(57)【要約】本発明は、計量タンク（１１１）中の流体のフォトルミネッセンスの測定による生物学的解析用の装置（１００）に関する。かかる装置（１００）は、吸収と蛍光の測定にそれぞれ適した異なるスペクトル範囲の光を発するように適合された少なくとも２つの光源（１２１と１３１）と、センサ（１４１）、光学システム（１４２）、およびフィルタ手段（１４４）を備えたセンサデバイス（１４０）とを備え、吸収および／または蛍光の測定を可能にすべく、本発明によればセンサ（１４１）、光学システム（１４２）、およびフィルタ手段（１４４）の３つの要素が相互に関係する。本発明によれば、センサ（１４１）の内部利得は、蛍光と吸収の測定が連続して実行されるよう設定可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
計量タンク（１１１）中の流体の電気光学的測定による生物学的解析用の装置（１００）であって、該装置（１００）は、吸収および蛍光の測定にそれぞれに適した異なるスペクトル領域の光を発するよう適合された少なくとも２つの光源（１２１，１３１）と、吸収および蛍光の各々の測定に関連するインピーダンスを測定する装置と、センサ（１４１）、光学システム（１４２）およびフィルタ手段（１４４）を備えた共有センサデバイス（１４０）とを備え、吸収および蛍光のうちの少なくとも一方の測定が可能となるようセンサ（１４１）、光学システム（１４２）およびフィルタ手段（１４４）の３つの要素が相互に関係し、蛍光および吸収の測定が連続して実行可能となるようセンサ（１４１）の内部利得が設定可能である、装置（１００）。
【請求項２】
前記センサ（１４１）が、内部アバランシェ利得を抑制するよう適合されたバイアス回路（１４３）に接続されたアバランシェフォトダイオードであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
抑制された内部利得が１であり、アバランシェフォトダイオード（１４１）が簡単なフォトダイオードとして作用することを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
バイアス回路（１４３）は、２つの異なる電圧である高圧と低圧を提供し、かつフォトダイオード（１４１）にバイアスをかけるべく高圧または低圧を提供するよう電気的に制御された２位置スイッチを備えることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記バイアス回路（１４３）は、電圧発生器によってアバランシェフォトダイオードに加えられるバイアス電圧を制御するデジタルまたはアナログ手段によって制御されるプログラム可能な電圧発生器を備えることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の装置。
【請求項６】
２つの光源（１２１，１３１）が光センサ（１４１）の光軸と同一平面内にある放射光軸を有することを特徴とする請求項１−５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
吸収波長の光を放射する光源（１３１）の光軸が、光センサ（１４１）の光軸と一直線上に並び、蛍光（１２１）を励起する光源の光軸はセンサ（１４１）および別の光源（１３１）の光軸に垂直であることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
もたらされる測定の関数として可変な電子利得で、電子増幅ステージ（２０３）にセンサ（１４１）が接続されることを特徴とする請求項１−７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
センサ（１４１）の内部利得および電子利得が、少なくとも好塩基球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、赤血球、血小板、赤芽球、網状赤血球、および網状血小板から選択された複数の細胞集団の吸収および蛍光測定を区別可能にすべく設定可能である請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
センサ（１４１）の内部利得および電子利得が、センサデバイスを用いた、サンプル中に存在する細胞のファミリーの分類および絶対計数を可能にする各分析サイクルの吸収および蛍光測定を区別可能にすべく設定可能であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
センサ（１４１）の内部利得および電子利得が、センサデバイスを用いた、少なくとも好塩基球と網状赤血球の分析サイクルの吸収および蛍光測定を区別可能にすべく設定可能
であることを特徴とすることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
使用される蛍光マーカがチアゾールオレンジであり、蛍光励起光源が約４７０ｎｍで光を放射し、センサデバイスのフィルタ手段は４９５ｎｍ付近に位置するカットオフ波長の色ガラスタイプのフィルタを有することを特徴とする請求項１−１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
生化学的および形態測定データを得るべく２つの光源が同時にオンにされ得ることを特徴とする請求項１−１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
生体サンプル中に存在する細胞集団を分類および数えるための、請求項１−１３のいずれか一項に記載の装置の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の属する技術分野は生物学的解析、詳細には血液分析の技術分野である。本発明は一般に、計量タンク中に存在する流体の電気光学的測定のための装置および方法に関する。かかる装置および方法は、流体（例えば生体液）中の微細物体の分類および計数を目的とする。
【０００２】
より正確には、本発明は、分析されるサンプル中に存在する細胞の数を計算および区別するための、電気的および光学的測定の使用に基づく分析法を使用した装置に関する。本発明に関連し、サンプルは好ましくは血液サンプルである。
【背景技術】
【０００３】
造血細胞に関し、当業者は、消光または吸収の現象を含む細胞の容積計または回折計による形態分析により、主な細胞系列（赤血球、血小板および白血球を含む）の区別が可能になることを知っている。白血球集団はそれ自体、リンパ球、単球、好中球、好酸球、および好塩基球のような複数のカテゴリに分類される。
【０００４】
これらの細胞の成熟度は、本願出願人により出願された特許文献１に記載されているように、その体積と白色光の見かけの吸収を同時に決定することによりある程度まで決定できる。準単色光を使用した装置が特許文献２に記載されている。
【０００５】
細胞の成熟度の評価は、それが早期診断を可能にするため非常に重要である。一般的に言うと、循環する血液に存在する細胞の大部分は成熟細胞である。
上述の種類の細胞の各々に関して、様々なレベルの成熟が知られている。したがって、赤血球は、前赤芽球の形でまず生産され、その後、好塩基性赤芽球となり、その後、多染性赤芽球となり、これが好酸赤芽球となり、それから網状赤血球へと発達する。これらの網状赤血球が、一旦循環する血液中に入ると、最後には赤血球に分化する。
【０００６】
白血球も、前骨髄芽球の形で骨髄でまず生産される。この骨髄芽球が、その後、骨髄球を生成し、次にこれが好塩基性、好酸性、または好中性顆粒球に変換され、最初は非分割型、次に年が経つにつれますます分割する核を有するようになる。
【０００７】
骨髄芽球は、単芽球、前単核、そして次に末梢循環に入る単球細胞を産出する単球系列の源である。
骨髄芽球の元となっている幹細胞は、リンパ球系列の幹細胞の形の分化によりリンパ細胞系列を生じさせかかる細胞系列の一部は胸腺および神経節（Ｔ系列）でて成熟し続け、残りは骨髄に残ってＢリンパ球系列を産出する。一旦形質細胞の形で活性化されたＢリンパ球は、病原性抗原と格闘するために抗体を生産する。
【０００８】
血小板は、巨核芽球に由来し、巨核芽球は骨髄芽球の元である骨髄始原細胞に由来し、骨髄芽球の成熟の最終段階に達すると（血小板減少症  巨核芽球）、骨髄芽球はその細胞質の分割により血小板を生産する。最近の血小板（網状血小板）は、原細胞の残留物であるＲＮＡを含んでいる。
【０００９】
いくつかの病理の診断には、造血細胞のますます精密な計数が必要とされている。詳細には、赤血球の未熟版である網状赤血球および赤芽球のような新しい集団が出現できることが必要とされている。同様に、未熟細胞、すなわち未熟リンパ球、単球または顆粒細胞
と呼ばれる白血球の前駆体の出現も、非常に重要である。同様に、活性化リンパ球または網状血小板の分類および計数により、患者の診断における有意義な改善を得ることが可能となるだろう。
【００１０】
赤血球の平均寿命は１２０日であるため、正常な再生率は０．８３％でなければならない。一般に許容される正常平均率は０．５％から１．５％であり、これらの値は３週齢未満の新生児ではより高い（２％から６％まで）。網状赤血球の観察および計数は、赤血球造血活性の指標となっており、したがって、特に化学療法後の骨髄再生のモニタにおける、組換えエリトロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）によるフォローアップ治療における、貧血診査バランスにおける、または溶血または代償性出血における、特に有用なパラメータである。
【００１１】
このような細胞の区別および計数が有用な病理のいくつかの例を以下に挙げる。
例えば、赤芽球を数える臨床上の利点は、特定の形式の貧血の検出にとって重要であると分かる場合がある。溶血性貧血の一般的特性は、赤血球の構造または機能の赤血球外要因または内因性奇形に起因し得る、成体型赤血球の過剰な破壊である。
【００１２】
赤白血病は、赤血球系列の細胞および顆粒球系列の前駆体の悪性の増殖を特徴とする、種々の急性骨髄芽球性白血病である。細胞学的視点から見て、末梢白血球過多症は、初期段階に血液中を循環する芽細胞が存在する（５９％）ことが留意される。骨髄球増加症は、未熟成分、顆粒球系列、または赤血球系列の循環する血液への通路に相当する。
【００１３】
識別に関しては、網状赤血球が、最も興味深い細胞ファミリーの一つを構成し、多数の方法が存在し、また自動血液分析で開発中である。これらの細胞系列は蛍光性の着色剤（例えば非対称シアニン染料、特にチアゾールオレンジ）により核酸をマーキングすることにより数えることが可能である。
【００１４】
上記チアゾールオレンジ分子は、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の細胞質内検出用の固有な物理化学的特性を有する。溶液中で遊離している場合、かかる分子は光励起により引き起こされる蛍光をほとんど示さない。チアゾールオレンジの立体化学的形状は、この分子が核酸塩基の間に挟まれる形状である。この状態で、チアゾールオレンジ分子は蛍光を発する。したがって、蛍光のレベルの検出および測定により、細胞質内の核酸を定量することが可能となる。細胞の性質は、細胞質内核酸のこの定量化を、第２の光学的または電気的測定と組み合わせたものから導き出され、それにより、細胞の絶対的または相対的計数が可能となる。
【００１５】
この蛍光を測定するための既存の電気光学素子は比較的複雑である。特に高い分析率が期待される場合、かかる装置はかなりのハードウェア資源を使用する。この状況で、略語ＦＳＣ（前方散乱）およびＳＳＣ（側方散乱）により一般に識別される回折を測定するか、または略語ＡＬＬ（軸方向の光の損失）により一般に識別される消光を測定するための１セットのセンサを備えたレーザ光源を使用することが比較的標準的な方法である。
【００１６】
かかるレーザは、レーザビームと交差する瞬間に細胞上または細胞内に存在する１つまたは複数のマーカまたは１つまたは複数の着色剤の蛍光を引き起こすことが可能にする。標準方法では、蛍光光および回折光がそれらの分光特性に基づいて分離される。このため、多誘電性の干渉光学フィルタ、つまり異なる屈折率を有する２つ以上の透明材料の交互配置によって得られるフィルタが一般に使用される。蛍光を測定するために、光電子増倍管またはフォトダイオードが使用され、大部分の時間、アバランシェ（電子雪崩）モードで動作する。これらのシステムは、光学的および機械的な視点から見て比較的複雑である。
【００１７】
特許文献３は、ＡＧＣ（自動利得制御）アバランシェフォトダイオードの使用を示す。この装置は、フォトダイオードの利得が印加電圧の関数として自動的に調節されるフローサイトメータ内で使用される。
【００１８】
出願人名Ｓｙｓｍｅｘの特許文献４は、各光源からデータを回収する複数のセンサについて開示している。この装置もＳＳＣ（側方散乱）の測定だけを達成している。
特許文献５は、流動中は細胞が分析されないオンライン読取り装置について開示している。ここでも、たとえデータが得られても（吸収、蛍光、反射率データ）、かかるデータは単一のセンサでは得られない。
【００１９】
特許文献６は、吸収読取りのない落射蛍光装置を示す。
特許文献７は、複数の異なる出所からデータを得ることが必要な場合に、複数のセンサを使用している。
【００２０】
特許文献８は、複数の蛍光色素でマーキングされた粒子の数を計算可能な装置について開示している。この装置は、単波長光源と、各蛍光のデータを回収可能な複数のセンサとを有する。
【００２１】
特許文献９は、複数の異なるセンサを使用したＦＳＣ、ＳＳＣおよび蛍光測定を達成可能な装置を開示している。
特許文献１０（Becton Dickinson and Co）は、流動中の細胞を数えるための複数の光
検出器に関連付けられた複数の蛍光の使用について記載している。各光検出器の利得は、検出された蛍光にそれを適合させるために調整され得る。
【００２２】
公知の装置はいずれも、（特に循環する血液中の）生物細胞を識別し数えるために必要な電気光学および光学流体測定システムを組み込んでいる。既存の装置のサイズおよび複雑さは高価となり、その作動が複雑となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第５，１３８，１８１号
【特許文献２】国際公開第２００６／０５３９６０号
【特許文献３】米国特許出願出願公開第２００６／０２１９８７３号
【特許文献４】欧州特許出願出願公開第１  ７１０  ５５８号
【特許文献５】欧州特許出願出願公開第０  ５３３  ３３３号
【特許文献６】国際公開第２００８／０１９４４８号
【特許文献７】欧州特許出願出願公開第０  ８０６  ６６４号
【特許文献８】米国特許第４，７４５，２８５号
【特許文献９】米国特許第５，４０８，３０７号
【特許文献１０】米国特許第６，８９７，９５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、本発明の主な目的は、計量タンク中の流体の電気光学的測定による生物学的分析用の装置を提案することにより、そのような欠点を軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
かかる装置は、吸収および蛍光の測定にそれぞれ適した異なるスペクトルの領域で光を発するよう適合された少なくとも２つの光源と、各吸収および蛍光の測定に関連するイン
ピーダンスを測定する装置と、センサ、光学システム、およびフィルタ手段を備えた共有センサ装置とを備え、センサ、光学システム、およびフィルタ手段の３つの要素が吸収および蛍光のうちの少なくとも一つを測定可能とするために相互に関係し、蛍光および吸収の測定が連続して行われるようにセンサの内部利得が構成可能である。
【００２６】
蛍光が光学システムによって測定され、センサが吸収を測定するために使用されるように、セットアップが構成される。このアプローチにより本発明の特徴である最適レベルの統合につながる。本発明の利点は、製造コストの低減および実施の容易さを含む。
【００２７】
このような装置を用いて、各細胞を「二重測定」モードで、すなわち抵抗率の測定と、吸光度および／または蛍光の測定との２つを測定可能となる。抵抗率測定を、吸光度または蛍光の測定と関連付けることで、容積測定の情報を得ることが可能となる。
【００２８】
見かけの吸光度は細胞の屈折／回折現象と大いに関連している。上記の測定により、細胞集団のセットに特異的な高感度な結果を得るのに十分な信頼できるデータが得られる。
本発明は、特定の機能を有する試薬を使用して予め化学的に調製された細胞懸濁液の読取りを可能にする、独創的で簡単な光学装置を提案する。これらの細胞懸濁液は、容積−吸収の読取り値および容積−蛍光の読取り値（すなわち同じセンサデバイスによって行なわれた２つのパラメータの電気光学的測定）を使用して連続して分析される。
【００２９】
この二重測定はハードウェア資源を非常に簡素化する。本発明の装置は、例えば以下のものの分類および計数を可能にする：血小板、赤血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤芽球、網状血小板、未熟リンパ球、未熟単球、未熟顆粒球、活性化リンパ球および非分割好中球。
【００３０】
本発明の１実施形態では、センサは、内部アバランシェ利得を抑制するよう適合されたバイアス回路に接続された、アバランシェフォトダイオードである。
本発明に新規な特定のバイアスに関する単純なアバランシェフォトダイオードの使用は、比較的低価格での本発明の単純かつ効率的な実施を可能にする。
【００３１】
本発明の有利な実施形態では、抑制された内部利得は１であり、アバランシェフォトダイオードは単純なフォトダイオードとして作用する。
この実施形態は、アバランシェフォトダイオードの挙動を、吸収測定に対して従来使用されていた標準フォトダイオードの挙動に低減させる。本発明によって提供される利得抑制がない状態では、高い光強度での吸収測定に使用されれば、アバランシェフォトダイオードは直ちに飽和するだろう。
【００３２】
本発明の１実施形態では、バイアス回路は、２つの異なる電圧（すなわち高圧と低圧）を提供し、かつフォトダイオードにバイアスをかけるために高圧または低圧を提供すべくデジタル制御される、２つの位置をとるスイッチ（以下、２位置スイッチと称する）、を備える。
【００３３】
単純な切り替え制御により、本発明の上記実施形態は非常に丈夫な動作を提供する。ダイオードは、スイッチの位置の関数として、高圧と低圧で連続的にバイアスされる。これは内部利得およびしたがって受信機の感度を変更する。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、バイアス回路は、プログラム可能な電圧発生器、またはこの発生器によりアバランシェフォトダイオードに加えられるバイアス電圧を制御するデジタルまたはアナログ手段によって制御される電圧発生器を備える。
【００３５】
この別の実施形態は単一の電圧発生器を使用することが可能である。
本発明の１つの特定の特徴によれば、２つの光源は、光センサの光軸と同一平面上の放射光軸を有する。
【００３６】
吸収モードにおいて、光学的装置は３つの平面、つまり入射瞳の平面、細胞を通過する平面、および受け入れ瞳の平面を結合させる。したがって照明はニュートンの光である。ここで、光学装置は、平面、水およびガラス、測定チャンバの屈折表面により導入される幾何および色収差を補正すべく、三次収差で補正される。よって測定にとって重要なすべての光学経路は同一平面である。
【００３７】
本発明の有利な特徴によれば、吸収波長の光を発生する光源の光軸は光センサの光軸と一直線上に並べられ、蛍光を励起させる光源の光軸はセンサの光軸および別の光源の光軸と垂直である。
【００３８】
この特徴はセンサデバイスに優れた吸収および蛍光挙動を与える。吸収測定のためには、センサデバイスを光源に対面して位置させる。蛍光測定のためには、光源はセンサデバイスに垂直に配置し、放射光がより低い強度の蛍光の測定に干渉するのを防止する。
【００３９】
本発明の別の特定の特徴によれば、蛍光に使用されるマーカはチアゾールオレンジであり、蛍光励起源は約４７０ナノメートル（ｎｍ）で放射しなければならず、センサデバイスのフィルタ手段は４９５ｎｍでカットオフする色フィルタを備えなければならない。
【００４０】
チアゾールオレンジの使用は、複数の細胞集団の識別に有利であることが知られている。本発明の文脈では、チアゾールオレンジの使用により、比較的低コストな色ガラスフィルタの使用が可能となる。そのような安価なフィルタは、特定の種類の帯域幅にのみ利用可能である。チアゾールオレンジは、４８８ｎｍに次位（第２）に位置する最大励起以下で励起された時でも、いくらかの効果を有する。よって発明者は、チアゾールオレンジの４７０ｎｍ周囲の波長の励起と、比較的低価格で利用可能な色ガラスフィルタの使用とを組み合わせると、アバランシェフォトダイオードまたは高い内部利得のセンサを用いて、完全に適切な定量的蛍光測定（つまり高感度かつ特異的な測定）を行なうことが可能となることを見出した。この発見は、アバランシェダイオードを用いた吸収測定の実施をさらに可能にする本発明により、特定の方法で使用される。
【００４１】
センサは、もたらされる測定の関数として可変な電子利得で、電子増幅ステージと有利に接続される。
電子増幅ステージの使用は、データを続いて処理するために利用可能なダイナミックレンジの使用を最大限にすることにより、光度の量化を改善する可能性を増大させる。
【００４２】
本発明の１つの応用特徴によれば、センサの内部利得および電子利得は、好塩基球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、赤血球、血小板、赤芽球、赤血球前駆物質、網状赤血球、および網状血小板から選択された複数の細胞集団の吸収および蛍光測定の区別を可能にすべく設定可能である。
【００４３】
この特徴は、計数される種々のタイプの細胞を測定するようデバイスを適合させるある程度の許容範囲を提供する。この許容範囲により、細胞の種類の関数としてセンサデバイスの感度およびデータ処理ダイナミックレンジの使用を変更することが可能となる。
【００４４】
特に、センサの内部利得および電子利得は、センサデバイスを用いて、各分析サイクルの吸収および蛍光測定の区別を可能にすべく有利に設定可能である。
ここで、分析サイクルとは、サンプル中に存在する細胞のファミリーの分類および絶対
的計数のためのデバイスの各使用サイクルを意味する。
【００４５】
これは、特定の試薬および他のパラメータ（例えば細胞が計量タンクに入る速度）で分析されるサンプルのインキュベーションに関するプロセスに相当する。したがって、ここでの文脈では、例えば５つの異なる分析サイクルを行なうことが可能である。ＬＭＮＥサイクルは、リンパ球、単球、好中球および好酸球の正確な分類および計数を可能にする分析サイクルに相当する。ＧＲ／ＰＬＴサイクルは、赤血球と血小板の絶対計数を可能にする。ＢＡＳＯサイクルは、好塩基球の識別および計数を可能にする。ＲＥＴＩＣサイクルは、赤血球の前駆物質である網状赤血球の識別および計数を可能にする。ＥＲＢサイクルは、かかる網状赤血球の前駆物質、すなわち赤芽球の計数を可能にする。
【００４６】
センサの内部利得および電子利得は、センサデバイスを用いた、少なくとも好塩基球および網状赤血球の吸収および蛍光測定の区別を可能すべく有利に設定可能である。
この特徴は、上記に言及した細胞のタイプの各々で観察される平均光度スペクトルを包含することが可能である。蛍光光度はＲＥＴＩＣサイクル中に最小となる。したがって、センサの感度が最大感度でなければならない。対照的に、好塩基球は、吸収測定により、光度が最も高い構成であることが明らかになっている。したがって、ＢＡＳＯサイクル中はセンサの感度が最小感度でなければならない。これらの２つのタイプの極端な細胞の計数を保証することにより、センサの内部利得および電子利得の変更によるデバイスの他の細胞タイプ向けの調節が可能である。
【００４７】
本発明のさらなる追加の特徴によれば、生化学的および形態学的データを得るために、２つの光源が同時にオンにされてもよい。
本発明の他の特徴および利点は、本発明の１つの非限定的な実施形態を示す、添付図面に関連して与えられた以下の説明から理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の装置の斜視図。
【図２】図１の装置の（ＸＺ）における断面図。
【図３】図１の装置の（ＹＺ）における断面図。
【図４】図１の装置の略平面図。
【図５】チアゾールオレンジの励起および蛍光スペクトル。
【図６】本発明の１実施形態におけるセンサに接続された電子制御回路の線図。
【図７】本発明の好ましい実施形態で使用される色ガラス光学フィルタの高域伝送。
【図８】装置を使用して得られ得る種々の結果。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
図１は、本発明の装置１００の好ましい実施形態の斜視図である。この装置１００は、４つの機能的アセンブリ：計量タンクをサポートするアセンブリ１１０、光源をサポートする２つのアセンブリ１２０および１３０、ならびに光センサをサポートするアセンブリ１４０から成る。図示した本発明の実施形態では、光源をサポートする２つのアセンブリ１２０および１３０は相互に垂直であり、２つのアセンブリのうちの１つが、センサを備えたアセンブリ１４０に対面している。
【００５０】
図２は、測定平面と交差するＸＺ平面における装置１００の断面図である。アセンブリ１１０は、計量タンク１１１と、フローサイトメトリーの法則に従って、分析される流体の流れ（フロー）を計量タンク１１１に生成すべく計量タンク１１１に流体を吐出するノズル１１２とを備えている。アセンブリ１３０は、計量タンクの適切な照明を提供する光源１３１および光学素子１３２を備えている。
【００５１】
アセンブリ１４０は、センサ１４１と、センサ１４１による光の適切な受け取りのための光学素子１４２とを備えている。アセンブリ１３０および１４０の光軸はフローの方向に垂直である。
【００５２】
図３は、測定平面と交差するＹＺ平面における装置１００の断面図である。アセンブリ１２０は、光源１２１と、計量タンクの適切な照明のための光学素子１２２とを備えている。
【００５３】
アセンブリ１２０の光軸も流体のフローの方向に垂直であることをここで再び指摘する。したがって、アセンブリ１２０、１３０および１４０の３つの光軸は同一平面内にあり、計量タンク１１１中の流体の流れはこの共通の平面に垂直である。
【００５４】
図４は、計量タンク１１１が光源１２１，１３１およびセンサ１４１と共に表された装置１００の略平面図である。
２つの光源１２１および１３１は異なる波長の光を放射し、２つのタイプの測定、すなわち吸収測定および蛍光測定に使用される。吸収測定は、細胞の存在（特に細胞の天然または人工シトクロムの存在）により引き起こされる回折、屈折／反射、および真の吸収効果の合計である見かけの吸収の測定である。
【００５５】
見かけの吸収の大部分は細胞の屈折性／回折現象に関与する。大部分の細胞（特に顆粒細胞系列の細胞）の場合、高品質な形態測定分析に寄与するのは顆粒とそのサイズおよび数の正確な評価である。
【００５６】
チアゾールオレンジの蛍光測定および吸収測定の本発明の非限定的な例を以下に説明する。
図５は、チアゾールオレンジの分光特性を表わす。最大吸収波長が約５１０ｎｍであることに注意する。この波長は、約５３０ｎｍに位置する再放射波長に近いが、それにもかかわらず主として約４８０ｎｍの第２の最大値で主に光を放射する光源を使用することが好ましい。
【００５７】
本発明の１実施形態では、光源１２１は、フローサイトメータの計量タンク１１１内を循環するチアゾールオレンジで標識された細胞を励起するのに使用される、２０ミリワット（ｍＷ）の４７３ｎｍレーザダイオードである。細胞の各々により放射された蛍光は、該細胞を構成する核酸の量に比例しているが、センサ１４１の光軸上に９０°で収集される。波長を安定させるために、レーザダイオード１２１は、経時的な温度変化および発光出力変化を防ぐべく、電流調節される。
【００５８】
レーザダイオード１２１により放射された光は、一方の軸に対して４０゜および該第１の軸に垂直なもう一方の軸に対して１０゜の中間高さ幅の角度で、非常に顕著に発散することがさらに知られている。
【００５９】
また、レーザダイオード１２１により放射されるビームの上記の非常に顕著な発散を改善するには、特定の視準（コリメーション）光学素子が必要である。かかる目的には、成型された非球面レンズが低価格であるため、従来多く使用されている。放射されたレーザビームのすべてを集めるため、かかるレンズの開口数は通常少なくとも０．５である。この種のレンズの使用により、発散が低いコリメートビームを形成することが可能となる。一対のアナモルフィックプリズムにより、楕円のコリメートビームを円形にすることが可能である。この動作は、円形ビームを得るために長軸を圧縮し、短軸を伸張することからなる。レーザダイオード１２１の楕円形は問題とならないため、本発明の装置では長軸の圧縮は必ずしも必要ないことに留意する。これとは逆に、レーザダイオード１２１は、噴
射ノズル１１２の出口から２００マイクロメートル（μｍ）のサイズが約２０×６０平方メートル（μｍ2）である楕円の捕獲ウィンドウ１１７にビームを適合させるのに好都合
である（図４参照）。
【００６０】
第２の光源１３１は、約６５０ｎｍで有利に光を放射する。本発明の１実施形態では、この光源は共振空洞発光ダイオード（ＲＣＬＥＤ）である。
本発明によれば、蛍光と吸収とを測定するためにセンサ１４１が使用される。センサ１４１は、蛍光と吸収に使用される光学素子１４２に結合されている。
【００６１】
センサ１４１は、自身の利得を変更するよう適合された電子制御回路１４３に接続される。
ここで説明する本発明の実施形態では、センサ１４１は、フォトダイオード１４１が本発明の原理に従って作動するようにバイアスが制御回路１４３により変更される、アバランシェフォトダイオードである。
【００６２】
本発明は、簡単なフォトダイオードとしてアバランシェフォトダイオードを構成すべく、アバランシェ利得を抑制する制御回路１４３を使用している。したがって、アバランシェフォトダイオードは切り替え可能な利得を有する。これはアバランシェダイオードの新規かつ以前には公表されていない使用態様である。
【００６３】
本発明の利点は、血液成分を特徴付けし、かつ数えるために１つのセンサデバイスのみを使用することである。測定ごとに二つの検出チャネル（吸光度と蛍光）が使用されないため、コスト削減が得られる。
【００６４】
図６は、フォトダイオード１４１を制御するための制御回路１４３の構造の機能ブロック図である。この回路１４３は、低圧と高圧を生成可能なプログラム可能な電圧源を備えている。
【００６５】
フォトダイオード１４１（例えばＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｓ５３４３）の検出感度および利得パラメータを設定するために、回路１４３内の２つのデジタル制御が使用される。
機能ブロック２０１により表わされるように、アバランシェ利得Ｍは、２位置スイッチに適合するＴＴＬＳ  １桁デジタル制御により制御される。内部利得とも呼ばれるこの利得は、受信機の感度、すなわち受信機が検出できる最小量の光子を決定する。
【００６６】
ＴＴＬＳ＝１の場合、例えば１５０ボルト（ｖ）に等しいいわゆる高圧は、アバランシェモードにおける接合にバイアスをかけ、１よりも大きい内部利得Ｍ（例えばＭ＝６０）をセンサに与え、センサの感度はその場合最大感度であり、通常１０ピコワット（ｐＷ）である。
【００６７】
アバランシェモードでは、検出される１つまたは複数の蛍光のレベルに匹敵する利得を得るために、逆電圧が調節される。本発明の好ましい実施形態では、センサ１４１が作動するエンクロージャの温度変化を考慮するために、電圧はその公称値付近で調整される。この電圧調整は、２５℃から４０℃までの動作温度の所与の範囲にわたり、利得をその公称値、通常約６０で安定させることを可能にする。
【００６８】
ＴＴＬＳ＝０の場合、例えば１５ボルトのいわゆる低圧は、利得なし（Ｍ＝１）でフォトダイオードモードにおける接合にバイアスをかけ、受信機の感度は約１ナノワットである。
【００６９】
使用されるバイアス電圧は、使用されるダイオードの関数としてもちろん変更してもよ
い。現在の実施形態で使用されるダイオードのタイプの場合、電子雪崩効果が始まる３０Ｖ以下の０でない電圧が、単一利得を提供するために選択され得る。これに対して、１５Ｖ以下では接合キャパシタンスが迅速に増加するため、関係する周波数範囲での動作を得るために、この１５Ｖという値より大幅に低くない電圧が選択されることが望ましい。
【００７０】
通常約１０−２０Ｖの低圧として、空間電荷領域はＰＮ接合内でさえ小さい。したがって、電子雪崩（アバランシェ）効果による増幅は実質的に抑制され、センサ１４１は簡単なフォトダイオードとして機能する。
【００７１】
フォトダイオード接合のピコファラド（ｐＦ）の静電容量を十分な値に減少させる目的で０でない値にバイアス電圧を設定することは、センサ１４１に、その持続期間が通常１０マイクロ秒（μｓ）である短い光のパルスの検出に適合する帯域幅を与える。しかしながら、この電圧はフォトダイオードでの内部増幅を防止するのに十分に低いままでなければならない。
【００７２】
接合キャパシタンスの減少は、センサに、解析システムからの信号の分析に適合する最適帯域幅を与えるために必要である。これらの信号はランダムパルス列である。
受信機回路による時間的分離能の要求およびほとんど歪みのない分析信号の必要は、帯域幅ＦP＞Ｆcoを課し、Ｆcoはパルスが有意に変形されない最小カットオフ周波数である
。実際、Ｆcoは例えば３５０キロヘルツ（ｋＨｚ）に等しい。
【００７３】
電子雪崩効果が抑制されるこの動作モードでは、センサ１４１は細胞の見かけ吸収を測定するために使用される。例えば、ヘモグロビンは赤血球の天然シトクロムである。エオシンは、例えば欧州特許第ＥＰ  ０  ４３０  ７５０号に記載されている方法により白血球により固定され得る人工シトクロムである。
【００７４】
本発明の異なる実施形態は、プログラム可能な電圧発生器か、またはそれ以外の制御可能な電圧発生器を使用することが可能である。アバランシェフォトダイオード１４１に加えられる逆電圧を、その内部利得およびしたがって受信機の感度を制御するデジタルまたはアナログ手段により制御することが可能である。
【００７５】
そのバイアスモードがいかなるものであっても、フォトダイオードは光電流を電圧に変換するためにトランスインピーダンスアンプブロック２０２に結合される。
発明の有利な実施形態では、トランスインピーダンス利得は３００キロオーム（ｋΩ）に等しい。十分な出力ダイナミックレンジを達成するため、出力電圧は±１５Ｖである。特に、正確な吸収測定には広いダイナミックレンジが必要である。
【００７６】
吸収測定は、連続成分Ｉからの光損失δＩの観察にある。分析信号δＩ＝σＩであり、σは分析された粒子による吸収によって失われた光の分画である。受信機が光電気ノイズにより制限されると、平均平方ノイズ値はｂ＝√２ｑＩＢに等しく、ｑは電子の電荷であり、Ｂは受信機回路の帯域幅である。
【００７７】
信号対雑音比は以下の通りである。
【００７８】
【数１】
2011525981.tif 000003
【００７９】
この式は、信号対雑音比が√Ｉと共に増加し、最も高い光束値を使用する必要があることを示している。それにもかかわらず、この光束は、方程式
【００８０】
【数２】
2011525981.tif 000004
【００８１】
により定義された特定値
【００８２】
【数３】
2011525981.tif 000005
【００８３】
以下であり、Ｒはトランスインピーダンス利得、ηは照明波長におけるセンサの量子収量であり、Ｖｓは第１増幅器（アンプ）の飽和電圧である。例としてここで与える一般的な値は、Ｖｓ＝１２Ｖ、Ｒ＝３００キロオーム、η＝６５０ｎｍで０．６ａｍｐｓ／ワット（Ａ／Ｗ）であり、これにより
【００８４】
【数４】
2011525981.tif 000006
【００８５】
＝６７マイクロワット（μＷ）が計算可能となる。基準δＩ／ｂ＝１により定義された検出限界により、検出できる光の分画σを決定することが可能となる：
【００８６】
【数５】
2011525981.tif 000007
【００８７】
検出可能な最小有効吸収部分はこの場合、
【００８８】
【数６】
2011525981.tif 000008
【００８９】
に等しい。
ここでａおよびｂはそれぞれ測定窓の高さおよび幅であり、これは血小板等の小さな要素の検出に適合する。
【００９０】
アバランシェモードにおいて、感度は最適感度であり、受信機回路の感度は、フォトダイオードの特性、特にＭ＝６０のアバランシェモードで得られる約１０ｐＷのフォトダイオードのノイズ等価電力（ＮＥＰ）により与えられる。
【００９１】
ブロック２０３は、第１ステージ２０２からの信号を下流回路の範囲内に条件付ける。ブロック２０３により電圧を、ＡＤ変換器またはプロセッサ回路の入力ダイナミックレンジに適合させることが可能となる。信号はアンプの利得の最適調節により条件付けられる。ここで、アンプは、閉ループ利得がＧ＝（１＋ｒ／Ｒ）により与えられる非反転演算増幅器であり、ｒはフィードバック抵抗、Ｒは非反転入力と接地との間の分岐の等価抵抗である。利得Ｇは有利には比１：５で可変であり、光検出感度をさらに増加させることを可能にする。
【００９２】
抵抗器Ｒはデジタル制御され、マイクロコントローラ（例えば図５に示された本発明の実施形態では既製のＡＤ５２９０デジタルポテンシオメーターを備えたブロック２０５）による遠隔制御に好都合であることにここで注意する。この配置が回路の帯域幅を保存するため、この抵抗器Ｒの位置は重要である。
【００９３】
ブロック２０４は制御回路１４３のためのフィルタかつ調整された電圧供給を有する。
ブロック２０６は制御線により送られる不要な信号のフィルタリングのためのデカップリングコンデンサを備える。
【００９４】
ブロック２０７はＩ／Ｏライン電気インターフェースコネクタである。
利得値の以下の表は、血液に含まれる異なるタイプのアリコートの分析に使用される利得ＭおよびＧの調整値を要約している：
【００９５】
【表１】
2011525981.tif 000009
【００９６】
本発明の装置を用いて、および上記の集団をすべて得るべく特定の条件下で行なわれた分析サイクルおよび動作のシーケンスを下記に説明する。
一般的に言うと、蛍光測定の場合、レーザダイオード１２１がオンになった（点けられた）後、ＡＰＤ利得が「Ｍ＝６０」に変更される。光源１３１はオフにされる（消される）。吸収測定の場合、ＡＰＤ利得が「Ｍ＝１」に切り換えられ、その後ＲＣＬＥＤがオフにされる（消される）。レーザダイオードがオフにされる（消される）。受信機に向かう蛍光を反射するようＲＣＬＥＤの放射ファイバに二色フィルタの配置を想定することが有利である。
【００９７】
患者の血液はＥＴＤＡチューブにサンプリングされる。その後、この血液サンプルは予測される結果を得るために使用される試薬に従って様々に、複数のアリコートに分割される。
【００９８】
アリコートＬＭＮＥは、本願出願人の欧州特許第１  ２３９  ２８３号に記載された試薬が導入されたアリコートである。この試薬は、赤血球の溶解を生じさせるように適合され、吸収とインピーダンス測定によるリンパ球、単球、好中球および好酸球の区別および計数を可能にする。ここで、１５マイクロリットル（ｍＬ）の血液を、１．８ミリリットル（ｍＬ）の試薬と混合させる。フォトダイオードの利得Ｍはこの場合１である。これは、吸収のためのフォトダイオードの定量的性質を取っている。演算増幅器の電子利得は、有利には、好塩基球に使用される電子利得よりわずかに高く、例えば３である。図８ａにおけるように、種々の細胞集団が示され、図８ａには任意の未熟顆粒の位置も示されている。
【００９９】
ＧＲ／ＰＬＴアリコートは、本願出願人の欧州特許第０  ８５６  ７３５号に記載された試薬が導入されたアリコートである。この試薬は、吸収とインピーダンスの測定による赤血球と血小板のサインに適合している。８μＬの血液を２．８ｍＬの試薬と混合させる。その後、フォトダイオードの利得Ｍは１に設定され、再びその吸収測定の定量的性質を取る準備ができる。演算増幅器の電子利得Ｇは、有利には、白血球に使用される電子利得より高く、例えば５である。図８ｂにおけるように、赤血球と血小板の数が表わされてもよい。
【０１００】
ＢＡＳＯアリコートは、欧州特許第１  ０３９  ２９７号に記載された試薬が導入されたアリコートである。この試薬は、好塩基球以外の白血球の容積測定のサイズを縮小するため、好塩基球を区別および数えることが可能となっており、吸収とインピーダンスを測定することによる好塩基性細胞のサインに適合している。１５μＬの血液を１．８ｍＬの試薬と混合させる。フォトダイオードの利得Ｍは再び１である。これは、吸収測定のためのフォトダイオードの定量的性質を取る。例えば、演算増幅器の電子利得Ｇは、有利には、１よりも大きい低い値、例えば２である。図８ｃにおけるように、好塩基球が表わされてもよい。
【０１０１】
ＲＥＴアリコートは、欧州特許第０  ８５６  ７３５号に記載された試薬が、蛍光測定により網状赤血球をサインするために導入されたアリコートである。２．４ｍＬの血液が２．５ｍＬの試薬と混合される。その後、フォトダイオードの利得Ｍは、フォトダイオードのアバランシェ利得に合わせて最大限にされ、ここでは６０に等しい。再び、これによってフォトダイオードは蛍光測定にとって十分な感度となる。予測される光量が低いため、演算増幅器の電子利得Ｇは、有利にはここで最大限にされ、例えばここでは５に等しくされる。例えば図８ｄにおけるように、網状赤血球が表わされる。この測定が血液分析のために実際に加味される価値を有するため、網状赤血球を測定するこの可能性は本発明の１つの利点である。この測定は、本発明により、より低コストで高い信頼性でアクセス可能である。さらに、網状赤血球が若いほど、ＲＮＡの量はよりより大きくなる。チアゾー
ルオレンジは核酸塩基と化学量的に統計学的様式で反応するため、網状赤血球が若いほど、蛍光強度は高くなる。したがって、ここで述べた本発明の装置および関連する方法は、比較的低価格で網状赤血球を分類および定量し、かつこれらの細胞の成熟に関する指標を与える、簡単な方法を提供する。
【０１０２】
ＥＲＢアリコートは、蛍光の測定により赤芽球（網状赤血球前駆物質）をサインするために、欧州特許第１  ２３９  ２８３号に記載された試薬が導入されたアリコートである。分析されるサンプルは、３０ｍＬの血液を２ｍＬの試薬と混合することにより調製される。その後、フォトダイオードの利得Ｍは、フォトダイオードのアバランシェ利得に合わせて最大限にされ、ここでは６０に等しい。これによってフォトダイオードは蛍光測定にとって十分な感度となる。例えば、演算増幅器の電子利得Ｇは１である。この値は、データの後の処理で提示されるダイナミックレンジでの蛍光の正確な定量化を可能にする。図８ｅにおけるように、赤芽球が表わされてもよい。
【０１０３】
適切な試薬を用いて得られたアリコートの各々に対し、本発明が可能にする二重測定（蛍光とインピーダンス、または吸光度とインピーダンス）が達成される。これは、特異的かつ高感度な様式で、上述した細胞集団を分類および数えることを可能にする。上述した細胞集団とは、すなわち赤血球、網状赤血球、赤芽球、血小板、網状血小板、および白血球であり、白血球に関しては、本発明により識別可能な複数のカテゴリ、例えばリンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球がある。したがって、本発明によれば、１０個の細胞集団が容易に識別可能であり、上述の５つのアリコートを使用して定量可能である。上記の調製した混合物の各々に対するインピーダンス測定による蛍光と吸収の測定により、これらの集団を識別することが可能となる。本発明では、白血球の前駆物質である単芽球およびリンパ芽球や、未熟顆粒を含む、他の細胞タイプを数えることが可能である。
【０１０４】
フォトダイオードから成る適切なセンサを越えて、受光システムは、色消しダブレットから成る。この開口は、網状赤血球に含まれていたもののような核酸に結合したチアゾールオレンジ由来の蛍光を検出可能にするのに十分である。
【０１０５】
色消し波長は、対象波長に集中している。１つの特定の実施形態では、細胞の吸収は６５０ｎｍで測定される。チアゾールオレンジを使用する場合、最大蛍光は５３０ｎｍの波長で放射される。５３０ｎｍおよび６５０ｎｍの波長のために最適化されたダブレットは、これらの２つの波長での細胞のフローの最適な視覚的焦点合わせを可能にする。
【０１０６】
蛍光波長と吸収波長での光量を正確に検出できるようにするため、光学システム１４２は、５３０ｎｍ（蛍光波長）および６５０ｎｍ（吸収波長）で色収差のために補正される。
【０１０７】
吸収フィルタ１４４（例えばＳｃｈｏｔｔ  ＧＧ４９５フィルタ）は、その厚さが約３ｍｍであるが、光ビームが平行となるセットアップの部分で受光チューブに設置される。このフィルタ１４４は、レーザビームから直角に回折されたレーザ光線を吸収する。
【０１０８】
図７は、フィルタ１４４の高域通過の伝送特性を表わす。４８８ｎｍの代わりに４７０ｎｍ付近でチアゾールオレンジの第２の吸収極大の波長を放射することにより、４８０ｎｍ付近の光の通過を許容し始めるこの種の簡単で比較的安価なフィルタ１４４を使用することが可能であることは明らかである。フィルタ１４４は実際、簡単な色ガラスであり、有効な色ガラスは光スペクトルにおいて稀である。４８８ｎｍで本発明を実施することはもちろん可能であるが、（少なくとも現在）これは費用の増大につながる。
【０１０９】
したがって、４８８ｎｍ付近での放射のためには、センサデバイスの方向への大きな回
折角を回避するため、別のタイプのガラス（例、ＧＧ５１０またはＯＧ５１５ガラス）の使用が望ましい。本発明の装置における４７０ｎｍ付近でのチアゾールオレンジの励起によって、たとえそれが比較的安価な色ガラスを使用しても４８８ｎｍにおけるよりも低いがより有効な発光効率が得られることが分かり、このことは非常に有利である。
【０１１０】
この特徴は、本発明の装置に蛍光測定を設置するコストの低減をさらに可能にする。このフィルタ１４４は、フレネル反射を縮小するために、広帯域（４００ｎｍと７００ｎｍの間の）反射防止処理を有している。
【０１１１】
レーザダイオード１２１からの４７３ｎｍ光線は、フィルタにすべて吸収される。５００ｎｍと６００ｎｍの間の発光帯の蛍光と、光源１３１からの６５０ｎｍ光線だけが送られる。
【０１１２】
ここで、光学装置は、特に測定チャンバ１１１の平面（水およびグラス）の屈折表面に導入される幾何学的および色収差を修正するために、三次収差に関して有利に補正される。
【０１１３】
最終分析では、示された装置は、センサ１４１の瞳孔上への細胞のフローのイメージングを可能にする。この平面における光学解像度は以下の式により与えられる。
Ｒ＝λ／（ＮＡｅ＋ＮＡｒ）
式中、λは照明波長、ＮＡｅおよびＮＡｒはそれぞれ照明ビームと受信ビームの開口数である。
【０１１４】
画像面で達成される測定は、純粋に光度測定であるが、センサ１４１の感度（その異種性により区別される２個の細胞を識別するその能力）は、パラメータＲ、特に信号対雑音比の計測に強く関連付けられる。
【０１１５】
０．６５の波長での最適な白血球の区別のためには、パラメータＲは１μｍ以下である必要がある。これはＮＡｅ＋ＮＡｒ＞０．６５の開口数拘束を課す。本発明の１つの実施形態では、放射と受信の開口は等しく、有利にはＮＡｅ＝ＮＡｒ＞０．３２５である。有利な実施形態では、この開口は０．３５に固定される。
【０１１６】
最後に、６５０ｎｍで光を吸収する好酸球中に存在する酵素であるペルオキシダーゼの吸収スペクトルは、好中球との分離の改善に寄与する。この意味で、本発明は、過去に開発された装置に対して、好中球／好酸球の分離を大いに改善する。
【０１１７】
明らかに、装置は、同様の結果を得るために、他の試薬および比較的異なるプロセスを用いて使用されてもよい。Ｔリンパ球、Ｂリンパ球またはＮＫリンパ球以外の細胞タイプを識別および数えるために、他の試薬が開発されていてもよい。その場合、かかる試薬は、抗体に結合された化学蛍光分子または粒子から成る免疫プローブを含み得る。試薬の調製は、上述したように識別をする２つのパラメータを可能にするものでなければならないことに注意する。
【０１１８】
最後に、本発明の原理に従えば、種々の実施形態が達成され得る。詳細には、生化学的および形態学的特性を同時に決定するのと同時に、２つの光源が同時にオンにされてもよい。本発明により達成される測定の連続的性質にもかかわらず、それは確かに経済的かつ医学的利点を有するが、これまでは吸収装置のみで可能であり、よってかかる測定を介してアクセス可能な集団の決定のみが可能であった、比較的低コストの装置における蛍光測定を許容する。
【図１】
2011525981.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2011525981.tif 000023
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