(57)【要約】  ｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者の間で、認識されるｔｏｐｏＩエピトープの型が異なることが発見された。Ｆ４断片（アミノ酸（ＡＡ）４５０〜６００）は、試験した全ての患者によって認識された。Ｆ１断片（ＡＡ５〜３０）及びＦ８断片（ＡＡ３５０〜４００）は、それぞれ、ｄｃＳＳｃ及びＳＬＥに対して特徴的なエピトープを表す。本発明は、診断への使用及び方法、並びに診断において使用するためのキットに関する。
2011528799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性自己免疫障害を診断するための、１つ又は複数の単離ペプチドの使用であって、前記１つ又は複数のペプチドが、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
の少なくとも１つを別々に、又は同時に含み、
前記１つ又は複数のペプチドが、野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％相同であるアミノ酸配列を有し、
患者からの試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
患者からの試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、
上記使用。
【請求項２】
１つ又は複数の単離ペプチドが、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
をさらに含み、
患者からの試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、又は好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
患者からの試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又は好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチドのエピトープが、野生型配列のそれぞれのエピトープから、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸又は１アミノ酸以下が相違している、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ａ）によるエピトープが、アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントであり、
ｂ）によるエピトープが、アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントであり、好ましくは、
ｃ）によるエピトープが、アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
エピトープが別々のペプチド上に存在している、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の１つ又は複数のペプチドを含む、全身性自己免疫障害の診断において使用するための診断用キットであって、
前記１つ又は複数のペプチドが、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、及び好ましくは、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
の少なくとも２つを別々に、又は同時に含む、上記キット。
【請求項７】
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含むペプチド、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含むペプチド
から選択される少なくとも１つのペプチドと、
アミノ酸４５１〜５９３にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含む参照ペプチドと、場合によって、
患者の自己抗体の、ペプチドのエピトープへの結合を検出するための手段と
を含む、請求項６に記載の診断用キット。
【請求項８】
ａ）によるペプチドが、アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片であり、
ｂ）によるペプチドが、アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片であり、
ｃ）によるペプチドが、アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片である、請求項７に記載の診断用キット。
【請求項９】
全身性自己免疫障害を示差的に診断するために有用な診断方法であって、
ｉ）患者から得た試料を、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
の少なくとも１つを含み、野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％相同であるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のペプチドと接触させるステップを含み、
前記試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
前記試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、上記診断方法。
【請求項１０】
１つ又は複数の単離ペプチドが、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
をさらに含み、
自己抗体の、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、又は好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
自己抗体の、ｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又は好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
使用の請求項３から５まで又はキットの請求項６若しくは７のいずれか一項に記載の１つ又は複数のペプチドが使用される、請求項９又は１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
試料が血液試料、好ましくは血清試料である、請求項１に記載の診断方法、請求項２から４までのいずれか一項に記載の使用又は請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性強皮症及び全身性エリテマトーデスの新規診断方法、そのような診断のための、抗トポイソメラーゼＩ及びその断片の使用、並びに診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性強皮症（ＳＳｃ）は、皮膚及び種々の内臓の免疫活性化、血管損傷、炎症、線維症を特徴とする全身性自己免疫障害である。免疫系の活性化によって、疾患特異的自己抗体の産生、リンパ球の活性化及び種々のサイトカインの分泌が導かれる［１］。大多数のＳＳｃ患者は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏＩ又はＴＯＰＩ）、ＲＮＡポリメラーゼ、セントロメアタンパク質、及びＵ３ＲＮＰを主に認識する抗核抗体を有する［２］。
【０００３】
ＴｏｐｏＩは、７６５アミノ酸（ＡＡ）長のＤＮＡ緩和酵素であり、５つの別個の領域：Ｎ末端ドメイン（ＡＡ１〜２１５）、コアサブドメインＩ〜ＩＩ（ＡＡ２１６〜４３５）、コアサブドメインＩＩＩ（ＡＡ４３６〜６３６）、リンカードメイン（６３７〜７１３）及びＣ末端ドメイン（ＡＡ７１４〜７６５）を含有する。
【０００４】
ＳＳｃの臨床患者は、２つの別個のサブセットに分類することができる。ｄｃＳＳｃは、皮膚、肺及び他の内臓の広範な線維症を特徴とするが、一方ｌｃＳＳｃでは、血管性の異常が中心であり、線維症は限られている［５］。
【０００５】
ＳＳｃに加えて、全身性強皮症の臨床的な徴候及び症状を示していない全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者において、抗ｔｏｐｏＩ抗体の存在が実証された［６、７］。これらの発見は、抗ｔｏｐｏＩ抗体の存在が、異種の臨床的結果を有し得ることを示唆している。
【０００６】
自己抗体の検出におけるｔｏｐｏ−Ｉ及びｔｏｐｏ−Ｉペプチドの使用が提案されている。
【０００７】
米国特許第５０７０１９２号に、ｔｏｐｏ−Ｉポリペプチドのクローニングについて記載されており、前記ｔｏｐｏ−Ｉポリペプチドと結合させることによって患者試料中の自己抗体を検出することが示されている。米国特許第５８４９５０３号に、突然変異ｔｏｐｏ−Ｉポリペプチドについて記載されており、それは、例えばイムノアッセイにおいて自己抗体を検出するために有用であると考えられている。
【０００８】
後に、いくつものグループが、ＳＳｃ患者における抗ｔｏｐｏＩ抗体のエピトープ特異性について研究した。これらの研究では、やはり、分子の中心部分及びＣ末端部分において種々のエピトープが示唆されている［１５〜２０］。報告では、ｔｏｐｏＩの免疫優性領域がＡＡ４８９〜５７３にわたることが示唆されている［１５、１６、１９］。しかし、ｔｏｐｏＩのドメイン構造を基にして構築した組換え融合タンパク質を使用した研究により、コアサブドメインＩ〜ＩＩが、コアサブドメインＩＩＩよりも頻繁に認識されることが実証された［１１］。抗ｔｏｐｏＩ自己抗体の縦断的分析により、これらの領域に対する反応性は安定であることが明らかになったが［９、１１］、限定数の血清を使用した研究により、抗ｔｏｐｏＩ自己抗体によって認識される領域は経時的に変化することが示された［１０］。したがって、全身性疾患におけるｔｏｐｏＩエピトープに関して、当技術分野にいくつかの不確実性が存在し、抗ｔｏｐｏＩ自己抗体のエピトープ特異性について、いくつものグループによって研究されているにもかかわらず、ｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者における比較的なエピトープのマッピングの報告はなく、また、異なるエピトープに結合する自己抗体に基づくこれらの疾患の示差的診断については示唆されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、全身性自己免疫障害を診断するための、１つ又は複数の単離ペプチドの使用であって、前記１つ又は複数のペプチドが、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
の少なくとも１つを別々に、又は同時に含み、
前記１つ又は複数のペプチドが、野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％相同であるアミノ酸配列を有し、
患者からの試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
患者からの試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、
使用に関する。
【００１０】
好ましい実施形態において、１つ又は複数の単離ペプチドは、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープも含み、
患者からの試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、又は好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
患者からの試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又は好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる。
【００１１】
前記ペプチドのエピトープは、野生型配列のそれぞれのエピトープから、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸又は１アミノ酸以下が相違していることが好ましい。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、
ａ）によるエピトープは、アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントであり、且つ／又は
ｂ）によるエピトープは、アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントであり、且つ／又は好ましくは、
ｃ）によるエピトープは、アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントである。
【００１３】
好ましい実施形態において、全てのエピトープは別々のペプチド上に存在する。
【００１４】
ある実施形態において、ペプチドのエピトープａ）及びｂ）は、異なるペプチド上に存在する。ある実施形態において、ペプチドは、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープが同じペプチド上に存在し、ｂ）によるエピトープが異なるエピトープ上に存在する、又はｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープが同じペプチド上に存在し、ａ）によるエピトープが異なるペプチド上に存在するところで使用することができる。
【００１５】
抗体のエピトープへの結合を特異的に検出することができる場合、代替の実施形態において、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープは１つのペプチド上に存在してよく、ｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープは別のペプチド上に存在してよい。
【００１６】
必要に応じて、適切な抗体標準品を使用することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、先の請求項のいずれか一項に記載の１つ又は複数のペプチドを含む、全身性自己免疫障害の診断において使用するためのキット、好ましくは診断用キットであって、
前記１つ又は複数のペプチドが、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、及び好ましくは、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
の少なくとも２つを別々に、又は同時に含むキットに関する。
【００１８】
本発明の好ましいキットは、
ａ）アミノ酸５〜３０にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含むペプチド、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含むペプチド
から選択される少なくとも１つのペプチドと、
アミノ酸４５１〜５９３にわたるＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープを含む参照ペプチドと、場合によって、
患者の自己抗体の、ペプチドのエピトープへの結合を検出するための手段と
を含む。
【００１９】
ａ）によるペプチドは、アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片であり、
ｂ）によるペプチドは、アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片であり、
ｃ）によるペプチドは、アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片であることが好ましい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、全身性自己免疫障害を示差的に診断するために有用な診断方法であって、
ｉ）患者から得た試料を、下記のエピトープ：
ａ）アミノ酸５〜３０にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ、
ｂ）アミノ酸３５０〜４００にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
の少なくとも１つを含み、野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩのペプチド断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％相同であるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のペプチドと接触させるステップを含み、
前記試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
前記試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出された場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる、診断方法に関する。
【００２１】
本発明の好ましい方法において、１つ又は複数の単離ペプチドは、
ｃ）アミノ酸４５１〜５９３にわたる前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のうち少なくとも２０アミノ酸長のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ
をさらに含み、
自己抗体の、ａ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ｂ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者におけるびまん型全身性強皮症（ｄｓＳＳＣ）、又は好ましくは遅発性のｄｓＳＳＣを示しているとみなされ、
自己抗体の、ｂ）によるエピトープ及びｃ）によるエピトープへの結合が検出され、且つ、好ましくは前記患者試料の自己抗体の、ａ）によるエピトープへの結合が検出されなかった場合、そのことは、前記患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は好ましくはレイノー現象を伴うＳＬＥを示しているとみなされる。
【００２２】
上記で定義した１つ又は複数のペプチドは、本発明の方法、使用及び／又はキットにおいて使用されることが好ましい。
【００２３】
好ましい実施形態において、試料は血液試料であり、血清試料であることが好ましい。
【００２４】
定義
「ＤＮＡトポイソメラーゼＩの一部のセグメントの免疫学的特性を有するエピトープ」は、本明細書では、抗体と結合可能であり、同様に前記セグメント、好ましくは患者の抗体、より好ましくは全身性疾患、好ましくは全身性強皮症又は全身性エリテマトーデスを有する患者の抗体と結合可能なエピトープと理解される。
【００２５】
本発明による「ＤＮＡトポイソメラーゼＩ」は、真核生物、好ましくは脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの供給源からの野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩ（ＥＣ５．９９．１．２）であってよく、又はそのような野生型ＤＮＡトポイソメラーゼＩと相同な配列を有する、又は、それらと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する突然変異体であってよい。前記突然変異ＤＮＡトポイソメラーゼＩの少なくとも１つの免疫学的特性が維持されていること、又は、野生型タンパク質と結合可能な１つ又は複数の抗体が、突然変異型タンパク質とも同様に結合可能であることが好ましい。前記ＤＮＡトポイソメラーゼＩは、天然の供給源から単離することができ、又は組換えで調製することができる。
【００２６】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、真核生物、好ましくは脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのトポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏＩ）に対する自己抗体に対するエピトープを有する任意のアミノ酸配列を示す。前記ペプチドのアミノ酸配列は、前記ｔｏｐｏＩをコードするポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡの全部又は一部によってコードされている、又は前記ペプチドのアミノ酸配列が、それらと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有することが好ましい。
【００２７】
「自己抗体」は、対象の抗体であり、前記対象のタンパク質に対して生じた、又は前記対象のタンパク質に結合可能な抗体である。
【００２８】
本明細書で使用する「患者」は、治療、診断、若しくはその体の試料が分析される、又は、治療、診断若しくは分析される予定の動物対象又はヒト対象を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】認識されたトポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏＩ）エピトープの型が、ｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者の間で異なることを示す図である。びまん型全身性強皮症（ｄｃＳＳｃ）の患者５個体、限局型全身性強皮症（ｌｃＳＳｃ）患者６個体及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者４個体から精製したＩｇＧを用いて選択したファージクローンの推定アミノ酸配列を、ヒトｔｏｐｏＩ配列に沿ってプロットした。
【図２】本研究において使用した組換えトポイソメラーゼＩ−マルトース結合性タンパク質融合構築物を示す図である。
【図３】トポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏＩ）融合タンパク質Ｆ４及びＦ１を抗原として使用した免疫ブロットを示す図である。精製した組換え融合タンパク質（パネルＡ：Ｆ４、パネルＢ：Ｆ１）又はマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を条片状に切り、患者の連続的な血清試料（示した日に得た）又は抗ＭＢＰ抗体（ａ−ＭＢＰ）でプローブした。ＭＷ：分子量マーカー（ｋＤａ）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ＳＳｃの発病における抗ｔｏｐｏＩ抗体の役割は、完全に理解されていないが、本発明に基づいて、ｔｏｐｏＩに対する免疫応答は、異なるエピトープ特異性を持つ抗ｔｏｐｏＩ自己抗体の産生を導く抗ｔｏｐｏＩ陽性の患者の間で異なる可能性があると仮定することができる。
【００３１】
先行技術において、ｔｏｐｏＩのドメイン構造又は抗原性の予測のいずれかに基づいて設計された種々の組換えｔｏｐｏＩ断片が使用されており、そのどちらも、可能性のあるエピトープを見落とす恐れがある［１２〜１８］。例えば、Ｈｕら［２１］は、Ｎ末端ドメイン全長（ＡＡ１〜２１３）を包含する融合タンパク質を使用し、分子のこの部分が抗ｔｏｐｏＩ抗体の標的にならないことを示した。それとは反対に、ＡＡ７０から始まるＮ末端ドメインを包含する融合タンパク質を用いて行われた他の以前の研究では、分子のこの部分が抗ｔｏｐｏＩ抗体によって認識されることが報告された［１３、１６、２０］。
【００３２】
これらの表面上矛盾した結果は、適用された異なる方法及び抗原構築物に起因する可能性があり、また、三次構造内に埋め込まれた短いエピトープの接近容易性に影響を及ぼし得る、可能性のある立体構造因子に起因する可能性が非常に高い。ここで、本発明者らがＮ末端部分で同定した新規エピトープ含有断片は、Ｆ１を含め、大部分が、２０〜３０ＡＡのみにわたることを予め示す。
【００３３】
したがって、本発明者らは、異なる戦略を選択し、バクテリオファージラムダ上に提示されたｔｏｐｏＩの抗原断片ライブラリーを構築し、このライブラリーをｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者の血清を用いてスクリーニングした。ライブラリーから選択したｔｏｐｏＩの領域を組換え融合タンパク質として発現させ、患者の血清を用いてさらに試験した。エピトープ特異性の縦断的分析を行い、臨床所見と比較した。
【００３４】
ファージ提示抗原断片ライブラリーから選択した断片に基づいて、９つのｔｏｐｏＩ−ＭＢＰ融合タンパク質を発現させ、これらの断片を、抗ｔｏｐｏＩ抗体陽性の患者の血清６７体を用いて試験した。我々の結果によると、大半の断片（Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５〜７、Ｆ９）の認識は、所与の疾患サブグループに対して特徴的なのではなく、ライブラリーのスクリーニングに使用した個々の患者の血清に対して特徴的である。このことは、認識されたｔｏｐｏＩエピトープにおいて個体間の差異と縦断的差異の両方を見いだしたＨｅｎｒｙらの結果と一致する［２０］。しかし、Ｆ４断片（ＡＡ４５１〜５９３）が試験した患者の血清全てにおいて検出された以外には、Ｆ１断片（ＡＡ５〜３０）がｄｓＳＳｃ患者の血清のサブセットによって特異的に認識され、Ｆ８断片（３５０〜４００）がＳＬＥ患者によって認識され、このことは、これらの断片が、それぞれ、ｄｃＳＳｃ及びＳＬＥに対して特徴的なエピトープを表している可能性があることを示している。
【００３５】
したがって、ファージ提示に基づいた手法で得られたデータは、認識されるエピトープの型が、ｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者の間で異なることを明白に実証している。ＡＡ４５１〜５９３領域（Ｆ４断片）に位置する、全てのＴｏｐｏＩ反応性患者によって認識される共通断片が見出されたことは、以前に発表された結果と一致する［１２、１３］。しかし、本結果によると、Ｆ４断片を用いて行ったＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイにより、全長抗原を使用する従来のＥＬＩＳＡ系よりも感度が高い、抗ｔｏｐｏＩ自己抗体を検出するためのツールが示される可能性がある。
【００３６】
ｔｏｐｏＩの免疫優性部分（Ｆ４断片）に加え、以前は抗ｔｏｐｏＩ抗体の標的になることが示されていなかった２つの新規領域が同定された。ｄｃＳＳｃ患者は、分子のＮ末端部分において、いくつかの短い断片（ＡＡ５〜１４５にわたる）を認識した。特に、Ｆ１断片（ＡＡ５〜３０）は、ｄｃＳＳｃ患者の血清のサブセットによって認識され、一方Ｆ８断片は、ＳＬＥ患者によって認識された。
【００３７】
さらに、臨床データの分析により、Ｆ１断片に対する自己抗体が、ｄｃＳＳｃの後期における疾患の進展を示す可能性があることが示唆されている。このＦ１断片は、実験的に証明されたグランザイムＢ切断部位を含有する［２２］。したがって、Ｔ細胞媒介細胞障害性応答の間に放出されるグランザイムＢによってｔｏｐｏＩがｉｎ  ｖｉｖｏで切断された結果、Ｆ１断片によって表される新生抗原決定基が形成され得る。全長抗原又は全長Ｎ末端ドメインを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、これらの短いエピトープを認識する抗体を検出することができない恐れがある。
【００３８】
臨床データの分析では、抗ｔｏｐｏＩ抗体のエピトープ特異性と疾患の臨床的な症状との間の明白な関連を実証することができなかった。しかし、理論にとらわれずに、抗Ｆ１抗体陽性のｄｃＳＳｃ患者と抗Ｆ１抗体陰性のｄｃＳＳｃ患者との間の疾患の持続期間の差異は、我々の縦断的分析の知見とともに、抗ｔｏｐｏＩ免疫応答が、分子の免疫優性部分（Ｆ４断片）に対して開始され、疾患の経過中の後期にＮ末端部分を標的とする可能性があることを示し得る。したがって、Ｆ１断片に対する自己抗体は、後期ｄｃＳＳｃの新規マーカーを表し得る。ｄｃＳＳｃにおけるこの「エピトープ拡散」の機構及びそれを容易にする因子については、さらに研究されなければならない。
【００３９】
さらに、Ｆ８陽性のＳＬＥ患者４個体及びＦ８陰性のＳＬＥ患者２６１個体の臨床データを比較することにより、Ｆ８断片に対する抗体を持つＳＬＥ患者はレイノー現象を有し、疾患の症状は軽度である（関節炎、中枢神経系及び腎臓の合併症がない）ことが示唆されている。
【００４０】
診断方法若しくは使用又は本発明のキットにおける好ましい実施形態において、自己抗体によって認識されるエピトープは、別々のペプチド上に存在する。別の好ましい実施形態において、抗体標準品は、通常の免疫学的方法によって調製することができる。
【００４１】
自己抗体の結合を検出することは、十分に当業者の技能の範囲内である。動態学的な方法並びに結合親和性又は結合活性を特徴とする方法のどちらも適用することができることは当業者にはすぐにわかる。例えば、下記の任意の方法を、どんな制限もなしに適用することができる：
イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテラルフロー、免疫沈降法、
結合アッセイ、例えば、バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、蛍光消光、
分光光度的方法、例えば、ＦＴ−ＩＲ、円偏光二色性、ＮＭＲ、
物理化学的方法、例えば、熱量測定法、超遠心分離法など。
【００４２】
診断方法の好ましい実施形態は、ＲＩＡ若しくはＤＥＬＰＨＩＡのようなイムノアッセイの形で、又は、好ましくはＥＬＩＳＡのような免疫吸着アッセイで行われる。
【００４３】
詳細な教示は、例えばＹｅｈｕｄａ  Ｓｈｅｏｅｎｆｅｌｄ、Ｐｉｅｒ−Ｌｕｉｇｉ  Ｍｅｒｏｎｉ、Ｍ．Ｅｒｉｃ  Ｇｅｒｓｈｗｉｎによる書籍「自己抗体（Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見ることができる。
【００４４】
ある特定の実施形態において、その目的は、障害及び他の抗体に関連付けられる複数の患者の自己抗体間を選択的に区別するアッセイを提供することであり得る。アッセイの感度を設定することは、十分に当業者の技能の範囲内であり、その当業者は適切な対照ペプチドを見つけることができる。そのようなペプチドの例は、本明細書で提供される。陽性内部対照は、実際にはＦ４断片それ自体である。陰性対照として、他の、非免疫原性断片又はＭＢＰのような他のタンパク質を使用することができる。
【００４５】
好ましい変異形において、患者がＩｇＭ及びＩｇＧのいずれの種も欠損していなければ、ＩｇＭ又はＩｇＧが自己抗体として測定される。
【００４６】
本発明は、概要を上記した診断方法を実行するためのキットにも関する。これらのキットは、上記の部品又は概要を上記した方法を行うのに有用な部品を含んでよい。キットは、エピトープを担持しているペプチド及び少なくとも使用説明書を必ず含む。
【００４７】
非限定的な実施例によって、以下に本発明をより詳細に説明する。しかし、当業者は、本発明の観念に基づき、且つ本発明の範囲内である他の実施形態を、当技術分野の知識及び当業者の一般知識に基づく実行において減らすことができることを理解されたい。さらに、引用した参考文献の教示は、特に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００４８】
方法
患者及び対照
我々の全強皮症コホート内の患者２９３個体から、従来のＥＬＩＳＡ試験（Ｈｙｃｏｒ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）において抗トポイソメラーゼ抗体陽性を示したＳＳｃの症例５９個体を選択した（これらの患者のうち３４個体がｄｃＳＳｃを有すると分類され、２５個体がｌｃＳＳｃと診断された）。従来のＥＬＩＳＡキットを用いて抗ｔｏｐｏＩ抗体の存在について試験したＳＬＥ患者２６５個体のうち、８個体が陽性の反応を示し、この試験のために選択された。ＳＳｃ患者５９個体からの血清試料１７７検体（各患者から３検体）及びＳＬＥ患者８個体からの血清試料２４検体を、２００４年〜２００７年に、６〜１２カ月の間隔で得た。患者の臨床データを、我々の標準プロトコールを使用してコード化した［８］。
【００４９】
対照用に、さまざまな年齢の健康な女性及び男性からの抗ｔｏｐｏＩ抗体陰性の血清試料１４６検体を使用した。さらに、年齢を適合させた、異なる炎症性のリウマチ性疾患の患者１１０個体（血管炎８個体、血清反応陰性脊髄関節炎４０個体、筋肉炎１１個体、シェーグレン症候群１１個体、乾癬性関節炎１０個体、関節リウマチ２０個体、リウマチ性多発筋痛１０個体）についても調査した。
【００５０】
この研究は、ペーチ大学医療センターの倫理委員会によって承認された。全ての患者及び健康な個体からインフォームド・コンセントを得た。
【００５１】
ｔｏｐｏＩ抗原断片ライブラリーの構築及び親和性選択
全長ヒトｔｏｐｏＩのコード領域を、全ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＩｎｓＴ／Ａｃｌｏｎｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用してＴ／Ａベクターにクローニングした。ラムダＤ−バイオファージ提示ベクター［９］を、以前述べられたように［１０］微改変して使用してライブラリーの構築を行った。ｔｏｐｏＩの一次ライブラリーは、独立したクローンを有する挿入断片を２×１０７個含有し、増幅されたライブラリーの力価は３×１０１１／ｍｌであった。ｄｃＳＳｃ患者５個体、ｌｃＳＳｃ患者６個体及びＳＬＥ患者４個体由来の、プロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で精製したＩｇＧを用いたｔｏｐｏＩ抗原断片ライブラリーの親和性選択を、基本的に記載の通りに行った［１１］。３回の選択後、個々のクローンを、さらに増殖させてＤＮＡ配列決定するために取り出した。
【００５２】
組換えｔｏｐｏＩ融合タンパク質の発現
選択したｔｏｐｏＩ断片を、ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＵＫ）を使用して、組換えマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質として発現させた。ＡＡ５〜３０（Ｆ１）、ＡＡ６９〜９２（Ｆ２）、ＡＡ８７〜１４５（Ｆ３）、ＡＡ４５０〜６００（Ｆ４）、ＡＡ６４０〜７０５（Ｆ５）、ＡＡ１７０〜２９０（Ｆ６）、ＡＡ２９５〜３５０（Ｆ７）、ＡＡ３５０〜４００（Ｆ８）、ＡＡ２９５〜４００（Ｆ９）を、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有するＰＣＲプライマーを用いて増幅し、ｐＭａｌ−ｃ２ベクターにクローニングした。融合タンパク質を、製造者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＵＫ）の説明書に従ってアミロース樹脂での親和性クロマトグラフィーを用いて溶菌液から精製し、精製されたタンパク質の完全性を、１０％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブリリアントブルー染色によって検証した。
【００５３】
Ｅｌｉｓａ
９６ウェルのポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳ中組換えｔｏｐｏＩ断片又はＰＢＳ中ＭＢＰを１０μｇ／ｍｌの濃度で用いてコーティングした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、洗浄緩衝液中３％脱脂粉乳で１時間ブロッキングした。血清試料を、２％脱脂粉乳を含有する洗浄緩衝液中、１：２５０希釈度で、３連で１時間インキュベートした。最後に、プレートを、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と一緒に６０分間インキュベートした。ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を用いて反応を展開させ、４９２ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定した。さらなる測定のためのカットオフ値を決定するために、健康な対照１４６個体の血清（予め、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて抗ｔｏｐｏＩ抗体に対して陰性であることを試験した）を、全ｔｏｐｏＩ断片及びＭＢＰに対して試験した。健康な対照の血清とｔｏｐｏＩ断片及びＭＢＰとの反応性は最小であることが示され（ＯＤ４９２  ０．０１９〜０．０３２）、さらなる測定のためにカットオフ値０．１を選択した。
【００５４】
免疫ブロット
ＳＤＳ試料緩衝液で１：１希釈した、精製ＭＢＰ融合タンパク質又はＭＢＰ（４０μｇ／ｍｌ）を１０分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で１時間ブロッキングした後、膜を、洗浄緩衝液中２％脱脂粉乳で１：５００に希釈した血清と一緒に１時間インキュベートした。洗浄後、１：２０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを１時間にわたって加えた。ＭＢＰ融合タンパク質を検出するために、膜の条片を、まずウサギ抗ＭＢＰ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＵＫ）（１：５０００）と一緒にインキュベートし、続いてＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（１：２０００）と一緒にインキュベートした。膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）基質を用いて展開し、Ｘ線フィルムに暴露させた。
【００５５】
統計分析
分類別のデータを、カイ二乗検定によって分析した。患者群間の可能性のある差異を調査するために、連続的な変数の頻度及び平均値を、スチューデントのｔ検定によって試験した。スピアマンの順位相関係数を使用して、光学密度の値と連続的な変数との間の関係を検定した。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意であるとみなした。統計分析は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアパッケージを使用して行った。
【００５６】
したがって、本診断方法は、それぞれの場合に適用できないことがあると同時に、患者がｔｏｐｏＩ反応性抗体を有する場合、少なくともｄｃＳＳｃとＳＬＥとを、安全に区別することができる。
【００５７】
結果
ファージ提示されたｔｏｐｏＩライブラリーを用いた、抗ｔｏｐｏＩ抗体のエピトープのマッピング
抗ｔｏｐｏＩ抗体によって認識されるエピトープを同定するために、バクテリオファージラムダ上に提示されたｔｏｐｏＩ抗原断片ライブラリーを構築し、その後抗ｔｏｐｏＩ陽性患者（ｄｃＳＳｓ患者５個体、ｌｃＳＳｃ患者６個体及びＳＬＥ患者４個体）の血清から精製した個々のＩｇＧを用いてこのライブラリーをスクリーニングした。３回の親和性選択の後、６０クローン（各患者群から３０）の挿入断片を配列決定した。推定アミノ酸配列をヒトｔｏｐｏＩと配列比較することにより、認識されたエピトープの型が、ｄｃＳＳｃ患者、ｌｃＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者の間で異なることが示された（図１）。
【００５８】
抗ｔｏｐｏＩ抗体による、組換えｔｏｐｏＩ融合タンパク質の認識
ｔｏｐｏＩ抗原断片ライブラリーの親和性選択によって得られた結果を検証するために、組換えｔｏｐｏＩ−ＭＢＰ融合タンパク質を構築した。ライブラリーの選択によって同定された断片に基づいて、９つの融合タンパク質を構築し、発現させた（図２）。これらの融合タンパク質の認識を、ＥＬＩＳＡによるライブラリーの選択に使用したものを含めた、抗ｔｏｐｏＩ抗体陽性患者６７個体（ｄｃＳＳｃ３４個体、ｌｃＳＳｃ２５個体及びＳＬＥ８個体）の血清を用いて試験した。結果を表１に要約する。
【表１】
2011528799.tif 000003
【００５９】
数字は、所与の断片に対して陽性である個々の患者を示し、括弧内の数字は陽性血清の割合を示す（ｄｃＳＳｃ：びまん型全身性強皮症；ｌｃＳＳｃ；限局型全身性強皮症；ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス）
【００６０】
Ｆ４断片（ＡＡ４５０〜６００）は、患者の血清６７検体全てによって認識された。Ｆ１断片（ＡＡ５〜３０）は、それぞれ、ｄｃＳＳｃ患者３４個体のうち９個体、ｌｃＳＳｃ患者２５個体のうち１個体、及びＳＬＥ患者８個体のうち０個体によって認識された。Ｆ８断片（ＡＡ３５０〜４００）は、ＳＬＥ患者８個体のうち４個体によって認識され、ＳＳｃ患者には認識されなかった。
【００６１】
ｔｏｐｏＩエピトープの反応性についての縦断的分析
Ｆ１断片、Ｆ４断片及びＦ８断片に対する抗体の反応が、経時的に一定のままであるかどうかを決定するために、各患者の３つの連続的な血清試料において、これらの断片に対する抗体の反応性をＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡの結果を、Ｆ１陽性患者１０個体、Ｆ４陽性患者の無作為に選択した１０個体、及びＦ８陽性患者４個体におけるウェスタンブロットによって確認した。各血清試料は、従来の抗Ｓｃｌ−７０ＥＬＩＳＡによっても検定した。
【００６２】
縦断的分析により、Ｆ４断片に対する反応性は６１症例（９４％）で安定であったことが示された。患者６７個体のうち１８個体が、従来の抗Ｓｃｌ−７０ＥＬＩＳＡによる測定でｔｏｐｏＩに対する抗体反応がない血清試料を少なくとも１つ有した。Ｆ４断片を用いたＥＬＩＳＡの結果をウェスタンブロットによって確認し、ＥＬＩＳＡにおいてＦ４反応性が陽性であった各血清はウェスタンブロットにおいても陽性であったことが示された（図３Ａ）。
【００６３】
Ｆ１断片に対する反応性は経時的に変化した。４症例において、初期の血清試料はＦ１に対する検出可能な抗体を少しも有さなかったが、免疫応答は経時的に陽性になり、強くなった。一症例において、Ｆ１に対する反応性は２番目の試料に現れたが、続く試料では見られなかった。残りのｄｃＳＳｃ患者４個体の全ての血清試料は、抗Ｆ１抗体に対して陽性であった。ＥＬＩＳＡの結果をウェスタンブロットによって確認し、この２つの方法によって得られた結果が完全に相関することが示された（図３Ｂ）。
【００６４】
Ｆ８に対する抗体に対して陽性であるＳＬＥ患者４個体の中で、反応性は患者１個体では安定であり、残りの３個体では変化した。
【００６５】
臨床知見
臨床データ（皮膚合併症の程度、手の拘縮、高窒素血症及び／又は悪性高血圧症、心臓合併症、運動不全並びに食道の狭窄／拡張、肺線維症の程度、努力性肺活量）の統計分析により、抗ｔｏｐｏＩ抗体のエピトープ特異性とＳＳｃの臨床的な症状との間に関連は示されなかった。しかし、ＳＳｃ患者のＦ１陰性群とＦ１陽性群との間で、平均年齢（Ｆ１陰性（患者数：４９）：５４．８±１３．５歳；Ｆ１陽性（患者数：１０）：６３．９±９．４歳；ｐ＝０．０４８）及び疾患の持続期間（Ｆ１陰性（患者数：４９）：１０．０±７．３年；Ｆ１陽性（患者数：１０）：１７．１±１２．９年；ｐ＝０．０１９）に有意な差異があった。さらに、Ｆ１断片に対して陽性である血清を持つｄｃＳＳｃ患者の平均年齢は、Ｆ１に対して検出可能なレベルの抗体を示さない患者と比較して有意に高かった（Ｆ１陰性（患者数：２５）：５１．９±１４．３歳；Ｆ１陽性（患者数：９）：６３．７±１０．０歳；ｐ＝０．０３）。
【００６６】
Ｆ１ペプチドに対する抗体が、ＳＳｃ患者に特異的であったか、及びその抗体の出現が単に加齢の結果ではないかを調査するために、年齢を適合させた（平均年齢：６２．４±５．４歳）健康な対照６４個体からの血清を、Ｆ１に対する抗体について試験した。１つの血清試料のみが陽性であるとわかった。Ｆ１断片に対する抗体の存在がＳＳｃに特異的かどうかを試験するために、年齢を適合させた（平均年齢：６５．５±４．８歳）、異なる結合組織病の患者１１０個体からの血清も試験し、４つの血清試料（血清陰性脊髄関節炎２検体、筋肉炎１検体、シェーグレン症候群１検体）のみが陽性であるとわかった。
【００６７】
Ｆ８陽性のＳＬＥ患者４個体及びＦ８陰性のＳＬＥ患者２６１個体の臨床データを比較することにより、Ｆ８断片に対する抗体を持つＳＬＥ患者はレイノー現象を有し、疾患の症状は軽度である（関節炎、中枢神経系及び腎臓の合併症がない）ことが示唆された。
【００６８】
要約すると、ｔｏｐｏＩの免疫優性部分に加え、ｄｃＳＳｃ、ｌｃＳＳｃ及びＳＬＥの患者の血清が、別個のｔｏｐｏＩエピトープを認識することが実証された。我々は、大半の断片の認識が、所与の疾患サブグループに対して特徴的なのではなく、個々の患者に対して特徴的であることを示した。しかし、Ｆ１断片（ＡＡ５〜３０）は、ｄｃＳＳｃ患者の血清のサブセットによって特異的に認識され、Ｆ８断片（３５０〜４００）はＳＬＥ患者によって認識され、このことは、Ｆ１断片及びＦ８断片が、それぞれ、ｄｃＳＳｃ及びＳＬＥに対して特徴的なエピトープを表している可能性があることを示している。
【００６９】
財源：国家保険基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｆｕｎｄ）（ＥＴＴ：３２／ＫＯ／２００４）
【００７０】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2011528799000001.app
【国際調査報告】
2011528799.tif 000009
2011528799.tif 000010
2011528799.tif 000011