(57)【要約】マイクロ共鳴体における光学的モードの励起を用いて標的物を検出する方法であって；少なくとも２個のマイクロ共鳴体を含む少なくとも１個のクラスターを調製し；該クラスターのある種の第１のスペクトルを得；標的物を該クラスターの表面上に吸着させ；該クラスターのある種の第２のスペクトルを得；及び該第１のスペクトルのライン形状を、該第２のスペクトルのライン形状と比較することにより、標的物を感知することを含んでなる方法。
2011508868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ共鳴体における光学的モードの励起を用いて標的物を検出する方法であって；
少なくとも２個のマイクロ共鳴体を含む少なくとも１個のクラスターを調製し；
該クラスターのある種の第１のスペクトルを得；
標的物を該クラスターの表面上に吸着させ；
該クラスターのある種の第２のスペクトルを得；及び
該第１のスペクトルのライン形状を、該第２のスペクトルのライン形状と比較することにより、標的物を感知することを含んでなる方法。
【請求項２】
該クラスターが、基材上に設置される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該クラスターが、流体セル内部に浮遊される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該クラスター内のマイクロ共鳴体の一部の型が、そのクラスター内の他の部分のマイクロ共鳴体の型と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該クラスターの第１のスペクトルが、該クラスターの表面への標的物を吸着させる為のプローブ分子の導入、及び該クラスター表面の非特異的結合部位の不動態化後に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的物が、該標的物を含む分析対象物に対して該クラスターを暴露することにより、該クラスターの表面に吸着される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的物が、測定レンジの少なくとも一部における、該第１のスペクトルのライン形状と該第２のスペクトルのライン形状の間の波長シフトの強度を決定することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該第１のスペクトルに対応する該第２のスペクトルを特定し、及び該第１のスペクトルのライン形状と該第２のスペクトルのライン形状との間の平均ピークシフトを、該第１のスペクトルのライン形状と該第２のスペクトルのライン形状との間の自己相関に基づいて得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の該クラスターを調製し；個々の該クラスターの第１のスペクトルを得；該クラスターの少なくとも一部の表面に標的物を吸着させ；個々の該クラスターの第２のスペクトルを得；及び、変化に先行する該第１のスペクトルのライン形状と、変化後の該第２のスペクトルのライン形状とを比較することにより、標的物を検知する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該クラスターの一部の形状が、該クラスターの他の部分の形状と異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該クラスターの少なくとも一つにおけるマイクロ共鳴体の部分の型が、そのクラスターのマイクロ共鳴体の他の部分の型と異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該クラスターの部分が、他のクラスターから分離されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該クラスターの部分が、該クラスターの他の部分とは異なる様式に官能化される請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該第１のスペクトル及び該第２のスペクトルが、測定における１回又は連続する該クラスターの表面の映像走査の記録により得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロ共鳴体における光学モードの励起を使用する、標的物を感知する為のバイオセンサーチップであって：表面を有する基材；及び該基材の表面に設置される少なくとも２個のマイクロ共鳴体を含む少なくとも１つのクラスターを有してなるバイオセンサーチップ。
【請求項１６】
複数個の該クラスターが基材表面に設置される、請求項１５に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１７】
該クラスターの一部の形状が、該クラスターの他の部分の形状と異なる、請求項１５に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１８】
該クラスターの少なくとも一つにおけるマイクロ共鳴体の部分の型が、そのクラスターのマイクロ共鳴体の他の部分の型と異なる、請求項１５に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１９】
該クラスターの部分が、他のクラスターから分離されている、請求項１５に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項２０】
該クラスターの部分が、該クラスターの他の部分とは異なる様式に官能化される請求項１５に記載のバイオセンサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ共鳴体のクラスターにおける光学キャビティーモード励起に基づく光学的バイオセンサーの技術に関する。
【０００２】
この出願は、２００７年１２月３１日出願の先行する米国仮出願番号６１／０１８，１４４に基づき優先権主張する非仮出願である。米国仮出願番号６１／０１８，１４４の全ての内容は、参考として取り入れられる。
【０００３】
先行する２００６年４月２１日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００３７１４、先行する２００７年４月２６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６９４４３、先行する２００８年１１月５日出願の米国仮出願番号６１／１１１，３６９、先行する１１月７日出願の米国仮出願番号６１／１１２，４１０、先行する２００８年５月１９日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０５９５９、及び先行する２００７年１２月２１日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７５３４の全ての内容は、参考として取り入れられる。
【背景技術】
【０００４】
光学的マイクロ共鳴体は、光を共鳴的再循環によって小体積に閉じ込め、微視的光放出体、レーザー、及びセンサー等の可能性を持つ用途が示されている（Ｋ．Ｊ．Ｖａｈａｌａ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４、ｐｐ．８３９−８４６、２００３）。該再循環は、マイクロ共鳴体内部に維持される光の波長及び伝播方向について、幾何学的依存性の境界条件を負わせる。従って、ある種の光学的モード、いわゆる「キャビティーモード」のみが効率的に励起され得る。これらの許容されるモードのエネルギーレベルは、マイクロ共鳴体の幾何学的及び光学的性質に決定的に依存するため、後者は、例えば力（例えばキャビティーの変形による。例えばＭ．  Ｇｅｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １５，  ６，  ｐｐ．  ３５９７−３６０６，  ２００７参照）、あるいは化学的濃度の変化（例えばマイクロ共鳴体の密な近接部における屈折率の対応する変化による。例えばＡ．  Ｍ．  Ａｒｍａｎｉ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｖａｈａｌａ，  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ３１，  ｐｐ．  １８９６−１８９８，  ２００６参照）の感知に使用され得る極めて高感度の微視的光学センサーを含む。同様にして、マイクロ共鳴体は、例えば特異的に結合する分子のマイクロ共鳴体へ、又は共鳴体中への吸着により、結果として生じるキャビティーの周囲又は内部の屈折率の変化を検知することによって生物学的分子検出に使用され得る。
【０００５】
マイクロ共鳴体内部への光の閉じ込めは、該マイクロ共鳴体とその周囲との間での高い反射性の境界を要求する。このことは、例えば光学的導波体内部の光の誘導と同様に、内部全反射（ＴＩＲ）によって達成され得る。図１Ａに示すように、ＴＩＲはマイクロ共鳴体の屈折率ｎｃａｖが、その周囲の屈折率ｎｅｎｖより大きい場合、即ちｎｃａｖ＞ｎｅｎｖにて起こりうる。しかしながら、この場合においてもＴＩＲは、αを反射が起こる位置においてキャビティー内の局所表面の法線から測定した場合に、角度αがいわゆる“臨界角”αｃｒｉｔ＝ａｒｃｓｉｎ （ｎｅｎｖ／ｎｃａｖ)以上についてのみ起こる（図１Ａ）。マイクロ共鳴体内部に蓄えられる光の波長に比べて表面の粗さが無視できる限り、このような単純な考察が有効である。従って、マイクロ共鳴体のひとつの一般的な最小サイズの限度は、滑らかな表面を調製しうる精度によって与えられる。
【０００６】
マイクロ共鳴体の利用に対する他の障害は、マイクロ共鳴体と周囲との高度に反射的な境界の必要性と直接に関連する。吸収が無い媒体における光路は可逆的であるから、境界は周囲から該境界に当たる光線についても高度に反射的であろう。従って、光反射率の要求を満たし、而して高い光貯留能力を与えるキャビティー内部のこれらの光学的モードは、外部からマイクロ共鳴体に入る光によっては、容易には集まり得ない。
【０００７】
Ｖｏｌｌｍｅｒ及び共同研究者らは、マイクロ球体中のキャビティーモードの集積の為に、光学ファイバーの非被覆コアとシリカマイクロ球体との間の減衰場カップリングを使用した（Ｆ．  Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８０，  ｐｐ．  ４０５７−４０５９，  ２００２）。この場合、光子はトンネリングによって、ファイバーの高屈折率のコアから高屈折率のマイクロ球体内部へ移動することができる。しかしながら、Ｚ． Ｇｕｏらによって、カップリング効率及びキャビティー内に生成されるキャビティーモードの周波数が、光学ファイバーとキャビティーとの間の距離に大きく依存することが示されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｄ  ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ３９，  ｐｐ．  ５１３３−５１３６，  ２００６）。その結果、マイクロ球体及び光学ファイバーは、それらの間の距離を一定に保つ為に固体の台上に固定されなければならない。Ｖｏｌｌｍｅｒらは、３００μｍの直径のシリカ球体の外表面へのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着によるキャビティーモードバイオセンシングを示すことができた。彼らは、センサーの感度が、球の半径をＲとして１／Ｒに比例することを示した。
【０００８】
Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ及び共同研究者らは、キャビティーモードを集積するために染料ドープしたポリスチレン（ＰＳ）マイクロ球体を使用した（Ｍ．  Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｖｏｌ．   ３１，  ｐｐ．  Ｌ９９−Ｌ１０１，  １９９２）。マイクロ球体は、染料分子を励起する為に極めて短いレーザーパルスにて照射された。ポンピングの為のレーザーパルスは、マイクロ球体表面に小さい入射角にて入射され、而して光は少ない損失のみにて（典型的には５−１０％）、光学的により高密度のマイクロ球体に侵入し得た。マイクロ球体内部の励起された染料分子は、蛍光を随意的な方向、即ち全内部反射の条件を満たす方向にも再放射する。従って、染料分子の放射波長範囲の全てのキャビティーモードが励起状態となる。高い押上げ強度においてレーザーが観測された。
【０００９】
Ｗｏｇｇｏｎ及び共同研究者らは、ポリマーラテックスビーズへのドーピングに半導体量子ドットを使用した（Ｍ．  Ｖ．  Ａｒｔｅｍｙｅｖ  ａｎｄ  Ｕ．  Ｗｏｇｇｏｎ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７６，  ｐｐ．  １３５３−１３５５，  ２０００  ；  Ｂ．  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８０，  ｐｐ．  ３２５３−３２５５，  ２００２）。 Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ及び共同研究者らの研究と同様に、ラテックスビーズの内部のキャビティーモードが、適切な波長の光による半導体量子ドットの励起によって集積されえた。而して量子ドットはその放射範囲のキャビティーモードを励起する蛍光を再放射する。一般的に、量子ドットの放射バンド幅は、数十ナノメーターであり、即ちほとんどの染料分子よりも短い。しかしながら、量子ドットの主要な優位点は、光退色についての非常に高い安定性である。最近、Ｗｏｇｇｏｎ及び共同研究者らは、この構成を結合マイクロ共鳴体におけるキャビティーモードの励起についても使用した（Ｂ．  Ｍ．  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０，  ｐｐ．  ２１１６−２１１８，  ２００５）。
【００１０】
Ｈａｌａｓ及び共同研究者らは、光学的バイオセンシングのための非金属コア及び金属外殻からなるより小さいコア−殻粒子を提案した（Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許６６９９７２４  Ｂ１）。彼らは、特に数十から数百ナノメーターの大きさの粒子、即ち外部直径＜１μｍを持った粒子を研究した。そのような導電性の殻は、殻のフリー電子の集合的な振動に対応する、いわゆる“プラズマ振動数”にて光学的に励起され得る。固体金属粒子のプラズマ振動数は、粒子サイズについて限界的依存性のみを示し、また基本的には電子密度や有効電子質量等の大きい物質の物理的性質により与えられるが、Ｈａｌａｓらは、コア−殻粒子の場合にプラズマ振動数の位置が、単に粒子のコア及び殻半径の比を変えることによって、可視から近赤外までの広い範囲にわたって同調させ得ることを示すことができた（Ｎ．  Ｈａｌａｓ，  Ｏｐｔｉｃｓ  ＆  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｎｅｗｓ  １３，   ８，  ｐｐ．  ２６−３１，  ２００２  ；  Ｓ．  Ｊ．  Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８８，  ｐｐ．  ２４３−２４７，  １９９８）。Ｈａｌａｓらは、プラズマ振動数を、外部殻表面に吸着した有機分子の表面増強ラマン輻射を維持し得る周波数範囲に同調させることによって、そのような粒子が、バイオセンサーとして使用し得ることを示唆した。而してラマン輻射を、タンパク質吸着の定性的測定として供与することができる。Ｈａｌａｓらが、組立てた粒子のコア−殻の性質を、プラズマ振動数の調整にのみ使用しており、マイクロ共鳴体モードの生成又は使用のためには使用していないことに注意しなければならない。従って、彼らはそのようなモードの集積のために非金属粒子コア中へ、いずれの種類の蛍光物質を埋め込むことも示唆していない。
【００１１】
これまでに種々の幾何学的形態が研究されてきた。最も単純なものはＶｏｌｌｍｅｒらに使用されたマイクロ球体（Ｆ．  Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８０，  ｐｐ．  ４０５７−４０５９，  ２００２）、リング又は円筒（Ｄ．  Ｋ．  Ａｒｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，  ｐｐ．  ９２５，  ２００３  ；  Ｈ．  Ｊ．  Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２３５，  ｐｐ．  ４０１，  ２００４）である。より低い対称性を有するより複雑なキャビティー、例えば六角形の断面を有するナノ結晶体（Ｔ．  Ｎｏｂｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９３，  １０，  １０３９０３，  ２００４）又は非対称キャビティー（Ｎｏｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，  ｐｐ．  ４５，  １９９７）も、キャビティーモードの励起に使用することができた。Ｓｃｈｅｒｅｒ及び共同研究者らは、フォトニック結晶構造を使用し（Ｏ．  Ｐａｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，  ｐｐ．  １８１９−１８２１，  １９９９）、二次元フォトニック結晶における単一の欠陥を有する０．０３立方マイクロメータのこれまで最小のマイクロ共鳴体体積を達成した。
【００１２】
幾つかのグループは、空中においてのみマイクロ共鳴体の集合体の光学的キャビティーモード、例えば、二量体（Ｔ．  Ｍｕｋａｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８２，  ｐｐ．  ４６２３−４６２６，  １９９９）、三量体及び四量体（Ｂ．  Ｍ．  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｂ   Ｖｏｌ．  ７０，  ｐｐ．  １１５３２３／１−５，  ２００４）、並びに線形鎖状体（Ｍ．  Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８３，  ｐｐ．  ５３７４−５３７７，  １９９９  ；  Ｖ．  Ｎ．  Ａｓｔｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８５，  ｐｐ．  ５５０８−５５１０，  ２００４  ；  Ｂ．  Ｍ．  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ３０，  ｐｐ．  ２１１６−２１１８，  ２００５）について研究を行っているが、光学的検出を目的とすることなく、キャビティー量子電気動力学的研究及び結合−共鳴光学導波体の開発の為であった。本願の実施態様とは対照的に、これらの研究のほとんどは、強結合及びモード分離を許容する正確に合致するキャビティーモードスペクトルを持った、同じ大きさ及び幾何（例えば、リソグラフパターン形成の方法によるマイクロ構造形成（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．））又は大きさ選択コロイド状球体（Ｍｕｋａｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）のマイクロ共鳴体を使用しており、これらは、それ以外の方法では測定可能ではない（例えば、Ｍｕｋａｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．参照）。マイクロ共鳴体の集合体形成の為に同じ幾何学及び大きさのマイクロ共鳴体を使用することは、本発明の実施態様により与えられるように、クラスターの集合においてマイクロ共鳴体のクラスターを同定する為の、特徴的なスペクトル的な指紋というアイデアを損なうものである。実際に、その調製によってもたらされるマイクロ共鳴体の大きさ分布による優位点を持つこと、及び特徴的なスペクトル的な指紋の生成について、このような種々の物を使用することは、本発明の実施態様の鍵となるアイデアの一つである。更に、Ａｓｔｒａｔｏｖ及び共同研究者ら（Ｖ．  Ｎ．  Ａｓｔｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８５，  ｐｐ．  ５５０８−５５１０，  ２００４）は、１％の僅かな大きさの分散を持った球状誘電性マイクロ共鳴体の鎖状体における光学的結合及び輸送現象を研究した。鎖状体は、頂部に１個の蛍光ビーズを有する非蛍光ＰＳビーズの鎖状体からなっていた。このビーズからのＷＧＭ放射は、次いで鎖状体を辿って下降する。該文献の図２に示されるように、異なったモードについて異なった程度で、光放射ビーズからの距離の増大と共にビーズからビーズへと強度が低下する一方で、観測可能なＷＧＭスペクトルは常に単一球体のもの、即ち非蛍光ビーズのもので、共鳴位置又はバンド幅についてＷＧＭ放射に影響しない。光放射ビーズのＷＧＭスペクトルの出現に対する異なった鎖状体を使用することの効果は、報告されていない。而して、ビーズのクラスターにおけるスペクトル的な指紋スペクトルの存在、特には大きいサイズの分散における存在についての結論は導くことができない。より最近には、Ａｓｈｉｌｉ等 （Ｓ．  Ｐ．  Ａｓｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｏｌ．  １４，  ｐｐ．  ９４６０−９４６６，  ２００６）は、半径の大きい不一致（それぞれ８及び５μｍの直径）を持った２個のマイクロ球体間のキャビティーモードの光学的結合を、それらの分離の関数として研究した。２個のマイクロ共鳴体間のギャップの大きさが減少に伴う、ＷＧＭ位置の若干のブルー・シフトが観察される一方で、このシフトは、球体−球体相互作用ではなくして、基質の効果に帰着するとされた。従って、スペクトル的指紋の存在に関しては何ら示されていない。要約すると、マイクロ共鳴体の集合体の光学的キャビティーモードスペクトルに関する文献に見出される研究は、本発明の実施態様に与えられるようなスペクトル的な指紋の存在に係る何らの証拠を与えるものでもなく、また光学的検出への応用に関するマイクロ共鳴体のクラスター又は集合体の応用を議論するものでもない。
【００１３】
マイクロ共鳴体の足跡をたどる光学的キャビティーモードの手段によるバイオセンシングの応用については、これまで非金属マイクロ共鳴体が主として適用されてきた。Ｉｌｃｈｅｎｋｏ及びＭａｌｅｋｉは、共鳴体表面への分子吸着によるクォリティ因子の現象を監視することにより、光学的センサーとしての極めて高いクォリティ因子を持ったホイスパーリング・ギャラリー・モード共鳴体を使用するための装置を記述している（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＳＰＩＥ，  ４２７０，  ｐｐ．  １２０−１３０，  ２００１）。この原理は、直径数十から数百マイクロメーターの共鳴体においてのみ達成可能な、Ｑ〜１０８−１０９の範囲の極めて高いクォリティ因子を要求する。より小さい共鳴体は、典型的にはより高い損失を有し、従って低いクォリティ因子を有する。而して、これにおいて示唆される方法は、２０〜３０マイクロメーター未満の全体的大きさを有する光学的センサーの開発には適合し難い。
【００１４】
Ｍａｌｅｋｉら （米国特許６，  ４９０，  ０３９  Ｂ２）は、球体形状を有する単一マイクロ球体のバイオセンシングへの使用方法を記述した。検出は、（生物学的−）分子がマイクロ球体表面に吸着した際に起こるキャビティーモード波長のシフトに基づく。実験的な設定は、キャビティーモードの主役を演じ、変換器として働く高クォリティ因子を有する単一マイクロ球体を必要とする。キャビティーモードは、光学ファイバーによってマイクロ粒子と結合された入射レーザーを使用するマイクロ粒子中のＴＩＲによって生成される。出力信号もまた、光学ファイバーによって集められ、次いで分析される。キャビティーモードの波長シフトは、（生物学的−）分子がマイクロ粒子に結合しているか否かに関する情報を与える。
【００１５】
Ｐｏｅｔｔｅｒら（ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００７４８，２００５）は、キャビティーモードの手段によるバイオセンシングについて、同様な方法を適用した。Ｗｏｇｇｏｎ及び共同研究者の研究法に続いて、彼らは量子ドットを含む蛍光マイクロ粒子又は粒子を使用した。その場合においては、キャビティーモードは球体内部の蛍光体により励起され、マイクロ球体と光ファイバーとの間の結合が必要とされない。更にこの研究法は、蛍光体、従ってキャビティーモードの励起の為の異なった光源（ＵＶランプ、ＨｅＮｅガスレーザー、アルゴンイオンレーザー、ＨｅＣｄガスレーザー等）の使用を可能とする。
【００１６】
Ｎｏｔｏら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８７，  ｐｐ．  ２２３９０１−１  ２２３９０１−３，  ２００５  ；  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９２，  ｐｐ．  ４４６６−４４７２，  ２００７）は、キャビティーモードに基づくバイオセンサーが、マイクロ球体の表面に結合した生物学的分子の存在を検出する為のみならず、生物学的分子そのものの関連する情報を得るためにも使用され得ることを示した。著者らは、波長のシフトが、考慮される生物学的分子の分子量に依存することを示した。著者らは、異なる種類のキャビティーモード励起（横断的電気的（ＴＥ）及び横断的磁気的（ＴＭ）モード）のキャビティーモード波長シフトを対比することにより、マイクロ球体に結合した生物学的分子の配向を決定することが可能であることを指摘した。後者の実験は、シリカ球体（ｒ＝２００μｍ）の表面に吸着したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて行われた。
【００１７】
Ｖｏｌｌｍｅｒら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８５，  ｐｐ．  １９７４−１９７９，  ２００３）は、単一シリカマイクロ球体におけるキャビティーモードの検出に基づくＤＮＡの検出の為のバイオセンサーを記述した。著者らは、異なる核酸と特異的に相互作用する為にオリゴヌクレオチドにより官能化された２個の単一マイクロ球体（ｒ＝ ２００μｍ）を使用した。彼らは、共通する光ファイバーに結合する２個のマイクロ球体を適用することにより、特定のＤＮＡ配列の多重的検出を例示した。本発明の実施態様とは対照的に、マイクロ球体は独立したセンサーシグナルを確立する為に互いに独立させて操作された。ＷＧＭ共鳴位置は、同じファイバーにより検出される一方で、それらは独立して記録された。とりわけ、互いに数マイクロメーター離間されて設置された２個のマイクロ球体間の交差結合は、観察されていない（１９７６頁、第１欄、下から３行目）。更に、著者らは、マイクロ球体の異なる組み合わせから得られたスペクトルにおける何らかの特定の差異に関して、報告しておらず、換言すれば彼らは本発明の態様において定義されるスペクトルの指紋の存在に関しては報告していない。
【００１８】
Ｔｅｒａｏｋａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｂ  ２３，  ７，  ｐｐ．  １４３４−１４４１，  ２００６）は、より最近に、キャビティーモードに基づくバイオセンサーの感度の向上方法について記述した。著者らは、シリカマイクロ球体を高屈折率物質、この場合にはポリスチレンにより被覆した。著者らは、この被覆されたマイクロ球体を用いて生物学的分子の検出について、感度における顕著な向上を主張している。
【００１９】
多くのグループが、液体環境におけるセンサー、例えば、遠隔的屈折率検知の為のセンサーとして非金属光学的マイクロ共鳴体を適用した（Ｐ．  Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ９０，  ｐｐ．  １６１１０１／１−３，  ２００７  ；  Ｓ．  Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ９２，  ｐｐ．  ２２１１０８／１−３，  ２００８  ；  Ｊ．  Ｌｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ９３，  １５１１３／１−３，  ２００８）。しかしながら、これらの何れのグループもマイクロ共鳴体のクラスターの光学的特性及び／又は応用に関しては、考慮あるいは研究を行わなかった。
【００２０】
他のグループは、マイクロキャビティーにおけるレーザー、即ちマイクロレーザーの製作及び使用を達成した（例えば、Ｍ．  Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｋａｍｉ  ＆  Ｋ．  Ｔａｋｅｄａ，  Ｏｐｔ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｖｏｌ  ９，  ｐｐ．  １２−１７，  １９９８  ；   Ｖ．  Ｓａｎｄｏｇｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ａ  Ｖｏｌ．  ５４，   ｐｐ．  Ｒ１７７７−Ｒ１７８０，  １９９６  ；  Ｓ．  Ｍ．  Ｓｐｉｌｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  ４１５，  ｐｐ．  ６２１−６２３，  ２００２  ；   Ｚ．  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ９０，  １１１１１９／１−３，  ２００７）。しかしながら、マイクロ共鳴体のクラスターにおけるレーザー、特には液体環境及び／又は生物学的検知の応用に関しては、これまで報告されていない。
【００２１】
要約すると、検知的応用の為の非金属マイクロ共鳴体を使用する研究は、これまでのところ単離されたマイクロ共鳴体の使用によってのみなされてきた。多重化について検討する場合において、即ち種々の分析対象物の併行的な検出の為の１個以上のマイクロ共鳴体の応用については、適用される異なったマイクロ共鳴体は、互いに独立して操作されるものと思われている。
【００２２】
生物学的検知への、金属被覆誘電性粒子の光学的キャビティーモードの応用は、ＷＯ２００７／１２９６８２に記述されている。それには、金属被覆誘電性粒子のクラスターも記述されている。しかしながら、記述全体を通して、共鳴体のクラスターから得られるキャビティーモードスペクトルが、それらの認識及び／又は助成された読み出し工程に使用され得る特徴的な指紋を示すであろうことには触れられていない。
【００２３】
閉鎖されたマイクロ共鳴体に加えて、解放されたマイクロ共鳴体の使用も生物学的検知について示唆されている。これらのマイクロ共鳴体は、薄い金属フィルムの顕微鏡的空隙を有してなる。光は、薄いフィルムの平面にのみ閉じ込められ、一方で垂直方向には自由である。Ｂｌａｉｒ及び共同研究者ら（Ｙ．  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５，  ｐｐ．  １３６８−１３７４，  ２００４  ；  Ｙ．  Ｌｉｕ  ＆  Ｓ．  Ｂｌａｉｒ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ，  ５７０３，  ｐｐ．  ９９−１０６，  ２００５）は、薄い金フィルムにパターン形成されたナノキャビティー内部に吸着された色素−標識タンパク質の蛍光増強を研究した。彼らは、２の因子を以っての蛍光増強、及び６の因子を以っての量子収率の増加を観察した。著者らは、基本的にシグナル強度の増大の為にナノ形成されたキャビティーの集合体を使用した一方で、彼らは試料から得られた蛍光放射のスペクトル的分析は行っていない。従って、彼らは、本発明の態様において明白に記述したような、一般的な光学的キャビティーモードも、何らの特徴的なスペクトル的指紋も観察できなかった。加えて、そのような特徴的指紋の存在は、彼らの場合には２つの理由から全く思いもよらないことである。第一には、方法が標準的パターンに依存していること、及び第二にはそれらの製作に電子ビームリソグラフィーを適用していることである。この技術の優れた精密さの為に、パターンの一定性からの偏差が予想通りに小さく、従って、基本的（一定の）パターンからの局所的偏差に基づくスペクトル的指紋の発生を危うくする。
【００２４】
金属粒子又は薄い金属フィルムのプラズマ励起に基づく標識無しでの生物学的検知の為の他の方法が種々存在する。これらの場合においては、入射光は、自由に進行するか、又は局所化表面プラズモン（金属におけるフリー電子の集合的振動に対応する）を送り出す為に使用される。次いで、プラズモンは、金属フィルム又は金属粒子の近傍環境に減衰電磁波を生成する。この環境における誘電特性が、例えば生物学的分子の吸着等により変化した場合に、プラズモン共鳴位置が変化する。従って、このシフトは、標識無し光学的バイオセンサーの読み出し信号として使用され得る。局所化プラズモン効果を利用する研究法の例は、米国特許公開２００３／０１７４３８４  Ａ１、ＥＰ  ０  ９６５  ８３５  Ａ２、ＷＯ２００６／１１１４１４、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ Ｖｏｌ．  ６３，  ｐｐ．  ２４−３０，  ２０００、及びＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｖｏｌ．  ２２，  ｐｐ．  ３１７４−３１８１，  ２００７に与えられている。ＷＯ２００６／１１１４１４は、生物学的検知の為の蛍光誘電粒子の金属被覆クラスターの使用を明示的に述べている。しかしながら、その使用及び／又は光学キャビティーモードの励起は、検討されてもいないし、又述べられてさえもいない。
【００２５】
フリー航行プラズモンの例は、ジェネラル・エレクトリック・ヘルス・ケア（ＵＫ）からビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）システムにより提供されている。
【００２６】
最近、いくつかのグループが、光学的キャビティーモードと表面プラズモンとの間の結合に関し、単一金属−被覆粒子について（Ｄ．  Ａｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ，  Ｖｏｌ．  １０９，  ｐｐ．  １５５１５−１５５１９，  ２００５）、あるいは金属基材に埋め込まれた粒子の規則的配列について（Ｒ．  Ｍ．  Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．  ９７，  ｐｐ．  １３７４０１／１−４，  ２００６）、検討を行った。後者のグループは、粒子の規則的配列を用いて研究を行い、不完全性の存在を無視することが出来た為、特徴的なスペクトル的指紋に関して報告していない。更に、彼らの研究法は、表面プラズモンが、外部からは容易に接近できない粒子／金属境界に生成される為、光学的検知には不適当である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、上述した関連技術において起こるであろう問題を解決する為に達成された。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明されたバイオセンサーは、（生物学的−）分子の検出の為の変換器機構としての光学的キャビティーモードの波長シフトに依存する。それは、単一の解離されたマイクロ共鳴体に代えて、互いに近接するか、又は接触するように配置された複数のマイクロ共鳴体、又はクラスターからなる。発明の一つの側面に従うと、マイクロ共鳴体における光学的モードの励起を用いて標的物を検出する方法であって；少なくとも２個のマイクロ共鳴体を含む少なくとも１個のクラスターを調製し；該クラスターのある種の第１のスペクトルを得；標的物を該クラスターの表面上に吸着させ；該クラスターのある種の第２のスペクトルを得；及び該第１のスペクトルのライン形状を、該第２のスペクトルのライン形状と比較することにより、標的物を感知することを含んでなる方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、キャビティー表面の可能性ある反射的性質の例を表わす概念図であり、図１Ａは、単純な非被覆誘電性キャビティーの場合の例を示し、ここにおいて光は、キャビティーの屈折率の実部ｎｃａｖが、隣接部の実部ｎｅｎｖより大きい場合に、いわゆる臨界角αｃｒｉｔより大きい全ての入射角αｉについて全内部反射（ＴＩＲ）により補足され（角度αｉ＜αｃｒｉｔにて入射する光は表面を通って容易に伝播され、これによって、例えばキャビティー内部の蛍光物質の光学的励起のために必要とされるような、外部からのキャビティーへのアクセスも許容する）、また、図１Ｂは、被覆キャビティー（興味ある波長において高い反射率を有する）の場合における例を示し、被覆に入射する光は任意の角度で反射される（このことはキャビティー内部への光の補足を促進し、しかしながら、例えばキャビティー内部の蛍光物質の光学的励起のために必要とされるような、外部からのキャビティーへのアクセスを困難にする）；
【図２】図２は、球状マイクロ共鳴体の特有のキャビティーモードの単純化した評価を示す模式図で、図２Ａは、ファブリーペロット（Ｆａｂｒｙ  Ｐｅｒｏｔ）モード（ＦＰＭ）の例を示し、図２Ｂは、ささやきの回廊（Ｗｈｉｓｐｅｒｉｎｇ  Ｇａｌｌｅｒｙ）モード（ＷＧＭ）を示す。
【図３】図３は、マイクロ球体表面への（生物学的−）分子の吸着によるＷＧＭの波長シフトを示す模式図で、図３Ａは、マイクロ球体表面を示し、図３Ｂは、ＷＧＭの波長シフトを示す。
【図４】図４は、場合により殻により被覆される基材上の個々のマイクロ共鳴体により形成されるクラスターの例を示す模式図であり、図４Ａは、クラスターを形成する殻を伴わない２個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｂは、３次元クラスターを形成する殻を伴わない５個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｃは、クラスターを形成する個々に殻により被覆された２個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｄは、コアを基材から隔離する全体として殻により被覆された２個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｅは、コアの基材との直接的接触を許容し、相互の接触は許容しない殻により個々に被覆された２個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｆは、基材に加えて相互のコアの直接的接触を許容するクラスターを形成する全体として殻により被覆された２個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｇは、３次元クラスターを形成する個々に殻により被覆された5個のマイクロ共鳴体を示し、図４Ｈは、基材に加えて相互のコアの直接的接触を許容するクラスターを形成する全体として殻により被覆された５個のマイクロ共鳴体を示す（これらの模式図は、他の個数の粒子に容易に拡張され得、該スキームの組み合わせも可能である）。
【図５】図５は、マイクロ粒子のクラスターにより輻射されるＷＧＭの測定のための実験配置を表す模式図である。
【図６】図６は、単一マイクロ球体（ｒ＝５μｍ）のＷＧＭスペクトルを示し、図６Ａは、乾燥環境において測定されたＷＧＭスペクトルを示し、図６Ｂは、水中にて測定されたＷＧＭスペクトルを示す（両スペクトルは、同一粒子にて測定された）。
【図７】図７は、ミリポア水中における１０μｍの名目直径の単一蛍光ポリスチレンビーズのＷＧＭスペクトル、並びに異なる個数のそのような粒子を含むクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、図７Ａは、水中の単一ビーズのＷＧＭスペクトルを示し、図７Ｂは、水中の２個のビーズのクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、図７Ｃは、水中の３個のビーズのクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、図７Ｄは、水中の４個のビーズのクラスターのＷＧＭスペクトルを示す。
【図８】図８は、ミリポア水中の２個の単一粒子のＷＧＭスペクトルを示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図９】図９は、ミリポア水中の２個のビーズからなる異なる２つのクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図１０】図１０は、ミリポア水中の３個のビーズからなる異なる２つのクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図１１】図１１は、ミリポア水中の４個のビーズからなる異なる２つのクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図１２】図１２は、多価電解質（ＰＥ）の層の順次的沈着後の単一マイクロ球体（ｒ＝５μｍ）のＷＧＭスペクトルを示し、図１２Ａは、ＷＧＭ概観スペクトルを示し、並びに図１２Ｂは、ＷＧＭの波長シフトをより詳細に可視化している図１２Ａにおいて黒の枠によって示される部分の拡大を示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図１３】図１３は、ＰＥの層の順次的沈着後の３個のマイクロ球体（ｒ＝５μｍ）からなるクラスターのＷＧＭスペクトルを示し、図１３Ａは、ＷＧＭ概観スペクトルを示し、並びに図１３Ｂは、ＷＧＭの波長シフトをより詳細に可視化している図１３Ａにおいて黒の枠によって示される部分の拡大を示し、明確にするために縦軸方向にスペクトルを移動してある。
【図１４】図１４は、ＰＥの吸着前及び第３のＰＥ被覆後のそれぞれのマイクロ球体のＷＧＭスペクトルから計算された自己相関の結果を示し、図１４Ａは、単一マイクロ球体の自己相関を示し、及び図１４Ｂは、３個のマイクロ球体からなるクラスターの自己相関を示し；挿入図はそれぞれの相関最大値の拡大図を示す。
【図１５】図１５は、異なるマイクロ球体のＷＧＭスペクトルから計算された相関の結果を示し、図１５Ａは、２種の異なった単一マイクロ球体の相関を示し、及び図１５Ｂは、それぞれ３個のマイクロ球体を含む２種の異なったクラスターの相関を示し；挿入図はそれぞれの相関最大値の拡大図を示す。
【図１６】図１６は、１から３のＰＥ層についてのクラスターに存在するビーズの個数の関数としての継続的ＰＥ沈着による平均ＷＧＭ波長シフトを表し、誤差のバーは同じビーズ数の異なるクラスターについての５−６回の測定の平均から計算された実験誤差を示す。
【図１７】図１７は、クラスター及び単一マイクロ球体のそれぞれに対するＢＳＡの吸着のＷＧＭ測定の結果を示し、図１７Ａは、クラスターを構成するマイクロ球体の個数の関数としてのＷＧＭの波長シフトを表し、図１７Ｂは、図１７Ａに示されるＷＧＭシフトから計算されたクラスターを構成するマイクロ球体の個数の関数としてのＢＳＡ射影面積を示し、誤差のバーは、検出単位（〜０．０１ｎｍ）の解像度を表し、実験誤差（同数のビーズの異なるクラスターについての測定）がこれらの限度内にあることが見出された。
【図１８】図１８は、基材上に沈積されるマイクロ共鳴体のクラスターの可能な配置の例を表す模式図であり、図１８Ａは、ランダム配置を示し、図１８Ｂは、規則的配置を示す。
【図１９】図１９は、マイクロ流動性フローセル中に浮遊するマイクロ共鳴体のクラスターを表す模式図である。
【図２０】図２０は、２つの異なった三量体の水中におけるＷＧＭスペクトルを示し、ここにおいて（ａ）及び（ｂ）は、レーザー閾値を越える中心励起からのスペクトル、（ｃ）はレーザー閾値を下回る中心励起からのスペクトル、並びに（ｂ）及び（ｃ）は同一クラスターから得たスペクトルである。
【図２１】図２１は、水に浸漬され、三量体の略図に示されるように異なった部位において励起された三量体により得られたＷＧＭスペクトルを示し、ここにおいて（ａ）は中心励起、（ｂ）は左上のビーズの励起、（ｃ）は左下のビーズの励起、（ｄ）は右側のビーズの励起である（全ての他のパラメーター、とりわけ励起強度は一定を保った）。
【図２２】図２２は、ナイルレッドのみ（上半分）又はＣ６Ｇ及びナイルレッド（下半分）の何れかがドープされ、４４２ｎｍ放射（ａ）又は５３２ｎｍ放射（ｂ）の何れかにより励起された１５μｍＰＳビーズのＷＧＭスペクトルをそれぞれ示す。
【図２３】図２３は、ナイルレッドのみがドープされた１個のビーズ、並びにＣ６Ｇ及びナイルレッドがドープされた１個のビーズからなる混合二量体の正準化ＷＧＭスペクトルを示し、ここにおいて（ａ）では二量体は４４２ｎｍ放射により中心にて励起され、（ｂ）では二量体はレーザー閾値より低い５３２ｎｍ放射により中心にて励起され、及び（ｃ）では二量体はレーザー閾値を越えて５３２ｎｍ放射により中心にて励起された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明に関する例示的実施態様は、添付の図面を参照して詳細に説明される。
【００３１】
用語の定義
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｃ６Ｇ：クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）６レーザー級
ｃｗ：連続波
ＤＦＢレーザー：分配帰還レーザーダイオード
ＰＡＡ：ポリ（アクリル酸）
ＰＡＨ：ポリ（アリルアミン塩酸塩）
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＰＥ：多価電解質
ＰＳ：ポリスチレン
ＰＳＳ：ポリ（４−スチレン硫酸ナトリウム）
ＴＩＲ：内部全反射
ＴＥ：横軸電気光学モード
ＴＭ：横軸磁気光学モード
【００３２】
表面における反射及び伝搬：  一般的に、物質の表面は、当たった光の一部分をその周囲に反射する一方で他の部分を物質中に伝播する能力を有し、それは進行の過程において吸収されるであろう。以下において、入射光に対する反射光の強度比を、周囲／物質界面（又は物質／周囲界面）の“反射能”又は“反射率”Ｒと称する。而して、入射光に対する伝播光の強度比を、この界面の“伝播率”Ｔと称する。Ｒ及びＴは、共に該界面の性質、即ちそれらの値が物質及びその周囲の両方の光学的性質に依存することに注意されたい。更に、それらは、該界面に入射する光の入射角及び偏光に依存する。Ｒ及びＴの両者は、反射及び伝播のフレネル方程式によって、計算され得る。
【００３３】
光学的キャビティー：  光学的キャビティーは、閉じた境界領域（キャビティーの“表面”）により制限された閉じた体積であり、これは、−少なくともある領域において、かつ適合する条件下で−電磁スペクトルの紫外（ＵＶ）、可視（ｖｉｓ）及び／又は赤外（ＵＶ）領域における光に対して高度に反射的である。その波長依存性に加えて、この境界領域の反射率は、該局所表面法線に対して該境界領域に入射する光の入射角にも依存的である（図１Ａ参照）。更に、反射率は、局所的部位、即ち光が入射する境界領域の位置にも依存し得る。光学的キャビティーの内部体積は、真空、空気、又はＵＶ、可視及び／又は赤外において高度に伝播性を示す何れかの物質からなっていてよい。特には、伝播性はキャビティーの表面が高い反射率を示す表面について、該電磁スペクトルの領域の少なくとも一部について高くなければならない。光学的キャビティーは、該光学的キャビティーを形成する物質とは異なる物質により被覆されていてよい。被覆に使用される該物質は、例えば異なった屈折率または吸光度等の異なった光学的性質を有してよい。更に、それは光学的キャビティーの物質とは異なった物理的、化学的又は生物化学的性質、例えば異なった機械的、光学的、電気的及び／又は磁気的性質、化学的不活性又は反応性、及び／又は抗汚濁又は他の生物学的官能性等を含んでもよい。以下において、光学的被覆を“殻”と称し、一方で光学的キャビティーを“コア”と称する。更に、全システム、即ちコアと殻を一緒にして、“（光学的）マイクロ共鳴体”と称する。後者の用語は、殻の物質が適用されない場合の全システムを記述するためにも使用される。更に、“マイクロ共鳴体のクラスター”なる用語は、全体として均質的又は異種的に被覆される光学的キャビティーの集合体（例えば、集合体の形成後）に対してのみならず、個々に被覆されるマイクロ共鳴体の集合体（例えば、異なった種類の核を有する）に対して使用される。ここにおいて検討した殻に加えて、マイクロ共鳴体又はマイクロ共鳴体のクラスターの表面の一部は、例えば、特異的結合事象の検出のための適当な（生物学的−）機能性インターフェイスを与えるための検知器の一部として、あるいは標的分子が共鳴体表面又はその一部に吸着した場合の検知工程において、付加的な層（例えば、殻の最上部）により被覆されてもよい。
【００３４】
光学的キャビティー（マイクロ共鳴体）は、２つのパラメーターにより特徴付けられる：
第１にはその体積、及び第２にはクォリティ因子である。以下において、“光学的キャビティー”（“マイクロ共鳴体”）なる用語は、クォリティ因子Ｑ＞１を有するこれらの光学的キャビティー（マイクロ共鳴体）を指す。使用される殻の物質に依存して、マイクロ共鳴体内に蓄積される光は、例えば高度に反射性の金属殻を使用した場合に、光学的キャビティー内にのみ蓄積されるか、あるいは例えば誘電性又は半導体殻を使用した場合に、殻にもしみ出し得る。従って、何れの用語（光学的キャビティーの体積及びＱ−因子又はマイクロ共鳴体のそれら）が、マイクロ共鳴体の得られる光学的性質を特徴付けるためにより適切であるかは、考慮される特定のシステムに依存する。光学的キャビティーを特徴付けるために下記に与えられる定義（クォリティ因子、光学的キャビティーの体積、光学的キャビティーモード、光学的接触、クラスター、レーザー閾値）は、マイクロ共鳴体に対応して保持される。
【００３５】
クォリティ因子：  光学的キャビティーのクォリティ因子（又は“Ｑ−因子”）は、そのキャビティー内部に光子を補足する可能性の尺度である。それは次のように定義され、
【００３６】
【数１】
2011508868.tif 000003
ここにおいて、ωｍ及びλｍは、それぞれキャビティーモードｍの周波数及び波長であり、Δωｍ及びΔλｍは、対応するバンド幅である。後者の二つの等式は、Ｑ−因子をキャビティー内の光学的モードの位置及びバンド幅に結び付ける。明らかに、キャビティーの蓄積能力は、その表面の反射率に依存する。従って、Ｑ−因子は、波長、偏光及び伝播の方向等のキャビティーモードの特性に依存し得る。
【００３７】
光学的キャビティーの体積：  光学的キャビティーの体積は、キャビティー表面、即ち反射的境界領域により閉じ込められる、内部的な幾何学的体積として定義される。
【００３８】
光学的キャビティーモード：  光学的キャビティーモード、あるいは単に“キャビティーモード”は、与えられたキャビティーについての電磁場方程式（マクスウェル方程式）の波動解である。これらのモードは、離散的であり、キャビティー表面における制限的境界条件のために整数ｍにより番号付けされ得る。従って、キャビティーの存在下での電磁スペクトルは、許容及び禁止帯に分割され得る。マクスウェル方程式の完全解は、キャビティーの内部側及び外部側のそれぞれの内部的及び外部的電磁場からなる。以下において“キャビティーモード”なる用語は、別途述べない限りキャビティー内部の内部電磁場を指す。波動解は、境界領域、即ちキャビティー表面の反射率に加えて、キャビティーの形状及び体積に依存する。
【００３９】
球体状キャビティーについては、波長依存性が容易に評価できる２つのタイプの解が存在する。単純化のため、我々は以下の議論においてこれらの評価法を使用する。図２は、これら２つの差異を例示する。我々は、両方の場合において定常波が形成されると仮定する。図２Ａにおいては、定常波が半径方向に形成され、一方、図２Ｂにおいては、それは球体と環境との内部境界の円周に沿って形成される（金属殻により被覆された球体の場合、定常波は内部側の殻の境界に沿って形成される）。これらの定常波は、半径方向又は方位角方向の何れかの対向的に伝播する進行モードの重ね合わせとして、それぞれ見ることができる。以下において、我々は半径方向におけるモードを、ファブリー−ペロット干渉計との類似に従って“ファブリー−ペロットモード”（ＦＰＭ）と称する。球体の周囲に沿って形成されるモードを、ロード・レイリー（Ｌｏｒｄ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ）により発見された音響学的発見との類似において、“ささやきの回廊モード”（ＷＧＭ）と称する。これらのモードの波長依存性の簡単な数学的記述のために、我々は次のような定常波の境界条件を使用する（例示のために図２を参照）：
ＦＰＭについては、
【００４０】
【数２】
2011508868.tif 000004
これは内部キャビティー表面における電場が、金属被覆を有するキャビティーの場合のように常に消滅することを述べている。ＷＧＭについては、境界条件は、
【００４１】
【数３】
2011508868.tif 000005
をもたらし、これは波が全周伝播後に位相が揃って戻らなければならないことを述べている。両方の式において、“ｍ”は整数であり、モードに番号付けするためにも使用され、Ｒは、球体の半径であり、またｎｃａｖはキャビティー内部の屈折率である。
【００４２】
モードの結合：  我々は、モードの結合を、互いに（物理的）接触するか、あるいは光学的な接触を許容するように近接して配置される２個以上の光学的キャビティー又はマイクロ共鳴体により放射されるキャビティーモード間の相互作用として定義する。Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ及び共同研究者らにより示されたように、マイクロ共鳴体間の強い結合によるモード分離は、同様な幾何学及び大きさのマイクロ共鳴体が接触される場合に起こり得る（Ｔ．  Ｍｕｋａｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８２，  ｐｐ．  ４６２３−４６２６，  １９９９）。この現象は、光導波構造の構成の為にも使用され得る（Ｂ．  Ｍ．  Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ３０，  ｐｐ．  ２１１６−２１１８，  ２００５）。加えて、Ａｓｔｒａｔｏｖ及び共同研究者らにより、大きさにおける小さい差異を有するマイクロ球体について（Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８３，  ｐｐ．  ５５０８−５５１０，  ２００４）、及び大きい差異を有するマイクロ球体について（Ｓ．  Ｐ．   Ａｓｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｏｌ．  １４，  ｐｐ．  ９４６０−９４６６，  ２００６）指摘されたように、光は、マイクロ共鳴体の大きさにおいて明確な不一致がある場合に一方のマイクロ共鳴体から隣接するマイクロ共鳴体に渡り得る。この現象は、光学的キャビティーモードの強結合に関連するものではないが、ＷＧＭスペクトルのライン形状にも影響を与え得、従ってここにおける定義に含めておく。
【００４３】
光学的接触：  ２つの光学的キャビティー又はマイクロ共鳴体は、光が一方のキャビティー又は共鳴体から他の一つに移動することができ、かつその逆が可能な場合に、“光学的接触”を有するといわれる。この意味において、光学的接触は、上記の定義における２個の共鳴体間でモード結合の可能性を許容する。従って、光学的キャビティー又はマイクロ共鳴体は、それが基材と光を交換しうる場合に、基材と光学的接触を持つ。
【００４４】
スペクトル的指紋：  スペクトル的指紋は、興味あるクラスターの組（例えば、同一の試料、基材、又は実験）の内のマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの異なるクラスターが、それらの光学的キャビティーモードスペクトルを比較することにより、互いに認識及び／又は区別され得るという意味において、特徴的なライン形状を持った光学的キャビティーモードスペクトルとして定義される。この意味において、スペクトル的指紋は、例えば、マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの所望のクラスターを同定するために互いに比較される必要があるような、関連する光学的キャビティーモードスペクトルの組の内で、例えば、モード位置、モード強度、モードのバンド幅及び／又は全体としてのライン形状等において固有な光学的キャビティーモードスペクトルとして考慮され得る。マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの所定の組が、スペクトル的指紋を示すか否かは、その励起及び／又は検出の方法に依存することに注意しなければならない。この意味において、励起及び検出は、適切な方法にて遂行される必要がある。更に、スペクトルの対比は、異なった光学的キャビティーモードスペクトルにおける相違を導き出すために適切な数学的アルゴリズム等の、適切な道具を必要とするであろう。このような数学的道具は、例えば実施例１に例示するように異なった（又は同一の）スペクトルの相関関数の計算でありうる。
【００４５】
クラスター：  クラスターは、１−、２−又は３次元的態様（図４参照）の何れかにて形成され得る任意的及び選択的な異なった幾何学及び形状のマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの集合体として定義される。個々のマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーは、それらの光学的キャビティーモードスペクトル及び／又はキャビティーモード結合の重ね合わせを促進するために、隣接するマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーが互いに接触するかあるいは密に近接するような方法の何れかにて配置される。接触するマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーは、物理的接触、即ち互いに触れ合っているか、あるいは、例えば先に定義されたように光学的接触であってよい。互いに密に隣接するマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーは、典型的にはそれらの表面から周囲に数百ナノメーター広がるそれらの減衰場の重ね合わせに十分な程度に接近するか、あるいはそれらのキャビティーモードスペクトルの選択的励起及び／又は検出に十分な程度（そのような選択的励起及び／又は検出のタイミングとは独立して）に接近するものであってよい。マイクロ共鳴体及び／又は工学的キャビティーが、例えば励起及び／又は検出当の操作の為に光ファイバー又は導波器又は他の光学的結合装置と結合される場合、それらの相互の配置（例えば、幾何及び分離について）は、異なる系から得られるスペクトルが区別可能なスペクトル、即ちスペクトル的な指紋を示すものである限り、重要ではない。次いで、そのようなスペクトル的指紋を示す“結合装置に装着されたマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティー”は、“マイクロ共鳴体のクラスター”としてみなされる。
【００４６】
代わりに、マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーのクラスターは、マイクロ共鳴体の任意の幾何及び形状の集合体、並びに／又は任意的及び選択的に異なった幾何及び形状の光学的キャビティーの集合体であり、これは、例えば光学的キャビティーモードが集合的に励起され、及び／又は集合的に検出されるように集合的に操作される。しかしながら、“集合的”なる用語は、励起及び／又は検出の時期には依存しないことを意味し、これは併行的な様式（例えば、検出器の配置又はＣＣＤカメラ等の併行的に操作される（複数チャンネル）検出器により光学的キャビティーモードスペクトルの励起輻射及び／又は検出に、クラスター全体が同時に曝されることによる）において、あるいは、所望のスペクトル範囲について、光源及び／又は検出器のいずれかで走査することにより連続的な方法において遂行され得る。これらの並行的及び連続的スキームの組合せも、より複雑な時間的序列に加えて適用可能である。この意味において、マイクロ共鳴体及び／又は光学キャビティーのクラスターは、マイクロ共鳴体の任意の幾何及び形状の集合体及び／又は任意的かつ選択的に異なった幾何及び形状の光学的キャビティーの集合体としてみることが出来、これは、適切な条件下で精査された場合に（時期及び／又は他の関連する条件に関わらず）、特徴的なスペクトル的指紋を示す。更には、クラスターを構成するマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーが、異なった光学的、物理的、化学的及び／又は生物学的機能を有してもよく、また異なった機能の異なった種類の殻を持ってもよいことに注意されたい。例えば、それらは異なった光学的機構（例えば、減衰場結合を介して、又は１種若しくは異なる種類の蛍光物質の励起による）によって励起され得る光学的キャビティーモードスペクトルの異なった種（例えば、ＦＰＭ又はＷＧＭ）を示し得る。既に上述したように、その組成とは独立して、唯一の極めて重要な基準は、クラスターが適切な条件下で精査され、分析された場合に特徴的なスペクトル的指紋を示すことである。
【００４７】
マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティー（又は得られたクラスター）は、表面に結合される（例えば図４に例示されるように）、又は例えば分析対象物について透過性の物質中に埋設される、又は液体媒質中に浮遊させて自由に動くようにすることが出来る。更に、クラスター又はそれらの構成マイクロ球体は、少なくとも一時的には、例えば液体媒質中に自由に浮遊するか、又はその分析のための物質（例えば、ポリマー、バイオポリマー、小胞、リポソーム、細胞膜、生きた細胞及び／又は組織）に浸透するように表面から離れてよい。個々のキャビティーは、上述したように各キャビティーが個別に被覆されるような方法（図４Ｃ、４Ｅ、４Ｇ）又はキャビティー（コア）が全体として被覆されるような方法（図４Ｄ、４Ｆ、４Ｈ）の何れによって被覆されてもよい。殻は、マイクロ共鳴体のコアを、互いに隔離（図４Ｃ、４Ｅ、４Ｇ）するか、及び／又は基材から隔離（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ）してもよく、あるいは直接的接触を許容（図４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ，４Ｈ）してもよい。更に、図４に示される略図の組合せも利用可能である。一般的に、マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーのクラスターは、不随意的又は秩序を持った様式で表面に配置することが出来、これによって１次、２次又は３次構造を形成する（図４、１８）。このような方法において、フォトニック結晶も形成され得る。クラスターは、例えばマイクロ操作技術及び／又はマイクロパターン形成及び／又は自己集積を用いて、随意的又は秩序を持った様式で形成され得る。更に、クラスターは、支持基材なしで懸濁物を形成してもよい。このような場合、及び上述と類似的に、クラスターを構成する個々のマイクロ共鳴体のコアは、それらの殻によって互いに分離されているか、あるいは直接に接触していてもよい。また、クラスターは、所望の物理的、化学的、生物化学的及び／又は生物機械的性質の感知を促進するために、例えば生細胞等の媒質内に、媒質中にクラスターを形成するマイクロ共鳴体の少なくとも一部が侵入して後のように、検出工程において形成されてもよい。
【００４８】
レーザー閾値：  “レーザー閾値”とも称されるマイクロ共鳴体（光学的キャビティー）の刺激放射のための閾値は、刺激放射による光増幅が、マイクロ共鳴体内を対応する光線が伝播する間に起こる損失をちょうど補うマイクロ共鳴体の光学的励起力として定義される。キャビティーモード内で伝達する光線の損失は、キャビティーモードに合致しない光線いついてよりも小さいため、キャビティーモードは、マイクロ共鳴体の全ての起こりうる光学的励起のうちで、典型的には最も低いレーザー閾値（これはそれぞれのモードの実際の損失に依存して互いに異なるものであるが）を示す。実際的には、レーザー閾値は、マイクロ共鳴体の光学的出力（例えば、特定のキャビティーモードについて）を、マイクロ共鳴体の蛍光物質（レーザー物理において“活性媒質”とも称される）を刺激するために使用する光学的励起力の関数として監視することにより決定され得る。典型的には、この依存性は、レーザー閾値がそれを上回る場合の方が下回る場合よりも（顕著に）高く、レーザー閾値はこれら２つの依存性の交点から決定され得る。“光学的マイクロ共鳴体のレーザー閾値”に関して述べる場合、典型的には観測されたスペクトル範囲内の最も低い閾値を有する光学的キャビティーモードのレーザー閾値を指している。類似的に、マイクロ共鳴体のクラスターのレーザー閾値は、所定の条件下での最も低い閾値を持ったクラスター内の光学的キャビティーモードのレーザー閾値を指す。
【００４９】
本発明は、マイクロ共鳴体のクラスターにおける光学的キャビティーモードを使用する光学的検知方法を提供する。単純化のために、発明は、例としての検知の応用において、染料−ドープ誘電性マイクロ球体により放射されるささやきの回廊（ｗｉｓｐｅｒｉｎｇ   ｇｌｌｅｒｙ）モード（ＷＧＭ）を使用して記述されるであろう。しかしながら、原則として例えば上述したファブリーペロットモード等の何れの他のタイプのキャビティーモード励起が、何れの種類のキャビティー幾何、物質、殻、及び／又は被覆と共に、キャビティーモード励起及び／又は読み取りの為の何れの好適な方法を適用して、同じ又は他の目的のために使用されてもよい。
【００５０】
ＷＧＭは、例えばそれらのレーザー特性により（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａ  ６０，  １，  ｐｐ．  ６３０−６３２，  １９９９及びＳｐｉｌｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，  ｐｐ．  ６２１−６２３，  ２００２）、光誘導のため（Ｖ．  Ｎ．  Ａｓｔｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８３，  ｐｐ．  ５５０８−５５１０，  ２００４）あるいは生物学的検知において（Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８０，  ２１，  ｐｐ．  ４０５７−４０５９，  ２００２）、光学及び光工学の多くの領域において応用が見出される。共鳴は、全内部反射（ＴＩＲ）により閉じ込められる光が、球体表面近傍を周回し、１回の完全な周回後に位相を揃えて戻る場合に生じる（図２Ｂ参照）。波長数が軌道内で一致することにより特徴付けられるＷＧＭ共鳴は、マイクロ球体表面に添加される物質に極めて敏感である。
【００５１】
ＷＧＭを使用する基本的な検出スキームは、キャビティー共鳴を変化させる大きさ、材料、屈折率又は周囲の屈折率等のマイクロ共鳴体を定義するパラメーターにおける何れかの変化である（Ｇ．  Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈｏｒｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ，  ｖｏｌ．   ２３，  ｐｐ．  ２１２−２１７，  ２００６）。特に、マイクロ共鳴体（マイクロ球体）の表面への分子の吸着は、そのＷＧＭスペクトルにおける変化を誘導することが示された（Ｆ．  Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８０，  ｐｐ．  ４０５７−４０５９，  ２００２）。この変化は、マイクロ球体の周囲の光学的性質及び吸着する分子の性質に依存して、波長の低下又は増大に向けての波長シフト（ブルー又はレッドシフト）として表れる。空気中のマイクロ球体については、簡単な描写として、マイクロ球体表面への分子の吸着はその半径の増加として解釈され、而してこの場合にはレッドシフトをもたらす（図３Ｂ）。モードは、球体赤道の周長に合致する波長数ｍにより特徴付けられる。球体の物質と同じ屈折率を有する物質が、球体の表面に最終的な吸着物層の厚さΔＲまで吸着すると仮定すれば、そのとき見出されるモードにおける波長λは、球体の周長の増大のためにΔλだけ増大する：Δλ／λ＝ΔＲ／Ｒ（図３Ｂ）であり、ここにおいてＲは物質の吸着前の球体の半径である。
【００５２】
特異的生物学的検知を確実にするため、特定のリガンド（抗原）に対する感受性を有するヌクレオチド、ペプチド配列、抗体又は他のタンパク質等のプローブ分子を、該プローブ分子の官能性及び球体のＱ−因子を保持するような方法で、球体に連結しなければならない。このことは、当業者に既知であるように、非特異的吸着部位のブロッキングにも関連する。ＷＧＭの減衰場よりも小さい厚さを有する材料の薄いフィルムは、マイクロ共鳴体のＱ−因子を顕著に変化させることはなく、従って、約１０−１００ｎｍの厚さの材料は、高いＱ−因子を保ったままマイクロ球体上に沈積され得る。ＷＧＭの減衰場は、対応するモードの波長の程度であることが文献的には一般に推定されている（Ｖｏｌｌｍｅｒ，   ２００５，  Ｂ．  Ｉ．  Ｆ．  ＦＵＴＵＲＡ，  ２０，  ｐ．  ２３９−２４４，  ２００５）。
【００５３】
実際的な観点からは、生物学的分子の検出は、共鳴体表面への生物学的分子の吸着前後における単一の単離されたマイクロ共鳴体のＷＧＭを測定することによって行われる（Ｖｏｌｌｍｅｒらにおいてはマイクロ球体）。次いで、両スペクトルの直接的比較が、異なるＷＧＭの波長シフトの強度を与え、これは共鳴体表面に吸着する生物学的分子の量に関連付けられる。先行技術の節に詳述したように、ある場合には吸着物の配向も、ＴＥ及びＴＭモードを別個に評価することにより決定され得る。典型的には、精度の向上のため、あるいは異なる結合事象の強度を同時に測定するためのいずれかにおいて、２個以上の単一マイクロ共鳴体が測定に含まれるであろう。従って、１個の、かつ同一の共鳴体についての参照測定の必要性は、特には（生物学的−）分子吸着による期待される大きさ（信号）変化が、マイクロ共鳴体の大きさ分布より想定される通りに小さいことから、その正確な位置の記録を必要とする。従って、生物学的分子吸着によるＷＧＭシフトを示す単一のマイクロ共鳴体は、吸着分子を持たないが僅かに大きい物とは区別することが出来ず、而して、位置、バンド幅及び強度に関する同じＷＧＭパラメーターを生じる。この問題は、特には２個以上の単一センサーが適用された場合に、例えばマイクロ流体装置、生細胞又は組織において分析対象物濃度の決定又は（局所的）屈折率、応力若しくは流れの測定の為に水溶液等の媒質中に浮遊するマイクロ共鳴体について、特に決定的となる。
【００５４】
これらの問題を解決する単純な方法は、単一マイクロ球体に代えて、検知の為にマイクロ球体のクラスターを使用することである。マイクロ球体のクラスターは、例えばマイクロ球体懸濁物を基材上に沈積することにより形成され得る。乾燥工程の間に、異なる球体数を有するクラスターが、表面に亘ってランダムに分布して形成される。各クラスターは、構成において内在する懸濁物中のマイクロ球体の標準偏差、および基本的に制御されない表面上の乾燥工程により導入されるランダムさの両方の為に、球体の大きさに加えて球体位置に関し、正確に同一の幾何を有した表面上の２個のクラスターを見出す確立が基本的に無視できるという意味において、固有である。クラスターの個々の構成体のＷＧＭパラメーター（例えば、モード位置、バンド幅、強度）は、クラスターの全構成体の位置により大きく影響を受ける周囲の屈折率に加えてその大きさに依存する（即ち、マイクロ球体は相互的な様式で、互いを“感知する”）ため、クラスター全体として放射されるＷＧＭスペクトルは、ほとんどランダムであり、また予測不能なＷＧＭの重ね合わせであり、而して特有の全体的ライン形状を生じる。このことは、バンド幅内の同種のキャビティーモードの重ね合わせを必要とするモード分離及び関連する量子電気力学的効果を達成することを目的とする、同じ大きさ及び制御された距離を有するマイクロ共鳴体の応用に焦点を当てた研究の主要部分である文献に記述されたクラスターの利用（先行技術の節参照）とは、鮮明に対照的である。従って、本実施態様に導入されるランダムさは、そのような研究には適さない。幾つかの研究が、光導波の目的で大きさの僅かな不一致（Ｖ．  Ｎ．  Ａｓｔｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８５，   ｐｐ．  ５５０８−５５１０，  ２００４）、及び大きい不一致（Ｖ．  Ｎ．  Ａｓｔｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ８５，  ｐｐ．   ５５０８−５５１０，  ２００４）を持ったマイクロ共鳴体の線形的鎖を使用してなされている。しかしながら、その研究においては、鎖内の球体の１個のみが蛍光、即ち光放射体として機能するものであり、鎖内に他にマイクロ球体が存在するにもかかわらず、先に検討した検知的応用についての全ての影響を伴って（即ち、スペクトル的指紋を欠いて）、基本的に単一球体のＷＧＭスペクトルが得られた。本実施態様において形成されたランダムクラスターでの光学的キャビティーモードの大きさ分布および所望の不一致にもかかわらず、偶発的モード結合を演繹的に除くことは出来ないが、しかしながらそれは実施態様の主要な側面ではない。隣接するマイクロ共鳴体間の特定の結合効果がない場合においてさえ、クラスターの個々の構成体から生じる光学的キャビティーモードの重ね合わせは、特定のライン形状を生じる。従って、光学的検知のために配列的様式で、又は流体媒体中に自由に浮遊する多くのクラスターとして調製された試料のような所定のクラスターの集合体内の、マイクロ共鳴体の各クラスターは、そのスペクトル的指紋とみなされ得る（少なくとも、興味ある集合体内で）特異的なＷＧＭスペクトルを示す。これは、異なるＷＧＭパラ���ーター（位置、バンド幅、強度等）を有するクラスターを構成する異なった大きさ及び変化する相互位置の個々のマイクロ共鳴体のＷＧＭの重ねあわせ、及びそれらの間に生じる可能性があるモード結合の両者の為である。単一の蛍光ＰＳ粒子から、及び２−４個の蛍光ＰＳ粒子のクラスターから得たＷＧＭスペクトルの例が図７に与えられる。明らかに、クラスタースペクトルは、構成粒子（マイクロ共鳴体）から生じるＷＧＭの重ね合わせのために低い対称性を示す。
【００５５】
クラスター形成のこのスキームは、コロイド状懸濁物の有限の大きさ分布のために優位点を有し、而して所望のスペクトル的指紋を得るためには極めて単純かつ直接的な方法である。しかしながら、例えばリソグラフ技術の手段等、クラスター製造のより進んだ方法を適用し、例えば異なる形状、大きさ、屈折率、被覆及び／又は蛍光物質当の異なったタイプのマイクロ共鳴体のクラスターを形成することも好ましいであろう。マイクロ共鳴体のそのような洗練された製造において、例えば高い精度を以って構造を再現できる製造技術、即ち、基準からの小さい偏差を達成しうる技術（例えば、ｅ−ビーム又はＸ線リソグラフィー）を適用した場合において、例えばそれらの光学的キャビティーモードスペクトルの分散の為に調製されるマイクロ共鳴体のある大きさ変動又は他の適当なパラメーターの有限の変動等、多分散性の原理が人工的に導入され得る。異なった形状のマイクロ共鳴体は、例えばモードの数及びタイプ、共鳴位置、及びバンド幅に関して典型的には異なったキャビティーモードスペクトルを示し、これによってクラスター内の励起可能なモードの数を減少させうる。得られる単純化されたモードスペクトルは、スペクトルの評価及び／又はそれらの保存及び処理を容易なものとし、従って全体の検知の適用を助けるであろう。
【００５６】
以下において、我々は殻を有さない誘電性マイクロキャビティーの例として、１０μｍの公称直径の染料ドープされたポリスチレンマイクロ球体を使用するアイデアの実行可能性を示す。一方において本実施態様は、光学的励起及び読み取りの為に使用されるスキーム（例えば、光ファイバー、プリズム結合器、焦点レーザービーム等の手段による近接場結合、あるいはラマン放射体、蛍光染料、半導体量子ドット、半導体量子井戸構造等の手段による内部励起）には依存せずに、共鳴体のクラスターに対して適用され得るが、内部励起スキームは、より少ない労力とより広い多様性を以って適用可能であるものと思われる（例えば、自由に移動するか、及び／又は遠隔的に操作されるクラスターの場合）。従って、内部励起スキームのひとつの例として、染料ドープされたポリマーラテックス粒子が、以下のように選択された。図８は、２個の単一マイクロ球体の典型的なＷＧＭスペクトルを示す。両方のスペクトルが、同じ特徴（ピークの数、ＴＥ及びＴＭモードの間隔、２つの連続するＴＥ又はＴＭモードの間隔）を示すことが分かる。従って、２個のマイクロ粒子を、それらのＷＧＭスペクトルによって区別することは不可能である、即ち、球体の位置の適切な記録なしでは、（生物学的−）分子の吸着前後についての同一球体に由来するスペクトルであるか、又は単に異なる球体に由来するものであるかを決定することが出来ない。しかしながら、正確な位置付けの必要性は、商業的センサーシステムの開発に対して大きな影響を与える。マイクロ球体のクラスターのＷＧＭスペクトルが、図９、１０及び１１に示される。単一球体とは対照的に、各スペクトルは、同じ個数のマイクロ球体を含む場合においても固有のライン形状を示す。従って、クラスター位置の何らの記録なしでもスペクトルは、発生するクラスターと固有に関連付け得る。
【００５７】
しかしながら、光学的検知へのマイクロ共鳴体のクラスターにおけるスペクトル的指紋の概念の応用について最も重要な点は、指紋が、例えば（生物学的−）分子によっても検知工程において全体的ライン形状を変化させることがなく、むしろその特徴のライン形状における全体的なシフトを示すことである。このような全体的なシフトが観測されるであろうことは、演繹的には推定され得ず、特にはいわゆるジェットモード（接触するマイクロ球体の線形さの接触点により規定される軸に沿っての光伝播）が、クラスターの環境条件の変化に対して、それらの周囲に対する異なった暴露の為に非結合ＷＧＭとは異なった感度を示すことを示唆しているマイクロ共鳴体の線形の鎖におけるモードの結合及び導波に関して刊行された文献から見ても推定され得ない。しかしながら、驚くべきことに本実施態様の発明者らは、クラスター表面上の極めて薄い有機フィルムの吸着においても、この吸着の主たる効果は全体としてのクラスターのスペクトル的指紋のスペクトルのシフトであることを見出した。このことは図１２及び１３に例示され、ここにおいてＰＥの薄層はクラスターに加えて個々のマイクロ共鳴体に吸着され、スペクトルが吸着の前後のそれぞれにおいて記録された（詳細については実施例１参照）。明確に分かるように、図１３に示される３個の球のクラスターのスペクトルは、単純にシフトを示し、一方で全体のライン形状が維持されている。従って、特徴的な指紋は処理の間に保持され、クラスターは感知工程の前、間及び後の何れの時点でも用意に同定され得る。
【００５８】
この方法は、検出スキームに加えて生物学的センサー配列自体の構築の両方を極めて単純化するため、光学的（生物学的−）センサーの構築の為に極めて有用である。全体の基材は、各クラスターの正確な位置を記録することなく、ＷＧＭスペクトルに関して調査され得る。クラスター表面への（生物学的−）分子の吸着後、更なるＷＧＭマッピングが基材に亘って行われうる。次いで、起こり得る波長シフトに関わらず、生物学的分子吸着の後に得たスペクトルは、単にライン形状の比較により先行して得られたスペクトルに関連付けられる。実施例１において、クラスター上に吸着される有機分子の規定量により生じる観測可能なピークシフトが、クラスター内のマイクロ球体の個数に依存せず、更には単一のマイクロ球体のシフトに似ていることが示される。その結果として、単一マイクロ球体について誘導された理論は、吸着する（生物学的−）分子の性質の特徴づけのために、クラスターについても使用され得る。この研究法の一つの興味深い拡張は、実施例１に記述されるように（自己−）相関関数の手段による（生物学的−）分子の吸着前後のスペクトルの相関である。（自己−）相関は、同一クラスターから得たスペクトルを同定するのみならず、同時に計算結果としてスペクトル間の平均ピークシフトも与える。従って、（自己−）相関関数により、あるいは他の公的な数学的（数値的）アルゴリズムにより数値的に処理されるマイクロ共鳴体のクラスターに基づく（生物学的−）センサーは、多数の（生物学的−）分子の結合事象の併行処理のための単純かつ迅速な解法を提供するものである。
【００５９】
クラスター形成及び検知の為に蛍光コロイド状球体を使用する本実施例は、その単純性のために大いに魅力的なものであるが、他の種類のマイクロ共鳴体及び特には他の種類の励起及び検出スキームが適用可能であることにも再度注意されたい。本実施例の一つの可能性ある欠点は、例えば、クラスターを構成するマイクロ共鳴体が、それらの特徴的なスペクトル的指紋の検出を許容するそれらの共通的検出を可能とするように、互いに近接した距離を以って集合させられる必要があることである。この影響は、例えば、クラスターの構成体を共通の光学的導波器又は他の種類の光学的結合装置（光ファイバー、プリズム等）に結合させることにより克服しうる。このような場合、スペクトル的指紋は、例えば興味ある波長領域にわたって、ファイバーに結合された適当な励起光源を調整し、導波器を通しての伝達を測定することにより得ることが出来る（Ａ．  Ｓｅｒｐｅｎｇｕｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２０，  ｐｐ．  ６５４ｆｆ．，  １９９５）。常に、励起波長は導波器に結合されたマイクロ共鳴体のひとつのＷＧＭに一致し、強度の低下が観察され、これはマイクロ共鳴体が互いに十分に離れて配置されていても、導波器とそれに結合されるマイクロ共鳴体の数及び種類の特定のシステムにやはり特徴的であろう。従って、該システムは、非局在化クラスターの１種と見ることが出来る。同じ種類の他のシステムとの比較は、マイクロ共鳴体の幾何、大きさ、屈折率、ドープ剤等の適当なパラメーターに関して、関与するマイクロ共鳴体のばらつきが十分に高い限り、多種のスペクトル的指紋を導くであろう。１個以上のマイクロ共鳴体の光ファイバーへの結合の利用可能性は、Ｖｏｌｌｍｅｒらにより示されている（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８５，  ｐｐ．  １９７４−１９７９，  ２００３）。この配置における例えばマイクロ共鳴体の大きさのばらつきを、例えば高度に多重化した導波器構造等において同種の他のシステムから区別するために利用する場合については、これまでに検討されたことがない。上述の例は、スペクトル的指紋を取得するための時期についても触れている。その一方で、後述の例においては、ＷＧＭスペクトルの迅速な多チャンネル検出のためにＣＣＤカメラシステムが使用され、これらのスペクトルはまた連続的走査によっても集められうる。導波器構造を使用する上述の例においては、例えば光源の走査（同調）によりそのような連続的走査が達成された（注：  十分に大きい自由なスペクトル範囲（＞スペクトロメータの解像度）を持った十分に小さいマイクロ共鳴体について、線形フォトダイオード配列又はモノクロメータ／ＣＣＤカメラシステムにより補助された並行的検出スキームが導波器結合の場合にも適用可能であり得る。そのような場合、可変調光源は稼動のための所望のスペクトル範囲全体を放射する広いバンド範囲の光源に置き換えてもよい）。連続的走査の更なる展開は、クラスターの個々の構成体からの光学的キャビティーモードスペクトルを取得すること、及びそれらを例えば物理的に代えて数値的に重ね合わせることであろう。そのような場合、先に検討したようにクラスターの局在化の必要性が不用となり得、また、クラスターはマイクロ共鳴体の集合体から任意的に適した選択をされるものとして規定されえる。
【００６０】
本実施態様の他の側面は、所定のクラスター内の個々のマイクロ共鳴体の読み取りに関連する。実施例３−５は、レーザー閾値を越えてのクラスター又はクラスターの個々の構成体の稼動が、光学的検知測定における感度およびシグナル−ノイズ比を如何に顕著に改善するかを示すのみならず、更にはクラスター内の個々のマイクロ共鳴体の研究を可能としていることも示す。更に、実施例５に示すように、マイクロ共鳴体のクラスター内の１種類を超える蛍光物質の適用は、クラスター内の個々のマイクロ共鳴体を特定する目的で使用され得る。検知的な応用に加えて、両方のスキームは、大きい集合体から個々の粒子、即ちマイクロ共鳴体を特定するための興味ある機会を提供する。ある粒子は、最初にその属するクラスターのスペクトル的指紋により指定され、次いで第２の工程において、クラスター内の構成体の個数が典型的には小さいという事実によって、そのクラスター内の単一粒子のキャビティーモードスペクトルによって指定される。更なる詳細については、後述の実施例が参照される。
【００６１】
材料
本実施態様のマイクロ共鳴体のクラスターは、一般に入手可能な材料を使用することにより製造され得る。以下の材料の説明は、当業者に本明細書の記述に従ってクラスターの構築を可能とするために提供される。
【００６２】
キャビティー物質：  キャビティーの製造のために選択される物質は、該キャビティーが稼動される電磁気的スペクトルの部分において低い吸収を示すものである。実際的には、これはキャビティーモードの励起のために選択される蛍光物質の放射スペクトルの領域である。含有され（クラスターを構成する）マイクロ共鳴体の異なるキャビティーは、異なる物質から調製されてよく、また、例えば選択的励起を許容すべく異なる蛍光物質がドープされてもよい。また、キャビティーは、異種的物質から成っていてもよい。一つの態様において、キャビティーはＩｎＧａＰ／ＩｎＧａＡｌＰ量子井戸構造等の半導体量子井戸構造から調製され、これは、キャビティー物質として、及び適当な放射により励起される場合の蛍光物質として同時に使用され得る。約３以上の半導体量子井戸構造の典型的に高い屈折率は、対応する真空中波長に比べて半導体内での波長低下のために、更にキャビティーの小型化を可能とする。一般的に、キャビティーの小型化を促すために、高い屈折率のキャビティー物質を選択することは有利である。キャビティー物質としてフォトニック結晶を選択し、該結晶の外部表面を蛍光物質により被覆するか、あるいは該結晶中に均質的又は不均一的様式で蛍光物質を埋設することもできる。フォトニック結晶は、励起可能なキャビティーモードの数を制限し、許容されるモードの総数を制限し、また許容されるモードの偏光を規定することが出来る。フォトニック結晶の全体にわたる蛍光物質の分布の性質は、所望のモードのみの励起を促し、一方で望まないモードを不適当な光学的励起により抑制することが出来る。
【００６３】
ある周波数範囲の光の伝播を許容しない、いわゆるフォトニック結晶の“バンドギャップ”を持つ２又は３次元非金属の周期的構造からなるフォトニック結晶の例は、Ｅ．Ｙａｂｌｏｎｏｖｉｔｃｈにより示されている（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，   Ｄｅｃ．  ｉｓｓｕｅ，  ｐｐ．  ４７−５５，  ２００１）。光は、周期的非金属構造において分布するブラッグ回折により伝播を妨げられ、これは異なって散乱される光子の破壊的干渉を招く。例えば、全体の周期構造中の一つの失われた散乱中心等の点欠陥により、フォトニック結晶の周期性が損なわれた場合には、ドープされた半導体のバンドギャップ内で起こる局在化した電子的エネルギーレベルのものと同様な、バンドギャップ内の空間的に閉じ込められた許容される光学的モードが起こりうる。
【００６４】
本実施態様において、示される光学的キャビティーは球体形状を有する。そのような球体形状は極めて有用なものであるが、基本的にはキャビティーは、関連技術に示されるようにキャビティーモードを維持することが出来る限り、偏球形状、円柱又は多角形形状等、何れの形状を有してもよい。形状は、キャビティー体積内の単一又は計数可能な平面中にモードの励起を制限する。
【００６５】
蛍光物質：  任意的に、クラスターの形成に使用されるマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーは、光学的キャビティーモードスペクトルの励起を促進するために、１種以上の蛍光物質がドープされてもよい。以下において、適当な蛍光物質の例が与えられる。蛍光物質として、励起波長λｅｘｃの光を吸収し、続いて輻射波長λｅｍ≠λｅｘｃの光を再放射する物質の何れかのタイプのものが使用され得る。これによって、放射波長範囲の少なくとも一部は、その励起に蛍光物質が使用されるキャビティーのモードスペクトル内に位置しなければならない。実際的には、蛍光染料、半導体量子ドット、半導体量子井戸構造、カーボンナノチューブ（Ｊ．  Ｃｒｏｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １２９，  ｐｐ．  ８０５８−９，  ２００７）、ラマン放射体等が使用され得る。ラマン放射体は、吸収した光子エネルギーを部分的に内部振動モードの励起に使用し、励起光よりも大きい波長の光を再放射する物質である。振動が既に励起されている場合、放射される光は入射励起光よりも小さい波長を持ち得、これによって振動を消滅させる（反ストローク放射）。いずれの場合においても、励起波長を適切に選択することにより、多くの非金属物質がラマン放射を示し得、上述したキャビティー物質は、特定の蛍光物質を添加しなくともラマン放射に使用され得る。本実施態様において使用され得る蛍光染料の例が、それぞれのピーク放射波長（単位：ｎｍ）と共に示される：  ＰＴＰ  （３４３）、ＤＭＱ  （３６０）、ブチル−ＰＢＤ  （３６３）、ＲＤＣ  ３６０  （３６０）、ＲＤＣ  ３６０−ＮＥＵ  （３５５）、ＲＤＣ  ３７０  （３７０）、ＲＤＣ  ３７６  （３７６）、ＲＤＣ  ３８８  （３８８）、ＲＤＣ  ３８９  （３８９）、ＲＤＣ  ３９０  （３９０）、ＱＵＩ  （３９０）、ＢＢＤ  （３７８）、ＰＢＢＯ  （３９０）、スチルベン  （Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）  ３  （４２８）、クマリン  ２  （４５１）、クマリン  １０２  （４８０）、ＲＤＣ  ４８０  （４８０／４７０）、クマリン  ３０７  （５００）、クマリン  ３３４  （５２８）、クマリン  １５３  （５４４）、ＲＤＣ  ５５０  （５５０）、ローダミン  ６Ｇ  （５８０）、ローダミン  Ｂ  （５０３／６１０）、ローダミン  １０１  （６２０）、ＤＣＭ  （６５５／６４０）、ＲＤＣ  ６５０  （６６５）、ピリジン  １  （７１２／６９５）、ピリジン  ２  （７４０／７２０）、ローダミン  ８００  （８１０／７９８）、及びスチリル  ９  （８５０／８３０）。
【００６６】
しかしながら、銀の殻により被覆されていないマイクロ共鳴体又はそれらのクラスターについては、ＵＶ−ＮＩＲ領域で稼動する他の染料が使用され得る。そのような蛍光染料の例が示される： ＤＭＱ、ＱＵＩ、ＴＢＳ、ＤＭＴ、ｐ−ターフェニル、ＴＭＱ、ＢＰＢＤ−３６５、ＰＢＤ、ＰＰＯ、ｐ−クォーターフェニル、エクサライト  （Ｅｘａｌｉｔｅ）  ３７７Ｅ、エクサライト  ３９２Ｅ、エクサライト  ４００Ｅ、エクサライト  ３４８、エクサライト  ３５１、エクサライト  ３６０、エクサライト  ３７６、エクサライト  ３８４、エクサライト  ３８９、エクサライト  ３９２Ａ、エクサライト  ３９８、 エクサライト  ４０４、エクサライト  ４１１、エクサライト  ４１６、エクサライト  ４１７、エクサライト  ４２８、ＢＢＯ、ＬＤ  ３９０、α−ＮＰＯ、ＰＢＢＯ、ＤＰＳ、ＰＯＰＯＰ、ビス−ＭＳＢ、スチルベン  ４２０、ＬＤ  ４２３、ＬＤ  ４２５、カルボスチリル  １６５、クマリン  ４４０、クマリン  ４４５、クマリン  ４５０、クマリン  ４５６、クマリン  ４６０、クマリン  ４６１、ＬＤ  ４６６、ＬＤ  ４７３、クマリン  ４７８、クマリン  ４８０、クマリン  ４８１、クマリン  ４８５、クマリン  ４８７、ＬＤ  ４８９、クマリン  ４９０、ＬＤ  ４９０、クマリン  ４９８、クマリン  ５００、クマリン  ５０３、クマリン  ５０４  （クマリン  ３１４）、クマリン  ５０４Ｔ  （クマリン  ３１４Ｔ）、クマリン  ５１０、クマリン  ５１５、クマリン  ５１９、クマリン   ５２１、クマリン  ５２１Ｔ、クマリン  ５２２Ｂ、クマリン  ５２３、クマリン  ５２５、クマリン  ５３５、クマリン  ５４０、 クマリン  ５４０Ａ、クマリン  ５４５、ピロロメテン  ５４６、ピロロメテン  ５５６、ピロロメテン  ５６７、ピロロメテン  ５６７Ａ、ピロロメテン  ５８０、ピロロメテン  ５９７、ピロロメテン  ５９７−８Ｃ９、ピロロメテン  ６０５、ピロロメテン  ６５０、フルオレセイン  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）  ５４８、二ナトリウムフルオレセイン、フルオロール  （Ｆｌｕｏｒｏｌ）  ５５５、ローダミン  ３Ｂ パークロレート、ローダミン  ５６０  クロライド、ローダミン ５６０  パークロレート、ローダミン  ５７５、ローダミン  １９  パークロレート、ローダミン  ５９０  クロライド、ローダミン  ５９０  テトラフルオロボレート、ローダミン  ５９０  パークロレート、ローダミン  ６１０  クロライド、ローダミン  ６１０   テトラフルオロボレート、ローダミン  ６１０  パークロレート、キトンレッド  （Ｋｉｔｏｎ  Ｒｅｄ）  ６２０、ローダミン  ６４０  パークロレート、スルホローダミン  ６４０、ＤＯＤＣ  アイオダイド、ＤＣＭ、ＤＣＭ  スペシャル、ＬＤ  ６８８、ＬＤＳ  ６９８、ＬＤＳ  ７２０、ＬＤＳ  ７２２、ＬＤＳ  ７３０、ＬＤＳ  ７５０、ＬＤＳ  ７５１、ＬＤＳ  ７５９、ＬＤＳ  ７６５、ＬＤＳ  ７９８、ＬＤＳ  ８２１、ＬＤＳ  ８６７、スチリル  １５、ＬＤＳ  ９２５、ＬＤＳ  ９５０、フェノキサゾン  （Ｐｈｅｎｏｘａｚｏｎｅ）  ６６０、クレシルバイオレット  （Ｃｒｅｓｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔ）  ６７０  パークロレート、ナイルブルー  （Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ）  ６９０ パークロレート、ナイルレッド  （Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ）、ＬＤ  ６９０  パークロレート、ＬＤ  ７００  パークロレート、オキサジン  （Ｏｘａｚｉｎｅ）  ７２０ パークロレート、オキサジン  ７２５  パークロレート、ＨＩＤＣ  アイオダイド、オキサジン  ７５０  パークロレート、ＬＤ  ８００、ＤＯＴＣ  アイオダイド、ＤＯＴＣ  パークロレート、ＨＩＴＣ  パークロレート、ＨＩＴＣ  アイオダイド、ＤＴＴＣ  アイオダイド、ＩＲ−１４４、ＩＲ−１２５、ＩＲ−１４３、ＩＲ−１４０、ＩＲ−２６、ＤＮＴＰＣ  パークロレート、ＤＮＤＴＰＣ  パークロレート、ＤＮＸＴＰＣ  パークロレート、ＤＭＯＴＣ、ＰＴＰ、ブチル−ＰＢＤ、エクサライト  ３９８、ＲＤＣ  ３８７、ＢｉＢｕＱ  スチルベン３、クマリン  １２０、クマリン  ４７、クマリン  １０２、クマリン  ３０７、クマリン  １５２、クマリン  １５３、フルオレセイン  ２７、ローダミン  ６Ｇ、ローダミン  Ｂ、スルホローダミン  Ｂ、ＤＣＭ／ピリジン  １、ＲＤＣ  ６５０、ピリジン  １、ピリジン  ２、スチリル  ７、スチリル  ８、スチリル  ９、アレクサフルオル  （Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）  ３５０  染料、アレクサフルオル  ４０５  染料、アレクサフルオル  ４３０  染料、アレクサフルオル  ４８８  染料、アレクサフルオル  ５００及びアレクサフルオル ５１４  染料、アレクサフルオル  ５３２  染料、アレクサフルオル  ５４６  染料、アレクサフルオル  ５５５ 染料、アレクサフルオル  ５６８ 染料、アレクサフルオル  ５９４  染料、アレクサフルオル  ６１０  染料、アレクサフルオル  ６３３  染料、アレクサフルオル  ６４７  染料、アレクサフルオル  ６６０  染料、アレクサフルオル  ６８０  染料、アレクサフルオル  ７００  染料、及びアレクサフルオル  ７５０  染料。
【００６７】
ほとんどのレーザー染料等の水不溶性染料は、マイクロ共鳴体に取り入れるために特に有用であり、一方でインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から入手可能な染料等の水溶性染料は、それらの環境又は外部表面を染色するために特に有用である。
【００６８】
マイクロ共鳴体にドープするための蛍光物質として使用され得る半導体量子ドットは、Ｗｏｇｇｏｎ及び共同研究者らにより記述されている（Ｍ．  Ｖ．  Ａｒｔｅｍｙｅｖ  ＆   Ｕ．  Ｗｏｇｇｏｎ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７６，  ｐｐ．  １３５３−１３５５，  ２０００  ；  Ｍ．  Ｖ．  Ａｒｔｅｍｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １，  ｐｐ．  ３０９−３１４，  ２００１）。それによって、量子ドット（例えばＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ）は、染料分子の蛍光放射がマイクロ共鳴体のキャビティーモードの流入のために使用し得ることを示したＫｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ及び共同研究者（Ｍ．  Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｖｏｌ．  ３１，   ｐｐ．  Ｌ９９−Ｌ１０１，  １９９２）によって記述されるのと同様な方法にて本実施態様に適用され得る。染料分子に対する量子ドットの主たる優位点は、退色等の減成に対して安定性がより高いことである。同様な議論が、例えばＩｎＧａＰ／ＩｎＧａＡｌＰから生成される構造等の半導体量子井戸構造にも当てはまり、これは退色に対して高い安定性を示し、また蛍光物質として使用できるのみならず、キャビティー物質としても使用できる。
【００６９】
蛍光物質の励起波長λｅｘｃは、所定のエネルギーを有する２個以上の光子が物質に吸収され、２倍以上のエネルギーの光子が放射される多光子工程が想定できるため、その放射波長λｅｍより小さい、即ちλｅｘｃ＜λｅｍである必要はない。又、上述したように、ラマン非ストローク工程が同様な目的で使用され得るであろう。
【００７０】
一般的に、蛍光物質は、キャビティー物質中に組み込まれ得るか、あるいは表面に吸着される。分布は、励起されるキャビティーモードのタイプを選択するために利用可能である。例えば、蛍光物質がコア表面近傍に濃縮される場合、ささやきの回廊モードがファブリーペロットモードよりも励起されやすい。蛍光物質がキャビティーの中心に濃縮される場合には、ファブリーペロットモードがより励起されやすい。不均一的分布の他の例は、蛍光物質が秩序を持った様式で分布されるもの、即ち蛍光物質の高い濃度を持った体積の規則的な２次元又は３次元的パターンの視点での規則性を持つものである。そのような場合、回折効果が起こりえて、それは、例えば分配回帰染料レーザーに見出されるのと同様に、キャビティーを異なった方向、偏光及び／又はモードにおいて励起させる。
【００７１】
殻：  キャビティー及び／又はマイクロ共鳴体のクラスターは、均質的又は不均一な（例えば穴あき）及び／又は均質的又は不均一な組成を有してよい殻に埋設され得る。蛍光物質によるキャビティー内部励起の場合には、殻は、選択された蛍光物質の励起波長λｅｘｃについて十分な透過性を示す任意の物質（金属、誘電性物質、半導体）からなってよい。また、殻は、例えばマイクロ共鳴体及び／又はマイクロ共鳴体のクラスターの表面を、所望の部位及び／又は領域のみ透明にするため、あるいは他の例をあげれば物質選択的な（生物学的−）官能化を容易にするため、所望の性質を有する異なった物質からなってもよい。半導体の場合は、殻は、励起波長が考慮される半導体のバンドギャップに対応する波長よりも高い場合には透明となる。金属については、例えば、典型的にはそれを超えると金属の伝導電子が電磁輻射の吸収にもはや寄与しない、金属のプラズマ振動数の優位点を取ることにより高い透明性が達成され得る。有用な金属に内には、アルミニウム、銀、金、チタン、クロム、コバルト等の遷移金属がある。殻は、例えば蒸着又はスパッタリングにより作成されるように連続的であるか、あるいはしばしばコロイド金属粒子の沈着と引続く非電気的メッキにより達成されるように連続的（あるいは穴あき）であってよい（Ｂｒａｕｎ  ＆  Ｎａｔａｎ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １４，  ｐｐ．  ７２６−７２８，  １９９８  ；  Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １３，  ｐｐ．  １２５３−１２５６，  ２００１  ；  Ｋａｌｔｅｎｐｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １５，  ｐｐ．  １１１３−１１１８，  ２００３）。殻が光の閉じ込めに使用される場合（例えばＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５９４４３参照）、殻の厚さは数ナノメーターから数百ナノメーターまで変化され得る。この目的についての唯一の厳密な要求は、殻の反射率が、Ｑ＞１の値を持つＱ−因子を可能とする所望のスペクトル範囲において十分に高いことである。球体キャビティーにおけるＦＰＭについては、Ｑ−因子は殻の反射率から（又はその逆も可）次式により計算され得る
【００７２】
【数４】
2011508868.tif 000006
ここにおいて、Ｒｓｈは、殻の反射率であり、λｍは、キャビティーモードｍの波長である。
【００７３】
生物学的官能性被覆：  マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーのクラスターは、（生物学的−）力学及び／又は（生物学的−）化学機能を容易にする（生物学的−）官能性被覆により被覆されてもよい。例えば、それらは所望の細胞応答を開始させる為、あるいは生物学的力学及び／又は生化学的検知を容易にする為に、特異的分析対象物を以って官能化されてもよい。また、クラスター内の個々のマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーが、（生物学的−）官能性被覆により被覆されてもよい。このような場合、それらは、例えば異なる分析対象物を検出する為、または参照若しくは対照を与える為に、異なる被覆を有してもよい。簡略にするために、被覆されたマイクロ共鳴体（光学的キャビティー）及び／又はマイクロ共鳴体（光学的キャビティー）のクラスターを、以下において“センサー”と称する。
【００７４】
該センサーに特異的分析対象物についての選択性を持たせるために、タンパク質、ペプチド及び核酸等の分析対象物を（好ましくは可逆的に）結合することが出来る結合剤により、センサー表面を被覆することが好ましい。結合剤を付ける方法は、ポリマー、無機物質（例えばシリカ、ガラス、チタン）及び金属表面等の種々の表面について当業者には周知であり、また本実施態様のセンサー表面を誘導するために同様に好適である。例えば、遷移金属被覆（例えば、金、銀、銅及び／又はそれらの合金及び／又は組成物）の場合、本実施態様のセンサーは、チオール化学を使用することにより科学的に修飾され得る。例えば金属被覆された非金属コアは、センサー表面をアミノ基にて修飾するために、アミノエタンチオール等のアミノ基を有するチオール分子の溶液に懸濁され得る。次いで、ｐＨ７−９の緩衝溶液に懸濁されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより修飾されたビオチンが、ＥＤＣにより活性化され、あらかじめアミノ基により修飾されたセンサー懸濁物に添加される。結果として、アミド結合が形成されて、金属被覆された非金属コアがビオチンにより修飾される。次いで、４つの結合部位を含むアビジンまたはストレプトアビジンが、ビオチンに結合され得る。次いで、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたは他の任意のリガンド等の任意のビオチン−誘導生物学的分子が、アビジン−修飾金属被覆非金属コアの表面に結合され得る。
【００７５】
別法として、アミノ−末端化表面は、水性グルタルジアルデヒド溶液と反応させてもよい。センサー懸濁物を水にて洗浄後、タンパク質またはペプチドの水溶液に曝し、それらのアミノ基を介しての生物学的分子の共有的結合を促す（Ｒ．  Ｄａｈｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９４，  Ｖｏｌ．  ６６，  ｐｐ．  ２８８８−２８９２）。センサーが、最初に例えばメルカプトウンデカン酸のエタノール性溶液に曝すことによりカルボキシ末端化された場合には、末端官能基はＥＤＣ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドの水溶液を用いて活性化され得る。最終的に、タンパク質またはペプチドは、水溶液からそれらのアミノ基を介して活性化表面に共有的に結合される（Ｈｅｒｒｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３，  Ｖｏｌ．  １９，  ｐｐ．  １８８０−１８８７）。
【００７６】
同様な様式において、非金属センサーも特異的に官能化され得る。例えば、ＰＰＳ、ＰＡＡ及びＰＡＨ等のＰＥは、文献に記載されるように使用され得て（Ｇ．  Ｄｅｃｈｅｒ，   Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．  ２７７，  ｐｐ．  １２３２ｆｆ．，  １９９７  ；   Ｍ．  Ｌｏｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｖｏｌ．  ３１，  ｐｐ．  ８８９３ｆｆ．，  １９９８）、アミノ（ＰＡＨ）またはカルボキシル（ＰＡＡ）基等の化学的官能性の高い密度を有するセンサー表面を達成する（この技術は、金属被覆センサーにも適用可能である）。次いで、例えば上述した方法と同じ結合化学がＰＥ被覆センサーに適用され得る。別法として、また金属表面の官能化について上述したチオール化学との類似において、アミノ−、メルカプト−、ヒドロキシ−、又はカルボキシ−末端化シロキサン、リン酸、アミン、カルボン酸又はヒドロキサム酸等の適当な種の結合剤が、センサー表面の化学的官能化のために使用され得て、これに基づいて、次いで生物学的分子の結合が、上述の例に記述したように達成され得る。適当な表面化学が、文献に見出され得る（例えば、Ａ．  Ｕｌｍａｎ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  Ｖｏｌ．  ９６，  ｐｐ．  １５３３−１５５４，  １９９６参照）。
【００７７】
表面及び粒子における生物学的特異的相互作用の制御及び同定についての一般的問題は、非特異的吸着である。この障害を抑える一般的技術は、非特異的吸着部位をブロックするために、官能化表面を他の強く付着する生物学的分子（例えばＢＳＡ）に曝すことに基づく。しかしながら、この方法の効率は、研究対象の生物学的システムに依存し、また交換プロセスが、解離及び表面結合分子種間で起こり得る。更には、非特異的吸着した生物学的分子の除去には多くの洗浄工程が要求され、而して低い親和性による特異的結合事象の同定を阻害する。
【００７８】
この問題の解決法は、ポリ−（ＰＥＧ）及びオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）の被覆のような、結合剤の不活性物質への組込みである。生物学的特異的認識要素をＯＥＧ−末端化被覆に組み込むための最も一般的技術は、タンパク質抵抗性ＥＧ分子及び結合剤の結合に好適な（又は結合剤自体を含む）第２の官能化分子種からなる２元溶液からの共吸着に基づく。別法として、結合剤の表面−移植化末端−官能化ＰＥＧ分子への直接結合も報告されている。最近に、ＣＯＯＨ−官能化ポリ（エチレングリコール）アルカンチオールが合成され、これは金表面に密充填単一層を形成する。生物学的特異性レセプターの共有的結合の後、被覆は効果的に非特異的相互作用を抑制し、一方で高い特異的認識を示す（Ｈｅｒｒｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３，  Ｖｏｌ．  １９，  ｐｐ．  １８８０−１８８７）。
【００７９】
表面に不動化された結合物は、抗体等のタンパク質、（オリゴ−）ペプチド、オリゴヌクレオチド及び／又はＤＮＡ切片（例えば、一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を含み得る遺伝子の特定の配列範囲である特異的標的オリゴヌクレオチド及び／又はＤＮＡにハイブリダイズする）あるいは炭水化物であってよい。非特異的相互作用を低減するために、結合物は好ましくは不活性担体材料中に組み込まれるであろう。
【００８０】
位置制御機能：  本実施態様のセンサーは、リモートセンサーとして使用してもよく、従って、例えば封止セルとのそれらの接触及び／又は相互作用を制御するために、それらの位置及び／又は移動の外的手段による制御が必要とされ得る。そのような制御は、異なった手段により行われてよい。例えば、磁気的及び電磁気的力が付与されたセンサーが、直接センサーとして適用されてよい（Ｃ．  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．   Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ９０，  ｐｐ．  １８４１０９／１−３，  ２００７）。例えば、鉄化合物等の磁気的物質を含む常磁性及び強常磁性ポリマーラテックス粒子が、異なる供給者から商業的に入手可能である（例えば、ＤｙｎａＢｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．又はＢｉｏＭａｇ／ＰｒｏＭａｇマイクロ球体、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）。磁気的物質が、典型的にはポリスチレンからなるポリマー性担体物質中に埋設されていることから、このような粒子は、下記の実施例に記述される非磁気的ＰＳビーズとしての光学的キャビティーモードセンサーと同様又は類似した方法にて使用されてよい。別法として、あるいは付加的には、磁気的物質／機能は、マイクロ共鳴体の殻及び／又はそれらの（生物学的−）官能性被覆に負わせてもよく、あるいはマイクロ共鳴体のクラスターに付加される（別個の）磁気的粒子を介して導入されてもよい。
【００８１】
更に、位置制御は、光学的ピンセットの手段により行われてもよい（Ｊ．  Ｒ．  Ｍｏｆｆｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ７７，   ｐｐ．  ２０５−２２８，  ２００８）。そのような場合において、光学的ピンセットのレーザー波長は、センサーを稼動するために使用される蛍光物質の励起及び／又は放射波長範囲に一致するか、又はしないように選択されてよい。例えば、蛍光物質（の一つ）の（選択的）励起用でもある光学的ピンセットの稼動波長を使用することが好ましいであろう。磁気的ピンセットに対する光学的ピンセットの一つの優位点は、多くの異なるセンサーが、同時に個別的に制御され得ることである（Ｃ．  Ｍｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｉｎｓｔｒ．  Ｖｏｌ．  ７１，  ｐｐ．  ２１９６−２２００，  ２０００）。
【００８２】
他のスキームにおいて、センサーの位置及び／又は動きは、音波（Ｍ．  Ｋ．  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ．  ６１８−６２５，  ２００７）、（２次元）電気泳動（Ｓ．  Ｓ．  Ｄｕｋｈｉｎ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｖ．  Ｄｅｒｊａｇｕｉｎ，  “Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７４  ；   Ｈ．  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｇｒｅｅｎ，  “ＡＣ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ：  ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔｕｄｉｅｓ   Ｐｒｅｓｓ，  Ｂａｌｄｏｃｋ，  ２００３  ；   Ｈ．  Ａ．  Ｐｏｈｌ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｖｏｌ．  ２２，  ｐｐ．  ８６９−６７１，  １９５１）、電気的湿潤法（Ｙ．  Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｃｈｏ，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  Ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ．  １３７−１４４，  ２００６）によって、並びに／又は所望の大きさ及び／若しくは機能の粒子及び／若しくは細胞の並べ替え／取り出しが可能であるようなマイクロ流体装置によって制御されてもよい（Ｓ．  Ｈａｒｄｔ，  Ｆ．  Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，  ｅｄｓ．，  “Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，  ２００７）。
【００８３】
また、例えば圧力差の適用によって粒子を固定及び放出可能なマイクロキャピラリーを使用することにより、センサーの位置制御のために機械的ピンセットも使用されえる（Ｍ．   Ｈｅｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．  １１８，  ｐｐ．   １７８９−１７９７，  ２００５）。この方法の利点は、例えば細胞検知実験において、センサー及び細胞が、同じ装置を用いて操作され得ることである（Ｍ．  Ｈｅｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．参照）。上述した２種以上のスキームの組合せも、センサー及び／又は細胞の位置制御のために好適であろう。
【００８４】
励起光源：  マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーのクラスターは、減衰場結合の方法又は蛍光物質の手段等の異なった方法にて励起されてよい。これらの方法は、単一マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーにおける光学的キャビティーモードの励起に関する文献中に、膨大に提供され、又検討されており（Ａ．  Ｎ．  Ｏｒａｅｖｓｋｙ，   Ｑｕａｎｔ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．  Ｖｏｌ．  ３２，  ３７７−４００，  ２００２  ；   Ｋ．  Ｊ．  Ｖａｈａｌａ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，  ｐｐ．  ８３９−８４６，  ２００３  ；  Ａ．  Ｂ．  Ｍａｔｓｋｏ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｓ．  Ｉｌｃｈｅｎｋｏ，  ＩＥＥＥ  Ｊ．  Ｓｅｌ．  Ｔｏｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．  Ｖｏｌ．  １２，  １，  ｐｐ．  ３−１４，  ２００６  ；  Ｍ．  Ｋｕｗａｔａ−Ｇｏｎｏｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．，  Ｖｏｌ．  ３１，  ｐｐ．   Ｌ９９−Ｌ１０１，  １９９２  ；  Ｆ．  Ｖｏｌｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．  Ｖｏｌ．  ５，  ５９１ｆｆ．，  ２００８  ；  Ａ．   Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｂ  Ｖｏｌ．  ９０，  ｐｐ．  ５６１−５６７，  ２００８）、当業者によって直接的な様式でクラスターの操作に拡張され得る。減衰場結合の場合には、光源は、クラスターを構成するマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの操作の所望のスペクトル範囲内で、適切な放射（例えば、適切なバンド幅、強度及び／又は視準を有する）を出すように選択され得る。蛍光物質の使用の場合には、光源は、その放射が蛍光物質の励起周波数範囲ωｅｘｃに該当するように選択されねばならない。一般的に、放射出力は、マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの励起の過程で起こりうる損失（放射損失、減衰、吸収、散乱）を過剰に補うものでなければならない。実際的には、タングステン又は水銀ランプ等の熱的光源が適用されてよい。より狭い放射プロフィールを有するレーザー又は高出力発光ダイオードは、試料及び環境の加熱を最小化するために好適に適用されるであろう。同様に調整可能な光源は、例えば異なる蛍光物質の使用及び／又は減衰場結合により異なるマイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーの順次励起のために、興味あるものでありうる。このような場合、光学的キャビティーモードの分離を可能とするに十分に狭いバンド幅を持った調整可能な光源の適用が、好ましい。幾つかの蛍光物質が、例えば非重複的励起周波数範囲等、適切な選択を以って使用される場合、単一光源より多くの光源が、例えば読み取り工程を更に容易にするため、又は参照測定のため等、マイクロ共鳴体の個々のクラスター及び／又はクラスター内の個々のマイクロ共鳴体を選択的に指定するように選択されてよい（実施例５参照）。光源は、マイクロ共鳴体の適切な励起を目的とし、一方で好ましからぬ副次効果を低減する（例えば、励起波長範囲選択、放射的過熱の抑制及び／又は放射誘導損傷のため）適切なフィルター及び／又は他の波長選択装置（例えば、ビーム分離器、伝搬性素子、有効口径）を備えてよい。更に、少なくとも１つの光源の励起出力は、使用されるクラスター内のマイクロ共鳴体の少なくとも��とつ、及び／又はマイクロ共鳴体のクラスターの少なくともひとつが、少なくとも一時的に、励起される光学的キャビティーモードの少なくともひとつのレーザー閾値を越えて稼動されるように選択され得る。
【００８５】
蛍光輻射の検出：  マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティーのクラスターからの光学的キャビティーモードスペクトルの検出の為に、当業者に知られている任意の集光光学系が適用され得る。例えば、マイクロ共鳴体及び／又は光学的キャビティー又はそれらのクラスターからの放射は、光ファイバー、導波構造、集積光学装置、近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）、又はそれらの任意の適切な組合せによる、適切な値の有効口径の顕微鏡対物レンズ及び／又は他の種類の適切な遠隔場光学系にて集められ得る。特に、集光系は、シグナルの遠隔場及び／又は近接場集光を使用してもよい。集光は、全体のクラスターから同時的に、又は例えば、クラスターの部分集合あるいはクラスターの個々の構成体から１個毎に連続的な様式で行われうる。後者の場合、異なるシグナルは、スペクトル的指紋を得るために（例えば、電子的又は数値的に、かつ測定の分析又は評価の段階において）、重ね合わされてよい。集めた光は、併行的（複数チャンネル）又は順次取得モード（単一チャンネル）にて稼動される任意の適切なスペクトル分析装置により分析され得る。例えば、共焦点蛍光顕微鏡が、レーザー光による蛍光励起を高い数値の有効口径を持った蛍光放射の集光と結合させ、引続いて蛍光放射のフィルター透過及びスペクトル分析がなされる。このような装置は細胞研究においてしばしば使用されるため、それらは本実施態様の手段のための好都合な道具を提供しえる。その他の好都合な装置は、例えばラマン顕微鏡であり、これもレーザー励起及び顕微鏡的光源からの光シグナルの高値有効口径を、スペクトル分析に組み合わせる。更には、両方の装置は、スペクトル分析とイメージ処理を同時的に可能とし、これは個々のマイクロ共鳴体及び／又はマイクロ共鳴体のクラスターの追跡を、それらの光学的応答を追跡しつつ促進する。そのようなイメージ情報が要求されない場合は、モノクロメータ、（小型）スペクトル分析機、蛍光プレート読取装置等の他のスペクトル分析装置が適用されてよい。
【００８６】
実施態様１：  分子検出のためのマイクロ共鳴体の単一クラスターに基づく光学的センサー
上記に定義された意味におけるマイクロ共鳴体のクラスターからなる光学的センサーを、図５に例示されるようにマイクロ流体フローセル中に配置する。マイクロ共鳴体の個数は、クラスターを形成するために２個を超えるか等しい必要がある。マイクロ共鳴体は、特定の（生物学的−）分子との特異的相互作用を促すために、官能化され得る。検知の為に、以下の検出スキームが遂行されなければならない。
１．プローブ分子の導入及びクラスター表面の非特異的結合部位の可能的不動態化後であるが、所望の標的分子への何れの暴露に先行する、フローセル中のマイクロ共鳴体のクラスターのＷＧＭスペクトル測定。
２．所望の標的分子を含む分析対象物に対するクラスターの暴露。
３．標的分子への暴露後のクラスターのＷＧＭスペクトルの測定。
４．（生物学的−）分子の吸着前後の両者のＷＧＭスペクトルの直接的比較により、ＷＧＭ波長シフトの強度が決定され、次いで溶液中の標的分子の存在に関連付けられる。データの分析は、実施例１に詳細が述べられるように、生物学的分子の吸着前後に測定される２つのＷＧＭスペクトルの自己相関によりなされ得る。
【００８７】
実施態様２：  分子検出のためのマイクロ共鳴体のクラスター配列に基づく光学的センサー
マイクロ共鳴体が複数のクラスターを形成するように配置されたマイクロ共鳴体のクラスターの配列からなる光学的センサーが、マイクロ流体フローセル中に配置される。マイクロ共鳴体は、基体上に不随意的に沈積される（図１８Ａ）か、又は整列した様式である（図１８Ｂ）か、あるいはマイクロ流体フローセル中に自由に浮遊しうる（図１９）。各クラスター中のマイクロ共鳴体の個数は、２個を超えるか等しい必要がある。マイクロ共鳴体は、（生物学的−）分子の特異的結合を確実にするために、（生物−）化学的に修飾され得る。異なるクラスターは、（例えば、材料の組成及び形状について）互いに独立している。異なるマイクロ共鳴体及び／又はクラスターは、例えば幾つかのマイクロ共鳴体及び／又はクラスターが第１の標的分子を検出するための第１のプローブ分子を有する一方で、他のマイクロ共鳴体及び／又はクラスターが、第１のものとは異なる第２の標的分子を検出するための第２のプローブ分子を有するように、複数の検知あるいは参照目的を可能とするように異なって（生物学的−）官能化をされてもよい。（生物学的−）検知のために、以下の検出スキームが遂行されなければならない。
【００８８】
１．１個以上の（異なった）プローブ分子の導入及びクラスター表面の非特異的結合部位の可能的不動態化後であるが、所望の標的分子への何れの暴露に先行する、フローセル中のマイクロ共鳴体のクラスターのＷＧＭスペクトル測定。
２．全てのクラスターからのスペクトルを得るため、クラスターを保持する表面又は体積についてのイメージ走査が、一回で、又は測定の順に記録され得る。
３．所望の標的分子を含む分析対象物に対するクラスターの暴露。
４．上述したように、所望の標的分子への暴露後の、マイクロ共鳴体の全てのクラスターのＷＧＭスペクトルの測定。
５．（生物学的−）分子の吸着前後の両者のＷＧＭスペクトルの直接的比較により、ＷＧＭ波長シフトの強度が決定され、次いで溶液中の標的分子の存在に関連付けられる。各クラスターが、固有であり、その指紋とみなされ得るＷＧＭスペクトルを示すと仮定すると、分析対象物の暴露前後の特異的ＷＧＭスペクトルを同定することが可能である。データの分析は、実施例１に詳細が述べられるように、生物学的分子の吸着前後に測定される２つのＷＧＭスペクトルの自己相関の使用によりなされ得る。
【００８９】
実施態様３：  特異的生物学的分子の検出のための、種々の形状を持ったマイクロ共鳴体のクラスター配列に基づく光学的バイオセンサー
マイクロ流体フローセル中にマイクロ共鳴体クラスターの配列からなる光学的センサーを配置する。考慮されるマイクロ共鳴体は、それらがキャビティーモードの励起を許容する限り、例えば球体、円柱、円盤又はリング形状等の、異なった幾何を有してよい。センサーは、均質な形状（球体、リング、円柱等のみ）を持つマイクロ共鳴体から構成されてよく、あるいは、異なった形状（例えば球体と円柱）を持った２種以上のマイクロ共鳴体の異種的混合物でありうる。クラスターを形成するマイクロ共鳴体は、基材上にランダムに沈積され得、あるいは溶液中に懸濁され得る。単一クラスター中のマイクロ共鳴体の個数は、クラスターを形成するために２個を超えるか等しい必要があり、また、マイクロ共鳴体の表面は、特定の（生物学的−）分子との特異的相互作用を促すために、官能化され得る。基材上に沈積される異なったクラスターは、例えば物質の選択、励起及び読み取りのスペクトル範囲、及び／又はそれらの官能化の視点で互いに独立している。検知の為に、実施態様２に示された検出スキームが適用され得る。
【００９０】
実施例１：  個々のマイクロ共鳴体及びマイクロ共鳴体のクラスター上への多電解質層の吸着
以下の実施例において、ＰＥの複数層がマイクロ球体のクラスターに加えて、単一マイクロ球体上に沈着された。ＰＥ層の吸着により誘導されるＷＧＭ波長シフトが、各吸着工程後に測定された。ＷＧＭセンサーとして、公称直径１０μｍのクマリン６Ｇ−ドープされたポリスチレン（ＰＳ）ビーズが使用された。ＷＧＭスペクトルの取得のための実験装置は、図５に詳細が示される。マイクロ球体は、最初にＰＡＨ−被覆顕微鏡カバーグラス上に、滴下被覆によって沈着され、ここにおいてそれらは、クラスターの位置及び配置が全体の実験を通して同様に保持されることを確保するために、表面との静電的相互作用の手段により不動化された。次いで、沈着されたビーズの周りに、フローセルを構築した。マイクロ球体内部のレーザー染料の励起は、４４２ｎｍにて放射するｃｗＨｅＣｄレーザーにより行われた。球体から散乱される蛍光は、転置顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＳ１００）に取り付けた１００倍対物レンズにより集め、次いで光ファイバーを通してモノクロメータ（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ  Ｔｒｉａｘ  ５５０）に導かれた。シグナルの検出は、モノクロメータの出力に配置したＣＣＤカメラ又は光電子増倍管のいずれかにより行う。
【００９１】
乾燥環境下で測定された単一ビーズの典型的なＷＧＭスペクトルは、図６Ａに示される。多くのピークが見られ、これらは異なったモード数及びモード準位のマイクロビーズ内の種々の励起光学的モードに対応する（詳細については、例えば、Ａ．  Ｎ．  Ｏｒａｅｖｓｋｙ，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｖｏｌ．  ３２，  ３７７−４００，  ２００２参照）。しかしながら、同じマイクロ粒子が水中にて測定されると（図６Ｂ）、蛍光スペクトルは大きく単純化される。その理由は、球体の環境の増大した屈折率のために、全内部反射の条件が変化し、これらの厳しい条件下では高いＱ−因子を持ったモードのみが残ることにある。これらのモードは、典型的にはそれらの軌道についての曲率の最大半径を有するもの、即ち球体の赤道の直近を伝播するものである。このようなモードは、文献的には１次モード又はｑ＝１モードと称される（例えば、Ａ．  Ｎ．  Ｏｒａｅｖｓｋｙ参照）。染料の蛍光輻射は、非偏光であるから、異なる偏光のＷＧＭが励起され得て、これはそれぞれＴＥ及びＴＭとして分類される。従って、図６のスペクトルは、異なる量子数ｍについて、即ち波長の異なった倍数のＴＥ及びＴＭの両者を示している（式３参照）。
【００９２】
図７−１１では、水中に浸漬された複数のマイクロ球体のクラスターに加えて、単一マイクロ球体の両方のＷＧＭスペクトルを比較している。これらのスペクトルから、クラスター（図７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び９−１１）が、それらの組成、即ちクラスターに存在するマイクロ球体数、マイクロ球体半径、及びクラスター内の球体の配置に従って、全く異なるライン形状を持ったスペクトルを示すことが分かる。クラスターのＷＧＭスペクトルのより複雑な構造は、クラスター中の個々のマイクロ球体のＷＧＭスペクトルが重ねあわされること、及びそれに加えて異なるマイクロ球体の間の結合効果が上述したように起こりうる事実に関連している。
【００９３】
ＰＥは、十分に規定された厚みを有する薄い有機フィルムを形成し、従って、検知的応用のためのマイクロ球体のクラスターにおけるＷＧＭ励起を試験するために、非常に興味あるシステムを提供する。多電解質（ＰＳＳ及びＰＡＨ）の複数層は、別に記述された層毎（ＬｂＬ）沈積方法（Ｇ．  Ｄｅｃｈｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，  ｐｐ．  １２３２−１２３７，  １９９７）を使用して、マイクロ球体表面容易に沈積され得る。ＷＧＭの測定は、引き続く沈積周期の間に、図５に示したようにフローセル内にてその場にて行われた。図１２は、ＰＥの複数の層がマイクロ球体に沈積される際に、単一マイクロ球体のＷＧＭスペクトルが、より大きい波長に向けてどのようにシフトするかを示している。同様な挙動が、例えば３個のマイクロ球体のクラスター（図１３）のように、クラスターについても認められる。ＰＥ層は、水性溶液（ＰＡＨ：０．５ＭのＮａＣｌ水溶液中の１．５ｍｇ／ｍｌ、ＰＳＳ：０．５ＭのＮａＣｌ水溶液中の１ｍｇ／ｍｌ）から吸着され、約１０分間インキュベートされた。
【００９４】
自己相関関数が、データ解析の為に使用された。図１４Ａ及び１４Ｂは、それぞれ、単一マイクロ球体（図１２参照）及び３個のマイクロ球体のクラスター（図１３参照）への第３の被覆後に得たスペクトルとＰＥ吸着前のスペクトルとの自己相関の結果を示す。両方のグラフにおいて、高い相関値及び狭いバンド幅を持ったはっきり示される極大が見られる。この極大の位置から、ＰＥ層の吸着によるＷＧＭの平均波長シフトが直接に決定され得る。自己相関関数が異なったクラスターを互いに区別するために使用し得ることを証明するために、図１５に示されるように同様な計算を異なる単一マイクロ球体に加えて異なるクラスター間について行った。異なる単一のマイクロ球体については、相関は、同様な球体から得られた２つの異なるスペクトル間の相関を計算した場合には同様な結果が得られ（図１５Ａ）、このことは単一マイクロ球体は、この方法では同定できないことを確認するものである。特に、相関の最大は、図１４Ａに示されるように対称的かつ狭い。しかしながら、相関が異なるクラスターから得られたＷＧＭスペクトル間で計算された場合（図１５Ｂ）、相関の最大のライン形状は顕著に広くなり、かつもはや対称的ではなく、このことは、このような相関が、同様なクラスターの異なるスペクトルが相関する場合とは明らかに区別しうることを意味している（図１４Ｂ参照）。従って、クラスターのＷＧＭスペクトルの固有のライン形状が確認され、また、例えばここに記述される方法によってそれらの同定に使用され得る。
【００９５】
図１６は、種々のＰＥ沈着の厚さについての、マイクロ球体の異なったクラスターの平均ＷＧＭ波長シフトを示す。ＷＧＭ波長シフトが、クラスター内に存在するビーズの個数には依存しないが、沈着されたＰＥの厚さのみに依存し、更には単一マイクロ球体について観察されるシフトに関しての誤差に同等であることが分かる。従って、クラスター中のマイクロ共鳴体の個数は、厳密に制御する必要が無い。更に、吸着層の平均厚さ（又は密度）等の一般的性質の計算のため、単一球体についての理論が適用され得る。クラスター及び単一球体間の良好な一致のため、異なる大きさの単一球体及びクラスターについて得られた平均ＷＧＭシフトは、吸着ＰＥ層の数の関数として、吸着層の厚さの決定に使用されるであろう。
【００９６】
ＰＳ球体とＰＥとの間の屈折率の差異が小さいものと仮定すると、ＰＥ被覆の厚さは、以下の等式に従ってＷＧＭ波長シフトから計算され得る。
【００９７】
【数５】
2011508868.tif 000007
ここにおいて、∂ωは考慮されるＷＧＭの波長シフトであり、ωは、初期振動数であり、∂Ｒは吸着によるマイクロ球体半径の増加量であり、Ｒは、初期マイクロ球体半径であり、ｎＬ及びｎＳは、それぞれ沈着層及びマイクロ球体の屈折率である。
【００９８】
表１は、ＷＧＭシフトにより実験的に決定されたＰＥ被覆の厚さと、中性子反射測定法（Ｍ．  Ｌｏｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３１，  ｐｐ．   ８８９３−８９０６，  １９９８）及び光散乱実験（Ｃａｒｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐｐ．  １１１１−１１１４，  １９９８）にて得られた参照データによる対応する値との対比を示す。ＷＧＭセンサーにより測定された厚さが期待される値より若干小さい第１の被覆を除いて、結果は文献的な値に良好に一致する。
【００９９】
【表１】
2011508868.tif 000008
【０１００】
合わせ見ると、我々の知見は、マイクロ球体のクラスターが、単一マイクロ球体と同様にして、光学的な（生物学的−）センサーとして使用され得ることを証明している。クラスターは、単一マイクロ球体と対比して、分子がそれらの表面に吸着した場合と同じＷＧＭシフトを示す。更には、ＷＧＭ波長シフトは、クラスターに存在するマイクロ球体の個数に依存しない。各クラスターが、その指紋として考慮され得る特定のＷＧＭスペクトルを示すことも例示された。この特徴は、分析対象物の吸着によりスペクトルがシフトした場合においても、そのＷＧＭスペクトルの特徴的ライン形状により各クラスターが同定され得ることからして、センサーの配列として特に興味深いものである。この驚くべき知見は、クラスターの正確な位置の退屈な記録操作を無用なものとし、従って、検出スキームを劇的に単純化する。上述した相関関数との組み合わせにおいて、クラスターの同定及び観測されるピークシフトの評価は、単一工程として遂行され得る。
【０１０１】
実施例２：  単一ビーズ及びビーズのクラスターへのウシ血清アルブミンの吸着
生物学的センサーの主たる応用は、明らかに所望の生物学的分子が分析対象物中に存在するかを検出することである。従って、溶液中のタンパク質の存在を検出する試み、及びその検出限界の観点からの生物学的センサーの性能を特徴づける試みを行った。この試験の為に選択したタンパク質は、不活化のために一般的に使用される周知のタンパク質であることから、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【０１０２】
生物学的センサー自体は、上述したように外部からの励起（４４２ｎｍにて稼動されるＣＷ  ＨｅＣｄレーザー）下にてＷＧＭを生成するための、レーザー染料（Ｃ６Ｇ）をドープしたポリスチレンマイクロ球体（ｒ＝５μｍ）のクラスターからなっている。該マイクロ球体は、カバーグラス上に不随意に沈積され、またフローセルは、その場での測定を実施するためにマイクロ球体の周りに構築される。
【０１０３】
最初に、種々の大きさのクラスターのＷＧＭスペクトルを、何れのＢＳＡの沈積にも先行して、ＰＢＳ緩衝液中において測定した。次いで、０．１％ＢＳＡ溶液（標準ＰＢＳ緩衝溶液ｐＨ７．４中）をフローセルに導入し、約１５分間のインキュベーション後、同じクラスターの他の一連のＷＧＭスペクトルを得た。図１７は、フローセルに約１時間ＢＳＡ溶液を注入し、続いてＰＢＳ緩衝溶液にてすすいだ後の追跡されるＷＧＭの相加平均波長シフトを、クラスターを形成するマイクロ球体の個数の関数として表している。最初の実施例において既に見出されたように、単一マイクロ球体と、マイクロ球体のクラスターとは、ＢＳＡの吸着について同様なＷＧＭ波長シフトを示す。観測され得る小さい偏差（図１７Ａ）は、なおも実験誤差（５回の独立した実験についての標準偏差として計算される）の範囲内であり、かつ使用した検出装置の解像限界（０．０１ｎｍとなっている）未満でもある。従って、球体表面のＢＳＡ分子の張出し面積等の種々のパラメーターを計算するために一般的に使用された単一球体の為に導かれた理論は、マイクロ球体のクラスターの場合にも使用され得る。以下の計算において、ＢＳＡ分子の完全な単一層が、クラスター表面に形成されたものと仮定する。ＢＳＡ分子の張出し面積（σp−１）は、以下の式を使用して、ＴＥモードのＷＧＭ波長シフトから計算される。
【０１０４】
【数６】
2011508868.tif 000009
【０１０５】
【数７】
2011508868.tif 000010
ここにおいて、ｎＳ、ｎｍ及びｎＬは、それぞれ、ビーズ（１．５９）、周囲媒体（１．３３）及びＢＳＡ（１．５）の屈折率である。αｅｘは、ＢＳＡの過剰偏光（４πε０ｘ３．８５ｘ１０−２１ｃｍ３）である。計算された張出し面積（σp−１）は、３．９８ｘ１０−１３ｃｍ２と４．５１ｘ１０−１３ｃｍ２との間で変化する。これらの値は、ＢＳＡの張出し面積に関して観光された値、Ａｒｎｏｌｄらによる３．４ｘ１０−１３ｃｍ２（Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２８，  ４，  ｐ．  ２７２−２７４，  ２００３）及びＦｅｒｒｅｒらによる３．５ｘ１０−１３ｃｍ２（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ８０，  ｐ．  ２４２２−２４３０，  ２００１）によく一致し、従って、単一層形成の仮定を裏付けている。我々のセンサーの現時点での質量感度は、ＢＳＡ分子（Ｍ＝６６０００ｇ／ｍｏｌ）の完全な単一層にて被覆されたマイクロ球体（ｒ＝５μｍ）を考慮すると、１ｐｇである。絶対質量感度限界は、ＢＳＡの完全な単一層の吸着により誘導されるシフトの約１０％であるＷＧＭ波長シフトが測定されることを仮定すると、約１００ｆｇである。現在の球体の大きさを用いると、これは０．０１ｎｍの最小検出可能波長シフトに対応し、これは実験に使用した光学装置により容易に可能である。
【０１０６】
比較例１
Ｖｏｌｌｍｅｒは、生物学的検知のためにマイクロ球体上へのＢＳＡの吸着に関する類似した実験を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ８０，  ２１，  ｐ．  ４０５７−４０５９，  ２００２）。彼らの場合には、ＷＧＭセンサーは、３００μｍの直径を有するシリカから調製される単一マイクロ球体からなっていた。マイクロ球体は、ブタン／亜酸化窒素のマイクロフレームトーチランプを用いて光ファイバーのチップを溶融することにより作製された。ＷＧＭの励起及び検出は、共に光ファイバーを介して行われた。ＷＧＭ励起は光ファイバーとマイクロ球体との間のナノメーター規模の間隙を必要とするため、マイクロ球体に関する光ファイバーの位置付けは、極めて厳密でなければならない。生物学的分子吸着によるＷＧＭ位置の変化は、光ファイバーを通して伝達される光学的場の強度変化を追うことにより検出される。励起波長の走査は、０．００９ｎｍ／ｍＡの精度を有する調和可能ＤＦＢレーザーにより行われた。生物学的センサー上へのＢＳＡの完全な単層の吸着は、０．０２１ｎｍのＷＧＭ波長シフトを生じた。
【０１０７】
Ｖｏｌｌｍｅｒにより作製されたセンサーと比べて、ここに提供されるセンサーは、完全な単一層を形成するために必要となるセンサー表面に吸着される生物学的分子の絶対質量については、より高感度である。更には、ＷＧＭ波長シフトがより大きい（ΔλＷＧＭ＝０．２ｎｍ）。これらの特徴は、センサーを構築するために使用したマイクロ球体のより小さい大きさによっている。更なる優位点は、励起及び検出のスキームが単純化されること、及びマイクロ球体中への蛍光染料の取込みの為に光ファイバーとの結合を必要としないことである。遠隔検知の可能性に加えて、これは更に、単一マイクロ球体に代えて、生物学的センサーとしてマイクロ球体のクラスターの使用を可能とし、このことは上述した検出スキームの実現可能性を大きく高める。
【０１０８】
実施例３：  刺激放射形式にて稼動されるマイクロ共鳴体のクラスター
上述の実施例において、蛍光マイクロ共鳴体は、低いないし中程度の励起強度にてｃｗレーザー輻射によって励起された。以下においては、我々は刺激放射の閾値、即ちレーザー閾値を越えるパルスレーザーの手段によるマイクロ共鳴体の励起の効果を記述する。
【０１０９】
実験。  公称直径１５μｍ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）のＰＳビーズに、当業者が既知の方法を使用してナイルレッドをドープした。引き続いて、先ず懸濁物をビーズ数を低減するためにミリポア水にて希釈し（典型的には５０−１００倍）、次いで懸濁物の小滴（１０−２０μｌ）をヴィトンシールを有するカバーグラス上に滴下した。水の高さを追加のミリポア水にてシーリングの上端まで上昇させ、次いで系を上部カバーとしてのクォーツ基材により封止した。このようにして試料を乾燥しないようにし、ビーズを重力によってのみ基材まで沈め、このようにして基材との弱いファンデルワールス相互作用のみが残るようにし、即ちそれらがほとんど自由に浮遊し、液体セル中での対流がないために定常的であるようにした。マイクロ共鳴体及びそれらのクラスターを、可変的反復速度（１０−５００ｋＨｚ）及び９ｐｓのパルス持続時間にて、Ｎｄ：ＹＡＧピコ秒レーザーの第二調和振動によって励起させた。レーザー輻射を組込み蛍光フィルターブロックを介して転置顕微鏡中に結合させ、マイクロ共鳴体励起と検出が、同じ顕微鏡対物レンズ（ニコン  １００ｘ）を通して伝達されるようにする。パルスエネルギーは、第二調和振動を生成する非線形光学結晶の前のラムダハーフプレートを回転させることによるか、又は単に平均出力を保ちつつ、レーザーパルスの反復速度を変化させるかの何れによっても変化させうる。検出のために、上記実施例のものと同じ系が適用された（冷却ＣＣＤカメラを備えた、Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｔｒｉａｘ  ５５０）。
【０１１０】
結果。  図２０は、共に基本的に同等な辺の長さを有する三角形を形成する１５μｍのＰＳビーズの２つの異なる三量体（図２１の略図参照）から得られた、レーザー閾値を越えて及びより低値で励起されたＷＧＭスペクトルを示す。レーザー閾値より低値にて得られたＷＧＭスペクトル（ｃ）は、上述の実施例にて見いだされた指紋的ライン形状に似ている。この三量体が、閾値を越えて励起された場合（スペクトル（ｂ））、全てのＷＧＭが同じ条件及び同じ効率をもってレーザー閾値に達するものではないため、ライン形状は、劇的に変化する。相対強度の変化に加えて、特にはモードのより小さい数の物がスペクトル（ｂ）に観測される。それにもかかわらず、２つのスペクトルの対比は、スペクトル（ｂ）において観測される全てのモードが、閾値を下回るＷＧＭスペクトル（ｃ）におけるピークに関連付けられることを示している。“欠失した”ピークはスペクトル（ｂ）になおも存在するが、それらはレーザーモードに比べてかなり低い強度の為に背景中に“埋没”されてしまうことに注意すべきである（図２０のスペクトルは、モード位置及び全体のライン形状の対比を容易にするために各最大強度について正準化され、また明確化の為に縦軸方向にずらして正準化されている）。
【０１１１】
閾値を下回る、及び越えた場合のライン形状のそれぞれにおける明確な差異のため、本実施態様についての最も重要な問題は、モードのより小さい数にもかかわらず、スペクトルの指紋的な特徴が刺激放射形式においても保持されるか否かである。このような場合がスペクトル（ａ）によって例示されており、これは第２の三量体からレーザー条件下で得られた。ＰＳビーズのサイズ分布のため、異なったレーザーモードが、スペクトル（ｂ）と比べて異なった位置に表れている。同様にライン形状は、付加的なモードの存在によって異なっている。このことは、マイクロ共鳴体のクラスターに基づくセンサーが、若干は変化するがそれらの個々の指紋を失うことなく、その一方でより優れたシグナル−ノイズ比及びレーザーモードのより小さいライン幅の優位点を以って、レーザー閾値を越えて稼動され得ることを示す（２００８年１１月７日出願の米国仮出願番号６１／１１２，４１０参照）。特に、より小さいライン幅は、より小さい波長シフトであってもより狭いモードを以って解像され得ることから、センサーの感度を向上する。
【０１１２】
実施例４：  選択的レーザーによるクラスター内のマイクロ共鳴体の選択的分析
この実施例は、レーザー閾値を越えてマイクロ共鳴体を稼動させる可能性を更に探るものである。レーザー及び非レーザーモード間の放射強度における顕著な差異のため、クラスター内の個々のマイクロ共鳴体は、それらがレーザー閾値を越えて別個に稼動され得る場合に、ＷＧＭスペクトルの観点から分析が可能である。このような場合、他のクラスターの非レーザー稼動構成体から生じる指紋的スペクトルは、上記実施例（図２０）に例示されるように単純に背景中に埋没されてしまう。
【０１１３】
図２１は、この手法を例示する（実験的詳細は、実施例３と同様）。図２１の略図に示されるように、三量体は、レーザービームを異なった領域に焦点を当てることにより、異なった方法にて励起された。ビーム焦点の直径は約３０μｍであり、従って、公称粒子直径の約２倍であるが、ビーム中心における約４倍高い強度によって、三量体内の個々のマイクロ共鳴体のレーザー閾値を越える選択的励起を許容する。スペクトル（ａ）は、ビーム中心を三量体の中心に合わせ、而して３個全てのビーズを閾値を越えて励起させることにより得た。スペクトル（ｂ）−（ｄ）は、次いで略図に示されるようにビーム中心を異なるビーズに合わせることにより得た。スペクトル（ｂ）及び（ｄ）は、明らかにそれぞれのビーズのレーザー稼動を示し、一方でスペクトル（ｃ）は、閾値を下回る。図２１が、達成された異なるＷＧＭ強度の直接的対比のために、ＣＣＤにより得られた非正準化の生データ（０．１秒の取得時間で１０回の取得の蓄積）を示すことに注意されたい。その低い強度のため、スペクトル（ｃ）の引き伸ばしを図２１（ｃ’）の上半分に示す。スペクトル（ｂ）−（ｄ）の全ては、水中における個々のビーズから得られたＷＧＭの特徴を示しており（図６Ｂ参照）、而して選択されたビーズの個別的分析を許容する。しかしながら、同時にクラスターは特徴的な指紋的スペクトルを示し、これによってその同定を容易にする。これらの２つの効果の組み合わせにおいて、表面上の個々のマイクロ共鳴体は、第１にはその特徴的な指紋的スペクトルによってその主たるクラスターを同定し（クラスターの全て（又はほとんどの）構成体を閾値を越えて励起することによる）、次いで、所望のビーズのみの閾値を越える選択的励起によって指定され得る。１個のクラスター中のマイクロ共鳴体の典型的な少ない個数（典型的には２−８個）のために、クラスター内の個々のマイクロ共鳴体は、それらの大きさ変動ゆえに単一粒子スペクトルによって区別され得、このことは同じクラスター内で、懸濁物中の数千個の粒子から（検出系の解像度の範囲内で）同等の大きさの２個の粒子を持つことは極めて起こり得ないことに注意されたい。クラスター内の個々のマイクロ共鳴体を指定するこの方法は、例えば、ビーズ半径並びに／又は周囲の屈折率及び／若しくは吸着物の特徴等の他のパラメーターを正確に決定することが必要な場合には、興味深い。そのような場合、異なったマイクロ共鳴体の大きさ及び異なったモードの偏光（ＴＥ、ＴＭ）によるＷＧＭモードシフトにおける僅かな差異は、正確に測定され、測定のより洗練された分析の為に使用され得る。同じクラスター内の異なるマイクロ共鳴体が、例えば異なる（生物学的−）分子を標的にするため、又は参照を目的として不動化層を有する等の、異なった官能化を持つ場合に、クラスター内のマイクロ共鳴体の個別的な読み取りを要するであろう。そのような場合、指紋的スペクトルの基本的アイデアは、クラスターを含む個々のマイクロ共鳴体の波長シフトにおける小さい差異のため、又はクラスターのマイクロ共鳴体の部分集合の指紋的スペクトルの分析により、維持され得る。後者の場合、部分集合スペクトルは、全体的な指紋が維持されるような様式���数値的には重複するであろう（例えば、異なる部分集合について測定された個々の波長シフトに従って波長軸を修正し、次いで修正した部分集合スペクトルを数値的に重ね合わせることによる）。
【０１１４】
実施例５：１種類を超えた蛍光性物質を適用することによるクラスター内のマイクロ共鳴体の選択的分析
上述の例において、クラスター内のマイクロ共鳴体の選択的分析は、レーザー閾値を超えた場合と下回る場合とのそれぞれにおいて、モード強度の顕著な差異を生じる優位点を取ることにより達成された。別のスキームにおいて、モ−ド強度のそのような顕著な差異は、クラスターの異なる構成体についての異なる励起スキームを使用することにより達成され得る。染料−ドープのＰＳビーズを適用する本実施例においては、このような異なった励起スキームは、粒子に異なった蛍光染料をドープし、選択的な染料励起を許容する適切な励起波長を持った励起光源を使用することにより、容易に達成され得る。しかしながら、全体のクラスターの指紋的スペクトルを達成するためには、適用される異なった染料の放射波長領域が、十分な程度に重複していること、即ち、試料内の他のクラスターから識別するために、十分な詳細を以って指紋的スペクトルを取得することを許容するものでなければならない。
【０１１５】
以下において、この技術の単純な例が与えられる。
実験。  異なる励起を有するが、重複する放射波長領域を有するＰＳビーズを得るために、１５μｍのビーズにＣ６Ｇ及びナイルレッドの混合物をドープした。実施例１及び２に示されるように、Ｃ６Ｇは４４２ｎｍにて励起され得るが、一方でナイルレッドはこの領域をほとんど吸収しない。Ｃ６Ｇは、４９０−５５０ｎｍの範囲において放射し、これは基本的にナイルレッドの励起の範囲である。従って、両方の染料を含むビーズは、輻射が同ビーズに存在するナイルレッドを励起するであろうＣ６Ｇによって４４２ｎｍにて、あるいはナイルレッドが直接に励起される５３２ｎｍのいずれかによって励起され得る。両方の場合において、放射波長範囲は、約５８０ｎｍから６５０ｎｍであり、而してナイルレッドのみをドープしたＰＳビーズの放射波長範囲に基本的に一致する。
【０１１６】
粒子の励起のために、４４２ｎｍにて作動されるＨｅＣｄレーザー、及び５３２ｎｍにて作動されるＮｄ：ＹＡＧピコセカンドレーザーが、上記の例では適用された。異なる光学的装置が二つのレーザービームのビーム誘導の為に使用されたため（ＨｅＣｄレーザーは、図５に示すように試料の頂部から、またＮｄ：ＹＡＧレーザーは顕微鏡の対物レンズを通して）、クラスターは容易に両方のビームにて同時的に及び／又は一方のビームのみに曝され得る。
【０１１７】
該試料（ＰＳビーズのクラスター）は、清浄化した顕微鏡カバーグラス上にて、１５μｍのＰＳビーズの混合物を水中に分散し、そのうちのある部分にＣ６Ｇ及びナイルレッドをドープし、またそのうちのある部分にはナイルレッドのみをドープすることにより調製された。クラスター内のあるビーズのみが４４２ｎｍ放射によって効果的に励起され、一方で他のビーズが励起されないことを確認することによって、クラスターを分析の為に選択した。このような“混合”クラスターは、以下のように研究されるであろう。
【０１１８】
結果。  第１の工程において、使用された２種類のビーズ（ナイルレッドのみがドープされたもの：“タイプＩ”；Ｃ６Ｇ及びナイルレッドがドープされたもの：“タイプＩＩ”）が、重複する輻射波長領域において、実際に異なった輻射強度を達成することが確認された。このことは、２種類の単一マイクロ共鳴体を、２つの異なった励起源に曝すことにより確認された。図２２は、典型的な結果を示している。上半分において、タイプＩの単一ＰＳビーズが４４２ｎｍ放射（ａ）及び５３２ｎｍ放射（ｂ）にそれぞれ曝された。明らかに、５３２ｎｍ放射は、ＷＧＭの励起においてより効果的である。図２２のスペクトルは、それらのＷＧＭ強度の直接的比較の為に、ＣＣＤカメラから得られたままの非正準化生データを示していることに注意されたい（スペクトル（ｂ）は明確化の為に若干ずらしてある）。また、レーザー強度は、同様な強度のＷＧＭスペクトルが達成されるように設定された。ＨｅＣｄレーザーは、中程度の出力のｃｗレーザーであることから、レーザー現象は達成されなかった。従って、ピコセカンドＮｄ：ＹＡＧレーザーも、閾値未満にて稼動させた。
【０１１９】
図２２の下半分において、タイプＩＩビーズから得られたスペクトルが、４４２ｎｍ放射（ａ）及び５３２ｎｍ放射（ｂ）のそれぞれを用いた励起について示される。このビーズ内のＣ６Ｇの存在の為、ナイルレッドはＣ６Ｇ放射を介して効果的に励起され得、而して該ビーズから得られたＷＧＭスペクトルは、基本的には励起源に非依存的である。
【０１２０】
従って、クラスターの指紋的スペクトルは、使用される全てのビーズが効果的に励起され得る５３２ｎｍによるクラスターの励起により得ることができ、一方で個々のビーズ（タイプＩＩのみ）が４４２ｎｍ放射を用いて特定され得る。
【０１２１】
この原理の実演として、図２３は、４４２ｎｍ放射（ａ）及び５３２ｎｍ放射（ｂ）によりそれぞれ励起された混合二量体（タイプＩの１個のビーズ及びタイプＩＩの１個のビーズ）から得られた正準化スペクトルを示す。スペクトル（ａ）において、他のモード（おそらくタイプＩビーズに由来する）からの幾らかの重要でない寄与に関わらず、水性環境での単一ビーズについて特徴的な１次のＴＭ／ＴＥ対（図６Ｂ及び例えばＰ．  Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ９０，  ｐｐ．  １６１１０１／１−３，  ２００７  ；  Ｓ．  Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ９２，  ｐｐ．  ２２１１０８／１−３，  ２００８参照）が、明確に特定され得、而してタイプＩＩビーズの分析に使用された。タイプＩビーズに関する情報は、次いで、例えばスペクトル（ｂ）からスペクトル（ａ）を差引くことにより得られるであろう。しかしながら、ここにおいて我々はタイプＩビーズに関する情報を入手するために励起用レーザーの異なった放射特性を利用する。スペクトル（ｃ）に示されるように、５３２ｎｍ放射の励起強度を、レーザー閾値を越えて設定し、而してタイプＩビーズのみのレーザースペクトルを得た（実施例３及び４参照）。繰り返すが、スペクトルは特徴的なＴＭ／ＴＥ対を示すが、この場合はタイプＩビーズ単独のＷＧＭを示す（全ての他の非レーザーモードは、上述の実施例にて検討したように、バックグランド中に埋没した）。タイプＩビーズのみがレーザー発光する理由は、使用した粒子のバッチにおいて、Ｃ６Ｇ／ナイルレッドをドープしたビーズが幾らか広いバンド幅を示し、従ってナイルレッドのみをドープしたビーズよりも低いＱ−因子を示す（図２２参照）という観察に関連する。この差異についての理由は現時点では明確でないが、一般的に最も高いＱ−因子を持ったモードが最も低いレーザー閾値を示すことから、タイプＩビーズの選択的レーザー化の為に使用され得る。従って、励起強度の適切な選択により、タイプＩビーズのみのレーザー発光が達成され得る。
【０１２２】
後者の手法は、選択的励起のための異なったスキーム（異なった蛍光染料及びレーザーのそれぞれの使用）が、クラスター内の個々のマイクロ共鳴体に関する情報を生じさせるために組み合わされ得ること、及び個々のスペクトルはそれらの励起のために使用されるスキームに依存して、レーザー閾値の下、及び越えて得られうることを示している。
【０１２３】
この例に示された手法についての応用は、実施例４の最後に議論したものと基本的に同様であり、即ち、改善された分析に関連し、またクラスター内の異なった官能化を受けたマイクロ共鳴体の応用に関連する。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図４（Ｄ）】
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【図４（Ｅ）】
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【図４（Ｆ）】
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【図４（Ｇ）】
2011508868.tif 000023
【図４（Ｈ）】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７ａ）】
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【図７ｂ）】
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【図７ｃ）】
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【図７ｄ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（Ａ）】
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【図１２（Ｂ）】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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【図１４（Ａ）】
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【図１４（Ｂ）】
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【図１５（Ａ）】
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【図１５（Ｂ）】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８（Ａ）】
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【図１８（Ｂ）】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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