｍｇ／ｋｇ以下他の実施形態では０．５ｍｇ／ｋｇ以下、さらに他の実施形態では０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１日に１回〜２か月おきに１回の間隔で複数回対象に投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、１週間に約１回、２週間おきに約１回、１か月に約１回、または２か月おきに約１回投与され得る。
【００２１】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳類対象）において異常な脈管形成に関連する疾患を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む方法が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき１ｍｇ／ｋｇ以下他の実施形態では０．５ｍｇ／ｋｇ以下、さらに他の実施形態では０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１日に１回〜２か月おきに１回の間隔で複数回対象に投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、１週間に約１回、２週間おきに約１回、１か月に約１回、または２か月おきに約１回投与され得る。
【００２２】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳類対象）においてＶＥＧＦシグナル伝達に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む方法が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦシグナル伝達に関連する疾患は関節リウマチ、乾癬、硬皮症、慢性閉塞性肺疾患または喘息である。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき１ｍｇ／ｋｇ以下、他の実施形態では０．５ｍｇ／ｋｇ以下、さらに他の実施形態では０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１日に１回〜２か月おきに１回の間隔で複数回対象に投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、１週間に約１回、２週間おきに約１回、１か月に約１回、または２か月おきに約１回投与され得る。
【００２３】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳類対象）において湿潤型急性黄斑変性または糖尿病性網膜症を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む方法が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき１ｍｇ／ｋｇ以下、他の実施形態では０．５ｍｇ／ｋｇ以下、さらに他の実施形態では０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１日に１回〜２か月おきに１回の間隔で複数回対象に投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、１週間に約１回、２週間おきに約１回、１か月に約１回、または２か月おきに約１回投与され得る。
【００２４】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳類対象）において増強されたＶＥＧＦシグナル伝達に関連する癌を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む方法が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、毒素、サイトカインまたは化学療法薬のいずれかであるコンジュゲートをさらに含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１または複数の化学療法薬と組み合わせられて、または結合されて投与される。ある特定の実施形態では、外科的腫瘍摘出または抗癌放射線療法などの１または複数の付加的治療手法を受けている。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、投与につき１ｍｇ／ｋｇ以下、他の実施形態では０．５ｍｇ／ｋｇ以下、さらに他の実施形態では０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、１日に１回〜２か月おきに１回の間隔で複数回対象に投与される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、１週間に約１回、２週間おきに約１回、１か月に約１回、または２か月おきに約１回投与され得る。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを含んでなるキットが提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。ある特定の実施形態では、キットは、抗体または抗原結合フラグメントの使用および／またはキットの他の成分の利用に関するをさらに含んでなる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、配列番号２〜２４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の他の実施形態では、これらのポリヌクレオチドを含んでなるベクターが提供され、ある特定の他の実施形態では、これらのベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを発現させる方法であって、これらの宿主細胞を、抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドをベクターから発現させる条件下で培養することによる方法が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ベクター内で、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターと作動可能なように連結されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターを含んでなる宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物が提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、該組成物は１または複数の生理学上許容される成分をさらに含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、１または複数の生理学上許容される成分は１または複数の薬学上許容される担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤または無毒の補助物質であり得る。これらの実施形態のある特定のものでは、１または複数の生理学上許容される成分は、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルから選択され得る１または複数の抗酸化剤を含んでなってよい。同様に、ある特定の実施形態では、１または複数の抗酸化剤を用いて本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントの酸化を阻害する、かつ／またはそのＶＥＧＦ結合親和性の減退を防ぐ方法が提供される。ある特定の実施形態では、該組成物に用いるための抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２１、２３または２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、異常な脈管形成に関連する疾患、異常な脈管形成に関連する炎症性疾患、ＶＥＧＦシグナル伝達に関連する炎症性疾患、湿潤型急性黄斑変性、糖尿病性網膜症または増強されたＶＥＧＦシグナル伝達に関連する癌を処置するための薬剤の製造における、本明細書で提供される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、異常な脈管形成に関連する疾患、異常な脈管形成に関連する炎症性疾患、ＶＥＧＦシグナル伝達に関連する炎症性疾患、湿潤型急性黄斑変性、糖尿病性網膜症またはＶＥＧＦシグナル伝達に関連する癌（例えば、非癌性細胞に比べて増強されたＶＥＧＦシグナル伝達を示す癌）の処置において用いるために提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の重鎖可変領域（ＨＣＤＲを含む）および軽鎖可変領域（ＬＣＤＲを含む）。
【図２】ｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。
【図３】ｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。
【図４】ｈＶＥＧＦ１６５に対するベバシズマブ結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。
【図５】ベバシズマブ（ＢＭ１）、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２による、ＶＥＧＦ−Ｒ１に対するｈＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図６】ベバシズマブ（ＢＭ１）、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２による、ＶＥＧＦ−Ｒ２に対するｈＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図７】ベバシズマブ（ＢＭ１）、ＸＰＡ．１０．０６４（０６４）およびＸＰＡ．１０．０７２（０７２）により結合されるｈＶＥＧＦ１６５エピトープの分析。
【図８】ＸＰＡ．１０．０６４とＧ１５３−６９４の同時局在。パネルＡはＸＰＡ．１０．０６４による染色を示す。パネルＢはＧ１５３−６９４による染色を示す。パネルＣは核色素による染色を示す。パネルＤはマージ画像を示し、強度が強いもの（白）が同時局在を表す。
【図９】ＸＰＡ．１０．０７２およびＧ１５３−６９４の同時局在。パネルＡはＸＰＡ．１０．０７２による染色を示す。パネルＢはＧ１５３−６９４による染色を示す。パネルＣは核色素による染色を示す。パネルＤはマージ画像を示し、強度が強いもの（白）が同時局在を表す。
【図１０】（Ａ）ＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２および（Ｂ）ＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【００３１】
【図１１】ＨＵＶＥＣの用量漸増ｈＶＥＧＦ１６５による処置はＶＥＧＦ−Ｒ２のリン酸化の増加をもたらす。
【図１２】ＨＵＶＥＣの用量漸増ｈＶＥＧＦ１６５およびベバシズマブによる処置はＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化の減少をもたらした。
【図１３】ＸＰＡ．１０．０６４（０６４）およびＸＰＡ．１０．０７２（０７２）ＩｇＧ２はｈＶＥＧＦ１６５により誘導されるＶＥＧＦ−Ｒ２のリン酸化を阻害する。
【図１４】マトリゲル（登録商標）プラグのビジュアルスコアリングシステム。スコア０〜３のそれぞれの例を示す。
【図１５】種々の用量のベバシズマブ（ＢＭ−１）、ＸＰＡ．１０．０６４（０６４）およびＸＰＡ．１０．０７２（０７２）の存在下での脈管形成阻害レベルを示すマトリゲル（登録商標）プラグアッセイ。
【図１６】マトリゲル（登録商標）プラグアッセイにより測定される脈管形成の阻害。数値は２人の盲検スコアラーからの結果の平均である。（Ａ）細胞無し；（Ｂ）ＤＵ１４５とαＫＬＨ；（Ｃ）ベバシズマブ（０．１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｄ）ベバシズマブ（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｅ）ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）；（Ｆ）ＸＰＡ．１０．０６４（０．１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｇ）ＸＰＡ．１０．０６４（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｈ）ＸＰＡ．１０．０６４（５ｍｇ／ｋｇ）；（Ｉ）ＸＰＡ．１０．０７２（０．１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｊ）ＸＰＡ．１０．０７２（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｋ）ＸＰＡ．１０．０７２（５ｍｇ／ｋｇ）。
【図１７】ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．０７２によるin vivoにおけるＡ６７３腫瘍成長の阻害。（１）ビヒクルのみ；（２）０．５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２；（３）５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２；（４）０．５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２；（５）５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２；（６）５ｍｇ／ｋｇ  ＣＨＯ．ＫＬＨ  ＩｇＧ２；（７）０．５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（８）５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ。
【図１８】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図１９】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのＸＰＡ．１０．０６４．０３  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図２０】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【００３２】
【図２１】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのＸＰＡ．１０．０６４．０７  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図２２】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのＸＰＡ．１０．０６４．１０  ＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図２３】４つの独立したアッセイ（＃１〜４）でのベバシズマブＩｇＧ２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図２４】ＸＰＡ．１０．０６４．０３（■）、ＸＰＡ．１０．０６４．０４（▲）、ＸＰＡ．１０．０６４．０６（▼）、ＸＰＡ．１０．０６４．０７（◆）、ＸＰＡ．１０．０６４．１０  （●）、ＸＰＡ．１０．０６４（□）およびベバシズマブ（ｘ、＊）によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。各抗体に関する結果は４つの独立したアッセイの平均である。
【図２５】２４日までのＸＰＡ．１０．０６４．０６およびベバシズマブによるin vivoにおけるＡ６７３腫瘍成長の阻害。（●）０．５ｍｇ／ｋｇイソ型対照抗体；（▼）０．１ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（◆）０．１ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（■）０．５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（▲）０．５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（□）５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；および（△）５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２。Ｘ軸上の矢印は投与日を示す。
【図２６】２８日までのＸＰＡ．１０．０６４．０６およびベバシズマブによるin vivoにおけるＡ６７３腫瘍成長の阻害。（●）０．５ｍｇ／ｋｇイソ型対照抗体；（▼）０．１ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（◆）０．１ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（■）０．５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（▲）０．５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（□）５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；および（△）５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２。Ｘ軸上の矢印は投与日を示す。
【図２７】３１日までのＸＰＡ．１０．０６４．０６およびベバシズマブによるin vivoにおけるＡ６７３腫瘍成長の阻害。（●）０．５ｍｇ／ｋｇイソ型対照抗体；（▼）０．１ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（◆）０．１ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（■）０．５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；（▲）０．５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２；（□）５ｍｇ／ｋｇベバシズマブ；および（△）５ｍｇ／ｋｇ  ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２。Ｘ軸上の矢印は投与日を示す。
【図２８】ｈＶＥＧＦ１６５結合に対する抗体メチオニン酸化の効果。Ａ．メチオニン酸化の存在下または不在下でのｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。Ｂ．メチオニン酸化の存在下または不在下でのｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。
【図２９】熱ストレス酸化条件後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合に対するメチオニンの効果。Ａ．熱ストレス酸化後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。Ｂ．メチオニンの存在下での熱ストレス酸化後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。
【図３０】酸化後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合親和性に対するメチオニンの効果。Ａ．メチオニンの存在下または不在下での熱ストレスによる酸化後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合のＥＬＩＳＡ分析。Ｂ．メチオニンの存在下または不在下での化学ストレスによる酸化後のｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４．０６結合のＥＬＩＳＡ分析。
【００３３】
【図３１】ＸＰＡ．１０．０６４重鎖および軽鎖ベクターｐＭＸＳＰ１１７の構造。ＸＰＡ．１０．０６４重鎖および軽鎖ベクターｐＭＸＳＰ１１９は、ｎｅｏ遺伝子の変わりにｈｉｓＤ遺伝子を有すること以外は同じ構造を有する。Ａ．環状構造。Ｂ．ＸｂａＩによる消化後の線状化構造。
【図３２】ＸＰＡ．１０．０６４．０６重鎖および軽鎖可変領域モジュラー発現ベクター。Ａ．重鎖ベクターの構造。Ｂ．軽鎖ベクターの構造。
【００３４】
詳細な説明
本発明の以下の記載は単に本発明の種々の実施形態を説明することを意図したものである。述べられている特定の改変はそれ自体、本発明の範囲を限定するものではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく種々の等価物、変化および改変が可能であることが明らかであり、このような等価の実施形態は本明細書に含まれると理解される。
【００３５】
略号
本明細書では以下の略号を用いる：ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害性；ＡＭＤ、加齢性黄斑変性；ＢＤＳ、原薬；ＢＭ−１、ベバシズマブ；ＣＤＣ、補体依存性細胞傷害性；ＣＮＶ、脈絡膜新血管新生；ＣＯＰＤ、慢性閉塞性肺疾患；ＤＦ、ダイアフィルトレーション；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＧＭＰ、適正製造基準；ＨＡＭＡ、ヒト抗マウス抗体；ＨＩＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞；ｈＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ；ＭＣＢ、マスターセルバンク；ｍｐｋ、ｍｇ／ｋｇ；ｍＶＥＧＦ、ネズミＶＥＧＦ；ＰＤ、薬力学；ＰＫ、薬物動態学；ＲＡ、関節リウマチ；ＲＩＡ、放射性免疫沈降；ＵＦ、限外濾過；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ＶＥＧＦ−Ｒ、血管内皮増殖因子受容体；ＶＨＬ、フォン・ヒッペル／リンドウ；Ｘ反応性、交差反応性
【００３６】
定義
本明細書において「抗体」とは、特定の抗原と結合する任意のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性（二価）抗体を含む。完全な抗体は２本の重鎖と２本の軽鎖を含んでなる。各重鎖は可変領域と第一、第二および第三の定常領域からなり、一方、各軽鎖は可変領域と定常領域からなる。哺乳類重鎖はα、δ、ε、γおよびμとして分類され、哺乳類軽鎖はγまたはκとして分類される。抗体は「Ｙ」型を有し、Ｙの幹はジスルフィド結合を介してともに結合された２本の重鎖の第二および第三の定常領域からなっている。このＹの各腕は、１本の軽鎖の可変領域および定常領域に結合された１本の重鎖の可変領域および第一の定常領域を含む。この軽鎖と重鎖の可変領域が抗原結合を担っている。両鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（軽（Ｌ）鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重（Ｈ）鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む）と呼ばれる３つの可変性の高いループを含む。本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントのＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ(Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991)の慣例によって定義または識別することができる。これら３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも保存性が高く、超可変ループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として知られるフランキングストレッチの間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体はそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいたクラスに割り付けられる。抗体の５つの主要なクラスまたはイソ型がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、これらはそれぞれα、δ、ε、γおよびμ重鎖の存在を特徴とする。これら主要な抗体クラスのいくつかはＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α１重鎖）などのサブクラスに分類される。
【００３７】
「二価」の抗体またはその抗原結合フラグメントは、２つの抗原結合部位を含んでなる。これら２つの抗原結合部位は同じ抗原に結合してもよいし、あるいは異なる抗原に結合してもよい（この場合、この抗体または抗原結合フラグメントは「二重特異性」として特徴付けられる）。
【００３８】
本明細書において「抗原結合フラグメント」とは、例えば、ダイアボディー、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディー（ｄｓダイアボディー）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディー）、１または複数のＣＤＲを含んでなる抗体の一部から形成される多重特異性抗体ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディー、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体または抗原と結合するが、完全な抗体構造を含まない他のいずれかの抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを表す。抗原結合フラグメントは、親抗体が結合するものと同じ抗原と結合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、１または複数の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域にグラフトされた、特定のヒト抗体に由来する１または複数のＣＤＲを含んでなり得る。
【００３９】
抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合により１本の重鎖の可変領域および第一の定常領域に結合された１本の軽鎖（可変領域と定常領域の双方）からなる抗体の一部を表す。
【００４０】
「Ｆａｂ」は、ヒンジ領域の部分を含むＦａｂフラグメントを表す。
【００４１】
「Ｆ（ａｂ’）２  」とは、Ｆａｂの二量体を表す。
【００４２】
抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して第二の重鎖の第二および第三の定常領域に結合された第一の重鎖の第二および第三の定常領域からなる抗体の一部を表す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの種々のエフェクター機能を担うが、抗原結合においては機能しない。
【００４３】
抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を持つための抗体の最小フラグメントを表す。Ｆｖフラグメントは、１本の重鎖の可変領域に結合された１本の軽鎖の可変領域からなる。
【００４４】
「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、互いに直接またはペプチドリンカー配列を介して連結された軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる操作抗体を表す(Houston 1988)。
【００４５】
「一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域と連結されたｓｃＦｖからなる操作抗体を表す。
【００４６】
「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」とは、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖を含まない抗体を表す(Riechmann 1999;Muyldermans 2001; WO94/04678; WO94/25591; 米国特許第６，００５，０７９号)。重鎖抗体は、元はラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）に由来するものであった。軽鎖を欠いているが、ラクダ化抗体は真正抗原結合レパートリーを有する(Hamers-Casterman 1993; Nguyen 2002; Nguyen 2003)。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生じる最小の既知の抗原結合単位に相当する(Koch-Nolte 2007)。
【００４７】
「ナノボディー」とは、重鎖抗体由来のＶＨＨドメインと２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体フラグメントを表す。
【００４８】
「ダイアボディー」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを含み、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖でＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含んでなる（ＶＨ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＬ）（例えば、Holliger 1993; EP404097；ＷＯ９３／１１１６１参照）。同じ鎖にある２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとの対合を余儀なくされ、それにより２つの抗原結合部位が作出される。
【００４９】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域のみを含む抗体フラグメントを表す。ある特定の場合では、２以上のＶＨドメインがペプチドリンカーで共有結合的に連結されて二価ドメイン抗体が作出される。この二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
【００５０】
ある特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖：ペプチドリンカーにより連結され、かつ、ジスルフィド橋により２つのＶＬ部分へ結合された２つのＶＨ部分を含んでなる。
【００５１】
ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディー」は、ＶＨ１とＶＬ１の間のジスルフィド橋を介してＶＬ１−ＶＨ２（ペプチドリンカーによって連結されている）に結合されたＶＨ１−ＶＬ２（これもペプチドリンカーによって連結されている）を含んでなる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’」は３つのペプチド鎖：重鎖がペプチドリンカー（例えば、長いフレキシブルリンカー）により連結され、かつ、それぞれジスルフィド橋を介してＶＬ１部分およびＶＬ２部分に結合されたＶＨ１−ＶＨ２部分を含んでなり、ジスルフィドにより対合した重鎖および軽鎖の各々は異なる抗原特異性を有する。
【００５３】
ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ−ＶＬ（ペプチドリンカーにより連結されている）が別のＶＨ−ＶＬ部分と二量体を形成したものを含んでなり、これにより、一方の部分のＶＨが他方の部分のＶＬと配位結合し、２つの同一の結合部位を形成している二価ダイアボディーである。他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーにより連結されている）がＶＬ１−ＶＨ２（これもペプチドリンカーにより連結されている）と会合したものを含んでなり、これにより、ＶＨ１とＶＬ１が配位結合し、ＶＨ２とＶＬ２が配位結合し、各配位結合対が異なる抗原特異性を有する二重特異性ダイアボディーである。
【００５４】
本明細書において「エピトープ」とは、抗体が結合する、抗原上の特定の原子またはアミノ酸の群を表す。２つの抗体がある抗原に競合的結合を示す場合には、それらはその抗原内の同じエピトープに結合し得る。例えば、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントがＶＥＧＦとの結合をめぐってベバシズマブと競合する場合には、この抗体は、必ずというわけではないが、ベバシズマブと同じエピトープと結合すると考えることができる。
【００５５】
本明細書において「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦリガンド」とは、現在知られている７つのＶＥＧＦリガンド：ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ（ウイルス由来）または胎盤増殖因子（ＰｌＧＦＦ）−１または−２の１つを表す。ＶＥＧＦ−Ａに関しては、現在知られている４つのスプライシングイソ型が存在し、それぞれは独特の生物学的機能を示す。アミノ酸１６５個のイソ型（ＶＥＧＦ１６５、配列番号１）はヘパリン結合型と可溶型の双方に存在する。アミノ酸１２１個のイソ型（ＶＥＧＦ１２１）は、ＶＥＧＦ１６５の１１５番残基と１５９番残基の間の領域に相当するフラグメントを欠いており、可溶型のみに存在する。より長いアミノ酸１８９個および２０６個のイソ型（それぞれＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６）は、ヘパリン結合能を保持している。本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５に対して高い結合親和性を示すが、ある特定の実施形態では、非ヒトＶＥＧＦタンパク質または他のＶＥＧＦイソ型に対して交差反応性であり得るか、または低レベルの結合親和性を示す。
【００５６】
本明細書において「ＶＥＧＦシグナル伝達」は、受容体リン酸化（例えば、チロシンリン酸化）、細胞内シグナル伝達分子（例えば、ＰＬＣγ；ホスホリパーゼＣ−γ）と受容体または他の細胞内シグナル伝達分子との結合、シグナル伝達カスケードの誘発および／または生物学的応答の誘発（例えば、細胞の生理または発達（例えば増殖）における遺伝子発現および変化の誘導）など、ＶＥＧＦと１または複数のＶＥＧＦ受容体との結合により誘導される細胞内事象を含む。
【００５７】
本明細書において「癌」または「癌症状」とは、新生物または悪性細胞の成長、増殖または転移により媒介されるいずれの身体症状も表し、固形癌と白血病などの非固形癌の双方を含む。本明細書において「腫瘍」は、新生物および／または悪性細胞の固形塊を表す。
【００５８】
本明細書において症状を「処置する」または症状の「処置」とは、症状の予防もしくは緩和、症状の発症もしくは進展速度の緩慢化、症状の進展リスクの軽減、症状に関連する徴候の進展の予防もしくは遅延、症状に関連する徴候の軽減もしくは終結、症状の完全もしくは部分的緩解の創出、症状の治癒、またはそのいくつかの組合せを含む。癌に関して「処置する」または「処置」とは、新生物もしくは悪性細胞の成長、増殖もしくは転移の阻害もしくは緩慢化、新生物もしくは悪性細胞の成長、増殖もしくは転移の進展の予防もしくは遅延、またはそのいくつかの組合せを表し得る。腫瘍に関して「処置する」または「処置」とは、腫瘍の全部または一部の根絶、腫瘍成長および転移の阻害もしくは緩慢化、腫瘍の進展の予防もしくは遅延またはそのいくつかの組合せを含む。
【００５９】
本明細書において「特異的に結合する」とは、例えば抗体とリガンド間などの２つの分子間の無作為でない結合反応を表す。本明細書において、第一のリガンドと特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、第二のリガンドと交差反応性を示すか、または低レベルの結合親和性を示し得る。ある特定の実施形態では、あるリガンドと特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、そのリガンドと、≦１０−７Ｍ（例えば、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）で結合する。本明細書においてＫＤは、会合速度に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を表し、当技術分野で公知の方法を用いて（例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎｅｘａ技術を用いて）求めることができる。ある特定の実施形態では、あるリガンドと特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、その抗体が別のリガンドと結合する結合親和性よりも１０倍以上高い（例えば≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧５０倍、≧１０２倍、≧１０３倍または≧１０４倍）結合親和性でそのリガンドと結合する。他の実施形態では、ｈＶＥＧＦ１６５などのあるリガンドと特異的に結合する抗体はそのリガンドと≦１０−７Ｍの結合親和性（ＫＤ）で結合するが、ｍＶＥＧＦ１６５などの別のリガンドに対しては検出可能な結合親和性を示さない。
【００６０】
「単離された」物質は、天然の状態から人の手によって変化させられている。「単離された」組成物または物質が天然に見られる場合には、それはその元の環境から変化させられているか、または取り出されているか、またはその双方である。例えば、生体動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その天然状態の共存材料から十分分離され、その結果、実質的に純粋な状態で存在している場合には、「単離され」ている。
【００６１】
本明細書において「ベクター」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現を行うため作動可能なように挿入され得るビヒクルを表す。ベクターは、それが宿主細胞内に運ぶ遺伝エレメントの発現を行う目的で宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用可能である。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして用いられる動物ウイルスのカテゴリーには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびリポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々なエレメントを含み得る。さらに、ベクターは複製起点を含み得る。ベクターはまた、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コーティングを含む、その細胞への進入を助けるための材料も含み得る。
【００６２】
本明細書において「宿主細胞」とは、外因性のポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入された細胞を表す。宿主細胞は、例えば、大腸菌もしくは枯草菌(B. subtilis)細胞などの細菌細胞、酵母細胞もしくはコウジカビ属(Aspergillus)細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２もしくはスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、または繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞などの動物細胞を含む様々な細胞種から選択することができる。
【００６３】
本明細書において「異常な脈管形成に関連する疾患」とは、増強された脈管形成、特に、ＶＥＧＦシグナル伝達に関連するか、または媒介される増強された脈管形成によって引き起こされる、増悪する、またはそうでなければ関連するいずれの症状も表す。このような症状としては、成長、増殖または転移のための新脈管形成に依存する細胞によって媒介される癌、例えば湿潤型ＡＭＤなどの眼の疾患および例えば、関節リウマチ、乾癬、硬皮症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息などの炎症性症状が含まれる。
【００６４】
本明細書において「結合をブロックする」または「結合をめぐって競合する」能力とは、抗体または抗原結合フラグメントの、２つの分子間の結合相互作用を任意の検出可能な是認点まで阻害する能力を表す。ある特定の実施形態では、２つの分子間の結合をブロックする抗体または抗原結合フラグメントは、その２分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。ある特定の実施形態では、この阻害は６０％より大きくてもよく、ある特定の実施形態では、７０％より大きくてもよく、ある特定の実施形態では、８０％より大きくてもよく、ある特定の実施形態では、９０％より大きくてもよい。ある特定の実施形態では、阻害される結合相互作用はｈＶＥＧＦ１６５に対するベバシズマブの結合相互作用であり得る。ある特定の他の実施形態では、阻害される相互作用は、ＶＥＧＦ−Ｒ１および／またはＶＥＧＦ−Ｒ２に対するｈＶＥＧＦ１６５または他のいずれかのＶＥＧＦリガンドの相互作用であり得る。
【００６５】
完全ヒトＶＥＧＦ抗体および抗原結合フラグメント
完全ヒト抗体は、安全性および有効性の双方の点でネズミ、キメラまたはヒト化抗体を超えるいくつかの潜在的利点を有する。第一に、それらが非ヒト残基を欠いていることで、完全ヒト抗体は投与後に宿主の免疫応答を生じる可能性が低くなる。第二に、完全ヒト抗体は一般に他の抗体種よりも低いクリアランス速度を示す。この低いクリアランス速度により、より低い用量および頻度の使用が可能となる。
【００６６】
本明細書では、in vivoで優れた抗腫瘍活性を有すると同定された抗ｈＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合フラグメントが提供される。これは、優れたin vivo生物作用とともに、ＫＤの関数としての優れたin vitro抗原結合特性を有する抗体の開発に伴う不確実性のために、予期されない、驚くべき発見である。実際のところ、ＶＥＧＦに対して特に高いin vitro結合親和性を有する抗体は必ずしも高いin vivo有効性を持たない(Liang 2006)。よって、本明細書に開示されているもののような高いin vivo有効性を有する抗体の同定は極めて予測しがたいものであり、包括的な科学試験を必要とする。
【００６７】
本明細書では、双方ともｈＶＥＧＦ１６５と特異的に結合する完全ヒト親抗体ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．０７２が開示される。以下に述べるように、親ＸＰＡ．１０．０６４抗体は高いin vivo有効性を有する抗体を生成するように親和性成熟したものである。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２は、ファージディスプレーｓｃＦｖライブラリーをｈＶＥＧＦ１６５でパンニングすることによって同定された。ＸＰＡ．１０．０７２の重鎖および軽鎖可変領域の配列はそれぞれ以下の配列番号２および３に示され、ＸＰＡ．１０．０６４の重鎖および軽鎖可変領域の配列はそれぞれ以下の配列番号４および５に示されている。ＸＰＡ．１０．０７２およびＸＰＡ．１０．０６４重鎖可変領域はそれぞれ配列番号２および４で示され、残基３１〜３５（ＨＣＤＲ１、配列番号６）、５０〜６６（ＨＣＤＲ２、配列番号７）および９９〜１０８（ＨＣＤＲ３、配列番号８）にＣＤＲを含む。配列番号３で示されるＸＰＡ．１０．０７２軽鎖可変領域は残基２６〜３５（ＬＣＤＲ１、配列番号９）、５１〜５７（ＬＣＤＲ２、配列番号１０）および９０〜１００（ＬＣＤＲ３、配列番号１１）にＣＤＲを含む。配列番号５で示されるＸＰＡ．１０．０６４軽鎖可変領域は残基２３〜３５（ＬＣＤＲ１、配列番号１２）、５１〜５７（ＬＣＤＲ２、配列番号１３）および９０〜１００（ＬＣＤＲ３、配列番号１４）にＣＤＲを含む。
【００６８】
成熟型ＸＰＡ．１０．０７２およびＸＰＡ．１０．０６４重鎖および軽鎖（シグナル配列を欠いている）のアミノ酸配列（ＣＤＲが下線で示されている）。
【００６９】
ＸＰＡ．１０．０７２重鎖：  RLQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWARQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDHRIVGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号２)。
【００７０】
ＸＰＡ．１０．０７２軽鎖：QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNLGSNFVYWYQQLPGTAPKLLIYRNHQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCASWDDSLRVVVFGGGTKLTVL (配列番号３)。
【００７１】
ＸＰＡ．１０．０６４重鎖：EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDHRIVGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号４)。
【００７２】
ＸＰＡ．１０．０６４軽鎖：SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGVVFGGGTKVTVL (配列番号５)。
【００７３】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖの、ＥＬＩＳＡにおいて高い親和性でｈＶＥＧＦ１６５と結合し、ｈＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２との結合を阻害する能力に基づき、ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧ２への変換のため、さらなる機能的研究のために抗体が選択された。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧ２は全て、ｈＶＥＧＦ１６５に対して、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定されたものと同様の高い結合親和性を示した。両抗体はｈＶＥＧＦ１２１とも結合した。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２はｍＶＥＧＦ１６５に対しては弱い結合を示すに過ぎない。ｈＶＥＧＦ１６５に対するＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２の結合親和性はそれぞれ１．２４〜１．７１ｎＭおよび１．６６〜１．７ｎＭである。Ｂｉａｃｏｒｅ分析もまた、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２が、ｈＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２との結合を、ベバシズマブに関して見られたものと同様の程度にブロックすることを明らかにした。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する能力は、両抗体がｈＶＥＧＦ１６５により誘導されるＶＥＧＦ−Ｒ２のリン酸化を阻害することを示すＥＬＩＳＡ試験によって確認された。
【００７４】
エピトープ分析は、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２がｈＶＥＧＦ１６５上の直鎖エピトープと結合すること、およびこれらのエピトープがベバシズマブにより結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複し得ることを示唆した。免疫組織化学分析法は、ベバシズマブとは違い、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２は双方とも広域の組織交差反応性を示すことを明らかにした。両抗体ともＨＵＶＥＣの増殖を阻害し、双方ともin vivoにおいて脈管形成および腫瘍成長を阻害した。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の特徴の概要を表１に示す。
【表１】
2011500086.tif 000002
【００７５】
結合および有効性が改良された突然変異型の完全ヒト抗体を作出するために、ＸＰＡ．１０．０６４の重鎖ＣＤＲに対して親和性成熟を行った。ＸＰＡ．１０．０６４  ＨＣＤＲ３をアミノ酸５個のブロックにおいてランダムに突然変異誘発することにより抗体ライブラリーを作製し、そのライブラリーを、ファージディスプレー技術を用い、ｈＶＥＧＦ１６５との結合に関してスクリーニングした。５つの親和性成熟型ＩｇＧ（ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０）のＨＣＤＲ３配列をそれぞれ以下の配列番号１５〜１９に示す。
【００７６】
ＸＰＡ．１０．０６４．０３：DQMVHGGLDY（配列番号１５）
【００７７】
ＸＰＡ．１０．０６４．０４：DEMQNGGLDY（配列番号１６）
【００７８】
ＸＰＡ．１０．０６４．０６：DEMTRGGLDY（配列番号１７）
【００７９】
ＸＰＡ．１０．０６４．０７：DEMHVGGLDY（配列番号１８）
【００８０】
ＸＰＡ．１０．０６４．１０：DEMVWGGLDY（配列番号１９）
【００８１】
ＸＰＡ．１０．０６４親和性成熟クローンのそれぞれは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定した場合に親ＸＰＡ．１０．０６４抗体またはベバシズマブよりも高い親和性でｈＶＥＧＦ１６５と結合し、かつ、ｍＶＥＧＦ１６５に対しては弱い結合を示すに過ぎなかった。親和性成熟クローンはまた、親ＸＰＡ．１０．０６４よりも大きい程度でＨＵＶＥＣの増殖を阻害する能力も示した。さらに、ＸＰＡ．１０．０６４．０６は、横紋筋肉腫腫瘍成長モデルにおいてin vivoで、０．１ｍｇ／ｋｇといった低用量でベバシズマブよりも大きい程度で腫瘍成長を阻害する能力を示した。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇでのＸＰＡ．１０．０６４．０６の投与後の腫瘍成長阻害率％は、少なくとも５倍多い用量でベバシズマブを投与することにより得られたものとほぼ同じであった。同じ用量で投与した場合、ＸＰＡ．１０．０６４．０６はベバシズマブよりも少なくとも２〜３倍長い時間、腫瘍成長を特定の大きさに阻害した。上記で述べたように、ＶＥＧＦ抗体の親和性を増大させることが必ずしもin vivo腫瘍成長低減の有効性の増大と相関しない(Liang 2006)ことから、このin vivo有効性の増大は予期されないことであった。
【００８２】
本明細書において、ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号１５〜１９で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７またはＸＰＡ．１０．０６４．１０のＨＣＤＲ３配列を含んでなる抗体および抗原結合フラグメントが提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、それぞれ配列番号６および７で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＨＣＤＲ１(GHYIH)および／またはＨＣＤＲ２(WINPYSGGTNFPREFQG)配列を含んでなり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ以下の配列番号２０〜２４で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７またはＸＰＡ．１０．０６４．１０の重鎖可変配列を含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、配列番号１２〜１４で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＬＣＤＲ配列の１または複数を含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号５で示されるＸＰＡ．１０．０６４の軽鎖可変配列を含んでなる。また、本明細書において、ある特定の実施形態では、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７またはＸＰＡ．１０．０６４．１０により結合されるものと同じエピトープと結合する抗体および抗原結合フラグメントが開示される。成熟親和性成熟ＸＰＡ．１０．０６４重鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を欠いている）は以下の配列番号２０〜２４に示す（ＣＤＲが下線で示されている）。
【００８３】
ＸＰＡ．１０．０６４．０３：EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDQMVHGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号２０)。
【００８４】
ＸＰＡ．１０．０６４．０４：  EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMQNGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号２１)。
【００８５】
ＸＰＡ．１０．０６４．０６：  EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMTRGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号２２)。
【００８６】
ＸＰＡ．１０．０６４．０７：  EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMHVGGLDYWGQGTLVTVSS(配列番号２３)。
【００８７】
ＸＰＡ．１０．０６４．１０：  EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMVWGGLDYWGQGTLVTVSS (配列番号２４)。ＣＤＲが下線で示されている。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１７および１８で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０６またはＸＰＡ．１０．０６４．０７のＨＣＤＲ３配列を含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、それぞれ配列番号６および７で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２配列を含んでなり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号２２および２３で示されるＸＰＡ．１０．０６４．０６またはＸＰＡ．１０．０６４．０７の重鎖可変配列を含んでなる。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、配列番号１２〜１４で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＬＣＤＲ配列の１または複数を含んでなる。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号５で示されるＸＰＡ．１０．０６４の軽鎖可変配列を含んでなる。
【００８９】
本明細書において、ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦと特異的に結合し、かつ、以下の特性：（１）ｈＶＥＧＦ１６５に対するＫＤが約１０−１０Ｍ（すなわち、親和性成熟ＸＰＡ．１０．０６４抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される平均ＫＤと同等）；（２）ｈＶＥＧＦ１６５に対するｋａが約１．８９×１０５（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される平均Ｋａと同等）；（３）ｈＶＥＧＦ１６５に対するｋｄが約１．７３×１０−５（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される平均ｋｄと同等）；（４）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性（ＫＤの関数として）が、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０のｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性がベバシズマブのものよりも大きいのと同程度に、ベバシズマブのもの（すなわち、約４．２５×１０−１０）よりも大きい；（５）ＨＵＶＥＣの細胞増殖をＩＣ５０  約１５４ｐＭ（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される平均ＩＣ５０と同等）で阻害することができる；（６）ＨＵＶＥＣの細胞増殖をベバシズマブの約５６％のＩＣ５０で阻害することができる；（７）ｈＶＥＧＦ１６５に対するＫＤが約１．９７×１０−１０Ｍ〜約３．４９×１０−１１Ｍ（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される範囲内）；（８）ｈＶＥＧＦ１６５に対するｋａが約１．５×１０５〜約２．１６×１０５（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される範囲内）；（９）ｈＶＥＧＦ１６５に対するｋｄが約６．６５×１０−６〜約２．９４×１０−５（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される範囲内）；（１０）ＨＵＶＥＣの細胞増殖を約１２９ｐＭ〜約１７４ｐＭのＩＣ５０（すなわち、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０により示される範囲内）で阻害することができる；（１１）ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性が、ｍＶＥＧＦ１６５に対する該抗体または抗原結合フラグメントの���合親和性よりも少なくとも約１０倍大きい；および（１２）ｈＶＥＧＦ１６５との結合をめぐってベバシズマブと競合することができる、の１または複数を有する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００９０】
さらに本明細書では、本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントと１または複数のＶＥＧＦリガンドまたはその抗原性フラグメントとを含んでなる複合体が提供される。これらの複合体はin vitroまたはin vivoで形成され得る。例えば、ある特定の実施形態では、このような複合体は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントが対象に投与され、その対象の体内のＶＥＧＦと結合した際に形成され得る。
【００９１】
本明細書で提供される親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０は、ＸＰＡ．１０．０６４  ＨＣＤＲ３のランダム突然変異誘発とその後の結合および機能アッセイによって作製されたものである。ある特定の実施形態では、ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＨＣＤＲ３のメチオニン残基を、例えば、アラニン、リシン、プロリン、トレオニンまたはロイシン残基などの別のアミノ酸残基で置換することができる。このような突然変異ＨＣＤＲ３配列の例を配列番号２５〜２９で示す。よって、ある特定の実施形態では、配列番号２５〜２９のいずれかで示されるＨＣＤＲ３配列を含んでなる抗体および抗原結合フラグメントが提供される。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、それぞれ配列番号６および７で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２配列を含んでなり得る。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはさらに、配列番号１２〜１４で示されるＸＰＡ．１０．０６４のＬＣＤＲ配列の１または複数を含んでなり得る。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号５で示されるＸＰＡ．１０．０６４の軽鎖可変配列を含んでなり得る。
【００９２】
ある特定の実施形態では、親抗体ＸＰＡ．１０．０６４の付加的親和性成熟型は、ＸＰＡ．１０．０６４  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３の１または複数の残基を突然変異誘発することにより作出される。よって、ある特定の実施形態では、ＸＰＡ．１０．０６４の１または複数のＣＤＲ配列（この１または複数のＣＤＲ配列は１または複数のアミノ酸置換を含む）を含んでなる抗体および抗原結合フラグメントが提供される。この方法で作出された抗体および抗原結合フラグメントを、結合特性の改良された親和性成熟抗体を同定するために、ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合に関してスクリーニングすることができる。有利な結合特性を有する抗体に対して、例えば、ＨＵＶＥＣの増殖、脈管形成、腫瘍成長および／またはｈＶＥＧＦ１６５により誘導されるＶＥＧＦ−Ｒ２のリン酸化を阻害するそれらの能力を調べるために１または複数の機能アッセイを行うことができる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５に対するベバシズマブのものよりも大きい親和性でｈＶＥＧＦ１６５と結合する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントはｈＶＥＧＦ１６５とＫＤ≦５００ｐＭで結合する。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントはｈＶＥＧＦ１６５とＫＤ≦２００ｐＭで、他の実施形態では≦１５０ｐＭで、他の実施形態では≦１００ｐＭで、さらに他の実施形態では≦５０ｐＭで結合する。
【００９４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ｍＶＥＧＦ１６５に対しては検出可能な結合親和性を示さないか、または弱い結合親和性を示す。これらの実施形態のある特定のものでは、抗体または抗原結合フラグメントは、ｍＶＥＧＦ１６５に対して≧約１００ｎＭのＫＤを示す。ある特定の実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５に対して、ｍＶＥＧＦ１６５に対する該抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性よりも少なくとも１０倍大きい（例えば、２０倍、３０倍または４０倍大きい）結合親和性を示す。これらの実施形態のある特定のものでは、ｈＶＥＧＦ１６５に対する該抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性は、ｍＶＥＧＦ１６５に対する該抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性よりも少なくとも５０倍大きい（例えば、６０倍、７０倍、８０倍または９０倍大きい）、ある特定の実施形態では、少なくとも１００倍大きい（例えば、１１０倍、１２０倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍または５００倍大きい）。
【００９５】
本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５およびｈＶＥＧＦ１２１に対するそれらの高い結合親和性ならびにＶＥＧＦのＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２への結合およびＶＥＧＦにより誘導される受容体リン酸化をブロックするそれらの能力に基づき、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害するために使用することができる。これに基づき、該抗体および抗原結合フラグメントはＶＥＧＦ発現および／またはシグナル伝達に関連する種々の症状を処置するために使用可能である。
【００９６】
本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ増殖を阻害すること、および脈管形成を阻害することが判明している。よって、該抗体および抗原結合フラグメントは増強された０１＊脈管形成に関連する種々の症状を処置するために使用可能である。例えば、該抗体および抗原結合フラグメントは、腫瘍部位からの血管の増殖を阻害すること、従って、腫瘍成長を阻害することによって癌を処置するために使用可能である。同様に、該抗体および抗原結合フラグメントは、腫瘍部位の血管を破壊して腫瘍壊死をもたらすことによって癌を処置するために使用可能である。癌の処置に関する本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントの有効性はin vivoですでに確認されている。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ベバシズマブと同等か、または大きいレベルで脈管形成および／または腫瘍成長を阻害する。in vivoＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍成長阻害試験では、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２は、供試した全ての用量でベバシズマブと同等か、または大きい程度で腫瘍成長を阻害した。親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０６は、ベバシズマブよりも有効に腫瘍成長を阻害した。腫瘍成長阻害率％の関数として、ＸＰＡ．１０．０６４．０６は、腫瘍成長の低減において、ベバシズマブよりもおよそ５倍有効であった。同様に、ＸＰＡ．１０．０６４．０６は、その抗体を同じ用量で投与した場合、ベバシズマブよりも有意に長い時間、腫瘍成長を特定の大きさに遅延させた。よって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、同じまたは同等の用量で投与した際に、ベバシズマブの少なくとも２倍有効に、腫瘍成長阻害率％により測定される腫瘍成長を阻害するか、または腫瘍成長時間を遅延させる。これらの実施形態のある特定のものでは、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、ベバシズマブの少なくとも３倍有効に、他の実施形態ではベバシズマブの少なくとも４倍有効に、他の実施形態ではベバシズマブの少なくとも５倍有効に、他の実施形態ではベバシズマブの５倍を超えて有効に、腫瘍成長を阻害する。同様に、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、ベバシズマブより低い用量で投与した際に、ベバシズマブとほぼ同程度か、またはベバシズマブよりも大きい程度で腫瘍成長を阻害する。これらの実施形態のある特定のものでは、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、ベバシズマブの用量の２分の１、他の実施形態ではベバシズマブの用量の３分の１、他の実施形態ではベバシズマブの用量の４分の１、他の実施形態ではベバシズマブの用量の５分の１で投与した際に、ベバシズマブとほぼ同程度か、またはベバシズマブよりも大きい程度で腫瘍成長を阻害する。本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは、ベバシズマブと比べて同等か、または改良された薬物動態（ＰＫ）特性を示し得る。例えば、該抗体または抗原結合フラグメントは、ベバシズマブと比べて長い循環半減期または低い免疫原性を示し得る。抗体または抗原結合フラグメントがベバシズマブと同等か、または改良された薬物動態特性を示すある特定の実施形態では、該抗体または抗原結合フラグメントは、ベバシズマブ投与の長い間隔に関連する負の作用を示すことなく、ベバシズマブよりも長い間隔で投与することができる。
【００９８】
本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、ＶＥＧＦシグナル伝達によって少なくとも部分的に制御される異常な脈管形成に関連する症状の処置において使用可能である。これらの症状は、一般に増強されたＶＥＧＦ発現レベルに関連し、湿潤型ＡＭＤまたは増殖性網膜症（糖尿病性網膜症など）などの増強された脈管形成に関連する眼疾患、糖尿病性腎疾患およびその他の糖尿病性血管増殖性疾患、嚢胞性繊維症および種々の腫瘍種が含まれる(Amoroso 1997;McColley 2000; Khamaisi 2003)。
【００９９】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを用いて治療可能な癌症状および腫瘍種としては、限定されるものではないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫、生殖細胞腫瘍、または白血病、リンパ腫もしくは多発性骨髄腫などの血液またはリンパ系の悪性疾患が挙げられる。より具体的には、本明細書に開示される抗体を用いて治療可能な癌症状および腫瘍種としては、限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌または肺の扁平上皮癌）、腹膜癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌腫／肝細胞腫）、胃癌(gastric or stomach cancer)（例えば、胃腸癌）、膵臓癌、脳腫瘍（例えば、膠芽腫／多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍または髄膜腫）、神経膠腫（例えば、脳室上衣細胞腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫または乏突起星状細胞腫などの混合神経膠腫）、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（例えば、肝芽細胞腫、肝細胞癌腫／肝細胞腫または肝臓癌腫）、膀胱癌（例えば、尿路上皮癌）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌(kidney or renal cancer)（例えば、腎臓のラブドイド腫瘍）、前立腺癌、陰門癌、陰茎癌、肛門癌（例えば、肛門扁平上皮癌）、甲状腺癌、頭頸部癌（例えば、鼻咽頭癌）、皮膚癌（例えば、黒色腫または扁平上皮癌）、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、軟組織肉腫（例えば、横紋筋肉腫、繊維肉腫、カポジ肉腫）、カルチノイド癌、眼癌（例えば、網膜芽細胞腫）、中皮腫、Ｔ細胞系統およびＢ細胞前駆体系統双方のリンパ性／リンパ芽球性白血病（例えば、急性リンパ性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性／リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性／骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）（肥満細胞白血病を含む）、慢性骨髄性／骨髄球性／骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、菌状息肉腫、セザリー徴候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、肥満細胞新生物、髄芽細胞腫、腎芽細胞腫、孤立性形質細胞腫、骨髄異形成徴候群、慢性および非慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系腫瘍、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、脳室上衣細胞腫、脈絡膜叢乳頭腫、真性赤血球増加症、血小板血症、特発性骨髄繊維症、ならびに小児肉腫（例えば、神経芽腫、横紋筋肉腫および骨肉腫）などの小児癌が挙げられる。また、腫瘍は悪性腫瘍（例えば、癌）または良性腫瘍（例えば、過形成症、嚢胞、偽性嚢胞、過誤腫、および新生物）であってもよい。
【０１００】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを用いて治療可能な腫瘍種にはまた、特定のバイオマーカーに関連する癌が含まれる。例えば、バイオマーカーとしては、限定されるものではないが、フォンヒッペル−リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子における突然変異および／または低酸素症誘導性因子−１α（ＨＩＦ−１α）の過剰発現が挙げられる。ある特定の実施形態では、該抗体は、ＶＨＬ腫瘍抑制遺伝子における突然変異を提示する癌を処置するために使用可能である。ＶＨＬ遺伝子における突然変異の結果、ＶＥＧＦ遺伝子中のエンハンサーエレメントと結合し、脈管形成を刺激する、低酸素症誘導性転写因子１αおよび２αの構成的安定化をもたらす(Harris 2000)。本明細書に開示される抗体を用いて治療可能なＶＨＬ突然変異腫瘍種としては、例えば、中枢神経系血管芽腫、網膜血管芽腫、内リンパ嚢腫瘍、明細胞腎細胞癌および／または腎嚢胞、クロム親和性細胞腫、膵嚢胞、神経内分泌腫瘍および精巣上体および広靱帯嚢腺腫が挙げられる。最初に突然変異特異的ネステッド逆転写ポリメラーゼ連鎖反応またはネステッド一本鎖コンフォメーション多型分析(Ashida 2003)を用いる分子検出などの既知の方法により、ＶＨＬ遺伝子突然変異の存在に関して対象を選択またはスクリーニングする。次に、特定された対象に対して、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントによる処置を行う。他の実施形態では、該抗体を用いて、対象におけるＨＩＦ−１αの過剰発現を提示する癌を処置することができる。ＨＩＦ−１αの過剰発現は組織（例えば、脳、乳房、子宮頸、食道、口咽頭、卵巣および前立腺組織）の生検によって調べることができる。特定された対象が選択され、該抗体または抗原結合フラグメントによる、またはＨＩＦ−１α阻害剤、例えば、４−Ｏ−メチルサルセルネオール(methylsarcerneol)、マナッサチン(manassantin)Ａ、マナサッチンＢ１、ＮＳＣ−１３４７５４、ＮＳＣ−６４３７３５、トポテカン、ＳＣＨ６６３３６、ＰＸ−４７８、Ｒ１１５７７７、セツキシマブ(Cetuximab)、１０３Ｄ５ＲおよびＮＳＡＩＤ(Kimbro 2006)と組み合わせた抗体または抗原結合フラグメントによる処置を受ける。本明細書では、対象が上述の１または複数のバイオマーカー（例えば、ＶＨＬ遺伝子突然変異）を有することが確認された場合に、その対象を本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントによる療法のために選択し、所望により、その対象を該抗体または抗体結合フラグメントで処置するための方法が提供される。
【０１０１】
本明細書に記載される抗体および抗原結合フラグメントにより処置可能な他の症状としては、関節リウマチ、乾癬、硬皮症、慢性閉塞性肺疾患および喘息などの炎症性症状が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ベバシズマブ処置に耐性となった症状を処置するために使用可能である。
【０１０２】
本明細書で提供される抗体および抗原結合フラグメントは種々の非治療的用途にも利用可能である。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５、その他のＶＥＧＦイソ型またはそのフラグメントを精製するためのアフィニティー精製薬剤として使用可能である。これらの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは当技術分野で公知の方法を用い、樹脂または濾紙などの固相に固定化され得る。該抗体または抗原結合フラグメントはまた、ｈＶＥＧＦ１６５、その他のＶＥＧＦイソ型またはそのフラグメントを溶液から沈殿させるために使用可能である。その他の非治療的実施形態では、該抗体または抗原結合フラグメントは種々のin vitroまたはin vivo診断または検出適用において使用可能である。これらの実施形態のある特定のものでは、該抗体または抗原結合フラグメントは検出可能な標識とコンジュゲートされていてもよい。他の実施形態では、該抗体または抗原結合フラグメントは、検出可能な標識とコンジュゲートされていなくてもよく、該抗体と結合する標識二次抗体を用いて検出さすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５発現を検出するために使用可能である。これらの実施形態のある特定のものでは、該抗体または抗原結合フラグメントは、増強されたｈＶＥＧＦ１６５発現に関連する症状を診断するために使用可能である。例えば、該抗体または抗原結合フラグメントは、対象における増強されたｈＶＥＧＦ１６５発現に関連する症状を診断するために、対象からの生体サンプルと接触させることができる。同様に、該抗体または抗原結合フラグメントは、対象に直接投与してもよく、この場合、ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合は、当分野で公知の方法を用いていて検出される。
【０１０３】
変異株エピトープ結合試験、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントが、ベバシズマブにより認識されるエピトープと少なくとも部分的に重複するＶＥＧＦ上の直鎖エピトープと結合し得ることを示す。よって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＶＥＧＦ１６５（配列番号１）の残基７９〜９４からなるか、またはそれを含んでなるエピトープと結合し得る。同様に、該抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１の残基７９〜９４に相当する配列と完全にまたは部分的に重複するエピトープと結合し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントはベバシズマブのｈＶＥＧＦ１６５への結合を競合的に阻害する。
【０１０４】
本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトにおいて、消失半減期が１７〜２１日である (Ferrara 2004)ベバシズマブと同等またはそれを超える消失半減期（ｔ１／２）を有していてよい。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、約２１日、２８日、３５日または６０日の消失半減期を持ち得る。消失半減期とは、投与された抗体の血漿濃度が２分の１まで低下するのにかかる時間を表し、当技術分野で公知の方法を用いて算出することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントの消失半減期は少なくとも１７日であり得る。ある特定の他の実施形態では、それは１７〜２１日であってもよく、これらの実施形態のある特定のものでは、それは２１日を超えてもよい。
【０１０５】
本明細書に開示される抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントなどの抗体のフラグメントまたはフラグメント群を含んでなる。これらのフラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメントを作製するためのパパインまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製するためのペプシンなどの酵素によるタンパク質分解切断のような、当技術分野で周知の方法を用いて抗体から作製することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、１または複数のヒトフレームワーク領域にグラフトされた配列番号２〜５または２０〜２４由来の１または複数のＣＤＲを含んでなってよい。
【０１０６】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは単独でまたは１または複数の付加的治療薬と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、化学療法、放射線療法、癌の処置のための外科術（例えば、腫瘍摘出）、１または複数の抗催吐薬または化学療法からくる合併症のための他の処置もしくは癌または上昇したＶＥＧＦ発現および／またはシグナル伝達により媒介される任意の身体の障害の処置で用いるための他のいずれかの治療薬と組み合わせて投与され得る。これらの実施形態のある特定のものでは、１または複数の付加的治療薬と組み合わせて投与される、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、それらの１または複数の付加的治療薬と同時に投与してもよく、これらの実施形態のある特定のものでは、該抗体または抗原結合フラグメントと付加的治療薬は同じ医薬組成物の一部として投与され得る。しかしながら、別の治療薬と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合フラグメントは、その薬剤と同時にまたはその薬剤と同じ組成物で投与されない。別の薬剤の前または後に投与される抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書でこの句を用いる場合、抗体または抗原結合フラグメントと第二の薬剤が異なる経路で投与されるとしても、該その薬剤と「組み合わせて」投与されるとみなされる。可能な場合、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与される付加的治療薬は、その付加的治療薬の製品情報シートに挙げられている計画に従うか、またはthe Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference， 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002))に従うか、または当技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。
【０１０７】
当業者ならば、様々なコンジュゲートが、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントと連結されてもよいことが分かるであろう（例えば、"Conjugate Vaccines"， Contributions to Microbiology and Immunology， J. M. Cruse and R. E. Lewis， Jr. (eds.)， Carger Press， New York， (1989)参照）。これらのコンジュゲートは抗体または抗原結合フラグメントと、他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、混和または付加により連結され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、１または複数のコンジュゲートに結合するために利用され得るエピトープ結合部分の外側に特異的な部位を含むよう操作してもよい。例えば、このような部位には、コンジュゲートへの共有結合を容易にするための１または複数の反応性アミノ酸残基、例えば、システインまたはヒスチジン残基が含まれ得る。ある特定の実施形態では、これらの抗体はコンジュゲートと間接的に連結してもよく、または別のコンジュゲートを介して連結してもよい。例えば、該抗体または抗原結合フラグメントをビオチンとコンジュゲートし、次いで、アビジンにコンジュゲートされた第二のコンジュゲートと間接的にコンジュゲートしてもよい。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントと連結されたコンジュゲートは該抗体または抗原結合フラグメントの１または複数の薬物動態（ＰＫ）特性を変化させる手段となる１または複数の薬剤、例えば、該抗体または抗原結合フラグメントの半減期を延長するか、または免疫原性を低減するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含んでなり得る（例えば、Katre 1990参照）。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントに連結されるコンジュゲートは１または複数の検出可能な標識を含んでなり得る。このような標識としては、限定されるものではないが、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐなどの放射性同位元素、その他のランタニド、発光標識、例えばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッドなどの蛍光標識、および例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素基質標識が挙げられる。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、細胞間メディエーターとして細胞に作用するタンパク質を含む１または複数のサイトカインと連結された、または組み合わせられた本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる組成物が提供される。サイトカインの例としては、限定されるものではないが、リンホカイン、モノカイン、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラクシン、プロリラクシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子αおよびβ、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子、血小板増殖因子、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦおよび顆粒球−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２などのインターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子、ならびにその他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、上記に挙げられたもののいずれかを含む任意のサイトカインと組み合わせて提供および／または投与され得る。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、１または複数の化学療法薬と連結された、または組み合わせられた本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる組成物が提供される。化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、ＡＬＴ−１１０、ＡＭＮ−１０７(Nilotinib)、アムルビシン、ＡＲＱ−１９７、アトラセンタン（Xinlay（登録商標））、ＡＶ−２９９、ＡＺＤ  １１５２、ＡＺＤ  ２１７１、バタブリン、ＢＩＯ−１１１、ＢＩＯ−１４０、カルシトリオール、ＣＣ  ８４９０、シレンジチド、ダサチニブ、デカタニブ、ＤＮ−１０１、エドテカリン、エンザスタウリン、エルロチニブ、エベロリムス、ギマテカン、ゴシポール（例えば、ゴシポール酢酸）、ＧＳＫ４６１３６４、ＧＳＫ６９０６９３、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ  １００１、ＩＰｄＲ、イピリムマブ、ＫＲＸ−０４０２、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ロナファルニブ、ルカントン、ＬＹ  ３１７６１５、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ノイラジアブ(neuradiab)、ノラトレキセド、オブリメルセン、オファツムマブ、ＯＮ  ０９１０．Ｎａ、オレゴボマブ、パニツムマブ、プラゾパニブ、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＲＴＡ  ７４４、ルビテカン、Ｓｄｘ  １０２、タランパネル、テムシロリムス、テスミリフェン、テトランドリン、チシリムマブ、ＴＫＩ−２５８、ＴＬＫ  ２８６、トラベクテジン、バンデタニブ、ビテスパン、Ｘｒ  ３１１、ザノリムマブ、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１およびゾレンドロネート、ヒストレリン、アザシチジン、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ケトコナゾール、ナイトロジェンマスタード、イブリツモマブチウキセタン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、エジトロネート(editronate)、シクロスポリン、エドウィナ(Edwina)−アスパラギナーゼおよびストロンチウム  ８９が挙げられる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１】
2011500086.tif 000003
を有するロミデプシン（ＦＫ−２２８）と連結される、または組み合わせられる。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化２】
2011500086.tif 000004
を有するＡＤＳ−１００３８０と連結される、または組み合わせられる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化３】
2011500086.tif 000005
を有するＣＧ−７８１と連結される、または組み合わせられる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化４】
2011500086.tif 000006
を有するＣＧ−１５２１と連結される、または組み合わせられる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化５】
2011500086.tif 000007
を有するＳＢ−５５６６２９と連結される、または組み合わせられる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化６】
2011500086.tif 000008
を有するクラミドシンと連結される、または組み合わせられる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化７】
2011500086.tif 000009
を有するＪＮＪ−１６２４１１９９と連結される、または組み合わせられる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、
【化８】
2011500086.tif 000010
【化９】
2011500086.tif 000011
【化１０】
2011500086.tif 000012
【化１１】
2011500086.tif 000013
または
【化１２】
2011500086.tif 000014
と連結される、または組み合わせられる。：
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１３】
2011500086.tif 000015
を有するボリノスタット（ＳＡＨＡ）と連結される、または組み合わせられる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１４】
2011500086.tif 000016
を有するエトポシド（ＶＰ−１６）と連結される、または組み合わせられる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１５】
2011500086.tif 000017
を有するゲムシタビンと連結される、または組み合わせられる。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、米国特許公報第２００４／０２０９８７８Ａ１号に開示されている化合物と連結され、または組み合わせられ、該化合物は以下のコア構造：
【化１６】
2011500086.tif 000018
を有する。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））（CaelyxまたはDoxil（登録商標）（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射；Ortho Biotech Products L.P.， Raritan， NJ）を含む）と結合されるか、または組み合わせて使用される。Doxil（登録商標）は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール  ２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ）と完全水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）とコレステロールからなるSTEALTH（登録商標）リポソーム担体中にドキソルビシンを含んでなる。ドキソルビシンは構造：
【化１７】
2011500086.tif 000019
を有する。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１８】
2011500086.tif 000020
を有する５’−デオキシ−５−フルオロウリジンと連結される、または組み合わせられる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化１９】
2011500086.tif 000021
を有するビンクリスチンと連結される、または組み合わせられる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化２０】
2011500086.tif 000022
を有するテモゾロマイド（メタゾラストン）と連結される、または組み合わせられる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ＺＫ−３０４７０９またはセリシクリブ（Ｒ−レスコビチン、ＣＹＣ−２０２）などのＣＤＫ阻害剤と連結される、または組み合わせられる。セリシクリブは構造：
【化２１】
2011500086.tif 000023
を有する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＤ０３２５９０１またはＡＺＤ−６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）などのＭＥＫ阻害剤と連結される、または組み合わせられる。ＰＤ０３２５９０１は構造：
【化２２】
2011500086.tif 000024
を有する。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化２３】
2011500086.tif 000025
を有するカペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロ−Ｎ−［（ペンチルオキシ）カルボニル］−シチジン）またはペメトレキセド（Ｌ−グルタミン酸，Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−，二ナトリウム塩，七水和物）と連結される、または組み合わせられる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、カンプトテシン(Beisler 1971; Stork 1971)と連結される、または組み合わせられる。カンプトテシンは構造：
【化２４】
2011500086.tif 000026
を有する。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、イリノテカン（Camptosar（登録商標）として販売；Pharmacia & Upjohn Co.; Kalamazoo， MI）；イリノテカンと５−フルオロウラシルとロイコボリンの組合せ；またはＰＥＧ標識イリノテカンと連結される、または組み合わせられる。イリノテカンは構造：
【化２５】
2011500086.tif 000027
を有する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、注入用フルオロウラシルおよびフォリン酸とともにオキサリプラチンからなるＦＯＬＦＯＸレジメン(Chaouche 2000; de Gramont 2000)と結合される。オキサリプラチンは構造：
【化２６】
2011500086.tif 000028
を有する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、タモキシフェン（AstraZeneca Pharmaceuticals LP; Wilmington， DEによりノルバデックス(Nolvadex)（登録商標）として販売）またはクエン酸トレミフェン（Shire US， Inc.; Florence， KYによりフェアストン(Fareston)（登録商標）として販売）などの抗エストロゲン作用薬と連結される、または組み合わせられる。タモキシフェンは構造：
【化２７】
2011500086.tif 000029
を有する。
【０１３５】
クエン酸トレミフェンは構造：
【化２８】
2011500086.tif 000030
を有する。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、アナストラゾール（AstraZeneca Pharmaceuticals LP; Wilmington， DEによりアリミデックス(Arimidex)（登録商標）として販売）、エキセメスタン（Pharmacia Corporation; Kalamazoo， MIによりアロマシン(Aromasin)（登録商標）として販売）またはレトロゾール（Novartis Pharmaceuticals Corporation; East Hanover， NJによりフェマーラ(Femara)として販売）などのアロマターゼ阻害剤と連結される、または組み合わせられる。アナストラゾールは構造：
【化２９】
2011500086.tif 000031
を有する。
【０１３７】
エキセメスタンは構造：
【化３０】
2011500086.tif 000032
を有する。
【０１３８】
レトロゾールは構造：
【化３１】
2011500086.tif 000033
を有する。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エストラジオール（Warner Chilcott， Inc.; Rockaway， NJによりエストロール(Estrol)（登録商標）として販売）または結合型エストロゲン（Wyeth Pharmaceuticals Inc.， Philadelphia， PAによりプレマリン(Premarin)（登録商標）として販売）などのエストロゲンと連結される、または組み合わせられる。ＤＥＳは構造：
【化３２】
2011500086.tif 000034
を有する。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ベバシズマブ、ＶＥＧＦＲ−２抗体ＩＭＣ−１Ｃ１１、その他のＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ−２５８、バタラニブ(Vatalanib)（ＰＴＫ／ＺＫ；ＣＧＰ−７９７８７；ＺＫ−２２２５８４）、ＡＧ−０１３７３６、３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロンまたはＶＥＧＦ受容体１と２の一部を含んでなる可溶性デコイ受容体であるＶＥＧＦ捕捉剤（ＡＶＥ−０００５）などの抗脈管形成薬と連結される、または組み合わせられる。ＣＨＩＲ−２５８は構造:
【化３３】
2011500086.tif 000035
を有する。
【０１４１】
バタラニブは構造：
【化３４】
2011500086.tif 000036
を有する。
【０１４２】
ＡＧ−０１３７３６は構造：
【化３５】
2011500086.tif 000037
を有する。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ＷＯ２００４／１３１４５：
【化３６】
2011500086.tif 000038
ＷＯ２００４／０９５４２：
【化３７】
2011500086.tif 000039
ＷＯ００／７１１２９：
【化３８】
2011500086.tif 000040
ＷＯ２００４／０９６０１：
【化３９】
2011500086.tif 000041
ＷＯ２００４／０１０５：
【化４０】
2011500086.tif 000042
ＷＯ０１／２９０２５：
【化４１】
2011500086.tif 000043
ＷＯ０２／３２８６１：
【化４２】
2011500086.tif 000044
および
ＷＯ０３／８８９００：
【化４３】
2011500086.tif 000045
で示されるコア構造を有する抗脈管形成薬と連結される、または組み合わせられる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、酢酸ゴセレリン（AstraZeneca UK Limited; Macclesfield， Englandによりゾラデックス(Zoladex)(登録商標）として販売）、酢酸ロイプロリド（Sanofi-Synthelabo Inc.; New York， NYによりエリガード(Eligard)（登録商標）として販売）またはパモ酸トリプトレリン（Pharmacia Company， Kalamazoo， MIによりトレルスター(Trelstar)として販売）などの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）またはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストと連結される、または組み合わせられる。
【０１４５】
酢酸ゴセレリンは［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］ＬＨＲＨの酢酸塩であり、化学名はｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ２アセテート［Ｃ５９Ｈ８４Ｎ１８Ｏ１４  Ｃ２Ｈ４Ｏ２）ｘ、ｘ＝１〜２．４］である。酢酸ゴセレリンの構造は、
【化４４】
2011500086.tif 000046
である。
【０１４６】
酢酸ロイプロリドはＬＨＲＨの合成ノナペプチドであり、化学名は５−オキソ−Ｌ−プロリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｎ−エチル−Ｌ−プロリンアミドアセテート（塩）である。酢酸ロイプロリドの構造は、
【化４５】
2011500086.tif 000047
である。
【０１４７】
パモ酸トリプトレリンは構造：
【化４６】
2011500086.tif 000048
を有する。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、スニチニブまたはリンゴ酸スニチニブと連結される、または組み合わせられる。スニチニブは構造：
【化４７】
2011500086.tif 000049
を有する。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、酢酸メドロキシプロゲステロン（Pharmacia & Upjohn Co.; Kalamazoo， MIによりプロベラ(Provera)（登録商標）として販売）、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（１７−（（１−オキソヘキシル）オキシ）プレグン−４−エン−３，２０−ジオン））、酢酸メゲストロールまたはプロゲスチンなどのプロゲステロン作用薬と連結される、または組み合わせられる。酢酸メドロキシプロゲステロンは構造：
【化４８】
2011500086.tif 000050
を有する。
【０１５０】
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロンは構造：
【化４９】
2011500086.tif 000051
を有する。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化５０】
2011500086.tif 000052
を有するラロキシフェン（Eli Lilly and Company; Indianapolis， INによりエビスタ(Evista)（登録商標）として販売）などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）と連結される、または組み合わせられる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ビカルタミド（AstraZeneca Pharmaceuticals LP; Wilmington， DEによりカソデックス(CASODEX)（登録商標）として販売）、フルタミド（２−メチル−Ｎ−［４−ニトロ−３  （トリフルオロメチル）  フェニル］プロパンアミド（Schering Corporation; Kenilworth， NJによりユーレキシン(Eulexin)（登録商標）として販売）、ニルタミド（Aventis Pharmaceuticals Inc.; Kansas City， MOによりニランドロン(Nilandron)（登録商標）として販売）または酢酸メゲストロール（Bristol-Myers Squibbによりメゲース(Megace)（登録商標）として販売）などの抗アンドロゲン作用薬と連結される、または組み合わせられる。ビカルタミドは構造：
【化５１】
2011500086.tif 000053
を有する。
【０１５３】
フルタミドは構造：
【化５２】
2011500086.tif 000054
を有する。
【０１５４】
ニルタミドは構造：
【化５３】
2011500086.tif 000055
を有する。
【０１５５】
酢酸メゲストロールは構造：
【化５４】
2011500086.tif 000056
を有する。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５（ムブリチニブ）、ＨＫＩ−２７２、ＯＳＩ−７７４（エルロチニブ；Hidalgo 2001）、ラパチニブ（ＧＷ２０１６；Rusnak 2001；Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／３５１４６号）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Erlichman 2001；Smaill 2000）、ＥＫＢ−５６９(Wissner 2003)、ＰＫＩ−１６６（ＣＧＰ−７５１６６）、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体(Abgenix， Inc.， Freemont， CA; Yang 1999; Yang 2001)、エルビタックス（ＩＭＣ−Ｃ２２５、セツキシマブ；米国特許第６，２１７，８６６号；Imclone， New York， NY）、ＧＷ−５７２０１６などの、ＥＧＦ受容体またはＨＥＲ２の作用と拮抗する１または複数の阻害剤、または任意の抗ＥＧＦＲもしくは抗ＨＥＲ２抗体と連結される、または組み合わせられる。
ＣＰ−７２４７１４は構造：
【化５５】
2011500086.tif 000057
を有する。
【０１５７】
ＴＡＫ−１６５（ムブリチニブ）は構造：
【化５６】
2011500086.tif 000058
を有する。
【０１５８】
ＨＫＩ−２７２は構造：
【化５７】
2011500086.tif 000059
を有する。
【０１５９】
ＯＳＩ−７７４（エルロチニブ）は構造：
【化５８】
2011500086.tif 000060
を有する。
【０１６０】
ラパチニブは構造：
【化５９】
2011500086.tif 000061
を有する。
【０１６１】
カネルチニブは構造：
【化６０】
2011500086.tif 000062
を有する。
【０１６２】
ＥＫＢ−５６９は構造：
【化６１】
2011500086.tif 000063
を有する。
【０１６３】
ＰＫＩ−１６６は構造：
【化６２】
2011500086.tif 000064
を有する。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化６３】
2011500086.tif 000065
を有する、ロナファルニブ（Schering-Plough， Kenilworth， NJによりサラサル(Sarasar)（登録商標）として販売）と連結される、または組み合わせられる。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、構造：
【化６４】
2011500086.tif 000066
または
【化６５】
2011500086.tif 000067
を有するＦＰＴ阻害剤と連結される、または組み合わせられる。
【０１６６】
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ＢＭＳ−２１４６６２（Hunt 2000; Dancey 2002；（Ｒ）−７−シアノ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−（１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル）−３−（フェニルメチル）−４−（２−チエニルスルホニル）−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン）またはＲ１５５７７７（チピファーニブ）；Garner 2002; Dancey 2002；（Ｂ）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン］；Johnson & Johnson， New Brunswick， NJによりザルネストラ(Zarnestra)として販売）などのＦＰＴ阻害剤と連結される、または組み合わせられる。ＢＭＳ−２１４６６２は構造：
【化６６】
2011500086.tif 000068
を有する。
【０１６７】
Ｒ１５５７７７は構造：
【化６７】
2011500086.tif 000069
を有する。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、アミフォスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４(Atadja 2004)、スベロイルアナリドヒドロキサム酸、バルプロ酸(Michaelis 2004)、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８(Furumai 2002)、ＳＵ１１２４８(Mendel 2003)、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレライド、アナストロゾール（AstraZeneca Pharmaceuticals LP， Wilmington， DEによりアリミデックス(Arimidex)（登録商標）として販売）、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチン(Garrido 1997)、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネート；ESP Pharma， Inc.， Edison， New Jerseyによりブスルフェックス(Busulfex)（登録商標）として販売）、サトラプラチン、カルボプラチン（Bristol-Myers Squibb， Princeton， NJによりパラプラチン(Paraplatin)（登録商標）として販売）、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（Novartis Pharmaceuticals Corporation， East Hanover， NJによりグリベック(Gleevec)（登録商標）として販売）、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン（Celgene Corporation， Warren， NJによりアルケラン（登録商標）により販売）、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド（Katz 1989；Novartis Pharm Corp.， E. Hanover， NJによりサンドスタチン(Sandostatin)ＬＡＲ（登録商標）デポーとして販売）、エドトレオチド（イットリウム−９０標識または非標識）、オキサリプラチン（Sanofi-Synthelabo Inc.， New York， NYによりエロキサチン(Eloxatin)（登録商標）として販売）、パミドロン酸（Novartis Pharmaceuticals Corp.， East Hanover， NJによりアレディア(Aredia)（登録商標）として販売）、ペントスタチン（Supergen， Dublin， CAによりニペント(Nipent)（登録商標）として販売）、プリカマイシン、ポルフィマー（Axcan Scandipharm Inc.， Birmingham， ALによりプロトフリン(Photofrin)（登録商標）として販売）、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ（Genentech， Inc.; South San Francisco， CAによりリツキサン(Rituxan)（登録商標）として販売）、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、サリドマイドとデキサメタゾンの組合せ、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、全てのトランス−レチノイン酸または１３−シス−レチノイン酸と連結される、または組み合わせられる。アミフォスチンは構造：
【化６８】
2011500086.tif 000070
を有する。
【０１６９】
ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４は構造：
【化６９】
2011500086.tif 000071
を有する。
【０１７０】
スベロイルアナリドヒドロキサム酸は構造：
【化７０】
2011500086.tif 000072
を有する。
【０１７１】
バルプロ酸は構造：
【化７１】
2011500086.tif 000073
を有する。
【０１７２】
トリコスタチンＡは構造：
【化７２】
2011500086.tif 000074
を有する。
【０１７３】
ＦＫ−２２８は構造：
【化７３】
2011500086.tif 000075
を有する。
【０１７４】
ＳＵ１１２４８は構造：
【化７４】
2011500086.tif 000076
を有する。
【０１７５】
ＢＡＹ４３−９００６は構造：
【化７５】
2011500086.tif 000077
を有する。
【０１７６】
ＫＲＮ９５１は構造：
【化７６】
2011500086.tif 000078
を有する。
【０１７７】
アミノグルテチミドは構造：
【化７７】
2011500086.tif 000079
を有する。
【０１７８】
アムサクリンは構造：
【化７８】
2011500086.tif 000080
を有する。
【０１７９】
アナグレライドは構造：
【化７９】
2011500086.tif 000081
を有する。
【０１８０】
アナストロゾーは構造：
【化８０】
2011500086.tif 000082
を有する。
【０１８１】
ブレオマイシンは構造：
【化８１】
2011500086.tif 000083
を有する。
【０１８２】
ブセレリンは構造：
【化８２】
2011500086.tif 000084
を有する。
【０１８３】
ブスルファンは構造：
【化８３】
2011500086.tif 000085
を有する。
【０１８４】
カルボプラチンは構造：
【化８４】
2011500086.tif 000086
を有する。
【０１８５】
カルムスチンは構造：
【化８５】
2011500086.tif 000087
を有する。
【０１８６】
クロラムブシルは構造：
【化８６】
2011500086.tif 000088
を有する。
【０１８７】
シスプラチンは構造：
【化８７】
2011500086.tif 000089
を有する。
【０１８８】
クラドリビンは構造：
【化８８】
2011500086.tif 000090
を有する。
【０１８９】
クロドロネートは構造：
【化８９】
2011500086.tif 000091
を有する。
【０１９０】
シクロホスファミドは構造：
【化９０】
2011500086.tif 000092
を有する。
【０１９１】
シプロテロンは構造：
【化９１】
2011500086.tif 000093
を有する。
【０１９２】
シタラビンは構造：
【化９２】
2011500086.tif 000094
を有する。
【０１９３】
ダカルバジンは構造：
【化９３】
2011500086.tif 000095
を有する。
【０１９４】
ダクチノマイシンは構造：
【化９４】
2011500086.tif 000096
を有する。
【０１９５】
ダウノルビシンは構造：
【化９５】
2011500086.tif 000097
を有する。
【０１９６】
ジエチルスチルベストロールは構造：
【化９６】
2011500086.tif 000098
を有する。
【０１９７】
エピルビシンは構造：
【化９７】
2011500086.tif 000099
を有する。
【０１９８】
フルダラビンは構造：
【化９８】
2011500086.tif 000100
を有する。
【０１９９】
フルドロコルチゾンは構造：
【化９９】
2011500086.tif 000101
を有する。
【０２００】
フルオキシメステロンは構造：
【化１００】
2011500086.tif 000102
を有する。
【０２０１】
フルタミドは構造：
【化１０１】
2011500086.tif 000103
を有する。
【０２０２】
ヒドロキシ尿素は構造：
【化１０２】
2011500086.tif 000104
を有する。
【０２０３】
イダルビシンは構造：
【化１０３】
2011500086.tif 000105
を有する。
【０２０４】
イフォスファミドは構造：
【化１０４】
2011500086.tif 000106
を有する。
【０２０５】
イマチニブは構造：
【化１０５】
2011500086.tif 000107
を有する。
【０２０６】
ロイコボリンは構造：
【化１０６】
2011500086.tif 000108
を有する。
【０２０７】
ロイプロリドは構造：
【化１０７】
2011500086.tif 000109
を有する。
【０２０８】
レバミゾールは構造：
【化１０８】
2011500086.tif 000110
を有する。
【０２０９】
ロムスチンは構造：
【化１０９】
2011500086.tif 000111
を有する。
【０２１０】
メクロレタミンは構造：
【化１１０】
2011500086.tif 000112
を有する。
【０２１１】
メルファランは構造：
【化１１１】
2011500086.tif 000113
を有する。
【０２１２】
メルカプトプリンは構造：
【化１１２】
2011500086.tif 000114
を有する。
【０２１３】
メスナは構造：
【化１１３】
2011500086.tif 000115
を有する。
【０２１４】
メトトレキサートは構造：
【化１１４】
2011500086.tif 000116
を有する。
【０２１５】
マイトマイシンは構造：
【化１１５】
2011500086.tif 000117
を有する。
【０２１６】
ミトタンは構造：
【化１１６】
2011500086.tif 000118
を有する。
【０２１７】
ミトキサントロンは構造：
【化１１７】
2011500086.tif 000119
を有する。
【０２１８】
ニルタミドは構造：
【化１１８】
2011500086.tif 000120
を有する。
【０２１９】
オクトレオチドは構造：
【化１１９】
2011500086.tif 000121
を有する。
【０２２０】
オキサリプラチンは構造：
【化１２０】
2011500086.tif 000122
を有する。
【０２２１】
パミドロン酸は構造：
【化１２１】
2011500086.tif 000123
を有する。
【０２２２】
ペントスタチンは構造：
【化１２２】
2011500086.tif 000124
を有する。
【０２２３】
プリカマイシンは構造(strcture)：
【化１２３】
2011500086.tif 000125
を有する。
【０２２４】
ポルフィマーは構造：
【化１２４】
2011500086.tif 000126
を有する。
【０２２５】
プロカルバジンは構造：
【化１２５】
2011500086.tif 000127
を有する。
【０２２６】
ラルチトレキセドは構造：
【化１２６】
2011500086.tif 000128
を有する。
【０２２７】
ストレプトゾシンは構造：
【化１２７】
2011500086.tif 000129
を有する。
【０２２８】
テニポシドは構造：
【化１２８】
2011500086.tif 000130
を有する。
【０２２９】
テストステロンは構造：
【化１２９】
2011500086.tif 000131
を有する。
【０２３０】
サリドマイドは構造：
【化１３０】
2011500086.tif 000132
を有する。
【０２３１】
チオグアニンは構造：
【化１３１】
2011500086.tif 000133
を有する。
【０２３２】
チオテパは構造：
【化１３２】
2011500086.tif 000134
を有する。
【０２３３】
トレチノインは構造：
【化１３３】
2011500086.tif 000135
を有する。
【０２３４】
ビンデシンは構造：
【化１３４】
2011500086.tif 000136
を有する。
【０２３５】
１３−シス−レチノイン酸は構造：
【化１３５】
2011500086.tif 000137
を有する。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、アブラキサンと連結される、または組み合わせて使用される。アブラキサンは、平均粒径がおよそ１３０ナノメートルのアルブミン結合型パクリタキセルを含んでなるパクリタキセルタンパク質結合粒子の注射用懸濁液である。アブラキサンは、静注前に２０ｍＬの０．９％塩化ナトリウム注射用ＵＳＰで再構成するための白〜黄色、無菌の凍結乾粉末として供給される。各単回使用バイアルには、１００ｍｇのパクリタキセルとおよそ９００ｍｇのヒトアルブミンが含まれる。再構成懸濁液１ミリリットル（ｍＬ）につき、５ｍｇのパクリタキセルを含む。アブラキサンは溶媒およびクレモフォール（ポリオキシエチル化ヒマシ油）不含である。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン  、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプトプリン(6-mecaptopurine)、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シミチジン、トラスツズマブ、デニロイキン、ディフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテジミブ(bortezimib)、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＢ、ＢＭＳ−２４７５５０(Lee 2001)、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン（３−ヒドロキシタモキシフェン）、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン（ＣＰ−３３６１５６）、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４(Thomas 2003)、ＶＸ−７４５(Haddad 2001)、ＰＤ  １８４３５２(Sebolt-Leopold 1999)、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６(Vlahos 1994)、ワートマニン、ＢＡＹ−４３−９００６(Wilhelm 2002)、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、Ｒａｆ阻害剤(Lowinger 2002)、フラボピリドール（Ｌ８６−８２７５／ＨＭＲ  １２７５；Senderowicz 2000）、ＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン；enderowicz 2000）、ｍＴＯＲ阻害剤のいずれも、ラパマイシン（シロリムス）、エベロリムス（ラパマイシンの４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）誘導体）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス；Sehgal 1994; Elit 2002）、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８またはＢＣ−２１０の１または複数と連結される、または組み合わせられる。ラパマイシン（シロリムス）は構造：
【化１３６】
2011500086.tif 000138
を有する。
【０２３８】
ＣＣＩ−７７９は構造：
【化１３７】
2011500086.tif 000139
を有する。
【０２３９】
ＡＰ−２３５７３は構造：
【化１３８】
2011500086.tif 000140
を有する。
【０２４０】
ＲＡＤ００１は構造：
【化１３９】
2011500086.tif 000141
を有する。
【０２４１】
ＡＢＴ−５７８は構造：
【化１４０】
2011500086.tif 000142
を有する。
【０２４２】
ＢＣ−２１０は構造：
【化１４１】
2011500086.tif 000143
を有する。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、スチリル置換ヘテロアリールＥＧＦＲ阻害剤を開示している米国特許第５，６５６，６５５号；ビス単環式および／または二環式アリールヘテロアリール炭素環式およびヘテロ炭素環式ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲ阻害剤を開示している米国特許第５，６４６，１５３号；ＥＧＦＲを阻害する三環式ピリミジン化合物を開示している米国特許第５，６７９，６８３号；受容体チロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体を開示している米国特許第５，６１６，５８２号；ＥＧＦＲを阻害する構造を有する化合物を開示しているFry 1994（Fry 1994の図１参照）；ＥＧＦＲを阻害するヘテロアリールエテンジイルまたはヘテロアリールエテンジイルアリール化合物を開示している米国特許第５，１９６，４４６号；およびＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲファミリーの受容体を阻害するＰＤ１６６２８５（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチルアミノエトキシ）フェニルアルニノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−オン）として同定された化合物を開示しているPanek 1997に示されている１または複数の化合物にと連結される、または組み合わせられる。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、ペグ化または非ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化または非ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ペグ化または非ペグ化インターフェロンα−２ｃ、ペグ化または非ペグ化インターフェロンαｎ−１、ペグ化または非ペグ化インターフェロンαｎ−３およびペグ化、非ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはアルブミン−インターフェロン−αの１または複数と連結される、または組み合わせられる。
【０２４５】
その他のインターフェロンαコンジュゲートは、インターフェロンαと水溶性ポリマーとをカップリングすることにより作製することができる。このようなポリマーの非限定例としては、ポリプロピレングリコールなどの他のポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが挙げられる。ポリアルキレンオキシド系ポリマーの代わりとして、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマーなどの有効非抗原性材料を使用することができる。このようなインターフェロンα−ポリマーコンジュゲートは、例えば、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，９１７、８８８号、ＥＰ出願第０２３６９８７号または第０５９３８６８号および国際公開第ＷＯ９５／１３０９０号に記載されている。ＰＥＧ１２０００−ＩＦＮα２ｂは、インターフェロンα−２ｂ分子のヒスチジン残基にＰＥＧポリマーを付着させることによって製造することができる。
【０２４６】
非経口投与に好適なペグ化インターフェロンαの医薬組成物は、無菌注射水中の、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩またはリン酸塩、例えば、リン酸水素ナトリウム／リン酸二水素ナトリウムバッファーなどの好適なバッファーと薬学上許容される賦形剤（例えば、スクロース）、担体（例えば、ヒト血漿アルブミン）、毒性薬剤（例えば、ＮａＣｌ）、保存剤（例えば、チメロサール(thimerosol)、クレゾールまたはベンジルアルコール）および界面活性剤（例えば、ツィーンまたはポリソルベート）を用いて処方することができる。ペグ化インターフェロンαは凍結乾燥粉末として２〜８℃の冷蔵下で保存することができる。再構成水溶液は２〜８℃間で保存した際に安定であり、再構成２４時間以内に使用される（例えば、米国特許第４，４９２，５３７号；同第５，７６２，９２３号および同第５，７６６，５８２号参照）。再構成水溶液はまた、インスリンなどの薬剤の送達に有用なものなどのプレフィルド多用量シリンジ中で保存してもよい。典型的な好適なシリンジは、Novo Nordiskから入手可能なNOVOLET（登録商標）Novo PenまたはSchering Corporation， Kenilworth， NJから入手可能なREDIPEN（登録商標）などのペン型シリンジに取り付けられたプレフィルドバイアルを含んでなるシステムを含む。その他シリンジシステムは、分離したコンパートメント内に希釈剤と凍結乾燥ペグ化インターフェロンα粉末を含有するガラスカートリッジを含んでなるペン型シリンジを含む。
【０２４７】
制吐薬を含んでなる組成物は、化学療法の一般的な副作用である悪心を予防または治療するのに有用である。よって、ある特定の実施形態では、１または複数の抗癌化学療法薬および１または複数の制吐薬（限定されるものではないが、カソピタント(casopitant)(GlaxoSmithKline)、ネツピタント(MGI-Helsinn)およびその他のＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン（MGI Pharmaによりアロキシ(Aloxi)として販売）、アプレピタント（Merck and Co.; Rahway， NJによりエメンド(Emend)として販売）、ジフェンヒドラミン（Pfizer; New York， NYによりベナドリル(Benadryl)（登録商標）として販売）、ヒドロキシジン（Pfizer; New York， NYによりアタラックス(Atarax)（登録商標）として販売）、メトクロプラミド（AH Robins Co，; Richmond， VAによりレグラン(Reglan)（登録商標）として販売）、ロラゼパム（Wyeth; Madison， NJによりアチバン(Ativan)として販売）、アルプラゾラム（Pfizer; New York， NYによりザナックス(Xanax)（登録商標）として販売）、ハロペリドール（Ortho-McNeil; Raritan， NJによりハルドール(Haldol)として販売）、ドロペリドール（イナプシン(Inapsine)（登録商標））、ドロナビノール（Solvay Pharmaceuticals， Inc.; Marietta， GAによりマリノール(Marinol)（登録商標）として販売）、デキサメタゾン（Merck and Co.; Rahway， NJによりデカドロン(Decadron)（登録商標）として販売）、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン（Pfizer; New York， NYによってメドロール(Medrol)（登録商標）として販売）、プロクロルペラジン（Glaxosmithkline; Research Triangle Park， NCによりコンパジン(Compazine)（登録商標）として販売）、グラニセトロン（Hoffmann-La Roche Inc.; Nutley， NJによりカイトリル(Kytril)（登録商標）として販売）、オンダンセトロン（Glaxosmithkline; Research Triangle Park， NCによりゾフラン(Zofran)（登録商標）として販売）、ドラセトロン（Sanofi-Aventis; New York， NYによりアンゼメット(Anzemet)として販売）、トロピセトロン（Novartis; East Hanover， NJによりノボバン(Navoban)（登録商標）として販売）と連結された、または組み合わせられた本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる組成物が提供される。また、本明細書では、このような組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳類対象）に投与することにより、癌を処置する方法が提供される。
【０２４８】
癌処置のその他の副作用としては、赤血球および白血球細胞欠乏症が含まれる。よって、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファまたはダルベポエチンアルファなどの赤血球および白血球欠乏症を処置する薬剤と連結された、または組み合わせられた本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる組成物が提供される。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、利尿薬、アドレナリン受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アルドステロンアンタゴニスト、血管拡張薬または中枢作用性アドレナリン作動薬などの１または複数の抗高血圧薬と連結された、または組み合わせられた抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる組成物が提供される。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、１または複数の生理学上許容される成分を含んでなる医薬組成物の一部として投与され得る。よって、本明細書において、ある特定の実施形態では、このような組成物およびこのような組成物を処方する方法が提供される。本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントと１または複数の生理学上許容される成分を含んでなる組成物は、高いＶＥＧＦ発現レベルおよび／またはシグナル伝達、および／または増強された脈管形成に関連する疾患の処置において使用可能である。
【０２５１】
本明細書に開示される医薬組成物において用いるための生理学上許容される成分は、例えば、薬学上許容される液体、ゲルまたは固体担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤または無毒の補助物質、当技術分野で公知のその他の成分またはそれらの種々の組合せを含み得る。好適な成分は、例えば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、保存剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤または乳化剤を含み得る。
【０２５２】
好適な抗酸化剤は、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルを含み得る。本明細書に開示されるように、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを含んでなる組成物中にメチオニンなどの１または複数の抗酸化剤を含むと、該抗体または抗原結合フラグメントの酸化が低減される。この酸化の低減は結合親和性の損失を防ぎ、または減らし、それにより抗体の安定性が向上し、保存期間が最大となる。よって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントとメチオニンなどの１または複数の抗酸化剤を含んでなる組成物が提供される。さらに、該抗体または抗原結合フラグメントとメチオニンなどの１または複数の抗酸化剤とを混合することにより、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントの酸化を防ぐ、保存期間を延長する、かつ／またはその有効性を向上させるための方法が提供される。
【０２５３】
好適な担体は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、無菌水注射液またはデキストロースおよび乳酸リンゲル液の注射液などの水性ビヒクル；植物起源の硬化油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油または落花生油などの非水性ビヒクル；静菌濃度または静真菌濃度の抗菌剤；塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張剤；リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーなどのバッファー；重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；塩酸プロカインなどの局所麻酔薬；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの沈殿防止剤および分散剤；ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）などの乳化剤；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤またはキレート剤；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含み得る。担体として用いられる抗菌剤は多用量容器中の医薬組成物に加えることができ、フェノール類またはクレゾール類、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを含み得る。好適な無毒の補助物質は、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を含み得る。
【０２５４】
本明細書において「治療上有効な量」または「有効用量」とは、疾患または症状を処置するのに有効な薬剤の用量または濃度を表す。例えば、癌を処置するための本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントの使用に関して、治療上有効な量は、腫瘍の全部または一部を根絶する、腫瘍成長を阻害もしくは緩慢化する、癌症状を媒介する細胞の成長もしくは増殖を阻害する、腫瘍細胞の転移を阻害する、腫瘍もしくは癌症状に関連するいずれかの徴候もしくはマーカーを改善する、または、腫瘍または癌症状の発症を予防するもしくは遅延させる、またはそれらの組合せを行うことができる抗体または抗原結合フラグメントの用量または濃度である。
【０２５５】
本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントの有効用量は、当技術分野で周知の方法を用いて決定され得る。例えば、有効用量は、特定の用量で投与した後に、対象において処置される腫瘍が萎縮するかどうか、成長を停止するかどうか、またはより緩慢に成長するかどうかを判定することにより設定され得る。腫瘍の大きさおよび進行は、例えば、Ｘ線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＣＴスキャンまたは視診（例えば、外科的手段）などの当技術分野で周知の方法を用いて判定することができる。例えば、処置される癌が多形性膠芽腫である場合、臨床医は、ＣＴまたはＭＲＩスキャンを用いて腫瘍を画像化することにより、処置の進行をモニタリングすることができる。腫瘍成長の徴候の出現（例えば、頭痛、挙動または運動の変化）に関する患者問診も情報が得られる。臨床医の所見に応じて、投与計画は相応に変更可能である。別の例では、処置される癌が黒色腫である場合、臨床医は黒色腫病巣の視診によって処置の進行をモニタリングすることができる。臨床医は、例えば、大きさ、厚さ、成長パターンの変化または外観の変化などの様々な視覚的パラメーターを評価することができる。臨床医の所見に応じて、投与計画は相応に変更可能である。
【０２５６】
一般に、腫瘍の大きさおよび増殖はチミジンＰＥＴスキャンを用いて測定することができる（例えば、Wells 1996参照）。チミジンＰＥＴスキャンは一般に、［２−１１Ｃ］−チミジンなどの放射性トレーサーの注射の後に対象の身体のＰＥＴスキャンを行うことを必要とする(Vander Borght 1991a; Vander Borght 1991b)。使用可能なその他のトレーサーとしては、［１８Ｆ］−ＦＤＧ（１８−フルオロデオキシグルコース）、［１２４Ｉ］ＩＵｄＲ（５−［１２４Ｉ］ヨード−２’−デオキシウリジン）、［７６Ｂｒ］ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン）、［１８Ｆ］ＦＬＴ（３’−デオキシ−３’フルオロチミジン）または［１１Ｃ］ＦＭＡＵ（２’−フルオロ−５−メチル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）が含まれる。
【０２５７】
本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントの有効用量は、例えば、体重、齢、過去の病歴、その時点の投薬、対象の健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、ならびに投与経路および腫瘍発達の程度などの当技術分野で公知の種々の因子によって個々異なる。用量は、これらの、またその他の状況または必要により示された場合には、当業者（例えば、医師または獣医師）により、比例して減らしたり増やしたりすることができる。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療上有効な用量で投与され得る。これらの実施形態のある特定のものでは、該抗体または抗原結合フラグメントは約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、これらの実施形態のある特定のものでは、用量は１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。所定の用量は、例えば、１日に１回、１日に２回以上、１週間に２回以上、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回または２か月以上おきに１回などの種々の間隔で投与され得る。ある特定の実施形態では、投与用量は処置コースの間に変化させ得る。例えば、ある特定の実施形態では、初期投与用量はその後の投与用量より高くてもよい。ある特定の実施形態では、処置コースの間で投与用量は対象の反応に応じて可変である。
【０２５９】
投与計画は最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために調整可能である。例えば、単回用量を投与してもよいし、または数回の分割用量を経時的に投与してもよい。
【０２６０】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントとある特定の実施形態では種々の化学療法薬を含んでなる医薬組成物は、製薬分野で周知の方法によって作製することができる。例えば、Gilman， et al.， （編） (1990)， The Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版， Pergamon Press; A. Gennaro（編），Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版， (1990)， Mack Publishing Co.， Easton， Pennsylvania.; Avis， et al.， （編） (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker， New York; Lieberman， et al.， （編） (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker， New York; and Lieberman， et al.， （編） (1990)， Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker， New York参照。
【０２６１】
本明細書に開示される抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内（静注を含む）、筋肉内または皮内注射）または非非経口（例えば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸または局所）経路などの当技術分野で公知のいずれの経路で投与してもよい。抗体または抗原結合フラグメントが注射により投与される実施形態では、注射用医薬組成物は、溶液、懸濁液またはエマルションを作製するのに好適な例えば、溶液、懸濁液、エマルションまたは固体形態など、いずれの慣例の形態で調製してもよい。注射製剤は、注射準備済み無菌溶液、使用前に溶媒と合わせるだけの凍結乾燥粉末などの無菌乾燥可溶性製品（皮下錠剤を含む）、注射準備済み無菌懸濁液、使用前にビヒクルと合わせるだけの無菌乾燥不溶性製品および無菌エマルションを含み得る。これらの溶液は水性または非水性のいずれであってもよい。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、単位用量非経口製剤がアンプル、バイアルまたは針付きシリンジにパーケージされる。当分野で知られ、かつ実施されているように、非経口投与用製剤は全て無菌でなければならない。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、無菌凍結乾燥粉末は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを好適な溶媒に溶解させることにより調製される。この溶媒は、安定性を高める賦形剤または粉末もしくは粉末から調製される再構成溶液のその他の薬理学的成分を含み得る。使用可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、デキストロース、ソルビトール(sorbital)、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の好適な薬剤が挙げられる。溶媒は、例えばクエン酸塩、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなどのバッファー、または当業者には公知のその他のバッファーを含んでよく、一実施形態では、およそ中性のｐＨである。次に、溶液を濾過除菌した後に当業者に公知の標準的条件下で凍結乾燥させると所望の製剤が得られる。一実施形態において、結果として得られる溶液は、凍結乾燥用のバイアルに分配される。各バイアルは、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその組成物の単回用量または複数用量回分を含み得る。正確なサンプルの抜き取りおよび正確な投与を助けるため、用量または用量セットに必要とされる量よりも少し多い量（例えば、約１０％）で過剰充填したバイアルが許容される。凍結乾燥粉末は適当な条件下、例えば薬４℃〜室温で保存することができる。
【０２６４】
凍結乾燥粉末の注射水による再構成は、非経口投与に使用するための製剤を提供する。一実施形態において、再構成のために、凍結乾燥粉末を滅菌水または他の適当な液体担体に加える。正確な量は、所定の選択された療法によって異なり、経験的に決定することができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを発現させるための発現系が提供される。これらの発現系は、該抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含んでなるベクターおよびこれらのベクターを含んでなる宿主細胞を含む。本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは当技術分野で公知の方法を用いて単離または合成し、増幅またはクローニング用の複製可能なベクターに挿入することができる。該抗体の軽鎖可変（ＶＬ）重鎖可変（ＶＨ）鎖をコードするポリヌクレオチドは単一のベクターから発現させてもよいし、または２つの別個のベクターを用いて発現させた後にin vitroで組み立ててもよい。ある特定の実施形態では、それらは同じ細胞内で２つの別個のベクターから同時に発現させ、細胞内で組み立てることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号または同第５，５９５，８９８号参照）。好適なベクターは、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始配列、ならびに表現型選択のためのマーカーをコードする遺伝子などの１または複数の調節配列の種々の構成を含み得る。本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントの発現に好適な骨格を有するベクターは当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，１９２，７３７号参照）。ある特定の実施形態では、該ベクターは、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリンのｔｈｅ重鎖（ＣＨ）および軽鎖（ＣＬ）の定常領域をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、該ベクターは抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のみを発現してもよく、この場合、この発現ポリペプチドは完全な抗体ではなくＦｖフラグメントを含んでなる。ベクターはポリヌクレオチド配列の増幅または発現に好適な宿主細胞に挿入することができる。これらの宿主細胞は抗体生産のため、例えば、最小必須培地（ＭＥＭ）(Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Sigma)およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１０(Sigma)などの当技術分野で公知の様々な培地で培養することができる。培地には例えば、ホルモン、増殖因子、塩、バッファー、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、グルコースまたはその他のエネルギー源などの様々な薬剤を添加することができる。温度およびｐＨなどの培養条件は、当技術分野で周知のパラメーターを用いて調整することができる。発現の後、本明細書で提供される１または複数の抗体または抗原結合フラグメントを、当技術分野で公知の方法を用いて精製することができる。
【０２６６】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、癌細胞への特異的送達のためのコンジュゲートを含んでなり得る。さらに、抗体または抗原結合フラグメントの腫瘍細胞への結合を用いて宿主の免疫応答を動員することもできる。この宿主の免疫応答は、本明細書で提供される完全ヒト抗体または抗原結合フラグメントに対応する１つの結合部位と別の抗原を認識する別の結合部位を有する二価抗体を用いることによって増強され得る。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、高フコース含量を有するオリゴ糖を含んでなり得る。他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、例えばフコース不含Ｆｃ抗体などの低フコース含量を有してもよい。低フコース抗体は、例えば、ラットＹＢ２／０細胞(Shinkawa 2003)またはＣＨＯ変異細胞系統Ｌｅｃ１３(Shields 2002)などの、フコシル化活性の低い細胞系統を用いて作製することができる。
【０２６８】
以下の実施例は、特許請求される発明をより良く例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。下記の特定の組成物、材料および方法は全体的にまたは部分的に本発明の範囲内にある。これらの特定の組成物、材料および方法は本発明を限定するものではなく、単に本発明の範囲内にある特定の実施形態を例示するに過ぎない。当業者ならば、発明の能力を行使することなく、また、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発することができる。まだ本発明の範囲内に属しながらも、本明細書に記載の手順において多くの改変がなされ得ることが理解されよう。このような改変が本発明の範囲内に含まれることは、発明者の意図するところである。
【実施例】
【０２６９】
実施例１：ｈＶＥＧＦ１６５と結合する抗体の作出：
ｈＶＥＧＦ１６５と結合する能力を有する抗体フラグメントのパネルを同定するために、ヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレーライブラリーを、固定したｈＶＥＧＦ１６５に対してパンニングした。パンニングは標準的なプロトコールを用いて行った（例えば、Methods in Molecular Biology， vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols Edited by: P.M. O’Brien and R. Aitken， Humana Press;， "Panning of Antibody Phage-Display Libraries，" Coomber， D.W.J.， pp. 133-145および"Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens，" Chames， P.， et al.， pp. 147-157参照）。
【０２７０】
要するに、ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＡＸＩＳＯＲＰプレートの３つのウェルを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度の組換えｈＶＥＧＦ１６５（R&D Systems、カタログ番号２９３−ＶＥ）５０μｌを用いてコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、空いている結合部位をＰＢＳ中５％のミルクを用い、室温で１時間ブロックした。次いで、５％ミルク／ＰＢＳ中のおよそ２００μｌのファージライブラリーをこれらのブロックしたウェルに加え、室温でおよそ１〜２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、結合したファージを標準的な方法（例えば、Sambrook and Russell， Molecule Cloning: A Laboratory Manual， 第3版， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001
参照）を用いて溶出した。溶出されたファージを対数増殖期の大腸菌(E. coli)ＴＧ１宿主細胞への３７℃で１時間の感染によって増幅させた。感染ＴＧ１細胞を、２，５００ＲＰＭで５分の遠心分離により回収し、１５ｃｍ、２ＹＴ−アンピシリン−２％グルコース寒天プレート上に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。その後、増幅したファージを用いてこのパンニングプロセスを繰り返した。
【０２７１】
この、パンニング、溶出および増幅のサイクルを、濃度を低下させながら（例えば、ラウンド１では５０μｇ／ｍｌ  ｈＶＥＧＦ１６５、ラウンド２では１０μｇ／ｍｌ、次に、ラウンド３では１０μｇ／ｍｌ）３ラウンド繰り返し、その時点で、播種されたＴＧ１細胞からの単一コロニーを用いて９６ウェルプレート中の培地に植菌した。微小培養物をＯＤ６００で０．６まで増殖させ、その時点で、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により可溶性ｓｃＦｖの発現を誘導し、シェーカーにて３０℃で一晩インキュベートした。細菌を回転沈降させ、周辺質抽出物を用い、ｓｃＦｖの固定ｈＶＥＧＦ１６５への結合を標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。
【０２７２】
実施例２：ｓｃＦｖによるｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ受容体への結合のブロック
ＥＬＩＳＡによりｈＶＥＧＦ１６５結合を示す実施例１からのファージクローンを、それらのｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ−Ｒ１および／またはＶＥＧＦ−Ｒ２への結合をブロックする能力に関して、マイクロプレートに基づく競合的スクリーニングＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ(Perkins Elmer， Waltham， MA)を用いて試験した。
【０２７３】
要するに、ビオチン化ｈＶＥＧＦ１６５溶液を１：１の容量で実施例１からの周辺質抽出物に、終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えた。この混合物１００μｌを、ＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２（R&D Systems：ＶＥＧＦ−Ｒ１／Ｆｌｔ−１、カタログ番号３２１−ＦＬ；ＶＥＧＦ−Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、カタログ番号３５７ＫＤ）でコーティングしたプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー中１：２５０希釈のユーロピュリウム−ストレプトアビジン(Europrium-Streptavidin)を５０μｌ／ウェルで加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＤＥＬＦＩＡ洗浄バッファーで洗浄した。ＤＥＬＦＩＡエンハンスメント・バッファーを５０μｌ／ウェルで加え、プレートを室温で５分間インキュベートした。プレートを時間分解蛍光ジェミニ(Time-Resolved Fluorescence Gemini)プレートリーダーで読み取った。
【０２７４】
実施例３：ｓｃＦｖのｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧへの変換：
ｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２への結合を６０％以上阻害した実施例２からの２つのｓｃＦｖ、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２を、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび／またはＩｇＧへの変換のために選択した。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の重鎖可変領域（重鎖ＣＤＲを含む）および軽鎖可変領域（軽鎖ＣＤＲを含む）を図１に示す。これらの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）はＫａｂａｔのナンバリングシステム(Kabat， E.A.， et al. 1987， Sequences of Proteins of Immunological Interest， US Department of Health and Human Services， NIH， USA)で決定された。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列はそれぞれ配列番号  ６、７および８で示される。ＸＰＡ．１０．０６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１２、１３および１４で示される。ＸＰＡ．１０．０７２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列はそれぞれ配列番号９、１０および１１で示される。
【０２７５】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２のｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質への変換のため、ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡを、ガンマ−２（γ２）重鎖定常領域遺伝子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするように改変された真核生物発現ベクター（米国特許第７，１９２，７３７号；ＷＯ２００４／０３３６９３）にクローニングした。
【０２７６】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２のＩｇＧへの変換のため、重鎖および軽鎖双方の可変領域を、カッパ（κ）、ラムダ（λ）またはガンマ−２（γ２）重鎖および軽鎖定常領域遺伝子をコードする真核生物発現ベクター（ＵＳ２００６／０１２１６０４）にクローニングした。
【０２７７】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧ抗体を、従前に記載されているように（ＵＳ２００６／０１２１６０４）、２９３Ｅ細胞で一時的に発現させた。培養６日目にトランスフェクト細胞からの上清を採取し、Ａタンパク質クロマトグラフィーによりＩｇＧを精製した。
【０２７８】
実施例４：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧ結合動態のＢｉａｃｏｒｅ分析：
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００とＡ／Ｇタンパク質(Piece)を高密度でフローセルに固定化したＣＭ５センサーチップ(Biacore)を用いて評価した。これらの試験のための希釈バッファーおよびランニングバッファーは、１：５０希釈のＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（登録商標）(Ckemicon)を含むＨＢＳ−ＥＰ(Biacore)であった。抗体捕捉は、およそ５０〜７０ＲＵの抗体捕捉を達成するため、様々な容量で、希釈ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−Ｆｃを２０μｌ／分でフローセル２（ｆｃ２）に注入することにより行った。抗体濃度はおよそ０．５μｇ／ｍｌであった。ｓｆ２１細胞から発現されたｈＶＥＧＦ１６５を、３０μｇ／ｍｌで５分かけて、ｆｃ１および２に対してＫｉｎｊｅｃｔ態様（解離１５分）を用いて注入した。３倍希釈系のｈＶＥＧＦ１６５の４種類の希釈液、濃度５μｇ／ｍｌ（１１９ｎＭ）、１．６６７μｇ／ｍｌ（３９．７ｎＭ）、０．５５μｇ／ｍｌ（１３．２ｎＭ）および０．１８５μｇ／ｍｌ（４．４ｎＭ）を調製した。再生は、５０μｌ／分で１００ｍＭ  ＨＣｌを２回、各１２秒間注入することで行った。データは、対照フローセルとブランク注入を二重に参照した後、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２と１：１ラングミュア(Langmuir)相互作用モデルに当てはめた。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−Ｆｃは、ｈＶＥＧＦ１６５に対して高く、かつ、ほぼ同一の結合親和性を示した。
【０２７９】
同様のプロトコールを用いて、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２の結合動態を評価した。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２は双方とも、類似の、低い一桁ナノモルの親和性でｈＶＥＧＦ１６５と特異的に結合し（図２〜４）、ｍＶＥＧＦ１６５とは弱い結合（＞１００ｎＭ）を示すだけであった。この抗体は双方とも、ベバシズマブと同等の結合動態を示した（表２）。
【表２】
2011500086.tif 000144
【０２８０】
実施例５：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧによる、ｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ受容体への結合のブロック：
ｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ−Ｒ１および／またはＶＥＧＦ−Ｒ２への結合をブロックするＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２の能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００をＣＭ５チップとともに用いて評価した。
【０２８１】
ＶＥＧＦ受容体(R&D Systems)をＣＭ５チップに、アミンカップリングによっておよそ１５，０００の密度で固定した(Biacore)。ＶＥＧＦ−Ｒ２をｆｃ２に固定し、ＶＥＧＦ−Ｒ１をｆｃ４に固定した。フローセル１および３は参照とし、受容体を固定したフローセルと同様に活性化およびブロックした。ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー中０．１５μｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５を抗体サンプルまたはバッファーと１：１で混合した。最終抗体濃度は１５、５、１．６６７、０．５５６、０．１８５、０．０６１７、０．０２０６および０μｇ／ｍｌであった。サンプルを、Ｂｉａｃｏｒｅ分析の開始前に少なくとも１時間インキュベートした。サンプルは全て２回注入し、各セットの抗体反復にはそれ自身の陽性対照と陰性対照（それぞれ、抗体を含まずＶＥＧＦを含む、およびＶＥＧＦを含まない）を含んだ。サンプルは全てのフローセルに１０μｌ／分で１．５分間注入した。再生はグリセン(Glycene) ｐＨ１．７５を５０μｌ／分で１２秒間注入して行った。
【０２８２】
データ分析に関しては、結合相の結合の直線部分の傾き（３０秒〜１分）を直線の当てはめによって求めた。各点からのシグナルは、最も近いブランクを差し引いた後、適合する１００％シグナル（抗体を含まない）対照で割り、そのサイクルの阻害パーセントを求めた。データはGraphPad Prismでプロットし、Ｓ字用量反応曲線を用いて当てはめを行い、ＥＣ５０を算出した。
【０２８３】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２は双方とも、ｈＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２への結合をベバシズマブと同等のレベルでブロックした（図５〜６、表３）。
【表３】
2011500086.tif 000145
【０２８４】
実施例６：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２により結合されるｈＶＥＧＦ１６５エピトープの分析
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２により認識されるｈＶＥＧＦ１６５エピトープが直鎖であるかコンフォメーションをとるかを調べるため、非還元型または還元型の加熱変性組換えｈＶＥＧＦ１６５のサンプル２００ｎｇ３つに対し、独立した３つＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行った。電気泳動タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ−Ｐ膜に転写し、これらのブロットをＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ、ＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧまたはベバシズマブ抗体とハイブリダイズさせ、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。結合は、増強された化学発光（ＥＣＬ）基質(Pierce)を用いて検出した。
【０２８５】
ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２およびベバシズマブは全て、ｈＶＥＧＦ１６５上の直鎖エピトープと結合する（図７）。
【０２８６】
実施例７：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｈＶＥＧＦ１２１エピトープ結合試験：
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２がベバシズマブと同じｈＶＥＧＦ１２１エピトープと結合するかどうかを調べるため、種々のｈＶＥＧＦ１２１突然変異体を用いて３回のＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを行った。
【０２８７】
これまでの突然変異分析では、ＶＥＧＦ残基Ｍ８１、Ｇ８８、Ｑ８９およびＧ９２がベバシズマブのｈＶＥＧＦ１６５への結合に重要であることが示されている(Fuh 2006)。これらの残基がＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２結合に重要であるかどうかを調べるため、以下のｈＶＥＧＦ１２１突然変異体：ｈＶＥＧＦ１２１−Ｍ８１Ａ、ｈＶＥＧＦ１２１−Ｑ８９Ａ、ｈＶＥＧＦ１２１−Ｇ９２ＡおよびｈＶＥＧＦ１２１−Ｇ８８Ｓを作出した。突然変異体をＣＨＯ−Ｋ１細胞内で一時的に発現させ、細胞上清をＥＬＩＳＡによる結合分析のために採取した。
【０２８８】
マイクロタイタープレートを１、２または５μｇ／ｍｌ濃度のＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２、ベバシズマブまたは対照ポリクローナルヤギ抗ヒトＶＥＧＦ（ＰＡＢ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを室温で１時間、ＰＢＳ中３０％のＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋ（登録商標）試薬(Millipore)でブロックし、各突然変異体では３０、６０または１００μｌのＣＨＯ−Ｋ１培養上清、または１μｇ／ｍｌの野生型ｈＶＥＧＦ１２１、組換えｈＶＥＧＦ１６５または組換えｍＶＥＧＦ１６５を適当なウェルに加えた。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、室温で１時間、ビオチン化ヤギポリクローナル抗ＶＥＧＦ抗体とともにインキュベートした。検出はＨＲＰ−結合型ストレプトアビジン、次いでＴＭＢ発色基質(Calbiochem)を製造者のプロトコールに従って用いて行った。
【０２８９】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２のｈＶＥＧＦ１２１突然変異体への結合パターンはベバシズマブの場合と同様であり（表４〜５）、この抗体が重複のある、または類似のエピトープと結合することを示す。
【表４】
2011500086.tif 000146
【表５】
2011500086.tif 000147
【０２９０】
実施例８：ＸＰＡ．１０．０６４とＸＰＡ．１０．０７２の組織交差反応性：
凍結された正常なヒト組織アレイ（ＴＭＡ）を用い、単色発色技術(single-color chromogenic technique)を用い、ＸＰＡ．１０．０６４とＸＰＡ．１０．０７２の免疫組織化学（ＩＨＣ）反応を評価した。ＴＭＡは３２の正常なヒト組織種を含み、各種は２〜３人の異なるドナーからの組織からなる。ＴＭＡに加えて、正常ヒト肝臓、腎臓、ファローピウス管、膵臓、尿管および副腎のより多数の切片が、ＴＭＡからの染色結果を確認するために、あるいはＴＭＡに含まれない組織に代えて用いられた。陽性対照は、ＵＶ−樹脂スライド上にスポットされたｈＶＥＧＦタンパク質および抗ｈＶＥＧＦウサギモノクローナル抗体による強い染色により評価される高レベルのｈＶＥＧＦを発現する腎臓癌腫組織を含んだ。
【０２９１】
ＴＭＡおよび正常ヒト組織およびｈＶＥＧＦタンパク質スポットおよび腎臓癌腫陽性対照を、ヒト・オン・ヒトＩＨＣ染色プロトコールを用いて、２０μｇ／ｍｌのＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２（ヒトＩｇＧ２）またはベバシズマブを用いて染色した。ヒト扁桃炎症例も、染色プロトコールの有効性をモニタリングするために含めた。最終的なプロトコールは、扁桃組織のＢ細胞領域中の、組織内在性免疫グロブリンと反応性を示さなかった。陰性対照抗体はヒトＩｇＧＩおよびＩｇＧ２(Sigma， St. Louis， MO)ならびにヒトＫＬＨ抗体ＣＨＯ．ＫＬＨＧ２．６０（ＩｇＧ２）であった。
【０２９２】
ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２およびベバシズマブは全て、ｈＶＥＧＦタンパク質スポットと、０〜４＋の尺度で２〜−３＋（ここで、４＋は、最も強い染色強度を示す）で反応した。腎臓癌腫組織に関して、ベバシズマブは不確かな染色を示したが、ＸＰＡ．１０．０６４とＸＰＡ．１０．０７２は腫瘍細胞の細胞質を染色した。
【０２９３】
ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２はいずれの組織要素も染色せず、最小のバックグラウンド染色を示すに過ぎなかった。ＣＨＯ．ＫＬＨＧ２．６０は、副腎皮質の細胞、食道、乳腺、膵臓、前立腺、胃、甲状腺、尿管、子宮頸部(ureter cervix)およびファローピウス管の上皮細胞と反応性を示した。この反応性のため、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２は、参照陰性対照として用いられた。
【０２９４】
ＸＰＡ．１０．０６４は、試験抗体の中で、最も幅広い組織反応性スペクトルを示した。ＸＰＡ．１０．０６４は、膀胱、ＧＩ管、ファローピウス管、乳腺、前立腺、尿管および子宮の平滑筋細胞で、また、ファローピウス管、前立腺、皮膚、小腸、胃、甲状腺、尿管、子宮の子宮内膜腺および子宮頸部の上皮細胞で、強く染色した。加えて、ＸＰＡ．１０．０６４は、小脳、大脳皮質および脊髄のニューロンおよび神経線維のいくつか、ならびに心筋および骨格筋、下垂体の細胞、腎糸球体、肝臓シヌソイド内皮、胸腺の間質細胞、肺のマクロファージおよび副腎皮質の細胞を染色した。ＸＰＡ．１０．０７２は、小脳、大脳皮質および脊髄の神経繊維で強く染色した。ＸＰＡ．１０．０７２はまた、ＧＩ管、ファローピウス管、前立腺、尿管および子宮の平滑筋、食道、ファローピウス管、乳腺、前立腺、胃、小腸、甲状腺および尿管の上皮細胞、肺のマクロファージおよび胎盤の繊維芽細胞／組織球も染色した。ベバシズマブは、全ての正常ヒト組織で染色陰性を示した。
【０２９５】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の免疫組織化学的反応性がオン・ターゲット結合を示すかオフ・ターゲット結合を示すかを調べるために、多色免疫蛍光に基づくアプローチを利用した。このアプローチは、抗体を試験するための、既知の「ゴールドスタンダード(gold standard)」である抗ＶＥＧＦ抗体の免疫反応性の同時比較に基づく。試験抗体のオン・ターゲット反応性は、「ゴールドスタンダード」抗体との同時局在として現れ、一報、同時局在が無ければオフ・ターゲット反応性を示す。
【０２９６】
陽性対照細胞（Ｄｕ１４５）および陰性対照細胞（Ｈｅｋ２９３）からの細胞ペレットの凍結切片を、最初の実験で用いられたものと同じ発色ＩＨＣ方法論を用いて、市販のマウス抗ヒト抗ＶＥＧＦ抗体（BD Pharmingen、クローンＧ１５３−６９４）で染色した。この抗体はＤｕ１４５細胞を染色したが、Ｈｅｋ２９３細胞は染色しなかった。加えて、この抗体で染色した結腸の凍結切片は、良好な内部陰性対照を含む、上皮および腫瘍関連マトリックス成分において特徴的な反応性パターンを示した。従って、Ｇ１５３−６９４を、「ゴールドスタンダード」陽性対照抗体とした。
【０２９７】
ゼノンＩｇＧ標識キット(Molecular Probes)のプロトコールを用い、一次抗体を、蛍光色素をコンジュゲートされたＦｃを標的とする抗ヒトＦａｂとプレインキュベートした後、反応しなかったＦａｂをモル過剰量の適当な正常血清で中和した。染色試薬として蛍光抗体−Ｆａｂ複合体を用い、その後、ＤＡＰＩによる核の対比染色を行った。結腸腺癌からの凍結切片（組織番号４５５８）を、これらの同時局在試験の対照ＶＥＧＦ陽性組織として用いた。ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２抗体を赤色(Alexa Fluor594)で標識し、「ゴールドスタンダード」抗体は緑色(Alexa Fluor488)で標識した。このアッセイを逆の色の組合せを用いて繰り返したが、本質的に同じ結果が得られた。ライカＴＣＳ−ＳＰモデルＤＭ  ＲＸＥレーザー走査共焦点顕微鏡およびライカ・コンフォーカル・ソフトウェア、バージョン２．０(Leica Microsystems， Wetzler， Germany)を用いて画像を取得した。複数の視野を４００倍で画像化し（少なくとも３回）、代表的な視野を、イメージ・プロ・ソフトウェア(Image Pro software)(Media Cybernetics， Silver Spring， MD)を用い、同時局在ｍに関して分析した。ベバシズマブは結腸癌と凍結ペレット切片の双方における最初のＩＨＣ研究の全てで本質的に陰性だったので、それは同時局在試験に含めなかった。
【０２９８】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２は、同等の高い程度の同時局在を示し、ＸＰＡ．１０．０６４は最も高い強度の組織染色を示した（図８〜９）。
【０２９９】
実施例９：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害：
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＩｇＧ２を、ＨＵＶＥＣの増殖をブロックするそれらの能力に関して試験した。
【０３００】
プールされたＨＵＶＥＣ（Clonetics番号ＣＣ−２５１９）を、ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ−２（ｒｈＥＧＦ、ｒｈＦＧＦ、ｒｈＶＧＥＦ、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ＩＧＦ、ヘパリン、ゲンタマイシン／アンホテリシンおよび２％ＦＢＳを添加）を含むＥＣＧＭ完全培地（Clonetics番号ＣＣ−３０２４）で増殖させた。細胞をＴ−７５フラスコ当たり２〜３×１０５細胞で播種し、３〜４日目に密集に達した。密集前の単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＰＢＳを含有する完全培地で中和した。
【０３０１】
ｈＶＥＧＦ１６５の存在下でのＨＵＶＥＣ増殖を測定するため、ＨＥＫ２９３細胞から発現されたｈＶＥＧＦ１６５の１６点用量滴定を、基本増殖培養液で希釈することによって設定した（最終的に０〜２００ｎｇ／ｍｌ、２×希釈、２×濃度、５０μｇ／ウェル）。ＨＵＶＥＣ細胞を、冷基本培地／０．１％ＢＳＡ中に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させ、５０μｌの細胞（１×１０４ｃ／ｗ）を、最終容量１００μｌ／ウェルとなるようにｈＶＥＧＦ１６５滴定プレートの各ウェルに加えた。外側のウェルにＰＢＳを満たし、脱水を防ぐためにプレートをパラフィルムで密閉した。プレートを９６時間、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした後、およそ１５分〜２０分かけて室温とした。Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ（TTG、Promega）を解凍し、基質温度にし、１００μｌの基質／バッファー混合物を各ウェルに加えた。このプレートを１〜２分間、オービタルプレートシェーカー上で振盪し、各ウェルから１５０μｌを、白底、白壁のプレートに移し、暗所で５〜１０分間インキュベートした。このプレートを１秒積算の照度計で読み取った。
【０３０２】
増殖阻害アッセイのため、ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２およびベバシズマブの滴定物を作製した（最終的に０〜５０μｇ／ｍｌ、３×希釈、４×濃度、最終容量２５μｇ／ウェル）。抗体をｈＶＥＧＦ１６５とともに１：１でプレインキュベートした。プレインキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＶＥＧＦ／抗体複合体を、５０μｌ／ウェルの再懸濁ＨＵＶＥＣ細胞に加え、そのプレートを９６時間インキュベートし、上記のようにＴｉｔｅｒＧｌｏバッファーで処理した。
【０３０３】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２  ｓｃＦｖおよびＩｇＧ２は、ＨＵＶＥＣの増殖を阻害した。ＩｇＧ２の結果を図１０および表６に示す。
【表６】
2011500086.tif 000148
【０３０４】
実施例１０：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２によるＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化の阻害：
ｈＶＥＧＦ１６５によるＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化を阻害するＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の能力をＥＬＩＳＡにより分析した。
【０３０５】
溶解液プレートを作製するため、２〜６継代のＨＵＶＥＣ細胞を溶解し、ＥＧＭ２完全培地(Lonza)のＴＣフラスコに播種し、１〜２継代の間増殖させた。密集前の細胞をトリプシン処理し、完全培地で中和し、ＰＢＳで２回洗浄し、計数した。細胞を、２４ｗ形式（三反復ウェル）にて完全培地中１×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を室温のＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＥＢＭ２培地(Lonza)中で５時間飢餓状態にした。ＰＢＳをデカントし、細胞を用量滴定ｈＶＥＧＦ１６５（刺激）または複合体形成前のＶＰＡ．１０．０６４＋ｈＶＥＧＦ１６５、ＶＰＡ．１０．０７２＋ｈＶＥＧＦ１６５もしくはベバシズマブ＋ｈＶＥＧＦ１６５（阻害）とともに５分間インキュベートした。ＶＰＡ．１０．０６４＋ｈＶＥＧＦ１６５およびＶＰＡ．１０．０７２＋ｈＶＥＧＦ１６５は、２倍の用量滴定の抗体と２倍ｈＶＥＧＦ１６５を１：１混合し（終濃度：２０ｎｇ／ｍｌ）、３７℃で２４時間インキュベートすることにより作製した。ｈＶＥＧＦ１６５、ＶＰＡ．１０．０６４＋ｈＶＥＧＦ１６５およびＶＰＡ．１０．０７２＋ｈＶＥＧＦ１６５をデカントし、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。６５μｇ／ウェルの溶解バッファー／ウェル（１％ ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）を加え、細胞を、必要とされるまで、３０分間４℃で揺動した。
【０３０６】
ＶＥＧＦ−Ｒ２に特異的な捕捉抗体（R&D Systems、ＶＥＧＦ−Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、カタログ番号３５７ＫＤ）を、ＰＢＳ中８．０ｇ／ｍｌの実施濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルでコーティングした。ＶＥＧＦ−Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は、リン酸化および非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２の双方と結合する。このプレートを密閉し、一晩インキュベートした。各ウェルを吸引し、洗浄バッファーで５回洗浄し、そのプレートを３００μｇ／ウェルのブロックバッファーを加え、室温で１〜２時間インキュベートすることによりブロックした。各ウェルを吸引し、洗浄バッファーで５回以上洗浄し、各ウェルに１００μｌのＨＵＶＥＣ溶解液を加えた。このプレートを室温で２時間インキュベートし、ウェルを吸引し、洗浄バッファーで５回洗浄した。リン酸化チロシンに特異的なＨＰＲコンジュゲート検出抗体１００μｌを各ウェルに加え、プレートを覆い、室温で２時間、直射光を遮ってインキュベートした。ウェルを吸引し、洗浄バッファーで５回洗浄し、基質溶液１００μｌを各ウェルに加えた。このプレートを室温で２０分間、直射光を遮ってインキュベートし、停止液５０μｌを各ウェルに加えた。各ウェルの光学濃度をマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。
【０３０７】
ｈＶＥＧＦ１６５の用量滴定物で処置されたＨＵＶＥＣはリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２の増加を示した（図１１）。ベバシズマブ＋ｈＶＥＧＦ１６５の用量滴定物で処理されたＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化の低下を示した（図１２）。ＸＰＡ．１０．０６４＋ｈＶＥＧＦ１６５またはＸＰＡ．１０．０７２＋ｈＶＥＧＦ１６５の用量滴定物で処理されたＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化の低下を示した。各抗体の結果を図１３にまとめる。
【０３０８】
実施例１１：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２による脈管形成の阻害：
マトリゲル（登録商標）プラグアッセイを用いて、in vivoにおいて脈管形成を阻害するＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の能力を測定した。
【０３０９】
６〜７週齢の雌ＮＵ／ＮＵマウスの腹部に、脈管形成を誘導するためのヒトＶＥＧＦを産生する、２×１０６のＤＵ１４５細胞を含む０．５ｍｌのマトリゲル（登録商標）(BD Biosciences， San Jose， CA)をｓ．ｃ．注射した。０日目と３日目に、マウスにビヒクル対照または０．１、１、または５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２もしくはベバシズマブをｉ．ｐ．注射した。７日目に、マウスを屠殺し、マトリゲル（登録商標）プラグを摘出し、秤量し、撮影した。プラグは、以下のスキーム：０は、着色または明らかな血管がない；１は、着色とわずかな血管をうかがわせる；２は、黄色から赤色ではっきり識別できる血管がある；そして、３は、均一な赤またはピンク色で、濃い血管がある、に基づいて、０〜３の視覚的スコアを与えた（図１４）。プラグは、プラグの順序をばらばらにした写真を受け取った盲検スコアラーによって評価された。
【０３１０】
ＸＰＡ．１０．０６４の投与は、全ての供試用量で脈管形成に有意な減少をもたらし、一報、ＸＰＡ．１０．０７２の投与は、１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇで有意な減少をもたらした（図１５および１６）。脈管形成阻害のレベルは、ベバシズマブの存在下で見られたものと同等であった。
【０３１１】
マウス血清中のＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０７２およびベバシズマブ濃度は、最後に抗体を投与してから４日目にＥＬＩＳＡにより測定した。供試したいずれの用量でも、３つに抗体間の抗体レベルに有意な差は無かった。
【０３１２】
実施例１２：ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２による腫瘍成長の阻害：
腫瘍成長を阻害するＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の能力を、従前に開示されたプロトコール(Liang 2006)を用い、Ａ６７３横紋筋肉腫腫瘍成長モデルで試験した。培養液中で維持されたＡ６７３細胞を密集まで増殖させた後に採取し、無菌の５０％マトリゲル（登録商標）に再懸濁させた。異種移植は、マトリゲル（登録商標）中の５×１０６個の細胞を６週間齢の雌ヌードマウスの横腹にｓ．ｃ．注射することにより確立した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した際に、マウスを１０匹ずつの８群に無作為に分け、ビヒクルのみ（群１）、０．５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２（群２）、５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２（群３）、０．５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２（群４）、５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０７２  ＩｇＧ２（群５）、５ｍｇ／ｋｇのイソ型対照抗ＫＬＨ  ＩｇＧ２（群６）、０．５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（群７）、または５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（群８）を用いて、１８日間、週に２回（計６回の投与）ｉ．ｐ．注射した。最後の投与の２４時間、７２時間および１６８時間後に血液および組織サンプルを採取した。
【０３１３】
ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２の投与は、供試した双方の用量で有意にin vivo腫瘍成長阻害をもたらした。双方の抗体の成長阻害レベルは、供試した全ての用量で、ベバシズマブで見られたレベルよりもわずかに高かった。血清レベルは、所定の用量で投与された全ての抗体に関して同等であった（０．５ｍｇ／ｋｇの血清レベルはおよび５〜７μｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｋｇの血清レベルはおよび７５〜１００μｇ／ｍｌ）。
【０３１４】
実施例１３：親和性成熟：
親和性を至適化するために、ＸＰＡ．１０．０６４に関して親和性成熟を行った。ｓｃＦｖライブラリーを、標準的な分子生物学技術（例えば、Clackson & Lowman， Phage Display - A Practical Approach (Oxford University Press， 2004)参照）を用いたＨＣＤＲ３のランダム突然変異誘発により作出した。１０アミノ酸ＣＤＲ全体をカバーするため、５アミノ酸の２ブロックでＨＣＤＲ３を無作為化し、ライブラリーＨ３Ｂ１（ＨＣＤＲ３のＮ末端５アミノ酸ブロック）とＨ３Ｂ２（ＨＣＤＲ３のＣ末端５アミノ酸ブロック）を得た。両ブロックで、実施例１に記載されているものと同様の技術を用い、ファージ選択を行った。標的抗原のコーティング濃度は一連のパンニングのラウンドごとに引き下げた。
【０３１５】
ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合のｋｏｆｆが親抗体よりも向上を示した５つのｓｃＦｖクローンを、実施例３に記載されているものと同様の技術を用い、ＩｇＧへ変換した。これらのＩｇＧのＶＥＧＦ結合親和性を、超低密度抗原表面に抗体を注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００（登録商標）にて試験した。ヒトまたはネズミＶＥＧＦ１６５を標準的アミンカップリング法によってＣ１（平坦カルボキシ表面）チップのフローセルに固定した。各抗原およそ８５ＲＵを固定し、参照フローセルを活性化し、ブロックした。抗体を２種類の異なる濃度で４００秒間、チップ表面に注入し、その後、解離をモニタリングした。データはＳｃｒｕｂｂｅｒ（登録商標）により二重参照法を用い、１：１相互作用で当てはめを行って分析した。再生は５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む９０ｍＭ  ＨＣｌで行った。
【０３１６】
親和性成熟クローンＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０はそれぞれｈＶＥＧＦ１６５と、親ＸＰＡ．１０．０６４またはベバシズマブよりも大きい親和性で結合した（表７）。ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０のＨＣＤＲ３アミノ配列をそれぞれ配列番号１５〜１９で示す。ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０の完全重鎖配列をそれぞれ配列番号２０〜２４で示す。ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０の軽鎖配列は、ＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０７２（配列番号５）と同一である。これらの５つの親和性成熟抗体は全て、ＨＣＤＲ３にメチオニン残基を含む。
【表７】
2011500086.tif 000149
【０３１７】
親ＸＰＡ．１０．０６４および親和性成熟クローンＸＰＡ．１０．０６４．０６およびＸＰＡ．１０．０６４．０７はそれぞれ、ｍＶＥＧＦ１６５に対しては弱い結合（＞１００ｎＭ）を示すに過ぎなかった（表８）。
【表８】
2011500086.tif 000150
【０３１８】
実施例１４：親和性成熟ＸＰＡ．１０．０６４によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害：
親和性成熟ＸＰＡ．１０．０６４  ＩｇＧ２を、上記の実施例９に記載されているものと同様のプロトコールを用い、ＨＵＶＥＣの増殖をブロックするそれらの能力に関して試験した。ＸＰＡ．１０．０６４、ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７、ＸＰＡ．１０．０６４．１０およびベバシズマブの滴定物を作製し、これらの抗体をｈＶＥＧＦ１６５とともに２時間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、ＶＥＧＦ／抗体複合体を、懸濁したＨＵＶＥＣ細胞に加えた。実験は、各抗体につき４回繰り返した。
【０３１９】
各抗体に関する個々の結果を図１８〜２３に示し、これらの結果を図２４にまとめる。親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０はそれぞれ、ＨＵＶＥＣ増殖を親ＸＰＡ．１０．０６４よりも高い程度で阻害した。各抗体の幾何平均ＩＣ５０を表９に示す。表９に示されているＰ値は、ベバシズマブと比較した場合の、各抗体のｌｏｇ（ＩＣ５０）に対する一対試験間片側ｔ検定に基づくものである。この分析では、親和性成熟ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０抗体は統計学的に互いに異ならなかった。
【表９】
2011500086.tif 000151
実施例１５：ＸＰＡ．１０．０６４．０６による腫瘍成長の阻害：
腫瘍成長を阻害するＸＰＡ．１０．０６４．０６の能力を、上記の実施例１２に述べられているものと同じＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍成長モデルを用いて試験した。０日目に始め、５０％マトリゲル（登録商標）中、２．５×１０６の腫瘍細胞を、６週齢のヌードマウスの正中胸椎領域にｓ．ｃ．注入した。３日目、腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達した際に、マウスを２０匹ずつの７群に無作為に分け、０．１、０．５または５ｍｇ／ｋｇのイソ型対照抗ＫＬＨ  ＩｇＧ２、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、または０．１、０．５または５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブを週に２回、ｉ．ｐ．注入した。腫瘍サイズを３、７、１０、１４、１７、２１、２４、２８および３１日目に測定した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した場合にはその際にマウスを屠殺した。各マウスにつき、最終の腫瘍測定の後に腫瘍および血清サンプルを採取した。
【０３２０】
ＸＰＡ．１０．０６４．０６およびベバシズマブは双方とも腫瘍成長を用量依存的に阻害した（図２５〜２７）。０．５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６により処理は１７日まで腫瘍退縮をもたらし、腫瘍サイズは２００ｍｍ３未満のままであった（図２５〜２７）。０．１または０．５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６で処理したマウスは、１７、２１、２４、２８および３１日目に、同じ用量のベバシズマブで処理したマウスよりも有意に小さい腫瘍を示した（図２５〜２７）。０．１ｍｇ／ｋｇのベバシズマブで処理した３匹のマウスと対照抗体で処理した３匹は、２４日目に、腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたことから屠殺しなければならず、一方、ＸＰＡ．１０．０６４．０６で処理したマウスには、本試験過程でこの閾値に達したものは無かった。
【０３２１】
０．１ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６で処理したマウスにおける２４日目（全ての動物が生存していた最後の測定日）の腫瘍成長阻害率％（％ＴＧＩ）（５５％）は、５倍用量のベバシズマブで見られたもの（０．５ｍｇ／ｋｇで５０％）と同等であった。同様に、０．５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６で処理したマウスにおける％ＴＧＩ（８５％）は、１０倍用量のベバシズマブで処理したマウスで見られたもの（５ｍｇ／ｋｇで９５％）とろ同等であった。これらの結果はＸＰＡ．１０．０６４．０６がin vivo腫瘍成長低下においてベバシズマブよりも少なくとも５倍有効であることを示す。２４日目の各抗体の腫瘍成長阻害率％の結果を表１０にまとめる。
【表１０】
2011500086.tif 000152
【０３２２】
各抗体による腫瘍成長の遅延を、抗体および対照による処理の後に腫瘍が５００ｍｍ３に達するまでにかかる日数の違いとして算出した。ＸＰＡ．１０．０６４．０６の腫瘍成長の遅延はＢＭ−１より、０．５ｍｇ／ｋｇ用量（それぞれ１４日と５日）および０．１ｍｇ／ｋｇ用量（それぞれ７日と２日）で有意に長かった。これらの結果は、抗体を同じ用量で投与した場合、ＸＰＡ．１０．０６４．０６はベバシズマブよりも少なくとも２〜３倍長い時間、腫瘍成長を特定の大きさに遅延させることを示す。結果を表１１にまとめる。
【表１１】
2011500086.tif 000153
【０３２３】
抗体／用量について、２８日目に、時間に対する腫瘍容積に基づく容量曲線下面積（ＡＵＣ）の算出を行った。０．５ｍｇ／ｋｇのＢＭ−１のＡＵＣは、同じ用量のＸＰＡ．１０．０６４．０６のそれよりも有意に高かった（それぞれ８８６５と５５１７）。その差は顕著なものではなかったが、ＢＭ−１のＡＵＣはまた、０．１ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６よりも高かった（それぞれ９６３８と８７０３）。結果を表１２にまとめる。
【表１２】
2011500086.tif 000154
【０３２４】
腫瘍成長を阻害するＸＰＡ．１０．０６４．０６の能力をさらにＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌モデルで試験した。予備的な結果は、０．１、０．５または５ｍｇ／ｋｇのＸＰＡ．１０．０６４．０６の週に２回投与では、３５日まで腫瘍サイズに統計学的に有意な低下をもたらさないことを示した。同じ濃度のベバシズマブでも同様の結果が得られた。
【０３２５】
実施例１６：親和性成熟抗体の酸化の阻害：
上記の実施例１３で述べたように、親和性成熟抗体ＸＰＡ．１０．０６４．０３、ＸＰＡ．１０．０６４．０４、ＸＰＡ．１０．０６４．０６、ＸＰＡ．１０．０６４．０７およびＸＰＡ．１０．０６４．１０はそれぞれ、ＨＣＤＲ３に、親抗体には存在しないメチオニン残基（具体的には、残基１０１）を含む。メチオニン残基の酸化は、保存中のタンパク質製品にとって一般的な劣化経路である。
【０３２６】
親和性成熟抗体に対するメチオニン酸化の影響を試験するため、ＸＰＡ．１０．０６４．０６および親ＸＰＡ．１０．０６４を双方とも酸化剤ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシダーゼ（ｔＢＨＰ）に曝した。各メチオニン残基で起こった酸化の程度をトリプシンマッピングとその後の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した。結果を表１３にまとめる。両抗体とも、  ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ  酸化  ａｔ  メチオニン残基４８と８１に酸化を示し、メチオニン残基７０に測定可能な酸化は無かった。１０１番のＸＰＡ．１０．０６４．０６における余分なメチオニン残基は有意な酸化度を示した。
【表１３】
2011500086.tif 000155
【０３２７】
ｈＶＥＧＦ１６５に対するこれらの酸化抗体の結合動態をＢｉａｃｏｒｅにより分析した。ＸＰＡ．１０．０６４の酸化はｈＶＥＧＦ１６５結合動態にほとんど影響しなかったが（図２８Ａ）、ＸＰＡ．１０．０６４．０６の酸化はin vitroにおけるＶＥＧＦ結合親和性に有意な低下をもたらした（図２８Ｂ）。
【０３２８】
酸化に関連する問題を克服し、長期保存のための親和性成熟抗体の安定性を高めるため、ＸＰＡ．１０．０６４．０６と抗酸化剤を含んでなる製剤を試験した。１０ｍＭのＬ−ヒスチジンおよび１４０ｍＭのＬ−アルギニン（ｐＨ６．０）中、１ｍｇ／ｍｌのＸＰＡ．１０．０６４およびＸＰＡ．１０．０６４．０６を化学的ストレスまたは熱ストレスによって酸化させた。化学的ストレスでは、抗体を室温で一晩、５ｍＭのＬ−メチオニンの存在下または不在下で０．１％のｔＢＨＰとともにインキュベートした。熱ストレスでは、抗体を４０℃で４週間、５ｍＭのＬ−メチオニンの存在下または不在下、ポリソルベート中でインキュベートした。ｈＶＥＧＦ１６５と結合する抗体の能力をＢｉａｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡにより分析した。抗体製剤中のメチオニンの存在は、熱ストレスの存在下でｈＶＥＧＦ１６５結合親和性を保ち（図２９Ａ、２９Ｂおよび３０Ａ）、また、結合親和性に対する化学的ストレスの負の影響を低減した（図３０Ｂ）。結果を表１４にまとめる。
【表１４】
2011500086.tif 000156
【０３２９】
実施例１７：ＸＰＡ．１０．０６４のさらなる親和性成熟：
ＸＰＡ．１０．０６４の重鎖可変領域にさらなる突然変異を導入することができる。具体的には、ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＨＣＤＲ３のメチオニン残基をアラニン、リシン、プロリン、トレオニンおよびロイシンの１または複数に突然変異させることができる。これらの突然変異体のＨＣＤＲ３アミノ配列はそれぞれ配列番号２５〜２９で示す。得られたＨＣＤＲ  配列を含む抗体に対して結合分析を行い、ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性を決定した。ｈＶＥＧＦ１６５に対する高い親和性と１０−５よりも速い解離速度を示す抗体をＩｇＧに形式変更し、ＨＵＶＥＣの増殖、脈管形成、腫瘍成長、および／またはｈＶＥＧＦ１６５により誘導されるＶＥＧＦ−Ｒ２のリン酸化を阻害するそれらの能力を決定するために、機能分析を行った。
【０３３０】
実施例１８：ＸＰＡ．１０．０６４．０６の発現：
ＣＨＯ−Ｋ１細胞内でＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２を発現させるために第一のベクターを構築した。このベクターｐＭＸＳＰ１１７は、それぞれγ−２定常領域およびκ定常領域に融合されたＸＰＡ．１０．０６４．０６重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、各領域はヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあり、マウス軽鎖３’非翻訳領域を伴う。このベクターはＧ４１８耐性形質転換体の選択のためにｎｅｏ遺伝子を含む。環状および線状化形態のｐＭＸＳＰ１１７の構造をそれぞれ図３１Ａおよび３１Ｂに示す。ｐＭＸＳＰ１１の構築前に、ＸＰＡ．１０．０６４．０６重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ図３２Ａおよび３２Ｂに示されるように、ｔｈｅ重鎖（γ−２）定常領域および軽鎖（κ）定常領域を含むモジュラー発現ベクターにクローニングした。抗体シグナル配列を含む重鎖可変領域は、ＳａｌＩ／ＢｌｐＩフラグメントとして重鎖モジュラーベクターにクローニングした。抗体シグナル配列を軽鎖可変領域は、ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩフラグメントとして軽鎖モジュラーベクターにクローニングした。
【０３３１】
ｎｅｏ遺伝子の代わりに、ヒスチジン耐性をコードするｈｉｓＤ遺伝子（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）を有すること以外はｐＭＸＳＰ１１７と同じ構造を有する第二のベクターｐＭＸＳＰ１１９を二段階で構築した。第一段階は、ＸＰＡ．１０．０６４．００６重鎖転写単位を、ｈｉｓＤ遺伝子を含むベクターセグメントと組み合わせてベクターｐＭＸＳＰ１１８を作出することを含んだ。第二段階は、ＸＰＡ．１０．０６４．０６軽鎖転写単位を、ＸＰＡ．１０．０６４．０６重鎖転写単位とｈｉｓＤ遺伝子を含むｐＭＸＳＰ１１８由来のベクターセグメントと組み合わせてｐＭＸＳＰ１１９を作出することを含んだ。
【０３３２】
ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞系統を開発した。トランスフェクション前に、非トランスフェクト細胞のリサーチ・セル・バンクから得た細胞を解凍し、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２血清不含培地(SAFC Biosciences， Lenexa， KS)で増殖させた。ＸＰＡ．１０．０６４．０６の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を、直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；２５，０００ＭＷ；Polysciences， Warrington， PA）を用い、ＸｂａＩ消化により線状化したｐＭＸＳＰ１１７でトランスフェクトすることにより、動物産物不含培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した（図３１Ｂ）。動物産物不含培地で３日間インキュベートした後、それらの細胞を、０．８ｍｇ／ｍｌのジェネティシン(Geneticin)（登録商標）および１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地に懸濁させ、９６ウェルプレートに播種した。単一のコロニーを含むウェルを、孔の深い９６ウェルプレートの、ＦＢＳ不含ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地に移した。ＥＬＩＳＡによりさらなるスクリーニングを行った後、上位生産クローンを、培養物１０ｍｌを含む５０ｍｌ減圧管および培養物２５ｍｌを含む１２５ｍｌ振盪フラスコで発現に関して試験した。
【０３３３】
生産能に基づいて選択したこのｐＭＸＳＰ１１７による最初のトランスフェクションから得られた上位生産株のいくつかを、ＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２を生産する目的で、生産培地に適応させた。生産レベルをさらに増大させるため、上位ジェネティシン耐性生産株を、選択マーカーが異なること以外は同じ重鎖配列および軽鎖配列を発現する付加的ベクター（例えば、ヒスチジノール耐性をコードするベクターｐＭＸＳＰ１１９）で再びトランスフェクトする。このｐＭＸＳＰ１１９ベクターをＸｂａＩ消化により線状化する。動物産物不含培地で３日間インキュベートした後、それらの細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン、８ｍＭのヒスチジノールおよび１％のＦＢＳを添加したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地に懸濁させ、９６ウェルプレートに播種する。ＥＬＩＳＡにより高生産株と同定された単一のコロニーを含むウェルを孔の深い９６ウェルプレートの、ＦＢＳ不含ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地に移す。ＥＬＩＳＡによりさらなるスクリーニングを行った後、上位生産クローンを振盪フラスコで発現に関して試験する。増殖能および生産能に基づいて選択したこの再トランスフェクションから得られた上位生産株のいくつかを、振盪フラスコ培養およびバイオリアクターでの増殖および生産を評価する目的で、動物産物不含培地に適応させる。リサーチ・セル・バンクとして、これらの上位株を生産培地に適応させたものが準備される。これらの試験の結果に基づき、１つのクローンがマスター・セル・バンク（ＭＣＢ）の作製のために選択され、これがＧＭＰ基準(Good Manufacturing Practice)下でのＸＰＡ．１０．０６４．０６  ＩｇＧ２の製造の開始点となる。
【０３３４】
実施例１９：ＸＰＡ．１０．０６４．０６の精製：
実施例１８に記載されているＣＨＯ−Ｋ１細胞など、ＸＰＡ．１０．０６４．０６またはそのフラグメントを発現する細胞は、以下の手順を用いて精製することができる。発酵が完了した後、デプスフィルター(CUNO， Meriden， CT)、次いで荷電メンブランフィルターそして除菌０．２μｍフィルターを含んでなる濾過系で濾過することにより、細胞培養物を明澄化し、採取する。細胞不含明澄培養液Ａタンパク質アフィニティーカラムに乗せ、その後、平衡化バッファーで洗浄する。抗体をｐＨ３〜４の範囲の低ｐＨバッファーで溶出した後、ｐＨ３．８＋／−０．２で最大６０分ウイルスの不活性化を行う。ウイルスを不活性化したこのプールを、ｐＨと伝導率に関して調整し、次いで、抗体がカラムを通過し、不純物が結合するフロースルーモードにて陰イオン交換カラムに乗せる。陰イオン交換カラムからの流出物を、凝集塊、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの不純物を除去する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム、次いでウイルス粒子を除去するためのＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ノーマル・フロー・パルボウイルス（ＮＦＰ）フィルター(Millipore)などのナノフィルターによる濾過でさらに精製する。限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を用い、このナノ濾過抗体プールを目的濃度に調製し、バッファーを調製バッファーに換え、原薬物質（ＢＤＳ）を得る。
【０３３５】
以上は単に本発明の様々な実施形態を例示することを目的とするものである。上述の具体的な改変は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な等価物、変更および改変が行えることは自明であり、このような等価実施形態が本明細書に含まれることも理解されよう。本明細書に引用されている全ての参照文献は、あたかも本明細書に全てが示されているように、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
【参照文献】
【０３３６】
1.  Al-Lazikani， B.， et al. 1997. J Mol Biol 273:927-948.
2.  Amoroso， A.， et al. 1997. Eur Rev Med Pharmacol Sci 1:17-25.
3.  Ashida， S.， et al. 2003. J Urol 169:2089-2093.
4.  Atadja， P.， et al. 2004. Cancer Res 64:689-695.
5.  Azzazy， H.E.， Highsmith， W.E. Jr. 2002. Clin Biochem 35:425-445.
6.  Beisler， J.A. 1971. J Med Chem 14:1116-1118.
7.  Berkman， R.A.， et al. 1993. J Clin Invest 91:153-159.
8.  Brown， L.F.， et al. 1993. Cancer Res 53:4727-4735.
9.  Brown， L.F.， et al. 1995. Human Pathol 26:86-91.
10.  Chaouche， M.， et al. 2000. Am J Clin Oncol 23:288-289.
11.  Chothia， C.， et al. 1985. J Mol Biol 186:651-663.
12.  Chothia， C.， Lesk， A.M. 1987. J Mol Biol 196:901-917.
13.  Chothia， C.， et al. 1989. Nature 342:877-883.
14.  Cumbers， S.J.， et al. 2002. Nat Biotechnol 20:1129-1134.
15.  Dancey， J.E. 2002. Curr Pharm Des 8:2259-2267.
16.  de Gramont， A.， et al. 2000. J Clin Oncol 18:2938-2947.
17.  Dimmeler， S.， Dernbach， E.， Zeiher， A.M. 2000. FEBS Lett 477:258-262.
18.  Dupont， J.， et al. 2005. Proc Am Soc Clin Oncol 23:199s.
19.  Dvorak， H.F.， et al. 1995. Am J Pathol 146:1029-1039.
20.  Elit， L. 2002. Curr Opin Investig Drugs 3:1249-1253.
21.  Erlichman， C.， et al. 2001. Cancer Res 61:739-748.
22.  Erikkson， U.， Alitalo， K. 1999. Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57.
23.  Ferrara， N. 1999. Curr Top Microbiol Immunol 237:1-30.
24.  Ferrara， N.， et al. 2004. Nat Rev Drug Discov 3:391-395.
25.  Fishwild， D.M.， et al. 1996. Nat Biotechnol 14:845-851.
26.  Fry， D.W.， et al. 1994. Science 265:1093-1095.
27.  Fuh， G.， et al. 2006. J Biol Chem 281:6625-6631.
28.  Furumai， R.， et al. 2002. Cancer Res 62:4916-4921.
29.  Garner， R.C.， et al. 2002. Drug Metab Dispos 30:823-830.
30.  Garrido， J.L.， et al. 1997. Cytobios 90:47-65.http://www.pnas.org/cgi/external_ref?access_num=A1997WF08700013&link_type=ISI
31.  Giri， J.G.， et al. 1994. EMBO J 13:2822-2830.
32.  Haddad， J.J. 2001. Curr Opin Investig Drugs 2:1070-1076.
33.  Hamers-Casterman， C.， et al. 1993. Nature 363:446-448.
34.  Harris， A.L. 2000. Oncologist 5 Suppl 1:32-36.
35.  Hawkins， R.E.， Russell， S.J.， Winter， G. 1992. J. Mol Biol. 226:889-896.
36.  Hidalgo， M.， et al. 2001. J Clin Oncol 19:3267-3279.
37.  Holash， J.， et al. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99:11393-11398.
38.  Holliger， P.， Prospero， T.， Winter， G. 1993. Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448.
39.  Houston， et al. 1988. Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883.
40.  Hunt， J.T.， et al. 2000. J Med Chem 43:3587-3595.
41.  Hunt， S. 2001. Curr Opin Mol Ther 3:418-424.
42.  Jianhua， H.， Kontos， C.D. 2002. J Biol Chem 277:10760-10766.
43.  Jostock， T.， et al. 2004. J Immunol Methods 289:65-80.
44.  Kabat， E.A.， et al. 1987. Sequences of Proteins of Immunological Interest， 4th Edition， Public Health Service， NIH， Washington， D.C.
45.  Kabat， E.A.， et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5th Edition， Public Health Service， NIH， Washington， D.C.
46.  Katre， N.V. 1990. J Immunol 144:209-213.
47.  Katz， M.D.， Erstad， B.L. 1989. Clin Pharm 8:255-273.
48.  Khamaisi， M.， et al. 2003. Nephrol Dial Transplant 18:1427-1430.
49.  Kim， K.S.， et al. 2003. J. Biol Chem 278:11449.
50.  Kimbro， K.S.， Simons， J.W. 2006. Endocr Relat Cancer 13:739-749.
51.  Koch-Nolte， F.， et al. 2007. FASEB J 21:3490-3498.
52.  Lee， F.Y.， et al. 2001. Clin Cancer Res 7:1429-1437.
53.  Lee， Y.K.， et al. 2004. Blood 104:788-794.
54.  Li， J.， et al. 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:3557-3562.
55.  Liang， W-C， et al. 2006. J Biol Chem 281:951-961.
56.  Lonberg， N. 2005. Nat Biotechnol 23:1117-1125.
57.  Lowinger， T.B.， et al. 2002. Curr Pharm Des 8:2269-2278.
58.  Lowman， H.B. 1998. Phage display of peptide libraries on protein scaffolds. In S. Cabilly， Editor， Methods in Molecular Biology， vol. 87: Combinatorial Peptide Library Protocols， Humana Press， Totowa， NJ， USA， pp. 249-264.
59.  Mattern， J.， Koomaqi， R.， Volm， M. 1996. Brit J Cancer 73:931-934.
60.  McColley， S.A.， et al. 2000. Am J Respir Crit Care Med 161:1877-1880.
61.  Mendel， D.B.， et al. 2003. Clin Cancer Res 9:327-337.
62.  Mendez， M.J.， et al. 1997. Nat Genet 15:146-156.
63.  Michaelis， M.， et al. 2004. Mol Pharmacol 65:520-527.
64.  Michels， S.， Rosenfeld， P.J. 2004. Retinal Physician 1:16-22.
65.  Michels， S.， et al. 2005. Opthamology 112:1035-1047.
66.  Murohara， T.， et al. 1998. Circulation 97:99-107.
67.  Muyldermans， S.， Cambillau， C.， Wyns， L. 2001. Trends Biochem Sci 26:230-235.
68.  Nguyen， V.K.， Desmyter， A.， Muyldermans， S. 2001. Adv Immunol 79:261-296.
69.  Nguyen， V.K.， et al. 2002. Immunogenetics 54:39-47.
70.  Panek， R.L.， et al. 1997. J Pharmacol Exp Ther 283:1433-1444.
71.  Riechmann， L.， Muyldermans， S. 1999. J Immunol Methods 231:25.
72.  Rosenfeld， P.J.， Moshfeghi， A.A.， Puliafito， C.A. 2005. Ophthalmic Surg Lasers Imaging 36:331-335.
73.  Rusnak， D.W.， et al. 2001. Mol Cancer Ther 1:85-94.
74.  Sebolt-Leopold， J.S.， et al. 1999. Nat Med 5:810-816.
75.  Sehgal， S.N.， et al. 1994. Med Res Rev 14:1-22.
76.  Senderowicz， A.M. 2000. Oncogene 19:6600-6606.
77.  Shields， R.L.， Lai， J.， Keck， R. 2002. J Biol Chem 277:26733-26740.
78.  Shinkawa， T.， et al. 2003. J Biol Chem 278:3466-3473.
79.  Smaill， J.B.， et al. 2000. J Med Chem 43:1380-1397.
80.  Stork， G.， Schultz， A.G. 1971. J Am Chem Soc 93:4074-4075.
81.  Tamura， M.， et al. 1998. Science 280:1614-1617.
82.  Thomas， A.L.， et al. 2003. Semin Oncol 30(3 Suppl 6):32-38.
83.  Tomizuka， K.， et al. 2000. Proc Natl Acad Sci USA 97:722-727.
84.  Vander Borght， T.， et al. 1991a. Gastroenterology 101:794-799.
85.  Vander Borght， T.， et al. 1991b. Int J Rad Appl Instrum [A] 42:103-104.
86.  Vlahos， C.J.， et al. 1994. J Biol Chem 269: 5241-5248.
87.  Wells， P.， et al. 1996. Clin Oncol (R Coll Radiol) 8:7-14.
88.  Wilhelm， S.， Chien， D.S. 2002. Curr Pharm Des 8:2255-2257.
89.  Wissner， A.， et al. 2003. J Med Chem 46:49-63.
90.   Yancopoulos， G.D.， et al. 2000. Nature (London) 407:242-248.
91.  Yang， X.D.， et al. 1999. Cancer Res 59:1236-1243.
92.  Yang， X.D.， et al. 2001. Crit Rev Oncol Hematol 38:17-23.
【図１】
2011500086.tif 000164
【図２】
2011500086.tif 000165
【図３】
2011500086.tif 000166
【図４】
2011500086.tif 000167
【図５】
2011500086.tif 000168
【図６】
2011500086.tif 000169
【図７】
2011500086.tif 000170
【図８Ａ】
2011500086.tif 000171
【図８Ｂ】
2011500086.tif 000172
【図８Ｃ】
2011500086.tif 000173
【図８Ｄ】
2011500086.tif 000174
【図９Ａ】
2011500086.tif 000175
【図９Ｂ】
2011500086.tif 000176
【図９Ｃ】
2011500086.tif 000177
【図９Ｄ】
2011500086.tif 000178
【図１０Ａ】
2011500086.tif 000179
【図１０Ｂ】
2011500086.tif 000180
【図１１】
2011500086.tif 000181
【図１２】
2011500086.tif 000182
【図１３】
2011500086.tif 000183
【図１４】
2011500086.tif 000184
【図１５】
2011500086.tif 000185
【図１６】
2011500086.tif 000186
【図１７】
2011500086.tif 000187
【図１８】
2011500086.tif 000188
【図１９】
2011500086.tif 000189
【図２０】
2011500086.tif 000190
【図２１】
2011500086.tif 000191
【図２２】
2011500086.tif 000192
【図２３】
2011500086.tif 000193
【図２４】
2011500086.tif 000194
【図２５】
2011500086.tif 000195
【図２６】
2011500086.tif 000196
【図２７】
2011500086.tif 000197
【図２８Ａ】
2011500086.tif 000198
【図２８Ｂ】
2011500086.tif 000199
【図２９Ａ】
2011500086.tif 000200
【図２９Ｂ】
2011500086.tif 000201
【図３０Ａ】
2011500086.tif 000202
【図３０Ｂ】
2011500086.tif 000203
【図３１】
2011500086.tif 000204
【図３２】
2011500086.tif 000205
【配列表】
2011500086000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月22日(2010.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011500086000001.app
【国際調査報告】
2011500086.tif 000221
2011500086.tif 000222
2011500086.tif 000223