(57)【要約】  本発明は、生理活性部分のポリマーまたは重合性化合物への選択的抱合方法に関する。さらに具体的には、本方法は、生理活性部分のペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基への選択的抱合方法であって、ペンダント基は、ポリマーまたは重合性化合物の一部分であり、ポリマーまたは重合性化合物と加水分解酵素を接触させて、生理活性部分とペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基との抱合を触媒するステップを含む方法に関する。生理活性部分の抱合は、重合性化合物の重合の前、最中、または後に行われてもよい。抱合は、ポリマーに形が与えられた後に行われてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性部分のペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基への選択的抱合方法であって、ペンダント基は、ポリマーまたは重合性化合物の一部分であり、ポリマーまたは重合性化合物と加水分解酵素を接触させて、生理活性部分とペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基との抱合を触媒するステップを含む方法。
【請求項２】
ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基が、（ａ）少なくとも２つの重合性部分と（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸残基とを含むポリマーまたは重合性化合物の一部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリマーまたは重合性化合物が、ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基以外に、尿素基、チオ尿素基、ウレタン基、チオウレタン基、エステル基、アミド基、糖ペプチド基、カーボネート基、スルホン、または炭水化物基から選択される部分を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
重合性化合物が式Ｉで表わされ、
【化１】
2011511829.tif 000014
式中、
−Ｇは、少なくともｎ個の官能基を有する多官能性化合物の残基または部分Ｘであり、
−Ｘはそれぞれ独立に、重合性基を含む部分を表し、
−Ｙはそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮＲを表し、
−Ｒはそれぞれ独立に、水素、または１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む置換および非置換炭化水素から選択される基を表し、
−Ｌは、１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む置換または非置換の炭化水素基を表し、
−ｎは、少なくとも１の値を有する整数であり、
−ＷはＯまたはＳであり、
−ＱはＯまたはＳであり、
−Ｚは、Ｈ、あるいは置換または非置換の炭化水素基である、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
−ＧはＸであり、
−それぞれＹ＝Ｏであり、かつＸはそれぞれ、ヒドロキシアルキレン、ヒドロキシエチルアクリレート、またはヒドロキシエチルメタクリレートを含む部分を表し、
−Ｒはそれぞれ、水素を表し、
−Ｌは、アミノ酸部分を表し、
−ｎ＝１であり、
−ＷはＯであり、
−ＱはＯであり、
−Ｚは、Ｈ、または１〜６個のＣ原子を有するアルキル基である、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸部分が、リシン部分、ジアミノプロピオン酸部分、ヒドロキシルリシン部分、Ｎ−α−メチル化リシン部分、またはジアミノブタン酸部分から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸残基がＬ型立体配置である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ポリマーが、請求項５〜７のいずれか一項に記載の化合物から構成されるポリマーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリマーまたは重合性化合物が、１つまたは複数のリシン−メチルエステル部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
加水分解酵素が、カルボン酸エステル加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、またはペプチダーゼの群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
加水分解酵素が、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼの群から選択されるペプチダーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
酵素がセリンエンドペプチダーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
酵素がサブチリシンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
酵素がサブチリシン・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酵素がシステインエンドペプチダーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酵素がパパインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
酵素が、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、リポザイム（ｌｙｐｏｚｙｍｅ）ＲＭ、ピカンターゼ（Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ）Ａ（登録商標）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、熱安定エステラーゼまたはリリパーゼ（ｌｉｌｉｐａｓｅ）から選択されるカルボン酸エステル加水分解酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
生理活性部分の抱合が、重合性化合物の重合の前、最中、または後に行われてもよい、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
生理活性部分の抱合が、ポリマーに形が与えられた後に行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
生理活性部分が、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生理活性部分のポリマーまたは重合性化合物への選択的抱合方法に関する。
【０００２】
生理活性部分を抱合しているポリマー、またはモノマー、マクロマーもしくはプレポリマーなどの重合性化合物は、生物医学的用途において広範囲にわたって使用される。例えば、生理活性部分は、ポリマーまたは重合性化合物の一部分である官能基、例えばカルボン酸を介して抱合され得る。しかし、抱合生成物の調製におけるある段階で、特定の工程段階が効率的に行われること、および／または遊離（すなわち、保護されていない）カルボン酸基の存在による望ましくない副反応を回避することを可能にするために、カルボン酸基は保護されていることがしばしば望ましく、または必要でさえある。しばしば、カルボン酸は、エステル化により炭化水素で保護されている。
【０００３】
保護されたカルボン酸に生理活性部分を化学的に抱合させることができるが、それより前に、脱保護ステップが必要である。しかし、このような脱保護は、特にポリマーまたは重合性化合物が、保護されたカルボン酸基以外に別のエステル基またはチオエステル基などの１つまたは複数の他の加水分解性基を含む場合に、問題となる可能性がある。
【０００４】
エステル基またはチオエステル基などの加水分解性基は、通常、水性の環境で酸または塩基によって加水分解される。しかし、こうした加水分解は選択的でないことが知られている。場合によっては、特に例えばポリマーまたは重合性化合物が、１つまたは複数の他の加水分解性基、例えば複数のエステル基を含む場合には、選択的加水分解が必要とされる。例えば、ｔ−ブチルエステルが一部の他のエステル基またはチオエステル基より選択的に加水分解されることは、例えば乾燥有機溶媒中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた化学的プロセスにおいて優先的に実現され得ることが知られている。しかし、いくつかの欠点がこのプロセスには伴う。エステルを効率的に脱保護するには、一般に大過剰のＴＦＡ（＞１０当量）を使用することが必要である。このような形の脱保護は、高酸性条件により、強酸性条件で安定でない化合物には不適なものとなる。ＴＦＡが媒介する脱保護において、微量の水があれば、通常、分子中の他の加水分解性基、特に他のエステル官能基またはチオエステル官能基の広範な加水分解を引き起こすのに十分であるので、反応は乾燥溶媒中で実施される。特に、官能基、例えば生理活性部分の一部分である官能基が、カルボン酸にカップリングすることになっている場合に、カップリングステップにおいてＴＦＡの存在は抱合反応に有害であり得るので、ＴＦＡの完全またはほぼ完全な除去は労力を要する（かつ高価である）が、極めて重要である。
【０００５】
生理活性部分のポリマーまたは重合性化合物への化学的抱合の場合に、生理活性部分は、副反応を回避するために、反応性基を化学カップリング剤で少なくとも部分保護するべきである。
【０００６】
化学カップリング剤は、しかも高価であり、再生利用することはできず、環境に優しくない。
【０００７】
保護された生理活性部分が使用されると、抱合反応の後に１つまたは複数の別の脱保護ステップがさらに必要になり、難題となる恐れがある。
【０００８】
本発明の目的は、上記のようなものなどの１つまたは複数の欠点を克服することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、生理活性部分をポリマーまたは重合性化合物に効率的に抱合させる新規方法を提供することである。
【００１０】
さらに、本発明の別の目的は、ポリマーまたは重合性化合物中に存在するカルボン酸基の脱保護ステップを必要としない方法を提供することである。
【００１１】
さらに、本発明の別の目的は、高価なカップリング試薬、または抱合プロセスにおいて複数のステップを必要としない方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、抱合の前に、生理活性部分が、その反応性官能基に保護基をあまりまたは全く必要としない方法を提供することである。
【００１３】
今回、生理活性部分をポリマーまたは重合性化合物に選択的に抱合させることが可能であることが判明した。
【００１４】
したがって、本発明は、生理活性部分のペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基への選択的抱合方法であって、ペンダント基は、ポリマーまたは重合性化合物の一部分であり、ポリマーまたは重合性化合物と加水分解酵素を接触させて、生理活性部分とペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基との抱合を触媒するステップを含む方法に関する。
【００１５】
驚くべきことに、生理活性部分を、ポリマーまたは重合性化合物中に存在するペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基に、ポリマーまたは重合性化合物の主鎖中に存在する可能性がある１つまたは複数の他の基、例えば他のエステル基、チオエステル基、ウレタン基、または尿素基に比べて高選択度で抱合させることが可能であることが判明した。
【００１６】
本発明の方法の利点は、本発明による酵素的プロセスが、化学的抱合プロセスに比べて環境に優しいことである。
【００１７】
別の利点は、触媒量の安価でかつ再生利用できる酵素によって、生理活性部分を立体的に大きいポリマーまたは重合性化合物に選択的に抱合させることができることである。
【００１８】
さらに別の利点は、抱合の前に、生理活性部分の反応性官能基は部分保護しか必要がなく、または全く保護する必要がないことである。
【００１９】
さらに、生理活性部分を、保護されたカルボン酸基および保護されていないカルボン酸基に選択的に抱合させることができ、保護されている場合、例えばエステル基またはチオエステル基の場合に、脱保護ステップが必要でないことは別の利点である。
【００２０】
生理活性部分が結合しているポリマーまたは重合性化合物が光学活性中心を有する場合、抱合反応中に、ポリマーまたは重合性化合物のラセミ化が全くまたはあまり起こらないことは別の利点である。
【００２１】
本明細書では、「ポリマー」という用語は、相対分子質量の小さい分子に実質的または概念的に由来する単位の多数回の繰返しを本質的に含む構造を表す。このようなポリマーとして、架橋ネットワーク、樹状および超分岐ポリマー、ならびに線状ポリマーを挙げることができる。オリゴマーは、１種のポリマー、すなわち相対分子質量の小さい分子に実質的または概念的に由来する単位の繰返し回数が比較的少ないポリマーとみなされる。
【００２２】
ポリマーは、分子量が２００Ｄａ以上、４００Ｄａ以上、８００Ｄａ以上、１０００Ｄａ以上、２０００Ｄａ以上、４０００Ｄａ以上、８０００Ｄａ以上、１００００Ｄａ以上、１０００００Ｄａ以上、または１００００００Ｄａ以上であってもよい。比較的低い質量、例えば８０００Ｄａ以下、具体的には４０００Ｄａ以下、さらに具体的には１０００Ｄａ以下のポリマーをオリゴマーと呼ぶことができる。
【００２３】
ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステルは、ポリマー主鎖中に存在しない、または次の重合ステップにおいて得られるポリマー主鎖中に存在しないカルボン酸、エステル、またはチオエステル基を意味する。
【００２４】
本発明が、生理活性部分と、ポリマーもしくはオリゴマーなどの化合物、または大きい重合性化合物、例えば１つを超える重合性部分を含む化合物中の立体的に近づき難いペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基との選択的抱合を可能にすることは特に驚くべきことである。
【００２５】
具体的には、本発明は、ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基が、（ａ）少なくとも２つの重合性部分と（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸残基とを含むポリマーまたは重合性化合物の一部分である方法に関する。
【００２６】
本発明による方法は、生理活性部分をポリマーまたは重合性化合物のペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基と選択的に抱合させるのに特に有用であるが、ポリマーまたは重合性化合物は、（ａ）少なくとも２つの重合性部分と（ｂ）少なくとも２つのアミン基を含むアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸残基とを含み、少なくとも２つのアミン基は、尿素基、チオ尿素基、ウレタン基、またはチオウレタン基を形成している。
【００２７】
したがって、本発明は、市販品として容易に入手可能なまたは容易に合成可能な出発化合物から得ることができるポリマーまたは重合性化合物中のペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基の選択的抱合を可能にする。例えば、ウレタンは、ジアミノ酸から調製することができるが、そのカルボン酸基は、第一級アルキルエステル、例えばＬ−リシンメチルエステルなどのメチルエステルで保護されている。
【００２８】
さらに、生理活性部分との高選択的抱合が、化学量論量の高価でかつ環境に優しくないカップリング剤を必要とすることなく実現できることは有利である。
【００２９】
ポリマーまたは重合性化合物は、ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基以外に、尿素基、チオ尿素基、ウレタン基、チオウレタン基、他のエステル基、アミド基、糖ペプチド基、カーボネート基、スルホン、および炭水化物基から選択される部分を含んでもよい。
【００３０】
本発明による方法は、さらに具体的には、生理活性部分を、式Ｉで表わされるポリマーまたは重合性化合物：
【化１】
2011511829.tif 000002
に選択的に抱合させるのに有用であり、
−Ｇは、少なくともｎ個の官能基を有する多官能性化合物の残基または部分Ｘであり、
−Ｘは、重合性基を含む部分を表し、
−Ｇ＝Ｘである場合、式Ｉは重合性化合物を表し、
−ＧがＸと異なる場合、式Ｉはポリマーまたはオリゴマーを表し、
−Ｙはそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮＲを表し、
−Ｗはそれぞれ独立に、ＯまたはＳを表し、
−Ｑは、ＯまたはＳを表し、
−Ｒはそれぞれ独立に、水素、あるいは１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む置換および非置換炭化水素から選択される基を表し、
−Ｌは、１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む置換または非置換炭化水素基を表し、
−ｎは、少なくとも１の値を有する整数であり、
−Ｚは、Ｈ、あるいは置換または非置換炭化水素基である。
【００３１】
原則として、Ｇは、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＲＮＨ、または−ＳＨで場合によっては官能化されている多官能性ポリマーまたはオリゴマーであり、反応して、式Ｉを生じる基は、−ＯＨ、第一級アミン、第二級アミン、または−ＳＨである。ＧがＸでない場合、Ｇは、ポリエステル、ポリチオエステル、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリチオエーテル、およびポリエーテルから選択されてもよい。
【００３２】
特に、Ｇは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ポリ酸無水物；ポリトリメチレンカーボネート；ポリオルトエステル；ポリジオキサノン；ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）；ポリウレタン；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；好ましくはポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドから選択されるポリアルキレンオキシド；ポリエーテル；ポロキサミン；ポリヒドロキシ酸；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリビニルピロリドン；ポリエチルオキサゾリン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシエチルセルロースやメチルヒドロキシプロピルセルロースなどのヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド、多糖および炭水化物（ポリスクロース、ヒアルラニックアシッド、デキストランおよびその誘導体、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、アルギネートなど）、ならびにタンパク質（ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、またはオバルブミンなど）などの天然ポリマー；ならびにこれらの部分のいずれかを含むそれらのコオリゴマー、コポリマー、およびブレンドから選択されてもよい。
【００３３】
部分Ｇは、その生物学的安定性および／または生分解性に基づいて選択されてもよい。生物学的安定性の高い化合物またはポリマーまたは物品を提供するには、ポリエーテル、ポリチオエーテル、芳香族ポリエステル、芳香族チオエステルが、一般に特に適している。生分解性を付与するオリゴマーおよびポリマーの好ましい例としては、脂肪族ポリエステル、脂肪族ポリチオエステル、脂肪族ポリアミド、および脂肪族ポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
好ましくは、Ｇは、ポリエステル、ポリチオエステル、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリチオエーテル、およびポリエーテルから選択される。特に、ポリエーテル、具体的にはポリアルキレングリコール、さらに具体的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で、良好な結果が実現した。
【００３５】
疎水性ポリマーの場合、Ｇは、好適にはポリブチレンオキシドまたはポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧＬ）などの疎水性ポリエーテルから選択されてもよい。
【００３６】
ＰＥＧなどのポリアルキレングリコールは、生成物が、タンパク質を含有する体液、例えば血液、血漿、血清、または細胞外マトリックスと接触している可能性がある用途において有利である。特に、汚損する傾向が少なく（非特異的タンパク質吸収が低い）、かつ／または生体組織の接着に有利な影響を及ぼすことがある。シグナル伝達ペプチドまたは生体分子が、細胞とコミュニケーションするのに必要であるとき、低汚損が望ましい。この場合、シグナル伝達ペプチドまたは生体分子が、非特異的タンパク質吸着によって隠蔽されることも覆われることもないことは重要である。
【００３７】
部分Ｇの数平均分子量（Ｍｎ）は、通常少なくとも２００ｇ／ｍｏｌ、特に少なくとも５００ｇ／ｍｏｌである。機械的特性の改善には、Ｍｎは好ましくは少なくとも２０００ｇ／ｍｏｌである。部分Ｇの数平均分子量は、通常１０００００ｇ／ｍｏｌまでである。数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で求められる。
【００３８】
炭化水素基Ｚは、原則として、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、およびＩの群から選択される１つまたは複数のヘテロ原子など、１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む任意の置換または非置換アルキルまたはアリール基であってもよい。通常、Ｃ原子の数は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個である。炭化水素は、直鎖状、分枝状、または環状であってもよい。アルキル基が保護基として極めて適しているので、最も好ましいのはアルキル基である。アルキル基は、非置換アルキル基でも、置換アルキル基、例えばヒドロキシアルキル基でもよい。
【００３９】
好ましくは、アルキル基は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルとすることができる。最も好ましくは、アルキル基はメチル基である。
【００４０】
原則として、重合性化合物中の重合性部分（式Ｉにおいて、「Ｘ」など）は、ポリマーの生成を可能にする部分であればいずれでもよい。特に、付加反応によって重合可能な部分から選択してもよい。このようなタイプの反応は、容易であり、うまく制御できることが判明した。さらに、重合反応は、脱離基から生成された生成物など、望ましくない副生物を生成することなく実施することができる。
【００４１】
好ましくは、重合性部分によって、ラジカル重合が可能になる。これは、熱開始重合反応の代わりに、光開始剤の存在下、ＵＶ、可視光、マイクロ波、近ＩＲ、γ線などの電磁放射線、または電子線により重合を開始することが可能になるので有利であることが判明した。これにより、ポリマーまたは重合性化合物（の一部分）の熱変性もしくは分解のリスクが全くなく、または少なくとも低下して、急速な重合が可能になる。熱重合は、特に生物学的部分、または熱が加われば影響を受けるはずの部分が存在しない場合に使用してもよい。例えば、熱重合は、１つまたは複数のオリゴペプチドおよび／またはタンパク質が、生理活性部分を形成し、またはその一部分であり、その活性部位が、高温での重合に必要とされる高温の影響を受けないとき使用してもよい。
【００４２】
重合性部分（式Ｉにおいて、「Ｘ」）の好ましい例としては、Ｃ＝Ｃ結合（特に、ビニル基）またはＣ≡Ｃ基（特に、アセチレン基）などの不飽和炭素−炭素結合を含む基、チオール基、エポキシド、オキセタン、ヒドロキシル基、エーテル、チオエーテル、ＨＳ−、Ｈ２Ｎ−、−ＣＯＯＨ、ＨＳ−（Ｃ＝Ｏ）−、またはそれらの組合せ、特にチオールとＣ＝Ｃ基の組合せが挙げられる。
【００４３】
特に好ましいのは、ヒドロキシル（メタ）アクリレートを含めて、アクリレート；ヒドロキシルアルキル（メタ）アクリレートを含めて、アルキル（メタ）アクリレート；ビニルエーテル；アルキルエーテル；不飽和ジエステルおよび不飽和二酸もしくはその塩（フマル酸塩など）；ならびにビニルスルホン、ビニルホスフェート、アルケン、不飽和エステル、フマレート、マレエート、またはそれらの組合せからなる群から選択される重合性部分である。より好ましいのは、アクリレート、メタクリレート、イタコネート、ビニルエーテル、プロペニルエーテル、アルキルアクリレート、およびアルキルメタクリレートから選択される部分である。最も好ましいのは、（メタ）アクリレートおよびアルキル（メタ）アクリレート、特にヒドロキシアルキルメタアクリレートおよびヒドロキシアルキルアクリレートから選択される部分である。このような部分は、容易に入手可能な出発材料から出発して、本発明の重合性化合物に導入することができ、良好な生体適合性を示し、インビボまたは他の医学的用途に特に有用となる。
【００４４】
特に、Ｘ−Ｙ部分がヒドロキシエチルアクリレートまたはヒドロキシエチルメタクリレートを表す重合性化合物で、良好な結果が実現した。
【００４５】
さらに好ましい実施形態において、重合性部分Ｘは、式−Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＨ２で表わされ、式中、Ｒ１は、エステル部分、エーテル部分、チオエステル部分、チオエーテル部分、ウレタン部分、チオウレタン部分、アミド部分、ならびに１つまたは複数のヘテロ原子、特にＳ、Ｏ、Ｐ、およびＮから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む他の部分からなる群から選択される１つまたは複数の部分を場合によっては含む置換および非置換の脂肪族、脂環式、および芳香族炭化水素基の群から選択される。Ｒ１は、直鎖状でも、分枝状でもよい。特に、Ｒ１は、１〜２０個の炭素原子を含んでもよく、さらに具体的には置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキレン、さらに具体的には置換または非置換のＣ２〜Ｃ１４アルキレンであってもよい。Ｒ２は、水素、ならびに置換および非置換アルキル基の群から選択されるが、アルキル基は、１つまたは複数のヘテロ原子、特にＰ、Ｓ、Ｏ、およびＮから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む。Ｒ２は、直鎖状でも、分枝状でもよい。特に、Ｒ２は、水素、または置換または非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル、特に置換または非置換のＣ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。
【００４６】
アミノ酸部分（式Ｉにおいて、「Ｌ」）は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、および／またはＯなど、ヘテロ原子を含有してもよい置換または非置換炭化水素である。
【００４７】
アミノ酸部分Ｌは、アミノ酸のＤ型異性体に基づいても、Ｌ型異性体に基づいてもよい。好ましくは、ＬはＣ１〜Ｃ２０炭化水素であり、より好ましくは、Ｌは直鎖状または分枝状Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、さらにより好ましくはＣ２〜Ｃ１２アルキレン、最も好ましくはＣ３〜Ｃ８アルキレンであり、アルキレンは、置換されていなくても、置換されていてもよく、かつ／または１つまたは複数のヘテロ原子を場合によっては含む。炭素原子の数は、８個以下など、好ましくは比較的少ない。
【００４８】
ポリマーまたは重合性化合物が医学的用途で使用されるよう意図されている場合、さらに具体的にはインビボで使用されるよう意図されている場合、アミノ酸部分は天然アミノ酸に基づくことが好ましい。これは、化合物またはポリマーが生分解性である場合に特に望ましい。それを考慮して、好ましいアミノ酸部分は、Ｌ型またはＤ型立体配置の、あるいはＤ型異性体もしくはＬ型異性体のラセミ化合物としてのまたは任意の混合物としてのリシン、ヒドロキシリシン、メチル化リシン、アルギニン、アスパラギン、ジアミノブタン酸、およびグルタミンの部分である。好ましくは、アミノ酸部分はＬ型立体配置である。特に、Ｌ−リシンで、良好な結果が実現した。
【００４９】
さらに具体的には、本発明は、重合性化合物が式Ｉで表わされる方法であって、式中、
−ＧはＸであり、
−Ｙはそれぞれ、Ｏであり、かつＸはそれぞれ、ヒドロキシアルキレン、ヒドロキシエチルアクリレート、またはヒドロキシエチルメタクリレートを含む部分を表し、
−Ｒはそれぞれ、水素を表し、
−Ｌは、アミノ酸部分を表し、
−ｎ＝１であり、
−ＷはＯであり、
−ＱはＯであり、
−Ｚは、Ｈ、または１〜６個のＣ原子を有するアルキル基である
方法に関する。
【００５０】
さらにより好ましくは、本発明は、重合性化合物が式Ｉで表わされる方法であって、式中、
−ＧはＸであり、
−Ｘはそれぞれ、ヒドロキシエチルアクリレートまたはヒドロキシエチルメタクリレートを含む部分を表し、
−Ｙはそれぞれ、Ｏを表し、
−Ｒはそれぞれ、水素を表し、
−Ｌは、アミノ酸部分を表し、
−ｎ＝１であり、
−ＷはＯであり、
−ＱはＯであり、
−Ｚは、メチル、エチル、またはｎ−プロピル基である
方法に関する。
【００５１】
生理活性部分は、例えば薬剤、安定化剤、抗血栓性部分、親水性を増加させる部分、または疎水性を増加させる部分から選択される。
【００５２】
例えば、生理活性部分は、細胞シグナル伝達部分、化合物、ポリマーまたは物品への細胞接着を改善することができる部分、細胞増殖（増殖の刺激または抑制など）を制御することができる部分、抗血栓性部分、創傷治癒を改善することができる部分、神経系に影響を及ぼすことができる部分、特定の組織または細胞の種類に対して選択的親和性を有する部分、および抗菌性部分から選択されてもよい。部分は、化合物、ポリマー、もしくは物品の残部に結合しているとき、および／またはそれから遊離するとき、活性を発揮することができる。抱合させることができる生理活性部分の例としては、パーフルオロアルカン、ポリエチレンオキシドやポリプロピレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド（親水性を増加させ、かつおよび／または汚損を低減するため）；ポリオキサゾリン；アミノ酸；環式ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、糖ペプチドを含めてペプチド、および糖タンパク質を含めてタンパク質；モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドを含めてヌクレオチド；ならびに炭水化物が挙げられる。好ましくは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質が抱合される。
【００５３】
創傷治癒を刺激するため、アミノ酸（アルギニン、グルタミン）を、または神経系の機能を調節するのにアミノ酸（アスパラギン）を抱合させてもよい。
【００５４】
ペプチドは、生物学的応答（例えば、細胞の成長増殖または細胞接着の増強）を増強または抑制することができるエピトープであり得る。例えば、抗体結合の増強が必要とされる場合、エピトープが最も明白な選択である。
【００５５】
ペプチドの例は、アミノ酸から構成される、表Ｉに記載されるような配列を含み、その略語は当業者に周知である。
【００５６】
【表１】
2011511829.tif 000003
【００５７】
環式ペプチドの好ましい例は、抗菌剤であるグラマシジンＳである。
【００５８】
適当なペプチドの別の例としては、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＯＰ）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ  １）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。特に、本発明の化合物の一部分を形成してもよいタンパク質の例としては、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞外マトリックスタンパク質、グリコサミノグリカン、アンジオポエチン、エフリン、および抗体が挙げられる。
【００５９】
好ましい炭水化物は、抗血栓性であるヘパリンである。
【００６０】
ヌクレオチドは、特に遺伝子療法用ヌクレオチドなど治療用ヌクレオチド、および好ましくは高い選択性および／または親和性を有して細胞性またはウイルス性タンパク質に結合することができるヌクレオチドから選択されてもよい。
【００６１】
好ましいヌクレオチドとしては、アプタマーが挙げられる。ＤＮＡベースとＲＮＡベースの両方のアプタマーの例は、Ｎｉｍｊｅｅら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ２００５，５６，５５５−５８３に記載されている。ウイルス性ＴＡＴタンパク質または細胞性タンパク質サイクリンＴ１に結合して、ＨＩＶ複製を抑制するＲＮＡリガンドＴＡＲ（トランス活性化応答）は、アプタマーの一例である。さらに、好ましいヌクレオチドとしては、ＶＡ−ＲＮＡ、および細胞増殖を調節する転写因子Ｅ２Ｆが挙げられる。
【００６２】
加水分解酵素は、好ましくはカルボン酸エステル加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１）、チオエステル加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．２）、またはペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４）の群から選択される。
【００６３】
好ましくは、加水分解酵素は、セリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．１８）、セリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２３）、またはメタロエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２４）の群から選択されるペプチダーゼである。最も好ましい酵素は、サブチリシン（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２１．６２）などのセリンエンドペプチダーゼ、好ましくはサブチリシン・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、またはパパイン（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２２．２）などのシステインエンドペプチダーゼである。酵素は、好ましくはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、リポザイム（ｌｙｐｏｚｙｍｅ）ＲＭ、ピカンターゼ（Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ）Ａ（登録商標）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、熱安定エステラーゼまたはリリパーゼ（ｌｉｌｉｐａｓｅ）から選択されるカルボン酸エステル加水分解酵素から選択されてもよい。
【００６４】
加水分解酵素は、任意の有機体、特に動物、植物、細菌、カビ、酵母、または真菌から得るまたは誘導することができる。特定の供給源からの酵素について述べられているとき、第１有機体を起源とするが、実際には（遺伝子組換え）第２有機体において産生された組換え酵素は、具体的にはその第１有機体に由来する酵素として包含されるよう意図されている。
【００６５】
加水分解酵素を固定化し、具体的には例えばアクリル酸担体などの担体にロードし、またはその保持されていない、すなわち遊離の形で使用してもよい。適当な固定化技法は、一般に当技術分野で周知である。
【００６６】
ペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステルを抱合し、さらに具体的にはペンダント型メチルエステルを抱合するために、特にペプチダーゼ、特にエンドペプチダーゼ、より好ましくはパパインまたはサブチリシンで、良好な結果が実現した。
【００６７】
本プロセスにおいて存在または使用する酵素の量を絶対値（例えば、グラム）で決定するのは、その純度が低い場合が多く、かつ一部分が不活性または部分活性な状態である可能性があるので困難である。より関連したパラメータは、酵素調製物の活性および任意の汚染酵素の活性である。これらの活性は、通常標準条件下で１分間当たり１マイクロモルの基質の変化を触媒する量と定義される活性単位（Ｕ）で表して測定される。典型的には、これは、純酵素の場合１０−６〜１０−１１ｋｇ、および工業用酵素調製物の場合１０−４〜１０−７ｋｇを表す。ポリマーまたは重合性化合物１グラム当たりの加水分解酵素の量は、原理的にはクリティカルではなく、例えばペンダント型カルボン酸、エステル、またはチオエステル基の反応性および酵素の費用価格に依存する可能性がある。酵素の典型的な量は、重合性化合物のポリマー１グラム当たり０．０１〜１０００Ｕである。好ましくは、０．１〜１００Ｕ／ｇが使用され、最も好ましくは１〜１０Ｕ／ｇが使用される。
【００６８】
生理活性部分のポリマーまたは重合性化合物への抱合は、一般に穏やかな条件および／または環境に優しい条件下で実施し得る。例えば、ポリマーまたは重合性化合物中に存在するいずれの加水分解性基も加水分解するはずである高酸性またはアルカリ性条件は必要とされない。通常、抱合は、ほぼ中性のｐＨ、わずかにアルカリ性またはわずかに酸性のｐＨ、例えば４〜１０のｐＨで実施してもよい。ポリマーまたは重合性化合物、酵素、および反応条件に依存する特定のｐＨは、当業者が容易に決定することができる。
【００６９】
特に酵素が十分に選択的な活性を示す場合、よりアルカリ性または酸性のｐＨも原理的には使用してもよい。好ましいｐＨは、ｐＨの関数として既知のまたは実験的に決定可能な酵素活性曲線、および本明細書に開示する情報に基づいて選択することができる。
【００７０】
本発明による方法は、水、水と１つもしくは複数の水混和性有機溶媒の混合物、水と１つもしくは複数の水不混和性有機溶媒の混合物、または１つまたは複数の有機溶媒中で実施することができる。１つまたは複数の有機溶媒が使用される場合、低級アルコールの群、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールから選択されてもよい。アルコールは、第一級アルコールでも、第二級アルコールでも、第三級アルコールでもよい。特に好ましいのは、ｔ−ブタノールまたはｔ−アミルアルコールなど第三級アルコールである。有機溶媒は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トルエン、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＢＴＥ）からも選択してもよい。
【００７１】
含水率は、ポリマーまたは重合性化合物、酵素、および反応条件に依存する。
【００７２】
酵素的抱合反応の温度は、温度の関数としての酵素活性や特定の温度における酵素の安定性などの因子を考慮して、通常広い制限内で選択することができる。通常、温度は少なくとも０℃、特に少なくとも１０℃、より好ましくは少なくとも１５℃である。通常、温度は８０℃まで、より好ましくは６０℃までである。
【００７３】
生理活性部分の抱合は、重合性化合物の場合、重合の前、最中、または後に行われてもよい。抱合は、ポリマーに形が与えられた後でさえ行われてもよい。形は、例えばコーティング、皮膜、多孔質足場、ミセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、リポソーム、繊維、ゲル、ロッド、またはポリメロソームであってもよい。
【００７４】
生理活性部分を抱合しているポリマーは、ポリマー−薬物コンジュゲートが化学療法で、また生物製剤を制御および標的薬物送達するために使用されている製薬部門においてだけでなく、ポリマー−ペプチドまたは抗体コンジュゲートを標的薬物送達するために使用する際にも広く使用されている。さらに、ポリマー−ペプチドコンジュゲートは、組織工学用の材料としても使用されている。
【００７５】
次に、下記の実施例で本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００７６】
方法および材料
ＨＰＬＣ法
ＨＰ１０９０液体クロマトグラフで、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）カラムを４０℃で使用して、分析用ＨＰＬＣ図を記録した。ＵＶ検出は、ＵＶＶＩＳ２０４Ｌｉｎｅａｒ分光計を使用し２２０ｎｍで実施した。グラジエントプログラムは、０〜２５分の直線グラジエントランプで緩衝液Ｂ５％→９８％、２５．１〜３０分から緩衝液Ｂ５％まで（緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ中０．５ｍｌ／Ｌ  メタンスルホン酸（ＭＳＡ）、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．５ｍｌ／Ｌ  ＭＳＡ）である。流速は、０〜２５．１分では１ｍＬ／分、および２５．２〜２９．８分では２ｍｌ／分であり、次いで３０分に終了するまで１ｍｌ／分に戻した。注入量は２０μＬであった。アジレント１１００シリーズシステムで、分析ＨＰＬＣの場合と同じカラムおよび同一の流速条件を用いて、ＨＰＬＣ−ＭＳ図を記録した。
【００７７】
保持時間：
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅ：１７．０２分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＨ：１５．１０分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−ＮＨ２：１３．５６分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：１３．６１分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ：１６．２４分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＮＨ２：１５．７０分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ：１５．４６分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ：１０．４１分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ：１３．１５分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ：９．８１分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ−（ＯｔＢｕ）２：２３．８２分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｌｅｕ−ＮＨ２：１５．７分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ：２１．５分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｖａｌ−ＮＨ２：１４．８分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ：１８．３分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ：１５．９分
ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ：１５．８分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅ：２０．５分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＨ：１７．４分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ：１０．９分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ−（ＯｔＢｕ）２：２５．０分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ：２３．８分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ：１８．２分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ：１８．４分
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｇｌｙ−ＮＨ２：１４．７４分
【００７８】
材料
Ｉ．  ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２＿ＯＭｅの合成（図１）
Ｎα，Ｎε−ジ−（２−メタクリルオキシ−エトキシカルボニル）−Ｌ−リシンメチルエステル（ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２＿ＯＭｅ）を、以下の通り調製した。
【００７９】
Ｌ−リシン−ジイソシアネートメチルエステル（２５１ｍｍｏｌ）、スズ（ＩＩ）−エチルヘキサノエート（０．１２０ｇ）、およびイルガノックス（Ｉｒｇａｎｏｘ）１０３５（１５０ｍｇ）に、乾燥空気下、制御温度（＜５℃）で２−ヒドロキシエチル−メタクリレート（ＨＥＭＡ、５０２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を４０℃で１８時間撹拌した。この間に、ＩＲのν＝２２６０ｃｍ−１におけるＮＣＯ伸縮振動が消失していた。溶媒を真空で蒸発させて、生成物をオイルとして得た。
【００８０】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２２℃，ＴＭＳ）：δ  ６．１３−６．１０（ｍ，２Ｈ），５．５７（ｑ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，２Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｂｓ，１Ｈ），４．３５−４．２７（ｍ，９Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９３（ｓ，６Ｈ），１．８８−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．７４−１．６１（ｍ，１Ｈ），１．５５−１．４４（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．３０（ｍ，２Ｈ）．
【化２】
2011511829.tif 000004
【００８１】
ＩＩ．  ＬＤＩ−（４−ペンテン）２＿ＯＭｅの合成（図２）
Ｎα，Ｎε−ジ−（４−ペンテン−１−オキシカルボニル）−Ｌ−リシンメチルエステル（ＬＤＩ−（４−ペンテン）２＿ＯＭｅ）（図２）を、以下の通り調製した。
【００８２】
Ｌ−リシン−ジイソシアネート−メチルエステル（５．３ｇ、２５ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に、２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）（２５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃に冷却し、４−ペンテノール（４．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。反応をＩＲ分光法（２２６０ｃｍ−１、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）で観測した。２時間後、３７．５ｍｇの２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）（０．０９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応を０℃でさらに１時間維持し、次いで室温で１８時間撹拌した。最後に、有機溶媒を真空で除去して、無色オイルとして表題化合物を９．６ｇ（２５ｍｍｏｌ、収率１００％）得た。
【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２２℃，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）＝５．８０−５．６６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２）；５．１６（ｍ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２）；４．９５−５．０２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２）；４．６２（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−）；４．２６（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ−）；４．０（ｍ，４Ｈ，−（Ｃ＝Ｏ）ＯＣＨ２−）；３．６９（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３）；３．１０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）；２．０５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）；１．８２−１．４１（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２−，−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）．
【化３】
2011511829.tif 000005
【００８４】
［実施例１］
サブチリシン−ＡによるＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２＿ＯＭｅおよびＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅへのペプチドカップリング（図３）
１．５ｍＬのアセトニトリル中１１０μｍｏｌのＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２＿ＯＭｅまたはＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅの溶液を撹拌して、表ＩＩおよびＩＩＩに示すように２．６ｍＬのＤＭＦに２〜４当量のアミノ酸またはペプチド誘導体および２〜４当量のピペリジンを溶解した溶液を添加した。続いて、０．２ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏに溶解した２２ｍｇのサブチリシン−Ａ（バッチ番号８３５６０５６、１ｍｇ当たりの活性単位７〜１５単位、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ製）を添加し、反応混合物を周囲温度で撹拌した。反応をＨＰＬＣ分析で観測した。
【００８５】
反応混合物から、一定の時間間隔で１０μＬずつ試料を採取した。１０μＬの試料を０．５ｍＬのアセトニトリルまたはメタノールで希釈し、シリンジフィルタ（アジレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、再生セルロースのメンブラン、孔径０．４５μｍ、直径１３ｍｍ）で濾過し、ＨＰＬＣで分析した。
【００８６】
生成物の同定は、未精製反応混合物を使用してＨＰＬＣ−ＭＳにより、またはそのＨＰＬＣ図と化学的に合成された基準化合物のＨＰＬＣ図との比較により行った。アジレント１１００シリーズシステムで、分析ＨＰＬＣの場合と同じカラムおよび同一の流速条件を用いて、ＨＰＬＣ−ＭＳ図を記録した。結果を表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
【化４】
2011511829.tif 000006
【００８７】
反応中に、ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅ出発材料は、ペプチド（またはアミノ酸）求核試薬と酵素カップリングすることによって所望の生成物であるＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ペプチドに変換される。選択される酵素の加水分解活性のため、ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅは、（水が存在する場合）対応するＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＨに部分加水分解される。
【００８８】
典型的な最終反応混合物中に存在する化合物は、出発材料ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅ、ペプチド（またはアミノ酸）、生成物ＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ペプチド（またはＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−アミノ酸）、および加水分解されたＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＨである。
【００８９】
ＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅのカップリングについても、同じ反応スキームが当てはまる。
【００９０】
［実施例２］
パパインによるＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅおよびＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅへのペプチドカップリング
１．２ｍＬのアセトニトリル中１１０μｍｏｌのＬＤＩ−（ＨＥＭＡ）２−ＯＭｅまたはＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅの撹拌した溶液に、２〜８当量のアミノ酸またはペプチド誘導体の溶液を添加した。ＨＣｌ塩として使用されたアミノ酸またはペプチド誘導体の場合、同じ当量のトリエチルアミンを添加した（表ＩＩを参照のこと）。続いて、表ＩＩおよびＩＩＩに示すように１０ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００ｍｇのパパイン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）製、カリカ・パパイア（Ｃａｒｉｃａ  Ｐａｐａｙａ）由来、３００００ＵＳＰ−Ｕ／ｍｇ、ａｒｔ．  ７１４４、バッチ番号３３３  Ｆ６７７０４４）、および０．８ｍＬの１００ｍＭ緩衝液を添加し、反応混合物を３７℃で撹拌した。
【００９１】
反応をＨＰＬＣ分析で観測した。反応混合物から、一定の時間間隔で１０μＬずつ試料を採取した。１０μＬの試料を０．５ｍＬのアセトニトリルで希釈し、シリンジフィルタ（アジレントテクノロジーズ、再生セルロースのメンブラン、孔径０．４５μｍ、直径１３ｍｍ）で濾過し、ＨＰＬＣで分析した。
【００９２】
生成物の同定は、未精製反応混合物を使用してＨＰＬＣ−ＭＳにより、またはそのＨＰＬＣ図と化学的に合成された基準化合物のＨＰＬＣ図との比較により行った。アジレント１１００シリーズシステムで、分析ＨＰＬＣの場合と同じカラムおよび同一の流速条件を用いて、ＨＰＬＣ−ＭＳ図を記録した。
【００９３】
結果を表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
【００９４】
【表２】
2011511829.tif 000007
【００９５】
反応収率は、ＨＰＬＣ分析で面積百分率として、以下の通り定義して決定した。
【数１】
2011511829.tif 000008
【００９６】
ペプチドまたはアミノ酸がＰｍｃ基を含む場合、反応収率は、ＨＰＬＣ分析で面積百分率として、以下の通り定義して決定した。
【数２】
2011511829.tif 000009
【００９７】
表ＩＩおよびＩＩＩに記載された反応時間は、所望の生成物への最大変換率と相関する。
【００９８】
【表３】
2011511829.tif 000010
【００９９】
反応収率は、ＨＰＬＣ分析で面積百分率として、以下の通り定義して決定した。
【数３】
2011511829.tif 000011
【０１００】
ペプチドまたはアミノ酸がＰｍｃ基を含む場合、反応収率は、ＨＰＬＣ分析で面積百分率として、以下の通り定義して決定した。
【数４】
2011511829.tif 000012
【０１０１】
表ＩＩおよびＩＩＩから、アミノ酸またはペプチド求核試薬がＮ末端にＧｌｙを有する場合、サブチリシンを使用することが好ましいことが明らかである。Ｎ末端に別のアミノ酸またはペプチド求核試薬が使用されている場合、パパインを使用することが好ましい。
【０１０２】
［実施例３］
Ｃａｌ−ＢによるＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅへのペプチドカップリング
２．０ｍＬのアセトニトリル中０．５ｍｍｏｌのＬＤＩ−（４−ペンテン）２−ＯＭｅの撹拌した溶液に、４当量のＨ−Ｇｌｙ−ＮＨ２．ＨＣｌ（２２０ｍｇ）および４当量のピペリジン（０．２０ｍＬ）を添加した。続いて、２２０ｍｇのＣａｌ−Ｂ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ製、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＮｏｖｏｚｙｍ  ４３５、バッチ番号ＬＣ２００２０４）を添加し、反応混合物を５０℃で撹拌した。３日後、出発材料の１５％が、生成物のＬＤＩ−（４−ペンテン）２−Ｇｌｙ−ＮＨ２）に変換されていた。
【０１０３】
生成物の同定は、未精製反応混合物を使用してＨＰＬＣ−ＭＳにより、かつそのＨＰＬＣ図と化学的に合成された参照化合物のＨＰＬＣ図との比較により行った。アジレント１１００シリーズシステムで、分析ＨＰＬＣの場合と同じカラムおよび同一の流速条件を用いて、ＨＰＬＣ−ＭＳ図を記録した。
【０１０４】
データはＨＰＬＣ面積百分率である。
【数５】
2011511829.tif 000013
【国際調査報告】
2011511829.tif 000015
2011511829.tif 000016
2011511829.tif 000017