(57)【要約】  組織増強、特に硬組織増強のための注入可能な放射線不透過組成物、それを用いるキット、および方法が記載される。注入可能な組成物は、孔を有する、生物学的に分解可能なフィブリンマトリックスを形成する。この組成物は、フィブリノゲン、トロンビンまたはフィブリノゲンを架橋させる他の薬剤、およびストロンチウム塩から形成される。随意であるが、ヨウ化造影剤がさらに組成物に含まれる。ある局面では、この組成物は、マトリックスを形成する際に実質的に発熱せず、結果得られるマトリックスは、典型的にエラストマーで見られる機械的特性を発現する。適切な放射線不透過性は、ヨウ化造影剤と組合わせるまたは組合わせないで、ストロンチウム塩を含むことにより達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フィブリノゲンを含む第１の成分と、
（ｂ）トロンビンを含む第２の成分と、
ストロンチウム塩、特に炭酸ストロンチウムとを混合することにより得ることができる組成物。
【請求項２】
カルシウム源と組み合わされて、前記イブリノゲンと前記トロンビンとから形成されるフィブリンマトリックスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ストロンチウム塩は、（ｉ）前記第１の成分（ａ）および／もしくは前記第２の成分（ｂ）に含まれるか、または（ｉｉ）別個の付加的な成分として与えられるかのいずれかである、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
活性物質、特に硬組織を増強、強化、支持、補修、再生、治療、または充填するのに好適な活性物質、詳細には副甲状腺ホルモンをさらに含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記副甲状腺ホルモンはＰＴＨ融合タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、約０．２から５ｍｇ／ｍｌの副甲状腺ホルモンを含む、請求項４−５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記副甲状腺ホルモンは、フィブリノゲンの凝固の間に作り出されるフィブリンに共有結合的に架橋される、請求項４または６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）の体積＋（ｂ）の体積に対して約０．０５から約０．６０ｇ／ｍｌ（５％から約６０％重量／体積）の炭酸ストロンチウムを含む、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．４ｇ／ｍｌ（４０％重量／体積）の炭酸ストロンチウムを含む、請求項１−８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、約２５から約１００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の成分は、（ａ）の体積＋（ｂ）の体積に対して約１から約４０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項１−９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第２の成分は、体積（ａ）＋（ｂ）に対してトロンビンを約２から約１５ＩＵ／ｍｌ含む、請求項１−１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ヨウ化造影剤をさらに含む、請求項１−１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヨウ化造影剤は、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレート、およびメトリザマイドからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）の体積＋（ｂ）の体積に対して約５０からおよび約５００ｍｇ／ｍｌのヨウ化造影剤を含む、請求項１２または１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
（ａ）の体積＋（ｂ）の体積に対して約１００から約４５０ｍｇ／ｍｌのヨウ化造影剤を含む、請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヨウ化造影剤は乾燥粉末状である、請求項１２−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
ａ）フィブリノゲンを含む第１の容器と、
ｂ）トロンビンを含む第２の容器と、
ｃ）ストロンチウム塩を含む第３の容器とを含む、キット。
【請求項１８】
前記ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１の容器はさらに、副甲状腺ホルモンまたはその生物学的に機能する断片を含む、請求項１７または１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記副甲状腺ホルモンはＰＴＨ融合タンパク質である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１の容器は、前記第１の容器と前記第２の容器との合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して約２５から約１００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の容器は、（ａ）の体積＋（ｂ）の体積に対して、約１から約４０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項１７−２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
乾燥粉末ヨウ化造影剤を含む第４の容器をさらに含む、請求項１７−２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
溶液中のヨウ化造影剤を含む第４の容器をさらに含む、請求項１７−２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記ヨウ化造影剤は、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレート、およびメトリザマイドからなる群から選択される、請求項２２または２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキットから形成される、フィブリンマトリックス。
【請求項２６】
医薬品として使用するための、請求項１−１６のいずれか１項に記載の組成物および／または請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
組織増強、特に硬組織増強のための医薬品の製造における、請求項１−１６のいずれか１項に記載の組成物および／または請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２８】
組織増強、特に硬組織増強のために使用するための請求項１−１６のいずれか１項に記載の組成物および／または請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
骨折、特に、骨粗鬆症による骨折を防止または治療するための医薬品の製造における請求項１−１６のいずれか１項に記載の組成物および／または請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項３０】
骨折、特に骨粗鬆症による骨折の防止または治療のために使用するための、請求項１−１６のいずれか１項に記載の組成物および／または請求項１７−２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
（ａ）フィブリノゲンを含む第１の成分と、
（ｂ）トロンビンを含む第２の成分と、
（ｃ）ストロンチウム塩を含む第３の成分とを含む、組成物。
【請求項３２】
前記フィブリノゲンおよびトロンビンは、カルシウム源と組み合わされてフィブリンマトリックスを形成する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである、請求項３１または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
副甲状腺ホルモンをさらに含む、請求項３１−３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記副甲状腺ホルモンはＰＴＨ融合タンパク質である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して、約０．２から５ｍｇ／ｍｌの副甲状腺ホルモンを含む、請求項３４−３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記副甲状腺ホルモンは、フィブリノゲンの凝固の間に作り出されるフィブリンに共有結合的に架橋される、請求項３４または３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．０５から約０．６０ｇ／ｍｌ（５％から約６０％重量／体積）の炭酸ストロンチウムを含む、請求項３１−３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．４ｇ／ｍｌ（４０％重量／体積）の炭酸ストロンチウムを含む、請求項３１−３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して約２５から約１００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の成分は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して、約１から約４０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項３１−３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第２の成分は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して、約２から約１５ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項３１−４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
ヨウ化造影剤をさらに含む、請求項３１−４１のいずれかに記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヨウ化造影剤は、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレートおよびメトリザマイドからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
体積（ａ）＋（ｂ）に対して約５０からおよび約５００ｍｇ／ｍｌのヨウ化造影剤を含む、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
体積（ａ）＋（ｂ）に対して約１００から約４５０ｍｇ／ｍｌのヨウ化造影剤を含む、請求項４２−４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ヨウ化造影剤は乾燥粉末状である、請求項４２−４５のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、組織増強のための組成物、当該組成物を形成することができる前駆成分、およびこのような組成物の使用に関する。詳細には、本発明は硬組織の増強のための組成物の形成に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
経皮の硬組織増強は、椎体形成術（vertebroplasty）および椎骨形成術（kyphoplasty）を含む医療処置を包含する。経皮の椎体形成術は、骨折部を安定化するよう、潰れたまたは弱った脊椎に針を通じてアクリル系のセメントを注入する技術である。この処置は、伝統的な保全療法に対応できないあるタイプの痛みを伴う椎骨の圧迫骨折ならびに何らかの痛みを伴うまたは不安定な良性および悪性の脊椎損傷を治療するのに有効である（プレドリー（Predley）ら、アメリカン・ファミリー・フィジシャン（American Family Physician）２００２、６６（４）：６１１−６１５）。セメントが与える機械的な支持および安定によって痛みの軽減が達成されることをほとんどの専門家が信じている。整形外科処置において用いられるアクリル系のセメントであるポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）の固形混合物は、死後分析において、椎体の強度および堅さを回復させることを示している。
【０００３】
椎体形成術のために用いられるセメントは、１９６０年代に最初に用いられてからずっと、整形外科において実績のある安全記録を有している。それでも、よりよい注入可能な硬組織増強材料を開発する研究が今でも行なわれている。これらの物質は、新しい硬組織増殖を誘導しつつ椎体を強くするのが理想的であろう。
【０００４】
椎体形成術および椎骨形成術は、以下の徴候に用いられる。すなわち、骨粗鬆症の圧迫骨折、血管腫、外傷性の圧迫骨折、および脊椎転移である。椎体形成術および椎骨形成術において用いられる標準的な材料は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）であるが、他のセメント（たとえば、リン酸カルシウムセメント）が狭い範囲で用いられる。この処置は、蛍光透視ガイダンスの下でのセメントの経皮注射を伴う。セメントは、治療されることになる領域にトロカールを通じて注入され、その場で硬化し、これにより機械的安定および痛みの軽減を与える。ＰＭＭＡは、非常に有効であるが、モノマー毒性、据え付け時の高い温度、狭い作業時間枠、骨梁硬組織よりも高い堅さを含むいくつかの欠点を有する。詳細には、後者の特性は、治療される脊椎に高すぎる堅さを与えると考えられ、これにより背骨における荷重分布が変わってしまい、その結果、隣接する脊椎の骨折の危険性を増加させる（トラウトＡＴ（Trout AT）、カルムスＤＦ（Kallmes DF）、カウフマンＴＪ（Kauffman TJ）、ジャーナル・オブ・ニューロラジオロジー（Journal of Neuroradiology）、２００６、２７：２１７−２２３）。隣接する脊椎の骨折を防止するために、ＰＭＭＡは現在、予防的治療としても用いられる。しかしながら、この処置は、単に骨折の危険性を他の脊椎に移すだけになり得る。
【０００５】
ＵＳ２００７／０２７５０２８およびＵＳ２００７／０２７６５０５は、骨増強のため、または骨空隙充填剤としての使用のためのフィブリンを含む生分解性の注入可能な組成物を開示する。これらの発明によると、（骨増強または骨空隙充填剤としての使用に必要とされる材料の機械的特性のような）特性は、組成物に含まれる粒子および可塑剤のタイプおよび含有量を調節することで調整される。これは、組成物に存在する可塑剤または粒子が、所望の効果を達成するのに絶対に必要とされるということを意味する。組成物における粒子または可塑剤の存在は、形成されるフィブリン凝固塊の機械的特性に大きな影響を与える（ＣＩジョーンズ（CI. Jones）、ＡＨグッダール（A.H. Goodall）／トロンボシス・リサーチ（Thrombosis Research）１１２（２００３）６５−７１；バイオロジカルケミストリ（Biological Chemistry）のＪ、ｖｏｌ．２６７、Ｎｏ．３４、１２月５日、ｐｐ．２４２５９−２４２６３、１９９２）とともに、粒子の存在は、治療される領域における新しい硬組織形成の分析に干渉し得る。さらに、粒子の存在は、治療のために示される部位ではない部位に材料が移動した場合に、安全性の問題となり得る。たとえば、粒子の存在は、材料が椎体形成術のために用いられる際に、材料の漏出およびその結果起こる肺塞栓が起こる場合、非常に危険となり得る。
【０００６】
ヨウ化造影剤は、フィブリンの凝固プロセスに影響を与えると知られている。詳細には、ヨウ素ベースの造影剤の存在は、凝固したフィブリンシーラントにおいて、薄い繊維および小さな孔の形成へと繋がる。これは、凝固塊の分解時間を大幅に長くし、組織再生プロセスの間に必要とされる加えられた生理活性物質の拡散および身体の細胞の細胞浸潤をより困難にする（トロンボシス・リサーチ（Thrombosis Research）、１１２：６５−７１（２００３）；Ｊ．バイオロジカルケミストリ（Biological Chemistry）、２６７（３４）：２４２５９−２４２６３（１９９２）を参照のこと）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した不利な点を克服する組織増強組成物への必要性が存在する。
したがって、この発明の目的は、造骨または細胞の内殖特性を保持する架橋マトリックスを形成する、組織増強のための注入可能な放射線不透過組成物を提供することである。
【０００８】
さらに、この発明の目的は、硬組織増強に好適な機械的特性が架橋マトリックス自体の機械的特性によって主に与えられる、硬組織増強のための改善された組成物を提供することである。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、硬組織増強において用いられるのに必要とされる機械的特性を有する架橋マトリックスを形成するための組成物を提供することである。
【００１０】
この発明のさらなる目的は、組織増強、特に硬組織増強のための改善されたキット、方法、および使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
組織増強のための注入可能な組成物、当該組成物の使用、ならびにそれを用いるキットおよび方法が本願明細書において記載される。注入可能な組成物は、孔を有し、生物学的に分解可能なフィブリンマトリックスを形成する。注入可能な組成物は、以下の前駆成分から形成される。すなわち、フィブリノゲン、トロンビンまたはフィブリノゲンを架橋させてフィブリン凝固塊を形成させる他の薬剤、およびストロンチウム塩である。随意であるが、この発明の組成物はさらに、副甲状腺ホルモンおよび／またはヨウ化造影剤を含んでもよい。ある局面では、この組成物からのマトリックス形成は、実質的に発熱性ではなく、結果得られるマトリックスは、エラストマーにおいて典型的に見られる機械的特性を発現する。適切な放射線不透過性は、ストロンチウム塩および／または好適なヨウ化造影剤を含むことで達成される。適切な粘性および凝固塊の強度は、粉末状薬剤、たとえばストロンチウム塩を含むことにより達成および制御される。適切な粘性および凝固塊の強度はさらに、最終フィブリンマトリックス（本願明細書において「フィブリン凝固塊」とも言及される）におけるフィブリノゲン成分の濃度によって、すなわちフィブリン凝固塊を構成する繊維メッシュの構造によって達成および制御される。ＰＭＭＡのような骨増強セメントとは異なり、本願明細書で記載される組成物は、手法の完了についての上限時間を有さない。これにより、材料を治療部位に届けるためにより多くの時間が得られる。
【００１２】
一実施の形態では、組織増強、特に硬組織増強のための注入可能な組成物は、
（ａ）フィブリノゲンを含む第１の成分と、
（ｂ）トロンビンを含む第２の成分と、
（ｃ）ストロンチウム塩を含む第３の成分とを含む。
【００１３】
好ましくは、ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである。好ましくは、ストロンチウム塩、特に炭酸ストロンチウムは、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．０５から約０．６０ｇ／ｍｌ（５％から約６０％重量／体積）、組成物に存在する。
【００１４】
他の好ましい実施の形態では、組成物は、第１の成分および第２の成分の合計の体積（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して、フィブリノゲンを約２５から約１００ｍｇ／ｍｌの量含み、第２の成分は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して、約１から約４０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００１５】
別の実施の形態では、組成物はさらに、副甲状腺ホルモンまたはその生物学的に機能する断片を含んでもよい。好ましくは、副甲状腺ホルモンはＰＴＨ融合ペプチド（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）である。より好ましくは、組成物は、第１の成分および第２の成分の合計の体積（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して、約０．２から５ｍｇ／ｍｌの副甲状腺ホルモンを含む。随意であるが、副甲状腺ホルモンは、フィブリノゲンの凝固の間に作り出されるフィブリンに共有結合的に架橋される。
【００１６】
別の実施の形態では、本発明の組成物はさらに、ヨウ化造影剤を含んでもよい。好ましくは、ヨウ化造影剤は、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレート、およびメトリザマイドからなる群から選択される。より好ましくは、組成物は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約５０から約５００ｍｇ／ｍｌのヨウ化造影剤を含み、さらにより好ましくは、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約１００から約４５０ｍｇ／ｍｌの造影剤を含む。随意であるが、ヨウ化造影剤は、乾燥粉末状で組成物に存在する。
【００１７】
別の実施の形態では、キットは、
ａ）フィブリノゲンを含む第１の容器と、
ｂ）トロンビンを含む第２の容器と、
ｃ）ストロンチウム塩を含む第３の容器とを含む。
好ましくは、ストロンチウム塩は、上述したように炭酸ストロンチウムである。
【００１８】
随意であるが、第１の容器はさらに、副甲状腺ホルモンまたはその生物学的に機能する断片を含む。
【００１９】
随意であるが、キットはさらに乾燥粉末ヨウ化造影剤または溶液中のヨウ化造影剤を含む第４の容器を含む。
【００２０】
他の実施の形態では以下のものが提供される。
組織増強、特に硬組織増強のための医薬品の製造における本発明の注入可能な組成物の使用。
【００２１】
組織増強、特に硬組織増強において使用するための本発明の組成物。
骨折を防止または治療するための医薬品の製造における本発明の組成物の使用。
【００２２】
骨折の予防または治療において使用するための本発明の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１ａは、以下の５つのフィブリノゲン組成物についての、粘性（Ｐａ  ｓ）対時間（秒）の線グラフの図である。当該フィブリノゲン組成物は、（Ｆ１）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末、フィブリンに対して０．１ｇ／ｍｌの１０ミクロンのリン酸三カルシウム粉末；（Ｆ２）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末；（Ｆ３）フィブリンに対してフィブリノゲン４０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末；（Ｆ４）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオヘキソール粉末；（Ｆ５）フィブリンに対してフィブリノゲン４０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、トロンビン注射器内の４００ｍｇのイオパミドール溶液である。図１ｂは、組成物Ｆ１（ＰＥＧなし）（実線）および組成物Ｆ２（ＰＥＧあり）（点線）の２つの組成物についての、粘性（ＰａＳ）対時間（秒）のグラフの図である。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、さまざまなフィブリノゲン組成物の押出パラメータを求めるのに用いられる計測器具の図である。
【図３】以下の７つのフィブリノゲン組成物について時間にわたる生理活性物質放出を示す線グラフの図である。当該フィブリノゲン組成物は、（ＦＡ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；（ＦＢ）フィブリンに対してフィブリノゲン５４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン４ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別個に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオジキサノール溶液）；（ＦＣ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン３７．５ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビン成分とともに保存されるイオジキサノール溶液）；（ＦＤ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン３７．５ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビン成分とともに存在するイオジキサノール溶液）；（ＦＥ）フィブリンに対してフィブリノゲン４４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３０３ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別個に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオジキサノール溶液）；（ＦＦ）フィブリンに対してフィブリノゲン４８ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン４ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオヘキソール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別個に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオヘキソール溶液）；（ＦＧ）フィブリンに対してフィブリノゲン５３ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１０ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌの粉末状のイオパミドールである。
【図４】図４ａおよび図４ｂは、以下の調合物についての圧縮弾性係数を示す図である。当該調合物は、１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；４）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ；５）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後で混合物に加えられる）；６）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール１５０ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム；７）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール４００ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウムである。
【図５】図５ａおよび図５ｂは、および以下の調合物について、一軸圧縮試験に続く５０％の歪みでの変形エネルギを示す図である。当該調合物は、１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；４）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ；５）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後で混合物に加えられる）；６）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール１５０ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム；７）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール４００ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウムである。
【図６】図６ａは、１０Ｇの１００ｍｍ椎体形成術針を通じた押出しの後に分離された緩衝剤の量の線グラフを示す図である。図６ｂは、注入された材料の３７°Ｃで５時間の露出の後で失われた揮発性成分の量の線グラフを示す図である。図６ｃは、以下の調合物について、注入された材料を３７℃で５時間の露出の後の重量損失のパーセントの線グラフを示す図である。当該調合物は、１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；４）フィブリンに対してフィブリノゲン８４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；５）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ；６）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後で混合物に加えられる）である。
【図７】図７ａおよび図７ｂは、以下の調合物について、一軸の圧縮試験に続く緩衝剤放出を示す図である。当該調合物は、１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；４）フィブリンに対してフィブリノゲン８４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ；５）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ；６）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後で混合物に加えられる）；７）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール１５０ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム；８）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール４００ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウムである。
【図８ａ】時間（時間）にわたる４つの組成物の各々からの生理活性物質の％放出のグラフの図である。当該組成物は、組成物Ｆａ（◆）、組成物Ｆｂ（■）、組成物Ｆｃ（▲）、および組成物Ｆｄ（ｘ）である。
【図８ｂ】時間（時間）にわたる３つの組成物の各々からの生理活性物質の％放出のグラフの図である。当該組成物は、組成物Ｆａ（◆）、組成物Ｆｂ（▲）、および組成物Ｆｃ（■）である。
【図９】以下の調合物を用いた治療の後の羊の脊椎における合計の体積に対する骨体積の％の棒グラフを示す図である。当該調合物は、Ａ）第３腰椎（Ｌ３）に注入されるフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオパミドール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ；Ｂ）Ｌ２に注入されるフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ；Ｃ）Ｌ５に注入されるフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ；Ｄ）Ｌ４に注入されるフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、１０ミクロンの１５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウム、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌである。
【図１０】羊の大腿骨顆／脛骨近位端の増強モデルにおける外科手術のために製造されたカスタムの照準装置を示す図である。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、蛍光透視法による照準装置の位置決めと、存在する無傷の骨の骨梁の間の空間内に注入された材料の位置とを示す図である。
【図１２】約８．１ｍｍの合計の厚みをカバーするμＣＴスライスを示す図である。針の先端部の周りに、雲隠った部分の中心に向かって成長している密度の濃い骨の形成を示している。残余の炭酸ストロンチウムがまだ存在している（調合物３、右の脛骨）。
【図１３】注射針先端部の元々の部分を中心とする対象の球状容積における骨の体積／合計の体積（ＢＶ／ＴＶ）の計算を示す図である。骨形成についてすべての椎骨増強材料調合物のプラスの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本願明細書において一般的に用いられる「活性物質」または「薬剤」または「生理活性物質」という用語は、生物学的過程に影響を与えるかまたは変更する化合物を指す。活性物質は、人間のような動物の病気または疾患の治療、予防、または診断のために用いられる（たとえば、治療薬、診断薬、および予防薬）。
【００２５】
本願明細書で一般的に用いられる「凝固」という用語は、たとえば、フィブリンを含むゲルを意味し、当該技術において公知の任意の種類の凝結状態を含む。
【００２６】
「フィブリノゲン」という用語は、フィブリノゲン自体だけでなく、凝固塊を形成するフィブリノゲンの誘導体も含む。
【００２７】
本願明細書で一般的に用いられるように、「トロンビン」という用語は、トロンビン自体と、フィブリノゲンまたはフィブリンのためのゲル化を誘発するか凝固塊を誘発する任意の薬剤とを含む。
【００２８】
本願明細書で一般的に用いられるように、「ゲル化する」という用語は、初期状態と比較して粘性が増加した如何なる状態も意味する。これは、たとえば、フィブリノゲンからのフィブリンの形成、またはコロイドのような、少なくとも１つの固相および少なくとも１つの液相の細かく分散された系において観察され得る。さらに、「ゲル化する」という用語は、当該技術において公知であるすべてのゲル状態を含む。
【００２９】
本願明細書で一般的に用いられる「硬組織」という用語は、骨、椎間板、腱、靭帯、および軟骨を指す。
【００３０】
本願明細書で一般的に用いられる「マトリックス」という用語は、材料に依存して、任意の組織または組織の機能を永久的または一時的に治療、増強、または置き換えるよう生体系と連結するよう意図される材料を指す。マトリックスは、その中に混合される活性物質の供給装置として作用する。一実施の形態では、本願明細書に記載されるマトリックスは、身体の必要な部位にゲルを形成することができる液状の前駆成分から形成される。「マトリックス」、「ゲル」、「シーラント」、および「３次元網目」という用語は、本願明細書では同義語的に用いられる。「マトリックス」、「ゲル」、および「シーラント」という用語は、前駆成分がともに混合されるとともに架橋反応が始まった後に形成される組成物を指す。したがって、「マトリックス」、「ゲル」、および「シーラント」という用語は、部分的または完全に架橋された高分子網目を含む。それらは、ペーストのような半固体または固体の形態を取る。前駆材料のタイプに依存して、マトリックスは、水で膨れ上がるが水に溶解しない、すなわち、ある期間の間、身体にとどまるヒドロゲルを形成し得る。
【００３１】
本願明細書で一般的に用いられる「フィブリンマトリックス」という用語は、カルシウム源、第ＸＩＩＩａ因子、および随意であるが、前駆成分に存在する１つ以上の賦形剤の存在下で架橋する、フィブリノゲンおよびトロンビンを含む前駆成分から形成される３次元のマトリックスを指す。
【００３２】
本願明細書で用いられる「骨折」という用語は、２つ以上の異なる骨セグメントを形成する全体の骨構造にわたる不連続または途切れを指す。
【００３３】
ＩＩ．組織増強のための注入可能な組成物
一実施の形態は、注入可能な組織増強組成物を提供し、より詳細には、少なくとも第１の成分、第２の成分、および第３の成分を含む注入可能な硬組織増強組成物を提供する。ここで「成分（ａ）」と言及される第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリンを含む。ここで「成分（ｂ）」と言及される第２の成分は、トロンビン、または第１の成分を架橋させるか、または凝固塊もしくはマトリックスを形成させる別の薬剤を含む。ここで時に「成分（ｃ）」と言及される第３の成分は、ストロンチウム塩を含む。好ましくは、ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウム（ＳｒＣＯ３）である。この組成物は、処置の間および後、Ｘ線で材料を可視化する必要がある場合に用いられ得る。
【００３４】
組成物は、随意であるが、副甲状腺ホルモンまたはその生物学的に機能する断片を含む。好ましくは、副甲状腺ホルモンは、ＰＴＨ融合タンパク質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）である。
【００３５】
組成物は、随意であるが、さらにヨウ化造影剤を含む。
いくつかの実施の形態では、硬組織増強組成物は、カルシウム塩粒子のような粒子状の充填剤を含む。
【００３６】
結果得られる組織増強組成物は、身体に完全に再吸収可能であるとともに生分解性である。
【００３７】
一般的に、フィブリノゲンおよびトロンビンは、混合の前に溶液中に存在する。ストロンチウム塩は、混合の前に、他の成分と空間的に分離している固体粉末内に加えられる。
【００３８】
注入可能な組織増強組成物は、組織のミネラル化されていない部分または中空部分内への注入を可能にするという利点があり、当該処置は、蛍光透視法といったさまざまな画像検査法によって同時に監視され得る。さらに、水溶性造影剤は、１週間後にはほぼ完全に組成物から拡散し得る。組成物の他の有益な特性には、最終の凝固した組成物の非常に有利な生分解性、取扱い易さ、長期貯蔵安定性、ならびに高い有効性、放射線不透過性、および粘性が含まれる。
【００３９】
一実施形態では、多成分系の付加的な造影剤は、少なくとも１つのヨウ素を有する有機化合物を含む。
【００４０】
注入可能な組織増強組成物は、ゲル化または部分的に架橋された状態にあり得、たとえば骨梁骨といった、組織のミネラル化されていない部分または中空部分の中に注入するのに好適な粘性を有し得る。組成物は、凝固前の液体の状態、ゲル化した状態または凝固状態において適用され得る。
【００４１】
注入可能な組成物の粘性または流動性は、組成物の用途に依存して変更され得る。典型的には、この流動性は、成分（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間の比率を変更、詳細には、フィブリノゲンの濃度を変動させることにより調節される。本願明細書で一般的に用いられる「体積（ａ）＋（ｂ）」は、フィブリノゲンを含む成分（ａ）がトロンビンを含む成分（ｂ）と混合される際の合計の体積を指す。フィブリノゲン濃度が高くなると、組成物がより粘性を帯び、最終のフィブリン凝固塊の強度が高くなる。たとえば、より高濃度のフィブリノゲンは、椎間板、腱、靱帯の修復といった機械的に困難な徴候に好適となり得る。さらに、フィブリノゲンがより高濃度になると、凝固塊の抵抗性が高くなる。より高濃度のフィブリノゲンはさらに、（実施例３に記載されるように）注入の間に緩衝剤の分離が少なくなることを可能にする。さらに粘性は、物質の放射線不透過性にも同時に寄与する、粉末状で存在するストロンチウム塩によって調節され得る。
【００４２】
Ａ．フィブリノゲン
一実施形態では、最終フィブリン凝固塊におけるフィブリノゲンの量は、たとえば約２５から約１００ｍｇ／ｍｌの範囲であり、典型的には約３０から約８０、さらにより典型的には約４５から約７０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは約５０から約６６ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは約５３から約６０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約５４から約５７ｍｇ／ｍｌであり、もっとも好ましくは約５５ｍｇ／ｍｌからである。これは、たとえば成分（ａ）を１００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン濃度で用い、成分（ａ）を成分（ｂ）とたとえば以下の体積比で混合することにより得られ得る。この体積比は、体積（ａ）：体積（ｂ）＝２（フィブリン中のフィブリノゲンの最終濃度＝６６．７ｍｇ／ｍｌ）の体積比から、体積（ａ）／体積（ｂ）＝４（フィブリン中のフィブリノゲンの最終濃度＝８０ｍｇ／ｍｌ）の体積比までである。代替的には、同様の結果が、体積（ａ）：体積（ｂ）＝１の体積比を保つとともに、たとえば約１１４ｍｇ／ｍｌから１６０ｍｇ／ｍｌといった約１００から２００ｍｇ／ｍｌの範囲の成分（ａ）中のフィブリノゲンの濃度を用いることによって得られ得る。
【００４３】
体積（ａ）＋（ｂ）中のフィブリノゲンの量は、約２５から１００ｍｇ／ｍｌであり得、体積（ａ）＋（ｂ）中のトロンビンの量は１から約４０ＩＵ／ｍｌであり得る。炭酸ストロンチウムの量は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して、０．０５から０．６０ｇ／ｍｌであり得る（以下、０．５％から６０％重量／体積として示す。１％ｗ／ｖは、体積（ａ）＋（ｂ）に対して０．０１ｇ／ｍｌの造影剤を示す）。
【００４４】
ある具体的な実施形態では、体積（ａ）＋（ｂ）中のフィブリノゲンの量は約４５から約７０ｍｇ／ｍｌであり得、好ましくは約５０から約６６ｍｇ／ｍｌであり得、より好ましくは約５３から約６０ｍｇ／ｍｌであり得、さらにより好ましくは約５４から約５７ｍｇ／ｍｌであり、もっとも好ましくは約５５ｍｇ／ｍｌからであり得る。体積（ａ）＋（ｂ）中のトロンビンの量は、２ＩＵ／ｍｌから約１５ＩＵ／ｍｌであり得る。フィブリノゲンが高濃度になれば、フィブリン凝固塊が強くなり、圧力下での注入の間に緩衝剤の分離が少なくなる。
【００４５】
Ｂ．トロンビン
トロンビン（「因子ＩＩａ」とも呼ばれる活性化第ＩＩ因子）は、凝固カスケードにおいて多くの効果を有する凝固タンパク質である。可溶性のフィブリノゲンを不溶性のフィブリンのストランドに変換するとともに多くの他の凝固に関連する反応を触媒するのは、セリンプロテアーゼである。トロンビンの代わりに、またはトロンビンに加えて、成分（ｂ）は、当該技術で公知である、他のフィブリノゲン架橋化合物を含んでもよい。
【００４６】
トロンビンまたは多成分系の成分（ｂ）はさらに、当該技術において公知である付加的な化合物を含んでもよい。成分（ｂ）中のトロンビンの濃度は、体積（ａ）＋体積（ｂ）の合計（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して１と約４０ＩＵ／ｍｌとの間、典型的には２と２０ＩＵ／ｍｌとの間、より好ましくは２と１５ＩＵ／ｍｌとの間になるように、変動し得る。
【００４７】
Ｃ．ストロンチウム塩
ストロンチウム塩はそれ自体が造影性を有する。これは、ヨウ化造影剤を用いなくてもよくなるか、用いられるヨウ化造影剤の量を低減することを可能にし得、これにより、画像ガイド用途のために最良の造影が得られる。驚くべきことに、ストロンチウム塩をフィブリンマトリックスに組み込んでも、フィブリン凝固構造は変化せず、かつフィブリンマトリックスは放射線不透過でありながら自身の造骨細胞内殖特性を保持するということが分かった。ヨウ素ベースの造影剤の部分的または完全な除去により、フィブリン凝固構造の変質が回避される。さらに、炭酸ストロンチウムのような無機塩類は、骨形成にプラスの影響を与え得る。
【００４８】
ストロンチウム塩は、たとえば、炭酸ストロンチウム（ＳｒＣＯ３）、臭化ストロンチウム、リン酸ストロンチウム（Ｓｒ３（ＰＯ４）２）、リン酸水素ストロンチウム（ＳｒＨＰＯ４）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、酢酸ストロンチウム（Ｓｒ（ＣＨ３ＣＯＯ）２  １／２Ｈ２Ｏ）、シュウ酸ストロンチウムＳｒＣ２Ｏ４といった無機複合体と、たとえば、ラネリック酸ストロンチウムおよびクエン酸塩ストロンチウムといった有機金属複合体とを含むが、これらに限定されない。骨形成にプラスの効果（すなわち、造骨性、骨結合性、もしくは骨誘導性のストロンチウム塩）または骨芽細胞もしくは破骨細胞に生物学的影響を与える、当該技術において公知であるストロンチウム塩は、本発明の組成物においても用いられ得る。
【００４９】
一実施形態では、成分（ｃ）は、粉末状のストロンチウム塩を、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．０５から約０．６０ｇ／ｍｌの範囲の量（５％から約６０％重量／体積）、より好ましくは体積（ａ）＋（ｂ）の混合物に対して１０％から４５％重量／体積で含む。好ましくは、ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである。
【００５０】
さらに、ストロンチウム塩を、凝固の前の当該注入可能な組成物の流動性と、最終凝固塊の強度および造影性とを向上させるよう用いてもよい。たとえば、炭酸ストロンチウムを合計の体積（ａ）＋（ｂ）（ＰＥＧといった溶解された任意の化合物を含む。粉末状の他の成分が別途加えられる場合、その粉末状の成分は含まない）に対して０．１ｇ／ｍｌの量だけ組成物に加えることで、１００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノールを含む組成物と同様の造影性が与えられる。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の好ましい組成物は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約４５から約７０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０から約６６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５３から約６０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約５４から約５７ｍｇ／ｍｌ、もっとも好ましくは約５５ｍｇ／ｍｌからの量のフィブリノゲンを含む成分（ａ）と、体積（ａ）＋（ｂ）に対して２ＩＵ／ｍｌから約１５ＩＵ／ｍｌの量のトロンビンを含む成分（ｂ）と、体積（ａ）＋（ｂ）に対して約０．０５から約０．６０ｇ／ｍｌの範囲の量（５％から約６０％重量／体積）で、より好ましくは体積（ａ）＋（ｂ）の混合物に対して
１０％から４５％重量／体積で、成分（ｃ）として与えられる無機塩類とを含む。好ましくは、成分（ｃ）の無機塩類は、ストロンチウム塩であり、より好ましくは、ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである。
【００５２】
随意であるが、注入可能な組成物には無機充填剤が含まれてもよい。好適な充填剤は、カルシウムおよびストロンチウム塩を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
一実施形態では、組成物は、充填剤を、フィブリノゲンおよびトロンビン溶液を組合わせた体積（ＰＥＧといった溶解された任意の化合物を含む。粉末状の他の成分が別途加えられる場合、その粉末状の成分は含まない）に対して、約０．０１ｇ／ｍｌから約０．５ｇ／ｍｌの量で含む。好ましくは、組成物は、当該合わされた溶液に対して、約０．０５ｇ／ｍｌおよび０．３ｇ／ｍｌの範囲の量の充填剤を含む。
【００５４】
Ｄ．ヨウ化造影剤
随意であるが、本発明の注入可能な組成物はさらに、有機造影剤、好ましくはヨウ化造影剤を含む。好適な有機造影剤は、当該技術において公知である蛍光透視法のような画像検査用途において利用可能な任意のヨウ化造影剤を含む。ヨウ化造影剤は、Ｘ線照射、放射線照射、赤外線照射、紫外線照射、電子もしくは中性子照射といった照射、または磁界、超音波、またはこれらの組合せを検出および／または適用することにより周りの組織を区別するのに有用である。一実施形態では、ヨウ化造影剤は低い浸透圧を有し、適切な程度までフィブリン集合を発生させることを可能にする。適切な造影は、ヨウ素ベースの造影剤を任意に組合せて使用することで得られ得る。
【００５５】
ヨウ素ベースの造影剤の例としては、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレート、およびメトリザマイドを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
フィブリンの特性に対するヨウ素ベースの造影剤の影響が、以下の文献に記載されている。詳細には、液体状で用いられる場合のヨウ素ベースの造影剤の存在によって、凝固の分解時間を大幅に長くするとともに、高分子の拡散をより困難にする薄い繊維および小さな孔が形成される（ＣＩジョーンズ（CI. Jones）、ＡＨグッダール（A.H. Goodall）／トロンボシス・リサーチ（Thrombosis Research）１１２  （２００３）  ６５−７１；バイオロジカルケミストリ（Biological Chemistry）のＪ、ｖｏｌ．２６７、Ｎｏ．３４、１２月５日、ｐｐ．２４２５９−２４２６３、１９９２年）。ヨウ素の存在によって特性が変化したフィブリン凝固塊は、組織増強および修復に使用するにはあまり好適でなくなる場合がある。
【００５７】
好ましい実施の形態では、ヨウ素ベースの造影剤は粉末状で用いられ、フィブリノゲンおよびトロンビンとは別個に保存される。典型的には、乾燥造影剤が、フィブリノゲンまたはフィブリンおよびトロンビンが均質化された後、組成物に加えられる。ヨウ素を組成物へ粉末状で添加することで、（本願明細書で提供される実施例において示されるように）凝固プロセスに対するその影響が最小化される。ひとたび他の成分と混ぜ合わされると、当該ヨウ素は、組成物において均質に分布し、これにより好適な放射線不透過性が提供される。粉末状の造影剤を加える前にフィブリノゲンをトロンビンと混合することで、ヨウ素が組成物に加えられる前にフィブリンの凝固を開始させることが可能になる。
【００５８】
一実施の形態では、組成物は、体積（ａ）＋（ｂ）の混合物に対して約５０から約５００ｍｇ／ｍｌの量、好ましくは体積（ａ）＋（ｂ）の混合物に対して約１００から約４５０ｍｇ／ｍｌの量の粉末状のイオジキサノール、イオヘキソール、またはイオパミドールを含む。
【００５９】
別の実施形態では、適切な造影が、ヨウ素およびストロンチウム塩の組合せによって達成される。たとえば、１０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウムは、１００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノールと同様の放射線不透過性を与える。
【００６０】
Ｅ．ポリオキシアルキレン分子
ポリオキシアルキレンが組成物に存在すれば、（実施例に記載されるように）ヨウ化造影剤がフィブリン凝固プロセスの生化学およびフィブリンマトリックスの最終構造に有害な影響を与えるのを防止することが示された。ポリオキシアルキレンとヨウ化造影剤との組合せは、画像ガイド用途に最適な造影性と、組織再生プロセスの間の凝固塊からの生理活性物質の拡散および身体の細胞の細胞浸潤に好適な開口孔および繊維構造とを注入可能な組成物に与える。
【００６１】
一般的に、フィブリノゲンおよびトロンビン成分は、混合の前に溶液中に存在する。ヨウ化造影剤は、トロンビン成分および／またはポリオキシアルキレンとともに溶液とするか、または混合の前に他の成分とは空間的に離れた固体粉末状とすることができる。ポリオキシアルキレンは、トロンビン成分および／または造影剤とともに溶液とすることができる。充填剤が注入可能な組成物に含まれる場合、当該充填剤は、混合の前に他の成分と空間的に離れた固体粉末の形、または当該成分の１つ以上と事前に混合された固体粉末の形とすることができる。
【００６２】
ポリオキシアルキレン分子の例としては、非官能化、低〜高分子量、線状または分岐ポリマーを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ポリオキシアルキレンはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００６３】
一実施形態では、ポリオキシアルキレンは、１０００Ｄａから２００００Ｄａの範囲の分子量を有する線状ヒドロキシ終端ＰＥＧである。
【００６４】
別の実施形態では、ポリオキシアルキレンは１０００Ｄａから２００００Ｄａの範囲の分子量を有する分岐ヒドロキシ終端ＰＥＧである。ヒドロキシ基は、ＰＥＧ分子の末端のうち少なくとも２つ、好ましくはその末端のすべてに存在する。もっとも好ましい分子は、その末端のすべてにヒドロキシ基が存在し、約１００００Ｄａの分子量を有する４つの末端を持つＰＥＧである。
【００６５】
注入可能な組成物におけるＰＥＧの最適な量は、造影剤の濃度によって変動する。注入可能な組成物におけるＰＥＧの量は、典型的には、フィブリノゲンおよびトロンビン溶液を組合わせた体積（ＰＥＧといった溶解された任意の化合物を含む。粉末状の他の成分が別途加えられる場合、その粉末状の成分は含まない）に対して、約５ｍｇ／ｍｌから約４０ｍｇ／ｍｌの範囲である。注入可能な組成物におけるＰＥＧの量は、好ましくは、フィブリノゲンおよびトロンビン溶液を組合わせた体積に対して約１０ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌである。
Ｆ．付加的な薬剤
随意であるが、注入可能な組成物および組成物を形成するのに用いられる前駆成分は、組織を増強、強化、支持、修復、再生、治癒、または充填するために好適な他の成分を含み得る。用いられてもよい付加的な薬剤の例としては、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）もしくはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）またはそれらの混合物といったカルシウム塩と、骨誘導剤と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、またはＯＰ−１）、変異増殖因子アルファおよびベータ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子であるがこれらに限定されない成長因子と、化学療法的または薬理的薬剤と、生理学的活性物質と、硬化および／または粘着剤と、鉱物質添加剤とを含むが、これらに限定されない。
【００６６】
ＰＴＨ
本願明細書で用いられる「ＰＴＨ」という用語は、ＰＴＨ１−８４のヒトの配列と、生分解性の自然または合成マトリックスに共有結合される際に骨形成特性を発現するＰＴＨの切断され、変更され、および対立する形態のすべてを含む。ＰＴＨの好ましい切断された形態は、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、またはＰＴＨ１−２５である。最も好ましいのは、ＰＴＨ１−３４である。牛のＰＴＨといったような他の源からのＰＴＨも好適であり得るが、好ましくはＰＴＨはヒトのＰＴＨである。
【００６７】
本願明細書で一般的に用いられる「ＰＴＨ融合ペプチド」は、少なくとも第１および第２のドメインを含むペプチドを指す。一方のドメインは、ＰＴＨ（天然または切断された形態、特にＰＴＨ１−３４）を含み、他方のドメインは、マトリックスへ架橋されるための基質ドメインを含む。酵素または加水分解の分解部位がさらに当該第１および第２のドメインの間に存在し得る。
【００６８】
ＰＴＨ融合ペプチドは、架橋され得るとともに、ＰＴＨ融合ペプチドの架橋可能な基質ドメインを介してマトリックスに共有結合され得る。基質ドメインの種類は、マトリックスの性質に依存する。フィブリンマトリックスへの組込みのためには、トランスグルタミナーゼ基質ドメインが特に好ましい。トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインであってもよい。この第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＧＡＫＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＫＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、またはＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であるか、またはこれらを含んでもよい。ＰＴＨとトランスグルタミナーゼ基質ドメインとの結合は、化学合成によって行なわれ得る。
【００６９】
トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子以外のトランスグルタミナーゼのための基質であり得る。最も好ましい第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列（ここで、以下「ＴＧ」と称する）を有する。フィブロネクチンといった、トランスグルタミナーゼが認識する他のタンパク質は、トランスグルタミナーゼ基質ペプチドに結合され得る。
【００７０】
【表１】
2011511651.tif 000002
【００７１】
したがって、ＰＴＨ融合ペプチドは、付着部位、すなわち第２のドメイン（すなわち第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインまたはシステイン）と、ＰＴＨ、すなわち第１のドメインとの間に分解可能部位を含むようさらに修正され得る。これらの部位は、非特異性の加水分解（すなわちエステル結合）によって分解可能であるか、または（タンパクまたは多糖分解のいずれかの）特異性酵素の分解のための基質であるかのいずれであってもよい。
【００７２】
タンパク分解のために用いられ得る酵素は数多くある。タンパク質分解可能部位は、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲン活性化因子のための基質を含み得る。基質の例として以下に列挙する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のアミノ末端に向かうアミノ酸１−５の位置を示す。Ｐ１’−Ｐ４’は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のカルボキシ末端に向かうアミノ酸１−４の位置を示す。
【００７３】
【表２】
2011511651.tif 000003
【００７４】
マトリックス内にＰＴＨを取込むために、マトリックスは、フィブリノゲンから形成されるフィブリンと、カルシウム源と、トロンビンとを含み、ＰＴＨ融合ペプチドは、凝固の間、フィブリン内に取り込まれることになる。ＰＴＨ融合ペプチドは、第１および第２のドメインといった２つのドメインを含む融合ペプチドであり、１つのドメイン、第２のドメインは、第ＸＩＩＩａ因子のような架橋酵素のための基質である。第ＸＩＩＩａ因子は、凝固の間に活性化するトランスグルタミナーゼである。この酵素は、トロンビンによる切断によって第ＸＩＩＩ因子から自然に形成され、グルタミン側鎖とリジン側鎖との間に形成されるアミド結合を介してフィブリン鎖同士を互いに付着させるよう機能する。酵素はさらに、第ＸＩＩＩａ因子を含んでいる場合、凝固の間に、他のペプチドをフィブリン（たとえばその細胞付着部位）に付着させるよう機能する。具体的には、配列ＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）が、第ＸＩＩＩａ因子について有効な基質として機能するのが実証されている。上述したように、それは、ＰＴＨに直接的に結合するか、またはＰＴＨ（第１のドメイン）とＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）配列（第２のドメイン）との間に分解部位を含み得るかのいずれかである。したがって、ＰＴＨ融合ペプチドは、凝固の間に、第ＸＩＩＩａ因子基質を介してフィブリン内に取込まれ得る。
【００７５】
ＰＴＨを含む第１のドメインと、架橋酵素のための基質ドメインを含む第２のドメインと、随意であるが、第１および第２のドメインの間の分解部位とを含むＰＴＨ融合ペプチドは、いくつかの異なる手法を用いてフィブリンゲルの中に取込まれ得る。好ましくは、第２のドメインは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインを含み、さらにより好ましくは、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインを含む。もっとも好ましくは、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む。このＰＴＨ融合ペプチドがフィブリノゲンの重合の間、すなわちフィブリンマトリックスの形成の間に存在する場合、当該ＰＴＨ融合ペプチドは、マトリックス内に直接的に取込まれる。
【００７６】
ＰＴＨ融合ペプチドの第１および第２のドメインの間の分解部位は、上述したように、酵素分解部位となり得る。好ましくは、分解部位は、プラスミンおよびマトリックス・メタロプロテイナーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能である。この酵素の分解部位のＫｍおよびｋｃａｔを注意深く選択することによって、および／またはマトリックスを分解するよう同種または異種の酵素を用いて分解部位の配置をタンパク質および用途の各タイプごとに調節することによって、タンパク質マトリックスの前もしくは後のいずれかに分解を発生するよう制御できた。このＰＴＨ融合ペプチドは、上述したように、フィブリンマトリックスの中に直接的に架橋され得た。しかしながら、酵素の分解部位を取込むことで、タンパク質分解の間のＰＴＨの放出が変化する。細胞由来のプロテアーゼは、封鎖された融合ペプチドに到達すると、新しく形成された分解部位にて、変更されたタンパク質を切断できる。この結果得られる分解生成物は、如何なる変更された融合配列および分解されたフィブリンがほぼ存在しない遊離されたＰＴＨを含むことになる。
【００７７】
好ましい実施形態では、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはその生物学的に機能する断片、好ましくはＰＴＨ１−３４、が組成物の中に含まれる。より好ましくは、ＰＴＨを含む第１のドメインと、架橋酵素のための基質ドメインを含む第２のドメインと、随意であるが、第１および第２のドメインの間の分解部位とを含むＰＴＨ融合ペプチドが、組成物に含まれる。好ましくは、ＰＴＨ融合ペプチドは、米国特許７，２４７，６０９、ＰＣＴ出願ＷＯ０３／０５２０９１、および米国特許２００７００１０４４０（これらの内容はここで参照により援用される）に開示されるように、ＰＴＨ１−３４を含む第１のドメインと、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ３のトランスグルタミナーゼ基質ドメインである第２のドメインと、プラスミン分解部位（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）とを含む。
【００７８】
好ましい実施形態では、配列ＹＫＮＲ（ＳＥＱ．ＮＯ：５）が第１のドメインと第２のドメインとの間に位置し、結合プラスミン（linkage plasmin）を分解可能にする。
【００７９】
特に好ましいＰＴＨ融合ペプチドは、ＴＧｐｌＰＴＨ：  ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。
【００８０】
好ましい融合たんぱく質は、ＴＧ−ＰＴＨ１−３４を含む。これは、天然のＰＴＨのアミノ酸１−３４と、ＴＧ（トランスグルタミナーゼ）基質ドメインとを含むＰＴＨの変形態様である。すなわち、ＮＱＥＱＶＳＰＬＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）である。
【００８１】
さらにより好ましくは、ＰＴＨ融合ペプチドは、フィブリノゲンの凝固の間に作り出されるフィブリンに共有結合的に架橋される。好ましい実施形態では、組成物は、ＰＴＨまたは生物学的に活性な機能断片を、第１の成分および第２の成分の合計の体積（「体積（ａ）＋（ｂ）」）に対して副甲状腺ホルモンとして約０．２から５ｍｇ／ｍｌの範囲の量で含む。
【００８２】
これらの化合物は、成分（ａ）から（ｃ）のいずれかの中に含まれてもよく、別の成分として含まれてもよい。
【００８３】
別の実施形態では、上記の通り、フィブリノゲン成分（成分（ａ））はさらに、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質、たとえば、フィブロネクチン、細胞関連タンパク質、他の血漿由来のタンパク質、たとえば第ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）血液凝固因子およびプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビタ、およびそれらの混合物を含んでもよい。本発明のフィブリノゲン溶液は、たとえば商業的に入手可能なフィブリノゲン溶液といった、当該技術水準において科学的および／または商業的に入手可能なフィブリノゲン組成物からなる任意の添加剤を含んでもよい。
【００８４】
Ｇ．注入可能な組成物によって形成されるフィブリンマトリックス
組織増強のために注入可能な組成物は、細胞マトリックスの中への内殖または移動を可能にするよう十分な共重合体間隔を有する高分子網目を形成するために前駆体分子を架橋することにより、フィブリンマトリックスを形成する。驚くべきことに、ストロンチウム塩をフィブリンマトリックスの中に取込んでも、凝固塊の構造が変わることはないということが分かった。結果得られる組成物は、良好な弾性および張力に対する抵抗を有する。
【００８５】
フィブリンマトリックス
フィブリンは、いくつかの生物医学的な用途について報告されている天然物質である。フィブリンは、ハッベルら（Hubbell et al）による米国特許第６，３３１，４２２号において、細胞内殖マトリックスのための物質として記載されている。フィブリンゲルは、多くの組織を結合する能力と傷の治癒におけるその元々の役割とにより、シーラントとして用いられている。さらに、これらの物質は、薬物供給手段として用いられるとともに、神経再生のために用いられている。フィブリンは、組織再生および細胞内殖のために堅固な支持部を提供する。
【００８６】
フィブリノゲンがフィブリンへと重合するプロセスはよく特徴付けられる。まず、プロテアーゼが、二量体のフィブリノゲン分子を２つの対称的な部位で切断する。フィブリノゲンを切断し得る可能性のあるプロテアーゼはいくつかあり、これらにはトロンビン、ペプチダーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩが含まれる。その各々は、異なる部位にてタンパク質を切断する。フィブリノゲンが切断されると、フィブリノゲンモノマーが一緒になり、非共有結合架橋ポリマーゲルを形成する自己重合ステップが起こる。この自己集合は、プロテアーゼ切断の発生の後、結合部位が露出したので起こる。結合部位が露出すると、分子の中心にあったこれらの結合部位がペプチド鎖の端部に存在するフィブリノゲン鎖上の他の部位に結合し得る。この態様で、ポリマー網目が形成される。次いで、第ＸＩＩＩａ因子、すなわちトロンビンタンパク質分解によって第ＸＩＩＩ因子から活性化されたトランスグルタミナーゼが、このポリマー網目を共有結合的に架橋し得る。他のトランスグルタミナーゼも存在し、フィブリンネットワークへの共有結合的架橋およびグラフトに伴われ得る。
【００８７】
架橋されたフィブリンマトリックスが形成されると、その後の分解は厳しく制御される。フィブリンの分解を制御する鍵分子の１つは、α２−プラスミンインヒビタである。この分子は、第ＸＩＩＩａ因子の作用によりフィブリンのα鎖に架橋することにより作用する。自身をゲルに結合することにより、高濃度のインヒビタがゲルに局在化され得る。次いで、このインヒビタは、フィブリンに対するプラスミノーゲンの結合を防止するとともにプラスミンを不活性化することによって作用する。α２−プラスミンインヒビタは、グルタミン基質を含む。完全な配列は、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によって同定されており、最初のグルタミンが架橋のための活性アミノ酸である。
【００８８】
好ましくは、フィブリンマトリックスには、実質的にカルシウムイオン源が存在しない。一実施形態では、フィブリンマトリックスは、ストロンチウム塩を含む。好ましくは、ストロンチウム塩は炭酸ストロンチウムである。随意であるが、フィブリンマトリックスは、ＰＴＨおよび／またはヨウ化造影剤といった活性物質を含む。
【００８９】
ＩＩＩ．キット
一実施形態では、キットは、
ａ）フィブリノゲンを含む第１の容器と、
ｂ）トロンビンを含む第２の容器と、
ｃ）特に第３の容器に含まれるストロンチウム塩とを含む。
【００９０】
好ましくは、第１の容器は、第１の容器および第２の容器合計の体積（体積（ａ）＋（ｂ））に対して、約２５から約１００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の容器は、体積（ａ）＋（ｂ）に対して、約１から約４０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。好ましくは、第３の容器（ｃ）は、成分（ａ）＋（ｂ）の合計の体積に対して、約０．０５から０．６ｇ／ｍｌの炭酸ストロンチウムを含む。
【００９１】
注入可能な組成物を形成するためのキットは、第１の成分（ａ）と、ともに組合わされたときに３次元のマトリックス、すなわち凝固塊またはゲル、を形成することができる第２の成分（ｂ）とを含む。キットは、特に第３の容器の中に第３の成分（ｃ）（ストロンチウム塩を含む）を含む。キットはさらに、異なる成分を組合わせるため取扱説明書と、注射器、ピペット、ピペットバルブ、およびバイアルなどといった、成分を混合および／または適用するための１つ以上の装置とを含んでもよい。一実施形態では、キットは、２方向注射器装置の形態である。これらの成分、活性物質、キャリア、賦形剤などは、両方の注射器の含有物を混合チャンバおよび／または針および／または静的ミキサーを通るように押し出すことによって混合される。本願明細書において「前駆成分」と称される成分（ａ）および（ｂ）は、乾燥粉末のような固体状であってもよく、緩衝剤のような溶液状であってもよい。前駆成分が固体状である場合、キットは、緩衝剤溶液と、前駆成分の溶液を調製するための取扱説明書とを含んでもよい。ストロンチウム塩は、２方向注射器に取り付け可能な別個の容器に与えられ、粉末状であるか、またはフィブリノゲンまたはトロンビン成分とともに溶液の中に存在し得る。
【００９２】
一実施形態では、キットにおける第１の容器（ａ）はフィブリノゲンを含み、第２の前駆体容器（ｂ）は、組合わされるとフィブリンマトリックスを形成するトロンビンを含む。フィブリノゲンは、（随意であるが、安定性を増加させるようアプロチニンとともに）、生理的ｐＨ（ｐＨ６．５から８．０、好ましくはｐＨ７．０から７．５の範囲）で緩衝溶液に溶解され、塩化カルシウム緩衝剤（たとえば４０から５０ｍＭの濃度範囲）の中のトロンビンの溶液とは別個に保存される。フィブリノゲンのための緩衝溶液は、５０ｍＭの好ましい濃度のヒスチジン緩衝溶液であり得、付加的に１５０ｍＭの好ましい濃度のＮａＣｌまたはトリス緩衝食塩水（好ましくは３３ｍＭの濃度）を含む。
【００９３】
好ましい実施形態では、フィブリノゲンおよびトロンビンの両方は、凍結乾燥された形で、互いに別個に保存される。使用の前に、トリスまたはヒスチジン緩衝剤がフィブリノゲンに加えられ、トロンビンは、塩化カルシウム溶液に溶解される。その後、フィブリノゲンおよびトロンビン溶液は、別個の容器／バイアル／注射器本体に配置され、２方向注射器のような２方向接続装置によって混合される。随意であるが、容器／バイアル／注射器本体は、注射器本体の壁に対して垂直な調節可能な仕切によって分けられる２つのチャンバを有する２部構成装置である。チャンバの一方が凍結乾燥されたフィブリノゲンまたはトロンビンを含み、他方のチャンバが適切な緩衝溶液を含む。プランジャーが押し下げられると、仕切は移動し、緩衝剤をフィブリノゲンチャンバの中に放出し、これによりフィブリノゲンを溶解させる。フィブリノゲンおよびトロンビンの両方が溶解されると、２部構成装置注射器の本体の両方が２方向接続装置に取り付けられ、その中身が当該接続装置に取り付けられる注射針を通じて押し出すことにより混合される。随意であるが、接続装置は、当該中身の混合を向上させるよう静的ミキサーを含む。
【００９４】
別の実施形態では、容器（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）はさらに副甲状腺ホルモンを含んでもよい。好ましくは、副甲状腺ホルモンはＴＧｐｌＰＴＨ１−３４であり、さらにより好ましくは、ＰＴＨは第１の容器（ａ）の中に含まれる。
【００９５】
別の実施形態では、キットは、乾燥粉末状のヨウ化造影剤または溶液中のヨウ化造影剤を含む第４の容器を含んでもよい。
【００９６】
ＩＶ．注入可能な組成物を作製する方法
注入可能な組織増強組成物は、まず成分（ｃ）を成分（ａ）または成分（ｂ）のいずれかと混合し、その後、成分（ｃ）および（ａ）の混合物を成分（ｂ）と混合するか、または成分（ｃ）および（ｂ）の混合物を成分（ａ）と混合することによって調製される。代替的には、注入可能な組織組成物は、成分（ｃ）を成分（ａ）および（ｂ）の混合物と混合することによって調製され得る。均質な混合物が形成されるのが好ましい。たとえば、フィブリノゲン溶液が１０ｃｃのルアーロック注射器に移され得、トロンビン溶液が１０ｃｃのルアーロック注射器に移され得、粉末状のストロンチウム塩が１０ｃｃのルアーロック注射器に移され得る。
【００９７】
フィブリノゲン溶液は、たとえば、付加的に１５０ｍＭの好ましい濃度のＮａＣｌまたはトリス緩衝食塩水（好ましくは濃度が３３ｍＭ）を含む５０ｍＭの好ましい濃度のヒスチジン緩衝溶液のような適切な緩衝剤で調製され得る。溶液は、均質化され、泡を取除くよう遠心分離され、たとえば０．２２μｍフィルタによるフィルタリングにより滅菌される。
【００９８】
トロンビン溶液は、たとえば再蒸留水中に約４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝剤のようなトロンビン希釈緩衝剤で調製される。溶液は、均質化され、泡を取除くよう遠心分離され、たとえば０．２２μｍフィルタによるフィルタリングにより滅菌される。
【００９９】
ストロンチウム塩は、照射または粉末の滅菌のための他の任意の好適な方法によって滅菌される。
【０１００】
随意であるが、第１の成分はさらに、副甲状腺ホルモンまたは生物学的に機能する断片、好ましくはＴＧｐｌＰＴＨ１−３４を含んでもよい。
【０１０１】
ヨウ化造影剤は、必要とされる場合、成分（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）の中、または別個に格納され得る。好ましくは、ヨウ化造影剤は、溶液中にある場合は、トロンビン成分（ｂ）のなかに格納される。ヨウ化造影剤は、粉末状の場合、ストロンチウム塩成分（ｃ）とともに格納されるか、または代替的には、１０ｃｃのルアーロック注射器の中に移される。ヨウ化造影剤は、別個に格納される場合、凍結乾燥（典型的には−５８℃および０．０３ｍｂａｒの条件で約１日）によって滅菌され、その後実質的に均質な固体粉末状に到達するまで粉砕される。
【０１０２】
フィブリノゲンと、トロンビンと、ストロンチウム塩と、随意であるがヨウ化造影剤とを含む注射器同士がルアーロックアダプタを通じて接続され、それらの中身は、注射器から注射器へと完全に中身を移すことにより均質化される。次いで、その混合物が組織に注入され得る。
【０１０３】
この場合、フィブリノゲンおよびトロンビン溶液が混合され、空になった注射器が取除かれ、ストロンチウム塩を含む注射器がルアーロックアダプタを介してフィブリノゲン／トロンビン混合物に接続され、注射器から注射器へと完全にその中身を移すことにより均質化された後、ストロンチウム塩成分はフィブリノゲンおよびトロンビンの混合物に対して混ぜられる。典型的には、液体状のフィブリノゲン／トロンビン混合物がストロンチウム塩の中に移される（その逆ではない）。これにより、粉末が注射器に詰まるのを防止する。一般的に、当該材料は、ほぼ少なくとも１分間は液体状のままであり、この時間中に、欠損部に注入され得るか、または代替的には予め形成されたゲルとして数分後に送達され得る。
【０１０４】
注入可能な組成物の調整は、約１８から約３７℃の範囲、たとえば２５℃といった任意の好適な温度で行なわれ得る。
【０１０５】
一実施形態では、組織増強、特に硬組織増強のための方法は、
ａ）フィブリノゲンを含む第１の成分を与えるステップと、
ｂ）ステップａ）の第１の前駆成分と組合わされると３次元のマトリックスを形成することができるトロンビンを含む第２の成分を与えるステップと、
ｃ）ストロンチウム塩を含む第３の成分を与えるステップと、
ｄ）第２および第３の成分を混合するステップと、
ｅ）第１の成分をステップｄ）の混合物と混合して、注入可能な組成物を形成するステップと、
ｆ）増強を必要とする組織に注入可能な組成物を注入して、３次元のマトリックスを形成するステップとを含む。
【０１０６】
さらなる実施形態では、ステップｆ）の組織は骨梁硬組織である。
Ｖ．注入可能な組成物の利用
本願明細書において記載される注入可能な組成物は、必要とされる部位に注入され得、その後、当該組成物は凝固するか、またはフィブリンマトリックスを形成する。当該組成物は、組織、特に硬組織の破損または断裂を低減、治療、または防止するよう用いられ得る。組成物は、椎体形成術、椎骨形成術、骨修復、椎間板修復、腱修復、靱帯修復、または軟骨修復において用いられ得る。一般的に、当該組成物は、組織における空間、たとえば骨梁骨の中に注入される。組織の多孔領域に注入されると、組成物は、組織を強化する凝固塊またはマトリックスを形成する。
【０１０７】
一実施形態は、開示される組成物を組織の多孔部位に注入するとともに、当該組成物がゲル、凝固塊、または架橋マトリックスを形成するのを可能にすることにより組織の病気を治療または防止するための方法を提供する。代表的な硬組織の病気は、骨、歯、軟骨、椎間板、脊椎、腱、靭帯の病気を含み、骨粗鬆症を含むが、これに限定されない。
【０１０８】
当該組成物は、硬組織に注入することにより硬組織の破損の危険性を防止または低減する予防薬として用いられ得る。
【０１０９】
当該組成物は、まず組織を強化し、その後、小および／または大分子、ペプチド、またはタンパク質といった活性物質の分解および放出により組織の再生効果を与える。好ましい実施の形態では、ＰＴＨ、好ましくはＰＴＨ１−３４が組成物に含まれる。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：時間の経過におけるさまざまなフィブリン組成物の粘性
材料
フィブリンシーラント溶液：８０ｍｇ／ｍｌの濃度のフィブリノゲンシーラント溶液。
【０１１１】
トロンビン  ５１０  ＩＵ／ｍｌ：溶液中、５１０ＩＵ／ｍｌのトロンビン。
トロンビン緩衝剤：Ｈ２Ｏ中、４０ＭｍのＣａＣｌ２。
【０１１２】
イオジキサノール：５−（アセチル−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ）−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−３−ジヒドロキシプロピル）−２，４，６−トリヨード−ベンゼン−１，３−ジカルボキサミド。
【０１１３】
イオヘキソール：１，３−ベンゼン−ジカルボキサミド，５−［アセチル（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ］−Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３ジヒドロキシプロピル）−２，４，６−トリヨード。
【０１１４】
イオパミドール：（Ｓ）−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−ジヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル］−５−［（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）アミノ］−２，４，６，−トリヨード−１，３−ベンゼンジカルボキサミド。
【０１１５】
リン酸三カルシウム：１０ミクロンの球形（Biotal）。
３９ＩＵ／ｍｌのトロンビン溶液がトロンビン希釈緩衝剤（４０Ｍｍの再蒸留水によるＣａＣｌ２溶液）で調製される。溶液は、均質化され、泡を取除くよう遠心分離され、０．２２μｍフィルタによるフィルタリングにより滅菌される。造影剤は、凍結乾燥（典型的には、−５８℃および０．０３ｍｂａｒの条件で約１日）により滅菌され、次いで実質的に均質な固体粉末状に到達するまで粉砕される。
【０１１６】
滅菌したフィブリノゲン（ａ）（８０ｍｇ／ｍｌ）は、２．５：１の体積／体積比でトロンビン（ｂ）と混合される。この混合は、体積（ａ）＋（ｂ）が約５７ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンと約１１ＩＵ／ｍｌのトロンビンとを含むように行なわれる。８０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン溶液２．５ｃｃが１０ｃｃのルアーロック注射器に移される。３９ＩＵ／ｍｌのトロンビン溶液１ｃｃが１０ｃｃのルアーロック注射器に移される。イオパミドール粉末１．４ｇが、１０ｃｃのルアーロック注射器に入れられる（フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌの粉末）。
【０１１７】
フィブリノゲンおよびトロンビンを含む注射器がルアーロックアダプタを介して接続され、それらの中身は、注射器から注射器へ完全に移されることにより均質化される。
【０１１８】
このフィブリノゲン／トロンビン混合物を含む注射器と造影剤の粉末を含む注射器とがルアーロックアダプタを介して接続され、それらの中身は、注射器から注射器へ完全に移されることにより均質化される。取扱い易さのために、まず、液体状のフィブリノゲン／トロンビン混合物が造影剤の粉末の中に移される（その逆ではない）。この材料は、ほぼ１分間、液体状のままであり、この時間の間、欠損部の中に注入され得るか、または代替的には予め形成されたゲルとして数分後に送達され得る。
【０１１９】
以下の組成物が調製される。すなわち、（Ｆ１）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末、フィブリンに対して０．１ｇ／ｍｌの１０ミクロンのリン酸三カルシウム粉末、（Ｆ２）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末、（Ｆ３）フィブリンに対してフィブリノゲン４０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドール粉末、（Ｆ４）フィブリンに対してフィブリノゲン５７ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオヘキソール粉末、（Ｆ５）フィブリンに対してフィブリノゲン４０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、トロンビン注射器中の４００ｍｇのイオパミドールの溶液、（Ｆ６）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、およびフィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオパミドールの溶液、（Ｆ７）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン４ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビン希釈緩衝剤による溶液、混合の前にはトロンビンと別個にされる）、および１５ｍｇ／ｍｌの４つの末端にヒドロキシ基が存在するＰＥＧ、分子量＝１００００Ｄａである。
【０１２０】
異なる造影剤およびフィブリノゲン濃度を有するそれぞれの凝固塊の経時ごとの粘性を図１ａに示す。詳細には、このグラフは、液体状と比べて、粉末状のヨウ素の混合によって、より高い粘性が与えられ（組成物Ｆ３  ｖｓ  Ｆ５）、フィブリノゲン濃度を増加させることによってより高い粘性が与えられ（Ｆ３  ｖｓ  Ｆ２）、イオヘキソールと比べて、イオパミドールによってより高い粘性が与えられ（Ｆ２  ｖｓ  Ｆ４）、カルシウム塩（１０ミクロンのリン酸三カルシウムの粉末）を含む調合物と、含まない調合物との２つの調合物によって同様の粘性が与えられることを示す。
【０１２１】
図１ｂに示されるように、ＰＥＧを加えることにより、ヨウ化造影剤を含むフィブリン凝固塊の粘性が向上する。このグラフは、ヨウ化造影剤のみ（ＰＥＧなし）を含む組成物と比較すると、ヨウ化造影剤とＰＥＧとの混合によってより高い粘性が与えられることが示される。
【０１２２】
実施例２：ＰＥＧを含む凝固塊の調製
材料
フィブリンシーラント溶液：緩衝溶液による８４ｍｇ／ｍｌ濃度のフィブリノゲンシーラント溶液
トロンビン５５６ＩＵ／ｍｌ：溶液中、５５６ＩＵ／ｍｌのトロンビン。
【０１２３】
トロンビン緩衝剤：Ｈ２Ｏ中の４０ＭｍのＣａＣｌ２。
ＰＥＧ：４つの末端にヒドロキシ基が存在、分子量＝１００００Ｄａ
前駆成分の調製
フィブリノゲンを滅菌した。
【０１２４】
トロンビンおよびヨウ化造影剤の溶液がトロンビン希釈緩衝剤（４０Ｍｍの再蒸留水によるＣａＣｌ２溶液）で調製された。適用可能な場合、ＰＥＧも当該溶液に溶解された。溶液は、均質化され、泡を取除くよう遠心分離され、０．２２μｍフィルタによるフィルタリングにより滅菌された。
【０１２５】
充填剤はガンマまたはベータ照射により滅菌された。
成分が、１０ｍｌのルアーロック注射器に充填された。
【０１２６】
注入可能な組成物の形成
６つの注入可能な組成物（それぞれここで「Ｃ１」〜「Ｃ６」と標識付けされた）が調製された。以下に列挙する濃度は、組合されたトロンビンおよびフィブリノゲン溶液（ＰＥＧといった溶解された任意の化合物を含む。粉末状の他の成分が別途加えられる場合、その粉末状の成分は含まない）の１ｍｌあたりの濃度である。
【０１２７】
この実施例で用いられる「ＰＥＧ」は、分子量が１００００Ｄａであり、４つの末端がすべてヒドロキシ基であるＰＥＧである。
【０１２８】
Ｃ１：フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン３７．５ＩＵ／ｍｌ、混合される前はトロンビンとともにされている４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール溶液。ＰＥＧなし。
【０１２９】
キットは、次のように調製された。２ｃｃのフィブリノゲン＋２ｃｃのトロンビン（７５ＩＵ／ｍｌ）
Ｃ２：フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン３．６ＩＵ／ｍｌ、ＰＥＧ１８ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール。
【０１３０】
キットは、次のように調製された。２．５ｃｃのフィブリノゲン＋０．５ｃｃのトロンビン（２０ＩＵ／ｍｌ）＋０．ｌｇのＰＥＧ、および２ｃｃのトロンビン希釈緩衝剤に溶解される２ｇのイオジキサノール。
【０１３１】
Ｃ３：フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、混合される前はトロンビンとは別にされている２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール溶液、１５ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ。
【０１３２】
キットは、次のように調製された。２ｃｃのフィブリノゲン＋０．５ｃｃのトロンビン（３２ＩＵ／ｍｌ）＋１．５ｃｃ［６６６ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール＋０．０６ｇのＰＥＧ］
Ｃ４：フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、混合される前はトロンビンとは別にされている２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール溶液、１１．２ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ。
【０１３３】
キットは、次のように調製された。２ｃｃのフィブリノゲン＋０．５ｃｃのトロンビン（３２ＩＵ／ｍｌ）＋１．５ｃｃの［６６６ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール＋０．０４５ｇのＰＥＧ］
Ｃ５：フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、混合の前はトロンビンとは別にされている２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール溶液、１８．７ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ。
【０１３４】
キットは、次のように調製された。２ｃｃのフィブリノゲン＋０．５ｃｃのトロンビン（３２ＩＵ／ｍｌ）＋１．５ｃｃ［６６６ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール＋０．０７５ｇのＰＥＧ］
Ｃ６：フィブリノゲン３２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、混合される前はトロンビンとは別にされている２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール溶液、１７ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ。
【０１３５】
キットは、次のように調製された。１ｃｃのフィブリノゲン＋０．５ｃｃのトロンビン（２４ＩＵ／ｍｌ）＋１．１３ｃｃの［６６６ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール＋０．０４５ｇの４つの末端を有するＰＥＧ１０Ｋ］
ＰＥＧなしの調合物（たとえばＣ１）は、２つの指の間で押さえられると容易に壊れる非常に脆いマトリックスを作り出した。
【０１３６】
ＰＥＧを含む調合物は、壊れるのにより高い圧縮強さの適用が必要となるとともに、張力において（指で引張る）Ｃ１よりもはるかに高い抵抗を示したより強靭なマトリックスを作り出した。これらの結果はさらに、ＰＥＧの在る組成物およびＰＥＧの無い組成物の繊維構造およびアモルファス組織の間に差があることをそれぞれ示す。
【０１３７】
分子量が１００００Ｄａの４つの末端がヒドロキシ基であるＰＥＧの場合に得られた結果と同様の結果が、組成物Ｃ１からＣ６において用いられるのと同様の濃度である以下のＰＥＧを用いても得られた。すなわち、末端がヒドロキシ基である線状のＰＥＧ、分子量＝１０００Ｄａ、分子量＝６０００Ｄａ、分子量＝１００００Ｄａ、分子量＝２００００Ｄａである。
【０１３８】
凝固塊の混濁
ＰＥＧが存在する状態での繊維構造の形成が、凝固の間、組成物の目視検査によって確認された。
【０１３９】
ＰＥＧ（Ｃ１）が無い調合物は透明なままである一方、ＰＥＧを含む調合物は不透明になり、これにより繊維構造の形成が示される。
【０１４０】
ＰＥＧの濃度が高くなればなるほど、凝固塊の混濁が高くなる。
ＰＥＧの濃度が高い場合、たとえば調合物Ｃ１からＣ６の各々について濃度が２倍より高い場合、混合処置が完了した後すぐに、繊維の凝集物が凝固塊に形成され始める。このような凝集物は最後にはともに凝固するが、フィブリン凝固塊と残余の緩衝剤との間で相分離が観察された。このような調合物は、相分離を示さない調合物と比べて、硬組織増強には適さない。
【０１４１】
ＰＥＧの最適濃度は、凝固塊における造影剤の量に依存する。
分子量が１００００Ｄａである４つの末端がヒドロキシ基であるＰＥＧを用いて得られる結果と同様の結果が、組成物Ｃ１からＣ６において用いられたのと同様の濃度の以下のＰＥＧを用いても得られた。すなわち、末端がヒドロキシ基である、線状のＰＥＧ、分子量＝１０００Ｄａ、分子量＝６０００Ｄａ、分子量＝１００００Ｄａ、分子量＝２００００Ｄａである。
【０１４２】
実施例３：機械的特性
押出しエネルギ
ヨウ化造影剤を含む凝固塊が実施例１に記載されたように調製される。混合処置の完了のすぐ後、組成物をステンレス鋼シリンダにてまだ液状のままで、４ｃｃ注入する。当該シリンダには直径が２ｍｍの穴が４つ、底部から６ｍｍのところに作られる（図２参照）。ステンレス鋼ピストンが、次いでシリンダの中に配置され、ＭＴＳマシン（変位における制御）を用いて圧縮され、これにより組成物を穴から押出す。圧縮荷重をテスト中ずっと測定した。荷重変位グラフをこれらの測定に基づき作製した。組成物の押出しに必要とされるエネルギは、荷重／変位曲線の下の領域として計算された。
【０１４３】
このモデルは、シリンダの穴が、血管を模倣して、漏出に好適な通路となる脊椎への体内注射を示す。詳細には、このモデルは、テスト対象の材料に関連付けられる漏出の潜在的危険性についての考えを提供する。押出しエネルギが高ければ高いほど、脊椎における体内漏出の危険性が低くなる。
【０１４４】
表３は、Ｆｆ、Ｆｇ、およびＦｈによって示されるように、液状ではなく粉末状の造影剤を加える利点と、フィブリノゲンの濃度を増加させる利点とを示す。さらに、一般的に、たとえばＦｂおよびＦｄによって示される（異なる時点の同じ組成物）ように、押出しエネルギは時間の経過とともに増加する。さらに、押出しエネルギは、たとえばＦｇおよびＦｅによって示されるように、高いトロンビン濃度を有する調合物についてより高くなる。一般的に、無機塩類造影剤が存在すれば、Ｆｌ、Ｆｍ、およびＦｎに示されるように押出しエネルギが大幅に増加する。ＰＥＧ（Ｆｏ）を含む組成物は、当該組成物を押出すのに、ＰＥＧが存在しない状態で形成された組成物よりも大幅に多いエネルギ量を必要とした。したがって、ＰＥＧを含む組成物は、ＰＥＧのない組成物よりも、脊椎における体内漏出の危険が低いと考えられる。
【０１４５】
【表３】
2011511651.tif 000004
【０１４６】
粉末状で混合されたヨウ化造影剤を用いるとともにフィブリノゲン濃度を増加して得られた凝固塊は、液状のヨウ化造影剤を用いて得られた凝固塊よりも視覚的により不透明になる。これは、最初の場合において、造影剤は、粉末状で混合されると、フィブリンの凝固塊にあまり影響を与えないということを示している。さらに、高濃度のフィブリノゲンを用いて得られる凝固塊は、低濃度のフィブリノゲンを用いて得られた凝固塊よりも張力および断裂においてはるかに高い抵抗を有する。
【０１４７】
より高濃度のフィブリノゲンを用いるがヨウ素を用いないで得られる凝固塊は、張力において良好な抵抗および弾性を示す。そのため、壊れることなく２本の手で強く引張られ得るとともに、結ぶこともできる。
【０１４８】
圧縮剛性
ヨウ化造影剤を有するまたは有さない、さまざまな濃度のフィブリノゲンを含む凝固塊が、実施例１に記載したように、８２または８４ｍｇ／ｍｌの初期フィブリノゲン濃度および５１８ＩＵ／ｍｌの初期トロンビン濃度から開始するよう調製される。炭酸ストロンチウム（ＣＡＳ番号１６３３−０５−２、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を含む調合物の場合、その後者の成分は、粉末状で与えられ、ヨウ素粉末の準備のために続く処置と同様に別個の注射器に充填される。１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、４）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ、５）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後に混合物に加えられる）、６）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解された１５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール、粉末状の２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム、７）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解された４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール、粉末状の２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウム。
【０１４９】
凝固塊が、１２ｍｍの直径および１２ｍｍの高さの円筒試験片に混合成形された後すぐに、同等の体積で作製される。凝固塊は、抽出の前に２０分間、型の中に維持される。その後、一定の歪み速度での一軸圧縮荷重が以下の条件で適用される。
【０１５０】
−予荷重：０．０２５Ｎ
−予荷重への到達とテスト開始の間隔：５秒
−歪み速度：５ｍｍ／分。
【０１５１】
−テスト終了：７５％の公称歪み
圧縮試験の完了時には、荷重は解放され、以下のパラメータが記録される。
【０１５２】
−初期弾性係数（１および２％の歪みの間の応力歪み曲線の線形補間による）
−５０％の歪みまでの変形エネルギ
同じ量のトロンビンを有するが、フィブリノゲンの濃度が増加する（番号１、２、および３）調合物同士の間の比較が、図４および図５に示される。図４および図５では、より高濃度のフィブリノゲンがより高い弾性係数（図４ａ）および変形エネルギ（図５ａ）につながることが示される。すべての調合物１）から７）についてのデータが図４ｂおよび図５ｂにおいてそれぞれ報告されている。図４ｂおよび図５ｂにおいて、無機塩類造影剤を含むことで、一般的に弾性係数および変形エネルギの増加が生じることが示される。
【０１５３】
実施例４：圧力下での注入についての好適さ
ヨウ化造影剤を有するおよび有さない、さまざまな濃度のフィブリノゲンを含む凝固塊が、８２または８４ｍｇ／ｍｌの初期フィブリノゲン濃度および５１８ＩＵ／ｍｌの初期トロンビン濃度から開始するよう実施例１に記載されるように調製される。炭酸ストロンチウム（ＣＡＳ番号１６３３−０５−２、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を含む調合物の場合、その後者の成分は粉末状で存在し、ヨウ素粉末の調製のために続く処置と同様に別個の注射器に充填される。１）フィブリンに対してフィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、２）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、３）フィブリンに対してフィブリノゲン７２ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、４）フィブリンに対してフィブリノゲン８４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、５）フィブリンに対してフィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン７ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ、６）フィブリンに対してフィブリノゲン５６ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、粉末状の４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム（フィブリノゲンおよびトロンビン成分が混合された後で混合物に加えられる）、７）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール１５０ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム、８）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、トロンビン溶液に事前に溶解されるイオジキサノール４００ｍｇ／ｍｌ、粉末状の２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウム。
【０１５４】
凝固塊の押出しまたは圧縮の後、放出される可能性のある緩衝剤を検出するよう２つのタイプのテストが行なわれる。
【０１５５】
椎体形成銃による凝固塊の押出
調合物１から６の凝固塊を、同等の体積で調製し、Ｏｐｔｉｍｅｄ  Ｃｅｍｅｎｔｏ−ＲＥ椎体形成注入銃を用いることにより１０Ｇの１００ｍｍ椎体形成術トロカール（Ｏｐｔｉｍｅｄ）を介して押出す。押出の間にかかる圧力により、緩衝剤が凝固塊から分離する。この緩衝剤は集められ、重量が記録される。押出された凝固塊はプラスチック容器に集められ、次いで３７℃で５時間、保存される。図６ａに示されるように、フィブリノゲンが高濃度であれば、押出の後の緩衝剤の分離が少なくなり、これにより凝固塊の元々の組成物を良好に維持するとともに、圧力下での注入により好適となる。これは、３７℃で５時間の温置の後、高いフィブリノゲン濃度を含む凝固塊について観察された低い重量減少によって確認される（図６ｂ、重量減少；図６ｃ、％重量減少）。
【０１５６】
機械的テストマシンを用いた凝固塊の圧縮
調合物１から８の凝固塊が、直径が１２ｍｍおよび高さが１２ｍｍ円筒試験片に混合成形された後すぐに、同等の体積で調製される。凝固塊は、抽出の前に２０分間、型の中に維持される。その後、試験片の重量が集められ、一定の歪み速度での一軸圧縮荷重が以下の条件で加えられる。
【０１５７】
−予荷重：０．０２５Ｎ
−予荷重への到達とテスト開始の間隔：５秒
−歪み速度：５ｍｍ／分。
【０１５８】
−テスト終了：７５％の公称歪み
圧縮試験の完了時に、荷重は解放され、歪んだ試験片が新たに計量される。緩衝剤の放出は、テストの前後の重量の差から計算される。
【０１５９】
トロンビンの量が同じであるがフィブリノゲン濃度が異なる調合物（調合物番号１、２、３、および４）同士の間の比較が図７ａに示される。図７ａにおいて、フィブリノゲンが高濃度（≧６０ｍｇ／ｍｌ）であれば、緩衝剤の放出が劇的に低減することに繋がるということが示される。すべての調合物１）から８）についてのデータが図７ｂにおいて報告される。図７ｂでは、無機塩類の造影剤を含むことでも緩衝剤放出の低減に繋がり得るということが示される。
【０１６０】
実施例５：繊維メッシュ構造
ヨウ化造影剤を含む凝固塊が実施例１に記載されるように調製される。炭酸ストロンチウムを含む凝固塊が実施例３に記載されるように調製される。３７℃で１時間温置した後、サンプルが走査電子顕微鏡分析（ＳＥＭ）のために調製される。
【０１６１】
ヨウ化造影剤が粉末状で加えられえた凝固塊は、造影剤が液状で加えられた凝固塊よりもより大きい気孔を示すとともに、通常のフィブリン凝固塊（造影剤なし）で得られたものにより類似している。ヨウ化造影剤が炭酸ストロンチウムに置換えられた凝固塊は、通常のフィブリン凝固塊に類似した開口気孔構造を示す。
【０１６２】
トロンビンユニット（thrombin unit）の濃度も重要な役割を果たしている。すなわち、濃度が高ければ高いほど、構造が強固になる。フィブリノゲンの濃度を増加させることでさらに、より小さな孔が得られる。一般的に、小さな孔は、細胞浸潤を低くし、凝固塊と外部環境との間で媒質の交換を低くし、分解をより遅くし、硬組織形成の効果を潜在的に低くし得る。したがって、孔のサイズと凝固塊の強度との間で適切な妥協点を見つけることが重要である。
【０１６３】
凝固塊の構造は、さらに生理活性物質が物理的に組成物に取込まれる際に、放出テストによって示される。以下の組成物が比較された。（ＦＡ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン２ＩＵ／ｍｌ、（ＦＢ）フィブリンに対してフィブリノゲン５４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン４ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオジキサノール溶液）、（ＦＣ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン３７．５ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビン成分とともに存在するイオジキサノール溶液）、（ＦＤ）フィブリンに対してフィブリノゲン４５ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン３７．５ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビン成分とともに存在するイオジキサノール溶液）、（ＦＥ）フィブリンに対してフィブリノゲン４４ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３０３ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオジキサノール溶液）、（ＦＦ）フィブリンに対してフィブリノゲン４８ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン４ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して３００ｍｇ／ｍｌのイオヘキソール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられるイオヘキソール溶液）、および（ＦＧ）フィブリンに対してフィブリノゲン５３ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビン１０ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌの粉末状のイオパミドール。図３は、生理活性物質のほぼ１００％が４８時間以内に通常のフィブリン凝固塊（２ＩＵ／ｍｌトロンビン、ヨウ素なし）から放出されることを示す。造影剤がトロンビン成分とともに液状で存在する場合、４８時間で検出される生理活性物質の量は約５０％である。造影剤が溶液中に存在するがフィブリノゲンおよびトロンビンとは別個に保存され、フィブリノゲンおよびトロンビンが混合された後で初めて組成物に加えられる場合、４８時間での放出は約６５％である。造影剤が粉末状で混合される場合、検出される生理活性物質の量は９０％に近く、放出特性は、通常のフィブリン凝固塊のものと同様である。これは、ヨウ化造影剤を粉末状で混合すると、液状で混合する場合よりもフィブリン構造をはるかに変化させないということを示している。
【０１６４】
凝固プロセスが、液体状のヨウ化造影剤と比べて、粉末状のヨウ化造影剤の存在にあまり影響されないという事実は、凝固時間の分析によってサポートされる。トロンビンユニットの量が同じ場合、ヨウ素が液状であるほうが、凝固するのに長くかかる。代替的には、トロンビンのユニットは、液状のヨウ素と比較して、粉末状のヨウ素を含む組成物の場合に劇的に低くなり得、これにより同等の凝固時間が得られる（表４参照）。
【０１６５】
【表４】
2011511651.tif 000005
【０１６６】
実施例６：注入可能な硬組織増強組成物の適用例
骨粗鬆症および年齢に関連する硬組織の鉱物密度の損失はしばしば脊椎の骨折につながる。本発明に従った注入可能な硬組織増強組成物をこれらの部位に注入することは、このような損傷の治療を補助するとともに、損傷を防止するよう予防的にも用いられ得る。蛍光透視法（Ｃアーム）により、椎体形成術トロカール（直径：３．２ｍｍ（１０Ｇ）、長さ１００ｍｍ）が経椎弓根的（transpendicular）な方策を用いて人間の死体の脊椎に配置される。
【０１６７】
フィブリンに対してフィブリノゲンを５３ｍｇ／ｍｌ、フィブリンに対してトロンビンを１１ＩＵ／ｍｌ、フィブリンに対して４００ｍｇ／ｍｌの粉末状のイオパミドールを含む組成物が実施例１に記載されるように調製される。混合処置が完了すると、当該液状材料が椎体形成術銃（Ｏｐｔｉｍｅｄ  Ｃｅｍｅｎｔｏ−ＲＥ）中に移される。この銃はトロカールに直接的に接続され（チューブが間に存在しない）、当該材料を銃から搾り出すことによりこの材料が脊椎に適用される。この注入は、混合処置が完了した後、３４分で行なわれた。約６ｃｃの材料がＴ９にて漏出なしに注入された（データは示さず）。
【０１６８】
蛍光透視法（Ｃアーム）により、２つの椎体形成術トロカール（直径：３．２ｍｍ（１０Ｇ）、長さ１００ｍｍ）が、経椎弓根的方策を用いて豚の死体の脊椎に配置される。４１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２ＩＵ／ｍｌのトロンビン、トロンビン注射器内の溶液中の１５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール、２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウムを含む組成物が実施例１および実施例３に記載されるように調製される。まず、フィブリノゲン成分がトロンビン成分を含むヨウ素と混合される。次いで、この混合物が炭酸ストロンチウムと均質化される。この混合処置が完了すると、当該液状材料が椎体形成術銃（Ｏｐｔｉｍｅｄ  Ｃｅｍｅｎｔｏ−ＲＥ）の中に移される。混合処置が完了して１５分後、当該材料がＴ１１に注入された。当該材料は、豚の脊椎への注入に好適な特性を有することを示した。
【０１６９】
実施例７：生理活性物質の放出
以下に列挙する成分を含む組成物を実施例１に記載される方法に従って調製した。
【０１７０】
生理活性物質（各組成物について同じ濃度）を含む以下の組成物（「Ｆａ」〜「Ｆｄ」と符号付けされる）がテストされた（ＥＬＩＳＡ）。
【０１７１】
（Ｆａ）４２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（通常のフィブリン凝固塊、造影剤なし、ＰＥＧなし）
（Ｆｂ）４２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２ＩＵ／ｍｌのトロンビン、４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられる溶液）、および２０ｍｇ／ｍｌの４つの末端がヒドロキシ基であるＰＥＧ、分子量＝１００００Ｄａ
（Ｆｃ）４２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２ＩＵ／ｍｌのトロンビン、２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別個に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられる溶液）、および１２．５ｍｇ／ｍｌの４つの末端がヒドロキシ基であるＰＥＧ、分子量＝１００００
（Ｆｄ）４２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２ＩＵ／ｍｌのトロンビン、２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（フィブリノゲンおよびトロンビンと別個に保存され、両者が混ぜ合わされるとフィブリノゲン／トロンビン混合物に加えられる溶液）、１２．５ｍｇ／ｍｌの４つの末端がヒドロキシ基であるＰＥＧ、分子量＝１００００、および１５％ｗ／ｖのＳｒＣＯ３。
【０１７２】
２５０ｍｇ／ｍｌのイオジキサノールと組合わせて１５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウムを加えることで、４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノールを含む組成物と同様の造影が与えられる。
【０１７３】
時間（６０時間）にわたる、以下に列挙する組成物の各々からの生理活性物質の％放出を示す結果が図８ａに与えられる。図８ａに示されるように、ＰＥＧを含む組成物からの生理活性物質の放出は、通常のフィブリン凝固塊（ＰＥＧなし、造影剤なし）の放出と同等であり、同様の凝固構造を示した。
【０１７４】
ＰＥＧを含まない組成物とは別個に、同様の放出テストを行なった。通常のフィブリン凝固塊（Ｆａ）を参考例として再び用いた。以下の組成物（「Ｆａ」〜「Ｆｃ」と符号付けされた）がテストされた。
【０１７５】
（Ｆａ）４５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（Osteogenic Gel）、
（Ｆｂ）４５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、３７．５ＩＵ／ｍｌのトロンビン、および３００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビンとともに存在する溶液）、ならびに
（Ｆｃ）４５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、３７．５ＩＵ／ｍｌのトロンビン、および４００ｍｇ／ｍｌのイオジキサノール（トロンビンとともに存在する溶液）。
【０１７６】
時間（６０時間）にわたる、上で列挙した組成物の各々からの生理活性物質の％放出を示す結果が図８ｂに与えられる。図８ｂに示されるように、溶液中に造影剤しか含まない（ＰＥＧなし）組成物からの生理活性物質の放出は、通常のフィブリン凝固塊（ＰＥＧなし、造影剤なし）放出の約半分であり、造影剤を含む組成物においてよりコンパクトな凝固構造を示した。
【０１７７】
実施例８：羊における注入可能な硬組織増強組成物の生体内研究
羊での椎骨の増強
１０Ｇ椎体形成術トロカール（Optimed）を、椎体形成術において用いられるのと同様の技術を用いて羊の腰椎の椎体に経椎弓根的または横方向に挿入する。椎体形成術銃Ｃｅｍｅｎｔｏ−ＲＥ（Optimed）を用いて、材料が脊椎に注入され、その流れが蛍光透視法により監視される。これらの動物は術後１２週間で犠牲にされ、新しい骨の形成がマイクロＣＴおよび組織学的検査により評価される。
以下の調合物が実施例１に記載されたように調製された。
【０１７８】
Ａ）フィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオパミドール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ。第３腰椎（Ｌ３）に注入。
【０１７９】
Ｂ）フィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ。Ｌ２に注入。
【０１８０】
Ｃ）フィブリノゲン６０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ。Ｌ５に注入。
【０１８１】
Ｄ）フィブリノゲン４２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン８ＩＵ／ｍｌ、イオジキサノール（粉末）４２５ｍｇ／ｍｌ、１０ミクロンの１５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウム、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４  ０．４ｍｇ／ｍｌ。Ｌ４に注入。
【０１８２】
Ｌ１およびＬ５の脊椎は、空のコントロール（empty control）（非処理）として用いられた。
【０１８３】
すべての調合物が、蛍光透視法によって監視される最小限侵襲処置について適切な放射線不透過性を示した。マイクロＣＴによって測定される骨の体積／合計の体積（ＢＶ／ＴＶ）は平均して、同じ治療された脊椎の未治療領域の約３０％と未治療の空のコントロール脊椎（図９）と比較して、材料が注入された脊椎の領域の６３％であった。結果を定性組織学的分析によって確認した。
【０１８４】
羊における大腿骨の顆／脛骨近位端の増強
この検査において、羊の大腿顆および脛骨近位端の骨幹端における無傷の骨の骨梁の間の空間内において新しい骨の合成を促進するさまざまな椎骨の増強材料の調合物の機能が評価された。平均体積が２．７ｍＬの椎骨の増強材料が、羊ごと（ｎ＝６匹の羊（調合物ごと））に４つの部位の各々に注入された。すなわち、生理活性物質ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４を有する椎骨の増強材料を１つの肢上の大腿顆および脛骨に、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）を有さない同じ椎骨の増強材料を反対側の脚上の大腿顆および脛骨近位端に注入した。これにより、平均のＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の量が、骨部位につき０．６２と１．０５ｍｇとの間、および動物につき１．２５と２．０８ｍｇとの間になる（２．７ｍＬの材料の注入を想定した計画された量）。以下の調合物がテストされた。
【０１８５】
１）フィブリノゲン４１ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２０ＩＵ／ｍｌ、１０ミクロンの２５％ｗ／ｖのリン酸三カルシウム、トロンビン注射器内の溶液中のイオジキサノール４００ｍｇ／ｍｌ。生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）有りまたは無し。
【０１８６】
２）フィブリノゲン５９ｍｇ／ｍｌ、トロンビン７ＩＵ／ｍｌ、粉末状のイオジキサノール４５０ｍｇ／ｍｌ、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）有りまたは無し。
【０１８７】
３）フィブリノゲン４１ｍｇ／ｍｌ、トロンビン４ＩＵ／ｍｌ、トロンビン注射器内の溶液中のイオジキサノール１５０ｍｇ／ｍｌ、２５％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）有りまたは。
【０１８８】
４）フィブリノゲン５５ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、炭酸ストロンチウム４０％ｗ／ｖ、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）有りまたは無し。
【０１８９】
５）フィブリノゲン４１ｍｇ／ｍｌ、トロンビン２ＩＵ／ｍｌ、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）有りまたは無し、金の球体５００ミクロン（ほぼ２５球体／ｍｌ）。
【０１９０】
材料の注入のない針の挿入のみからなる偽手術コントロール（sham control）（ｎ＝３匹の羊、合計すると６つの偽手術脛骨および６つの偽手術大腿骨）と、蛍光透視法による可視化のために金の粒子で強化された未変更のフィブリンからなる調合物５）と結果を比較した。
【０１９１】
この処置は、１０Ｇ（３．２ｍｍの直径）の１００ｍｍの長さの針を、その先端部が大腿顆または脛骨近位端の骨梁の部分に到達するように配置することからなる。これは、脛骨および大腿骨の内側および外側の側面での正確な位置決めを可能にするカスタムメイドの照準装置（図１０）の補助によりなされた。これには、所与の方向および予測可能な長さでの穴開け（drilling）を含む。
【０１９２】
次いで、事前に重合化した椎骨の増強材料が、骨の骨梁の間の空間内に分散するように注入された。注入処置の完了後には、針を取除き、セルフタッピンねじを挿入した。このねじは、犠牲処置時に、挿入ポイントの特定と針の方向とのためのマーカとして機能する。動物は、麻酔から回復すると、制限無く動くことが許された。
【０１９３】
蛍光透視画像を、外科手術（横方向の画像）中および外科手術直後（横方向および頭尾方向の画像）に撮像した。放射線写真が６および１２週目に撮られた。生体内の骨の染色を、６週目にカルセイングリーンと、１２週目の犠牲処置の２日前にキシレノールオレンジとを注入することにより行なった。犠牲処置の後、ダイヤモンドでコーティングされたドリルを用いて、脛骨および大腿骨全体にわたって、直径が３２ｍｍの骨の円筒を抜き出した。この円筒は、その軸が針の穴の方向に沿った状態で、針の挿入ポイントに中心がある。この抽出された骨の円筒は次いで、真の高分解能３Ｄ分析の基礎を提供するμＣＴによって分析のために処理された。
【０１９４】
結果
外科手術処置は、良好に忍容された。この治療は、もっとも高いテストされた量である３５μｇ／ｋｇまで、安全であった。体内追跡観察および死後の肉眼による検査により、椎骨の増強材料調合物のいずれについても毒性の兆候が示されなかった。１匹の羊を膣および膀胱の壁における腫瘍の存在により術後６週間で安楽死させなけければならなかったが、これは研究治療には関係ないことである。
【０１９５】
手術の最中および術後直ちに撮像された蛍光透視画像により、椎骨の増強材料調合物のすべてが羊の大腿顆および脛骨近位端の骨梁骨を増強するのに好適であることが証明された。特に、４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウムを含む調合物は、放射線不透過性、漏出の危険性、および取扱いについてもっともよい結果を出した。
【０１９６】
放射線不透過性：すべての椎骨の増強材料調合物は、蛍光透視制御の下、経皮的な骨注入に好適である良好な放射線不透過性を示した。４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウムを含む調合物４が、最良の放射線不透過性を示した（目視検査による定性的評価）。
【０１９７】
漏出：漏出体積の定量は、蛍光透視画像から実質的に推定された。静脈への漏出が１００回の注入のうち３４回観察された（３４％）。そのうち、１６回は０．２ｍＬ未満であり、１１回は０．２と０．４ｍＬとの間であり、７回は０．５と１．５ｍＬの間であった。約０．５ｍＬの漏出による症状の発現が１回だけ（１％）あり、心臓の苦難（徐脈および停止（arrest））があった。しかしながら、この羊は、術後直ちに回復し、さらなる問題なしに追跡調査を終えた。骨髄腔への漏出が１９のケースで起こり（１９％）、皮質骨からの漏出が４つのケースで起こり（４％）、１つのケースでは、漏出のタイプは報告されなかった（１％）。骨髄腔への漏出および皮質骨からの漏出の発生はすべて、症状を引起さないものであり、椎骨の増強材料の機能ではなく骨梁骨内の針の位置決めの不正確さに関連したものであった。最も少ない量の漏出を示した調合物は、最も多い量の粉末状の充填剤（４０％ｗ／ｖの炭酸ストロンチウム）を含み、充填剤を含まない調合物は多量の漏出を示した。一般的に、脛骨および大腿骨への注入は、漏出の数において同様の結果を示した。未変更のフィブリン調合物については、適切な術中の蛍光透視法による監視に好適ではない放射線不透過性により、漏出の発生は検査され得なかった。
【０１９８】
放射線写真：平面放射線写真を術後６週目および１２週目（犠牲）に撮像した。結果は、ＴＣＰ充填剤およびヨウ化造影剤を含む調合物ならびに充填剤およびヨウ化造影剤を含まない調合物は、６週目の時点で既に見えなくなったということを示した。これは、ヨウ素成分が最初の６週でフィブリンマトリックスから拡散したことを示している。ＴＣＰを含む調合物の場合、充填剤が大幅に分解されたのか、またはＴＣＰと骨とのＸ線吸収度が同様であるので充填剤材を識別できなかったのか不明確である。これら２つの調合物と対照的に、高いＸ線吸収性の炭酸ストロンチウム充填剤を含み、金粒子とともに未変更のフィブリンを有する調合物は、６週目および犠牲処置の際でも見ることができ、放射線不透過剤が存在することと、注入された部位から材料が大きく動いていないこととを示す。
【０１９９】
μＣＴ：μＣＴ画像により、所望の骨梁の骨領域における針の一貫した配置および椎骨増強材料の注入について、外科手術の方法の好適さが確認された。μＣＴの２次元画像の目視検査により、ＴＣＰを含み、充填剤を含まない調合物については骨形成が貧弱であるのが示された。ＴＣＰを含む調合物で治療された羊は、注入された材料の周りに再吸収領域を示した。対照的に、より高い骨密度が、炭酸ストロンチウムを含む２つの調合物において識別された。新しい骨の形成および椎骨増強材料の分解は、材料と骨との間の界面から材料の中心に向かって、内側にて起こった。画像は、残余の炭酸ストロンチウムの存在を示した（図１２）。さらに、偽治療された羊は、大幅な新しい骨の形成を示さなかった。
【０２００】
注射針先端部の元々の位置に中心をおく対象の球状容積における骨の体積／合計の体積（ＢＶ／ＴＶ）の計算は、偽手術コントロールと比較して、生理活性物質（ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４）の有無にかかわらず、骨形成についてすべての椎骨増強材料調合物のプラスの効果を示した。特に、炭酸ストロンチウムを含む２つの調合物は、骨形成（図１３および表５）の点において最良の結果を示した。さらに、大腿骨においてよりも脛骨において、ＢＶ／ＴＶ値がより高くなる傾向があった。なお、調合物１）についての値は、分析においてＴＣＰを含むために高く見積もりすぎている可能性がある（ＴＣＰは骨と同様のＸ線吸収度を有する）。
【０２０１】
【表５】
2011511651.tif 000006
【０２０２】
本願明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、別途定義されていなければ、開示された発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本願明細書で引用された文献および引用された材料は、具体的に参照により援用される。
【０２０３】
当業者であるならば、本願明細書で記載された発明の具体的な実施の形態の多くの均等物を、だたの日常の実験を用いて、認識または確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲において包含されるよう意図される。
【図４】
2011511651.tif 000007
【図５】
2011511651.tif 000008
【図６】
2011511651.tif 000009
【図７】
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【図８ａ】
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【図９】
2011511651.tif 000012
【図１１ａ）】
2011511651.tif 000013
【図１１ｂ）】
2011511651.tif 000014
【図１２】
2011511651.tif 000015
【図１】
2011511651.tif 000016
【図２】
2011511651.tif 000017
【図３】
2011511651.tif 000018
【図８ｂ】
2011511651.tif 000019
【図１０】
2011511651.tif 000020
【図１３】
2011511651.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月16日(2010.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも
（ａ）フィブリノゲンを含む第１の成分と、
（ｂ）トロンビンを含む第２の成分と、
（ｃ）炭酸ストロンチウムを含む第３の成分とを
混合することにより得ることができる組成物。
【請求項２】
炭酸ストロンチウムの濃度は、前記第１および第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、０．０５ｇ／ｍｌから０．６０ｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、２５ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度のフィブリノゲンを含み、前記第２の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、１ＩＵ／ｍｌから４０ＩＵ／ｍｌの間の濃度のトロンビンを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、前記第１および第２の成分をカルシウム源の存在下で反応させることにより形成される、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
活性物質、特に硬組織を増強、強化、支持、補修、再生、治療、または充填するのに好適な活性物質をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記活性物質はＰＴＨを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＴＨは、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、ＰＴＨ１−２５、またはＰＴＨ融合ペプチドからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＰＴＨは、第１および第２のドメインを含む融合ペプチドであり、前記第１のドメインはＰＴＨ１−３４を含み、前記第２のドメインは、形成の間にフィブリンマトリクスに共有結合的に架橋可能な基質ドメインを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＰＴＨの濃度は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、０．２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間の範囲である、請求項６から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
ヨウ化造影剤をさらに含む、請求項１から９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヨウ化造影剤は、ディアトリゾエート、イオデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグレート、およびメトリザマイドからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ）フィブリノゲンを含む第１の容器と、
ｂ）トロンビンを含む第２の容器と、
ｃ）炭酸ストロンチウムを含む第３の容器とを含む、キット。
【請求項１３】
炭酸ストロンチウムの濃度は、前記第１および第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、０．０５ｇ／ｍｌから０．６０ｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１に記載のキット。
【請求項１４】
前記第１の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、２５ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度のフィブリノゲンを含み、前記第２の成分は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、１ＩＵ／ｍｌから４０ＩＵ／ｍｌの間の濃度のトロンビンを含む、請求項１２から１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
活性物質、特に硬組織を増強、強化、支持、補修、再生、治療、または充填するのに好適な活性物質をさらに含む、請求項１２から１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
前記活性物質はＰＴＨを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＰＴＨは、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、ＰＴＨ１−２５、またはＰＴＨ融合ペプチドからなる群から選択される、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ＰＴＨは、第１および第２のドメインを含む融合ペプチドであり、前記第１のドメインはＰＴＨ１−３４を含み、前記第２のドメインは、形成の間にフィブリンマトリクスに共有結合的に架橋可能な基質ドメインを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＰＴＨの濃度は、前記第１の成分および前記第２の成分の合計の体積（（ａ）の体積＋（ｂ）の体積）に対して、０．２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間の範囲である、請求項１６から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
ヨウ化造影剤をさらに含む、請求項１２から１９に記載のキット。
【請求項２１】
医薬品として使用するための、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物および／または請求項１２から２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
硬組織増強のために使用するための、請求項２１に記載の組成物またはキット。
【請求項２３】
特に脊椎の骨折を低減または防止する予防治療として、骨折を治療または防止するための請求項２１に記載の組成物またはキット。
【請求項２４】
骨折を局所的に治療、防止、または低減することに使用するための、炭酸ストロンチウム。
【国際調査報告】
2011511651.tif 000022
2011511651.tif 000023
2011511651.tif 000024