(57)【要約】本発明は、正常臓器と比較したECT2の過剰発現を検出することによって肺癌または食道癌を検出するための方法を特徴とする。肺癌または食道癌の治療または予防のための化合物を、肺癌または食道癌におけるECT2の過剰発現、ECT2の細胞増殖機能に基づいて同定する方法も開示する。また、ECT2遺伝子に対する二本鎖分子またはECT2タンパク質に対する抗体を投与することによって、肺癌または食道癌を治療するための方法も提供する。本発明はまた、提供される方法において有用な、二本鎖分子およびそれらをコードするベクターを含む産物、さらにはそれらの分子またはベクターを含む組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、肺癌または食道癌を有する患者の予後を評価するための方法：
a）患者由来の生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルを検出する段階；
b）検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
c）（b）の比較に基づいて患者の予後を判定する段階。
【請求項２】
肺癌がNSCLCである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
食道癌がESCCである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
対照レベルが予後良好な対照レベルに対応し、かつ対照レベルと比較して発現レベルが上昇していることが予後不良と判定される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ECT2発現レベルが前記対照レベルを少なくとも10％上回る、請求項4記載の方法。
【請求項６】
他の肺癌関連遺伝子または食道癌関連遺伝子の発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、請求項1記載の方法：
a）ECT2遺伝子のmRNAを検出すること；
b）ECT2タンパク質を検出すること；および
c）ECT2タンパク質の生物活性を検出すること。
【請求項８】
前記発現レベルが、プローブとECT2遺伝子の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション段階がDNAアレイ上で行われる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記発現レベルが、ECT2タンパク質に対する抗体の結合を検出することによって決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記生物試料が痰または血液を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖がSEQ ID NO：1および2からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が該センス鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子がETC2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、かつ該標的配列がSEQ ID NO：11のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続したヌクレオチドを含む、二本鎖分子。
【請求項１３】
標的配列が、SEQ ID NO：11のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続したヌクレオチドからなる、請求項12記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
一本鎖オリゴヌクレオチド配列を介して結びついたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のオリゴヌクレオチド分子である、請求項12記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項12記載の二本鎖分子。
【請求項１６】
約19〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項15記載の二本鎖分子。
【請求項１７】
前記単一のオリゴヌクレオチド分子が、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]が、SEQ ID NO：1および2のヌクレオチド配列であり；[B]が、3〜23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ[A']が、[A]に対して相補的なヌクレオチド配列である、請求項14記載の二本鎖分子。
【請求項１８】
請求項12記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１９】
二次構造を有する転写物をコードし、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項18記載のベクター。
【請求項２０】
転写物が、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を結びつける一本鎖オリゴヌクレオチド配列をさらに含む、請求項19記載のベクター。
【請求項２１】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、該センス鎖核酸がSEQ ID NO：1および2のヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に対して相補的な配列からなる、ベクター。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]が、SEQ ID NO：1および2のヌクレオチド配列であり；[B]が、3〜23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ[A']が、[A]に対して相補的なヌクレオチド配列である、請求項21記載のベクター。
【請求項２３】
細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の薬学的有効量を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1または2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的とする、薬学的組成物。
【請求項２４】
前記二本鎖分子が、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]が、SEQ ID NO：1または2の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]が、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチドループ配列であり、かつ[A']が、[A]に対して相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗原と結合する、ECT2を認識する抗体。
【請求項２６】
請求項25記載の抗体の薬学的有効量を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項２７】
患者由来の生物試料におけるECT2の発現のレベルを決定する段階を含む、対象における肺癌もしくは食道癌、または肺癌もしくは食道癌を発症する素因を診断する方法であって、該遺伝子の正常対照発現レベルと比較して該試料の発現レベルが上昇していることにより、該対象が肺癌に罹患しているか肺癌を発症するリスクを有することが示される、方法。
【請求項２８】
前記試料の発現レベルが正常対照レベルを少なくとも10％上回る、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、請求項28記載の方法：
（a）ECT2のmRNAを検出すること、
（b）ECT2によってコードされるタンパク質を検出すること、および
（c）ECT2によってコードされるタンパク質の生物活性を検出すること。
【請求項３０】
生物試料が肺組織または食道組織を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための候補化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）候補化合物を、ECT2によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（b）該ポリペプチドと候補化合物との結合活性を検出する段階；および
（c）該ポリペプチドと結合する候補化合物を選択する段階。
【請求項３２】
以下の段階を含む、肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）候補化合物を、ECT2を発現する細胞と接触させる段階；および
（b）ECT2の発現レベルを、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる候補化合物を選択する段階。
【請求項３３】
以下の段階を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）候補化合物を、ECT2によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（b）段階（a）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（c）ECT2によってコードされるポリペプチドの生物活性を、候補化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する候補化合物を選択する段階。
【請求項３４】
ポリペプチドの生物活性が細胞増殖活性である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）候補化合物を、ECT2の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（b）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（c）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して低下させる候補化合物を選択する段階。
【請求項３６】
細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、前記対象における肺癌または食道癌を治療または予防するための方法であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1または2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年7月16日に提出された米国特許仮出願第61／081,165号の恩典を主張し、その開示内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、癌の検出、診断および予後予測のための方法、ならびに癌の治療および予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
原発性肺癌は、ほとんどの国において癌死の主因である（Alberg AJ. et al. J Clin Oncol 2005;14:3175-85（非特許文献1）、Parkin DM. Lancet Oncol 2001;2:533-43（非特許文献2））。一方、食道扁平上皮癌（ESCC）は、最も頻度の高い胎児消化管悪性腫瘍の1つである（Shimada H. et al. Surgery 2003;133:486-94（非特許文献3））。外科手術手法およびアジュバント放射線化学療法の進歩にもかかわらず、進行した肺癌または食道癌を有する患者は多くの場合、致死的な疾患進行を来す（Parkin DM. Lancet Oncol 2001；2：533-43（非特許文献2）、Shimada H. et al. Surgery 2003；133：486-94（非特許文献3））。このため、これらの2種の主要な胸部癌の生物学的過程（biology）を解明すること、およびより有効な治療を導入することが、患者の生存の改善のためには極めて重要である（Daigo Y. and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53（非特許文献4））。特異的分子ターゲティングの考え方が革新的な癌治療戦略の開発に応用されており、現時点では主に、治療用モノクローナル抗体および低分子作用物質という2通りのアプローチを診療に利用することができる（Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23（非特許文献5））。今日までに、4種類の標的治療薬（ベバシズマブ、セツキシマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブ）が、進行した非小細胞肺癌（NSCLC）の治療に関するランダム化試験において検討されている（Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23（非特許文献5）、Sandler A. et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50（非特許文献6）、Shepherd FA. et al. N Engl J Med 2005;353:123-32（非特許文献7）、Thatcher N. et al. Lancet 2005;366:1527-37（非特許文献8））。血管新生促進タンパク質である血管内皮増殖因子（VEGF）に対する治療用抗体（ベバシズマブ）または上皮増殖因子受容体（EGFR）に対する治療用抗体（セツキシマブ）を、従来の化学療法に追加することは、NSCLC患者において有意な生存上の利点を有している（Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23（非特許文献5）、Sandler A. et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50（非特許文献6）)。2種類の低分子EGFRチロシンキナーゼ阻害薬であるエルロチニブおよびゲフィチニブは、進行したNSCLC患者のサブセットに対して有効であることが示されている（Shepherd FA. et al. N Engl J Med 2005;353:123-32（非特許文献7）、Thatcher N. et al. Lancet 2005;366:1527-37（非特許文献8））。しかし、毒性の問題のためにこれらの治療レジメンは厳選された患者に限定される上、利用しうるすべての治療が適用された場合でさえ、良好な反応を示す患者の割合は依然として非常に低い（Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23（非特許文献5）、Sandler A. et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50（非特許文献6）、Shepherd FA. et al. N Engl J Med 2005;353:123-32（非特許文献7）、Thatcher N. et al. Lancet 2005;366:1527-37（非特許文献8））。
【０００４】
肺癌および食道癌の診断、治療および／または予防のための、可能性のある分子標的を単離するために、本発明者らは以前、27,648種の遺伝子またはESTからなるcDNAマイクロアレイを使って、101例の肺癌患者および19例のESCC患者からの癌細胞の遺伝子発現プロファイルのゲノムワイド分析を行った（Daigo Y. and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53（非特許文献4）、Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205（非特許文献9）、Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99（非特許文献10）、Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43（非特許文献11）、Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006；28:799-805（非特許文献12）、Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75（非特許文献13）、Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84（非特許文献14））。各々の遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するために、本発明者らは、肺癌および食道癌の臨床材料の腫瘍組織マイクロアレイ分析とRNA干渉（RNAi）法との組み合わせによるスクリーニングシステムを確立した(Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41（非特許文献15）、Ishikawa N. et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70（非特許文献16）、Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46（非特許文献17）、Furukawa C. et al. Cancer Res 2005;65:7102-10（非特許文献18）、Ishikawa N. et al. Cancer Res 2005; 65:9176-84（非特許文献19）、Suzuki C. et al. Cancer Res 2005;65:11314-25（非特許文献20）、Ishikawa N. et al. Cancer Sci 2006;97:737-45（非特許文献21）、Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19（非特許文献22）、Hayama S. et al. Cancer Res 2006;66:10339-48（非特許文献23）、Kato T. et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42（非特許文献24）、Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51（非特許文献25）、Yamabuki T. Cancer Res 2007;67:2517-25（非特許文献26）、Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22（非特許文献27）、Kato T. et al. Cancer Res 2007;67:8544-53（非特許文献28）、Taniwaki M. et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31（非特許文献29）、Ishikawa N. et al. Cancer Res 2007;67:11601-11（非特許文献30）、Mano Y. et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13（非特許文献31）、Suda T. et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8（非特許文献32）、Kato T. et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70（非特許文献33）)。この過程において、本発明者らは、上皮細胞トランスフォーミング配列2（epithelial cell transforming sequence 2）（ECT2）癌遺伝子を、肺癌および食道癌に関する予後予測用バイオマーカーおよび治療標的として同定した（WO 2004／031413号（特許文献1）、WO2007／013671号（特許文献2））。
【０００５】
ECT2はマウス上皮細胞株BALB／MKから発現クローニング手順によって単離され、それはインビトロでトランスフォーミング活性を付与した（Miki T. Methods Enzymol 1995；256:90-8（非特許文献34））。ECT2は、タンパク質のC末端にDbl相同性（DH）／プレクストリン相同性（PH）カセットを有し、かつRho GTPアーゼのグアニンヌクレオチド交換を媒介する、Dblファミリーのメンバーである（Tatsumoto T. et al. J Cell Biol 1999；1475:921-8（非特許文献35））。ECT2のN末端は、細胞周期チェックポイントおよびDNA損傷応答に関与する多くのタンパク質において保存されているBRCTドメインの縦列反復配列を含む（Kim JE. et al. J Biol Chem 2005；280:5733-9（非特許文献36））。ECT2は中心紡錘体および細胞の赤道面表層（equatorial cortex）に局在し、RhoAを活性化することによって細胞質分裂を誘発する（Petronczki M. et al. Dev Cell 2007;12:713-25（非特許文献37）、Scoumanne A. and Chen X. Cancer Res 2006;66: 6271-9（非特許文献38）、Eguchi T. et al. Oncogene 2007;26:509-20（非特許文献39）、Hara T. et al. Oncogene 2006;25:566-78（非特許文献40））。ECT2はグリオーマ細胞において過剰発現されることが示されている（Sano M. et al. Oncol Rep 2006;16:1093-8（非特許文献41））。細胞質分裂にECT2が働くという証拠にもかかわらず、ヒト癌の進行におけるECT2活性化の意義、および治療標的としてのその臨床的可能性は、先行技術において十分には記述されていない。
【０００６】
本発明者らは、本明細書において、肺癌および食道癌に関する、医療施設での癌予測バイオマーカーとして、および有用な治療標的としてのECT2の同定を報告するとともに、癌の進行におけるECT2の生物学的役割についても記述する。
【０００７】
近年、遺伝子特異的siRNAを用いる癌治療法の新たなアプローチが、臨床試験において用いられている（Bumcrot D et al., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2(12): 711-9（非特許文献42））。RNAiは、主要な技術プラットフォームの中でも重要な地位を占めるに至っている（Putral LN et al., Drug News Perspect 2006 Jul-Aug, 19(6): 317-24（非特許文献43）；Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9（非特許文献44）；Dykxhoorn DM et al., Gene Ther 2006 Mar, 13(6): 541-52（非特許文献45））。しかしながら、抗癌薬の開発のためには、癌特異的遺伝子のターゲティングに有用な改良された二本鎖分子が必要とされている。本発明はそのような改良を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2004／031413号
【特許文献２】WO2007／013671号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Alberg AJ. et al. J Clin Oncol 2005;14:3175-85
【非特許文献２】Parkin DM. Lancet Oncol 2001;2:533-43
【非特許文献３】Shimada H. et al. Surgery 2003;133:486-94
【非特許文献４】Daigo Y. and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53
【非特許文献５】Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23
【非特許文献６】Sandler A. et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50
【非特許文献７】Shepherd FA. et al. N Engl J Med 2005;353:123-32
【非特許文献８】Thatcher N. et al. Lancet 2005;366:1527-37
【非特許文献９】Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205
【非特許文献１０】Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99
【非特許文献１１】Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43
【非特許文献１２】Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006；28:799-805
【非特許文献１３】Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75
【非特許文献１４】Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84
【非特許文献１５】Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41
【非特許文献１６】Ishikawa N. et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70
【非特許文献１７】Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46
【非特許文献１８】Furukawa C. et al. Cancer Res 2005;65:7102-10
【非特許文献１９】Ishikawa N. et al. Cancer Res 2005; 65:9176-84
【非特許文献２０】Suzuki C. et al. Cancer Res 2005;65:11314-25
【非特許文献２１】Ishikawa N. et al. Cancer Sci 2006;97:737-45
【非特許文献２２】Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19
【非特許文献２３】Hayama S. et al. Cancer Res 2006;66:10339-48
【非特許文献２４】Kato T. et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42
【非特許文献２５】Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51
【非特許文献２６】Yamabuki T. Cancer Res 2007;67:2517-25
【非特許文献２７】Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22
【非特許文献２８】Kato T. et al. Cancer Res 2007;67:8544-53
【非特許文献２９】Taniwaki M. et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31
【非特許文献３０】Ishikawa N. et al. Cancer Res 2007;67:11601-11
【非特許文献３１】Mano Y. et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13
【非特許文献３２】Suda T. et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8
【非特許文献３３】Kato T. et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70
【非特許文献３４】Miki T. Methods Enzymol 1995；256:90-8
【非特許文献３５】Tatsumoto T. et al. J Cell Biol 1999；1475:921-8
【非特許文献３６】Kim JE. et al. J Biol Chem 2005；280:5733-9
【非特許文献３７】Petronczki M. et al. Dev Cell 2007;12:713-25
【非特許文献３８】Scoumanne A. and Chen X. Cancer Res 2006;66: 6271-9
【非特許文献３９】Eguchi T. et al. Oncogene 2007;26:509-20
【非特許文献４０】Hara T. et al. Oncogene 2006;25:566-78
【非特許文献４１】Sano M. et al. Oncol Rep 2006;16:1093-8
【非特許文献４２】Bumcrot D et al., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2(12): 711-9
【非特許文献４３】Putral LN et al., Drug News Perspect 2006 Jul-Aug, 19(6): 317-24
【非特許文献４４】Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9
【非特許文献４５】Dykxhoorn DM et al., Gene Ther 2006 Mar, 13(6): 541-52
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、癌性細胞におけるECT2遺伝子の特異的発現の発見に基づく。
【００１１】
さまざまな種類の肺癌細胞、食道癌および膀胱癌細胞における遺伝子のゲノムワイド発現プロファイル解析を通じて、発現が高頻度に上方制御されている遺伝子のセットが同定された。それらの遺伝子の中から、本発明者らは、遺伝子ECT2（上皮細胞トランスフォーミング配列2）をさらなる検討のために選択した。ECT2遺伝子の発現は、肺癌、食道癌および膀胱癌において亢進していることが本発明者らによって検出された。本発明の過程において、ECT2遺伝子は、腺癌（ADC）および扁平上皮癌（SCC）を含む非小細胞肺癌（NSCLC）、小細胞肺癌（SCLC）ならびに食道扁平上皮癌（ESCC）において高頻度で上方制御されていることがさらに明らかになった。さらに、本明細書で初めて示されたように、低分子干渉RNA（siRNA）によるECT2遺伝子の抑制は、肺癌細胞の増殖阻害および／または細胞死をもたらす。このため、この遺伝子は今や、さまざまな種類のヒト新生物に対する新規治療標的として用いることができる。
【００１２】
本明細書において同定されたECT2遺伝子、さらにはその転写産物および翻訳産物は、癌に関するマーカーとしての診断上の有用性、ならびに癌を治療するため、またはその症状を軽減するためにその発現および／または活性を改変することのできる癌遺伝子標的としての有用性を満たす。
【００１３】
本明細書では、ECT2の過剰発現が肺癌およびESCCの進行と関連しており、肺癌およびESCCの患者の予後不良をもたらすという証拠を提示する。したがって、ECT2遺伝子は肺癌またはESCCに関する有用な予後指標である。特に、切除検体におけるECT2の過剰発現は、予後不良の可能性の高い患者に対するアジュバント療法の適用のために有用な指標である。さらに、ECT2のアップレギュレーションは、肺癌および食道癌の発生に関する頻度の高い重要な特徴であるため、ECT2分子のターゲティングは、肺癌およびESCCの臨床的管理のための新たな診断戦略および治療戦略の開発に特に有用である。
【００１４】
したがって、本発明は、患者由来の生体試料におけるECT2レベルを対照試料のそれと比較することによって、肺癌または食道扁平上皮癌を有する患者の予後を評価または判定するための方法を提供する。発現レベルが上昇していることは、治療後の寛解、回復および／または生存に関する予後が不良であること、ならびに臨床転帰が不良である見込みが比較的高いことを示す。本発明はさらに、NSCLCまたはESCCの予後を評価するためのキットであって、ECT2検出用試薬を含むキットも提供する。
【００１５】
本発明の治療方法には、対象における癌の治療または予防のための方法であって、アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む方法が含まれる。本発明に関して、アンチセンス組成物は特異的標的遺伝子（すなわち、ECT2遺伝子）の発現を低下させる。例えば、アンチセンス組成物は、ECT2遺伝子配列に対して相補的なヌクレオチドを含みうる。または、本方法は、siRNA組成物を対象に投与する段階を含んでもよい。本発明において、siRNA組成物は、ECT2遺伝子の発現を低下させる。さらにもう1つの方法において、対象における癌の治療または予防を、二本鎖分子組成物を対象に投与することによって行うこともできる。本発明においては、核酸特異的な二本鎖分子組成物はECT2遺伝子の発現を低下させる。事実、本発明者らは、ECT2遺伝子に対するsiRNAの阻害効果を実証している。例えば、siRNAによる癌細胞の細胞増殖の阻害が実施例の項に示されており、このことはECT2遺伝子が癌に対する好ましい治療標的として役立つことを実証している。
【００１６】
本明細書に記載された方法の1つの利点は、癌の顕性臨床症状の検出の前に、疾患が同定されることである。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。しかし、前記の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明の他の代替的な態様を制限するものではないことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】肺癌および食道癌ならびに正常組織におけるECT2の発現を示している。A、半定量的RT-PCR分析によって検出した、15例の臨床肺癌（肺ADC、肺SCCおよびSCLC；上のパネル）および15例の肺癌細胞株（下のパネル）におけるECT2遺伝子の発現。B、半定量的RT-PCR分析によって検出した、10例の臨床的ESCCおよび10例の食道癌細胞株におけるECT2遺伝子の発現。C、ウエスタンブロット分析によって調べた、6例の肺癌細胞株および4例のESCC細胞株におけるECT2タンパク質の発現。D、23種の正常ヒト組織からのmRNAのノーザンブロット法によって検出した正常組織におけるECT2遺伝子の発現（上のパネル）、ならびに5例の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺および精巣）および肺SCC組織の免疫組織化学分析によって調べたECT2タンパク質の発現（下のパネル）。
【図２】NSCLC患者およびESCC患者に関するECT2過剰発現と予後不良との関連を示している。A、上のパネル、肺SCC組織および正常肺組織におけるECT2の強発現、ECT2の弱発現、およびECT2発現の欠如の代表例（原倍率100倍）。下のパネル、NSCLCの患者の生存に関するカプラン-マイヤー分析（ログランク検定によりP＝0.0004）。B、上のパネル、ESCC組織および正常食道組織におけるECT2の強発現、ECT2の弱発現、およびECT2発現の欠如の代表例（原倍率100倍）。下のパネル、ESCCの患者の生存に関するカプラン-マイヤー分析（ログランク検定によりP＝0.0088）。
【図３】ECT2に対するsiRNAによるNSCLC細胞およびESCC細胞の増殖の阻害を示している。A、半定量的RT-PCRによって分析した、A549細胞およびTE9細胞における、ECT2に対するsiRNA処理（si-ECT2-#1もしくは#2）または対照siRNA（LUCもしくはSCR）に応じてのECT2の発現（上のパネル）。si-ECT2または対照siRNAをトランスフェクトした腫瘍細胞のMTTアッセイおよびコロニー形成アッセイ（中央および下のパネル）。B、ECT2に対するsiRNA（si-ECT2-#1）および対照siRNA（SCR）のトランスフェクションから48時間後および72時間後のA549細胞のフローサイトメトリー分析。si-ECT2-#1のトランスフェクションは48時間時点でG2／M停止をもたらし（左のパネル）、その後、72時間時点ではサブG1画分の増加をもたらした（右のパネル）。
【図４】哺乳動物細胞へのECT2導入による細胞浸潤性の増大を示している。上のパネル、ウエスタンブロット分析によって検出した、NIH3T3細胞およびCOS-7細胞におけるECT2の一過性発現。中央および下のパネル、ECT2発現プラスミドのトランスフェクション後のマトリゲルマトリックス中でのNIH3T3細胞およびCOS-7細胞の浸潤的性質の増大を示しているアッセイ。ギムザ染色（倍率100倍；中央のパネル）およびマトリゲルでコーティングしたフィルターを通過して遊走する細胞の数（下のパネル）を示している。アッセイは3回ずつ、三連ウェル中で行った。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書で用いる場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」という単語は、別に明示する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
【００１９】
「単離された」および「精製された」という用語は、ある物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、その他）に関連して本明細書で用いられる場合、その物質が、そうでなければその天然源中に含まれるであろう少なくとも1つの物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）の由来である細胞もしくは組織源に由来する糖質、脂質もしくは他の混入タンパク質などの細胞物質を実質的に含まないか、または化学合成される場合に前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドが単離されるか組換えにより産生される細胞の細胞成分から前記ポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物が含まれる。このため、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドには、異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を（乾燥重量比で）約30％、20％、10％または5％未満有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えによって産生される場合には、それは培地も実質的に含まないことが好ましく、これには培地がタンパク質調製物の体積の約20％、10％または5％未満であるポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって産生される場合には、それは前駆化学物質もその他の化学物質も実質的に含まないことが好ましく、これにはタンパク質の合成にかかわる前駆化学物質またはその他の化学物質がタンパク質調製物の体積の（乾燥重量比で）約30％、20％、10％、5％未満であるポリペプチドの調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離または精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色などの後に単一バンドが出現することによって示すことができる。1つの好ましい態様において、本発明の抗体は単離または精製されている。
【００２０】
「単離された」または「精製された」核酸分子、例えばcDNA分子などは、組換え技術によって作製された場合には他の細胞物質もしくは培地を実質的に含まないこと、または化学合成された場合には前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。1つの好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離または精製されている。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、天然のアミノ酸重合体のほかに、1つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基または非天然の残基、例えば、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるようなアミノ酸重合体にも適用される。
【００２２】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸には、遺伝暗号によってコードされるもののほか、細胞内での翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリン）がある。「アミノ酸類似体」という語句は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造（水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したα炭素）を有するが、修飾されたR基または修飾された骨格を有する化合物のことを指す（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）。「アミノ酸模倣物」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物のことを指す。
【００２３】
本明細書において、アミノ酸は、IUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨されている一般的に知られた三文字表記または一文字表記によって表すことができる。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、別に明示しない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、一般的に受け入れられている一文字表記によって表す。アミノ酸と同様に、それらは天然の核酸重合体および非天然の核酸重合体の両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸または核酸分子は、DNA、RNAまたはそれらの組み合わせで構成されうる。
【００２５】
本発明は、一部には、肺癌および食道癌の患者由来の細胞におけるECT2遺伝子の発現亢進の発見に基づく。ヒトECT2遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ ID NO：11に示されており、GenBankアクセッション番号NM_018098として入手することもできる。本明細書において、ECT2遺伝子は、ヒトECT2遺伝子のほか、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシを含む他の動物のものも包含する。しかし、本発明はそれらには限定されず、他の動物において見いだされる、ECT2遺伝子に対応するアレル突然変異体および対立遺伝子も含む。
【００２６】
ヒトECT2遺伝子によってコードされるアミノ酸配列はSEQ ID NO：12に示されており、GenBankアクセッション番号NP_060568.3として入手することもできる。本発明では、ECT2遺伝子によってコードされるポリペプチドを「ECT2」と称し、時には「ECT2ポリペプチド」または「ECT2タンパク質」と称する。
【００２７】
本発明の1つの局面によれば、機能的等価物も「ECT2ポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、タンパク質の「機能的等価物」とは、そのタンパク質と等価な生物活性を有するポリペプチドのことである。すなわち、ECT2タンパク質の生物活性を保持している任意のポリペプチドを、本発明におけるそのような機能的等価物として用いることができる。そのような機能的等価物には、ECT2タンパク質の天然のアミノ酸配列に、1つまたは複数のアミノ酸が置換された、欠失した、付加された、または挿入されたものが含まれる。または、ポリペプチドが、各々のタンパク質の配列に対して少なくとも約80％の相同性（配列同一性とも称する）、より好ましくは少なくとも約90％〜95％の相同性を有するアミノ酸配列で構成されてもよい。他の態様において、ポリペプチドは、ECT2遺伝子の天然のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされうる。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、その産生のために用いられる細胞もしくは宿主、または利用する精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無または形態に関してさまざまであってよい。しかしながら、それが本発明のヒトECT2タンパク質のものと等価な機能を有する限り、それは本発明の範囲内にある。
【００２９】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、その下で核酸分子が、典型的には核酸の混成物中で、標的配列とはハイブリダイズすると考えられるが、他の配列とは検出可能な程度にはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993）に見ることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、pHでの特定の配列の融解温度（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である（標的配列は過剰に存在するため、Tmでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によって得ることもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％ SDS、42℃でインキュベートして、または5×SSC、1％ SDS、65℃でインキュベートして、50℃の0.2×SSCおよび0.1％ SDS中で洗浄する。
【００３０】
本発明に関して、ヒトECT2タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によってルーチンに選択されうる。例えば、30分間またはそれ以上にわたる68℃でのプレハイブリダイゼーションを「Rapid-hyb buffer」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて行い、標識したプローブを添加した上で、1時間またはそれ以上にわたって68℃で加温することによって、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。その後の洗浄段階は、例えば、低ストリンジェント条件下で行うことができる。低ストリンジェント条件には、例えば、42℃、2×SSC、0.1％ SDS、または好ましくは50℃、2×SSC、0.1％ SDSが含まれうる。しばしば、高ストリンジェンシー条件を用いることが好ましい。例示的な高ストリンジェンシー条件には、2×SSC、0.01％ SDS中にて室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％ SDS中にて37℃で20分間の洗浄を3回行って、1×SSC、0.1％ SDS中にて50℃で20分間の洗浄を2回行うことが含まれうる。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性があり、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
【００３１】
一般に、タンパク質における1つまたは複数のアミノ酸の改変はそのタンパク質の機能に影響を及ぼさないことが知られている。事実、突然変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち、ある特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持していることが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、当業者は、単一のアミノ酸もしくは低いパーセンテージのアミノ酸を変更するアミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入もしくは置換、または、タンパク質の変更により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」とみなされるものが、本発明に関して許容されることを認識しているであろう。
【００３２】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸突然変異の数は特に限定されない。しかし、アミノ酸配列の5％またはそれ未満を改変することが一般に好ましい。したがって、1つの好ましい態様において、そのような突然変異体において突然変異させるアミノ酸の数は、一般に30アミノ酸またはそれ未満、好ましくは20アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは10アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは6アミノ酸またはそれ未満であり、さらにより好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
【００３３】
突然変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に突然変異させることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られる工程）。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；ヒドロキシル基を含む側鎖（S、T、Y）；イオウ原子を含む側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミドを含む側鎖（D、N、E、Q）；塩基を含む側鎖（R、K、H）；および芳香族を含む側鎖（H、F、Y、W）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当技術分野で周知である。例えば、以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的置換物であるアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。
【００３４】
そのような保存的に改変されたポリペプチドは、本ECT2タンパク質に含められる。しかし、本発明はそれらには限定されず、ECT2タンパク質の少なくとも1つの生物活性が保持されている限り、ECT2タンパク質には非保存的改変物も含まれる。さらに、改変タンパク質から、多型変異体、種間相同体、およびこれらのタンパク質のアレルによってコードされるものが除外されることはない。
【００３５】
その上、本発明のECT2遺伝子は、ECT2タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドも包含する。ECT2タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加えて遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を、当該タンパク質をコードするDNAの配列情報（SEQ ID NO：11）に基づいて合成されたプライマーを用いて利用することもできる。ヒトECT2遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、通常、それらの元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」は典型的には、40％またはそれ以上、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは90％〜95％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」中のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００３６】
I．二本鎖分子：
本明細書で用いる場合、「二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子のことを指し、これには例えば、低分子干渉RNA（siRNA；例えば、二本鎖リボ核酸（dsRNA）または低分子ヘアピンRNA（shRNA））および低分子干渉DNA／RNA（siD／R-NA；例えば、DNAとRNAの二本鎖キメラ（dsD／R-NA）またはDNAとRNAの低分子ヘアピンキメラ（shD／R-NA））が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「dsRNA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、その相補的配列を介して1つにアニーリングして二本鎖RNA分子を形成している、2つのRNA分子の構築物のことを指す。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択された「センス」または「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されたヌクレオチド配列を有するRNA分子も含みうる。
【００３８】
「shRNA」という用語は、本明細書で用いる場合、互いに相補的な第1および第2の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステム-ループ構造を有するsiRNAのことを指す。これらの領域の相補性の度合いおよび向きは、領域間で塩基対合が起こって、第1および第2の領域がループ領域によって連結され、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如のためにループが生じるのに十分である。shRNAのループ領域はセンス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、これを「介在性一本鎖」と称することもある。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「siD／R-NA」という用語は、RNAとDNAの両方で構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子のことを指し、これはRNAとDNAのハイブリッドおよびキメラを含み、標的mRNAの翻訳を妨げる。本明細書において、ハイブリッドとは、DNAで構成されるポリヌクレオチドとRNAで構成されるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成している分子を表す；一方、キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がRNAおよびDNAを含みうることを表す。siD／R-NAを細胞に導入する標準的な手法が用いられる。siD／R-NAは、センス核酸配列（「センス鎖」とも称する）、アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称する）またはその両方を含む。siD／R-NAは、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように、例えばヘアピンのように構築することができる。siD／R-NAはdsD／R-NAまたはshD／R-NAのいずれであってもよい。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「dsD／R-NA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、その相補的配列を介して1つにアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、2つの分子の構築物のことを指す。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択された「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含みうる。dsD／R-NAを構築する2つの分子の一方もしくは両方がRNAおよびDNAの両方で構成される（キメラ分子）か、または代替的には、分子の一方はRNAで構成され、もう一方はDNAで構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【００４１】
「shD／R-NA」という用語は、本明細書で用いる場合、互いに相補的な第1および第2の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステム-ループ構造を有するsiD／R-NAのことを指す。これらの領域の相補性の度合いおよび向きは、領域間で塩基対合が起こって、第1および第2の領域がループ領域によって連結され、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如のためにループが生じるのに十分である。shD／R-NAのループ領域はセンス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、これを「介在性一本鎖」と称することもある。
【００４２】
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル性結合を含んでもよい。当技術分野において周知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを高めることができる。当業者は、本分子に組み入れることのできる他のタイプの化学修飾も承知しているであろう（例えば、WO03／070744号；WO2005／045037号）。1つの態様において、修飾は、分解に対する抵抗性の改善または取り込みの改善を提供するために用いることができる。そのような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、2'-O-メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、2'-デオキシ-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5'-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基取り込み（inverted deoxyabasic residue incorporation）（US20060122137号）が含まれる。
【００４３】
もう1つの態様において、修飾は、二本鎖分子の安定性を向上させるため、またはそのターゲティング効率を高めるために用いることができる。修飾には、二本鎖分子の2つの相補鎖間の化学的架橋、二本鎖分子の1つの鎖の3'または5'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、2-フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび2'-デオキシリボヌクレオチド（WO2004／029212号）が含まれる。もう1つの態様において、修飾は、標的mRNA中および／または相補的二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対する親和性を高めるか低下させるために用いることができる（WO2005／044976号）。例えば、修飾されていないピリミジンヌクレオチドを2-チオ、5-アルキニル、5-メチルまたは5-プロピニルピリミジンに置換することができる。加えて、修飾されていないプリンを7-デアザ、7-アルキルまたは7-アルケニルプリンに置換することもできる。もう1つの態様において、二本鎖分子が3'突出を有する二本鎖分子である場合には、3'末端ヌクレオチドが突出したヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。これ以上の詳細については、US20060234970号などの公開文書が入手可能である。本発明はこれらの例には限定されず、結果として得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して用いることができる。
【００４４】
さらに、本発明の二本鎖分子は、例えばdsD／R-NAまたはshD／R-NAのように、DNAおよびRNAの両方を含んでもよい。特に、DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドポリヌクレオチド、またはDNA-RNAキメラポリヌクレオチドでは安定性の増大を示す。DNAとRNAの混合、すなわちDNA鎖（ポリヌクレオチド）およびRNA鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）のいずれかまたは両方にDNAおよびRNAの両方を含むキメラ型二本鎖分子などを、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成させることもできる。DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、それが標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がDNAであってアンチセンス鎖がRNAであるハイブリッド、またはその逆のものであってよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子も、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAで構成されるもの、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAおよびRNAで構成されるものであってよい。
【００４５】
二本鎖分子の安定性を向上させるためには、分子ができるだけ多くのDNAを含むことが好ましいが、一方、標的遺伝子の発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でRNAであることが求められる。キメラ型二本鎖分子の好ましい一例としては、二本鎖分子の上流部分領域（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖の内部の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はRNAである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の5'側（5'末端）およびアンチセンス鎖の3'側（3'末端）のことを表す。すなわち、好ましい態様においては、アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方が、RNAからなる。例えば、本発明のキメラ型またはハイブリッド型の二本鎖分子は、以下の組み合わせを含む。
センス鎖：5'-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'：アンチセンス鎖、
センス鎖：5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-5'：アンチセンス鎖。
【００４６】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の内部の標的配列またはそれに対する相補配列の末端から数えて9〜13ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例には、鎖の長さが19〜21ヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では5'側領域、アンチセンス鎖では3'側領域）がRNAであり、残りの半分がDNAであるものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子において、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖全体がRNAである場合にはるかに高くなる（US20050004064号）。
【００４７】
本発明において、二本鎖分子が、低分子ヘアピンRNA（shRNA）、ならびにDNAおよびRNAからなる低分子ヘアピン（shD／R-NA）といったヘアピンを形成してもよい。shRNAまたはshD／R-NAは、RNA干渉を介した遺伝子発現のサイレンシングのために用いうるタイトなヘアピンターンを作り出すRNA配列またはRNAとDNAの混合物の配列である。shRNAまたはshD／R-NAは、一本鎖の上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、これらの配列はループ配列によって隔たれている。一般に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてdsRNAまたはdsD／R-NAとなり、続いてそれがRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と結合する。この複合体は、dsRNAまたはdsD／R-NAの標的配列に合致するmRNAと結合してそれを切断する。
【００４８】
ECT2遺伝子に対する二本鎖分子（例えば、「ECT2 siRNA」）は、遺伝子の発現レベルを低下させるために用いることができる。本明細書において、「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子のことを指す。本発明に関して、二本鎖分子は、上方制御性マーカー遺伝子であるECT2に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列から構成される。二本鎖分子は、それが標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含むように、すなわち、ヘアピン構造を有するヌクレオチドであるように構築される。二本鎖分子はdsRNA、shRNA、dsD／RNAまたはshD／RNAのいずれであってもよい。
【００４９】
ECT2遺伝子の二本鎖分子は標的mRNAとハイブリダイズし、すなわち、通常は一本鎖mRNA転写物と会合し、それによってmRNAの翻訳に干渉して、最終的には、当該遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明のsiRNA分子は、ECT2遺伝子のmRNAとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする能力によって定義することができる。
【００５０】
本発明に関して、二本鎖分子は好ましくは、500、200、100、50または25ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、二本鎖分子は19〜25ヌクレオチド長である。ECT2二本鎖分子の例示的な標的核酸配列には、SEQ ID NO：1または2に対応するオリゴヌクレオチド配列が含まれる。このため、本発明の好ましい二本鎖分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1または2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的とし、この二本鎖分子は、ETC2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に当該遺伝子の発現を阻害する。センス鎖は、標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、標的配列は、SEQ ID NO：11のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続したヌクレオチドを含む。より好ましくは、標的配列は、SEQ ID NO：11のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続したヌクレオチドからなる。二本鎖分子は、一本鎖オリゴヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のオリゴヌクレオチド分子であってよい。
【００５１】
配列中のヌクレオチド「t」は、RNAまたはその誘導体中では「u」に置き換えられるべきである。したがって、例えば、本発明は、オリゴヌクレオチド配列
5'-gauaaaggaugaucuugaa-3' (SEQ ID NO: 1) または
5'-cagaggagauuaagacuau-3' (SEQ ID NO: 2)
を有する二本鎖RNA分子を提供する。
【００５２】
二本鎖分子の阻害活性を高める目的で、ヌクレオチド「u」を、アンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。付加する「u」の数は、少なくとも2個、一般的には2〜10個、好ましくは2〜5個である。付加された「u」は、二本鎖分子のアンチセンス鎖の3'末端に一本鎖を形成する。
【００５３】
ヘアピンループ構造を形成させる目的で、任意のヌクレオチド配列で構成されるループ配列をセンス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有する二本鎖分子も提供し、式中、[A]は、ECT2遺伝子のmRNAまたはcDNAと特異的にハイブリダイズする配列に対応するオリゴヌクレオチド配列である。好ましい態様において、[A]は、ECT2遺伝子の配列（例えば、SEQ ID NO：1）に対応するヌクレオチド配列であり；[B]は、3〜23ヌクレオチドで構成されるヌクレオチド配列であり；かつ[A']は、[A]の相補的配列で構成されるヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']とハイブリダイズし、すると領域[B]で構成されるループが形成される。ループ配列は好ましくは3〜23ヌクレオチド長でありうる。ループ配列は、例えば、以下の配列で構成される群から選択することができる（ambion.com/techlib/tb/tb_506.htmlにある、ワールドワイドウェブ上のAmbion社のウェブサイトを参照）：
CCC、CCACCまたはCCACACC：Jacque JM et al., Nature 2002, 418: 435-8。
UUCG：Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5；Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44。
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4:457-67。
「UUCAAGAGA（DNAでは「ttcaagaga」）は、特に適したループ配列である。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列も、活性のあるsiRNAをもたらす（Jacque J-M et al., Nature 2002, 418:435-8）。
【００５４】
本発明における使用に適した例示的なヘアピン二本鎖分子には、
5'-gauaaaggaugaucuugaa-[b]-uucaagaucauccuuuauc-3' （標的配列SEQ ID NO：1の場合）；および
5'-cagaggagauuaagacua-[b]-uagucuuaaucuccucug-3' （標的配列SEQ ID NO：2の場合）が含まれる。
【００５５】
適した二本鎖分子のオリゴヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト（ambion.com／techlib／misc／siRNA_finder.html）から入手可能なsiRNA設計用のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。このコンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子の合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００５６】
siRNA標的部位の選択：
1．目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を、可能性のある標的部位として記録する。Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7は、標的配列を、5'および3'非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン付近の領域（75ヌクレオチド以内）に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらが調節タンパク質の結合部位を多く含むと考えられるためである。UTR結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、エンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性がある。
2．可能性のある標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有する標的領域は検討から除外する。相同性検索はBLAST（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:3389-402；J Mol Biol 1990, 215:403-10）を用いて行うことができ、これはncbi.nlm.nih.gov/BLAST/にあるワールドワイドウェブ上のNCBIのサーバーにある。
3．合成用の適格な標的配列を選択する。Ambion社では、遺伝子の全長にわたって、好ましくは複数の標的配列を評価用に選択することができる。
【００５７】
二本鎖分子を細胞に導入するための標準的な手法を用いることができる。例えば、ECT2の二本鎖分子を、mRNA転写物と結合することのできる形態で、細胞にそのまま導入することができる。これらの態様において、本発明の二本鎖分子は典型的には、アンチセンス分子に関して上述したように修飾される。他の修飾も可能であり、例えば、コレステロールと結合させた二本鎖分子は、改良された薬理学的特性を示している（Song et al., Nature Med 2003, 9:347-51）。
【００５８】
または、二本鎖分子をコードするDNAを、ベクター（本明細書中では以後、「siRNAベクター」とも称する）中に保有させることもできる。そのようなベクターは、例えば、ECT2遺伝子標的配列を、その配列に隣接する機能的に連結された調節配列（例えば、核内低分子RNA（snRNA）U6プロモーターまたはヒトH1 RNAプロモーター由来のRNAポリメラーゼIII転写ユニット）を有する発現ベクター中に、両方の鎖の発現が（DNA分子の転写によって）可能になるような様式でクローニングすることによって作製することができる（Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20: 500-5）。例えば、ECT2遺伝子のmRNAに対するアンチセンスであるRNA分子を第1のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの3'側にあるプロモーター配列）によって転写させ、ECT2遺伝子のmRNAに対するセンス鎖であるRNA分子を第2のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの5'側にあるプロモーター配列）によって転写させる。センス鎖およびアンチセンス鎖をインビボでハイブリダイズさせて、ECT2遺伝子発現のサイレンシングのための二本鎖分子構築物を生成させる。または、2つの構築物を利用して、一本鎖構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作り出すこともできる。この場合には、ヘアピンなどの二次構造を有する構築物が、標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含む単一の転写物として作製される。
【００５９】
二本鎖分子のベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション促進剤を用いることができる。FuGENE6（Roche diagnostics）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Oligofectamine（Invitrogen）およびNucleofector（和光純薬工業）が、トランスフェクション促進剤として有用である。このため、本薬学的組成物は、そのようなトランスフェクション促進剤をさらに含んでもよい。
【００６０】
II．抗体：
本発明は、ECT2タンパク質に対する抗体または抗体の断片を提供する。換言すれば、本発明の抗体は、ECT2の特異的発現を検出するために用いることができる。このため、本発明の抗体は、ECT2関連疾患、例えば肺癌および食道癌を診断するため、ならびにそれらの疾患を治療するために有用である。抗体は、ECT2タンパク質またはその断片（例えば、コドン703〜883に対応するECT2のCOOH末端部分（SEQ ID NO：8））を用いることによって調製することができる（実施例における「D．抗ECT2ポリクローナル抗体の調製」の項目を参照）。このため、本発明の好ましい態様は、SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗原と結合する、ECT2を認識する抗体である。
【００６１】
表1および2に示されているように、ECT2の発現が組織免疫染色によって観察される場合には、肺癌および食道癌を有する患者の生存率は低い。この知見は、ECT2の発現が、悪性腫瘍の予後の診断において指標として有用であろうということを示唆する。このため、ECT2特異的抗体を用いることで、予後をより正確に診断しうる。
【００６２】
さらに、本発明の抗体は、ECT2の機能解析のために有用なツールであるに違いない。「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、天然の抗体のほかに、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合性断片（例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、FvおよびrIgG）を含む、非天然の抗体も包含する。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）も参照のこと。また、例えば、Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York（1998）も参照のこと。そのような非天然の抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築すること、組換えにより産生すること、または例えば、参照により本明細書に組み入れられるHuse et al. , Science 246:1275-81(1989)によって記載されているように、さまざまな重鎖およびさまざまな軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、CDRグラフト抗体、単鎖抗体および二機能性抗体などを作製するこれらの方法および他の方法は、当業者に周知である（Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-6 (1993)；Ward et al., Nature 341:544-6 (1989)；Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988；Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992)；Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)；これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６３】
「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。この用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合（heteroconjugate）抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝的に操作された形態も含まれる。この用語はまた、組換え単鎖Fv断片（scFv）のことも指す。抗体という用語にはまた、二価分子または二重特異性分子、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）も含まれる。二価分子および二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al. (1992) J Immunol 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:6444, Gruber et al. (1994) J Immunol :5368, Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781, Hu et al. (1997) Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026, およびMcCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301に記載されている。
【００６４】
典型的には、抗体は重鎖および軽鎖を有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは定常領域および可変領域を含む（これらの領域は「ドメイン」としても知られる）。軽鎖および重鎖の可変領域は、4つの「フレームワーク」領域を含み、それらは「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって分断されている。フレームワーク領域およびCDRの範囲は明確に定められている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、1つの種の内部では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖および重鎖が組み合わされたフレームワーク領域は、CDRを三次元空間に配置して整列させる働きをする。
【００６５】
CDRは、抗原のエピトープとの結合の主な原因となる。各鎖のCDRは典型的には、N末端から順に番号を付してCDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれ、これらはまた、典型的には、その個々のCDRが位置している鎖によっても識別される。すなわち、VH CDR3は、それが存在する抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方、VL CDR1は、それが存在する抗体の軽鎖の可変ドメインのCDR1のことである。
【００６６】
「VH」という言及は、Fv、scFvまたはFabの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域のことを指す。「VL」という言及は、Fv、scFv、dsFvまたはFabの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域のことを指す。
【００６７】
「単鎖Fv」または「scFv」という語句は、通常の二本鎖抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインが連結されて1つの鎖を形成している抗体のことを指す。典型的には、活性結合部位の適切なフォールディングおよび生成が可能となるように、2つの鎖の間にリンカーペプチドが挿入される。
【００６８】
「キメラ抗体」とは、（a）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域と、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと結合するように、定常領域もしくはその一部分が改変、置換もしくは交換されている；または（b）可変領域もしくはその一部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域によって改変、置換もしくは交換されている、免疫グロブリン分子のことである。
【００６９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む免疫グロブリン分子のことである。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体が、レシピエント抗体にも、導入されるCDRまたはフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、その中のCDR領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（FR）領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むと考えられる（Jones et al., Nature 321:522-5 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-7 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6 (1992)）。ヒト化は、本質的には、Winterらの方法（Jones et al., Nature 321:522-5 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-7 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-6 (1988)）に従って、齧歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって行うことができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である。
【００７０】
「エピトープ」、「抗原性」および「決定基」という用語は、抗体が結合する抗原の部位のことを指す。エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続的なアミノ酸のいずれによっても形成されうる。連続したアミノ酸配列によって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露しても保たれるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは典型的には、特有の空間コンフォメーションにある少なくとも3個、より一般的には少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶解析法および二次元核磁気共鳴法が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed（1996）を参照。
【００７１】
「非抗体性結合タンパク質」または「非抗体性リガンド」または「抗原結合性タンパク質」という用語は、以下により詳細に考察するような、アドネクチン、アビマー（avimer）、単鎖ポリペプチド結合分子および抗体様結合ペプチド模倣物を含む、非免疫グロブリン性のタンパク質スカフォールドを用いる抗体模倣物を互換的に指す。
【００７２】
抗体と類似した様式で標的を標的化して結合する、その他の化合物が開発されている。これらの「抗体模倣物」の特定のものは、抗体の可変領域に代わる代替的なタンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリン性のタンパク質スカフォールドを用いる。
【００７３】
例えば、Ladnerら（米国特許第5,260,203号）は、凝集しているが分子的には分離している抗体の軽鎖および重鎖可変領域のものに類似した結合特異性を有する、単一ポリペプチド鎖性の結合分子を記載している。この単鎖結合分子は、ペプチドリンカーによって連結された抗体の重鎖および軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含み、2つのペプチド抗体のものに類似した構造へとフォールディングすると考えられる。この単鎖結合分子は、より小型であること、安定性がより高いこと、およびより容易に改変されることを含む、従来の抗体を上回るいくつかの利点を示す。
【００７４】
Kuら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(14):6552-6556 (1995)）は、シトクロムb562を基にした抗体の代替物を開示している。Kuら（1995）は、シトクロムb562のループのうち2つをランダム化してウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリーを作製した。個々の突然変異体は、抗BSA抗体と同様にBSAと選択的に結合することが見いだされた。
【００７５】
Lipovsekら（米国特許第6,818,418号および第7,115,396号）は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様のタンパク質スカフォールドおよび少なくとも1つの可変ループを特徴とする抗体模倣物を開示している。これらのフィブロネクチンを基にした抗体模倣物はアドネクチンとして知られ、標的とした任意のリガンドに対する高親和性および特異性を含む、天然抗体または人工抗体（engineered antibody）と同じ多くの特徴を呈する。新たな、または改良された結合タンパク質を導き出すための任意の手法を、これらの抗体模倣物に関して用いることができる。
【００７６】
これらのフィブロネクチンを基にした抗体模倣物の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造に類似している。このため、これらの模倣物は、性質および親和性の点でネイティブ抗体の抗原結合特性に類似した抗原結合特性を呈する。さらに、これらのフィブロネクチンを基にした抗体模倣物は、抗体および抗体断片を上回るいくつかの利点を示す。例えば、これらの抗体模倣物はネイティブなフォールディング安定性に関してジスルフィド結合に依拠せず、それ故に、通常であれば抗体を分解させる条件下でも安定である。加えて、これらのフィブロネクチンを基にした抗体模倣物の構造はIgG重鎖のそれに類似しているため、インビボでの抗体の親和性成熟の過程に類似した、ループのランダム化およびシャッフリングの過程をインビトロで用いることができる。
【００７７】
Besteら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1898-1903 (1999)）は、リポカリンスカフォールドを基にした抗体模倣物（Anticalin（登録商標））を開示している。リポカリンは、タンパク質の末端に4つの超可変ループを有するβ-バレルで構成される。Beste（1999）は、ループをランダム突然変異誘発に供した上で、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。3種の変異体がフルオレセインとの特異的結合を呈し、そのうち1つの変異体が抗フルオレセイン抗体の結合に類似した結合を示した。さらなる分析により、ランダム化された位置のすべてが可変性であることが判明しており、このことはAnticalin（登録商標）が抗体の代替物として用いるのに適すると考えられることを示している。
【００７８】
Anticalin（登録商標）は、典型的には160〜180残基である小型の単鎖ペプチドであり、生産コストの低さ、貯蔵下での安定性の高さ、および免疫反応の低下を含む、抗体を上回るいくつかの利点をもたらす。
【００７９】
Hamiltonら（米国特許第5,770,380号）は、結合部位として用いられる複数の可変ペプチドループが結びつけられた、カリックスアレーンの剛性非ペプチド性有機スカフォールドを用いる合成抗体模倣物を開示している。ペプチドループはすべて、カリックスアレーンの幾何学的に同じ側から、互いに対して突き出ている。この幾何学的コンフォメーションのために、ループのすべてが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が高くなる。しかし、他の抗体模倣物とは対照的に、カリックスアレーンを基にした抗体模倣物はペプチドのみからなってはおらず、それ故にプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。このスカフォールドが純粋にペプチド、DNAまたはRNAからなっているわけではないことは、この抗体模倣物が極限的な環境条件下で比較的安定であること、および長い寿命を有することを意味する。さらに、このカリックスアレーンを基にした抗体模倣物は比較的小型であるため、それは免疫原性応答を起こす可能性がより低いと考えられる。
【００８０】
Muraliら（Cell. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003)）は、抗体をより小型のペプチド模倣物に小型化するための方法を考察し、彼らはそれらを「抗体様結合ペプチド模倣物」（ABiP）と命名しているが、それらも抗体の代替物として有用である可能性がある。
【００８１】
Silvermanら（Nat. Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と命名された、複数のドメインを含む単鎖ポリペプチドである融合タンパク質を開示している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからインビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって開発された結合タンパク質の1つのクラスであり、さまざまな標的分子に対する親和性および特異性の点で抗体と幾分類似している。その結果得られるマルチドメインタンパク質は、単エピトープ性結合タンパク質と比較して向上した親和性（場合によってはナノモル濃度以下）および特異性を呈しうる、複数の独立した結合ドメインを含むことができる。アビマーの構築および使用の方法に関するそのほかの詳細は、例えば、米国特許出願公開第20040175756号、第20050048512号、第20050053973号、第20050089932号および第20050221384号に開示されている。
【００８２】
非免疫グロブリン性タンパク質フレームワークのほかに、抗体特性は、RNA分子および非天然オリゴマーを含む化合物においても模倣されており（例えば、プロテアーゼ阻害薬、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体およびβ-ターン模倣物）、これらはすべて、本発明とともに用いるのに適している。
【００８３】
III．肺癌および食道癌の診断
ECT2遺伝子の発現は、肺癌または食道癌を有する患者において特異的に亢進していることが見いだされた。このため、本明細書において同定された遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、癌に関するマーカーとしての診断上の有用性を有する。より詳細には、細胞試料におけるECT2遺伝子の発現を測定することにより、肺癌または食道癌を診断することができる。したがって、本発明は、対象におけるECT2遺伝子の発現レベルを決定することによって、対象における肺癌もしくは食道癌、または肺癌もしくは食道癌を発症する素因を診断する方法を提供する。
【００８４】
本発明によれば、対象の病状を調べるための中間的結果を得ることができる。そのような中間的結果を別の情報と組み合わせることで、医師、看護師または他の従事者が、対象が肺癌または食道癌に罹患していると判定するのを補助することができる。すなわち、本発明は、癌を調べるための診断用マーカーECT2を提供する。または、本発明を、対象由来の組織中の癌性細胞を検出して、対象が肺癌または食道癌に罹患していると判定するための有用な情報を医師に提供するために用いることもできる。
【００８５】
本発明の診断方法は、ECT2遺伝子の発現を決定する（例えば、測定する）段階を伴う。既知の配列に関するGenBank（商標）データベースの項目によって得られる配列情報を用いることで、当業者に周知の従来の手法を用いて、ECT2遺伝子の検出および測定を行うことができる。例えば、ECT2遺伝子に対応する配列データベース項目中の配列を、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析において、ECT2遺伝子に対応するRNA配列を検出するためのプローブを構築する目的に用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは典型的には、ECT2配列の少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個または少なくとも200個の連続したヌクレオチドを含む。もう1つの例として、これらの配列は、例えば、増幅を利用する検出方法、例えば逆転写を利用するポリメラーゼ連鎖反応などにおいて、ECT2核酸を特異的に増幅するためのプライマーを構築する目的に用いることができる。もう1つの例として、ECT2に対する抗体、例えば抗ECT2ポリクローナル抗体または抗ECT2モノクローナル抗体は、イムノアッセイ、例えば免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析またはELISAなどのために用いることができる。
【００８６】
続いて、被験細胞集団、例えば患者由来の組織試料において検出されたECT2遺伝子の発現レベルを、参照細胞集団におけるその遺伝子の発現レベルと比較することができる。参照細胞集団は、比較されるパラメーターが既知である1つまたは複数の細胞、すなわち、非小肺癌細胞（例えば、LC細胞）、食道扁平上皮癌細胞（例えば、EC細胞）、正常肺上皮細胞（例えば、非LC細胞）または正常食道上皮細胞（例えば、非EC細胞）を含む。
【００８７】
参照細胞集団と比較した被験細胞集団における遺伝子発現のレベルが、LC、EC、またはそれらに対する素因の存在を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非LC細胞または非EC細胞で構成される場合には、被験細胞集団と参照細胞集団との間の遺伝子発現レベルの類似性は、被験細胞集団が非LCまたは非ECであることを示す。その反対に、参照細胞集団がLC細胞またはEC細胞で構成される場合には、被験細胞集団と参照細胞集団との間の遺伝子発現の類似性は、被験細胞集団がLC細胞またはEC細胞を含むことを示す。
【００８８】
被験細胞集団におけるECT2遺伝子の発現レベルは、それと参照細胞集団におけるECT2遺伝子の発現レベルとの違いが1.1倍を上回る、1.5倍を上回る、2.0倍を上回る、5.0倍を上回る、10.0倍またはそれ以上であるならば、「変化した」とみなされる、または「異なる」と考えられる。
【００８９】
被験細胞集団と参照細胞集団との間の遺伝子発現の差異は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、対照核酸は、細胞が癌状態にあるか非癌状態にあるかによる差がないことが判明しているものである。このため、対照核酸の発現レベルは、被験細胞集団および参照細胞集団におけるシグナルレベルを標準化するために用いることができる。例示的な対照遺伝子には、例えば、βアクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質P1が非限定的に含まれる。
【００９０】
被験細胞集団は、複数の参照細胞集団と比較することができる。複数の参照細胞集団のそれぞれは、既知のパラメーターに関して差があってよい。すなわち、被験細胞集団を、例えばLC細胞またはEC細胞を含むことが判明している第1の参照細胞集団、ならびに例えば非LC細胞または非EC細胞（正常細胞）を含むことが判明している第2の参照集団と比較することができる。被験細胞集団は、LC細胞またはEC細胞を含むことが判明しているかそれが疑われる対象からの組織試料または細胞試料中に含まれるものでもよい。
【００９１】
被験細胞集団は、体組織または体液、例えば、生体液（例えば、血液、痰、唾液）から入手することができる。例えば、被験細胞集団を肺組織または食道組織から精製することができる。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。上皮細胞は、好ましくは、非小細胞癌または食道扁平上皮癌であることが判明しているかそれが疑われる組織由来のものである。
【００９２】
参照細胞集団内の細胞は、好ましくは、被験細胞集団の組織型と類似した組織型に由来する。任意で、参照細胞集団は、細胞株、例えばLC細胞株もしくはEC細胞株（すなわち、陽性対照）または正常な非LC細胞株もしくは非EC細胞株（すなわち、陰性対照）である。または、対照細胞集団が、アッセイされるパラメーターまたは状態が判明している細胞から得られた分子情報のデータベースに由来してもよい。
【００９３】
対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシが非限定的に含まれる。
【００９４】
本明細書に開示されるECT2遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法を用いて、タンパク質レベルまたは核酸レベルで決定することができる。例えば、これらの核酸配列の1つまたは複数を特異的に認識するプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション分析を、遺伝子発現の決定のために用いることができる。または、遺伝子発現を、ECT2遺伝子配列、例えばSEQ ID NO：3および4に対して特異的なプライマーを用いる、逆転写を利用するPCRアッセイを用いて測定することもできる。また、発現をタンパク質レベルで、すなわち、ECT2遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベル、またはその生物活性を測定することによって決定することもできる。そのような方法は当技術分野で周知であり、これには例えば、該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、例えば、実施例1に記載された、SEQ ID NO：8または12を非限定的に含むアミノ酸配列を認識した抗ECT2ポリクローナル抗体を利用するイムノアッセイが非限定的に含まれる。遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性は一般に周知であり、これには例えば、細胞増殖活性が含まれる。Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2006, John Wiley and Sons；およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【００９５】
本発明に関して、ECまたはLCは、被験細胞集団（すなわち、患者由来の生物試料）におけるECT2核酸の発現レベルを測定することによって診断することができる。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば、肺組織または食道組織から得られた細胞を含む。遺伝子発現を、血液または他の体液、例えば唾液もしくは痰から測定することもできる。他の生物試料をタンパク質レベルの測定のために用いることもできる。例えば、診断しようとする対象から得た血液または血清中のタンパク質レベルを、イムノアッセイまたはその他の従来の生物アッセイによって測定することができる。
【００９６】
ECT2遺伝子の発現を被験細胞集団または生物試料においてまず決定し、続いて、ECT2遺伝子の正常対照発現レベルと比較する。正常対照レベルは、LCにもECにも罹患していないことが判明している対象由来の細胞集団において典型的に認められるECT2遺伝子の発現に対応する。患者由来の組織試料におけるECT2遺伝子の発現レベルに、正常対照試料からの発現と比較して、変化または差異（例えば、上昇）があることは、対象がLCまたはECに罹患しているかそれらを発症するリスクを有することを示す。例えば、被験細胞集団におけるECT2遺伝子の発現が、正常対照細胞集団における発現と比較して増大していることは、対象がLCまたはECに罹患しているかそれらを発症するリスクを有することを指し示す。
【００９７】
被験細胞集団におけるECT2遺伝子の発現レベルが、正常対照発現レベルと比較して増大していることは、対象がLCまたはECに罹患しているかそれらを発症するリスクを有することを示す。例えば、ECT2遺伝子の発現レベルが少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれ以上増大していることは、対象がLCまたはECに罹患しているかそれらを発症するリスクを有することを示す。
【００９８】
IV．ECT2遺伝子の発現を阻害する作用物質を同定するスクリーニングアッセイ：
ECT2遺伝子の発現、またはその遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、ECT2遺伝子を発現する被験細胞集団を被験作用物質と接触させ、続いてその後の遺伝子発現レベルまたはその遺伝子産物の活性のレベルを決定することによって同定することができる。作用物質の存在下における遺伝子発現のレベルまたはその遺伝子産物の活性のレベルが、被験作用物質の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して低下していることは、その作用物質がECT2遺伝子の阻害因子であり、それ故にLCおよびECの阻害において有用であることを示す。
【００９９】
被験細胞集団は、ECT2遺伝子を発現する任意の細胞を含みうる。例えば、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば肺組織または食道組織由来の細胞を含みうる。さらに、被験細胞集団が、非小細胞肺癌細胞または食道扁平上皮癌細胞に由来する不死化細胞株であってもよい。または、被験細胞集団が、ECT2遺伝子がトランスフェクトされた細胞、またはECT2遺伝子由来の調節配列（例えば、プロモーター配列）がレポーター遺伝子と機能的に連結されたものがトランスフェクトされた細胞で構成されてもよい。
【０１００】
作用物質は、例えば、阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAまたはリボザイム）、抗体、ポリペプチドまたは有機低分子であってよい。適した阻害性作用物質に関するスクリーニングは、多数の作用物質をマルチウェルプレート（例えば、96ウェル、192ウェル、384ウェル、768ウェル、1536ウェル）を用いて同時スクリーニングすることによる、ハイスループット法を用いて行うことができる。ハイスループットスクリーニングのための自動化システムは、例えば、Caliper Life Sciences, Hopkinton, MAから販売されている。スクリーニングに利用しうる有機低分子ライブラリーは、例えば、Reaction Biology Corp., Malvern, PA；TimTec, Newark, DEから購入することができる。
【０１０１】
IV-1．治療用作用物質の同定：
本明細書に開示された、示差的に発現されるECT2遺伝子はまた、LCおよびECを治療するための治療用作用物質の候補を同定するために用いることもできる。本発明の方法は、このため、被験作用物質が、LC状態またはEC状態に特徴的なECT2遺伝子の発現レベルを非LC状態または非EC状態に特徴的な遺伝子発現レベルに変換させうるか否かを判定するための治療用作用物質の候補のスクリーニングを伴う。
【０１０２】
本方法においては、被験細胞集団を1つまたは複数の被験作用物質に対して曝露し（逐次的にまたは組み合わせて）、細胞におけるECT2遺伝子の発現を測定する。被験細胞集団においてアッセイされた遺伝子の発現レベルを、被験作用物質に曝露されていない参照細胞集団における同じ遺伝子の発現レベルと比較する。
【０１０３】
ECT2遺伝子の発現を抑制することのできる作用物質は、顕著な臨床的有益性を有する。そのような作用物質は、動物または被験対象における肺癌または食道癌の増殖を阻止または予防する能力に関してさらに試験することができる。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、LCおよび／またはECの治療において標的に作用する候補作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。以上に詳述したように、ECT2遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルを制御することにより、LCおよび／またはECの発生および進行を制御することができる。このため、そのような発現レベルおよび活性レベルを癌状態または非癌状態の指標として用いるスクリーニング方法を通じて、LCおよび／またはECの治療において標的に作用する候補作用物質を同定することができる。本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含みうる：
（a）候補化合物を、ECT2ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（b）ポリペプチドと候補化合物との結合活性を検出する段階；および
（c）ポリペプチドと結合する候補化合物を選択する段階。
【０１０５】
または、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含みうる：
（a）候補化合物を、ECT2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；および
（b）ECT2遺伝子の発現レベルを、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる候補化合物を選択する段階。
【０１０６】
ECT2遺伝子を発現する細胞には、例えば、LCまたはECから樹立された細胞株が非限定的に含まれる；そのような細胞は本発明の上記のスクリーニングのために用いることができる。
【０１０７】
本発明によれば、細胞増殖の阻害における候補化合物の治療効果、またはECT2関連疾患を治療もしくは予防するための候補化合物を、評価することができる。このため、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補化合物をスクリーニングするための方法、およびECT2関連疾患を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０１０８】
本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含みうる：
a）候補化合物を、ECT2遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
b）ECT2遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
c）b）の発現レベルを、候補化合物の治療効果と相関づける段階。
【０１０９】
本発明において、治療効果は、ECT2遺伝子の発現レベルと相関づけることができる。例えば、候補化合物が、ECT2遺伝子の発現レベルを、被験作用物質または被験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させる場合には、候補化合物を、治療効果を有する候補作用物質または候補化合物として同定または選択することができる。または、被験作用物質または被験化合物が、ECT2遺伝子の発現レベルを、候補化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、候補化合物を、有意な治療効果を有しない化合物として同定することができる。
【０１１０】
または、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含みうる：
（a）候補化合物を、ECT2ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（b）段階（a）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（c）ECT2ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を、候補化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して抑制する化合物を選択する段階。
【０１１１】
本発明によれば、細胞増殖の阻害における候補化合物の治療効果、またはECT2関連疾患を治療もしくは予防するための候補化合物を、評価することができる。このため、本発明はまた、ECT2ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を抑制する候補化合物、またはECT2関連疾患を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の段階を含む方法も提供する：
a）候補化合物を、ECT2ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
b）段階（a）のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；および
c）b）の生物活性を、被験作用物質または被験化合物の治療効果と相関づける段階。
【０１１２】
本発明において、治療効果は、ECT2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性と相関づけることができる。例えば、候補化合物が、ECT2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を、候補化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して抑制または阻害する場合には、候補化合物を、治療効果を有する候補化合物として同定または選択することができる。または、候補化合物が、ECT2ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を、候補化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して抑制も阻害もしない場合には、候補化合物を、有意な治療効果を有しない化合物として同定することができる。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法に用いるためのタンパク質は、ECT2遺伝子に関する既知のヌクレオチド配列を用いた組換えタンパク質として入手することができる。ECT2遺伝子およびそのコードされるタンパク質に関する情報に基づき、当業者は、そのタンパク質の任意の生物活性をスクリーニングのための指標として選択し、選択した生物活性に関するアッセイのために適した任意の測定方法を選択することができる。具体的には、ECT2タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。このため、その生物活性を、そのような細胞増殖活性を用いて決定することができる。
【０１１４】
または、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含みうる：
（a）候補化合物を、ECT2遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（b）前記レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（c）前記レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性レベルと比較して低下させる候補化合物を選択する段階。
【０１１５】
本発明によれば、細胞増殖を阻害することに関する候補化合物の治療効果、またはECT2関連疾患を治療もしくは予防するための候補化合物を、評価することができる。このため、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補化合物をスクリーニングするための方法、およびECT2関連疾患を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０１１６】
本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含みうる：
a）候補化合物を、ECT2遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子から構成されるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
b）前記レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；ならびに
c）b）の発現レベルを、候補化合物の治療効果と相関づける段階。
【０１１７】
本発明において、治療効果は、前記レポーター遺伝子の発現または活性と相関づけることができる。例えば、候補化合物が、前記レポーター遺伝子の発現または活性を、候補化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させる場合には、候補化合物を、治療効果を有する候補化合物として同定または選択することができる。または、候補化合物が、前記レポーター遺伝子の発現または活性を、候補化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、候補化合物を、有意な治療効果を有しない作用物質または化合物として同定することができる。
【０１１８】
適したレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。本発明のスクリーニング方法のために適したレポーター構築物は、ECT2遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製することができる。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ECT2遺伝子に関するヌクレオチド配列情報に基づいて、ゲノムライブラリーから単離することができる。
【０１１９】
スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を、ECT2遺伝子の転写調節領域と連結することによって調製することができる。本明細書において、ECT2遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから、少なくとも500bp上流、好ましくは1000bp、より好ましくは5000または10000bp上流までの領域のことである。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはPCRによって増やすこともできる。転写調節領域を同定するための方法は周知であり、アッセイプロトコールもまた周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０１２０】
IV-2．LCおよび／またはECを治療するための治療用作用物質の選択：
個体の遺伝的構成の差異は、彼らが種々の薬剤を代謝する相対的能力の差異をもたらす可能性がある。対象において代謝されて抗LCおよび／または抗EC作用物質として作用する作用物質は、癌状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって現れる。このため、示差的に発現されるECT2遺伝子は、LCおよび／またはECの治療的または予防的な阻害因子と推定されるものを、その作用物質が対象におけるLCおよび／またはECの適した阻害因子であるか否かを判定する目的で、選択した対象由来の被験細胞集団において試験することを可能にする。
【０１２１】
特定の対象に対して適切であるLCおよび／またはECの阻害因子を同定するためには、その対象由来の被験細胞集団を治療用作用物質に対して曝露して、ECT2遺伝子の発現を判定する。
【０１２２】
本発明の方法に関して、被験細胞集団は、ECT2遺伝子を発現するLCおよび／またはEC細胞を含む。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。例えば、被験細胞集団を候補作用物質の存在下でインキュベートし、被験細胞集団の遺伝子発現パターンを測定して、1つまたは複数の参照発現プロファイル、例えば、LC参照発現プロファイル、EC参照発現プロファイル、または正常参照発現プロファイル、例えば、非LCおよび非EC参照発現プロファイルと比較することができる。
【０１２３】
LCおよび／またはECを含む参照細胞集団に比して、被験細胞集団におけるECT2遺伝子の発現が低下していることは、その作用物質が治療的有用性を有することを示す。または、被験細胞集団および参照細胞集団におけるECT2遺伝子の発現の類似性は、その作用物質が代替的な治療的有用性を有することを示す。
【０１２４】
本発明に関して、被験作用物質は任意の化合物または組成物でありうる。例示的な被験作用物質には、免疫調節性物質（例えば、抗体）、阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖阻害性オリゴヌクレオチドおよびリボザイム）ならびに低分子有機化合物が非限定的に含まれる。
【０１２５】
IV-3．候補化合物：
本発明のスクリーニングアッセイによって単離された化合物は、ECT2遺伝子の発現、またはECT2遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する薬物の開発のための候補として役立てることができ、肺癌および／または食道癌の治療または予防に応用することができる。
【０１２６】
その上、ECT2遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失および／または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含められる。
【０１２７】
本発明のスクリーニングアッセイによって単離された化合物は、癌を治療または予防する潜在能力を有する。これらの候補化合物が癌を治療または予防する潜在能力は、癌に対する治療用作用物質を同定するための第2のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１２８】
V．肺癌および食道癌の予後を評価するための方法：
本発明によれば、ECT2の発現は、NSCLC患者またはESCC患者の予後がより不良であることと有意に関連していることが新たに発見された（図2参照）。したがって、本発明は、患者の生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルの検出する段階；検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および、予後不良（低い生存率）を指し示すものとして、発現レベルが対照レベルに比して上昇していることを判定する段階によって、肺癌または食道癌、特にNSCLCまたはESCCを有する患者の予後を評価または判定するための方法を提供する。
【０１２９】
本明細書において、「予後」という用語は、症例の性質および症状によって示される、疾患の確度の高い転帰ならびに疾患からの回復の見通しに関する予測のことを指す。すなわち、見通しの良くない、悲観的で、不良な予後は、治療後の生存期間または生存率がより低いことによって定義される。その反対に、前向きで、見通しの良い、または良好な予後は、治療後の生存期間または生存率が上昇していることによって定義される。
【０１３０】
本発明に関して、「予後を評価すること（または判定すること）」という語句は、肺癌または食道癌の進行、特にNSCLCおよびESCCの再発、転移性拡散ならびに疾患再発の予測および尤度分析を包含することを意図している。予後を評価または判定するための本方法は、治療的介入を含む治療様式、疾患の病期分類などの診断基準、ならびに新生物性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよびサーベイランスに関する決断を下す上で臨床的に用いられることを意図している。
【０１３１】
本方法に用いる患者由来の生物試料は、試料中でECT2遺伝子を検出しうる限り、評価されようとする対象に由来する任意の試料であってよい。好ましくは、生物試料は肺細胞または食道細胞（それぞれ肺または食道から得られる細胞）である。その他の適した生物試料には、痰、血液、血清または血漿などの体液が非限定的に含まれる。または、試料は、組織から精製された細胞であってもよい。生物試料は、患者から、治療の前、最中および／または後を含むさまざまな時点で入手することができる。
【０１３２】
本発明によれば、患者由来の生物試料において測定されたECT2遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復および／または生存に関する予後が不良であること、ならびに臨床転帰が不良である見込みが高いことが示された。したがって、本方法によれば、比較のために用いられる「対照レベル」は、例えば、治療後にNSCLCまたはESCCに関して良好なまたは前向きな予後を示した個体または個体の集団において、あらゆる種類の治療の前に検出されたECT2遺伝子の発現レベルであってよく、本明細書ではこれを「予後良好な対照レベル」と称することにする。または、「対照レベル」は、例えば、治療後にNSCLCまたはESCCに関して不良なまたは悲観的な予後を示した個体または個体の集団において、あらゆる種類の治療の前に検出されたECT2遺伝子の発現レベルであってもよく、本明細書ではこれを「予後不良な対照レベル」と称することにする。「対照レベル」は、単一の参照集団または複数の参照集団に由来する単一の発現パターンのことである。したがって、対照レベルは、その疾患状態（予後が良好または不良）が判明しているNSCLCもしくはESCCの患者または患者の集団において、あらゆる種類の治療の前に検出されたECT2遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。疾患状態が判明している患者群における、ECT2遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均+/-2 S.D.または平均+/-3 S.D.の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１３３】
対照レベルは、疾患状態（予後が良好または予後が不良）が判明している肺癌または食道癌の患者（対照または対照群）から、あらゆる種類の治療の前に、予め収集して保存しておいた試料を用いることにより、被験生物試料と同時に決定することができる。
【０１３４】
または、対照レベルを、対照群から予め収集して保存しておいた試料中のECT2遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づく統計学的方法によって決定することもできる。さらに、対照レベルは、予め検査した細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。その上、本発明の1つの局面によれば、生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された対照レベルである、複数の対照レベルと比較することもできる。患者由来の生物試料の組織型に類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。
【０１３５】
本発明によれば、ECT2遺伝子の発現レベルと予後良好な対照レベルに類似性があることは、患者の予後がより見通しの良いことを示し、予後良好な対照レベルに対して発現レベルが上昇していることは、治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関する、より見通しの良くない不良な予後を示す。一方、予後不良な対照レベルに対してECT2遺伝子の発現レベルが低いことは、患者の予後がより見通しの良いことを示し、発現レベルと予後不良な対照レベルに類似性があることは、治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関する、より見通しの良くない不良な予後を示す。
【０１３６】
または、本発明は、対象由来の肺組織または食道組織の試料における癌細胞を検出するための方法であって、対象由来の生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、前記遺伝子の正常対照レベルと比較して前記発現レベルが上昇していることにより、組織における癌細胞の存在またはその疑いがあることが指し示される方法を提供する。
【０１３７】
そのような結果を別の情報と組み合わせることで、医師、看護師または他の医療従事者が、対象が本疾患に罹患していると診断するのを補助することができる。または、本発明は、対象が本疾患に罹患していると診断するために有用な情報を医師に提供することもできうる。例えば、本発明によれば、対象から得られた組織中の癌細胞の存在に関して疑いがある場合には、ECT2遺伝子の発現レベルを、組織病理、血液中の既知の腫瘍マーカーのレベルおよび対象の臨床経過などを含む、疾患の異なる局面と共に考察することにより、臨床的判断に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血液中の肺腫瘍診断用マーカーには、IAP、ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SP1、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、STNおよびCYFRAがある。または、CEA、DUPAN-2、IAP、NSE、SCC、SLXおよびSpan-1といった血液中の食道腫瘍診断用マーカーも周知である。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態のさらなる診断のための中間的結果として役立つ。
【０１３８】
もう1つの態様において、本発明は、癌の診断用マーカーを検出するための方法であって、対象由来の生物試料におけるECT2遺伝子の発現を、肺癌または食道癌の診断用マーカーとして検出する段階を含む方法を提供する。
【０１３９】
生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルは、発現レベルと対照レベルとの差異が1.0倍を上回る、1.5倍を上回る、2.0倍を上回る、5.0倍を上回る、10.0倍を上回る、またはそれ以上である場合に、変化したとみなすことができる。または、生物試料におけるECT2遺伝子の発現レベルは、発現レベルが対照レベルに対して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％またはそれ以上上昇しているかまたは低下している場合に、変化したとみなすことができる。
【０１４０】
被験生物試料と対照レベルとの間の発現レベルの差異は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質P1をコードするものを含む、癌性細胞と非癌性細胞との間で発現レベルに差がないことが判明しているポリヌクレオチドを、ECT2遺伝子の発現レベルを標準化するために用いることができる。
【０１４１】
発現レベルは、当技術分野において周知の手法を用いて、患者由来の生物試料における遺伝子転写物を検出することによって決定することができる。本方法によって検出される遺伝子転写物には、mRNAおよびタンパク質といった、転写産物および翻訳産物の両方が含まれる。
【０１４２】
例えば、ECT2遺伝子の転写産物は、ハイブリダイゼーション、例えば当該遺伝子転写物に対するECT2遺伝子プローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーション分析によって検出することができる。検出はチップ上またはアレイ上で行うことができる。ECT2遺伝子を含む多数の遺伝子の発現レベルを検出するためには、アレイの使用が好ましい。もう1つの例として、増幅を利用する検出方法、例えばECT2遺伝子に対して特異的なプライマーを用いる逆転写を利用するポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）などを、検出のために用いることもできる（実施例を参照）。ECT2遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーは、ECT2遺伝子の全配列（SEQ ID NO：11）を参照することにより、従来の手法を用いて設計および調製することができる。例えば、実施例において用いられるプライマー（SEQ ID NO：3および4）を、RT-PCRによる検出のために用いることができるが、本発明はそれらには限定されない。
【０１４３】
具体的には、本方法のために用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ECT2遺伝子のmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、その下でプローブまたはプライマーが、標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融解温度（Tm）よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは平衡状態の下でプローブの50％が占有されている。典型的には、ストリンジェントな条件は、pH 7.0〜8.3で塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約0.01〜1.0Mであり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、10〜50ヌクレオチド）に対しては少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーに対しては少なくとも約60℃であるものと考えられる。また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によってストリンジェントな条件を得ることもできる。
【０１４４】
または、翻訳産物を、本発明の評価のために検出することもできる。例えば、ECT2タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物としてのタンパク質の量を決定するための方法には、ECT2タンパク質を特異的に認識する抗体を用いるイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv、その他）を、その断片がECT2タンパク質に対する結合能を保っている限り、検出のために用いることもできる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製するための方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するための任意の方法を本発明において用いることができる。
【０１４５】
または、ECT2タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学分析を介して観察される染色の強度から、ECT2遺伝子の発現レベルを決定することもできる。すなわち、強い染色が観察されることはECT2タンパク質の存在量の増加を示すと同時に、ECT2遺伝子の高い発現レベルも示す。NSCLC組織またはESCC組織を、好ましくは、免疫組織化学分析のための被験材料として用いることができる。
【０１４６】
さらに、ECT2遺伝子の発現レベルに加えて、他の肺細胞または食道細胞関連遺伝子、例えば、NSCLCまたはESCCにおいて示差的に発現されることが判明している遺伝子の発現レベルを、評価の精度を向上させるために決定することもできる。そのような他の肺細胞または食道細胞関連遺伝子には、WO 2004／031413号またはWO2007／013671号に記載されたものが含まれる。
【０１４７】
本方法に従ってNSCLCまたはESCCの予後に関して評価されようとする患者は、好ましくは哺乳動物であり、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれる。
【０１４８】
VI．癌の治療または予防のための薬学的組成物：
VI-1．二本鎖分子を含む薬学的組成物
本発明は、項目「I．二本鎖分子」において上述した、または本発明の上記のスクリーニング方法によって選択される二本鎖分子の任意のものを含む、癌の治療または予防のための組成物を提供する。
【０１４９】
本発明の二本鎖分子は、肺癌または食道癌のような、ECT2遺伝子を過剰発現する癌、例えばNSCLCまたはESCCの予防または治療に用いる目的に適合させることができる。このため、本発明の好ましい態様は、有効成分としての、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1または2からなる群より選択される前記ヌクレオチド配列を標的とする二本鎖分子である、細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の薬学的有効量を含む、肺癌または食道癌の治療または予防のための薬学的組成物である。
【０１５０】
1つの態様において、本発明の1つまたは複数の二本鎖分子を含む組成物は、対象への投与のための送達媒体、例えばリポソーム、担体および希釈剤ならびにそれらの塩の中に封入することができ、かつ／または薬学的に許容される製剤中に存在することができる。核酸分子の送達のための方法は、Akhtar S & Juliano RL. Trends Cell Biol. 1992 May;2(5):139-44.；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995；Maurer N, et al., Mol Membr Biol. 1999 Jan-Mar;16(1):129-40.；Hofland & Huang. Handb Exp Pharmacol. 1999 137:165-192に記載されている。それはさらに、核酸分子の送達のための一般的な方法も記載している（米国特許第6,395,713号およびWO 199402595号）。これらのプロトコールは、事実上あらゆる二本鎖分子の送達のために利用することができる。二本鎖分子は、リポソーム中への封入、イオントフォレーシスによるもの、または生分解性高分子、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Gonzalez H, et al., Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec;10(6):1068-74.；WO 03／47518号およびWO 03／46185号を参照）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）およびPLCAミクロスフェア（例えば、米国特許第6,447,796号および米国特許出願第2002130430号を参照）、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフェアなどの他の媒体中への組み入れによるもの、またはタンパク質性ベクター（WO 200053722号）によるものを非限定的に含む、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与することができる。もう1つの態様において、本発明の核酸分子を、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えばポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-GAL）またはポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-triGAL）誘導体とともに製剤化または複合体化することもできる。1つの態様において、本発明の核酸分子は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第20030077829号に記載されているように、製剤化される（すなわち、脂質を基剤とする製剤）。
【０１５１】
また、全体的な治療効果を高めるために、本発明の二本鎖分子を他の治療用化合物と組み合わせて対象に投与することもできる。ある適応症を治療するための複数の化合物の使用は、有益な効果を高める一方で、副作用の存在を低下させる可能性がある。
【０１５２】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌の治療に用いるための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば、本発明は、ECT2遺伝子を発現する癌の治療に用いるための薬学的組成物を製造するための、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1または2からなる群より選択される配列を標的とする分子である、細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関する。
【０１５３】
または、本発明はさらに、ECT2遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、有効成分としての、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1および2からなる群より選択される配列を標的とする分子である、細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子とともに、薬学的または生理的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程も提供する。
【０１５４】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、有効成分を薬学的または生理的に許容される担体と混合する段階を含み、有効成分が、細胞におけるECT2遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、その分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1および2からなる群より選択される配列を標的とする、方法または工程も提供する。
【０１５５】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌の治療に用いるための二本鎖核酸分子も提供する。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成しているセンス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含み、かつSEQ ID NO：1および2からなる群より選択される配列を標的とする。
【０１５６】
VI-2．抗体を含む薬学的組成物
さまざまな癌において過剰発現されるECT2遺伝子の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物と結合するか、あるいは遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。ECT2ポリペプチドに対する抗体はそのような化合物として言及することができ、癌の治療または予防のための薬学的組成物の有効成分として用いることができる。
【０１５７】
本発明は、ECT2遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはそれらの抗体の断片の使用に関する。本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、II．抗体の項目のことを指す。このため、本発明の好ましい態様は、SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗原と結合する、ECT2を認識する抗体を薬学的有効量含む組成物である、肺癌または食道癌の治療または予防のための薬学的組成物である。
【０１５８】
抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）などの種々の分子とのコンジュゲーションによって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を含む。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。そのような修飾方法は、当技術分野において慣例的である。
【０１５９】
または、本発明のために用いられる抗体は、ECT2ポリペプチドに対する非ヒト抗体に由来する可変領域およびヒト抗体に由来する定常領域を有するキメラ抗体、または、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）およびヒト抗体に由来する定常領域から構成されるヒト化抗体であってもよい。そのような抗体は、既知の技術を用いることによって調製することができる。ヒト化は、齧歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6を参照）。したがって、そのようなヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１６０】
ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域も含む完全ヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知のさまざまな手法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を伴う（例えば、Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227:381-8を参照）。同様に、ヒト免疫グロブリン座位を、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは例えば、米国特許第6,150,584号；第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号に記載されている。
【０１６１】
得られた抗体を人体に対して投与しようとする場合には（抗体療法）、免疫原性を低減するためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【０１６２】
上記のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを、それらには限定されることなく、適切に選択して組み合わせて使用することにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムを、アフィニティーカラムとして用いることができる。用いられる例示的なプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROSおよびSepharose F.F. (Pharmacia）が含まれる。
【０１６３】
アフィニティークロマトグラフィー以外の、例示的なクロマトグラフィーには、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順を、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うこともできる。
【０１６４】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌の治療に用いるための薬学的組成物の製造における、本発明の抗体の使用も提供する。
【０１６５】
または、本発明はさらに、ECT2遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、薬学的または生理的に許容される担体を抗体とともに製剤化するための段階を含む方法または工程も提供する。
【０１６６】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、有効成分を薬学的または生理的に許容される担体と混合するための段階を含み、有効成分が抗体であるような方法または工程も提供する。
【０１６７】
もう1つの態様において、本発明はまた、ECT2遺伝子を発現する癌の治療に用いるための抗体も提供する。
【０１６８】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先されるものとする。
【０１６９】
以下では、実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。しかし、以下の材料、方法および例は本発明の諸局面を例証しているに過ぎず、本発明の範囲を限定することは全く意図していない。したがって、本明細書で記載したものに類似するか等価である方法および材料を、本発明の実施または検討に用いることができる。
【実施例】
【０１７０】
I．材料および方法
A．細胞株および組織試料
本研究に用いた15例のヒト肺癌細胞株には、5例の腺癌（ADC；NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549およびPC-14）、5例の扁平上皮癌（SCC；SK-MES-1、NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1703およびLU61）、1例の大細胞癌（LCC；LX1）および4例の小細胞肺癌（SCLC；SBC-3、SBC-5、DMS273およびDMS114）が含まれた。本研究に用いた10例のヒト食道癌細胞株は以下の通りであった；9例のSCC細胞株（TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9およびTE10）ならびに1例のADC細胞株（TE7）（Nishihira T. et al. J Cancer Res Clin Oncol 1993；119: 441-49）。細胞はすべて、10％ウシ胎仔血清（FCS）を加えた適切な培地中で単層に増殖させ、5％ CO2を含む加湿空気中にて37℃で維持した。正常対照として用いたヒト小気道上皮細胞（SAEC）は、Cambrex Bio Science Inc.製最適化培地（SAGM）中で増殖させた。
【０１７１】
腫瘍切除前に抗癌治療を受けていない患者からの原発性NSCLCおよびESCC組織試料を、事前にインフォームドコンセントを得た上で入手した（Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205., Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75., Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84., Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46）。腫瘍はすべて、UICC（国際対がん連合）のpTNM病理分類に基づいて病期分類した（表1)（Sobin L. and Wittekind Ch., 6th edition. New York: Wiley-Liss；2002）。組織マイクロアレイ上での免疫染色のために用いた、ホルマリン固定した原発性肺腫瘍および隣接する正常肺組織試料は、手術を受ける242例の患者（ADC 136例、SCC 87例、LCC 16例、ASC 3例；女性患者76例および男性患者166例；年齢の中央値63.3歳、26〜84歳の範囲）から入手した。合計240例のホルマリン固定した原発性ESCC（女性患者21例および男性患者219例；年齢の中央値61.9歳、41〜81歳の範囲）および隣接する正常食道組織の試料を、手術を受ける患者から入手した。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個別の施設内倫理委員会によって承認された。
【０１７２】
B 半定量的RT-PCR
各試料からのmRNAの合計3μgのアリコートを、ランダムプライマー（Roche Diagnostics）およびSuperscript II（Invitrogen）を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。半定量的RT-PCR実験は、ヒトECT2に対して特異的な合成プライマーの以下のセットまたは内部対照としてβ-アクチン（ACTB）特異的プライマーを用いて行った：
ECT2
5'-GCGTTTTCAAGATCTAGCATGTG-3' (SEQ ID NO.:3)および
5'-CAATTTTCCCATGGTCTTATCC-3' (SEQ ID NO.:4)、
ACTB
5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ ID NO.:5) および
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ ID NO.:6)。
PCR反応は、産物強度が確実に直線的増幅期にあるようにサイクル数に関して最適化した。
【０１７３】
C ノーザンブロット分析
23例の組織にわたるヒト多組織ブロット（BD Bioscience）を、プライマー
5'-TGGTGAAAGCTGGAAGGAAG-3' (SEQ ID NO.:7) および 
5'-CAATTTTCCCATGGTCTTATCC-3' (SEQ ID NO.:4)
を用いてプローブとして調製した、[α-32P]-dCTPで標識した、ECT2の719bpのPCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、製造元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは、増感スクリーンを用いて-80℃で7日間行った。
【０１７４】
D 抗ECT2抗体
Hisタグ付加エピトープをNH2末端に含む、ECT2のCOOH末端部分（コドン703〜883）（SEQ ID NO：8）を発現するプラスミドを、pET28ベクター（Novagen）を用いて調製した。組換えタンパク質を大腸菌（Escherichia coli）BL21 codon-plus株（Stratagene）において発現させ、Ni-NTA Superflow（QIAGEN）を用い供給元のプロトコールに従って精製した。このタンパク質をウサギに接種し、免疫血清を標準的な方法に従ってアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗ECT2ポリクローナル抗体を、ウエスタンブロット法および免疫染色に用いた。この抗体は、ECT2発現ベクターをトランスフェクトした細胞株からの溶解物、ならびに、いずれかはECT2を内因性に発現するがいずれかはそうでない、肺癌および食道癌細胞株からの溶解物を用いたウエスタンブロットにおいて、ECT2に対して特異的であることが確認された。
【０１７５】
E ウエスタンブロット法
腫瘍細胞を、溶解バッファー；50mM Tris-HCl（pH 8.0）、150mM NaCl、0.5％ NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、およびProtease Inhibitor Cocktail Set III（Calbiochem）中に溶解した。各溶解物のタンパク質含量を、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準物質として用いるBio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad）によって決定した。10μgの各溶解物を、10〜12％の変性ポリアクリルアミドゲル（3％ポリアクリルアミド濃縮ゲルを含む）で分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare Bio-sciences）に電気泳動的に移行させた。TBST中の5％脱脂粉乳によるブロッキングの後に、膜をウサギポリクローナル抗ヒトECT2抗体（組換えECT2に対して作製；上記を参照されたい）とともに室温で1時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（GE Healthcare Bio-sciences）とともに室温で1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後に、増強化学発光キット（GE Healthcare Bio-sciences）を用いて反応物を発光させた。
【０１７６】
F 免疫組織化学および組織マイクロアレイ
ホルマリン固定してパラフィンブロック中に包埋した臨床試料中のECT2タンパク質の臨床病理学的な意義を調べるために、切片を以下の様式でENVISION+ Kit／HRP（DakoCytomation）を用いて染色した。抗原賦活化のために、スライドをTarget Retrieval Solution High pH（DakoCytomation）中に浸漬し、オートクレーブ内において108℃で15分間煮沸した。3.3μg／mlのウサギポリクローナル抗ヒトECT2抗体（組換えECT2に対して作製；上記を参照されたい）を、内因性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後に各スライドに添加し、切片を二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（Histofine Simple Stain MAX PO（G）, Nichirei）とともにインキュベートした。発色基質を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１７７】
腫瘍組織マイクロアレイは、切除後の組織の収集、固定および保存のための同一のプロトコールを用いて、それぞれ単一の施設の群によって得られた（上記を参照されたい）、242例のホルマリン固定した原発性NSCLCおよび240例の原発性ESCCで構築した（Chin S. et al. Mol Pathol 2003;56:275-79., Callagy G. et al. Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34., Callagy G. et al. J Pathol 2005;205:388-96）。個々の腫瘍の組織学的不均一性を考慮した上で、試料採取のための組織領域を、スライド上の対応するH&E染色切片との目視による位置合わせに基づいて選択した。供与側の腫瘍ブロックから採取した3つ、4つまたは5つの組織コア（直径0.6mm；深さ3〜4mm）を、組織マイクロアレイヤー（Beecher Instruments）を用いて、受容側のパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアは各症例からパンチ法によって採取し、この結果得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学分析のために用いた。臨床病理学的データを事前に知らされていない独立した3人の研究者が、ECT2陽性について半定量的に評価した。各腫瘍組織コアの内部での染色の強度はほぼ均一であったため、ECT2染色の強度は以下の基準を用いて半定量的に評価した：強陽性（2+としてスコア化）、核および細胞質を完全に不明瞭にする、腫瘍細胞の50％超における暗褐色染色；弱陽性（1+）、腫瘍細胞の核および細胞質において認めることのできる、何らかの程度の弱い褐色染色；欠如（0としてスコア化）、腫瘍細胞における染色が認められない。調査者が別個に強陽性であると定義した場合にのみ、症例が強陽性であると認めた。
【０１７８】
G 統計学的分析
統計学的分析は、StatView統計プログラム（SaS）を用いて行った。強いECT2免疫反応性については、Fisherの正確検定を用いて、年齢、性別、病理学的TNMステージおよび組織学的型といった臨床病理学的変数との関連に関して評価した。手術日からNSCLCもしくはESCCに関連する死亡日まで、または最後の経過観察時までの腫瘍特異的な生存曲線を計算した。カプラン-マイヤー曲線を各関連変数およびECT2発現に関して計算し、患者サブグループ間の生存期間の差をログランク検定を用いて分析した。臨床病理学的変数と癌関連死亡率との間の関連を判定するために、Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量分析および多変量分析を行った。第1に、本発明者らは、死亡と、年齢、性別、組織像、pT分類およびpN分類を含む、可能性のある予後因子との間の関連について、1回につき1つの因子を考慮に入れて分析した。第2に、強いECT2発現を常に強制的にモデルに入れる後ろ向き（段階的）手法に対して、多変量Cox分析を、エントリーレベル（entry level）のP値が0.05未満を満たしたあらゆる変数で適用した。本モデルが因子を加え続ける間、独立因子がエクジットレベル（exit level）P＜0.05を上回ることはなかった。
【０１７９】
H RNA干渉アッセイ
肺癌細胞および食道癌細胞におけるECT2の生物学的機能を評価するために、低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖を標的遺伝子（Dharmacon）に対して用いた。RNAiのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りとした：対照1（ルシフェラーゼ（LUC）：フォチナス-フィラリス（Photinus pyralis）のルシフェラーゼ遺伝子）
5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3' (SEQ ID NO.: 9);
対照2（スクランブル（SCR）：5Sおよび16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ（Euglena gracilis）遺伝子
5'-GCGCGCUUUGUAGGAUUCG-3' (SEQ ID NO.: 10); si-ECT2-#1、
5'-GAUAAAGGAUGAUCUUGAA-3' (SEQ ID NO.: 1); si-ECT2-#2、
5'-CAGAGGAGAUUAAGACUAU-3' (SEQ ID NO.: 2)。
【０１８０】
肺癌細胞株A549および食道癌細胞株TE9を10cm培養皿にプレーティングし（1枚当たり1.5×106個）、24μlのLipofectamine 2000（Invitrogen）を用い、製造元の指示に従っていずれかのsiRNAオリゴヌクレオチド（100nM）をトランスフェクトした。7日間のインキュベーション後に、コロニー形成を評価するためにこれらの細胞をギムザ溶液によって染色し、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって細胞数を評価した。
【０１８１】
I フローサイトメトリー
siRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞を、5×105個／100mm培養皿の密度でプレーティングした。トランスフェクションから2日後または3日後に細胞をトリプシン処理し、PBS中に収集して、70％冷エタノール中で30分間固定した。100μg／mlのRNアーゼ（Sigma-Aldrich）による処理後に、細胞をPBS中の50μg／mlヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich）で染色した。フローサイトメトリーはBecton Dickinson FACScanで行い、ModFitソフトウエア（Verity Software House, Inc）により分析した。ゲーティングされていない（ungated）少なくとも20,000個の細胞から選択した細胞を、DNA含量に関して分析した。
【０１８２】
J マトリゲル浸潤アッセイ
ECT2を発現するように設計したp3XFLAGタグ付加（C末端）プラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたNIH3T3細胞およびCOS-7細胞を、10％ FCSを含むDMEM中でコンフルエントに近くなるまで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって採取し、血清もプロテイナーゼ阻害薬も添加しないDMEM中で洗浄して、DMEM中に1×105個／mlの濃度で懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリックス（Becton Dickinson Labware）の乾燥層を、DMEMによって室温で2時間にわたり再水和した。10％ FCSを含むDMEM（0.75ml）を、24ウェルマトリゲル浸潤チャンバーのそれぞれの下方チャンバーに添加し、0.5ml（5×104個）の細胞懸濁液を上方チャンバーの各インサートに対して添加した。インサートのプレートを37℃で24時間インキュベートした。続いてチャンバーの処理を行った；マトリゲルを通過して浸潤している細胞を固定し、供給元（Becton Dickinson Labware）による指示通りにギムザによって染色した。
【０１８３】
II．結果
A．肺癌および食道癌ならびに正常組織におけるECT2の発現
本発明者らは以前、27,648種の遺伝子またはESTからなるcDNAマイクロアレイを用いて、101例の肺癌（NSCLC 86例またはSCLC 15例）および19例のESCCのゲノムワイド発現プロファイル分析を行い（Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205., Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99., Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43., Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006；28:799-805., Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75., Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84. WO 2004／031413号、WO2007／013671号）、検討した肺癌試料および食道癌試料の大多数で、癌細胞におけるECT2転写物の発現の亢進（3倍またはそれ以上）を同定した。本発明者らは、半定量的RT-PCR実験により、検討した肺癌組織15例中12例、肺癌細胞株15例中10例、ESCC組織10例中8例、およびESCC細胞株10例中4例においてその過剰発現を確認した（図1Aおよび1B）。本発明者らは引き続いて、ヒトECT2に対して特異的なウサギポリクローナル抗体を作製し、ウエスタンブロット分析により、肺癌細胞株6例中5例およびESCC細胞株4例中2例におけるECT2タンパク質の過剰発現を確認した（図1C）。ECT2 cDNAをプローブとして用いるノーザンブロット分析により、4.3kb転写物が、検討した23種の正常ヒト組織のうち精巣のみで同定された（図1D、上のパネル）。本発明者らは引き続いて、5種の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺および精巣）ならびに肺癌におけるECT2タンパク質の発現について抗ECT2抗体を用いて検討し、前者の4種の組織中ではほとんど検出されないが、精巣細胞および肺癌細胞の核内および細胞質中には陽性ECT2染色が現れることを見いだした（図1D、下のパネル）。
【０１８４】
ECT2 cDNAをプローブとして用いるノーザンブロット分析により、4.3kb転写物が、検討した23種の正常ヒト組織のうち精巣のみで同定された（図1D、上のパネル）。本発明者らは引き続いて、5種の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺および精巣）ならびに肺癌におけるECT2タンパク質の発現について抗ECT2抗体を用いて検討し、前者の4種の組織中ではほとんど検出されないが、精巣細胞および肺癌細胞の核内および細胞質中には陽性ECT2染色が現れることを見いだした（図1D、下のパネル）。
【０１８５】
B ECT2過剰発現とNSCLC患者およびESCC患者の予後不良との関連
肺癌および食道癌の発生におけるECT2の生物学的および臨床病理学的な意義を調べるために、本発明者らは、外科的切除を受けた242例のNSCLCおよび240例のESCC症例由来の組織切片を含む組織マイクロアレイ上での免疫組織化学染色を行った。抗ECT2ポリクローナル抗体によるECT2染色は、肺腫瘍細胞の核および細胞質で主として観察されたが、それらの周囲の正常肺細胞においては検出されなかった（図2A、上のパネル）。本発明者らは、組織アレイ上のECT2発現レベルを、欠如（0としてスコア化）から弱／強陽性（1+〜2+としてスコア化）までに分類した。242例のNSCLCのうち、ECT2は112例の症例において強染色され（46％；スコア2+）、91例の症例において弱染色され（38％；スコア1+）、39例の症例では染色されなかった（16％：スコア0）（詳細は表1Aに示されている）。本発明者らは次に、ECT2発現レベル（強陽性と弱陽性／欠如との比較）とさまざまな臨床病理学的変数との相関を検討し、NSCLCにおけるECT2の強発現が、非ADC性組織像（P＝0.0389、Fisherの正確検定；表1A）および原発性腫瘍の切除後の腫瘍特異的5年生存率（P＝0.0004、ログランク検定；図2A、下のパネル）と有意に関連していることを見いだした。本発明者らはまた、単変量分析を適用して、患者予後と、年齢（65歳以上と65歳未満との比較）、性別（男性と女性との比較）、組織像（非ADCとADCとの比較）、pTステージ（腫瘍サイズ；T2〜T3とT1との比較）、pNステージ（リンパ節転移；N1〜N2とN0との比較）およびECT2発現（スコア2+と0、1+との比較）を含むいくつかの要因との間の関連についても評価した。これらのパラメーターはすべて、予後不良と有意に関連していた（表1B）。Cox比例ハザードモデルを用いた多変量分析により、pTステージ、pNステージ、年齢およびECT2強染色がNSCLCの独立した予後因子であることが示された（表1B）。
【０１８６】
（表１Ａ）NSCLC組織におけるECT2陽性と患者の特徴との間の関連（n＝242）
2011528221.tif 000002
*ADC：腺癌
+P＜0.05（Fisherの正確検定）
【０１８７】
（表１Ｂ）NSCLCの患者における予後因子に関するCox比例ハザードモデル分析
2011528221.tif 000003
+P＜0.05
【０１８８】
検討した240例のESCC症例のうち、ECT2は81例の症例において強染色され（34％；スコア2+）、135例の症例において弱染色され（56％；スコア1+）、24例の症例では染色されなかった（10％；スコア0）（図2B、上のパネル）（詳細は表2Aに示されている）。本発明者らは、ECT2強陽性（スコア2+）と、pTステージ（より深部への腫瘍浸潤症例ほど高い；P＝0.0124）およびpNステージ（リンパ節転移陽性症例ほど高い；Fisherの正確検定によりP＝0.0442；表2A）との有意な相関を見いだした。腫瘍が強いECT2発現を示したESCC患者は、弱いECT2発現を有する者／ECT発現が欠如した者と比較して、腫瘍特異的生存期間がより短いことが明らかになった（ログランク検定によりP＝0.0088；図2B、下のパネル）。ESCCの予後と、年齢（65歳以上と65歳未満との比較）、性別（男性と女性との比較）、pTステージ（腫瘍の深達度；T2、T3とT1との比較）、pNステージ（N1とN0との比較）およびECT2発現（スコア2+ 14と0、1+との比較）を含むいくつかの要因との間の関連を評価する単変量分析により、年齢を除くこれらのパラメーターのすべてが予後不良と有意に関連していることが明らかになった（表2B）。多変量分析では、ECT2の強発現は、本研究に参加した外科治療を受けたESCC患者に関する独立した予後因子として統計学的に有意なレベルには達しなかった（P＝0.1872）が、pTステージおよびpNステージならびに性別は有意なレベルに達しており、このことは食道癌におけるECT2発現とこれらの臨床病理学的要因との関連性を示唆する（表2B）。
【０１８９】
（表２Ａ）ESCC組織におけるECT2陽性と患者の特徴との間の関連（n＝240）
2011528221.tif 000004
+P＜0.05（Fisherの正確検定）
【０１９０】
（表２Ｂ）ESCCの患者における予後因子に関するCox比例ハザードモデル分析
2011528221.tif 000005
+P＜0.05
【０１９１】
C．ECT2に対する低分子干渉RNAによる癌細胞の増殖の阻害
ECT2が肺癌細胞および食道癌細胞の増殖または生存に必須であるか否かを評価するために、本発明者らは、ECT2に対する合成オリゴヌクレオチドsiRNAを、ECT2が内因性に過剰発現されるA549細胞およびTE9細胞にトランスフェクトした。si-ECT2-#1または-#2をトランスフェクトした細胞におけるECT2のレベルは、いずれかの対照siRNAをトランスフェクトしたものと比較して有意に低下していた（図3A、上のパネル）。MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイにより、si-ECT2-#1または-#2をトランスフェクトした細胞の数の劇的な減少が明らかになった（図3A、中央および下のパネル）。ECT2に対するsiRNAによる腫瘍抑制の機序を解明するために、本発明者らは、これらのsiRNAをトランスフェクトした腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析を行ったところ、処置後48時間の時点ではG2／M期にある細胞の有意な増加が見いだされ、その後、処置後72時間の時点ではサブG1画分の細胞の増加が見いだされた（図3B）。
【０１９２】
D．ECT2による哺乳動物細胞浸潤の活性化
ECT2が、細胞の運動性と関連のあるRho GTPアーゼに対するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）であること、ならびに組織マイクロアレイ上での免疫組織化学分析により、ECT2強陽性の腫瘍を有する肺癌患者および食道癌患者がECT2弱陽性／陰性腫瘍を有する者よりも短い癌特異的生存期間を示していることから、本発明者らは、2種類の哺乳動物細胞（NIH3T3およびCOS-7）を用いるマトリゲルアッセイにより、細胞浸潤において考えられるECT2の役割について検討した。いずれの細胞へのECT2 cDNAのトランスフェクションも、マトリゲルを通過するそれらの浸潤活性を有意に増大した（図4）。また、この結果により、ECT2が細胞の高悪性度表現型の一因である可能性も示唆された。
【０１９３】
III．結果の考察
肺、食道、口腔、咽頭および喉頭の癌を含む気道消化管癌は、米国における癌死全体の3分の1を占めており、世界のいくつかの地域では最も頻度の高い癌である（Daigo Y. and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53）。最新の外科的手法と、放射線療法および化学療法などのさまざまなアジュバント治療様式との併用にもかかわらず、ESCC患者の5年全生存率は40％前後にとどまっており、肺癌患者のそれは15％に過ぎない（Parkin DM. Lancet Oncol 2001;2:533-43., Shimada H. et al. Surgery 2003;133:486-94）。このため、特異的な発癌経路を標的とすることによる新たな癌診断薬および治療薬のさらなる開発が急務となっている。本発明者らは、レーザーマイクロダイセクションによる癌細胞の濃縮の後に、27,648種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いて、101例の肺癌および19例のESCCのゲノムワイド発現プロファイル解析を行った。本発明者らは、組織マイクロアレイ上の数百もの臨床試料における標的候補のタンパク質発現を系統的に解析し、RNAiシステムを用いて機能喪失型表現型を調べ、これらのタンパク質の生物学的機能をさらに明確にした。これらの分析を通じて、本発明者らは、癌細胞では上方制御されるが正常臓器では発現されず、新規な診断用バイオマーカー、治療薬および／または免疫療法の開発のための優れた候補である可能性のある、いくつかの腫瘍性タンパク質を同定した（Daigo Y. and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54）。本研究では、Rho GTPアーゼに対するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）をコードするECT2が、肺癌試料および食道癌試料の大半において高い頻度でトランス活性化されていること、およびその遺伝子産物が癌細胞の増殖／浸潤に不可欠な役割を果たすことが初めて開示された。
【０１９４】
低分子Rho GTPアーゼは、アクチン細胞骨格、遺伝子転写、細胞運動性、細胞接着および細胞質分裂の調節といった必須な細胞過程において重要な役割を果たすことが知られている（Etienne S. et al. J Immunol 1998；161: 5755-61., Kaibuchi K. Prog Mol Subcell Biol 1999；22: 23-38）。ECT2は、プレクストリン相同性（PH）ドメインと縦列に並んだDbl相同性（DH）ドメインを含み、RhoAおよびCdc42といった低分子GTP結合タンパク質上でのグアニンヌクレオチド交換を触媒する（Miki T. Methods Enzymol 1995;256:90-8., Das B. et al. J Biol Chem 2000;275:15074-81）。ECT2の発現はE2Fによって直接調節され（Eguchi T. et al. Oncogene 2007；26: 509-20.）、ECT2タンパク質はG2/M期の間にCDK1によってThr341でリン酸化されて、GEF活性の増大および細胞質分裂の調節をもたらす（Hara T. et al. Oncogene 2006；25: 566-78）。有糸分裂後期のPlk1活性は、中心紡錘体へのECT2の動員を促進し、細胞質分裂の開始を誘発して、ヒト細胞における分割面の指定の一因になると提唱されている（Petronczki M. et al. Dev Cell 2007；12: 713-25）。本研究では、ECT2に対する特異的siRNAによる癌細胞の処置が、siRNAトランスフェクションから48時間後にG2／M停止を通じた癌細胞増殖の阻害をもたらし、その後、72時間時点でアポトーシスをもたらすことが実証された。別の証拠も、ヒトの発癌におけるECT2の意義を示している。ECT2の発現は、細胞浸潤の顕著な促進をもたらした。その上、組織マイクロアレイ実験を通じて得られた臨床病理学的証拠も、ECT2陽性腫瘍を有するNSCLC患者またはESCC患者は、ECT2陰性腫瘍を有する者よりも癌特異的生存期間が短いことを示している。肺癌細胞および食道癌細胞におけるECT2発現レベルの上昇の基礎をなす正確な分子的機序はまだ解明されていないが、インビトロおよびインビボでのアッセイによって得られた結果は、ECT2が重要な増殖因子である可能性が高く、癌細胞の高悪性度表現型と関連している可能性があることを示している。本明細書で提供した証拠に基づけば、ECT2は今や、典型的な癌-精巣抗原として分類することができる。そのような抗原は、癌治療法のための非常に魅力のある標的の一群として認知されている（Suda T. et al. Cancer Sci 2007；98: 1803-8., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008；99: 1448-54）。このため、低分子化合物によるECT2酵素活性の選択的阻害は、有害事象のリスクが非常に少ない、癌に対する有用な治療戦略である。その上、ECT2腫瘍抗原は、ECT2発現を伴う癌細胞に対する細胞傷害性T細胞による特異的免疫応答を誘導することのできる癌ワクチン用のHLA拘束性エピトープペプチドのスクリーニングにも有用である。本明細書で提示したデータは、ECT2が癌細胞の生存の原因となる基本的機能を有することを示しているため、このタンパク質由来のペプチドを用いるワクチン接種は、抗原発現を喪失した免疫回避性変異体腫瘍が出現するリスクを低下させると考えられる。
【０１９５】
以上の結論として、これらのデータは、癌患者の治療のための、ECT2の発癌活性を特異的に標的とする新たな抗癌薬を設計するための基盤を提供する。切除検体におけるECT2過剰発現も、不良な臨床転帰を有する可能性が高い肺癌患者および食道患者に対するアジュバント療法の適用のための有用な指標となる。
【０１９６】
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノムワイドcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた、本明細書に記載した癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療のための標的としての特異的な遺伝子が同定される。これらの示差的に発現される遺伝子のサブセットの発現に基づき、本発明は、癌の同定および検出のため、さらには予後の評価のための分子診断マーカーを提供する。
【０１９７】
本明細書に記載した方法は、癌の予防、診断および治療のための別の分子標的の同定にも有用である。本明細書中に提示されたデータは、癌の包括的理解を深め、新規な診断戦略の開発を促すとともに、治療薬および予防薬の分子標的をも提供する。そのような情報は、腫瘍発生に関する理解をさらに深めるのに寄与するとともに、癌の診断、治療、さらに最終的にはその予防のための新規な戦略をも提供する。
【０１９８】
本明細書中に引用したすべての特許、特許出願および刊行物は、GenBankアクセッション番号を含め、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９９】
加えて、本発明を詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明してきたが、前記の説明は例示的および説明的な性質のものであり、本発明およびその好ましい態様を例証することを意図したものであることが理解されるべきである。ルーチンな実験を通じて、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えることができることを容易に認識するであろう。したがって、本発明は上記の説明によって定義されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって定義されることを意図する。
【図１Ａ】
2011528221.tif 000006
【図１Ｂ】
2011528221.tif 000007
【図１Ｃ】
2011528221.tif 000008
【図１Ｄ】
2011528221.tif 000009
【図２Ａ】
2011528221.tif 000010
【図２Ｂ】
2011528221.tif 000011
【図３Ａ】
2011528221.tif 000012
【図３Ｂ】
2011528221.tif 000013
【図４】
2011528221.tif 000014
【配列表】
2011528221000001.app
【国際調査報告】
2011528221.tif 000015
2011528221.tif 000016
2011528221.tif 000017