(57)【要約】  本発明は、アンドロゲン受容体の発現の低下をもたらす、細胞中のアンドロゲン受容体mRNAを標的化するオリゴマー化合物(オリゴマー)に関する。アンドロゲン受容体発現の低下は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害などの特定の医学的障害の治療にとって有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合計10〜30個のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む長さ10〜30個のヌクレオチドのオリゴマーであって、前記連続するヌクレオチド配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体遺伝子に対応する領域または配列番号1などのmRNAの逆相補体もしくはその天然変異体と少なくとも80％相同であり、少なくとも1個のLNA単位を含む、前記オリゴマー。
【請求項２】
前記連続するヌクレオチド配列が、i)配列番号94もしくは配列番号58、ii)配列番号105もしくは配列番号77またはiii)配列番号2〜22および86〜106からなる群より選択される配列に対応する領域と少なくとも80％相同である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記連続するヌクレオチド配列が、請求項１に記載の対応する領域の逆相補体について不一致を含まないか、または1もしくは2個以下の不一致を含む、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
前記オリゴマーのヌクレオチド配列が、前記連続するヌクレオチド配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記連続するヌクレオチド配列が、長さ10〜18個のヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記連続するヌクレオチド配列が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
前記ヌクレオチド類似体が、固定核酸(LNA)単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より選択される糖修飾ヌクレオチドなどの糖修飾ヌクレオチドである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
前記ヌクレオチド類似体がLNAである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項９】
ギャップマーである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
アンドロゲン受容体遺伝子またはmRNAを発現する細胞中のアンドロゲン受容体遺伝子またはmRNAの発現を阻害する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
前記オリゴマーが、
5'-AsMeCsMeCsasasgstststscststscsAsGsMeC-3'(配列番号58)および、
5’-MeCsMeCsMeCsasasgsgscsascstsgscsAsGsA-3'(配列番号77)
(式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、およびMeCは5-メチルシトシン塩基を含むβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す)
から選択される連続するヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩もしくはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害の治療のためなどの、医薬としての使用のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１６】
癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物を、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害に罹患するか、または罹患する可能性がある患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
アンドロゲン受容体を発現している細胞中のアンドロゲン受容体を阻害する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲートを、該細胞に投与して、該細胞中のアンドロゲン受容体を阻害することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アンドロゲン受容体の発現を調節するための化合物、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、アンドロゲン受容体の発現の低下を誘導する、細胞中のアンドロゲン受容体mRNAを標的化するオリゴマー化合物(オリゴマー)に関する。アンドロゲン受容体発現の低下は、癌、特に、前立腺癌または乳癌などの様々な医学的障害にとって有益である。
【０００２】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2007年11月26日に出願された米国特許仮出願第60/990,125号(その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)の利益を請求する。
【背景技術】
【０００３】
アンドロゲン受容体(AR)は、男性ホルモンであるテストステロンまたはジヒドロテストステロンの結合により活性化される核受容体の型である。アンドロゲン受容体の主な機能は、遺伝子発現を調節するDNA結合転写因子としてのものである。しかしながら、アンドロゲン受容体はまた、DNA結合とは無関係のさらなる機能も有する。アンドロゲン受容体は、プロゲステロン受容体と最も密接に関連し、プロゲスチンはより高い用量でアンドロゲン受容体を阻害することができる。
【０００４】
ヒトにおいては、AR遺伝子は1コピーであり、X染色体上の位置Xq11-12に認められるが、その受容体自身は2個のアイソフォーム(AおよびB)で存在する。AR-Aは最初の187アミノ酸(N末端トランケーション)を欠く87 kDaタンパク質である。アイソフォームAR-Bは完全長の110 kDa型である。
【０００５】
アンドロゲン受容体へのアンドロゲンの結合は、該受容体に対するコンフォメーション変化を誘導し、熱ショックタンパク質の解離、ダイマー化および細胞質ゾルから細胞核への輸送をもたらし、そこでアンドロゲン受容体ダイマーは特定のDNA配列(ホルモン応答エレメントと呼ばれる)に結合する。他の核タンパク質との相互作用に依存して、ARは遺伝子発現を制御し、インスリン様増殖因子I(IGF-1)などの特定の遺伝子の転写を増加または減少させる。
【０００６】
また、アンドロゲン受容体は、細胞質中のシグナル伝達タンパク質を介する細胞質活性も有する。細胞質アンドロゲン受容体へのアンドロゲンの結合は、遺伝子転写とは無関係の細胞機能、例えば、イオン輸送、ならびに、例えば、他のシグナル伝達経路を媒介することにより、他の転写因子の活性に影響することによる遺伝子転写の間接的影響の急速な変化を引き起こし得る。
【０００７】
アンドロゲン受容体の過剰発現、または突然変異アンドロゲン受容体遺伝子の発現が、前立腺癌および乳癌などの癌、ならびにポリグルタミン酸疾患(Monksら、PNAS November 2 2007、オンライン刊行)、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄萎縮および筋肉萎縮ならびにKennedy疾患などのいくつかの疾患において示されている。
【０００８】
WO97/11170は、アンドロゲン受容体mRNAに選択的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、良性前立腺過形成または前立腺癌を有すると診断された患者を治療する方法を報告している。27〜29ヌクレオチドの3個のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が開示されている。
【０００９】
米国特許第6,733,776号およびEP 0 692 972は、アンドロゲン受容体遺伝子にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含むリポソームを適用することにより男性ホルモン性脱毛症を治療する方法を報告している。特定の配列を含み、アンドロゲン受容体を標的化するアンチセンス分子は提供されていない。
【００１０】
米国特許出願第2005/0164970号は、アンドロゲン受容体mRNAを標的化するsiRNA複合体を用いて前立腺癌を治療する方法を報告している。
【００１１】
WO 2005/027833は、長さ12〜40個のモルホリノサブユニットのモルホリノオリゴヌクレオチドを患者に投与することを含む前立腺癌を治療する方法を報告している。
【００１２】
WO 2001/083740は、ヒトアンドロゲン受容体を標的化する18〜20個の連続する単位の未変化モルホリノ主鎖を有するアンチセンス化合物を報告している。
【００１３】
モルホリノアンチセンス化合物は核酸標的への結合を介して作用し、mRNAスプライシングまたは翻訳開始に関与する分子などの、他の分子によるmRNAへの接近を遮断する。
【００１４】
米国特許第7,067,256号は、見かけ上、アンドロゲン受容体の不活化を媒介するリボザイムを報告している。アンドロゲン受容体mRNAの対応する領域に対する19ヌクレオチドのRNA分子アンチセンスが提供されている。
【００１５】
しかしながら、siRNA、モルホリノアンチセンスおよびリボザイムの適用にも拘わらず、上記のアンドロゲン受容体阻害剤はいずれも、in vivoで、および薬学的に許容し得る用量で、アンドロゲン受容体を効率的に下方調節することに成功していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
例示的な態様においては、本発明は、LNA化学の使用に基づいて、および／またはアンドロゲン受容体mRNA上の特に有効な標的部位の選択によって選択された新規クラスのアンドロゲン受容体アンタゴニストを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、10〜30ヌクレオチドなどの合計10〜50個の連続するヌクレオチド配列を含む、長さ10〜30ヌクレオチドなどの10〜50ヌクレオチドのオリゴマーであって、連続するヌクレオチド配列が、配列番号1などの哺乳動物アンドロゲン受容体遺伝子もしくはmRNAまたはその天然の変異体などの哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の逆相補体に対応する領域と少なくとも80％(例えば、85％、90％、95％、98％、もしくは99％)相同である、前記オリゴマーを提供する。かくして、例えば、前記オリゴマーは、配列番号1の(対応する)部分の配列を有する一本鎖核酸分子にハイブリダイズする。
【００１８】
本発明は、本発明に従うオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートを提供する。
【００１９】
本発明は、前記オリゴマーまたは本発明に従うコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害の治療のためなど、医薬としての使用のための本発明に従うオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００２１】
本発明は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害の治療のための医薬の製造における、本発明に従うオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００２２】
本発明は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害を治療する方法であって、該疾患または医学的障害に罹患するか、または罹患する可能性がある患者に、本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２３】
本発明は、アンドロゲン受容体を発現している細胞中のアンドロゲン受容体を阻害する方法であって、該細胞中のアンドロゲン受容体の阻害を行うために該細胞に本発明に従うオリゴマー、またはコンジュゲートを投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明は、合計10〜50核酸塩基の連続する核酸塩基配列を含む長さ10〜50核酸塩基のオリゴマーであって、連続する核酸塩基配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域と少なくとも80％相同である前記オリゴマーを提供する。
【００２５】
本発明は、合計10〜50核酸塩基の連続する核酸塩基配列を含む長さ10〜50核酸塩基のオリゴマーであって、連続する核酸塩基配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％同一である前記オリゴマーを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、前記オリゴマーの核酸塩基に加えて、本発明のオリゴマーに共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分(「コンジュゲート部分」)を含むコンジュゲートなどの、本発明に従うオリゴマーを含むコンジュゲートを提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、医学における使用のための本発明に従うオリゴマーを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄萎縮および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患などの、本明細書で言及される1種以上の疾患の治療のための医薬の製造における、本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄萎縮および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患などの、本明細書で言及される1種以上の疾患の治療における使用のための、本発明に従うオリゴマーを提供する。
【００３１】
本発明のオリゴマーを含む医薬組成物および他の組成物も提供する。さらに、細胞または組織中のARの発現を下方調節する方法であって、該細胞または組織を、in vitroまたはin vivoで、本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物と接触させることを含む前記方法も提供する。
【００３２】
また、補助動物またはヒトに、治療上または予防上有効量の本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することにより、ARの発現、または過剰発現と関連する疾患または症状を有すると疑われるか、またはその傾向がある(罹りやすい)、非ヒト動物またはヒトを治療する方法も開示する。さらに、ARの発現の阻害のため、およびARの活性と関連する疾患の治療のためのオリゴマーの使用方法を提供する。
【００３３】
本発明は、乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄萎縮および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患を治療する方法であって、(有効量の)1種以上の本発明のオリゴマー、コンジュゲート、またはその医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む前記方法を提供する。
【００３４】
本発明は、下方調節などにより、細胞または組織中のアンドロゲン受容体の発現を阻害するか、または低下させる方法であって、該細胞または組織を、有効量の1種以上の本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲート、または医薬組成物と接触させて、アンドロゲン受容体の発現を阻害するか、または低下させる工程を含む前記方法を提供する。
【００３５】
本発明は、いくつかの実施形態においては、隣接するモノマーがリン酸基またはホスホロチオエート基により共有結合した10〜30個の連続するモノマーからなるオリゴマーであって、少なくとも10個の連続するモノマーの第1の領域を含み、第1の領域の少なくとも1個のモノマーがヌクレオシド類似体であり、第1の領域の配列が哺乳動物アンドロゲン受容体遺伝子または哺乳動物アンドロゲン受容体mRNAの最良に整列された標的領域の逆相補体と少なくとも80％同一である、前記オリゴマーを提供する。
【００３６】
一態様においては、本発明のオリゴマーを、
5'-AsMeCsMeCsasasgstststscststscsAsGsMeC-3'(配列番号58)および、
5’-MeCsMeCsMeCsasasgsgscsascstsgscsAsGsA-3'(配列番号77)
(式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、およびMeCは5-メチルシトシン塩基を含むβ-D-オキシ-LNAモノマーを表す)
からなる群より選択する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】表3に提供されるオリゴヌクレオチドを、リアルタイムPCRを用いて、トランスフェクションの24時間後にMCF7細胞中、1、4および16 nMの濃度でアンドロゲン受容体mRNAをノックダウンさせるその能力について評価した。全ての結果をGAPDHに対して正規化し、AR mRNAの阻害を未処理対照％として示す。示される結果は、3回の独立した実験の平均である。
【図２】表3に提供されるオリゴヌクレオチドを、リアルタイムPCRを用いて、トランスフェクションの24時間後にA549細胞中、1、4および16 nMの濃度でアンドロゲン受容体mRNAをノックダウンさせるその能力について評価した。全ての結果をGAPDHに対して正規化し、AR mRNAの阻害を未処理対照％として示す。示される結果は、3回の独立した実験の平均である。
【図３−１】ヒトアンドロゲン受容体mRNA配列(Genbankアクセッション番号NM_000044)およびマウスアンドロゲン受容体mRNA配列(Genbankアクセッション番号NM_0134769)の配列アラインメントである。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図３−５】図３−４の続きである。
【図３−６】図３−５の続きである。
【図４−１】本発明に従うオリゴマーにより標的化されるヒトAR mRNA(cDNA)の好ましい標的領域の位置を示す。16マーの標的部位を示したが、いくつかの実施形態においては、これらの標的領域は示される領域に対して5'または3'側に追加の4塩基を含んでもよく、すなわち、最大24個の連続するヌクレオチドの標的領域である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５−１】配列番号1：ヒトアンドロゲン受容体(ジヒドロテストステロン受容体；精巣性女性化症；脊髄および延髄性筋肉萎縮；Kennedy疾患)(AR)、転写変異体1、mRNA(Genbankアクセッション番号NM_000044)を示す。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６】配列番号81：マウスアンドロゲン受容体mRNA配列を示す。
【図７】配列番号82：アカゲザルアンドロゲン受容体mRNA配列を示す。
【図８】配列番号83：ヒトアンドロゲン受容体タンパク質アミノ酸配列を示す。
【図９】配列番号84：マウスアンドロゲン受容体タンパク質アミノ酸配列を示す。
【図１０】配列番号85：アカゲザルアンドロゲン受容体タンパク質アミノ酸配列を示す。
【図１１】トランスフェクションの24時間後のLNCaP中のAR mRNAを示す。
【図１２】トランスフェクションの24時間後のA549中のAR mRNAを示す。
【図１３】細胞増殖アッセイ-A549、トランスフェクション後の経時変化を示す。
【図１４】細胞増殖アッセイ-トランスフェクション後の経時変化を示す。
【図１５】トランスフェクションの24、48または72時間後のLNCaP細胞中のキャスパーゼ3/7活性を示す。
【図１６】トランスフェクションの24、48または72時間後のA549細胞中のキャスパーゼ3/7活性を示す。
【図１７】in vivoでのオリゴマー処理後の血漿中の平均PSAを示す。
【図１８】腫瘍増殖のin vivoでの阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
オリゴマー
本発明は、配列番号1に示されるアンドロゲン受容体核酸、および哺乳動物アンドロゲン受容体をコードするそのような核酸分子の天然の変異体などの哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸分子の機能を調節するのに用いるためのオリゴマー化合物(以後、オリゴマーと呼ぶ)を用いる。本発明の文脈における用語「オリゴマー」とは、2個以上のヌクレオチドの共有結合により形成される分子(すなわち、オリゴヌクレオチド)を指す。本明細書では、本発明のオリゴマー中に存在するヌクレオチドなどのそれぞれの単一のヌクレオチドを、「モノマー」または「単位」と呼ぶこともできる。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、長さ10〜30ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む(すなわち、10〜30個の共有結合したモノマーを含むか、またはそれからなる)。
【００３９】
種々の実施形態においては、本発明の化合物は、RNA(単位)を含まない。種々の実施形態においては、本発明に従う化合物は線状分子であるか、または線状分子として合成される。そのような実施形態においては、前記オリゴマーは一本鎖分子であり、典型的には、例えば、同じオリゴマー内の別の領域と相補的である、少なくとも3、4または5個の連続するヌクレオチドの短い領域(すなわち、二本鎖)を含まない。この点で、いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは(本質的には)二本鎖ではない。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、本質的には二本鎖ではなく、例えば、siRNAではない。種々の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、完全に連続するヌクレオチド領域からなってもよい。かくして、前記オリゴマーは実質的には自己相補的ではない。siRNAは、典型的には、いずれかの末端上に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する、21〜23ヌクレオチド長などの2個の相補的な短いRNA(または等価な核酸塩基単位)配列を含む。in vivoでの取込みを増強するために、siRNAを、コレステロール基などのステロールなどにコンジュゲートさせることができる(典型的には、一方または両方の鎖の3'または5'末端で)。
【００４０】
本発明はさらに、AR mRNAもしくは遺伝子、またはその対立遺伝子変異体、特に、配列番号2〜22に対応するものの中の標的配列であって、該標的配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドがARを下方調節することができる前記標的配列を提供する。例えば、配列番号2〜22のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列に対応する標的配列を、それぞれ図4に示す(上記で示された配列番号の対応するオリゴについては、太字および下線で示す)。変異体配列、例えば、限定されるものではないが、そのような標的配列の対立遺伝子変異体(遺伝子座Xq11-12に存在する(AR)遺伝子など)などの変異体配列も本発明の範囲内にある。変異体配列は、AR中の標的配列に対して、少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％の配列相同性を有してもよい。典型的には、前記変異体配列に対応する本発明のオリゴマーは、依然としてARを下方調節することができる。
【００４１】
例えば、配列番号44〜80に示されるものなどの、LNAオリゴヌクレオチドの具体的設計も開示する。本発明のオリゴマーは、アンドロゲン受容体mRNAおよびタンパク質発現の強力な阻害剤であると考えられる。
【００４２】
標的
好ましくは、哺乳動物アンドロゲン受容体を、ヒトまたはマウスアンドロゲン受容体からなる群より選択する。好ましくは、哺乳動物アンドロゲン受容体は、配列番号1に示される核酸によりコードされるアンドロゲン受容体などの、ヒトアンドロゲン受容体である。さらなる哺乳動物アンドロゲン受容体遺伝子(標的)およびその対応するタンパク質を、以下の表に示す：
2011504362.tif 000002
【００４３】
ヒトにおけるアンドロゲン受容体遺伝子は、対立遺伝子変異の程度を示し、いくつかの多型性が、上記に開示された核酸に関するGenBankアクセッション番号はcDNA配列を指し、mRNA配列自体を指すわけではないことを認識すべきである。成熟mRNAの配列を、ウラシル塩基(U)により置換されるチミン塩基(T)を有する対応するcDNA配列から直接誘導することができる。
【００４４】
ヒトにおけるアンドロゲン受容体遺伝子が対立遺伝子変異の程度を示し、いくつかの多型性が、疾患表現型と関連することを認識すべきである(Moonyら、NAR 15; 31(8) 2003)。例えば、CAG反復伸長が、ポリグルタミン伸長障害と関連し、他の特徴的な対立遺伝子変異体が(GGC)nトリヌクレオチド反復を含み、ならびにR726L、T887AおよびL710H単一ヌクレオチド多型を同定し、後者の2つは他のステロイドリガンドのAR受容体の乱雑性の増強と相関することが示された。一実施形態においては、nは5〜31の範囲であってよい。22個未満のCAG反復は、アフリカ系アメリカ人男性において前立腺癌の危険性の増強と関連し、従ってこれは好ましい対立遺伝子変異体であってよい。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、標的核酸はR726L、T887AおよびL710Hなどの、1個以上の単一ヌクレオチド多型を含むAR対立遺伝子変異体である。
【００４６】
従って、いくつかの実施形態においては、標的は(CAG)nトリヌクレオチド反復、または(GGC)nトリヌクレオチド反復を含むAR対立遺伝子変異体である。
【００４７】
哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸は、好ましい実施形態においては、配列番号1として示されるヒトアンドロゲン受容体cDNA配列および／もしくは配列番号81として示されるマウスアンドロゲン受容体cDNA配列、またはその対立遺伝子変異体である。本発明に従うオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
従って、本発明に従うオリゴマーの「標的」は、アンドロゲン受容体mRNAである。アンドロゲン受容体遺伝子を発現している細胞中に導入された場合、前記オリゴマーは、アンドロゲン受容体mRNAレベルの低下をもたらし、その結果、細胞中のアンドロゲン受容体の発現レベルが低下する。
【００４９】
アンドロゲン受容体は、タンパク質キナーゼCδ(PRKCD)、グルタチオンS-トランスフェラーゼθ2(GSTT2)、一過性受容電位陽イオンチャンネルサブファミリーVメンバー3(TRPV3)、ピロリン-5-カルボキシレートリダクターゼ1(PYCR1)もしくはオルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT)からなる群より選択される遺伝子などのいくつかの遺伝子の発現を調節することが知られ、そのような遺伝子は、本明細書ではアンドロゲン受容体標的と呼ばれ、そのようなものとして、いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーを用いて、前記アンドロゲン受容体標的を発現しているか、または発現することができる(すなわち、細胞中のアンドロゲン受容体標的の抑制(ARによる)の緩和の場合)細胞中の1個以上のアンドロゲン受容体標的の発現を調節することができる。
【００５０】
アンドロゲン受容体mRNAを標的化するオリゴマーは、5'非翻訳リーダー、エクソン、イントロンおよび3'非翻訳尾部などの標的mRNA核酸に沿った任意の部位にハイブリダイズすることができる。しかしながら、アンドロゲン受容体mRNAを標的化するオリゴマーは、標的核酸の成熟mRNA形態にハイブリダイズするのが好ましい。
【００５１】
好適には、本発明のオリゴマーは、アンドロゲン受容体遺伝子の発現を下方調節することができる。この点で、本発明のオリゴマーは、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中で、アンドロゲン受容体の阻害を行うことができる。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは標的核酸に結合し、正常発現レベルと比較して、少なくとも10％もしくは20％の発現を阻害し、より好ましくは、正常発現レベルと比較して(オリゴマーの投与の直前など)、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％阻害する。いくつかの実施形態においては、そのような調節は、0.8〜20 nMなどの0.04〜25 nMの濃度の本発明の化合物を用いる場合に認められる。同じか、または異なる実施形態においては、発現の阻害は98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、70％未満の阻害などの100％未満の阻害である。発現レベルの調節を、例えば、SDS-PAGE、次いで、標的タンパク質に対する好適な抗体を用いるウェスタンブロッティングなどの方法により、タンパク質レベルを測定することにより決定することができる。あるいは、発現レベルの調節を、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRにより、mRNAのレベルを測定することにより決定することができる。mRNAレベルを介して測定する場合、0.8〜20 nMなどの0.04〜25 nM濃度などの好適な用量を用いる場合、下方調節のレベルは、いくつかの実施形態においては、典型的には本発明の化合物の非存在下では、正常レベルの10〜20％のレベルである。
【００５２】
従って、本発明は、アンドロゲン受容体タンパク質および／もしくはmRNAを発現している細胞中のアンドロゲン受容体タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節もしくは阻害する方法であって、本発明に従うオリゴマーもしくはコンジュゲート(好適には、有効量のもの)を、前記細胞に投与するか、または前記細胞と接触させて、該細胞中のアンドロゲン受容体タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節もしくは阻害することを含む前記方法を提供する。好適には、前記細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。投与または接触は、いくつかの実施形態においては、in vitroで起こってもよい。投与または接触は、いくつかの実施形態においては、in vivoで起こってもよい。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「標的核酸」とは、配列番号1などのヒトアンドロゲン受容体などの哺乳動物アンドロゲン受容体ポリペプチドをコードするDNAまたはRNA、アンドロゲン受容体をコードする核酸またはその天然の変異体、およびそれから誘導されるRNA核酸、好ましくはプレ-mRNAなどのmRNAであるが、好ましくは成熟mRNAを指す。いくつかの実施形態においては、例えば、研究または診断において用いる場合、「標的核酸」は、上記DNAまたはRNA核酸標的から誘導されるcDNAまたは合成オリゴヌクレオチドであってよい。本発明に従うオリゴマーは、好ましくは、標的核酸にハイブリダイズすることができる。配列番号1はcDNA配列であり、そのようなものとして、成熟mRNA標的配列と一致するが、cDNA配列中ではウラシルはチミジンと置換されていることが認識されるであろう。
【００５４】
用語「その天然変異体」とは、マウス、サル、および好ましくはヒトなどの哺乳動物などの規定の分類群内に天然で存在する核酸配列のアンドロゲン受容体ポリペプチドの変異体を指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然変異体」に言及する場合、この用語はまた、染色体転座もしくは複製によりX染色体：66.68-66.87 Mbに認められるアンドロゲン受容体をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子変異体、ならびにそれから誘導されるmRNAなどのRNAを包含してもよい。「天然変異体」はまた、アンドロゲン受容体mRNAの選択的スプライシングから誘導される変異体を含んでもよい。特定のポリペプチド配列を参照する場合、例えば、この用語はまた、従って、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解的切断、糖鎖付加などの翻訳同時修飾または翻訳後修飾により加工することができる天然形態のタンパク質をも含む。
【００５５】
オリゴマー配列
前記オリゴマーは、配列番号1に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に一致する連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。かくして、前記オリゴマーは、配列番号2〜22および86〜106からなる群より選択される配列を含むか、またはそれからなってもよく、該オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、必要に応じて、前記選択された配列に対する1、2、または3個の不一致を有してもよい。
【００５６】
前記オリゴマーは、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸(例えば、配列番号1)の等価な領域と全部相補的(完全に相補的)である連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。かくして、前記オリゴマーは、アンチセンスヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。
【００５７】
しかしながら、いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズし、依然として標的に十分に結合して所望の効果、すなわち、標的の下方調節を示す場合、1、2、3、または4個(以上)の不一致を許容してもよい。不一致を、例えば、オリゴマーヌクレオチド配列の長さの増加および／またはヌクレオチド配列内に存在する、LNAなどのヌクレオチド類似体の数の増加により相殺することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、連続するヌクレオチド配列は、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域などの標的配列にハイブリダイズする場合、2個以下の不一致などの3個以下の不一致を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、連続するヌクレオチド配列は、連続するヌクレオチド配列は、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域などの標的配列にハイブリダイズする場合、1個以下の不一致を含む。
【００６０】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、例えば、100％相同(同一)などの、配列番号2〜22および86〜106からなる群より選択される対応する配列と少なくとも80％相同であるのが好ましい。
【００６１】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば、100％相同(同一)などの、配列番号1に存在する対応する配列の逆相補体と少なくとも80％相同であるのが好ましい。
【００６２】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば、100％相補的(完全に相補的)などの、配列番号1に存在するサブ配列と少なくとも80％相補的であるのが好ましい。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、および22からなる群より選択される配列の1つ、またはその少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列から選択されるか、もしくはそれを含み、該オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、必要に応じて、前記配列と比較した場合、1、2、または3個の不一致を含んでもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、配列番号86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105および106からなる群より選択される配列の1つ、またはその少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列から選択されるか、もしくはそれを含み、該オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、必要に応じて、前記配列と比較した場合、1、2、または3個の不一致を含んでもよい。
【００６５】
他の好ましいオリゴマーは、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、および22からなる群より選択される配列から選択されるヌクレオチド配列を有する、長さ12、13、14、15または16個の連続するヌクレオチドの配列などの(連続する)ヌクレオチド配列を含み、該オリゴマー(またはその連続するヌクレオチド部分)は、必要に応じて、前記選択された配列に対して1、2、または3個の不一致を含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、前記サブ配列は、12〜18ヌクレオチドなどの12〜22ヌクレオチドなどの、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、もしくは29個の連続するヌクレオチドからなってもよい。好適には、いくつかの実施形態においては、前記サブ配列は、本発明のオリゴマーの連続するヌクレオチド配列と同じ長さのものである。
【００６７】
しかしながら、いくつかの実施形態においては、オリゴマーのヌクレオチド配列は、標的配列と非相補的である、独立に、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドなどの、追加の5'もしくは3'ヌクレオチドを含んでもよいことが認識される。この点で、本発明のオリゴマーは、いくつかの実施形態においては、追加のヌクレオチドにより5'または3'にフランキングする連続するヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、追加の5'または3'ヌクレオチドは、DNAまたはRNAなどの天然のヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、追加の5'または3'ヌクレオチドは、本明細書ではギャップマーの文脈においてオリゴマーと呼ばれるD領域である。
【００６８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号44などの配列番号2に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号45などの配列番号3に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号46などの配列番号4に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号47などの配列番号5に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号48、49もしくは50などの配列番号6に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号51、52もしくは53などの配列番号7に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号54、55もしくは56などの配列番号8に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号57などの配列番号9に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号58、59もしくは60などの配列番号10に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号61などの配列番号11に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号62などの配列番号12に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号63、64もしくは65などの配列番号13に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号66などの配列番号14に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号67などの配列番号15に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号68などの配列番号16に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号69、70もしくは71などの配列番号17に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号72などの配列番号18に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号73、74もしくは75などの配列番号19に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号76などの配列番号20に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号77、78もしくは79などの配列番号21に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号80などの配列番号22に記載のヌクレオチド配列、またはその11、12、13、14、15もしくは16個の連続するヌクレオチドなどの少なくとも10個の連続するヌクレオチドのサブ配列からなるか、またはそれを含む。
【００８９】
本発明のオリゴマー(または連続するヌクレオチド配列)と、本明細書に開示されるものなどの、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸もしくはその逆相補体との「相同性」を決定する場合、相同性の決定を、本発明の化合物の対応するヌクレオチド配列および哺乳動物アンドロゲン受容体(もしくは標的核酸)をコードする核酸、またはその逆相補体の対応する領域との単純なアラインメントにより行うことができ、整列する塩基数を計数し、本発明の化合物中の連続するヌクレオチドの総数により除算し、100を掛けることにより、相同性を決定する。そのような比較においては、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、ギャップ内のヌクレオチド数が本発明のヌクレオチドと標的核酸との間で異なる場合、領域よりもむしろ単なる不一致であることが好ましい。
【００９０】
用語「に対応する(corresponding to)」および「に対応する(corresponds to)」とは、オリゴマーもしくは連続するヌクレオチド配列のヌクレオチド配列(第1の配列)と、i)配列番号1などの、アンドロゲン受容体タンパク質をコードするmRNAなどの核酸標的の逆相補体のサブ配列、および／またはii)配列番号2〜22および86〜106、もしくはそのサブ配列からなる群などの本明細書で提供されるヌクレオチドの配列から選択されるさらなる配列の等価な連続するヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体を、その等価な、または対応するヌクレオチドと直接比較する。i)またはii)の下でさらなる配列に対応する第1の配列は、典型的には、第1の配列(連続するヌクレオチド配列など)の長さに渡ってその配列と同一であるか、または本明細書に記載のように、いくつかの実施形態においては、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば、100％相同である(同一である)など、対応する配列と少なくとも80％相同である。
【００９１】
用語「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体および天然のヌクレオチド中のヌクレオチドが同一であることを示すと意図される。例えば、前記ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位をアデニンに連結する場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結されたペントース単位(2-デオキシリボースとは異なる)を含む。
【００９２】
長さ
前記オリゴマーは、長さ合計10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の連続するヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、長さ合計10〜22、例えば、12〜18、例えば、13〜17または12〜16、例えば、13、14、15、16個の連続するヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００９４】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、長さ合計10、11、12、13または14個の連続するヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、22個以下のヌクレオチド、例えば、20個以下のヌクレオチド、例えば、18個以下のヌクレオチド、例えば、15、16または17個のヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、20個未満のヌクレオチドを含む。
【００９６】
ヌクレオチド類似体
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」とは、糖部分、塩基部分および共有結合したリン酸基を含むグリコシドを指し、DNAもしくはRNA、好ましくはDNAなどの天然ヌクレオチドと、本明細書では「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる、修飾された糖および／もしくは塩基部分を含む非天然ヌクレオチドとの両方を含む。
【００９７】
非天然ヌクレオチドとしては、二環式ヌクレオチドまたは2'置換ヌクレオチドなどの2'修飾ヌクレオチドなどの修飾糖部分を有するヌクレオチドが挙げられる。
【００９８】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分における修飾の理由で、DNAまたはRNAなどの天然ヌクレオチドの変異体である。類似体は、原理的にはオリゴヌクレオチドの文脈において天然ヌクレオチドに対する単なる「サイレント」または「等価物」であってもよい、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように作用する方法に対して機能的な効果を有さないものであってよい。それにも拘わらず、そのような「等価な」類似体は、例えば、その製造がより容易であるか、もしくはより安価であるか、または保存もしくは製造条件に対してより安定であるか、またはタグもしくは標識を表す場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、前記類似体は、例えば、標的への結合親和性の増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加および／または細胞中への輸送の容易性の増加をもたらすことにより、オリゴマーが発現を阻害するように作用する方法に対して機能的な効果を有するであろう。ヌクレオシド類似体の特定例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213ならびにスキーム1：
【化１】
2011504362.tif 000003
【００９９】
に記載されている。
【０１００】
かくして、前記オリゴマーは、天然ヌクレオチド、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチド(本明細書では、一般的に「DNA」と呼ぶ)であるが、おそらくリボヌクレオチド(本明細書では一般的に「RNA」と呼ぶ)、またはそのような天然ヌクレオチドと1種以上の非天然ヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチド類似体との組合せの単純な配列を含むか、またはそれからなってもよい。そのようなヌクレオチド類似体は、好適には、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強することができる。
【０１０１】
好適かつ好ましいヌクレオチド類似体の例は、PCT/DK2006/000512に提供されており、またはその参考文献に記載されている。
【０１０２】
LNAまたは2'-置換された糖などの、オリゴマーへの親和性増強ヌクレオチド類似体の組込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズを低下させることができ、非特異的または異常な結合が起こる前にオリゴマーのサイズに対する上限を低下させることもできる。
【０１０３】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、3〜8個のヌクレオチド類似体、例えば、6または7個のヌクレオチド類似体を含む。間違いなく最も好ましい実施形態においては、少なくとも1個の前記ヌクレオチド類似体は、固定核酸(LNA)である；例えば、少なくとも3個または少なくとも4個または少なくとも5個または少なくとも6個または少なくとも7個または8個のヌクレオチド類似体はLNAであってよい。いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオチド類似体はLNAであってよい。
【０１０４】
ヌクレオチドのみからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する場合、その配列により定義される本発明のオリゴマーは、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Tm(すなわち、ヌクレオチド類似体を増強する親和性)を上昇させる、LNA単位もしくは他のヌクレオチド類似体などの前記配列中に存在する1個以上のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチド類似体を含んでもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーのヌクレオチド配列と、標的配列との任意の不一致は、本明細書で呼ばれるB領域、および／もしくは本明細書で呼ばれるD領域などの親和性を増強するヌクレオチド類似体の外側の領域、ならびに／またはオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオチドなどの修飾されていない部位、ならびに／または連続するヌクレオチド配列に対して5'もしくは3'側にある領域に認められるのが好ましい。
【０１０６】
ヌクレオチドのそのような修飾の例は、2'置換基を提供するか、または結合親和性を増強し、ヌクレアーゼ耐性の増強も提供し得る架橋された(固定核酸)構造を産生するように糖部分を修飾することを含む。
【０１０７】
好ましいヌクレオチド類似体は、オキシ-LNA(β-D-オキシ-LNA、およびα-L-オキシ-LNAなど)、および／またはアミノ-LNA(β-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNAなど)および／またはチオ-LNA(β-D-チオ-LNAおよびα-D-チオ-LNAなど)および／またはENA(β-D-ENAおよびα-L-ENAなど)などのLNAである。最も好ましいのは、β-D-オキシ-LNAである。
【０１０８】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマー内(本明細書で言及されるAおよびC領域など)に存在するヌクレオチド類似体を、例えば、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、アラビノ核酸(ANA)単位、2'-フルオロ-ANA単位、HNA単位、INA(介入核酸 - 参照により本明細書に組み入れられるものとする、Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925)単位および2'MOE単位から独立に選択する。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはその連続するヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチド類似体の上記の型の1つのみが存在する。
【０１０９】
いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド類似体は、2'-O-メトキシエチル-RNA(2'MOE)、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオチド類似体であり、そのようなものとして、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの3つの型の類似体から独立に選択されるヌクレオチド類似体を含んでもよく、または3つの型から選択される類似体の1つの型のみを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、少なくとも1個の前記ヌクレオチド類似体は、2'-MOE-RNA、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-MOE-RNAヌクレオチド単位である。いくつかの実施形態においては、少なくとも1個の前記ヌクレオチド類似体は、2'-フルオロDNA、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオチド単位である。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、少なくとも1個の固定核酸(LNA)単位、例えば、1、2、3、4、5、6、7、または8個のLNA単位、例えば、3〜7個もしくは4〜8個のLNA単位、または3、4、5、6もしくは7個のLNA単位を含む。いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオチド類似体はLNAである。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、β-Dもしくはα-L配置またはその組合せ中に、β-D-オキシ-LNAと、以下のLNA単位：チオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および／もしくはENAのうちの1個以上の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、全てのLNAシトシン単位は5'メチル-シトシンである。本発明のいくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、LNAおよびDNA単位の両方を含んでもよい。好ましくは、LNAおよびDNA単位の合計は、10〜25、好ましくは10〜20、さらにより好ましくは12〜16個である。本発明のいくつかの実施形態においては、連続するヌクレオチド配列などのオリゴマーのヌクレオチド配列は、少なくとも1個のLNAからなり、残りのヌクレオチド単位はDNA単位である。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、必要に応じて、ホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド間結合と共に、唯一のLNAヌクレオチド類似体および天然ヌクレオチド(RNAもしくはDNA、最も好ましくはDNAヌクレオチドなど)を含む。
【０１１１】
用語「核酸塩基」とは、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然ならびに非天然変異体の両方を包含する。かくして、「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環類似体およびその互変異性体をも包含する。
【０１１２】
核酸塩基の例としては、限定されるものではないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンが挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、オリゴマー中に存在する核酸塩基の少なくとも1個は、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾核酸塩基である。
【０１１４】
LNA
用語「LNA」とは、「固定核酸(Locked Nucleic Acid)」として知られる二環式ヌクレオチド類似体を指す。それはまた、LNAモノマーを指してもよく、または「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いる場合、1個以上のそのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。
【０１１５】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物中で用いられるLNAは、好ましくは一般式I：
【化２】
2011504362.tif 000004
【０１１６】
(式中、Xは-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され；
Bは水素、置換されていてもよいC1-4アルコキシ、置換されていてもよいC1-4アルキル、置換されていてもよいC1-4アシルオキシ、核酸塩基、DNA介入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポーター基、およびリガンドから選択され；
Pはそれに続くモノマーとのヌクレオシド間結合、または5'末端基のためのラジカル位置を表し、そのようなヌクレオシド間結合または5'末端基は必要に応じて、置換基R5を含むか、もしくは同等に適用可能な置換基R5*を含み；
P*はその前のモノマー、または3'末端基とのヌクレオシド間結合を表し；
R4*およびR2*は一緒になって、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1〜4個の基／原子からなるビラジカルを表し、
式中、Zは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、RaおよびRbは各々独立に、水素、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、C1-12アルコキシ、C2-12アルコキシアルキル、C2-12アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、C1-6アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、DNA介入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個の双子置換基RaおよびRbは一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表してもよく、ならびに存在するそれぞれの置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*は、水素、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、C1-12アルコキシ、置換されていてもよいC2-12アルケニル、置換されていてもよいC1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、C1-6アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、DNA介入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポーター基、およびリガンドから独立に選択され、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個の双子置換基は一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ、もしくは置換されていてもよいメチレンを表すか、または一緒になって-O-、-S-、および-(NRN)-(式中、RNは水素およびC1-4アルキルから選択される)から選択される1個以上のヘテロ原子／基により中断および／もしくは終結されてもよい1〜5個の炭素原子のアルキレン鎖からなるスピロビラジカルを形成してもよく、2個の隣接する(非双子)置換基は二重結合をもたらすさらなる結合を表してもよく；ならびにビラジカル中に存在し、含まれない場合、RN*は水素およびC1-4アルキルから選択される)
ならびにその塩基性塩および酸付加塩；
の構造を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態においては、R5*はH、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3、および-CH=CH2から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、および-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択されるビラジカルを表し、ここで、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfはそれぞれ、水素、置換されていてもよいC1-12アルキル、置換されていてもよいC2-12アルケニル、置換されていてもよいC2-12アルキニル、ヒドロキシ、C1-12アルコキシ、C2-12アルコキシアルキル、C2-12アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12アルコキシカルボニル、C1-12アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、C1-6アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、DNA介入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポーター基、およびリガンドから独立に選択され、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個の双子置換基RaおよびRbは一緒になって置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表してもよい。
【０１１９】
さらなる実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、-CH(CH2-O-CH3)-O-から選択されるビラジカル(二価基)を表す。
【０１２０】
全てのキラル中心について、非対称基をRまたはSの向きに見出すことができる。
【０１２１】
好ましくは、本発明のオリゴマー中で用いられるLNAは、式：
【化３】
2011504362.tif 000005
【０１２２】
(式中、Yは-O-、-O-CH2-、-S-、-NH-、またはN(RH)であり；ZおよびZ*はヌクレオチド間結合、末端基または保護基から独立に選択され；Bは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、ならびにRHは水素およびC1-4アルキルから選択される)
のいずれかに従う少なくとも1個のLNA単位を含む。
【０１２３】
特に好ましいLNA単位をスキーム2に示す。
【化４】
2011504362.tif 000006
【０１２４】
用語「チオ-LNA」は、上記一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択される固定ヌクレオチドを含む。チオ-LNAはβ-Dおよびα-L-配置のいずれかにあってよい。
【０１２５】
用語「アミノ-LNA」とは、上記一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-(式中、Rは水素およびC1-4アルキルから選択される)から選択される固定ヌクレオチドを指す。アミノ-LNAはβ-Dおよびα-L-配置のいずれかにあってよい。
【０１２６】
用語「オキシ-LNA」とは、上記一般式中のYが-O-または-CH2-O-である固定ヌクレオチドを指す。オキシ-LNAはβ-Dおよびα-L配置のいずれかにあってよい。
【０１２７】
用語「ENA」とは、上記一般式中のYが-CH2-O-(-CH2-O-の酸素原子が、塩基Bに関して2'位置に結合している)である固定ヌクレオチドを指す。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、LNAはβ-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNAおよびβ-D-チオ-LNA、特に、β-D-オキシ-LNAから選択される。
【０１２９】
RNAseの動員
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害、または他の方法などにより、標的mRNAの非RNaseに媒介される分解を介して機能し得るが、本発明の好ましいオリゴマーは、RNase Hなどのエンドリボヌクレアーゼ(RNase)を動員することができると認識される。
【０１３０】
前記オリゴマー、または連続するヌクレオチド配列は、相補的標的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNaseを動員することができる、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の連続するヌクレオチドを含む、少なくとも8個または少なくとも9個の連続するヌクレオチド単位(残基)などの少なくとも7個の連続するヌクレオチド単位などの少なくとも6個の領域を含む。RNAseを動員することができる連続する配列は、本明細書に記載のギャップマーの文脈において言及されるB領域であってよい。いくつかの実施形態においては、B領域などのRNAseを動員することができる連続する配列のサイズは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオチド単位などのより大きいものであってよい。
【０１３１】
EP 1 222 309は、RNaseHを動員する能力を決定するのに用いることができる、RNaseH活性を決定するためのin vitro方法を提供する。オリゴマーは、相補的RNA標的と共に提供された場合、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いる、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合基を含む、2'置換基を含まない、等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも10％もしくは20％未満などの少なくとも5％などの少なくとも1％の、pmol/分で測定される初期速度を有する場合、RNase Hを動員することができると考えられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNase Hと共に提供される場合、pmol/分で測定されるRNase H初期速度が、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いる、2'置換を含まず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合基を含む、等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定される初期速度の10％未満または20％未満などの、5％未満などの1％未満である場合、RNase Hを動員することが本質的にできないと考えられる。
【０１３３】
他の実施形態においては、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNase Hと共に提供される場合、pmol/分で測定されるRNase H初期速度が、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いる、2'置換を含まず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合基を含む、等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定される初期速度の少なくとも80％などの、少なくとも60％などの少なくとも40％などの少なくとも20％である場合、RNase Hを動員することができると考えられる。
【０１３４】
典型的には、相補的標的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNaseを動員することができる連続的ヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、RNA標的とのDNA/RNA様二本鎖を形成するヌクレオチド単位からなり、α-L配置にあるDNA単位およびLNA単位の両方を含み、特に好ましくはα-L-オキシLNAである。
【０１３５】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドとヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでもよく、ギャップマー、ヘッドマーまたはミクスマーの形態にあってもよい。
【０１３６】
ヘッドマーは、5'末端の非RNase動員ヌクレオチド類似体の連続的伸長、次いで、3'末端に向かってRNaseにより認識および切断され得るDNAもしくは修飾ヌクレオチド単位の連続的伸長(少なくとも7個のそのようなヌクレオチドなど)により定義され、テイルマーは5'末端でRNaseにより認識および切断され得るDNAもしくは修飾ヌクレオチドの連続的伸長(少なくとも7個のそのようなヌクレオチドなど)、次いで、3'末端に向かう非RNase動員ヌクレオチド類似体の連続的伸長により定義される。ミクスマーと呼ばれる本発明に従う他のキメラは、RNaseおよび非RNase動員ヌクレオチド類似体により認識および切断され得るDNAもしくは修飾ヌクレオチドの代替組成物からなる。いくつかのヌクレオチド類似体はまた、RNaseHの結合および切断を媒介することもできる。α-L-LNAはある程度までRNaseH活性を動員するため、ギャップマー構築のためにRNaseHにより認識および切断され得るDNAもしくは修飾ヌクレオチドのより小さいギャップが必要であってよく、ミクスマー構築物中により高い可撓性を導入することができる。
【０１３７】
ギャップマー設計
好ましくは、本発明のオリゴマーはギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNAseを動員することができるヌクレオチドの連続的伸長に対して5'および3'にある1〜6個のヌクレオチド類似体などの、親和性増強ヌクレオチド類似体の領域により5'および3'の双方にフランキングする(これらの領域を、それぞれA領域およびC領域と呼ぶ)、本明細書ではB領域と呼ばれる、少なくとも6個もしくは7個のDNAヌクレオチドの領域などの、RNAseHなどのRNAseを動員することができるヌクレオチドの連続的伸長を含むオリゴマーである。
【０１３８】
好ましくは、ギャップマーは、式(5'から3'に向かって)、A-B-C、または必要に応じて、A-B-C-DもしくはD-A-B-Cの(ポリ)ヌクレオチド配列(式中、A領域(5'領域)はLNA単位などの1〜6個のヌクレオチド類似体などの、少なくとも1個のLNA単位などの、少なくとも1個のヌクレオチド類似体からなるか、もしくはそれを含み、ならびに、B領域はDNAヌクレオチドなどの、RNAseを動員することができる少なくとも5個の連続的ヌクレオチド(mRNA標的などの相補的RNA分子と二本鎖中で形成される場合)からなるか、もしくはそれを含み、ならびにC領域(3'領域)はLNA単位などの、1〜6個のヌクレオチド類似体などの、少なくとも1個のLNA単位などの、少なくとも1個のヌクレオチド類似体からなるか、もしくはそれを含み、ならびに存在する場合、D領域はDNAヌクレオチドなどの1、2もしくは3個のヌクレオチド単位からなるか、もしくはそれを含む)を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態においては、A領域は、3もしくは4個のLNA単位などの、3もしくは4個のヌクレオチド類似体などの、2〜5個のLNA単位などの、2〜5個のヌクレオチド類似体などの、LNA単位などの1、2、3、4、5もしくは6個のヌクレオチド類似体からなり；および／またはC領域は、3もしくは4個のLNA単位などの、3もしくは4個のヌクレオチド類似体などの、2〜5個のLNA単位などの、2〜5個のヌクレオチド類似体などの、LNA単位などの1、2、3、4、5もしくは6個のヌクレオチド類似体からなる。
【０１４０】
いくつかの実施形態においては、Bは、RNAseを動員することができる5、6、7、8、9、10、11もしくは12個の連続的ヌクレオチド、またはRNAseを動員することができる6〜10個、もしくは7〜9個、例えば、8個の連続的ヌクレオチドからなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態においては、B領域は、1〜12個のDNA単位、好ましくは、4〜12個のDNA単位、より好ましくは6〜10個のDNA単位、例えば、7〜10個のDNA単位、最も好ましくは8、9もしくは10個のDNA単位からなるか、またはそれを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態においては、A領域は、LNAなどの3もしくは4個のヌクレオチド類似体からなり、B領域は7、8、9もしくは10個のDNA単位からなり、C領域はLNAなどの3もしくは4個のヌクレオチド類似体からなる。そのような設計は、(A-B-C)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3を含み、DNA単位などの1または2個のヌクレオチド単位を有してもよいD領域をさらに含んでもよい。
【０１４２】
さらなるギャップマー設計は、WO2004/046160に開示されており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１４３】
参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許仮出願第60/977409号は、いくつかの実施形態においては、本発明に従うギャップマーオリゴマーであってよい、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーを指す。
【０１４４】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、合計10、11、12、13もしくは14個のヌクレオチド単位の連続するヌクレオチド配列からなり、連続するヌクレオチド配列は式(5'から3'に向かって)、A-B-C、または必要に応じてA-B-C-DもしくはD-A-B-C(式中、AはLNA単位などの1、2もしくは3個のヌクレオチド類似体単位からなり；Bは相補的RNA分子(mRNA標的など)との二本鎖中で形成される場合、RNAseを動員することができる7、8もしくは9個の連続するヌクレオチド単位からなり；ならびにCはLNA単位などの1、2もしくは3個のヌクレオチド類似体単位からなる)のものである。存在する場合、Dは1個のDNA単位からなる。
【０１４５】
いくつかの実施形態においては、Aは1個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Aは2個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Aは3個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Cは1個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Cは2個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Cは3個のLNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Bは7個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態においては、Bは8個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態においては、Bは9個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態においては、Bは2、3、4、5、6、7もしくは8個のDNA単位などの1〜9個のDNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、BはDNA単位からなる。いくつかの実施形態においては、Bは、α-L-配置にある2、3、4、5、6、7、8もしくは9個のLNA単位などの、α-L-配置にある少なくとも1個のLNA単位を含む。いくつかの実施形態においては、Bは少なくとも1個のα-L-オキシLNA単位を含むか、またはα-L-配置にある全てのLNA単位がα-L-オキシLNA単位である。いくつかの実施形態においては、A-B-C中に存在するヌクレオチドの数を、(ヌクレオチド類似体単位-B領域-ヌクレオチド類似体単位)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または;1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または; 1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1からなる群より選択する。いくつかの実施形態においては、A-B-C中のヌクレオチドの数を、2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択する。いくつかの実施形態においては、AおよびCは両方とも、それぞれ2個のLNA単位からなり、Bは8もしくは9個のヌクレオチド単位、好ましくは、DNA単位からなる。
【０１４６】
ヌクレオチド間結合
用語「結合基」または「ヌクレオチド間結合」は、2個のヌクレオチド、2個のヌクレオチド類似体、およびヌクレオチドとヌクレオチド類似体などを一緒に共有結合させることができる基を意味すると意図される。特定かつ好ましい例としては、リン酸基およびホスホロチオエート基が挙げられる。
【０１４７】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列を、結合基を介して一緒に結合させる。好適には、それぞれのヌクレオチドを、結合基を介して3'隣接ヌクレオチドに連結する。
【０１４８】
好適なヌクレオチド間結合としては、PCT/DK2006/000512内に列挙されたもの、例えば、PCT/DK2006/000512(参照により本明細書に組み入れられるものとする)の34頁の第1パラグラフに列挙されたヌクレオチド間結合が挙げられる。
【０１４９】
いくつかの実施形態においては、その通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼの抗原に対する耐性がより高いもの、例えば、ホスホロチオエートもしくはボラノホスフェートへのヌクレオチド間結合を改変するのが好ましい。これらの2つは、RNaseHにより切断可能であり、また、アンチセンス阻害の経路が標的遺伝子の発現を低下させる。
【０１５０】
本明細書に提供される好適な硫黄(S)を含むヌクレオチド間結合が好ましい。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合も、特に、ギャップマーのギャップ領域(B)にとって好ましい。また、ホスホロチオエート結合を、フランキング領域(AおよびC、ならびにAもしくはCからDについては、必要に応じて、D領域内)のために用いることもできる。
【０１５１】
しかしながら、A、BおよびC領域は、特に、例えば、ヌクレオチド類似体の使用が、エンドヌクレアーゼ分解から、AおよびC領域内のヌクレオチド間結合を保護する場合、例えば、AおよびC領域がLNAヌクレオチドを含む場合、ホスホジエステル結合などの、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間結合を含んでもよい。
【０１５２】
前記オリゴマー中のヌクレオチド間結合は、標的RNAのRNase H切断を可能にするような、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってよい。改善されたヌクレアーゼ耐性および製造の容易性などの他の理由のため、ホスホロチオエートが好ましい。
【０１５３】
本発明のオリゴマーの一態様においては、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を、ホスホロチオエート基により互いに連結する。
【０１５４】
特に、ヌクレオチド類似体単位(典型的には、Aおよび／もしくはC領域中)の間の、またはそれに隣接する、さもなければホスホロチオエートオリゴマーへの、1もしくは2個の結合などの、ホスホジエステル結合の含有は、オリゴマーの生体利用能および／または生体分布を改変することができる(参照により本明細書に組み入れられるものとする、WO 2008/053314を参照されたい)。
【０１５５】
上記の実施形態などのいくつかの実施形態においては、好適かつ非特異的に示される場合、全ての残存する連結基は、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエート、またはその混合物であってよい。
【０１５６】
いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオチド間結合基は、ホスホロチオエートである。本明細書で提供されるものなどの、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、種々の実施形態においては、結合がホスホロチオエート結合である場合、本明細書で開示されるものなどの代替的な結合を用いることができる、例えば、特にLNA単位などのヌクレオチド類似体間の連結のために、リン酸(ホスホジエステル)結合を用いることができることが理解されるであろう。同様に、本明細書で提供されるものなどの、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、C残基を5'メチル修飾シトシンとして注釈する場合、種々の実施形態においては、オリゴマー中に存在する1個以上のCsは、いくつかの実施形態においては、修飾されていないC残基であってよい。
【０１５７】
オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーを、例えば、22〜43および44〜80からなる群より選択することができる。
【０１５８】
コンジュゲート
本開示の文脈においては、用語「コンジュゲート」は、1個以上の非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分への本明細書に記載のオリゴマーの共有結合(「コンジュゲーション」)により形成される異種性分子を示す。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例としては、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組合せなどの大分子剤が挙げられる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であってよい。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであってよい。
【０１５９】
従って、様々な実施形態においては、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続する配列からなるポリヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでもよい。連続するヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、前記化合物はコンジュゲート成分などの非ヌクレオチド成分を含んでもよい。
【０１６０】
本発明の様々な実施形態においては、オリゴマー化合物を、例えば、オリゴマー化合物の細胞取込みを増加させるために用いることができるリガンド／コンジュゲートに連結する。WO2007/031091は、好適なリガンドおよびコンジュゲートを提供しており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１６１】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明に従う化合物と、該化合物に共有結合した少なくとも1種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートも提供する。従って、本発明の化合物が本明細書に開示される特定の核酸またはヌクレオチド配列からなる様々な実施形態においては、前記化合物はまた、該化合物に共有結合した少なくとも1種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分(例えば、1種以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない)を含んでもよい。
【０１６２】
コンジュゲーション(コンジュゲート部分への)は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取込みを増強することができる。そのような部分としては、限定されるものではないが、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１６３】
また、本発明のオリゴマーを、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲートさせることもできる。
【０１６４】
特定の実施形態においては、コンジュゲートされた部分は、コレステロールなどのステロールである。
【０１６５】
様々な実施形態においては、コンジュゲートされた部分は、例えば、長さ3〜10などの2〜20などの1〜50アミノ酸残基の正に荷電したペプチド、および／またはポリエチルグリコール(PEG)もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドなどの正に荷電したポリマーを含むか、またはそれからなる(本明細書に組み入れられるものとするWO 2008/034123を参照されたい)。好適には、ポリアルキレンオキシドなどの正に荷電したポリマーを、WO 2008/034123に記載の放出可能なリンカーなどのリンカーを介して、本発明のオリゴマーに結合させることができる。
【０１６６】
例えば、以下のコンジュゲート部分を、本発明のコンジュゲート中で用いることができる。
【化５】
2011504362.tif 000007
【０１６７】
活性化オリゴマー
本明細書で用いられる用語「活性化オリゴマー」とは、1個以上のコンジュゲートされた部分へのオリゴマーの共有結合を許容する少なくとも1個の機能的部分、すなわち、それ自身、核酸でもモノマーでもない部分に共有結合(すなわち、官能化)されて、本明細書に記載のコンジュゲートを形成する、本発明のオリゴマーを指す。典型的には、機能的部分は、好ましくは、コンジュゲートされた部分に結合することができる親水性基および末端基(例えば、アミノ、スルフヒドリルもしくはヒドロキシル基)であるスペーサーである、例えば、アデニン塩基の3'-ヒドロキシル基もしくは環外NH2基を介して、オリゴマーに共有結合することができる化学基を含むであろう。いくつかの実施形態においては、この末端基は保護されず、例えば、NH2基である。他の実施形態においては、末端基を、例えば、Theodora W GreeneおよびPeter G M Wuts、第3版(John Wiley & Sons, 1999)による「Protective Groups in Organic Synthesis」に記載のものなどの任意の好適な保護基により保護する。好適なヒドロキシル保護基の例としては、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが挙げられる。好適なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルもしくはトリフルオロアセチルなどのアシル基が挙げられる。いくつかの実施形態においては、機能的部分は、自己切断的である。他の実施形態においては、機能的部分は生分解性である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第7,087,229号を参照されたい。
【０１６８】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーを5'末端で官能化して、オリゴマーの5'末端へのコンジュゲートされた部分の共有結合を可能にする。他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを3'末端で官能化することができる。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、主鎖に沿って、またはヘテロ環塩基部分上で官能化することができる。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、5'末端、3'末端、主鎖および塩基から独立に選択される2個以上の位置で官能化することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、共有結合された1個以上のモノマーを合成の間に機能的部分に組み入れることにより合成する。他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、官能化されたモノマーを用いて合成し、オリゴマーを合成の完了の際に官能化する。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーを、アミノアルキルリンカー(ここでアルキル部分は式(CH2)wを有し、式中、wは1〜10の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖もしくは分枝鎖であってよく、官能基はエステル基(-O-C(O)-(CH2)wNH)を介してオリゴマーに結合している)を含むヒンダードエステルを用いて官能化する。
【０１７０】
他の実施形態においては、前記オリゴマーを、(CH2)w-スルフヒドリル(SH)リンカー(式中、wは1〜10の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖もしくは分枝鎖であってよく、官能基はエステル基(-O-C(O)-(CH2)wSH)を介してオリゴマーに結合している)を含むヒンダードエステルを用いて官能化する。
【０１７１】
いくつかの実施形態においては、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と共にコンジュゲートする(ジスルフィド結合の形成を介する)。
【０１７２】
上記のヒンダードエステルを含む活性化オリゴマーを、当業界で公知の任意の方法、および特に、PCT公開第WO 2008/034122号およびその実施例(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示された方法により合成することができる。
【０１７３】
さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、実質的に米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能化試薬、すなわち、親水性スペーサー鎖を介して、保護された、もしくは保護されていないスルフヒドリル、アミノもしくはヒドロキシル基を含む他方の末端に連結された、一方の末端にホスホルアミダイトを有する、実質的に線状の試薬を用いて、オリゴマー中にスルフヒドリル、アミノもしくはヒドロキシル基を導入することにより官能化する。そのような試薬は主に、前記オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態においては、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。他の実施形態においては、活性化オリゴマーは、3'-ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。さらに他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの主鎖上のヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載の2種以上の官能化試薬を用いて官能化する。そのような官能化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み入れる方法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。
【０１７４】
いくつかの実施形態においては、固相結合オリゴマーの5'末端を、ジエニルホスホルアミダイト誘導体を用いて官能化した後、例えば、Diels-Alder環化付加反応を介して、アミノ酸またはペプチドを用いて脱保護されたオリゴマーをコンジュゲートさせる。
【０１７５】
様々な実施形態においては、2'-カルバミン酸置換糖もしくは2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖などの2'-糖修飾を含むモノマーの、前記オリゴマーへの組込みにより、オリゴマーの糖へのコンジュゲートされた部分の共有結合が容易になる。他の実施形態においては、1個以上のモノマーの2'位置にアミノ含有リンカーを含むオリゴマーを、例えば、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を用いて調製する。例えば、Manoharanら、Tetrahedron Letters, 1981, 34, 7171を参照されたい。
【０１７６】
さらなる実施形態においては、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基上、グアニンの環外N2上、またはシトシンのN4もしくは5位置上などの核酸塩基上にアミン含有機能的部分を有してもよい。様々な実施形態においては、そのような官能化を、オリゴマー合成中に既に官能化された市販の試薬を用いることにより達成することができる。
【０１７７】
いくつかの機能的部分が市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分が、Pierce Co. (Rockford, III.)から入手可能である。他の市販の連結基は、5'-アミノ-改変剤C6および3'-アミノ-改変剤試薬であり、両方ともGlen Research Corporation (Sterling, Va.)から入手可能である。5'-アミノ-改変剤C6は、ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)からも入手可能である。同様に、いくつかの実施形態においては、アミノ結合-2、および3'-アミノ-改変剤は、Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto, Calif.)からも入手可能である。
【０１７８】
組成物
本発明のオリゴマーを、医薬製剤および組成物中で用いることができる。好適には、そのような組成物は、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。PCT/DK2006/000512は、好適かつ好ましい製薬上許容し得る希釈剤、担体およびアジュバントを提供している(参照により本明細書に組み入れられるものとする)。好適な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もPCT/DK2006/000512(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に提供されている。
【０１７９】
用途
本発明のオリゴマーを、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いることができる。
【０１８０】
研究においては、そのようなオリゴマーを用いて、細胞および実験動物中でのアンドロゲン受容体タンパク質の合成を特異的に阻害する(典型的には、mRNAを分解もしくは阻害することによりタンパク質形成を防止することによる)ことによって、標的の機能的分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にすることができる。
【０１８１】
診断においては、前記オリゴマーを用いて、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞および組織中でのアンドロゲン受容体発現を検出および定量することができる。
【０１８２】
治療のためには、アンドロゲン受容体の発現を調節することにより治療することができる、疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、好適には有効量の本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。さらに、治療上または予防上有効量の1種以上の本発明のオリゴマーまたは組成物を投与することにより、アンドロゲン受容体の発現と関連する、疾患または症状を有するか、またはその傾向を有すると疑われる、ヒトを治療するなどの哺乳動物を治療する方法も提供される。
【０１８３】
本発明に従う医薬組成物を、前立腺癌または乳癌などの癌などの、異常なレベルのアンドロゲン受容体と関連する症状の治療のために用いることができる。
【０１８４】
本発明に従う医薬組成物を、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮ならびにKennedy疾患、またはポリグルタミン酸疾患の治療のために用いることができる。
【０１８５】
本明細書で言及される治療は予防的であってよいと認識されるであろう。
【０１８６】
好適な用量、製剤、投与経路、組成、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤はまた、参照により本明細書に組み入れられるものとするPCT/DK2006/000512にも提供されているが、癌の治療にのみ特異的に適用可能であるPCT/DK2006/000512の態様が、治療用／医薬組成物および本発明の方法においては好適ではないことを認識するべきである。
【０１８７】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物もしくはコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体またはアジュバントとを含む医薬組成物も提供する。PCT/DK2006/000512は、好適かつ好ましい製薬上許容し得る希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１８８】
本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、典型的には有効量で投与する。
【０１８９】
本発明はまた、本明細書に記載の障害の治療のための医薬の製造、または本明細書に記載の障害の治療方法における、本明細書に記載の本発明の化合物もしくはコンジュゲートの使用も提供する。
【０１９０】
本発明はまた、本明細書に記載の障害を治療する方法であって、本明細書に記載の本発明に従う化合物、および／または本発明に従うコンジュゲート、および／または本発明に従う医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む前記方法も提供する。
【０１９１】
2種以上の活性成分を含む医薬組成物
本発明に従う医薬組成物はさらに、前立腺癌もしくは乳癌などの癌の治療にとって有用であると示されたもの、特に、従来の抗アンドロゲン療法において用いられる薬剤などの他の活性成分を含んでもよい。
【０１９２】
1つのそのようなクラスの化合物は、受容体部位でアンドロゲンの結合を遮断する、非ステロイド系抗アンドロゲン(NSAA)である。
【０１９３】
黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体(LHRH-A)は、アンドロゲンの精巣産生を去勢レベルまで抑制する。
【０１９４】
混合アンドロゲン遮断療法の一部としてLHRH-Aと共に用いる場合、CASODEXなどのNSAAは、前立腺癌細胞の増殖を阻害するのを助ける。一実施形態においては、本発明は、本発明に従う医薬組成物、ならびに本発明の医薬組成物の投与の前に、その間に、またはその後に投与してもよい、NSAAおよび／もしくはLHRH-A剤を投与することを含むことを特徴とする、混合アンドロゲン遮断療法を提供する。
【０１９５】
本発明はまた、第1の部分が本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートおよび／もしくは医薬組成物を含み、さらなる部分が非ステロイド系抗アンドロゲンおよび／もしくは黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体を含む、キットの部分も提供する。従って、このキットの部分を、第1の部分とさらなる部分の両方を、同時に、または他方の後に一方を投与することを含む、本明細書に記載の治療方法において用いることができる。
【０１９６】
医学的適応
本発明に従うオリゴマーおよび他の組成物を、突然変異型のARの過剰発現または発現と関連する症状の治療のために用いることができる。ARを用いる医学的介入が前立腺癌または乳癌に対する治療オプションをもたらすであろうことが当業界の指導的科学者により提唱されている。
【０１９７】
異常なレベルのアンドロゲン受容体と関連し、従って、本発明に従う組成物、コンジュゲートおよび化合物を用いて治療することができるさらなる症状としては、乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される障害が挙げられる。
【０１９８】
一実施形態においては、異常なレベルのアンドロゲン受容体と関連し、従って、本発明に従う組成物、コンジュゲートおよび化合物を用いて治療することができる症状としては、乳癌または前立腺癌などの癌からなる群より選択される障害が挙げられる。
【０１９９】
本発明はさらに、本明細書に開示される任意かつ全ての症状の治療のための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０２００】
一般的に記述される、本発明の一態様は、異常なレベルのアンドロゲン受容体と関連する症状に罹患するか、またはそれに罹りやすい哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、1個以上のLNA単位を含むARに標的化された、治療上有効量のオリゴマーを投与することを含む前記方法に関する。
【０２０１】
本発明の興味深い態様は、上記の症状の治療のための医薬の調製における、本明細書で定義されるオリゴマー(化合物)または本明細書で定義されるコンジュゲートの使用に関する。
【０２０２】
本発明の方法を、異常なレベルのアンドロゲン受容体により引き起こされる疾患に対する治療または予防のために用いるのが好ましい。
【０２０３】
さらに、本明細書に記載の本発明は、治療上有効量のアンドロゲン受容体を調節するオリゴマーを、そのような療法を必要とするヒトに投与することを含む、疾患を予防または治療する方法を包含する。本発明はさらに、アンドロゲン受容体を調節するオリゴヌクレオチド化合物の短期間の投与の使用を包含する。
【０２０４】
本発明の一実施形態においては、前記オリゴマー(化合物)を、例えば、オリゴマーの細胞取込みを増加させるために、リガンドまたはコンジュゲートに連結する。いくつかの実施形態においては、前記コンジュゲートは、コレステロールなどのステロールである。
【０２０５】
本発明のオリゴマーを、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲートすることもできる。
【０２０６】
別に記述されるように、本発明はさらに、異常なレベルのアンドロゲン受容体を治療する方法であって、本発明のオリゴマー、または本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、さらなる化学療法剤の投与をさらに含む前記方法に関する。前記さらなる投与は、さらなる化学療法剤が、本発明の化合物にコンジュゲートされ、医薬組成物中に存在するか、または個別の製剤中で投与されるようなものであってよい。
【０２０７】
本発明はまた、医薬としての使用のための本明細書で定義されるオリゴマー、組成物またはコンジュゲートにも関する。
【０２０８】
本発明はさらに、異常なレベルのアンドロゲン受容体または突然変異形態のAR(本明細書に記載の疾患の1つと関連するものなどの、対立遺伝子変異体など)の発現の治療のための医薬の製造における本明細書で定義される化合物、組成物、またはコンジュゲートの使用に関する。
【０２０９】
さらに、本発明は、乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患から選択される疾患または症状に罹患する被験体を治療する方法であって、本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む前記方法に関する。
【０２１０】
さらに、本発明は、タンパク質キナーゼCδ(PRKCD)、グルタチオンS-トランスフェラーゼθ2(GSTT2)、一過性受容電位陽イオンチャンネルサブファミリーVメンバー3(TRPV3)、ピロリン-5-カルボキシレートリダクターゼ1(PYCR1)もしくはオルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT)からなる群より選択される遺伝子、mRNAおよび／またはタンパク質などのアンドロゲン受容体(すなわち、アンドロゲン受容体標的)により調節される、遺伝子、ならびにその対応するmRNAおよびタンパク質産物を調節する方法に関する。アンドロゲン受容体標的に依存して、前記調節は、アンドロゲン受容体標的の発現もしくは活性の増加、または発現もしくは活性の低下をもたらすことができる。
【０２１１】
実施形態
本発明の以下の実施形態を、本明細書に記載の他の実施形態と組合わせて用いることができる。
【０２１２】
1. 合計10〜50個の核酸塩基の連続する核酸塩基配列であって、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域と少なくとも80％相同である前記配列を含む、長さ10〜50個の核酸塩基のオリゴマー。
【０２１３】
2. 前記オリゴマーが少なくとも1個のLNA単位を含む、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２１４】
3. 連続する核酸塩基配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域に対して4個以上、例えば、3個以上の不一致を含む、実施形態1または2に記載のオリゴマー。
【０２１５】
4. 連続する核酸塩基配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域に対して1個以下の不一致を含む、実施形態3に記載のオリゴマー。
【０２１６】
5. 連続する核酸塩基配列が、哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸の対応する領域に対して不一致を含まない(すなわち、相補的である)、実施形態4に記載のオリゴマー。
【０２１７】
6. 前記オリゴマーの核酸塩基配列が連続する核酸塩基配列からなる、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２１８】
7. 哺乳動物アンドロゲン受容体をコードする核酸が、配列番号1などのヒトアンドロゲン受容体ヌクレオチド配列、またはその天然の対立遺伝子変異体である、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２１９】
8. 連続する核酸塩基配列が、ヒトアンドロゲン受容体核酸配列と、マウスアンドロゲン受容体核酸配列などの非ヒト哺乳動物アンドロゲン受容体核酸配列の両方の対応する領域と相補的である、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２０】
9. 連続する核酸塩基配列が、相補的アンドロゲン受容体標的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNaseHを動員することができる少なくとも7個の核酸塩基残基の連続するサブ配列を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２１】
10. 連続する核酸塩基配列が、相補的アンドロゲン受容体標的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNaseHを動員することができる少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の核酸塩基残基の連続するサブ配列を含む、実施形態9に記載のオリゴマー。
【０２２２】
11. 前記連続するサブ配列が、相補的アンドロゲン受容体標的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNaseHを動員することができる、14、15もしくは16個の核酸塩基残基などの長さ少なくとも12個の核酸塩基もしくは少なくとも14個の核酸塩基などの、長さ少なくとも9個もしくは少なくとも10個の核酸塩基である、実施形態9または10のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２３】
12. 前記オリゴマーを、1種以上の非核酸塩基化合物とコンジュゲートさせる、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の実施形態に記載のオリゴマー。
【０２２４】
13. 前記オリゴマーが10〜22個の核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜12のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２５】
14. 前記オリゴマーが12〜18個の核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２６】
15. 前記オリゴマーが14、15または16個の核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜14のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２７】
16. 前記連続する核酸塩基配列が、配列番号86〜106からなる群より選択される核酸配列中に存在する連続するヌクレオチド配列に対応する、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２８】
17. 前記オリゴマーまたは連続する核酸塩基配列が、配列番号2〜22からなる群より選択されるヌクレオチド配列中に存在する対応する核酸塩基を含むか、またはそれから選択される、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２２９】
18. 前記連続する核酸塩基配列が、少なくとも1個の親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３０】
19. 前記連続する核酸塩基配列が、5〜8個の親和性増強ヌクレオチド類似体などの、合計2、3、4、5、6、7、8、9または10個の親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態18に記載のオリゴマー。
【０２３１】
20. 残存する核酸塩基が、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチド、好ましくはDNAヌクレオチドからなる群より選択される、少なくとも1個の親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態1〜19のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３２】
21. 前記オリゴマーが、5'から3'の向きに、式：A-B-C、および必要に応じて式：A-B-C-Dの核酸塩基の配列を含み、式中、
Aは、1、2、3、4、5もしくは6個のヌクレオチド類似体などの少なくとも1個のヌクレオチド類似体、好ましくは2〜5個のヌクレオチド類似体、好ましくは、2、3もしくは4個のヌクレオチド類似体、最も好ましくは、2、3もしくは4個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含み、および；
Bは、RNAseHを動員することができる、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個の連続する核酸塩基などの、DNA核酸塩基などの、RNAseHを動員することができる少なくとも5個の連続する核酸塩基(AR mRNA標的などの、相補的RNA分子との二本鎖中で形成される場合)、またはRNAseHを動員することができる6〜10個、もしくは7〜9個、例えば、8個の連続する核酸塩基からなるか、またはそれを含み、および；
Cは、1、2、3、4、5、もしくは6個のヌクレオチド類似体などの少なくとも1個のヌクレオチド類似体、好ましくは、2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば、2、3もしくは4個のヌクレオチド類似体、最も好ましくは、2、3もしくは4個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含み；および
Dは、存在する場合、1〜3個もしくは1〜2個のDNAヌクレオチドなどの、1個以上のDNAヌクレオチドからなるか、またはそれを含む、好ましくは、それからなる、
前記核酸塩基の配列を含む。
【０２３３】
22. A領域が、2、3もしくは4個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含む、実施形態21に記載のオリゴマー。
【０２３４】
23. B領域が、アンドロゲン受容体mRNA標的などの、相補的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNAseHを動員することができる7、8、9もしくは10個の連続するDNAヌクレオチドまたは等価な核酸塩基からなるか、またはそれを含む、実施形態21〜22のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３５】
24. C領域が、2、3または4個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含む、実施形態21〜23のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３６】
25. D領域が、存在する場合、1個または2個のDNAヌクレオチドからなる、実施形態21〜24のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３７】
26. Aが、3個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含み；
Bが、アンドロゲン受容体mRNA標的などの、相補的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNAseHを動員することができる7、8、9もしくは10個の連続するDNAヌクレオチドまたは等価な核酸塩基からなるか、またはそれを含み；
Cが、3個の連続するヌクレオチド類似体からなるか、またはそれを含み；
Dが、存在する場合、1個または2個のDNAヌクレオチドからなる、
実施形態21〜25のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２３８】
27. 連続する核酸塩基配列が、10、11、12、13または14個の核酸塩基からなり、
Aが1、2もしくは3個の連続するヌクレオチド配列からなり；
Bが7、8、もしくは9個の連続するDNAヌクレオチドまたはアンドロゲン受容体mRNA標的などの、相補的RNAとの二本鎖中で形成される場合、RNAseHを動員することができる等価な核酸塩基からなり；
Cが1、2もしくは3個の連続するヌクレオチド類似体からなり；
Dが存在する場合、1個のDNAヌクレオチドからなる、
実施形態26に記載のオリゴマー。
【０２３９】
28. Bがα-L-オキシLNAなどの、α-L-配置にある少なくとも1個のLNA核酸塩基を含む、実施形態21〜27のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４０】
29. ヌクレオチド類似体が、固定核酸(LNA)単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、PNA単位、HNA単位、およびINA単位からなる群より独立に、または集合的に選択される、実施形態1〜28のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４１】
30. 全てのヌクレオチド類似体がLNA単位である、実施形態29に記載のオリゴマー。
【０２４２】
31. 2〜8個のヌクレオチドLNA単位などの1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNA単位を含む、実施形態1〜30のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４３】
32. LNAが、β-Dおよびα-L配置またはその組合せにある、オキシ-LNA、チオ-LNA、およびアミノ-LNAから独立に選択される、実施形態29〜31のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４４】
33. LNAが全てβ-D-オキシ-LNAである。実施形態32に記載のオリゴマー。
【０２４５】
34. A領域およびC領域のヌクレオチド類似体または核酸塩基がβ-D-オキシ-LNAである、実施形態21〜33のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４６】
35. オリゴマー中に存在する核酸塩基の少なくとも1個が、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾核酸塩基である、実施形態1〜34のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４７】
36. 前記オリゴマーが、少なくとも50℃のTmで、対応する哺乳動物アンドロゲン受容体mRNAとハイブリダイズする、実施形態1〜35のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４８】
37. 前記オリゴマーが、80℃以下のTmで、対応する哺乳動物アンドロゲン受容体mRNAとハイブリダイズする、実施形態1〜36のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２４９】
38. ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群より独立に選択される、実施形態1〜37のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２５０】
39. 前記オリゴマーが、少なくとも1個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態38に記載のオリゴマー。
【０２５１】
40. DNAもしくはRNA単位に隣接するか、またはその間にあるか、またはB領域内にあるヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態39に記載のオリゴマー。
【０２５２】
41. 少なくとも一対の連続するヌクレオチド類似体間の結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態39または40に記載のオリゴマー。
【０２５３】
42. 連続するヌクレオチド類似体間の全ての結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態39または40に記載のオリゴマー。
【０２５４】
43. 全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態42に記載のオリゴマー。
【０２５５】
44. 実施形態1〜43のいずれか1つに記載のオリゴマーと、前記化合物に共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【０２５６】
45. 実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマーまたは実施形態44に定義されたコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【０２５７】
46. 前記オリゴマーがプロドラッグとして構成される、実施形態45に記載の医薬組成物。
【０２５８】
47. 非ステロイド系抗アンドロゲン剤および黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体からなる群より選択されるさらなる治療剤をさらに含む、実施形態45または46に記載の医薬組成物。
【０２５９】
48. 乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患または障害の治療のための医薬の製造における、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲートの使用。
【０２６０】
49. 乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患または障害の治療における使用のための、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲート。
【０２６１】
50. 乳癌もしくは前立腺癌などの癌、脱毛症、良性前立腺過形成、脊髄および筋肉萎縮、Kennedy疾患ならびにポリグルタミン酸疾患からなる群より選択される疾患または障害を治療する方法であって、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜47のいずれか1つに定義された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む前記方法。
【０２６２】
51. 前立腺癌または乳癌などの癌を治療する方法であって、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜47のいずれか1つに定義された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む前記方法。
【０２６３】
52. 細胞または組織中のアンドロゲン受容体の発現を低下させるか、または阻害する方法であって、該細胞または組織と、実施形態1〜43のいずれか1つに定義された化合物、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜47のいずれか1つに定義された医薬組成物とを接触させて、アンドロゲン受容体の発現を低下させるか、または阻害する工程を含む前記方法。
【０２６４】
アンドロゲン受容体により調節される遺伝子(すなわち、アンドロゲン受容体標的)を発現している細胞中での該遺伝子の発現を調節する方法であって、該細胞または組織と、実施形態1〜43のいずれか1つに定義された化合物、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜47のいずれか1つに定義された医薬組成物とを接触させて、アンドロゲン受容体標的の発現を調節する工程を含む前記方法。
【０２６５】
(実施例)
【実施例１】
【０２６６】
モノマー合成
LNAモノマー構成要素および誘導体を、以下の公開された手順およびそこに引用された参考文献に従って調製した(WO 07/031081およびそこに引用された参考文献を参照)。
【実施例２】
【０２６７】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドを、WO 07/031081に記載の方法に従って合成した。表1は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の例を示す。表2および3は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴ)の例を示す。
【実施例３】
【０２６８】
オリゴヌクレオチドの設計
本発明に従って、一連の様々なオリゴヌクレオチドを設計して、ヒトアンドロゲン受容体mRNA(GenBankアクセッション番号NM_000044、配列番号1)の様々な領域を標的化した。
【表１】
2011504362.tif 000008
【０２６９】
2011504362.tif 000009
【０２７０】
【表２】
2011504362.tif 000010
【実施例４】
【０２７１】
in vitroモデル：細胞培養物
標的核酸発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、様々な細胞型のいずれかにおいて試験することができる。標的を、内因的に、または該標的をコードする核酸の一過性もしくは安定なトランスフェクションにより発現させることができる。標的核酸の発現レベルを、例えば、ノーザンブロット分析、リアルタイムPCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、日常的に決定することができる。例示目的で以下の細胞型を提供するが、標的が選択された細胞型において発現されるという条件で、他の細胞型を日常的に用いてもよい。
【０２７２】
細胞を以下に記載の好適な培地中で培養し、95〜98％の湿度および5％CO2中、37℃で維持した。細胞を週に2〜3回、日常的に継代した。
【０２７３】
A549：ヒト肺癌細胞系A5439を、DMEM (Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養した。
【０２７４】
MCF7：ヒト乳癌細胞系MCF7を、EagleMEM (Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + 1xNEAA + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養した。
【実施例５】
【０２７５】
in vitroモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチド+を用いる処理
実施例4に列挙された細胞系を、トランスフェクションビヒクルとして陽イオンリポソーム製剤LipofectAMINE 2000 (Gibco)を用いてオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を6穴細胞培養プレート(NUNC)中に播種し、80〜90％集密まで処理した。用いたオリゴ濃度は、1 nM〜16 nMの最終濃度であった。オリゴ-脂質複合体の製剤化を、無血清OptiMEM (Gibco)および5μg/mLのLipofectAMINE 2000の最終脂質濃度を用いて、本質的には製造業者により記載されたように実行した。細胞を37℃で4時間インキュベートし、オリゴ含有培養培地の除去により処理を停止させた。細胞を洗浄し、血清含有培地を添加した。オリゴ処理の後、細胞を20時間回復させた後、それらをRNA分析のために収穫した。
【実施例６】
【０２７６】
in vitroモデル：RNAおよびcDNA合成の抽出
全RNA単離および第1鎖合成
全RNAを、上記のように、および製造業者の説明書に従って、Qiagen RNeasyキット(Qiagenカタログ番号74104)を用いてトランスフェクトされた細胞から抽出した。第1鎖合成を、製造業者の説明書に従ってAmbion社製の逆転写酵素試薬を用いて実施した。
【０２７７】
それぞれのサンプルについて、0.5μgの全RNAを、RNaseを含まないH2Oで10.8μlに調整し、2μlのランダムデカマー(50μM)および4μlのdNTPミックス(2.5 mMの各dNTP)と混合し、70℃で3分間加熱した後、サンプルを氷上で急速に冷却した。氷上のサンプルを冷却した後、2μlの10xバッファーRT、1μlのMMLV逆転写酵素(100 U/μl)および0.25μlのRNase阻害剤(10 U/μl)を各サンプルに添加した後、42℃で60分間インキュベートし、95℃で10分間、酵素を熱不活化した後、サンプルを4℃まで冷却した。
【実施例７】
【０２７８】
in vitroモデル：リアルタイムPCRによるアンドロゲン受容体発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
アンドロゲン受容体発現のアンチセンス調節を、当業界で公知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、アンドロゲン受容体mRNAレベルを、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイムPCRにより定量することができる。リアルタイム定量的PCRが現在好ましい。RNA分析を、全細胞RNAまたはmRNA上で実施することができる。
【０２７９】
RNA単離およびノーザンブロット分析などのRNA分析の方法は、当業界で日常的なものであり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。
【０２８０】
リアルタイム定量的(PCR)を、Applied Biosystem社から入手可能な、市販のMulti-Color Real Time PCR Detection Systemを用いて都合良く達成することができる。
【０２８１】
アンドロゲン受容体mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
ヒトアンドロゲン受容体mRNAのサンプル含量を、製造業者の説明書に従って、ヒトアンドロゲン受容体ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystemsカタログ番号Hs00171172_m1)を用いて定量する。
【０２８２】
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) mRNA量を、サンプル調製において任意の偏差を正規化するための内因性対照として用いた。
【０２８３】
ヒトGAPDH mRNAのサンプル含量を、製造業者の説明書に従って、ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystemsカタログ番号4310884E)を用いて定量した。
【０２８４】
リアルタイム定量的PCRは、当業界でよく知られた技術であり、例えば、Heidら、Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994に教示されている。
【０２８５】
リアルタイムPCR：実施例6に記載のように実施された第1鎖合成に由来するcDNAを2〜20倍に希釈し、Applied Biosystems社製のTaqman 7500 FASTまたは7900 FASTを用いるリアルタイム定量的PCRにより分析した。プライマーおよびプローブを、2 x Taqman Fast Universal PCRマスターミックス(2x)(Applied Biosystemsカタログ番号4364103)と混合し、4μlのcDNAに添加して、最終容量を10μlにした。各サンプルを2回分析した。目的のRNAを発現する細胞系から精製された材料上で調製されたcDNAの2倍希釈液をアッセイして、アッセイに関する標準曲線を作製した。滅菌H2Oを、鋳型を含まない対照のためにcDNAの代わりに用いた。PCRプログラム：95℃で30秒間、次いで、95℃で3秒間、60℃で20〜30秒間の40サイクル。標的mRNA配列の相対量を、Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21またはSDS Software Version 2.3を用いて、算出されたサイクル閾値から決定した。
【実施例８】
【０２８６】
in vitro分析：オリゴヌクレオチド化合物によるヒトアンドロゲン受容体mRNA発現のアンチセンス阻害
表3に提供されるオリゴヌクレオチドを、1、4および16 nMの濃度でアンドロゲン受容体mRNAをノックダウンするその能力について評価した(図1および2を参照)。
【表３】
2011504362.tif 000011
【０２８７】
2011504362.tif 000012
【０２８８】
表3に示されたように、16 nMの配列番号48、51、54、58、63、69、73および77のオリゴヌクレオチドは、これらの実験において、A549およびMCF7細胞中でのアンドロゲン受容体mRNA発現の90％を超える阻害を示し、従って好ましい。また、例えば、アンドロゲン受容体発現の良好な阻害をも提供する、長さ(より短いか、もしくはより長い)および／または核酸塩基含量(例えば、類似体単位の型および／もしくは比率)を変化させる、例示されたアンチセンスオリゴ配列に基づくオリゴヌクレオチドも好ましい。
【実施例９】
【０２８９】
in vivo分析：オリゴヌクレオチド化合物によるマウスアンドロゲン受容体mRNA肝臓発現のアンチセンス阻害
ヌードマウスに、100 mg/kgのオリゴヌクレオチドと共にq3dx4を静脈内投与した(群のサイズ：5匹のマウス)。アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号48、51、58、63、77)を、0.9％のリン酸緩衝生理食塩水に溶解した。最後の投与の24時間後に動物を犠牲にし、肝臓組織をサンプル化し、RNA抽出およびQPCR分析を行うまでRNA中で保存した。全RNAを抽出し、肝臓サンプル中でのAR mRNA発現を、マウスAR QPCRアッセイ(カタログ番号Mm01238475_m1、Applied Biosystems)を用いて、実施例7に記載のようなQPCRにより測定した。結果をマウスGAPDH(カタログ番号4352339E、Applied Biosystems)に対して正規化し、生理食塩水処理された対照と比較したノックダウンを定量した。表4のデータは、生理食塩水処理された動物と比較した下方調節の％として提供されたものである。
【表４】
2011504362.tif 000013
【０２９０】
表4に示されたように、100 mg/kgの配列番号58および77のオリゴヌクレオチドは、これらの実験においてマウス肝臓細胞中でのアンドロゲン受容体mRNA発現の90％を超える阻害を示し、従って好ましい。
【実施例１０】
【０２９１】
in vitro分析：ヒトアンドロゲン受容体mRNAのアンチセンス阻害
増殖する生細胞の測定(MTSアッセイ)
LNCaP前立腺癌細胞およびA549肺癌細胞を、トランスフェクションの前日に6穴プレート中に150000細胞／ウェルの密度で播種した。A549細胞をDMEM (Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養したが、LNCaP細胞をRPMI 1640培地(Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養した。次の日、培地を除去した後、5μg/mlのLipofectamine2000 (Invitrogen)を含む1.2 mlのOptiMEMを添加した。細胞を7分間インキュベートした後、OptiMEM中に希釈した0.3 mlのオリゴヌクレオチドを添加した。最終オリゴヌクレオチド濃度は4および16 nMであった。処理の4時間後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、100μlの培地中の透明な96穴プレート(Scientific Orange番号1472030100)中、5000細胞／ウェルの密度で播種した。10μlのテトラゾリウム化合物[3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、内部塩；MTS]および電子カップリング試薬(エト硫酸フェナジン；PES)(CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)を添加することにより、指示された時間に生細胞を測定した。生細胞を、Powerwave (Biotek Instruments)中、490 nmで測定した。OD490 nmを、時間に対してプロットした(図13および図14を参照)。図13および図14に示されるように、配列番号58および77のオリゴヌクレオチドは、LNCaP前立腺癌細胞およびA549肺癌細胞の両方の増殖を阻害し、従って好ましい。
【実施例１１】
【０２９２】
in vitro分析：ヒトアンドロゲン受容体mRNAのアンチセンス阻害によるキャスパーゼ3/7活性
LNCaP前立腺癌細胞およびA549肺癌細胞を、トランスフェクションの前日に、6穴プレート中、150000細胞／ウェルの密度で播種した。A549細胞をDMEM (Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養したが、LNCaP細胞をRPMI 1640培地(Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養した。次の日、培地を除去した後、5μg/mlのLipofectamine2000 (Invitrogen)を含む1.2 mlのOptiMEMを添加した。細胞を7分間インキュベートした後、OptiMEM中に希釈した0.3 mlのオリゴヌクレオチドを添加した。最終オリゴヌクレオチド濃度は4および16 nMであった。処理の4時間後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、100μlの培地中の白色の96穴プレート(Nunc)中、5000細胞／ウェルの密度で播種した。キャスパーゼ3/7活性を、100μlのキャスパーゼ-Glo 3/7アッセイ(promega)を添加することにより指示された時間に測定した。キャスパーゼ3/7活性をルミノメーターを用いて測定した。キャスパーゼ3/7活性を、3つの異なる時点、14時間、48時間および72時間で測定した(図15および図16を参照)。図15および図16に示されるように、配列番号58および77のオリゴヌクレオチドは、LNCaP前立腺癌細胞およびA549肺癌細胞の両方においてキャスパーゼ3/7活性を誘導し、従って好ましい。
【実施例１２】
【０２９３】
in vitro分析：前立腺癌細胞LNCaPおよび肺癌細胞系A549中でのオリゴヌクレオチド化合物によるヒトアンドロゲン受容体mRNA発現のアンチセンス阻害
オリゴヌクレオチドを、0.5、1、2、4、8および16 nMの濃度で、アンドロゲン受容体mRNAをノックダウンするその能力について評価した(図11を参照)。LNCaP前立腺癌細胞およびA549肺癌細胞を、トランスフェクションの前日に、6穴プレート中、150000細胞／ウェルの密度で播種した。A549細胞をDMEM (Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養したが、LNCaP細胞をRPMI 1640培地(Sigma) + 10％ウシ胎仔血清(FBS) + 2 mM Glutamax I + ゲンタマイシン(25μg/ml)中で培養した。次の日、培地を除去した後、5μg/mlのLipofectamine2000 (Invitrogen)を含む1.2 mlのOptiMEMを添加した。細胞を7分間インキュベートした後、OptiMEM中に希釈した0.3 mlのオリゴヌクレオチドを添加した。最終オリゴヌクレオチド濃度は0.5、1、2、4、8および16 nMであった。細胞を洗浄し、血清を含有する培地を添加した。オリゴ処理の後、細胞を20時間回復させた後、それらをRNA分析のために収穫した。RNA単離、cDNA合成およびqPCRのための手順は、実施例5、6および7に記載された通りであった。図11および12に示されるように、配列番号58および77のオリゴヌクレオチドは、肺癌細胞系A549およびアンドロゲン受容体依存的22RV1前立腺癌細胞系の両方におけるAR mRNA発現のノックダウンにおいて強力であった。
【実施例１３】
【０２９４】
PSAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果(図17)
平均体重27.3±2.4 gの6〜7週齢の雄の無胸腺nu/nuマウス(Harlan Sprague Dawley)を試験に用いた。1000万個の22RV1細胞(アンドロゲン非依存的前立腺癌細胞系)を、1：1の比のPBS (Gibco#14190)およびMatrigel (BD#356234)中に懸濁し、それぞれのマウスに皮下注射した。腫瘍が150〜200 mm3の平均体積に達した時、マウスを9つの実験群に分割した。平均腫瘍サイズが152.66±27.97 mm3に達した時、200μlのオリゴを静脈内注射した。オリゴを、3日毎に、合計5回与えた。対照ビヒクルを、オリゴと同じ計画で与えた。16日目に、マウスを犠牲にし、血液をEDTA入りチューブに収集し、5分間遠心分離した。次いで、50μlの上清を、セーレムのALPCO Diagnostics社製のELISAキット(PSAHU-L01)を用いて、PSAアッセイにかけた。
【０２９５】
腫瘍増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果(図18)
平均体重27.3±2.4 gの6〜7週齢の雄の無胸腺nu/nuマウス(Harlan Sprague Dawley)を試験に用いた。1000万個の22RV1細胞(アンドロゲン非依存的前立腺癌細胞系)を、1：1の比のPBS (Gibco#14190)およびMatrigel (BD#356234)中に懸濁し、それぞれのマウスに皮下注射した。腫瘍が150〜200 mm3の平均体積に達した時、マウスを9つの実験群に分割した。平均腫瘍サイズが152.66±27.97 mm3に達した時、200μlのオリゴを静脈内注射した。オリゴを、3日毎に、合計5回与えた。対照ビヒクルを、オリゴと同じ計画で与えた。各マウスの腫瘍体積を、カリパスで2つの寸法を測定することにより決定し、式：腫瘍体積＝(長さ x 幅2)/2)を用いて算出した。
【実施例１４】
【０２９６】
ポリエチレングリコールを含むオリゴマーのコンジュゲートの調製
配列番号48または配列番号63に示される配列を有するオリゴマーを、Fmocなどのブロッキング基で遮断されたヘキサン-1-アミンなどのアミノアルキル基を、日常的なホスホルアミダイト化学を用いてオリゴマーの5'リン酸基に結合させ、得られた化合物を酸化し、それらを脱保護し、それらを精製して、それぞれ、式(IA)および(IB)：
【化６】
2011504362.tif 000014
【０２９７】
(式中、太字の大文字はヌクレオシド類似体モノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、MeCは5-メチルシトシンを表す)
を有する官能化オリゴマーを達成することにより、5'末端上で官能化する。
【０２９８】
式(II)：
【化７】
2011504362.tif 000015
【０２９９】
(式中、PEG部分は12,000の平均分子量を有する)
に示されるものなどの、活性化PEGの溶液、ならびにPBSバッファー中の式(IA)および(IB)の各化合物を、室温で12時間、個別の溶液中で攪拌する。反応溶液を塩化メチレンで3回抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させる。得られる残渣を二重蒸溜水に溶解し、陰イオン交換カラムに充填する。未反応のPEGリンカーを水で溶出させ、生成物をNH4HCO3溶液で溶出させる。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、それぞれ、式(IIIA)および(IIIB)：
【化８】
2011504362.tif 000016
【０３００】
(式中、配列番号48および63の各オリゴマーは、遊離可能なリンカーを介して、平均分子量12,000を有するPEGポリマーに結合する)
に示される、コンジュゲート配列番号48および63を得る。
【０３０１】
上記のプロセスを用いて配列番号51、58および77に示される配列を有するオリゴマーを用いて作製することができるPEGポリマーコンジュゲートの化学構造を、それぞれ、式(IVA)、(IVB)および(IVC)：
【化９】
2011504362.tif 000017
【０３０２】
(式中、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、MeCは5-メチルシトシンを表す)
に示す。
【０３０３】
それぞれ、式(IVA)、(IVB)および(IVC)に示されるコンジュゲートを作製するためにこのプロセスで用いることができる活性化オリゴマーは、式(VA)、(VB)および(VC)：
【化１０】
2011504362.tif 000018
【０３０４】
に示される化学構造を有する。
【図１】
2011504362.tif 000019
【図２】
2011504362.tif 000020
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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