(57)【要約】  本発明は、クローナルシークエンシングを使用する一回のシークエンシング操作で、複数の個体の、完全な、複数の部位のＨＬＡ遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を実行するための、方法及び試薬を提供する。
2011500041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の個体のＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定する方法であり：
（ａ）各個体において、多形性部位を含む前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのエキソンを増幅することにより、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を取得し、ここで、各増幅反応は、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを用いて実行され、ここで：
（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列を含み；そして
（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列を含み；
（ｂ）複数の個体由来のＨＬＡ単位複製配列をプールし、そしてエマルジョンＰＣＲを実行し；
（ｃ）パイロシークエンシングを用いて、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を並行して決定し；続いて
（ｄ）該ＨＬＡ単位複製配列と既知のＨＬＡ配列を比較して、各個体に対してＨＬＡ対立遺伝子を割り当てることにより該個体中にいずれのＨＬＡ対立遺伝子が存在しているかを決定；
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための順プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ結合領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための逆プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ結合領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記逆プライマーが、表１に示されるプライマー配列を有する、請求項４の方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための順プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有し；かつ、前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための逆プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項７】
前記順プライマーが表１に示されるプライマーのアダプター領域を有し；かつ、前記逆プライマーが表１に示されるプライマーのアダプター領域を有する、請求項６の方法。
【請求項８】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの個別識別タグ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｇ）を有し、かつ、前記逆プライマーが、表１に示されるプライマーの個別識別タグを有する、請求項１の方法。
【請求項９】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有し、かつ、前記逆プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
複数の個体におけるＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定するためのＨＬＡ単位複製配列を取得するためのプライマーのペアを含むキットであり、ここで、該プライマーのペアが、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを含み、ここで：（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含み；（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含む、前記キット。
【請求項１１】
前記プライマーのペアが、表１に示される順プライマー及び逆プライマーを含む、請求項１０のキット。
【請求項１２】
１つ以上のプライマーのペアを含むキットであり、各プライマーのペアが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ−結合領域の配列を有するＨＬＡ単位複製領域を取得するための順プライマーを含み；そして表１に示されるプライマーのＨＬＡ−結合領域の配列を有する該ＨＬＡ単位複製領域を取得するための逆プライマーを含む、前記キット。
【請求項１３】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有し、そして前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
１５個のプライマーのペアを含み、該プライマーのペアが、ＨＬＡ−Ａのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｂのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｃのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＤＲＢ１のエキソン２を増幅し；ＤＰＢ１のエキソン２を増幅し、ＤＰＡ１のエキソン２を増幅し、ＤＱＡ１のエキソン２を増幅し；そしてＤＱＢ１のエキソン２及びエキソン３を増幅する、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩは、クラスＩＩにおいてはエキソン２に、そしてクラスＩにおいてはエキソン２及び３に主に局在するパッチワーク多形が複雑なパターンを有する、ヒトゲノム中で最も多形的な遺伝子である。現代のＨＬＡ分類手法において、造血幹細胞の移植において臨床的に重要なＨＬＡ対立遺伝子の対立遺伝子レベルでの分類（ａｌｌｅｌｅ  ｌｅｖｅｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、技術的に困難である。ドナーと患者との間の正確な、対立遺伝子レベルでのＨＬＡの適合が、急性及び慢性両方の移植片対宿主拒絶反応の発生率及び重症度を低下させ、並びに移植の成功率を改善することにより、全体的な移植生存率を顕著に改善することが、幾つかの大規模な研究により実証されている。例えば、８つの最も重要なＨＬＡ対立遺伝子の８つとも適合している場合、６つが適合している場合と比較して、移植の１２ヶ月後の生存率が６０％亢進した。
【０００２】
現在の実務において、数百万人の潜在的骨髄ドナーは、ＨＬＡ型の分類としては中〜低程度の、Ａ、Ｂ、及び多くのケースにおいてＤＲＢ１遺伝子座での分類をもって登録されている。この最初の分類に基づいて、複数の関連していない潜在的適合ドナーが選択され、それから、これら及び追加的な遺伝子座について対立遺伝子レベルで分類することにより、レシピエントに最も良好に適合するドナーを同定する。
【０００３】
目下のところ、最高分解能のＨＬＡ分類は、キャピラリー電気泳動を使用する蛍光、サンガー法を基礎とするＤＮＡシークエンシングを用いて行うものである。しかしながら、両対立遺伝子を一緒に増幅し、シークエンシングする場合、対立遺伝子間の複数の多形、及び位相不確実性（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）により、該ＨＬＡ分類データの不確実性はなおも存在し得る。正確な分類データを得るには、増幅してから２つの対立遺伝子を個別に解析する等の時間のかかるアプローチを必要とする。
【０００４】
次世代シークエンシング法は、数百万個の単一ＤＮＡ分子を並行してクローナルに増幅した後、やはり並行してシークエンシングを行う。最近、そのような次世代パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）シークエンシング法により読取り可能な塩基長は２５０ヌクレオチド超まで向上している。最近の発明では、クローナルシークエンシングを一つのエキソン内の連結した多形の位相を設定するのに使用し得るという発見に基づいて、ＨＬＡ遺伝子型決定法の改善を提供し、そして各ＨＬＡ対立遺伝子の配列の正確な決定を可能とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、部分的には、一回のシークエンシング操作で、複数の対象から取得した試料について、８つの遺伝子座のＨＬＡ遺伝子型決定を実行することができるという発見に基づいている。従って、幾つかの態様において、本発明は、複数の個体のＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定する方法を提供し、該方法は：
（ａ）各個体において、多形性部位を含む前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのエキソンを増幅することにより、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を取得し、ここで、各増幅反応は、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを用いて実行され、ここで：
（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含み；そして
（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含み；
（ｂ）複数の個体由来のＨＬＡ単位複製配列をプールし、そしてエマルジョンＰＣＲを実行し；
（ｃ）パイロシークエンシングを用いて、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を並行して決定し；続いて
（ｄ）該ＨＬＡ単位複製配列と既知のＨＬＡ配列を比較し、各個体に対してＨＬＡ対立遺伝子を割り当てることにより、該個体中にいずれのＨＬＡ対立遺伝子が存在しているかを決定する；
工程を含む。本発明に係る好ましい態様において、ＨＬＡ単位複製配列を増幅するための順プライマー及び逆プライマーは、表１に示されるプライマーのＨＬＡ−ハイブリダイゼーション領域の配列を有する。また、更に好ましい態様において、該プライマーは、表１に示されるプライマーの個別識別タグ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｇ）をも有する。特に好ましい態様において、該プライマーは、表１に示されるプライマーの配列を有する。
【０００６】
更に、本発明は、複数の個体におけるＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定するためのＨＬＡ単位複製配列を取得するためのプライマーのペアを含むキットを提供し、ここで、該プライマーのペアが、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを含み、ここで：（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含み；（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ配列を含む。好ましい態様において、前記キットは、表１に示される１つ以上の順プライマー及び逆プライマーを含む。他の好ましい態様において、前記キットは、ＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を決定するためのエキソンを増幅するプライマーのペアを含み、ここで、各プライマーのペアは、表１に示されるプライマーから選択される。
【０００７】
加えて、本発明は、１つ以上のプライマーのペアを含むキットを提供し、ここで、各プライマーのペアは、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有するＨＬＡ単位複製配列を取得するための順プライマー；及び表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有するＨＬＡ単位複製配列を取得するための逆プライマーを含む。加えて、そのようなプライマーは、表１に示される配列を有するアダプター領域を含む。更に好ましい態様において、該プライマーは、表１に示されるプライマーの個別識別タグを有する。特に好ましい態様において、前記順プライマーは表１に示されるプライマーの配列を有し、そして前記逆プライマーは表１に示されるプライマーの配列を有する。
【０００８】
更に、本発明は、１５個のプライマーのペアを含むキットを提供し、ここで、該プライマーのペアは、ＨＬＡ−Ａのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｂのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｃのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＤＲＢ１のエキソン２を増幅し；ＤＰＢ１のエキソン２を増幅し、ＤＰＡ１のエキソン２を増幅し、ＤＱＡ１のエキソン２を増幅し；そしてＤＱＢ１のエキソン２及びエキソン３を増幅する。好ましい態様において、本発明は、少なくとも６個、又は少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個のプライマーのペアを含むキットを提供する。好ましくは、前記プライマーのペアは、表１に示されるプライマーから選択される。
【０００９】
加えて、本発明は、ＨＬＡ−Ａのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｂのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｃのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＤＲＢ１のエキソン２を増幅し；ＤＰＢ１のエキソン２を増幅し、ＤＰＡ１のエキソン２を増幅し、ＤＱＡ１のエキソン２を増幅し；そしてＤＱＢ１のエキソン２及びエキソン３を増幅する各プライマーのペアを形成する複数のプライマーのペアを含むキットを提供し、該所望の各エキソン領域を増幅する複数のプライマーのペアは、同一のＨＬＡハイブリダイゼーション領域及び同一のアダプター領域を有するが、識別タグが異なる。好ましい態様において、所望の各エキソン領域に対して１２個以上の複数のプライマーのペアが存在し、該プライマーのペアは、異なる複数の識別タグを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係る順方向及び逆方向の融合プライマーの模式図を示す。
【図２】読取り長のヒストグラムを提供する。
【図３】順方向及び逆方向の読取りの読取り深度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用されるとき、「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の配列変化を指す。１つ以上の遺伝子の変化が、対立遺伝子を構成し得る。ＨＬＡ対立遺伝子において、典型的には、複数の遺伝子の変化が、対立遺伝子を構成し得る。ＨＬＡ対立遺伝子配列の例として、Ｍａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ  （１９９８）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５１：  ４１７−６６に記載されるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、並びにＭａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：１に記載されるＤＲＡ、ＤＲＢ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子が挙げられる。
【００１２】
本明細書中で使用されるとき、「多形性」及び「多形」という用語は、集団中に、特定の遺伝子配列又はコードされるアミノ酸配列が変化したものが２つ以上見出される状態を指す。多形性部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）とは、核酸中の、変化の存在を判別するヌクレオチドの相異が存在する部位を指す。本明細書中で使用されるとき、「単一ヌクレオチド多形」又はＳＮＰという用語は、単一のヌクレオチド部位から構成される多形性部位を指す。
【００１３】
「遺伝子型」という用語は、個体又は試料中に含まれる遺伝子の対立遺伝子の種類を指す。本明細書中で使用されるとき、個体の遺伝子型と、その個体を起源とする試料の遺伝子型との間に差異は存在しない。
【００１４】
本明細書中で使用されるとき、ＨＬＡ遺伝子の「遺伝子型の決定」とは、対象の各対立遺伝子中に存在するＨＬＡ多形を決定することを指す。本発明において、「ＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型の決定」とは、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の対立遺伝子決定基である部位にある、少なくともエキソン２及びエキソン３、そして典型的にはエキソン４中に存在する多形性塩基を同定することを指す。本発明において、「ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の遺伝子型の決定」とは、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の対立遺伝子決定基である部位にある、少なくともエキソン２及びエキソン３、そして典型的にはエキソン４中に存在する多形性塩基を同定することを指し；そして本発明において、「ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の遺伝子型の決定」とは、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の対立遺伝子決定基である部位にある、少なくともエキソン２及びエキソン３、そして典型的にはエキソン４中に存在する多形性塩基を同定することを指す。同様に、本発明において、ＤＲＢｌ、ＤＰＢｌ、ＤＰＡｌ、又はＤＱＡｌの「遺伝子型の決定」とは、それらの遺伝子の対立遺伝子決定基である部位にある、エキソン２中に存在する多形性塩基を同定すること、及びＤＧＢ１対立遺伝子の対立遺伝子決定基である部位にある、エキソン２及びエキソン３中に存在する多形性塩基を同定することを指す。
【００１５】
本明細書中で使用されるとき、「対立遺伝子決定基」とは、そのバリエーションの存在がＨＬＡ抗原のバリエーションを生じさせる、多形性部位を指す。
【００１６】
本発明に置いて、「標的領域」という用語は、ＨＬＡ遺伝子の、多形性部位の存在が解析されるべき核酸領域を指す。
【００１７】
「オリゴヌクレオチド」とは、共有結合した２つ以上のヌクレオチドサブユニットから構成される単鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。本明細書中で使用されるとき、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には塩基長が約１０〜１００ヌクレオチド、通常は塩基長が２０〜６０ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖基（ｓｕｇａｒ  ｇｒｏｕｐ）は、リボース、デオキシリボース、又はそれらの修飾された誘導体、例えばｏ−メチルリボース等であってもよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合により、又は限定されないが、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻害しない、僅かな、若しくは天然に起こらない結合を含む他の結合により連結されていてもよい。更に、オリゴヌクレオチドは、一般的ではないヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分を有していてもよい。本明細書中に定義されるオリゴヌクレオチドは、核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよく、又は共有結合したリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを有していてもよい。所定の配列のオリゴヌクレオチドは、例えば化学的及び生化学的合成により、及び組換え核酸分子からのインビボ若しくはインビトロ発現等により、当業者に知られている技術により生産されてもよい。
【００１８】
「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生産物の合成が誘導される適切な緩衝液及び適切な温度条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として機能するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明において、プライマーは、所望のＨＬＡ配列に正確に、又は実質的に相補的な、「ＨＬＡ結合領域」又は「ＨＬＡハイブリダイゼーション領域」を含む。このプライマーの領域は、典型的には、塩基長が、約１５〜２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドである。
【００１９】
本明細書中で使用されるとき、プライマーの「アダプター領域」とは、本明細書中に記載される手順に従い取得されるＨＬＡ単位複製配列に一般的であり、エマルジョンＰＣＲの微小粒子又は他の固相表面上に存在するオリゴヌクレオチドとアニーリングする配列を提供する、５’末端のプライマー配列の領域を指す。該「アダプター配列」は、更にシークエンシングプライマーが結合する部位として機能するものであってもよい。該アダプター領域は、典型的には、塩基長が１５〜３０ヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
「個別識別タグ」、「バーコード」、「識別タグ」、「多重識別タグ」、「分子識別タグ」、又は「ＭＩＤ」という用語は、本明細書中で、同様の意味で、特定の対象から取得されるＤＮＡのマーカーとして機能するプライマー中に存在するヌクレオチド配列を指す。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき、「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、プライマー及びオリゴマーフラグメントを指す。この用語は塩基長で限定されず、そしてポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基の他の任意のＮ−グリコシドの直線ポリマーの総称である。これらの用語は、二重鎖及び単鎖ＤＮＡ、並びに二重鎖及び単鎖ＲＮＡを含む。
【００２２】
核酸、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、又は限定されないが、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋エチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、又はスルホン結合を含む修飾結合、並びにそれらの結合の組合せを含んでもよい。
【００２３】
核酸、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、生物学的に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）、並びに／又は該５つの生物学的に存在する塩基以外の塩基を含んでもよい。これらの塩基は、例えばハイブリダイゼーションを安定化又は不安定化し；プローブ分解を促進又は阻害し；又は検出可能部分若しくは消光部分の接続点として機能する籐の様々な目的を果たし得る。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドは、限定されないが、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル−アデニン、イミダゾール、置換イミダゾール、５−フルオロウラシル、５ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄマンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン、２チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、及び５−プロピニルピリミジンを含む、１つ以上の修飾された、非標準の、又は誘導体化された塩基部分を含んでもよい。修飾された、非標準の、又は誘導体化された塩基部分の他の例は、米国特許第６，００１，６１１号、第５，９５５，５８９号、第５，８４４，１０６号、第５，７８９，５６２号、第５，７５０，３４３号、第５，７２８，５２５号、及び第５，６７９，７８５において見出され得る。更に、核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む、１つ以上の糖部分を含んでもよい。
【００２４】
「増幅条件」という用語は、標的ヌクレオチドを足がかりとする伸長可能なポリヌクレオチド（例えばプライマー）のハイブリダイゼーション、及び該伸長可能なポリヌクレオチドの温度依存的な伸長が可能な条件を指す。本明細書中で使用されるとき、「増幅条件」又は標的核酸の増幅に十分な条件は、当業者に周知である。例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  による、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｅｄｓ．，  ２００３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；及びＢａｒｔｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓｔｉｒｌｉｎｇによる、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｅｄｓ．，  ２００３，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００２５】
「増幅」という用語は、本明細書中で核酸増幅反応の前後で使用されるとき、核酸鋳型、例えば標的核酸配列のコピー数を増大する反応を指す。
【００２６】
導入
本発明は、多重並行クローナルシークエンシング解析が、同時に、複数の個体中の、少なくとも３つ、典型的には少なくとも６つ、そして好ましくは少なくとも８つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型の決定に使用され得るという発見に基づく、ＨＬＡ遺伝子型決定方法を提供する。次世代シークエンシング法は、数百万個の単一ＤＮＡ分子を並行してクローナルに増幅した後、やはり並行してシークエンシングを行う。近年、そのような次世代シークエンシング法の単発の操作（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）により取得可能な読取り長は、２５０ヌクレオチドを超えるまで増大している。これらのクローナルな読取り長は、一つのエキソン中の連結した多形の相を設定し、それにより、各ＨＬＡ対立遺伝子の配列を正確に決定することを可能とする。本発明において、該システムは、本明細書中に記載されるパイロシークエンシングプラットフォームを使用して、１回のシークエンシング操作で、例えば２４又は４８個の対象等の複数の個体について、完全な、８つの遺伝子座のＨＬＡ分類を可能とする程度に十分に高効率である。
【００２７】
本発明に係る高度に多重化した単位複製配列は、試料のプールを可能としつつ特定の個体に配列を割り当てる、試料特異的な内部的配列タグ（バーコード又はＭＩＤ）を採用する。本発明において、シークエンシングにより生じるデータから、少なくとも８つの遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、ＤＰＢｌ）、並びにＤＲＢ３、４、及び５のＨＬＡ遺伝子型が取得され得る。また、このＨＬＡシークエンシングシステムは、例えばＳＣＩＤ患者の血中に存在する、僅かな、胎盤を通過しない（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）母性対立遺伝子等のキメラ混合物を検出することもできる。
【００２８】
ＨＬＡ遺伝子
非と白血球抗原系（ＨＬＡ）複合体は、第６番染色体短腕上の約３５０万塩基対に及ぶ。主要な領域は、クラスＩ及びクラスＩＩ領域である。主要なクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃであり、そして主要なクラスＩＩ抗原は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲである。該ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ抗原のα及びβ鎖をコードする。ＨＬＡ遺伝子は、最も多形的な遺伝子である。ＨＬＡ抗原中で表現される（故に移植用の分類において注目される）多形は、クラスＩＩ遺伝子ではエキソン２に、そしてクラスＩ遺伝子ではエキソン２及び３において、優勢に局在する。
【００２９】
本発明において、本明細書中に記載のＨＬＡ遺伝子の遺伝子型は、ＨＬＡ遺伝子中に存在する多形の決定を指す。ＨＬＡ−Ａにおいて、エキソン２及びエキソン３中に存在する多形は、個体からＰＣＲにより生成された単位複製配列をシークエンシングすることにより決定される。典型的な態様において、エキソン４の配列も決定される。エキソン２、エキソン３、及びエキソン４、又はそれらの対立遺伝子決定要素を含む領域は、単位複製配列を取得するために、個別のＰＣＲ反応においてそれぞれ増幅される。同様に、ある個体において、単位複製配列は、エキソン２及びエキソン３、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃにあっては、幾つかの態様においてはエキソン４について取得される。各エキソンは、特定のＨＬＡ対立遺伝子が明確に分類されるいずれかの末端から、読取り枠間を十分に重複させて、両方の鎖をシークエンシングすることにより、完全にシークエンシングされ得る。
【００３０】
個体から取得した各試料は、所望のエキソン、又は所望のエキソンの多形領域を標的とするプライマーを使用して、別個に各エキソンについて増幅される。該増幅反応において採用されるプライマーは、追加的な配列：エマルジョンＰＣＲ用アダプター配列及び単一の個体に由来するＤＮＡのマーカーとみなされる識別配列を含む。
【００３１】
増幅プライマー
本発明は、ＨＬＡ遺伝子の所望のエキソンを増幅する増幅プライマーを採用する。典型的には、該プライマーは、エキソンの完全な多形部分が取得されるように設計される。
【００３２】
本発明において、本発明の他順増幅用のプライマー配列は、クローナルなシークエンシング及び解析を促進するのに使用され得る配列を含むように設計される。従って、本発明の増幅用プライマー（本明細書中で、「融合プライマー」とも称される）は、以下の要素：アダプター、固有識別タグ、及びＨＬＡ単位複製配列を取得するための増幅反応において使用される、所望のＨＬＡ遺伝子とハイブリダイズする配列を含む。図１は、本発明に係る融合プライマーの模式図を提供する。
【００３３】
プライマー配列のアダプター部分は、単位複製配列融合プライマーの５’末端に存在する。該アダプター領域は、シークエンシング反応用のプライマーのアニーリング部位とみなされ、かつエマルジョンＰＣＲのために表面にアニーリングされるように、ビーズ又は固相表面上に存在する配列に対応する配列を含む。ＨＬＡエキソンを増幅するための順プライマーは、５’末端にアダプター配列を含み、ここではこれをアダプター領域Ａと称する。逆プライマーは、５’末端にアダプター配列を有する領域を含み、ここではこれをアダプター領域Ｂと称する。上述のように、アダプター領域中に存在する配列及びそれらの相補体は、エマルジョンＰＣＲ用のビーズへの単位複製配列のアニーリングを可能とする。場合によっては、該アダプターは更に、非反復的（ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｉｎｇ）ヌクレオチド配列（即ちＡＣＧＴ、ＣＡＧＴ等）を含む固有識別鍵配列を含み得る。この鍵配列は、典型的には、前記反応に含まれるコントロール配列からＨＬＡ遺伝子型決定用単位複製配列を区別するために含まれる。そのような配列は、例えば、ＷＯ／２００４／０６９８４９及びＷＯ／２００５／０７３４１０に記載されている。アダプタープライマーを構成するための追加的な手引きは、例えば、ＷＯ／２００６／１１０８５５で得られる。
【００３４】
幾つかの態様において、本発明において使用されるアダプター配列は、４５４  ＧＳ−ＦＬＸ  ４５４  シークエンシングシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のプライマーＡ及びプライマーＢ配列である。プライマーＡ配列は５’  ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡ  ３’  （配列番号１）である。プライマーＢ配列は５’  ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣ  ３’  （配列番号２）である。上記のように、典型的には、これらのプライマーは、コントロール配列から単位複製配列を区別するための識別配列を提供する追加的な「鍵」配列を含む。
【００３５】
本発明に係るＨＬＡ遺伝子型決定方法において使用されるＰＣＲプライマーは、更に個別識別タグを含む。これらの個別識別タグは、試験される各個体に由来するＨＬＡ単位識別配列をマーキングするのに使用される。所望のＨＬＡ配列は遺伝子型決定がなされる個体由来の核酸試料から増幅される。上記のように、対立遺伝子決定要素として機能する多形を含むＨＬＡエキソン、又はそれらのエキソンの領域は、個別に増幅される。前記対象から取得した単位識別配列は、同一の識別タグを用いてマーキングされる。このタグは、対象の各単位識別配列を増幅するのに使用される融合プライマー中に含まれる。従って、シークエンシング反応において、識別タグもシークエンシングされる。これらのＩＤタグは、ＨＬＡ単位複製配列を取得するのに使用される融合プライマー中、該融合プライマーのアダプター領域とＨＬＡ点火領域（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）との間に存在する。
【００３６】
識別タグの長さは様々である。典型的には、タグの長さは４又は５ヌクレオチドである。幾つかの適用において、識別配列は、より長く、例えば６、８、又は１０ヌクレオチド以上であるのが望ましい場合がある。そのような配列の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １２：８５２−８５５，  ２００６；  Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３５：ｅｌ３０，  ２００７；  Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５：ｅ９１，  ２００７を参照されたい）。本発明の最も一般的な態様において、識別タグの長さは４〜１０ヌクレオチドである。
【００３７】
個別識別タグは、特定のパラメーターを考慮して設計され得る。例えば、４残基のＩＤタグにおいて、シークエンシング反応におけるヌクレオチドのフローサイクルを考慮する４塩基を選択するのが望ましい。例えば、ヌクレオチドがＴ、Ａ、Ｃ、及びＧの順序で加えられるとしたら、典型的には、陽性である残基の後に陰性であり得る残基が続くようにタグ配列を設計するのが望ましい。従って、この例において、もしシークエンシング反応において組み込まれるヌクレオチドがＴとなるようにタグ配列が「Ａ」塩基で始まるとすると、タグ配列中の第二の塩基はＡが含まれないものであるべきである。加えて、タグ配列中に、又は融合プライマーの、アダプター領域の最後の塩基、若しくはＨＬＡ特異的領域の最初の塩基に基づいて、ホモポリマーが形成されるのを回避するのが望ましい。
【００３８】
前記融合プライマーの点火領域（本明細書中でＨＬＡ結合領域、又はＨＬＡハイブリダイゼーション領域とも称される）は、所望のエキソン（又は幾つかの態様においては、エキソンの領域）を増幅するために、所望のＨＬＡ配列とハイブリダイズするプライマーの領域である。典型的には、融合プライマーのＨＬＡ領域は、全エキソン配列を取得するために、増幅されるべきエキソンに隣接するイントロン配列とハイブリダイズする。ＨＬＡ配列は、好ましくは、所望のＨＬＡエキソンを選択的に増幅するように選択されるが、幾つかの態様において、プライマーのペアは、関連するＨＬＡ遺伝子の高度に類似する領域も増幅する場合がある。例えば、下記の実施例の部分に記載されるＤＲＢ１のエキソン２におけるプライマーは、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、及びＤＲＢ５遺伝子座も増幅する。これらのプライマーは、そのエキソンの配列からＨＬＡ遺伝子型を明確に決定するのに十分な特異的で、エキソンを増幅するように選択される。
【００３９】
ＨＬＡ遺伝子及び対立遺伝子の配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ及び他の遺伝子データベースを含む様々なデータベースを通じて取得可能であり、並びに公開されている（例えば、Ｍａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ  （１９９８）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５１  ：  ４１７−６６，  ｌｉｓｔｉｎｇ  ＨＬＡ−Ａ，  ＨＬＡ−Ｂ，  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｃ  ａｌｌｅｌｅｓ；  Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：１，  ｌｉｓｔｉｎｇ  ＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ａｌｌｅｌｅｓ−ＤＲＡ，  ＤＲＢ，  ＤＱＡｌ，  ＤＱＢｌ，  ＤＰＡｌ，  ａｎｄ  ＤＰＢｌを参照されたい）。
【００４０】
ＰＣＲプライマーは、当業者に既知の原則に基づいて設計され得る。プライマー設計の方策は、例えばＲｕｂｉｎ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ａ．  Ａ．  Ｌｅｖｙ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９９６．２４  （１８）：  ｐ．  ３５３８−４５；及びＢｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９９．２７  （３）：  ｐ．  ５２８−３６等の学術文献を通じて見出され得る。例えば、プライマーのＨＬＡ特異的領域の長さは、典型的には約２０ヌクレオチド以上、例えば２０〜３５ヌクレオチドである。考慮すべき他のパラメーターは、Ｇ／Ｃ含量比、内部二次構造形成を免れ、及びプライマーダイマー形成を防止するように考慮した設計、並びに融解温度（Ｔｍ）である。
【００４１】
本発明において使用されるプライマーの例は、表１に提供されている。表１において、順プライマーは、５’末端に４５４シークエンシングシステム「Ａ」プライマー配列を有し、そして４ヌクレオチドの鍵（ＴＣＡＧ）が続き、これらは合わせてアダプター領域を構成し；続いて識別タグ（特段の言及がない限り４ヌクレオチド）；続いて検出されるＨＬＡ遺伝子とハイブリダイズする領域を有する。逆プライマーは、５’末端に４５４シークエンシングシステム「Ｂ」プライマー配列を有し、そして４ヌクレオチドの鍵（ＴＣＡＧ）が続き、これらは合わせてアダプター領域を構成し、続いて識別タグ領域、続いてＨＬＡ特異的領域を有する。
【００４２】
本発明の方法において使用されるプライマーは、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域を含み得る。他の態様において、そのようなプライマーは、表１に示されるＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列と実質的に同一の部分を含み得る。従って、例えば、本発明のプライマーは、表１に示されるプライマーセットのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の少なくとも１０、１５、又は２０以上の隣接したヌクレオチドを含み得る。
【００４３】
ＨＬＡ遺伝子型を決定する各対象におけるＨＬＡ増幅は、個別に実行される。従って、個別の対象に由来する単位複製配列は、その後のエマルジョンＰＣＲ及びシークエンシング解析のためにプールされる。
【００４４】
所望のＨＬＡ単位複製配列を増幅するのに使用される鋳型核酸は、典型的には、遺伝子型を決定する対象から単離したゲノムＤＮＡから得られる。本発明において、並行してなされる反応により、２つ以上の対象のＨＬＡ遺伝子型が決定される。本発明において、少なくとも１２個、そして典型的には少なくとも１６、２０、２４、３０、３６、又は４８個の対象のＨＬＡ遺伝子型が決定される。
【００４５】
ＨＬＡ増幅は、いずれの種類の増幅反応を使用して取得されてもよい。本発明において、典型的には、本明細書中に記載のプライマーのペアを使用するＰＣＲにより、多重の単位複製配列が生じる。典型的には、例えば高精度Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）等の誤り率の低いポリメラーゼを使用するのが望ましい。
【００４６】
対象からＨＬＡ単位複製配列を取得するのに適した条件を決定するために、ＰＣＲ条件を最適化し得る。各ＨＬＡ単位複製配列は、別個のＰＣＲ反応において、別個に増幅され得る。幾つかの態様において、対象のＨＬＡ単位複製配列は、特定の単位複製配列を複製するためのプライマーペアを含む、単発又は多重の反応で取得され得る。
【００４７】
エマルジョンＰＣＲ
ＨＬＡ単位複製配列は、ビーズに結合し、そしてエマルジョンＰＣＲに付される。エマルジョンＰＣＲは、当該技術分野で既知である（例えば、ＷＯ／２００４／０６９８４９、ＷＯ／２００５／０７３４１０、米国特許出願公開第２００５０１３０１７３号、ＷＯ／２００７／０８６９３５及びＷＯ／２００８／０７６８４２を参照されたい）。エマルジョンＰＣＲにおいて、増幅は、増幅されるべき鋳型、本発明においては単位複製配列を、固相担体、好ましくは通常球状のビーズの形態の固相担体と接触させることにより実行される。
【００４８】
ＨＬＡ単位複製配列は、アダプター領域を介して、その単位複製配列がビーズ表面に結合しているプライマーとアニーリングすることにより、ビーズと結合する。そのため、ビーズには、アダプター部分中のＨＬＡ単位複製配列に相補的な単一種のプライマーが大量に結合している。該ビーズは、水性反応混合物中に懸濁しており、油中水エマルジョンの中に封入されている。該エマルジョンは、熱に安定な油相に包埋された、例えば直径約６０〜２００μｍの分離した微小な水相の液滴である。油が添加され、平均で、そのエマルジョンが１個の標的核酸及び１個のビーズのみを含むように、エマルジョンの液滴が形成される。好ましくは、各微小な液滴は、増幅反応溶液（即ち、ポリメラーゼ、塩、及び例えばアダプター領域に対応する適切なプライマー等の、核酸増幅に必要な試薬群）を含む
【００４９】
本発明において、ＨＬＡ単位複製配列が両方向にシークエンシングされるため、エマルジョンＰＣＲは、典型的には２つのビーズの集団を用いて実行される。一方のビーズ集団において、逆プライマー上に存在するアダプター配列に対応する第一のプライマーがビーズに結合している。第二の集団において、順プライマー上に存在するアダプター配列に対応する第二のプライマーがビーズに結合している。よって、典型的には、エマルジョン増幅反応において使用されるプライマーは、「鍵」配列等の追加的な配列を有さず、アダプター領域の配列を有する。エマルジョン増幅反応は、典型的には、非対称的に実行される。例えば、前記２つのＰＣＲプライマーは、非対称ＰＣＲを実行するために、８：１又は１６：１の比率（即ち、一方のプライマー８又は１６に対し、第二のプライマーが１）で存在し得る。
【００５０】
エマルジョン増幅の後、例えばエマルジョンＰＣＲの間の増幅プライマー上に存在するビオチン等の部分を通じて、単鎖ＨＬＡ単位複製配列の鋳型を有するビーズが単離され、それから、ピロリン酸の放出及び同時に起こる酵素によるヌクレオチドの分解による塩基の取り込みの検出に基づくＤＮＡシークエンシング技術を使用して、該鋳型がシークエンシングされる（例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、６，２５８，５６８号及び６，２１０，８９１号に記載される）。
【００５１】
クローナルな単位複製配列は、シークエンシングプライマーを使用して、そしてポリメラーゼ反応用の４つの異なるｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを添加して、シークエンシングされる。各ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰがプライマー伸長産物に組み込まれるとき、ピロリン酸分子が放出される。ピロリン酸の放出は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における発光等により、酵素的に検出され得る。加えて、反応の間、アピラーゼ（ａｐｙｒａｓｅ）等のヌクレオチド分解酵素が、組み込まれていないヌクレオチドを分解するために存在し得る（米国特許第６２５８５６８号を参照されたい）。他の態様において、前記反応は、シークエンシングプライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド分解酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、並びにＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼを含むピロリン酸検出系の存在下で実行され得る（例えば米国特許第６２５８５６８号を参照されたい）。
【００５２】
個別のＤＮＡ分子の配列について一旦シークエンシングデータを取得して、これらの配列ファイルをそれら２つのＨＬＡ対立遺伝子のＨＬＡ配列データベースと比較することにより、明確なエキソン配列が決定され得る。ＧＳＦＬＸシステム（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により達成される読取り長（ａｖｇ  ＝  ２５０ｂｐ）は、各エキソンを決定するのに十分な重複を可能とする。エキソン配列データファイルに基づく各遺伝子座の遺伝子型の指定（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、例えばＣｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発されたソフトウェア等により実行され得る。該ソフトウェアの重要な側面は、標的配列以外にプライマーにより増幅された関連する配列読取り（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄ）（偽遺伝子及び他の望ましくないＨＬＡ遺伝子）を排除する能力である。
【００５３】
キット
本明細書中に記載される組成物及び試薬は、キットに同封され得る。典型的には、本発明に係るキットは、ＨＬＡ対立遺伝子中の所望の領域を増幅するのに適した、本明細書中に記載の複数のプライマーのペアを含む。該複数のプライマーのペアは、アダプター領域、個別識別タグ及びＨＬＡハイブリダイゼーション領域を含む順プライマー、並びにアダプター領域、個別識別タグ及びＨＬＡハイブリダイゼーション領域を含む逆プライマーを含む。しばしば、本発明に係るキットは、例えば１２個以上の複数の個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ遺伝子の遺伝子型を決定するのに十分なプライマーのペアを含む。
【００５４】
幾つかの態様において、キットは、追加的に、エマルジョンＰＣＲにおいて使用され得る、アダプター領域に対応するプライマーを結合した、１つ以上の集団のビーズを含む。幾つかの態様において、実施者の判断に応じて選択される反応を実施するのに適した試薬を含む、１つ以上の反応区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を含み得る。例えば、幾つかの態様において、１つ以上のシークエンシング試薬を含む１つ以上の反応区画を含み得る。
【００５５】
前記キット中に含まれる様々な成分は、典型的には、個別の容器に含まれるが、幾つかの態様において、１つ以上の成分が、同一の容器中に存在する場合がある。加えて、キットは、本明細書中に記載される組成物及び試薬を任意の組合せで含み得る。幾つかの態様において、キットは、本開示に係る方法を実施するのに必須又は付随的であり得る追加的な試薬を含み得る。そのような試薬には、限定されないが、緩衝剤、対照ポリヌクレオチド等が含まれる。
【００５６】
本出願において、特段の言及がない限り、単数系の使用は複数形を含む。本明細書中で使用される項目の見出しは組織化のみを目的とし、いかなる意味においても記載されている対象の事項を限定するものとして解釈されない。本教示は、様々な実施例と組み合わせて記載されるが、本教示がそれらの態様に限定されることを意図するものではない。
【実施例】
【００５７】
多重パイロシークエンシング
単発の４５４操作における複数の試料の複数のＨＬＡ遺伝子座の解析は、ＰＣＲプライマー内に分子ＩＤ（ＭＩＤ）タグを組み込むことにより促進される。表１は、アダプター配列（ビーズ捕捉用）及び４塩基ＭＩＤタグを有する４５４ＨＬＡ特異的融合プライマーの配列を示す。ＭＩＤタグが５塩基の配列も提供されている。
【００５８】
最初の実施例において、ＨＬＡ遺伝子型が既知の２４個の細胞株を解析した。次の実施例では、４８個の試料を解析した。
【００５９】
ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子座のエキソン２、３、及び４、ＤＲＢｌ、ＤＰＢｌ、ＤＰＡｌ、ＤＱＡｌのエキソン２、並びにＤＱＢ１のエキソン２及び３に対する、１５個のプライマーペアを設計した。各標的配列についてのプライマーが異なる１２個のＭＩＤタグを有するように設計し、合計で１８０個のペアとなった。ＤＲＢ１のエキソン２に対するプライマーは、特定のＤＲＢ１ハプロタイプ上に存在する、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、及びＤＲＢ５遺伝子座も増幅する。様々な試料を増幅した後、それらのＰＣＲ産物を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析により定量し、適切な濃度に希釈し、そしてエマルジョンＰＣＲ用にプールした。２４個及び４８個の個体についてのパイロシークエンシングをそれぞれ２つ又は４つのマイクロタイタープレートを使用して達成した。全ての単位複製配列の読取り長の分布を、図２に示す。平均長は、２５０ｂｐであった。この長さは、前記順配列及び逆配列読取りが、各エキソン、及び究極的には各対立遺伝子の配列の明確な指定を可能とするのに十分である。個体あたりの各エキソンの読取りの個数を、図３に示す。
【００６０】
遺伝子型決定ソフトウェア
これらの複合的な配列データファイルからの遺伝子型の指定を促進するために、各エキソンから得られた順配列及び逆配列読取りをＨＬＡ配列データベースと比較するソフトウェアプログラム（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）が開発された。また、このデータベースは、ＨＬＡ偽遺伝子及び関連遺伝子の配列も含むため、偽遺伝子又は非標準的（ｎｏｎ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子（例えばＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨ）から生じた配列を排除することができる。
【００６１】
プローブハイブリダイゼーションＨＬＡタイピング及びＳａｎｇｅｒシークエンシングに基づいてＨＬＡ型が判明している２４個の細胞株由来ＤＮＡ試料を、８つ全ての遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＲＢ１、−ＤＱＡｌ、−ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、ＤＰＢｌ）にについてシークエンシングした。ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５のエキソン２も、ＤＲＢプライマーペアにより生じる単位複製配列中に同定された。続いて、４８個の試料（２４個の細胞株ＤＮＡ及び２４個の血液試料から抽出したＤＮＡ）のシークエンシングを同一の遺伝子座について行い、それから、該配列データから、Ｃｏｎｅｘｉｏ  ＡＴＦソフトウェアにより、遺伝子型の指定を行った。ソフトウェアによる遺伝子型決定の結果と、既に決定されていたＨＬＡ型との合致率は、９９．４％であった。
【００６２】
キメラ混合物の解析（少数変異検出）
典型的なＧＳＦＬＸ操作において生じる大量の配列読取り（ｎ＝３００〜３５０Ｋ）は、試料中に存在する少数の変異の配列の検出を可能とする。そのような配列を検出する感度を推定するために、２個のＨＬＡホモ接合体由来の、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂのエキソン２及び３、並びにＤＲＢ１のエキソン２のＰＣＲ産物の様々な割合（１／１、１／１０、１／１００、１／１０００）での混合物を調製した。１／００の混合物中に存在する少数変異を、良好な再現性をもって検出することができた。
【００６３】
所定の個体の血液は、キメラ、即ち子供の循環系の中に残留母体細胞が極めて低い割合で存在し、又は母親の循環系中に僅かに胎児細胞が維持される。しばしば、ＳＣＩＤ患者は、極めて低い割合で母体細胞を保持する。そのような患者が造血幹細胞移植の提供者である場合、この潜在的なキメラのレベルを特定することは、臨床的に重要である。子供の体内に母体細胞が存在しているというＳＣＩＤの状態を模倣するために、１つの対立遺伝子を共有する２つのヘテロ接合体の試料の様々な割合での混合物を調製した。この実施例において、少数変異を検出することができた。
【００６４】
ＨＳＴ移植の提供者であった２名のＳＣＩＤＳ患者についても、それらの親と共に解析を行った。各ケースにおいて、胎盤を通過しない母性対立遺伝子の存在を検出することができた。
【００６５】
クローナルシークエンシング、ＨＬＡエキソンから増幅した個別のＤＮＡ分子から生成した単位複製配列の解析は、明確なエキソン配列の決定を可能とし、そして、これらの配列のファイルとＨＬＡ配列データベースとを比較することにより、２つのＨＬＡ対立遺伝子の決定を可能とする。ＧＳＦＬＸシステム（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により達成される読取り長（ａｖｇ  ＝  ２５０ｂｐ）は各エキソンを決定するのに十分な重複を可能とする。本実施例において、エキソン配列データファイルに基づく各遺伝子座の遺伝子型の指定は、Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発されたソフトウェア（ＡＴＦ）により実行された。該ソフトウェアの重要な側面は、標的配列以外にプライマーにより増幅された関連する配列読取り（偽遺伝子及び他の望ましくないＨＬＡ遺伝子）を排除する能力である。また、該ソフトウェアは、最初にゲノムＤＮＡから標的配列をＰＣＲ増幅したときの誤り、エマルジョンＰＣＲにおける誤り、又はパイロシークエンシングの誤りにより生じた非常に少数の読取りを排除できる。パイロシークエンシングの誤りの十分に裏付けられたカテゴリーは、ホモポリマー管（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｒａｃｔ）の長さの決定におけるものである。例えば、殆どの配列読取りが正しいＧの繰り返しを含む中、１回しか繰り返さないＧを含む僅かな配列読取りを見出した。
【００６６】
単発のＧＳＦＬＸ操作のコストは考慮されるべきである。このシステムによる高精度の臨床ＨＬＡタイピングの費用効率を良好にするために、単発の操作で、複数の試料を複数の遺伝子座について解析する。ＭＩＤタグ及びピコタイタープレートの複数の領域の使用により、これらの実施例で記載されるように、８つの遺伝子座において２４又は４８個の試料を解析することを可能とする。
【００６７】
この複数の遺伝子座における複数の個体の複数の解析により、大量の配列読み取りを並行して生成することが可能となる。また、少数変異の配列を検出することも可能である。２つの異なるゲノムＤＮＡ試料由来のＰＣＲ産物の混合物において、１／１００の頻度で存在するＨＬＡエキソン配列が確実に検出される。関連しているが望まれない配列、及び誤りを含む少数の配列も、排除される（殆どのＨＬＡ対立遺伝子は複数の多形により互いに異なっているが、誤りを含む配列は、典型的には、正しい配列とヌクレオチドが１つだけ異なっている）。
【００６８】
上記発明は、理解を明確にする目的で、例証及び実施例により、幾分詳細に記載されているが、本発明の教示を踏まえて、当業者が、添付した請求項の精神及び範囲から逸脱すること無く、それらにある程度の変化及び改変を行い得ることは明白である。
【００６９】
本明細書中に引用されている全ての文献、特許、受入番号、及び特許出願は、各個別の文献又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により援用されることが示唆されているかのように、本明細書中に参照により援用される。
【００７０】
【表１−１】
2011500041.tif 000003
【００７１】
【表１−２】
2011500041.tif 000004
【００７２】
【表１−３】
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【００７３】
【表１−４】
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【００７４】
【表１−５】
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【００７５】
【表１−６】
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【００７６】
【表１−７】
2011500041.tif 000009
【００７７】
【表１−８】
2011500041.tif 000010
【００７８】
【表１−９】
2011500041.tif 000011
【００７９】
【表１−１０】
2011500041.tif 000012
【００８０】
【表１−１１】
2011500041.tif 000013
【００８１】
【表１−１２】
2011500041.tif 000014
【００８２】
【表１−１３】
2011500041.tif 000015
【００８３】
【表１−１４】
2011500041.tif 000016
【００８４】
【表１−１５】
2011500041.tif 000017
【００８５】
【表１−１６】
2011500041.tif 000018
【００８６】
【表１−１７】
2011500041.tif 000019
【００８７】
【表２】
2011500041.tif 000020
【図１】
2011500041.tif 000021
【図２】
2011500041.tif 000022
【図３】
2011500041.tif 000023
【配列表】
2011500041000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月8日(2009.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
キメラ混合物の解析（少数変異検出）
典型的なＧＳＦＬＸ操作において生じる大量の配列読取り（ｎ＝３００〜３５０Ｋ）は、試料中に存在する少数の変異の配列の検出を可能とする。そのような配列を検出する感度を推定するために、２個のＨＬＡホモ接合体由来の、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂのエキソン２及び３、並びにＤＲＢ１のエキソン２のＰＣＲ産物の様々な割合（１／１、１／１０、１／１００、１／１０００）での混合物を調製した。１／１００の混合物中に存在する少数変異を、良好な再現性をもって検出することができた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の個体のＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定する方法であり：
（ａ）各個体において、多形性部位を含む前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのエキソンを増幅することにより、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を取得し、ここで、各増幅反応は、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを用いて実行され、ここで：
（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列を含み、該ＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列の長さが１５〜４０ヌクレオチドであり、所望のＨＬＡ遺伝子エキソンの配列と正確に、又は実質的に相補的であり；そして
（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列を含み、該ＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列の長さが１５〜４０ヌクレオチドであり、所望のＨＬＡ遺伝子エキソンの配列と正確に、又は実質的に相補的であり；
（ｂ）複数の個体由来のＨＬＡ単位複製配列をプールし、そしてエマルジョンＰＣＲを実行し；
（ｃ）パイロシークエンシングを用いて、各個体のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌ単位複製配列を並行して決定し；続いて
（ｄ）該ＨＬＡ単位複製配列と既知のＨＬＡ配列を比較して、各個体に対してＨＬＡ対立遺伝子を割り当てることにより該個体中にいずれのＨＬＡ対立遺伝子が存在しているかを決定；
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための順プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ結合領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための逆プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ結合領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記逆プライマーが、表１に示されるプライマー配列を有する、請求項４の方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための順プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有し；かつ、前記ＨＬＡ単位複製配列を取得するための逆プライマーが、表１に示されるプライマーのＨＬＡハイブリダイゼーション領域の配列を有する、請求項１の方法。
【請求項７】
前記順プライマーが表１に示されるプライマーのアダプター領域を有し；かつ、前記逆プライマーが表１に示されるプライマーのアダプター領域を有する、請求項６の方法。
【請求項８】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの個別識別タグ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｇ）を有し、かつ、前記逆プライマーが、表１に示されるプライマーの個別識別タグを有する、請求項１の方法。
【請求項９】
前記エマルジョンＰＣＲが非対称的に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１つの順プライマーと１つの逆プライマーを含む少なくとも１つのプライマーペアが、増幅された配列からＨＬＡ遺伝子型を明確に決定するのに十分な特異性をもって、関連するＨＬＡ遺伝子の高度に類似する領域を増幅する用に設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数の個体におけるＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡｌ、及びＤＰＢｌのＨＬＡ遺伝子型を並行して決定するためのＨＬＡ単位複製配列を取得するためのプライマーのペアを含むキットであり、ここで、該プライマーのペアが、ＨＬＡ遺伝子エキソンを増幅するための順プライマー及び逆プライマーを含み、ここで：（ｉ）該順プライマーは、５’から３’’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡハイブリダイゼーション配列を含み、該ＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列の長さが１５〜４０ヌクレオチドであり、所望のＨＬＡ遺伝子エキソンの配列と正確に、又は実質的に相補的であり；（ｉｉ）該逆プライマーは、５’から３’にかけて以下の配列：アダプター配列、分子同定配列、及びＨＬＡハイブリダイゼーション配列を含み、該ＨＬＡ−ハイブリダイゼーション配列の長さが１５〜４０ヌクレオチドであり、所望のＨＬＡ遺伝子エキソンの配列と正確に、又は実質的に相補的である、前記キット。
【請求項１２】
前記プライマーのペアが、表１に示される順プライマー及び逆プライマーを含む、請求項１１のキット。
【請求項１３】
１つ以上のプライマーのペアを含むキットであり、各プライマーのペアが、表１に示されるプライマーのＨＬＡ−結合領域の配列を有するＨＬＡ単位複製領域を取得するための順プライマーを含み；そして表１に示されるプライマーのＨＬＡ−結合領域の配列を有する該ＨＬＡ単位複製領域を取得するための逆プライマーを含む、前記キット。
【請求項１４】
前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有し、そして前記順プライマーが、表１に示されるプライマーの配列を有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
１５個のプライマーのペアを含み、該プライマーのペアが、ＨＬＡ−Ａのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｂのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＨＬＡ−Ｃのエキソン２、エキソン３、及びエキソン４を増幅し；ＤＲＢ１のエキソン２を増幅し；ＤＰＢ１のエキソン２を増幅し、ＤＰＡ１のエキソン２を増幅し、ＤＱＡ１のエキソン２を増幅し；そしてＤＱＢ１のエキソン２及びエキソン３を増幅する、請求項１３に記載のキット。
【国際調査報告】
2011500041.tif 000024
2011500041.tif 000025
2011500041.tif 000026