(57)【要約】本発明の発明者らは、Ｇタンパク質共役型受容体５５（ＧＰＲ５５）は、ヒトの高悪性度の乳癌細胞において高度に発現しており、その発現レベルは、これらの細胞の侵襲性および転移能（例えば、骨への転移）と相関している可能性があることを示す。本発明の様々な態様で、乳癌の転移特性に関連する診断手段またはバイオマーカーが開示される。本発明はまた、乳癌の進行および拡散を阻害するための、この受容体を標的とする薬理作用物質に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得た生物学的試料中の乳癌細胞の転移能を予測し、または転移の予後を判定する方法であって、前記細胞中のＧＰＲ５５発現のレベルを評価する工程を含む方法。
【請求項２】
（ａ）前記試料をＧＰＲ５５に特異的に結合する結合剤と接触させる工程、
（ｂ）前記結合剤に結合するＧＰＲ５５の量を検出する工程、
（ｃ）ＧＰＲ５５の量を所定のカットオフ値と任意に比較し、それによって前記癌細胞の転移能を判定する工程、を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤は抗体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を定量する工程、
（ｂ）前記試験試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を、所定の値と任意に比較し、それによって前記癌細胞の転移能を判定する工程、を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料は、原発性腫瘍から採取されるものである請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＰＲ５５発現のレベルは、前記細胞中のリファレンス遺伝子またはタンパク質と比較されて標準化される請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＰＲ５５発現のレベルは、対照値と比較される請求項１〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記個体における転移のリスクもしくは可能性の診断における使用、または転移に対する治療のための個体の選択における使用のための請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）第１の時点で個体から得られた生物学的試料におけるＧＰＲ５５発現のレベルを評価する工程と、
（ｂ）引き続く時点で前記個体から得られた生物学的試料を使用して工程（ａ）を繰り返す工程と、
（ｃ）工程（ｂ）において検出されたＧＰＲ５５発現のレベルを、工程（ａ）において検出された量と比較し、それによって前記個体の癌の進行をモニターする工程と、を含む個体における乳癌の進行をモニターするための方法。
【請求項１１】
所定期間を通じて前記個体における転移のリスクをモニターし、または前記個体が受けている抗癌治療の有効性をモニターするための請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれか１項に記載の方法における使用のための検査キットであって、前記検査キットは、
（ａ）前記ＧＰＲ５５のヌクレオチド配列の少なくとも３０の近接するヌクレオチドを含む核酸分子と、
（ｂ）試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡへの核酸分子の結合を検出するための手段と、を含み、
または、前記検査キットは、
（ａ）ＧＰＲ５５に選択的に結合する抗体と、
（ｂ）ＧＰＲ５５への前記抗体の結合を検出するための手段と、を含む検査キット。
【請求項１３】
個体の乳癌の治療方法における使用のための薬剤についてのスクリーニング方法であって、前記薬剤はＧＰＲ５５阻害剤であり、前記スクリーニング方法は、前記ＧＰＲ５５受容体への前記物質の結合を評価する工程、または前記ＧＰＲ５５の発現を阻害するその能力を評価する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
（ｉ）ＧＰＲ５５を含む細胞または膜を、試験化合物に所定の時間の間曝露する工程と、
（ｉｉ）ＧＰＲ５５の活性または発現を検出する工程と、
（ｉｉｉ）前記化合物で処理された細胞または膜中の前記ＧＰＲ５５の活性または発現を、前記化合物で処理されていない対照細胞または対照膜中で見出された活性または発現に対して比較する工程と、
（ｉｖ）前記対照に対して、ＧＰＲ５５の活性を低下させ、またはＧＰＲ５５の発現を低下させる薬剤を選択する工程と、を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
個体の乳癌の治療方法における使用のための医薬組成物を産生するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）請求項１３または請求項１４に記載の方法の使用によって薬剤を選択する工程と、
（ｉｉ）前記薬剤を産生する工程と、
（ｉｉｉ）前記薬剤を医薬組成物に処方する工程と、を含む方法。
【請求項１６】
個体の乳癌の治療方法における使用のためのＧＰＲ５５阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】
腫瘍と、ＧＰＲ５５阻害剤とを接触させる工程を含む、患者における乳癌の治療方法。
【請求項１８】
乳癌の治療のための薬物の調製におけるＧＰＲ５５阻害剤の使用。
【請求項１９】
前記ＧＰＲ５５阻害剤は、下記の様式のうち１つ以上の様式でその効果を発揮する、請求項１３〜１８いずれか１項に記載の方法、組成物、方法または使用：
（ａ）ＧＰＲ５５の発現を低下させる
（ｂ）ＧＰＲ５５に直接的に拮抗する、または受容体の脱感作もしくは受容体の分解を増大させる、
（ｃ）ＧＰＲ５５と、その内在性リガンドとの間の相互作用を低下させる、
（ｄ）ＧＰＲ５５に媒介された細胞内シグナルを低下させる、かつ／または
（ｅ）内在性のＧＰＲ５５と、内在性リガンド結合について競合させる。
【請求項２０】
前記治療は、原発性乳癌の転移を阻害する請求項１３〜１９いずれか１項に記載の方法、組成物、方法または使用。
【請求項２１】
前記治療は、骨への原発性乳癌の転移を阻害する請求項１３〜２０いずれか１項に記載の方法、組成物、方法または使用。
【請求項２２】
前記治療は、癌の再発のリスクを低下させるアジュバント治療である請求項１３〜２１いずれか１項に記載の方法、組成物、方法または使用。
【請求項２３】
前記治療は併用療法であり、前記ＧＰＲ５５阻害剤は、同時に、または経時的に、乳癌の治療のためのさらなる治療的介入と組み合わせて使用される請求項１３〜２２いずれか１項に記載の方法、組成物、方法または使用。
【請求項２４】
前記さらなる治療的介入は、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、および／またはトラスツズマブの投与を含む請求項２３記載の方法、組成物、方法または使用。
【請求項２５】
前記さらなる治療的介入は、外科的介入である請求項２３記載の方法、組成物、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的に、内在性カンナビノイドＧタンパク質共役型受容体５５（ＧＰＲ５５）およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のカンナビノイド受容体（ＣＢ１およびＣＢ２）の薬理作用論は十分確立されている。
【０００３】
しかし、近年、ＣＢ１およびＣＢ２受容体と相反する薬理学的特性を有する、推定上の新規なカンナビノイド受容体についての証拠が現れている。
【０００４】
ＧＰＲ５５は、これまでは、オーファンＧＰＣＲだった。ヒトＧＰＲ５５の発現は、後に、回腸、脾臓、扁桃腺、精巣、ならびに乳房組織および脂肪組織において見出され、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって出願された特許で示された。ＧＰＲ５５との、ＣＢ１およびＣＢ２の配列相同性は、それぞれ、たった１３．５％および１４．４％であることが見出された（非特許文献１；特許文献１；非特許文献２）。
【０００５】
１つの最近の研究（非特許文献３）は、ＧＰＲ５５が、ＣＢｘ作動薬または非定型カンナビノイドの血管拡張作用を媒介するという仮説の検証を追究した。当該研究は、ＧＰＲ５５は、非定型カンナビノイドによって活性化されるが、その血管拡張効果を媒介しないことを示した。
【０００６】
別の最近の研究（非特許文献２）は、ＧＰＲ５５共役タンパク質をＧ１３として同定し、低分子ＧＴＰアーゼｒｈｏＡ、ｒａｃ１およびｃｄｃ４２の下流の活性化を見出した。著者らは、ＧＰＲ５５は、当該文献に記載された非ＣＢ１／ＣＢ２受容体のうちの１つについての候補であると結論付けた。
【０００７】
特許文献２（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、ＧＰＲ５５活性の修飾因子の同定に関する。修飾因子についてのいくつかのアッセイが論じられている。
【０００８】
特許文献３（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、ＧＰＲ５５活性のカンナビノイド−リガンド型修飾因子の同定に関する。修飾因子についてのいくつかのアッセイが論じらていれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第０，１１３，８１４号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／８６３０５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８４４号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓａｗｚｄａｒｇｏ  Ｍ．、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ．、Ｌｅｅ  Ｄ．Ｋ．、Ｌｙｎｃｈ  Ｋ．Ｒ．、Ｃｈｅｎｇ  Ｒ．、Ｈｅｎｇ  Ｈ．Ｈ．Ｑ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓ．Ｒ．、Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ｂ．Ｆ．、（１９９９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ＧＰＲ５２，  ΨＧＰＲ５３  ａｎｄ  ＧＰＲ５５：  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６４、１９３−１９８
【非特許文献２】Ｒｙｂｅｒｇ  Ｅ．、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｎ．、Ｓｊｏｅｇｒｅｎ  Ｓ．、Ｈｊｏｒｔｈ  Ｓ．、Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎ  Ｎ−Ｏ．、Ｌｅｏｎｏｖａ  Ｊ．、Ｅｌｅｂｒｉｎｇ  Ｔ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．、Ｄｒｍｏｔａ  Ｔ．、Ｇｒｅａｓｌｅｙ  Ｐ．Ｊ．、（２００７）．Ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５２、１０９２−１  １０１１
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓ  Ｄ．Ｇ．、Ｂｅｈｍ  Ｄ．Ｊ．、Ｗａｌｋｅｒ  Ｄ．Ｊ．、Ａｏ  Ｚ．、Ｓｈａｐｌａｎｄ  Ｅ．Ｍ．、Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｄ．Ａ．、Ｒｉｄｄｉｃｋ  Ｍ．、Ｄｏｗｅｌｌ  Ｓ．、Ｓｔａｔｏｎ  Ｐ．Ｃ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．、Ｂａｏ  Ｗ．、Ａｉｙａｒ  Ｎ．、Ｙｕｅ  Ｔ−Ｌ．、Ｂｒｏｗｎ  Ａ．Ｊ．、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．Ｄ．、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓ．Ａ．、（２００７）．  Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅｉｒ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５２、８２５−８３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の発明者らは、ＧＲＰ５５がヒトの高悪性度の乳癌細胞中で発現し、その発現レベルは、これらの細胞の侵襲性および転移能と相関している可能性があることを発見した。
【００１２】
転移は、原発性腫瘍（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）から離れた二次部位（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｉｔｅｓ）への、悪性腫瘍の拡散である。原発性腫瘍の転移能を早い段階で知ることは、臨床医に、治療およびアジュバント治療における使用についての、重要な情報を与えることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の様々な態様では、ＧＰＲ５５発現は、乳癌の転移特性に関連する診断手段またはバイオマーカーとして使用されてもよい。
【００１４】
発明者らは、さらに、高悪性度の乳腺細胞の遊走は、この受容体を標的とする薬理作用物質によって改変される可能性があることを発見した。
【００１５】
従って、本発明のさらなる態様は、乳癌の進行および拡散を阻害するための、当該受容体の治療標的に関する。
【００１６】
乳癌の転移がどのように骨に向けられる可能性があるかについてのモデルもまた、本願明細書で開示される。この観点（骨への転移）における評価および介入は、本発明のさらなる態様の基礎を形成する。
【００１７】
従って、１つの態様では、本発明は、患者から得た生物学的試料における乳癌細胞の転移能の予測、または、転移の予後の判定についての方法を提供し、当該方法は、当該細胞中のＧＰＲ５５発現のレベルを評価する工程を含む。
【００１８】
当該方法は、原発性腫瘍の試料（前外科的生検または術中生検（ｉｎｔｒａｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｉｏｐｓｙ））を得る工程が先行していてもよい。
【００１９】
より詳細に記載される通り、「発現」のレベルは、ＧＰＲ５５の核酸またはタンパク質のレベルのいずれかから検出されてよい。例えば、タンパク質は、細胞膜、小胞体またはゴルジ体中で、（直接結合または活性によって）検出されてもよく、または、核酸は、ＧＰＲ５５をコードするｍＲＮＡから、直接的または間接的に（例えば、そのｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを介して）検出されてもよい。
【００２０】
好ましい実施態様では、当該評価は、イムノアッセイベースの試験であってもよい。例えば、標識された抗体は、イムノアッセイにおいて、細胞または細胞膜中のＧＰＲ５５レベルを評価するために使用されてもよい。しかし、当該技術分野で周知の他の方法として、蛍光顕微鏡観察、ウエスタンブロット解析、ｍ−ＲＮＡのノーザンブロット解析およびスロットブロット解析、ｍＲＮＡの酵素増幅および解析、蛍光標識細胞分取等の使用も含んでいてもよい。
【００２１】
１つの実施態様では、当該方法は、
（ａ）癌患者から得られた生物学的試料を、ＧＰＲ５５またはＧＰＲ５５  ｍＲＮＡに特異的に結合する結合剤と接触させる工程と、
（ｂ）当該結合剤に結合したＧＰＲ５５またはＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を検出する工程と、
（ｃ）ＧＰＲ５５またはＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を所定のカットオフ値と任意に比較し、それによって当該癌細胞の転移能を判定する工程と、を含んでいてもよい。
【００２２】
１つの態様では、
（ａ）癌患者から得られた生物学的試料を、ＧＰＲ５５に特異的に結合する結合剤と接触させる工程と、
（ｂ）当該結合剤に結合したＧＰＲ５５の量を検出する工程と、
（ｃ）ＧＰＲ５５の量を所定のカットオフ値と任意に比較し、それによって当該癌細胞の転移能を判定する工程と、を含む方法が提供される。
【００２３】
当該結合剤は、ＧＰＲ５５タンパク質の細胞外領域に特異的に結合してもよい。好ましくは、当該薬剤は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、および抗体のエピトープ結合断片から選択される抗体である。当該薬剤は、例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、および生物発光標識で検出可能に標識されてもよい。
【００２４】
別の態様では、当該方法は、個体の試料に存在する核酸分子を含む試験試料を得てから、当該試験試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を定量し、当該試験試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を、所定の値と任意に比較する工程を含んでいてもよい。
【００２５】
試験試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を定量する工程は、試験試料を、ストリンジェントな条件下で当該ＧＰＲ５５  ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子に曝露する工程を含んでいてもよい。例えば、当該方法は、約３０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのプローブを０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４／７％  ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、６５℃で使用してもよい。当該ストリンジェントな条件は、０．１％  ＳＤＳ／０．１×ＳＳＣ中で、６８℃で洗浄する工程を含んでいてもよい。
【００２６】
さらに好ましくは、当該試験試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの量を定量する工程には、ｍＲＮＡの特異的な増幅、次いで、例えば、下記実施例に記載されたＲＴ−ｑＰＣＲ解析を介した増幅産物の定量化を伴う。
【００２７】
使用される、発現を評価するための方法が何であれ、定量された量は、好ましくは、細胞中のリファレンス遺伝子またはタンパク質と比較されて標準化される。このような遺伝子の選択は、当業者によって決定されてもよい。下記実施例で使用されたリファレンス遺伝子は、ＧＡＰＤＨである。Ｒｙｂｅｒｇら（２００７）は、ｒｂ３６Ｂ４を使用した。
【００２８】
ＧＰＲ５５の（好ましくは標準化された）発現レベルは、対照（例えば、ヒト転移性細胞株、およびヒト非転移性細胞株）と比較されてもよい。様々な細胞株が下記実施例中で試験された。
【００２９】
ＧＰＲ５５の発現は、ＣＢ１およびＣＢ２と関連する可能性がある。下記の通り、ＣＢ１およびＣＢ２の発現は、単一の細胞株に限られるが、その結果はまた、当該癌細胞株の相対的な病原力と、ＧＰＲ５５発現の相対的レベルとの間の相関を示した。
【００３０】
本発明の方法は、乳癌の診断および、（例えば、ＴＮＭシステムまたはＡＪＣＣシステムによる）病期分類の従来の方法、ならびにＨＥＲ２の存在についての試験と組み合わせて使用されてもよい。
【００３１】
別の態様では、乳癌細胞の転移能の予測、または、生物学的試料中の転移の予後の判定の方法は、例えば、ＧＰＲ５５発現が所定の値を超える場合に、患者における乳癌のリスク、または、特に、転移のリスクもしくは可能性を診断するために使用されてもよい。
【００３２】
別の態様では、当該方法は、例えば、ＧＰＲ５５発現が所定の値を超える場合に、化合物による治療、またはアジュバント治療についての個体の選択のために使用されてもよい。
【００３３】
本発明の他の態様では、ＧＰＲ５５およびその発現は、特定の治療法および併用化学療法を選択し、またはモニターするためのバイオマーカーとして使用されてもよい。
【００３４】
従って、１つの態様では、本発明は、患者における乳癌の進行をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で当該患者から得られた生物学的試料におけるＧＰＲ５５発現のレベルを評価する工程と、
（ｂ）引き続く時点で当該患者から得られた生物学的試料を使用して工程（ａ）を繰り返す工程と、
（ｃ）工程（ｂ）において検出されたＧＰＲ５５発現のレベルを、工程（ａ）において検出された量と比較し、それによって、当該患者における癌の進行をモニターする工程と、を含む方法を提供する。
【００３５】
例えば、発現レベルが徐々に増加する場合は、癌が進行しており、一方、発現レベルが一定のままであるか、または時間と共に減少する場合は、癌は進行していない可能性があるものとして特定される。
【００３６】
好ましい実施態様では、当該方法は、下記のように実施される：
（ａ）所定時間内に第１の時点で患者から得られた生物学的試料と、ＧＰＲ５５に特異的に結合する結合剤とを接触させ、
（ｂ）当該試料中において、当該結合剤と結合したポリペプチドの量を検出し、
（ｃ）引き続く時点で当該患者から得られた生物学的試料を使用して、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し、
（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量と、工程（ｂ）において検出された量とを比較し、それによって、当該患者における癌の進行をモニターする。当該ポリペプチドの量が所定時間で増加している場合は癌は進行しており、一方、当該ポリペプチドの量が一定のままであるか、または時間と共に減少している場合は癌は進行していない。
【００３７】
当該方法は、所定期間を通じて、患者における転移のリスクをモニターするために使用されてもよい。
【００３８】
当該方法はまた、治療処置を継続するべきかどうかを決定するために使用されてもよく、または、患者が受けている転移の抗癌治療の有効性をモニターするために使用されてもよい。
【００３９】
本願明細書に記載された診断方法、予後診断方法、および他の方法は、検査キットの使用によって実施されてもよく、このようなキットは、本発明のさらなる態様を形成する。
【００４０】
従って、本発明は、例えば、試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡの存在または量を測定するための、上記の診断方法、または予後診断方法の全てを評価または援助するための検査キットを提供する。当該キットは、
（ａ）ＧＰＲ５５のヌクレオチド配列の少なくとも３０の近接するヌクレオチドを含む核酸分子と、
（ｂ）試料中のＧＰＲ５５  ｍＲＮＡへの核酸分子の結合を検出するための手段と、を含む。
【００４１】
当該核酸は、ノーザンブロットもしくは他のブロット解析によってｍＲＮＡを直接的に解析するもの、または酵素増幅およびｍＲＮＡの解析において使用できるもの（例えば、プライマー）であってもよい。
【００４２】
他の態様では、検査キットは、
（ａ）ＧＰＲ５５に選択的に結合する抗体と、
（ｂ）ＧＰＲ５５への抗体の結合を検出するための手段と、を含んでいてもよい。
【００４３】
いずれの場合であっても、当該キットは、ヒト転移性細胞株、およびヒト非転移性細胞株からなる群から選択される細胞を含む対照試料を含んでいてもよい。
【００４４】
当該抗体は、蛍光顕微鏡観察、ウエスタンブロット解析、蛍光標識細胞分取、または全ての他のイムノアッセイにおいて有用なものであってもよい。
【００４５】
本願明細書における開示を踏まえると、ＧＰＲ５５の阻害は、乳癌の治療において有用である可能性があることを見出すことができる。
【００４６】
従って、本発明のさらなる態様は、患者における乳癌の治療方法における使用のためのＧＰＲ５５阻害剤を含む組成物を提供する。当該患者は、上記のように特定された者であってもよい。
【００４７】
本発明はまた、患者における乳癌の治療方法を提供し、当該方法は、腫瘍とＧＰＲ５５阻害剤とを接触させる工程を含む。
【００４８】
本発明はまた、乳癌の治療のための薬物の調製におけるＧＰＲ５５阻害剤の使用を提供する。
【００４９】
「患者」は、哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５０】
「ＧＰＲ５５阻害剤」は、いくつかの方法によって、その効果を達成できる。例えば、このような薬剤は、
（ａ）例えばｓｉＲＮＡまたは本願明細書に記載された他の方法を介し、容易に入手できる配列情報を使用してＧＰＲ５５の発現を減少させることができ、
（ｂ）受容体に直接的に拮抗でき、または受容体の脱感作もしくは受容体の分解を増加させることができ（例示的な拮抗薬は本願明細書に記載される）、
（ｃ）ＧＰＲ５５と、その内在性リガンド（例えば、実施例に記載のリガンド）との間の相互作用を（好ましくは、ＧＰＲ５５に直接的に結合することによって）減少させることができ、
（ｄ）例えば、Ｇタンパク質の共役を遮断することにより、ＧＰＲ５５に媒介された細胞内シグナルを減少させることができ、かつ／または、
（ｅ）内在性リガンド結合について内在性のＧＰＲ５５と競合することができる。
【００５１】
好ましい阻害剤は、ＧＰＲ５５に対して産生された中和抗体であってもよい。このような抗体の使用は、本発明の１つの特徴を示す。
【００５２】
他の阻害剤としては、天然または合成の拮抗薬（例えば、カンナビジオール）が挙げられる。
【００５３】
非天然型阻害剤が好ましい可能性がある。例えば、拮抗薬は、ＧＰＲ５５結合親和性を維持しつつ、高度に特異的な結合および治療用途のために最適化されてもよい。本発明の阻害剤は、その自然環境から、実質的に純粋もしくは均一な形態で、または、元々の種に由来する他の生物学的物質を含まずに、もしくは実質的に含まずに単離および／または精製されて提供されてもよい。本願明細書で使用される場合、用語「単離される」とは、これらの可能性の全てを含む。
【００５４】
さらに、このような阻害剤の薬剤的に許容できる活性誘導体、およびその使用は、本発明の範囲内である。このような誘導体の例としては、塩、溶媒和化合物、アミド、エステル、エーテル、Ｎ−オキシド、化学的に保護された形態、およびそのプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
好ましくは、当該ＧＰＲ５５阻害剤は特異的なＧＰＲ５５阻害剤である。
【００５６】
特異的なＧＰＲ５５阻害剤は、例えば、ＣＢ１受容体またはＣＢ２受容体に対するよりも大きな阻害能で、ＧＰＲ５５受容体を優先的に標的とするものである。
【００５７】
本願明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、患者における乳癌の重症度の軽減が意図されるＧＰＲ５５阻害剤の全ての投与を指し、疾病の発症のリスクを有する個体、またはその個体における疾病の発症を示す症状を有する個体における疾病の治癒、当該疾病の症状の軽減、および疾病の発症の予防または抑止が意図される治療を含む。
【００５８】
好ましい治療は、原発性乳癌の転移を最小限にするもの等であってもよく、すなわち、本発明の方法、使用および組成物は、乳癌の転移の治療および／または予防のために適用されてもよい。
【００５９】
下記の通り、相対的に高いＧＰＲ５５の発現を有する細胞株において、内在性カンナビノイド、アナンダミド（ＡＥＡ）等の推定上のＧＰＲ５５作動薬は、走化性因子として作用した。遊走は、ＧＰＲ５５拮抗薬であるＣＢＤによる前処理によって阻害されることを見出した。
【００６０】
従って、本発明は、乳癌の転移を阻害する方法を提供し、当該方法は、腫瘍または当該腫瘍に由来する転移と、ＧＰＲ５５阻害剤とを接触させる工程を含む。乳癌の転移を阻害するためのＧＰＲ５５阻害剤の使用、および、この目的のための薬物の調製におけるＧＰＲ５５阻害剤の使用もまた、提供される。
【００６１】
別の好ましい治療は、骨への原発性乳癌の転移を最小限にするもの等であってもよく、すなわち本発明の方法、使用および組成物は、転移性腫瘍細胞の走化作用／骨への遊走の治療および／または予防のために適用されてもよい。
【００６２】
乳癌の転移は、骨組織中に位置することがある。本願明細書中のデータは、内在性カンナビノイドが骨中で産生され、これらが骨への腫瘍細胞の転移についての走化性因子として作用できることを示す。これは、高悪性度の転移性乳癌において上方制御されるＧＰＲ５５受容体の活性化を介すると考えられる。
【００６３】
従って、本発明は、骨への乳癌の転移を阻害する方法を提供し、当該方法は、腫瘍または当該腫瘍に由来する転移と、ＧＰＲ５５阻害剤とを接触させる工程を含む。乳癌の骨への転移を阻害するためのＧＰＲ５５阻害剤の使用、および、この目的のための薬物の調製におけるＧＰＲ５５阻害剤の使用もまた提供される。
【００６４】
本発明は、さらなる態様において、上記の全ての治療方法および阻害方法（例えば、乳癌の転移の阻害および／または転移性腫瘍細胞の走化作用もしくは骨への遊走の阻害）において使用できる物質についてのスクリーニング方法を提供し、当該方法は、一般的に、ＧＰＲ５５受容体への当該物質の結合、またはＧＰＲ５５の発現を阻害するその能力を評価する工程を含む。
【００６５】
好ましい態様では、当該方法は、
（ｉ）ＧＰＲ５５を含む細胞または膜を、試験化合物に所定の時間の間曝露する工程と、
（ｉｉ）ＧＰＲ５５の活性または発現を検出する工程と、
（ｉｉｉ）当該化合物で処理された細胞または膜中のＧＰＲ５５の活性または発現と、当該化合物で処理されていない対照細胞もしくは対照膜中で見出された活性または発現とを比較する工程と、を含んでいてもよく、
本発明の方法および治療における使用について有効性を有する化合物は、当該対照に対して、ＧＰＲ５５の活性を低下させ、またはＧＰＲ５５の発現を低下させる。
【００６６】
１つの実施態様では、上記の全ての治療方法および阻害方法において使用できる物質を産生する方法は、
（ｉ）上記スクリーニング方法の使用により物質を同定する工程と、
（ｉｉ）当該物質を産生する工程と、を含む。
【００６７】
本発明の方法、使用および組成物の他の好ましい態様または実施態様は、これから論じられる。
【００６８】
本願明細書で開示される、または本願明細書で開示される方法を使用して同定されるＧＰＲ５５阻害剤は、上記の本発明の医薬品および他の使用のための組成物中に存在してもよく、または当該組成物中に処方されてもよい。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、活性な化合物（すなわち、ＧＰＲ５５阻害剤）に加えて、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者に周知の他の物質を含んでいてもよい。このような物質は、無毒性でなければならず、有効成分の有効性を妨げてはならない。当該担体または他の物質の正確な性質は、投与経路に依存するだろう。
【００７０】
従って、本発明のさらなる態様は、上記治療のための薬物を作製する方法を提供し、当該方法は、ＧＰＲ５５阻害剤の使用、例えば、このような阻害剤を、薬剤的に許容できる成分と混合することによって、投与に適した医薬組成物を産生する工程を含む。
【００７１】
ＧＰＲ５５阻害剤は、単独または他の治療と組み合わせて、同時にまたは経時的に投与されてもよい。
【００７２】
骨への乳癌の転移を阻害するための本発明の方法は、例えば、エストロゲンレベルを低下させる医薬による治療と組み合わせて使用されてもよい。
【００７３】
例えば、ハーセプチンの使用と同様に、増加したレベルのＧＰＲ５５発現について陽性であると検査された患者は、従来の化学療法、例えば、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドによる治療によって、パクリタキセルおよびＧＰＲ５５阻害剤（および、当該患者がＨＥＲ−２陽性である場合は、任意にトラスツズマブ）の後に、またはこれらの前に処置されてもよい。
【００７４】
疾病の再発および進行を防ぐための手術後の乳癌についてのアジュバント治療は、本発明に特に包含され、すなわち、ＧＰＲ５５阻害剤は、治療において使用されてもよく、当該治療は、外科的介入（例えば、乳房切除）を含む。当該外科的介入は、当該ＧＰＲ５５阻害剤の使用に先行し、または当該使用に続き、それ自体は、請求項に係る発明の一部を形成しなくてもよい。
【００７５】
従って、ホルモン療法、化学療法、放射線療法、または温熱療法と組み合わせた併用療法もまた包含され、任意に外科的介入と組み合わせたものが含まれる。乳癌のための他の治療は当該技術分野で周知であり、それらの使用自体は本発明の一部を形成するものではない。それでも、ＧＰＲ５５発現の阻害と組み合わせたこのような治療の使用は、本発明の一部を形成する。
【００７６】
本発明の関連する態様によれば、ＧＰＲ５５阻害剤、またはこれを含む組成物は、個体に投与されることが意図される。これは、全身性または局所性であってもよい。投与は、好ましくは、「治療的有効量」での投与であり、これは、患者に、例えば乳癌の減少、寛解、または退縮という有益性を示すのに十分なものである。
【００７７】
従って、本発明のさらなる態様では、上記治療方法は、治療が必要な患者に、有効量のＧＰＲ５５阻害剤を投与する工程を含んでいてもよい。
【００７８】
投与される実際の（有効な）量、ならびに投与の速度および時間経過については、特定の被験者（例えば、ヒト患者または動物モデル）における疾病の重症度、および当該被験者の全体の症状を考慮し、最終的には医師の裁量である。適した用量の範囲は、典型的に、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００７９】
本発明の阻害剤としてのＧＰＲ５５に対して産生された抗体の使用は、２５ｍｇ〜５０００ｍｇを、注射可能な形態で、週１回、週２回または週３回の量（または乳癌の重症度に応じてより多くの回数）でのその抗体の投与を伴ってもよい。あるいは、徐放デバイスを使用し、患者に最適な用量を与えてもよく、その場合は反復投与の必要をなくせる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】乳癌細胞株中でのＧＰＲ５５の相対的な発現。Ｔ４７ＤおよびＬＮＣａｐについては、ｎ＝１であるため、統計検定は行うことができず、Ｓ．Ｅ．Ｍを算出できなかった。全ての他の細胞株について、ｎ＝３である。ＭＤＡ−ＭＢ２３１については、これらの値を１００％として設定したため、エラーバーを示していない。ｎｓ＝有意でない。＊＝ＭＤＡ−ＭＢ２３１と比較して、Ｐ＜０．０５。統計解析は、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  一元配置ＡＮＯＶＡ、およびＤｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ検定によって行った。
【図２】ＮＢ１に対する、乳癌細胞株中のＣＢ１の発現。ｎ／ｄ＝ＣＢ１  ｃＤＮＡは検出されなかった。ＮＢ１については、これを１００％と設定したため、Ｓ．Ｅ．Ｍは示していない。
【図３】希釈されていないＨＬ６０  ｃＤＮＡ中のＣＢ２  ｃＤＮＡの濃度に対する、乳癌および前立腺癌の細胞株中のＣＢ２発現。ｎ／ｄ＝ＣＢ２  ｃＤＮＡが検出されなかった。
【図４】平均ＤＭＳＯ媒体の遊走に対する、血清飢餓腫瘍細胞へのＦＢＳの化学誘引物質の効果を測定するために使用されたボイデンチャンバーアッセイ。＊＊＝Ｐ＜０．０１、対応ノンパラメトリックｔ検定を使用して検定した。同じ培養フラスコおよび継代数からの細胞を含む全てのウェルでの、１つのボイデンチャンバーアッセイから得られた結果。
【図５】対照に対する、細胞遊走へのＦＢＳおよびＯ−１６０２の効果を測定するために使用されたボイデンチャンバーアッセイ。全ての０．０１％  ＤＭＳＯ媒体のウェルからの平均細胞遊走数に対して表わされた、３つの個々のボイデンチャンバーアッセイから貯えられた結果。個々のアッセイでは、異なる継代数の細胞を使用した。＊＊＝Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照との比較、Ｆｒｅｉｄｍａｎ  一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ検定。ＦＢＳ対Ｏ−１６０２は、有意ではなかった（図示していない）。
【図６】媒体対照と比較した、腫瘍細胞の遊走に対するＦＢＳおよびＪＷＨ０１５の効果を測定するために使用したボイデンチャンバーアッセイ。全ての０．０１％  ＤＭＳＯ媒体のウェルからの平均細胞遊走数に対して表わされた、３つの個々のボイデンチャンバーアッセイから貯えられた結果。個々のアッセイでは、異なる継代数の細胞を使用した。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＝Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照との比較、Ｆｒｅｉｄｍａｎ  一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ検定。ＦＢＳ対ＪＷＨ０１５、有意差なし（図示していない）。
【図７】媒体対照と比較した、腫瘍細胞の遊走に対するＦＢＳおよびアナンダミド（ＡＥＡ）の効果を測定するために使用されたボイデンチャンバーアッセイ。全ての０．０１％  ＤＭＳＯ媒体のウェルからの平均細胞遊走数に対して表わされた、３つの個々のボイデンチャンバーアッセイから貯えられた結果。個々のアッセイでは、異なる継代数の細胞を使用した。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＝Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照との比較、Ｆｒｅｉｄｍａｎ  一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ検定。ＦＢＳ対ＡＥＡ、有意でない（図示していない）。
【図８】媒体対照と比較した、腫瘍細胞の遊走に対するＦＢＳおよびＣＢＤの効果を測定するために使用されたボイデンチャンバーアッセイ。全ての０．０１％  ＤＭＳＯ媒体のウェルからの平均細胞遊走数に対して表わされた、２つの個々のボイデンチャンバーアッセイから貯えられた結果。個々のアッセイでは、異なる継代数の細胞を使用した。＊＝Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない、ＤＭＳＯ対照との比較、Ｆｒｅｉｄｍａｎ  一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ検定。
【図９】ボイデンチャンバー遊走アッセイ。ＣＢＤ（１μＭ）とのプレインキュベーション後の、ＦＢＳへ遊走したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数を示すヒストグラム。当該データは、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３〜４）を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  多重比較検定。
【図１０】Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）細胞浸潤アッセイ。ＣＢＤ（１μＭ）とのプレインキュベーション後の、ＦＢＳへ浸潤したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数を示すヒストグラム。当該データは、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  多重比較検定。
【図１１】ボイデンチャンバー遊走アッセイ。ＬＰＩ（１μＭ）とのプレインキュベーション後の、ＦＢＳへ遊走したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数を示すヒストグラム。当該データは、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３〜４）を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  多重比較検定。
【図１２】ボイデンチャンバー遊走アッセイ。ＣＢＤ（１μＭ）と組み合わせたＬＰＩ（１μＭ）とのプレインキュベーション後の、ＦＢＳへ遊走したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数を示すヒストグラム。当該データは、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３〜４）を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  多重比較検定。
【図１３】ＧＰＲ５５の低い自然レベルの発現を示す（図１に示される）ＭＣＦ７細胞を用いたＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）細胞浸潤アッセイ。ＧＰＲ５５を形質移入されたＭＣＦ７細胞がＦＢＳへ浸潤した一方、空ベクターを形質移入された細胞は浸潤しなかったことを示すヒストグラム。ＣＢＤは、ＧＰＲ５５過剰発現細胞中で、ＦＢＳに誘導される浸潤を有意に減弱した。
【図１４】ＧＰＲ５５の低い自然レベルの発現を示す（図１に示される）ＭＣＦ７細胞を用いたボイデンチャンバー遊走アッセイ。ＧＰＲ５５を過剰発現するＭＣＦ７細胞もまた、ＦＢＳへ遊走した一方、空ベクターを形質移入された細胞は遊走しなかった。ＧＰＲ５５過剰発現細胞において、ＦＢＳに誘導された遊走は、１μＭ  ＬＰＩとのプレインキュベーションによって有意に促進され、ＧＰＲ５５に対するｓｉＲＮＡを使用すると完全に消滅した。当該データは、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝２）を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  多重比較検定。
【図１５】ヒト  Ｍ−ＣＳＦ−依存性マクロファージを、ＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養し、次いで、２−ＡＧまたはアナンダミドで、さらに５日間処理した。媒体（０．１％  ＤＭＳＯ）対照±ＳＥＭの％として表わされた、破骨細胞の培養液中のＦ−アクチンリング数（ｎ＝４〜７の実験、それぞれ５回繰り返した）。＊＊対照と比較したＰ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【図１６】ヒト破骨細胞のＬＰＳ処理後の、２−ＡＧ（Ａ）およびアナンダミド（Ｂ）のレベル。細胞をＰＢＳ中で洗い、９０分間、２００μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで処理した。値は、３人の別々の提供者からの、平均値±ＳＥＭを示す。対照およびＬＰＳ処理細胞中の２−ＡＧのレベルには、有意差がなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔの対応ｔ検定）。アナンダミドのレベルは、２つの対照試料において検出不可能であり、これは統計解析を妨げた。（Ｃ）ＰＴＨで処理されたＭＧ−６３細胞中の２−ＡＧレベル。細胞を、４０ｎＭまたは１００ｎＭのＰＴＨにおいて示された時間で処理した。当該結果は、対照の％として表わされ、平均値±ＳＥＭである（ｎ＝２〜４の実験、それぞれについて２回測定した）。＊＊対照と比較したＰ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
（定義および詳細な方法）
本発明の他の態様および、本願明細書で使用される定義について、これからさらに詳細に論じられる。
【００８２】
（ＧＰＲ５５受容体の核酸）
ｈＧＰＲ５５は、ＥＭＢＬ受入番号ＢＣ０３２６９４である。参照の便宜のため、複写物が本願明細書に添付される。
【００８３】
（ＧＰＲ５５  ｍＲＮＡおよび発現の評価）
ＧＰＲ５５の発現の評価方法は、例えば、Ｒｙｂｅｒｇ（２００７）の記載、または下記実施例に記載されたような、当該技術分野における従来の方法であってもよい。
【００８４】
（ＧＰＲ５５受容体の作動薬および拮抗薬）
ＧＰＲ５５受容体に対して作動薬として作用する幅広い範囲のカンナビノイドが公知である。これらは、ＡＥＡ等の内在性カンナビノイドおよびＴＨＣ等の大麻の成分を含む。Ｏ−１６０２およびＣＰ５５９４０等の自然に存在するカンナビノイドの合成誘導体もまた、作動薬として作用することが見出された。
【００８５】
カンナビジオール（ＣＢＤ）もまた大麻の成分であり、ＧＰＲ５５拮抗薬として同定された。
【００８６】
表１は、これらの化合物のうちのいくつか、およびその効果の概略を示す。
【００８７】
【表１】
2011523699.tif 000003
【００８８】
（新規なＧＰＲ５５阻害剤の同定）
新規な薬物の同定を導く医薬品の研究は、リード化合物が見出される前および後でさえも、非常に多数の候補物質のスクリーニングを伴う可能性があることが周知である。
【００８９】
特に、結合アッセイ、拮抗薬の効力、およびＧＰＲ５５のＧタンパク質の共役に対する「遮断薬」の活性は、（本願明細書に記載される新規な方法および応用における使用のために）、例えば、Ｒｙｂｅｒｇ（２００７）によって記載された従来の方法によって評価され、与えることができる。化合物はまた、ＥＲＫリン酸化アッセイ（Ｏｋａら、２００８）を使用して同定できる。例示的な方法は、下記の通りである。
【００９０】
（放射性リガンド結合アッセイ）
放射性リガンド結合は、５ｍｇの膜タンパク質を、５０ｎＭ  ［３Ｈ］−（−−）−シス−３−［２−ヒドロキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−トランス−４−（３−ヒドロキシプロピル）シクロヘキサノール（ＣＰ５５９４０）（Ｔｏｃｒｉｓ、米国、ミズーリ州、エリスビル）、［３Ｈ］−ＳＲ１４１７１６（アマシャム、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）、または［３Ｈ］−Ｒ（ρ）−［２，３−ジ−ヒドロ−５−メチル−３−［（モルフォリニル）メチル］ピロロ［１，２，３−ｄｅ］−１，４−ベンゾ−オキサジニル］−（１−ナフタレニル）−メタノン−メシル酸塩（ＷＩＮ５５，２１２−２）（アマシャム）、十分量のバッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む９６ウェルプレートの各ウェルに加え、各ウェルの総容積を２００μｌにすることによって開始する。非特異的結合を、１０μＭ  ＣＰ５５９４０（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＲ１４１７１６およびＷＩＮ５５，２１２−２（Ｔｏｃｒｉｓ）の存在下で定量した。当該膜を、３０℃で９０分間インキュベーションし、次いで、氷冷した洗浄バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）を加えることによって反応を停止し、次いで、Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ｂ  ガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド、トゥルク）（０．０５％  ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）処理した）に通し、Ｍｉｃｒｏ  ９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ノルウェー、リール）を使用して真空下で急速濾過した。当該フィルターを３０分間、５０℃で乾燥し、次いで、パラフィンシンチラントパッドを当該フィルター上で融解させ、結合放射活性を１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）シンチレーションカウンタを使用して定量した。
【００９１】
（［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合アッセイ）
［３５Ｓ］−グアノシン５０−［ｇ−３５Ｓ］−三リン酸（ＧＴＰｇＳ）結合アッセイを、０．０１％  ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）（シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス）、１０ｍＭ  グアノシン５０−二リン酸塩（ＧＤＰ）（シグマ）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（シグマ）および０．５３ｎＭ  ［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ（アマシャム）と共に０．０２５μｇ／μｌの膜タンパク質を含む膜バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４）中で、最終量を２００μｌとし、３０℃で、４５分間行った。非特異的結合を、２０μＭの未標識のＧＴＰｇＳ（シグマ）の存在下で定量した。当該反応を、氷冷した洗浄バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）を加えることによって停止し、次いで、真空下で、Ｗａｌｌａｃ  ＧＦ／Ｂ  ガラス繊維フィルターに通して、セルハーベスター（Ｓｋａｔｒｏｎ）を使用して、急速濾過した。当該フィルターを、３０分間、５０℃で乾燥させ、次いで、パラフィンシンチラントパッドを当該フィルター上で融解させ、結合放射活性を、ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  シンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ）を使用して定量した。拮抗薬の効力を、実験の当日に実験的に定量されたＣＰ５５９４０のＥＣ８０濃度に対して定めた。データを、式  ｙ＝Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ）））および推測されるＥＣ５０（Ａは、非特異的結合量、Ｂは全結合量、ＣはＩＣ５０、Ｄは傾き）を使用して適合させた。
【００９２】
（［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合アッセイにおけるペプチドおよび抗体の遮断）
［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合アッセイを、上記のように、Ｇ−タンパク質サブユニットＧα１３、ＧαｉおよびＧαｓについてのペプチドまたは抗体を含む、または含まない膜のさらなるプレインキュベーションと共に、１５分間、３０℃で行った（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）。データを対応ｔ検定を使用して分析した（＊＊Ｐｏ０．０５；＊＊＊Ｐｏ０．０１）。
【００９３】
この態様および他の態様において、物質（推定上の拮抗薬）は、例えば、現在当該技術分野で周知のもの等（例えば、Ｎｅｗｔｏｎ（１９９７）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ、７（１０）：１１８３−１１９４を参照）のコンビナトリアルライブラリーの生成物として与えられてもよい。
【００９４】
基本的に、本願明細書に記載されたスクリーニング方法は、当該技術分野で周知のもの等の高処理スクリーニング系と同様に使用されてもよく、結合パートナーに基づく。例えば、国際公開第２０００１１２１６号パンフレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を参照。これは、特異的な核酸またはアミノ酸の配列が入手可能な分子標的を調節する可能性がある試験化合物の評価のための、迅速な、高処理スクリーニングを可能にする。国際公開第２０００１６２３１号パンフレット（Ｎａｖｉｃｙｔｅ）には、吸収等の１つ以上の生物学的利用率の特性による化合物ライブラリーのスクリーニング方法（このようなスクリーニングは、受容体結合ベースのスクリーニングに加えて、またはその代替法として使用されてもよい）について記載されている。米国特許第６０２７８７３号明細書（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｌ．）には、分析のために試料を保持する方法、およびその装置が開示されている。米国特許第６００７６９０号明細書（Ａｃｌａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）には、高処理スクリーニング系および他の用途において使用されてもよい集積マイクロ流体デバイスが記載されている。他の高処理スクリーニング系は、例えば、独国特許出願公開第１９８３５０７１号明細書（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ；Ｆ  Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、国際公開第２００００３８０５号パンフレット（ＣｏｍｂｉＣｈｅｍ）および国際公開第２００００２８９９号パンフレット（Ｂｉｏｃｅｐｔ）に記載されている。
【００９５】
本発明における使用のための新規な化合物（特に、ＧＰＲ５５拮抗薬）はまた、模倣薬の設計のために使用されてもよい。これは、活性な化合物の合成が困難または高価である場合、または当該化合物が特定の投与方法に適していない場合に望ましい可能性がある。所定の標的特性を有する化合物からの模倣薬の設計において共通して採用されるいくつかの工程がある。最初に、標的特性の特定において重大な、かつ／または重要な化合物の特定の部分が特定される。当該化合物の活性な領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として公知である。一旦ファルマコフォアが見出されると、その構造は、その物性（例えば立体化学、結合、大きさ、および／または電荷）に従い、様々な情報源、例えば、分光学的技術、Ｘ線回折のデータおよびＮＭＲからのデータを使用してモデリングされる。三次元構造が特定されてもよい。計算解析、類似性マッピング（これは、原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／またはボリュームをモデリングする）および他の技術を、このモデリング工程において使用できる。次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基を移植できる鋳型分子が選択される。当該鋳型分子およびこれに移植された化学基は、模倣薬を容易に合成できるように簡便に選択でき、薬理学的に許容できる傾向にあり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは分解しない一方、リード化合物の生物学的活性を保持する。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法は、ＧＰＲ５５を自然に発現しやすい細胞を利用してもよい。
【００９７】
ＧＰＲ５５を自然に発現しにくい細胞を使用することも可能である。ただし、このような細胞は、ＧＰＲ５５をコードする発現ベクターで形質転換される。このような細胞は、本発明の使用において好ましい試験細胞を示す。これは、動物細胞または原核細胞でさえも、ヒト  ＧＰＲ５５を発現し、従って、ヒト乳癌の治療における使用のための候補薬物の有効性を試験するための良い細胞モデルとなるように形質転換される可能性があるためである。
【００９８】
国際公開第０１／８６３０５号パンフレット（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、ＧＰＲ５５活性の修飾因子の同定に関する。国際公開第２００４／０７８４４号パンフレット（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、ＧＰＲ５５活性のカンナビノイド−リガンド型修飾因子の同定に関する。修飾因子についてのいくつかのアッセイは、これらの文書に記載され、これらの文書の開示は、阻害剤の提供または試験に関連する限り、本願明細書に特に組み込まれる。
【００９９】
一般的に言えば、当業者は、ベクターを構築し、スクリーニングを容易にするために、細胞または細胞株中のＧＰＲ５５の組み換え遺伝子発現のための手順を設計することが十分にでき、様々な同定方法の実施態様における、このような細胞および細胞株の使用は、本発明の１つの態様を形成する。適したベクターは、プロモーター配列、転写終結コドンの断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列等の、適切な制御配列を含むように選択または構築できる。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら  編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照。
【０１００】
本願明細書に記載されたスクリーニング方法はまた、ＧＰＲ５５を含む細胞膜、または単離された可溶性ＧＰＲ５５の使用に基づいていてもよい。このような膜は、好ましくは、上記の細胞に由来する。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法における使用のための細胞は、当該方法がｉｎ  ｖｉｖｏベースの試験である場合、実験動物（例えば、マウスまたはラット）内に含まれていてもよい。あるいは、当該細胞は、（ｅｘ  ｖｉｖｏベースの試験における）組織試料中にあってもよく、または、当該細胞は、培養液中で培養されてもよい。このような細胞は、機能的なＧＰＲ５５を発現しなければならず、または、これを発現するように誘導されてもよいことが理解されるだろう。
【０１０２】
本発明の組成物は、いずれかの適した経路および投与手段のために処方されてもよい。薬剤的に許容できる担体、または希釈剤としては、経口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下等）または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等）投与に適した処方中で使用されるものが挙げられる。当該処方は、便宜に単位投与形態中にあってもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。このような方法は、有効成分と、１つ以上の副成分を構成する担体とを結合させる工程を含む。一般的に、当該処方は、有効成分と、液状担体または細かく割られた固形担体または両方とを、均一に、かつ密接に結合させ、次いで、必要であれば、その生成物を成形することによって調製される。
【０１０３】
固形組成物のために、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等の従来の無毒性固形担体を使用してもよい。活性な化合物（デキサメタゾン結合の阻害剤）を、例えば、ポリアルキレングリコール、アセチル化されたトリグリセリド等を担体として使用して、座剤として処方してもよい。液体の薬剤的に投与可能な組成物は、例えば、上記の活性な化合物、および担体（例えば、水、生理食塩水、水溶性のブドウ糖、グリセロール、エタノール等）中に、任意の配合剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を溶解、分散等し、それによって、溶液または懸濁液を形成することによって調製される。
【０１０４】
このような投与形態を調製する実際の方法は、当業者に公知、または明白である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、第１５版、１９７５を参照）。投与される組成物または処方は、いずれの場合においても、治療されている患者の症状を軽減するのに効果的な量の活性な化合物を含む。
【０１０５】
無毒性担体で調整した０．２５〜９５％の範囲の有効成分を含む投与形態または組成物を調製してもよい。
【０１０６】
経口投与のために、薬剤的に許容できる無毒性の組成物は、いずれかの通常使用される賦形剤（例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等）の取り込みによって形成される。このような組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放製剤等の形態をとる。このような組成物は、１％〜９５％、さらに好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％の有効成分を含んでいてもよい。
【０１０７】
非経口投与は、一般的に、皮下、筋肉内または静脈内のいずれかの注射によって特徴付けられる。注射剤は、従来の形態（溶液または懸濁液のいずれかとして）、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液にするのに適した固形形態、または乳剤として調製できる。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等である。
【０１０８】
近年、非経口投与のために考案されたアプローチは、一定レベルの投与量が維持される、徐放製剤または持続放出製剤の埋め込みを使用する。例えば、米国特許第３，７１０，７９５号明細書を参照。
【０１０９】
このような非経口組成物（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に含まれる活性な化合物の割合は、その特定の性質、および当該化合物の活性および患者の要求に高度に依存する。しかし、溶液中の０．１％〜１０％の有効成分の割合が使用でき、組成物が、上記の割合に引き続いて希釈される固形物である場合はさらに高くなるだろう。好ましくは、当該組成物は、溶液中に０．２〜２％の活性薬剤を含む。
【０１１０】
静脈内、皮膚または皮下の注射について、有効成分は、パイロジェンを含まず、適したｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容できる水溶液の形態であるだろう。当業者は、例えば、等張の媒体（塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸リンゲル注射剤等）を使用して、適した溶液を十分に調製できる。保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤は、必要であれば含まれていてもよい。
【０１１１】
上記阻害方法は、例えば、研究目的、または他の理由のために、原則として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われてもよい。
【０１１２】
所望であれば、投与される医薬組成物はまた、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミン等）の少量の無毒性補助物質を含んでいてもよい。
【０１１３】
本願明細書に記載される通り、ＧＰＲ５５および特に細胞外領域に特異的な抗体は、診断上および予後診断上の有用性を有し、当該技術分野で公知の方法によって得られ、または与えられてもよい。
【０１１４】
本発明の抗体は、動物に抗原を注入することによって、ポリクローナル血清として産生してもよい。好ましいポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の技術を使用して、抗原を動物（例えば、ウサギ）に接種することによって産生されてもよい。当該抗原は、（グリコシル化された形態またはグリコシル化されていない形態の）全ＧＰＲ５５タンパク質、またはその断片であってもよい。
【０１１５】
あるいは当該抗体は、モノクローナルであり、マウスにおいて産生されていてもよい。従来のハイブリドーマ技術が、抗体を産生するために使用されてもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するために使用される抗原は、（グリコシル化された形態またはグリコシル化されていない形態の）全ＧＰＲ５５タンパク質またはその断片であってもよい。
【０１１６】
当該抗体は、γ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）であることが好ましい。
【０１１７】
抗体の可変部が、抗体の特異性を定め、そのため、この領域は、本発明の抗体の機能的誘導体において保存されなければならないことが理解されるだろう。可変領域を超えた領域（Ｃ領域）は、配列において相対的に一定である。本発明の抗体の特徴部は、ＶＨ領域およびＶＬ領域であることが理解されるだろう。ＣＨ領域およびＣＬ領域の正確な性質は、全体的に見ると、本発明にとって重要ではないことがさらに理解されるだろう。実際は、本発明の好ましい抗体は、非常に異なるＣＨ領域およびＣＬ領域を有していてもよい。さらに、下記でより完全に論じられる通り、好ましい抗体の機能的誘導体は、Ｃ領域を含まない可変領域を含んでいてもよい（例えば、ｓｃＦＶ抗体）。
【０１１８】
抗体の誘導体は、ポリクローナル混合物中のモノクローナル抗体または特異的な抗体と７５％の配列同一性、さらに好ましくは９０％の配列同一性を有していてもよく、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。ほとんどの配列の変異性が、フレームワーク領域（ＦＲｓ）中で生じていてもよい一方で、抗体のＣＤＲｓの配列、およびその機能的誘導体はほとんど保存されていることが理解されるだろう。
【０１１９】
本発明の第７の態様のいくつかの好ましい実施態様は、可変領域および定常領域の両方を有する分子に関連する。しかし、定常部を全く含まず抗体の可変部を基本的に含む抗体断片（例えば、ｓｃＦＶ抗体）もまた、本発明に包含されることが理解されるだろう。
【０１２０】
１つの種中で生じた抗体は、異なる種を治療するために使用される場合、いくつかの重大な欠陥を有することが知られる。例えば、マウスの抗体がヒトにおいて使用される場合、当該抗体は、血清中で短い循環半減期を有する傾向にあり、治療されている患者によって、異種タンパク質として認識される。これは、不必要なヒト抗マウス（またはラット）抗体反応の発生をもたらす。これは、特に、抗体の頻繁な投与が要求される場合に、その排除を促進し、その治療効果を遮断し、過敏反応を誘導する可能性があるため、厄介である。従って、ヒト治療における使用のための好ましい抗体（非ヒト由来の抗体である場合）はヒト化される。
【０１２１】
モノクローナル抗体は、非ヒトｍＡｂｓの産生を通常伴うハイブリドーマ技術によって産生される。当該技術によって、ほぼ全ての特異性を有するげっ歯類のモノクローナル抗体を産生できる。従って、本発明の好ましい実施態様では、このような技術を、ＧＰＲ５５に対するモノクローナル抗体を開発するために使用してもよい。このような抗体は、治療的に有用であるが、このような抗体は、（上記の通り）ヒトにおける理想的な治療薬ではないことが理解されるだろう。理想的には、ヒト  モノクローナル抗体は、医薬用途において好ましい選択であるだろう。しかし、従来の細胞融合技術を使用したヒトｍＡｂｓの産生は、現在まであまりうまくいっていない。ヒト化の問題は、非ヒト（例えば、げっ歯類）ｍＡｂｓ由来のＶ領域配列、およびヒト抗体由来のＣ領域（理想的には、Ｖ領域由来のＦＲｓ）配列を使用する抗体の設計によって、少なくとも部分的に取り組まれる可能性がある。得られる「設計された」ｍＡｂｓは、その由来であるげっ歯類のｍＡｂｓよりも、ヒトにおいて免疫原性が少なく、そのため、臨床使用について、より適している。
【０１２２】
ヒト化された抗体は、キメラのモノクローナル抗体であってもよく、これは、組み換えＤＮＡ技術を使用して、げっ歯類の免疫グロブリンの定常部が、ヒト抗体の定常部に置き換えられる。次いで、キメラのＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子は、完全にグリコシル化された抗体を産生するために、適した制御因子を含む発現ベクターにクローニングされ、哺乳類細胞に導入されてもよい。この工程において適切なヒトＨ鎖のＣ領域遺伝子を選択することによって、抗体の生物学的活性は、あらかじめ定められる可能性がある。このようなキメラ抗体は、エフェクター機能を活性化する能力を、特定の医薬用途について、目的に合わせることができ、当該キメラ抗体が誘導する抗グロブリン反応を低下させる点で、非ヒトのモノクローナル抗体よりも優れている。
【０１２３】
このようなキメラ分子は、本発明の乳癌の治療にとって好ましい薬剤である。ＲＴ−ＰＣＲは、ヒト領域を有するｍＡｂのキメラ体を構築するためにクローニングされ使用される好ましいｍＡｂｓから、ＶＨおよびＶＬの遺伝子を単離するために使用してもよい。
【０１２４】
抗体のさらなるヒト化は、ＣＤＲグラフト、または抗体の再形成を伴ってもよい。このような抗体は、げっ歯類のｍＡｂの重鎖および軽鎖のＣＤＲｓ（これは当該抗体の抗原結合部位を形成する）を、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に移植することによって産生される。
【０１２５】
本発明のタンパク質およびペプチド薬剤（例えば、ＧＰＲ５５阻害剤）は、いくつかの方法（標的部位でのプロテアーゼ活性等）によって分解にさらされてもよい。このような分解は、その生物学的利用率を制限し、従って、治療有効性を制限する可能性がある。生物学的構成において改善された安定性を有するペプチド誘導体を設計および産生できる、いくつかの十分に確立された技術がある。このようなペプチド誘導体は、プロテアーゼを媒介した分解に対する増加した抵抗性の結果として、改善された生物学的利用率を有していてもよい。好ましくは、本発明の使用に適した誘導体は、その由来であるタンパク質またはペプチドよりも、さらにプロテアーゼ耐性がある。ペプチド誘導体、およびその由来であるタンパク質またはペプチドのプロテアーゼ抵抗性は、周知のタンパク質分解アッセイの方法によって評価されてもよい。次いで、ペプチド誘導体およびペプチドについてのプロテアーゼ抵抗性の相対値は、比較されてもよい。
【０１２６】
本発明のタンパク質およびペプチドのペプトイド誘導体は、本発明の第１の態様の受容体の構造、または本発明の第４、５または６の態様の薬剤の知識から、容易に設計できる。市販のソフトウェアを、よく確立された手順に従って、ペプトイド誘導体を開発するために使用してもよい。
【０１２７】
レトロペプトイド（この中で、全てのアミノ酸が、ペプトイド残基によって、逆転した順序で置き換えられる）もまた、本発明のタンパク質またはペプチドを模倣できる。レトロペプトイドは、１つのペプトイド残基を含む、ペプチドまたはペプトイド−ペプチドのハイブリッドと比較して、リガンド結合溝中で逆方向に結合していることが予想される。結果として、当該ペプトイド残基の側鎖は、元々のペプチドにおける側鎖と同じ方向を向くことができる。
【０１２８】
本発明のペプチドまたはタンパク質の修飾された形態のさらなる実施態様は、Ｄ−アミノ酸の形態を含む。この場合、アミノ酸残基の順序は反転する。Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を使用したペプチドの調製は、通常の代謝過程による、このような誘導体のいずれかの不必要な分解を大きく減少させ、その投与頻度と共に、投与に必要な誘導体の量を減少させる。
【０１２９】
上記の通り、異なる態様では、当該方法における使用のための阻害剤は、ＧＰＲ５５の発現を減少させる核酸である可能性がある。これは、転写レベルまたは翻訳レベルで作用する可能性がある。
【０１３０】
１つの実施態様では、これは、内在性のＧＰＲ５５転写物に結合するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの分子であってもよい。このようなアンチセンス分子は、ＧＰＲ５５発現を減少させ、それによって、ＧＰＲ５５に媒介された活性を減少させる。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡもまた、本発明の薬剤として使用されてもよい。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的な破壊をもたらし、遺伝子発現の標的とされたノックアウトを可能にするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、遺伝子発現抑制機構の一部を形成する。遺伝子発現抑制において使用されるｓｉＲＮＡは、典型的に各３’末端で２−ヌクレオチドオーバーハングを有する、２１のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡを含む可能性がある。あるいは、ヘアピンループによって結合されたセンス配列およびアンチセンス配列を使用した、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してもよい。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの両方は、化学的に合成し、細胞に一過性のＲＮＡｉを導入することができ、または、遺伝子発現の長期間の阻害のためのプロモーターから内在的に発現させることができる。本発明の薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡ分子は、１０〜５０のヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡの片方を含んでいてもよい。好ましくは、本発明の薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、１８〜３０のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、本発明の薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、２１〜２５のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、本発明の薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、２１のヌクレオチドを含む。
【０１３２】
ＧＰＲ５５についてプレデザインされたｓｉＲＮＡは、アプライドバイオシステムズ（米国、カリフォルニア州  ９４４０４、フォスターシティー、８５０  リンカーン  センター  ドライブ）から、現在は、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉ  ＲＮＡｓ（ＩＤｓ  ｓ１７７６０−ｓ１７７６２）という商品名で市販されている。
【０１３３】
従って、当該ベクターは、当該技術分野で公知の方法（例えば、本願明細書において引用された参考文献のいずれかに記載された方法；当該参考文献は、参照により、本願明細書に特に組み込まれる）のいずれかによってｓｉＲＮＡを、細胞に導入するのに適した、ＧＰＲ５５をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
【０１３４】
１つの実施態様では、当該ベクターは、センスおよびアンチセンスの方向の両方の本発明の核酸配列を含んでいてもよく、その場合は、ＲＮＡとして発現した場合、センスおよびアンチセンスの区画は、結合して二本鎖ＲＮＡを形成するだろう。これは、例えば、細胞中でプロセシングされてｓｉＲＮＡを産生する可能性がある長い二本鎖ＲＮＡ（例えば、２３ヌクレオチド超）であってもよい（例えば、Ｍｙｅｒｓ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：３２４〜３２８を参照）。
【０１３５】
従って、ＧＰＲ５５の、２０〜２５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜２３ｂｐを含む二本鎖ｓｉＲＮＡの使用は、例えば、任意に、分解を防ぐために保護された形態で、合成的に産生され、本発明の１つの態様を形成する。あるいは、ｓｉＲＮＡは、ベクターから、（回収および使用のために）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで産生されてもよい。
【０１３６】
本願明細書におけるいずれの副題も、便宜のみのために含まれ、多少なりとも開示内容を制限するものとして解釈されるものではない。
【０１３７】
本発明については、これから、下記の非限定的な図および実施例への参照と共に、さらに記載される。本発明の他の実施態様は、これらを踏まえて、当業者が思い付くだろう。
【０１３８】
本願明細書で引用された全ての参考文献の開示は、当業者によって本発明を実施するために使用される限り、相互参照によって本願明細書に特に組み込まれる。
【実施例】
【０１３９】
下記の方法を、本願明細書における実施例の実行において使用した。
【０１４０】
（細胞培養）
ＭＤＡ−ＭＢ２３１：これは、高転移性ヒト乳癌細胞株である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、浸潤性の表現型を有する。
【０１４１】
ＭＣＦ７：このヒト乳腺癌細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１よりも、少ない浸潤性の表現型を有する。
【０１４２】
Ｔ４７Ｄ：ヒト乳管癌。この細胞株は、コラーゲン線維芽細胞マトリックスを透過できないこと、およびボイデンチャンバーによる化学浸潤（ｃｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｏｎ）および走化性のアッセイにおいて活性が低いことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非浸潤性であると考えられている。
【０１４３】
上記の細胞株の詳細は、テキサス大学  ＭＤ  アンダーソン癌センターの「ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ」（テキサス大学  ＭＤ  アンダーソン癌センター；１５１５  Ｈｏｌｃｏｍｂｅ  Ｂｌｖｄ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ  ７７０３０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ｃａｎｃｅｒｂｉｏｌｏｇｙ／）において見出すことができる。
【０１４４】
細胞培養物を、それらのそれぞれの培地中に維持した。ただし、ＭＤＡ−ＭＢ２３１は、５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベーションした。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、３７℃で、ＣＯ２を含まない恒温器でインキュベーションした。
【０１４５】
細胞を、２０ｍＬのそれらのそれぞれの培地を含む２００ｍｌの培養フラスコ中で、コンフルエントまで培養した。コンフルエンスに達した際に、細胞培養物を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５ｍＬの非酵素的細胞解離溶液を使用して、フラスコ表面から解離させた。５ｍＬのそれらのそれぞれの培地を加え、細胞懸濁液の一部を、２０ｍｌの培地を含む新しい２００ｍｌの細胞培養フラスコに移した。
【０１４６】
ＲＮＡ抽出手順における使用のため、トリゾールを細胞可溶化物に加え、トリゾール可溶化液を、−８０℃で、後の使用のために凍結した。
【０１４７】
（ＲＮＡ抽出）
凍結したトリゾール可溶化液を、氷上で解凍し、ゲノムＤＮＡを、当該可溶化液を、１９Ｇの針に、数回、粘性がなくなるまで通すことによって剪断した。０．２ｍｌのクロロホルムを加え、当該溶液を、室温で５分間インキュベーションし、核小体タンパク質複合体を分離させた。
【０１４８】
当該溶液を１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離し、水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。０．５ｍＬのイソプロパノールを加えた後、当該溶液を、室温で１０分間インキュベーションし、ＲＮＡを沈殿させた。次いで、当該溶液を、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、水相を移し、目に見える白色のＲＮＡペレットを放置した。
【０１４９】
当該ＲＮＡペレットを、１ｍＬの７５％  エタノールを加えることによって洗浄し、ボルテックスし、次いで、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離した。水相を移し、当該試料を風乾させた。当該ＲＮＡ試料を、１００μｌのＨ２Ｏ中で希釈した。
【０１５０】
（ＲＮＡ精製）
ＲＮＡ精製を、キアゲン  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｋｉｔを使用して行った。
【０１５１】
３５０μｌのＲＬＴバッファーを各１００μｌのＲＮＡ試料水溶液に加え、混合した。２５０μｌの無水エタノールを各ＲＮＡ試料に加え、ピペッティングによって混合した。各試料を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに移し、１２０００ｒｐｍ、室温で１５秒間、遠心分離した。各カラムを、新しい回収チューブに移した。５００μｌのＲＰＥバッファーを、各ＲＮｅａｓｙ  ｃｏｌｕｍｎに加え、次いで、１２０００ｒｐｍ、室温で１５秒間、遠心分離した。５００μｌのＲＰＥバッファーを再度加え、当該カラムを、１２０００ｒｐｍ、室温で、２分間、遠心分離した。回収チューブを空にし、当該カラムを１２０００ｒｐｍ、室温で、２分間、再度遠心分離し、エタノールを完全に除去した。
【０１５２】
ＲＮｅａｓｙ  ｃｏｌｕｍｎを、１．５ｍｌ  回収チューブに移し、３０μｌ  Ｈ２Ｏを各カラムに加えた。当該試料を、Ｈ２Ｏと共に、室温で２分間インキュベーションし、その後、１２０００ｒｐｍ、室温で１分間、遠心分離した。ＲＮｅａｓｙ  ｃｏｌｕｍｎを、新しい１．５ｍｌ  回収チューブに移し、第２の３０μｌ  Ｈ２Ｏを加え、２分間、室温でインキュベーションした。次いで、当該カラムを、１２０００ｒｐｍ、室温で１分間、遠心分離したが、第１のＨ２Ｏ遠心工程に対して、鉛直軸上に１８０度回転させた。これは、ＲＮｅａｓｙ  ｃｏｌｕｍｎ表面上に不均等に分布したＲＮＡが失われないようにするためである。
【０１５３】
第１および第２のＨ２Ｏインキュベーションならびに遠心からの、３μｌの一定分量のＲＮＡ試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計における使用のために調製した。
【０１５４】
（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光測定）
ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００  ＵＶ−Ｖｉｓ  分光光度計およびソフトウェアを、１回分の精製された各ＲＮＡ試料についてのＲＮＡ濃度、および２６０／２３０ｎｍの吸光度比を測定するために使用した。
【０１５５】
分光光度計を、ＤＥＰＣ処理水の「ブランク」で較正した。次いで、試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計に個々に入れ、吸光度を測定し、記録した。ＲＮＡ濃度値を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ソフトウェアによって算出した。
【０１５６】
各細胞株について最も高いＲＮＡ濃度を与えた試料を、ｃＤＮＡの作製のために使用し、他の試料は捨てた。精製されたＲＮＡ試料を、少量ずつ分注し、−８０℃で、後の使用のために凍結した。
【０１５７】
（逆転写）
２μｇのＲＮＡを得るために必要な各ＲＮＡ試料溶液の量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計を使用して定めた濃度値を使用して算出した。この量を、０．５ｍｌのＤＥＰＣ処理され、オートクレーブされたチューブに移し、後に作成する逆転写していない対照試料のためにこれを２回行った。次いで、これらの試料を、ＤＥＰＣ処理水中で希釈し、総量１１μｌにした。１μｌのランダムプライマー（濃度  ２μｇ／μｌ）を各ＲＮＡ試料に加え、パルスボルテックスした。
【０１５８】
次いで、各試料を１０分間、７０℃で、サーモサイクラーにかけた。当該試料を３分間、氷上で冷却し、次いで、パルスし、反応物をペレットにした。４μｌの５×反応バッファー、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、および２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴを、各試料に加えた。１μｌの逆転写酵素を、各細胞株のＲＮＡ試料のうちの１つに加え、各細胞株についての別のＲＮＡ試料を逆転写酵素を含まない対照にした。当該試料を混合し、１０分間、室温でインキュベーションした。当該試料を、４２℃で、５０分間、次いで９５℃で、５分間サーモサイクラーにかけた。８０μｌのＤＥＰＣ処理水を、各反応試料に加えた。
【０１５９】
（ＲＴ−ｑＰＣＲ解析）
プローブ反応溶液を、使用された各ＰＣＲウェル中に下記の量の物質を含むように混合した。１μｌの目的の遺伝子（ＧＰＲ５５、ＣＢ１またはＣＢ２）のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、１μｌのＶＩＣ標識ＧＡＰＤＨ  プローブ、１０μｌのプローブ混合物および５μｌのＨ２Ｏ。
【０１６０】
ＧＰＲ５５発現ＨＥＫ２９３細胞、ＣＢ１発現ＮＢ１細胞、またはＣＢ２発現Ｈ６０細胞からのｃＤＮＡを、１、１０、１００、１０００、１００００および１００００の係数で希釈し、これらの目的遺伝子についての標準曲線を作成した。
【０１６１】
３μｌの標準曲線の希釈物を反応混合物を含むウェルに加え、これを２回行った。各細胞株からの３μｌのｃＤＮＡを、個々の反応ウェルに加え、これを３回行い、各細胞株について３μｌの逆転写していないＲＮＡ試料を、反応ウェルに加え、これを３回行い、対照にした。
【０１６２】
プローブ反応混合物のみを含みｃＤＮＡ溶液を含まない２つのブランクのウェルもまた、対照として作製した。プラスチックフィルムをＰＣＲプレートのウェルを覆うために使用し、当該プレートを１分間、反応混合物をスピンダウンするために遠心分離した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、およびＤｕａｌ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ  ｔｅｍｐｌａｔｅを有するソフトウェアを、ｑＰＣＲ解析のため、かつ、相対的なＧＡＰＤＨおよび目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現を定量するために使用した。二重鎖ｃＤＮＡの変性を、９５℃の温度で行い、ｃＤＮＡ二本鎖のアニーリングを６０℃で行った。変性およびアニーリングを、それぞれ、１０秒および３０秒のサイクルで、計４０サイクル行った。ＧＯＩおよびＧＡＰＤＨの発現についての標準曲線を、ｃＤＮＡの異なる希釈係数の蛍光についての所定の閾値に達するのに必要な増幅サイクル数から作成した。次いで、この標準曲線を、各癌細胞株についての試験試料中のＧＯＩおよびＧＡＰＤＨのｃＤＮＡの任意の濃度を算出するために使用した。
【０１６３】
３回分の試験試料についての目的の遺伝子およびＧＡＰＤＨの平均濃度を算出した。次いで、目的の遺伝子の濃度を、それらの値をその対応するＧＡＰＤＨ濃度値で割ることによって、標準化した。
【０１６４】
ＧＰＲ５５について、発現ついての、これらの標準化された濃度値を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１に対して表わした（この細胞株が最も高いレベルのＧＰＲ５５発現を有することが見出されたためである）。
【０１６５】
（ボイデンチャンバー細胞遊走）
全ての走化性アッセイに使用された細胞をそれらのそれぞれの無血清培地に漬け、実験の前に１９時間インキュベーションした。血清飢餓細胞を５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、その培養プレートから、５ｍＬの非酵素的細胞解離溶液を使用して解離した。細胞の解離後、５ｍＬの各無血清培地を加え、細胞懸濁液を汎用容器（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を捨て、残った細胞ペレットを、２ｍＬの無血清培地中に再懸濁した。
【０１６６】
１０μｌの得られた細胞懸濁液を血球計算器に移し、１ｍＬの懸濁液あたりの細胞数を、計測した細胞数から算出した。無血清培地を、細胞懸濁液に、当該懸濁液を１×１０６細胞／ｍｌの細胞数にするために必要な量加えた。
【０１６７】
（手順  Ｉ−細胞遊走に対するＧＰＲ５５リガンドの濃度勾配の効果）
１０％  ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯ媒体を含む）、０．０１％  ＤＭＳＯ媒体対照および１μＭの試験薬物（０．０１％  ＤＭＳＯ媒体中のＯ−１６０２）の溶液を調製した。全ての希釈は、試験された細胞型についての適切な無血清培地中で行った。実施された各アッセイについて、ボイデンチャンバーの２４の中央のウェルを使用した。下部チャンバーのウェルに、２６μｌの溶液を入れ、やや正のメニスカスを形成した。８μｍの孔直径のポリカーボネートフィルターで、下部のウェルを覆い、ボイデンチャンバーのシリコンガスケットも定位置に置いた。次いで、上部チャンバーを定位置に固定し、４５μｌの細胞懸濁液を２４の上部のウェルのそれぞれに加えた。次いで、ボイデンチャンバーを３７℃（細胞型に応じて、ＣＯ２を含む、または含まない）で４時間インキュベーションした。
【０１６８】
この手順において、各化合物の濃度勾配の化学誘引効果を、化合物についての化学誘引効果を示す、上部のウェルから当該フィルターの下側への細胞遊走によって試験した。
【０１６９】
（手順  ＩＩ  細胞遊走へのＣＢＤまたはＬＰＩによる細胞の前処理の効果）
１×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を２回分調製し、適量の０．１％  ＤＭＳＯおよび１μＭ  ＣＢＤまたはＬＰＩ（共に０．１％  ＤＭＳＯ媒体を含む）を１回分ずつに加え、細胞懸濁液の濃度を０．０１％  ＤＭＳＯおよび１μＭ  試験化合物（０．０１％  ＤＭＳＯ媒体を含む）にした。当該細胞懸濁液を、各化合物と共に、３０分間、３７℃、５％  ＣＯ２中でインキュベーションした。
【０１７０】
このように、実施されたアッセイでは、１０％  ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）および０．０１％  ＤＭＳＯ媒体への０．０１％  ＤＭＳＯ媒体で処理された細胞の遊走、ならびに１μＭまたは１００ｎＭのＣＢＤ（１０％  ＦＢＳおよび０．０１％  ＤＭＳＯを含む）への１μＭまたは１００ｎＭのＣＢＤ処理された細胞の遊走を試験した。当該ボイデンチャンバーを、３７℃、５％  ＣＯ２で、４時間、インキュベーションした。
【０１７１】
（遊走細胞の固定および染色）
インキュベーション後、当該ボイデンチャンバーを解体し、フィルターを取り外し、７０％  エタノールを含むペトリ皿に、遊走細胞側を上に向けて、７分間置いた。次いで、当該フィルターを、蒸留水を含むペトリ皿に２分間、遊走細胞側を上に向け、移した。次いで、非遊走細胞側のフィルターにワイパーブレードを引き、全ての非遊走細胞を除き、当該フィルターを風乾させた。
【０１７２】
次いで、当該フィルターの遊走細胞側を固定し、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標）染色セットを使用して染色した。次いで、当該フィルターを、外科用メスを使用して、２片に切り、２列の柱状（ｃｏｌｕｍｎ）にした。各フィルター片を、キシレンおよびｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロマイドを使用して、顕微鏡スライド上に載せた。
【０１７３】
（遊走細胞の計測）
遊走細胞を、Ｌｅｉｔｚ顕微鏡を使用して計測した。個々のウェルおよびその境界を１０倍の対物レンズを使用して視覚化し、次いで、細胞を４０倍の対物レンズを使用して計測した。各遊走ウェル内の３つの重複していない４０倍の視野のうちの４分の１において見出された細胞を計測した。計測された各ウェル中で同一の視野を選択した。各視野内の細胞の全量を、４分の１において見出された細胞数に４を掛けることによって算出した。次いで、４つの視野のそれぞれについての細胞数を合計し、この数字を各個々のウェル内で遊走した細胞数についての測定値として使用した。
【０１７４】
各個々の薬物型について行われた全てのアッセイについての結果を、０．０１％  ＤＭＳＯ媒体対照のウェル中で遊走した平均細胞数を算出することによって貯えた。次いで、各個々のウェルについての細胞数を、媒体の平均の割合として表わした。
【０１７５】
（Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）細胞浸潤アッセイ）
細胞を８０％のコンフルエンスまで培養し、次いで、アッセイ開始前に一晩血清飢餓に置いた。氷上で、０．５×ＢＭＥ原液を、５×原液から、コニカルチューブ中で調製し、反転させて混合した。１００μｌのＢＭＥ原液を２４ウェルプレートの各ウェルへ分注し、当該チャンバーを３７℃で一晩インキュベーションした。翌朝、細胞を播種し、１×洗浄バッファーを使用して１度洗浄し、計測し、５×１０５細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。次いで、上部チャンバーを慎重に吸引し、チャンバーを乾かさないように注意し、ウェルあたり１００μｌの細胞を当該上部チャンバーに加えた。次いで、ウェルあたり５００μｌの（化学誘引物質を含む、または含まない）培地を、当該チャンバーの下部のウェルに加えた。次いで、当該チャンバーを組み立て、３７℃で、加湿された環境で、２４時間インキュベーションした。翌日、上部チャンバーを注意深く吸引し、１００μｌの１×洗浄バッファーで洗浄し、下部のウェルを５００μｌの洗浄バッファーで洗浄した。１２μｌのカルセインＡＭ溶液を１２ｍＬの細胞解離液に加え、５００μｌのこの溶液を下部チャンバーに加えた。次いで、チャンバーを再度組み立て、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、上部チャンバーを取り外し、溶解したカルセインＡＭを４８５ｎｍの励起波長、５２０ｎｍの発光波長で判定した。
【０１７６】
（組織培養および一過性の細胞形質移入）
ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞を、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地中で維持し、３７℃で、ＣＯ２を含まない環境でインキュベーションした。ＭＣＦ７細胞を、１０％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で維持し、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベーションした。
【０１７７】
ＭＣＦ７細胞を、ＧＰＲ５５もしくは空ベクタープラスミド、ＧＰＲ５５もしくは陰性対照ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせで、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（溶液Ｖを使用）での電気穿孔により、それぞれプログラム  Ｘ−０１３またはＰ−０２０で、これらの細胞株について推奨される手順に従い、形質移入した。下記の細胞走化性アッセイを進める前に、細胞を、形質移入後に２４時間インキュベーションした。ＧＰＲ５５発現のノックダウンのため、ＧＰＲ５５に対する一連の４つの二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製、カタログ番号：ＬＱ−００５５８１−００）。
【０１７８】
（実施例１  細胞株中の受容体の発現レベル）
異なる細胞株中のＧＰＲ５５、ＣＢ１またはＣＢ２の濃度を、上記方法で記載したように、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して定め、次いで、それらの値を、それらのそれぞれのＧＡＰＤＨ濃度で割ることによって、標準化した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株は、最も高いレベルのＧＰＲ５５発現を有することを見出し、このレベルを１００％として定め、他の細胞株中の発現のレベルを、これに対して算出した。相対的なＧＰＲ５５発現についての結果を、図１に示す。
【０１７９】
ＧＰＲ５５発現を、乳癌細胞株中で見出した。ＭＣＦ７中のＧＰＲ５５の発現は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１よりも、統計的に低かった。
【０１８０】
ＣＢ１の発現は、ＭＣＦ７細胞株中のみで見出され、他の癌細胞株のいずれにおいても、ＣＢ１のｃＤＮＡは検出されなかった。ＭＣＦ７中の発現もまた、希釈されていない神経芽細胞腫（ＮＢ１）ｃＤＮＡについての発現と比較して、相対的に低いことが見出された。
【０１８１】
ＣＢ２の発現は、Ｔ４７Ｄ細胞株中のみで見出され、他の癌細胞株では検出されなかった。
【０１８２】
下記の表２は、異なる癌細胞株中で見出される異なるカンナビノイド受容体ＧＰＲ５５、ＣＢ１およびＣＢ２についての、相対的な発現レベル（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）の概略を示す。
【０１８３】
【表２】
2011523699.tif 000004
【０１８４】
従って、従来のカンナビノイド受容体（ＣＢ１およびＣＢ２）の発現は、乳癌および前立腺癌の細胞株中ではほとんど検出不可能であることが見出された。ＣＢ１の発現は、ＮＢ１細胞株に対して０．６％の発現を有していたＭＣＦ７乳癌細胞株中でのみ見出された。ＡＥＡが、ＭＣＦ７細胞株中の細胞増殖を阻害することが以前に示された。
【０１８５】
全ての他の癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１サブクローン、Ｔ４７ＤおよびＬＮＣａｐ）について、ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＣＢ１発現を全く検出しなかった。
【０１８６】
ＣＢ２の発現は、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株中のみで見出され、ＨＬ６０細胞株に対して、２％の発現を有していた。他の細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１  サブクローン、ＭＣＦ７およびＬＮＣａｐ）のいずれにおいても、ＣＢ２の発現は検出されなかった。これは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株およびＭＣＦ７細胞株中でＣＢ２の発現が検出されなかったＭｃＫａｌｌｉｐら（２００５）による研究と一致している。
【０１８７】
新規なカンナビノイド受容体ＧＰＲ５５の発現は、細胞株全体でより制限された発現を有するＣＢ１およびＣＢ２受容体と対照的に、より広い範囲の癌細胞において見出された。ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１  サブクローンおよびＴ４７Ｄ細胞は、最も高いレベルのＧＰＲ５５発現を有することが見出され、ＭＣＦ７細胞は、より制限されたレベルの発現を示した。しかし、ＣＢ１およびＣＢ２と対照的に、ＧＰＲ５５  ｃＤＮＡの増幅による蛍光は、全ての癌細胞株中のＧＰＲ５５についての所定の交点に達した。これは、ＧＰＲ５５発現が、癌細胞株中のＣＢ１およびＣＢ２よりも相対的に高い可能性があることを示唆する。
【０１８８】
当該結果は、癌細胞株の病原力と、ＧＰＲ５５のその相対的な発現との間の相関を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの比較において、非常に浸潤性であり、一方、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＣＦ７細胞は、相対的に非浸潤性であると以前に同定された（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センターのウェブサイト；Ｓｏｍｍｅｒｓら、１９９４）。
【０１８９】
本願明細書に記載される新規な発見は、染色体２ｑ上のＧＰＲ５５遺伝子の位置と一致し、この位置は、乳癌細胞中で不安定であるとして以前に同定された領域である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００３）。
【０１９０】
さらに、少なくとも７０の遺伝子中の変化した遺伝子発現の「サイン」は、原発転移性癌細胞のＤＮＡマイクロアレイ解析によって以前に同定され、これらの遺伝子のうち５８が上方制御されることが見出された（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、２００２）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究では、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞がマウスに注入され、骨に特異的に転移する細胞が単離され、発現の変化が、これらの７０の予後不良の遺伝子のうち４６で見出された（Ｍｉｎｎら、２００５）。興味深いことに、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中のこれらのサイン遺伝子（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅ）の１つであり、ＧＰＲ５５の下流で活性化されるＣｄｃ４２は、上方制御されることが示された（Ｍｉｎｎら、２００５）。
【０１９１】
最後に、Ｇ１２およびＧ１３は、共にヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧ１２ファミリーに属し（ＲｉｏｂｏおよびＭａｎｎｉｎｇ、２００５）、癌細胞および異常増殖の発生についての重要な形質転換因子であることが以前に見出された（ＲａｄｈｉｋａおよびＤｈａｎａｓｅｋａｒａｎ、２００１）。近年では、乳癌細胞中のこれらのＧタンパク質のα−サブユニットの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその侵襲性を増加させることが示された。Ｇ１２の阻害はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで乳癌細胞の転移のレベルを減少させることが示され、興味深いことに、増加したＧ１２の発現が生検によって採取された初期段階のヒト乳癌細胞中で見出された。Ｇ１２の活性化はまた、乳癌細胞中でＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化を導くことが見出された（Ｋｅｌｌｙら、２００６）。最近の研究（Ｒｙｂｅｒｇら、２００７）は、ＧＰＲ５５共役タンパク質をＧ１３として同定した。
【０１９２】
要約すると、発明者らは、ＣＢ１およびＣＢ２の発現は単一の細胞株に限られた一方、ＧＰＲ５５発現は、試験された全ての癌細胞株において見出されたことを示した。当該結果はまた、癌細胞株の相対的な病原力と、ＧＰＲ５５発現の相対的レベルとの相関を示した。
【０１９３】
（実施例２：ボイデンチャンバーアッセイにおけるＭＤＡ−ＭＢ２３１サブクローンの走化作用の刺激）
（ＦＢＳ対媒体）
血清飢餓細胞を使用し、ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）の化学誘引物質の効果を、その０．０１％  ＤＭＳＯ媒体対照に対して試験し、これをまた、後に、試験カンナビノイド化合物のための媒体として使用した。このアッセイの結果を図４に示す。
【０１９４】
図４は、腫瘍細胞の遊走が、１０％  ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）を含むウェルにおいて有意に増加し、平均遊走数は、０．０１％  ＤＭＳＯ媒体対照単独の存在下で認められたもののほぼ４倍であることを示す。
【０１９５】
（Ｏ−１６０２）
図５は、推定上のＧＰＲ５５作動薬であるＯ−１６０２（０．０１％  ＤＭＳＯ中で調製した）と共に行ったボイデンチャンバー走化性アッセイの結果を示す。ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）および０．０１％  ＤＭＳＯ媒体を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
【０１９６】
１μＭの推定上のＧＰＲ５５作動薬Ｏ−１６０２は、媒体対照と比較して細胞遊走を有意に増加させ、細胞株に対して化学誘引物質の特性を有することが見出された。
【０１９７】
（ＪＷＨ０１５）
図６は、ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）および０．０１％  ＤＭＳＯをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した、血清飢餓細胞に対するＧＰＲ５５作動薬ＪＷＨ０１５（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）の化学誘引物質の効果を示す。
【０１９８】
提案されたＧＰＲ５５作動薬ＪＷＨ０１５は、対照と比較して細胞数が有意に増加し、細胞遊走に対する陽性の効果を有することが見出された。
【０１９９】
（ＡＥＡ）
図７は、血清飢餓細胞の遊走への内在性カンナビノイドＡＥＡ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）の効果を示す。ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）および０．０１％  ＤＭＳＯ媒体を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
【０２００】
内在性カンナビノイドのリガンドＡＥＡもまた、対照と比較して細胞数が有意に増加し、細胞遊走に対する陽性の効果を有することを見出した。ＦＢＳの結果は、全ての以前の遊走アッセイにおいて見出されたものと一致した。
【０２０１】
（実施例３：ボイデンチャンバー走化性アッセイおよび浸潤アッセイにおける、ＣＢＤによるＭＤＡ−ＭＢ２３１の走化作用の阻害）
図８は、血清飢餓細胞の遊走に対するＣＢＤ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）の効果を示す。ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）および０．０１％  ＤＭＳＯ媒体をそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。ＣＢＤは、腫瘍細胞の遊走に対して効果がなく、対照と比較して、遊走細胞数における有意差がないことを見出した。
【０２０２】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ＧＰＲ５５拮抗薬であるＣＢＤ（１μＭ、０．０１％  ＤＭＳＯを含む）または０．０１％  ＤＭＳＯ媒体と共にプレインキュベーションし、ＦＢＳの濃度勾配への遊走に対する効果を、３つの個々のボイデンチャンバー遊走アッセイを使用して測定した。１μＭ  ＣＢＤ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）もまた、１０％  ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）と共にＣＢＤ処理された細胞の遊走ウェル中に入れ、ＣＢＤの濃度勾配が存在しないようにした。従って、ＦＢＳに誘導された遊走に対する効果は、ＣＢＤプレインキュベーションによるものだろう。図９は、ＣＢＤが、ＦＢＳへの腫瘍細胞の走化作用を有意に阻害することを表わす結果を示す。
【０２０３】
ＣＢＤ（１μＭ）プレインキュベーションもまた、ＦＢＳへの腫瘍細胞の浸潤に対する阻害効果を有することを見出した（図１０）。ＦＢＳの浸潤促進効果は、ＣＢＤによる前処理によって有意に減弱された。
【０２０４】
（実施例４：ボイデンチャンバー走化性アッセイにおける、ＬＰＩによるＭＤＡ−ＭＢ２３１の走化作用の増強）
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ＧＰＲ５５作動薬であるＬＰＩ（１μＭ、０．０１％  ＤＭＳＯを含む）または０．０１％  ＤＭＳＯ媒体と共にプレインキュベーションし、ＦＢＳの濃度勾配への遊走に対する効果を、３つの個々のボイデンチャンバー遊走アッセイを使用して測定した。１μＭ  ＬＰＩ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）も、１０％  ＦＢＳ（０．０１％  ＤＭＳＯを含む）と共にＬＰＩ処理細胞の遊走ウェルに入れ、ＬＰＩの濃度勾配が存在しないようにした。従って、ＦＢＳに誘導された遊走への効果は、ＬＰＩのプレインキュベーションによるものだろう。図１１は、ＬＰＩが、ＦＢＳへの腫瘍細胞の走化作用を有意に増加させることを表わす結果を示す。ＬＰＩの効果は、ＧＰＲ５５拮抗薬であるＣＢＤと共にインキュベーションすることによって阻害される（図１２）。
【０２０５】
（実施例５：ＧＰＲ５５の過剰発現は、ＭＣＦ７細胞中の浸潤性の表現型を誘導し、腫瘍細胞の浸潤および遊走へのＣＢＤおよびＬＰｌの効果は、ＧＰＲ５５によって媒介される）
ＭＣＦ７細胞は、非常に低いレベルのＧＰＲ５５の自然発現を呈した（図１）。空ベクターを形質移入されたＭＣＦ７細胞は、Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）細胞浸潤アッセイ（図１３）において、ＦＢＳへ遊走しなかった。対照的に、一過性にＧＰＲ５５を過剰発現するＭＣＦ７細胞においては、ＦＢＳへの細胞の有意な浸潤があった（図１３）。ＧＰＲ５５拮抗薬である、ＣＢＤは、対照（空ベクターを形質移入された）ＭＣＦ７細胞の基礎の浸潤への効果がなかった。しかし、ＣＢＤは、ＧＰＲ５５を過剰発現するＭＣＦ７細胞中のＦＢＳに誘導された浸潤を有意に阻害した（図１３）。これらの結果は、ＣＢＤによる腫瘍細胞の浸潤の阻害は、ＧＰＲ５５によって媒介されることを示す。
【０２０６】
同様に、ボイデンチャンバー走化性アッセイにおいて、ベクターを形質移入されたＭＣＦ７細胞は、ＦＢＳへ遊走せず、ＬＰＩによって影響されなかった（図１４）。しかし、ＧＰＲ５５を一過性に過剰発現するＭＣＦ７細胞において（図１４）、ＬＰＩは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で認められたのと同様の様式でＦＢＳに誘導された遊走を促進する。さらに、ＬＰＩへのＧＰＲ５５を発現するＭＣＦ７細胞の遊走は、ＧＰＲ５５に対するｓｉＲＮＡによって完全に阻害され、ＬＰＩによる細胞遊走の刺激は、ＧＰＲ５５によって媒介されることを確かめた。
【０２０７】
（概略）
１．乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＧＰＲ５５を発現し、ＭＣＦ７細胞は、この受容体を有意に低いレベルで発現する。
２．推定上のＧＰＲ５５作動薬Ｏ−１６０２、ＡＥＡ、およびＪＷＨ０１５は、全て、ＧＰＲ５５を発現する腫瘍細胞の遊走を促進することが見出された。
３．ＧＰＲ５５拮抗薬であるＣＢＤ（１μＭ）による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の３０分間の前処理は、遊走を消滅させ、ＦＢＳへの当該細胞の浸潤を減弱させることが見出された。対照的に、ＧＰＲ５５作動薬であるＬＰＩ（１μＭ）による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の３０分間の前処理は、ＦＢＳへの細胞の遊走を増加させることが見出された。細胞の生存率を評価するためのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイにおいて、ＣＢＤは、最大１０μＭの濃度での４時間の処理（遊走アッセイ）、または１μＭでの２４時間の処理（浸潤アッセイ）を行ったこれらの細胞への細胞傷害作用を有さなかったことに注意されたい。
４．ＭＣＦ７細胞は、低いレベルのＧＰＲ５５の自然発現を呈し、非浸潤性である。ＧＰＲ５５の過剰発現は、ＭＣＦ７細胞中の浸潤性の表現型を誘導し、腫瘍細胞の浸潤および遊走へのＣＢＤならびにＬＰＩの効果は、ＧＰＲ５５によって媒介される。
【０２０８】
（実施例６  骨細胞中の内在性カンナビノイド産生）
（内在性カンナビノイド２−ＡＧおよびアナンダミドは、細胞極性およびヒト破骨細胞による再吸収を刺激する）
１０ｎＭおよび１００ｎＭの２−ＡＧによるヒト破骨細胞の処理は、細胞極性、すなわち、Ｆ−アクチンリング数（図１１）および吸収活性における有意な増加をもたらしたが、この刺激効果は、より高濃度（１μＭ）では失われた。１０ｎＭ〜１μＭのアナンダミドによる破骨細胞の培養液の処理は、Ｆ−アクチンリング数に有意な変化をもたらさなかったが（データは示していない）、再吸収を有意に刺激した（図１１）。
【０２０９】
（内在性カンナビノイドは、ヒトの骨芽細胞および破骨細胞によって産生される）
２−ＡＧおよびアナンダミドの基礎レベルを、ヒトの骨芽細胞様細胞株、マクロファージ、および破骨細胞中で定量した。２−ＡＧは、ＭＧ−６３（０．１１±０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）骨芽細胞様細胞、ＴＥ８５（０．２８±０．０３ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）骨芽細胞様細胞、ヒト  マクロファージ（０．４３±０．１４ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）、およびヒト破骨細胞（０．１１±０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）中で検出され、マクロファージよりも破骨細胞において有意に低いレベルだった。アナンダミドは、ＭＧ−６３細胞（０．１２±０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質）およびヒト破骨細胞（０．１３±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、６人の提供者のうちの４人）中で検出されたが、ＴＥ８５骨芽細胞様細胞またはヒト  マクロファージ中では検出されなかった。
【０２１０】
ＬＰＳによる処理は、３人の別々の提供者に由来するヒト破骨細胞において検出された２−ＡＧのレベル（０．０６±０．０１から０．０．９±０．０１ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、０．２４±０．０８から０．２０±０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、０．１９±０．０４から０．１２±０．０４ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、図１２Ａ）を変化させなかったが、検出されたアナンダミドの量を大きく増加させた（０．０６±０．０１から０．１４±０．０３ｐｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、検出不可能から０．１５±０．０９ｐｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、または０．２２±０．０７ｐｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質、図１２Ｂ）。ＰＴＨによるＭＧ−６３細胞の長い処理は、検出された２−ＡＧのレベルの有意な増加をもたらし（図１２Ｃ）、検出されたアナンダミドのレベル（データは示していない）は変化しなかった。
【０２１１】
乳癌の転移は、しばしば骨組織に位置している。データは、内在性カンナビノイドが、骨中で産生され、これらは、腫瘍細胞の遊走に伴うＰＴＨ受容体の活性化に反応して産生されることを示す。さらに、内在性カンナビノイドは、腫瘍細胞への走化性因子として作用し、従って、高悪性度の転移性乳癌で上方制御されるＧＰＲ５５受容体の活性化を介して、骨への腫瘍細胞の転移に関係する要因として作用する可能性がある。
【０２１２】
（参考文献）
Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、テキサス大学、Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センターのウェブサイト
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ｃａｎｃｅｒｂｉｏｌｏｇｙ／ｄｌｎｄｅｘ．ｃｆｍ？ｐｎ＝３１０６２０３２−ＢＯＥＢ−１１Ｄ４−８０ＦＢ００５０８Ｂ６０３Ａ１４（２００８年４月７日に利用した）
【０２１３】
発明者；Ｂｒｏｗｎ  Ａ．、Ｗｉｓｅ  Ａ．
出願人；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（２００３）。米国特許第０，１１３，８１４号明細書
Ｂｒｏｗｎ  Ａ．Ｊ．，（２００７）．  Ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５２、５６７−５７５
【０２１４】
Ｊａｒａｉ  Ｚ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ｊ．Ａ．、Ｖａｒｇａ  Ｋ．、ら（１９９９）．  Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｉｔｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ＣＢ１  ｏｒ  ＣＢ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ、９６（２４）、１４１３６−１４１４１
【０２１５】
Ｊｏｈｎｓ  Ｄ．Ｇ．、Ｂｅｈｍ  Ｄ．Ｊ．、Ｗａｌｋｅｒ  Ｄ．Ｊ．、Ａｏ  Ｚ．、Ｓｈａｐｌａｎｄ  Ｅ．Ｍ．、Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｄ．Ａ．、Ｒｉｄｄｉｃｋ  Ｍ．、Ｄｏｗｅｌｌ  Ｓ．、Ｓｔａｔｏｎ  Ｐ．Ｃ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｐ．、Ｂａｏ  Ｗ．、Ａｉｙａｒ  Ｎ．、Ｙｕｅ  Ｔ−Ｌ．、Ｂｒｏｗｎ  Ａ．Ｊ．、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．Ｄ．、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓ．Ａ．、（２００７）．  Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅｉｒ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５２、８２５−８３１
【０２１６】
Ｋｅｌｌｙ  Ｐ．、Ｍｏｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｊ．、Ｊｕｎｅｊａ  Ｊ．、Ｂｏｏｄｅｎ  Ｍ．Ａ．、Ｄｅｒ  Ｃ．Ｊ．、Ｄａａｋａ  Ｙ．、Ｄｅｗｈｉｒｓｔ  Ｍ．Ｗ．、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｔ．Ａ．、Ｃａｓｅｙ  Ｐ．Ｊ．、（２００６）．  Ｔｈｅ  Ｇ１２  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、１０３（２１）、８１７３−８１７８
【０２１７】
ＭｃＫａｌｌｉｐ  Ｒ．Ｊ．、Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ  Ｍ．、Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ  Ｐ．Ｓ．、（２００５）．Δ−９−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４（６）、３２８１−３２８９
【０２１８】
Ｍｉｌｌｅｒ  Ｂ．Ｊ．、Ｗａｎｇ  Ｄ．、Ｋｒａｈｅ  Ｒ．、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｆ．Ａ．、（２００３）．  Ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７３（４）、７４８−７６７
【０２１９】
Ｍｉｎｎ  Ａ．Ｊ．、Ｋａｎｇ  Ｙ．、Ｓｅｒｇａｎｏｖａ  Ｉ．、Ｇｕｐｔａ  Ｇ．Ｐ．、Ｇｉｒｉ  Ｄ．Ｄ．、Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎ  Ｍ．、Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ  Ｖ．、Ｇｅｒａｌｄ  Ｗ．Ｌ．、Ｂｌａｓｂｅｒｇ  Ｒ．、Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．，（２００５）．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１５（１）、４４−５５
【０２２０】
Ｏｋａ  Ｓ．、Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｋ．、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｓ．、Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｔ．、（２００７）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＰＲ５５  ａｓ  ａ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３６２（４）、９２８−９３４
【０２２１】
Ｒｙｂｅｒｇ  Ｅ．、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｎ．、Ｓｊｏｅｇｒｅｎ  Ｓ．、Ｈｊｏｒｔｈ  Ｓ．、Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎ  Ｎ−Ｏ．、Ｌｅｏｎｏｖａ  Ｊ．、Ｅｌｅｂｒｉｎｇ  Ｔ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．、Ｄｒｍｏｔａ  Ｔ．、Ｇｒｅａｓｌｅｙ  Ｐ．Ｊ．、（２００７）．Ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５２、１０９２−１  １０１１
【０２２２】
Ｓａｗｚｄａｒｇｏ  Ｍ．、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ．、Ｌｅｅ  Ｄ．Ｋ．、Ｌｙｎｃｈ  Ｋ．Ｒ．、Ｃｈｅｎｇ  Ｒ．、Ｈｅｎｇ  Ｈ．Ｈ．Ｑ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓ．Ｒ．、Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ｂ．Ｆ．、（１９９９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ＧＰＲ５２，  ΨＧＰＲ５３  ａｎｄ  ＧＰＲ５５：  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６４、１９３−１９８
【０２２３】
Ｓｏｍｍｅｒｓ  Ｃ．Ｌ．、Ｂｙｅｒｓ  Ｓ．Ｗ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｅ．Ｗ．、Ｔｏｒｒｉ  Ｊ．Ａ．、Ｇｅｌｍａｎｎ  Ｅ．Ｐ．、（１９９４）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、３１、３２５−３３５
【０２２４】
Ｓａｗｚｄａｒｇｏ  Ｍ．、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ．、Ｌｅｅ  Ｄ．Ｋ．、Ｌｙｎｃｈ  Ｋ．Ｒ．、Ｃｈｅｎｇ  Ｒ．、Ｈｅｎｇ  Ｈ．Ｈ．Ｑ．、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓ．Ｒ．、Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ｂ．Ｆ．、（１９９９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ＧＰＲ５２，  ΨＧＰＲ５３  ａｎｄ  ＧＰＲ５５：  ＧＰＲ５５  ｉｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６４、１９３−１９８
【０２２５】
Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ  Ｖ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｄ．Ｒ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｂ．Ｒ．、Ａｂｏｏｄ  Ｍ．Ｅ．、（１９９６）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＢ２）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２７８  （３）、９８９−９９９
【０２２６】
Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．、Ｂａｉｌｌｉｅ  Ｇ．Ｌ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ａ．Ｍ．、Ｒａｚｄａｎ  Ｒ．Ｋ．、Ｒｏｓｓ  Ｒ．Ａ．、Ｐｅｒｔｗｅｅ  Ｒ．Ｇ．、（２００７）．Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄｌｙ  ｈｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＣＢ１  ａｎｄ  ＣＢ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５０、６１３−６２３
【０２２７】
ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  Ｌ．Ｊ．、Ｄａｉ  Ｈ．、ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  Ｍ．Ｊ．ら、（２００２）．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ、４１５、５３０−５３６
【０２２８】
【表３】
2011523699.tif 000005
2011523699.tif 000006
2011523699.tif 000007
2011523699.tif 000008
【図１】
2011523699.tif 000009
【図２】
2011523699.tif 000010
【図３】
2011523699.tif 000011
【図４】
2011523699.tif 000012
【図５】
2011523699.tif 000013
【図６】
2011523699.tif 000014
【図７】
2011523699.tif 000015
【図８】
2011523699.tif 000016
【図９】
2011523699.tif 000017
【図１０】
2011523699.tif 000018
【図１１】
2011523699.tif 000019
【図１２】
2011523699.tif 000020
【図１３】
2011523699.tif 000021
【図１４】
2011523699.tif 000022
【図１５】
2011523699.tif 000023
【図１６】
2011523699.tif 000024
【配列表】
2011523699000001.app
【国際調査報告】
2011523699.tif 000025
2011523699.tif 000026
2011523699.tif 000027
2011523699.tif 000028