(57)【要約】  本発明は、人間の繊維芽細胞においてLPAとAC抑制剤がAMPKを抑制することによって、老化された人間繊維芽細胞の細胞増殖現象を誘導する分子的メカニズムに関するものである。  さらに詳しくは、本発明はLPAとACIが有効成分として含有された組成物において、LPAとACIがAMPKαの互いに異なるリン酸化を調節することによりp53を非活性化させて老化細胞の増殖現象を誘導し、このような結果から、老化細胞の細胞増殖現象にAMPK信号伝達が重要な作用をすることを証明した。【選択図】なし
2011520872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジン酸、及びアデニリルシクラーゼの抑制剤を有効成分として含有する老化細胞の細胞老化調節用組成物。
【請求項２】
前記アデニリルシクラーゼの抑制剤は、2',5'-ジディオキシアデノシン、シス-N-(2-フェニルシクロペンチル)アザシクロトリデック-1-エン-2-アミン、及び9-(テトラヒドロ-2'-フリル)アデニンから構成された群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記リゾホスファチジン酸の有効量は1乃至50μMであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記アデニリルシクラーゼ抑制剤の有効量は1乃至500μMであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記老化細胞は、人間細胞から由来したものであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
リゾホスファチジン酸、及びアデニリルシクラーゼの抑制剤の有効量を老化細胞に処理する段階を含む細胞の老化調節方法。
【請求項７】
前記アデニリルシクラーゼの抑制剤は、2',5'-ジディオキシアデノシン、シス-N-(2-フェニルシクロペンチル)アザシクロトリデック-1-エン-2-アミン、及び9-(テトラヒドロ-2'-フリル)アデニンから構成された群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の調節方法。
【請求項８】
前記リゾホスファチジン酸の有効量は1乃至50μMであることを特徴とする 請求項6に記載の調節方法。
【請求項９】
前記アデニリルシクラーゼ抑制剤の有効量は1乃至500μMであることを特徴とする請求項6に記載の調節方法。
【請求項１０】
前記老化細胞は、人間細胞から由来したものであることを特徴とする請求項6に記載の調節方法。
【請求項１１】
リゾホスファチジン酸、及びアデニリルシクラーゼの抑制剤の有効量を患者に投与する段階を含む細胞老化の調節を必要とする患者の細胞老化調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾホスファチジン酸(LPA)及びアデニリルシクラーゼ(ACI)を有効成分として含有する細胞老化調節用組成物に関するものであって、さらに詳しくは、LPA及びACIを有効成分として含有する細胞老化調節用組成物、及びこれらの有効量を老化細胞に処理する段階を含む細胞老化調節方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞老化は、発達、成熟及び腫瘍形成を含む複雑な生物学的過程において重要な役割を果たし、細胞老化の基本的な特徴を理解するための多くの試みがなされている(Peacocke and Campisi, 1991; Smith and Pereira-Smith, 1996)。細胞老化の特徴の一つは、成長因子及びマイトジェンに対する反応性低下(hyporesponsiveness)である。
【０００３】
一方、リゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid: LPA)は、人間の二倍性繊維芽細胞において細胞内Ca2+の移動、アクチン重合及びホスファチジン酸の生成を含む同一な信号伝達現象を誘導する主なマイトジェンアゴニストであって、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(G−タンパク質)を通じて細胞外メッセンジャー(extracellular messenger)として作用する。また、LPAはLPA受容体を通じて細胞の模様、走化性や分化といった多様な生物学的効果を示す物質として知られている(Moolenaar, 2000; Moolenaar et al., 1997)。LPA受容体にはLPA1、LPA2、そしてLPA3のようなアイソタイプ(isotype)があり、これらは百日咳毒素に敏感なGiαと結合(An et al., 1998)してアデニリルシクラーゼの活性を抑制し、その結果、cAMPを減少させる(Taussig et al., 1993)。
【０００４】
興味深いことに、LPAは若い細胞でcAMPの量を減少させ、老化細胞ではcAMPを増加させて下部信号伝達系を調節する(Jang et al., 2006a; Jang et al., 2003; Jang et al., 2006b)。cAMP信号伝達とAMPK信号伝達の相互連関性は、筋肉、肝、そして脂肪細胞においてよく知られている(Cohen and Hardie, 1991; Kahn et al., 2005; Long and Zierath, 2006)。哺乳類のAMPKはserine/threonineキナーゼ活性を有するタンパク質であって、触媒サブユニットであるαと、二つの調節サブユニットであるβとγからなっている。AMPKはαサブユニットの活性化ループにあるThr172がリン酸化されると、活性化される。AMPKの活性調節において一番重要な因子であるAMPがγサブユニットに結合すると、AMPKの上位キナーゼ(AMPKKともいう)によるリン酸化が誘導される。AMPKKとしては、ポイツ・イエーガー症候群から変異されて発見されたLKB 1/STK11 (Hawley et al., 2003; Shaw et al., 2004; Woods et al., 2003a)、カルシウム/カルモジュリン依存タンパク質キナーゼキナーゼ(CaMKK)-α and β(Hawley et al., 2005; Hong et al., 2005; Hurley et al., 2005; Woods et al., 2005)、そしてTAK1 (Woods et al., 2003a)が挙げられる。
【０００５】
AMPKのThr172に加え、αとβサブユニットに他のリン酸化部位が存在することが明らかになったが、これらがAMPK活性を調節する役割に対してはよく知られていない(Mitchelhill et al., 1997; Stein et al., 2000; Warden et al., 2001; Woods et al., 2003b)。その中でも、AMPKα1のSer485 (AMPKα2の場合、Ser491に該当)は自己リン酸化部位であって(Horman et al., 2006)、PKA (Hurley et al., 2006)や、protein kinase B(PKB)/AKT (Hahn-Windgassen et al., 2005; Horman et al., 2006; Soltys et al., 2006)によってリン酸化されると知られている。PKAやPKB/AKTによるSer485/491リン酸化は、α-Thr-172の接近性を減少させ、結局、AMPKのThr-172のリン酸化を減少させてAMPKの活性化を阻害する。
【０００６】
腫瘍抑制遺伝子(tumor suppressor gene)産物であるp53は、Ser15がAMPKによってリン酸化されて活性化されるが、この過程は、このタンパク質が核へ移動して転写活性を示すのに必須的である。p53の転写活性はp53-依存的なサイクリン依存性キナーゼ(cyclin-dependent kinase: cdk)阻害剤の役割をするp21タンパク質の量調節に関与する。Cdkは真核細胞の細胞周期を司る主要酵素である。正常的な真核細胞では、信号伝達体系(signal transduction pathway)を通じて外部から成長信号を受けると、一定過程の細胞周期によって細胞増殖が起こる。このとき、cdkは細胞周期の各段階毎に特異的に発現されるサイクリン(cyclin)という調節タンパク質と結合することによって機能的単位体を形成するようになり、これによって、細胞周期の各段階毎に活性化される特異的サイクリン−cdk複合体が作られるようになる。サイクリン−cdk複合体の活性は様々なメカニズムによって調節されるが、その例として、cdkはリン酸化又は脱リン酸化されるか、特定抑制タンパク質と結合することもあり、サイクリンが分解(proteolysis)されることもある。細胞周期は正確な時間に、正確な場所で進行されるように調節される。このような細胞周期の精巧な調節は、サイクリン−cdk複合体を含んだ様々な調節因子によって誘導される。このような調節メカニズムの一例として、p21タンパク質がある。DNAが損傷されると、活性化される癌抑制遺伝子であるp53がp21遺伝子発現を誘導する。p21はS-phaseを誘導するサイクリン−cdk複合体に結合してCDK 4/6/2のキナーゼ活性を阻害することによって、Rbのリン酸化を防ぐ。その結果、細胞はG1に留まりながら、損傷されたDNAを修理する時間を得るようになる。
【０００７】
AMPKはp53をリン酸化させ、これにより、p21の発現を増加させることによって細胞増殖を抑制すると知られている。しかし、上述したように、このような細胞内分子種の細胞増殖に対する理論は多様に提案されており、このような現象をさらに明確にすることが要求されている。
【発明の概要】
【０００８】
発明の開示
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは上記のような細胞増殖に関与する細胞内分子種及び信号伝達体系をより明確にするために鋭意努力した結果、LPAの場合、若い細胞と老化細胞の両方において細胞の増殖を誘導するのに対し、ACIは若い細胞では細胞増殖を減少させるが、老化細胞では細胞増殖を誘導するという事実を発見した。このような事件にはAMPKが深く関連されていることを発見した。このようにLPAとACIが互いに異なるようにAMPKのリン酸化を調節することによってAMPKの活性を減少させ、老化細胞の増殖が増加されることを証明し、LPA及びACIを同時に処理する場合、LPA及びACIを単独で処理した場合より、さらに効果的に細胞増殖が誘導されることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の目的はLPA及びACIを有効成分として含有する細胞老化調節用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、LPA及びACIの有効量を老化細胞に処理する段階を含む細胞老化調節方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、LPA及びACIを含む組成物を、細胞老化調節が必要とされる患者に投与する細胞老化調節方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、添付された請求範囲及び図面とともに、下記の詳細な記載によってさらに明確になる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、LPA及びACIを有効成分として含有する細胞老化調節用組成物、及びこれらの有効量を老化細胞に処理する段階を含む細胞老化調節方法に関するものであって、本発明の細胞老化用組成物及び細胞老化調節方法を用いて老化細胞の細胞老化を調節する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】LPAとACIが老化細胞の細胞増殖とS期への導入に及ぼす影響を示した結果であって、（A）及び(B)は継代培養をした若い細胞(PD 20: A)と老化した細胞(PD 64: B)にLPA及びACIを単独又は同時に処理した後、1、2、そして4日間培養して細胞を計数した結果を示したグラフであり、(C)は若い細胞と老化した細胞を2日間無血清培地で育て、細胞が育たない状態(G0/G1期)に停止させた後、LPA及びACIを単独又は同時に処理し、1、2、そして4日間培養して細胞を計数した結果を示したグラフである。  このとき、(A)及び(B)の細胞の計数は対照群と比較して、意味のある数字を表示し、有意水準は0.001に定め、P値0.001以下を意義あるものと判読し、(C)の細胞周期はフローサイトメトリーを使用して分析した。S期への導入された細胞の程度は3回繰り返した値を計算し、有意水準は0.001に定め、P値0.001以下を比較群と対照して意義あるものと判読した。
【図２】軟アガー実験法(soft agar assay)により、LPAとACIが若い細胞と老化細胞で細胞群集(colony)を形成しないという事実を確認した結果である。10％牛血清と0.3％トップアガーを含むDMEM培地に若い細胞と老化細胞を分散させて60mm培養皿にある0.6％基礎アガー層上に分株させ、30 μM LPA (L)、300 μM ACI (A)、そしてLPAとACIを同時に3週間処理したグループを何も処理しなかった対照群とともに70％エタノールで固定させ、トリパンブルー(trypan blue)で染色した後、顕微鏡で観察して形成された細胞群集を計数した。陽性対照群として HelaとHepG2癌細胞株を軟アガー皿に分株し、上記のように LPA、ACI、LPA+ACIで処理し、細胞群集を形成するか否かを確認した。 軟アガー皿で細胞群集を形成する数字を平均 +/-標準偏差の形態で表記し、各実験は最小3回以上繰り返して実施した。
【図３】若い細胞と老化細胞においてp21とサイクリンD1の発現にLPAとACIが及ぼす影響を示す結果であって、a-f, g-l及びm-rは、それぞれ継代培養をした若い細胞(PD 20:Y)と老化細胞 (PD 65:S)を無血清培地で48時間育てた後、LPA(a-f)、及びACI(g-l)を単独又は同時に(m-r)処理し、1、2、そして4日間培養して細胞を4％過酸化水素で固定した後、p21waf1/cip1 (A)とサイクリンD1 (B)抗体を使用して染色し、免疫蛍光で確認した写真である。このとき、核はDAPIで染色した。
【図４】若い細胞と老化細胞、そして若者と老人の背中の皮膚でAMPKの発現程度を確認した結果であって、(A)は継代培養をした若い細胞(PD 20:Y)と、老化した細胞(PD 64:S)からタンパク質を抽出し、45μgの同量のタンパク質を使用してAMPKα、p-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、p53、p-Ser15- p53、p21waf1/cip1、そしてβ-actinの発現程度を確認したウェスタンブロッティング結果写真であり、(B)は継代培養をした若い細胞(a, c, e, g, i)と老化細胞(b, d, f, h, j)を固定した後、抗AMPKα (a, b)、抗p-Thr172-AMPKα (c, d)、抗 抗p-Ser485/491-AMPKα (e, f)、抗p53 (g, h)、抗p-Ser15-p53 (i, j)で染色し、発現程度を確認した結果(核はDAPIで染色した)であり、(C)は10歳の少年と58歳の人の背中の皮膚において、AMPKα (a, b)、p-Thr172-AMPKα (c, d)、p53 (e, f)、そして抗p-Ser15-p53 (g, h)の抗体を使用し、実験材料と方法に記述したとおりに免疫染色して発現量を確認した蛍光写真である。それぞれの実験は3回繰り返して同一な結果を得た。
【図５】AICARとAMPKIが若い細胞と老化細胞でAMPKの活性化と細胞の増殖に及ぼす影響を示した結果であって、(A)及び(B)は若い細胞と老化細胞を2日間無血清培地で育てた後、4日間10mMのAMPK抑制剤であるAMPKI (A)と10 mMのAMPK活性剤であるAICAR (B)を処理し、このように処理した細胞からタンパク質を抽出してAMPKα and p-Thr172-AMPKα、総 p53、p-Ser15-p53、そしてp21waf1/cip1のタンパク質量を免疫ブロッティングで確認した結果であり、(C)及び(D)は若い細胞(C)と老化した細胞(D)に10 mM AMPKIと10 mMのAICARを処理して4日間培養した後、細胞計数方法で細胞増殖の程度を測定した結果を示したグラフである。このとき、実験はそれぞれ3回ずつ繰り返して、P値0.001以下のものを対照群と比較し、意義あるものと判読した。
【図６】LPAとACIが若い細胞と老化細胞のAMPKとp53のリン酸化に及ぼす影響を示した結果であって、(A)及び(B)は継代培養をした若い細胞 (PD 18:A)と老化した細胞 (PD 64:B)に30μMのLPAと300μMのLPA及びACIを単独、又は同時に処理し、1、2、そして4日間培養した後、培養した細胞からタンパク質を抽出してAMPKα、p-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、p53、p-Ser15- p53、p21waf1/cip1、そしてβ-actinのタンパク質量を免疫ブロッティングで確認した写真である。
【図７】PKA抑制剤であるRp-cAMP処理後、LPAとACIが老化細胞のAMPKのリン酸化に及ぼす影響を示した結果であって、(A)及び(B)は老化した細胞 (PD 64)に 10mMのPKA抑制剤であるRp-cAMPを1時間前処理し、LPA (A)及びACI (B)をそれぞれ単独処理して1、2、そして4日間培養した後、培養した細胞からタンパク質を抽出し、同量の45μgタンパク質を用いてAMPKα、p-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、p53、p-Ser15-p53, p21waf1/cip1、そしてβ-actinのタンパク質量を免疫ブロッティングで確認した写真である。
【図８】LPAとACIが老化細胞でLKB1のリン酸化に及ぼす影響を示した結果であって、継代培養をした若い細胞(PD 18)と老化した細胞(PD 64)に30 μMのLPAと300 μMのLPA及びACIを単独、又は同時に処理し、1、2、そして4日間培養した後、培養した細胞からタンパク質を抽出し、同量の45μgタンパク質を用いてLKB1とp-Ser431-LKB1、そしてβ -actinのタンパク質量を免疫ブロッティングで確認した写真である。
【図９】LPA及びACIが老化細胞のAMPK活性を調節する模型図であって、(A)は若い細胞に対するLPA及びACIの影響の模型図であり、若い細胞にLPAを処理すると、cAMPの量が減少し、PKAの活性が抑制され、結果的にAMPKの活性を増加させるp-Ser485/491-AMPKの活性を減少させてAMPの活性が減少されるが、LPAはまた、PKAに依存的なLKB1のリン酸化を減少させ、結局、AMPKの非活性化を増加させるp-Thr172- AMPKの量を減少させて、AMPKの活性を減少させるようになる。ACIはcAMP/PKAを減少させてp-Ser485/491- AMPKαのリン酸化を抑制し、LKB1もまた、少し活性化させることによって、結果的にp-Thr172-AMPKαのリン酸化が増加され、AMPKが活性化されるようになる。その結果、若い細胞ではむしろACIによって細胞増殖が減少される結果を示す。  (A)は老化細胞に対するLPA及びACIの影響の模型図であって、老化した細胞にLPAを処理すると、LPAがcAMPの量を増加させてPKAを活性化させることによって、AMPKα上のSer485/491のリン酸化が増加されてAMPK自体の活性を減少させ、それと同時にp-Thr172-AMPKαのリン酸化もまた減少させることによって、AMPKの活性を減少させる結果をもたらす。逆に、ACIの場合にはp-Ser485/491-AMPKαのリン酸化には変化を与えず、LKB1とLKB1のリン酸化を減少させることによってp-Thr172-AMPKαのリン酸化を減少させ、AMPKの活性を減少させる結果をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、LPA及びACIを有効成分として含有する細胞老化調節用組成物に関するものである。
【００１７】
また、本発明はLPA及びACIの有効量を老化細胞に処理する段階を含む細胞老化調節方法に関するものである。
【００１８】
本発明で使用される用語「老化(senescene)」は「老化(aging)」と同一な意味を有する。細胞を関連して、用語「若い細胞(young cell)」は「老化前(presenescent)」の幼い細胞を意味する。特に定義がないと、本明細書に使用される全ての技術的、そして科学的用語は当業者に通常的に理解される意味と同一な意味を有する。例えば、本明細書に使用される用語はBenjamin Lewin, Genes VII (Oxford University Press(2000);、及びKendrew et al., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd.(1994))から確認することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施例によると、本発明に適切な細胞は人間、豚、牛などを含む哺乳動物の細胞から由来するものであって、より好ましくは人間細胞であり、最も好ましくは人間の繊維芽細胞である。
【００２０】
本発明の方法は何の老化細胞にも適用することができるが、治療の目的でより重要な細胞は、中枢神経系で(a)複製能(replicative capacity)を有する細胞：例えば、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患及び脳卒中のような老化−関連疾病で重要な役割をするアストロサイト、内皮細胞及び繊維芽細胞；(b)外皮(integument)に制限された複製能を有する細胞：例えば、皮膚アトロピ、弾性繊維分解(elastolysis)及び皮膚皺、皮脂線過形成、老人性黒点、毛髪白化、及び毛髪損失、慢性皮膚潰瘍及び老化−関連傷治癒能の弱化といった外皮の老化−関連疾病で重要な役割をする繊維芽細胞、皮脂線細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞及び毛嚢細胞；(c)関節軟骨に制限された複製能を有する細胞：例えば、退行性関節疾患で重要な役割をする軟骨細胞、及び陰窩及び滑繊維芽細胞(lacunal and synovial fibroblasts)；(d)骨に制限された複製能を有する細胞：例えば、骨粗鬆症で重要な役割をする造骨細胞、骨髄間質(stromal)繊維芽細胞及び骨前駆細胞；(e)免疫系に制限された複製能を有する細胞：例えば、老化関連免疫系弱化で重要な役割をするB及びTリンパ球、単球、好中球(neutrophil)、好酸球、好塩基性白血球、NK細胞及びこれらの各々の前駆細胞；(f)血管系に制限された複製能を有する細胞：例えば、動脈硬化、石灰化、血栓及び動脈瘤といった血管系の老化−関連疾患で重要な役割をする表皮細胞、平滑筋細胞及び外膜繊維芽細胞(adventitial fibroblast)、及び(g)目に制限された複製能を有する細胞：例えば、黄班変性で重要な役割をする着色された上皮及び血管内皮細胞である。
【００２１】
本発明の好ましい実施例によると、LPAを老化細胞に単独で使用すると、細胞内cAMPの量が増加される。一方、アデニリルシクラーゼ(ACI)を単独で使用する場合、若い細胞と老化細胞でPKAの活性を通じて完全に下位信号伝達が遮断され、若い細胞では細胞の数字を減少させ、老化細胞では細胞の数字を増加させる。また、老化細胞でp21とサイクリンD1の発現を減少させてS期導入を増加させ、老化細胞を若い細胞のような形態に変化させる。しかし、LPAとACIを老化細胞に同時に処理すると、LPA及びACIを単独で処理したときより、さらに効果的に細胞増殖が誘導されることを発見し、このような現象は若い細胞に処理したときとは違う様相であった。また、LPA及びACIが老化細胞に処理されるとき、細胞内AMPKの活性が減少され、これにはLPAとACIが互いに異なるようにAMPKの活性を調節し、互いに異なるようにThr172-AMPKαのリン酸化に関与することを確認した。従って、LPAとACIによる老化調節はAMPKの活性と関係があることが分かった。
【００２２】
本発明の老化細胞に対する老化調節用組成物及び老化調節方法において、前記LPA及びACIは同時に、又はLPA及びACIを順番と関係なく順次処理することを全て含む。また、細胞の老化調節に必要な前記LPA及びACIの有効量はそれぞれ1乃至50μM、及び1乃至500μMであり、好ましくは30乃至50μM、及び200乃至300μMである。
【００２３】
また、前記アデニリルシクラーゼ抑制剤は、例えば、2',5' - ジディオキシアデノシン(2',5'-ジデオキシアデノシン)、シス - N - (2-フェニルシクロペンチル)アザシクロトリデック-1-エン- 2 -アミン (シス-N-(2-フェニルシクロペンチル)アザシクロトリデセ-1-エン-2-アミン: MDL12,330A ハイドロクロライド)、及び9-(テトラヒドロ-2'-フリル)アデニン (9-(テトラヒドロ-2'-フリル) アデニン: SQ22536)があり、最も好ましくは9-(テトラヒドロ-2'-フリル)アデニンであるが、これに特に限定されるものではない。
【００２４】
本発明の組成物は、有効成分の生理的活性を最大限維持させるために適正量の塩及びPH調節剤が溶解された緩衝溶液を含むことができる。本発明の有効成分が効果的に作用するようにするために、分散剤、又は安定化剤をさらに含めて投与することができる。
【００２５】
本発明の組成物にタンパク質が含まれる場合、本発明の組成物は、通常、薬剤学的に許容される担体を含むことができ、これらには炭水化物類化合物(例：ラクトース、アミロース、デクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、でんぶん、セルロースなど)、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物性油(例：とうもろこし油、綿種子油、豆油、オリーブ油、ココナッツ油)、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は上記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の組成物は薬剤学的に許容される組成物の全ての投与経路で投与することができる。詳しくは、経皮、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与である場合には静脈内注入、皮下内注入、筋肉組織内注入などで投与することができ、好ましくは筋肉内注入で投与することができる。
【００２７】
本発明の組成物の適合した投与量は、薬剤学的組成物の投与方法を適用することができ、これによって製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、普通に熟練された医者は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。
【００２８】
本発明の組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び/又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量形態に製造されるか、又は多容量容器内に内入させて製造されることができる。この際に剤形は、オイル又は水生媒質中の溶液、懸濁液、又は乳化液形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤形態であり、分散剤又は安定化剤を追加的に含むことができる。また、有効成分の生理的活性を最大限維持させるために適正量の塩及びPH調節剤が溶解された緩衝溶液を含むことができる。
【００２９】
また、本発明はLPA及びACIの有効量を含む組成物を細胞老化調節が必要とされる患者に投与する細胞老化調節方法に関するものである。
【００３０】
本発明の細胞老化調節方法は、LPA及びACIの有効量を含む組成物を治療対象に投与して老化関連疾患が治療及び改善される効果が優れており、前記 LPA及びACIの有効量を含む組成物、及びこれを細胞に処理する細胞老化調節方法で言及した事項と同一である。
【００３１】
前記「老化関連疾患」は、例えば、中枢神経系疾患であるアルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患及び脳卒中；皮膚外皮疾患である皮膚アトロピ、弾性繊維分解(elastolysis)及び皮膚皺、皮脂線過形成、老人性黒点、毛髪白化、及び毛髪損失、慢性皮膚潰瘍及び老化−関連傷治癒能の弱化；関節軟骨疾患である退行性関節疾患、骨粗鬆症；免疫系関連疾患；血管系疾患である動脈硬化、石灰化、血栓及び動脈瘤；眼科疾患である黄班変性などがあり、これに限定されるものではない。
【００３２】
また、本発明の治療対象となる患者は人間を含む全ての哺乳動物であり、好ましくは人間である。
【００３３】
以下、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３４】
＜実施例＞
1.実験材料
細胞培養のための培地としては、Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM: JBI)を使用し、 LPA、propidium iodide (PI)、そしてトリパンブルー(trypan blue)はシグナ社 (Sigma, St. Louis, MO, USA)から購入した。10% 牛胎児血清(FBS)、細胞培養に使われる抗生剤であるペニシリンとストレプトマイシンはGibco/BRL社(Carlsbad, CA, USA)から購入した。AMPKα、p-Thr172-AMPKα、 p-Ser485/491-AMPKα、p53、p-Ser15-p53、そしてp21WAF1/CIP1に対する多クローン性抗体は殆どCell Signaling社(Beverly, MA, USA)から購入し、β-actinに対する多クローン性抗体はSanta Cruz社(Santa Cruz, CA, USA)から購入した。PKAの抑制剤であるRp-cAMP、ACの抑制剤であるACI(SQ22536)はCalBiochem社 (San Diego, CA, USA)から購入し、二次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼが付いている抗ウサギ-IgG、抗マウス-IgGはZymed社(South San Francisco, California, USA)から購買した。免疫ブロッティングのためのNC膜(nitrocellulose membrane)はSchleicher& Schuell(Dassel, Germany)から購入し、タンパク質定量に使われるBCA (bicinchoninic acid)とECL (enhanced chemiluminescence)セットはPierce-バイオテクノロジー社(Lockford, IL, USA)のものを使用した。免疫組織化学染色のためのベクタスタイン・エリート・エイビイシイ・キット(Vectastain elite avidin-biotin complex kit)はベクターラボラトリーズ (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)から、EnVision検査システムはDakoCytomation社 (Carpinteria, CA, USA)から、オートメーションバッファーはBiomeda社 (Foster City, CA, USA)から購入して使用した。
【００３５】
2.細胞培養
人の繊維芽細胞は新生児の陰茎包皮(foreskin)から一次培養(primarily culture)を通じて確保した(Boyce and Ham, 1983)。一次培養は10％牛胎児血清と1％抗生剤を添加したDMEM培地で実施した。若い細胞のタンパク質量は初期継代培養細胞 population doubling (PD) 25未満の細胞を使用し、老化細胞は PD 65-70以上の継代培養細胞を使用して比較した。老化細胞は若い細胞と比べてそのサイズが大きく、かつ平らになり、多核化されるという形態的変化を示し、ベータガラクトシダーゼ活性が増加し、細胞増殖が減少されるという特徴を示した(Yeo et al., 2000)。
【００３６】
細胞にLPAとACIを処理するときには細胞培養皿の表面積の60-70％程度が満たされたとき、1−2日間、血清のないDMEMで培養する。この際、細胞はGo/G1状態であって、細胞の増殖が抑制される。その後、血清のないDMEMに0.1％BSAを添加してLPAとACIを処理した後、二日以上、細胞を培養させた。このような方法でLPA及びACI単独、LPA＋ACI、AMPKI、そしてAICARを若い細胞と老化細胞に処理して、生きている細胞の数を1日、2日、そして4日にわたってトリパンブルーで染色し、細胞増殖を確認した。
【００３７】
3.タンパク質抽出及び免疫ブロッティング
タンパク質の発現水準を確認するために人の繊維芽細胞を用意し、これを冷たい溶解用緩衝溶液(25 mM Hepes, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1% Triton X-100 and protease inhibitors)に溶解し、これを4℃で9000rpmで10分間遠心分離してその上澄液を取り出した。この細胞から得た抽出物でBCL法を使用してタンパク質を定量した。このように得たタンパク質を同量(45μｇ)取って、SDS-PAGEで電気泳動し、分離させた。分離されたタンパク質を電気泳動ゲルからNC膜に移動させた。その後、ブロット(transferされたNC membrane)を5％脱脂粉乳が入っているTTBS(Tris Buffered Saline with Tween-20)で1時間、非特異性タンパク質の結合を遮断させた後、希釈された1次抗体と4℃で一晩中、抗原抗体反応をさせた。その後、ブロットをTTBSで洗滌し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が付いている抗-IgGsを5％脱脂粉乳が入っているTTBSに1：5000に希釈し、常温で1時間反応させた。その後、TTBSで洗滌して抗原抗体の非特異的結合をなくした後、過酸化酵素基質を含んでいるECL キット(Pierce)を用いてＸ線フィルム(Kodak)に現像・印画し、それぞれのタンパク質を確認した。
【００３８】
4.免疫蛍光染色
まず、24ウェルプレートにカバースリップ(coverslips)を敷き、適正数の若い細胞と老化細胞を分株した。実験によってそれぞれ処理された細胞らは、培地を除去してPBSで2回洗滌した後、4％過酸化水素で固定し、2％BSAが含まれたPBS(遮断血清)で非特異性タンパク質の染色を遮断した。この細胞らを抗AMPKα、抗p-Thr172-AMPKα、抗p-Ser485/491-AMPKα、抗p53、抗p-Ser15-p53、抗p21waf1/cip1、抗サイクリン D1などの一次抗体で染色した。核を染色するために、DAPIをともに1：1000に希釈して染色した後、Zeiss LSM 510レーザースキャニング顕微鏡を使用して観察した。
【００３９】
5.免疫組織化学染色
人の皮膚を生検し、PBS(pH 7.4)に溶かした4％ホルマリンで固定した。この組織を冷たい10％過酸化水素に入れて一晩中処理した後、パラフィン包埋組織を作って5 mm厚みに薄切りした。薄切りされた包埋組織を作ってキシレンとアルコールで脱パラフィンと含水処理をさせた。それぞれの抗体によって10 mMクエン酸塩緩衝溶液に700ｗで10分間電子レンジで沸かした。その後、切片を15分間3％過酸化水素に浸し、内因性過酸化酵素の作用を遮断させた後、水洗した。このスライドを5％遮断血清に一晩中作用させて非特異性タンパク質の染色を遮断した。このスライドを抗AMPKα、p-Thr172-AMPKα、p53、p-Ser15-p53の一次抗体を用いて室温で1時間1：100に反応させた。一次抗体に反応させたスライドを3回 水洗した後、二次抗体を用いて室温で30分間反応させ、再び水洗し、HRPと反応させた。二次抗体はDakoCytomation EnVision detection system社の抗rabbitを使用した。HRPと反応させた後、DABを使用して発色し、染色した。スライドはエタノールで脱水し、キシレンで洗った後、封入した。このスライドはLeica DEF 280顕微鏡を使用してx200の比率で写真を撮った。
【００４０】
6.細胞周期分析
若い細胞と老化細胞を30 μM LPA、300 μM ACI、LPA+ACI、10 mM AMPKI、10 mM AICARで処理して1日/2日/4日間培養させた。細胞周期を分析するために緩衝溶液で二回洗った後、細胞を0.25％トリプシンを使用して遠心分離し、冷たい70％エタノールを使用して固定した。その後、RNaseが含まれた50 mg/mlのPIを使用し、フローサイトメトリー(Becton Dickinson FACSorter)を用いて分析を行った。
【００４１】
7.統計学的分析方法  
統計分析はGraph-Pad Prism (GraphPad, SanDiego, CA)を用いた。LPAを処理しなかったグループと、LPAを処理したグループ(1 day/2 day/4 day)間の比較のために事後検証方法でt-testを試行した。この際、統計的有意性を検定するための有意水準は0.001に定め、P値が0.001以下であるものを意義あると判読した。
【００４２】
＜結果＞
1.LPAとACIは老化細胞の増殖とS期への進入を増加させる。
【００４３】
老化細胞においてLPAによる細胞増殖現象とともにcAMP量が増加されることを確認(Yeo et al., 2002)したため、ACの抑制剤であるACIを使用してLPAによって高くなったcAMPの量を減少させたとき、細胞増殖現象にどのような影響を及ぼすのか調査した。無血清培地で二日間培養し、G0/G1期で細胞増殖を抑制した後、細胞をLPA、ACI、又はLPA＋ACIで処理して1、2、4日目に全体細胞数を測定するか、S期に進入される細胞数を測定して細胞増殖力を評価した。300 μM ACIを処理すると、若い細胞では細胞増殖が減少される反面(図1A)、老化細胞では対照群と比較して細胞増殖が増加したことを確認した(図1B)。若い細胞にLPAとACIを同時に処理すると、LPAのみ処理したときに増加していた細胞増殖力が完全に減少されることを確認した。しかし、老化細胞をLPAとACIで同時に処理すると、LPAやACIのみを単独で処理したときよりずっと高い細胞増殖力を確認することができた(図1B、ACI＋LPA)。
【００４４】
S期に進入された細胞の数もまた、LPAとACIを処理したときに類似した結果を示した。老化した細胞において、LPAとACIを同時に処理したときだけでなく、ACI単独でも、S期に導入された細胞の数が顕著に増加したことを確認した(図1C)。このような結果は、ACIの効果が若い細胞と老化した細胞で互いに異なるということを示す。すなわち、若い細胞ではLPAのみが細胞増殖力を増加させるが、老化した細胞ではLPAとACIが両方とも細胞増殖力を増加させることを確認した。
【００４５】
LPAとACIを繊維芽細胞と癌細胞群にも処理した後、軟アガーにおける実験方法(soft agar assay)によって確認した結果、癌細胞株とは違って、繊維芽細胞はLPAやACIのいずれを処理しても全く細胞群集を形成しないことを確認した(図2)。このような結果から、LPAとACIが正常的な細胞増殖のみを誘導し、細胞を変化させて腫瘍化させる要素ではないという事実を確認した。
【００４６】
2.老化細胞においてLPAとACIによるp21とサイクリンD1の発現減少
p21とサイクリンD1はpRbの脱リン酸化形態の維持に重要なタンパク質であって(Noda et al., 1994)、細胞の増殖とS期への進入を遮断するものとして知られており(Atadja et al., 1995; Stein et al., 1999)、老化細胞では顕著に増加されている。従って、免疫蛍光方法を使用して4日間、30 μM LPA、300 μM ACI、そしてLPA+ACIを同時に処理してp21とサイクリンD1の発現程度を確認した(図3A)。若い細胞にACIを単独、あるいはLPA+ACIを同時に処理して確認してみた結果、2日と4日目に一部分でp21の発現が増加したことを確認した(図3A)。
【００４７】
しかし、老化した細胞ではACIを処理した後、2日と4日目にp21の発現が減少されることを確認した。老化細胞は、ACIを処理した4日目に殆どの細胞が若い細胞のような形態に変化され、同じ顕微鏡領域で対照群と比べて多くの細胞を確認することができた(老化細胞は細胞サイズが大きく、同じ顕微鏡領域で細胞が多く見られない)。LPAとACIを老化細胞に同時に処理すると、ACIを単独で処理したものと比べてp21の発現が顕著に減少されるのを確認することができた。サイクリンD1も同様の様相を示した(図3B)。上記のような実験結果は、p21とサイクリンD1の増加がS期への導入と関連されていることを示し、老化細胞にACIを処理すると、p21とサイクリンD1の発現が減少されて老化細胞のDNA合成が増加し、細胞の増殖を誘導した。
【００４８】
3.老化細胞と老人の背中の皮膚細胞におけるAMPK活性
細胞内老化においてAMP:ATPの比率が増加してAMPKが活性化されるということは良く知られている(Wang et al., 2003)。p53は活性化されたAMPKの基質であって、AMPKによってSer15がリン酸化され、これはp21の発現に必須的である(Jones et al., 2005)。今回の実験を通じて若い細胞と老化細胞のAMPK活性を比較するためにAMPKαの活性化を示すThr172-AMPKαのリン酸化を免疫ブロッティングで確認した(図4A)。また、AMPKの活性化を減少させるSer485/491-AMPKのリン酸化や、p53、p-Ser15-p53、p21、そしてβ-actinも免疫ブロッティングで確認した。その結果、基本的にp-Thr172-AMPKα、p53、p-Ser15-p53、そしてp21のタンパク質発現が若い細胞で低いことを確認した。しかし、老化細胞ではAMPKの活性形であるThr172-AMPKαのリン酸化は増加されており、AMPKの不活性形であるSer485/491-AMPKαのリン酸化は減少されていることを確認した。全体的なAMPKの量は老化しても変わらなかった。しかし、p53のSer15のリン酸化とp21は老化細胞で増加されており、このような結果から、AMPKが活性化されていることを確認した。
【００４９】
若い細胞と老化細胞でp-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、そして p-Ser15-p53の発現を共焦点顕微鏡を通しても比較してみた(図4B)。AMPKはリン酸化とは関係なく殆どは細胞質に存在していたが、部分的には核にも存在していた。細胞でThr172-AMPKαのリン酸化は若い細胞と比べて老化細胞で増加されている反面、Ser485/491-AMPKαのリン酸化は若い細胞と比べて老化細胞で減少されていることを確認した。やはり殆どのp53は細胞質に存在していたが、老化細胞ではSer15-p53のリン酸化が核に蓄積されていることが見られた。
【００５０】
AMPKがリン酸化されて活性化された現象は、細胞だけでなく老化した固体でも増加されていることを、若い人と老化した人の背中の皮膚組織の免疫染色を通じて確認することができた(図4C)。AMPKαとp53の発現程度は若い人と老化した人の背中の皮膚において差異がなかった。しかし、p-Thr172-AMPKαは老化した人の背中の皮膚組織で、そしてp-Ser15-p53は若い人の背中の皮膚組織で増加されていることを確認することができた。上記のような結果から、活性化されたAMPKとp53の発現が老化した固体でも増加されており、殆ど核に存在することが分かった。
【００５１】
4.老化細胞の増殖はAMPKの活性によって調節される。
【００５２】
AMPKの活性が老化細胞の増殖を抑制するのかを知るために、AMPKの活性抑制剤であるAMPKIとAMPKの活性促進剤であるAICARを使用して調査した(図5)。この薬物を細胞に処理した後、p-Thr172-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現を測定した。AMPKαとp53、そしてβ-actinを対照群として使用した。AMPKIは若い細胞でp-Thr172-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現に影響を与えなかった(図5A)。p-Ser15-p53とp21の場合には若い細胞で発現自体が低かった。AMPKIは老化細胞で増加されていたタンパク質を完全に減少させることが分かった。AMPKIとは逆に、AICARの場合は、老化細胞で増加されていたタンパク質をむしろさらに増加させることが分かった(図5B)。何故なら、老化細胞でAMPKはp21の活性を増加させ、細胞の増殖を減少させるが、AICARの場合、若い細胞でもAMPKを増加させて細胞増殖を減少させ、AMPKIの場合には、老化細胞でAMPKを減少させ、p21の発現を減少させることによって、むしろ細胞の増殖を誘導した。
【００５３】
また、図5Cと図5Dに示したように、AMPKIが若い細胞と老化細胞でともに細胞の増殖を増加させ、AICARの場合、二つの細胞でともに細胞増殖を減少させたため、AMPKが活性化されると、若い細胞と老化細胞の細胞増殖が抑制されることを確認することができた。確かなことは、AMPKIによる老化細胞の細胞増殖(図5D)がAMPKの不活性化を通じたSer15-p53のリン酸化減少とp21の発現減少によるものであると予測することができる。逆に、AICARの場合、AMPKを活性化させることによってp53のリン酸化とp21の発現を増加させ、若い細胞と老化細胞でともに細胞増殖を抑制させたことを確認することができた。
【００５４】
5.若い細胞と老化細胞でLPAとACIによる相違したAMPKリン酸化様相
LPAとACIは両方とも老化細胞の増殖を増加させ、今回の実験を通じてこの薬物がAMPKのリン酸化に影響を与え、その活性を調節することを確認した。若い細胞でLPAを処理してから4日後にThr172-AMPKαとSer485/491-AMPKαのリン酸化がともに減少されることを確認した(図6A)。LPAを処理した後、対照群であるβ-actinとAMPKの量には変化がなかったが、p-Ser15-p53とp21の量は確認できなかった(若い細胞で基本的な発現が少ない)。老化細胞ではLPAを処理した4日目にThr172-AMPKαのリン酸化が減少され、Ser485/491-AMPKαのリン酸化は徐々に増加することを確認した(図6B)。また、老化細胞にLPAを処理した後、p-Ser15-p53、そしてp21の発現もまた減少された。
【００５５】
上記のような結果から、若い細胞にLPAを処理すると、AMPKの活性は減少するが、4日目までも少し残っているのに対し、老化細胞にLPAを処理すると、AMPKの活性が徐々に減少され、4日が経つと、殆ど抑制されることを確認し、LPAの場合には若い細胞と老化細胞の両方で細胞増殖現象を増加させることを確認した。しかし、LPAとは逆にACIを処理した後、一日が経つと、若い細胞でThr172-AMPKαのリン酸化を増加させ、Ser485/491-AMPKαのリン酸化は減少させることを確認した。
【００５６】
若い細胞ではSer15-p53とp21の発現は確認することができなかった(若い細胞は基本的に発現が少ない)。老化細胞でACIの場合にはSer485/491-AMPKαのリン酸化には影響を与えないが、Thr172-AMPKαのリン酸化は減少させることを確認した。また、老化細胞にACIを処理すると、Ser15-p53のリン酸化とp21の発現を減少させることを確認した。
【００５７】
上述したように、若い細胞ではACIがAMPKの活性を増加させて細胞の増殖を抑制させ、老化細胞ではACIがAMPKの活性を減少させて細胞の増殖を増加させることを確認した。
【００５８】
若い細胞にLPAとACIを同時に処理すると、ACIのみ単独で処理した同様のタンパク質の発現を確認することができた。LPAとACIを同時に処理した場合、若い細胞ではThr172-AMPKαのリン酸化が増加される反面、老化細胞では減少されることを確認することができた。老化細胞の細胞増殖増加はAMPKの活性減少とそれによるp53のリン酸化減少、そしてp21の発現によるものであることを確認することができた。
【００５９】
上述したように、老化細胞の細胞増殖現象にAMPKの活性抑制が重要であり、これはAMPKの多様な部位のリン酸化調節によるものであることを確認することができた。
【００６０】
6.LPAによる老化細胞のAMPK抑制に関与するPKA
以前の研究を通じて、PKC依存的なACイソ型(AC2/4/6)の発現が老化細胞で増加してその活性が増加し、結果的にcAMPの量が増加してcAMP依存型キナーゼであるPKAの活性が増加する結果を招くということが分かった(Jang et al., 2006b; Rhim et al., 2006)。また、AMPKの活性抑制に関与するSer485/591のリン酸化はPKAの活性によって調節(Hurley et al., 2006)され、PKAによる Ser485/591のリン酸化は、結局Thr172-AMPKαのリン酸化を減少させる結果を招くため、老化細胞でもPKAの信号伝達が重要であるのかを確認するためにPKAの抑制剤であるRp-cAMPを1時間前処理した後、観察した(図7)。
【００６１】
図7Aに示したように、老化細胞にPKAを抑制した後、LPAを処理すると、 p-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現が全く変わらないことを確認することができた。これは、PKAがLPAによるAMPKの活性調節において、Ser485/491のリン酸化増加を通じて上位信号伝達に重要な役割を果たすことを示す。
【００６２】
図7Bに示したように、老化細胞にPKAを抑制した後、ACIを処理したときも同様にp-Ser485/491の発現には変化がないことを確認することができ、 p-Thr172-AMPKα、p-Thr172-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現もまた、全く変わらないことを確認することができた。
【００６３】
ACIもまた、PKAによって下位の信号伝達が遮断されることを確認することができた。これにより、ACIも同様に老化細胞でPKAがACIによるAMPKの活性調節において重要な役割を担当することが分かった。
【００６４】
7.老化細胞においてLPAによる腫瘍抑制剤であるserine/threonineタンパク質リン酸化
酵素の一種であるLKB1のSer431のリン酸化が調節され、ACIによってLKB1タンパク質の発現が減少される。
【００６５】
最近、腫瘍抑制剤であるLKB1がAMPKKの一種であるという事実が明らかになった(Hawley et al., 2003; Shaw et al., 2004; Woods et al., 2003a)。Ser431-LKB1のリン酸化はLKB1の活性化形態で細胞の成長を増加させると知られているため(Sapkotaetal.,2001)、この実験を通じてLPAやACIを単独で処理するか、同時に処理したとき、p-Ser431-LKB1、LKB1、そしてβ-actinの発現にはどのような影響があるのかを調査した(図8)。若い細胞にLPAを処理した結果、Ser431-LKB1のリン酸化は徐々に減少した反面、LKB1の発現には大きな変化がないことを確認した。逆に、老化細胞にLPAを処理した結果、Ser431-LKB1のリン酸化が徐々に増加したことを確認した。
【００６６】
ACIの場合には、若い細胞でSer431-LKB1のリン酸化を増加させた反面、老化細胞ではLKB1とSer431-LKB1のリン酸化が徐々に減少されることを確認することができた。LPAとACIを同時に処理した場合も、若い細胞と老化細胞にACIを単独で処理したときとほぼ同一な結論を得ることができた。
【００６７】
＜討論＞
老化細胞にLPAを処理するとcAMPの量が増加されるため、ACの抑制剤 (SQ22536)でcAMPの量を減少させてcAMPが老化細胞の増殖において何の役割を果たすのかを調査した。興味深いことに、ACIは若い細胞と老化細胞でともにPKAの活性を完全に抑制したが、ACI処理によって若い細胞の数は減少するのに対し、老化細胞の数は増加することを確認した。ACIは老化細胞で二種類の細胞周期抑制剤であるp21とサイクリンD1の発現を減少させてS期に進入する細胞数を増加させたと推定することができる(Atadja et al., 1995; Stein et al., 1999)。また、ACIは多くの老化細胞を若い細胞のような形態に変化させることも確認した。若い細胞にLPAとACIを同時に処理すると、LPAのみ処理したときに起こった細胞の増殖増加、S期への進入増加、p21とサイクリンD1の発現減少現象が完全になくなることが分かった。一方、老化細胞にLPAとACIを同時に処理すると、LPAとACIを単独で処理したときより、さらに効果的に細胞増殖を誘導することを確認した。老化細胞でACIによるp21とサイクリンD1の発現減少が、DNA合成増加と細胞増殖を招く原因になったと推定することができる。今回の実験を通じて、LPAは若い細胞と老化細胞でともに細胞の増殖を誘導するのに対し、ACIは若い細胞の増殖は抑制するが、老化細胞の増殖は増加させることを確認した。
【００６８】
AMPKは正常細胞と腫瘍細胞で多様な細胞反応を調節することによって細胞の増殖を抑制する(Motoshima et al., 2006)。このようなAMPKは細胞が老化すると、活性が増加される(Wang et al., 2003)。AMPKの活性は、老化細胞でp53のSer15のリン酸化とこれによるp21の発現を通じて細胞周期を抑制させるものとして提案された(Jones et al., 2005)。結局、持続的なAMPKの活性化はp53依存的に細胞の老化を加速化させるようになる。今回の実験では繊維芽細胞にLPAやACIを処理すると、AMPKの活性を調節することによって細胞増殖を調節するという仮説に基づいて実験を行った。Thr172-AMPKαのリン酸化で評価されるAMPKの活性化、p53のSer15リン酸化、そしてp21の発現が老化細胞と老人の背中の皮膚組織で増加されていることを確認した。
【００６９】
LPAは若い細胞と老化細胞の両方でAMPKの活性化を減少させることを確認した。このようなAMPKの活性減少は若い細胞と老化細胞でLPAによる細胞増殖増加において一部の役割を担当することができる。老化細胞でLPAはp-Ser15-p53とp21の発現を減少させてGo/G1段階における細胞周期停滞を解くと認められる。ACIを単独で処理するか、LPAと同時に処理すると、若い細胞ではAMPKの活性が増加される反面、老化細胞ではAMPKの活性が減少することによって、若い細胞の増殖は減り、老化細胞の増殖は増加される結果が招かれる。今回の実験を通じて、LPAとACIがAMPKの活性を若い細胞と老化細胞で異なるように調節し、細胞増殖にも異なる影響を及ぼすことを確認した。
【００７０】
AMPKの活性は多様なAMPKKによる様々な部位のリン酸化によって調節され得る(Hurley et al., 2006)。LPAとACIがAMPKの様々な部位のリン酸化を異なるように調節するという仮説を確認するために、AMPKの活性形であるリン酸化されたThr172-AMPKαの水準とAMPKの不活性形であるリン酸化された Ser485/491-AMPKαの水準を調査した。LPAの場合、若い細胞と老化細胞でAMPKを活性化させるThr172-AMPKαのリン酸化を減少させる反面、ACIの場合、若い細胞ではThr172-AMPKαのリン酸化が増加されてAMPKが活性化され、老化細胞ではThr172-AMPKαのリン酸化が減少されてAMPKが不活性化されることを確認した。このようにLPAとACIが互いに異なるようにAMPKの活性を調節することによって、 若い細胞と老化細胞の細胞増殖に相違した効果をもたらした。Ser485/491のリン酸化はThr172のリン酸化を抑制するため、LPAによるSer485/491のリン酸化増加が老化細胞のAMPK活性を減少させたと推測することができる。
【００７１】
若い細胞でACIを単独で処理するか、LPAと同時に処理する場合には Ser485/491-AMPKαのリン酸化が減少し、AMPKの活性が増加して、若い細胞の細胞増殖が抑制された。老化細胞ではACIを処理すると、Ser485/491-AMPKαのリン酸化には変化がなかったが、ACI自体がThr172のリン酸化を抑制することによってAMPKの活性を減少させた。このような結果を通じて、老化細胞にはACIがAMPKの活性を抑制する別のメカニズムが存在することが分かった。
【００７２】
ACIの場合、LPAとは違って、AMPKKを調節してAMPKの活性を調節し、細胞の増殖を調節すると仮定することができる。ひどいエネルギー不足状態やその他の条件ではLKB1を活性化させてAMPKのThr172のリン酸化を誘導することができる(Hawley et al., 2003; Shaw et al., 2004; Woods et al., 2003a)。AMPKのThr172のリン酸化は、細胞内カルシウムが増加された状態でカルシウム/カルモジュリン酵素によってもリン酸化が増加され、AMPKを活性化させることができる(Hawley et al., 2005; Hong et al., 2005; Hurley et al., 2005; Woods et al., 2005)。AMPKの自己リン酸化部位であるSer485/491も細胞のエネルギー不足やその他の様々な刺激によるAMPK活性化を制限する役割を担当する(Hurley et al., 2006)。このSer485/491部位はインシュリン刺激によって活性化されるAkt/PKBによってもリン酸化され(Beauloye et al., 2001 Gamble and Lopaschuk, 1997; Kovacic et al., 2003; Witters and Kemp, 1992)、またcAMPの量を増加させる薬剤に反応して活性化されるPKAによってもリン酸化される(Hurley et al., 2006)。今回の実験は様々な上位信号のうち、PKAとLKB1の二つのタンパク質リン酸化酵素に焦点を合わせて実験を行った。
【００７３】
LKB1はSTRAD (STE20-related adaptor) α/βと、MO25 (mouse protein 25) α/βのような補助タンパク質と結合して複合体を形成しており、この複合体がLKB1の活性を増加させる。このようなLKB1/STRAD/Mo25複合体はAMPK/TSC2/mTOR経路の上位に存在するキナーゼとしてよく知られている(Hawley et al., 2003; Milburn et al., 2004)。LKB1の活性は既によく知られているSer431だけでなく、他の四箇所(Ser31、Ser325、Thr336、及びThr366)のリン酸化によって調節される(Sapkota et al., 2002; Sapkota et al., 2001)。基本的に若い細胞では老化細胞と比べてSer431-LKB1のリン酸化が増加されており、LKB1が活性化されるようになる。活性化されたLKB1がAMPKとp53の活性化とこれによるp21の発現増加によって、休止期にある若い細胞の増殖を中断させる原因となり得る。若い細胞にLPAを処理すると、LKB1自体の量の変化には影響を与えないが、リン酸化されたSer431-LKB1の水準が徐々に減ることを確認することができた。このようなLKB1の活性減少は、若い細胞でThr172-AMPKαのリン酸化を減らすことによってAMPKの活性を減少させた。ACIの場合には若い細胞でSer431-LKB1のリン酸化を増加させることによって、リン酸化されたThr172-AMPKαの量を増加させた。ACIは若い細胞でPKAを不活性化させることによって、PKA依存的なSer485/491αのリン酸化を減少させた。興味深いことに、ACIは若い細胞とは違って、老化細胞で全体LKB1タンパク質量とリン酸化されたLKB1の量をともに減少させることを確認した。このようなLKB1のリン酸化減少は、p-Thr172-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21発現減少を招く原因となり得る。
【００７４】
ACIはまた、老化細胞でPKAを不活性化させることによって、PKA依存的なSer485/491-AMPKのリン酸化とLKB1のSer431のリン酸化を減少させた。細胞にLPAとACIを同時に処理したときもACIを単独で処理したときと類似したLKB1とLKB1のリン酸化様相を確認することができたが、これは、ACIを単独で処理したときよりはその効果が低かった。
【００７５】
PKAは直接AMPKのSer485/491をリン酸化させるか(Hurley et al.,2006)、又は間接的にLKB1のリン酸化を通じてThr172-AMPKをリン酸化させる上位キナーゼである(Collins et al.,2000;Sapkotaetal.,2001)。従って、LKB1のリン酸化とこれによるAMPKの活性化は、LPAとACIによるPKAの活性変化によって調節され得る。若い細胞にLPAを処理すると、cAMPの量が減少することによってPKAの活性が減少されるため(Jang et al., 2006b)、LPAは若い細胞でSer485/491-AMPKαのリン酸化を減少させる。しかし、老化細胞ではLPAがPKAを活性化させることによって(Jang et al., 2006a)、PKA依存的なSer485/491-AMPKαのリン酸化を増加させ、これによりThr172-AMPKαのリン酸化は減少される。老化細胞をPKA抑制剤で処理すると、LPAによって誘導されるp-Thr172-AMPKα、p-Ser485/491-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現変化が完全に遮断されるため、恐らくPKAがSer485/491-AMPKαのリン酸化増加を通じてAMPKを不活性化させる主な上位タンパク質であることが分かる。結局、LPAは若い細胞ではSer431-LKB1のリン酸化を減少させるが、老化細胞では増加させる。従って、LKB1依存的なThr172-AMPKαのリン酸化はLPAによって若い細胞では減少する反面、老化細胞では増加し得る。老化細胞にPKA抑制剤を処理してPKAを不活性化させると、ACIによって誘導されるp-Thr172-AMPKα、p-Ser15-p53、そしてp21の発現減少が遮断されるため、PKAがACIによるAMPKの不活性化過程において重要な上位タンパク質の一つであることが分かる。また、PKAはさらに他の上位キナーゼであるCaMKKsをリン酸化させて、このAMPKKの活性を抑制し、Thr172-AMPKαのリン酸化を間接的に調節することができるため、PKA、LKB1、そしてCaMKKsの総体的な活性変化によってAMPK活性が調節されると言える。βアドレナリン作動性受容体（β-adrenergic receptors）を通じたホルモンの刺激だけでなく、運動や断食のような生理的な刺激は、PKA (Cohen and Hardie, 1991)とAMPK (Kahn et al., 2005; Long and Zierath, 2006)とをともに活性化させる結果を招きかねない。
【００７６】
AMPKの信号伝達系はLKB1、p53、TSC1やTSC2などのような多くの腫瘍抑制遺伝子を含み、これは多様な刺激による増殖因子の信号伝達を抑制する一種の代謝調節スイッチの役割を担当する。数々の研究結果は、AMPKの活性化が、細胞の老化や細胞の増殖を基盤として起こる動脈硬化症やインシュリン耐性、そして癌のような老化関連疾病の治療的対象になり得ると主張している(Igata et al., 2005; Luo et al., 2005; Motoshima et al., 2006; Shaw et al., 2004)。AICARによるAMPKの活性は人の血管平滑筋細胞のような正常細胞や癌細胞の細胞周期の停滞を誘導する。血管平滑筋細胞においてAICARはp53タンパク質の量とSer15-p53リン酸化を増加させることによって、Go/G1期にある細胞を増加させ、S期とG2/M期に進入された細胞の数を減少させる(Igata et al., 2005)。癌細胞においてAICARはp21、p27、そしてp53タンパク質の発現増加とともに、S期における細胞周期停滞を通じて多様な癌細胞の増殖を抑制した(Rattan et al., 2005)。今回の実験を通じて、AICARが若い細胞と老化細胞でAMPKの活性を増加させて細胞の増殖を抑制させたことを確認した。このようなAICARは若い細胞と老化細胞でp-Thr172-AMPKα、p53、p-Ser15-p53、そしてp21の発現を増加させることによって細胞の増殖を抑制させた。逆に、AMPKIは若い細胞と老化細胞の細胞増殖を増加させた。老化細胞にAMPKIを処理してAMPKの活性を抑制すると、 p-Thr172-AMPKα、p53、p-Ser15-p53、そしてp21の発現を減少させることによって、細胞の増殖だけでなく若い細胞のような形態変化まで誘導した。従って、LPAとACIによって細胞老化を防止するためには、AMPKの活性抑制が絶対必要であることが分かった。
【００７７】
結論として、今回の実験を通じて、老化細胞でLPAとACIが互いに異なるようにAMPKの活性を調節することをモデルを通じて提案した(図9）。AMPKの活性形αサブユニットは二つの主なリン酸化部位、すなわち、α-Thr172とα-Ser485/491を含む。Thr172-AMPKαがリン酸化される場合にはAMPK活性が増加され、Ser485/491-AMPKαがリン酸化される場合にはThr172-AMPKαのリン酸化を減らしてAMPK活性が抑制される。若い細胞にLPAを処理すると、細胞内cAMP量が減少し、PKAが抑制されて、結果的にSer485/491-AMPKαのリン酸化が減少されるようになる(図9A）。しかし、若い細胞でLPAはPKAに依存的なLKB1のリン酸化を減少させてThr172- AMPKαのリン酸化を減少させ、結果的にAMPKが不活性化されて細胞の増殖が増加するようになる。ACIはcAMP/PKA信号伝達システムを減少させるため、Ser485/491-AMPKαのリン酸化を減少させてAMPKを活性化させる。また、ACIは弱いながらもLKB1の活性を増加させてThr172-AMPKαのリン酸化と、これによるAMPK活性を増加させる。老化細胞をLPAで処理すると、細胞内cAMP量が増加し、PKAが活性化されてSer485/491-AMPKαのリン酸化を増加させ、Thr172-AMPKαのリン酸化は減少させることによってAMPKを不活性化させ、細胞の増殖を誘導するようになる（図9B）。逆に、ACIはSer485/491-AMPKαのリン酸化には変化を与えないが、LKB1の発現減少を通じてThr172-AMPKαのリン酸化を減少させ、究極的にAMPKを不活性化させることによって細胞増殖を誘導する。今回の発明は、老化細胞も若い細胞同様の細胞増殖能力を有しており、LPAとACIがAMPKの互いに異なる部位のリン酸化を調節することによってAMPKの活性を抑制し、老化細胞の増殖を誘導したことを示している。
【００７８】
以上のように本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのように具体的な技術は、ただ好ましい具現例であるたけで、これらによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物によって定義されるものである。
【００７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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