(57)【要約】本発明は、生物マーカーを使用して癌を検出する方法を提供する。本発明の１つの態様では、所定レベルの予測可能性を用いて、対象で転移性癌を発症するリスクを評価するための方法を提供する。転移性前立腺癌を発症するリスクは、対象由来のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定することによって決定する。対象が転移性癌を発症するリスクが高いことは、サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの臨床的に有意な変化を測定することによって決定される。あるいは、対象が転移性癌を発症するリスクが高いことは、有効量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較することによって決定される。いくつかの態様では、この基準値が指標である。
2011528442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定レベルの予測可能性を用いて、対象における癌再発のリスクまたは転移性癌を発症するリスクを評価するための方法であって、
ａ．前記対象由来のサンプル中の、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定するステップと、
ｂ．前記サンプル中の前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの臨床的に有意な変化を測定するステップであって、前記変化が、前記対象において癌再発のリスクまたは転移性癌を発症するリスクが高いことを示しているステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、
ａ）表２、
ｂ）表３、
ｃ）表４、
ｄ）表５、
ｅ）表６、
ｆ）表７、および
ｇ）表２〜７から選択された２つ以上の表
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、サイクリンＤ１およびＳＰＰ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌に関連する少なくとも１つの標準的なパラメータを測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が前立腺癌であり、前記標準パラメータがグリーソンスコアである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの前記レベルが、電気泳動、免疫化学的手法または非浸潤性イメージングによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫化学的検出が、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、または酵素結合免疫吸着アッセイによって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、原発性腫瘍、再発性腫瘍、または転移性前立腺癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、腫瘍生検標本、血液または生物学的液体中の循環腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生検標本が、コア生検標本、切除組織生検標本、または切開組織生検標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
４個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現レベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
所定レベルの予測可能性を用いて、対象における癌再発のリスクまたは転移性癌を発症するリスクを評価するための方法であって、
ａ．前記対象由来のサンプル中の、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定するステップと、
ｂ．前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記基準値が指標値である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所定レベルの予測可能性を用いて、対象における腫瘍の進行を評価するための方法であって、
ａ．第１の期間で、前記対象由来の第１のサンプル中の、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｂ．第２の期間で、前記対象由来の第２のサンプル中の２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、ステップ（ｂ）で検出されたレベルまたは基準値と比較するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記第１のサンプルが、前記腫瘍の治療前に前記対象から採取される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のサンプルが、前記腫瘍の治療後に前記対象から採取される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
所定レベルの予測可能性を用いて、再発性癌または転移性癌の治療の有効性をモニタするための方法であって、
ａ．第１の期間で、前記対象由来の第１のサンプル中の、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｂ．第２の期間で、前記対象由来の第２のサンプル中の、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、ステップ（ｂ）で検出されたレベルまたは基準値と比較するステップであって、治療の有効性が、前記対象由来の２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの変化によってモニタされるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記対象が、前記癌の治療を事前に受けている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のサンプルが、前記癌の治療前に前記対象から採取される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のサンプルが、前記癌の治療後に前記対象から採取される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のサンプルを、前記癌の再発後に前記対象から採取する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のサンプルを、前記癌の再発前に前記対象から採取する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
所定レベルの予測可能性を用いて、腫瘍を有すると診断された対象に関する治療レジメンを選択するための方法であって、
ａ．第１の期間で、前記対象由来の第１のサンプル中の、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｂ．任意選択で第２の期間で、前記対象由来の第２のサンプル中の２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、基準値または任意選択でステップ（ｂ）で検出された量と比較するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記対象が、腫瘍の治療を事前に受けている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のサンプルを、前記腫瘍を治療する前に前記対象から採取する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のサンプルを、前記腫瘍を治療した後に前記対象から採取する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された２個以上のマーカーの、マーカーレベルのパターンを含む、転移性前立腺癌基準発現プロファイル。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプロファイルを作成するのに十分な、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２からなる群から選択された対応するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出する複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ検出試薬を含むキット。
【請求項２９】
前記検出試薬が、１つもしくは複数の抗体またはその断片を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記検出試薬が１種または複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記検出試薬が１種または複数のアプタマーを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
請求項２７に記載の１つまたは複数の転移性前立腺癌基準発現プロファイルと、任意選択で追加の試験結果および対象情報とを含有する機械可読媒体。
【請求項３３】
生理学的または生化学的な経路に関連した転移を示す１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネル。
【請求項３４】
前記生理学的または生化学的な経路が、細胞移動、血管新生、細胞外マトリックス分解、溢出、コロニー形成またはアノイキスを含む、請求項３３に記載のパネル。
【請求項３５】
腫瘍の進行を示す１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネル。
【請求項３６】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを発現する細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞を、候補化合物を含む組成物と接触させるステップと、
（ｃ）物質が前記ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現または活性を変化させるか否かを決定するステップと
を含み、それにより、前記化合物の存在下で観察された前記変化が、細胞を、前記化合物を含まない組成物と接触させたときに観察されない場合、前記同定された化合物は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する方法。
【請求項３７】
前記細胞を、インビボ、エキソビボ、またはインビトロで接触させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象の癌を治療する方法であって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３９】
対象の前立腺癌を治療しまたは予防する方法であって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する薬剤を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
ゲノムが内在性のＰｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の両方のホモ接合型破壊を含有するダブルノックアウトのトランスジェニックマウスであって、野生型マウスと比較して、前立腺腫瘍の形成に対する感受性の増加を示すトランスジェニックマウス。
【請求項４１】
請求項４０に記載のトランスジェニックマウス由来の細胞。
【請求項４２】
上皮細胞である、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
前記上皮細胞が、前立腺細胞、乳房細胞、結腸細胞または肺細胞である、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４４】
前立腺癌の進行を阻害する治療剤についてスクリーニングする方法であって、候補治療剤を請求項４０に記載のトランスジェニックマウスに投与するステップと、前記マウスにおいて前記治療剤の前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｅｒ）の進行に対する効果を評価するステップとを含む方法。
【請求項４５】
生物マーカーを同定する方法であって、試験化合物の非存在下において請求項４０に記載のトランスジェニックマウスから得た第１のサンプル中の遺伝子発現プロファイル、ゲノムプロファイルまたはプロテオミクスプロファイルを、試験化合物の存在下において請求項４０に記載のトランスジェニックマウスから得たサンプル中の前記プロファイルと比較するステップを含む方法。
【請求項４６】
前記サンプルが、細胞サンプル、血液サンプルまたは循環腫瘍細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
生物マーカーを同定する方法であって、第１の期間において請求項４０に記載のトランスジェニックマウスから得た第１のサンプル中の遺伝子発現プロファイル、ゲノムプロファイルまたはプロテオミクスプロファイルを、第２の期間において請求項４０に記載のトランスジェニックマウスから得たサンプル中のプロファイルと比較するステップを含む方法。
【請求項４８】
前記サンプルが、細胞サンプル、血液サンプルまたは循環腫瘍細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
キットであって、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、サイクリンＤ１およびＳＰＰ１の検出または定量化のための試薬ならびに前記キットを使用するための指示を含むキット。
【請求項５０】
ゲノムが内在性のＰｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の両方のホモ接合型破壊を含有する細胞を前立腺組織が含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記Ｐｔｅｎ遺伝子または前記Ｓｍａｄ４遺伝子のいずれかにそのような破壊がない対照哺乳動物と比較して、前立腺癌の発症に対する感受性の増加を示し、Ｓｍａｄ４遺伝子ではなく、Ｐｔｅｎ遺伝子のみにおけるホモ接合型破壊を有する対照哺乳動物と比較して、転移性であって、緩徐進行型ではない前立腺癌の発症に対する感受性の増加を示す、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５１】
癌を治療するための方法であって、
ａ）癌細胞がＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２のうちの２個以上のレベルにおいて臨床的に有意な変化を示す対象を提供するステップであって、前記変化が、前記対象において癌が再発するかまたは転移性癌を発症するリスクの増加を示すステップと、
ｂ）前記対象を、看護療法の標準に加えて、アジュバント療法も用いて治療するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
前記看護療法の標準が、手術、放射線照射またはアンドロゲン除去である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前立腺癌を、前立腺癌の治療を必要とする対象において治療するための方法であって、
ａ）対象の前立腺癌組織由来のサンプル中のＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＹＣＬＩＮ  Ｄ１およびＳＰＰ１の発現レベルに関する情報を得るステップと、
ｂ）ＳＰＰ１阻害剤またはＣＤ４４阻害剤を、前記発現レベルに基づいて前立腺癌が再発するかまたは転移性癌を発症するリスクがあると同定される対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項５４】
前記阻害剤が、抗ＳＰＰ１抗体、ＳＰＰ！ｓｉＲＮＡ、ＣＤ４４抗体またはＣＤ４４ｓｉＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
対象の癌に治療レジメンが有益であるかどうかを決定する方法であって、
ａ）２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２のレベルを検出するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で検出された２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較するステップと
を含む方法。
【請求項５６】
アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法であって、
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２の２個以上を測定することにより、前記患者における転移のリスクを評価するステップであって、前記患者由来の腫瘍サンプル中の前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、前記患者がアジュバント治療を必要としていることを示すステップ
を含む方法。
【請求項５７】
腫瘍患者に治療決定を知らせる方法であって、
前記患者から得た腫瘍サンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２の２個以上に関する情報を得るステップと、
前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意に変化した場合に、前記患者における腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンを選択するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０８１，２８６号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、癌転移に伴う生物学的徴候および癌転移をもたらす遺伝的ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの同定と、そのような生物学的徴候およびＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを癌のスクリーニング、予防、診断、治療、モニタリング、および予後に使用する方法とに関する。本発明はさらに、遺伝子工学的に作製された転移性前立腺癌マウスモデルにも関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌（ＰＣＡ）は、米国内においては、最も頻繁な男性の癌であり、癌死亡の主要な原因である。ほとんどの高齢男性は前立腺新生物をもっているが、圧倒的多数の症例が、局在性の緩徐進行型の状態に留まり、治療介入の必要はない。しかし、早期ＰＣＡのサブセットは、治療せずに放置すると、侵襲性の悪性挙動の段階に進むことが「決まって」おり、前立腺を越えて広がり、転移性疾患に容赦なく進行し、最終的には死をもたらす。現時点では、緩徐進行型疾患と侵襲性疾患とを正確に区別することができないために、緩徐進行型疾患に罹患している可能性がある多くの男性が、死亡率の高い治療介入を不必要に受けている。
【０００４】
グリーソンの類別、ＰＳＡおよび腫瘍段階を含めて、治療成果を予測するための、腫瘍を階層化する現在の方法は、臨床病理学的因子に基づいている。これらの方式は役立つが、治療成果を十分には予測せず、重要なことには、転移性疾患およびＰＣＡに特異的な死亡のリスクの最も意味のある臨床エンドポイントには確実にはつながらない。医学上の必要性が満たされていないこのことから、進行のリスクを示し、標的を定めた介入療法のための機会を提供することが可能な生物マーカーを同定することを目指して、ＰＣＡ進行の遺伝的および生物学的な基礎を定義するための努力が盛んに払われるようになった。ヒトＰＣＡの遺伝的研究によって、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の不活性化、ならびにＥＴＳファミリーのトランスロケーションおよび調節不全を含めた、いくつかのサイン事象が同定されている。さらに、Ｎｋｘ３．１、ｃ−ＭｙｃおよびＳＰＩＮＫを含めた、多くのその他の重要な遺伝子的および／またはエピジェネティックな変化も同定されている。また、網羅的分子解析によって、ＥＣＡＤ、ＡＩＰＣ、Ｐｉｍ−１キナーゼ、ヘプシン、ＡＭＡＣＲおよびＥＺＨ２等の一連の潜在的な再発／転移の生物マーカーも同定されている。しかし、ヒトＰＣＡが極めて均質性に乏しいことから、臨床の場においては、単一の生物マーカーの有用性が制限されており、したがって、予後を示す多重遺伝子生物マーカーのパネルまたはサインを定義するためのより包括的な転写プロファイリング研究が求められている。これらの予測サインは、よりロバストであるようである。しかし、それらの臨床的有用性は、転写ネットワークの内在するノイズおよび状況特異的な性質、ならびに癌ゲノムが極めて不安定であることに起因して依然として不確かである。こうした癌ゲノムの不安定性は、無数の付随する遺伝子的およびエピジェネティックな事象を示し、疾患の顕著な不均質性をもたらす。これらの因子によって、疾患の進行のリスクを正確に示すことが可能な生物マーカーの同定が妨げられている。したがって、複雑なヒトのデータセットと一緒に使用して、癌の発生および挙動を、特に、早期において予測するために使用し得るロバストな生物マーカーを同定することができるヒト癌のより正確なモデルが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は一部、タンパク質、核酸、多型、代謝産物およびその他の分析対象等の特定の生物学的なマーカー（本明細書では、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」と呼ぶ）、ならびに特定の生理学的な状態および状況が、早期癌において存在または変化するという発見に関する。これらが変化または存在すると、これらの新生物に、転移性癌の再発および進行のリスクの増加が生じる。こうした癌は、例えば、前立腺癌または乳癌である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の１つの態様では、所定レベルの予測可能性を用いて、対象で転移性癌を発症するリスクを評価するための方法を提供する。転移性前立腺癌を発症するリスクは、対象由来のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定することによって決定する。対象が転移性癌を発症するリスクが高いことは、サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの臨床的に有意な変化を測定することによって決定される。あるいは、対象が転移性癌を発症するリスクが高いことは、有効量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較することによって決定される。いくつかの態様では、この基準値が指標である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、第１の期間で、対象由来の第１のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出し、第２の期間で、対象由来の第２のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出し、検出されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較することによって、所定レベルの予測可能性を用いて、対象における腫瘍の進行を評価するための方法を提供する。いくつかの態様では、第１のサンプルは、腫瘍の治療前に対象から採取され、第２のサンプルは、腫瘍の治療後に対象から採取される。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、第１の期間で、対象由来の第１のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出し、任意選択で第２の期間で、対象由来の第２のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出することによって、所定レベルの予測可能性を用いて、治療の有効性をモニタし、または転移性癌の治療レジメンを選択するための方法を提供する。第１の期間で検出されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを、第２の期間で検出されたレベルまたは基準値と比較する。治療の有効性は、対象由来のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルの変化によってモニタされる。
【０００９】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴには、例えば、本明細書に記述されるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２が含まれる。１、２、３、４、５、１０、またはそれ以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが測定される。いくつかの実施形態では、表２、３、４、５、６または７に列挙するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴから選択された少なくとも２個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを測定する。好ましくは、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、サイクリンＤ１およびＳＰＰ１が測定される。任意選択で、本発明の方法は、腫瘍に関連する少なくとも１つの標準的なパラメータを測定するステップをさらに含む。標準パラメータは、例えば、グリーソンスコアである。
【００１０】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルは、電気泳動または免疫化学的手法によって測定される。例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルは、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、または酵素結合免疫吸着アッセイによって検出される。場合により、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、非侵襲性の画像技術を使用して検出する。
【００１１】
対象は、原発性腫瘍、再発性腫瘍、または転移性腫瘍を有する。いくつかの態様では、サンプルは、腫瘍の治療を事前に受けている対象から採取される。あるいは、サンプルは、腫瘍の治療前に対象から採取される。サンプルは、コア生検標本、切除組織生検標本、または切開組織生検標本などの腫瘍生検標本である。サンプルは、血液または生物学的液体中の循環腫瘍細胞である。
【００１２】
本発明には、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２から選択された２個以上のマーカーの有効量の、マーカーレベルのパターンを含有する、転移性前立腺癌基準発現プロファイルも含まれる。（好ましくは、このプロファイルは、表１Ａ、１Ｂ、２、３、４、５、６または７のうちのいずれか１つに列挙するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのマーカーレベルのパターンを含有する。１つまたは複数の転移性腫瘍基準発現プロファイルと、任意選択で追加の試験結果および対象情報とを含有する機械可読媒体も含まれる。別の態様では、本発明は、対応するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出する複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ検出試薬を含むキットを提供する。例えば、このキットは、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、サイクリンＤ１およびＳＰＰ１の検出試薬を含む。検出試薬は、例えば、抗体またはその断片、オリゴヌクレオチド、またはアプタマーである。
【００１３】
別の態様では、本発明は、生理学的または生化学的な経路に関連した腫瘍の転移または進行を示す１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含有するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルを提供する。生理学的または生化学的な経路として、例えば、Ｐ１３Ｋ、ＲＡＣ−ＲＨＯ、ＦＡＫおよびＲＡＳのシグナル伝達経路が挙げられる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、対照と比較して疾患において示差的に発現した１つまたは複数の遺伝子を同定して、遺伝子標的リストが作成し；疾患の進行の機能的局面に関連した標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定することによって、疾患の予後を示す生物マーカーを同定する方法を提供する。機能的局面は、例えば、細胞移動、血管新生、遠位コロニー形成、細胞外マトリックス分解、またはアノイキスである。任意選択で、この方法は、進化的に保存された変化を含む、遺伝子標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定して、第２の遺伝子標的リストが作成するステップを含む。この疾患は、例えば、浸潤性または転移性癌などの癌である。
【００１５】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを発現する細胞を提供し、細胞を、候補化合物を含む組成物と接触させ（例えば、インビボ、エキソビボ、またはインビトロ）、物質がＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を変化させるか否かを決定することによって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物が同定される。化合物の存在下で観察された変化が、細胞を、化合物を含まない組成物と接触させたときに観察されない場合、同定された化合物は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する。
【００１６】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性もしくは発現を調節する化合物を対象に投与することによって、またはＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴにより調節された化合物の活性もしくは発現を調節する薬剤を対象に投与することによって、対象の癌が治療される。
【００１７】
癌細胞がＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２のうちの２個以上のレベルにおいて臨床的に有意な変化を示す対象を提供し、この対象を、手術または放射線に加えて、アジュバント療法も用いて治療することによって、癌を治療する。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの変化は、対象において癌が再発するかまたは転移性癌を発症するリスクが高まっていることを示している。さらに、対象の前立腺癌組織由来のサンプル中のＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＹＣＬＩＮ  Ｄ１およびＳＰＰ１の発現レベルに関する情報を得、ＳＰＰ１阻害剤、ＣＤ４４阻害剤または両方を投与することによって、前立腺癌を、その治療を必要とする対象において治療する。この対象は、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＹＣＬＩＮ  Ｄ１およびＳＰＰ１の発現レベルに基づいて、前立腺癌が再発するかまたは転移性癌を発症するリスクがあると同定されているものである。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、有効量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを測定することにより患者における転移のリスクを評価することによって、アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法を提供し、患者由来の腫瘍サンプル中の２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、患者がアジュバント治療を必要としていることを示している。例えば、本明細書に記載する方法は、特定の対象が臨床治験に適しているかどうかを決定するのに有用である。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、患者由来の腫瘍サンプル中の有効量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに関する情報を得、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意な形で変化する場合には、患者における腫瘍の転移を阻止するかまたは低下させる治療レジメンを選択することによって、治療の決定についての情報を腫瘍患者に提供する方法を提供する。
【００２０】
種々の実施形態では、所定レベルの予測可能性を用いて評価／モニタリングを行う。所定レベルの予測可能性とは、臨床または診断の精度の許容できるレベルが得られる方法を意味する。臨床および診断の精度は、本明細書に記載する方法等の当技術分野で公知の方法によって決定する。
【００２１】
本発明はさらに、ゲノムが、前立腺上皮中の内在性のＰｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の両方のホモ接合型破壊を可能にする遺伝子改変を含有するダブルノックアウトのトランスジェニックマウスも提供する。当業者であれば、Ｐｔｅｎ遺伝子またはＳｍａｄ遺伝子を、ＬｏｘＰ部位を組み込んでリコンビナーゼの媒介により切除すること（すなわち、現在の系統）によってか、あるいは例えば、生殖系列形態かまたはインサイツもしくは細胞培養における前立腺上皮の体細胞形質導入かのいずれかにおいて、突然変異ノックインを行い、これらの遺伝子をＲＮＡｉの媒介により消去し、それに続いて、これらの初代細胞を腎臓莢膜内または同所性に再導入することによって、この破壊を達成することができることを認識するであろう。また、生殖系列伝達を回避する、標的ＥＳクローンを使用するキメラの形成を含めて、その他の工学的作製の戦略も明らかである。このトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、前立腺腫瘍の形成に対する感受性の増加を示す。また、このマウスは、Ｐｔｅｎのみのシングルノックアウトのトランスジェニックマウスと比較して、転移性前立腺癌の形成に対する感受性の増加も示す。また、このマウス由来の細胞も含まれる。好ましくは、これらの細胞は、前立腺上皮細胞、乳房上皮細胞、肺上皮細胞または結腸上皮細胞等の上皮細胞である。
【００２２】
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと同様のまたは均等な方法および材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記述する。本明細書に記述される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により明らかに組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めた本発明の明細書が優先する。さらに、本明細書に記述される材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定しようとするものではない。
【００２３】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかにされ、そのような記述および範囲に包含されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ｐｔｅｎ喪失前立腺が、ｐ−Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３およびＳｍａｄ４の発現レベルを上方制御したことを示す図である。（Ａ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウス間における示差的発現遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（３３３１個のプローブセット、青色で示す）を、等しいサイズの無作為に選択した遺伝子セット１０個と比較した。（Ｂ）１５週における各遺伝子型由来のＡＰ組織のウエスタンブロット解析が、Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウスにおいては、対照マウスと比較して、ｐＳｍａｄ２／３レベルの増強、Ｓｍａｄ４の上方制御、およびＩｄ１の誘導を示している。（Ｃ）Ｓｍａｄ４については、１５週齢ＡＰの免疫組織化学的解析の実施により、Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウス（パネルｃ）において、対照マウス（パネルａ）と比較して上方制御が生じていることを実証している。Ｓｍａｄｐｃ−／−マウスを、陰性対照として使用した（パネルｂ）。スケールバー、５０μｍ。（Ｄ、Ｅ）ヒトＰＣＡとヒト転移との間におけるＳｍａｄ４の発現のＯｎｃｏｎｍｉｎｅ解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ／）。Ｙｕらの前立腺発現データセットにおいて、Ｓｍａｄ４が示差的に発現したヒートマップ（Ｄ）。Ｙｕらの前立腺発現データセットおよびＤｈａｎａｓｅｋａｒａｎら（２００１年）の前立腺発現データセットにおけるヒトＰＣＡとヒト転移との間のＳｍａｄ４の発現のボックスプロット（Ｅ）。
【図２】図２は、Ｓｍａｄ４の喪失は、前立腺腫瘍を開始しないが、Ｐｔｅｎ欠損細胞癌を致死性にすることを示す図である。（Ａ）９週齢のＷＴ、Ｓｍａｄ４およびＰｔｅｎの単一突然変異体および二重突然変異体における前側前立腺（ＡＰ）の組織病理学的解析（ヘマトキシリン／エオシン染色）から、ＷＴマウスおよびＳｍａｄｐｃ−／−マウスにおいては正常な腺が、しかし、Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウスにおいてはＰＩＮ病変、およびＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−マウスにおいては浸潤（矢印）が明らかになっている。スケールバー、５０μｍ。（Ｂ）カプラン−マイヤーの全体的な累積サバイバル解析。Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−コホート（ｎ＝２６）（アステリスク）について、Ｐｔｅｎｐｃ−／−コホート（ｎ＝２８）と比較して、寿命の統計学的に有意な減少を見出した（Ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）２２週齢における、代表的なＷＴ、Ｓｍａｄｐｃ−／−、Ｐｔｅｎｐｃ−／−、およびＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−の前側前立腺または前立腺腫瘍の肉眼的解剖学的形態。スケールバー、０．５ｃｍ。
【図３】図３は、Ｓｍａｄ４の喪失は、増殖を増強し、Ｐｔｅｎ喪失誘導型の細胞の老化を回避することを示す図である。（Ａ）１５週齢ＡＰの組織病理学的な増殖解析から、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体（パネルｊ）におけるいくつかの浸潤病巣（矢印、パネルｅ）中の増殖の増加が実証されている。１５週齢ＡＰのＴｕｎｅｌ解析からは、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体（パネルｉ、ｊ）およびＰｔｅｎｐｃ−／−前立腺腫瘍（パネルｈ）においては、有意な差がないことが示されている。Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン／エオシン。スケールバー、５０μｍ。（Ｂ）Ｓｍａｄ４の喪失によって、Ｐｔｅｎ喪失誘導型の細胞の老化が回避された。１５週齢ＡＰのβ−Ｇａｌ染色解析。スケールバー、１００μｍ。（Ｃ）（Ａ、ｆ〜ｊ）で行った、１５週齢ＡＰのｂｒｄｕパルス標識の定量化を行った。３匹のマウス由来の代表的な切片を、各遺伝子型について数えた。（Ｄ）１５週のＡＰにおける、アポトーシスについてのＴＵＮＥＬアッセイの定量化。３匹のマウス由来の代表的な切片を、各遺伝子型について数えた。（Ｅ）（Ｂ）で行った、１５週のＡＰ切片上に見られるβ−Ｇａｌ染色の定量化。３匹のマウス由来の代表的な切片を、各遺伝子型について数えた。Ｃ〜Ｅのエラーバーは、三つ組で実施した代表的な実験についてのｓ．ｄ．を示す。アステリスクは、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−との間の統計学的有意性を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、Ｓｍａｄ４が喪失すると、Ｐｔｅｎ欠損細胞癌が、完全な浸透を伴う、リンパ節および肺への転移に進行することを示す図である。（Ａ）前立腺癌の無転移サバイバル曲線（カプラン−マイヤープロット）。腰部リンパ節および／または肺における転移病巣を、１６〜３２週齢のＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−コホートにおいてのみ見出した。転移の完全な浸透を伴うＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−（ｎ＝２５）（アステリスク）について、Ｐｔｅｎｐｃ−／−コホート（ｎ＝２５）と比較して統計学的有意性（Ｐ＜０．０００１）を見出した。（Ｂ）転移病巣（暗い矢印）を伴う、代表的な腰部リンパ節（破線の円）および肺の肉眼的解剖学的形態。スケールバー、０．５ｃｍ。（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色切片が、リンパ節（暗い矢印）および肺における転移性前立腺癌細胞を示している。免疫組織化学的解析によって、リンパ節および肺における転移性細胞が、ＣＫ８陽性およびＡＲ陽性（前立腺上皮マーカー）であることを示している。スケールバー、５０μｍ。Ｍｅｔｓ、転移；ＬＮ、リンパ節。
【図５】図５は、表１Ａからの２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、ヒト前立腺癌の侵襲性および転移を予測することを示す図である。この特定の実験では、表１Ａに列挙する２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、Ｐｔｅｎ由来の３つの腫瘍サンプルとＰｔｅｎ  Ｓｍａｄ４由来の３つの腫瘍サンプルとの比較から得た。表１Ａからの２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、Ｇｌｉｎｓｋｙら（２００４年）の前立腺癌遺伝子発現データセットから、予後を示す有用性について評価した。生化学的再発（ＢＣＲ）を、ＰＳＡレベル（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）によって定義した。患者サンプルが、表１Ａに列挙する２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリーに分かれた（高リスク群および低リスク群）。
【図６】図６は、細胞の動きの遺伝子が、転移性Ｓｍａｄ４／Ｐｔｅｎ前立腺腫瘍においては、緩徐進行型Ｐｔｅｎ腫瘍と比較して、示差的に発現することを示す図である。示差的発現遺伝子の分子機能に関するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）解析では、細胞の動きの遺伝子は、Ｓｍａｄ４／Ｐｔｅｎ前立腺腫瘍については、いずれかをＰｔｅｎ腫瘍と比較した場合、１８番または１番としてランク付けられることが明らかになった。（Ａ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した遺伝子の分子機能に関するＩＰＡからは、これらの遺伝子が、細胞の動き、細胞死、細胞の成長および増殖、細胞間のシグナル伝達および相互作用、細胞の発達、細胞形態、細胞周期、細胞のシグナル伝達、翻訳後修飾、脂質代謝、小型分子の生化学、薬物代謝、ビタミンおよび鉱物の代謝、細胞の機能および維持、分子輸送、遺伝子発現、ＤＮＡの複製および修復において役割を果たすことが明らかになっている。細胞の動きの遺伝子は、１番としてランク付けられている。（Ｂ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−；ｐ５３ｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した遺伝子の分子機能に関するＩＰＡ解析からは、これらの遺伝子が、細胞死、遺伝子発現、細胞の成長および増殖、細胞の発達、アミノ酸代謝、翻訳後修飾、小型分子の生化学、細胞の機能および維持、細胞形態、細胞の集合および組織化、細胞周期、細胞間のシグナル伝達および相互作用、薬物代謝、脂質代謝、分子輸送、細胞性傷害、抗原提示、細胞の動き、炭水化物代謝、ＲＮＡの傷害および修復、ＤＮＡの複製および修復、核酸代謝、細胞のシグナル伝達、タンパク質合成において役割を果たすことが明らかになっている。Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍とは対照的に、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；ｐ５３ｐｃ−／−腫瘍のＩＰＡからは、細胞の動きの遺伝子が１８番にランク付けられることが示されている。
【図７】図７は、遺伝子プロファイリングおよびプロモーター解析から、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現する６６個の推定されるＳｍａｄ４標的遺伝子のサブセットが明らかになっていることを示す図である。（Ａ）６６個の遺伝子が、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した。（Ｂ）分子機能に関するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）から、これら６６個の遺伝子は、細胞の動き、癌、細胞の成長および増殖、ならびに細胞死において役割を果たすことが明らかになっている。
【図８】図８は、１７個のＳｍａｄ標的遺伝子サインによって、癌の侵襲性および転移を予測することができることを示す図である。（Ａ）１７個のＳｍａｄ標的遺伝子サインの開発を示す略図である。コンピュータ解析によって、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現する２８４個の遺伝子のうち、推定されるＳｍａｄ標的遺伝子が６６個あることが明らかになっている。１７個の遺伝子サインを、ヒト転移性ＰＣＡデータセットとのオーバーラップに基づいて開発した。（Ｂ）１７個の遺伝子が、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した。（Ｃ）それに続いて、これらの１７個の推定されるＳｍａｄ標的遺伝子を、前立腺癌遺伝子発現データセット上で予後を示す有用性について評価した。腫瘍サンプル（列）と遺伝子（行）との階層的クラスター分析を示す。赤色は、遺伝子発現の高い相対レベルを示し、一方、緑色は、遺伝子発現の低い相対レベルを示す。ヒートマップの上の水平バーは、各患者の再発状況を示す（１、生化学的なまたは腫瘍の再発；０、無再発）。患者が、この１７個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリーに分かれた。リンパ節およびその他の遠位の転移を、赤色の矢印によって示す。（Ｄ）カプラン−マイヤーサバイバル解析は、この１７個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいた。（Ｅ、Ｆ）Ｃと同様に、１７個の遺伝子サインを、乳房腺癌データセットにおいて評価した。カプラン−マイヤー解析を、この１７個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいて、生存確率（Ｅ）および無転移生存（Ｆ）について実施した。
【図９】図９は、Ｓｍａｄ４の喪失は、前立腺腫瘍を最長２年齢まで開始しないことを示す図である。Ｓｍａｄ４単一突然変異体における１年齢（ＡＰ）（Ａ）および２年齢（Ｂ）の前側前立腺の組織病理学的解析（ヘマトキシリン／エオシン染色）から、Ｓｍａｄｐｃ−／−マウスにおける正常な腺が明らかになっている。スケールバー、５０μｍ。
【図１０】図１０は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−マウスにおける代表的な水腎症の組織病理学的解析を示す図である。（Ａ）２６週齢において前立腺腫瘍を有する代表的なＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−の肉眼的解剖学的形態であり、巨大な前立腺腫瘍（破線の円）を示している。スケールバー、２ｃｍ。（Ｂ、Ｃ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウス（Ｂ）および水腎症（矢印）を伴うＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−マウス（Ｃ）由来の代表的な腎臓の組織病理学的解析。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。スケールバー、１ｍｍ。
【図１１】図１１は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した２８４個の癌生物学関連遺伝子のサブセット（表１Ａを参照されたい）のマイクロアレイ解析を示す図である。（Ａ）２８４個の遺伝子が、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した。（Ｂ）分子機能に関するＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）から、これら２８４個の遺伝子は、細胞の動き、癌、細胞の成長および増殖、ならびに細胞死において役割を果たすことが明らかになっている。
【図１２】図１２（Ａ）は、６６個のＳｍａｄ標的遺伝子が推定され、それに続いて、それらを、前立腺癌遺伝子発現データセット上で予後を示す有用性について評価した様子を示す図である。腫瘍サンプル（列）と遺伝子（行）との階層的クラスター分析を示す。赤色は、遺伝子発現の高い相対レベルを示し、一方、緑色は、遺伝子発現の低い相対レベルを示す。ヒートマップの上の水平バーは、各患者の再発状況を示す（１、生化学的なまたは腫瘍の再発；０、無再発）。患者が、この６６個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリーに分かれた。リンパ節およびその他の遠位の転移を、赤色の矢印によって示す。（Ｂ）は、この６６個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいたカプラン−マイヤーサバイバル解析を示す図である。
【図１３】図１３は、初代マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において、Ｐｔｅｎの喪失がｐ５３依存性経路を通して惹起した細胞の老化を、Ｓｍａｄ４の喪失により、回避することができることを示す図である。（Ａ）ＷＴ  ＭＥＦ（パネルａ）、Ｓｍａｄ−／−ＭＥＦ（パネルｂ）、Ｐｔｅｎ−／−ＭＥＦ（パネルｃ）、およびＰｔｅｎ−／−；Ｓｍａｄ−／−ＭＥＦ（パネルｄ）の老化の染色。各遺伝子型の３つの独立したＭＥＦからの代表的な切片。（Ｂ）β−Ｇａｌ染色の定量化。エラーバーは、三つ組で実施した代表的な実験についてのｓ．ｄ．を示す。アステリスクは、Ｐｔｅｎｐｃ−／−変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体との間の統計学的有意性を示す（Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）各遺伝子型からのＭＥＦのウエスタンブロット解析から、（遺伝子型について、５匹以上のマウスの）二つ組で実施した代表的な実験についてのｐ５３の発現レベルが示されている。アクチンを内部添加対照として使用した。
【図１４】図１４は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体からの前立腺上皮細胞が、ヌードマウスにおいて、前立腺上皮細胞マーカーを有する同所性の転移性腫瘍を形成することを示す図である。（Ａ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体からの前立腺上皮細胞を同所性に注入すると、前立腺中には腫瘍（破線の円）が形成され、肺転移（矢印）も形成される。スケールバー、１ｃｍ。（Ｂ）免疫組織化学的解析によって、同所性腫瘍および肺転移が、ＣＫ８陽性および＃ＡＲ陽性（前立腺上皮のマーカー）であることが示されている。スケールバー、５０μｍ。
【図１５】図１５は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体からの前立腺上皮細胞が、ヌードマウスにおいて、前立腺上皮細胞マーカーを有する同所性の転移性腫瘍を形成することを示す図である。（Ａ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体からの前立腺上皮細胞を腎臓移植すると、前立腺中には腫瘍（破線の円）が形成され、肺転移（矢印）も形成される。スケールバー、１ｃｍ。（Ｂ）免疫組織化学的解析によって、腎臓腫瘍および肺転移が、ＣＫ８陽性および＃ＡＲ陽性（前立腺上皮のマーカー）であることが示されている。スケールバー、５０μｍ。
【図１６】図１６は、Ｐｔｅｎ−Ｓｍａｄ４二重欠損前立腺腫瘍細胞において、Ｓｍａｄ４を修復し、ＴＧＦβ１を用いて処理すると細胞生存率が減少することを示す図である。（Ａ）Ｓｍａｄ４欠損前立腺癌細胞において、Ｓｍａｄ４を修復し、ＴＧＦβ１を用いて処理すると細胞生存率が減少している。親対照細胞（Ｃｏｎｔｌ）およびＳｍａｄ４−Ｔｅｔ  ｏｎ細胞（Ｓｍａｄ４）を、５％活性炭処理ＦＢＳ含有培地中、１μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下または非存在下で、０．０１６ｎｇ／ｍＬ、０．０３１ｎｇ／ｍＬ、０．０６３ｎｇ／ｍＬ、０．１２５ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を用いて処理し、次いで、細胞生存率を、アデノシン三リン酸定量化によってアッセイした。エラーバーは、三つ組で実施した代表的な実験についてのｓ．ｄ．を示す。黒色のバー、Ｄｏｘなしの対照親の系；青色のバー、Ｄｏｘありの対照親の系；赤色のバー、ＤｏｘなしのＳｍａｄ４ｔｅｔ−ｏｎ系；緑色のバー、ＤｏｘありのＳｍａｄ４ｔｅｔ  ｏｎ系。（Ｂ）Ｄｏｘ処理時のＳｍａｄ４の発現のウエスタンブロット解析は、Ｄｏｘ処理ありまたはＤｏｘ処理なしのＳｍａｄ４ｔｅｔ−ｏｎ系のＳｍａｄ４の発現を示している。ｒａｎを、内部添加対照として使用した。（Ｃ）ＴＧＦβ１処理がある場合またはない場合の細胞の形態。細胞の写真を、ＴＧＦβ１またはビヒクルを用いて処理した４日後に撮影した。
【図１７】図１７は、Ｓｍａｄ４の喪失によって、Ｐｔｅｎ喪失誘導型の自己貪食が回避されることを示す図である。（Ａ）ＴＧＦβ１処理がある場合またはない場合の細胞の形態。細胞の写真を、ＴＧＦβ１またはビヒクルを用いて処理した３日後に撮影した。（Ｂ）１５週齢のＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体およびＰｔｅｎｐｃ−／−マウスからの前立腺腫瘍細胞の透過型電子顕微鏡観察。
【図１８】図１８は、性腺摘除によるホルモン除去を施したＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４二重突然変異体マウスが、ホルモン不応性の転移性ＰＣＡを発症したことを示す図である。（Ａ）性腺摘除した動物のカプラン−マイヤーの全体的な累積サバイバル解析。性腺摘除したＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−コホート（ｎ＝２２）について、無性腺摘除Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−コホート（ｎ＝２０）と比較して、寿命の統計学的に有意な延長（Ｐ＜０．０００１）が見出された（アステリスク）。矢印は、１５週齢における性腺摘除を示す。（Ｂ）性腺摘除術は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体において、前立腺癌の転移を遮断しなかった。より高い倍率の写真（枠で囲まれた領域）を右に示す（パネルｂ）。代表的なリンパ節転移の組織病理学的解析。スケールバー、パネルａについては２００μｍ、パネルｂについては５０μｍ。（Ｃ）組織病理学的増殖解析によって、性腺摘除されたＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体においては、性腺摘除されたＷＴマウスおよびＰｔｅｎｐｃ−／−マウスと比較して、高い増殖（褐色の染色）が明らかになった。Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン／エオシン。スケールバー、５０μｍ。１５週齢において性腺摘除された２３週齢のマウスに対して、解析を実施した。（Ｄ）１５週齢において性腺摘除された２３週齢のマウスのｂｒｄｕパルス標識の定量化。３匹のマウス由来の代表的な切片を、各遺伝子型について数えた。アステリスクは、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−との間の統計学的な有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１９】図１９は、ＰｔｅｎおよびＳｍａｄ４が協力して、前立腺癌の開始および進行を制御する機序のモデルを示す図である。前立腺におけるＰｔｅｎの喪失の結果、前立腺腫瘍の発生が生じるが、さらなる進行は、Ｐｔｅｎの喪失が引き起こした増殖遮断／老化によって抑制された。ＰｔｅｎおよびＳｍａｄ４の両方の喪失により、Ｐｔｅｎ喪失誘導型の増殖遮断／老化、ならびにおそらく、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２またはＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２のサブセットによる差し迫った細胞の動き等のその他の細胞性および細胞内の抑制機構が回避され、最終的には、前立腺腫瘍細胞が進行して転移が生じる。
【図２０】図２０は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で種間三角計測により示差的に発現した遺伝子が、ヒトＰＣＡにおける臨床治療成果とつながりがあることを示す図である。（Ａ）Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で示差的に発現した遺伝子（表１Ｂ）と、ヒト転移性ＰＣＡデータセット１９とのオーバーラップに基づいた、５６個の遺伝子セットの開発を示す略図。（Ｂ）それに続いて、この５６個の遺伝子セット（表７）を、前立腺癌遺伝子発現データセット上で、予後を示す有用性について評価した。患者サンプルが、この５６個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスター（低リスク群および高リスク群）のカテゴリーに分かれた。生化学的再発（ＢＣＲ）ＰＳＡレベル（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）のカプラン−マイヤー解析は、この５６個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいた。「高リスク」コホートについては、「低リスク」コホートと比較して、ＢＣＲ  ＰＳＡ無再発生存の統計学的な有意性（Ｐ＝０．００１８）が見出された。
【図２１】図２１は、インビトロにおいて浸潤を機能的に誘導または阻害するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを同定するアプローチを示す図である。
【図２２】図２２は、候補遺伝子を機能的に検証するための浸潤アッセイの使用を示す図である。三つ組の、ＳＰＰ１および／またはＧＦＰ対照を過剰発現するＰＣ３細胞を用いた代表的なＢｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイ。（Ａ）ＳＰＰ１を強制発現させることよって、ヒトＰＣＡ  ＰＣ３細胞の浸潤活性を有意に増強するその能力が、浸潤アッセイにより確認された。（Ｂ）棒グラフは、強制されたＳＰＰ１とＧＦＰ対照との間の統計学的有意性を示す（Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）この表によって、細胞の動きに関与するとしてアノテートされている浸潤促進性の遺伝子、それらばかりでなく、動きに関与するとは分類されないが、インビトロにおいて浸潤性かつ転移性の特性を誘導する遺伝子も、このアッセイが同定することが確認されている。細胞の動きをアノテートされている遺伝子以外の遺伝子と比較して、有意に高い頻度（Ｐ＝０．０２、フィッシャーの直接確率検定）の、浸潤が検証されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、細胞の動きの遺伝子としてアノテートされている。
【図２３】図２３は、Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ４トランスクリプトームデータから得られた情報である４（４）個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ遺伝子サインＰＴＥＮ−ＳＭＡＤ４−Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１−ＳＰＰ１、組織病理学的データ、および浸潤検証データが、ヒトＰＣＡにおける臨床治療成果とつながりがあることを示す図である。（Ａ）前立腺癌遺伝子発現データセット上では、ＰｔｅｎおよびＳｍａｄ４の発現の調節不全が、関連のＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１（増殖／老化）およびＳＰＰ１（運動性ネットワーク）と一緒になって生じ、それに続いて、ヒト前立腺癌の進行と相関することが示された。患者サンプルが、Ｋ平均法により、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１のサインによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリー（高リスク群および低リスク群）に分かれた。高リスク群の患者は、カプラン−マイヤー解析により、生化学的再発（ＢＣＲ）ＰＳＡレベル（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）の統計学的有意性を示した。（Ｂ）ＰＣＡの進行における、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１のサインの有意な相関性を、独立したＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＰＨＳ）データセットにおいてｃ−ｓｔａｔｉｓｔｉｃを用いて検証した。ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１は、致命的な治療成果の予測においては、グリーソンスコアと類似する検出力を示している。ＰＨＳにおいては、ＰＴＥＮ遺伝子、ＳＭＡＤ４遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子およびＳＰＰ１遺伝子を、グリーソンに加えることによって、グリーソン単独のモデルよりも、致命的な治療成果の予測が有意に改善されている。さらに、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１の４個の遺伝子のセットが、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ、２．５版）において管理された２４４個の二方向性サインのうち、最も強化されているとランク付けられ、このことからも、致命的な治療成果の予測における、この４個の遺伝子サインのロバストな有意性が示された。
【図２４】図２４は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−二重突然変異体とＰｔｅｎｐｃ−／−マウスとの間で種間三角計測により示差的に発現した遺伝子が、ヒト乳癌における臨床治療成果とつながりがあることを示す図である。（Ａ）５６個の遺伝子のセット（表７）を、続いて、乳房腺癌データセット上で予後を示す有用性について評価した。患者サンプルが、この５６個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスター（低リスク群および高リスク群）のカテゴリーに分かれた。カプラン−マイヤー解析を、この５６個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいて、生存確率（ｐ＝０．００３５８）（Ａ）および無転移生存（ｐ＝００４９２）について実施した（Ｂ）。
【図２５】図２５は、前立腺の進行および乳癌の進行の両方に相関するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、ヒト乳癌における臨床治療成果と強いつながりがあることを示す図である。（Ａ）前立腺癌および乳癌の両方において進行相関性発現を示す２０個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ（表６）を、乳房腺癌データセット上で、予後を示す有用性について評価した。患者サンプルが、この２０個の進行相関性遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスター（低リスク群および高リスク群）のカテゴリーに分かれた。カプラン−マイヤー解析を、これら２０個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴによって定義された群に基づいて、生存確率（ｐ＝２．９３ｅ−１１）（Ａ）および無転移生存（ｐ＝４．６２ｅ−１０）（Ｂ）について実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、転移性前立腺癌を有し、または転移性前立腺癌を発症するリスクのある対象に関連した徴候、およびそのような対象をもたらすＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの同定に関する。本発明はさらに、浸潤性かつ転移性の前立腺癌のマウスモデルも提供し、このマウスの前立腺上皮は、Ｐｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子等の開始病変の欠失または突然変異性もしくはエピジェネティックな消去のその他の手段を維持する。当業者であれば、癌遺伝子の導入遺伝子の過剰発現を含めて、その他の開始病変が、Ｓｍａｄ４の欠失に連動して、悪性の進行を可能にする場合があるであろうことを認識するであろう。このマウスモデルを使用して、癌検出生物マーカーを同定することができる。
【００２６】
ヒト癌には、数え切れない遺伝子的およびエピジェネティックな変化が生じており、悪性プロセスを引き起こし、所与の腫瘍の臨床挙動を決定付ける変化を解読するのは大変な課題である。多くの癌型にわたり、特に、前立腺癌について、腫瘍が悪性となる可能性を反映する正確な予測生物マーカーが必要であることは明らかである。前立腺癌の場合、現在の管理アルゴリズムでは、治療が不十分であり死亡のリスクが生じる場合、または不必要な、死を招く恐れのある治療に曝される場合のいずれかに至る。
【００２７】
遺伝子工学的に作製されたマウスモデルが、ヒトの非常に複雑なゲノムデータセットを探るための「フィルター」として極めて強力であることが示されている。特に、ヒト癌のこれらの洗練された遺伝子工学的に作製されたマウスモデルは、高解像度の比較癌ゲノミクス解析においては、癌に関連する転写および染色体ＤＮＡの異常パターンの相当なオーバーラップを示すことが記載されている。染色体ＤＮＡ異常パターンからは、多くの新規の癌遺伝子の迅速かつ効率的な同定に至っている。また、血清プロテオームの類似の種間比較も、ヒトにおいて膵臓癌の早期検出生物マーカーを同定するのに有効であることが証明されている。したがって、本物のヒト前立腺癌遺伝子によって誘導される転移の疾患状況を再現する妥当なマウスモデルの開発が、予後を示す生物マーカーおよび早期検出の生物マーカーならびに予想される治療標的を開発するための我々の努力を大いに促進することは理にかなっている。
【００２８】
緩徐進行型Ｐｔｅｎ欠損前立腺ＰＩＮ病変の網羅的トランスクリプトーム解析から、ＰＩＮを越える進行を遮断する、Ｐｔｅｎ不活性化の状況においては、老化応答を引き起こすＳｍａｄ４依存性のチックポイントの存在が暗示された。実際に、Ｐｔｅｎの欠失と一緒に、マウス前立腺上皮中のＳｍａｄ４も同時に欠失させると、潜伏期間の短い劇症性の転移性前立腺のモデルが生じ、この仮説の明確な遺伝子的証拠を得た。これが、本物の前立腺腫瘍抑制因子によって誘導される転移性前立腺癌のマウスモデルであることは、ヒトにおいてＰＣＡが原発性から転移性に進行する間はＳｍａｄ４が一貫して下方制御されることが実証されたことによって支持されている。このモデルの妥当性は、２つの種にわたり保存されている、予測されたＳｍａｄ４の直接標的１７個によって、ヒトの前立腺および乳房の腺癌を、再発または生存によって測定した場合に治療成果の有意な差を示す２つの群に階層化することが可能であることが実証されたことによってもさらに補強された。したがって、本発明者らは、転移性ＰＣＡの本物の遺伝子工学的に作製されたマウスモデルを確立するに至り、これにより、今後の機構研究ならびに予後を示す生物マーカーおよび早期検出の生物マーカーの探索におけるゲノムおよびプロテオミクスの比較解析が可能となる。
【００２９】
Ｐｔｅｎ機能の喪失が、前立腺の発癌の最も顕著な遺伝子的事象の１つであることが確立されている。Ｐｔｅｎが喪失すると、マウス前立腺において、前立腺の腫瘍形成が生じる。しかしまた、これは、腫瘍細胞が浸潤性の段階に進行するのを遮断する、腫瘍抑制因子のさらなるレベルとして機能することができる細胞の老化も引き起こす。Ｐｔｅｎがｐ５３の不活性化を通して引き起こした老化の無効化は、前立腺腫瘍が緩徐進行型病変から浸潤性腫瘍に進行するのに寄与する。本発明者らはまた、Ｓｍａｄ４が喪失すると、Ｐｔｅｎの喪失が惹起した細胞の老化が回避され得ることも発見するに至った。Ｓｍａｄ４の喪失による老化の無効化は、Ｐｔｅｎの喪失と協同して働き、腫瘍細胞の促進においてその役割を果たすことができる。また、このことは、ｐ５３の喪失による細胞の老化の回避が、Ｐｔｅｎの喪失と協同して働き、前立腺腫瘍が転移性ではないが中程度の浸潤性の病変に進行するのに寄与するという以前の報告にも一致する。したがって、この独特のＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４モデル系は、今後、この重要な腫瘍の生物学的プロセスについての分子事象をさらに細かく調べるためのツールをもたらす。
【００３０】
Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ４二重突然変異マウスにおいては、老化の回避の結果、前立腺腫瘍細胞が浸潤性かつ転移性の状況に進行したが、Ｐｔｅｎ／ｐ５３不活性化を示すマウスモデルにおいては、老化を回避しても、転移は生じない。マウス前立腺におけるＰｔｅｎ単独の不活性化は、Ｐｔｅｎマウスのごく一部（８匹中２匹）では、非常な高齢（１年超）になると何らかの弱い転移の表現型を生じ得る。これらの観察から、Ｐｔｅｎの喪失以外に、追加の遺伝子的またはエピジェネティックな変化が、前立腺腫瘍細胞が転移性の状況を達成するためには必要であることが示されている。細胞の老化の回避は、進行のための必須条件であり得るが、ロバストな転移性の状況を達成するためには、自己貪食の活性解除等のその他の生物学的プロセスが必要である可能性が高い。その他の生物学的プロセスの存在の裏付けとして、我々は、Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ欠損腫瘍細胞においてＳｍａｄ４を再構成しても、老化は復元されないが、細胞が非転移性になることを観察した。具体的には、我々は、Ｓｍａｄ４の発現を時間依存性および用量依存性に修復する誘導性のＳｍａｄ４ｔｅｔ−ｏｎ系を確立した。Ｓｍａｄ４の修復によって、腫瘍が、ＴＧＦβ処置に応答して、細胞死に対する感受性を増加させることができることが見出された。
【００３１】
標準的なＴＧＦβ−Ｓｍａｄ経路は、リガンド−受容体の複合体から開始し、核内で終了する。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合により、受容体−リン酸化（ｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｅｄ）Ｒ−Ｓｍａｄが、Ｓｍａｄ４とオリゴマーを形成し、核にトランスロケーションし、ＤＮＡ上のＳｍａｄ結合エレメントに直接結合し、そこで、これらは、多種多様な遺伝子アレイを誘導または抑制することができる。良性の前立腺上皮においては、ＴＧＦ−βは、分化を惹起し、増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することによって、前立腺中でホメオスタシスを維持するための機構を提供する。したがって、ＴＧＦβのこの主要な働きが、前立腺腫瘍の進行抑制において決定的な役割を果たすことが憶測された。ＴＧＦβシグナル伝達の腫瘍抑制因子の役割は、ＴＧＦβを不活性化する受容体の突然変異の存在、ならびに前立腺癌を含めた、複数の癌におけるＳｍａｄ２タンパク質、Ｓｍａｄ３タンパク質およびＳｍａｄ４タンパク質の消去によって強調される。ＴＧＦβは、多くの正常な細胞型および腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されたが、また、ＴＧＦβは、増殖、遊走、および進行した細胞癌が浸潤性の高い、未分化かつ転移性の表現型を獲得するプロセスである上皮−間葉系間移行（ＥＭＴ）を含めて、上皮腫瘍が悪性となる可能性を増強するという報告もあった。より最近になって、乳腺腫瘍の微小環境中のＴＧＦβが、癌細胞を予備刺激して肺へ転移させることができることが実証されている。これは、ＴＧＦβが、Ｓｍａｄシグナル伝達経路を介してアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）を誘導することを通して行われる。腫瘍の抑制および促進のこれらの逆説的な活性はおそらく、所与の細胞中のその他のシグナル伝達経路の活性に依存し、これらの活性は、異なる細胞の状況およびその他の組織との相互作用によって決定付けられる。今では、Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ４モデルから、少なくともＰｔｅｎ欠損のバックグラウンド上では、Ｓｍａｄ４の喪失は、単独では前立腺病変の発生を開始するには十分ではないが、前立腺腫瘍の加速および完全な浸透を伴う転移への進行を促すことを明らかに示すことによって、前立腺癌におけるＴＧＦβ経路の役割が明確になっている（図３）。Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ４モデル研究から、Ｓｍａｄ４の喪失が、Ｐｔｅｎの喪失によって引き起こされた老化を無効にすることができることが明らかに実証された。Ｐｔｅｎ欠損のバックグラウンドにおけるｐ５３の喪失による老化の無効化からは、緩徐進行型前立腺腫瘍の浸潤性病変への進行が生じるが、転移には至らない。したがって、老化は、緩徐進行型から浸潤性の状況への前立腺腫瘍形成の間の早期の障壁であると見なされている。Ｓｍａｄ４を、Ｐｔｅｎ／Ｓｍａｄ４二重突然変異前立腺腫瘍細胞中に戻して修復しても、老化は修復されなかった（未公開のデータ）。しかし、Ｓｍａｄ４を修復すると、ＴＧＦβ１処置により、細胞の生存率が減少した。したがって、この老化の障壁は、腫瘍の進行を遮断するための、（１つまたは複数の）発癌性シグナルに対する一過性の細胞応答であり得る。
【００３２】
さらに、同等の早期のＰｔｅｎ欠損前立腺腫瘍およびＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ欠損前立腺腫瘍（各遺伝子型について、ｎ＝５）の分子比較トランスクリプトーム解析から、３７２個の遺伝子の示差的発現が明らかになった。これらのうち、少なくとも６６個の遺伝子が、それらのプロモーター中にＳｍａｄ結合エレメントを含有する。我々は、比較癌ゲノミクスを通して、多くの腫瘍の型にわたり疾患の進行に影響する遺伝子ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを発見するにあたり、ヒト転移性前立腺腫瘍のコピー数のプロファイルを用いた種間統合を通して、ヒト前立腺癌の場合の再発のリスクならびに乳癌の場合の転移のリスクおよび生存と強力に関連性がある、これらのＳｍａｄ４標的のうちの１７個を同定し、これによって、この新規の転移性前立腺モデルのヒトとの関連性およびその使用を支持する。
【００３３】
したがって、本発明は、転移性前立腺癌の動物モデルを提供する。したがって、本発明の動物モデルは、正常集団および疾患に罹患している患者集団の両方に関与する種々の遺伝子の機構を解明するためのスクリーニングツールとしての特定の有用性を示す。
【００３４】
本発明はまた、転移性腫瘍に関連したＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することによって、転移性前立腺癌をもちまたは転移性前立腺癌を経験するリスクのある、転移性腫瘍に対して無症候性の対象も含めた対象を、同定するための方法も提供する。これらの徴候およびＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌の治療および療法を受けた対象をモニタし、癌を有する対象で有効となり得る療法および治療を選択しもしくは修正するのにも有用であり、そのような治療および療法の選択および使用は、腫瘍の進行を遅くし、またはその発症を実質的に遅延させもしくは予防し、または腫瘍転移の発生を低下させもしくは予防するものである。
【００３５】
（定義）
「精度」は、測定されまたは計算された量（試験で報告された値）と、その実際の（または真の）値との適合性の程度を指す。臨床精度は、真の結果（真陽性（ＴＰ）または真陰性（ＴＮ））対誤判別された結果（偽陽性（ＦＰ）または偽陰性（ＦＮ））の割合に関係し、感受性、特異性、陽性的中率（ＰＰＶ）、もしくは陰性的中率（ＮＰＶ）、またはその他の尺度の中でも可能性、オッズ比と言える。
【００３６】
本発明の文脈における「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」は、限定するものではないが、タンパク質、核酸、および代謝産物を、これらの多型、変異、変種、修飾、サブ単位、断片、タンパク質−リガンド複合体、および分解生成物、タンパク質−リガンド複合体、元素、関連する代謝産物、およびその他の分析物またはサンプル由来の尺度と共に包含する。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、変異タンパク質または変異核酸を含むこともできる。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、非血液感染性因子または健康状態の非分析的生理学的マーカー、例えば本明細書で定義された「臨床パラメータ」、ならびに本明細書でも定義される「伝統的な実験室でのリスク因子」も包含する。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、数学的に生成された任意の計算された指標、または、時間的傾向および差を含む前述の測定のいずれか１つもしくは複数の組合せも含む。利用可能な場合には、および本明細書で他に記述されない場合、遺伝子産物であるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、公文書での略称、またはｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｎａｍｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  （ＨＧＮＣ）によって割り当てられかつｔｈｅ  ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）にこの出願日に列挙された遺伝子記号をベースにして同定され、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅとしても公知である。
【００３７】
「（１個または複数の）ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」は、そのレベルが転移性前立腺癌を有しまたは転移性前立腺癌を発症し易くなりまたは転移性前立腺癌のリスクのある対象において変化する、全ての核酸またはポリペプチドの１種または複数を包含する。個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを表１Ｂにまとめ、これらをまとめて本明細書では、とりわけ「転移性腫瘍関連タンパク質」、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴポリペプチド」、または「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質」と呼ぶ。ポリペプチドをコードする、対応する核酸を、「転移性腫瘍関連核酸」、「転移性腫瘍関連遺伝子」、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸」、または「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ遺伝子」と呼ぶ。他に指示しない限り、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」、「転移性腫瘍関連タンパク質」、「転移性腫瘍関連核酸」は、本明細書に開示される配列のいずれかを指すことを意味する。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質または核酸の、対応する代謝産物も、前述の伝統的なリスクマーカー代謝産物と同様に測定することができる。
【００３８】
健康状態（例えば、年齢、家族歴、および伝統的なリスク因子として一般に使用されるその他の測定値）の生理学的マーカーを、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ生理機能」と呼ぶ。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの前述の種類の１つまたは複数、好ましくは２つ以上を数学的に組み合わせた測定値から得た計算された指標を、「ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標」と呼ぶ。
【００３９】
「臨床パラメータ」は、限定するものではないが、年齢（Ａｇｅ）、人種（ＲＡＣＥ）、性別（Ｓｅｘ）、または家族歴（ＦａｍＨＸ）など、対象の健康状態またはその他の特徴の全ての非サンプルまたは非分析物生物マーカーを包含する。
【００４０】
「循環内皮細胞」（「ＣＥＣ」）は、炎症を含めたある状況で、血流に剥落する血管内壁からの内皮細胞であり、癌の病因に関連した新しい脈管構造の形成に寄与する。ＣＥＣは、腫瘍進行および／または抗血管新生療法に対する応答のマーカーとして役立てることができる。
【００４１】
「循環腫瘍細胞」（「ＣＴＣ」）は、原発性腫瘍から転移に剥落する上皮由来の腫瘍細胞であり、循環内に進入する。末梢血中の循環腫瘍細胞の数は、転移性癌を有する患者の予後に関連する。上皮細胞を検出する免疫学的方法を使用して、これらの細胞を分離および定量化することができ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光法またはその他のアプローチによって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのそれらの発現を定量化することができる。
【００４２】
「ＦＮ」は、偽陽性であり、疾患状態の試験では、疾患対象を誤って非疾患または正常であると分類することを意味する。
【００４３】
「ＦＰ」は、偽陽性であり、疾患状態の試験では、正常な対象を誤って疾患を有すると分類することを意味する。
【００４４】
「式」、「アルゴリズム」、または「モデル」は、任意の数学的方程式、アルゴリズム的、分析的、もしくはプログラムされたプロセス、または１つもしくは複数の連続したもしくはカテゴリー的入力（本明細書では、「パラメータ」と呼ぶ。）を得、かつ出力値を計算する統計的技法であり、時々「指標」または「指標値」と呼ばれる。「式」の非限定的な例には、合計、比、および回帰演算子が含まれ、例えば、係数または指数、生物マーカー値の変換および正規化（限定するものではないが、性別、年齢、または人種などの臨床パラメータをベースにした正規化スキームを含む。）、規則および指針、統計的分類モデル、および歴史的集団で訓練された神経回路網がある。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴおよびその他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを組み合わせる際に特に使用されるものは、対象サンプルで検出されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルと転移性疾患の対象のリスクとの関係を決定するための、１次および非１次方程式と統計的分類分析である。パネルおよび組合せ構成において、特に興味深いものは、構造的および共同統計分類アルゴリズムであり、リスク指標構成の方法であり、とりわけ、相互相関、主成分分析（ＰＣＡ）、因子軸回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ線形判別分析（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダム予報（ＲＦ）、帰納的分配木（ＲＰＡＲＴ）、ならびにその他の関連ある決定木分類技法、収縮重心（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、Ｋｔｈ最短隣接、ブースティング、判別木、神経回路網、Ｂａｙｅｓｃｉａｎネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデルなどの確立された技法を含む、パターン認識フィーチャーを利用するものである。その他の技法は、当業者に周知のＣｏｘ、Ｗｅｉｂｕｌｌ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ、およびＧｒｅｅｎｗｏｏｄモデルも含めた、生存および時間事象ハザード分析で使用することができる。これら技法の多くは、順方向選択、逆方向選択、または段階的選択などのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ選択技法、所与のサイズの遺伝的アルゴリズムの全ての可能性あるパネルの全数調査と組み合わせて有用であり、またはこれら技法そのものは、それ自体の技法において生物マーカー選択法を含んでいてもよい。これらは、追加の生物マーカーとモデル改良とのトレードオフを定量するために、かつ過剰適合を最小限に抑えるのを助けるために、Ａｋａｉｋｅ情報基準（ＡＩＣ）またはＢａｙｅｓ情報基準（ＢＩＣ）と結合してもよい。得られる予測モデルは、ブートストラップ、リーブワンアウト（ＬＯＯ）、および１０倍クロス確認（１０倍ＣＶ）などの技法を使用して、その他の研究で確認することができまたは当初慣れていた研究でクロス確認することができる。様々なステップで、誤検出率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）は、当技術分野で公知の技法により、値の順列によって推定することができる。「医療経済効用関数」は、ケア基準に診断または治療の介入を導入する前後で理想化された適用可能な患者集団での臨床結果範囲の予測された確率の組合せから得られた式である。これは、そのような介入の精度、有効性、��よび性能特性の推測値と、各結果に関連した費用および／または値の測定（有用性）であって、ケアの実際の医療制度コスト（サービス、サプライ、装置、および薬物など）から得ることができ、かつ／または各結果をもたらす生活の質で調整した年数（ＱＡＬＹ）当たりの推定許容値として包含する。全ての予測された結果全体を通して、ある結果に関して予測される集団サイズとそれぞれの結果の期待効用との積の合計は、ケアの所与の基準の全医療経済効用である。（ｉ）介入のあるケア基準に関して計算された全医療経済効用と、（ｉｉ）介入のないケア基準に関する全医療経済効用との差は、医療経済コストまたは介入の値の全体的な尺度をもたらす。これは、それ自体が分析される全患者群の中で（または介入群の中でのみ）分割されて、単位介入当たりのコストに到達し、市場ポジショニング、価格決定、および医療制度の受入れの前提事項として、そのような決定を案内する。そのような医療経済効用関数は、介入の費用効果を比較するのに一般に使用されるが、保険制度が支払いをしようとするＱＡＬＹ当たりの許容される値、または、新しい介入に必要な許容される費用効果のある臨床性能特性を推定するのに変換してもよい。
【００４５】
本発明の診断（または予後）介入では、各結果（疾患分類診断試験では、ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、またはＦＮであってもよい。）が異なるコストを有するので、医療経済効用関数は、特異性よりも感受性を、またはＮＰＶよりもＰＰＶを、臨床状況および個々の結果のコストおよび値に基づいて優先的に支持してもよく、したがって、より直接的な臨床または分析性能尺度とは異なる可能性のある医療経済性能および値の別の尺度をもたらす。これらの異なる測定および相対的なトレードオフは、一般に、全ての性能尺度が不完全を好むことになるが異なる程度まで、エラー率０の完全試験（０予測対象結果誤判別またはＦＰおよびＦＮとも呼ばれる。）の場合でのみ集中することになる。
【００４６】
「測定する」または「測定」、あるいは「検出する」または「検出」は、そのような物質の定性的または定量的な濃度レベルの誘導を含めた、臨床または対象由来サンプル中の、所与の物質の存在、不存在、定量、または量（有効量にすることができる。）を評価すること、または、対象の非分析物臨床パラメータの値もしくは分類を別の方法で評価することを意味する。
【００４７】
「陰性予測値」または「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）または全ての陰性試験結果の真陰性率によって計算される。これは、試験をしようとする集団の、疾患の有病率および試験前確率によっても本質的に影響を受ける。
【００４８】
例えば、臨床診断試験などの試験の特異性、感受性と、陽性および陰性予測値について論じている、Ｏ’Ｍａｒｃａｉｇｈ  ＡＳ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＲＭ、「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ  Ｏｆ  Ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ，  Ｈｏｗ  Ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ  Ｏｒ  Ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ  Ｒｅｓｕｌｔｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄ．１９９３年、３２（８巻）：４８５〜４９１頁を参照されたい。しばしば、連続診断試験測定を使用する２元疾患状態分類アプローチでは、感受性および特異性は、Ｐｅｐｅら、「Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｄｄｓ  Ｒａｔｉｏ  ｉｎ  Ｇａｕｇｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ，  ｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ」、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、２００４年、１５９（９巻）：８８２〜８９０頁による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によってまとめられ、また、曲線下面積（ＡＵＣ）またはｃ統計、すなわち、単一の値でのみ試験（またはアッセイ）カットポイントの全範囲にわたって試験、アッセイ、または方法の感受性および特異性の表示を可能にする指標によってまとめられる。例えば、Ｓｈｕｌｔｚ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、１４章、Ｔｅｉｔｚ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ（編）、４版、１９９６年、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９２〜１９９頁；およびＺｗｅｉｇら、「ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａｎ  Ｅｘａｍｐｌｅ  Ｓｈｏｗｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｎｄ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｒｏｎｏｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３８（８巻）：１４２５〜１４２８頁も参照されたい。尤度関数、オッズ比、情報理論、予測値、較正（適合度を含む。）、および再分類測定を使用する代替の手法は、Ｃｏｏｋ、「Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｉｓｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ  ｉｎ  Ｒｉｓｋ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００７年、１１５巻：９２８〜９３５頁に要約されている。
【００４９】
最後に、試験によって定義された対象コホートでのハザード率と絶対および相対リスク率は、臨床精度および有効性のさらなる測定値である。基準限界、識別限界、およびリスク閾値を含めた異常なまたは疾患値を定義するのに、多数の方法が頻繁に使用されている。
【００５０】
「分析精度」は、測定プロセスそのものの再現性および予測可能性を指し、変動係数などの測定値と、異なる時間、使用者、装置、および／または試薬を用いた同じサンプルまたは対照の一致および較正の試験にまとめることができる。新しい生物マーカーを評価する際のこれらおよびその他の課題は、Ｖａｓａｎ、２００６年にもまとめられている。
【００５１】
「性能」は、とりわけ臨床および分析精度、使用特性（例えば、安定性、使い易さ）、医療経済値、および試験の成分の相対コストなどのその他の分析およびプロセス特性も含めた、診断または予後試験の全体的な有用性および質に関する用語である。これら因子のいずれかは、優れた性能の源であってよく、したがって試験に役立てることができ、関連あるものとしてＡＵＣや結果までの時間、寿命などの、適切な「性能マトリックス」によって測定してもよい。
【００５２】
「陽性予測値」または「ＰＰＶ」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）または全ての陽性試験結果の真陽性率によって計算される。これは疾患の有病率および試験がなされる集団の試験前確率の影響を本質的に受ける。
【００５３】
本発明の文脈における「リスク」は、転移性事象への変換のように、ある事象が特定の期間にわたって生じる確率に関し、対照の「絶対」リスクまたは「相対」リスクを意味することができる。絶対リスクは、関連ある時間コホートに関する測定後の実際の観察を参照しながら、または関連ある期間に関して追跡された統計的に有効な歴史コホートから明らかにされた指標値を参照しながら、測定することができる。相対リスクは、低リスクコホートの絶対リスクまたは平均集団リスクと比較した対象の絶対リスクの比を指し、これは臨床リスク因子がどのように評価されるかによって変動する可能性がある。オッズ比、すなわち所与の試験結果に関する陽性事象と陰性事象との割合も、非変換に一般に使用される（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）に従い、但しｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は非事象の確率である。）。
【００５４】
本発明の文脈における「リスク評価」または「リスクの評価」は、事象または疾患状態が生じる可能性がある確率、オッズ、または尤度、事象または１つの疾患状態から別の状態への変換、すなわち原発性腫瘍から転移性前立腺癌または転移を発症するリスクへの変換、または１次的な転移性事象のリスクから２次的な転移性事象への変換の発生率を予測することを包含する。リスク評価は、予め測定した集団に対する絶対的なまたは相対的な意味で、将来の臨床パラメータ、伝統的な実験室リスク因子の値、またはその他の癌の指標の予測を含むこともできる。本発明の方法は、転移性前立腺癌のリスクの連続的またはカテゴリー的測定を行うのに、したがって転移性腫瘍のリスクがあると定義された対象のカテゴリーのリスクスペクトルを診断し定義するのに使用してもよい。カテゴリー的シナリオでは、本発明は、正常なおよび転移性腫瘍のより高いリスクにあるその他の対象コホートを区別するのに使用することができる。そのような異なる使用は、異なるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せおよび個別的なパネル、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフポイントを必要とする可能性があるが、それぞれの意図される用途には精度および性能に関して同じである前述の測定にかけてもよい。
【００５５】
本発明の文脈における「サンプル」は、対象から単離された生体サンプルであり、例としてかつ限定することなく、組織生検標本、全血、血清、血漿、血液細胞、内皮細胞、循環腫瘍細胞、リンパ液、腹水、間質液（「細胞外液」とも呼ばれ、細胞間の空間に見出される流体を包含し、とりわけ歯肉溝滲出液が含まれる。）、骨髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、粘液、痰、汗、尿、または任意のその他の分泌液、排出物、またはその他の体液を含むことができる。
【００５６】
「感受性」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）または疾患対象の真陽性率によって計算される。
【００５７】
「特異性」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）または非疾患もしくは正常な対象の真陰性率によって計算される。
【００５８】
「統計的に有意な」とは、変化が、偶然によってのみ生じると予測され得るもの（「偽陽性」の可能性がある。）よりも大きいことを意味する。統計的有意は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般に使用される有意性の尺度には、少なくとも所与のデータポイントのように極端な結果を得る確率を示すｐ値が含まれ、このデータポイントは、偶然でのみ得られた結果であると想定される。結果はしばしば、０．０５以下のｐ値で非常に有意であると見なされる。
【００５９】
本発明の文脈における「対象」は、好ましくは哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシにすることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、腫瘍転移の動物モデルを代表する対象として、有利に使用することができる。対象は、オスまたはメスにすることができる。対象は、原発性腫瘍または転移性腫瘍を有するものと、また任意選択で腫瘍の治療介入をすでに受けておりまたは受けているものと予め診断されまたは特定されたものにすることができる。あるいは対象は、転移性前立腺癌を有するものと予め診断されていないものにすることもできる。例えば対象は、転移性前立腺癌に関する１つまたは複数のリスク因子を示すものにすることができる。
【００６０】
「ＴＮ」は真陰性であり、疾患状態の試験において、非疾患または正常な対象を正確に分類することを意味する。
【００６１】
「ＴＰ」は、真陽性であり、疾患状態の試験において、疾患対象を正確に分類することを意味する。
【００６２】
「伝統的な実験室のリスク因子」は、対象サンプルから単離されまたは得られた生物マーカーに対応するもので、臨床実験室で現在評価されておりかつ伝統的なグローバルリスクアセスメントアルゴリズムで使用されている。腫瘍転移についての伝統的な実験室リスク因子として、例えば、グリーソンスコア、浸潤の深さ、血管密度、増殖指数等が挙げられる。腫瘍転移に関するその他の伝統的な実験室のリスク因子は、当業者に公知である。
【００６３】
（本発明の方法および使用）
本明細書に開示する方法は、転移性前立腺癌を発症するリスクがある対象、または乳癌を有する対象等のその他の癌の対象に使用し、これらの対象は、転移性前立腺癌もしくはその他の癌型に罹患しているとすでに診断されていても、または診断されていなくてもよく、原発性腫瘍もしくは転移性前立腺癌およびその他の癌型について治療および／もしくは療法をすでに受けていても、または受けていなくてもよい。本発明の方法は、原発性腫瘍または転移性前立腺癌および他の癌型を有する対象の治療レジメンをモニタしまたは選択するのに、および転移のリスク因子を示す対象など、転移性前立腺癌および他の癌型を有すると予め診断されていない対象をスクリーニングするのに使用することもできる。好ましくは、本発明の方法は、転移性前立腺癌および他の癌型に関して無症候性の対象を特定および／または診断するのに使用される。「無症候性」は、伝統的な兆候および症状を示さないことを意味する。
【００６４】
本発明の方法は、伝統的なリスク因子のみをベースにして、すでに転移性前立腺癌および他の転移性癌型を発症するリスクがより高い対象を特定および／または診断するのに使用してもよい。
【００６５】
転移性前立腺癌および他の転移性癌型を有する対象は、対象由来サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効数（２個以上にすることができる。）の量（存在または不存在を含む。）量を測定し、次いでこの量を基準値と比較することによって、特定することができる。次いでタンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドと、タンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドの多型、変異したタンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドなどの生物マーカーの発現の量およびパターンの変化、または、対象サンプル中の代謝産物もしくは他の分析物の分子量の変化を基準値と比較したものが、特定される。
【００６６】
基準値は、同じ癌を有する対象、同じまたは類似する年齢範囲を有する対象、同じまたは類似する人種群の対象、癌の家族歴を有する対象などを含むがこれに限定するものではない集団研究から得られた数または値に対するもの、または、癌の治療を受けている対象の出発サンプルに対するものにすることができる。そのような基準値は、癌転移の数学的アルゴリズムおよび計算された指標から得られた、集団の統計分析および／またはリスク予測データから得ることができる。基準ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標は、統計的および構造的分類のアルゴリズムおよびその他の方法を使用して構成し使用することもできる。
【００６７】
本発明の一実施形態では、基準値は、転移性腫瘍を発症するリスクがないかまたはそのようなリスクが低い１つまたは複数の対象から得られた対照サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量である。本発明の別の実施形態では、基準値は、転移性前立腺癌に関して無症候性のおよび／または伝統的なリスク因子に欠けている、１つまたは複数の対象から得られた対照サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量である。別の実施形態では、そのような対象は、診断上関連ある期間に関してモニタされかつ／または定期的に再試験され（「長期的研究」）、そのような試験の後に、転移性前立腺癌が継続して存在しないことを確認する（疾患または事象がない生存）。そのような期間は、基準値を決定するための初期試験データから１年、２年、２から５年、５年、５から１０年、１０年、または１０年以上であってもよい。さらに、適正に保存された歴史的対象サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの遡及的測定を、これら基準値を確立するのに使用してもよく、したがって必要とされる研究時間が短縮される。
【００６８】
基準値は、癌の治療および／または療法の結果として転移性リスク因子の改善を示す対象から得られたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を含むこともできる。基準値は、公知の浸潤性または非浸潤性技法によって疾患であることが確認された、または転移性腫瘍を発症するリスクが高い、または転移性前立腺癌に罹患している対象から得られたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を含むこともできる。
【００６９】
別の実施形態では、基準値は、指標値または基礎値である。指標値または基礎値は、転移性腫瘍を有していない、または転移に対して無症候性の、１つまたは複数の対象からのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の複合サンプルである。基礎値は、癌の治療または療法の結果として転移性腫瘍リスク因子の改善が示された対象由来のサンプル中に、ある量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含むこともできる。この実施形態では、対象由来サンプルとの比較を行うために、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量は同様に計算されかつ指標値と比較される。任意選択で、転移性前立腺癌を有しまたは転移性腫瘍を発症するリスクが高いことが明らかにされた対象は、癌の進行を遅らせまたは転移性前立腺癌を発症するリスクを低下もしくは予防する治療レジメンを受けるように選択される。
【００７０】
転移性前立腺癌の進行、または癌治療レジメンの有効性は、経時的に対象由来の有効量（２つ以上であってもよい。）のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出し、検出されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を比較することによって、モニタすることができる。例えば、第１のサンプルは、対象が治療を受ける前に得ることができ、１つまたは複数の後続サンプルは、対象の治療後または治療中に採取される。癌は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が基準値に対して経時的に変化する場合、進行性（または、あるいは、治療が進行を予防しない。）と見なされ、それに対して癌は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が経時的に一定（基準集団に対して、すなわち本明細書で使用される「一定」）である場合には進行性ではない。本発明の文脈で使用される「一定」という用語は、基準値に対する経時的な変化を含むと解釈される。
【００７１】
例えば、本発明の方法は、腫瘍の攻撃性を区別しかつ／または腫瘍の病期（例えば、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩ期、またはＩＶ期）を評価するのに使用することができる。この方法により、患者を、高または低リスク群に階層化し、それに応じて治療することが可能になる。
【００７２】
さらに、特定の対象への投与に適した治療または予防薬は、対象から得られたサンプル中に有効量（２個以上でよい。）のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出し、この対象由来サンプルを、対象由来サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量（２個以上でよい。）を決定する試験化合物に曝すことによって、特定することができる。このように、癌を有する対象または転移性腫瘍を発症するリスクがある対象において使用される治療または治療レジメンは、対象から得られたサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量に基づいて選択することができ、基準値と比較することができる。２つ以上の治療または治療レジメンに関しては、癌の発症を遅延させまたは進行を遅くするよう対象で使用するにはどの治療または治療レジメンが最も効果的になるかを決定するために、並行して評価することができる。
【００７３】
本発明はさらに、対象由来サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量（２個以上でよい。）を決定し、基準サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量と比較し、対象サンプル中の量の変化を基準サンプルと比較して特定することによって、転移性前立腺癌に関連するマーカー発現の変化をスクリーニングするための方法を提供する。
【００７４】
本発明はさらに、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量が、腫瘍から得たサンプルにおいて測定して臨床的に有意に変化した場合に、患者が腫瘍を有していると特定し、腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンで患者を治療することによって、腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。
【００７５】
さらに本発明は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を測定することにより、患者における転移のリスクを評価することによって、アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法であって、患者からの腫瘍サンプル中の２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、患者がアジュバント治療を必要としていることを示す方法を提供する。
【００７６】
患者から得た腫瘍サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量に関する情報を得、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意に変化する場合に、患者における腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンを選択することによる、腫瘍患者の治療決定に関する情報。
【００７７】
基準サンプル、例えば対照サンプルが、転移性癌を有していない対照から得たものである場合、または基準サンプルが、転移性前立腺癌への急速な進行の高い尤度を有する者に対する値を反映する場合、試験サンプルおよび基準サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が類似していることは、治療が効果的であることを示す。しかし、試験サンプルおよび基準サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が異なることは、臨床結果または予後がそれほど好ましくないことを示す。
【００７８】
「効果的」とは、治療が、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の量または活性の減少をもたらすことを意味する。本明細書に開示されるリスク因子の評価は、標準的な臨床プロトコルを使用して実現することができる。有効性は、転移性疾患を診断し、特定し、または治療するための任意の公知の方法に関連して決定することができる。
【００７９】
本発明は、転移病変に関連した一般的な生理学的経路を示す１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、例えば、転移に関連した異なる疾患状態または後遺症を排除しまたはこれらを区別するのに使用することができる１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルも提供する。単一のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、本発明による前述の特徴のいくつかを有していてもよく、あるいは、本発明の所与の適用例に向けて適切な場合には１個または複数のその他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの代わりに使用してもよい。
【００８０】
本発明は、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物を結合させる検出試薬を有するキットも含む。本発明によって、検出試薬、例えば２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質または核酸をそれぞれ結合することができる抗体および／またはオリゴヌクレオチドのアレイも提供される。一実施形態では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴがタンパク質であり、アレイは、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に有意な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２を結合する抗体を含有する。別の実施形態では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが核酸であり、アレイは、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に優位な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、有効量のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２を結合するオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含有する。
【００８１】
別の実施形態では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴはタンパク質であり、アレイは、基準値と比較して、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現の統計学的に有意な変化を測定するのに十分に有効な量の表１〜７のうちのいずれか１つに列挙するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに結合する抗体を含有する。別の実施形態では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは核酸であり、アレイは、基準値と比較して、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現の統計学的に有意な変化を測定するのに十分に有効な量の表１〜７のうちのいずれか１つに列挙するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに結合するオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含有する。
【００８２】
本発明によれば、転移性腫瘍を発症するリスクがある１つまたは複数の対象を治療するための方法であって、１つまたは複数の対象からのサンプル中に存在するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の変化量の存在を検出し；転移性疾患を発症するリスクが低い１つまたは複数の対象であるいは転移性疾患の伝統的なリスク因子のいずれかを示さない対象で測定された基礎値に、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの変化量または活性が戻るまで、１種または複数の癌調節剤で１つまたは複数の対象を治療する方法も提供される。
【００８３】
本発明によれば、転移性腫瘍を有する１つまたは複数の対象を治療するための方法であって、１つまたは複数の対象からのサンプル中に存在するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の変化レベルの存在を検出し；転移性腫瘍を発症するリスクが低い１つまたは複数の対象で測定された基礎値に、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの変化量または活性が戻るまで、１種または複数の癌調節剤で１つまたは複数の対象を治療することによる方法も提供される。
【００８４】
本発明によれば、癌と診断された対象における転移性前立腺癌を発症するリスクの変化を評価するための方法であって、第１の期間で、対象由来の第１のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量（２個以上でよい。）を検出し、第２の期間で、対象由来の第２のサンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を検出し、第１と第２の期間で検出されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を比較する方法も提供される。
【００８５】
（本発明の診断および予後指標）
本発明によって、癌型のうち、前立腺、乳房等の原発性、局所浸潤性および／または転移性の腫瘍の診断および予後診断が可能になる。転移性前立腺癌を発症するリスクは、試験サンプル（例えば、対象由来サンプル）中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、およびその他の分析物の有効量（２個以上でよい。）を測定し、多数の個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果からおよび非分析物臨床パラメータからの情報を単一の測定値または指標へと組み合わせるために数学的アルゴリズムまたは式をしばしば利用して、有効量を基準または指標値と比較することによって、検出することができる。転移性前立腺癌または他の転移性癌型のリスクが高いことが明らかにされた対象は、任意選択で、転移性前立腺癌または他の転移性癌型の発症を予防しまたは遅延させるための予防または治療化合物の投与などの治療レジメンを受けるように選択することができる。
【００８６】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の量は、試験サンプル中で測定することができ、基準限界、識別限界、またはカットオフポイントもしくは異常値を定義するリスク画定閾値などの技法を利用して「正常対照レベル」と比較することができる。「正常対照レベル」は、転移性腫瘍に罹患していない対象で典型的に見出される、１個もしくは複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴまたは組み合わせたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＴの指標のレベルを意味する。そのような正常対照レベルおよびカットオフポイントは、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが単独で使用されるのかまたはその他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴと組み合わせた方式で１つの指標として使用されるのかに基づいて、変化してもよい。あるいは正常対照レベルは、臨床的に関連ある対象期間を通して転移性腫瘍を発症することのない予め試験された対象からの、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパターンのデータベースにすることができる。
【００８７】
本発明は、転移性前立腺癌、または他の転移性癌型に変換されるリスクの連続的またはカテゴリー的測定を行うのに使用してもよく、したがって、転移性事象を有するリスクがあると定義された対象のカテゴリーのリスクスペクトルを診断し定義するのに使用してもよい。カテゴリー的シナリオでは、本発明の方法は、正常および疾患対象コホートを区別するのに使用することができる。その他の実施形態では、本発明は、転移性事象を有するリスクにあるものと、転移性事象にさらに急速に進行するもの（あるいは、転移性事象までの推定される対象期間がより短いもの）、よりゆっくり進行するもの（または、転移性事象までの対象期間がより長いもの）、または転移性癌を有するもの、正常なものとが区別されるように使用してもよい。そのような異なる使用は、個々のパネル、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフポイントで、異なるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せを必要とする可能性があるが、前述の同じ精度測定と、意図される用途に関連したその他の性能マトリックスの下に置いてもよい。
【００８８】
転移性事象を有するリスクがある対象を特定することによって、この対象が転移性疾患状態に変換されるのを遅延させ、低減させ、または予防するために、様々な治療介入または治療レジメンを選択し開始することが可能になる。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の有効量のレベルは、転移性疾患または転移性事象の治療経過をモニタすることも可能にする。この方法では、生体サンプルを、癌の治療レジメン、例えば薬物治療を受けた対象から得ることができる。必要に応じて、生体サンプルは、治療の前、間、または後の様々な時点で対象から得られる。
【００８９】
いくつかのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが機能活性を示すことから、その機能を解明することによって、高いＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを示す対象を、例えば、ＴＧＦβシグナル伝達を通して機能する、そのような経路を選択的に標的にする薬剤／薬物を用いて管理することができ、したがって、対象を、ＴＧＦβシグナル伝達経路の種々の構成成分の遮断を増強する薬剤を用いて治療することができる。
【００９０】
本発明は、患者または対象集団を、任意の数のセッティングでスクリーニングするのに使用することもできる。例えば、健康管理組織、公衆衛生団体、または学校保健プログラムは、上述のような介入が必要なものを特定するために、または疫学的データを収集するために、対象群をスクリーニングすることができる。保険会社（例えば、健康、生命、または障害）は、補償範囲または価格設定を決定する過程で申込者を、または可能性ある介入を目的として既存のクライアントを、スクリーニングしてもよい。そのような集団スクリーニングで収集されたデータは、特に癌または転移性事象のような状態への任意の臨床的進行と関係している場合、例えば健康管理組織、公衆衛生団体、および保険会社の運用において、価値あるものになる。そのようなデータアレイまたは収集は、機械可読媒体に記憶させることができ、改善されたヘルスケアサービス、費用効果のあるヘルスケア、改善された保険運用などを提供するために、任意の数の健康関連データ管理システムで使用することができる。例えば、米国特許出願第２００２／００３８２２７号；米国特許出願第２００４／０１２２２９６号；米国特許出願第２００４／０１２２２９７号；および米国特許第５，０１８，０６７号を参照されたい。そのようなシステムは、以下にさらに詳述するように、内部データストレージから直接、または遠隔にある１つもしくは複数のデータストレージ部位から、データにアクセスすることができる。
【００９１】
機械可読記憶媒体は、前記データを使用するための命令によってプログラムされた機械を使用したときに、経時的なまたは薬物療法に応答した転移性疾患リスク因子に関連する対象情報などであるがこれに限定されない様々な目的で使用することが可能な、機械可読データまたはデータアレイでコードされたデータ記憶材料を含むことができる。本発明の生物マーカーの有効量の測定および／またはこれら生物マーカーからのリスクに関して得られる評価は、とりわけプロセッサ、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリおよび／または記憶素子を含む。）、少なくとも１つの入力装置、および少なくとも１つの出力装置を含む、プログラマブルコンピュータで実行される、コンピュータプログラムで実施することができる。プログラムコードは、上述の機能を実行し出力情報を生成するために、入力データに適用することができる。出力情報は、当技術分野で公知の方法により、１つまたは複数の出力装置に適用することができる。コンピュータは、例えば、従来設計のパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、またはワークステーションであってもよい。
【００９２】
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するための高レベル手続き型またはオブジェクト指向プログラミング言語で実行することができる。しかし、プログラムは、必要に応じてアセンブリまたは機械言語で実行することができる。言語は、コンパイラ型またはインタープリタ型言語である。そのようなコンピュータプログラムのそれぞれは、本明細書に記述される手順を実行するために記憶媒体または装置がコンピュータによって読まれるときに、コンピュータを設定し操作するための汎用または専用目的のプログラマブルコンピュータで読取り可能な記憶媒体または装置（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスケットまたはこの開示の他の箇所で定義されるようなその他のもの）に記憶することができる。本発明の健康関連データ管理システムは、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として実装されると見なしてもよく、そのように構成されたこの記憶媒体によれば、コンピュータは、本明細書に記述される様々な機能を実効するために特定のおよび所定の手法で操作される。
【００９３】
次いでＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の有効量のレベルを決定し、基準値、例えばその転移状態が知られている対照の対象または集団と、または指標値もしくは基礎値と比較することができる。基準サンプルまたは指標値もしくは基礎値は、治療が行われた１つまたは複数の対象から得てもよくまたは導き出してもよく、または、癌もしくは転移性事象を発症するリスクが低い１つまたは複数の対象から得てもよくまたは導き出してもよく、または、治療を行った結果として改善が見られた対象から得てもよくまたは導き出してもよい。あるいは、基準サンプルまたは指標値もしくは基礎値は、治療が行われていない１つまたは複数の対象から得てもよくまたは導き出してもよい。例えばサンプルは、治療の進行をモニタするために、癌または転移性事象の初期治療と癌または転移性事象の後続の治療を受けた対象から収集してもよい。基準値は、本明細書に開示されるような、集団研究からのリスク予測アルゴリズムまたは計算された指標から得られた値を含むこともできる。
【００９４】
したがって本発明のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌をもたずまたは転移性事象を有するリスクがなく、癌または転移性事象を発症することが予測されない対象の、「基準ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイル」を生成するのに使用することができる。本明細書に開示されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌を有し、または転移性事象を有するリスクがある対象から得られた「対象ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイル」を生成するのに使用することもできる。対象ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルは、癌または転移性事象を発症するリスクがある対象を診断しまたは特定するために、疾患の進行ならびに疾患の進行の速さをモニタするために、また治療法の有効性をモニタするために、基準ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルと比較することができる。本発明の基準および対象ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルは、とりわけＶＣＲによって読取り可能であるようなアナログテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュ媒体などであるがこれらに限定されない機械可読媒体に入れることができる。そのような機械可読媒体は、臨床パラメータおよび伝統的な実験室リスク因子の測定値などであるがこれらに限定されない追加の試験結果を含むこともできる。あるいは、またはさらに、機械可読媒体は、病歴および任意の関連ある家族歴などの対象情報を含むこともできる。機械可読媒体は、本明細書に開示されるようなその他の疾患リスクアルゴリズムおよび計算された指標に関する情報を含有することもできる。
【００９５】
対象の遺伝子構造の相違は、それらが様々な薬物代謝する相対的な能力の相違をもたらす可能性があり、癌または転移性事象の症状またはリスク因子を調節することができる。癌を有しまたは癌もしくは転移性事象を発症するリスクがある対象は、年齢、人種、およびその他のパラメータを様々にすることができる。したがって、本明細書に開示されるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの使用は、単独での使用および薬物代謝の公知の遺伝的要因と一緒に組み合わせた使用の両方において、選択された対象で試験される推定上の治療または予防薬が対象の癌または転移性事象を治療しまたは予防するのに適したものになる所定レベルの予測可能性を可能にする。
【００９６】
特定の対象に適した治療薬または薬物を特定するために、対象からの試験サンプルを治療薬または薬物に曝すこともでき、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の１種または複数のレベルを決定することができる。１個または複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルは、治療または治療薬もしくは薬物への曝露の前および後に対象から得られたサンプルと比較することができ、または、そのような治療もしくは曝露の結果としてリスク因子（例えば、臨床パラメータまたは伝統的な実験室リスク因子）に改善が見られた１つまたは複数の対象から得られたサンプルと比較することができる。
【００９７】
対象細胞（すなわち、対象から単離された細胞）は、候補薬剤の存在下でインキュベートすることができ、試験サンプル中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現のパターンを測定して基準プロファイル、例えば転移性疾患基準発現プロファイルまたは非疾患基準発現プロファイルまたは指標値または基礎値と比較する。試験薬剤は、栄養補助食品を含めた任意の化合物または組成物またはこれらの組合せにすることができる。例えば、試験薬剤は、癌治療レジメンで頻繁に使用され、その薬剤を本明細書に記述する。
【００９８】
本発明の前述の方法は、癌であると診断された、および外科的介入を受けた対象の、進行および／または改善を評価またはモニタするのに使用することができる。
【００９９】
（本発明の性能および精密測定）
本発明の性能、したがって絶対的および相対的臨床有用性は、上述のように多数の方法で評価してもよい。性能の様々な評価の中で、本発明は、臨床診断および予後に精度をもたらすものである。診断または予後試験、アッセイ、また方法の精度は、これらの試験、アッセイ、または方法によって、癌を有しまたは癌もしくは転移性事象のリスクがある対象を区別できる能力に関係し、対象が、「有意な変化」（例えば、臨床的に有意な「診断的に有意な」）をＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルに有するか否かに基づく。「有効量」とは、（１個または複数の）ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに関する所定のカットオフポイント（または閾値）とは異なり、したがって対象が（１個または複数の）ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが決定群である癌を有しまたは転移性事象を有するリスクがあることを示す「有意な変化」（例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現または活性レベル）をもたらすためのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの適切な数（１個または複数でよい。）の測定値を意味する。正常と異常との間のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴレベルの相違は、好ましくは統計的に有意である。以下に示すようにかつ本発明を全く限定することなく、統計的有意性の実現、したがって好ましい分析、診断、および臨床精度は、一般に、統計的に有意なＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標を実現するための、いくつかのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せをパネル内で一緒に使用し数学的アルゴリズムと組み合わせるが、必ずしも必要というわけではない。
【０１００】
疾患状態のカテゴリー的診断では、試験（またはアッセイ）のカットポイントまたは閾値を変化させることによって、通常は感受性および特異性を変化させるが、定性的に逆相関にある。したがって、対象の状態を評価するために提案された医学的試験、アッセイ、または方法の精度および有用性の評価の際には、感受性および特異性の両方を常に考慮すべきであり、感受性および特異性はカットポイントの範囲全体にわたって有意に変化し得ることから、感受性および特異性が報告されるカットポイントが何か心に留めておくべきである。全ての潜在的なカットポイント値を包含するＡＵＣなどの統計の使用は、本発明を使用するほとんどのカテゴリー的リスク測定に好ましいが、連続リスク測定の場合、観察された結果またはその他の判断基準に対する適合度および較正の統計が好ましい。
【０１０１】
所定レベルの予測可能性とは、この方法が、許容可能なレベルの臨床または診断精度を提供することを意味する。そのような統計、すなわち「許容可能な程度の診断精度」の使用は、本明細書では、ＡＵＣ（試験またはアッセイ用のＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．６０、望ましくは少なくとも０．６５、より望ましくは少なくとも０．７０、好ましくは少なくとも０．７５、より好ましくは少なくとも０．８０、最も好ましくは少なくとも０．８５である、試験またはアッセイ（ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な存在を決定するための本発明の試験などであり、それによって、癌の存在および／または転移性事象を有するリスクが示される。）と定義される。
【０１０２】
「非常に高度な診断精度」とは、ＡＵＣ（試験またはアッセイ用のＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．７５、０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、より望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、より好ましくは少なくとも０．９２５、最も好ましくは少なくとも０．９５である、試験またはアッセイを意味する。
【０１０３】
あるいは、この方法は、癌、転移性癌、または治療に対する応答の存在または不存在を、少なくとも７５％の精度で、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の精度で予測する。
【０１０４】
任意の試験の予測値は、試験の感受性および特異性と、試験がなされる集団の状態の有病率に依存する。ベイズの定理に基づくこの概念によれば、スクリーニングされる状態が個々にまたは集団に存在する可能性が高くなるほど（試験前の確率）、陽性試験の妥当性は高くなり、かつその結果が真陽性である可能性が高くなる。したがって、状態が存在する可能性が低い任意の集団で試験を使用する際の問題は、陽性結果が限られた値を有することである（すなわち、偽陽性になり易い。）。同様に、非常に高いリスクの集団では、陰性試験結果は偽陰性になり易い。
【０１０５】
その結果、ＲＯＣおよびＡＵＣは、低疾患有病率を試験した集団（毎年１％未満の発生率（出現率）を有するもの、または指定された対象期間全体を通して１０％未満の累積有病率を有するものと定義される。）での、試験の臨床的有用性に関して、誤った方向に導く可能性がある。あるいは、この開示の中の別の場所で定義された絶対リスクおよび相対リスクを用いて、臨床的有用性の程度を決定することができる。試験がなされる対象の集団は、試験の測定値により４分の１ずつに分類することもでき、その上位４分の１（集団の２５％）は、癌または転移性事象を発症する最高相対リスクを有する対象の群を含み、下位４分の１は、癌または転移性事象を発症する最低相対リスクを有する対象の群を含む。一般に、低罹患率集団において上位から下位４分の１までの相対リスクの２．５倍超を有する試験またはアッセイから得られた値は、「高度な診断精度」を有すると見なされ、各４分の１に関して相対リスクの５から７倍を有する値は、「非常に高い程度の診断精度」を有すると見なされる。それにも関わらず、臨床的に有用な各４分の１に関する相対リスクの単に１．２から２．５倍を有する試験またはアッセイから得られた値は、疾患のリスク因子として広く使用され；それらは、将来の転移性事象の予測に関して総コレステロールを有しまた多くの炎症性生物マーカーに関するような場合である。しばしば、そのようなより低い診断精度試験は、前述のグローバルリスク評価指標で行われたように、治療的介入に関して意味のある臨床閾値を得るために追加のパラメータと組み合わせなければならない。
【０１０６】
医療経済効用関数は、所要の試験の性能および臨床値を測定する、さらに別の手段であり、それぞれの臨床的および経済的値の実際の測定を基にして、潜在的なカテゴリー的試験結果の重み付けからなる。医療経済動向は、医療経済効用関数が特に、試験をした対象の正確な判別の利益と誤判別のコストとに関する経済的値を与えるので、精度に密に関係している。性能測定として、試験の標的価格を超えた、試験当たりの医療経済値（試験コストの前）の増加をもたらす性能レベルを実現する試験を必要とすることは、異常ではない。
【０１０７】
一般に、診断精度を決定する代替方法は、疾患カテゴリーまたはリスクカテゴリー（転移性事象を有するリスクにあるものなど）が、治療用途での閾値がまだ確立されておらずまたは病気に罹る前の診断に関する判断基準が存在していないような、関連ある医師会および医療活動によってまだ明確に定義されていない場合に、連続測定で一般に使用される。リスクの連続測定では、計算された指標に関する診断精度の測定は、典型的には予測連続値および実測値（または歴史的指標計算値）との間の曲線の当て嵌めと較正とを基にし、Ｒ平方、Ｈｏｓｍｅｒ−ＬｅｍｅｓｈｏｗのＰ値統計、および信頼区間などの測定値を利用する。そのようなアルゴリズムを使用する予測値を、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により商用化された将来の乳癌再発リスクに関する試験の場合のように、歴史的観察コホート予測を基にした信頼区間（通常は９０％または９５％ＣＩ）を含めて報告することは、異常ではない。
【０１０８】
一般に、診断精度の程度、すなわちＲＯＣ曲線のカットポイントを定義し、許容可能なＡＵＣ値を定義し、本発明のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を構成するものの相対濃度の許容可能な範囲を決定することによって、当業者は、所定レベルの予測可能性および性能を有する対象を特定し、診断し、見通しを立てるために、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを使用することが可能になる。
【０１０９】
（本発明のリスクマーカー（ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ））
本発明の生物マーカーおよび方法によれば、当業者は、癌または転移性事象のいかなる症状も示さないにも関わらず癌または転移性事象を発症するリスクがあり得る対象を、特定し、診断し、またはその他の手法で評価することが可能になる。
【０１１０】
我々は、浸潤性かつ転移性の前立腺癌のマウスモデルを提供し、このマウス前立腺上皮は、Ｐｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の欠失を維持する。表１Ａは、２８４（２８４）個の過剰発現した／増幅している遺伝子または下方制御された／欠失している遺伝子を含む。表１Ｂは、３７２（３７２）個の過剰発現した／増幅している表現型または下方制御された／欠失している表現型に相関する、本発明のヒト相同体ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む。
【０１１１】
【表１Ａ−１】
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【０１１２】
【表１Ａ−２】
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【０１１３】
【表１Ａ−３】
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【０１１４】
【表１Ａ−４】
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【０１１５】
【表１Ａ−５】
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【０１１６】
【表１Ａ−６】
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【０１１７】
【表１Ａ−７】
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【０１１８】
【表１Ａ−８】
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【０１１９】
【表１Ａ−９】
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【０１２０】
【表１Ｂ−１】
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【０１２１】
【表１Ｂ−２】
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【０１２２】
【表１Ｂ−３】
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【０１２３】
【表１Ｂ−４】
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【０１２４】
【表１Ｂ−５】
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【０１２５】
【表１Ｂ−６】
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【０１２６】
【表１Ｂ−７】
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【０１２７】
【表１Ｂ−８】
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【０１２８】
【表１Ｂ−９】
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【０１２９】
【表１Ｂ−１０】
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当業者なら、本明細書に示されるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、多型、イソフォーム、変異体、誘導体、核酸および前駆タンパク質を含む前駆体、切断産物、受容体（可溶性および膜貫通受容体を含む。）、リガンド、タンパク質−リガンド複合体、および翻訳後修飾変種（架橋またはグリコシル化など）、断片、および分解産物、ならびに任意の多単位核酸、タンパク質、および糖タンパク質構造であって、完全に組み立てられた構造の構成サブ単位としてＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのいずれかを含んだものを含むが、これらに限定されない全ての形および変種を包含することを理解するであろう。
【０１３０】
当業者なら、上記列挙されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、転移性疾患に関連するとは一般に認められない多くを含めた生理学的および生物学的経路の多様な集合から得られることに、留意するであろう。種々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのこれらのグループ分けは、高い有意性のセグメント内にあっても、疾患の進行の病期または速度の種々のシグナルを前もって知らせることができる。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのそのような明らかなグループ分けによって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからのより生物学的に詳細なかつ臨床的に有用なシグナルが可能になり、それと共に、多数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴシグナルと組み合わせたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴアルゴリズム内でのパターン認識の機会も可能になる。
【０１３１】
本発明は、一態様では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの部分集合に関し；その他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴおよび上記表１に列挙されておらずこれら生理学的および生物学的経路に関連している生物マーカーも、シグナルおよび情報がこれらの研究から得られたものであることを考えれば有用であると証明することができる。その他の生物マーカー経路関与因子（すなわち、上記表１のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのリストに含まれた生物マーカーを有する共通経路におけるその他の生物マーカー関与因子）が癌または転移性事象における関連ある経路関与因子でもあるような程度まで、これらの因子は、表１でこれまで開示されてきたように、生物マーカーと機能的に均等であってもよい。これらのその他の経路関与因子は、本発明の文脈においてＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴとも見なされ、但しこれらの因子は、良好なバイオマーカーのある定義された特徴をさらに共有し、本明細書に開示された生物学的プロセスおよび有用なシグナル対雑音比での前記生物マーカーのバイオアベイラビリティなどの分析的に重要な特徴と、血清または腫瘍生検標本などの有用でアクセス可能なサンプルマトリックスとの両方への関与を含む可能性がある。そのような要件は、典型的には、生物学的経路の多くのメンバーの診断有用性を限定し、分泌物質を構成する経路メンバーでのみ頻繁に生ずるが、これらは、癌または転移性事象の疾患進行に関連してもしなくても、アポトーシスまたは内皮リモデリングもしくはその他の細胞代謝回転もしくは細胞壊死性経過などのその他の理由により、細胞の原形質膜でアクセス可能なものならびに細胞死により血清中に放出されるものである。しかし、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに関するこの高い基準を満たす、残されたおよび将来の生物マーカーは、非常に価値あるものとなるようである。
【０１３２】
さらに、その他の列挙されていない生物マーカーは、表１のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴとして列挙された生物マーカーに、非常に高度に相関することになる（本出願の目的では、任意の２個の変数は、０．５以上の決定係数（Ｒ２）を有する場合、「非常に高度に相関した」と見なされることになる。）。本発明は、前述のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに対するそのような機能的および統計的均等物を包含する。さらに、そのような追加のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの統計的有用性は、多数の生物マーカーと任意の新しい生物マーカーとの間の相互相関に実質的に依存し、しばしば、基礎をなす生物学の意味を詳述するためにパネル内での操作を必要とすることになる。
【０１３３】
列挙されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの１個または複数、好ましくは２個以上は、本発明の実施に際して検出することができる。例えば、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個以上、２７０個以上、２８０個以上、２９０個以上、３００個以上、３１０個以上、３２０個以上、３３０個以上、３４０個以上、３５０個以上、３６０個以上、３７０個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することができる。
【０１３４】
いくつかの態様では、本明細書に記述される３７２個の全てのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することができる。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの数を検出することができる好ましい範囲は、１から３７２個、特に２、４、５、１０、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０個の間から選択された任意の最小値であって、公知の全ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、特に４、５、１０、２０、５０、および７５個までの任意の最大値と組み合わせたものによって結び付けられた範囲を含む。特に好ましい範囲には、２〜５個、２〜１０個、２〜５０個、２〜７５個、２〜１００個、５〜１０個、５〜２０個、５〜５０個、５〜７５個、５〜１００個、１０〜２０個、１０〜５０個、１０〜７５個、１０〜１００個、２０〜５０個、２０〜７５個、２０〜１００個、５０〜７５個、５０〜１００個、１００〜１２５個、１２５〜１５０個、１５０〜１７５個、１７５〜２００個、２００〜２１０個、２１０〜２２０個、２２０〜２３０個、２３０〜２４０個、２４０個〜２５０個、２５０〜２６０個が含まれる。
【０１３５】
（ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルの構造）
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのグループ化は、「パネル」に含めることができる。本発明の文脈における「パネル」は、複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む生物マーカーの群（これらがＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、臨床パラメータ、または伝統的な実験室リスク因子であるか否かに関わらず）を意味する。パネルは、追加の生物マーカー、例えば臨床パラメータ、伝統的な実験室リスク因子であって、癌または癌転移と共に存在しまたはこれらに関連することが公知であるものを、表１に列挙されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択された群と組み合わせて含むこともできる。
【０１３６】
上述のように、列挙された個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、臨床パラメータ、および伝統的な実験室リスク因子の多くは、単独で使用しかつＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの多数の生物マーカーパネルのメンバーとしてではない状態で使用する場合、個々の正常な対象、転移性事象を有するリスクにある対象、および癌を有する対象を、選択された一般集団において互いに信頼性をもって区別する際に、ほとんどまたは全く臨床的な用途がなく、したがって、これら３つの状態の間で任意の対象を分類するのに、単独で信頼性をもって使用することができない。これら集団のそれぞれにおいて、十分に行われた研究で一般に生じるように、それらの平均測定値に統計的に有意な差がある場合であっても、そのような生物マーカーは、個々の対象に対するそれらの適用可能性を制約し続ける可能性があり、その対象に関する診断または予後予測にほとんど寄与しない。統計的有意性の一般的尺度は、観察が偶然によってのみ引き起こされた可能性を示すｐ値であり；好ましくは、そのようなｐ値は０．０５以下であり、問題の観察が偶然によって生じた機会が５％以下であることを表す。そのようなｐ値は、行われた研究のパワーに著しく依存する。
【０１３７】
この個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ性能と、伝統的な臨床パラメータおよび２〜３個の伝統的な実験室危険因子だけを組み合わせる式の一般的な性能とにも関わらず、本発明は、２個以上のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのある特定の組合せを、１つまたは複数の生理学的または生物学的経路に関与することが公知であるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せを含んだ多数の生物マーカーパネルとして使用することもでき、また、そのような情報を組み合わせて、個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを超えた組合せの性能特性を組み合わせかつ多くの場合はその性能特性を拡張する、統計的分類アルゴリズムおよびその他を含めた様々な式の使用を通して臨床的に有用なものにできることに留意した。これら特定の組合せは、許容可能なレベルの診断精度を示し、多数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからの十分な情報が導かれた式と組み合わされた場合、１つの集団から別の集団へと移すことが可能な高レベルの診断精度が、信頼性をもってしばしば実現される。
【０１３８】
２個よりも少ない特定のまたはより低い性能のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、意図される徴候に向けて新規なおよびより有用な組合せへとどのように組み合わせるかという一般概念は、本発明の重要な態様である。多数の生物マーカーは、しばしば、適正な数学的および臨床的アルゴリズムが使用される場合、個々の構成要素よりも良好な性能をもたらすことができ；これは、感受性および特異性の両方でしばしば明らかであり、より大きなＡＵＣをもたらす。第２に、既存の生物マーカーには、改善されたレベルの感受性または特異性を新しい式を通して実現するために必要であったように、新規な感知できない情報がしばしば存在する。この隠された情報は、次善の臨床性能を独自に有すると一般に見なされる生物マーカーの場合であっても、有効になり得る。事実、単独で測定された単一の生物マーカーに対する高偽陽性率に関する次善の性能は、一部の重要な追加の情報が、第２の生物マーカーおよび数式との組合せが存在しないことが明らかではない生物マーカーの結果の情報内に含まれる指標になり得ると考えられる。
【０１３９】
当技術分野で公知のいくつかの統計的およびモデリングアルゴリズムを使用して、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択を支援すると共に、これらの選択を組み合わせたアルゴリズムを最適化することができる。因子および交差生物マーカー相関／共分散分析などの統計的ツールは、パネル構造へのより合理的なアプローチを可能にする。ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ間のユークリッド標準化距離を示す、数学的クラスタリングおよび分類木は、有利に使用することができる。そのような統計的分類技法の、経路によって知らされた播種は、特定の経路または生理学的機能の全体への寄与を基にした個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択に基づく合理的な手法となり得るので、用いてもよい。
【０１４０】
最終的に、統計的分類アルゴリズムなどの式は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを選択するためにかつ多数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからの結果を単一指標へと組み合わせるのに必要な最適な式を作成し導き出すために、直接使用することができる。しばしば、前進的（０ポテンシャル説明パラメータ）および後退的選択（全ての利用可能なポテンシャル説明パラメータ）などの技法が使用され、ＡＩＣまたはＢＩＣなどの情報基準は、パネルの性能および診断精度と使用されるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの数との間のトレードオフを定量するのに使用される。前進的または後退的選択パネルにおける個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの位置は、そのアルゴリズム用の漸増的情報内容の提供に密接に関連付けることができ、したがって、寄与のオーダーは、パネル内のその他の構成要素であるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに非常に依存している。
【０１４１】
臨床アルゴリズムの構築
任意の式を使用して、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果を組み合わせて、本発明の実行に有用な指標となすことができる。上記したように、そのような指標は、種々のその他の指示のうちとりわけ、ある疾患状況が別の疾患状況へ変換する確率、尤度、絶対的もしくは相対的なリスク、時間もしくは速度を示してもよく、または転移性疾患の将来の生物マーカーの測定値を予測してもよいが、これらに限定されない。これは、特定の期間もしくは範囲について、または残りの生涯リスクについてであってもよく、あるいは単に別の基準対象集団と比べた指標として提供してもよい。
【０１４２】
種々の好ましい式を本明細書に記載するが、本明細書および上記の定義において言及するもの以外のいくつかのその他のモデルおよび式の型が、当業者には周知である。使用される実際のモデルの型または式自体は、トレーニング集団におけるその結果の性能および診断の精度の特徴に基づいて、見込みがあるモデルの領域から選択され得る。その式自体の詳細は通常、関連のあるトレーニング集団におけるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果から得ることができる。その他の用途のうちとりわけ、そのような式によって、一連の対象クラスへの、１つまたは複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのインプットから得られた（例えば、対象が、正常なクラス、転移性事象を有するリスクがあるクラス、癌を有するリスクがあるクラスの一員であることを予測するのに有用である）フィーチャーの空間を位置付けて、ベイズのアプローチを使用してリスクの確率関数の推定値（例えば、癌もしくは転移性事象のリスク）を得ること、またはクラス条件付き確率を推定し、次いで、先の場合と同様に、ベイズの規則を使用してクラスの確率関数を求めることを意図することができる。
【０１４３】
好ましい式には、広いクラスの統計学的分類アルゴリズム、特に、判別分析の使用がある。判別分析の目標は、以前に同定されたフィーチャーのセットから、クラスの一員であることを予測することである。線形判別分析（ＬＤＡ）の場合、いくつかの判断基準による群間における分離を最大化するフィーチャーの線形の組合せを同定する。異なる閾値を用いる、固有遺伝子（ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ）に基づいたアプローチを使用するＬＤＡ（ＥＬＤＡ）、または多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）に基づいた踏み石アルゴリズムのために、フィーチャーを同定することができる。ホテリング−ローリーの統計量に基づいて非分離の確率を最小化する前向きアルゴリズム、後向きアルゴリズムおよびステップワイズアルゴリズムを実施することができる。
【０１４４】
固有遺伝子に基づいた線形判別分析（ＥＬＤＡ）は、Ｓｈｅｎら、（２００６年）によって開発された、フィーチャーを選択する技法である。この式は、改変された固有値解析（ｅｉｇｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、多変量のフレームワーク中のフィーチャー（例えば、生物マーカー）を選択して、最も重要な固有ベクター（ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ）と関連性があるフィーチャーを同定する。「重要な」は、何らかの閾値と比べて分類しようとするサンプル間における差の最大の分散を説明する固有ベクターと定義される。
【０１４５】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、２つのクラスを分離する超平面を見出そうとする分類式である。この超平面は、サポートベクター、すなわち、この超平面からまさしくマージンの距離だけ離れているデータ点を含有する。現在のデータ寸法では分離超表面が存在しそうにない事象においては、元々の変数の非線形関数をとることにより、データをより大きな寸法に投影することによって、次元を大きく拡大する（ＶｅｎａｂｌｅｓおよびＲｉｐｌｅｙ、２００２年）。必要ではないが、ＳＶＭのためのフィーチャーにフィルターをかけることによってしばしば、予測が改善される。最も良好な一変量のフィーチャーを選択するために非パラメトリックなクラスカル−ワリス（ＫＷ）検定を使用して、サポートベクターマシンためのフィーチャー（例えば、バイオマーカー）を同定することができる。また、ランダムフォレスト（ＲＦ、Ｂｒｅｉｍａｎ、２００１年）または再帰分割（ＲＰＡＲＴ、Ｂｒｅｉｍａｎら、１９８４年）も別個にまたは組み合わせて使用して、最も重要である生物マーカーの組合せを同定することができる。ＫＷおよびＲＦの両方では、全フィーチャーからいくつかのフィーチャーを選択する必要がある。ＲＰＡＲＴは、利用可能な生物マーカーのサブセットを使用して、単一の分類木を生み出す。
【０１４６】
予測式に当てはめる前に、個々のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの測定値の結果に前処理をして、より貴重な形態の情報となすために、その他の式を使用することができる。最も注目すべきは、対数関数またはロジスティック関数等のいずれかの通常の数学的変換を使用して、生物マーカーの結果を、集団の平均値等に関して、正規またはその他の分布状態として正規化することはいずれも当業者には周知である。特に興味深いのは、年齢、性別（ｇｅｎｄｅｒ）、人種または性（ｓｅｘ）等の臨床パラメータに基づいた一連の正規化であり、特定の式が、あるクラスに属する対象に対してもっぱら使用されるか、または臨床パラメータをインプットとして連続的に組み合わせる。その他の場合には、分析対象に基づいた生物マーカーを組み合わせて、計算した変数となし、これらを、それに続いて、式に当てはめる。
【０１４７】
正規化される見込みがある一対象の個々のパラメータ値に加えて、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏら、（２００１年）ＪＡＭＡ  ２８６巻：１８０〜１８７頁に概要が述べられている技法、またはその他の類似の正規化および再較正の技法に従って、全ての対象または任意の公知のクラスの対象についての全体的な予測式自体を、再較正するかまたは別の場合には集団の予想有病率および平均生物マーカーパラメータ値についての調整に基づいて調整することができる。そのような疫学的調整統計量は、モデルに当てはめる過去のデータの登録簿によって、連続的に捕捉、確認、改善およびアップデートすることができ、これらのデータは、機械可読性であってもよく、もしくはそうではなくてもよく、またはこれらの統計量の補足、確認、改善およびアップデートは時には、保管サンプルの遡及的クエリーもしくはそのようなパラメータおよび統計量の過去の研究を参照することによって行ってもよい。式の再較正またはその他の調整の対象であり得る追加の例として、オッズ比の限界についてのＰｅｐｅ，  Ｍ．Ｓ．ら、２００４年による研究；ＲＯＣ曲線に関するＣｏｏｋ，  Ｎ．Ｒ．、２００７年による研究において使用されている統計量が挙げられる。最後に、絶対的なリスクに対して較正し、分類子またはリスクの式の各種の数値結果についての信頼区間を提供するために、実際の臨床集団ならびに研究結果および観察されたエンドポイントを参照することにより、分類子の式自体の数値結果を処理後に変換することができる。この例が、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ製品における再発スコアの式のアウトプットに関して選ばれた実際の臨床研究を使用して得られた絶対的なリスクの提示、およびそのリスクについての信頼区間である。さらなる改変は、分類子またはリスクの式のアウトプットに基づき、年齢または性等のそれらの臨床パラメータによって定義かつ選択された、研究のより小さな亜集団についての調整である。
【０１４８】
臨床パラメータとの組合せ、および伝統的な実験室リスク因子
本発明の実行に際しては、上記の臨床パラメータのうちのいずれかを、ある式へのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのインプットとして、または特定のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのパネルおよび式を使用して測定しようとする関連のある集団を定義する事前選択の判断基準として使用することができる。また、上記で注目したように、臨床パラメータは、生物マーカーの正規化および前処理において、またはＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択、パネルの構築、式の型の選択および誘導、ならびに式の結果の後処理においても有用な場合がある。伝統的な実験室リスク因子についても、ある式へのインプットまたは事前選択の判断基準のいずれかとして、類似アプローチをとることができる。
【０１４９】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの測定
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルまたは量の実際の測定値を、タンパク質または核酸のレベルにおいて、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定することができる。例えば、核酸レベルにおいては、これらの配列のうちの１つまたは複数を特異的に認識するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション解析およびサザンハイブリダイゼーション解析、ならびにリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、遺伝子発現を決定することができる。あるいは、例えば、遺伝子の示差的に発現した配列に対して特異的なプライマーを使用する逆転写に基づいたＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、またはＰａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．による、分枝鎖ＲＮＡを増幅および検出する方法によって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を測定することもできる。また、タンパク質レベルにおいても、例えば、本明細書に記載する遺伝子産物がコードするペプチドのレベルを測定することによって、またはそれらの細胞内における局在化もしくは活性を、例えば、ＡＱＵＡ（登録商標）（ＨｉｓｔｏＲｘ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）または米国特許第７，２１９，０１６号等の技術プラットフォームを使用して測定することによって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を決定することができる。そのような方法は、当技術分野では周知であり、そのような方法として、例えば、遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体に基づいたイムノアッセイ、アプタマー、または分子インプリントが挙げられる。任意の生物学的な材料を、タンパク質またはその活性の検出／定量化のために使用することができる。あるいは、適切な方法を選択して、分析した各タンパク質の活性によって、マーカー遺伝子がコードするタンパク質の活性を決定することもできる。
【０１５０】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異およびそれらの多型を、任意の適切な様式で検出することができるが、典型的には、対象由来のサンプルを、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異または多型に結合する抗体と接触させ、次いで、反応産物の有無を検出することによって検出する。抗体は、上記で詳細に論じたように、前述の抗体のモノクローナル、ポリクローナル、キメラまたは断片であってよく、反応産物を検出するステップは、任意の適切なイムノアッセイを用いて実施することができる。対象由来のサンプルは典型的には、上記したように、生物学的液体であり、上記の方法を実施するために使用した生物学的液体と同じサンプルであってよい。
【０１５１】
本発明に従って実施するイムノアッセイは、均一アッセイであっても、または不均一アッセイであってもよい。均一アッセイの場合、免疫学的反応は通常、特異的抗体（例えば、抗ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質抗体）、標識された分析対象、目的のサンプルを含む。抗体が標識された分析対象に結合すると、標識から発生するシグナルが直接的または間接的に改変される。免疫学的反応およびその程度の検出の両方を、均一溶液中で実施することができる。利用することができる免疫化学標識には、フリーラジカル、放射性同位体、蛍光染料、酵素、バクテリオファージまたは補酵素がある。
【０１５２】
不均一アッセイのアプローチの場合、試薬は通常、サンプル、抗体および検出可能なシグナルを発生させるための手段である。上記のサンプルを使用することができる。抗体を、ビーズ（プロテインＡおよびプロテインＧのアガロースビーズ等）、プレートまたはスライド等の支持体上に固定化し、液相中で、抗原を含有することが疑われる検体と接触させることができる。次いで、支持体を液相から分離し、支持相または液相のいずれかを検出可能なシグナルについて、そのようなシグナルを発生させるための手段を利用して調べる。シグナルは、サンプル中の分析対象の存在と関係がある。検出可能なシグナルを発生させるための手段は、放射性標識、蛍光標識または酵素標識の使用を含む。例えば、検出すべき抗原が、第２の結合部位を含有する場合、その部位に結合する抗体を、検出可能な基にコンジュゲートさせ、分離ステップの前に、液相の反応溶液に添加することができる。固体の支持体上の検出可能な基の存在によって、試験サンプル中の抗原の存在が示される。適切なイムノアッセイの例は、オリゴヌクレオチド、免疫ブロット、免疫蛍光法、免疫沈降、化学発光法、電気化学発光（ＥＣＬ）または酵素結合免疫アッセイである。
【０１５３】
当業者であれば、本明細書に開示する方法を実施するのに有用であり得る多数の特異的なイムノアッセイのフォーマットおよびそれらの変更形態に精通しているであろう。一般に、Ｅ．  Ｍａｇｇｉｏ、Ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、（１９８０年）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）を参照されたい。また、Ｓｋｏｌｄらに対する米国特許第４，７２７，０２２号、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｏｒｒｅｓｔらに対する米国特許第４，６５９，６７８号、標題「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｄａｖｉｄらに対する米国特許第４，３７６，１１０、標題「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｌｉｔｍａｎらに対する米国特許第４，２７５，１４９号、標題「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｍａｇｇｉｏらに対する米国特許第４，２３３，４０２号、標題「Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ」、およびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらに対する米国特許第４，２３０，７６７号、標題「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ａｓ  Ｌａｂｅｌ」も参照されたい。
【０１５４】
受動結合等の公知の技法に従って、抗体を、診断アッセイに適した固体の支持体（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧのアガロース等のビーズ、ラテックスまたはポリスチレン等の材料から形成されたマイクロスフェア、プレート、スライドまたはウエル）にコンジュゲートさせることができる。同様に、公知の技法に従って、本明細書に記載する抗体を、検出可能な標識または基、例として、放射標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ、緑色蛍光タンパク質、ローダミン）にコンジュゲートさせることもできる。
【０１５５】
また、抗体は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異および多型の翻訳後修飾、例として、チロシンリン酸化、スレオニンリン酸化、セリンリン酸化、グリコシル化（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）を検出するのに有用な場合もある。そのような抗体は、１つまたは複数の目的のタンパク質中のリン酸化されたアミノ酸を特異的に検出し、本明細書に記載するイムノブロット、免疫蛍光法およびＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用され得る。これらの抗体は、当業者には周知であり、市販されている。また、翻訳後修飾は、反射マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）における準安定イオンを使用して決定することもできる（Ｗｉｒｔｈ，  Ｕ．ら（２００２年）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２巻（１０号）：１４４５〜５１頁）。
【０１５６】
酵素活性を示すことが知られているＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのタンパク質、ポリペプチド、突然変異および多型については、インビトロにおいて当技術分野で公知の酵素アッセイを使用して、それらの活性を決定することができる。そのようなアッセイとして、多くの中でもとりわけ、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、レダクターゼアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。公知のアルゴリズム、例として、ヒルプロット、ミカエリス−メンテン式、ラインウィーバー−バーク解析等の線形回帰プロット、およびスキャッチャードプロットを使用して速度定数ＫＭを測定することによって、酵素活性の動態調節を決定することができる。
【０１５７】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列についてのデータベースエントリーによって提供される配列情報を使用し、当業者に周知の技法を使用して、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列の発現を、（それらが存在する場合）検出し、測定することができる。例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列に対応する、配列データベースエントリーに属する配列、または本明細書に開示する配列に属する配列を使用して、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析または特定の核酸配列を特異的にかつ好ましくは定量的に増幅する方法においてＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築することができる。別の例として、これらの配列を使用して、例えば、増幅に基づいた検出方法、例として、逆転写に基づいたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）においてＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築することもできる。遺伝子発現の変化に、遺伝子の増幅、欠失、多型および突然変異が伴う場合、試験集団と基準集団とでの配列比較を、試験細胞集団および基準細胞集団において調べたＤＮＡ配列の相対的な量を比較することによって行うことができる。
【０１５８】
本明細書に開示する遺伝子の発現を、当技術分野で公知の任意の方法を使用してＲＮＡレベルで測定することができる。例えば、これらの配列のうちの１つまたは複数を特異的に認識するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション解析を使用して、遺伝子の発現を決定することができる。あるいは、例えば、示差的に発現した配列に対して特異的なプライマーを使用する逆転写に基づいたＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、発現を測定することもできる。また、例えば、その他の標的増幅の方法（例えば、ＴＭＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ）、またはシグナル増幅の方法（例えば、ｂＤＮＡ）等を使用して、ＲＮＡを定量化することもできる。
【０１５９】
あるいは、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのタンパク質および核酸の代謝産物を測定することもできる。用語「代謝産物」は、代謝過程の任意の化学的または生化学的な産物、例として、生物学的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物または脂質）のプロセシング、切断または消費によって産生された任意の化合物を含む。代謝産物は、当業者に公知の多様な方法で検出することができ、それらには、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析、放射化学分析、近赤外分光法（ｎｅａｒ−ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、光散乱分析（ＬＳ）、質量分析、熱分解質量分析、比濁分析、分散型ラマン分光法、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー、質量分析と組み合わせたマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、質量分析と組み合わせたイオンスプレー分光法、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、およびＩＲ検出がある。（ＷＯ０４／０５６４５６およびＷＯ０４／０８８３０９を参照されたい。これらは、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている。）この点に関しては、上記で言及した検出方法、または当業者に公知のその他の方法を使用して、その他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの分析対象を測定することができる。例えば、サンプル中の循環カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を、蛍光染料、例として、Ｆｌｕｏシリーズ、とりわけ、Ｆｕｒａ−２Ａ、Ｒｈｏｄ−２を使用して検出することができる。その他のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの代謝産物も同様に、そのような代謝産物を検出するために特異的に設計または手直しした試薬を使用して検出することができる。
【０１６０】
キット
また、本発明は、キットの形態として一緒に包装されたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出試薬、例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸の一部に対して相補性を示す相同な核酸配列、例として、オリゴヌクレオチド配列を有することによって、１つまたは複数のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸を特異的に同定する核酸、またはＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸がコードするタンパク質に対する抗体も含む。これらのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ遺伝子の断片であってよい。例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、２００、１５０、１００、５０、２５または１０ヌクレオチド長以下であってよい。キットは、別個の容器中に、核酸または抗体（固体のマトリックスにすでに結合しているか、またはそれらをマトリックスに結合させる試薬が別個に包装されているかのいずれか）、（正および／もしくは負の）対照処方、ならびに／または検出可能な標識、例として、とりわけ、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、シアニン染料、Ａｌｅｘａ染料、ルシフェラーゼ、放射標識を含有することができる。アッセイを実施するための指示（例えば、書類、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を、キット中に含めることができる。アッセイは、例えば、当技術分野で公知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチＥＬＩＳＡの形態であってよい。
【０１６１】
例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出試薬を、多孔性条片等の固体のマトリックス上に固定化して、少なくとも１つのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出部位を形成することができる。多孔性条片の測定または検出の領域は、核酸を含有する複数の部位を含むことができる。また、試験条片は、負および／または正の対照のための部位も含有することができる。あるいは、対照部位を、試験条片とは別個の条片上に設けてもよい。場合により、異なる検出部位が、異なる量の固定化核酸、例えば、第１の検出部位においてはより多い量を、かつそれに続く部位ではより少ない量を含有してもよい。試験サンプルを添加すると、検出可能なシグナルを示す部位の数によって、サンプル中に存在するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量の定量的な指示が得られる。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状に構成することができるが、典型的には、試験条片の幅にわたる棒状または点状の形状をとる。
【０１６２】
あるいは、キットは、１つまたは複数の核酸配列を含む核酸基板アレイを含有する。アレイ上の核酸は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２によって示される１つまたは複数の核酸配列を特異的に同定する。種々の実施形態では、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３７２によって示される配列のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または２７５個以上の発現を、アレイに対する結合によって同定することができる。基板アレイは、例えば、固体の基板、例えば、米国特許第５，７４４，３０５号に記載されている「チップ」であってよい。あるいは、基板アレイは、溶液アレイ、例えば、ｘＭＡＰ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｃｙｖｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣｅｌｌＣａｒｄ（Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ’Ｍｏｓａｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）であってもよい。
【０１６３】
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出のための抗体の適切な供給元として、例えば、Ａｂａｚｙｍｅ、Ａｂｎｏｖａ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃｙｔｏｌａｂ、ＤＡＫＯ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧｌｏｂｏＺｙｍｅｓ、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＫＭＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋｏｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬａｂＦｒｏｎｔｉｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｆｅｓｃｒｃｅｎ、Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄｉｃｌｏｎｅ、ＭｉｃｒｏＰｈａｒｍ  Ｌｔｄ．、ＭｏｄｉＱｕｅｓｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｎｅｏｃｌｏｎｅ、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｎｖｅｒａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｏｌｙｓｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｍｃｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｃａｒｃｈ、ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｂｏｓｃｒｅｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ、Ｔｅｃｈｎｏｐｈａｒｍ、Ｔｅｒｒａ  Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｔｒｉｌｌｉｕｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、およびＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ等の商業的な供給元が挙げられる。しかし、当業者であれば、表１のＰＣ���ＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのうちのいずれかに対する抗体、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを日常的に作製することができる。
【０１６４】
癌を治療または予防する方法
本発明は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２４５の発現もしくは活性を減少させるか、またはＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ２４６〜２７２の発現もしくは活性を増加させることによって、対象において癌の症状を治療、予防または軽減するための方法を提供する。治療用化合物を、予防または治療のために、癌を発症するリスクがある（または癌の発症に対して感受性である）対象に投与する。そのような対象を、標準的な臨床における方法を使用するかまたは（例えば、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＩＴ１〜３７２）の発現もしくは活性の異常なレベルを検出することによって同定する。治療剤は、細胞周期の調節、細胞増殖およびタンパク質キナーゼ活性の阻害剤を含む。
【０１６５】
この治療方法は、癌細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比べて、癌細胞中で発現が減少している遺伝子（「過小発現遺伝子」）の１つまたは複数の遺伝子産物の発現もしくは機能または両方を増加させるステップを含む。これらの方法では、対象を、有効量の化合物を用いて治療する。この有効量の化合物により、対象中の過小発現遺伝子のうちの１つまたは複数の量が増加する。投与は、全身投与であってもまたは局所投与であってもよい。治療用化合物は、過小発現遺伝子のポリペプチド産物またはその生物学的に活性な断片を含み、癌細胞中での発現を可能にする発現調節エレメントも有する核酸によって、過小発現遺伝子がコードされる。これらの治療用化合物として、例えば、癌細胞に内在するそのような遺伝子の発現レベルを増加させる（すなわち、１つまたは複数の過小発現遺伝子の発現を上方制御する）薬剤が挙げられる。そのような化合物の投与によって、対象の細胞中のそうした１つまたは複数の遺伝子の異常な過小発現の作用が無効になり、対象の臨床状態が改善される。
【０１６６】
また、この方法は、正常細胞と比べて、癌細胞中で発現が異常に増加している遺伝子（「過剰発現遺伝子」）の１つまたは複数の遺伝子産物の発現もしくは機能または両方を減少させるステップも含む。発現を、当技術分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかで阻害する。例えば、こうした１つまたは複数の過剰発現遺伝子の発現を、阻害するかまたはそれに拮抗する核酸、例えば、こうした１つまたは複数の過剰発現遺伝子の発現を破壊するアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することによって、発現を阻害する。
【０１６７】
あるいは、これらの過剰発現遺伝子の１つまたは複数の遺伝子産物の機能は、これらの遺伝子産物に結合するかまたは別の場合にはそれらの機能を阻害する化合物を投与することによっても阻害される。例えば、この化合物は、１つまたは複数の過剰発現した遺伝子産物に結合する抗体である。
【０１６８】
これらの調節方法を、エキソビボもしくはインビトロにおいて（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによって）か、またはそれ代わって、インビボにおいて（例えば、薬剤を対象に投与することによって）実施する。この方法は、タンパク質もしくはタンパク質の組合せ、または核酸分子もしくは核酸分子の組合せを、示差的発現遺伝子の異常な発現または活性を相殺する療法として投与するステップを含む。
【０１６９】
（疾患または障害に罹患していない対象と比べた）遺伝子のレベルまたは生物学的活性の増加によって特徴付けられる疾患および障害を、１つまたは複数の過剰発現遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、活性を低下させるかまたは阻害する）治療剤を用いて治療することができる。活性に拮抗する治療剤を、治療または予防（例えば、ワクチン）のために投与する。
【０１７０】
活用できる治療剤として、例えば、（ｉ）１つまたは複数の過剰発現する配列または過小発現する配列のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体；（ｉｉ）１つまたは複数の過剰発現する配列または過小発現する配列に対する抗体；（ｉｉｉ）１つまたは複数の過剰発現する配列または過小発現する配列をコードする核酸；（ｉｖ）「機能不全」である（すなわち、１つまたは複数の過剰発現する配列または過小発現する配列のコード配列内部への異種の挿入に起因する）１つまたは複数のアンチセンス核酸；あるいは（ｖ）調節物質（すなわち、過剰／過小発現したポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられる。相同組換えによりポリペプチドの内在性機能を「ノックアウトする」ために、機能不全アンチセンス分子が活用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１２８８〜１２９２頁、１９８９年を参照されたい）。
【０１７１】
（疾患または障害に罹患していない対象と比べた）レベルまたは生物学的活性の減少によって特徴付けられる疾患および障害を、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて治療することができる。活性を上方制御する治療剤を、治療または予防の形で投与することができる。活用できる治療剤として、これらに限定されないが、ポリペプチド（またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体）、あるいは生物学的利用率を増加させるアゴニストが挙げられる。
【０１７２】
トランスジェニック動物に関する総括
本発明のトランスジェニック動物は、Ｐｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の、一方または両方の内在性対立遺伝子を機能しない形態で有する。不活性化は、内在性遺伝子の改変、通常、遺伝子のコード領域に対する欠失、置換または付加によって達成することができる。改変によって、遺伝子産物の合成を阻止してもよく、または機能活性を欠く遺伝子産物を得てもよい。典型的な改変は、エクソン内部への、選択マーカー等の外来性セグメントの導入であり、それによって、エクソンを破壊するかまたはエクソンを欠失させる。
【０１７３】
マウスにおける内在性遺伝子の不活性化は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞中の内在性遺伝子とターゲティング構築物との間の相同組換えによって達成することができる。典型的には、このターゲティング構築物は、セグメントに隣接する標的遺伝子の陽性の選択マーカーを含有する。通常、これらのセグメントは、標的遺伝子と同じ種（例えば、マウス）に由来する。しかし、これらのセグメントが標的遺伝子に対して、それとの相同組換えを起こすのに十分な配列同一性を示すならば、それらをヒト等の別の種から得ることができる。また典型的には、この構築物には、これらのセグメントの一方または両方の外側に位置する陰性の選択マーカーも含有させて、内在性遺伝子との相同組換えを起こすように設計する（米国特許第６，２０４，０６１号を参照されたい）。また場合により、この構築物には、これらのセグメントの内部または末端に位置する一対の部位特異的組換え部位、例として、ｆｒｔも含有させて、内在性遺伝子との相同組換えを起こすように設計する。この構築物を、ＥＳ細胞内に、通常、エレクトロポレーションにより導入し、内在性遺伝子との相同組換えを起こして、内在性遺伝子内部に、陽性の選択マーカーならびに隣接セグメントの部分（および存在する場合には、ｆｒｔ部位）を導入する。所望の組換えを起こしたＥＳ細胞は、陽性および陰性の選択によって選択することができる。陽性の選択は、所望の相同組換えを起こした細胞について選択し、陰性の選択は、陰性の組換えを起こした細胞を選択して除く。これらの細胞は、インビトロにおいて培養した着床前胚から得られる。Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９巻、２５５〜２５８頁（１９８４年）（全ての目的でその全体が参照により組み込まれている）。形質転換ＥＳ細胞を、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせる。これらのＥＳ細胞は、胚のコロニーを形成し、いくつかの胚においては、得られたキメラ動物の生殖系列を形成するかまたはそれに寄与する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１４６８〜１４７４頁（１９８８年）（全ての目的でその全体が参照により組み込まれている）を参照されたい。キメラ動物を非トランスジェニック動物と繁殖させて、ヘテロ接合型トランスジェニック動物を生み出すことができる。ヘテロ接合型動物を相互に繁殖させて、ホモ接合型動物を生み出すことができる。ヘテロ接合型動物またはホモ接合型動物のいずれかを、ｆｌｐリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物と繁殖させることができる。リコンビナーゼが発現すると、ｆｒｔ部位が存在する場合には、導入されたそれらの間のＤＮＡ部分の切除が生じる。
【０１７４】
また、機能の不活性化は、その他の種についても達成することができ、したがって、ラット、ウサギおよびその他のげっ歯類、ヒツジ等のｂｏｖｉｎｅ、ヤギ等のｃａｒｐｉｎｅ、ブタ等のｐｏｒｃｉｎｅ、ならびにウシおよび水牛等のｂｏｖｉｎｅが適している。マウス以外の動物については、機能が不活性化された遺伝子を生み出すためには、核移植技術が好ましい。Ｌａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２９５巻、１０８９〜９２頁（２００２年）を参照されたい。ＥＳ細胞および胎性線維細胞を含めて、種々の細胞型を、卵母細胞内に導入しようとする核のためのドナーとして利用することができる。ドナーの核は、その中で、上記に記載したように、構築物が導入され、内在性遺伝子との相同組換えが起きている、インビトロにおいて培養した細胞から得る（全ての目的でそれぞれその全体が参照により組み込まれているＷＯ９８／３７１８３およびＷＯ９８／３９４１６を参照されたい）。ドナーの核を卵母細胞内に、融合、電気的もしくは化学的な誘導（ＷＯ９７／０７６６９、ＷＯ９８／３０６８３およびＷＯ９８／３９４１６のうちのいずれかを参照されたい）、またはマイクロインジェクション（全ての目的でその全体が参照により組み込まれているＷＯ９９／３７１４３を参照されたい）によって導入する。移植した卵母細胞を、それに続いて、培養して胚に発達させ、それに続いてこれらの胚を、偽妊娠雌動物の卵管内に移植すると、トランスジェニック子孫が誕生する（ＷＯ９７／０７６６９、ＷＯ９８／３０６８３およびＷＯ９８／３９４１６のうちのいずれかを参照されたい）。ヘテロ接合型導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を相互に繁殖させて、ホモ接合型導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を生み出すことができる。
【０１７５】
本発明のいくつかのトランスジェニック動物は、Ｐｔｅｎ遺伝子およびＳｍａｄ４遺伝子の、一方または両方の対立遺伝子の不活性化を有し、かつ、前立腺癌、その病態または根底にある生化学的プロセスと関係がある追加の表現型を付与する第２の導入遺伝子も有する。Ｐｔｅｎ遺伝子またはＳｍａｄ遺伝子を、ＬｏｘＰ部位を組み込んでリコンビナーゼの媒介により切除すること（すなわち、現在の系統）によってか、あるいは例えば、生殖系列形態かまたはインサイツもしくは細胞培養における前立腺上皮の体細胞形質導入かのずれかにおいて、突然変異ノックインを行い、これらの遺伝子をＲＮＡｉの媒介により消去し、それに続いて、これらの初代細胞を腎臓莢膜内または同所性に再導入することによって、この破壊を達成することができる。また、生殖系列伝達を回避する、標的ＥＳクローンを使用するキメラの形成を含めて、その他の工学的作製の戦略も明らかである。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１）
一般的な方法
ＰｔｅｎおよびＳｍａｄ４の条件対立遺伝子、ジェノタイピングおよび発現解析。
【０１７７】
ＰｔｅｎｌｏｘＰおよびＳｍａｄ４ｌｏｘＰの条件ノックアウト対立遺伝子が、他の箇所で記載されている。前立腺上皮特異的欠失が、ＰＢ−Ｃｒｅ４によって生じた２５。ＰＣＲジェノタイピング戦略では、（ｉ）Ｐｔｅｎは、プライマー１（５’−ＣＴＴＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣ−３’；配列番号１）、プライマー２（５’−ＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＧＴＧＣ−３’；配列番号２）、およびプライマー３（５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＡＣ−３’；配列番号３）を活用し、（ｉｉ）Ｓｍａｄ４は、プライマー１（５’−ＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧ−３’；配列番号４）、およびプライマー２（５’−ＴＴＣＡＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡ−３’；配列番号５）を活用する。Ｓｍａｄ４欠失対立遺伝子を検出するためには、プライマー２、およびプライマー３（５’−ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴ−３’；配列番号６）を使用した。
【０１７８】
ウエスタンブロット解析のために、組織および細胞を、完全ミニプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ）を用いて溶解させた。ウエスタンブロットを、２０〜５０μｇのタンパク質可溶化液を活用して得、Ｓｍａｄ４、ｐ５３（１Ｃ１２）、ｐＳｍａｄ２／３、ｐＳｍａｄ１／５／８．（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ２１Ｃｉｐ１（Ｍ−１９）およびＰＴＥＮ（Ａ２Ｂ１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体と共にインキュベートした。
【０１７９】
組織解析。
【０１８０】
正常組織および腫瘍組織を、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中で一晩固定し、１×ＰＢＳを用いて１回洗浄し、７０％エタノール中に移し、４℃で保管した。Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ  Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）が、標準的なプロトコールに従って、組織を、エタノールによる脱水によって処理し、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）を、抗体検出、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンによる（Ｈ＆Ｅ）染色のために調製した。免疫組織化学的研究のために、ホルマリン固定パラフィン包埋切片をウサギポリクローナル抗ＰＴＥＮまたは抗ｐ５３抗体と共に一晩インキュベートし、それに続いて、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）と共にインキュベートし、切片をＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ）と共にインキュベートし、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色することによって可視化した。免疫蛍光研究のために、前立腺腫瘍細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｃ８ウエルスライド上に、５，０００細胞／ウエルで播種し、メタノールを用いて−２０℃で１０分間固定し、抗ＣＫ８抗体および抗ＣＫ１８抗体（ＣＭ５、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ｖ１．３８）により画像処理した。統計学的有意性を、スチューデントｔ検定により決定した。種々の遺伝子型の前立腺組織における老化をアッセイするために、凍結６μｍ切片を、他の箇所の記載に従って、ＳＡ−β−Ｇａｌについて染色した。
【０１８１】
初代細胞系およびｔｅｔ−誘導性細胞系の樹立。
【０１８２】
以前の記載に従って、前立腺癌組織を、Ｐｔｅｎｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ；Ｓｍａｄ４ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ；ＰＢ−Ｃｒｅ４＋マウスから解体し、刻み、０．５％Ｉ型コラーゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて消化した。４０μｍメッシュを通してろ過した後、捕捉した断片を、Ｉ型コラーゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてコートした組織培養皿中に蒔いた。典型的な上皮の形態を示す細胞を収集し、単一細胞を、９６ウエルプレートの各ウエル中に播種した。３つの独立した細胞系（３１３２−１、−２および−３）を樹立し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５μｇ／ｍＬウシ下垂体抽出物、５μｇ／ｍＬウシインスリンおよび６ｎｇ／ｍＬ組換えヒト上皮増殖因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を足したＤＭＥＭ中に維持した。Ｓｍａｄ４誘導性細胞系を樹立するために、製造元のプロトコールに従って、マウスＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４欠損前立腺腫瘍細胞系に、ヒトＳＭＡＤ４コード領域を含有するｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を形質導入し、ｔｅｔ−ｏｎの安定な細胞系を樹立した。ＳＭＡＤ４の導入を、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（ｄｏｘ）を用いて達成し、ウエスタンブロット解析により確かめた。
【０１８３】
細胞培養に基づくアッセイ。
【０１８４】
細胞生存率アッセイのために、前立腺上皮細胞を、９６ウエルプレート中、１００μｌの５％活性炭処理ＦＢＳ含有培地中に、５０００細胞／ウエルで蒔いた。２日間のインキュベーションの後、培地を交換した。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、製造元のプロトコールに従って４日目に測定した。
【０１８５】
トランスクリプトーム解析、ゲノム解析およびインシリコにおけるプロモーター解析。
【０１８６】
トランスクリプトーム解析のために、サイズおよび段階が適合する、局在性、原発性のＰｔｅｎｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍およびＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍を単離し、全ｍＲＮＡを、抽出し、標識し、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙに、製造元プロトコールに従ってハイブリダイズさせた。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウスＭＯＥ４３０の生データ（ＣＥＬファイル）を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのａｆｆｙ  ｐａｃｋａｇｅのロバストなマルチアレイ解析（ＲＭＡ）を使用して前処理した。次いで、バックグラウンドについて較正し、正規化した強度データを、マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を使用して解析して、示差的に発現する遺伝子を同定した。２倍のカットオフを使用して、我々は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−サンプルとＰｔｅｎｐｃ−／−サンプルとを区別する目的変数ありの遺伝子リストを生成した。マウスのリストとヒト遺伝子のリストとの交差から、２８４個の遺伝子（２００個の上方制御された遺伝子および８４個の下方制御された遺伝子）のＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４のオルソロガスなセットを得た。
【０１８７】
インシリコにおけるプロモーター解析のために、脊椎動物保存結合部位についての位置頻度マトリックス（ＰＦＭ）を、ＴＲＡＮＳＦＡＣ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌから抽出した。位置重みマトリックス（ＰＷＭ）を、ＰＦＭから、ＴＦＢＳモジュールを使用して構築した。また、ＴＦＢＳモジュールは、３ｋｂプロモーター配列内部の結合部位についてスキャンするためにも使用した。これらは、Ｂｉｏｍａｒｔを介してＥｎｓｅｍｂｌからダウンロードした。標的遺伝子セット中に観察された転写因子結合部位を、無作為に選択したバックグラウンド（マウスゲノム）遺伝子セット中の転写因子結合部位と比較した。ｚスコアおよびｐ値（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：ＣＰＡＮからのＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を計算して、標的遺伝子セット中で、所与の結合部位が過剰描写されているかどうかを決定した。
【０１８８】
我々は、マウスＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４が、ヒト前立腺癌におけるコピー数変化についての標的であるかどうかを決定するために、以前の記載に従って、ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎによって処理した、転移性ヒト前立腺癌のＡＣＧＨプロファイルＧＳＥ８０２６の最小共通領域（ＭＣＲ）中の常在遺伝子を使用した。Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍とＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍との間で有意な示差的発現を示し、かつ転移性のヒト前立腺腫瘍においてコピー数変化を示す共通のオルソロガスな遺伝子を選択して、臨床的にアノテートされたサンプルのさらなるコンピュータ解析を行った。
【０１８９】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラム（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して、Ｐｔｅｎｐｃ−／−ＰＣＡモデルとＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−ＰＣＡモデルとで有意に調節される細胞の機能および経路をさらに解析した。
【０１９０】
臨床治療成果の解析。
【０１９１】
我々は、マウスＰｔｅｎ／Ｓｍａｄ４トランスクリプトームサインまたは転移性ヒト前立腺ＡＣＧＨデータセット２７とのその交差から出現した６６個のＳｍａｄ標的遺伝子のリストを使用して、「種間発現モジュール比較」アプローチを実行した（図７Ａ）。前立腺癌および乳癌の発現プロファイルを使用して、これらの遺伝子セットの予後を示す値を評価した。６６個の遺伝子のｍＲＮＡ発現および１７個の遺伝子のｍＲＮＡ発現に基づいて、スピアマンの順位相関係数を使用して、臨床的に局在性の前立腺癌サンプルの２つの主要なクラスターを同定した。また我々は、統計学的有意性を実証するために、Ｇｌｉｎｓｋｙの前立腺癌プロファイリング研究またはＣｈａｎｇの乳癌プロファイリング研究（参考文献）から、１７個の遺伝子の無作為セット１０群も選択した。
【０１９２】
統計学的解析。
【０１９３】
無浸潤曲線および累積サバイバル曲線を、以前に記載されたことがあるカプラン−マイヤー分析を用いて得た。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することによって行った。腫瘍発生率は、カプラン−マイヤー分析を使用することによってプロットした。統計学的有意性を、ログランク検定を使用することによって測定した。
【０１９４】
（実施例２）
ＰＴＥＮ欠損前立腺腫瘍は、著しいＴＧＦＢ−ＳＭＡＤ４経路の活性化を示す。
【０１９５】
Ｐｔｅｎ腫瘍抑制因子を前立腺特異的に欠失させると、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）が生じ、長期の潜伏期間に続いて、時には、病変が腺癌に進行する場合があるが、それにもかかわらず、浸潤性および転移性の特色は最小限に留まる。我々は、浸潤性かつ転移性の腺癌への進行を制約することができるであろう、Ｐｔｅｎ欠損ＰＩＮにおいて活性化されるチックポイントを定義するために、示差的発現遺伝子の知識ベース経路解析を使用して、１５週齢において、ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰＰｂ−Ｃｒｅ４腫瘍において発症した前側前立腺の高グレードのＰＩＮ疾患と、Ｐｂ−Ｃｒｅ４マウス由来の前側前立腺上皮との間において不偏探索を実施した。この経路解析から、脂肪肝、ＢＭＰおよびＴＧＦβが、無作為に生成した遺伝子リストについて観察されたものを上回って強化された上位の３つのネットワークであることが明らかになった（図１Ａ）。
【０１９６】
ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびアクチビンファミリーを含む、リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーは、ＩＩ型受容体に結合し、この受容体は、Ｉ型受容体を動員し、リン酸化する。それに続いて、このＩ型受容体は、受容体調節型ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）をリン酸化する。Ｓｍａｄ２／３のＴＧＦｂによる活性化およびＳｍａｄｌ／５／８のＢＭＰによる活性化の際には、これらの受容体により活性化されたＲ−Ｓｍａｄは、共通のコメディエーターＳｍａｄ４に結合して、機能性タンパク質複合体を形成し、これらの複合体は、核に遊走して、多種多様な癌関連遺伝子標的を調節にする。示差的発現遺伝子リスト中では、ＢＭＰシグナル伝達ネットワークおよびＴＧＦβシグナル伝達ネットワークの両方が強化されることから、これらの共通のコメディエーターＳｍａｄ４の直接的な分子的検証に至った。この目的のために、ウエスタンブロットアッセイおよびＩＨＣアッセイを行い、Ｐｔｅｎ−／−ＰＩＮ疾患においては、野生型前立腺組織と比べて、Ｓｍａｄ４の発現、リン酸活性化（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）型Ｓｍａｄ２／３およびＳｍａｄ応答性標的ＩＤ１の著しい上方制御を記録した（図１ＢおよびＣ）。それに比べて、構成的に発現させたｐＳｍａｄｌ／５／８は、Ｐｔｅｎ−／−腫瘍においては、野生型前立腺組織と比べて、わずかな増加を示したに過ぎない（図１Ｂ）。換言すると、これらの緩徐進行型Ｐｔｅｎ−／−前立腺腫瘍は、ＢＭＰ／ＴＧＦβ−Ｓｍａｄ４のシグナル伝達経路の著しい活性化を示し、このことから、前立腺癌進行の遮断におけるＳｍａｄ４の関与の可能性が示唆される。この仮説は、ヒトＰＣＡにおけるＳｍａｄ４発現が、疾患が原発性から転移性に進行する間は、有意に下方制御されるという観察と合致している（図１Ｄ〜Ｆ）。
【０１９７】
（実施例３）
ＳＭＡＤ４により、ＰＴＥＮ欠損前立腺腫瘍の進行が制約を受ける。
【０１９８】
我々は、Ｓｍａｄ４依存性の進行の遮断およびその結果として生じる進行性疾患の不活性化のこの仮説に遺伝子的に対処するために、前立腺特異的欠失化体（ｄｅｌｅｔｏｒ）Ｐｂ−Ｃｒｅ４を活用して、前立腺上皮中のＰｔｅｎおよび／またはＳｍａｄ４を特異的に欠失させた。ＰｔｅｎｌｏｘＰ／ｌｏｘＰＰｂ−Ｃｒｅ４マウスおよびＳｍａｄ４ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰＰｂ−Ｃｒｅ４マウス（以下、Ｐｔｅｎｐｃ−／−およびＳｍａｄ４ｐｃ−／−）は、以前の報告１８，２０と同様に、ロバストなＣｒｅ媒介型組換えを、前立腺、具体的には、前側前立腺葉、腹側前立腺葉および背外側前立腺葉においてのみ示した（未公開のデータ）。以前のＰｔｅｎ研究１８、２０と合致して、このＰｔｅｎｐｃ−／−マウスは、早ければ９週齢で、全ての３つの葉において、高グレードのＰＩＮを一貫して発症した。対照的に、ＰＢ−Ｃｒｅ４（以下、ＷＴ）同腹仔およびＳｍａｄ４ｐｃ−／−同腹仔は、正常な前立腺組織像を示した（図２Ａ）。注目すべきことに、２年齢まで、Ｓｍａｄ４の欠損は、前立腺組織像に対して識別可能な影響を示さず（図９ＡおよびＢ）、この組織像は、腫瘍のない状態を維持した（ｎ＝１５；未公開のデータ）。
【０１９９】
このＰｔｅｎｐｃ−／−モデルは、緩慢に進行する新生物の表現型を示し、浸潤性の特色は、１７〜２４週齢後に出現する。大部分のマウスが、１年齢時に生存している（図２Ｂ）。それとは極めて対照的に、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウスは、浸潤性の高いＰＣＡを、９週齢までに発症し（図２Ａ、ｄ）、３２週齢までに全ての事例で死亡してしまった（図２Ｂ，Ｃ）。これらの大型の前立腺腫瘍は、膀胱出口の閉塞、および水腎症を発症し、これは、流出の閉塞に起因する腎臓の膨張であり、その結果、腎不全に至り、死亡の原因となる可能性が高い（図１０）。
【０２００】
我々は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−の進行の表現型についての腫瘍生物学的基礎を理解し始めるために、発達しつつある前立腺腫瘍において、Ｓｍａｄ４の状況の、増殖、アポトーシスおよび老化のレベルに対する影響を評価した。我々は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍、特に、浸潤性腫瘍の前面において、増殖の著しい増加を観察した。一方、Ｐｔｅｎｐｃ−／−腫瘍は、より中程度の増殖活性を示した（図３Ａ、Ｃ）。また、これらの明確に異なる増殖性のプロファイルと一致して、我々は、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍においては、Ｐｔｅｎｐｃ−／−腫瘍と比べてＳＡ−β−Ｇａｌ活性の著しい減少も観察し（図３Ｂ、Ｅ）、このことは、癌遺伝子誘導型老化（ＯＩＳ）のチックポイントの活性解除と一致する。最後に、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍およびＰｔｅｎｐｃ−／−腫瘍は、ＴＵＮＥＬアッセイにより測定した場合、アポトーシスによる細胞死においては差を示さなかった（図３Ａ、Ｄ）。
【０２０１】
（実施例４）
ＳＭＡＤ４の喪失は、完全に浸透的浸潤性かつ転移性である表現型を引き起こす。
【０２０２】
ヒトにおける致命性ＰＣＡの必須の特色は、浸潤性かつ転移性の疾患への進行であり、このことは、Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍の詳細な連続的なおよびエンドポイントの組織病理学的調査を促す。Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍は、基底膜を通る浸透を、早ければ９週で示した（ｎ＝７匹調査）。一方、同じ期間の間に、全てのＰｔｅｎｐｃ−／−新生物（ｎ＝７匹調査）は、基底膜に限局した（未公開のデータ）。注目すべきことに、最終エンドポイントの調査では、全ての２５匹の腫瘍担持Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウスが、流入領域リンパ節への転移性の広がりを示し、また、これらのマウスのうち、２匹は肺転移も示した（図４Ａ、４Ｂ、ａ、ｂ）。記録した転移性疾患が前立腺上皮起源であることを、サイトケラチン（ＣＫ）８およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）についての陽性の染色によって確認した（図４Ｃ、ｅ、ｆ）。２５匹のＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウスはいずれも、泌尿器の閉塞に起因する迅速な終焉に、かつ／またはヒトＰＣＡにおけるこの主要な特色を可能にするＳｍａｄ４の喪失を上回る遺伝子事象の必要性に関係し得る骨への転移を示なかったことは注目に価する（図１０）。対照的に、２５匹のＰｔｅｎｐｃ−／−腫瘍担持マウスはいずれも、転移性病変を、最長１年齢まで発症しなかった（図４Ａ）が、８匹の１．５年齢超のマウス中、１つの腰部リンパ節転移および１つの肺転移を記録した。この観察は、以前の報告と一致する。我々の知る限り、これは、ヒトＰＣＡと同様、ＣＫおよびＡＲの前立腺マーカーを保持する、最初の完全に浸透的転移性の前立腺線癌モデルである。
【０２０３】
（実施例５）
ヒト前立腺癌におけるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの同定およびそれらの予後を示す有用性
Ｐｔｅｎｐｃ−／−ＰＣＡモデルとＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−ＰＣＡモデルとで際立って異なる進行の表現型、および配列特異的転写因子としてのＳｍａｄ４の突出した機能から、Ｓｍａｄ４が悪性の進行を特に前立腺癌において制約するように機能し得るであろう機序を解明するための比較トランスクリプトーム解析のための理想的な枠組みが得られる。我々は、この目的のために、両方のモデルから、およそ１５週齢において、同等な大きさの早期原発性前側葉前立腺腫瘍を得た。組織学的調査から、これらのマウスにおいては転移性の疾患がないことを記録した（未公開のデータ）。腫瘍サンプルを処理して、遺伝子発現プロファイリングのために、組織像、免疫組織化学的検査およびＲＮＡ抽出を行った。各遺伝子型からの３つの腫瘍を用いた最初の比較解析によって、２８４個の示差的に発現したＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを同定した（表１Ａ）。それに続く、各遺伝子型からの５つの腫瘍の拡大した群を用いた解析によって、３７２個の示差的に発現したＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの拡大した群を同定した（表１Ｂ）。予想通り、目的変数なしの分類によって、Ｐｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍とＰｔｅｎｐｃ−／−腫瘍とが容易に分離された（未公開のデータ）。これら２つのモデル間の表現型の差を考慮すると、２８４個の示差的発現遺伝子（２００個の上方制御された遺伝子および８４個の下方制御された遺伝子）の知識ベース経路解析が、細胞の動きを最も有意な機能カテゴリーとして特定し、それには、これらの転移促進性のＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−原発性腫瘍において強化されている癌、細胞死、ならびに細胞の成長および増殖が続くことを特定したことは満足な結果であった（図１１）。
【０２０４】
次に、我々は、マウス前立腺腫瘍発現プロファイルの比較を通して発見したＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、ヒト癌と関連性があることを確認することを追求した。我々は、この目的のために、ＰＳＡの再発（いわゆる生化学的再発）までの時間を用いてアノテートされた７９個の臨床的に局在性の検体からなるＧｌｉｎｓｋｙらによるヒトＰＣＡ遺伝子発現データセット１を活用した。表１Ａに列挙する２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを使用した、階層的クラスター分析による目的変数なしの分類によって、臨床患者サンプルが、再発について有意な臨床治療成果を示すサブグループに階層化された（図５、ｐ＜０．０００１）。
【０２０５】
（実施例６）
統合的な解析により、転移可能な原発性腫瘍において予測されるＳＭＡＤ４標的のセットが定義される。
【０２０６】
次に、我々は、２８４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのプロモーターを、進化的に保存されているＳｍａｄ結合性エレメントについてスキャンして、６６個の予測される直接的なＳｍａｄ４転写標的を同定した（図７Ａ；完全なリストについては、表２を参照されたい）。この６６個のＳｍａｄ４転写標的（４５個の上方制御される標的および２１個の下方制御される標的）の知識ベース経路解析が、細胞の動きを最も有意な機能カテゴリーとして再度特定し（ｐ＝２．４６×１０−１２）、それには、これらの転移促進性のＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−原発性腫瘍において強化されている癌（ｐ＝３．７７×１０−１０）、細胞の成長および増殖（ｐ＝４．１４×１０−８）、ならびに細胞死（ｐ＝５．７５ｘ１０−７）が続くことを特定した（図７Ｂ）。際立つことには、６６個の遺伝子のうち、２８個が細胞の動きの遺伝子として機能によりアノテートされている。この６６個の遺伝子リストは、ヒト転移性ＰＣＡのアレイ−ＣＧＨプロファイル１９ともさらに交差し、このことから、進行性の疾患においては、主要なＳｍａｄ４依存性の進行を引き起こす事象自体が、標的とされ、ゲノム変化を起こすことが推論される。すなわち、Ｓｍａｄ４の喪失により上方制御された遺伝子自体が、標的とされて増幅され、一方、下方制御された遺伝子は、欠失されるであろう。この種を越えて得られた１７個の遺伝子（図８Ａ）のうち、５個（ＦＳＣＮ１、ＩＤ３、ＫＲＴ６Ａ、ＳＰＰ１およびＺＢＴＢ１６）は細胞の動きにつながることが公知である。興味深いことに、メラノーマにおける比較腫瘍ゲノム解析から最近、ＦＳＣＮ１が主要な転移および予後を示すＰＣｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔとして同定されており（未公開のデータ）、我々の遺伝子サインは、複数の腫瘍型にわたり、浸潤および転移のプロセスならびに臨床治療成果と関連性がある可能性が高まっている。
【０２０７】
（実施例７）
種間三角計測ＳＭＡＤ４転写標的は、臨床治療成果につながる
我々は、これらの進化的に保存されている予測されるＳｍａｄ４標的についてのヒトとの関連性の証拠および転移性ＰＣＡのこの新規モデルについてのさらなる証明を集めるために、ヒトＰＣＡにおいて、マウスのみの６６個の遺伝子リストと比べて、１７個の種間三角計測遺伝子の、ＰＳＡ再発を階層化する能力を評価した。我々は、この目的のために、ＰＳＡの再発（いわゆる生化学的再発）までの時間を用いてアノテートされた７９個の臨床的に局在性の検体からなるＧｌｉｎｓｋｙらによるヒトＰＣＡ遺伝子発現データセット１５を活用した。１７個の遺伝子リストを使用した、階層的クラスター分析による目的変数なしの分類によって、これらの患者の腫瘍が２つの主枝のうちの１つに割り当てられた（図７Ｃ）。統計学的有意性のためにはサンプルサイズが小さすぎるにもかかわらず、このコホート中の５つの転移性検体のうちの４つが、これらの１７個の遺伝子によって定義された高リスク群にクラスター形成した（図７Ｂ）。さらに、Ｇｌｉｎｓｋｙのプロファイリング研究１５からの１７個の遺伝子セットの無作為に選択したリスト（ｎ＝１０）は、統計学的に有意な分離を生成することができなかった（Ｐ＝０．８６１０；０．６０８６；０．１８２７；０．８３３８；０．６３９１；０．７９１８；０．１８１４；０．９８５１；０．３９４６；０．９２０１；）が、この１７個の遺伝子リストによって階層化されたこれら２つのサブクラスのカプラン−マイヤー解析からも、再発までの時間の有意な差が示された（ｐ＝０．００８６）（図７Ｄ）。それに比べて、６６個の遺伝子セットは、患者を示差的な治療成果サブクラスに階層化することはできず（ｐ＝０．０６２６）、このことにより、６６個の遺伝子リストから、ノイズのバイスタンダーが種間フィルターによって有効に間引かれていることが立証された（図１２）。
【０２０８】
次に、我々は、この１７個の遺伝子リストが前立腺に特異的であるかどうかを評価するために、２９５個の原発性乳癌からの治療成果によってアノテートされている発現データ２８を使用して類似の解析を実施した。図８Ｅに示すように、この１７個の遺伝子を用いた目的変数なしのクラスター化によって、これらの乳腺腫瘍サンプルが全体的な生存（ｐ＜０．０００１）および無転移生存（ｐ＝０．０００５）において有意な差を示す２つの群に細分類された（図８Ｆ）。無作為に選択した１７個の遺伝子のリスト（ｎ＝１０）は再度、カプラン−マイヤー曲線の何らかの有意な分離を達成することができなかった（Ｓｕｐｐ  ｉｎｆｏまたはｆｉｇ）。一方、この６６個の遺伝子セットは、このタスクにおいては不明確な性能、すなわち、（ｐ＝０．０２６３）の全体的な生存および（ｐ＝０．０８８６）の無転移生存を示した。
【０２０９】
総合すると、これらの相関解析は、複数のヒト腫瘍型において、進行の間のＳｍａｄ４の頻繁かつ有意な下方制御と併せて、ヒトの前立腺および乳房の腺癌を、良好な治療成果のサブクラスと不良な治療成果のサブクラスとに分類する（Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータ、ボックスプロットに示す）ための、これらの進化的に保存されているＳｍａｄ４標的の検出力を実証し、このＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウスが、ヒトＰＣＡ中に存在するサイン事象によって引き起こされた転移性前立腺と強い関連性を示すモデルであることを検証するのに役立ち、我々の統合的種間解析アプローチを支持している。
【０２１０】
（実施例８）
インシリコにおける解析によって、細胞の動きの遺伝子が、転移性ＰＴＥＮ／ＳＭＡＤ４腫瘍においては、緩徐進行型ＰＴＥＮ腫瘍と比較して、示差的に発現されることが明らかになっている。
【０２１１】
Ｐｔｅｎｐｃ−／−ＰＣＡモデルとＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−ＰＣＡモデルとで際立って異なる進行の表現型、および２８４個の遺伝子パネルの、ヒトＰＣＡ患者集団を階層化する能力によって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、転移性の進行を機能的に誘導していることが強調される。我々は、これらの遺伝子によって付与される生物学的活性の型に関する早期の洞察を得るために、知識ベース経路解析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した（図６）。細胞の動きのカテゴリーは、転移性ではないが浸潤性であるＰｔｅｎｐｃ−／−；ｐ５３ｐｃ−／−腫瘍においては、１８番としてランク付けされ（図６Ｂ）、一方、細胞の動きの遺伝子は、転移易発性のＰｔｅｎｐｃ−／−；Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍については、１番としてランク付けされた（図６Ａ）。
【０２１２】
（実施例９）
ヒト前立腺癌において進行相関性発現を示すＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ
ゲノムの不安定性が腫瘍形成を引き起こして、共通の明確に異なる遺伝子プロファイルを示す、不均一な細胞亜集団から構成される原発性腫瘍を生み出すことは十分に確立されている。したがって、原発性腫瘍中のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ−発現の亜集団には増殖性の利点が与えられ、そうした亜集団が究極的に広がる場合、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現が、より均一に派生した転移病変においては、強化されて現れることに起因して増加することは理にかなっている。そのような進行関連発現を評価するために、３７２個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ上の非常に多数の前立腺癌発現プロファイリングデータにおいて調べた。７４（７４）個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、ヒト前立腺癌においては、進行相関性発現を示すことが見出され（表４）、このことによって、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのヒト癌との関連性がさらに強調された。
【０２１３】
（実施例１０）
種間およびプラットフォーム間の三角計測ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、ヒト前立腺癌の予後を示す
次に、転移易発性マウス腫瘍と緩徐進行型マウス腫瘍との間でＲＮＡレベルにおいて示差的に発現した３７２個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含むこの転移サインを、ヒト転移性前立腺癌データセット１９中のコピー数異常（ＣＮＡ）中に存在する非常に多数の遺伝子と整合させた。我々は、以前の記載２４に従って、ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎによって処理した、転移性ヒト前立腺癌のＡＣＧＨプロファイルＧＳＥ８０２６１９の最小共通領域（ＭＣＲ）中の常在遺伝子を使用した。Ｐｔｅｎｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍とＰｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−マウス前立腺腫瘍との間で有意な示差的発現を示し、かつ転移性のヒト前立腺腫瘍においてコピー数変化を示す共通のオルソロガスな遺伝子を選択して、さらなるコンピュータ解析を行った。この解析によって、転移易発性マウス腫瘍においては、ＲＮＡレベルで示差的に発現し、転移性ヒト前立腺癌においては、ＤＮＡレベルで示差的に発現する５６個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが同定された（表７）（図６Ａ）。
【０２１４】
それに続いて、この５６個の遺伝子セット（表７）を、前立腺癌遺伝子発現データセット上で、予後を示す有用性について評価した。患者サンプルが、この５６個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリーに分かれた（低リスク群および高リスク群）。生化学的再発（ＢＣＲ）ＰＳＡレベル（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）のカプラン−マイヤー解析は、この５６個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいた。「高リスク」コホートについては、「低リスク」コホートと比較して、ＢＣＲ  ＰＳＡ無再発生存の統計学的有意性（Ｐ＝０．００１８）が見出された（図２１Ｂ）。
【０２１５】
（実施例１１）
浸潤に機能的に関与するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを同定するための遺伝子スクリーニング。
【０２１６】
遺伝子スクリーニングは、転移を機能的に誘導するＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのサブセットを同定するのに有用である（図２２）。特定のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ（特に、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２４５）の異種性の過剰発現によって、ヒト細胞の浸潤活性が増加する。同様に、特定のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ（特に、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ２４６〜３７２）の下方制御の結果、浸潤の増強も生じる。
【０２１７】
（実施例１２）
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、インビトロにおいて浸潤を直接引き起こす
上方制御および下方制御されるＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに相当するｃＤＮＡクローンを、ｐＭＳＣＶレトロウイルス系中で発現させた。ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ３に、レトロウイルス上清を個々に形質導入し、標準的な２４ウエルのマトリゲル浸潤チャンバーを使用して、浸潤について三つ組でアッセイした。各遺伝子の浸潤性を、ＧＦＰ対照と比較した（表５）。三つ組の、ＳＰＰ１および／またはＧＦＰ対照を過剰発現するＰＣ３細胞を用いた代表的なＢｏｙｄｅｎチャンバー浸潤アッセイを示す（図２３Ａ）。ＳＰＰ１を強制発現させることよって、ヒトＰＣＡ  ＰＣ３細胞の浸潤活性を有意に増強するその能力が、浸潤アッセイにより確認された。浸潤のレベルの差は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５）（図２３Ｂ）。特定の浸潤促進性のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、細胞の動きの遺伝子としてアノテートされており、一方、その他は、そうではない（表５、図２３Ｃ）。興味深いことに、我々は、ＰＣ３細胞中では、これら２８個の細胞の動きの遺伝子からは、１２ヒットがあり（４３％のヒット）；一方、その他の機能カテゴリーに属する３８個の遺伝子からは、６ヒットしかない（１６％のヒット）ことを見出した。したがって、これらの機能的検証の結果によって、これらの遺伝子が細胞の動きを可能にする遺伝子であるというインシリコにおけるアノテーションの正確さが確認されている。インビボにおける進行性Ｐｔｅｎｐｃ−／−Ｓｍａｄ４ｐｃ−／−腫瘍の表現型およびインシリコにおける細胞運動性分子プロファイルの背景に対して、推定されるＳｍａｄ４−Ｐｔｅｎ標的の浸潤促進活性を記載するこれらの機能データから、この浸潤遮断が、ＴＧＦβ／ＢＭＰ−Ｓｍａｄ４シグナル伝達ネットワークによる進行阻害の主要な機構であり、このことを、その後の臨床検証の優先順位付けのために活用することができることが示されている。
【０２１８】
（実施例１３）
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの小型のパネルが、ヒト前立腺癌における予後を示す。
【０２１９】
特定の実施形態では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０個または全３７２個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを測定して、個々の腫瘍の、転移する傾向に関する予後情報を提供するのが好都合である。その他の実施形態では、小型のパネルのＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを利用して、そのような予後情報を提供するのが好都合である。図５、８、１２、および２１は、ヒトのＰＣＡまたは乳房の治療成果を階層化する＞１６個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴから構成されるパネルを同定している。次に、我々は、ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのより小型のパネルの有用性を探索した（図２４）。前立腺癌遺伝子発現データセット上では、ＰｔｅｎおよびＳｍａｄ４の発現の調節不全が、関連のＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１（増殖／老化）およびＳＰＰ１（運動性ネットワーク）と一緒になって生じ、それに続いて、ヒト前立腺癌の進行と相関することが示された（図２４Ａ）。患者サンプルが、Ｋ平均法により、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１のサインによって定義された２つの主要なクラスターのカテゴリー（高リスク群および低リスク群）に分かれた。高リスク群の患者は、カプラン−マイヤー解析により、生化学的再発（ＢＣＲ）ＰＳＡレベル（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）の統計学的有意性を示した。ＰＣＡの進行における、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１のサインの有意な相関性を、独立したＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＰＨＳ）データセットにおいてｃ−ｓｔａｔｉｓｔｉｃを用いて検証した。ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１は、致命的な治療成果の予測においては、グリーソンスコアと類似する検出力を示している。ＰＨＳにおいては、ＰＴＥＮ遺伝子、ＳＭＡＤ４遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子およびＳＰＰ１遺伝子を、グリーソンに加えることによって、グリーソン単独のモデルよりも、致命的な治療成果の予測が有意に改善されている（図２４Ｂ）。さらに、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１およびＳＰＰ１の４個の遺伝子のセットが、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ、２．５版）において管理された２４４個の二方向性サインのうち、最も強化されているとランク付けられ、このことからも、致命的な治療成果の予測における、この４個の遺伝子サインのロバストな有意性が示された（図２４Ｃ）。
【０２２０】
（実施例１４）
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、乳房における予後を示す
ＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、前立腺癌の状況において発見されたが、複数の癌型に関連性がある中心的な転移性のプロセスを調節する可能性が高い。我々は、この可能性を探索するために、乳房腺癌データセット上で、予後を示す有用性について、５６個の種間／プラットフォーム間でフィルターをかけたＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを評価した（表７）。患者サンプルが、この５６個の遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスター（低リスク群および高リスク群）のカテゴリーに分かれた。カプラン−マイヤー解析を、この５６個の遺伝子のクラスターによって定義された群に基づいて、生存確率（ｐ＝０．００３５８）（図２５Ａ）および無転移生存（ｐ＝００４９２）（図２５Ｂ）について実施した。さらに次に、我々は、前立腺癌において進行相関性発現を示す７４個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを調べ（表４）、乳癌においても進行相関性発現を示す２０個のＰＣＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴも同定した。前立腺癌および乳癌の両方において進行相関性発現を示すこれら２０個のＰＣＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ（表６）を、乳房腺癌データセット上で、予後を示す有用性について評価した。患者サンプルが、この２０個の進行相関性遺伝子サインによって定義された２つの主要なクラスター（低リスク群および高リスク群）のカテゴリーに分かれた。カプラン−マイヤー解析を、これら２０個のＰＣＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔによって定義された群に基づいて、生存確率（ｐ＝２．９３ｅ−１１）（図２６Ａ）および無転移生存（ｐ＝４．６２ｅ−１０）（図２６Ｂ）について実施した。
【０２２１】
【表２−１】
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【０２２２】
【表２−２】
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【０２２３】
【表３】
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【０２２４】
【表４−１】
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【０２２５】
【表４−２】
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【０２２６】
【表５−１】
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【０２２７】
【表５−２】
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【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
【表７−１】
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【０２３０】
【表７−２】
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【０２３１】
【表７−３】
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【０２３２】
【数１】
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【０２３３】
【数２】
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【０２３４】
【数３】
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【０２３５】
【数４】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2011528442.tif 000063
【図２５】
2011528442.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月29日(2011.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011528442000001.app
【国際調査報告】
2011528442.tif 000065
2011528442.tif 000066
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