(57)【要約】本発明は、予防上または治療上の抗腫瘍ワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は、特にナチュラルキラー (NK) 細胞を活性化するこれらの能力を介して、MHC-Iネガティブ表現型を有している生きた動物の腫瘍細胞に、係るMHC-Iネガティブの細胞を産生するための方法に、および抗腫瘍因子としてのこれらの治療上の使用に関する。さらに、本発明は、例えば、特定の培養条件の使用により及び／又はMHC-I発現のレベルに直接的に又は間接的に影響する外因性の因子の使用により、動物の腫瘍細胞におけるMHC-I分子の発現のレベルを変調させるための方法に関する。また、本発明は、活性化 NK 細胞、これらの抗腫瘍因子としての治療上の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬またはワクチンとしてMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている動物の腫瘍細胞。
【請求項２】
請求項1に記載の腫瘍細胞であって、前記腫瘍細胞(T)の40%を超える細胞がインビトロでシンジェニックな非活性化NK 細胞(E)の存在下で4 時間後に5:1のE:T 比で溶解される腫瘍細胞。
【請求項３】
ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示している単離された又は培養物に存在する生きている動物の腫瘍細胞。
【請求項４】
請求項3に記載の腫瘍細胞であって、適切な培養条件下で以下の事項を減少させる能力がある外因性起源の因子を含んでいる腫瘍細胞：
内因性のERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量;および、任意で、
細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量。
【請求項５】
請求項4に記載の腫瘍細胞であって、適切な培養条件下で細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させる能力がある外因性起源の第二の因子を含んでいる腫瘍細胞。
【請求項６】
請求項3〜5の何れか一項に記載の腫瘍細胞であって、以下の事項を有している腫瘍細胞：
前記細胞に存在するERK5 タンパク質の発現レベル又は量において、同一の培養条件下で前記外因性の因子の非存在下でのERK5 タンパク質の発現のレベルまたはERK5 タンパク質の量と比較して、25%〜90%の減少;および
細胞表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量において、同一の培養条件下で前記外因性の因子の非存在下での細胞表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量と比較して、50%〜100%の減少。
【請求項７】
請求項3〜6の何れか一項に記載の腫瘍細胞であって、前記ERK5ネガティブ表現型が少なくとも部分的に転写後の機構により生じる腫瘍細胞。
【請求項８】
請求項7に記載の腫瘍細胞であって、配列番号 2の配列で表わされるヒト ERK5 タンパク質をコード化している遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列の部分と少なくとも 85%の相同性の程度を有している15〜25ヌクレオチド残基の配列を含んでいる外因性起源の核酸分子又はその動物の均等物の一つを含む腫瘍細胞。
【請求項９】
請求項8に記載の腫瘍細胞であって、前記の外因性起源の核酸分子は以下の分子である腫瘍細胞:
miRNA, siRNA, アンチセンスRNA, センス RNAまたはリボザイム型の分子;または
前記細胞において活性であるプロモーターの制御下で、転写によりshRNA, アンチセンスRNA, センス RNA, miRNA, siRNAまたはリボザイム 型のRNAの分子を生じる配列を含んでいるDNAの分子。
【請求項１０】
前記転写後の機構がRNA干渉機構である、請求項9に記載の腫瘍細胞。
【請求項１１】
請求項10に記載の腫瘍細胞であって、前記外因性起源の核酸分子は、前記細胞中で活性であるプロモーターの制御下に配列番号 3, 4または5の配列の一つを含んでいるDNAの分子を含み、その転写によりshRNA 分子を生じる腫瘍細胞。
【請求項１２】
請求項9〜11の何れか一項に記載の腫瘍細胞であって、前記外因性起源の核酸の分子は、レンチウイルス, レトロウイルス, アデノウイルスまたはアデノ関連ベクターの手段により又はナノ粒子の手段により細胞に導入される腫瘍細胞。
【請求項１３】
腫瘍を患う患者から抽出され、前記外因性起源の因子を添加することによって修飾され、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示するため十分な培養条件および期間で維持された初代腫瘍細胞である、請求項3〜12の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項１４】
請求項1〜13の何れか一項に記載の腫瘍細胞であって、前記腫瘍細胞がヒト細胞である腫瘍細胞。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞がリンパ球, 白血球, 乳房または前立腺の癌細胞または転移性細胞である、請求項1〜14の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項１６】
医薬またはワクチンとしての請求項3〜15の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項１７】
ヒトまたは動物の患者の癌または転移の発生の予防または治療のための医薬またはワクチンとしての請求項1, 2または16の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞は前記患者から抽出され、修飾されてMHC-Iネガティブ表現型を提示する請求項1, 2, 16または17に記載の腫瘍細胞。
【請求項１９】
請求項18に記載の腫瘍細胞であって、さらに修飾されてERK5ネガティブ表現型を提示する腫瘍細胞。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞は細胞株から由来するアロジェニックな細胞である、請求項1, 2, 16または17に記載の腫瘍細胞。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞は患者が患う癌の原因であるものと同じ型の腫瘍細胞である、請求項1, 2,または16 〜20の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項２２】
前記腫瘍細胞は患者が患う癌の原因であるものと異なる型の腫瘍細胞である、請求項1, 2,または16 〜20の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項２３】
前記癌が白血病, リンパ腫, 骨髄腫, 乳癌または前立腺癌である、請求項17〜22の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞がBまたはTリンパ球である、請求項23に記載の腫瘍細胞。
【請求項２５】
前記ワクチンまたは医薬はアロジェニックな骨髄または血球の移植物と組み合わせて投与される、請求項1, 2,または16 〜24の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項２６】
前記ワクチンまたは医薬は別の抗癌治療と組み合わせて投与される、請求項1, 2,または16 〜24の何れか一項に記載の生きている腫瘍細胞。
【請求項２７】
前記ワクチンまたは医薬は活性化されたNK 細胞の投与と組み合わせて投与される、請求項1, 2,または16 〜24の何れか一項に記載の生きている腫瘍細胞。
【請求項２８】
前記ワクチンまたは医薬は局所的に患者の内因性の腫瘍細胞の近傍に、前記癌を患う患者の器官に又はその近傍に、又は血液系に投与される、請求項1, 2,または16 〜27の何れか一項に記載の生きている腫瘍細胞。
【請求項２９】
請求項3 〜28の何れか一項に記載の生きている腫瘍細胞から得られた腫瘍細胞株。
【請求項３０】
生きている動物の腫瘍細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を変調するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、以下を含む方法：
c)  単離された又は培養された動物の腫瘍細胞を培養することであって、
(iii)  呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地において、または
(iv)  発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援する培地において;
前記腫瘍細胞の表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量が変調されることを許容するため十分な期間で培養すること、および
d)  前記腫瘍細胞を回収すること。
【請求項３１】
請求項30に記載の方法であって、前記期間は2日および6月の間を含む方法。
【請求項３２】
請求項30または31に記載の方法であって、前記培地は、グルコースまたはミトコンドリアのインヒビターなどの一または二以上の呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する化合物であって、前記一または二以上の化合物は、前記細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を減少させるため十分な量で存在する方法。
【請求項３３】
請求項32に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は、前記一または二以上の化合物の非存在下でのそれらの発現の全体レベルまたはそれらの全体量と比較して、それらの表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量の50%から100%の減少を提示する際に回収される。
【請求項３４】
請求項33に記載の方法であって、前記培地は、グルコースを10〜100 mMの範囲の濃度で含む方法。
【請求項３５】
請求項30または31に記載の方法であって、前記培地は、グルタミンまたはピルビン酸をガラクトースと共に,またはジクロロ酢酸(DCA)などの一または二以上の発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援する化合物であって、前記一または二以上の化合物は、前記細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を増加させるため十分な量で存在する方法。
【請求項３６】
請求項35記載の方法であって、前記培地は、以下のものを含む方法：
グルタミンを濃度 1 〜 10 mMの範囲およびガラクトースを濃度 1 〜 25 mMの範囲;または
ピルビン酸（pyruvate）を濃度 1 〜 50 mMの範囲およびリンゴ酸（malate）を濃度 1 〜 50 mMの範囲;または
ジクロロ酢酸を濃度 1 〜 100 mMの範囲。
【請求項３７】
請求項32〜34の何れか一項に記載の方法であって、さらに以下の工程を含む方法：
(iii)  前記細胞に、適切な培養条件下で前記細胞における内因性のERK5タンパク質の発現のレベルまたは量を減少させる能力があり、任意で前記細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を減少させる能力もある外因性の因子を導入すること;および
(iv)  前記腫瘍細胞を、前記細胞にERK5ネガティブ表現型に加えてMHC-Iネガティブ表現型を提示させるため十分である条件および期間で培養すること。
【請求項３８】
請求項30〜37の何れか一項に記載の方法によって得ることができる生きている腫瘍細胞。
【請求項３９】
ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示している動物の腫瘍細胞を得るためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、以下を含む方法：
a)  単離された又は培養された動物の腫瘍細胞に、適切な培養条件下で内因性のERK5 タンパク質の発現レベル又は量と、できるかぎり（possibly）前記細胞の表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量も減少させる能力がある第一の外因性の因子を導入すること;
b)  前記腫瘍細胞を、前記細胞にERK5ネガティブおよびMHC-Iネガティブ表現型を提示させるため十分である条件および期間で培養すること,
c)  前記細胞を回収すること。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法であって、工程 a)がさらに前記腫瘍細胞に適切な培養条件下で膜レベルでMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させる能力がある外因性起源の第二の因子を導入することを含む方法。
【請求項４１】
請求項39または40に記載の方法であって、前記細胞は、前記細胞が以下を提示する際に回収される方法:
前記細胞に存在するERK5 タンパク質の発現レベル又は量において、同一の培養条件下で前記第一の外因性の因子の非存在下でのERK5 タンパク質の発現のレベルまたはERK5 タンパク質の量と比較して、25%〜90%の減少;および
細胞表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量において、同一の培養条件下で前記第一の又は第二の外因性の因子の非存在下での細胞表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量と比較して、50%〜100%の減少。
【請求項４２】
請求項30〜41の何れか一項に記載の方法であって、前記の工程 a)で言及される腫瘍細胞は、癌を患う患者から由来する初代細胞（primary cell）である方法。
【請求項４３】
請求項30〜41の何れか一項に記載の方法であって、前記の工程 a)で言及される腫瘍細胞は、腫瘍細胞株から由来する細胞である方法。
【請求項４４】
活性化されたNK細胞を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、以下を含む方法：
(i)  インビトロまたはエクスビボで生きているNK 細胞を、NK 細胞の活性化を誘導する十分な条件および期間でMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている腫瘍細胞と接触させることと;
(ii)  前記の活性化したNK 細胞を回収すること。
【請求項４５】
請求項44に記載の方法であって、前記生きている腫瘍細胞は、ERK5ネガティブ表現型も提示する方法。
【請求項４６】
請求項44または45に記載の方法であって、前記の工程 i)で言及されるNK 細胞は、癌を患う被験者または健常ドナーから得られた初代のNK 細胞である方法。
【請求項４７】
請求項44または45に記載の方法であって、前記の工程 i)で言及されるNK 細胞は、NK 細胞株から又は生物学的材料バンク、特に臍帯血移植バンク, 組織バンクまたは血液バンクから由来する方法。
【請求項４８】
請求項44〜47の何れか一項に記載の方法であって、前記NK細胞がヒトの細胞又はヒト化した細胞である方法。
【請求項４９】
請求項44〜48の何れか一項に記載の方法であって、前記のMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている腫瘍細胞は、請求項32〜34または37の何れか一項に記載の方法によりえられる細胞である方法。
【請求項５０】
請求項44〜49の何れか一項に記載の方法を行うことで得られる活性化したNK 細胞。
【請求項５１】
医薬またはワクチンとしての請求項50に記載の活性化したNK 細胞。
【請求項５２】
癌の予防または治療のための医薬またはワクチンとしての請求項51に記載の活性化したNK 細胞。
【請求項５３】
請求項52に記載の活性化したNK 細胞であって、前記医薬またはワクチンは、請求項1〜28の何れか一項に記載の腫瘍細胞も含むNK 細胞。
【請求項５４】
患者における癌の予防または治療の医薬または生きている細胞ワクチンの製造のための、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を有するヒトまたは動物の腫瘍細胞を賦与する能力のある因子の使用。
【請求項５５】
請求項54に記載の使用であって、前記因子が以下の能力がある使用。
前記腫瘍細胞のERK5 タンパク質の発現レベル又は量を、同一の培養条件下で前記因子の非存在下でのERK5 タンパク質の発現のレベルまたはERK5 タンパク質の量と比較して、25%〜90%まで減少させること;および
前記腫瘍細胞の表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を、同一の培養条件下で前記因子の非存在下でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは量と比較して、50%〜100%まで減少させること。
【請求項５６】
請求項54または55に記載の使用であって、前記因子は、配列番号 2の配列で表わされるヒト ERK5 タンパク質をコード化している遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列の部分と少なくとも 85%の相同性の程度を有している15〜25ヌクレオチド残基の配列を含んでいる核酸の分子を含む使用。
【請求項５７】
請求項56に記載の使用であって、前記核酸分子が以下のものである使用:
アンチセンスRNA, センスRNA, miRNA, siRNAまたはリボザイム型の分子;または
前記細胞において活性であるプロモーターの制御下で、転写によりshRNA, アンチセンスRNA, センス RNA, miRNA, siRNAまたはリボザイム 型のRNA分子を生じる配列を含んでいるDNAの分子。
【請求項５８】
請求項57に記載の使用であって、前記核酸分子は、細胞中で活性であるプロモーターの制御下に配列番号 3, 4または5の配列の一つを含んでいるDNA分子を含み、転写によりshRNA 分子を生じる使用。
【請求項５９】
請求項56, 57または58に記載の使用であって、前記因子は、プラスミドまたはウイルス性のベクターである使用。
【請求項６０】
請求項59に記載の使用であって、前記ウイルス性のベクターは、レンチウイルス, レトロウイルスまたはアデノウイルスのベクターである使用。
【請求項６１】
請求項1〜28の何れか一項に記載の細胞または請求項29に記載の細胞株からの細胞、同様に、薬学的に許容されるビヒクルを含んでいる治療の組成物またはワクチン。
【請求項６２】
請求項61に記載の治療の組成物またはワクチンであって、さらに治療上の抗腫瘍分子を含んでいる治療の組成物またはワクチン。
【請求項６３】
請求項61または62に記載の治療の組成物またはワクチンであって、さらに活性化したNK 細胞を含んでいる治療の組成物またはワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
本発明は、予防上または治療上の抗腫瘍ワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は、特にナチュラルキラー (NK) 細胞を活性化するこれらの能力を介して、陰性（negative）のMHC-I表現型を有している生きた動物の腫瘍細胞に、係るMHC-Iが陰性の細胞を産生するための方法に、および抗腫瘍因子としてのこれらの治療上の使用に関する。さらに、本発明は、例えば、特定の培養条件の使用により及び／又はMHC-I発現のレベルに直接的に又は間接的に影響する外因性の因子の使用により、動物の腫瘍細胞におけるMHC-I分子の発現のレベルを変調（modulating）させるための方法に関する。また、本発明は、活性化 NK 細胞、これらの抗腫瘍因子としての治療上の使用に関する。
【０００２】
最近の観察によって、癌を臨床レベルで治癒（curing）させる能力のある効果的な免疫応答の存在に関する疑問が多少解決された。しかしながら、腫瘍抗原（tumoral antigens）または腫瘍関連抗原(TAA；  tumor-associated antigens)は、よくても弱く免疫原性であることが証明されている。腫瘍細胞に基づくワクチンは、ペプチドまたはcDNAでの免疫化の代替として興味深いものである。現在、それらには、一般にアポトーシス細胞または細胞抽出物が含まれる。実際、幾つかの第一臨床試験では、放射線照射した自己の腫瘍細胞を使用して、抗腫瘍の免疫応答をブーストした(1)。しかしながら、アポトーシスの細胞または細胞抽出物は、強く免疫原性であることは証明されていなく、腫瘍細胞に対する免疫系の活性化が失われる。生きている細胞は、死にかかっている細胞（dying cells）よりも良い免疫原であるはずだが、係る腫瘍細胞は高度に活性化されるはずの宿主免疫系により急速に効率的に排除されなければならないことから、腫瘍の免疫化が誘導される。現在の努力は、主に樹状細胞(DC)などのエフェクター細胞の遺伝子工学的な開発に向けられる。別の可能性（しかし、詳細に探索されていない）は、腫瘍細胞を変化させてそれらに高度な免疫原性を与えることからなる。一例は、満足な免疫応答を誘導するためアポトーシスを経験している腫瘍細胞の数を増加させることであろう。キナーゼ  ERK5（extracellular-regulated kinase 5）またはMAPK7（mitogen-activated protein kinase 7）(2, 3)は、正常および白血病性のＴ細胞に存在し(4)、TEY (Thr-Glu-Tyr) 活性化モチーフを他のERKキナーゼと共有している。そのキナーゼの別の構造上の特徴は、ユニークであり、例えば、核  ―  細胞質のシャットリング（shuttling）を制御する調節性の大きなＣ末端である(5)。ERK5は、ErbB (6), Ras (7), 血清 (8), IGF-II (9), Bcr-Abl (10) および IL-6 (11)に依存的な生存および増殖のシグナル伝達を媒介する。様々なグループが、腫瘍細胞におけるERK5 カスケードの関与を記載している。例として、ERK5は、乳癌細胞の増殖に明らかに役割を担っていることが示されている(6, 8)。ERK5を活性化するMEK5 キナーゼの過剰発現およびヒトの前立腺癌における予後の不良を導く骨性の転移の発生の間の関連性が確立されている（12）。また、ERK5は、乳癌細胞の化学療法抵抗性（chemoresistance）に必要とされ（13）、肺癌細胞における細胞生存を媒介する(9)。また、ERK5は、骨髄腫の細胞に発現し、ERK5の阻害により、増殖がブロックされ、デキサメサゾンで誘導されるアポトーシスが促進される（11）。また、ERK5発現は、Bcr/Ablを発現している白血病性細胞の生存に必須である（10）。さらにまた、全てのホジキンリンパ腫細胞は、構成的に活性なERK5経路を発現する（14）。最後に、miRNAs(またはミクロ RNAまたはmiR)-143 および -145の発現（結腸癌細胞における及び異なる腫瘍細胞株において発現のレベルが減少することが示された）は、多くの悪性の B リンパ球〔慢性リンパ球系白血病細胞(CLL), Ｂ型リンパ腫, ＥＢウイルス (EBV)で形質転換されたB リンパ球株および バーキットリンパ腫細胞株を含む〕において減少する。CLLの13 患者およびＢ型リンパ腫の9患者のうち8患者からの試験した全てのサンプルは、miR-143 および -145の非常に低いレベルの発現を示した。miR-143 および -145の発現のレベルは、バーキットリンパ腫の���ト細胞株中でも低く、ＥＢウイルス (EBV)で形質転換されたＢリンパ球細胞株の細胞の増殖とは逆に関連する。さらに、前駆体の又は成熟したmiR-143のRaji細胞への導入によって、成長の有意な用量依存的な阻害が導かれる。また、ERK5は、miR-143の標的の一つであることが同定されており、ヒト結腸癌細胞で得られた結果を確認している(35)。
【０００３】
インビボでのERK5またはMEK5遺伝子の無効化によって、胚性の血管形成および心臓の発生の双方が影響され、11.5日までに胚致死（embryonic lethality）が導かれる(15-17)。内皮細胞におけるERK5の機能の重要性は、成体マウスにおけるERK5のターゲティングによる欠失により確認され（血管の統合性を擾乱させる）、内皮の不全を生じ死に至る（18）。また、ERK5は、腫瘍関連の新生血管形成に必要とされる。Mx1-Cre 導入遺伝子を保持しているERK5 flox/flox マウスにおいて、宿主のERK5 遺伝子の欠失は、腫瘍の異種移植片の容積を減少させ、血管密度（vascular density）の有意な減少が導かれる（19）。このようにERK5は、細胞内の腫瘍原性シグナル（oncogenic signals）の伝達、腫瘍関連の血管形成および、幾つかのケースにおいて、浸潤/転移などの腫瘍形成と関連する幾つかの処理において中心的役割を担う。興味深いことに、ERK5-/- MEF細胞は、基礎的な条件（basal conditions）のもとでアポトーシスを経験し、ERK5+/- MEFsはソルビトール誘導性アポトーシスで感作されることから、ERK5レベルの小さな減少が有意な効果を有することが示唆されている(20);  この事項は発明者により観察された（21）。
【０００４】
これらの観察は、ERK5が発癌に重要な役割を担うことを示唆しているが、その機構は十分に調べられていない。発明者により得られた最近の結果（21）は、ERK5がヒトおよびマウスの白血病Ｔ細胞において抗アポトーシス転写制御因子NF-κBの活性化を媒介することを示す。スモールヘアピン RNA (shERK5)「shERK5」によるERK5 ノックダウンによって、細胞生存度が減少し、細胞はデスレセプター誘導性のアポトーシスに感作される。また、発明者は、彼等の以前の研究において、shERK5 を発現しているマウスリンパ球から由来するEL4 Ｔリンパ球系統の細胞(EL4-shERK5 細胞)がインビトロで増殖するが、インビボでマウスに皮下腫瘍を誘導することに失敗することを示した。これらのデータは、ERK5がヒト および マウスの 白血病性の T リンパ球の生存に必須であることを示唆し、このタイプの悪性疾患における治療上の介入の有望な標的を示す。
【０００５】
免疫系は、骨髄（特に、B, T および NK リンパ球, 樹状細胞, Langherhans細胞, 単球, マクロファージ, 好中球, マスト細胞, 好塩基球 および 好酸球）において産生される細胞を使用する統合的なシステムの複合体である。即時型で抗原特異的ではないとの主な特徴を有する「先天性（innate）」または「自然（natural）」の免疫応答および遅延型で抗原特異的との主な特徴を有する「適応性（adaptive）」または「後天性（acquired）」の応答の間を区別できる。また、適応性の応答は、先天性の応答とは対照的に、同じ抗原での二次的な攻撃(二次応答)に対する反応を惹起するとの特徴を有し、一次応答よりも効果的で急速である。
【０００６】
先天性の抗腫瘍免疫に重要な役割を担うナチュラルキラー (NK) 細胞は、異常に振る舞う細胞（例えば、腫瘍細胞）を自発的に殺すが、健常細胞は回避される。特に、NK 細胞は、主要組織適合複合体 クラス I (MHC-I)の発現のレベルをダウンレギュレートすることにより細胞傷害性 T リンパ球 (CTL)の制御を回避した腫瘍細胞を殺す。NK細胞の活性化または阻害は、レセプターを阻害すること又はレセプターを活性化することの何れかから派生する統合シグナルにより細かく調整される。全てのこれらのシグナルは、パーフォリンおよびグランザイムを放出する又はデスレセプターリガンド（アポトーシスによる標的細胞の死をもたらす）を発現するNK細胞の溶解活性を制御する。インヒビター又は「KIR」レセプターは、MHC クラス I 分子に特異的である。インビトロで、NK 細胞は、腫瘍細胞（好ましくは、適切な MHC-I 発現を欠いているもの）の接種により局所的にリクルートできる（22）。それら細胞の多能性によって、それら細胞は癌の臨床アプローチに利用される魅力的な標的となる（23, 24）。NK細胞は、NK 細胞が末梢血 および 脾臓に豊富に存在することから、血液起源の癌（例えば、白血病 および リンパ腫）に特に有利であろう。さらに、新しいデータは、ＮＫ細胞に基づく免疫療法が幹細胞移植(SCT)と組み合わせて使用されえることを示唆する。パイロット臨床試験は、ドナー由来のNK細胞の養子移入（adoptive transfer）によりハプロタイプの一致するSCTにつづく急性骨髄性白血病 (「AML」)の患者における移植が強化（consolidates）されることを示した（25, 26）。
【０００７】
大抵の腫瘍細胞は、腫瘍形成の最初の段階の間に好気性の解糖(呼吸)からより嫌気性様（anaerobic-like）の解糖(発酵)に変化することから、彼らは低い酸化的リン酸化(OXPHOS)を行う。この変化は、特異的な遺伝子発現が関与するWarburg効果37として知られている38。この段階で、腫瘍細胞は宿主免疫系からの攻撃を回避しなければならず、最も広範囲の機構は主要組織適合複合体 I (MHC-I; 40)の形質膜発現のダウンレギュレーションである。発明者は、本出願で双方の現象がリンクすることを示した：  すなわち、呼吸を行うよう強制された発酵性に成長している腫瘍細胞はMHC-Iの発現をアップレギュレートし、その逆もまた同じく、OXPHOS培地中での腫瘍細胞の成長は発酵状態に変化した際にMHC-I 発現を減少させる。呼吸を行っている腫瘍細胞はクラス I 分子の重鎖および軽鎖の有意に高いmRNAレベルを示すことから、呼吸はMHC-I 発現を転写レベルで誘導する。MAPK ERK5の発現（MHC-I 遺伝子のプロモーターを活性化する41）は、OXPHOS条件でアップレギュレートされ、ミトコンドリアに蓄積する。このプロセスは、腫瘍細胞の生存およびOXPHOS条件下でのMHC-I 発現に必須である。発明者により得られた結果は、腫瘍細胞の代謝の変化がERK5 発現を変調させ、MHC-I 発現の修飾を導くことを示す。また、発明者は、OXPHOS条件下での腫瘍細胞成長において、大抵のERK5がミトコンドリア分画で単離されたこと及び呼吸を強制的に行わせた際にshERK5 細胞の細胞死が有意に増加したことを示し、呼吸におけるERK5の役割を示唆している。要約すると、呼吸から発酵への変化は、腫瘍細胞にそれらのMHC-Iをダウンレギュレートする可能性を提供し、選択的な有利性（免疫応答の逃避）を与える。
【０００８】
今回、発明者は、一方で特定の培養条件下でインビトロまたはエクスビボで修飾されERK5ネガティブ表現型を提示する腫瘍細胞がMHC-Iネガティブ表現型も有するとの事実、他方でMHC-Iネガティブ表現型（および好ましくはERK5ネガティブ表現型）を提示している腫瘍細胞が生きた抗腫瘍ワクチンとして使用されえるとの事実を示した。彼等は、実際にERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示している腫瘍細胞をマウスに投与することによって、修飾された腫瘍細胞に対抗するのみならず、MHC-Iポジティブ表現型の「内因性（endogenous）」の腫瘍細胞にも対抗するNK細胞が関与する先天性の免疫応答を誘導することを示した。
【０００９】
この事項は、NK 細胞は、投与された腫瘍細胞により一旦活性化されると、活性化レセプター（例えば、CD94/NKG2C, NKG2D, KIR2DS）の活性化により、MHC-Iポジティブ腫瘍細胞を溶解させる能力があるとの事実により説明できる。「内因性」の腫瘍細胞により発現された抗原MIC-A, MIC-B (ストレスおよび直接的に活性化レセプターNKG2Dと相互作用することにより誘導された二つのMHC-I関連分子)およびhsp70(「wt」または「野生型」)は活性化NK細胞により認識され、腫瘍細胞がMHC-Iポジティブ表現型を有するとの事実にもかかわらず、腫瘍細胞の溶解が惹起される状態にある。さらに、NK 細胞による癌細胞の溶解から由来する抗原の樹状細胞による提示が細胞傷害性 T リンパ球 (CTL)が関与している適応的免疫反応を活性化する可能性がある。
【００１０】
さらに、発明者は、マウスでERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を蓄積する腫瘍細胞を用いることによって、まさにMHC-Iネガティブ表現型を有している細胞を使用する抗腫瘍作用の有効性に利点が存在することを実証し（例 1, 表 1を参照されたい）、抗腫瘍効果がMHC-Iネガティブ表現型のみと関連するのではなく、ERK5ネガティブ表現型が追加の抗腫瘍効果を産生できることを示唆している。本出願に提示された結果は、特にインビトロまたはエクスビボで修飾されERK5ネガティブ表現型を提示する腫瘍細胞は、Fasの高レベルの発現および抗-アポトーシスの プロテインＣ-FLIPの低レベルの発現を有することを示す（図 12, 16, 17）。結果として、これらの細胞は、NK 細胞および細胞傷害性 T リンパ球などのFasLを発現している細胞の優れた標的である。さらに、c-FLIPの発現は、ERK5でその活性化が制御されることが示されているNF-κBにより制御される（21）。
【００１１】
最終的に、発明者は、ERK5ネガティブおよびMHC-Iネガティブの表現型を組み合わせている腫瘍細胞が生物体から急速に排除されたことを実証した(マウスに関して三日未満)。結果として、これらの細胞は、治療における使用に適合される。
【００１２】
特に、発明者は、修飾され干渉機構により細胞においてERK5 タンパク質の発現のレベルを減少することができる短いRNA「shERK5」を発現するEL4 腫瘍細胞によって、マウスにおいて誘導されえる免疫応答の促進に焦点を合わせた。修飾されERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を有する「弱毒化（attenuated）」癌細胞がマウスを白血病から防御する能力があることを彼等は示した。
【００１３】
また、発明者は、EL4-shERK5細胞が注射後の三日（換言すれば、適応応答を惹起するため必要な時間よりかなり前に）で排除されることを示した。発明者は、生得的な免疫系（特に、NK 細胞）がこの応答に関与すると仮定した。得られた結果はこの仮説を確認するものであり、主にこれらの細胞による主要組織適合複合体 クラス I (MHC-I)の発現のレベルの大きな減少およびデスレセプターへの感受性が増加することが原因で、NK 細胞がインビボでEL4-shERK5 細胞を効率的に排除することを示している。
【００１４】
発明者は、このような免疫系の活性化は、野生型(「wt」)細胞により生じた腫瘍に対する免疫応答を誘導できるだろうとの仮説を立てた。この仮説は、短期および長期の実験により確認された。M-MLV ウイルスで誘導されたリンパ腫から由来するYac-1 細胞と対照的に、EL4 細胞はC57BLマウスにおいて9,10-ジメチル-1,2-ベンゾアントラセンにより誘導されたリンパ腫から由来する。EL4-shERK5 細胞により誘導された免疫応答は、マウスをレトロウイルスにより誘発された白血病から保護した。さらに、EL4-shERK5 細胞は、MHC-Iの発現レベルが同様に非常に減少したYac-1 細胞よりも効率的にマウスを保護した。さらに、EL4-shERK5 細胞は、NF-κBの活性化が減少し、デスレセプターで誘導されるアポトーシスに高度に感受性となる（21）。この事項によって、これらの細胞がYac-1 細胞よりもNK 細胞のよりよい標的であり、効果的な抗腫瘍性の免疫応答を誘導することが説明される。この出願の関連において、末梢血および脾臓にNK 細胞が優先的に存在することから、NK 細胞は血液癌に対する抗腫瘍性の免疫応答に必須の役割を担う（23）。このようなことから、発明者は、白血病リンパ球に対する免疫応答を誘導する細胞を調製した。
【００１５】
彼等の試験において、発明者は、特にERK5ネガティブ表現型（negative ERK5 phenotype）およびMHC-Iネガティブ表現型（negative MHC-I phenotype）を有するように修飾された腫瘍細胞を用いることにより、マウスをワクチン接種し、レトロウイルスで誘導される白血病の発生から防御することは可能であったことを実証した。ウイルスから由来するペプチド, 中和抗体または抗原で感作された免疫細胞は、以前の研究で感染の直後に使用され、ウイルスの複製がブロックされ、白血病の発生が予防された（32-34）。本研究において、発明者によりマウスは、修飾されERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示し、特異的な抗原がロードされていないが、しかし、NK 細胞の標的を構成するよう修飾された腫瘍細胞でワクチン接種された。さらに、ワクチン接種プロトコールは、感染後二月で開始された。白血病を誘発するため、M-MuLV ウイルスは、出生後の最初の三日でマウスに感染しなければならない。このことによりウイルスに対する効果的な免疫応答の発生が予防されることが一般に考えられる。結果として、発明者が用いたプロトコールによって、疾患が最初の段階をとおして進行し、結果として、ウイルスに対する免疫応答の阻害はこれらのマウスで効果的であるべきである。EL4 細胞はM-MuLV ウイルスから由来するのではなく、このウイルスによりおそらく感染されないので、それら細胞はウイルスに対する免疫応答を誘導できるだろうことを確認することは可能ではない。さらに、ウイルス複製は、この段階で白血病を誘発するため必要とされない。結果として、shERK5を発現している細胞は、腫瘍に対する免疫応答を誘導するはずであり、ウイルス感染に役割はない。発明者により開発されたERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示するため修飾された腫瘍細胞は、種々の腫瘍に対する免疫応答を活性化する能力がある。本発明で提示される結果は、NK 細胞がワクチン接種プロセスの最初の段階に必須の役割を担うことを示す。最近の結果によって、適応性の免疫応答においてNK 細胞により担われる重要な役割が実証された。NK細胞の役割には、樹状細胞(DC)または直接的にNK 細胞にリンクした効果が関与するだろう。
【００１６】
本発明は、特にワクチンまたは医薬として治療に使用するためのMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている動物の腫瘍細胞に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、生きている動物の腫瘍細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を変調するためのインビトロまたはエクスビボの方法に関し、該方法は、以下を含む：  
a)  単離された又は培養された動物の腫瘍細胞を培養することであって、
(i)  呼吸代謝経路を犠牲（expense）にして発酵代謝経路を支援（favors）する培地において、または
(ii)  発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援する培地において;
前記腫瘍細胞の表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量が変調されることを許容するため十分な期間で培養すること、および
ｂ）前記腫瘍細胞を回収すること。
【００１８】
細胞が培養される期間は、好ましくは2日および6月の間（例えば、3 日〜4 月, 3 日〜1 月または3〜12 日）が含まれる。
【００１９】
発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援すること（または、その逆）は、例えば、放射性の 14Cでマークされた培地中の代謝性の基質（例えば、グルコース）を用いて証明できる。高レベルの14Cを含有しているCO2の回収は主に呼吸経路を使用する細胞を意味し、他方で高レベルの14Cを含有している乳酸の回収は主に発酵経路を使用する細胞を意味する。また、発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援することは、ノニルアクリジンオレンジ（NAO）またはミトトラッカーレッドを用いてFACsでミトコンドリア量を分析することで証明できる（特に、図 22を参照されたい）。高レベルの蛍光の検出は、主に呼吸経路を使用する細胞を意味する。
【００２０】
好適な態様において、前記培地は、一または二以上の呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する化合物であって、前記一または二以上の化合物は、前記細胞の表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を減少させるため十分な量で存在する化合物を含む。呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地は、例えば、グルコースなどの発酵性の基質, またはミトコンドリアインヒビター ロテノン, オリゴマイシン, アンチマイシンまたはカルボニルシアニドp-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)などの呼吸をブロックする化合物を含んでいる培地である。好適な態様において、腫瘍細胞は、前記一または二以上の化合物の非存在下でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはそれらの全体量と比較して、それら細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量の50%から100%の減少を提示する際に回収される。特定の態様において、培地は、グルコースを10〜100 mMの範囲の濃度（例えば、25 mMの濃度）で含む。
【００２１】
また、この態様による方法は、さらに以下の工程を含むことができる：
(i)  前記細胞に、適切な培養条件下で前記細胞における内因性のERK5タンパク質の発現のレベルまたは量を減少させる能力があり、任意で前記細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を減少させる能力がある外因性の因子を導入すること;および
(ii)  前記腫瘍細胞を、前記細胞にERK5ネガティブ表現型に加えてMHC-Iネガティブ表現型を提示させるため十分である条件および期間で培養すること。
【００２２】
ERK5レベルを減少させる能力のある適切な外因性因子の例には、以下にさらに詳細に記載される小さい有機分子, ペプチド, 細胞内（intracellular）の抗体および核酸が含まれる。
【００２３】
別の態様によると、前記培地は、一または二以上の発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援する化合物であって、前記一または二以上の化合物は、前記細胞の表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量を増加させるため十分な量で存在する化合物を含む。
【００２４】
発酵代謝経路を犠牲にして呼吸代謝経路を支援（favors）する培地は、例えば、グルタミンまたはピルビン酸をガラクトースと共に, またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ キナーゼ (PDK1) インヒビター〔例えば、ジクロロ酢酸(DCA)〕を含んでいる培地である。特定の態様において、腫瘍細胞は、前記一または二以上の化合物の非存在下でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量と比較した、それらの表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量の50%から100%の増加を呈する際に回収される。特定の態様において、培地は、以下のものを含む：
グルタミンを濃度 1 〜 10 mMの範囲およびガラクトースを濃度 1 〜 25 mMの範囲;または
ピルビン酸（pyruvate）を濃度 1 〜 50 mMの範囲およびリンゴ酸（malate）を濃度 1 〜 50 mMの範囲;または
ジクロロ酢酸を濃度 1 〜 100 mMの範囲。
【００２５】
このように得られたMHC-Iポジティブ表現型を提示している腫瘍細胞をインビトロで使用して、細胞傷害性 T リンパ球 (CTL)を活性化できる。また、これらの MHC-I ポジティブ腫瘍細胞を、CTL 応答を促進するための医薬またはワクチンとして使用できる。
【００２６】
また、本発明は、上記の方法により得ることができる生きている腫瘍細胞（特に、このように得られたMHCがネガティブな腫瘍細胞）に向けられる。
【００２７】
さらに、本発明は、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている動物の腫瘍細胞に関する。
【００２８】
特に、本発明は、一または二以上の外因性起源（exogenous origin）の因子を含む生きている動物の腫瘍細胞に関し、該因子は適切な培養条件下で:
○  配列番号 1で表わされるヒトのERK5 タンパク質又はその動物の均等物の一つなどの内因性のERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量;および
○  細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量;
を前記細胞がERK5ネガティブ表現型 および MHC-Iネガティブ表現型を有するように減少させる能力がある。
【００２９】
また、本発明は、一または二以上の外因性起源の因子を含むERK5ネガティブ表現型 および MHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている動物の腫瘍細胞に関し、該因子は適切な培養条件下で以下のものを減少させる能力がある:
○  内因性のERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量(例えば、ヒトの腫瘍細胞のケースにおいて配列番号 1で表わされるヒトのERK5 タンパク質又は動物の腫瘍細胞のケースにおいてその動物の均等物の一つ);および／または
○  細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量。
【００３０】
好ましくは、本発明の細胞は、単離された形態にある又は培養物に存在する。
【００３１】
「ERK5ネガティブ表現型を提示している細胞（cell presenting a negative ERK5 phenotype）」の用語は、細胞（特に、ミトコンドリア分画）に存在するERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量において、同一の培養条件下で外因性の因子の非存在下でのERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量と比較して、少なくとも 10%, 好ましくは 25%〜90%、例えば、 25%〜50%または50%〜75%の減少を有している細胞を意味する。特に好適な態様において、ERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量の減少は、100%と同等ではない。好ましくは、25% 〜50%の範囲, 45% 〜55%の範囲又は50% 〜75%の範囲である。好ましくは、所与のタイプの腫瘍細胞について、ERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量のパーセンテージの減少は、細胞が少なくとも 一, 好ましくは 二, 三 または六 月の期間培養で維持されえるものである。
【００３２】
本発明によると、腫瘍細胞は、前記腫瘍細胞が非活性化NK 細胞によることを含む、シンジェニック（syngenic）なNK 細胞(例えば、同じ個体からの又は密接に関連し、免疫学的に適合性の個体からの細胞)により溶解される能力がある場合に「MHC-Iネガティブ表現型を提示している（presenting a negative MHC-I phenotype）」と考えられる。従って、シンジェニックな非活性化NK 細胞（syngenic non activated NK cells）により溶解される能力は、腫瘍細胞がMHC-Iネガティブ表現型を有することの指標（indication）である。本発明の文脈において、少なくとも 40%, 好ましくは 少なくとも 50%の腫瘍細胞 (T)がインビトロでシンジェニックなNK 細胞(E)の存在下で4 時間後に5:1のE:T 比で溶解される場合、かかる腫瘍細胞はMHC-Iネガティブであると考えられる。
【００３３】
さらに、MHC-Iネガティブ表現型が細胞に外因性の因子を導入することにより誘導されるケースにおいて、細胞表面（即ち、細胞膜レベル）に提示されたMHC-I タンパク質の細胞膜レベルでの発現の全体レベル又は全体量において、同一の培養条件下で前記細胞が前記外因性の因子の非存在下での細胞表面の膜レベルで、MHC-I タンパク質の発現の全体レベル又はこれらの全体量と比較して、25% 〜100%, 好ましくは 50% 〜100%, より好ましくは 75% 〜95%、例えば、85% 〜95%の減少を有する場合に前記細胞は「MHC-Iネガティブ表現型を提示している」と考えられる。好ましくは、所与のタイプの腫瘍細胞について、MHC-I タンパク質の細胞膜レベルでの発現の全体レベルまたは全体量のパーセンテージの減少は、細胞が少なくとも 一, 好ましくは 二, 三 または六 月の期間培養で維持されえるものである。
【００３４】
「外因性起源の因子（agent of exogenous origin）」の用語は、天然状態で細胞に存在しない因子を意味する。
【００３５】
「内因性のERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量の減少（reduction in the level of expression or the quantity of endogenous ERK5 protein）」の用語は、細胞に存在するERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量において、外因性の因子の非存在下で同一の培養条件下で前記細胞におけるERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量と関連して、少なくとも 10%, 好ましくは 25%〜90%、例えば、25%〜50%または50%〜75%の減少を意味する。特に好適な態様において、ERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量の減少は、100%と同等（equal）ではない。好ましくは、25% 〜50%の範囲, 45% 〜55%の範囲又は50% 〜75%の範囲である。
【００３６】
「MHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたは全体量のパーセンテージの減少（reduction in the overall level of expression or the overall quantity of MHC-I proteins）」の用語は、主要組織適合複合体 クラス I (MHC-I)のタンパク質の部分（part）を形成している細胞の表面で発現された全てのタンパク質（膜タンパク質）の発現レベル又は量における、前記外因性の因子の非存在下で、同一の培養条件下で、細胞表面での主要組織適合複合体 クラス I (MHC-I)の発現レベル又はその量と比較して、25% 〜100%, 好ましくは 50% 〜100%, より好ましくは 75% 〜95%、例えば、85% 〜95%の減少を意味する。
【００３７】
本発明の細胞におけるERK5 タンパク質の発現レベル又は量は、当業者に周知の様々な技術（例えば、特異的なERK5 抗体のウエスタンブロット検出による技術）を用いて測定してもよい。
【００３８】
細胞表面に存在するMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量は、FACS（蛍光活性化セルソーティング）型 フローサイトメトリーなどの当業者に周知の様々な技術を用いてMHC-I タンパク質の特異的な標識した抗体を検出してもよい。
【００３９】
配列番号 1の配列で表わされるヒトのERK5 タンパク質の「動物の均等物（animal equivalents）」の用語は、配列番号 1の配列で表わされるヒトのERK5 タンパク質（図 8を参照されたい）と高い配列相同性または同一性および機能を有している様々な動物種（例えば、マウス, ラット, イヌ, ブタ, ネコまたは他の哺乳類）のタンパク質を意味し、例えば、ヒトのERK5 タンパク質の配列番号 1の配列と少なくとも 70%, 75%, 80%, 85%, 90% または95%の相同性または配列同一性を有しているタンパク質あるいはヒトのERK5 タンパク質をコードする遺伝子（ENTREZ Gene ID: 5598, HGNC: 6880, localization: 17p11.2）の配列と少なくとも 70%, 75%, 80%, 85%, 90% または95% 配列同一性または相同性を有している遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。それらは、特にヒト ERK5 タンパク質をコードしている遺伝子に関してオルソロガス（orthologous）な遺伝子（即ち、同じ祖先の遺伝子から種分化イベント後に進化してきた異なる生物体に存在する遺伝子）によりコードされたタンパク質であってもよい。
【００４０】
ERK5ネガティブ表現型および／またはMHC-Iネガティブを提示している細胞を産生できる適切な培養条件は、特に腫瘍細胞のタイプおよび使用された因子または複数の因子の関連で決定される。特に、マウスの TまたはBリンパ球においてERK5をターゲティングするshRNA型分子の発現ベクターからなる単一の因子を用いるケースにおいて、正常な培養条件下で少なくとも 二 月の期間が細胞がERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を有するため必要であることを発明者は確立した。好適な態様によると、腫瘍細胞は、呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地（例えば、10〜100 nMのグルコースを含む培地）で、細胞がMHC-Iネガティブ表現型を呈することを許容する十分な期間（例えば、3〜12 日）培養される。好ましくは、本発明の細胞は、ラット, マウス, イヌ, ブタ またはネコの細胞などの哺乳類細胞である。特に好適な態様において、ヒト細胞（human cell）またはヒト化細胞（humanized cell）である。
【００４１】
細胞におけるERK5 タンパク質の発現レベル又は量および細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量における減少は、例えば、100〜2500 Daの範囲の分子量を有している小さい有機分子, ペプチド, 細胞内の抗体（intracellular antibody）または核酸の分子などの様々な外因性の因子を用いて得られてもよい。本発明の好適な態様によると、単一の因子（例えば、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）を使用して、細胞におけるERK5 タンパク質の発現レベル又は量および細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量における減少が得られる。本発明の別の好適な態様によると、二または三以上の因子の組み合わせを使用して、この減少が得られてもよい。特定の態様によると、第一の外因性の因子（例えば、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）を使用してERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量が減少され、第二の因子（例えば、アデノウイルスタンパク質gp19Kの合成をおこなうベクターまたはβ2-ミクログロブリンをターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）を使用して細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量が減少される。別の好適な態様によると、外因性の因子（例えば、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）を使用してERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量が減少され、腫瘍細胞がMHC-Iネガティブ表現型を提示するまで少なくとも 3〜12 日を発酵性の培地において培養される。これらの態様は、特に腫瘍細胞が癌を患う患者から得られ、修飾されてERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示し、治療目的で同じ患者に投与されることが意図された初代細胞であるケースにおいて、好適である。上記で説明されたとおり、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子（interfering RNA molecule）の合成を駆動するベクター単独で形質転換された癌細胞によるMHC-Iネガティブ表現型の発現に必要な時間（マウスの T またはBリンパ球のため少なくとも 二 月）は、幾つかのケースにおいて、治療上の使用に若干の適合性を有することが証明される可能性がある。また、これらの態様は、shERK5単独の使用が培養の五 または六 月後にMHC-Iネガティブ表現型を提示している細胞を得るため十分ではない特定の腫瘍細胞（例えば、Jukart細胞）のため使用できる（図 25）。好適な態様によると、細胞におけるERK5 タンパク質の発現レベル又は量および細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量における減少は、少なくとも部分的に転写後の機構により生じる。この態様によると、外因性起源の因子は、好ましくは配列番号 2の配列で表わされるヒト ERK5 タンパク質をコード化している遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列の部分と少なくとも 85%、例えば、最低 90%, 少なくとも 95%または100%の相同性の程度を有している15〜25（例えば、18〜24）のヌクレオチド残基の配列を含んでいる外因性起源の核酸の分子, 又はその動物の均等物の一つを含む。
【００４２】
「相同性の程度（degree of homology）」の用語は、「相同性の程度（degree of homology）」の用語は、特に二つのDNAまたはRNA配列の間のパーセンテージ同一性、二つのDNAまたはRNA配列の間の相補性の程度またはDNA配列およびRNA配列の間のまたは逆にRNA配列およびDNA配列の間の同等性（equivalence）または相補性の程度を意味する。
【００４３】
外因性起源の核酸の分子は、好ましくは、細胞中で活性であるプロモーターの制御下で、アンチセンス RNA, センス RNA, miRNA, siRNA またはリボザイム 型の分子, または転写によりshRNA, アンチセンス RNA, センス RNA, miRNA, siRNAまたはリボザイム 型のRNA分子を生じる配列を含んでいるDNAの分子である。好ましくは、外因性起源の核酸の分子は、26 塩基対を超える二本鎖RNAではない。
【００４４】
「shRNA」分子または「ショートヘアピン RNA（short hairpin RNA）」の用語は、好ましくは15〜25 ヌクレオチドを含み、標的DNAまたはRNAの配列 と相同的なセンス配列 (i) および配列 (i)と相補的なアンチセンス配列(ii)を含み、配列 (i)および (ii)は少なくとも 2、例えば、2〜100, 2〜50, 3〜40または10〜40ヌクレオチドを含んでいる配列(iii)で分けられている又は分けられていないRNA 鎖を意味する。
【００４５】
センス (i) および アンチセンス (ii) 配列の相補性により、これらの ＲＮＡ分子は自身でフォールドして配列 (iii)から構成されるループを含んでいるヘアピンとして形成されるビカテナリーRNA（bicatenary RNA）の形態をとる傾向がある。伝統的には、shRNA分子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下にあり、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ II またはIII, 好ましくは ＲＮＡポリメラーゼ III、例えば、U6またはH1 プロモーターである。
【００４６】
miRNA(または「ミクロ RNA」または「miR」)は、一般に21〜24ヌクレオチドの範囲の長さを有し、最初にpri-ＲＮＡ分子(一次転写物)に転写される遺伝子(タンパク質をコードしない)によりコードされる21〜24のヌクレオチドの範囲の長さを有する単一鎖RNAであり、これは次にDrosha ヌクレアーゼ および Pasha 二本鎖 RNA 結合タンパク質の介入により変形（transformed）され、約 70 ヌクレオチドのショートヘアピン RNA (プレ-miRNA)を産生する。miRNAは、次に細胞質のプレ-miRNAにおいてdicerエンドヌクレアーゼの作用により産生される。大多数の多細胞生物体のゲノムは、一般に数百のミクロ RNA遺伝子を含む。miRNAsは転写後のリプレッサーであり、メッセンジャーＲＮＡと対形成することにより、それらはメッセンジャーＲＮＡのデグラデーション又はそれらタンパク質への翻訳の抑制をガイドする。特に、「miRNA 143」（GenBankアクセッション番号:  AJ535834）がERK5 タンパク質の発現を減少させることが示されている（35）。
【００４７】
「siRNA」〔「短分子干渉RNA（short interfering RNA）」または「小分子干渉RNA干渉（small interfering RNA）」または「サイレンシング RNA（silencing RNA）」〕の用語は、15〜25の長さ（好ましくは、18〜24 塩基対）で標的 DNAまたはRNAの配列と少なくとも 85%の相同性を有している短い二本鎖 RNAを意味する。通常、これらの分子は、非特異的なインターフェロン反応を惹起することなく哺乳類細胞においてRNA 干渉機構を誘発する能力がある。
【００４８】
「アンチセンスRNA（antisense RNA）」の用語は、特に標的遺伝子の転写後に得られたmRNA 分子と少なくとも 85%の相補性を有する少なくとも 15, 好ましくは 少なくとも 20または25、例えば、 20〜500, 20 〜200, 25 〜150または25 〜100 ヌクレオチドの配列を含んでいるＲＮＡ分子を意味する。
【００４９】
「センスRNA（sense RNA）」の用語は、特に標的遺伝子の転写後に得られたmRNA 分子と少なくとも 85%の同一性を有する少なくとも 15, 好ましくは 少なくとも 20または25、例えば、 20〜500, 20 〜200, 25 〜150または25 〜100 ヌクレオチドの配列を含んでいるＲＮＡ分子を意味する。
【００５０】
「リボザイム（ribozyme）」の用語は、特に標的遺伝子の転写後に得られたmRNA 分子と少なくとも 85%の相補性を有する少なくとも 15, 好ましくは 少なくとも 20または25、例えば、 20〜500, 20 〜200, 25 〜150または25 〜100 ヌクレオチドの少なくとも一の配列を含み、前記mRNAを切断する能力があるリボザイムを意味する。
【００５１】
特に好適な態様によると、細胞におけるERK5 タンパク質の発現レベル又は量および細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量における減少は、少なくとも部分的にRNA干渉機構により生じる。この態様の好適な変法によると、外因性起源の核酸分子は、shRNA 分子である。特に好適な態様によると、外因性起源の核酸分子は、細胞中で活性であるプロモーターの制御下に配列番号 3, 4または5の配列の一つを含んでいるDNAの分子を含み、転写によりshRNA 分子を生じる。
【００５２】
なお別の好適な態様によると、細胞で提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量における減少（および任意で細胞におけるERK5 タンパク質の発現のレベルまたは量の減少）は、少なくとも部分的に前記細胞を呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地（例えば、10 〜100 nMのグルコースを含んでいる培地）で細胞がMHC-Iネガティブ表現型を呈することを許容する十分な期間（例えば、3〜12 日）培養することにより生じる。
【００５３】
外因性起源の核酸の分子は、好ましくはプラスミドまたはウイルス性のベクターを介して細胞に導入される。特に、組込みベクター（integrative vector）, 特にレンチウイルスまたはレトロウイルスのベクター,または非組込みベクター（non integrative vector）, 特にアデノウイルスベクターであってもよい。特に好適な態様によると、外因性起源の核酸の分子は、アデノウイルスまたはアデノ関連ベクターなどの非組込み型のウイルスベクターを介して細胞に導入される。別の好適な態様によると、外因性起源の核酸の分子は、特にナノ粒子に基づくベクター, 特にポリアミドアミン (PAMAM) デンドリマーが共有結合性に結合し、DNA プラスミドと複合体化（complexed）されるメソポーラスシリカのナノスフェアなどの非ウイルスベクターを介して細胞に導入される（36）。
【００５４】
好適な態様によると、本発明の腫瘍細胞は、リンパ球, 白血球, 乳房または前立腺の癌細胞または転移性細胞（metastatic cell）である。
【００５５】
特に好適な態様によると、本発明の細胞は、腫瘍を患う患者から抽出され、外因性起源の前記因子を添加することによって修飾され、MHC-Iネガティブ表現型（および、好ましくは、ERK5ネガティブ表現型）を提示するため十分な培養条件および期間で維持された初代腫瘍細胞（primary tumor cell）である。この態様によると、第二の外因性の因子（例えば、アデノウイルスタンパク質gp19Kの合成をおこなうベクターまたはβ2-ミクログロブリンをターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）は、好ましくは細胞表面で提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させるため使用される。
【００５６】
別の好適な態様によると、本発明の細胞は、腫瘍を患う患者から抽出された初代腫瘍細胞を発酵性の培地（特に、少なくとも 10mM, 好ましくは 少なくとも 25mMのグルコースを含んでいる培地）において培養することで得られる。この態様によると、細胞は、さらに外因性の因子の導入により修飾でき、この因子は、例えば、さらに細胞表面で提示されるMHC-I タンパク質の及び／又はERK5 タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させるための、アデノウイルスタンパク質gp19Kの合成をおこなうベクターまたはERK5もしくはβ2-ミクログロブリンをターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクターである。
【００５７】
別の特に好適な態様によると、本発明の細胞は、外因性起源の因子を添加することによって修飾され、培養の条件下で、ERK5ネガティブ表現型 および MHC-Iネガティブ表現型を提示するため十分な期間で維持された腫瘍細胞系統からの細胞である。
【００５８】
また、本発明は、本発明による細胞から得られた腫瘍細胞系統に関する。
【００５９】
また、本発明は、ワクチンまたは医薬としての本発明による細胞に関する。
【００６０】
また、本発明は、患者の癌を治療する又は予防するための方法に関し、該方法はMHC-Iネガティブ表現型と好ましくはERK5ネガティブ表現型をも呈する腫瘍細胞を、病状, 前歴（antecedents）および齢との関連性として決定された用量, 頻度および期間で患者に投与することを含む。好ましくは、上記のMHC-Iネガティブ表現型と好ましくはERK5ネガティブ表現型をも呈する腫瘍細胞は、本発明の方法により調製される。
【００６１】
本発明の細胞を、特にヒトまたは動物の患者の癌または転移の発生を予防する又は治療するための処置に使用しえる。
【００６２】
特に、本発明の細胞を、ヒトまたは動物の患者の癌または転移の発生の予防または治療を意図する医薬またはワクチンの製造に使用しえる。
【００６３】
ワクチン接種は、微生物（例えば、細菌または弱くした又は殺したウイルス）を生物体に接種することからなる技術である。結果的に、この接種によって、生物体の特異的な免疫応答の発生を生じる。慣習的に、ワクチンは予防の様式で使用され、「予防（preventive）」または「予防的（prophylactic）」ワクチン接種の用語が使用される。このようなワクチンにより惹起される特異的な免疫応答によって、生物体における記憶細胞(B および T リンパ球)の存在が導かれ、新しい感染の間の急速で効果的な免疫応答が許容される。最近、新しいワクチンが、既に病気の個体を治療するため研究されてきた。この事項は、「治療ワクチン接種（therapeutic vaccination）」と称される。本発明の所期の目的は、減弱されたワクチン又は死菌ワクチンの注射と同じ原理を用いて、長期記憶を発生させることではなく、免疫系を刺激することである。このタイプのアプローチは、特に免疫系が重度に易感染性である疾患を治療するため（特に、癌または自己免疫疾患を治療するため）研究された。特に好適な態様によると、本発明の細胞を使用して、ヒトまたは動物の患者の癌または転移の発生の処置を意図する治療ワクチンが製造される。
【００６４】
好ましくは、医薬またはワクチンは、本発明の細胞を生きた形態（live form）で含む。
【００６５】
好ましくは、患者は、新生児, 子供または成人のヒトの患者である。
【００６６】
好適な態様によると、医薬またはワクチンは、治療される患者から抽出され、修飾されてMHC-Iネガティブ表現型と好ましくはERK5ネガティブ表現型をも呈する初代腫瘍細胞を含む。初代腫瘍細胞は、特に外因性の因子を前記細胞に添加すること、培養の条件下で、MHC-Iネガティブ表現型と好ましくはERK5ネガティブ表現型をも呈するため十分な期間で前記細胞を維持することによって修飾できる。代わりに、初代細胞を、呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地（例えば、10〜100 nMのグルコースを含む培地）で、細胞がMHC-Iネガティブ表現型を呈することを許容する十分な期間（例えば、3〜12 日）培養できる。
【００６７】
別の好適な態様によると、医薬またはワクチンは、細胞株から由来するアロジェニック（allogenic）な腫瘍細胞を含む。この態様によると、医薬またはワクチンを製造するため使用される腫瘍細胞は、患者が患う癌の原因であるものと同じ型または異なる型の腫瘍細胞であってもよい。
【００６８】
好適な態様によると、医薬またはワクチンを使用して、多数のNK 細胞が動員される癌（特に、血液または骨髄の癌）が予防または治療される。特に好適な態様によると、医薬またはワクチンを使用して、白血病, リンパ腫, 骨髄腫, 乳癌または前立腺癌の発生（進行）が予防または治療される。
【００６９】
白血病は、血液細胞が影響される癌であり、白色細胞（white cells）の前駆体の異常で過剰な増殖（分化段階でブロックされる）により特徴付けられ、骨髄と次に血液を完全に侵略することで終了する。また、白血病性細胞（Leukemic cells）は、他の器官（例えば、リンパ性の神経節, 脾臓, 肝臓または中枢神経系）を侵襲する。急性白血病は、未成熟の組織学的に異常で無能（ineffective）な血液細胞の急速な増殖により特徴付けられる。それらは、子供または若い成人に出現する;  これらの細胞が血液および器官をとおして拡散することを阻止するため直ちに治療をしなければならない。慢性白血病は、より成熟した癌細胞であるが、なお異常であり血液をとおして通過し、月から年の単位で生じる変化により特徴付けられる。慢性白血病は、主に高齢者に出現する。このタイプの白血病は、後の段階で治療することができる。
【００７０】
本発明の医薬またはワクチンを使用して、特に進化の様々な段階での急性リンパ性白血病(ALL), 慢性リンパ性白血病(CLL), 急性の骨髄球性白血病(AML)または慢性骨髄球性白血病(CML)などの異なるタイプの白血病を治療しえる。
【００７１】
リンパ腫（lymphoma）は、リンパ系の癌である。リンパ系は、骨髄, 脾臓, 胸腺, リンパ性の神経節（lymphatic ganglia）および血管を含み、生物体の防御を提供する。リンパ腫は、二次リンパ領域（secondary lymphoid regions）に発生する腫瘍であるとの事実により白血病から区別される。
【００７２】
本発明の医薬またはワクチンを使用して、特にWHO(World Heath Organization)分類で規定されるB表現型のリンパ腫, T および NK表現型のリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を治療しえる。さらに、本発明の医薬またはワクチンを使用して、特にAnn Arbor分類〔ステージI:  単一の神経節群または単一の器官の攻撃;  ステージII:  横隔膜の同側の一を超える神経節領域の病気（体の下部または上部）;  ステージIII:  横隔膜の両側の複数のアデノパシー（体の下部および上部）;  ステージIV:  一または二以上の内臓および骨髄の散在性の病〕により区別される四つのステージなどのリンパ腫の進化の様々な段階で様々なタイプのホジキンまたは非ホジキンリンパ腫を治療しえる。
【００７３】
骨髄腫（myeloma）は、プラズマ細胞（即ち、活性化したBリンパ球）が影響され、異常な免疫グロブリンの合成が関与する骨髄性の癌である。「骨の多発性骨髄腫（Multiple myeloma of the bones）」または「カーラー病（Kahler's disease）」は、80%のケースが免疫グロブリンをＧ型(2/3のケース)またはＡ型 (1/3のケース)のいずれかで分泌し、これが隣接する骨を次第に破壊するプラズマ細胞を有する複数の溶骨性の腫瘍（プラスマ細胞腫）の骨格における発生により特徴付けられる。
【００７４】
本発明の医薬またはワクチンを使用して、様々なタイプの骨髄腫（特に、骨の複数の骨髄腫）を治療しえる。さらに、本発明の医薬またはワクチンを使用して、特にDurie-Salmon分類〔ステージI:  小さい腫瘍量, 6千億未満の悪性細胞/m2;  ステージII:  中間の腫瘍量, 6千億および1兆2千億の間の悪性細胞/m2; ステージIII:  大きい腫瘍量, 1兆2千億を超える悪性細胞/m2〕により区別される三つのステージなどの骨髄腫の進化の様々な段階での、同様に、腎機能〔ステージA:  正しい腎機能, クレアチン血症  20 mg/lまたは180 μmol/l未満;  ステージB:  低下した腎機能, クレアチン血症  20 mg/lまたは180 μmol/lを超える〕および骨損傷〔0 = 骨損傷なし; 1 = 骨粗鬆症; 2 = 骨溶解損傷（bone lysis lesions）; 3 = 主要な骨損傷および骨折〕との関連性で様々な下位分類での様々なタイプの骨髄腫を治療しえる。
【００７５】
好適な態様によると、医薬またはワクチンを使用して、転移の発生を予防または治療しえる。
【００７６】
別の好適な態様によると、本発明の医薬またはワクチンの製造に使用される腫瘍細胞は、リンパ球, 特に BまたはT リンパ球である。
【００７７】
本発明のワクチンまたは医薬を、患者の病状, 患者の前歴および年齢との関連性で決定された用量、頻度および期間で投与しえる。本発明のワクチンまたは医薬は、癌の診断から治癒まで患者に投与してもよい。特に、癌の発生における様々なステージで投与してもよい。好ましくは、本発明のワクチンまたは医薬は、ヒト患者に少なくとも 1 000 000, 好ましくは 1 000 000 および 50 000 000の間、例えば、5 000 000 および 20 000 000 の間の本発明の細胞を含んでいる用量を毎日, 毎週, 隔月または毎月のインターバルで投与される。
【００７８】
本発明のワクチンまたは医薬は、例えば、患者の静脈内, 皮内, 筋肉内, 腹腔内または皮下に投与してもよい。好ましくは、本発明のワクチンまたは医薬は、局所的に患者の「内因性」腫瘍細胞の近傍（near vicinity）で又は癌を患う患者の器官に又はその近傍に又は血液系に投与される。
【００７９】
好適な態様によると、本発明のワクチンまたは医薬は、患者に骨髄または造血幹細胞のアロジェニック間移植と組み合わせて投与されることが意図される。
【００８０】
ヒトの主要組織適合性複合体に対応するHLA (ヒト白血球抗原) 系によって、身体及びその免疫系が自己(全ての組織など)を非自己(ウイルス, 細菌, 移植片)から識別することが許容される。各個体は、細胞表面に見つけられるユニークなHLAタイプを有する。そのため、自己の HLA マーカーを表面に有していない任意の細胞が免疫系により攻撃される。個体のHLAタイピングは、組織適合性を支配している6つの遺伝子A, B, C, DR, DQ および DPを提示する様々な対立遺伝子により決定される。これらの遺伝子は、全て6番染色体に存在し、多くの対立遺伝子を含む。実際、268の対立遺伝子が遺伝子Aに, 517が遺伝子Bに, 129 が遺伝子Cに, 333 が遺伝子DRに, 53 が遺伝子DQに及び 109 が遺伝子DPに同定されている。これらの遺伝子の各々に対して多数の対立遺伝子があるため、可能な組み合わせの数が極度に高い。
【００８１】
同一のHLAタイピングを有する同胞（sibling）から由来するアロジェニックな造血幹細胞を移植することによって、白血病が治癒されえる。しかしながら、75%の患者は、同一の HLAタイプを有している兄弟または姉妹を有していない。この場合、ボランティアのドナーは、ドナー細胞が拒絶反応を惹起することを阻止するためレシピエントのものと可能なかぎり近いHLAタイプを有する個体を使用しえる。骨髄移植との関連において、レシーバー（receiver）の免疫系は、非常に弱くなり又は非存在となり、通例は拒絶反応の起源にはならない。しかしながら、患者の新しい免疫を産生しなければならないドナーから移植された細胞は、レシーバの組織を「非自己」と認識し、攻撃するだろう。この事項は、移植片  対  宿主病（GvH 疾患）と称される。
【００８２】
代替の選択は、同一の一のハプロタイプ(父親または母親の何れかから由来する個体のゲノタイプの半分)およびレシーバと異なる一のハプロタイプを有しているファミリーのメンバーから由来する幹細胞を使用することである。この事項は、ハプロ同一移植（haplo-identical transplantation）と称される。ハプロ同一移植によって、結果的に広範に T リンパ球が枯渇して致死的な GvH 拒絶反応が阻止されるであろう。しかしながら、このタイプの移植片の抗白血性効果（anti-leukemic effect）は、ドナーのT リンパ球に基礎を置くことはできなく、ドナーのNK 細胞に依存的なアロ反応を惹起することのみに基礎を置き、非自己認識に基づく。アロ反応性（alloreactive）の NK 細胞は、リンパ造血部位（lympho- hematopoietic sites）に局在し、白血病性細胞を含むレシーバのリンパ造血細胞（lympho-hematopoietic cells）を攻撃するが、他の健常な器官はさける。白血病性細胞を排除することに加えて、NK 細胞がレシーバのT リンパ球を殺傷するとの事実は宿主 対 移植片型(HvG)の拒絶反応が避けられることを意味し、また、NK 細胞がレシーバの樹状細胞を殺傷するとの事実はドナーのT 細胞の活性化を予防でき、結果としてGvH 型の拒絶反応を避けることできることを意味する。しかしながら、このアプローチは、全例に使用することができない。というのも、約 30%の集団がアロ反応性の NK 細胞の影響に耐性だからである。
【００８３】
本発明の腫瘍細胞および／またはインビトロまたはエクスビボでの本発明の腫瘍細胞により活性化されたNK 細胞の使用と組み合わせた骨髄移植物または幹細胞によって、特に同一のHLA 型を有しているドナーの非存在下で、NK 細胞の作用をインビボでより効果的としえる。
【００８４】
別の好適な態様によると、本発明のワクチンまたは医薬は、別の抗癌治療（例えば、化学療法または放射線治療による治療）と組み合わせた投与が意図される。
【００８５】
特に、本発明のワクチンまたは医薬は、腫瘍抗原をロードした樹状細胞の移植との組み合わせなどの獲得免疫応答を強化するための治療と組み合わせた投与を意図してもよい。
【００８６】
別の好適な態様によると、本発明のワクチンまたは医薬は、活性化 NK 細胞（即ち、腫瘍細胞と既に接触され、溶解またはアポトーシスをもたらす能力があることが示されているNK 細胞、特にMHC-Iネガティブ表現型および任意でERK5ネガティブ表現型も有している腫瘍細胞と接触されているNK 細胞）の投与と組み合わせた投与を意図する。
【００８７】
「組み合わせの投与（administration in combination）」の用語は、別の抗癌治療に合わせて同時に又は別々に行われる本発明のワクチンまたは医薬の投与を意味する。
【００８８】
また、本発明は、本発明の細胞、同様に、薬学的に許容されるビヒクルを含んでいる治療またはワクチンの組成物に関する。
【００８９】
特定の態様によると、本発明の治療またはワクチンの組成物は、治療上の抗腫瘍分子も含む。
【００９０】
特定の態様によると、本発明の治療またはワクチンの組成物は、活性化されたNK 細胞も含む。
【００９１】
また、本発明は、ヒトまたは動物の患者における癌の予防または治療を意図する生きている細胞ワクチンまたは医薬を製造するための、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を有するヒトまたは動物の腫瘍細胞を賦与（endowing）する能力のある因子の使用に関する。
【００９２】
好適な態様によると、本発明の細胞のワクチンまたは医薬を製造するため使用される因子は、以下に示す能力がある:
○  少なくとも10%, 好ましくは 25%〜90%, 好ましくは 25%〜90%、例えば、25%〜50%または50%〜75%まで、同一の培養条件下で前記因子の非存在下での発現または量のレベルと比較して、腫瘍細胞におけるERK5 タンパク質の発現または量のレベルを減少させること;および
○  50% 〜100%, 好ましくは 75% 〜95%、例えば、 85% 〜95%まで、同一の培養条件下で前記因子の非存在下での細胞表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量と比較して、腫瘍細胞の表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量を減少させること。
【００９３】
好適な態様によると、本発明の因子は、配列番号 2の配列で表わされるヒト ERK5 タンパク質をコード化している遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列の部分と少なくとも 85%、例えば、最低 90%, 少なくとも 95%または100%の相同性の程度を有している15〜25（例えば、18〜24）のヌクレオチド残基の配列を含んでいる外因性起源の核酸の分子, 又はその動物の均等物の一つ, 又はその動物の均等物の一つを含む。外因性起源の核酸の分子は、好ましくは、細胞において活性であるプロモーターの制御下で、RNAアンチセンス, RNAセンス, miRNA, siRNA またはリボザイム 型の分子, または転写によりshRNA, アンチセンス RNA, センス RNA, miRNA, siRNAまたはリボザイム 型のRNA分子を生じる配列を含んでいるDNA分子である。特に好適な態様によると、外因性起源の核酸分子は、細胞中で活性であるプロモーターの制御下に配列番号 3, 4または5の配列の一つを含んでいるDNAの分子を含み、転写によりshRNA 分子を生じる。
【００９４】
好適な態様によると、外因性起源の核酸分子を含んでいる因子は、プラスミドまたはウイルス性のベクター, より好ましくは組込みウイルスベクター、例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルスのベクター, および特に好ましくは非組込み性のウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターである。
【００９５】
好適な態様によると、外因性起源の核酸分子を含んでいる因子は、特にナノ粒子に基づくベクター, 特に核酸分子がポリアミドアミン (PAMAM)のデンドリマーが共有結合性に結合したメソポーラスシリカのナノスフェアと複合体化されたDNA プラスミドに含まれる因子である。
【００９６】
また、本発明は、医薬またはワクチンとしてのMHC-Iネガティブ表現型を有している生きている動物の腫瘍細胞に関する。好適な態様によると、腫瘍細胞はERK5ネガティブ表現型も有する。また、本発明は、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示している動物の腫瘍細胞を得るためのインビトロまたはエクスビボの方法に関し、該方法は以下を含む：
a)  単離された又は培養された動物細胞に、適切な培養条件下で内因性のERK5 タンパク質の発現レベル又は量および細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させる能力がある一または二以上の外因性の因子を導入すること;
b)  前記腫瘍細胞を、ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示させるため十分である条件および期間で培養すること;および
c)  前記細胞を回収すること。
【００９７】
本発明の方法の特に好適な態様によると、工程 a)は、適切な培養条件下でERK5 タンパク質の発現レベル又は量を減少させる及び細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させる能力がある単一の外因性の因子（例えば、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成を行うベクター）を投与することを含む。本発明の方法の別の特に好適な態様によると、工程 a)は、適切な培養条件下でERK5タンパク質の発現のレベル又は量を減少させる能力がある、第一の外因性の因子（例えば、ERK5 タンパク質をターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）並びに適切な培養条件下で細胞表面に提示されたMHC-I タンパク質の発現の全体レベル又は全体量を減少させる能力がある、第二の外因性の因子（例えば、β2-ミクログロブリンをターゲティングするＲＮＡ干渉分子の合成をおこなうベクター）を投与することを含む。
【００９８】
ERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を有している細胞を産生できる適切な培養条件は、特に腫瘍細胞のタイプおよび使用された因子または複数の因子の関連で決定される。特に、マウスの TまたはBリンパ球においてERK5をターゲティングするshRNA型分子の発現ベクターからなる単一の因子を用いるケースにおいて、少なくとも 二 月の期間が細胞がERK5ネガティブ表現型およびMHC-Iネガティブ表現型を提示するため必要であることを発明者は確立した。この期間は、腫瘍細胞を呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地で培養することで短くできる。特定の態様において、工程b)は、腫瘍細胞を、呼吸代謝経路を犠牲にして発酵代謝経路を支援する培地（例えば、10〜100 nMのグルコースを含む培地）で、前記細胞がMHC-Iネガティブ表現型を呈することを許容する十分な期間（例えば、3〜12 日）培養することを含む。好適な態様によると、腫瘍細胞は、以下の場合に回収される：
○  前記細胞に存在するERK5 タンパク質の発現レベル又は量において、同一の培養条件下で前記外因性の因子の非存在下でのERK5 タンパク質の発現のレベルまたはERK5 タンパク質の量と比較して、10%, 好ましくは 25%〜90%, 例えば、25%〜50%または50%〜75%の減少がえられる;および
○  細胞表面に提示されるMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量において、同一の培養条件下で前記外因性の因子の非存在下での細胞表面でのMHC-I タンパク質の発現の全体レベルまたはMHC-I タンパク質の全体量と比較して、50% 〜100%, 好ましくは 75% 〜95%、例えば、 85% 〜95%の減少がえられる。
【００９９】
また、好ましくは、腫瘍細胞のMHC-I 表現型が少なくとも 40%, 好ましくは 少なくとも 50%の腫瘍細胞 (T)がインビトロでシンジェニックなNK 細胞(E)の存在下で4 時間後に5:1のE:T 比で溶解される場合、前記腫瘍細胞が回収される。
【０１００】
特に好適な態様によると、培養条件および期間は、本発明の方法を実施することでえられる腫瘍細胞におけるERK5 タンパク質の発現または量の減少が100%と等しくないように選択される。
【０１０１】
本発明の方法の好適な態様によると、工程 a)で言及される腫瘍細胞は、癌を患う患者からえられた初代細胞（primary cell）である。
【０１０２】
本発明の方法の代替の好適な態様によると、工程 a)で言及される腫瘍細胞は、腫瘍細胞株からえられる細胞である。
【０１０３】
また、本発明は、活性化NK細胞, それらの調製、それらの治療における使用に関する。実際、発明者は、特に、L1210-shERK5 細胞(この細胞はERK5 および MHC-Iネガティブである)をマウスの腹膜に注射した48h 後、腹膜の細胞のなかのグランザイム A および／または B (即ち、活性化NK 細胞)を発現している細胞のパーセンテージが非修飾L1210 細胞の注射の場合よりも非常に高いことを示した（図 15）。従って、MHC-Iネガティブ細胞もインビトロで使用して、ナイーブなNK 細胞（naive NK cells）を活性化することができる。このように得られた活性化NK細胞は、次に患者に投与できる。
【０１０４】
また、本発明は、活性化したNK 細胞を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法に関し、該方法は以下を含む：
a)  インビトロまたはエクスビボで生きているNK 細胞を、NK 細胞の活性化を誘導する十分な条件および期間でMHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている腫瘍細胞と接触させることと;
b)  活性化したNK 細胞を回収すること。
【０１０５】
好ましくは、工程 a)の生きている腫瘍細胞は、ERK5ネガティブ表現型も提示する。
【０１０６】
特に、「活性化したNK 細胞（activated NK cells）」の用語は、例えば、FACSを用いて証明されるグランザイム A および／または B, FasL および／または パーフォリンを発現しているNK 細胞を意味する。本発明の方法を用いて得られたＮＫ細胞活性化のレベルは、活性化がNK 細胞のサイトカイン (例えば IL2, IL-12またはIL-15)と又はアルファ-またはベータ-インターフェロンとの接触により影響される際に取得されるだろうレベルよりも有意に高い。
【０１０７】
本発明の方法の工程 a)で言及される培養の条件および期間は、特に用いた腫瘍細胞のタイプとの関連で決定される。好ましくは、NK(E) 細胞および本発明の腫瘍細胞(T)は、互いにE:T 比が少なくとも 1:1, 好ましくは 少なくとも 5:1、例えば、5:1 〜35:1の範囲の比,または5:1 〜15:1の範囲の比で、数時間（好ましくは少なくとも 5, 7または10 時間）の期間、例えば、5 〜15 時間の範囲または7 および 10 時間の間の期間で存在する。
【０１０８】
本発明の方法を実施することでえられる活性化したNK 細胞は、特にFACSで精製され、凍結または使用まで培養に維持されることによる条件などの適切な条件下で保存されてもよい。
【０１０９】
本発明の方法の好適な態様によると、MHC-Iネガティブ表現型および任意でERK5ネガティブ表現型を提示している生きている腫瘍細胞は、本発明の細胞または上記の陰性の ERK5 および MHC-I 細胞を得るための方法を行うことで得られる細胞である。
【０１１０】
本発明の方法の特定の態様によると、工程 a)で言及されるNK 細胞は、癌を患う患者からえられた初代NK 細胞（primary NK cells）である。別の特定の態様によると、工程 a)で言及されるNK 細胞は、健常ドナーから得られる。別の態様によると、工程 a)で言及されるNK 細胞は、NK 細胞株から又は生物学的材料バンク（例えば、特に、臍帯血移植バンク, 組織バンクまたは血液バンク）から由来する。好ましくは、NK 細胞は、哺乳類細胞、特にラット, マウス, イヌ, ブタまたはネコの細胞である。最も好ましくは、NK 細胞は、ヒトの又はヒト化した細胞（humanized cells）である。なお好ましくは、MHC-Iネガティブ表現型を提示している生きている腫瘍細胞は、係るものを得ることに関して本発明の文脈において記載された方法の一つにより得られた細胞である。また、本発明は、本発明による上記の方法により得ることができる活性化したＮＫ細胞に関する。
【０１１１】
本発明は、さらに活性化した表現型を有する活性化したＮＫ細胞に向けられる。特に、本発明による活性化したＮＫ細胞は、インビトロでサイトカイン(例えば、IL2, IL12またはIL15)で又はアルファまたはベータインターフェロンで活性化したNK 細胞よりも、インビトロであろうとインビボであろうと腫瘍細胞のターゲティング及び溶解がより効率的である。
【０１１２】
本発明の活性化したNKを使用して、癌を予防または治療するための医薬またはワクチンの製造に使用しえる。特定の態様によると、本発明の医薬またはワクチンは、本発明の腫瘍細胞も含む。別の好適な態様によると、本発明のワクチンまたは医薬は、腫瘍抗原をロードされた樹状細胞も含む。実際に、本発明の腫瘍細胞および腫瘍抗原をロードされた樹状細胞で活性化されたNK 細胞の移植の組み合わせによって、抗腫瘍効果が強化（reinforces）される。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】注射後三日でのEL4-shERK5 細胞の腹膜クリアランス（Peritoneal clearance）。CFSE (5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)で標識されたEL4-wt, EL4-shERK5-A, EL4-shERK5-B またはEL4-shLuc 細胞の各々の百万の細胞を、シンジェニックなC57/B6 マウスの腹膜に注射した。三日後、腹膜の細胞を回収し、注射した細胞の生存をFACS (蛍光活性化セルソーティング)型のフローサイトメトリーで評価した。注射の三日後、EL4-wt および EL4-shLuc 細胞が腹膜に生存するが、EL4-shERK5 細胞が排除されたことを結果は示す。
【図２】EL4-shERK5 細胞に関するMHC-Iの表面発現。A)  EL4-shERK5-A, EL4-shERK5-B および EL4-shLuc 細胞を、選択の抗生物質(ピューロマイシン)の存在下で又は非存在下で培養した。細胞を抗Hdkb抗体で標識し、MHC-Iの発現のレベルをFACS 型 フローサイトメトリーで分析した。EL4-wt および RMAS細胞を、それぞれMHC-I 表面発現に関するポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。EL4-shERK5-A および EL4-shERK5-B細胞は、抗生物質の存在下でMHC-Iの表面発現の欠損を示すことを結果は示す。B)  ERK5のA)に記載された様々な細胞株による発現を、免疫ブロットで分析した。Vav および ERK2に関する抗体をコントロールとして使用した。EL4-shERK5-A および EL4-shERK5-B細胞は、抗生物質の存在下でERK5発現の欠損を示すことを結果は示す。
【図３】EL4-shERK5 細胞の排除におけるNK 細胞の関与。A)  トータルの脾細胞, 精製NK細胞またはNK 細胞を欠いている脾細胞を、異なる比率で51CrをロードしたEL4-shERK5 標的細胞とインキュベートした。4 時間後、上清を収集し、細胞溶解活性を51Crの遊離との関連性として測定した。100%のEL4-shERK5 細胞を、精製NK 細胞の存在下でNK 細胞:標的細胞 (E:T)比を35:1 から75:1で溶解した。B)  精製 NK 細胞を異なる比率で51Crと四 時間標識したEL4-shERK5またはYac-1 細胞とインキュベートした。細胞溶解活性を測定した。Yac-1 標的細胞よりも非常に多くの数のEL4-shERK5 標的細胞を、NK 細胞で溶解した。NK 細胞がEL4-shERK5 細胞の排除の原因であること、標的細胞のERK5ネガティブ表現型がMHC-Iネガティブ表現型単独と比較して付加的な効果を導くことを結果は示す。
【図４】ERK5の構成的な活性化は、MHC-I 感受性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を誘導する。A)  一千万のJurkat 細胞(ヒト 腫瘍細胞)を、5 μgのERK5, MEK5D またはERK5 および MEK5D 発現産物, 2.5 μgのレポーター遺伝子（MHC-1 遺伝子プロモーターの制御下）: Pd-1 および 1 μgのβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミド(コントロール)でトランスフェクトした。48 時間後、ルシフェラーゼ および ガラクトシダーゼ活性を測定し、結果をルシフェラーゼ/ガラクトシダーゼ 比 (相対ルシフェラーゼ 活性)として表した。構成的に活性な遺伝子MEK5と組み合せたERK5の過剰発現によって、MHC-I プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を活性化することを結果は示す。B)  実験を、それぞれの 発現プラスミド ERK5 および MEK5D, ERK5KM (不活性のERK5 変異体), ERK5 AEF (活性化不可能なERK5変異体)またはshERK5で繰り返した。ERK5がMHC-I プロモーターの活性化を誘導することを結果は示す。さらに、不活性の変異体(ERK5KM)用いること又は発現をshERK5で減少させることによりERK5の活性をブロックすることによって、このプロモーターの発現の基礎レベルが減少される。従って、ERK5は、MHC-I遺伝子の転写を制御する。
【図５】マウスにEL4-shERK5 注射後の腹膜におけるNK 細胞のリクルート。5 x 105のEL4-shERK5 またはEL4-shLuc またはPBS 細胞を、シンジェニックなマウスの腹膜に注射した。三日後、腹膜からの細胞集団をフローサイトメトリー (FACSCalibur)で分析した。A)  腹膜におけるリンパ球のパーセンテージ。B)  腹膜に回収されたNK 細胞のパーセンテージ。C)  腹膜のリンパ球集団に回収されたNK 細胞のパーセンテージ。EL4-shERK5 細胞の注射後、NK 細胞が腹膜にリクルートされることを結果は実証している。
【図６】EL4-shERK5 細胞を共注射後の野生型 (wt) EL4 細胞の生存。CFSEをロードした 2.5 x 105のEL4-shLuc 細胞, EL4-shERK5細胞または2.5 x 105のEL4-shLuc 細胞および 2.5 x 105のEL4-shERK5 細胞の混合物を、シンジェニックなマウスの腹膜に注射した。三日後の腹膜洗浄後のCFSE+ 細胞のパーセンテージを示す。EL4-shERK5 細胞を完全に排除し、他方でEL4-shLuc 細胞の生存は実質的にEL4-shERK5 細胞との共注射後に減少した。
【図７】EL4-shERK5 細胞での免疫化。マウスを、2または6 週で2.5 x 105のEL4-shERK5 細胞で免疫し、それから皮下で2.5 x 105 EL4-wt細胞を注射した。腫瘍サイズを12, 14 および 16 日後に測定した。EL4-wt 細胞からの皮下腫瘍の発生は後に開始されたこと及び二または六週でEL4-shERK5細胞で免疫したマウスにおいて腫瘍容積が非常に縮小したことを結果は示す。EL4-shERK5 細胞での免疫化によって、野生型 (wt) EL4 細胞で誘導された皮下腫瘍に対して防御される。
【図８Ａ】ヒトのERK5タンパク質。ヒトのERK5タンパク質のアミノ酸配列(アクセッション番号:  AAA81381, Zhou et al, 1995) (配列番号1)およびヒトのERK5タンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列(アクセッション番号:  U25278, Zhou et al, 1995, コード配列: ヌクレオチド 84 から2531) (配列番号2)。
【図８Ｂ】ヒトのERK5タンパク質。ヒトのERK5タンパク質のアミノ酸配列(アクセッション番号:  AAA81381, Zhou et al, 1995) (配列番号1)およびヒトのERK5タンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列(アクセッション番号:  U25278, Zhou et al, 1995, コード配列: ヌクレオチド 84 から2531) (配列番号2)。
【図９】「shERK5」分子の発現ベクターの調製に使用したヌクレオチド 配列 (1), (2) および (3)  （配列番号 3, 4 および 5）。
【図１０】L1210-shERK5 および shLuc 細胞を、様々な濃度のCFSEをロードし、ウサギ血清 (コントロール)または抗-アシアロ GM1 抗血清で処理されたシンジェニックなＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜に注射した。48 時間後、腹膜細胞をFACSで分析した。shLuc 細胞は排除されず、他方でshERK5 細胞は対照マウスの腹膜から排除されたが、NK 細胞を排除することが意図された抗-アシアロ GM1 抗血清の治療を受けたマウスの腹膜からは排除されなかった。
【図１１】L1210-shERK5 細胞は3H-チミジンをロードされ、NK 細胞の存在下で又は非存在下でインキュベーションされた;  (A) シンジェニックなBalb/cまたは(B) アロジェニックなC57/B6, および L1210-shLuc 細胞は3H-チミジンをロードされ、シンジェニックなBalb/c NK 細胞(C)の存在下または非存在下でインキュベーションされた。二つのタイプのNK 細胞(シンジェニックなBalb/c および アロジェニックなC57/B6)は、L1210-shERK5 細胞を外来性と認識し、それらが類似する効率で排除されることを結果は示す。対照的に、L1210-shLuc 細胞は外来性と認識されない；  これらの細胞は、MHC-Iを発現し、排除されない。E:T = エフェクター細胞(NK)  ／  標的細胞(L1210-shERK5)の比。
【図１２】L1210-shERK5 細胞は3H-チミジンをロードされ、(A)  EGTA (グランザイムで誘導される細胞死をブロックする)または(B)  抗-FasL 抗体(Fasで誘導される細胞死をブロックする)の存在下で又は非存在下でシンジェニックなBalb/c NK 細胞とインキュベーションされた。NK 細胞で排除されたL1210-shERK5 細胞の量がEGTAまたは抗-FasL 抗体の存在下で減少したことを結果は示し、shERK5 細胞をNK 細胞で排除する際にグランザイム および Fasを用いる機構の重要性が実証された。
【図１３】MHC-Iの発現のレベルを、L1210-shLucまたはshERK5 細胞において抗-H2Kd 抗体でのFACSで分析した。点線は、コントロールのIgGで標識された細胞に対応する。shERK5 細胞がMHC-I発現を形質膜レベルで失うことを結果は示す。
【図１４】PBS, L1210-shLuc 細胞またはL1210-shERK5細胞の注射を腹膜に受けたシンジェニックなＢＡＬＢ／ｃマウス。48 時間後、腹膜細胞を回収し、NK 細胞を抗-CD49b 抗体で定量した。腹膜におけるNK 細胞の(B) 数、同様に、(A) 比率は、shERK5 細胞を受けたマウスにおいて高いことを結果は示し、NK 細胞がshERK5 細胞により腹膜にリクルートされることを実証している。
【図１５】PBS, L1210-shLuc 細胞またはL1210-shERK5細胞の注射を腹膜に受けたシンジェニックなＢＡＬＢ／ｃマウス。48 時間後、腹膜細胞を回収し、A および B グランザイムを発現しているNK 細胞 (CD49b+)の数をFACSで分析した。L1210-shERK5 細胞でリクルートされたNK 細胞は、グランザイム陽性であり、結果として、活性化された表現型を有することを結果は実証している。
【図１６】L1210-shLucまたはL1210-shERK5 細胞を、PMA/イオノマイシン処理で活性化された又は活性化されていない細胞傷害性 BM3.3 リンパ球で一時間インキュベーションし、抗-Fas 抗体で標識し、FACSで分析した。活性化 T リンパ球が、L1210-shERK5 細胞においてFasのデスレセプターの発現のレベルにおいて大きな増加を誘導することを結果は示している。この現象は、一般的にこれらの細胞がなぜ細胞傷害性リンパ球による攻撃に高度に感受性であることの説明に寄与する。
【図１７】抗-アポトーシスの プロテインＣ-FLIPの二つのアイソフォーム L および Sの発現を、L1210-shLuc および L1210-shERK5 細胞において免疫ブロットで分析した。shERK5 細胞のc-FLIP タンパク質の二つのアイソフォームのレベルが減少したことを結果は示す(β-アクチン:  コントロール)。
【図１８】L1210-shLuc (コントロール) および L1210-shERK5 細胞からのRNAを、単離し、ベータ-2-ミクログロブリンの特異的なプライマーでqPCR を行った。L1210-shERK5 細胞のベータ-2-ミクログロブリン（形質膜レベルでMHC-I 分子の安定化に必須のタンパク質）が非常に低下していることを結果は示し、なぜL1210-shERK5 細胞が非常に僅かな MHC-I タンパク質を形質膜のレベルで発現するかを説明することに寄与する。
【図１９−１】MHC-Iの原形質膜発現は、細胞の代謝状態に依存する。A)  30 x 103 (25 mM グルコース)または120 x 103 (4 mM Gln  プラス  10 mM ガラクトース)の L1210 細胞を、対応する培地で異なる期間インキュベーションした。MHC-I 発現を、抗-H-2Kd 抗体を用いてFACsで分析した。B)  L1210 細胞をグルコース, Gln  プラス  ガラクトース (10 mM)またはピルビン酸  プラス  リンゴ酸(各々、12.5 mM)において3日インキュベーションし、MHC-IまたはCD19発現をFACsで分析した。C)  30 x 103 (25 mM グルコース)または120 x 103 (10 mM ガラクトースまたは12.5 mMの各々のピルビン酸およびリンゴ酸)のJurkat 細胞を、対応する培地で異なる期間インキュベーションした。MHC-I 発現を、抗-HLA-ABC抗体を用いてFACsで5日後に分析した。D)  30 x 103 L1210 細胞を、25 mM DCAの有り無しで25 mM グルコースにおいてインキュベーションした。E)  L1210 細胞を、Gln 培地で3 日間インキュベーションし、グルコースまたはGln 培地の何れかに3 日間配置し、MHC-I 発現をFACsで分析した。グルコースにおいて連続的に成長している細胞の染色は、Glnにおいて、次にグルコースにおいて三日間成長している細胞のものと同一であり、図には記載されない。
【図１９−２】MHC-Iの原形質膜発現は、細胞の代謝状態に依存する。A)  30 x 103 (25 mM グルコース)または120 x 103 (4 mM Gln  プラス  10 mM ガラクトース)の L1210 細胞を、対応する培地で異なる期間インキュベーションした。MHC-I 発現を、抗-H-2Kd 抗体を用いてFACsで分析した。B)  L1210 細胞をグルコース, Gln  プラス  ガラクトース (10 mM)またはピルビン酸  プラス  リンゴ酸(各々、12.5 mM)において3日インキュベーションし、MHC-IまたはCD19発現をFACsで分析した。C)  30 x 103 (25 mM グルコース)または120 x 103 (10 mM ガラクトースまたは12.5 mMの各々のピルビン酸およびリンゴ酸)のJurkat 細胞を、対応する培地で異なる期間インキュベーションした。MHC-I 発現を、抗-HLA-ABC抗体を用いてFACsで5日後に分析した。D)  30 x 103 L1210 細胞を、25 mM DCAの有り無しで25 mM グルコースにおいてインキュベーションした。E)  L1210 細胞を、Gln 培地で3 日間インキュベーションし、グルコースまたはGln 培地の何れかに3 日間配置し、MHC-I 発現をFACsで分析した。グルコースにおいて連続的に成長している細胞の染色は、Glnにおいて、次にグルコースにおいて三日間成長している細胞のものと同一であり、図には記載されない。
【図２０】A)  Jurkat細胞を5日間グルコースまたはグルタミン培地でインキュベーションし、HLAまたはMICA発現をFACsで分析した。B)  L1210 細胞を3日間グルコース中でDCAの有り無しでインキュベーションし、CD19 発現をFACsで分析した。C)  Jurkat細胞を5日間 Gln 培地においてインキュベーションした。それから, 細胞を、グルコースまたはGln培地の何れかで5日間インキュベーションし、MHC-I 発現をFACsで分析した。グルコース中で連続的に成長している細胞の染色は、Glnにおいて、次にグルコースにおいて三日間成長している細胞のものと同一であり、図には記載されない。
【図２１】呼吸がクラス I 分子の発現を誘導する。A)  百万(25 mM グルコース)または一千万(10 mM ガラクトースまたは各々12.5 mMのピルビン酸およびリンゴ酸)のL1210 細胞を異なる培地で3 日で成長させた。RNAを抽出し、β2m (左)またはH-2Kd (右)に特異的プライマーでのqPCRで分析した。B)  一千万のJurkat 細胞を2.5 μg のレポーター遺伝子 PD-1-Luc および 1 μg のβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした。一日後、細胞を、DCA および 2-デオキシグルコース (5 mM)の存在または非存在下でグルコース, Gln またはピルビン酸  プラス  リンゴ酸を含んでいる培地に配置した。四十八時間後、ライセート（lysates）調製し、ルシフェラーゼ および ガラクトシダーゼ活性を分析した。相対的なルシフェラーゼ単位は、ルシフェラーゼ/ガラクトシダーゼの比を表す。データは、少なくとも 3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  * p<0.05; ** p < 0.005）。C)  L1210 細胞をグルコース, Glnおよびピルビン酸  プラス  リンゴ酸の培地において3日インキュベーションし、MHC-IをFACsで分析した〔インタクトなもの（左）または透過化したもの（右）のパネル〕。
【図２２−１】A)  一千万のJurkat 細胞を2.5 μg のレポーター遺伝子 HLA-A-Luc および 1 μg のb-ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした。一日後、細胞をグルコース (25 mM)またはGln (4 mM)  プラス  ガラクトース (10 mM)を含んでいる培地に配置した。四十八時間後、ライセート（lysates）調製し、ルシフェラーゼ および ガラクトシダーゼ活性を分析した。相対的なルシフェラーゼ単位は、ルシフェラーゼ/ガラクトシダーゼの比を表す。データは、3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  ** p < 0.001）。B)  百万のJurkat細胞をグルコース (25 mM)またはGln (4 mM)  プラス  ガラクトース (10 mM)を含んでいる培地に配置した。五日後、ミトコンドリアの量を、ノニルアクリジンオレンジ(NAO：  nonyl acridine orange)またはミトトラッカーレッド（mitotracker Red）を用いてFACsで分析した。C)  L1210 細胞を3日間 Gln 培地においてインキュベーションした。それから, 細胞を、グルコースまたはGln培地の何れかで3日間インキュベーションし、タンパク質発現をウエスタンブロットで分析した。D)  shERK5-発現細胞におけるダウンレギュレートしたERK5 発現。細胞全体の抽出物におけるタンパク質発現を、対応する抗体でのウエスタンブロッティングで分析した。
【図２２−２】A)  一千万のJurkat 細胞を2.5 μg のレポーター遺伝子 HLA-A-Luc および 1 μg のb-ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした。一日後、細胞をグルコース (25 mM)またはGln (4 mM)  プラス  ガラクトース (10 mM)を含んでいる培地に配置した。四十八時間後、ライセート（lysates）調製し、ルシフェラーゼ および ガラクトシダーゼ活性を分析した。相対的なルシフェラーゼ単位は、ルシフェラーゼ/ガラクトシダーゼの比を表す。データは、3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  ** p < 0.001）。B)  百万のJurkat細胞をグルコース (25 mM)またはGln (4 mM)  プラス  ガラクトース (10 mM)を含んでいる培地に配置した。五日後、ミトコンドリアの量を、ノニルアクリジンオレンジ(NAO：  nonyl acridine orange)またはミトトラッカーレッド（mitotracker Red）を用いてFACsで分析した。C)  L1210 細胞を3日間 Gln 培地においてインキュベーションした。それから, 細胞を、グルコースまたはGln培地の何れかで3日間インキュベーションし、タンパク質発現をウエスタンブロットで分析した。D)  shERK5-発現細胞におけるダウンレギュレートしたERK5 発現。細胞全体の抽出物におけるタンパク質発現を、対応する抗体でのウエスタンブロッティングで分析した。
【図２３】呼吸はERK5 発現を誘導する。A)  百万(グルコース)または二百万(Gln および ピルビン酸  プラス  リンゴ酸)の細胞を、異なる培養培地で三 日インキュベーションし、異なるタンパク質の発現を免疫ブロットで明らかとした。B)  一千万のJurkat 細胞を、5 μg のwt ERK5の発現ベクター, 構成的に活性なMEK5 (MEK5D), 2.5 μgのレポーター遺伝子 PD-1-Luc, および 1 μgのβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした。一日後、細胞を、グルコース (25 mM), 2-デオキシグルコース (2 mM), DCA (15 mM), Gln (4 mM) および／または ピルビン酸  プラス  リンゴ酸(各12.5 mM)を含んでいる培地に配置した。四十八時間後、ライセート（lysates）を調製し、ルシフェラーゼ および ガラクトシダーゼ活性を分析した。相対的なルシフェラーゼ単位は、ルシフェラーゼ/ガラクトシダーゼの比を表す。データは、少なくとも 3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  * p<0.05; ** p < 0.005）。
【図２４−１】ERK5は、白血病細胞のミトコンドリアに局在する。A)  左のパネル:  百万のjurkat 細胞をパラホルムアルデヒド固定し、ミトトラッカーレッド, ERK5およびHoeschtで染色した。細胞を共焦点顕微鏡観察で分析した。右のパネル:  Jurkat細胞の抽出物を、ミトコンドリア (m) および サイトゾル (c) フラクションに分画し、異なるタンパク質の相対的な局在を研究した。５０ μgのこれらのフラクションまたは細胞全体の抽出物をERK5局在化に関して分析した。フラクションの純度を、Lat, トポイソメラーゼ および Cox IVをそれぞれサイトゾル, 核 および ミトコンドリアのマーカーとして用いて分析した。B)  呼吸は、ERK5のミトコンドリアへのトランスロケーションを誘導する。L1210 細胞を、グルコースまたはGln培地で三 日インキュベーションし、A)のとおり染色し、Cox IV (赤色)を使用してミトコンドリア(下のパネル)を標識するか又はA)のとおり細胞分画に供した。C)  ERK5発現のダウンレギュレーションによって、OXPHOS培地における細胞生存が損なわれる。５０(グルコース) x 103 または150 x 103 (OXPHOS)のL1210またはJurkat 細胞を、72 時間異なる培地でインキュベーションした。生存を、材料および方法に記載のとおりアッセイした。データは、少なくとも 3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  * p<0.005; ** p < 0.0005）。
【図２４−２】ERK5は、白血病細胞のミトコンドリアに局在する。A)  左のパネル:  百万のjurkat 細胞をパラホルムアルデヒド固定し、ミトトラッカーレッド, ERK5およびHoeschtで染色した。細胞を共焦点顕微鏡観察で分析した。右のパネル:  Jurkat細胞の抽出物を、ミトコンドリア (m) および サイトゾル (c) フラクションに分画し、異なるタンパク質の相対的な局在を研究した。５０ μgのこれらのフラクションまたは細胞全体の抽出物をERK5局在化に関して分析した。フラクションの純度を、Lat, トポイソメラーゼ および Cox IVをそれぞれサイトゾル, 核 および ミトコンドリアのマーカーとして用いて分析した。B)  呼吸は、ERK5のミトコンドリアへのトランスロケーションを誘導する。L1210 細胞を、グルコースまたはGln培地で三 日インキュベーションし、A)のとおり染色し、Cox IV (赤色)を使用してミトコンドリア(下のパネル)を標識するか又はA)のとおり細胞分画に供した。C)  ERK5発現のダウンレギュレーションによって、OXPHOS培地における細胞生存が損なわれる。５０(グルコース) x 103 または150 x 103 (OXPHOS)のL1210またはJurkat 細胞を、72 時間異なる培地でインキュベーションした。生存を、材料および方法に記載のとおりアッセイした。データは、少なくとも 3つの独立した実験の平均±SDとして示され、スチューデントのｔ-検定を用いて評価した（コントロール細胞との比較  * p<0.005; ** p < 0.0005）。
【図２５】Jurkat wt 細胞またはERK5に対するスモールヘアピン RNAsを発現する細胞(shERK5, 細胞株 3 および 4)またはスクランブル配列(shscr：  scramble sequence)を、HLA 発現に関して分析した。ERK5 タンパク質の正確なダウンレギュレーションを、アクチンをローディング・コントロール（loading control）としたウエスタンブロットで分析した。
【０１１４】
実験の部
例  1
最近、発明者は、shERK5を発現しているEL4 細胞 (EL4-shERK5)がシンジェニックなマウスにおける皮下腫瘍の誘導を生じさせることができないことを示した（21）。また、これらの細胞は、腹膜に注射された際に、腫瘍を誘導させず、注射後の72 h未満で除去された（図 1）。ルシフェラーゼ ショートヘアピン RNA (shRNA) (EL4-shLuc)を発現しているEL4 細胞を、以前に発明者により得られた皮下腫瘍での結果と一致して、野生型 (wt) 細胞のものと類似する量で回収された（21）。この癌細胞のクリアランスに関する短い期間は、生得的（innate）な免疫応答（即ち、NK 細胞）が、これらの細胞に対する免疫応答のもとにあることを示唆している。同じ様式において、EL4-shERK5 細胞（しかし、EL4-shLuc 細胞ではない）は、MHC-Iの表面発現が減少した（図 2A）。EL4-shERK5 細胞は、MHC-Iネガティブであると考えられるRMA-S 細胞のものと類似するMHC-Iの量を発現した（29）。この事項によって、なぜNK 細胞がEL4-shERK5 細胞を「異物」と認識するかが説明される。MHC-I発現のレベルの減少は、抗生物質選択の数週間後に観察された。この効果が可逆的であったかどうかを決定するため、発明者は選択に使用した抗生物質の非存在下でEL4-shERK5 細胞をインキュベーションした。数週間後、これらの細胞は、タンパク質 ERK5の正常なレベルを回復しはじめた（図 2B）、MHC-Iの発現を回復した（図 2A）。発明者は同じプロトコールをshLucを発現している細胞に使用した場合、MHC-IまたはERK5の発現レベルの変化を観察しなかった。
【０１１５】
発明者は、トータルの脾細胞, 精製NK 細胞およびNK 細胞が除去された脾細胞の三つの異なるエフェクターの集団に対しEL4-shERK5 細胞を標的として使用した（図 3）。精製NK 細胞（purified NK cells）が、ERK5-欠陥細胞を殺傷するため最も効果的な集団であることが示された。対照的に、NK 細胞の除去は、ERK5-欠陥細胞（ERK5-deficient cells）に向けた脾細胞の細胞傷害活性を非常に減少させた。興味深いことに、これらの細胞は、他のシンジェニックなMHC-I-欠陥細胞（例えば、RMA-SまたはYac-1 細胞）よりもより良いNK 細胞の標的であることが判明した（図 3B およびデータ示さず）。この事項が、デスレセプターが関与した後にアポトーシスをブロックするだろうNF-(Bの活性化におけるERK5の役割を反映していることはかなり確からしい（21）。要約すると、NK 細胞は、インビトロでのEL4-shERK5 細胞の根絶（eradication）の原因であった（図 3）。これらの結果は、別のタイプの腫瘍細胞、Ｂ型のマウスリンパ腫から由来するL1210 細胞で確認された（図 10）。
【０１１６】
Jurkat 細胞(ヒト腫瘍細胞)における構成的に活性なMEK5 遺伝子と組み合せたERK5の過剰発現がクラス I 遺伝子から由来するMHC-I プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を活性化したので、ERK5により制御されるMHC-Iの発現にはおそらく転写調節が関与することを発明者は示した〔図 4, (27)〕。対照的に、別々の各タンパク質のトランスフェクションは、前記プロモーターを活性化しなかった。
【０１１７】
インビボで、NK 細胞は、腫瘍細胞（好ましくは、適切な MHC-I 発現がないもの）の接種により局所的にリクルートされえる（22）。この理由のため、発明者は、EL4-wt 細胞およびshERK5 細胞を、シンジェニックなマウスの腹膜に注射し、三日後にNK 細胞の存在を調査した（図 5）。トータルのリンパ球の量は、EL4-shERK5 細胞の接種後に著しく増加しなかった（図 5A）。対照的に、NK 細胞の数は、コントロール細胞を接種されたマウスよりもshERK5 細胞を接種されたマウスにおいて有意に高かった（図 5B）。さらに、NK 細胞のパーセンテージは、EL4-shERK5 細胞の注射を受けているマウスにおいて腹膜リンパ球の集団において増加した（図 5C）。EL4-shLuc 細胞を注射した場合、これらの異なる集団における変化は観察されなかった。
【０１１８】
発明者により得られた結果は、NK 細胞がインビボでEL4-shERK5 細胞を排除することを強く示唆する。最近の結果によって、NK 細胞により担われる腫瘍の免疫学的監視における重要な役割が明らかとされた（30）。発明者は、EL4-shERK5 細胞の事前の注射（またはワクチン接種）がEL4-wt 細胞で誘導された腫瘍の進行に影響しえるかどうかを調査した。EL4-shERK5 および wt 細胞の共注射は、腹膜のwt 細胞の生存を有意に減少させ（図 6）、EL4-shERK5 細胞がEL4-wt 細胞に対する免疫応答を誘導することを示唆している。さらにこの仮説を探求するため、シンジェニックなマウスをEL4-shERK5 細胞でワクチン接種し、80%のマウスにおいてEL4-wt 細胞により開始される腫瘍成長（tumor development）の有意な減少を生じ、その20%において腫瘍の成長が完全に予防された（図 7）。
【０１１９】
最終的に、発明者は、新生児をモロニー マウス白血病ウイルス (M-MuLV)株で感染させることによりＴ細胞白血病が誘発されているより妥当なモデルで腫瘍成長を阻害できるかどうかを調査した。M-MuLVを感染させたC57/B6 マウスから由来するYac-1 株からのT 白血病性細胞を、コントロールとして使用された動物に注射した。Yac-1 細胞（EL4-shERK5 細胞と同様）は、表面にMHC-Iを発現しなく、我々の系でインビボで腫瘍を形成しない。新生児マウスは、M-MuLV ウイルスで腹腔内に接種され、上記のとおり潜伏期3-4 月でT リンパ腫を誘発した（31）。
【０１２０】
感染後60 日、マウスは、150 000の Yac-1 細胞またはEL4-shERK5 細胞の注射を月毎に二月、それから二週毎に受けた。マウスを、麻酔下で定期的に触診で検査して器官の腫脹を検出し、血を取りヘマトクリットを決定した。表 1の結果は、マウスがEL4-shERK5 細胞および（低程度で）Yac-1 細胞により白血病から保護されたことを示している。
【０１２１】
表1．  shERK5で修飾された細胞は、マウスをM-MuLV-誘発性の白血病から防御する。新生児マウスを、M-MuLV ウイルスで感染させた。二 月後、マウスを三群に分けた。第一群は、如何なる治療もうけない。第二群はYac-1 細胞の注射を受け、第三群はEL4-shERK5 細胞の注射を受けた。感染後五月に生存しているマウスの数が示される。
【０１２２】
【表１】
2011520473.tif 000002
【０１２３】
例  2
発明者は、マウスの腫瘍細胞の別のタイプ（Ｂ型マウスリンパ腫から由来するL1210 細胞）で第二系列の実験を実施した。結果は、表 2 および 図 10 〜18に示される。
【０１２４】
表 2に示される結果は、shRNA ターゲティング ERK5 (「L1210-shERK5 細胞」)の発現ベクターでトランスフェクトされたL1210 細胞がマウスにおいてインビボで腫瘍を誘発しないことを示す。
【０１２５】
表 2:  二群のマウスは、それぞれshRNA ターゲティング ERK5 (「L1210-shERK5 細胞」)の発現ベクターでトランスフェクトされたL1210 細胞またはコントロールとして使用された発現ベクター shLucでトランスフェクトされたL1210 細胞の注射を受けた。腫瘍容積を8, 11 および 13 日後に測定した。
【０１２６】
【表２】
2011520473.tif 000003
【０１２７】
また、発明者は、L1210-shERK5 細胞が無処置マウスの腹膜から排除されたが、NK 細胞を排除することが目的の前処置をうけたマウスの腹膜から排除されないことを示した。対照的に、L1210-shLuc 細胞は、腹膜から排除されなかった（図 10）。また、発明者は、アロジェニックな及びシンジェニックなNK 細胞の双方がL1210-shERK5 細胞を異物と認識し、それらを類似する効率で排除することを示した（図 11）。FACSでL1210-shLucまたはshERK5 細胞の発現のレベルを評価するための抗-H2kd 抗体 (MHC-Iに属しているタンパク質)の使用によって、shERK5 細胞が形質膜でのMHC-Iの発現を失うことが示された（図 13）。L1210-shLucまたはshERK5 細胞の腹膜注射48 時間後に回収されたマウス 腹膜細胞からのNK 細胞の抗-CD49b 抗体(NK 細胞の表面で発現されたタンパク質)での定量によって、腹膜におけるNK 細胞の数と同様に比率がshERK5 細胞を受けたマウスで非常に高かったことが示されたので、NK 細胞がshERK5 細胞により腹膜にリクルートされることを示している（図 14）。また、発明者は、次にFACSでAおよびB グランザイムを発現しているNK 細胞(CD49b+)を定量することにより本実験を繰り返し、L1210-shERK5 細胞によりリクルートされたNK 細胞はグランザイム陽性で結果的に活性化の表現型を有することを示した（図 15）。また、発明者は、シンジェニックな NK 細胞および EGTA (これはグランザイムにより誘導される細胞死をブロックする)または抗-FasL抗体 (これはFasにより誘導される細胞死をブロックする)の存在下でL1210-shERK5 細胞をインキュベーションすることによって、NK 細胞により排除されるL1210-shERK5 細胞の量の実質的な減少が導かれることが示され、NK 細胞によるshERK5 細胞の排除にグランザイム および Fasが関与している機構の重要性が実証された。L1210-shLucまたはshERK5 細胞を、PMA/イオノマイシン処理により活性化され（又は活性化されない）、抗-Fas 抗体で標識された細胞傷害性 リンパ球 BM3.3でインキュベーションすることによって、活性化T リンパ球(PMA/イオノマイシン処理により活性化された)がL1210-shERK5 細胞においてデスレセプター Fasの発現レベルの実質的な増加を誘導することが証明され、このことは一般にこれらの細胞が細胞傷害性リンパ球による攻撃に高度に感受性であるとの事実の説明に寄与する（図 16）。また、shERK5 細胞が抗-アポトーシスの プロテインＣ-FLIPの二つのアイソフォーム（L および S）のレベルを減少させたことを発明者は示した（図 17）。最終的に, L1210-shERK5 細胞のベータ2-ミクログロブリン（形質膜レベルでMHC-I 分子の安定化に必須であるタンパク質）のRNAレベルの減少が大きいことを発明者は示し、なぜL1210-shERK5 細胞が非常に僅かな量の MHC-I タンパク質が形質膜のレベルで発現するかを説明することに寄与している（図 18）。
【０１２８】
例  3
材料および方法：
1)  試薬および抗体
抗体 抗-H2Kb-FITC, 抗-H2Kd-PE および 抗-NK1.1-APCを、BD Pharmingenから入手した。ERK5 および β-アクチンに対する抗体を、Cell Signalling Technologyから入手した。ロバ 抗-ウサギまたはヒツジ 抗-マウス IgGsを、Amershamから入手した。5(6)-カルボキシフルオセインジアセタート, スクシンイミジル エステル (CFSE：  5(6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)を、Sigma-Aldrichから入手した。
【０１２９】
2)  細胞培養
EL4 Ｔリンパ球株細胞, L1210 Ｂリンパ球株細胞, Yac-1 細胞, RMA-S, Jurkatおよびマウスの初代細胞を、5%のFBS および 50 μMの2-MEを添加したRPMI 1640-Glutamax (GIBCO)で培養した。
【０１３０】
3)  プラスミド
ERK5の発現ベクター〔構成的に活性なMEK5 変異体 (S313D/T317D, MEK5DDと称される) および β-ガラクトシダーゼ〕は、本明細書に記載された（21）。shERK5 および shLucコントロールに関するpSiren-retroQ-puro (BD Biosciences) レトロウイルスベクターは、本明細書に記載された（21）。ここで使用されるMHC クラス I プロモーター 構築物は、ブタの クラス I 遺伝子 PD1 (27)から由来し、Dinah Singer (NCI/NIH)博士から供与された。
【０１３１】
4)  一過性トランスフェクションおよび安定な細胞株の作出
対数増殖期のJurkat 細胞を、指摘された量のプラスミドでエレクトロポレーションでトランスフェクトした（21）。各実験において、細胞を、空ベクターを添加した同じ総量のDNAでトランスフェクトした。細胞を、DNA 混合物と周囲温度で10 minインキュベーションし、260 mV, 960 μFで400 μlのRPMI1640中でエレクトロポレーションした。安定な細胞株を、前に記載されたとおり作出した（21）。簡単に説明すると、細胞を、1.5 x 106 細胞/mlで播種した。shERK5またはコントロールプラスミドに関するレトロウイルスベクター pSIRENを発現している293T 細胞からの１mlの上清を、プレーティング後に添加した。三日後、細胞を、2.5 μg/mlのピューロマイシン（Sigma-Aldrich）で培養した。一週後、生存している細胞を、単離し、使用するまで選択培地で維持した。
【０１３２】
5)  レポーターアッセイ
全ての実験において、細胞は、β-ガラクトシダーゼ レポータープラスミドでトランスフェクトされた（21）。トランスフェクトされた細胞 (1 x 106)を、2 日後収穫し、PBSで二回洗浄した。細胞を、100 μlのルシフェラーゼ溶解緩衝剤 (Promega, Charbonnieres, France)中で溶解した。そして、ルシフェラーゼ アッセイ (40 μl)を、Bertholdのルミノメータを用いて製造者（Promega, Charbonnieres, France）の指示にしたがい行った。β-ガラクトシダーゼをアッセイするため、40 μlのライセート（lysates）を200 μlのβ-ガラクトシダーゼ 緩衝剤 (50 mM のリン酸緩衝剤, pH 7.4; ONPG 200 μg; 1 mM MgCl2; 50 mM β-メルカプトエタノール)に添加し、吸光度を400 nmで測定した。結果を、対応するβ-ガラクトシダーゼ活性で標準化したルシフェラーゼ単位として表現した。トランスフェクトされたタンパク質の発現レベルを、従来の免疫ブロット分析でチェックした。
【０１３３】
6)  CFSE標識化および腹膜のクリアランス
細胞を、以下の通りCFSEで標識した。１μl のストック溶液(5 mM)を、10 mlのPBSに希釈した。五百万の細胞を、一度PBSで洗浄し、1 mlのCFSE/PBS 溶液に再懸濁した。周囲温度（ambient temperature）で2 minインキュベーション後、細胞を10 mlのPBSで一度PBSで洗浄し、指摘された濃度に再懸濁した。指摘された量の細胞を、150 μlのPBS中で腹腔内に注射した。マウスを三日後に屠殺し、腹膜細胞を収集し、PBSで洗浄し、FACSCalibur フローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。
【０１３４】
7)  細胞傷害性活性の測定
脾臓のNK 細胞を、製造者の指示にしたがい抗-DX5 磁気ビーズ(Miltenyi Biotec, Germany)を用いたポジティブ選択で単離した。簡単に説明すると、生存可能な単一細胞懸濁物（viable single-cell suspensions）を、ポリスチレン組織培養皿でインキュベーションした (1 時間、37℃)。非接着性の脾臓細胞(107 細胞)を、抗-DX5 磁気ビーズとインキュベーション(15 分間, 4℃)し、二回洗浄し、25 LD カラムにロードした（5 x 107 細胞）。収集されたDX5+ 細胞の純度は、典型的には 98% である（データ示さず）。直接的なNK細胞の細胞傷害活性を、標的細胞をNa2 51CrO4 で一時間(EL4 細胞)または3H-チミジンで一晩(L1210 細胞)標識することで評価した。一万個の標的細胞を、エフェクター細胞と指摘された比率で96ウェルのVプレート中で200 マイクロリットルの最終容量で混合した（4 時間、３７℃）。自発性（spontaneous）の 51Cr 放出(細胞溶解の表現)を、標的細胞を培地単独とインキュベートすることで決定した。最大放出を、2.5% Triton X-100を添加することで決定した。3H-チミジン (その% 放出は、DNA 断片化に対応する)での実験に関して、細胞を2% のTriton X-100, 80 mM のTris/HCl, pH 7.5 および 8 mM のEDTAを含んでいる25 μlの溶液で透過化し、15 分間、37℃でインキュベーションした。プレートを15 分間、400xgで遠心分離し、50 μlの上清を2 mlのシンチレーション 液体（GE Healthcare）に添加した。自発性の遊離をエフェクター細胞の非存在下で毎分のカウント数（またはcpm）として決定し、トータルの標識化を標的細胞の直接測定により得た。特異的な溶解のパーセンテージまたはDNA断片化は以下の式と等しい：
[(サンプル cpm - 自発性の cpm)/(最大 cpm - 自発性の cpm)] x 100
自発性の遊離は、常に51Crの場合10%未満(EL4 細胞)であり、3H-チミジンで20%未満である。全ての実験を、三回行った。
【０１３５】
8)  インビボでの腫瘍進行
皮下の腫瘍形成に関して、EL4 細胞をPBSで洗浄し、1.5 x 106 細胞/mlに再懸濁した。トータルで2.5 x 105 細胞を、EL4-shERK5 細胞での前処理に関して及びEL4-shLuc 細胞の接種に関してC57B/6 マウスの側腹部の皮下に注射した。腫瘍成長を、2 日毎分析した。腫瘍を測定し、容積を V = 長さ x (重量)2/2の式を用いて計算した。M-MuLV-誘発性の白血病実験に関して、新生児マウスを出生後二 日に前に記載されたとおりM-MuLVで感染させた（28）。二月後、マウスは、腹腔内に2.5 x 105 Yac-1またはEL4-shERK5 細胞またはPBSを二週毎に注射された。白血病の進行を、触診 および／または ヘマトクリット測定でモニターした。動物が関与している全ての実験を、Centre Nationale de la Recherche Scientifique [National Center for Scientific Research]のガイドライン および 規定にしたがい行った。
【０１３６】
9)  フローサイトメトリー
腹膜の脾臓細胞(3 x 106)または細胞株(2 x 105)を、200 μlのPBS中でFITC- PE-またはAPC-結合抗体で20 分間、周囲温度で染色した。最後に、細胞を洗浄し、CellQuest ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いてFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。
【０１３７】
10)  免疫ブロット
細胞をPBSで洗浄し、SDS-Laemmli 緩衝剤で溶解した。タンパク質を10% SDS-PAGEのミニゲルで分離し、免疫ブロット分析のため前に記載されたとおり処理した（21）。
【０１３８】
11)  統計学的分析
ペアのサンプルの平均間の差の統計分析を、対応のあるt-検定を用いて行った。結果を、信頼区間 (p)として示した。図に記載された全ての実験は、少なくとも三回行なわれ、類似する結果であった。
【０１３９】
例  4
腫瘍細胞代謝の変化が腫瘍細胞の免疫回避を強調する
腫瘍形成のプロセスの間、細胞は二つの状況で不都合な環境に直面する：  つまり、細胞は急速な成長のため栄養素を得なければならないこと、また細胞は宿主免疫系からの攻撃を回避しなければならないことである。豊富な酸素の存在下でさえ、癌細胞は酸化的リン酸化 (OXPHOS, 呼吸)よりもATPの産生に効率が低い嫌気性の解糖(発酵)によるグルコースの代謝を好むことを1920s 37 にOtto Warburgが見つけた。しかしながら、発酵は、ATPの産生が呼吸よりも非常に迅速であり、腫瘍細胞が急速に成長するため選択的な利点を提供する。Paul Ehrlich（1909）は、免疫系が潜在的に「圧倒的な頻度（overwhelming frequency）」の癌腫を抑制できるだろうとのアイデアを最初に想像した人物であった。しかしながら、このアイデアは、腫瘍関連抗原（TAAs）の存在が確立されるまで探究されなかった。1960年代にMacfarlane BurnetおよびLewis Thomasは、現在では一般に承認されている「癌の免疫学的監視（cancer immunosurveillance）」42 の仮説を提案した39, 43。しかしながら、癌の免疫学的監視およびWarburg効果の間の関連性は、これまで記載されていない。双方のプロセスは腫瘍成長の早期に起こり、それらが関連するだろうことが示唆される。臨床的に検出可能な腫瘍の出現は、免疫応答を回避する洗練された戦略を発達させた高度に選択された腫瘍クローンの増殖の結果である可能性がある。おそらく、最も関連性のある事項は、主要組織適合複合体 クラス I (MHC-I)の発現のトータル（total）または選択的な欠損である。MHC-Iは、自己認識を媒介するので、内因性に合成された TAAs をCD8+ 細胞傷害性 T リンパ球 (CTLs)に提示するだろう。MHC-Iの変化によって、腫瘍細胞はCTLsを回避し、そして適応性の免疫応答を回避することが許容される40。
【０１４０】
グルコースがもはや利用可能ではない場合、細胞は強制されて大抵の培養培地に存在するグルタミン (Gln)の酸化などの代替のエネルギー基質を使用する。このプロセスは、グルタミノリシスと称され、ATP 産生のためOXPHOSを必要とする44, 45。25 mM グルコース中で成長しているL1210 B 白血病性細胞は、10 mM ガラクトース および 4 mM Glnを添加したグルコース欠乏培地（glucose-deprived medium）に変更された（図 19A）。ガラクトースをGln含有培地に添加し、五炭糖リン酸経路をつうじて核酸の産生を許容した 44, 45 。MHC-I 発現を、ＦＡＣＳ分析で分析した。Glnにおける三 日間の細胞成長によって、MHC-I 発現は3倍の増加を示す。2または4 日の付加的なインキュベーションによって、小規模の付加的な増加が導かれ（図 19A）、より短期のインキュベーションによって、より小規模の増加が示された（データ示さず）。従って、我々は、引き続く試験で主として3 日を選択した。呼吸性基質（respiratory substrates）としてピルビン酸およびリンゴ酸の存在下で成長している細胞は、類似する増加を示した(図 19B, 左パネル)。Ｂ細胞抗原 CD19の発現（図 19B, 右パネル）は、異なる培地において変化しなかった。図 19Bの下のパネルは、これらの結果の統計学的な有意性を示す。また、Jurkat Ｔ細胞はMHC-I 発現を増加(図 19C)させたが、密接に関連するMHC クラス I 鎖-関連遺伝子 A を増加させなかった(MICA; 図 20A)。ジクロロ酢酸 (DCA)〔ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ (PDK1) インヒビター 46〕は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH1) 47 を活性化し、ピルビン酸をKreb’s サイクルに入れて、代謝が高グルコース培地においてさえも呼吸に変更される47。DCAは、25 mM グルコースの存在下でMHC-I 発現を増加させた（図 19D）。再び、CD19の発現は、変更されなかった（図 19B および 図 20B）。これらのデータによって、グルコース欠乏が我々の観察を強調（underlined）するとの事項が排除された。次ぎに、我々は、MHC-Iのアップレギュレーションが可逆的であるかどうかを検査した。Gln培地においてMHC-IがアップレギュレーションされたL1210またはJurkat 細胞を、グルコースまたはGln 培地に配置した。我々は、24 h後のMHC-I レベルの低下を観察しなかった（データ示さず）。しかしながら、48 時間後、細胞はMHC-I の低下を開始し（データ示さず）、三日後、細胞がグルコース中で連続的に成長しているものと基本的に同じレベルに達する（図 19E および 図 20C）。この事項は、腫瘍細胞の代謝状態が原形質膜でのMHC-Iの発現をコントロールすることを意味する。この発現は、転写を含む異なるレベルで制御される40。クラス I 分子は、軽鎖 β2-ミクログロブリン (β2m; 12 kDa) および MHC 領域〔ヒトのヒト白血球抗原 (HLA)およびマウスのH-2〕内の幾つかの異なる遺伝子によりコードされた一つの重鎖(45 kDa)からなる。腫瘍細胞における異常な MHC クラス I 発現の根底にある分子機構は、β2m, クラス I 重鎖遺伝子および抗原提示機構(APM, 40)のコンポーネントをコードしている遺伝子の変異またはエピジェネティックな変化を含む。
【０１４１】
OXPHOS 培地で2 日成長しているL1210 細胞は、β2m およびクラス I 分子 H-2Kd の重鎖の双方の高いmRNA 発現を示した（図 21A）。そのうえ、それらの培地において成長しているJurkat 細胞は、MHC-I 遺伝子 PD-1 のプロモーター (図 21B)またはヒト HLA-A 遺伝子の近位プロモーター(図 22A)によりコントロールされるトランスフェクトされたレポーター遺伝子の発現を増加させた。図 19と一致して、この効果はグルコース欠乏が原因ではない。というのも、DCAのグルコース培地への付加も、PD-1 レポーターを活性化したからである(図 21B)。我々のGln培地は、5 % の非透析（non-dialysed）のウシ胎児血清を含有する（従って、0.5 mM付近のグルコース）。解糖を完全にブロックするため、我々は2-デオキシグルコースを使用したところ、全ての培地においてPD-1 プロモーターの発現が増加された（図 21B）。クラス I 分子の転写の増加は、OXPHOS 培地において成長している細胞のMHC-I 分子の高いトータルの発現と関連する（図 21C および 23A）。従って、呼吸は、原形質膜へのトランスロケーションを増加させるだけではなく、MHC-I 分子のデノボ（de novo）の発現を誘導する。
【０１４２】
最近、我々は、ERK5 経路の選択的な活性化が白血病性細胞のMHC-I 発現を誘導することを見つけた 41。図 23Aは、OXPHOS 培地において成長している白血病性細胞がERK5 発現を増加させたことを示す。我々の以前の試験 41と一致して、ERK5 および 構成的に活性な MEK5 変異体 (MEK5D)のトランスフェクションによって、PD-1遺伝子レポーターが活性化され、全ての試験したOXPHOS条件で強く相乗作用した(図 23B)。
【０１４３】
ERK5の細胞内局在は調査した細胞タイプに依存し、サイトゾルまたは核における濃縮が記載された。免疫蛍光染色は、ERK5がJurkat 細胞のサイトゾルに局在することを示し（図 24A）、ミトコンドリアマーカーのミトトラッカーレッドで陽性に染色された区画が含まれる（図 24A）。タンパク質間相互作用（protein-protein interaction）の定量的な測定によって、20%のERK5はJurkat 細胞中でチトクロムＣと共局在（colocalised）することを示した。我々はこれらの結果を生化学的な試験により確認し、大抵のERK5 タンパク質が可溶性のサイトゾル分画にあることを見つけた、しかし、有意なレベルのERK5がミトコンドリア分画にも見つられた（図 24A, 右パネル）。この事項は、ERK5が異なる区画に局在し、ミトコンドリアが有意な量のERK5を含有することを意味する。
【０１４４】
予期されたとおり 45、OXPHOS条件で成長しているL1210 細胞は、ミトコンドリアの膜電位と非依存性にミトコンドリアと結合するミトトラッカーレッドまたはノニル アクリジンオレンジ (NAO)での染色が増加する（図 22）。この事項は高いERK5 発現(図23)と相関し、MHC-I 発現(図19Eおよび図20C)と同様に可逆的であった(図22C)。OXPHOS条件下、大抵のERK5 タンパク質は、チトクロムＣと共局在し(図 24B, 底部のパネル)、ミトコンドリア分画に単離された(図 24B, 最上部のパネル)。実際に、デノボで発現されたERK5 タンパク質の最大の分画は、ミトコンドリアに見つかり、サイトゾルには見つからない(図 24B, 最上部のパネル)。
【０１４５】
細胞代謝におけるERK5の役割を研究するため、我々はERK5のshRNAを安定に発現している白血病性細胞(shERK5)またはスクランブルコントロール（shscr）を作出した。これらの細胞は、ERK5 レベルの約 50%の減少を示し（図 22D）、MEF ERK5+/-に記載されたものと類似していた 48。他の細胞株 45で観察されたとおり、Shscr（同様に wt）細胞はOXPHOS培地中で生存するが（図 24C）、これらの細胞はグルコース培地よりも遅く増殖する（データ示さず）。しかしながら、強制的に呼吸を行わせる場合、shERK5 細胞は細胞死の有意な増加を示した。shERK5発現Jurkat 細胞のDNA マイクロアレイ 分析によって、これらの細胞がミトコンドリアに欠陥があることが確認された（データ示さず）。
【０１４６】
shERK5を安定に発現している腫瘍細胞はOXPHOS 培地においてアポトーシスを生じ、呼吸-誘導性MHC-I 発現におけるERK5の役割を調査するための使用が制限される。二つのドミナントネガティブな ERK5 構築物(ERK5 KM および AEF)による又はshERK5の発現によるERK5 経路の一過性の阻害によって、PD-1 および HLA-A プロモーターのガラクトース誘導性の活性化がブロックされた（図 24D）。
【０１４７】
腫瘍細胞は、腫瘍形成のプロセスの間にこれらの細胞の環境の変化に直面する。時々、この事項は不都合である可能性があるが、癌細胞は特異的なクローンの選択後これらの状況も利用できる。呼吸から発酵へと変化させることによって、MHC-I 発現が減少し、インビボでの適応性の免疫応答が回避されることを我々の結果は示す。発酵を行うことによりクローンの自然選択が導かれ、MHC-I 発現がダウンレギュレートする。この事項は、多くの腫瘍において大規模に観察された。
【０１４８】
重要な問題は、このプロセスがどれほど一般的であるのかである。我々の研究は、インビトロで特異的なエンハンセオソームのため他の細胞タイプ より高いMHC-I レベルを示す造血性の細胞が生じることを示した40  49。従って、この制御は、BまたはT 白血病性細胞のような造血細胞に限定されるだろう。しかし、少なくともインビトロで異なる代謝状態にある細胞は、この制御を示すことができない可能性がある。例えば、既にミトコンドリアを使用する細胞は、グルコース欠乏後により低い効果を示すであろう。そのうえ、培養において高いパーセンテージの細胞株がMHC-I 発現の内因性の欠乏（例えば、クラス I 分子の重鎖、軽鎖の変異 40）を示すことが原因で、この現象が幾つかの細胞株で観察できなかった可能性がある。
【０１４９】
興味深い問題は、いかにしてERK5が代謝を制御するかである。我々のshERK5-発現細胞を用いたDNA マイクロアレイ アッセイは、代謝経路の強い変化を示し、この変化はミトコンドリアに選択的な（しかし、部分的な）ERK5 局在化により媒介できた。ERK5は、HIF-1 50による制御を介した低酸素症（hypoxia）と関連する遺伝子を制御する。しかしながら、ERK5は、これらの遺伝子を正常酸素状態（低酸素症ではなく）で制御する。そのうえ、ほとんど 30%の口の扁平上皮癌(OSCCs：  oral squamous cell carcinomas)はERK5 51の発現の増加を示す。これらの癌腫は、電子伝達鎖遺伝子の有意なダウンレギュレーションを示す。まとめると、全てのこれらの結果は、ERK5がHIFにより制御されるもののみならず、異なる代謝性のプロセスの発現をコントロールすることを示唆している。このようなことから、我々の結果は、なぜ最小限のERK5 レベルが細胞生存に必須であるかを明らかにする 48, 21, 10, 52。
【０１５０】
癌の分野における新しい理解に加えて、我々の結果によって、成熟細胞よりもより嫌気性の解糖代謝を示す胚性細胞がMHC-I 発現を欠乏するかが説明できた53。実際に、我々の予備的な結果は、ガラクトース培地におけるマウス胚性線維芽細胞 (MEFs)の成長がMHC-I 発現を増加させることを示す（データ示さず）。この事項は、腫瘍細胞が胚様の代謝を経験し37, 47、胚様の抗原の発現（例えば、低いMHC-I 発現）を獲得することを意味するであろう。
【０１５１】
このデータは、細胞代謝にERK5が重要な役割を担うことを支持し、なぜ哺乳類細胞が生存するため最小限のレベルのERK5 タンパク質を必要とするかを説明するであろう 48, 21, 10, 52。
【０１５２】
幾つかの早期の癌研究は、正常組織および腫瘍の間の代謝性の差に注目した 1。例えば、腫瘍細胞は、適切な酸素供給の条件（即ち、ワールブルグ効果）においてさえも、高い 解糖の割合を維持する。従って、腫瘍細胞は、主に呼吸の代わりに発酵によりATPを産生する。発酵が産生するATPは少ないが、呼吸より迅速であり、おそらく供給源が限定される場合に腫瘍に選択的な利点を提供する47。ワールブルグ効果は、ヒトの癌で十分に遍在性（ubiquitous）であり、ポジトロン放出断層撮影(PET)による腫瘍検出が可能である。代謝のリモデリングに関与するシグナル伝達経路および参加する分子のの分析によって、大抵の解糖酵素の特定の(急速な)アイソフォームの発現を誘導する転写制御因子  低酸素症誘導性因子 1α (HIF1α)の中心的役割が明らかとされた 54。HIF1αは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ (PDH)を、そのキナーゼ (PDK1; 55, 56)のアップレギュレーションにより阻害する。これによりピルビン酸のアセチル-CoAへの転換が低くなり、究極的には呼吸鎖によるATP 産生を低下させ、Warburg効果および癌の細胞成長を増強する。興味深いことに、細胞外シグナル制御キナーゼ 5 (ERK5：  extracellular-regulated kinase 5)の選択的な活性化によって、HIF1α-制御遺伝子の強いアップレギュレーションが導かれる 50。ERK5は、直接的にHIF1αを活性化しなく、低酸素症により活性化されない。この事項からERK5が正常酸素状態（normoxia）下でHIF1α-制御遺伝子の制御に必須であることが示唆される。
【０１５３】
初代および白血病性の細胞 4に存在するERK5 2, 3 は、TEY 活性化モチーフを他のERKsと共有するが、その他の構造上の特徴は、ユニークである（例えば、ヌクレオ-細胞質のシャットリングをコントロールする大きい調節性のＣ末端 5）。ERK5発現を欠いているマウスの胚性線維芽細胞 (MEF)が自発性のアポトーシスを経験するとの事実によりERK5の必須の役割が強調された 48。そのうえ、一つのERK5対立遺伝子の発現をブロックすることは、自発性（spontaneous）のアポトーシスを有意に増加させる 48。我々の結果 21, 52は、スモールヘアピン RNA (shERK5)の発現によるERK5 レベルのダウンレギュレーションが白血病性細胞株において自発性のアポトーシスを誘導することを示す。従って、ERK5の特定の水準（単にその活性化のみならず）が、細胞の生存に決定的に重要である。
【０１５４】
方法の概要
白血病性の T 細胞株 Jurkat および マウスの白血病性の B L1210 細胞株を、6% FBSを添加したRPMI 1640-Glutamax (GIBCO)で成長させた。特定の実験において、細胞を、2 mM グルタミンを含有するが、グルコースを含有しないRPMI 1640（GIBCO 11879）でインキュベーションした。この培地は、25 mM グルコース (グルコース培地), 2 mM グルタミン (Gln-培地)または各12.5 mMのピルビン酸  プラス  リンゴ酸(ピルビン酸-培地)で補充された。
【０１５５】
MHC クラス I プロモーター構築物は、記載されたブタの クラス I 遺伝子 PD1 49 およびヒトの HLA-A 遺伝子 57 から由来した。
【０１５６】
フローサイトメトリーに関して、細胞株 (1 x 105)を、20 分間、RTで指摘されたFITC-, PE-またはAPC-結合抗体で200μlのPBS中で染色した。細胞を洗浄し、CellQuest ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いてFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。透過化した細胞におけるトータルMHC-I 発現に関して、異なる培地で成長しているL1210 細胞を、抗-H2Kd-PEで15 minインキュベーションし、PBSで洗浄し、2 % PFAで15 min固定した。次ぎに、それら細胞を、0.5% サポニンで透過化し、抗-H2Kd-PE (トータルのMHC-I 発現)またはコントロールのIgG-PE (膜のMHC-I 発現)でインキュベーションした。PBS洗浄後、細胞をFACsで分析した。
【０１５７】
免疫蛍光共焦点イメージを、外部アルゴンレーザーを備えるZeiss LSM 510 倒立レーザースキャニング顕微鏡を用いてZeiss fluor 63X 対物レンズを用いて獲得した。分析を、Imaris ソフトウェアで行った。二つの標識の共局在（colocalization）の程度を、Imaris 5.0.2., 64-ビット バージョン(Bitplane AG, Saint Paul, MN, USA, www.bitplane.com)の「共局在」モジュールを用いて測定した。このプログラムは、二つのチャネルで取得された共焦点の切片の積み重ねを分析する。各々の共焦点の切片は、ピクセルと称される区画要素（square elements）のアレイからなる。ボクセル（voxel）は、基部がピクセル（pixel）であり、高さが共焦点の切片の厚さであるプリズム（prism）としてのピクセルから規定された。Imaris 共局在は、各ボクセルにおける各標識の強度を測定することにより全体の共焦点の積み重ねを分析する。前記プログラムは、二つの標識の各々の(0-255 スケールのピクセル強度における)強度閾値を決定するための反復手順 58 を使用する。この閾値を超える強度のボクセルは、バックグランドを超えると考えられる。両方の標識の閾値がそれぞれの閾値を超える場合、ボクセルは共局在を有していると規定される。閾値の設定における調査者のバイアスを回避するため、前記プログラムは、自動閾値特性（automatic thresholding feature）を有する 58。
【０１５８】
［参照文献］
1. Berd, D., H. C. Maguire, Jr., P. McCue, and M. J. Mastrangelo. 1990. Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumor-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. J Clin Oncol 8:1858-1867.
2. Lee, J. D., R. J. Ulevitch, and J. Han. 1995. Primary structure of BMK1: a new mammalian map kinase. Biochem Biophys Res Commun 213:715-724.
3. Zhou, G., Z. Q. Bao, and J. E. Dixon. 1995. Components of a new human protein kinase signal transduction pathway. J Biol Chem 270:12665-12669.
4. Garaude, J., S. Kaminski, S. Cherni, R. A. Hipskind, and M. Villalba. 2005. The Role of ERK5 in T-Cell Signalling. Scand J Immunol 62:515-520.
5. Buschbeck, M., and A. Ullrich. 2005. The Unique C-terminal Tail of the Mitogen-activated Protein Kinase ERK5 Regulates Its Activation and Nuclear Shuttling. J Biol Chem 280:2659-2667.
6. Esparis-Ogando, A., E. Diaz-Rodriguez, J. C. Montero, L. Yuste, P. Crespo, and A. Pandiella. 2002. Erk5 participates in neuregulin signal transduction and is constitutively active in breast cancer cells overexpressing ErbB2. Mol Cell Biol 22:270-285.
7. English, J. M., G. Pearson, T. Hockenberry, L. Shivakumar, M. A. White, and M. H. Cobb. 1999. Contribution of the ERK5/MEK5 pathway to Ras/Raf signaling and growth control. Journal of Biological Chemistry 274:31588-31592.
8. Mulloy, R., S. Salinas, A. Philips, and R. A. Hipskind. 2003. Activation of cyclin D1 expression by the ERK5 cascade. Oncogene 22:5387-5398.
9. Linnerth, N. M., M. Baldwin, C. Campbell, M. Brown, H. McGowan, and R. A. Moorehead. 2005. IGF-II induces CREB phosphorylation and cell survival in human lung cancer cells. Oncogene 24:7310-7319.
10. Buschbeck, M., S. Hofbauer, L. D. Croce, G. Keri, and A. Ullrich. 2005. Abl-kinase-sensitive levels of ERK5 and its intrinsic basal activity contribute to leukaemia cell survival. EMBO Rep 6:63-69.
11. Carvajal-Vergara, X., S. Tabera, J. C. Montero, A. Esparis-Ogando, R. Lopez-Perez, G. Mateo, N. Gutierrez, M. Parmo-Cabanas, J. Teixido, J. F. San Miguel, and A. Pandiella. 2005. Multifunctional role of Erk5 in multiple myeloma. Blood 105:4492-4499.
12. Mehta, P. B., B. L. Jenkins, L. McCarthy, L. Thilak, C. N. Robson, D. E. Neal, and H. Y. Leung. 2003. MEK5 overexpression is associated with metastatic prostate cancer, and stimulates proliferation, MMP-9 expression and invasion. Oncogene 22:1381-1389.
13. Weldon, C. B., A. B. Scandurro, K. W. Rolfe, J. L. Clayton, S. Elliott, N. N. Butler, L. I. Melnik, J. Alam, J. A. McLachlan, B. M. Jaffe, B. S. Beckman, and M. E. Burow. 2002. Identification of mitogen-activated protein kinase kinase as a chemoresistant pathway in MCF-7 cells by using gene expression microarray. Surgery 132:293-301.
14. Nagel, S., C. Burek, L. Venturini, M. Scherr, H. Quentmeier, C. Meyer, A. Rosenwald, H. G. Drexler, and R. A. Macleod. 2006. Comprehensive analysis of homeobox genes in hodgkin lymphoma cell lines identifies dysregulated expression of HOXB9 mediated via ERK5 signaling and BMI1. Blood.
15. Sohn, S. J., B. K. Sarvis, D. Cado, and A. Winoto. 2002. ERK5 MAPK regulates embryonic angiogenesis and acts as a hypoxia-sensitive repressor of vascular endothelial growth factor expression. J Biol Chem 277:43344-43351.
16. Regan, C. P., W. Li, D. M. Boucher, S. Spatz, M. S. Su, and K. Kuida. 2002. Erk5 null mice display multiple extraembryonic vascular and embryonic cardiovascular defects. Proc Natl Acad Sci U S A 99:9248-9253.
17. Wang, X., A. J. Merritt, J. Seyfried, C. Guo, E. S. Papadakis, K. G. Finegan, M. Kayahara, J. Dixon, R. P. Boot-Handford, E. J. Cartwright, U. Mayer, and C. Tournier. 2005. Targeted deletion of MEK5 causes early embryonic death and defects in the extracellular signal-regulated kinase 5/myocyte enhancer factor 2 cell survival pathway. Mol Cell Biol 25:336-345.
18. Hayashi, M., S. W. Kim, K. Imanaka-Yoshida, T. Yoshida, E. D. Abel, B. Eliceiri, Y. Yang, R. J. Ulevitch, and J. D. Lee. 2004. Targeted deletion of BMK1/ERK5 in adult mice perturbs vascular integrity and leads to endothelial failure. J Clin Invest 113:1138-1148.
19. Hayashi, M., C. Fearns, B. Eliceiri, Y. Yang, and J. D. Lee. 2005. Big mitogen-activated protein kinase 1/extracellular signal-regulated kinase 5 signaling pathway is essential for tumor-associated angiogenesis. Cancer Res 65:7699-7706.
20. Wang, X., K. G. Finegan, A. C. Robinson, L. Knowles, R. Khosravi-Far, K. A. Hinchliffe, R. P. Boot-Handford, and C. Tournier. 2006. Activation of extracellular signal-regulated protein kinase 5 downregulates FasL upon osmotic stress. Cell Death Differ.
21. Garaude, J., S. Cherni, S. Kaminski, E. Delepine, C. Chable-Bessia, M. Benkirane, J. Borges, A. Pandiella, M. A. Iniguez, M. Fresno, R. A. Hipskind, and M. Villalba. 2006. ERK5 activates NF-kappaB in leukemic T cells and is essential for their growth in vivo. J Immunol 177:7607-7617.
22. Glas, R., L. Franksson, C. Une, M. L. Eloranta, C. Ohlen, A. Orn, and K. Karre. 2000. Recruitment and activation of natural killer (NK) cells in vivo determined by the target cell phenotype. An adaptive component of NK cell-mediated responses. J Exp Med 191:129-138.
23. Hallett, W. H., and W. J. Murphy. 2006. Positive and negative regulation of Natural Killer cells: Therapeutic implications. Semin Cancer Biol 16:367-382.
24. Wodnar-Filipowicz, A., and C. P. Kalberer. 2006. Function of natural killer cells in immune defence against human leukaemia. Swiss Med Wkly 136:359-364.
25. Passweg, J. R., A. Tichelli, S. Meyer-Monard, D. Heim, M. Stern, T. Kuhne, G. Favre, and A. Gratwohl. 2004. Purified donor NK-lymphocyte infusion to consolidate engraftment after haploidentical stem cell transplantation. Leukemia 18:1835-1838.
26. Miller, J. S., Y. Soignier, A. Panoskaltsis-Mortari, S. A. McNearney, G. H. Yun, S. K. Fautsch, D. McKenna, C. Le, T. E. Defor, L. J. Burns, P. J. Orchard, B. R. Blazar, J. E. Wagner, A. Slungaard, D. J. Weisdorf, I. J. Okazaki, and P. B. McGlave. 2005. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood 105:3051-3057.
27. Howcroft, T. K., J. D. Weissman, A. Gegonne, and D. S. Singer. 2005. A T lymphocyte-specific transcription complex containing RUNX1 activates MHC class I expression. J Immunol 174:2106-2115.
28. Audit, M., J. Dejardin, B. Hohl, C. Sidobre, T. J. Hope, M. Mougel, and M. Sitbon. 1999. Introduction of a cis-acting mutation in the capsid-coding gene of moloney murine leukemia virus extends its leukemogenic properties. J Virol 73:10472-10479.
29. Gays, F., M. Unnikrishnan, S. Shrestha, K. P. Fraser, A. R. Brown, C. M. Tristram, Z. M. Chrzanowska-Lightowlers, and C. G. Brooks. 2000. The mouse tumor cell lines EL4 and RMA display mosaic expression of NK-related and certain other surface molecules and appear to have a common origin. J Immunol 164:5094-5102.
30. Suck, G. 2006. Novel approaches using natural killer cells in cancer therapy. Semin Cancer Biol 16:412-418. 
31. Fan, H. 1997. Leukemogenesis by Moloney murine leukemia virus: a multistep process. Trends Microbiol 5:74-82.
32. Kawabata, H., A. Niwa, S. Tsuji-Kawahara, H. Uenishi, N. Iwanami, H. Matsukuma, H. Abe, N. Tabata, H. Matsumura, and M. Miyazawa. 2006. Peptide-induced immune protection of CD8+ T cell-deficient mice against Friend retrovirus-induced disease. Int Immunol 18:183-198.
33. Messer, R. J., U. Dittmer, K. E. Peterson, and K. J. Hasenkrug. 2004. Essential role for virus-neutralizing antibodies in sterilizing immunity against Friend retrovirus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 101:12260-12265.
34. Reuter, T., M. Heldmann, S. Schimmer, K. Schepers, and U. Dittmer. 2004. Protection of mice against Friend retrovirus infection by vaccination with antigen-loaded, spleen-derived dendritic cells. Vaccine 22:2686-2689.
35. Akao, Y., Nakagawa Y., Kitade Y., Kinoshita T., and Naoe T. 2007. Downregulation of microRNAs-143 and -145 in B-cell malignancies. Cancer Sci 98:1914-1920.
36. Radu D.R., Lai C-Y., Jeftinija K., Rowe E.W., Jeftinja S. and Lin V.S-Y. 2004. A Polyamidoamine Dendrimer-Capped Mesoporous Silica Nonosphere-Based Gene Transfection Reagent. J. Am. Chem. Soc.126:13216-13217.
37. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science 124, 269-70 (1956).
38. Gogvadze, V., Orrenius, S. & Zhivotovsky, B. Mitochondria in cancer cells: what is so special about them? Trends Cell Biol 18, 165-73 (2008).
39. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J. & Schreiber, R. D. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-8 (2002).
40. Aptsiauri, N. et al. MHC class I antigens and immune surveillance in transformed cells. Int Rev Cytol 256, 139-89 (2007).
41. Charni, S. et al. ERK5 Knockdown generates mouse leukemia cells with low MHC class i levels that activate NK cells and block tumorigenesis. J Immunol 182, 3398-405 (2009).
42. Burnet, F. M. The concept of immunological surveillance. Prog Exp Tumor Res 13, 1-27 (1970).
43. Dunn, G. P., Koebel, C. M. & Schreiber, R. D. Interferons, immunity and cancer immunoediting. Nat Rev Immunol 6, 836-48 (2006).
44. Reitzer, L. J., Wice, B. M. & Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem 254, 2669-76 (1979).
45. Rossignol, R. et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Res 64, 985-93 (2004).
46. Whitehouse, S., Cooper, R. H. & Randle, P. J. Mechanism of activation of pyruvate dehydrogenase by dichloroacetate and other halogenated carboxylic acids. Biochem J 141, 761-74 (1974).
47. Bartrons, R. & Caro, J. Hypoxia, glucose metabolism and the Warburg's effect. J Bioenerg Biomembr 39, 223-9 (2007).
48. Wang, X. et al. Activation of extracellular signal-regulated protein kinase 5 downregulates FasL upon osmotic stress. Cell Death Differ (2006).
49. Howcroft, T. K., Weissman, J. D., Gegonne, A. & Singer, D. S. A T lymphocyte-specific transcription complex containing RUNX1 activates MHC class I expression. J Immunol 174, 2106-15 (2005).
50. Schweppe, R. E., Cheung, T. H. & Ahn, N. G. Global gene expression analysis of ERK5 and ERK1/2 signaling reveals a role for HIF-1 in ERK5-mediated responses. J Biol Chem 281, 20993-1003 (2006).
51. Sticht, C. et al. Activation of MAP kinase signaling through ERK5 but not ERK1 expression is associated with lymph node metastases in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Neoplasia 10, 462-70 (2008).
52. Garaude, J. et al. SUMOylation regulates the transcriptional activity of JunB in T lymphocytes. J Immunol 180, 5983-90 (2008).
53. van den Elsen, P. J., Holling, T. M., van der Stoep, N. & Boss, J. M. DNA methylation and expression of major histocompatibility complex class I and class II transactivator genes in human developmental tumor cells and in T cell malignancies. Clin Immunol 109, 46-52 (2003).
54. Weidemann, A. & Johnson, R. S. Biology of HIF-1alpha. Cell Death Differ 15, 621-7 (2008).
55. Kim, J. W., Tchernyshyov, I., Semenza, G. L. & Dang, C. V. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab 3, 177-85 (2006).
56. Papandreou, I., Cairns, R. A., Fontana, L., Lim, A. L. & Denko, N. C. HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption. Cell Metab 3, 187-97 (2006).
57. Gobin, S. J. & van den Elsen, P. J. Transcriptional regulation of the MHC class Ib genes HLA-E, HLA-F, and HLA-G. Hum Immunol 61, 1102-7 (2000).
58. Costes, S. V. et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys J 86, 3993-4003 (2004).
【図１】
2011520473.tif 000004
【図２】
2011520473.tif 000005
【図３】
2011520473.tif 000006
【図４】
2011520473.tif 000007
【図５】
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【図６】
2011520473.tif 000009
【図７】
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【図８Ａ】
2011520473.tif 000011
【図８Ｂ】
2011520473.tif 000012
【図９】
2011520473.tif 000013
【図１０】
2011520473.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2011520473.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2011520473.tif 000019
【図１６】
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【図１７】
2011520473.tif 000021
【図１８】
2011520473.tif 000022
【図１９−１】
2011520473.tif 000023
【図１９−２】
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【図２０】
2011520473.tif 000025
【図２１】
2011520473.tif 000026
【図２２−１】
2011520473.tif 000027
【図２２−２】
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【図２３】
2011520473.tif 000029
【図２４−１】
2011520473.tif 000030
【図２４−２】
2011520473.tif 000031
【図２５】
2011520473.tif 000032
【配列表】
2011520473000001.app
【国際調査報告】
2011520473.tif 000033
2011520473.tif 000034
2011520473.tif 000035
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2011520473.tif 000037
2011520473.tif 000038
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