(57)【要約】  本発明は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質およびその遺伝子に関し、より詳細には、新規なスプライスバリアントであるプレ（γ）プロＧＤＮＦによってコードされており、生物学的制御下で分泌される、ＧＤＮＦタンパク質の新規スプライスバリアントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製したヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（γ）プロＧＤＮＦ）。
【請求項２】
配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ末端のロイシン残基がメチオニン残基で置換されてなる、配列番号６に示した修飾ヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント（プレ（γ）プロＧＤＮＦ）。
【請求項３】
配列番号２の１番〜１３４番アミノ酸と共に、配列番号２のアミノ酸−４７番〜−１番からなる配列の一部分であって、制御能を有するがシグナル配列を欠いた部分を包含する、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの成熟部分ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１９に示したアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロアミノ酸配列。
【請求項５】
配列番号２１に示したアミノ酸配列を包含する、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロアミノ酸配列。
【請求項６】
制御能を有する、配列番号２１に示したシグナル配列の一部分。
【請求項７】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端の３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号２４に示したアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの短縮型ポリペプチド。
【請求項８】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端の３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号２６に示したアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの短縮型ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の３９番〜１３４番アミノ酸と共に、配列番号２のアミノ酸−４７番〜−１番であるシグナル配列の一部分であって、制御能を有する部分を包含する、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの短縮型成熟部分ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２７に示したアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのＶ３４Ｍ変異体。
【請求項１１】
配列番号２９に示したアミノ酸配列を包含する、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのＶ３４Ｍ変異体。
【請求項１２】
配列番号３１に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製され且つＶ３８Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（β）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１３】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端から３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号３５に示したアミノ酸配列からなる、短縮型ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（β）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１４】
配列番号３３に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製され且つＶ６４Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（α）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその一部をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号５に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号２０に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号２２に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号２３に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２５に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号２８に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号３０に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号３２に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号３６に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号３４に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
発現制御分子に発現可能な状態で結合した請求項１５〜２６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを包含するベクター。
【請求項２８】
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ウイルスベクターが、組み換えワクシニアウイルスベクター、組み換えアデノウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター、組み換えバキュロウイルスベクター、組み換えパピローマウイルスベクター、組み換えレンチウイルスベクターまたは組み換えトリ ポックスウイルスベクターであるか、in vivoにおいて遺伝子発現を制御可能なウイルスベクターであることを特徴とする、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
非ウイルスベクターが、細菌、真菌、哺乳類、昆虫、植物または酵母に由来のベクター、リポソーム、あるいはＤＮＡのポリアミン誘導体であることを特徴とする、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれかに記載のベクターを包含する、天然の環境から単離された形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３２】
ＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントα、βまたはγのプレプロ配列のＣ末端２６アミノ酸領域である、配列番号４３に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３３】
プレ（α）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプロ領域である、配列番号４４に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
プレ（α）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域である、配列番号４９に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３５】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプロ領域である、配列番号４５に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３６】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域である、配列番号５０に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３７】
配列番号２または配列番号６に示したアミノ酸配列からなるプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントに特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
プレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域である、配列番号１９または配列番号２１に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３９】
神経障害または神経変性疾患の治療用である、請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれるＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその部分ペプチド。
【請求項４０】
請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれるＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその部分ペプチドの、神経障害または神経変性疾患の治療剤を製造するための用途。
【請求項４１】
神経障害または神経変性疾患の治療用である、請求項１５のポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項１５のポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドの、神経障害または神経変性疾患の治療剤を製造するための用途。
【請求項４３】
神経障害が、中枢神経異常、脊髄損傷、依存症、アルコール中毒症、虚血症、癲癇、うつ病または脳梗塞であることを特徴とする、請求項４０または４２の用途。
【請求項４４】
神経変性疾患が、パーキンソン氏病、アルツハイマー病または萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であることを特徴とする、請求項４０または４２の用途。
【請求項４５】
請求項１６〜２５のいずれかのポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドの、神経障害または神経変性疾患の治療剤を製造するための用途であって、in vivoで製造されるプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質およびプレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質の分泌が、神経刺激および神経生理学的刺激の制御下にあることを特徴とする用途。
【請求項４６】
神経障害または神経変性疾患の治療方法であって、神経障害または神経変性疾患を発症した対象に治療に効果的な量のプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質、プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質、または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを包含する方法。
【請求項４７】
プレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質が、請求項２、５、８または１１のいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質が、請求項１２および１３のタンパク質、ならびに配列番号５２に示したタンパク質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
治療に効果的な量のＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントを薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有し、該ＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントは、請求項１〜１４のいずれかのＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５０】
ベクターに挿入した治療に効果的な量のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物であって、該ポリヌクレオチドは、請求項１６〜２６のいずれかのポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるものであり、該ベクターは、治療に効果的なＧＤＮＦタンパク質産物のin vivo合成を達成するために、神経障害または神経変性疾患を発症した患者の細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適したものであることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質およびそのｃＤＮＡに関し、より詳細には、ＧＤＮＦタンパク質の新規なスプライスバリアントである（γ）プロＧＤＮＦに関する。（γ）プロＧＤＮＦは新規なｍＲＮＡスプライスバリアントであるプレ（γ）プロＧＤＮＦによってコードされており、神経活動依存的に分泌されるものである。更に本発明は、（γ）プロＧＤＮＦタンパク質、そのｃＤＮＡおよびそれらの部分の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＮＦとは、末梢交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、腸管神経ニューロンおよび感覚ニューロンのみならず、中脳ドーパミンニューロンおよび運動ニューロンの発生と生存を支える神経栄養因子である。パーキンソン氏病（ＰＤ）の種々の動物モデルにおいて、ＧＤＮＦはドーパミンニューロンの神経毒誘導性の死を防止し、軸索新芽形成を促進することで機能回復をもたらすことができる。２つのＧＤＮＦスプライスバリアント、即ち、プレ（α）プロＧＤＮＦ（以前はＧＤＮＦαと呼ばれていた）およびプレ（β）プロＧＤＮＦ（以前はＧＤＮＦβと呼ばれていた）が報告されている（Suter-Crazzolara and Unsicker, Neuroreport, 5:2486-2488 (1994)）。これらのスプライスバリアントはGDNF ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって産生される。
【０００３】
神経栄養因子を含む多くのタンパク質が、前駆体であるプレプロ成熟タンパク質の形で合成される。ＥＲシグナルペプチドからなるプレ領域は、シグナルペプチチダーゼによって翻訳の際に切り落とされ、プロ成熟タンパク質は合成された直後にＥＲのルーメン内に放出される。成熟タンパク質のタンパク質切断は細胞内または細胞外マトリクス、あるいはその両方で起こりうる。プロ成熟タンパク質は切断されずに、切断された成熟タンパク質とは異なる機能を有することもある。例えば、成熟した脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびプロＢＤＮＦの両方が神経細胞から分泌される。成熟ＢＤＮＦはＴｒｋＢ受容体に結合して、神経の生存、分化およびシナプス修飾を誘導するが、一方、プロＢＤＮＦはｐ７５NTR受容体およびソルチリン受容体に結合し、アポトーシスを誘導する（詳細はThomas and Davies, Curr. Biol., 15:262-264 (2005)、Teng et al., J. Neurosci., 25:5455-5463 (2005)を参照）。
【０００４】
ＧＤＮＦスプライスバリアントは、アミノ末端シグナル配列（プレ領域）および成熟ドメインから切断されるプロ配列を含んでいる（Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993)）（図１）。（β）プロＧＤＮＦのプロ領域は、（α）プロＧＤＮＦのプロ領域よりも２６アミノ酸（ａａ）短い（Trupp et al., J. Cell Biol., 130:137-148 (1995)）。これらスプライスバリアントの産生する成熟ＧＤＮＦタンパク質はほぼ同一である。成熟ＧＤＮＦは１３４アミノ酸（ａａ）からなり、２つの推定Ｎ−グリコシル化部位と共に、ＴＧＦ−βタンパク質ファミリーの他のメンバーと相対的に同じ間隔で位置する７つの保存されたシステインを保有する（Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993)、Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol., 4:435-438 (1997)、Chang et al., Endocri. Rev., 23:787-823 (2002)）（図１）。生物学的に活性な成熟ＧＤＮＦ二量体は、単量体の対になっていないシステインの間の共有ジスルフィド結合によって形成される（Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol. 4:435-438 (1997))。
【０００５】
科学的な文章において、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡおよびＧＤＮＦタンパク質という名称は、全長プレ（α）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡ、および（α）プロＧＤＮＦタンパク質のタンパク質切断によって産生される成熟ＧＤＮＦタンパク質に対して使用されてきた。この成熟ＧＤＮＦタンパク質は広範に渡り研究されており、PubMedにはＧＤＮＦを引用する文献が２５００件以上存在する。ＧＤＮＦは、神経突起の長さ、細胞の大きさ、およびドーパミン作動性ニューロンの数に対する増加能のみならず、培地からの高親和性ドーパミン取り込みに基づいて同定された（Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993)）。ＧＤＮＦは、ＰＤ動物モデルにおける黒質ドーパミン作動性ニューロンの毒物誘導性変性に対する防御およびＰＤ患者の治療において強力な因子である（Airaksinen and Saarma, Nat. Rev. Neurosci. 3:383-394 (2002) および Bespalov and Saarma, Trends Pharmacol. Sci. 28:68-74 (2007)に報告有り）。更にＧＤＮＦは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、依存症、アルコール中毒症およびうつ病の動物モデルの処置において治療的役割を担っている（Bohn, Exp. Neurol., 190:263-275 (2004)、Messer et al., Neuron, 26:247-257 (2000)、He et al., J. Neurosci., 25:619-628 (2005)、Angelucci et al., Int. J. Neuropsychopharmacol., 6:225-231 (2003)に報告有り）。ＧＤＮＦには神経系の外でも重要な役割がある。ＧＤＮＦは腎臓の発生においてモルフォゲンとして働き、精原細胞の分化を制御する（Sariola and Saarma, J. Cell Sci. 116:3855-3862 (2003)に報告有り）。
【０００６】
（α）プロＧＤＮＦタンパク質は、例えば、米国特許第６，３６２，３１９号およびヨーロッパ特許第０ ６１０ ２５４号に開示されており、ＧＤＮＦの短縮型は米国特許第６，１８４，２００号およびヨーロッパ特許第０ ９２０ ４４８号に開示されている。成熟ＧＤＮＦタンパク質を使用したパーキンソン氏病治療の臨床試験が行われてきた。前臨床研究では有望な結果（Gill et al., Nat. Med., 9:589-595 (2003)、Slevin et al., J. Neurosurg., 102:401 (2005)）が得られたものの、フェーズＩ／II試験の結果は残念なものだった。パーキンソン氏病症状の改善は統計学的に有意なものではなく、安全性に潜在的な危険があると報告された。従って、成熟ＧＤＮＦタンパク質による臨床試験は完全に停止した（Lang et al., Ann. Neurol., 59:459-466 (2006)）。
【０００７】
プレ（β）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡスプライスバリアントの存在は、１９９４年にラット組織についてSuter-CrazzolaraとUnsicker（Neuroreport, 5:2486-2488）によって初めて報告され、１９９７年にはMatsushita et al.（Gene, 203:149-157 (1997)）によってマウス組織、１９９８年にはGrimm et al.（Hum. Mol. Genet., 12:1873-1886 (1998)）によってヒト組織について報告された。ｍＲＮＡ発現データに加え、Trupp et al.（J. Cell Biol., 130:137-148 (1995)）は、プレ（β）プロＧＤＮＦ ｃＤＮＡのコードする分泌ＧＤＮＦタンパク質は、Ｅ１０ニワトリ傍脊椎交感神経ニューロンにおいてロバストな生存、広範にわたる神経突起の伸張および細胞体サイズの増加を促進することを示した。
【０００８】
発明の概要
本願に記載した発明は、プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦと呼ばれる公知のＧＤＮＦ ｍＲＮＡ スプライスバリアントの他に、プレ（γ）プロＧＤＮＦと命名した第３の選択的スプライスバリアントが存在することを示している（図３と４）。ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はエキソン２から開始するが、プレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントはエキソン２配列の全長を欠失しており、エキソン１に選択的タンパク質翻訳開始コドンＣＴＧを含有する（図２）。
【０００９】
プレ（γ）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡのコードする（γ）プロＧＤＮＦタンパク質のプレプロ領域は全長４７アミノ酸（ａａ）であり、（α）プロＧＤＮＦのプレプロ領域よりも３０ａａ短い（図１）。プレ（γ）プロＧＤＮＦのプレプロ領域のＣ末端２６ａａはエキソン３にコードされているため、プレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦの対応する領域と同一である。エキソン１のコードする、（γ）プロＧＤＮＦの始めの２１ａａはこのスプライスバリアントに固有である（図２）。３種のＧＤＮＦスプライスバリアントの産生する成熟ＧＤＮＦタンパク質は、いずれもほぼ同一である（図１）。
【００１０】
我々の結果は、（α）プロＧＤＮＦ、（β）プロＧＤＮＦおよび（γ）プロＧＤＮＦがプロＧＤＮＦタンパク質としてだけでなく、プロＧＤＮＦのタンパク質切断によって発生する成熟タンパク質としても分泌されていることを示している。（α）プロＧＤＮＦおよび成熟ＧＤＮＦの分泌は構成的であるが、（β）プロＧＤＮＦおよび（γ）プロＧＤＮＦの分泌は神経活動依存的である、即ち、神経刺激および神経生理学的刺激によって制御されている。このような特徴ゆえに、（α）プロＧＤＮＦとそのｃＤＮＡよりも、（β）プロＧＤＮＦおよび（γ）プロＧＤＮＦならびにそれらをコードするｃＤＮＡの方が、ＰＤの遺伝子療法的処置におけるより有力な治療分子である。
【００１１】
従って、本発明の主な対象は、配列番号２に示したアミノ酸配列を包含し、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントによってコードされている、単離精製したヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントである。比較として、配列番号４に示したアミノ酸配列を包含し、マウス プレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントによってコードされている、マウス（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントも単離精製した。
【００１２】
本発明の更なる対象は、アミノ末端のロイシン残基をメチオニン残基で置換した、ヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの修飾体である。修飾タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【００１３】
本発明の別の対象は、配列番号２の１番〜１３４番アミノ酸と共に、（γ）プロ配列、即ち、配列番号２のアミノ酸−４７番〜−１番からなる配列の一部分であって、制御能を有するがシグナル配列を欠いた部分を包含する、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの成熟部分ポリペプチドである。
【００１４】
本発明の対象は、ヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロアミノ酸配列および修飾プレプロ配列、即ち、それぞれ配列番号１９および配列番号２１に示したアミノ酸配列にも及ぶ。配列番号２１に示したプレプロ配列の（γ）プロ部分であって、制御能を有するものも本発明に含まれる。
【００１５】
ヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの短縮型ポリペプチド、即ち、成熟部分ポリペプチドのＮ末端の３８個のアミノ酸を欠失したもの（配列番号２４）、および短縮型ポリペプチドの上述したLeu−Met修飾体（配列番号２６）は本発明の更なる対象である。
【００１６】
また、ヒト（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントのＶ３４Ｍ変異体（配列番号２７）、およびそのLeu−Met修飾体（配列番号２９）も本発明の対象に含まれる。
【００１７】
本発明の更なる態様は、単離精製され且つＶ３８Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（β）プロＧＤＮＦ）、および成熟部分ポリペプチドのＮ末端から３８個のアミノ酸を欠失した該プレ（β）プロＧＤＮＦの短縮型である。これらタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１と配列番号３５に示した。更に、プレ（β）プロＧＤＮＦスプライスバリアントおよびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号５１に示した）の、神経障害または神経変性疾患の治療、特に遺伝子療法における用途も本発明の一態様である。
【００１８】
本発明は更に、単離精製され且つＶ６４Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（α）プロＧＤＮＦ）を企図する。そのアミノ酸配列を配列番号３３に示した。
【００１９】
本発明の更なる対象は、上述した形態のＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントをコードする、単離したポリヌクレオチドである。
【００２０】
（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントに特異的に結合する抗体も本発明の更に別の対象である。（α）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントおよび／または（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプロ部分に特異的に結合する抗体も提供する。更に、プレ（α）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域に特異的に結合する抗体も企図する。
【００２１】
本発明の好ましい１つの態様においては、組み換え型のヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントがコードするタンパク質を提供する。
【００２２】
プレ（γ）プロＧＤＮＦ分子およびそれをコードする配列の相同体が他の哺乳動物から取得可能であることを認識されたい。一例として、配列番号４に示したアミノ酸配列を包含するマウス（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントを提供する。
【００２３】
発明の詳細な説明
略語
ａａ                      アミノ酸
ＡＬＳ                    筋萎縮性側索硬化症
ＡｔＴ−２０細胞系        マウス脳下垂体腫瘍細胞系
ＢＤＮＦ                  脳由来神経栄養因子
ＢＨＫ−２１              ベビーハムスター腎細胞系
ｂｐ                      塩基対
ＢＳＡ                    ウシ血清アルブミン
ＣＤＲ                    相補性決定領域
ＣＨＯ細胞系              チャイニーズハムスター卵巣細胞系
ＣＯＳ−７                ＳＶ４０形質転換サル腎細胞系
ＤＭＥＭ                  ダルベッコ変法イーグル培地
ＥＬＩＳＡ                酵素免疫吸着アッセイ
ＥＲ                      小胞体
ＦＣＡ                    フロイント完全アジュバント
ＦＣＳ                    ウシ胎仔血清
ＦＩＡ                    フロイント不完全アジュバント
ＧＤＮＦ                  グリア細胞系由来神経栄養因子
ＧＦＰ                    緑蛍光タンパク質
ＨＣ                      海馬
ＨＥＫ−２９３細胞系      ヒト胚性腎細胞系
ＨＰＬＣ                  高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ                    西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＨＳ                      ウマ血清
ＫＬＨ                    スカシ貝ヘモシアニン
ＬＴＲ                    長い末端反復配列
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ   マトリックス支援レーザー脱離イオン化
飛行時間型質量分析計
ＭＰＬ−ＴＤＭ            モノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロース
ジコリノミコレート
ＮＧＦ                    神経成長因子
ｎｔ                      ヌクレオチド
ＯＲＦ                    オープンリーディングフレーム
ＰＢＳ                    リン酸緩衝食塩水
ＰＣ−６．３細胞系        ラット褐色細胞腫由来細胞系ＰＣ１２クローン
ＰＤ                      パーキンソン氏病
ＰＦＡ                    パラホルムアルデヒド
ＲＴ                      室温
ＲＴ−ＰＣＲ              逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤ                      標準偏差
ＴＭＢ                    ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
ＴＧＦ−β                トランスフォーミング増殖因子β
ＵＴＲ領域                非翻訳領域
【００２４】
プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦと呼ばれるＧＤＮＦ ｍＲＮＡスプライスバリアントをコードする３種のｃＤＮＡを、マウス腎組織と脳組織、ならびにヒトの脳組織、腎組織と子宮組織からＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて同定した。これらｃＤＮＡ分子を更に特徴付けるために、導入および発現用ベクターにこれらをクローニングし、シーケンシングした。
【００２５】
３種のＧＤＮＦスプライスバリアントｍＲＮＡの違いは、ＧＤＮＦタンパク質のプレプロ領域をコードするエキソン１と２にあり、プロ領域の最後の２６ａａをコードするエキソン３のＯＲＦおよび成熟ＧＤＮＦは全３種のＧＤＮＦスプライスバリアントで同一だった。プレ（β）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡは、プレ（α）プロＧＤＮＦのそれと比べてエキソン２の３’末端の７８ｂｐを欠失している（Grimm et al., Hum. Mol. Genet., 7:1873-1886 (1998)）。プレ（γ）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡは、エキソン２の全長を欠失しており、プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦと比べて、エキソン１の３’末端に６１ｂｐの特徴的な配列を含んでいる。
【００２６】
ヒトおよびマウスの（β）プロＧＤＮＦおよび（γ）プロＧＤＮＦが分泌されるか否かを調べるために、それぞれのＧＤＮＦスプライスバリアントをコードするｃＤＮＡを用いた一過性のトランスフェクションおよびウエスタンブロット解析によって、これらの発現と分泌を種々の細胞系で検討した。その結果、ヒトとマウスの両方の（β）プロＧＤＮＦおよびそれらの成熟ＧＤＮＦがＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ−２９３細胞系、ＰＣ−６．３細胞系およびＡｔＴ−２０細胞系で分泌されることが判明した。更に、マウス（γ）プロＧＤＮＦおよびその成熟ＧＤＮＦはＣＨＯ細胞系、ＰＣ−６．３細胞系およびＢＨＫ−２１細胞系でも分泌され、ＣＴＧ翻訳開始コドンがＡＴＧ開始コドンで置換されているヒト（γ）プロＧＤＮＦおよびその成熟ＧＤＮＦはＢＨＫ−２１細胞系で分泌された。
【００２７】
マウスおよびヒトの（α）プロＧＤＮＦおよび（β）プロＧＤＮＦの分泌が構成的なのか、神経活動で刺激されるのか（即ち、活動依存的なのか）を調べるために、脱分極化していない分化ＰＣ−６．３細胞および脱分極化した分化ＰＣ−６．３細胞におけるそれらの発現と分泌を一過性のＧＤＮＦ ｃＤＮＡトランスフェクション、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡ解析を用いて検討し、ラットＨＣ初代培養細胞におけるそれらの発現と分泌を一過性のトランスフェクションおよびＥＬＩＳＡ解析を用いて検討した。結果は、（α）プロＧＤＮＦは構成的に分泌されているが、（β）プロＧＤＮＦの分泌は活動依存性であり、（β）プロＧＤＮＦプロ領域の２６ｂｐの欠失は活動依存性分泌に必須であることを示した。（γ）プロＧＤＮＦもプロ領域の同じ２６ｂｐを欠失しており、この分泌もまた活動依存性であることが示唆されている。
【００２８】
用語の定義
特に断りがない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同じである。以下の定義は明確性を増すために記載した。
【００２９】
「単離した」ものが分子である場合、この「単離した」という用語は、ある分子が本来存在する自然環境中の成分から同定され、分離および／または回収されたものであり、したがって、「人の手によって」天然の状態から改変されたものであることを意味する。例えば、単離したポリヌクレオチドは、ベクターや物質組成物の一部であってもよいし、また、細胞に含まれるものでもよく、ベクター、物質組成物、または特定の細胞はポリヌクレオチドが本来存在した環境ではないため、そのような場合も「単離した」ということができる。「単離した」という用語は、本発明のポリヌクレオチド配列の特性を示さないことが技術的にわかっているゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、全細胞から得た全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ製品、ゲノムＤＮＡ製品、流れ負荷全細胞ゲノムＤＮＡ製品やその他の組成物を指すことはない。
【００３０】
「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して作製したＤＮＡやＲＮＡの類似体、および誘導体、断片およびホモログが含まれる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡを含むものが好ましい。
【００３１】
「単離した核酸分子」は、核酸の天然原料に存在する他の核酸分子から分離したものである。単離した核酸は、核酸を誘導した生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（即ち、核酸の５’末端と３’末端に位置する配列）を含んでいないことが好ましい。更に、ｃＤＮＡ分子などの単離した核酸分子を組み換え技術で製造した場合には、他の細胞成分や培養液を実質的に含有しないことが可能であり、また化学合成した場合には、化学的前駆体や他の薬品を実質的に含有しないことも可能である。
【００３２】
「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡやｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、生物学的機構によって他のポリマーやマクロ分子の合成の際にテンプレートとして働くという固有の性質であり、他のポリマーやマクロ分子とは、定義されたヌクレオチド配列を有するもの（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡとｍＲＮＡ）、または定義されたアミノ酸配列及びそれに起因する生物学的特性を有するものである。従って、遺伝子は、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳によって細胞または他の生物系の中でタンパク質が製造される場合には、タンパク質をコードしている。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表で提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖は、共にタンパク質あるいはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードしていると言える。
【００３３】
特に記載しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、一群の縮重配列であって、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質とＲＮＡをコードするヌクレオチド配列にはイントロンが含まれてもよい。
【００３４】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基と遺伝子の非コード鎖のヌクレオチド残基とからなり、それぞれのヌクレオチド残基は、遺伝子の転写によって製造されるｍＲＮＡ分子のコード鎖と相同または相補的である。
【００３５】
「ゲノムＤＮＡ」は、遺伝子と相同なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。従ってゲノムＤＮＡは、細胞または生物に含まれるゲノムの完全な相補鎖である。
【００３６】
「オリゴヌクレオチド」は一連の連結したヌクレオチド残基を含むものであり、このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応や他の応用法に使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有している。短いオリゴヌクレオチド配列をゲノム配列やｃＤＮＡ配列に基づいて作製するか、そこから設計し、オリゴヌクレオチドと同一、類似または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを特定の細胞または組織について増幅、確認または存在を明らかにするために使用する。オリゴヌクレオチドは核酸の一部を含むものである。
【００３７】
「変異体（variant）」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を維持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。一般的に変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００３８】
「スプライスバリアント」とは、１つの遺伝子から転写される複数の異なる成熟ｍＲＮＡ分子である。スプライシングの過程を選択的スプライシングと呼び、これは真核細胞で起こりうる現象である。１つの遺伝子から転写翻訳された種々の異なるスプライスバリアントタンパク質の機能は顕著に異なる場合がある。
【００３９】
「ストリンジェンシー」ホモログ（即ち、ヒト以外の生物種から誘導したプレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアント分子をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、当業界で周知の核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの方法を用いて、特定のヒト配列の全部又は一部をプローブとした、低度、中度または高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションで得ることができる。
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをテンプレートとし、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、プレ(γ)プロＧＤＮＦスプライスバリアントを増幅することができる。こうして得た核酸を適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。更にプレ(γ)プロＧＤＮＦ配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡ合成装置によって製造することもできる。
【００４１】
「プライマー」とは、指定したポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズすることができ、相補的なポリヌクレオチドの合成開始点を提供することのできるポリヌクレオチドである。このような合成は、合成を誘導する条件下、即ち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、そしてＤＮＡポリメラーゼなどの合成用試薬の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれた時に生じる。典型的なプライマーは一本鎖であるが、二本鎖でもよい。
【００４２】
典型的なプライマーはデオキシリボ核酸であるが、種々の用途において、広範にわたる合成および天然のプライマーが有用である。テンプレートにハイブリダイズして合成開始点として機能するように設計されたプライマーはテンプレートと相補的であるが、テンプレートの配列を完全に反映する必要はない。このような場合、プライマーのテンプレートへの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば発色性、放射性または蛍光性の成分で標識し、検出可能な成分として使用することができる。
【００４３】
本願で使用する「ベクター」という用語は、外因性の核酸をコードする全てのプラスミドやウイルスを意味する。この用語には、ウイルス粒子や細胞への核酸の移送を助ける非プラスミド性や非ウイルス性の化合物、例えば、ポリリシン化合物なども含まれると理解されたい。ベクターは、所望のタンパク質またはその変異体（mutant）をコードする核酸を細胞に送達するための送達用ベヒクルとして適切なウイルスベクターでもよいし、同じ目的に適した非ウイルスベクターでもよい。ＤＮＡを細胞や組織に送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの具体例は当業界でよく知られており、例えば、Ma et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746 (1997)）に記載されている。ウイルスベクターの例としては、組み換えワクシニアウイルス、組み換えアデノウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えアデノ随伴ウイルス、組み換えトリポックスウイルス、組み換えバキュロウイルス、組み換えパピローマウイルス、組み換えレンチウイルスなど（Cranage et al., EMBO J. 5.3057-3063 (1986)、ＰＣＴ出願公報 W094/17810、ＰＣＴ出願公報 W094/23744）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非ウイルスベクターの例としては、細菌、真菌、哺乳類、昆虫、植物または酵母に由来のベクター、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列、好ましくはその特定の用途に応じて少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、またはそれ以上（例えば、６０００ｎｔ）のものである。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列を検出するためのものである。より長いプローブは、天然原料または組み換え原料から得ることができ、特異性が高く、短いオリゴマープローブよりもハイブリダイズするのに時間がかかる。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよく、ＰＣＲ、膜によるハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を示すように設計することができる。プローブは、生物試料中の核酸分子にもハイブリダイズするので、染色体地図の作成、連鎖解析、組織の同定および／またはタイピング、ならびに種々の法医学的および診断的な本発明の方法に直ちに応用することができる。
【００４５】
「ホモログ」とは、他の生物種から誘導した特定遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４６】
「パーセント（％）核酸配列同一性」とは、複数の配列のアライメントを行い、必要であれば、最大の配列同一性を達成するためのギャップを導入した後の候補配列に含まれる、特定タンパク質と同一であるヌクレオチドのパーセントである。
【００４７】
ＯＲＦとは、開始コドン（ＡＴＧまたはＣＴＧ）を有し、３つの「終止」コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）のいずれか１つで終止するヌクレオチド配列である。
【００４８】
「抗体」という用語は最も広義で使用しており、特にモノクローナル抗体、多価特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディおよび一本鎖分子のみならず、所望の生物活性を有する限り、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’）とＦｖ）もこの定義に含まれる。更に、上述した抗体およびその誘導体をコードするＤＮＡ断片やｃＤＮＡも含まれる。
【００４９】
本願で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、一群の実質的に相同な抗体から得られた抗体である、即ち、一群に含まれる個別の抗体は、微量しか存在しない天然で発生しうる変異を除けば、全て同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製品と比べて、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原に存在する単一の決定基に対するものである。その特異性に加えモノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されていない培養ハイブリドーマで合成される点が有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の一群から得られたものという抗体の性質を表しており、特定の方法で抗体を製造することが必要であると理解してはいけない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、初めてKohler et al., Nature, 256: 495 (1975)に発表されたハイブリドーマ法、あるいは組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.）を参照）で製造することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)とMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５０】
本願におけるモノクローナル抗体には、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、所望の生物活性を有する限り、その断片も含まれる。キメラ抗体とは、その重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の生物種から誘導した抗体の対応する配列と同一または相同であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、鎖の残りは、別の生物種から誘導した抗体の対応する配列と同一または相同であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属するものである（Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984)、Cabilly et al., Gene, 40:157-161 (1985); Cabilly et al., Gene, 85:553-557 (1989)、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。
【００５１】
本発明の抗体は更にポリクローナル抗体も包含する。ポリクローナル抗体の製造方法は当業者には公知である。ポリクローナル抗体は哺乳動物で製造することができる。例えば、免疫剤を、所望によりアジュバントと共に種々の動物（ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない）に投与することで、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導する。概して、免疫剤および／またはアジュバントは、哺乳動物に対して複数回の皮下注射または腹腔内注射によって投与される。免疫剤としては、プレプロＧＤＮＦポリペプチド、その適当な画分またはその融合タンパク質が挙げられる。免疫を受ける哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤を結合することが有用である。このような免疫原性のタンパク質としては、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ サイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用可能なアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化のプロトコルは、過度な実験なしに当業者が選択することができる。その後、哺乳動物から採血し、血清のプレプロＧＤＮＦ力価を計測する。所望により、抗体力価が上昇するまで哺乳動物に追加免疫を与えてもよい。
【００５２】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンから誘導した最小配列を含むその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’）や、抗体の他の抗原結合性サブ配列）である。大部分のヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定部位（ＣＤＲ）内の残基を、所望の特異性、親和性と結合容量（capacity）を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト動物種の抗体（ドナー抗体）の残基で置換したものである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を、対応する非ヒト残基で置換する。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入したＣＤＲやフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでいてもよい。このような修飾は、抗体の性能を更に改良し、最適化するために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つ存在する可変ドメインの実質的に全てを含んでおり、可変ドメインにおいては、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列である。最適なヒト化抗体は、更に免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリン、の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含んでいる。詳細については、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)、とPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照。ヒト化抗体には、霊長類化抗体も含まれ、このような抗体の抗原結合領域は、マカクザルを目的の抗原で免疫して製造した抗体から誘導したものである。
【００５３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、生きた生物を使用せずに酵素学的にＤＮＡを複製するための技術である。この技術は、温度媒介性反応酵素であるＤＮＡポリメラーゼを用いて、少量のＤＮＡを指数関数的に増幅することを可能にする。
【００５４】
逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）とは、特定のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を増幅するための技術である。ＲＮＡ鎖を始めに相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、次にＰＣＲで増幅する。
【００５５】
ＤＮＡシーケンシングとは、与えられたＤＮＡ断片の配列と呼ばれるヌクレオチドの順番を決定するための方法である。
【００５６】
発現ベクターとは、標的細胞に特定ＤＮＡ配列を導入し、発現させるための環状ＤＮＡ分子である。発現プラスミドの構築とは、例えば、所望の遺伝子のＯＲＦを含有する特定のＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングする操作である。
【００５７】
トランスフェクションとは、外来ＤＮＡを細胞に導入することを意味する、トランスフェクションには、発現プラスミドの進入を可能にする一過性の穴を細胞に設けることも含まれる。一度、発現プラスミドが細胞に進入すると、このＤＮＡ配列にコードされているタンパク質が細胞の転写および翻訳機構によって産生される。プラスミドＤＮＡは細胞ゲノムには取り込まれず、発現は一過性である。
【００５８】
細胞培養とは、細胞系または組織から単離した初代細胞を制御した条件下で培養することである。細胞は、細胞培養器内の適当な温度と混合気体の存在下で、培地の中で増殖および維持される。
【００５９】
ウエスタンブロット解析とは、与えられたサンプル内のタンパク質を検出する方法である。質量によって変性タンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用する。分離後にはタンパク質をメンブランに移し、タンパク質を認識する抗体を用いてそこで検出する。
【００６０】
酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とは、２種の抗体を用いてサンプル中の抗体または抗原の存在を検出するための技術である。第１の抗体は抗原特異的であり、もう一方は抗原−抗体複合体と反応するもので、酵素にカップリングしている。この第２の抗体は、発色性基質、放射性基質または蛍光発生基質によるシグナルの発生をもたらすものでもよい。
【００６１】
免疫蛍光解析においては、特定のタンパク質エピトープの検出に一次抗体を使用する。この一次抗体を、酵素、放射性標識または発蛍光団を用いて標識された二次抗体で検出する。免疫蛍光標識した細胞や組織サンプルは、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で解析する。
【００６２】
本発明は、GDNF遺伝子の新規なスプライスバリアントであるプレ(γ)プロＧＤＮＦの発見に基づくものである。本願の実施例は、プレ（γ）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡがヒト脳で発現されており（図４）、このスプライスバリアントのコードするタンパク質の分泌は、生物学的および生理学的に厳格な制御下にあることを示しており、これらはパーキンソン氏病、ＡＬＳ、依存症、アルコール中毒症、虚血症、癲癇およびうつ病の治療において、（γ）プロＧＤＮＦタンパク質が（α）プロＧＤＮＦよりも強力な治療用分子であることを指し示している。更に、プレ（γ）プロＧＤＮＦ ｍＲＮＡの発現を肺と子宮で特徴付けた（データは示さない）。
【００６３】
治療
プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦには、ＧＤＮＦ活性に関連した疾患または異常、あるいはＧＤＮＦ応答性が有利に働く疾患または異常の治療のためのin vivoの遺伝子治療となる哺乳動物、特にヒトへの投与において有用である。特に好ましいのは神経障害、更に好ましくは中枢神経異常、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、依存症、およびアルコール中毒症である。
【００６４】
タンパク質の発現または活性の調節を達成するための遺伝子操作も特に本発明が企図する手法である。目的のトランスジーンを動物内に導入する時は、適切であればいかなるベクターを用いてもよい。公知文献に開示されたベクターの例としては、例えばレンチウイルスベクター（ただしこれに限定されない）などの非増殖性レトロウイルスベクター（Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman and Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.）、アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第５，８２４，５４４号、米国特許第５，７０７，６１８号、米国特許第５，７９２，４５３号、米国特許第５，６９３，５０９号、米国特許第５，６７０，４８８号、米国特許第５，５８５，３６２号、Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992)、Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992)およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992)を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第５，８８８，５０２号、米国特許第５，８３０，７２５号、米国特許第５，７７０，４１４号、米国特許第５，６８６，２７８号、米国特許第４，８６１，７１９号を参照）、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、米国特許第５，４７４，９３５号、米国特許第５，１３９，９４１号、米国特許第５，６２２，８５６号、米国特許第５，６５８，７７６号、米国特許第５，７７３，２８９号、米国特許第５，７８９，３９０号、米国特許第５，８３４，４４１号、米国特許第５，８６３，５４１号、米国特許第５，８５１，５２１号、米国特許第５，２５２，４７９号およびGnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87-98 (1997)を参照）、アデノウイルスとアデノ随伴ウイルスとのハイブリッドベクター（例えば、米国特許第５，８５６，１５２号を参照）またはワクシニアウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，８７９，９３４号、米国特許第５，８４９，５７１号、米国特許第５，８３０，７２７号、米国特許第５，６６１，０３３号および米国特許第５，３２８，６８８号を参照）、リポフェクチン仲介遺伝子導入系（ＢＲＬ製）、リポソームベクター（例えば、米国特許第5,631,237号“Liposomes comprising Sendai virus proteins (センダイウイルスタンパク質を包含するリポソーム)”）、in vivoにおいて遺伝子発現を制御可能なウイルスベクター、およびこれらの組み合わせである。なお上記文献の記載は全て本明細書に組み込まれているものとする。また、好ましい態様においては、非増殖性アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびレンチウイルスを用いる。
【００６５】
半透性の、移植可能な膜状装置は、特定の環境において薬物を送達するのに有用な手段である。例えば、可溶性の（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦ、あるいはキメラを分泌する細胞を上記の装置に封入し、患者、例えば、パーキンソン氏病を患う患者の脳に移植することができる。米国特許第４，８９２，５３８号（Aebischer et al.）、米国特許第５，０１１，４７２号（Aebischer et al.）、米国特許第５，１０６，６２７号（Aebischer et al.）、ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１０４２５、ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１０４７０、Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991)、Aebischer et al., Exper. Neurology, 111:269-275 (1991)、および Tresco et al., ASAIO, 38:17-23 (1992)を参照されたい。
【００６６】
したがって、本発明は、神経の損傷またはその他の（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦ反応性細胞の損傷を予防または治療する方法であって、（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦを分泌する細胞を、治療を必要とする患者の体内へ移植することを包含する方法に関する。また、本発明は、本願に記載した神経の損傷または他の細胞の損傷を予防または治療するために移植する装置であって、半透膜とそこに封入された（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦを分泌する細胞とを包含し、該半透膜は（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦに対して透過性であるが、細胞にとって有害な患者由来の因子に対しては不透性である装置に関する。（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦを製造するようにex vivoで形質転換した患者自身の細胞は、所望により、上記のようなカプセル封入を行うことなく、患者に直接移植することができる。生細胞の膜封入の方法は当業者にはよく知られたものであり、封入細胞の調製と封入細胞の患者への移植は過度な実験を行わずとも実施可能である。
【００６７】
したがって、本発明には、神経の損傷を予防または治療する方法であって、（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦを産生する能力を天然に有する細胞、または生物工学的に分泌するようにした細胞を、治療を必要とする患者の体内に移植することを包含する方法が含まれる。患者がヒトの場合、分泌された（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦは、可溶性のヒト（β）プロＧＤＮＦまたは（γ）プロＧＤＮＦであることが好ましい。移植物は、非免疫原性であるか、免疫原性の移植細胞が免疫系により認識されるのを防ぐものであるか、またはこの両方であることが好ましい。ＣＮＳに送達するのに好ましい移植部位は線条体である。
【００６８】
ウイルスベクターを用いる態様において好ましいポリヌクレオチドは、目的の標的組織における発現を促進する適切なプロモーターとポリアデニル化配列を含んでいる。本発明において哺乳動物細胞による発現に適したプロモーター／エンハンサーとしては、例えば、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー（Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29:2494-2502 (1991) および Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)）；ラウス肉腫ウイルスのプロモーター（Davis et al., Hum. Gene Ther., 4:151 (1993)）；シミアンウイルス４０のプロモーター、レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ケラチン１４のプロモーターおよびαミオシンＨ鎖プロモーターが挙げられる。
【００６９】
遺伝子治療用途においては、例えば欠損遺伝子の代わりに、治療に有効な遺伝子産物のin vivo合成を行うために遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」には、単一の治療によって永続効果が得られる従来の遺伝子治療と、治療に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡを１回または繰り返して投与することを含む遺伝子治療剤の投与との両方がある。アンチセンスＲＮＡとアンチセンスＤＮＡはin vivoにおいて特定の遺伝子の発現を阻害するための治療物質として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みが限定されるためその細胞内濃度が低いにも関らず、細胞内に導入されて阻害剤として働くことが明かになっている（Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:41434146 (1986)）。オリゴヌクレオチドは、例えば、負の電位を帯びたリン酸ジエステル基を、電位を帯びていない基で置換するといった修飾によって、取り込み量を高めることができる。
【００７０】
生細胞に核酸を導入する際に利用可能な方法はいろいろある。使用する方法は、核酸をin vitroの培養細胞に導入するか、あるいは目的宿主内の細胞にex vivoまたはin vivoで導入するかによって異なる。In vitroでの哺乳動物細胞への核酸導入に適した方法としては、リポソームを利用する方法（Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)、Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979)、Felgner, Sci. Am., 276(6):102-6 (1997) および Felgner, Hum. Gene Ther., 7(15):1791-3, (1996)）、エレクトロポレーション法（Tur-Kaspa, et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, (1986) および Potter, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, (1984)）、直接マイクロインジェクション法（Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099 (1985)）、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)）、リン酸カルシウム沈殿法（Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467 (1973)、Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, (1987) および Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695 (1990)）、細胞の超音波処理法（Fechheimer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467 (1987)）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント法（gene bombardment using high velocity microprojectiles）（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9568-9572 (1990)）などが挙げられる。現在、in vivo遺伝子導入法として好ましい方法としては、ウイルス（概してレトロウイルス）ベクターによるトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソームを介したトランスフェクション（Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)）などが挙げられる。状況によっては、標的細胞の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、あるいは標的細胞に提示された受容体に対するリガンドなどの標的細胞をターゲティングする物質を、核酸材料と共に用いることが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質をターゲティングおよび／または取り込みの促進に用いてもよく、そのようなタンパク質としては、特定の細胞種に対して屈性を示すキャプシッドタンパク質やその断片、サイクリングの際に内在化するタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化をターゲットとして細胞内半減期を延ばすタンパク質などが挙げられる。なお、受容体を介したエンドサイトーシスに関する技術については、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987) および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)に開示されている。現在までに公知の遺伝子標識および遺伝子治療のプロトコルに関する文献としては、Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【００７１】
本発明の具体的な態様においては、発現構築物は、リポソームに封入されていてもよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞状の構造体である。多重層リポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。このようなリポソームは、リン脂質を過剰量の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、自己再配列を経て閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水とそれに溶解した溶質を封入する（Ghosh and Bachhawat,“In Liver Diseases, Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands (肝臓病における、特異的な受容体とリガンドを用いる標的診断および治療法)”, Wu, G., Wu, C., ed., New York: Marcel Dekker、pp. 87-104 (1991)）。陽イオンリポソームにＤＮＡを添加すると、位相変化（topological transition）が生じて、リポソームは光学的に複屈折性を示す液晶性凝縮小球となる（Radler, et al., Science, 275:810-814 (1997)）。このようなＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療や遺伝子送達に用いる非ウイルスベクターとなる可能性がある。
【００７２】
また本発明においては、「リポフェクション」法を含む様々な市販のアプローチも考えられる。本発明のある態様においては、リポソームは赤血球凝集性のウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成していてもよい。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞へ入り込むのを促進することが報告されている（Kaneda, et al., Science, 243: 375-378 (1989)）。他の態様においては、リポソームは、細胞核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）（Kato, et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364 (1991)）との複合体として、またはＨＭＧ−１と共に使用してもよい。更に他の態様においては、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方との複合体を形成するか、または３種を共に使用してもよい。In vitroおよびin vivoにおいて核酸の導入と発現に有効に用いることができる発現構築物は、本発明に適用可能である。
【００７３】
治療用遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いることができる他のベクター送達システムとしては、受容体仲介送達ベヒクルが挙げられる。このようなシステムは、ほぼ全ての真核細胞に見られる受容体仲介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的な取り込みを利用する。種々の受容体は細胞種特異的に分布するため、このようなシステムを用いた送達は高い特異性を示す（Wu and Wu, Adv. Drug Del. Rev., 12:159-167 (1993)）。
【００７４】
本発明の他の１つの態様においては、発現構築物は、単に裸の組み換えＤＮＡまたはプラスミドからなるものでもよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過させる上記のいずれの方法によって行ってもよい。これはin vitroでの導入に特に適するが、in vivoでの使用に適用してもよい。Dubensky, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533 (1984)には、ポリオーマウイルスのＤＮＡをリン酸カルシウム（CaPO4）沈殿物の形態で成体マウスおよび新生マウスの肝臓と脾臓に注射して、能動的なウイルス複製および急性感染に成功したことが報告されている。Benvenisty and Neshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555 (1986)にも、リン酸カルシウム（CaPO4）沈殿したプラスミドの腹腔内直接投与がトランスフェクトした遺伝子の発現をもたらすことが報告されている。
【００７５】
裸のＤＮＡ発現構造物を細胞に導入するための本発明の他の１つの態様では、粒子衝突法が使用できる。この方法は、ＤＮＡで被覆したマイクロプロジェクタイルが細胞膜を貫通し、細胞を殺すことなく細胞内に侵入するほどの高速に加速する技術によるものである（Klein, et al., Nature, 327:70-73 (1987)）。小さい粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。そのような装置の１つは、高圧放電を用いて電流を発生させ、その結果として原動力を提供する技術に基づくものである（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572 (1990)）。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンや金のビーズのような、生物学的に不活性な物質からなる。
【００７６】
当業者は、in vivoとex vivoの状況下で、どのように遺伝子送達を適用するかを認識している。ウイルスベクターに関しては、通常、ウイルスベクターの原液を調製する。ウイルスの種類と達成可能な力価により、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11または１×１０12の感染性粒子を患者に送達する。リポソームまたはその他の非ウイルス性の処方物（formulation）についても、相対的な取り込み効率を比較することにより、同様の数値が外挿できる。薬学的に許容される組成物となる処方物については後述する。
【００７７】
様々な細胞種に対する様々な投与方法が考えられる。実用的には、いかなる細胞、組織または器官の種類に関しても、全身送達（systemic delivery）が考えられる。他の態様においては、種々の直接的、局所的そして部分的なアプローチを用いることができる。例えば、細胞、組織または器官に発現ベクターまたはタンパク質を直接注射することができる。
【００７８】
また、別の態様においては、ex vivoの遺伝子治療が考えられる。Ex vivoの態様においては、細胞を患者から取り出し、少なくともある程度の期間にわたり、体外で維持する。この期間中に、取り出した細胞に治療を施し、その後、細胞を患者の体内に再導入する。
【００７９】
In vivoの標的細胞への遺伝子伝播の方法は以下の工程を含んでいる。（１）その発現がＣＮＳの疾患または機能不全に関連した、適切な１種または数種の導入遺伝子の選択、（２）遺伝子伝播に適した、効率的なベクターの選択および開発、（３）標的細胞のin vivo形質導入および導入遺伝子発現が安定におよび効率的に行われることの実証、（４）遺伝子療法の工程によって重度の有害な作用が生じないことの実証、（５）宿主動物において所望の表現型が達成されることの実証。
【００８０】
他のベクターを用いてもよいが、本発明で使用する好ましいベクターはウイルスベクターおよび非ウイルスベクターである。選択するベクターは以下の条件を満足するものである。１）ベクターは標的細胞に感染するものでなければならず、よって、適切な宿主域を有するウイルスベクターを選択しなければならない、２）導入する遺伝子は、細胞内における安定な持続および発現を達成するために、長期間にわたって（細胞死を招くことなく）細胞内に存続可能であり、発現されるものである、３）ベクターは標的細胞に対して全くもしくは極少量の損傷しか与えない。
【００８１】
哺乳動物成体の脳細胞は非分裂性であるため、選択した組み換え発現ベクターは、非分裂性細胞にトランスフェクト可能であり、そこで発現されるものでなければならない。現在では、このような特性を有するベクターに、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルス、ＨＩＶ由来のレンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）などの特定のＲＮＡウイルスが含まれる。このような特性を有する他のベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。しかし、上記ウイルスのうちの数種（例えば、ＡＡＶとＨＳＶ）は毒性および／または免疫原生を有する。近年、ＨＩＶ由来レンチウイルスベクターシステムが開発され、他のレトロウイルスと同様に、導入遺伝子を宿主細胞の細胞核に挿入する（発現の安定性を向上させる）ことが可能でありながらも、他のレトロウイルスとは異なり、非分裂性細胞の細胞核に導入することができる。レンチウイルスベクターは、直接注入の後に脳細胞を安定にトランスフェクトし、ウイルスタンパク質由来の検出可能な発病を生じることなく、外来導入遺伝子を安定に発現する（Naldini, et al., Science, 272:263-267 (1996)を参照、この記載をもってこの論文の内容を本願に導入したものとする）。ＨＩＶ−１レトロウイルスベクターを初めて構築した研究者らの教示に従えば、通常の知識を有する当業者は、本発明の方法における使用に適したレンチウイルスベクターを構築することができる（レトロウイルスの構築に関するより一般的な文献としては、例えば、Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual（遺伝子伝播と発現、実験マニュアル）, W. Freeman Co. (NY 1990)およびMurray, E J, ed., Methods in Molecular Biology（分子生物学の手法）, Vol. 7, Humana Press (NJ 1991)を参照）。
【００８２】
組み換えＡＡＶベクターの使用は効率的である。なぜならその感染は比較的長期持続性であり、毒性導入遺伝子が組み換えられていない限り、通常は毒性ではない。ＡＡＶはヘルパー依存性のパルボウイルスであり、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムとそれを取り巻く単純な、無エンベロープ性の正二十面体のタンパク質の殻からなる。ヒトの成人人口の約８５％がＡＡＶに対して血清陽性である。しかしながら、ＡＡＶ感染に関連付けられた病理はない。ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとなるアデノウイルスまたはヘルペスウイルスに依存してＡＡＶによる生産的な感染を達成する。ヘルパーウイルスが存在しない場合には、ＡＡＶゲノムは毒性の攻撃（ＵＶ照射、ヒドロキシ尿素暴露）に応答して増幅する。毒性の攻撃またはヘルパーウイルスが存在しない場合には、野生型ＡＡＶはヒトの染色体１９に部位特異的に組み込まれる。これは染色体組み込み部位におけるＡＡＶ−染色体複合体の形成を仲介するＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によって生じる現象である。ウイルスゲノムのパッケージングと組み込みのために、２つの１４５塩基対の逆位末端配列（ＩＴＲ）を残し、ウイルスゲノムの大部分（９６％）を除去する。組み換えＡＡＶの効率的な伝播のための技術として、当業界で組換えＡＡＶ、すなわちｒＡＡＶが開発された。それはミニアデノウイルスゲノムプラスミドという、１つのプラスミドの中にＡＡＶのパッケージング機能とアデノウイルスのヘルパー機能がコードされたものである。更に、高度に精製されたｒＡＡＶを単離するためのｒＡＡＶの方法は、ｒＡＡＶ保存液の滴定と同様に、比較的簡単であり、迅速に処理することが可能である。ｒＡＡＶ仲介導入遺伝子発現をトレースする際には、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と呼ばれる、非常によく特徴付けられた２３８アミノ酸の蛍光タンパク質をｒＡＡＶ内にバイシストロニックに配置して使用することが多い。種々のプロモーターを介したｒＡＡＶ仲介遺伝子伝播による選択的且つ特異的な発現も同定されている。我々が組み換えＡＡＶを構築する際には、市販のＡＡＶヘルパーフリーシステム（Stratagene）を使用した。プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦを、一般的な組み換えＤＮＡ技術を用いてＡＡＶシステムのベクター／プラスミドにクローニングする。
【００８３】
プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを発現するウイルスベクター
本発明で使用するための神経系成長因子の組み換え発現用ベクターの構築は、当業者には詳細な説明の必要のない一般的な技術によって達成することができる。ＡＡＶベクターを構築するための詳細はここに記載した。更なる情報については、通常の知識を有する当業者は、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)内の記載を参照してもよい。
【００８４】
簡単に説明すると、組み換え発現ベクターの構築には、通常の連結技術を使用する。構築したベクター内に正しい配列が含まれていることを確認するためには、連結混合物を宿主細胞の形質転換に使用し、成功した形質転換体を、適切な場合には、抗生物質で選択する。形質転換体からベクターを用意し、制限酵素および／またはシーケンシングによる、例えば、Messing et al.の方法（Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)）、Maxam et al.の方法（Methods in Enzymology, 65:499 (1980))、または当業者によく知られているほかの適切な方法で分析する。切り出した断片のサイズによる分離は、例えば、Maniatis et al.（Molecular Cloning, pp. 133-134 (1982)）に記載の一般的なゲル電気泳動によって行う。
【００８５】
ｃＤＮＡ（プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧ）の発現は、転写、翻訳または翻訳後のレベルで制御する。転写開始は、遺伝子発現に初期の重要な事象である。転写はプロモーター配列およびエンハンサー配列に依存し、これら配列と相互作用する特定の細胞因子による影響を受ける。多くの原核生物遺伝子の転写単位はプロモーターと、場合によってはエンハンサーまたは制御因子からなる（Banerji et al., Cell 27:299 (1981)、Corden et al., Science, 209:1406 (1980)、およびBreathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50:349 (1981)）。レトロウイルスの場合、レトロウイルスゲノムの複製に関わる制御因子は長い末端反復配列（ＬＴＲ）に存在する（Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses（腫瘍ウイルスの分子生物学：ＲＮＡ腫瘍ウイルス）, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)）。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲはプロモーター配列とエンハンサー配列を含んでいる（Jolly et al., Nucleic Acids Res., 11:1855 (1983)、Capecchi et al., Enhancer and eukaryotic gene expression（エンハンサーと真核生物遺伝子発現）内, Gulzman and Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991)）。他の強力なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）や他の野生型ウイルスプロモーターが含まれる。
【００８６】
ｒＡＡＶの製造および使用する方法、ならびにin vivoの種々の細胞にｒＡＡＶを送達する方法については、米国特許第５，７２０，７２０号、第６，０２７，９３１号、第６，０７１，８８９号、およびＷＯ ９９／６１０６６に開示されており、これらの記載は本願に組み込まれているものとする。種々の血清型のＡＡＶが入手可能であり、組織指向性を示す。従って、使用すべき適切な血清型は、形質導入する組織に依存する。
【００８７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および選択したプロモーターを使用して神経系において成功した、局所的な長期にわたる非毒性の導入遺伝子発現については、Klein et al., Experimental Neurology, 150:183-194 (1998), “Neuron-Specific Transduction in the Rat Septohippocampal or Nigrostriatal Pathway by Recombinant Adeno-associated Virus Vectors（組み換えアデノ随伴ウイルスベクターによる、ラットの中隔海馬経路または黒質線条体経路におけるニューロン特異的な形質導入）”を参照することができる。
【００８８】
神経栄養因子であるＮＧＦ、ＧＤＮＦとＢＤＮＦの有意に持続性の安定な発現が可能な組み換えＡＡＶを使用した遺伝子療法の方法、およびその結果として得られた神経科学的に定量的な治療効果については、Klein et al., Neuroscience, 90:815-821 (1999), “Long-term Actions of vector-derived Nerve Growth Factor or Brain-derived Neurotrophic Factor on Choline Acetyltransferase and Trk Receptor Levels in the Adult Rat Basal Forebrain（成体ラット前脳基底部におけるコリンアセチルトランスフェラーゼレベルおよびＴｒｋ受容体レベルに対する、ベクター誘導性神経成長因子および脳誘導性神経栄養因子の長期活動）”を参照。
【００８９】
より重要なパラメーターが、標的組織に送達するプレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦの用量である。ウイルスベクターの場合、プレ（β）プロＧＤＮＦ濃度およびプレ（γ）プロＧＤＮＦ濃度は、神経栄養組成物に含まれるウイルス粒子／ｍｌと定義することができる。ウイルス発現ベクターを用いたプレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦの送達に最適な条件としては、プレ（γ）プロＧＤＮＦの各単位用量に２．５〜２５μｌのプレ（γ）プロＧＤＮＦ組成物が含まれ、組成物は、薬学的に許容される液体中のウイルス発現ベクターを含み、１ｍｌのプレ（β）プロＧＤＮＦ組成物またはプレ（γ）プロＧＤＮＦ組成物当たり、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦを発現するウイルス粒子を１０10〜１０15個提供する。このように高い力価は、特にＡＡＶの時に有用である。レンチウイルスの場合は、通常、力価はより低く、１０8〜１０10形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）である。
【００９０】
実施例
【実施例１】
【００９１】
ＧＤＮＦスプライスバリアントｃＤＮＡのクローニングとＲＴ-ＰＣＲによるＧＤＮＦスプライスバリアントｍＲＮＡの発現分析
プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡを、ＲＴ-ＰＣＲによって、マウスの肝臓および脳細胞から（第１ペアーとしてプライマー４２と４３およびネスト化プライマーとしてプライマー４６と４７を使用して）クローニングし、ヒトの肝臓、子宮および脳細胞から（第１ペアーとしてプライマー５３と４９およびネスト化プライマーとしてプライマー４８と５４を使用して）クローニングした（図３および４）。マウスの全ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出キット（Ambion）を用いて単離し、ヒトＲＮＡは、Clontech社より入手した。ファーストストランドｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）（Promega）でプライミングした、異なる組織から得られた全ＲＮＡ（５μｇ）をテンプレートとして、逆転写酵素（SuperscriptII、Invitrogen）により合成した。
【００９２】
マウスおよびヒトのプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのクローニングに用いたプライマーは、以下の通りである：
マウスGdnf遺伝子の５’側の第１のプライマー（プライマー４２）
５’−GCTCCTGCCCGAGGTC−３’（配列番号７）
マウスGdnf遺伝子の３’側の第１のプライマー（プライマー４３）
５’−CCTTTCTTCGCACTGTAGCAG−３’（配列番号８）
マウスGdnf遺伝子の５’側のネスト化プライマー（プライマー４６）
５’−GTCCGGATGGGTCTCCTGG−３’（配列番号９）
マウスGdnf遺伝子の３’側のネスト化プライマー（プライマー４７）
５’−CACAGCAGTCTCTGGAGCCG−３’（配列番号１０） 
ヒトGDNF遺伝子の５’側の第１のプライマー（プライマー５３）
５’−GACCTGTTGGGCGGGGCTC−３’（配列番号１１）
ヒトGDNF遺伝子の３’側の第１のプライマー（プライマー４９）
５’−CCTGGGAACCTTGGTCCCTTTC−３’（配列番号１２） 
ヒトGDNF遺伝子の５’側のネスト化プライマー（プライマー４８）
５’−GCTCCAGCCATCAGCCCGG−３’（配列番号１３） 
ヒトGDNF遺伝子の３’側のネスト化プライマー（プライマー５４）
５’−CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG−３’（配列番号１４）
【００９３】
ＰＣＲ反応は、５０μｌまたは２５μｌ容量で実施した。５０μｌ容量の場合、２／５容量の逆転写反応液と、耐熱性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ（Roche）を含む酵素混合物３．７５単位を使用し、２５μｌ容量の場合、１／５容量の逆転写反応液と、上記酵素混合物１．８６単位を使用し、エキスパンドロングディスタンステンプレート（Expand Long Distance Template）ＰＣＲシステムキット（Roche）を用い、このキットの製造元の取扱説明書に従ってＰＣＲ反応を行った。第１のＰＣＲ反応に引き続き、ネスト化ＰＣＲ反応を行った。この際、第１ＰＣＲ反応の反応液１〜２μｌをネスト化ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。第１ＰＣＲ反応とネスト化ＰＣＲ反応のいずれにおいても、ＤＮＡを以下の条件下で増幅した：９４℃（２分）；９４℃（１０秒）、６２℃（３０秒）、６８℃（１分）を１０サイクル；９４℃（１５秒）、６２℃（３０秒）、６８秒（１分２０秒）を２５サイクル；６８℃（７分）、４℃（５分）を１サイクル。得られた増幅ＲＴ-ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル上に展開し、ＰＣＲ断片の直接シーケンシングを行うか、ＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen）にクローニングした後、配列を確認した。ＤＮＡ断片は、ＡＢＩ ３１００ キャピラリーシークエンサーと、その製造元が推奨するダイターミネーター（Dye Terminator）（v3.1）
キット（Applied Biosystems）を用いてシーケンシングを行った。 
【００９４】
ゲル抽出ヒトＰＣＲ断片のシーケンシングには、GDNF遺伝子の５’側のプライマーとして５’−GCTCCAGCCATCAGCCCGG−３’（配列番号１５）、GDNF遺伝子の３’側のプライマーとして５’−CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG−３’（配列番号１６）を用いた。マウスのＰＣＲ断片のシーケンシングには、GDNF遺伝子の５’側のプライマーとして５’−GTCCGGATGGGTCTCCTGG−３’（配列番号９）と、GDNF遺伝子の３’側のプライマーとして５’−CACAGCAGTCTCTGGAGCCG−３’（配列番号１０）を用いた。
【００９５】
各ｍＲＮＡの発現を分析するために、マウスとヒトのプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦを、制限酵素XhoIおよびHindIIIによってｐＣＲ２．１ベクターから開裂させ、同じ制限酵素によって開裂させたｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクターに連結した。挿入したＰＣＲ断片のシーケンシングには、５’側のプライマーとして５’−CAACGGGACTTTCCAAAATG−３’（配列番号３７）と３’側のプライマーとして３’−GGACACGCTGAACTTGTGG−５’（配列番号３８）を使用した。
【００９６】
更なる発現分析のために、ヒトのプレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦをｐＡＡＶ-ＭＣＳおよびｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ発現ベクター（Stratagene）内にクローニングし、それによりｐＡＡＶ−ＭＣＳ-プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ-プレ（β）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ-プレ（α）プロＧＤＮＦおよびｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ-プレ（β）プロＧＤＮＦの発現構築物を得た。クローニングに用いたプライマーは以下の通りである：
５’側のプライマー（８９） 
５’−CAACAAGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGTGG−３’（配列番号３９）
３’側のプライマー（９０）
３’−CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG−５’（配列番号４０）
【００９７】
発現分析のために、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの翻訳開始コドンＣＴＧを、従来の翻訳開始コドンＡＴＧで置換した後、ｃＤＮＡを、ｐＡＡＶ-ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）内にクローニングすることにより、ｐＡＡＶ-ＭＣＳ-プレ（γ）プロＧＤＮＦ-ＡＴＧ発現構築物を得た。クローニングに用いたプライマーは以下の通りである：
５’側のプライマー（９１） 
５’−CAACAAGGATCCATGGGACTTGGGGCACCTGGAGTTAATG−３’（配列番号１７） 
３’側のプライマー（９２）
５’−CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAGCGG−３’（配列番号１８） 
【００９８】
プライマー８９と９０またはプライマー９１と９２は、Dynazyme ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes）とDynazyme１０×緩衝液とを利用したＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応液の総量は５０μｌであり、テンプレートとして、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１内のヒト プレ（α）プロＧＤＮＦまたはプレ（β）プロＧＤＮＦを４０ｎｇ含んでいた。ＤＮＡは、以下の条件下で増幅した：  ９５℃（５分）；９５℃（４５秒）、５６℃（４５秒）、７２℃（１分）を２５サイクル；７２℃（７分），４℃（７分）を１サイクル。増幅したＰＣＲ産物は、制限酵素BamHIおよびXhoIで開裂させ、同じ制限酵素で開裂させたｐＡＡＶ−ＭＣＳベクター（Stratagene）に連結し、配列を確認した。
【００９９】
挿入したＰＣＲ断片のシーケンシングに用いたプライマーは、５’側の５’−ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC−３’（配列番号４１）および３’側の３’−TAGAAGGACACCTAGTCAGA−５’（配列番号４２）であった。
【実施例２】
【０１００】
細胞培養
ＣＨＯ、ＨＥＫ-２９３、ＰＣ-６．３およびＡｔＴ-２０細胞系は、抗生物質と共に１０％ ＦＣＳ（Gibco）（ＣＨＯおよびＨＥＫ-２９３細胞）、１０％ ＨＳ（Gibco）および５％ ＦＣＳ（ＰＣ-６．３細胞）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、または１０％ ＦＣＳ、４．５ｇ／ｌグルコースおよび１．５ｇ／ｌ炭酸ナトリウム（ＡｔＴ-２０細胞）を含むＤＭＥＭ中で培養した。ＢＨＫ-２１細胞系は、抗生物質と共に７．５％ ＦＣＳ、０．０４％トリプトースリン酸ブロス（Difco）および１％ グルタミン酸塩（Gibco）を含む最小培地（ＭＥＭ）中で培養した。得られた細胞を、マウス プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡ、もしくはヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡを含むｐＥＧＦＰ-Ｎ１（Invitrogen）発現ベクターでトランスフェクトした。他の実験系においては、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）トランスフェクションプロトコルを用いて、ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ-ＡＴＧのｃＤＮＡを含むｐＡＡＶ-ＭＣＳまたはｐＡＡＶ-ＩＲＥＳ-ｈｒＧＦＰベクターをトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析においては、トランスフェクトした細胞をＯｐｔｉＭＥＭ（Sigma）培地中で４８時間培養し、その後、培地を回収し、細胞からタンパク質抽出物を得た。分泌タンパク質（培地）は、Amicon Ultra-4 遠心用フィルターユニット（Millipore）を用いて濃縮するか、マウス抗ＧＤＮＦ抗体を用いて免疫沈降させた。タンパク質抽出物は、１５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に展開し、Ｄ２０抗体（Santa Cruz）を用いたウェスタンブロットにより分析した。免疫蛍光検査分析においては、トランスフェクトした細胞を、正常な栄養培地で２４時間培養した後、固定化ならびに膜透過化処理を行った。細胞を、一次抗体および二次抗体で染色し、その画像を、顕微鏡（AX70 Provis、Olympus）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、Olympus）にて取得した。
【０１０１】
結果
上記実験の結果、ヒトおよびマウスの両方の（γ）プロＧＤＮＦ、（β）プロＧＤＮＦおよびこれらの成熟ＧＤＮＦがＣＨＯ細胞系から分泌され（図５および６）、更には、ＨＥＫ-２９３、ＰＣ-６．３およびＡｔＴ-２０細胞系からも分泌された。マウス（γ）プロＧＤＮＦおよびその成熟ＧＤＮＦは、ＢＨＫ-２１（図７）、ＣＨＯおよびＰＣ-６．３細胞系からも分泌され、そしてヒト（γ）プロＧＤＮＦ-ＡＴＧ（ＣＴＧ翻訳開始コドンがＡＴＧで置換されている）とその成熟ＧＤＮＦは、ＢＨＫ-２１およびＣＯＳ-７細胞系から分泌された（図８）。
【実施例３】
【０１０２】
分化したＰＣ-６．３細胞および海馬初代培養細胞からのヒト プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦの分泌
ＰＣ-６．３細胞の分化と刺激
トランスフェクションの後、ＰＣ-６．３を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５％ ＨＳ（Gibco）、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦを含む分化培地中にて培養した。７２時間後に培地を除去し、（場合により５０ｍＭ ＫＣｌを含む）無血清ＤＭＥＭで置換した。トランスフェクションに用いた発現構築物は、ｐＥＧＦＰ内のヒトとマウスのプレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦであった。ＥＬＩＳＡ分析においては、終止コドンを欠くラット プレプロＢＤＮＦ（ドイツ国、マインツ市、Johannes-Gutenberg大学のDr. Volkmar Lessmanの提供による）を含むｐＥＧＦＰ-Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）を、活動依存性分泌の陽性コントロールとして使用した（Haubensak et al., J. Cell Sci., 111:1483-93 (1998)）。この構築物は、上記の他の構築物と同様の手順でクローニングした。ウェスタンブロット分析においては、５時間後に培地（上清）を回収し、Amicon Ultra-4遠心用フィルターユニット（Millipore）を用いて濃縮した。タンパク質抽出物を１５％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上に展開し、ＧＤＮＦを認識するＤ２０抗体（Santa Cruz）を用いたウェスタンブロットにより分析した。ＥＬＩＳＡ分析においては、２時間後に培地を回収し、GDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）またはBDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）を用いて分析した。
【０１０３】
トランスフェクトされた、分化したＰＣ-６．３細胞の免疫蛍光分析
ｐＥＧＦＰ-Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）内に、終止コドンを有するｃＤＮＡをクローニングすることにより、ヒトのプレ（α）プロＧＤＮＦまたはプレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物を得た。ＰＣ-６．３細胞は、トランスフェクション前の３日間に亘って、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５％ ＨＳ（Gibco）、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦを含む分化培地中にて分化させた。トランスフェクションに用いた発現構築物は、ｐＥＧＦＰ内のヒトおよびマウスのプレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦであった。トランスフェクションの２４時間後に細胞は、４％ＰＦＡで固定化するか、最初に５０ｍＭ ＫＣｌおよび５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで２時間刺激してタンパク質合成を停止させ、その後、４％ＰＦＡで固定化した。全細胞を０．５％ ＢＳＡ（Sigma）でブロックし、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体であるポリクローナル抗ＧＤＮＦ（GeneWay Biotech Inc.、希釈率１:７５０）および成熟ゴルジ体用のモノクローナル抗ＧＭ１３０（Abcam、希釈率１:１００）と共に室温で０．５％ＢＳＡと共に１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体であるＣｙ２接合ロバ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch laboratories）およびＣｙ３接合ロバ抗ラビットＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch laboratories）と共に培養した。最後に、カバーガラスをImmu-mount（Thermo electron corporation）と共にマウントした。その画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。
【０１０４】
海馬初代ニューロンの培養、トランスフェクションおよび細胞の脱分極
海馬ニューロンを調製するために、Ｅ１８ラットの海馬を解剖した。組織を、０．２５％トリプシンのＨＢＳＳ溶液で１０〜１５分間、３７℃で消化した。その後、ＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ）を追加し、得られた試料をシリコン化ガラスピペットで吸い上げることで粉砕した。細胞は、１０ｍＭのグルコース（Sigma）を含むＨＢＢＳで三度洗浄した。得られた懸濁液において、ラットニューロンヌクレオフェクター（Nucleofector）キット（Amaxa biosystems）を使用して、該キットの製造元の推奨に従い、ヒトまたはマウスのプレ（α）プロＧＤＮＦもしくはプレ（β）ＧＤＮＦのｃＤＮＡを含むｐＥＧＦＰ-Ｎ１（Invitrogen）発現ベクターで細胞をトランスフェクトした。細胞は、ポリ−Ｄ−リシン臭化水素塩（Sigma）でコートした培養皿上に播種して、Ｌ−グルタミン酸塩（Gibco Invitrogen）および１×のＢ-２７（Gibco Invitrogen）を添加したNeurobasal培地（Gibco Invitrogen）中で培養した。４日間培養を行った後、培地を除去し、（場合により５０ｍＭ ＫＣｌを含む）Neurobasal培地（Gibco Invitrogen）で置換した。１５〜３０分後に、培地を回収し、ＧＤＮＦ濃度を、GDNF EmaxR イムノアッセイシステム（Promega）を用い、製造元の推奨に従って分析した。
【０１０５】
結果
免疫蛍光検査分析の結果から、分化したＰＣ−６．３細胞において、刺激の前後でプレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦのコードするタンパク質の局在に明らかな相違があることが分かる。刺激しなかったＰＣ−６．３細胞においては、プレ（α）プロＧＤＮＦのコードするＧＤＮＦは、小胞体＋／−ゴルジ体よりも、ゴルジ複合体単独により高頻度に局在していた（図９）。これに対して、プレ（β）プロＧＤＮＦのコードするＧＤＮＦの大部分が小胞体＋／−ゴルジ体に局在し、ゴルジ複合体単独に局在したものは僅かであった。ＫＣｌ刺激後、（β）プロＧＤＮＦおよびその成熟ＧＤＮＦは、（α）プロＧＤＮＦおよびその成熟ＧＤＮＦと比較して、より速やかに小胞体区画に移動した（図９）。ウェスタンブロット分析の結果から、ヒトおよびマウスの両方のプレ（α）プロＧＤＮＦ ｃＤＮＡのコードするＧＤＮＦは、分化した神経様ＰＣ−６．３細胞から構成的に分泌されるが、それに対して、（β）プロＧＤＮＦ ｃＤＮＡのコードするＧＤＮＦの分泌は活動依存的であることが分かる（図１０および１１）。この結果は、ラットＢＤＮＦを陽性コントロールとして使用したＥＬＩＳＡ分析によっても確認された（図１２）。これらの結果は、（β）プロＧＤＮＦおよびそれをコードするｃＤＮＡは、（α）プロＧＤＮＦおよびそのｃＤＮＡよりも、ＰＤの遺伝子治療用分子として、遙かに有望である可能性を示唆している。
【０１０６】
考察
完全な黒質線条体ドーパミン系における組み換えレンチウイルスベクター送達による長期に亘るin vivoでのプレ（α）プロＧＤＮＦ発現は、ドーパミン合成における必須酵素であるチロシンヒドロキシラーゼの選択的ダウンレギュレーションを発生させる（Georgievska, et al., J. Neurosci., 24:6437-6445 (2004)、Sajadi, et al., J. Neurochem., 93:1482-1486 (2005)）。更に、６−ヒドロキシドパーミン障害パーキンソン病ラットの線条体への組み換えレンチウイルスベクター送達による継続的なin vivoでのプレ（α）プロＧＤＮＦ発現は、維持されている線条体ドーパミン終末におけるチロシンヒドロキシラーゼのダウンレギュレーションを誘発する（Georgievska, et al., Exp. Neurol., 177:461-474 (2002)）。これは、おそらくは、ドーパミンニューロンが、継続的ＧＤＮＦ刺激下においてチロシンヒドロキシラーゼ酵素活性の低下によるドーパミン合成の増加と放出を代償することができるという代償機構によるものであろう。パーセフィンは、ＧＤＮＦファミリーの神経栄養因子の一つである。高濃度のパーセフィンが神経毒であることは、実験により明確にされている（Tomac, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 99:9521-9526 (2002)）。最近のヒト以外の霊長類に対する実験も、高濃度のＧＤＮＦが脳毒性を誘発することを示している（Lang, et al., Ann. Neurol., 59:459-466 (2006)）。従って、将来の治療においては、高濃度のＧＤＮＦを避け、ＧＤＮＦのレベルを生理学的に制御できる系とすることが好ましい。我々が行ったin vitroでの実験結果は、プレ（β）プロＧＤＮＦのコードするＧＤＮＦの分泌は、生物学的刺激によって制御され、プレ（α）プロＧＤＮＦのコードすＧＤＮＦの分泌は構成性であることを示している。このため、（β）プロＧＤＮＦおよびそれをコードするｃＤＮＡは、（α）プロＧＤＮＦおよびそのｃＤＮＡよりも、ＰＤの遺伝子治療用分子として遙かに有望である。
【実施例４】
【０１０７】
ウィルスベクターの構築およびウィルス粒子の産生
ウィルスベクターを構築するために、ＡＡＶヘルパー・フリー・システム（Stratagene）を、製造元の利用説明書に従って使用する。適切な制限酵素を使用して、ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧのコード配列を、ｐＡＡＶ−ＭＣＳのマルチクローニング部位またはｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰベクターに導入し、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦまたはｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧ、もしくはｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦまたはｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを得る。上記のベクターは、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＡＡＶ−ＲＣベクターと共にＡＡＶ−２９３細胞に共トランスフェクトし、それによりプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを発現する組み換えＡＡＶ粒子を作製する。従って、ＧＦＰ発現対照ウィルス粒子を作製するためには、ベクターｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰを使用する。
【０１０８】
組み換えウィルス粒子は、ＡＡＶヘルパー・フリー・システム（Stratagene）の製造元による使用説明書に従って作製および精製する。組み換えウィルスの画分は、−８０℃で保存する。ウィルス粒子の数は、サザンブロットによって決定する。
【実施例５】
【０１０９】
パーキンソン病の神経保護動物モデルにおけるin vivo遺伝子伝播
動物：  体重２５０〜２８０ｇの雄ウィスターラット（Harlan）を３匹または４匹のグループに分け、１２時間：１２時間の明暗サイクル、室温２２℃の条件下で飼育する。水道水およびラット・チョー（Rat Chow）（Altromin 1324、Chr. Petersen A/S）を随意に摂取できるようにする。
【０１１０】
ウィルス注入および６−ＯＨＤＡ障害の誘発：  全ての定位注射は、PaxinosとWatsonのアトラス（The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. Academic press, San Diego, 1997）に従って、ブレグマと硬膜に対応する座標（A/P ＋ 1.0、L/M ＋ 2.7、D/V −4）を用いて、左線条体に対して行った。定位手術は、イソフルラン麻酔下（導入時４．５ ％、手術時２．５％）で、公知の２段階法（Kearns et al., J. Neurosci., 17:7111-7118 (1997)）により行う。対象動物に、ＧＦＰもしくはプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡを組み込んだ組み換えＡＡＶベクターを注射する（ｎ＝５〜７/グループ）。組み換えＡＡＶベクター注射１４日後に、再度、動物を麻酔し、２０μｇの６−ＯＨＤＡ（Sigma）（この量は遊離塩基換算であり、０．０２％アスコルビン酸を加えた３または４μｌの氷冷生理食塩水に溶解して使用）を、ブレグマと硬膜に対応する座標（A/P ＋ 1.0、L/M ＋ 2.7、D/V −4）を用いて、線条体に１回注射する。注射速度は、１μｌ／分であり、注射器は抜き取る前に更に３分間放置する。６−ＯＨＤＡの注射に先立って、６−ＯＨＤＡのノルアドレナリン神経終末への取り込みを防止して神経終末を破壊から保護するために、デシプラミン（desipramine）（Sigma、濃度１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与量１ｍｌ／ｋｇ）を投与する。
【０１１１】
行動試験：ｒＡＡＶベクター注射１０日後、そして６−ＯＨＤＡ注射の４週間後にも、ラットに、アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を注射して、自動ロータメーターボウル（ペンシルバニア州、アレンタウン、Colbourn Instruments, Inc.）中で、１２０分に亘り旋回反応をモニターする。旋回運動の観察の後、脳を潅流し、免疫組織化学検査のために回収する。
【０１１２】
チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学的解析：  ６−ＯＨＤＡ注射の２８日後、ラットを、ペントバルビタールナトリウムで深く麻酔し、ＰＢＳおよび引き続き２００ｍｌの氷冷 ４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で心臓潅流する。脳は解剖して更に上記と同じ固定液で３〜４時間固定し、２５％ショ糖に移して４８時間静置した。凍結ミクロトーム上で、４０μｍの連続切片を作製した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫組織化学的解析を公知の手法（Kirik et al., Eur. J. Neurosci., 13:1589-1599 (2001)）に従って行う。
【０１１３】
形態学的解析、ＳＮ細胞数：  ＳＮｐｃ内のＴＨ陽性細胞の数を、光学的細胞分画法（optical fractionator method）（West, et al., Anat. Rec., 231:482-497 (1991)）を用いて推定する。ＳＮｐｃは、公知の手法（Sauer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:8935-8939 (1995)）により、Olympus BX51 顕微鏡に取り付けられたステレオインベスティゲーター（Stereo Investigator）プラットホーム（MicroBrightField）を用いて分析する。簡単に説明すると、各ラットについて、中間終止核（medial terminal nucleus）（ＭＴＮ）が存在するＳＮｐｃの中心部分（PaxinosとWatsonのアトラス （Paxinos, G. & Watson, C., 1997, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. Academic press, San Diego）におけるレベル A/P −５．３ｍｍ）から、３個所を選択して定量する。参照するエリアを、それぞれ低出力（４×）で輪郭を付し、細胞を高倍率（６０×、オイル浸漬）の対物レンズを使用して計数する。細胞数は、平均数／１切片として表す。細胞数の計測は、光学的分画法と、解剖装置の原則並びに公平な計測ルールとを組み合わせて行う。
【０１１４】
統計学的分析：神経保護研究において、同側性の回転数とＴＨ陽性細胞の数は一方向ＡＮＯＶＡにより分析し、その後、Ｔｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒの事後検定を行う。
【実施例６】
【０１１５】
パーキンソン病の神経再生動物モデルにおけるin vivo遺伝子伝播
動物：体重２５０〜２８０ｇの雄ウィスターラット（Harlan）を３匹または４匹のグループに分け、１２時間：１２時間の明暗サイクル、室温２２℃の条件下で飼育する。水道水およびラット・チョー（Rat Chow）（Altromin 1324, Chr. Petersen A/S）を随意に摂取できるようにする。
【０１１６】
ウィルス注入および６−ＯＨＤＡ障害の誘発：  全ての定位注射は、PaxinosとWatsonのアトラス（The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. Academic press, San Diego, 1997）に従って、ブレグマと硬膜に対応する座標（A/P ＋ 1.0、L/M ＋ 2.7、D/V −4）を用いて、左線条体に対して行う。定位手術は、イソフルラン麻酔下（導入時４．５ ％、手術時２．５％）で、公知の２段階法（Kearns et al., J. Neurosci., 17:7111-7118 (1997)）により行う。対象動物に、２０μｇ ６−ＯＨＤＡ （Sigma）（この量は遊離塩基換算であり、０．０２％アスコルビン酸を加えた３ｐｉの氷冷生理食塩水に溶解して使用）を、ブレグマと硬膜に対応する座標（A/P ＋ 1.0、L/M ＋ 2.7、D/V −4）を用いて、線条体に１回注射する。注射速度は、１μｌ／分であり、注射器は抜き取る前に更に３分間放置する。６−ＯＨＤＡの注射に先立って、６−ＯＨＤＡのノルアドレナリン神経終末への取り込みを防止して神経終末を破壊から保護するために、デシプラミン（desipramine）（Sigma）（濃度１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与量１ｍｌ／ｋｇ）を投与する。６−ＯＨＤＡ注射の２８日後、ラットを再度麻酔して、ＧＦＰもしくはプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧのｃＤＮＡを組み込んだｒＡＡＶベクターを注射する（ｎ＝５〜７／グループ）。６−ＯＨＤＡ注射２１日後に、また更にｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、またはｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧの送達の１、２、４および８週間後に、ラットにアンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を注射して、自動ロータメーターボウル（ペンシルバニア州、アレンタウン、Colbourn Instruments, Inc.）中で、１２０分に亘り旋回反応をモニターする。旋回運動の観察の後、脳を潅流し、免疫組織化学検査のために回収する。行動試験、チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学的解析、形態学的解析、および黒質細胞のカウントを上記および次の方法で行う。
【０１１７】
チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学的解析：  ＡＶＶ注射の８週間後、ラットを、ペントバルビタールナトリウムで深く麻酔し、ＰＢＳおよび引き続き２００ｍｌ 氷冷 ４％ ＰＦＡで心臓潅流する。脳は解剖して、更に上記と同じ固定液で３〜４時間固定し、２５％ショ糖に移して４８時間静置した。凍結ミクロトーム上で、４０μｍの連続切片を作製した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫組織化学的解析を公知の手法（Kirik et al., Eur. J. Neurosci., 13:1589-1599 (2001)）に従って行う。
【０１１８】
形態学的解析、ＳＮ細胞数：  ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性細胞の数を、光学的分画法（optical fractionator method）（West, et al., Anat. Rec., 231:482-497 (1991)）を用いて推定する。ＳＮｐｃは、公知の手法（Sauer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:8935-8939 (1995)）により、Olympus BX51 顕微鏡に取り付けられたステレオインベスティゲーター（Stereo Investigator）プラットホーム（MicroBrightField）を用いて分析する。簡単に説明すると、各ラットについて、中間終止核（medial terminal nucleus）（ＭＴＮ）が存在するＳＮｐｃの中心部分（PaxinosとWatsonのアトラス （Paxinos, G. & Watson, C., 1997, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. Academic press, San Diego）におけるレベル A/P −５．３ｍｍ）から、３個所を選択して定量する。参照するエリアを、それぞれ低出力（４×）で輪郭を付し、細胞を高倍率（６０×、オイル浸漬）の対物レンズを使用して計数する。細胞数は、平均数／１切片として表す。細胞数の計測は、光学的分別法と、解剖装置の原則並びに衡平な計測ルールとを組み合わせて行う。
【実施例７】
【０１１９】
癲癇の動物モデルにおける、プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦのウィルス送達の利用
電極の埋め込みとウィルスの脳室内注射：  雄スプラーグドーリーラット（Sprague Dawley rats）（２００〜３００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、定位固定装置（stereotaxic frame）に入れる。テフロン被覆ステンレス鋼ワイヤー製の双極電極を、右扁桃体基底外側核に埋め込む（ブレグマから−２．８ｍｍ前後方、＋４．９ｍｍ外側；および−８．６ｍｍ背側）（Paxinos and Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. New York: Academic Press, Paper Back, 1997）。対照ラットには、４〜８μｌの対照ウィルス（ＡＡＶ−ＧＦＰ）を、他のラットには、４〜８μｌのプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを発現するＡＶＶを、先端を右側脳室（−0.8ｍｍ前後方、＋1.5ｍｍ外側、および−3.6ｍｍ背側）（Paxinos and Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（ラット脳の脳定位座標）. New York: Academic Press, Paper Back, 1997）に埋め込んだカニューレにより定位的に投与する。カニューレと電極は、歯科用セメントおよび複数のアンカースクリューを用いて頭蓋骨に強固に固定し、アース線をアンカースクリューの１つに取り付ける（Binder et al.，J. Neurosci., 19:1424-1436 (1999)）。術後、キンドリング刺激を与える前に、ラットを４日間回復させる。 
【０１２０】
キンドリング：  キンドリング刺激は、それぞれ６０Ｈｚ １秒の、脳波図上で認められる発作の閾値（electrographic seizure threshold）（ＥＳＴ）よりも１００μＡ高い振幅での一連の１ミリ秒二相矩形波からなる。ＥＳＴは、刺激の最初の日に、１００μＡから始めて、１分間隔で１００μＡずつ刺激を強めることによって決定する（Kokaia et al., Eur. J. Neurosci., 11:1202-1216 (1999)）。１日に２回ラットに刺激を与えることを１１日間行う（刺激の合計回数は２２回）。刺激毎に、行動学的（発作分類）および電気生理学［脳波図上で認められる発作の継続時間（electrographic seizure duration （ＥＳＤ））］パラメータを、治療について知らされていない観察者によって記録する。行動学的発作分類は、Racineの分類（Racine, 1972）に従って記録する。この分類は以下の通りである: クラス０ − 行動的変化無し、クラス１ − 顔面クローヌス、 クラス２ − 点頭（head nodding）、クラス３ − 一側前肢クローヌス（unilateral forelimb clonus）、 クラス４ − 両側性前肢クローヌスによる立ち上がり（rearing with bilateral forelimb clonus）、およびクラス５ − 立ち上がりと転倒（姿勢制御能の喪失）。
【０１２１】
動物の分析：最後の刺激の４時間後、２４時間後または１週間後に、動物を断頭する。組織を塩化トリフェニルテトラゾリウムで染色し、in situ標識分析により、皮質組織のアポトーシス細胞を検出する。
【実施例８】
【０１２２】
脳卒中の動物モデルにおける、ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦおよびｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧによるin vivoの遺伝子伝播
ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦまたはｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧの皮質への送達：  プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを発現する組み換えＡＶＶベクターの脳卒中の遺伝子治療への利用可能性を調査するために、３０分間または９０分間一過性両側総頚動脈結紮（transient bilateral common carotid artery ligation）したラットの皮質にプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧを発現するｒＡＶＶベクターを注入する（Arvidsson et al., Neurobiol. Dis., 14:542-556 (2003)）。ｒＡＶＶベクターを注入した動物の皮質組織において、プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧのレベルが、ＧＦＰを発現するｒＡＶＶ（ｒＡＡＶ−ＧＦＰ）を注入した対照動物と比較して有意に高かった場合には、ｒＡＶＶは、プレ（α）プロＧＤＮＦ遺伝子、プレ（β）プロＧＤＮＦ遺伝子またはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧ遺伝子を送達、発現することができることを意味する。
【０１２３】
広域前脳虚血の誘発：  虚血発作時の体重が２８０〜２９０ｇの雄ウィスターラット（Taconic M&B A/S）２３匹を、１２時間：１２時間の明暗サイクルの条件下で、食料と水を随意に摂取できるようにして飼育する。一晩断食させた後、ラットに３．５％ハロタンを吸入させ、その後、１〜２％のハロタンを含むＮ2Ｏ：Ｏ2（７０：３０）を人工的に通風させることによって麻酔する。血液サンプルの採取、血圧の記録および薬剤注入のためのカニューレを、それぞれラットの尾動脈および静脈に挿入する。直腸近辺に温度計を設置して体温を測定し、加熱パッドを用いて３７℃付近に維持する。頚動脈を取り出し、その後、５０ＩＵのヘパリンを投与し、ハロタン濃度を０．５％まで下げ、臭化ベクロニウム（オランダ国、ボクステル、Organon Teknika B.V.）を、筋弛緩薬として２ｍｇ／ｈで静脈注入した。その後の３０分間の定常状態の間に、生理学的パラメータおよび脳波図（ＥＥＧ）をモニターする。虚血は、両側総頸動脈の閉塞と、頸静脈からの血液抜き取りによる低血圧（動脈圧：４０〜５０ｍｍＨｇ）との組み合わせにより誘発する。血流は、返血および血管閉塞クリップの除去の１０分後に回復する。直後の血液再循環時に、全身性アシドーシスを防止するために、炭酸水素ナトリウム（０．５ｍｌ、濃度５０ｍｇ／ｍｌ）を静脈投与する（Arvidsson et al., Neuroscience, 106:27-41 (2001)）。 
【０１２４】
動物の分析：  再灌流の４時間後、２４時間後および１週間後に、動物を断頭する（各グループはｎ＝６）。偽手術されたラット（ｎ＝５）も同様に処置するが、総頸動脈の閉塞は行わない。組織を塩化トリフェニルテトラゾリウムで染色し、in situ標識分析により、皮質組織のアポトーシス細胞を検出する。
F
【実施例９】
【０１２５】
コリン作動性細胞死の動物モデルにおけるin vivoの遺伝子伝播
In vivo遺伝子送達を利用した神経変性の防止のためのプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧ発現ＡＶＶベクターの送達のレベルとパラメータを決定するために、コリン作動性細胞死のin vivoラットモデルを使用し、動物へのウィルスベクターの注射を行った。動物モデルを得るにあたり、前脳基底核コリン作動性神経細胞死を誘発するために、成体の雄ウィスターラットに対して脳弓切断（fornix transections）を行う。プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧベクター（ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ-プレ（β）プロＧＤＮＦまたはｐＡＡＶ−ＭＣＳ-プレ（γ）プロＧＤＮＦ−ＡＴＧ）もしくは対照ＥＧＦＰベクターを、前脳基底部コリン作動系に、１０10〜１０12粒子／ｍｌ含む２．５〜１０μｌのストックベクター溶液（神経栄養組成物）として注射する。粒子は、３〜５分かけて、右脳半球の以下の座標に注入した: 脳表面からAP−0.3、ML−0.5、DV−6。皮膚を縫合して、ラットは２〜４週間生存させる。
【実施例１０】
【０１２６】
家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデルにおけるin vivoの遺伝子伝播
一般的事項：  筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの選択的変性を伴う、極めて進行性が高い致死的疾患である。ＧＤＮＦは、ＡＬＳおよび他の運動ニューロン疾患に対する有望な治療薬であるとされている。ＡＶＶが、安全性が確認された有用な遺伝子送達システムとして開発されたため、我々は、ＡＬＳモデルであるＧ９３Ａマウスにおける、ＡＶＶベクターの仲介によるＧＤＮＦ ｃＤＮＡの筋内送達の治療効力を調査する。家族性ＡＬＳモデルであるＧ１Ｈトランスジェニックマウスは、Gly93Ala変異を有するヒト スーパーオキシドジスムターゼ（superoxide dismutase）（ＳＯＤ１）を保有している（Gurney et al. Science, 264:1772-1775 (1994)）。プレ（α）プロＧＤＮＦスプライスアイソフォームを含むＡＶＶが、ＡＬＳに対する安全性も確立された有用な遺伝子送達システムとして開発されたため（Wang et al., Gene Ther., 9:381-383 (2002)）、我々は、ＡＬＳモデルであるＧ９３Ａマウスにおける、プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦ、およびプレ（γ）プロＧＤＮＦ-ＡＴＧのｃＤＮＡのＡＶＶベクター（ｒＡＡＶ-プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ-プレ（β）プロＧＤＮＦ、およびｒＡＡＶ-プレ（γ）プロＧＤＮＦ）を媒介とした筋内送達の治療効力を調査する。
【０１２７】
動物およびウィルス注入：  Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）を有する雄のトランスジェニックマウスを、The Jackson Laboratory （メイン州、バーハーバー）より得る。ＡＶＶベクタープラスミドは、上で詳細に説明したものを使用する。
【０１２８】
生後９〜１０週で、ＡＬＳマウスを、ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦベクター、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦベクター、およびｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦベクターをそれぞれ注入する３つの治療グループ（各グループはｎ＝１０）、ならびにＡＡＶ−ＧＦＰベクターおよびベヒクルをそれぞれ注入する２つの対照グループ（各グループはｎ＝５）にランダムに振り分けた。尚、ベクターまたはベヒクルの注入は、四肢（腓腹筋および上腕三頭筋）に対して行い、投与量は、腓腹筋に対して２５μｌであり、上腕三頭筋に対して１５μｌである。
【０１２９】
行動試験：  マウスを、試験前３日間、ロータロッド装置（Rota−Rod/7650またはマウス用Rota−Rod踏み車）に慣れさせる。検出のために、マウスを５、１０および２０ｒｐｍで回転するロッドに乗せ、マウスがロッド上に留まった時間を自動的に記録する。発症時期は、従来の知見に従い、２０ｒｐｍ回転時にマウスがロッド上に５分間留まれなかった時とする（Li et al., Science, 288: 335-339 (2000)）。マウスが５分を越してロッド上に留まった場合には、試験を終了し、記録を５分とする。試験は、マウスが試験の課題を遂行できなくなるまで、２日毎に行った。死亡時期については、ラットを、その背中から背臥位に置いた際に、３０秒以内に自ら姿勢を正常に正せなくなった際の年齢として記録した（Li et al., Science, 288: 335-339 (2000)）。
【０１３０】
形態学的解析：  筋肉切片（１０μｍ）を冷却したアセトンで固定し、一次抗体としてのウサギ抗ＧＤＮＦ Ｄ２０ポリクローナル抗体（1:500; Santa Cruz）および二次抗体としてのビオチン化抗ウサギ抗体（1:400; Santa Cruz）と共に培養した。その後、切片を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（Vectastain ABCキット、Vector Laboratories）により、３，３’−ジアミノベンジジンを色原体として使用して可視化する。
【０１３１】
筋肉を二重免疫蛍光染色するために、筋肉切片を順次、ブロッキング溶液、ウサギ抗ＧＤＮＦ Ｄ２０ポリクローナル抗体（1:500; Santa Cruz）、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ （1:200; Santa Cruz）、およびテトラメチルローダミン結合−α−ブンガロトキシン（Molecular Probes）と共にインキュベートする。切片は、共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ ＮＴ（ドイツ国、ハイデルベルク、Leica）で観察し、写真を撮影する。
【０１３２】
脊髄の形態学的解析の目的で、ニッスル染色、ＳＭＩ−３２免疫染色またはＣＴＢ免疫染色用の連続横断切片（３０μｍ）を得る。浮動性切片は、マウス オン マウスキット（Mouse-on-Mouse（M.O.M） kit）（Vector Laboratories）を使用し、その製造元のプロトコルに従いＳＭＩ−３２免疫組織化学染色する。ＣＴＢ免疫反応性解析用に処理した切片は、５％ウサギ血清にてブロッッキングし、抗ＣＴＢ抗体（希釈率：１：１０００、ＣＴＢに対するヤギ抗血清）と共にインキュベートする。切片は、標準的ＡＢＣ法により可視化する。
【０１３３】
形態測定分析および細胞数計測：  形態測定分析は、Olympus BX51顕微鏡とKS 400イメージ解析ソフトウェア（Zeiss）を利用してＣＣＤカメラにて取得したイメージに対して行う。筋肉繊維の平均面積は、ランダムに選択したエリアにおいて筋繊維数が１，０００を超すものに関して計算する。脊髄に存在する運動ニューロンの数を比較するために、公知の手法（Lewis et al., Nat. Genet., 25:402-405 (2000)）にしたがって、ニッスル染色ならびにＳＭＩ−３２免疫染色およびＣＴＢ免疫染色された脊髄の頚膨大から腰仙膨大に亘る切片のニューロンの数を計測する。各マウスにつき、６つの連続する切片のそれぞれに関して少なくとも２０個所を計測対象とする。但し、以下の基準を満たす大きな細胞形状を有するもののみを対象とする：脊髄中心管からの側線より下の脊髄前角に位置し、核小体を有する明確な核を有し、少なくとも１つの太い突起を有する。
【実施例１１】
【０１３４】
脊髄損傷の動物モデルにおけるin vivoの遺伝子伝播
一般的事項：  損傷した脊髄への神経栄養因子の送達は、神経の生存と再生を刺激することが証明されている。このことは、十分な栄養因子供給の欠如が、哺乳類の脊髄における自発的再生の欠落の１つの要因であることを示している。以前に、脊髄損傷成体ラットにおける、組み換えアデノウィルス（ＡｄＣＭＶｇｄｎｆまたはＡｄＣＭＶｌａｃＺ）の仲介によるプレ（α）プロＧＤＮＦの送達および機能回復と中枢神経細胞萎縮の試験を行った。その結果、アデノウィルスの仲介によるプレ（α）プロＧＤＮＦの送達は、脊髄損傷ラットにおいて、皮質脊髄運動ニューロンの逆行性萎縮を防止し、運動機能を改善できることが分かった（Tang et al., Neuroreport, 15:425-429 (2004)）。
【０１３５】
神経栄養因子を供給する遺伝子送達アプローチを利用して、プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦまたはプレ（γ）プロＧＤＮＦを発現するＡＶＶベクター（ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦまたはｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ）を、脊髄損傷部位に注入する。脊髄損傷成体ラットについて、皮質脊髄路（ＣＳＴ）再生を解剖学的に分析し、感覚−運動機能の改善を行動分析した。
【０１３６】
動物：  全ての実験は、ヘルシンキ大学の実験動物センター（Laboratory Animal Center）で行う。そこでは、全ての実験動物研究およびプロトコルは、フィンランド国法、ＥＵ指令（８６／６０９）、欧州協定（ＥＴＳ １２３）および遺伝子技術に関するフィンランド国内法に従う。雌成体ルイスラット（１６０〜１９０ｇｍ）を、４〜６匹のグループに分け、標準仕様ケージにて、１２時間：１２時間の明暗サイクル、標準的な随意の食事および水摂取方法にて飼育する。ラットを、ヒプノルム（Hypnorm）（１２０μｌ／体重２００ｇ）（Janssen Pharmaceutics）とドルミカム（Dormicum）（０．７５ｍｇを含む１５０μｌ／体重２００ｇ）（Roche Pharmaceuticals）を皮下注射して麻酔する。比較的長い処置による眼の乾燥を防ぐためにビタミンＡ含有眼軟膏を塗布する。虹彩切除ハサミおよび鋭く尖った刃物を使用して、Liebscher et al.の手順（Liebscher et al., Ann. Neurol., 58:706−719 (2005)）に従い、胸郭レベルＴ８において、ＣＳＴの主要部を含む脊髄の背側半分とＣＳＴの背外側および腹側内側部分とを含む個所にＴ型の損傷を与えた。
【０１３７】
ウィルスの送達：  ラットを、４群に分けて（それぞれ、ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、ｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦおよびＡＡＶ−ＧＦＰを使用）、同様の外科処置ならびに行動手順で処置する。実験は、以下のように二重盲検法にて行う：ラットにランダムなコード番号を付し、異なる群のラットをケージ内で混合する。全ての実験者は、実験の全段階（手術、健康管理、行動試験、ならびに再生、発芽および損傷のサイズの評価を含む）において、処置内容は知らされない。
【０１３８】
手術前に、全てのラットを、ベースライン測定値を得る前４週間に亘って行動試験に慣れさせるように扱い、そして訓練する。４種のＡＶＶ注射に際し、ラットをランダムに以下の実験グループに分けた：損傷＋ｒＡＡＶ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、損傷＋ｒＡＡＶ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、損傷＋ｒＡＡＶ−プレ（γ）プロＧＤＮＦ、損傷＋対照ＡＡＶ−ＧＦＰ。ＡＶＶ注射は、損傷を与えた直後に、傷を１μｌの生理溶液で洗浄してから開始する。２週間後に、行動評価を開始し、週毎に繰り返す。５週間後に、ＣＳＴについて一方向トレース実験を行う。手術の９週間後、行動学的プロトコル終了の後、形態学的解析を行う。
【０１３９】
ＢＢＢ歩行運動スコア:  全ての試験は、デジタルビデオカメラでモニターし、二重盲検法にて分析した。手術前４週間の準備訓練の後、ベースライン測定値を得る。手術後、行動評価を週毎に行う。ラットは自由に行動できる状態にし、２人の観察者が、ラットが後肢を使う能力を４分間に亘って評価する。関節運動、足底接地（paw placement）、体重の支持、および前肢と後肢の協調を、２１ポイントＢＢＢ歩行運動スケール（Basso et al., J. Neurotrauma, 12:1−12 (1995)）に従って判定する。
【０１４０】
水泳試験：  水泳試験のための機構は、長方形のプレキシガラス容器（１５０×４０×１３ｃｍ）である。容器中の水（２３〜２５℃）の水位は、ラットが容器の底に触れることを防ぐのに十分な高さとする。無傷のラットは、前肢を顎下に固定しての、後肢と尾による水かきである（Stolz et al., Behav. Brain Res., 106:127-132 (1999)）。各ラットにつき計５回の試験を行い、それをプールの底に４５°の角度で設置された鏡を使用してモニターし、ラットを横並びに下から同時に撮影する。水泳の成績を、以下の動きを記録することによって分析した：  前肢の使用：２ポイント＝不使用（正常）、１ポイント＝前肢の片方を全距離に亘って使用、もしくは前肢の両方を半分の距離に亘って使用、０ポイント＝前肢の両方を常に使用；後肢の距離（躰支持のベース）：２ポイント＝距離小、後肢は躰の下、１ポイント＝脚は躰の外側だが、足は躰の下に留まっている、０ポイント＝距離大、脚と足の両方が躰の外側；後肢のストローク：２ポイント＝力強いストローク、１ポイント＝中程度のストローク、０ポイント＝弱いストロークもしくはストローク無し；尾の動き：２ポイント＝尾全体が標準的な強い動き、１ポイント＝部分的な動き、０ポイント＝非常に弱いか、動き無し。従って、正常な泳ぎの場合には、７〜８ポイントとなり、日常的に訓練を受けているラットであれば到達する値である。
【０１４１】
神経繊維数の計測および発芽評価
ＣＳＴの主要部分から再生される神経繊維の数を、最終倍率４００倍にて、脊髄の矢状断面全般にわたり、体軸方向の幅０．２５ｍｍ、損傷個所に対して０．５ｍｍ、２ｍｍおよび５ｍｍ尾側の３つの特定領域について計測した。スコア（０＝発芽無し、３＝非常に強い発芽）の記録は、実験の意図を知らされていない（blinded）経験を積んだ観察者により、密度、異常発達、損傷またはその近辺への曲進、長さ、損傷の頭側直近におけるＣＳＴ発芽の樹枝状分岐を判定することで行われる。
【実施例１２】
【０１４２】
ＧＤＮＦプレ−プロ領域に対する抗体３２０／（α）プロＧＤＮＦ、３２１／プロＧＤＮＦおよび３２２／（β）プロＧＤＮＦの作製
ペプチド合成
それぞれに対する抗体を生成するための以下の３つのペプチドを調製した。
ペプチドＡ３２０: CGKRLLEAPAEDHSLGHRRVP（配列番号４６）（３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体用）、
ペプチドＡ３２１: CPEDYPDQFDDVMD（配列番号４７）（３２１／プロＧＤＮＦ抗体用）、および 
ペプチドＡ３２２: CHTASAFPLPAANM（配列番号４８）（３２２/（β）プロＧＤＮＦ抗体用）。 
【０１４３】
ペプチドの調製は、Ｆｍｏｃ化学手法を用いたペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）に基づいて行う。「Ｆｍｏｃ」は、クロロぎ酸９−フルオレニルメチル（9H-(f)luoren-9-yl(m)eth(o)xy(c)arbonyl）の略語であり、アミノ酸のＮαにＦｍｏｃ保護基を付加して不要な反応を防ぎ、酸性条件下で安定化させることを示す。合成は、ペプチドのＣ末端からＮ末端にかけて、自動合成装置を使用し、０．１ｍｍｏｌスケールで、標準的手法（Benoiton、Chemistry of Peptide Synthesis（ペプチド合成の化学）、Taylor & Francis Group、2005）に従って行った。合成中、アミノ酸側鎖の官能基は、永久的な保護基により保護されており、これは合成完了後に開裂させるが、合成中の全ての化学薬品に対して安定である。開裂後、ペプチド純度をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）技術により調節し（ペプチドは、アセトニトリルに溶解した）、ＨＰＬＣから溶出する異なる画分をＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）で制御し、凍結乾燥装置にて凍結乾燥した。さらに、２ｍｇのペプチドを、免疫化のためにＨＰＬＣで精製した（純度＞９５％）。ペプチド−樹脂は、−２０℃で保管し、ペプチドパウダーは＋４℃で保管した。
【０１４４】
ＫＬＨの結合
２ｍｇの高純度ペプチドを、後に行う免疫化における免疫反応を刺激するためのキャリアタンパク質ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）に結合した。ＫＬＨは、その大きな分子量（ＭＷは４．５×１０5〜１．３×１０7）、強い免疫原性、および結合使用可能なリシンの存在故に、ここでの目的に適している。ペプチドへの結合のために、マレイミド活性化ＫＬＨを使用した。マレイミド基は、ペプチドのＮ末端に付加したシステイン（但し、部位特異的結合を確実にし、ペプチドを免疫反応に曝すために、ペプチド１分子につきシステイン１つのみを付加し、内部システインは避ける）のＳＨ基と反応する。反応は、中性条件下で行い、後に透析によって精製した。最終的な反応溶液は、ＰＢＳにより結合物の濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとした。結合工程は、結合工程の前後に回収したサンプル（ＫＬＨを有するペプチドとＫＬＨを有さないペプチド）を用いたエルマン試験によって制御した。エルマン試験においては、エルマン試薬（５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ））を用いて、スルフヒドリル基含有ペプチドのＫＬＨに対する結合効率を評価する（Walker、The Protein Protocols Handbook（タンパク質プロトコルハンドブック）、2nd edition、Humana Press inc. 2002、pp 595-596）。
【０１４５】
免疫化
免疫化スケジュール：  ０日目−免疫前血清および第１回免疫化、１４日目−第２回免疫化、３５日目−第３回免疫化、４５日目−予備採血およびＥＬＩＳＡ試験、５６日目−第４回免疫化、６６日目−最終採血およびＥＬＩＳＡ試験。最初の免疫化は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を用いて行い、他の免疫化はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて行った。フロイントアジュバントは、油中水滴型エマルションであって、ＦＣＡは結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の死菌も含んでおり、これらは免疫反応を増進するために使用した。アジュバントは、ＫＬＨ−ペプチド結合物溶液と１：１の比率になるよう慎重に混合して、２個所に皮下注射した。１つのプロジェクトに２匹のウサギを使用した。気管支静脈（air vain）から血液を採取して、血液凝固−遠心分離に付して血清を調製する。免疫前血清の量は、〜１ｍｌ、ＥＬＩＳＡ試験のための予備血清の量は、〜０．３ｍｌ、最終血清の量は、〜３０ｍｌであった。
【０１４６】
ＥＬＩＳＡ
適切な量のペプチドＡ３２０、Ａ３２１またはＡ３２２をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した（手順はＫＬＨの結合と同様）。このペプチド−ＢＳＡ結合物を、高容量タンパク質結合マイクロタイタープレートに塗布した（各サンプルにつき２回塗布した）。免疫前血清、予備血清および最終血清を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体となる抗ウサギＩｇＧ抗体を使用し、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用した、標準的なＥＬＩＳＡによって検出した。光学密度は、ELISA−readerを使用し、４５０ｎｍで測定した。
【０１４７】
ＩｇＧ特異的精製
ＩｇＧの精製は、マブゾーベントR（MAbsorbent）技術により行った。マブゾーベントR合成アフィニティーリガンド吸着材は、血清、血漿、腹水、哺乳類細胞培養上清またはトランスジェニック材料からの抗体の精製における有用性が確認されており、従来のタンパク質Ａ精製に替わる革新的な選択肢である。抗血清からの抗体の精製は、抗体をマブゾーベントＡ１Ｐ／Ａ２Ｐに結合させることによって行う。マブゾーベント合成アフィニティーリガンド吸着材は、組み換えタンパク質Ａおよび天然タンパク質Ａを「模倣」する。しかし、上記のマブゾーベント吸着剤は、ＩｇＧの全てのサブクラスに結合する点でタンパク質Ａとは異なる。マブゾーベント吸着剤は、多岐にわたるヒトおよび哺乳類のポリクローナル抗体（ウシ、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびウサギを含む）や完全モノクローナル抗体、キメラヒト化抗体、抗体断片に効率的に結合する。
【０１４８】
最初に、空のカラムおよびマブゾーベント吸着剤と共に提供される取り扱い説明書に従ってカラムを準備した。簡単に説明すると、吸着材のスラリーをゆっくり混合し、カラムに添加し、結合バッファーにより平衡化した。
【０１４９】
次に、結合バッファーで希釈した抗血清を適量カラムに添加してインキュベートし、流し出した。血清中の抗体は、マブゾーベントＡ１Ｐ／Ａ２Ｐに結合した。カラムを洗浄し、アフィニティー吸着材から抗体を溶出させ、各２ｍｌの画分に回収した。その後、新たな精製のためにカラムを再度平衡化した。この工程は、必要量の抗血清が精製されるまで繰り返しても良い。平衡化と結合は中性ｐＨで行い、溶出は酸性条件下で行った。抗体の回収後、全ての画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、抗体濃度をＢＣＡTMタンパク質アッセイ技術によって測定した。最終的に、抗体はＰＢＳ中、−２０℃で保管した。
【０１５０】
エピトープ特異的精製
エピトープ特異的アフィニティー精製のために、ＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックス技術を用いた。ＮＨＳ―活性化セファロースは、抗原（本実験においてはペプチド）と安定なアミド結合を形成し、後に、血清中の抗体を結合する。抗体は溶出し、回収する。この方法は、特定のペプチドに対する血清中の抗体を精製するのに役立つ。
【０１５１】
最初に、空のカラムおよびＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックスと共に提供される取り扱い説明書に従ってカラムを準備した。簡単に説明すると、ＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックスを空のカラムに添加し、洗浄して保存液を除去した。カップリング溶液中に溶解した抗原をカラムに添加し、インキュベーション期間中にセファロースの活性基に結合させた。その後、溶媒中における未反応の活性基はＴｒｉｓバッファーを加えて静置することによりブロックした。その後、２種類の異なるバッファー（ｐＨが異なり、例えば、第１バッファーのｐＨが８〜９で、第２バッファーのｐＨが３〜４）でカラムを洗浄した。
【０１５２】
次に、予め用意したカラムを結合バッファーで平衡化し、ＰＢＳで希釈した抗血清を適量、カラムにロードした。カラム中のスラリーを数分放置して、抗体を抗原に結合させた。カラムを、バッファーのｐＨ値をｐＨ８〜６．５の範囲で変えながら洗浄し、酸性条件下で抗体を溶出させ、画分を１ｍｌずつ回収した。回収の後、全ての画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、抗体濃度をＢＣＡTMタンパク質アッセイ技術によって測定した。最終的に、抗体はＰＢＳ中、−２０℃で保管した。
【０１５３】
プロＧＤＮＦ抗体の特異性の特徴付
プロＧＤＮＦ抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析および免疫蛍光分析により確認した。免疫蛍光分析においては、１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションに使用した発現構築物は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）内のヒトおよび／またはマウスのプレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦ、およびｐＡＡＶ−ＭＣＳベクター内の、ＡＴＧをタンパク質コード開始コドンとして有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦであった。ｐＡＡＶ−ＭＣＳベクター内のプロドメインを欠くヒト プレＧＤＮＦ（フィンランド国、ヘルシンキ大学、Dr. Pia Runeberg−Roosの提供による）を対照として使用した。この構築物は、上記の他の構築物と同様の手順でクローニングした。空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターによる組み換えＧＦＰタンパク質の発現を、擬似トランスフェクション対照とした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加した新たなＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、ＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）、ポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）またはポリクローナル３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）、および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体であるＣｙ２結合ロバ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch laboratories）およびＣｙ３結合ロバ抗ラビットＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch laboratories）と共に培養した。細胞核はヘキストで染色し、最後に、カバーガラスをImmu-mount（Thermo electron corporation）と共にマウントした。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。ウェスタンブロット分析においては、１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションに使用した発現構築物は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）内のヒトおよびマウスのプレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦ、ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰベクター（Stratagene）内のヒト プレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦ、およびｐＡＡＶ-ＭＣＳベクター（Stratagene）内のヒト プレ（α）プロＧＤＮＦとプレ（β）プロＧＤＮＦであった。ｐＡＡＶ−ＭＣＳベクター内のプロドメインを欠くヒト プレＧＤＮＦを対照として使用した。この構築物は、上記の他の構築物と同様の手順でクローニングした。空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターによる組み換えＧＦＰタンパク質の発現を、擬似トランスフェクション対照とした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。���胞と培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでサンプルを分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:５００）またはポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:５００）、および成熟ＧＤＮＦ用のポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）、さらに引き続きＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。
【０１５４】
結果
免疫蛍光分析の結果、３２１／プロＧＤＮＦ抗体は、（α）プロＧＤＮＦ、（β）プロＧＤＮＦおよび（γ）プロＧＤＮＦのＧＤＮＦプロドメインを認識するが、プロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質や組み換えＧＦＰタンパク質は認識しないことが分かった。さらに、トランスフェクトしていない細胞には、特異的な染色は見られない。（α）プロＧＤＮＦおよび（β）プロＧＤＮＦのみならずプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質も、成熟ＧＤＮＦを認識するマウス抗ＧＤＮＦ抗体により検出される（図１３）。免疫蛍光分析の結果、３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体は、（α）プロＧＤＮＦのＧＤＮＦプロドメインを認識するが、（β）プロＧＤＮＦ、（γ）プロＧＤＮＦおよびプロ領域を欠いたＧＤＮＦや組み換えＧＦＰタンパク質は認識しないことが分かった。（α）プロＧＤＮＦおよび（β）プロＧＤＮＦのみならずプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質も、成熟ＧＤＮＦを認識するマウス抗ＧＤＮＦ抗体により検出される。マウス抗ＧＤＮＦ抗体による染色に加えて、プレ（β）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞においては、若干のＧＦＰシグナル（緑）が見られるが（図１４）、これは、おそらくｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターからの漏れによるものと思われる。免疫蛍光分析の結果、３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体は、（β）プロＧＤＮＦのＧＤＮＦプロドメインを認識するが、（α）プロＧＤＮＦ、（γ）プロＧＤＮＦおよびプロ領域を欠いたＧＤＮＦや組み換えＧＦＰタンパク質は認識しないことが分かった。（α）プロＧＤＮＦおよび（β）プロＧＤＮＦのみならずプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質も、成熟ＧＤＮＦを認識するマウス抗ＧＤＮＦ抗体により検出される。マウス抗ＧＤＮＦ抗体による染色に加えて、プレ（β）プロＧＤＮＦのｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞においては、若干のＧＦＰシグナルが見られるが（図１５）、これは、おそらくｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターからの漏れによるものと思われる。
【０１５５】
ウェスタンブロット分析の結果、３２１／プロＧＤＮＦ抗体は、（α）プロＧＤＮＦおよび（β）プロＧＤＮＦのＧＤＮＦプロドメインを認識するが、プロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質や組み換えＧＦＰタンパク質は認識しないことが分かった。さらに、３２１／プロＧＤＮＦ抗体は、（α）プロＧＳＴ融合タンパク質および（β）プロＧＳＴ融合タンパク質を認識する。成熟ＧＤＮＦに対する抗ＧＤＮＦ Ｄ２０抗体は、（α）プロＧＤＮＦ、（β）プロＧＤＮＦ、及びプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質を認識する（図１６）。ウェスタンブロットにおいては、３２２／（α）プロＧＤＮＦ抗体は（α）プロＧＤＮＦのＧＤＮＦプロドメインを認識するが、（β）プロＧＤＮＦやプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質は認識しない。成熟ＧＤＮＦに対する抗ＧＤＮＦ Ｄ２０抗体は、（α）プロＧＤＮＦ、（β）プロＧＤＮＦ、及びプロ領域を欠いたＧＤＮＦタンパク質を認識する（図１７）。
【実施例１３】
【０１５６】
プレ（γ）プロＧＤＮＦに特異的な抗体の作製
プレ（γ）プロＧＤＮＦペプチドに固有のアミノ酸配列を有するペプチドを、実施例１２で使用したような公知の技術により調製する。
【０１５７】
ＫＬＨの結合
高純度ペプチドを、後に行う免疫化工程において免疫反応を刺激するために、キャリアタンパク質ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）に結合する。ペプチドへの結合のために、マレイミド活性化ＫＬＨを使用する。マレイミド基は、ペプチドのＮ末端に付加したシステイン（但し、部位特異的結合を確実にし、ペプチドを免疫反応に曝すために、ペプチド１分子につきシステイン１つのみを付加し、内部システインは避ける）のＳＨ基と反応する。反応は、中性条件下で行い、後に透析によって精製する。最終的な反応溶液は、ＰＢＳにより結合物の濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする。結合工程は、実施例１２に記載したように、結合工程の前後に回収したサンプル（ＫＬＨを有するペプチドとＫＬＨを有さないペプチド）を用いたエルマン試験によって制御する。エルマン試験においては、エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ））を用いて、スルフヒドリル基含有ペプチドのＫＬＨに対する結合効率を評価する（Walker, The Protein Protocols Handbook（タンパク質プロトコルハンドブック）, 2nd edition, Humana Press inc. 2002、pp 595-596）。
【０１５８】
免疫化
ウサギを以下のプロトコルに従って免疫化する：０日目−免疫前血清および第１回免疫化、１４日目−第２回免疫化、３５日目−第３回免疫化、４５日目−予備採血およびＥＬＩＳＡ試験、５６日目−第４回免疫化、６６日目−最終採血およびＥＬＩＳＡ試験。最初の免疫化は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を用いて行い、他の免疫化はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて行う。フロイントアジュバントは、油中水滴型エマルションであって、ＦＣＡは結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の死菌も含んでおり、これらは免疫反応を増進するために使用する。アジュバントは、ＫＬＨ−ペプチド結合物溶液と１：１の比率になるよう慎重に混合して、２個所に皮下注射する。気管支静脈（air vain）から血液を採取して、血液凝固−遠心分離に付して血清を調製する。免疫前血清の量は、〜１ｍｌ、ＥＬＩＳＡ試験のための予備血清の量は、〜０．３ｍｌ、最終血清の量は、〜３０ｍｌである。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡ
適切な量の免疫化用ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合する（手順はＫＬＨの結合と同様）。このペプチド−ＢＳＡ結合物は、高容量タンパク質結合マイクロタイタープレートに塗布する（各サンプルにつき２回塗布する）。続いて、プレート上の空いている結合部位をＢＳＡでブロックした。希釈液を、免疫前血清、予備血清および（最終ＥＬＩＳＡ実施中の）最終血清から調製し、ウェルに加える。結合サンプルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体となる抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して検出し、所謂「サンドイッチ」を作製する。陰性の対照としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２つのウェルで使用し、各工程の後にプレートをインキュベートして、洗浄する。最後に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）添加後に、ＨＲＰとの比色反応が起こり、光学密度は、ELISA−readerを使用し、４５０ｎｍで測定する。
【０１６０】
抗体精製
ＩｇＧの精製は、マブゾーベントR（MAbsorbent）技術により行う。抗血清からの抗体の精製は、抗体をマブゾーベントＡ１Ｐ／Ａ２Ｐに結合させることによって行う。マブゾーベント合成アフィニティーリガンド吸着材は、組み換えタンパク質Ａおよび天然タンパク質Ａを「模倣」する。最初に、空のカラムおよびマブゾーベント吸着剤と共に提供される取り扱い説明書に従ってカラムを準備する。簡単に説明すると、吸着材のスラリーをゆっくり混合し、カラムに添加し、結合バッファーにより平衡化する。
【０１６１】
次に、結合バッファーで希釈した抗血清を適量カラムに添加してインキュベートし、流し出した。血清中の抗体は、マブゾーベントＡ１Ｐ／Ａ２Ｐに結合する。カラムを洗浄し、アフィニティー吸着材から抗体を溶出させ、各２ｍｌの画分に回収する。その後、新たな精製のためにカラムを再度平衡化する。この工程は、必要量の抗血清が精製されるまで繰り返しても良い。平衡化と結合は中性ｐＨで行い、溶出は酸性条件下で行う。抗体の回収後、全ての画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、抗体濃度をＢＣＡTMタンパク質アッセイ技術によって測定する。最終的に、抗体はＰＢＳ中、−２０℃で保管する。
【０１６２】
エピトープ特異的アフィニティー精製のために、ＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックス技術を用いる。ＮＨＳ―活性化セファロースは、抗原（本実験においてはペプチド）と安定なアミド結合を形成し、後に、血清中の抗体を結合する。抗体は溶出し、回収する。この方法は、特定のペプチドに対する血清中の抗体を精製するのに役立つ。
【０１６３】
最初に、空のカラムおよびＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックスと共に提供される取り扱い説明書に従ってカラムを準備する。簡単に説明すると、ＮＨＳ−活性化セファロースRマトリックスを空のカラムに添加し、洗浄して保存液を除去した。カップリング溶液中に溶解した抗原をカラムに添加し、インキュベーション期間中にセファロースの活性基に結合させる。その後、溶媒中における未反応の活性基はＴｒｉｓバッファーを加えて静置することによりブロックする。その後、２種類の異なるバッファー（ｐＨが異なり、例えば、第１バッファーのｐＨが８〜９で、第２バッファーのｐＨが３〜４）でカラムを洗浄する。
【０１６４】
次に、予め用意したカラムを結合バッファーで平衡化し、ＰＢＳで希釈した抗血清を適量、カラムにロードする。カラム中のスラリーを数分放置して、抗体を抗原に結合させた。カラムを、バッファーのｐＨ値をｐＨ８〜６．５の範囲で変えながら洗浄し、酸性条件下で抗体を溶出させ、画分を１ｍｌずつ回収する。回収の後、全ての画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、抗体濃度をＢＣＡTMタンパク質アッセイ技術によって測定する。最終的に、抗体はＰＢＳ中、−２０℃で保管する。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の構造の模式図である。アミノ末端のシグナル配列はタンパク質の翻訳の際に切断されるものであるが、明瞭化するために含まれている。各領域内のアミノ酸は、成熟分子内のものを非常に薄い網掛けで示し、プロ領域のものを薄い網掛けで示し、プレ領域のものを濃い網掛けで示した。プレ（γ）プロＧＤＮＦにおいては、プレプロ領域を薄い網掛けで示した。７つの保存されたシステイン残基の相対的な位置は黒い縦線で示した。ＧＤＮＦの２つの推定Ｎ−グリコシル化部位は矢印で示した。
【図２】プレ（α）プロＧＤＮＦスプライスバリアント、プレ（β）プロＧＤＮＦスプライスバリアントおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントの特徴を示す図。ＧＤＮＦ ｃＤＮＡにおいては、スプライスバリアントのＯＲＦを濃い網掛けで示し、非翻訳領域（ＵＴＲ）領域を薄い網掛けで示した。プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦのＯＲＦはエキソン２と３に分割され、プレ（γ）プロＧＤＮＦにおいてＯＲＦはエキソン１と３に分割される。プレ（β）プロＧＤＮＦスプライスバリアントはエキソン２の３’領域内の７８ｂｐを欠失している。プレ（γ）プロＧＤＮＦスプライスバリアントは、固有の６１ｂｐの配列をエキソン１に有し、更に選択的タンパク質翻訳開始コドンＣＴＧを有している。成熟ＧＤＮＦはエキソン３にコードされており、３種のスプライスバリアントにおいてほぼ同一である。
【図３】腎組織におけるマウスＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる分析。レーン１：胎生期１３（Ｅ１３）の腎組織、レーン２：Ｅ１５の腎組織、レーン３：Ｅ１７の腎組織、レーン４：出生後１日（Ｐ１）の腎組織、レーン５：Ｐ５の腎組織、レーン６：Ｐ６の腎組織、レーン７：空のレーン、レーン８：陰性のＰＣＲ用対照。プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのバリアントは矢印で示した。プレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦのバリアントは、サンプルＥ１３〜Ｐ１で検出された。プレ（γ）プロＧＤＮＦバリアントはサンプルＥ１３、Ｅ１５およびＰ１で検出された。
【図４】成体の脳組織におけるヒトＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる分析。レーン１と２：ヒト成体脳組織、レーン３：陽性のＰＣＲ用対照、レーン４：陰性のＰＣＲ用対照。プレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのバリアントは矢印で示した。
【図５】ＣＨＯ細胞で発現させたマウス（α）プロＧＤＮＦタンパク質およびマウス（β）プロＧＤＮＦタンパク質の分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦまたはマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞と培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、マウス抗ＧＤＮＦ抗体（３．３μｇ／サンプル）を用いてＧＤＮＦを免疫沈降させ、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物、レーン２：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物、レーン３：トランスフェクトしていない細胞（陰性の対照）の細胞溶解物、レーン４：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン５：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン６：トランスフェクトしていない細胞（陰性の対照）の培地。
【図６】ＣＨＯ細胞で発現させたヒト（α）プロＧＤＮＦタンパク質およびヒト（β）プロＧＤＮＦタンパク質の分析。ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦまたはヒト プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞と培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物、レーン２：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物、レーン３：トランスフェクトしていない細胞（陰性の対照）の細胞溶解物、レーン４：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン５：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン６：トランスフェクトしていない細胞（陰性の対照）の培地。
【図７】ＢＨＫ細胞で発現させたマウス（γ）プロＧＤＮＦタンパク質の分析。マウス プレ（β）プロＧＤＮＦまたはマウス プレ（γ）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＢＨＫ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞と培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン２：マウス プレ（γ）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした細胞の培地、レーン３：トランスフェクトしていない細胞（陰性の対照）の培地。
【図８Ａ】ＢＨＫ細胞およびＣＯＳ−７細胞に発現させたヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質の分析。ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有し、ＡＴＧまたはＣＴＧをタンパク質コード開始コドンとして有するプレ（γ）プロＧＤＮＦｃＤＮＡを、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＢＨＫ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦとＡＴＧ翻訳開始コドンを含むｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培地、レーン２：ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦと共にＣＴＧ翻訳開始コドンと終止コドンを含むｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培地。
【図８Ｂ】ＢＨＫ細胞およびＣＯＳ−７細胞に発現させたヒト（γ）プロＧＤＮＦタンパク質の分析。ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有し、ＡＴＧまたはＣＴＧをタンパク質コード開始コドンとして有するプレ（γ）プロＧＤＮＦｃＤＮＡを、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＢＨＫ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地をＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦとＡＴＧ翻訳開始コドンを含むｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の培地、レーン２：トランスフェクトしていないＣＯＳ−７細胞（陰性の対照）の培地。
【図９Ａ】分化ＰＣ−６．３細胞におけるＧＤＮＦの細胞内局在の免疫蛍光分析。ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦまたはヒト プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。ＰＣ-６．３細胞は、トランスフェクション前の３日間に亘って、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５％ ＨＳ（Gibco）、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ神経栄養因子（ＮＧＦ）を含む分化培地中にて分化させた。トランスフェクションの２４時間後に細胞は、４％ＰＦＡで固定化するか、最初に５０ｍＭ ＫＣｌおよび５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで２時間刺激してタンパク質合成を停止させ、その後、４％ＰＦＡで固定化した。全細胞を０．５％ ＢＳＡ（Sigma）でブロッキングし、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体であるポリクローナル抗ＧＤＮＦ抗体（GeneWay Biotech Inc.、希釈率１:７５０）および成熟ゴルジ体用のモノクローナル抗ＧＭ１３０抗体（Abcam、希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を繰り返した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。非刺激ＰＣ−６．３細胞の細胞内に局在するプレ（α）プロＧＤＮＦ（白）またはプレ（β）プロＧＤＮＦ（グレー）のコードするタンパク質の定量。ゴルジ体単独または小胞体＋／−ゴルジ体（ｎ＝３）に存在するタンパク質のパーセントを示した。＊、Ｐ＝０．００２３。エラーバーはＳＤである。
【図９Ｂ】分化ＰＣ−６．３細胞におけるＧＤＮＦの細胞内局在の免疫蛍光分析。ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦまたはヒト プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。ＰＣ-６．３細胞は、トランスフェクション前の３日間に亘って、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５％ ＨＳ（Gibco）、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦを含む分化培地中にて分化させた。トランスフェクションの２４時間後に細胞は、４％ＰＦＡで固定化するか、最初に５０ｍＭ ＫＣｌおよび５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで２時間刺激してタンパク質合成を停止させ、その後、４％ＰＦＡで固定化した。全細胞を０．５％ ＢＳＡ（Sigma）でブロッキングし、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体であるポリクローナル抗ＧＤＮＦ抗体（GeneWay Biotech Inc.、希釈率１:７５０）および成熟ゴルジ体用のモノクローナル抗ＧＭ１３０抗体（Abcam、希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を繰り返した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。分化ＰＣ−６．３細胞の細胞内に局在するプレ（α）プロＧＤＮＦおよびプレ（β）プロＧＤＮＦのコードするタンパク質の定量。ゴルジ体単独、小胞体＋／−ゴルジ体または小胞体単独（ｎ＝３）に存在するタンパク質のパーセントを示した。細胞は未処理（０ｈ）、または５０ｍＭ ＫＣｌおよび５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで２時間処理した（２ｈ）。
【図１０】分化ＰＣ−６．３細胞から回収した細胞培地に含まれるマウスＧＤＮＦのウエスタンブロット分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦまたはマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。１０％ウマ血清（ＨＳ）および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＰＣ−６．３細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、５％ ＨＳ、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ＮＧＦ）と抗生物質を含むＤＭＥＭである分化培地に交換した。７２時間後にはＰＣ−６．３細胞を２５ｍＭ ＫＣｌを含むＤＭＥＭで５時間処理することによって脱分極化した。対照細胞（脱分極化しないもの）はＤＭＥＭで処理した。培地（上清）を回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。細胞倍地については、プロＧＤＮＦ、プロセッシングされた中間体プロＧＤＮＦおよび成熟ＧＤＮＦのバンドを矢印で示した。レーン１：マウスプレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地、レーン２：マウスプレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地、レーン３：マウスプレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地、レーン４：マウスプレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地。
【図１１】分化ＰＣ−６．３細胞から回収した細胞培地に含まれるヒトＧＤＮＦのウエスタンブロット分析。ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦまたはヒト プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。１０％ ＨＳおよび５％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＰＣ−６．３細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、５％ ＨＳ、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｍｇ／ｍｌ ＮＧＦと抗生物質を含むＤＭＥＭである分化培地に交換した。７２時間後にはＰＣ−６．３細胞を５０ｍＭ ＫＣｌを含むＤＭＥＭで５時間処理することによって脱分極化した。対照細胞（脱分極化しないもの）はＤＭＥＭで処理した。培地（上清）を回収し、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地、レーン２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地、レーン３：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地、レーン４：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地。
【図１２Ａ】ＰＣ−６．３細胞培地のＧＤＮＦ濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ解析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦまたはマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。終止コドンを欠いたラット プレプロＢＤＮＦを含むｐＥＧＦＰ-Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）を対照として使用した。１０％ＨＳおよび５％ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＰＣ−６．３細胞を２４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、５％ ＨＳ、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｍｇ／ｍｌ ＮＧＦと抗生物質を含むＤＭＥＭである分化培地に交換した。７２時間後にはＰＣ−６．３細胞を５０ｍＭ ＫＣｌを含むＤＭＥＭで２時間処理することによって脱分極化した。対照細胞（脱分極化しないもの）はＤＭＥＭで処理した。培地（上清）を回収し、ＧＤＮＦはGDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）を用いて分析し、ＢＤＮＦはBDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）を用いて分析した。カラム１：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地、カラム２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地、カラム３：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地、カラム４：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地。（ｎ＝３）。＊、Ｐ＝０．０９２２２７。エラーバーはＳＤである。
【図１２Ｂ】ＰＣ−６．３細胞培地のＧＤＮＦ濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ解析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦまたはマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。終止コドンを欠いたラット プレプロＢＤＮＦを含むｐＥＧＦＰ-Ｎ１発現ベクター（Invitrogen）を対照として使用した。１０％ＨＳおよび５％ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＰＣ−６．３細胞を２４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、５％ ＨＳ、２．５％ ＦＣＳおよび５０ｍｇ／ｍｌ ＮＧＦと抗生物質を含むＤＭＥＭである分化培地に交換した。７２時間後にはＰＣ−６．３細胞を５０ｍＭ ＫＣｌを含むＤＭＥＭで２時間処理することによって脱分極化した。対照細胞（脱分極化しないもの）はＤＭＥＭで処理した。培地（上清）を回収し、ＧＤＮＦはGDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）を用いて分析し、ＢＤＮＦはBDNF Emax ImmunoAssay System（Promega）を用いて分析した。カラム１：ラット プレプロＢＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化ＰＣ−６．３細胞の培地、カラム２：ラット プレプロＢＤＮＦでトランスフェクトした脱分極化していないＰＣ−６．３細胞の培地（ｎ＝３）。＊、Ｐ＝０．００３０７。エラーバーはＳＤである。
【図１３Ａ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２１／プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ、タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡを、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、ＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。マウス（α）プロＧＤＮＦ、ヒト（β）プロＧＤＮＦ、ヒト（γ）プロＧＤＮＦ、およびプロ領域を欠いたヒト成熟ＧＤＮＦをＣＨＯ細胞で過剰発現させ、３２１／プロＧＤＮＦ抗体（赤）および抗ＧＤＮＦ抗体（緑）による２重免疫蛍光染色に付した。トランスフェクトしていない細胞を対照として用いた。細胞核は青で示した。
【図１３Ｂ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２１／プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ、タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡを、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、ＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。ＧＦＰタンパク質（緑）をＣＨＯ細胞に発現させ、３２１／プロＧＤＮＦ抗体（赤）による免疫蛍光染色に付した。細胞核は青で示した。
【図１４Ａ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦおよびマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。ＧＦＰは空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、（α）プロＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。マウス（α）プロＧＤＮＦ、マウス（β）プロＧＤＮＦ、ヒト（γ）プロＧＤＮＦ、およびプロ領域を欠いたヒト成熟ＧＤＮＦをＣＨＯ細胞で過剰発現させ、３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（赤）および抗ＧＤＮＦ抗体（緑）による２重免疫蛍光染色に付した。細胞核は青で示した。
【図１４Ｂ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦおよびマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。ＧＦＰは空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、（α）プロＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。ＧＦＰタンパク質（緑）をＣＨＯ細胞に発現させ、３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（赤）による免疫蛍光染色に付した。細胞核は青で示した。
【図１５Ａ】ＣＨＯ細胞内のプレ（β）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦおよびマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。ＧＦＰは空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、（β）プロＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。マウス（α）プロＧＤＮＦ、マウス（β）プロＧＤＮＦ、ヒト（γ）プロＧＤＮＦ、およびプロ領域を欠いたヒト成熟ＧＤＮＦをＣＨＯ細胞で過剰発現させ、３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体（赤）および抗ＧＤＮＦ抗体（緑）による２重免疫蛍光染色に付した。細胞核は青で示した。
【図１５Ｂ】ＣＨＯ細胞内のプレ（β）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関する免疫蛍光分析。マウス プレ（α）プロＧＤＮＦおよびマウス プレ（β）プロＧＤＮＦを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Invitrogen）にクローニングすることで得た。タンパク質コード開始コドンとしてＡＴＧを有するヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦ、およびヒト プレＧＤＮＦのそれぞれを含む発現構築物は、終止コドンを有するｃＤＮＡをｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現ベクター（Stratagene）にクローニングすることで得た。ＧＦＰは空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターから発現させた。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞をカバーガラスつきの４穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で０．８μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、０．１％ Triton X-100（Sigma）による膜透過処理に付した。細胞は、一次抗体である、（β）プロＧＤＮＦプロドメイン用のポリクローナル３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率１:２００）および成熟ＧＤＮＦ用のモノクローナルマウス抗ＧＤＮＦ抗体（希釈率１:１００）と共に、０．５％ＢＳＡの存在下、室温で１時間培養し、洗浄して、その後、二次抗体による染色を同様に繰り返した。細胞核はヘキストで染色した。画像を、顕微鏡（AX70 Provis、オリンパス社製）を介して電荷結合素子カメラ（DP70、オリンパス社製）にて取得した。ＧＦＰタンパク質（緑）をＣＨＯ細胞に発現させ、３２２／（β）プロＧＤＮＦ抗体（赤）による免疫蛍光染色に付した。細胞核は青で示した。
【図１６Ａ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２１／プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）または成熟ＧＤＮＦ用のポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン２：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン５：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン６：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１０：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１１：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン１２：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地。サンプルは３２１／プロＧＤＮＦ抗体で検出した。
【図１６Ｂ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２１／プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）または成熟ＧＤＮＦ用のポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン２：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン５：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン６：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１０：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１１：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン１２：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地。サンプルはＤ２０抗体で検出した。
【図１６Ｃ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦ、プレ（β）プロＧＤＮＦおよびプレ（γ）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２１／プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２１／プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）または成熟ＧＤＮＦ用のポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。レーン１：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン２：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン５：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン６：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１０：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞、レーン１１：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地、レーン１２：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地。（α）プロＧＳＴ融合タンパク質および（β）プロＧＳＴ融合タンパク質を３２１／プロＧＤＮＦ抗体で検出した。
【図１７Ａ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）またはポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。細胞は、以下の構築物でトランスフェクトした。レーン１：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン５：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン６：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター、レーン１０：プロ領域を欠いたｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦ。３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体でＣＨＯ細胞を分析した際の、細胞に関する結果。
【図１７Ｂ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）またはポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。細胞は、以下の構築物でトランスフェクトした。レーン１：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン５：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン６：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター、レーン１０：プロ領域を欠いたｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦ。３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体でＣＨＯ細胞を分析した際の、培地に関する結果。
【図１７Ｃ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）またはポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。細胞は、以下の構築物でトランスフェクトした。レーン１：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン５：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン６：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター、レーン１０：プロ領域を欠いたｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦ。Ｄ２０抗体でＣＨＯ細胞を分析した際の、細胞に関する結果。
【図１７Ｄ】ＣＨＯ細胞内のプレ（α）プロＧＤＮＦのプロドメインを認識する３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体の特異性に関するウエスタンブロット分析。１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＨＯ細胞を６穴プレートに播種し、各ウエルが約８０％コンフルエンスに達した時点で４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換した。細胞および培地（上清）をトランスフェクションの４８時間後に回収し、培地を濃縮した後、１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてナイロンメンブランにブロッティングし、５％牛乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）溶液でブロッキングした。ＧＤＮＦは、ＥＣＬ法を用いて、ポリクローナル３２０／（α）プロＧＤＮＦ抗体（希釈率は１：５００）またはポリクローナルＤ２０抗体（Santa Cruz、希釈率は１：５００）のいずれか一方、およびＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）で検出した。細胞は、以下の構築物でトランスフェクトした。レーン１：マウス プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン２：ヒト プレ（α）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン３：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン４：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（α）プロＧＤＮＦ、レーン５：マウス プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン６：ヒト プレ（β）プロＧＤＮＦ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、レーン７：ヒト ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン８：ヒト ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレ（β）プロＧＤＮＦ、レーン９：ＧＦＰを発現する空のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター、レーン１０：プロ領域を欠いたｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プレＧＤＮＦ。Ｄ２０抗体でＣＨＯ細胞を分析した際の、培地に関する結果。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
配列番号１   [223]：  完全なヒト プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦ
配列番号３   [223]：  マウス プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦ
配列番号５   [223]：  ＡＴＧを含むヒト プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦ
配列番号７   [223]：  プライマー４２
配列番号８   [223]：  プライマー４３
配列番号９   [223]：  プライマー４６
配列番号１０ [223]：  プライマー４７
配列番号１１ [223]：  プライマー５３
配列番号１２ [223]：  プライマー４９
配列番号１３ [223]：  プライマー４８
配列番号１４ [223]：  プライマー５４
配列番号１５ [223]：  ヒトＧＤＮＦの５’プライマー
配列番号１６ [223]：  ヒトＧＤＮＦの３’プライマー
配列番号１７ [223]：  プライマー９１
配列番号１８ [223]：  プライマー９２
配列番号１９ [223]：  Leuを含むプレ−ガンマ−プロのａａ配列
配列番号２０ [223]：  ＣＴＧを含むプレ−ガンマ−プロのｎｔ配列
配列番号２１ [223]：  Metを含むプレ−ガンマ−プロのａａ配列
配列番号２２ [223]：  ＡＴＧを含むプレ−ガンマ−プロのｎｔ配列
配列番号２３ [223]：  ＣＴＧを含む短縮型プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号２５ [223]：  ＡＴＧを含む短縮型プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号２７ [223]：  Leuを含むＶ３４Ｍ プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのａａ
配列番号２８ [223]：  ＣＴＧを含むＶ３４Ｍ プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号２９ [223]：  Metを含むＶ３４Ｍ プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのａａ
配列番号３０ [223]：  ＡＴＧを含むＶ３４Ｍ プレ−ガンマ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号３１ [223]：  Ｖ３８Ｍプレ−ベータ−プロＧＤＮＦのａａ
配列番号３２ [223]：  Ｖ３８Ｍプレ−ベータ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号３３ [223]：  Ｖ６４Ｍプレ−アルファ−プロＧＤＮＦのａａ
配列番号３４ [223]：  Ｖ６４Ｍプレ−アルファ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号３５ [223]：  短縮型プレ−ベータ−プロＧＤＮＦのａａ
配列番号３６ [223]：  短縮型プレ−ベータ−プロＧＤＮＦのｎｔ
配列番号３７ [223]：  ｐＥＧＦＰの５’プライマー
配列番号３８ [223]：  ｐＥＧＦＰの３’プライマー
配列番号３９ [223]：  プライマー８９
配列番号４０ [223]：  プライマー９０
配列番号４１ [223]：  ｐＡＡＶ−ＭＣＳの５’プライマー
配列番号４２ [223]：  ｐＡＡＶ−ＭＣＳの３’プライマー
配列番号４３ [223]：  ＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントアルファ、ベータ
またはガンマのプレプロ配列のＣ末端２６アミノ酸領域
配列番号４４ [223]：  ヒト プレ−アルファ−プロＧＤＮＦのプロペプチド
配列番号４５ [223]：  ヒト プレ−ベータ−プロＧＤＮＦのプロペプチド
配列番号４６ [223]：  抗体３２０のエピトープ（マウス アルファ−プロ配列に
基づく）
配列番号４７ [223]：  抗体３２１のエピトープ（プロＧＤＮＦのＣ末端に基づく）
配列番号４８ [223]：  抗体３２２のエピトープ（ベータ−プロ配列に基づく）
配列番号４９ [223]：  プレ−アルファ−プロＧＤＮＦのプレプロ領域
配列番号５０ [223]：  プレ−ベータ−プロＧＤＮＦのプレプロ領域
配列番号５１ [223]：  ヒト プレ−ベータ−プロＧＤＮＦ
配列番号５１ [223]：  プロペプチド
【図１】
2011500075.tif 000002
【図２】
2011500075.tif 000003
【図３】
2011500075.tif 000004
【図４】
2011500075.tif 000005
【図５】
2011500075.tif 000006
【図６】
2011500075.tif 000007
【図７】
2011500075.tif 000008
【図８Ａ】
2011500075.tif 000009
【図８Ｂ】
2011500075.tif 000010
【図９Ａ】
2011500075.tif 000011
【図９Ｂ】
2011500075.tif 000012
【図１０】
2011500075.tif 000013
【図１１】
2011500075.tif 000014
【図１２Ａ】
2011500075.tif 000015
【図１２Ｂ】
2011500075.tif 000016
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2011500075.tif 000019
【図１４Ｂ】
2011500075.tif 000020
【図１５Ａ】
2011500075.tif 000021
【図１５Ｂ】
2011500075.tif 000022
【図１６Ａ】
2011500075.tif 000023
【図１６Ｂ】
2011500075.tif 000024
【図１６Ｃ】
2011500075.tif 000025
【図１７Ａ】
2011500075.tif 000026
【図１７Ｂ】
2011500075.tif 000027
【図１７Ｃ】
2011500075.tif 000028
【図１７Ｄ】
2011500075.tif 000029
【配列表】
2011500075000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月12日(2009.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製したヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（γ）プロＧＤＮＦ）。
【請求項２】
配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ末端のロイシン残基がメチオニン残基で置換されてなる、配列番号６に示した修飾ヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント（プレ（γ）プロＧＤＮＦ）。
【請求項３】
配列番号２の１番〜１３４番アミノ酸と共に、配列番号２のアミノ酸−４７番〜−１番からなる配列の一部分であって、制御能を有するがシグナル配列を欠いた部分を包含する、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの成熟部分ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１９に示したアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロアミノ酸配列。
【請求項５】
配列番号２１に示したアミノ酸配列を包含する、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロアミノ酸配列。
【請求項６】
制御能を有する、配列番号２１に示したシグナル配列の一部分。
【請求項７】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端の３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号２４に示したアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの短縮型ポリペプチド。
【請求項８】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端の３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号２６に示したアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントの短縮型ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の３９番〜１３４番アミノ酸と共に、配列番号２のアミノ酸−４７番〜−１番であるシグナル配列の一部分であって、制御能を有する部分を包含する、ヒト プレ（γ）プロＧＤＮＦの短縮型成熟部分ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２７に示したアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのＶ３４Ｍ変異体。
【請求項１１】
配列番号２９に示したアミノ酸配列を包含する、請求項２に記載のヒトＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのＶ３４Ｍ変異体。
【請求項１２】
配列番号３１に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製され且つＶ３８Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（β）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１３】
成熟部分ポリペプチドのＮ末端から３８個のアミノ酸を欠失した、配列番号３５に示したアミノ酸配列からなる、短縮型ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（β）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１４】
配列番号３３に示したアミノ酸配列を包含する、単離精製され且つＶ６４Ｍ変異を有する、ヒト グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質スプライスバリアント（プレ（α）プロＧＤＮＦ）。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその一部をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１に示した核酸配列からなる、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号５に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号２０に示した核酸配列からなる、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号２２に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号２３に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２５に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号２８に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号３０に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号３２に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号３６に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号３４に示した核酸配列を包含する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
発現制御分子に発現可能な状態で結合した請求項１５〜２６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを包含するベクター。
【請求項２８】
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ウイルスベクターが、組み換えワクシニアウイルスベクター、組み換えアデノウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター、組み換えバキュロウイルスベクター、組み換えパピローマウイルスベクター、組み換えレンチウイルスベクターまたは組み換えトリ ポックスウイルスベクターであるか、in vivoにおいて遺伝子発現を制御可能なウイルスベクターであることを特徴とする、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
非ウイルスベクターが、細菌、真菌、哺乳類、昆虫、植物または酵母に由来のベクター、リポソーム、あるいはＤＮＡのポリアミン誘導体であることを特徴とする、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれかに記載のベクターを包含する、天然の環境から単離された形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３２】
ＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントα、βまたはγのプレプロ配列のＣ末端２６アミノ酸領域である、配列番号４３に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３３】
プレ（α）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプロ領域である、配列番号４４に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプロ領域である、配列番号４５に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３５】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域である、配列番号５０に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３６】
プレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントである、配列番号２または配列番号６に示したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体。
【請求項３７】
配列番号１９または配列番号２１に示したアミノ酸配列からなるプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントのプレプロ領域に特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
神経障害または神経変性疾患の治療用である、請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれるＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその部分ペプチド。
【請求項３９】
請求項１〜１４のいずれかで定義したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれるＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントまたはその部分ペプチドの、神経障害または神経変性疾患の治療剤を製造するための用途。
【請求項４０】
神経障害または神経変性疾患の治療用である、請求項１５のポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項１５のポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドの、神経障害または神経変性疾患の治療剤を製造するための用途。
【請求項４２】
神経障害が、中枢神経異常、脊髄損傷、依存症、アルコール中毒症、虚血症、癲癇、うつ病または脳梗塞であることを特徴とする、請求項３９または４１の用途。
【請求項４３】
神経変性疾患が、パーキンソン氏病、アルツハイマー病または萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であることを特徴とする、請求項３９または４１の用途。
【請求項４４】
請求項１６〜２５のいずれかのポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドの、神経障害または疾患の治療剤を製造するための用途であって、in vivoで製造されるプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質およびプレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質の分泌が、神経刺激および神経生理学的刺激の制御下にあることを特徴とする用途。
【請求項４５】
神経障害または神経変性疾患の治療方法であって、神経障害または神経変性疾患を発症した対象に治療に効果的な量のプレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質、プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質、または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを包含する方法。
【請求項４６】
プレ（γ）プロＧＤＮＦタンパク質が、請求項２、５、８または１１のいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
プレ（β）プロＧＤＮＦタンパク質が、請求項１２および１３のタンパク質、ならびに配列番号５２に示したタンパク質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
治療に効果的な量のＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントを薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有し、該ＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントは、請求項１〜１４のいずれかのＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアント、および配列番号５２に示したＧＤＮＦタンパク質スプライスバリアントからなる群より選ばれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４９】
ベクターに挿入した治療に効果的な量のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物であって、該ポリヌクレオチドは、請求項１６〜２６のいずれかのポリヌクレオチドおよび配列番号５１に示したポリヌクレオチドからなる群より選ばれるものであり、該ベクターは、治療に効果的なＧＤＮＦタンパク質産物のin vivo合成を達成するために、神経障害または神経変性疾患を発症した患者の細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適したものであることを特徴とする医薬組成物。
【国際調査報告】
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