(57)【要約】生存細胞、アポトーシス細胞及び死細胞を分離する方法、及びこのような方法に用いる抗体につき記述する。抗体は、炎症性疾患、癌の治療及び創傷治癒に用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
死細胞及びアポトーシス細胞に対して結合特異性を有する抗体分子であって、
該抗体分子は、Seq ID No:1又はその変異型と、Seq ID No:2又はその変異型と、Seq ID No:3又はその変異型とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及び／又はSeq ID No:4又はその変異型と、Seq ID No:5又はその変異型と、Seq ID No:6又はその変異型とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含む、抗体分子。
【請求項２】
前記抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及び／又はSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
前記抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及びSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
前記抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも２つ、及び／又はSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも２つを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５】
前記抗原結合ドメインは、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記抗体ＶＨドメインは、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、前記抗体ＶＬドメインは、Seq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記抗体ＶＨドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれアミノ酸配列Seq ID No:1、Seq ID No:2及びSeq ID No:3を有するＣＤＲを含む、請求項５又は６に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記抗体ＶＨドメインは、アミノ酸配列Seq ID No:7を有する、請求項７に記載の抗体分子。
【請求項９】
前記抗体ＶＬドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれアミノ酸配列Seq ID No:4、Seq ID No:5及びSeq ID No:6を有するＣＤＲを含む、請求項５〜8のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記抗体ＶＬドメインは、アミノ酸配列Seq ID No:8を有する、請求項９に記載の抗体分子。
【請求項１１】
前記抗体分子は、IgM分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１２】
前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB6抗体分子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
死細胞に対して結合特異性を有する抗体分子であって、
該抗体分子は、IMAB7抗体分子のCDRL1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、IMAB7抗体分子のCDRL2のアミノ酸配列に相当するか、又はその変異型であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、IMAB7抗体分子のCDRL3のアミノ酸配列に相当するか、又はその変異型であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、IMAB7抗体分子のCDRH1のアミノ酸配列に相当するか、又はその変異型であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、IMAB7抗体分子のCDRH2のアミノ酸配列に相当するか、又はその変異型であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、IMAB7抗体分子のCDRH3のアミノ酸配列に相当するか、又はその変異型であるアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した１つ以上のＣＤＲを含み、
前記IMAB7抗体分子は、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB7抗体分子である、抗体分子。
【請求項１４】
前記抗体分子は、前記CDRL1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも１つのＣＤＲ、及び／又は前記CDRH1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも１つのＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１3に記載の抗体分子。
【請求項１５】
前記抗体分子は、前記CDRL1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも１つのＣＤＲ、及び前記CDRH1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択したＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１3又は１４に記載の抗体分子。
【請求項１６】
前記抗体分子は、前記CDRL1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも２つのＣＤＲ、及び／又は前記CDRH1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも２つのＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１3〜１５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１７】
前記抗原結合ドメインは、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含む、請求項１3〜１６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１８】
前記抗体ＶＬドメインは、前記CDRL1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ前記抗体ＶＨドメインは、前記CDRH1のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH2のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲと、前記CDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲとからなるグループから選択した少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１７に記載の抗体分子。
【請求項１９】
前記抗体ＶＨドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれ前記CDRH1、CDRH2及びCDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、請求項１７又は１８に記載の抗体分子。
【請求項２０】
前記抗体ＶＨドメインは、前記IMAB7抗体分子の抗体ＶＨドメインに相当する抗体ＶＨドメインを含む、請求項１９に記載の抗体分子。
【請求項２１】
前記抗体ＶＬドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれ前記CDRL1、CDRL2及びCDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２２】
前記抗体ＶＬドメインは、前記IMAB7抗体分子の抗体ＶＬドメインに相当する抗体ＶＬドメインを含む、請求項２１に記載の抗体分子。
【請求項２３】
前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４１０号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB7抗体分子のCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２４】
前記抗体分子は、IgM分子である、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２５】
前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４１０号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB7抗体分子である、請求項２４に記載の抗体分子。
【請求項２６】
試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法であって、当該方法が、
（ｉ） 前記試料を、前記標的細胞又は細胞成分に特に結合する抗体分子と接触させる工程と、
（ii） 前記抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程と、
（iii）前記試料から前記複合体を分離する工程と、
を含み、前記工程（i）及び（ii）の少なくとも一方は、生理学的条件下で実施可能である、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法。
【請求項２７】
前記工程（i）及び（ii）は、生理学的条件下で実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記生理学的条件は、３５〜４１℃の範囲内の温度を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生理学的条件はさらに、２．３mM未満のカルシウム濃度を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記分離する工程は二次結合成分の使用を伴わない、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体分子は、IgM分子である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法であって、当該方法が、
前記試料を、前記標的細胞に特に結合するIgM抗体分子と接触させる工程と、
前記IgM抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程と、
前記試料から前記複合体を分離する工程と、
を含み、前記分離する工程は二次結合成分の使用を伴わない、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法。
【請求項３３】
前記標的細胞は、非生存細胞であり、且つ前記方法は、生存細胞から非生存細胞を分離する方法である、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記非生存細胞は、死細胞又はアポトーシス細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体分子は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３６】
前記非生存細胞は、死細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体分子は、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法であって、当該方法が、
前記試料を、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子と接触させる工程と、
前記抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程と、
前記試料から前記複合体を分離する工程と、
を含み、前記標的細胞は非生存細胞である、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法。
【請求項３９】
前記抗体分子は、磁気ビーズに結合される抗体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法は、生存細胞から非生存細胞又は細胞成分を分離する方法である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
試料中の非生存細胞の細胞集団を濃縮する方法であって、当該方法が、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記試料からの標的細胞の除去を含む、試料中の非生存細胞の細胞集団濃縮方法。
【請求項４２】
生体試料中の非生存細胞又はその細胞成分を検出する方法であって、当該方法が、
前記試料を、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子と接触させる工程と、
前記試料の前記非生存細胞又はその細胞成分への前記抗体分子の結合を検出する工程と、
を含む、生体試料中の非生存細胞検出方法。
【請求項４３】
前記方法は、前記試料を、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の抗体分子と接触させる工程と、前記試料の前記非生存細胞又はその細胞成分への前記抗体分子の結合を検出する工程と、を含み、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の抗体分子の結合は、アポトーシス細胞又は溶解細胞の存在を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
溶解を受けた細胞とアポトーシスを起こしていない細胞とを区別する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶解を受けた細胞又はその細胞成分と、アポトーシスを起こしていない細胞又はその細胞成分とを検出可能試薬によって区別する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
検出可能試薬は、プロピジウムヨウ化物、エチジウムホモ二量体-１、７-アミノアクチノマイシンD、TO-PRO-3ヨー化物、又はその任意の組み合わせを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
検出可能試薬は、特に溶解した細胞又はその細胞成分には結合するも、アポトーシスを起こしていない細胞には結合しない抗体分子を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
特に溶解した細胞又はその細胞成分には結合するも、アポトーシスを起こしていない細胞又はその細胞成分には結合しない抗体分子は、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
医薬に用いる請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５１】
炎症性疾患の治療に用いる請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５２】
癌の治療に用いる請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５３】
創傷の治療に用いる請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５４】
アポトーシス細胞又は死細胞に対する免疫反応を増強する方法であって、該方法は、前記細胞への請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子の投与を含む、免疫反応増強方法。
【請求項５５】
披験者の炎症性疾患を治療する方法であって、該方法は、前記披験者に請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子を投与することを含む、炎症性疾患の治療方法。
【請求項５６】
披験者の癌を治療する方法であって、該方法は、前記披験者に請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子を投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項５７】
披験者の創傷を治療する方法であって、該方法は、前記創傷に請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子を投与することを含む、創傷の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、死細胞及び瀕死細胞の検出方法、このような方法に用いる試薬及びこのような試薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、細胞の陽性常な発達及びホメオスタシスにおける基本的に重要なプロセスである。アポトーシスが多くの病状に関与していることも知られている。例えば、アポトーシス及びアポトーシス経路における欠陥は、癌、心臓病、脳卒中、アルツハイマー病、虚血性疾患及び自己免疫疾患に特に関連すると考えられている。例えば、癌は、増殖速度が増大しない場合でも、アポトーシス経路における欠陥に起因することがある。
【０００３】
アポトーシスを誘発できない抗癌剤候補は、臨床効果を低下させる可能性があり、アポトーシスアッセイは薬剤の高スループットスクリーニングのための重要なツールとなっている。アポトーシス調節剤の開発には、アポトーシス細胞及び／又は死細胞の存在を判定するための確固たるアッセイを必要とする。例えば、血液試料又は生検試料のような生体試料におけるアポトーシス細胞及び／又は死細胞の存在を同定及び／又は定量化するのに、従来技術の多数の方法を利用可能であるけれども、これらの各方法には、特有な欠点がある。
【０００４】
アポトーシスをアッセイするための方法が従来多数知られている。核酸染色剤は、アポトーシスの間における核の特徴的な分解を活用して、細胞集団内のアポトーシス細胞を同定するのに用いることができるが、この分解が、クロマチンの崩壊と分裂、核膜の分解、及び細胞核のブレブ形成をもたらし、「（細胞の）小核」を形成することになる。
【０００５】
従来技術で用いられる他の方法は、例えば、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−８のようなアポトーシス経路のエフェクターの活性測定のような、細胞内のプロテアーゼ活性の測定を含む。アポトーシスの特徴は、活性ミトコンドリアの崩壊なので、ミトコンドリア染色剤をアポトーシス細胞の同定のために用いることができる。他のアポトーシスアッセイは、アポトーシス細胞内の変化を測定するために、フリーラジカルのプローブ又はイオン指示薬を用いる。最も一般的に用いられるアポトーシスアッセイの１つは、血管抗凝血剤のアネキシンVの使用に基づくものである。アネキシンVは、ホスファチジルセリンに高親和性を有するリン脂質結合タンパク質である。しかしながら、生存細胞においては、アネキシンVは、ホスファチジルセリンが細胞膜の細胞質面にあるので、ホスファチジルセリンと結合しない。しかし、アポトーシス細胞においては、ホスファチジルセリンは細胞膜の外側表面に外面化されているので、そこで、ホスファチジルセリンはアネキシンVと結合することができる。しかし、アポトーシスの検出のためのアッセイにアネキシンVを用いることには、多くの欠点がある。特に、アネキシンVのホスファチジルセリンへの結合は、Ca2+ に依存するので、アッセイに用いる緩衝液の選択が制限される。これにより、通常、試料をアッセイする前に緩衝液を交換する必要があり、それは時間がかかるだけでなく、細胞に対するストレスを増して、非生存細胞を増大させることになる。
【０００６】
抗体ベースの技術は、細胞の検出方法に用いられると同様に、特定試料内の細胞の亜母集団の分離といったような、分離技術も通常用いられる。磁性粒子は、多くの異なる種（ヒト、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類など）からの、多系統の生存細胞の集団内における細胞（一般に、リンパ球サブセット、単核白血球、樹枝状細胞、幹細胞、腫瘍細胞など）を分画するために、通常使用される。一般に、分画効率を高めるために、細胞集団の選択は、間接的手段により行われる。すなわち、典型的に１つ以上の一次抗体は、細胞に結合することができ、この抗体が結合された細胞は、二次抗体に結合された、又は一次抗体がビオチニル化されていれば、（ストレプト）アビジンに結合された磁性粒子を用いて引き出される。その上、このような技術は、一般に、少なくとも一部分において、低い非生理的温度で、及び／又は、当面の細胞の生存能力を維持するのに最適な培養地とは組成が異なる緩衝液の存在下で、行なう必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６４１，８７０号明細書
【特許文献２】欧州特許第４０４０９７号明細書
【特許文献３】国際公開第９３／１１１６１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２１５，９２７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２２５，３５３号明細書
【特許文献７】米国特許第３，７７３，９１９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zapata et al., Protein Eng 8(10):1057-1062 [1995]
【非特許文献２】Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)
【非特許文献３】Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 6444-6448 (1993)
【非特許文献４】Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept of Health and Human Services, Public Health Service, Nat'l Inst, of Health, NIH Publication No. 91-3242, 1991 and online at www.kabatdatabase.com http://immuno.bme.nwu.edu.
【非特許文献５】Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984)
【非特許文献６】Kohler and Milstein (1975) Nature, 256 :495-499
【非特許文献７】Clackson et al. (1991 ) Nature, 352: 624-628
【非特許文献８】Marks et al. (1992) Bio/ Technology, 10: 779-783
【非特許文献９】Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988
【非特許文献１０】Knappik et al, J. MoI. Biol. (2000) 296, 57-86
【非特許文献１１】Krebs et al., J. Immunol. Meth. (2001) 2154 67-84
【非特許文献１２】Gram et al, 1992, P.N.A.S. 89 3576-3580
【非特許文献１３】Barbas et al 1991 PNAS 3809-3813
【非特許文献１４】Scier 1996 J MoI Biol 263 551- 567
【非特許文献１５】Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed.,Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 2005
【非特許文献１６】Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3<rd> edition Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001
【非特許文献１７】Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21<st> edition, Gennaro AR, etal, eds., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
【非特許文献１８】Dive, C, C. D. Gregory, et al. (1992). "Analysis and discrimination of necrosis, and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry." Biochimica et Biophvsica Acta 1133(3): 275-285.
【非特許文献１９】Ogden et al (2005) J. Immunol. 174, 3015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、試料内における非生存細胞の存在を検出するために用いることができる更なるアッセイ、例えば、特に、最適培養条件のような細胞の生理的条件を最小の摂動で用いることができる（摂動は生存能力を低下させるから）技術に対する、従来の技術のいくつかの課題を克服する高スループットのアッセイ及び単純な分離技術で使用できるアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、死細胞及び瀕死の細胞に選択的に結合し、選択的に結合するために、（例えばアネキシンVを用いる現在既知の方法により必要とされるような）非生理学的温度又は高いカルシウム濃度を必要としない検出可能試薬を特定した。さらに、本発明者は、細胞が培養で典型的に維持されるような、実質的な生理学的条件下で用いることができる、単純で新規な細胞分離技術を開発した。実施例で示すように、本発明者は、自身で驚いたことに、アポトーシス細胞成分又は死細胞成分のエピトープ向けの抗体が、生理学的条件下の試料内の他の細胞又は細胞成分から、そのような細胞成分又は細胞を分離するために、高効率で直接用いることができることを実証した。
【００１１】
従って、本発明の第１の実施態様では、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法を提供し、当該方法が、前記試料を、前記標的細胞又は細胞成分に特に結合する抗体分子と接触させる工程と、 前記抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程と、前記試料から前記複合体を分離する工程と、を含み、前記分離する工程は、生理学的条件下で実施可能である。
【００１２】
一実施態様では、前記抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程は、生理学的条件下で実施される。
【００１３】
本発明の文脈では、「生理学的条件」は、３０〜４５℃の範囲、例えば、３５〜４１℃の範囲の温度を言う。
【００１４】
多くの従来の分離技術−例えば、アネキシンVを利用する方法−は、例えば２．３mMよりも大きい例えばカルシウム濃度のような、非常に特別な条件を必要とする。なお、このような従来の分離技術に対して、本発明の方法は、最小のCa2+又は自由なCa2+が無いことを含む広いカルシウム濃度の範囲で行うことができ、この条件は、細胞分離で基本的問題である細胞の凝集を最小にする。一実施態様では、「生理学的」の用語は、さらに、例えば２．０mMの２．３mMよりも小さいカルシウム濃度、又は、例えば１mMの１．５mMよりも小さいカルシウム濃度を言う。一実施態様では、本方法は、例えば、１．８〜２．２mMの範囲のカルシウムの生理学的に通常のレベルで行われる。
【００１５】
別の実施態様では、本方法は、例えば、２mMの自由なCa2+を本質的にキレートする濃度で、ＥＤＴＡのようなカルシウムキレート剤の存在下で行われる。
【００１６】
さらに、本発明者が驚いたことに、死細胞成分又は全細胞を試料から分離するためのこのような抗体ベースの技術は、例えば、二次抗体又はストレプト（アビジン）のような二次タンパク質のような二次結合部分を必要とせずに、効率的に行うことができることが分かった。一般的に、今まで、生存細胞又は生存細胞成分の異なるサブタイプの分離に主として限定してきた抗体ベースの細胞分離技術は、二次抗体の使用を必要とするものであった。典型的に、標的細胞は一次抗体により結合され、その後の分離工程は、二次抗体の捕捉を含み、又は、一次抗体が、例えばビオチンの標識を付ける場合、例えば、ストレプト（アビジン）のような捕捉部分の捕捉を含む。実施例で説明するように、本発明者は、本発明の第１の実施態様の方法を用いて、瀕死細胞、死細胞、又は、瀕死細胞若しくは死細胞からの成分を、二次抗体又は実際に例えばビオチンの標識を付けた一次抗体を使用する必要がなく、試料から分離することができることを示した。本発明者は、磁気ビーズに直接結合した一次抗体が、試料内の標的死細胞成分を効率的に結合し、磁界を加えることにより、そのような細胞又は細胞成分を試料から分離するために用いることができることを示した。実際に、実施例で示すように、テストされる抗体に関して、本発明者が非常に驚いたことに、このような「直接の」技術は、生存細胞分離技術に従来適用されたような、一次抗体及び二次抗体システムを用いる分離の効率より大きくなくとも、実質的に等しかった。
【００１７】
従って、本発明の一実施態様では、分離工程は、二次結合部分の使用を含まない。
【００１８】
このような実施態様では、本発明で用いるための抗体分子は、複合体として、分離を可能にする基質を設ける。このような基質は、磁性粒子又は磁気ビーズにすることができる。他の実施態様では、基質は、固体の基質であり、コラム分離技術で用いるような場合、ポリスチレンのビーズ等である。抗体は、従来の方法を用いて、このような基質に結合することができる。
【００１９】
本発明の特別の実施態様では、抗体分子は、例えば、磁気ビーズのような磁性粒子に結合する。
【００２０】
例えば、Miltenyiのようないくつかの従来の技術のシステムは、二次抗体又はストレプトアビジンを時々用いないで、細胞集団の効率的な陽性（効率的な陰性ではないけれども）選択を可能にする非常に小さいビーズ（１００nm未満）を用いるけれども、このようなシステムは、磁気分離を仲介するために、高勾配磁界（ＨＧＭＦ）を必要とする。典型的に、細胞分離のための高勾配磁界は、０．６〜１テスラの範囲の強力な磁界が加えられる鋼線のコラム（細胞懸濁液がコラムを通過する）を用いて、発生される。
【００２１】
本発明者は、そのようなシステムと大いに異なって、本発明は、直接陰性選択により生存細胞の高効率分離を達成するために用いることができることを驚きをもって示した。さらに、本発明は、ビーズを用いて高効率陰性選択を達成するために用いることができ、ビーズは、単純磁界、すなわち高勾配磁界の必要はない、により分離するために、十分に高い超常磁性である。
【００２２】
従って、本発明の一実施態様では、分離工程は、従来の磁界を用いて、すなわち高勾配磁界がない場合で、行うことができる。従来の磁界は、任意の従来の磁石を用いて発生することができる。使用できる従来の磁石の例は、StemCell TechnologiesからのEasySep磁石（カタログ番号１８０００）及びAdemtechからのAdem-Mag SV（カタログ番号２０１０１）磁石を含む。
【００２３】
一実施態様では、本方法は、直径が、例えば２５０nmを超える、１５０nmを超えるような、１２５nmを超える磁気ビーズ又は磁性粒子を用いて行う。しかしながら、従来の磁石を用いて分離することができるより小さい磁気ビーズ又は磁性粒子も用いることができる。例えば、約４０nmのサイズの超常磁性のビーズが従来技術として既知であり、本発明の１つ以上の実施態様で用いることができる。
【００２４】
本発明で使用のための抗体分子は、例えば、IgM（免疫グロブリンM）、IgE（免疫グロブリンE）、IgA（免疫グロブリンA）又はIgG（免疫グロブリンG）のような任意の免疫グロブリンクラスにすることができる。本発明の特別の一実施態様では、抗体分子は、IgM抗体である。
【００２５】
本発明者は、IgM抗体が、例えば、二次抗体のような二次結合部分を必要とせずに、細胞又は細胞成分の亜母集団を混合母集団から分離するのに特別の効率を示すことを見出した。このようなIgM抗体分子を用いて観察した驚くべき効率的な分離は、生存細胞又はその成分を細胞の集団から分離すること、及び、非生存細胞又はその成分を生存細胞及び非生存細胞又はそれらの成分の混合集団から分離することにおいて、それらの使用を可能にする。
【００２６】
従って、本発明の第２の独立の実施態様では、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法を提供し、当該方法が、前記試料を、前記標的細胞又は細胞成分を特異的に結合するIgM抗体分子と接触させる工程と、前記IgM抗体分子が前記標的細胞と複合体を形成することを可能にする工程と、前記試料から前記複合体を分離する工程と、を含み、前記分離する工程は二次結合部分の使用を含まない。
【００２７】
一実施態様では、前記方法は、温度及び／又はカルシウム濃度の生理学的条件下で行われる。
【００２８】
本発明者は、磁気ビーズに直接接合した抗体分子を、試料内の標的抗原を結合するために用いることができ、磁界を加えることにより、抗原が存在するそのような標的細胞又は細胞成分を他の試料成分から分離するために用いることができることを示した。
【００２９】
本発明の第１又は第２の実施態様では、抗体分子は、例えば死細胞又はアポトーシス細胞である非生存細胞の細胞又は細胞成分に対する結合特異性を有する分子である。このような実施態様では、本発明の方法は、そのような細胞を細胞集団から除去するのに用いることができる。従って、本発明の一実施態様では、前記標的細胞は、非生存細胞であり、且つ前記方法は、生存細胞から非生存細胞又はその細胞成分を分離する方法である。
【００３０】
実施例で説明するように、本発明者は、アポトーシス細胞又は死細胞のエピトープに対する結合特異性を有する新規な抗体を開発した。本明細書でＩＭＡＢ６と呼ぶ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、仮受託番号０７１２０４１０で２００７年１２月４日にＥＣＡＣＣに預託された。
【００３１】
本発明者は、死細胞にさらされるが、アポトーシス無傷細胞を含む無傷細胞にさらされないエピトープに対する結合特異性を有する新規な抗体をさらに開発した。本明細書でＩＭＡＢ７と呼ぶ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、仮受託番号０７１２０４１０で２００７年１２月４日にＥＣＡＣＣに預託された。
【００３２】
いずれか１つの理論に限定されることなく、ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７は、両方共、ホスファチジルセリンの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、ＩＭＡＢ６が結合するエピトープは、細胞がアポトーシスであるか又は溶解させられている場合のみ、細胞外にあるホスファチジルセリンの一部に存在し、ＩＭＡＢ７が結合するエピトープは、細胞内にあり、従って溶解後のみにさらされるホスファチジルセリンの一部に存在する。
【００３３】
本発明の方法の一実施態様では、抗体分子はＩＭＡＢ６である。別の実施態様では、抗体分子はＩＭＡＢ７である。実際に、このような抗体は、本発明の第３及び第４の独立の実施態様を表わす。
【００３４】
本発明の抗体の提供は、死細胞及び瀕死細胞にも選択的に結合する関連する抗体及び抗体分子の開発を可能にする。
【００３５】
本発明の第３の実施態様が含むのは、死細胞及びアポトーシス細胞に対する結合特異性を有する抗体分子であり、前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB６抗体分子の１つ以上のCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。本発明の特別の実施態様では、前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB６抗体分子の（i）CDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び／又は（ii）CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。
【００３６】
本発明の第４の実施態様が含むのは、死細胞及びアポトーシス細胞に対する結合特異性を有する抗体分子であり、前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４１０号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB７抗体分子の１つ以上のCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。本発明の特別の実施態様では、前記抗体分子は、受託番号第０７１２０４１０号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB７抗体分子の（i）CDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び／又は（ii）CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。
【００３７】
本発明のこの一実施態様では、抗体分子は、IgM分子である。しかしながら、抗体は、任意のクラスにすることができ、従ってIgG、IgE、IgA又はIgMにすることができる。
【００３８】
本発明の抗体は、アポトーシス細胞、死細胞又は死細胞成分を試料から分離する任意の方法に用いることができる。従って、本発明の第５の実施態様では、試料から標的細胞又は細胞成分を分離する方法を提供する。当該方法は、前記試料を、本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子と接触させる工程と、前記抗体分子が前記標的細胞又はその細胞成分と複合体を形成することを可能にする工程と、前記試料から前記複合体を分離する工程と、を含み、前記標的細胞又はその細胞成分は非生存細胞又はその細胞成分である。
【００３９】
本発明の方法及び抗体は、死細胞を生存細胞から分離することを可能にすることにより、例えば、細胞培養において生存細胞の数を最大に確保するために、細胞集団の濃縮における特別の有用性を見出す。抗体は、実質的に生理学的条件、特に、生理学的温度で使用できるため、培養における細胞の濃縮において特別の有用性を見出す。死細胞を除去するために、通常の生理学的条件に摂動を与える不利がないので、細胞培養中の細胞は、最適条件下で維持することができる。
【００４０】
従って、本発明の第６の実施態様では、試料中の細胞集団を濃縮する方法を提供し、当該方法が、本発明の第１、第２又は第５の実施態様の方法を用いて、前記試料からの標的細胞の除去を含む。
【００４１】
細胞の分離において有用性が見出されると共に、本発明の抗体は、単純な検出技術で用いることもできる。上記のように、ＩＭＡＢ６は、死細胞及びアポトーシス細胞の両方を結合する非生存細胞に対する特異性を有することが見出されたが、一方、ＩＭＡＢ７は、死細胞のみに対する結合選択性を有する。
【００４２】
従って、本発明の第７の実施態様は、生体試料中の非生存細胞又はその細胞成分を検出する方法を提供し、当該方法が、前記試料を、本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子と接触させる工程と、前記非生存細胞又はその細胞成分への前記抗体分子の結合を検出する工程と、を含む。
【００４３】
死細胞及びアポトーシス細胞の両方を同定する必要がある場合、本発明の第３の実施態様の抗体を使用することができる。多くの状況において、例えば、死細胞及びアポトーシス細胞のような生存細胞の異なるタイプ間で区別する必要はない。
【００４４】
しかしながら、いくつかの実施態様では、このような細胞間で区別することは有用であり得る。従って、本発明の第７の好ましい実施態様では、当該方法が、溶解を受けた細胞とアポトーシスを起こしていない細胞とを区別する工程をさらに含む。
【００４５】
既知の技術である溶解を受けた細胞とアポトーシスを起こしていない細胞とを区別する任意の適切な方法を用いることができる。例えば、溶解した細胞の検出可能マーカーを用いることができる。一実施態様では、検出可能マーカーはプロピジウムヨー化物である。使用できる他の検出可能マーカーは、例えば、エチジウムホモ二量体-１、７-アミノアクチノマイシンD、TO-PRO-3ヨー化物（全て分子プローブ（Molecular Probe）から利用可能）のような、細胞非透過性のエチジウム薬剤を含む。
【００４６】
代替として又は追加として、検出可能マーカーは、溶解した細胞に結合できる抗体分子を含むことができる。
【００４７】
本発明の特別の実施態様では、死細胞のみ検出したい場合、本発明の第４の実施態様による抗体分子を用いることができる。
【００４８】
抗体ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７の特別な利点は、各々、結合後の固化を存続するのに十分に強いことである。典型的に、抗体ベースの技術のようなアポトーシス標準染色技術の研究において、典型的に、アネキシンＶとプロピジウムヨウ化物との組み合わせは、固化に適していなくて、それゆえに、標識化後の試料の即時の分析を必要とする。しかしながら、対照的に、抗体ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７は強く、付着される細胞及び細胞成分との結合は、固化により破壊されない。これは、細胞試料がその後の分析のために保存される点において特に有利である。細胞分析方法において、固化、すなわち、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド等のような架橋試薬による保存が望ましいことが多い。例えば、アネキシンＶは高Ca緩衝剤の存在下でのみ、結合する必要があり、結合したままであるため、アネキシンＶ／プロピジウムヨウ化物の標識化後の試料は、新しいうちに分析する必要があり、固化プロセスは生存細胞が染料に対して透過性になることに導くことが多いため、プロピジウムヨウ化物の標識化は固定試料に対して誤った方向に導く。
【００４９】
従って、本発明の特別の実施態様では、本発明で使用の及び使用のための抗体分子は、非生存細胞に結合することができ、ホルムアルデヒドを用いて固化状態に持ちこたえることができる。
【００５０】
ある高悪性度の悪性腫瘍では、アポトーシスによる細胞死は、頻繁に起きる。宿主の免疫細胞（マクロファージ）は、アポトーシス細胞を取り込み、抗炎症性及び免疫抑制反応を引き出すために、これらの腫瘍に対し補充されて、抗癌免疫攻撃から腫瘍を保護する。本発明者の実験室からの研究によれば、アポトーシス細胞に対する抗体は、腫瘍のマクロファージ反応を抗炎症性（癌擁護）から炎症性擁護（抗癌）へ切り替える潜在能力を有することを示した。この点において、本発明の抗体は、治療法の潜在能力を有し、腫瘍内の細胞死を目標とし、抗癌免疫を促進するために用いることができる。
【００５１】
従って、本発明の抗体は、アポトーシス細胞及び死細胞に特異的に結合することにより、このような細胞に対する免疫反応を増強するために、用いることができる。
【００５２】
従って、本発明の第８の実施態様では、アポトーシス細胞又は死細胞に対する免疫反応を増強する方法を提供し、該方法は、前記細胞への本発明の第３の実施態様の抗体分子又は本発明の第４の実施態様の抗体分子の投与を含む。
【００５３】
免疫反応を増強することにより、抗体は、例えば、炎症性病状のような多くの病状の治療での使用を見出すことができ、その場合、炎症性部位又は腫瘍にマクロファージの浸潤を増強することが望ましい。抗体は、創傷の治癒を増強するのにも有用であり得る。
【００５４】
従って、本発明の第９の実施態様では、披験者の炎症性疾患を治療する方法を提供し、該方法は、前記披験者に本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を投与することを含む。
【００５５】
本発明の第１０の実施態様では、披験者の癌を治療する方法を提供し、該方法は、前記披験者に本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を投与することを含む。
【００５６】
本発明の第１１の実施態様では、披験者の創傷を治療し、又は創傷の治癒を促進する方法を提供し、該方法は、前記創傷に本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を投与することを含む。
【００５７】
本発明の第１２の実施態様では、本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を含む、医薬組成物を提供する。
【００５８】
本発明の第１３の実施態様では、医薬に用いる本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を提供する。
【００５９】
本発明の第１４の実施態様では、炎症性疾患の治療に用いる本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を提供する。
【００６０】
本発明の第１５の実施態様では、癌の治療に用いる本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を提供する。
【００６１】
本発明の第１６の実施態様では、創傷の治療に用いる本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子を提供する。
【００６２】
本発明の第８から第１６のいずれか１つの実施態様では、抗体分子は、本発明の第３の実施態様の抗体分子である。
【００６３】
本発明の第１７の実施態様では、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託されたハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００６４】
本発明の第１８の実施態様では、受託番号第０７１２０４１０号でＥＣＡＣＣに預託されたハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００６５】
本発明の第１９の実施態様では、本発明の第３又は第４の実施態様の抗体分子をコードする核酸分子を提供する。
【００６６】
本発明の第２０の実施態様は、生体試料中のアポトーシス細胞を検出するためのキットを含み、当該キットが、
（i）本発明の第３の実施態様の抗体分子と、
（ii）溶解を受けた細胞の検出可能マーカー、又は、本発明の第４の実施態様の抗体分子のいずれかを、選択的に含む。
【００６７】
本発明の第２０の一実施態様では、当該キットは、抗体を標識化するための標識をさらに含む。
【００６８】
本発明の各実施態様の好ましい及び代替の特徴は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、変更すべきところは変更して他の実施態様の各々に対するものとしてである。
【００６９】
［詳細な説明］
［抗体分子］
本発明の文脈において、抗体分子は別の分子に対して結合特異性を有する分子である。抗体分子は、免疫グロブリン又はその一部、又は抗体結合ドメインであるか若しくは抗体結合ドメインと同種の結合ドメインを含む任意のポリペプチドのことを言うと理解すべきである。特異抗体分子は、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、及びそれらの抗体フラグメント、及び別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体を含む。抗体擬態物も抗体分子に含まれる。抗体分子は無傷抗体又はそのフラグメントとすることができる。
【００７０】
無傷抗体は、H鎖及びL鎖から成り、各々がそれぞれVＨ及びVＬで示される可変領域を担持する免疫グロブリン分子を含む。可変領域は、３つの相補性決定領域（超可変領域としても知られるCDR）及び４つのフレームワーク領域（FR）又は骨格領域から成る。CDRは、抗原分子と相補性立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。
【００７１】
抗体フラグメントは、無傷抗体の結合能力を保有することができ、無傷抗体の代わりに使用できる。従って、本発明の目的のため、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「抗体分子」は抗体フラグメントを含むと解釈すべきである。抗体フラグメントの例は、Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, dAb, 及びFvフラグメント, scFvs, 二重特異性scFvs,ダイアボディ（diabodies）、線形抗体（特許文献１の実施例２；非特許文献１を参照）、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含む。
【００７２】
Fabフラグメントは、VＨ及びCH１と共に全L鎖（VＬ及びCL）から成る。Fab’ フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、CH１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有することにより、Fabフラグメントと異なる。F(ab’)2フラグメントは、２つのジスルフィド結合のFabフラグメントを含む。
【００７３】
Fdフラグメントは、VＨドメイン及びCH１ドメインから成る。
【００７４】
Fvフラグメントは、単一抗体のVＬ及びVＨドメインから成る。
【００７５】
単鎖Fvフラグメントは、scFvが抗原結合部位を形成できるようにするリンカーによりつながれたVＨドメイン及びVＬドメインを含む抗体フラグメントである（非特許文献２を参照）。
【００７６】
ダイアボディは、Vドメインを鎖間ではなくて鎖内に対形成させて、多価のフラグメント、すなわち、２つの抗原−結合部位を有するフラグメントが得られるように、VＨドメインとVＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０の残基）を有する、scFvフラグメント（前段落を参照）を構成することにより調製される小形の抗体フラグメントである（例えば、特許文献２、特許文献３及び非特許文献３を参照）。
【００７７】
フラグメントにはさらに、個々のCDRも含まれる。
【００７８】
上記のように、本発明において使用の及び使用のための抗体分子は、IMAB６又はIMAB７の抗体に限定されず、アポトーシス細胞又は死細胞又はそれらの細胞成分に結合する能力を維持するが、生存細胞に結合しない他の抗体分子にも拡張される。
【００７９】
従って、本発明の第3の態様の実施形態では、抗体分子は、死細胞及びアポトーシス細胞に対して結合特異性を有する抗体分子であって、該抗体分子は、Seq ID No:1又はその変異型と、Seq ID No:2又はその変異型と、Seq ID No:3又はその変異型とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及び／又はSeq ID No:4又はその変異型と、Seq ID No:5又はその変異型と、Seq ID No:6又はその変異型とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含む。
【００８０】
Seq ID No:1〜6に対応するアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Seq ID No: 1:
T G Y T F S S Y W I E
Seq ID No: 2: 
E I L P G S G S T N Y N E K F K G 
Seq ID No: 3: 
G G T A R A T H Y A M D Y 
Seq ID No: 4: 
K A S Q S V S N D V A 
Seq ID No: 5: 
Y A S N R Y T 
Seq ID No: 6: 
Q Q D Y S S P Y T 
【００８１】
抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及び／又はSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含むことができる。
【００８２】
抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つ、及びSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む抗原結合ドメインを含むことができる。
【００８３】
抗体分子は、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも２つ、及び／又はSeq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも２つを含む抗原結合ドメインを含むことができる。
【００８４】
抗原結合ドメインは、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含むことができる。このような実施形態では、抗体ＶＨドメインは、Seq ID No:1と、Seq ID No:2と、Seq ID No:3とからなるグループから選択したアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、抗体ＶＬドメインは、Seq ID No:4と、Seq ID No:5と、Seq ID No:6とからなるアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含むことができる。一実施形態では、抗体ＶＨドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれアミノ酸配列Seq ID No:1、Seq ID No:2及びSeq ID No:3を有するＣＤＲを含むことができる。
【００８５】
一実施形態では、抗体ＶＨドメインは、アミノ酸配列Seq ID No:7を有する。抗体ＶＬドメインは、ＣＤＲ１、２及び３としてそれぞれアミノ酸配列Seq ID No:4、Seq ID No:5及びSeq ID No:6を有するＣＤＲを含むことができる。
【００８６】
本発明の第3の態様の一実施形態では、抗体ＶＬドメインは、アミノ酸配列Seq ID No:8を有することができる。一実施形態では、第３の態様の抗体分子は、受託番号第０７１２０４０９号でＥＣＡＣＣに預託された細胞株から得ることができるIMAB6抗体分子である。
【００８７】
Seq ID No:7及び8に対応するアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Seq ID No: 7: 
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGTARATHYAMDYWGQGTSVTVSS 
Seq ID No: 8: 
DIVITQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDF TFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR
【００８８】
既知の抗体のＣＤＲを決定することは、当業者にとって、いつものことであり、従って、本明細書で提供されるように、IMAB7抗体を用いて、これらの抗体のＣＤＲを容易に同定することができる。
【００８９】
一実施形態では、抗体分子は、IMAB7抗体のL鎖のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲ（すなわち、CDRL1、CDRL2、CDRL3）のうちの少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つか、又は３つ全てを含む抗原結合ドメインを含む。
【００９０】
一実施形態では、抗体分子は、IMAB7抗体のＨ鎖のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲ（すなわち、CDRH1、CDRH2、CDRH3）のうちの少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つか、又は３つの全てを含む抗原結合ドメインを含む。
【００９１】
一実施形態では、抗体分子は、IMAB7のCDRL1、CDRL2及びCDRL3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つ、例えば、２つの又は３つのＣＤＲを有する抗体ＶＬドメインを含み、又は、抗体ＶＨドメインは、IMAB7のCDRH1、CDRH2及びCDRH3のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する少なくとも１つの、例えば、２つの又は３つのＣＤＲを有する。
【００９２】
一実施形態では、抗体ＶＬドメインは、IMAB7の抗体ＶＬドメインに相当し、及び／又は、抗体ＶＨドメインは、IMAB7の抗体ＶＨドメインを含む。
【００９３】
一実施形態では、抗体分子は、抗体ＶＨドメイン、抗体ＶＬドメイン又は両方を含む。
【００９４】
１つ以上のアミノ酸残基が変更されるこのような抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、ＣＤＲ配列として用いることもできる。ＣＤＲの変異型のアミノ酸配列において変更されるアミノ酸残基は、全ＣＤＲの内で、好ましくは３０％以下であり、より好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。このような変異型は、本出願及び既知の技術の教示を用いて提供することができる。ＣＤＲは、抗体のH鎖又はL鎖の配列又はそれらの一部を含むフレームワーク構造内に担持することができる。好ましくは、このようなＣＤＲは、自然発生のＶＨドメイン及びＶＬドメインのＣＤＲの位置に相当する位置に位置付ける。このようなＣＤＲの位置は、非特許文献４に説明されているように、決定することができる。
【００９５】
さらに、変更は、可変領域のフレームワーク領域（FR）に対して代替的に又は追加的に行うことができる。フレームワーク領域（FR）内でのこのような変更は、抗体の安定性を向上し、抗体の免疫原性を減らすことができる。
【００９６】
本発明で使用の及び使用のための抗体は、「キメラ」抗体を含み、キメラ抗体内で、H鎖及び／又はL鎖の部分は、特定種から導かれた抗体又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一又は同種であり、一方、鎖の残余は、所望の生物活性を示す限りそのような抗体フラグメントと同様に、別の種から導かれた抗体又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一又は同種である（特許文献４及び非特許文献５を参照）。ここで対象とするキメラ抗体は、非ヒトの霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列から導かれる可変領域の抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００９７】
［抗体の生産］
上で論じたように、IMAB6抗体及びIMAB7抗体を生産するハイブリドーマは、それぞれ受託番号第０７１２０４０９号及び第０７１２０４１０号で２００７年１２月４日にＥＣＡＣＣに預託された。本発明で使用の及び使用のための他の抗体分子は、天然に又は合成的に任意の適切な方法で生産することができる。このような方法は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（非特許文献６）、組み換えＤＮＡ技術（例えば、特許文献４を参照）又は抗体ライブラリを用いるファージ提示技術（例えば、非特許文献７及び非特許文献８を参照）を含むことができる。他の抗体生産技術は非特許文献９に説明されている。
【００９８】
従来のハイブリドーマ技術は、抗原を結合できるリンパ球の生産を導き出すために、典型的には、マウス又は他の動物の免疫付与に抗原を関係させる。リンパ球は、単離されて、骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成して、それから、ハイブリドーマ細胞は、親の骨髄腫細胞の成長を抑制するが、ハイブリドーマ細胞を生産する抗体の成長を可能にする条件下で培養される。ハイブリドーマは、生産される抗体の結合特異性を変更したり、しなかったりする場合もある、遺伝子の突然変異の影響を受ける可能性がある。合成抗体は、既知の技術を用いて作ることができる（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１を参照）。
【００９９】
抗体分子のＶＨ、ＶＬ又はＣＤＲにおいて、又は実際にはフレームワーク領域（FR）において、既知の任意の適切な技術を用いて、変更をすることができる。例えば、可変ＶＨドメイン及び／又は可変ＶＬドメインは、ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３を、そのようなＣＤＲを欠くＶＨドメイン又はＶＬドメインに導入することにより、作ることができる。非特許文献８は、シャッフリング技術を説明しており、そのシャッフリング技術において、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーが生成されて、それから、新規なＶＨ領域を作る特別な抗体のＣＤＲ３に結合される。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲが生成された配列を含む新規なＶＨドメイン及びＶＬドメインを作ることができる。
【０１００】
従って、本発明で使用するための抗体分子は以下の工程（ａ）〜（ｅ）を備える方法によって生産することができる。
（ａ）可変ドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供する工程であって、前記可変ドメインは、置換すべきＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を含み、又は、核酸は、そのようなＣＤＲのコード領域を欠く工程。
（ｂ）前記レパートリーを、Seq ID No:1,2,3,4,5又は6として本明細書に示すような配列を有するアミノ酸配列をコードするドナー核酸と結合して、可変ドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供するために、ドナー核酸を、レパートリー内のＣＤＲ領域に挿入する工程。
（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現する工程。
（ｄ）アポトーシス細胞又は死細胞に特有な特異的抗原結合フラグメントを選択する工程。
（ｅ）特異的抗原結合フラグメント又はそれをコードする核酸を回収する工程。
【０１０１】
本発明の変異型抗体を生産する代替技術は、例えば、変異性ＰＣＲ（非特許文献１２を参照）を用いて、ＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードするランダム突然変異遺伝子を含むことができる。追加的に又は代替的に、ＣＤＲは、例えば、非特許文献１３及び非特許文献１４により説明された分子進化的手法を用いて、突然変異生成の標的にすることができる。
【０１０２】
このような変異型を生産して、抗体及びフラグメントは、所望の活性、例えば、非生存のアポトーシス細胞及び／又は死細胞を選択的に結合する能力に対して、テストすることができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態で、本発明の抗体は標識化することができる。使用できる標識は、放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はビオチンのような酵素標識を含む。本発明で用いる検出可能な試薬は、技術的に任意の適切な方法を用いて検出することができる。例えば、一実施形態で、試薬は、試薬特有の抗体を用いて検出することができる。別の実施形態で、試薬は標識化することができる。任意の適切な標識を用いることができる。例えば、使用できる標識は、フェリチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びそれらの誘導体のようなタンパク質に限定されることなく、例えばフルオレセインのような蛍光マーカー、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、又は３５Ｓのような放射性標識、アルコールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼのような酵素、エバンスブルー又はクマシーブリリアントブルーのような染料、検出可能な金属又は検出可能な免疫グロブリンを含む。
【０１０４】
核酸
一実施形態で、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子を提供する。本発明の及び本発明用の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。核酸は、組み換え技術により、合成的に、又は標準技術を用いるクローニングを含めて技術的に利用可能な任意の手段により、生産することができる。
【０１０５】
核酸は、任意の適切なベクターに挿入することができる。本発明の核酸を含むベクターは、本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態で、ベクターは発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞内に核酸を発現させることができる制御配列に動作可能にリンクされる。様々なベクターを用いることができる。例えば、適切なベクターは、例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスのようなウイルス、酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド又はコスミドＤＮＡを含むことができる。
【０１０６】
ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞内に導入するために、用いることができる。多種多様の宿主細胞を本発明の核酸の発現のために用いることができる。本発明用の適切な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞とすることができる。それらは、例えば、大腸菌、酵母菌のような細菌、昆虫細胞及び哺乳類細胞を含む。使用できる哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、NS0骨髄腫細胞、サル細胞株、ヒト細胞株、それらの派生物及び他の多くのものを含む。
【０１０７】
遺伝子産物の発現を調整し、遺伝子産物を組み換え、及び／又は遺伝子産物を特殊に処理する宿主細胞株を使用することができる。このような処理は、グリコシル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成及び一般的翻訳後修飾を含むことができる。
【０１０８】
従って、本発明は、また、本発明の１つ以上の核酸、又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１０９】
本発明には、また、本発明の抗体分子の生産方法も含み、その方法は、核酸からの抗体分子の発現が起きる条件下で、本発明の核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び、抗体分子を随意単離及び／又は純化することを含む。
【０１１０】
例えば核酸構築物の調製のような核酸の操作、突然変異生成、シークエンシング、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子の発現、並びにタンパク質の解析のための既知の技術及びプロトコルに関するさらなる詳細については、例えば、非特許文献１５及び非特許文献１６を参照されたい。
【０１１１】
分離法
上記のように、本発明は、細胞又は細胞成分を、細胞培養調合液、血液、血清又は任意の他の生体試料のような試料から分離する方法を含む。このような方法において、本発明の及び本発明用の抗体分子は、一旦標的細胞又は標的細胞成分に結合された抗体分子の分離を可能にするために、基質に共役させることができる。
【０１１２】
固定化技術又は分離技術で用いることができる任意の適切な固体基質を使用することができる。このような基質は、ビーズ、シート、粒子、膜などの形状にすることができる。一実施形態において、基質は、結合能力を高めるために、特別の材料から作られる。本発明の特別の実施形態において、抗体分子は、磁性粒子又は磁性ビーズに共役させる。このような磁性粒子又は磁性ビーズは、磁界を加えることにより、試料から容易に分離することができる。
【０１１３】
それらの抗体及びフラグメントは、既知の適切な技術を用いて、磁性粒子のような基質に結合することができる。結合は、直接的に又は間接的にすることができる。一実施形態において、抗体は、例えば、基質上にある官能基により、基質に共有結合させることができる。このような官能基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基又はアルデヒド基を含むことができる。
【０１１４】
使用できる特別の方法は、抗体をスルホニルエステルを有する基質に結合することを含む。スルホニルエステルは、抗体上で、アミノ基又は−SH基と反応して、CH２−NH又はCH２−S−を生み出す。抗体を基質に結合する別の方法は、基質上にカルボキシル基を供給することであり、カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドと共に活性化することにより、支持体（基質）と抗体との間にアミノ結合を形成する。アミノ基を含む支持体は、グルタルアルデヒドを用いて活性化することができて、抗体のアミノ基と共有結合を形成する。
【０１１５】
上記のように、本発明の特別な実施形態において、抗体は、標的細胞又は標的細胞成分と接触させられて、二次抗体を必要とせずに、分離される。このような実施形態において、抗体は、標的細胞又は標的細胞成分と接触する前に、基質に結合することができる。代替の実施形態において、標的細胞又は標的細胞成分に結合する抗体は、二次抗体により、又は、任意の抗体がビオチンで標識される場合、実際には、（ストレプト）アビジンのような結合パートナーにより、分離することができる。
【０１１６】
本発明の方法は、陽性細胞選択又は陰性細胞選択のために用いることができる。陽性細胞選択では、関心のある細胞が結合されて、試料から除去される。対照的に、陰性細胞選択では、瀕死細胞若しくは死細胞又は瀕死細胞若しくは死細胞からの実成分のような汚染細胞が、試料から除去される。
【０１１７】
上記のように、本発明の特別な実施形態は、試料内の生存細胞の数を最適化するために、細胞培養試料のような細胞試料に対し、死細胞、瀕死細胞又はアポトーシス細胞の除去に関する。従って、本発明の方法は、細胞培養の高質化戦略に用いることができる。特別な実施形態において、本発明は、非生存細胞及びその成分の除去により、細胞培養の質を高めるために磁性活性化細胞選別法を含む。
【０１１８】
状況次第で、特別な陽性選択プロトコルでは、結合細胞（又は細胞成分）を抗体分子から分離することが所望される。このような分離を達成するためのいくつかの技術は、周知である。このような技術は、例えば、機械技術であり得（例えば、特許文献５及び特許文献６を参照）、又は、例えば、パパイン若しくはキモパパインを用いる酵素技術であり得る。
【０１１９】
治療
「治療」とは、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意の養生法を含む。治療は、既存の状態に関することもあり、又は予防（予防的措置）でもあり得る。治療は、治療効果、軽減効果又は予防効果を含むことができる。
【０１２０】
「癌の治療」は、癌性増殖及び／又は血管新生により引き起こされる病気の治療を含み、かつ、腫瘍性成長又は腫瘍の治療を含む。本発明を用いて治療することができる腫瘍の例は、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む非上皮性悪性腫瘍、例えば乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、子宮頸部癌及び卵巣癌の上皮性悪性腫瘍、非小細胞肺癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、腎芽細胞腫、急性リンパ性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星状細胞腫、神経膠腫、及び網膜芽細胞腫である。
【０１２１】
本発明が利用法を見つける炎症性疾患は、限定はされないが、腹膜炎、関節炎、胸膜炎、肺線維症、全身性硬化症及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような炎症性疾患を含む。本発明が有用な他の疾患は、炎症性肺疾患、アトピー性皮膚炎、ＮＥＲＤＳ（結節、好酸球増多症、リウマチ、皮膚炎及び腫脹）、肺線維症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発動脈炎及びヴェーゲナー肉芽腫症を含む脈管炎肉芽腫性疾患、サルコイド、特発性肺線維症、自己免疫疾患、好酸球性肺炎、心筋梗塞による再かん流傷害、アテローム、糸球体腎炎、関節リウマチ及び痛風を含む。
【０１２２】
［医薬組成物］
本発明による、及び、本発明で用いる医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬品として許容できる賦形剤、キャリア、緩衝安定剤、又は他の当業者に周知の物質を含むことができる（例えば、非特許文献１７を参照）。このような物質は、アセテート、トリス、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝剤；抗酸化物質；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンのようなアミノ酸；炭水化物；キレート剤；強壮剤及び界面活性剤を含むことができる。
【０１２３】
医薬組成物は、特定の適応症に必要であるとして選択され、好ましくは、本発明の医薬組成物の活性に悪影響を与えない相補的な活性を有する１つ以上のさらなる活性化合物も含むことができる。活性成分は、ミクロスフェア、マイクロカプセルリポソーム、他の微粒子送達システムにより投与することができる。例えば、活性成分は、マイクロカプセル内に封入することができ、マイクロカプセルは、例えば、液滴形成技術又は界面重合法により調製することができ、例えば、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内に、又は、マクロエマルジョン内に、それぞれ、ヒドロキシ・メチルセルロース、又は、ゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリル酸塩）−マイクロカプセルを封入し得る。詳細は、非特許文献１７を参照されたい。
【０１２４】
徐放性製剤を、活性薬剤の送達のために用いることができる。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体の疎水性ポリマーによる半透過性の基質を含み、その基質は、例えば、フィルム、坐薬又はマイクロカプセルのような造形品の形である。徐放性基質の例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリル酸塩）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（特許文献７）、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸塩の共重合体、非分解性のエチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１２５】
投与量
本発明の、及び、本発明で用いる抗体は、必要に応じて、個人に利益を示すのに十分な「治療に有効な量」で個人に適切に投与される。実際の投与レジメンは、治療される疾患、疾患の重症度、治療される患者、用いる薬剤を含む多数の要因に応じ、医師の裁量下にある。
【０１２６】
本発明は、以下の限定しない実施例でさらに説明する。以下の添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】スタウロスポリンによるアポトーシスの誘導後のＰＩ−陰性のＢＬ細胞にＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７の区別を示す標識を付けることを例示する図である。
【図２】光散乱及びＰＩ蛍光アッセイを用いる ‘生存’ＢＬ細胞又は死ＢＬ細胞の識別を例示する図である。
【図３】スタウロスポリンによるアポトーシスの誘導後のＰＩ−陰性（アポトーシス細胞）及びＰＩ−陽性（死細胞）のＢＬ細胞にＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７の区別を示す標識を付けることを例示する図である。
【図４】スタウロスポリンによるアポトーシスの誘導後の‘生存’細胞光散乱区域及び死細胞光散乱区域にＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７の区別を示す標識を付けることを例示する図である。
【図５】スタウロスポリンを用いて、ＢＬ細胞でのアポトーシスの誘導後の‘生存’細胞光散乱区域での、アポトーシス細胞の徐々の出現を例示する図である。
【図６】冷凍保存後に、ＢＬ細胞でのアポトーシスの誘導後の‘生存’細胞光散乱区域での、アポトーシス細胞の徐々の出現を例示する図である。
【図７】アポトーシスの胸腺細胞についてのアネキシンVとＩＭＡＢ６との同程度の反応性を例示する図である。
【図８】ＰＩ−陰性のアポトーシスのＢＬ細胞についてのアネキシンVとＩＭＡＢ６との同程度の反応性を例示する図である。
【図９】ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７が、リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と反応することを例示する図である。
【図１０Ａ】ＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子による、死細胞の直接の枯渇を例示し、３つの異なる方法により死細胞を枯渇した細胞の試料における、トリパンブルー（trypan blue）の染色で陽性の細胞の割合を例示する棒グラフの図である。
【図１０Ｂ】ＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子による、死細胞の直接の枯渇を例示し、図１０Ａと同じ方法を用いて、死細胞を枯渇した後の細胞の試料における、ＦＡＣＳにより評価した死細胞の割合を例示する図である。
【図１１】死細胞の枯渇のための細胞と磁性粒子との相互作用は、試料の回転により改善されないことを例示する図である。
【図１２】３７℃で完全な培養基でのＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子によるＢＬ死細胞の効率的な枯渇を例示する図である。
【図１３】３７℃で完全な培養基でのＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子によるＢＬ死細胞の効率的な枯渇の相互作用の時間の効果を例示する図である。
【図１４】ＩＭＡＢ６に結合した３００nm及び５００nmの磁性粒子によるＢＬ培養からの直接の死細胞の枯渇を例示する図である。
【図１５】フローサイトメトリーによる生存細胞と死細胞とを分離するためのＩＭＡＢ６の使用を実証するための実験結果を例示する図である。
【図１６】ＩＭＡＢ６の標識化によりアポトーシス細胞から放出される微粒子の検出を例示する図である。
【図１７】微粒子、ブレブ及びアポトーシス細胞の分離を例示する図である。
【図１８】ＩＭＡＢ６が生体内のアポトーシス細胞への免疫反応を調整することを例示する図である。
【図１９】ＩＭＡＢ６のＨ鎖の可変（Ｖ）領域の核酸及びアミノ酸の配列を例示し、ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を示す図である。
【図２０】ＩＭＡＢ６のＬ鎖の可変（Ｖ）領域及び固定領域の核酸及びアミノ酸の配列を例示し、ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
［1.ＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７は、アポトーシスを起こしている細胞の異なるエピトープを認識して、生存細胞と、アポトーシス細胞と、死細胞とを見分ける］
ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、当業者に標準的な手続きを用いて、BALB/cマウスの免疫付与及び免疫脾臓細胞とNS0骨髄腫細胞との融合により生成した。抗体のイソタイプは、どちらの場合にもIgM（免疫グロブリンM）とした。
【０１２９】
［実施例１］
ヒトのバーキットリンパ腫（ＢＬ）細胞株ＢＬ２を誘導して、プロテインキナーゼ阻害剤である、スタウロスポリン（１μM）で３０分〜４時間の指示時間（図１）の間、３７℃での刺激によって、アポトーシスを迅速且つ同時に起こさせた。スタウロスポリンは、多くの細胞型において周知のアポトーシス誘導剤である（同一の機構により誘導されたアポトーシスＢＬ細胞にアネキシンVが結合することの実証は後を参照）。次に、細胞を採取して、標準の処理により、ＩＭＡＢ６又はＩＭＡＢ７の抗体で標識化した。これらの抗体は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでいるＲＰＭＩ１６４０培地で培養するＩＭＡＢ６又はＩＭＡＢ７のハイブリドーマ培養の無細胞の上澄み製剤から調合した。ＩＭＡＢ６は、セントリプラス（Centriplus）限外ろ過装置(ミリポア(Millipore)、ＭＷカットオフ１００，０００kDa)を用いて濃縮した。ＩＭＡＢ７は、硫酸アンモニウムの沈殿により調合されて、その後にリン酸緩衝食塩水（PBS、Ca2+及びMg2+がない）に対する透析が続く。抗体（４０μl）は、ＢＬ２細胞（５×１０５）に加えられて４℃で３０分間インキュベートされた。細胞は、５％の陽性常ヤギ血清（NGS）を含むPBS内で洗浄されて、その後、４０μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG（免疫グロブリンG）（全分子）フルオレセインイソチオシアネート（FITC）共役（GAM）、シグマ、PBS/5% NGS内で１：２５）内で、４℃でさらに１５分間インキュベートされた。PBS/5% NGS内でさらに洗浄後、細胞は、プロピジウムヨウ化物を含む同一の緩衝剤（PI、シグマ、０．８μg/ml）で再懸濁されて、当業者に標準の手続きを用いて、ベックマン・コールター（Beckman Coulter）ＸＬフロー血球計算器でアッセイされた。
【０１３０】
図1は、スタウロスポリン治療後、指示時間でのＰＩが陰性（すなわち、細胞膜の完全性を保つ）である染色した細胞調合液の蛍光ヒストグラムを示す。ＧＡＭ（赤のヒストグラム）は、背景標識を示す。ほとんどすべての細胞は、スタウロスポリンの刺激後、３時間でＩＭＡＢ６は確実に染色されるが、一方、ＩＭＡＢ７は、この時間では、どの細胞も標識を付けられない。
【０１３１】
追加のフローサイトメトリーアッセイ（図３及び４）は、ＩＭＡＢ７が陽性常細胞膜を保つ細胞に結合することができないのに、この抗体が溶解した細胞に結合することを示す（これは、インビトロのアポトーシスプログラムの遅発性の特徴である）。フローサイトメトリーは、光散乱パラメータを用いて染色しない調合液で、死ＢＬ細胞と生存ＢＬ細胞又はアポトーシスＢＬ細胞との識別を可能にすることは、以前に実証されている（非特許文献１８）。これを例示するために、図２は、ＢＬ細胞が、前方への及び側方への光散乱に基づき、死細胞又は‘生存’細胞を表わす細胞集団区域に分割することができることを実証する（図２の左のパネル）。ＰＩ蛍光アッセイは、死細胞の区域に収まる細胞はＰＩ−陽性であり、一方、‘生存’細胞の区域に収まる細胞はＰＩ−陰性である（図２の右のパネル）。実際には、‘生存’細胞は、真の生存細胞かそれとも瀕死細胞を含み、瀕死細胞は、アポトーシスに達しているが、細胞膜の完全性を保っている細胞である。このような瀕死細胞は、アネキシンVかそれともＩＭＡＢ６（ＩＭＡＢ７ではない）を用いて視覚化することができる。
【０１３２】
［実施例２］
スタウロスポリン治療後、３時間でのＰＩ−陰性及びＰＩ−陽性のＢＬ細胞集団を比較する。これらの細胞の蛍光ヒストグラムは、ＰＩ−陽性（死細胞）及び‘生存’細胞の区域ＰＩ−陰性（アポトーシス細胞、瀕死細胞）は共にＩＭＡＢ６の標識を付けるが、一方、ＰＩ−陽性はＩＭＡＢ７の標識を付けるが、ＰＩ−陰性はＩＭＡＢ７の標識を付けない。
【０１３３】
これらの結果は、図4で確認されるが、同じスタウロスポリン治療の細胞のＩＭＡＢ６／７の標識特性は、光散乱の特徴によりアッセイされる。図示するように、死細胞の区域及び‘生存’細胞の区域（この場合、主に、アポトーシス細胞）は共にＩＭＡＢ６の標識を付けるが、一方、死細胞の区域はＩＭＡＢ７の標識を付けるが、‘生存’細胞の区域はＩＭＡＢ７の標識を付けない。
【０１３４】
まとめると、これらの結果は、ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７が、瀕死（アポトーシス）細胞及び死細胞の異なるエピトープに結合し、これらの抗体が（１）生存細胞、（２）瀕死細胞、及び（３）死細胞を区別するために、用いることができることを実証する。
【０１３５】
［2．ＩＭＡＢ６は、異なる種での多数の刺激により誘導されたアポトーシスの段階をモニターするために用いることができ、アネキシンVと同じ細胞に標識を付ける］
［実施例３］
図５は、上記のように、スタウロスポリンで刺激され、ＩＭＡＢ６の標識を付けられたＢＬ２細胞を示す。この場合、結合したＩＭＡＢ６は、ヤギ抗マウスIgG（免疫グロブリンG）（全分子）フィコエリトリン共役（シグマ、ＰＢＳで１：２５／５％ＮＧＳ）を二次抗体として用いて、可視化する。この実験は、‘生存’細胞の光散乱区域で、０時間での約５％から、１時間での２６％を経て、３時間での９５％を超えるまで、アポトーシス細胞の徐々の出現を実証する。
【０１３６】
［実施例４］
図６では、冷凍保存後の解凍に続いて、ＢＬ細胞においてアポトーシスが誘発された。５％ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＦＣＳで懸濁されたＢＬ２細胞は、１分当たり約１℃の割合の標準手続きの後に、−８０℃に冷凍された。その後、細胞は、３７℃で急速に解凍され、ＤＭＳＯを除去するために、洗浄され、培地（２mMのＬ−グルタミン酸及び１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁された。指示された時間に、細胞は、上記のように、ＩＭＡＢ６の標識を付けられて、フローサイトメトリーによりアッセイされた。図6に示すように、‘生存’細胞の光散乱区域での、アポトーシス細胞の徐々の出現は、死細胞の区域での、死細胞のかなりの数の出現の前に、ＩＭＡＢ６の標識を付けることにより、明らかにされる。
【０１３７】
［実施例５］
ＢＬ２細胞は、Ｂ細胞由来のヒト腫瘍細胞株である。図７は、ＩＭＡＢ６がアポトーシスの主マウス胸腺細胞も結合し、その反応性は、（ａ）ヒト細胞、（ｂ）悪性細胞、（ｃ）細胞株、又は（ｄ）Ｂ系統細胞に制限されない。胸腺は、BALB/cマウスから注意深く解剖されて、胸腺細胞の懸濁は、２つのガラスの顕微鏡スライドの冷凍した両端間で器官をすりつぶした後、標準手続きにより分離された。胸腺細胞は、デキサメタゾン（１００ｎＭ）を用いる一晩中のインキュベーションによりアポトーシスを起こすように誘導された。胸腺細胞は、その後、（１）上記のように、ＩＭＡＢ６及びFITC共役GAMの標識を付けられるか、又は（２）製造業者の指示により、FITC共役アネキシンV（ベンダー（Bender））の標識を付けられて、アネキシンV共役は、アネキシンV結合段階中に及び後に２．５mM Ca2+の常駐を必要とする（注記：上記の標識化方法により実証されたように、ＩＭＡＢ６は、アネキシンVの場合のように、標識化される細胞への結合されるＩＭＡＢ６の標識化プロセスかそれともメンテナンスにおいて、Ca2+に対するこのような要求を有しない。）。図７に示すように、標識化される細胞のフローサイトメトリーの分析は、胸腺細胞についてのアネキシンVとＩＭＡＢ６との同程度の反応性（青のヒストグラム）を明らかにする。赤のヒストグラムは、背景の蛍光を示す（アネキシンVの場合は、標識化されない胸腺細胞であり、ＩＭＡＢ６の場合は、二次抗体のみにさらされた胸腺細胞である。）。
【０１３８】
［実施例６］
図８は、ＩＭＡＢ６がアネキシンVと同程度の反応性を有することを、さらに、実証する。この実験シリーズで、ＢＬ２細胞は、スタウロスポリンを用いてアポトーシスに誘導されて、ＩＭＡＢ６／ＦＩＴＣかそれともアネキシンV／ＦＩＴＣで標識化され、さらに、フローサイトメトリーにより説明され分析される方法を用いてプロピジウムヨウ化物で標識化される。プロピジウムヨウ化物の染色がない場合のアネキシンVでの標識化は、アポトーシスを評価するために一般的に使用される。図８は、スタウロスポリンによる刺激後、様々な時間でのＩＭＡＢ６の陽性細胞の％（黒色）及びアネキシンVの陽性細胞の％（市松模様）で、アポトーシスを起こしているＰＩ陰性細胞について、アネキシンV及びＩＭＡＢ６の反応性を比較する。その結果は、ＩＭＡＢ６の反応性が、アネキシンVの反応性に近似しており、抗体が、経時変化の初期段階の間、わずかにより反応しやすく見えることを実証する。
【０１３９】
［3．ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７は、リン脂質に結合する］
［実施例７］
ＩＭＡＢ６の特異性は、標準的アプローチを用いて、ＥＬＩＳＡでリン脂質に対してテストした。手短に、ＥＬＩＳＡプレートの源泉は、リン脂質（ａ）ホスファチジルセリン（ＰＳ）、（ｂ）ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）又は（ｃ）ＰＳとＰＧとの組み合わせでコーティングした。リン脂質ストック（クロロホルムの中で１ｍＭ）は、１００μg/mlに希釈し、５０μlアリコートは、ＥＬＩＳＡプレートの源泉の中で室温で蒸発乾固した。源泉は、０．３％のゼラチンを含む１００μlＰＢＳを用いて、２時間、魚の皮（シグマ）からブロックし、３ＸＰＢＳを用いて洗浄し、その後、各々ＰＢＳ／ゼラチン内で１：１０に希釈された５０μlのＩＭＡＢ６又はＩＭＡＢ７に、１時間、３７℃でさらした。ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７の抗体は、セリーヌ（Celline）バイオリアクター（インテグラ（Integra）、ＩＭＡＢ６）か、それとも、加熱不活性化したＦＣＳが補充されたＲＰＭＩの中の組織培養瓶（ＩＭＡＢ７）かの、どちらかで成長する、対応のハイブリドーマ細胞の無細胞の上澄みであった。ＰＢＳ内でさらに３回洗浄した後、源泉は、ヤギ抗マウスIgM（免疫グロブリンM）-ペルオキシダーゼ抗体共役（シグマ、ＰＢＳ／ゼラチン内で１：１０００）にさらに１時間、３７℃でさらした。３ＸＰＢＳ洗浄後、源泉は、ペルオキシダーゼ基質（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（登録商標）ＯＰＤ（ｏ-フェニレンジアミン二塩酸塩、シグマ）を用いて、３５分間、室温でインキュベートし、Ｈ２ＳＯ４でブロックし、Anthos 96-源泉プレートリーダーを用いて４９２nmで読み取る。図９に示すように、ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７は、ＰＳ及びＰＧ両方共と反応する。このアッセイでは、リン脂質を受け入れないが、別の方法で同等に処理される源泉から、背景の吸光度値を記録した。ＩＭＡＢ６抗体の調合液を用いて達成したより高い吸光度値は、通常の培養瓶からよりも、セリーヌ（Celline）バイオリアクターから得られる、より高い抗体力価のためである。フローサイトメトリーのデータを考え合わせて、細胞についてではなく、ＥＬＩＳＡにおいて同一の反応性であるため、これらの結果は、ＩＭＡＢ６及びＩＭＡＢ７が、アポトーシスの間、細胞に異なってさらされるＰＳ及び／又はＰＧに異なるエピトープを指定することを実証する。
【０１４０】
[4．ＩＭＡＢ６は、死細胞を直接の枯渇により有効に除去するために、超常磁性の粒子に直接結合することができる］
［実施例８］
ヒトのＢ細胞株、ＢＬ２から死細胞を奪う以下の３つの方法がある。
方法１：磁石上の瀕死／死細胞を枯渇するために、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＧＡＭ）に結合した３００nmの超常磁性の粒子を用いた分離に続いて、モノクロナール抗体ＩＭＡＢ６の標識を瀕死の細胞及び死細胞に第一に付ける方法。
方法２：ＩＭＡＢ６に結合した３００nmの超常磁性の粒子を直接結合し、それから、磁石上の瀕死／死細胞を枯渇する方法。
方法３：Ficoll-Paque上の標準密度勾配の遠心分離による方法。
各々の方法に対して、分離後、枯渇した試料を、ＰＢＳ内で０．２％のトリパンブルー（trypan blue）を用いて染色し、試料中にとどまる死細胞の割合を顕微鏡によって評価した。並列の試料は、死細胞を上記のように、光散乱特性により規定して、フロー血球計算器（ＸＬ、ベックマン・コールター（Beckman Coulter））を用いてテストした（非特許文献１８）。結果を図１０に示す。
【０１４１】
カルボキシル活性化した３００nmの超常磁性の粒子（Ademtech, Pessac, France）は、その粒子の製造業者の指示により、ＥＤＣ（１-エチル-３-[3-ジメチルアミノプロピル]）カルボジイミド塩酸塩、Pierce, Rockford IL）を用いて、ＩＭＡＢ６（単独で、又は牛ラクトフェリン（ＬＦ）の存在下で、）か、それとも、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（シグマ、Aldrich, UK）のどちらかに結合した。磁気分離のために、細胞（１００μl、７．５×１０７/ml）は、−標識されていないか、それとも、洗浄後に、３０分間、４℃でＩＭＡＢ６抗体の標識を事前に付けるかのどちらかであるが、−０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＰＢＳ（Ca2+及びMg2+が含まれていない）及び０．１mgのＧＡＭ結合又はＩＭＡＢ６結合の磁性粒子を含む２mM ＥＤＴＡ（「マグセップ（Magsep）緩衝剤」）で再懸濁し、１．５mlエッペンドルフ管で４℃３０分間、弱い回転でインキュベートした。細胞及び粒子は、その後、０．５ml ＰＢＳ/ＢＳＡ/ＥＤＴＡ（マグセップ（Magsep）緩衝剤）で穏やかに再懸濁し、エッペンドルフ管を磁石上に４分間、置いて（Ademtech, Adem-Mag SV）、その後、懸濁液中の細胞を除去し、上記のように、生死判別試験を行った。Ficoll-PaqueＰＬＵＳ（Amersham）上の密度勾配の分離を、製造業者の指示により、行った。
【０１４２】
図１０Ａ及び図１０Ｂの両方から理解できるように、３００nmの超常磁性の粒子に直接結合したＩＭＡＢ６抗体は、最初の試料から死細胞を非常に有効に除去し、その効率は、標準密度勾配の遠心分離による方法（方法３）とほぼ同様である。相互作用／分離の緩衝剤中のＥＤＴＡの存在は、このシステムにおける効率的な死細胞の枯渇が、Ca2+を必要としないことを実証する。
【０１４３】
本実施例では、方法１（細胞にＩＭＡＢ６の標識を事前に付けて、ＧＡＭに結合した磁性粒子を用いて磁気枯渇を試みる方法）は、二次抗体の磁性粒子への非効率的な結合のため、失敗した可能性がある。方法１の試料の死細胞の明らかにより大きい数は、重要ではない。本実施例は、ＩＭＡＢ６を用いる間接的方法が、必然的に非効率的であることを証明せず、強化した粒子の結合により、改善できることが可能である。本実施例は、直接的方法が、非常に効率的であることを明白に証明する。ＩＭＡＢ６と共のＬＦの存在は、死細胞の枯渇において、粒子の有効性を改善することができなかった。
【０１４４】
［実施例９］
ＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子による、死細胞の直接の枯渇には、磁石を用いての枯渇工程の前に、粒子と死細胞との間の効率的な相互作用を必要とする。本実施例において、定常状態下、又は弱い回転での細胞と粒子との共同でインキュベートする効果を実証する。細胞及び粒子は、いくつかの修正をして実施例８と同様に取り扱った。修正は以下の通りである：相互作用／分離の緩衝剤は、上記のように、ＰＢＳ/ＢＳＡ/ＥＤＴＡマグセップ（Magsep）緩衝剤であり、細胞は５×１０７/mlであり、０．０５mgのＩＭＡＢ６に結合した３００nmの粒子との相互作用は、静圧管の中でか、それとも連続する弱い回転のどちらかで、４℃で１０、２０又は４０分間、行われた。死細胞は、上記のように、トリパンブルー（trypan blue）が陽性であるとして、顕微鏡によって数え上げた。図１１に示すように、回転は、死細胞の枯渇において、効率を促進することができなかった。実際、細胞の回転は、生死判別にマイナスの効果があった（少しのビーズ試料も、静的かそれとも完全に４０分間のローターのどちらかでも、インキュベートされなかった。）。
【０１４５】
［5．インビトロの生理的条件下でＩＭＡＢ６に結合した磁性粒子を用いる、死細胞の直接の枯渇］
［実施例１０］
本実施例では、ＩＭＡＢ６に結合した粒子による直接の死細胞の枯渇についての環境条件を変える効果を実証する。具体的に言うと、温度と緩衝剤培養基の両方共、変える。方法論は、以前の例で少し修正して説明したものと大まかに似ている。手短に、ＢＬ細胞（５×１０７/ml）は、マグセップ（Magsep）緩衝剤又は完全なＢＬ培養基（図１２のＢＬ培養基：１０％ＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ）における、０．０５mgのＩＭＡＢ６に結合した３００nmの粒子を有する静的１．５ml管の中で、４５分間、４℃、室温（ＲＴ）又は３７℃でインキュベートした。ビーズのない制御細胞は、３７℃でインキュベートした。磁石上の分離の後（４−５分）、陰性に選択された細胞は、０．８μg/ml ＰＩで標識化後、ＰＩ陽性細胞のフローサイトメトリーによる分析に従った。
【０１４６】
図１２に示すように、マグセップ（Magsep）緩衝剤（黒の棒）において、死細胞の枯渇（ＰＩ−陽性細胞の減少）の効率のわずかな変化のみ、温度の変化により得られた。しかしながら、細胞が完全なＢＬ培養基（市松模様の棒）での枯渇工程に従う際、最適な状態は、生理学的温度３７℃で達成した。これらの結果は、死細胞が、完全な培養基において最適な生理学的状態でＩＭＡＢ６に結合した粒子により、細胞培養から直接、効率的に枯渇することができることを実証する。
【０１４７】
［実施例１１］
さらに、図１３に示すように、前の実施例で説明した同一の方法論を用いた、３７℃での完全なＢＬ培養基における細胞と磁性粒子との相互作用の時間変化は、磁気分離の前に４０〜６０分の相互作用の時間を選ぶ場合、最適な効率に近づくことを示した。
【０１４８】
［実施例１２］
本実施例では、（ａ）２つの磁性粒子のサイズを比較し、（ｂ）粒子結合反応におけるＩＭＡＢ６抗体の濃度の効果をテストし、（ｃ）２つの順次的な磁気分離工程の効果を実証する。方法論は、３００nm及び５００nmの両方のカルボキシル活性粒子（Ademtech）のバッチを、第１の結合反応の２倍のＩＭＡＢ６抗体の濃度を受ける第２の結合反応を有する各サイズの粒子に対する２つの結合反応で用いたことを除いて、上記の実施例で説明したものと類似である。バッチは、図１４において、３００／１、３００／２、５００／１及び５００／２で区別する。３７℃で４０分間の完全な培養基における粒子と共に共同でインキュベートされたＢＬ細胞と共に、試料につき０．１mgの粒子を用いて、相互作用／分離の２つのモードを比較した。第１のモードは、上記実施例で説明したように、アデムテック（Ademtech）磁石（Adem-Mag SV）の中の１．５mlポリプロピレンのエッペンドルフ管の中であり、第２のモードは、イージーセップ（EasySep）磁石を用いるシステムセルテクノロジー（SystenCell Technologies）により提供される汎用磁気細胞分離プロトコルに続いて、１２×７５mm Falcon ２０５２ ＦＡＣＳ管（Becton Dickinson）の中であった。各々の場合に、細胞をＰＩで染色し、１〜２回の磁気分離後に、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１４９】
図１４に示すように、ＰＩ−陽性死細胞は、２種類の管、エッペンドルフ管及びＦＡＣＳ管を用いて類似の効率を有する３００nm及び５００nmの両方の粒子により枯渇した。より高いＩＭＡＢ６抗体の濃度に結合した３００nmの粒子が、最も効率的に機能した。大抵の死細胞は、第１の磁気分離の間に枯渇し、第２の枯渇工程では、陰性に選択された集団には、ほとんど影響がない。
【０１５０】
［実施例１３］
［フローサイトメトリーによる生存細胞と死細胞とを分離するためのＩＭＡＢ６の使用］
約５０％が生存で約５０％が死んでいるバーキットリンパ腫の細胞の混合体（プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）の蛍光により評価するように）は、ＦＩＴＣに結合した二次抗体により続いてＩＭＡＢ６でインキュベートされ、蛍光活性の細胞分類に従った。結果を図１５に示す。死細胞のパーセントをＩＭＡＢ６の陰性細胞の分類の前（５８．５％）及び後（４．３９％）で示す。これにより、ＩＭＡＢ６は、生存細胞を死細胞から分類するために有効に使用できることを実証する。
【０１５１】
［実施例１４］
［ＩＭＡＢ６の標識化によりアポトーシス細胞から放出される微粒子の検出］
細胞内微粒子（＜１μ）は、スタウロスポリンを３時間用いてバーキットリンパ腫の細胞を誘導し、その後、ＩＭＡＢ６／ＦＩＴＣを用いて免疫染色した後に、収集した。細胞から抽出した微粒子（ＭＰ）の標識化は、超遠心分離洗浄工程（１００，０００ｇ、２０分）を用いて行った。微粒子は、無血清培養内のスタウロスポリンで処理するＢＬ細胞の３時間のインキュベーション、弱い遠心分離（５０ｇ）による細胞の除去及びその後の無細胞上澄みの超遠心分離（１００，０００ｇ、２０分、４℃）により、準備した。微粒子は、蛍光ビーズ標準（ベックマン・コールター（Beckman Coulter）、バッキンガムシャー州、英国）を用いて、１００〜１０００nmの範囲にあると推定した。結果を図１６に示す。上部パネルは、細胞及び微粒子の光散乱特性を示す。下部パネルは、微粒子の選択的ゲーティングを示す。下部左パネルは、光散乱の対数を示し、下部中央パネルは、ＩＭＡＢ６の赤の染色を示し、下部右パネルは、光散乱との関連でのＩＭＡＢ６の染色の粒子の背景を示し、１μより小さいサイズの微粒子の範囲にわたる標識化を実証する。
【０１５２】
［実施例１５］
［微粒子、ブレブ及びアポトーシス細胞の分離］
ＩＭＡＢ６は、ポリスチレンに吸着し、生存及びアポトーシスのハイブリドーマ細胞の混合体、アポトーシス細胞から抽出したブレブ及び微粒子にさらした。結果を図１７に示す。微粒子の「砂」の中のブレブ及びアポトーシス細胞（矢印）に注意されたい。
【０１５３】
［実施例１６］
［生体内のアポトーシス細胞への免疫反応の調整］
バーキットリンパ腫の異種移植片が、非特許文献１９に記載されているように、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに発生し、ＰＢＳ（制御）又はＩＭＡＢ６抗体が接種された。その後、アポトーシスのレベル（カスパーゼ−３、ＴＵＮＥＬ）及びマクロファージ浸潤（ＣＤ６８、ガレクチン−３）を、免疫染色の組織切片の形態学的分析により評価した。結果を図１８に示す。ＩＭＡＢ６の（１）顕著に増加したアポトーシスのレベル及び（２）顕著に増加したマクロファージ浸潤のレベルの効果に注意されたい。これらの結果の１つの非制限的な解釈は、ＩＭＡＢ６が、強化したマクロファージ浸潤をもたらす腫瘍内のアポトーシス細胞のクリアランスを抑制することである。
【０１５４】
本明細書で参照した全ての文献は、本明細書に参照することにより組み込まれる。本発明の記載された実施形態の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求の範囲の発明は、このような特定の実施形態に過度に限定すべきでないことを理解すべきである。実際に、当業者に明らかな、本発明を実行するのに説明したモードの様々な修正は、本発明によりカバーされることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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