(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患及びアレルギー疾患を治療及び予防するための改善された方法及び組成物を提供する。更に具体的には、本発明は、細菌エンドトキシンの変異サブユニット、特定の細胞受容体と結合し得るペプチド、並びに自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連する１種以上のエピトープを含む融合タンパク質である、新規な免疫調節複合体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細菌エンテロトキシンの変異サブユニット、
（ｂ）特定の細胞受容体と結合し得るペプチド、及び
（ｃ）自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連する１種以上のエピトープを含む融合タンパク質である免疫調節複合体。
【請求項２】
１種以上のエピトープが、自己免疫疾患と関連する自己免疫エピトープである、請求項１記載の免疫調節複合体。
【請求項３】
自己免疫疾患が、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病から選択される、請求項２記載の免疫調節複合体。
【請求項４】
１種以上のエピトープが、アレルギー誘発疾患と関連するアレルギー誘発性エピトープである、請求項１記載の免疫調節複合体。
【請求項５】
アレルギー性疾患が、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び食品に対する過敏症から選択される、請求項４記載の免疫調節複合体。
【請求項６】
融合タンパク質が、細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットの変異サブユニットを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫調節複合体。
【請求項７】
ＡＤＰ−リボシル化サブユニットが、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニット、並びにクロストリジウム、赤痢菌及びシュードモナス菌毒素のＡＤＰ−リボシル化サブユニットから選択される、請求項６記載の免疫調節複合体。
【請求項８】
ＡＤＰ−リボシル化サブユニットが、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、及び百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニットから選択される、請求項７記載の免疫調節複合体。
【請求項９】
細菌エンテロトキシンの変異サブユニットが配列番号：１のＣＴＡ１−Ｒ７Ｋである、請求項８記載の免疫調節複合体。
【請求項１０】
細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットが、ＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性が、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１０％未満、好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の５％未満、更に好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１％未満であるように変異している、請求項６記載の免疫調節複合体。
【請求項１１】
融合タンパク質が、抗原提示し得る細胞上で発現する受容体に特異的に結合するペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の免疫調節複合体。
【請求項１２】
融合タンパク質が、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞上で発現する受容体に特異的に結合するペプチドを含む、請求項１１記載の免疫調節複合体。
【請求項１３】
融合タンパク質が、Ｂリンパ球のようなリンパ球、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選択される細胞上で発現する受容体に特異的に結合する、請求項１２記載の免疫調節複合体。
【請求項１４】
前記ペプチドが、単一、又は１個以上のＤサブユニットのような単一又は複数コピーで、プロテインＡ又はその断片により構成されている、請求項１３記載の免疫調節複合体。
【請求項１５】
配列番号：３の免疫調節複合体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の免疫調節複合体をコードする、分離核酸。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸を含む発現システム。
【請求項１８】
請求項１７記載の発現システムを含む、形質転換細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の免疫調節複合体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療のための請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
自己免疫疾患が、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病から選択される、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
アレルギー性疾患が、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び食品に対する過敏症から選択される、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療のための医薬品の製造のための、請求項１〜１５のいずれか１項記載の免疫調節複合体の使用。
【請求項２４】
自己免疫疾患が、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病から選択される、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
アレルギー性疾患が、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び食品に対する過敏症から選択される、請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載の免疫調節複合体の有効量を患者に投与することを含む、患者における自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療のための方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患が、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
アレルギー性疾患が、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び食品に対する過敏症から選択される、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及び医学の分野に関する。本発明は、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療及び予防のための改善された方法及び組成物を提供する。具体的には、本発明は、細菌エンドトキシンの変異サブユニット、特定の細胞受容体に結合し得るペプチド、並びに自己免疫疾患又はアレルギー疾患と関連する、１種以上の自己抗原又はアレルギー誘発エピトープを含む融合タンパク質である、新規な免疫修飾複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患及び免疫反応の調節
自己免疫疾患は、身体の正常細胞及び／又は組織において誤った方向に行くようになった免疫細胞によって起こる任意の疾患である。自己免疫疾患は、米国の人口の３％に影響を及ぼし、先進工業国の同様の割合の人口にも影響を及ぼしていると思われる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ８４：２２３−４３，１９９７）。自己免疫疾患は、疾患の臨床症状を引き起こす、身体（例えば、膵臓、脳、甲状腺又は消化管）内の器官、組織又は細胞型の損傷及び／又は機能不全を起こす自己タンパク質、自己ポリペプチド、自己ペプチド及び／又は他の自己分子を異常に標的とするＴ及びＢリンパ球により特徴づけられる（Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：８９９−９０５  ２００１）。自己免疫疾患には、特定の組織に影響を及ぼす疾患、並びに複数の組織に影響を及ぼし得る疾患が含まれる。これは、部分的に、自己免疫反応が、特定の組織に限定される抗原又は身体内に広く分布している抗原に向けられるかどうかに依存するいくつかの疾患についてであり得る。組織特異的自己免疫の特性は、単一の組織又は個々の細胞型の選択的標的である。それにもかかわらず、偏在する自己タンパク質を標的とする特定の自己免疫疾患も特定の組織に影響を及ぼし得る。例えば、多発性肺炎においては、自己免疫反応は、偏在するタンパク質ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼを標的とするが、主に関与する臨床症状は筋肉の自己免疫性破壊である。
【０００３】
免疫系は、種々の外来病原体に対して哺乳動物を保護するが、同時に自己抗原に対する保護反応を生じるように設計された、高度な複合体メカニズムを使用する。応答するかどうか（抗原特異性）を決定することに加え、免疫系は、各病原体を処理する適切なエフェクター機能（エフェクター特異性）をも選択しなければならない。これらのエフェクター機能を臨界的に媒介及び制御する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。更に、それはＴ細胞がこれらの機能を媒介することによる主要なメカニズムであるように思われる、ＣＤ４＋Ｔ細胞からの特定のサイトカインの生成である。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞により製造されるサイトカインのタイプの特徴づけ、並びにどのようにしてその分泌が制御されるかは、どのようにして免疫反応が制御されるかの理解において非常に重要である。
【０００４】
長期間飼育マウスＣＤ４＋Ｔ細胞クローンから産生したサイトカインの特徴づけは、２０年以上に初めて公表された（Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：２３４８−２３５７，１９８６）。これらの研究においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）及びヘルパーＴ２（Ｔｈ２）と命名された、２種の異なるパターンのサイトカインを産生することが示されている。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びリンホトキシン（ＬＴ）を産生するが、Ｔｈ２クローンはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１３を優先的に産生することがわかった（Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：１２２９−１２４４，１９８７）。多少遅れて、更なるサイトカイン、ＩＬ−９及びＩＬ−１０がＴｈ２クローンから分離された（Ｖａｎ  Ｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：３６３−３６８，１９８９）（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７０：２０８１−２０９５，１９８９）。最終的に、ＩＬ−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのさらなるサイトカインが、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞の両方から分泌されることがわかった。最近、ライム病患者の炎症関節から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｔｈ１及びＴｈ２と異なるＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットを含むことが報告された（Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：６１０７−６１１５，２０００）。これらのＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴ細胞プライミングを高め、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＮＯＳ−２、金属プロテアーゼ及びケモカインを含む、複数の炎症性メディエータを産生する線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ及び上皮細胞を刺激し、炎症の誘導をもたらす活性化Ｔ細胞によって優先的に産生される炎症性サイトカイン、Ｔｈ１７．ＩＬ−１７と呼ばれている。ＩＬ−１７の発現は、ＲＡ、ＭＳ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及びぜん息のような種々のアレルギー性及び自己免疫疾患の患者内で上昇し、これは、このような疾患の誘導及び／又は発達に対するＩＬ−１７の寄与を示唆している。
【０００５】
今は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）と呼ばれているサプレッサＴ細胞は、末梢性免疫寛容の能動機構として自己反応性Ｔ細胞を抑制することを示す十分な証拠がある。Ｔｒｅｇ細胞は、今までのところ、その起源に従い、２種のサブタイプ、すなわち、天然（又は構成的）及び誘導（適応性）に分類することができる（Ｍｉｌｌｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：８４１−８５５，２００４）。更に、表面マーカー又はサイトカイン生成物に従い、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞及びＴＧＦ−β産生Ｔｈ３細胞）、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｖｅｔｏ  ＣＤ８＋細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ（ＮＫ１．１＋ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞、ＮＫ１．１−ＣＤ４−ＣＤ８−細胞等のような、種々のＴｒｅｇ細胞サブセットが特定されている。累積証拠は、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が、病原性自己免疫反応の下方制御及び免疫ホメオスタシスの維持において積極的な役割を果たすことを示す（Ａｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６２７−６３３，２００３）。
【０００６】
自己免疫疾患には、身体内の多くの異なる器官及び組織に影響し得る広範囲の疾患が包含される（例えば、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０００７】
ヒトの自己免疫疾患の最新の治療法には、グルココルチコイド、細胞毒性薬が含まれ、最近、生物学的治療法が開発された。一般に、ヒトの全身性自己免疫疾患の管理は経験的であり不十分である。大部分、コルチコステロイドのような広範囲の免疫抑制剤は、多種多様の重度の自己免疫疾患及び炎症性疾患において用いられる。コルチコステロイドに加え、他の免疫抑制剤が、全身性自己免疫疾患の管理に用いられる。シクロホスファミドは、Ｔ−及びＢリンパ球の両方の広範囲の消耗、並びに細胞性免疫の機能障害を引き起こすアルキル化剤である。サイクロスポリン、タクロリムス及びミコフェノール酸モフェチルは、Ｔ−リンパ球抑制の特性を有する天然の生成物であり、それらは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を治療するために用いられ、血管炎及び筋肉炎の範囲を限定する。これらの薬剤は重大な腎臓毒性と関連している。メトトレキサートも、疾患の進行を少なくすることを目的とし、ＲＡにおける「二次」治療薬として用いられる。それは、多発性筋炎及び他の結合組織疾患においても用いられる。試みられてきた他の方法には、サイトカインの作用を阻害し、又はリンパ球を消耗することを意図するモノクローナル抗体が含まれる（Ｆｏｘ，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  ９９：８２−８８，１９９５）。多発性硬化症（ＭＳ）の治療には、再発率を２０〜３０％まで低下させる、インターフェロンβ及びコポリマー１が含まれ、疾患の進行について適度の効果のみを与える。ＭＳは、メチルプレドニゾロン、他のステロイド類、メトトレキサート、クラドリビン及びシクロホスファミドを含む免疫抑制剤によっても治療される。これらの免疫抑制剤は、ＭＳの治療において最小の効果を有する。ＭＳの治療法としての抗体Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、アルファ−４−インテグリンアンタゴニストの導入は、治療を受けている患者における進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の発生により見劣りしてしまう。ＲＡのための最新の治療は、メトトレキサート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ロイフロナミド、プレドニゾン、最近開発されたＴＮＦαアンタゴニスト、エタネルセプト及びインフリキシマブのような免疫機能を非特異的に抑制又は調節する薬剤を用いる（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２８：１４３１−５２，２００１）。エタネルセプト及びインフリキシマブは、全世界的にＴＮＦαを阻害し、患者に、敗血症による死、慢性マイコバクテリア感染及び脱髄性の事象の影響を受けやすくする。
【０００８】
器官特異的自己免疫の場合、多くの異なる治療法が試みられてきた。可溶性タンパク質抗原を全身に投与し、それに続く抗原に対する免疫反応を阻害する。このような療法には、実験的自己免疫脳脊髄炎を患っている動物及び多発性硬化症を患っているヒトへの、ミエリン塩基性タンパク質、その優性ペプチド又はミエリンタンパク質の混合物の送達（Ｂｒｏｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４３−６，１９９６；Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１１３９−４３，１９９４；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：８０９−３７，１９９４）、コラーゲン誘発関節炎を患っている動物及びリウマチ様関節炎を患っているヒトへの、ＩＩ型コラーゲン又はコラーゲンタンパク質混合物の投与（Ｇｕｍａｎｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９１：４６６−７３，１９９９；ＭｃＫｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４２：１２０４−８，１９９９；Ｔｒｅｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１７２７−３０，１９９３）、自己免疫性糖尿病を患っている動物及びヒトへのインシュリンの送達（Ｐｏｚｚｉｌｌｉ  ａｎｄ  Ｇｉｓｅｌｌａ  Ｃａｖａｌｌｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  １６：３０６−７，２０００）、並びに自己免疫性ブドウ膜炎を患っている動物及びヒトへのＳ−抗原の送達（Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２３：５８３−９２，１９９７）が含まれる。他のアプローチは、Ｔ細胞受容体及びＭＨＣ分子に結合したペプチドの間の特異的相互作用に基づくペプチド抗原の全身投与のための合理的治療法を設計する試みである。糖尿病の動物モデルにおけるペプチドアプローチを用いた１つの研究は自己ペプチドに対する抗体産生の開発をもたらした（Ｈｕｒｔｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７７：１４９９，１９９３）。他のアプローチはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチド免疫の投与である（例えば、Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４１，１９８９を参照されたい）。更に他のアプローチは自己ペプチド又はタンパク質抗原の経口摂取による経口免疫寛容の誘導である（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ，Ｉｍｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：３３５，１９９７を参照されたい）。
【０００９】
粘膜免疫寛容は、粘膜経路により、通常、経口、経鼻又は鼻−呼吸器により（膣及び直腸でもよい）、前もって投与された抗原を投与するための全身性の免疫寛容の現象を意味する（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：８０９−８３７，１９９４）。粘膜免疫寛容は、モルモットにおいて、遅延型又は接触過敏症反応のモデル中で２０世紀の初期に発見されたが、寛容のメカニズムは、現代免疫学の時代まで定義されていないままで残っていた。細胞分離技術、サイトカイン産生試験、及び抗原特異的Ｔ細胞が生体内で追跡される遺伝子組換えモデルの使用は、粘膜免疫寛容のメカニズムを徐々に明らかにしてきた（Ｇａｒｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｍｏｗａｔ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１１９−１３７，１９９７）。粘膜経路による抗原投与が、抗原の投与経路及び投与量に依存する、異なるタイプの寛容をもたらし得ることが明らかになってきた。例えば、高濃度の経口抗原は、Ｔ細胞の活性化、それに続いて、高濃度の可溶性抗原の非経口的投与に類似する反応性Ｔ細胞の欠失又はアネルギーを誘発する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：１７７−１８０，１９９５）。これは、その抗原に特定のＴ細胞の死滅、その後の抗原投与に対する無反応、すなわち、受動寛容をもたらす。対照的に、低濃度の経口抗原は欠失又はアネルギーを誘発しないが、繰り返し投与した場合は抗炎症サイトカインを分泌する調節性保護Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞の出現、すなわち、能動寛容により特徴づけられる異なるタイプの免疫反応を誘発する（ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ，Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：５４１−５５４，１９９７）。これらのＴｒｅｇ細胞は、通常、ＣＤ４（ヘルパー）Ｔ細胞のクラスに属する。損傷を受けていないタンパク質抗原の鼻咽頭粘膜への点滴も、保護的であるＴｒｅｇ細胞を誘導する。この場合には、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞はいずれも誘導され得る。経口又は鼻腔内抗原投与後の調節性Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのような抗炎症性サイトカインを産生する。粘膜免疫寛容を誘導するために、抗原をエアロゾルの形態で投与することもできる。これら３種の経路、経口、鼻腔内及びエアロゾル吸入は、それぞれのケースにおいて、抗原摂取をもたらし、異なるリンパ様部分の提示をもたらす。従って、経口抗原は、大部分ｎｏ
Ｔ細胞は腸間膜リンパ節に、ある程度はパイエル板に提示され、鼻腔内抗原は深頸｛しんけい｝リンパ節に、吸入した抗原は縦隔リンパ節に提示される。それぞれのケースにおいて、抗原への繰り返し暴露は、調節性Ｔ細胞を誘発することができるが、これらの細胞の性質は、抗原の経路及び形態に依存して異なる。経口抗原により誘発される調節性細胞はＣＤ４  Ｔ細胞であり、αβヘテロ二量体からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するが、鼻腔吸入抗原の場合は、調節性細胞は、γδヘテロ二量体を発現するＣＤ８  Ｔ受容体（すなわち、γδＴ細胞でもあり得る。これらの細胞のいくつかは、従来のαβ−ヘテロ二量体ＴＣＲの代わりにααホモ二量体であるＣＤ８受容体を有していてもよい。ＣＤ８αα及びγδＴＣＲを有する大部分の細胞は皮膚又は粘膜組織中に存在する。
【００１０】
過去数十年にわたって、西側諸国においては、アレルギー性疾患の発生及び流行のいずれもが顕著に増加した。アレルギー性鼻炎は、人口の１５〜２０％に影響を及ぼす、最も一般的な疾患である。アレルギー反応は、肥満細胞表面での特異的ＩｇＥのアレルゲン媒介架橋、並びにヒスタミン及び他のメディエータの遊離を誘導し、急性アレルギー反応を引き起こす好塩基球、それに続く、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生する好酸球、好中球及びＴｈ２細胞の流入により特徴づけられる遅発相反応により誘発される。
【００１１】
特定の免疫療法（ＳＩＴ）は、アレルギー性鼻炎の効果的治療法として認識されている。伝統的に、ＳＩＴは少量の特定アレルゲンの皮下投与の繰り返しによって実施されてきた。この治療法の形態は効果的な治療の選択肢であり得るが、この免疫療法の形態の安全性、並びにワクチンとして用いられるアレルゲン抽出物の統一の困難性は重要である。従って、アレルギー性疾患に対する、代わりの新規な治療法の開発に強い関心がある。アプローチの１つは、粘膜ワクチンの使用である（Ｗｉｄｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４，５７７−５８３，２００５）。他の代替え手段は、ワクチンとして低下したアレルギー誘発性あるいはアレルギー誘発性を全く伴わないアレルゲン誘導体の使用を基本としている（Ｖｒｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２，３１３−３２０，２００４）。これらには、アレルゲンの腫瘍抗原Ｔ細胞エピトープを表わすタンパク質工学及び合成ペプチドにより得られるアレルゲンが含まれる。例えば、Ｏｌｅらは、オリーブの花粉の最も関連するアレルゲンとして特定している（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，６３１−６３６，１９９０）。
【００１２】
免疫反応は、一般に自己ポリペプチドを、単独で、又はアジュバント（免疫調節薬）と組み合わせて送達することにより変化する。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、アジュバントとしての役割を果たす水酸化アルミニウム中に製剤化された組換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、非自己抗原を含む。このワクチンは、感染から保護するためにＢ型肝炎ウイルス表面抗原に対する免疫反応を誘発する。他のアプローチは、弱毒化し、複製欠損性、及び／又は非病原性の形態のウイルス又は細菌の送達を含み、各非自己抗原は病原体に対する宿主保護免疫反応を誘発する。例えば、経口用ポリオワクチンは、弱毒化した生ウイルス、非自己抗原からなり、細胞に感染し、ワクチン接種した個体内で複製し、臨床疾患を起こすことなく、ポリオウイルス、外来性又は非自己抗原に対する効果的な免疫を誘発する。また、不活化ポリオワクチンは、感染又は複製することができない不活性化又は「死滅」ウイルスを含み、皮下投与され、ポリオウイルスに対する保護的免疫を誘導する。
【００１３】
自己免疫疾患の治療のためにＤＮＡ療法が開示されている。このようなＤＮＡ療法には、自己免疫反応を促進する自己反応性Ｔ細胞のレベルを変化させるＴ細胞受容体の抗原結合領域をコードするＤＮＡが含まれる（Ｗａｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：８９９−９０５，１９９６；米国特許第５，９３９，４００号）。自己抗原をコードするＤＮＡが粒子に結合し、遺伝子銃によってＭＳ及びコラーゲン誘発関節炎を予防するために皮膚に送達される（ＷＯ  ９７／４６２５３；Ｒａｍｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５：４０９−４１３，１９９７）。接着分子、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）、ケモカイン（例えば、Ｃ−Ｃケモカイン）及び他の免疫分子（例えば、Ｆａｓ−リガンド）をコードするＤＮＡは動物モデルにおいて自己免疫疾患を治療するために用いられてきた（Ｙｏｕｓｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：３６１−３７１，２０００；Ｗｉｌｄｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：６７１−６７９，２０００；Ｗｉｌｄｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５８６０−５８６６，２０００）。
【００１４】
１種以上の自己抗原をコードする核酸を投与することによる自己免疫疾患の治療法は、ＷＯ  ００／５３０１９、ＷＯ  ２００３／０４５３１６及びＷＯ  ２００４／０４７７３４に開示されている。これらの方法は成功しているが、更なる改善が必要である。
【００１５】
細菌エンテロトキシンは、感染症の予防のためのワクチンにおいて免疫賦活アジュバントとして用いられる。コレラ毒素（ＣＴ）及び密接に関連のあるＥ．ｃｏｌｉ非耐熱性毒素（ＬＴ）は、おそらく、今日では実験的使用における、最も強力かつ最も研究された粘膜アジュバントである（Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２０：４９３−５００）が、診療所で利用された時に、その潜在毒性及びベル麻痺（顔面神経の麻痺）の場合と関連していることから、市場から撤退するに至った（Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８１：１１２９−１１３２，２０００；Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（Ｓｕｐｐｌ．ｌ）：Ｓ４２−４４，２００１；Ｍｕｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０：８９６−９０３，２００４）。細菌エンテロトキシンＣＴ及びＬＴは、実験動物並びにヒトにおいて効果的な免疫促進物質であることが示された（Ｆｒｅｙｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３６：２１５−２３６，１９９９）。構造的に、これらのエンテロトキシンはＡＢ５複合体であり、１個のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性Ａ１サブユニットと、ＢサブユニットのペンタマーにＡ１が結合しているＡ２サブユニットとからなる。ホロトキシンは、Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を介して、ほとんどの哺乳動物細胞と結合し、特に、細胞膜中のＧＭ１−ガングリオシド受容体と相互作用する。ホロトキシンは粘膜免疫反応を向上させることがわかったが、ＣＴＢ及び抗原の間の複合体は免疫系を特異的に寛容化するために用いられてきた（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ５０：４２−５４，１９９４）。マウスにおける研究は、ＣＴ及びＬＴが鼻腔内に投与された時に嗅神経及び嗅球内に蓄積し、ＣＴ及びＬＴのＢサブユニットのＧＭ１−ガングリオシド受容体に結合する能力に依存するメカニズムは、全ての有核哺乳動物細胞上に存在することを示した（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２４３１−２４３８，２００２）。ＣＴ及びＬＴの毒性の低い変異体は十分なアジュバント機能により設計されたが、このような分子は、未だに、特にＣＴ及びＬＴのアジュバント活性がＡサブユニットのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性と標的細胞上におけるガングリオシド受容体と結合する（Ｓｏｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：６６７−６７６，２００２）能力の組み合わせであるように思われていると考えられる場合に有害反応を引き起こすという重大な危険を伴っている（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：１１２３−１１３２，１９９８；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１２０３−１２１０，１９９７）。これらの観察及び他の観察は、ヒトのためのワクチンにおけるＣＴ又はＬＴホロトキシンの使用を除外する。一方、最近の観察は、Ａ１サブユニットについてコードする遺伝子内に部位特異的な突然変異を導入することにより毒性をなくし、又は大いに低下させて、これらの分子のアジュバント機能を維持することが可能であることを証明した。効��的なアジュバントであることを示す突然変異分子の具体例はＬＴＫ６３及びＬＴＲ７２であり（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：１１２３−１１３２，１９９８）、前者は酵素活性を有さず、後者はＡＤＰ−リボシル化能力が顕著に低下している。これにもかかわらず、ＧＭ１−ガングリオシド受容体依存結合は、これらの変異に問題を残し、その結果、神経細胞蓄積及び神経毒性をいまだに引き起こし得る。
【００１６】
この毒性に対する有効性のジレンマに対する、よりよい解決法は、非常に効果的な粘膜及び全身性アジュバントであることが証明されたＣＴＡ１−ＤＤ分子である（Ａｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：３９３６−３９４６，１９９７；米国特許第５，９１７，０２６号）。このユニークなアジュバントは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに由来する免疫グロブリン結合成分の二量体と組み合わせた、ＣＴの酵素的に活性なＡ１サブユニットをベースとする。その結果、この分子は、全ての有核細胞への結合を回避し、望ましくない反応をもたらし、ホロトキシンにおけるＣＴＡ１−酵素を完全に利用する。従って、今までの全ての研究は、ＣＴＡ１−ＤＤが非毒性であり、優れた免疫増強機能を維持していることを見出した。全身的に与えた場合、ＣＴＡ１−ＤＤは、無傷のＣＴの効果と同等のアジュバント効果を提供し、アジュバントと一緒に投与した特定の免疫原に対する細胞性及び体液性免疫のいずれをも非常に増大させる。ＣＴホロトキシンの毒性の要件であるＢサブユニットの欠失であるように、それは、粘膜アジュバントとしても機能し、安全であるべきである。ＣＴＡ１−ＤＤはガングリオシド受容体と結合できず、むしろ、それはＢ細胞を標的とし、相互作用し得る細胞の制限されたレパートリーに対するＣＡＴ１−ＤＤアジュバントを限定する。しかし、アジュバント効果はＢ細胞欠失マウスにおけるＣＡＴ１−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内免疫に続く、特異的なＣＤ４Ｔ細胞免疫の強力な誘導において示されるように、Ｂ細胞に完全に依存しているというわけではない（Ｅｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：１２４３−５２，２００８，Ａｋｈｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６３：９７−１０５，２００６）。
【００１７】
ＣＴＡ１−ＤＤのアジュバント効果は、ＡＤＰ−リボシル化酵素活性を欠くＣＴＡ１−Ｅ１１２Ｋ−ＤＤ変異体及びＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤには存在しない（Ｌｙｃｋｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ９７：１９３−１９８，２００５）。
【００１８】
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤと、オブアルブミン（ＯＶＡ−ｐ３２３−３３９）に由来するペプチドとの融合をベースとする実験系を用いるＷａｄｅｌｌ及びＬｙｃｋｅ（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５（５），Ａ１２３０，２００１）は、脾臓のＣＤ４Ｔ細胞集団における免疫寛容の刺激が、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＯＶＡ−ＤＤ融合タンパク質の投与に続くことを観察したと主張した。しかし、このミーティングの要約は実験の詳細及び結果を提供せず、どのような実験が実施されたか、どのような結果が得られたかの疑念を読者に残す。このＯＶＡペプチドが自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連するペプチドでないので、このＯＶＡペプチドを用いた非生理的システムにおいて得られるあらゆる結果が、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の病態生理学に対するあらゆる妥当性にまで拡大し得るかどうかも疑わしい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第５，９３９，４００号
【特許文献２】ＷＯ  ９７／４６２５３
【特許文献３】ＷＯ  ００／５３０１９
【特許文献４】ＷＯ  ２００３／０４５３１６
【特許文献５】ＷＯ  ２００４／０４７７３４
【特許文献６】米国特許第５，９１７，０２６号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ８４：２２３−４３，１９９７
【非特許文献２】Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：８９９−９０５  ２００１
【非特許文献３】Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：２３４８−２３５７，１９８６
【非特許文献４】Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：１２２９−１２４４，１９８７
【非特許文献５】Ｖａｎ  Ｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：３６３−３６８，１９８９
【非特許文献６】Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７０：２０８１−２０９５，１９８９
【非特許文献７】Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：６１０７−６１１５，２０００
【非特許文献８】Ｍｉｌｌｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：８４１−８５５，２００４
【非特許文献９】Ａｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６２７−６３３，２００３
【非特許文献１０】Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献１１】Ｆｏｘ，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  ９９：８２−８８，１９９５
【非特許文献１２】Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２８：１４３１−５２，２００１
【非特許文献１３】Ｂｒｏｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４３−６，１９９６；Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１１３９−４３，１９９４；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：８０９−３７，１９９４
【非特許文献１４】Ｇｕｍａｎｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９１：４６６−７３，１９９９；ＭｃＫｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４２：１２０４−８，１９９９；Ｔｒｅｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１７２７−３０，１９９３
【非特許文献１５】Ｐｏｚｚｉｌｌｉ  ａｎｄ  Ｇｉｓｅｌｌａ  Ｃａｖａｌｌｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  １６：３０６−７，２０００
【非特許文献１６】Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２３：５８３−９２，１９９７
【非特許文献１７】Ｈｕｒｔｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７７：１４９９，１９９３
【非特許文献１８】Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４１，１９８９
【非特許文献１９】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｉｍｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：３３５，１９９７
【非特許文献２０】Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：８０９−８３７，１９９４
【非特許文献２１】Ｇａｒｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｍｏｗａｔ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１１９−１３７，１９９７
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：１７７−１８０，１９９５
【非特許文献２３】ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ，Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：５４１−５５４，１９９７
【非特許文献２４】Ｗｉｄｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４，５７７−５８３，２００５
【非特許文献２５】Ｖｒｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２，３１３−３２０，２００４
【非特許文献２６】Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，６３１−６３６，１９９０
【非特許文献２７】Ｗａｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：８９９−９０５，１９９６
【非特許文献２８】Ｒａｍｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５：４０９−４１３，１９９７
【非特許文献２９】Ｙｏｕｓｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：３６１−３７１，２０００
【非特許文献３０】Ｗｉｌｄｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：６７１−６７９，２０００
【非特許文献３１】Ｗｉｌｄｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５８６０−５８６６，２０００
【非特許文献３２】Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２０：４９３−５００
【非特許文献３３】Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８１：１１２９−１１３２，２０００；Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（Ｓｕｐｐｌ．ｌ）：Ｓ４２−４４，２００１；Ｍｕｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０：８９６−９０３，２００４）。
【非特許文献３４】Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ５０：４２−５４，１９９４
【非特許文献３５】Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２４３１−２４３８，２００２
【非特許文献３６】Ｓｏｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：６６７−６７６，２００２
【非特許文献３７】Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：１１２３−１１３２，１９９８；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１２０３−１２１０，１９９７
【非特許文献３８】Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：１１２３−１１３２，１９９８
【非特許文献３９】Ａｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：３９３６−３９４６，１９９７
【非特許文献４０】Ｅｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：１２４３−５２，２００８，Ａｋｈｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６３：９７−１０５，２００６
【非特許文献４１】Ｌｙｃｋｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ９７：１９３−１９８，２００５
【非特許文献４２】ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５（５），Ａ１２３０，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＣＴＢ及びウシコラーゲンＩＩ由来のペプチドの複合体は、コラーゲン誘発性自己免疫性の耳疾患、並びにコラーゲン誘発性関節炎の発症からマウスを保護し得ることがわかった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｔｏｌ  Ｒｈｉｎｏｌ  Ｌａｒｙｎｇｏｌ  １１０：６４６−６５４，２００１；Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４２：１６２８−３４，１９９９）。しかし、前記で議論したように、ＣＴＢは、ＧＭ１−ガングリオシド結合特性及び潜在的な神経毒性効果のためにヒトへの使用には適していない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、免疫調節複合体を投与することを含み、免疫調節複合体が、細菌エンテロトキシンの変異サブユニット、特定の細胞受容体と結合し得るペプチド、及び疾患と関連する１種以上のエピトープを含む融合タンパク質である、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療のための改善された方法及び組成物に関する。治療的又は予防的有効量の免疫調節複合体の患者への投与は、疾患と関連する抗原に対する免疫反応の抑制を誘発し、その結果、疾患を治療又は予防する。
【００２３】
治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合、エピトープは自己免疫エピトープであり得、治療すべき疾患がアレルギー性疾患である場合、エピトープはアレルギー誘発性エピトープであり得る。
【００２４】
一実施態様においては、本発明は、細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットの変異サブユニットを含む融合タンパク質である免疫調節複合体を提供する。好ましくは、ＡＤＰ−リボシル化サブユニットは、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニット、並びにクロストリジウム、赤痢菌及びシュードモナス菌毒素のＡＤＰ−リボシル化サブユニットから選択される。更に好ましくは、細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットは、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、及び百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニットから選択される。
【００２５】
細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットは、ＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性が、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１０％未満、好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の５％未満、更に好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１％未満であるように変異している。
【００２６】
好ましい一実施態様においては、融合タンパク質は、天然のＣＴＡ１の７位のアミノ酸、アルギニンがリジンに置換されたＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ変異体（配列番号：１）を含む。
【００２７】
一実施態様においては、融合タンパク質は、抗原提示し得る細胞、特にＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞上で発現する受容体に特異的に結合するペプチドを含む。抗原提示細胞は、Ｂリンパ球のようなリンパ球、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選択し得る。
【００２８】
自己ペプチドは、前記細胞の受容体、好ましくは前記抗原提示細胞により発現するＩｇ又はＦｃ受容体、最も好ましくはＢリンパ球及び樹状細胞の受容体と結合するペプチドである。
【００２９】
特異的な標的ペプチドの具体例は、
（ｉ）単球、好中球、好酸球、線維芽細胞及び内皮細胞に存在するＧＭ−ＣＳＦ受容体α／βヘテロ二量体と結合し得る顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、
（ｉｉ）それぞれ、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩ分子のコレセプターとして機能するＴ細胞受容体（ＴｃＲ）と共にＴ細胞上で発現するＣＤ４及びＣＤ８（ＭＨＣクラスＩはほとんどの有核細胞で発現するが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、樹状細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄球及び赤血球前駆細胞及びいくらかの上皮細胞で発現する）、
（ｉｉｉ）Ｂ細胞上で発現するＣＤ８０及びＣＤ８６Ｂ７と結合するＴ細胞上で主に発現する２種のホモ二量体タンパク質、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４、
（ｉｖ）Ｔ細胞上で発現するＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９又はＣＤ１５４）と相互作用する成熟Ｂ細胞の表面に主に存在するＣＤ４０、
（ｖ）肥満細胞、好塩基球、好酸球、血小板、樹状細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＢ細胞上に存在する、多くの高又は低親和性Ｆｃ受容体と相互作用する、Ｉｇ重鎖定常領域の種々のアイソタイプ、
（ｖｉ）正常な液性免疫反応の発生に重要であり、自己免疫の発生にも関与していると思われるＢ−細胞上で発現する、補体受容体（ＣＲｓ）、ＣＲ１及びＣＲ２、
（ｖｉｉ）樹状細胞上で発現するデクチン−１のようなＣ型レクチン受容体（ＣＬＲｓ）、
（ｖｉｉｉ）抗原の取り込み、及び樹状細胞のサブセット上において高レベルで発現するエンドサイトーシス受容体、ＤＥＣ２０５、
（ｉｘ）骨髄性細胞で主として見いだされる、多くの可溶性因子及びタンパク質（ＬＰＳ、フィブリノーゲン、ｉＣ３ｂ）についての細胞表面受容体、ＣＤ１１ｃ、
（ｘ）樹状細胞、マクロファージ及び他の抗原提示細胞上に存在するマンノース受容体、
（ｘｉ）マクロファージ上に存在する、特定のＨＳＰ６０、
（ｘｉｉ）樹状細胞のサブセットにより発現するインテグリンアルファ鎖、ＣＤ１０３の受容体と結合し得るペプチドである。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、単一、又は１個以上のＤサブユニットのような複数コピーで、プロテインＡ又はその断片により構成されている。
本発明の他の特に好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、抗原を提示し得る細胞上で発現する受容体と特異的に結合する、一本鎖抗体断片のような抗体断片により構成される。
【００３１】
自己ペプチドは、好ましくは、得られる融合タンパク質が水溶性を保持し、融合タンパク質が、天然の毒素に結合する受容体と異なる特定の細胞受容体を標的とすることができ；その結果、少なくとも前記サブユニットの細胞体取り込みを介在する。
【００３２】
自己抗原エピトープは、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はリウマチ様関節炎（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）のような自己免疫疾患と関連し得る。
【００３３】
いくつかの実施態様においては、ＩＤＤＭと関連する自己抗原エピトープは、プレプロインシュリン、プロインシュリン、インシュリン及びインシュリンＢ鎖；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）−６５及び−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）及び膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群から由来するエピトープである。
【００３４】
いくつかの実施態様においては、ＭＳと関連する自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プレテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群から由来するエピトープである。
【００３５】
いくつかの実施態様においては、ＲＡと関連する自己抗原エピトープは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン及びフィブリンからなる群から由来するエピトープである。好ましい一実施態様においては、エピトープはＩＩ型コラーゲンに由来し、好ましくは、エピトープは、２６０〜２７３位のアミノ酸を含む、共有の免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ｓｈａｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＩＩ２６０−２７３）である。
【００３６】
アレルギー性エピトープは、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胞隔炎、アトピー性皮膚炎又は食品に対する過敏症と関連し得る。ある実施態様においては、アレルギー性エピトープは、オリーブの花粉からのＯｌｅ  ｅ１アレルゲン、スギ花粉からのＣｒｙ  ｊＩ及びＣｒｙ  ｊＩＩアレルゲン、オオアワガエリ花粉のｎＰｈ１  ｐ４、又は主要なカバの木の花粉のＢｅｔ  ｖ１、ヨモギの花粉の主要なアレルゲンＡｒｔ  ｖ１のような植物の花粉、ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ１又はイヌアレルゲンＣａｎ  ｆ１、イエダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ１、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｍ１、Ｂｌｏ  ｔ４のような動物、アルテルナリア抗原Ａｌｔ  ａ１、アスペルギルス抗原Ａｓｐ  ｆ１、クラドスポリウム抗原ＣｌＡ  ｈ１及びＣｌａ  ｈ２、ペニシリウム抗原Ｐｅｎ  ｃｈ１３のような真菌抗原；若しくは鶏卵白アレルゲンＧａｌ  ｄ１、Ｇａｌ  ｄ２及びＧａｌ  ｄ３、ピーナツアレルゲンＡｒａ  ｈ２、大豆アレルゲンＧｌｙ  ｍ１、Ｇｌｙ  ｍ５及びＧｌｙ  ｍ６、魚アレルゲンＧａｄ  ｃ１又はエビアレルゲンＰｅｎ  ａ１のような食物アレルゲンから由来するエピトープである。
【００３７】
好ましい一実施態様においては、免疫調節複合体は、融合タンパク質ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（配列番号：３）であり、ここで、ＣＯＬは、２６０〜２７３位のアミノ酸を含む、共有の免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０−２７３）（配列番号：４）である。
【００３８】
本発明は、疾患と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む、本発明の免疫調節複合体を患者に投与することを含む、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びグレーブス病のような自己免疫疾患の治療、予防及び／又は防止のための方法及び組成物を提供する。
【００３９】
特定の実施態様においては、本発明は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む、本発明の免疫調節複合体を患者に投与することを含む、自己免疫疾患、ＩＤＤＭの治療、予防及び／又は防止のための改善方法を提供する。ある実施態様においては、ＩＤＤＭと関連する自己抗原エピトープは、プレプロインシュリン、プロインシュリン、インシュリン及びインシュリンＢ鎖；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）−６５及び−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）及び膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群から由来するエピトープである。
【００４０】
他の実施態様においては、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む、本発明の免疫調節複合体を患者に投与することを含む、ＭＳの治療、予防及び／又は防止のための改善方法を提供する。ある実施態様においては、自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プレテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群から由来するエピトープである。
【００４１】
他の実施態様においては、本発明は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む、本発明の免疫調節複合体を患者に投与することを含む、ＲＡの治療、予防及び／又は防止のための改善方法を提供する。ある実施態様においては、自己抗原エピトープは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン及びフィブリンからなる群から由来するエピトープである。好ましい一実施態様においては、エピトープはＩＩ型コラーゲンに由来し、好ましくは、エピトープは、２６０〜２７３位のアミノ酸を含む、共有の免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０−２７３）である。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、単一、又は１個以上のＤサブユニットのような複数コピーで、プロテインＡ又はその断片により構成されている。本発明の他の特に好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、抗原を提示し得る細胞上で発現する受容体と特異的に結合する、一本鎖抗体断片のような抗体断片により構成される。
【００４３】
異なる自己抗原エピトープを含む、複数の免疫調節複合体は混合物として投与することができ、それぞれ個々の免疫調節複合体は、複数の自己抗原エピトープを含んでいてもよい。同様に、異なるアレルギー性エピトープを含む複数の免疫調節複合体は混合物として投与することができ、それぞれ個々の免疫調節複合体は、複数のアレルギー誘発エピトープを含んでいてもよい。
【００４４】
特定の変形においては、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の治療、予防及び／又は防止のための方法及び組成物は、更に、他の薬剤、例えば、免疫調節配列を含むポリヌクレオチド、薬理作用のある物質、アジュバント、サイトカイン、サイトカインをコードするベクターと組み合わせて本発明の免疫調節複合体を投与することを含む。
【００４５】
本発明の更に他の実施態様は、本発明の免疫調節複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患の予防、防止及び／又は治療に用いることができる。自己免疫疾患は、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病からなる群から選択することができる。アレルギー性疾患は、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胞隔炎、アトピー性皮膚炎又は食物に対する過敏症からなる群から選択することができる。
【００４６】
本発明の更に他の実施態様は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療のための医薬品の製造のための本発明の免疫調節複合体の使用を提供する。自己免疫疾患は、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病からなる群から選択することができる。アレルギー性疾患は、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胞隔炎、アトピー性皮膚炎又は食物に対する過敏症からなる群から選択することができる。
【００４７】
更に他の実施態様においては、本発明は、本発明の免疫調節複合体をコードする分離核酸配列を提供する。従って、本発明は、細菌エンテロトキシンの変異サブユニット、特定の細胞受容体と結合し得るペプチド、及び自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連する１種以上のエピトープを含む融合タンパク質である免疫調節複合体をコードする分離核酸配列を提供する。
【００４８】
一実施態様においては、本発明の核酸は、細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットの変異サブユニットを含む融合タンパク質をコードする。好ましくは、ｖ−サブユニットは、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニット、並びにクロストリジウム、赤痢菌及びシュードモナス菌毒素のＡＤＰ−リボシル化サブユニットから選択される。最も好ましくは、細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットは、コレラ毒素（ＣＴ）のＡ１サブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ１サブユニット、及び百日咳毒素（ＰＴＸ）のＳ１サブユニットから選択される。細菌エンテロトキシンのＡＤＰ−リボシル化サブユニットは、ＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性が、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１０％未満、好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の５％未満、更に好ましくは、対応する野生型のＡＤＰ−リボシル化サブユニットのＡＤＰ−リボシル化活性の１％未満であるように変異している。
【００４９】
一実施態様においては、本発明の核酸は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を特異的に発現する、抗原を提示し得る細胞上で発現する受容体に特異的に結合するペプチドを含む融合タンパク質をコードする。抗原提示細胞は、Ｂリンパ球のようなリンパ球、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選択することができる。
【００５０】
一実施態様においては、本発明の核酸は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又はリウマチ様関節炎（ＲＡ）又はシェーグレン症候群（ＳＳ）のような自己免疫疾患と関連する自己抗原エピトープを含む融合タンパク質をコードする。
【００５１】
他の実施態様においては、本発明の核酸は、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胞隔炎、アトピー性皮膚炎又は食物に対する過敏症のようなアレルギー性疾患と関連するアレルギー性エピトープを含む融合タンパク質をコードする。
【００５２】
ある実施態様においては、ＩＤＤＭと関連する自己抗原エピトープは、プレプロインシュリン、プロインシュリン、インシュリン及びインシュリンＢ鎖；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）−６５及び−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）及び膵島細胞抗原６９ｋＤからなる群から由来するエピトープである。ある実施態様においては、ＭＳと関連する自己抗原エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プレテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）からなる群から由来するエピトープである。ある実施態様においては、ＲＡと関連する自己抗原エピトープは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン及びフィブリンからなる群から由来するエピトープである。ある実施態様においては、ＳＳと関連する自己抗原エピトープは、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０、フォドリン、Ｒｏ（又はＳＳＡ）及びＬａ（又はＳＳＰ）リボ核タンパク質からなる群から由来する。
【００５３】
本発明の核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【００５４】
他の実施態様においては、本発明は、本発明の核酸を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患の予防、防止及び／又は治療に用いることができる。更に、本発明は、本発明の核酸の有効量を患者に投与することを含む、患者における自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の予防、防止及び／又は治療方法を提供する。
【００５５】
更に他の実施態様においては、本発明は、本発明の核酸を含む組換えプラスミド、ベクター及び発現系を提供する。組換え型発現系は、好ましくは細菌の発現に適用される。本発明は、更に、本発明のプラスミド、ベクター又は発現系を含む形質転換細胞を提供する。形質転換細胞は、好ましくは形質転換細菌細胞である。
【００５６】
定義
特に定義しない限り、本明細書で用いられる、全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いられる場合、以下の用語及び表現は特に記載しない限り下記のものとみなす。
【００５７】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」なる用語は、ホスホジエステル結合により結合する複数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチド又は関連する構造変異体）からなるポリマーを意味する。ポリヌクレオチド又は核酸は、実質的に任意の長さであってもよく、通常は約６ヌクレオチド〜１０９ヌクレオチド又はそれ以上の長さであってもよい。ポリヌクレオチド及び核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成型及び混合ポリマー、センス及びアンチセンス鎖の両方、二本鎖及び一本鎖が含まれ、当業者に容易に認識されるように、化学的又は生化学的に修飾されてもよく、非天然又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「抗原」は、Ｂ細胞又はＴ細胞又は両者により、免疫系により認識され得るあらゆる分子を意味する。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「自己抗原」は、病原性免疫反応を誘発する内因性分子、通常は、多糖類又はタンパク質若しくはそれらの断片を意味する。自己抗原には、シトルリン化ペプチドを含む、他の形態の翻訳後修飾を含む、グリコシル化タンパク質及びペプチド、並びにタンパク質及びペプチドが含まれる。「自己免疫疾患に関連する」ような自己抗原又はそのエピトープを意味する場合、病態生理学を誘導し（すなわち、疾患の原因と関連する）、又は病態生理学的過程を媒介又は促進することにより；及び／又は病態生理学的過程の標的となることにより、自己抗原又はエピトープが疾患の病態生理に関与することを意味することが理解される。例えば、自己免疫疾患においては、免疫系は異常に自己抗原を標的とし、自己抗原が発現し、及び／又は存在する細胞及び組織の損傷および機能障害を起こす。正常な生理的条件下では、自己抗原は、「免疫寛容」と命名される工程により自己抗原を認識する能力を有する免疫細胞の排除、不活性化又は活性の欠失を通して宿主免疫系により無視される。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「アレルゲン」は、病原性免疫反応を誘発する外因性分子、通常は、多糖類又はタンパク質若しくはそれらの断片を意味する。アレルゲンには、他の形態の翻訳後修飾を含む、グリコシル化タンパク質及びペプチド、並びにタンパク質及びペプチドが含まれる。アレルゲンは、例えば、花粉、真菌、昆虫毒、ふけ、カビ、食品に由来する。ピーナッツのＡｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、Ａｒａ  ｈ３及びＡｒａ  ｈ６；鶏卵白のＧａｌ  ｄ１、Ｇａｌ  ｄ２及びＧａｌ  ｄ３；大豆のＧｌｙ  ｍ１；魚のＧａｄ  ｃ１；及びエビのＰｅｎ  ａ１のような多くの食物アレルゲンが精製され、十分に特徴づけられている。多くのネコ（Ｆｅｌ  ｄ１）及びイヌ（Ｃａｎ  ｆ１）アレルゲン、並びにイエダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ１及びＤｅｒ  ｐ１が十分に特徴づけられている。野生型のオオアワガエリの花粉ｎＰｈ１  ｐ４、並びに多くの関連組換え型アレルゲン、ｒＰｈ１  １ｐ、ｒＰｈ１  ２ｐ、ｒＰｈ１  ５ｐ、ｒＰｈ１  ６ｐ、ｒＰｈ１  ７ｐ、ｒＰｈ１  １１ｐ、ｒＰｈ１  １２ｐ、主要なカバの木の花粉のアレルゲンＢｅｔ  ｖ１、主要なオオバコの花粉のアレルゲンＰｌａ  Ｉ１、主要なオリーブの花粉のアレルゲンＯｌｅ  ｅ１、主要なブタクサの花粉のアレルゲンＡｍｂ  ａ１、主要なヨモギの花粉のアレルゲンＡｒｔ  ｖ１及びＡｒｔ  ｖ３が十分に定義されている。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「エピトープ」なる用語は、動物の免疫系のＢ−細胞又はＴ細胞のいずれかにより認識される特定の形状又は構造を有すると理解される。ピオトープは糖化ペプチドのような多糖類又はポリペプチドの一部を含む。
【００６２】
「自己抗原エピトープ」は、病原性免疫反応を誘発する自己抗原のエピトープを意味する。
【００６３】
「アレルギー誘発エピトープ」は、病原性免疫反応を誘発するアレルゲンのエピトープを意味する。
【００６４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために本明細書において置換可能に用いられる。この用語は、１種以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣物、並びに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーである、アミノ酸のポリマーに適用される。
【００６５】
「自己タンパク質」、「自己ポリペプチド」又は「自己ペプチド」は本明細書において置換可能に用いられ、動物のゲノム内にコードされ；動物内で産生又は生成され；動物の一生の間のいずれかの時に後翻訳的に修飾され、動物内で非生理的に存在する、あらゆるタンパク質自己ポリペプチド又はペプチド又は断片、若しくはそれらの誘導体を意味する。本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドを記載するために用いられる「非生理的」又は「非生理的に」なる用語は自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドについての動物における正常な役割又は過程からの離脱又は逸脱を意味する。「疾患と関連する」又は「疾患に関与する」ような自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドを意味する場合、自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドが形状又は構造において修飾されていてもよく、その結果、生理的役割又は過程を実施することができず、又は病態生理を誘発し、病態生理過程を媒介又は促進することにより、及び／又は病態生理的過程の標的であることにより病状又は疾患の病態生理に関与することを意味することが理解される。例えば、自己免疫疾患において、免疫系は自己タンパク質が発現及び／又は存在する細胞及び組織の損傷及び機能障害を引き起こす自己タンパク質を異常に攻撃する。また自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドは、非生理的レベルにおいて、それ自体で発現することができ、非生理的に機能し得る。例えば、神経変性疾患においては、自己タンパク質は異常に発現し、脳内の損傷において凝集し、その結果、神経機能障害を起こす。他のケースにおいては自己タンパク質は、消耗でない病状又は過程を悪化させる。例えば、変形性関節症においては、コラゲナーゼ及びマトリクスメタロプロテイナーゼは、関節の関節面を覆う軟骨を異常に分解する。自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドの翻訳後修飾の具体例は、グリコシル化、脂質基の付加、可逆的リン酸化、ジメチルアルギニン残基の付加、シトルリン化及びタンパク質分解であり、特には、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるフィラグリン及びフィブリンのシトルリン化、α−β−クリスタリンリン酸化、ＭＢＰのシトルリン化、並びにキャスパーゼ及びグランザイムによるＳＬＥ自己抗原タンパク質分解である。免疫学的には、自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドは、全て宿主の自己抗原であると考えられ、正常な生理的条件下では、「免疫慣用」と命名された過程を通して自己抗原を認識する能力を有する免疫細胞の活性の排除、不活性化又は欠失を通した宿主の免疫系により無視される。自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドは、免疫機能を制御するための免疫系の細胞により生理的排他的に発現する分子である免疫タンパク質自己ポリペプチド又はペプチドを含まない。免疫系は、動物界に存在する無数の潜在的に病原性の微生物に対する、迅速で非常に特異的で保護的な反応を引き起こす手段を提供する防御メカニズムである。免疫タンパク質自己ポリペプチド又はペプチドの具体例は、Ｔ細胞受容外、免疫グロブリン、１型インターロイキンを含むサイトカイン、インターフェロン及��ＩＬ−１０を含む２型サイトカイン、ＴＮＦ、リンホトキシン、並びにマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ及びベータ、単球走化性タンパク質及びＲＡＮＴＥＳのようなケモカイン、並びにＦａｓ−リガンドのような免疫機能に直接関与する他の分子を含むタンパク質である。本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドに含まれる、特定の免疫タンパク質自己ポリペプチド又はペプチドがあり、それらは、クラスＩ  ＭＨＣ膜糖タンパク質、クラスＩＩ  ＭＨＣ糖タンパク質及びオステオポンチンである。自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドは、代謝性又は機能障害を引き起こす遺伝的又は後天性の欠損症のために、患者に完全又は実質的に存在しないタンパク質自己ポリペプチド及びペプチドを含まず、前記タンパク質自己ポリペプチド又はペプチドを投与するか、又は前記タンパク質自己ポリペプチド又はペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与するかのいずれかにより置換される（遺伝子治療）。このような障害の具体例には、デュシェーヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症及びホモシスチン尿症が含まれる。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「調節」、「調節する」又は「免疫反応を変化させる」は、自己免疫又はアレルギー誘発性エピトープには、例えば、免疫調節複合体、又は免疫複合体をコードするポリヌクレオチドの投与の結果として生じる、核酸、脂質、リン脂質、炭水化物、自己自己ポリペプチド、タンパク質複合体、又はリボ核タンパク質複合体が含まれる。このような調節には、免疫反応に関与し、又は関与し得る、あらゆる免疫細胞の存在、能力又は機能の任意の変化が含まれる。免疫細胞には、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非プロフェッショナル抗原提示細胞、炎症性細胞、又は免疫反応に関与し、若しくは影響し得る任意の他の細胞が含まれる。「調節」には、存在する免疫反応、発現する免疫反応、潜在的な免疫反応に与えられる、又は免疫反応を誘導し、調節し、影響を及ぼし又は応答する能力の任意の変化が含まれる。調節には、免疫反応の一部として免疫細胞内の遺伝子、タンパク質及び／又は他の分子の発現及び／又は機能における任意の変化が含まれる。
【００６７】
「免疫反応の調節」には、例えば、以下の：免疫細胞の排除、欠失又は隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞又は炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節し得る免疫細胞の生成又は誘発；免疫細胞における反応しない状態の誘発（すなわち、アネルギー）；免疫細胞の活性又は機能、若しくはそのようにする能力（これらの細胞により発現するタンパク質のパターンの変化を含むが、これに限定されない）の増大、低下又は変化が含まれる。具体例には、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、転写因子、キナーゼ、副刺激因子又は他の細胞用面受容体、若しくはこれらの調節事象の任意の組み合わせのような、特定のクラスの分子の産生及び／又は分泌の変化が含まれる。
【００６８】
例えば、免疫調節複合体、又は免疫調節複合体をコードするポリヌクレオチドは、所望でない免疫反応を媒介するか、又は媒介し得る免疫細胞を排除、隔離又は不活性化し；防御免疫反応を媒介するか、又は媒介し得る免疫細胞を誘発、生成又は刺激し；免疫細胞の物理的又は機能特性を変化し；若しくはこれらの効果の組み合わせを実施することにより、免疫反応を調節することができる。免疫反応の調節の測定の具体例には、免疫細胞集団の存在又は非存在の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる）；シグナルに対する反応において増殖又は分裂する能力又は抵抗力を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（抗−ＣＤ３抗体、抗−Ｔ細胞受容体抗体、抗−ＣＤ２８抗体、カルシウムイオノフォア、ＰＭＡ自己ペプチド又はタンパク質抗原に保持した抗原提示細胞；Ｂ細胞増殖アッセイを用いるような）；他の細胞を死滅又は溶解する能力の測定（細胞毒性Ｔ細胞アッセイ等）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体及び他の細胞の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット解析、タンパク質マイクロアレイ解析による）；免疫細胞中の免疫細胞又はシグナル経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、チロシン、セリン又はスレオニンのリン酸化、若しくはポリペプチド開裂のウェスタンブロット及び免疫沈降解析、及びタンパク質複合体の生成・解離；タンパク質アレイ解析；ＤＮＡ転写、ＤＮＡアレイを用いた増殖又はサブトラクティブハイブリダイゼーション）；アポトーシス、壊死又は他のメカニズム（例えば、アネクシンＶ染色、ＴＵＮＥＬアッセイ、ＤＮＡラダーを測定するためのゲル電気泳動、組織学；蛍光性キャスパーゼアッセイ、キャスパーゼ基質のウェスタンブロット解析）による細胞死の測定；遺伝子、タンパク質及び免疫細胞により産生される他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット解析、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、２−次元電気泳動、ウェスタンブロット解析、酵素免疫測定法、フローサイトメトリー）；並びに、例えば、多発性硬化症の場合には、疾病重症度または再発率を測定し（当業者に高知の臨床スコアを用いて）、１型糖尿病の場合には血中グルコースを測定し、リウマチ様関節炎の場合には関節炎症による自己タンパク質又は自己ポリペプチドに関与する自己免疫、神経変性又は他の疾患の改善のような臨床症状又は転帰の測定（臨床スコア追加治療の使用の要求、機能状態、画像研究）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
「患者」は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット又はウサギのような動物を意味する。
【００７０】
疾患又は障害を「治療する」、「治療」又は「治療法」は、免疫調節複合体又は免疫調節複合体をコードするポリヌクレオチドを、単独で又は本明細書に開示される他の化合物と併用して投与することにより、臨床上又は診断上のいずれかの症状の減少、停止又は消失により証明されるように、疾患の進行を遅くし、停止し、又は回復することを意味する。「治療する」、「治療」又は「治療法」は、急性又は慢性の疾患又は障害における症状の重症度の減少、例えば、自己免疫疾患の経過の再発又は寛解の場合に再発率を低下し、自己免疫疾患の症状の場合に炎症を減少させることを意味する。好ましい実施態様においては、疾患の治療は、疾患の進行を回復し、停止し、又は軽減し、理想的には疾患自体を排除する点である。本明細書で用いられる場合、疾患の寛解と疾患の治療とは同等である。
【００７１】
本発明との関連で用いられるように、疾患又は障害を「予防する」、「予防」又は「防止」は、免疫調節複合体又は免疫調節複合体をコードするポリヌクレオチドを、単独で又は本明細書に開示される他の化合物と併用して投与し、疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害の一部又は全ての症状の発生又は発症を防止し、疾患又は障害の発症の可能性を少なくすることを意味する。
【００７２】
免疫調節複合体の「治療的又は予防的有効量」は、例えば、疾患の症状及び／又は原因を改善することにより、疾患を治療又は予防するのに十分な免疫調節複合体の量を意味する。例えば、治療的有効量は広い範囲に含まれ、臨床試験により決定され、特定の患者については、例えば、疾患の重症度、患者の体重、年齢及び他の因子を含む当業者に公知の因子に基づいて決定される。
【００７３】
（図１）
免疫調節複合体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤをコードするＤＮＡ構築物
ｐＣＴＡ１−ＤＤプラスミドは、ｔｒｐプロモータの制御下に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩにクローニングされるコレラ毒素Ａ１遺伝子（ａａ１−１９４）、及びブドウ球菌プロテインＡからの２個のＤフラグメントを含む。ＣＴＡ１及びＤＤフラグメントの間にコラーゲンペプチドを挿入し、ｐＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤを得る。インビトロ突然変異誘発によりＲ７Ｋ変異を構築し、ｐＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを得る。Ｐｔｒ＝ｔｒｐプロモータ。ＣＯＬ＝コラーゲンペプチド、Ｄ＝ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡからのＩｇ−結合成分。
【００７４】
（図２）
ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性
ＣＴ、ＣＴＡ１−ＤＤ及びＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を、［Ｕ−１４Ｃ］アデニンの取り込みによるＡＤＰリボシルアグマチンの生成についてアッセイした。値は平均ｃｐｍを表す。
【００７５】
（図３）
ＩｇＧ結合
固相上において、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤのヒトＩｇＧ１に結合する能力をＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち、９６ウェルのプレートを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬで、室温で一晩コーティングし、次いで、洗浄し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。連続希釈したＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを、対応するサブウェル内でインキュベートした。２時間後、ウェルを広範囲に洗浄し、１／１００に希釈した、ホスファターゼ標識したウサギ抗−マウスＩｇＧを各ウェルに加えた。基質を加え、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤのヒトＩｇＧ１への結合を酵素反応により検出し、分光光度計を用いて４５０ｎｍにおけるＯＤとして評価した。
【００７６】
（図４）
不活性又は活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内投与
ＤＢＡ／１マウスに、５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを鼻腔内投与した。コントロールのマウスにはＰＢＳを投与した。１週間後、腹腔注射によりＲｉｂｉ−アジュバント中のコラーゲンタンパク質を全てのマウスに抗原投与した。鼻腔内投与の１６日後にマウスを犠牲にし、インビトロにおけるリコール抗原に対して反応するコラーゲン特異的Ｔ細胞のレベルを評価した。培養７２時間後の増殖を評価し、ウェルあたりの組み込まれた［３Ｈ］ＴｃＲの取り込みのレベルとして測定した。データを、平均ｃ．ｐ．ｍ±ＳＤとして表した。グループあたり５頭のマウスを用いた３回の実験からの代表的な結果。
【００７７】
（図５）
不活性及び活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内投与
ＤＢＡ／１マウスに、５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを鼻腔内投与した。コントロールのマウスにはＰＢＳを投与した。１週間後、腹腔注射によりＲｉｂｉ−アジュバント中のコラーゲンを全てのマウスに抗原投与し、次いで、更に８日後、リコール抗原に対するコラーゲン特異的Ｔ細胞のレベルをインビトロで評価した。培養上清中の９６時間刺激した細胞からのサイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生を測定し、未処理のマウスからの細胞を用いた培養物からのバックグラウンドレベルを上回る、ｎｇ／ｍＬ±ＳＤで表した平均のサイトカイン濃度として表した。グループあたり５頭のマウスを用いた３回の実験からの代表的な結果。
【００７８】
（図６）
流入領域リンパ節における局所寛容の誘発
ＤＢＡ／１受容体に、ＰＢＳ、又は５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ若しくはＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを投与した。１週間後、腹腔注射により、Ｒｉｂｉ−アジュバント中のコラーゲンを用いて全てのマウスを免疫した。鼻腔内投与の１６日後にマウスを犠牲にし、頸部リンパ節中のＴ細胞増殖を測定した。培養７２時間に増殖反応を記録し、［３Ｈ］ＴｃＲの取り込みにより評価し、ｃ．ｐ．ｍ±ＳＤとして与えた。グループあたり５頭のマウスを用いた３回の実験の１つの代表的な実験。
【００７９】
（図７）
抗−ＩＩ型コラーゲン抗体産生の阻害
ＤＢＡ／１受容体に、ＰＢＳ、又は５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ若しくはＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを投与した。１週間後、腹腔注射により、Ｒｉｂｉ−アジュバント中のコラーゲンを用いて全てのマウスに抗原投与した。コラーゲン特異的な全ＩｇＧ及びＩｇＡの力価をＥＬＩＳＡにより測定した。Ａ）ＩｇＡの力価。Ｂ）ＩｇＧの力価。結果は、グループあたり５頭の動物を用いた３回の実験の代表例であり、値は、ｌｏｇ１０の力価±ｓ．ｅ．ｍとして表わす。
【００８０】
（図８）
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを用いた粘膜処理
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の誘導のために、完全フロイントアジュバントで乳化したラットＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）をマウスの尾に注射した。２１日後、不完全フロイントアジュバントで乳化したＣＩＩを、関節内の疾患を誘発するための追加免疫として尾に注射した。マウスを、予防的並びに治療的に鼻腔内処理し、関節組織障害及び破壊の程度を記録し、以下の疾患の誘発を４２日目に評価した。コラーゲン免疫の前後に３日間連続し、マウスをＰＢＳ、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで鼻腔内処理した。Ａ）経時的な関節炎の頻度。Ｂ）４５日における関節炎の頻度。Ｃ）４５日目における関節炎スコア。
【００８１】
（図９）
組織学的レベルでの関節におけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの影響
ＣＩＡコントロール（Ａ）（ＰＢＳ）及びＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（Ｂ）処理したマウスの関節を除去し、ホルマリン中に固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＣＩＡ関節の１つの低い出力及び１つの高い出力のイメージが示され、細胞の浸潤及び軟骨／骨の破壊が明らかに見える。
【００８２】
（図１０）
ＤＢＡ／１マウスの粘膜ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理後の組織学的変化
ＣＩＡコントロール（Ａ）（ＰＢＳ）及びＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（Ｂ）処理したマウス。関節を除去し、ホルマリン中に固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織学的顕微鏡写真は、２人の別々の研究者により知らない状態で記録され、平均的なグレードの結果が得られる。
【００８３】
（図１１）
ＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理したＣＩＡマウスにおけるＩＬ−１０の大いな増大及びＩＬ−６産生の減少
未処理（ＰＢＳ）（白色四角）ＣＩＡマウスあるいは５μｇのＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＤＤ（灰色四角）又はＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（黒色四角）で処理されたマウスを犠牲にして血清を集め、ＩＬ−１０（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の濃度について分析した。サイトカインレベルは、グループあたり１０〜１２頭のマウスの平均ｐｇ／ｍＬ±ＳＤで表した。これは、同じ結果を与える２つの実験の代表の１つである。Ｐ−値は、未処理コントロールＣＩＡマウスにおける結果と有意に匹敵することを示す。
【００８４】
（図１２）
制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０に対する、ＣＩＩ−特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答の歪み（ｓｋｅｗｉｎｇ）
未処理（ＰＢＳ）（白色四角）ＣＩＡマウス、５μｇのＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＤＤ（灰色四角）又はＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ（黒色四角）で処理されたマウスから、膵臓リンパ球を分離し、リコールＣＯＬ自己ペプチドの存在下又は非存在下、インビトロで活性化した。９６時間後に上清を集め、ＩＬ−１０（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の含有量について分析した。値は、各実験において、１０〜１２頭のマウスのグループについて、平均ｐｇ／ｍＬ±ＳＤとして表わす。結果は、同じ結果を与える、２つの独立の実験の平均である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】免疫調節複合体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤをコードするＤＮＡ構築物
【図２】ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性
【図３】ＩｇＧ結合
【図４】不活性又は活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内投与
【図５】不活性及び活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内投与
【図６】流入領域リンパ節における局所寛容の誘発
【図７】抗−ＩＩ型コラーゲン抗体産生の阻害
【図８】ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを用いた粘膜処理
【図９】組織学的レベルでの関節におけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの影響
【図１０】組織学的レベルでの関節におけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの影響
【図１１】ＣＴＡ１Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理したＣＩＡマウスにおけるＩＬ−１０の大いな増大及びＩＬ−６産生の減少
【図１２】制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０に対する、ＣＩＩ−特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答の歪み（ｓｋｅｗｉｎｇ）
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明は、患者内に存在し、非生理学的状態に関与する１種以上の自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドと関連する疾患の、患者内での予防、防止及び／又は治療のための方法及び組成物に関する。本発明は、特に、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病のような、非生理学的状態における患者内に存在する１種以上の自己ポリペプチドと関連する自己免疫疾患の予防、防止及び／又は治療のための方法及び組成物に関する。本発明は、前記疾患と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節複合体を患者に投与することを含む、自己免疫疾患の改善された予防、防止及び／又は治療方法を提供する。１種以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節複合体の治療的又は予防的有効量の患者への投与は、自己免疫疾患と関連する自己抗原に対する免疫反応の抑制を誘発し、その結果、前記疾患の治療を誘発する。
【００８７】
自己免疫疾患
自己抗原と関連する自己免疫疾患の具体例を表１に示し、特定の具体例を本明細書において以下に更に詳細に説明する。
具体的な自己免疫疾患及び関連自己抗原
【００８８】
【表１】
2011507511.tif 000002
【００８９】
リウマチ様関節炎
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、世界の人口の０．８％に影響を及ぼす、慢性の自己免疫性滑膜炎である。リウマチ様関節炎は、浸食性の破壊を起こす慢性の炎症性滑膜炎によって特徴づけられる。ＲＡは、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージにより介在される。
【００９０】
Ｔ細胞がＲＡにおいて重大な役割を担っているという証拠には、（１）滑膜に浸透するＣＤ４＋Ｔ細胞の支配、（２）シクロスポリンのような薬剤を用いて機能するＴ細胞の抑制と関連する臨床改善、及び（３）特定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子とＲＡとの関連性が含まれる。ＲＡと関連するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は自己ペプチド結合及びＴ細胞への提示に関与する、β鎖の第三の超可変領域内の６７〜７４位と同じアミノ酸配列を含む。ＲＡは、自己タンパク質又は修飾自己タンパク質を認識し、滑膜関節内に存在する自己反応性Ｔ細胞により介在される。ＲＡにおいて標的とされる自己抗原には、例えば、ＩＩ型コラーゲン由来のエピトープ；ｈｎＲＮＰ；Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン、ケラチン、シトルリン；ｇｐ３９を含む軟骨タンパク質、Ｉ５、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＩｇＭ（リウマチ因子）；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；カルジオリピン；アルドラーゼＡ；シトルリン−修飾フィラグリン及びフィブリンが含まれる。修飾アルギニン残基を含むフィラグリンペプチドを認識する自己抗体（脱イミン化してシトルリンを生成）は、高比率のＲＡ患者の血清内で特定された。自己反応性Ｔ及びＢ細胞応答は、いずれも複数の患者において、同じ免疫優勢ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）ペプチド２５７−２７０に対して配向する。
【００９１】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、最も一般的なＣＮＳの脱髄性疾患であり、３５０，０００人のアメリカ人及び世界の百万人の人に影響を及ぼしている。症状の発症は、通常２０〜４０歳で発生し、片側の視力障害、筋力低下、知覚異常、運動失調、めまい、尿失禁、構音障害又は精神障害（頻度の減少する順に）の急性又は亜急性の発作として現れる。これらの症状は、遅い軸索伝導によるネガティブな伝導異常性、及び異所性刺激の生成によるポジティブな伝導異常性（例えば、レルミット症候群）の両方を起こす脱髄の局所性病変に由来する。ＭＳの診断は、時間により異なり、神経機能障害の客観的な臨床上の証拠をもたらし、ＣＮＳ白質の別個の領域に関与する、神経機能障害の少なくとも２種の異なる発作を含む病歴を基準とする。研究室の研究は、ＣＮＳ白質損傷の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、ＩｇＧのオリゴクローナルな結合、及び異常な誘発応答を含む、ＭＳの診断を指示する、追加の客観的証拠を提供する。多くの患者は、徐々に進行する再発寛解型の疾患の経過を経験するが、ＭＳの臨床経過は個人の間で非常に変化し、劇症の慢性の進行性疾患に対して生涯にわたり、さまざまな穏やかないくつかの発作に限定される範囲であり得る。ＩＦＮ−ガンマを分泌する能力を備えるミエリン−自己反応性Ｔ細胞の定量的増加は、ＭＳ及びＥＡＦの原因と関連する。
【００９２】
多発性硬化症及び実験的自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫脱髄疾患自己免疫反応の自己抗原標的は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）；サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）；ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）５及びミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＢＯＰ）；アルファ−Ｂ−クリスタリン（熱ショックタンパク質）；ウイルス及び細菌、例えば、インフルエンザ、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等の模倣ペプチド；ＯＳＰ（オリゴデンドロサイト特異的タンパク質）；シトルリン修飾ＭＢＰ（６個のアルギニンがシトルリンに脱イミノ化されている、ＭＢＰのＣ８イソ型）等を含んでいてもよい。内在性膜タンパク質ＰＬＰは、ミエリンの優性な自己抗原である。ＰＬＰの抗原性の抗原決定基はいくつかのマウスの株において確認され、残基１３９４５１、１０３−１１６、２１５−２３２、４３−６４及び１７８−１９１を含む。少なくとも２６種のＭＢＰエピトープが報告されている（Ｍｅｉｎｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２，  ２６３３−４３，１９９３）。注目に値すべきは、残基１−１１、５９−７６及び８７−９９である。いくつかのマウスで確認された免疫優性ＭＯＧエピトープは、残基１−２２、３５−５５、６４−９６を含む。
【００９３】
ヒトのＭＳ患者においては、以下のミエリンタンパク質及びエピトープが、自己免疫Ｔ及びＢ細胞反応の標的として特定された。ＭＳの脳プラークから溶出する抗体は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド８３−９７を認識した（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１１１４−１１２２，１９９７）。他の研究は、ＭＳ患者の約５０％がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞の反応性を（６〜１０％コントロール）、２０％がＭＢＰに対する反応性を（８〜１２％コントロール）；８％がＰＬＰに対する反応性を（０％コントロール）、０％がＭＡＧに対する反応する（０％コントロール）ことを見出した。この研究においては、１０名のＭＯＧ反応性患者のうち７名が、ＭＯＧ１−２２、ＭＯＧ３４−５６、ＭＯＧ６４−９６を含む３種のペプチドエピトープのうちの１種に焦点を合わせたＴ細胞増殖反応を有していた（Ｋｅｒｌｅｒｏ  ｄｅ  Ｒｏｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：３０５９−６９，１９９７）。Ｔ及びＢ細胞（脳障害溶出Ａｂ）は、ＭＢＰ８７−９９に焦点を合わせて反応する（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：６８−７０，１９９３）。ＭＢＰ８７−９９においては、アミノ酸モチーフＨＦＦＫが、Ｔ及びＢ細胞両方の反応の主要な標的である（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１１１４−２２，１９９７）。他の研究は、残基ＭＯＢＰ２１−３９及びＭＯＢＰ３７−６０を含む、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）に対するリンパ球反応を観察した（Ｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１１０３−９，２０００）。
ＭＳを染色し、脳を制御するためのＭＯＧ及びＭＢＰペプチドの免疫金複合体を用いて、ＭＢＰ及びＭＯＧの両ペプチドは、ＭＳプラーク結合Ａｂｓにより認識された（Ｇｅｎａｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：４２０−３４，１９９６）。
【００９４】
インシュリン依存性糖尿病
ヒトＩ型又はインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、ランゲルハンス細胞の膵臓組織内のβ細胞の自己免疫破壊により特徴づけられる。β細胞の消耗は、血中グルコースレベルを制御の不能をもたらす。顕性糖尿病は、血中グルコース濃度が特定のレベル、通常は約２５０ｍｇ／ｄＬを超えて上昇した場合に発生する。ヒトにおいては、長い発症前期間が糖尿病の発症に先行する。この期間に、膵臓ベータ細胞機能が徐々に失われる。疾患の発生は、インシュリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ及びチロシンホスファターゼＩＡ２（ＩＡ２）に対する自己抗体の存在と関連している。
【００９５】
発症前状態の間に評価され得るマーカーは、膵臓中の膵島炎の存在、島細胞抗体のレベル及び頻度、島細胞表面抗体、膵臓ベータ細胞上のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の異常な発現、血中グルコース濃度及びインシュリンの血漿濃度である。膵臓中のＴリンパ球数、島細胞抗体の増加及び血中グルコースの上昇は、インシュリン濃度の低下のように、前記疾患を示す。
【００９６】
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、ヒトＩＤＤＭと同様に、多くの臨床的、免疫学的及び組織病理的特徴を備える動物モデルである。ＮＯＤマウスは、島の炎症及びベータ細胞の破壊を自然に発生し、高血糖及び顕性糖尿病を誘発する。糖尿病が発症するにはＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が必要であるが、それぞれの役割は不明瞭なままである。ＮＯＤマウスを寛容化する条件下における、タンパク質としてインシュリン又はＧＡＤ５の投与は疾患を予防し、他の自己抗原に対する応答を下方制御する。
【００９７】
血清中で種々の特異性を有する自己抗体との組み合わせの存在は非常に感受性であり、ヒトのＩ型糖尿病に特異的である。例えば、ＧＡＤ及び／又はＩＡ−２に対する抗体の存在は、コントロール血清由来のＩ型糖尿病を特定するのに９８％感受性であり、制御された血清からのＩ型糖尿病の特定に９９％特異的である。糖尿病でない、１型糖尿病患者の一等親血縁者においては、ＧＡＤ、インシュリン及びＩＡ−２を含む３種の自己抗原のうちの２種についての抗体特異性の存在は、５年以内のＩＤＭの発現について９０％を超える陽性予測値を示唆する。
【００９８】
ヒトにおいてインシュリン依存性糖尿病を標的とする抗原には、例えば、チロシンホスファターゼＩＡ−２；ＩＡ−２［ベータ］；６５ｋＤａ及び６７ｋＤａの両方の形態のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）；カルボキシペプチダーゼＨ；インシュリン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）；グリマ３８；島細胞抗原６９ＫＤａ（ＩＣＡ６９）；ｐ５２；２種のガングリオシド抗原（ＧＴ３及びＧＭ２−１）；島細胞特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）；及び島細胞グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）が含まれる。
【００９９】
ヒトＩＤＤＭは、現在、組換え型インシュリンのガイドインジェクション又はポンプをベースとする送達に対する血中グルコース濃度を観察することによって処理されている。適切な血中グルコース制御を達成するために食事及び運動療法が寄与する。
【０１００】
自己免疫性ブドウ膜炎
自己免疫性ブドウ膜炎は、米国において４００，０００人の人々が影響され、１年に４３，０００人の新規なケースが発生すると推定される目のＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。自己免疫性ブドウ膜炎は、現在、ステロイド、メトトレキサート及びシクロスポリンのような免疫抑制剤、静脈への免疫グロブリン及びＴＮＦα−アンタゴニストで治療されている。
【０１０１】
実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、神経網膜、ブドウ膜及び目の中の関連組織を標的とする疾患である。ＥＡＵは、ヒトの自己免疫性ブドウ膜炎と、多くの臨床的及び免疫学的特徴を共有し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化したブドウ膜炎誘発性ペプチドの末梢投与により誘発される。
【０１０２】
ヒトの自己免疫性ブドウ膜炎における自己免疫反応に標的とされる自己抗原には、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、ロドプシン及びレコベリンが含まれる。
【０１０３】
原発性胆汁性肝硬変
原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、主に４０〜６０歳の女性に影響を及ぼす、器官特異的自己免疫疾患である。このグループ内の患者数は１，０００人あたり１人と報告されている。ＰＢＣは、小さい肝内胆管の内側を覆う肝内胆管上皮細胞（ＩＢＥＣ）の進行性破壊により特徴づけられる。これは、閉塞及び胆汁の分泌の障害を誘発し、最終的に肝硬変を起こす。上皮細胞ライニング／分泌系の損傷により特徴づけられる、シェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、自己免疫性甲状腺疾患及びリウマチ様関節炎を含む他の自己免疫疾患との関連が報告されている。機動性抗原（ｄｒｉｖｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ）に関する注意は、５０年の間、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）の発見を誘導する、ミトコンドリアに集中している（Ｇｅｒｓｈｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １７４：２１０−２２５，２０００；Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １７４：２２６−２３７，２０００）。臨床症状が出現するよりずっと前から９０〜９５％の患者の血清中に存在するＡＭＡは、すぐにＰＢＣの実験室診断の基礎になった。ミトコンドリアにおける自己抗原反応性はＭ１及びＭ２と命名された。Ｍ２反応性は、４８〜７４ｋＤａの成分のファミリーに関する。Ｍ２は２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体（２−ＯＡＤＣ）の酵素の複数の自己抗原サブユニットを表し、本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド又は自己ペプチドの他の具体例である。ＰＢＣの原因病理論におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）複合体の役割を特定する研究は、ＰＤＣが疾患の誘発において中心的役割を演じることを支持する。ＰＢＣの９５％の場合における最も多い反応性は、ＰＤＣ−Ｅ２に属するＥ２  ７４ｋＤａサブユニットである。２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ複合体（ＯＧＤＣ）及び分岐鎖（ＢＣ）２−ＯＡＤＣを含む、関連するが異なる複合体が存在する。３種の構成要素の酵素（Ｅ１，２，３）は、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を伴い、２−オキソ酸基質をアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）に変換する触媒機能に寄与する。哺乳類のＰＤＣは、プロテインＸ又はＥ−３結合タンパク質：（Ｅ３ＢＰ）と呼ばれる追加成分を含む。ＰＢＣの患者においては、主要な抗原反応は、ＰＤＣ−Ｅ２及びＥ３ＢＰに関する。Ｅ２ポリペプチドは、２個の縦列反復リポイルドメインを含むが、Ｅ３ＢＰは、１個のリポイルドメインを含む。リポイルドメインは、ＰＢＣの複数の自己抗原標的内に見いだされ、本明細書において、「ＰＢＣリポイルドメイン」と呼ばれる。ＰＢＣは、グルココルチコイド、並びにメトトレキサート及びシクロスポリンＡを含む免疫抑制剤と処理される。
【０１０４】
シェーグレン症候群
シェーグレン症候群（ＳＳ）は、主として唾液腺及び涙腺に影響を及ぼし、ドライアイ（乾性角結膜炎）及び口渇（口内乾燥）を誘発する慢性自己免疫疾患である。関与するかもしれない他の器官には、気管支樹、腎臓、肝臓、血管、末梢神経及び膵臓が含まれる。特に興味のあるものは、ＳＳの二重表示：４０代及び５０代の女性における原発性疾患として単独（原発性ＳＳ）、又は他の自己免疫疾患との関連（続発性ＳＳ）のいずれかであり：分泌腺（乾燥症状）及び全身性（腺外）の臨床症状が存在し得る。ＳＳの特徴は、リウマチ因子、抗核及び沈降抗体の存在である。細胞質／核リボ核タンパク質粒子（Ｒｏ／ＳＳＡ及びＬａ／ＳＳＢ）は、ＳＳの自己免疫反応において顕著な役割を有する。免疫蛍光によりポジティブな核パターンに関与する他の抗原には、以下の：Ｋｕ、ＮＯＲ−９０（核小体形成部位）、ｐ−８０コイリン、ＨＭＧ−１７（高移動度群）、Ｋｉ／ＳＬが含まれる。更に、抗チログロブリン、抗赤血球及び抗唾液腺上皮抗体を含む、器官特異的自己抗体も認識される（Ｃｌｉｏら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２３：４６−５７，２００における総説）。１２０ｋＤの器官特異的自己抗原が、細胞骨格タンパク質α−フォドリンとして特定されている（Ｈａｎｅｊｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：６０４−６０７，１９９７）。ＨＳＰ６０は、ＳＳに関与することが示唆されている他の自己抗原である。ＨＳＰ６０又はＨＳＰ６０に由来するペプチド（アミノ酸残基４３７−４６０）が、ＳＳの動物モデルにおいてＳＳ−関連組織病理的特徴を減少することがわかった（Ｄａｌａｌｅｕ  εｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５８：２３１８−２３２８，２００８）。主要な標的抗原Ｒｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢ及び関連する抗体は分子レベルで広範囲に定義されている。Ｓｏ／ＳＳＡは、小さい細胞質ＲＮＡを含むリボ核タンパク質である。Ｒｏ／ＳＳＡ抗原、６０ｋＤタンパク質（６０ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ、Ｒｏ６０）は、いくつかの小さい細胞質ＲＮＡ分子の１種と結合する。５２ｋＤペプチドは、Ｒｏ／ＳＳＡ抗原（５２ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ；Ｒｏ５２）のもう一方の成分である。Ｌａ／ＳＳＢ抗原は、４０８個のアミノ酸からなるポリペプチドからなる。６０ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ及びＬａ／ＳＳＢタンパク質は、いずれもＲＮＡ認識モチーフ（ＲＮＰ）として知られている８０個のアミノ酸配列を含むＲＮＡ結合タンパク質のファミリーのメンバーである。いくつかの方法を用いる、６０ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ、５２ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ及びＬａ／ＳＳＢ分子のＢ細胞エピトープマッピングは、いくつかの研究において特定のエピトープを示す。６０ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡ自己抗原のＢ細胞エピトープは、分子の中央部及びカルボキシ末端部分に位置すると思われる。２種の特異的エピトープ：ＴＫＹＫＱＲＮＧＷＳＨＫＤＬＬＲＳＨＬＫＰ（１６９−１９０）及びＥＬＹＫＥＫＡＬＳＶＥＴＥＫＬＬＫＹＬＥＡＶ（２１１−２３２）領域が特定された（Ｒｏｕｔｓｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２６：５１４−５２１，１９９６）。５２ｋＤ  Ｒｏ／ＳＳＡタンパク質の抗原決定基は、分子の中心部では主として線状である。４種��ペプチド（アミノ酸２−１１、１０７−１２６、２７７−２９２及び３６５−３８２）が、抗Ｒｏ／ＳＳＡ血清により認識されることが報告された（Ｒｉｃｃｈｉｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９５：３９７−４０７，１９９４）。精製ＩｇＧとの反応性に富む４種のペプチドが、Ｌａ／ＳＳＢタンパク質の１４５−１６４、２８９−３０８、３０１−３２０及び３４９−３６８の領域にわたることが報告された（Ｔｚｉｏｕｆａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０８：１９１−１９８，１９９７）。
【０１０５】
他の自己免疫疾患及び関連自己抗原
重症筋無力症についての自己抗原には、アセチルコリン受容体中のエピトープが含まれる。尋常性天疱瘡において標的とされる自己抗原には、デスモグレイン−３が含まれる。尋常性天疱瘡についての主要な自己抗原にはデスモグレイン−３が含まれる。筋肉炎のパネリストには、ｔＲＮＡシンテターゼ（例えば、スレオニル、ヒスチジル、アラニル、イソロイシル及びグリシル）；Ｋｕ；ＳｃＩ；ＳＳＡ；Ｕ１  Ｓｎリボ核タンパク質；Ｍｉ−Ｉ；Ｍｉ−Ｉ；Ｊｏ−Ｉ；Ｋｕ；及びＳＲＰが含まれる。強皮症のパネリストには、Ｓｃｌ−７０；セントロメア；Ｕ１リボ核タンパク質；及びフィブリラリンが含まれる。悪性貧血のパネリストには、内因子；胃のＨ／Ｋ  ＡＴＰアーゼの糖タンパク質ベータサブユニットが含まれる。全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）のエピトープ抗原には、ＤＮＡ；リン脂質；核抗原；Ｒｏ；Ｌａ；Ｕ１リボタンパク質；Ｒｏ６０（ＳＳ−Ａ）；Ｒｏ５２（ＳＳ−Ａ）；Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）；カルレティキュリン；Ｇｒｐ７８；Ｓｃｌ−７０；ヒストン；Ｓｍタンパク質；及びクロマチン等が含まれる。グレーブス病については、エピトープには、Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体；甲状腺刺激ホルモン受容体；Ｔｇ；及びＴＰＯが含まれる。
【０１０６】
移植片対宿主病
ヒトにおける組織及び器官移植の大いな限定は、受容体の免疫系による組織移植の拒絶である。供与者及び受容者の間のＭＨＣクラスＩ及びＩＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲ）対立遺伝子の一致が大きければ大きいほど移植片がより残存する。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、同種造血細胞を含む移植片を受け取る患者における有意な罹患率及び死亡率を引き起こす。造血細胞は、骨髄移植片、幹細胞片及び他の移植片中に存在する。ＨＬＡ適合同胞種からの移植片を受け取った患者の約５０％は、中程度から重度のＧＶＨＤを発症し、非ＨＬＡ適合移植片よりも頻度は高い。中程度から重症のＧＶＨＤを発症した患者の３分の１は結果として死亡する。供与者の移植片中のＴリンパ球及び他の免疫細胞は、そのアミノ酸配列に変異、特に、ヒトの第６染色体上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）内にコードされるタンパク質における変異を有するポリペプチドを発現する受容者の細胞を攻撃する。同種造血細胞を必要とする移植片内のＧＶＨＤの最も影響力のあるタンパク質は、高度に重合した（ヒトの間における広範囲なアミノ酸変異）クラスＩタンパク質（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ）及びクラスＩＩタンパク質（ＤＲＢ１、ＤＱＢ１及びＤＰＢ１）である（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，３８５−３８９，２００１）。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子が、供与者及び受容者の間で血清学的に適合する場合であっても、ＤＮＡ配列は、適合する供与者及び受容者対においてさえ、クラス−Ｉを標的とするＧＶＨＤについての基礎を供給するクラスの３０％において対立遺伝子レベルで不一致があることを示す。少量の組織適合性自己抗原ＧＶＨＤは、しばしば、皮膚、腸、肝臓、肺及び膵臓に損傷を起こす。ＧＶＨＤは、グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキサート、フルダラビン及びＯＫＴ３により処理される。
【０１０７】
組織移植拒絶反応
肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、並びにその他の器官及び組織を含む組織移植の免疫拒絶反応は、移植した器官に対する移植片受容者における免疫反応により媒介される。同種の移植された器官は、移植受容者のアミノ酸配列と比較した場合に、そのアミノ酸配列中に変異を有するタンパク質を含む。移植された器官のアミノ酸配列は、移植された受容者のものと異なるので、移植された器官に対して受容者内で、しばしば免疫反応を誘発する。
移植された器官の拒絶反応は主要な合併症並びに組織移植の限界であり、受容者における器官の移植の失敗を引き起こし得る。拒絶反応から起こる慢性的な炎症は、しばしば移植された組織内の機能障害を誘発する。移植片受容者は、現在では、拒絶反応を予防及び抑制するための種々の免疫抑制剤で処理されている。これらの薬剤には、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ、セルセプト、ＦＫ−５０６及びＯＫＴ３が含まれる。
【０１０８】
治療のための組成物及び方法
本発明は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連する１種以上のエピトープを含む免疫調節複合体を含む、前記疾患の治療、予防及び／又は防止のための改善された方法及び組成物を提供する。本発明の免疫調節複合体は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患と関連する１種以上のエピトープを含む、前記疾患と関連する１種以上のエピトープを含む免疫調節複合体の投与を含む。
【０１０９】
特定の実施態様においては、本発明は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節複合体を患者に投与することを含む、ＩＤＤＭの治療、予防及び／又は防止のための改善された方法を提供する。
【０１１０】
ＩＤＤＭを治療又は予防するために投与される免疫調節複合体には、１種以上の自己タンパク質、例えば、プレプロインシュリン、プロインシュリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）−６５及び−６７；チロシンホスファターゼＩＡ−２；島細胞特異的グルコース−６−ホスファターゼ関連タンパク質（ＩＧＲＰ）；及び／又は島細胞抗原６９ｋＤに由来する自己抗原エピトープが含まれる。また、ＩＤＤＭを治療又は予防するために投与される免疫調節複合体には、同一又は異なる自己タンパク質、自己ポリペプチド、又は自己ペプチドに由来する複数の自己抗原エピトープが含まれる。好ましい実施態様においては、ＩＤＤＭを治療又は予防するために投与される免疫調節複合体には、自己ポリペプチド、プリプロインシュリン又はプロインシュリンに由来する自己免疫エピトープが含まれる。
【０１１１】
他の実施態様においては、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む免疫調節複合体を患者に投与することを含む、ＭＳの治療、予防及び／又は防止のための改善された方法を提供する。ＭＳを治療するために投与される免疫調節複合体には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）５ミエリン−関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及び／又はミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）を含むが、これらに限定されない１種以上の自己ポリペプチドに由来する自己抗原エピトープが含まれる。また、免疫調節複合体は、前記疾患と関連する、同一又は異なる自己タンパク質、自己ポリペプチド、又は自己ペプチドに由来する複数の自己抗原エピトープを含む。
【０１１２】
他の実施態様においては、本発明は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）と関連する１種以上の自己抗原エピトープを含む本発明の免疫調節複合体を患者に投与することを含む、ＲＡの治療、予防及び／又は防止のための改善された方法を提供する。ある実施態様においては、自己抗原エピトープは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲン、ＧＰ−３９、フィラグリン及びフィブリンからなる群から由来するエピトープである。好ましい一実施態様においては、エピトープは、ＩＩ型コラーゲンに由来し、好ましくは、エピトープはアミノ酸２６０−２７３を含む共有の免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０−２７３）である。
【０１１３】
また、異なる自己ポリペプチドに由来する自己抗原エピトープを含む、複数の免疫調節複合体を投与してもよい。
【０１１４】
更に他の実施態様においては、本発明は、本発明の免疫調節複合体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む核酸配列、並びにこのような核酸配列を含むプラスミド、ベクター及び発現系を提供する。
【０１１５】
本発明の免疫調節複合体は、組換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【０１１６】
プラスミド、ベクター及び発現系を構築するための技術は当該技術分野において周知であり、当業者は、特定の条件及び方法を開示する標準的な供給源材料を熟知している。
【０１１７】
本発明のプラスミド、ベクター及び発現系は、当該技術分野において周知である標準的な核酸連結及び制限技術を使用する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．２００１を参照されたい）。分離したプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断、調製及び分類される。ＤＮＡ構築物の配列は、例えば、ＤＮＡ配列分析の標準的方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３−５４６７を参照されたい）を用いて確認することができる。
【０１１８】
特定の核酸分子を分離するための更に他の好都合な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５５：３３５−３５０，１９８７）又は逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。特定の核酸配列は、ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡから分離することができる。ＲＮＡは、例えば、当業者に公知の技術により、細胞、組織又は全有機体から分離することができる。次いで、ポリ−ｄＴ又はランダムな６量体プライマー、デオキシヌクレオチド及び安定な逆転写酵素を用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。次いで、ＰＣＲにより、生成したｃＤＮＡから所望のポリヌクレオチドを増幅することができる。また、興味のあるポリヌクレオチドを、適切なｃＤＮＡライブラリーから容易に増幅することができる。興味のあるポリヌクレオチド配列の５’及び３’の両末端とハイブリダイズするプライマーを合成し、ＰＣＲのために用いる。プライマーは、同様に制限消化したプラスミドベクター内への増幅配列の容易な消化及び連結のために、５’末端に特定の制限酵素部位を含んでいてもよい。
【０１１９】
免疫調節複合体の送達
免疫調節複合体の治療的及び予防的有効量は、約１μｇ〜約１０ｍｇの範囲である。免疫調節複合体の好ましい治療的又は予防的有効量は、約５μｇ〜約１ｍｇの範囲である。免疫調節複合体の最も好ましい治療的有効量は約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。特定の実施態様においては、免疫調節複合体は、１ヶ月に１回、６〜１２ヶ月間、また、維持投与として３〜１２ヶ月毎に投与する。他の治療計画が開発され、毎日から週１回、１ヶ月に１回〜年に１回の範囲であり、疾患の重症度、患者の年齢、通常に訓練された医師により考慮されるような他の因子に依存し、免疫調節複合体が投与される。
【０１２０】
一実施態様においては、免疫調節複合体は鼻腔内に送達される。他の変形においては、免疫調節複合体は、経口、舌下、皮下、経皮、皮内、静脈、粘膜又は筋肉内に送達される。
【０１２１】
製剤
免疫調節複合体は、他の物質、例えば、薬物、アジュバント、サイトカイン又は免疫促進複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と併用して投与することができる。
【０１２２】
実施例
以下の実施例は、本発明を実施するための特定の実施態様である。実施例は説明の目的のためにのみ提供され、多少なりとも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例１】
【０１２３】
免疫調節複合体ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ
ＣＴＡ１−ＤＤ変異体の構築、融合タンパク質の発現及び精製は、基本的にÅｇｒｅｎ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，１６２：２４３２−２４４０）に開示されたようにして実施した。
【０１２４】
ｐＣＴＡ１−ＤＤプラスミドは、ｔｒｐプロモータの制御下に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩにクローニングされたコレラ毒素Ａ１遺伝子（ａａ１−１９４）、及びブドウ球菌プロテインＡからの２本のＤ断片をコードするＤＮＡを含む。コラーゲンペプチド、共有の免疫優性ＩＩ型コラーゲンペプチド（ＣＩＩ２６０−２７３）をコードするＤＮＡを、ＣＴＡ１及びＤＤ部分をコードするＤＮＡの間に挿入し、ｐＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤプラスミドを得た（図１）。
【実施例２】
【０１２５】
ＡＤＰリボシル化活性
分子設計における変化がＣＴＡ１の酵素活性についての機能的結果を有するかどうかを調べた。無細胞ＮＡＤ：アグマチン−アッセイを用いて、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を分析した。ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤの線形容量応答活性が見られた。一方、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを用いて、ＡＤＰ−リボシル化活性が見られた（図２）。これらの結果は、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤがその酵素活性を失っていることを明白に証明する。
【実施例３】
【０１２６】
ＩｇＧへの結合
ＩｇＧの結合はＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ変異体は
固相においてヒトＩｇＧへの結合能力を保持しており、これはＤＤ−成分がＣＴＡ１内の変異により影響を受けないことを示す（図３）。
【実施例４】
【０１２７】
不活性又は活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤアジュバントを用いた鼻腔内投与
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ変異体は、インビボにおけるＴ細胞寛容を促進するために用いられた。ＤＢＡ／１マウスに、５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを鼻腔内投与した。コントロールのマウスにはＰＢＳを投与した。１週間後、全てのマウスに、Ｒｉｂｉアジュバント内のコラーゲンタンパク質を腹腔内に抗原投与した。鼻腔内投与の１６日後にマウスを犠牲にし、インビトロにおけるリコール抗原に対するコラーゲン特異的Ｔ細胞応答のレベルを評価した。インビトロでのペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞リコール反応を調べた。脾臓から細胞を分離し、ＣＯＬ又は全コラーゲンタンパク質に対するＴ細胞増殖反応に供する。コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対するＴ細胞の増殖反応が、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理マウスの脾臓から分離した細胞内においては、未処理（ＰＢＳ）のコントロールマウスからの細胞内と比較して有意に低いことがわかった（図４）。一方、酵素的に活性なＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ融合タンパク質は、インビトロにおけるリコール抗原暴露に対する増強した増殖反応から明らかなようにＴ細胞プライミングの強い増強を誘発する（図４）。鼻腔内投与に続き、酵素的に不活性な構築物は、インビボにおけるＴ細胞応答の障害を一貫して証明する。ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの投与に対する副作用は記録されず；平均体重で影響はなく、又は塗布部位における作用若しくは局所的な炎症作用に影響しなかった。従って、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤは、安全かつ無毒の、特定のＴ細胞寛容を促進する手段であると思われる。
【実施例５】
【０１２８】
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの鼻腔内投与後の寛容化Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生の減少
リコール抗原暴露に対する免疫Ｔ細胞のサイトカイン活性における鼻腔内のＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ投与の影響を調べるため、上清中のＩＦＮ−γの産生量を測定した。ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ寛容原で処理したマウスからのＴ細胞のＩＦＮ−γレベルの減少が観察された。一方、活性ＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤを投与されたマウスは、未処理のコントロールマウスよりも多くのＩＦＮ−γを産生した。従って、鼻腔内処理後のリコール抗原に対するＩＦＮ−γの産生の減少は、マウスがＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤにより有効に寛容化されることを裏付けた。
【実施例６】
【０１２９】
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで鼻腔内投与した後の寛容
脾臓のＴ細胞中で検出された全身性寛容が、流入領域リンパ節内のＴ細胞中においても誘発されるかどうかを調べるため、マウスをＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで鼻腔内処理し、１週間後、マウスを犠牲にし、頸部リンパ節からリンパ球を調製した。リコールＡｇに対するＴ細胞反応が強力に抑制されることがわかった（図６）。
【実施例７】
【０１３０】
抗ＩＩ型コラーゲン抗体産生の阻害
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理により誘発される寛容の程度についての良好な理解を得るため、鼻腔内処理に続く抗原投与免疫に対する血清反応を解析した。ＤＢＡ／１受容者に、ＰＢＳ又は５μｇのＣＴＡ１−ＣＯＬ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを投与した。１週間後、全てのマウスの腹腔内に、コラーゲン及びＲｉｂｉ−アジュバントを抗原投与した。コラーゲン特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの全力価をＥＬＩＳＡにより測定した。抗コラーゲン反応は大いに低下し、抗コラーゲンＩｇＧ及びＩｇＡはいずれも数倍低下した（図７）。
【実施例８】
【０１３１】
マウスにおけるＣＩＡ処理
ＲＡのマウスＣＩＡモデルを、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ寛容源による鼻腔内処理の臨床的価値を測定するために用いた。ＣＩＡモデルは、ＲＡが原因である、多くの臨床的、組織学的及び免疫学的特徴を共有しており、そのためＲＡに対する潜在的治療法を試験するためにもっとも用いられているモデルである。完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）内のコラーゲンによる抗原投与免疫前後に、ＰＢＳ、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤでＤＢＡ１マウスを鼻腔内処理し、２１日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で追加免疫した。次いで、マウスを犠牲にし、ＣＩＡの関節炎の発生率及び関節炎の関節指数を測定した。
【０１３２】
マウスのＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理の治療的効果は、足の肥大及び臨床スコアにより評価されるように、コントロール群（ＰＢＳ）と比較し、ＣＩＡの発生率（図８Ａ、８Ｂ）及び重症度（図８Ｃ）の低下をもたらした。２６、２７及び２８日におけるＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの治療後、それほど多くない肥大が認められた。
【０１３３】
コントロールのＰＢＳ群における関節炎指数は、コラーゲン免疫の３週間後に劇的に症状し、６週後にピークに達した。一方、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ群においては、顕著に低い関節炎指数が記録され、多くの動物は全く症状がなかった。実験の完了時において、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで処理したグループにおいては４０％のマウスが関節炎を発症したが、１００％のコントロールマウスが影響を受けた。更に、関節炎指数は、処理群における関節炎について陽性と記録されたマウスについて、大部分のマウスが疾患に苦しめられていないことを示した（図８Ｃ）。自己ペプチドを用いず、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤで処理したコントロールマウスはＰＢＳコントロールマウスのように影響されず、これは、疾患を予防するＣＯＬに特異的な効果であり、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤはそのような効果を有しないことを示す（図８Ｂ）。興味深いことに、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤキャリアの治療的及び予防的処理は、いずれも有意な保護作用を有していた。
【実施例９】
【０１３４】
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤは、ＣＩＡマウスモデルにおいて組織学的変化を予防する
関節炎を記録したデータは、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤの処理後に採取される試料の組織学的解析により更に確認された。マウスを犠牲にし、関節をホルマリン中に固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。軟骨の腐食及び滑膜細胞浸潤、並びに軟骨及び骨の破壊は、未処理のマウスにおいては更に重症であった（図９Ａ）。一方、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理マウスは、疾患の有意な減少又は症状のないことを明らかにした（図９Ｂ）。マウスからの組織切片は、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理が、１００％が、関節において重度の組織破壊に苦しめられる未処理のコントロールマウスと比較し、疾患を完全に予防し、又は有意に減少することを裏付けた。重要なことに、骨及び軟骨の破壊は、コントロールマウスと比較し、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理において有意に低かった（図１０）。注目すべきは、これらの実験の間に、体重における有意な差は観察されなかった（データは示さない）。これらの組織学的結果は、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤにより粘膜処理が、ＲＡのマウスＣＩＡモデルにおける免疫病理的過程を効率的に抑制することを明らかに示した。
【実施例１０】
【０１３５】
ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理したＣＩＡマウスにおけるＩＬ−１０の強力な増強及びＩＬ−６産生の減少
未処理（ＰＢＳ）ＣＩＡマウス、若しくは５μｇのＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで処理したマウスを犠牲にし、血清を集め、ＩＬ−１０（図１１Ａ）及びＩＬ−６（図１１Ｂ）の濃度について分析した。著しく、処理マウス中のＩＬ−１０の血清レベルは、未処理又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤで処理したマウスよりもかなり上昇していた（図１１Ａ）。一方、血清に含まれるＩＬ−６は、未処理のＣＩＡ疾患マウスと比較し、治療的に処理したマウスにおいて、有意に低下していた（図１１Ｂ）。ＩＬ−６のレベルは、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤ群においては、未処理マウスで観察されたのと同様であった（データは示さず）。更に、未処理のＣＩＡ疾患マウスにおいて検出されるレベルに対抗するように、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理は、抗ＣＩＩ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３血清力価の有意な減少をもたらした。従って、個々のマウスにおける、高ＩＬ−１０及び低ＩＬ−６血清濃度は、低関節炎指数により評価されるように、ＣＩＡ疾患に対する、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ誘発性の防御と十分に相関関係がある。
【実施例１１】
【０１３６】
制御性Ｔ細胞及びＩＬ−１０に関するＣＩＩ特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答の歪み
未処理（ＰＢＳ）のマウス、若しくは５μｇのＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＤＤ又はＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで処理したマウスから脾臓リンパ球を分離し、リコールＣＯＬ自己ペプチドの存在下又は非存在下、インビトロで刺激した。９６時間後に上清を集め、ＩＬ−１０（図１２Ａ）及びＩＬ−６（図１２Ｂ）の含有量について分析した。
【０１３７】
ＭＨＣクラスＩＩで制限された、リコールペプチド−抗原投与（ＣＯＬ）に対し、血清ＩＬ−１０の劇的な増加、及び脾臓Ｔ細胞により産生されたＩＬ−１０の増加が、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤで処理したマウスにおいて観察された。実際、これは、サイトカインのＴ細胞起源、それ故、制御性Ｔ細胞の誘発を示唆する。いくつかの、ＣＩＡモデルの以前の研究は、経口寛容がＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋（１６，４６）であるＩＬ−１０産生ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を誘発し得ることを証明した。粘膜免疫寛容の更に他の研究においては、制御性Ｔ細胞がＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−細胞であることがわかった。従って、天然ＣＤ２５＋及び誘導性ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞が、いずれもＣＩＡ、及びおそらくＲＡの抑制に関与しているかもしれない。予備研究（データは示さず）は、更に、ＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤを用いた鼻腔内処理が、このようなＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−Ｔｒ１型の細胞を促進することを示した。従って、鼻腔内の治療のためのＣＴＡ１−Ｒ７Ｋ−ＣＯＬ−ＤＤ処理は、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞を含むＣＤ４＋エフェクタＴ細胞の機能を制御するＴｒｅｇの発症を刺激し、その結果、滑膜への浸透を抑制し、ＣＩＡを効果的に予防すると結論される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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