(57)【要約】本発明は、ｐＩ値が調節されたシグナル配列（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ）のＮ−領域を含むポリペプチド断片もしくはその変異体および／またはｐＩ値が調節された親水性ポリペプチドで構成された分泌エンハンサーを用いた、組換え外来タンパク質の分泌効率向上方法に関するものである。本発明の方法は、不溶性沈殿物の沈澱を防止して、細胞外またはペリプラズム外での組換えタンパク質の分泌効率を向上させることで、組換え外来タンパク質の生産に有用でありうるのみならず、強力な分泌エンハンサーを用いて膜透過性を向上させることにより、有効な治療用タンパク質の伝達に有用でありうる。2011504746.tif 000012
2011504746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域のｐＩ値および／または先導配列を含む、ｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離が調節された、ポリペプチド断片またはその変異体をコードする、ポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項２】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片は、ｐＩ値が９．９０〜１１．４１に調節された１〜６個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片は、ｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節された１〜１２個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片が、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群から選択される塩基性アミノ酸が加えられるか、本来の酸性アミノ酸が前記塩基性アミノ酸に代替されることでｐＩ値が高くなることを特徴とする、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）の酸性アミノ酸が加えられるか、本来の塩基性アミノ酸が前記酸性アミノ酸に代替されることでｐＩ値が低くなることを特徴とする、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ポリペプチド断片におけるｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離が、グリシン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことによって調節されることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
遺伝子コンストラクトが、Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの前に連結されたタンパク質切断酵素認識部位をコードするヌクレオチドを追加で含むことを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】
先導配列とタンパク質切断酵素認識部位をコードするヌクレオチドの間の距離が、グリシン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことで、０〜２に調節されることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
遺伝子コンストラクトが、外来タンパク質をコードする遺伝子の挿入のための制限酵素認識部位を追加で含む、請求項１〜請求項８のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１０】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチド；ならびに、
（ｉｉｉ）該ポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、ｐＩ値が調節された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項１２】
Ｎ−領域を含むポリペプチド断片のｐＩ値が５〜１１に調節されることを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が１１〜１４に調節されることを特徴とする、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
Ｎ−領域を含むポリペプチド断片のｐＩ値が２〜５に調節されることを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が２〜１４に調節されることを特徴とする、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片が、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群から選択される塩基性アミノ酸が加えられるか、本来の酸性アミノ酸が前記塩基性アミノ酸に代替されることで、ｐＩ値が高くなることを特徴とする、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）の酸性アミノ酸が加えられるか、本来の塩基性アミノ酸が前記酸性アミノ酸に代替されることで、ｐＩ値が低くなることを特徴とする、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
分泌エンハンサーが、少なくとも６０％が親水性アミノ酸である２〜５０個のアミノ酸で構成されたペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１９】
分泌エンハンサーが、親水性アミノ酸が６〜２０個反覆されたペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
親水性アミノ酸が、リジン、アルギニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
遺伝子コンストラクトが、分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに連結された、外来遺伝子の挿入のための制限酵素認識部位を追加で含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
遺伝子コンストラクトが、作動可能に連結された外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを追加で含むことを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質が、ヒラメヘプシジンＩであることを特徴とする、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜請求項２４のいずれか一項記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した形質転換体。
【請求項２６】
宿主細胞が、原核生物細胞または真核生物細胞であることを特徴とする、請求項２５に記載の形質転換体。
【請求項２７】
原核生物細胞が、ウイルス、大腸菌、およびバシラスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２８】
真核生物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、および植物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２９】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
６）工程５）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項３０】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸がＬｙｓであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
５）工程４）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項３３】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が５〜１１に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
５）工程４）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項３５】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が１１〜１４に調節されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜５に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
５）工程４）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項３８】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が２〜１４に調節されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
７）工程６）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項４１】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸がＬｙｓであることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
６）工程５）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項４４】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が５〜１１に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
６）工程５）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項４６】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が１１〜１４に調節されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜５に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
６）工程５）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項４９】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が２〜１４に調節されることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４０または請求項５０記載の方法によって製造された組換え融合外来タンパク質。
【請求項５２】
請求項５１記載の組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項５３】
脳疾患の治療に使用されることを特徴とする、請求項５２に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
８）工程７）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項５５】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸がＬｙｓであることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項５８】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が５〜１１に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項６０】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が１１〜１４に調節されることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜５に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項６３】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が２〜１４に調節されることを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
８）工程７）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
９）工程８）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【請求項６６】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸がＬｙｓであることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
細胞内に送達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【請求項７０】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が５〜１１に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に伝達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【請求項７３】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が１１〜１４に調節されることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜５に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【請求項７７】
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値が２〜１４に調節されることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質の分泌効率向上方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現代のバイオテクノロジーにおける核心は、組換えタンパク質の生産であり、その中でも重要なことは、元来形態の水溶性タンパク質を手軽に生産することである。水溶性タンパク質の生産は、活性タンパク質の生産及び回収、機能研究のための結晶化、産業化などに非常に重要である。現在まで大腸菌を用いた多くの組換えタンパク質生産研究が進行されてきたが、これは、大腸菌は操作が容易で成長時間が短く、発現が安定で、低費用と規模を容易に変えることができるという長所があるからである。
【０００３】
しかし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産された外来起源の組換えタンパク質は、適切な翻訳後シャペロンや翻訳後プロセシングがないので、生産された組換えタンパク質の適切なフォールディングが起きないか、または不溶性タンパク質封入体で形成される（Ｂａｎｅｙｘ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年，第１０巻，ｐ．４１１−４２１（非特許文献１））。
【０００４】
シグナル配列が、タンパク質をペリプラズム外で分泌するようにするということが知られているので、シグナル配列の構造及び機能に対する研究がアミノ末端塩基性領域（Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８８年，第２６３巻，ｐ．１０３００−１０３０３（非特許文献２））、疎水性領域（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０年，第１７２巻，ｐ．１２２５−１２３１（非特許文献３））、切断領域（Ｄｕｆｆａｕｄ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８８年，第２６３巻，ｐ．１０２２４−１０２２８（非特許文献４））を対象にして進行された。同時に、水溶性タンパク質を生産するために様々なシグナル配列を用いたベクターが開発された（ｏｍｐＡ：Ｇｈｒａｙｅｂ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８４年，第３巻，ｐ．２４３７−２４４２（非特許文献５）；Ｄｕｆｆａｕｄ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７年，第１５３巻，ｐ．４９２−５０７（非特許文献６）；ｐｈｏＡ：Ｄｏｄｔ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８６年，第２０２巻，ｐ．３７３−３７７（非特許文献７）；Ｋｏｈｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０年，第１８巻，ｐ．１０６９（非特許文献８）；ｅｌｔＡ：Ｍｏｒｉｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９１年，第２６６巻，ｐ．１７２８−１７３２（非特許文献９）；ｂｌａ：Ｏｋａ等，Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７年，第５１巻，ｐ．１０９９−１１０４（非特許文献１０）；ｅｌｔＩＩｂ−Ｂ：Ｊｏｂｌｉｎｇ等，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９９７年，第３８巻，ｐ．１５８−１７３（非特許文献１１））。しかし、今までのシグナル配列を用いたベクターは、水溶性タンパク質を発現させるのに限界があり、また、発現されたタンパク質までも組換え融合タンパク質で生産されるので、シグナル配列切断酵素及びタンパク質切断酵素の切断部位を有して元来形態のアミノ末端を有した組換えタンパク質を得ることは、とても難しいのが実情である。シグナル配列を用いた組換えタンパク質生産が難しい原因としては、１）水溶性タンパク質の生産に対する予測が不可能で、多くの研究者等が組換えタンパク質の水溶性は全タンパク質のアミノ酸配列の特性によると推測していて；２）シグナル配列として作用する配列があまりにも多く、SecA/シグナルペプチドの相互作用を直接的に調査することができる分析方法が開発され得なかったからである（Ｔｒｉｐｌｅｔｔ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１年，第２７６巻，ｐ．１９６４８−１９６５５（非特許文献１２））。
【０００５】
本発明者等は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号（特許文献１）でシグナル配列（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ）のＮ−領域及び／またはＮ−領域を含むシグナル配列の疎水性断片を含む変異されたシグナル配列及び／または親水性ポリペプチドで構成された分泌エンハンサーを含む変異されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを提供し、接着性タンパク質をコードするヌクレオチドを追加で含むようにすることで、前記遺伝子コンストラクトで接着性タンパク質の水溶性発現が増加されることを明らかにした。また、前記シグナル配列のＮ−領域の断片の長さによるｐＩ値を分析して、前記断片すなわち、ＯｍｐＡＳＰ１−３〜全体長さがＯｍｐＡＳＰ１−２１と同一なｐＩ値（１０．５５）を有するものが、接着性タンパク質の水溶性発現に重要な影響を与えることを確認した。さらに本発明者等は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号（特許文献１）でヒラメのＨｅｐｃｉｄｉｎ  Ｉのような両親媒性ドメインを含むタンパク質の場合、前記シグナル配列のＮ−領域の断片だけでは水溶性発現に限界があることを発見し、親水性分泌エンハンサー配列を遺伝子コンストラクトに追加することで、ヒラメのＨｅｐｃｉｄｉｎ  Ｉの水溶性発現を増加させる方法を確立した。
【０００６】
それで、本発明者等は、多様なｐＩ値のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む組換え発現ベクターを製造し、前記組換えベクターでシグナル配列Ｎ−末端のｐＩ値が外来タンパク質の水溶性発現に影響を与えることと、外来タンパク質の構造的特性によって分泌エンハンサーが必要な場合、シグナル配列Ｎ−末端のｐＩ値と分泌エンハンサーのｐＩ値との関連性を証明して、外来タンパク質を発現するように構成された組換え発現ベクターでシグナル配列のＮ−末端のｐＩ値を調節する方法が、前記外来タンパク質の水溶性発現に効果的に使用できることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｎｅｙｘ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年，第１０巻，ｐ．４１１−４２１
【非特許文献２】Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８８年，第２６３巻，ｐ．１０３００−１０３０３
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０年，第１７２巻，ｐ．１２２５−１２３１
【非特許文献４】Ｄｕｆｆａｕｄ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８８年，第２６３巻，ｐ．１０２２４−１０２２８
【非特許文献５】Ｇｈｒａｙｅｂ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８４年，第３巻，ｐ．２４３７−２４４２
【非特許文献６】Ｄｕｆｆａｕｄ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７年，第１５３巻，ｐ．４９２−５０７
【非特許文献７】Ｄｏｄｔ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８６年，第２０２巻，ｐ．３７３−３７７
【非特許文献８】Ｋｏｈｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０年，第１８巻，ｐ．１０６９
【非特許文献９】Ｍｏｒｉｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９１年，第２６６巻，ｐ．１７２８−１７３２
【非特許文献１０】Ｏｋａ等，Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７年，第５１巻，ｐ．１０９９−１１０４
【非特許文献１１】Ｊｏｂｌｉｎｇ等，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９９７年，第３８巻，ｐ．１５８−１７３
【非特許文献１２】Ｔｒｉｐｌｅｔｔ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１年，第２７６巻，ｐ．１９６４８−１９６５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、外来起源の遺伝子から効果的に水溶性組換え融合タンパク質を生産して元来形態のアミノ末端を有したタンパク質で回収する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、（ｉ）プロモーター、ならびに（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値及び／または先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する。
【００１１】
また、本発明は、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体に作動可能に連結されたｐＩ値が調節された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した形質転換体を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記形質転換体を用いた組換えタンパク質の分泌効率向上方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記製造方法によって製造された組換え融合外来タンパク質を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、元来形態の外来タンパク質の生産方法を提供する。
【００１８】
同時に、本発明は、細胞内に伝達させようとする物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、組換えタンパク質の不溶性沈澱を防止し、細胞質外またはペリプラズムへの分泌効率を向上させることによって、組換え外来タンパク質の生産に有用に使用するのみならず、強力な分泌エンハンサーを用いて膜透過性を向上させて、治療用タンパク質の伝達に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の好ましい態様の応用は、添付の図面を参照することにより最もよく理解される。
【図１Ａ】シグナル配列に使用したＯｍｐＡＳＰｔｒ及びその変異体先導配列によって水溶性に発現された接着性タンパク質（水溶性分画約２０μｇ）の相対的な発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）。デンシトメーター分析値は、３個の異なるクローンで発現した発現量の相対的平均値である：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；（Ｂ）ウエスタンブロット；及び、（Ｃ）デンシトメーター分析；１ａ：Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Ala-Lys(pI9.90)（配列番号１５）；レーン２：Met-Lys-Ala-Lys(pI10.55)（配列番号１６）；レーン３：Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI10.82)（配列番号１７）；レーン４：Met-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI10.99)（配列番号１８）；レーン５：Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI11.11)（配列番号１９）；レーン６：Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI11.21)（配列番号２０）；レーン７：Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI11.28)（配列番号２１）；及び、レーン８：Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI11.41)（配列番号２２）。
【図１Ｂ】シグナル配列に使用したＯｍｐＡＳＰｔｒ及びその変異体先導配列によって水溶性に発現された接着性タンパク質Ｍｅｆｐ１（水溶性分画約２０μｇ）の相対的な発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）。デンシトメーター分析値は、３個の異なるクローンで発現した発現量の相対的平均値である：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；（Ｂ）ウエスタンブロット；及び、（Ｃ）デンシトメーター分析；１ｂ：Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Ala-Lys(pI9.90)（配列番号１５）；レーン２：Met-Arg-Ala-Lys(pI11.52)（配列番号２３）；レーン３：Met-Arg-Arg-Ala-Lys(pI12.51)（配列番号２４）；レーン４：Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI12.98)（配列番号２５）；レーン５：Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI13.20)（配列番号２６）；及び、レーン６：Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI13.35)（配列番号２７）。
【図２】組換えベクターpET22b(+)(ompASP1-7×mefp1*)の先導配列(Met-Ala-Lys)を変異させたクローンによって水溶性に発現された接着性タンパク質（水溶性分画約２０μｇ）の相対的な発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）。デンシトメーター分析値は、３個の異なるクローンで発現された発現量の相対的平均値である：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；（Ｂ）ウエスタンブロット；及び、（Ｃ）デンシトメーター分析；Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI2.73)（配列番号３５）；レーン２：Met-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI2.87)（配列番号３６）；レーン３：Met-Glu-Glu(pI3.09)（配列番号３７）；レーン４：Met-Ala-Glu(pI3.25)（配列番号３８）；レーン５：Met-Ala-Ala(pI5.60)（配列番号３９）；レーン６：Met-Cys-His(pI7.13)（配列番号４０）；レーン７：Met-Ala-His(pI7.65)（配列番号４１）；レーン８：Met-Ala-Lys(pI9.90)（配列番号１５）；及び、レーン９：Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI12.98)（配列番号２５）。
【図３】先導配列部分Met-Glu-Glu(pI3.09)と切断酵素認識部位（Ｘａ）の間の距離が多様な多くのクローンから得られた組換えＭｅｆｐ１融合タンパク質（水溶性分画約２０μｇ）の水溶性発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及び、（Ｂ）ウエスタンブロット；Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Glu-Glu(pI3.09)（配列番号３７）；レーン２：Met-Glu-Glu-Xa(pI4.01)（配列番号４６）；レーン３：Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Xa(pI4.01)（配列番号４７）；レーン４：Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Xa(pI4.01)（配列番号４８）；及び、レーン５：Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Xa(pI4.01)（配列番号４９）。
【図４Ａ】pET-22b(+)[ompASP1-11-7×mefp1*](*:Ra-6×His)クローンを基本にLysの間の距離が異なるようにデザインされた多くの先導配列クローンから得られた組換えＭｅｆｐ１融合タンパク質（水溶性分画約２０μｇ）の水溶性発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及び、（Ｂ）ウエスタンブロット；４ａ：Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Lys(pI10.82)（配列番号５６）；レーン２：Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=0)（配列番号５７）；レーン３：Met-Lys-Ala-Thr-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=2)（配列番号５８）；レーン４：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=4)（配列番号５９）；レーン５：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Lys-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=6)（配列番号６０）；及び、レーン５：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Lys-Ala-Ala(pI10.55,d1=8)（配列番号６１）；
【図４Ｂ】pET-22b(+)[ompASP1-11-7×mefp1*](*:Ra-6×His)クローンを基本にLysの間の距離が異なるようにデザインされた多くの先導配列クローンから得られた組換えＭｅｆｐ１融合タンパク質（水溶性分画約２０μｇ）の水溶性発現量を示した図（矢印：組換えＭｅｆｐ１）：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及び、（Ｂ）ウエスタンブロット；４ｂ：Ｍ：マーカー；レーン１：Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI10.82)（配列番号１７）；レーン２：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Lys(pI10.82,d1=4,d2=1)（配列番号１０６）；レーン３：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Lys(pI10.82,d1=4,d2=2)（配列番号１０７）；レーン４：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys(pI10.82,d1=4,d2=3)（配列番号１０８）；及び、レーン５：Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(pI10.82,d1=4,d2=4)（配列番号１０９）。
【図５】先導配列としてシグナル機能と分泌増強機能を同時に有するように挿入されたＭｅｔ−７×同型アミノ酸のアミノ酸配列ｐＩ値及び疎水性値がｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩ水溶性発現（水溶性分画約２０μｇ）に及ぼす効果を示した図（矢印：組換えｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩ）：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及び、（Ｂ）ウエスタンブロット；Ｍ：マーカー；レーン１：MRRRRRRR(pI13.28,hy+1.97)（配列番号７０）；レーン２：MKKKKKKK(pI11.28,hy+1.97)（配列番号７１）；レーン３：MHHHHHHH(pI8.08,hy-0.35)（配列番号７２）；レーン４：MYYYYYYY(pI5.59,hy-1.55)（配列番号７３）；レーン５：MCCCCCCC(pI4.57,hy-0.69)（配列番号７４）；レーン６：MEEEEEEE(pI2.78,hy+1.97)（配列番号７５）；及び、レーン７：MDDDDDDD(pI2.52,hy+1.97)（配列番号７６）。
【図６】ｐＩ値が調節されたＯｍｐＡＳＰ断片（Ｍｅｔ−２  ａａｓ）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−分泌エンハンサー候補配列−Ｘａで構成された先導配列で、Ｎ−末端ｐＩ値が分泌エンハンサー配列及び水溶性発現（水溶性分画約２０μｇ）に及ぼす効果を示した図（矢印：組換えｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩ）：（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及び、（Ｂ）ウエスタンブロット；Ｍ：マーカー；レーン１：MAH(pI7.65)-OmpASP4-10(pI5.70)-6×Arg(pI13.20;hy+1.75)-Xa(pI7.05)（配列番号８６）；レーン２：MAH-OmpASP4-10-6×Tyr(pI5.55;hy-1.33)-Xa（配列番号８７）；レーン３：MAH-OmpASP4-10-6×Glu(pI2.82;hy+1.75)-Xa（配列番号８８）；レーン４：MAA(pI5.60)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa（配列番号８９）；レーン５：MAA-OmpASP4-10-6×Tyr-Xa（配列番号９０）；レーン６：MAA-OmpASP4-10-6×Glu-Xa（配列番号９１）；レーン７：MEE(pI3.09)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa（配列番号９２）；レーン８：MEE-OmpASP4-10-6×Tyr-Xa（配列番号９３）；及び、レーン９：MEE-OmpASP4-10-6×Glu-Xa（配列番号９４）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
【００２２】
「外来タンパク質」または「目的外来タンパク質」は、当業者が大量に生産しようとするタンパク質で、組換え発現ベクターに前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して形質転換体で発現することができるすべてのタンパク質を意味する。
【００２３】
「融合タンパク質」は、元来の外来タンパク質の配列のＮ−末端またはＣ−末端に他のタンパク質が連結されたり他のアミノ酸配列が付加されたタンパク質を意味する。
【００２４】
「シグナル配列」は、ウイルス、原核生物細胞または真核生物細胞で発現される外来タンパク質をペリプラズムまたは細胞外部で分泌するために前記外来タンパク質が細胞内膜を効率的に通過できるように手助けする有効な配列を意味する。シグナル配列は、陽電荷が充電されたＮ−領域、中央の特異的な疎水性領域、及び切断領域を有するＣ−末端で構成されている。本発明で使用したシグナル配列断片は、陽電荷が充電された領域、中央の特異的な疎水性領域、及び切断領域を有するＣ−末端を含む配列の全体または一部を意味する。
【００２５】
「先導配列」は、外来タンパク質のＮ−末端に位置するアミノ酸配列を意味する。
【００２６】
「ポリペプチド断片」は、特定ポリペプチドの機能を維持しながら最小長さまたはそれ以上の大きさを有するポリペプチド配列を意味する。本明細書で特別に言及しない限り、全体長さのポリペプチドは、これに含まれない。例えば、本明細書で言及している「シグナル配列のＮ−領域を含むポリペプチド断片」は、シグナル配列の中でシグナル配列として機能する短縮されたシグナル配列を意味し、全体シグナル配列はこれに含まれない。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」は、二つ以上の核酸分子がリン酸ジエステル結合で連結された重合体分子を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡがこれに含まれる。
【００２８】
「分泌エンハンサー」は、シグナル配列または先導配列領域の後で親水性を増加させる役割を遂行する、親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドを意味する。
【００２９】
「シグナル配列のＮ−領域」は、通常のシグナル配列で保存的に発見される部分であり、Ｎ−末端に位置した塩基性が強い配列を意味し、シグナル配列によって１〜１０個のアミノ酸で構成される。
【００３０】
「中央の特異的な疎水性領域」は、一般的なシグナル配列の構造の中でＮ−領域に続く領域で、多数の疎水性アミノ酸によって疎水性を強く帯びた部分を意味する。
【００３１】
「シグナル配列断片」は、すべて、シグナル配列の一部を意味し、本明細書で特別に言及しない限り、シグナル配列のＣ−末端部位が切断して除去された断片を意味する。
【００３２】
「シグナル配列断片の変異体」は、シグナル配列断片で一番目アミノ酸Ｍｅｔ以外の配列を任意に変異させたものを意味する。
【００３３】
「タンパク質切断酵素認識部位」は、タンパク質切断酵素が認識して切断する特定位置のアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
「両親媒性ドメイン」は、親水性及び疎水性領域が混在しているドメインで、膜貫通ドメインと類似の構造を有するタンパク質内部の領域を意味する。したがって、本明細書では、「膜貫通類似ドメイン」と同一な意味で使用される。
【００３５】
「膜貫通類似ドメイン」は、ポリペプチドのアミノ酸配列分析時、膜タンパク質の膜貫通ドメインと類似の構造を有することが予測される部位を意味する（Ｂｒａｓｓｅｕｒ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１９９０年，第１０２９（２）巻，ｐ．２６７−２７３）。一般的に前記膜貫通類似ドメインは、膜貫通ドメインを予測する多様なコンピューターソフトウェアを通じて容易に予測が可能である。前記コンピューターソフトウェアの例としては、ＴＭｐｒｅｄ、ＨＭＭＴＯＰ、ＴＢＢｐｒｅｄ、ＤＡＳ−ＴＭｆｉｌｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｉｍ．ｈｕ／ＤＡＳ／ＤＡＳ．ｈｔｍｌ）などが存在する。前記「膜貫通類似ドメイン」は、実際に膜貫通特性を有することが解明された「膜貫通ドメイン」も含む。
【００３６】
「発現ベクター」は、ベクターの転写に提供される追加断片に作動可能に連結された目的ポリペプチドをコードする断片で構成される線形または円形のＤＮＡ分子である。そのような追加断片は、プロモーター及びストップコドン配列を含む。発現ベクターはまた、一つ以上の複製開始点、一つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、その他などを含む。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されたり、または両方の要素を含む。
【００３７】
「作動可能に連結された」は、断片が配列されてそれらの意図した目的、例えば、転写がプロモーターで開始し、コードされた断片を通じてストップコドンまで進行するのに作用することを意味する。
【００３８】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３９】
本発明者等は、接着性タンパク質をコードする塩基配列７×ｍｅｆｐ１の５’末端に、大腸菌でタンパク質分泌を誘導するシグナル配列であるＯｍｐＡシグナルペプチド（ＯｍｐＡＳＰ）の一部であるＯｍｐＡＳＰ１（Ｍｅｔ）及びＯｍｐＡＳＰ１−２（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ）のコード配列を融合して、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−７×ｍｅｆｐ１＊）及びｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−２−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製作した（表１参照）。製作されたクローンベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して発現した結果、一つのアミノ酸（ｌｙｓｉｎｅ；Ｌｙｓｉｎｅ；Ｌｙｓ；Ｋ；ｐＩ＝９．７２）の違いによって、前記二つのクローンから発現されたＭｅｔ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１５）及びＭｅｔ−Ｌｙｓ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１６）タンパク質の水溶性発現に顕著な差があることを確認した（図１ａのレーン１及びレーン２参照）。すなわち、Ｎ−末端でｐＩ値に影響を与えるＬｙｓがとても重要に水溶性発現に作用することを確認し、今度は前記接着性タンパク質のＮ−末端にある２番目アミノ酸であるＬｙｓ（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までの配列を先導配列のｐＩ値を計算するための基準に設定した。前記二つのタンパク質を対象に、ＯｍｐＡＳＰ断片（Ｍｅｔ［Ｍ］またはＭｅｔ−Ｌｙｓ）からＭｅｆｐ１の初めの二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までのｐＩ値をコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）で分析した結果、Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＬｙｓペプチドのｐＩ値は９．９０で、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＬｙｓペプチドのｐＩ値は１０．５５で示された（表１参照）。前記結果を裏付けるために、ＯｍｐＡＳＰ１−２よりＬｙｓをもう一つ有しているシグナル配列断片ＯｍｐＡＳＰ１−３（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号１７）のコード配列を融合してｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−３−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製作し、前記と同一な方法で水溶性発現を調査した結果（図１ａのレーン３参照）、Ｍｅｆｐ１の初めの二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までの先導配列Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＬｙｓのｐＩ値１０．８２は、水溶性発現の増加と良い相関関係を示した。
【００４０】
それで、本発明者等は、ｐＩ値の調節が水溶性タンパク質発現に影響を与えることができるかどうかを確認するために、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−３−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンのＯｍｐＡＳＰ断片のＬｙｓとＭｅｆｐ１の最も初めのアミノ酸であるＡｌａとの間にｐＩ値を増加させることができるアミノ酸であるＬｙｓを追加で挿入したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−３−Ｌｙｓｎ−７×ｍｅｆｐ１＊）及びＭｅｔ（ＯｍｐＡＳＰ１）とＭｅｆｐ１の最も初めのアミノ酸であるＡｌａとの間にｐＩ値を増加させることができるアミノ酸であるＡｒｇを追加で挿入したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−Ａｒｇｎ−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製造し、前記タンパク質のＮ−末端からＭｅｆｐ１の初めの二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までのｐＩ値を分析した（表１参照）。製作されたクローンベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換して発現し、その発現量を前記Ｍｅｔ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１５）、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１６）及びＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１７）タンパク質の発現量と比較した結果、Ｌｙｓによって増加したｐＩ値１０．９９〜１１．２１の間（配列番号１８〜２０）の水溶性発現結果は、対照区に使用したｐＩ値１０．５５（配列番号１６）と類似の発現量を示したが（図１のレーン４〜レーン６参照）、ｐＩ値１１．２８からは徐々に減少する現象を示し（図１のレーン７参照）、特にｐＩ値１１．４１（配列番号２２）では非常に減少した結果を示した（図１のレーン８参照）。前記結果は、Ｌｙｓの場合、先導配列のｐＩ値が１０．５５以上でｐＩ値が膜透過性に特異的に関与していることを示し、Ｌｙｓによって増加したｐＩ値１０．８２〜１１．４１では、先導配列ＯｍｐＡＳＰ１−３−Ｌｙｓｎ−Ａｌａ−ＬｙｓでＬｙｓが追加された配列なので、ＯｍｐＡＳＰが有するｐＩ値１０．５５と同一な膜貫通チャンネルを有することが予想される。
【００４１】
また、Ａｒｇによって増加したｐＩ値１１．５２〜１３．３５間（配列番号２３〜２７）の水溶性発現結果は、二つのＡｒｇが連結された先導配列のｐＩ値１２．５１で発現が若干増加した結果を除き、ｐＩ値が上昇するほど徐々に弱く発現され、ｐＩ値１３．３５では非常に減少した（表１及び図１ｂ参照）。Ａｒｇの場合、二つのＡｒｇが連結された場合に減少した分子量（図１ｂのレーン３参照）は、先導配列の一部が蛋白質分解酵素によって切断されたと判断され、追加されたＡｒｇを有する先導配列ＯｍｐＡＳＰ１−Ａｒｇｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓは共通してＡｒｇ特異的膜透過性を有すると思慮される。しかし、現工程で前記Ａｒｇ特異的膜透過機序とＴＡＴ（ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）システムのシグナル配列（Ｂｅｒｋｓ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９６６年，第２２巻，ｐ．３９３−４０４）との関係は説明しにくい。
【００４２】
また、本発明者等は、ｐＩ値が低く調節された先導配列のＮ−末端がＭｅｆｐ１タンパク質の水溶性発現に与え得る影響を確認するために、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−７×ｍｅｆｐ１＊）を対照とし、先導配列であるＭｅｔ−Ａｌａ−ＬｙｓのＡｌａ−Ｌｙｓの配列を多様に変形することで、ｐＩ値が２．７３〜７．６５（配列番号３５〜４１）で低いｐＩ値を多様に有するようにする先導配列の変異体（ＭＤＤＤＤＤＡＡ；ｐＩ２．７３、ＭＤＤＤＡＡ；ｐＩ２．８７、ＭＥＥ；ｐＩ３．０９、ＭＡＥ；ｐＩ３．２５、ＭＡＡ；ｐＩ５．６０、ＭＣＨ；ｐＩ７．１３、ＭＡＨ；ｐＩ７．６５）を製造し（表２参照）、その発現量を調査した。その結果、接着性タンパク質の水溶性発現量は、ｐＩ値が２．８７〜７．６５で対照区であるｐＩ９．９０と類似か高く発現したことが示され、特にその中でもｐＩ値３．０９（配列番号３７）で発現量が最も高かった（図２のレーン３参照）。発現形態を分析してみると、ｐＩ２．７３〜３．２５のＡｓｐ／Ｇｌｕ特異的発現とｐＩ値３．２５〜９．９０の比較的緩やかな傾斜の二つの発現形態が存在した。したがって、ｐＩ値が低く調節された先導配列Ｎ−末端ｐＩ値による接着性タンパク質の水溶性発現には、二つのスペクトルがあることを確認し、もう一度Ｎ−末端のｐＩ値の影響を確認することができた。すなわち、前記先導配列のＮ−末端変異体の中で、ＭＡＡ（ｐＩ５．６０）（配列番号３９）、ＭＣＨ（ｐＩ７．１３）（配列番号４０）及びＭＡＨ（ｐＩ７．６５）（配列番号４１）の場合は、電荷とは相関関係が低い配列で、前記変異体の短い配列内に韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で提起されたものと同じ分泌エンハンサーが位置していることはありえないので、前記発現量の差は、全面的に先導配列のＮ−末端変異体のｐＩ値によるものと判断される。前述したように、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−３−Ｌｙｓｎ−７×ｍｅｆｐ１＊）及びｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−Ａｒｇｎ−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンで発現された先導配列に高い＋荷電を有する接着性タンパク質及び強い−荷電を有する先導配列ＭＤＤＤＤＤＡＡ（配列番号３５）を有した接着性タンパク質の場合も、発現と荷電とは相関性がないことが明らかにされた。
【００４３】
したがって、前記結果を基にｐＩ値範囲による水溶性発現パターンを分析した結果、高いｐＩ値で接着性タンパク質の水溶性発現には、（１）ｐＩ値１０．８２を中心とするｐＩ値（９．９０〜１１．４１）のＬｙｓ特異的膜透過機序、（２）二つのＡｒｇを有したｐＩ値１２．５１を中心とするｐＩ値（１１．５２〜１３．３５）のＡｒｇ特異的形態の膜透過機序があると思慮され、その外の広範囲なｐＩ値（２．７３〜９．９０）では、（３）低いｐＩ値（２．７３〜３．２５）間にはＡｓｐ／Ｇｌｕ特異的膜透過機序と、（４）ｐＩ値３．２５〜９．９０での比較的非特異的膜透過機序があると予想される。このような膜透過機序を分類してみると、高いｐＩ値を有する先導配列では、Ｌｙｓ特異的ＯｍｐＡＳＰのＳｅｃ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐＩ値９．９０〜１１．４１）及びＡｒｇ特異的膜透過機序（ｐＩ値１１．５２〜１３．３５）、広範囲な低いｐＩ値（ｐＩ値２．７３〜９．９０）を有する先導配列では、最適ｐＩ値３．０９を有するＡｓｐ／Ｇｌｕ特異的膜透過機序（ｐＩ値２．７３〜３．２５）及び多様なｐＩ値３．２５〜９．９０で中心になるｐＩ値なしに比較的非特異的膜透過機序を有する一種の受動的膜透過機序を有することに分類され得ると推測される。また、この四種類の膜透過機序は、すべて荷電の増加及び発現量の関係とは一致しないことが分かる。したがって、ｐＩ値とタンパク質膜透過性との関連性を分析したこのような結果は、今後タンパク質の膜透過機序を明らかにして水溶性組換えタンパク質の発現研究に効果的に用いられ得るであろう。
【００４４】
高いｐＩ値１１．４１及び１３．３５で低い発現率を示した先導配列（配列番号２２及び配列番号２７）は、同じ値の比較的高い親水性値１．９３を有していて、低いｐＩ値２．７３で低い発現率を示した先導配列（配列番号３５）も比較的高い親水性値１．０９を有していた。この先導配列における顕著に増加した親水性は、親水性膜貫通類似ドメインの脂質二重膜との結合を誘導することによって膜透過性を減少させることが考えられ、これは、親水性を有した膜貫通類似ドメインがヒラメヘプシジンＩの水溶性発現を抑制するという前記出願（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号）において提唱された仮説と合致する。しかし、Ｌｙｓを添加した場合、先導配列（配列番号１８〜２１）は比較的高い親水性値を有しているが、ある程度親水性値の相殺があるようにみうけられる。したがって、Ｌｙｓの追加によって膜透過性が増加することは非常に興味深い。
【００４５】
また、ＭＥＥ（ｐＩ３．０９）（配列番号３７）変異体によって増加した発現の結果から、前記接着性外来タンパク質の先導配列のｐＩ値３．０９が、一つの相応しいｐＩ値であると判断することができた。前記先導配列変異体とそれに連結された外来タンパク質との間の距離を最適化させて、元来形態のアミノ末端を有したタンパク質を生産するため、Ｘａ因子認識部位（Ｘａ）を含むようにＭＥＥ（ｉ＝ｎ）−Ｘａの形態にデザインし、（  ）中にｐＩ値に影響を与えないＯｍｐＡＳＰ４−９のアミノ酸をｉｎｓｅｒｔ（ｉ）＝ｎ（０、２、４、６）として挿入して、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＭＥＥ−（ｉ＝ｎ）−Ｘａ−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製造した（表３参照）。その結果、ＭＥＥとＸａ間にアミノ酸の挿入がない時と二つのアミノ酸が挿入された時に水溶性タンパク質の発現量が最も多かった（図３参照）。すなわち、先導配列と切断酵素認識部位の距離がｉ＝０〜２で最適であることが確認された。また、前記水溶性タンパク質は、切断酵素認識部位を含んでいるので、切断酵素を処理することで公知された方法によって元来形態のＮ−末端を有する組換えタンパク質に生産することができる。
【００４６】
接着性タンパク質の水溶性発現にシグナル配列を含むＮ−末端のｐＩ値が影響を与えることができることを確認した本発明者等は、続いてタンパク質のｐＩ値に影響を与えることができるアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）の距離が、前記タンパク質の水溶性発現に与え得る影響を確認しようとした。すなわち、タンパク質のＮ−末端で先導配列ＭＫＡＫとＭＫＫは計算的に同じｐＩ値を有するが、Ｌｙｓ間にｐＩ値に少ない影響を与えるアミノ酸（例えば、Ａｌａ［アラニン；Ａｌａｎｉｎｅ；Ａ］）を含んでＬｙｓ間の距離が離れた場合にはその機能に差があることを予想し、シグナル配列ＯｍｐＡＳＰ断片アミノ酸配列を基に、ＭＫ１−（ｄ＝ｎ）−Ｋ２−（８−ｎ）の形態にデザインして（  ）中にｐＩ値に影響を与えないｄ１＝ｎ（０、２、４、６、８）個のＯｍｐＡＳＰ１−１１のアミノ酸を挿入してｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＫ１−（ｄ１＝ｎ）−Ｋ２−（８−ｎ）−ＡＡ−ｍｅｆｐ１３−１０−６×ｍｅｆｐ１＊］クローンを製造した（表４参照）。その結果、二つのＫ間の距離（Ｋ１−Ｋ２の距離ｄ１）がｄ１＝４で水溶性タンパク質が最も強く発現された（表４及び図４ａ参照）。すなわち、ｄ１＝４がｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の最適距離であることが確認された。さらに、ｄ１＝４にして、前記クローンの下線を引いたＡｌａをＬｙｓ（Ｋ３）で代替した後、Ｋ２とＫ３間にｄ２＝ｎ（１、２、３、４）個のＡｌａを挿入してｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＫ１−（ｄ１＝４）−Ｋ２−（ｄ２＝ｎ）−ＡＫ３−ｍｅｆｐ１３−１０−６×ｍｅｆｐ１＊］クローンを製造した（表４参照）。その結果、Ｋの間（Ｋ２−Ｋ３の距離ｄ２）は、ｄ２＝２＞１＞４＞３の順に最適距離が確認され、このような最適距離に対する結果は、接着性タンパク質の水溶性発現と直接的な関連があることが明らかにされた。また、前記結果は、先導配列のｐＩ値及びＬｙｓ−Ｌｙｓ間の距離が重要な要因であって、配列が重要な要因ではないということを示している（表４及び図４ｂ参照）。
【００４７】
前記接着性タンパク質（Ｍｅｆｐ１）は、図１ａのレーン１で示されたようにシグナル配列のＭｅｔのみを前記タンパク質のＮ−末端に付着しても水溶性発現がある程度観察されるタンパク質である。また、シグナル配列及び先導配列のｐＩ値調節及び前記配列のアミノ酸間の距離の調節によって、前記接着性タンパク質の水溶性発現量を増加させることができた。しかし、ヒラメヘプシジンＩタンパク質は、分子内に両親媒性ドメインまたは膜貫通類似ドメインを含んでいて、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号では、シグナル配列機能と前記ドメインを相殺することができる親水性値が大きい分泌エンハンサーが含まれることによって水溶性タンパク質に発現することができた。そこで、本発明者等は、前記ヒラメヘプシジンＩの水溶性タンパク質への発現のために前記タンパク質のＮ−末端の先導配列をシグナル配列機能と前記分泌エンハンサー機能を同時に含むようにＭ−７×同型アミノ酸が連結された形態にデザインして、ｐＩ値が２．５２〜１３．２８に調節され、疎水性値−１．５５〜＋１．９７に調節されたタンパク質の発現のためのｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−７×同型アミノ酸−ｏｆｈｅｐＩ＊＊）クローンを製造した（表５参照）。前記同型アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）などが同一なアミノ酸配列で７回連続したことを示す。前記疎水性値は、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）によってホップアンドウッドスケール（Ｈｏｐｐ  ＆Ｗｏｏｄｓ  ｓｃａｌｅ、ウインドウサイズ：６、シキイ値：０．００）で計算した。前記疎水性値が＋になる場合、ペプチドは親水性を帯び、−になる場合疎水性を帯び、絶対値が大きいほど親水性または疎水性の程度が高いことを意味する。前記タンパク質の発現量を調査した結果、MRRRRRRR配列（ｐＩ１３．２８、親水性値＋１．９７）（配列番号７０）及びMKKKKKKK配列（ｐＩ１１．２８、親水性値＋１．９７）（配列番号７１）を有したクローンでのみ、ヘプシジンＩの水溶性発現が観察された（図５参照）。前記先導配列は、シグナル配列（MRRRRRRR及びMKKKKKKK）としても高いｐＩ値を示し、分泌エンハンサー配列（RRRRRRR及びKKKKKKK）としても高いｐＩ値と高い親水性値を有する。前記結果は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号でヒラメヘプシジンＩの水溶性発現の場合、ヒラメヘプシジンＩの場合シグナル配列の高いｐＩ値と内部に含まれた両親媒性ドメインまたは膜貫通類似ドメインより高い親水性値の指標を必要とした事実と一致する。しかし、前記先導配列（MRRRRRRR及びMKKKKKKK）と類似のＭＫＫ（Ｋ）ｎ（ｎ＝６）ＡＫ及びＭ（Ｒ）ｎ（ｎ＝８）ＡＫ配列は、接着性タンパク質の場合、対照区であるＭＡＫと比べて水溶性発現をほとんど増加させることができなかった。また、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号でｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−８−ＳｍａＩ−Ｘａ−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンのＳｍａＩ位置に６個のアルギニン（Ａｒｇ）または６個のリジン（Ｌｙｓ）にあたるヌクレオチドを代置した結果、接着性タンパク質の水溶性分泌が若干増加することはしたが、ヒラメヘプシジンＩの分泌エンハンサー配列ほど顕著な増加は得られなかった（データなし）。したがって、ヒラメヘプシジンＩにおいて、この先導配列（MRRRRRRR配列；MKKKKKKK配列）のシグナル機能部分と分泌増強機能部分が複合的なものなのかまたは別個（Ｍｅｔのみを先導配列で有する場合：ｐＩ値５．７０）のものなのかを判断することはとても難しいと判断される。
【００４８】
それで、本発明者等は、前記の結果を基にヒラメヘプシジンＩの水溶性発現に低いｐＩ値の変異したシグナル配列が及ぼす影響を調べるため、前記タンパク質のＮ−末端をシグナル配列の変異体（ＭＡＨ；ｐＩ７．６５、ＭＡＡ；ｐＩ５．６０またはＭＥＥ；ｐＩ３．０９）ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×同型アミノ酸及びＸａ因子認識部位（Ｘａ）がｏｆＨｅｐＩに連結された形態にデザインして、ｐＩ値と疎水性／親水性値が調節された先導配列でタンパク質の発現のためのクローンを製造した（表６参照）。前記クローンの発現量を調査した結果、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＡＨ（ｐＩ７．６５）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊］及びｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＡＡ（ｐＩ５．６０）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊］では良好に発現され、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＥＥ（ｐＩ３．０９）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊］では弱いがある程度発現され、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＥＥ（ｐＩ３．０９）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ｇｌｕ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊］で比較的良好な水溶性発現が観察された（図６参照）。前記結果は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で提示した、外来タンパク質のＮ−末端が高いｐＩ値（１０．５５）のシグナル配列断片（ＯｍｐＡＳＰ１−１０）と高いｐＩ値及び高い親水性値を有した６×Ａｒｇ及び６×Ｌｙｓを含むように構成された場合のみならず、本発明の外来タンパク質のＮ−末端が低いｐＩ値に変異されたシグナル配列断片と低いｐＩ値及び高い親水性値を有した６×Ｇｌｕを含むように構成されたヒラメヘプシジンＩの場合でも、水溶性発現が可能であることを示す。
【００４９】
したがって、ヒラメヘプシジンＩの水溶性発現の場合を通じてシグナル配列断片のｐＩ値と分泌増強配列のｐＩ値及び親水性値との相互間に非常に緊密な関連性があり、シグナル配列の断片のｐＩ値が５．６０、７．６５及び１０．５５の時には高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーが要求され、シグナル配列断片の低いｐＩ値が３．０９の時には高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーだけではなく低いｐＩ値及び高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーも活用可能であることが解明された。すなわち、シグナル配列断片のｐＩ値が分泌エンハンサーのｐＩ値及び高い親水性値の特性を規定するようにみられ、シグナル配列断片ｐＩ値と分泌エンハンサー間に相互性があることを示した。
【００５０】
このような結果は、Ｎ−末端断片でＭｅｔにすぐに分泌エンハンサー候補配列を連結する場合、水溶性発現が高いｐＩ値と親水性を有したアミノ酸であるＡｒｇ及びＬｙｓに限られたが、疎水性部分を含むシグナル配列断片のＮ−末端にｐＩ値を変化させた場合には、高いｐＩ値と親水性アミノ酸だけではなく低いｐＩ値と親水性を有したＧｌｕまで分泌エンハンサー配列に使用することができ、分泌エンハンサー配列の活用幅が拡がることを示している。このような結果は、ｐＩ値が変異した先導配列のＮ−末端に疎水性断片が連結されてＮ−末端断片自体の親水性を低めることによって、後に連結された親水性の分泌エンハンサー配列の範囲を拡大し得るものと解釈される。
【００５１】
また、前記結果は、ヒラメヘプシジンＩでもシグナル配列断片及び変異したシグナル配列断片のｐＩ値にスペクトルがあることを示す。すなわち、シグナル配列断片ｐＩ値のスペクトルの差は、分泌エンハンサーの機能に影響を与え、シグナル配列の低いｐＩ値３．０９で高いｐＩ値と高い親水性値である分泌エンハンサー６×Ａｒｇ及び低いｐＩ値と高い親水性値である分泌エンハンサー６×Ｇｌｕによる水溶性ヘプシジンＩの発現が可能で、残りシグナル配列のｐＩ値５．６０、７．６５及び１０．５５では、高いｐＩ値と高い親水性値である分泌エンハンサー６×Ａｒｇによって水溶性発現が可能だった。しかし、前記結果の中で先導配列ｐＩ値３．０９、５．６０、及び７．６５の場合は、図２で示した場合のように接着性タンパク質の広いスペクトルの先導配列断片のｐＩ値が有する膜透過機序と類似の機能で膜透過過程に関与すると思慮される。しかし、ｐＩ値１０．５５は、図１に示した場合のように、ＯｍｐＡＳＰ断片特定ｐＩ値１０．５５の特異的ｐＩ値による水溶性タンパク質発現の調節を受けたと思慮される。
【００５２】
結論的に接着性タンパク質のシグナル配列断片及び先導配列断片のｐＩ値が水溶性発現に決定的に影響を及ぼし、荷電とは相関性がなかった。接着性タンパク質の水溶性発現と先導配列のｐＩ値との相互関係は、ｐＩ値９．９０〜１１．４１のＬｙｓによる特異的膜透過機序、ｐＩ値１１．５２〜１３．３５のＡｒｇによる特異的膜透過機序、低いｐＩ値２．７３〜３．２５のＡｓｐ／Ｇｌｕ特異的膜透過機序とｐＩ値３．２５〜９．９０までの非特異的膜透過機序があることを初めて確認した。しかし、接着性タンパク質の場合、先導配列に分泌エンハンサー配列として知られたｐｏｌｙ  Ｌｙｓ及びｐｏｌｙ  Ａｒｇ配列（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号）を連結した場合、発現が顕著に増加することはなかったので、接着性タンパク質のように内部に膜貫通類似ドメインのない場合は、先導配列に分泌エンハンサー配列を連結しても発現増加とは相関性が少ないと予想される。また、先導配列と切断酵素認識部位を連結する時とシグナル配列断片内のＬｙｓ距離間に最適距離があることを最初に確認した。
【００５３】
膜貫通類似ドメインがあるヒラメヘプシジンＩは、シグナル配列断片及び先導配列のｐＩ値だけでは水溶性発現がとても微弱か不可能だったが、Ｎ−末端断片でＭｅｔにすぐに分泌エンハンサー候補配列を連結した場合、高いｐＩ値と親水性を有したアミノ酸であるＡｒｇ及びＬｙｓで水溶性発現が可能で、様々のｐＩ値を有するようにＮ−末端のｐＩ値を変異させたシグナル配列断片を高いｐＩ値と親水性を有した分泌エンハンサー配列と連結した時、水溶性発現が可能だったが、低いｐＩ値を有した先導配列は、高いｐＩ値と親水性を有したアミノ酸及び低いｐＩ値と親水性を有したアミノ酸の分泌エンハンサー配列と連結した時、水溶性に発現が可能だった。この結果は、接着性タンパク質Ｍｅｆｐ１の発現がシグナル配列断片及び先導配列の広範なｐＩスペクトルにおいて誘導されうるという既述の結果を裏付ける。しかし、分泌エンハンサー配列は、ｐＩ値に関係なく高い親水性を有したアミノ酸を共通に必要とするので、水溶性に発現されるためには、ヒラメヘプシジンＩが内部に有している膜貫通類似ドメインより高い親水性が必要である。
【００５４】
また、疎水性部分を含むシグナル配列断片のＮ−末端のｐＩ値を変化させた場合、Ｍｅｔにすぐに分泌エンハンサー候補配列を連結した場合より、分泌エンハンサー配列の活用幅が拡がることが分かる。このような結果は、シグナル配列に連結された疎水性部分が、先導配列（シグナル配列断片のＮ−末端のｐＩ値を変化させた配列）Ｎ−末端の親水性を低めてアンカーとして先導配列の機能を自由にし、親水性分泌エンハンサー配列の膜透過範囲を拡大するものと解釈され、先導配列Ｎ−末端ｐＩ値と分泌エンハンサー配列相互間には、一種の相互性があることが思慮される。
【００５５】
以下、本発明の好ましい実施態様を詳しく説明する。
【００５６】
本発明は、（ｉ）プロモーター、ならびに（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値及び／または先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する。
【００５７】
ここで、前記プロモーターは、ウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターであることが好ましい。前記ウイルス起源のプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ウシパピローマウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターであることが好ましいがこれに制限されるのではない。前記原核生物起源のプロモーターは、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、ラクトースプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、またはｔａｃプロモーターであることが好ましいが、これに制限されるのではない。前記真核生物起源のプロモーターは、酵母起源のプロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターであることが好ましい。前記酵母起源のプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートジヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼプロモーター、３−ホスホグリセレートミュターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールジヒドロゲナーゼ  ２プロモーター、イソシトクロムＣプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、サッカロマイセス・セレビシエＧＡＬ１プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエＧＡＬ７プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエＧＡＬ１０プロモーター、またはメタノール資化酵母ＡＯＸ１プロモーターであることが好ましいが、これに制限されるのではない。前記動物細胞起源のプロモーターは、熱ショックタンパク質プロモーター、プロラクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターであることが好ましいが、これに制限されるのではない。本発明でのプロモーターは、本発明の外来遺伝子を宿主細胞で正常に発現させることができるものならすべて使用可能である。
【００５８】
前記シグナル配列は、ウイルス、原核生物及び真核生物起源のシグナル配列であることが好ましく、ＯｍｐＡシグナル配列、ＣＴ−Ｂ（コレラ毒素Ｂサブユニット）シグナル配列、ＬＴIIｂ−Ｂ（大腸菌易熱性エンテロトキシンＢサブユニット）シグナル配列、ＢＡＰ（バクテリアルアルカリホスファターゼ）シグナル配列（Ｉｚａｒｄ  ａｎｄ  Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４年，第１３巻，ｐ．７６５−７７３）、酵母カルボキシペプチダーゼＹシグナル配列（Ｂｌａｃｈｌｙ−Ｄｙｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７年，第１０４巻，ｐ．１１８３−１１９１）、クルイベロマイセス・ラクティスの致死毒素ガンマサブユニットシグナル配列（Ｓｔａｒｋ  ＆  Ｂｏｙｄ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９８６年，第５（８）巻，ｐ．１９９５−２００２）、牛成長ホルモンのシグナル配列（Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．（Ｅｄ），ＧＥＮＥＳ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４年，ｐ．２９０．）、インフルエンザノイラミニダーゼのシグナルアンカー（Ｌｅｗｉｎ  Ｂ（Ｅｄ），ＧＥＮＥＳ  Ｖ，ｐ２９７．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４年）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットα（ＴＲＡＰ−α、Ｐｒｅｈｎ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９０年，第１８８（２）巻，ｐ．４３９−４４５）のシグナル配列、ツィンアルギニン輸送（Ｔａｔ）シグナル配列（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０００年，第３８１（２）巻，ｐ．８９−９３）などを使用することができるが、これに限定されるのではない。
【００５９】
前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片は、ｐＩ値が９．９０〜１１．４１に調節された１〜６個のアミノ酸の長さで構成されるポリペプチド、またはｐＩ値が３．０９〜９．９０に調節され、前記アミノ酸は１〜１２個のアミノ酸の長さで構成されるポリペプチドであることが好ましいが、その長さはこれに限定されず、前記ペプチドのアミノ酸配列及び長さは、Ｎ−領域のｐＩ値を考慮して、他のアミノ酸に代替したり適切な長さに調節することができる。さらに好ましい様態として、前記シグナル配列のＮ−領域を含むポリペプチド断片のｐＩ値は、外来タンパク質の水溶性発現のためにスクリーニングすることができる（図１及び表１参照）。また、先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離は、ポリペプチド断片が外来タンパク質の水溶性発現を最適化することができる長さに調節することができる（図１〜４及び表１〜４参照）。
【００６０】
前記ｐＩ値が調節されたポリペプチド断片のｐＩ値の調節は、Ｎ−領域のアミノ酸の間にｐＩ値に影響を与えることができるアミノ酸を追加することで達成することができる。具体的に、前記断片のｐＩ値を高めるためには、塩基性アミノ酸、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）などを追加で含むことで達成することができ、ｐＩ値を低めるためには、酸性アミノ酸、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）などを追加することで達成することができる。また、ｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の間の距離の調節のためには、グリシン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことで達成することができる。前記のようなアミノ酸の置換方法は、当業界によく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００６１】
一方、本発明の一実施態様で、本発明の発現ベクターの前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能にタンパク質切断酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが連結される（表３参照）。ここで、前記タンパク質切断酵素認識部位は、Ｘａ因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼＩ認識部位またはフリン（Ｆｕｒｉｎ）認識部位を単独で使用するか、いずれか二つ以上を順次に連結して使用することができる。一方、前記タンパク質切断酵素認識部位は、Ｘａ因子の場合、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであることが好ましい。また、前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドとタンパク質切断酵素認識部位をコードするヌクレオチドの間に、グリシン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことによって、長さが０〜２に調節されたアミノ酸を追加で含むことが好ましい。本発明の好ましい実施例で、前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドと切断酵素認識部位を連結するのに最適な距離の範囲を確認した（表３及び図３参照）。
【００６２】
また他の実施態様で、本発明の発現ベクターは、追加で外来タンパク質をコードする遺伝子の挿入のための制限酵素部位が含まれる。前記制限酵素部位は、前記シグナル配列のＮ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの後に連結され、分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドが含まれたベクターの場合には、前記ポリヌクレオチドの後に連結することができる。ベクター内にタンパク質切断酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが存在する場合には、制限酵素部位は付加したり付加しなかったりすることができるが、元来形態のタンパク質を生産するという観点では、制限酵素部位を通じた外来タンパク質をコードする遺伝子のクローニングは、好ましくないこともある。
【００６３】
一方、上述したベクターに外来タンパク質をコードする遺伝子を追加で挿入することができる。ここで、前記外来タンパク質は、特別にこれに制限されるのではないが、当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を組換え融合タンパク質に発現することができる。または、前記外来タンパク質は、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることが好ましく、前記内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインのないタンパク質は、特別これに制限されるのではないが、Ｍｅｆｐ１重合体であることが好ましい。
【００６４】
また、本発明は、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、シグナル配列断片及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体に作動可能に連結された、ｐＩ値が調節された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチド、で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する。
【００６５】
前記外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質であることが好ましい。前記膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有した外来タンパク質は、＋荷電のある部分が膜の脂質二重層に付着してこのような膜貫通類似構造が一種のアンカーの役割を遂行して、細胞外部に分泌がよくなされないものと推定される。このような分泌困難なタンパク質を細胞外に分泌させるために本発明の前記発現ベクターは非常に効率的である。本発明のベクターは、前記のように膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有したタンパク質の水溶性生産に相応しいが、これは本発明の変異したシグナル配列が有している誘導シグナルと高い親水度が、外来目的タンパク質が内部に有している膜貫通ドメインが有している親水度より大きい場合、新生ポリペプチド（ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）がペリプラズムの外に移動することができるからであると思慮される。その原理は、前記ドメインが脂質二重層に付く力より変異されたシグナル配列が有する誘導シグナルの方向性と高い親水度がさらに大きくて分泌が促進されるからであると推測される。前記膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有した外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、ヒラメヘプシジンＩであることが好ましい。
【００６６】
他のタンパク質の場合にも、疎水性プロファイルを分析する時、タンパク質の内部に膜貫通類似ドメインに判定される部分が示れるが、連続的な多数の疎水性アミノ酸で構成された配列後に連続的な多数の親水性アミノ酸で構成された配列が示される場合、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有したタンパク質と判定して本発明の発現システムに適用させることができる。そのような判定のために、コンピューターソフトウェアを用いることができ、代表的なものは、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）、ＤＯＭｐｒｏ（Ｃｈｅｎｇ等，Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ，２００６年，第１３（１）巻，ｐ．１−２０；//www.ics.uci.edu/~baldig/dompro.html）、ＴＭｐｒｅｄ（//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）、ＨＭＭＴＯＰ（//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）、ＴＢＢｐｒｅｄ（//www.imtech.res.in/raghava/tbbpred/）、ＤＡＳ−ＴＭｆｉｌｔｅｒ（//www.enzim.hu/DAS/DAS.html）などが存在する。
【００６７】
ここで、本発明の（ｉｉｉ）の分泌エンハンサーのｐＩ値は、（ｉｉ）のポリペプチドの断片のｐＩ値によって変化することが好ましい。すなわち、前記ポリペプチド断片のｐＩ値が５〜１１に調節された場合、前記分泌エンハンサーはｐＩ値が１１〜１４に調節されることが好ましい。また、前記ポリペプチド断片のｐＩ値が２〜５に調節された場合、前記分泌エンハンサーはｐＩ値が２〜１４に調節されることが好ましい。前記ポリペプチド断片は、内部にリジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群から選択される塩基性アミノ酸を加えるか前記断片内部の酸性アミノ酸を前記塩基性アミノ酸に代替することでｐＩ値が高くなるように調節することができるが、内部にアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）の酸性アミノ酸を加えるか前記断片内部の塩基性アミノ酸を前記酸性アミノ酸に代替することでｐＩ値が低くなるように調節することができる。本発明の好ましい実施例で、ヒラメヘプシジンＩの水溶性発現の場合を通じてシグナル配列断片のｐＩ値と分泌増強配列のｐＩ値及び親水性値との相互間に非常に緊密な関連性があって、シグナル配列の断片のｐＩ値が５．６０、７．６５及び１０．５５の時には高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーが要求され、シグナル配列断片の低いｐＩ値が３．０９の時には、高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーだけでなく低いｐＩ値及び高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーも活用可能であることが解明された（表５、表６、図５及び図６参照）。
【００６８】
本発明のベクターの前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを連結することができる。分泌エンハンサーは、ｐＩ値が調節された親水性増加配列で構成されていて、これを通じてシグナル配列の親水性を増加させて外来タンパク質のペリプラズム外への移動を促進することができる。前記分泌エンハンサーは、少なくとも６０％以上の親水性アミノ酸で構成された親水性ペプチドであり、より好ましくは６５％以上の親水性アミノ酸、最も好ましくは７０％以上の親水性アミノ酸で構成されたポリペプチドであり、その長さは特別これに制限されるのではないが、２〜５０個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであることが好ましく、さらに好ましくは４〜２５個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、それより好ましいのは６〜２０個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、６個の親水性アミノ酸が反覆する構造を有するポリペプチドで構成されることが最も好ましい。前記方法において、親水性アミノ酸は特別これに制限されるのではないが、アスパラギン、グルタミン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましく、さらに好ましくはリジン、アルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。前記分泌エンハンサーのｐＩ値は、外来タンパク質の水溶性発現のためにスクリーニングすることができる。すなわち、本発明の実施例で明らかにした外来タンパク質の水溶性発現を助けることができる特定範囲の分泌エンハンサーのｐＩ値の調節に基づいて、前記ポリペプチドのシグナル配列及び先導配列のアミノ酸配列及び長さを調節することができる（表５、表６、図５及び図６参照）。
【００６９】
本発明の発現ベクターで、前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドとタンパク質切断酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドの間に挿入されるが（表６参照）、このような挿入の場合、前記Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドとタンパク質切断酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドの間に挿入された制限酵素部位、特に、ＳｍａＩのような平滑末端を生成する制限酵素によって切断される制限酵素部位を通じて行われることが好ましい。同様に、前記タンパク質切断酵素認識部位は、Ｘａ因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼＩ認識部位及びフリン認識部位からなる群から単独または融合の形態で使用される。
【００７０】
発明の実施態様で、本発明の発現ベクターは、遺伝子コンストラクトが分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに連結された外来遺伝子の挿入のための制限酵素部位を追加で含み、前記遺伝子コンストラクトに作動可能に連結された外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを追加で含む。前記外来遺伝子は、制限酵素部位を通じてクローニングすることができる。本発明の発現ベクターは、タンパク質切断酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドを追加で含むこともでき、この場合には、前記ポリヌクレオチドとフレームが合うように（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）連結され、外来タンパク質分泌後タンパク質切断酵素で切断時、元来形態の外来タンパク質が生産されるようにできる。
【００７１】
また、本発明は、前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した形質転換体を提供する。
【００７２】
ここで、前記宿主細胞は、特別これに制限されるのではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましく、前記原核生物細胞は特別これに制限されるのではないが、ウイルス、大腸菌、バシラスからなる群から選択されたものが好ましく、前記真核生物細胞は特別これに制限されるのではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または植物細胞であることが好ましい。
【００７３】
また、本発明は、前記形質転換体を用いた組換えタンパク質の分泌効率向上方法を提供する。
【００７４】
具体的には、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値９．９０〜１１．２８の先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、切断酵素認識部位及び外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び、
６）工程５）の形質転換体を培養して水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程を含む外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法を提供する。
【００７５】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値３．０９〜９．９０の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、切断酵素認識部位及び外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び、
５）工程４）の形質転換体を培養して水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程を含む外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法を提供する。
【００７６】
本発明の好ましい実施例で詳しくみたように、接着性タンパク質であるＭｅｆｐ１の水溶性発現のために、先導配列のｐＩ値を多様に調節してみた結果、ｐＩ値が９．９０〜１１．４１の範囲（表１及び図１参照）またはｐＩ値が３．０９〜９．９０の範囲で最も水溶性発現量が多いことを確認することができた（表２及び図２参照）。また、前記先導配列のｐＩ値を１０．５５及び１０．８２に定めてｐＩ値に影響を与えるＬｙｓの距離をｐＩ値に影響を与えないアミノ酸組成を使用して調節した結果、最適の発現を示す距離があることを確認した（表４及び図４参照）。
【００７７】
工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸は、好ましくはＬｙｓである。
ここで、前記外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を組換え融合タンパク質に発現することができる。または、前記外来タンパク質は、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることが好ましく、前記内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインのないタンパク質は、特別これに制限されるのではないが、Ｍｅｆｐ１重合体であることが好ましい。
【００７８】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値２〜５の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び、
５）工程４）の形質転換体を培養して水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程を含む外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法を提供する。
【００７９】
同時に、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値９．９０〜１１．２８の先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；及び、
７）工程６）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程を含む組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００８０】
前記外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質であることが好ましい。
【００８１】
本発明方法の分泌エンハンサーのｐＩ値は、ポリペプチドの断片のｐＩ値によって変化することが好ましい。すなわち、前記ポリペプチド断片のｐＩ値が５〜１１に調節された場合、前記分泌エンハンサーは、ｐＩ値が１１〜１４に調節されることが好ましい。また、前記ポリペプチド断片のｐＩ値が２〜５に調節された場合、前記分泌エンハンサーは、ｐＩ値が２〜１４に調節されることが好ましい。前記ポリペプチド断片は、内部にリジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる群から選択される塩基性アミノ酸を加えるか前記断片内部の酸性アミノ酸を前記塩基性アミノ酸に代替することでｐＩ値が高くなるように調節することができるが、内部にアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）の酸性アミノ酸を加えるか前記断片内部の塩基性アミノ酸を前記酸性アミノ酸に代替することでｐＩ値が低くなるように調節することができる。本発明の好ましい実施例で、ヒラメヘプシジンＩの水溶性発現の場合を通じてシグナル配列断片のｐＩ値と分泌増強配列のｐＩ値及び親水性値との相互間に非常に緊密な関連性があって、シグナル配列の断片のｐＩ値が５．６０、７．６５及び１０．５５の時には高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーが要求され、シグナル配列断片の低いｐＩ値が３．０９の時には高いｐＩ値と高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーだけでなく低いｐＩ値及び高い親水性値アミノ酸の分泌エンハンサーも活用可能であることが解明された（表５、表６、図５及び図６参照）。
【００８２】
また、本発明は、組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値９．９０〜１１．２８の先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；及び、
７）工程６）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程を含む組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００８３】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値３．０９〜９．９０の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；及び、
６）工程５）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程を含む組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００８４】
前記組換え融合外来タンパク質は、上述した本発明の発現ベクターが形質転換された形質転換体で発現してタンパク質を回収することで生産することができる。回収方法は、当業者に公知された通常の方法を使用することができる。
【００８５】
ここで、前記外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を組換え融合タンパク質に発現することができる。または、前記外来タンパク質は、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることが好ましく、前記内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインのないタンパク質は特別これに制限されるのではないが、Ｍｅｆｐ１重合体であることが好ましい。
【００８６】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値５〜１１の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；及び、
６）工程５）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程を含む組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００８７】
同時に、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値２〜５の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；及び、
６）工程５）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程を含む組換え融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００８８】
前記外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質であることが好ましい。
【００８９】
さらに、前記外来タンパク質として、脳を標的とする治療用タンパク質、例えばβ−アミロイドに特異的なｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）使用する場合、本発明の方法によって製造した変異されたシグナル配列と外来タンパク質間の融合タンパク質は、従来はタンパク質が通過することができなかった血液脳関門を通過して脳に直接作用することができる。したがって、本発明の方法は、薬物伝達体系、特に、脳疾患治療のための薬物伝達体系の発展に画期的な契機になり得る。前記血液脳関門の通過問題だけではなく、本発明の製造方法によって製造された融合外来タンパク質は、経口投与時、胃の中で分解される前に、胃壁を通過したり、皮膚に塗布またはパッチすることで、皮膚を通過して体内に完全に伝達することができる。そのことによって、従来のタンパク質製剤の最も大きな問題点である投与方法の制限（静脈注射、筋肉注射、皮下注射または鼻腔投与）を解消し、より簡便な投与方法である経口投与、経皮投与が可能になる。
【００９０】
また、本発明は、前記製造方法によって製造された組換え融合外来タンパク質を提供する。
【００９１】
ここで、外来タンパク質は、特別これに制限されるのではないが、脳を標的とする治療用タンパク質であることが好ましい。また、前記方法によって製造される融合外来タンパク質は、本発明の変異したシグナル配列によって血液脳関門を通過することができる膜透過部位を有するようになる。
【００９２】
さらに、本発明は、本発明の製造方法によって製造された前記変異したシグナル配列と外来タンパク質の組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。前記薬学的組成物は、特別これに制限されるのではないが、脳疾患治療に使用されることが好ましい。
【００９３】
また、本発明は、前記組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００９４】
前記薬学的組成物は、特に脳卒中と老人性痴呆症（アルツハイマー）に現在使われている脳疾患治療用タンパク質製剤の伝達可能性を向上させられると期待される。
【００９５】
また、本発明の薬学的組成物は、目的組織に到達することができるなら一般的なあらゆる経路を通じて投与することができ、具体的に局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮などで投与することができ、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができ、好ましい剤形は、注射剤である。注射剤は、等張滅菌溶液または生理食塩水の添加が可能で、皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射などが可能である。投与量は、患者の疾病の種類及び重症度、年齢、性別、投与方法、標的細胞、発現程度など多様な要因によって変えることができ、当分野の専門家によって容易に決定され得る。
【００９６】
本発明による薬学的組成物は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば賦形剤、崩解剤、甘味料、滑沢剤、香味剤などを追加で含むことができる。前記崩解剤には、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスカメロースナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キトサン、グアガム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、マグネシウムアルミニウムシリケート、ポラクリリンカリウムなどがある。また、本発明による薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、ここで、薬剤学的に許容可能な添加剤には、澱粉、ゼラチン化澱粉、結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド状シリコンジオキサイド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴（ｔａｆｆｙ）、アラビアゴム、糊化前澱粉、とうもろこし澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、カルナウバ蝋、合成硅酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、タルクなどを使用することができる。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記薬学的組成物に対して０．１〜９０重量部含むことが好ましい。
【００９７】
経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸薬などが含まれる。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアゾールなどが該当し、よく使用される単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤では、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐薬、エアゾールなどの外用剤及び滅菌注射製剤の形態に剤形化して使用することができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏、硬膏、ローション剤、リニメント剤、ペースト剤またはパップ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して使用することができるが、これに限定されるのではない。非水性溶剤、懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００９８】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって異なるが、当業者によって適切に選択することができる。しかし、好ましい効果のために経口投与剤の場合、一般的に成人の場合、１日に体重１ｋｇ当たり本発明の薬学的組成物を１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与するのが好ましい。投与は、一日に一度投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００９９】
また、本発明は、元来形態の外来タンパク質を生産する方法を提供する。
【０１００】
具体的には、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値９．９０〜１１．２８の先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；及び、
８）工程７）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程を含む元来形態の外来タンパク質の生産方法を提供する。
【０１０１】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であり、工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸には、Ｌｙｓを使用することができる。
【０１０２】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値３．０９〜９．９０の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；及び、
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程を含む元来形態の外来タンパク質の生産方法を提供する。
【０１０３】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることを特徴とする。
【０１０４】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値５〜１１の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；及び、
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程を含む元来形態の外来タンパク質の生産方法を提供する。
【０１０５】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがあるタンパク質であり、工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値は１１〜１４に調節されることを特徴とする。
【０１０６】
同時に、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値２〜５の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；及び、
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程を含む元来形態の外来タンパク質の生産方法を提供する。
【０１０７】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがあるタンパク質であり、工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値は２〜１４に調節されることを特徴とする。
【０１０８】
同時に、本発明は、細胞内に伝達させようとする物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【０１０９】
具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値９．９０〜１１．２８の先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；
８）工程７）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを分離する工程；及び、
９）工程８）の先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを細胞内に伝達させようとする物質と結合させる工程を含む前記物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【０１１０】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であり、工程２）のｐＩ値に影響を与えるアミノ酸には、Ｌｙｓを使用することができる。
【０１１１】
前記細胞内に伝達させようとする物質は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生理活性分子であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【０１１２】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値３．０９〜９．９０の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを分離する工程；及び、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを細胞内に伝達させようとする物質と結合させる工程を含む前記物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【０１１３】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることを特徴とする。
【０１１４】
前記細胞内に伝達させようとする物質は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生理活性分子であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【０１１５】
また、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値５〜１１の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを分離する工程；及び、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを細胞内に伝達させようとする物質と結合させる工程を含む前記物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【０１１６】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがあるタンパク質であり、工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値は１１〜１４に調節されることを特徴とする。
【０１１７】
前記細胞内に伝達させようとする物質は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生理活性分子であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【０１１８】
同時に、具体的に、
１）シグナル配列及び／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値２〜５の先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、切断酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）で製造された遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から前記融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の分離した融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを分離する工程；及び、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー及び切断酵素認識部位が連結されたペプチドを細胞内に伝達させようとする物質と結合させる工程を含む前記物質の細胞内運搬体の製造方法を提供する。
【０１１９】
前記外来タンパク質は、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがあるタンパク質であり、工程２）の親水性分泌エンハンサーのｐＩ値は２〜１４に調節されることを特徴とする。
【０１２０】
前記細胞内に伝達させようとする物質は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生理活性分子であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を実施例によってより詳しく説明する。
【０１２２】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【０１２３】
＜実施例１＞接着性タンパク質遺伝子ＤＮＡ多重体カセットのクローニング
本発明者等は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号と同一の配列を有し、配列番号９５（Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys）で表わされるＭｅｆｐ１を基にして、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、配列番号９６（5’-TAC AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC-3’）で表わされる正方向プライマーと、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、配列番号９７（5’-TTT GTA GGT TGG CGG ATA AGA CGG CTT AGC-3’）で表わされる逆方向プライマーとを用いて、合成ｍｅｆｐ１  ＤＮＡを製作した。左側アダプター（以下「Ｌａ」と称する）合成ＤＮＡは、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、配列番号９８（5’-GAT CCG AAT TCC CCG GG-3’）で表わされる、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位を内部に持つ正方向プライマーと、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、配列番号９９（5’-TTT GTA CCC GGG GAA TTC G-3’）で表わされる逆方向プライマーとを用いて合成した。右側アダプター（以下「Ｒａ」と称する）合成ＤＮＡは、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、本発明では配列番号１００（5’-TAC AAA CGT AAG CTT GTC GAC C-3’）で表わされる、Ａｒｇ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ部位を内部にもつ正方向プライマーと、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で使用されたものと同一の、配列番号１０１（5’-TCG AGG TCG ACA AGC TTA CG-3’）で表わされる逆方向プライマーとを用いて合成した。大韓民国登録特許第３７９，０２５号に公示された方法でｍｅｆｐ１  ＤＮＡ多重体を製作してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）にクローニングし、７回反覆されたｍｅｆｐ１  ＤＮＡ多重体をスクリーニングして、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）Ｌａ−７×ｍｅｆｐ１−Ｒａ」と命名した。
【０１２４】
＜実施例２＞Ｎ−末端変異体クローンにおける接着性タンパク質の発現
本発明者等は、Ｍｅｆｐ１のＮ−末端のｐＩ値の調節による水溶性発現を目的として、ＯｍｐＡシグナル配列ペプチド（ＯｍｐＡＳＰ）断片を導入するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）Ｌａ−７×ｍｅｆｐ１−Ｒａを鋳型にＰＣＲを遂行した。その結果、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターに、多様なｐＩ値のシグナル配列ＯｍｐＡＳＰ断片またはその変異体と、Ｍｅｆｐ１の先導配列と、前記実施例１で製作したｍｅｆｐ１カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）とが連結された、Ｎ末端を有する発現ベクターが製作された（表１〜表４）。
【０１２５】
前記表１〜表４のように製作したＮ−末端を有した発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を通常の方法で形質転換して、ＬＢ培地［トリプトン２０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＫＣｌ１．８６ｍｇ／ｌ］に５０μｇ／ｍｌアンピシリンと一緒に３０℃で１６時間培養した。次に、培養液をＬＢ培地を用いて２００倍に希釈した。希釈培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、ＯＤ６００値が０．３になるように培養した。さらに３時間培養した。培養液１ｍｌを４，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離してペレットを１００〜２００μｌ試料バッファー（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、１％グリセロール、０．１％ブロムフェノールブルー）で懸濁した。懸濁液は、タンパク質を分離するためにソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を使用して、１５×２−ｓサイクルパルス（３０％出力）で粉砕し、細胞残物を除去するために、１６，０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離を遂行して非水溶性部分を分離した。水溶性分画のタンパク質をブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６年，第７２巻，ｐ。２４８−２５４）で定量した後、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、Ｌａｅｍｍｌｉなどの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年，第２２７巻，ｐ．６８０−６８５）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行してクマシブルー染色法（Ｓｉｇｍａ，米国）で染色した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行したゲルをニトロセルロース膜（Ｒｏｃｈｅ，米国）に移動させた。次に、５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ，米国）に浸した後、膜を０．４μｇ／ｍｌ抗−Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）が含まれた溶液に３７℃、２時間浸けた。次に、ＨＲＰ−結合ウサギ抗−マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を２次抗体に使用して、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ，米国）を染色液に使用して染色した。前記方法で得られた接着性タンパク質バンドの濃度は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，米国）を用いてデンシトメーター分析方法で定量化した。
【０１２６】
＜実施例３＞ｐＩ値が増加した短いシグナル配列及びその変異体配列が接着性タンパク質発現に及ぼす影響
接着性外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列７×ｍｅｆｐ１の５’末端に、分泌を誘導するＯｍｐＡシグナル配列ペプチドＯｍｐＡＳＰ（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の配列番号４６またはＭｏｖｖａ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８０年，第５５巻，ｐ．２７−２９）の一部のＯｍｐＡＳＰ１（Ｍｅｔ）、ＯｍｐＡＳＰ１−２（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ）及びＯｍｐＡＳＰ１−３（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）のコード配列を融合して、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＯｍｐＡＳＰ１−７×ｍｅｆｐ１＊）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＯｍｐＡＳＰ１−２−７×ｍｅｆｐ１＊）及びｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＯｍｐＡＳＰ１−３−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製作した（表１）。
【０１２７】
製作されたクローンベクターで実施例２の方法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換してタンパク質を発現させ、その発現量を確認した結果、一つのアミノ酸（Ｌｙｓｉｎｅ；Ｌｙｓ；Ｋ；ｐＩ＝９．７２）の差によって前記二つのクローンから発現されたＭｅｔ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１５）及びＭｅｔ−Ｌｙｓ−７×Ｍｅｆｐ１＊（配列番号１６）タンパク質の水溶性発現に顕著な差があることを確認した（図１ａのレーン１及びレーン２、表１）。前記結果は、一つのアミノ酸であるＬｙｓが融合タンパク質のＮ−末端で接着性タンパク質の発現量に大きく影響を与えることを意味し、このことから接着性タンパク質のＮ−末端二番目に位置するＬｙｓも水溶性発現に影響を及ぼし得ることが予想された。そこで、前記二つのタンパク質からＯｍｐＡＳＰ断片（Ｍｅｔ［Ｍ］及びＭｅｔ−Ｌｙｓ）からＭｅｆｐ１の初めの二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までを先導配列にしてｐＩ値をコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）で分析した結果、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号１５）ペプチドのｐＩ値は９．９０で、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号１６）ペプチドのｐＩ値は１０．５５と示された。前記結果を裏付けるために、ＯｍｐＡＳＰ１−２よりＬｙｓをもう一つ多く有しているシグナル配列断片ＯｍｐＡＳＰ１−３（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）のコード配列を用いて前記と同一な方法でクローンを製作して接着性タンパク質の水溶性発現を調査した結果（図１ａのレーン３）、水溶性発現の増加は、Ｍｅｆｐ１の初めの二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までの先導配列ＯｍｐＡＳＰ１−３（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）−Ａｌａ−ＬｙｓのｐＩ値１０．８２と相関関係を示した（図１ａのレーン３及び表１）。したがって、前記の結果は、先導配列でＬｙｓ増加によるｐＩ値の変異範囲９．９０から１０．８２までは、先導配列のｐＩ値と発現量が関係していることを証明した。
【０１２８】
（表１）組換えベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰｔｒ−７×ｍｅｆｐ１＊）でｐＩ値が増加したＯｍｐＡＳＰｔｒ及びその変異体クローンのプライマー、先導配列及びＭｅｆｐ１の発現結果
2011504746.tif 000003
2011504746.tif 000004
【０１２９】
＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２のＲａ及びＨｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）の余剰配列を示す。
【０１３０】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０１３１】
イタリックの太文字：シグナル配列断片−接着性タンパク質の先導配列断片（Ｍｅｆｐ１の二番目までのアミノ酸；Ala-Lys）及びその変異体をコードする多様な大きさのオリゴヌクレオチドを示す。
【０１３２】
一般文字：Ala-Lysを除いたＭｅｆｐ１三番目アミノ酸からをコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１３３】
（  ）：シグナル配列断片及びその変異体が接着性タンパク質のＮ−末端（Ala-Lys）と連結された先導配列のｐＩ値を示す。
【０１３４】
ＯｍｐＡＳＰｔｒ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号のＯｍｐＡＳＰの断片を意味する。
【０１３５】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号に記載されたプライマーを示す。
【０１３６】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２に示されるＲａ（右側アダプター；Ａｒｇ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ）に相補的なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１３７】
組換えＭｅｆｐ１タンパク質の発現結果は、無発現時「−」、弱発現時「＋／−」及び発現時「＋」の個数で発現量を表示した。
【０１３８】
＜実施例４＞先導配列の高いｐＩ値が接着性タンパク質の発現に及ぼす影響
本発明者等は、実施例３でＬｙｓによる先導配列ｐＩ値の調節が水溶性タンパク質発現と関連があることを確認した。そこで前記ｐＩ値が水溶性タンパク質発現に普遍的に影響を与えることができるかどうかを確認するためにｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−３−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンのＯｍｐＡＳＰ１−３断片とＭｅｆｐ１間にｐＩ値を増加させることができるアミノ酸であるＬｙｓを追加で挿入したｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ｏｍｐＡＳＰ１−３−（Ｌｙｓ）ｎ−７×ｍｅｆｐ１＊］（ｎ＝１、２、３、４、６）（配列番号４〜配列番号８及び配列番号１８〜配列番号２２）、及びＭｅｔ（ＯｍｐＡＳＰ１）とＭｅｆｐ１間にｐＩ値を増加させることができるアミノ酸であるＡｒｇを追加で挿入したｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ｏｍｐＡＳＰ１−（Ａｒｇ）ｎ−７×ｍｅｆｐ１＊］（ｎ＝１、２、４、６、８）（配列番号９〜配列番号１３及び配列番号２３〜配列番号２７）クローンを製造した（表１）。各クローンのＯｍｐＡＳＰ断片からＭｅｆｐ１の初め二つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｌｙｓ）までの先導配列ｐＩ値を分析した。
【０１３９】
製作されたクローンベクターを用いて実施例２の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、タンパク質を発現させてその発現量を確認した。その結果、ＬｙｓによってｐＩ値が増加した先導配列（図１ａのレーン４〜レーン８及び表１の配列番号１８〜配列番号２２）と連結された接着性タンパク質の中で、ｐＩ値が１０．９９〜１１．２１に増加した先導配列（図１ａのレーン４〜レーン６及び表１の配列番号１８〜配列番号２０）の場合では、その水溶性発現量が、対照区であるｐＩ値が１０．５５の先導配列（図１ａのレーン２及び表１の配列番号１６）と類似か若干増加していた。ｐＩ値が１１．２８の先導配列（図１ａのレーン７及び表１の配列番号２１）の場合では、水溶性発現量が対照群より減少し、ｐＩ値が１１．４１の先導配列（図１ａのレーン８及び表１の配列番号２２）の場合では、ほとんど発現されなかった。ｐＩ値増加にもかかわらず発現量が顕著に減少したｐＩ値が１１．４１の先導配列（シグナル配列２２）は、比較的高い親水性値１．９３を有していて先導配列部分に増加し過ぎた親水性値は、脂質二重膜に結合することができる（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号）ので膜透過力を減少させたと判断される。しかし、ｐＩ値１０．９９、１１．１１、１１．２１及び１１．２８の先導配列は、比較的高い親水性値（各々１．１４、１．３２、１．５３及び１．６９）を有するけれど、Ｌｙｓを添加した場合、ある程度の親水性値の相殺があり、特異的膜透過機序を有するように思われる。しかし、荷電の増加と発現量とは全く一致しないことが分かる。
【０１４０】
また、ＡｒｇによってｐＩ値が増加した先導配列（配列番号２３〜配列番号２７；ｐＩ値１１．５２〜１３．３５）と連結された接着性タンパク質の中で、ｐＩ値が１１．５２〜１２．５１に増加した先導配列（配列番号２３〜配列番号２４）の場合では、水溶性発現量が対照区であるｐＩ値が９．９０の先導配列（配列番号１５）と類似か若干増加した（２個のＡｒｇを有したｐＩ値１２．５１を有した先導配列、配列番号２４）が、その発現量の差は大きくなく、ｐＩ値が１２．９８、１３．２０及び１３．３５の先導配列（配列番号２５〜２７）の場合では、ｐＩ値の増加とともに水溶性発現量が減少した（表１及び図１ｂ参照）。発現量が最も低いｐＩ値１３．３５の先導配列（配列番号２７）は、比較的高い親水性値１．９３を示していて、先導配列部分における顕著な親水性値の増加は、脂質二重膜への結合力の増加により（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号）、膜透過力を減少させたと判断される。またこの場合、荷電の増加と発現量とは全く一致しないことが分かる。
【０１４１】
二つのＡｒｇが連結されたｐＩ値１２．５１の先導配列（ＭＲＲＡＫ、配列番号２４）は、発現が若干増加した結果を示した。前記先導配列を有した水溶性接着性タンパク質は、３／３頻度で予想より減少した分子量を示し、Ｎ−末端部分が切断されたことが示唆された（図１ｂのレーン３参照）。このような現象は、ペリプラズム分画でも同様に観察された（データなし）。しかし、他のＡｒｇが連結された先導配列では、先導配列部分に切断が観察されなかった。したがって、切断された先導配列の存在は、一種の蛋白質分解酵素が関与すると考えられ、人為的にＡｒｇが加えられた先導配列なども共通的にＡｒｇ特異的膜透過機序を有することが予想される。
【０１４２】
＜実施例５＞先導配列の低いｐＩ値による接着性タンパク質の水溶性発現への影響
本発明者等は、ｐＩ値が低く調節された先導配列のＮ−末端がＭｅｆｐ１タンパク質の水溶性発現に与え得る影響を確認した。
【０１４３】
具体的に、ＯｍｐＡＳＰ１−７×ｍｅｆｐ１＊を対照群に先導配列であるＭｅｔ（ＯｍｐＡＳＰ１）＋Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｍｅｆｐ１のＮ−末端）のアミノ酸配列を多様に変形することで、ｐＩ値２．７３〜７．６５を有する配列番号３５〜配列番号４１の先導配列の変異体［ＭＤＤＤＤＤＡＡ（配列番号３５；ｐＩ値２．７３）、ＭＤＤＤＡＡ（配列番号３６；ｐＩ値２．８７）、ＭＥＥ（配列番号３７；ｐＩ値３．０９）、ＭＡＥ（配列番号３８；ｐＩ値３．２５）、ＭＡＡ（配列番号３９；ｐＩ値５．６０）、ＭＣＨ（配列番号４０；ｐＩ値７．１３）、ＭＡＨ（配列番号４１；ｐＩ値７．６５）］を製造し（表２）、前記変異体のｐＩ値を分析し、対照群としてＭＡＫ（配列番号１５；ｐＩ値９．９０）及びＭＲＲＲＲＡＫ（配列番号２５；ｐＩ値１２．９８）を使用してその発現量を調査した。
【０１４４】
製作されたクローンベクターを実施例２の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してタンパク質を発現してその発現量を確認した結果、配列番号３５〜配列番号４１の先導配列を含むすべてのクローンで水溶性の接着性タンパク質が発現され、その中でもｐＩ値３．０９〜７．６５（配列番号３７〜配列番号４１）は、対照群のｐＩ値９．９０（配列番号１５）及び１２．９８（配列番号２５）より顕著に高い発現量を示し、特にｐＩ値が３．０９（配列番号３７）でその発現量が最も高かった（図２及び表２）。最も低い発現率を示した先導配列（配列番号３５；ｐＩ値２．７３）も、比較的高い親水性値１．０９を有していて、先導配列部分における顕著に増加した親水性値は、脂質二重膜への結合力の増加により（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号）、膜透過力を減少させたと判断される。また、この場合も荷電の増加と発現量とは一致しないことが分かる。
【０１４５】
（表２）組換えベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）ｏｍｐＡＳＰ１−７×ｍｅｆｐ１＊の先導配列（Met-Ala-Lys）変異体クローンの発現結果
2011504746.tif 000005
【０１４６】
＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２のＲａ及びＨｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）の余剰配列を示す。
【０１４７】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０１４８】
イタリックの太文字：先導配列（Met-Ala-Lys）及びその変異体をコードする多様な大きさのオリゴヌクレオチドを示す。
【０１４９】
一般文字：Ala-Lysを除いたＭｅｆｐ１三番目アミノ酸からをコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１５０】
（  ）：先導配列（Met-Ala-Lys）の変異体配列のｐＩ値を示す。
【０１５１】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で製作されたプライマーを示す。
【０１５２】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２に示されるＲａ（右側アダプター；Ａｒｇ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ）に相補的なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１５３】
組換えＭｅｆｐ１タンパク質の発現結果は、無発現の時「−」、弱発現時「＋／−」及び発現時「＋」の個数で発現量を表示した。
【０１５４】
＜実施例６＞元来形態（ｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）の接着性タンパク質生産のための先導配列と切断酵素認識部位（Ｘａ）距離の最適化
【０１５５】
実施例５においてＭｅｆｐ１タンパク質の先導配列により増加した発現の結果から、前記接着性外来タンパク質の先導配列の最適ｐＩ値の一つが３．０９（ＭＥＥ；配列番号３７）であることが確認された。続いて、前記ｐＩ値が３．０９の先導配列（ＭＥＥ）とＸａ因子認識部位（Ｘａ）との距離を前記先導配列と連結されたＭｅｆｐ１配列一部分の長さで最適化させて、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号に記載された方法で元来形態のアミノ末端を有した水溶性タンパク質を回収することができる融合タンパク質を生産した。これは、先導配列（ＭＥＥ）に連結されたＭｅｆｐ１目的タンパク質のアミノ酸配列の一部（Ｍｅｆｐ１３−８）を挿入配列（ｉｎｓｅｒｔ＝ｉ）に使用することで、先導配列の延長に起因する構造的変化を最小化するためである。
【０１５６】
具体的に、Ｘａ因子認識部位（Ｘａ）を含むようにＭＥＥ−（ｉ＝ｎ）−Ｘａの形態にデザインし、（  ）中に先導配列ＭＥＥに連結されたＭｅｆｐ１配列の一部分のアミノ酸ｎ＝０、２、４及び６を挿入して最適タンパク質発現のためのｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＭＥＥ−（ｉ＝ｎ）−Ｘａ−７×ｍｅｆｐ１＊）クローンを製造した（表３）。
【０１５７】
製作されたクローンベクターを実施例２の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してタンパク質を発現してその発現量を確認した結果、ＭＥＥとＸａ間の距離が４のとき最も顕著に発現量が減少し、正確にはｉ＝０＞２＞６＞４の順に発現量が減少した（図３）。また、前記水溶性タンパク質は、切断酵素認識部位を含んでいるので、前記の方法で生産された組換えタンパク質を切断酵素Ｘａ因子で処理することにより、公知された方法によってＭＥＥ−（ｉ＝ｎ）−Ｘａが除去された元来形態のＮ−末端を有する組換えタンパク質（７×Ｍｅｆｐ１＊）を生産することができる。
【０１５８】
（表３）組換えベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＭＥＥ−（ｉ＝ｎ）−Ｘａ−７×ｍｅｆｐ１＊）の発現結果
2011504746.tif 000006
【０１５９】
＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２のＲａ及びＨｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）の余剰配列を示す。
【０１６０】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０１６１】
太い文字：先導配列（ＭＥＥ）のオリゴヌクレオチド。
【０１６２】
イタリック太文字：表２の先導配列（ＭＥＥ）クローンでＭＥＥに連結されたＭｅｆｐ１配列の一部分（Ｍｅｆｐ１３−８）のオリゴヌクレオチドを示す。
【０１６３】
ATC GAA GGT CGT：Ｘａ因子切断酵素認識部位のオリゴヌクレオチドを示す。
【０１６４】
一般文字：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の配列番号１のＭｅｆｐ１基本単位アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１６５】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で製作されたプライマーを示す。
【０１６６】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２に示されるＲａ（右側アダプター；Ａｒｇ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ）に相補的なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１６７】
組換えＭｅｆｐ１タンパク質の発現結果は、無発現時「−」、弱発現時「＋／−」及び発現時「＋」の個数で発現量を表示した。
【０１６８】
（ｉ）：先導配列（ＭＥＥ）とＸａ間に挿入されたアミノ酸の数を示す。
【０１６９】
＜実施例７＞ＯｍｐＡＳＰ１−１１内でＬｙｓ距離調節による接着性タンパク質の水溶性発現
本発明者等は、接着性外来タンパク質の水溶性発現にシグナル配列を含むＮ−末端のｐＩ値が影響を与え得ることを確認した後、ＯｍｐＡシグナル配列断片（ＯｍｐＡＳＰｔｒ）でｐＩ値に影響を与えることができるアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）の距離が、Ｍｅｆｐ１タンパク質の水溶性発現に与え得る影響を確認した。具体的に、先導配列ＭＫＫ（配列番号５６）とＭＫＡＫ（配列番号１６）は、タンパク質のＮ−末端で計算的に同じｐＩ値１０．５５を有するが、Ｌｙｓ間にｐＩ値に影響を少なく与えるアミノ酸（例えば、Ａｌａ［アラニン；Ａｌａｎｉｎｅ；Ａ］）が含まれ、Ｌｙｓ間の距離（ｄｉｓｔａｎｃｅ＝ｄ）が減った場合にはその機能に差があることを予想した。
【０１７０】
それで、シグナル配列断片ＯｍｐＡＳＰ１−１１アミノ酸配列を基にＭＫ１−（ｄ＝ｎ）−Ｋ２−（８−ｎ）の類似形態にデザインし、（  ）中にｐＩ値に影響を与えないＯｍｐＡＳＰ１−１１組成アミノ酸ｄ１＝ｎ（０、２、４、６、８）を挿入してｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＫ１−（ｄ１＝ｎ）−Ｋ２−（８−ｎ）−ＡＡ−ｍｅｆｐ１３−１０−６×ｍｅｆｐ１＊］クローンを製造した（表４）。前記クローンの先導配列は、ＯｍｐＡＳＰ１−２断片（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ）から、ｐＩ値に影響を与えるＭｅｆｐ１の二番目のアミノ酸であるＬｙｓを、下線を引いたＡｌａに変異させた配列（Ａｌａ−Ａｌａ）までは、すべて同一なｐＩ値１０．５５を有している。表４のように製作されたクローンベクターを実施例２の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してタンパク質を発現し、その発現量を確認した。
【０１７１】
その結果、二つのＫ間の距離（Ｋ１−Ｋ２の距離ｄ１）が、ｄ１＝４＞２＞６＞０＞８の順に発現が減少した。したがって、ｄ１＝４で水溶性タンパク質が最も強く発現され、ｐＩ値に影響を与えるアミノ酸の最適距離であることが確認された。追加的に、ｄ１＝４にして、前記クローンの下線を引いたＡｌａをＬｙｓ（Ｋ３）に代替した後、Ｋ２とＫ３間にｄ２＝ｎ（１、２、３、４）個のＡｌａを挿入してｐＥＴ−２２ｂ（＋）［ＭＫ１−（ｄ１＝４）−Ｋ２−（ｄ２＝ｎ）−ＡＫ３−ｍｅｆｐ１３−１０−６×ｍｅｆｐ１＊］クローンを製造し（表４）、前記と同じ方法で発現量を確認した。
【０１７２】
その結果、Ｋの間（Ｋ２−Ｋ３の距離ｄ２）は、ｄ２＝２が最適で、ｄ２＝２＞１＞４＞３の順に最適距離が確認され、このような最適距離に対する結果は、接着性タンパク質の水溶性発現と直接的な関連があることが解明された。
【０１７３】
また、前記結果は、先導配列のｐＩ値及びＬｙｓ−Ｌｙｓ間の距離が重要な要因であって、配列が重要な要因ではないということを示している（表４及び図４）。
【０１７４】
結論として、接着性タンパク質の先導配列断片のｐＩ値が水溶性発現に決定的に影響を及ぼし、ｐＩ値スペクトルによる最大発現ｐＩ値が存在した。しかしながら、接着性タンパク質の水溶性発現と荷電とは関連がなかった。また、ｐＩ値に影響を与えるアミノ酸Ｌｙｓの間の距離が重要な要因であることを示した。
【０１７５】
（表４）組換えベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）ｏｍｐＡＳＰ１−１１−７×ｍｅｆｐ１＊のＯｍｐＡＳＰ１−１１変異体クローンのプライマー、先導配列及びＭｅｆｐ１の発現結果
2011504746.tif 000007
2011504746.tif 000008
【０１７６】
＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２のＲａ及びＨｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）の余剰配列を示す。
【０１７７】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０１７８】
イタリック文字：接着性タンパク質のＮ−末端（Ala-Ala）と連結されたシグナル配列断片ＯｍｐＡＳＰ１−１１またはその変異体先導配列をコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１７９】
イタリック太文字：先導配列断片でのLysアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１８０】
Ala：接着性タンパク質のＮ−末端のAla-LysのLysがAlaに代替された。
【０１８１】
一般文字：Ala-Lysを除いたＭｅｆｐ１三番目アミノ酸からをコードするオリゴヌクレオチドを示す。
【０１８２】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で製作されたプライマーを示す。
【０１８３】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の図２に示されるＲａ（右側アダプター；Ａｒｇ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ）に相補的なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１８４】
組換えＭｅｆｐ１タンパク質の発現結果は、無発現時「−」で、発現時「＋」の個数で発現量を表示した。
【０１８５】
（ｄ）：Lys間の距離を示す。
【０１８６】
＜実施例８＞Ｎ−末端変異体によるヒラメヘプシジンＩの発現の調査
本発明者等は、ヒラメヘプシジンＩ（Ｋｉｍ等，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５年，第６９巻，ｐ．１４１１−１４１４）は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号による前記ヘプシジンＩの水溶性発現にシグナル機能と分泌エンハンサーが同時に必要であるという結果を根拠にして、本実施例では、ヘプシジンＩの先導配列Ｎ−末端ｐＩ値の調節による水溶性発現のために、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターに多様なｐＩ値のシグナル機能と分泌エンハンサー機能を同時に有する先導配列またはシグナル配列ＯｍｐＡＳＰ断片の変異体、分泌エンハンサー候補配列または／及びＸａ因子認識部位（Ｘａ）とｏｆＨｅｐＩが作動可能にポリヌクレオチドが連結されるようにｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターに組換えすることで製作した（表５〜表６）。
【０１８７】
前記表５及び表６のように製作したＮ−末端を有した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に通常の方法に形質転換してＬＢ培地［トリプトン２０ｇ、酵母抽出物）５．０ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＫＣｌ１．８６ｍｇ／ｌ］に、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと一緒に３０℃で１６時間培養した。培養後培養液をＬＢ培地を使用して２００倍に希釈した。希釈培養液に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加してＯＤ６００値が０．３になるように培養した。発現のために３時間培養した。培養液１ｍｌを４，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離してペレットを１００〜２００μｌ試料バッファー（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、１％グリセロール、０．１％ブロムフェノールブルー）で懸濁した。懸濁液は、タンパク質を分離するためにソニケーターを使用して、１５×２−ｓサイクルパルス（３０％出力）で粉砕し、細胞残物を除去するために、１６，０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離を遂行して非水溶性部分を分離した。水溶性分画のタンパク質をブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６年，第７２巻，ｐ。２４８−２５４）で定量した後、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、Ｌａｅｍｍｌｉなどの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年，第２２７巻，ｐ．６８０−６８５）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行してクマシブルー染色法（Ｓｉｇｍａ，米国）で染色した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行したゲルをニトロセルロース膜（Ｒｏｃｈｅ，米国）に移動させた。次に、５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ，米国）に浸した後、膜を０．４μｇ／ｍｌ抗−Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）が含まれた溶液に３７℃、２時間浸けた。次に、ＨＲＰ−結合ウサギ抗−マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を２次抗体に使用して、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ，米国）を染色液に使用して染色した。
【０１８８】
＜実施例９＞先導配列のｐＩ値調節によるヒラメヘプシジンＩの水溶性発現
本発明者等は、実施例４及び５と類似に、先導配列のｐＩ値調節によるヒラメヘプシジンＩの水溶性発現に及ぼす影響を確認した。
【０１８９】
そこで、ヒラメヘプシジンＩの水溶性タンパク質への発現のために、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号の分泌エンハンサーをスクリーニングする方法と同様に、前記タンパク質のＮ−末端をＭｅｔと分泌エンハンサー候補配列を含むようにＭｅｔ−７×同型アミノ酸が連結された形態にデザインして、ｐＩ値が２．５２〜１３．２８に調節され疎水性／親水性値−１．５５〜＋１．９７に調節されたタンパク質の発現のためのｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｍｅｔ−７×同型アミノ酸−ｏｆｈｅｐＩ＊＊）クローンを製造した（表５）。前記同型アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）などが同一なアミノ酸配列で７回連続されたものの中から選択された。前記疎水性値は、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）によってホップアンドウッドスケール（ウインドウサイズ：６、シキイ値：０．００）で計算した。前記疎水性値が＋になる場合、ペプチドは親水性を帯び、−になる場合は疎水性を帯び、絶対値が大きいほど親水性または疎水性の程度が高いことを意味した。
【０１９０】
製作されたクローンベクターにより実施例８の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換してタンパク質を発現させ、その発現量を確認した。その結果、MRRRRRRR配列（ｐＩ１３．２８、疎水性値＋１．９７［親水性］）及びMKKKKKKK配列（ｐＩ１１．２８、疎水性値＋１．９７［親水性］）を有したクローンでのみ、ヘプシジンＩの水溶性発現が観察された（図５）。
【０１９１】
（表５）組換えベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｍｅｔ−７×ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａａｓ−ｏｆｈｅｐＩ＊＊）の発現
2011504746.tif 000009
【０１９２】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０１９３】
太い文字：ｐＩ値及び疎水性値に影響を与える先導配列部分の多様な大きさのオリゴヌクレオチドを示す。
【０１９４】
ｏｆｈｅｐＩ：ｏｌｉｖｅ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  Ｈｅｐｃｉｄｉｎ  Ｉ（ｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩ：ｏｆＨｅｐＩ）の遺伝子を示す（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号；Ｋｉｍ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５年，第６９巻，ｐ．１４１１−１４１４）。
【０１９５】
＊＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号のＧｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ−６×Ｈｉｓを示す（Ｇｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩは、逆方向プライマーデザインから由来）。
【０１９６】
一般文字：ヘプシジンＩ部分のオリゴヌクレオチドを示す。
【０１９７】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で製作されたプライマーを示す。
【０１９８】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号のｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩのＣ−末端及びＧｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ部分が含まれた相補配列のオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１９９】
組換えｏｆＨｅｐＩ＊＊発現結果は、無発現時「−」で、発現時「＋」の個数で発現量を表示した。
【０２００】
疎水性値：ホップアンドウッドスケール（ウインドウサイズ：６、シキイ値：０．００）によるＤＮＡＳＩＳＴＭで計算した。ホップアンドウッドスケールによる疎水性値が、＋が出る場合、当該ペプチドは親水性を帯びて、−が出る場合は疎水性を帯びる。絶対値が大きいほど親水性または疎水性の程度が高いことを意味する。
【０２０１】
＜実施例１０＞ヒラメヘプシジンＩの水溶性発現にシグナル配列変異体の低いｐＩ値が及ぼす影響
比較的高いｐＩ値１０．５５を有したＯｍｐＡＳＰ１−１０をシグナル配列に使用してヒラメヘプシジンＩの水溶性タンパク質への発現結果は、韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で報告した。しかし、本研究で接着性タンパク質の場合、実施例４及び実施例５の結果を通じて先導配列の高いｐＩ値だけではなく、低いｐＩ値でも水溶性発現が増加されることが分かった。それで、本発明者等は、ヒラメヘプシジンＩの水溶性発現にシグナル配列変異体の低いｐＩ値が及ぼす影響を調査した。
【０２０２】
具体的に、先導配列は、シグナル配列断片ＯｍｐＡＳＰ１−３の変異体［ＭＡＨ（配列番号４１）；７．６５、ＭＡＡ（配列番号３９）；５．６０またはＭＥＥ（配列番号３７）；３．０９］−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×同型アミノ酸（多様なｐＩ値と疎水性値を有したアミノ酸）−Ｘａ因子認識部位（Ｘａ）が順に連結された形態にデザインし、それからプシジンＩの発現のためのクローンを製造した（表６）。前記同型アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）などが同一なアミノ酸配列で６回連続されたものの中から選択した。前記疎水性値は、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（日立、日本）によってホップアンドウッドスケール（ウインドウサイズ：６、シキイ値：０．００）で計算した。前記疎水性値が＋になる場合ペプチドは親水性を帯び、−になる場合は疎水性を帯び、絶対値が大きいほど親水性または疎水性の程度が高いことを意味した。
【０２０３】
表６のクローンベクターにより実施例８の方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換してタンパク質を発現させ、その発現量を確認した。その結果、組換えタンパク質ＭＡＨ（ｐＩ７．６５）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊は良好に発現し、ＭＡＨ（ｐＩ７．６５）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ｇｌｕ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊も非常に弱く発現し、ＭＡＡ（ｐＩ５．６０）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊は良好に発現し、ＭＡＡ（ｐＩ５．６０）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ｇｌｕ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊も非常に弱く発現し、ＭＥＥ（ｐＩ３．０９）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ａｒｇ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊はある程度発現し、ＭＥＥ（ｐＩ３．０９）−ＯｍｐＡＳＰ４−１０−６×Ｇｌｕ−Ｘａ−ｏｆＨｅｐＩ＊＊は比較的良好に水溶性に発現した（図６）。
【０２０４】
このような結果は、Ｍｅｔに分泌エンハンサー配列を直接連結した場合、水溶性発現は高いｐＩ値と親水性を有したアミノ酸であるＡｒｇ及びＬｙｓに限られた。しかし、疎水性部分を有したシグナル配列断片のＮ−末端のｐＩ値を変化させた場合、高いｐＩ値と高い親水性アミノ酸だけではなく、Ｇｌｕのような低いｐＩ値と高い親水性を有したアミノ酸も、分泌エンハンサー配列に使用することができ、分泌エンハンサー配列の幅が拡がることが分かる。したがって、このような結果は、先導配列のＮ−末端に連結された疎水性部分がＮ−末端断片自体の親水性を低下させて、断片をシグナル配列のような自由なアンカー機能として機能させ、その結果親水性の分泌エンハンサー配列の範囲を拡大することが示唆された。また、この結果は、シグナル配列断片のＮ−末端のｐＩ値変異によって連結された分泌エンハンサー配列による水溶性発現量の差があることから、先導配列Ｎ−末端ｐＩ値と分泌エンハンサー配列の間には一種の相互性があることが予想される。
【０２０５】
（表６）組換えベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ｏｍｐＡＳＰ１−２  ａａｓ−ｏｍｐＡＳＰ４−１０−６×ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａａｓ−Ｘａ−ｏｆｈｅｐＩ＊＊）の発現
2011504746.tif 000010
2011504746.tif 000011
【０２０６】
ｏｆｈｅｐＩ：ｏｌｉｖｅ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  Ｈｅｐｃｉｄｉｎ  Ｉ（ｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩ）の遺伝子を示す（Ｋｉｍ等，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５年，第６９巻，ｐ．１４１１−１４１４）。
【０２０７】
＊＊：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号のＧｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ−６×Ｈｉｓを示す（Ｇｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩは、逆方向プライマーデザインに由来）。
【０２０８】
CAT：ＮｄｅＩ位置を保存するために延長された。
【０２０９】
太文字：ｐＩ値に影響を与えるシグナル配列変異体のオリゴヌクレオチドを示す。
【０２１０】
イタリック太文字：分泌エンハンサー候補配列で多様なｐＩ及び疎水性値と関連したアミノ酸のオリゴヌクレオチドを示す。
【０２１１】
一般文字：ヘプシジンＩ部分のオリゴヌクレオチドを示す（韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号；Ｋｉｍ等，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５年，第６９巻，ｐ．１４１１−１４１４）。
【０２１２】
Ａ：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号で製作されたプライマーを示す。
【０２１３】
逆方向プライマー：韓国公開特許第１０−２００７−０００９４５３号のｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎＩのＣ−末端及びＧｌｕ／ＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ部分が含まれた相補配列のオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０２１４】
組換えｏｆＨｅｐＩ＊＊発現結果は、無発現時「−」、弱発現時「＋／−」及び発現時「＋」の個数で表示した。
【０２１５】
疎水性値：ホップアンドウッドスケール（ウインドウサイズ：６、シキイ値：０．００）によるＤＮＡＳＩＳＴＭで計算した。ホップアンドウッドスケールによる疎水性値が、＋が出る場合、当該ペプチドは親水性を帯びて、−が出る場合は疎水性を帯びる。絶対値が大きいほど親水性または疎水性の程度が高いことを意味する。
【０２１６】
当業者は、本願明細書に開示された概念及び特定の実施の形態が、本発明の同一目的を提供するために、他の態様を修飾若しくは変更する基礎として、容易に使用できることを理解するべきである。また、当業者は、このような等価の態様が、請求の範囲に定義したような発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解するべきである。
【図１Ａ】
2011504746.tif 000013
【図１Ｂ】
2011504746.tif 000014
【図２】
2011504746.tif 000015
【図３】
2011504746.tif 000016
【図４Ａ】
2011504746.tif 000017
【図４Ｂ】
2011504746.tif 000018
【図５】
2011504746.tif 000019
【図６】
2011504746.tif 000020
【配列表】
2011504746000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月3日(2010.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域のｐＩ値および／または先導配列を含む、ｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離が調節された、ポリペプチド断片またはその変異体をコードする、ポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項２】
Ｎ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片は、ｐＩ値が９．９０〜１１．４１に調節された１〜６個のアミノ酸で構成されるポリペプチド、またはｐＩ値が３．０９〜９．８９に調節された１〜１２個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチド；ならびに、
（ｉｉｉ）該ポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、ｐＩ値が調節された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項４】
Ｎ−領域を含むポリペプチド断片のｐＩ値が２〜４．９または５．０〜１１．０に調節されることを特徴とする、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか一項記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した形質転換体。
【請求項６】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．８９または９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
６）工程５）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項７】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜４．９または５．０〜１１．０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；ならびに、
５）工程４）の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
【請求項８】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．８９または９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
７）工程６）の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項９】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜４．９または５．０〜１１．０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；ならびに、
６）工程５）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項８または請求項９記載の方法によって製造された組換え融合外来タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
脳疾患の治療に使用されることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．８９または９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
８）工程７）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項１４】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜４．９または５．０〜１１．０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；ならびに、
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
【請求項１５】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が３．０９〜９．８９または９．９０〜１１．２８に調節された先導配列を設計する工程；
２）先導配列内でｐＩ値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程；
３）工程１）の先導配列、工程２）の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
４）工程３）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
５）工程４）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
６）工程５）の形質転換体を培養する工程；
７）工程６）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
８）工程７）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
９）工程８）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【請求項１６】
１）シグナル配列および／または外来タンパク質の先導配列のＮ−領域を含むｐＩ値が２〜４．９または５．０〜１１．０に調節された先導配列を設計する工程；
２）工程１）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程；
３）工程２）の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程；
４）工程３）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
５）工程４）の形質転換体を培養する工程；
６）工程５）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；
７）工程６）の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程；ならびに、
８）工程７）の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に伝達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明は、組換えタンパク質の不溶性沈澱を防止し、細胞質外またはペリプラズムへの分泌効率を向上させることによって、組換え外来タンパク質の生産に有用に使用するのみならず、強力な分泌エンハンサーを用いて膜透過性を向上させて、治療用タンパク質の伝達に有用に用いることができる。
[請求項101]
(i)プロモーター、ならびに
(ii)該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域のpI値および/または先導配列を含む、pI値に影響を与えるアミノ酸間の距離が調節された、ポリペプチド断片またはその変異体をコードする、ポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
[請求項102]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片は、pI値が9.90〜11.41に調節された1〜6個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであることを特徴とする、請求項101に記載の発現ベクター。
[請求項103]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片は、pI値が3.09〜9.90に調節された1〜12個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであることを特徴とする、請求項101に記載の発現ベクター。
[請求項104]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片が、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)及びヒスチジン(His)からなる群から選択される塩基性アミノ酸が加えられるか、本来の酸性アミノ酸が前記塩基性アミノ酸に代替されることでpI値が高くなることを特徴とする、請求項102に記載の発現ベクター。
[請求項105]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片が、アスパラギン酸(Asp)またはグルタミン酸(Glu)の酸性アミノ酸が加えられるか、本来の塩基性アミノ酸が前記酸性アミノ酸に代替されることでpI値が低くなることを特徴とする、請求項103に記載の発現ベクター。
[請求項106]
ポリペプチド断片におけるpI値に影響を与えるアミノ酸間の距離が、グリシン(Gln)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、トリプトファン(Trp)、メチオニン(Met)、システイン(Cys)及びプロリン(Pro)からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン(Ser)、スレオニン(Thr)、チロシン(Tyr)、アスパラギン(Asn)及びグルタミン(Gln)からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことによって調節されることを特徴とする、請求項101に記載の発現ベクター。
[請求項107]
遺伝子コンストラクトが、N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの前に連結されたタンパク質切断酵素認識部位をコードするヌクレオチドを追加で含むことを特徴とする、請求項101に記載の発現ベクター。
[請求項108]
先導配列とタンパク質切断酵素認識部位をコードするヌクレオチドの間の距離が、グリシン(Gln)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、トリプトファン(Trp)、メチオニン(Met)、システイン(Cys)及びプロリン(Pro)からなる群から選択される中性の無極性アミノ酸、またはセリン(Ser)、スレオニン(Thr)、チロシン(Tyr)、アスパラギン(Asn)及びグルタミン(Gln)からなる群から選択される中性の極性アミノ酸を追加で含むことで、0〜2に調節されることを特徴とする、請求項107に記載の発現ベクター。
[請求項109]
遺伝子コンストラクトが、外来タンパク質をコードする遺伝子の挿入のための制限酵素認識部位を追加で含む、請求項101〜請求項108のいずれか一項記載の発現ベクター。
[請求項110]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項109に記載の発現ベクター。
[請求項111]
(i)プロモーター;
(ii)該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチド;ならびに、
(iii)該ポリペプチド断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、pI値が調節された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチド、
で構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
[請求項112]
N-領域を含むポリペプチド断片のpI値が5〜11に調節されることを特徴とする、請求項111に記載の発現ベクター。
[請求項113]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が11〜14に調節されることを特徴とする、請求項112に記載の発現ベクター。
[請求項114]
N-領域を含むポリペプチド断片のpI値が2〜5に調節されることを特徴とする、請求項111に記載の発現ベクター。
[請求項115]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が2〜14に調節されることを特徴とする、請求項114に記載の発現ベクター。
[請求項116]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片が、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)及びヒスチジン(His)からなる群から選択される塩基性アミノ酸が加えられるか、本来の酸性アミノ酸が前記塩基性アミノ酸に代替されることで、pI値が高くなることを特徴とする、請求項112に記載の発現ベクター。
[請求項117]
N-領域を含むpI値が調節されたポリペプチド断片が、アスパラギン酸(Asp)またはグルタミン酸(Glu)の酸性アミノ酸が加えられるか、本来の塩基性アミノ酸が前記酸性アミノ酸に代替されることで、pI値が低くなることを特徴とする、請求項114に記載の発現ベクター。
[請求項118]
分泌エンハンサーが、少なくとも60%が親水性アミノ酸である2〜50個のアミノ酸で構成されたペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項111に記載の組換え発現ベクター。
[請求項119]
分泌エンハンサーが、親水性アミノ酸が6〜20個反覆されたペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項111に記載の発現ベクター。
[請求項120]
親水性アミノ酸が、リジン、アルギニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項118に記載の発現ベクター。
[請求項121]
遺伝子コンストラクトが、分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに連結された、外来遺伝子の挿入のための制限酵素認識部位を追加で含む、請求項111に記載の発現ベクター。
[請求項122]
遺伝子コンストラクトが、作動可能に連結された外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを追加で含むことを特徴とする、請求項111に記載の発現ベクター。
[請求項123]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項122に記載の発現ベクター。
[請求項124]
膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質が、ヒラメヘプシジンIであることを特徴とする、請求項123に記載の発現ベクター。
[請求項125]
請求項101〜請求項124のいずれか一項記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した形質転換体。
[請求項126]
宿主細胞が、原核生物細胞または真核生物細胞であることを特徴とする、請求項125に記載の形質転換体。
[請求項127]
原核生物細胞が、ウイルス、大腸菌、およびバシラスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項126に記載の形質転換体。
[請求項128]
真核生物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、および植物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項126に記載の形質転換体。
[請求項129]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が9.90〜11.28に調節された先導配列を設計する工程;
2)先導配列でpI値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程;
3)工程1)の先導配列、工程2)の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
4)工程3)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
5)工程4)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;ならびに、
6)工程5)の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
[請求項130]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項129に記載の方法。
[請求項131]
工程2)のpI値に影響を与えるアミノ酸がLysであることを特徴とする、請求項129に記載の方法。
[請求項132]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が3.09〜9.90に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;ならびに、
5)工程4)の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
[請求項133]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項132に記載の方法。
[請求項134]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が5〜11に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;ならびに、
5)工程4)の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
[請求項135]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項134に記載の方法。
[請求項136]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が11〜14に調節されることを特徴とする、請求項134に記載の方法。
[請求項137]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が2〜5に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;ならびに、
5)工程4)の形質転換体の培養物から目的タンパク質の水溶性発現量が最も高い形質転換体を選別する工程、
を含む、外来タンパク質の分泌効率を向上させる方法。
[請求項138]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項137に記載の方法。
[請求項139]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が2〜14に調節されることを特徴とする、請求項137に記載の方法。
[請求項140]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が9.90〜11.28に調節された先導配列を設計する工程;
2)先導配列内でpI値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程;
3)工程1)の先導配列、工程2)の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
4)工程3)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
5)工程4)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
6)工程5)の形質転換体を培養する工程;ならびに、
7)工程6)の培養液から前記組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
[請求項141]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項140に記載の方法。
[請求項142]
工程2)のpI値に影響を与えるアミノ酸がLysであることを特徴とする、請求項140に記載の方法。
[請求項143]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が3.09〜9.90に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;ならびに、
6)工程5)の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
[請求項144]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項143に記載の方法。
[請求項145]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が5〜11に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;ならびに、
6)工程5)の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
[請求項146]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項145に記載の方法。
[請求項147]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が11〜14に調節されることを特徴とする、請求項145に記載の方法。
[請求項148]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が2〜5に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;ならびに、
6)工程5)の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程、
を含む、組換え融合外来タンパク質の製造方法。
[請求項149]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項148に記載の方法。
[請求項150]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が2〜14に調節されることを特徴とする、請求項148に記載の方法。
[請求項151]
請求項140または請求項150記載の方法によって製造された組換え融合外来タンパク質。
[請求項152]
請求項151記載の組換え融合外来タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
[請求項153]
脳疾患の治療に使用されることを特徴とする、請求項152に記載の薬学的組成物。
[請求項154]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が9.90〜11.28に調節された先導配列を設計する工程;
2)先導配列内でpI値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程;
3)工程1)の先導配列、工程2)の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
4)工程3)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
5)工程4)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
6)工程5)の形質転換体を培養する工程;
7)工程6)の培養液から組換え融合外来タンパク質を分離する工程;ならびに、
8)工程7)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
[請求項155]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項154に記載の方法。
[請求項156]
工程2)のpI値に影響を与えるアミノ酸がLysであることを特徴とする、請求項154に記載の方法。
[請求項157]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が3.09〜9.90に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;ならびに、
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
[請求項158]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項157に記載の方法。
[請求項159]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が5〜11に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;ならびに、
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
[請求項160]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項159に記載の方法。
[請求項161]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が11〜14に調節されることを特徴とする、請求項159に記載の方法。
[請求項162]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が2〜5に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;ならびに、
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を分離する工程、
を含む、元来形態の外来タンパク質の生産方法。
[請求項163]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項162に記載の方法。
[請求項164]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が2〜14に調節されることを特徴とする、請求項162に記載の方法。
[請求項165]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が9.90〜11.28に調節された先導配列を設計する工程;
2)先導配列内でpI値に影響を与えるアミノ酸間の距離を調節する工程;
3)工程1)の先導配列、工程2)の距離調節部位、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
4)工程3)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
5)工程4)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
6)工程5)の形質転換体を培養する工程;
7)工程6)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;
8)工程7)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程;ならびに、
9)工程8)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
[請求項166]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項165に記載の方法。
[請求項167]
工程2)のpI値に影響を与えるアミノ酸がLysであることを特徴とする、請求項165に記載の方法。
[請求項168]
細胞内に送達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項165に記載の方法。
[請求項169]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が3.09〜9.90に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程;ならびに、
8)工程7)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
[請求項170]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含まないタンパク質であることを特徴とする、請求項169に記載の方法。
[請求項171]
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項169に記載の方法。
[請求項172]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が5〜11に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程;ならびに、
8)工程7)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に伝達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
[請求項173]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項172に記載の方法。
[請求項174]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が11〜14に調節されることを特徴とする、請求項172に記載の方法。
[請求項175]
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項172に記載の方法。
[請求項176]
1)シグナル配列および/または外来タンパク質の先導配列のN-領域を含むpI値が2〜5に調節された先導配列を設計する工程;
2)工程1)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、タンパク質切断酵素認識部位、及び外来タンパク質をこの順に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを製造する工程;
3)工程2)の遺伝子コンストラクトを通常の発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを製造する工程;
4)工程3)の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程;
5)工程4)の形質転換体を培養する工程;
6)工程5)の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程;
7)工程6)の融合外来タンパク質を前記タンパク質切断酵素認識部位を切断することができるタンパク質切断酵素で切断した後、元来形態の外来タンパク質を除いた先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを分離する工程;ならびに、
8)工程7)の先導配列、親水性分泌エンハンサー、及びタンパク質切断酵素認識部位を含むペプチドを、細胞内に送達させようとする目的物質と結合させる工程、
を含む、目的物質の送達のための細胞内運搬体の製造方法。
[請求項177]
外来タンパク質が、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、および両親媒性ドメインの一つまたは複数を含むタンパク質であることを特徴とする、請求項176に記載の方法。
[請求項178]
工程2)の親水性分泌エンハンサーのpI値が2〜14に調節されることを特徴とする、請求項176に記載の方法。
[請求項179]
細胞内に伝達させようとする物質が、天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、ポリペプチド、アンチセンスペプチド核酸、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物、及び生理活性分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項176に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011504746000001.app
【国際調査報告】
2011504746.tif 000041