(57)【要約】多発性硬化症（ＭＳ）は、最もよく見られる身体障害を引き起こす神経学的状態であり、若い成人に発症する。現在のところ、ＭＳに対する有効な処置法は存在しない。ゆえに、この疾患の発症や進行に関係する局所的免疫反応を特異的に標的とする処置法が強く必要とされている。本発明は、ミエリン塩基性タンパク質のペプチド、すなわち、ＭＢＰ３０−４４；ＭＢＰ８３−９９；ＭＢＰ１３１−１４５；およびＭＢＰ１４０−１５４を含む組成物に関する。この組成物は、疾患、特に、多発性硬化症および／または視神経炎の処置に用いられ得る。また、本発明はこのような使用および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
ＭＢＰ３０−４４；
ＭＢＰ８３−９９；
ＭＢＰ１３１−１４５；
およびＭＢＰ１４０−１５４
を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、本質的には、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
ＭＢＰ３０−４４；
ＭＢＰ８３−９９；
ＭＢＰ１３１−１４５；および
ＭＢＰ１４０−１５４
からなる、組成物。
【請求項３】
疾患を処置または予防するための請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
多発性硬化症を処置または予防するための請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
視神経炎を処置または予防するための請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
多発性硬化症の処置のための薬剤の製造における、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項７】
視神経炎の処置のための薬剤の製造における、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項８】
多発性硬化症を処置または予防することを必要とする被験体における多発性硬化症を処置または予防する方法であって、
請求項１または２に記載の組成物を該被験体に投与する工程
を含む、方法。
【請求項９】
視神経炎を処置または予防することを必要とする被験体における視神経炎を処置または予防する方法であって、
請求項１または２に記載の組成物を該被験体に投与する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記組成物は用量漸増プロトコルに従って投与される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、ＨＬＡ−ＤＱ６またはＨＬＡ−ＤＲ２が陽性である被験体に投与される、請求項８から１０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
同時投与、個別投与、または逐次投与のためのキットであって、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
ＭＢＰ３０−４４；
ＭＢＰ８３−９９；
ＭＢＰ１３１−１４５；および
ＭＢＰ１４０−１５４
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミエリン塩基性タンパク質のペプチドを含む組成物に関する。この組成物は、多発性硬化症の処置に用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
（緒言）
（多発性硬化症）
多発性硬化症（ＭＳ）は、最もよく見られる身体障害を引き起こす神経学的状態であり、若い成人に発症する。英国では、およそ８万５千人がＭＳにかかっている。
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）では、神経組織の炎症により、脳や脊髄内の神経繊維に対して保護的な絶縁体として働く脂肪質であるミエリンの欠損が引き起こされる。このミエリンの欠損すなわち脱髄は、神経細胞に沿って複数の領域に瘢痕組織または硬化をあとに残す。したがって、この硬化により、多種多様な徴候や症状が生じ、通常、再発と寛解とを繰り返す。
【０００４】
ＭＳの一般的な症状としては、視力の低下または失明、ふらつきおよび不均衡な歩行、不明瞭な言語ならびに頻尿および尿失禁が挙げられる。また、ＭＳは、情動の変化、鬱状態、筋攣縮および重度の麻痺を引き起こし得る。
【０００５】
現在、ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患であると一般的に認識されている。
【０００６】
ＭＳの現在の処置法では、一般に免疫系を抑制する。例えば、ある一つの処置法では、骨髄移植し、細胞分裂抑制剤または免疫抑制剤を投与する。この処置法は、一部の患者には有効であるが、高価で相対的にリスクが高い。さらに、細胞分裂抑制剤の投与は、ＭＳの処置では議論の的となっていると考えられる。なぜならば、その効果は不確かであり、潜在的な重い副作用が存在するからである。
【０００７】
インターフェロン−β（ＩＦＮβ）を用いた処置では、一部の患者のＭＳの症状は軽減され、したがって、広く用いられている。しかしながら、インターフェロン−βの働きのメカニズムは不明確であり、ＩＦＮβによる処置は、多くの患者にとっては有効ではない。さらに、ＩＦＮβを用いた処置は、ほとんどの患者では、抗ＩＦＮβ抗体の発生により悪化を招く（非特許文献１）。
【０００８】
現在のところ、ＭＳに対する有効な処置法は存在しない。その処置は、単にその症状の軽減に重点が置かれ、通常、免疫系の全般的な抑制により行われる。ゆえに、この疾患の発症や進行に関係する局所的免疫反応を特異的に標的とする処置法が強く必要とされている。
【０００９】
（合成ペプチド）
ＭｅｔｚｌｅｒおよびＷｒａｉｔｈ（非特許文献２）は、一般に用いられるＭＳのインビボモデルであるマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて自己免疫反応の抑制を誘導するために、合成ペプチドを使用することを述べた最初の研究者であった。この研究では、ＭＢＰ由来のペプチドが鼻孔内経路により投与され、疾患抑制のレベルは用いられたペプチドの抗原強度と相関関係にあることが見出された。
【００１０】
その後、１９９５年に、ＬｉｕおよびＷｒａｉｔｈ（非特許文献３）は、可溶性ＭＢＰ由来ペプチドの腹腔内投与によりマウスにてＥＡＥの抑制を誘導することも可能であることを証明した。この研究では、Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の両方の抑制が達成され、免疫応答開始後のペプチド投与により、進行中の免疫反応の抑制を引き起こし得ることが証明された。
【００１１】
しかしながら、Ｔ細胞エピトープとして作用し得る全てのペプチドが、寛容を誘導できるわけではないことが見出された。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のペプチド８９−１０１は、免疫後の免疫優性抗原であり、また、Ｔ細胞反応性のための初回免疫およびＥＡＥの誘発の両方の観点では非常に有効な免疫原である。しかしながら、このペプチドは、溶液で投与された場合、寛容の誘発には有効でないことが証明されている（非特許文献４）。
【００１２】
本発明者らは、これまで、ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、そして追加的な抗原プロセッシングを伴わずにＴ細胞に対する提示される能力と、ペプチドがインビボで寛容を誘導する能力との間に関連があることを証明している。抗原プロセッシング非依存性である（すなわち、ＭＨＣに結合するために追加的な抗原プロセッシングを必要としない）ペプチドが、インビボで免疫寛容を生じると予測され得る。これらのペプチドは、抗原プロセッシング非依存性エピトープ（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｔ  ｅｐｉＴＯＰＥ（Ｓ））にちなみ、「アピトープ（ａｐｉｔｏｐｅ（ｓ））」と呼称される。
【００１３】
特許文献１では、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）由来の以下のアピトープ、すなわち、３０−４４、８０−９４、８３−９９、８１−９５、８２−９６、８３−９７、８４−９８、１１０−１２４、１３０−１４４、１３１−１４５、１３２−１４６および１３３−１４７が記載されている。
【００１４】
特許文献２では、以下のＭＢＰペプチド、すなわち、１３４−１４８；１３５−１４９；１３６−１５０；１３７−１５１；１３８−１５２；および１４０−１５４が、アピトープとして同定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第０２／１６４１０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０６４４６４号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ，Ｇ．，Ｍｕｎｓｃｈａｕｅｒ，Ｆ．Ｅ．，３ｒｄ  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｆ．（２００２）Ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７３，４６５−４６９
【非特許文献２】Ｍｅｔｚｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１１５９−１１６５  （１９９３）
【非特許文献３】Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１２５５−１２６３  （１９９５）
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｒａｉｔｈ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２５１−１２６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、この度、すべてがアピトープである４つのＭＢＰペプチドの「カクテル」がＭＳの処置に特に有効であることを見出した。これら４つのペプチドは、組み合わされた場合に、相乗的効果を発揮することができると考えられる。
【００１８】
第１の局面では、したがって、本発明は、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、すなわち、
ＭＢＰ３０−４４；
ＭＢＰ８３−９９；
ＭＢＰ１３１−１４５および
ＭＢＰ１４０−１５４
を含む、組成物に関する。
【００１９】
上記組成物は、本質的には、ＭＢＰ３０−４４、８３−９９、１３１−１４５および１４０−１５４からなってもよい。
【００２０】
上記組成物は、疾患、特に、多発性硬化症の処置または予防に用いられてもよい。
【００２１】
上記組成物は、視神経炎、特に、多発性硬化症に関連づけられる視神経炎の処置または予防に用いられてもよい。
【００２２】
第２の局面では、本発明は、本発明の上記第１の局面に従う組成物を被験体に投与することにより多発性硬化症および／または視神経炎を処置または予防する方法に関する。
【００２３】
本発明の上記第２の局面の方法では、上記組成物は、用量漸増（ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）プロトコルに従って投与されてもよい。
【００２４】
上記カクテル中のペプチドのうちの２つ（ＭＢＰ３０−４４および１３１−１４５）は、ＨＬＡ−ＤＱ６結合性を有し、２つ（ＭＢＰ１４０−１５４および８３−９９）は、ＨＬＡ−ＤＲ２結合性を有することが見出された。これらのアピトープを組み合わせて使用することにより、単一のペプチドを用いた治療法に比べ、ＭＳ患者に見られる種々の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプがより広範囲に（ｗｉｄｅｓｐｅａｄ）カバーされる。
【００２５】
本発明の上記第２の局面の方法は、ＨＬＡ−ＤＱ６またはＨＬＡ−ＤＲ２陽性被験体に対する上記組成物の投与を含んでもよい。
【００２６】
第３の局面では、本発明は、同時投与、個別投与または逐次投与のためのキットであって、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、すなわち、
ＭＢＰ３０−４４；
ＭＢＰ８３−９９；
ＭＢＰ１３１−１４５および
ＭＢＰ１４０−１５４
を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
（図の紹介）
【図１】Ｔ細胞クローンＭＳ４９：Ｄ３に対する、ＨＬＡ−ＤＱ６によるＭＢＰ３０−４４の提示。
【図２】Ｔ細胞クローンＭＳ１７：Ａ２に対する、ＨＬＡ−ＤＱ６によるＭＢＰ１３０−１４４の提示。
【図３】Ｔ細胞クローンＮ５：１９に対する、ＨＬＡ−ＤＲ２ａまたはＨＬＡ−ＤＲ２ｂでトランスフェクトされたＬ細胞によるＭＢＰ１３９−１５３の提示。
【図４】アピトープＭＳ６による寛容化後のリンパ節細胞の増殖応答。
【図５】アピトープＭＳ７に応答した脾細胞の増殖。ＰＢＳもしくはアピトープＭＳ７（８３−９９）の鼻腔内投与による処置を受けたマウスから得られる脾細胞。
【図６】アピトープＭＳ７に応答した脾細胞の増殖。ＰＢＳもしくはアピトープＭＳ７（８３−９９）の皮下／皮内投与による処置を受けたマウスから得られる脾細胞。
【図７】ＰＢＳもしくはアピトープＭＳ７（８３−９９）のどちらかの皮下／皮内投与による処置を受けたマウスから得られる脾細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ−２の生成量。
【図８】スネレン視力表の例。
【図９】ヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する患者ＰＢＭＣ応答。
【図１０】ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７に対する患者ＰＢＭＣ応答。
【図１１】ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７による処置前（来診（ｖｉｓｉｔ）１）と処置後（来診８）のＭＢＰに対するＴ細胞増殖応答の比較。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（詳細な説明）
本発明の第１の局面は、ミエリン塩基性タンパク質由来の複数のペプチドを含む組成物に関する。
【００２９】
（ミエリン塩基性タンパク質）
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、ヒトの脳白質より単離可能な１８．５ｋＤａのタンパク質である。この成熟タンパク質は、１７０個のアミノ酸を有し、その配列は文献にて広く入手可能である（例えば、以下を参照：Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  （１９８６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４６：４７−５３，Ｆｉｇｕｒｅ  １；Ｋａｍｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ  （１９８６），ＰＮＡＳ  ８３：４９６２−４９６６，Ｆｉｇｕｒｅ  ２；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８１７，６２９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ  （１９８７），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１７：３２１−３２８，Ｆｉｇｕｒｅ  ４；Ｍｅｄｅｖｅｃｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００６），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８０：５４５−５５２，Ｆｉｇｕｒｅ  ３Ｂ）。
【００３０】
（ＭＢＰペプチド）
用語「ペプチド」は、代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに結合した、一連の残基（代表的には、Ｌ−アミノ酸）を表す通常の意味で使用される。この用語は、変性ペプチドおよび合成ペプチド類似物を含む。
【００３１】
本発明の組成物およびキットに用いられるペプチドは、化学的な手法を用いて生成されてもよい（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．Ｍｉｋｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．）。例えば、ペプチドは、固相法により合成され（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）、樹脂より切断され、分取高速液体クロマトグラフィによって精製され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）。例えば、ＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造業者により提供される取扱説明書に従って、自動合成がおこなわれてもよい。
【００３２】
また、ペプチドは、組み換え手段によって、あるいは、より長いポリペプチドから切断することによって、生成されてもよい。例えば、ペプチドは、ＭＢＰ全体から切断することによって得られてもよい。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解法）によって、確認されてもよい。
【００３３】
本発明の組成物およびキットに用いられるペプチドは、以下のものである。
【００３４】
【化１】
2011500776.tif 000002
用語「ＭＢＰ３０−４４」、「ＭＢＰ８３−９９」、「ＭＢＰ１３１−１４５」および「ＭＢＰ１４０−１５４」は、改変ペプチドを含む。例えば、未改変ペプチドのＭＨＣ結合特異性が、Ｔ細胞に提示される能力とともに維持される限り、ペプチドを、アミノ酸の挿入、除去または置換によって変異させてもよい。ペプチドは、例えば、未改変配列から５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの変異を有していてもよい。
【００３５】
または（加えて）、ペプチドのアミノ酸配列を変更せずに改変が行われてもよい。例えば、Ｄ−アミノ酸または他の非天然アミノ酸を含ませることができ、通常のアミド結合をエステルまたはアルキル主鎖結合に置き換えることができ、ＮまたはＣ−アルキル置換基、側鎖修飾、および、ジスルフィド架橋や側鎖アミドまたはエステル結合などの拘束を含ませることができる。このような変更により、ペプチドのインビボでの安定性が増し、生物学的耐用期間が長くなるかもしれない。
【００３６】
エピトープの改変は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ（またＰａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３を参照）にて提供され得るＫ．Ｐａｒｋｅｒ（ＮＩＨ）により考案されたプログラム「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ」を用いて導かれる、より効率的なＴ細胞の誘導についての予想に基づいて、行われてもよい。
【００３７】
ＭＢＰペプチドは、中性または塩の形態で、組成物に配合されてもよい。薬学的に受容可能である塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）酸付加塩が挙げられ、そしてそれらは、例えば、塩酸またはリン酸等の無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から得られてもよい。
【００３８】
（組成物）
本発明の組成物は、予防または治療の用途のものでもよい。
【００３９】
この組成物は、注射可能な溶液または懸濁液として調製されてもよく、また、注射する前の液体への溶解または懸濁に適した固体として調製されてもよい。また、この調製物が乳化されてもよく、または、ペプチドがリポソーム内に封じ込められていてもよい。有効成分は、薬学的に受容可能でありかつ有効成分と相溶性を有する賦形剤とともに混合されもよい。適する賦形剤には、例えば、水、食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせがある。
【００４０】
さらに、必要に応じて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含んでもよい。緩衝塩としては、リン酸塩、クエン酸塩、および酢酸塩が挙げられる。塩酸および／または水酸化ナトリウムが、ｐＨ調整に用いられてもよい。安定化のために、スクロース、トレハロース等の二糖類が用いられてもよい。
【００４１】
組成物では、ペプチドの相対比（ＭＢＰ３０−４４：ＭＢＰ８３−９９：ＭＢＰ１３１−１４５：ＭＢＰ１４０−１５４）は、およそ１：１：１：１であってもよい。または、例えば、寛容原性応答（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を自己反応性Ｔ細胞の特定のサブセットに着目させるために、または、１つのペプチドが特定のＨＬＡ型において他のものより良好に働くことが分かっている場合、各ペプチドの相対比が変更されてもよい。
【００４２】
配合後、組成物は無菌容器に入れられ、その容器は密閉され、低温、例えば、４℃にて保存されるか、または、フリーズドライ処理されてもよい。
【００４３】
好都合に、組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）粉末として調製される。凍結乾燥は、安定化状態での長期保存を可能にする。凍結乾燥する工程は、当業者には公知である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／９７／０１／００６．ｈｔｍｌを参照のこと。フリーズドライ処理に先立って、マンニトール、デキストラン、グリシン等の充填剤が、通常用いられる。
【００４４】
組成物は、経口、静脈内（水溶性であれば）、筋肉内、皮下、舌下、鼻腔内、皮内または座剤の経路、またはインプラント（例えば、徐放性分子を用いて）等の都合の良い方法で投与されもよい。
【００４５】
組成物（ｃｏｎｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、鼻腔内、皮下または皮内の経路を介して、有利に投与されてもよい。
【００４６】
本発明の方法および薬学的組成物は、ヒト被験体の処置に用いてもよい。代表的には、医師が、個々の被験体に最も適する実際の投与量を決め、それは特定の患者の年齢、体重、および応答により変わる。
【００４７】
好ましい実施の形態では、「用量漸増」プロトコルに従ってもよく、そのプロトコルでは、複数の用量が濃度を増加させつつ患者に投与されるというものである。このようなアプローチは、例えば、蜂毒アレルギーに対する免疫治療法の用途におけるホスホリパーゼＡ２ペプチドに対して用いられている（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：７４７−７５４  ａｎｄ  Ａｋｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：９８−１０６）。
【００４８】
（キット）
好都合に、４つのＭＢＰペプチドは、混合組成物またはカクテルの形態で、一緒に投与されてもよい。しかしながら、同時投与、別個投与、逐次投与または併用投与のために、キットの形態でペプチドを別個に提供することが好ましい場合もある。
【００４９】
例えば、キットは、４つのペプチドを、別個の容器に、または、それぞれが２つのペプチドを含むように２つの容器に、含んでもよい。容器の内容物は、投与前に、混合してもよいし、しなくてもよい。
【００５０】
キットは、混合および／または投与手段（例えば、鼻腔内投与のための噴霧器；皮下／皮内投与用の注射器や針）を備えてもよい。キットは、使用説明書を備えてもよい。
【００５１】
本発明の薬学的組成物またはキットは、疾患の処置および／または予防に用いられてもよい。
【００５２】
特に、組成物／キットは、多発性硬化症および／または視神経炎の処置および／または予防に用いられてもよい。
【００５３】
（多発性硬化症）
多発性硬化症（ＭＳ）は、若い成人（２０〜４０歳）に最もよく見られる神経性疾患であり、ヨーロッパではおよそ３８万５千人、アメリカではおよそ３０万人がかかっている。それは、中枢神経系の慢性変性疾患であり、この疾患では、脳および／または脊髄の所々でミエリンが徐々に破壊され、それによって神経連結性が妨げられ、筋力低下、協調の欠如、および言語もしくは視覚障害を引き起こす。
【００５４】
１０年の後、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）であると初期に診断された個体のおよそ半数は、再発の頻度は減少するが障害が高まると感じている。これは、二次性進行型ＭＳ（ＳＯＭＳ）として知られている。一部の予測では、２５年以内に、ＲＲＭＳにかかっている人のうちのおよそ９０％が、二次性進行型へと進行するだろうとされている。ＲＲＭＳの場合と同様に、二次性進行型ＭＳは多様性に富む。一部の患者では、障害の増大または進行は非常にゆるやかであり、他の患者では、それがより速く起こり得る。一般に、しかしながら、発病からの回復の完全性は次第に低下し、症状は強まる傾向となり障害も大きくなる。臨床的発病はよりはっきりしなくなり寛解が現れる傾向となるが、より多くのＣＮＳ組織がそれまでに破壊されており、累積的な損傷がＭＲＩでより明白となる。
【００５５】
本発明の組成物は、ＭＳを最近発症した患者、ＲＲＭＳの患者またはＳＰＭＳの患者の処置に用いられてもよい。
【００５６】
本発明の組成物は、視力の低下または失明、ふらつきおよび不均衡な歩行、不明瞭な言語、頻尿および尿失禁、情動の変化ならびに鬱状態を含むＭＳの症状のうちの１つ以上を軽減または改善できる。ＳＰＭＳは、筋攣縮や重度の麻痺を伴い得る。
【００５７】
特に、この組成物は、視神経炎を改善できる。
【００５８】
（視神経炎）
視神経炎（ＯＮ）は、眼の網膜に仕える視神経の、脱髄を伴う炎症である。それは、可変性の疾患であり、以下の症状のいずれかを呈し得る：視野のかすみ；視力の低下；一部またはすべての色覚の異常；全盲または半盲目；および眼の奥の痛み。
【００５９】
視神経炎は、多発性硬化症の最も頻繁に見られる症状の１つであり、ＭＳの発症時に最もよくある症状である。ＯＮは、しかしながら、虚血性視神経症等の、ＭＳ以外の要因に起因し得る。
【００６０】
ＯＮは、７０％の症例で、一側性で（片方の眼のみにおいて）現れる。
【００６１】
もっとも代表的には、視神経炎は、まず、１５〜５０歳の人がかかる。この年齢の群では、研究により、患者のうちの５０％以上が１５年以内に多発性硬化症へと変わることが示された。ＭＳの場合と同様に、女性は男性のおよそ２倍の確率でＯＮを呈しやすく、白人種の有病率は他の人種群よりも高い。
【００６２】
視神経炎の主な症状には以下のものがある。
・視力の低下（視野のかすみ）
・眼の痛み
・色弱（色覚低下）
・運動・音眼内閃光（左右の眼の動きや音により引き起こされる視覚的な閃光感覚）
・ウートホフ症状、熱または極度の疲労により症状は悪化する。
【００６３】
本発明に従う組成物を用いたＯＮの処置により、これらの症状のいずれかを予防、軽減、または改善できる。ＯＮの進行を観察するために、視力が、スネレン視力表を用いて、都合よく測定されてもよい。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例は、本発明を例示する目的を持つものであるが、本発明を限定する事項として解釈されるべきものではない。本発明は、特に、それらの実施例に記載の具体的な実施形態に関連するものである。
【００６５】
実施例のために、以下の名称がＭＢＰペプチドに対して用いられる。
【００６６】
【化２】
2011500776.tif 000003
この４つのペプチドの組成物を、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７と呼ぶ。
【００６７】
（実施例１  ＨＬＡ−ＤＱ６拘束性ミエリン塩基性タンパク質Ｔ細胞エピトープの同定）
ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、多発性硬化症に感受性を付与する（Ｎｅｐｏｍ  ａｎｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４９３−５２５）。北欧および中欧、オーストラリアならびに北米の白人種では、その関連性は、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−ＤＲ２に結びつけられる（ＤＲ２ａ  ［ＤＲＢ５＊０１０１］およびＤＲ２ｂ  ［ＤＲＢ１＊１５０１］、Ｈａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）Ｈｕｍａｎ  ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．７：１２２９−１２３４）。ＭＨＣの対立遺伝子ＤＲ２およびＤＱ６は、異なる遺伝子座で見られるが、この２つの対立遺伝子間には有意な連鎖不平衡が存在する。この２つの対立遺伝子間の一致は９９％であり、これら対立遺伝子をランダムに再対合させた場合に予想されるよりはるかに大きい。したがって、ＭＳに関連づけられる特定のＴ細胞エピトープが、ＨＬＡ−ＤＲ２拘束性ではなくＨＬＡ−ＤＱ６拘束性であり得る可能性が生じる。
【００６８】
本研究の目的は、ヒトＭＢＰ  Ｔ細胞エピトープが、ＨＬＡ−ＤＲ２陽性ＭＳ患者から単離されたＴ細胞クローンに対してＨＬＡ−ＤＱ６分子によって提示されるか否かを確認することであった。Ｔ細胞活性を、［３Ｈ］−チミジン取り込み法を用いてＴ細胞増殖によって、測定した。
【００６９】
（ペプチド抗原）
ＭＢＰペプチドの３０−４４、１３０−１４４および１３９−１５３を、Ｌ−アミノ酸および標準的なＦ−ｍｏｃ化学反応法を用いて、アビメド社（Ａｂｉｍｅｄ）製ＡＭＳ４２２マルチプルペプチドシンセサイザで合成した。
【００７０】
（抗原提示細胞）
ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＲ２ａまたはＨＬＡ−ＤＲ２ｂのいずれかでトランスフェクトされたＬ−細胞、またはＨＬＡ−ＤＱ、ＤＰおよびＤＲを発現するＭｇａｒ細胞（ＥＡＣＣ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，ＵＫ）を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。
【００７１】
（Ｔ細胞クローン）
Ｔ細胞クローンＭＳ４９：Ｄ３およびＭＳ１７：Ａ２をＭＳ患者から生成し、クローンＮ５：１９を健常個体から生成した。３つすべてのクローンをＤＲ２陽性個体から単離した。
【００７２】
（抗原提示アッセイ）
抗原提示細胞を、様々な濃度のペプチドおよび適切なＴ細胞とともにインキュベートした。Ｔ細胞の増殖つまり活性を、［３Ｈ］−チミジン取り込み法を用いて測定し、刺激指数（ＳＩ＝（ペプチドを含む培養物の１分間の修正されたカウント数（ｃｃｐｍ））／（ペプチドを含まない培養物のｃｃｐｍ））として表した。
【００７３】
（結果）
ＨＬＡ−ＤＱ６でトランスフェクトされたＬ細胞によりペプチドＭＢＰ３０−４４が提示された場合に、Ｔ細胞クローンＭＳ４９：Ｄ３は、最も高いペプチド濃度で、非常に強い増殖応答（コントロール用のＭｇａｒ細胞の１．５倍大きい）を示した（図１）。ＨＬＡ−ＤＱ６でトランスフェクトされたＬ細胞によりＭＢＰ１３０−１４４が提示された場合、より強い応答が、ＭＳ１７：Ａ２Ｔ細胞に誘発された（コントロール用のＭｇａｒ細胞と比べて、増殖が３．２４倍に増大した−図２）。
【００７４】
ＤＲ２個体から単離された第３のＴ細胞クローンＮ５：１９は、主要なエピトープＭＢＰ１４０−１５４に対して、そして、この領域の範囲に及ぶ（１３８−１５６）部分的に一致する一連の１５残基のペプチドに対しても、応答した。ペプチド１３９−１５３は、ＨＬＡ−ＤＲ２ｂでトランスフェクトされたＬ細胞により提示された場合ではなく、ＨＬＡ−ＤＲ２ａでトランスフェクトされたＬ細胞により提示された場合に、Ｔ細胞クローンＮ５：１９の増殖を刺激した（図３）。
【００７５】
（結論）
ＨＬＡ−ＤＲ２陽性個体から単離されたＴ細胞クローンは、ＨＬＡ−ＤＱ６拘束性ＭＢＰ  Ｔ細胞エピトープに応答する。これは、ＨＬＡ−ＤＲ２の多発性硬化症との関連がＭＢＰ  Ｔ細胞エピトープのＤＲ２拘束性のものに限定されておらず、ＤＱ６拘束性とされていてもよいことを示す。
【００７６】
本発明のＭＢＰ組成物では、上記ペプチドのうち２つ（ＭＢＰ３０−４４およびＭＢＰ１３１−１４５）は、ＨＬＡ−ＤＱ６結合性を有し、２つ（ＭＢＰ１４０−１５４およびＭＢＰ８３−９９）は、ＨＬＡ−ＤＲ２結合性を有する。したがって、これらのアピトープを用いたペプチド治療法は、ＨＬＡ−ＤＲ２個体またはＨＬＡ−ＤＱ６個体のいずれかを対象とするものであり得る。
【００７７】
（実施例２−ＨＬＡ：ＤＲ２トランスジェニックマウスにおける、アピトープＭＳ６での寛容誘発）
本研究は、アピトープ（アピトープＭＳ６）が、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示された場合に、多発性硬化症のヒト化マウスモデルで免疫寛容を誘発し得ることを証明するために設計された。アピトープＭＳ６は、ＭＢＰ１４０−１５４に対応するＭＢＰのＴ細胞エピトープから選択されるアピトープであり、ＭＨＣクラスＩＩにより抗原提示細胞に提示され、プロセシングされずにＴ細胞を刺激し得る（国際公開第０３／０６４４６４号参照）。用いられたマウスモデルは、ヒトＭＨＣ分子ＨＬＡ：ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）を遺伝子導入したものである（Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：３４３−３４７）。
【００７８】
アピトープ投与後のマウスでのアネルギーの誘発またはＣＤ４＋Ｔ細胞数の変化を、インビボにて抗原を用いて攻撃した場合のＴ細胞増殖の低下によって観察してもよい。
【００７９】
（ペプチド合成）
アピトープＭＳ６（ＭＢＰペプチド１４０−１５４）を、Ｌ−アミノ酸および標準的なＦ−ｍｏｃ化学反応法を用いて、アビメド社（Ａｂｉｍｅｄ）製ＡＭＳ４２２マルチプルペプチドシンセサイザで合成した。
【００８０】
（マウスおよび寛容誘発）
８〜１２週齢のＨＬＡ：ＤＲ２トランスジェニックマウスを、この研究に用いた。これらのマウスを、０日目での免疫前の−８日目、−６日目および−４日目に、２５μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのアピトープＭＳ６、または２５μｌのＰＢＳ単独の鼻腔内投与による事前処置によって、寛容化させた。
【００８１】
寛容化後、同容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とＰＢＳとを含む１００μｌの乳濁液であって、２００μｇのアピトープＭＳ６および４００μｇの加熱死滅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むもので、マウスを皮下免疫した。鼻腔内にてＰＢＳを用いてあらかじめ寛容化されたマウスのコントロール群を、ペプチドを用いずに免疫した。
【００８２】
皮下免疫から１０日目に、流入領域（ｄｒａｉｎｉｎｇ）膝窩リンパ節および鼠径リンパ節を取り出し、Ｔ細胞活性を、様々な濃度のアピトープＭＳ６に応答するＴ細胞の増殖を評価分析することにより評価した。増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込み法を用いて測定し、刺激指数（ＳＩ＝ペプチドを含む培養物の１分間の修正されたカウント（ｃｃｐｍ）／ペプチドを含まない培養物のｃｃｐｍ）として表した。
【００８３】
（結果）
ＰＢＳを用いて寛容化させた後にアピトープＭＳ６を用いて免疫させたＡ群のマウスは、用量に依存する様式でアピトープＭＳ６を用いて再び攻撃した場合、抗原刺激に応答した（図４）。ペプチド濃度の上昇とともに、ＳＩは中央値である２．５から１０へ上昇した。この群のすべてのマウスは、鼻腔内投与したＰＢＳがアピトープＭＳ６に対する寛容を誘発することができなかったことを示した。
【００８４】
対照的に、アピトープＭＳ６を用いた鼻腔内前処置は、このペプチドで刺激されたリンパ球の増殖応答に大きな影響を与えた。Ｂ群のマウス由来のリンパ球は、有意な程度で応答できず、１５０μｇ／ｍｌという高いペプチド濃度であっても応答できなかった（ＳＩ中央値３，図４）。これらのデータは、アピトープＭＳ６がＨＬＡ−ＤＲ２マウス由来のリンパ球において寛容を誘発したことを示唆している。
【００８５】
ＰＢＳを用いて事前処置および免疫されたマウス（Ｃ群）から抽出されたリンパ球は、アピトープＭＳ６に対していかなる応答も示さなかった（図４）。Ｃ群におけるペプチドに対する応答の欠如は、Ａ群で見られる増殖応答がまさにアピトープＭＳ６による免疫に対する応答であったことを実証している。
【００８６】
（結論）
これらのデータは、プロセッシングを必要とせずＨＬＡ：ＤＲ２  ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＭＢＰペプチド（アピトープＭＳ６）が、鼻腔内投与された場合、寛容を誘発し得るという仮説を裏付けている。
【００８７】
（実施例３−ＨＬＡ：ＤＲ２およびＴ細胞受容体（ＭＢＰ）８２−１００のダブルトランスジェニックマウスでのアピトープＭＳ７（ＭＢＰ８３−９９）による寛容の誘発）
本研究では、ＨＬＡ：ＤＲ２結合ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）８２−１００ペプチドのためのＴ細胞受容体とともにＨＬＡ：ＤＲ２を発現しているダブルトランスジェニックマウスでの寛容を誘発するアピトープＭＳ７（ＭＢＰペプチド８３−９９）の能力を調べる。
【００８８】
これらのダブルトランスジェニック動物由来の脾細胞は、アピトープＭＳ７に応答してインビトロで増殖する。アピトープに対するこのインビトロでの脾細胞の応答が、インビボでそれが繰り返し投与された後で低下することまたは抑止することは、寛容の状態が達成されていることを示している。
【００８９】
寛容誘発を、アピトープ投与の鼻腔内経路および皮下／皮内経路の両方を使用して試みた。
【００９０】
（寛容誘発）
６または７匹の年齢（８〜１２週齢）および性別が一致するダブルトランスジェニックマウスの群を用いた。第１の実験では、１つの群を、３週間にわたって同じ間隔で、２５μｌのＰＢＳ中の１００μｇのアピトープＭＳ７を用いて鼻腔内に１０回処置をした。コントロール群には、ＰＢＳを単独で与えた。第２の実験では、同量のペプチドを、１００μｌのＰＢＳで皮下／皮内投与により与えた。コントロール群には、同量のＰＢＳを与えた。
【００９１】
（増殖アッセイ）
ペプチドまたはＰＢＳの最後の投与から３日目に、脾臓を摘出し、細胞懸濁液を調製した。脾細胞を、０．５μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのアピトープＭＳ７とともにインキュベートし、４８時間、７２時間、および９６時間の培養後に［３Ｈ］−チミジン取り込み法によって増殖を評価した。結果を刺激指数（ＳＩ＝（抗原を含む培養物の１分間のカウント（ｃｐｍ））／（抗原を含まない培養物の１分間のカウント））として表した。
【００９２】
（サイトカイン測定）
第２の実験では、皮下／皮内経路を介して寛容誘発が引き起こされており、脾細胞からの細胞培養液の上澄みを４８時間および７２時間の培養時に回収し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ＩＦＮ−γとインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在について検定した。
【００９３】
（結果）
調査が行われた３つのすべての時点で、鼻腔内経路および皮下／皮内経路の両方を介してＰＢＳで処置されたマウス由来の脾細胞は、アピトープＭＳ７に対して強い増殖を示し、その応答の大きさもペプチド濃度とともに上昇した。増殖の急激な低下が、両経路の投与によりアピトープＭＳ７で処置されたマウスからの脾細胞培養物で観察された。図５に示すように、７２時間後、５μｇ／ｍｌのアピトープＭＳ７を含む培養物で観察された平均ＳＩは、アピトープＭＳ７で鼻腔内処置したマウスでは１７であった。ＰＢＳ処置したコントロールマウスからの対応する培養物では、平均ＳＩとして８９が観察された。同様に、図６に示すように、皮下／皮内経路によるアピトープＭＳ７の投与により、平均ＳＩが、ＰＢＳ処置した動物の１２４からアピトープＭＳ７処置した動物の４９へと低下した。
【００９４】
４８時間培養液からの培養上澄み中で検出されたＩＮＦγとＩＬ−２の濃度を、図７に示した。インビボでのペプチドによる処置を繰り返すことにより、増殖応答の低下と並行して、両方のサイトカインの分泌が減少したことが分かる。
【００９５】
（結論）
これらの結果は、アピトープＭＳ７に対する寛容をヒトの系に模倣して設計されたマウスモデルにおいてうまく誘発することができ、この寛容が多発性硬化症治療での使用のその可能性を裏付けていることを示している。さらに、ヒトに対して好まれて利用される経路である皮下／皮内経路により投与された場合でも、その効力は維持される。
【００９６】
アピトープＭＳ６およびＭＳ７のインビボでの効力を示したが、現在のところアピトープＭＳ１およびＭＳ４の効力を示すことは不可能である。これは、ＨＬＡ−ＤＱ６分子を発現するトランスジェニックマウスが存在しないからである。この分子を発現するマウスの作成が行われているが、それらは胸腺にてＣＤ４  Ｔ細胞を生成できておらず、よって、ＨＬＡ−ＤＱ６の状況下で抗原に対する免疫応答を開始しないということが分かっている。
【００９７】
（実施例４−４つのＭＢＰペプチドの組成物の用量漸増の研究）
４つのペプチドの組合わせ（ＭＢＰの３０−４４、１３１−１４５、１４０−１５４および８３−９９）を、二次性進行型多発性硬化症の患者でのＡＴＸ−ＭＳ−１４６７の非盲検の用量漸増研究に用いた。
【００９８】
最終研究投与から４週間後と３ヶ月後に、患者を、視力（すなわち、視神経炎の軽減）、免疫学的パラメータおよびＣＮＳの炎症について観察した。
【００９９】
（実施例４Ａ−視力のモニタリング）
視神経炎（ＯＮ）は、眼の網膜に仕える視神経の、脱髄を伴う炎症である。ＯＮは、多発性硬化症の最も頻繁に見られる症状の１つであり、ＭＳの発症時に最もよくある症状である。
【０１００】
ＯＮの典型的な症状としては、視野のかすみ、視力の喪失、一部またはすべての色覚の異常、全盲または半盲目および眼の奥の痛みが挙げられる。
【０１０１】
ＭＳに伴う神経炎症プロセスにより生じる視神経炎に対するＡＴＸ−ＭＳ−１４６７処置の効果を調べた。ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７を、上記で概要が示された用量漸増プロトコルに従って投与し、それから、処置から１ヶ月後、患者の視力を標準スネレン視力表（図８）を用いて検査した。
【０１０２】
結果は、処置後１ヶ月の視力が臨床的に有意に改善したことを示している。これは、スクリーニングでの初期の視力検査と１ヶ月後の再検査との比較分析で明らかにされた。６／２４と６／９という初期スクリーニング時の視力測定値（それぞれ右眼と左眼）が、処置後、６／９（右眼）と６／６（左眼）へと改善した。患者の視力は、過去２年間は変化していなかった。
【０１０３】
（実施例４Ｂ−免疫学的パラメータのモニタリング）
上記で説明したように、ミエリン塩基性タンパク質（ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７）由来の４つのアピトープＴＭペプチドを含むカクテルを用いたペプチド治療法の効果を、ＭＳ患者に対して調査した。試験への移行時に、最初の投与前に最大１４日間かけて、各患者をスクリーニングした（来診１）。２５μｇのＡＴＸ−ＭＳ−１４６７の最初の投与を来診２で行い、来診３で５０μｇ、来診４で１００μｇ、来診５で４００μｇ、来診６および７の両方で８００μｇをそれぞれ投与した。さらなる検査を、１ヶ月後と３ヶ月後の経過観察（来診８および来診９）にて行った。以下の表にて、プロトコルの概要を示し、ペプチド投与および血液採取とともに各患者によりなされた臨床ための来診の回数を示す。
【０１０４】
【表１】
2011500776.tif 000004
血液検体を、来診１および来診３から来診９までにおいて回収し、ポジティブコントロールであるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、精製ヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびＡＴＸ−ＭＳ−１４６７を含む様々な抗原に対する免疫応答について試験した。測定される免疫応答としては、インビトロＴ細胞増殖、組織培養液の上澄みへのサイトカインの分泌およびサイトカインＲＮＡの生成が挙げられる。
【０１０５】
（結果）
ＭＢＰに対する有意な応答が見られ、来診３で増殖のピークがあった（図９）。これは、インターフェロンγの分泌のピークと相関関係にあった。しかしながら、重要なことに、インターフェロンγの分泌レベルは３回目の来診後低下し、来診８までにバックグラウンドレベルとなった。ＩＬ−１０濃度は来診７までは大きな変化はなかったが、そこからこのサイトカインの分泌は有意に増加した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＴＮＦαの濃度は、すべての時点でＭＢＰに応じてバックグランドに近かった。
【０１０６】
ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７には、増殖応答や増加サイトカイン応答が観察されなかった（図１０）。
【０１０７】
（結論）
ＭＢＰに対する応答が、来診３で観察され、そこでＩＬ−２とインターフェロンγの分泌が高まったことが示され、これはこの時点での増殖のピークと相関関係にあった。この応答の増大はペプチド投与に起因すると考えられる。
【０１０８】
しかしながら、重要なことに、サイトカイン分泌が一時的に増加した後、インターフェロンγがベースラインレベルに戻った。また、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７の最も高い用量の２回目の投与後に、ＩＬ−１０分泌が有意に増加した。動物モデルでは、合成ペプチドを用いた特異的免疫治療法は有効であり、それによってＩＬ−１０分泌調節性Ｔ細胞が誘導される。マウスでのＩＬ−１０分泌調節性Ｔ細胞の誘導は、低レベルのインターフェロンγ分泌を伴うペプチドに対する一過性の応答を含む（Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：１６２５−１６３４；Ｓｕｎｄｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：１２４０−１２４８）。これに続いて、インターフェロンγが減少し、それと同時にＩＬ−１０が増加する。ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７処置後に示されたサイトカイン分泌の動態により、実験マウスであらかじめ観察されたパターンが効果的に再現されており、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７がＩＬ−１０分泌調節性Ｔ細胞を誘導するかもしれないことを示唆している。
【０１０９】
（実施例４Ｃ−ＭＢＰに対する応答は、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７処置により大きく下方制御される）
二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の患者６名を、実施例４Ｂで示された用量漸増プロトコルに従うフェーズＩ／ＩＩａの臨床試験に参加させ、完了させた。
【０１１０】
ＨＬＡの遺伝子型同定により、試験に参加した６名の患者が、ＭＳに関連付けられるＨＬＡ−ＤＲ１５ハプロタイプを含む広範なＨＬＡハプロタイプを表すことが示された。試験に参加した６名の患者によって表される広いＨＬＡ−ＤＲＢ１分布は、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７は安全でありＨＬＡ−ＤＲの遺伝子型に関係なくＭＳ患者において良好な耐容性を示すことを意味する。
【０１１１】
ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７を用いた患者の処置では、抗ペプチド抗体が生成されなかった。これは、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７の使用が安全であり、この試験に伴う注射部位での合併症またはアレルギー症状がなかったことと相関関係にあることを示している。
【０１１２】
Ｔ細胞応答の十分な分析により、以下のことが示された。
ａ）ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７による処置は、非特異性の免疫抑制効果を有しなかった。これは、精製タンパク質誘導体である、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原に対する免疫応答が維持されたという事実（データを示さず）によりはっきりと示されている。
ｂ）プロトコルを用いたＡＴＸ−ＭＳ−１４６７による処置は、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７もしくはミエリン塩基性タンパク質のいずれに対しても攻撃的な免疫応答を引き起こさなかった（データを示さず）。
ｃ）ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７による処置の前（来診１）と後（来診８）のＴ細胞増殖応答の比較により、ミエリン塩基性タンパク質に対する応答が有意に低下したことが示された（図１１）。Ｖ１でＭＢＰに対して応答した３名の個体はすべて、Ｖ８までにこのタンパク質に対する応答が低下したことを示した。すべての患者をまとめると、Ｖ１からＶ８まででＭＢＰに対する応答が有意に低下したことが明らかになった（Ｐ＝０．０３１３）。
【０１１３】
（材料および手法）
（製剤化および投与量）
４つのペプチドのそれぞれは、固相ペプチド合成を用いて契約のもと別個に製造され、ＨＰＬＣを用いて精製される。それらは、凍結乾燥状態で保存される。
【０１１４】
ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７は、皮内投与のためのリン酸緩衝食塩水中の、アピトープＭＳ１、ＭＳ４、ＭＳ６およびＭＳ７の１：１：１：１混合物である。
【０１１５】
２つの強度のＡＴＸ−ＭＳ−１４６７、すなわち、それぞれ４ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌのペプチドを、ＡＴＸ−ＭＳ−１４６７ＡおよびＡＴＸ−ＭＳ−１４６７Ｂと称されるものを、用量漸増を可能にするために調製した。この養生法では、７〜１４日の間隔で別々に投与される５つの用量漸増のための注入量（２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、４００μｇ、および８００μｇの総量）を用いる。患者には、最初の８００μｇを投与した後、７〜１４日間で２回目の８００μｇ用量を与える。
【０１１６】
研究薬剤の６つの用量を投与した後、患者は最後の研究投与から４週間後と３ヶ月後に評価される。
【０１１７】
（視力検査）
６メートルでの検査のための標準サイズのスネレン視力表を用い、それはバックライト照明を備えており、患者は６メートル離れて座る（図８）。
【０１１８】
それぞれの眼を、患者が読むことができる表中の最も低い列について、検査した。これは、（視力）＝６／（患者が読んだ列）として表される。
【０１１９】
（イムノアッセイ）
ｉ）Ｔ細胞増殖
凍結保存ＰＢＭＣを、４８ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＵＳＡ）中のα−ＭＥＭ中の１．５×１０６個の細胞を含む１ｍｌの培養液内に準備する。様々な濃度のＭＢＰおよびペプチド抗原に対する応答を１０日間にわたって観察する。コントロールウェルは、抗原を含まない。２０時間、または、２日間、４日間、６日間、８日間および１０日間の培養後、細胞懸濁液の１００μｌアリコートを各１ｍｌ培養液から二連で取り出し、［３Ｈ］−チミジン取り込み法により抗原に応答した増幅を測定する。
【０１２０】
ｉｉ）分泌されたサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−ａならびにＩＦＮ）の測定：
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ａｓｓａｙ：
培養液上澄みのサイトカイン濃度を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、測定する。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検体データを得た後、ＢＤ  ＣＢＡソフトウェアを用いて、結果を図および表のかたちで作成する。サイトカインの最小定量可能濃度は、以下のとおりである。すなわち、ＩＬ−２およびＩＬ−４が、２．６ｐｇｍｌ−１であり、ＩＬ−５が、２．４ρｇｍｌ−１であり、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αが、２．８ｐｇｍｌ−１であり、そして、ＩＦＮ−γが、７．１ｐｇｍｌ−１である。
【０１２１】
（サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）のＲＮＡを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ）
ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの分析のために、ＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液、６．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ混合液、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（フォワードプライマー濃度：ＩＬ−２  ３００ｎＭ、ＩＬ−１０  ６００ｎＭ、ＩＦＮ−γ  ６００ｎＭ、ＴＮＦ−α  ６００ｎＭ、リバースプライマー濃度：ＩＬ−２  ６００ｎＭ、ＩＬ−１０  ９００ｎＭ、ＩＦＮ−γ  ９００ｎＭ、ＴＮＦ−α  ６００ｎＭ）、２００ｎＭのＦＡＭ−ＴＡＭＲＡプローブならびに０．０５ＵμｌのプラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む最終容積２０μｌで行う。繰り返し条件は、以下のとおりである。すなわち、９４℃で３０秒間の初期変性工程の後、９４℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクルを３５回行う。β−２ミクログロブリンでは、上記のＰＣＲ混合液を、０．１μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに３ｍＭのＭｇＣｌ２とともに加え、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ストックの×３００００希釈）を用いて定量化する。９５℃で１分間の変性工程の後、増幅を９４℃で１５秒間、６１℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルを３５回行いつつ続ける。ＰＣＲ反応と生成されたアンプリコンの蛍光検出を、Ｏｐｔｉｃｏｎ２システム（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）で行う。ベースライン蛍光を、サイクル１から１０までの測定を行うことにより確立させる。Ｃｔ値を、蛍光がベースラインの標準偏差を８〜１０回超えた時点を測定することによって計算する。試料を、二連でアッセイし、そして、コピー数を、各ターゲットＤＮＡの標準曲線より計算する。ＲＮＡインプットコピー数およびｃＤＮＡ合成の差を、サイトカイン発現をβ−２ミクログロブリンの発現に対して標準化することによって修正する。
【０１２２】
（ＨＬＡの遺伝子型同定）
ＨＬＡ遺伝子発現の分析を、標準的な単一鎖コンフォメーションポリモルフィズムポリメラーゼ連鎖反応技術により、末梢血白血球から抽出されたＤＮＡに対して行う。各患者のＨＬＡの型を、免疫学的アッセイの結果の解釈のために用いる。
【０１２３】
（血清抗ペプチド抗体アッセイ）
９６ウェルプレートを、１−１０μｇ／ｍｌの各アピトープＭＳ１、ＭＳ４、ＭＳ６またはＭＳ７で、ｐＨ９．６で一晩、４℃にてコーティングする。ｐＨ７、２．０５％のリン酸緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でプレートを４回洗浄し、ＰＢＳ中の５％ＦＣＳで、室温にて１時間ウェルをブロックする。血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：１００で希釈し、複製ウェル内で室温にて１時間インキュベートする。４回の洗浄後、ＰＢＳで１：１２０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加え、室温にて１時間プレートをインキュベートする。４回の洗浄後、３０％過酸化水素を加えた０．４ｍｇ／ｍｌのフェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温にて１５〜２０分間インキュベートする。２．０ＭのＨ２ＳＯ４（５０μｌ）を用いて発色を止め、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにて吸光度値（ＯＤ）を測定する。結果を、１：１００希釈血清のＯＤとして報告する。
【０１２４】
（ＭＲＩスキャン）
ＣＮＳの炎症を、ガドリニウム増強ＭＲＩスキャンを用いて検査する。増強病変の体積と数を調べ、ベースラインスキャンと比較する。
【０１２５】
本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変形は、本発明の範囲および思想から逸脱することなく、当業者にとって明らかである。本発明が具体的な好ましい実施形態に関して説明されているが、特許請求の範囲に記載された発明が、このような具体的な実施形態により過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、化学分野、生物学分野または関連する分野の当業者に明白である、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、本発明に包含されるものと意図される。本明細書にて言及した全ての刊行物は、ここで援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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