(57)【要約】  本発明は、（ｉ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が少なくとも３００Ｄａの分子量を有するもの；（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び（ｉｉｉ）少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料を含有する液体水性薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が５０００−５００００Ｄａの分子量を有するもの；
（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料
を含有する液体水性薬学的組成物。
【請求項２】
上記ＰＥＧ部分が３５０００−４５０００Ｄａの範囲の分子量を有している請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記ＰＥＧ部分がグリコペグ化されている請求項１から２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉｉ）がメタ−クレゾール及び／又はフェノール及び／又はベンジルアルコール及び／又はクロロクレゾールである請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉｉ）が０．１−３０．０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１−２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含められている請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
上記芳香族保存料（ｉｉｉ）が１．０−５．０ｍｇ／ｍＬのメタ−クレゾール、又は１．０−１０．０ｍｇ／ｍＬのフェノール、又は５．０−３０．０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール、又は１．０−５．０ｍｇ／ｍＬのクロロクレゾールである請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドが０．１−９０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
約５．０から約８．０、例えば約５．０から約７．５；約５．０から約７．０；約５．０から約６．５、約５．０から約６．０、約５．５から約７．０；約５．５から約６．５、約６．０から約７．０、約６．４から約６．６、又は約５．２から約５．７の範囲のｐＨ値を有している請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
緩衝剤（ｉｉ）が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸及びコハク酸の酸及び塩からなる群から選択される少なくとも一の成分を含む請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
緩衝剤（ｉｉ）の濃度が１−１００ｍＭである請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
（ｉ）が４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａであり、（ｉｉ）が約５から約６の範囲のｐＨを維持し、（ｉｉｉ）が１．０−１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフェノールか、又は１．０−５．０ｍｇ／ｍＬの濃度のｍ−クレゾールである請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）が４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａであり、（ｉｉ）が約５から約６の範囲のｐＨを維持し、（ｉｉｉ）がフェノールとｍ−クレゾールの組合せである請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬として使用される請求項１から１１の何れか一項に記載の液体水性薬学的組成物。
【請求項１４】
第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療のための医薬の調製における請求項１から１２の何れか一項に記載の液体水性薬学的組成物の使用。
【請求項１５】
第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療方法であって、請求項１から１３の何れか一項に記載の有効量の液体水性薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化されたセリンプロテアーゼ、緩衝剤、及び芳香族保存料を含有するセリンプロテアーゼの新規製剤（以下、複数用量薬学的組成物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は、血友病Ａ、血友病Ｂ、グランツマン血小板無力症及び第ＶＩＩ（ａ）因子欠損症のような血液凝固疾患の治療のための重要な治療剤であることが分かっている。生命を脅かすか、散在性か又は外科的に隔絶された出血を被っているが他には血液凝固疾患には罹っていないヒトにおいて血液凝固を亢進するためにまた使用される。
【０００３】
現在の市販の組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）製剤ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、１．２ｍｇの組換えヒト第ＶＩＩａ因子、５．８４ｍｇのＮａＣｌ、２．９４ｍｇのＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、２．６４ｍｇのＧｌｙＧｌｙ、０．１４ｍｇのポリソルベート８０、及び６０．０ｍｇのマンニトールの凍結乾燥ケーキを含むバイアル（約３．０ｍＬの容器容積）として提供されている。この製品は使用前に２．０ｍＬの注射用水（ＷＦＩ）によってｐＨ５．５に再構成され、約０．６ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩａ因子濃度となる。
【０００４】
保存された液体製剤の使用には、注射直前にＷＦＩで再構成される凍結乾燥ケーキよりもよい幾つかの利点がある。一つの利点は、保存された液体は使用するのがより簡便であることである。保存された液体の他の利点は、患者又は介護者が同じバイアルから数回投薬しうることである。
【０００５】
多量（例えば１０−２０ｍｇ）の活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド（例えばｒｈＦＶＩＩａ）の投与が必要な治療用途では、かなり多い容量（例えば１５−３０ｍＬ）が投与される必要があるので、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）組成物のような製剤を利用するのは不便である。従って、適切な量のＦＶＩＩポリペプチドが小容量で提供され得るように、濃縮されたＦＶＩＩポリペプチド製剤に対する必要性が尚も存在している。
【０００６】
例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドのようなセリンプロテアーゼの液体製剤は、それら自体が生物学的酵素であり基質であるので、自己分解による分解を被る。第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子は４種のそのようなセリンプロテアーゼの例である。ＦＶＩＩポリペプチドのようなプロテアーゼを製剤化することは、ＦＶＩＩポリペプチドが同じ製剤中の他のＦＶＩＩポリペプチドを切断し、それらを不活性にするので、製薬工業にとって大きな課題である。液体製剤では、ＦＶＩＩポリペプチドは数時間以内に自己不活性化し、ＦＶＩＩポリペプチドの濃度が高い場合は課題は特に緊急である。従って、ＦＶＩＩポリペプチドの液体製剤を作製する場合、自己分解は克服すべき最も大きなハードルである。
【０００７】
第ＶＩＩ因子阻害剤／安定剤を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体製剤は過去に記載されている。しかしながら、これらの第ＶＩＩ因子阻害剤／安定剤は第ＶＩＩ因子ポリペプチド分子と共に注射されなければならず、ヒトへのかかる第ＶＩＩ因子阻害剤／安定剤の効果は一般には知られていない。
【０００８】
ＷＯ２００５／００２６１５Ａ１は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド；約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するのに適した緩衝剤；少なくとも一種の金属含有剤で、該金属が亜鉛を除く酸化状態＋ＩＩの第一遷移系列金属からなる群から選択されるもの；及び非イオン性界面活性剤を含有する液体水性薬学的組成物を開示している。
【０００９】
ＷＯ２００５／０１６３６５Ａ１は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）；約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するのに適した緩衝剤（ｉｉ）；及び−Ｃ（＝Ｎ−Ｚ１−Ｒ１）−ＮＨ−Ｚ２−Ｒ２モチーフを含む少なくとも一種の安定化剤（ｉｉｉ）（例えばベンズアミジン又はアルギニン）を含有する液体水性薬学的組成物を開示している。
【００１０】
複数用量製剤は、注射可能な薬学的製品に有利である。幾つかの注射用量が数日にわたって同じバイアルから取り出される場合、保存料はしばしば規制機関からの要求である。多くの異なった化合物が注射可能な製品中に保存料として使用されている（S. Nema, N.R. Washkuhn及びR.J. Brendel: Excipients and their use in injectable products, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51 (4), 166-171）。
【００１１】
しかしながら、保存料の存在はしばしば第ＶＩＩ因子ポリペプチドの溶解度を減少させ、これが液体中でのかかるセリンプロテアーゼの製剤化に伴う別の大きな課題である。保存料と共に、比較的高濃度で活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する新規な複数用量薬学的組成物に対する必要性がある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、溶液中において改善された安定性を有する可溶型ＦＶＩＩポリペプチドの創製に関する。
【００１３】
本発明は、液体溶液中において改善された溶解度を有する安定化されたＦＶＩＩポリペプチドの創製にも関する。本発明者は、複数投与量の取り出しに適したＦＶＩＩポリペプチド液体製剤を創製した。かかる製剤は、芳香族保存料を、一又は複数のポリエチレングリコール部分で官能化されている第ＶＩＩ因子ポリペプチドと組み合わせることによって得ることができる。
【００１４】
第一の態様では、本発明は、
（ｉ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が少なくとも３００Ｄａの分子量を有するもの；
（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料
を含有する液体水性薬学的組成物に関する。
【００１５】
より詳細には、本発明は、
（ｉ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が５０００−５００００Ｄａの分子量を有するもの；
（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料
を含有する液体水性薬学的組成物に関する。
【００１６】
本発明の第二の態様は、医薬として使用されるここに記載の液体水性薬学的組成物に関する。
【００１７】
本発明の第三の態様は、第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療のための医薬の調製におけるここに記載の液体水性薬学的組成物の使用に関する。
【００１８】
本発明の第四の態様は、第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療方法であって、ここに記載の有効量の液体水性薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【００１９】
本発明の第五の態様は、ここに記載の液体水性薬学的組成物と場合によっては不活性ガスを含む気密容器に関する。
【００２０】
本発明の第六の態様は、ここに記載の組成物の調製のためのキットに関し、該キットは、
（ａ）少なくとも第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）を凍結乾燥形態で含む第一の容器；
（ｂ）水性再構成液体を含む第二の容器を含み、該液体は少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉ）を少なくとも含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｒＦＶＩＩａ及びｍ−クレゾールを含む溶液中において、ｍ−クレゾール濃度が０−３ｍｇ／ｍｌから増加するつれて、ｒＦＶＩＩａがより沈殿する傾向があることを示している。図１は、１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ及びｍ−クレゾールの溶液（他は同じ）中において、ｍ−クレゾール濃度が０−３ｍｇ／ｍｌから増加するつれて、１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａがほんの僅かに沈殿するか全く沈殿しないことをまた示している。更に、図１は、６ｍｇ／ｍｌのフェノールを含む溶液中で、１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａがｒＦＶＩＩａより可溶性である（沈殿が少ない）ことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
上述のように、本発明は、一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された高濃度の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、比較的高濃度の芳香族保存料と共に含有する新規な安定化された液体水性薬学的組成物の開発にある。
【００２３】
より詳細には、液体水性薬学的組成物は、
（ｉ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ（ａ）因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が少なくとも３００Ｄａの分子量を有するもの；
（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料
を含有する。
【００２４】
ＰＥＧ部分で官能化された第ＶＩＩ因子ポリペプチド
第ＶＩＩ因子ポリペプチド
薬学的組成物の生物学的効果は、主として第ＶＩＩ因子ポリペプチドの存在に帰するが、他の活性成分を第ＶＩＩ因子ポリペプチドと組み合わせて含めてもよい。
【００２５】
ここで用いられる場合、「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子（すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、並びに野生型ヒト第ＶＩＩ因子と実質的に同じか又は改善された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体を包含する。「第ＶＩＩ因子」は、その未切断（チモーゲン）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びにそのそれぞれの生物活性型を生じるようにタンパク分解的にプロセシングされたもの（これは第ＶＩＩａ因子と命名されうる）を包含するものである。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２及び１５３の間で切断されて第ＶＩＩａ因子を生じる。「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、第ＶＩＩａ因子生物学的活性が野生型第ＶＩＩａ因子の活性に対して実質的に改変され、増加され又は低減されている変異体を含むポリペプチドをまた包含する。これらのポリペプチドは、限定しないが、ポリペプチドの生物活性を改変し又は破壊する特定のアミノ酸配列改変が導入されている第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子を含む。
【００２６】
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（１）組織因子（ＴＦ）に結合し、（２）第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク分解的切断を触媒して活性型第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ第ＩＸａ又はＸａ因子）を生じるその能力に由来する。
【００２７】
本発明の成功を評価する目的で、液体製剤化第ＶＩＩポリペプチドの生物学的活性（「第ＶＩＩ因子生物学的活性」）は、調製物の血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化されうる。ここに記載されるアッセイ４を参照のこと。このアッセイでは、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプール化ヒト血清標準との比較により、「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）脂質膜に包埋されたＴＦ及び第Ｘ因子を含む系における第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性型第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生産する能力の測定（Ｐｅｒｓｓｏｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性の系における第Ｘ因子の加水分解の測定（「インビトロタンパク質分解アッセイ」、以下のアッセイ２を参照）；（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴に基づく機器を用いたそのＴＦへの第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの物理的な結合の測定（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）；（ｉｖ）第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解の測定；又は（ｖ）ＴＦ非依存性インビトロ系でのトロンビンの生産の測定によって、定量されうる。
【００２８】
野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同じか又は改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、上述のような凝固アッセイ（アッセイ４）、タンパク質分解アッセイ（アッセイ２）、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合に、同じ細胞型で生産された第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものを包含する。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、上述のような凝固アッセイ（アッセイ４）、タンパク質分解アッセイ（アッセイ２）、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合に、同じ細胞型で生産された野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、最も好ましくは約１％未満を示すものを包含する。限定するものではないが、野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、ＴＦ非依存性第Ｘ因子タンパク分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異体及びＴＦに結合するが第Ｘ因子を切断しないものが含まれる。
【００２９】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じかより良好な生物活性を示すにせよ、あるいは野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変されているか減少した生物活性を示すにせよ、第ＶＩＩ因子の変異体には、限定するものではないが、野生型第ＶＩＩ因子の配列とは一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００３０】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じ生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５５８０５６０号に開示されている増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク分解的に切断された第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１−５０５，１９９５）；第ＶＩＩａ因子の酸化型（Ｋｏｒｎｆｅｌｔ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６３：４３−５４，１９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されているＦＶＩＩ変異体；国際公開第０２／３８１６２号（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されている増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体；国際公開第９９／２０７６７号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に開示された修飾されたＧｌａ−ドメインを有し、亢進された膜結合性を示すＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第０１／５８９３５号（Ｍａｘｙｇｅｎ ＡｐＳ）に開示されたＦＶＩＩ変異体が含まれる。
【００３１】
野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有するＦＶＩＩ変異体の非限定的な例は、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、国際公開第０３／２７１４７号、国際公開第０３／３７９３２号；国際公開第０２／３８１６２号（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されたＦＶＩＩ変異体；及びＪＰ２００１０６１４７９（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ．）に開示された亢進活性を有するＦＶＩＩａ変異体を含む。
【００３２】
野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に減少した又は改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的な例は、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２，１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０，１９９８）、及びＧｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９，１９９３）を含む。
【００３３】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの例には、限定しないが、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ
１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、及びアミノ酸配列Ｉｌｅ１５３−Ａｒｇ２２３に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
【００３４】
ある実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＶＩＩａ）、好ましくは組換え型ヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＶＩＩａ）である。
【００３５】
他の実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子配列変異体である。
【００３６】
ある実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは野生型ヒト第ＶＩＩ因子と異なるグリコシル化を有する。
【００３７】
現在最も興味深い実施態様では、タンパク質はその活性化型の第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。
【００３８】
様々な実施態様では、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＶＩＩ因子配列変異体である場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比率は、本明細書中に記載の「インビトロタンパク質分解アッセイ」（アッセイ２）で試験される場合、少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも約２．０、又は４．０、最も好ましくは少なくとも約８．０である。
【００３９】
ある実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子関連のポリペプチド、特に、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比率が、「インビトロ加水分解アッセイ」（下記のアッセイ１を参照）で試験される場合に少なくとも約１．２５である変異体である。他の実施態様では、その比率が少なくとも約２．０である。更なる実施態様では、その比率が少なくとも約４．０である。
【００４０】
薬学的組成物では、活性成分の濃度が、単位用量の使用により患者に不必要な不快感を引き起こさない程度にすることが望ましい場合が多い。よって、約２−１０ｍＬより多い単位用量は望ましくない場合が多い。本発明の目的では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度はよって典型的には比較的高く、つまり少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬである。異なる実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、０．１−９０ｍｇ／ｍＬ；０．５−８０ｍｇ／ｍＬ；１．０−８０ｍｇ／ｍＬ；１．５−７０ｍｇ／ｍＬ；２−６０ｍｇ／ｍＬ；３−５０ｍｇ／ｍＬ；又は５−５０ｍｇ／ｍＬ；又は１０−５０ｍｇ／ｍｌ；又は１５−５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００４１】
第ＶＩＩａ因子の濃度は、簡便にはｍｇ／ｍＬ又はＩＵ／ｍＬとして表され、未修飾ｒＦＶＩＩａでは１ｍｇは通常４３０００−５６０００ＩＵ以上を表す。（比活性はペグ化第ＶＩＩａ因子では低くされうる）。
【００４２】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、典型的には一又は複数のオリゴヌクレオチドがポリペプチド鎖のアミノ酸に共有的に結合され、最も典型的にはアスパラギン結合（Ｎ結合）又はセリン結合（Ｏ結合）のグリコフォームで表される。第ＶＩＩ因子の天然に生じるグリコシル化部位は、Ａｓｎ−１４５（Ｎ１４５）、Ａｓｎ−３２２（Ｎ３２２）、Ｓｅｒ−５２（Ｓ５２）、及びＳｅｒ−６０（Ｓ６０）位にある。
【００４３】
ＰＥＧ部分
「ＰＥＧ部分で官能化された」なる用語は、本発明においては、「ペグ化された」なる用語と同義語である。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの官能化を表す一又は複数のＰＥＧ部分は第ＶＩＩ因子ポリペプチドのポリペプチド骨格の任意の部分又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドの一体部分であるオリゴ糖の何れかに共有的に結合している（「グリコペグ化第ＶＩＩ因子ポリペプチド」）。グリコペグ化第ＶＩＩ因子は本出願人の先の出願ＷＯ２００４／０００３６６Ａ１及びＷＯ２００５／０１４０３５Ａ１に十分に記載している。しかして、ＰＥＧ部分は典型的には、少なくとも３００Ｄａ、例えば３００−１０００００Ｄａ；例えば約５０００−５００００Ｄａ；例えば約１００００から約４５０００Ｄａ；例えば約３５０００から約４５０００；例えば約３９０００から４２０００Ｄａ、例えば約４００００から約４１０００Ｄａ；例えば約５００−２００００Ｄａ、又は５００−１５０００Ｄａ、又は２０００−１５０００Ｄａ、又は３０００−１５０００Ｄａ、又は３０００−１２０００Ｄａ、又は約１０Ｄａの分子量を有している。ＰＥＧ部分は直鎖状又は分枝状でありうる。４０Ｋなる用語は、およそ４００００から４１０００ＤａであるＰＥＧ部分を意味する。
【００４４】
当業者には明らかであるように、ＰＥＧ部分は、上に概説した第ＶＩＩ因子ポリペプチドにＰＥＧ部分が結合されるためには「接合基」を必要としうる。
【００４５】
「接合基」なる用語はポリマー分子に付着可能なオリゴ糖部分の官能基を示すものである。有用な接合基は、例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン又はハロアセテートである。
【００４６】
オリゴ糖部分への接合基は、ポリマーとの反応前に活性化されうる。あるいは、ポリマー上に存在する基は、オリゴ糖部分との反応前に活性化されうる。活性化された基は、オリゴ糖部分に存在するかポリマー部分に存在するかどうかにかかわらず、活性化された離脱基の形態でありうる。活性化された離脱基なる用語は、有機又は酵素調節置換反応で容易に置換される部分を含む。活性化された離脱基は当該分野で知られており、例えばVocadlo等, In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol 2, Wiley-VCH Verlag, Germany (2000)；Kodama等, Tetrahedron Letters 34:6419 (1993)；Lougheed等, J.Biol. Chem. 274:37717 (1999)が参照される。
【００４７】
ポリマーの活性化のための方法及び化学は文献に記載されている。ポリマーの活性化のために一般的に使用される方法は、臭化シアン、過ヨウ素酸、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハロゲン化物、トリクロロトリアジン等での官能基の活性化を含む（例えば Taylor (1991), Protein immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, N.Y.；Wong (1992), Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton；Hermanson等, (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.；Dunn等編 Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991を参照）。
【００４８】
本発明の実施に有用な反応性基及び反応クラスは一般に比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、限定されないが、求核置換（例えばアシルハロゲン化物、活性エステルとのアミンとアルコールの反応）、求電子置換（例えばエナミン反応）及び炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子結合への付加（例えばマイケル反応、ディールス・アルダー反応）を含む。
【００４９】
これらのまた他の有用な反応は、例えばMarch, Advanced Organic Chemistry, 3版, John Wiley & Sons, N. Y. 1985；Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996；Feeney等, Modifications of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, 1982に記載されている。
【００５０】
反応性官能基は、それらがオリゴ糖及びポリマー部分を組み立てるのに必要な反応に関与しないか又はこれを妨害しないように、選択することができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に関与することから保護されうる。有用な保護基の例には、例えばGreene等, Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, N.Y., 1991を参照のこと。
【００５１】
炭水化物を他の分子に結合させるための一般的アプローチ法は文献で知られている（例えばLee等, Biochemistry 28:1856 (1989)；Bhatia等, Anal. Biochem. 178:408 (1989)；Janda等, J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990)；及びBednarski等, WO 92/18135を参照）。
【００５２】
緩衝剤（ｉｉ）
液体水性薬学的組成物をヒトなどの哺乳動物に直接非経口投与するために有用にするために、通常、組成物のｐＨ値を合理的な限界内、例えば約５．０から約９．０に保つことが必要である。所定の条件下で好適なｐＨ値に確保するために、薬学的組成物はまた約５．０から約９．０の範囲にｐＨを保つために好適な緩衝剤（ｉｉ）を含む。
【００５３】
「緩衝剤」なる用語は、溶液のｐＨを約５．０から約９．０の許容される範囲に維持する薬剤ないしは薬剤の組合せを包含する。
【００５４】
一実施態様では、緩衝剤（ｉｉ）は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸(例えばナトリウム又は酢酸カルシウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸及びコハク酸の塩類及び酸からなる群から選択される少なくとも一の成分である。緩衝剤は、混合物が特定の範囲のｐＨ値を提供することができる場合に２以上の成分の混合物を含みうることは理解されるであろう。かかる緩衝剤の例は酢酸及び酢酸ナトリウムである。
【００５５】
緩衝剤の濃度は、溶液の好適なｐＨを維持するために選択される。様々な実施態様では、緩衝剤の濃度は、１−１００ｍＭ；例えば１−５０ｍＭ；例えば１−２５ｍＭ；又は２−２０ｍＭである。
【００５６】
一実施態様では、組成物のｐＨは、約５．０から約８．０、例えば約５．０から約７．５、約５．０から約７．０、約５．０から約６．５、約５．０から約６．０、約５．５から約７．０、約５．５から約６．５、約６．０から約７．０、約６．４から約６．６、又は約５．２から約５．７に維持される。
【００５７】
芳香族保存料（ｉｉｉ）
薬学的組成物は、少なくとも0.1 mg/mLの濃度で少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉｉ）を更に含有する。
【００５８】
保存料は典型的には微生物の増殖を遅延させるために組成物に含められる；つまり芳香族保存料は静菌又は殺菌効果を有している。しかしながら、本発明者は、抗酸化剤との併用で、芳香族保存料は、水溶液中で、特にかなり高濃度で製剤化されるものにおいて、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定性について非常に顕著な効果をまた有していることを見出した。
【００５９】
次において、「芳香族」なる用語は、その構造中に、炭素原子の６員不飽和環、つまりベンゼン環を含む化学的化合物を意味する。
【００６０】
本発明の芳香族保存料の例は、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、クロロ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムを含む。
【００６１】
本発明の一実施態様では、少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉｉ）はメタ−クレゾール及び／又はフェノール及び／又は ベンジルアルコール及び／又はクロロクレゾールである。
【００６２】
少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉｉ）は、通常、ｐＨ範囲及び芳香族保存料のタイプに応じて、０．１−３０．０ｍｇ／Ｍｌ、例えば０．１−２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含められる。例えば、典型的な濃度は１．０−５．０ｍｇ／ｍＬ、例えば１．０−４．０ｍｇ／ｍＬのメタ−クレゾール；１．０−１０．０ｍｇ／ｍＬ、例えば１−６ｍｇ／ｍＬのフェノール；５．０−３０．０ｍｇ／ｍＬ、例えば５．０−２０．０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール；又は１．０−５．０ｍｇ／ｍＬ、例えば１．０−３．０ｍｇ／ｍＬのクロロクレゾールである。
【００６３】
抗酸化剤（ｉｖ）
水性組成物中における第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定性が、芳香族保存料（ｉｉｉ）を抗酸化剤（ｉｖ）と組み合わせることによって更に増大させることができることが見出された。少なくとも一種の抗酸化剤は、典型的には少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００６４】
異なった実施態様では、少なくとも一種の抗酸化剤（ｉｖ）は、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、メチオニンアナログ、メチオニン含有ペプチド、メチオニンホモログ、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン及びシスタチオニンからなる群から選択される。好ましい実施態様では、抗酸化剤はＬ−メチオニンである。
【００６５】
少なくとも一種の抗酸化剤の濃度は、典型的には０．１−５．０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１−４．０ｍｇ／ｍＬ、０．１−３．０ｍｇ／ｍＬ、０．１−２．０ｍｇ／ｍＬ、又は０．５−２．０ｍｇ／ｍＬである。
【００６６】
更なる成分
液体水性薬学的組成物は、上述の成分に加えて、組成物の調製、製剤化、又は投与のために有益な更なる成分を含有しうる。
【００６７】
ある実施態様では、組成物は浸透圧調節剤（ｖ）を更に含有する。
【００６８】
ここで使用される場合、「浸透圧調節剤」なる用語は、溶液の浸透圧に寄与する薬剤を含む。浸透圧調節剤（ｖ）は、中性塩、アミノ酸、２−５のアミノ酸残基のペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一種の薬剤を含む。ある実施態様では、組成物は二以上のかかる薬剤を組み合わせて含有する。
【００６９】
「中性塩」とは、水溶液に溶解させたときに酸でも塩基でもない塩を意味する。
【００７０】
一実施態様では、少なくとも一種の浸透圧調節剤（ｖ）は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、レブリン酸カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、及びレブリン酸マグネシウムからなる群から選択される中性塩である。
【００７１】
更なる実施態様では、浸透圧調節剤（ｖ）は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一種と組み合わせた塩化ナトリウムを含む。
【００７２】
また更なる実施態様では、浸透圧調節剤（ｖ）は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも一種である。
【００７３】
異なった実施態様では、浸透圧調節剤（ｖ）は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１５００ｍＭ、少なくとも１８００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、又は少なくとも２２００ｍＭの濃度で存在する。
【００７４】
一連の実施態様では、浸透圧調節剤（ｖ）は、５−２２００ｍＭ、例えば２５−２２００ｍＭ、５０−２２００ｍＭ、１００−２２００ｍＭ、２００−２２００ｍＭ、４００−２２００ｍＭ、６００−２２００ｍＭ、８００−２２００ｍＭ、１０００−２２００ｍＭ、１２００−２２００ｍＭ、１４００−２２００ｍＭ、１６００−２２００ｍＭ、１８００−２２００ｍＭ、又は２０００−２２００ｍＭ；５−１８００ｍＭ、２５−１８００ｍＭ、５０−１８００ｍＭ、１００−１８００ｍＭ、２００−１８００ｍＭ、４００−１８００ｍＭ、６００−１８００ｍＭ、８００−１８００ｍＭ、１０００−１８００ｍＭ、１２００−１８００ｍＭ、１４００−１８００ｍＭ、１６００−１８００ｍＭ；５−１５００ｍＭ、２５−１４００ｍＭ、５０−１５００ｍＭ、１００−１５００ｍＭ、２００−１５００ｍＭ、４００−１５００ｍＭ、６００−１５００ｍＭ、８００−１５００ｍＭ、１０００−１５００ｍＭ、１２００−１５００ｍＭ；５−１２００ｍＭ、２５−１２００ｍＭ、５０−１２００ｍＭ、１００−１２００ｍＭ、２００−１２００ｍＭ、４００−１２００ｍＭ、６００−１２００ｍＭ、又は８００−１２００ｍＭの濃度で存在する。
【００７５】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも一種の浸透圧調節剤（ｖ）はイオン強度調節剤（ｖ／ａ）である。
【００７６】
ここで使用される場合、「イオン強度調節剤」なる用語は、溶液のイオン強度に寄与する薬剤を含む。該薬剤は、限定されないが、中性塩、アミノ酸、２から５のアミノ酸残基のペプチドを含む。ある実施態様では、組成物は二以上のかかる薬剤を併用して含む。
【００７７】
イオン強度調節剤（ｖ／ａ）の好ましい例は、中性塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムである。好ましい薬剤（ｖ／ａ）は塩化ナトリウムである。
【００７８】
「イオン強度」なる用語は、式：μ＝１／２Σ（［ｉ］（Ｚｉ２））（ここで、μはイオン強度、［ｉ］はイオンのミリモル濃度、Ｚｉはそのイオンの電荷（＋又は−）である）によって定義される溶液のイオン強度（Μ）である（例えば Solomon, Journal of Chemical Education, 78(12):1691-92, 2001；James Fritz及びGeorge Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979を参照）。
【００７９】
本発明の異なった実施態様では、組成物のイオン強度は、少なくとも５０、例えば少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６５０、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１６００、少なくとも２０００、少なくとも２４００、少なくとも２８００、又は少なくとも３２００である。
【００８０】
ある特定の実施態様では、浸透圧調節剤（ｖ）及びイオン強度調節剤の全濃度は、任意の他の成分が浸透圧及びイオン強度に対して有しうる効果に応じて、１−５００ｍＭ、例えば１−３００ｍＭ、又は１０−２００ｍＭ、又は２０−１５０ｍＭの範囲である。
【００８１】
一実施態様では、組成物は等張である；他の実施態様では、高浸透圧性である。
【００８２】
「等張性」なる用語は、「血清と等張性」、つまり約３００±５０ミリオスモル／ｋｇを意味する。等張性は投与前の溶液の浸透圧の指標であることを意味する。「高浸透圧性」なる用語は血清の生理学的レベルを越える浸透圧のレベル、例えば３００±５０ミリオスモル／ｋｇを越えるレベルを示すことを意味する。
【００８３】
また、本発明の特定の実施態様は、ナトリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択されるかなり高濃度のイオン強度改変剤を伴う、芳香族保存料（ｉｉｉ）と抗酸化剤（ｉｖ）の組合せに関する。この実施態様では、イオン強度改変剤（ｖ／ａ）、つまり、ナトリウム塩、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は、１５−１０００ｍＭ、例えば２５−１０００ｍＭ、５０−１０００ｍＭ、１００−１０００ｍＭ、２００−１０００ｍＭ、３００−１０００ｍＭ、４００−１０００ｍＭ、５００−１０００ｍＭ、６００−１０００ｍＭ、７００−１０００ｍＭ；１５−８００ｍＭ、２５−８００ｍＭ、５０−８００ｍＭ、１００−８００ｍＭ、２００−８００ｍＭ、３００−８００ｍＭ、４００−８００ｍＭ、５００−８００ｍＭ；１５−６００ｍＭ、２５−６００ｍＭ、５０−６００ｍＭ、１００−６００ｍＭ、２００−６００ｍＭ、３００−６００ｍＭ；１５−４００ｍＭ、２５−４００ｍＭ、５０−４００ｍＭ、又は１００−４００ｍＭの濃度で存在する。
【００８４】
これらの実施態様において、ナトリウム塩は塩化ナトリウムであり得、カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、及びレブリン酸カルシウムからなる群から選択され得、マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、レブリン酸マグネシウム、及び強酸のマグネシウム塩からなる群から選択されうる。より特定の実施態様では、カルシウム塩及び／又はマグネシウム塩は塩化ナトリウムと組み合わせて使用される。
【００８５】
現在好ましい一実施態様では、組成物は、カルシウム（Ｃａ２＋）塩及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）塩、例えば塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、レブリン酸カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、レブリン酸マグネシウム、強酸のマグネシウム塩からなる群から選択される一又は複数の塩からなる群から選択される一又は複数のイオン強度調節剤を含む。この一実施態様では、カルシウム（Ｃａ２＋）及び／又はマグネシウム（Ｍｇ２＋）塩の濃度は少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ又は約１０ｍＭである。
【００８６】
上記のものと組み合わせることができる更なる実施態様では、薬学的組成物は、非イオン性界面活性剤（ｖｉ）をまた含みうる。界面活性剤（洗浄剤としても知られる）は、（例えばタンパク質凝集を生じる）空気／溶液界面誘導ストレス及び溶液／表面誘導ストレスからタンパク質を保護する薬剤を一般に含む。
【００８７】
非イオン性界面活性剤の典型的なタイプは、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレン／ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンステアレート、及びポリオキシエチレンヒマシ油である。
【００８８】
非イオン性界面活性剤の例示的な例は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレンドデシルエーテル）、ポロキサマー１８８，ポロキサマー４０７、ＰＥＧ８０００、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシ−２３−ラウリルエーテル、Ｍｙｒｊ４９、及びクレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）Ａ、特にポロキサマー１８８である
【００８９】
一実施態様では、非イオン性界面活性剤は、０．００５−２．０重量％の量で存在する。
【００９０】
保存料と抗酸化剤の組合せは、任意の更なる安定化剤の必要性を劇的に減少させるものと信じられるが、そのような薬剤を原理的には所望に応じて加えてもよい。かかる更なる安定化剤の例は、（ａ）金属含有剤で、該金属が亜鉛を除く酸化状態＋ＩＩの第一遷移系列金属からなる群から選択されるもの；及び（ｂ）−Ｃ（＝Ｎ−Ｚ１−Ｒ１）−ＮＨ−Ｚ２−Ｒ２モチーフを含む少なくとも一種の安定化剤から選択されるものである。
【００９１】
（ａ）タイプの安定化剤については、これらはＷＯ２００５／００２６１５に記載され、定義されている。
【００９２】
（ｂ）タイプの安定化剤については、これらはＷＯ２００５／０１６３６５に記載され、（一般的にかつＺ１、Ｚ２、Ｒ１及びＲ２の詳細な意味に関して明示的に）定義されている。簡便には、Ｚ１及びＺ２が独立して−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−及び単結合からなる群から選択され、ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１−４−アルキル、アリール及びアリールメチルからなる群から選択され、Ｒ１及びＲ２が独立して水素、置換されていてもよいＣ１−６−アルキル、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、又はＺ２及びＲ２は上述の通りであり、−Ｃ＝Ｎ−Ｚ１−Ｒ１がヘテロ環の一部を形成し、又はＺ１及びＲ１が上述の通りであり、−Ｃ−ＮＨ−Ｚ２−Ｒ２が複素環の一部を形成し、又は−Ｃ（＝Ｎ−Ｚ１−Ｒ１）−ＮＨ−Ｚ２−Ｒ２が複素環を形成し、ここで−Ｚ１−Ｒ１−Ｒ２−Ｚ２−がビラジカルであることがしかしながら述べられる。
【００９３】
しかしながら、現在好ましい実施態様では、組成物の上記更なる成分の何れも第ＶＩＩ因子ポリペプチド安定化剤ではない。
【００９４】
好ましい実施態様
本発明者は、ここに記載の特に有利な、つまり液体水性薬学的組成物として、
（ｉ）１−９０ｍｇ／ｍＬの一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された第ＶＩＩ因子ポリペプチドであって、該ＰＥＧ部分が５０００−６００００Ｄａの分子量を有するもの；
（ｉｉ）約５．０から約９．０の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）０．１−２０ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の芳香族保存料
（ｉｖ）０．１−５．０ｍｇ／ｍＬの濃度の少なくとも一種の抗酸化剤
を含有する実施態様を今特定した。
【００９５】
他の好ましい実施態様では、液体水性組成物は、
（ｉ）４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ、
（ｉｉ）約５から約６の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）１．０−１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフェノール又は１．０−５．０ｍｇ／ｍＬの濃度のｍ−クレゾールの何れかを含む。
【００９６】
第三の好ましい実施態様では、水性組成物は、
（ｉ）４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ、
（ｉｉ）約５から約６の範囲にｐＨを維持するために適した緩衝剤；及び
（ｉｉｉ）フェノールとｍ−クレゾールの組合せ
を含む。
【００９７】
安定性
一実施態様では、本発明に係る組成物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定な使用準備が整った液体組成物として有用である。使用準備が整った液体組成物は、２℃から８℃の範囲の温度で保存される場合、典型的には少なくとも６ヶ月、好ましくは３６ヶ月安定であるべきである。他の実施態様では、本発明に係る組成物は、使用前に水性液体で再構成される乾燥組成物として有用であり、該液体は芳香族保存料を含む。凍結乾燥組成物は、２５℃で保存される場合、典型的には少なくとも６ヶ月、好ましくは３６ヶ月間、安定でなければならない。乾燥組成物を再構成液体と混合することにより得られる液体組成物は、２℃から８℃の範囲の温度で保存される場合、典型的には少なくとも一週間、好ましくは４週間以上、安定でなければならない。
【００９８】
「安定」なる用語は、（ｉ）２℃から８℃で６ヶ月の保存後に、一段階の凝固アッセイ（アッセイ４）によって測定して組成物がその初期の生物学的活性の少なくとも５０％を保持するか、又は（ｉｉ）２℃から８℃で６ヶ月の保存後に、重鎖分解産物の量は、最初の試料が重鎖分解産物を含まないと仮定して（つまり、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのみをパーセントの計算に入れる）、せいぜい４０％（ｗ／ｗ）である。好ましくは、組成物は、２から８℃で６ヶ月の保存後にその初期の活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。また、好ましくは、組成物中の重鎖分解産物の量は、せいぜい３０％（ｗ／ｗ）、せいぜい２５％（ｗ／ｗ）、せいぜい２０％（ｗ／ｗ）、せいぜい１５％（ｗ／ｗ）、せいぜい１０％（ｗ／ｗ）、せいぜい５％（ｗ／ｗ）、又はせいぜい３％（ｗ／ｗ）である。
【００９９】
好ましくは、安定な組成物は、２から８℃で６ヶ月の保存後にその初期の活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。
【０１００】
好ましくは、様々な実施態様では、安定な組成物中の重鎖分解産物の量は、せいぜい３０％（ｗ／ｗ）、せいぜい２５％（ｗ／ｗ）、せいぜい２０％（ｗ／ｗ）、せいぜい１５％（ｗ／ｗ）、せいぜい１０％（ｗ／ｗ）、せいぜい５％（ｗ／ｗ）、又はせいぜい３％（ｗ／ｗ）である。
【０１０１】
使用方法
理解されるように、ここに定義される液体水性薬学的組成物は、医薬品の分野で使用されうる。よって、本発明は、医薬として使用され、特に第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療のための医薬として使用されるここに定義される液体水性薬学的組成物を提供する。
【０１０２】
従って、本発明はまた第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療のための医薬の調製におけるここに定義される液体水性薬学的組成物の使用、並びに第ＶＩＩ（ａ）因子応答性疾患の治療方法であって、ここで定義される液体水性薬学的組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１０３】
本発明の調製物は、任意の第ＶＩＩ因子応答性疾患、例えば出血疾患、例えば凝固因子欠損（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＸＩ凝固因子欠損症、第ＶＩＩ凝固因子欠損症）によって引き起こされるもの；血小板減少症又はフォン・ヴィレブランド病、又は凝固因子阻害剤；並びに脳内出血、又は任意の原因の過剰な出血を治療するために使用されうる。調製物はまた手術又は他の外傷に関連したヒトに又は抗凝固治療を受けている患者に投与されうる。
【０１０４】
「有効量」なる用語は、所望の応答を達成するために用量を調節することができる資格のある医師によって決定されるべき用量である。用量の考慮因子は、効能、生物学的利用能、所望の薬物動態／薬力学的プロファイル、治療条件、患者関連因子（例えば、体重、健康、年齢等々）、同時投与される医薬（例えば抗凝固剤）の存在、投与時間、又は開業医に知られている他の因子を含む。
【０１０５】
「治療」なる用語は、病気、症状、又は疾患に抗することを目的にして、患者、例えば哺乳動物、特にヒトを管理し、ケアすることとして定義され、徴候又は合併症の発症を防止し、又は軽減し、又は病気、症状、又は疾患を除去するための第ＶＩＩ因子ポリペプチドの投与を含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む本発明に係る薬学的組成物は、かかる治療を必要とする患者に非経口的に投与されうる。かかる非経口投与の非限定的な例は、場合によってはペン様装置又は注入ポンプによる皮下、筋肉内又は静脈内注射である。
【０１０６】
重要な実施態様では、薬学的組成物は、当該分野で知られている方法に従って、皮下、筋肉内又は静脈内注射に適合される。
【０１０７】
気密容器
よって、本発明は、ここに記載の液体水性薬学的組成物と場合によっては不活性ガスを含む気密容器（例えばバイアル又はカートリッジ（例えばペンアプリケータのカートリッジ）をまた提供する。
【０１０８】
不活性ガスは、窒素、アルゴン等からなる群から選択されうる。容器（例えばバイアル又はカートリッジ）は、典型的にはガラス又はプラスチックから形成され、場合によってはゴム隔壁又は薬学的組成物の一体性を保持して針の貫通を可能にする他の閉塞手段によって閉止されてもよい。更なる実施態様では、容器は、密封バッグ、例えば密封プラスチックバッグ、例えばラミネート（例えば金属（例えばアルミニウム）ラミネートプラスチックバッグ）に封入されたバイアル又はカートリッジである。
【０１０９】
凍結乾燥第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むキット
上に定義された液体水性薬学的組成物は、典型的には非経口投与、例えば注射による直接の使用を主として意図している。液体水性薬学的組成物は、医師又は最終使用者による実際の非経口投与前のある時に、例えば使用の１−２４時間前に、又は更には数週間前、例えば使用の２−４週間前に、例えば複数用量バッチの形態で、対応する凍結乾燥製剤から調製することができると想定される。かかる例では、医師又は最終使用者には、適切な量の水性再構成液と共に凍結乾燥形態で第ＶＩＩ因子ポリペプチドを受け取るのが簡便である。
【０１１０】
よって、本発明の更なる態様は、ここに記載の組成物の調製のためのキットに関し、該キットは、
（ａ）一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で官能化された少なくとも第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ｉ）を凍結乾燥形態で含む第一の容器；
（ｂ）水性再構成液体を含む第二の容器を含み、該液体は緩衝剤（ｉｉ）と少なくとも一種の芳香族保存料（ｉｉ）を少なくとも含む。
ある実施態様では、第一の容器と第二の容器は、例えばシリンジ装置のアンプル、例えばペンのように、装置の別個のコンパートメントとして配置されてもよい。
【実施例】
【０１１１】
一般的方法
溶液に溶解された固形物及び溶液に混合された液体に言及する場合は共にパーセントは（重量／重量）である。例えば、ポロキサマー１８８は１００％ストック重量／溶液重量に言及する。
【０１１２】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性を決定するのに適したアッセイ
本発明において有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、簡単な予備インビトロ試験、つまり、第一世代凝固アッセイ、インビトロ加水分解アッセイ、トロンビン産生アッセイ、一段階凝固アッセイ及び第Ｘ因子産生アッセイとして実施できる次の適切なアッセイによって選択されうる。値は野生型ＦＶＩＩａのものと比較されうる。
【０１１３】
インビトロ加水分解アッセイ（アッセイ１）
インビトロ加水分解アッセイを使用して、他のペプチド又はタンパク質を切断する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの能力を評価する。
【０１１４】
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（以後、双方とも「第ＶＩＩａ因子」と称する）を特異的活性についてアッセイすることができる。それらはまたその特異的活性を直接比較するために併行してアッセイしてもよい。アッセイはマイクロタイタープレート（MaxiSorp, Nunc, Denmark）で実施する。色素生産性基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（S-2288, Chromogenix, Sweden）、最終濃度１ｍＭを、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中の第ＶＩＩａ因子（最終濃度１００ｎＭ）に添加する。４０５ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０プレートリーダー（Molecular Devices, USA）で、連続的に測定する。２０分のインキュベーション中に発現され、酵素を含まないブランクウェルの吸光度を引いた後の吸光度を使用し、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子の活性間の比を算出する：
比＝(４０５ｎｍでの第ＶＩＩ因子ポリペプチド)／(４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
【０１１５】
それらに基づいて、天然第ＶＩＩ因子より低い、匹敵する、又は高い活性を持つ第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性間の比が約１．０対約１．０である第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【０１１６】
このアッセイにおいて測定される活性はしばしば「アミド分解活性（amidolytic activity）」と称されうる。
【０１１７】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性はまた適切には１００−１０００ｎＭの濃度で生理学的基質、例えば第Ｘ因子を使用して測定することができ（「インビトロタンパク分解アッセイ」）、ここで、生成される第Ｘａ因子が適切な発色性基質（例えばＳ−２７６５）の添加後に測定される。加えて、活性アッセイは生理学的温度で実施されうる。
【０１１８】
インビトロタンパク質分解アッセイ（アッセイ２）
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（以後、双方とも「第ＶＩＩａ因子」と称する）を平行してアッセイし、それぞれの特異的活性を直接比較する。アッセイはマイクロタイタープレート（MaxiSorp, Nunc, Denmark）にて実施する。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１００μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中の第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）及び第Ｘ因子（０．８μＭ）を１５分インキュベートする。ついで、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０μＬの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４を添加することにより、第Ｘ因子切断を停止させる。生成した第Ｘａ因子の量を、色素生産性基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（S-2765, Chromogenix, Sweden）、最終濃度０．５ｍＭを添加することにより測定する。４０５ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０プレートリーダー（Molecular Devices, USA）で連続的に測定する。ＦＶＩＩａを含まないブランクウェルの吸光度を引いた後、１０分間で発現した吸光度を使用し、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性の比を算出する。
比＝(４０５ｎｍでの第ＶＩＩポリペプチド)／(４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
【０１１９】
それらに基づいて、天然第ＶＩＩ因子より低い、匹敵する、又は高い活性を持つ第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性間の比が約１．０対約１．０である第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【０１２０】
一段階凝固アッセイ（凝固アッセイ）（アッセイ４）
凝固アッセイを使用して、血液を凝固させる第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの能力を評価した。第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた一段階凝固アッセイを使用することによって特異的活性（「凝固活性」）についてアッセイされうる。この目的に対して、試験される試料を、５０ｍＭのＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）、１％のＢＳＡに希釈し、４０μｌを、４０μｌの第ＶＩＩ因子欠損血漿及び１０ｍＭのＣａ２＋を含む８０μｌのヒト組換え組織因子及び合成リン脂質と共にインキュベートする。凝固時間（凝血時間）を測定し、パラレルラインアッセイにおいて参照標準を使用した標準曲線と比較する。
【０１２１】
第Ｘ因子活性化（アッセイ５）
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、活性化アッセイ（アッセイ５）を使用することによって第Ｘ凝固因子を活性化するその能力についてアッセイできる。この目的のために、脂質付加したＴＦ（１０ｐＭ）及び試験されるべき試料をＢＳＡバッファーに１００ｐＭの濃度まで希釈し（アッセイ４を参照）、第Ｘ因子（５０ｎＭ）を加える前に室温で６０分インキュベートする。１／２容量の停止バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，１００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのＥＤＴＡ）の添加によって更に１０分後に反応を停止させる。生成される第Ｘａ因子の量を、基質Ｓ２７６５（０．６ｍＭ，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を加え、１０分間連続して４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって、決定する。
【０１２２】
高分子量タンパク質（ＨＭＷＰ）含有量
サイズ排除ＨＰＬＣ法を使用して、４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ製剤中の高分子量タンパク質（ＨＭＷＰ）の相対含有量を決定した。
【０１２３】
ＨＭＷＰ含有量の決定−ＨＭＷＰ ＧＰＣ法
非解離条件下で試料のＨＭＷＰ量を分析するためにＳＥ−ＨＰＬＣ，サイズ排除クロマトグラフィー法を使用した。
【０１２４】
使用したカラムは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬ又は同様の仕様のカラムであった。分析的実験は、２１−２５℃での均一濃度の溶出と続く２１５ｎｍでのＵＶ検出によって実施される。溶出バッファーは、ｐＨ６．８に緩衝され、２５ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、１０ｍＭの酢酸カルシウム、２０％のイソプロパノールを含んでいた。一試料に対する通常の操作時間は４０分であった。
【０１２５】
クロマトグラムは典型的には２つの小さいピークと続く２つの主ピークからなる。最も短い保持で、２つの小さいピークが現れる−ポリマーピークは最も低い保持で、ジペグ化ＦＶＩＩａの単量体とモノペグ化ＦＶＩＩａの二量体に対応するピークが続く。これらには、モノペグ化ＦＶＩＩａの単量体と塩ピークの２つの主要なピークが続く。
【０１２６】
重鎖断片化アッセイ
重鎖断片化産物の量を決定する目的で、逆相ＨＰＬＣをＡＣＥ ３μｍＣ４，３００Å，４．６×１００ｍｍカラム（Advanced Chromatography Technologies, パーツ番号ACE-213-1046）で実施した。カラム温度：６０℃。Ａ−バッファー：０．０５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂ−バッファー：０．０６％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。変性バッファー：６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭの塩化カルシウム，ｐＨ７．５。試料は、５０μｌの分析試料＋５０μｌの変性バッファー＋５μｌのＤＴＴ＋１μｌの酢酸から調製し、６０℃で１５分インキュベートした。
【０１２７】
カラムは３５から８０％Ｂの線形勾配で３０分で溶出させた。流量：０．７ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。負荷：２５μｇのＦＶＩＩａ。重鎖分解産物の初期含量を、重鎖分解産物の測定した含量から引いた。つまり、重鎖分解産物の初期含量は０％に設定した。重鎖分解産物の時間ｘでの含量をついで次のようにして計算した：
％＝（ＨＣＤＰ（ｘ）−ＨＣＤＰ（０））／（ＨＣＤＰ（ｘ）−ＨＣＤＰ（０）＋ＦＶＩＩ（ｘ））×１００％
＝（ＨＣＤＰ（ｘ）−ＨＣＤＰ（０））／（ＦＶＩＩ（０））×１００％
ここで、ＨＣＤＰ（ｘ）は時間ｘでの重鎖分解産物の測定された含量、ＨＣＤＰ（０）は重鎖分解産物の測定された初期含量、ＦＶＩＩ（ｘ）は時間ｘでのインタクトな第ＶＩＩ因子ポリペプチドの量である。
【０１２８】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの調製及び精製
本発明での使用に適したヒト精製第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばHagen等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されているように、又は欧州特許第０２００４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、ＤＮＡ組換え技術によって作製される。
【０１２９】
第ＶＩＩ因子はまたBroze及びMajerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980とHedner及びKisiel, J.Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983に記載されている方法によって製造されうる。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を伴わないで第ＶＩＩ因子を生じる。また更に精製された第ＶＩＩ因子調製物は、最終精製工程として更なるゲル濾過を含めることによって得ることができる。第ＶＩＩ因子はついで既知の手段によって、例えば幾つかの異なった血漿タンパク質、例えば第ＸＩＩａ、ＩＸａ又はＸａ因子によって、活性型第ＶＩＩａ因子に転換される。あるいは、Bjoern等(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)に記載されているように、第ＶＩＩ因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ(登録商標)（Pharmacia fine Chemicals）等に通過させることによって、又は溶液中での自己活性化によって、活性化されうる。
【０１３０】
第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子の修飾によって又は組換え技術によって製造されうる。野生型第ＶＩＩ因子と比較した場合に改変されたアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を、既知の手段、例えば部位特異的突然変異誘発によって、アミノ酸コドンを改変するか又は天然第ＶＩＩ因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンの幾つかを除去することによって修飾することによって、製造することができる。
【０１３１】
第ＶＩＩａ因子分子の機能に重要な領域の外側に置換をなすことができ、尚も活性なポリペプチドが生じることは当業者には明らかであろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に必須の、従って置換を好ましくは受けないアミノ酸残基は、当該分野で知られている手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（例えばCunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照）に従って同定することができる。後者の技術では、変異は分子中のあらゆる正電荷残基に導入され、生じた変異体分子は、血液凝固と、分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定するために架橋活性がそれぞれ試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識のような技術によって決定される三次元構造の解析によって決定することができる（例えばde Vos等, 1992, Science 255: 306-312；Smith等, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904；Wlodaver等, 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照）。
【０１３２】
一つのヌクレオチドを他のヌクレオチドに交換するための核酸配列中への変異の導入は、当該分野で知られている方法の何れかを使用する部位特異的突然変異誘発によって達成されうる。特に有用なものは、関心あるインサートと所望の変異を含む２つの合成プライマーと共にスーパーコイル二重鎖ＤＮＡベクターを利用する手順である。それぞれがベクターの反対ストランドに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって温度サイクル中に伸展する。プライマーの導入時に、ねじれたニックを含む変異プラスミドが生成される。温度サイクル後に、生成物を、メチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで処理し、親ＤＮＡテンプレートを消化させ、変異を含む合成されたＤＮＡを選択する。例えば、遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術のような、変異体を創製し、同定し、及び単離するために当該分野で知られている他の手順をまた使用することができる。
【０１３３】
由来するその細胞からのポリペプチドの分離は、限定されないが、接着細胞培養物からの所望の産物を含む細胞培養培地の除去；非接着細胞を除去するための遠心分離又は濾過等々を含む当該分野で知られている任意の方法によって達成されうる。
【０１３４】
場合によっては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを更に精製できる。精製は、限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー、例えば抗第ＶＩＩ因子抗体カラム（例えばWakabayashi等, J. Biol. Chem. 261:11097, 1986；及びThim等, Biochem. 27:7785, 1988を参照）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順（例えば調製用等電点電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度差（例えば硫酸アンモニウム沈降）、又は抽出等を含む当該分野で知られている任意の方法を使用して達成されうる。一般には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982；及びProtein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden編, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと。精製後、調製物は、宿主細胞由来の非第ＶＩＩ因子ポリペプチドを好ましくは１０重量％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満含む。
【０１３５】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンを使用するタンパク分解切断によって活性化されうる。例えば、Osterud等, Biochem. 11:2853 (1972)；Thomas, 米国特許第４４５６５９１号；及びHedner等, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)を参照のこと。あるいは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ(登録商標)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等に通過させることによって、又は溶液中での自己活性化によって、活性化されうる。ついで、得られた活性化型第ＶＩＩ因子ポリペプチドを製剤化させ、本願に記載されたようにして投与されうる。
【０１３６】
次の実施例は本発明の実施を例証する。これらの実施例は例証目的のためだけに含められ、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０１３７】
作用実施例
実施例１
ｒＦＶＩＩａ及び１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの溶液をＮＡＰ１０カラムで、６．２５ｍＭのＣａＣｌ２及び６．２５ｍＭのヒスチジンをｐＨ６．０で含むバッファーにバッファー交換した。ついで、試料は、２０μｌのｒＦＶＩＩａ又は１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ溶液の何れか及び５μｌの５ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、１０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、１５ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール又は３０ｍｇ／ｍｌのェノールを含むように作製された。最終濃度はおよそ２．６ｍｇ／ｍｌのｒＦＶＩＩａ又は２．６ｍｇ／ｍｌの１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ、５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのヒスチジン及び１、２又は３ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール又は６ｍｇ／ｍｌフェノールであった。試料を簡単に振盪（ボルテックス）し、１．５ｍｍの光路を持つ１５μｌのキュベットに移した。ついで、濁度を４００ｎｍでの吸光度として測定した。高濁度はＦＶＩＩポリペプチドの大きな凝集体の沈殿の兆候である。実験から、ｒＦＶＩＩａの溶液が保存料の存在下で有意な濁度を示すことが分かり、ｍ−クレゾール及びフェノールが試料の沈殿を誘導することを示している（図１を参照）。他方、１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの溶液は保存料の存在下で低い濁度を示し、この分子が可溶性のままであることを示している（図１を参照）。
【０１３８】
この実施例は、一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分での官能化が、芳香族保存料を含む液体製剤中におけるＦＶＩＩａの溶解度を増加させることを証明している。
【０１３９】
実施例２
４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａを、１０ｍＭのＨｉｓ，ｐＨ５．５、２０ｍＭのＣａＣｌ２、６％のスクロース及び０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンと共に２２ｍｇ／ｍｌで製剤化した。２００μｌの試料を凍結乾燥させ、３ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール又は１５ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールの何れかで再構成した。再構成の直後に、２０μｌの試料を抜き出し、１０ｍＭのＨｉｓ，ｐＨ５．５、２０ｍＭのＣａＣｌ２、６％のスクロース中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ついで、低保存料含有量のこれら参照試料を４℃で保存した。３  ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール及び１５ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む試料をまた４℃で保存した。５週間後、更なる２０μｌを抜き出し、１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ついで、これらの試料を、参照試料と共に、サイズ排除クロマトグラフィー、凝固活性及びＦＸ活性化によってアッセイした。表１は分析結果を示し、凝固活性及びＦＸ活性化は参照試料に対して得られた値に対して与えられている。これらの結果は、高濃度の保存料の存在の結果、試料の分解は殆どないか又はない。
2011520999.tif 000002
【０１４０】
実施例３
グリコペグ化４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの一連の異なった製剤を調製した。全ての製剤は、２０ｍｇ／ｍｌの４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍｇ／ｍｌのスクロース、２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、０．０７ｍｇ／ｍｌのｔｗｅｅｎ８０及び０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンを含んでいた。４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの濃度は、この実施例では、ＰＥＧ基を考慮しないで、タンパク質含有量として特定される。また、製剤は、次のように、表２に特定された条件及び成分を有していた：
2011520999.tif 000003
【０１４１】
各製剤の２つの試料を調製し、５℃でインキュベートした。０、４、８及び１２週で、試料を［ＦＶＩＩポリペプチド］沈殿について可視的に検査し、２つのアリコートを各試料から抜き出し、１ｍｇ／ｍｌの４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ濃度まで希釈し、−８０℃で凍結させた。全ての試料を集めた後、各製剤及び時点から一つの試料を、ＦＶＩＩポリペプチドの断片化、高分子量タンパク質及び二量体／２−ＰＥＧについて分析した。各製剤と時点からの全ての４試料をアミド分解活性についてアッセイした。製剤２及び９に対しては、全ての時点からの４試料全てを凝固活性についてアッセイした。
【０１４２】
表３は、ＦＶＩＩポリペプチド断片（Δ断片）、高分子量タンパク質（ΔＨＭＷＰ）及び二量体／２−ＰＥＧ（Δ二量体）の含有量の変化、並びに４及び１２週後の視覚検査の結果を示す。
2011520999.tif 000004
【０１４３】
芳香族保存料を含む全ての製剤は、保存料のない他は同一の製剤よりも低い断片化速度を有していることが明らかに分かる（製剤２対１、製剤４対３、製剤７対６、製剤９対８）。他方、芳香族保存料の有無はＦＶＩＩポリペプチドの沈殿に影響を及ぼさないようである。
【図１】
2011520999.tif 000005
【国際調査報告】
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