(57)【要約】  本発明は、生理活性剤などの種々のカーゴ分子を送達するためのポリマー組成物の調製に有用な金属キレートポリ（エーテルアミド）ポリマー類を提供する。溶液中、金属イオンと金属結合性アミノ酸を含むワクチンエピトープなどのカーゴ分子とを、ポリマー組成物中に装入し、非共有結合性錯体中に保持することができる。このようなポリマー組成物のナノ粒子もまた、この溶液から直接的に調製することができる。【選択図】  図１
2011523669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリマー類：
一般構造式（Ｉ）、
【化１】
2011523669.tif 000035
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり；
Ｒ１は−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化２】
2011523669.tif 000036
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され； 
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）、
【化３】
2011523669.tif 000037
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択される化学式を有するＰＥＡポリマーまたは、構造式（ＩＶ）、
【化４】
2011523669.tif 000038
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり、ｍは、約０．１から０．９の範囲であり；ｐは、約０．９から０．１の範囲であり；
Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化５】
2011523669.tif 000039
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、ＣＨ２ＣＯＯ−、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され； 
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され；
Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群から独立して選択される
化学式を有するＰＥＡポリマーのうちの少なくとも１つまたはその塩を含んでなる組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−であり、式中、Ｒ６が式（ＩＩ）により表される化学構造を有し、Ｒ７が、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーとの錯体中に金属イオンをさらに含んでなり、前記金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびそれらの組合わせからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記錯体中に、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−含有基中における不飽和領域および／または孤立電子対からなる負極性の微小領域を有する極性分子、Ｈｉｓタグ化分子、生物学的分子、および親油性治療分子、ならびにそれらの組合わせからなる群から選択される少なくとも１種のカーゴ分子をさらに含んでなる請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種のカーゴ分子が、パクリタキセル、シロリムス、エベロリムス、ドセタキセルおよびビオリムスからなる群から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種のカーゴ分子が、血清アルブミンを含んでなる請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種のカーゴ分子が、標的細胞、臓器または組織に対して特異的に結合するリガンドを含んでなる請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種のカーゴ分子が、標的細胞、臓器または組織に対して毒性であるか、または特異的に結合する請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
ポリマーとの錯体中に金属をさらに含んでなり、前記金属が、Ｇｄ（ＩＩＩ）およびＲｈ、Ｉｒ、Ｙｔの放射性同位元素の金属からなる群から選択され、前記組成物が診断用組成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−であり、式中、Ｒ６がＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２であり、前記金属イオンがＧｄ（ＩＩＩ）である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｏ−、Ｓ−またはＮ−含有基中における不飽和領域および／または孤立電子対からなる負極性の微小領域を有する極性分子、Ｈｉｓタグ標識分子、生物学的分子、および親油性分子からなる群から選択される少なくとも１種の殺細胞分子またはターゲティングカーゴ分子をさらに含んでなる請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
ナノ粒子を作製する方法であって：
ａ）１）請求項１に記載の少なくとも１種のポリマーと；
２）Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋およびＧｄ３＋からなる群から選択される金属イオンと；
３）非プロトン性極性溶媒と、
を重縮合条件下水溶液中で一緒に接触させること、
ｂ）前記溶液中、前記ポリマーと前記金属カチオンとの非共有結合性錯体を含有するナノ粒子を形成すること；および
ｃ）サイズ排除分離により前記溶液から前記ナノ粒子を得ること、
を含んでなる方法。
【請求項１３】
前記溶液が、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−含有基中における不飽和領域および／または孤立電子対からなる負極性の微小領域を有する極性分子、生物学的分子、Ｈｉｓタグ化分子、および親油性分子からなる群から選択される少なくとも１種のカーゴ分子をさらに含んでなり、前記形成されたナノ粒子中の前記錯体が、少なくとも１種のカーゴ分子をさらに含んでなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液が、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８のアミノ酸配列をさらに含んでなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｈｉｓタグ化分子が、病原性エピトープを含有するアミノ酸配列を含んでなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｈｉｓタグ化分子を、前記溶液中に組換え発現する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｈｉｓタグ化分子を、細菌内で組換え発現する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）オリゴまたはポリエチレングリコール、多糖類、脂質、生物学的高分子および水不溶性薬物からなる群から選択される生理活性剤；および
ｂ）請求項１に記載のポリマー、
を含んでなる組成物であって、
前記組成物が、前記生理活性剤により両側にフランクされている線状ポリマーである組成物。
【請求項１９】
前記生理活性剤が、高分子免疫賦活アジュバントである請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ｃ）Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋からなる群から選択される金属イオンであって、以下のアミノ酸配列内に保持される金属イオン；
ｄ）病原性エピトープを含んでなるアミノ酸配列、
をさらに含んでなり、前記金属イオンと前記アミノ酸配列とが、前記ポリマーのＲ１と非共有結合性錯体を介して前記ポリマーに結合している請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]ポリアミノカルボン酸は、生物の汚染除去における錯体化剤またはキレート化剤としてしばしば用いられており、最近、洗浄剤におけるリン酸塩の代替物として提案されている。これらの化合物は、種々の金属イオン、多くの場合三価のランタニドと錯体を形成することが知られている。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）およびＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−五酢酸）などのポリアミノカルボン酸もまた、インビボ送達組成物に診断用部分および治療用部分をキレート化するために一般的に用いられている。
【０００２】
[0002]キレート化性を有するポリマーもまた作製されている。ＭＲＩ造影剤として、高分子ガドリニウム（Ｇｄ）錯体の臨床適用が報告されている。例えば、Ｇｄキレートは、線形ポリ（アミノ酸）、多糖類、タンパク質および種々のデンドリマーなどの生物医学的ポリマーに結合している。ＤＴＰＡ酸無水物とジアミン類との共重合化およびＧｄ（ＩＩＩ）との錯体化もまた報告されている。しかしながら、デキストラン類、ポリリシンなどの典型的な生分解性ポリマーから調製されたものなど、高分子系の臨床適用は、Ｇｄ［ＩＩＩ]錯体の排泄が遅いこと、およびその結果として毒性Ｇｄイオンが長期に組織蓄積することにより制限されていた。したがって、当業界におけるこれらの進歩に関わらず、排泄が遅い問題を避けるために、生分解性のより大きくより良好な高分子系が求められている。
【０００３】
［発明の概要]
[0003]本発明は、一般構造式（Ｉ）、
【化１】
2011523669.tif 000003
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり；
Ｒ１は−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化２】
2011523669.tif 000004
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され； 
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）、
【化３】
2011523669.tif 000005
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択される化学式を有するＰＥＡポリマーまたは、構造式（ＩＶ）、
【化４】
2011523669.tif 000006
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり、ｍは、約０．１から０．９の範囲であり；ｐは、約０．９から０．１の範囲であり；
Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化５】
2011523669.tif 000007
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、ＣＨ２ＣＯＯ−、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され；
Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルからなる群から独立して選択される化学式を有するＰＥＡポリマーのうちの少なくとも１つまたはその塩を含んでなる組成物を提供する。
【０００４】
[0004]別の実施形態において、本発明は、ポリマーの非共有結合性錯体および遷移金属イオンを含有するナノ粒子を形成するために、１）水溶液中に溶解させた式（Ｉ）または（ＩＶ）により記載された化学構造を有する少なくとも１種のポリマーと；２）Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋からなる群から選択される金属イオンとを一緒に接触させることによってナノ粒子を作製する方法を提供する。
【０００５】
[0005]さらに別の実施形態において、本発明は、対象に本発明の組成物を投与することによって、その対象にカーゴ分子を送達する方法を提供する。
【０００６】
[0006]さらに別の実施形態において、本発明は、
ａ）１）式（Ｉ）または（ＩＶ）の本発明のキレート化ポリマーと；
２）Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋およびＧｄ３＋からなる群から選択される金属イオンと；
３）非プロトン性極性溶媒と、
を、重縮合条件下、水溶液中で一緒に接触させること、
ｂ）前述の溶液中、前述のポリマーと前述の金属カチオンとの非共有結合性錯体を含有するナノ粒子を形成すること；および
ｃ）ゲルろ過分離により前述の溶液から前述のナノ粒子を得ること、
により、ナノ粒子を作製する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ポリマー：ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）（式Ｉａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】インフルエンザウィルスに感染後、免疫化したマウスの生存曲線のグラフを示す。黒◆＝緩衝液のみで免疫化した動物；▲＝ウィルス、陽性対照によって腹腔内的に免疫化した動物；＊＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎおよびポリＩ：Ｃと共に製剤化したＨＡＰＲ８エクトドメインとＮＰＰＲ８双方によって鼻腔内的に１回免疫化した動物；黒四角＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎおよびポリＩ：Ｃと共に製剤化したＨＡＰＲ８エクトドメインとＮＰＰＲ８双方によって鼻腔内的に１回免疫化した動物。
【図３】インフルエンザウィルスに感染後、免疫化したマウスの体重変化を示すグラフを示す。〇＝緩衝液のみで免疫化した動物；＊＝ウィルス、陽性対照によって腹腔内的に免疫化した動物；▲＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎおよびポリＩ：Ｃと共に製剤化したＨＡＰＲ８エクトドメインとＮＰＰＲ８双方によって鼻腔内的に１回免疫化した動物の平均体重変化；黒四角＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｚｎと共に製剤化したＨＡＰＲ８エクトドメインとＮＰＰＲ８によって鼻腔内的に免疫化したマウス；◇＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｚｎと共に製剤化したＨＡＰＲ８エクトドメインによって鼻腔内的に免疫化した動物。
【図４】インフルエンザウィルスに感染後、免疫化したマウスの平均体重変化パーセンテージのグラフを示す。黒四角＝製剤緩衝液中、ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）ポリマーによって免疫化した動物の体重変化（７日目までに全てのマウスがウィルス感染で死亡）。〇＝ウィルス、陽性対照によって腹腔内的に免疫化したマウス；▲＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎおよびポリＩ：Ｃ粒子と共にＨＡＰＲ８−３とＮＰＰＲ８を鼻腔内投与した動物の平均体重変化（１匹のマウスが８日目までに死亡、ＨＡタンパク質に対して測定可能な抗体応答を生ぜず）；△＝ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎおよびポリＩ：Ｃ粒子と共にＨＡＰＲ８−３とＮＰＰＲ８を皮下的に免疫化したマウス（１匹を除く全てのマウス８日目までに死亡）。
【図５】インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）由来のＨｉｓタグ化核タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図６】インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）由来のＨＡＰＲ８エクトドメイン抗原のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図７】インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）由来のＨＡＰＲ８−２  Ｈｉｓタグ化サブ断片抗原のアミノ酸配列を示す。下線部分は、細菌の発現に関するシグナル配列として付加されており、細菌によって産生されたアミノ酸配列では現れない（配列番号３）。
【図８】インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）由来のＨＡタンパク質のＨＡＰＲ８  ３  Ｈｉｓタグ化サブ断片抗原のアミノ酸配列を示す。下線部分は、細菌の発現に関するシグナル配列として付加されており、細菌によって産生されたアミノ酸配列では現れない（配列番号４）。
【図９】インフルエンザ株Ａ／ＶＮ／１２０３／２００４由来のＨｉｓタグ化核タンパク質抗原のアミノ酸配列を示す（配列番号５）。
【図１０】インフルエンザ株Ａ／ＶＮ／１２０３／２００４由来のＨＡＶＮエクトドメイン抗原のアミノ酸配列を示す（配列番号６）。
【図１１】インフルエンザ株Ａ／ＶＮ／１２０３／２００４由来のＨＡタンパク質のＨＡＶＮ−２  Ｈｉｓタグ化サブ断片のアミノ酸配列を示す。下線の配列は、細菌発現に関するシグナル配列として付加されており、細菌によって産生されたアミノ酸配列では現れない（配列番号７）。
【図１２】インフルエンザ株Ａ／ＶＮ／１２０３／２００４由来のＨＡタンパク質のＨＡＶＮ−３  Ｈｉｓタグ化サブ断片抗原のアミノ酸配列を示す。下線の配列は、細菌発現に関するシグナル配列として付加されており、細菌によって産生されたアミノ酸配列では現れない（配列番号８）。［発明の詳細な説明]
【０００８】
[0019]本発明は、ポリ（エステルアミド）ＰＥＡの主鎖にポリアミノカルボン酸を組み込むことによって生分解性金属キレート化ポリマーを得ることができるという発見に基づいている。このような生分解性金属キレート化ポリマーは、別個の金属親和性リガンドの結合なしで金属カチオンをキレート化する。
【０００９】
[0020]本発明の生分解性金属キレート化ポリマーは、既知のＰＥＡの溶液縮重合に用いられる二酸構築ブロックが、本発明ではＥＤＴＡタイプのポリ酸（すなわちポリアミノ酢酸）に替わっていることを除いては、既知のポリ（エステルアミド）ＰＥＡに構造的に関連している。本発明のポリマーの合成に用いられるこのタイプのポリアミノ酸から調製されるモノマーは、溶液縮合の条件下でジアミンと反応してビス（アルファ−アミノアシル）−ジオールジエステルモノマーを有するアミド結合を形成する等価の酸二無水物である。したがって、重合時にポリアミノ酢酸の２つのカルボン酸基はポリマー主鎖の形成に取り込まれ、それに伴ってイミノ酢酸基を有する。ポリマー中のポリアミノ酢酸のインライン残基の残りの未結合カルボン酸基は遊離しており、溶液中の金属カチオンにキレート化する。
【００１０】
[0021]したがって、一実施形態において、本発明は、一般構造式（Ｉ）、
【化６】
2011523669.tif 000008
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり；
Ｒ１は−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化７】
2011523669.tif 000009
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され； 
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）、
【化８】
2011523669.tif 000010
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択される化学式を有するＰＥＡポリマーまたは、構造式（ＩＶ）、
【化９】
2011523669.tif 000011
により表される化学式であって、式中
ｎは、約１５から約１５０の範囲であり、ｍは、約０．１から０．９の範囲であり；ｐは、約０．９から０．１の範囲であり；
Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｒ６−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−であり、式中、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ｐ−Ｃ６Ｈ４、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２および式（ＩＩ）、
【化１０】
2011523669.tif 000012
の化学構造を有する化合物、ならびにそれらの組合わせからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ７は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、および保護基からなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールおよび保護基からなる群から独立して選択され；
個々のｎ単位における２つのＲ３は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ３＋、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ２＋）ＮＨ２、４−メチレンイミダゾリニウム、ＣＨ２ＣＯＯ−、（ＣＨ２）２ＣＯＯ−およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され； 
Ｒ４は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）、構造式（ＩＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片、１，４−アンヒドロエリトリトールの断片、およびそれらの組合わせからなる群から独立して選択され；
Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルからなる群から独立して選択される化学式を有するＰＥＡポリマーのうちの少なくとも１つまたはその塩を含んでなる組成物を提供する。
【００１１】
[0022]本発明の金属キレート化ポリマーは生分解性であり、水溶性であり得る。本発明の金属キレート化ポリマーは、それと結合した、例えば、Ｎａ対イオンやＫａ対イオンなど、塩を形成する対イオンを有し得る。
【００１２】
[0023]また、前述のポリマーがイミノ二コハク酸（式ＩＩ）を用いて合成される場合、本発明の式（Ｉ）または（ＩＶ）の金属キレート化ポリマーは、ポリアミノ酸の脱水環化の産物としてイミド単位を含有し得る。それで本発明のポリマーは、式（Ｖ）：
【化１１】
2011523669.tif 000013
で示される化学構造を含む。
【００１３】
[0024]本発明の金属キレート化ポリマーは、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択される対イオンと任意に結合することができる。例えば、前述のポリマーは、ナトリウムイオンと結合して、前述のポリマーの、または本発明の金属キレート化ポリマーを含有する組成物の水溶性を増加させることができる。本発明のポリマーは、遊離酸の形態で、またはアルカリ金属塩などの金属塩として保存することができる。ペンダントイミノ酢酸基におけるプロトンは、ＮａイオンまたはＫイオンと部分的に、または完全に置換して塩を形成することができる。
【００１４】
[0025]本明細書で用いられる用語「アリール」とは、フェニル基または少なくとも１つの環が芳香族である約９から１０の環原子を有するオルト縮合二環炭素環式基を意味する、本明細書における構造式のことである。一定の実施形態において、１つまたは複数の環原子は、１つまたは複数のニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル、またはトリフルオロメトキシと置換できる。アリールの例として、限定はしないが、フェニル、ナフチル、およびニトロフェニルが挙げられる。本明細書に用いられる用語「アルケニレン」とは、主鎖または側鎖に少なくとも１つの不飽和結合を含有する二価の分枝状または非分枝状の炭化水素鎖を意味する、本明細書における構造式のことである。
【００１５】
[0026]本明細書に用いられる用語「アルケニル」とは、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基のことである。
【００１６】
[0027]本明細書に用いられる「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基のことである。
【００１７】
[0028]本明細書に用いられる「アリール」とは、６から１４までの範囲の炭素原子を有する芳香族基のことである。
【００１８】
[0029]本発明の組成物に用いられる金属キレート化ポリマーは、重縮合体である。式（ＩＶおよびＶ）中の比率「ｍ」および「ｐ」は、これらの重縮合ポリマーの記述において無理数として定義される。さらに、「ｍ」および「ｐ」は各々任意の重縮合体内での範囲をとるため、このような範囲は一対の整数で定義することができない。全てのビス−アミノアシルジオール−ジエステル（ｉ）およびアディレクショナルなアミノ酸（例えばリシン）モノマー残基（ｉｉ）が、ポリアミノ酸モノマー残基（ｉｉｉ）によって、それら自体と、または互いに結合するという規則により、各ポリマー鎖は、共に結合したモノマー残基のストリングである。したがって、ｉ−ｉｉｉ−ｉ；ｉ−ｉｉｉ−ｉｉ（またはｉｉ−ｉｉｉ−ｉ）およびｉｉ−ｉｉｉ−ｉｉの線形の組合わせのみが形成される。次いで、これらの組合わせの各々は、ＰＥＡに関して二酸モノマー残基（ｉｉｉ）により、それら自体に、または互いに結合する。したがって、各ポリマー鎖は、モノマー、ｉ、ｉｉおよびｉｉｉの整数からなるモノマー残基の統計的であるがランダムではないストリングである。しかし、一般に、任意の実際の平均分子量（すなわち、十分な平均長）のポリマー鎖では、式（ＩＶ）におけるモノマー残基の比率「ｍ」および「ｐ」は、整数（有理整数）にはならない。さらに、全てのポリ分散コポリマー鎖の縮合体で、全ての鎖にわたって平均した（すなわち、平均鎖長に正規化した）モノマーｉ、ｉｉおよびｉｉｉの数は整数にはならない。次いで、これらの比率は、無理数（すなわち、有理数でない実数）のみをとり得る。本明細書で用いられている用語の無理数は、ｎとｊが整数である形ｎ／ｊではない比率から誘導される。
【００１９】
[0030]本明細書に用いられる用語「アミノ酸」および「α−アミノ酸」は、アミノ基、カルボキシル基および本明細書で定義されているＲ３基などのペンダントＲ基を含有する化学的化合物を意味する。本明細書に用いられる用語「生物学的α−アミノ酸」は、合成に用いられるアミノ酸を意味し、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、またはそれらの混合物から選択される。本明細書に用いられる用語「アディレクショナルアミノ酸」は、Ｒ基（例えば、式（ＩＶ）内のＲ５）がポリマー主鎖内に挿入されるようにα-アミノ酸から得られたポリマー鎖内の化学的部分を意味する。
【００２０】
[0031]本発明の金属キレート化ポリマーは、非プロトン性溶媒中、ポリアミノ酢酸誘導の二無水物とジアミン、特にビス（アルファアミノアシル）−ジオールジエステルとの溶液重縮合産物として調製することができる。ビス（アルファアミノアシル）−ジエステルモノマーおよびそれらの誘導ポリマーに特有のエステル結合は生体酵素によって加水分解され、非毒性の分解産物を形成することができる。
【００２１】
[0032]一代替法において、本発明の金属キレート化ポリマーの製造に用いられるα-アミノ酸の少なくとも１つは、生物学的α−アミノ酸である。例えば、Ｒ３がＣＨ２Ｐｈである場合、合成に用いられる生物学的α−アミノ酸はＬ−フェニルアラニンである。Ｒ３がＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である代替法では、前述ポリマーは、生物学的α−アミノ酸、Ｌ−ロイシンを含有する。本明細書に記載されているモノマー内のＲ３を変えることによって、他の生物学的α−アミノ酸、例えば、グリシン（Ｒ３がＨの場合）、アラニン（Ｒ３がＣＨ３の場合）、バリン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）２の場合）、イソロイシン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３の場合）、フェニルアラニン（Ｒ３がＣＨ２Ｃ６Ｈ５の場合）、またはメチオニン（Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３の場合）ならびにそれらの組合わせを用いることもできる。さらに他の代替実施形態において、本発明のＯＥＧベースのポリマー送達組成物の作製に用いられるポリマーに含有される種々のα−アミノ酸の全てが本明細書に記載される生物学的α−アミノ酸である。
【００２２】
[0033]さらに別の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のカーゴ剤を対象の体内部位へ送達するための方法を提供する。この実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１種のカーゴ分子が配位錯体内の金属イオンとの配位錯体内に保持されているポリマーナノ粒子の分散体として製剤化されている本発明の組成物を、対象の体内のインビボ部位へ注入することを含む。注入されたナノ粒子は徐々に錯体化されたカーゴ分子を放出する。
【００２３】
[0034]本発明のナノ粒子の分散体は、非経口的に、例えば、皮下に、筋内に、または臓器などの体内部位へ注入することができる。生分解性ナノ粒子は、少なくとも１種の、例えば２種の異なるカーゴ分子の標的化された時限放出のために全身の循環内への担体として作用する。約１０ｎｍから約５００ｎｍの粒径範囲にある本発明のポリマー粒子は、このような目的で循環内へ直接入る。
【００２４】
[0035]前述ポリマーの生分解の速度を調整し、前述ポリマーの構築ブロックの選択、金属カチオン、そして特に本発明の組成物中に含まれるポリアミノ酸に依り、選択された時間にわたるカーゴ分子の連続的な送達をもたらすために、本発明の組成物に用いられる生分解性ポリマーを設計することができる。
【００２５】
[0036]ＰＥＡ金属キレート化ポリマーに用いられる好適な保護基には、トシル塩（例えばＴｏｓ−ＯＨ）、または当業界に知られている他のものが含まれる。一般式（ＩＩＩ）の好適な１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールには、Ｄ−グルシトール、Ｄ−マンニトール、またはＬ−イジトールなどの糖アルコール類から誘導したものが含まれる。ジアンハイドロソルビトールは、本発明のＯＥＧベースのポリマー送達組成物の作製に用いられる１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの現在好ましい二環式断片である。
【００２６】
[0037]一代替法において、Ｒ３はＣＨ２Ｐｈであり、合成に用いられるα−アミノ酸はＬ−フェニルアラニンである。Ｒ３がＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２である代替法において、ポリマーはα−アミノ酸、ロイシンを含有する。Ｒ３を変えることによって、他のα−アミノ酸、例えばグリシン（Ｒ３がＨの場合）、アラニン（Ｒ３がＣＨ３の場合）、バリン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）２の場合）、イソロイシン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）―ＣＨ２―ＣＨ３の場合）、フェニルアラニン（Ｒ３がＣＨ２−Ｃ６Ｈ５の場合）、リシン（Ｒ３が（ＣＨ２）４−ＮＨ２）；またはメチオニン（Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３の場合）を用いることもできる。
【００２７】
[0038]ビス−（Ｌ−ロイシン）−１，６−ヘキサンジオールジエステルモノマー（Ｌｅｕ（６）と称される）の作製に用いられるインラインα−アミノ酸の選択（Ｒ３の選択による）およびジオールの選択、ならびに本発明のポリマーにおけるインラインポリ酢酸残基の選択は、本発明の金属キレート化ポリマーの電子特性の決定を助ける。例えば、本明細書においてＬｅｕ（６）−ＥＤＴＡと称されるポリマーは、疎水性セグメント（すなわちＬｅｕ（６））と強く荷電したセグメント（すなわち、インラインＥＤＴＡ）交互から構成される。その結果生じるポリマーは水溶性である。１：１のモル分率（金属：インライン−ＥＤＴＡ）での金属キレート化により、インラインＥＤＴＡ基は中和され、メタレート化ポリマーは、疎水性セグメントと中性の極性セグメントが交互に存在するストリングになる。その結果生じるメタレート化ポリマーは、本発明の方法を用いて容易に粒子へと凝縮する（それにつれて、金属結合特性を有する予備混合されたカーゴ分子を捕捉する）。
【００２８】
[0039]本発明のポリマーのビス（α−アミノ酸）−ジオールジエステルセグメントにおけるアミノ酸残基は、生分解性および生体適合性を付与することに加え、金属に結合した、または中性、極性のポリマーに異なる生物物理学的および生化学的特性を付与するために選択することができる。例えば、前述の例において、ＬｅｕをＡｒｇまたはＬｙｓに置換して、Ａｒｇ（６）−またはＬｙｓ（６）ＥＤＴＡを作製することにより、本発明のポリマーは正に荷電したセグメントと負に荷電したセグメント交互から構成され、したがって、全体的に電荷が中性で極性である。このようなポリマーは、それら自体が強く負に荷電しているポリ（核酸）と弱く相互作用する。しかし、金属キレート化の際、負に荷電したインラインＥＤＴＡセグメントは中和され、その結果カチオン性ポリマーとなり、これは、正に荷電したＡｒｇ（６）セグメントと負に荷電したポリ（核酸）とのクーロン相互作用、ならびに金属化されたインラインＥＤＴＡセグメントとポリ（核酸）との間の金属媒介イオン結合の双方により、ポリ（核酸）と強く相互作用する。したがって、この例で、上記の本発明のポリマーにおいてＬｅｕをＡｒｇまたはＬｙｓに置換することは、負に荷電した極性のカーゴ分子のローディングに必要とされるより大きな安定性の付与に十分である。
【００２９】
[0040]逆に、上記のＬｅｕ（６）−ＥＤＴＡの例において、ＬｅｕをＡｓｐまたはＧｌｕに置換することにより、本発明のポリマーは、カチオン性の極性カーゴ分子のローディングに最も好適となる。上記のＬｅｕ（６）−ＥＤＴＡの例において、ＬｅｕをＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎおよびそれらの組合わせと置換することにより、本発明の金属化ポリマーは、糖および高グリコシル化したタンパク質などの中性、極性の、またはポリ（ヒドロキシル化）カーゴ分子のローディングに最も好適となる。
【００３０】
[0041]本発明の金属化ポリマーを特定のカーゴ分子の特性に調整するためにインラインα−アミノ酸残基を選択することに加えて、異なるポリマー鎖可撓性（Ｔｇ）、それにより異なる粒子機械特性、ならびに異なるポリマー鎖溶解性を付与するために、ビス−ＡＡ（ジオール）セグメントのジオールを選択することができる。例えば、剛体の二環式ジアンヒドロヘキシトールジオール（イソソルビド、ＤＡＳ）は、水に不溶性のポリマー（式Ｉｂ）を生じ；一方、より短い脂肪族ジオールまたは疎水性の１，４−アンヒドロエリトリトールは、ポリマーに親水性と水溶性を付与する（式Ｉｃ）。
【００３１】
[0042]したがって、ＹおよびＺが統計的に交換可能なＸ−Ｙ−Ｘ−Ｚを作製することができ、ここでＸはインラインキレート化セグメントであり、ＹとＺは異なるビス−ＡＡ（ジオール）セグメントであり、ポリマーを１つまたは複数のカーゴ分子へと良好に調整することができる。
【００３２】
[0043]本発明の金属キレート化ポリマーの作製に有用なポリアミノ酸の非限定的な例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）などが挙げられる。このようなポリアミノ酸の酸二無水物残基の合成は、本明細書の実施例に例示されている。ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡの酸二無水物は市販品が入手できる。
【００３３】
[0044]酸二無水物とジアミンとの溶液重縮合からの本発明の金属キレート化ポリマーの形成には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）などの非プロトン性極性溶媒が用いられる。重縮合時に用いられるジアミンと酸二無水物の分子構造および疎水性に依り、得られるポリマーは水溶液に可溶性であるか疎水性（したがって、不溶性）である。
【００３４】
[0045]ポリマー主鎖に沿っているイミノ酢酸基に依って、本発明のポリマーは種々の金属カチオンと配位錯体を形成することができる。本発明の金属結合ポリマーと金属配位錯体を形成して本発明の「金属化ポリマー」を形成するのに有用な遷移金属カチオンとしては、限定はしないが、Ｃａ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｆｅ（２＋および３＋）、およびＺｎのカチオンが挙げられる。非放射性かつ非画像化金属の中で生体安全性を基にして最も重要なものは、Ｚｎ、続いてＮｉである。放射性または画像化金属化ポリマーの調製に有用な金属イオンとしては、レニウム、イリジウム、およびイットリウムなどの放射性金属同位元素が挙げられる。一実施形態において、診断適用における画像化に現在好ましい、本発明のポリマーに結合した遷移金属カチオンはＧｄ（ＩＩＩ）であり、本発明の金属キレート化ポリマーの作製に用いられるポリアミノ酸はＤＴＰＡである。
【００３５】
[0046]遊離のイミノ酢酸基は、本発明の組成物および方法に用いられる可撓性のポリマー鎖に沿って位置しているため、金属イオンは、カーゴ分子の表面の結合部位に対して最良の位置に配置することができる。その結果、カーゴ分子は、形成された金属親和性錯体により当該ポリマーに非共有的に結合することができる。他の実施形態では、ポリマー分子の遊離の−ＮＨ２端をアシル化して、カーゴ分子が当該ポリマーの遊離端ではなく、金属親和性錯体によってのみ結合することを確実にすることができる。
【００３６】
[0047]配位錯体内で本発明の金属キレート化ポリマーのイミノ酢酸基に結合した遷移金属カチオンは、キレート化金属の少なくとも１つの自由結合価が金属カチオンに対して親和性を有する治療的カーゴ分子の結合に利用可能な、本明細書で「金属化ポリマー」と称される組成物を作り出す。下記により詳細に説明されるように、ポリマー主鎖におけるアミノ酸は、金属化ポリマー組成物およびこのような組成物のナノ粒子におけるカーゴ分子を安定化する電気力の和にさらに寄与する。
【００３７】
[0048]本発明の金属化ポリマーによって錯体化することのできる好適なカーゴ分子としては、薬物；「生化学製剤」、およびＨｉｓタグ化分子などの極性生理活性剤が挙げられる。本明細書に用いられる用語「生化学製剤」は、配列番号１〜８で記載されているものなど、ワクチン抗原を含めて、天然および合成的に製造されたタンパク質、ペプチド、ポリアミノ酸、融合タンパク質、およびポリ核酸を包含する。本明細書に用いられる用語「高分子生化学製剤」には、タンパク質、ポリペプチドおよびポリ核酸など、生理活性が分子のユニークな三次元折りたたみ構造に依っている生化学製剤が含まれる。また、ワクチン抗原の生理活性は、親の病原体に生じる分子の天然の三次元折りたたみ構造がワクチン製剤において保存されることに依ることも発見されている。本明細書下記により詳述されるように、本発明の金属化ポリマーにおける電気力は、生化学製剤および高分子生化学製剤、ならびに負の極性の微小領域を含有する親油性カーゴ分子を、水溶液から捕捉し安定化することができる。
【００３８】
[0049]生化学製剤カーゴ分子（例えば、タンパク質、ペプチド抗原、またはＨｉｓタグを有する融合構築体）における少なくとも１つのヒスチジン残基の存在は、ポリマーへのカーゴ生化学製剤の結合に寄与する重要な因子である。カーゴ生化学製剤のアミノ端またはカルボキシル端におけるＨｉｓ（すなわちＨｉｓタグ）により、金属親和性錯体内の金属イオンに対するカーゴ分子の結合特異性が改善される。したがって、一実施形態において、結合効率を確実にするために、少なくとも１から約１０の隣接Ｈｉｓ残基、例えば６つのＨｉｓ残基（すなわち「ヘキサＨｉｓタグ」）が、タグとしてアミノ端およびカルボキシ端の一方または双方に組み込まれる。Ｈｉｓタグが付加されると、Ｈｉｓタグおよび金属キレート、例えばＮｉまたはＺｎの金属キレートは最終組成物、例えばナノ粒子内への残留が可能になる。
【００３９】
[0050]結合に寄与するヒスチジン基のｐＫ値は中性の領域にあるので、ポリマーに対するカーゴ生化学製剤分子の結合は約７のｐＨ値で生じると考えられる。しかしながら、個々のアミノ酸の実際のｐＫ値は、隣接するアミノ酸残基の影響に強く依存し得る。タンパク質の構造に依り、アミノ酸のｐＫ値は理論的ｐＫ値から１ｐＨ単位まではずれる可能性があることが種々の実験によって示されている。したがって、約８のｐＨ値を有する反応溶液で結合の改善が達成されることが多い。
【００４０】
[0051]カーゴ生化学製剤分子に存在するシステインおよびトリプトファンなどの他の金属結合アミノ酸もまた金属結合に寄与する。さらに、本発明の組成物および方法において、生化学製剤は、生化学製剤カーゴ分子としての使用に好適であるとして確立された金属結合タンパク質のクラスに属する必要はない。結晶学者は構造解析過程の重要な一部として、構造研究中のタンパク質の遷移金属結合類縁体をルーチンに用いている。この方法は「同形置換法」と呼ばれ、タンパク質およびポリ核酸は全て、分子内で金属結合部位が生物学的に機能的であるかないかに関わりなく、遷移金属に少なくとも弱く結合するという発見がもたらされた（Ｍ  Ｂａｂｏｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（２００８）７０：２０８−２１７頁ならびにｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｐａｇｅｓ／０８８７−３５８５／ｓｕｐｐｍａｔ／における世界的ウェブに見られる補遺およびＮ  Ｖａｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ（２００５）１０：４７６−４８２頁）。
【００４１】
[0052]本発明の金属化ポリマー中、および本発明の重縮合法を用いて作製されたナノ粒子中に、このようなカーゴ分子を捕捉し保持するためには、遷移金属に対する高分子生化学製剤を含む全ての生化学製剤の弱い親和性、ならびに本発明の組成物の主鎖アミノ酸で十分であることが、本発明において発見された。本発明の金属化ポリマーによってもたらされた結合活性により、ロードされた粒子が安定化する。驚くべきことに、高分子として親油性である一定の生理活性分子でさえ、本発明の金属化ポリマーによってキレート化することができる。このような生理活性分子は、約２．０から６．０の範囲のｃＬｏｇＰを有することを特徴とするが、また、１）不飽和領域（芳香族基を含む）および２）Ｏ−、Ｓ−およびＮ−含有基における不対電子からなる負極性微小領域の存在も特徴とする。錯体化したこのような親油性カーゴ分子を有する本発明の金属化ポリマーは、ナノ粒子の重縮合のための本発明の方法を用いて、ナノ粒子として製剤化することもできる。本発明の金属化ポリマーによって錯体化するための現在好ましいこのような高分子親油性薬剤化合物の例としては、限定はしないが、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン類、ならびにシロリムス、エベロリムスおよびビオリムスなどのリムス化合物が挙げられる。
【００４２】
[0053]より具体的には、パクリタキセルは、約３．５のｃＬｏｇＰを有するので、きわめて水溶性の低い高親油性薬剤の高分子特性を有する。しかし、原子レベルでその表面を調べると、この分子は高分子レベルでは疎水性であるが、芳香族基および酸素原子によって提供される極性の微小領域があることが示されている。この疎水性分子の表面にわたって見られる極性の微小領域が、極性であると共に疎水性であるアミノ酸側鎖に沿って並んでいるその標的タンパク質（ベータ−チューブリン）の空隙へパクリタキセルが結合する原因となっている。本発明の金属化ポリマーにおける弱く結合している遊離配位部位に対するこのような化合物の結合活性（すなわち、ミクロ親和性の和）によって、本発明の金属化ポリマーのナノ粒子内の親油性カーゴ分子の安定化が導かれると考えられる。
【００４３】
[0054]別の例として、現在使用されている最も疎水性の薬剤の１つであるラパマイシン（シロリムス）は、約５．５のｃＬｏｇＰを有するので、パクリタキセルより約１００倍以上疎水性である。しかし、ラパマイシンは不飽和結合のいくつかの微小領域（パクリタキセル上の芳香族領域に類似した）または酸素原子周囲に不対電子（パクリタキセルのように）を有する。分子レベルにおけるこれらの微小電気的領域は、ラパマイシンのタンパク質生物標的、ｍＴＯＲに対するラパマイシン親和性の特異性を方向付ける上で重要であると考えられる。それらは、強い多価イオン結合の集中源であるため、臨床的に有用な化合物、例えば、大型の標的タンパク質におけるリガンド部位に特異的にインビボ結合する化合物の最も疎水性のものにさえ見られる微小極性領域を探索しはまり込みを行う上で、金属イオンは理想的に適している。
【００４４】
[0055]本発明の金属化ポリマーにおけるローディングに好適な別の例は、市販品が入手でき、当業界で十分に認められている血清アルブミン（ＳＡ）である。ＳＡは、金属キレート化ポリマーのコーティング、インプラントまたは粒子への包含に特に適したものにする以下の化学的および生物学的特性を有する（本明細書の実施例５に示されているように）：１）固有の高親和性の金属結合部位、２）腫瘍周囲の新生血管に対する付随的な標的性；および３）高い血液適合性（ＳＡロード粒子を静脈内送達に使用し得る可能性が生じる）。
【００４５】
[0056]ＳＡはその高い血液適合性により、本発明の組成物におけるカーゴ分子として使用される場合、いくつかの治療的使用法を有し得る：１）金属に対する解毒剤として、２）親油性（したがって、細胞貫通性）毒素（例えば、パクリタキセルなどの植物防御分子）に対する解毒剤として、３）天然の疎水性分子（脂肪酸、ステロイド類）に対する血漿輸送剤として、または４）血液の浸透圧を維持するための薬剤（血液量と他の体液との交換調節にとって重要）。
【００４６】
[0057]さらに、本発明の金属化ポリマーとキレート化するのに好適なカーゴ生理活性剤の特定例としては、限定はしないが、インスリン、ヒト成長ホルモン、およびカルシトニンなどの薬剤、治療的生物学的製剤；治療的およびターゲティング抗体ならびにそれらの活性断片；凝固因子などの既知の治療的血液因子、およびサブユニットワクチンへの包含に好適なものなどのタンパク質抗原と糖タンパク質抗原双方が挙げられる。また、ペプチド（サブユニットワクチンに対する病原性エピトープを含有するものを含む）を、本発明の金属化ポリマー組成物内に組み込むことができる。エピトープのユニークな三次元折りたたみ構造が保存されているサブユニットワクチンの製剤化において、病原性エピトープを含む特定のアミノ酸配列を、本発明の金属化ポリマー組成物内へ組み込むことができる。このような抗原性アミノ酸配列の非限定的な例としては、本明細書の図５〜１２において配列番号１〜８で記載されているものが挙げられる。
【００４７】
[0058]カーゴをロードした金属化ポリマーの製剤は多様であり、インプラント、コーティングおよびワクチン製剤などのナノ粒子が含まれる。例えば、一実施形態において、本発明は、ポリマー粒子の形成に一般的に用いられる乳濁法の必要性を回避している溶液重縮合の技法を用いて、本発明の金属化ポリマーをナノ粒子として製剤化する方法を提供する。本明細書の実施例４および５に記載されているように、本発明の金属化ポリマーは、１つまたは複数のカーゴ分子とさらに錯体化されていてもいなくても、金属化ポリマーの重縮合における最終ステップとしてナノ粒子内に容易に製剤化される。さらに、Ｃｈｕｕ  ＣＣ、Ｋａｔｓａｒａｖａ  Ｒ、米国特許第６，５０３，５３８Ｂ１明細書に開示されているように、作製に用いられるジオールが脂肪族二カルボン酸である、より疎水性のＰＥＡ類第一世代に基づいた粒子よりも水性環境でより分散性である粒子が、本発明の重縮合法によって得られる。
【００４８】
[0059]手短に述べると、カーゴをロードした金属化ポリマーのナノ粒子調製のための本発明の方法は、以下のステップを含む：ａ）カーゴ分子と本発明のポリマーの水溶液との均一な混合物を調製するステップ；ｂ）カーゴ分子の攪拌溶液へ水性金属塩をボーラス添加することにより、カーゴ分子／遷移金属塩溶液を調製するステップ；およびｃ）室温での攪拌下、ｂ）へａ）の溶液を滴下添加することによりナノ粒子を生成させるステップ。ナノ粒子は、サイズ排除濾過法、透析法、または遠心分離法および洗浄法により、例えば、当業界で知られており、本明細書の実施例４および５に記載されている技法により、反応溶液から回収される。
【００４９】
[0060]あるいは、キレート化カーゴ分子を有する本発明の金属化ポリマーは、噴霧、浸漬など、当業界に知られている種々の技法を用いて、種々のタイプの粒子の外側への粘稠な液体コーティングとして適用することができる。コーティングとしての使用では、本発明に包含されるカーゴ分子は、限定はしないが、血清アルブミン、トランスフェリン、それらの抗体および活性断片などの血液因子、ならびにこのようなカーゴ分子のＨｉｓタグ化融合構築体から選択される。このようなコーティングは、当業界に知られている医学的処置に用いられる種々のタイプの固体対象物の外側の少なくとも一部に適用することもできる。このようなコーティングは、コーティングが適用される粒子または医学的装置の血液または組織への適合性を増大させるために使用することができる。
【００５０】
[0061]他の実施形態において、キレート化金属カチオンなしの本発明の金属キレート化ポリマーを、金属の解毒および／または創傷ケアの目的で対象に投与することができ、治療的生理活性剤に伴って、単独で、またはアジュバントとして、インプラントまたは粒子としての投与用に製剤化される。
【００５１】
[0062]さらに他の実施形態において、本発明の金属化ポリマーを、治療的薬剤および生物学的製剤の提示および／または送達のために使用されるコーティング、インプラントおよび粒子として製剤化することができる。例えば、本発明の金属化ポリマーは、表面マーカー、特異的受容体、またはタンパク質ドッキング部位を標的として、薬剤および抗体または他のリガンドなどの生物学的リガンドと共に共ロードすることができ、ここでの生物学的リガンドは、当該組成物およびキレート化薬剤を標的細胞または癌細胞の型などの細胞型へ送達するために用いられる。前述の薬剤は、天然のリガンド分子を殺し、そのドッキングを阻止するため、または標的組織または癌細胞における分子の複製を防止するために選択することができる。
【００５２】
[0063]本発明のさらに他の実施形態において、本発明のポリマーの粒子は、本明細書に記載されたカーゴ常磁性または強磁性の金属、および生物学的リガンドと共ロードされる。常磁性または強磁性の金属は、生物学的リガンドが非経口的に一回注入された当該組成物を送達する標的の臓器、組織または細胞の診断用画像化のために用いられる。このような診断用組成物を用いる方法は、当業界によく知られている。
【００５３】
[0064]さらに他の実施形態において、本明細書に記載されている放射性金属が本発明の金属キレート化ポリマーによりキレート化され、第二の分子、当業界に知られており本明細書に記載されているターゲティングリガンドが、組織または細胞のターゲティングに用いられる。例えば、細胞表面上の細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体、例えばＣＤ２０に特異的に結合する抗体などのリガンドを取り込むことにより、放射性金属は癌性腫瘍内の幹細胞を標的にしてその幹細胞を殺すことができる。
【００５４】
[0065]本発明の他の実施形態において、診断用画像化のためのナノ粒子を、本明細書に記載されている診断用金属イオン（例えばＧｄ３＋）および標的の細胞、臓器または組織に特異的に結合するリガンドと共ロードする。Ｇｄ画像化を実施する方法は当業界によく知られており、限定はしないが、診断用画像化のために診断用組成物が非経口的に注入され、当業界に知られており本明細書に記載されているターゲティングリガンドが組織または細胞の標的化に用いられるインビボ磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）が含まれる。
【００５５】
[0066]その結果、一実施形態において、本発明の金属キレート化ポリマーは診断用金属とキレート化され、所望の標的細胞、臓器または組織の画像化に用いるためにインビボ投与することができる診断用組成物を形成し、しかもこのポリマー組成物は容易に生分解され排泄される。したがって、本発明の金属キレート化ポリマーを用いて作製された本発明の診断用組成物は、キレート化した毒性イオンの長期組織蓄積を避け、本明細書に記載された重縮合の方法を用いてナノ粒子として製剤化することができる。
【００５６】
[0067]さらに他の実施形態において、本発明のポリマーをポリマー末端基により生理活性剤と結合させ、および／または末端基を用いて、ＡＢＡタイプのブロックシステムが得られる。ここでＢは、式（Ｉ）または式（ＩＶ）のポリマーであり、Ａブロックは、ＰＥＧ（オリゴ−またはポリエチレングリコール）、多糖類、脂質類、ポリペプチドまたはポリ（核酸）などの生物学的高分子および活性剤などの化合物から選択される。双方の場合で、Ｂブロックポリマーの高分子鎖は、アミンまたは酸無水物の活性末端基の等量または同数を有することが好ましい（他の結合部位は、高分子鎖に沿ったペンダントカルボン酸基であろう）。
【００５７】
[0068]同一の末端基の等量または同数を有するＡＢＡブロックキレート化ポリマーへの組み込みのためのＢブロックの合成は、本明細書に記載された本発明のキレート化ポリマーの重縮合に用いられる１つの二官能価モノマー（すなわち、ジアミン、または活性化ポリ酸）が、重合の初めに予備計算上過剰に導入されるインバランス技法を用いて達成された。Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ分光法によってモニターされているように、酸無水物の末端基が過剰に用いられると、大量の重合環（マクロ環）が生じるためこの過程は複雑になった。しかし、無機塩基（例えばＫ２ＣＯ３）の導入により反応速度は著しく低下し、得られる線形ＡＢＡブロックポリマーのＭｗがより良好に制御できることが判明した。
【００５８】
[0069]本発明のキレート化ポリマー分子は、末端基結合を経て、場合によってリンカーを介して、キレート化ポリマー分子に結合した生理活性剤を有することができる。例えば、一実施形態において、キレート化ポリマーは、構造式ＶＩＩＩ：
【化１２】
2011523669.tif 000014
を有するポリマー−生理活性剤末端基結合内に含まれ、
式中ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、上記のとおりであり、Ｒ８は、−Ｏ−、−Ｓ−、およびＮＲ１０からなる群から選択され、式中Ｒ１０はＨまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり；Ｒ９は、本明細書に記載された生理活性剤である。
【００５９】
[0070]ワクチン製剤を得るために、一実施形態において、天然のコンフォメーションを維持する少なくとも１つの病原性エピトープを含んでなるアミノ酸配列を、本発明のポリマーにおけるポリアミノ酢酸のインライン残基（すなわち、本発明のキレート化ポリマーまたは金属化ポリマーにおける複数のＲ３における）の非結合カルボン酸基を介して本発明のキレート化ポリマーに結合させる。あるいは、ワクチン製剤において、本発明のポリマーにおけるポリアミノ酢酸のインライン残基の非結合カルボン酸基は遊離であって溶液中の金属カチオンをキレート化し、金属化ポリマーを形成する。この金属カチオンは、病原性エピトープ中の金属結合アミノ酸のさらなる結合を促進する。金属化ポリマーワクチン製剤のナノ粒子は、ポリマー粒子の形成に通常用いられる乳濁技術を必要とせずに、直接ポリマー含有溶液から容易に得られる。本発明のキレート化（例えば、金属化）ポリマー類を用いたナノ粒子としてのワクチン製剤に関する方法は、本明細書の実施例８および９に記載してある。
【００６０】
[0071]以下に詳細に記載してあるさらに別の実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の末端基結合のＲ９は、１種以上の種々の免疫賦活アジュバントなどの生理活性剤である。免疫賦活アジュバントとしては、イミキモドなどの薬物；ＱＳ−２１などの脂質；ｄｓＲＮＡ類縁体ポリＩ：ポリＣなどの核酸；またはＧＭ−ＣＳＦなどの免疫賦活タンパク質が挙げられる。本発明のポリマーに対する末端基結合に有用な特に望ましい免疫賦活アジュバントは、タイプにより下表６に整理されたワクチン組成物として製剤化された本発明のキレート化ポリマー類の有効性を増強する。
【００６１】
【表１】
2011523669.tif 000015
【００６２】
【表２】
2011523669.tif 000016
【００６３】
ワクチン製剤のナノ粒子の調製における免疫賦活アジュバントの末端基結合方法の例は、本明細書の実施例１０に例示してある。
【００６４】
[0072]あるいは、下記の構造式（ＩＸ）に示すように、リンカー、−Ｘ−Ｙ−は、構造式（Ｉ）および（ＩＶ）の分子中のＲ８と生理活性剤Ｒ９との間に挿入することができ、式中Ｘは、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、置換アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、Ｏ基、Ｎ基、およびＳ基から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する５〜６員の複素環式系、置換複素環式、（Ｃ２〜Ｃ１８）アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｃ６およびＣ１０アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アリールアルキニル、置換アリールアルキニル、アリールアルケニル、置換アリールアルケニル、アリールアルキニル、置換アリールアルキニルからなる群から選択され、これらの置換基は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｓ［（＝Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル]、−Ｓ［（Ｏ２）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル]、−Ｃ［（＝Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル]、ＣＦ３、−Ｏ［（ＣＯ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル]、−Ｓ（Ｏ２）［Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）]、−ＮＨ［（Ｃ＝Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル]、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）の群から選択され；式中Ｒ１１およびＲ１２は、独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＲ１０−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０−、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０−、および−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１０−からなる群から選択される。
【化１３】
2011523669.tif 000017
【００６５】
[0073]さらに別の実施形態において、本発明のキレート化ポリマー類は、ＡＢＡタイプのブロック系の設計に使用することができ、式中Ｂは、式（Ｉ）または式（ＩＶ）のポリマーであり、Ａブロックは、ＰＥＧ（オリゴまたはポリエチレングリコール）、多糖類、脂質類、ポリペプチドまたはポリ（核酸）などの生物学的高分子および生理活性剤などの化合物から選択される。本発明のＡＢＡブロックポリマー類は、本明細書の実施例１０に記載されている末端基結合技法により形成される。
【００６６】
[0074]本発明のキレート化または金属化ポリマー類を利用する本発明のＡＢＡブロックポリマー類の製造法、ならびにこのようなポリマー類を用いた全末端基結合法において、Ｂポリマーの高分子鎖は、活性の等しい末端基：アミンまたは無水物を有することが好ましい（他の結合部位としては、高分子鎖に沿ったペンダントカルボン酸基であろう）。
【００６７】
[0075]上記のとおり生理活性剤の単純な末端基結合でも、本発明のＡＢＡブロックポリマー類の形成でも、等しい量または数の活性末端基を含有する本発明のキレート化ポリマーの合成が、末端基結合に利用される。これらの手法の双方で、不均衡技法に関しては、本明細書に記載している本発明のキレート化ポリマー類の重縮合に用いられる１種の二官能価モノマー（すなわち、ジアミンまたは活性化ポリ酸）が、予め算出されたた過剰量で重合開始時に導入される。無水物末端基が過剰に用いられる場合、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ分光法によりモニターされるように、大量のポリマー環（マクロ環）が生成するため、この方法は複雑になる。しかしながら、無機塩基（例えば、Ｋ２ＣＯ３）の導入により、反応速度が有意に減少し、生じた線形ＡＢＡブロックポリマーのＭｗが良好に制御できることが分かった。
【００６８】
[0076]一実施形態において、ＡＢＡブロックポリマー中のＡブロックとしてＰＥＧが導入されると、金属化ポリマーによる配位錯体中に保持される極めて不溶性のカーゴ薬物の溶解性を増加させる。不溶性カーゴ薬物との金属化ポリマーにより、Ａブロックとしての溶解性増強ＰＥＧ分子に両側をフランクされているＢブロックが形成する。本発明のこの実施形態において、驚くべきことに、本発明の他の実施形態を用いて製剤化されたナノ粒子のサイズと比較して、ＡＢＡブロックポリマーから形成されたナノ粒子のサイズは、相当に減少することが分かった。例えば、このようなＡＢＡブロックポリマーのナノ粒子は、約５０ｎｍから約１００ｎｍの範囲、例えば、約６８ｎｍで得られた。
【００６９】
[0077]本発明を、さらに以下の非限定的実施例により例示する。
【００７０】
［実施例１]
[0078]材料  試薬：ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ−ＤＡ、９８％）、エチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ−ＤＡ、９８％）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ、ＩＤＲＡＮＡＬ（商標）ＩＶ）は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し用いた。他の二無水物、例えば、ＥＧＴＡ二無水物は、仏国特許第１，５４８，８８８号（Ｃｌ．Ｃ０７ｄ）明細書；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．（１９６９）７１：８１３８０ｑにおいてＧｅｉｇｙ、Ｊ．Ｒ．Ａ．−Ｇ．により報告されているように、ピリジン中、親の四酢酸の無水酢酸脱水により調製することができる。
【００７１】
[0079]イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）二ナトリウム塩（Ｂａｙｐｕｒｅ  ＣＸ１００  Ｇ、  ７７％）は、Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ、Ｂａｄ  Ｂｅｒｌｅｂｕｒｇ、独国からサンプルを恵与された。アミノ酸：Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシンおよびジオール類１，３−プロパンジオールならびに１，６−ヘキサンジオールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【００７２】
[0080]無水溶媒ジメチルホルムアミド（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、ニュージャージー州）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および他の溶媒アセトン、２−プロパノール、メタノール、トルエン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カリフォルニア州）は、市販の供給源から購入した。
【００７３】
[0081]材料の特性  モノマー類およびポリマーの化学構造は、標準的な化学的方法により特性化した。ＮＭＲスペクトルは、１ＨＮＭＲ分光法に関して５００ＭＨｚで操作するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−５００分光計（Ｎｕｍｅｇａ  Ｒ．Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ、サンディエゴ、カリフォルニア州）により記録された。内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）と共に、溶媒ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．アンドーバー、マサチューセッツ州）を用いた。
【００７４】
[0082]合成されたモノマー類の融点は、自動Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＦＰ６２  融点装置（コロンバス、オハイオ州）上で測定した。合成されたモノマー類およびポリマー類の熱的性質は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ  ８２２ｅ）上で特性化した。サンプルはアルミニウムパンに入れた。窒素流下、１０℃／分の走査速度で測定を実施した。
【００７５】
[0083]合成されたポリマーの数平均分子量ならびに重量平均分子量（ＭｗおよびＭｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を、高圧液体クロマトグラフィーポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４耐熱性指標検出器を備えたモデル５１５ゲル透過クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．ミルフォード、マサチューセッツ州）により測定した。使用された溶出液は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）中、０．１％のＬｉＣｌ溶液であった。２種類のＳｔｙｒａｇｅｌ（登録商標）ＨＲ  ５Ｅ  ＤＭＦタイプカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を接続し、ポリスチレン標品で較正した。
【００７６】
[0084]モノマー合成：本発明の生分解性ポリアミノカルボン酸含有ポリマー類の合成は、２つの基本ステップ：１）ビス求核性試薬：ビス（アルファアミノアシル）−ジオール−ジエステル類のジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩類（式ＶＩの化合物）の合成；２）ステップ１）で得られたモノマーとテトラカルボン酸二無水物との溶液重縮合を含んだ。
【００７７】
【化１４】
2011523669.tif 000018
ビス（α−アミノ酸）ジエステル類の酸塩（一般式ＶＩ）の合成
[0085]構造式（ＶＩ）のジエステル類は、公表された手法に従った手法を用いて調製した：１５０ｍＬのトルエン中、アルファ−アミノ酸（０．１ｍｏｌ），ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．１１ｍｏｌ）およびジオール（０．０５ｍｏｌ）の懸濁液を攪拌し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋコンデンサ内で３．６ｍＬ（０．２ｍｏｌ）の水が発生するまで（１２〜２４時間）還流した。不均一な反応混合物を室温に冷却し、固形生成物をろ過し、トルエンで洗浄し、減圧乾燥した。この方法を用いジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩類として合成されたモノマー類は、本明細書中、以下のとおり称される：
ビス−（Ｌ−ロイシル）−１，６−ヘキサンジオールジエステル、（Ｌ−Ｌｅｕ（６）−２ＴｏｓＯＨ）、
ビス−（Ｌ−フェニルアラニル）−１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトールジエステル、（Ｌ−Ｐｈｅ（ＤＡＳ）−２ＴｏｓＯＨ）
ビス−（グリシン）−１，４−アンヒドロエリトリトールジエステル、（Ｇｌｙ（ＴＨＦ）−２ＴｏｓＯＨ）。
【００７８】
[0086]収率および融点（Ｍｐ）は、公表されたデータと同一であった。（Ｋａｔｓａｒａｖａら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）３７：３９１−４０７頁；Ｚ．Ｇｏｍｕｒａｓｈｖｉｌｉら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．-  Ｐｕｒｅ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）Ａ３７：２１５−２２７頁；ＺＤ  Ｇｏｍｕｒａｓｈｖｉｌｉら、米国特許出願公開第２００７０２８２０１１号明細書）。
【００７９】
式（ＶＩＩ）のビス（Ｌ−アルギニル）−１，６−ヘキサンジエステルテトラトシル塩（Ａｒｇ（６）−４ＴｏｓＯＨ）の合成
【化１５】
2011523669.tif 000019
[0087]式（ＶＩＩ）を有するモノマー類を合成するため、０．２２ｍｏｌのｐ−トルエンスルホン酸一水和物を使用すること以外は、上記と同じ手法に従った。モノマーの精製については、５ｇの粗製モノマーを３０ｍＬの加熱２−プロパノールに溶解し、過剰のアルギニンを除去するためにろ紙を介してろ過した。冷凍庫に保存後、粘稠性モノマー層を分離した。この手法を２回反復し、最終生成物を一晩減圧乾燥した。次いで生成物を１ｇ／ｍＬ水に再度溶解し、凍結乾燥した。ｍｐ＝２６４−２６８°Ｃ（ＤＳＣ、５  °Ｃ／分）  を有する吸湿性白色物質を、７５．９  ％の収率で収集した。元素分析：Ｃ４６Ｈ７０Ｎ８Ｏ１６Ｓ４（１１１９．３５）。理論値：Ｃ４９．３６、Ｈ６．３０、Ｎ１０．０１。実測値：Ｃ  ４９．７２、Ｈ６．５３、Ｎ９．９６。
【００８０】
Ｒ３＝ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝  ＰＥＧ２００である式（ＶＩ）のビス−Ｌ−ロイシン−ＰＥＧ２００−ジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩の合成：
【化１６】
2011523669.tif 000020
[0088]Ｌ−ロイシン（１７．４６ｇ）（０．１３３ｍｏｌｅ）、２６．５３ｇ（０．１４ｍｏｌｅ）のｐ−トルエンスルホン酸一水和物および１１．２５ｍＬ（６３．４ｍｍｏｌｅ）のＰＥＧ−２００（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１９０ｍＬの乾燥トルエン中に懸濁させ、オーバーヘッドスターラーを用いて攪拌した。溶液を、約８時間加熱還流し、発生した水（４．８ｍＬ）をＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋコンデンサ内に採集した。室温に放置後、黄褐色油層を分離した。次に溶媒をデカントし、生成物を５０ｍＬの２−プロパノールに溶解し、５０ｍＬのヘキサン中油として沈殿させた。収集された橙褐色の粗製油状生成物の収量は４２ｇであった。１０ｇの材料を、１５０ｍＬの熱ベンゼン中に再度溶解し、次いで４℃で一晩油として圧潰させた。溶媒をデカントし、生成物を６０℃で２４時間真空オーブン内で乾燥した。
【００８１】
[0089]Ｌ−ロイシン−ＰＥＧ２００−ジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩：５００ＭＨｚ  １ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、ｐｐｍ、δ）：０．８９［ｄ，１２Ｈ，ＣＨ−（ＣＨ３）２]、１．６０［ｍ，４Ｈ，−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−]、１．７４［ｍ，２Ｈ，−ＣＨ−（ＣＨ３）２]、２．２９［ｓ，６Ｈ，−Ｐｈ−ＣＨ３]、３．５０［ｓ，４Ｈ，−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−]、３．５３−３．６４［ｍ，ｍ〜１０Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−]、４．００［ｓ，２Ｈ，＋Ｈ３Ｎ−ＣＨ−]、４．２３−４．３４［ｍ，ｍ，４Ｈ，−ＯＣＯ−ＣＨ２−]、７．１４−７．４９［ｄ，ｄ，８Ｈ，Ｐｈ]、８．３３［ｓ，６Ｈ，＋Ｈ３Ｎ−]。
【００８２】
［ポリマー類の合成］
［１．重縮合に関する反応条件の試験］
[0090]反応パラメータを最適化し、生成物のＭｗを増加させるために、ＥＤＴＡ−ＤＡとジアミンモノマーＬ−Ｌｅｕ（６）．２ＴｏｓＯＨとの重縮合を試験した。
【００８３】
［１．１．塩基の影響］
[0091]トリエチルアミン（ＴＥＡ）を、塩基／触媒として用いた。ＥＤＴＡ−ＤＡと２モル当量の塩基（Ｌ−ｌｅｕ（６）コモノマーの各トシレートに対して１当量）との反応を、４モル当量（各トシレートに対して１当量およびＥＤＴＡから形成され得られた遊離カルボン酸基各々に対して１当量）との反応と比較した。下表１に見られる結果は、ＥＤＴＡのカルボン酸に拠る場合、塩基のモル当量を２倍増加させて使用すると、分子量の点でポリマーの大きさが２倍以上になることを示している。
【００８４】
【表３】
2011523669.tif 000021
【００８５】
［１．２．ポリマーＭｗに対する温度の影響］
[0092]６０℃で実施された元のＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）反応中、反応混合物の色は、淡黄色から暗琥珀色に変化して著しくより暗色となり、また粘稠性がより低下することが認められた。変色に対する温度の影響を比較するため、ならびにより高い分子量の獲得を試みるため、反応を６０℃、４０℃、２０℃、および０℃で実施した。これらの結果は本明細書の表２に記載してある。
【００８６】
[0093]反応温度を低下させると、反応混合物の変色は有意に少なくなり、より高いＭｗの生成物が得られた。この結果は、無水物が低温でもジアミンコモノマーと容易に反応すること、また、連鎖伸長の終了または阻害を生じさせる予見不能な副反応がより高い温度で生じたことを示唆している。
【００８７】
【表４】
2011523669.tif 000022
【００８８】
［３．１．３．反応速度論］
[0094]上記の重縮合実験から見られるように、最初の１時間以内にポリマーは最大分子量に達した。ＥＤＴＡ−ジアミン縮合反応に関する最適温度（下表３を参照）は、０℃〜２０℃の範囲であると考えられた。
【００８９】
【表５】
2011523669.tif 000023
【００９０】
［３．１．４．溶媒の選択］
[0095]重縮合反応を実施する際の適性に関して、非プロトン性極性溶媒ＤＭＳＯ、ＤＭＦおよびＤＭＡｃを比較した。ＤＭＳＯは、ＥＤＴＡ−酸二無水物を容易に溶解するので第一選択の溶媒であった。しかし、重縮合反応が進行するにつれて、形成されたポリマーは、これら３種の反応溶媒のいずれにも懸濁化した。３種の反応溶媒の各々で得られたポリマーの分子量を表３に示してある。
【００９１】
[0096]ＤＭＳＯおよびＤＭＦは双方ともポリマー類の変色を生じさせ、ＤＭＳＯの使用は、明らかに亜硫酸臭を生じさせた。この反応をＤＭＡｃ中で実施した場合、弱点は見られなかった：ポリマーおよび懸濁液は灰白色であり、臭気はなかった。表４のデータから見られるように、ＤＭＦおよびＤＭＡｃ中で形成されたポリマー類のＭｗは同等であったが、ＤＭＳＯの使用により、分子量の著しく低いポリマーが生じた。
【００９２】
【表６】
2011523669.tif 000024
【００９３】
ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）Ｐｏｌｙｍｅｒ（式Ｉａ）の合成：
【化１７】
2011523669.tif 000025
[0097]重縮合のため、ビス−（Ｌ−ロイシル）−１，６−ヘキサンジオールジエステルジトシレート（８．３２ｍｍｏｌ、５．７３４ｇ）およびＥＤＴＡ−ＤＡ（８．３２ｍｍｏｌ、２．１３３ｇ）を一緒に混合し、次いで４．６９ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＦ）および４．６９ｍＬの乾燥トリエチルアミン（ＴＥＡ）を窒素下で加えた。この反応液を、０oＣ（氷浴）で８時間攪拌し、５ｍｏｌ％過剰のＥＤＴＡ−ＤＡ（０．４２ｍｍｏｌ、０．１０７ｇ）の添加によりクエンチした。室温でさらに１６時間攪拌を続け、１Ｌのアセトン中にポリマーを沈殿させた（粗製ポリマーＭｗ＝１４４，０００ｇ／ｍｏｌ、ＧＰＣ、ＤＭＡｃ、ＰＳ）。上澄液をデカントし：ポリマーをアセトンですすぎ、風乾し、次いでメタノール中に再懸濁し、酸性水ｐＨ＝２（ＨＣｌ）中で沈殿させた。上澄液をデカントし、脱イオン（ＤＩ）水により完全に洗浄した。次に採集したポリマーを、一定重量になるまで室温で減圧乾燥した。回収した生成物（式Ｉａ）の収率は、約６０％であった。酸処理後の最終生成物は、Ｍｗ＝５０，７００ｇ／ｍｏｌ（ＧＰＣ、ＤＭＡｃ、ＰＳ）およびガラス転移温度Ｔｇ＝７７°Ｃを有した。
【００９４】
[0098]水中でのより高い溶解度を得るために、この調製ポリマーの５ｇを、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に溶解することによりＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）のナトリウム塩に変換し、ＤＩ水に対して透析した（ＭＷＣＯ＝３．５ＫＤａ）。凍結乾燥ポリマーを、白色綿毛様粉末として約５０％の収率で回収し、１Ｈ−ＮＭＲ（図１）により特性化した。元素分析：Ｃ２８Ｈ４６Ｎ４Ｎａ２Ｏ１０（６４４．６７）；理論値：Ｃ４９．０３、Ｈ７．８３、Ｎ８．２７。実測値：Ｃ５２．１７、Ｈ７．１９、Ｎ８．６９、Ｍｗ＝１０６，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４２（ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ８．４、ＯＥＧ標品）；Ｔｇ＝１４６ °Ｃ。
【００９５】
ＰＥＡ  ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ（ＤＡＳ）、（式Ｉｂ）のポリマー合成：
【化１８】
2011523669.tif 000026
[0099]溶液重縮合のため、Ｌ−Ｐｈｅ（ＤＡＳ）．２ＴｏｓＯＨ（１８．８０ｍｍｏｌ、１４．７５７  ｇ）およびＤＴＰＡ−ＤＡ（１８．８０ｍｍｏｌ、６．７１８ｇ）を一緒に混合し、次いで１５．６７ｍＬの乾燥ＤＭＳＯおよび１１．０ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）をアルゴン下で加えた。この反応液を、室温で２４時間攪拌し、ポリマー生成物を２．５Ｌのアセトン中に沈殿させた。上澄液をデカントし、ポリマーをアセトンですすいでから風乾した。式Ｉｂのポリマーを、再度ＤＭＳＯ中に懸濁し、１：１ｖ／ｖのＤＩ水で希釈し、透析用バッグに移し（ＭＷＣＯ＝３．５Ｋ）、ＤＩ水中で透析した。透析したサンプルを凍結乾燥すると、約９０％収率の白色ポリマー粉末を得た。重量平均Ｍｗ＝２４，５００（ｇ／ｍｏｌ）（ＧＰＣ）、Ｔｇ＝１２２°Ｃ．
【００９６】
ＰＥＡ  ＤＴＰＡ−Ｇｌｙ（ＴＨＦ）、（式Ｉｃ）のポリマー合成：
【化１９】
2011523669.tif 000027
[0100]重縮合反応に関して、Ｇｌｙ（ＴＨＦ）−２ＴｏｓＯＨモノマー（２６．０６ｍｍｏｌ、１４．６６４ｇ）およびＤＴＰＡ−ＤＡ（２６．０６ｍｍｏｌ、９．３１３ｇ）を、２１．７２ｍＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に室温、アルゴン下で混合し、１５．２６ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えた。この重縮合反応を２６時間継続し、ポリマー生成物を２．５Ｌのアセトン中に沈殿させた。上澄液をデカントし：ポリマーをアセトンですすぎ、風乾した。ポリマーを蒸留Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、この溶液を透析用バッグに移し（ＭＷＣＯ＝３．５Ｋ）、蒸留Ｈ２Ｏ中で３日間透析し（ＤＩ水）、次いで凍結乾燥すると、約５０％収率の白色ポリマー物質が得られた。次に式Ｉｃの生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＳＥＣにより特性化した。Ｍｗ＝１４，４００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６２（ＳＥＣ、１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ８．４、ＯＥＧ標品）。
【００９７】
ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ａｒｇ（６）、（式Ｉｄ）のポリマー合成：
【化２０】
2011523669.tif 000028
[0101]重縮合反応は、式Ｉａ、ＩｂおよびＩｃの調製の際と同様に４５°Ｃで１時間実施した。次いでもう１時間、温度を６５°Ｃまで上げて、反応物を完全に溶解させてから、再度４５°Ｃでさらに６時間攪拌を続けた。アセトン中にポリマーを沈殿させ、ろ紙を介してろ過し、一晩真空オーブン中で乾燥した。ポリマーを、ＮａＨＣＯ３（５ｇのポリマー当り０．５ｇの重炭酸塩）と共に再度水中に溶解し、ＤＩ水中で３日間透析し、凍結乾燥機で乾燥した。式Ｉｄのポリマーの１Ｈ−ＮＭＲ分析において、ｐ−トルエンスルホン酸の対イオンは検出されなかった。Ｅｌ．元素分析  Ｃ２８Ｈ５２Ｎ１０Ｏ１０（６８８．７７）；理論値：Ｃ４８．８３、Ｈ７．６１、Ｎ２０．３４。実測値：Ｃ４４．９５、Ｈ７．７９、Ｎ１８．７６、Ｍｗ＝１７，８００ｇ／ｍｏｌ．（ＳＥＣ）。
【００９８】
[0102]ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、このポリマーのＭｗを特性化した。この計測器は、３０°Ｃの内温設定でＷａｔｅｒｓ  ６００ＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ７１７プラスオートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ  ４１０耐熱性指標検出器から構成された。５０μＬアリコートのサンプル溶液を、３０°Ｃに維持されたＷａｔｅｒｓ、Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）５００、７．８´３００ｍｍカラムに注入し、ｐＨ４．８の１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を用いて０．６ｍＬ／分で溶出させた。２．０ｍｇ／ｍＬサンプルのＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ａｒｇ（６）ポリマーを、ｐＨ４．８の１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液中に溶解した。ポリマーの保持時間を、ヒトチログロブリン（６６０ｋＤａ）、ウシグロブリン（１５８ｋＤａ）、卵白アルブミン（４５ｋＤａ）、ミオグロビン（１７．８ｋＤａ）、およびウリジン（０．４８ｋＤａ）の混合物を含有するタンパク質標品（Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ、Ａｑｕｅｏｕｓ  ＳＥＣ１）から得られた保持時間と比較した。
【００９９】
[0103]式ＩｅのＰＥＡ  ＥＤＴＡ  Ｌｅｕ（ＰＥＧ２００）の合成：
【化２１】
2011523669.tif 000029
ビス−（Ｌ−ロイシル）−ＰＥＧ２００−ジエステルジトシレート（Ｌ−Ｌｅｕ（ＰＥＧ２００）．２ＴｏｓＯＨ）（３．１７７ｇ）およびＥＤＴＡ−ＤＡ（１．０３２１ｇ）を一緒に混合し、次いで２．１２ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＦ）および１．２４ｍＬの乾燥トリエチルアミン（ＴＥＡ）を窒素下で加えた。この反応液を、０oＣ（氷浴）で６時間、さらに室温で１８時間攪拌し、ＥＤＴＡ−ＤＡ（０．２６ｇ）の添加によりクエンチした。室温でさらに１６時間攪拌を続け、１Ｌのアセトン中にポリマーを沈殿させた。生成物を再度アセトンですすぎ、風乾し、次いで１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３中に再度溶解し、２０ｍＬの脱イオン水で希釈し、ＤＩ水に対して透析した（ＭＷＣＯ＝３．５ＫＤａ）。凍結乾燥ポリマーを、白色綿毛様粉末として２ｇの収量収率で回収し、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ、δ）により特性化した：０．８９［ｄ，ｄ  １２Ｈ，−ＣＨ−（ＣＨ３）２]、１．６０［ｍ，４Ｈ，−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）２]、１．７４［ｍ，２Ｈ，−ＣＨ−（ＣＨ３）２]、２．８６［ｓ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−]、３．２８［ｓ，４Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｎ＜]、３．４３［ｓ，４Ｈ，＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、３．７０−３．７８［ｍ，〜１４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−]、４．２６−４．３３［ｍ，ｍ，４Ｈ，−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−]、４．４７［ｍ，２Ｈ，−ＨＮ−ＣＨ＜]、Ｍｗ＝３３，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４；（ＳＥＣ、１０ｍＭのＰＢＳ  ｐＨ８．４、＋２０％ｖ／ｖのＭｅＯＨ、ＯＥＧ標品）。
【０１００】
［ポリマー金属結合体の調製および結合能力の決定］
[0104]水溶性ポリマーＰＥＡ−ＤＴＰＡ−Ｌｅｕ（６）とＧｄ（ＩＩＩ）との錯体化：  ３００ｍｇのＰＥＡ−ＤＴＰＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｎａ塩（Ｍｗ１３，１００ｇ／ｍｏｌ、ＧＰＣ、ＤＭＡｃ、ＰＳ）を、約８ｍＬのＤＩ水に溶解した。次にこの溶液に攪拌しながら、等モル量のＧｄＣｌ３．６Ｈ２Ｏ水溶液を滴下により加えた。０．１ＭのＮａＯＨを添加することによりｐＨを５．８に維持した。攪拌を１日続けた。溶液中に遊離のＧｄイオンがもはや検出されなくなるまでこの溶液を透析し（Ｂａｒｇｅ，Ａ．ら、Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ（２００６）１：１８４−１８８頁により記載されたキシレノールオレンジ試験）、次いでサンプルを凍結乾燥した。錯体化後にポリマーの見かけの分子量値の減少が見られ（Ｍｗ＝８，７００ｇ／ｍｏｌ）、この結果は、金属に結合した際のＤＴＰＡポリマー中の電荷の中和に起因すると考えられる。金属結合により、さらに水力学的値の変化が生じた。ＩＣＰ−ＭＳ測定により決定された結合Ｇｄ（ＩＩＩ）の含量は、１ＤＴＰＡケージ当り＞９０％であった。
【０１０１】
［実施例２]
［ＥＧＴＡベースのＰＥＡ合成［ＣＯ−ＥＧＴＡ]：ワンポット反応（スキーム１）］
【化２２】
2011523669.tif 000030
[0105]３０ｍＬの乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）および５ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）のエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を、２５０ｍＬの三頚丸底フラスコに装入し、氷浴上で冷却し、アルゴン下でガスシールした。次に４．５５ｍＬ（３３ｍｍｏｌ）の無水トリフルオロ酢酸を加え、白色固体が、透明な淡黄色ＥＧＴＡ二無水物の粘稠性層に完全に変換するまで（約４時間）攪拌した。次に氷浴を、メタノール／ドライアイス浴に置き換えて反応混合物を、-４０°Ｃから-３０°Ｃに冷却した。別個に、１６．５ｍＬ（０．１１８ｍｏｌ）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を２０ｍＬの乾燥ＤＭＦで希釈し、反応混合物に１時間に亘って滴下により加え、攪拌を約-３０°Ｃで３０分間続けた。次に、９．０４８ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）のビス−（Ｌ−ロイシン）−１，６−ヘキサンジオールジエステルのジアミンモノマージ−ｐ−トルエンスルホン酸塩を加え、室温で一晩攪拌した。この粗製ポリマー溶液は、Ｍｗ＝３６ｋｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４６２を有した（ＧＰＣ、ＤＭＡｃ、ＰＳ）。反応溶液をロータリー蒸発させて揮発性ＤＣＭを除去し、２０ｍＬの水で希釈し、ＤＩ水に対して透析した。凍結乾燥後、Ｍｗ＝３０ｋｇ／ｍｏｌ（ＳＥＣ、ＰＥＯ）を有する５．９４ｇのポリマーを採集した。ポリマーを、メタノール／酢酸エチルの再沈殿によりさらに精製した。本発明のポリマー構造を、Ｄ２Ｏ中の１ＨＮＭＲ分析により確認した。
【０１０２】
［実施例３]
［ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）．ニッケル［パクリタキセル]ナノ粒子の製剤化］
[0106]本実験を実施して、非水溶性生理活性剤であるパクリタキセルの送達を目的として本発明の金属キレート化ポリマー類をナノ粒子として製剤化するために本発明の手法を例示した。
【０１０３】
[0107]水性ポリマー予製液（Ａ）の調製：１２０ｍｇ量の本発明のポリマーＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）（Ｒ１＝−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−；Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６である式ＩのＭｗ＝２４ｋｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６８）を、３ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に室温で溶解し、ｐＨ＝７．０を有する１７ｍＬの水性２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液中に１ｍＬ／分の速度で滴下により加えた。この緩衝溶液を室温で激しく攪拌して、６ｍｇ／ｍＬ濃度を有する均一なポリマー溶液を得た。１５分間攪拌を続けてから、この溶液を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２Ｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に対してｐＨ＝７．０で一晩透析した。この透析膜は、１２〜１４ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する混合セルロース（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ（商標））であった。透析後の最終ポリマー回収率は、アミノ酸分析による推定で８２％であった。このアミノ酸分析は、不活性雰囲気下、６Ｎ−塩酸中でポリマーを加水分解することにより実施した。次にこの加水分解物を、蛍光体６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートにより誘導してから、逆相ＨＰＬＣにより分析した。
【０１０４】
[0108]パクリタキセル／ＮｉＣｌ２予製液（Ｂ）の調製：０．９５ｍＬのＮＭＰ溶液中、２ｍｇのパクリタキセル（ＰＴＸ、ＬＣ  Ｌａｂｓ）を、室温でボルテックス攪拌により調製した。別個のバイアル内で、５．１６ｍｇのＮｉＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を、０．２ｍＬの脱イオン水に溶解した。２ｍｇ／ｍＬのＰＴＸおよび１．２９ｍｇ／ｍＬのＮｉＣｌ２（９５％ｖ／ｖのＮＭＰ、および５％ｖ／ｖのＨ２Ｏ）を含有するＰＴＸ／ＮｉＣｌ２の予製液（Ｂ）は、０．９５ｍＬのＰＴＸ溶液に０．０５ｍＬのＮｉＣｌ２水溶液をボーラス添加として添加することにより作製した。この混合物を、ボルテックス攪拌をして相（Ｃ）と称した。
【０１０５】
[0109]３．１  本発明のＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]ナノ粒子の調製法：０．５ｍＬのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）予製液（Ａ）を、２．５ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳで希釈して、０．１％のポリマー水溶液を作製し、相（Ｄ）と称した。３ｍＬの相（Ｄ）に、０．２５ｍＬの相（Ｃ）を室温で攪拌しながら０．２５ｍＬ／分の添加速度の滴下により加えるとＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]ナノ粒子が生成した。この混合物をさらに５分間攪拌し、２Ｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０に対して一晩透析した。この透析用膜は、１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯを有する混合セルロース（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ（商標））であった。形成されたナノ粒子の懸濁液は、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）により測定すると１５１．１ｎｍの単一モーダルのｚ平均径および平均−４５．５ｍＶのゼータ電位を有した。ナノ粒子中の最終ＰＴＸの回収率は、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２０  ＵＳＰ法）による決定で５６．５μｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は、アミノ酸分析による決定で５４％であった。
【０１０６】
[0110]３．２  ＰＥＡ予製液を除いたＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]ナノ粒子を形成する対照方法：比較を目的として、０．５ｍＬのＰＥＡ予製液の使用を、２５ｍｍのＨＥＰＥＳ５００マイクロリットルのみの添加に置き換えたこと以外、ナノ粒子生成物の形成に関しては、上記２．１節に記載された手法を反復した。この手法を用いると、血球計算器を用いて光学顕微鏡による測定で３μｍから３００μｍのサイズの結晶性凝集体が形成した。
【０１０７】
[0111]３．３  ＮｉＣｌ２を除いたＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]ナノ粒子形成を合成する対照方法：ナノ粒子生成物の形成に関しては５０μＬのＮｉＣｌ２ストック溶液の使用を、ＮＭＰ中の０．９５ｍＬのＰＴＸに添加された５０μＬの脱イオンＨ２０に置き換えたこと以外上記２．１節に記載された手法を反復した。透析後の結果は、１０μｍから５００μｍ範囲のサイズの結晶性凝集体形成であった。
【０１０８】
［実施例４]
［ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）．ニッケル［ＰＴＸ]−［６−ヒスチジンタグ化−緑色蛍光タンパク質]ナノ粒子の形成］
[0112]本実験を実施して、疎水性生理活性剤ならびに抗体または他の既知のタンパク質様ターゲティングリガンドなどのＨｉｓタグターゲティングタンパク質双方の同時送達用の水溶性標的化ナノ粒子として本発明のニッケルキレート化ポリマー類を製剤化するための本発明の手法を例示した。高疎水性薬物であるパクリタキセルの送達用に、Ｈｉｓタグターゲティングタンパク質を本発明のキレート化ポリマー類にキレート化させる本手法にならって、ペプチドではなくてタンパク質である６Ｈｉｓタグ化ＧＦＰを用いた。
【０１０９】
[0113]水性ポリマーの予製液（Ａ）の調製：４０ｍｇの遊離酸の形体であるＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）（Ｍｗ＝２５ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５９、ＧＰＣ、ＰＳ）を、４ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中、ｐＨ＝１１．２で超音波処理浴を用いて溶解した。完全溶解後のｐＨは、７．４であった。アミノ酸分析による決定では、標的化ＰＥＡ濃度は１０ｍｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は９２％であった。
【０１１０】
[0114]ＰＴＸ／ＮｉＣｌ２の予製液（Ｂ）の調製：０．６８ｍｇのＰＴＸを、室温で  ９６７μＬのＮＭＰに溶解した。別個の容器に、ボルテックス攪拌および超音波処理浴を用いて室温で、５．１６ｍｇのＮｉＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を０．２ｍＬの脱イオン水に溶解した。ＰＴＸ／ＮｉＣｌ２の予製液（Ｂ）は、９６７μＬのＰＴＸ溶液に３３μＬの水性ＮｉＣｌ２溶液をボーラス添加することにより生成した。この混合物をボルテックス攪拌し、０．６８ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルおよび０．８５ｍｇ／ｍＬのＮｉＣｌ２（９７％ｖ／ｖのＮＭＰ、および３％ｖ／ｖのＨ２Ｏ）を含有する最終予製液を相（Ｃ）と称した。
【０１１１】
[0115]本発明のＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［６−ヒスチジンタグ化−緑色蛍光タンパク質（６Ｈｉｓ−ＧＦＰ）]ナノ粒子を調製する方法：０．１ｍＬのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）の予製液（Ａ）を、３．４ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳによりｐＨ＝７．０で希釈した。ボーラスとして、０．５ｍＬのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ＝７．０に１ｍｇの６Ｈｉｓ−ＧＦＰを加えた。形成された相（Ｄ）と称される均一の混合物を、室温でさらに５分間攪拌した。室温で電磁攪拌しながら０．２５ｍＬ／分の添加速度で、０．２５ｍＬの相（Ｃ）の相（Ｄ）への滴下による添加によってＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［６Ｈｉｓ−ＧＦＰ]のナノ粒子を生成させた。５分間攪拌を続け、この混合物を、１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯを有する混合セルロース（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ（商標））膜中、５００ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０に対して一晩透析した。透析後のナノ粒子の分散液は、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）により測定すると８６ｎｍのｚ平均径および平均−３７．４ｍＶのゼータ電位を有した。ナノ粒子中の最終ＰＴＸの回収率は、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２０  ＵＳＰ法）により決定すると１４．９μｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は、アミノ酸分析により決定すると９６％であった。ナノ粒子における最終６Ｈｉｓ−ＧＦＰの回収率は、４８５での励起、５２０での発光（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）のＧＦＰ蛍光により測定して４９％であった。
【０１１２】
［実施例５]
［ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）．ニッケル［ＰＴＸ]−［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）]ナノ粒子の製剤化］
[0116]本実験を実施して、通常の血中タンパク質であるウシ血清アルブミンにより、生理活性剤であるパクリタキセルの標的化送達用のナノ粒子として本発明の金属キレート化ポリマー類を製剤化する手法を例示した。
【０１１３】
[0117]水性ポリマーの予製液（Ａ）の調製：遊離酸として１５０ｍｇのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）（Ｍｗ＝２５ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５９、ＧＰＣ、ＰＳ）を、超音波処理浴を介して１５ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にｐＨ＝１１．１５で溶解した。完全溶解後の溶液（Ａ）と称される、この溶液の最終ｐＨは７．４であった。ＰＥＡ濃度は、アミノ酸分析により決定すると１０ｍｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は８３％であった。
【０１１４】
[0118]ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）]のナノ粒子の調製：０．１ｍＬのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）の予製液（Ａ）を、３．８ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．０で希釈し、０．１ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０溶液中１ｍｇのＢＳＡ（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ）と混合した。形成された相（Ｂ）と称される均一混合物を、室温で５分間攪拌した。次いで、室温で攪拌しながら相（Ｂ）に対し、上記実施例４に記載したように調製された２５０マイクロリットルの相（Ｃ）を滴下による添加（０．２５ｍＬ／分の添加速度で）により、ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［ＢＳＡ]のナノ粒子の分散液を生成させた。この分散液を、１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯを有する混合セルロース（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ（商標））中、０．５Ｌの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０に対して一晩透析した。透析後の分散液は、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）により測定すると６５．７ｎｍの単一モーダルのｚ平均径および平均−２９．２ｍＶのゼータ電位を有した。ナノ粒子中の最終パクリタキセルの回収は、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２０  ＵＳＰ法）による決定で１９．６μｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は、アミノ酸分析による決定で７３％であった。ナノ粒子における最終ＢＳＡの回収率は、アミノ酸分析による決定で７３％であった。
【０１１５】
［実施例６]
［ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）亜鉛［６−ヒスチジンタグ化−緑色蛍光タンパク質]のナノ粒子の製剤化］
[0119]本実験を実施して、Ｈｉｓタグ化タンパク質の取込み用のナノ粒子として本発明の亜鉛キレート化ポリマー類を製剤化する手法を例示した。
【０１１６】
[0120]水性ポリマーの予製液（Ａ）の調製：遊離酸として２２．６ｍｇのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）（Ｍｗ＝３４ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６７、ＧＰＣ、ＰＳ）を、超音波処理浴中２．２６ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にｐＨ＝７．０で溶解した。最終溶液のｐＨは７．１０であった。ＰＥＡの最終濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであり、予製液（Ａ）と称した。
【０１１７】
[0121]ＺｎＣｌ２の予製液（Ｂ）の調製：１００ｍｇのＺｎＣｌ２を、５０ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にｐＨ７で溶解した。ＺｎＣｌ２予製液の濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。１．０６ｍＬのＺｎＣｌ２予製液（Ｂ）を、３．９４ｍＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０に添加して、０．４２３ｍｇ／ｍＬのＺｎＣｌ２の最終濃度が得られ、溶液（Ｂ）と称した。
【０１１８】
[0122]６．１  ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｚｎ−［６Ｈｉｓ−ＧＦＰ]のナノ粒子（Ｃ）の調製：７．６５ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０中、８５０μＬのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）予製液（Ａ）の希釈液を調製して、１ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度を得た。ボーラスとして、１ｍＬのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ＝７．０中、１ｍｇの６Ｈｉｓ−ＧＦＰを、２ｍＬの希釈ＰＥＡ予製液（Ａ）に加え、均一な混合物を、室温で５分間攪拌した。室温で電磁攪拌しながら０．２５ｍＬ／分の添加速度で１ｍＬのＺｎＣｌ２溶液（Ｂ）を滴下により加えて、ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｚｎ−［６Ｈｉｓ−ＧＦＰ]のナノ粒子を生成した。この混合物をさらに３０分間攪拌した。分散液中に形成されたナノ粒子（６．１）は、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）による測定で３１ｎｍのｚ平均径を有した。ナノ粒子中の最終６Ｈｉｓ−ＧＦＰの回収率は、４８５での励起、５２０での発光（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）のＧＦＰ蛍光による測定で８４％であった。
【０１１９】
[0123]６．２  ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｚｎ−［６Ｈｉｓ−ＧＦＰ]の非ＰＥＡ対照の調製：２ｍＬのＰＥＡ溶液（Ａ）を除外し、２ｍＬの２５ｍｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０により置き換えたこと以外は、上記の製剤の調製手法（６．１）を反復した。得られた製剤を測定すると、結晶性凝集体を含有したがナノ粒子は含有しなかった。重縮合法を用いてナノ粒子を得るために、本発明の金属キレート化ポリマーが必要であることを本実験は示している。
【０１２０】
[0124]６．３  ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）亜鉛［６Ｈｉｓ−ＧＦＰ]ナノ粒子の非ＺｎＣｌ２対照の調製: １ｍＬのＺｎＣｌ２溶液を除外し、１ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０により置き換えたこと以外は、上記の製剤の調製手法（６．１）を反復した。得られた分散液（６．３）は、９から５００ナノメートルの範囲の粒径サイズを有した。重縮合手法において金属イオンの存在が、ナノ粒子の形成を補助することを本実験は示している。
【０１２１】
［実施例７]
［ＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）．ニッケル［ＰＴＸ]−［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）]のナノ粒子の製剤化］
[0125]水性ポリマー予製液（Ａ）の調製：ナトリウム塩として８７ｍｇのＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）（Ｍｗ＝８２ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２３、（ＳＥＣ）を、ボルテックス攪拌により８．７ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液にｐＨ＝７．０で溶解した。溶解後、サンプルを０．４５μｍのＧＨＰ（親水性ポリプロピレン）のディスクフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通してろ過した。ろ過後の最終ｐＨは７．５４であった。最終ポリマー回収率は、アミノ酸分析による推定で７９．８％であった。
【０１２２】
[0126]ＰＴＸ／ＮｉＣｌ２予製液（Ｂ）の調製：７．５ｍｇのＰＴＸを、７５０μＬのＮＭＰに室温で溶解した。別個の容器に、４．０２ｍｇのＮｉＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を、室温でボルテックス攪拌および超音波処理浴により０．２５ｍＬの脱イオン水に溶解した。ＰＴＸ／ＮｉＣｌ２の予製液（Ｂ）は、７５０μＬのＰＴＸ溶液に２５０μＬの水性ＮｉＣｌ２溶液のボーラス添加により生成した。この混合物をボルテックス攪拌し、７．５ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルおよび４．０２ｍｇ／ｍＬのＮｉＣｌ２（７５％ｖ／ｖのＮＭＰ、および２５％ｖ／ｖのＨ２Ｏ）の最終予製液を相（Ｃ）と称した。
【０１２３】
[0127]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）]のナノ粒子の調製：２．０ｍＬのＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）予製液（Ａ）を、６ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．０で希釈し、１．０ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液、ｐＨ＝７．０中２０ｍｇのＢＳＡ（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ）と混合した。形成された相（Ｄ）と称される均一混合物を、室温で５分間攪拌した。室温で攪拌しながら９ ｍＬの相（Ｄ）に、０．２５ｍＬ／分の添加速度で１０００μｌの相（Ｃ）の滴下により添加するとＰＥＡ．ＥＤＴＡ．Ｌｅｕ（６）Ｎｉ［ＰＴＸ]−［ＢＳＡ]のナノ粒子が生成した。このナノ粒子分散液を、１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯを有する混合セルロース（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ（商標））中、０．５Ｌの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０に対して一晩（１６時間）透析した。ＨＥＰＥＳの透析後のサンプルを、類似の透析用チューブ中、０．５Ｌの０．９％ＮａＣｌ（ＶＷＲ）に対してさらに３時間透析した。透析後の分散液中のナノ粒子は、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）による測定で１１８．３ｎｍのｚ平均径および平均−１７ｍＶのゼータ電位を有した。粒子中の最終パクリタキセルの回収は、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２０、ＵＳＰ法）による決定で６６８μｇ／ｍＬであり、最終ポリマーの回収率は、アミノ酸分析による決定で６７％であった。最終ＢＳＡの回収率は、アミノ酸分析による決定で７４％であった。これらの結果は下表５に要約してある。
【０１２４】
【表７】
2011523669.tif 000031
【０１２５】
［実施例８]
[0128]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）（式Ｉａ）などの本発明のキレート化ポリマー類は、水溶液に可溶性であり、したがって、核酸（ＲＮＡを含む）、抗体断片、タンパク質ドメイン、および全タンパク質など、有機環境では、他の場合に構造的に不安定となり得る鋭敏な生物学的分子の形成に対して良性の環境を提供する。縮合の誘導に金属を使用するこのポリマーの能力は、ナノ粒子または微小粒子中への製剤成分の捕捉を可能にすると共に粒子表面上のタンパク質表示を可能にする。とりわけこの後者の特質は、組換え技術試験用の推定上のワクチン抗原の形成に有用であり、この特質を利用して、そのようなタンパク質抗原配列に、ポリ（ヒスチジン）セグメントである「Ｈｉｓタグ」を付加することができる。このようなＨｉｓタグ化タンパク質は、金属イオンを介してキレート化ポリマーへの抗原の係留を促進し、製剤がワクチンとして投与される際に免疫系に対する自然に折りたたまれた抗原部位の表示を可能にする。
【０１２６】
[0129]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）などの本発明のキレート化ポリマー類による製剤のためのＨｉｓタグ化ポリペプチド類は、哺乳動物の組織培養物、バキュロウィルス感染昆虫細胞、酵母および細菌などの任意の既知の発現系から生成させることができる。代表的なタンパク質精製法としては、微小流動化による細胞溶解に次ぐイオン交換クロマトグラフィーおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が挙げられる。インフルエンザなどの感染症に対するワクチンとして使用のために調製されたタンパク質は、ワクチンを受ける対象者の免疫系により、体液性免疫と細胞性免疫の双方を誘導することができるように自然に折りたたまれたタンパク質ドメインを保存する必要がある。ポリマー粒子中に１種以上のタンパク質を組み込むために、本発明のキレート化ポリマー類および方法を用いて調製されたＨｉｓタグ化タンパク質の製剤を調製することができ、次いでこの製剤を、アジュバントもしくはターゲティング部分などの他の添加物を有して、または有さずに混合し得るか、またはこれらのワクチン粒子を個々に投与することができる。
【０１２７】
[0130]インフルエンザウィルス血球凝集素（ＨＡ）の天然立体配座状態は、しっかりした防護性Ｂ細胞応答にとって重要であり、このウィルスタンパク質の全ての部分に対する抗体により防護を提供し得ることから、ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）と、ウィルス表面に自然に曝露されているインフルエンザウィルスのＨＡタンパク質の部分（外部ドメイン）との金属縮合製剤は、バキュロウィルス感染ＳＦ９細胞内で産生された。ｐＢａｃ−ＨＡＰＲ８バキュロウィルスを１（ＭＯＩ＝１）の感染多重度で用いて、１ミリリットル当り１．５×１０６個の細胞密度で、５００ｍＬのＳｆ９００  ＩＩ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）中、ＳＦ細胞を感染させた。この感染細胞を、４８時間から７２時間増殖させ、遠心分離により採取した。細胞タンパク質を、０．１％のトリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ緩衝液中に懸濁させることにより可溶化してから、Ｎｉ−装填キレート化セファロース（ＧＥ）を用いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。精製タンパク質を、２５ｍＭのトリス５０容量、ｐＨ８．０の２回交換、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析し、２ミクロンのフィルターを通してろ過した。血球凝集素抗原は、有効性のために天然の折りたたみを保存するために必要であることから、組換え産生されたＨＡ外部ドメインを、標準的プロトコル（すなわち、Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ；Ｃｏｘ，ＮおよびＳｔｏｈｒ，Ｋ、ＷＨＯ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＮＣＳ／２００２．５）に従って血球凝集反応のアッセイによりシアル酸結合関数について試験した。対照として、Ａ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザウィルスと共に、ニワトリの赤血球を血球凝集反応のアッセイに用いた。
【０１２８】
[0131]アミノ酸１から４９８（Ｇｅｎｅｂａｎｋの登録番号ＮＰ＿０４０９８２）プラスヘキサ−Ｈｉｓタグをコードするため、インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（ＮＰＰＲ８、配列番号１）由来の核タンパク質（ＮＰ）をコードするＤＮＡ配列を設計した。インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４に由来するＮＰの配列（ＮＰＶＮ、配列番号５）は、アミノ酸１から４９５（Ｇｅｎｅｂａｎｋの登録番号ＡＡＷ８０７２０）プラスヘキサ−Ｈｉｓ−標識をコードする。精製およびポリマーのローディングを補助するために、これらのウィルスＮＰ配列の各々をコードする遺伝子カセット中にカルボキシ末端ヘキサ−ヒスチジンを含めた。
【０１２９】
[0132]インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）の遺伝子カセットを、オリゴヌクレオチドのオーバーラッピングおよびＰＣＲにより合成的に調製し、ｐＥＴ２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローン化した。ＮＰＰＲ８およびＮＰＶＮ発現ベクターを、ＢＬ２１−ＤＥ３へ形質変換した。この細菌を、選択的ＴＢ培地（Ｇｅｎｅｓｓｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で飽和状態まで増殖させてから、新鮮な氷冷培地で２倍に希釈した。２００μＭのＩＰＴＧにより室温でこれらの培養物中のタンパク質発現を誘導した。４時間から６時間の誘導後、細菌を遠心分離し、得られたペレットを凍結した。ＮＰタンパク質を、ＩＭＡＣにより精製した。細菌性ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中で解凍し、音波処理により溶解した。この細菌溶解液を、２３，０００×ｇで遠心分離し、上澄液を２５ｍＭのイミダゾールに調整してから、ニッケルを予備ロードしたキレート化セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上を通過させた。このロードされたカラムを、５０カラム容量の氷冷洗浄用緩衝液３（５０ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１１４、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）、および２０カラム容量の洗浄用緩衝液４（５０ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で連続して洗浄した。カラム結合ＨＡタンパク質を、ＰＢＳ中５００ｍＭのイミダゾールにより溶出させた。溶出されたＮＰ  タンパク質を、１００容量のＰＢＳの２回交換に対して透析した。精製した組換えＮＰＰＲ８およびＮＰＶＮを、色素産生カブトガニの血球溶解成分（ＬＡＬ）アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ）によりエンドトキシン含量に関してルーチン的に試験し、さらに既知の方法（Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｐ．、Ｃ．Ｓｃｈｗａｒｚ、およびＭ．Ｄｏｎｚｅａｕ、「Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｔｏ  ｐｕｒｉｆｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ．」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）４６（２）：４８３−８頁）を用いて、タンパク質溶液が１エンドトキシン単位／ｍＬ以下を含むまで、トリトンＸ−１１４洗浄のＩＭＡＣサイクルにより再度精製した。
【０１３０】
[0133]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）とＨｉｓタグ化精製組換えインフルエンザタンパク質との製剤は、以下のとおり作製した。クエン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７中、酢酸Ｚｎ溶液を、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８中のヘキサ−Ｈｉｓタグ化ＨＡＰＲ８の外部ドメイン（配列番号２）および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、ＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）の攪拌混合物に緩やかに滴下すると、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化ＨＡＰＲ８の外部ドメイン（配列番号２）、１．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）、および．３６７ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｚｎが生成した。Ｈｉｓタグ化ＮＰＰＲ８（配列番号１）製剤を、同じ手法を用いて作製したが、ＮＰＰＲ８タンパク質を、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７中で導入した。このＮＰＰＲ８−Ｚｎ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）製剤は、最終濃度が０．４６５ｍｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化ＮＰＰＲ８（配列番号１）、０．２３３ｍｇ／ｍＬのＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）、および０．０５７ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｚｎを含有した。ＰＥＡキレート化ポリマーおよびインフルエンザ抗原の金属イオン縮合体は、投与までルーチン的に４℃で保存した。
【０１３１】
[0134]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｚｎ−インフルエンザタンパク質抗原の試験を、Ｂ６／Ｃ３  Ｆ１マウスへの投与により実施した。これらの動物におけるＨＡ抗原およびＮＰ抗原双方に対する体液性応答を、血清中に産生した抗体および細気管支−肺胞洗浄液を評価することによる定量的ＥＬＩＳＡｓにより評価した。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴにより、インターフェロンガンマを測定することによって評価した。インターフェロンガンマの産生は、ＨＡまたは  ＮＰからのペプチドで再刺激された免疫化マウスから単離された脾細胞により評価した。図２および３は、２５μｇのＨＡＰＲ８−３および９μｇのＮＰＰＲ８を含有する１用量のＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）製剤をマウスの鼻腔内に投与した実験からのデータを示している。これらのマウスを、１４日目に放血させ、２１日目に１０ＬＤ５０の感染性ウィルスにより鼻腔内で誘発させた。次の３週間、動物の罹患率および死亡率をモニターした。図２のデータでは、亜鉛およびＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）で製剤化されたインフルエンザタンパク質の単一用量を投与した動物は、この製剤がポリＩ：Ｃアジュバントも含有してない限り生存しなかったことを示している。これらの生存動物においては有意な体重減少があったが（図ＩＩ）、ポリＩ：Ｃアジュバントを含有する製剤を投与されたマウスは、本発明のワクチンの１回のみの投与後、ウィルス誘発で生存を保った。この生存は、腹腔内ウィルスの投与群ならびにＨＡＰＲ８外部ドメインおよびＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−ＺｎとＰｏｌｙ  ポリＩ：Ｃアジュバントとで製剤化されたＮＰＰＲ８の製剤の投与群によってのみ、１００ｎｇ／ｍＬ以上のレベルでの抗−ＨＡ  ＩｇＧ２ａ抗体を産生したことを示すＥＬＩＳＡデータと相関している。製剤化されたＮＰＰＲ８タンパク質を含有する製剤を投与された動物全てが、高レベルの抗−ＮＰ抗体を産生した。
【０１３２】
［実施例９]
[0135]本試験において、凝集能力を有するバキュロウィルス産生と細菌産生双方の赤血球凝集素（ＨＡ）ドメインを推定上のインフルエンザ抗原として用いる。製剤候補の評価には、上記の赤血球凝集素アッセイを、凝集阻害アッセイと関連させて用いた。試験したＨＡタンパク質またはタンパク質サブドメインが本発明のワクチンへ製剤化する前に標的結合活性を有したならば、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、またはＮｉ２＋などのカチオンによって製剤化されたＨｉｓタグ化ＨＡもまた赤血球凝集活性を有するはずである。実施例のインフルエンザ赤血球凝集素抗原断片（配列番号２、３、４、６、７、８）または他のインフルエンザＨＡタンパク質由来の同様の配列断片を、作製に用いられる生物に依って、細菌のシグナル配列（配列番号３、４、７および８における下線）を有して、または有さずに発させることができる。この赤血球凝集試験をパスする精製タンパク質は良好なインフルエンザ抗原として役立つ。
【０１３３】
[0136]好首尾なワクチンＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｚｎ製剤の全てのタンパク質成分を細菌から精製したインフルエンザワクチンもまた試験した。下記の免疫化実験において、先の実施例で記載したワクチン候補と比較して、製剤にアジュバントとしてポリＩ：Ｃを添加し、またさらにＮＰＰＲ８を含有させる。また、感染後のワクチン接種した動物の罹患を除く試みで、この試験でプライム増強療法を試験した。
【０１３４】
[0137]ＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）（製剤Ｉａ）および細菌発現のＨｉｓタグ化ＨＡポリペプチド、例えばＨＡＰＲ８−３（配列番号４）またはＨＡＶＮ−３（配列番号８）の製剤は、各配列に細菌シグナル配列を含ませたことを除いて、実施例８に記載した通り作製した。１．１ｍｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化ＨＡポリペプチド、０．５５ｍｇ／ｍＬのＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）、および０．１２０ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｚｎの最終濃度を得るのに十分な、トリス生理食塩水緩衝液ｐＨ８中、Ｈｉｓタグ化ＨＡポリペプチドとクエン酸生理食塩水緩衝液ｐＨ７中、ＰＥＡ−ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）の攪拌混合物中に、クエン酸生理食塩水緩衝液ｐＨ７中、酢酸Ｚｎの溶液を徐々に滴下した。細菌発現のＨｉｓタグ化ＨＡポリペプチド製剤と共に使用されるＮＰＰＲ８（配列番号１）製剤は、実施例８に記載されているように作製したが、最終濃度は、１．１ｍｇ／ｍＬのＮＰＰＲ８（配列番号１）、０．５５ｍｇ／ｍＬのＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）、および０．１２ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｚｎであった。
【０１３５】
[0138]ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）および細菌発現させたＨｉｓタグ化インフルエンザ抗原の粒子製剤に関する異なる投与経路の効果を試験するために、１０バルブ／ｃマウスの一群に対し、皮下、または鼻腔内に製剤を投与した。次いで、これら２つの投与経路の有効性を比較した。
【０１３６】
[0139]５０μｌの用量が２５μｇのＨＡＰＲ８−３および２５μｇのＮＰＰＲ８を含有する製剤で動物を初回抗原刺激した。各々は、５μｇのポリＩ：Ｃを含有するＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）−Ｚｎ粒子として製剤化した。最初の用量の２週間後、各群のマウスを同一混合物の第二の用量で追加抗原投与した。３週間後、全てのマウスを、１０ＬＤ５０の感染性Ａ／プエルトリコ／８／３４ウィルスに鼻腔内感染させた。これらの実験の結果は、これらの粒子製剤の投与経路の重要性を示している。ＺｎおよびＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）と共に製剤化されたＨＡＰＲ８−３およびＮＰＰＲ８のタンパク質を鼻腔内投与された動物では、１０匹中９匹の動物が感染誘発を生き残った。対照的に、同一製剤を皮下投与された動物で生き残ったのは１０匹中１匹であった。図４に示されるよう鼻腔内ワクチンを投与されたマウスは、ウィルス感染に応答した体重減少の程度に反映されるように、罹患率の減少も示した。鼻腔内にワクチン投与されたマウスは、皮下にワクチン投与されたマウスよりも、同一のワクチンと用量ではるかに良好に免疫応答したことを、これらの結果は示している。
【０１３７】
［実施例１０]
[0140]下記のスキーム２および３に示されるように、末端基の結合には、以下の結合法が考慮された。
【０１３８】
[0141]末端基結合の第１の例において、本発明のＰＥＡキレート化ポリマーを優勢なアミン末端基によって合成し、次いで、モノ活性化ＰＥＧ、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＶＡ（ＬａｙｓａｎＢｉｏ社、アラブ、アラバマ州からのｍＰＥＧ−吉草酸スクシンイミジル）に結合させた。これらの反応は、下記のスキーム２に従い、非プロトン性有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＮＭＰ）中で実施した。
【化２３】
2011523669.tif 000032
使用されたＢポリマー中の無水酸末端基によって、アミン基またはヒドロキシ基を介して高分子または活性薬剤とさらに結合することが可能になり、下記スキーム３に示されるようなアミド結合またはエステル結合が得られる。
【化２４】
2011523669.tif 000033
【０１３９】
［酸二無水物末端によるＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）の合成およびｍＰＥＧ−ＮＨ２によるさらなる結合によるＡＢＡブロックポリマーの形成］
[0142]５．２１８ｇ（７．６ｍｍｏｌ、０．９１当量）のＬ−Ｌｅｕ（６）−２ＴｏｓＯＨ、２．１３２６ｇ（８．３ｍｏｌ、１．００当量）のＥＤＴＡ−ＤＡを、２．３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に懸濁し、この懸濁液をアルゴン下でガスシールした。次いで、４．６４ｍｌ（３３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加え、室温で３時間、攪拌を続けた。（粗製サンプルのＭｗは、ＧＰＣ（ＤＭＡｃ、ＰＳ）によって分析し、Ｍｗ＝５１，５００ｇ／ｍｏｌを得た）。次いで、２．０１ｇのｍＰＥＧ−アミン（ＭＷ５０００、ＬａｙｓａｎＢｉｏ社、アラブ、アラバマ州）および４ｍＬのＤＭＳＯを加え、５０℃で一晩攪拌を続けた。ポリマーは５００ｍＬのアセトン中で沈殿した。これを１００ｍＬのＤＩ水で再溶解させた。ポリマーを完全に溶解させるため、１５ｍｇのＮａＨＣＯ３を加え、この溶液を、ＭＷＣＯ＝１２〜１４ＫＤａの透析バッグ中で、ＤＩ水に対して透析した。凍結乾燥させたポリマーを、白色綿毛状粉末として２．２ｇの収量で回収し、結合ＰＥＧの製剤は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）により確認した。Ｍｗ＝３６，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３８；（Ｓｅｃ、１０ｍＭのＰＢＳ  ｐＨ８．４、＋２０％ｖ／ｖのＭｅＯＨ、ＯＥＧ標品）。
【０１４０】
［ＰＥＡ  ＥＤＴＡ−Ｌｅｕ（６）の結合−ラミナリンによる酸二無水物末端ポリマー］
[0143]さらなる実例で、グルカンなどの多糖アジュバントを、本発明のキレート化ポリマーに末端基結合させた。この実施例では、市販入手できる代表的なグルカンであるラミナリンを、ワクチン調製において有用な代表的な多糖アジュバントとして利用した。アジュバントの結合は、以下のスキーム４に従って達成した：
【化２５】
2011523669.tif 000034
【０１４１】
[0144]より具体的には、４．２８３ｇ（６．２ｍｍｏｌ、０．８４当量）のＬ−Ｌｅｕ（６）−２ＴｏｓＯＨ、１．８９２６ｇ（７．４ｍｏｌ、１．００当量）のＥＤＴＡ−ＤＡを７．９５ｍＬの無水Ｎ−メチル１−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に懸濁し、アルゴン下でガスシールした。次いで、１．９ｍＬ（１４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加え、室温で１６時間攪拌を続けた。（粗製サンプルのＭｗは、ＧＰＣ（ＤＭＡｃ、ＰＳ）によって分析し、Ｍｗ＝５１，０００ｇ／ｍｏｌを得た）。別個に、１ｇのラミナリン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ＝５，０００ｇ／ｍｏｌ）を７．５ｍＬのＮＭＰ中に溶解させ、２ｍＬのポリマー反応溶液加え（約２ｍＬ）てから、さらに１３．９μＬのＴＥＡを加え、この溶液を６０℃でさらに１６時間攪拌した。この溶液を１００ｍＬのＤＩ水で希釈し、１２〜１４ＫＤａのＭＷＣＯ透析バッグに移し、ＤＩ水に対して透析した。凍結乾燥させたポリマーを、白色綿毛状粉末として、１．１８ｇの収量で回収した。結合ポリマーの試験は、ニンヒドリン試験で陰性であった。結合ラミナリンの存在は、３７％ｗ／ｗロードで１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）により確認した。Ｍｗ＝７０，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２；（ＳＥＣ、１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ８．４、＋２０％ｖ／ｖのＭｅＯＨ、ＯＥＧ標品）。
【０１４２】
[0145]全ての刊行物、特許、および特許文書は、参照として個々に援用されているように、本明細書に参照として援用されている。本発明は種々の特定の、および好ましい実施形態および技法を参照として説明した。しかし、当然ながら、本発明の趣旨および範囲内にあって多くの変型および修飾をなし得る。
【０１４３】
[0146]本発明は上記の実施例を参照として説明したが、当然ながら、本発明の趣旨および範囲内での修飾および変型が包含される。
【０１４４】
[0147]したがって、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月4日(2011.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011523669000001.app
【国際調査報告】
2011523669.tif 000067
2011523669.tif 000068