(57)【要約】本発明は、水溶性ポリマーを含む改質剤に関し、前記水溶性ポリマーは少なくとも１つの反応性セレン基を有し、前記反応性セレン基はチオール基と反応可能であり、それによって-Ｓｅ-Ｓ-結合を形成する。更に、本発明は、前記改質剤を生産する方法、及び、例えばＧ-ＣＳＦのような薬学活性剤の変性におけるそれらの使用に関する。加えて、本発明は、水溶性ポリマー及び薬学活性剤を有するコンジュゲートに関し、ここで、水溶性ポリマーはＳ−Ｓｅ結合を介して薬剤に結合され、それらの生産の方法及び薬剤としてのそれらの使用に関する。最後に、本発明は、進歩性のあるコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ポリマーを含む改質剤であって、前記水溶性ポリマーは少なくとも１つの反応性セレン基を含み、該反応性セレン基はチオール基と反応することが可能であり、それにより−Ｓｅ−Ｓ−結合を形成することを特徴とする改質剤。
【請求項２】
前記反応性セレン基は、二セレン化基（−Ｓｅ−Ｓｅ−）、セレノ亜硫酸塩基（−ＳｅＳＯ３−）、セレノール基、又は、セレノアート基を含むことを特徴とする請求項１に記載の改質剤。
【請求項３】
式Ｉ又はＩＩに記述される構造を有するが、これらの式においてＰは水溶性ポリマーであり、Ｌは連結基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の改質剤。
【化１２】
2011523936.tif 000013
【請求項４】
式ＩＩＩ又はＩＶに記述される構造を有するが、ここでＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃｌ−Ｃ６アルキル基であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の改質剤。
【化１３】
2011523936.tif 000014
【請求項５】
請求項１から４に記載の改質剤を生産するプロセスであって、以下の工程を含む。
（ｉ）式Ｖの化合物を供給する工程であるが、ここでＡは官能基であり、Ｌは連結基である工程。
【化１４】
2011523936.tif 000015
（ｉｉ）活性化された水溶性ポリマーで式Ｖの化合物を反応させる工程。
（ｉｉｉ）オプションとして、工程（ｉｉ）の生成物を、スルフィトリシス反応を受けさせる工程。
【請求項６】
工程（ｉ）において、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であるところの式ＶＩの化合物が供給され、
【化１５】
2011523936.tif 000016
上記式において、であり、工程（ｉｉ）において、式ＶＩの化合物がＰＥＧ−ＮＨＳと反応することを特徴とする請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
特にポリペプチドのシスティン残基のペグ化のために、ポリペプチドのシスティン残基への水溶性ポリマーの付加のための、請求項１から４の何れかに記載の改質剤の使用。
【請求項８】
Ｇ−ＣＳＦのＣｙｓ１８がペグ化される、特にモノペグ化されることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項９】
水溶性ポリマーと、チオール基を含む薬学活性剤とを含むコンジュゲートであって、前記水溶性ポリマーは前記薬学活性剤にＳ−Ｓｅ−結合を介して連結されていることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｐは水溶性ポリマーであり、Ｌは連結基であり、Ｓｅはセレン原子であり、Ｐｅｐｔはポリペプチドであり、そして、Ｓは当該ポリペプチドのシスティン残基に属するイオウ原子であるところの式ＶＩＩによる構造を有する請求項９に記載のコンジュゲート。
【化１６】
2011523936.tif 000017
【請求項１１】
ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｌは好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＨ２−残基であり、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｓｅはセレン原子であり、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球コロニー刺激因子であり、Ｓは前記顆粒球コロニー刺激因子のシスティン残基に属するイオウ原子であるところの式ＶＩＩＩによる構造を有する請求項９又は１０に記載のコンジュゲート。
【化１７】
2011523936.tif 000018
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコール残基は前記Ｇ−ＣＳＦの前記Ｃｙｓ１８に特定的に付加されることを特徴とする請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
薬剤としての使用のための請求項９から１２項のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
好中球減少症の療法のための請求項９から１２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記療法は、骨髄抑制抗がん剤を受ける非骨髄悪性腫瘍を持つ患者において行われることを特徴とする請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項９から１２のいずれかに記載のコンジュゲートの調製のためのプロセスであって以下の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１つの遊離チオール基を有する薬学活性剤を供給する工程、及び
（ｉｉ）請求項１から４のいずれかに記載の改質剤と、前記薬学活性剤を反応させる工程。
【請求項１７】
（ａ）請求項９から１２のいずれかに記載のコンジュゲートと、（ｂ）１つ又はそれ以上の薬学的に容認される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール基と、好ましくは、-Ｓｅ-Ｓ-結合を形成するように、薬学活性剤（pharmaceutically active agent）のチオール基と、反応可能な反応性のセレン基の少なくとも１つを含むような、水溶性のポリマーを含む改質剤に関する。更に、本発明は、改質剤を製造する方法及び例えば、Ｇ-ＣＳＦのような薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の改質における前記改質剤の使用及び生産のための方法に関する。加えて、本発明は、薬剤としてのコンジュゲート（conjugates）の生産及び使用のための方法及び薬学活性剤（pharmaceutically active agent）へのＳ−Ｓｅ結合を介して結合される水溶性のポリマー並びに薬学活性剤（pharmaceutically active agent）を含むコンジュゲートに関する。最後に、本発明は進歩性のあるコンジュゲートを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数年において、遺伝子組み換えたんぱく質及びペプチドのような薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の数は劇的に増加してきた。しかしながら、これらのたんぱく質及びペプチドの多くは、短い生体内半減期、免疫原性、低いタンパク分解抵抗性、又は、低い溶解度のために、治療用途に対して適していない。これらの欠点を克服するため、種々のソリューションが適用された。これらのソリューションの１つは、水溶性ポリマー、特にポリエチレン・グリコールの付加によるたんぱく質及びペプチドの化学的改質（変性）である。このアプローチは、ペグ化として知られるが、たんぱく質の性質の改善において効果的であると証明されてきた。たんぱく質へのＰＥＧ鎖の付加は、その分子量を増加させ、かつ、生体内半減期を伸ばす。たんぱく質に包み込まれたＰＥＧ鎖は、たんぱく質に関して遮蔽効果を持ち、そして、コンジュゲートのたんぱく質分解劣化及び免疫原性が低下する。
【０００３】
ＰＥＧは、リジン残基のアミノ基及びＮ末端アミノ酸のアミノ基を介して、たんぱく質及びペプチドに最も一般的に付加される。たんぱく質の表面の上のリジンの数は通常多く、そして、そのため、リジン・アミノ基のペグ化は、位置異性体及びマルチペグ化形態との複合混合物の形成という結果になる。
【０００４】
リジン残基より典型的に生じ難いシステン残基は、部位特異的なペグ化に対する更に好ましい可能性を提供する。異なる反応基を備えるＰＥＧ試薬は、遊離チオール残基の改質のために使用されることができる。当該技術分野においては、チオール及びジスルフィド（保護されたチオール）反応基を備えるＰＥＧ試薬が提案された。しかしながら、そのようなＰＥＧ試薬は、還元環境下で容易に切断され得る、ジスルフィド結合をチオールと形成する。現在、２個の市販ＰＥＧ試薬が、上述した欠点を有するジスルフィド結合を形成することによって、たんぱく質の改質に対して利用可能である。前記試薬はＰＥＧチオール及びＰＥＧオルソピリジルジスルフィド試薬に基づいており、米国特許公開番号2005/0014903A1に記述されている。同様に、EP1586334においては、Ｇ−ＣＳＦのＣｙｓ１８のペグ化のためのプロセスが提案されている。しかしながら、このプロセスは、上述した欠点を含む-Ｓ-Ｓ-結合を有するコンジュゲートへと導く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それゆえ、本発明の目的は、少なくとも１個の遊離システイン基を含むポリペプチド等のような少なくとも１つのチオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の改質のために有利な薬剤（agent）を提供することである。好ましくは、上記改質は可逆であるべきである。
【０００６】
特に、本発明の目的は、反応時間が短くなるべく、少なくとも１つのチオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の改質のための改質剤を提供することである。加えて、改質剤の低余剰は必要であるべきである。また更に、部位特異的なペグ化が達成されるべきである。
【０００７】
本発明の更なる目的は、水溶性ポリマー及び薬学活性剤（pharmaceutically active agent）を含むコンジュゲートを生産する容易なかつ信頼性のあるプロセスを提供することであり、ここで、前記水溶性ポリマーは、前記薬学活性剤（pharmaceutically active agent）のチオール基を介して結合されるべきである。
【０００８】
一般的に、市販の入手可能なチオール反応ＰＥＧ試薬は、アルカリ性の条件下でのみ使用可能であり、ここで、たんぱく質のジスルフィド結合された二量体及び多量体の形成のような通常望ましくない副作用が生ずる。それ故、本発明の更なる目的は、アルカリ条件に比べて、反応レートがより遅いことが予期されるが、酸性の条件下においても使用され得るチオール反応性ＰＥＧ試薬を提供することである。通常、表面に露出したシステン残基を含むたんぱく質は、ジスルフィド結合された二量体及び多量体に自発的に酸化し得る。この反応は、酸性条件下で遅く、そして、進歩性のある改質剤（agent）との改質反応が酸性のｐHで起こり得るということが有利な点である。
【０００９】
最後に、本発明の目的は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のこれらの目的は、セレン基を、特に、チオール基と反応するセレン基を含む改質剤（modifying agent）を用いることによって、思いがけず解決することができたのである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
それゆえ、本発明の主題は、水溶性ポリマーを含む改質剤（agent）であり、ここで、その水溶性ポリマーは少なくとも１つの反応性セレン基を含み、その反応性セレン基はチオール基（−ＳＨ）と反応することが可能なものであり、しかして、セレン―硫黄結合（Ｓｅ−Ｓ−結合）を形成する。
【００１２】
上記改質剤（modifying agent）は、以下の２つの必要な特徴を含んでいる。
（１）水溶性ポリマーと、及び
（２）反応性セレン基である。
【００１３】
オプションとして、上記改質剤（modifying agent）は、付加的に以下を含む。
（３）連結基（linking group）、ここにおいて、通常、前記連結基は前記水溶性ポリマー及び反応性セレン基とを連結する。
【００１４】
上記各特徴（１）、（２）、及び（３）に関して、以下ようなことが述べられる。
【００１５】
水溶性ポリマー（１）は２５℃において、水に可溶である任意のポリマーである。典型的には水溶性ポリマーは、水の中で少なくとも約４０％（重量で）可溶であり、より好ましくは水の中で少なくとも約５５％（重量で）可溶であり、より好ましくは水の中で約７５％（重量で）可溶であり、特に好ましくは水の中で約９０％（重量で）可溶である。最も好ましくは、水溶性ポリマー又はセグメントが水の中で約９５％（重量）可溶であるか、或いは、水の中で完全に可溶でありことである。ここで、全ての可溶性データは２５℃でのものである。
【００１６】
前記可溶性ポリマー（１）は、例えば、線形、分枝状、多分岐状、及び、マルチアーム状等のような、種々の幾何学形状を有することができる。線形構造を有する水溶性ポリマーが好ましい。前記水溶性ポリマーは、単官能基、ホモ２官能基、及びヘテロ２官能基ポリマーを含むことができる。
【００１７】
例えば、ポリエチレン・グリコールのような水溶性ポリマー（１）は、通常、３００から１００，０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは、１０００から６０，０００ダルトン、より好ましくは、６０００から４０，０００ダルトン、特に好ましくは、１０，０００から４０，０００ダルトンの重量平均分子量を有している。好ましい実施例においては、前記ポリマーは、２０，０００から４０，０００ダルトンの範囲の分子量を有している。１個の好ましいポリマーは、約２０，０００ダルトンの分子量を有している。
【００１８】
妥当な水溶性ポリマー（１）のための例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオール（例えば、ポリエーテル・ポリオール若しくはポリエステル・ポリオール）、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレン・オキシド、セルロース、スクロース、ヒドロキシアルキル・スターチ（ＨＡＳ）、及びヒドロキシエチル・スターチ（ＨＥＳ）である。
【００１９】
好ましい実施例においては、前記水溶性ポリマーはヒドロキシアルキル・スターチ（ＨＡＳ）若しくは特にヒドロキシエチル・スターチ（ＨＥＳ）である。本発明の文脈においては、用語「ヒドロキシアルキル・スターチ」は、ヒドロキシアルキル基によって置換されたスターチ誘導体（starch derivatives）を示している。この文脈では、前記アルキル基は、置換されてもよい。好ましくは、前記ヒドロキシアルキルは、２から１０の炭素原子、より好ましくは、２から４個の炭素原子を含んでいる。それ故、「ヒドロキシアルキル・スターチ」は、好ましくは、ヒドロキシエチル・スターチ、ヒドロキシプロピル・スターチ、そして、ヒドロキシブチル・スターチを含むが、ここで、ヒドロキシエチル・スターチ及びヒドロキシプロピル・スターチが好ましい。ＨＡＳのヒドロキシアルキル基は、少なくとも１つのＯＨ基を含んでいる。「ヒドロキシアルキル・スターチ」との表現は、各誘導体をも含み、前記アルキル基は一置換若しくは多置換される。この文脈において、前記ＨＡＳが水に可溶であるとすれば、前記アルキル基は、ハロゲン、特にフッ素、で置換されるか、若しくは、アリール基で置換されることが好ましい。更にまた、ヒドロキシアルキルの末端ヒドロキシ基は、エステル化されるか若しくはエーテル化されてもよい。また、ヒドロキシアルキル・スターチのアルキル基は、線形若しくは分岐されてもよい。更に、アルキルの代わりに、線形若しくは分岐した、置換若しくは非置換のアルケン基が使用されてもよい。
【００２０】
ヒドロキシエチル・スターチ（ＨＥＳ）は、本発明の文脈において、好ましいＨAＳである。このヒドロキシエチル・スターチ（ＨＥＳ）は、自然に生ずるアミロペクチンの誘導体であり、体内においてα―アミラーゼによって劣化される。ＨＥＳ−タンパク質―コンジュゲートの調製は、現在の技術において記述されている（例えば、ＤＥ２６１６０８６若しくはＤＥ２６４６８５４におけるＨＥＳ−ヘモグロビン―コンジュゲートを参照）。ＨＥＳは、単位重量あたり９５％までの濃度で、コーン・スターチ内に存在する、炭水化物ポリマー・アミロペクチンの置換された誘導体である。ＨＥＳは、有利な生物学的な性質を示し、クリニックにおいて血液希釈治療において、そして、血液量の置換薬剤（bloodvolume replacement agent）として使用される。アミロペクチンは、ぶどう糖部分（glucose moieties）から構成され、ここで、主たる鎖において、α−１，４−グリコシド結合（α-1,4-glycosidic bonds）が存在し、分岐部分においてはα−１，６−グリコシド結合（α-1,6-glycosidic bonds）が見出される。この分子の物理化学的性質は、グリコシド結合のタイプによって主に決定される。ギザギザのα−１，４−グリコシド結合のため、一回転あたりの約６個のグルコース単量体を備える螺旋構造体が生産される。
【００２１】
本発明の文脈において、ヒドロキシエチル・スターチは、１−３００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有してもよいが、ここで、５−１００ｋＤａの平均分子量がより好ましい。ヒドロキシエチル・スターチは、更に、ヒドロキシエチル基に対して、０．１から０．８のモル置換度、及び、Ｃ２対Ｃ６−置換の比を２−２０の範囲内に示すことができる。
【００２２】
より好ましい実施例において、前記水溶性ポリマーは、ポリアルキレン・オキシド、特にポリエチレン・グリコール（これ以降、ＰＥＧと称する）である。ここで使用されるような「ＰＥＧ」若しくは「ポリエチレン・グリコール」は、２つの以下の構造：「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」又は「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」のいずれか１つを含む。変数「ｎ」は、３から４０００、好ましくは、１０から３５００、より好ましくは、５５から２５００、一層より好ましくは、８０から１５００、特に好適には、１５０から９００の範囲に亘っている。もしＰＥＧが分岐される場合には、上記−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−鎖は、１又はそれ以上の分岐単位で、中断され得る。
【００２３】
前記ＰＥＧ残基は、例えば、単官能基の、二官能基の、又は、多官能基のもので在り得る。ＰＥＧが単官能基である（このことは好ましい）場合には、ＰＥＧ残基は、末端キャップ部分（end-capping moiety）Ｒを含むが、このとき、ＰＥＧが、Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−となる。ここで、Ｒは、例えば水素、水酸基、又は、Ｃ１−Ｃ２０のアルコキシル基となり得る。好ましくは、Ｒは、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、又は、ベンジルオキシ基であるが、メトキシ基が特に好適である。
【００２４】
更に、ＰＥＧは、線形及び分岐される得る。もしＰＥＧが分岐するならば、上述した線形構造は、分岐ユニットによって中断される。
【００２５】
一般的に、反応性セレン基（２）は、従来の条件下において、実用的な速度又は直ちに反応する任意のセレン基である。本発明において、反応性セレン基（２）は、チオール基（−ＳＨ）と反応することが可能であり、それによって、Ｓｅ−Ｓ結合を形成する。
【００２６】
好ましい実施例において、反応性セレン基（２）は、二セレン（diselenide）化基（−Ｓｅ−Ｓｅ−）、セレノ亜硫酸塩（selenosulfide）基（−ＳｅＳＯ３−）、セノール（selenol）基（−ＳｅＨ）、又は、セレノアート（selenoate）基（−Ｓｅ-）を含む。より好ましくは、反応性セレン基（２）は、二セレン化基（−Ｓｅ−Ｓｅ−）、又は、セレノ亜硫酸塩基（−ＳｅＳＯ３−）を含む。
【００２７】
オプションとして、本発明の改質剤（modifying agent）は更に連結基（linking group）（３）を更に含む。用語「連結基（linking group）」は、相互に結合する部分（interconnecting moieties）を連結するために、好ましくは水溶性ポリマーと反応性セレン基とを連結するために、オプションとして使用される原子又は原子の集合体を意味するようにここでは使用される。本発明の連結基は、好ましくは、加水分解に対して安定である。
【００２８】
通常、連結基は、１から１０個の橋架け原子、好ましくは、２から６個の橋架け原子を含むが、ここで、これらの橋架け原子は、オプションとして、例えばアルキル又はアルコキシ残基のような側鎖を含んでもよい。
【００２９】
適切な連結基の例は、-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＯＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-、-ＣＯ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＯ-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-、-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ２-、及び、上述の任意の２個若しくはそれ以上の組み合わせである。
【００３０】
好ましくは、連結基は-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨＲ-ＣＨ２-であり、ここで、Ｒは、水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、特にＲは水素又はカルボキシル基である。
【００３１】
本発明の好適な実施例の主題は、以下の式Ｉ又はＩＩに記述されたような構造を有する改質剤（modifying agent）である。
【化１】
2011523936.tif 000002
【００３２】
ここで、上式において、Ｐは水溶ポリマーであり、そして、Ｌは連結基である。好ましくは、Ｐ及びＬは、上述したように、夫々水溶性ポリマー及び連結基から選択される。特に、ＰはＰＥＧ残基であり、そして、Ｌは-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨＲ-ＣＨ２-であるが、ここで、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基のいずれかであり、特に、Ｒは水素又はカルボキシル基である。
【００３３】
上述したように、水溶性ポリマーは、二官能基、又は、多官能基のものであり得る。従って、本発明の主題は、また、式Ｉａ又はＩＩａにおいて記述されるような構造を有する改質剤（modifying agent）でもある。
【化２】
2011523936.tif 000003
【００３４】
上記式において、Ｐは水溶性ポリマーであり、Ｌは連結基であり、そして、ｎは２から１０の数である。好ましくは、Ｐ及びＬは、上述したように、夫々、水溶性ポリマー及び連結基から選択される。また、ｎは、好ましくは２、３、又は４であり、特に、２が好ましい。特に、ＰはＰＥＧ残基であり、Ｌは−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＨ２−であるが、ここで、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、特に、Ｒは水素又はカルボキシル基である。
【００３５】
本発明の特に好ましい実施例の主題は、式ＩＩＩ又はＩＶにおいて記述されているような構造を有する改質剤（modifying agent）である。
【化３】
2011523936.tif 000004
【００３６】
上記式において、ＰＥＧはポリエチレン・グリコールであり、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基である。ＰＥＧの上述した好ましい実施例（例えば、分子量、末端キャップ基（end-capping groups））は、また化学式ＩＩＩ及びＩＶにおけるＰＥＧに対して適用する。
【００３７】
本発明の更なる主題は、上述する進歩性のある改質剤（modifying agents）を生産するためのプロセスでもある。
【００３８】
従って、本発明は、進歩性のある改質剤（modifying agent）を生産するためのプロセスを含み、以下の工程を含む。
（ｉ）式Ｖの化合物を供給する工程、
【化４】
2011523936.tif 000005
【００３９】
ここで、Ａは官能基であり、そして、Ｌは連結基である。
（ｉｉ）活性化された水溶性ポリマーと、式Ｖの化合物とを反応させる工程、そして
（ｉｉｉ）オプションとして、工程（ｉｉ）の生産物がスルフィトリシス反応（sulfitolysis reaction）を受ける工程。
【００４０】
工程（ｉｉ）の結果である生成物は、化学式Ｉ、Ｉａ、及びＩＩＩによるそれぞれの化合物に対応する。付加的な反応工程（ｉｉｉ）の結果である生成物は、化学式ＩＩ、Ｈａ、及び、ＩＶによるそれぞれの化合物に相当する。
【００４１】
進歩性のあるプロセスの工程（ｉ）において、式Ｖによる化合物が生成される。式Ｖよる化合物は、二セレン化結合、２つの連結基Ｌ、及び２つの官能基Ａを含む。
【００４２】
連結基Ｌに関しては、上述した好ましい実施例に言及される。好ましくは、連結基は-ＣＨＲ-ＣＨ２-であり、ここでＲは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１-Ｃ６アルキル基であり、特に、水素又はカルボキシル基である。
【００４３】
官能基Ａは、活性化された水溶性ポリマーと反応可能であり、そして、好ましくは安定な連結を形成することができる。官能基Ａは、好ましくは、アミノ基、ヒドロキシル基、及び、カルボキシル基から選択される。最も好ましくは、官能基Ａは、第一級アミノ基で、即ち、Ａは-ＮＨ２である。
【００４４】
式Ｖによる化合物は、「活性化された水溶性ポリマー」と工程（ｉｉ）において反応する。用語の活性化された水溶性ポリマーは、上記定義された如何なる水溶性ポリマーをも含み、式Ｖの上記定義された官能基Ａと反応可能である１つ又はそれ以上の基を含む。反応基に対する例は、Ｎ-ヒドロキシこはく酸イミドエステル（N-hydroxy-succinimide esters）、ジクロロトリアジン（dichlorotriazine）、トレシレート（tresylate）、スクシンイミジル炭酸塩（succinimidyl carbonate）、ベンゾトリアゾール炭酸塩（benzotriazole carbonate）、ｐ-ニトロフェル炭酸塩（p-nitrophenyl carbonate）、トリクロロフェル炭酸塩（trichlorophenyl carbonate）、カルボニルイミダゾール（carbonilimidazole）、イソシアネート（isocyanate）、イソチオシアネート（isothiocyanate）、及び、アルデヒド反応基（aldehyde reactive group）である。
【００４５】
好ましくは、工程（ｉｉ）において、活性化されたＰＥＧが使用され、即ち、Ｎ-ヒドロキシこはく酸イミドエステル（N-hydroxysuccinimide esters）、ジクロロトリアジン（dichlorotriazine）、トレシレート（tresylate）、スクシンイミジル炭酸塩（succinimidyl carbonate）、ベンゾトリアゾール炭酸塩（benzotriazole carbonate）、ｐ-ニトロフェル炭酸塩（p-nitrophenyl carbonate）、トリクロロフェル炭酸塩（trichlorophenyl carbonate）、カルニルイミダゾール（carbonilimidazole）、アルデヒド反応基（aldehyde reactive group）を持つＰＥＧ試薬が使用される。特に、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル残基（N-hydroxysuccinimide ester residue）で活性化されるポリエチレン・グリコール（polyethylene glycol）（以降ＰＥＧ-ＮＨＳと称する）が用いられる。
【００４６】
好ましい実施例に関して、以下の点が指摘される。式Ｖの官能基Ａがアミノ基である場合、「活性化された水溶性ポリマー」（好ましくは、活性化されたＰＥＧ）は１つ又はそれ以上のアミノ反応性基（amino-reactive groups）を含む。もし「Ａ」がカルボキシル基であれば、「活性化された水溶性ポリマー」は１つ又はそれ以上のヒドラジド基（hydrazide groups）を含む。もし「Ａ」がヒドロキシル基であれば、「活性化された水溶性ポリマー」は１つ又はそれ以上のイソシアネート基（isocyanate groups）を含んでいる。上述の代わりとして、反対のアプローチもまた可能である。即ち、活性化された水溶性ポリマー（好ましくは、活性化されたＰＥＧ）は、アミノ基、ヒドロキシル基、又は、カルボキシル基を持ち、そして、「Ａ」は、活性化された水溶性ポリマーに対して上述したように適した官能基である。
【００４７】
故に、工程（ｉ）における進歩性のあるプロセスの好ましい実施例においては、式ＶＩによる化合物が生産される。
【化５】
2011523936.tif 000006
【００４８】
ここで、上記の式において、Ｒは水素又はカルボキシル基であり、工程（ｉｉ）において、式ＶＩによる化合物はＰＥＧ-ＮＨＳと反応する。式ＶＩによる化合物は、式Ｖによる化合物のより特定的な実施例である。
【００４９】
セレノシステイン（selenocystine）（Ｒ＝ＣＯＯＨ）又はセレノシスタミン（selenocystamine）（Ｒ＝Ｈ）は、式ＶＩによる化合物として使用されることが特に好ましい。
【００５０】
カップリング反応（ｉｉ）は、水溶液又は非水溶液内においてなされ得る。ｐＨは、６から１０の範囲に亘り、好ましくは、７．５から８．５の範囲に亘ってよい。その反応は、例えば、１０から５０℃で、好ましくは２０から３０℃で、なされ得る。その反応時間は、例えば、１時間から２０時間の間で変化するかもしれない。
【００５１】
セレノシスタミン（selenocystamine）は、水溶液内において容易に分解するが、例えば１Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）のアルカリ溶液によって、セレノシスタミン（selenocystine）の遅い分解速度が好ましくは増加可能である。しかしながら、ＰＥＧ-ＮＨＳとの反応に対しては、溶液のｐＨは減少させらなければならない。カップリング反応が終了すると、残滓セレノシステイン（residual selenocystine）は、限外濾過（ultrafiltration）によって、又は、有機相抽出によって、混合物から除去可能である。後者は、固体の形態でＰＥＧ混合物の分離を提供する。一般に、非反応のＰＥＧ-ＮＨＳは、時間と共に加水分解し非反応性形態となるため、除去される必要はない。二置換のセレノシステイン（disubstituted selenocystine）又はセレノシスタミン（selenocystamine）の量は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）によって、又は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって定性的に見積もることができる。工程（ｉｉ）の反応生成物質（以降（ＰＥＧ-Ｓｅ）２とも称する）が出発物質（ＰＥＧ-ＮＨＳ）の２倍の大きさであるので、両方法が適用可能である。
【００５２】
反応工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む好ましい実施例は、以下に示される反応スキームにより図解される。
【化６】
2011523936.tif 000007
【００５３】
ここで、Ｒは好ましくはＨ又はＣＯＯＨである。
【００５４】
付加的な反応工程（ｉｉｉ）において、二セレン化基（diselenide group）を含む改質剤（modifying agent）は、セレノ亜硫酸塩基（selenosulfite group）を含む改質剤（modifying agent）を生じるように反応させられ得る。
【００５５】
反応（ｉｉｉ）は、いわゆるスルフィトリシス（sulfitolysis）である。この反応工程（ｉｉｉ）を実行するために、スルフィトリシス試薬（sulfitolysis reagents）が使用され得る。適切なスルフィトリシス試薬（sulfitolysis reagent）は、Ｎａ２ＳＯ３及びＮａ２Ｓ４Ｏ６を混合することによって調整されてもよい。この反応は、水溶液内で実施可能である。この溶液は好ましくは緩衝される。ｐＨは、７から１０、好ましくは８から９の範囲になってもよい。この反応は、例えば、１０から５０℃、好ましくは２０から３０℃で行われ得る。反応時間は、例えば、１時間から２０時間の間で変化するかもしれない。
【００５６】
単量体型（＝ＰＥＧ・ＳｅＳＯ３-）の形成は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタ可能である。反応が終了すると、低分子量試薬は、限外濾過（ultrafiltration）によって除去し得る。
【００５７】
反応工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む好ましい実施例は、以下に示される反応スキームによって図解される。
【化７】
2011523936.tif 000008
【００５８】
ここで、Ｒは好ましくはＨ又はＣＯＯＨである。
【００５９】
改質剤（modifying agents）の双方の形態（２量体的なもの、即ち工程（ｉｉ）の反応生成物並びに単量体的なもの、即ち工程（ｉｉｉ）の反応生成物）は、例えばＰＥＧ―ＮＨＳ試薬のような活性化された水溶性ポリマーの未反応分と関連する不純物を含んでもよい。これらの不純物は、例えばチオール含有タンパク質のようなチオール含有活性薬剤（thiol containing active agents）のペグ化反応のような、抱合反応（conjunction reaction）において、干渉しないので、除去される必要がない。
【００６０】
オプションとして、未反応の活性化された水溶性ポリマーは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー若しくは逆相クロマトグラフィーから選択されるように、異なるクロマトグラフィー技術を用いることによって除去可能である。セレンノシスティン（selenocystine）から調整された二量体Ｓｅ―ＰＥＧ試薬、及び、単量体Ｓｅ―ＰＥＧ試薬の場合、イオン交換クロマトグラフィーは、負電荷の存在のため、使用され得る。セレノシスタミン（selenocystamine）から調製された二量体Ｓｅ―ＰＥＧ試薬は、サイズ排除クロマトグラフィー若しくは逆相クロマトグラフィーによって効果的に精製され得る。
【００６１】
本発明の改質剤（modifying agents）は、チオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）に、好ましくはポリペプチドのシステイン残基に、水溶性ポリマーを付加するために使用され得る。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合、改質剤（modifying agent）は、チオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）のペグ化のため、特にポリペプチドのシステイン残基のペグ化のために、使用され得る。好ましくは、本発明の改質剤（modifying agent）はＧ−ＣＳＦのペグ化のために使用されるが、ここで、特にＧ−ＣＳＦのＣｙｓ１８がペグ化され、より詳しくはモノペグ化される。
【００６２】
その結果、本発明の主題は、チオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）及び水溶性ポリマーを更に含むコンジュゲート（conjugate）であるが、ここで、水溶性ポリマーは薬学活性剤（pharmaceutically active agent）にＳ−Ｓｅ結合を介して連結される。
【００６３】
故に、本発明の更なる主題は、本発明のコンジュゲート（conjugate）の調製のためのプロセスでり、以下の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１つの遊離チオール基（free thiol group）を持つ薬学活性剤（pharmaceutically active agent）を供給し、そして、
（ｉｉ）前記薬学活性剤（pharmaceutically active agent）を本発明による改質剤（modifying agent）と反応させる。
【００６４】
このことは、遊離チオール基を持つアミノ酸、ペプチド、又は、タンパク質のようなチオール基を含む薬学活性剤（pharmaceutically active agent）が、進歩性のある改質剤（modifying agents）と反応できることを意味する。この反応によって、以下のスキームに図解されるように、セレニルスルフィド結合（selenylsulfide bond）を介して、共有結合が形成される。
【化８】
2011523936.tif 000009
【００６５】
Ａは薬学活性剤（pharmaceutically active agent）、好ましくは、遊離システイン残基を有するポリペプチドである。
【００６６】
水溶性ポリマーが二官能基の又は多官能基の場合、類似の反応が生ずるかもしれない。以下の反応スキームを参照。
【化９】
2011523936.tif 000010
【００６７】
Ａは、薬学活性剤（pharmaceutically active agent）、好ましくはポリペプチド、であり、遊離システイン残基を持つ。ｎは自然数であり、好ましくは２から１０であり、より好ましくは２、３、又は、４である。
【００６８】
一般に、用語「薬学活性剤（pharmaceutically active agent）」は、インビボ又はインビトロにおいて実証でき得る薬理学的な、好ましくは有益な、効果を提供する如何なる薬剤、薬、化合物、組成物、又は、混合物を意味する。
【００６９】
薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の一般的な例は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体及び抗体の誘導体、多糖類、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、電解質、及び、それらの混合物である。
【００７０】
アスパラギナーゼ（aspariginase）、アムドキソビル（amdoxovir）（ＤＡＰＤ）、べカプレミン（becaplermin）、ビスホスホネート（bisphosponates）、カルシトニン（calcitonins）、シアノビリン（cyanovirin）、デニロイキン（denileukin）、ジフチトクス（diftitox）、エリスロポエチン（erythropoietin）（ＥＰＯ）、赤血球生成刺激剤（erythropoiesis stimulating protein）（ＮＥＳＰ）、例えば、因子Ｖ（Factor V）、因子ＶＩＩ（Factor VII）、因子ＶｉＩａ（Factor VIIIa）、因子ＶＩＩＩ（Factor VIII）、因子ＩＸ（Factor IX）、因子Ｘ（Factor X）、因子ＸＩＩ（Factor XII）、因子ＸＩＩＩ（Factor XIII）、ヴォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor）のような凝固因子（coagulation factors）、セレデース（cere-dase）、セレザイム（cerezyme）、アルファグルコシダーゼ（alpha-glucosidase）、コラーゲン（collagen）、スクロスポリン（cyclosporin）、アルファ・ディフェンシンス（alpha defensins）、ベータ・ディフェンシンス（beta defensins）、エキセンディン・フォー（exedin-4）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte colony stimulating factor）（Ｇ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（thrombopoietin）（ＴＰＯ）、アルファ・ワン・プロテナーゼ・インヒビター（alpha-1 proteinase inhibitor）、エルカトニン（elcatonin）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor）（ＧＭ−ＣＳＦ）、フィブリノゲン（fibrinogen）、卵胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone）（ＦＳＨ）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone）（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（growth hormone releasing hormone）（ＧＨＲＨ），ＧＲＯ−ベータ（GRO-beta）、ＧＲＯ−ベータ抗体（GRO-beta antibody）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor）、ＣＤ−４０リガンド（CD-40 ligand）、へパリン（heparin）、ヒト血清アルブミン（human serum albumin）、例えばインターフェロン・アルファ（interferon alpha）、インターフェロン・ベータ（interferon beta）、インターフェロン・ガンマ（interferon gamma）、インターフェロン・オメガ（interferon omega）、インターフェロン・タウ（interferon tau）、コンセンサスインターフェロン（consensus interferon）のようなインターフェロン（interferons）、例えばインターロイキン−１・レセプター（interleukin-1 receptor）、インターロイキン−２（interleukin-2）、インターロイキン−２融合タンパク質（inter-leukin-2 fusion proteins）、インターロイキン−１レセプター・アンタゴニスト（interleukin-1 receptor antagonist）、インターロイキン−３（interleukin-3）、インターロイキン−４（interleukin-4）、インターロイキン−４・レセプター（interleukin-4 receptor）、インターロイキン−６（interleukin-6）、インターロイキン−８（interleukin-8）、インターロイキンー１２（interleukin- 12）、インターロイキン−１３・レセプター（interleukin-13 receptor）、インターロイキン−１７・レセプター（interleukin- 17 receptor）のようなインターロイキン・レセプター（interleukin receptors）やインターロイキン（interleukins）、インシュリン（insulin）、低分子量へパリン（low molecular weight heparin）（ＬＭＷＨ）、プロインシュリン（pro-insulin）、インフルエンザ・ワクチン（influenza vaccine）、インシュリンのような成長因子（insulin-like growth factor）（ＩＧＦ）、インシュリントロピン（insulintropin）、マクロファージ・コロニー刺激因子（macrophage colony stimulating factor）（Ｍ−ＣＳＦ）、モノクローナル抗体（monoclonal antibodies）、例えばアルテプラーゼ（alteplase）、ウロキナーゼ（urokinase）、レテプラーゼ（reteplase）、ストレプトキナーゼ（streptokinase）、パミテプラーゼ（pamiteplase）、ラノテプラーゼ（lanoteplase）及びテネテプラーゼ（teneteplase）のようなプラスミノゲン活性化因子（plasminogen activators）、神経成長因子（nerve growth factor）（ＮＧＦ）、オステオプロテジェリン（osteoprotegerin）、血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor）、組織成長因子（tissue growth factors）、トランスフォーミング成長因子−１（transforming growth factor-1）、血菅内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor）、白血病抑制因子（leukemia inhibiting factor）、ケラチン化成長因子（keratinocyte growth factor）（ＫＧＦ）、グリアル成長因子（glial growth factor）（ＧＧＦ）、Ｔ−細胞レセプター（T-cell receptors）、ＣＤ分子／抗原（CD molecules/antigens）、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor）（ＴＮＦ）、球送化性タンパク質−１（monocyte chemoattractant protein-1）、血菅肉皮増殖因子（endothelial growth factors）、上皮小体ホルモン（parathyroid hormone）（ＰＴＨ），又は、それらの混合物である。上述した活性化剤は、遊離チオール基を含むか、又は、それらが遊離チオール基を含むようなやり方で改質されることが必要である。「遊離チオール基」は、ジスルフィド結合を介して他のチオール基に連結されていないチオール基（−ＳＨ）を意味する。
【００７１】
抗体のための例としては、例えばＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ（trastuzumab））、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ（bevacizumab）），ＥＧＦ（例えば、セツキシマブ（cetuximab）），ＣＤ２０（例えば、リツキマブ（rituximab））、ＴＮＦ（例えば、インフリキシマブ（infliximab）、アダリムマブ（adalimumab））に対する抗体が知られている。抗体の誘導体のための例も知られており、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質（immune globulin Fc fusion proteins）（例えば、エタネルセプト（etanercept））、又は、Ｆａｂフラグメント（Fab fragments）（例えば、ラニミズマブ（ranibizumab））を有している。
【００７２】
好ましくは、薬学活性剤（pharmaceutically active agents）は、好ましくはポリペプチドのシステイン残基に属する、少なくとも１つの遊離チオール基を備えるポリペプチドである。このことは、チオール基は、自然に存在する不対システィン残基に属し得るが、タンパク質構造に化学的に若しくは遺伝子的に導入され得ることを意味する。その代わりとして、遊離チオール基は、タンパク質のジスルフィド結合の還元によっても達成可能である（もし、このジスルフィド結合がタンパク質の望ましい生物学的な活性度のために必要でないならば）。
【００７３】
好ましいポリペプチドの例は、ＥＰＯ、ＩＦＮ−［アルファ］、ＩＦＮ−［べータ］、ＩＦＮ−［ガンマ］、コンセンサス（consensus）ＩＦＮ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、インシュリン、ＦＳＨ、ＰＴＨ、又は、それらの混合物である。特にＧ−ＣＳＦが好ましい。その代わりとして、ＥＰＯが特に好ましい。
【００７４】
一般的に、本発明は、一次構造的形態（即ち、アミノ酸残基の連続的な配列）の一部又は全てと、１又はそれ以上の生物的な性質（例えば、免疫的性質及びインビトロ生物的活性）及び物理的な性質（例えば、分子量）とを有する精製され単離されたポリペプチドを好ましくは用いる。これらのポリペプチドは、遺伝子合成によって、又は、ゲノムの若しくはｃＤＮＡのクローニングによって、得られる外因性のＤＮＡ配列の原核生物若しくは真核生物宿主発現（procaryotic or eucaryotic host expression）（例えば、培養液中のバクテリア、イースト、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞によって）の化学的な合成方法の生産物であることによっても特徴付けられる。典型的なイースト（例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccaromyces cerevisiae））、若しくは、プロカリオート（procaryote）［例えば、エシェリキア（Escherichia coli）（大腸菌）］ホスト細胞の生成物は、如何なる哺乳動物のタンパク質とも関連していない。脊椎動物（例えば、ヒトでない哺乳類及び鳥類）細胞における微生物発現の生産物は、如何なるヒトタンパク質と関連していない。用いられるホストに依存して、本発明に使用されるポリペプチドは、哺乳動物若しくは他の真核性の炭水化物とグリコシル化されてもよく、又は、非グリコシル化されてもよい。本発明のポリペプチドは、イニシャル・メチオニン・アミノ酸残基（initial methionine amino acid residue）（位置−１における）を含んでもよい。
【００７５】
特に、大腸菌内において生産される遺伝子組換えヒトグラニュロシティコロニー刺激因子（recombinant human granulocyte-colony stimulating factor）（Ｇ−ＣＳＦ）が使用される。好ましいＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示される。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示されるアミノ酸配列は、好ましくはグリコシル化されておらず、フィルグラスチム（Filgrastim）として市販されている。その代わりとして、特に真核生物宿主発現によって生ずる遺伝子組換えヒトグラニュロシティコロニー刺激因子（recombinant human granulocyte-colony stimulating factor）（Ｇ−ＣＳＦ）が使用される。この好ましい実施例のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ１が存在しないならば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１において示されるものと同じである。加えて、この好ましい実施例のポリペプチドは、グリコシル化され、レノグラスチム（Lenograstim）として市販される。
【００７６】
さらに好ましい実施例において、エリスロポエチン（erythropoietin）（ＥＰＯ）及びその誘導体も使用されてよい。そのようなＥＰＯは、当該技術分野において周知である。エリスロポエチン（Erythropoietin）は、約３４ｋＤａの酸性グリコプロテインホルモン（acid glycoprotein hormone）である。ヒトエリスロポエチン（Human erythropoietin）は、単量体として自然に存在する１６６アミノ酸ポリペプチドである（Lin et al., 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP148605 B2, EP411678 B2）。
【００７７】
本発明の文脈において使用されるＥＰＯは、如何なるヒト由来若しくは他の哺乳類由来であり得るが、ヒトの腎臓、胚ヒト肝臓（embryonic human liver）、又は、動物、好ましくは猿の腎臓、のような自然に生ずる源から精製により得る事ができる。好ましくは、ＥＰＯは遺伝子組み換え的に生産される。これは、真核生物若しくは原核生物細胞、好ましくは哺乳類、昆虫、イースト、植物、バクテリア細胞内における、或いは、ＥＰＯの遺伝子組換え生産物のために便利である如何なる他の細胞タイプ内における生産物を含んでいる。また、ＥＰＯは、トランスジェニック動物（transgenic animals）内において（例えば、乳液、血液等の体液内において）、特に家禽類、好ましくは鶏のような、トランスジェニック鳥類の卵内において、或いは、トランスジェニック植物若しくは藻類において、発現するかもしれない。
【００７８】
ＥＰＯは、Ｎ−及び／又はＯ−連結のグリコシル化を介して、即ちＥＰＯはグリコシル化されるが、ＥＰＯに付加される１つ又はそれ以上の炭酸塩の側鎖（好ましくは、１から４、好ましくは４）を含んでもよい。通常、ＥＰＯが真核生物細胞内で生産される際、ポリペプチドは翻訳後に（posttranslationally）グリコシル化される。その結果、炭酸塩側鎖は、哺乳類、特にヒト、昆虫、植物、又は、イースト細胞内の生合成中に、ＥＰＯに付加されたかもしれない。
【００７９】
ポリペプチドの遺伝子組換え生産は当該技術分野において公知である。一般に、これは、適切な発現ベクターを備えるホストセルのトランスフェクション、ポリペプチドの生産を可能にする条件下におけるホストセルの培養、及び、ホストセルからのポリペプチドの精製、を含む。
【００８０】
特に、ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有してもよい（EP148605B2参照）。また、「エリスロポエチン（erythropoietin）」又は「ＥＰＯ」という表現は、ＥＰＯ変異体をも包含するが、ここにおいて、１つ又はそれ以上のアミノ酸（例えば、１から２５、好ましくは１から１０、より好ましくは１から５、最も好ましくは１から２）がヒトＥＰＯの配列に比べて他のアミノ酸によって交換され、そして、ＥＰＯはエリスロポエチン活性（erythropoietic activity）を示している（EP640619Blを参照）。
【００８１】
エリスロポエチン活性度の測定は、当該技術分野において記述されている（インビトロにおける活性度の測定に対しては、例えば、Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff；インビボにおけるＥＰＯ活性度の測定に対しては、例えば、Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl. , 1995, N-and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36；（ＥＰＯ及び改質ＥＰＯは雌のＮＭＲＩマウスの中に１日目、２日目、３日目において注入され（タンパク質５０ｎｇ／マウス等量）、血液サンプルが４日目において取得されて、さらに網状赤血球が決定された））。
【００８２】
一般に、ポリペプチドの上述した例は、類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター、異性体、及び、それらの薬学的に容認される塩の形態を包含することができる。また、上述したポリペプチドは、少なくとも１つの遊離チオール基が存在するとすれば、合成の、遺伝子組換えの、天然の、グリコシル化された、及び、非グリコシル化された形態、並びに、生物学的に活性なそれらのフラグメントを包含する。
【００８３】
用語「生物学的に活性な」特に「生物学的に活性なフラグメント」の意味は、当業者によって理解される。特に、フラグメント若しくは誘導体は、もし親の分子の生物学的な活性の質を保持するならば、たとえ、そのような活性が増加又は減少したとしても、生物学的に活性であると考慮される。より詳しくは、生物学的に活性であることは、フラグメント若しくは誘導体が、適切な投与量において投与されるならば、治療的に効果が当然あることを意味する。
【００８４】
その結果、本発明の好ましい実施例の主題は、式ＶＩＩによる構造を有するコンジュゲートである。
【化１０】
2011523936.tif 000011
【００８５】
ここで、上式において、Ｐは水溶性ポリマーであり、Ｌは連結基であり、Ｓｅはセレン原子であり、Ｐｅｐｔはポリペクチドであり、そして、Ｓはそのポリペプチドのシステイン残基に属するイオウ原子である。Ｐ、Ｌ、及び、Ｐｅｐｔに関しては、好ましい実施例に対して与えられた説明が参照される。
【００８６】
特定の好ましい実施例においては、本発明は、式ＶＩＩＩによる構造を有するコンジュゲートに関する。
【化１１】
2011523936.tif 000012
【００８７】
上述した式において、ＰＥＧは、ポリエチレン・グリコールであり、Ｌは連結基で、好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＨ２−残基であるが、ここで、Ｒは水素、カルボキシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、そして、Ｓｅはセレン原子であり、Ｇ−ＣＳＦは顆粒コロニー刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor）であり、更にＳは顆粒コロニー刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor）のシステイン残基に属するイオウ原子である。式ＶＩＩＩにおいて、「Ｇ−ＣＳＦ」は、好ましくは大腸菌内で生産される遺伝子組み換えヒト顆粒コロニー刺激因子（human granulocyte-colony stimulating factor）（Ｇ−ＣＳＦ）である。好ましいＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は図８に示される。その代わりとして、レノグラスチム（Lenograstim）として知られるＧ−ＣＳＦが使用可能である。
【００８８】
式ＶＩＩＩにおいて「Ｓ」は、Ｇ−ＣＳＦのＣｙｓ１８残基のイオウ原子であることが特に好ましい。故に、Ｃｙｓ１８においてモノペグ化されたＧ−ＣＳＦが特に好ましい。
【００８９】
進歩性のあるコンジュゲートは、薬剤として使用可能である。従って、本発明の更なる主題は、薬剤としての使用のための進歩性のあるコンジュゲートである。
【００９０】
好ましい実施例においては、進歩性のあるコンジュゲートは、好中球減少症（neutropenia）の治療のために使用される。特に、この治療は、骨髄抑制抗がん剤（myelosuppressive anti-cancer drugs）を受ける非骨髄悪性腫瘍（non-myeloid malignancies）を持つ患者において行われる。
【００９１】
上述で議論したように、本発明は、また本発明のコンジュゲートの調製のためのプロセスに関し、以下の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１つの遊離チオール基を有する薬学活性剤（pharmaceutically active agents）を供給し、そして、
（ｉｉ）前記薬学活性剤（pharmaceutically active agents）を、本発明による改質剤（modifying agent）と反応させる（コンジュゲート反応）。
【００９２】
抱合反応（conjugation reaction）は、水溶液内ですることができる。水溶液は、好ましくは緩衝される。ｐＨは３から１０、好ましくは６から９の範囲であってもよい。その反応は、例えば、２から５０℃、好ましくは２０から３０℃の範囲で実施可能である。一般に、抱合反応（conjugation reaction）は、実質的にそれ以上のコンジュゲート反応が生じなくなるまで進行することが許容されるが、これは、時間をかけて反応の進行をモニターすることにより一般に決定されることができる。反応の進行は、種々の時点における反応混合物からのアリコート（aliquots）を抜き出し、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、反応混合物を分析すして、モニタすることができる。反応時間は、１時間から５０時間、好ましくは１０時間から２５時間の範囲で変化するかもしれない。
【００９３】
本発明の上記プロセスにおいて、水溶性ポリマー及び薬学活性剤（pharmaceutically active agent）の好ましい実施例についで上述されてきた全てのコメントが適用される。好ましくは、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、活性剤はＧ−ＣＳＦである。
【００９４】
遊離チオール基のペグ化に対して、好ましくは前記チオール基は、本発明の改質剤（modifying agent）との反応を許容するように、充分に露出されなければならない。Ｇ−ＣＳＦにおいて、Ｃｙｓ１８残基は、通常溶媒に部分的に露出されるのみであり、改質剤（modifying agent）によって充分にアクセス可能な訳ではない。それゆえ、好ましくはＧ−ＣＳＦは、ペグ化反応に先立ち、可逆的に変性させられる（好ましくは、温和な条件の下で）。これは、例えば尿素、ＧｄＨＣｌ、ＤＭＳＯ、ＳＤＳ、ＮＬＳ、ツイーン（Tweens）のような種々の化合物の付加によって達成可能である。ペグ化反応の後、好ましくは再生工程（renaturation step）が実施される。この再生工程は、緩衝液交換及び／又は希釈によって誘発され得る。
【００９５】
抱合反応（conjugation reaction）は、改質剤（modifying agen）の１モル過剰下で通常実行される。好ましい実施例において、反応性セレン原子対反応性チオール基のモル比は、０．９：１から１０：１、より好ましくは１．０から５：１、より好ましくは１．１：１から３：１である。
【００９６】
結果的にコンジュゲートされた生産物は、例えば、過剰試薬、未だコンジュゲートされていない反応物質、望ましくないマルチ・コンジュゲートされた種、及び／又は、遊離の又は未反応のポリマーから、分離するために好ましくは精製される。結果として得られるコンジュゲートは、ＭＡＬＤＩ、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動法、及び／又は、クロマトグラフィーのような分析方法を使って、さらに特徴づけられ得る。
【００９７】
最後に、本発明の更なる主題は、以下のものを含む医薬組成物である。
（ａ）本発明によるコンジュゲート、
（ｂ）１つ又はそれ以上の薬学的に容認される賦形剤。
【００９８】
コンジュゲート（ａ）に対して、好ましい実施例についての上述したコメントの全てが適用される。
【００９９】
一般に、「薬学的に容認される賦形剤」は、本発明の組成に含まれることができるものであって、患者に対して、顕著な有害な毒性効果を引き起こさない賦形剤を意味する。
【０１００】
適切な賦形剤のための例は、炭水化物、抗菌薬剤、界面活性剤、緩衝剤，酸、塩基、酸化防止剤、無機塩類、及び、それらの混合物である。
【０１０１】
適切な炭水化物賦形剤ための例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄマンノース、ソルボースのような単糖類 、ラクトース、スクロース、トレハロースのような二糖類、でんぷんのような多糖類、及び、マンニトール、ソルビトールのようなアルジトールである。無機塩類又は緩衝液のための例は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム(無水)（sodium phosphate monobasic）、リン酸水素二ナトリウム（sodium phosphate dibasic）、及び、これらの組み合わせである。適切な界面活性剤のための例は、「ツイーン２０」、「ツイーン８０」、ソルビタンエステルのようなポリソルベート、レシチン、脂肪酸、脂肪酸エステルのようなリン脂質のような脂質、コレステロールのようなステロイド、そして、ＥＤＴＡのようなキレート剤である。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、全てのタイプ製剤を含み、ここで、注射にふさわしい製剤が好ましい。組成物におけるコンジュゲートの量は変化するであろうが、単位投与形態（例えば、バイアル）に組成物が貯蔵されるときは、好ましくは治療効果のある投与量であろう。
【０１０３】
本発明の薬剤調製は、好ましくは注射により投与され、それ故、一般的に溶液又は懸濁液である。
【０１０４】
本発明は、以下の実施例によって説明されるであろう。
【０１０５】
実施例
【０１０６】
Ａ）本発明において使用される方法
【０１０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
【０１０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、新規なＳｅ−ＰＥＧ試薬の形成を監視するために、並びに、タンパク質とＳｅ−ＰＥＧ試薬との間のカップリング反応の見積りのために使用された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、商業的に入手可能な４％から１２％のビス・トリス・ゲル（Bis-Tris gels）（インビトロジェン（Invitrogen）社製）を使用してなされた。検出の２つのタイプが使用された。即ち、ＰＥＧの可視化のためのヨウ素染色、及び、タンパク質の可視化のためのシンプリーブルー（Simply Blue）（インビトロジェン社製）の染色が使用された。
【０１０９】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）
【０１１０】
ＣＥＣは、ペグ化混合物からＣｙｓ１８残基においてペグ化されたＧ−ＣＳＦを単離するために用いられた。ＳＰ−５ＰＷ  ＴＳＫ−ゲル（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）を備える８ｍｌのカラム（トリコーン（Tricorn）１０／１００）が分離のために用いられた。結合バッファー（binding buffer）は、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ  ｐＨ３．８であった。Ｇ−ＣＳＦのペグ化された形態及び非ペグ化された形態が、３５カラム体積において、０から１００％の溶出緩衝液（７５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．０）から、浅い直線的勾配（shallow linear gradient）を使用して、分離された。この分離は、流速２．０ｍｌ／ｍｉｎにおいてなされた。非還元条件（シンプリーブルー（Simply Blue）染色及びヨウ素染色）下でなされたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＣＥＣ部分はプールされた。
【０１１１】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
逆相高速液体クロマトグラフィーは、Ｓｅ−ＰＥＧ試薬の分析のために用いられた。コロナ  プラス及びクナウアＵＶ検出器を使うことにより、ウォーターズ・ボンダパック・フェニル  カラム（Waters Bondapak Phenyl coloumn）（３．９ x １５０ mm, 粒子サイズ：１０μｍ）で、それは行われた。ビンディング溶離液は、４０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏであった。ＰＥＧ部分は、４０−５０  ％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏからの線形勾配を用いて分離された。流速は、１  ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルは、４０％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中において固体ＰＥＧ混合物を分解することにより調製し、１０ｌの注入体積で注入された。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
Ｂ）図面の説明
【０１１３】
【図１】図１：Ｓｅ−ＰＥＧ試薬のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ヨウ素染色、非還元条件）。
【０１１４】
レーン１：  ＰＥＧ  ＭＷ  標準（５ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ）
レーン２：  開始  １０ｋＤａ  ｍＰＥＧ―ＮＨＳ試薬
レーン３：  セレノシステイン及び１０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬の反応混合物
レーン４：  セレノシスタミン及び１０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬の反応混合物
レーン５：  セレノシスタミン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬の反応混合物
レーン６：  セレノシスティン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬の反応混合物
レーン７：  セレノシスタミン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製されたＰＥＧ―ＳｅＳＯ３  試薬の反応混合物
レーン８：  セレノシスタミン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製されたＰＥＧ―ＳｅＳＯ３  試薬の反応混合物
レーン２、３、４、５、及び６：  より高い分子量を有する染点は、（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬に相当し、より低い分子量を有する染点は開始物のＰＥＧ―ＮＨＳ試薬に相当する。  
レーン７及び８：  ＰＥＧ―ＳｅＳＯ３の形成は、（ＰＥＧ―Ｓｅ）２に相当する高い分子量の染点の非出現によって確認される。
【０１１５】
【図２】図２：  乾燥ＤＭＦにおいて調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ヨウ素染色、非還元条件）
【０１１６】
レーン１：  ＰＥＧ  ＭＷ  標準（５ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ）
レーン２：  セレノシステイン及び１０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（Ｓｅ−ＰＥＧ）２  試薬の反応混合物
【０１１７】
【図３】図３：  Ｇ−ＣＳＦ及び異なったＳｅ−ＰＥＧ試薬のペグ化混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（シンプリーブルー染色、非還元条件）
【０１１８】
レーン１：  タンパク質  ＭＷ  標準（２．５ｋＤａ、３．５ｋＤａ、６ｋＤａ、１４．４ｋＤａ、２１．５ｋＤａ、３１．０ｋＤａ、３６．５ｋＤａ、５５．４ｋＤａ、６６．３ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、１１６．３ｋＤａ、２００ｋＤａ）
レーン２：  Ｇ−ＣＳＦ＋ニューラスタ（Neulasta）
レーン３：  Ｇ−ＣＳＦとセレンシスタミン及び１０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬とのペグ化混合物
レーン４：  Ｇ−ＣＳＦとセレンシステイン及び１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬とのペグ化混合物
レーン５：  Ｇ−ＣＳＦとセレンシスタミン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬とのペグ化混合物
レーン６：  Ｇ−ＣＳＦとセレンシスタミン及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ―ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬とのペグ化混合物
レーン３及び４：  より高い分子量を有する染点は１０のｋＤａＳｅ−ＰＥＧ試薬とコンジュゲートされたＧ−ＣＳＦに相当し、より低い分子量を有する染点は天然Ｇ−ＣＳＦに相当する。  
レーン５及び６：  より高い分子量を有する染点は、２０のｋＤａＳｅ−ＰＥＧ試薬とコンジュゲートされたＧ−ＣＳＦに相当し、より低い分子量を有する染点は天然Ｇ−ＣＳＦに相当する。
【０１１９】
【図４】図４：（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製され、精製されたＧ−ＣＳＦコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（シンプリーブルー染色、還元及び非還元条件）。
【０１２０】
レーン１：  タンパク質  ＭＷ  標準（２．５ｋＤａ、３．５ｋＤａ、６ｋＤａ、１４．４ｋＤａ、２１．５ｋＤａ、３１．０ｋＤａ、３６．５ｋＤａ、５５．４ｋＤａ、６６．３ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、１１６．３ｋＤａ、２００ｋＤａ）  
レーン２：  Ｇ−ＣＳＦ＋ニューラスタ（Neulasta）；還元条件
レーン３：  （セレノシスタミン及び１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された１０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えたＧ−ＣＳＦコンジュゲート；還元条件
レーン４：  Ｇ−ＣＳＦ＋ニューラスタ（Neulasta）；非還元条件
レーン５：  （セレノシスタミン及び１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された１０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えたＧ−ＣＳＦコンジュゲート；非還元条件
【０１２１】
非還元条件において、単一の高分子量バンドが観測され、そして、それはペグ化されたＧ−ＣＳＦに相当する。還元条件の下で、ＰＥＧはタンパク質から切断され、そして、単一バンドは、天然Ｇ−ＣＳＦに相当する分子量で観測される。
【０１２２】
【図５】図５：  （ＰＥＧ―Ｓｅ）２又はＰＥＧ−ＳｅＳＯ３試薬を用いて調製され、精製されたＧ−ＣＳＦコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（シンプリーブルー染色、還元及び非還元条件）。
【０１２３】
レーン１：  タンパク質  ＭＷ  標準（１５ｋＤａ、２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、５０ｋＤａ、６６ｋＤａ、１００ｋＤａ）
レーン２：  Ｇ−ＣＳＦ；非還元条件
レーン３：  ニューラスタ（Neulasta）；非還元条件
レーン４：  （セレノシスタミン及び２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された２０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲート；非還元条件
レーン５：  （セレノシスタミン及び２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからＰＥＧ―ＳｅＳＯ３を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された２０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲート；非還元条件
レーン６：  Ｇ−ＣＳＦ；還元条件
レーン７：  ニューラスタ（Neulasta）；還元条件
レーン８：  （セレノシスタミン及び２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された２０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲート；還元条件
レーン９：  （セレノシスタミン及び２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから（ＰＥＧ―Ｓｅ）２を用いて調製された）Ｃｙｓ１８に付加された２０  ｋＤａ  ＰＥＧを備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲート；還元条件
【０１２４】
非還元条件において、単一の高分子量のバンドが観測され、そして、それはペグ化されたＧ−ＣＳＦに相当する。還元条件下で、ＰＥＧはタンパク質から切断され、そして単一バンドが天然Ｇ−ＣＳＦに相当する分子量のところに観測される。
【０１２５】
【図６】図６：  セレノシステイン及び２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＨＳから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  試薬の反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（コロナ検出器）
【０１２６】
【図７】図７：  セレノシスティンから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  試薬の反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（クナウアＵＶ検出器、＝２１５ｎｍ）。ｔｒ＝１８  ｍｉｎにおける信号は、ポリマー二量体  Ｓｅ−Ｓｅ基の吸収を示すが、このことは、（ＰＥＧ−Ｓｅ）２の合成が定量的収率で進行したことが示している。
【０１２７】
【図８】図８：  ｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０、及び、７．５におけるＧ−ＣＳＦ及び（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  ペグ化混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（シンプリーブルー染色、非還元条件）
【０１２８】
レーン１：タンパク質  ＭＷ  標準（２．５ｋＤａ、３．５ｋＤａ、６ｋＤａ、１４．４ｋＤａ、２１．５ｋＤａ、３１．０ｋＤａ、３６．５ｋＤａ、５５．４ｋＤａ、６６．３ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、１１６．３ｋＤａ、２００ｋＤａ）
レーン２：Ｇ−ＣＳＦ＋ニューラスタ（Neulasta）
レーン３：ｐＨ４．０におけるペグ化混合物
レーン４：ｐＨ５．０におけるペグ化混合物
レーン５：ｐＨ６．０におけるペグ化混合物
レーン６：ｐＨ７．０におけるペグ化混合物
レーン７：ｐＨ７．５におけるペグ化混合物
【０１２９】
高分子量の染点は２０ｋＤａ  Ｓｅ−ＰＥＧ試薬とコンジュゲートされたＧ−ＣＳＦに相当し、低分子量の染点は天然Ｇ−ＣＳＦに相当する。Ｇ−ＣＳＦ二量体の位置は、矢印で示されている。
【０１３０】
結果は、Ｓｅ−ＰＥＧ試薬が酸性条件で使用可能であり、そしてコンジュゲーション収率はより高いｐＨにおいてより良いことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
Ｃ）実行された反応
【０１３２】
実施例１：  セレノシステイン及び１０ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの  （ＰＥＧ―Ｓｅ）２  試薬の調製
【０１３３】
工程１  セレノシステインの可溶化
【０１３４】
セレノシスティンの８．５ｍｇは、１  Ｍ  ＫＯＨの１０１．６１の中で分解された。ｐＨは、０．２Ｍ  Ｋ２Ｂ４Ｏ７の１．０１７  ｍｌを付加することにより約９．８に調整された。
【０１３５】
工程２  ＰＥＧ及びセレノシステインのカップリング反応
【０１３６】
１０ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の９２４  ｍｇ（０．０９２ｍｍｏｌ）が、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の２  ｍｌ  中で分解された。この溶液に対して、分解されたセレノシスティン（工程１）の０．４１１  ｍｌ（０．００９２  ｍｍｏｌ）が加えられた。この反応は、１８時間室温で進行することが許容された。
【０１３７】
工程３  低分子量不純物の除去
【０１３８】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が限外濾過のために使用された。緩衝液は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５に交換された。緩衝液交換後の容積は４  ｍｌであった。
【０１３９】
実施例２：  セレノシスティン、及び、乾燥ＤＭＦにおける１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの、（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  試薬の調製
【０１４０】
工程１  ＰＥＧ及びセレノシステインのカップリング反応
【０１４１】
セレノシスティンの３．３  ｍｇ（０．０１  ｍｍｏｌ）、６９．１  ｍｇ（０．５  ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３を含む乾燥ＤＭＦの３  ｍｌ中に懸濁された。１時間の後、１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の２００  ｍｇ（０．０２  ｍｍｏｌ）が添加されて、そして、この反応混合物が、不活性アルゴン雰囲気の下で、室温において５日間攪拌されながら放置された。この溶液に対して、１０  ｍｌの水が付加されて、そして、その混合物はもう１日間攪拌すべく放置された（加水分解によるＰＥＧ−ＮＨＳ試薬のクエンチング）。
【０１４２】
工程２  低分子量不純物の除去
【０１４３】
ポリマー混合物は、濾過され、そして、結果として得られるろ液が、ジクロロメタンで３回洗浄された。組み合わされた有機相は、減圧下で濃縮され、ポリマー混合物はジエチルエーテルの滴下追加によって沈殿させられた。遠心分離の後、沈殿物は、室温で１２時間、高真空下で乾燥された。
【０１４４】
実施例３：  セレノシスタミン及び１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  試薬の調製
【０１４５】
工程１  セレノシスタミン原液の調製
【０１４６】
セレノシスタミンの６．２ｍｇは、０．２Ｍ  Ｎａ−リン酸塩のｐＨ８．５の０．３１ｍｌに分解された。
【０１４７】
工程２  ＰＥＧ及びセレノシスタミンのカップリング反応
【０１４８】
１０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の９３９  ｍｇ（０．０９４  ｍｍｏｌ）が、０．２Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の４．２６  ｍｌ内で分解された。この溶液に、０．１５ｍｌ（０．００９４  ｍｍｏｌ）の分解されたセレノシスタミン（工程１）が添加された。この反応は、１８時間室温で進行することが許可された。
【０１４９】
工程３  低分子量不純物の除去
【０１５０】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が、限外濾過のために使用された。緩衝液は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５  に交換された。緩衝液交換後の体積は、４．７７５  ｍｌであった。
【０１５１】
実施例４：  セレノシステイン及び  ２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの（ＰＥＧ−Ｓｅ）２、及び、ＰＥＧ―ＳｅＳＯ３試薬の調製
【０１５２】
工程１  セレノシスティンの可溶化
【０１５３】
セレノシステインの２３．３  ｍｇは、１Ｍ  ＫＯＨの１４０  ｌにおいて分解された。ｐＨは、０．２  Ｍ  Ｋ２Ｂ４Ｏ７の０．４ｍｌの追加により約９．９に調節された。
【０１５４】
工程２  ＰＥＧ及びセレノシステインのカップリング反応
【０１５５】
２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の６１０  ｍｇ（０．０３  ｍｍｏｌ）は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ  ８．５の２  ｍｌ  中において分解された。この溶液に、分解したセレノシスティン（工程１）の２７．５  ｌ（０．００３  ｍｍｏｌ）が添加された。この反応は１８時間室温で進行することが許可された。
【０１５６】
工程３  低分子量不純物の除去
【０１５７】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が、限外濾過のために使用された。緩衝液は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５に交換された。緩衝液交換後の体積は、１３．６  ｍｌであった。
【０１５８】
工程４  亜硫酸塩分解試薬（sulfitolysis reagent）の調製
【０１５９】
亜硫酸塩分解試薬（sulfitolysis reagent）は、Ｎａ２ＳＯ３の０．３１５ｇ、及び、ｐＨ８．０の  １  M  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  溶液の１  ｍｌ中におけるＮａＳ４Ｏ６の０．１２１ｇを分解することによって調製され、水で２５ｍｌへ希釈された。
【０１６０】
工程５  （ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の亜硫酸塩分解（sulfitolysis）
【０１６１】
亜硫酸塩分解試薬の６．２５  ｍｌが、（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬（工程２）の１０．２  ｍｌに対して、追加された（二セレン化基に向かって１００倍モル過剰量）。この反応は、１８時間室温で進行することが許可された。
【０１６２】
工程６  低分子量不純物の除去
【０１６３】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が、限外濾過のために使用された。緩衝液は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５に交換された。緩衝液交換後の体積は、８．１  ｍｌであった。
【０１６４】
実施例５：  セレノシスタミン、及び、２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの（ＰＥＧ−Ｓｅ）２及びＰＥＧ―ＳｅＳＯ３試薬の調製
【０１６５】
工程１  セレノシスタミン原液の調製
【０１６６】
セレノシスタミンの１２．４  ｍｇは、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の０．３４１  ｍｌ内で分解された。
【０１６７】
工程２  ＰＥＧ及びセレノシスタミンのカップリング反応：
【０１６８】
２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の５８３  ｍｇ（０．０３  ｍｍｏｌ）が、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の１．９０６  ｍｌ中に分解された。この溶液に対して、分解されたセレノシスタミン（工程１）の２７．５  ｌ（０．００３  ｍｍｏｌ）が添加された。この反応は１８時間室温で進行することが許可された。
【０１６９】
工程３  低分子量不純物の除去
【０１７０】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が、限外濾過のために使用された。緩衝液は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５に交換された。緩衝液交換後の体積は、１３．０  ｍｌであった。
【０１７１】
工程４  （ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の亜硫酸塩分解
【０１７２】
亜硫酸塩試薬（実施例４、工程４）の６．２５  ｍｌが、（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬（工程３）の９．７５  ｍｌに対して添加された（二セレン化基に向けて亜硫酸の１００倍モル余剰量）。この反応は１８時間室温で進行することが許可された。
【０１７３】
工程５  低分子量不純物の除去
【０１７４】
１０  ＭＷＣＯを備えるアミコンウルトラ１５が、限外濾過のために使用された。緩衝剤は、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ７．５に交換された。緩衝液交換後の体積は、９．０  ｍｌであった。
【０１７５】
実施例６：  セレノシスタミン及び  ２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳからの（ＰＥＧ−Ｓｅ）２の調製
【０１７６】
工程１  セレノシスタミン原液の調製
【０１７７】
セレノシスタミンの２２．２  ｍｇが、０．１  Ｍ  Ｋ２Ｂ４Ｏ７  ｐＨ８．０の中で分解された。
【０１７８】
工程２  ＰＥＧ及びセレノシスタミンのカップリング反応
【０１７９】
２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳ試薬の３２１  ｍｇ（０．０１６  ｍｍｏｌ）が、０．１  Ｍ  Ｋ２Ｂ４Ｏ７  ｐＨ８．０の１．０７５  ｍｌ中で分解された。この溶液に対して、分解されたセレノシスタミン（工程１）の０．１１４（０．００５４  ｍｍｏｌ）が添加された。この反応は２４時間の間、光から保護され、室温で進行することが許可された。
【０１８０】
工程３  低分子量不純物の除去及び固体（ＰＥＧ−Ｓｅ）２の単離
【０１８１】
反応混合物のｐＨは、シュウ酸の添加により３．０に調整され、更に２０  ｍｌの最終体積に水で希釈された。緩衝溶液は、次いでジクロロメタンで３回抽出された。組み合わされた有機部分は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥された。この有機溶液は、ロータリーエバポレーション（回転蒸発）により濃縮されて、（ＰＥＧ−Ｓｅ）２が、ジエチルエーテルの滴下によって沈殿させられた。遠心分離の後、沈殿物は、室温で１２時間高真空状態で乾燥された。
【０１８２】
実施例７：  セレノシステン及び  １０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬を備えるＧ−ＣＳＦのコンジュゲーション
【０１８３】
工程１  Ｃｙｓ１８におけるＧ−ＣＳＦのペグ化：
【０１８４】
Ｇ−ＣＳＦ溶液のｐＨを７．５に調整するために、０．２  Ｍ  Ｎａリン酸塩ｐＨ８．５の３．６３６  ｍｌがＧ−ＣＳＦ（２０ｍｇ）バルク溶液の１１．２  ｍｌに添加された。その後、セレノシステイン（実施例１、工程３）及び１０％  ＳＤＳの０．１７２  ｍｌから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の２．１８  ｍｌが添加された。ペグ化反応は、２４時間光から保護された状態で室温において進行することが許容された。ペグ化混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０１８５】
実施例８：  セレノシスタミン及び  １０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬を備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲートの調製
【０１８６】
工程１  Ｃｙｓ１８におけるＧ−ＣＳＦのペグ化：
【０１８７】
Ｇ−ＣＳＦ溶液のｐＨを７．５に調整するために、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩ｐＨ８．５の３．２４６  ｍｌが、１０．８  ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（１９．２  ｍｇ）バルク溶液に添加された。その後、セレノシスタミン（実施例３、工程３）及び１０％  ＳＤＳの  ０．２  ｍｌから調製された１０  ｋＤａ  （ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の３．６５  ｍｌが添加された。ペグ化反応は、２６時間光から保護された状態で室温において進行することが許容された。
【０１８８】
工程２  ペグ化の終了：
【０１８９】
緩衝液は、セファデックスＧ−２５カラムを使って、２５  ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ  ３．８に交換され、同じ緩衝液を用いて１＋１に希釈された。その後、そのサンプルは、４℃で１８時間放置された。このペグ化混合物は、非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０１９０】
工程３  ＣＥＣによるＣｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦの単離：
【０１９１】
Ｃｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦを含むフラクションは、溶離緩衝液の６３％と７１％の間で溶出された。プールされたフラクションは、還元及び非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０１９２】
実施例９：  セレノシスタミン及び  ２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬を備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲートの調製
【０１９３】
工程１  Ｃｙｓ１８におけるＧ−ＣＳＦのペグ化：
【０１９４】
Ｇ−ＣＳＦ溶液のｐＨを７．５に調整するために、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の０．４６２  ｍｌが、Ｇ−ＣＳＦ（２．５  ｍｇ）バルク溶液の１．４  ｍｌに添加された。その後、セレノシスタミン（実施例５、工程３）及び１０％  ＳＤＳの  ０．０４５  ｍｌから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の２．６  ｍｌが添加された。ペグ化反応は、２４時間光から保護された状態で室温において進行することが許容された。
【０１９５】
工程２  ペグ化の終了：
【０１９６】
緩衝液は、セファデックスＧ−２５カラムを使って、２５  ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ  ３．８に交換され、同じ緩衝液を用いて１＋１に希釈された。その後、このサンプルは４℃で２４時間放置された。
【０１９７】
工程３  ＣＥＣによるＣｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦの単離
【０１９８】
Ｃｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦを含むフラクションは、溶離緩衝液の６３％と６７％の間で溶出された。プールされたフラクションは、還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０１９９】
実施例１０：  セレノシスタミン及び  ２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製されたＰＥＧ−ＳｅＳＯ３試薬を備えるＧ−ＣＳＦコンジュゲートの調製
【０２００】
工程１  Ｃｙｓ１８におけるＧ−ＣＳＦのペグ化：
【０２０１】
Ｇ−ＣＳＦ溶液のｐＨを７．５に調整するために、０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ８．５の２．０３９  ｍｌが、６．１７９  ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（１１  ｍｇ）バルク溶液に添加された。セレノシスタミン（実施例５、工程５）及び１０％  ＳＤＳの０．１６３  ｍｌから調製された２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＳｅＳＯ３試薬の７．９２  ｍｌが添加された。ペグ化反応は、２４時間光から保護された状態で室温において進行することが許容された。
【０２０２】
工程２  ペグ化の終了：
【０２０３】
緩衝液は、セファデックスＧ−２５カラムを使って、２５  ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ  ３．８に交換され、同じ緩衝液を用いて１＋１に希釈された。その後、このサンプルは４℃で２４時間放置された。
【０２０４】
工程３  ＣＥＣによるＣｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦの単離：
【０２０５】
Ｃｙｓ１８においてペグ化されたＧ−ＣＳＦを含んだフラクションは、溶離緩衝液の５９％と６７％の間で溶出された。プールされたフラクションは、還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０２０６】
実施例１１：  異なったｐＨ値における、セレノシスタミン及び  ２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳから調製された（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬を備えるＧ−ＣＳＦのコンジュゲーション
工程１  ｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０、及び、７．５の緩衝液中のＣｙｓ１８におけるＧ−ＣＳＦのペグ化
【０２０７】
（ＰＥＧ−Ｓｅ）２  試薬を備えるＧ−ＣＳＦのペグ化の前に、Ｇ−ＣＳＦ溶液（Ｇ−ＣＳＦの１４０  μｌ／０．２５  ｍｇ）のｐＨは、それぞれ０．２  Ｍ  Ｎａ−リン酸塩の０μｌ、４．１μｌ、６．６μｌ、１５．３μｌ、及び、７．２μｌの付加によって４．０、５．０、６．０、７．０、及び、７．５に調整された。全てのサンプルにおけるＧ−ＣＳＦの同一濃度を達成するために、Ｈ２Ｏの適切な体積が添加された。Ｇ−ＣＳＦは、光から保護された状態で室温において、２４時間ＳＤＳの０．１％の存在下で、２０  ｋＤａ（ＰＥＧ−Ｓｅ）２試薬の１０モル過剰量で、ペグ化された。ペグ化混合物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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