(57)【要約】本発明は、歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）の単離された集団、ならびに、これらの細胞を単離する方法および用いる方法を提供する。ＤＰＭＳＣ集団は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４に関して非常に均質である。上記集団は、約２８〜３０時間の平均倍加速度を有する。上記ＤＰＭＳＣは、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、１つ以上に分化する可能性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）の単離された集団であって、前記集団中の前記細胞の少なくとも９０％が、以下のマーカー、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現する、集団。
【請求項２】
前記集団中の前記細胞の少なくとも９５％が、以下のマーカー、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現する、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記細胞集団の約９０〜９９％が、以下のマーカー、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記集団中の前記細胞の０．２５〜１％が、ＣＤ３４およびＣＤ４５を共発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項５】
前記集団の前記細胞が、以下のもの、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｒｅｘ−１のそれぞれのｍＲＮＡを共発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項６】
前記集団が、約２８〜３０時間の平均倍加速度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項７】
前記ＤＰＭＳＣが、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、１つ以上に分化する可能性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項８】
前記ＤＰＭＳＣが、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、少なくとも２つに分化する可能性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項９】
前記ＤＰＭＳＣが、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、３種類すべてに分化する可能性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１０】
前記ＤＰＭＳＣがヒトＤＰＭＳＣである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１１】
ヒト歯髄に由来する細胞の単離された集団であって、前記集団中の前記細胞の少なくとも９０％が、以下のマーカー、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現し、前記集団中の前記細胞の０．２５〜１％が、ＣＤ３４およびＣＤ４５を共発現し、前記細胞が、正常な核型を有し、前記集団の前記細胞が、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統のうち、少なくとも２つの細胞型に分化する可能性を有する、集団。
【請求項１２】
前記細胞が、以下のもの、骨芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞のうち、任意の１つ以上に分化する可能性を有する、請求項１〜３または１１のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１３】
前記ＤＰＭＳＣが、歯器官に由来する、請求項１〜３または１１のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１４】
前記歯器官が、子供由来である、請求項１２に記載の細胞集団。
【請求項１５】
前記歯器官が、成人由来である、請求項１２に記載の細胞集団。
【請求項１６】
分化を誘導するように培養された細胞の単離された集団であって、開始時の集団が請求項１に記載のＤＰＭＳＣであり、上記分化によって、上記ＤＰＭＳＣが、骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、肝臓上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵島細胞、膵臓外分泌細胞、腸上皮細胞、腎上皮細胞、表皮に関連する構造、毛包、歯の周囲にある軟組織、象牙質（歯）、エナメル質（歯）、セメント質（歯）からなる群より選択される分化した細胞になる、細胞の単離された集団。
【請求項１７】
前記集団中の前記細胞のゲノムが、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物の挿入によって、または、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物による前記細胞ゲノムのあるセグメントの置換によって、または、前記細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失もしくは不活性化によって改変されていない、請求項１〜３または１１のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１８】
請求項１に記載のＤＰＭＳＣ集団を得る方法であって、血小板由来増殖因子、インスリン、セレン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、デキサメタゾン、リノール酸、アスコルビン酸からなる群より選択される成長因子を加えた培地で、歯髄源を培養し、請求項１に記載のＤＰＭＳＣ集団を得る工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記ＤＰＭＳＣがヒトＤＰＭＳＣであり、前記歯髄源がヒト由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
粘着細胞および非粘着細胞が、免疫除去、物理的な除去または化学的な除去によって選別されることなく一緒に培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ４５＋のグリコホリンＡを共発現する細胞出発源または単核細胞の細胞培養物を除去しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養器に前記細胞を入れる工程をさらに含み、ここで、前記細胞培養器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
血清を約０．５〜２．２５％の割合で含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
インスリンが、約１０〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で、トランスフェリンが、０より多いが約１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で、セレンが、約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で、リノール酸が、約０〜約１μｇ／ｍの濃度で、デキサメタゾンが、約０．００５〜約０．１５μＭの濃度で、Ｌ−アスコルビン酸が、約１０〜５０ｍｇＦ／Ｌの濃度で、血小板由来増殖因子が、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、上皮増殖因子１が、約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、インスリン様成長因子が、１〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、線維芽細胞増殖因子−ｂ１が、約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
治療援助が必要な個体に治療援助を提供する方法であって、治療を支援するのに有効な量のＤＰＭＳＣを前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の培養方法によって作り出される、ＤＰＭＳＣ集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００８年６月２６日に出願された、イタリア国特許出願ＲＭ２００８Ａ０００３４２に関連し、ならびにこの優先権の利益を主張する。上記イタリア国特許出願の内容は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）を単離し、用いるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
幹細胞から臓器および組織を作製し、次いで移植することは、多くの病状に実行可能な処置法を与えるものであり、これにより、幹細胞は、多くの分野で研究の主要な焦点となっている。移植のための臓器および組織を作製するために幹細胞を用いることは、例をいくつか挙げると、糖尿病、パーキンソン病、肝疾患、心疾患、自己免疫障害に実行可能な治療を与える。しかし、臓器および組織の移植に関連して、少なくとも２つの大きな問題がある。第１に、ドナーとなる臓器および組織が不足している。イタリアでは、レシピエントには、移植に必要とされる臓器の１０％だけしか与えられていない。例えば、Ｎｏｒｄ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｒｅｐｏｒｔ  ２００７を参照。Ｎｏｒｄ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｒｅｐｏｒｔによれば、２００６年に新しい腎臓が必要であった９，０００人のイタリア人のうち、たった約１，２００人しか腎臓を手に入れておらず、２００６年には、肝臓移植の待機リストにある患者のうち、平均で１２％が、適切な臓器入手を待っている間に亡くなっている。第２の大きな問題は、移植した組織と、レシピエントの免疫システムとの潜在的不適合である。提供された臓器または組織が、宿主の免疫システムによって外来のものであると認識されるため、患者は、経済的にも身体的にもきわめて負担の大きい抗拒絶反応薬を与えられなければならない。
【０００４】
異種移植、すなわち、別の種に由来する組織または臓器の移植によって、ヒトの臓器および組織の不足を克服する代替的な可能性を与えることができる。異種移植は、移植計画を向上させるという利点をもたらし、まだ健康な状態で臓器を摘出することができ、移植手術の前に、患者に任意の可能な前処置を受けさせることができる。残念なことに、異種移植は、組織不適合性の問題を克服することができないだけではなく、さらにそれを悪化させる。さらに、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌによれば、損傷を受けたウイルスは、種を隔てる壁を越えてしまうという証拠がある。ブタは、臓器および組織のドナーとして候補になり得るが、２種以上のウイルスが、ブタからヒトへと種を超えて伝染することが示されている。例えば、マレーシアでは、Ｈｅｎｄｒａウイルスが発生し、７０人を超えるヒトに伝染し、死に至らしめた疾病をどうにかして食い止めようと、１００万匹を超えるブタを処分したことが報告された。例えば、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９８：５４９を参照。
【０００５】
したがって、移植のための臓器および組織の有望な供給源は、幹細胞技術の発展の中にある。理論的に、幹細胞は、自己再生性の細胞分裂を行い、無限に、表現型および遺伝子型が同一の娘細胞を生じ、最終的に、少なくとも１つの最終的な細胞型へと分化することができる。患者自身の幹細胞から組織または臓器を作製することによって、または、レシピエントの免疫システムが、細胞を外来のものだと認識しないように異種細胞を遺伝的に改変することによって、感染または組織拒絶に関連するリスクを伴なわずに、異種移植に関連する利点をもたらすように、移植組織を作製することができる。
【０００６】
また、幹細胞は、遺伝子治療の結果を向上させる展望を与える。患者自身の幹細胞を、インビトロで遺伝的に改変し、インビボで再び導入して、望ましい遺伝子産物を産生することができる。これらの遺伝的に改変された幹細胞は、体内の特定部位に移植するための、または全身に適用するための多くの細胞型を形成するように分化誘導される可能性を有する。または、レシピエントの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原を発現するか、またはＭＨＣを発現しないように異種幹細胞を遺伝的に改変し、拒絶に関連するリスクを伴なわずに、ドナーからレシピエントへこれらの細胞を移植することができる。
【０００７】
幹細胞は、広範囲にわたって無限に増殖する可能性を有し、いくつかの細胞系統に分化する増殖可能性を有し、移植に際し組織を再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）させることができる細胞である。典型的な幹細胞は、自己再生能力に制限がなく、多能性の分化可能性を有する胚幹（ＥＳ）細胞である。これらの細胞は、胚盤胞内部の細胞塊に由来するか、または、着床後の胚から得られる始原生殖細胞に由来する場合がある（胚性生殖細胞またはＥＧ細胞）。ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、マウスに由来しており、もっと最近では、非ヒト霊長類およびヒトにも由来する。マウスの胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入されると、ＥＳ細胞は、マウス（動物）のすべての組織に寄与し得る。出生後の動物に移植されると、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、奇形腫を作り、このことも、これらの細胞の多能性を示す。ＥＳ（およびＥＧ）細胞は、ＳＳＥＡ−１抗体およびＳＳＥＡ−４抗体での染色が陽性であることによって同定することができる。
【０００８】
分子レベルで、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、これらの未分化細胞にきわめて特異的な多くの転写因子を発現する。これらの転写因子としては、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇが挙げられる。また、ＬＩＦ−Ｒ、および転写因子Ｓｏｘ−２、Ｒｏｘ−１も発見されているが、後者のＳｏｘ−２とＲｏｘ−１は、ＥＳ細胞ではない細胞でも発現する。Ｏｃｔ−４は、原腸形成前の胚、卵割初期段階の胚、胚盤胞内部の細胞塊の細胞、および胎生期癌（ＥＣ）細胞で発現する転写因子である。インビトロおよび成体動物で細胞が分化誘導されると、Ｏｃｔ−４は、下方制御される。Ｏｃｔ−４は、生殖細胞でのみ見られる。いくつかの研究から、Ｏｃｔ−４はＥＳ細胞の未分化表現型を維持するのに必要であり、胚形成および分化の初期段階を決定するのに重要な役割を果たすことが示されている。Ｏｃｔ−４は、Ｒｏｘ−１と組み合わせると、ジンクフィンガータンパク質Ｒｅｘ−１の転写活性化を引き起こし、ＥＳを未分化状態に維持するのにも必要である。ヒトまたはマウスの始原生殖細胞は、ＬＩＦの存在を必要とする。ＥＳ細胞の別の特徴は、テロメラーゼの存在であり、このテロメラーゼが、これらの細胞に、インビトロにおける無制限の自己再生能力を与える。
【０００９】
幹細胞は、ほとんどの臓器組織で同定されている。最も特性決定されているのは、造血幹細胞である。造血幹細胞は、中胚葉に由来する細胞であり、細胞表面マーカーおよび機能的特徴に基づいて精製されている。骨髄、血液、臍帯血、胎児の肝臓および卵黄嚢から単離された造血幹細胞は、レシピエントの生命のために造血を再開し、複数の造血系統を生み出す前駆細胞である（Ｆｅｉ，Ｒ．ら、特許文献１；ＭｃＧｌａｖｅら、特許文献２；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．ら、特許文献３；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、特許文献４；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、特許文献５；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、特許文献６；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、特許文献７；Ｈｉｌｌ，Ｂ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９６）２４（８）：９３６−９４３を参照）。致死的に放射線を浴びた動物またはヒトに移植した場合、造血幹細胞は、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、リンパの造血細胞プールを再配置させることができる。インビトロで、造血幹細胞は少なくともいくらかの自己再生性の細胞分裂が起こるよう誘導され得、インビボでみられるのと同じ系統へと分化誘導され得る。したがって、この細胞は、幹細胞の基準を満たす。しかし、造血系統の細胞のみを形成するように分化する幹細胞は、他の損傷を受けた組織、例えば、高用量の化学療法剤で損傷を受けた心臓または胚の組織を修復するための細胞供給源をもたらすことはできない。
【００１０】
広範囲に研究されている第２の幹細胞は、神経幹細胞である（Ｇａｇｅ  Ｆ．Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１４３３−１４３８、２０００；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  Ｃ．Ｎ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈ．９：４９９−５１３、１９９９；Ｏｋａｂｅ  Ｓ．ら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９：８９−１０２、１９９６）。神経幹細胞は、最初は、胎児の脳の脳室下帯および嗅球で同定された。最近まで、成体の脳には、もはや幹細胞の可能性を有する細胞は含まれていないと考えられていた。しかし、げっ歯類におけるいくつかの研究、もっと最近では、非ヒト霊長類およびヒトにおけるいくつかの研究から、成体の脳に幹細胞が存在し続けていることが示された。これらの幹細胞は、インビボで増殖し、インビボで、少なくともある種の神経細胞を連続的に再生することができる。エクスビボで培養する場合、神経幹細胞を、増殖するように誘導し得、ならびに異なる種類のニューロンおよびグリア細胞に分化するように誘導し得る。脳に移植すると、神経幹細胞は、生着し（ｅｎｇｒａｆｔ）、神経細胞およびグリア細胞を生み出すことができる。したがって、この細胞は、幹細胞の範囲に含まれる。
【００１１】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、元々、胚性中胚葉に由来し、成体の骨髄から単離され、分化して筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、腱を形成することができる。胚形成中、中胚葉は、肢芽中胚葉、すなわち骨、軟骨、脂肪、骨格筋、場合によれば内皮を生み出す組織へと成長する。また、中胚葉は、内臓中胚葉へと分化し、ここから、心筋、平滑筋、または内皮前駆細胞および造血前駆細胞からなる血島を生じることができる。したがって、初期の中胚葉幹細胞または間葉幹細胞は、多くの種類の細胞および組織の供給源をもたらすことができる。幹細胞と名付けられている第３の組織特異的な細胞は、間葉幹細胞であり、最初に、Ｆｒｉｄｅｎｓｈｔｅｉｎによって記載された（Ｆｒｉｄｅｎｓｈｔｅｉｎ、Ａｒｋｈ．Ｐａｔｏｌ．、４４：３−１１、１９８２）。多くの間葉幹細胞が単離されている（例えば、Ｃａｐｌａｎ，Ａ．ら、特許文献８；Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．ら、特許文献９；Ｃａｐｌａｎ，Ａ．ら、特許文献１０；Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．ら、米国特許第５，７３６，３９６号；Ｃａｐｌａｎ，Ａ．ら、米国特許第５，８３７，５３９号；Ｍａｓｉｎｏｖｓｋｙ，Ｂ．、米国特許第５，８３７，６７０号；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．、米国特許第５，８２７，７４０号；Ｊａｉｓｗａｌ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）６４（２）：２９５−３１２；Ｃａｓｓｉｅｄｅ  Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９６）１１（９）：１２６４−１２７３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｂ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９９８）２３８（１）：２６５−２７２；Ｙｏｏら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｅ．Ａｍ．（１９９８）８０（１２）：１７４５−１７５７；Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４（１２）：４１６４−４１７３；Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９９）１０３（５）：６９７−７０５を参照）。記載されている多くの間葉幹細胞の中で、すべてが、一般的に、間葉由来であると考えられている分化細胞のみを形成するように分化が限定されていることが示されている。今日までに報告されているうちで最も多能性の間葉幹細胞は、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらが単離した細胞であり、ＳＨ２＋  ＳＨ４＋  ＣＤ２９＋  ＣＤ４４＋  ＣＤ７１＋  ＣＤ９０＋  ＣＤ１０６＋  ＣＤ１２０ａ＋ＣＤ１２４＋ＣＤ１４−  ＣＤ３４−ＣＤ４５−の表現型を発現する。この細胞は、間葉由来の多くの細胞型を生成するように分化させることができるが、造血細胞は、増殖させた培養物中では決して同定されないため、間葉系統の細胞に分化する可能性は明らかに制限されていることが、この細胞を単離したチームによって報告されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：１４３−１４７）。
【００１２】
胃腸幹細胞、表皮幹細胞、卵形細胞とも呼ばれる肝幹細胞を含む、他の幹細胞が同定されている（Ｐｏｔｔｅｎ  Ｃ．、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３５３：８２１−３０、１９９８；Ｗａｔｔ  Ｆ．、Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３５３：８３１、１９９７；Ａｌｉｓｏｎ  Ｍ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌ  ２９：６７８−８３、１９９８）。
【００１３】
ＥＳ細胞と比較して、組織特異的な幹細胞は、自己再生能が低く、複数の系統に分化するが、多能性ではない。それに加え、一つには、これらの細胞が非常に豊富に含まれる集団を大量に得ることは困難なため、組織特異的な幹細胞でのテロメラーゼ活性度は、完全には調査されていない。
【００１４】
最近まで、臓器特異的な幹細胞は、その同じ組織の細胞にのみ分化することが可能であると考えられていた。最近の多くの刊行物は、成体の臓器特異的な幹細胞が、異なる組織の細胞へと分化することが可能な場合があることを示唆している。多くの研究で、骨髄移植の際に移植された細胞が、骨格筋へと分化することがあることを示している（Ｆｅｒｒａｒｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：５２８−３０、１９９８；Ｇｕｓｓｏｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：３９０−４、１９９９）。これは、骨髄に存在する間葉細胞の分化可能性としてあり得る範囲内であると考えることができる。Ｊａｃｋｓｏｎは、筋衛星細胞は造血細胞に分化し得、再び、臓側板内の表現型に変化することが可能であることを報告した（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９６：１４４８２−６、１９９９）。他の研究から、ある胚層（例えば、臓側板）に由来する幹細胞が、異なる胚層から胚形成中に誘導されると考えられる組織に分化可能であることが示されている。例えば、骨髄移植を受けたヒトまたは動物で検出された内皮細胞またはそれらの前駆体は、少なくとも一部分は、骨髄ドナーに由来するものである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：４３４−８、１９９９；Ｌｉｎ、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：７１−７、２０００）。したがって、内臓中胚葉、および臓側板ではない胚葉（例えば、ＭＳＣ）に由来する子孫は、注入した骨髄とともに移動する。もっと驚くべきことは、げっ歯類およびヒトの両方において、肝臓上皮細胞および胆管上皮細胞が、ドナーの骨髄に由来していることを示す報告である（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１１６８−１１７０、１９９９；Ｔｈｅｉｓｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３１：２３５−４０、２０００；Ｔｈｅｉｓｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：１１−６、２０００）。同様に、３グループで、神経幹細胞が造血細胞へと分化することが可能であることが示されている。最後に、Ｃｌａｒｋｅらは、胚盤胞に注入された神経幹細胞が、キメラマウスのすべての組織に寄与し得ることを報告した（Ｃｌａｒｋｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１６６０−３、２０００）。
【００１５】
これらの研究の多くは、１個の細胞が、異なる臓器の組織へと分化し得ることを決定的には示していない。多くの研究者は、最初の細胞（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の表現型を同定しなかった。ＷｅｉｓｓｍａｎおよびＧｒｏｍｐｅによる研究は例外であり、彼らは、肝臓を再配置させる細胞が、造血幹細胞中に豊富に含まれるＬｉｎ−ＴｈｙｔＬｏｗ  Ｓｃａ１＋骨髄細胞中に存在していることを示した。同様に、Ｍｕｌｌｉｇａｎのグループは、ＨＳＣを豊富に含む骨髄Ｓｐ細胞が、筋肉および内皮に分化可能であることを示し、Ｊａｃｋｓｏｎらは、筋肉Ｓｐ細胞が、造血再構築に関与していることを示した（Ｇｕｓｓｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：３９０−４、１９９９）。
【００１６】
異種胚幹細胞から作製した組織および臓器の移植は、この細胞を、特定の細胞表面マーカーの発現を阻害するようにさらに遺伝的に修飾するか、または、移植拒絶を防ぐために、化学療法による免疫抑制剤の使用を続けることを必要とする。したがって、胚幹細胞の研究は、移植のための臓器供給が限定されているという問題に対する有望な代替解決法を与えるが、異種細胞または異種組織の移植を維持するための免疫抑制の必要性に関連する問題およびリスクは残っている。大多数の人々に対する治療に対し、免疫適合性の細胞を与えるためには、概算で、２０種類の免疫学的に異なる胚幹細胞株を樹立することが必要である（Ｗａｄｍａｎ，Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９８：５５１）。
【００１７】
自家幹細胞または同種異系幹細胞の供給源として、胚ではなく、成長した個体に由来する細胞を用いることは、移植した胚幹細胞の使用に関連する組織不適合性の問題を克服し、また、胚幹細胞研究に関連する倫理的なジレンマも解決する。したがって、組織移植のために自家幹細胞を使用することに関連する最も大きな欠点は、この細胞の分化可能性が限定的なことである。完全に成長した生物（特に、ヒト）に由来する多くの幹細胞が単離されている。しかしこれらの細胞は、多様性があることが報告されてはいるが、複数の細胞型に分化する可能性が限定的であることが示されている。
【００１８】
したがって、複数の分化可能性を有する幹細胞が、本発明者らおよびそれ以外の人によってすでに単離されていたとしても、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、支質、平滑筋、心筋、造血細胞を含む、異なる系統の広範囲の細胞型へと分化する可能性を有する前駆細胞は、記載されていない。細胞および組織の移植および遺伝子治療によって、予想される治療的前進を与えたい場合、最も大きな分化可能性または最も広範囲にわたる分化可能性を有する幹細胞または前駆細胞が必要である。必要なことは、胚幹細胞に匹敵する成体の細胞である。
【００１９】
胚幹細胞治療の代替法として、成体幹細胞が有望であることが示されている（Ｃａｐｌａｎ、１９９１、２０００、２００３、２００４、２００５；ＣａｐｌａｎおよびＢｒｕｄｅｒ、２００１；ＫｕｅｈｌｅおよびＧｏｏｄｅｌｌ、２００２；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ、２００４）。例えば、マウス骨髄（ｍＭＡＰＣ）に由来する多能性成体前駆細胞は、数種の胚幹（ＥＳ）細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ−４（ＰＯＵ転写因子）、Ｒｅｘ−１（転写因子）およびＳＳＥＡ−１（ステージに特異的な胚抗原）を発現し、１つの細胞を胚盤胞に注入すると、すべての胚細胞系統に寄与することが示された（Ｊｉａｎｇら、２００２）。骨髄は、治療価値が立証されている優れた幹細胞源であるが、骨髄を集めるプロセスは、侵襲的であり、さらに、近年のデータでは、がんの発症に骨髄幹細胞が関与している（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、２００４）。多能性成人幹細胞の有望な供給源のリストを、臍帯血、骨髄、脂肪組織、羊膜幹細胞からなる小さなグループ（Ｊｉａｎｇら、２００２；Ｚｕｋら、２００２；Ｍｉｋｉら、２００５）よりも大きく広げることは、価値が高い。げっ歯類での初期の発見（Ｍａｎｎら、１９９６）に続き、ヒトの剥脱した（ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ）脱落歯の歯髄にある比較的成熟した幹細胞（ＳＨＥＤ）の近年の発見は、潜在的な非侵襲性の幹細胞源をもたらした（Ｍｉｕｒａら、２００３）。ＳＨＥＤは、インビトロで、数種類の間葉幹細胞マーカー（例えば、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ１４６）を発現しつつ、迅速に増え、増殖することが示された。歯髄由来の幹細胞（Ｍｉｕｒａら、２００３）は、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ、Ｎａｎｏｇ、または全能幹細胞の任意の他の特徴の発現が示されておらず、一方、これらの多系統最終分化は、わずかに成功を収めているだけであったため、ＥＳ細胞またはｍＭＡＰＣと比較して、治療価値の将来性としては劣っていると思われる（Ｊｉａｎｇら、２００２；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ、２００３；Ｌａｓｌｅｔｔら、２００３；Ｍｉｔｓｕｉら、２００３；Ｐｉｅｒｄｏｍｅｎｉｃｏら、２００５；Ｌａｉｎｏら、２００６）。ＳＨＥＤは、ＳＨＥＤのうち、たった９％だけが、未分化細胞のマーカーを発現するため、きわめて不均質であることが示されており、ＳＨＥＤから得られたクローンが、これらのマーカーの発現を維持するか否かも明らかではない（Ｍｉｕｒａら、２００３）。以前に、天然環境からの幹細胞の除去は、幹細胞の分化性能を変化させ得ることが報告されている（ＢｉｓｓｅｌｌおよびＬａｆａｒｇｅ、２００５；ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＶｅｒｆａｉｌｌｉｅ、２００５）。歯髄から得られた幹細胞について記載しているさらなる刊行物としては、以下のものが挙げられる。ＷＯ  ０３／０６６８４０、ＷＯ  ０４／０９４５８８、ＵＳ  ２００５／０１０６７２４、ＵＳ  ２００７／０００９４９２、ＵＳ  ２００７／０２５８９５７、ＷＯ  ０３／０６６８４０、ＥＰ  １７４８０６６  Ａ１、ＷＯ  ２００６／０１０６００、ＷＯ  ２００６／１０００８８。しかし、これらの参考文献は、いずれも、異なる系統の細胞に分化させることが可能な、均質な幹細胞集団精製物を記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，６３５，３８７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４６０，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１３６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７５０，３９７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７５９，７９３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６８１，５９９号明細書
【特許文献７】米国特許第５，７１６，８２７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４８６，３５９号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８２７，７３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８１１，０９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、必要なことは、多様な細胞になる能力を有するＥＳ細胞の柔軟性を示すが、胚に由来しない供給源および非侵襲性の供給源に由来するような幹細胞集団である。本発明は、これらの要求を満たし、同時にさらなる利益を与えるものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本明細書は、本明細書に引用した参考文献を考慮して、最もよく理解される。参考文献のいくつかについては、実施例の章の後に、完全な書誌情報をのせている。本明細書で参照されるすべての刊行物、特許、特許出願、公開された特許出願の開示内容は、それぞれの全体が本明細書に参照によって援用される。
【００２３】
（発明の概要）
本発明は、歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）の単離物の組成物、これらの細胞を単離し、培養し、分化させる方法、および、これらの細胞を用いる方法を提供する。ＤＰＭＳＣの単離された集団は、特定のマーカー表現型を示し、この表現型は、タンパク質分析または核酸分析（例えば、ｒｔ−ＰＣＲ）によって測定することができる。したがって、一態様では、本発明は、集団中の細胞の少なくとも約９０％が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）するＤＰＭＳＣの単離された集団を提供する。別の態様では、本発明は、集団中の細胞の少なくとも約９５％が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現するＤＰＭＳＣの単離された集団を提供する。別の態様では、本発明は、細胞集団の約９０〜９９％が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを発現するＤＰＭＳＣの単離された集団を提供する。
【００２４】
別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、この集団中の細胞の０．２５〜１％が、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現する表現型を示してもよい。別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、この集団中の細胞のうち、１％未満がＣＤ３４およびＣＤ４５を発現する表現型を示してもよい。別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、この集団の細胞が、以下のもの：Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｒｅｘ−１それぞれのｍＲＮＡを共発現する表現型を示してもよい。別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、この集団が約２８〜３０時間の平均倍加速度を有する表現型を示してもよい。別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、ＤＰＭＳＣが、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、１つ、２つ、または３つすべてに分化する可能性を有する表現型を示してもよい。別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、ヒトＤＰＭＳＣであってもよい。
【００２５】
また、本発明は、ヒト歯髄に由来するＤＰＭＳＣの単離された集団を提供し、ここで、この集団中の細胞の少なくとも約９０％が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４のそれぞれを共発現し、集団中の細胞の０．２５〜１％が、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現し、細胞が、正常な核型を有し、集団の細胞が、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、少なくとも２つの細胞型に分化する可能性を有する。
【００２６】
別の態様では、任意のＤＰＭＳＣ集団は、細胞が、以下のもの：骨芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞のうち、任意の１つ以上に分化する可能性を有する表現型を示してもよい。
【００２７】
ある態様では、ＤＰＭＳＣは、歯器官（ｔｏｏｔｈ  ｏｒｇａｎ）に由来する。一態様では、歯器官は、子供由来である。別の態様では、歯器官は、成人由来である。
【００２８】
ある態様では、ＤＰＭＳＣ集団は、組織培養プレート、瓶およびマトリックスのような容器に入れられている。
【００２９】
また、本発明は、分化を誘導するように培養されたＤＰＭＳＣの単離された集団を提供し、ここで、開始時の集団は上述のＤＰＭＳＣであり、この分化によって、ＤＰＭＳＣは、骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、肝臓上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵島細胞、膵臓外分泌細胞、腸上皮細胞、腎上皮細胞、表皮に関連する構造、毛包、歯の周囲にある軟組織、象牙質（歯）、エナメル質（歯）、セメント質（歯）からなる群より選択される分化した細胞になる。
【００３０】
また、本発明は、集団中の細胞のゲノムが、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物の挿入によって、または、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物による細胞ゲノムのあるセグメントの置換によって、または、細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失もしくは不活性化によって改変されていない、ＤＰＭＳＣの単離された集団を提供する。
【００３１】
また、本発明は、血小板由来増殖因子、インスリン、セレン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、デキサメタゾン、リノール酸、アスコルビン酸からなる群より選択される１つ以上の成長因子を追加した培地で、歯髄源を培養してＤＰＭＳＣ集団を得ることによる、上述のＤＰＭＳＣ集団を得る方法を提供する。ある態様では、上述の成分が、培地にすべて含まれている。ある態様では、ＤＰＭＳＣは、ヒトＤＰＭＳＣであり、歯髄源は、ヒトに由来する。他の態様では、粘着細胞および非粘着細胞が、免疫除去（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、物理的な除去または化学的な除去によって選別されることなく一緒に培養される（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）。他の態様では、本方法は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ４５グリコホリンＡを発現する細胞の出発源または単核細胞の細胞培養物を除去しない。他の態様では、本方法は、細胞培養器に細胞を入れる工程をさらに含み、ここで、細胞培養器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の基質を含まない。本方法の他の態様では、血清を約０．５〜２．５％の割合で含む。
【００３２】
本発明の別の態様では、上述の培養する方法は、以下の１つ以上の培養パラメータを含む。インスリンは、約１０〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で、トランスフェリンは、０より多いが、約１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で、セレンは、約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で、リノール酸は、約０〜約１μｇ／ｍの濃度で、デキサメタゾンは、約０．００５〜約０．１５μＭの濃度で、Ｌ−アスコルビン酸は、約１０〜５０ｍｇ／Ｌの濃度で、血小板由来増殖因子は、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、上皮増殖因子１は、約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、インスリン様成長因子は、１〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、線維芽細胞増殖因子−ｂ１は、約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。さらに別の態様では、上述の培養する方法は、上述の成分を培地にすべて含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣを分化細胞に分化誘導する方法、およびこれらの方法によって得られる分化した細胞の組成物を提供する。
【００３４】
また、本発明は、本明細書に記載したいずれかのプロセスによって作り出される細胞も包含する。一実施形態では、本発明は、実施例１に記載する培養方法によって作り出されるＤＰＭＳＣを提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、治療を支援するのに有効な量のＤＰＭＳＣを個体に投与することにより、それが必要な個体への治療援助を提供する方法を提供する。別の態様では、本発明は、有益な効果のために、それが必要な個体に、幹細胞を投与する方法を提供する。ある実施形態では、有効量の細胞が、それが必要な個体に導入される。他の実施形態では、それが必要な個体は、本明細書に記載する医学的状態、生物学的状態、遺伝学的状態または生理学的状態のうち、任意の１つ以上を有する個体である。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）子宮内に、十分な量のＤＰＭＳＣを移植し、移植後の、出生前または出生後の個体においてヒト細胞を産生させるために、細胞または組織のキメラ事象を作り出すこと、（ｂ）遺伝的欠陥を有する個体、または遺伝的欠陥を有するおそれがある個体において、上述の細胞に、治療用の酵素、タンパク質または他の産物を産生させることによって、遺伝的欠陥を有する個体、または遺伝的欠陥を有するおそれがある個体に、治療用の酵素、タンパク質または他の生体産物を与える方法を提供する。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）望ましい遺伝子産物をコードする、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物を１つ以上のＤＰＭＳＣに導入することによって、ＤＰＭＳＣを遺伝的に改変すること、（ｂ）この細胞を培養物中で増やすこと、（ｃ）この細胞を個体の体内に導入し、望ましい遺伝子産物を産生させ、これによって遺伝子治療を施すことによって、治療目的の処置を必要とする個体に遺伝子治療を施す方法を提供する。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ＤＰＭＳＣを培養し、ＤＰＭＳＣを増殖させ、（ｂ）有効量の増やしたＤＰＭＳＣと、上述の個体の損傷を受けた組織とを接触させて治療を施すことによって、それが必要なヒト個体において、損傷を受けた組織に治療を施す方法を提供する。一実施形態では、局所的な注射または全身注入によって、個体の体内に細胞を導入する。別の実施形態では、さらなる遺伝物質、サイトカイン、成長因子、または細胞の成長および分化を促進する他の因子を与える適切なマトリックスインプラントと共に、個体の体内に細胞を導入する。別の実施形態では、個体の体内に導入する前に、細胞をポリマーカプセルに封入する。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）表現型のデータを得ることが可能な、統計学的に有意な個体の集団からＤＰＭＳＣを単離し、（ｂ）上述の統計学的に有意な個体集団に由来するＤＰＭＳＣを増やし、ＤＰＭＳＣ培養物を樹立し、（ｃ）上述の培養したＤＰＭＳＣ中にある少なくとも１つの遺伝子多型を同定し、（ｄ）上述の培養したＤＰＭＳＣを分化誘導し、（ｅ）正常な遺伝子型を有するＤＰＭＳＣが示す分化パターンと、同定した遺伝子多型を有するＤＰＭＳＣが示す分化パターンとを比較することによって、遺伝子多型に関連する異常な代謝プロセスを特性決定することによって、生理学的異常に関連する遺伝子多型を同定する方法を提供する。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）殺腫瘍性タンパク質、抗血管形成性タンパク質、または抗原に対する免疫反応の刺激に関連するタンパク質と共にがん細胞表面に発現するタンパク質を発現するようにＤＰＭＳＣを遺伝的に改変し、（ｂ）遺伝的に改変したＤＰＭＳＣを、がん細胞の増殖を止めるか、またはがん細胞を根絶するのに有効な量で個体に導入することによって、それが必要な個体においてがんを処置する方法を提供する。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）統計学的に有意な個体集団からＤＰＭＳＣを単離し、（ｂ）統計学的に有意な個体集団からのＤＰＭＳＣを増やし、複数のＤＰＭＳＣ培養物を樹立し、（ｃ）上述のＤＰＭＳＣ培養物と、１つ以上の生物学的作用物質または薬理学的作用物質とを接触させ、（ｄ）上述の１つ以上の生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する１つ以上の細胞応答を同定し、（ｅ）統計学的に有意な集団中の個体に由来するＤＰＭＳＣ培養物の細胞応答を比較し、生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する細胞応答を決定することによって、生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する細胞応答を決定する方法を提供する。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣに由来する神経網膜細胞を、個体に有効量投与する工程を含む、それが必要な個体において失明を処置する方法を提供する。一実施形態では、失明は、以下のもの：神経網膜疾患、黄斑変性、糖尿病性網膜症、緑内障または網膜色素変性のうち、任意の１つ以上に関連する。別の実施形態では、ＤＰＭＳＣは、個体において失明を改善する内因性遺伝子または導入遺伝子を選択的に発現するように、遺伝的に修飾される。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣに由来する歯肉様物質を個体に有効量投与する工程を含む、それが必要な個体において歯周病を処置する方法を提供する。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣに由来する皮膚上皮組織を個体に有効量投与する工程を含む、それが必要な個体において皮膚移植術および形成術を支援する方法を提供する。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、造血細胞または血液細胞へと分化誘導する様式でＤＰＭＳＣを培養する工程を含む、ヒト造血細胞または血液細胞をエクスビボで作り出す方法を提供する。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣに由来する心筋細胞を、心不全を改善するのに有効な量で個体に投与する工程を含む、それが必要な個体において心疾患を処置するための、治療援助を提供する方法を提供する。ある実施形態では、心疾患は、心筋炎、心筋症、心不全、心臓発作によって引き起こされる損傷、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心臓弁の機能不全からなる群より選択される。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣ、またはＤＰＭＳＣに由来するニューロンに関連する分化細胞を、神経変性疾患の改善を支援するのに有効な量で個体に投与する工程を含む、それが必要な個体において神経疾患を処置するための、治療援助を提供する方法を提供する。ある実施形態では、神経疾患は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳに関連する痴呆、脊髄損傷、脳または他の神経に影響を及ぼす代謝性疾患からなる群より選択される。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＭＳＣ、ＤＰＭＳＣに由来する軟骨細胞、またはＤＰＭＳＣに由来する骨芽細胞を、軟骨変性疾患の改善を支援するのに有効な量で個体に投与する工程を含む、それが必要な個体において関節または軟骨の疾患を処置するための、治療援助を提供する方法を提供する。ある実施形態では、関節または軟骨の疾患は、軟骨裂傷、軟骨の菲薄化、変形性関節症、骨折、治癒していない骨折、変形性関節症、骨に広がる癌性腫瘍によって引き起こされる骨の穴からなる群より選択される。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１個体に由来するＤＰＭＳＣからの、少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子プロフィールを決定する工程と、（ｂ）この遺伝子プロフィールを、アクセス可能な媒体に格納する工程によって、薬物探査を支援するために、多能性が誘導された幹細胞の遺伝子プロフィールのデータベースを与える方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（詳細な説明）
本発明は、ＤＰＭＳＣを単離するための組成物、方法、細胞の特定の分化を誘導する方法、およびこれらから得られる細胞集団を提供する。さらに具体的には、本発明は、ＤＰＭＳＣ集団のうち、かなりの割合または部分が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を共発現し、さらに、同じ集団内で、集団のうちの少しの割合の細胞しか、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しないような、非常に均質なＤＰＭＳＣの単離された集団に関する。この非常に均質なＤＰＭＳＣ集団は、内胚葉、中胚葉、外胚葉の種々の細胞系統の細胞を生成するように分化する可能性を有する。
【００５１】
（Ｉ．一般的な技術）
本発明の実施は、異なる明記がなされない限り、当該分野の範囲内である、幹細胞生物学、細胞培養、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学の従来の技術を利用する。このような技術は、文献に完全に説明されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、２００４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎｏｔａｒａｎｎｉら編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｌａｎｚａ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００６）；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｍｏｈａｎ  Ｃ．Ｖｅｍｕｒｉ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；初版（２００７年８月１０日））；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ、Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ編、初版（２００８年３月７日））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｚａら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００４年９月１４日））；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｖｏｌ  ８６：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｅｎｎｉｅ  Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、初版（２００８年５月１５日））；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ａｎｄｒｅｗ  Ｊ．Ｃａｎｔら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、初版（２００７年１月２２日））；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、第２���（２００８年１月３１日））；Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｍｅｒａｌ  Ｂｅｋｓａｃ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；初版（２００７年５月３日））；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｐａｉｒ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｎａｂｉｌ  Ｄｉｂら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、初版（２００５年１１月１６日））；Ｂｌｏｏｄ  Ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｎｄ  Ｎｕｒｓｉｎｇ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ（Ｋｉｍ  Ｓｃｈｍｉｔ−Ｐｏｋｏｒｎｙ（著者）およびＳｕｓａｎ  Ｅｚｚｏｎｅ（編集者）、Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；第３版（２００６年５月２２日））；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．ＫｌｕｇおよびＣｒａｉｇ  Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；初版（２００１年１２月１５日））；および、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｋｅｒｒｙ  Ａｔｋｉｎｓｏｎら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版（２００３年１２月８日））が挙げられる。
【００５２】
異なる定義がなされない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。
【００５３】
この章に記載する定義が、本明細書に参照によって援用される特許、公開された特許出願、他の刊行物に記載されている定義と矛盾するか、矛盾しなくても一致しない場合、本明細書に参照によって援用される定義よりも、この章に記載する定義が優先する。
【００５４】
（ＩＩ．定義）
本明細書で使用される場合、用語「歯髄由来幹細胞（ＤＰＳＣ）」、「歯髄由来前駆細胞」、「歯髄類似細胞（ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｃｅｌｌ）」（ＤＰＭＳＣ）は、同じ意味で用いられ、特定のマーカーのパネル：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９，ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の共発現がかなり一様である、非常に均質な細胞集団を指す。上述のリストに加え、他のマーカーもＤＰＭＳＣで発現する場合があることも理解されるべきである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「非常に均質な」、「均質な」ＤＰＭＳＣ集団は、特定のマーカーのパネル：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ３４、ＣＤ４５の共発現がかなり一様であるＤＰＭＳＣ集団を指す。一態様では、本発明のＤＰＭＳＣ集団のうち、かなりの割合または部分が、以下のマーカー：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を発現し、さらに、同じ集団内で、集団のうちの少しの割合の細胞しかＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。本明細書に記載したマーカープロフィールを共発現するＤＰＳＭＣ集団の割合は、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％のいずれかであってもよい。ある態様では、本明細書に記載したマーカープロフィールを共発現するＤＰＳＭＣ集団の割合は、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％のいずれかであってもよい。ＤＰＭＳＣ集団は、培養、増殖または分化のための容器に入れられていてもよく、この容器には、標準的な細胞培養器だけではなく、ＤＰＭＳＣを培養するのに当業者が使用するマトリックスおよび他の材料が包含される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語、多能性ＤＰＭＳＣの「集団」または「単離された集団」は、多能性ＤＰＭＳＣ以外の成分を実質的に含まない細胞の調製物をもたらすように操作された、１個以上のＤＰＭＳＣの集団を指す。ある態様では、細胞調製物は、少なくとも約６０％（重量、容積または数による）は、この細胞が産生されるとき、または培養されるときに存在する他の成分を含まない。種々の態様では、細胞は、少なくとも約７５％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％（重量、容積または数において）純粋である。ある態様では、この割合は、細胞培養物または細胞集団中の幹細胞の割合を指す。集団、または単離したＤＰＭＳＣ集団は、例えば、機械的または物理的または化学的な抽出、蛍光活性化細胞選別、または当業者に公知の他の技術による、例えば、天然の供給源からの精製によって、得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または視覚的検査によってアッセイすることができる。
【００５７】
「純度」は、幹細胞の純度を記述するために使用される場合、組成物中の幹細胞のみの存在を指すのではなく、その幹細胞が、その天然組織の環境から除去されるように操作されていることを示し、さらに、得られた集団に存在する他の細胞との関係性も示す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「多能性」は、内胚葉（例えば、胃の内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、尿生殖器）または外胚葉（例えば、表皮組織、神経系）の３種類の胚葉細胞へと分化するＤＰＭＳＣの可能性を指す。多能性幹細胞から、任意の胎児または成体の細胞型を発生させことができる。多能性幹細胞は、胚外組織（例えば、インビボでは胎盤、またはインビトロではトロホブラスト）をもたらす可能性を欠いているため、多能性幹細胞単独では、胎児または成体の動物へと成長することはできない。
【００５９】
「個体」、「被験体」または「患者」は、脊椎動物である。特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）、ペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギなど）、農業用動物（例えば、ウシ、家畜など）、スポーツ用動物（例えば、ウマ）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）が挙げられる。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６０】
「処置」または「処置すること」とは、有益な結果または望ましい結果（臨床的な結果を含む）を得るためのアプローチを意味する。本発明の目的のために、有益な結果または望ましい結果としては、限定されないが、ある状態に関連する症状の緩和、ある状態に関連する１つ以上の症状の程度を弱めること、または、ある状態に関連する症状が悪化するのを予防することが挙げられる。ある態様では、本明細書に開示した１種類以上の細胞を用いた処置は、副作用が全く無いか、現時点で利用可能な治療に関連する副作用よりも、副作用が少ない。
【００６１】
「処置を受けること」は、初期処置および／または継続処置を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、ある疾患または状態の進行を「遅らせること」は、その疾患または状態の進行を延ばし、妨げ、遅らせ、妨害し、安定させ、および／または延期させることを意味する。この遅れは、疾患歴および／または処置される個体によって、さまざまな期間になり得る。当業者には明白なことであるが、十分に遅らせるか、または顕著に遅らせることは、事実上、その個体で、その疾患または状態が進行しないという点で、予防を包含し得る。例えば、本方法は、本方法を用いない場合と比較して、所与の時間で疾患が進行する可能性を減らし得、および／または所与の時間で疾患の程度を弱め得る。ある態様では、このような比較は、統計的に有意な数の個体を用いた臨床研究に基づくものである。標準的な臨床技術を用いて、疾患の進行を検出することができる。また、進行とは、初期には検出可能ではない場合がある疾患の進行を指していてもよく、発生、再発、発症を含む。
【００６３】
「有効量」（処置または予防の内容で使用する場合、または、痛みを和らげるか、または特定の状態の症状を緩和するという内容で使用する場合）は、臨床的な結果を含む有益な結果または望ましい結果を得るのに十分な量である。１回以上の投与で、有効量を投与してもよい。本発明の目的のために、有効量のＤＰＭＳＣは、処置される個体の状態の１つ以上の症状を減らすことが可能な、細胞の特定の量である。ＤＰＭＳＣの有効量は、ＤＰＭＳＣが、多能性を有し、分化していない状態で成長するかまたは増殖する場合のＤＭＰＳＣの使用、ならびに、特定の経路（例えば、神経、心筋細胞、軟骨細胞など）への分化を誘導するためにＤＰＭＳＣをさらに培養する場合のＤＭＰＳＣの使用を包含する。「治療を援助する」という内容で使用する場合、有効量は、治療レジメンを向上させ（ＤＰＭＳＣを含まないレジメンと比較した場合）、そのような場合に、有益な結果または望ましい結果を与える。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「それが必要な」は、ある状態または疾患を有する個体、または、その状態または疾患の「リスクがある」個体を含む。本明細書で使用される場合、「リスクがある」個体は、ある状態が進行するリスクがある個体である。「リスクがある」個体は、検出可能な疾患または状態を有していても、有していなくてもよく、本明細書に記載した処置法の前に、検出可能な疾患が示されていてもよく、示されていなくてもよい。「リスクがある」は、ある個体が、１つ以上のいわゆるリスク因子をかかえており、この因子が、ある疾患または状態の進行と相関関係にあり、当該分野で公知の測定可能なパラメータであることを示す。これらの１つ以上のリスク因子をかかえている個体は、これらのリスク因子が存在しない個体よりも、その疾患または状態が進行する可能性が高い。これらのリスク因子としては、限定されないが、年齢、性別、食事、以前の疾患歴、前触れとなる疾患の存在、遺伝学的（すなわち、遺伝性の）考慮事項、種族に関するプロトコルおよび考慮事項、環境曝露が挙げられる。
【００６５】
「医薬的に許容されるキャリア」とは、活性成分と組み合わせた場合に、熟練した専門家の知識に基づいて、その成分が生体活性を保持することができ、許容できない免疫反応（例えば、重篤なアレルギーまたはアナフィラキシーショック）を引き起こさないような任意の物質を意味する。例としては、限定されないが、標準的な医薬キャリア、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸緩衝化生理食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、種々の種類の加湿剤のうち、任意のものが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水である。細胞に注入するための例示的なキャリアは、ＣＭＣである。このようなキャリアを含む組成物は、従来の周知の方法で処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；および、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照、これらを、それぞれの内容全体について、特に処方物に関して本明細書に参照によって援用する）。
【００６６】
「組成物」または「組成物類」を一般的に言及する場合、本発明の組成物類を含み、本発明の組成物類に適用可能である。また、本発明は、本明細書に記載した成分を含む医薬組成物も提供する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、単数形である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」は、異なる明記がなされない限り、複数個のものも含む。例えば、「１つの（ａ）」ＤＰＭＳＣは、１つ以上の歯髄類似細胞を含む。
【００６８】
本明細書中の値またはパラメータに対し、「約」が記載されている場合、その値またはパラメータ自体が指している態様を含む（そして、記載する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００６９】
態様および本明細書に記載した本発明の態様は、態様および態様「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を含むことが理解される。
【００７０】
（ＩＩＩ．歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）の集団）
本発明は、複数の胚葉（例えば、外胚葉、中胚葉、内胚葉）に由来する多くの種類の細胞へと分化させることが可能な歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）の均質な集団を提供する。これらの細胞は、体の異なる胚葉に由来する多くの種類の細胞へと分化する能力について、大きな柔軟性を示す。ＤＰＭＳＣは、胚幹細胞と似た分化表現型を示す。本明細書に記載される本発明の細胞は、中胚葉、外胚葉、内胚葉に由来する少なくとも１つ、２つまたは３つの分化細胞型を形成するように分化する可能性を有する。本発明のＤＰＭＳＣ集団の表現型は、特定のマーカーを発現する細胞集団の割合が比較的大きい（または、他の特定のマーカーを発現しない細胞集団の割合が少ない）という観点で、当該分野で記載されている他の幹細胞培養物よりも均質であり、他の幹細胞培養物は、全体として、幹細胞集団が広範囲の表現型を示すという観点で、かなり不均質な傾向があった。
【００７１】
（Ａ．歯髄由来のＤＰＭＳＣ）
培養のための歯髄の出発源を用いることによって、ＤＰＭＳＣを得ることができる。本発明の一態様では、歯髄の供給源は、子供由来であってもよい（例えば、失われていく乳歯の一部分として失われた歯）。本発明の別の態様では、歯髄源は、乳歯を失った後に成長した成人の歯に由来してもよい。別の態様では、出発源は、歯器官に由来していてもよい。一態様では、脱落歯髄単核細胞は、歯髄に由来する。
【００７２】
本発明のＤＰＭＳＣは、任意の脊椎動物から得ることができる。本発明の一態様では、ＤＰＳＭＣは、哺乳動物（例えばヒト）から得られる。本発明の他の態様では、ＤＰＭＳＣは、非ヒトから得られる。本発明のさらに他の態様では、ＤＰＭＳＣは、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）、ペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギなど）、農業用動物（例えば、ウシ、家畜など）、スポーツ用動物（例えば、ウマ）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）から得られる。すべての場合に、非ヒト胚は、本発明のＤＰＭＳＣを得るプロセスで破壊される。
【００７３】
したがって、本発明は、ヒトＤＰＭＳＣ、非ヒトＤＰＭＳＣ、霊長類ＤＰＭＳＣ、および異なる動物種に由来するＤＰＭＳＣの組成物（例えば、集団または単離された集団）を提供する。本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣは、本明細書に記載する実験条件で、ＤＰＭＳＣの大部分が選択的に増殖するような、歯髄の亜集団であってもよい。本発明の他の態様では、歯髄片と培地との間の勾配は、細胞を、細胞が損傷部位と認識する場所に向かわせるベクターとして役立つ場合があり、これは、細胞をペトリ皿における継続した選択的移動に導き得る。
【００７４】
（Ｂ．ＤＰＭＳＣの表現型）
本発明のＤＰＭＳＣ集団は、種々の表現型によって記述することができる。一態様では、ＤＰＭＳＣ集団は、特定のマーカーの共発現の均質性という観点で記述することができる。これらのマーカーは、細胞表面に存在していてもよく、当該分野で標準的な方法（例えば、フローサイトメトリー）で検出することができる。または、ＤＰＭＳＣ集団は、細胞内の特定遺伝子の発現によって記述することができ、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、ｒｔ−ＰＣＲ）で測定することができる。さらに別の代替例では、ＤＰＭＳＣは、その核型（例えば、通常の核型）または生体での特徴によっても記述することができる。生体活性の非限定的な例としては、細胞の倍加時間、テロメラーゼ活性、分化能が挙げられる。
【００７５】
本発明の一態様では、ＤＮＡ含有量は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、ＦＩＳＨ）によって測定することができる。テロメラーゼ活性の検出は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、ＴＲＡＰ−アッセイ／ＴＲＡＰｅｚｅキット）によって決定することができる。本発明の別の態様では、細胞は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）によって染色することができる。アルカリホスファターゼ活性は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、アルカリホスファターゼ染色）によって測定することができる。本発明のさらに別の態様では、グリコーゲンは、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、過ヨウ素酸シッフ染色）によって検出することができる。アルブミン濃度は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって決定することができ、尿素濃度は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＴＭ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ）によって決定することができる。ここに記載した標準的なアッセイの詳細は、実施例２中に見いだすことができる。
【００７６】
したがって、一態様では、本発明のＤＰＭＳＣ集団は、マーカー、例えば、限定されないが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４の共表現において均質である。均質性は、所与のＤＰＭＳＣ集団内で、同じマーカープロフィールを発現する細胞の割合を指す。ある態様では、本発明は、集団中の細胞の約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を共発現するという点で均質なＤＰＭＳＣ集団を提供する。他の態様では、本発明は、集団中の細胞の少なくとも約４０％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を共発現するという点で均質なＤＰＭＳＣ集団を提供する。好ましくは、ＤＰＭＳＣ集団は、集団中のＤＰＭＳＣの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を共発現するという程度まで均質である。他の態様では、ＤＰＭＳＣ集団の約９０〜９９％が、これらのマーカーを共発現する。
【００７７】
別の態様では、ＤＰＭＳＣ集団中、低い割合（例えば、＜１％）の細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５のようなマーカーの発現を示す。ＤＰＭＳＣ集団のかなりの割合または部分（例えば、少なくとも約９０％）が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４を共発現する同じ均質な集団で、細胞が１４〜２０倍加した後に得られるヒトＤＰＭＳＣ集団のうち、低い割合または部分（例えば、０．２５％〜１％）が、ＣＤ３４、ＣＤ４５を発現する。本発明の別の態様では、ＤＰＭＳＣ集団中の低い割合の細胞が、ＣＤ６６ｅ、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＶＥ−Ｃａｄ、ＣＤ１１７を発現する。
【００７８】
ＤＰＭＳＣ集団がＳＳＥＡ−４を発現するという本発明者らの発見は、接種密度２−１０３／ｃｍ２で増殖させたヒトＤＰＭＳＣが、解凍後にＳＳＥＡ−４タンパク質を発現することを示している他の免疫組織化学アッセイおよび細胞蛍光アッセイと一致している（Ｋａｎｎａｇｉ  Ｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：２３５５−６１、１９８３）。
【００７９】
本発明の別の態様では、ＤＰＭＳＣ集団は、メッセンジャーＲＮＡ発現の特定のプロフィールも発現した。ｒｔ−ＰＣＲによってＤＰＭＳＣ集団を分析し、増殖段階中のメッセンジャーの発現を決定することができる。本発明のＤＰＭＳＣ集団で検出可能なメッセンジャー発現の非限定的な例としては、Ｏｃｔ−４、ＭＤＲ−１、Ａｂｃｇ−２、Ｍｓｘ−２、ＰＰＡＲ−γ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＫ−１９、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオネクチン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰｒ−Ｉａ、ＢＭＰｒ−Ｉｂ、Ｃｂｆａ−Ｉ  Ｉ型、Ｃｂｆａ−Ｉ  ＩＩ型、Ｄｌｘ−５、コラーゲンＩ、ＦＧＦｒ−Ｉ、ＦＧＦｒ−ＩＩ、アグレカン、ｄｅｒｍｏ−Ｉ、歯のマトリックスタンパク質、Ｇ−Ｆａｐ、グリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）、β３−チューブリン、ニューロフィラメントＬ（ｌｉｇｈｔ）、Ｍ（ｍｅｄｉｕｍ）、Ｈ（ｈｅａｖｙ）、ＮＳＥ、ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、Ｎ−ｎｏｓ、ＡＳＡ、ＳＭＡ、心筋アクチン、ミオカルジン、ＡＮＰ、Ｇａｔａ−４、Ｎｋｘ−２．５、Ｍｅｆ−２ａ、ｃ−ＴｎＩ、ミオシン重鎖が挙げられる。一方、ＤＰＭＳＣ集団は、ＭＨＣ−α、ＭＨＣ−β、ＫＤＲ、ＴＲＴ、オステオポンチン、ＢＭＰｒ−ＩＩ、コラーゲンＩＩ、Ｍａｐ−２、Ｖ−Ｍｌｃ、ｃＴｎＴのメッセンジャーＲＮＡを最小限の値で発現する状態から、まったく発現しない状態である。本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣ集団は、以下のもの：Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡおよびＢ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｒｅｘ−１のそれぞれのｍＲＮＡを共発現する。
【００８０】
本発明のＤＰＭＳＣ集団を特性決定するそれ以外の別の様式は、タンパク質発現によるものである。タンパク質発現を決定することができる１つの様式は、増殖段階中の、ＤＰＭＳＣの免疫蛍光法である。本発明のＤＰＭＳＣ集団で検出可能なタンパク質発現の非限定的な例としては、アグレカン、コラーゲンＩ、ＦＧＦｒ−Ｉ、ＦＧＦｒ−ＩＩ、ｃ−ＴｎＴ、コラーゲンＩＩ、ＳＭＡ、ニューロフィラメントＬ（ｌｉｇｈｔ）、Ｇ−Ｆａｐ、ＮＳＥ、ＶＷＦ、Ｃｂｆａ−Ｉ、Ｇａｔａ−４、Ｍｓｘ−２、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４が挙げられる。また、免疫ブロット法を用い、増殖段階中のＤＰＭＳＣのタンパク質発現を決定することもできる。本発明のＤＰＭＳＣ集団で検出可能なタンパク質発現の非限定的な例としては、ＡＳＡ、Ｓｅｒｃａ、β３−チューブリン、シナプトフィシン、Ｍｓｘ−２、Ｏｃｔ−４、コネキシン−４３、Ｄｌｘ−５、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、Ｃａ−チャネル、Ｃｂｆａ−Ｉが挙げられる。
【００８１】
ＤＰＭＳＣは、胚幹（ＥＳ）細胞／胎生期癌（ＥＣ）細胞の未分化状態を維持するのに必要なＰＯＵ−ドメイン転写因子Ｏｃｔ−４のｍＲＮＡを発現する。Ｏｃｔ−４は、原腸形成前の胚、分割初期段階の胚、胚盤胞内部の細胞塊の細胞、および胎生期癌（ＥＣ）細胞で発現する転写因子であり（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊら、Ｃｅｌｌ  ９５：３７９−９１、１９９８）、細胞が分化誘導されると、下方制御される。Ｏｃｔ−４の発現は、胚形成および分化の初期段階を決定づけるのに重要な役割を果たす。Ｏｃｔ−４は、Ｒｏｘ−１と組み合わせると、ジンクフィンガータンパク質Ｒｅｘ−１の転写活性化を引き起こし、ＥＳを未分化状態に維持するのにも必要である（Ｒｏｓｆｊｏｒｄ  Ｅ、Ｒｉｚｚｉｎｏ  Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０３：１７９５  ８０２、１９９７；Ｂｅｎ−Ｓｈｕｓｈａｎ  Ｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：１８６６−７８、１９９８）。それに加え、ＥＳ／ＥＣだけではなく、他の多くの分化細胞でも発現するＳｏｘ−２は、ＥＳ／ＥＣを未分化状態に維持するのに、Ｏｃｔ−４とともに必要である（Ｕｗａｎｏｇｈｏ  Ｄ．ら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ４９：２３−３６、１９９５）。
【００８２】
本発明のヒトＤＰＭＳＣは、ＳＳＥＡ−４を発現し、ＳＳＥＡ−４を用いた染色に陽性である。Ｏｃｔ−４のタンパク質レベルは、４０より多く細胞が倍加したヒトＤＰＭＳＣ培地では減少する傾向があり、この結果は、理論によって束縛されないが、分化表現型が部分的に失われたことによるものであろう。したがって、ＳＳＥＡ−４とともに、Ｏｃｔ−４の存在は、ＤＰＭＳＣ培養物中に最も初期の細胞が存在することと相関関係があるマーカーである。
【００８３】
本発明のＤＰＭＳＣは、歯髄源から培養を開始してから、どれだけ多くの倍加が起こったかによって異なる増殖速度を示す。したがって、一態様では、本発明は、最初の１０細胞倍加では、平均倍加時間が約３０〜４０時間であるＤＰＭＳＣの単離された集団を包含する。平均倍加時間は、最初の１０細胞倍加ＤＰＭＳＣ集団で、約３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間または４０時間であってもよい。一実施形態では、倍加時間は、最初の１０細胞倍加では約３６時間である。最初の１０細胞倍加が起こった後で、細胞の倍加時間は、約３０〜３５細胞倍加まで約２８時間であってもよく、次いで、倍加速度は、その後徐々に遅くなっていく。本発明のＤＰＭＳＣは、培養中の期間を平均した場合、ＤＰＭＳＣの増殖について平均倍加時間が２５〜４０時間のＤＰＭＳＣの単離された集団を包含する。本発明のさらに別の態様では、平均倍加時間は、１．２５〜２．５％ヒト血清培地で約２８時間であってもよく、０．２５−０．５％ヒト血清培地で約２９又は３０時間であってもよい。最初の初代培養細胞（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｌｕｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ）のおおよその数は、約８０〜８００であってもよい。
【００８４】
本発明のＤＰＭＳＣ集団は、少なくとも約１ヶ月間、好ましくは約２ヶ月間、さらにもっと好ましくは、約３ヶ月間またはそれ以上、分化していない多能性ＤＰＭＳＣとして増殖させることができる。または、本発明のＤＰＭＳＣ集団は、歯髄源から培養を開始してから、少なくとも約１０倍加、好ましくは、少なくとも約２０倍加、さらにもっと好ましくは、少なくとも約３０、約４０、約５０、約６０、またはそれ以上の倍加の間、分化していない多能性ＤＰＭＳＣとして増殖させることができる。また、本発明は、凍結保存したＤＰＭＳＣから増殖させたＤＰＭＳＣ集団を包含する。
【００８５】
本発明の別の態様では、ＤＰＭＳＣ集団は、テロメア活性の測定値として、内部コントロールと比較した場合、テロメア長の低下も示す。本発明の一実施形態として実施例にさらに詳細に記載しているように、再接種密度２×１０３細胞／ｃｍ２で培養した２種類のドナー（６歳）のＤＰＭＳＣのテロメア長は、１０〜２０ｋｂｐであった。内部コントロールである１３０１細胞株のテロメア長が１００％であると概算した。ＤＰＭＳＣの平均テロメア長は、コントロールと比較して、Ｐ２が１８．４％であり、Ｐ５が１７．１％であった（解凍後）。したがって、本発明のＤＰＭＳＣは、コントロール細胞株の７５％未満、好ましくは、約６５％未満、好ましくは、約５５％未満、さらに好ましくは、約４５％未満のテロメア長を有するＤＰＭＳＣの単離された集団を包含する。
【００８６】
本発明のＤＰＳＭＣの集団は、外胚葉系統、内胚葉系統または中胚葉系統の細胞型のうち、１つ以上（例えば、２つ、または３つすべて）に分化する可能性を有する。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ集団は、以下のもの：骨芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、肝細胞のうち任意の１つ以上に分化する可能性を有する。別の態様では、本発明のＤＰＳＭＣ集団は、以下のもの：骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、肝臓上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵島細胞、膵臓外分泌細胞、腸上皮細胞、腎臓上皮細胞、表皮に関連する構造、毛包、歯の周囲にある軟組織、象牙質（歯）、エナメル質（歯）、セメント質（歯）のうち、任意の１つ以上に分化する可能性を有する。本発明は、ＤＰＭＳＣを記述し、特性決定するために、本明細書の上の章およびそれ以外の箇所に記載されているような、上述のパラメータのいずれかおよびすべてを、任意の組み合わせで意図する。
【００８７】
（ＩＶ．歯髄類似細胞を単離する方法および／または培養する方法）
本明細書に記載したように単離される、歯髄類似細胞（ＤＰＭＳＣ）を、上述のような歯髄源から始め、本発明の方法を用いて培養してもよい。歯髄は、酵素によって脱凝集化（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅ）させてもよく、または酵素以外によって脱凝集化させてもよい（例えば、機械的脱凝集化）。一態様では、分離した混合状態の細胞集団に、任意の種類の除去技術（例えば、免疫除去または物理的な除去または化学的な除去）を行わない。別の態様では、この方法は、以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４５＋グリコホリンＡを発現する細胞（例えば、単核細胞）を除去する工程を含まない。
【００８８】
次いで、この細胞を、例えば、任意の１つ以上の種類の培養容器（例えば、プラスチック培養皿）に入れ、種々の成長因子を追加した増殖培地中に維持することができる。成長因子は、ＤＰＭＳＣ集団を得るため、血小板由来増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−ｂ（ＦＧＦ−ｂ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、デキサメタゾン、リノール酸、アスコルビン酸、セレンから選択されてもよい。一実施形態では、培地には、上述のすべての成分が追加されていてもよい。一実施形態では、増殖培地は、実施例に記載されており、Ｍｉｄを含まない培地と呼ばれる。使用可能な成長因子としては、限定されないが、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の線維芽細胞増殖因子−ｂ（ＦＧＦ−ｂ）が挙げられ、１０−１０〜１０−８Ｍのデキサメタゾンまたは他の適切なステロイド、０〜１μｇ／Ｌのリノール酸、１０〜５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸を伴なう。
【００８９】
本発明の別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣを、インスリンを約１０〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で、トランスフェリンを、０より多いが、約１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で、セレンを約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で、リノール酸を約０〜約１μｇ／ｍの濃度で、デキサメタゾンを約０．００５〜約０．１５μＭの濃度で、Ｌ−アスコルビン酸を約１０〜５０ｍｇ／Ｌの濃度で、血小板由来増殖因子を約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、上皮増殖因子を約１〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、インスリン様成長因子を１〜約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、線維芽細胞増殖因子−ｂ１を約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で含む培地で培養する。
【００９０】
本発明の別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣを、約１．２５％のヒト血清、血小板由来増殖因子−ＢＢを約１〜約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、上皮増殖因子を約１〜約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、インスリン様成長因子−Ｉを約１〜約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、線維芽細胞増殖因子−Ｉを約１〜約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、デキサメタゾンを約１０−１０〜約１０−８Ｍの濃度で、リノール酸を約２０〜約１００μｇ／Ｌの濃度で、アスコルビン酸を約１０〜約５０ｍｇ／Ｌの濃度で、ゲンタマイシンを約０．５ｍｌ／Ｌの濃度で追加した、Ｆ−１２  Ｃｏｏｎ変法／Ａｍｂｅｓｉ変法／Ｍｅｄｉｕｍ  １９９／ＣＭＲＬ  １０６６を含む増殖培地で構成される培地で培養する。本発明の別の態様では、ＤＰＭＳＣを、約１０００Ｕ／ｍＬの濃度のコラーゲナーゼＩＩと、ＣＴＣ溶液とを含有する培地に入れ、場合により、解離させる。ＣＴＣ溶液は、約０．５容積％の割合でトリプシンを、コラーゲナーゼＩＩを約２２Ｕ／ｍＬの濃度で、ニワトリ血清を約０．２容積％の割合で含有する。本発明のさらに別の態様では、歯髄細胞の集団に、任意の種類の除去技術（例えば、免疫除去または物理的な除去または化学的な除去）を行わず、初代培養で増殖させたコロニーが密集状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達したら、細胞をＣＴＣ溶液によって剥離し、増殖培地で二次培養してもよい。細胞の分化を防ぐために、培養物は、半密集状態（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｌｙ）に維持する。
【００９１】
ある代替例では、ＤＰＭＳＣを、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質とともに細胞培養器に入れてもよい。別の代替例では、ＤＰＭＳＣを、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質を含まない状態で、細胞培養器に入れてもよい。さらに別の代替例では、ＤＭＰＳＣを、ＤＭＰＳＣが沈殿し、三次元構造を形成するように細胞培養器に入れてもよい。当業者には公知であるように、三次元構造（例えば、足場（生体足場を含む）を用いてＤＰＭＳＣを培養してもよく、および／または、ＤＰＭＳＣを細胞および／または組織に分化させてもよい。例えば、気管、血液細胞、脳組織、腎臓、膵臓、肝臓、心臓、肺、脊髄、神経、神経細胞、ニューロン、軟骨、骨、再生医療で使用可能な他の細胞および／または組織を成長させるための足場を用いてＤＰＭＳＣを培養してもよい。
【００９２】
細胞を未分化状態に維持するために、低血清培地で培養することが好ましい。血清は、単離されるＤＰＭＳＣの種によって、ヒト血清であってもよく、非ヒト血清であってもよい。ヒト血清は、自家血清であってもよい。低血清とは、本明細書で使用される場合、約０．５〜２．５容積％の割合レベルを指す。一態様では、本発明は、インスリン、セレン、リノール酸、デキサメタゾン、血小板由来増殖因子を含有する、１．２５％のヒト低血清培地を加えることを含む、ＤＰＭＳＣを単離し、その後にＤＰＭＳＣを増殖させる方法を提供する。ヒト低血清培地は、Ｍ−１９９およびＣＭＲＬ−１０６６を混合したＦ１２であってもよい。インスリンは、場合により、約１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在してもよい。低血清培地は、有効量のトランスフェリンを、０より多いが、約１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で含んでいてもよく、セレンは、約０．１〜約５μｇ／Ｌの濃度で存在していてもよく、リノール酸は、０〜約１μｇ／ｍＬの濃度で存在していてもよく、デキサメタゾンは、約１０−１０〜１０−８Ｍの濃度で存在していてもよい。低血清培地は、約１０〜５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有していてもよい。低血清培地は、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子、１〜約１５ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、１〜約１５ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子、１〜約１５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−ｂを含有していてもよい。また、本発明は、上に列挙した成長因子成分のうち、任意の１つまたはすべてを加えた、無血清培地の使用も意図している。
【００９３】
幹細胞分野の技術者は、ごく普通に、増殖について本明細書に記載した培地条件を用いて、本発明のＤＰＭＳＣを培養することができる。一旦培地で樹立したら、細胞を凍結し、凍結ストックとして保存することができる。一実施形態では、細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む本明細書に記載した増殖培地を用いて凍結し、保存する。培養した細胞の凍結ストックを調製する他の方法も、当業者には公知である。また、増殖のためにＤＰＭＳＣを培養することに加え、子孫細胞へと分化誘導するために、他の因子を加えた培地でＤＰＭＳＣ集団を培養してもよい。
【００９４】
また、本発明は、本明細書に記載した培養方法によって作り出したＤＰＭＳＣ集団を含む。また、本発明は、本明細書に記載した条件で培養した細胞を含み、最初に培養した細胞（例えば、培地に導入する際の細胞）および培養プロセスの任意の点での細胞を含む。
【００９５】
本発明の別の態様では、広範囲にわたる分化可能性を有する歯髄細胞の集団、および中胚葉、内胚葉、外胚葉から誘導される系統を、本発明で提示する固有の増加／選別手順によって単離してもよく、この手順は、自家ヒト血清を低い割合で使用することを含む。
【００９６】
（ＩＩＩ．ＤＰＭＳＣを分化誘導し、方向性が決まった（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞および組織特異的な細胞型を形成すること、およびこれらの使用）
本発明は、本明細書に記載の多能性ＤＰＭＳＣに由来する分化細胞、およびこれらの細胞の分化を誘導する方法をさらに提供する。一態様では、本発明は、以下のもの：臓側板細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞のうち、任意の１つ以上に分化することが可能なＤＰＭＳＣを意図する。別の態様では、本発明は、以下のもの：骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、皮膚上皮細胞、肝臓上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓の内分泌細胞または島細胞、膵臓外分泌細胞、腸上皮細胞、腎臓上皮細胞、または表皮に関連する構造（例えば、毛包）のうち、任意の１つ以上に分化することが可能なＤＰＭＳＣを意図する。別の態様では、本発明は、歯の周囲にある軟組織を形成することが可能な子孫細胞、または歯（例えば、象牙質、エナメル質、セメント質）を形成することが可能な子孫細胞へと分化することが可能なＤＰＭＳＣを意図する。さらに別の態様では、本発明は、以下のもの：骨芽細胞および筋細胞のうち、任意の１つ以上に分化することが可能なＤＰＭＳＣを意図する。
【００９７】
また、本発明は、本明細書に記載されるような多能性ＤＰＭＳＣ単離物を提供し、細胞のゲノムは、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物の挿入によって、またはあらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物による細胞ゲノムのあるセグメントの置換によって、または細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失もしくは不活性化によって、改変されていない。
【００９８】
本明細書に記載されるような、および／または、さらに当業者に公知であるような、適切な成長因子、ケモカインおよびサイトカインを用いて、本発明のＤＰＭＳＣを分化誘導し、例えば、中胚葉起源の種々の細胞、および神経外胚葉起源の細胞（例えば、グリア細胞、乏突起膠細胞、ニューロン）、および内胚葉起源の細胞（例えば、肝細胞）を含む、多くの細胞系統を作り出すことができる。本発明は、これらの方法を意図する。
【００９９】
（Ａ．臓側板）
臓側板は、本発明の均質なＤＰＭＳＣ集団を用いて増殖させられ得る。一実施形態では、骨芽細胞を増殖させるために、２０，０００細胞／ｃｍ２のＤＰＭＳＣを、約１０−６〜１０−８Ｍ（好ましくは、約１００ｎＭ）のデキサメタゾン、β−グリセロホスフェートと、０．５〜３ｍＭ（好ましくは、１ｍＭ）のアスコルビン酸とともに培養してもよい。骨芽細胞の存在を示すために、培養してから約３ヶ月後に、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（ＣａＰｏ４の銀還元）を用いてもよく、または、オステオネクチン、オステオポンチンおよびオステオカルシンに対する抗体（免疫組織化学／ウェスタン／ｒｔ−ＰＣＲ）を用いてもよい。Ｘ−Ｒａｙ回折パターンおよび赤外線スペクトルを用い、ヒドロキシアパタイト形成の存在を評価してもよい。
【０１００】
（Ｂ．筋肉）
ＤＰＭＳＣを、分化誘導前に密集状態のＤＰＭＳＣを接種することによって、任意の筋肉表現型に分化するように誘導してもよい。一態様では、筋肉細胞への分化を誘導するために、約１０，０００細胞／ｃｍ２のＤＰＭＳＣ細胞を、ＩＢＭＸ  ０．１〜１ｍＭ（好ましくは、０．５ｍＭ）およびＶＥＧＦ  ５〜２０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ  ５％ＦＢＳで処理してもよい。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光を用い、分化を評価することができる。インビトロでの骨格筋への分化は、当業者に公知の標準的な技術および市販の抗体を用いて、免疫組織化学またはウェスタンブロット分析のいずれかによって、ミオゲニン、アクチニン、骨格筋アクチン、骨格筋ミオシンの逐次的な活性化を検出することによって示すことができる。骨格筋アクチン、Ｓｅｒｃａ  ２ａ、Ｃａ−チャネル、Ｍｓｘ−２を誘導から１５日後に検出してもよく、骨格筋ミオシンを４０日後に検出してもよい。免疫組織化学によれば、約７０〜８０％の細胞が、１４日後に、成熟した筋肉タンパク質を発現することができる。分化培地で処理すると、培養１５日間に、ＡＳＡ、Ｃａ−チャネル、ＳＭＡ、ｃ−ＴｎＴ、コネキシン−４３、Ｇａｔａ−４、ミオシン重鎖、ミオゲニン、Ｎｋｘ−２．５、Ｎ−カデリン、Ｓｅｒｃａ−２ａ  ＡＴＰａｓｅを発現させることができる。それに加え、骨格筋ミオシンは、アクチニンと同様に、４０日目に、組織化され得、ＡＳＡと共発現され得る。平滑筋アクチンは、誘導から２日後に検出することができ、継続することができる。リアノジン受容体は、発現しないかもしれない。
【０１０１】
（Ｃ．神経細胞）
ＤＰＭＳＣを、神経細胞へと分化するように誘導することができる。ある実施形態に関する実施例でさらに詳細に記載するように、神経の発達は、神経分化培地でＤＰＭＳＣを培養することによって誘導することができる。神経分化培地は、最小必須培地（例えば、ＤＭＥＭ−ＨＧ）を含んでいてもよい。神経分化培地は、典型的には、１つ以上のさらなる添加剤（例えば、抗生物質、成長因子、栄養素、またはこれらの組み合わせ）を含有する。このような添加剤の具体的で非限定的な例としては、ＮＴ−３（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＤＮＦ（約５ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ）、ＩＢＭＸ（約０．１μＭ〜約１００μＭ）、インドメタシン（約１０μＭ〜約５００μＭ）が挙げられる。別の態様では、この培地は、以下のもの：ＤＭＥＭ−ＨＧ、１×ＩＴＳ、ＦＧＦ（例えば、約０．５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬで）のうち、任意の１つ以上を含んでいてもよい。また、この培地は、特定の細胞型への分化を誘導するために、１つ以上の以下のサイトカインを含有してもよい：ドーパミン作動性ニューロンを得るために、５〜５０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ（好ましくは、約１６ｎｇ／ｍＬ）。ＤＰＭＳＣを神経細胞へと分化誘導するための成長因子の選択は、神経系の胚発生で知られていることに基づいていてもよく、またはインビトロでのＣＮＳ分化を評価した試験からでもよい。
【０１０２】
本発明の一態様では、神経への指定（ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース中、ＤＰＭＳＣ細胞を約３，０００細胞／ｃｍ２でインキュベートすることによって誘導される。２４時間後に、培地を、１５日間にわたって、Ｂ２７、ＥＧＦを約１０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦを約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で含み、ＤＭＥＭ−高グルコース、１０％  ＦＢＳを含む、神経に方向づける培地（ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）と交換する。細胞を１：３で継代し、ＮＴ−３を約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＮＧＦを約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＢＤＮＦを約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＢＨＡを約２０μＭの濃度で、ＩＢＭＸを約５０μＭの濃度で、ＡＴＲＡを約１μＭの濃度で、プロゲステロンを約２０ｎＭの濃度で含む、神経に方向づける培地に入れた。
【０１０３】
本発明の別の態様では、神経に方向づけられた細胞を、ＤＭＥＭ、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＴ−３、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＤＮＦ、約５μｇ／ｍｌの濃度のインスリン、約２００μＭの濃度のインドメタシン、約０．５ｍＭの濃度のＩＢＭＸからなる神経分化培地と接触させることによって、神経分化が誘導される。神経に方向づけられたＤＰＭＳＣ細胞を、神経分化培地中、約１日間インキュベートする。
【０１０４】
本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣ細胞を、培養皿の底に沈殿させ、３Ｄ構造を形成させることができる。例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、湿度１００％加湿雰囲気で、３７℃で神経分化が起こると予想されるであろう。神経分化を約４週間検出してもよい。本発明の別の態様では、神経に誘導されたＤＰＭＳＣ細胞の形態は、成熟ニューロンの形態に非常によく似ており、それは、多数の神経突起を有しており、分化してから約３〜約４週間、顕著に分岐した状態で増加した。
【０１０５】
約２〜４週後、細胞培養物を試験し、星状膠細胞およびニューロンの成長を決定することができる。星状膠細胞を、グリア線維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ−ｆｉｂｒｉｌａｒ−ａｃｉｄｉｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ））陽性細胞として同定することができ、乏突起膠細胞を、グルコセレブロシド陽性（Ｇａｌ  Ｃ）として同定することができ、ニューロンを、ＮｅｕｒｏＤ、チューブリン−ＩＩＩＢ（Ｔｕｊｉ）、シナプトフィシン、ニューロフィラメント−６８、１６０−２００ｋＤａを逐次的な様式で発現する細胞として同定することができる。
【０１０６】
ある非限定的な実施例では、ニューロン１個あたりの神経突起の数は、分化させてから２週間後、３週間後から４週間後に、３±１から５±１および７±２まで増加する場合がある。ニューロンの特性を有する細胞への分化は、ウェスタンブロットによって、ＧＦＡＰ、ニューロフィラメント−１６０、シナプトフィシン、β３−チューブリンの存在を示すことによって確認することができる。免疫蛍光を使用すると、シナプトフィシン、Ｓｙｎａｐｓｙｎ  Ｉ、ニューロフィラメント１６０、β３−チューブリン、Ｎ−カデリン（Ｎ−ｃａｄｅｒｉｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、Ｎ−カドヘリン、ニューロフィラメント−６８、ＮＳＥの存在を明らかにすることができる。
【０１０７】
ｒｔ−ＰＣＲを使用すると、細胞が、β３−チューブリン、ニューロフィラメント−６８ｋＤａ、−１６０ｋＤａ、−２００ｋＤａ、ビメンチン、ＮＳＥ、β３−チューブリン、Ｇ−Ｆａｐ、グリピカン、Ｍｕｓａｓｈｉ、ｎ−Ｎｏｓを発現するが、ＭＡＰ−２は発現しないことを示すことができる。脳で特異的に発現し、インビボおよびインビトロで神経の発達に影響を与えると思われる他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられる。ＢＤＮＦは、インビトロで、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、ニューロン前駆体をニューロンへと分化させるのを促進し、インビボで、海馬幹細胞の神経突起伸長を促進する神経成長因子ファミリーのメンバーである。ある非限定的な実施例では、５〜２０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは、１６ｎｇ／ｍＬ）のＢＤＮＦおよびＥＧＦで処理されたＤＰＭＳＣは、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンへと分化し得、このことは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を助けるＢＤＮＦの既知の機能と一致している。
【０１０８】
本発明の一態様では、神経幹前駆体マーカーであるビメンチンは、増殖および神経分化の両方で発現するが、誘導中には、あまり組織化されない。神経内分泌核性因子であるＮｅｕｒｏ−Ｄ／Ｂｅｔａ−２は、増殖中にのみ発現する。別のニューロフィラメント神経幹マーカーであるネスチンの発現は、増殖段階から誘導段階に向かって低下する。β３−チューブリンは、分化後、ＤＰＭＳＣ細胞の約９９％で発現する。構造的ニューロフィラメントであるＮＦ−１６０およびＮＦ−２００は、分化中にのみ発現し、発現陽性率は、ＮＦ−１６０の場合、約５０％であり、ＮＦ−２００ではそれほど多くはなく、これは、成熟神経表現型と一致している。対称的に、ＮＦ−６８タンパク質は、ＮＳＥで示されるのと同様に、増殖中と、神経誘導後に発現する。
【０１０９】
本発明の別の態様では、シナプス小胞輸送マーカー（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｃｉｃｌｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒ）であるＳｙｎａｐｓｙｎ−Ｉおよびシナプトフィシンは、すべての神経誘導ＤＰＭＳＣ細胞で分化後に発現し、同時に、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｎ−カデリン、ｐ７５−ＮＧＦｒは、誘導後にしか検出されない。乏突起膠細胞マーカー−４は、発現しない。星状膠細胞マーカーＧ−Ｆａｐは、増殖中および神経分化中に発現するが、誘導中にはあまり組織化されない。ＧＦＡＰおよびβ３−チューブリンは、共発現する。
【０１１０】
（Ｄ．心筋細胞）
心筋細胞への分化は、分化誘導前に、密集状態のＤＰＭＳＣを蒔くことによって達成することができる。一態様では、心筋細胞への細胞分化を誘導するために、密集状態（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２）のＤＰＭＳＣ細胞を、ＦＢＳ（約１％〜約１０％）、ＩＢＭＸ（約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ）、ＶＥＧＦ（約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ  ＨＧで処理し、分化に好ましい条件（例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃）で培養することができる。心筋細胞への分化を、約２週間〜約３ヶ月間検出し得る。インビトロでの筋肉分化を、市販の抗体および特定のプライマーを用いた、免疫組織化学またはウェスタンブロットのいずれか、および、ｒｔ−ＰＣＲ分析によって、アクチニン、骨格筋アクチンおよび心筋アクチン、骨格筋ミオシンの逐次活性化を検出することによって示すことができる。また、ＡＳＡ、Ｃａ−チャネル  ＤＨＰＲ、ＳＭＡ、ｃ−ＴｎＴ、コネキシン−４３、Ｍｓｘ−２、ミオシン重鎖、Ｇａｔａ−４、Ｓｅｒｃａ  ２Ａの発現は、心筋細胞経路への分化の指標として決定することもできる。
【０１１１】
本発明の別の態様では、任意の筋肉表現型への分化は、分化誘導の前に、ＤＰＭＳＣを１１，０００細胞／ｃｍ２で蒔くことによって達成することができる。心筋細胞への細胞分化を誘導するために、密集状態のＤＰＭＳＣ細胞を、約５％のＦＣＳ、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のｂＦＧＦ、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ−１を含有するＤＭＥＭで処理することができる。細胞を、４日ごとに培地を交換しつつ、約２週間〜約３ヶ月間、密集状態に達するまで培養することができる。
【０１１２】
心筋細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こることが予想されるであろう。本発明の一態様では、心筋細胞への分化を約２週間〜約３ヶ月間検出し得る。分化期間中、細胞は、長くなり、不規則な形になった。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、骨格筋アクチン（ＳＫＭＡ）、心筋アクチン（ＣＡ）、心筋トロポニンＴ（ｃ−ＴＮＴ）、筋細胞エンハンサー因子−２ａ（Ｍｉｏｃｙｔｅ  ｅｎａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ−２ａ）（ＭＥＦ−２ａ）、ミオシン重鎖（Ｍｈｃ）の共発現を、増殖中および分化中に検出することができる。
【０１１３】
本発明の別の態様では、Ｇａｔａ−４およびＮｋｘ−２．５のｍＲＮＡ発現レベルは、増殖段階および分化段階の両方で低く、一方、Ｍｓｘ−２のｍ−ＲＮＡ発現は高い。ミオカルジンの発現は、分化後に低下する。本発明のさらに別の態様では、細胞は、α−アクチニン、α−サルコメアアクチン、ミオシン重鎖のフィラメントを組織化することができる。α−サルコメアアクチンおよびミオシン重鎖は、分化している細胞の一部で共発現され得、組織化され得る。
【０１１４】
本発明の一態様では、ギャップジャンクションは、細胞と細胞との接触部位の近くのコネキシン−４３の存在によって示すことができる。Ｌ型カルシウムチャネル、Ｓｅｒｃａ−２  ＡＴＰａｓｅポンプ、ｃ−ＴＮＴも、分化細胞で同定することができる。ＳＭＡは、増殖段階において高レベルで発現させられ得、発現は、誘導後に低下し、繊維状構造は損なわれない。Ｍｓｘ−２の発現は、増殖段階から分化段階に向かって常に低下し、一方、ＧＡＴＡ−４の発現は、心筋細胞の誘導後に失われる。
【０１１５】
（Ｅ．肝細胞）
一態様では、肝細胞への分化は、ＤＭＥＭ低グルコース１〜１０％ＦＣＳ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、オンコスタチン（ＯＳＭ）（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（約１ｍＭ〜約１００ｍＭ）、ＬＤＬ（約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−４（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ）、リノール酸（約１８０μｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ）、グルコース（約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ）を用い、分化誘導する前に密集状態（例えば、２０，０００細胞／ｃｍ２）のＤＰＭＳＣを蒔き、分化に好ましい条件で培養することによって達成することができる。当業者は、アルブミンを発現、分泌する小上皮細胞を観察することによって、肝細胞への分化経路を解明することができる。それに加え、この細胞を、ＨＧＦ受容体、サイトケラチン１９、Ａｂｃｇ−２、ＭＤＲ−Ｉ、トランスフェリン、ソマトスタチン、エリスロポエチン、シトクロムＰ−４５０サブユニット２ｅ１のｍＲＮＡ発現について試験することができる。それに加え、アルブミン、尿素、サイトケラチン−８−１８−１９、ＨＮＦ−３β、ＨＮＦ−４αの存在および分泌はまた、肝細胞へ分化する可能性を示し得る。
【０１１６】
本発明の別の態様では、肝実質細胞への分化は、密集状態のＤＰＭＳＣを、ＤＭＥＭ低グルコース１％ＦＣＳ、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度の肝細胞成長因子、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のオンコスタチン、約１０ｍＭの濃度のニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｍｉｄｅ）、約１．２５μｇ／ｍＬの濃度のＬＤＬ、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ−４、インスリン（約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ）、約０．０００１８ｇ／Ｌの濃度のリノール酸、約１．２５ｇ／Ｌの濃度のグルコースとともに約１４〜約３７日間インキュベートすることによって達成することができる。肝性分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こることが予想され得、肝性分化を、約５週間後に検出し得る。
【０１１７】
本発明の別の態様では、約１４〜約３７日後、分化細胞は、偏在性の核を有する球形を呈し得る。増殖段階から分化段階の間、これらの細胞は、アルブミン、トランスフェリン、ソマトスタチン、エリスロポエチン、シトクロムＰ−４５０サブユニット２ｅ１の発現が増加し、ｃ−ＭＥＴ／ＨＧＦ−ｒ、Ａｂｃｇ−２、ＭＤＲ−Ｉは一定量発現し、サイトケラチン−１９の発現が低下することを示すことができる。本発明のさらに別の態様では、大部分の細胞が、小さな繊維組織化を伴い分化した後、肝臓上皮に特異的なサイトケラチン８、１８、１９に対し、染色陽性であってもよい。細胞は、肝性誘導後、肝実質細胞核性因子４αおよび３βの両方を発現することができる。別の態様では、細胞は、肝実質細胞のいくつかの機能、例えば、ＰＡＳ染色で示されるような、グリコーゲンを蓄える能力、および培養上清中の上述の因子の濃度および用量を試験することによって調べられるような、アルブミンおよび尿素を生成する能力を獲得することができる。
【０１１８】
（ＩＶ．ＤＰＭＳＣまたはＤＰＭＳＣ単離物と、培養成分とを含有するキット）
本発明のＤＰＭＳＣ（および／または本発明のＤＰＭＳＣに由来する分化細胞）は、適切な包装材料を備えるキットで提供することができる。例えば、ＤＰＭＳＣは、分化していない状態で培養するために、本明細書ですでに記載したような適切な因子および培地を別個に包装して添付した、凍結ストック（例えば、本明細書に記載されるような適切な保存媒体中）として提供することができる。さらに、すでに記載したような、分化を誘導するための別個に包装した因子も提供することができる。
【０１１９】
幹細胞（例えば、患者に由来する幹細胞）を単離し、培養するための有効量の適切な因子を含有するキットも、本発明によって提供される。個体（例えば、患者）から歯髄を得たら、技術者は、本明細書に記載した方法を用いるか、またはキットで提供される、本明細書に記載したＤＰＭＳＣのマーカープロフィール（例えば、抗−ＣＤ４５および抗−グリコホリンＡ）に基づく１つ以上の選別ツールを用いて幹細胞を選別し、次いで、キット成分として供給されている培地を用い、この細胞を本発明の方法によって記載されるように培養する。基本的な培地の組成は、本明細書ですでに記載している。また、キットは、本明細書に記載したような細胞を培養し、分化させ、または使用する１つ以上の任意の方法を伝える指示書を含有していてもよい。
【０１２０】
（Ｖ．ＤＰＭＳＣ、およびＤＰＭＳＣに由来する分化細胞を使用する方法）
本発明のＤＰＭＳＣは、未分化状態および分化状態の両方で多くの用途を有する。本発明は、上記処置が必要な個体にＤＰＭＳＣを投与する方法を提供する。したがって、本発明のある態様では、ＤＰＭＳＣを、治療を援助するために個体に投与することができる。以下に列挙したすべての状態において、ＤＰＭＳＣ、およびＤＰＭＳＣに由来する分化細胞は、処置目的で使用可能なだけではなく、この状態の治療を援助する目的でも使用可能であることが理解されるべきである。当業者は、ＤＰＭＳＣ集団が、例えば、ある状態を処置するという治療目的のために使用されるとき（例えば、組織修復および／または処置を援助するか、または支援する）、そのＤＰＭＳＣ集団があるべき適切な状態（分化状態と未分化状態）を簡単に決定するであろう。ある状況では、ＤＰＭＳＣを、分化していない多能性状態で使用する。ＤＰＭＳＣを、場合により、個体にさらなる利益を与えるように、（例えば、遺伝学的に）操作してもよい。その他の場合、必要としている個体が上記細胞から利益を得ることができるように特定の経路へと分化を誘導する様式で、ＤＰＭＳＣを培養することがふさわしい場合がある。
【０１２１】
ＤＰＭＳＣ、および本発明のＤＰＭＳＣ選別で使用する培地は、変性疾患または遺伝性疾患を処置するために臨床的に修復する医薬品において、非常に期待が持てるものであり、ＥＳ細胞の使用によって生じる倫理的な問題点もない。エクスビボで増えた自家ＤＰＭＳＣ細胞を、損傷したか、老化したか、または罹患した組織および臓器を修復する目的で自家移植に使用することができる。特定の遺伝子をＤＰＭＳＣ細胞に安定に形質導入する能力によって、変性障害および先天性障害を処置するために、自家細胞を遺伝的に操作することもできる。
【０１２２】
分化して骨細胞を形成するように誘導された本発明のＤＰＭＳＣを、骨粗鬆症、パジェット病、骨折、骨髄炎、骨壊死、軟骨形成不全、骨形成不全、遺伝性多発性外骨腫症、多発性骨端異形成症、マルファン症候群、ムコ多糖症、神経線維腫症または脊柱側弯症、局所的な奇形の再建手術、二分脊椎、半椎または融合した脊椎、肢部の異常、腫瘍で損傷を受けた組織の再構築、感染後（例えば、中耳感染）の再構築における組織再生のための細胞治療として、および／または細胞治療を援助するものとして使用することができる。
【０１２３】
ＤＰＭＳＣを分化誘導し、細胞治療のための骨格筋細胞を形成させることができ、および／または、デュシェーヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、骨格筋ミオパチー、および骨格筋の損傷を修復するための再建手術の処置における、組織修復のための細胞治療を援助することができる。ＤＰＭＳＣを分化誘導し、胃腸管系の進行性の異常（例えば、食道閉鎖症、腸閉塞、腸重積症）の処置における細胞治療または組織修復のために、および、腸梗塞の手術後または結腸間吻合術後に組織を置き換えるために、平滑筋細胞を形成させることができる。また、本発明のＤＰＭＳＣから生成する平滑筋細胞を、膀胱または子宮を再構築するために、新血管形成のために、例えば、アテローム性動脈硬化症または動脈瘤によって損傷した血管を修復するために使用してもよい。平滑筋前駆細胞（メサンギウム細胞）を、糸球体疾患のための、または、糖尿病性ニューロパチーにおける細胞治療または組織再生のためのインビトロモデルとして使用してもよい。平滑筋の前駆体を、血圧を制御する役割を有する、遠位尿細管の緻密斑または傍糸球体組織を修復するのに使用することもできる。
【０１２４】
ＤＰＭＳＣに由来する心筋細胞は、心筋梗塞後の、うっ血性心不全を伴う、弁置換中の、先天性心異常による、または心筋症もしくは心内膜炎によって生じる、心組織損傷を処置するために、組織を修復するための細胞治療および／または細胞治療を援助するのに有用な場合がある。細胞は、局所的に送達してもよいし、特に、有効性を高めるために、注射によって送達してもよい。
【０１２５】
ＤＰＭＳＣから分化した小グリア細胞を、脊髄損傷および神経変性障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病）を処置するのに、ならびに、中枢神経系が影響を受ける感染症の間に損傷した組織を修復するのに使用することができる。サイトカインを産生するように遺伝的に改変した小グリア細胞を、血液脳関門によってアクセスが制限されている中枢神経系の感染症を処置するための移植でも使用することができる。また、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳がんの結果生じる脳卒中の後、神経組織を再生するために、および、脊髄損傷後に再生するために、成長因子または成長因子インヒビターを産生させるために、グリア細胞を用いることもできる。
【０１２６】
ＤＰＭＳＣから分化させた小グリア細胞を、神経外胚葉細胞へと分化誘導し、脊髄損傷および神経変性障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病）の処置するために、ならびに、中枢神経系が影響を受ける感染症の間に損傷した組織を修復するために使用することができる。サイトカインを産生するように遺伝的に改変した小グリア細胞を、血液脳関門によってアクセスが制限されている中枢神経系の感染症を処置するための移植でも使用することができる。また、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳がんの結果生じる脳卒中の後、神経組織を再生するために、および、脊髄損傷後に再生するために、成長因子または成長因子インヒビターを産生させるために、グリア細胞を用いることもできる。乏突起膠細胞および星状膠細胞を生成するように誘導されたＤＰＭＳＣを、例えば、脱髄した組織（特に、脊髄）に移植するために使用することができ、これらの細胞は、周囲にある神経組織を有髄化するように機能する。この技術は、乏突起膠細胞および星状膠細胞の前駆体の供給源として胚幹細胞を用いて、マウスにおいて、有効であることが示されている（Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５：７５４−７５６）。本発明のＤＰＭＳＣは、胚細胞の広範囲の分化特性を示すことが可能であるが、移植のための自家細胞を与えるというさらなる利点をもたらすことができる。したがって、本発明のＤＰＭＳＣまたはその神経に関連する分化細胞を、神経の欠損または変性を伴う疾患（中でも、限定されないが、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳに関連する痴呆、脊髄損傷、脳または他の神経に影響を与える代謝性疾患が挙げられる）を処置するのに用いることができる。
【０１２７】
本発明の細胞のその他の用途としては、ＤＰＭＳＣ集団の子宮内移植を行い、移植後で、かつ出生前または出生後のヒトまたは動物においてヒト細胞を産生するように組織または細胞のキメラ現象を生じさせることによって、治療用の酵素、タンパク質、または他の生体産物をもたらすことが挙げられ、ここで、上述の細胞は、遺伝的欠陥を修正するように、ヒトまたは動物において治療用の酵素、タンパク質、または他の生体産物を産生する。
【０１２８】
本発明は、（ａ）ＤＭＰＳＣを培養して増殖させる工程と、（ｂ）有効量の上述の増やしたＤＰＭＳＣと、個体の損傷を受けた組織とを接触させて、治療を支援する工程とを含む、それが必要なヒト個体において、損傷を受けた組織のための治療を提供する方法を含む。上述の細胞を、局所的な注射または全身注入によって個体の体内に導入してもよい。上述の細胞を、適切なマトリックスインプラントと組み合わせて、個体の体内に導入してもよい。マトリックスインプラントは、さらなる遺伝物質、サイトカイン、成長因子、または細胞の増殖および分化を促進する他の因子を提供してもよい。上述の細胞を、個体の体内に導入する前に、例えば、ポリマーカプセルに封入してもよい。
【０１２９】
また、本発明は、表現型のデータを得ることが可能な、統計学的に有意な個体集団からＤＰＭＳＣを単離する工程と、上述の統計学的に有意な個体集団に由来するＤＰＭＳＣを増やし、ＤＰＭＳＣ培養物を樹立する工程と、上述の培養したＤＰＭＳＣ中にある少なくとも１つの遺伝子多型を同定する工程と、上述の培養したＤＰＭＳＣを分化誘導させる工程と、正常な遺伝子型を有するＤＰＭＳＣが示す分化パターンと、同定した遺伝子多型を有するＤＰＭＳＣが示す分化パターンとを比較することによって、少なくとも１つの遺伝子多型に関連する異常な代謝プロセスを特性決定する工程とを含む、生理学的異常に関連する遺伝子多型を同定するためにＤＰＭＳＣを用いる方法を提供する。
【０１３０】
本発明は、殺腫瘍性タンパク質、抗血管形成性タンパク質、または抗原に対する免疫反応の刺激に関連するタンパク質と共に腫瘍細胞表面に発現するタンパク質を発現するようにＤＰＭＳＣを遺伝的に改変する工程と、遺伝的に改変したＤＰＭＳＣを、抗がん効果を発揮させるのに有効な量で個体に導入する（例えば、がん細胞の成長を止めるか、またはがん細胞を死滅させるための異なる様式で、培養した細胞を改変し、この細胞を使用する）工程とを含む、個体においてがんを処置する方法（または、ある実施形態では、治療用タンパク質を、がんを有する個体に送達する方法）をさらに提供する。
【０１３１】
本発明は、統計学的に有意な個体集団からＤＰＭＳＣを単離し、統計学的に有意な個体集団からのＤＰＭＳＣを増やし、複数のＤＰＭＳＣ培養物を樹立し、上述のＤＰＭＳＣ培養物と、１つ以上の生物学的作用物質または薬理学的作用物質とを接触させ、上述の１つ以上の生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する１つ以上の細胞応答を同定し、統計学的に有意な集団中の個体に由来するＤＰＭＳＣ培養物の１つ以上の細胞応答を比較することによる、生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する細胞応答を特性決定するためにＤＰＭＳＣを用いる方法を提供する。
【０１３２】
別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、歯の疾患を処置するために、歯の成分となる物質を作り出すために使用することができる。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、皮膚移植術および形成術に利用可能な、多能性幹細胞に由来する皮膚上皮組織を成長させるために使用することができる。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、筋肉（例えば、陰茎または心臓の筋肉）を増強するために使用することができる。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、治療用途のためにエクスビボで血液を作り出すために、または、出生前または出生後の動物において、ヒトに用いるためにヒト造血細胞および／または血液を作り出すために使用することができる。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、がん処置における化学療法または放射線療法から患者を回復させるのを支援するため、自己免疫疾患の処置においてレシピエントの耐容性を誘導するため、治療薬として使用することができる。別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、ＡＩＤＳまたは他の感染症を処置するために使用することができる。
【０１３３】
別の態様では、本発明のＤＰＭＳＣ細胞を、心疾患（限定されないが、心筋炎、心筋症、心不全、心臓発作によって引き起こされる損傷、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心臓弁の機能不全が挙げられる）を処置するために使用することができる。遺伝的に操作した哺乳動物に由来する多能性幹細胞、またはその分化した子孫細胞を、ＣＮＳの欠損または損傷に関連する疾患を処置するために使用することができる。
【０１３４】
ＤＰＭＳＣ集団またはその分化した子孫細胞（例えば、間質細胞）を、インビボまたはインビトロで他の細胞型（限定されないが、造血細胞、膵島細胞またはβ細胞、肝実質細胞などを含む）の増殖および分化を助けるために使用することができる。幹細胞、または軟骨に分化した子孫細胞を、関節または軟骨の疾患（限定されないが、軟骨裂傷、軟骨の菲薄化、変形性関節症を含む）を処置するために使用することができる。さらに、幹細胞または骨芽細胞に分化した子孫細胞を、骨に悪い影響を及ぼすプロセス（中でも、限定されないが、骨折、治癒していない骨折、変形性関節症、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｌｏｍａ）のような骨に広がる腫瘍によって引き起こされる骨の「穴」などを含む）の改善を支援するために使用することができる。
【０１３５】
また、本発明は、本明細書に記載するような、ＤＰＭＳＣの少なくとも１つの遺伝子プロフィールのデータべースを提供する方法、および、薬物探査を支援するような、このデータバンクの使用を包含する。したがって、一態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの個体由来のＤＰＭＳＣから、少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子プロフィールを決定する工程と、（ｂ）この遺伝子プロフィールを、アクセス可能な媒体に格納する工程とによって、薬物探査を支援するための、多能性が誘導された幹細胞の遺伝子プロフィールのデータベースを提供する方法を提供する。
【０１３６】
本発明の細胞を、先天性の神経変性障害または貯蔵障害（例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー（球様細胞白質萎縮症、カナバン病）、フコース蓄積症、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマンピック病、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、テイサックス病など）を処置するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用することができる。また、本発明の細胞を、外傷性障害（例えば、脳卒中、ＣＮＳの出血、ＣＮＳの外傷）；末梢神経系障害（例えば、脊髄損傷または脊髄空洞症）；網膜の障害（例えば、網膜剥離、黄斑変性および他の網膜の変性障害、糖尿病性網膜症）に使用することもできる。
【０１３７】
また、本発明は、それが必要な個体に、特異的に分化した細胞を投与する工程を含む、特異的に分化した細胞を治療のために使用する方法を提供する。さらに、内因性遺伝子または導入遺伝子を選択的に発現するように遺伝的に操作した多能性幹細胞の使用、および、ある疾患を処置するために個体に移植／投与するための、インビボで増殖したＤＰＭＳＣの使用を提供する。例えば、多能性幹細胞またはＤＰＭＳＣに由来する神経網膜細胞を、限定されないが、神経網膜疾患（限定されないが、黄斑変性、糖尿病性網膜症、緑内障または網膜色素変性によって引き起こされる）によって引き起こされる失明を処置するために使用することができる。上述の細胞を、ある細胞を個体に生着させるために使用することができ、これは、自家細胞、同種異系細胞または外因性細胞を哺乳動物に投与し、組織に特異的な代謝機能、酵素機能、凝固機能、構造的機能または他の機能を回復させるか、または修正することを含む。分化した幹細胞を哺乳動物に投与するために、上述の細胞を、ある細胞を個体に生着させるために使用することができ、これは、インビボで細胞型に分化させることができる。上述の細胞、またはインビトロもしくはインビボで分化した子孫細胞を、遺伝性疾患、変性疾患、心臓血管疾患、代謝性貯蔵疾患、神経疾患、またはがん疾患プロセスを修正するために使用することができる。
【０１３８】
移植で、免疫拒絶を防ぐためにいくつかのアプローチを使用してもよい。万能ドナー細胞に関し、ＤＰＭＳＣを、遺伝性疾患または他の疾患を治し、酵素を置き換えるための細胞治療および遺伝子治療のための万能ドナー細胞として役立つように操作することができる。未分化ＤＰＭＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ型、ＨＬＡ−ＩＩ型のｍＲＮＡを発現し、タンパク質を非常に少ない割合で発現する。ＤＰＭＳＣを、ＨＬＡ−Ｉ型抗原およびＨＬＡ−ＩＩ型抗原を除去し、可能性として、候補レシピエントに由来するＨＬＡ抗原を導入することによって、この細胞が、ＮＫが介在する殺傷の容易な標的となることを避け、無制限のウイルス複製および／または悪性転換を受けやすくなるのを避けて、万能ドナー細胞として役立つように修飾し得る。ＨＬＡ−抗原の除去は、相同的組み換えによって、またはプロモーター領域に点変異を導入することによって、または、抗原の最初のエクソンに点変異を導入して停止コドンを導入することによって（例えばキメラプラスト（ｃｈｉｍｅｒｏｐｌａｓｔ）を用いて）達成することができる。宿主のＨＬＡ抗原の移動は、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスまたは他のウイルスの形質導入によって、または、標的細胞をＨＬＡ−抗原のｃＤＮＡでトランスフェクションすることによって達成することができる。ＤＰＭＳＣを、体内または血液における、タンパク質のある量または所与の範囲またはレベルを確立し、設定するために用いることができる。
【０１３９】
免疫認識を避けるための子宮内移植に関し、ＤＰＭＳＣを、遺伝的異常を修正するように、または、細胞を導入するように（これは免疫システム発生前の宿主によって許容される）設定している子宮内移植で使用することができる。これは、動物において大量にヒト細胞（例えば、血液）を作り出す様式であり得、または、正しいタンパク質または酵素を作り出す細胞を移植することによって、ヒト胚の遺伝的欠陥を修正する様式として使用することができる。
【０１４０】
また、本発明は、望ましい遺伝子産物をコードする、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物を細胞に導入することによって細胞を遺伝的に改変する工程と、この細胞を培地で増やす工程と、この細胞を個体の体内に導入し、望ましい遺伝子産物を産生する工程とを含む、治療的処置を必要とする個体において、遺伝子治療にＤＰＭＳＣを用いる方法を提供する。今まで、遺伝子治療に使用されるヒト細胞は、本質的に、骨髄および皮膚細胞に限定されていた。その理由は、他の種類の細胞は、体から抽出し、培地で増殖させ、遺伝的に改変し、次いで、その組織を採取した患者に首尾よく再び移植することができなかったためである。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９２：３０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９５）２７３：１５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３を参照。本発明のＤＰＭＳＣは、体から抽出され得、単離され得、未分化状態のままで培地で増殖させられ得、または、培地中で分化誘導させられ得、種々の技術を用いて遺伝的に改変され得る（特に、ウイルス形質導入）。遺伝物質の取り込みおよび発現は、実証することが可能であり、外来ＤＮＡの発現は、増殖の間、安定である。外来ＤＮＡを幹細胞に挿入するためのレトロウイルスおよび他のベクターは、当業者に公知である。例えば、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９８）７２（１１）：８８７３−８８８３；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１（１２）：９４６６−９４７４；Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０（９）：３３０４−３３１５；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０（６）：９３５−９４５；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）２２７（３）：７０７−７１１を参照。レトロウイルスベクターを用いて形質導入したら、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅＧＦＰ））の発現は、最終的に分化した筋肉細胞、および単離したＤＰＭＳＣに由来する内皮でも続き、このことは、ＤＰＭＳＣに導入したレトロウイルスベクターの発現が分化中も続いていることを示している。
【０１４１】
造血幹細胞は、分化可能性が限定的であるが、遺伝子治療への有用性を示している（Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．（１９９５）７：５６−６３を参照）。本発明の細胞は、レトロウイルスベクターを未分化幹細胞に導入したとしても、最終的に分化した筋肉細胞、内皮、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞が、高感度緑色蛍光タンパク質の発現を保持しているという事実が示すように、最終的に分化した場合に、形質導入されたＤＮＡまたはトランスフェクトされたＤＮＡを保持することが可能な広範囲の分化細胞型を与える。
【０１４２】
本発明のＤＰＭＳＣは、その上、遺伝子治療に関して、造血幹細胞と比べて他の利点を与える。本発明の幹細胞は、局所麻酔で得られた骨髄吸引物から比較的容易に単離され、培地で増やすのが容易であり、外因性遺伝子でトランスフェクションするのが容易である。同じ目的のために十分な数の造血幹細胞は、少なくとも１Ｌの骨髄から単離しなければならず、さらに、この細胞を培地で増やすことは困難である（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：７１−７４を参照）。
【０１４３】
遺伝子治療の候補遺伝子としては、例えば、アポリポタンパク質Ｅ（アルツハイマー病および心臓血管疾患のリスクと相関関係にある）、ＭＴＨＦＲ（改変体はホモシステインレベルの上昇および脳卒中リスクの上昇と関連する）、Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ（血栓症のリスクと相関関係にある）、ＡＣＥ（改変体は心疾患のリスクと相関関係にある）、ＣＫＲ−５（ＨＩＶに対する耐性と関連がある）、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、これを欠くと、レッシュナイハン病を引き起こす）、ＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、これを欠くと、重篤な免疫不全疾患を引き起こす）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ、これを欠くと、重篤な複合免疫不全疾患を引き起こす）、ｐ２１（毛細血管拡張性運動失調症を処置するための候補遺伝子として提案されている）、ｐ４７（これを欠くことは、慢性肉芽腫症患者の好中球のオキシダーゼ活性の欠如と相関関係にある、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ５５０６７およびＭ３８７５５）、Ｒｂ（腫瘍の形成に関連する網膜芽細胞腫感受性遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１５４００）、ＫＶＬＱＴｌ（カリウムチャネルタンパク質、不整脈と関連する異常形態、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４０９９０）、ジストロフィン遺伝子（デュシェーヌ型筋ジストロフィーに関連する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１８５３３、Ｍ１７１５４、Ｍ１８０２６）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症に関連する膜貫通コンダクタンス制御因子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２８６６８）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（毛細血管拡張性運動失調症に関連する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２６４５５）、ＶＨＬ（このタンパク質の減少または変異が、フォンヒッペルリンドウ病と関連する：Ｌａｔｉｆ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６０：１３１７−１３２０）をコードする遺伝子が挙げられる。上記の遺伝的に改変した細胞を用いて有効に処置可能な他の疾患としては、第ＩＸ因子欠乏、アデノシンデアミナーゼ欠損症（重篤な複合免疫不全疾患、すなわちＳＣＩＤＳに関連する）、糖尿病、グルコセレブロシダーゼα−イズロニダーゼ欠損症が挙げられる。
【０１４４】
これらの新規遺伝子は、酵素レベルが制御され得るように、誘導プロモーターによって駆動され得る。これらの誘導プロモーター系としては、産生すべきタンパク質に結合するヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインの変異体を挙げることができる。これは、タンパク質を発現させるために、個体にタモキシフェンを摂取させることが必要である。代替法は、テトラサイクリンによるオンオフシステム、ＲＵ４８６、ラパマイシンによる誘導システムである。相対的に選択的な発現を得るためのさらなる方法は、組織特異的なプロモーターを使用することである。例えば、脳において、ニューロン特異的なエノラーゼプロモーター（Ａｄ−ＮＳＥ）またはグリア線維酸性タンパク質プロモーター（ＧＦＡＰ）プロモーターによって駆動される遺伝子を導入することができ、これは、脳組織においてほとんどもっぱら発現することを可能にする。同様に、ＴｅｃプロモーターまたはＶＥ−カドヘリンプロモーターを用いることによって、内皮のみでの発現が得られるであろう。
【０１４５】
遺伝的に改変したＤＰＭＳＣを局所的に導入してもよく、または、全身に注入してもよい。分化可能性がさらに制限されているヒト幹細胞は、第ＩＸ因子の遺伝子でトランスフェクトすると、ＳＣＩＤマウスに全身注入してから少なくとも８週間後に、タンパク質を分泌する。例えば、Ｋｅａｔｉｎｇ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８：３９２１を参照。本発明のＤＰＭＳＣは、他の非胚性幹細胞よりも大きな分化可能性を有しており、サイトカイン、成長因子、他の因子が細胞の分化を誘導する種々の組織に移動することが可能なため、全身投与または局所投与のためのさらなる利点を与える。周辺組織の一部分になった分化細胞は、導入した遺伝子のタンパク質産物を産生する能力を保持している。
【０１４６】
パーキンソン病において、例えば、治験から、死体のヒト胚から得られた中脳のドーパミンニューロンが、パーキンソン病患者の脳で生き残り、機能できることが示されている。ＰＥＴスキャンは、細胞移植周辺領域での［１８Ｆ］フルオロドーパの取り込みが、移植後に増加し、少なくとも６年間そのまま維持されている患者もいることを示している。例えば、Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｓ．およびＡ．Ｂｉｏｒｋｌｕｎｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９９（Ｓｕｐｐｌ．）Ａ３２−Ａ−３９；Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：６３５−６３６；Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：６５３−６５９を参照。胚細胞とは異なり、本発明で記載したようなＤＰＭＳＣ単離物は、移植のための細胞の供給を容易にし、胚細胞移植治療を疾患治療のための魅力的な代替法にする分化可能性を維持している。
【０１４７】
ＡＩＤＳ治療の場合、本発明のＤＰＭＳＣを、Ｒｅｖ  Ｍ１０（ＨＩＶに感染した細胞で産生される野生型Ｒｅｖの機能を抑止する、Ｒｅｖのトランスドミナントネガティブ変異体）を産生するように遺伝的に操作することができる。例えば、Ｂｅｖｅｃ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９８７０−９８７４；Ｒａｎｇａ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５（３）：１２０１−１２０６を参照。造血系統の細胞へと分化誘導し、患者に導入すると、ＤＰＭＳＣは、ＨＩＶ感染患者で激減したＴ細胞の供給を再配置することができる。遺伝的に改変した細胞が、変異型Ｒｅｖ  Ｍ１１０を有しているため、これらの細胞は、ほとんどのＨＩＶ株による感染の致死効果に対し、耐性である可能性が高いと思われる。
【０１４８】
また、遺伝的に改変したＤＰＭＳＣを、この細胞を宿主の免疫システムから守りつつ、分泌タンパク質を産生するように、不活性キャリアに封入することができる。細胞をマイクロカプセル化する技術は、当業者に公知であり、例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７（２）：７８−８３を参照。細胞をマイクロカプセル化するための材料としては、例えば、ポリマーカプセル、アルギネート−ポリ−Ｌ−リジン−アルギネートマイクロカプセル、バリウムポリ−Ｌ−リジンアルギネートカプセル、バリウムアルギネートカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）中空繊維、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維が挙げられる。米国特許第５，６３９，２７５号（Ｂａｅｔｇｅ，Ｅ．ら）には、例えば、遺伝的に操作した細胞を含有する生体適合性カプセルを用い、長期間にわたって、生体活性分子を安定に発現する、改良されたデバイスおよび方法が記載されている。このような生体適合性免疫隔離（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）カプセルを、本発明のＤＰＭＳＣと組み合わせ、多くの生理学的障害（例えば、糖尿病およびパーキンソン病を含む）を処置する方法を提供する。
【０１４９】
糖尿病患者において、例えば、生理学的治療レベルのインスリンを産生するように遺伝的に改変された異種幹細胞を、患者の組織に送達するために封入してもよい。または、自家幹細胞を、上に記載したようにレトロウイルスベクターで形質導入するために、患者自身の骨髄吸引物から誘導してもよい。生理学的治療レベルのインスリンを産生するように遺伝的に改変すると、上述の細胞を、ＣｈａｎｇまたはＢａｅｔｇｅによって記載されているように封入し、患者の組織（ここで、この細胞は長期間にわたってインスリンを産生し続ける）に導入することができる。
【０１５０】
本発明の細胞をマイクロカプセル化する別の利点は、マイクロカプセルに種々の細胞を組み込むチャンスであり、それぞれ、生物学的な治療分子を産生する。本発明のＤＰＭＳＣを、複数の別個の系統に分化誘導し得、それぞれを、治療に有効なレベルの生体活性分子を産生するように遺伝的に改変することができる。異なる遺伝要素を有するＤＰＭＳＣを一緒に封入し、種々の生体活性分子を産生させることができる。
【０１５１】
本発明のＤＰＭＳＣをエクスビボで遺伝的に改変し、１つ以上の望ましい遺伝子産物を発現させることができる。次いで、ＤＰＭＳＣをエクスビボでスクリーニングするか、または選別し、首尾よく改変されている細胞を同定し、これらの細胞を、個体に局所的または全身的に再導入することができる。または、ＤＰＭＳＣを遺伝的に改変し、培養し、移植のための特定の細胞系統を作り出すように分化誘導することができる。いずれかの場合にも、移植したＤＰＭＳＣは、望ましい遺伝子産物を発現することが可能な、安定にトランスフェクトされた細胞源をもたらす。特に、患者自身の骨髄吸引物がＤＰＭＳＣ源である場合、この方法は、移植細胞を作り出すのに、免疫学的に安全な方法を提供する。この方法を、多くの例の中でいくつかを挙げると、糖尿病、心筋症、神経変性疾患、アデノシンデアミナーゼ欠損症を処置するのに使用することができる。糖尿病において、例えば、ＤＰＭＳＣを単離し、インスリンを産生するように遺伝的に改変し、次いで、この疾患を患っている患者に移植することができる。疾患が自己免疫と関連している場合、免疫サーベイランスを避けるために、改変したＭＨＣを発現するか、またはＭＨＣを発現しないようにＤＰＭＳＣを遺伝的に改変することができる。移植した膵島細胞でＭＨＣ発現を抑制することは、ウイルスゲノムのＥ３領域を発現するアデノウイルスベクターを用いて首尾よく行われる。本発明者らが示しているように、本発明の細胞は安定にトランスフェクト、または形質導入され得、したがって、糖尿病患者に移植するためのより永久的なインスリンの供給源を提供することができる。
【０１５２】
ドナーＤＰＭＳＣは、特に、ＭＨＣ発現を変えるように遺伝的に改変されている場合、および、自家ＤＰＭＳＣは、望ましいヘモグロビン遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変されている場合、鎌状赤血球貧血およびサラセミアを処置するための細胞治療に特に有効であろう。
【０１５３】
（ＤＰＭＳＣを遺伝的に改変する方法）
本明細書に記載する方法によって単離した細胞を、当業者に公知の種々の方法によって、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入することによって遺伝的に修飾することができる。これらの方法は、一般的に、主要な４つのカテゴリーにグループ分けされる。（１）ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクターの使用を含むウイルス移動（ｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルス、ウシパピローマウイルスなど；（２）リン酸カルシウムトランスフェクション法およびＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法を含む、化学的移動；（３）例えば、リポソーム、赤血球ゴースト、プロトプラストのようなＤＮＡを含む膜性ビヒクルを用いる、膜融合移動；（４）物理的な移動技術、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または直接的な「裸の」ＤＮＡの移動。
【０１５４】
ＤＰＭＳＣを、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物を挿入することによって、あらかじめ選択しておいたＤＮＡ単離物で細胞ゲノムのあるセグメントを置換することによって、または、細胞の細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失または不活性化によって、遺伝的に改変することができる。細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失または不活性化は、例えば、種々の手段（限定されないが、遺伝的組み換えを含む）によって、アンチセンス技術（ペプチド核酸、すなわちＰＮＡの使用を含んでいてもよい）によって、または、リボザイム技術によって達成することができる。あらかじめ選択しておいた１つ以上のＤＮＡ配列の挿入は、相同的組み換えによって、または、宿主細胞ゲノムへのウイルス組み込みによって達成することができる。また、望ましい遺伝子配列を、プラスミド発現ベクターおよび核局在配列を用い、細胞、特に核に組み込んでもよい。ポリヌクレオチドを核に向けて移動させる方法は、当該分野で記載されている。遺伝物質を、目的の遺伝子が特定の化学物質／薬物を用いて正または負に誘導され、所与の薬物／化学物質を投与した後に除かれることを可能にするプロモーターを用いて導入することができ、または、化学物質による誘導（限定されないが、タモキシフェン応答性のエストロゲン受容体変異体）、特定の細胞区画における発現（限定されないが、細胞膜を含む）を可能にするようにタグ化することができる。
【０１５５】
（相同的組み換え）
リン酸カルシウムによるトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ／カルシウムイオンの沈着物に依存しており、この方法を用い、標的遺伝子またはポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡをＤＰＭＳＣ単離物または培養物に導入することができる。簡単に言うと、プラスミドＤＮＡを、塩化カルシウム溶液内で混合し、次いで、リン酸緩衝化溶液に加える。沈殿が生成したら、培養した細胞に上述の溶液を直接加える。ＤＭＳＯまたはグリセロールでの処理を用いて、トランスフェクションの効率を高めることができ、ビス−ヒドロキシエチルアミノエタンスルホネート（ＢＥＳ）を用いて、安定な形質転換体のレベルを高めることができる。リン酸カルシウムによるトランスフェクションシステムは、市販されている（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．製のＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標））。
【０１５６】
ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションはまた、当業者に公知であり、一時的なトランスフェクションが望ましい場合には、しばしばより高効率であるため、リン酸カルシウムによるトランスフェクションよりも好ましい場合がある。
【０１５７】
本発明の細胞が細胞単離物であるため、マイクロインジェクションは、細胞に遺伝物質を移動させるのに特に有効な場合がある。簡単に言うと、細胞を、光学顕微鏡のステージに置く。顕微鏡によって与えられる拡大を利用しつつ、ガラス製マイクロピペットを核に導き、ＤＮＡまたはＲＮＡを注入する。この方法は、望ましい遺伝物質を核に直接送達するため、注入したポリヌクレオチドの細胞質性分解およびリソソーム性分解が避けられるので有益である。この技術は、トランスジェニック動物の生殖系列修飾を達成するために有効に使用されている。
【０１５８】
また、本発明の細胞は、エレクトロポレーションを用いて遺伝的に修飾することができる。標的となるＤＮＡまたはＲＮＡを、培養した細胞の懸濁物に加える。ＤＮＡ／ＲＮＡ細胞の懸濁物を、２つの電極の間に置き、電気パルスに供し、膜を貫通する孔を発生させることによって、細胞の外側の膜を一時的に透過性にする。標的ポリヌクレオチドが、膜に開いた孔を通って細胞に入り、そして、電場を中止すると、この孔は約１〜３０分で閉じる。
【０１５９】
細胞を遺伝的に修飾するための、ＤＮＡまたはＲＮＡのリポソーム送達は、ポリヌクレオチドと安定な複合体を形成する陽イオン性リポソームを用いて行うことができる。リポソーム複合体を安定化するために、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を加えてもよい。リポソーム移動のための推奨される試薬は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、市販されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）は、例えば、陽イオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロリドおよびＤＯＰＥの混合物である。線形ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡの送達は、リポソーム送達を用いて、インビトロまたはインビボで達成することができ、リポソーム送達は、リポソームが大きなＤＮＡ片を運ぶことができ、一般的にポリヌクレオチドを分解から守ることができ、特定の細胞または組織に標的化され得るという事実のため、好ましい方法であり得る。リポソーム技術による多くの他の送達システムも市販されており、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＦｕＧｅｎｅ  ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。陽イオン性脂質が介在する遺伝子移動の効率は、精製ウイルスまたは細胞エンベロープ成分（例えば、水疱性口内炎ウイルスエンベロープの精製Ｇ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ））をＡｂｅ，Ａ．らの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：６１５９  ６１６３）に組み込むことによって高めることができる。
【０１６０】
リポポリアミンでコーティングされたＤＮＡを用いる、初代哺乳動物細胞株および樹立した哺乳動物細胞株にＤＮＡを送達するのに有効であることが示されている遺伝子移動技術を使用し、標的ＤＮＡをＤＰＭＳＣに導入することができる。この技術は、一般的に、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．およびＢｅｈｒ，Ｊ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９３）２１７：５９９−６１８によって記載される。
【０１６１】
裸のプラスミドＤＮＡを、単離したＤＰＭＳＣに由来する分化細胞で形成された組織の塊に直接注入することができる。この技術は、プラスミドＤＮＡを骨格筋組織に移動させるのに有効であることが示されており、マウス骨格筋での発現が、筋肉内に１回注射してから１９ヶ月を超える期間で観察されている。より迅速に分裂する細胞は、裸のプラスミドＤＮＡをもっと効率的に取り込む。したがって、プラスミドＤＮＡで処理する前に、細胞分裂を刺激することは有益である。
【０１６２】
また、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による遺伝子移動を使用し、インビトロまたはインビボで遺伝子をＤＰＭＳＣに移動させることができる。マイクロプロジェクタイルによる遺伝子移動の基本的な手順は、Ｊ．ＷｏｌｆｆによってＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９９４）の１９５ページに記載された。簡単に言うと、標的遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを、通常は、１〜３ミクロンの大きさの金粒子またはタングステン粒子である、マイクロビーズ上にコーティングする。コーティングされた粒子を、放電チャンバの上に挿入されたキャリアシート上に置く。放電したら、キャリアシートを固定スクリーンに向けて進める。固定スクリーンは、キャリアシートがさらに移動するのを止める障壁を形成し、ポリヌクレオチドでコーティングされた粒子が、通常は、ヘリウム流によって標的表面（例えば、分化ＤＰＭＳＣで形成された組織の塊）に向かって噴射される。微粒子注入技術は、すでに記載されており、この方法は、当業者に公知である（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（ＮＹ）（１９９３）１５：２２５−２３６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２７２６−２７３０；Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：９５６８−９５７２を参照）。
【０１６３】
Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）１６：８０−８５）によって記載されるように、シグナルペプチドをプラスミドＤＮＡに接続し、もっと効率的に発現させるために、核にＤＮＡを向かわせることができる。
【０１６４】
本発明のＤＰＭＳＣおよびその子孫細胞を遺伝的に改変するために、ウイルスベクターを用いる。すでに記載されている物理的方法のように、ウイルスベクターを使用し、１つ以上の標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、またはリボザイム配列を、例えば、細胞に送達する。ウイルスベクターおよびＤＮＡを細胞に送達するためにこれらを使用する方法は、当業者に周知である。本発明の細胞を遺伝的に改変するために使用可能なウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター）、ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【０１６５】
レトロウイルスベクターは、迅速に分裂する細胞に形質導入するのに有効であるが、同様に、分裂していない細胞にＤＮＡを効果的に移動させるための多くのレトロウイルスベクターが開発されている（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：８８７３−８８８３）。レトロウイルスベクターについてのパッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、当業者に公知である。パッケージング細胞株は、カプシド産生およびウイルスベクターのビリオン成熟に必要なウイルスタンパク質を提供する。一般的に、これらは、ｇａｇレトロウイルス遺伝子、ｐｏｌレトロウイルス遺伝子、ｅｎｖレトロウイルス遺伝子を含む。適切なパッケージング細胞株は、レトロウイルスベクター系に対しある程度の特異性を提供する、同種指向性、異種指向性、または両種性であるレトロウイルスベクターを産生するための、既知の細胞株の中から選択される。
【０１６６】
レトロウイルスＤＮＡベクターは、一般的に、パッケージング細胞株とともに使用し、細胞内で、望ましい標的配列／ベクターの組み合わせを産生する。簡単に言うと、レトロウイルスＤＮＡベクターは、マルチクローニング部位の近くに配置されている２つのレトロウイルスＬＴＲと、ＳＶ４０プロモーターとを含有するプラスミドＤＮＡであり、第１のＬＴＲは、ＳＶ４０プロモーターに対して５に配置されており、ＳＶ４０プロモーターはマルチクローニング部位にクローニングされる標的遺伝子配列に作動可能に結合し、次いで、３に第２のＬＴＲが結合している。一旦生成したら、すでに記載されているように、リン酸カルシウムが介在するトランスフェクションを用い、レトロウイルスＤＮＡベクターを、パッケージング細胞株に移すことができる。ウイルスを産生してから約４８時間後に、標的遺伝子配列を含有するウイルスベクターを得る。
【０１６７】
レトロウイルスベクターを特定の細胞型に標的化することは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．らによって示され（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：６９２３−６９２９）、彼らは、両種性マウス白血病ウイルスエンベロープに融合した、表面糖タンパク質高分子量黒色腫関連抗原に対する単鎖可変フラグメント抗体を使用し、上記ベクターを標的化し、標的遺伝子を黒色腫細胞に送達した。標的化した送達が望ましい場合、例えば、分化細胞が、遺伝的改変の望ましい目的である場合、本発明のＤＰＭＳＣに由来するそれぞれの分化細胞系統によって発現する特定のマーカーに対する抗体フラグメントに融合したレトロウイルスベクターを用い、これらの細胞に標的を送達してもよい。
【０１６８】
また、レンチウイルスベクターを用い、本発明の細胞を遺伝的に改変する。多くのこのようなベクターは、文献に記載されており、当業者に公知である。Ｓａｌｍｏｎｓ，Ｂ．およびＧｕｎｚｂｕｒｇ，Ｗ．Ｈ．、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：１２９−１４１。これらのべクターは、ヒト造血幹細胞を遺伝的に改変するのに有効である（Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：５７８１−５７８８）。パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターについて記載されている（Ｋａｆｒｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：５７６−５８４；Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：８４６３−８４７１を参照）。
【０１６９】
組み換えヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）は、エリスロポエチン受容体を発現する細胞へのＤＮＡ送達を標的とするために、首尾よく使用されている（Ｌａｑｕｅｒｒｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：９６８３−９６９７）。また、これらのベクターを用い、本発明の細胞を遺伝的に改変してもよく、本発明者らは、ウイルスベクターによって安定に形質導入されることを示した。
【０１７０】
アデノウイルスベクターは、高い形質導入効率を有しており、ＤＮＡ挿入物を８Ｋｂまで組み込むことができ、複製細胞および分化細胞の両方を感染させることができる。多くのアデノウイルスベクターが文献に記載されており、当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２１９−２２３；Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３を参照）。標的ＤＮＡをアデノウイルスベクターに挿入する方法は、標的ＤＮＡを特定の細胞型に導入するために、組み換えアデノウイルスベクターを用いる方法のように、遺伝子治療の技術者に知られている（Ｗｏｌｄ，Ｗ．、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９８）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．を参照）。特定の細胞型に対する結合アフィニティは、ウイルスベクターの線維配列を修飾することによって示される。アデノウイルスベクター系は、遺伝子移動における制御されたタンパク質発現を可能にすることが記載されている（Ｍｏｌｉｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：８３５８−８３６１）。また、遺伝的に改変された受容体特異性を有するアデノウイルスベクターを増やし、特定の細胞型を標的として形質導入するシステムも記載されている（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：４７０−４７５）。近年記載されているヒツジアデノウイルスベクターは、さらに、既存の体液性免疫による、良好な遺伝子移動を妨害する可能性に対処する（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：６９３０−６９３６）。
【０１７１】
また、アデノウイルスベクターは、標的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡと、ポリリジン（これは複製能力のないアデノウイルスに結合している）とを縮合させることによって構築された分子結合体ベクターを用いる、標的化された遺伝子移動および安定な遺伝子発現を提供可能である（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：  ８５６３−８５７１）。
【０１７２】
アルファウイルスベクター（特に、シンドビスウイルスベクター）も、本発明の細胞に形質導入するために利用可能である。これらのベクターは、市販されており（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）、例えば、米国特許第５，８４３，７２３号、ならびにＸｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：１１８８−１１９１；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６４３９−６４４６；およびＦｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１１３７１−１１３７７に記載されている。
【０１７３】
また、本発明の幹細胞を、組織修復のために使用することができる。本発明者らは、本発明のＤＰＭＳＣが分化して多くの細胞型（線維芽細胞、骨芽細胞、（骨格筋、平滑筋、心筋）細胞を含む）を形成することを示している。例えば、本明細書にすでに記載した方法によって、骨芽細胞に分化するように誘導されたＤＰＭＳＣを、骨に移植し、修復プロセスを促進するか、弱くなった骨を強化するか、または関節表面を再び平らにする（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）ことができる。
【０１７４】
また、マトリックスは、本発明の細胞を特定の解剖学的部位に送達するために使用され、この部位で、細胞によって取り込まれるために、マトリックスに組み込まれた特定の成長因子、または、マトリックスに組み込まれたプラスミドにコードされた特定の成長因子は、最初の細胞集団を増殖させるために使用され得る。例えば、特定のポリマーマトリックスの形成で使用される発泡プロセス中に、ＤＮＡを、マトリックスの孔に組み込むことができる。発砲プロセスで使用されるポリマーが広がるにつれて、ＤＮＡが孔に取り込まれ、このことは、プラスミドＤＮＡの制御された持続放出を可能にする。このようなマトリックス調製方法は、Ｓｈｅａらによって、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：５５１−５５４に記載されている。
【０１７５】
Ｂｏｎａｄｉｏ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９）Ｊｕｌｙ  ５（７）：７５３−７５９によって記載されるように、サイトカイン、成長因子またはホルモンをコードするプラスミドＤＮＡを、ポリマー遺伝子−活性化マトリックスキャリア内に取り込むことができる。次いで、上記生分解性ポリマーを、破壊された骨の近くに移植する。例えば、ここに、ＤＰＭＳＣが移植され、上記ＤＮＡを取り込み、このことは、上記ＤＰＭＳＣが、高い局所濃度のサイトカイン、成長因子またはホルモンを産生することを引き起こし、これにより、損傷を受けた組織の治癒が促進される。
【０１７６】
本発明によって提供される細胞、または本発明の方法によって単離されるＤＰＭＳＣを用い、移植のための組織または臓器を作り出すことができる。Ｏｂｅｒｐｅｎｎｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：１４９−１５５）は、イヌの膀胱の外側に由来する筋肉細胞と、イヌの膀胱の内側に由来する内側細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）とを培養し、これらの培養物に由来する組織のシートを調製し、小さなポリマー球を、外側を筋肉細胞で、内側を内側細胞でコーティングすることによる、機能を発揮する膀胱の作製を報告した。次いで、この球をイヌの泌尿器系に挿入すると、膀胱として機能し始めた。Ｎｉｃｋｌａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：４８９−４９３は、培養した平滑筋および内皮細胞からの長い血管移植材料の製造を報告した。培養した細胞から組織の層を作製する他の方法は、当業者に公知である（例えば、Ｖａｃａｎｔｉら、米国特許第５，８５５，６１０号を参照）。これらの方法は、本発明の細胞と組み合わせて使用する場合に、特に有用な場合があり、上記細胞は、すでに記載されている非胚性幹細胞よりも広範囲に分化する。
【０１７７】
本発明のＤＰＭＳＣを、組織損傷領域に直接注射するか、または全身注入することによって細胞を心臓組織に向かわせ、心筋細胞を再配置するのに使用することができる。この方法は、血管形成と組み合わせた場合に、特に有効な場合がある。注射方法および血管形成を促進する方法は、両方とも当業者に公知である。本発明のＤＰＭＳＣは、より広い分化範囲をもたらし、これらの技術を利用する心臓組織または他の組織を修復するためのよりさまざまな細胞源をもたらす。
【０１７８】
また、本発明のＤＰＭＳＣは、例えば、高用量の化学療法の後に、骨髄を再配置する目的で有用である。化学療法の前に、ＤＰＭＳＣを患者から得る。幹細胞を、本発明の方法によって単離し、培地で増殖させ、分化誘導する。次いで、分化した細胞および未分化細胞の混合物を、患者の骨髄腔に再導入する。現在、この目的のために、造血幹細胞を用いて治験が進行中である。しかし、本発明のＤＰＭＳＣは、骨髄だけではなく、他の組織において化学療法で損傷を受けた部分を置き換えることが可能な細胞を生成するようにさらに分化するという、さらなる利点を与える。
【０１７９】
または、Ｌａｗｍａｎらが記載した方法（ＷＯ  ９８／４２８３８）を用い、１以上の同種異形ドナーに由来する幹細胞の組織適合性抗原を変えることができる。この方法を用いて、凍結ストックの調製、貯蔵、および、例えば自身の骨髄を再構成のために使用することができない患者（例えば、白血病患者）への投与のための、利用可能な骨髄移植のパネルを作製することができる。
【０１８０】
患者の免疫システムの細胞または血液細胞の再配置は、例えば、患者に由来する自家幹細胞を単離し、これらの細胞を培養し増やして集団にし、次いで、この細胞を患者に再び導入することによって達成することができる。この方法は、免疫システムまたは骨髄細胞を、放射線および／または化学治療によって除去しなければならない場合、例えば、多発性骨髄腫、非ホジキン型リンパ腫、自己免疫疾患、または固体腫瘍がんと診断された患者を治療するために、放射線および／または化学治療によって除去しなければならない場合、特に有効な場合がある。
【０１８１】
白血病、自己免疫疾患または遺伝性疾患（例えば、鎌状赤血球貧血またはサラセミア）を処置するために、患者の血液または免疫システム細胞を、本発明の同種異系細胞または本発明によって単離された細胞を用いて再配置することは、特に、組織適合性抗原が、Ｌａｗｍａｎらに記載されている様式（ＷＯ  ９８／４２８３８）において改変されている場合に、行うことができる。
【０１８２】
本明細書に記載される目的のために、本発明の自家ＤＰＭＳＣまたは同種異系ＤＰＭＳＣのいずれかを、遺伝的に改変されているかまたは改変されていない分化した形態または未分化形態のいずれかで、許容されるマトリックス表面上またはマトリックス表面の周囲において、または医薬的に許容されるキャリアと組み合わせて、ある組織部位に直接注射するか、全身注入することによって患者に投与することができる。
【０１８３】
（ＤＰＭＳＣは、分化の経路を研究するためのモデル系を与える）
本発明のＤＰＭＳＣ集団のさらに別の使用は、研究ツールとしての使用である。本発明の細胞は、発生プロセスへのさらなる研究にも有用である。Ｒｕｌｅｙら（ＷＯ  ９８／４０４６８）は、例えば、特定の遺伝子の発現を阻害するための、ならびにこれらの阻害された遺伝子のＤＮＡ配列を得るためのベクターおよび方法を記載している。本発明の細胞を、Ｒｕｌｅｙに記載されているようなベクターで処理し得、ＤＮＡ配列分析によって同定可能な遺伝子の発現を阻害することができる。次いで、この細胞を分化誘導することができ、改変された遺伝子型／表現型の影響を特徴付けることができる。
【０１８４】
Ｈａｈｎら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４００：４６４４６８）は、例えば、正常なヒト上皮線維芽細胞に、すでにがんと相関関係にある遺伝子の組み合わせを導入することで、この細胞を、腫瘍形成性の変換を起こすように誘導することができることを示した。
【０１８５】
誘導可能な発現要素を含有するベクターを用いて遺伝子発現を制御し、細胞分化への特定の遺伝子産物の影響を調べる方法を提供する。誘導可能な発現系は、当業者に公知である。このようなシステムの１つは、Ｎｏ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）  ９３：３３４６−３３５１によって記載されるエクジソン誘導系である。
【０１８６】
特定の遺伝的改変、毒性物質、化学療法剤、または他の薬剤が、発生経路に及ぼす影響を調べるために、ＤＰＭＳＣを用いることができる。当業者に公知の組織培養技術によって、異なる個体に由来する数十万もの細胞サンプルの大量培養が可能となり、このことは、例えば、催奇性または変異誘発性であるおそれがある化合物を迅速にスクリーニングする機会を与える。
【０１８７】
発生経路を調べるために、ＤＰＭＳＣを、特定の成長因子、サイトカイン、または他の薬剤（疑わしい催奇性化学物質を含む）で処理することができる。また、すでに記載した方法及びベクターを用いて、ＤＰＭＳＣを遺伝的に改変することができる。さらに、アンチセンス技術、または天然の遺伝子配列の発現を変えるように細胞に導入されたタンパク質を用いた処理によって、ＤＰＭＳＣを改変することができる。例えば、望ましいペプチドまたはポリペプチドを細胞に導入するために、シグナルペプチド配列を用いることができる。ポリペプチドおよびタンパク質を細胞に導入するのに特に有効な技術は、Ｒｏｊａｓらによって、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６：３７０−３７５に記載されている。この方法は、培地に導入すること、および、細胞膜を通って細胞の内側に移行させることが可能なポリペプチドまたはタンパク質産物を提供する。任意の数のタンパク質をこの様式において用い、細胞の分化に対する標的タンパク質の影響を決定することができる。または、Ｐｈｅｌａｎらによって（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）１６：４４０−４４３）に記載されている技術を用い、細胞に運び入れるために、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２を機能性タンパク質に接続することができる。
【０１８８】
また、本発明の細胞を、潜在的化学療法剤または遺伝子治療ベクターの有効性を試験するために、欠陥表現型を有する分化した細胞を産生するように、外来ＤＮＡを導入することによって、または、ゲノムＤＮＡをサイレンシングするかもしくは切除することによって、遺伝的に操作してもよい。
【０１８９】
（ＤＰＭＳＣは、ハイスループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）スクリーニングのための種々の培養した分化細胞型および未分化細胞型をもたらす）
本発明のＤＰＭＳＣを、例えば、薬理ゲノム学または薬理遺伝学において、標的サイトカイン、ケモカイン、成長因子、または医薬組成物のハイスループットスクリーニングのためのシステムを与えるために、例えば、９６ウェル培養プレートまたは他のマルチウェル培養プレートで培養してもよい。本発明のＤＰＭＳＣは、同じ固体に由来する特定の細胞系統を形成するように、細胞を分化させることが可能な、固有のシステムを与える。ほとんどの初代培養物とは異なり、これらの細胞は、培地で維持することができ、長期間研究することができる。同じ個体および異なる個体に由来する複数の細胞培養物を、目的の因子で処理し、同じ遺伝子構成を有する特定の種類の分化細胞、または遺伝的に異なる個体に由来する類似の種類の細胞に対し、細胞因子が及ぼす影響に差があるか否かを決定することができる。
【０１９０】
したがって、サイトカイン、ケモカイン、医薬組成物、成長因子を、例えば、これらの効果をもっと明確に解明するために、タイミングよく、費用効果が高い様式でスクリーニングすることができる。大きな個体集団から単離され、遺伝子多型（特に、１個のヌクレオチド多型）が存在するかしないかについて特性決定された細胞を、種々のスクリーニング技術で使用するために細胞培養バンクに保存してもよい。例えば、当業者に公知の方法にしたがって決定可能な、統計学的に有意な個体集団に由来する歯髄類似細胞は、さまざまな基質（例えば、医薬組成物、ワクチン調製物、細胞毒性化学物質、変異誘発物質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、阻害化合物、化学療法剤、多くの他の化合物または因子）に対する正または負の応答が増加することに関連する多型を同定するための、ハイスループットスクリーニングのための理想的なシステムを与える。このような研究から得られた情報は、感染症、がん、多くの代謝性疾患の処置のための広範囲の潜在的重要性を有する。
【０１９１】
生物学的作用物質もしくは薬理学的作用物質、またはこのような作用物質の組み合わせライブラリーに対する細胞応答を特性決定するためにＤＰＭＳＣを用いる方法において、ＤＰＭＳＣを、統計学的に有意な個体集団から単離し、培養物を増やし、１つ以上の生物学的作用物質または薬理学的作用物質と接触させる。分化した細胞が、特定の生物学的作用物質または薬理学的作用物質にとって望ましい標的であるように、培養物を増やす前、または増やした後に、ＤＰＭＳＣを分化誘導させることができる。統計学的に有意な集団中の個体に由来するＤＰＭＳＣ培養物の１つ以上の細胞応答を比較することによって、生物学的作用物質または薬理学的作用物質の効果を決定することができる。または、遺伝的に同一のＤＰＭＳＣ、またはこの細胞から分化した細胞を使用し、別個の化合物（例えば、組み合わせライブラリーの化合物）をスクリーニングすることができる。細胞を利用するハイスループットスクリーニングと組み合わせて使用するための遺伝子発現システムが記載されている（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ，Ｃ．およびＫｏｓｔ，Ｔ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１０月８日、５：６２９−６３４を参照）。内皮細胞活性化のインヒビターを同定するのに使用される高容量スクリーニング技術は、Ｒｉｃｅらによって記載されており、この技術は、初代ヒト臍静脈内皮細胞のための細胞培養システムを利用する（Ｒｉｃｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２４１：２５４−２５９）。本発明の細胞は、多くの標的生物学的作用物質または薬理学的作用物質を同定するために使用されるハイスループットスクリーニング技術のための、最終的に分化した細胞および未分化細胞の種々の細胞型を与える。重要なことに、本発明の細胞は、生物学的作用物質または薬理学的作用物質に対する応答が異なっているかもしれない種々の遺伝的に多様な個体に由来する細胞培養物の供給源を与える。
【０１９２】
（ＤＰＭＳＣおよび遺伝的プロファイリング）
遺伝的改変は、疾患への感受性に間接的および直接的に影響を及ぼす場合がある。直接的な場合、１個のヌクレオチドの変更であっても、１個のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を生じ、タンパク質のアミノ酸配列を変える場合があり、疾患または疾患への感受性に直接寄与する場合がある。得られたタンパク質の機能的変化は、しばしば、インビトロで検出され得る。例えば、特定のＡＰＯ−リポタンパク質  Ｅ遺伝子型は、ある個体では、アルツハイマー病の発症および進行と関連がある。
【０１９３】
ＤＮＡ配列の異常は、ダイナミック−アレルスペシフィックハイブリダイゼーション法（ｄｙｎａｍｉｃ−ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＤＮＡチップ技術、当業者に公知の他の技術によって検出することができる。タンパク質コード領域は、ヒトゲノムのわずか約３％に相当すると概算され、コード領域に位置する共通のＳＮＰは、おそらく２００，０００〜４００，０００存在すると概算されている。
【０１９４】
ＳＮＰに関連する遺伝分析を用いた以前の研究設計は、表現型の特性決定を行うことが可能な大量の個体から遺伝分析用サンプルを得ることを含む。残念なことに、この様式で得られる遺伝相関は、容易に同定可能な表現型に関連する特定の多型の同定に限定されており、疾患の背後にある原因に関するさらなる情報は与えられない。
【０１９５】
本発明のＤＰＭＳＣは、疾患に関連する遺伝要素の同定と、その疾患を患うヒトで示される最終的な表現型の発現との間のギャップを埋めるのに必要な要素を与えることができる。簡単に言うと、ＤＰＭＳＣを、表現型のデータを得ることが可能な、統計学的に有意な個体集団から単離する（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８）Ｄｅｃ，８（１２）：１２２９−１２３１を参照）。次いで、これらのＤＰＭＳＣサンプルを培養して増やし、細胞の継代培養物を凍結ストックとして保存し、その後の発生研究のための培養物を与えるために使用することができる。増やした細胞集団から、遺伝子多型を同定するために複数の遺伝的分析を行ってもよい。例えば、当業者に公知の現行技術（例えば、ＤＮＡチップ技術）を用いて、比較的短い時間で大量のサンプル集団において、１個のヌクレオチド多型を同定してもよい（Ｗａｎｇ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：１０７７−１０８２；Ｃｈｅｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：６１０−６１４；Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：２３１−２３８；Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：３６５−３７０；Ｚｈａｏ，Ｌ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９８）６３：２２５−２４０）。ＳＮＰ分析のための技術も、Ｓｙｖａｎｅｎ（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．（１９９９）１３：１−１０）、Ｘｉｏｎｇ（Ｘｉｏｎｇ，Ｍ．およびＬ．Ｊｉｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）６４：６２９−６４０）、Ｇｕ（Ｇｕ、Ｚ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９８）１２：２２１−２２５）、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７８：１５８０−１５８１）、Ｈｏｗｅｌｌ（Ｈｏｗｅｌｌ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：８７−８８）、Ｂｕｅｔｏｗ（Ｂｕｅｔｏｗ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２１：３２３−３２５）、Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｍ（Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｍ，Ｂ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）１０４：８９−９３）によって記載されている。
【０１９６】
特定の多型が、特定の疾患表現型と関連がある場合、多型の保有者として同定した個体に由来する細胞を、非保有者に由来する細胞をコントロールとして用い、発生異常について試験することができる。本発明のＤＰＭＳＣは、特に、本明細書に記載の特定の方法および当業者に公知である特定の他の方法を用いて、この細胞を分化誘導し、特定の細胞型を得ることができるため、特定の遺伝性疾患提示に関連する発生異常を試験するための実験システムを与える。例えば、特定のＳＮＰが、神経変性障害に関連している場合、未分化ＤＰＭＳＣ、およびニューロン前駆体、グリア細胞、または神経由来の他の細胞へと分化したＤＰＭＳＣを用い、細胞での多型の効果を特性決定することができる。特定の多型を示す細胞を、分化プロセス中に、薬物感受性、ケモカインおよびサイトカイン応答、成長因子、ホルモン、インヒビターに対する応答、および受容体発現および／または受容体の機能の変化に対する応答に影響を与える遺伝要素を同定するために、追跡できる。この情報は、遺伝的起源の疾患または遺伝的素因が存在する疾患の処置法の設計に非常に有益であろう。
【０１９７】
ＤＰＭＳＣを用いて、生理学的異常に関連する遺伝子多型を同定する本方法では、ＤＰＭＳＣを、表現型データを得ることが可能な、統計学的に有意な個体集団（少なくとも１つの遺伝子多型を有するメンバーを含むために十分な集団サイズであると当業者によって定義される、統計学的に有意な集団）から単離し、培養物を増やし、ＤＰＭＳＣ培養物を樹立する。次いで、培養した細胞に由来するＤＮＡを用い、上記集団に由来する、培養したＤＰＭＳＣ中の遺伝子多型を同定し、細胞を分化誘導する。通常の遺伝子型を有するＤＰＭＳＣによって示される分化パターンと、同定された遺伝子多型を有するＤＰＭＳＣによって示される分化パターンとを比較することによって、または通常の遺伝子型を有するＤＰＭＳＣによって示される推定薬物に対する応答と、同定された遺伝子多型を有するＤＰＭＳＣによって示される推定薬物に対する応答とを比較することによって、特定の遺伝子多型と関連する異常な代謝プロセスを同定し、特性決定する。
【０１９８】
（ＤＰＭＳＣは、より安全なワクチン送達を提供する）
また、本発明のＤＰＭＳＣ細胞は、抗原タンパク質を産生するように遺伝的に改変された場合、抗原提示細胞として使用することもできる。複数の改変された自家前駆細胞または同種異系前駆細胞を用いて、例えば、本発明の前駆細胞を、長期間放出のための生分解性マトリックスに埋め込まれているプラスミドと組み合わせて提供して、付随する細胞（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ）をトランスフェクトし、１個または複数の抗原に対する免疫応答を誘発することができ、抗原提示細胞を順次放出することによって、免疫応答の最終的な効果を高め得る。いくつかの抗原を長期間にわたって複数回投与すると、最終的な抗原チャレンジに際し、高められた免疫応答がもたらされることが当該分野で公知である。または、ＤＰＭＳＣを、Ｚｈａｎｇらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１：１０４５−１０４９）において、抗原提示細胞として使用し、特定の抗原に対するＴ−細胞寛容を誘導することができる。
【０１９９】
多くの現行のワクチン調製物は、さらなる化学物質および他の基質、例えば、抗生物質（ワクチン培養物中、微生物の増殖を防ぐため）、アルミニウム（アジュバント）、ホルムアルデヒド（トキソイドワクチンについて微生物産物を不活性化するため）、グルタミン酸一ナトリウム（安定化剤）、卵タンパク質（孵化鶏卵を用いて調製したワクチンの成分）、亜硫酸塩（安定化剤）、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）（防腐剤）を組み込んでいる。これらの加えられた成分に部分的に起因して、現在、ワクチン調製物の安全性に関する、広範囲の社会的関心が存在する。チメロサールは、例えば、水銀を含有し、塩化エチル水銀、チオサリチル酸、水酸化ナトリウム、エタノールの組み合わせから作られる。さらに、いくつかの研究は、結論に達してはいないが、いくつかのワクチン成分と、考えられる合併症（例えば、自己免疫に一般的に関連する疾患）との間に関連性があり得ることを示唆している。したがって、もっと有効なワクチン治療が必要とされており、ワクチン接種という方法でのより大きな安心感があれば、ワクチンイニシアチブ（ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）との社会的協力は、もっと有効なワクチン治療を推進することを容易にする。
【０２００】
本発明のＤＰＭＳＣを、Ｔ細胞に対する抗原を提示する樹状細胞を形成するように分化させ、それによって、外来生物に対する応答を活性化させることができる。これらの樹状細胞を、すでに記載した技術を用いて、外来抗原を発現するように遺伝的に改変することができる。ワクチンを送達するこの方法の特別な利点は、２種類以上の抗原を、１個の遺伝的に改変された細胞によって提示させることができるという事実にある。
【０２０１】
異種起源の分化したＤＰＭＳＣワクチンベクターまたは未分化ＤＰＭＳＣワクチンベクターは、外来細胞表面マーカーによって免疫システムを刺激するというさらなる利点を付与する。ワクチン設計実験は、複数の抗原を用いた免疫応答の刺激が、ワクチン調製物内の特定の個々の抗原に対する高い免疫応答を誘発できることを示している。
【０２０２】
免疫学的に有効な抗原は、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）、ポリオ、ジフテリア、百日咳、破傷風、ライム病、麻疹、おたふく風邪、風疹、ヘモフィルスインフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）、ＢＣＧ、日本脳炎、黄熱病、ロタウイルスについて同定されている。
【０２０３】
ヒト個体において、本発明のＤＰＭＳＣを用いて、感染体に対する免疫応答を誘導する方法は、歯髄類似細胞のクローン集団を培養で増やし、ある感染体に対する防御免疫反応を誘発するために、増やした細胞を、あらかじめ選択しておいた１つ以上の抗原分子を発現するように遺伝的に改変し、免疫応答を誘導するのに有効な量の遺伝的に改変された細胞を個体に導入することによって、行うことができる。遺伝的に改変した細胞を投与する方法は、当業者に公知である。免疫応答を誘導するのに有効な遺伝的に改変した細胞の量は、当業者に既知の方法によって決定される場合、測定可能な抗体反応をもたらすために、望ましい抗原を十分に発現する細胞の量である。好ましくは、抗体反応は、適切な感染体を用いてチャレンジした際に、疾患に対する抵抗によって検出することが可能な防御抗体反応である。
【０２０４】
（ＤＰＭＳＣおよびがん治療）
本発明のＤＰＭＳＣは、がん治療の新規ビヒクルを与える。例えば、ＤＰＭＳＣを、局所または全身に送達する場合、内皮細胞、または内皮組織に向かう前駆体へと分化誘導することができる。この細胞は、新しく生成した腫瘍に供給する血管の形成（血管形成）に関与し、従って、内皮組織内で分裂し、増殖する。外から送達した要素での刺激によって、これらの細胞が、アポトーシスを受けるように遺伝的に操作することによって、新しく生成した血管を破壊することができ、腫瘍への血流をなくすことができる。外から送達する要素の例は、テトラサイクリンという抗生物質であり、細胞は、テトラサイクリン応答要素の制御下にあるアポトーシスを促進する遺伝子（例えば、カスパーゼまたはＢＡＤ）でトランスフェクトされるか、または形質導入される。テトラサイクリン応答要素は、文献に記載されており（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．＆  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：５５４７  ５５５１）、内皮細胞でのインビボ導入遺伝子発現制御を提供し（Ｓａｒａｏ，Ｒ．＆  Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（１９９８）７：４２１  ４２７）、市販されている（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）。
【０２０５】
または、未分化ＤＰＭＳＣ、または組織特異的な細胞系統を形成するように分化させられたＤＰＭＳＣを、腫瘍細胞に毒性であるかまたは血管形成を破壊する産物を産生し細胞外環境に運び出すように遺伝的に改変することができる（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９）２８５：２４５−２４８によって記載されている色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））。例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎらは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９（腫瘍形成に関連するマトリクスメタロプロテイナーゼ）を選択的に阻害するアミノ酸配列を含有する環状ペプチドを記載しており、これは、動物モデルにおいて腫瘍増殖および侵潤を予防し、インビボで血管新生した血管を特に標的とする（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：７６８  ７７４）。細胞が、腫瘍部位に送達され、腫瘍阻害産物を産生し、次いで、破壊されることが望ましい場合、誘導プロモーター制御下のアポトーシス促進タンパク質を組み込むように、細胞をさらに遺伝的に改変することができる。
【０２０６】
また、ＤＰＭＳＣは、患者から単離し、エクスビボで培養し、特に、抗原への免疫反応を高めることに関連する受容体と組み合わせて、適切な抗原を発現するようにエクスビボで遺伝的に改変し、個体に再び導入し、腫瘍細胞で発現するタンパク質に対する免疫反応を引き起こすことが可能なため、がんワクチンを送達するベクターを与える。
【実施例】
【０２０７】
（実施例）
実施例は、本発明の純粋な例示であることが意図されており、したがって、決して、本発明を限定するものであるとみなすべきではなく、ならびに、上に記載した本発明の詳細な態様および態様も記載する。
【０２０８】
省略語：ＢＤＮＦ＝脳由来神経栄養因子、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ＝神経性分化転写因子（また、β細胞Ｅ−ｂｏｘトランスアクチベーター２）、ｂＦＧＦ＝塩基性線維芽細胞増殖因子、ＢＨＡ＝ブチル化ヒドロキシアニソール、ＢＭＰ−受容体＝１Ｂ骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ型、ｃ−Ｍｅｔ＝ＨＧＦ受容体、ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地、ＥＣＭ＝細胞外マトリックス、ＥＧＦ＝上皮増殖因子、ＥＳ＝胚幹細胞、ＦＡＣＳ＝蛍光活性化細胞選別、ＦＢＳ＝胎仔ウシ血清、ＦＮ＝フィブロネクチン、ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質、ＨＧＦ＝肝実質細胞成長因子、ＭＡＰＣ＝多能性成人前駆細胞、ＮＦ−Ｍ＝ニューロフィラメント１６０−ｋＤａ、ＮＦ−Ｌ＝ニューロフィラメント６８ｋＤａ、ＮＦ−Ｈ＝２００ｋＤａニューロフィラメント２００ｋＤａ、ＮＧＦ＝β−神経成長因子、ＮＴ−３＝ニューロトロフィン−３、ＮＴＲＫ３＝ＮＴ−３受容体、Ｏｓｃ＝オステオカルシン、Ｏｓｐ＝オステオポンチン、Ｒｕｎｘ２＝ｒｕｎｔ相同ドメイン転写因子、ＳＳＥＡ−４＝段階特異的胚抗原（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）４、Ｔｒｋ−Ａ＝チロシンキナーゼ受容体Ａ（また、ＮＧＦ受容体）、ＴｕＪ１＝β−ＩＩＩ−チューブリンＩＩＩ。
【０２０９】
（実施例１Ａ  ＤＰＭＳＣの単離）
（細胞培養）
ドナーにインフォームドコンセントを行いつつ、５〜７歳の子供（患者１０人）の正常に剥脱したヒト脱落歯から、歯髄を抽出した。針を用いて歯髄を抽出し、１．２５％ヒト血清を追加し、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約１〜１５ｎｇ／ｍｌ）の上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約１〜１５ｎｇ／ｍｌ）のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、約１〜１５ｎｇ／ｍｌ）の線維芽細胞増殖因子−ｂ（ＦＧＦ−ｂ）、１０−１０〜１０−８Ｍのデキサメタゾンまたは他の適切なステロイド、０〜１μｇ／ｍＬのリノール酸、１０〜５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸を追加したＦ１２／Ｍｅｄｉｕｍ  １９９／ＣＭＲＬ  １０６６が入った３５ｍｍのペトリ皿に移した。歯髄の組織外植片を用い、未成熟ＤＰＭＳＣを単離した。ＤＰＭＳＣの増殖培養物を上述の条件で１日間維持し、次いで、コラーゲナーゼ／トリプシン／ニワトリ血清（ＣＴＣ）培地に細胞を入れ、場合により、解離させ、３５ｍｍペトリ皿に播種した。ＣＴＣ培地を使用することにより、細胞と細胞との接合ジャンクション（例えば、密着結合およびデスモソーム）がより発達した細胞を分離しやすくなり、トリプシン単独の場合よりも、このようなジャンクションを有する細胞の分離が良好である。
【０２１０】
細胞が分化するのを防ぐために、培養物を半密集状態に維持し、１週間に２回培地を新しいものに変えつつ、３日ごとに細胞を継代した。７日後、粘着細胞の小さなコロニーが発生した。２週間後、ＤＰＭＳＣ細胞は、細胞質減少を示している小さな非常に増殖性の細胞であった。成長曲線から、２．５−１．２５−０．５％ヒト血清（ＨＳ）を含む培地において、ＤＰＭＳＣは増殖するが、０．５％ＨＳでは、培地を毎日変えるかまたは２日ごとに変えることが必要であることを確認した。倍加時間を、１．２５％〜２．２５％ＨＳ培地では２８時間と概算し、０．２５％〜０．５％ＨＳ培地では、２９〜３０時間であると概算した。ＤＰＭＳＣは、通常の核型を示した。
【０２１１】
【表１】
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表１は、プレーティング効率、複製時間、培地飢餓前に必要な日数の指標を示す。
【０２１２】
凍結する場合、１．２５％ヒト血清、成長因子、１０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を追加したＦ１２／Ｍｅｄｉｕｍ１９９／ＣＭＲＬ１０６６を含む培地に、細胞を５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させ、温度を１℃／分の速度で最終温度−７０℃に到達するまで、ゆっくりと徐々に下げていった。その後、細胞を液体窒素に移した。ＤＰＭＳＣの入った冷凍バイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌ）を解凍する場合、このバイアルを３７℃の恒温槽に２分間入れ、その後、１．２５％ヒト血清を追加したＦ１２／Ｍｅｄｉｕｍ  １９９／ＣＭＲＬ  １０６６で２回洗浄し、培地に入れた。すべての培養物を５％ＣＯ２中、３７℃の高湿環境でインキュベートした。
【０２１３】
歯髄から出した細胞が高密度であるにもかかわらず、密集状態の細胞培養物、特に、特定の成長因子が存在しない状態において予想され得るように、分化も、ゆっくりとした増殖も観察されなかった。同時に、トリプシン処理後の、その後の密集培養では、分化も、ゆっくりとした増殖もみられた。理論によって束縛されないが、トリプシン処理を伴なう最初の継代をする前に生育培養物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）として歯髄を外植することによって、任意の幹細胞が未成熟なまま分化することを防ぎ得ることが可能であろう。
【０２１４】
（実施例１Ｂ  ＤＰＭＳＣを単離および／または培養する方法）
ドナーにインフォームドコンセントを行いつつ、５〜７歳の子供（患者１２人）の正常に剥脱したヒト脱落歯から、歯髄を抽出した。針を用いて歯髄を抽出し、１．２５％のヒト血清、１〜５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−Ｉ（ＦＧＦ−ｂ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０−１０〜１０−８Ｍのデキサメタゾン（ＭＰ）、２０〜１００μｇ／Ｌのリノール酸（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０〜５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｌ／Ｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を追加した、Ｆ−１２  Ｃｏｏｎ変法／Ａｍｂｅｓｉ変法（Ｇｉｂｃｏ）／Ｍｅｄｉｕｍ  １９９（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）／ＣＭＲＬ  １０６６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で構成される増殖培地が入った３５ｍｍのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｔａｌｙ）に移した。ＤＰＭＳＣの増殖培養物を上述の条件で１日間維持し、次いで、コラーゲナーゼＩＩ  １０００Ｕ／ｍＬ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を含有し、ＣＴＣ溶液（トリプシン０．５％、Ｓｉｇｍａ）、コラーゲナーゼＩＩ  ２２Ｕ／ｍＬ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）、ニワトリ血清０．２％（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地に細胞を入れ、場合により、解離させた。次いで、細胞を３５ｍｍペトリ皿に播種した。
【０２１５】
歯髄細胞の集団には、任意の種類の除去技術（例えば、免疫除去または物理的な除去または化学的な除去）を行わず、２〜３週間後に初代培養で成長させたコロニーが密集状態に達したら、細胞をＣＴＣで分離し、増殖培地が入った１００ｍｍ皿で二次培養した。細胞が分化するのを防ぐために、培養物を半密集状態に維持し、３日ごとに細胞を２・１０３細胞／ｃｍ２の密度で継代した。
【０２１６】
（実施例２Ａ  ＤＰＭＳＣ細胞集団の表現型を分析する方法）
（免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＦＩＳＨおよび免疫ブロット法）
免疫蛍光およびＦＩＳＨの分析は、４％緩衝化パラホルムアルデヒドまたはメタノール／アセトンで固定した細胞で行い、ＦＡＣＳ分析は、ＣＴＣで短期間インキュベーションして培養基質から分離したＰ３−Ｐ５細胞で行った。染色は、適切に結合体化した一次抗体または結合体化していない一次抗体のいずれかを用い、その後、結合体化した二次抗体とともにインキュベーションすることによって行った。細胞内染色は、製造業者の指示にしたがって、Ｉｎｔｒａｓｔａｉｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（Ｄａｋｏ、Ｄａｎｍａｒｋ）を利用する透過工程の後に行った。
【０２１７】
画像の取得は、６３倍の油浸対物レンズ（開口数：１．４０）または４０倍の油浸対物レンズ（開口数：１．２５）のいずれかを利用し、Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２，  Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｔａｌｙ）で行った。Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０ＦＸカメラに接続したＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｔａｌｙ）で構成される生細胞イメージング専用システムを利用し、落射蛍光顕微鏡画像および位相差顕微鏡画像を得た。この目的で、１０倍の対物レンズ（開口数：０．２５）を使用した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ５０カメラに接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｉｔａｌｙ）を利用して、明視野像を取り込んだ。この目的で１０倍の対物レンズ（開口数：０．４０）を使用した。画像を整え、重ね合わせ、コントラストを調節するために、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを利用した（Ａｄｏｂｅ、ＵＳＡ）。
【０２１８】
Ｘ染色体プローブおよびＹ染色体プローブ（Ｖｙｓｉｓ）を利用し、製造業者の指示にしたがって、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）を行った。エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のＤＮＡ含有量を決定した。
【０２１９】
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｔａｌｙ）を用い、製造業者によって推奨されているように、免疫ブロット法のための溶解物を集め、次いで、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ  ＧＥＮＥＳＩＳ  Ｖ２．１６プログラムで定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサンプルを電気泳動させ、ポリビニリデンジフルオリド膜またはニトロセルロース移動膜（Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース移動膜；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。５％  ＢＳＡおよび０．５〜１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水で膜をブロックした。ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて抗体／抗原複合体を検出した。
【０２２０】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｔａｌｙ）を用い、製造業者が推奨するように、増殖培地または分化培地で成長させた２．５×１０６のＤＰＭＳＣ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）で処理した後、２μｇの全ＲＮＡを用い、ランダムヘキサヌクレオチドおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ＰＣＲ増幅は、８０ｎｇ〜１５０ｎｇの範囲のｃＤＮＡ量、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、２Ｕ  Ｔａｑ  Ｉポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｉｔａｌｙ）を用い、最終容積５０μｌで行った。ＰＣＲの条件を表２に記載している。
【０２２１】
最適条件およびサイクル数は、ＰＣＲの線形段階の範囲内にサンプルが増幅するように決定した。反応生成物を１〜２％寒天ゲルで分析した。
【０２２２】
（ＴＲＡＰアッセイ）
テロメラーゼ活性の検出は、製造業者の指示にしたがって、ＴＲＡＰｅｚｅキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を利用して行った。
【０２２３】
（核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ））
単一細胞に由来するクローンから、分裂中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）を調製し、増殖培地で７２時間培養した。標準的な手順にしたがって、ＱＦＱバンディング技術およびＲＢＡバンディング技術を用い、それぞれ、バンド分解能４００〜６５０で染色体分析を行った。
【０２２４】
（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）
細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、６０Ｗランプの前に直接置いた透明ガラス製コプリンジャー（ｃｏｐｌｉｎ  ｊａｒ）中の２％硝酸銀（Ｓｉｇｍａ）で１時間処理した。スライドを蒸留水（ｄＨ２Ｏ）ですすぎ、２．５％チオ硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で５分間固定し、ｄＨ２Ｏで洗浄した。Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）で細胞を１分間対比染色し、水道水ですすいだ。
【０２２５】
（アルカリホスファターゼ染色）
骨形成培地で２８日間分化させた細胞を、メタノール中、−２０℃、２分間で固定し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で１０分間洗浄した。次いで、すばやく５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムアルカリホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を用いてスライドを５〜１０分間染色し、ｄＨ２Ｏですすいだ。
【０２２６】
（グリコーゲン検出のための過ヨウ素酸−シッフ染色）
１％過ヨウ素酸でスライドを５分間酸化させ、ｄＨ２Ｏで３回すすいだ。次いで、スライドをシッフ試薬で１５分間処理し、ｄＨ２Ｏで５〜１０回すすぎ、Ｍａｙｅｒヘマトキシリンで１分間染色し、ｄＨ２Ｏですすいだ。
【０２２７】
（アルブミンおよび尿素の産生）
１７日間分化させた後、培地を取り除いた。新しい培地を加える前に、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。４日後に、上清を集め、すぐに急速冷凍した（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）。アルブミン濃度を、製造業者の指示にしたがって、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｅｌｉｓａ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｂｅｔｈｙｌ−Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）によって決定した。尿素濃度は、製造業者の指示にしたがって、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＴＭ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈａｙｗａｒｄ）によって決定した。
【０２２８】
（実施例２Ｂ  ＤＰＭＳＣ細胞集団の表現型分析）
ＲＴ−ＰＣＲから、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡ−Ｂ、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｒｅｘ−１が発現していることがわかった。ＤＰＭＳＣは、Ｒｅｘ−１（低）、Ｋｌｆ−４、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡ−アイソフォームＢ、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡを発現した。体細胞におけるＫｌｆ−４、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡ−アイソフォームＢ、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃの過剰発現が、未分化の幹段階に戻ることを許可し得ることに注意すべきである。
【０２２９】
ＤＰＭＳＣの幹性転写因子（ｓｔｅｍｎｅｓｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）のｍＲＮＡの発現を、ＮＴＥＲＡ２胚幹細胞株と比較した。抗体を用いた染色から、細胞の約９９％が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇに対して強く陽性であることを確認した。Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇの発現が均一であることを、フローサイトメトリーによってさらに確認し、一方、予想されるように、ヒト初代線維芽細胞は、このマーカーに陰性であった。
【０２３０】
増殖中ＤＰＭＳＣ細胞において、９９％のＯＣＴ−４発現を観察し、そのシグナルは、細胞質および核の両方に局在化していた。免疫ブロット法から、コントロール＋細胞ＮＴＥＲＡ−２と同じ発現量でＯｃｔ−４の２つのアイソフォームが存在することを示した。免疫蛍光分析から、ＤＰＭＳＣ細胞集団の約９６％がＯｃｔ−４を発現することを示した。また、ＦＡＣＳ分析から、この細胞集団の約９９％が、増殖中のＤＰＭＳＣ細胞でＳｏｘ−２を発現し、そのシグナルは、細胞質および核の両方に局在化していることを示した。増殖中のＤＰＭＳＣ細胞の約９９％がＮａｎｏｇを発現し、そのシグナルは、もっぱら核に局在化していた。
【０２３１】
この点に関し、Ｏｃｔ−４に陽性であることが示されていたのはほんのわずかの羊膜幹細胞のみであること、Ｏｃｔ−４陽性の細胞の割合はｍ−ＭＡＰＣのＯ２濃度に依存して、０．０１％未満から８０％まで変動していたことに注意すべきである（Ｊｉａｎｇら、２００２）。Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇに陽性の細胞の割合が高いことは、きわめて均一の幹細胞集団であることを示していた。この観察結果と一致し、以下に示すように、本発明者らは、同じ種類の組織に向かって、幹細胞の集団全体が均一に分化することを示した。他のＥＳマーカーであるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＡＬＰは、ＤＰＭＳＣ細胞ではあまり均一に発現しなかったが、ＳＳＥＡ−１は例外であった。
【０２３２】
ＤＰＭＳＣでのＡＬＰ  ｍＲＮＡ発現が、ＮＴＥＲＡ２細胞に匹敵することを決定するために実験を行った。アルカリホスファターゼアッセイおよびＢＩＣＰ／ＮＢＴ基質の形質転換において、ＤＰＭＳＣは、増殖段階で高い酵素活性を示した。ＤＰＭＳＣは、細胞の９９％で、ＳＳＥＡ−１については検出可能なシグナルがないこと、ＳＳＥＡ−３については低いものの、シグナルが存在することを示した。ＤＰＭＳＣは、ＳＳＥＡ−４のＦＡＣＳ分析において９２％陽性であり、その上、ＳＳＥＡ−４抗体は、ＤＰＭＳＣを染色する。ＴＲＡ−１−６０に関する免疫蛍光試験において、ＤＰＭＳＣでは、低いものの、陽性の積分シグナルを得た。ＴＲＡ−１−８１に関する免疫蛍光試験において、ＤＰＭＳＣでは、低いものの、陽性の積分シグナルを得た。
【０２３３】
さらに、生育細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｃｅｌｌ）は、ＦＡＣＳで、ヒト間葉幹細胞に特異的な抗原に対し、均一に陽性であり、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４を高レベルで発現した（＞９０〜９５％）。
【０２３４】
生育細胞は、低レベルのＣＤ６６ｅ、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＶＥ−Ｃａｄ、ＣＤ１１７を発現した。上記表現型は、より均質であり、解凍した後でも同じ結果が得られたが、４０よりも多く細胞倍加したヒトＤＰＭＳＣ培養物では、これらのタンパク質のレベルは低下した。これは、未分化表現型が部分的に失われていることが原因であろう。非常に少ない割合（例えば、１％未満）のＤＰＭＳＣが、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現した。ＤＰＭＳＣ細胞集団中での以下のマーカーの発現レベルは、以下のとおりであった。
【０２３５】
【表２】
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また、ＤＰＭＳＣ細胞単離物における幹細胞マーカーｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、相対テロメラーゼ活性をＮＴＥＲＡ２およびＫｉｔＣｔｒ＋ポジティブコントロールと比較した。ドナー（６歳）由来のＤＰＭＳＣのＰ２およびＰ５のテロメア長を、Ｆｌｏｗ  Ｆｉｓｈ技術を用いて決定した。テロメア長は、それぞれ、１３０１細胞（長いテロメア）に対し、Ｐ２が約１４．７Ｋｂｐ（１８．４％）、Ｐ５が約１３．８ｋｂｐ（１７．１６％）であった。本発明者らは、ｒｔ−ＰＣＲによって、テロメラーゼｍＲＮＡが存在することを証明しており、その酵素活性は、ＮＴＥＲＡ２細胞に対して１５．８％であった。
【０２３６】
ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＡＬＰ、ＴＲＴの存在および活性ならびにテロメア長と組み合わせたＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇの存在は、ＳＳＥＡ−１が存在しないことと同様に、ＤＰＭＳＣ培養物中に最も初期の細胞が存在していることと相関関係にあるマーカーである。増殖段階中、コラーゲンＩ、線維芽細胞増殖因子受容体−Ｉ（ＦＧＦｒ−Ｉ）、成長因子受容体−ＩＩ（ＦＧＦｒ−ＩＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃ−ＴｎＴ）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ニューロフィラメントＬ（ｌｉｇｈｔ）（ＮＦ−Ｌ）、グリア線維酸性タンパク質（Ｇ−Ｆａｐ）、神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）、コア結合因子Ｉ型およびＩＩ型（Ｃｂｆａ−Ｉ  Ｔｙ  Ｉ、ＩＩ）、Ｍｕｓｃｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｏｍｅｏｂｏｘ  ２（Ｍｓｘ−２）、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、コネキシン−４３、Ａｂｃｇ−２、Ｓｅｒｃａ−２ａ、ネスチン、ビメンチンのタンパク質発現を決定するために免疫蛍光を行った。増殖段階中のメッセンジャー発現を、ＲＴ−ＰＣＲで決定し、ＭＤＲ−１、Ａｂｃｇ−２、ＦＧＦｒ−Ｉ、ＦＧＦｒ−ＩＩ、Ｍｓｘ−２、Ｄｌｘ−５、ＰＰＡＲ−γ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＫ−１９、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオネクチン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰｒ−Ｉａ、ＢＭＰｒ−Ｉｂ、Ｃｂｆａ−Ｉ  Ｉ型、Ｃｂｆａ−Ｉ  ＩＩ型、コラーゲンＩ型、アグレカン、Ｄｅｒｍｏ−Ｉ、歯のマトリックスタンパク質、Ｇ−Ｆａｐ、グリピカン、β３−チューブリン、ニューロフィラメントＬ（ｌｉｇｈｔ）、Ｍ（ｍｅｄｉｕｍ）およびＨ（ｈｅａｖｙ）、ＮＳＥ、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、サルコメアアクチン（ＡＳＡ）、ＳＭＡ、心筋アクチン、ミオカルジン、ＡＮＰ、Ｇａｔａ−４、Ｎｋｘ−２．５、ミオシン重鎖が発現していることを示した。免疫ブロット分析から、ＡＳＡ、Ｓｅｒｃａ  ２ａ、β３−チューブリン、Ｍｓｘ−２、コネキシン−４３、Ｄｌｘ−５、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、Ｃａ−チャネルＤＨＰＲ、Ｃｂｆａ−Ｉ  Ｔｙ  Ｉ−ＩＩが発現していることを示した。
【０２３７】
ＦＧＦｒ−ＩＩは、増殖中に低い程度で発現し、時には、発現しなかった。増殖段階で、コネキシン−４３の９９％の発現を観察した。Ｃｘ−４３発現を、増殖中および筋細胞分化中の両方において、免疫ブロット法によって観察した。ＧＡＴＡ−４の発現は、核および細胞質（核周囲）の染色を示した。Ａｂｃｇ−２  ｍＲＮＡは、増殖中および肝細胞分化中の両方において高レベルで発現した。ＭＤＲ−ＩおよびＡｂｃｇ−２のｍＲＮＡは、増殖中および分化中の両方において発現した。増殖段階中のＤＰＭＳＣについて、ｎｅｕｒｏ  Ｄ発現に関する免疫組織化学および蛍光実験から、核に局在化していることを示した。増殖中および神経分化中の免疫ブロット法から、完全に分化した後は発現していないことを示した。平滑筋アクチンのタンパク質およびｍＲＮＡは、増殖段階中に発現した。心筋に特異的なアクチンのアイソフォームについて、発現量が低く、増殖中にタンパク質およびｍＲＮＡが存在することを示した。神経幹細胞マーカーであるネスチンタンパク質は、ＤＰＭＳＣ中で発現した。別の神経幹細胞マーカーであるビメンチンのタンパク質およびｍＲＮＡは、増殖段階中にＤＰＭＳＣで発現した。
【０２３８】
非脱落性の成人の永久歯に由来する同じ細胞の集団を得て、以下に示すように、免疫表現型について分析した。
【０２３９】
【表３】
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１４〜２０細胞倍加後に得られた成人の第三大臼歯のＤＰＭＳＣ  ３°を、ＦＡＣＳによって免疫表現型分析し、低い割合（例えば、１％未満）の細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５を発現せず、集団中の大部分の（例えば、９０％を超える）細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤｗ９０、ＣＤ１０５を発現することを示した。この細胞集団は、ＣＤ６６ｅ、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＶＥ−Ｃａｄ、ＣＤ１１７を低いレベルで発現した。本明細書に記載したプロトコルおよび培地を用いて得られた細胞集団の表現型は、単に市販されている培地を用いて得られた細胞集団の表現型と比べ、非常に均質であった。
【０２４０】
理論によって束縛されないが、ＤＰＭＳＣは、本発明者らの実験条件で大部分が選択的に増殖する、歯髄の亜集団に相当すると言うことができる。歯髄片と培地との間の勾配は、細胞を、細胞が損傷部位と認識する場所に向かわせるベクターとして役立つ場合があり、これは、細胞をペトリ皿における継続した選択的移動に導く。
【０２４１】
成長曲線から、ＤＰＭＳＣは、１．２５−２．５％のヒト血清（ＨＳ）を含む培地において、さらに０．２５−０．５％のヒト血清（ＨＳ）を含む培地においても高速で増殖するが、後者の条件の場合には、培地を毎日、または２日ごとに交換する必要があることを確認した。倍加時間を、１．２５％〜２．５％ＨＳ培地では２８時間と概算し、０．２５％〜０．５％ＨＳ培地では、２９〜３０時間であると概算した。ＢＭＳＣと比較した場合の、このような高い増殖の程度は、Ｇｈｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ．ら（２０００）およびＰｉｅｒｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ｌ．ら（２００５）から得られた結果と一致している。
【０２４２】
この点に関し、体細胞におけるＫｌｆ−４、Ｏｃｔ−４のアイソフォームＡ−アイソフォームＢ、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃの過剰発現が、この細胞が未分化の幹段階に戻ることを許可し得ることに注意すべきである（Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍ．ら、２００７、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ａ．ら、２００７）。
【０２４３】
ＤＰＭＳＣは、ＭＩＡＭＩ細胞と同様に、３種類すべての胚葉の最終的な組織特異的分化中にみられる多数の異なる種類のメッセンジャーＲＮＡを発現する。なぜ、多くの核性因子（例えば、Ｓｏｘ−２、Ｇａｔａ−４、Ｃｂｆａ−Ｉ、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ／Ｂｅｔａ２、ＨＮＦ−３β、ＨＮＦ４α、Ｍｓｘ−２、Ｄｌｘ−５など）について、これほど高程度の核外シグナルが存在するのかという疑問について調べた。理論によって束縛されないが、この変わった発現パターンは、不活性化した核性因子が蓄積した結果である可能性があり、これは、細胞を分化刺激に対してすばやく応答させることを可能にする。この仮説は、通常は分化に関連している多くのｍ−ＲＮＡ種が未分化細胞で発現していることを説明することができ、このことは、この細胞に、多能性を保持するか、または多様な系統へと発達するための機能が分子的に備わっている可能性があることを示唆する。ＩＤＰＳＣ（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６）と、本研究で記載する細胞集団との間の集団純度が似ていることから、本発明者らは、これらが似ていると考えている。違いは、非常に低いヒト血清を含む培地を用いていることであり、このことは、本発明者らの細胞をヒトへの臨床適用により適するようにする。
【０２４４】
ＤＰＭＳＣ細胞、および、これらを選別するために使用する培地は、変性疾患または遺伝性疾患を処置するための臨床的修復医薬品として大きな有望性を保持しており、ＥＳ細胞を用いることによって起こる倫理的な問題点もない。エクスビボで増やした自家ＤＰＭＳＣ細胞を、損傷したか、老化したか、または罹患した組織および臓器を修復する目的で自家移植に使用することができる。特定の遺伝子をＤＰＭＳＣ細胞に安定に形質導入する能力によって、変性障害および先天性障害を処置するために、自家細胞を遺伝的に操作することもできる。
【０２４５】
（実施例３Ａ  方向性の決まった前駆細胞型および組織特異的な細胞型を作製するために、ＤＰＭＳＣを分化誘導する）
適切な成長因子（ケモカインおよびサイトカイン）を用い、本発明のＤＰＭＳＣを、中胚葉に由来する種々の細胞ならびに神経外胚葉および内胚葉に由来する細胞を含む多くの細胞系統を生成するように分化誘導した。
【０２４６】
（骨芽細胞への分化）
約２０，０００個／ｃｍ２のＤＰＭＳＣを、デキサメタゾン（約１０ｎＭ〜約５００ｎＭ）、β−グリセロホスフェート（約１ｍＭ〜約５ｍＭ）、アスコルビン酸（約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ）、Ｃａ２＋（約１ｍＭ〜約２ｍＭ）、Ｍｇ２＋（約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ）、グルコース（約１ｇ／ｍｌ〜約５ｇ／ｍｌ）、ヒト血清（約０．５％〜約２％）、レチノイン酸（約１００ｎＭ〜約５００ｍＭ）、１７−β−エストロゲン（約０．１μＭ〜約１０μＭ）、ビタミンＫ２（約０．１μＭ〜約１０μＭ）、ビタミンＤ３（約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ）、カルシトニン（約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ）を含むＦ−１２培地で培養した。骨芽細胞の存在を示すために、本発明者らは、約３ヶ月培養した後、ミネラルの沈着についてはＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色アッセイ（ＣａＰｏ４の銀還元）を、オステオネクチン、コネキシン−４３、オステオポンチン（初期骨芽細胞マーカー）、オステオカルシン（後期骨芽細胞マーカー）を検出するためには抗体およびプライマーを用いた。同時に、本発明者らは、ｒｔ−ＰＣＲによって、ＢＭＰｒ−Ｉａ、Ｉｂ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４の存在について分析した。また、本発明者らは、ｘ−Ｒａｙ回折パターンを用い、ヒドロキシアパタイト生成の存在を評価した。
【０２４７】
ある方法では、ＤＰＭＳＣ細胞を骨芽細胞培地に懸濁させ、ペトリ皿（例えば、培養皿）に入れた。ＤＰＭＳＣ細胞を培養皿の底に沈殿させた。骨芽細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こると予想されるであろう。骨芽細胞への分化を約２週間〜約８週間後に検出し、これは、約３週間〜約４ヶ月の範囲であった。
【０２４８】
骨芽細胞へ誘導してから３ヶ月後、形態の変化を観察した。ｒｔ−ＰＣＲによって、増殖中および骨芽細胞への分化中に、ＤＰＭＳＣ細胞内のコア結合因子Ｉ型およびＩＩ型を検出した。免疫ブロット法は、Ｃｂｆａ−Ｉ（骨芽細胞マスター遺伝子）のアイソフォームが、ＤＰＭＳＣ細胞で発現していることを示した。Ｃｂｆａ−Ｉは、増殖中および３ヶ月後、骨芽細胞分化中に発現した。Ｍｓｘ−２は、増殖中および分化中の集団で構成的に発現した。Ｄｌｘ−５は、ｒｔ−ＰＣＲおよび免疫ブロット法によって示されるように、分化中に下方制御された。細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンＩ、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオネクチンのｍＲＮＡが、増殖中および分化中の集団で発現した。
【０２４９】
初期骨芽細胞マーカーであるオステオポンチンを、増殖中、および骨芽細胞への誘導から１４日後、３ヶ月後に検出するためにｒｔ−ＰＣＲ分析を行った。増殖中は、非常に少ないオステオポンチンの発現を観察するか、または発現を観察できず、一方、１４日目には発現量の増加を観察し、分化の３ヶ月後には発現量の低下を観察した。分化段階において、コネキシン−４３およびオステオポンチンが共発現した。免疫蛍光から、増殖中にはオステオカルシンは存在しないこと、一方、骨芽細胞に分化した後に、オステオカルシンが発現したことを示した。
【０２５０】
（実施例３Ｂ  骨芽細胞への分化）
約４０，０００個／ｃｍ２のＤＰＭＳＣ細胞を、デキサメタゾン（約１００ｎＭ〜約２５ｎＭ、ＭＰ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、β−グリセロホスフェート１．５ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、アスコルビン酸−３Ｐ  １３．５μＭ（Ｆｌｕｋａ）、Ｃａ２＋  １．２ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｇ２＋  ０．６ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、グルコース２ｇ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ）、ヒト血清０．５％〜１％、レチノイン酸２５０ｎＭ（ＭＰ）、１７−β−エストロゲン１μＭ（ＭＰ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、ビタミンＫ２  １０μＭ（Ｓｉｇｍａ）、ビタミンＤ３（約５ｎＭ〜約１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、カルシトニン（約１ｎＭ〜約２ｎＭ、ＭＰ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含むＦ−１２  Ｃｏｏｎ変法／Ａｍｂｅｓｉ変法培地で培養した。
【０２５１】
本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣ細胞を骨芽細胞培地に懸濁させ、培養皿に入れた。この実施例では、ＤＰＭＳＣ細胞を培養皿の底に沈殿させ、三次元構造を形成させる。骨芽細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こると予想されるであろう。骨芽細胞への分化を、２週間〜８週間検出してもよい。
【０２５２】
骨形成を確認するために、細胞を、オステオカルシン（ＯＳＣ）、コラーゲンＩ、ＣＢＦＡ−１、ＡＬＰ、オステオネクチン（ＯＳＮ）、オステオポンチン（ＯＰ）、骨形態形成タンパク質−２、４、７（ＢＭＰ−２、−４、−７）、さらに、骨形成に関与する受容体である骨形態形成タンパク質受容体−Ｉａ、Ｉｂ−ＩＩ（ＢＭＰｒ−Ｉａ、−Ｉｂ、ＩＩ）ならびにホメオドメインタンパク質ｍｕｓｃｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｏｍｅｏｂｏｘ−２（Ｍｓｘ２）およびｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ５（Ｄ１ｘ５）を含むいくつかの遺伝子の発現について、ＲＴ−ＰＣＲによって試験した。
【０２５３】
いくつかの骨形成遺伝子のプロモーターに結合する転写因子であるＣＢＦＡ−１  Ｉ型およびＩＩ型の発現（Ｄｕｃｙら、１９９７）を、骨に誘導されたＤＰＭＳＣ細胞において、すべての時間点で観察した。ＣＢＦＡ−１  Ｉ型の発現は、誘導されていないＤＰＭＳＣ細胞でも基礎的な発現が観察されているため、骨に誘導された細胞に特異的なものではなかった。半定量（ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲによってＣＢＦＡ−１  Ｉ型およびＩＩ型の発現量を定量することで、ＩＩ型については、誘導されていないＤＰＭＳＣと比較して、遺伝子発現量が時間に依存して増加していること、Ｉ型については、誘導されていないＤＰＭＳＣと比較して、遺伝子発現量が時間に依存して低下していることを確認した。これらのデータは、ＣＢＦＡ−１タンパク質の発現も実証したウェスタンブロットによって支持された。
【０２５４】
分化したＤＰＭＳＣ細胞およびコントロールＤＰＭＳＣ細胞において、すべての時間点でＡＬＰおよびコラーゲンＩの発現が観察されたが、処置を９０日間続けると、ＡＬＰおよびコラーゲンＩの発現レベルが増えた。ＣＢＦＡ−１、コラーゲンＩ、ＡＬＰに加え、分化したＤＰＭＳＣ細胞およびコントロールＤＰＭＳＣ細胞において、ＯＳＮの発現も観察した。これらの遺伝子の発現は、骨形成の指標であるが、これらは特異的なマーカーではない。しかし、分化後期の骨特異性遺伝子ＯＳＣの発現を、誘導されたＤＰＭＳＣ細胞でも誘導されていないＤＰＭＳＣ細胞でも観察した。ＯＳＣタンパク質は、免疫蛍光および免疫ブロット法で決定される場合、誘導から３ヶ月後にしか発現していなかった。このことは、文献にも記載されている（Ｎｅｆｕｓｓｉ  Ｊ．Ｒ．ら、１９９７）。
【０２５５】
骨に誘導されたＤＰＭＳＣ細胞発現される初期骨芽細胞分化マーカー（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ．ら、２００２）ＯＳＰは、三相性であると思われる。すなわち、増殖中には発現せず、誘導から１４日目には多く発現しており、誘導から３ヶ月後には発現量が低下する。これらのデータを、免疫蛍光によって確認した。骨に誘導されたＤＰＭＳＣ細胞および誘導されていないＤＰＭＳＣ細胞は、両方とも、骨芽細胞の分化に関与する遺伝子であるホメオドメインタンパク質ｍｓｘ−２を発現した（Ｂｅｎｓｏｎら、２０００）。Ｄｌｘ５は、誘導されていないＤＰＭＳＣ細胞で検出され、その発現量は、誘導されたＤＰＭＳＣ細胞では低下していた。データを、ウェスタンブロットによって確認した。
【０２５６】
分化したＤＰＭＳＣ細胞およびコントロールＤＰＭＳＣ細胞において、すべての時間点でＢＭＰ−２および４の発現を観察した。同時に、ＢＭＰｒ−Ｉａおよびｌｂの発現をすべての時間点で観察したが、分化した細胞では発現量が増加していた。一方、ＢＭＰ−７メッセンジャーの発現は、増殖中にのみ存在し、ＢＭＰｒ−ＩＩの発現は、ＤＰＭＳＣ細胞では常に起こらなかった。
【０２５７】
分化中に、ミネラル分の塊がいくらか生じ、ミネラル分の沈着を明らかにするために、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色アッセイ（ＣａＰｏ４の銀還元）を用いた。また、Ｘ線回折パターンを用い、ヒドロキシアパタイト形成の存在を評価した。３Ｄ−凝集実験は、同じ結果を示した。免疫染色は、一次抗体をネガティブコントロールとして用い、Ｈｏｂｉｔ細胞株（Ｋｅｅｔｉｎｇ  Ｐ．Ｅ．ら、１９９２）をポジティブコントロールとして用いた場合に、染色が検出されなかったという実験で特異的であることが示された。
【０２５８】
（実施例４Ａ  成体の歯髄幹細胞に由来する神経細胞の作製）
分化したニューロンは、有糸分裂後ニューロンであり、したがって、ニューロン再生は、通常、インビボではほとんど観察されないか、またはまったく観察されない。神経変性障害および脳の外傷による障害の治療は、新しい増殖性神経幹細胞（ＮＳＣ）を、脳の欠損領域に導入して、欠損組織の機能を回復させることができれば、顕著に進むであろう。出生後骨髄から選択したＤＰＭＳＣ（すべての中胚葉細胞型に分化する）を、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞に分化させることもできる。
【０２５９】
ＤＰＭＳＣ培養物を、上述のように樹立した。神経発生は、以下のように誘導した。神経分化培地からなる培地で増殖させ、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞を作製した。この培地は、以下のもので構成されていた。ＤＭＥＭ−ＨＧ、１×ＩＴＳ、０．５〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ（好ましくは、約１０ｎｇ／ｍＬ）。この培地は、特定の細胞型へ分化誘導するために、１つ以上の以下のサイトカインも含んでいた。ドーパミン作動性ニューロンの場合、５〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（好ましくは、約１６ｎｇ／ｍＬ）。ＤＰＭＳＣを神経細胞へと分化誘導するための成長因子の選択は、神経系の胚発生で知られていること、または、インビトロでＮＳＣ分化を評価した研究から知られていることに基づいていた。星状膠細胞を、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に陽性の細胞として同定し、乏突起膠細胞を、グルコセレブロシド陽性（Ｇａｌ  Ｃ）として同定し、ニューロンを、ＮｅｕｒｏＤ、チューブリン−ＩＩＩＢ（Ｔｕｊｉ）、シナプトフィシンおよびニューロフィラメント−６８、１６０−２００ｋＤａを逐次的な様式で発現する細胞として同定した。
【０２６０】
脳で特異的に発現し、インビボおよびインビトロで神経発生に影響を与える他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられる。ＢＤＮＦは、インビトロで、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、ニューロン前駆体をニューロンに分化させるのを促進し、海馬幹細胞の神経突起伸長をインビボで促進する、神経成長因子ファミリーのメンバーである。黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を支えるというＢＤＮＦの既知の機能と一致して、ＤＰＭＳＣを、１６ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦＲで処理した場合、チロシンヒドロキシラーゼに陽性のニューロンへの排他的な分化を観察した。
【０２６１】
ポスト歯髄（ｐｏｓｔ−ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ）からＤＰＭＳＣを単離し、エクスビボで増やし、インビトロでグリア細胞または特定の神経細胞型へ分化誘導することの容易性は、ＮＳＣ移植における重要な問題の１つ、すなわち、適切なドナー組織の入手可能性における問題を回避した。
【０２６２】
一般的に、神経分化は、神経への指定、神経への方向づけ、神経分化という少なくとも３つの連続する工程で進む。神経への指定を、３０００／ｃｍ２のＤＰＭＳＣ細胞を、神経指定培地と接触させることによって誘導した。神経指定培地は、最小必須培地（例えば、ＤＭＥＭ−ＨＧ）を含んでいた。神経指定培地は、典型的には、１つ以上のさらなる添加剤（例えば、血清、抗生物質、成長因子、栄養素、またはこれらの組み合わせ）を含んでいた。このような添加剤の具体的で非限定的な例としては、血清（約５容積％〜約２５容積％）が挙げられる。
【０２６３】
ＤＰＭＳＣ細胞を、神経への指定を誘導するのに十分な時間、神経指定培地でインキュベートした。このようなインキュベート時間は、約１２時間〜約３６時間、例えば、約２４時間、または１〜２日間であった。神経への方向づけは、神経に指定された（ｎｅｕｒａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）ＤＰＭＳＣを、神経に方向づける培地と接触させることによって誘導した。神経に方向づける培地は、最小必須培地（例えば、ＤＭＥＭ−ＨＧ）を含んでいた。神経に方向づける培地は、典型的には、１つ以上のさらなる添加剤（例えば、抗生物質、成長因子、栄養素、またはこれらの組み合わせ）を含んでいた。このような添加剤の例としては、ＥＧＦ（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＮＴ−３（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＤＮＦ（約５ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＨＡ（約０．１μＭ〜約１００μＭ）、ＩＢＭＸ（約０．１μＭ〜約１００μＭ）、ＡＴＲＡ（約０．１μＭ〜約１０μＭ）、プロゲステロン（約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ）２０ｎＭが挙げられる。神経に指定されたＤＰＭＳＣを、神経への方向づけを誘導するのに十分な時間、神経に方向づける培地でインキュベートした。このようなインキュベート時間は、約１０日間〜約２０日間、例えば、約１５日間であった。
【０２６４】
ニューロンあたりの神経突起の数は、分化から３〜４週間で増加した。ニューロンの特性を有する細胞への分化は、ウェスタンブロットによって、ＧＦＡＰ、ニューロフィラメント−１６０、シナプトフィシン、β３−チューブリンの存在を示すことによって確認した。シナプトフィシン、Ｓｙｎａｐｓｙｎ  Ｉ、ニューロフィラメント１６０、β３−チューブリン、Ｎ−カデリン（Ｎ−ｃａｄｅｒｉｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、Ｎ−カドヘリン、ニューロフィラメント−６８、ＮＳＥ、ネスチン、ｐ７５−ＮＧＦｒ、ビメンチンの存在は、免疫蛍光で検出した。β３−チューブリン、ニューロフィラメント−６８、−１６０、−２００、ビメンチン、ＮＳＥ、β３−チューブリン、Ｇ−Ｆａｐ、グリピカン、Ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチンの発現は、ｒｔ−ＰＣＲによって検出した。
【０２６５】
（実施例４Ｂ  神経への分化）
神経への指定は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＤＰＭＳＣ細胞（３，０００細胞／ｃｍ２）をインキュベートすることによって誘導する。２４時間後、培地を、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ）を含有し、ＤＭＥＭ−高グルコース、１０％ＦＢＳを含む、神経に方向づける培地と１５日間の間交換する。次いで、細胞を１：３で継代し、ＮＴ−３  ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＮＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＢＤＮＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＢＨＡ  ２０μＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＩＢＭＸ  ５０μＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＡＴＲＡ  １μＭ（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン  ２０ｎＭ（Ｓｉｇｍａ）を含む、神経に方向づける培地に入れる。
【０２６６】
神経への分化は、神経に方向づけられた細胞と、ＤＭＥＭ、ＮＴ−３  ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＮＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＢＤＮＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、５μｇ／ｍｌ  インスリン（Ｓｉｇｍａ）、２００μＭ  インドメタシン（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）からなる神経分化培地とを接触させることによって誘導される。神経に方向づけられたＤＰＭＳＣ細胞を、神経分化培地で１日間インキュベートした。
【０２６７】
本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣ細胞のペレットを、培養皿中の３つの連続した培地に懸濁させた。この実施例では、ＤＰＭＳＣ細胞を培養皿の底に沈殿させ、三次元（３Ｄ）構造を形成させた。神経への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こると予想されるであろう。神経への分化を、４週間検出してもよい。
【０２６８】
神経誘導されたＤＰＭＳＣ細胞の形態は、成熟ニューロンの形態と非常に似ており、それは、大量の神経突起を有しており、神経突起は分化から３〜４週間で増加し、顕著に分岐した。
【０２６９】
半定量ｒｔ−ＰＣＲから、ＤＰＭＳＣ細胞は、増殖中は低レベルで、誘導後は高レベルで、β３−チューブリン、ニューロフィラメント−６８、−１６０、−２００、ビメンチン、ＮＳＥ、Ｇ−Ｆａｐ、Ｍｕｓａｓｈｉを発現することを示した。神経幹前駆体マーカーであるビメンチンは、増殖中および神経分化中の両方で発現したが、誘導中は、あまり組織化しなかった。神経内分泌核性因子であるＮｅｕｒｏ−Ｄ／Ｂｅｔａ−２は、免疫蛍光およびウェスタンブロットで示される場合、増殖中にのみ発現した。
【０２７０】
別のニューロフィラメント神経幹マーカーであるネスチンの発現は、増殖段階から誘導段階に向かって低下した。β３−チューブリンは、免疫蛍光およびウェスタンブロットの両方でアッセイされ、分化した後に、ＤＰＭＳＣ細胞の９９％で大いに発現した。構造的ニューロフィラメントであるＮＦ−１６０およびＮＦ−２００は、分化中にのみ発現し、陽性率は、ＮＦ−１６０の場合、約５０％であり、ＮＦ−２００ではそれほど多くはなく、これは、成熟神経表現型と一致している（Ｄ’ｉｐｐｏｌｉｔｏ  Ｇ．ら、２００４）。また、データは、ＮＦ−１６０の場合、免疫ブロット法で確認した。対称的に、ＮＦ−６８タンパク質は、ＮＳＥで示されるのと同様に、増殖中と、神経誘導後に常に発現した。
【０２７１】
シナプス小胞輸送マーカーであるＳｙｎａｐｓｙｎ−Ｉおよびシナプトフィシンは、神経誘導させたすべてのＤＰＭＳＣ細胞で分化後にのみ発現し、同時に、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｎ−カデリン（Ｎ−ｃａｄｅｒｉｎ）、ｐ７５−ＮＧＦｒを、免疫蛍光を用いて、誘導後にのみ検出した。
【０２７２】
乏突起膠細胞マーカー−４（Ｏ−４）は、発現しなかった。星状膠細胞マーカーＧ−Ｆａｐは、増殖中および神経分化中に発現するが、誘導中にはあまり組織化されなかった。ＧＦＡＰおよびβ３−チューブリンは、共発現し、これは、最近の発見と一致していた（Ｓｏｅｎ  Ｙ．ら、２００６）。３Ｄ−凝集実験は、同じ結果を示した。特異性免疫染色（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）を、一次抗体をネガティブコントロールとして用い、Ｂｅ２Ｃ膠芽細胞腫細胞株をポジティブコントロールとして用いた場合に、染色が検出されないという実験で示した。
【０２７３】
（実施例５Ａ  心筋細胞への分化）
任意の心筋細胞への分化は、分化誘導する前に、ＤＰＭＳＣを１０，０００細胞／ｃｍ２で接種することによって達成することができる。心筋細胞への細胞分化を誘導するために、密集状態のＤＰＭＳＣ細胞を、ＦＢＳ（約１％〜約１０％）、ＩＢＭＸ（約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ）、ＶＥＧＦ（約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ  ＨＧで処理した。ＤＰＭＳＣ細胞を、心筋細胞培地に懸濁させ、培養皿に入れた。ＤＰＭＳＣ細胞を培養皿の底に沈殿させた。心筋細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こると予想されるであろう。心筋細胞への分化を、約２週間〜約３ヶ月間検出した。インビトロでの筋肉への分化は、市販の抗体および特異的なプライマーを用いる免疫組織化学またはウェスタンブロットおよびｒｔ−ＰＣＲ分析によって、アクチニン、骨格筋アクチンおよび心筋アクチン、骨格筋ミオシンの逐次活性化を検出することによって示した。免疫組織化学によると、細胞の９０％が、１４日後に成熟筋肉タンパク質を発現した。分化培地で処理すると、培養１８日間で、ＡＳＡ、Ｃａ−チャネルＤＨＰＲ、ＳＭＡ、ｃ−ＴｎＴ、コネキシン−４３、Ｍｓｘ−２、ミオシン重鎖、Ｇａｔａ−４、Ｓｅｒｃａ２Ａを発現した。それに加え、心筋重鎖ミオシンが組織化され、アクチニンと同様に、最大３０日間までＡＳＡと共発現した。
【０２７４】
（実施例５Ｂ  心筋細胞への分化）
任意の筋肉表現型へ分化させるには、分化誘導の前に、ＤＰＭＳＣを１１，０００細胞／ｃｍ２で接種することが必要であった。心筋細胞への細胞分化を誘導するために、密集状態のＤＰＭＳＣ細胞を、５％  ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ製）を含むＤＭＥＭで処理した。細胞を密集状態にして、４日ごとに培地を交換しつつ、約２週間〜約３ヶ月間培養した。
【０２７５】
本発明の一態様では、ＤＰＭＳＣ細胞を心筋細胞培地に懸濁し、培養皿に入れた。この実施例では、ペレット状のＤＰＭＳＣ細胞を培養皿の底に沈殿させ、三次元構造を形成させた。心筋細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こると予想されるであろう。心筋細胞への分化を、２週間〜３ヶ月間検出してもよい。心筋細胞への分化を、約２週間〜約３ヶ月間検出してもよい。この分化期間中、細胞は、長くなり、不規則な形になった。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、骨格筋アクチン（ＳＫＭＡ）、心筋アクチン（ＣＡ）、心筋トロポニンＴ（ｃ−ＴＮＴ）、筋細胞エンハンサー因子−２ａ（ＭＥＦ−２ａ）、ミオシン重鎖（Ｍｈｃ）の共発現を、半定量ｒｔ−ＰＣＲによって、増殖中および分化中に検出した。最後の段階で、発現が増加した。
【０２７６】
Ｇａｔａ−４およびＮｋｘ−２．５のメッセンジャー発現は、両方の段階において非常に低かった。Ｍｓｘ−２のｍ−ＲＮＡ発現は、増殖中および分化中で非常に高かった。ミオカルジンの発現は、分化後に低下した。細胞が、α−アクチニン、α−サルコメアアクチン、ミオシン重鎖の組織化されたフィラメントを有したことを示した。データを、ウェスタンブロットで確認した。α−サルコメアアクチンおよびミオシン重鎖が共発現し、分化している細胞の一部で組織化した。このことは、文献と一致していた。
【０２７７】
ギャップジャンクションを、細胞と細胞との接触部位の近くにあるコネキシン−４３の存在によって示した。Ｌ型カルシウムチャネル、Ｓｅｒｃａ−２  ＡＴＰａｓｅポンプ、ｃ−ＴＮＴも、分化細胞で同定した。増殖段階において、ＳＭＡは高い程度で発現し、誘導後にその発現は低下したが、免疫蛍光で示される場合、繊維状構造を損なうことはなかった。
【０２７８】
α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は、胚および胎児の心筋細胞には存在するが、成人の心筋細胞には存在しないことが報告されており、このことは、これらの心筋細胞が、心筋細胞の初期段階に相当し得ることを示唆している（Ｌｅｏｒ  Ｊ．ら、１９９６、Ｅｔｚｉｏｎ  Ｓ．ら、２００１）。Ｍｓｘ−２の発現は、増殖段階から分化段階に向かって常に低下し、一方、ＧＡＴＡ−４の発現は、心筋細胞の誘導後に失われた。３Ｄ−凝集実験は、同じ結果を示した。特異性免疫染色は、二次抗体をネガティブコントロールとして用い、外植した心臓の培養片をポジティブコントロールとして用いた場合に、染色が検出されないという実験で示した。
【０２７９】
（実施例６Ａ  肝細胞への分化）
肝細胞を得るために、ＤＭＥＭ低グルコース  １〜１０％ＦＣＳ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、オンコスタチン（ＯＳＭ）（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（約１ｍＭ〜約１００ｍＭ）、ＬＤＬ（約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−４（約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ）、リノール酸（約１８０μｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ）、グルコース（約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ）を用いて、分化誘導する前に、ＤＰＭＳＣを２０，０００細胞／ｃｍ２で接種した。１４〜３７日後に、アルブミンを発現および分泌する小さな類上皮細胞が見えた。それに加え、細胞は、ＨＧＦ受容体、サイトケラチン１９、Ａｂｃｇ−２、ＭＤＲ−Ｉ、トランスフェリン、ソマトスタチン、エリスロポエチン、シトクロムＰ−４５０サブユニット２ｅ１のｍＲＮＡを発現した。アルブミン、尿素、サイトケラチン−８−１８−１９、ＨＮＦ−３βおよびＨＮＦ−４αの存在および分泌は、肝細胞へ分化することが可能であることを示唆していた。
【０２８０】
（実施例６Ｂ  肝細胞への分化）
肝実質細胞分化を、密集状態のＤＰＭＳＣ細胞において、ＤＭＥＭ低グルコース１％ＦＣＳ、肝細胞成長因子２０ｎｇ／ｍＬ（ＨＧＦ）（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、オンコスタチン１０ｎｇ／ｍｌ（ＯＳＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ニコチンアミド１０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＬＤＬ  １．２５μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、ＦＧＦ−４  １０ｎｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、インスリン（１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、リノール酸０．０００１８ｇ／Ｌ（ＭＰ）、グルコース１．２５ｇ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ）で１４〜３７日間インキュベートすることによって誘導した。肝細胞への分化は、例えば、空気９５％、５％  ＣＯ２、１００％の加湿雰囲気で、３７℃で起こることが予想され得、肝臓への分化を、５週間後に検出してもよい。
【０２８１】
分化した細胞は、１４〜３７日後に、偏在性の核を有する球状の形を呈した。増殖から分化に向かって、これらの細胞は、半定量ｒｔ−ＰＣＲで示される場合、ｃ−ＭＥＴ／ＨＧＦ−ｒ（肝実質細胞核性因子受容体）、Ａｂｃｇ−２、ＭＤＲ−Ｉ（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  Ｍ．Ｍ．ら、２００４、Ｄｅ  Ｃｏｐｐｉ  Ｐ．ら、２００７）の発現と同様に、アルブミン、トランスフェリン、ソマトスタチン、エリスロポエチン、シトクロムＰ−４５０サブユニット２ｅ１の発現が増加しており、ならびに、サイトケラチン−１９（Ｃｋ−１９）の発現が低下した。
【０２８２】
細胞は、免疫蛍光で示される場合、分化後にのみ、大きな割合で、肝上皮特異的サイトケラチン８、１８、１９について染色陽性であり、小さな繊維状の組織を伴なった。細胞は、免疫ブロット法によって示される場合、肝細胞へ誘導した後、肝実質細胞核性因子４αおよび３βを発現した。これらは、肝性上皮へと最終的に形態および機能の方向性を決めるために重要な核性因子である（Ｎａｇｙ  Ｐ．ら、１９９４、Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ  Ｒ．ら、２００６）。細胞は、肝細胞のいくつかの機能（例えば、ＰＡＳ染色で示されるような、グリコーゲンを蓄える能力、および培養上清中のアルブミンおよび尿素の濃度／用量を試験することによって調べられるような、上述の因子を生成する能力）を獲得した。特異性免疫染色は、二次抗体をネガティブコントロールとして用い、ＨｅｐＧ２細胞をポジティブコントロールとして用いた場合に、染色が検出されないという実験で示した。
【０２８３】
（実施例７  置換治療および／または遺伝子治療のためのＤＰＭＳＣ）
有効量の本発明のＤＰＭＳＣを、それが必要な個体に有効量のＤＰＭＳＣを投与することによって、先天性の神経変性障害または貯蔵障害（例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー（球様細胞白質萎縮症、カナバン病）、フコース蓄積症、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマンピック病、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、テイサックス病など）を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。これらを用い、後天性の神経変性障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病）を処置するか、またはその症状を緩和する。また、これらを外傷性障害（例えば、脳卒中、ＣＮＳの出血、ＣＮＳの外傷）；末梢神経系障害（例えば、脊髄損傷または脊髄空洞症）；網膜の障害（例えば、網膜剥離、黄斑変性および他の網膜の変性障害、糖尿病性網膜症）に使用する。
【０２８４】
有効量の本発明のＤＰＭＳＣを、いくつかの臓器疾患を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。この細胞を、先天性の肝障害、例えば、貯蔵障害、例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシス；ビリルビンが上昇する障害、例えば、クリグラーナジャー症候群；アンモニア障害、例えば、尿素サイクルの先天異常、例えば、オルニチン脱炭酸酵素欠乏症、シトルリン血症、アルギニノコハク酸尿症；アミノ酸および有機酸の先天異常、例えば、フェニルケトン尿、遺伝性チロシン血症、α１−アンチトリプシン欠乏症；凝固障害、例えば、第ＶＩＩＩ因子欠乏および第ＩＸ因子欠乏を治療または緩和するために使用する。この細胞を、ウイルス感染による後天的な肝障害を処置するために使用する。本発明の細胞を、エクスビボ用途で、例えば、人工肝臓（腎臓透析に類似）を作製するため、凝固因子を産生するため、および、肝上皮によって作られるタンパク質または酵素を産生するために使用する。
【０２８５】
本発明の細胞を、胆管障害（例えば、胆汁肝硬変および胆道閉鎖症）を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。
【０２８６】
本発明の細胞を、膵臓障害（例えば、膵臓閉鎖症、膵臓の炎症、α１−アンチトリプシン欠乏症）を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。さらに、膵臓上皮を本発明の細胞から作ること、ならびに神経細胞を作り得ることと同様に、β細胞を作製することができる。糖尿病を治療するために、上述の細胞を使用する（皮下移植または膵臓内移植または肝臓内移植）。
【０２８７】
さらに、本発明の細胞を、腸上皮障害（例えば、腸閉鎖症、炎症性腸障害、腸梗塞、腸切除）を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。
【０２８８】
さらに、本発明の細胞を、皮膚障害（例えば、脱毛症、皮膚の欠損、例えば、火傷および白皮症）を処置するか、またはその症状を緩和するための細胞置換治療および／または遺伝子治療で使用する。
【０２８９】
【化１】
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【０２９０】
【化２】
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【０２９１】
【化３】
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【０２９２】
【化４】
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【０２９３】
【化５】
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【０２９４】
【化６】
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【０２９５】
【化７】
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【０２９６】
【化８】
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【０２９７】
【化９】
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【０２９８】
【化１０】
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【０２９９】
【化１１】
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【０３００】
【化１２】
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【０３０１】
【化１３】
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【０３０２】
【化１４】
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【国際調査報告】
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