(57)【要約】 本発明は、支持体に固定された核酸アナログ、例えばPNA(Peptide Nucleic Acid)プローブと標識されていない標的核酸のハイブリダイゼーション反応後に、検出可能な標識と、前記標識を標的核酸に導入する物質を加えて標的核酸を選択的に標識する方法、及びこれを用いた標的核酸の検出方法に関するものであって、プローブと相補的に結合されている標的核酸のみ選択的に標識し、少量の標識導入物質(例：酵素)と標識で標識が可能であり、低コスト・高効率で標識することができ、ハイブリダイゼーションした標的核酸とハイブリダイゼーションしていないプローブとのシグナル差異を増幅してハイブリダイゼーション検出感度を向上させることができる。更に、プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応前、又はハイブリダイゼーション反応と同時に標的核酸を断片化することにより、ハイブリダイゼーション反応の効率又は特異性を増加させることができる。
2011507493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に固定された核酸アナログプローブを有するアレイ上で標的核酸を選択的に標識する方法において、
未標識の標的核酸を核酸アナログプローブにハイブリダイズさせた後、前記アレイに検出可能な標識と前記標識を未標識の標的核酸に導入する物質（agent）とを加える方法であって、前記核酸アナログプローブが前記物質（agent）と反応しないために核酸アナログプローブとハイブリダイズした標的核酸のみが選択的に標識される前記方法。
【請求項２】
核酸アナログがPNA(Peptide Nucleic Acid)である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検出可能な標識を核酸に導入する物質が、検出可能な標識を核酸の末端に導入する酵素、又は検出可能な標識を核酸の末端若しくは中間に導入する化学物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な標識を核酸の末端に導入する酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ、又はリガーゼ(ligase)である、 請求項3に記載の方法。
【請求項５】
リガーゼがT4 RNA リガーゼである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
検出可能な標識がddNTP、dNTP又はオリゴヌクレオチドに連結されたものである、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が、分枝DNA(bDNA)増幅、3SR(self-sustained sequence replication) 、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、ハイブリッドキャプチャー、リガーゼ連鎖反応(LCR)、重合酵素連鎖反応(PCR)、核酸配列基礎増幅(NASBA)、逆転写−重合酵素連鎖反応(RT-PCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写−媒介増幅(TMA)、RNAから由来したcDNA、転写RNAから由来したcRNA、及びローリングサークル増幅(RCA)から構成された群から選択される方法によって増幅されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が断片化(fragmentation)されたものである、請求項1に記載の核酸アナログアレイにおいて標的核酸を選択的に標識する方法。
【請求項９】
標的核酸がハイブリダイゼーション反応前、又はハイブリダイゼーション反応と同時に断片化されたものである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸がヌクレアーゼ(nuclease)を加えて断片化されたものである、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレアーゼはDNaseＩ、エキソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼ及びこれらの混合物から構成された群から選択されるものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸が超音波処理(sonication)によって断片化されたものである、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸がRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸がマイクロRNA(microRNA)である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
検出可能な標識が、ビオチン、ローダミン、シアニン(Cyanine) 3、シアニン 5、ピレン(pyrene)、シアニン 2、緑色蛍光タンパク質(GFP: Green Fluorescent Protein)、カルセイン(Calcein)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、アレクサ(Alexa) 488、6−カルボキシ−フルオレセイン(FAM)、2´，4´，5´，7´−テトラクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(HEX)、2´，7´−ジクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)、フルオレセインクロロトリアジニル(FluoresceinChlorotriazinyl)、フルオレセイン、オレゴングリーン(Oregon Green)、マグネシウムグリーン(Magnesium Green)、カルシウムグリーン(Calcium Green)、6−カルボキシ−4´，5´−ジクロロ−2´，7´−ジメトキシフルオレセイン(JOE)、テトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine)、テトラメチル−ローダミンイソチオシアネート(TRITC)、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、ローダミンファロディン(Rhodamine Phalloidin)、ピロニン Y(Pyronin Y)、リスアミン(Lissamine)、ROX(X-rhodamine)、カルシウムクリムゾン(Calcium Crimson)、テキサスレッド(Texas Red)、ナイルレッド(Nile Red)、及びチアジカルボシアニン(Thiadicarbocyanine)から構成された群から選択されるものである、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
1)第1項乃至第15項のうち、何れか1項の方法によって標的核酸を選択的に標識し、；
2)段階1)の標識からのシグナルを検出する：段階を含む、核酸アナログアレイにおいて標的核酸を検出する方法。
【請求項１７】
(1)支持体に固定された核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションされている標的核酸を検出することができるようにする検出可能な標識；及び、
(2)前記検出可能な標識を核酸アナログプローブには導入せず、核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションされている標的核酸にのみ導入する物質：を含む、第1項乃至第15項のうち、何れか1項による核酸アナログアレイにおいて標的核酸を選択的に標識する方法に使用するためのキット。
【請求項１８】
(1)支持体に固定された核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションしている標的核酸を検出することができるようにする検出可能な標識；及び、
(2)前記検出可能な標識を核酸アナログプローブには導入せず、核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションされている標的核酸にのみ導入する物質：を含む、第16項による核酸アナログアレイにおいて標的核酸を検出する方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体に固定された核酸アナログプローブを使用した標的核酸の選択的標識化及び検出に関するものであって、更に詳しくは、固定された核酸アナログプローブと標識されていない標的核酸のハイブリダイゼーション反応後に、検出可能な標識と前記標識を標的核酸に導入する物質を加えて、標的核酸を選択的に標識する方法、及びこれを用いた標的核酸の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然の状態では、核酸を検出することは難しいため、核酸を標識して検出する方法が、分子生物学や細胞生物学の多様な分野で行われてきた。特異的なハイブリダイゼーション反応(specific hybridization reaction)をベースとしたサザンブロッティング(Southern blotting)、ノーザンブロッティング(Northern blotting)、インサイチュハイブリダイゼーション(in situ hybridization)、核酸マイクロアレイ(microarray)のシグナルを検出するために、標識された核酸が広く使用されてきた。重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)で、標識された単量体(標識されたdNTP)、又は標識されたプライマーを使用してDNAを増幅するとともにDNAを標識する方法が知られている。このように標識されたDNAをマイクロアレイで検出することができる。PCRと同時に核酸を標識する方法は、標識のための別途段階が必要ではないという利点がある反面、蛍光色素などで標識された単量体を用いる場合、標識されていない単量体を用いる場合よりPCRの効率が落ちるという欠点がある。また、RNAはPCR法で増幅することができないため、PCRで標識する方法によりRNAを検出しようとすると、逆転写(reverse transcription)を通じてcDNAを合成する段階が必要であり、特にマイクロRNA(microRNA, miRNA)のようにその長さが短い場合、cDNAの合成が煩雑となる問題がある。
【０００３】
マイクロアレイ又はチップに固定化されたプローブにおいて、標的核酸の長さが長いほど、プローブへの接近が難しく、ハイブリダイゼーション反応効率が落ちるため、なるべく長さの短い標的核酸をハイブリダイゼーション反応に用いるのが望ましい。標的核酸の長さが200bp以上になると、ハイブリダイゼーションの効率が急速に減少して特異なシグナルが減少し、バックグランドのシグナルとの区別が難しくなり、400bp以上の標的核酸からは特異的なシグナルが殆ど検出されず、解析が不可能である(文献 [Optimization of fragmentation conditions for microarray analysis of viral RNA, Martin et al., 2005, Analytical biochemistry, 347, 316-323]、及び[Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid, Regis et al., 2005, BioTechniques, 39, 89-96])。上記の問題を解決するために、標的が散在している場合、それぞれの短い断片に増幅させる方法や、長く増幅させた後、制限酵素で断片化する方法、及びゲノムを増幅した後、それぞれの特異的プライマーで短い断片を再び増幅する方法などが使用されてきた。(文献 [Toward genome-wide SNP genotyping, Ann-Christine Syvanen, 2005, Nature genetics, 37, S5-S10] 、及び[Assessing Genetic Variation: Genotyping Single Nucleotide Polymorphism, Ann-Christine Syvanen, Nature, 2001, 2, 930-942])。しかし、このような方法は、各々の断片を全て増幅しなければならない不便さがあり、蛍光標識されたdNTPや蛍光標識されたプライマーを用いた増幅反応には、多量の蛍光物質が必要となるため、非効率的で時間やコストがかかり、及び／または大きな労力を要する。このような増幅時の不便さを解消し、増幅効率を増加させるために、増幅反応中に蛍光物質を標識せず増幅後に核酸加水分解酵素(DNase Ｉ)などを用いて増幅された標的核酸を断片化し、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ、又はリガーゼ(ligase)を用いて断片化された二重鎖(double strand)又は一重鎖(single strand)に蛍光物質を付着した後、ハイブリダイゼーションする方法などが使用されてきた(米国公開特許第2004−67493号及び第2005−191682号)。これらの方法では、標的核酸を増幅した後、チップ上でハイブリダイゼーション反応を行う前に溶液上で標識化反応を行うため、標識化反応を妨害し得る増幅反応後の残余dNTPや増幅酵素を除去しなければならなく、断片化された全ての標的核酸を蛍光色素で標識化するため、非常に多い量の酵素と蛍光色素が必要とされ、高いコストが所要される(アンプリチップCYP 450テスト(Amplichip CYP 450 test)、ロシュ(Roche))。また、残余標的核酸の反応により非特異シグナルが増加する可能性も排除することはできない。
【０００４】
最近、DNAから転写されるが、タンパク質には翻訳されない21〜35塩基の短い非翻訳RNA(non-coding RNA)が多く発見され、この中で特にマイクロRNAは、真核生物で発見される短い一重鎖(single strand)RNA分子であって、遺伝子発現を制御する調節物質である。マイクロRNAが癌及び細胞増殖、細胞分化、アポトーシス及び脂肪代謝調節などに重要な働きをしていることが明らかになっており、関心が集まっている。また、マイクロRNAをバイオマーカーとして使用されており、マイクロRNAの発現パターンを分析することで、特定疾病や癌を診断し、予測することができる(文献 [Stenvang J, Silahtaroglu AN, Lindow M, Elmen J, Kauppinen S. (2008) “The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics” Seminars in cancer biology 18:89-102])。
【０００５】
RNAを検出するための古典的な方法であるノーザンブロッティング法は、多量のRNAが必要であり、時間と努力が多く要求され、一度に一種類のRNAしか検出することができない。これに対し、多数の相補的なプローブを表面に固定したマイクロアレイを用いて様々なマイクロRNAの発現パターンを同時に解析する方法も開発された。マイクロアレイを使用して効果的にマイクロRNAの発現パターンを解析するためには、長さが短いマイクロRNAを効果的に標識する方法が必要である。マイクロRNAを増幅せず、検出する場合には、マイクロRNAをcDNAに逆転写する段階を経ずにマイクロRNAを直接検出した方が有利である。酵素を用いるか、化学的な方法でマイクロRNAに標識物質を結合させ、マイクロRNAを標識する方法が知られている。酵素を用いる場合には、リガーゼ、ポリ(A)重合酵素(poly(A) polymerase)、又はターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼのような酵素を用いて、マイクロRNAの3´末端に標識された単量体や標識可能な塩基配列を付着することもでき、ポリヌクレオチドキナーゼ(polynucleotide kinase)を用いて5´末端に標識分子を付着することもできる。リン酸- シチジル-リン酸  (phosphate-cytidyl-phosphate, pCp)とT4リガーゼを用いて標識する方法が常用化されている(米国特許出願公開 US 2008/0026382 A1 “Enzymatic labeling of RNA”文献 [Wang H, Ach RA, Curry B. (2007) “Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA”RNA 13:151-159])。この方法ではCy3又はCy5と結合したpCpを用いて溶液中でRNAを標識した後、マイクロアレイで分析した。
【０００６】
酵素を用いる方法以外にも化学的な方法を通じて標的核酸を標識する方法が知られている。核酸の塩基に共有結合を通じて標識物質を貼り付ける方法(文献 [J. A. Wolff, P. M. Slattum, J. E. Hagstrom, V. G. Budker “Gene expression with covalently modified polynucleotides” US Patent 7,049,142])は、核酸塩基が変形されるため、相補的な塩基配列とのハイブリダイゼーション反応を妨げる欠点がある。標識化合物を核酸のグアニン塩基に付着する化学的な標識化方法(文献 (H. J. Houthoff, J. Reedijk, T. Jelsma, R. J. Heetebrij, H. H. Volkers, “Methods for labeling nucleotides, labeled nucleotides and useful intermediates” US Patent 7,217,813))も同様な欠点があり、さらにこの方法ではグアニン塩基を含まない配列を標識することができない。
【０００７】
ペプチド核酸(Peptide nucleic acid, PNA)は、核酸塩基がリン酸結合ではなく、ペプチド結合で連結された核酸アナログの一種であって、1991年にNielsenなどによって初めて合成された(文献 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O. (1991)“Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”, Science 254:1497-1500])。図1に示したように、PNAはDNAのホスホジエステル(phosphodiester)結合がペプチド結合(peptide bond)に代替されており、DNAのようなアデニン、チミン、グアニンとシトシンを有し、塩基特異的にDNAやRNAとハイブリダイゼーション反応を起こし得る。PNAは天然では見られず、人工的に化学的な方法で合成される。PNAは相補的な塩基配列の天然核酸とハイブリダイゼーション反応を通じて二重鎖を形成する。長さが同一である場合、PNA/DNAの二重鎖はDNA/DNA二重鎖より、PNA/RNA二重鎖はDNA/RNA二重鎖より安定している。また、PNAは単一塩基不整合(single base mismatch)のため、二重鎖が不安定になる程度が大きいので、SNP(single nucleotide polymorphism)を検出する能力が天然核酸より優れている。PNAは化学的に安定しているだけでなく、核酸分解酵素(nuclease)やタンパク質分解酵素(protease)によって分解されないため、生物学的にも安定している。PNAは電気的に中性であるため、PNA/DNA、PNA/RNAの二重鎖の安定性は塩濃度によって影響を受けることはない。
【０００８】
最近、PNAチップにおいて、PNAの生物学的酵素に対して安定した性質を利用した研究が進行されている。一例として、本発明者らはPNAチップにおいてプローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応時にヌクレアーゼを加えて標的核酸を断片化し、PNAプローブと標的核酸間のハイブリダイゼーション効率を増加させるか、ハイブリダイゼーション反応後にヌクレアーゼを加えてPNAプローブとミスマッチ(mismatched)された標的核酸のみを選択的に分解し、ハイブリダイゼーションの特異性を増加させる方法を案出し、これに関して特許出願し、韓国出願番号第2007−18384号が与えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国公開特許第2004−67493号
【特許文献２】米国公開特許第2005−191682号
【特許文献３】米国特許出願公開 US 2008/0026382 A1 “Enzymatic labeling of RNA
【特許文献４】J. A. Wolff, P. M. Slattum, J. E. Hagstrom, V. G. Budker “Gene expression with covalently modified polynucleotides” US Patent 7,049,142
【特許文献５】H. J. Houthoff, J. Reedijk, T. Jelsma, R. J. Heetebrij, H. H. Volkers, “Methods for labeling nucleotides, labeled nucleotides and useful intermediates” US Patent 7,217,813
【特許文献６】韓国出願番号第2007−18384号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Optimization of fragmentation conditions for microarray analysis of viral RNA, Martin et al., 2005 Analytical biochemistry, 347, 316-323
【非特許文献２】Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid, Regis et al., 2005, BioTechniques, 39, 89-96
【非特許文献３】Toward genome-wide SNP genotyping, Ann-Christine Syvanen, 2005, Nature genetics, 37, S5-S10
【非特許文献４】Assessing Genetic Variation: Genotyping Single Nucleotide Polymorphism, Ann-Christine Syvanen, Nature, 2001, 2, 930-942
【非特許文献５】Stenvang J, Silahtaroglu AN, Lindow M, Elmen J, Kauppinen S. (2008) “The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics” Seminars in cancer biology 18:89-102
【非特許文献６】Wang H, Ach RA, Curry B. (2007) “Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA”RNA 13:151-159
【非特許文献７】Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O. (1991)“Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”, Science 254:1497-1500
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、上記のような従来技術の問題を解決するために生物学的酵素に安定した核酸アナログ、例えば、PNAは標識化されず、ハイブリダイゼーションした標的核酸のみ標識化されるようにすることによって、より多様な標的核酸を用いることができ、複雑な増幅又は前処理過程を経ることなく高い特異性とS/N比率で変異を検出することができ、未反応標識物質を分離する段階を経ることなく高い感度で標的核酸を検出することができるということを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、固定化された核酸アナログプローブを用いて標的核酸を効率的に標識する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記標識方法を用いて、固定化された核酸アナログプローブで標的核酸を効率的に検出する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、前記標識又は検出方法に使用するためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
その一、本発明は、
支持体に固定された核酸アナログプローブと標識されていない標的核酸のハイブリダイゼーション反応後に検出可能な標識(detectable label)、及び前記標識を標的核酸に導入する物質を加えるが、
前記核酸アナログプローブは前記物質と反応しないものであるため、ハイブリダイゼーションした標的核酸のみ選択的に標識する段階からなる、支持体に固定化された核酸アナログプローブからなるアレイにおいて、標的核酸を選択的に標識する方法に関するものである。
【００１６】
その二、本発明は、
(1)前記方法によって標的核酸を選択的に標識し、
(2)段階(1)の標識からのシグナルを検出する段階からなる、支持体に固定化された核酸アナログプローブからなるアレイにおいて、標的核酸を検出する方法に関するものである。
【００１７】
その三、本発明は、
(1)核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションした標的核酸を検出することができるようにする検出可能な標識、及び、
(2)検出可能な標識を核酸アナログプローブには導入せず、核酸アナログプローブとハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ導入する物質からなる、支持体に固定化された核酸アナログからなるアレイにおいて、標的核酸を選択的に標識するか、検出する方法に使用するためのキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、プローブとハイブリダイゼーションした標的核酸のみ標識化されるようにすることによって、同じ量の酵素と標識を用いてより高い感度で標的核酸を検出するか、より少ない量の酵素と標識を用いて同じ感度で標的核酸を検出することができる。また、標的核酸の増幅過程中に標識を添加しないため、広く散在している遺伝子変異を1回又は減少された回数で増幅することができ、広く散在しているSNPや遺伝子変異を検出する全ての方法に利用することができる。例えば、多様な方法で増幅されたか、RNAから製造されたcDNAを含む標的核酸に対し、突然変異、SNP、遺伝型、遺伝子発現、スプライシング変異体又はエピジェネティクな(epigenetic）分析、又は再配列分析(resequencing)などに広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
上記及び他に記載の、本発明の特徴及び優位性については、以下に示した図から理解することができる。
【図１】図1は、DNAとPNAの基本構造の違いを示した図である。
【図２】図２は、従来技術によるDNAチップにおける標識化方法と、本発明の実施形態の一例による、PNAチップにおける標識化方法の原理を比較した図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態の一例により、PNAチップにハイブリダイゼーションする間に標的核酸を断片化し、ハイブリダイゼーションした後、検出可能な標識を加えてPNAプローブと結合している標的核酸を選択的に標識する原理を示した図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態の一例により、PNAチップにハイブリダイゼーションした後、標識する方法を示した図である。
【図５】図５は、増幅及びヌクレアーゼ処理を行った後、様々なサイズの標的核酸を1.5％アガロースゲル上で電気泳動した結果を示す写真である。
【図６−９】図６乃至図９は、本発明の実施形態の一例により、断片化し、ハイブリダイゼーションした後、標識化した結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示した写真及びグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態の一例により、ハイブリダイゼーション時に断片化した後、標識化した結果を示す定量分析データを示したグラフである。
【図１１】図１１は、従来技術(ハイブリダイゼーション前に標識化)と本発明(ハイブリダイゼーション後に標識化)による定量分析データを示したグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態の一例により、マイクロRNAをPNAチップにハイブリダイゼーションした後に、標識した蛍光イメージを示す写真であり、
【図１３】図１３は、PNAチップにハイブリダイゼーションする前にマイクロRNAを標識して測定した蛍光イメージを示す写真であり、
【図１４】図１４は、マイクロRNAをPNAチップにハイブリダイゼーションした後、標識して測定した蛍光量と、マイクロRNAを標識した後、PNAチップにハイブリダイゼーションして測定した蛍光量を比較して示したグラフである。
【図１５】図１５は、DNAチップに標的核酸をハイブリダイゼーションせずに、T4 RNAリガーゼとpCp-Cy3で処理した後、測定した蛍光イメージを示した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用される酵素に作用しない代表的な核酸アナログはPNAであるため、以下、PNAプローブが支持体の一定の位置に固定されたPNAチップ、又はマイクロアレイを例として説明する。本発明による方法は、区別することができる様々なビーズにそれぞれ異なるPNAプローブを固定したビーズアレイを含む支持体にPNAプローブを固定した全ての装置に適用することができる。
【００２１】
本発明では、標的核酸の長さにより標的核酸の断片化を行うことも、行わないこともあるが、以下、標的核酸の断片化を行う場合と、標的核酸の断片化を行わない場合に分けて説明する。
【００２２】
1) 標的核酸の断片化を行う場合
図2に示したように、50 bp〜8 kb、特に2〜8 kbの長さの標的核酸の場合、従来技術によるDNAチップでは、標的核酸を増幅及び断片化し、この断片を標識化した後、ハイブリダイゼーション反応を行ってハイブリダイゼーションしたシグナルを検出する。これに比べて、本発明は標的核酸を増幅し、より小さいサイズに断片化したPNAプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行った後、PNAプローブとハイブリダイゼーションした標的核酸を標識することを特徴とする。本発明の他の実施形態では、標的核酸を増幅した後、PNAチップ上でハイブリダイゼーション反応を行うとともに断片化した後、PNAプローブとハイブリダイゼーションした標的核酸を選択的に標識することを特徴とする(図3参照)。
【００２３】
本発明の実施形態の一例では、配列番号1乃至8のPNAオリゴマーを用いてPNAチップを作製し、ハイブリダイゼーションを行った後、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼと蛍光標識物質を添加してその検出シグナルを測定した。韓国登録特許第464261号の方法によって、PNAオリゴマーをBts(Benzothiazolesulfonyl)基で保護されたPNA単量体と機能化されたレジンから固体相合成法(solid phase synthesis)で合成した。この方法以外にも、公知のFmoc, Boc合成法を使用してPNAを合成することもできる。配列番号1の PNAオリゴマーは、薬物代謝遺伝子であるCYP 450遺伝子のうち、抗うつ性薬剤、及び過敏性薬剤の薬物代謝に関与するCYP 2C19遺伝子の4番エキソンに位置した636番位置と完全に結合することができるプローブであり、配列番号2は配列番号1と一つの塩基が異なるように設計されたプローブである。配列番号3乃至8は、CYP 450遺伝子のうち、多くの薬物の代謝と関連された遺伝子2D6遺伝子において薬物代謝に影響を与える一部SNPを検出するプローブであって、各変異位置と完全に結合することができるプローブと一つの塩基が異なるように設計された変異検出用プローブで構成される。使用されたプローブは13乃至17  ｍｅｒの長さで設計し、合成した。
【００２４】
表１
【表１】
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【００２５】
本発明の実施形態の一例では、チップのハイブリダイゼーションに使用する標的核酸を、
(1)プライマー(下記表2参照)で増幅し、ヌクレアーゼを添加して断片化した後、PNAチップでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ検出可能な標識物質を付着する方法(図2の右側参照)；及び
(2)プライマー(下記表2参照)を用いて増幅させ、ハイブリダイゼーション反応時にヌクレアーゼを添加して断片化するとともに、PNAプローブでハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ検出可能な標識物質を付着する方法(図3参照)；
を用いてPNAチップのハイブリダイゼーションの特異的なシグナルとシグナル分離能を比較した。
【００２６】
例えば、本発明による方法は、
(a)PNAチップの標的核酸を用意する段階；
(b)標的核酸を断片化する段階；
(c)プローブPNAと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を行う段階；
(d) ハイブリダイゼーション反応後、残余反応物を除去するために洗浄する段階；
(e) ハイブリダイゼーションした標的核酸に検出可能な標識物質を付着する段階；
(f)残余反応物を除去するために洗浄する段階；及び
(g) ハイブリダイゼーションによるシグナルを検出する段階；からなることができる。
【００２７】
段階(a)では、一般的に使用する全ての核酸増幅方法を使用することができる。本発明では増幅反応中に特別な蛍光標識物質を含まないため、使用される増幅方法に特別な制限がなく、例えば、分枝DNA(bDNA; branched DNA)増幅、3SR(self-sustained sequence replication)、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅(selective amplification of target polynucleotide sequences)、ハイブリッドキャプチャー(hybrid capture)、リガーゼ連鎖反応(LCR; ligase chain reaction)、重合酵素連鎖反応(PCR)、核酸配列基礎増幅(NASBA; nucleic acid sequence based amplification)、逆転写−重合酵素連鎖反応(RT-PCR; reverse transcription-PCR)、鎖置換増幅(SDA; stand displacement amplification)、転写−媒介増幅(TMA; transcription mediated amplification)、RNAから由来したcDNA、転写RNAから由来したcRNA、及びローリングサークル増幅(RCA; rolling circle amplification)などの方法を使用することができる。標識物質を添加して核酸を増幅する場合には、2kb以上の長い標的核酸は増幅効率が減少するか、増幅反応に多量の標識化dNTP(即ち、dATP, dCTP, dGTP, dTTP)が必要となる。これに比べて、本発明では増幅反応中に特別な蛍光標識物質を含まないため、標的核酸のサイズに特別な制限がなく、多様なサイズの標的核酸を増幅することが可能である。
【００２８】
段階(b)では、ハイブリダイゼーション効率を増加させるために、標的核酸を断片化する。本発明において使用可能な断片化方法には制限がないが、例えば、DNAを無作為で断片化する方法を用いる。増幅された核酸を無作為で断片化するためには、DNaseＩ(文献[Comparison of Two CYP 2D6 Genotyping Methods and assessment of genotype-Phenotype Relationship, Chou et al., 2003, clinical chemistry. 49(4) 542-551])、APエンドヌクレアーゼなど(文献[Recognition of oxidized abasic sites by repair endonucleases. Haring et al., 1994, Nuc. Acids Res. 22:2010-2015]、及び米国公開特許第2005-191682号)を使用することができる。
【００２９】
本発明ではヌクレアーゼを用いて核酸を断片化することができる。本発明で使用可能なヌクレアーゼには特別な制限がなく、DNaseＩ、エキソヌクレアーゼ(exonuclease)、又はエンドヌクレアーゼ(endonuclease)などを単独又は混合して使用することができる。エキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼの具体的な例には、エキソヌクレアーゼ 1(exonuclease 1)、S1 ヌクレアーゼ(S1 nuclease)、 マングビーンヌクレアーゼ(Mung bean nuclease)、リボヌクレアーゼA (ribonuclease A)、リボヌクレアーゼT1(ribonuclease T1)、又はヌクレアーゼP1(nuclease P1)などが挙げられる。その他にも化学的な方法を用いて核酸を断片化することもできる(文献 [In vitro detection of endonuclease ＩＶ-specific DNA damage formed by bleomycin in vivo. Levin and Demple, Nuc. Acids Res. 1996, 24:885-889]、及び米国公開特許第2005-191682号)。また、超音波処理(sonication)のような物理的な方法を用いて核酸を断片化することもできる。
【００３０】
段階(c)は一般的なハイブリダイゼーション反応であって、断片化された標的核酸をハイブリダイゼーションを行う緩衝液と混合して添加し、適当な温度で反応を行うと、プローブと相補的な標的核酸が結合する。DNAが固定されたDNAチップはDNAプローブ自体が生物学的酵素に不安定で、ヌクレアーゼによってDNAプローブ自体が分解されることもあり得るため、好ましくない。従って、本発明ではヌクレアーゼや他の生物学的酵素に非常に安定しているPNAを用いる。図1に示したように、PNAの生物学的酵素及びヌクレアーゼに非常に安定した性質により、ハイブリダイゼーションと標的核酸の断片化を同時に行うことが可能になる。PNAにはN-アミノエチルグリシン骨格が一番広く使用されるが、変形された骨格を有するPNAも同じ目的で用いることができる(文献 [P.E. Nielsen and M.Egholm “An Introduction to PNA” in P.E. Nielsen (Ed.) “Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications” 2nd Ed. Page 9 (Horizon Bioscience, 2004)]。PNA以外にも他のヌクレアーゼに安定したDNAアナログを使用することもできるが、例えば、ホスホロチオアート(phosphorothioate)、 2′-O-メチル、2−0−アリル、2−0−プロピル、2′-O-ペンチル、2′-フルオロなどに変形されたDNAを使用することができる(文献 [Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha-ras, Monia et al., 1996, J bio, chem. 271: 14533-14540]、及び[Characterization of fully 2′-modified oligoribonucleotide hetero- and homoduplex hybridization and nuclease sensitivity, Cummins et al., 1995, Nuc. Acids Res. 23:2019-2024]).
【００３１】
また、本段階では段階(b)のようにヌクレアーゼを単独又は混合して添加することができ、この場合、ハイブリダイゼーションと同時に標的核酸を断片化してハイブリダイゼーション効率を増加させることができる(即ち、段階(b)と段階(c)を同時に行う)。特に、S1ヌクレアーゼは多様に用いられているヌクレアーゼであって、一本鎖のＤＮＡとニック(nick)が形成された二本鎖ＤＮＡを分解し、ループ(loop)やギャップ(gap)が形成されたヘテロ二本鎖ＤＮＡ(heteroduplex DNA)も分解することができる(文献 [vogt., 1980 Methods Enzymol. 65:248-255])。従って、S1 ヌクレアーゼを使用する場合、PNAとDNAが完全に結合された部位ではS1 ヌクレアーゼが認知することができず、強い結合をそのまま維持する反面、一つの塩基配列がミスマッチされているPNAとDNAの結合は不安定な結合であるため、S1 ヌクレアーゼにより標的DNAが分解される。その結果、ハイブリダイゼーションの特異性を増加させることができ、またハイブリダイゼーションと同時に断片化反応を行うため、処理過程を簡略化させることができ、さらには長い標的を短く断片化するため、ハイブリダイゼーション効率も増加させることができる。DNase Ｉを用いて断片化した場合、標的核酸は50〜200 bpの長さになる。
【００３２】
段階(d)は、一般的な洗浄方法と同様に行われるが、ハイブリダイゼーション反応後に、反応しなかった残余標的核酸などを除去してプローブに相補的に結合された標的核酸のみが残ると、次の段階で少ない量の標識物質と酵素を用いて効果的に標的核酸を標識することができる。
【００３３】
段階(e)は、ハイブリダイゼーションした標的核酸を検出するために、標的核酸を標識物質で標識化する過程である。ハイブリダイゼーション反応を行った後、固定化されたPNAプローブと結合している標的核酸のみを標識化することになる。この際に主に使用する方法は、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼやリガーゼなどの酵素を用いて、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡフラグメントに標識物質を付着する。 ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼは標的核酸の3´末端に核酸を付加させる酵素であり、好ましくは、核酸の3´−OH部分にddNTP、又は核酸断片の端にdNTP又はオリゴヌクレオチドを貼り付ける役割をする。特異的なシグナルを誘導するために、dNTP(即ち、dATP, dCTP, dGTP, dTTP)、例えばdCTPにCy5やCy3のような蛍光物質を直接付着するか、ビオチンのように蛍光物質と反応することができる物質を付着する。ddNTP(即ち、ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)なども同様に使用可能であり、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチドなども使用可能である。上記したように、酵素を用いること以外にも、化学物質を用いて蛍光物質を付着する方法も利用することができる。この際に化学物質は、PNAプローブとは反応せず、PNAプローブと結合されている標的核酸とのみ反応し、標的核酸を選択的に標識化するものであって、標的核酸の末端や中間を標識化するものである。
【００３４】
使用可能な標識物質に特別な制限はないが、例えば、ビオチン、ローダミン、シアニン(Cyanine) 3、シアニン 5、ピレン(pyrene)、シアニン 2、緑色蛍光タンパク質(GFP: Green Fluorescent Protein)、カルセイン(Calcein)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、アレクサ(Alexa) 488、6−カルボキシ−フルオレセイン(FAM)、2´，4´，5´，7´−テトラクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(HEX)、2´，7´−ジクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)、フルオレセインクロロトリアジニル(Fluorescein Chlorotriazinyl)、フルオレセイン、オレゴングリーン(Oregon Green)、マグネシウムグリーン(Magnesium Green)、カルシウムグリーン(Calcium Green)、6−カルボキシ−4´，5´−ジクロロ−2´，7´−ジメトキシフルオレセイン(JOE)、 テトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine)、テトラメチル−ローダミンイソチオシアネート(TRITC)、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、ローダミンファロディン(Rhodamine Phalloidin)、ピロニン Y(Pyronin Y)、リスアミン(Lissamine)、ROX(X-rhodamine)、カルシウムクリムゾン(Calcium Crimson)、テキサスレッド(Texas Red)、ナイルレッド(Nile Red)、及びチアジカルボシアニン (Thiadicarbocyanine)を使用することができる。
【００３５】
本発明によるハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ蛍光物質を標識化する方法はDNAチップには適用されない。これは、固定化されているプローブがDNAなので、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼと反応して固定化されているプローブに蛍光標識物質が付着されるため、プローブとハイブリダイゼーションしている標的核酸との区別が容易ではないためである。このような理由でDNAチップで主に使用されている蛍光標識化方法は、増幅反応中、又は増幅反応後、断片化された標的核酸に蛍光標識物質を付着する方法を使用する。これは、増幅反応中、又は後に残余dNTPや増幅酵素などが蛍光物質標識化反応を妨害するため、必ず除去する過程を経なければならない。また、増幅されて断片化された全てのＤＮＡフラグメントに蛍光物質を付着しなければならないため、多量の蛍光標識物質と反応酵素が必要となる。これに比べて、本発明の方法は、ハイブリダイゼーション反応後にプローブと結合された標的核酸にのみターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用して蛍光物質を標識化し、残余反応物質を除去する前処理過程を経ないため、実験のステップを減らし、労力や時間を減らすことができる。また、増幅された全ての標的核酸に蛍光標識物質を付着させる方法と比べ、非常に少ない量の酵素と蛍光標識物質で、効率良く標識化することができる。
【００３６】
段階(f)は、一般的な洗浄方法と同一な方法で行われ、未反応の残余標識物質と酵素などを除去する。
【００３７】
段階(g)におけるハイブリダイゼーションによるシグナルの検出は、シグナル誘発物質の種類によって蛍光検出法、電気化学的方法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法、又は光学的性質の差異を用いた検出法など、よく知られている方法によって行われる。本発明の具体的な実施形態では、標識化物質としてビオチンを使用し、Cy5が付着されたストレプトアビジンはビオチンと結合するため、蛍光シグナルを発光させるために用いる。
【００３８】
2) 標的核酸の断片化を行わない場合
図4に示したように、比較的に短い長さ(400 bp以下、特に10〜200 bp未満)の標的核酸の場合、PNAチップ上で標的核酸とPNAプローブのハイブリダイゼーション反応を行い、洗浄した後、PNAプローブとハイブリダイゼーションした標的核酸を選択的に標識し、検出することを特徴とする。
【００３９】
例えば、本発明による方法は、
(a)PNAチップの標的核酸を用意する段階；
(b)プローブPNAと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を行う段階；
(c) ハイブリダイゼーション反応後、残余反応物を除去するために洗浄する段階；
(d) ハイブリダイゼーションした標的核酸に検出可能な標識物質を付着する段階；
(e)残余標識物質を除去するために洗浄する段階；及び、
(f)標識したシグナルを検出する段階；からなることができる。
段階(a)〜(f)は、前記「1)標的核酸の断片化を行う場合」と実質的に同一に行われるため、以下、これに対する説明は省略する。
【００４０】
段階(a)において、標的核酸は、例えばRNA、特に細胞から抽出した全体RNA、更に、特にマイクロRNAなどである。
【００４１】
段階(d)において、標的核酸がRNAである場合は、標識物質と結合したpCpをT4 RNAリガーゼとともに添加するのが効果的である。本発明によるハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ蛍光物質を標識化する方法は、DNAチップには適用することができない。DNAチップにおいて固定化されたDNAプローブが酵素によって標識されると、DNAプローブと結合した標的核酸からだけでなく、標的核酸が結合しなかったDNAプローブからもシグナルが生じてしまうからである(図1５参照)において、本発明の具体的な実施形態では、Cy3と結合したpCpを用いて蛍光シグナルを検出した。
【００４２】
本発明による方法を用いると、増幅過程中に蛍光標識物質を添加する必要がないため、多様な増幅方法や、蛍光物質を含まない多様な標的核酸を用いることができ、断片化方法を用いる場合、標的核酸のサイズに制限がないため、広範囲の標的核酸を用いることができる。また、ハイブリダイゼーション反応を行う前に標識物質を付着する方法と比べて、ハイブリダイゼーションした標的核酸のみ選択的に標識化するため、簡素化された方法で少量の標識物質と酵素を用いて、経済的で、且つ効率的に標識化することができるようになり、核酸のハイブリダイゼーションによって検出する全ての方法に広く適用されることができる。
【００４３】
以下、本発明の実施例によって更に具体的に説明するが、これは本発明の理解のためであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【００４４】
実施例1：標的核酸を作製ためのプライマーの合成
本発明による標的核酸を作製するために、まず、PCRに使用するためのプライマーを合成した。使用プライマーとしては、表2に示したように薬物代謝に関連したCYP 450遺伝子のうち、2C19遺伝子と2D6遺伝子の全ての部位を増幅することができる3つのプライマーを選択した。
【００４５】
PCRに使用したプライマーは、ビオチンが付着されていないプライマーをバイオニア(韓国)に依頼して合成した。
【００４６】
表２
【表２】
2011507493.tif 000005
【００４７】
実施例2：標的核酸を作製するための突然変異誘発及びクローニング
ヒトの全DNAから各プライマーを用いて増幅した核酸を、pGEM-T easyベクター(プロメガ（Promega）、米国)に組み込んだ後、E. coli JM 109細胞に形質変換してDNAを大量に確保した。DNAをシーケンスにより変異がないことを確認し、正常なDNAのクローンを得た。
【００４８】
薬物代謝に影響を与える変異遺伝子を有するクローンを確保するために、上記した方法で製造された正常クローンを用いてストラタジーン突然変異誘発キット  (Stratagene mutagenesis kit) (プロメガ、米国)を使用して変異を誘発し、変異遺伝子を有するクローンを得た。
【００４９】
実施例3：プライマーを用いたPCRによる標的核酸の作製
鋳型DNAとしては前記方法でクローニングした正常DNAと変異DNAを使用した。表2に示した各々のプライマーを用いて次のような条件でPCRを行い、DNAを増幅させた。
【００５０】
鋳型DNA溶液(50ng/μｌ) 2μｌ、表2に示した各々のセンスプライマー(20pmol/μｌ) 1μｌ、及びアンチセンスプライマー(20pmol/μｌ) 1μｌ、dNTP(25 mM) 3μｌ、10×Taq緩衝液(MgCl2含み) 5μｌ、バンドドクター(Band Doctor)(ソルゼント(solgent)、韓国) 5μｌ、Taq(5U/μｌ、ソルゼント、韓国) 0.2μｌ、蒸留水36.8μｌの組成で94℃で5分間処理した後、94℃で１分、62℃で1分、72℃で6分を35回繰り返した後、72℃で更に7分間反応させた。
【００５１】
反応が終わったPCR産物(1.9 kb, 2.7 kb, 4.4 kb) 5μｌにゲルローディング緩衝液(サンバイオ(Sunbio)、韓国)1μｌを入れ、1.5％アガロースゲル上で電気泳動した後、1μｇ/mｌ エチジウムブロミド(EtBr)で染色した後、UV トランスイルミネーター(UV-transilluminator)で産物を確認した(図5の左側、及び中間写真参照)。
【００５２】
実施例4：PNAチップの作製
上記表1に示した配列番号1乃至8の精製されたPNAオリゴマーをPNAArrayTMスポッティング緩衝液(パナジン、韓国)に50mMに希釈してエポキシ基がコーティングされたガラス板にピン方式でスポッティングし、75％湿度が維持される常温で4時間定置した。その後、DMF(dimethyl formamide)に入れて15分間超音波洗浄し、0.1 Mこはく酸無水物を添加したDMFに入れ、40℃で2時間反応させて残余アミン基を除去した。DMFで15分間洗滌し、3次蒸留水で15分間超音波洗浄した。その後、0.1 Mエタノールアミンが入っている100 mMトリス緩衝液(Tris-HCI)に入れて40℃で2時間反応し、固体表面の残余エポキシ基を不活性化した。3次蒸留水を用いて5分間洗浄した後、乾燥した。
【００５３】
実施例5：増幅した標的核酸の断片化
2〜5 kbに増幅した産物を断片化するために、増幅産物10μｌにDNaseＩ(1000 U/μｌ) 0.3μｌを加えた。ここに20 mM EDTA 0.3μｌを添加した後、蒸留水9.4μｌの組成で25℃で30分反応させ、酵素の活性を抑制するために95℃で5分間反応させた。その結果、約50〜200 bpに断片化された核酸を得た(図5の右側写真参照)。
【００５４】
実施例6：断片化された標的核酸のハイブリダイゼーション反応
断片化したPCR産物5μｌに、PNAArrayTMハイブリダイゼーション用緩衝液(パナジン、韓国) 100μｌを添加した。実施例4で作製したPNAチップに100μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を接触させ、40℃で1時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後にPNAArrayTM洗浄用緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。
【００５５】
実施例7：ハイブリダイゼーション反応と同時に標的核酸の断片化
PCR産物10μｌにDNaseＩ(1000 U/μｌ) 0.3μｌと20mM EDTA 0.3μｌを添加し、 PNAArrayTMハイブリダイゼーション緩衝液(パナジン、韓国) 90μｌを添加した。実施例4で作製したPNAチップに、100μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を接触させて40℃で1時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後にPNAArrayTM洗浄緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。
【００５６】
実施例8：ハイブリダイゼーション反応後、プローブと特異的に結合した標的核酸の、蛍光物質による標識化
実施例6及び7の方法でハイブリダイゼーションしたPNAチップに、各々反応緩衝液100μｌのうち、5×ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(ロシュ、ドイツ) 緩衝液 20μｌ、25 mM CoCl2 溶液1μｌ、11−ビオチン−ddUTP 0.01 mM 1μｌ、TdT(400 U/μｌ) 0.01μｌ、蒸留水79.9μｌの組成で37℃で30分間反応させた。反応後にPNAArrayTM洗浄用緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。
【００５７】
乾燥させたPNAチップに蛍光反応を起こすためにハイブリダイゼーション用緩衝液100μｌとストレプトアビジン-Cy5を混合して使用した。40℃で30分間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後にPNAArrayTM洗浄緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。蛍光スキャナー(Genepix 4000B、エキソン、米国)を用いてPNAチップのイメージを分析した。その結果を図6乃至図９に示した。図6乃至図９に示したように、2〜5 kbの標的核酸をDNase Ｉを処理して断片化し、チップにハイブリダイゼーションさせた後、蛍光物質で標識化した結果、固定化されたPNAプローブには蛍光物質が付着されず、ハイブリダイゼーションした標的核酸にのみ蛍光物質が付着されて特異的なシグナルが生じ、特異的なシグナルと非特異的なシグナルが分離されるのを確認することができた。また、図１０に示したように、ハイブリダイゼーションと同時にDNase Ｉを添加して断片化した後、蛍光物質で標識化した結果、断片化して標識した場合と同様の特異的なシグナルとＳ／Ｎ比が得られた。
【００５８】
比較例1：ハイブリダイゼーション反応前の、断片化した標的核酸の蛍光物質による標識化
文献 [Comparison of Two CYP 2D6 Genotyping Methods and Assessment of Genotype-Phenotype Relationship, Chou et al., 2003, clinical chemistry. 49(4) 542-551]に提示された方法によって断片化し、アルカリフォスファターゼで精製した標的核酸10μｌに5×ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ (ロシュ、ドイツ)緩衝液 6.8μｌ、25 mM CoCl2溶液0.8μｌ、11−ビオチン−ddUTP 1 mM 0.8μｌ、TdT(400 U/μｌ) 1.6μｌの総20μｌの組成で37℃で35分間反応させた。酵素の活性を抑制するために95℃で5分間さらに反応させた。反応した産物20μｌにPNAArrayTMハイブリダイゼーション用緩衝液(パナジン、韓国) 80μｌを添加して使用した。実施例4で作製したPNAチップに100μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を接触させ、40℃で1時間、ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後にPNAArrayTM洗浄緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。その結果を図１１に示した。図１１に示したように、従来技術の方法と比べて本発明の方法で標識化した場合、より強い特異的なシグナルとより高いＳ／Ｎ比が得られた。
【００５９】
実施例9：PNAチップ上でハイブリダイゼーションを行った後に標識した、蛍光強度の測定
15種類のマイクロRNA(miR-107, miR-103, miR-10b, miR-124a, miR-140-5p, miR-140, miR-141, miR-155, miR-17-3p, miR-199a-3p, miR-199b, miR-200a, miR-20a, miR-224, miR-372)の知られた塩基配列と同一な塩基配列を有し、何ら標識も付着せずに合成した15種のRNAを混合した溶液5.6μｌをPNAArrayTMハイブリダイゼーション用緩衝液(パナジン、韓国) 100μｌに混合し、これらのマイクロRNA配列に相補的な塩基配列のPNAプローブが固定化されているマイクロアレイで、40℃で2時間、ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応後にPNAArrayTM洗浄用緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。このマイクロアレイに10×T4 RNA リガーゼ緩衝液10μｌ、0.1％ ウシ血清アルブミン(BSA) 2μｌ、T4 RNA リガーゼ 1μｌ(15ユニット)とCy3が付着されたpCp(pCp-Cy3) 3μｌ(Agilent, 米国)を添加した後、RNA分解酵素がない水(RNase-Free water)を入れて最終体積を100μｌにした溶液を接触させ、37℃で2時間反応させた。反応後にPNAArrayTM洗浄緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗滌し、乾燥した。蛍光スキャナー(Genepix 4000B、米国)を用いてガラススライドに固定されたPNAプローブから発光する蛍光強度を測定した。PMA利得700、レーザ出力100％設定で読み取ったイメージを図１２に、蛍光強度を図１４に示した。
【００６０】
比較例2：標識後にPNAチップ上でハイブリダイゼーション前に標識した、蛍光強度の測定
15種のマイクロRNA(miR-107, miR-103, miR-10b, miR-124a, miR-140-5p, miR-140, miR-141, miR-155, miR-17-3p, miR-199a-3p, miR-199b, miR-200a, miR-20a, miR-224, miR-372)の知られた塩基配列と同一な塩基配列を有し、何ら標識も付着せずに合成した15種のRNAを混合した溶液5.6μｌを10×CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)緩衝液 0.7μｌ、CIP(Promega、米国) 0.7μｌ16ユニット）に添加し、最終体積を7μｌにした後、37℃で30分間反応させた。反応液に100% DMSO(dimethyl sulfoxide)(Sigma、米国) 5μｌを入れ、100℃で10分間置いた。反応液を常温に冷ました後、10×T4 RNA リガーゼ緩衝液10μｌ、0.1％ BSA 2μｌ、T4 RNA リガーゼ 1μｌ(15ユニット)とpCp-Cy3 3μｌ(Agilent, 米国)を添加した後、RNA分解酵素がない水(RNase-Free water)を入れて最終体積を25μｌにし、16℃で2時間反応させた。反応液をMicro-6スピンコラム(Bio-Rad、米国)を使用して精製した。精製した反応液をPNAArrayTMハイブリダイゼーション用緩衝液(パナジン、韓国) 75μｌと混合した後、これらのマイクロRNA配列に相補的な塩基配列のPNAプローブが固定化されているマイクロアレイで、40℃で2時間、ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応後にPNAArrayTM洗浄用緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗浄し、乾燥した。蛍光スキャナー(Genepix 4000B、米国)を用いてガラススライドに固定されたPNAプローブ位置から出る蛍光強度を測定した。PMA利得700、レーザ出力100％設定で読み取ったイメージを図１３に、蛍光強度を図１４に示した。
【００６１】
PNAチップ上にマイクロRNAをハイブリダイゼーションした後に、標識して蛍光強度を測定した実施例9は、PNAチップ上にハイブリダイゼーションする前に、マイクロRNAを標識して蛍光強度を測定した比較例2と比べ、蛍光シグナルが5〜36倍強く現れた。
【００６２】
比較例3：DNAチップ上で標識した蛍光強度の測定
DNAプローブが固定されたマイクロアレイに、標的核酸をハイブリダイゼーションすることなく10×T4 RNA リガーゼ緩衝液10μｌ、0.1％ BSA 2μｌ、T4 RNA リガーゼ 1μｌ(15ユニット)とpCp-Cy3 3μｌ(Agilent, 米国)を添加した後、RNA分解酵素がない水(RNase-Free water)を入れて最終体積を100μｌにした溶液を接触させ、37℃で2時間反応させた。反応後にPNAArrayTM洗滌緩衝液(パナジン、韓国)で、常温で5分間2回洗滌し、乾燥した。蛍光スキャナー(Genepix 4000B、米国)を用いてガラススライドに固定されたDNAプローブ位置から出る蛍光強さを測定した。PMA利得700、レーザ出力100％設定で読み取ったイメージを図1５に示した。標的核酸がなくてもDNAプローブが固定された全ての位置から蛍光シグナルが生じるため、DNAマイクロアレイには本発明の方法を適用することができない。
【図１】
2011507493.tif 000006
【図２】
2011507493.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011507493.tif 000012
【図８】
2011507493.tif 000013
【図９】
2011507493.tif 000014
【図１０】
2011507493.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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