(57)【要約】  本発明は、新脈管形成および靱帯再生および／または軟骨再構成を制御するためのマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）およびそのある種の誘導体の使用に関する。Ｍ６Ｐおよびそのある種の誘導体は、特に靱帯再生および／または軟骨再構成に用いられる医薬組成物の調製に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
靱帯再生および／または軟骨再構成のための医薬組成物の調製を目的とする、少なくとも１種類の下記の式（Ｉ）
【化１】
2011520803.tif 000018
(上記式中、
Ｒ１は、線状または分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル基、ヒドロキシル、アミン、チオール、カルボキシル、アジドおよびニトリル基から選択される１個以上の官能基を含んでなるアルキル基、飽和または不飽和のＣ３−Ｃ６炭化水素を基礎とする環、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、チオール、カルボキシル、アジドおよびニトリル基から選択される１個以上の官能基を含んでなる飽和または不飽和のＣ３−Ｃ６炭化水素を基礎とする酸素、窒素および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでなる飽和または不飽和複素環を表し、
ｎは、０または１の整数であり、
Ｒ２は、下記の基（Ｇ１）−（Ｇ４）
【化２】
2011520803.tif 000019
（上記式中、
Ｒ３およびＲ’３は、同一または異なり、水素またはナトリウム原子を表し、
Ｒ４は、酸素または硫黄原子を表し、
矢印は、Ｒ２を有する炭素原子上の基の連結点を表す）
から選択される）
の化合物の活性成分としての使用。
【請求項２】
Ｒ１がメチル基を表す、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１について記載した官能化アルキル基がＣ１−Ｃ４モノ−およびジヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ４モノ−およびジアミノアルキル、Ｃ１−Ｃ４モノ−およびジチオアルキル、およびＣ１−Ｃ４モノ−およびジカルボキシアルキル基から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１について記載した炭化水素を基礎とする環がシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、フェニルおよびベンジル環から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１について記載した複素環を基礎とする環が、オキサジアゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、イミダゾール、チアジアゾール、ピロール、テトラゾール、フラン、チオフェン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペリジン、ピラン、ピラジンおよびピリダジン環から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物において、ｎ＝０であるとき、Ｒ２は基Ｇ３およびＧ４から選択され、ｎ＝１であるとき、Ｒ２はＧ１およびＧ２から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物が、Ｒ２が請求項１で定義した通りの基Ｇ１またはＧ３（上記式中、Ｒ３およびＲ’３は同一であり、ナトリウム原子を表す）を表すものおよびＲ２が請求項１で定義した通りの基Ｇ２またはＧ４（上記式中、Ｒ３はナトリウム原子を表す）を表すものから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物が、
メチル Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート、
メチル （二ナトリウム）Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート、
メチル ６，７−ジデオキシ−７−ナトリウムスルホナト−Ｄ−マンノヘプトピラノシド
（メチル ６，７−ジデオキシ−Ｄ−マンノヘプトピラノシド）ウロン酸、および
メチル ６−デオキシ−６−マロネート−Ｄ−マンノピラノシド
から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が、メチル ６，７−ジデオキシ−７−ナトリウムスルホナト−α−Ｄ−マンノヘプトピラノシド、メチル ６−デオキシ−６−マロネート−α−Ｄ−マンノピラノシド、および（メチル ６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノヘプトピラノシン）ウロン酸から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
医薬組成物が少なくとも１個の式（Ｉ）の化合物を含むポリマー性生物学的材料の形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新脈管形成（angiogenesis）および靱帯再生および／または軟骨再構成を制御するためのマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）およびそのある種の誘導体の使用に関する。Ｍ６Ｐおよびそのある種の誘導体は、特に靱帯再生および／または軟骨再構成を目的とする医薬組成物の調製に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
多くの病状は、新脈管形成の現象に関連した要素または段階を有するものとして記載されている。とりわけ、多くの癌、糖尿病性網膜症、アテローム性硬化症、関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、および炎症性病状または創傷治癒の遅延と関連した病状が挙げられる。
【０００３】
新脈管形成は、先在する毛細血管網状組織に由来する新生血管形成（neovascularization）の機構である。先在する血管からの小血管である毛細血管の出芽は、最良の場合には胚の発生および胎盤の着床中に生じ、これは創傷の治癒または血管の閉塞の克服の事例であるが、最悪の場合には癌（腫瘍の増殖および転移の発生）、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症または年齢と関連する黄斑変性などのある種の眼科疾患に見られる。これら総ての過程について、一般的機構は同じままである。内皮細胞の活性化によって、基底膜および周囲の細胞外マトリックスが分解する。定方向移動(directed migration)の後に増殖期が続く。細胞は、次いで毛細血管型の構造に分化して組織の成長に必要な脈管網状組織を形成する。近年、新脈管形成は単一因子によって制御されているのではなく、正常または腫瘍細胞によって産生されるインデューサーとインヒビターのバランスによって制御されていることが明らかになってきた。これらの因子の中で、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のようなポリペプチドが新脈管形成の重要なレギュレーターであると思われている。
【０００４】
多くの分子が、新脈管形成の阻害または活性化効果について検討されてきた。
【０００５】
新脈管形成の阻害に関しては、癌治療における最近の概念の変革は、腫瘍を灌漑する(irrigates)脈管網状組織を標的とすることにある。現在では、腫瘍内または腫瘍周囲の血管新生（vascularization）の展開は、腫瘍の増殖および血液系を介する転移による伝播のいずれにとっても重要な事象であることが十分に確認されている。２００５年１２月に、英語化学評論雑誌であるNatureは、新脈管形成にその論点を当て、臨床試験を受けている８０を含むと３００を上回るインヒビターが挙げられた。しかしながら、試験を行った最初の薬剤であるアンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、メタロプロテアーゼマトリックスインヒビターなどは、がっかりさせるモノであった。更に最近の分子の中では、ベバシズマブを挙げることができる。患者に投与すると、それは毛細血管を循環しているまたは腫瘍に拡散したある型のＶＥＧＦであるＶＥＧＦ−Ａを中和する。その最初の適応症は、２００４年における化学療法と組み合わせた転移性結腸直腸癌についてであった。それは、現在転移性腎臓癌、肺癌および乳癌に対する臨床試験中である。しかしながら、それは高血圧および出血の危険性を増加させることが観察されている。スニチニブおよびソラフェニブを挙げることもでき、それらは経口錠剤の形態で処方することができるという利点を有しかつ治療結果を助長する。それらは、高血圧、疲労または皮膚の問題のような幾つかの副作用を生じるといった欠点も有する。
【０００６】
従って、本発明者らは、マンノース−６−ホスフェートおよび下記に記載されるようなある種の選択されたその誘導体（式（Ｉ）の化合物）は新脈管形成阻害活性を有し、靱帯再生および／または軟骨再構成を可能にすることを見出した。
【０００７】
本発明の主題は、靱帯再生および／または軟骨再構成のための医薬組成物の調製を目的とする、少なくとも１種類の下記の式（Ｉ）
【化１】
2011520803.tif 000002
(上記式中、
Ｒ１は、線状または分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル基；ヒドロキシル、アミン、チオール、カルボキシル、アジドおよびニトリル基から選択される１個以上の官能基を含んでなるアルキル基；飽和または不飽和のＣ３−Ｃ６炭化水素を基礎とする環；ヒドロキシル、アミン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、チオール、カルボキシル、アジドおよびニトリル基から選択される１個以上の官能基を含んでなる飽和または不飽和のＣ３−Ｃ６炭化水素を基礎とする環；酸素、窒素および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでなる飽和または不飽和複素環を表し、
ｎは、０または１の整数であり、
Ｒ２は、下記の基（Ｇ１）−（Ｇ４）
【化２】
2011520803.tif 000003
(上記式中、
Ｒ３およびＲ’３は、同一または異なり、水素またはナトリウム原子を表し、
Ｒ４は、酸素または硫黄原子を表し、
矢印は、Ｒ２を有する炭素原子上の基の連結点を表す）
から選択される）
化合物の活性成分としての使用である。
【０００８】
本発明によれば、Ｒ１について記載したＣ１−Ｃ４アルキル基の中では、メチル基が特に好ましい。
【０００９】
Ｒ１について記載した官能化アルキル基の中では、特にＣ１−Ｃ４モノ−およびジヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ４モノ−およびジアミノアルキル、Ｃ１−Ｃ４モノ−およびジチオアルキル、およびＣ１−Ｃ４モノ−およびジカルボキシアルキル基を挙げることができる。
【００１０】
Ｒ１について記載した炭化水素を基礎とする環の中では、特にシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、フェニルおよびベンジル環を挙げることができる。
【００１１】
Ｒ１について記載した複素環の中では、特にオキサジアゾール、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、イミダゾール、チアジアゾール、ピロール、テトラゾール、フラン、チオフェン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペリジン、ピラン、ピラジンおよびピリダジン環を挙げることができる。上式（Ｉ）の化合物において、ｎ＝０のとき、Ｒ２は好ましくはＧ３およびＧ４から選択され、ｎ＝１であるとき、Ｒ２はＧ１およびＧ２から選択される。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ２が上記で定義した通りの基Ｇ１またはＧ３（上記式中、Ｒ３およびＲ’３は同一であり、ナトリウム原子を表す）を表すものおよびＲ２が上記で定義した通りの基Ｇ２またはＧ４（上記式中、Ｒ３はナトリウム原子を表す）を表すものから選択される。
【００１３】
上式（Ｉ）の化合物の中では、特に
メチル Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート（これは文献中マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）という名称で知られている）、
メチル （二ナトリウム）Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート、
メチル ６，７−ジデオキシ−７−ナトリウムスルホナト−Ｄ−マンノヘプトピラノシド
（メチル ６，７−ジデオキシ−Ｄ−マンノヘプトピラノシド）ウロン酸、および
メチル ６−デオキシ−６−マロネート−Ｄ−マンノピラノシド
を挙げることができる。
【００１４】
これらの化合物の中では、メチル Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）、メチル （二ナトリウム）Ｄ−マンノピラノシド６−ホスフェート、およびメチル ６，７−ジデオキシ−７−ナトリウムスルホナト−Ｄ−マンノヘプトピラノシドが特に好ましい。
【００１５】
マンノース−６−ホスフェートおよび上記の式（Ｉ）の化合物の幾つかは、それ自体知られており、医薬分野において特に皮膚創傷治癒を改良し同時に見苦しい傷跡の形成を小さくする目的で既に提案されてきている(Clavel, C. et al., Il Farmaco, 2005, 60, 721-725)。しかしながら、それらは全くそれに用いられたことはなく、靱帯再生および/または軟骨再構成に対するこれらの化合物の活性は未だに報告されていない。
【００１６】
上記から分かるように、本発明による式（Ｉ）の化合物は新脈管形成阻害活性と靱帯再生および／または軟骨再構成に対する活性を有する。従って、それらは靱帯再生および／または軟骨再構成を目的とする医薬組成物の調製に用いることができる。具体的には、靱帯再生または軟骨再構成の際には、アド・ホック細胞(ad hoc cells)を含む生体適合性ポリマーから形成されるインプラントが一般に用いられる。この場合には、インプラントの血管新生を防止して無細胞材料を保持するようにするのが望ましい。従って、本出願については、医薬組成物は、好ましくは少なくとも１個の式（Ｉ）の化合物を含むポリマー性生物学的材料（biomaterial）の形態である。
【００１７】
上記で定義した通りの本発明の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物の他に、少なくとも１個の薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる。
【００１８】
当業者であれば、医薬組成物の投与経路によって変化する１個以上の薬学上許容可能な賦形剤を選択するであろう。言うまでもないことであるが、当業者であれば、その時点で用いられる（複数の）賦形剤は本発明による組成物と関連した本質的特性と適合性であることを確保するように留意するであろう。
【００１９】
更に、薬剤または医薬組成物の形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、ゲルカプセル、座薬、ポリマー性生物学的材料など）は、選択される投与経路によって変化する。
【００２０】
従って、本発明の目的には、薬剤または医薬組成物は、任意の適当な経路、例えば、経口、局所、全身、静脈内、筋肉内または粘膜を介して、あるいはパッチまたはポリマー性生物学的材料を用いて投与することができる。
【００２１】
経口投与に適当な賦形剤の非制限的例としては、特にタルク、ラクトース、澱粉およびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ポリエチレングリコール、アクリル酸ポリマー、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、動物、植物または合成脂肪、パラフィン誘導体、グリコール、安定剤、防腐剤、酸化防止剤、湿潤剤、固結防止剤、分散剤、乳化剤、フレーバー向上剤、浸透剤、可溶化剤などを挙げることができる。
【００２２】
薬剤および医薬組成物を処方して投与する手法は当該技術分野で周知であり、当業者であれば特にレミントンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)の最新版を参照することができる。
【００２３】
式（Ｉ）の化合物は、下記に定義されている式（ＩＩ）のＤ−マンノピラノシドから、例えば、下記の反応工程図Ａに準じて、Van der Klein P.A.M. et al., Carbohydr. Res., 1992, 224, 193-200によって報告されているのと同様な方法による式（ＩＶ）の対応する環状スルフェート前駆体の親核置換の後、サッカリド単位によって生じたヒドロキシル基の脱保護によって容易に調製することができる。
【化３】
2011520803.tif 000004
（上記式中、
Ｒ１、Ｒ２およびｎは、式（Ｉ）の化合物について上記したのと同じ意味を有し、Ｎｕは導入することが所望な基Ｒ２に相当する親核性基を表す。）
【００２４】
この方法は、Khanjin N. A. et al., Tetrahedr. Lett., 2002, 43, 4017-4020による文献に記載の方法の適応に相当する。
【００２５】
この方法によって調製した式（ＩＶ）の環状スルフェートは、白色粉末の形態で室温にて数ヶ月間保管することができ、分解は全く見られない。モノスルフェート塩の純粋な中間体は、脱保護段階の前に水とジクロロメタンのような溶媒との間で分配することによって未反応親核性基および他の不純物から容易に分離することができる。式（Ｖ）の化合物の環状モノスルフェートおよびイソプロピリデン基の同時かつ定量的開裂は、Amberlyst-15(H+)樹脂のようなイオン交換樹脂上で行うことができ、環状モノスルフェート基は１０−３０分間でかつイソプロピリデン基はメタノール／テトラヒドロフラン混合物中で室温にて３−５時間で脱保護することができる。この方法に準じて調製した総ての式（Ｉ）の化合物は、６０−９５％の収率で得ることができる。
【実施例】
【００２６】
上記の配合の他に、本発明は、下記の記載から明らかになり、本発明による式（Ｉ）の化合物の調製の例および式（Ｉ）に対応しない他のＤ−マンノピラノース誘導体と比較して式（Ｉ）の化合物の新脈管形成阻害活性の証明の例、および新脈管形成促進活性を有し従って本発明の部分を形成しない３種類のＤ−マンノピラノシド誘導体（ＤＭ）（ＤＭ１：メチル ７−アミノ−６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド；ＤＭ２：メチル ６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシドおよびＤＭ３：メチル ７−二ナトリウムホスホナト−６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノヘプトピラノシド）と比較して様々な本発明による式（Ｉ）の化合物６ｍｇ／ｍｌの存在下にて培養した後にヒナドリ胚の血管新生の写真を示す添付図１にも関連している。
【００２７】
しかしながら、これらの例は単に本発明の例示の目的で挙げられているものであり、如何なる点においても本発明を何ら制限するものではないことを理解すべきである。
【００２８】
実施例１：メチル ６，７−ジデオキシ−７−ナトリウムスルホナト−α−Ｄ−マンノ−ヘプトピラノシド（式Ｉ−１の化合物）の調製
【化４】
2011520803.tif 000005
【００２９】
1) 第一段階: メチル 2,3-O-イソプロピリデン-4,6-O-(環状スルフェート)-α-D-マンノピラノシド(化合物3)の調製
【化５】
2011520803.tif 000006
【００３０】
化合物(3)は、2つの副段階で対応するスルファイト(2)を介して中間体を精製することなく得た。
【００３１】
1-a) 対応するスルファイト(2)の調製
【化６】
2011520803.tif 000007
【００３２】
メチル 2,3-O-イソプロピリデン-α-D-マンノピラノシド(1) 3.79 g (16.18ミリモル, 1当量)とトリエチルアミン6.75ml (48.54ミリモル, 3当量)を、ジクロロメタン(CH2Cl2) 75mlに溶解した。混合物を0℃に冷却し、塩化チオニル(SOCl2)1.3ml (17.80ミリモル, 1.1当量)を徐々に加えた。 塩化トリメチルアンモニウムの白色沈澱が即座に形成し、反応混合物は次第に黄色に変化した後、5 - 10分間かけて褐色に変化した。次いで、石油エーテル(PE)と酢酸エチル(EtOAc)の混合物(8/2 v/v)を移動相として用いて、薄層クロマトグラフィー(TLC)を行った。このTLCの結果は、出発材料は最早残っておらず(Rf = 0)所望なスルファイトが2種類のジアステレオ異性体(Rf = 0.45および0.60)の形態で得られたことを示していた。次いで、反応混合物を濾過し、有機相を蒸留水、1N塩酸溶液(HCl)および再度蒸留水で洗浄した。これを硫酸ナトリウム(Na2SO4)上で乾燥し、濾過して、濃縮し、淡褐色固形物を得て、これを直ちに反応に再度用いた。
【００３３】
1-b) スルファイト(2)のスルフェート(3)への酸化
【化７】
2011520803.tif 000008
【００３４】
上記の副段階1-a)で得た粗製スルファイト(2)(16.18ミリモル, 理論上1当量)を、CH2Cl2とアセトニトリル(CH3CN)の混合物(1/1 v/v)からなる溶液60mlに溶解した後、メタ過ヨウ素酸ナトリウム3.8 g (17.80ミリモル, 1.1当量)、水20mlおよび塩化ルテニウム14 mg (0.06ミリモル, 0.004当量)を連続して加えた。反応は発熱性であり、ヨウ素酸ナトリウム(NaIO3)沈澱の形成が極めて速やかに観察された。1時間反応後、TLC上ではスルファイトは残っておらず、スルフェート(3)のみが観察された。次いで、反応混合物を濾過し、CH2Cl2 100mlで希釈した。反応からの残留水を除去し、有機相を5%重炭酸ナトリウム(NaHCO3)で2回洗浄した後、蒸留水で洗浄した。それをNa2SO4上で乾燥し、濾過し、濃縮して、淡褐色固形物を得た。
【００３５】
この固形物を活性炭の存在下にてできるだけ少量のCH2Cl2に溶解し、シリカ上で濾別した。シリカを、CH2Cl2 300mlで洗浄した。ルテニウム塩を含む褐色不純物が、表面に残った。次いで、得られた白色固形物を、更に精製することなく段階2)で用いた。
【００３６】
収率: 2段階で84 %。
Rf: 0.48 (PE/EtOAc 7/3 v/v)。
MS: (ESI+/MeOH) m/z: 297 [M+H]+, 319 [M+Na]+。
1H NMR(400.13 MHz, アセトン-d6)δppm: 1.38および1.53 (2s, 6H, H2); 3.46 (s, 3H, OCH3); 4.17 (td, 1H, J5-4 = J5-6b = 10.6 Hz, J5-6a = 5.5 Hz, H5); 4.32 (dd, 1H, J2-3 = 5.6 Hz, J2-1 = 0.4 Hz, H2); 4.42 (dd, 1H, J3-2 = 5.6 Hz, J3-4 = 7.7 Hz, H3); 4.59 (dd, 1H, J4-3 = 7.8 Hz, J4-5 = 10.4 Hz, H4); 4.64 (t, 1H, J6b-5 = 10.7 Hz, J6b-6a = -10.7 Hz, H6b); 4.87 (dd, 1H, J6a-5 = 5.5 Hz, J6a-6b = -10.5 Hz, H6a); 5.01 (d, 1H, J1-2 = 0.5 Hz, H1)。
13C NMR (100.62 MHz, CDCl3) δppm: 26.4および28.3 (2C, C2'); 56.1 (1C, OCH3); 58.9 (1C, C5); 72.3 (1C, C6); 73.6 (1C, C3); 76.3 (1C, C2); 84.6 (1C, C4); 99.4 (1C, C1); 111.0 (1C, C1')。 
【００３７】
2) 第二段階: メチル 6,7-ジデオキシ-7-スルホナト-α-D-マンノヘプトピラノシド 2 (化合物I-1)の調製
【００３８】
2-a) 親核攻撃
【化８】
2011520803.tif 000009
【００３９】
イソプロピルメチルスルホネート303 mg (2.19ミリモル, 1.3当量)および3滴1.1-ジフェニルエチレン(着色指示薬)を、アルゴン下にて無水テトラヒドロフラン(THF) 2mlに溶解した。混合物を-70℃の温度まで冷却した後、ブチルリチウム2.19ミリモル(1.3当量)を滴加した。赤色(1.1-ジフェニルヘキシルリチウムによる)が徐々に現れた。ブチルリチウムの添加を停止したが、暗赤色は持続した。同一温度で5分間攪拌後、無水THF 3ml に予め溶解した上記の段階1)で得た化合物(3) 500 mg (1.69ミリモル, 1当量)を徐々に混合物に加えた。赤色は速やかに消失した。次いで、ヘキサメチルホスホトリアミド(HMPT) 580 μl (3.37ミリモル, 2当量)を加えた。次に、混合物を室温まで温度上昇した。15分後、総ての出発材料は消費された。次いで、反応混合物をCH2Cl2 20mlで希釈した。生成物を蒸留水2 x 10mlで抽出した。次に、この水相を、ジフェニルエチレンおよびHMPTのような有機不純物が除去されるまでCH2Cl2で洗浄した。凍結乾燥後、得られた固形物を更に精製することなく直ちに反応に再使用した。
【００４０】
収率: 定量的。
Rf: 0.35 (CH2Cl2/MeOH 85/15 v/v)。
【００４１】
生成物は、アニスアルデヒドでカーキ色を呈した。
【００４２】
2-b) 脱保護
【化９】
2011520803.tif 000010
【００４３】
メチル 6,7-ジデオキシ-7-スルホネート-4-リチウムスルフェート-2,3-(9-イソプロピリデン-α-D-マンノヘプトピラノシド (4) 744 mg (1.69ミリモル, 1当量)を蒸留水 10mlに溶解した後、Aldrich社からAmberlyst-15 H+の商品名で発売されている陽イオン交換樹脂 500 mgを添加した。3時間の反応後、樹脂を濾去し、水相を凍結乾燥した。得られた固形物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって移動相として8/2 (v/v)の比率のイソプロパノール(iPrOH)/アンモニア水(NH4OH)混合物を用いて精製し、透明フォームを得た。次に、スルホン酸のプロトンのナトリウム対イオンによる交換を、水中でDow Corning社から発売されているDowex(登録商標)Na+を用いて行った。
【００４４】
収率: 95%。
Rf: 0.40 (iPrOH/NH4OH 6/4 v/v)。
MS(FAB+/NBA) m/z: 273 [M+H]+, 242 [M-OMe]+。
MS(FAB-/NBA) m/z: 271 [M-H]-。
1H NMR (400.13 MHz, D2O) δppm: 1.97 (m, 1H, H7a); 2.36 (m, 1H, H7b); 2.99 (m, 1H, H6a); 3.13 (m, 1H, H6b); 3.37 (s, 3H, OCH3); 3.78 (m, 1H, H5); 3.89-3.96 (m, 2H, H3およびH2); 4.45 (t, 1H, J4-5 = J4-3 = 9.4 Hz, H4); 4.70 (s, 1H, H1)。
13C NMR (100.62 MHz, D2O) δppm: 26.8 (1C, C7); 47.6 (1C, C6); 55.4 (1C, OCH3); 69.1 (1C, C5); 69.9 (1C, C3); 70.4 (1C, C2); 79.0 (1C, C4); 100.9 (1C, C1)。
【００４５】
実施例２：（メチル ６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノヘプトピラノシン）ウロン酸（式１−２の化合物）の調製
【化１０】
2011520803.tif 000011
【００４６】
1) 第一段階: メチル 6-シアノ-6-デオキシ-4-O-ナトリウムスルフェート-2,3-O-イソプロピリデン-α-D-マンノピラノシド(化合物6)の調製
【化１１】
2011520803.tif 000012
【００４７】
上記の実施例1の段階1)の後に得られたのと同じメチル 2,3-O-イソプロピリデン-4,6-0-(環状スルフェート)-α-D-マンノピラノシド(化合物3) 1 g (3.38ミリモル, 1当量)をジメチルホルムアミド(DMF) 3mlに溶解した後、シアン化ナトリウム 331 mg (6.75ミリモル, 2当量)を加えた。混合物を、室温で20時間磁気攪拌した。次いで、反応混合物を(シアン化水素(HCN)の放出を回避するため)1% NaHCO3 20mlで希釈し、CH2Cl2 10mlで洗浄した。生成物を、有機相から再度蒸留水2 x 10mlで抽出した。合わせた水相を凍結乾燥して淡黄色固形物を得て、これは直ちに反応に再使用するのに十分な純度であった。しかしながら、この生成物は、グラディエント溶出(CH2Cl2 - CH2Cl2/MeOH 91/9 v/v)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製することもできる。
【００４８】
収率: 定量的。
Rf: 0.49 (CH2Cl2/MeOH 85/15 v/v)。
【００４９】
生成物は、アニスアルデヒドで暗赤色を呈した。
【００５０】
MS(ESI+/MeOH) m/z: 384 [M+Na]+。
MS(ESI+/MeOH) m/z: 322 [M-Na]-.
1H NMR (400.13 MHz, アセトン-d6) δppm: 1.24および1.41 (2s, 6H, H2'); 2.76 (dd, 1H, J6a-5 = 9.3 Hz, J6a-6b = -17.3 Hz, H6a); 3.18 (dd, 1H, J6b-5 = 2.8 Hz, J6b-6a = -17.3 Hz, H6b); 3.46 (s, 3H, OCH3); 3.86 (td, 1H, J5-6a = J5-4 = 9.6 Hz, J5-6b = 2.8 Hz, H5); 4.15 (d, 1H, J2-3 = 7.4 Hz, H2); 4.21 (dd, 1H, J4-5 = 9.9 Hz, J4-3 = 7.0 Hz, H4); 4.44 (ddほとんど分割せず, 1H, H4); 4.93 (s, 1H, H1)。
13C NMR (100.62 MHz, アセトン-d6) δppm: 20.6 (1C, C6); 25.5および27.1 (2C, C2'); 54.5 (1C, OCH3); 64.9 (1C, C5); 75.6 (1C, C2); 76.3 (1C, C4); 76.9 (1C, C3); 98.1 (1C, C1); 109.8 (1C, C1'); 118.1 (1C, C7)。
【００５１】
2) 第二段階: メチル 6-シアノ-6-デオキシ-α-D-マンノピラノシド(化合物7)の調製
【化１２】
2011520803.tif 000013
【００５２】
上記の前段階で得られたメチル 6-デオキシ-6-シアノ-4-ナトリウムスルフェート-2,3-O-イソプロピリデン-α-D-マンノヘプトピラノシド(6) 873 mg (2.53ミリモル, 1当量)をメタノール(MeOH)とTHFの混合物(1/1; v/v)から形成した溶液20mlに溶解した後、Amberlyst-15 H+ 1 gを加えた。1時間15分反応させた後、樹脂を濾去し、反応媒質を5% NaHCO3でpH = 8に中和した。有機溶媒をロータリーエバポレーター上で留去し、残っている水を凍結乾燥した。混合物をMeOHに溶解し、不溶性のNaHCO3を濾別した。生成物をグラディエント溶出(CH2Cl2 - CH2Cl2/MeOH 92/8 v/v)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、白色フォームを得た。
【００５３】
収率: 72 %。
Rf: 0.56 (CH2Cl2/MeOH 85/15 v/v)。
MS: (ESI+/MeOH) m/z: 226 [M+Na]+, 242 [M+K]+, 429 [2M+Na]+。
1H NMR (400.13 MHz, D2O) δppm: 2.86 (dd, 1H, J6a-5 = 7.4 Hz, J6a-6b = -17.3 Hz, H6a); 3.04 (dd, 1H, J6b-5 = 3.6 Hz, J6b-6a = -17.3 Hz, H6b); 3.44 (s, 3H, OCH3); 3.60 (t, 1H, J4-5 = J4-3 = 9.7 Hz, H4); 3.76 (dd, 1H, J3-4 = 9.6 Hz, J3-2 = 3.4 Hz, H3); 3.84 (ddd, 1H, J5-63 = 7.1 Hz, J5-6b = 3.2 Hz, J5-4 = 10.1 Hz, H5); 3.96 (dd, 1H, J2-3 = 3.4 Hz, J2-1 = 1.7 Hz, H2); 4.78 (d, 1H, J1-2 = 1.5 Hz, H1)。
13C NMR (100.62 MHz, D2O) δppm: 51.4 (1C, C6); 55.2 (1C, OCH3); 67.8 (1C, C5); 70.2 (1C, C2); 70.7 (1C, C3); 71.6 (1C, C4); 101.4 (1C, C1)。
【００５４】
3) 第三段階: (メチル 6,7-ジデオキシ-α-D-マンノヘプトピラノシド)ウロン酸(1-2)の調製
【００５５】
上記の前段階で得られたメチル 6-デオキシ-6-シアノ-α-D-マンノヘプトピラノシド(7) 200 mg (0.98ミリモル, 1当量)を30%過酸化水素(H2O2)水溶液2mlに溶解した後、水酸化ナトリウム(NaOH) 60 mg (1.46ミリモル, 1.5当量)を加えた。溶液を室温に放置した。12時間、次いで24時間反応させた後、更に過酸化水素溶液1mlおよび水酸化ナトリウム30 mgを反応媒質に加えた。
【００５６】
48時間後、反応媒質をAmberlites H+樹脂で中和した後、濾過して、凍結乾燥した。次いで、得られた生成物をグラディエントグラディエント溶出(CH2Cl2 - CH2Cl2/MeOH 85/15 v/v)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。
【００５７】
Rf: 0.25 (イソプロパノール/NH4OH 85/15 v/v)。
収率: 80%。
MS: (ESI+/MeOH) m/z: 245 [M+Na]+。
MS: (ESI-/MeOH) m/z: 221 [M-H]-。
【００５８】
実施例３：メチル ６−デオキシ−６−マロネート−α−Ｄ−マンノピラノシド（化合物１−３）の調製
【化１３】
2011520803.tif 000014
【００５９】
1) 第一段階: メチル 2,3,4-トリ-O-ベンジル-6-デオキシ-6-[ビス(2,2,2-トリフルオロエチル)マロネート]-α-D-マンノピラノシド(化合物8)
【化１４】
2011520803.tif 000015
【００６０】
メチル 2,3,4-トリ-O-ベンジル-α-D-マンノピラノシド765 mg (1.65ミリモル, 1当量)、ビス(2,2,2-トリフルオロエチル)マロネート 530 mg (1.98ミリモル, 1.2当量)およびトリフェニルホスフィン866 mg (3.3ミリモル, 2当量)を、トルエン10mlに溶解した。次いで、833 mg (3.3ミリモル, 2当量) de 1,1'-(アゾジカルボニル)ジピペリジン(ADDP) を(30分間かけて)滴加した。混合物を室温で磁気攪拌し、反応をTLC (Et2O/PE 4/6 v/v)によって観察した。48時間後、反応媒質をシリカ上で濾過し、濃縮し、カラムに直接加えた。生成物をグラディエントグラディエント溶出(PE - PE/Et2O 85/15 v/v)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、無色油状生成物を得た。
【００６１】
収率: 55 %。
Rf: 0.79 (Et2O/PE 6/4 v/v)。
MS: (ESI+/MeOH) m/z: 713 [M+Na]+。
MS: (ESI-/MeOH) m/z: 737 [M-H]-。
1H NMR (400.13 MHz, CDCl3) δppm: 2.45 (ddd, 1H, J6a-5 = 10.0 Hz, J6a-6b = -14.4 Hz, J63-7 = 4.9 Hz, H6a); 2.87 (ddd, lH,J6b-5 = 2.6 Hz, J6b-6a = -14.1 Hz, J6b-7 = 9.0 Hz, H6b); 3.51 (s, 3H, OCH3); 3.84 (td, IH5J5-4 = J5-6a = 9.7 Hz, J5-6b = 2.6 Hz, H5); 3.96 (t, 1H, J4-3 = J4-5 = 9.3 Hz, H4); 4.02 (dd, 1H, J2-1 = 1.9 Hz, J2-3 = 2.9 Hz, H2); 4.11 (dd, 1H, J3-2 = 3.1 Hz, J3-4 = 9.2 Hz, H3); 4.11 (dd, 1H, J7-6a = 5.0 Hz, J7-6b = 9.2 Hz, H7); 4.72 (m, 4H, H3') ; 4.84 (s, 2H, H1'); 4.87 (d, 1H, J1-2 = 1.7 Hz, H1); v0 = 4.96 (ABq, 2H, vA= 4.93. vB = 4.99. Δv = 24.8 Hz, JAB = 12.2 Hz, H1 ); V0 = 5.06 (ABq, 2H, vA = 4.90. vB = 5.21. Δv = 121.8 Hz, JAB = 11.0 Hz, H1'); 7.50-7.62 (m, 15H, HPh)。
13C NMR (100.62 MHz, CDCl3) δppm: 31.5 (1C, C6); 48.4 (1C, C7); 55.3 (1C, OCH3); 61.5 (q, 1C, JC-F = 37.2 Hz, C3'); 69.5 (1C, C5); 72.6. 73.4および75.7 (3C, C1'); 75.1 (1C, C2); 78.7 (1C, C4); 80.5 (1C, C3); 99.7 (1C, C1); 123.1 (q, 1C, JC-F = 276.9 Hz, C4'); 127.3-128.9 (15C, CHPh); 138.7、138.8および138.9 (3C, CHPh); 167.4および167.7 (2C, C8)。
19F NMR (188.31 MHz, CDCl3) δppm: -74.14 (dd, JF-H = 8.5 Hz)。
【００６２】
2) 第二段階: メチル 6-デオキシ-6-マロネート-α-D-マンノピラノシド (化合物1-3)の調製
【００６３】
2-a) ベンジル基の水素化分解
【化１５】
2011520803.tif 000016
【００６４】
上記の前段階で得られたメチル 6-デオキシ-6-[ビス(2,2,2-トリフルオロエチル)マロネート]-2,3,4-トリ-O-ベンジル-α-D-マンノピラノシド (8) 380 mg (0.53ミリモル, 1当量)をMeOH 20mlに溶解した後、パラジウム/炭素(Pd/C) 130 mgを加えた。反応媒質を水素雰囲気下に12時間置いた後、シリカで濾過し、濃縮して、白色フォームを得て、これを反応に直接再使用した。
【００６５】
収率: 90 %。
Rf: 0.34 (Et2O)。
【００６６】
2-b) マロネート単位の加水分解
【化１６】
2011520803.tif 000017
【００６７】
メチル 6-デオキシ-6-[ビス(2,2,2-トリフルオロエチル)マロネート]-α-D-マンノピラノシド (9) 211 mgを飽和アンモニア性メタノール溶液5mlに溶解し、5℃で5時間放置した。次いで、反応媒質を濃縮した後、グラディエントグラディエント溶出(CH2Cl2/MeOH 9/1 v/v - CH2Cl2/MeOH 65/45 v/v)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、白色固形物を得た。
【００６８】
収率: 90 %。
Rf: 0.28 (CH2Cl2/MeOH 75/25 v/v)。
MS: (ESI+/MeOH) m/z: 279 [M-H]-。
1H NMR(400.13 MHz, D2O) δppm: 1.96 (m, 1H, H6a); 2.49 (m, 1H, H6b); 3.41 (s, 3H, OCH3); 3.49 (m, 2H, H3およびH4); 3.61 (dd, 1H, J7-6a = 5.75 Hz, J7-6b = 9.68 Hz, H7); 3.71 (m, 1H, H5); 3.92 (dd, 1H, J2-1 = 1.68 Hz, J2-3 = 3.26 Hz, H2); 4.72 (s, 1H, H1)。
13C NMR (100.62 MHz, D2O) δppm: 31.8 (1C, C6); 49.9 (1C, C7); 55.5 (1C, OCH3); 70.2. 70.6および71.0 (4C, C2, C3, C4およびC5); 101.3 (1C, C1); 174.1および174.9 (2C, C8)。
【００６９】
実施例４：新脈管形成時のＭ６Ｐおよびその３種類の誘導体の阻害活性の証明−本発明の部分を形成しない３種類のＤ−マンノピラノシド誘導体との比較
【００７０】
この実施例では、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）およびそれぞれ上記の実施例１−３で調製した式（１−１）、（１−２）および（１−３）の化合物の新脈管形成の阻害に対する活性を、３種類のＤ−マンノピラノシド誘導体（ＤＭ）および新脈管形成促進活性を有し従って本発明の部分を形成しない３種類のＤ−マンノピラノシド誘導体（ＤＭ）（ＤＭ１：メチル ７−アミノ−６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド；  ＤＭ２：  メチル ６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシドおよびＤＭ３：  メチル ７−二ナトリウムホスホナト−６，７−ジデオキシ−α-D-マンノヘプトピラノシド)と比較して検討した。この検討は、Ribatti D. et al., Nat. Protoc, 2006, 1(1), 85-91の方法に若干の小変更を加えた方法に準じてヒナドリ胚で行った。
【００７１】
１）  材料および方法
この検討は、ヒナドリ胚の絨毛尿膜（ＣＡＭ）で行った。ＣＡＭは、絨毛膜と尿膜との融合によってインキュベーションの４日目に形成した胚体外膜である。それは、誕生のときまでヒナドリ胚と胚体外環境との間でガス交換が可能である。このＣＡＭは、殻と直接接触している連続表面を形成する極めて厚い毛細管の網状組織から構成されている。この膜の速やかな毛細血管増殖は１１日目まで継続し、その後、有糸分裂指数は急速に減少し、脈管系は孵化直前の１８日目にはその最終的配置に到達する（２１日目に孵化）。
【００７２】
ホワイトレグホン種の雌鶏の受精卵を胚形成の開始時からインキュベーターに入れ、３８℃の温度で一定湿度に保った。インキュベーションの２日目に、アルブミン２−３ｍｌを取り出した後、殻に窓を開けてＣＡＭを殻から外した。次に、窓を接着テープで密封し、卵をインキュベーターに戻して、実験の当日までその発生を継続した。７日目に、不活性合成ポリマー（直径０．４ｃｍのニトロセルロースフィルターディスク）を試験化合物（６ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）の溶液のそれぞれ２０μｌに浸漬した後、ＣＡＭ上に配置した。次いで、新脈管形成に対する試験物質の影響を１２日目に観察し、新脈管形成促進または阻害応答を視覚により定量的に評価した。
【００７３】
２）  結果
得られた結果を写真撮影し、添付図１に示す。図において、Ｍ６Ｐおよび化合物（Ｉ−１）、（Ｉ−２）および（Ｉ−３）は、ヒナドリ胚の血管新生に対して阻害効果を有することを観察することができる。反対に、本発明の部分を形成しない誘導体ＤＭ１、ＤＭ２およびＤＭ３は、ヒナドリ胚の血管新生に対して活性化効果を有する。これらの結果は、Ｄ−マンノピラノース誘導体は、極めて類似した化学構造にも関わらず、新脈管形成の調節に対して全く反対の挙動を有する可能性があることを示している。
【００７４】
これらの結果は、全体として本発明による式（Ｉ）の化合物は新脈管形成に対して阻害作用を有することを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の部分を形成しない３種類のＤ−マンノピラノシド誘導体（ＤＭ）（ＤＭ１：メチル ７−アミノ−６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド；ＤＭ２：メチル ６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシドおよびＤＭ３：メチル ７−二ナトリウムホスホナト−６，７−ジデオキシ−α−Ｄ−マンノヘプトピラノシド）と比較して様々な本発明による式（Ｉ）の化合物６ｍｇ／ｍｌの存在下にて培養した後にヒナドリ胚の血管新生の写真。
【図１】
2011520803.tif 000020
【国際調査報告】
2011520803.tif 000021
2011520803.tif 000022
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