(57)【要約】受容体Ｆｎ１４に結合して、Ｆｎ１４を発現する癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する抗体および抗体断片を開示する。前記抗体および抗体断片を用いて、腫瘍細胞死を誘発すると共に、患者の障害を治療する方法も開示する。本発明は少なくとも部分的に、Ｆｎ１４に結合して、腫瘍細胞死を誘発する抗体の同定および特性付けに基づいている。これらの抗体は、低用量で癌の動物モデルに有効であり、かつ、腫瘍の増殖を予防する作用が持続する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１の４２位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８またはＰ３Ｇ５の配列番号１への結合を交差ブロックし、かつ、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、またはＰ２Ｄ３のエピトープと同じエピトープで、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片が配列番号１のポリペプチドに結合することによって、ＴＷＥＡＫの前記ポリペプチドへの結合をブロックする、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と同一である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と同一である、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、（ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｖ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
（ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
（ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
（ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と同一である、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
重鎖が配列番号３７または配列番号３９を含み、軽鎖が配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５を含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
重鎖が配列番号３７を含み、軽鎖が配列番号４３を含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号２もしくは配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記第１の重鎖ＣＤＲが、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、前記第２の重鎖ＣＤＲが、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、前記第３の重鎖ＣＤＲが、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と同一である、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記第１の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、前記第２の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、前記第３の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と同一である、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記第１の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、前記第２の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、前記第３の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と同一である、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記第１の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、前記第２の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、前記第３の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と同一である、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号２もしくは配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、（ｉｉｉ）（ａ）配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含み、かつ（ｉｖ）インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
（ｉ）前記第１の重鎖ＣＤＲが、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、前記第２の重鎖ＣＤＲが、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、前記第３の重鎖ＣＤＲが、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）前記第１の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、前記第２の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、前記第３の軽鎖ＣＤＲが、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ３と同一である、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
（ｉ）前記第１の重鎖ＣＤＲが、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、前記第２の重鎖ＣＤＲが、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、前記第３の重鎖ＣＤＲが、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）前記第１の軽鎖ＣＤＲが、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、前記第２の軽鎖ＣＤＲが、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、前記第３の軽鎖ＣＤＲが、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と同一である、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
（ｉ）前記第１の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、前記第２の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、前記第３の重鎖ＣＤＲが、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）前記第１の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、前記第２の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、前記第３の軽鎖ＣＤＲが、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と同一である、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト生殖細胞系列フレームワーク領域とトータルで少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１１または配列番号１２のＶＨドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＨドメインフレームワーク領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のＶＬドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＬドメインフレームワーク領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（ｉ）配列番号１１または配列番号１２のＶＨドメインのフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＨドメインフレームワーク領域、および（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のＶＬドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＬドメインフレームワーク領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
前記ＶＨドメインが、配列番号８の１〜１２１番目のアミノ酸を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
前記ＶＬドメインが、配列番号９の１〜１１１番目のアミノ酸を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
前記ＶＨドメインが、配列番号８の１〜１２１番目のアミノ酸を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号９の１〜１１１番目のアミノ酸を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３６】
重鎖が配列番号８を含み、軽鎖が配列番号９を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３７】
重鎖が配列番号１６を含み、軽鎖が配列番号９を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、結腸癌細胞ＷｉＤｒの細胞殺滅を誘発または増大する、請求項１〜３７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４０】
前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４３】
前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｓｃ断片、またはＦｃ断片である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記抗体またはその抗原結合断片が多特異性抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４５】
前記多特異性抗体が双特異性抗体である、請求項４４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記抗体またはその抗原結合断片が多価抗体である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
前記抗体が、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する単離細胞。
【請求項４９】
哺乳類Ｂ細胞と骨髄腫細胞とを融合することによって得られる融合細胞である、請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項５１】
腫瘍細胞死を誘発する方法であって、Ｆｎ１４を発現する腫瘍細胞と、腫瘍細胞死を誘発するのに有効な量の、請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片とを接触させることを含む方法。
【請求項５２】
腫瘍細胞の増殖を予防または減少させる方法であって、腫瘍を有する哺乳類に、腫瘍細胞の増殖を予防または減少させるのに有効な量の、請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項５３】
癌を治療する方法であって、癌を有する哺乳類に、請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片を治療有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法
【請求項５４】
前記癌が結腸癌または乳癌である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類がヒトである、請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年５月１５日に出願された仮出願第６１／０５３，６５０号、２００９年２月３日に出願された仮出願第６１／１４９，５１７号、および２００９年４月２７日に出願された仮出願第６１／１７３，１３７号の優先権を主張するものである。これらの各先行出願の全体的内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連サイトカインは、免疫調節とアポトーシス調節に関与する機能を含む一連の機能を有するタンパク質のスーパーファミリーである。ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子）は、このスーパーファミリーのメンバーの１つである。ＴＷＥＡＫ受容体のＦｎ１４は、成長因子によって調節される前初期応答遺伝子であって、細胞外マトリックスへの細胞接着を減少させ、血清刺激による増殖と移動を低下させる遺伝子である（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３１６６−３３１７６（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は少なくとも部分的に、Ｆｎ１４に結合して、腫瘍細胞死を誘発する抗体の同定および特性付けに基づいている。これらの抗体は、低用量で癌の動物モデルに有効であり、かつ、腫瘍の増殖を予防する作用が持続する。
【０００５】
１つの態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１の４２位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する単離Ｆｎ１４結合タンパク（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）を特色とする。「選択的に結合する」という用語は、Ｆｎ１４結合タンパクの標的タンパク（例えば配列番号１のポリペプチド）が異種のタンパク質群の中に存在するときに、Ｆｎ１４結合タンパク質が、その標的タンパク質に対する特異性を示す形で、標的タンパク質に結合することを指す（すなわち、「選択的」結合には、非特異的なタンパク質間相互作用は含まれない）。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「配列番号１の４２位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで」結合するとは、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１の野生型ヒトＦｎ１４というタンパク質に選択的に結合できるが、４２位にトリプトファンの代わりにアラニンを含む、配列番号１の突然変異体には有意に結合できないことを指す。例えば、４２位にトリプトファンの代わりにアラニンを含む、配列番号１の突然変異体への結合は、同じアッセイ条件下で、配列番号１の野生型ヒトＦｎ１４タンパク質に対して生じる結合のレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満のレベルで生じる場合がある。
【０００７】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８、Ｐ２Ｄ３、またはＰ３Ｇ５の配列番号１への結合を交差ブロックし、かつ、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【０００８】
あるモノクローナル抗体（例えばＰ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、またはＰ２Ｄ３）が先にＦｎ１４に結合することによって、その後、同一のモノクローナル抗体がＦｎ１４に結合するのを阻害するのと同じレベルで、Ｆｎ１４結合タンパク質が先にＦｎ１４に結合することによって、その後、上記のモノクローナル抗体がＦｎ１４に結合するのを阻害すると、そのＦｎ１４結合タンパク質は、上記のモノクローナル抗体のＦｎ１４への結合を交差ブロックする。例えば、Ｐ４Ａ８が先にＦｎ１４に結合することによって、その後、同一のモノクローナル抗体がＦｎ１４に結合するのを阻害するのと同じレベルで、Ｆｎ１４結合タンパク質が先にＦｎ１４に結合することによって、その後、Ｐ４Ａ８がＦｎ１４に結合するのを阻害すると、そのＦｎ１４結合タンパク質は、Ｐ４Ａ８のＦｎ１４への結合を交差ブロックする。特定の実施形態では、Ｆｎ１４結合タンパク質は、Ｐ４Ａ８自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のレベルまで、Ｐ４Ａ８のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする。特定の実施形態では、Ｆｎ１４結合タンパク質は、Ｐ４Ａ８のヒトＦｎ１４への結合を別の抗Ｆｎ１４抗体（例えばＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２、ＩＴＥＭ−３、またはＩＴＥＭ−４）が交差ブロックするよりも高い程度で、Ｐ４Ａ８のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする。
【０００９】
特定の実施形態では、Ｐ４Ａ８は、Ｆｎ１４結合タンパク質自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のレベルで、Ｆｎ１４結合タンパク質のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする。
【００１０】
特定の実施形態では、（ｉ）Ｆｎ１４結合タンパク質は、Ｐ４Ａ８のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックすると共に、（ｉｉ）Ｐ４Ａ８は、Ｆｎ１４結合タンパク質のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする。
【００１１】
双方向の完全な交差ブロックは、２つの抗体が同じフットプリントを有すること、すなわち、同じエピトープに結合することを示している。特定の実施形態では、一方向または双方向の交差ブロックは完全ではなく、部分的、例えば、当該抗体自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のレベルである。一方向または双方向の部分的な交差ブロックは、２つの抗体のフットプリントが同一ではないが、重複しているか、または非常に近い場合があることを示している。
【００１２】
Ｆｎ１４結合タンパク質の結合については、上記のように説明できるが、Ｐ４Ａ８の代わりにＰ３Ｇ５またはＰ２Ｄ３と比較して説明することもできる。交差ブロック実験は、Ｆｎ１４結合タンパク質の結合親和性に基づくＦｎ１４への結合の飽和濃度以上で存在する試験用Ｆｎ１４結合タンパク質によって行ってよい。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｆｎ１４結合タンパク質は、本明細書に記載されている諸実験、例えば、交差ブロック実験、ならびに、様々な種のＦｎ１４および突然変異Ｆｎ１４タンパク質への結合実験の１つもしくは複数の実験によって特徴付けた場合、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、またはＰ２Ｄ３のエピトープと同じエピトープ、または実質的に同じエピトープに結合する。
【００１４】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、Ｐ４Ａ８のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体、Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体、またはＰ２Ｄ３のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体の配列番号１への結合を交差ブロックし、かつ、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体、またはその抗原結合断片）も開示する。
【００１５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）抗体の定常領域に突然変異を含み（その結果、エフェクター機能が低下または欠如する）、（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する単離抗体またはその抗原結合断片も開示する。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１の４２位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号１のポリペプチドに結合する。
【００１６】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃまたは定常領域が免疫系のタンパク質および／または細胞に結合する機能的能力を指す。エフェクター機能を低下させた抗体、およびこのような抗体を遺伝子工学技術で作る方法は当該技術分野において周知であり（例えば、国際公開第０５／１８５７２号、国際公開第０５／０３１７５号、および米国特許第６，２４２，１９５号を参照されたい）、本明細書でさらに詳細に説明されている。典型的なエフェクター機能としては、補体タンパク質（例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑ）、ならびに／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および/もしくはＦｃγＲＩＩＩｂ）に結合する能力が挙げられる。上記分子の１つもしくは複数の分子に結合できることの機能的結果としては、オプソニン化、食作用、抗原依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、および/またはエフェクター細胞の調節が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクター機能の低下とは、抗体（またはその断片）の可変領域の抗原結合能は維持したまま（結合親和性が低下するか、同様か、同一か、または高くなるかは問わない）、Ｆｃがその同系統の受容体、補体タンパク質、またはエフェクター細胞に結合することによって少なくとも部分的に誘発される生化学的活性または細胞活性のうちの１つもしくは複数の活性が低下することを指す。エフェクター機能の低下、例えば、ＦｃのＦｃ受容体または補体タンパク質への結合は、低下の比率（例えば１．５分の１、２分の１などに低下）によって表すことができ、例えば、当該技術分野において既知の結合アッセイを用いて測定した結合活性の低下率（％）に基づいて算出してよい（例えば、国際公開第０５／１８５７２号を参照されたい）。Ｆｃ媒介性受容体の超架橋も、活性を増大させる要因であることがある。
【００１７】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、もしくはＰ２Ｄ３（または、Ｐ４Ａ８のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体、Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体、もしくはＰ２Ｄ３のＶＨドメインとＶＬドメインを含むモノクローナル抗体）と同じエピトープで、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、（ｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＦｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）が、配列番号１のポリペプチドに結合すると、このポリペプチドへのＴＷＥＡＫの結合がブロックされるか、または低下する。結合は、少なくとも約１０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低下する場合がある。ＴＷＥＡＫのＦＮ１４への結合は、様々な細胞ベースの系で測定することができる。例えば、Ｆｎ１４をコードするベクターで細胞をトランスフェクションすることができると共に、検出可能なマーカーに結合させた可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質と、これらの細胞を接触させることによって、トランスフェクションした細胞へのＴＷＥＡＫの結合を測定することができる。可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質を加える前に、Ｆｎ１４結合タンパク質を上記の細胞に加えて、Ｆｎ１４結合タンパク質が、ＴＷＥＡＫのＦｎ１４への結合をブロックまたは低下させるかを判断することができる。
【００１９】
配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、ＴＷＥＡＫのＦｎ１４への結合に起因する少なくとも１つの生物学的活性、例えば、ＩＬ−８の誘発、カスパーゼの切断の誘発、および／またはＮＦκＢ活性の誘発を模倣する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）（例えばアゴニスト抗体）も開示する。
【００２０】
本明細書では更に、配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、カニクイザルＦｎ１４、マウスＦｎ１４、およびラットＦｎ１４にも有意に（または検出可能な形で）結合する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）を開示する。
【００２１】
本明細書では、配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、細胞の表面上のＦｎ１４に結合した後に、細胞にインターナリゼーションされる、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００２２】
配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、腫瘍細胞を殺す抗体またはその抗原結合断片としては、本明細書に記載されている特徴、例えば、（ｉ）アゴニスト活性、または、ＴＷＥＡＫのＦｎ１４への結合に起因する生物学的作用のうちの少なくともいくつかの模倣、（ｉｉ）ＴＷＥＡＫのＦｎ１４への結合の有意なブロック、（ｉｉｉ）Ｗ４２を含むヒトＦｎ１４のエピトープへの結合、（ｉｖ）ヒトＦｎ１４、カニクイザルＦｎ１４、ラットＦｎ１４、およびマウスＦｎ１４への有意な結合、ならびに、（ｉｖ）少なくともいくつかのエフェクター機能の欠損または誘発低下といった特徴のいずれかの組み合わせを有する抗体が挙げられる。例えば、１つの実施形態では、Ｆｎ１４抗体は、ＴＷＥＡＫのＦｎ１４への結合をブロックするアゴニスト抗体である。この抗体は更に、Ｗ４２を含むＦｎ１４のエピトープに結合するか、および／または、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有してよい。
【００２３】
特定の実施形態では、配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合すると共に、細胞殺滅を誘発または増大する単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）は、当該技術分野において既知の抗体、例えば、ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２、ＩＴＥＭ−３、またはＩＴＥＭ−４（例えば、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３４１、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＢＢＲＣ  ３０６：８１９、およびＨａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＢＢＲＣ  ２９９：４８８に記載されているようなもの）ではない。
【００２４】
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、１０−２〜１０−６ｓ−１、典型的には１０−２〜１０−５ｓ−１、例えば、１０−２〜１０−３ｓ−１、すなわち１×１０−３〜５×１０−３ｓ−１などの範囲内である（実施例１４も参照されたい）。１つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態（例えば、本明細書に記載されているヒト化形態）と類似（例えば、因数が５もしくは１０以内）の親和性および／または反応速度で、ヒトＦｎ１４に結合する。抗Ｆｎ１４抗体の親和性と結合反応速度は、例えば、バイオセンサー技術（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））を用いて試験することができる。
【００２５】
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、１０−２〜１０−６ｓ−１、典型的には１０−２〜１０−５ｓ−１の範囲内である。１つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態（例えば、本明細書に記載されているヒト化形態）と類似（例えば、因数が５もしくは１０以内）の親和性および／または反応速度で、ヒトＦｎ１４に結合する。
【００２６】
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、１０−２〜１０−６ｓ−１、典型的には１０−２〜１０−５ｓ−１の範囲内である。１つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体Ｐ３Ｇ５、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態（例えば、本明細書に記載されているヒト化形態）と類似（例えば、因数が５もしくは１０以内）の親和性および／または反応速度で、ヒトＦｎ１４に結合する。
【００２７】
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の結合速度は、１０５〜１０７Ｍ−１ｓ−１、すなわち５×１０５〜５×１０６Ｍ−１ｓ−１、例えば７×１０５〜３×１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲内である（実施例１４を参照されたい）。特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の結合定数は、１０５〜１０７Ｍ−１ｓ−１、すなわち５×１０５〜５×１０６Ｍ−１ｓ−１など、例えば７×１０５〜３×１０６Ｍ−１ｓ−１であり、解離定数は１０−２〜１０−３ｓ−１、すなわち１×１０−３〜５×１０−３ｓ−１である。抗体またはその抗原結合断片の親和性定数は、１０−１０、１０−９、もしくは１０−８Ｍ、またはそれ未満、すなわち１０−１０Ｍ〜１０−９などの範囲、例えば５×１０−１０〜５×１０−９Ｍ、または１×１０−９〜５×１０−９Ｍであってよい（実施例１４を参照されたい）。これらの反応速度パラメーターは、例えば本質的にヒトＦｎ１４の細胞外領域すなわちシステインリッチ領域（例えば、ヒトＦｎ１４の約２８番目のアミノ酸から６８、６９、７０、もしくは８０番目までのアミノ酸、または、約２８番目のアミノ酸から約６８〜８０番目までのアミノ酸）からなる可溶性ヒトＦｎ１４タンパク質のような可溶性Ｆｎ１４タンパク質への抗体またはその抗原結合断片の結合の特徴を示している場合がある。
【００２８】
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｎ１４の残基Ｃ４９、Ｗ４２、Ｋ４８、Ｄ５１、Ｒ５８、Ａ５７、Ｈ６０、Ｒ５６、Ｌ４６、およびＭ５０のうちの１つもしくは複数の残基と相互作用する。
【００２９】
特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体は、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、またはＰ２Ｄ３が結合するエピトープと実質的に同じエピトープに結合する。２つの抗体が実質的に同じエピトープに結合するか否かは、競合アッセイによって判定することができる。このようなアッセイは、ビオチンのような検出可能な標識でコントロール抗体（例えばＰ４Ａ８、または本明細書に記載されている他の抗体）を標識することによって行ってよい。Ｆｎ１４に結合した標識の強度を測定する。重複するエピトープに結合することによって、標識した抗体が非標識抗体（試験抗体）と競合する場合、その強度は、ネガティブコントロールの非標識抗体による結合と相対的に低下することになる。
【００３０】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と同一である。
【００３２】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、（ｉｉｉ）配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｖ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列と同一である。
【００３３】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と同一である。
【００３４】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と同一である。
【００３５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含み、（ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含み、かつ（ｉｖ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記のＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列と同一であり、かつ（ｉｉ）上記のＶＬドメインは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号３７または配列番号３９を含み、上記軽鎖は配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号３７を含み、上記軽鎖は配列番号４３を含む。
【００３６】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号２もしくは配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、上記第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、上記第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号２または配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と同一である。いくつかの実施形態では、上記第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、上記第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、上記第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と同一である。
【００３７】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、上記第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、上記第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、上記第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５または配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と同一である。いくつかの実施形態では、上記第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、上記第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、上記第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と同一である。
【００３８】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）（ａ）配列番号２もしくは配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号２もしく配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と少なくとも９０％同一である第１の重鎖ＣＤＲ、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と少なくとも９０％同一である第２の重鎖ＣＤＲ、および配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と少なくとも９０％同一である第３の重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、（ｉｉｉ）（ａ）配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号５もしくは配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲ、または（ｂ）配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と少なくとも９０％同一である第１の軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と少なくとも９０％同一である第２の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と少なくとも９０％同一である第３の軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含み、かつ（ｉｖ）インビボまたはインビトロで癌細胞（例えば結腸癌細胞ＷｉＤｒ）の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、上記第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、上記第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）上記第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、上記第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、上記第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ３と同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、上記第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、上記第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）上記第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、上記第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、上記第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３と同一である。いくつかの実施形態では、（ｉ）上記第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１と同一であり、上記第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ２と同一であり、上記第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号４のＣＤＲ−Ｈ３と同一であり、（ｉｉ）上記第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、上記第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ２と同一であり、上記第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ３と同一である。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号８の１〜１２１番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号９の１〜１１１番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号８の１〜１２１番目のアミノ酸を含み、上記ＶＬドメインは、配列番号９の１〜１１１番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号８を含み、上記軽鎖は配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号１６を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号１６を含み、上記軽鎖は配列番号９を含む。
【００３９】
本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系列フレームワーク領域とトータルで少なくとも９０％同一である（または少なくとも９５、９８、もしくは９９％同一である）フレームワーク領域を任意に含むことができる。「トータルで」という用語は、配列比較の際に、個々のフレームワーク領域ではなく、すべてのフレームワークを総合して考慮することを意味する。例えば、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１または配列番号１２のＶＨドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一である（または少なくとも９５、９８、もしくは９９％同一である）ＶＨドメインフレームワーク領域を含むことができる。別の例では、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のＶＬドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一である（または少なくとも９５、９８、もしくは９９％同一である）ＶＬドメインフレームワーク領域を含むことができる。場合によっては、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１１または配列番号１２のＶＨドメインのフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＨドメインフレームワーク領域、および（ｉｉ）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のＶＬドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも９０％同一であるＶＬドメインフレームワーク領域を含むことができる。
【００４０】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１３を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４１】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、その各ＣＤＲが、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１１の対応するＣＤＲと異なるＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１１のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、その各ＣＤＲが、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１３の対応するＣＤＲと異なるＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１３のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４２】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１４を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４３】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１１のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１１のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１４のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１４のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１４のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４４】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１５を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１１のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１１のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１５のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１５のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１５のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４６】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１３を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４７】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１２のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１２のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１３のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１３のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４８】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１４を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００４９】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１２のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１２のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１４のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１４のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１４のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００５０】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２を含むＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１５を含むＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００５１】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合し、（ｉｉ）配列番号１２のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＨドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１２のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＨドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１２のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＨドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号１５のＣＤＲと同一であるＣＤＲを含むＶＬドメイン、または、多くても１個、２個、３個、もしくは４個の改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）という形で、配列番号１５のＣＤＲと異なるＣＤＲを含むＶＬドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号１５のフレームワーク領域とトータルで少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であるＶＬドメインを含む、単離Ｆｎ１４結合タンパク質（例えば単離抗体またはその抗原結合断片）も開示する。
【００５２】
１つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、Ｐ４Ａ８の３つ又は６つすべてのＣＤＲまたは近似のＣＤＲ、例えば、同一であるか、または少なくとも１個（ただし、多くても２個、３個、もしくは４個）のアミノ酸が改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）されたＣＤＲ、あるいは、本明細書に記載されている他のＣＤＲを含む。
【００５３】
１つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、Ｐ３Ｇ５の３つ又は６つすべてのＣＤＲまたは近似のＣＤＲ、例えば、同一であるか、または少なくとも１個（ただし、多くても２個、３個、もしくは４個）のアミノ酸が改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）されたＣＤＲ、あるいは、本明細書に記載されている他のＣＤＲを含む。
【００５４】
１つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、Ｐ２Ｄ３の３つ又は６つすべてのＣＤＲまたは近似のＣＤＲ、例えば、同一であるか、または少なくとも１個（ただし、多くても２個、３個、もしくは４個）のアミノ酸が改変（例えば、置換、欠失、もしくは挿入）されたＣＤＲ、あるいは、本明細書に記載されている他のＣＤＲを含む。
【００５５】
Ｆｎ１４タンパク質と相互作用する抗Ｆｎ１４抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸は、突然変異していないのが好ましい（または、突然変異している場合、保存アミノ酸残基によって置換されているのが好ましい）。抗体Ｐ４Ａ８の変異体、または、Ｐ４Ａ８由来の抗体もしくは抗原結合断片（例えば、配列番号１１および配列番号１３を含む抗体または抗原結合断片）の変異体の１つの実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１の残基Ｓ３２には変化がない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１の残基Ｙ３４は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１の残基Ｙ３６は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ２の残基Ｙ５４は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ３の残基Ｒ９６は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１の残基Ｄ３１は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１の残基Ｙ３２は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｓ５２は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｙ５４は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｎ５５は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｙ５７は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ３の残基Ｙ１０１は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ３の残基Ｙ１０５は変わらない。別の実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ３の残基Ｙ１０６は変わらない。
【００５６】
１つの実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、ＣＤＲの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個、または、可変鎖の１本もしくは２本は、既知の抗体、例えば、ＩＴＥＭ−Ｉ、ＩＴＥＭ−２、ＩＴＥＭ−３、またはＩＴＥＭ−４由来ではないものとする。
【００５７】
１つの実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、他のＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーメンバーと交差反応しない。
【００５８】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片は、例えば、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、一価抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、多特異性抗体（例えば双特異性抗体）、多価抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｓｃ断片、またはＦｖ断片であり得る。
【００５９】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片は「多特異性」、例えば双特異性、三特異性、または四特異性以上であってよく、多特異性とは、１種もしくは複数種の抗原（例えばタンパク質）上に存在する２種類以上のエピトープを同時に認識して、これらに結合することを意味する。したがって、ある結合分子が「単一特異性」であるか「多特異性」、例えば「双特異性」であるかは、その結合分子が反応するエピトープの種類の数を指す。多特異性抗体は、Ｆｎ１４タンパク質の種々のエピトープに対して特異的であっても、Ｆｎ１４に加えて、異種のポリペプチドまたは固体支持物質のような異種のエピトープに対して特異的であってもよい。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「価」という用語（「多価抗体」の中で用いられるようなもの）は、結合分子に存在する潜在的結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。各結合ドメインは、１つのエピトープに特異的に結合する。結合分子が２つ以上の結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同じエピトープに特異的に結合しても（２つの結合ドメインを有する抗体の場合、「二価単一特異性」という）、異なるエピトープに結合してもよい（２つの結合ドメインを有する抗体の場合、「二価双特異性」という）。抗体は、各特異性において双特異性かつ二価であってもよい（「双特異性四価抗体」という）。別の実施形態では、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。
【００６１】
双特異性二価抗体、およびそれらを作製する方法は例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１、３３３号、ならびに、米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号、および同第２００２／０１５５５３７号に記載されており、これらの開示内容はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。双特異性四価抗体、およびそれらを作製する方法は例えば、国際公開第０２／０９６９４８号、および国際公開第００／４４７８８号に記載されており、これらの開示内容は双方とも、参照により本明細書に組み込まれる。一般的には、国際公開第９３／１７７１５号、国際公開第９２／０８８０２号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／０５７９３号、国際公開第２００７／１０９２５４号、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５、６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。これらの参考文献はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体、例えばその抗体の１本または２本の重鎖を１つもしくは複数のｓｃＦｖに結合させて、双特異性抗体を形成する。別の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体は、双特異性分子を形成する目的である抗体に結合されているｓｃＦｖの形態をしている。抗体−ｓｃＦｖ構築体は、例えば国際公開第２００７／１０９２５４号に記載されている。
【００６３】
上記の抗体の重鎖および軽鎖は、実質的に完全長であり得る。このタンパク質は、少なくとも１本、任意で２本の完全な重鎖と、少なくとも１本、任意で２本の完全な軽鎖を含むことも、抗原結合断片を含むこともできる。更に別の実施形態では、上記の抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択した重鎖定常領域を有する。典型的には、この重鎖定常領域は、ヒト定常領域またはヒト定常領域の修飾形態である。別の実施形態では、上記の抗体は、例えばκまたはλから選択した軽鎖の定常領域、特定的にはκ（例えばヒトκ）の定常領域を有する。
【００６４】
特定の実施形態では、抗体またその抗原結合断片の結合によって、細胞の表面上の受容体Ｆｎ１４が架橋またはクラスター化される。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、例えばプロテインＡに結合することによってマルチマーを形成しても、多価であってもよい。
【００６５】
エフェクター機能を高める目的で、例えば、本発明の抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を高めるか、または、標的受容体／Ｆｎ１４の架橋を促進させるように、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を修飾することができる。これは、本抗体のＦｃ領域に１つもしくは複数のアミノ酸置換基を導入することによって実現させてよい。この代わりに、またはこれに加えて、システイン残基（単一または複数）をＦｃ領域に導入し、それによって、この領域で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにしてもよい。このように生成されたホモ二量体抗体では、インターナリゼーション能が向上しているか、および／または、補体媒介性細胞殺滅性と抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）が向上している場合がある。抗腫瘍活性が向上したホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製してもよい。あるいは、２つのＦｃ領域を有するように抗体を遺伝子工学技術で作製することができ、それによって、上記の抗体は、補体溶解能とＡＤＣＣ能が向上している場合がある。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。加えて、抗体を脱フコシル化して、該修飾された抗体のＡＤＣＣが、脱フコシル化していない形態の抗体よりも高くなるようにできる。例えば、国際公開第２００６０８９２３２号を参照されたい。
【００６６】
本発明では、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えばＤＮＡも提供する。本発明では、上記の核酸と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の核酸とハイブリダイゼーションする核酸も包含する。
【００６７】
また、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を産生する単離細胞も開示する。本発明では、本明細書に記載されているタンパク質をコードする核酸を含む細胞、例えば単離細胞も提供する。この細胞は例えば、哺乳類のＢ細胞と骨髄腫細胞を融合させることによって得られる融合細胞であり得る。
【００６８】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も開示する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞死を誘発する方法であって、Ｆｎ１４を発現する腫瘍細胞と、腫瘍細胞死を誘発するのに有効な量の、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片とを接触させることを含む方法を特色とする。
【００７０】
腫瘍細胞の増殖を予防または減少させる方法であって、腫瘍を有する哺乳類に、腫瘍細胞の増殖を予防または減少させるのに有効な量の、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む方法も開示する。
【００７１】
癌を治療する方法であって、癌を有する哺乳類に、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を治療有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法も開示する。この癌は例えば、結腸癌または乳癌であり得る。
【００７２】
本明細書に記載されている方法に従って治療する哺乳類は例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、またはサルであり得る。
【００７３】
本明細書では、「抗体または抗原結合断片」と言及した場合には、この語句は、「タンパク質」と置き換えてもよいと理解すべきである。つまり、抗体およびその抗原結合断片の説明は、それらの抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質のようなタンパク質にも適用される。
【００７４】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野の者が一般的に理解するような意味と同じ意味を有する。本発明の実施および試験では、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を用いることができ、その代表的な方法および材料については下に説明されている。本明細書で言及されている公報、特許出願、特許、およびその他の参照文献はいずれも、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含め、本出願が優先される。本明細書の材料、方法、および実施例は、例示するためのものに過ぎず、限定することは意図していない。
【００７５】
本発明の他の特徴および利点は、下記の発明を実施するための形態と特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ２３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８で結腸癌細胞ＷｉＤｒをインビトロで処置すると、細胞の生存能が低下することを示しているグラフであって、ＭＴＴアッセイで測定したものである。
【図２】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体（Ｐ４Ａ８）が、インビトロで結腸癌細胞Ｗｉｄｒのアポトーシスを誘発できることを示している折れ線グラフ（図２Ａ）および棒グラフ（図２Ｂ）であって、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定したものである。
【図３】インビトロでＦｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、およびＰ３Ｇ５に対する耐性があるＦｎ１４＋乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の一例を示しているグラフであって、ＭＴＴアッセイによって測定したものである。
【図４】ＩＬ−８誘発アッセイにおいて、Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８、Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８が、アゴニストであることを示しているグラフであって、様々な抗体濃度にわたるＩＬ−８（ｎｇ／ｍｌ）によって測定したものである。
【図５】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８がインビボにおいて、結腸腫瘍細胞ＷｉＤｒを治療するのに有効であることを示している折れ線グラフ（上）と棒グラフ（下）であって、腫瘍接種日からの各日数における腫瘍体積（ｍｍ３）（上）、または、腫瘍接種から４５日目の腫瘍重量（グラム）によって測定したものである。
【図６】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８で処置した動物で、明らかな毒性が認められなかったことを示しているグラフであって、腫瘍接種からの各日数における重量（ｇ）によって測定したものである。
【図７】大きなＷｉｄｒ腫瘍の治療における、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８の様々な投与量および投与のタイミングの効能を示しているグラフであって、腫瘍接種日からの各日数における腫瘍体積（ｍｍ３）によって測定したものである。
【図８】Ｗｉｄｒ腫瘍の抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８に対する用量応答を示しているグラフであって、腫瘍接種日からの各日数における腫瘍体積（ｍｍ３）によって測定したものである。
【図９】Ｗｉｄｒ腫瘍の抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８に対する用量応答を示しているグラフであって、腫瘍接種日からの各日数における試験体のコントロールに対する比率（％）によって測定したものである。
【図１０】様々な用量の抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８で処置した動物で、明らかな毒性が認められなかったことを示しているグラフであって、腫瘍接種日からの各日数における体重変化率（％）によって測定したものである。
【図１１】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３およびＰ４Ａ８がインビボにおいて、乳腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１を治療するのに有効であることを示しているグラフであって、腫瘍接種日からの各日数における腫瘍体積（ｍｍ３）によって測定したものである。
【図１２】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ４Ａ８とＰ２Ｄ３が、複数の種（ヒト（ｈｕ）、マウス（ｍｕ）、およびカニクイザル（ｃｙｎｏ））に由来するＦｎ１４に対する交差反応性を有することを示しているグラフである。
【図１３】Ｐ４Ａ８では、野生型Ｆｎ１４と比べて、突然変異部Ｗ４２Ａを有するヒトＦｎ１４に対する結合が有意に低いことを示しているヒストグラムである。
【図１４Ａ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１４Ｂ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１４Ｃ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１４Ｄ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１４Ｅ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１４Ｆ】抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ａ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｂ）、抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｃ）、抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｄ）、抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｅ）、および抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのＤＮＡ配列（図１４Ｆ）である。
【図１５】ｈＰ４Ａ８ＩｇＧ１とｈＰ４Ａ８ＩｇＧ１の多量体型がインビトロにおいて、結腸癌細胞ＷｉＤｒを殺すことを示しているグラフであって、ＭＴＴアッセイによって測定したものである。
【図１６】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｄ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８が、ヒト表面Ｆｎ１４とカニクイザル表面Ｆｎ１４に、同程度のＥＣ５０値で結合することを示しているグラフである。
【図１７】抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｄ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８がマウス表面Ｆｎ１４に、同程度のＥＣ５０値で結合することを示しているグラフである。
【図１８Ａ】異なる重鎖エフェクター機能を有するｈｕＰ４Ａ８変異体が、ヒトＦｎ１４（図１８Ａ）とラットＦｎ１４（図１８Ｂ）に、同程度のＥＣ５０値で結合することを示しているグラフである。
【図１８Ｂ】異なる重鎖エフェクター機能を有するｈｕＰ４Ａ８変異体が、ヒトＦｎ１４（図１８Ａ）とラットＦｎ１４（図１８Ｂ）に、同程度のＥＣ５０値で結合することを示しているグラフである。
【図１９Ａ】Ｐ４Ａ８が、ヒト、カニクイザル、およびマウスの表面Ｆｎ１４には結合するが、アフリカツメガエルＦｎ１４には結合しないことを示しているヒストグラムである。
【図１９Ｂ】融合タンパク質Ｆｃ−ｈｕＴＷＥＡＫが、ヒト、カニクイザル、マウス、およびアフリカツメガエルの表面Ｆｎ１４に結合することを示しているヒストグラムである。
【図１９Ｃ】融合タンパク質ｍｕＦｃ−ｍｕＴＷＥＡＫが、ヒト、カニクイザル、マウス、およびアフリカツメガエルの表面Ｆｎ１４に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２０】Ｆｎ１４の細胞外ドメインのギャップ付きアラインメントである。
【図２１Ａ】Ｆｃ−ＴＷＥＡＫが突然変異体Ｆｎ１４  Ｗ４２Ａのすべてに結合することを示しているヒストグラムである。
【図２１Ｂ】Ｗ４２Ａへの突然変異によってＰ４Ａ８のＦｎ１４への結合が無効になることを示しているヒストグラムである。
【図２２】残基Ｗ４２が、巨大な疎水性残基Ｗ４２ＦまたはＷ４２Ｙに突然変異すると、Ｐ４Ａ８のＦｎ１４への結合が正常な状態に回復することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ａ】Ｆｃ−ＴＷＥＡＫが、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｂ】Ｐ４Ａ８が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｃ】Ｐ３Ｇ５が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｄ】Ｐ２Ｄ３が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｅ】ＩＴＥＭ−１が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｆ】ＩＴＥＭ−４が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｇ】ＩＴＥＭ−２が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２３Ｈ】ＩＴＥＭ−３が、ヒトＦｎ１４の一連の点突然変異体に結合することを示しているヒストグラムである。
【図２４】様々な型のｈｕＰ４Ａ８が、ｃｈＰ４Ａ８と同等であることを示しているグラフであって、２９３Ｅ細胞で一過性に過剰発現させた表面ヒトＦｎ１４への直接結合性をＦＡＣＳ（希釈滴定）によってアッセイしたものである。
【図２５】様々な型のｈｕＰ４Ａ８が、ｃｈＰ４Ａ８と本質的に同等なＦｎ１４結合親和性を保持していたことを示しているグラフであって、競合ＥＬＩＳＡによってアッセイしたものである。
【図２６】ｈＰ４Ａ８とｈＰ４Ａ８の多量体型（ｈＰ４Ａ８−ｍｕｌｔｉ）による刺激に応答して、ＷｉＤｒ細胞でカスパーゼ３／７が活性化することを示しているグラフである。
【図２７】Ｐ４Ａ８に応答して、ＷｉＤｒ細胞で転写因子ＮＦκＢが誘発されることを示しているグラフである。
【図２８】ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１と、Ｆｃの機能が弱められた型のＰ４Ａ８（ｈＰ４Ａ８−ＩｇＧ１ａｇｌｙおよびｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ）のＡＤＣＣ活性を示しているグラフである。.
【図２９】Ｐ４Ａ８ｈＩｇＧ１とＰ４Ａ８ｈＩｇＧ４ＰａｇｌｙをＷｉＤｒおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１にインビボ投与したアッセイの結果を示しているグラフである。
【図３０】ヒト結腸腫瘍細胞ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウスに様々な用量で投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３１】ヒト結腸腫瘍細胞ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウスに様々な用量で投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３２】ヒト結腸腫瘍細胞ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウスに様々な用量で投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３３】乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持ＳＣＩＤマウスに様々な用量で投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３４】乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持ＳＣＩＤマウスに様々な用量で投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３５】胃癌細胞Ｈｓ７４６Ｔ異種移植片モデルでのヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１の効能を示しているグラフである。
【図３６】胃癌細胞Ｈｓ７４６Ｔ異種移植片モデル（図３６Ａ）と胃癌細胞Ｎ８７異種移植片モデル（図３６Ｂ）でのヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１の効能を示しているグラフである。
【図３７】ヒト結腸腫瘍細胞ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウスに様々な投与スケジュールで投与した抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のインビボでの効能を示しているグラフである。
【図３８Ａ】一連の抗体が、抗体Ｐ２Ｄ３のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする能力を示しているグラフである。
【図３８Ｂ】一連の抗体が、抗体Ｐ３Ｇ５のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする能力を示しているグラフである。
【図３８Ｃ】一連の抗体が、抗体Ｐ４Ａ８のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする能力を示しているグラフである。
【図３８Ｄ】一連の抗体が、抗体ＩＴＥＭ−４のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする能力を示しているグラフである。
【図３８Ｅ】一連の抗体が、抗体ＩＴＥＭ−３のヒトＦｎ１４への結合を交差ブロックする能力を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
Ｐ４Ａ８、Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８は、ヒトＦｎ１４に特異的に結合すると共に、Ｆｎ１４活性を作動させるか、または、細胞表面上のＦｎ１４にＴＷＥＡＫが結合することに起因する活性の少なくともいくつかを模倣する典型的な抗体である。Ｐ２Ｄ３およびＰ３Ｄ８は、同じアミノ酸配列を有することが分かっている。本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体は、例えば、カスパーゼ依存性アポトーシスのようなアポトーシス、および／または、内因性ＴＮＦ−α媒介性細胞死によって細胞殺滅を誘発すると共に、Ｆｎ１４が発現している癌などの疾患を治療または予防する目的で用いることができる。
【００７８】
Ｆｎ１４
Ｆｎ１４は、ＦＧＦ誘導性受容体である。正常組織の細胞上に低レベルで発現する場合が多く、損傷もしくは疾患の際に、または、癌（例えば腫瘍）細胞上でアップレギュレートする場合がある。理論に束縛されなければ、Ｆｎ１４のリガンド（例えばＴＷＥＡＫ）によってＦｎ１４が刺激されると、腫瘍細胞死を誘発することができると共に、抗Ｆｎ１４抗体も、腫瘍細胞を殺傷するのに有効であると考えられている。また、Ｆｎ１４はヒト腫瘍内で過剰発現するとも考えられている。抗Ｆｎ１４抗体は、腫瘍細胞死を引き起こすことができるので、治療上、癌を治療するのに有益である場合がある。
【００７９】
ヒトＦｎ１４の配列は以下の通りである。
【００８０】
ＭＡＲＧＳＬＲＲＬＬＲＬＬＶＬＧＬＷＬＡＬＬＲＳＶＡＧＥＱＡＰＧＴＡＰＣＳＲＧＳＳＷＳＡＤＬＤＫＣＭＤＣＡＳＣＲＡＲＰＨＳＤＦＣＬＧＣＡＡＡＰＰＡＰＦＲＬＬＷＰＩＬＧＧＡＬＳＬＴＦＶＬＧＬＬＳＧＦＬＶＷＲＲＣＲＲＲＥＫＦＴＴＰＩＥＥＴＧＧＥＧＣＰＡＶＡＬＩＱ（配列番号１）
更なるＦｎ１４のタンパク質配列としては、マウスＦｎ１４（例えばＮＣＢＩ受託番号ＡＡＦ０７８８２またはＮＰ＿０３８７７７またはＱ９ＣＲ７５またはＡＡＨ２５８６０）、ヒトＦｎ１４（例えばＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０５７７２３またはＢＡＡ９４７９２またはＱ９ＮＰ８４またはＡＡＨ０２１７８またはＡＡＦ６９１０８）、ラットＦｎ１４（例えばＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿８５１６００またはＡＡＨ６０５３７）、およびアフリカツメガエルＦｎ１４（例えばＮＣＰＩ受託番号ＡＡＲ２１２２５またはＮＰ＿００１０８３６４０）が挙げられる。これらのＦｎ１４タンパク質を、例えば免疫原として用いて、抗Ｆｎ１４抗体を調製することができる。続いて、本明細書に記載されているように、これらの抗Ｆｎ１４抗体をスクリーニングして、アゴニスト抗体を同定することができる。
【００８１】
抗Ｆｎ１４抗体
本開示は、Ｐ４Ａ８、Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８のような抗Ｆｎ１４アゴニスト抗体の具体例の配列を含む。上記のような特定的な抗体は例えば、当該アミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製して発現させることによって、または、ヒト生殖系列遺伝子を突然変異させて、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子をもたらすことによって、作製することができる。さらに、上記の抗体および他の抗Ｆｎ１４抗体（例えばアゴニスト抗体）は、例えば下記の諸方法のうちの１つもしくは複数の方法を用いて製造することができる。
【００８２】
抗体、特にヒト抗体を得るには、多数の方法を利用することができる。１つの例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージまたはリボゾームディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９２／１５６７９号、国際公開第９３／０１２８８号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／０９６９０号、および国際公開第９０／０２８０９号に記載されている。Ｆａｂ’をファージ上に提示させることは、例えば、米国特許第５，６５８，７２７号、同第５，６６７，９８８号、および同第５，８８５，７９３号に記載されている。
【００８３】
ディスプレイライブラリーの利用に加えて、別の方法を用いて、Ｆｎ１４結合抗体を得ることができる。例えば、Ｆｎ１４タンパク質またはそのペプチドを、非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、またはラットなどにおいて抗原として用いることができる。加えて、細胞表面のＦｎ１４タンパク質と有効に結合する抗体を産生させる手段として、Ｆｎ１４をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞を非ヒト動物に注射することができる。
【００８４】
１つの実施態様では、上記の非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片によって、マウス抗体の産生ができないマウス株を遺伝子工学技術で作ることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製および選択してよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号、国際公開第９６／３４０９６号、および国際公開第９６／３３７３５号を参照されたい。
【００８５】
別の実施形態では、モノクローナル抗体を上記の非ヒト動物から得てから修飾、例えば、ヒト化または脱免疫する。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されているヒト化抗体を調製する目的で用いてよい例示的なＣＤＲ移植法を説明している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全部または一部を、非ヒト抗体の少なくとも一部と置換してよい。Ｆｎ１４に結合する有用なヒト化抗体を得るには、結合のために欠かせないＣＤＲ、またはそのようなＣＤＲの結合決定基を置換するだけでよい場合もある。
【００８６】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の対応する配列と置換することによって生成することができる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、ならびに、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，８５９，２０５号、および米国特許第６，４０７，２１３号によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離、操作、および発現させることを含む。このような核酸の供給源は当業者には周知であり、例えば、上述のように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子、または合成構築体から得てよい。続いて、ヒト化抗体をコードする組み換えＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８７】
ヒト生殖細胞系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７−２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン配列の包括的ディレクトリーを提供している（英国ケンブリッジ、ＭＲＣプロテイン・エンジニアリング・センター（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．らがコンパイル）。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域およびＣＤＲ用のヒト配列の供給源として用いることができる。共通ヒトフレームワーク領域も、例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されているように用いることができる。
【００８８】
また、非ヒトＦｎ１４結合抗体も、国際公開第９８／５２９７６号および国際公開第００／３４３１７号に開示されている方法によって、ヒトＴ細胞エピトープを特異的に欠失させること、すなわち「脱免疫」することによって修飾してよい。簡潔に言うと、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを解析することができ、これらのペプチドは、（国際公開第９８／５２９７６号および国際公開第００／３４３１７号に定義されているような）潜在的Ｔ細胞エピトープを表す。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出には、「ペプチドスレッディング」というコンピューターモデリング法を利用することができ、加えて、国際公開第９８／５２９７６号および国際公開第００／３４３１７号に記載されているように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースで、ＶＨおよびＶＬの配列に存在するモチーフについて検索することもできる。これらのモチーフは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲの１８種類の主要なアロタイプのいずれかに結合し、その結果、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変領域内の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、１つのアミノ酸を置換することによって削除することができる。可能な限り、保存的置換を行う。ヒト生殖細胞系列抗体の配列中のある位置に共通のアミノ酸を用いてよい場合が多いが、これに限らない。脱免疫変化を同定した後、突然変異誘発またはその他の合成法（例えば、デノボ合成、カセット置換など）によって、ＶＨとＶＬをコードする核酸を構築することができる。突然変異を誘発させた可変領域は任意で、ヒト定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域に融合させることができる。
【００８９】
場合によっては、潜在的Ｔ細胞エピトープは、抗体機能にとって重要であることが知られているか、または予測される残基を含むことになる。例えば、潜在的Ｔ細胞エピトープは通常、ＣＤＲの方に偏っている。加えて、潜在的Ｔ細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基内に生じることがある。これらの潜在的エピトープを削除するための変更には、場合によっては、さらなる精査、例えば、変更した鎖と変更のない鎖を作製して試験することによる精査が必要になる。可能な場合、ＣＤＲと重複する潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＣＤＲ以外での置換によって削除することができる。場合によっては、ＣＤＲ内での改変が唯一の選択肢であり、したがって、この置換を行った場合と行わなかった場合の変異体を試験することができる。別のケースでは、潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために必要な置換は、抗体の結合にとって非常に重要であり得るフレームワーク内の残基位置での置換である。これらのケースでは、この置換を行った場合と行わなかった場合の変異体を試験する。したがって、場合によっては、いくつかの異なる脱免疫化重鎖可変領域および軽鎖可変領域を設計し、重鎖と軽鎖の様々な組合せを試験して、最適な脱免疫化抗体を同定する。続いて、種々の変異体の結合親和性について、脱免疫化の程度、特に、可変領域に残存する潜在的Ｔ細胞エピトープの数と併せて検討することによって、最終的な脱免疫化抗体の選択を行うことができる。脱免疫化を用いて、どんな抗体、例えば、非ヒト配列を含む抗体、例えば、合成抗体、マウス抗体、その他の非ヒトモノクローナル抗体、またはディスプレイライブラリーから単離した抗体、も修飾することができる。
【００９０】
また、抗体をヒト化する別の方法を用いることもできる。例えば、別の方法では、抗体の三次元構造、結合決定基と三次元的に近接しているフレームワーク位置、および免疫原性ペプチド配列を説明することができる。例えば、国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号、および同第６，４０７，２１３号、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１を参照されたい。さらに別の方法は、「ヒューマニアリング（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）」というものであり、例えば、米国特許出願公開第２００５−００８６２５号に記載されている。
【００９１】
本発明の抗体は、ヒトＦｃ領域、例えば、野生型Ｆｃ領域、または、１つもしくは複数の改変を含むＦｃ領域を含むことができる。１つの実施形態では、定常領域を改変、例えば、突然変異させて、抗体の特性を修正する（例えば、Ｆｃ受容体への結合性、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうち一つもしくは複数を増大または低下させる）。例えば、ヒトＩｇＧ１の定常領域を１つもしくは複数の残基、例えば、２３４番目および２３７番目の残基のうちの１つもしくは複数の残基で突然変異させることができる。抗体は、重鎖のＣＨ２領域に、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体への結合および補体活性化の機能を低下または改変させる突然変異を有してよい。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載されているような突然変異を有してよい。また、抗体は、当該技術分野（例えばＡｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８）において開示されているような、ＩｇＧ４のヒンジ領域における突然変異のように、免疫グロブリンの２本の重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる突然変異を有してもよい。米国特許出願公開第２００５−００３７０００号も参照されたい。
【００９２】
親和性の成熟
１つの実施形態では、例えば突然変異誘発によって抗Ｆｎ１４抗体を修飾して、さまざまな修飾抗体をもたらす。続いて、これらの修飾抗体を評価して、機能特性が改変された抗体（例えば、結合性が向上した抗体、安定性が向上した抗体、抗原性が低下した抗体、またはインビボでの安定性が向上した抗体）を１種もしくは複数種同定する。１つの実施態様では、ディスプレイライブラリー技術を用いて、該さまざまな修飾抗体を選別つまりスクリーニングする。続いて、例えば、さらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、第２のライブラリーから、さらに親和性の高い抗体を同定する。他のスクリーニング技法も用いることができる。
【００９３】
いくつかの実施態様では、該突然変異誘発は、結合界面にあることが知られているか、またはその可能性が高い領域を標的にする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合には、突然変異誘発は、本明細書に記載されているように、重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域を対象にすることができる。さらに、突然変異誘発は、ＣＤＲに近いかまたは隣接するフレームワーク領域、例えば、特定的にはＣＤＲ接合部から１０、５、または３アミノ酸以内にあるフレームワーク領域を対象にすることができる。抗体の場合には、突然変異誘発は、例えば段階的な改善を行う目的で、ＣＤＲの１個または数個に限定することもできる。
【００９４】
１つの実施形態では、突然変異誘発を用いて、抗体を１つもしくは複数の生殖細胞系列配列にさらに近づける。１つの例示的な生殖細胞系列化法は、単離抗体の配列と類似する（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似する）１つもしくは複数の生殖細胞系列配列を同定することを含むことができる。続いて、単離抗体で突然変異（アミノ酸レベルの突然変異）を漸増的な形、組み合わせた形、またはこの双方の形で起こすことができる。例えば、考え得る生殖細胞系列突然変異の一部または全部をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作製する。続いて、該突然変異抗体を評価して、例えば、単離抗体と比べた場合に１つもしくは複数の追加の生殖細胞系列残基を有し、かつ、有用なままである（例えば機能活性を有する）抗体を同定する。１つの実施形態では、可能なかぎり多くの生殖細胞系列残基を単離抗体に導入する。
【００９５】
１つの実施形態では、突然変異誘発を用いて、ＣＤＲ領域に生殖細胞系列残基を１つもしくは複数置換または挿入する。例えば、生殖細胞系列のＣＤＲ残基は、修飾される可変領域と類似する（例えば最も類似する）生殖細胞系列配列に由来し得る。突然変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合活性またはその他の機能活性）を評価して、生殖細胞系列残基が許容されるかを判定ことができる。同様の突然変異誘発をフレームワーク領域内で行うことができる。
【００９６】
生殖細胞系列配列の選択は、様々な方法で行うことができる。例えば、生殖細胞系列配列が、選択性または類似性に関する所定の基準、例えば、非ヒトドナー抗体と特定の比率、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるという基準、に適合すれば、その生殖細胞系列配列を選択することができる。この選択は、少なくとも２個、３個、５個、または１０個の生殖細胞系列配列を用いて行うことができる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合には、類似の生殖細胞系列配列の同定は、生殖細胞系列配列を１つ選択することを含むことができる。ＣＤＲ３の場合には、類似の生殖細胞系列配列の同定は、生殖細胞系列配列を１つ選択することを含むことができるが、アミノ末端部分およびカルボキシル末端部分に別々に寄与する２つの生殖細胞系列配列を用いることも含んでもよい。別の実施態様では、２個以上または３個以上の生殖細胞系列配列を用いて、例えば、コンセンサス配列を形成する。
【００９７】
２つの配列間の「配列同一率」の算出は、以下のように行う。最適な比較を行う目的で、当該配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に、ギャップを挿入することができると共に、比較する目的上、非相同配列を無視することができる）。Ｂｌｏｓｓｕｍ６２というスコアリング行列を有するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて、ギャップペナルティーを１２、ギャップ伸長ペナルティーを４、フレームシフトギャップペナルティーを５として、最適なアラインメントを最高スコアとして判定する。続いて、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、当該分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一率（％）は、当該配列によって共有されている同一の位置の数の関数である。
【００９８】
別の実施形態では、該抗体を修飾して、改変されたグリコシル化パターン（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンから改変されたパターン）を有するようにしてよい。この文脈で用いる場合、「改変」とは、欠損した炭化水素部分を１つもしくは複数有し、および／または、元の抗体に付加されたグリコシル化部位を１つもしくは複数有することを意味する。本明細書に開示されている抗体にグリコシル化部位を付加することは、アミノ酸配列を改変して、グリコシル化部位のコンセンサス配列を含めることによって行ってよく、このような技法は、当該技術分野において周知である。抗体上の炭化水素部分の数を増やす別の手段は、グリコシドを抗体のアミノ酸残基に化学的または酵素的にカップリングすることによるものである。これらの方法は、例えば、国際公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９−３０６に記載されている。当該技術分野において説明されているように（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２、Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１、およびＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０）、抗体上に存在するどんな炭化水素部分の除去も、化学的または酵素的に行ってよい。サルベージ受容体結合エピトープを提供することによって半減期をインビボで延長する修飾については、例えば米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【００９９】
１つの実施形態では、抗体は、Ｐ４Ａ８、Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｇ５、またはＰ３Ｄ８のＣＤＲ配列とわずかしか異ならないＣＤＲ配列を有する。わずかな差異としては、ＣＤＲ、例えばＣｈｏｔｉａまたはＫａｂａｔのＣＤＲの配列中の典型的には５〜７番目のアミノ酸のいずれかのうちの１個または２個が置換されているようなわずかなアミノ酸変化が挙げられる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有する関連アミノ酸によって置換する。このような置換は、当業者の技量の範囲内である。ＣＤＲとは異なり、構造フレームワーク領域（ＦＲ）に対するより大きな変更は、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなく行うことができる。ＦＲに対する変更としては、非ヒト由来のフレームワークをヒト化すること、または、抗原との接触もしくは結合部位の安定化にとって重要なフレームワーク残基を遺伝子工学技術で作製すること、例えば、定常領域のクラスもしくはサブクラスを変更すること、Ｆｃ受容体への結合などのエフェクター機能を改変させる場合のある特定のアミノ酸残基を変更すること（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−６２、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−２４）、または、定常領域の由来元である種を変更することが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
当該抗Ｆｎ１４抗体は、完全長抗体の形態、または、抗体の断片の形態、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、およびｓｃＦｖ断片であり得る。抗体の断片は、可変領域、例えばＶＨまたはＶＬのような抗原結合断片であり得る。
【０１０１】
さらなる形態としては、単一の可変ドメイン、例えばラクダまたはラクダ化ドメインを含むタンパク質が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００５−００７９５７４号、およびＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（６）：５３１−７を参照されたい。
【０１０２】
本発明では、抗Ｆｎ１４と、その酸性変異体の１種もしくは複数種との混合物を含む組成物であって、例えば、その酸性変異体の量が、約８０％、７０％、６０％、６０％、５０％、４０％、３０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満である組成物を提供する。また、少なくとも１つの脱アミド部位を含む抗Ｆｎ１４を含む組成物であって、例えば、その抗Ｆｎ１４の少なくとも約９０％が脱アミド化されないように（すなわち、抗体の１０％未満が脱アミド化されるように）、その組成物のｐＨが約５．０〜約６．５である組成物も提供する。特定の実施形態では、これらの抗体の約５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が脱アミド化されている。上記のｐＨは、５．０〜６．０、例えば５．５または６．０であってよい。特定の実施形態では、該組成物のｐＨは、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５である。
【０１０３】
「酸性変異体」は、目的のポリペプチドの変異体のうち、（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーによって判定した場合に、）目的のポリペプチドよりも酸性である変異体である。酸性変異体の例は脱アミド化変異体である。
【０１０４】
ポリペプチド分子の「脱アミド化」変異体は、元のポリペプチドの１つもしくは複数のアスパラギン残基がアスパラギン酸に変換されたポリペプチド、すなわち、中性のアミド側鎖が、全体として酸性の特徴を有する残基に変換されたポリペプチドである。
【０１０５】
「混合物」という用語は、本明細書において、抗Ｆｎ１４抗体を含む組成物に関して使用する場合、所望の抗Ｆｎ１４抗体と、その酸性変異体の１種もしくは複数種が双方とも存在することを意味する。これらの酸性変異体は、大部分が脱アミド化された抗Ｆｎ１４抗体を、少量の他の酸性変異体（単一または複数）と共に含んでもよい。.
１つの実施形態では、脱アミド化部位（ＮＧ）内、または脱アミノ化部位の近くのアミノ酸を突然変異させて、抗体の脱アミド化を減少または排除する。例えば、ヒト化Ｐ４Ａ８の重鎖（配列番号１１）のＣＤＲ２は、５５位（Ｎ、すなわちＡｓｎ）および５６位（Ｇ、すなわちＧｌｙ）に脱アミド化部位（ＮＧ）を含む。抗体の脱アミド化を減少または排除する目的で、配列番号１１のＣＤＲ２を含む抗体（または本明細書に記載されているその変異体）のＣＤＲ２内に、配列番号１１の５４位、５５位、または５６位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換基を導入することができる。この際、５４位はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐであり、５５位はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、５６位はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐである。ただし、５５位がＡｓｎである場合には、５６位はＧｌｙではない。例えば、脱アミド化部位ＮＧでは、ＮまたはＧのいずれか一方を別のアミノ酸に置換してよい。１つの実施形態では、５５位の該アスパラギン（Ｎ５５）をセリンで置換する（すなわちＣＤＲ２のＮ５５Ｓ突然変異）。類似体の追加的な例としては、５４位がＧｌｙ、５５位がＡｓｎ、５６位がＶａｌのもの、５４位がＧｌｙ、５５位がＡｓｎ、５６位がＡｌａのもの、５４位がＧｌｙ、５５位がＡｓｐ、５６位がＧｌｙのもの、５４位がＧｌｙ、５５位がＧｌｎ、５６位がＧｌｙのもの、５４位がＧｌｙ、５５位がＡｌａ、５６位がＧｌｙのもの、５４位がＧｌｙ、５５位がＧｌｙ、５６位がＧｌｙのもの、５４位が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐからなる群から選択され、５５位がＡｌａであり、５６位がＧｌｙであるもの、５４位が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐからなる群から選択され、５５位がＧｌｙであり、５６位がＧｌｙであるものが挙げられる（例えば国際公開第２００３／０７３９８２号を参照されたい）。
【０１０６】
特定の実施形態では、脱アミド化を排除する目的で突然変異させた抗体の結合親和性（ＫＤ）、会合速度（ＫＤ  ｏｎ）、および／または解離速度（ＫＤ  ｏｆｆ）は、野生型抗体のものと同程度であり、例えば、その差異は、約５倍、２倍、１倍（１００％）、５０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満である。
【０１０７】
特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体は血管新生を阻害する。あるいは、抗Ｆｎ１４抗体は、血管新生を刺激しても、血管新生に対する作用を及ぼさなくてもよい。血管新生に対する作用は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイ、例えば、ＨＵＶＥＣ細胞に対する内皮増殖アッセイ、または、角膜ポケットアッセイ、創傷閉鎖アッセイ、および当該技術分野において既知の他のアッセイで判定することができる。
【０１０８】
抗体断片
従来、抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質分解によって得ていた。この代わりに、これらの抗体断片は、組み換え宿主細胞によって直接産生させることもできる。抗体断片Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖはいずれも、大腸菌で発現させ、大腸菌から分泌させることができるので、これらの断片を大量に容易に製造することができる。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することができると共に、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ'）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ'）２断片は、組み換え宿主細胞の培養液から直接単離することができる。インビボ半減期が延長しており、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ'）２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＦｖとｓｃＦｖは、定常領域がない無傷の結合部位を含むので、インビボで使用中に非特異的結合を減少させるのに適している。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか一方にエフェクタータンパク質を融合できる。該抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体断片は、単一特異性であっても双特異性であってもよい。
【０１０９】
双特異性抗体
双特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な双特異性抗体は、Ｆｎ１４タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他の双特異性抗体は、Ｆｎ１４の結合部位と他のタンパク質の結合部位を兼ね備えることができる。あるいは、細胞防御機構をＦｎ１４発現細胞に集中および限局化させるように、抗Ｆｎ１４アームを、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）のような白血球上のトリガー分子、または、Ｆｃ−γ−ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ−γ−ＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃ−γ−ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧのＦｃ受容体（Ｆｃ−γ−Ｒ）に結合するアームと組み合わせてもよい。双特異性抗体を用いて、Ｆｎ１４を発現する細胞に細胞毒性剤を限局化することもできる。これらの抗体は、Ｆｎ１４結合アームと、細胞毒性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。双特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ'）２双特異性抗体）として調製することができる。
【０１１０】
完全長双特異性抗体の従来の作製法は、重鎖と軽鎖が異なる特異性を有する２対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を共発現させることに基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。異なるアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合には、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主細胞に同時トランスフェクションする。これによって、３つのポリペプチド断片の割合を調節する際の柔軟性が大きくなる。しかしながら、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することによって、高い収率が得られるときには、２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することもできる。
【０１１１】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面を遺伝子工学技術で作製して、組み換え細胞培養液から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化することができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面から得られる１つもしくは複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置換する。大きなアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）に置換することによって、大きな側鎖と同じまたは同等の大きさの代償性「空隙」を第２の抗体分子の界面上に作製する。これによって、ホモダイマーのような不要な他の最終産物と比べて、ヘテロダイマーの収量を増大させる機構が得られる。
【０１１２】
双特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体も挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート抗体には、アビジンに結合させることができるものもあれば、ビオチンに結合させることができるものもある。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の利便的な架橋法を用いて作製してよい。
【０１１３】
「ダイアボディー」技術は、双特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供する。該双特異性抗体断片は、短すぎて同一鎖上ではＶＨドメインとＶＬドメインとの対形成ができないリンカーによってＶＬに連結されているＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨドメインとＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインとＶＨドメインとの対形成を強いられ、それによって、２つの抗原部位が形成される。
【０１１４】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速くインターナリゼーション（および／または異化）することができる。本明細書に記載されている抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば四価抗体）であることができ、その抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸を組み換え発現させることによって、容易に製造することができる。この多価抗体は、二量化ドメインと３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。例示的な二量化ドメインは、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域を含む（または、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域からなる）。多価抗体は、３〜約８（例えば４）個の抗原結合部位を含む（または、３〜約８（例えば４）個の抗原結合部位からなる）ことができる。当該多価抗体は任意で、少なくとも１本のポリペプチド鎖（例えば少なくとも２本のポリペプチド鎖）を含み、このポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでよく、このＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域のポリペプチド鎖であり、Ｘ１とＸ２は、アミノ酸またはペプチドスペーサーを表しており、ｎは０または１である。
【０１１５】
抗体の産生
いくつかの抗体、例えばＦａｂ抗体は、細菌細胞、例えば大腸菌細胞内で産生させることができる。抗体は、真核生物細胞内でも産生させることができる。１つの実施形態では、これらの抗体（例えばｓｃＦｖ抗体）は、ピキア（例えば、Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５を参照されたい）、ハンゼヌラ、またはサッカロミセスのような酵母細胞内で発現させる。
【０１１６】
１つの好ましい実施形態では、抗体は、哺乳類細胞内で産生させる。抗体を発現させるための例示的な哺乳類細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているような選択可能なマーカーＤＨＦＲと共に用いるものを含む）、リンパ球細胞株、例えば骨髄腫細胞ＮＳ０、ＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、および、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳類に由来する細胞が挙げられる。例えば、この細胞は、哺乳類上皮細胞である。
【０１１７】
組み換え発現ベクターは、様々な免疫グロブリン領域をコードする核酸配列に加えて、宿主細胞内での該ベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）、および選択可能なマーカー遺伝子のような追加的な配列を含んでよい。該選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、該選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する。
【０１１８】
抗体発現用の例示的な系では、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション法によって、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。該組み換え発現ベクター内では、抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子をそれぞれ、エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素のように、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来するもの）に機能的に連結して、これらの遺伝子の高レベルの転写を促す。また、該組み換え体発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も含み、これによって、メトトレキセートによる選別／増幅法を用いて、該ベクターでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の選別が可能になる。選別した形質転換宿主細胞を培養して、該抗体の重鎖および軽鎖を発現可能にし、培養培地から該抗体を回収する。標準的な分子生物学的技法を用いて、該組み換え発現ベクターを調製し、該宿主細胞をトランスフェクションし、形質転換体を選別し、その宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧ結合マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。
【０１１９】
Ｆｃドメインを含む抗体の場合には、抗体産生系によって、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体が合成されるのが好ましい。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化する。このアスパラギンは、二分岐型オリゴ糖で修飾するための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγ受容体と補体Ｃ１ｑによって媒介されるエフェクター機能に必要であることが証明されている（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。１つの実施形態では、該Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳類発現系で産生させる。抗体のＦｃドメインまたは他の領域は、他の真核生物翻訳後修飾体を含むこともできる。
【０１２０】
また、抗体は、トランスジェニック動物によって産生させることもできる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号には、トランスジェニック動物の乳腺内で抗体を発現させる方法が記載されている。乳特異的プロモーターと、目的の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸とを含むトランスジーンを構築する。このようなトランスジェニック哺乳類の雌が産生した乳汁は、分泌した乳汁の中に、目的の抗体を含む。この抗体は、該乳汁から精製するか、または、いくつかの用途では直接使用する。また、動物は、本明細書に記載されている核酸の１つもしくは複数の核酸を含むように準備する。
【０１２１】
特性付け
抗体の結合特性は、いずれかの標準的な方法、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、Ｘ線結晶構造解析、配列解析、および走査型突然変異誘発といった方法のうちの１つによって測定できる。抗体は、Ｆｎ１４の１つもしくは複数の活性を促す（例えば、Ｆｎ１４のシグナル伝達を促す）ことを示す統計的に有意な作用を有することが好ましい。
【０１２２】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）
目的のタンパク質と標的（例えばＦｎ１４）との結合相互作用は、ＳＲＰを用いて解析することができる。ＳＰＲまたはＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）は、いずれの相互作用体も標識しなくても、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。該ＢＩＡチップの結合表面において質量変化が起きる（結合が起きたことの指標となる）と、表面付近で光の屈折率に変化が生じる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）。屈折率が変化すると、検出可能な信号が発生し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。ＳＰＲを用いる方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号、Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５、およびバイアコア・インターナショナル社（スウェーデン、ウプサラ）の提供するオンライン資料に記載されている。ＳＰＲで得た情報を用いて、生体分子の標的への結合に関して、平衡解離定数（Ｋｄ）、ならびに、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む速度パラメーターを正確かつ定量的に測定することができる。
【０１２３】
また、バイアコアのクロマトグラフィー技法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，“ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇ”，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３．２，（Ｍａｙ  １９９４）を参照。Ｊｏｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０：１９１−１９８も参照されたい）を用いて、Ｆｎ１４（例えばヒトＦｎ１４）への結合をめぐって相互に競合し合う様々な抗体の能力を評価することによって、エピトープを直接マッピングすることもできる。例えばウエスタンブロットおよび免疫沈降アッセイで抗体を評価するための更なる総合的な手引きは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８８））で見出すことができる。
【０１２４】
アゴニスト抗体
Ｆｎ１４に結合する抗体を同定したら、それらの抗体がＦｎ１４のアゴニストであるかを判定する目的で、抗体をアッセイすることができる。抗Ｆｎ１４抗体が、Ｆｎ１４のシグナル伝達の下流作用を増大または活性化する（例えば、天然のリガンド（例えばＴＷＥＡＫ）によるＦｎ１４への結合部よりも下流のイベントを増大または活性化する）か、または、天然のリガンド（例えばＴＷＥＡＫ）のＦｎ１４への結合によって生じる作用を模倣する能力について、抗Ｆｎ１４抗体を評価することができる。同タイプの作用が生じる限りは、上記の模倣は、天然リガンドの作用と同程度であることも、天然リガンド作用と多少の程度の差があることもできる。
【０１２５】
例えば、Ｆｎ１４発現細胞（例えば、結腸癌細胞ＷｉＤｒのような癌細胞）の細胞殺滅を誘発または増大する能力について、抗体を評価することができる。別の実施形態では、Ｆｎ１４発現細胞（例えばＡ３７５細胞）でのＩＬ−８の分泌を誘発または増大する能力、ＮＦ−κＢ  ｐ５２および／または細胞周期阻害因子ｐ２１  Ｗａｆｌ／Ｃｉｐｌの発現またはタンパク質レベルを誘発または増加させる能力について、抗体を評価する。
【０１２６】
本明細書に記載されているように癌を治療する目的で、マウスまたはヒト化Ｐ４Ａ８の活性と同程度の活性を有する抗体、例えば、同じ量で、マウスまたはヒト化Ｐ４Ａ８が生む作用の少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の作用を生む抗体を用いてよい。例えば、癌を治療する目的で、Ｐ４Ａ８によって産生されるＩＬ−８の量の少なくとも約５０％の量のＩＬ−８の産生を誘発する抗Ｆｎ１４抗体、Ｐ４Ａ８の少なくとも５０％の有効性で細胞殺滅を誘発する抗体、および、Ｐ４Ａ８によって産生される量の少なくとも約５０％の量でのＮＫ−κＢ  ｐ５２またはｐ２１の発現を誘発する抗体をそれぞれ用いることができる。当然ながら、Ｐ４Ａ８または本明細書に記載されているほかの抗体の活性よりも強力な活性を有する抗体も、本発明に包含される。
【０１２７】
寄託
モノクローナル抗体１．Ｐ４Ａ８．３Ｃ７（Ｐ４Ａ８）、モノクローナル抗体１．Ｐ３Ｇ５.１Ｅ４（Ｐ３Ｇ５）、およびモノクローナル抗体１.Ｐ２Ｄ３．３Ｄ５（Ｐ２Ｄ３）を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、２００９年４月７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたものであり、それらの受託番号は、ＰＴＡ−９９４７（Ｐ４Ａ８）、ＰＴＡ−９９４９（Ｐ３Ｇ５）、およびＰＴＡ−９９４８（Ｐ２Ｄ３）である。寄託物の状態が原因で、寄託機関が、本明細書に基づいて発行される特許の存続期間の満了前に、請求に応じてサンプルを提供できない場合には、出願人は、その寄託物を差し替える義務を認める。また、出願人は、当該寄託物が一般に公開されることになる当該特許の発行について、ＡＴＣＣに通知する責任も認める。当該特許の発行前に、米国特許法施行規則第１．１４条、および米国特許法第１１２条の条項に基づき、特許庁長官に当該寄託物が入手可能となる。
【０１２８】
エフェクター機能を低下させた抗体
抗体および抗体−抗原複合体と、免疫系の細胞との相互作用は、様々な応答（本明細書ではエフェクター機能という）を引き起こす。ＩｇＧ抗体は、細胞表面のＦｃγ受容体ファミリーのメンバーおよび補体系のＣ１ｑに結合することによって、免疫系のエフェクター経路を活性化する。クラスター化した抗体によるエフェクタータンパク質のライゲーションによって、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の調節、エンドサイトーシス、および細胞殺滅を含む様々な応答が生じる。いくつかの臨床用途では、これらの応答は、モノクローナル抗体の効能に不可欠である。他の用途では、これらの応答は、炎症および抗原担持細胞の排除などの望ましくない副作用を引き起こす。したがって、本発明はさらに、エフェクター機能を改変させた、例えば低下させたＦｎ１４結合タンパク質（抗体を含む）に関する。
【０１２９】
本発明の抗Ｆｎ１４抗体のエフェクター機能は、多くの既知のアッセイのうちの１つを用いて確定してよい。該抗Ｆｎ１４抗体のエフェクター機能は、第２の抗Ｆｎ１４抗体よりも低下している場合がある。いくつかの実施形態では、この第２の抗Ｆｎ１４抗体は、Ｆｎ１４に特異的に結合する任意の抗体であってもよい。別の実施形態では、該第２のＦｎ１４特異的抗体は、Ｐ４Ａ８のような本発明の抗体のどの抗体であってもよい。別の実施形態では、目的の抗Ｆｎ１４抗体を修飾して、エフェクター機能を低下させた場合には、該第２の抗Ｆｎ１４抗体は、目的の抗Ｆｎ１４抗体の未修飾型または親型であってよい。
【０１３０】
例示的なエフェクター機能としては、Ｆｃ受容体への結合、食作用、アポトーシス、炎症誘発性応答、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。他のエフェクター機能としては、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＣＤＤ）（これによって、抗体が、細胞障害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはマクロファージ上のＦｃ受容体に結合して、細胞死をもたらす）、および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）（補体カスケードの活性化によって誘導される細胞死）が挙げられる（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）、Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５）、およびＲａｖｅｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）で概説されている）。このようなエフェクター機能には一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わされていることが必要であり、このエフェクター機能は、当技術分野において既知である標準的なアッセイを用いて評価することができる（例えば、国際公開第０５／０１８５７２号、国際公開第０５／００３１７５号、および米国特許第６，２４２，１９５号を参照されたい）。
【０１３１】
エフェクター機能は、Ｆｃドメインが欠損した抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２、または単鎖Ｆｖを用いることによって回避することができる。代替策は、ＦｃγＲＩに結合するが、Ｃ１ｑならびにＦＣγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩには十分には結合しないＩｇＧ４サブタイプ抗体を用いることであった。ＩｇＧ２サブタイプも、Ｆｃ受容体への結合性が低いが、ＦｃγＲＩＩａのアロタイプＨ１３１と、Ｃ１ｑへの有意な結合性を保持している。したがって、すべてのＦｃ受容体およびＣ１ｑへの結合を排除するには、Ｆｃ配列のさらなる変更が必要である。
【０１３２】
ＡＤＣＣを含むいくつかの抗体エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。抗体の特定のＦｃＲに対する親和性、およびその結果、その抗体によって媒介されるエフェクター活性は、抗体のＦｃ領域および/または定常領域のアミノ酸配列および/または翻訳後修飾体を改変することによって調節できる。
【０１３３】
ＦｃＲは、免疫グロブリンのアイソタイプに対する特異性によって定義される。すなわち、ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥのＦｃ受容体はＦｃεＲ、ＩｇＡのＦｃ受容体はＦｃαＲなどという。ＦｃγＲでは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）という３つのサブクラスが同定されている。ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩにはいずれも、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）という２つのタイプがある。ＦｃγＲの各サブクラスは、２つまたは３つの遺伝子によってコードされると共に、選択的ＲＮＡスプライシングによって、多数の転写産物が生じるため、ＦｃγＲアイソフォームに広範な多様性が存在する。例えば、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）には、ＩＩａ、ＩＩｂ１、ＩＩｂ３、およびＩＩｃというアイソフォームが含まれる。
【０１３４】
ヒト抗体とマウス抗体上にあるＦｃγＲ結合部位は、２３３〜２３９番目の残基（ＫａｂａｔらのＥＵインデックス番号、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ｗｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３１９−３３０（１９８６）、Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３（１９８８）、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１（１９９１）、Ｃｈａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：９０３６−９０４０（１９９１））からなるいわゆる「ヒンジ領域下流」にすでにマッピングされている。２３３〜２３９番目の残基のうち、結合に関与すると考えられるものとしては、Ｐ２３８およびＳ２３９が挙げられる。ＦｃγＲへの結合に関与すると考えられるものとして既に挙げられている他の領域は、ヒトＦｃγＲＩに対するＧ３１６〜Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）（配列比較のみによるものであり、置換変異体の評価は行われていない）（Ｗｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３１９−３３０）（１９８６））、ヒトＦｃγＲＩＩＩに対するＫ２７４〜Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１）（ペプチドベース）（Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４３−５１（１９８４））、およびヒトＦｃγＲＩＩＩに対するＹ４０７〜Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（ペプチドベース）（Ｇｅｒｇｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１２：７３９−７４３（１９８４）、およびＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｌａｚａｒ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０３：４００５−４０１０（２００６）。ＦｃＲへの結合に関与するアミノ酸残基の上記および他のストレッチまたは領域は、Ｉｇ−ＦｃＲ複合体の結晶構造を調べれば、当業者には明らかであろう（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６（６７９３）：２６７−３３、およびＳｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８１−６を参照されたい）。したがって、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、上記の残基のちの１つもしくは複数の残基を修飾させたものを含む。
【０１３５】
ｍＡｂのエフェクター機能を低下させるための他の既知のアプローチとしては、エフェクター結合相互作用に関与する、ｍＡｂ表面上のアミノ酸を突然変異させること（Ｌｕｎｄ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２６５７−６２、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４、および、異なるサブタイプ配列セグメントの組み合わせ（例えば、ＩｇＧ２とＩｇＧ４の組み合わせ）を用いて、いずれかのサブタイプ単独の場合よりも、Ｆｃγ受容体への結合を大きく低下させること（Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−１６２４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（２００３）５８５−５９３）が挙げられる。例えば、エフェクター機能を低下させる手段として、Ｎ結合型グリコシル化部位を除去することができる。
【０１３６】
当技術分野では、一部またはすべてのＦｃ受容体サブタイプに対する親和性（したがって、エフェクター機能）が改変および/または低下された多数のＦｃ変異体が知られている。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２２４１８８号、米国特許出願公開第２００７／０１４８１７１号、米国特許出願公開第２００７／００４８３００号、米国特許出願公開第２００７／００４１９６６号、米国特許出願公開第２００７／０００９５２３号、米国特許出願公開第２００７／００３６７９９号、米国特許出願公開第２００６／０２７５２８３号、米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号、米国特許出願公開第２００６／０１９３８５６号、米国特許出願公開第２００６／０１６０９９６号、米国特許出願公開第２００６／０１３４１０５号、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号、米国特許出願公開第２００５／０２４４４０３号、米国特許出願公開第２００５／０２３３３８２号、米国特許出願公開第２００５／０２１５７６８号、米国特許出願公開第２００５／０１１８１７４号、米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号、米国特許出願公開第２００４／０２２８８５６号、米国特許出願公開第２００４／１３２１０１号、米国特許出願公開第２００３／１５８３８９号を参照されたい。また、米国特許第７，１８３，３８７号、同第６，７３７，０５６号、同第６，５３８，１２４号、同第６，５２８，６２４号、同第６，１９４，５５１号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号も参照されたい。
【０１３７】
ＣＤＣでは、抗体−抗原複合体は補体に結合し、その結果、補体カスケードが活性化され、細胞膜傷害複合体が生成される。古典補体経路の活性化は、同系列の抗原に結合している抗体（適切なサブクラスのもの）に、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。したがって、補体カスケードの活性化は、免疫グロブリンのＣ１ｑタンパク質に対する結合親和性によって部分的に調節される。該補体カスケードを活性化するには、抗原性標的に結合されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３のうち少なくとも２つの分子、またはＩｇＭの１つのみの分子にＣ１ｑが結合することが必要である（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７−９４（１９９５）ｐ.８０）。補体の活性化を評価するには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってよい。
【０１３８】
ＩｇＧ分子の様々な残基がＣ１ｑへの結合に関与していることが提唱されており、この残基としては、ＣＨ２ドメイン上の残基Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２、同じβストランドに極めて近いターン上に位置する３３１番目のアミノ酸残基、ヒンジ領域下流に位置する残基Ｌｙｓ２３５およびＧｌｙ２３７、ならびに、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域に位置する２３１〜２３８番目の残基が挙げられる（例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１５２Ａ（Ａｂｓｔｒａｃｔ）（１９９３）、国際公開第９４／２９３５１号、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７８：６６１−６６７（１９９３）、Ｂｒｅｋｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４：２５４２−４７（１９９４）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ，２８８：３３８−３４４（１９８０）、Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：７３８−４０（１９８８）、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４１７８−４１８４（２０００、米国特許第５，６４８，２６０号、および米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。ＩｇＧ１における例として、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのＣＯＯＨ末端領域中の２つの突然変異、すなわちＫ３２２ＡおよびＰ３２９Ａは、ＣＤＣ経路を活性化せず、Ｃ１ｑの結合を１００分の１未満に低下させることが示されている（米国特許第６，２４２，１９５号）。
【０１３９】
したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明で提供するＦｎ１４抗体のＣＤＣ活性を低下させる目的で、上記の残基の１つもしくは複数の残基を修飾、置換、または除去しても、１つもしくは複数のアミノ酸残基を挿入してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、免疫応答をさらに活性化させる可能性を低下または排除する目的で、当該抗体のエフェクター機能を低下または排除することが望ましい場合がある。また、エフェクター機能を低下させた抗体は、抗体を投与された患者における血栓塞栓イベントのリスクを低下させる場合がある。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明は、１つもしくは複数のＦｃＲ受容体に対する結合性が低下しているが、補体に結合する能力（例えば、天然の抗Ｆｎ１４抗体、非変異体の抗Ｆｎ１４抗体、または親抗Ｆｎ１４抗体と同程度の能力、または、いくつかの実施形態では、これらよりも低い能力）を保持している抗Ｆｎ１４抗体を提供する。したがって、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、補体に結合して、これを活性化することができると同時に、ＦｃＲ、例えばＦｃγＲＩＩａ（例えば、血小板上に発現するＦｃγＲＩＩａ）への結合性が低下している。ＦｃγＲＩＩａ（例えば、血小板上に発現するＦｃγＲＩＩａ）への結合性が低下しているか、または無いが、Ｃ１ｑに結合して、少なくともある程度まで、補体カスケードを活性化できるこのような抗体は、血栓塞栓イベントのリスクを低下させると同時に、望ましいエフェクター機能を保持している可能性がある。代替的な実施形態では、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、１つもしくは複数のＦｃＲへの結合性が低下しているが、他の１つもしくは複数のＦｃＲに対する結合能は保持している。例えば、米国特許出願公開第２００７−０００９５２３号、同第２００６−０１９４２９０号、同第２００５−０２３３３８２号、同第２００４−０２２８８５６号、および同第２００４−０１９１２４４号を参照されたい。これらの特許出願には、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、および／またはＦｃＲＩＩＩへの結合性が低下した抗体を生じさせる様々なアミノ酸修飾、ならびに、１つのＦｃＲへの結合性を向上させるが、別のＦｃＲへの結合性は低下させるアミノ酸置換が記載されている。
【０１４１】
したがって、抗Ｆｎ１４抗体の定常領域に関連するエフェクター機能は、その定常領域、特にＦｃ領域の特性を改変することによって調節することができる。特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、エフェクター機能を有する第２の抗体であって、エフェクター機能を媒介する天然の定常領域またはＦｃ領域を含む非変異体抗体、天然抗体、または親抗体であってよい第２の抗体と比較する。特定的な実施形態では、エフェクター機能の調節としては、活性が無効にされるか、または完全に存在しない状態が挙げられる。
【０１４２】
天然配列のＦｃまたは定常領域は、天然に存在するＦｃまたは定常鎖領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。相対的なエフェクター機能を評価する目的で用いるコントロール分子は、試験抗体または変異抗体が含むＦｃ領域と同じタイプ／サブタイプのＦｃ領域を含むのが好ましい。変異体であるかまたは改変されたＦｃまたは定常領域は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、翻訳後修飾、アミノ酸の置換、挿入、または欠失など）が原因で、天然配列の重鎖領域の配列とは異なるアミノ酸配列を含む。したがって、該変異定常領域は、例えばグリコシル化パターンの改変を含む翻訳後修飾の改変をもたらす１つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含んでよい。親抗体または親Ｆｃ領域は、例えば、エフェクター機能を改変した、例えば低下させた定常領域（すなわちＦｃ）を構築する目的で用いられる正常なエフェクター機能を有する変異体である。
【０１４３】
エフェクター機能を改変した（例えば、低下させたか、または排除した）抗体は、変異定常領域、Ｆｃ領域、または重鎖領域を有する抗体を遺伝子工学技術で作るか、または産生させることによって生成してよい。組み換えＤＮＡ技術、ならびに／または、細胞の培養および発現条件を用いて、機能および／または活性が改変された抗体を産生させてよい。例えば、組み換えＤＮＡ技術を用いて、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域（例えば、Ｆｃ領域または定常領域など）に、１つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を遺伝子工学技術で行ってよい。あるいは、例えばグリコシル化パターン（下記を参照されたい）のような翻訳後修飾の変更は、抗体を産生する宿主細胞ならびに細胞の培養条件および発現条件を操作することによって実現できる。
【０１４４】
アミノ酸置換のようなアミノ酸の改変によって、抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく、本発明の抗Ｆｎ１４抗体のエフェクター機能を改変することができる。例えば、上記のアミノ酸置換（例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｋｙｓ３２０、Ｌｙｓ３３２、Ｌｙｓ２３５、Ｇｌｙ２３７、Ｋ３３２、およびＰ３２９）を用いて、エフェクター機能を低下させた抗体を生成できる。
【０１４５】
別の実施形態では、アミノ酸置換は、重鎖定常領域の２３４番目、２３５番目、２３６番目、２３７番目、２９７番目、３１８番目、３２０番目、および３２２番目のアミノ酸残基のうちの１つもしくは複数のアミノ酸残基に対して行ってよい（米国特許第５，６２４，８２１号、および米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたい）。このような置換によって、エフェクター機能を改変する一方で、抗原結合活性は保持することができる。２３４番目、２３５番目、２３６番目、および２３７番目のアミノ酸のうちの１つもしくは複数のアミノ酸での改変によって、非修飾抗体または非変異抗体と比べて、ＦｃγＲＩ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性を低下させることができる。２３４番目、２３６番目、および／または２３７番目のアミノ酸残基は、例えばアラニンで置換してよく、２３５番目のアミノ酸残基は、例えばグルタミンで置換してよい。別の実施形態では、抗Ｆｎ１４  ＩｇＧ１抗体は、２３４位のＬｅｕをＡｌａで置換した基、２３５位のＬｅｕをＧｌｕで置換した基、および２３７位のＧｌｙをＡｌａで置換した基を含んでよい。
【０１４６】
これに加えて、またはこの代わりに、３１８番目、３２０番目、および３２２番目のＦｃアミノ酸残基を改変してもよい。これらのアミノ酸残基は、マウスＩｇＧおよびヒトＩｇＧにおいて高度に保存されているが、これらのアミノ酸残基は、補体の結合を媒介する。これらのアミノ酸残基を改変すると、Ｃ１ｑ結合性が低下するが、抗原結合性、プロテインＡ結合性、または、Ｆｃがマウスマクロファージに結合する能力は改変されないことが示されている。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、エフェクター機能を低下または排除する置換基を含む免疫グロブリンＩｇＧ４である。本発明の抗Ｆｎ１４抗体のＩｇＧ４  Ｆｃ部分は、２３３番目の残基においてグルタミン酸をプロリンで置換した基、２３４番目の残基においてフェニルアラニンをアラニンまたはバリンで置換した基、および２３５番目の残基においてロイシンをアラニンまたはグルタミン酸で置換した基（上記のＥＵインデックス番号、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１））のうちの１つもしくは複数の置換した基を含んでよい。さらに、２９７番目の残基（ＥＵインデックス番号）においてＡｓｎをＡｌａで置換することによって、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＮ結合型グリコシル化部位を除去すると、エフェクター機能がさらに低下すると共に、存在し得るすべての残りのエフェクター活性が排除される場合がある。エフェクター機能を低下させた別の例示的なＩｇＧ４突然変異体は、重鎖定常領域中に突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（突然変異ＰＥ）を含む、ＩｇＧ４サブタイプの変異体である。この突然変異の結果、エフェクター機能が低下する。米国特許第５，６２４，８２４号、および米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたい。ＩｇＧ４の態様において、エフェクター機能を低下させる別の例示的な突然変異は、本明細書に記載されているように、Ｓ２２ＢＰ／Ｔ２２９Ａである。
【０１４８】
定常領域における他の例示的なアミノ酸配列の変化としては、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅらによって説明されている突然変異Ａｌａ−Ａｌａが挙げられるが、これに限定されない（国際公開第９４／２８０２７号、および国際公開第９８／４７５３１号を参照されたい。また、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００；１６−２８も参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、突然変異Ａｌａ−Ａｌａを含め、定常領域内に突然変異を有する抗Ｆｎ１４抗体を用いて、エフェクター機能を低下または無効化してよい。これらの実施形態によれば、抗Ｆｎ１４抗体の定常領域は、２３４位におけるアラニンへの突然変異、または２３５位におけるアラニンへの突然変異を含む。これに加えて、抗Ｆｎ１４抗体の定常領域は、二重突然変異、すなわち、２３４位におけるアラニンへの突然変異と、２３５位におけるアラニンへの第２の突然変異を含んでもよい。
【０１４９】
１つの実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体は、ＩｇＧ４のフレームワークであって、突然変異Ａｌａ−Ａｌａが、２３４位におけるフェニルアラニンからアラニンへの突然変異、および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの突然変異を表すことになるフレームワークを含む。別の実施形態では、該抗Ｆｎ１４抗体は、ＩｇＧ１のフレームワークであって、突然変異Ａｌａ−Ａｌａが、２３４位におけるロイシンからアラニンへの突然変異、および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの突然変異を表すことになるフレームワークを含む。この代わりに、またはこれに加えて、抗Ｆｎ１４抗体は、ＣＨ２ドメイン中の点突然変異Ｋ３２２Ａを含む他の突然変異を有してもよい（Ｈｅｚａｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−８）。
【０１５０】
他の例示的なアミノ酸置換基は、国際公開第９４／２９３５１号（この特許は参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、この特許には、抗体がＦｃＲＩに結合する能力を改変することによって、抗体がＣ１ｑに結合する能力を低下させ、その結果、抗体が補体を固定する能力を低下させる突然変異をＣＨ２ドメインのＮ末端領域中に有する抗体が列挙されている。ＩｇＧ２のＣＨ２の上方領域の突然変異（この突然変異によって、ＦｃＲの結合がより低下する）について記載しているＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：３６１３−３６２１）も参照されたい。
【０１５１】
アミノ酸置換基を含む上記の抗体変異体のいずれかを生成する方法は、当技術分野において周知である。これらの方法としては、部位特異的（オリゴヌクレオチド媒介性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、カセット突然変異誘発によって抗体または抗体の少なくとも定常領域をコードする調製ＤＮＡ分子を調製することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
部位特異的変異誘発は、当技術分野において周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）、およびＫｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８７）を参照されたい）。
【０１５３】
また、ＰＣＲ突然変異誘発は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製するのにも適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、およびＶａｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）を参照されたい。配列変異体を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）によって説明されている技法に基づいている。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体であって、抗体のＦｃ領域またはその一部が、エフェクター誘発活性が自然に低下したＦｃ領域（またはその一部）と置換されている抗Ｆｎ１４抗体に関する。例えば、ヒトＩｇＧ４の定常領域は、補体活性化能が低いかまたは無い。さらに、種々のＩｇＧ分子は、ＦｃＲに対する結合親和性が異なり、この原因は少なくとも部分的には、ＩｇＧのヒンジ領域の長さと柔軟性が異なる（ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に減少する）ことにある場合がある。例えば、ＩｇＧ４は、ＲｃγＲＩＩａに対する結合性が低いか、または結合性がない。キメラ分子およびキメラ定常領域の例については、例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９，５９：２１５９−２１６６）、およびＭｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，３４：４４１−４５２）を参照されたい。
【０１５５】
また、本発明は、Ｆｃ領域がまったくないエフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体にも関する。このような抗体は、本発明の抗体誘導体および抗原結合断片と称してよい。このような誘導体および断片は、非抗体タンパク質配列または非タンパク質構造体、特に、動物、例えばヒトの患者に投与したときに、送達および／またはバイオアベイラビリティを促進するように設計された構造体に融合できる（下記を参照されたい）。
【０１５６】
上述のように、ヒンジ領域内の変更も、エフェクター機能に影響を及ぼす。例えば、ヒンジ領域の欠失によって、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下する場合があると共に、補体活性化能が低下する場合がある（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８１  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７８：５２４−５２８）。したがって、本開示は、ヒンジ領域に改変部を有する抗体にも関する。
【０１５７】
特定的な実施形態では、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を阻害する目的で、本発明の抗体を修飾してよい。ＣＤＣ活性の調節は、抗体のＦｃ領域に１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を導入することによって行ってよい（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、および米国特許第６，２４２，１９５号を参照されたい）。この代わりに、またはこれに加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによって、Ｆｃ領域に鎖間ジスルフィド結合を形成できる。このようにして生成したホモ二量体抗体は、インターナリゼーション能が向上もしくは低下しているか、および／または、補体媒介性細胞殺滅能が向上もしくは低下している可能性がある。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）、Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）、国際公開第９９／５１６４２号、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３４−４０（１９９８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、および国際公開第９４／２９３５１号を参照されたい。
【０１５８】
さらに、エフェクター機能は、抗体の結合親和性に応じて変わる場合のあることが分かる。例えば、親和性の高い抗体は、相対的に親和性の低い抗体と比べて、補体系を活性化する効率が高い場合がある（Ｍａｒｚｏｃｃｈｉ−Ｍａｃｈａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２８：８９−１０１）。したがって、（例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失などの方法によって抗体の可変領域を変更することによって）抗体を改変して、その抗体の抗原に対する結合親和性が低下するようにしてもよい。結合親和性の低い抗体は、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣが低下しているなど、エフェクター機能が低下している場合がある。
【０１５９】
エフェクター機能が低下した本発明の抗Ｆｎ１４抗体としては、抗Ｆｎ１４親抗体または抗Ｆｎ１４非変異抗体よりも、１つもしくは複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合親和性が低下した抗体が挙げられる。したがって、ＦｃＲに対する結合親和性が低下した抗Ｆｎ１４抗体としては、抗Ｆｎ１４親抗体または抗Ｆｎ１４非変異抗体と比べて、１つもしくは複数のＦｃ受容体に対する結合親和性が１．５分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、４分の１、もしくは５分の１、またはそれ以下に低下した抗Ｆｎ１４抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、親抗体または非変異抗体の約１０分の１の親和性で、ＦｃＲに結合する。別の実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、親抗体または非変異抗体の約１５分の１の親和性、または約２０分の１の親和性で、ＦｃＲに結合する。該ＦｃＲ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ、ならびにそれらのアイソフォーム、かつ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲR、ＦｃδＲ、および/またはＦｃαＲのうちの１つもしくは複数の受容体であってよい。特定的な実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、ＦｃγＲＩＩａに対する結合親和性が１．５分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、４分の１、もしくは５分の１、またはそれ以下に低下している。
【０１６０】
したがって、特定の実施形態では、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、第２の抗Ｆｎ１４抗体よりも、補体タンパク質への結合性が低い。特定の実施形態では、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、結合性が第２の抗Ｆｎ抗体の約１．５分の１以下、約２分の１以下、約３分の１以下、約４分の１以下、約５分の１以下、約６分の１以下、約７分の１以下、約８分の１以下、約９分の１以下、約１０分の１以下、または約１５分の１以下である。
【０１６１】
本発明の特定の実施形態は、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２のＣＤＲ−Ｈ３から選択された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲ配列を含む抗Ｆｎ１４抗体であって、天然または親のＦｃ領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Ｆｃ領域をさらに含む抗体に関する。さらなる実施形態では、該抗Ｆｎ１４抗体は、上記のＣＤＲのうちの少なくとも２つを含み、別の実施形態では、該抗体は、３つのすべての重鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１６２】
本発明の別の実施形態は、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号５のＣＤＲ−Ｌ３から選択された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗Ｆｎ１４抗体であって、天然または親のＦｃ領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Ｆｃ領域をさらに含む抗体に関する。さらなる実施形態では、該抗Ｆｎ１４抗体は、上記の軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも２つを含み、別の実施形態では、該抗体は、３つのすべての軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１６３】
本発明のさらなる実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、配列番号５の３つのすべての軽鎖ＣＤＲ配列を含むと共に、配列番号２の３つのすべての重鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明は、ＶＬ配列が配列番号９の１〜１１１番目のアミノ酸である抗Ｆｎ抗体であって、天然または親のＦｃ領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Ｆｃ領域をさらに含む抗体に関する。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明は、ＶＨ配列が配列番号８の１〜１２１番目のアミノ酸である抗Ｆｎ抗体であって、天然または親のＦｃ領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Ｆｃ領域をさらに含む抗体に関する。
【０１６６】
グリコシル化を改変した抗Ｆｎ１４抗体
グリカンを除去すると、すべての種のＦｃ受容体ファミリーのすべてのメンバーへの結合性を大きく低下させる構造変化が生じる。抗Ｆｎ１４抗体を含むグリコシル化抗体では、Ｆｃ二量体のＣＨ２ドメイン中のＮ結合型保存部位に結合しているグリカン（オリゴ糖）は、ＣＨ２ドメインの間に包み込まれており、糖残基は、対向するＣＨ２ドメイン上の特定のアミノ酸残基と接触している。それぞれ異なるグリコシル化パターンは、抗体のそれぞれ異なる生物学的特性と関連付けられている（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６５：１１１−１２８、Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：２６−３２）。ある種の特定のグリコフォームは、潜在的に有益な生物学的特性をもたらす。グリカンの喪失によって、ドメイン間の間隔が変わると共に、相互に対する可動性が増大し、グリカンの喪失は、Ｆｃ受容体ファミリーのすべてのメンバーの結合に対する阻害作用を及ぼすと予想される。例えば、様々なグリコシル化抗体を用いたインビトロ試験によって、ＣＨ２のグリカンを除去するとＦｃ構造が変化し、その結果、Ｆｃ受容体と補体タンパク質Ｃ１Ｑへの抗体の結合性が大きく低下することが実証されている。エフェクター機能を低下させる別の既知のアプローチは、ＦｃのＣＨ２ドメインの２９７位（ＥＵインデックス番号）のＮ結合型グリカンの産生を阻害するか、またはこのグリカンを除去することである（Ｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８３  ＰＮＡＳ  ８０：６６３２、Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１１４５、Ｄｏｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １０：２１１、Ｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５：１６５、Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７２：４８１、Ｐｏｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２３３、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１）。また、様々なグリコフォームが、薬物動態、薬力学、受容体相互作用、および組織特異的ターゲッティングを含め、治療物質の特性に大きな影響を及ぼすことができることも知られている（Ｇｒａｄｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５−２９７）。特に、抗体では、オリゴ糖の構造は、抗体のエフェクター機能（例えば、ＣＤＣを誘発する補体複合体Ｃ１への結合、およびＡＤＣＣ経路の調節を担うＦｃγＲ受容体への結合）に加えて、プロテアーゼ耐性、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される抗体の血中半減期、食作用、および抗体フィードバックに関連する特性に影響を及ぼすことができる（Ｎｏｓｅ  ａｎｄ  Ｗｉｇｚｅｌｌ，１９８３、Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｄｗｅｋ，１９８３、Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９、Ｃａｒｔ��ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ，８９：４２８５−４２８９）。
【０１６７】
したがって、抗体のエフェクター機能を調節する別の手段としては、抗体の定常領域のグリコシル化を改変することが挙げられる。グリコシル化の改変としては、例えば、グリコシル化残基の数の減少または増加、グリコシル化残基のパターンまたは位置の変更、および、糖構造の変更が挙げられる。ヒトＩｇＧ上に存在するオリゴ糖は、エフェクター機能の程度に影響を及ぼす（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．４４−５３）。すなわち、ヒトＩｇＧのオリゴ糖の微小不均一性は、ＣＤＣおよびＡＤＣＣのような生物学的機能、様々なＦｃ受容体への結合性、ならびに、Ｃ１ｑタンパク質への結合性に影響を及ぼすことができる（Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ．＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９７，１５  ２６−３２、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  ２７６（９）：６５９１−６０４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；２７７（３０）：２６７３３−４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  ２７８（５）：３４６６−７３、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０）。例えば、ＩｇＧがＣ１ｑに結合して、補体カスケードを活性化する能力は、２つのＣＨ２ドメインの間に位置する炭水化物部分（通常はＡｓｎ２３７で固定されている）の有無または修飾に左右される場合がある（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７−９４（１９９５））。
【０１６８】
Ｆｃ含有ポリペプチド、例えばＩｇＧ抗体のような抗体のグリコシル化部位は、標準的な技法によって同定できる。グリコシル化部位の同定は、実験によるものであることも、配列解析またはモデリングデータに基づくこともできる。コンセンサスモチーフ、すなわち、様々なグリコシルトランスフェラーゼによって認識されるアミノ酸配列が説明されている。例えば、Ｎ結合型グリコシル化モチーフのコンセンサスモチーフは、ＮＸＴまたはＮＸＳ（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）である場合が多い。潜在的なグリコシル化モチーフの位置を特定するためのいくつかのアルゴリズムも説明されている。したがって、抗体またはＦｃ含有断片内の潜在的なグリコシル化部位を同定するには、例えば、センター・フォー・バイオロジカル・シークエンス・アナラシスの提供するウェブサイト（Ｎ結合型グリコシル化部位を予測するためのサービスＮｅｔＮＧｌｙｃと、Ｏ結合型グリコシル化部位を予測するためのサービスＮｅｔＯＧｌｙｃを参照されたい）のような利用可能な公開データベースを用いることによって、抗体の配列を調べる。
【０１６９】
インビボ研究によって、アグリコシル化抗体のエフェクター機能の低下が確認された。例えば、アグリコシル化抗ＣＤ８抗体は、マウスにおいてＣＤ８担持細胞を枯渇させることができず（Ｉｓｓａｃｓ，１９９２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３０６２）、アグリコシル化抗ＣＤ３抗体は、マウスまたはヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない（上記のＢｏｙｄ，１９９５、Ｆｒｉｅｎｄ，１９９９  Ｔｔａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２）。
【０１７０】
重要なことに、ＣＨ２ドメインのグリカンの除去は、エフェクター機能に対して有意な作用を及ぼすと思われるが、抗体の他の機能的特性と物理的特性は変わらないままである。具体的には、グリカンを除去しても、血中半減期と抗原への結合性に対する作用は全くかほとんどなかったことが示されている（上記のＮｏｓｅ，１９８３、上記のＴａｏ，１９８９、上記のＤｏｒａｉ，１９９１、上記のＨａｎｄ，１９９２、Ｈｏｂｂｓ，１９９２  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：９４９）。
【０１７１】
アグリコシル化アプローチのインビボでの検証が存在するが、アグリコシル化ｍＡｂによる残存エフェクター機能が報告されている（例えば、Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（３）：２３３−４１、Ｄｏｒａｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １０（２）：２１１−７を参照されたい）。Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．には、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂタンパク質への残存結合性が示されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−１６２４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（２００３）５８５−５９３）。したがって、エフェクター機能、特に補体活性化能のさらなる低下は、場合によっては確実に活性を完全に無効化すようにするために重要な場合がある。このような理由で、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにＧ１／Ｇ４ハイブリッドのアグリコシル化形態が、本発明の方法と、エフェクター機能を低下させた本発明の抗体組成物で有用であると想定される。
【０１７２】
任意でＦｃ部分の他の有益な特質を維持したまま、本発明の抗Ｆｎ１４抗体を修飾または改変して、（第２のＦｎ１４特異的抗体と比べて、）エフェクター機能を低下させてよい。
【０１７３】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、エフェクター機能を低下させたアグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体であって、該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ結合型保存部位が修飾されていることを特徴とする抗体に関する。Ｆｃ二量体のＣＨ２ドメインのＮ結合型保存部位の修飾によって、アグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体を得ることができる。このような修飾の例としては、該Ｆｃ二量体のＣＨ２ドメインのＮ結合型保存部位の突然変異、ＣＨ２ドメインのＮ結合型部位に結合しているグリカンの除去、およびグリコシル化の妨止が挙げられる。例えば、重鎖ＣＨ２ドメインの標準的なＮ結合型Ａｓｎ部位をＧｌｎ残基に変更することによって、アグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体を作製できる（例えば国際公開第０５／０３１７５号、および米国特許出願公開第２００６−０１９３８５６号を参照されたい）。
【０１７４】
本発明の１つの実施形態では、上記の修飾は、重鎖グリコシル化部位で突然変異させて、その部位でのグリコシル化を妨止するものを含む。したがって、本発明の１つの実施形態では、該アグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、すなわちＮ２９８Ｑ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号を用いるとＮ２９７）を突然変異させることによって調製して、適切な宿主細胞内で発現させる。例えば、この突然変異は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（登録商標）（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）社製の独特の部位突然変異誘発キットのためのメーカー推奨のプロトコルに従うことによって実施できる。
【０１７５】
この突然変異抗体は、宿主細胞（例えばＮＳＯ細胞またはＣＨＯ細胞）内で安定的に発現させてから、精製することができる。一例として、精製は、プロテインＡクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを用いて行うことができる。追加的な発現および精製法を用いてよいことは当業者には明らかである。
【０１７６】
本発明の別の実施形態では、アグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体は、エフェクター機能が低下しており、この抗体または抗体誘導体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ結合型保存部位での修飾は、ＣＨ２ドメインのグリカンの除去、すなわち脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体は、従来の方法によって生成してから、酵素的に脱グリコシル化してもよい。抗体を酵素的に脱グリコシル化する方法は、当業者には周知である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９７３、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ＆Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，１９７６  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５１：１７０４−８０）。
【０１７７】
本発明の別の実施形態では、脱グリコシル化は、ツニカマイシンのようなグリコシル化阻害剤を含む培地中で抗体を産生する宿主細胞を増殖させることによって実現できる（Ｎｏｓｅ＆Ｗｉｇｚｅｌｌ，１９８３）。すなわち、上記の修飾は、前記抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ結合型保存部位におけるグリコシル化を低下または防止することである。
【０１７８】
本発明の別の実施形態では、組み換えＸポリペプチド（またはこのようなポリペプチドを含む細胞もしくは細胞膜）を抗原として用いて、抗Ｆｎ１４抗体または抗体誘導体を生成してから、その後にこれらを脱グリコシル化してよい。
【０１７９】
代替的な実施形態では、本発明のアグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体、またはグリコシル化を低下させた抗Ｆｎ１４抗体は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第０５／１８５７２号および米国特許出願公開第２００７−００４８３００号）に記載されている方法によって製造できる。例えば、１つの実施形態では、抗Ｆｎ１４アグリコシル化抗体は、第１のアミノ酸残基を改変することによって（例えば、置換、挿入、欠失によって、または、化学修飾によって）製造でき、この場合、改変した第１のアミノ酸残基は、立体障害もしくは帯電のいずれかまたは両方によって、第２の残基のグリコシル化を阻害する。特定の実施形態では、該第１のアミノ酸残基は、アミノ酸置換基によって修飾する。さらなる実施形態では、このアミノ酸置換基は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる群から選択する。別の実施形態では、該アミノ酸置換基は、非従来型のアミノ酸残基である。該第２のアミノ酸残基は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合型グリコシル化モチーフの近くまたは内部にあってよい。１つの実施形態では、Ｋａｂａｔのインデックス番号によれば、該第１のアミノ酸残基は２９９番目のアミノ酸であり、該第２のアミノ酸残基は２９７番目のアミノ酸である。例えば、該第１のアミノ酸置換基は、Ｋａｂａｔのインデックス番号によれば、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖであってよい。特定的な実施形態では、このアミノ酸置換基はＴ２９９Ｃである。
【０１８０】
また、本発明の抗体がブロック部分を含むように、本発明の抗体を修飾することによって、エフェクター機能を低下できる。例示的なブロック部分としては、例えば、グリコシダーゼがポリペプチドをグリコシル化する能力をブロックすることによってグリコシル化を低下させるのに十分な立体体積および／または電荷を有する部分が挙げられる。これに加えて、またはこの代わりに、上記のブロック部分は、例えば、Ｆｃ領域が受容体または補体タンパク質に結合する能力を阻害することによって、エフェクター機能を低下できる。いくつかの実施形態では、本発明は、変異Ｆｃ領域を含むＦｎ１４結合タンパク質、例えば抗Ｆｎ１４抗体であって、その変異Ｆｃ領域が、第１のアミノ酸残基とＮ−グリコシル化部位を含み、この第１のアミノ酸残基を側鎖成分によって修飾して、未修飾の第１のアミノ酸残基よりも増加した立体体積または増大した静電荷をもたらし、それによって、Ｎ−グリコシル化部位のグリコシル化レベルを低下させるか、またはその他の形でＮ−グリコシル化部位のグリコシル化を改変する抗体に関する。これらの実施形態のうちの特定の実施形態では、変異Ｆｃ領域が、コントロールの非変異Ｆｃ領域よりも低いエフェクター機能をもたらす。さらなる実施形態では、立体体積が増加した側鎖は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒからなる群から選択されたアミノ酸残基の側鎖である。さらに別の実施形態では、静電荷が増大した側鎖成分は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる群から選択されたアミノ酸残基の側鎖である。
【０１８１】
したがって、１つの実施形態では、Ｄ、Ｅ、Ｋ、またはＲのような帯電側鎖成分でＴ２９９を置換することによって、グリコシル化とＦｃの結合性を調節することができる。この結果得られる抗体は、望ましくない静電相互作用のせいで、グリコシル化が低下すると共に、Ｆｃ受容体に対するＦｃの結合親和性が低下することになる。
【０１８２】
別の実施形態では、アグリコシル化されていると共に、システイン付加体を形成することもできるＴ２９９Ｃ変異抗体は、対照物であるそのアグリコシル化抗体よりもエフェクター機能（例えばＦｃγＲＩ結合性）が低い場合がある（例えば国際公開第０５／１８５７２号を参照されたい）。したがって、グリコシル化モチーフに近接する第１のアミノ酸を改変することによって、第２のアミノ酸残基での抗体のグリコシル化を阻害することができ、該第１のアミノ酸がシステイン残基である場合、該抗体は、エフェクター機能がさらに低下する場合がある。これに加えて、サブタイプＩｇＧ４の抗体のグリコシル化の阻害は、他のサブタイプにおけるアグリコシル化の作用よりも、ＦｃγＲＩ結合性に対して大きな影響を及ぼす場合がある。
【０１８３】
追加的な実施形態では、本発明は、グリコシル化を改変した抗Ｆｎ14抗体であって、１つもしくは複数のＦｃＲ受容体に対する結合性が低下していると共に、任意で、１つもしくは複数のＦｃ受容体および／または補体に対する結合性が向上しているかまたは正常である抗体、例えば、グリコシル化を改変した抗体であって、少なくとも、１つもしくは複数のＦｃ受容体および／または補体に対する結合親和性が、天然のコントロール抗Ｆｎ１４抗体）と同じまたは同程度である抗体に関する。例えば、グリカン構造体として主にＭａｎ５ＧｌｃＮａｃ２Ｎ−グリカンが存在する抗Ｆｎ１４抗体（例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２Ｎ−グリカン構造体が、Ｉｇ組成物の次の主なグリカン構造体よりも少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する抗体）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２Ｎ−グリカン構造体が主なものではない抗Ｆｎ１４抗体集団よりも、エフェクター機能が改変されている場合がある。主に上記のグリカン構造体を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する結合性が低下しており、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合性が向上しており、複合体Ｃ１のサブユニットＣ１ｑに対する結合性が向上している（米国特許出願公開第２００６−０２５７３９９号）。上記のグリカン構造体は、主なグリカン構造体である場合にはＡＤＣＣを増大させ、ＣＤＣを増大させ、血中半減期を延長し、Ｂ細胞の抗体産生を増加させ、かつマクロファージによる食作用を低下させる。
【０１８４】
一般に、糖タンパク質上のグリコシル化構造体は、発現宿主と培養条件によって異なることになる（Ｒａｊｕ，ＴＳ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．４４−５３）。このような相違は、エフェクター機能と薬物動態の両方に変化をもたらすことができる（Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９６；８９（４）：５７３−５７８、Ｎｅｗｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．１９９６；１０６（２）：２５９−６４）。例えば、ガラクトシル化は、細胞培養条件によって変化する場合があり、その特定のガラクトースパターンに応じて、いくつかの免疫グロブリン組成物は免疫原性になる場合がある（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：８３９−８４５）。非ヒト哺乳類細胞によって産生された糖タンパク質のオリゴ糖構造体は、ヒト糖タンパク質のオリゴ糖構造体とさらに近似している傾向がある。さらに、タンパク質発現宿主系は、主なＩｇグリコフォームを発現するように、遺伝子工学技術で作製するかまたは選択するかしても、あるいは、主なグリカン構造体を有する糖タンパク質を自然に産生できる。主なグリコフォームを有する糖タンパク質を産生する遺伝子工学的なタンパク質発現宿主系の例としては、遺伝子ノックアウト／突然変異系（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＪＢＣ，２７７：２６７３３−２６７４０）、遺伝子操作（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：１７６−１８０）、またはこれら両方を組み合わせたものが挙げられる。あるいは、特定の細胞は、主なグリコフォームを自然に発現する（例えば、ニワトリ、ヒト、および雌ウシ）（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０：４７７−４８６）。したがって、当業者は、多くの発現宿主系のうちの少なくとも１つを選択することによって、グリコシル化（例えば、主に１つの特定のグリカン構造体）が改変された抗Ｆｎ１４抗体または抗体組成物を発現させることができる。本発明の抗Ｆｎ１４抗体を産生させる目的で用いてよいタンパク質発現宿主系としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞などが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００７−００６５９０９号、同第２００７−００２０７２５号、および同第２００５−０１７０４６４号には、細菌細胞内でアグリコシル化免疫グロブリン分子を産生させることが記載されている。さらなる例として、ＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎは、グリコシル化が欠損したＣＨＯ細胞株内で抗体を産生させ（１９９４  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１０８７−１０９６）、この細胞株で産生された抗体が、補体媒介性細胞溶解を行えないことを示した。糖タンパク質を産生させるための、当技術分野で見出される発現宿主系の他の例としては、Ｒａｊｕの国際公開第９９／２２７６４号およびＰｒｅｓｔａの国際公開第０３／３５８３５号のＣＨＯ細胞、Ｔｒｅｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３０：５９−７０のハイブリドーマ細胞、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：９０６２−９７０の昆虫細胞、ならびに、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ���の国際公開第０４／７４４９９号の植物細胞が挙げられる。所与の細胞または抽出物が、所与のモチーフのグリコシル化をもたらす限りでは、例えばゲル電気泳動および／または質量分析を用いて、モチーフがグリコシル化されたかを判定ための技術のうち、当該技術分野において認識されている技術を利用することができる。
【０１８５】
抗体のグリコシル化部位を改変する追加的な方法は、例えば米国特許第６，３５０，８６１号、米国特許第５，７１４，３５０号、国際公開第０５／１８５７２号、および国際公開第０５／０３１７５号に記載されており、これらの方法を用いて、グリコシル化を改変、低下、または消失させた本発明の抗Ｆｎ１４抗体を産生させることができる。
【０１８６】
エフェクター機能を低下させたアグリコシル化抗Ｆｎ１４抗体は、修飾部を含むか、または機能的部分を含むようにコンジュゲートされてよい抗体であってよい。このような機能的部分としては、ブロック部分（例えばＰＥＧ部分、システイン付加体など）、検出可能部分（例えば、蛍光性部分、放射性同位体部分、放射線不透過性部分など。診断的部分を含む）、治療的部分（例えば、細胞毒性剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗感染剤、抗癌剤、抗神経修飾剤、放射性核種など）、および／または、結合部分すなわちベイト（例えば、予め抗体をある腫瘍に向けてから、第２の分子（相補的結合部分すなわちプレイと、上記のような検出可能部分または治療的部分からなる）に結合させる）が挙げられる。
【０１８７】
Ｆｎ１４関連障害
抗Ｆｎ１４抗体（本明細書に記載されている抗体など）を用いて、Ｆｎ１４関連障害のような様々な障害を治療することができる。例えば、抗Ｆｎ１４抗体を用いて、患者の癌、例えば固形腫瘍の癌を治療することができる。抗Ｆｎ抗体で治療することができる癌の例としては、結腸癌と乳癌が挙げられる。治療することができる癌のさらに他の例としては、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、二次骨癌、腸癌（結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌）、脳腫瘍、二次脳腫瘍、乳癌、二次乳癌、頸癌、小児癌、内分泌癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌（例えば胃癌）、咽喉癌（食道癌）、頭頸部癌、カポージ肉腫、腎癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、二次肝癌、肺癌（例えばＮＳＣＬＣ）、二次肺癌、二次リンパ節癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮種、骨髄腫、神経内分泌癌、卵巣癌、食道癌、膵癌（膵臓癌）、陰茎癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、脊髄癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、原発不明癌、膣癌、外陰癌、および子宮癌（子宮内膜癌）が挙げられる。
【０１８８】
治療することができる腫瘍としては、Ｆｎ１４を発現している腫瘍、例えば、正常な成熟細胞でのＦｎ１４発現レベルよりも高いレベルでＦｎ１４を発現している腫瘍が挙げられる。
【０１８９】
「治療する」という用語は、統計的に有意な程度まで、または当業者にとって検出可能な程度まで、障害と関連する状態、症状、またはパラメーターを改善させるか、または、障害の進行もしくは再燃（障害に起因する二次損傷を含む）を予防するのに有効な量、方式、および／または形態で、本明細書に記載されている組成物を投与することを指す。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、固形腫瘍を有する患者を、本明細書に記載されている抗Ｆｎ抗体で治療すると、その固形腫瘍の寸法が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％縮小する。
【０１９１】
上記の障害の１つを患う危険性があるか、上記の障害の１つと診断されているか、または、上記の障害の１つを有する患者に、総合的な治療効果をもたらす量および期間で、抗Ｆｎ１４抗体を投与することができる。該抗Ｆｎ１４抗体は、単独で投与することも（単剤療法）、他の薬剤と組み合わせて投与することも（併用療法）できる。併用療法の場合、投与の量と期間は、例えば相加的または相乗的治療効果をもたらす量と期間であり得る。さらに、抗Ｆｎ抗体の投与（第２の薬剤の有無にはかかわらない）は、第１の治療、例えば一時治療としても、すでに施した治療（すなわち、抗Ｆｎ抗体による治療以外の治療）に対する応答が不十分な患者に対する第２の治療としても用いることができる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｎ抗体を別の化学療法剤と併用することができる。いくつかの実施形態では、該併用療法には、２種以上の抗Ｆｎ１４抗体を用いること、例えば、本明細書に記載されている抗Ｆｎ抗体のうちの少なくとも１種を別の抗Ｆｎ抗体を併用すること、例えば、本明細書に記載されている抗Ｆｎ抗体のうちの２種以上を用いることが含まれる。
【０１９２】
特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体を投与される患者は、腫瘍細胞上でＦｎ１４が発現している。例えば、正常な成熟細胞でのＦｎ１４発現レベルよりも高いレベルでＦｎ１４が発現している。特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体を投与される患者は、腫瘍細胞の表面上のＦｎ１４発現レベルが検出可能な患者である。腫瘍細胞上のＦｎ１４のレベルは、例えば本明細書に記載されている抗体を用いる免疫組織化学またはＦＡＣＳによって測定できる。
【０１９３】
併用療法の特定の実施形態では、望ましくない潜在的毒性作用を最小限に抑えるなどの目的で、抗Ｆｎ１４抗体療法と組み合わせる療法つまり治療は、正常細胞上でのＦｎ１４の発現を有意には誘発しないものである。第２の療法つまり治療が、正常細胞上のＦｎ１４のレベルを誘発させる併用療法の特定の実施形態では、第１の療法、すなわち併用する療法を実施した後、Ｆｎ１４レベルの上昇が本質的に正常に戻った時点で、抗Ｆｎ１４抗体を投与する。
【０１９４】
特定の実施形態では、本明細書に記載されているＦｎ１４抗体、例えばＦｎ１４アゴニスト抗体で治療する患者は、Ｆｎ１４アゴニスト抗体によって悪化するか、または悪化する場合のある疾患を有する患者ではない。例えば、特定の実施形態では、Ｆｎ１４抗体、例えばアゴニスト抗体で治療する患者は、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発硬化、脳卒中、線維症、神経修飾疾患、アルツハイマー病、ＡＬＳ、全身性エリテマトーデス、または、米国特許第７，１６９，３８７号、国際公開第０３／０８６３１１号、国際公開第２００６／０８８８９０号、または国際公開第２００６／０８９０９５号に定められている疾患を有する患者ではない。特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体を投与される患者は、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、腸疾患、狼瘡、クローン病、多発硬化、糖尿病、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）を有するか、または患う可能性のある患者ではない。
【０１９５】
特定の実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体を投与される患者は、抗炎症治療を受けたか、受けているか、または受ける予定である。例えば、患者は、抗Ｆｎ１４抗体による治療と同時か、この治療の前、または後に、抗炎症剤で治療してもよい。例示的な抗炎症剤としては、メトトレキセート、ＴＮＦ−α遮断薬、Ｔｗｅａｋ遮断薬、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、サリチル酸（アスピリン）のような非ステロイド性抗炎症薬、金化合物、ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、ステロイド類、および免疫抑制薬が挙げられる。
【０１９６】
特定の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞上で発現しているＦｎ１４のレベルを割り出し、続いて、そのレベルが、正常細胞、例えば、癌細胞と同じタイプまたは系統の正常細胞上でのレベルよりも高い場合には、該患者を抗Ｆｎ１４抗体で治療し、上記のレベルが正常細胞、例えば、癌細胞と同じタイプまたは系統の正常細胞上でのレベルよりも低いか、または、Ｆｎ１４のレベルが検出不可能であった場合には、該患者を抗Ｆｎ１４抗体で治療しないことを含む。
【０１９７】
特定の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞上でＦｎ１４が（最低閾値レベルで）発現しているか判定し、続いて、Ｆｎ１４の発現が（最低閾値レベルで）検出された場合には、該患者を抗Ｆｎ１４抗体で治療し、Ｆｎ１４の発現が（最低閾値レベルで）検出されなかった場合には、該患者を抗Ｆｎ１４抗体で治療しないことを含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、Ｆｎ１４抗体は、Ｆｎ１４の発現が検出されない疾患を治療するのにも有用である場合がある。
【０１９９】
癌
抗Ｆｎ１４抗体を用いて、癌、例えば結腸癌または乳癌であると診断されたか、癌を羅患する危険がある患者を治療することができる。この癌は、原発癌、二次癌、または転移癌であり得る。
【０２００】
療法：抗Ｆｎ１４抗体（本明細書に記載されている抗体など）を単独で、または別の癌療法（標準的な癌療法など）と併用して、癌を治療するか、または、癌発症のリスクを軽減することができる。本明細書に記載されている併用治療に加えて、抗Ｆｎ１４抗体は、ゲムシタビン（例えば膵癌治療用）、タキソールもしくはトラスツズマブ（例えば乳癌治療用）、イリノテカン、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、もしくはセツキシマブ（例えば結腸癌治療用）、または、トラスツズマブ（例えば胃癌治療用）と併用することができる。
【０２０１】
他の癌治療としては、外科的手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、およびモノクローナル抗体療法が挙げられる。Ｆｎ１４抗体は、これらの治療法のいずれの治療法とも併用することができる。療法の選択は、腫瘍の位置と悪性度分類、および、疾患の病期、ならびに、患者の全身状態に左右される。
【０２０２】
体の他の部位を損傷することなく、癌を完全に除去することが治療の目標である。この目標は、外科的手術によって達成できる場合もあるが、癌が微小転移によって隣接組織に浸潤するか、または遠位部位に拡散する傾向によって、外科的手術の効果は限定的である場合が多い。化学療法の効果は、体内の他の組織に対する毒性によって限定される場合が多い。放射線も、正常組織を損傷させることがある。
【０２０３】
外科的手術：理論上は、癌は、外科的手術によって完全に除去すれば治癒させることができるが、これは常に可能なわけではない。外科的手術の前に、癌が体内の他の部位に転移していると、通常、完全な外科的切除は不可能である。癌の進行の１つのモデルでは、腫瘍は局所的に増殖してからリンパ節に拡散し、続いて、体の他の部位に拡散する。このモデルを受けて、小型の癌では、手術のような局所限定治療が主流となった。小型の局所腫瘍でさえも転移能があるという認識が大きくなりつつある。
【０２０４】
癌の外科的処置の例としては、乳癌での乳房切除、および前立腺癌での前立腺切除が挙げられる。外科的手術の目標は、腫瘍のみの除去、または、器官全体の除去のいずれか一方であり得る。単一の癌細胞は肉眼では見ることができないが、新たな腫瘍に再増殖することができる。
【０２０５】
外科的手術は、原発腫瘍の除去に加えて、病期分類を行うのに、例えば、疾患の程度と、領域リンパ節に転移しているか否かとを判定するのに不可欠である場合が多い。病期分類は、予後とアジュバント療法の必要性の主要な決定因子である。
【０２０６】
外科的手術は、脊髄圧迫または腸閉塞のような症状を制御するために、待機治療に不可欠である場合もある。
【０２０７】
抗Ｆｎ１４抗体は、外科的手術の前、最中、および／または後に、外科的手術と併用することができる。例えば、抗Ｆｎ１４抗体は、外科的手術の部位、例えば、腫瘍の切除が行われる区域内および／またはその区域周辺の組織上に局所投与することも、外科的手術を受けた患者が回復期を過ぎた後の療法として投与することもできる。
【０２０８】
放射線療法：放射線療法（放射線治療、Ｘ線療法、または放射線照射ともいう）は、癌細胞を殺すと共に、腫瘍を縮小させる目的で電離放射線を用いるものである。放射線療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）によって外部から実施することも、近接照射療法によって内部から実施することもできる。放射線療法の作用は、治療が施される領域に限局かつ限定される。放射線療法は、治療が施される区域（「標的組織」）内の細胞を損傷または破壊する。放射線療法の目標は、可能な限り多くの癌細胞を損傷することであると同時に、近隣の正常組織への被害を限定することである。したがって、放射線療法は、何回にも分けて実施して、治療を行っていない間に正常組織が回復できるようにする。
【０２０９】
放射線療法を用いて、脳癌、乳癌、頸癌、喉頭癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、または軟部組織肉腫を含むほぼすべてのタイプの固形腫瘍を治療することができる。白血病とリンパ腫を治療する目的でも、放射照射を用いる。各部位に対する放射線量は、各癌型の放射線感受性と、放射線照射によって損傷する場合のある隣接する組織および器官の有無を含む多くの因子によって決まる。
【０２１０】
抗Ｆｎ１４抗体は、例えば放射線治療の前、最中、および／または後に、放射線療法と併用することができる。例えば、抗Ｆｎ１４抗体は、放射線照射済み／照射中／照射予定の部位に局所投与することができる。
【０２１１】
化学療法：化学療法は、癌細胞を破壊することができる薬剤で癌を治療するものである。「化学療法」とは通常、標的療法とは対照的に、急速に分裂する細胞全般に影響を及ぼす細胞毒性薬を指す。化学療法薬は、様々な可能な方法で、細胞分裂、例えば、ＤＮＡの複製、または新たに形成された染色体の分離を妨害する。大半の化学療法形態は、急速に分裂する細胞のすべてを標的とし、癌細胞に対して特異的であるわけではないが、正常細胞は通常、ＤＮＡの損傷を修復できるが、多くの癌細胞は修復できないことから、ある程度の特異性が得られる場合もある。
【０２１２】
癌療法で用いる化学療法剤の例としては、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、５フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン、Ｇｌｉａｄｅｌインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソーマルドキソルビシン、リポソーマルダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
【０２１３】
いくつかの薬剤は、単独よりも併用の方が有効であるので、２種以上の薬剤を同時に投与する場合が多い。併用化学療法として、２種以上の化学療法剤を用いる場合が多い。抗Ｆｎ１４抗体は、化学療法（例えば１種もしくは複数種の化学療法剤）と併せて、例えば化学療法剤（１種もしくは複数種）の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
【０２１４】
標的療法：標的療法は、調節不全のタンパク質または癌細胞の他の同定分子に対して特異的な薬剤を用いることからなる。小分子標的療法薬は一般に、癌細胞中の突然変異したか、過剰発現したか、またはその他の形である重要なタンパク質上の酵素ドメインの阻害剤である。顕著な例は、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブとゲフィチニブである。モノクローナル抗体療法は、治療剤が、癌細胞の表面上のタンパク質に特異的に結合する抗体である別の方策である。例としては、抗Ｆｎ１４抗体、典型的に乳癌に用いられる抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体のトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、および、典型的に様々なＢ細胞悪性疾患に用いられる抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブが挙げられる。
【０２１５】
標的療法は、細胞表面受容体または腫瘍周辺の羅患細胞外マトリックスに結合することができる「誘導装置」として、少量のペプチドも必要とする場合がある。このペプチド（例えばＲＧＤ）に結合している放射性核種は、癌細胞の近くで崩壊すると、最終的には癌細胞を殺滅する。
【０２１６】
抗Ｆｎ１４抗体は、別の標的療法、例えば、本明細書に記載されている標的療法と併せて、その標的療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
【０２１７】
光線力学療法：光線力学療法（ＰＤＴ）は、３つの要素からなる癌治療法であり、光線感作物質、組織の酸素、および光（レーザーを用いる場合が多い）を必要とする。ＰＤＴは、例えば、基底細胞癌（ＢＣＣ）または肺癌の治療法として用いることができる。また、ＰＤＴは、大きな腫瘍を外科的に除去した後に、残りの悪性組織を除去するのに有用である場合もある。
【０２１８】
抗Ｆｎ１４抗体は、光線力学療法と併せて、例えば光線力学療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
【０２１９】
免疫療法：癌免疫療法とは、患者自身の免疫系が腫瘍と闘うように促すように設計された多様な一連の治療策を指す。腫瘍に対する免疫応答を生じさせる最新の方法としては、表在性膀胱癌に対するＢＣＧ膀胱内注入療法、および、免疫応答を誘発するインターフェロン（例えばインターフェロン−γ）と他のサイトカインを例えば腎細胞癌と黒色腫の患者に用いることが挙げられる。
【０２２０】
同種造血幹細胞移植は、免疫療法の１つの形態とみなすことができる。それは、ドナーの免疫細胞が、移植片対腫瘍作用で腫瘍を攻撃することになる場合が多いからである。
【０２２１】
抗Ｆｎ１４抗体は、本明細書に記載されている免疫療法と併せて、例えばその他の免疫療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
【０２２２】
ホルモン療法：いくつかの癌の増殖は、特定のホルモンを供給またはブロックすることによって阻害することができる。ホルモン感受性腫瘍の一般的な例としては、特定のタイプの乳癌および前立腺癌が挙げられる。エストロゲンまたはテストステロンの除去またはブロックは、重要な追加治療である場合が多い。特定の実施形態では、プロゲストゲンのようなホルモンアゴニストの投与は、治療上有益であることがある。
【０２２３】
抗Ｆｎ１４抗体は、本明細書に記載されているホルモン療法と併せて、例えばそのホルモン療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
【０２２４】
結腸癌  結腸癌は、大腸（結腸）または直腸（結腸の末端部）で発症する癌である。このような癌は、「結腸直腸癌」と呼ばれる場合もある。最も一般的なタイプは結腸癌腫である。リンパ腫、カルチノイド腫瘍、黒色腫、および肉腫のような他のタイプの結腸癌はまである。
【０２２５】
原因：アメリカ癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）によれば、結腸直腸癌は、米国における癌関連死の代表的原因の１つである。結腸癌の原因は１つではない。ほぼすべての結腸癌は、初めは良性ポリープとして現れ、このポリープがゆっくりと癌へと進化する。患者が、結腸直腸ポリープを有する場合、結腸癌を患うリスクが高くなり、体内のいずれかの癌、結腸癌になった家族、潰瘍性大腸炎、クローン病、乳癌の病歴、および／または特定の遺伝的症候群も、結腸癌発症のリスクを増大させる。
【０２２６】
症状：結腸癌の多くの症例では、症状は見られない。しかし、下痢、便秘、または用便習慣のその他の変化、血便、原因不明の貧血、下腹部の腹痛および圧痛、腸閉塞、原因不明の体重減少、ならびに細便といった症状は、結腸癌を示している場合がある。結腸癌は、適切なスクリーニングによって、症状の発現前に検出することができ、症状の発現前であれは、ほぼ治癒可能である。
【０２２７】
検査および試験：理学的検査で問題が明らかになるのはまれであるが、腹部腫瘤を感じる場合がある。直腸検査によって、直腸癌患者に、結腸癌ではない腫瘤が見つかる場合がある。結腸直腸癌を診断するための画像検査としては、結腸鏡検査とＳ状結腸鏡検査が挙げられる。便潜血反応（ＦＯＢＴ）によって、少量の血便が検出される場合があり、これは、結腸癌を示唆していることもある。しかし、この試験は、結腸癌患者では陰性である場合が多い。このため、ＦＯＢＴは典型的には、結腸鏡検査またはＳ状結腸鏡検査と共に実施する。全血球算定によって、鉄のレベルが低い貧血の徴候が明らかになる場合がある。
【０２２８】
患者が結腸直腸癌を有する場合には、追加の試験、病期分類を行って、当該癌が拡散しているかを調べることになる。病期０期は、腸管の最内層にあるごく初期の癌であり、Ｉ期では、癌は結腸の内層にあり、ＩＩ期では、癌は結腸の筋壁に拡散しており、ＩＩＩ期では、癌はリンパ節まで拡散しており、ＩＶ期では、癌は他の器官まで拡散している。
【０２２９】
治療法：治療法は部分的には、癌の病期によって決まる。一般に、治療法としては、癌細胞を殺滅するための化学療法薬、癌細胞を除去するための外科的手術、および／または、癌組織を破壊するための放射線療法を挙げることができる。さらに、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、結腸癌を治療することができる。病期０期の結腸癌は、多くの場合、結腸鏡検査中に、癌細胞を除去することによって治療してよい。さらに、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法（例えば外科的手術または化学療法）と併用して、病期０期の結腸癌を治療することができる。病期Ｉ期、ＩＩ期、およびＩＩＩ期の癌では、癌性である結腸部分を除去するためには、さらに大規模な外科的手術が必要となる。また、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法（例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法）と併用して、病期Ｉ期、ＩＩ期、またはＩＩＩ期の結腸癌を治療することができる。病期ＩＩＩ期の結腸癌を有する患者はほぼ全員、外科的手術後、約６〜８カ月間、化学療法を受けるべきである。病期ＩＩＩ期の結腸癌を治療するのに用いる化学療法剤の例は、５−フルオロウラシルである。また、病期ＩＶの結腸癌を有する患者を治療する目的で、化学療法も用いる。イリノテカン、オキサリプラチン、および５−フルオロウラシルが、最もよく使われる三大薬剤である。カペシタビンも用いられる。さらに、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法（例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法）と併用して、病期ＩＶ期の結腸癌を治療することができる。肝臓に拡散した病期ＩＶ期の疾患を有する患者には、肝臓を特異的に標的とする様々な治療法を用いることができる。この治療法としては、癌の切除、剥離、または寒冷療法を挙げることができる。化学療法剤または放射線照射は、肝臓に直接送達できる場合がある。さらに、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法（例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法）と併用して、肝臓または体内の他の場所に転移した結腸癌を治療することができる。結腸癌患者に放射線療法を用いることもあるが、通常は、病期ＩＩＩ期の直腸癌患者では、放射線療法は化学療法と併せて用いる。同様に、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体は、例えば放射線療法と併用して、病期ＩＶ期の結腸癌を治療することができる。
【０２３０】
予後：患者の体の状態は、癌の病期を含む多くの事象に左右される。一般に、早期の時点で治療すると、９０％を超える患者が、診断から少なくとも５年間生存する。しかし、早期発見される結腸直腸癌は約３９％に過ぎない。癌が拡散してしまうと、５年生存率は大幅に低下する。患者の結腸癌が５年以内に再発しなければ、治癒したとみなされる。病期Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ期の癌は、治癒可能とみなされている。大半のケースで、病期ＩＶの癌は治癒不能である。
【０２３１】
考えられる合併症：合併症としては、転移、結腸内での癌腫の再発、二次原発結腸直腸癌の発生が挙げられる。
【０２３２】
予防：結腸癌は大抵、結腸鏡検査によって、治癒可能性が最も高い再早期に発見することができる。５０歳以上の男女はほぼ全員、結腸鏡検査を受けるべきである。食生活とライフスタイルの改変が重要である。低脂肪・高繊維の食事は、結腸癌のリスクを低下させる場合があると示唆している証拠がいくつかある。抗Ｆｎ１４抗体を用いて、例えば結腸癌を患うリスクがあると同定された患者の結腸癌発症のリスクを低下させるか、または結腸癌を予防することができる。
【０２３３】
乳癌  乳癌は、乳房の組織で発症する癌である。乳癌の主要な２つのタイプは、腺管癌と小葉癌である。まれに、乳房の他の領域で乳癌が発症する場合もある。乳癌の多くは、エストロゲン感受性である（エストロゲン受容体陽性癌、すなわちＥＲ陽性癌）。ＨＥＲ２陽性である乳癌もある。
【０２３４】
原因：リスクファクターとしては下記のものが挙げられる。
【０２３５】
年齢と性別−−乳癌を患うリスクは年齢とともに向上する。進行乳癌の症例の大半は、５０歳超の女性で見つかる。女性が乳癌を発症する可能性は、男性の約１００倍である。
【０２３６】
乳癌の家族歴−−乳癌、子宮癌、卵巣癌、または結腸癌を患った近親者がいるほど、乳癌のリスクが高い。乳癌の女性の約２０〜３０％に、乳癌の家族歴がある。
【０２３７】
遺伝的特質−−最も一般的な遺伝子異常は、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子に見られる。これらの遺伝子の１つに突然異変がある女性では、存命中に乳癌になる可能性は最大で約８０％である。ＡＴＭ遺伝子、ＣＨＥＫ−２遺伝子、および癌抑制遺伝子ｐ５３で見られる遺伝子異常を含む他の遺伝子異常も乳癌と関連付けられているが、これらはまれである。
【０２３８】
月経周期−−初潮が早かった（１２歳未満）か、または、閉経が遅かった（５５歳超）女性では、乳癌のリスクが増大する。
【０２３９】
アルコールの摂取−−１日にグラス１〜２杯を超えるアルコールを摂取すると、乳癌のリスクが増大する場合がある。
【０２４０】
出産−−出産していないか、３０歳以降にしか出産をしていない女性では、乳癌のリスクが増大する。２回以上妊娠するか、または若年齢で妊娠すると、乳癌のリスクが低下する。
【０２４１】
ＤＥＳ−−流産を予防する目的でジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を服薬した女性では、４０歳以降に乳癌のリスクが増大する場合がある。
【０２４２】
ホルモン補充療法（ＨＲＴ）−−ホルモン補充療法を数年以上受けたことのある女性ほど、乳癌のリスクが高い。
【０２４３】
肥満症−−肥満症は乳癌と関連付けられているが、この関連付けには異論がある。
【０２４４】
放射線照射−−小児または青少年時に、胸部の癌を治療する目的で放射線療法を受けると、乳癌を発症するリスクが増大する。
【０２４５】
症状：早期乳癌では通常、症状は現れない。癌が増殖したときの症状として、乳房または腋窩の硬くて、縁が不均一で、通常は痛みのないしこり、乳房または乳頭の大きさ、形、または感触の変化、例えば、発赤、陥凹形成、またはしわ、乳頭からの流体（血性で、透明〜黄色または緑色で、膿のように見える場合がある）が挙げられる。男性では、乳癌の症状としては、乳房のしこり、乳房の痛み、および圧痛が挙げられる。
【０２４６】
進行乳癌の症状として、骨痛、乳房の痛みまたは不快感、皮膚潰瘍、片腕（癌のある乳房に隣接する腕）の腫脹、および体重減少が挙げられる。
【０２４７】
検査および試験：医師は、症状とリスクファクターについて質問すると共に、理学的検査を実施することになる。この検査には、乳房、腋窩、ならびに、頚部および胸部のいずれもが含まれる。追加の検査として、マンモグラフィ、胸部ＭＲＩ、胸部超音波、胸部生検、針吸引、または、さらに精密な検査のために乳房のしこりの全部もしくは一部を除去する目的で乳房のしこりを除去するものが挙げられる。患者が乳癌である場合には、今後の治療を決める手引きとなるように追加の試験を行って、癌が拡散しているか（例えば病期分類）を調べる。
【０２４８】
乳癌の病期は、０期からＩＶ期までに及ぶ。一般に、乳癌は、上皮内（非浸潤性）乳癌、または浸潤性乳癌である場合がある。病期数が大きいほど、癌の進行度が高い。
【０２４９】
治療：治療は、該癌の種類と病期、該癌が特定のホルモンに対して感受性があるか、該癌がＨＥＲ２／ｎｅｕという遺伝子を過剰産生（過剰発現）するか否かを含む多くの因子に基づく。一般に、癌の治療法としては、化学療法、放射線療法、癌組織を除去するための外科的手術、すなわち、乳房のしこりを除去するランペクトミー、乳房の全部または一部と癌の可能性がある近隣の構造物を除去する乳房切除術が挙げられる。さらに、本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、乳癌を治療することができる。別の治療法としては、ホルモン療法と標的療法が挙げられる。ホルモン療法の例は、タモキシフェンという薬剤である。この薬剤は、エストロゲンの作用をブロックする。このエストロゲンは、乳癌細胞の生存と増殖を助けることができるものである。エストロゲン感受性乳癌の大半の女性において、この薬剤が有効である。エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）のようなアロマターゼ阻害剤というさらに新しい分類の医薬は、乳癌である閉経後の女性において、タモキシフェンと同等か、またはこれを上回る効果があることが示されている。標的治療では、癌に至る場合のある、細胞の特定の変化を識別する特殊な抗癌剤を用いる。このような薬剤の１つはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））である。病期ＩＶのＨＥＲ２陽性乳癌の女性には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）と化学療法を併せると、化学療法単独よりも効果があることが示されている。研究によって、早期のＨＥＲ２陽性乳癌の女性でも、この医薬と化学療法を併せると、癌再発のリスクが５０％低下することも示されている。本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体をＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（単独または化学療法との併用）と併用して、治療を行うことができる。
【０２５０】
癌の治療は、局所治療であっても、全身治療であってもよい。放射線照射と外科的手術は、局所治療の形態である。化学療法は、全身治療の１つのタイプである。
【０２５１】
大半の女性には、複数の治療法を組み合わせた治療が行なわれる。病期Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ期の乳癌の女性では、主な目標は、癌を治療すると共に、癌の再発を予防することである。病期ＩＶの癌の女性では、目標は、症状を改善すると共に、生存期間が延長するように助けることである。大半のケースでは、病期ＩＶの乳癌は治癒することができない。本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ期の乳癌を治療することができる。
【０２５２】
病期０期−−ランペトミーと放射線照射または乳房切除が標準的な治療法である。
【０２５３】
病期ＩおよびＩＩ期−−ランペトミーと放射線照射または乳房切除と共に、ある種のリンパ節の除去が標準的な治療法である。また、ホルモン療法、化学療法、および生物学的療法が術後に推奨される場合もある。
【０２５４】
病期ＩＩＩ期−−治療には、外科的手術の後、場合によって、化学療法、ホルモン療法、および生物学的療法を行うことが含まれる。
【０２５５】
病期ＩＶ期−−治療には、外科的手術、放射線照射、化学療法、ホルモン療法、またはこのような治療の組み合わせが含まれる場合がある。
【０２５６】
適切な治療を受けている乳癌患者の５年生存率は下記のとおりである。
【０２５７】
病期０期：１００％
病期Ｉ期：１００％
病期ＩＩＡ期：９２％
病期ＩＩＢ期：８１％
病期ＩＩＩＡ期：６７％
病期ＩＩＩＢ期：５４％
病期ＩＶ期：２０％
考えられる合併症：乳癌は、体の他の部分に拡散することができる。場合によっては、腫瘍全体を除去し、近隣のリンパ節に癌がないことが明らかになった後でさえも、癌は再発する。癌治療の副作用または合併症が起こり得る。例えば、放射線療法によって、一過性の乳房腫脹、ならびに、領域周辺の疼痛および痛みが起こる場合がある。
【０２５８】
予防：一般に、健康的な食生活といくつかのライフスタイルの変更によって、癌になる総体的な可能性が低下する場合がある。
【０２５９】
乳癌は、早期発見した方が治療が容易で、かつ治癒可能である場合が多い。早期発見法には、乳房の自己検査（ＢＳＥ）、医療専門家による乳房の臨床検査、および／またはスクリーニングマンモグラフィが含まれる。
【０２６０】
医薬組成物
抗Ｆｎ抗体（本明細書に記載されている抗体のようなもの）は、患者に投与するための、例えば、本明細書に記載されている障害を治療するための医薬組成物として調合することができる。典型的には、医薬組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含有する。本明細書で使用する場合、「製薬学的に許容可能な担体」としては、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる。医薬組成物としては、製薬学的に許容可能な塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）を挙げることができる。
【０２６１】
製薬学的な調合は、十分に確率された技術であり、例えばＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、およびＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）でさらに説明されている。
【０２６２】
医薬組成物は様々な形態であってよい。この形態としては例えば、液体、半固体、および固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば注射可能溶液および不融性溶液）、分散液剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および座剤が挙げられる。好ましい形態は、意図した投与方法と治療用途によって決まる場合がある。典型的には、本明細書に記載されている薬剤用の組成物は、注射可能溶液または不融性溶液の形態である。
【０２６３】
１つの実施形態では、抗Ｆｎ１４抗体は、塩化ナトリウム、第二リン酸ナトリウム七水和物、第一リン酸ナトリウム、および安定剤といった賦形剤材料と共に調合する。抗Ｆｎ１４抗体は例えば、好適な濃度で緩衝液中に供給することができると共に、２〜８℃で保管することができる。
【０２６４】
このような組成物は、非経口投与（例えば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内注射）することができる。「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、本明細書で使用する場合、通常注射によって行われる腸内投与および局所投与以外の投与方法を意味し、非経口投与としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６５】
医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液剤、リポソーム、または高濃度での安定的な保管に適したその他の秩序構造体として調合することができる。本明細書に記載されている薬剤を所要量で適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙されている構成要素の１つまたは構成要素の組み合わせと共に組み込んでから、ろ過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液剤は、塩基性分散媒と、上に列挙されているものから選択した所要の他の構成要素とを含有する滅菌ビヒクル中に、本明細書に記載されている薬剤を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌散剤の場合には、好ましい調製法は、本明細書に記載されている薬剤と、任意の追加的な所望の成分の予めろ過滅菌した溶液に由来する任意の追加的な所望の成分との粉末を生じさせる真空乾燥と凍結乾燥である。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液剤の場合には、所要の粒径を維持することによって、および、界面活性剤を用いることによって、溶液の適切な流動率を維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０２６６】
特定の実施形態では、該抗Ｆｎ１４抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のように、急速な放出から当該化合物を保護することになる担体と共に調製してよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性・生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許を得ているか、または一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照されたい。
【０２６７】
抗Ｆｎ１４抗体は、例えば、抗Ｆｎ１４抗体の安定化、および／または、循環、例えば血液、血清、もしくは他の組織における滞留性を例えば少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、または５０倍向上させる部分によって修飾することができる。
【０２６８】
例えば、該抗Ｆｎ１４抗体は、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドのような実質的に非抗原性のポリマーと結合（例えば共役）させることができる。好適なポリマーは、実質的に重量によって変わることになる。平均分子量が約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００ダルトン）であるポリマーを用いることができる。
【０２６９】
例えば、該抗Ｆｎ１４抗体は、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンなどに共役させることができる。このようなポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマー、およびこれらのブロックコポリマー（ただし、ブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件とする）が挙げられる。追加的な有用なポリマーとしては、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマーのようなポリオキシアルキレン、ポリメタクリル酸、カルボマー、ならびに、分岐または非分岐多糖類が挙げられる。
【０２７０】
いくつかの実施態様では、該抗Ｆｎ１４抗体は、標識または他の薬剤、例えば、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤のような別の治療薬剤に結合させるか、または別の形でこれらと会合させることもできるが、多くの実施形態では、この構造は不要である。細胞毒性剤および化学療法剤の例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド（例えば、メイタンシノールまたはＤＭ１メイタンシノイド、メイタンシンのスルフヒドリル含有誘導体）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、タキサン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。
【０２７１】
該抗Ｆｎ１４抗体を第２の薬剤（例えば化学療法剤）と併用する場合、これら２つの薬剤は、別々に調合することも、一緒に調合することもできる。これらの薬剤は、相乗的に有効な量で調合または使用することができる。これらの薬剤の一方または両方を、単剤療法で用いる量よりも少ない量で用いることもできる。例えば、それぞれの医薬組成物を、例えば投与直前に混合して一緒に投与することも、例えば同じ回数または異なる回数で別々に投与することもできる。
【０２７２】
また、他のＦｎ１４結合剤またはＦｎ１４アゴニスト剤を用いることもできる。この薬剤は、患者に投与することができるあらゆるタイプの化合物（例えば、有機もしくは無機小分子、核酸、タンパク質、またはペプチド模倣体）であってよい。１つの実施形態では、この薬剤は、生物剤、例えば分子量が５〜３００ｋＤａであるタンパク質である。例えば、Ｆｎ１４アゴニスト剤は、Ｆｎ１４結合部の下流のイベントを活性化する場合がある。Ｆｎ１４に結合するアゴニスト抗体以外の例示的なＦｎ１４アゴニスト剤としては、ＴＷＥＡＫと、ＴＷＥＡＫの可溶性形態が挙げられる（例えば米国特許第７，１０９，２９８号を参照されたい）。このような薬剤は、本明細書に記載されている１種もしくは複数種の抗体との併用療法の一環として投与することができる。また、本明細書に記載されている他の治療剤も、例えば標準的な方法または本明細書に記載されている方法によって、医薬組成物として提供することができる。
【０２７３】
投与
該抗Ｆｎ１４抗体は、様々な方法によって、患者、例えば抗Ｆｎ１４抗体の投与が必要な患者、例えばヒトの患者に投与することができる。多くの用途では、投与経路は、静脈内注射または注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）または筋肉内注射のうちの１つである。関節内送達も用いることができる。他の非経口投与法も用いることができる。このような方法の例としては、動脈内注射、髄腔内注射、包内注射、眼窩内注射、心臓内注射、皮内注射、経気管注射、表皮下注射、関節内注射、被膜下注射、クモ膜下注射、脊椎内注射、硬膜外注射、および胸骨内注射が挙げられる。場合によっては、投与は、癌の部位に直接、例えば、腫瘍の中および／または腫瘍に隣接する部位に行ってよい。場合によっては、経口投与することもできる。
【０２７４】
該抗体の投与の経路および／または方法は、例えば断層画像を用いて、例えば腫瘍を視覚化することによって、例えば患者をモニタリングすることによって、個々の症例に合わせることもできる。
【０２７５】
該抗体は、固定用量で、または、ｍｇ／ｋｇという単位の用量で投与することができる。該用量は、該抗Ｆｎ１４抗体に対する抗体の産生を低下または回避させるように選択することもできる。投与レジメンは、所望の応答、例えば、治療応答、または治療効果の組み合わせが得られるように調整する。一般に、該抗Ｆｎ１４抗体（および任意で第２の薬剤）の用量は、バイオアベイラブルな量で薬剤を患者に供給する目的で用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与することができる。他の用量を用いることもできる。
【０２７６】
組成物は、抗体を約１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０〜１００ｍｇ／ｍｌ、または約１００〜１５０ｍｇ／ｍｌ、または約１００〜２００ｍｇ／ｍｌ含有してよい。
【０２７７】
特定の実施形態では、組成物中の該抗Ｆｎ１４抗体は、大半が単量体形態であり、例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９８．５％、または９９％が単量体形態である。特定の抗Ｆｎ１４抗体組成物は、例えばＡ２８０ｎｍのＵＶによって検出した場合において、凝集物を約５、４、３、２、１、０．５、０．３、または０．１％未満含有してよい。特定の抗Ｆｎ１４抗体組成物は、例えばＡ２８０ｎｍのＵＶによって検出した場合において、断片を約５、４、３、２、１、０．５、０．３、０．２、または０．１％未満含有する。
【０２７８】
投与単位形態または「固定用量」とは、本明細書で使用する場合、物理的に分離した単位であって、治療を受ける患者用の単位投与として適した単位を指し、各単位は、所要の製剤用担体と連動として、かつ任意で別の薬剤と連動して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。単回または複数回投与を行ってよい。この代わりに、またはこれに加えて、持続注入によって該抗体を投与してもよい。
【０２７９】
例えば、少なくとも２用量、３用量、５用量、１０用量、またはそれ以上の用量の投与に対応するのに十分である期間（治療過程）にわたって定期的な間隔で、例えば、約１〜１２週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらに好ましくは約４、５、または６週間にわたって、１日に１もしくは２回、または１週間に約１〜４回、好ましくは１週間に１回、２週間に１回（２週間ごと）、３週間に１回、月に１回、抗Ｆｎ１４抗体の１回分の用量を投与することができる。患者を有効に治療するために必要な用量とタイミングに影響を及ぼす可能性のある因子としては、例えば、疾患または障害の重症度、調合、送達経路、過去の治療、患者の全般的健康状態および／または年齢、ならびに、存在する他の疾患が挙げられる。さらに、治療的に有効な量の化合物で患者を治療することとしては、単回治療を挙げることができ、好ましくは、一連の治療を挙げることができる。また、動物モデルを用いて、有用な用量、例えば初回用量またはレジメンを決定することもできる。
【０２８０】
対象者に、本明細書に記載されている癌または他の障害を発症する危険性がある場合、その癌または障害が完全に発症する前に、例えば予防的な措置として、本発明の抗体を投与することができる。このような予防的な措置の持続期間は、該抗体の単回投与であり得るし、あるいは、この処置を継続してもよい（例えば複数回投与）。例えば、上記の障害を患う危険性があるか、または疾患の素因を有する対象者を、数日間、数週間、数カ月、または数年間にわたって本発明の抗体で治療して、その障害が発症または激症化しないようにしてもよい。
【０２８１】
医薬組成物は、本明細書に記載されている薬剤を「治療有効量」含有してよい。このような有効量は、投与される薬剤の作用、または、２種以上の薬剤を用いる場合には、それらの薬剤の併用作用に基づいて決定することができる。また、薬剤の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに、個体内で所望の応答、例えば、少なくとも１つの障害パラメーターの改善、または、障害の少なくとも１つの症状の改善を当該化合物が引き出す能力といった因子によって変わる場合がある。また、治療有効量は、その組成物のあらゆる有毒作用または有害作用よりも治療上有益な作用が上回る量でもある。
【０２８２】
治療用の装置およびキット
該抗Ｆｎ１４抗体を含有する医薬組成物は、医療装置を用いて投与することができる。この装置は、可搬性、室温での保管性、ならびに、緊急時に、例えば、訓練を受けていない患者、または現場の救助隊員が、医療設備および他の医療機器から離れていても使用できるような使いやすさなどの特徴を有する設計にすることができる。この装置は、例えば、抗Ｆｎ１４抗体を含有する製剤を収容するための１つもしくは複数のハウジングを備えることができると共に、１単位用量以上の該抗体を送達するように設計することができる。さらに、この装置は、第２の薬剤、例えば化学療法剤を、該抗Ｆｎ１４抗体も含有する単一の医薬組成物として、または２つの別々の医薬組成物として投与するように設計することもできる。
【０２８３】
上記の医薬組成物は注射器によって投与してもよい。また、上記の医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような無針皮下注射装置を用いて投与することもできる。周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で医薬を分注するための植え込み型微量注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通じて医薬を投与するための医療装置を開示している米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、薬剤を持続的に送達するための植え込み型可変流量注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数のチャンバー区画を有する浸透圧性薬剤用送達システムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および、浸透圧性薬剤用送達システムを開示している米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。他の多くの装置、インプラント、送達システム、およびモジュールも知られている。
【０２８４】
抗Ｆｎ１４抗体は、キットで提供することができる。１つの実施形態では、このキットは、（ａ）抗Ｆｎ１４抗体を含有する組成物が入った容器と、任意で（ｂ）情報資料を含む。この情報資料は、記述的資料、教材、マーケティング資料、または、本明細書に記載されている方法および／もしくは治療的有用性を得るための薬剤の使用法に関するその他の資料であり得る。
【０２８５】
１つの実施形態では、上記のキットは、本明細書に記載されている障害を治療するための第２の薬剤、例えば化学療法剤も含む。例えば、該キットは、該抗Ｆｎ１４抗体を含有する組成物が入った第１の容器と、該第２の薬剤が入った第２の容器を含む。
【０２８６】
該キットの情報資料の形態は限定されない。１つの実施形態では、該情報資料は、当該化合物の製造、当該化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチ、または製造地情報などに関する情報を含むことができる。１つの実施形態では、該情報資料は、本明細書に記載されている癌または他の障害を患ったか、または患う危険性がある患者を治療する目的で、例えば好適な用量、剤形、または投与方法（例えば、本明細書に記載されている用量、剤形、または投与方法）で該抗Ｆｎ１４抗体を投与する方法に関する。この情報は、印刷物、コンピューター可読資料、録画、もしくは録音、または、例えばインターネット上の価値のある資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む様々な形式で提供することができる。
【０２８７】
該キット内の組成物は、本発明の抗体に加えて、溶媒もしくは緩衝剤、安定剤、または保存剤のような他の成分を含有することができる。該抗体は、任意の形態、例えば液体形態、乾燥形態、または凍結乾燥形態、好ましくは実質的に純粋および／または無菌の形態で提供することができる。薬剤を液体溶液で提供する場合、この液体溶液は水溶液であるのが好ましい。薬剤を乾燥形態として提供する場合、再構成は一般に、好適な溶媒を加えることによって行う。この溶媒、例えば滅菌水または緩衝液は、任意で該キットに入れることができる。
【０２８８】
該キットは、薬剤を含有する１種もしくは複数種の組成物用の１つもしくは複数の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、該キットは、組成物と情報資料用の別々の容器、仕切り、または区画を含む。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジに入れることができ、情報資料は、プラスチック製のスリーブまたは小袋の中に入れることができる。別の実施形態では、該キットの別々の要素を１つの分割されていない容器に入れる。例えば、ラベルの形で情報資料が貼付されている瓶、バイアル、またはシリンジに組成物を入れる。いくつかの実施形態では、該キットは、複数の（例えば一群の）個別の容器を含み、この各容器には、１つもしくは複数の単位投与形態（例えば、本明細書に記載されている投与形態）の薬剤が入っている。これらの容器には、単位用量を組み合わせたもの、例えば、該抗Ｆｎ１４抗体と該第２の薬剤を例えば所望の比率で含む１単位分を入れることができる。例えば、該キットは、例えば、それぞれ１回分単位用量を組み合わせたものが入ったシリンジ、アンプル、ホイル製の袋、ブリスターパック、または医療用装置を複数含む。該キットの容器は、気密性、防水性（例えば湿度の変化または蒸発に対して不透過性）、および／または遮光性であり得る。
【０２８９】
該キットは、組成物の投与に適した装置、例えば、注射器またはその他好適な送達装置を任意に含む。この装置は、一方または両方の薬剤を予め充填した状態で提供することができ、あるいは、空の状態にすることもできるが、充填に適したものである。
【０２９０】
Ｆｎ１４発現細胞への標的化
本明細書に記載されている抗Ｆｎ１４抗体を用いて、Ｆｎ１４発現細胞、または、Ｆｎ１４と関連する組織もしくはその他の構造物にペイロードを向けることができる。例えば、外来遺伝子（例えば遺伝子治療用）を送達することができるウイルスもしくはウイルス様粒子、またはリポソーム、例えば、治療剤もしくは外来遺伝子を封入するリポソームに該抗体を結合させることができる。抗体を用いてウイルスを標的にする例示的な方法は、Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：９０７９−８０８３に記載されている。例えばＣｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００５）５：６３−７０、およびＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００４）１５：１０３４−１０４４も参照されたい。
【０２９１】
また、本発明の抗Ｆｎ１４抗体は、化学療法剤のような治療剤を含むリポソームに結合させてもよい。抗体のリポソームへの結合は、標的化送達のためにトキシンまたは化学療法剤を抗体に結合させる目的で広く用いられているヘテロ二官能性架橋剤のような任意の既知の架橋剤によって行ってよい。例えば、リポソームへの共役は、炭水化物指向性架橋試薬である４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を用いて行うことができる（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７）。また、抗体含有リポソームも、周知の方法によって調製することができる（例えば、独国特許第３，２１８，１２１号、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−９２、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０−３４、米国特許４，４８５，０４５号、および同第４，５４４，５４５号を参照されたい）。
【０２９２】
診断利用
抗Ｆｎ１４抗体は、Ｆｎ１４の存在をインビトロ（例えば、組織、生検材料のような生体サンプル）またはインビボ（例えば患者の生体内撮像）で検出するための診断法で用いることができる。例えば、ヒト抗Ｆｎ１４抗体または事実上のヒト抗Ｆｎ１４抗体を患者に投与して、その患者の体内のＦｎ１４を検出することができる。例えば、例えばＭＲＩ検出用標識または放射性標識で該抗体を標識することができる。検出可能な標識を検出するための手段を用いて、患者を評価することができる。例えば、患者を走査して、患者の体内の該抗体の局在を評価することができる。例えば、患者は、例えばＮＭＲまたはその他の断層撮影手段を用いて撮像する。
【０２９３】
画像診断に有用な標識の例としては、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈのような放射性標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子断層撮影法（「ＰＥＴ」）の走査装置によって検出可能な陽電子放出同位体、ルシフェリンのような化学発光物質、ならびに、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素マーカーが挙げられる。また、短距離検出用プローブによって検出可能な同位体のような短距離放射線発光体も採用することができる。既知の技法を用いて、このような試薬で該タンパク質リガンドを標識することができる。例えば、抗体の放射性標識に関する技法については、Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。また、Ｃｏｌｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６も参照されたい。
【０２９４】
患者は、例えばガンマカメラまたはエミッショントモグラフィーを用いる放射性核種走査のような既知の技法を用いて、インビボで「撮像」することができる。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。あるいは、放射性標識が陽電子（例えば１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放出する場合には、ブルックヘブン国立研究所にあるＰｅｔ  ＶＩと命名された撮影装置のような陽電子放射型横断断層撮影走査装置を用いることもできる。
【０２９５】
ＭＲＩ造影剤  磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、ＮＭＲを用いて生体の内部の特徴を可視化するものであり、予後、診断、治療、および外科的手術に有用である。ＭＲＩは、放射性トレーサー化合物なしに用いることができ、明らかに有益である。いくつかのＭＲＩ技法は、欧州特許第０  ５０２  ８１４Ａ号に概説されている。一般に、様々な環境における水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関する差異を利用して、画像を生成する。しかし、これらの差異は、鮮明で高解像度な画像をもたらすには不十分である場合がある。
【０２９６】
これらの緩和時間定数の差異は、造影剤によって大きくすることができる。このような造影剤の例としては、いくつかの磁性剤、常磁性剤（主にＴ１を変化させる）、および、強磁性剤または超常磁性剤（主にＴ２応答を変化させる）が挙げられる。キレート剤（例えば、キレート剤ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＮＴＡ）を用いて、いくつかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、Ｇｄ３＋）を付着（および毒性を低下）させることができる。他の薬剤は、粒子（例えば、直径１０μｍ〜約１０ｎｍ未満）の形態であり得る。粒子は、常磁性、坑常磁性、または超常磁性の特性を有することができる。粒子としては、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、およびその他の遷移元素の磁性鉱物化合物を挙げることができる。磁性粒子として、１種もしくは複数種の磁性結晶（非磁性物質の有無にかかわらない）が挙げられる。非磁性物質としては、合成または天然ポリマー（セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）を挙げることができる。
【０２９７】
また、（ｉ）天然に豊富に存在するフッ素原子の実質的にすべてが、１９Ｆ同位体であるため、実質的にすべてのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり、（ｉｉ）トリフルオロ酢酸無水物のような化学的に活性な多くのポリフッ化化合物が比較的低価格で市販されており、かつ（ｉｉｉ）ヘモグロビンに代わるものとして、酸素を運搬するのに用いられるペルフルオロ化ポリエーテルなど、多くのフッ化化合物が、ヒトで用いるためのものとして医学的に許容可能であることが明らかになっているので、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子、または複数のこのような原子を含む指示基で、該抗Ｆｎ１４抗体を標識することもできる。インキュベートションのためにそのような時間を置いた後、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４６：７８−８８によって説明されているような装置の１つを用いて、全身ＭＲＩを行って、Ｆｎ１４の分布を特定および撮像する。
【０２９８】
別の態様では、本開示は、インビトロでサンプル（例えば、血清、血漿、組織、生検材料のような生体サンプル）におけるＦｎ１４の存在を検出する方法を提供する。本発明を用いて、障害、例えば癌を診断することができる。この方法としては、（ｉ）該サンプルまたはコントロールサンプルを該抗Ｆｎ１４抗体と接触させて、（ｉｉ）例えば、該抗Ｆｎ１４とＦｎ１４との複合体の形成を検出することによるか、または、該抗Ｆｎ１４抗体またはＦｎ１４の存在を検出することによって、Ｆｎ１４の存在について、該サンプルを評価することが挙げられる。例えば、この抗体は、例えば支持体上に固定化することができ、その支持体上に抗原が保持されていることを検出するか、および／または、抗原上に支持体が保持されていることを検出する。コントロールサンプルを含めることもできる。該コントロールサンプルと比べて、該サンプル内での複合体の形成の統計的に有意な変化は、該サンプル内にＦｎ１４が存在する兆候でる場合がある。一般に、蛍光偏光、顕微鏡検査、ＥＬＩＳＡ、遠心分離、クロマトグラフィー、および細胞選別（例えば蛍光活性化細胞選別）を含む用途で、抗Ｆｎ１４抗体を用いることができる。
【０２９９】
以下は、本発明の実施例である。これらの例は、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものとはみなさない。
【実施例】
【０３００】
実施例１：抗Ｆｎ１４抗体
ヒト表面Ｆｎ１４を発現するＣＨＯ細胞を投与することによって、Ｆｎ１４欠損マウス内で抗Ｆｎ１４抗体Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、Ｐ２Ｄ３、およびＰ３Ｄ８を産生させ、Ｆｎ１４−ｍｙｃ−Ｈｉｓというタンパク質で免疫増強した。初期の免疫戦略として必要と思われたこの免疫戦略はうまくいかなかった。上記の抗体は、インビトロでヒトＦｎ１４タンパク質およびカニクイザルＦｎ１４タンパク質の両方に結合する。ヒトＦｎ１４タンパク質（上）とカニクイザルＦｎ１４タンパク質（下）とのアラインメントは下記のとおりである。
【０３０１】
【化１】
2011523414.tif 000003
Ｐ４Ａ８の特性については、後でさらに説明するが、その特性としては、一価結合親和性が約１．６または２ｎＭであること、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するインビトロでの効能に関するＥＣ５０が１７０ｐＭであること、ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスのＦｎ１４において種間交差反応性があること、インビトロで腫瘍細胞死を誘発する能力、インビボで腫瘍異種移植片モデルで有効であること、インビトロおよびインビボでＮＦ−κＢのシグナル伝達とカスパーゼ−３／７の誘発を誘発すること、マウスでの半減期が２日であること、ラットでの半減期が５日超であること、ならびに、他のＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合しないことが挙げられる。
【０３０２】
実施例２：抗Ｆｎ１４抗体は、インビトロで腫瘍細胞を殺滅する
抗Ｆｎ１４抗体（Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、またはＰ３Ｄ８）、ポジティブコントロールのアゴニスト（Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ）、またはネガティブコントロール（ＭＯＰＣ２１）（それぞれ、ＩＦＮ−γと組み合わせた）によって、それらの濃度を増しながら結腸癌細胞Ｗｉｄｒを処置した。生存率の低下（ＭＴＴアッセイによるスコアリング）によって、細胞死を測定した。抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８、ならびに、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫは、腫瘍細胞を殺滅することができた（図１）。ＷｉＤｒのＭＴＴアッセイにおけるＰ４Ａ８のＥＣ５０は約３０ｎｇ／ｍｌである。ＭＴＴアッセイにおいて、ヒト化Ｐ４Ａ８ＩｇＧ１（ｈＰ４Ａ８ＩｇＧ１、後述）でも同様の結果が得られた。加えて、多量体型のｈＰ４Ａ８ＩｇＧ１（ｈＰ４Ａ８ＩｇＧ１をプロテインＡに結合させることによって生成）で処置したところ、作用が向上した（図１５）。
【０３０３】
Ｐ４Ａ８抗体がインビトロで結腸癌細胞ＷｉＤｒのアポトーシスを誘発する能力をＴＵＮＥＬアッセイによって測定した。ＷｉＤｒ細胞をＰ４Ａ８抗体またはポジティブコントロール（Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ）（それぞれ、ＩＦＮ−γと組み合わせた）で処置するか、または、未処置のままにするかした。Ｐ４Ａ８抗体とＦｃ−ＴＷＥＡＫはいずれも、腫瘍細胞を殺滅することができた（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０３０４】
抗Ｆｎ１４抗体がインビトロで乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１を殺滅する能力について、抗Ｆｎ１４抗体を試験した。抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、もしくはＰ３Ｄ８、またはポジティブコントロールのアゴニスト（Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ）（それぞれ、ＩＦＮ−γと組み合わせた）によって、それらの濃度を増しながら上記の癌細胞を処置した。生存率の低下（ＭＴＴアッセイによるスコアリング）によって、細胞死を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞はインビトロにおいて、該抗Ｆｎ１４抗体に対する耐性があった（図３）。
【０３０５】
試験したすべての細胞内に、Ｐ４Ａ８が速やかにインターナリゼーションされた。内部顆粒の体裁は、小型かつ多数（ＷｉＤｒ）なものから、大型かつ少数（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）のものまで様々であった。加えて、Ｐ４Ａ８による細胞の処置によって、Ｆｎ１４自体が誘発または安定化された。この現象は、Ｆｎ１４  ｍＲＮＡの増加に起因するものではなかった。
【０３０６】
実施例３：インターロイキン−８の分泌の誘発
抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ３Ｄ８を試験して、それらがインビトロでインターロイキン８（ＩＬ−８）の分泌を誘発する能力を評価した。ネガティブコントロールのＭＯＰＣ２１、ポジティブコントロールのｈＦｃＴＷＥＡＫ、または、抗体Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、もしくはＰ３Ｄ８によって、それらの濃度を増しながらＡ３７５細胞を処置した。各濃度において、培地中に分泌されたＩＬ−８のレベルを測定した。上記の各抗体はＩＬ−８の分泌を誘導した。したがって、上記の各抗体は、Ｆｎ１４アゴニストとしての機能を果たすことができる（図４）。
【０３０７】
実施例４：インビボでの腫瘍の治療
該抗Ｆｎ１４抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、結腸癌細胞ＷｉＤｒ異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Ｆｎ１４抗体（Ｐ２Ｄ３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、もしくはＰ３Ｄ８）、ネガティブコントロール（ＰＢＳ、ＭＯＰＣ２１、もしくはＰ１．１７）、またはポジティブコントロール（Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ）で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図５に示されている。腫瘍の体積（ｍｍ３、上のパネル）、または腫瘍の重量（グラム、下のパネル）によって、腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Ｆｎ１４抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった（図５）。
【０３０８】
上記の抗Ｆｎ１４抗体とコントロールの毒性についても試験した。どの処置でも、繰り返し投与した後でさえも、明らかな毒性は観察されなかった（マウスの体重によって測定）（図６）。
【０３０９】
実施例５：大きな腫瘍の治療
該抗Ｆｎ１４抗体がインビトロで癌を治療する能力を大きな腫瘍で試験した。結腸癌細胞Ｗｉｄｒ異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Ｆｎ１４抗体（Ｐ４Ａ８、１００μｇ）またはネガティブコントロール（ＰＢＳもしくはＭＯＰＣ２１）で処置した。抗体は週に１回投与し、試験期間を通じて継続したか、１６日目に投与を開始して早期（３７日目）に終了したか、または、遅れて（３７日目に）投与を開始して試験が終わるまで実施した。腫瘍の体積（ｍｍ３）によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Ｆｎ１４抗体は、処置の開始が遅くてもまたは処置を早く終了しても、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった（図７）。
【０３１０】
実施例６：用量応答
ＷｉＤｒ細胞異種移植片の用量応答を調べた。様々な用量の抗Ｆｎ１４抗体Ｐ４Ａ８とネガティブコントロールＰＢＳを試験した（ある期間（日数）にわたる腫瘍の体積（ｍｍ３））。抗体の用量が増えるのに伴って、効能が向上した（図８）。
【０３１１】
また、試験試料のコントロールに対する比率（％Ｔ／Ｃ）として、用量応答も解析した。図９に示されているように、抗体の用量が増えるのに伴って、効能が向上した。様々な量の抗体とコントロールの毒性についても試験した。どの処置でも、繰り返し投与した後でさえも、明らかな毒性は観察されなかった（体重の変化率（％）によって測定）（図１０）。
【０３１２】
実施例７：インビボでの乳癌細胞の治療
該抗Ｆｎ１４抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Ｆｎ１４抗体（Ｐ２Ｄ３もしくはＰ４Ａ８）、またはネガティブコントロール（ＰＢＳまたはＭＯＰＣ２１）で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図１１に示されている。腫瘍の体積（ｍｍ３）によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Ｆｎ１４抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった（図１１）。
【０３１３】
実施例８：抗体の交差反応性
抗Ｆｎ１４抗体Ｐ４Ａ８およびＰ２Ｄ３は、多数の種に由来するＦｎ１４に対し交差反応性がある。図１２に示されているように、上記の抗体の双方とも、フローサイトメトリー（平均蛍光値（ＭＦＩ））によって判定したところ、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｎ１４と反応する。ＥＣ５０値も図１２に示されている。Ｐ４Ａ８は、ラットＦｎ１４とも交差反応性がある。アカゲザルＦｎ１４をクローニングして、ヒトＦｎ１４と同一であることを決定した。したがって、上記の抗体のアカゲザルＦｎ１４に対する結合特性は、ヒトＦｎ１４に対する結合特性と同じである。
【０３１４】
ヒトＦｎ１４（ＮＭ＿０１６６３９）、カニクイザルＦｎ１４（実施例１を参照）、マウスＦｎ１４（ＮＭ＿０１３７４９）、ラットＦｎ１４（ＮＭ＿１８１０８６）、およびアフリカツメガエルＦｎ１４（ＮＭ＿００１０９０１７１）をコードする完全長Ｆｎ１４  ｃＤＮＡを遺伝子工学技術で作製して、関係のない５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを除去すると共に、同一の最適化コザック配列を付加してから、それらのＤＮＡをｐＮＥ００１（完全に配列が確認されているベクターｐＵＣ系ＥＢＶ発現ベクターであって、インビトロジェンの発現ベクターｐＣＥＰ４に由来するベクター）にサブクローニングした。この発現ベクター内では、プロモーターＣＭＶ−ＩＥとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルによって異種遺伝子の発現が制御されるが、ＥＢＮＡ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子が欠損している。Ｆｎ１４発現ベクター（ヒト：ｐＥＡＧ２１２１、カニクイザル：ｐＥＡＧ２１２０、マウス：ｐＥＡＧ２１２６、ラット：ｐＥＡＧ２２７５、およびアフリカツメガエル：ｐＥＡＧ２２３７）と、ＥＧＦＰレポーターを含むＥＢＶ発現ベクターとを１：１のモル比で、２９３Ｅ細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションから２日目に、細胞を、（希釈滴定によって）目的のモノクローナル抗体で染色し、緑色のＥＧＦＰ陽性生細胞にゲーティングを行った状態でＦＡＣＳにかけた。このタイプのアッセイは、Ｆｎ１４の細胞表面密度に左右されるので、所与のトランスフェクションに関する見かけＥＣ５０値を反映する。したがって、この直接結合アッセイでは、真のＫｄ値は得られない。
【０３１５】
下に示されているのは、ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスの完全長Ｆｎ１４の推定タンパク質配列のアラインメントである。
【０３１６】
【化２】
2011523414.tif 000004
コンセンサスと同一の部分は大文字になっており、コンセンサスと異なる部分は小文字になっている。予測シグナル配列は、１番目の残基から２７番目の残基までであり、予測膜貫通ドメインは、７９番目の残基から１０１番目の残基までである。ヒトＦｎ１４に対する全体的同一率（％）は上に示されている。
【０３１７】
図１６は、一連の抗ｈｕＦｎ１４  ｍＡＢ  Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｄ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８のヒト表面Ｆｎ１４およびカニクイザル表面Ｆｎ１４に対する直接結合性のＦＡＣＳアッセイを示しており、いずれの抗体も、同程度のＥＣ５０値で結合する。図１７は、一連の抗ｈｕＦｎ１４  ｍＡＢ  Ｐ２Ｄ３、Ｐ３Ｄ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ４Ａ８のマウス表面Ｆｎ１４に対する直接結合性のＦＡＣＳアッセイ示しており、いずれの抗体も、霊長類Ｆｎ１４への結合に関する値と同程度の見かけＥＣ５０値で結合する。ヒト化Ｐ４Ａ８（Ｈ１／Ｌ１）（ｈｕＰ４Ａ８）（後述されている）は、真のマウスＰ４Ａ８  ｍＡｂと同程度の親和性で、ヒトＦｎ１４に結合する。図１８Ａは、異なる重鎖エフェクター機能を有するｈｕＰ４Ａ８変異体のヒトＦｎ１４上への直接結合性に関するＦＡＣＳデータを示しており、図１８Ｂは、上記のｈｕＰ４Ａ８変異体のラットＦｎ１４上への直接結合性に関するＦＡＣＳデータを示している。ｈｕＰ４Ａ８のヒトＦｎ１４およびラットＦｎ１４への結合においては、見かけＥＣ５０が同程度であったことが観察された。
【０３１８】
図１９Ａは、Ｐ４Ａ８が、ヒト、カニクイザル、およびマウスの表面Ｆｎ１４には十分に結合するが、アフリカツメガエルＦｎ１４への結合は検出できなかったことを示している。図１９Ｂと図１９Ｃは、融合タンパク質Ｆｃ−ｈｕＴＷＥＡＫとｍｕＦｃ−ｍｕＴＷＥＡＫの双方が、ヒト、カニクイザル、マウス、およびアフリカツメガエルの表面Ｆｎ１４に十分に結合することを示しており、Ｐ４Ａ８がアフリカツメガエルＦｎ１４に結合しないのは、アフリカツメガエルＦｎ１４の表面提示の欠損が原因ではないことを示唆している。下に示されているのは、ヒトＦｎ１４（上）とアフリカツメガエルＦｎ１４（下）とのギャップ付きアラインメントであり、類似部分は４８．３％であり、同一部分は４０．８％に過ぎない。
【０３１９】
【化３−１】
2011523414.tif 000005
これらの結果によって、Ｐ４Ａ８結合部位はＦｎ１４上のＴＷＥＡＫ結合部位と似てはいるが、微妙に異なることが示唆されている。
【０３２０】
また、Ｐ４Ａ８が他のＴＮＦファミリー受容体に結合しないこと、および、この点において、Ｆｎ１４に対して選択的であることも示されている。
【０３２１】
実施例９：Ｐ４Ａ８のエピトープのＦｎ１４残基Ｗ４２へのマッピング（Ｐ４Ａ８の突然変異Ｗ４２Ａに対する感受性）
野生型ヒトＦｎ１４、カニクイザルＦｎ１４、ラットＦｎ１４、マウスＦｎ１４、および突然変異Ｗ４２Ａを有するヒトＦｎ１４をコードする核酸で２９３Ｅ細胞をトランスフェクションした。Ｐ４Ａ８のこれらの細胞への結合をＦＡＣＳによって判定した。その結果は図１３に示されている。そのヒストグラムに示されているように、Ｐ４Ａ８は、突然変異Ｗ４２Ａを有するヒトＦｎ１４タンパク質に、野生型ヒトＦｎ１４タンパク質よりも有意に低く結合する。同様に、抗体Ｐ３Ｇ５も、突然変異Ｗ４２Ａを有するヒトＦｎ１４タンパク質に、野生型よりも有意に低く結合する（図示なし）。
【０３２２】
図２０は、Ｆｎ１４細胞外ドメインのギャップ付きアラインメントである（ヒトＦｎ１４はＥ２８〜Ｐ８０の残基）。突然変異Ｗ４２Ａは、ストラタジーンのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩというキットをメーカー推奨のプトロコルに従って用いて、部位特異的突然変異誘発によって、完全長のヒトＦｎ１４、カニクイザルＦｎ１４、およびマウスＦｎ１４  ｃＤＮＡ用のＥＢＶ発現ベクターで構築した。導入された制限酵素認識部位の変化についてスクリーニングすることによって、突然変異プラスミドを同定した。Ｗ４２Ａ突然変異発現ベクター（ヒトＦｎ１４  Ｗ４２ＡのベクターはｐＥＡＧ２２５１、マウスＷ４２ＡのベクターはｐＥＡＧ２２５０、カニクイザルＷ４２ＡのベクターはｐＥＡＧ２２４９という）におけるＤＮＡ塩基配列決定法によって、得られたプラスミド内のＦｎ１４  ｃＤＮＡ配列を確認した。野生型ｈｕＦｎ１４と、ヒトＦｎ１４、カニクイザル１４、およびマウス１４の突然変異Ｗ４２Ａを２９３Ｅ細胞内で一過性に過剰発現させ、上記のように、Ｆｃ−ＴＥＷＡＫまたはＰ４Ａ８  ｍＡｂの結合をＦＡＣＳアッセイでアッセイした。図２１Ａには、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫがすべてのＷ４２Ａ突然変異体に結合することが示されており、図２１Ｂには、試験したすべての種において、Ｗ４２Ａへの突然変異によって、Ｐ４Ａ８の結合が無効になることが示されている。我々は、さらなるエピトープマッピング試験を行うために、ｈｕＦｎ１４発現プラスミドｐＥＡＧ２１２に部位特異的突然変異誘発を行って、他の点突然変異を生じさせた。図２２には、残基Ｗ４２を大きい疎水性残基Ｗ４２Ｆ（ｐＹＬ３７３）またはＷ４２Ｙ（ｐＹＬ３７４）に突然変異させると、Ｐ４Ａ８の結合が正常に戻ることが示されている。
【０３２３】
鋳型のｐＥＡＧ２１２１（ｈｕＦｎ１４のＥＢＶ発現ベクター）上での部位特異的突然変異誘発によって、アフリカツメガエルの残基を数多くの位置でヒトの配列に置換することによって、一連のＦｎ１４点突然変異体を作製した（ｐＹＬ３９１  Ｔ３３Ｑ、ｐＹＬ３９２  Ｓ４０Ｒ、ｐＹＬ３９３  Ｌ６５Ｑ、ｐＹＬ３９６  Ｍ５０Ａ、ｐＹＬ３９７  Ｒ５６Ｋ、ｐＹＬ３９８  Ｒ５６Ｐ（上記のアフリカツメガエルの変化よりも劇的な置換）、およびｐＹＬ３９９  Ｈ６０Ｋ）。直接結合に関するＦＡＣＳアッセイによって、上記の一連の突然変異体のすべてがＦｃ−ＴＷＥＡＫに結合することが示された（図２３Ａ）。アゴニストの抗Ｆｎ１４  ｍＡｂ（Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、Ｐ２Ｄ３、およびＰ３Ｄ８）、ならびに、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３４１）によって説明されているアゴニストｍＡｂのＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２、ＩＴＥＭ−３、およびＩＴＥＭ−４を、ヒトＦｎ１４、カニクイザルＦｎ１４、ラットＦｎ１４、マウスＦｎ１４、ならびに、一連のすべてのｈｕＦｎ１４突然変異体（Ｗ４２Ａ、Ｔ３３Ｑ、Ｓ４０Ｒ、Ｌ６５Ｑ、Ｍ５０Ａ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５６Ｐ、およびＭ５０Ａ）への直接結合に関するＦＡＣＳアッセイで試験した。Ｐ４Ａ８の一連の突然変異体への結合は、図２３Ｂに示されており、Ｐ３Ｇ５の結果は図２３Ｃに、Ｐ２Ｄ３の結果は図２３Ｄに、ＩＴＥＭ−１の結果は図２３Ｅに、ＩＴＥＭ−４の結果は図２３Ｆに、ＩＴＥＭ−２の結果は図２３Ｇに、ＩＴＥＭ−３の結果は図２３Ｈに示されている。これらの結果によって、Ｐ３Ｇ５とＰ４Ａ８は、Ｆｎ１４のＷ４２Ａ置換体に対する感受性があるが、Ｐ２Ｄ３（およびＰ３Ｄ８）と、抗Ｆｎ１４ｍＡｂである４つのＩＴＥＭは、Ｗ４２Ａという変化に対する感受性がないことが示唆されている。試験したすべての抗体は、ヒトＦｎ１４、カニクイザルＦｎ１４、ラットＦｎ１４、およびマウスＦｎ１４に結合する。
【０３２４】
実施例１０：免疫組織化学
パラフィン組織切片中のＦｎ１４を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）試薬としての用途に関して、抗Ｆｎ１４抗体Ｐ４Ａ８を試験した。パラフィン切片は、正常膵組織と膵臓腫瘍組織のものを入手した。Ｐ４Ａ８は、パラフィン切片中のＦｎ１４を染色することができた。その結果によって、Ｆｎ１４が、正常組織よりも膵臓腫瘍で過剰発現することが証明された。
【０３２５】
また、Ｐ４Ａ８を用いて、正常組織中のＦｎ１４のレベルも測定した。ヒト組織アレイ（凍結およびパラフィン）をＰ４Ａ８で染色した。その結果によって、大半は、上皮細胞、内皮および筋肉、ならびに細胞質分布が軽度に染色されるが、場合によっては、わずかまたは中程度に染色されることが示された（膜は強調表示されなかった）。
【０３２６】
実施例１１：抗Ｆｎ１４抗体の配列
抗体Ｐ４Ａ８のＶＨドメインのアミノ酸配列は、
【０３２７】
【化３−２】
2011523414.tif 000006
である。Ｐ４Ａ８のＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号１７）は、図１４Ａに示されている。
【０３２８】
抗体Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインのアミノ酸配列は、
【０３２９】
【化３−３】
2011523414.tif 000007
である。Ｐ３Ｇ５のＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）は、図１４Ｂに示されている。
【０３３０】
抗体Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインのアミノ酸配列は、
【０３３１】
【化３−４】
2011523414.tif 000008
である。Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号１９）は、図１４Ｃに示されている。
【０３３２】
抗体Ｐ４Ａ８のＶＬドメインのアミノ酸配列は、
【０３３３】
【化３−５】
2011523414.tif 000009
である。Ｐ４Ａ８のＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号２０）は、図１４Ｄに示されている。
【０３３４】
抗体Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインのアミノ酸配列は、
【０３３５】
【化３−６】
2011523414.tif 000010
である。Ｐ３Ｇ５のＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号２１）は、図１４Ｅに記載されている。
【０３３６】
抗体Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインのアミノ酸配列は、
【０３３７】
【化３−７】
2011523414.tif 000011
である。Ｐ２Ｄ３のＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号２２）は、図１４Ｆに記載されている。
【０３３８】
上記の各可変ドメイン配列では、ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１／ＣＤＲ−Ｈ２／ＣＤＲ−Ｈ３、およびＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｌ３）に下線が引かれている。
【０３３９】
Ｐ３Ｄ８は、Ｐ２Ｄ３のＶＨドメインとＶＬドメインと同一であるＶＨドメインとＶＬドメインを有する。
【０３４０】
抗Ｆｎ１４抗体のマウス重鎖サブグループＩＩ（Ａ）の可変ドメインのアラインメントは下記のとおりである。
【０３４１】
【化４】
2011523414.tif 000012
Ｐ４Ａ８とＰ３Ｇ５の各重鎖では、ＣＤＲ−Ｈ１（左）、ＣＤＲ−Ｈ２（中央）、およびＣＤＲ−Ｈ３（右）に下線が引かれている。
【０３４２】
抗Ｆｎ１４抗体のマウス重鎖Ｐ３Ｇ５（ＩＩＡ）とＰ２Ｄ３（ＩＢ）のアラインメントは下記のとおりである。
【０３４３】
【化５】
2011523414.tif 000013
Ｐ４Ａ８とＰ２Ｄ３の各々の重鎖では、ＣＤＲ−Ｈ１（左）、ＣＤＲ−Ｈ２（中央）、およびＣＤＲ−Ｈ３（右）に下線が引かれている。
【０３４４】
抗Ｆｎ１４抗体のマウスκサブグループＩＩＩの軽鎖可変ドメインのアラインメントは下記のとおりである。
【０３４５】
【化６】
2011523414.tif 000014
Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５、およびＰ２Ｄ３の各々の軽鎖では、ＣＤＲ−Ｌ１（左）、ＣＤＲ−Ｌ２（中央）、およびＣＤＲ−Ｌ３（右）に下線が引かれている。
【０３４６】
実施例１２：キメラ抗体
マウスＰ４Ａ８の重鎖と軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを用いて、マウス−ヒトキメラ（ｃｈキメラ）発現用ベクターを構築した。このｃｈキメラでは、ｍｕＰ４Ａ８の可変領域が、ヒトのＩｇＧ１とκ定常領域に結合している。キメラＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１重鎖のｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまで）を下に示す。
【０３４７】
【化７−１】
2011523414.tif 000015
【０３４８】
【化７−２】
2011523414.tif 000016
ｃｈＰ４Ａ８の重鎖の推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３４９】
【化８】
2011523414.tif 000017
キメラＰ４Ａ８の軽鎖のｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３５０】
【化９−１】
2011523414.tif 000018
【０３５１】
【化９−２】
2011523414.tif 000019
ｃｈＰ４Ａ８−ヒトκ軽鎖の推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３５２】
【化１０−１】
2011523414.tif 000020
発現ベクター（ｃｈＰ４Ａ８重鎖のベクターｐＸＷ３６２とｃｈＰ４Ａ８軽鎖のベクターｐＸＷ３６４）を２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を、抗体の分泌と特異性に関して試験した（空のベクターをトランスフェクションした細胞と、分子クローニングした無関係のｍＡｂのベクターをトランスフェクションした細胞をコントロールとして使用した）。馴化培地のウエスタンブロット解析（抗ヒト重鎖および軽鎖抗体によって行った）によって、ｃｈＰ４Ａ８をトランスフェクションした細胞が、重鎖と軽鎖を合成し、かつこれらを効率的に分泌したことが示された。ヒトＦｎ１４への直接結合のＦＡＣＳによって、ｃｈＰ４Ａ８の特異性が確認された。
【０３５３】
ＣＨＯ細胞内でｃｈＰ４Ａ８を安定的に発現させるための発現ベクターを構築した。ｍＡｂのｃｈＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１，κを分泌する安定ＣＨＯ細胞株は、この抗体の軽鎖と重鎖をコードするベクターで同時トランスフェクションすることによって得た。希釈滴定ＦＡＣＳアッセイによって、表面に発現しているヒトＦｎ１４への直接結合性によって、ｃｈＰ４Ａ８の結合親和性がマウスＰ４Ａ８  ｍＡｂの結合親和性と同等であることが証明された。
【０３５４】
実施例１３：ヒト化抗体
２つのヒト化Ｐ４Ａ８（ｈｕＰ４Ａ８）重鎖（生殖細胞系列ｈｕＶＨ１−１８フレームワーク／コンセンサスＨＵＭＶＨ１  ＦＲ４／Ｐ４Ａ８Ｈ  ＣＤＲ）の例を下に示す（それぞれに、アミノ酸配列とＤＮＡ配列を示してある。ＣＤＲには下線が引かれており、復帰突然変異は太字になっている）。
【０３５５】
【化１０−２】
2011523414.tif 000021
３つのヒト化Ｐ４Ａ８（ｈｕＰ４Ａ８）軽鎖（Ｋ０３７６５９フレームワーク／Ｐ４Ａ８Ｌ  ＣＤＲ）の例を下に示す（それぞれに、アミノ酸配列とＤＮＡ配列を示してある。ＣＤＲには下線が引かれており、復帰突然変異は太字になっている）。
【０３５６】
【化１０−３】
2011523414.tif 000022
重鎖Ｈ１  ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１の安定ＣＨＯ発現ベクターｐＹＬ３１０を構築した。ｐＹＬ３１０の重鎖Ｈ１  ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１のｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３５７】
【化１１−１】
2011523414.tif 000023
【０３５８】
【化１１−２】
2011523414.tif 000024
ｐＹＬ３１０によってコードされる重鎖ｈｕＰ４Ａ８−ＩｇＧ１  Ｈ１の推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３５９】
【化１２】
2011523414.tif 000025
重鎖Ｈ２  ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１の安定ＣＨＯ発現ベクターｐＹＬ３２０を構築した。ｐＹＬ３２０の重鎖Ｈ２  ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１のｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３６０】
【化１３−１】
2011523414.tif 000026
【０３６１】
【化１３−２】
2011523414.tif 000027
ｐＹＬ３２０によってコードされる重鎖ｈｕＰ４Ａ８−ＩｇＧ１  Ｈ２の推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３６２】
【化１４】
2011523414.tif 000028
完全長型の軽鎖Ｌ２  ｈｕＰ４Ａ８−κの安定ＣＨＯ発現ベクターｐＹＬ３１７のｃＤＮＡも構築した。ｐＹＬ３１７の軽鎖ｈｕＰ４Ａ８  Ｌ２κのｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３６３】
【化１５−１】
2011523414.tif 000029
【０３６４】
【化１５−２】
2011523414.tif 000030
ｐＹＬ３１７によってコードされる軽鎖ｈｕＰ４Ａ８  Ｌ２κの推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３６５】
【化１６】
2011523414.tif 000031
完全長型の軽鎖Ｌ１  ｈｕＰ４Ａ８−κの安定ＣＨＯ発現ベクターのｃＤＮＡ変異体ｐＹＬ３２１も構築した。ｐＹＬ３２１の軽鎖ｈｕＰ４Ａ８  Ｌ１κのｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３６６】
【化１７−１】
2011523414.tif 000032
【０３６７】
【化１７−２】
2011523414.tif 000033
ｐＶＬ３２1によってコードされる軽鎖ｈｕＰ４Ａ８κの推定成熟タンパク質配列を以下に示す。
【０３６８】
【化１８】
2011523414.tif 000034
完全長型の軽鎖Ｌ３  ｈｕＰ４Ａ８−κの安定ＣＨＯ発現ベクターのｃＤＮＡ変異体ｐＹＬ３２２を構築した。ｐＹＬ３２２の軽鎖ｈｕＰ４Ａ８  Ｌ３κのｃＤＮＡインサートの配列（シグナル配列のイニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＡＧまで）を下に示す。
【０３６９】
【化１９−１】
2011523414.tif 000035
ｐＶＬ３２２によってコードされる軽鎖ｈｕＰ４Ａ８  Ｌ３κの推定成熟タンパク質配列を以下に示す。
【０３７０】
【化１９−２】
2011523414.tif 000036
重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドを同時トランスフェクションすることによって、６つのすべての型のｈｕＰ４Ａ８を２９３細胞内で一過性に発現させた。すべての型のｈｕＰ４Ａ８を組み立てて、同程度の力価で分泌させた（一過性にトランスフェクションした細胞から得た馴化培地における力価をＥＬＩＳＡによって定量化して、結合アッセイに関して正規化した）。図２４には、２９３Ｅ細胞内で一過性に過剰発現させた表面ヒトＦｎ１４への直接結合をＦＡＣＳ（希釈滴定）によってアッセイしたところ、一過性に発現させたすべての型のｈｕＰ４Ａ８の生物活性がｃｈＰ４Ａ８と同等であったことが示されている。図２５には、競合ＥＬＩＳＡ（９６ウェルプレートのウェルにコーティングした融合タンパク質ｈｕＦｎ１４−ｈｕＦｃへの結合を、一定量のビオチン化マウスＰ４Ａ８による結合と競合させた）によってアッセイしたところ、６つのすべての型のｈｕＰ４Ａ８のＦｎ１４に対する結合親和性がｃｈＰ４Ａ８と本質的に同等であったことが示されている。ｐＹＬ３１０とｐＹＬ３２１との同時トランスフェクションによって、ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ1，κ（Ｈ１／Ｌ１）ｍＡｂを分泌する安定ＣＨＯ細胞株を得た。この抗体は、重鎖の成熟配列におけるＡｓｎ３０１（ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン内の天然のグリコシル化部位）がグリコシル化している。Ａｓｎ３０１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）のＡｓｎ２９７に相当する。
【０３７１】
上記のＨ１／Ｌ１の組み合わせを含むと共に、アグリコシル化されたＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ｈｕＩｇＧ４重鎖を有するヒト化型のＰ４Ａ８（ｈｕＰ４Ａ８−ａｇｌｙＧ４Ｐ重鎖）を構築した。ＩｇＧ４重鎖Ｓ２２８Ｐに変更を施して、抗体半分を削除し、Ｔ９９Ａに変更を施して、ＣＨ２のＮ結合グリカンを削除し、それによって、エフェクター機能を低下させる。このアグリコシル化抗体では、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）と補体媒介性細胞障害（ＣＭＣ）の両方に関するエフェクター機能が低下している。重鎖の成熟配列（配列番号８）を下に示すが、残基Ｓ２８８ＰとＴ２９９Ａは、下線が引かれていると共に、太字になっている（ＶＨドメインは、１〜１２１番目の残基に相当し、ＩｇＧ４定常ドメインは、１２２〜４４７番目の残基に相当する）。
【０３７２】
【化２０】
2011523414.tif 000037
このタンパク質は、下記のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０３７３】
【化２１−１】
2011523414.tif 000038
【０３７４】
【化２１−２】
2011523414.tif 000039
【０３７５】
【化２１−３】
2011523414.tif 000040
上記の抗体の軽鎖ｈｕＰ４Ａ８κの成熟配列（配列番号）は下記のとおりである（ＶＬドメインは１〜１１１番目の残基に相当する）。
【０３７６】
【化２２】
2011523414.tif 000041
上記のアグリコシル化ｈｕＩｇＧ４重鎖に加えて、Ｔ２９９Ａアグリコシル化ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１重鎖も、配列番号９の軽鎖と併せて用いることができる。残基Ｔ２９９Ａに下線を引いて太字にした状態で、Ｔ２９９Ａアグリコシル化ｈｕＰ４Ａ８−ｈｕＩｇＧ１重鎖の成熟配列（配列番号６）を下に示す（ＶＨドメインは１〜１２１番目の残基に相当する）。
【０３７７】
【化２３】
2011523414.tif 000042
このタンパク質は、下記のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０３７８】
【化２４−１】
2011523414.tif 000043
【０３７９】
【化２４−２】
2011523414.tif 000044
【０３８０】
【化２４−３】
2011523414.tif 000045
ｐＥＡＧ２２２８によってコードされる重鎖ｈｕＰ４Ａ８−ａｇｌｙ  ＩｇＧ１の推定成熟タンパク質配列を下に示す。
【０３８１】
【化２５】
2011523414.tif 000046
ヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１の特徴としては、溶解度が１２ｍｇ／ｍｌを超えること、ｐＩ（計算値）が８．１であること、ｐＩ（ＩＥＦ）が９．１〜９．２であること、インビトロ細胞毒性のＥＣ５０（Ｗｉｄｒ細胞によるＭＴＴアッセイによる）が３０ｎｇ／ｍｌであること、インビボ異種移植片に関するＥＣ５０が、（本明細書にさらに示されているような）動物モデルに応じて３．２または６．４ｍｇ／ｋｇであること、ＦＡＣＳによるＷｉｄｒ細胞への結合のＥＣ５０が０．１２ｎＭであることが挙げられる。
【０３８２】
実施例１４：結合親和性
ＥＬＩＳＡ直接結合アッセイを用いて、Ｆｎ１４に対するｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１のＥＣ５０を推定した。９６ウェルのＥＬＩＡプレートを炭酸ナトリウム中の２μｇ／ｍｌのマウスＦｎ１４−マウスＦｃでｐＨ９．５、４０℃にてオーバーナイトでコーティングした。プレートは、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間、室温にてブロックした。ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１の濃度は、２μｇ／ｍｌから１１ｐｇ／ｍｌまで滴定し、インキュベーション時間は室温にて１時間であった。結合したｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１をＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧによって検出した。このＥＬＩＳＡ条件下でのｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１のＥＣ５０は、約６．７９ｎｇ／ｍｌである。
【０３８３】
別の実験では、バイアコアのＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔをメーカーの説明書に従って用いて、様々なアイソフォームのマウスまたはヒト化Ｐ４Ａ８をセンサーチップＣＭ５に固定化した。簡潔に述べると、タンパク質をｐＨ５．０のアセテート１０ｍＭ中で３０μｇ／ｍｌまで希釈し、チップ表面（１：１のＮ−ヒドロキシスクシニミドと１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を１０μｌ投入して活性化させておいたもの）の上に１０μｌ投入した。加えて、各実験における１つのフローセルは、バックグラウンドコントロールとして誘導体化しないでおいた。続いて、１Ｍのエタノールアミンを５０μｌ注ぐことによって、過剰な遊離アミン基をキャッピングした。典型的な固定化レベルは約１２００ＲＵであった。
【０３８４】
０．３〜３０ｎＭに及ぶ一連の濃度のヒトＦｎ１４をバイアコアバッファー＃１（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３．４ｍＭのＥＤＴＡ＋０．００５％の界面活性剤Ｐ−２０＋０．０５％のＢＳＡ）中で調製した。これらの実験で用いた可溶性Ｆｎ１４タンパク質のアミノ酸配列は、ＥＱＡＰＧＴＡＰＣＳＲＧＳＳＷＳＡＤＬＤＫＣＭＤＣＡＳＣＲＡＲＰＨＳＤＦＣＬＧＣＡＡＡＰＰＡＰＦＲＬＬＷＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＨＨＨＨＨＨであった。サンプルを抗体およびコントロール表面の上に、不規則な順番で、流速５０μｌ／分にて５分間流してから、バイアコアバッファー＃１中で１５分解離させた。各サイクル後、チップを１５ｍＭのＮａＯＨで再生した。
【０３８５】
一連の各濃度において投入前応答をＹ軸の０に、投入開始時をＸ軸の０に設定することによって、生データを正規化した。さらに、活性表面での応答値から非誘導体化表面での応答値を減じてから、次いで活性表面での結合データから活性表面でのバッファーのみでの応答値を減じることによって、データを正規化した（いわゆるデータの「二重参照」）。続いて、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎというソフトウェアで１：１の結合に関してＭａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｖｅｒｇアルゴリズムを用いてデータを適合させることによって、一連の各濃度での全体的な会合速度定数と解離速度定数を決定した。これらの速度定数の比率（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）から、親和性定数を算出した。当該結合アッセイは、９５％を超える純粋な単量体の可溶性ヒトＦｎ１４で行った。
【０３８６】
結合アッセイの前に、ヒトＦｎ１４の吸光スキャンを行った。Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．，Ｖａｊｄｏｓ，Ｆ．，Ｆｅｅ，Ｌ．，Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒａｙ，Ｔ．（１９９５）“Ｈｏｗ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｍｏｌａｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｏｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４：２４１１−２３）の方法によって、アミノ酸配列から算出した吸光係数を用いた。
【０３８７】
吸光スキャンは結合アッセイの前に行った。当該ｍＡｂは、上記の実験では固定化された種であるので、正確な速度定数を決定するのに、質量、濃度、または分子量を正確に把握する必要はなく、このため、１５０ｋＤａというおおよその分子量と、１．５というおおよその質量吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度から抗体の濃度を推定した。
【０３８８】
【表１】
2011523414.tif 000047
ヒト化Ｐ４Ａ８の可溶性単量体ヒトＦｎ１４に対する一価結合親和性（つまり「固有親和性」）は、約１〜４または５ｎＭの範囲内である。
【０３８９】
固定化したＦｎ１４（二価のＦｎ１４−Ｆｃ）に対するＰ４Ａ８抗体全体の二価結合親和性（親和性およびアビディティー成分）は、約５０ｐＭである。
【０３９０】
実施例１５：カスパーゼアッセイ
カスパーゼアッセイは、切断されたカスパーゼ３および７のレベルを測定するものである。ｈＰ４Ａ８による処置に応じて、カスパーゼ切断の誘発を測定した。カスパーゼ３および７は、アポトーシスの誘発部位のすぐ近くにある「実行」カスパーゼとみなされており、したがって、このアッセイは、ｈＰ４Ａ８の想定ＭＯＡに関連するものである。
【０３９１】
腫瘍細胞ＷｉＤｒを９６ウェルプレートに播き、８０Ｕ／ｍｌのｈＩＦＮｇの存在下で、ある範囲の濃度（１μｇ／ｍｌ、１：３の希釈比で滴定）のｈＰ４Ａ８に暴露した。培養液中で３日置いた後、プロメガのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ試薬を用いて、切断されたカスパーゼ３および７の存在を測定した。そのデータは、未処置細胞と比較した場合のフォールドチェンジとして表されている。
【０３９２】
結果によって、ｈＰ４Ａ８による刺激に応答して、ＷｉＤｒ細胞内でカスパーゼ３／７が誘発されたと共に、最も低い濃度で試験したときでさえも、多量体型のｈＰ４Ａ８（ｈＰ４Ａ８−ｍｕｌｔｉ）に応答した際に、最大の効果が観察されたことが示されている（図２６）。単量体形態のＰ４Ａ８の濃度を増しながら試験すると、用量応答が観察される。エキソビボの腫瘍でも同様の結果が得られた。
【０３９３】
実施例１６：ＮＦκＢ誘発アッセイ
ＮＦ−κＢアッセイは、カノニカル（ｐ５０、ｐ６５）およびノンカノニカル（ｐ５２、ＲｅｌＢ）ＮＦ−κＢ経路の誘発を測定するものである。ＴＷＥＡＫ／Ｆｎ１４経路がＮＦ−κＢを通じてシグナル伝達することは十分確立されているので、これは、ｈＰ４Ａ８のアゴニスト活性を証明するための関連アッセイである。
【０３９４】
腫瘍細胞ＷｉＤｒを６ウェルのディッシュ内で増殖させ、１μｇ／ｍｌのＰ４Ａ８（このアッセイでは、マウス型のＰ４Ａ８を用いた）、または比較するために１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｃ−ＴＷＥＡＫに暴露した。処置後、様々な時点（１分〜２４時間の範囲）で、培養液から核抽出物を調製した。続いて、その核抽出物に対してＥＬＳＡキット（アクティブモティフのＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦκＢ  Ｆａｍｉｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）によって解析を行って、個々のＮＦ−κＢファミリーメンバー（ｐ５０、ｐ６５、ｐ５２、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ）を測定した。すべての値を非刺激細胞に対して正規化した。
【０３９５】
その結果によって、Ｐ４Ａ８に応答して、ＷｉＤｒ細胞内でＮＦκＢファミリーメンバーのｐ５０、ｐ５２、ｐ６５、およびＲｅｌＢが誘発されたことが示されており、これは、カノニカルＮＦ−κＢ経路とノンカノニカルＮＦ−κＢ経路の両方が刺激されることを示唆している（図２７）。エキソビボの腫瘍でも同様の結果が得られた。
【０３９６】
実施例１７：エフェクター機能
ｈＰ４Ａ８のＡＤＣＣ活性をインビトロで評価した。活性は、腫瘍細胞株ＷｉＤｒとＭＤＡ−ＭＢ２３１内で測定した。ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１（すなわち、ヒトＩｇＧ１に結合したＶＨ１およびＶＬ１配列を有するヒト化Ｐ４Ａ８）を、Ｆｃの機能が弱められた型のＰ４Ａ８（ｈＰ４Ａ８−ＩｇＧ１ＴｇｌｙおよびｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ）と比較した。
【０３９７】
ドナーＰＢＭＣから単離したＮＫ細胞を、ＩＬ−２の存在下にてオーバーナイトでインキュベートした。標的細胞のＷｉＤｒとＭＤＡ−ＭＢ−２３１を５１Ｃｒで標識した。様々な濃度の抗体の存在下で、培養ＮＫ細胞と標識標的細胞を５：１の比率で合わせて４時間、３７度にてインキュベートした（また、２：１の比率でも行った。データは示されていない）。このアッセイには、自発的放出コントロール（ＮＫ細胞なし）と最大放出コントロール（Ｔｏｒｉｔｏｎ−Ｘ−１０で処置した標的細胞）を含めた。このインキュベーション期間の経過後、上清中のｃｐｍを測定した。溶解率（％）を下記のように算出した。
【０３９８】
【数１】
2011523414.tif 000048
ＷｉＤｒの実験とＭＤＡ−ＭＢ２１３の実験のいずれにおいても、ｈＩｇＧ１では有意なＡＤＣＣ活性が観察されたが、Ｆｃの機能が弱められたＰ４Ａ８抗体（ｈＰ４Ａ８−ＩｇＧ１ＴｇｌｙおよびｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ）では観察されなかった。ポジティブコントロールでは多少の活性が見られたが、ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１ほどは強くなかった（図２８）。これらの実験によって、該インビトロアッセイで抗体がＡＤＣＣを誘発できる能力によって測定すると、ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１がＡＤＣＣ能を有することが証明されている。
【０３９９】
グリコシル化が活性に及ぼす作用も判定した。ＷｉＤｒ細胞内でのＭＴＴアッセイ（上記）を用いて、グリコシル化がインビトロ活性に作用を及ぼすか試験した。ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１（エフェクター機能が完全）とｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ（エフェクター機能なし）をこのアッセイで比較した。研究用標準品の材料をこのアッセイで試験した。結果によって、該インビトロアッセイにおいて、ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ４Ｐａｇｌｙと比べて、ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１の活性が、軽度ではあるが、再現性のある程度に向上したことが示されている。
【０４００】
ＷｉＤｒおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１双方の異種移植片アッセイにおいて、ｈＰ４Ａ８．ＩｇＧ１のＦｃのエフェクター機能も、インビボでＰ４Ａ８活性に寄与することが示された。Ｐ４Ａ８  ｈＩｇＧ１を６．４ｍｇ／ｋｇでいずれかの動物モデルに投与した方が、Ｐ４Ａ８ｈＩｇＧ４Ｐａｇｌｙを同じ用量で投与した場合よりも有効である（図２９）。
【０４０１】
実施例１８：ヒト化Ｐ４Ａ８．ＩｇＧ１のインビボでの短期効能と長期効能
０．９〜２５．６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で単剤として、１週間に１度（ｑｗ）のスケジュールで６週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与したＦｎ１４抗体Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１の効能をヒト結腸腫瘍ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウス内で評価した。マウスは、腫瘍接種から１２日目（平均腫瘍体積は約２００ｍｍ３であった）からＱＷのスケジュール（矢印で示されている）で、１２．８ｍｇ／ｋｇのＩＤＥＣ１５１（ネガティブコントロール）と、１２．８、６．４、３．２、１．８、および０．９ｍｇ／ｋｇのＰ４Ａ８．ｈＩｇＧ１でＩＰ処置した。データは、処置グループあたり１０匹のマウスの平均値±標準誤差である。＊すべての投与グループにおいて、２０〜６０日目までのネガティブコントロールＩＤＥＣ１５１との比較におけるｐ値は０．００１未満である。
【０４０２】
Ｐ４Ａ８ｈＩｇＧ１は、アイソタイプが一致するネガティブコントロール抗体と比べて、０．９〜２５．６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、統計的に有意な（ｐ＜０．００１）効能を示した（図３０、図３１、および図３２）。０．９ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、および６．４ｍｇ／ｋｇの用量のグループ全体にわたって、用量依存的な効能が観察された。６．４ｍｇ／ｋｇを超える用量では、６．４ｍｇ／ｋｇ、１２．８ｍｇ／ｋｇ、および２５．６ｍｇ／ｋｇの用量のグループ全体にわたって、用量依存性は観察されなかった（図３０および図３１）。試験した用量範囲全体にわたって、Ｐ４Ａ８ｈＩｇＧ１の効能が最小の用量は、このモデルにおいて単剤として投与した場合、ｑｗ×６のスケジュールでは、０．９ｍｇ／ｋｇであると思われる（図３０および図３１）。同じ投与スケジュールにおいて、効能が最大の用量は６．４ｍｇ／ｋｇである。図３２に示されているように、抗体Ｐ４Ａ８.ｈＩｇＧ１は、投与終了から５０日以上にわたって、有効性を維持した。０．９〜２５．６ｍｇ／ｋｇの範囲のすべての用量（ｎ＝１０匹のマウス／処置グループ）は、体重減少が見られなかったことによって示されているように、ｑｗ×６のスケジュールで良好な耐性を示した。
【０４０３】
１週間に１度の投与スケジュールに加えて、Ｐ４Ａ８ｈＩｇＧ１の投与は、２週間に１度、または３週間に１度投与した場合も、ヒト結腸腫瘍ＷｉＤｒ担持無胸腺ヌードマウスで有効であることが明らかになった（図３７）。この実験での処置は、該腫瘍が比較的大きくなったとき（約５００ｍｍ３）に開始し、腫瘍の静止が観察された。該抗体の半減期が、抗体の通常の範囲から低い範囲内であっても（担腫瘍マウスにおいて２．５日未満）、驚くべきことに、該抗体は、頻繁には投与しなくてもインビボで有効である。
【０４０４】
６．４〜２５．６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で単剤として、１週間に１度（ｑｗ）のスケジュールで６週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与したＦｎ１４抗体Ｐ４Ａ８.ｈＩｇＧ１の効能を乳癌腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持ＳＣＩＤマウスで評価した。ヒト乳腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスは、腫瘍接種から１６日目（平均腫瘍体積は約２００ｍｍ３であった）からＱＷのスケジュール（矢印で示されている）で、２５．６ｍｇ／ｋｇのＩＤＥＣ１５１（ネガティブコントロール）と、２５．６、１２．８、および６．４ｍｇ／ｋｇのＰ４Ａ８．ｈＩｇＧ１でＩＰ処置した。データは、処置グループあたり９匹のマウスの平均値±標準誤差である。＊すべての投与グループにおいて、２３〜６３日目までのネガティブコントロールＩＤＥＣ１５１との比較におけるｐ値は０．００１未満である。
【０４０５】
Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１は、アイソタイプが一致するネガティブコントロール抗体と比べて、６．４〜２５．６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、統計的に有意な（ｐ＜０．００１）効能を示した（図３３）。試験グループの平均腫瘍寸法を平均ネガティブコントロールに対する比率（％）として比較したものが図３４に示されており、点線は、米国国立癌研究所による活性の基準（４２％）を示している。
【０４０６】
単剤として投与した場合のＰ４Ａ８．ｈＩｇＧ１の効能が最小の用量は、このモデルではまだ決定していない。６．４ｍｇ／ｋｇ、１２．８ｍｇ／ｋｇ、および２５．６ｍｇ／ｋｇの容量グループ全体にわたって、用量依存性は観察されなかった。これらの用量は、有意な体重減少が見られなかったことによって示されているように、良好な耐性を示した。
【０４０７】
意外なことに、Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１のヒト乳腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１アッセイでの効能は、親抗体Ｐ４Ａ８よりも大きかった。これらの２つの抗体のヒト結腸腫瘍ＷｉＤｒアッセイでの効能は同程度であった。
【０４０８】
実施例１９：Ｐ４Ａ８.ｈＩｇＧ１を多量体化すると、活性が向上する
Ｐ４Ａ８．ｈＩｇＧ１をプロテインＡによって多量体化したところ、ＭＴＴアッセイにおいて、ＷｉＤｒ細胞の死滅と、ＷｉＤｒ細胞内のカスパーゼの活性化が増大した（図１５および図２６）。
【０４０９】
実施例２０：ヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１の胃癌での効能
ヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１抗体は、胃癌Ｈｓ７４６Ｔ異種移植片モデルにおいて、様々な試験用量で、抗腫瘍作用を呈することが示された（図３５および図３６Ａ）。加えて、胃癌細胞Ｎ８７異種移植片モデルにおいて、ヒト化Ｐ４Ａ８  ＩｇＧ１で、３．２ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、および１２．８ｍｇ／ｋｇにて週に１度処置したことによって、単剤での効能（腫瘍寸法が７０〜８０％縮小）が証明された（図３６Ｂ）。
【０４１０】
したがって、Ｐ４Ａ８は、インビボアニマルモデルで腫瘍細胞を有効に殺滅すると共に、持続的な作用を及ぼす。
【０４１１】
実施例２１：Ｐ４Ａ８とＦｎ１４との相互作用の界面におけるアミノ酸残基
マウスＰ４Ａ８のＦａｂとヒトＦｎ１４の細胞外ドメインとの複合体を蒸気拡散法によって結晶化し、２０℃の温度で置いた。１０〜１４日で、３０％のＰＥＧ８０００、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）、０．２Ｍの硫酸リチウムを含有する結晶化溶液中に、回折品質の平板状結晶が生じた。結晶（０．２×０．２×０．０１ｍｍ３）をそのままの状態で回収し、液体窒素で急速冷凍した。ナショナル・シンクロトロン・ライト・ソース（ニューヨーク州アプトン）にて、ビームラインＸ２５で分解能３．５Åまでの回折データを取得した。ＨＫＬ２０００というプログラム（米国バージニア州シャーロッツビルのＨＫＬリサーチ）によるデータ処理によって、上記の結晶がＰ２１の空間群に属しており、おおよその格子定数がａ＝６１．１Å、ｂ＝１０３．３Å、ｃ＝７６．１Å、β＝９７．２°であることが明らかになり、非対称単位あたり２つのＰ４Ａ８  Ｆａｂ−Ｆｎ１４複合体と一致した。ヒト化Ｐ４Ａ８のホモロジーモデルとインハウスのＦｎ１４ＮＭＲ構造を用いるＭＯＬＥＲＰ（Ｖａｇｉｎ＆Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  １９９７；３０：１０２２−１０２５）による分子置換によって、Ｐ４Ａ８  ＦａｂとＦｎ１４分子を置換したところ、４６％というＲ因子を得た。電子密度マップで、Ｆｎ１４の高システインドメインの５０〜６７番目の残基のみを明らかにすることができた。この密度マップから欠けているのは、Ｆｎ１４細胞外ドメインのＨ３  ＣＤＲとＮ末端残基であった。該界面のさらに完全なモデルは、ｈｕＦｎＨ細胞外ドメインの最新のＮＭＲ構造（Ｈｅ＆Ｄａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；１８：６５０−６５６）をＰ４Ａ８  Ｆａｂ／Ｆｎ１４結晶構に重ね合わせることによって作成した。この後に、ＲＯＳＥＴＴＡ（Ｄａｓ＆Ｂａｋｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００８；７７：３６３−８２）というソフトウェアによるＨ３  ＣＤＲのモデリングと、複合体全体の条件付き最適化による精密化を行った。表２には、Ｐ４Ａ８とＦｎ１４との界面でのアミノ酸相互作用が明らかにされている。
【０４１２】
【表２】
2011523414.tif 000049
実施例２２：細胞株のＰ４Ａ８、Ｐ４Ａ８多量体、およびＴＷＥＡＫに対する感受性
１０μｇ／ｍｌで開始してから、１：２で段階希釈して、ある用量曲線のＰ４Ａ８と細胞を混合することによって、細胞株のＦＡＣＳ解析をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ１％、ＢＳＡ０．１％、Ｎａ  Ａｚｉｄｅ）で行った。コントロールｍＡｂとして、ＩＤＣＥ１５１を同じ方式で調製してから、各抗体を当該細胞と３０分間、４℃にてインキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄してから、当該細胞をＰＥ標識抗ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソンラブス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ））と３０分間、４℃にてインキュベートした。２回洗浄してから、当該細胞を２％のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｃａｌｉｂｅｒ  Ｆａｃｓｃａｎ（カリフォルニア州サンノゼのベクトン・ディッキンソン）で捕捉した。Ｆｌｏｗ  Ｊｏ（オレゴン州アシュランドのツリー・スター社）というソフトウェアを用いてデータを解析し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を決定した。Ｐ４Ａ８１．２５μｇ／ｍｌの濃度におけるＭＦＩに従って、下記の基準によって、細胞株（表３参照）の発現レベルをスコアリングした。
【０４１３】
マイナス  ＭＦＩが１０未満
低  ＭＦＩが１０〜２９
中  ＭＦＩが３０〜５９
高  ＭＦＩが６０以上
３連で、９μｇ／ｍｌから始めて１：３で段階希釈したＦｃ−Ｔｗｅａｋ、ｈＰ４Ａ８  ＩｇＧ１、ｈＰ４Ａ８  ＩｇＧ１多量体、またはコントロールｍＡｂのＩＤＥＣ１５１と共に、８０Ｕ／ｍｌのヒトＩＮＦｇを含有する培地に該細胞を播くことによって、ＭＴＴアッセイの準備をした。これらの細胞を３〜４日間インキュベートし、Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ）を用いて増殖させた。個々のサンプルの各々において、生存率（％）＝（処置したウェルのＯＤ／未処置のウェルの平均ＯＤ）×１００という式を用いて、生存率（％）を決定した。各処置条件において平均値を算出してから、阻害剤の濃度に対して、生存率（％）をプロットした。
【０４１４】
下記の基準を用いて、９μｇ／ｍｌにおける増殖を阻害できる能力によって、ＭＴＴアッセイの結果（表３参照）をスコアリングした。
【０４１５】
活性なし  −（マイナス）
生存率が８０％超  ＋／−
生存率が約８０％  ＋
生存率が約６０％  ＋＋
生存率が約４０％  ＋＋＋
生存率が２０％未満  ＋＋＋＋
【０４１６】
【表３−１】
2011523414.tif 000050
【０４１７】
【表３−２】
2011523414.tif 000051
実施例２３：抗体の交差ブロック
抗体の交差ブロックを以下のように評価した。可溶性ヒトＦｎ１４を表面上に固定化した。続いて、この表面を未標識の第１の抗体と接触させた。次いで、ビオチン化した第２の抗体を加え、第２の抗体の上記表面への結合を測定した。第２の抗体の結合が妨げられることによって、第１の抗体が、第２の抗体のＦｎ１４への結合を交差ブロックしたことが示された。１パネルの抗体が、所定の抗Ｆｎ１４抗体の結合を交差ブロックできる能力は、図３８Ａ（Ｐ２Ｄ３がビオチン化した第２の抗体であった）、図３８Ｂ（Ｐ３Ｇ５がビオチン化した第２の抗体であった）、図３８Ｃ（Ｐ４Ａ８がビオチン化した第２の抗体であった）、図３８Ｄ（ＩＴＥＭ−４ビオチン化した第２の抗体であった）、および図３８Ｅ（ＩＴＥＭ−３ビオチン化した第２の抗体であった）に示されている。これらの実験では、Ｐ１Ｂ１２とＰ１Ｃ１２を非関連コントロール抗体として用いた。＊は、未標識の第１の抗体を用いなかったケースを示している。
【０４１８】
以下は、これらの交差ブロック実験で用いたプロトコルの概要である。
【０４１９】
１．  コーニングのＣｏｓｔａｒ３５９０を用いて、オーバーナイトで４℃にて、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．５）中の０．１μｇ／ｍｌのｈＦｎ１４−ｈＦｃでプレートをコーティングする。
【０４２０】
２．  ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）中の３％のＢＳＡで、１時間、室温にてブロックする。
【０４２１】
３．  洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。
【０４２２】
４．  抗Ｆｎ１４抗体を１０μｇ／ｍｌで、ウェルあたり１００μｌにて、９６ウェルプレートを横断するように（１〜１２に）水平に加え、１時間インキュベートする。
【０４２３】
５．  洗浄せずに、ビオチン化した抗Ｆｎ１４抗体を０．２μｇ／ｍｌで、ウェルあたり１００μｌにて、９６ウェルプレートを横断するように（Ａ〜Ｈに）水平に加え、１時間インキュベートする。
６．  洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。
７．  ＨＲＰ−ＳＡを１：２０００で加え、ウェルあたり１００μｌ入れて、室温にて１時間、インキュベートする。
８．  １：１の比率の試薬Ａと試薬Ｂを混合することによって、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製する（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ、ＢＤバイオサイエンス５５５２１４）。ウェルあたり１００μｌを加える。
９．  色が現れたら、４０５ｎｍにおける値を読み取る。
１０．  １００μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、４５０ｎｍにおける値を読み取る。
【０４２４】
その他の実施形態
本発明の詳細な説明と関連させて、本発明について説明してきたが、上記の説明は、例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されている。その他の態様、利点、および修正形態は、下記の請求項の範囲内である。
【図１】
2011523414.tif 000052
【図２】
2011523414.tif 000053
【図３】
2011523414.tif 000054
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011523414.tif 000058
【図８】
2011523414.tif 000059
【図９】
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【図１０】
2011523414.tif 000061
【図１１】
2011523414.tif 000062
【図１２】
2011523414.tif 000063
【図１３】
2011523414.tif 000064
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2011523414.tif 000066
【図１４Ｃ】
2011523414.tif 000067
【図１４Ｄ】
2011523414.tif 000068
【図１４Ｅ】
2011523414.tif 000069
【図１４Ｆ】
2011523414.tif 000070
【図１５】
2011523414.tif 000071
【図１６】
2011523414.tif 000072
【図１７】
2011523414.tif 000073
【図１８Ａ】
2011523414.tif 000074
【図１８Ｂ】
2011523414.tif 000075
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
2011523414.tif 000079
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
2011523414.tif 000082
【図２３Ａ】
2011523414.tif 000083
【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
2011523414.tif 000088
【図２３Ｇ】
2011523414.tif 000089
【図２３Ｈ】
2011523414.tif 000090
【図２４】
2011523414.tif 000091
【図２５】
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【図２６】
2011523414.tif 000093
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2011523414.tif 000097
【図３１】
2011523414.tif 000098
【図３２】
2011523414.tif 000099
【図３３】
2011523414.tif 000100
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【国際調査報告】
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