(57)【要約】  免疫原性組成物およびワクチン組成物、ならびにそれらの調製および使用の方法を提供し、これらの組成物は、反芻動物をブルータングウイルスによる感染から防御する、そうした感染症の重症度を最低限に留める、そうした感染症を予防する、および／またはそうした感染症を寛解させるのに有効である。本明細書に開示するアジュバントを含む２回不活性化ブルータングウイルスの組成物の少なくとも１回の動物への投与は、動物に対して免疫をもたらし、ブルータングウイルスによる感染から防御するのに有効であり、それによって、ブルータングウイルスの１つまたは複数の株または血清型によって引き起こされる疾患の重症度を低下させ、かつ／またはそうした疾患を予防する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物中でブルータングウイルス（ＢＴＶ）に対する免疫応答を惹起するための組成物であって、少なくとも１つの株の２回不活性化したブルータングウイルスの免疫原性有効量、および生物学的に許容できるアジュバントを含む組成物。
【請求項２】
２回不活性化ＢＴＶが、１回目は、約１０ｍＭの濃度の不活性化剤を用いて不活性化され、２回目は、約５ｍＭの濃度の不活性化剤を用いて不活性化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
不活性化剤がバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である、請求項１または２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
株が血清４型である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ワクチン組成物または免疫原性組成物である、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
動物が、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
反芻動物が、ヒツジまたは子ヒツジである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
生物学的に許容できるアジュバントが、水酸化アルミニウム、サポニン、ＳＬ−ＣＤ、ＣａｒｂｏｐｏｌおよびＳＰ−Ｏｉｌのうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
生物学的に許容できるアジュバントが、水酸化アルミニウムとサポニンとの混合物を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
水酸化アルミニウムが、約１％と約１０％との間の濃度で存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
水酸化アルミニウムが、約２％と約５％との間の濃度で存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
水酸化アルミニウムが、約３％の濃度で存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
惹起した免疫応答が、動物をブルータングウイルスの病原性株による感染から防御する、またはブルータングウイルスの病原性株による感染症に伴う少なくとも１つの症状の重症度を低下させる、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
ブルータングウイルスに対する動物の免疫応答を増強するため、または前記疾患に伴う少なくとも１つの症状を予防もしくは低減するための方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物を単回または複数回投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
動物が、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
反芻動物が、ヒツジまたは子ヒツジである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与するステップが、非経口投与によって達成される、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
非経口投与するステップが、筋肉内注射によって達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与するステップが、経口投与によって達成される、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
経口投与するステップが、手による送達または大量適用によって達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ブルータングウイルスの大流行を予防するまたはその状況を改善する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物を動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
動物が、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
反芻動物が、ヒツジまたは子ヒツジである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
投与するステップが、非経口投与によって達成される、請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
非経口投与するステップが、筋肉内注射によって達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
投与するステップが、経口投与によって達成される、請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
経口投与するステップが、手による送達または大量適用によって達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
不活性化全ブルータングウイルス（ＢＴＶ）を生成する方法であって、
ａ）１：１０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｂ）ステップａ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｃ）ステップｂ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約２４時間撹拌するステップと、
ｄ）２回目に、１：２０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｅ）ステップｄ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｆ）ステップｅ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約４８時間撹拌するステップと、
ｇ）不活性化剤を中和して、最終ｐＨを約７．２に調節するステップと
を含み、
ＢＴＶの不活性化が生じ、ＢＴＶの免疫原性は維持される方法。
【請求項２９】
不活性化剤がバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）の不活性化剤の最終濃度が約１０ｍＭである、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ステップｄ）の不活性化剤の最終濃度が約５ｍＭである、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
全ブルータングウイルスが血清４型である、請求項２８から３１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反芻動物をブルータングウイルス（ＢＴＶ）の病原性株または血清型に対して免疫化するためのワクチン組成物または免疫原性組成物、およびそうしたワクチンを作製し、これらの組成物を用いて反芻動物を免疫化するため方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブルータングは、節足動物媒介ウイルス性疾患であり、これは、ウシ、ヒツジ、ヤギおよび野生反芻動物において発症する。罹患動物において、ブルータングは、感染性ウシウイルス性下痢、水泡性口内炎ウイルス、悪性カタル熱、口腔カンジダ症、牛疫、光線過敏および口蹄疫に似た病変を呈する。ブルータングウイルス（ＢＴＶ）が、ウシにおける水無脳症、ならびにウシおよびヒツジにおける不妊、流産および欠損のある仔の出産を引き起こす原因とみなされている。文献には、２４種の血清型が不顕性感染から急性の電撃性感染に及ぶ問題を引き起こすとして報告されている。また、ウイルスを慢性的に持続して発散するウシも認められている。ＢＴＶによって、身体状態の著しい喪失が生じ、堵殺動物の販売が遅れることがある。ＢＴＶに感染したヒツジの場合、体毛に破損が生じることによって、体毛の成長が損なわれる恐れがある。これによって、欠損のあるまたは低収率の羊毛が生じる。ＢＴＶ感染に続く著しい衰弱の結果、細菌またはクラミジアによる二次感染、およびその他の侵略要因に対する抵抗性が低下する恐れがある。また、感染動物の生殖効率も悪影響を受ける。
【０００３】
感染動物では流産および欠損のある子孫が観察され、一部の動物では、１または複数回の繁殖期にわたり不妊状態を生じる場合がある。ブルータング感染がもたらす最も顕著な被害は、ウシ、ウシの精液、およびヒツジを、ブルータングが流行する地域から輸出する生産者に課される禁輸措置および厳密な試験要件の結果生じる経済的な損失である。
【０００４】
自然条件下では、このウイルスの伝染は、少なくとも４つのＣｕｌｉｃｏｉｄｅｓ種、例えば、スナバエ（ｓａｎｄ  ｆｌｙ）、ヌカカ（ｍｉｄｇｅ）による虫刺されを介して生じる。同じｃｕｌｉｃｏｉｄベクターによる、ウシとヒツジとの間におけるＢＴＶの生物学的伝染が実験的に実証されている（Ｌｕｅｄｋｅら、２８  ＡＪＶＲ  ４５７（１９６７））。ウシ、ヒツジ、および野生反芻動物の多くの種が、ＢＴＶのリザーバとして作用することができ、ウイルスが越冬するための手段となる。３年もの長期にわたり続く場合がある持続性のＢＴＶによるウイルス血症がウシにおいて同定されている（Ｈｏｕｒｒｉｇａｎ、５１  Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  １７０（１９７５））。ＢＴＶが国内で確立されてしまうと、事実上、このウイルスを根絶することは不可能である（Ｅｒａｓｍｕｓ、５１  Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  ２０９）。ブルータングの病原体は、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）科、オルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）属に属する。
【０００５】
ブルータングの病因がウイルスによるものであることは、１９０６年にＴｈｅｉｌｅｒによって確立された（Ｅｒａｓｍｕｓ、５１  Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  １６５（１９７５））。それ以来、いくつかの報告が文献に登場しており、そこでは、（ａ）ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびいくつかの野生反芻動物からのブルータングウイルスの単離、ならびに（ｂ）ブルータング病の臨床的および病理学的な特色が確認され、（ｃ）異なるＢＴＶ血清型から生じる感染症が記載されている。例えば、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ（Ｊ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ  Ａｎｉｍ  Ｉｎｄｕｓ  ７（１９４４）；ＫｏｍａｒｏｖおよびＧｏｌｄｓｍｉｔ、Ｒｅｆｕａｈ  Ｖｅｔ  ９６（１９５１）；ＰｒｉｃｅおよびＨａｒｄｙ、１２４  Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｎ  ２５５（１９５４）；Ｓｈｏｐｅら、１１１  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５５（１９６０）；ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎおよびＨａｒｄｙ、２５  ＡＪＶＲ  １９５８（１９６４）；Ｌｕｅｄｋｅら、３０  ＡＪＶＲ  ５１１（１９６９）；Ｈｏｕｒｒｉｇａｎら、５１  Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  １７０（１９７５）を参照されたい。米国内においては、ブルータングの免疫学的制御は最初に、ＭｃＫｅｒｃｈｅｒら、ｌ１８  ＡＪＶＲ  ３１０（１９７５）によって、ニワトリの受精卵中で増殖させたＢＴＶ国際血清１０型のワクチンを用いて試みられた。この製品は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（Ｊ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ  Ｉｎｄｕｓ  ２３１（１９４７））の製品を模したものであった。Ａｌｅｘａｎｄｅｒは、ブルータングウイルスのニワトリ胚中での増殖に最初に成功した人である。
【０００６】
早期のワクチン接種プロトコールは、南アフリカおよびイスラエルにおいて、いくつかのブルータング株を含有する、卵を用いて弱毒化した多価の生ウイルスワクチンを使用して日常的に実施された。Ｃｕｔｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造され、米国内において使用されていた卵馴化ワクチンは、ワクチン接種したヒツジにおける重度の反応のために回収されるに至った。それに続いて、ＫｅｍｅｎｙおよびＤｒｅｈｌｅ、２２  ＡＪＶＲ  ９２１（１９６１）は、ＢＴＶ国際血清１０型を、卵からウシ腎臓細胞培養物へ馴化させた。この改変生ウイルスワクチンは、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙによって製造され、米国内においてヒツジのために使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
反芻動物、具体的には、ヒツジおよび子ヒツジを、ブルータングウイルスに対して免疫化する場合に使用するためのワクチンの開発における改良が求められている。本発明は、この必要性に応えるものである。本明細書における参照文献の引用によって、いずれの場合であっても、そのような参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めているとみなしてはならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、本明細書に記載する方法を使用してブルータングウイルスを２回不活性化することができ、反芻動物をＢＴＶの種々の株および病原性血清型に対して免疫化するためのワクチン組成物および免疫原性組成物の調製にこれらの２回不活性化ウイルスを使用することができることが見い出されるに至った。さらに、アジュバントと賦形剤との特定の組合せを本発明の組成物中に使用した場合、こうした組合せは、この組成物を投与した反芻動物中で有効な免疫応答を惹起するために有効であることも決定されている。
【０００９】
したがって、本発明の１つの態様は、動物中でブルータングウイルス（ＢＴＶ）に対する免疫応答を惹起するための組成物を提供し、この組成物は、少なくとも１つの株の２回不活性化したブルータングウイルスの免疫原性有効量、および生物学的に許容できるアジュバントを含む。
【００１０】
１つの実施形態では、この組成物中に使用する２回不活性化ＢＴＶを、１回目は、約１０ｍＭの濃度の不活性化剤を用いて不活性化し、２回目は、約５ｍＭの濃度の不活性化剤を用いて不活性化する。
【００１１】
１つの実施形態では、ＢＴＶをこの組成物中で使用する目的で、ＢＴＶを処理するために使用する不活性化剤は、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である。
【００１２】
１つの実施形態では、この組成物は、血清４型であるＢＴＶ株を含む。
【００１３】
１つの実施形態では、この組成物は、ワクチン組成物または免疫原性組成物である。
【００１４】
１つの実施形態では、この組成物を用いて治療すべき動物は、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物である。
【００１５】
１つの実施形態では、この組成物を用いて治療すべき動物は、ヒツジまたは子ヒツジである。
【００１６】
１つの実施形態では、この組成物と共に使用すべき生物学的に許容できるアジュバントは、水酸化アルミニウム、サポニン、ＳＬ−ＣＤ、ＣａｒｂｏｐｏｌおよびＳＰ−Ｏｉｌのうちの１つまたは複数からなる群から選択される。
【００１７】
１つの実施形態では、この組成物と共に使用すべき生物学的に許容できるアジュバントは、水酸化アルミニウムとサポニンとの混合物を含む。１つの実施形態では、水酸化アルミニウムは、約１％と約１０％との間の濃度で存在する。１つの実施形態では、水酸化アルミニウムは、約２％と約５％との間の濃度で存在する。１つの実施形態では、水酸化アルミニウムは、約３％の濃度で存在する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明の組成物を用いて惹起した免疫応答は、動物をブルータングウイルスの病原性株による感染から防御する、またはブルータングウイルスの病原性株による感染症に伴う少なくとも１つの症状の重症度を低下させる。
【００１９】
本発明の第２の態様は、ブルータングウイルスに対する動物の免疫応答を増強するため、またはこの疾患に伴う少なくとも１つの症状を予防もしくは低減するための方法を提供し、この方法は、上記の本発明の組成物を単回または複数回投与するステップを含む。
【００２０】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスに対する動物の免疫応答を増強するため、またはこの疾患に伴う少なくとも１つの症状を予防もしくは低減するための方法は、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物において、そのような効果を達成する場合に有用である。１つの実施形態では、反芻動物は、ヒツジまたは子ヒツジである。
【００２１】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスに対する動物の免疫応答を増強するため、またはこの疾患に伴う少なくとも１つの症状を予防もしくは低減するための方法は、組成物を非経口投与によって投与するステップを提供する。非経口投与するステップは、筋肉内注射によって達成することができる。
【００２２】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスに対する動物の免疫応答を増強するため、またはこの疾患に伴う少なくとも１つの症状を予防もしくは低減するための方法は、組成物を経口投与によって投与するステップを提供し、これは、手による送達または大量適用によって達成することができる。
【００２３】
本発明の第３の態様は、ブルータングウイルスの大流行を予防するまたはその状況を改善する方法を提供し、この方法は、本発明の組成物を動物に投与するステップを含む。
【００２４】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスの大流行を予防するまたはその状況を改善する方法は、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシおよびシカからなる群から選択される反芻動物である動物を治療することを提供する。１つの実施形態では、反芻動物は、ヒツジまたは子ヒツジである。
【００２５】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスの大流行を予防するまたはその状況を改善する方法は、本発明の組成物を非経口投与によって投与するステップを提供する。非経口投与するステップは、筋肉内注射によって達成することができる。
【００２６】
１つの実施形態では、ブルータングウイルスの大流行を予防するまたはその状況を改善する方法は、本発明の組成物を経口投与によって投与するステップを提供する。経口投与するステップは、手による送達または大量適用によって達成することができる。
【００２７】
本発明の第４の態様は、不活性化全ブルータングウイルス（ＢＴＶ）を生成する方法を提供し、この方法は、
ａ）１：１０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｂ）ステップａ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｃ）ステップｂ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約２４時間撹拌するステップと、
ｄ）２回目に、１：２０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｅ）ステップｄ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｆ）ステップｅ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約４８時間撹拌するステップと、
ｇ）不活性化剤を中和して、最終ｐＨを約７．２に調節するステップと
を含み、
この方法によって、ＢＴＶの不活性化が生じ、ＢＴＶの免疫原性は維持される。
【００２８】
１つの実施形態では、上記の２回不活性化ＢＴＶを調製するための方法は、不活性化剤としてのバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の使用を提供する。１つの実施形態では、ステップａ）の不活性化剤の最終濃度は、上記したように、約１０ｍＭである。１つの実施形態では、ステップｄ）の不活性化剤の最終濃度は、上記したように、約５ｍＭである。
【００２９】
１つの実施形態では、２回不活性化全ＢＴＶを調製するための上記の方法は、血清４型であるブルータングウイルスを利用する。
【００３０】
本発明の第５の態様は、反芻動物をＢＴＶの種々の株および血清型に対して免疫化するための医薬品を調製するために、少なくとも１つの２回不活性化ＢＴＶ株を使用することを提供する。１つの実施形態では、医薬品の調製において使用するための少なくとも１つの２回不活性化ＢＴＶ株は、血清４型である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の方法および治療についての方法を記載する前に、記載する特定の方法および実験条件が変化する場合があることから、本発明は、そのような方法および条件に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定する意図はないことも理解されたい。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈上そうでないことが明確に定められない限り、複数について言及することも含む。したがって、例えば、「この方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」と言及する場合、１つもしくは複数の方法、ならびに／または本明細書に記載する型のおよび／もしくは本開示を読み取れば当業者には明らかとなるであろう、１つもしくは複数のステップ等を含む。
【００３３】
したがって、本出願においては、当技術分野に属する従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を利用することができる。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ」（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００３４】
本明細書に記載するものに類似するまたはそれらと同等である任意の方法および材料を、本発明の実行または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を、ここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物の全体が、参照により組み込まれている。
【００３５】
定義
本明細書で使用する用語は、当業者であれば認識し、知っている意味を有するが、便宜のため、かつ完全を期すために、特定の用語およびそれらの意味を以下に記載する。
【００３６】
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、統計学的に意味のある範囲の値に属することを意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、典型的には５０％以内、より典型的には２０％以内、さらにより典型的には１０％以内、その上より典型的には５％以内であってよい。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容差は、研究下の特定の系に依存し、当業者であれば、このことを容易に理解することができる。
【００３７】
「アジュバント」は、組成物、典型的にはワクチン組成物中の、抗原の免疫原性を増強する１つまたは複数の物質を含む組成を意味する。アジュバントは、抗原を緩慢に放出する組織デポーとして、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化薬としても役立つことができる（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、１９８４、ｐ．３８４）。しばしば、アジュバントの非存在下では、抗原単独を用いた一次ワクチン接種が、液性または細胞性の免疫応答を惹起できないことがあるであろう。アジュバントとして、これらに限定されないが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等の鉱物のゲル、リゾレシチン等の表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素のエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ならびに有用である可能性があるヒトのアジュバント、例として、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。好ましくは、アジュバントは、生物学的に許容できるアジュバントである。本発明の１つの実施形態では、組成物を、２つのアジュバント、すなわち、水酸化アルミニウムとサポニンとの組合せと共に投与する。
【００３８】
本明細書に記載する組成物中で利用するアジュバントは典型的には、「生物学的に許容できるアジュバント」であり、したがって、不活性化ＢＴＶと組み合わせて使用することができ、その結果、得られた組成物は、動物に対して毒性を伴うことなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与することができる。本明細書では、水酸化アルミニウム、サポニン、ＳＰ−Ｏｉｌ、ＳＬ−ＣＤまたはＣａｒｂｏｐｏｌからなる群から選択される、１つまたは複数の生物学的に許容できるアジュバントと組み合わせた、２回不活性化ＢＴＶを含む組成物を例示する。特定の実施形態では、２つのアジュバントを使用して、ＢＴＶに対する好ましい免疫応答を惹起する。その他の実施形態では、代謝可能な油、例として、１つまたは複数の不飽和テルペン系炭化水素の混合物の使用を考慮することができ、例えば、スクアレンまたはスクアランと、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）等のポリオキシエチレン−ポリプロピレンのブロックコポリマーとの混合物がある。
【００３９】
不活性化ＢＴＶ株またはそれに由来する分子が、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することが可能である場合、そのような株または分子は、「抗原性を示す」。典型的には、抗原性を示す分子は、ポリペプチドまたはその変異体であり、これは、少なくとも約５個、典型的には少なくとも約１０個のアミノ酸の「エピトープ」を含有する。ポリペプチドの抗原性を示す部分は、本明細書ではまた「エピトープ」とも呼ばれ、抗体もしくはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である部分であってもよく、または、免疫化のために、抗原性を示す部分を担体ポリペプチドにコンジュゲートすることによって、この分子に対する抗体を生成するために使用される部分であってもよい。抗原性を示す分子は、それ自体が免疫原性である、すなわち、担体なしで免疫応答を惹起することが可能である必要はない。
【００４０】
本開示においては、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法においてそれらに割り当てられた意味を有することができ、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができることに留意されたい。「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語は、米国特許法においてそれらに割り当てられた意味を有し、例えば、それらによって、本発明の新規または基本的な特徴を損なわない追加の成分またはステップを包含することが可能になる。すなわち、それらによって、本発明の新規または基本的な特徴を損なう、追加の、列挙されていない成分またはステップが排除され、本明細書に引用する、または参照により本明細書に組み込まれている当技術分野の参照文献等の先行技術の成分またはステップが排除される。これは、特に、特許性がある、例えば、先行技術、例として、本明細書に引用する、または参照により本明細書に組み込まれている参照文献等を越えて、新規性、進歩性、独創性がある実施形態を定義することが、本文書の目的であるからである。さらに、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語も、米国特許法においてそれらに帰された意味を有し、すなわち、これらの用語によって、条件が固定されることを意味する。
【００４１】
ワクチン組成物または免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、対象において、対象とする抗原またはワクチンの組成物中に存在する分子に対して、液性および／または細胞媒介性の免疫応答が生じることである。本発明の目的では、「液性免疫応答」は、抗体媒介性免疫応答であり、これには、本発明の抗原／ワクチンに対して親和性を有する抗体の生成が関与する。一方、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／またはその他の白血球によって媒介される免疫応答である。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子が伴う、抗原性を示すエピトープの提示によって惹起される。これによって、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）が活性化される。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞表面上で発現するタンパク質を伴って提示されるペプチド抗原に対して特異性を示す。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を引き起こし、促すのを助ける。細胞性免疫の別の態様では、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答が関与する。ヘルパーＴ細胞が作用して、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を、ＭＨＣ分子を伴ってペプチド抗原を細胞表面上に提示しているそれらの細胞に対して集中させるのを助ける。また、「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化されたＴ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する細胞を含めた、その他の白血球によって産生される、その他のそのような分子の産生も指す。特定の抗原または組成物の、細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力を、いくつかのアッセイ、例として、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイによって、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、感作させた対象中で抗原に対して特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって、または抗原を用いた再刺激に対する応答において、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を測定することによって決定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照されたい。
【００４２】
「免疫原性有効量」は、動物において免疫応答を惹起する全不活性化ＢＴＶの量である。この量は、レシピエント動物の種、品種、年齢、サイズ、健康状況に依存し、その動物の、１つまたは複数のＢＴＶ株への以前の曝露によって、そのような１つまたは複数の株が毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）株であっても非毒性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）株であっても影響を受ける。本明細書で使用する場合、１つまたは複数の適切なアジュバントと組み合わせて利用する場合、全不活性化ＢＴＶの「免疫原性有効量」は、ＢＴＶの免疫原性を増強するのに十分であり、したがって、病原性または毒性のＢＴＶの株または血清型を用いる攻撃に対して防御免疫をもたらすＢＴＶの量である。
【００４３】
「免疫原性」という用語は、抗原またはワクチンの、液性または細胞媒介性のいずれかまたは両方の免疫応答を惹起する能力を指す。本明細書で使用する場合、「免疫原性」という用語は、ＢＴＶが、液性および／または細胞性の免疫応答を惹起することが可能であることを意味する。また、免疫原性株は抗原性も示す。免疫原性組成物は、動物に投与した場合、液性および／または細胞性の免疫応答を惹起する組成物である。
【００４４】
「免疫原性組成物」という用語は、抗原、例えば、微生物を含有する任意の医薬組成物に関し、こうした組成物を使用して、哺乳動物において免疫応答を惹起することができる。この免疫応答は、Ｔ細胞応答、Ｂ細胞応答、またはＴ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を含むことができる。この組成物は、細胞表面でのＭＨＣ分子を伴う抗原の提示によって、哺乳動物を感作させるために役立つことができる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球または抗体を産生させて、免疫化した宿主の将来の防御を可能にすることもできる。「免疫原性組成物」は、細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫応答または抗体媒介性（Ｂ細胞）免疫応答のいずれかまたは両方を誘導する全微生物またはそれに由来する免疫原性部分を含む、生存する弱毒化したワクチンまたは死滅させた／不活性化したワクチンを含有することができ、微生物による感染症に伴う１つまたは複数の症状から動物を防御してもよく、または微生物による感染症に起因する死から動物を防御してもよい。
【００４５】
「不活性化」という用語は、本発明のワクチン組成物または免疫原性組成物の中で使用しようとする微生物の性質が非感染性であることを指す。特に、当業者には、ワクチンのために、微生物、例えば、ＢＥＩを非感染性とするために使用することができる、そのような材料が分かっている。また、本発明においては、ブルータングウイルスを非感染性とするための特定の方法を開発するに至ったが、これらの方法はまた、ウイルス調製物の完全な不活性化を果たすと同時に、ワクチン調製物の免疫原性の保持にも重点を置いて開発されている。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「単離した」という用語は、言及する材料を自然の環境から取り出すことを意味する。したがって、単離した生物学的材料は、細胞構成成分、すなわち、中に自然の材料が天然に存在する細胞の構成成分（例えば、細胞質または膜の構成成分）のうちの一部または全部を含有しない状態であってよい。材料が細胞の抽出物または上清の中に存在する場合には、その材料は単離された状態にある。単離したタンパク質は、その他のタンパク質もしくは核酸、または両方と結合することができ、細胞内では、単離したタンパク質は、そうしたタンパク質または核酸と結合している。単離したタンパク質が、膜結合タンパク質である場合には、単離したタンパク質は、細胞膜と結合することができる。単離した細胞小器官、細胞または組織は、それが生物体内で見い出される解剖学的部位から取り出された状態にある。単離した材料は精製することができるが、そうである必要はない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「非経口投与」という用語は、消化管以外の何らかの手段による投与を意味し、具体的には、物質の生物体内への静脈内、皮下、筋肉内または髄内への注射による導入を意味するが、また、その他の口以外および鼻以外の経路からの投与、例として、腹腔内注射または局所適用も意味する。
【００４８】
「病原性」という用語は、細菌またはウイルス等の任意の感染物質の疾患を引き起こす能力を指す。本発明の場合には、「病原性」という用語は、ブルータングウイルス（ＢＴＶ）が、反芻動物、具体的には、ヒツジまたは子ヒツジにおいて疾患を引き起こす能力を指す。「非病原性」微生物は、「病原性」ＢＴＶ株について上記した特徴を欠く微生物を指す。ＢＴＶによって引き起こされた疾患はしばしば、感染動物中の病変によって特徴付けられ、これらは、感染性ウシウイルス性下痢、水泡性口内炎ウイルス、悪性カタル熱、口腔カンジダ症、牛疫、光線過敏および口蹄疫に似ている。ブルータングウイルス（ＢＴＶ）は、ウシにおける水無脳症、ならびにウシおよびヒツジにおける不妊、流産および欠損のある仔の出産を引き起こす原因とみなされている。
【００４９】
「薬学的に許容できる担体」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた動物での使用について、連邦、州政府の規制機関もしくはその他の規制機関によって承認されている、または米国薬局方もしくはその他の一般に認められている薬局方において収載されている担体を意味する。「担体」という用語は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌の液体、例として、水および油であってよく、こうした油には、石油系油、動物系油、植物系油または合成した油、具体的には、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等がある。この医薬組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。また、食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液も、液体の担体として、具体的には、注射用液剤のために利用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等がある。また、この組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も所望により含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続性放出製剤等の形態をとることができる。この組成物を、従来の結合剤および担体、例として、トリグリセリドと共に坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例として、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。適切な薬学的担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与形態に適合しなければならない。
【００５０】
「防御」という用語は、例えば、哺乳動物、具体的には反芻動物、例えば、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギまたはウシを、感染または疾患から、特定の病原体、例として、ブルータングウイルスに対する免疫応答を誘導することによって遮蔽することを指す。そのような防御は一般に、哺乳動物の、本明細書に記載するワクチン組成物を用いた治療に続いて達成される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「精製した」という用語は、無関係の材料、すなわち、そこから当該材料を得る自然の材料を含めて、混入物の存在を低減させるまたは排除する条件下で単離されている材料を指す。例えば、精製した細菌またはタンパク質は典型的には、組織培養物または卵タンパク質を含めて、宿主細胞または培養構成成分、非特異的病原体等を実質的に含有しない。本明細書で使用する場合、「実質的に含有しない」という用語は、材料の解析試験の文脈で、操作の観点から使用される。典型的には、混入物を実質的に含有しない精製した材料は、少なくとも５０％純粋、より典型的には少なくとも９０％純粋、さらにより典型的には少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成の解析、生物学的アッセイ、および当技術分野で知られているその他の方法によって評価することができる。精製方法は、当技術分野では周知である。「実質的に純粋」という用語は、当技術分野で知られている従来の精製技法を使用して達成することができる最も高い程度の純度を指す。
【００５２】
「サポニン」は、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，ＭおよびＷａｇｎｅｒ  Ｈ．（１９９６、Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓａｐｏｎｉｎｓ、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、３６３〜３８６頁）に教示されている。サポニンは、植物界および海洋動物界において広く分布するステロイドまたはトリテルペンの配糖体である。サポニンは、振とう時に泡立つ、水性のコロイド溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることで知られている。サポニンが細胞膜付近にあると、膜内に穴様構造を生み出し、これは、膜の破裂を引き起こす。赤血球の溶血が、この現象の例であり、これは、特定のサポニンが示す特性であって、全てのサポニンが示すわけではない。サポニンは、全身性投与のためのワクチンにおけるアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血の活性が、当技術分野では広範に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−ＤｕｂｏｉｓおよびＷａｇｎｅｒ、上記）。例えば、「Ｑｕｉｌ  Ａ」（南米の木、キリヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）モリナ（Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来する）、およびその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号、および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、１９９６、１２（１〜２）：１〜５５、およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。Ｑｕｉｌ  Ａの画分を含み、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれている粒子構造は、溶血性を示し、ワクチンの製造において使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１）。これらの構造は、アジュバント活性を示すことが報告されている（ＥＰ０１０９９４２Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１）。溶血性サポニンであるＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ  ＡのＨＰＬＣによって精製した画分）が、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらを生成する方法が、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に開示されている。また、これらの参照文献には、全身性ワクチンの強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（Ｑｕｉｌ−Ａの非溶血性画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、Ｋｅｎｓｉｌら（１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１４６巻、４３１〜４３７）にもさらに記載されている。また、ＱＳ２１と、ポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも知られている（ＷＯ９９／１０００８）。Ｑｕｉｌ  Ａの画分を含む粒子性のアジュバント系、例として、ＱＳ２１およびＱＳ７が、ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載されている。全身性ワクチン接種の研究において使用されたことがあるその他のサポニンには、その他の植物種、例として、ジプソフィラ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）およびサポナリア属（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に由来するものがある（Ｂｏｍｆｏｒｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０（９）：５７２〜５７７、１９９２）。また、サポニンは、粘膜適用ワクチンの研究においても使用されたことがあることが知られており��これらは、良好な免疫応答の誘導を様々な程度でかなえている。Ｑｕｉｌ−Ａのサポニンは以前に、抗原を鼻腔内投与した場合には、免疫応答を誘導する効果はないことが示されている（Ｇｉｚｕｒａｒｓｏｎら、１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３、２３〜２９）が、その他の著者は、このアジュバントを使用して成功を収めている（Ｍａｈａｒａｊら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８６、３２（５）：４１４−２０。ＣｈａｖａｌｉおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７４（３）：３４７−５９）。Ｑｕｉｌ  Ａのサポニンを含むＩＳＣＯＭは、胃内および鼻腔内のワクチン製剤において使用されたことがあり、アジュバント活性を示した（ＭｃＩ  Ｍｏｗａｔら、１９９１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７２、３１７−３２２；ＭｃＩ  ＭｏｗａｔおよびＤｏｎａｃｈｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１２、３８３−３８５）。また、Ｑｕｉｌ  Ａの無毒性画分であるＱＳ２１は、経口または鼻腔内のアジュバントとしても記載されている（Ｓｕｍｉｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８、７２（６）：４９３１〜９、ＷＯ９８／５６４１５）。鼻腔内ワクチン接種の研究におけるその他のサポニンの使用が記載されている。例えば、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）のサポニンが、鼻腔内および胃内の両方のワクチンにおいて使用されたことがある（Ｅｓｔｒａｄａら、Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９８、２１（３）：２２５〜３６）。
【００５３】
「ＳＬ−ＣＤ」という用語は、米国特許第６，６１０，３１０号および第６，１６５，９９５号に記載されているシクロデキストリンアジュバントのファミリーに属するスルホリポ−シクロデキストリン（ｓｕｌｐｈｏｌｉｐｏ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を指す。典型的には、ＳＬ−ＣＤは、代謝可能な油、例として、１つまたは複数の不飽和テルペン系炭化水素、例えば、スクアレンとの混合物、好ましくは、非イオン性界面活性剤、例として、ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンとの混合物中に配合される。
【００５４】
「ＳＰ−Ｏｉｌ」という用語は、１％〜３％ｖ／ｖのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンのブロックコポリマー、２％〜６％ｖ／ｖのスクアレン、０．１％〜０．５％ｖ／ｖのポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン、および緩衝化塩溶液を含む油性エマルジョンであるアジュバントを指す。
【００５５】
「反芻動物」という用語は、ウシ、ヒツジ、キリン、ヤギおよびシカを含めた、胃が４つの区画に分割されていることを特徴とする、任意の多様な有蹄、偶蹄、および通常は有角の哺乳動物を指す。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（その変形形態、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」を含む）は、以下のうちの任意の１つまたは複数を指す：（ｉ）従来のワクチンの場合と同様、感染または再感染を予防すること、（ｉｉ）症状の重症度を低下させること、または症状を排除すること、および（ｉｉｉ）問題とする病原体または障害を、実質的または完全に排除すること。したがって、治療は、（感染に先立って）予防的に行っても、または（感染に続いて）治療的に行ってもよい。本発明においては、予防的な治療が、好ましい様式である。本発明の特定の実施形態によれば、予防的および／または治療的な免疫化を含めて、宿主動物をウイルス感染に対して治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくは、反芻動物、例として、ヒツジ、子ヒツジ、ウシまたはヤギに対して、予防的および／または治療的な免疫を付与するために有用である。また、本発明の方法は、生物医学研究に適用するために、哺乳動物に対して実行することもできる。
【００５７】
「２回不活性化」という用語は、本発明に記載する特定の方法を使用して、ＢＴＶを非感染性とし、かつウイルス調製物の免疫原性を保持することを指す。より具体的には、ＢＥＩとのＢＴＶのインキュベーションを２回使用することによって、本発明のＢＴＶを２回不活性化し、不活性化の第１のステップを、ＢＴＶを１０ｍＭの濃度のＢＥＩと共に２４時間インキュベートすることによって達成し、２回目の不活性化を、ＢＴＶを５ｍＭの濃度のＢＥＩと共に４８時間インキュベートすることによって達成する。
【００５８】
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、互換的に使用され、動物において免疫応答を誘導する、少なくとも１つの免疫原性組成を含む医薬組成物を指す。ワクチンまたはワクチン組成物は、動物を、感染が引き起こす疾患または場合によっては死から防御することができ、この活性な構成成分の免疫学的活性を増強する、１つまたは複数の追加の構成成分を含んでも、または含まなくてもよい。ワクチンまたはワクチン組成物は、医薬組成物に典型的なさらなる構成成分を追加して含むことができる。ワクチンまたはワクチン組成物は、例えば、アジュバントまたは免疫調節物質を含めて、ワクチンまたはワクチン組成物に典型的なさらなる構成成分を追加して含むことができる。ワクチンの免疫原性的に活性な構成成分は、完全な、生存する生物体を、それらの元々の形態としてか、もしくは改変した生ワクチン中の弱毒化した生物体としてかのいずれかで、または死滅させたもしくは不活性化したワクチンとして、適切な方法によって不活性化した生物体を、またはウイルスの１つもしくは複数の免疫原性構成成分を含むサブユニットワクチンを、または当業者に既知の方法によって調製した、遺伝子操作し、突然変異させたもしくはクローニングしたワクチンを含むことができる。ワクチンまたはワクチン組成物は、上記の要素のうちの１つを、または同時に２つ以上を含むことができる。
【００５９】
一般的な説明
大型動物の業界に対する潜在的な影響に起因して、ブルータングウイルスに対するワクチンの開発は、特に、ウシおよびヒツジの業界にとって極めて重要である。病原性株は、たとえ弱毒化したとしても、通常、生ウイルスにはその毒性を示す状況に復帰する傾向があることから、その価値が限られる可能性が高い。さらに、不活性化ワクチンを商業的に使用しようとするならば、ウイルスを完全に不活性化して、動物に対する適切な安全性プロファイルを保証しなければならないことも必須である。さらにまた、不活性化が、免疫応答の誘導に関与するウイルスまたはウイルスの構成成分の免疫原性に対して、有害な効果を示さないことも重要である。
【００６０】
したがって、本発明は、動物、具体的には、ヒツジもしくは子ヒツジもしくはウシ等の反芻動物をブルータングウイルス（ＢＴＶ）感染に対して免疫化するため、または疾患の少なくとも１つの症状の重症度を低下させるための組成物および方法に関する。この組成物は、少なくとも１つの２回不活性化ＢＴＶ株および生物学的に許容できるアジュバントを含む。特定の実施形態では、少なくとも２つの生物学的に許容できるアジュバントの組合せを利用する。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、この方法は、反芻動物を病原性があるＢＴＶに対して免疫化すること、およびこの動物をそのような感染から防御することを提供する。
【００６２】
特に、本発明の方法は、反芻動物をＢＴＶによる感染に対して免疫化するための、少なくとも１つの全体を２回不活性化したＢＴＶ株を含むワクチン組成物または免疫原性組成物の使用を提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、反芻動物をＢＴＶによる感染に対して免疫化するための、ＢＴＶの血清４型を含むワクチン組成物または免疫原性組成物の使用を提供する。
【００６３】
本発明の組成物および方法において使用すべきブルータングウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の任意の既知の受託機関から得ることができる。そうした受託機関は、種々の血清型のＢＴＶの株を保持している。例えば、ＡＴＣＣは、ＢＴＶのいくつかの異なる株を維持しており、これらは、ＡＴＣＣのカタログに、以下の指定受託番号で収載されている：ＶＲ−１８７（血清１０型）、ＶＲ−８７２（血清１１型）、ＶＲ−８７３（血清１３型）、ＶＲ−８７５（血清１７型）、ＶＲ−９８３（血清２型）、ＶＲ−１２３１（血清１０型）、ＶＲ−１２３１ＡＦ（血清１０型）およびＶＲ−１２３１ＣＡＦ（マウス血清１０型）。さらに、血清４型が、Ｍｅｒｔｅｎｓら（Ｍｅｒｔｅｎｓ，ＰＰら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６１（２）：４３８−４４７、（１９８７））、およびＢｒｅａｒｄら（Ｂｒｅａｒｄ，Ｅ．らＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．、１２５（２）：１９１−１９７、（２００７））によって記載されている。
【００６４】
不活性化の方法
不活性化ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物は、ＢＴＶの、不活性化剤、例として、ホルマリンもしくは疎水性溶媒、酸等による処理、紫外線光もしくはＸ線の照射、加熱等によって調製することができる。不活性化を、当技術分野で理解されている様式で実施する。例えば、化学的な不活性化の場合、適切なウイルス試料またはウイルスを含有する血清試料を、ウイルスを不活性化するのに十分な量または濃度の不活性化剤で、（不活性化剤に依存して）十分に高い（または低い）温度またはｐＨで、十分な長さの時間にわたり処理する。加熱による不活性化を、ウイルスを不活性化するのに十分な温度で、十分な長さの時間にわたり実施する。照射による不活性化を、ウイルスを不活性化するのに十分な波長の光またはその他のエネルギー源を使用して、十分な長さの時間にわたり実施する。ウイルスが、感染に対して感受性の細胞に感染することが不可能である場合、このウイルスは、不活性化されたとみなされる。１つの特定の実施形態では、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）が、不活性化のために使用する手段である。
【００６５】
本発明の特定の態様では、少なくとも１つの全ＢＴＶを２回不活性化した形態を生成するための方法を提供する。この方法は、
ａ）１：１０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｂ）ステップａ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｃ）ステップｂ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約２４時間撹拌するステップと、
ｄ）２回目に、１：２０の不活性化剤対ＢＴＶ比を用いて、不活性化剤でＢＴＶを処理するステップと、
ｅ）ステップｄ）の不活性化剤／ＢＴＶの混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズするステップと、
ｆ）ステップｅ）の混合物を無菌容器中にデカントし、混合物を約４８時間撹拌するステップと、
ｇ）不活性化剤を中和して、最終ｐＨを約７．２に調節するステップと
を含み、
この方法によって、ＢＴＶの不活性化が生じ、ＢＴＶの免疫原性は維持される。
【００６６】
１つの実施形態では、上記の２回不活性化ＢＴＶを調製するための方法は、不活性化剤としてのバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の使用を提供する。１つの実施形態では、ステップａ）の不活性化剤の最終濃度は、上記したように、約１０ｍＭである。１つの実施形態では、ステップｄ）の不活性化剤の最終濃度は、上記したように、約５ｍＭである。
【００６７】
１つの実施形態では、２回不活性化全ＢＴＶを調製するための上記の方法は、血清４型であるブルータングウイルスを利用する。
【００６８】
ワクチン組成物または免疫原性組成物、および使用方法
免疫原性有効量の本発明のワクチンを、ブルータングウイルス（ＢＴＶ）による感染に対する防御を必要とする反芻動物に投与する。反芻動物に接種する免疫原性有効量または免疫原性量は、日常的な試験によって容易に決定するまたは容易に増減することができる。有効量は、ワクチンに対する十分な免疫学的応答を達成して、動物を、ウイルスへの曝露に対して防御する量である。好ましくは、動物を、ウイルス性疾患の有害な生理学的症状または作用のうちの１つから全てを、顕著に低減させる、寛解させる、または完全に予防する程度まで防御する。
【００６９】
ワクチン組成物または免疫原性組成物は、単回用量また反復用量で投与することができる。活性な抗原性を示す薬剤の適切な投与量を、動物の体重、抗原の濃度、およびその他の典型的な要因に基づいて決定または滴定するための方法が、当技術分野では知られている。
【００７０】
望ましくは、このワクチン組成物または免疫原性組成物を、ウイルスにまだ曝露していない反芻動物に投与する。全体を２回不活性化したウイルス、またはそうしたウイルスのその他の抗原性を示す形態を含有するワクチンを、好都合に、鼻腔内投与、経皮投与（すなわち、皮膚表面上にまたは皮膚表面において適用して、全身性に吸収させる）、非経口投与等を行うことができる。非経口投与経路として、これらに限定されないが、筋肉内経路、静脈内経路、腹腔内経路、皮内経路（すなわち、皮膚の下に注射する、または別の場合には皮膚の下に置く）等が挙げられる。筋肉内経路および皮内経路からの接種が、ウイルス感染性ＤＮＡクローンを使用したその他の研究において成功を収めている（Ｅ．Ｅ．Ｓｐａｒｇｅｒら、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｓ  ｂｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８：１５７−１６０（１９９７）；Ｌ．Ｗｉｌｌｅｍｓら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｓｈｅｅｐ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９：７７５−７７７（１９９２））ことから、実用的な鼻腔内投与経路に加えて、これらの経路が、最も好ましい。
【００７１】
液剤として投与する場合、本発明のワクチンは、水性の液剤、シロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤等の形態で調製することができる。そのような製剤は、当技術分野では知られており、典型的には、抗原およびその他の典型的な添加剤を、適切な担体または溶媒の系中に溶解させることによって調製される。適切な「生理的に許容できる」担体または溶媒として、これらに限定されないが、水、食塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセロール等が挙げられる。典型的な添加剤は、例えば、認可されている染料、香料、甘味剤、およびチメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）等の抗菌保存剤が挙げられる。そのような液剤は、例えば、部分加水分解ゼラチン、ソルビトールまたは細胞培養培地を添加することによって安定化させることができ、従来の方法によって、当技術分野で既知の試薬、例として、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、それらの混合物等を使用して緩衝化することができる。
【００７２】
また、液体製剤は、その他の標準的な共配合成分と組み合わせた懸濁化剤または乳化剤を含有する懸濁剤および乳剤も含む。これらの型の液体製剤は、従来の方法によって調製することができる。懸濁剤を、例えば、コロイドミルを使用して調製することができる。乳剤を、例えば、ホモジナイザーを使用して調製することができる。
【００７３】
体液系中に注入するために設計した非経口製剤には、ブタの体液レベルに対応する適切な等張性とｐＨ緩衝化が必要になる。等張性は、必要であれば、塩化ナトリウムおよびその他の塩を用いて適切に調節することができる。エタノールまたはプロピレングリコール等の適切な溶媒を使用して、製剤中の成分の溶解性および液体調製物の安定性を増加させることができる。本発明のワクチン中で利用することができるさらなる添加剤として、これらに限定されないが、デキストロース、従来の抗酸化剤、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の従来のキレート剤が挙げられる。また、非経口投与剤型は、使用前に滅菌もしなければならない。
【００７４】
アジュバント
２回不活性化ブルータングウイルスを、アジュバントと共に送達することができる。１つの実施形態では、ワクチンは、全体を２回死滅させた／不活性化したＢＴＶであり、これを、アジュバントと共に投与する。アジュバントは、動物の、ワクチンに対する免疫学的応答を向上させる物質である。アジュバントは、ワクチンと同じ時期に、同じ部位において投与してもよく、または異なる時期に、例えば、追加免疫として投与してもよい。また、アジュバントは、ワクチンを投与する様式または部位とは異なる様式または部位で反芻動物に好都合に投与することもできる。適切なアジュバントとして、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、Ａｌｈｙｄｏｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、デンマーク）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、非イオン性のブロックポリマーまたはコポリマー、（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等のような）サイトカイン、（Ｑｕｉｌｌａｉａ  Ａ、またはＱｕｉｌ  Ａ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、デンマーク）を含めた）サポニン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）等が挙げられる。その他の適切なアジュバントとして、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から単離された熱不安定性または熱安定性のエンテロトキシン、コレラ毒素またはそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、フロイント不完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバント等が挙げられる。ジフテリア毒素、破傷風毒素および百日咳毒素等の毒素に基づいたアジュバントは、使用前に、例えば、ホルムアルデヒドを用いて処理することによって不活性化することができる。１つの実施形態では、ワクチン組成物を、少なくとも２つのアジュバントの組合せと共に送達する。１つの実施形態では、ワクチン組成物を、水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｏｒｏｇｅｌ（登録商標））およびサポニン（Ｑｕｉｌ  Ａ）の両方の組合せと共に送達する。
【００７５】
免疫応答を測定するためのアッセイ
反芻動物をＢＴＶに対してワクチン接種した機能的成果を、細胞性もしくは液性の免疫またはＴ細胞活性の誘導をモニターする適切なアッセイによって評価することができる。これらのアッセイは、当業者には知られているが、例えば、クロム放出アッセイを使用する細胞溶解性Ｔ細胞活性の測定を含むことができる。あるいは、Ｔ細胞増殖アッセイを、免疫反応性またはその喪失の指標として使用することもできる。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験を行って、病原体に対してワクチン接種した哺乳動物における防御のレベルを、本発明の方法を使用して評価することもできる。典型的なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでは、本明細書に記載するウイルス等の抗原を動物にワクチン接種することを含むことができる。抗体またはＴ細胞応答の発生を誘導するのに十分な時間、一般に、注射後約１〜２週間待機した後、動物を、いずれかのウイルス等の抗原を用いて攻撃し、ウイルス感染症に伴う１つもしくは複数の症状の寛解、または動物の生存をモニターする。ＢＴＶに対するワクチン接種の投与計画が成功すれば、非ワクチン接種対照と比較して、ウイルス感染症に伴う１つもしくは複数の症状の顕著な減少、またはウイルス血症の減少、またはウイルス感染症に伴う病変の数もしくは重症度の減少、または生存が認められる。また、血清を収集して、ワクチンの注射に応答して産生された抗体レベルを、当業者に既知の方法によって測定してモニターすることもできる。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例によって、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は、例証のためのものに過ぎず、これらには、本発明の条件および範囲を確定する意味は全くないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が示されている場合、また、特定された範囲を超える条件およびそれに満たない条件の両方も、一般にあまり好都合ではないが、使用することができることを理解されたい。別段の記載がない限り、本明細書で示す部分およびパーセントは全て重量に関するものであり、温度は全て摂氏で表現する。
【００７７】
（実施例１）
製造プロセス
一般的な説明
製造プロセスを、無菌条件下で、以下に記載する標準的な製造方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ）の指示に従って実施する。標準的な製造方法において無菌的と定義される操作を開始する前に、空気ろ過装置および層流キャビネットが正しく動作する状態にあることを確かめ、このプロセスにおいて使用する材料が、オートクレーブ中もしくはろ過によって正当に滅菌されている、または確立された方法に従って殺菌されていることを確認する。無菌的な操作を、以下の確立された無菌の取扱い技法に従って実施する。
【００７８】
製造プロセスの各ステップの説明
最終抗原の製造方法（継代３回）
ＢＨＫ−２１細胞培養物の入手
ＢＨＫ−２１細胞（作業用細胞ストックまたはＷＣＳ）を液体窒素中で凍結保存する。ＷＣＳ凍結保存チューブを、＋３７℃まで迅速に解凍することによって解凍し、次いで、これを、培地（ＭＥＭ−Ｇｌａｓｇｏｗ＋照射したウシ胎仔血清）を含有する培養フラスコ中に接種する。
【００７９】
この培養フラスコを、＋３７±１℃でインキュベートする。接種時から少なくとも５時間が経過したら、培地をフラスコから除去し、あらかじめ＋３７±１℃の温度とした同じ組成の新しい培地を添加する。
【００８０】
培養物を、定期的に観察し、その発展（コンフルエンス）および細胞形態を記録する。
【００８１】
この培養フラスコから生成のために必要なフラスコを得るために、必要とされる継代培養を３〜５日置きに実施する。
【００８２】
新たに調製したトリプシン溶液を用いて、培養物をトリプシン処理することによって継代培養を実施し、細胞懸濁液の計数を、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中で生体染色（トリパンブルー）により行う。次いで、細胞懸濁液を、タンクまたはフラスコの中に含有させた無菌の培地中で磁気撹拌により希釈し、これを、培養フラスコ中に分配する。
【００８３】
培養操作開始時に、回転フラスコ中で、培地のｐＨを７．２±０．２に調節する。
【００８４】
最後の培養物を、トリプシン処理し、遠心分離したら、細胞懸濁液を、抗原を製造するセクションに届ける。
【００８５】
最終抗原の製造（継代３回）
継代２回抗原（接種材料）の生成
最終抗原（継代３回）のバッチを生成するために、接種材料（継代２回抗原）を、以下の方法に従って調製する。
【００８６】
作業用播種ウイルス（ＷＳＶ）を−７０±１０℃で凍結保存する。ＷＳＶから、接種材料を得るために２回継代を行う。１回目の継代では、効力の制御を実施し、２回目の継代では、凍結操作後に、無菌性および効力の制御を行う。
【００８７】
継代１回抗原（プレ接種材料）
培養第２〜３日のＢＨＫ−２１細胞を有する１つのフラスコ中から、培地を除去し、感染媒体（ＭＥＭ−Ｇｌａｓｇｏｗ中のＷＳＶ懸濁液）で置換する。
【００８８】
培養物を、＋３７±１℃でインキュベートする。
【００８９】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が６０％超である場合、細胞の単層剥離を促進するために、フラスコを撹拌下に置き、次いで、−７０±１０℃で凍結する。
【００９０】
継代２回抗原（接種材料）
継代１回抗原を、ＭＥＭ−Ｇｌａｓｇｏｗ中で希釈する。培養第２〜３日のＢＨＫ−２１細胞を有する必要な増殖フラスコの培地を除去し、調製したウイルス懸濁液で置換し、次いで、＋３７±１℃のインキュベーター中に置く。
【００９１】
ＣＰＥが６０％超である場合、細胞の単層剥離を促進するために、フラスコを撹拌下に置き、次いで、−７０±１０℃で凍結する。
【００９２】
最終抗原（継代３回）の培養物の接種、感染および収集
無菌容器中で、ＭＥＭ−Ｇｌａｓｇｏｗ、培養フラスコからのＢＨＫ−２１細胞懸濁液および照射されたウシ胎仔血清を、撹拌下で混合およびホモジナイズする。
【００９３】
懸濁液をホモジナイズしたら、細胞の計数を、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中で行う。
【００９４】
この懸濁液を、必要なフラスコに接種し、＋３７±１℃でインキュベートする。
【００９５】
培養第２〜３日に、培地を、各フラスコから除去し、感染媒体、すなわち、ＭＥＭ−Ｇｌａｓｇｏｗ＋継代２回抗原（接種材料）で置換する。次いで、感染フラスコを、＋３７±１℃、回転運動下でインキュベートする。
【００９６】
ＣＰＥが６０％超である場合、細胞の単層剥離を促進するために、フラスコを撹拌下に置き、培養物を収集およびホモジナイズし、ｐＨを確かめる。必要であれば、塩酸を用いて調節して、７．２±０．２のｐＨを得、次いで、収集した最終抗原（継代３回）を不活性化する。
【００９７】
培養プロセスの特徴
−  培養を、回転フラスコ中で行う。
−  試料を、トリパンブルーを用いて１／２に希釈した後、細胞の計数をＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー中で行う。
−  培養物を、＋３７±１℃で１時間当たり１２〜１４回回転させながらインキュベートする。
−  培養物の状況および発展を定期的に観察し、細胞形態を、倒立顕微鏡を用いて観察する。
−  最終抗原（継代３回）の製造プロセス全体を通して、空気の試料を休息期間および製造期間の間に採取することによって、作業室の環境制御を実施し、また、作業設備を制御するために、提示プラーク（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐｌａｑｕｅ）および接触プラーク（ｃｏｎｔａｃｔ  ｐｌａｑｕｅ）も解析する。
【００９８】
試料採取
継代１回抗原：継代１回抗原の試料を、品質管理部（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）による効力の制御のために採取する。
【００９９】
継代２回抗原：継代２回抗原の試料を、品質管理部による効力および無菌性の制御のために採取する。
【０１００】
継代３回抗原：継代３回抗原の試料を、品質管理部による効力、無菌性および同一性の制御のために採取する。
【０１０１】
不活性化抗原の製造
最終抗原の不活性化プロセスは合計７２時間にわたり、使用するＢＥＩの濃度は１５ｍＭである。
【０１０２】
０．１Ｍ  ＢＥＩを、不活性化されつつある抗原１リットル当たり１００ｍｌの割合で添加することによって、最終抗原を不活性化する（最終濃度１０ｍＭ）。
【０１０３】
ＢＥＩの添加後、この混合物を少なくとも１５分間ホモジナイズし、ｐＨを確かめる。ホモジナイズするプロセスの後、この混合物を無菌容器中にデカントし、これを、撹拌下、３７±１℃で２４時間保つ。
【０１０４】
２４時間後、０．１Ｍ  ＢＥＩを、不活性化されつつある抗原１リットル当たり５０ｍｌの割合で添加することによって、最終抗原の２回目の不活性化を実施する（最終濃度５ｍＭ）。ＢＥＩの２回目の添加後、プロセスを、１回目の添加について上記に記載した同じ条件下で繰り返すが、混合物の撹拌は４８時間維持する。
【０１０５】
残留ＢＥＩの中和
中和
不活性化プロセスが完了したら、ＢＥＩを中和するために、１Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液を、不活性化抗原１リットル当たり５ｍｌの割合で添加する（最終濃度５ｍＭ）。
【０１０６】
この混合物をホモジナイズした後、ｐＨを確かめる。必要であれば、塩酸を用いて調節を行い、７．２±０．２のｐＨを得る。
【０１０７】
不活性化および中和した抗原の理論タイターの計算
不活性化および中和した抗原の理論タイターを計算するために、不活性化前の抗原のタイター、ならびに不活性化プロセスにおけるＢＥＩの添加および中和プロセスにおけるチオ硫酸ナトリウムの添加に相当する希釈の要因を考慮に入れる。
【０１０８】
抗原１リットルにつき、１００ｍｌの０．１Ｍ  ＢＥＩ溶液を１回目の不活性化に添加し、追加の５５ｍｌを２回目の不活性化に添加する。こうすると、最終抗原１０００ｍｌは、不活性化抗原１１５５ｍｌとなる。直ちに、中和プロセスにおいて、不活性化抗原１リットル当たり５ｍｌの１Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液を添加する。こうすると、不活性化抗原１１５５ｍｌは、不活性化および中和した抗原１１６１ｍｌとなる。
【０１０９】
不活性化および中和のプロセスは、最終抗原の希釈が、合計すると１／１．１６であることを意味する（最終抗原１０００ｍｌが、不活性化および中和した抗原１１６１ｍｌになる）。この理由で、不活性化前に１０７．２ＴＣＩＤ５０／ｍｌの標準タイターを示す抗原は、不活性化および中和の後には１０７．２／１．１６の理論タイターを有するとみなされる。
【０１１０】
試料採取
無菌性および不活性化の制御のために、不活性化および中和した抗原の試料を、品質管理部のために採取する。
【０１１１】
（実施例２）
攻撃後のウイルス血症の低減に対する効果によるアジュバントの選択
２月齢の子ヒツジにおけるプレ免疫原性実験
動物に、皮下経路によってワクチン接種し（２ｍＬ）、３週間後に再ワクチン接種した。
【０１１２】
ワクチンＡ−３、Ｂ−３およびＣ−３を用いてワクチン接種した動物を、再ワクチン接種の７〜８週間後に攻撃した（攻撃用量＝１０７ＴＣＩＤ５０の生ウイルス／動物）。攻撃した動物のうち、防御を示したものはなかった。しかし、ウイルス血症の低減が、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム）とＱｕｉｌ−Ａ（サポニン）をアジュバントとして用いてワクチン接種した動物においてのみ観察された。
【０１１３】
【表１】
2011504174.tif 000002
【０１１４】
ワクチン接種後の抗体の応答
【０１１５】
【表２】
2011504174.tif 000003
【０１１６】
攻撃の結果
バッチＡ−３、Ｂ−３およびＣ−３を用いてワクチン接種した動物を、再ワクチン接種の７〜８週間後に攻撃した（各群５匹）。また、２匹の非ワクチン接種対照も攻撃した。
【０１１７】
ブルータングウイルス（ＢＴＶ）を、血液試料中で、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ（Ａｌｇｅｔｅ、スペイン）において実施したリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって検出した。（Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら（２００６）．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １８：７〜１７）。血液試料を、感染後第４および７日に採取した（Ｄ＋４ｐ．ｉ．およびＤ＋７ｐ．ｉ．）。血液試料の処理、９６ウエル核酸抽出法に続く全核酸抽出、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら、２００６（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１８：７〜１７）の記載に従って実施した。ＰＣＲ解析について、閾値サイクルを求めた（Ｃｔ）。３６未満のＣｔ値を示す場合には、試料をＢＴＶ陽性とみなした。３６と４０との間のＣｔ値を示す試料は、不確定とみなした。
【０１１８】
【表３】
2011504174.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2011504174.tif 000005
【０１２０】
【表５】
2011504174.tif 000006
【０１２１】
ワクチン接種動物と非ワクチン接種動物とを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を考慮に入れ比較するために、対照群の平均Ｃｔを、異なるワクチン接種群のそれぞれの平均Ｃｔから減じた。（Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら（２００６）．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １８：７〜１７）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって達成した検出では、対数目盛上で、シグナルと試料中に存在するウイルスＲＮＡの分量（１ミリリットル当たり当量ＴＣＩＤ５０感染単位）との間に直線関係が示されることを実証した（０．９９４８の相関係数、および−３．３３４の傾き）。この理由により、各ワクチン接種群と対照群との間のＣｔの平均の差を３．３３４で割り、得られた数の対数を計算した。
【０１２２】
【表６】
2011504174.tif 000007
【０１２３】
結論
計算した数［ｌｏｇ（Ｃｔの差／３．３３４）］は、対照群とワクチン接種群との間の関係を表す。攻撃後第７日において、
１．アジュバントであるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとＱｕｉｌ−Ａを用いてワクチン接種した動物は、対照群と比べて、血中のウイルスが少なく、３分の１であった。（非ワクチン接種動物についてのデータは１匹のみからである）
２．ＳＰ−ｏｉｌまたはＳＬ−ＣＤのアジュバントを用いてワクチン接種した動物は、対照群と比較して、ウイルス血症の低減を何ら示さなかった（非ワクチン接種動物についてのデータは１匹のみからである）
３．Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム）とＱｕｉｌ−Ａ（サポニン）は、ＳＰ−ｏｉｌまたはＳＬＣＤよりも優れたアジュバントである。
【０１２４】
（実施例３）
抗原濃度の、ウイルス血症の低減に対する効果
２月齢の子ヒツジにおけるプレ免疫原性実験
動物に、皮下経路によってワクチン接種し（２ｍＬ）、３週間後に再ワクチン接種した。
【０１２５】
ワクチンＡ−１、Ａ−２およびＡ−３を用いてワクチン接種した動物を、再ワクチン接種の５〜６週間後に攻撃した（攻撃用量＝１０７ＴＣＩＤ５０の生ウイルス／動物）。攻撃した動物のうち、防御を示したものはなかった。しかし、ウイルス血症の抗原用量依存性の低減が観察された。
【０１２６】
【表７】
2011504174.tif 000008
【０１２７】
ワクチン接種後の抗体の応答
【０１２８】
【表８】
2011504174.tif 000009
【０１２９】
攻撃の結果
バッチＡ−１、Ａ−２およびＡ−３を用いてワクチン接種した動物を、再ワクチン接種の５〜６週間後に攻撃した（各群５匹）。また、２匹の非ワクチン接種対照も攻撃した。
【０１３０】
ブルータングウイルス（ＢＴＶ）を、血液試料中で、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ（Ａｌｇｅｔｅ、スペイン）において実施したリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって検出した。（Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら（２００６）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １８：７〜１７）。血液試料を、感染後第３および５日に採取した（Ｄ＋３ｐ．ｉ．およびＤ＋５ｐ．ｉ．）。血液試料の処理、９６ウエル核酸抽出法に続く全核酸抽出、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら、２００６（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１８：７〜１７）の記載に従って実施した。ＰＣＲ解析について、閾値サイクルを求めた（Ｃｔ）。３６未満のＣｔ値を示す場合には、試料をＢＴＶ陽性とみなした。３６と４０との間のＣｔ値を示す試料は、不確定とみなした。
【０１３１】
【表９】
2011504174.tif 000010
【０１３２】
【表１０】
2011504174.tif 000011
【０１３３】
【表１１】
2011504174.tif 000012
【０１３４】
ワクチン接種動物と非ワクチン接種動物とを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を考慮に入れ比較するために、対照群の平均Ｃｔを、異なるワクチン接種群のそれぞれの平均Ｃｔから減じた。Ｍｉｇｕｅｌ  Ａｎｇｅｌ  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｃｌａｖｅｒｏら（２００６）．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １８：７〜１７）は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって達成した検出では、対数目盛上で、シグナルと試料中に存在するウイルスＲＮＡの分量（１ミリリットル当たり当量ＴＣＩＤ５０感染単位）との間に直線関係が示されることを実証した（０．９９４８の相関係数、および−３．３３４の傾き）。この理由により、各ワクチン接種群と対照群との間のＣｔの平均の差を３．３３４で割り、得られた数の対数を計算した。
【０１３５】
【表１２】
2011504174.tif 000013
【０１３６】
【表１３】
2011504174.tif 000014
【０１３７】
結論
計算した数［ｌｏｇ（Ｃｔの差／３．３３４）］は、対照群とワクチン接種群との間の関係を表す。攻撃後第５日において、
１．１０６ＴＣＩＤ５０／用量を用いてワクチン接種した動物は、対照群（非ワクチン接種動物）と比べて、血中のウイルスが少なく、２分の１であった。
２．１０６．７ＴＣＩＤ５０／用量を用いてワクチン接種した動物は、対照群（非ワクチン接種動物）と比べて、血中のウイルスが少なく、６分の１であった。
３．１０７ＴＣＩＤ５０／用量を用いてワクチン接種した動物は、対照群（非ワクチン接種動物）と比べて、血中のウイルスが少なく、１３分の１であった。
【０１３８】
（実施例４）
アジュバントおよび投与組成物
１月齢の子ヒツジにおける免疫原性実験
動物に、皮下経路によってワクチン接種し（２ｍＬ）、３週間後に再ワクチン接種した。
【０１３９】
ワクチンＫ１、Ｋ２、Ｋ６およびＫ８を用いてワクチン接種した動物を、再ワクチン接種の３〜４週間後に攻撃した（攻撃用量＝１０７ＴＣＩＤ５０の生ウイルス／動物）。ワクチンＫ１およびＫ２を用いてワクチン接種した動物のみが防御された。
【０１４０】
【表１４】
2011504174.tif 000015
【０１４１】
ワクチン接種後の抗体の応答
【０１４２】
【表１５】
2011504174.tif 000016
【０１４３】
【表１６】
2011504174.tif 000017
【０１４４】
攻撃
ＥＬＩＳＡの結果により、ＳＰ−ｏｉｌおよびＤｒａｋｅｏｌを配合したワクチンは、攻撃のためには考慮しなかった。また、以前の実験からの安全性の結果に基づいて、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０６を配合したワクチンも切り捨てた。
【０１４５】
バッチＫ１、Ｋ２、Ｋ７およびＫ８を用いてワクチン接種した子ヒツジを、再ワクチン接種後第２４日に攻撃した。５匹の非ワクチン接種対照群を含めた。
【０１４６】
【表１７】
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【０１４７】
結論
ウイルス血症を予防することが可能な唯一のワクチンは、１×１０７ＴＣＩＤ５０／用量、ならびにアジュバントとしてのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとＱｕｉｌ−Ａを配合したバッチＫ２であった。同じアジュバントを配合したバッチＫ１を用いてワクチン接種した５匹の動物のうちのわずか１匹において、ウイルス血症が検出可能であったが、これは、より低い抗原濃度（３×１０６ＴＣＩＤ５０／用量）の場合であった。
【０１４８】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０６（Ｓｅｐｐｉｃ）を配合したワクチンのバッチＫ７およびＫ８を用いて得られた結果は、満足なものではなかった。
【０１４９】
類似の血清学的結果を示すＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０７（Ｓｅｐｐｉｃ）についての攻撃の結果は入手できていない。
【０１５０】
（実施例５）
最終的なワクチン組成物
【０１５１】
【表１８】
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【国際調査報告】
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