(57)【要約】  ポリマーミセルおよび会合したポリヌクレオチドを含む組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーミセルおよび当該ミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、当該ミセルが複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、当該複数のブロックコポリマーは、ほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で当該ミセルが安定であるように会合し、
（ａ）当該ミセルが以下から選択される２以上の特徴をさらに有し：
（ｉ）当該ミセルがミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを有する、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、
（ｉｉｉ）核酸の非存在下での自発的なミセル集合；
（ｉｖ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン；
（ｖ）粒径、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ；
（ｂ）当該ブロックコポリマーが以下から選択される１以上の特徴を有する組成物：
（ｉ）当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０、
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０。
【請求項２】
ポリマーミセルおよび当該ミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、当該ミセルが複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、当該複数のブロックコポリマーは、ほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で当該ミセルが安定であるように会合し、
（ａ）当該ミセルが以下から選択される２以上の特徴をさらに有し、
（ｉ）当該ミセルがミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを有する、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、０．５Ｍ ＮａＣｌ中、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、
（ｉｉｉ）核酸の非存在下での自発的なミセル集合；
（ｉｖ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン；
（ｂ）当該ブロックコポリマーが以下から選択される１以上の特徴を有する組成物：
（ｉ）当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０、
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０。
【請求項３】
ポリマーミセルおよび当該ミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、当該ミセルが複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、当該複数のブロックコポリマーがほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で当該ミセルが安定であるように会合し、当該ミセルは以下から選択される２以上の特徴をさらに有する組成物：
（ｉ）会合数、ミセルあたり約１０〜約１００の鎖、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、
（ｉｉｉ）粒径、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ。
【請求項４】
ポリマーミセルおよび当該ミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、当該ミセルが複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、当該複数のブロックコポリマーがほぼ中性ｐＨの水性溶媒で当該ミセルが安定であるように会合し、当該ブロックコポリマーは以下から選択される２以上の特徴をさらに有する組成物：
（ｉ）当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０、
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０、
（ｉｉｉ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン。
【請求項５】
当該ミセルが副段落（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の特徴のうち３つ以上を有する請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
当該ミセルが副段落（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の全ての特徴を持つ請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
当該ブロックコポリマーが副段落（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の全ての特徴を有する請求項１または３に記載の組成物。
【請求項８】
当該ブロックコポリマーが、当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
当該ブロックコポリマーが、当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１．５〜約１：６を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
当該ブロックコポリマーが、当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：２〜約１：４を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
当該ミセルが、ミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
当該ミセルが、ミセルあたり約２０〜約６０のブロックコポリマーを含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
当該ミセルが、ミセルあたり約３０〜約５０のブロックコポリマーを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
当該ミセルが臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬを有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
当該ミセルが臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬを有する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
当該ミセルが臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬを有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
当該ブロックコポリマーが、当該親水性ブロック対当該疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１．５〜約１：６を有し、当該ミセルが、
（ｉ）ミセルあたり約２０〜約６０のブロックコポリマーを含み、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬを有する
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
当該ブロックコポリマーが、当該親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：２〜約１：４を有し、当該ミセルが、
（ｉ）ミセルあたり約３０〜約５０のブロックコポリマーを含み、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬを有する
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
当該ブロックコポリマーが多分散性指数、約１．０〜約２．０を有する請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
当該ブロックコポリマーが多分散性指数、約１．０〜約１．７を有する請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
当該ブロックコポリマーが多分散性指数、約１．０〜約１．４を有する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
当該ミセルが凝集分子量Ｍｗ、約０．５×１０６〜約３．６×１０６を有する請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
当該ミセルが凝集分子量Ｍｗ、約０．７５×１０６〜約２．０×１０６を有する請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
当該ミセルが凝集分子量Ｍｗ、約１．０×１０６〜約１．５×１０６を有する請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
当該ミセルが粒径、約５ｎｍ〜約５００ｎｍを有する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
当該ミセルが粒径、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍを有する請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
当該ミセルが粒径、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍを有する請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
各々のミセルと会合しているポリヌクレオチドの数が、約１〜約１００００である請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
各々のミセルと会合しているポリヌクレオチドの数が、約４〜約５０００である請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
各々のミセルと会合しているポリヌクレオチドの数が、約１５〜約３０００である請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
各々のミセルと会合しているポリヌクレオチドの数が、約３０〜約２５００である請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
当該ミセルが、複数のカチオン性モノマー単位を含むブロックコポリマーを含み、当該親水性ブロック中の当該カチオン種が当該ポリヌクレオチドとイオン会合している請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
当該カチオン性モノマー単位がカチオン性モノマー、非電荷ブレンステッド塩基モノマーまたはそれらの組み合わせの残基である請求項３４に記載の組成物。
【請求項３４】
当該ポリヌクレオチドがａＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡである請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
当該ポリヌクレオチドが当該ミセルの中心にない請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
当該ミセルが、当該親水性ブロックおよび／または当該疎水性ブロック中に複数のアニオン性モノマー単位を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
当該ミセルが、当該親水性ブロックおよび／または当該疎水性ブロック中に複数の非電荷モノマー単位を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
当該ミセルが、当該親水性ブロックおよび／または当該疎水性ブロック中に複数の両性イオンモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
当該ミセルが、当該疎水性ブロック中に複数の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
当該ミセルが、当該疎水性ブロック中に少なくとも２０の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
当該ミセルが、当該疎水性ブロック中に少なくとも１５の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
当該ミセルが、当該疎水性ブロック中に少なくとも１０の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
当該ミセルが、当該疎水性ブロック中に少なくとも５の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
１以上の当該複数のブロクックコポリマーに共有結合的に結合した１以上のポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体（polymer bioconjugate）を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
当該ポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
当該ミセルが、プロトン化可能なアニオン種および複数の疎水性種を有する複数のモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
当該アニオン性モノマー単位が、アニオン性モノマー、非荷電ブレンステッド酸モノマーまたはそれらの組み合わせの残基である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
当該ミセルが、疎水性種を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
当該１以上のブロックコポリマーが膜不安定化ブロックコポリマーである請求項１〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年５月１３日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／０５２，９０８、２００８年５月１３日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／０５２，９１４、２００８年８月２２日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／０９１，２９４、２００８年１１月６日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／１１２，０４８、２００８年１２月２４日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／１４０，７７４および、２００９年４月２１日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／１７１，３６９、２００８年１２月２４日出願のＮｏ．６１／１４０，７７９、２００８年１１月６日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／１１２，０５４、２００９年４月２１日出願の米国仮出願Ｎｏ．６１／１７１，３５８の優先権を主張し、その各々は引用により全体としてここに組み込まれる。
【０００２】
ここに記載されるのは、ポリマーから形成されるミセルおよび前記ミセルの使用である。
【背景技術】
【０００３】
ある場合において、治療剤、例えばポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を生細胞に提供することが有利である。ある場合において、前記ポリヌクレオチドの生細胞への送達により治療的有用性が提供される。
【発明の概要】
【０００４】
ここで提供されるのは、治療剤の細胞内送達のためのミセル（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、前記細胞内送達はインビトロであり；別の実施形態において、前記細胞内送達はインビボである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルは特に、患者における所望の部位の治療的介入のミセルの正味重量の標的送達のために設計される。したがってミセルは、好ましくは生理学的ｐＨでの希釈に対して安定である。いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルは生理学的条件下で安定であり、ミセルの望ましくない解離を防止する臨界ミセル濃度を有する。更なるまたは別の実施形態において、ここで記載されるミセルを含むブロックポリマーは生理学的条件下で増強されたミセルの完全性のために設計されたブロック割合、ブロックサイズおよび／または中心的性質および／または外殻特性を有する。更なるまたは別の実施形態において、生理学的環境でのミセルの完全性もまた、ミセルを含むブロックコポリマーの組成に依存する。したがってここで提供されるのは、最小の毒性および／またはミセルの正味重量の損失による治療剤の効率的な細胞内送達に適切なミセルを提供するために設計される特定のパラメータ（例えば、ミセルの外殻ブロックおよび中心ブロックにおけるブロックコポリマーの数平均分子量、ブロックコポリマーの荷電部分の数など）である。
【０００６】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ポリマーミセルおよびミセルに会合するポリヌクレオチドを含む組成物であり、ミセルは複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーは親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、複数のブロックコポリマーは、ミセルがほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で安定であるように会合し、
（ａ）ミセルはさらに以下から選択される２以上の特性を有する：
（ｉ）ミセルが、ミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを含む、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ
（ｉｉｉ）核酸の非存在下での自発的ミセル会合、
（ｉｖ）重量平均分子量約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン；
（ｖ）粒径約５ｎｍ〜約５００ｎｍ；および
（ｂ）以下から選択される１以上の特性；
（ｉ）疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比が１：１〜１：１０、および
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０。
【０００７】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ポリマーミセルおよびミセルと会合するポリヌクレオチドを含む組成物であり、各々のブロックコポリマーは親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、複数のブロックコポリマーはほぼ中性ｐＨの水系溶媒中でミセルが安定であるように会合し、
（ａ）ミセルは以下から選択される２以上の特性をさらに有する：
（ｉ）ミセルが、ミセルあたり約１０〜１００のブロックコポリマーを含む、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ中で約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ；
（ｉｉｉ）核酸の非存在下での自発的ミセル会合、
（ｉｖ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン；および
（ｂ）以下から選択される１以上の特性を有するブロックポリマー：
（ｉ）疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０、および
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０。
【０００８】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ポリマーミセルおよびミセルと会合するポリヌクレオチドを含む組成物であり、ミセルは複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーは親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、複数のブロックコポリマーがほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で安定であるように会合し、ミセルはさらに以下から選択される２以上の特性を有する：
（i）会合数、ミセルあたり約１０〜１００鎖、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ
（ｉｉｉ）粒径約５ ｎｍ〜約５００ ｎｍ
いくつかの実施形態において提供されるのは、ポリマーミセルおよびミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物であり、ミセルは複数のブロックコポリマーを含み、各々のブロックコポリマーは親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含み、複数のブロックコポリマーは、ほぼ中性の水系溶媒中でミセルが安定であるように会合し、ブロックコポリマーは以下から選択される２以上の特性を有する：
（ｉ）疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０、
（ｉｉ）多分散性指数、約１．０〜約２．０、および
（ｉｉｉ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ ｇ／ｍｏｌ。
【０００９】
ある実施形態において、副段落（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）（ｉｖ）および（ｖ）の３つ以上の特性を有する。ある実施形態において、副段落（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のすべての特性を有する。
【００１０】
ある実施形態において組成物は副段落（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のすべての特性を有するブロクコポリマーを含む。いくつかの実施形態においてブロックコポリマーは、疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１〜約１：１０を有する。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１．５〜約１：６を有する。ある実施形態においてブロックコポリマーは疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：２〜約１：４を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組成物はミセルあたり約１０〜１００のブロックコポリマーを含むミセルを含む。いくつかの実施形態において、ミセルはミセルあたり約２０〜約６０のブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルはミセルあたり約３０〜約５０のブロックコポリマーを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において組成物は、約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの臨界ミセル濃度ＣＭＣを有するミセルを含む。いくつかの実施形態においてミセルは、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの臨界ミセル濃度ＣＭＣを有する。いくつかの実施形態においてミセルは、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの臨界ミセル濃度ＣＭＣを有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において組成物は、疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：１．５〜約１：６を有するブロックコポリマーを含み；ミセルは
（ｉ）ミセルあたり約２５〜約６０のブロックコポリマーを含み、および
（ｉｉ）約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの臨界ミセル濃度を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態においてブロックコポリマーは、疎水性ブロック対親水性ブロックの数平均分子量Ｍｎ比、約１：２〜約１：４を有し；ミセルは：
（ｉ）ミセルあたり約３０〜約５０のブロックコポリマーを含み、および
（ｉｉ）約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの臨界ミセル濃度ＣＭＣを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは約１．０〜約２．０の多分散性指数を有する。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、約１．０〜約１．７の多分散性指数を有する。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは約１．０〜約１．４の多分散性指数を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ここで提供される組成物は約０．５×１０６〜約３．６×１０６の凝集分子量Ｍｗを有するミセルを含む。いくつかの実施形態において、ミセルは約０．７５×１０６〜２．０×１０６の凝集分子量Ｍｗを有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約１．０×１０６〜約１．５×１０６の凝集分子量Ｍｗを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ミセルは約５ｎｍ〜約５００ｎｍの粒径を有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの粒径を有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約２０ｎｍ〜約１００ｎｍの粒径を有する。
【００１８】
ここで提供される組成物のいくつかの実施形態において、各々のミセルと会合するポリヌクレオチドの数は約１〜約１０，０００である。いくつかの実施形態において、各々のミセルと会合するポリヌクレオチドの数は約４〜約５，０００である。いくつかの実施形態において、各々のミセルと会合するポリヌクレオチドの数は約１５〜約３，０００である。いくつかの実施形態において、各々のミセルと会合するポリヌクレオチドの数は約４０〜約２，５００である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、複数のカチオン性モノマー単位であり、親水性ブロックにおけるカチオン種はポリヌクレオチドとイオン会合している。いくつかの実施形態において、カチオン性モノマー単位はカチオン性モノマー、非荷電のブレンステッド塩基モノマー、またはその組合せの残基である。
【００２０】
ここで提供される組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡｉ作用物質またはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはミセルの中心には存在しない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、親水性ブロックおよび／または疎水性ブロックにおける複数のアニオン性モノマー単位を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ミセルは複数の非荷電モノマー単位を親水性ブロックおよび／または疎水性ブロックに含むブロックコポリマーを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ミセルは、親水性ブロックおよび／または疎水性ブロッに複数の両性イオンモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ミセルは疎水性ブロックに複数の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルは疎水性ブロックに少なくとも２０の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルは疎水性ブロックに少なくとも１５の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルは疎水性ブロック中に少なくとも１０の荷電可能な残基を含むブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルは少なくとも５の荷電可能な残基を疎水性ブロックに含むブロックコポリマーを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ここで記載される組成物は、共有結合的に１以上の複数のブロックポリマーに結合する１以上のポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体（bioconjugate）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、プロトン化し得るアニオン種および複数の疎水性種を有する複数のモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、アニオン性モノマー単位はアニオン性モノマー、非荷電ブレンステッド酸モノマー、またはそれらの組合せの残基である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ミセルは、疎水性種を有する重合可能なモノマー由来の複数のモノマー単位を含むブロックコポリマーを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、ブロックコポリマーを不安定化する膜である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴および利点は、説明的な実施形態、ここで本発明の原理が利用されるが、ここで説明する以下の詳細な記載を参照することによってより良く理解され、その添付図面は以下である：
【図１】図１：組成物の説明的な例およびＲＡＦＴ合成したポリマーの特性。
【図２】図２：［ＰＥＧＭＡｗ］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーの合成の説明的な例。
【図３】図３：組成物の説明的な例およびＲＡＦＴ合成したポリマーの特性。
【図４】図４：組成物の説明的な例およびＰＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡコポリマーの特性。
【図５】図５：［ＰＥＧＭＡｗ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーの合成の説明的な例。
【図６】図６：組成物の説明的な例およびＲＡＦＴ合成したポリマーの特性。
【図７】図７：組成物の説明的な例およびＲＡＦＴ合成したポリマーの特性。
【図８】図８：ＰＤＳＭＡの合成。
【図９】図９：ｓｉＲＮＡ結合のためのＨＰＭＡ−ＰＤＳＭＡコポリマーの合成。
【図１０】図１０：ブロックコポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６のＮＭＲ分光法の説明的な例。
【図１１】図１１：有機溶媒中のポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の粒子安定性の説明的な例。
【図１２】図１２：ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の説明的な透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析。
【図１３】図１３：ポリマー構造に対するｐＨ効果の説明的な例。
【図１４】図１４：ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の臨界安定濃度（ＣＳＣ）の説明的な例。
【図１５】図１５：ｓｉＲＮＡと複合体を形成するポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の粒径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定の説明的な例。
【図１６】図１６：異なる電荷比でのポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６／ｓｉＲＮＡ錯体のゲルシフト分析の説明的な例。
【図１７】図１７：哺乳類細胞において培養されたｓｉＲＮＡ−ミセル複合体のノックダウン活性の説明的な例。
【図１８】図１８：哺乳類細胞において培養されたｓｉＲＮＡ−ミセル複合体のノックダウン活性の説明的な例。
【図１９】図１９：ポリマーミセルの不安定化活性およびそれらのｓｉＲＮＡ錯体の説明的な実証。
【図２０】図２０：細胞取り込みおよびポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の細胞内分布の説明的な蛍光顕微鏡法。
【図２１】図２１：ガラクトース末端官能化ポリ［ＤＭＡＥＭＡ］−マクロＣＴＡの説明的な例。
【図２２】図２２：ガラクトース官能化されたＤＭＡＥＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）またはＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）ジブロックコポリマーの説明的な例。
【図２３】図２３：結合可能なｓｉＲＮＡおよびピリジルジスルフィドアミンの構造の説明的な例。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
ここで、ある実施形態において提供されるのは、ポリマーミセルおよびミセルと会合したポリヌクレオチドを含む組成物である。一般に各々のブロックコポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含む。ある実施形態において、ここで記載されるポリマーミセルは、水系溶媒中、例えば中性ｐＨで安定となるような様式で会合する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ミセルを含むブロックコポリマーは外殻ブロックおよび中心ブロックを含む。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは疎水性の中心および親水性の外殻を含む。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは自己会合する。いくつかの実施形態において、ミセルの形成はポリヌクレオチド非存在下で起こる。いくつかの実施形態において、ミセルの形成はポリヌクレオチドの存在下で起こる。特定の実施形態において、ここで記載されるミセルは自発的に自己会合する。
【００３２】
ある実施形態において、ミセルの中心は複数の疎水性基を含む。いくつかの実施形態において、疎水性基はほぼ中性ｐＨで疎水性である。さらに特定の実施形態において、疎水性基は弱酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ約６および／または約ｐＨ５）でより疎水性である。ある実施形態において、２、４、１０、１５、２０以上の疎水性基が、ポリマーブロックに存在し、これは他の同様のポリマーブロックと共にミセルの中心を形成し得る。いくつかの実施形態において、疎水性基は約１以上のπ値を有する。化合物のπ値は、相対的な親水性−親油性値の尺度である（例えば、Ｃａｔｅｓ， Ｌ．Ａ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｉｅｓ ｂｙ Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔｓ” Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｄｕｃ．４５：１１−１３（１９８１）を参照のこと）。
【００３３】
特定の実施形態において、外殻ブロックは親水性である（例えば、ほぼ中性のｐＨにおいて）。いくつかの実施形態において、ミセルは約４．７〜約６．８のｐＨで不安定化するか、または解離する。
【００３４】
ある場合には、ここで提供されるのは生細胞への治療剤の送達のために適切なミセル組成物である（これは例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドを含む）。いくつかの実施形態において、ミセルは複数のブロックコポリマーと、任意に少なくとも１つの治療剤を含む。ある実施形態において、ここで提供されるミセルは生体適合性があり、安定であり（これは化学的および／または物理的安定を含む）、および／または再現可能に合成される。さらに、いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセル会合は非毒性であり（例えば、低い毒性を示す）、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチド）の正味重量を分解から保護し、自然発生的プロセス（例えばエンドサイトーシス）を介して生細胞に入り、および／または細胞と接触した後、治療剤（例えばオリゴヌクレオチドまたはペプチド）の正味重量を生細胞の細胞質へと送達する。ある場合には、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）がｓｉＲＮＡおよび／または他の「ヌクレオチドに基づく」薬剤であり、これは細胞中で少なくとも１つの遺伝子の発現を変更する。したがって、ある実施形態において、ここで提供されるミセルはｓｉＲＮＡまたはペプチドの細胞への送達に有用である。ある場合には、細胞はインビトロであり、他の場合、細胞はインビボ（例えば、人間の対象）である。いくつかの実施形態において、治療に効果的な量のｓｉＲＮＡまたはペプチドを含むミセルは、それを必要とする（例えば、ノックダウンされる遺伝子を必要とし、ここで投与されたｓｉＲＮＡにより遺伝子をノックダウンし得る）個体に投与される。特定の場合、ここで記載されるミセル組成物は、個体の特異的標的細胞へのｓｉＲＮＡまたはペプチドの送達に有用であるか、またはそのために特異的に設計されている。
【００３５】
定義
この出願に関して、特に示さない限り、単数形の使用には複数形も含まれ、またその逆も同様である。即ち、「ａ」および「ｔｈｅ」は、その語が何を修飾しようと１以上を指す。例えば「ポリマー」または「ヌクレオチド」は１のポリマーもしくはヌクレオチド、または複数のポリマーまたはヌクレオチドを指す。同様に、特に示さない限り、またはそのことが意図されないことが内容から明らかでない限り、「ポリマー」および「ヌクレオチド」は１のポリマーまたは１のヌクレオチド、および複数のポリマーまたはヌクレオチドを指す。
【００３６】
ここで用いられる通り、いずれかの相互作用により保持される場合、２つの成分または化合物は「結合して（ａｔｔａｃｈｅｄ）」おり、これには１以上の共有結合、１以上の非共有相互作用（例えば、イオン結合、静電力、ファンデルワールス相互作用、それらの組み合わせなど）またはそれらの組合せが含まれる。
【００３７】
脂肪族化合物または脂肪族基：「脂肪族化合物」または「脂肪族基」の語は、ここで用いられる通り、直鎖（即ち、非分枝）、分枝または環状（縮合、架橋およびスピロ縮合した多環を含む）であってよく、完全に飽和しているか、または１以上の不飽和単位を含んでもよいが、芳香族ではない炭化水素部分を意味する。他に示さない限り、脂肪族基は１〜２０の炭素原子を含む。
【００３８】
アニオン性モノマー：ここで用いられる通り、「アニオン性モノマー」または「アニオン性モノマー単位」はモノマーまたはモノマー単位であり、これはアニオン性荷電状態または非荷電状態に存在する基を有するが、非荷電状態は、例えば求電子剤の除去（例えば、プロトン（Ｈ＋）、例えばｐＨに依存した方法で）により、アニオン性荷電状態になることができる。ある場合には、ほぼ生理学的ｐＨで基は実質的にマイナスに荷電するが、弱酸性ｐＨでプロトン化し、実質的に中性になる。前記基の非限定的な例は、カルボキシル基、バルビツール酸およびその誘導体、キサンチンおよびその誘導体、ボロン酸、ホスフィン酸、スルフィン酸、ホスフェート、ならびにスルホンアミドを含む。
【００３９】
アニオン種：ここで用いられる通り、「アニオン種」は、アニオン性荷電または非荷電状態に存在する基、残基または分子であるが、非荷電状態は、求電子剤の除去により（例えば、プロトン（Ｈ＋）、例えばｐＨに依存した方法で）、アニオン性荷電状態になることができる。ある場合において、基、残基または分子は、ほぼ生理学的ｐＨで実質的にマイナスに荷電するが、弱酸性ｐＨでプロトン化を経て実質的に中性になる。
【００４０】
アリールまたはアリール基：ここで用いられる通り、「アリール」または「アリール基」の語は、単環、二環および三環系を指し、これは５〜１４の環の要素（ｍｅｍｂｅｒ）を有し、ここで系において少なくとも１つの環は芳香族であり、系において各々の環は３〜７の環の要素を含む。
【００４１】
ヘテロアルキル：「ヘテロアルキル」の語はアルキル基を意味し、ここで骨格の炭素原子の少なくとも１つはヘテロ原子に置換される。
【００４２】
へテロアリール：「ヘテロアリール」の語はアリール基を意味し、ここで環の要素の少なくとも１つはヘテロ原子である。
【００４３】
ヘテロ原子：「ヘテロ原子」の語は、水素または炭素以外の原子を意味し、例えば酸素、硫黄、窒素、リン、ホウ素、ヒ素、セレンまたはケイ素原子を意味する。
【００４４】
ここで用いられる通り、ミセルは、安定なミセルと同一、実質的に同様または同様の様式で機能せず、および／または同一、実質的に同様または同様の物理的および／または化学的特性を持たない場合、「崩壊」している。ミセルの「崩壊」は、いずれかの適切な様式により決定し得る。ある場合、同じブロックコポリマーを含み、水系溶液中ｐＨ７．４で形成されるか、またはヒト血清中で形成されるミセルの流体力学的粒径の５倍、４倍、３倍、２倍、１、８倍、１．６倍、１．５倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍または１．１倍未満の流体力学的粒径を持たない場合、ミセルは「崩壊」している。ある場合において、同じブロックコポリマーを含み、水系溶液中ｐＨ７．４で形成されるか、またはヒト血清中で形成されるミセルの会合濃度の５倍、４倍、３倍、２倍、１．８倍、１．６倍、１．５倍、１．４倍１．３倍、１．２倍または１．１倍未満の会合濃度を持たない場合、ミセルは「崩壊」している。
【００４５】
ここで用いられる通り、「荷電種」「荷電可能な基」または「荷電可能なモノマー単位」は荷電または非荷電状態のいずれかの状態にある種、基またはモノマー単位である。ある場合、「荷電可能なモノマー単位」は、求電子剤の付加または除去により（例えば、プロトン（Ｈ＋）、例えばｐＨに依存する方法で）、荷電状態（アニオン性もしくはカチオン性荷電状態のいずれか）に変換され得るものである。「荷電可能な種」、「荷電可能な基」または「荷電可能なモノマー単位」の何れかの語の使用は、特に明記しない限り「荷電可能な種」、「荷電可能な基」または「荷電可能なモノマー単位」の他のいずれかの開示を含む。「アニオンに荷電した、または荷電可能な基」または「アニオン種に荷電した、または荷電可能な基」である「荷電可能な種」は種または基であり、これはアニオン荷電状態または非荷電状態のいずれかであるが、例えばプロトン（Ｈ＋）などの求電子剤の除去により「非荷電状態」をアニオン荷電状態に変換することができる。特定の実施形態において、荷電可能な種は、ほぼ中性のｐＨでアニオンに荷電する種である。ポリマー上の荷電可能な種の全てが荷電可能な種のｐＫａ（酸解離定数）に近いｐＨでアニオン性であるが、むしろアニオン性および非アニオン種の平衡が共存するであろうことは強調すべきである。「カチオンに荷電した、または荷電可能」または「カチオン種に荷電した、または荷電可能」である「荷電可能な種」は、カチオン荷電状態または非荷電状態のいずれかであるが、例えば、求電子剤、例えばプロトン（Ｈ＋）などの付加により非荷電状態をカチオン荷電状態に変換することができる。特定の実施形態において、荷電可能な種は、ほぼ中性のｐＨでカチオンに荷電する種である。ポリマー上の荷電したカチオン種すべてが荷電したカチオン種のｐＫａ（酸解離定数）の付近のｐＨで、カチオン性ではないがむしろカチオン種および非カチオン種の平衡が共存するであろうことは強調すべきである。ここで記載される「荷電可能なモノマー単位」は「荷電可能なモノマー残基」に代えて用いられる。
【００４６】
ここで用いられる通り、「実質的に非荷電の」または「中性した荷電」は、±１０〜±３０ ｍＶのゼータ電位、および／または、負電荷に荷電可能な荷電可能な種（例えば、脱プロトン化によりアニオン性になる酸性種）の第一数（ｚ）および正電荷に荷電可能な荷電可能な種（プロトン化によりカチオン性になる塩基性種）の第二数（０．５ｚ）の存在を含む。
【００４７】
ここで用いられる通り、「連結部分」または「リンカー」は、化学的結合または多官能価の（例えば、二官能価の）残基であり、これはＲＮＡｉ剤、例えばオリゴヌクレオチドおよび／または標的剤をブロックコポリマーへ連結するために用いられる。リンカー部分はアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバメート、尿素、アミンまたは他の結合、例えばアフィニティクロマトグラフィーでの生体分子の固定のために通常用いられる結合を形成し得る種々の化合物のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、連結部分は開裂可能な結合を含み、これは例えば不安定であり、および／または特定の細胞内パラメータ（例えば、ｐＨまたは酸化還元電位）の変化により開裂する結合である。いくつかの実施形態において、連結部分は開裂不可能である。特定の実施形態において、連結部分は１以上の共有結合によりＲＮＡｉ剤または標的剤に結合する。いくつかの実施形態において、連結部分は１以上の共有結合によってポリマーを不安定化するｐＨ依存性の膜に結合する。
【００４８】
疎水性種：ここで用いられる通り「疎水性種」（ここで「疎水性増強部分」と交換可能に用いられる）の語は部分、例えば置換基、残基または基であり、これは分子、例えばモノマーまたはポリマーなどに共有結合的に結合する場合、分子の疎水性を増加するか、または疎水性増強部分として働く。「疎水性」の語は、化合物の非極性溶媒と水との間の化合物の転移の自由エネルギーにより測定される物理的特性を説明する専門用語である（Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6: 1302-1307.)。化合物の疎水性は、そのｌｏｇＰ値、即ち分配係数（Ｐ）の対数により評価することができ、これは２つの不混和性の溶媒、例えばオクタノールと水の混合物の２つの相中の化合物の濃度の比として規定される。疎水性を決定する実験的方法、およびコンピュータ支援のｌｏｇＰ値の計算方法は、当業者に既知である。本発明の疎水性種は、脂肪族、ヘテロ脂肪族およびヘテロアリール基を含むがこれらに限定されない。
【００４９】
ここで用いられる通り、「疎水性中心」は疎水性部分を含む。特性の場合において、「疎水性中心」は実質的に非荷電である（例えば、電荷は実質的に中性ではない）。
【００５０】
ポリマーを不安定化する膜は、特許請求の範囲に明確に記載されていない理論にとらわれず、直接的または間接的に、細胞膜構造（例えばエンドソーム膜）における変化（例えば、浸透性の変化）を誘発することができ、それにより薬剤（ポリヌクレオチド）が、ミセル（またはその構成要素であるポリマー）と会合またはそれから独立し、前記膜構造を通過する、例えば、細胞に入るか、または細胞内小胞（例えば、エンドソーム）に出ることを可能にする。膜不安定化ポリマーは、（必ずしもそうではないが）膜破壊的なポリマーである。膜破壊的なポリマーは直接的または間接的に、細胞内小胞の溶解または細胞膜の破壊を誘発し得る（例えば、相当の割合の細胞膜の集合について観察される通り）。
【００５１】
一般に、ポリマーまたはミセルの膜不安定化または膜破壊的性質は種々の手段により評価し得る。１つの非限定的なアプローチにおいて、細胞膜構造における変化は、前記膜の外側の環境での薬剤（例えばポリヌクレオチド）の細胞膜（例えばエンドソーム膜）からの放出を測定する分析における評価、例えば前記薬剤の存在もしくは非存在、または前記薬剤の活性の決定により観察することができる。別の非限定的なアプローチは、例えば興味の対象となる細胞膜の代理の分析として、赤血球の溶解（溶血）を測定することに関する。前記アッセイは、単一のｐＨ値、またはｐＨ値の範囲で行われてよい。
【００５２】
ここで用いられる通り、「ミセル」は中心および親水性の殻を含む粒子を含み、当該中心が少なくとも部分的、大部分、または実質的に疎水性相互作用によってまとまっている。特定の場合において、ここで用いられる通り、「ミセル」は、少なくとも２つのドメイン、内側のドメインもしくは中心、および外側のドメインもしくは外殻を含む多成分ナノ粒子である。当該中心は少なくとも部分的、大部分または実質的に疎水性相互作用によってまとまっており、ミセルの中心に存在する。ここで用いられる通り、「ミセルの外殻」は、ミセルの中心ではない部分として定義される。
【００５３】
「ｐＨ依存性の膜不安定化疎水性物質」は、少なくとも部分的、大部分または実質的に疎水性であり、且つｐＨ依存性の様式で膜を不安定化する。特定の場合において、ｐＨ依存性の膜を不安定化する荷電可能な疎水性物質は、ブロックコポリマーの疎水性ポリマーセグメントであり、および／または複数の疎水性種を含み；複数のアニオン性の荷電可能な種を含む。いくつかの実施形態において、アニオン性の荷電可能な種は、ほぼ中性のｐＨでアニオン性である。更なるまたは別の実施形態において、アニオン性の荷電可能な種は、より低い、例えばエンドソームｐＨで非荷電である。いくつかの実施形態において、膜を不安定化する荷電可能な疎水性物質は、非ペプチド性および非脂質性ポリマー骨格を含む。
【００５４】
ここで用いられる通り、通常の生理学的ｐＨは、哺乳類の体の主要な液体、例えば血液、血清、通常の細胞のサイトソルなどのｐＨをいう。特定の場合において、通常の生理学的ｐＨはほぼ中性ｐＨであり、これは例えばｐＨ約７．２〜約７．４を含む。いくつかの場合において、ほぼ中性のｐＨは、ｐＨ６．６〜７．６を含む。ここで用いられる通り、中性ｐＨ、生理学的および生理学的ｐＨは同義であり、交換可能である。
【００５５】
ここで用いられる通り、集合が生理学的条件を示す水溶液中、例えばｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水で解離または不安定化しない場合、ミセルは「安定である」と記載される。ミセルの安定性は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）により定量的に定義され、これは疎水性プローブ分子の取り込みにより示される通り（例えば、動的光散乱測定により決定される通り）、不安定性が生じる場合のミセル濃度として規定される。特定の場合において、安定なミセルは、流体力学粒径を有するものであり、これはｐＨ７．４の水溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）の中で初めに形成された同じブロックコポリマーを含む流体力学粒径の約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％である。いくつかの場合において、安定なミセルは形成／集合濃度を有するものであり、ｐＨ７．４の水溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）中で初めに形成された同じブロックコポリマーを含むミセルの形成／集合濃度の約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以内である。
【００５６】
ここで用いられる通り、安定なミセルと同一、実質的に類似または類似の様式で機能、および／または同一の、実質的に類似または類似の物理的および／または化学的特性を持たない場合、ミセルは「不安定化」している。ミセルのいずれかの「不安定化」がいずれかの方法で決定され得る。ある場合には、同じブロックコポリマーを含み、ｐＨ７．４の水溶液中で形成されるかまたはヒト血清中で形成されるミセルの流体力学的粒径の５倍、４倍、３倍、２倍、１．８倍、１．６倍、１．５倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍または１．１倍未満の流体力学的粒径を有さない場合、ミセルは「不安定化」している。ある場合には、同じブロックコポリマーを含み、ｐＨ７．４の水溶液中で形成されるかまたはヒト血清中で形成されるミセルの集合の５倍、４倍、３倍、２倍、１．８倍、１．６倍、１．５倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍または１．１倍未満の濃度の集合を有さない場合、ミセルは「不安定化」している。
【００５７】
ナノ粒子：ここで用いられる通り、「ナノ粒子」の語は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有するいずれかの粒子をいう。一般に、ナノ粒子は真核細胞によりそれらの取り込みが可能なほど小さな寸法を有するべきである。典型的にナノ粒子は、２００ｎｍ未満のもっとも長い一直線の寸法（例えば直径）を有する。より小さなナノ粒子は例えば、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または１０ｎｍ〜３０ｎｍの直径を有し、これはいくつかの実施形態で用いられる。
【００５８】
オリゴヌクレオチドノックダウン剤：ここで用いられる通り、「オリゴヌクレオチドノックダウン剤」は、配列特異的な方法で分子内の核酸を標的とし結合することにより遺伝子発現を抑制するオリゴヌクレオチド種である。オリゴヌクレオチドノックダウン剤の非限定的な例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｉｃｅｒの基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡまたはＲＮＡ、抗原オリゴヌクレオチド、およびいずれかの類似帯およびその前駆体が含まれる。
【００５９】
ここで用いられる通り、「ヌクレオチド」の語はそのもっとも広い意味では、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）鎖に結合する、または結合し得る化合物および／または物質をいう。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）鎖に結合する、または結合し得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態において「ヌクレオチド」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）をいう。特定の実施形態において、「少なくとも１つのヌクレオチド」は、存在する１以上のヌクレオチドをいい；種々の実施形態において、１以上のヌクレオチドは個々のヌクレオチドであるか、非共有結合的に互いに結合するか、または共有結合的に互いに結合する。このように特定の場合には、「少なくとも１つのヌクレオチド」は１以上のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）をいう。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは少なくとも２つのヌクレオチドのモノマー単位を含むポリマーである。
【００６０】
ここで用いられる通り、「オリゴヌクレオチド」の語は７〜２００ヌクレオチドのモノマー単位を含むポリマーをいう。いくつかの実施形態において「オリゴヌクレオチド」は、１本および／または２本鎖ＲＮＡおよび１本および／または２本鎖ＤＮＡを包含する。さらに「ヌクレオチド」、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」の語および／または同様の語は、核酸類似体、すなわち修飾された骨格を有し、これはペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ホスホノ−ＰＮＡ、モルホリノ核酸または修飾されたリン酸基を有する核酸（例えば、ホスホロチオエート、ホスホネート、５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）を含むがこれらに限定されない。ヌクレオチドは、天然供給源から精製することができ、これは組換え発現系を用いて産生され、任意に精製、化学的に合成等される。ここで用いられる通り、「ヌクレオチド」は単糖および塩基を含む化合物を表す語である。単糖はペントースおよびヘキソース単糖を含むがこれらに限定されない。単糖はさらに、単糖模倣物およびハロゲン、メトキシ、水素もしくはアミノ基によりヒドロキシル基を置換すること、または更なるヒドロキシル基のエステル化により修飾される単糖も含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、天然のヌクレオシドホスフェート（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジンリン酸）であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態において、塩基は、種々の核酸中で天然に生じるいずれかの塩基および前記天然に生じる塩基を模倣するかまたは似ている他の修飾を含む。修飾または誘導体化塩基の非限定的な例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−１−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−ア
デニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロプル）ウラシル、２−アミノアデニン、ピロールピリミジン、２，６−ジアミノプリンを含む。
【００６１】
ヌクレオチド塩基もまた、共通の核酸塩基、例えばジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリルまたはニトロイミダゾリルなどを含む。ヌクレオチドもまた、標識を保持し、または塩基、例えば脱塩、即ち塩基を含まないモノマーを含むヌクレオチドを含む。核酸配列は、特に示さない限り５’〜３’方向に提示される。ヌクレオチドは、配列特異的な方法によりワトソン−クリック塩基対を介して水素結合により他のヌクレオチドに結合し得る。前記塩基対は、互いに相補的であると考えられている。オリゴヌクレオチドは、１重らせん、２重らせんまたは３重らせんであってよい。
【００６２】
ＲＮＡｉ剤：ここで用いられる通り、「ＲＮＡｉ剤」の語は、ＲＮＡｉ機構により遺伝子発言の阻害を仲介し、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ダイサー基質およびそれらの前駆体を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：ここで用いられる通り、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」の語は、長さ約１５〜５０塩基対であり、任意に０〜２の一重らせんオーバーハングをさらに含むヌクレオチド二本鎖をいう。ｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的ＲＮＡと完全な様式でハイブリダイズする部分を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの標的部分間での１以上のミスマッチが存在してもよい。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは標的転写の分解を生じることにより遺伝子発現の阻害を仲介する。
【００６４】
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ハイブリダイズするか、または互いにハイブリダイズし、２重らせん（２本鎖）構造および少なくとも１つの１重らせん部分を形成することができる少なくとも２つの相補的部分を有するオリゴヌクレオチドをいう。
【００６５】
ダイサー基質：「ダイサー基質」は、約２５塩基対よりも大きい、二本鎖ＲＮＡであり、これは細胞中のＲＮＡＩＩＩファミリーのメンバー、ダイサーの基質である。ダイサー基質は、切断され、約２１塩基の二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生じ、これはＲＮＡ干渉効果を惹起し、ｍＲＮＡノックダウンによる遺伝子サイレンシングを生じる。
【００６６】
治療剤：ここで用いられる通り、「治療剤」のフレーズは、患者、器官、組織または細胞に投与されるとき、治療的効果を有し、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を誘発するいずれかの薬剤をいい、これはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ剤、ペプチドおよびタンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
治療学的に効果のある量：ここで用いられる通り、用語「治療学的に効果のある量」の治療剤は、障害、疾患および／または状態に罹患するか、または感受性のある患者に投与したとき、障害、疾患および／または状態の症状の発症を治療、診断、予防および／または遅らせるのに十分な量を意味する。
【００６８】
ミセルの特性
診断剤および／または治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチドなど）の細胞内送達のためのミセルがここで提供される。いくつかの実施形態において、前記分子内送達はインビトロであり；他の実施形態において前記細胞内送達はインビボである。いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルは、患者における治療的介入の所望の部位におけるミセルの正味重量の標的送達のために特異的に設計される。いくつかの実施形態において、ここで記載される通り、ミセルは特定の所望の性質を有する。例えば、ミセルは特定の環境（中性／生理学的ｐＨ）で安定であり、他の環境（より酸性のｐＨ）でより不安定であるように所望されてもよい。したがって、ここで提供される材料は、前記所望のミセルの性質に寄与する特定のパラメータを開示する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルは生理学的条件で安定であり、臨界ミセル濃度を有し、これはミセルの望ましくない解離を防止する。更なるまたは別の実施形態において、ミセルの完全性（例えば、生理学的環境において）はミセルを含むブロックコポリマーの組成にも依存する。したがって、ここで提供されるのは特定のパラメータ（例えば、外殻ブロック中のブロックコポリマーとミセルの中心ブロックとの数平均分子量比、ブロックコポリマー中の電荷部分の数など）であり、これは最小の毒性および／またはミセル正味重量の損失を有する治療剤の効果的な細胞内送達に適しているミセルを提供するために設計される。
【００７０】
したがって、ここで記載されるのは、ミセルおよび当該ミセルと会合するポリヌクレオチドを含む組成物であり、当該ミセルは、当該ミセルがほぼ中性ｐＨの水性溶媒中で安定であるように会合する複数のブロックコポリマーを含む。さらにここで記載されるミセルは、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：
（ｉ）当該ミセルがミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを有する、
（ｉｉ）臨界ミセル濃度ＣＭＣ約０．２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、
（ｉｉｉ）核酸の非存在下での自発的なミセル集合；
（ｉｖ）粒径約５ｎｍ〜約５００ｎｍ；
（ｖ）重量平均分子量、約０．５×１０６〜約３．６×１０６ダルトン。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるいずれかのミセルは、上記特性の少なくとも２つを有することにより特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ここで提供されるいずれかのミセルは、上記特性の少なくとも３つを有することにより特徴付けられる。上記特性のすべてを有することにより特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、周囲の溶媒（例えば０．５Ｍ ＮａＣｌ）の高いイオン強度に対して安定であり；および／またはミセルは、有機溶媒の濃度の増加とともに増加する不安定性を有し、前記有機溶媒はジメチルホルミアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＡ）およびジオキサンを含むがこれらに限定されない。
【００７２】
ミセルの組成
ここで提供されるミセルは、ミセルあたり複数のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーはコポリマーである。更なる実施形態において、コポリマーはブロックコポリマーである。ブロックコポリマーはモノブロックポリマーまたはマルチブロックポリマー（例えばジブロックポリマー）である。ここで用いられる通り、「コポリマー」の語は、ポリマーが２以上の異なるモノマーの重合の結果であることを意味する。「モノブロックポリマー」は、単一のポリマー工程の合成の産物である。モノブロックポリマーの語は、コポリマー（即ち、１種類を超えるモノマーの重合の産物）およびホモポリマー（即ち１種類のモノマーの重合の産物）を含む。「ブロック」コポリマーは、構成単位またはモノマー単位の１以上の副結合を含む構造をいう。いくつかの実施形態において、ポリマー中に見出されるモノマー残基はさらに、修飾され、構成単位に到達する。いくつかの実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、非脂質性構成単位またはモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーはジブロックコポリマーである。ジブロックコポリマーは２つのブロックを含み；前記ポリマーの概略的な一般化は以下により示される：［ＡａＢｂＣｃ ・・・］ｍ − ［ＸｘＹｙＺｚ ・・・］ｎ、式中、各々の文字はモノマーまたはモノマー単位を表わし、モノマー単位の各々の下付き文字は、特定のブロック中のその単位のモル分率を示し、３つの点は各々のブロック中に更なる（２、３個であってよい）モノマー単位があってよいことを示し、ｍおよびｎはジブロックコポリマー中の各々のブロックの分子量を示す。いくつかの場合において図に示唆される通り、各々のモノマー単位の数および性質は、各々のブロックについて個々に制御される。図は、各々のブロック中のモノマー単位の数または種々の種類のモノマー単位の数のいかなる関係を意味するものではなく、且つそのように解釈すべきでない。また、当該図は、特定のブロック内でいずれかの特定数のモノマー単位またはモノマー単位の配置を記載するものでもない。各々のブロックにおいてモノマー単位は特に示さない限り、純粋にランダムな、交互にランダムな、規則的に交互の、規則的なブロックの、またはランダムなブロックの配置で配置されてよい。純粋にランダムな配置、例えば、非限定的な形態：ｘ−ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｙ−ｚ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ…を有してよい。非限定的な、例となる交互にランダムの配置は、非限定的な形態：ｘ−ｙ−ｘ−ｚ−ｙ−ｘ−ｙ−ｚ−ｙ−ｘ−ｚ・・・を有してよく、典型的な規則的に交互の配置は非限定的な形態：ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｚ・・・を有してよい。典型的な規則的なブロック配置は、以下の非限定的な配置：・・・ｘ−ｘ−ｘ−ｙ−ｙ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｘ・・・を有してよく、一方、典型的なランダムなブロック配置は非限定的な配置：・・・ｘ−ｘ−ｘ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｙ−ｙ−ｙ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｚ−ｚ−ｚ−・・・を有してよい。グラジエントポリマーにおいて、１以上のモノマー単位の含有率は、ポリマーのアルファ末端からオメガ末端へ勾配の様式で増加または減少する。先行する包括的ないずれの��合においても、個々のモノマー単位もしくはブロックの特定の並列、ブロック中のまたはモノマー単位の数またはブロックの数ではなく、またはそれらは、本発明のミセルを形成するブロックコポリマーの実際の構造に関係するか、またはそれを限定するいずれかの方法として解されるべきではない。
【００７３】
ここで用いられる通り、モノマー単位を囲む括弧は、モノマー単位それら自体がブロックを形成することを意味するものではなく、それを意味するものと解されるべきではない。即ち、角括弧内でモノマー単位は、いずれかの方法で、即ち純粋にランダムな、交互にランダムな、規則的に交互の、規則的なブロックの、またはランダムなブロックの配置でブロック内の他のモノマー単位と組み合わされてもよい。ここで記載されるコポリマーは任意に、交互の、勾配の、またはランダムなコポリマーである。いくつかの場合において、コポリマーは本質的にランダムなコポリマーからなる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、ミセルあたり約１０〜約５００のブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、ミセルあたり約１０〜約２５０のブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、ミセルあたり約１０〜約１００のブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、ミセルあたり約３０〜約５０のブロックコポリマーを含む。
【００７５】
ミセルの形成および安定性
いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルは、ブロックコポリマーの自発的な自己会合により形成され、水混和性の溶媒（例えばエタノールであるがこれに限定されない）から水性溶媒（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）への希釈により組織化された集合（例えば、ミセル）を形成する。いくつかの実施形態において、ミセルの形成は、水性溶媒中でポリマーの乾燥形態を直接的に溶解することにより生じる。いくつかの実施形態において自発的なミセル形成は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非存在下で生じる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、水混和性の溶媒（例えばエタノールであるがこれに限定されない）からｐＨ約７．４〜約５．５の水性溶媒への希釈に際して安定である。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、水混和性の溶媒（例えばエタノールであるがこれに限定されない）からｐＨ約７．４〜約６．８の水性溶媒への希釈に際して安定である。ここで記載されるミセルは、水混和性の溶媒（例えばエタノールであるがこれに限定されない）からｐＨ約７．４、約７．２、約７．０、約６．８、約６．４、約６．２、約６．０または約５．８の水性溶媒への希釈に際して安定である。ここで記載されるミセルは、水性溶媒中で安定である。特定の実施形態において、ここで提供されるミセルは選択されたｐＨ、例えば、ほぼ生理学的ｐＨ（例えば、ヒト血漿を循環させるｐＨ）の水性溶媒中で安定である。特定の実施形態においてここで提供されるミセルは中性ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．４）の水性溶媒中で安定である。特定の実施形態において、水性溶媒は動物（例えば、ヒト）血清または動物（例えば、ヒト）血漿である。ミセルの安定性は、設定されたｐＨに限定されないが、少なくとも設定されたｐＨを含むｐＨ値で安定であると理解されるべきである。特定の実施形態において、ここで記載されるミセルは実質的にほぼ中性のｐＨよりも酸性のｐＨで、より安定性が低い。更なる特定の実施形態において、ここで記載されるミセルはｐＨ約７．４よりもｐＨ約５．８で実施的により安定性が低い。
【００７７】
特定の実施形態において、ここで記載されるミセルは、ほぼ中性ｐＨ、濃度約１０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、または約２５０μｇ／ｍＬで安定である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ミセルは、水性溶液中の希釈に対して安定である。特定の実施形態においてミセルは、生理学的ｐＨ（例えば、ヒトにおいて血液を循環させるｐＨ）、約１００μｇ／ｍＬ〜約０．１μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ）の臨界安定濃度（例えば、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ））で安定である。いくつかの実施形態において、生理学的ｐＨでミセルのＣＭＣは、１００μｇ／ｍＬ未満、５０μｇ／ｍＬ未満、１０μｇ／ｍＬ未満、５μｇ／ｍＬ未満、または２μｇ／ｍＬ未満である。ここで用いられる通り、「ミセルの不安定化」は、ミセルを形成するポリマー鎖が、少なくとも部分的に脱凝集し、構造的に変化し（例えば、サイズの拡大および／または形状の変化）、および／または非結晶性超分子構造（例えば、非ミセル性超分子構造）を形成することを意味する。臨界安定濃度（ＣＳＣ）、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）および臨界会合濃度（ＣＡＣ）の語は、ここで互換可能に用いられる。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、臨界安定濃度または臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を構成する希釈に対して安定である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるいずれかのミセルの臨界安定濃度またはＣＭＣは、中性ｐＨで約１００μｇ／ｍＬ〜約０．１μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態においてここで記載されるＣＭＣは、中性ｐＨで、約８０μｇ／ｍＬ〜約０．２μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ〜約０．２μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ〜約０．２μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ〜約０．２μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ〜約０．２μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルのＣＭＣは約１００μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、または約０．２μｇ／ｍＬである。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるいずれかの臨界ミセル濃度またはＣＭＣは、エンドソーム溶解性ｐＨ（例えば約５）で、ほぼ中性ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．４）でのミセルのＣＭＣよりも約２０倍高い。特定の実施形態において、ここで記載されるいずれかのミセルの臨界ミセル濃度またはＣＭＣは、エンドソーム溶解性のｐＨ（例えば、ｐＨ約５）で、ほぼ中性ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．４）でのミセルのＣＭＣの約１０倍高い。いくつかの実施形態において、ここで記載されるいずれかのミセルの臨界ミセル濃度またはＣＭＣは、エンドソーム溶解性のｐＨ（例えば、ｐＨ約５）で、ほぼ中性ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．４）でのミセルのＣＭＣの約５倍または約２倍高い。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるいずれかのミセルの臨界ミセル濃度またはＣＭＣは、エンドソーム溶解性のｐＨ（例えば、約ｐＨ５）で、約１００μｇ／ｍＬ〜約０．５μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルのＣＭＣは、エンドソーム溶解性のｐＨで、約１００μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、または約０．５μｇ／ｍＬである。
【００８２】
粒径
特定の実施形態において、ミセルはナノ粒子である。特定の実施形態において、ミセルは真のミセルである。更なる実施形態において、生理活性剤への結合の非存在下、ミセルは平均流体力学的粒子径、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約３０〜８０ｎｍを有するナノ粒子またはミセルである。粒径は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、電子顕微鏡技術（例えば、ＴＥＭ）によるもの、および他の方法を含むがこれらに限定されない何れかの方法により決定し得る。
【００８３】
特定の実施形態において、ここで記載されるミセルは、（イオン的および／または共有結合的に）生理活性剤（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）、診断剤および／または標的剤（例えば、抗体））へ会合するブロックコポリマーを含み、約５００ｎｍ以下、約４５０ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約３５０ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、または約５０ｎｍ以下の粒径を有する。
【００８４】
ポリヌクレオチドの正味重量
いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは１〜約１０，０００のポリヌクレオチドと会合する（例えば、イオン的および／または共有結合的に）。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、約４〜約５０００、約１０〜約４０００、約１５〜約３０００、または約３０〜約２５００のポリヌクレオチドと会合する。いくつかの実施形態において、ミセル対ポリヌクレオチドの電荷比は、約５：１〜約１：１である。いくつかの実施形態において、ミセル対ポリヌクレオチドの電荷比は、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１である。
【００８５】
ポリマー構造および特性
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含む。いくつかの実施形態において、前記ブロックのうちの少なくとも１つはグラジエントポリマーブロックである。更なる実施形態において、ここで用いられるブロックコポリマーは任意にグラジエントポリマーによりにより置換される（即ち、ミセル中で使用されるポリマーは、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを有するグラジエントポリマーである。）
親水性ブロック
特性の実施形態において、親水性ブロックは外殻のブロックであり、例えば非荷電の、カチオン性の、ポリカチオン性の、アニオン性の、ポリアニオン性の、または両性イオン性のブロックである。特定の実施形態において、親水性ブロックは中性（非荷電）である。特定の実施形態において、親水性ブロックは、正味の正電荷を含む。特定の実施形態において、親水性ブロックは正味の負電荷を含む。特定の実施形態において、親水性ブロックは正味の中性電荷を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、親水性のブロックは単一のモノマーを含むホモポリマーブロックである。他の実施形態において、親水性のブロックは複数の１以上の親水性のモノマー単位（例えば、１以上のＤＭＡＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、ＨＰＭＡ、オリゴエチレングリコールアクリレート、ＮＩＰＡＡＭなど）を含む。ある実施形態において、親水性のモノマー単位は親水性基（例えばヒドロキシル基、チオール基、ＰＥＧ基または他のポリオキシル化アルキル基など、またはそれらの組合せ）を含む。いくつかの実施形態において、親水性モノマー単位は実質的に荷電不可能であり、これは例えば、親水性モノマー単位が生理学的ｐＨ（例えば、７．２〜７．４などの中性ｐＨ）で実質的に非荷電であることを意味する。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、５より多い、１０より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い親水性基または種を含む。
【００８７】
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは各々、（１）中性または非荷電の（例えば、実質的に非荷電の）親水性のブロック；および（２）中心を形成するポリマーセグメントの疎水性相互作用により安定化するミセルの疎水性中心を形成する疎水性ブロック（例えば中心のブロック）を有する。ある実施形態において、中性または非荷電の親水性ブロックは複数の中性モノマー残基、例えばＰＥＧＭＡまたはＨＰＭＡなどを含む。
【００８８】
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは各々、（１）カチオン性またはポリカチオン性の荷電親水性ブロック；および（２）中心を形成するポリマーセグメントの疎水性相互作用により安定化するミセルの疎水性中心を形成する疎水性ブロック（例えば、中心のブロック）を有する。ある実施形態において、親水性ブロックは複数のカチオン性モノマー残基、例えばＤＭＡＥＭＡなどを含む。前記実施形態のうちのいくつかにおいて、ポリヌクレオチドは、親水性ブロック中のカチオン性種とイオン会合している。
【００８９】
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは各々、（１）アニオン性またはポリアニオン性の荷電した親水性ブロック；および（２）中心を形成するポリマーセグメントの疎水性相互作用によって安定化するミセルの疎水性中心を形成する疎水性ブロック（例えば、中心のブロック）を有する。ある実施形態において、アニオン性またはポリアニオン性の荷電した親水性ブロックは、複数のアニオン性のモノマー残基、例えば無水マレイン酸またはアクリル酸などを含む。
【００９０】
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは各々、（１）両性またはポリ両性の荷電した親水性ブロック；および（２）中心を形成するポリマーセグメントの疎水性相互作用により安定化されるミセルの疎水性中心を形成する疎水性ブロック（例えば、中心のブロック）を有する。
【００９１】
疎水性ブロック
ある実施形態において、ここで記載されるいずれかのブロックコポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性の基、部分、モノマー単位、種などを含む、ある実施形態において、ここで記載されるいずれかのブロックコポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性の基、部分、モノマー単位、種など、および複数の荷電可能な構成単位またはモノマー単位を含む。
【００９２】
ある実施形態において、ブロックコポリマーは、第１および第２構成単位を含む疎水性ブロックを含む。ある実施形態において、第１構成単位は、脱プロトン化によるアニオン種を含む。ある実施形態において、第１構成単位は、酸性ｐＨ（例えばエンドソームのｐＨ、ｐＨ約６．５未満、ｐＨ約６．０未満、約ｐＨ５．８未満、約ｐＨ５．７未満など）において非荷電である。いくつかの実施形態において、ここで記載される通り、第１構成単位および第２構成単位はプロトン化によるカチオン性種である。特定の実施形態において、第２構成単位のｐＨは、約６〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７．５、または他の何れかの適切なｐＫａである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるいずれかのブロックコポリマーの疎水性ブロックは、疎水性の基、部分、モノマー単位、種などをさらに含む。いくつかの実施形態において、疎水性モノマー単位は、疎水性の基、例えばアルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基などを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーはポリマー骨格に結合し、近接する荷電可能な構成単位（例えば、アニオン性部分（例えばカルボン酸基））を遮蔽し、それによりミセルの解離を低減させるかまたは防止する疎水性基を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの疎水性ブロックは、５より多い、１０より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い疎水性基または種を含む。いくつかの実施形態において疎水性の種が、アニオン性の荷電可能なモノマー単位に存在する。いくつかの実施形態において、疎水性モノマー単位対アニオンに荷電可能な構成単位を含むモノマー単位の比は、中性ｐＨで約１：６〜約１：１、約１：５〜約１：１、約１：４〜約１：１、約１：３〜約１：１、約１：２〜約１：１である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、疎水性モノマー単位は、非限定的な例として、ブチルメタクリレート、ブチルアクリレート、スチレンなどがある。特定の実施形態において、ここで有用な疎水性モノマー単位は、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルアクリル酸の（Ｃ２−Ｃ８）アルキルエステルに由来するモノマー単位である。
【００９５】
さらに特定の実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーの疎水性ブロックは、複数のカチオン性モノマー単位および複数のアニオン性モノマー単位を含む。さらに特定の実施形態において、疎水性ブロックは実質的に同じ数のカチオン性およびアニオン種を含む（即ち、疎水性ブロックおよび／またはミセルの中心は実質的に正味の中性である）。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの疎水性ブロック中の実質的に同じ数のカチオン性およびアニオン種の存在により、疎水性ブロックおよび／またはほぼ中性ｐＨで実質的に正味の中性であるミセルの中心が提供される。
【００９６】
アニオン性構成単位
いくつかの実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、生理学的ｐＨでアニオン性の複数のアニオン性の構成単位を含む。いくつかの実施形態において、アニオン性の構成単位はプロトン化可能なアニオン性の種を含む。特定の実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、複数のアニオン性構成単位を含み、各々のアニオン性構成単位は、非荷電のブレンステッド酸モノマーの残基である（即ち、構成単位はブレンステッド酸の共役塩基である）。ここで記載される種々の実施形態において、ここで記載される生理学的ｐＨでアニオン性または負に荷電した構成単位（これは例えば、特定の親水性構成単位を含む）は、１以上の酸基またはその共役塩基を含む。アニオン性の構成単位の非限定的な例は、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸など、またはそれらの組合せを含むモノマー残基を含む。いくつかの実施形態において、ここで用いられる通常の生理学的ｐＨでアニオン性または負に荷電した構成単位は、非限定的な例として、アクリル酸、Ｃ２−Ｃ８アルキルアクリル酸モノマー（例えば、メチルアクリル酸、エチルアクリル酸、プロピルアクリル酸、ブチルアクリル酸など）などのモノマー残基を含む。
【００９７】
生理学的液体のｐＨがほぼアニオン種のｐＫａの場合、両方の形態における荷電可能な種の平衡分布が存在するだろう。アニオン種の場合、ｐＨがアニオン種のｐＫａのとき、集団の約５０％がアニオン性であり、約５０％が非荷電だろう。更なるｐＨは荷電可能な種のｐＫａであり、より高いｐＨ値でアニオン性形態が優勢であり、より低いｐＨ値で非荷電形態が優勢であるように、この平衡中で対応するシフトが存在するだろう。ここで記載される実施形態は、いずれかのｐＨ値でブロックコポリマーの形態を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、保護された種、例えばエステル、または遊離酸のいずれかとして存在し得る何れかの有機または無機酸が、本発明の意図の中にあるが、通常の生理学的ｐＨでアニオン性の構成単位は、カルボン酸、例えば非限定的に、２−プロピルアクリル酸のモノマー残基などである（即ち、それに由来する構成単位、１−プロピルプロピオン酸、−ＣＨ２Ｃ（（ＣＨ２）２ＣＨ３）（ＣＯＯＨ）− （ＰＡＡ））。ここで記載されるアニオン性のモノマー残基または構成単位は、アニオンに荷電した、または荷電可能な種を含み、これはプロトン化可能なアニオン種である。特定の場合において、アニオン性モノマー残基はほぼ中性ｐＨでアニオン性であってよい。
【００９９】
モノマー、例えば無水マレイン酸（Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S. Stayton "pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride）Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery" Biomacromolecules  7:2407-2414, 2006)が、疎水性ロックにアニオン種を導入するために用いられてもよい。前記実施形態において、負に荷電した構成単位は、無水マレイン酸モノマー残基に由来する。
【０１００】
カチオン性構成単位
いくつかの実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、生理学的ｐＨでカチオン性であるかまたは正に荷電した、複数のカチオン性構成単位を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性の構成単位は、脱プロトン化可能なカチオン性種を含む。ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは複数のカチオン性構成単位を含み、各々のカチオン性構成単位は非荷電のブレンステッド塩基モノマーの残基である（即ち、構成単位は、ブレンステッド塩基の共役酸である）。ブレンステッド塩基モノマーの非限定的な例は、ジアルキルアミノ基を含むモノマーを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性の構成単位は、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、アミノ基、アルキルアミノ基、グアニジン基、イミダゾリル基、ピリジル基、トリアゾリル基など、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ここで用いられる通常の生理学的ｐＨでカチオン性である構成単位は、非限定的な例として、ジアルキルアミノアルキルメタクリレート（例えば、ＤＭＡＥＭＡ）を含む。
【０１０１】
生理学的液体のｐＨがカチオン種の約ｐＫａである場合、両方の形態で荷電可能な種の平衡分布が存在するだろう。更なるｐＨが荷電可能な種のｐＫａの場合、この平衡において、より低いｐＨではカチオン形態が、より高いｐＨでは非荷電形態が優勢であるように対応するシフトが存在するだろう。ここで記載される実施形態は、何れかのｐＨ値においてブロックコポリマーの形態を含む。
【０１０２】
中性および両性イオン性の構成単位
ここで記載される種々の実施形態において、生理学的ｐＨで中性の構成単位は１以上の親水性基、例えばヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオールなどを含む。いくつかの実施形態において、ここで用いられる通常の生理学的ｐＨで中性の親水性の構成単位は、非限定的な例としてＰＥＧ化されたアクリル酸、ＰＥＧ化されたメタクリル酸、ヒドロキシアルキルアクリル酸、ヒドロキシアルキルアルカクリル酸（例えば、ＨＰＭＡ）などを含む。
【０１０３】
ここで記載される種々の実施形態において、生理学的ｐＨで両性イオン性である構成単位は、生理学的ｐＨでアニオン性または負に荷電した基およびカチオン性または正に荷電した基を含む。いくつかの実施形態において、ここで用いられる通常の生理学的ｐＨで両性イオン性である親水性の構成単位は、非限定的な例として生理学的ｐＨでリン酸基およびアンモニウム基を含むモノマー残基を含み、例えばこれは引用によりその開示かここに組み込まれるＵＳ ７，３００，９９０において説明されている。
【０１０４】
ブロックコポリマーの組成
特定の実施形態において、第１構成単位は脱プロトン化によるアニオン種であり、第２構成単位はプロトン化によるカチオン種であり、アニオン種対カチオン種の比は、中性ｐＨで約１：１０〜約１０：１、約１：６〜約６：１、約１：４〜約４：１、約１：２〜約２：１、約１：２〜約３：２、または約１：１である。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な構成単位対第２の荷電可能な構成単位の比は、約１：１０〜約１０：１、約１：６〜約６：１、約１：４〜約４：１、約１：２〜約２：１、約１：２〜約３：２、または約１：１である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマー中に存在するアニオン性の種、基またはモノマー単位に荷電可能な構成基またはモノマー単位は、ほぼ中性ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．４）で少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％である種、基またはモノマー単位である。特定の実施形態において、これらは荷電可能な種、基またはモノマー単位はＨ＋の損失により荷電し、ほぼ中性ｐＨでアニオン種になる。更なるまたは別の実施形態において、ポリマー中に存在するアニオン性の荷電可能な種、基またはモノマー単位に荷電することができる荷電可能な種、基またはモノマー単位は、弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ約６．５未満；約６．２未満；約６未満；約５．９未満；約５．８未満；約５．７未満；約５．６未満；約５．５未満；約５．０未満；または約ほぼエンドソームｐＨ）で、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％の中性または非荷電である。
【０１０６】
ここで記載されるブロックコポリマーの特定の実施形態において、各々の構成単位は種々のモノマー単位に存在する。いくつかの実施形態において、第１モノマー単位は、第１の荷電可能な種を含む。更なるまたは別の実施形態において、第２モノマー単位は、第２の荷電可能な種を含む。更なるまたは別の実施形態において、第３モノマー単位は、第３の荷電可能な種を含む。
【０１０７】
代表的な例
特定の実施形態において、ブロックコポリマー（例えば、膜不安定化ブロックコポリマー）は化学式Ｉを有する：
【化１】
2011520901.tif 000003
【０１０８】
いくつかの実施形態において：
Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、−Ｃ−、−C−Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ）ａＣ（Ｏ）Ｏ−、 −Ｏ（Ｃ）ａＣ（Ｏ）−および−O（Ｃ）ｂＯ−からなる群より選択され；式中、
ａは１〜４であり；
ｂは２〜４であり：
Ｙ４は、水素、（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル、（３Ｃ−６Ｃ）シクロアルキル、Ｏ−（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＲ６（１Ｃ−１０Ｃ）、（４Ｃ−１０Ｃ）ヘテロアリール、および（６Ｃ−１０Ｃ）アリールであり、これらのいずれかは任意に１以上のフッ素基により置換され；
Ｙ０、Ｙ１およびＹ２は独立して、共有結合、（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（２Ｃ−１０Ｃ）アルキル−、−ＯＣ（Ｏ）（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル−、−Ｏ（２Ｃ−１０Ｃ）アルキル−および−Ｓ（２Ｃ−１０Ｃ）アルキル−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６（２Ｃ−１０Ｃ）アルキル−、−（４Ｃ−１０Ｃ）ヘテロアリール−および−（６Ｃ−１０Ｃ）アリール−からなる群より独立して選択され；
Ｙ３は−（１Ｃ−１０Ｃ）アルキル−、−（４Ｃ−１０Ｃ）ヘテロアリールおよび−（６Ｃ−１０Ｃ）アリールであり；式中、
Ｒ１〜Ｒ５およびＹ０〜Ｙ４により完全には置換されていないＡ１〜Ａ４の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子を備え；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、独立して、水素、−ＣＮ、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは任意に1以上のフッ素原子で置換されてよく；
Ｑ０は、生理学的ｐＨで親水性の残基、および生理学的ｐＨで少なくとも部分的に正に荷電した残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理学的ｐＨで少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いｐＨでプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩等）；生理学的ｐＨで実質的に中性（または電荷を持たない）の残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；生理学的ｐＨで少なくとも部分的に両性イオン性の残基（例えば、生理学的ｐＨでアンモニウム基およびリン酸基を含むモノマー残基）；結合可能な（conjugatable）残基または官能化可能な(functionalizable)残基（例えば、反応性基（例えば、アジド、アルキン、スクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ピリジルジスルフィド等）を含む残基）；または水素からなる群より選択され；
Ｑ１は、生理学的ｐＨで親水性の残基および生理学的ｐＨで少なくとも部分的に正に荷電した残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理学的ｐＨで少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いｐＨでプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩等）；生理学的ｐＨで実質的に中性の残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；または生理学的ｐＨで少なくとも部分的に両性イオン性の残基（例えば、生理学的ｐＨでアンモニウム基およびリン酸基を含む）；
Ｑ２は、生理学的ｐＨで正の電荷を有する残基であり、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、およびピリジルを含むがこれらに限定されない；
Ｑ３は、生理学的pHで負の電荷を有するが、より低いｐＨでプロトン化を受ける残基であり、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩およびリン酸塩を含むがこれらに限定されない；
mは、約０〜１．０未満であり（例えば、０〜約０．４９）；
ｎは、０より大きく〜約１．０であり（例えば、約０．５１〜約１．０）；
ここで、ｍ＋ｎ＝１であり；
ｐは、約０．１〜約０．９であり（例えば、約０．２〜約０．５)；
ｑは、約０．１〜約０．９であり（例えば、約０．２〜約０．５)；
ｒは、０〜約０．８であり（例えば、０〜約０．６)；
ここで、ｐ＋ｑ＋ｒ＝１であり；
ｖは、約１〜約２５ｋＤａまたは約５〜約２５ｋＤａであり；
ｗは、約１〜約５０ｋＤａまたは約５〜約５０ｋＤａである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ｐおよびｑで示されるモノマー残基の数または割合は、各々約３０％、各々約２０％、各々約１０％などである。ある実施形態において、ｐは実質的にｑと同じである。ある実施形態において、少なくとも部分的に荷電しているということは一般に、微量よりも多い量の荷電した種、例えば少なくとも２０％の残基が荷電し、少なくとも３０％の残基が荷電し、少なくとも４０％の残基が荷電し、少なくとも５０％の残基が荷電し、少なくとも６０％の残基が荷電し、少なくとも７０％の残基が荷電していることなどを含む。
【０１１０】
ある実施形態において、ｍは０であり、Ｑ１は生理学的ｐＨで親水性且つ実質的に中性（または非荷電）の残基である。いくつかの実施形態において、実質的に非荷電であることは、例えば５％未満が荷電し、３％未満が荷電し、１％未満が荷電していることなどを含む。ある実施形態において、ｍは０であり、Ｑ１は生理学的ｐＨで親水性且つ少なくとも部分的にカチオン性の残基である。ある実施形態において、ｍは＞０であり、ｎは＞０であり、Ｑ０またはＱ１のうちの１つは、生理学的ｐＨで親水性であり、少なくとも部分的にカチオン性の残基であり、他のＱ０またはＱ１は生理学的ｐＨで親水性であり、実質的に中性の残基である。特定の実施形態において、ｍは＞０であり、ｎは＞０であり、Ｑ０またはＱ１のうちの１つは、生理学的ｐＨで親水性であり、少なくとも部分的にアニオン性の残基であり、他のＱ０またはＱ１は生理学的ｐＨで親水性であり、実質的に中性の残基である。ある実施形態において、ｍは＞０であり、ｎは＞０であり、Ｑ１は生理学的ｐＨで親水性であり、少なくとも部分的にカチオン性の残基であり、Ｑ０は結合可能または官能化可能な残基である。ある実施形態において、ｍは＞０であり、ｎは＞０であり、Ｑ１は生理学的ｐＨで親水性であり、実質的に中性の残基であり、Ｑ０は結合可能または官能化可能な残基である。
【０１１１】
ある実施形態において、ここで記載されるミセルは式ＩＩのブロックコポリマーを含む：
【化２】
2011520901.tif 000004
【０１１２】
いくつかの実施形態において：
Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は−Ｃ−Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ）ａＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ）ａＣ（Ｏ）−および−Ｏ（Ｃ）ｂＯ−からなる群より選択され、式中、
ａは１〜４であり；
ｂは２〜４であり；
Ｙ０およびＹ４は、独立して、水素、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、（３Ｃ〜６Ｃ）シクロアルキル、Ｏ−（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＲ６（１Ｃ〜１０Ｃ）、（４Ｃ〜１０Ｃ）ヘテロアリールおよび（６Ｃ〜１０Ｃ）アリールからなる群より選択され；そのいずれかは、1以上のフッ素基で任意に置換され；
Ｙ１およびＹ２は独立して、共有結合、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−ＯＣ（Ｏ）（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−および−Ｓ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、（４Ｃ〜１０Ｃ）へテロアリールおよび（６Ｃ〜１０Ｃ）アリールからなる群より選択され；
Ｙ３は、共有結合、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−（４Ｃ〜１０Ｃ）ヘテロアリール−および（６Ｃ〜１０Ｃ）アリールからなる群より選択され；
Ｒ１〜Ｒ５およびＹ０〜Ｙ４により完全には置換されていないＡ１〜Ａ４の四価の炭素原子、適切な数の水素原子を備え；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、水素、−ＣＮ、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは1以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Ｑ１およびＱ２は、生理学的ｐＨで正に荷電した残基であり、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリルおよびピリジルが含まれるがこれらに限定されない；
Ｑ３は、生理学的pHで負に荷電しているが、より低いｐＨでプロトン化を受ける残基であり、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、およびリン酸塩を含むがこれらに限定されない；
ｍは、０〜約０．４９であり；
ｎは、約０．５１〜約１．０であり；
ここで、ｍ＋ｎ=１であり；
ｐは、約０．２〜約０．５であり；
ｑは、約０．２〜約０．５であり；
ここで、ｐは、実質的にｑと同じであり；
ｒは、０〜約０．６であり；
ここで、ｐ＋ｑ＋ｒ＝１であり；
ｖは、約５〜約２５ｋＤａであり；
ｗは、約５〜約５０ｋＤａである。
【０１１３】
ある実施形態において、ここで記載されるミセルは（例えば、通常の生理学的ｐＨで）、式ＩＩＩのブロックポリマーを含む：
【化３】
2011520901.tif 000005
【０１１４】
ある実施形態において、示される通り置換されたＡ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、式ＩＩＩのポリマーの構成単位を含む（これはここで「モノマー単位」および「モノマー残基」と交換可能に用いられる）。特定の実施形態において、式ＩＩＩのＡ基を構成するモノマー単位は、適切な条件下、重合可能な適合性がある。ある場合において、エチレン骨格または構造単位である−（Ｃ−Ｃ−）ｍ−ポリマー（各々のＣは、Hおよび／または他の適切な基で２置換される）は、炭素−炭素二重結合＞Ｃ＝Ｃ＜を含むモノマーを用いて重合される。ある実施形態において、Ａ基は各々（例えば、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４の各々）、−Ｃ−Ｃ−（すなわち、エチレンモノマー単位またはポリマー骨格）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ）ａＣ（Ｏ）Ｏ−（すなわち、ポリ無水物モノマー単位またはポリマー骨格）、−Ｏ（Ｃ）ａＣ（Ｏ）−（すなわち、ポリエステルモノマー単位またはポリマー骨格）、または−Ｏ（Ｃ）ｂＯ−（すなわち、ポリアルキレングリコールモノマー単位またはポリマー骨格）等である（ここで、Ｃは各々、Ｈおよび／またはここに記載する通りいずれかの他の適切な基（上記のＲ１２および／またはＲ１３を含む）で２置換される）。特定の実施形態において、「ａ」は整数１〜４であり、「ｂ」は整数２〜４である。ある実施形態において、式IIIの骨格に結合する「Ｙ」および「Ｒ」基は各々（すなわち、Ｙ０、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５のいずれか１つ）は、特定のモノマー単位のいずれかの「Ｃ」（いずれかの（Ｃ）ａまたは（Ｃ）ｂを含む）に結合する。特定の実施形態において、特定のモノマー単位のＹおよびＲの両方が、同じ「Ｃ」に結合する。ある特定の実施形態において、特定のモノマー単位のＹおよびＲの両方が、同じ「Ｃ」に結合し、存在する場合、「Ｃ」はモノマー単位のカルボニル基に対してアルファである。
【０１１５】
特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ１１は独立して、水素、アルキル（例えば、１Ｃ〜５Ｃアルキル）、シクロアルキル（例えば、３Ｃ〜６Ｃシクロアルキル）、またはフェニルから選択され、Ｒ１〜Ｒ１１のいずれかは、フッ素、シクロアルキル、またはフェニルにより任意に置換され、これは１以上のアルキル基で任意に置換されてよい。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、Ｙ０およびＹ４は独立して、水素、アルキル（例えば、１Ｃ〜１０Ｃアルキル）、シクロアルキル（例えば、３Ｃ〜６Ｃシクロアルキル）、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル）、またはフェニルから選択され、その各々は１以上のフッ素で任意に置換される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、Ｙ１およびＹ２は独立して、共有結合、アルキル、好ましくは（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、好ましくは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、好ましくは−ＯＣ（Ｏ）−（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、Ｏ−アルキル、好ましくは−Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、および−Ｓ−アルキル、好ましくは−Ｓ−（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキルからなる群より選択される。ある実施形態において、Ｙ３は、共有結合、アルキル（好ましくは（１Ｃ〜５Ｃ）アルキル）およびフェニルからなる群より選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、Ｚは存在するか、または存在しない。ある実施形態において、Ｒ１および／またはＲ４は水素であり、Ｚ−はＯＨ−である。ある実施形態において、Ｚ−はいずれかの対イオン（例えば、１以上の対イオン）であり、非限定的な例として、クロリド、無機もしくは有機のホスフェート、スルフェート、スルホネート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、バレレート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、ミリステート、パルメート（palmate）、ステアレート、パルミトレート、オレエート、リノレート（linolate）、アラキデート（arachidate）、ガドレエート（gadoleate）、ワクチネート（vaccinate）、ラクテート、グリコラート、サリチレート、デスアミノフェニルアラニン（desamionphenylalanine）、デスアミノセリン（desaminoserine）、デスアミノスレオニン（desaminothreonine）ε−ヒドロキシカプロエート、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレートまたは３−ヒドロキシバレレートである。いくつかの実施形態において、Ｙ、Ｒおよび任意のフッ素の各々が選択された骨格の炭素に共有結合した場合、完全には置換されていないいずれかの炭素は、適切な数の水素原子を備える。数ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒは、ブロック中で各構造単位のモル分率を意味し、vおよびwは、各ブロックの分子量を意味する。
【０１１９】
ある実施形態において、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、−Ｃ−、−Ｃ−Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ１２Ｒ１３）ａＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（ＣＲ１２Ｒ１３）ａＣ（Ｏ）−およびＯ（ＣＲ１２Ｒ１３）ｂＯからなる群より選択され；ここで、
ａは１〜４であり；
ｂは２〜４であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立して、水素、（１Ｃ〜５Ｃ）アルキル、（３Ｃ〜６Ｃ）シクロアルキル、（５Ｃ〜１０Ｃ）アリール、および（４Ｃ〜１０Ｃ）ヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは１以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Ｙ０およびＹ４は独立して、水素、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、（３Ｃ〜６Ｃ）シクロアルキル、Ｏ−（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは1以上のフッ素基で任意に置換され；
Ｙ１およびＹ２は独立して、共有結合、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−ＯＣ（Ｏ）（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−および−Ｓ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−からなる群より選択され；
Ｙ３は、共有結合、（１Ｃ〜５Ｃ）アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；Ｒ１〜Ｒ５およびＹ０〜Ｙ４により完全には置換されていないＡ１〜Ａ４の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子を備え；
Ｚは、1以上の生理学的に許容可能な対イオンであり；
ｍは、０〜約０．４９であり；
ｎは、約０．５１〜約１．０であり；
ここでｍ＋ｎ＝１であり；
ｐは、約０．２〜約０．５であり；
ｑは、約０．２〜約０．５であり；
ここでｐは、実質的にｑと同じであり；
ｒは、０〜約０．６であり；
ここでｐ＋ｑ＋ｒ＝１であり；
ｖは、約１〜約２５ｋＤａであるか、または約５〜約２５ｋＤａであり；
ｗは、約１〜約５０ｋＤａであるか、または約５〜約５０ｋＤａである。
【０１２０】
特定の実施形態において、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、独立して、−Ｃ−Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ）ａＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ）ａＣ（Ｏ）−および−Ｏ（Ｃ）ｂＯ−からなる群より選択され；ここで
ａは、１〜４であり；
ｂは、２〜４であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、水素、（１Ｃ〜５Ｃ）アルキル、（３Ｃ〜６Ｃ）シクロアルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは１以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Ｙ０およびＹ４は独立して、水素、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、（３Ｃ〜６Ｃ）シクロアルキル、Ｏ−（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは1以上のフッ素基で任意に置換され；
Ｙ１およびＹ２は独立して、共有結合、（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−ＯＣ（Ｏ）（１Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−、−Ｏ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−および−Ｓ（２Ｃ〜１０Ｃ）アルキル−からなる群より選択され；
Ｙ３は、共有結合、（１Ｃ〜５Ｃ）アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ１〜Ｒ５およびＹ０〜Ｙ４により完全には置換されていないＡ１〜Ａ４の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子を備え；
Ｚは、生理学的に許容可能な対イオンであり；
ｍは、０〜約０．４９であり；
ｎは、約０．５１〜約１．０であり；
ここでｍ＋ｎ＝１であり；
ｐは、約０．２〜約０．５であり；
ｑは、約０．２〜約０．５であり；
ここでｐは、実質的にｑと同じであり；
ｒは、０〜約０．６であり；
ここでｐ＋ｑ＋ｒ＝１であり；
ｖは、約５〜約２５ｋＤａであり；
ｗは、約５〜約２５ｋＤａである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、
Ａ１は、−Ｃ−Ｃ−であり；
Ｙ１は、−Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｒ６は、水素であり；
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ−ＣＨ３であり；
Ｒ２は、−ＣＨ３である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、
Ａ２は、−Ｃ−Ｃ−であり；
Ｙ２は、−Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｒ９は、水素であり；
Ｒ１０およびＲ１１は各々、−ＣＨ３であり；
Ｒ３は、−ＣＨ３である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、
Ａ３は、−Ｃ−Ｃ−であり；
Ｒ４は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｙ３は、共有結合であり；
Ｚ−は、生理学的に許容可能なアニオンである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、
Ａ４は、−Ｃ−Ｃ−であり；
Ｒ５は、水素および−ＣＨ３からなる群より選択され；
Ｙ４は、−Ｃ(Ｏ)Ｏ(ＣＨ２)３ＣＨ３である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、
Ａ０は、Ｃ−Ｃ−であり；
Ｒ１は、水素および（１Ｃ〜３Ｃ）アルキルからなる群より選択され；
Ｙ０は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（１Ｃ〜３Ｃ）アルキルからなる群より選択される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ｍは０である。  
いくつかの実施形態において、ｒは０である。  
いくつかの実施形態において、ｍおよびｒはともに０である。
【０１２７】
ある実施形態において、ブロックコポリマーはジブロックコポリマーであり、式ＩＶ１の化学式を有する（通常の生理学的ｐＨまたはほぼ中性ｐＨにおいて）：
【化４】
2011520901.tif 000006
【０１２８】
ある場合において、化合物ＩＶ１構成単位は、左の角括弧および右の丸括弧の中に示される通りであり、それらは以下のモノマーに由来する：
【化５】
2011520901.tif 000007
【０１２９】
文字ｐ、ｑおよびｒは、ブロック内の各々の構成単位のモル分率を示す。文字ｖおよびｗは、ジブロックコポリマー中の各々のブロックの分子量（数平均）を示す。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ここで提供される化合物は以下の構造を有する：
【化６】
2011520901.tif 000008
【０１３１】
上述の通り、文字ｐ、ｑおよびｒはブロック内の各々の構成単位のモル分率を示す。文字ｖおよびｗは、ジブロックコポリマー中の各々のブロックの分子量（数平均）を示す。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるのは以下のポリマーである：
［ＤＭＡＥＭＡ]ｖ−[Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ]ｗ                              IV3
［ＰＥＧＭＡ］ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ                          IV4
［ＰＥＧＭＡｍ−／−ＤＭＡＥＭＡｎ］ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ        IV5
［ＰＥＧＭＡｍ−／−ＭＡＡ（ＮＨＳ）ｎ］ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ    IV6
［ＤＭＡＥＭＡｍ−／−ＭＡＡ（ＮＨＳ）ｎ］ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ  IV7
［ＨＰＭＡｍ−／−ＰＤＳＭｎ］ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ              IV8
［ＰＥＧＭＡｍ−／−ＰＤＳＭｎ]ｖ−［Ｂｐ−／−Ｐｑ−／−Ｄｒ］ｗ            IV9
いくつかの実施形態において、Ｂはブチルメタクリレート残基であり；Ｐはプロピルアクリル酸残基であり；ＤおよびＤＭＡＥＭＡおよびジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；ＰＥＧＡはポリエチレングリコールメタクリレート残基（例えば、１〜２０エチレンオキシド単位、例えば化合物ＩＶ２に示されるものなど、４〜５のエチレンオキシド単位、または７〜８のエチレンオキシド単位を有する）であり；ＭＡＡ(ＮＨＳ)は、メチルアクリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド残基であり；ＨＰＭＡは、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド残基であり；ＰＤＳＭは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基である。ある実施形態において、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｗおよびｖは、上述した通りである。特定の実施形態において、ｗは、約０．１ｘ〜約５ｘ、または約１ｘ〜約５ｘ ｖである。
【０１３３】
式ＩＶ１〜ＩＶ９の化合物は、ここで提供される化合物ポリマーの例であり、ポリマーの第１ブロックを作る種々の構造単位を含む。いくつかの実施形態において、第１ブロックの構造単位は、ポリマーを作るために変化させるか、または化学的に処理され、第１のブロックは、中性（例えばＰＥＧＭＡ）、カチオン性（例えばＤＭＡＥＭＡ）、アニオン性（例えば、ＮＨＳが加水分解されて酸になるＰＥＧＭＡ−ＮＨＳ、もしくはアクリル酸）、両性電解質（例えば、ＮＨＳが加水分解されて酸になるＤＭＡＥＭＡ−ＮＨＳ）、または両性イオン性（例えばポリ[２−メタクリロイルオキシ−２‘トリメチルアンモニウムエチルホスフェート])であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、第１のブロックにピリジルジスルフィド官能基を含むポリマー（例えば[ＰＥＧＭＡ−ＰＤＳＭ]−[Ｂ−Ｐ−Ｄ]）は、チオール化ｓｉＲＮＡと任意に反応し、ポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体を形成する。
【０１３４】
特定の実施形態において、式ＩＶ３の化合物は、ここに記載する通り、Ｐ７クラスのポリマーであり、以下表１に示す分子量、多分散性およびモノマー組成を有する。
【表１】
2011520901.tif 000009
【０１３５】
いくつかの実施形態において、式ＩＶ３のポリマーは表２に従うＰ７クラスのポリマーである。
【表２】
2011520901.tif 000010
【０１３６】
いくつかの特定の実施形態において式ＩＶ３のポリマーは、Ｐ７ｖ６と呼ばれるＰ７クラスのポリマーである。ＰＲｘ０７２９ｖ６は、Ｐ７ｖ６と本願および種々の優先権出願において交換可能に用いられる。
【０１３７】
膜不安定化ブロックコポリマー
ある実施形態において、ここで提供されるミセルまたはその成分部分は、膜を不安定化する（例えば、膜不安定化ブロック、基、部分などを含む）。更なるまたは別の実施形態において、複数のブロックコポリマーはミセルの外殻および中心を形成する。特定の実施形態において、ミセルは親水性および／または荷電した外殻を含む。更なるまたは別の実施形態においてミセルは実質的に疎水性の中心（例えば、疎水性の基、モノマー単位、部分、ブロックなどを含む中心）を含む。特定の実施形態において、１以上のブロックコポリマーは各々、（１）ミセルの外殻を形成する親水性の荷電ブロック；および（２）ミセルの中心を形成する実質的に疎水性のブロックを含む。いくつかの実施形態において、１以上のブロックコポリマーは複数の第１の荷電可能な種および複数の疎水性促進剤を含む。特定の実施形態において、第１の荷電可能な種は、アニオン性の荷電可能な種である（例えば特定のｐＨで荷電しているか、または荷電する）。更なる実施形態において、１以上のブロックコポリマーは第２の荷電可能な種を含む（即ち、親水性ブロックは１より多くの種々のタイプのアニオン種を有してよい）。ある実施形態において、ミセルは少なくとも１つのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）はミセルの中心にはない。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、膜不安定化ブロックコポリマーは（ｉ）複数の疎水性モノマー残基、（ｉｉ）荷電可能な種を有する複数のアニオン性モノマー残基、当該荷電可能な種は生理学的ｐＨでアニオン性であり、エンドソームｐＨで実質的に中性または非荷電である、および（ｉｉｉ）複数のカチオン性モノマー残基を任意に含む。いくつかの実施形態において、共に作用する膜崩壊の２つのメカニズムの組合せ、（ａ）ポリカチオン（例えばＤＭＡＥＭＡなど）および（ｂ）疎水化したポリアニオン（例えばプロポリアクリル酸）はポリマーにより与えられた膜不安定化の効力に対して追加的または相乗的な作用を与える。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマー中のアニオン種対カチオン種の比の変更により、ここにおいて記載されるミセルの膜不安定化活性が変更される。前記実施形態において、ブロックコポリマー中のアニオン種：カチオン種の比は、生理学的ｐＨで約４：１〜約１：４である。前記実施形態のうちのいくつかにおいて、ブロックコポリマーの疎水性ブロック中のアニオン種対カチオン種の比の変更により、ここにおいて記載されるミセルの膜不安定化活性が変更される。前記実施形態のうちのいくつかにおいて、ここに記載されるブロックコポリマーの疎水性ブロックにおけるアニオン種：カチオン種の比は、生理学的ｐＨで、約１：２〜約３：１、または約１：１〜約２：１である。
【０１４０】
ある実施形態において、ここで提供されるミセル中の膜不安定化ブロックコポリマーは、中心のセクション（例えば、中心のブロック）を含み、これは複数の疎水性基を含む。更なる特定の実施形態において中心のセクション（例えば、中心のブロック）は、複数の疎水性基および複数の第１の荷電可能な種または基を含む。さらに特定の実施形態において、前記第１の荷電可能な種または基は、負に荷電し、および／または負に荷電した種もしくは基に荷電可能である（例えば、ほぼ中性ｐＨ、またはｐＨ約７．４で）。いくつかの特定の実施形態において、中心のセクション（例えば、中心のブロック）は複数の疎水性基、複数の第１の荷電可能な種または基、ならびに複数の第２の荷電可能な種または基を含む。さらに特定の実施形態において、第１の荷電可能な種もしくは基は、負に荷電し、および／または負に荷電した種もしくは基に荷電可能であり、第２の荷電可能な種もしくは基は正に荷電し、および／または正に荷電した種もしくは基に荷電可能である（例えば、ほぼ中性ｐＨまたはｐＨ約７．４で）。
【０１４１】
親水性ブロック対疎水性ブロックの比
ある実施形態において、ここで提供されるミセルはさらに、または代わりに他の基準：（１）個々のブロックの分子量およびそれらの相対長さ比は、形成されるミセルのサイズおよびその相対的安定性を決定するために増減され、（２）アニオン性治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド剤）との効果的な複合体の形成および／またはその電荷中和を行うため、ポリマーの親水性ブロックのサイズを変化させる（例えばカチオンモノマーの数を変化させることによって）。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分量（Ｍｎ）のブロック比は約１：１〜約１：１０である。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量（Ｍｎ）のブロック比、約１：１〜約５：１または約１：１〜約２．５：１のコポリマーを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分量（Ｍｎ）のブロック比は約１：１〜約１：１０である。いくつかの実施形態において、ここで記載されるミセルは、親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量（Ｍｎ）のブロック比、約１：１〜約５：１または約１：１〜約２．５：１のコポリマーを含む。
【０１４４】
ポリマー構造
特定の実施形態において、ここで提供されるのは以下の構造のブロックコポリマーである：
α−[Ｄｓ−Ｘｔ]ｂ−[Ｂｘ−Ｐｙ−Ｄｚ]ａ−ω [構造１]
α−[Ｂｘ−Ｐｙ−Ｄｚ]ａ−[Ｄｓ−Ｘｔ]ｂ−ω [構造２]
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｓおよびｔは、ポリマーブロック中の個々のモノマー単位Ｄ（ＤＭＡＥＭＡ）、Ｂ（ＢＭＡ，Ｐ（ＰＡＡ）および親水性の中性モノマー（Ｘ）のモル％組成（一般に０〜５０％）であり、ａおよびｂはブロックの分子量であり、［Ｄｓ−Ｘｔ］は、親水性ブロックであり、αおよびωはポリマーの反対の端を示す。ある実施形態において、ｘは５０％、ｙは２５％、ｚは２５％である。ある実施形態において、ｘは６０％、ｙは２０％、ｚは２０％である。ある実施形態において、ｘが７０％、ｙは１５％、ｚは１５％である。ある実施形態において、ｘが５０％、ｙは２５％、ｚは２５％である。ある実施形態において、ｘが３３％、ｙは３３％、ｚは３３％である。ある実施形態において、ｘが５０％、ｙは２０％、ｚは３０％である。ある実施形態において、ｘが２０％、ｙは４０％、ｚは４０％である。ある実施形態において、ｘが３０％、ｙは４０％、ｚは３０％である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ここで記載されるブロックポリマーは、約２，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａ、または約７，０００ｋＤａ〜約１５，０００ｋＤａの親水性ブロックを含む。特定の実施形態において、親水性ブロックは、約７，０００ｋＤａ、約８，０００ｋＤａ、約９，０００ｋＤａ、約１０，０００ｋＤａ、約１１，０００ｋＤａ、約１２，０００ｋＤａ、約１３，０００ｋＤａ、約１４，０００ｋＤａまたは約１５，０００ｋＤａである。ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマーは、約１０，０００ＫＤａ〜約１００，０００ＫＤａ、約１５，０００ＫＤａ〜約３５，０００ＫＤａ、または約２０，０００ＫＤａ〜約３０，０００ＫＤａの疎水性ブロックを含む。いくつかの特定の実施形態において、１２，５００ＫＤａの親水性ブロックおよび２５，０００ＫＤａの疎水性ブロックを含む（１：２の長さ比）を含むブロックコポリマーはミセルを形成する。いくつかの特定の実施形態において、１０，０００ＫＤａの親水性ブロックおよび３０，０００ＫＤａの疎水性ブロックを含む（１：３の長さ比）ブロックコポリマーはミセルを形成する。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、１０，０００ＫＤａの親水性ブロックおよび２５，０００Ｋｄａの疎水性ブロックを含む（長さ比１：２．５）ブロックコポリマーは約４５ｎｍ（動的光散乱測定または電子顕微鏡法により決定される通り）のミセルを形成する。いくつかの特定の実施形態において、ミセルは８０または１３０ｎｍ（動的光散乱測定または電子顕微鏡法により決定される通り）である。典型的に、ミセルの外殻を形成する[Ｄｓ−Ｘｔ]の分子量（または長さ）が中心を形成する疎水性ブロック−[Ｂｘ−Ｐｙ−Ｄｚ]に比較して増加する場合、ミセルのサイズは増加する。いくつかの場合、外殻を形成するポリマーのカチオン性のブロックのサイズ（[Ｄｓ−Ｘｔ]は、オリゴヌクレオチド薬剤により複合体形成／電荷中和を提供するために重要である。例えばある場合において、約２０塩基対（即ち、４０のアニオン性電荷）のｓｉＲＮＡについてカチオン性ブロックは効果的な結合を提供するために適切な長さ、例えば４０のカチオン性電荷を有する。７．４のｐＫａ値を有する８０のＤＭＡＥＭＡモノマー（ＭＷ＝１１，６８０）を含む外殻ブロックについては、当該ブロックはｐＨ７．４で４０のカチオン性電荷を有する。いくつかの場合において、安定なポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体（例えば、複合体）を、同数の反対の電荷間での静電相互作用により形成する。ある場合において、多くの過剰正電荷の回避により、有意なインビトロおよびインビボの毒性を予防する。
【０１４７】
多分散性
いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルに用いられるブロックコポリマーは、低い多分散性指数（ＰＤＩ）または鎖の長さの差を有する。多分散性指数（ＰＤＩ）は何れかの適切な方法、例えばポリマー鎖の重量平均分子量をそれらの数平均分子量で割ることにより決定する。数平均分子量は、鎖の数で割った個々の鎖の分子量の合計である。重量平均分子量は、その分子量の分子数で割った分子量の二乗に比例する。重量平均分子量は常に数平均分子量よりも大きいため、多分散性は常に１以上である。数が同じものに近づくにつれ、即ち、多分散性が１の値に近づくにつれ、ポリマーが単分散に近づき、ここにおいてはいずれの鎖も正確に同じ数のモノマー単位を有する。１に近づく多分散性の値は、強烈なラジカル重合化を用いることにより達成可能である。多分散性を決定する方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱、マトリクス支援レーザー脱離イオン化クロマトグラフィー、およびエレクトロスプレー質量クロマトグラフィーなどであるが、これらに限定されず、当該分野で周知である。いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセル集合のブロックコポリマーは、０．２未満、１．５未満、１．４未満、または１．３未満、または１．２未満の多分散性指数（ＰＤＩ）を有する。
【０１４８】
合成
ある実施形態において、ブロックコポリマーはエチレン不飽和モノマーを含む。「エチレン不飽和モノマー」の語はここで、少なくとも１つの炭素２重または３重結合を有する化合物として定義される。エチレン不飽和モノマーの非限定的な例は：アルキル（アルキル）アクリレート、メタクリレート、アクリレート、アルキルアクリルアミド、メタクリルアミド、アクリルアミド、スチレン、アリルアミン、アリルアンモニウム、ジアリルアミン、ジアリルアンモニウム、Ｎ−ビニルホルムアミド、ビニルエーテル、ビヌルスルホナート、アクリル酸、スルボベタイン、カルボキシベタイン、ホスフォベタインまたは無水マレイン酸である。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるブロックコポリマーの製造における使用に適するモノマーは、非限定的な例として以下のモノマーのうちの１以上を含む：メチルメタクリレート、エチルアクリレート、プロピルメタクリレート（全ての異性体）、ブチルメタクリレート（全ての異性体）、２−エチルヘキシルメタクリレート、イソボロニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、α−メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（全ての異性体）、ブチルアクリレート（全ての異性体）、２−エチルヘキシルアクリレート、イソボロニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレンおよびグリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（全ての異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、オリゴエチレングリコールメタクリレート、イタコン酸無水物、イタコン酸、グリシジルアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（全ての異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、N-メチルアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、ビニル安息香酸（全ての異性体）、ジエチルアミノスチレン（全ての異性体）、α−メチルビニル安息香酸（全ての異性体）、ジエチルアミノα-メチルスチレン（全ての異性体）、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、ビニルアセテート、ビニルブチレ��ト、ビニルベンゾエート、ビニルクロリド、ビニルフルオリド、ビニルブロミド、マレイン酸無水物、Ｎ−アリールマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−アルキルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、エチレン、プロピレン、１，５−ヘキサジエン、１，４−ヘキサジエン、１，３−ブタジエン、１，４−ペンタジエン、ビニルアルコール、ビニルアミン、Ｎ−アルキルビニルアミン、アリルアミン、Ｎ−アルキルアリルアミン、ジアリルアミン、Ｎ−アルキルジアリルアミン、アルキルエニミン、アクリル酸、アルキルアクリレート、アクリルアミド、メタクリル酸、アルキルメタクリレート、メタクリルアミド、N-アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、スチレン、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビニルナフタレン、ビニルピリジン、エチルビニルベンゼン、アミノスチレン、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、ビニルビフェニル、ビニルアニソール、ビニルイミダゾリル、ビニルピリジニル、ビニルポリエチレングリコール、ジメチルアミノメチルスチレン、トリメチルアンモニウム、エチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムプロピルアクリルアミド、ドデシルアクリレート、オクタデシルアクリレート、またはオクタデシルメタクリレートモノマーから選択されるアクリレートおよびスチレン、またはこれらの組合せ。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、これらのモノマーの官能化された種類が任意に用いられる。ここで用いられる通り、官能化されたモノマーは、マスクされた、またはマスクされていない官能基、例えば重合化後に他の部分が結合可能な基を含むモノマーである。前記基の非限定的な例は、第１級アミノ基、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル、アジドおよびシアノ基である。いくつかの適切なマスキング基（masking group）が利用可能である（例えば、その開示が引用によりここに組み込まれるT.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991 and P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994を参照のこと）。
【０１５１】
ここで記載されるポリマーは、いずれかの適切な方法で調製される。ここで提供されるポリマーを製造するために用いられる適切な合成方法は、非限定的な例として、カチオン性、アニオン性および遊離ラジカル重合化を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性の方法が用いられる場合、モノマーは触媒により処理され、重合化を開始する。任意に、１以上のモノマーを用い、コポリマーを形成する。いくつかの実施形態において、前記触媒はイニシエータであり、これは例えば、プロトン酸（ブレンステッド酸）またはルイス酸を含み、ルイス酸を用いる場合、いくつかのプロモータ、例えば水またはアルコールなども任意に用いられる。いくつかの実施形態において触媒は、非限定的な例として、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、リン酸、フッ化水素、クロロスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、三塩化アルミニウム、アルキルアルミニウムクロリド、三フッ化ホウ素複合体、四塩化スズ、五塩化アンチモン、塩化スズ、四塩化チタン、五塩化リン、オキシ塩化リン、またはオキシ塩化クロムである。ある実施形態において、ポリマー合成は、純粋であるか（neat）、またはいずれかの適切な溶媒中で行われる。適切な溶媒は、ペンタン、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムまたはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むがこれらに限定されない。ある実施形態において、ポリマー合成は、いずれかの適切な反応温度で行われ、これは例えば約−５０℃〜約１００℃、または約０℃〜約７０℃を含む。
【０１５２】
ある実施形態において、ブロックコポリマーはフリーラジカル重合化により調製される。フリーラジカル重合化方法が用いられる場合、（ｉ）モノマー、（ｉｉ）任意にコポリマー、および（ｉｉｉ）フリーラジカルの任意の供給源が提供され、フリーラジカル重合化方法を開始する。いくつかの実施形態において、いくつかのモノマーが高温での加熱により自己開始するため、フリーラジカルの供給源は任意である。ある場合において、重合化混合物を形成した後、混合物を重合化反応に供する。重合化条件は、ここで述べる通り、少なくとも１つのモノマーを生じ、少なくとも１つのポリマーを形成する条件である。前記条件はいずれかの適切なレベルに任意に変化し、非限定的な例として温度、圧力、環境、重合化混合物において用いられる出発成分の比率、および反応時間を含む。重合化はいずれかの適切な方法により行われ、これは例えば、水溶液中、分散系、懸濁液、エマルションまたはバルク（bulk）を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、イニシエータは反応混合物中に存在する。ここで記載される重合化反応に有用な場合、いずれかの適切なイニシエータが任意に用いられる。前記イニシエータは、非限定的な例として、１以上のアルキルペルオキシド、置換されたアルキルペルオキシド、アリールペルオキシド、置換されたアリールペルオキシド、アシルペルオキシド、アルキルヒドロペルオキシド、置換されたアルキルヒドロペルオキシド、アリールヒドロペルオキシド、置換されたアリールヒドロペルオキシド、ヘテロアルキルヒドロペルオキシド、置換されたヘテロアルキルヒドロペルオキシド、ヘテロアルキルヒドロペルオキシド、置換されたヘテロアルキルヒドロペルオキシド、ヘテロアリールペルオキシド、置換されたヘテロアリールペルオキシド、ヘテロアリールヒドロペルオキシド、置換されたヘテロアリールヒドロペルオキシド、アルキル過酸エステル、置換されたアルキル過酸エステル、アリール過酸エステル、置換されたアリール過酸エステル、またはアゾ化合物を含む。特定の実施形態において、ベンゾイルペルオキシド（ＢＰＯ）および／またはＡＩＢＮがイニシエータとして用いられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、重合化反応はいずれかの方法によりリビングモード（living mode）で行われ、これは例えば原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、窒素酸化物介在リビングフリーラジカル重合（ＮＭＰ）、開環重合（ＲＯＰ）、変性移動（ＤＴ）または可逆付加開裂移動（ＲＡＦＴ）であるがこれらに限定されない。慣習的なおよび／またはリビング／制御重合方法を用いて、種々のポリマー構造が製造されてよく、例えばブロック、グラフト、星形、およびグラジエントポリマーなどがあるがこれらに限定されず、それによってモノマー単位は統計的にまたは鎖に亘る勾配の様式で分布するか、またはブロック配列またはペンダントグラフトで同種重合する。他の実施形態において、ポリマーはキサントゲン酸塩（ＭＡＤＩＸ）の可逆的付加−開裂連鎖移動によるマクロ分子設計によって合成される（Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, No. 18, 1497-1503 (2001).)。
【０１５５】
ある実施形態において、可逆付加開裂連鎖移動またはＲＡＦＴが本発明のエチレン骨格ポリマーの合成に用いられる。ＲＡＦＴはリビング重合反応である。ＲＡＦＴはフリーラジカル変性連鎖移動反応を含む。いくつかの実施形態において、ここに記載されるポリマーを調製するためのＲＡＦＴの手法は、チオカルボニルチオ化合物、例えばチジオエステルチオエステル、ジチオカルバメート、トリチオカルボネートおよびキサンテートを使用するがこれらに限定するものではなく、可逆連鎖移動のメカニズムにより重合を媒介する。ある実施形態において、前記化合物のうちのいずれかのＣ＝Ｓ基を有するポリマーラジカルの反応により、安定化されたラジカル中間体が形成される。典型的には、これらの安定化されたラジカル中間体は、標準的なラジカル重合に特有の末端反応を受けないが、むしろ再開始またはモノマーによる生長反応をさせることができるラジカルを再導入し、これは当該反応においてＣ＝Ｓ結合を再形成する。ほとんどの場合、このＣ＝Ｓ結合への付加のサイクルは、後に次のラジカルの開裂が起こるが、すべてのモノマーが消費されるかまたは反応がクエンチされるまで続く。一般に、いずれかの特定の時間で、低い濃度の活性化ラジカルは通常の末端反応を制限する。
【０１５６】
ここで記載する重合プロセスは、いずれかの適切な溶媒またはそれらの組合せ中、任意に起こる。適切な溶媒は、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アセトニトリル、ヘキサメチルホスホルアミド、酢酸、ギ酸、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジオキサン、メチレンクロリド、エーテル（例えば、ジエチルエーテル）、クロロホルム、およびエチルアセテートを含む。１つの側面において、溶媒は、水、ならびに水および水混和性有機溶媒、例えばＤＭＦとの混合物を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、結合可能な基（例えば、アジドまたはピリジルジスルフィド基）を含む鎖移動試薬の存在下、ポリマーを調製することにより、結合可能な基がここで提供されるポリマーのα末端に導入され、ここで結合可能な基は、重合プロセスの条件に適合する。前記鎖移動試薬の非限定的な例が、引用により開示がここに組み込まれるHeredia, K. L et al (see Chem. Commun., 2008, 28, 3245-3247に記載される。いくつかの実施形態において、鎖移動試薬は、結合可能な基を含み、アンマスキング反応（unmasking reaction）の後でこれはｓｉＲＮＡ試薬または標的薬剤に結合する。いくつかの実施形態において、標的薬剤、これは例えば低分子標的薬剤（例えば、ビオチン残基または単糖類）などであるがこれらに限定されず、これが鎖移動試薬の存在下ポリマーを調製することによりここで提供されるα末端に結合し、連鎖移動試薬は標的薬剤を含む。
【０１５８】
いくつかの場合において、ブロックポリマーは結合可能なモノマー（例えば、結合可能な基を有するモノマー）を含み、これは化学分野において既知の、例えば「クリック」化学（例えば「クリック」反応、引用により組み込まれるWu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17を参照のこと）を介して、重合後の付加的官能性（例えば、低分子標的薬剤）の導入に用いられる。いくつかの実施形態において、前記結合可能な基を含むモノマーは疎水性モノマーおよびアニオン種に荷電可能なものを含むモノマーと共重合する。いくつかの場合において、アクリル酸またはアルキルアクリル酸のＮ−ヒドロキシスクシニドエステルは、他のモノマーと共重合し、アミノ官能化した分子、例えば標的リガンドまたはＰＥＧのアミノ誘導体と反応するコポリマーを形成する。いくつかの実施形態において、結合可能な基を含むモノマーはピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）である。
【０１５９】
ある実施形態において、ブロックコポリマーはＰＥＧ置換されたモノマー単位（例えば、ＰＥＧは側鎖であり、ポリヌクレオチドキャリアブロックの骨格を含まない）を含む。いくつかの場合において、ここで記載される１以上のポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、または約１，０００〜約３０，０００の分子量を有するブロックを含む。いくつかの実施形態においてＰＥＧは、ここで提供されるポリマーキャリアのポリマーに存在するポリマー末端基、または１以上のペンダント修飾可能な基に結合可能である。いくつかの実施形態においてＰＥＧ残基は、ここで提供されるポリマーキャリアのポリマー（例えば、ブロックコポリマー）の親水性セグメントまたはブロック内で修飾可能な基に結合する。ある実施形態において、２〜２０のエチレンオキシド単位を含むＰＥＧ残基は共重合し、ここで提供されるポリマーキャリアを形成するポリマーの親水性部分を形成する。
【０１６０】
ミセルの正味重量：ポリヌクレオチド
ここで提供されるのは診断剤および／または治療剤（これは例えば、オリゴヌクレオチドを含む）を生細胞に送達するミセルである。いくつかの実施形態において、ミセルは複数のブロックコポリマーと任意に少なくとも１つの治療剤（ポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ）を含む。ここで提供されるミセルは、生体適合性があり、安定（化学的および／または物理的安定を含む）であり、および／または再生可能に合成される。好ましくは、ここで提供されるミセルは、非毒性であり（例えば、低い毒性を示し）、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）の正味重量を分解から保護し、自然発生的なプロセスを介して（例えば、エンドサイトーシスにより）生細胞に入り、および／または治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）の正味重量を細胞に接触した後、生細胞の細胞質に送達する。
【０１６１】
ある場合において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）はｓｉＲＮＡおよび／または別の「ヌクレオチドに基づく」薬剤であり、これは細胞中で少なくとも１つの遺伝子の発現を変更する。したがってある実施形態において、ここで提供されるミセルは細胞にｓｉＲＮＡを送達するために有用である。ある場合において、細胞はインビトロであり、他の場合、細胞はインビボである（例えばマウスまたはヒト）。いくつかの実施形態において、治療効果のあるｓｉＲＮＡを含むミセルは、必要な場合に個体に投与される（例えば、遺伝子ノックダウンを必要とし、当該遺伝子が投与されたｓｉＲＮＡによりノックダウンすることができる場合）。特定の場合、ミセルは個体の特異的な標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達のために有用であるか、または特異的に設計される。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるミセルはそれを必要とする個体にＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達する。ここで提供される前記実施形態うちのある特定の実施形態において、ミセルは、ポリマーバイオ結合体、例えばブロックコポリマーと結合した（イオン的または共有結合的に）ＲＮＡｉ剤を含んでいる。更に特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤はブロックコポリマーのアルファ末端に結合し、他の特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤はブロックコポリマーのオメガ末端に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは１以上のポリマーのモノマー単位のペンダント側鎖に共有結合的に結合する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ分子はポリヌクレオチドである。ある実施形態において、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータである。更なる実施形態において、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドノックダウン剤またはＲＮＡｉ剤である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはダイサー基質またはｓｉＲＮＡである。
【０１６４】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは５’および３’末端を含み、膜不安定化ポリマーにポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかで結合する。種々の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、結合部分を介して共有結合的にブロックコポリマーに結合する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、結合部分は親和結合対を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはｐＨ依存性の膜不安定化ポリマーの末端のうちの１つは、ポリヌクレオチドを提供する化学的部分および／または互いに親和性を有するポリマー、例えばアリールボロン酸−サリチルヒドロキサム酸、ロイシンジッパーもしくは他のペプチドモチーフまたは他の種類の化学的親和結合により修飾される。
【０１６６】
ここで記載されるミセルのブロックコポリマーとＲＮＡｉ剤との結合部分（例えば、共有結合）は、任意に開裂不可能であるか、または開裂可能である。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤の前駆体（例えば、ダイサー基質）は、開裂不可能な結合部分によりポリマー（例えば、ポリマーのアルファまたはオメガ末端の結合可能な基）に結合する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は開裂可能な結合部分を介して結合する。いくつかの場合、ここで提供されるミセルのポリマーとＲＮＡｉとの結合部分は開裂可能な結合を含む。他の場合、ここで提供されるミセルのＲＮＡｉ剤とポリマーとの間の結合部分は開裂不可能である。ある実施形態において、ここで記載されるミセルで用いられる開裂可能な結合は、非限定的な例としてジスルフィド結合（例えば、細胞質の還元環境中で解離するジスルフィド結合）を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／またはエンドソーム条件で開裂可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／または特異的酵素（例えば、ホスファターゼまたはプロテアーゼ）により開裂可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／または細胞内パラメータ（例えばｐＨ、還元電位）の変化により開裂可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、ポリマー（例えば、ポリマーのアルファまたはオメガ末端の結合可能な基）とＲＮＡｉ剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）との間の共有結合は、いずれかの適切な化学的結合方法により達成され、これはアミン−カルボキシルリンカー、アミン−スルフヒドリルリンカー、アミン−糖リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−糖リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−糖リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル−スルフヒドリルリンカー、糖−ヒドロキシルリンカー、糖−糖リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、２官能化架橋試薬を用い、ＲＮＡｉの適切な結合可能な基とブロックコポリマーとの共有結合を達成する。いくつかの実施形態において、結合はまたｐＨ感受性の結合およびリンカーにより行われ、これはヒドラゾンおよびアセタール結合を含むがこれらに限定されない。ある実施形態において、ＲＮＡｉ（例えばリボオリゴヌクレオチド）分子は、ポリマーのアルファまたはオメガ末端に、ＲＮＡｉ剤の末端のリボース残基の２’および３’−ヒドロキシルによるボロン酸エステルの形成を介して結合されるボロン酸官能基（例えば、フェニルボロン酸残基）に共有結合的に結合する。他のいずれかの適切な結合方法が同様に、任意に用いられてもよく、例えば多種多様の結合化学が利用可能である（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびここにおける章を参照のこと）。
【０１６７】
ある実施形態において、ここで記載されるブロックコポリマー（例えば、ポリマーのアルファまたはオメガ末端の結合可能な基）を有するポリヌクレオチドのポリマーバイオ結合体（例えばｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）は、以下の２つの工程を含む方法に従って調製される：（１）オリゴヌクレオチドの修飾可能な末端基（例えば、５’−もしくは３’−ヒドロキシルまたはアミノ基）を、何れかの適切な活性化試薬を用いて活性化すること、これは例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）、イミダゾール、Ｎ−ヒドロスクシニミド（ＮＨＳ）およびジシクロヘキシルジカルボジイミド（ＤＣＣ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキベンゾトリアゾール）、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）およびＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカルボネート（ＤＳＣ）などであるがこれらに限定されない；および（２）ポリマー（例えば、ポリマーのアルファまたはオメガ末端）をオリゴヌクレオチドの末端に共有結合させること。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’−または３’−末端の修飾可能な基は、ポリマーへの結合の前に他の官能基により置換される。例えば、ヒドロキシル基（--ＯＨ）はスルフヒドリル基（--ＳＨ）、カルボキシ基（--ＣＯＯＨ）またはアミン基（--ＮＨ２）を有するリンカーにより任意に置換される。
【０１６８】
さらに別の実施形態において、１以上の塩基（例えば、５−アミノアルキルピリミジン）に導入される官能基を含むオリゴヌクレオチドは、いずれかの適切な順序に従って活性化剤または反応性の２官能性リンカーを用いてここで提供されるミセルを含むコポリマーに結合する。種々の前記活性化剤および２官能性リンカーは、Ｓｉｇｍａ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎその他の供給者から商業的に入手可能である。
【０１６９】
いくつかの特定の実施形態において、ブロックコポリマーは、マスクされた結合可能な基を含む連鎖移動薬剤を用いてＲＡＦＴ重合により調製される。特定の場合、ＣＴＡを含むピリジル−ジスルフィドを用いて、前記ポリマーを合成する。ＲＮＡｉ剤の共有結合的な末端結合は、チオール含有ＲＮＡｉ剤をポリマーにより処理することにより達成される。いくつかの場合、ポリマー濃度と比較して過剰なチオール含有ＲＮＡｉ剤が用いられ、結合を達成する。
【０１７０】
ある実施形態において、ここで記載されるミセルは生理活性剤（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡなど）の細胞内送達を促進する。ある実施形態において、ここで記載されるミセルは直接的なポリマー−ＲＮＡ結合により連結されるｓｉＲＮＡの細胞内送達を促進する。ある実施形態においてｓｉＲＮＡの細胞内送達を増強するミセルは、水溶性および／または薬物動態特性を増強する第１のブロック（例えば、親水性モノマーを含む第１のブロック）、ならびにｐＨ応答性の第２のブロックを含む。
【０１７１】
標的部分
ある実施形態において、ミセルの細胞取り込みの効率は、標的部分のミセルへの結合により増強される。「標的リガンド」（これは「標的部分」と互換可能である）は、細胞（例えば、選択細胞）の表面に結合する。いくつかの実施形態において、標的部分は特異的細胞表面抗原を認識するか、または標的細胞表面上のレセプターに結合する。適切な標的リガンドは、非限定的な例として、抗体、抗体様分子、またはペプチド、例えばＲＧＤ含有ペプチドなどのインテグリン結合ペプチド、またはビタミンなどの低分子、例えば葉酸、ラクトースおよびガラクトースなどの糖、または他の低分子を含む。細胞表面の抗原は、細胞表面分子、例えばタンパク質、糖、脂質または他の細胞表面上の抗原を含む。特定の実施形態において、細胞表面抗原は内在化する。ここで提供されるミセルの標的部分により標的化される細胞表面抗原の例は、トランスフェリンレセプタータイプ１および２、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、VEGFレセプター、インテグリン、ＮＧＦ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６９、およびアシアログリコプロテインレセプターが含まれる。標的リガンドもまた、人工的な親和性分子、例えばペプチド模倣薬またはアプタマーを含む。
【０１７２】
種々の実施形態において標的リガンドは、ミセルのポリマー（例えばブロックコポリマー）のいずれかの末端、またはモノマー単位の側鎖もしくはペンダント基に結合するか、ポリマーに組み込まれる。ある実施形態において、標的薬剤残基を含むモノマー（例えば、標的薬剤を含む重合可能なビニルモノマー）を共重合し、ここで提供されるミセルを形成するブロックコポリマーを形成する。ある実施形態において、１以上の標的リガンドが結合部分を介してここで提供されるミセルのブロックコポリマーに結合する。いくつかの実施形態において、標的リガンドをブロックコポリマーに結合する結合部分は、開裂可能な結合部分（例えば、開裂可能な結合を含む）である。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／またはエンドソーム条件で開裂可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／または特異的な酵素により開裂可能な結合（例えば、ホスファターゼまたはプロテアーゼ）を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は開裂可能であり、および／または分子内パラメータ（例えば、ｐＨ、還元電位）の変化により開裂可能な結合を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、標的薬剤はタンパク性の標的薬剤（例えば、ペプチド、抗体、抗体断片）である。ポリマーの標的部分への結合はいずれかの適切な方法、例えば結合の化学的アプローチのうちのいずれか１つにより達成され、これはアミン−カルボキシルリンカー、アミン−スルフヒドリルリンカー、アミン−糖リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−糖リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−糖リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル−スルフヒドリルリンカー、糖−ヒドロキシルリンカー、糖−糖リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において「クリック」化学が、標的リガンドをここで提供されるミセルのブロックコポリマーに結合するために用いられる（「クリック」反応の例についてはWu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta 2007, 40, 7-17を参照のこと）。多種多様の結合化学が任意に用いられる（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびこの中の章を参照のこと）。いくつかの実施形態において、標的リガンドはモノマーに結合し、次に、結果として得られる化合物はここで記載されるミセル中で用いられるポリマー（例えばコポリマー）の重合合成で用いられる。いくつかの実施形態において標的リガンドは、ミセルのポリマーに結合するｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖に結合する。ある実施形態において、標的薬剤はセンスまたはアンチセンス鎖の５’または３’末端に結合する。
【０１７４】
特定の実施形態において、ここで提供されるミセルは生体適合性である。ここで用いられる通り、「生体適合性」は、化合物（例えば、ポリヌクレオチドと会合するミセル）の性質をいい、これはそれ自体またはそのインビボ分解産物により特徴付けられ、これは生組織に対して非障害性であるか、または少なくとも最小のおよび／または修復可能な障害性であり；および／または生組織中で免疫反応を生じないか、または少なくとも最小限および制御可能に生ずる。塩に関しては現在、何れかの両性イオン（例えば、カチオン性種またはアニオン種）が生体適合性であることが好ましい。ここで用いられる通り、「生理学的に許容可能な」とは、生体適合性と互換性がある。いくつかの例において、ここで用いられるミセルおよび／またはポリマー（例えば、コポリマー）は、カチオン性脂質と比べて低い毒性を呈する。
【０１７５】
細胞取り込み
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含むミセルは、エンドサイトーシスにより細胞に送達される。細胞内小胞およびエンドソームは本明細書にわたって互換可能に用いられる。ＲＮＡｉ剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の細胞質への成功的な送達は一般に、エンドソームのエスケープ（endosomal escape）のメカニズムを有する。ある場合において、ここで提供されるＲＮＡｉ剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含むミセルは、エンドサイトーシスに際して、エンドソームのコンパートメント中のより低いｐＨに感受性がある。ある場合において、エンドサイトーシスは、荷電可能なモノマー単位もしくはアニオン性単位（例えば、ブロピルアクリル酸単位）に荷電可能な種、またはここで提供されるポリマーおよび／またはミセルの種のプロトン化または電荷中和を誘発し、これによりポリマー中の構造変化が生じる。ある場合においてこの構造変化は、さらに疎水性の膜不安定化形態を生じ、これはエンドソームから細胞質への治療剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の放出を媒介する。ｓｉＲＮＡを含むこれらのミセルにおいて、ｓｉＲＮＡの細胞質への送達は、そのｍＲＮＡのノックダウン効果を生じさせることができる。これらの他の種類のＲＮＡｉ剤を含むポリマー結合体において、細胞質への送達によりそれらの所望の作用を生じさせることができる。
【０１７６】
さらにある実施形態において、ここにおいて提供されるミセルは選択的に疎水性の低分子、例えば疎水性の低分子化合物など（例えば、疎水性低分子薬剤）を選択的にミセルの疎水性中心に取り込む。特定の実施形態において、ここで提供されるミセルは疎水性の低分子、例えば疎水性の低分子化合物ピレリンなどをミセルの疎水性中心に取り込む。
【０１７７】
例
本出願の明細書に亘って、種々の既知の頭字語および略語が用いられ、モノマーまたは前記モノマーの重合に由来するモノマー残基が記載される。特に示した場合を除き、限定することなく：「ＢＭＡ」（または対応する簡単な表記としての文字「Ｂ」）は、ブチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を示し；「ＤＭＡＥＭＡ」（または対応する簡単な表記としての文字「Ｄ」）は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基であり；「Ｇａｌ」はガラクトースまたはガラクトース残基をいい、これは任意にヒドロキシル保護部分（例えば、アセチル）、またはそれに由来するｐｅｇ化した（pegylated）誘導体（以下に示す通り）を含む；ＨＰＭＡは、２−ヒドロキシプロピルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を示す；「ＭＡＡ」はメチルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を示す；「ＭＡＡ（ＮＨＳ）」はメタクリル酸のＮ−ヒドロキシル−スクシニミドエステルまたはそれに由来するモノマー単位を示す；「ＰＡＡ」（または対応する簡単な表記としての文字「Ｐ」）は、２−プロピルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を示し、「ＰＥＧＭＡ」とはｐｅｇ化したメタクリルモノマー、ＣＨ３Ｏ(ＣＨ２Ｏ)７−８ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２またはこれに由来するモノマー残基をいう。各々の場合において、いずれかの記号が、モノマー（全ての塩またはそのイオン化類似体を含む）、またはモノマーの重合に由来するモノマー残基（全ての塩またはそのイオン化類似体を含む）を示し、示された特定の形態は、当業者にとってその内容から明確である。
【０１７８】
例１：ジブロックポリマーおよびコポリマーの調製
以下の一般式のジブロックポリマーおよびコポリマーを調製する：
[Ａ１ｘ−／−Ａ２ｙ]ｎ−[Ｂ１ｘ−／−Ｂ２ｙ−／−Ｂ３ｚ]１−５ｎ
式中、［Ａ１−Ａ２］は第１のブロックコポリマーであり、これはモノマーＡ１およびＡ２の残基から構成され、
[Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３]は、第２のブロックコポリマーであり、これはモノマーＢ１、Ｂ２、Ｂ３の残基から構成され、
ｘ、ｙ、ｚはモノマー残基中のモル％のポリマー組成であり、
ｎは分子量である。
【０１７９】
代表的なジブロックコポリマーは：
[ＤＭＡＥＭＡ]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
[ＰＥＧＭＡｗ]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
[ＰＥＧＭＡｗ−ＤＭＡＥＭＡ]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
[ＰＥＧＭＡｗ−ＭＡＡ(ＮＨＳ)]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
[ＤＭＡＥＭＡ−／−ＭＡＡ(ＮＨＳ)]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
[ＨＰＭＡ−／−ＰＤＳＭ]−[Ｂ−／−Ｐ−／−Ｄ]
であり、式中：
Ｂはブチルメタクリレートであり、
Ｐはプロピルアクリル酸であり、
ＤはＤＭＡＥＭＡ、ジメチルアミノエチルメタクリレートであり、
ＰＥＧはポリエチレングリコールメタクリレートであり、例えばｗ＝４〜５または７〜８のエチレンオキシド単位であり）
ＭＡＡ（ＮＨＳ）はメチルアクリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドであり、
ＨＰＭＡはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、
ＰＤＳＭはピリジルジスルフィドメタクリレートである。
【０１８０】
これらのポリマーは、ポリマーまたはコポリマーの第１ブロックの組成が変化するか、または化学的に処理されて第１のブロックが中性（例えばＰＥＧＭＡ）、カチオン性（ＤＭＡＥＭＡ）、アニオン性（ＰＥＧＭＡ−ＮＨＳ、ここでＮＨＳは酸に加水分解される）、両性（ＤＭＡＥＭＡ−ＮＨＳ、ここでＮＨＳは酸に加水分解される）、または両性イオン性（例えば、ポリ［２−メタクリロイルオキシ−２’トリメチルアンモニウムエチルホスフェート］）である場合、ポリマーが作られる。さらに、［ＰＥＧＭＡ−ＰＤＳＭ］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーは第１ブロック中にピリジルジスルフィド官能基を含み、これはチオール化ｓｉＲＮＡと反応し、ポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体を形成してよい。
【０１８１】
例１．１：ＲＡＦＴによるブロックコポリマーの調製のための一般的合成手順
Ａ．ＲＡＦＴ連鎖移動剤
連鎖移動剤（ＣＴＡ）、４−シアノ−４−（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸（ＥＣＴ）、これは後のＲＡＦＴ重合に用いられるがこの合成は、Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68による手順から採用された。手短に言えば、エタンチオール（４．７２ｇ、７６ｍｍｏｌ）を１０分間に亘って、０℃で攪拌した水素化ナトリウムのジエチルエーテル（１５０ｍｌ）の懸濁液（油中６０％）（３．１５ｇ、７９ｍｍｏｌ）に添加した。次に、二硫化炭素（６．０ｇ、７９ｍｍｏｌ）の添加前に溶液を１０分間に亘り攪拌した。粗製Ｓ−エチルトリチオカルボン酸ナトリウム（７．８５ｇ、０．０４９ｍｏｌ）を濾過により回収し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に懸濁し、ヨウ素（６．３ｇ、０．０２５ｍｏｌ）と反応させた。１時間後、溶液を濾過し、チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。次に、粗製のビス（エチルスルファニルチオカルボニル）ジスルフィドをロータリーエバポレーションにより単離した。ビス−（エチルスルファニルチオカルボニル）ジスルフィド（１．３７ｇ、０．００５ｍｏｌ）および４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（２．１０ｇ、０．００７５ｇ）の酢酸エチル（５０ｍＬ）溶液を１８時間、還流下１８時間加熱した。溶媒のロータリーエバポレーションの後、粗製の４−シアノ−４（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸（ＥＣＴ）を、固定相としてシリカゲル、溶出液として５０：５０酢酸エチルへキサンを用いてカラムクロマトグラフィーにより単離した。
【０１８２】
Ｂ．ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）マクロ連鎖移動剤（ｐｏｌｙＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡ）
ＥＣＴおよび２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０）（和光化学）をラジカルイニシエータとして用い、ＤＭＡＥＭＡのＲＡＦＴ重合を、窒素雰囲気下、１８時間、ＤＭＦ中３０℃で行った。初期のモノマー対ＣＴＡの比（[ＣＴＡ]ｏ／[Ｉ]ｏは、１００％の変換での理論上のＭｎが１０，０００（ｇ／ｍｌ）となるものであった。初期ＣＴＡ対イニシエータの比（[ＣＴＡ]ｏ／[Ｉ]ｏ）は、１０：１であった。結果として得たポリＤＭＡＥＭＡマクロ連鎖移動剤を、５０：５０ ｖ：ｖ ジエチルエーテル／ペンタンの沈殿により単離した。結果として得たポリマーをアセトンに再溶解し、次にペンタン（ｘ３）中に沈殿させ、真空中で一晩乾燥した。
【０１８３】
Ｃ．ポリ（ＤＭＡＥＭＡ）マクロＣＴＡのＤＭＡＥＭＡ、ＰＡＡおよびＢＭＡのブロック重合
所望の化学量論的な量のＤＭＡＥＭＡ、ＰＡＡおよびＢＭＡを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（溶媒に対して２５重量％のモノマーおよびマクロＣＴＡ）にポリ（ＤＭＡＥＭＡ）マクロＣＴＡを溶解した。全ての重合について[Ｍ]ｏ／[ＣＴＡ]ｏおよび[ＣＴＡ]ｏ／[Ｉ]ｏがそれぞれ、２５０：１および１０：１であった。Ｖ７９の添加の後、溶液を３０分間窒素パージし、１８時間、３０℃で反応させた。結果として得たジブロックコポリマーを５０：５０ ｖ：ｖ ジエチルエーテル／ペンテン中に沈殿させることにより単離した。次に沈殿させたポリマーをアセトンに再溶解し、続いてペンタン（ｘ３）に沈殿させ、真空中一晩乾燥した。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、ＤＭＦ中のポリ（ＤＭＡＥＭＡ）マクロＣＴＡおよびジブロックポリマー試料の両方の分子量および多分散性をポリメチルメタクリレート基準について決定した（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ＧＰＣｍａｘ ＶＥ２００１および屈折計ＶＥ３５８０ (Ｖｉｓｃｏｔｅｋ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ)に直列に連結したＳＥＣ Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｒ−３０００ および Ｒ−４０００ カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）。１．０重量％のＬｉＢｒを含むＨＰＬＣ−グレードのＤＭＦを移動相として使用した。ＲＡＦＴ合成したポリマーのいくつかの分子量および組成を図１にまとめる。
【０１８４】
例１．２  ポリ(ＰＥＧＭＡ)マクロＣＴＡからのＤＭＡＥＭＡ、ＰＡＡおよびＢＭＡの第２ブロック(Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３)の共重合の調製
所望の化学量論的な量のＤＭＡＥＭＡ、ＰＡＡおよびＢＭＡを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（溶媒に対して２５重量％のモノマーおよびマクロＣＴＡ）に溶解したポリ（ＰＥＧＭＡ）マクロＣＴＡに添加した。全ての重合について、[Ｍ]ｏ／[ＣＴＡ]ｏおよび[ＣＴＡ]ｏ／[Ｉ]ｏはそれぞれ、１５０：１および１０：１であった。ＡＩＢＮの添加後、溶液を３０分間、窒素パージされ、６〜１２時間、６８℃で反応させた（図２）。次に、結果として得たジブロックコポリマーをアセトンに再溶解し、続いてペンタン（ｘ３）に沈殿させ、真空中で一晩乾燥した。Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ＧＰＣｍａｘ ＶＥ２００１および屈折計ＶＥ３５８０（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いたゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用い、ＤＭＦ中のポリ（ＰＥＧＭＡ）マクロＣＴＡおよびジブロックポリマー試料の両方の分子量および多分散性（ＰＤＩ、Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した。１．０重量％のＬｉＢｒを含むＨＰＬＣ−グレードのＤＭＦを移動相として使用した。ＣＤＣｌ３中でＮＭＲ分光法
を使用してポリマー構造を確認し、第２のブロックの組成を算出した。[ＰＥＧＭＡｗ]−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマー（ｗ＝７〜８）の合成については図２にまとめ、[ＰＥＧＭＡｗ]−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマー（ｗ＝７〜８）の特性決定については図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃにまとめる。
【０１８５】
例１．３  ＰＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡコポリマーの調製および特性決定
例１．１および１．２に記載したのと同じ手順でポリマー合成を行った。第１ブロックにおけるＰＥＧＭおよびＤＭＡＥＭＡの比は、個々のモノマーの種々の供給比を用いることにより変化させ、図４に記載するコポリマーを作った。
【０１８６】
例１．４  ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）コポリマーの調製および特性決定
第１ブロックコポリマーの所望の組成を得るモノマー供給比を用いて、例１．１および１．２に記載した（および図５にまとめた）のと同じ手順でポリマー合成を行った。［ＰＥＧＭＡｗ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマー（第１ブロック中のモノマーのコポリマー比は７５：２５）の合成および特性決定について図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃにまとめる。
【０１８７】
例１．５ＤＭＡＥＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）コポリマーの調製および特性決定
第１ブロックコポリマーの所望の組成を得るモノマー供給比を用いて、例１．１および１．２に記載した（および図５にまとめた）のと同じ手順でポリマー合成を行った。ＤＭＡＥＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）コポリマー（第１ブロック中のモノマーのコポリマー比は７０：３０）の合成および特性決定について図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃにまとめる。ポリマーを含むＮＨＳ
をｐＨ７．４〜８．５、１〜４時間、室温または３７℃、水性緩衝液（リン酸または重炭酸）中でインキュベートし、加水分解した（酸性の）形態を生じ得る。
【０１８８】
例２  ｓｉＲＮＡ薬剤送達のためのＨＰＭＡ−ＰＤＳ(ＲＮＡ)コポリマー結合体の調製および特性決定
Ａ．ピリジルジスルフィドメタクリレートモノマー（ＰＤＳＭＡ）の合成
ＰＤＳＭＡの合成スキームを図８にまとめる。Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２（登録商標）(５ｇ，２２．５９ｍｍｏｌ)を４０ｍｌのメタノールおよび１．８ｍｌのＡｃＯＨに３０分間に亘り溶解した。反応を室温４８で時間、Ｎ２下、攪拌した。溶媒の蒸発後、残渣の油を４０ｍｌジエチルエーテルで２度洗浄した。粗製の化合物を１０ｍｌメタノールに溶解し、生成物を５０ｍｌジエチルエーテルに２度沈殿させ、淡黄色固体として所望の化合物１を得た。収率：９５％。
【０１８９】
ピリジンジチオエチルアミン（１、６．７ｇ、３０．０７ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２３ｍｌ、３０．３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）およびピリジン（２５ｍｌ）に溶解し、メタクリロリルクリリド（３．３３ｍｌ、３３．０８ｍｍｏｌ）をシリンジにより０℃で緩徐に添加した。反応混合物を２時間室温で攪拌した。反応後、反応をｓａｔ． ＮａＨＣＯ３（３５０ｍｌ）により停止し、酢酸エチル（３５０ｍｌ）により抽出した。組み合わせた有機層をさらに、１９％ ＨＣｌ（１００ｍｌ、１回）および純粋（１００ｍｌ、２回）によりさらに洗浄し、ＭａＳＯ４により乾燥した。純粋な生成物をカラムクロマトグラフィー（ＥＡ／Ｈｅｘ：１／１０〜２／１）により、黄色シロップとして精製した。Ｒｆ＝０．２８（ＥＡ／Ｈｅｘ＝１／１)。収率：５５％。
【０１９０】
Ｂ．ＨＰＭＡ−ＰＤＳＭＡコポリマー合成
フリラジカルイニシエータとして２，２’−アゾ−ビス−イソブチリルニトリル（ＡＩＢＮ）を用いて、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）およびピリジルジスルフィドメタクリレートのＲＡＦＴ重合を（典型的には７０：３０のモノマー比で）ＤＭＦ中、８時間、窒素環境下、６８℃で行った（図９）。ＣＴＡ対ＡＩＢＮのモル比は１０：１であり、モノマー対ＣＴＡ比を、１００％の変換の場合、分子量２５，０００ｇ／ｍｏｌが達成されるように設定する。ポリ（ＨＰＭＡ−ＰＤＳ）マクロＣＴＡを、メタノールからジエチルエーテルへの沈殿を繰り返すことにより単離した。
【０１９１】
マクロＣＴＡを真空下２４時間乾燥し、次にジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、プロピルアクリル酸（ＰＡＡ）およびブチルメタクリレート（ＢＭＡ）のブロック重合に用いる。等モル量のＤＭＡＥＭＡ、ＰＡＡおよびＢＭＡ（[Ｍ]ｏ／[ＣＴＡ]ｏ＝２５０）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（溶媒に対して２５重量％のモノマーおよびマクロＣＴＡ）に溶解したＨＰＭＡ−ＰＤＳマクロＣＴＡに添加する。ラジカルイニシエータＡＩＢＮをＣＴＡとともにイニシエータに１０：１の比で添加する。重合を窒素雰囲気下、６８℃で８時間、続行する。その後、結果として得たジブロックポリマーを、５０：５０のジエチルエーテル／ペンタンに４回沈殿させることにより単離し、沈殿の間エタノール中に再溶解する。次に生成物をジエチルエーテルで１度洗浄し、真空中一晩乾燥する。
【０１９２】
Ｃ．ＨＰＭＡ−ＰＤＳＭＡコポリマーへのｓｉＲＮＡ結合
二本鎖ＲＮＡとしてジスルフィド修飾した５’−センス鎖とともにチオール化ｓｉＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を商業的に入手した。結合のための遊離チオールは、凍結乾燥した化合物を水中に溶解することにより調製し、アガロースゲル内に固定したジスルフィド還元剤ＴＣＥＰにより１時間処理する。次に還元したＲＮＡ（４００μＭ）を５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、ピリジルジスルフィド官能化したポリマーにより２４時間処理した（図８）。
【０１９３】
ＲＮＡチオールとのピリジルジスルフィドポリマーの反応により、２−ピリジンチオンを精製し、これは分光学的に測定し、結合効率を測定することが出来る。さらにジスルフィド交換について確認するため、結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ１６．５％トリシンゲル上で泳動する。平衡して、結合反応のアリコート（aliquot）を、ＳＤＳ−ＰＧＡＥの前に固定化したＴＣＥＰにより処理し、還元環境でポリマーからＲＮＡの放出を確認する。結合反応を、１、２および５のポリマー／ＲＮＡ化学量論で行う。２−ピリジンエチオンの放出について３４３ｎｍのＵＶ分光測定を用いて、結合効率を測定する。
【０１９４】
例３：細胞標的剤によるポリマーの合成：葉酸プロパルギルによるアジド−末端ポリマーのクリック反応
制御されたラジカル重合とアジド−アルキンクリック化学との組合せを用い、興味の対象の特定の受容体（例えば、葉酸）を含む特定の組織／細胞の活性ターゲティングに対する可能性のある生物学的リガンド（例えば、葉酸）と結合したブロックコポリマーミセルを調製する。アジド連鎖移動剤（ＣＴＡ）を用いることを除き、実施例１に示すような可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって、ブロックコポリマーを合成する。次に、ポリマーのアジド末端を標的剤（例えば、葉酸）のアルキン誘導体と反応させ、標的剤を含有するポリマーを生成する。
【０１９５】
ＲＡＦＴ剤の合成
ＲＡＦＴ連鎖移動剤（ＣＴＡ）、２−ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル−２−メチル-プロピオン酸 ３−アジドプロピルエステル（Ｃ１２−ＣＴＡＮ３）を以下のように調製する：
３−アジドプロパノールの合成。３−クロロ−１−プロパノール（５．０ｇ，５３ｍｍｏｌ，１．０当量）およびアジ化ナトリウム（８．５９ｇ，１３２ｍｍｏｌ，２．５当量)を、DMF（２６．５ｍＬ）中、１００℃で４８時間反応させる。反応混合物を室温まで冷却し、エチルエーテル（２００ｍＬ）に注ぎ、飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）で抽出する。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４により乾燥し、ろ過する。上清を濃縮し、生成物を得る（５．１ｇ，９５％の収率)。
【０１９６】
２−ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル−２−メチルプロピオン酸塩化物（ＤＭＰ−Ｃｌ）の合成。２−ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル−２−メチル−プロピオン酸 (ＤＭＰ，Ｎｏｖｅｏｎ＞９５％)（１．０ｇ，２．７ｍｍｏｌ，１．０当量）を、５０ｍＬ丸底フラスコ中の塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解し、溶液を約０℃まで冷却する。塩化オキサリル（０．４１７ｇ，３．３ｍｍｏｌ，１．２当量）を窒素雰囲気下、緩徐に添加し、室温に到達させ、合計３時間撹拌する。結果として得られる溶液を減圧濃縮し、酸塩化物の生成物を得る（１．０ｇ，９９％の収率)。
【０１９７】
２−ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル−２−メチルプロピオン酸 ３−アジドプロピルエステルの合成。３−アジドプロパノール（２６５ｍｇ，２．６２ｍｍｏｌ，１．０当量）を、５０ｍＬ丸底フラスコ中の塩化メチレン（５ ｍＬ）に溶解し、溶液を約０℃まで冷却する。塩化メチレン（５ｍＬ）中のトリエチルアミン（０．７３ ｍＬ）溶液を１０分間に亘って滴下する。塩化メチレン（５ｍＬ）中のＤＭＰ−Ｃｌ（１．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）溶液を滴下し、溶液を３時間撹拌しながら室温にする。溶液を減圧濃縮し、エチルエーテル（１００ｍＬ）で希釈し、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、およびＮａＣｌ飽和溶液（５０ｍＬ）で続けて洗浄する。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４（１．０g）で乾燥し、ろ過する。上清を減圧濃縮し、残留油として生成物を得る（１．０５ｇ，９０％の収率)。
【０１９８】
葉酸プロパルギルの合成
葉酸（１．０ｇ，０．００２２ｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、水／氷浴中で冷却する。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（２６０ｍｇ，０．００２５ｍｏｌ）およびＥＤＣ（４４０ｍｇ，０．００２５ｍｏｌ）を加え、結果として得られる混合物を氷浴中で３０分間撹拌する。DMF（５．０ｍＬ）中のプロパルギルアミン（１２４ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）溶液を添加し、結果として得られる溶液を室温まで温め、２４時間撹拌する。反応混合物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、３０分間撹拌し、沈殿を形成する。橙黄色の沈殿をろ過し、アセトンで洗浄し、６時間減圧乾燥し、１．０１ｇの生成物を得る（９３％の収率）。
【０１９９】
アジド末端ポリマーと葉酸プロパルギルとのクリック反応
アジド末端ポリマーを葉酸プロパルギルと以下の手順例により反応させる。DMF（７ｍＬ）中のＮ３−α−[Ｄｓ−Ｘｔ]ｂ−[Ｂｘ−Ｐｙ−Ｄｚ]ａ−ω（０．０８００ｍｍｏｌ）溶液およびペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，Ａｌｄｒｉｃｈ，９９％）、（８．７ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）を６０分間窒素パージし、窒素雰囲気下、ＣｕＢｒ（７．２ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）および葉酸プロパルギル（４２ｍｇ，０．０８８ｍｍｏｌ）を含み、磁気性撹拌子を備えたバイアルにシリンジを用いて移す。反応混合物を、酸素非存在下、２６℃で２２時間撹拌する。反応混合物を空気に暴露し、中性アルミナのカラムに溶液を通過させる。ＤＭＦを減圧除去し、生成物をヘキサン中に沈殿させる。得られる葉酸末端ブロックコポリマー、葉酸−α−[Ｄｓ−Ｘｔ]ｂ−[Ｂｘ−Ｐｙ−Ｄｚ]ａ−ωをＴＨＦに溶解し、ろ過し、過剰な葉酸プロパルギルを除去する。ＴＨＦを除去し、次にポリマーを脱イオン化（ＤＩ）水に溶解し、１０００Ｄａの分子量カットオフを有する分子膜を用いて６時間透析する。凍結乾燥によりポリマーを単離する。
【０２００】
例４：ブロックコポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６のＮＭＲ分光法（図１０）
ＮＭＲ分光法を用いるこの例により、ポリマーＰＲｘ０７１９ｖ６が水溶液中でミセル様構造を形成することが証明される。
【０２０１】
重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）および重水（Ｄ２Ｏ）中、２５℃で１Ｈ ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶ３０１に記録した。重水素ロック（ＣＤＣｌ３，Ｄ２Ｏ）を用い、化学シフトは、テトラメチルシラン（ＣＤＣｌ３について）および３−（トリメチルシリル）プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸、ナトリウム塩（Ｄ２Ｏについて）のｐｐｍで測定した。ポリマー濃度は６ｍｇ／ｍｌであった。
【０２０２】
水性緩衝液中の合成ポリマーのＮＭＲ分光法は、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６を例として用い、本発明のジブロックポリマーが水溶液中でミセルを構成することを証明した。ミセルの形成により、保護された（shielded）粘性の内部中心が形成され、これは中心セグメントを形成するプロトンの動きを制限し、溶媒と中心のプロトンとの重水素交換を防止する。これは対応するプロトンの１Ｈ ＮＭＲシグナルの有意な抑制または消失により反映される。我々は溶液ＮＭＲの固有の特性を用い、ミセルの中心の疎水性ブロックが効果的に保護されることを示した。ミセルが水性溶媒中で形成される場合、疎水性コポリマーブロックのプロトンのシグナルの消失するはずである。
【０２０３】
図１０は、ＣＤＣｌ３（有機溶媒）およびＤ２Ｏ（水性溶媒）中のポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の１Ｈ ＮＭＲ実験について示す。室温、ＣＤＣｌ３中の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図１０Ａ）は、全てのポリマープロトンに起因するシグナルを示し、これはポリマー鎖がＣＤＣｌ３中で分散し（非凝集）、それらの運動を保存し、それらのプロトンが溶媒と交換し得ることを示す。このことから、保護された中心を有する安定なミセルは有機溶媒中のＰＲｘ０７２９ｖ６からは形成されないことが示される。図１０ＢはＤ２Ｏ中のＰＲｘ０７２９ｖ６の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。疎水性ブロック（ＢＭＡ、ＰＡＡ、ＤＭＡＥＭＡ）のプロトンを示すシグナルはスペクトルから消失している。このことから、保護された中心を有する安定なミセルは、水性溶媒中ＰＲｘ０７２９ｖ６から形成されることが示される。さらに、同じスペクトルにおいて、ＤＭＡＥＭＡ（２．２８ｐｐｍ）の２つのメチル基のプロトンの共鳴に起因するシグナルは有意に抑制され、このことは、外殻を構成する第１のポリＤＭＡＥＭＡブロック、即ち、主にＤＭＡＥＭＡの荷電基のみが水に露出していることを意味する。単純な計算により、疎水性ブロックのＰＡＡ、ＤＭＡＥＭＡの積分した割合（２９００）をＣＤＣｌ３（５６００）中でのシグナルから減算することにより、この結論と矛盾しないＤ２Ｏ（２８１１）中での同じシグナルの概略値を得る。
【０２０４】
まとめると、１Ｈ ＮＭＲの結果は、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６が規則的な中心−外殻構造を有するミセルを形成し、ここで第１ブロックポリＤＭＡＥＭＡが、疎水性単位（ＢＭＡ）および反対の電荷の静電安定単位（ＰＡＡ，ＤＭＡＥＭＡ）を包囲する水和した外殻を有するミセルを形成する。
【０２０５】
例５：有機溶媒中でのポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６粒子の安定性（図１１）
この例は、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６のミセル構造が有機溶媒中で解離することを示し、これは、ミセルの中心の疎水性とも矛盾しない。
【０２０６】
ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６を、濃度１ｍｇ／ｍＬで種々の溶媒に溶解し、粒径を動的光散乱により測定した。図１１は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の濃度の増加により凝集鎖へのミセルの解離が生じることを示す。
【０２０７】
例６：ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析（図１２）
この例により、電子顕微鏡を用いて、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６が球形のミセル様粒子を形成することが証明される。
【０２０８】
ＰＢＳ中のポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を、３０分間、炭素を被覆した銅グリッドに適用する。グリッドをＫａｒｎｏｖｓｋｙの溶液に固定し、カコジラート緩衝液中で１度洗浄し、次に水中で８回洗浄する。グリッドを酢酸ウラニルの６％溶液で１５分染色した後、分析の時まで乾燥させた。ＪＥＯＬ顕微鏡について透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を実施した。図１２は、ＰＲｘ０７２９ｖ６の典型的な電子顕微鏡写真を示し、これは動的光散乱により溶液中で決定したものとほぼ同じ大きさの球形粒子を示す。
【０２０９】
例７：ポリマー構造に対するｐＨの影響（図１３）
この例により、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６のミセル構造がｐＨ７．４から４．７へ低下することにより解離することが示される。
【０２１０】
ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の粒径を、ｐＨ７．４で動的光散乱により測定し、０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．００４ｍｇ／ｍＬの５倍の連続希釈法でＰＢＳ中、ｐＨ４．７までの一連の酸性ｐＨ値を下げる。図１３Ａにより、ｐＨ７．４でポリマーは４μｇ／ｍＬまでの希釈に対して安定であり、ここでこれは凝集を生じる形態に解離し始める。図１３Ｂは、ｐＨ４，７までの増加する酸性ｐＨ値において、ミセル構造からのポリマーの解離が増強され、即ち、より高い濃度で生じ、１〜８ｎｍの大きさのポリマーモノマーのレベルが増加することを示す。
【０２１１】
例８：ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）（図１４）
以下の例により、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６により形成されるミセルが１００倍希釈に対して安定であることが証明される。
【０２１２】
ｐＨ７．４のＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬ±０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度のポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の粒径。ＰＢＳ±０．５Ｍ ＮａＣｌによる１ｍｇ／ｍＬ〜１．６μｇ／ｍＬの５倍の範囲に亘る連続希釈法で動的光散乱により、粒径を測定した。
【０２１３】
図１４は、約４５ｎｍの粒径が、約１０μｇ／ｍＬの濃度まで安定であることを示す。ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６は、約５μｇ／ｍＬ（ＣＭＣ）未満で不安定であり、ここで個々のポリマー鎖は解離し、非特異性の凝集体を形成する。
【０２１４】
例９：異種性（混合）ポリマーミセルの調製
異種性（混合）ポリマーミセルは２以上の組成の異なるポリマーを含む。２以上の組成の異なるポリマーの各々（例えば、ポリマーＡおよびポリマーＢ）は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロックコポリマーであってよい。
【０２１５】
異種性ミセルは、第１変性溶媒中で第１ポリマーおよび第１ポリマーと組成の異なるおよび第２ポリマーを含み、第１ポリマーおよい第２ポリマーの異種性混合物を形成する。異種性混合物が第２水性溶媒に露出し、第１ポリマーの疎水性ブロックは水性溶媒中の第２ポリマーと会合し、集合して第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性ミセルを形成する。
【０２１６】
ポリヌクレオチドは少なくとも１つの第１ポリマー、第２ポリマーまたは異種性ミセルとともに会合し得る（イオン性または共有結合的に結合）。
【０２１７】
非限定的な例として、ブロックコポリマー＃１を含む第１ポリマーは、例１に記載する通り、ＲＡＦＴ重合により調製される。ブロックコポリマー＃２を含む第２ポリマーは同様に、異なる親水性ブロックと同じ疎水性ブロックにより調製される。例えば、（ポリＤＭＡＥＭＡ）カチオン性親水性ブロックは代わりに、中性親水性ブロック、例えば、そのペンダント基に共有結合的に結合するポリエチレングリコールオリゴマーを有するモノマー単位を含むホモポリマーブロック（例えばＰＥＧＭＡ）を有するように調製される。別の例として、異種性ポリマーミセルは、代替の第２ポリマーを用いて調製することも可能であり、これは、１００％エタノール中で等量の２つのポリマーを混合し、その後ｐＨ７．４のＰＢＳ中で２０倍希釈またはｐＨ７．４のＰＢＳで透析することにより形成される５０％ＤＭＡＥＭＡおよび５０％ＰＥＧＭＡのランダムコポリマーを含む。各々の場合、上記一般的手順に従い、異種性ミセルを形成し得る。
【０２１８】
例１０：ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の特性決定
アガロースゲル阻害による完全な、セラム安定なｓｉＲＮＡの確認の後、ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体についてサイズ、ゼータ電位をＺｅｔａＰＡＬＳ検出器（Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, 15 mW laser，入射ビーム= ６７６ｎｍ）を用いて特性を決定した。手短に言えば、ポリマーをリン酸緩衝塩（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）中、０．１ｍｇ／ｍＬで配合し、ｐＨ７．４で５０％がプロトン化する正に荷電したＤＭＡＥＭＡおよび負に荷電したｓｉＲＮＡに基づき理論上の所望の電荷比でＧＡＰＨ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）にポリマーを添加することにより複合体を形成した。９０°の散乱角度で相関関数を収集し、水中２５℃の粘土および屈折率を用い、粒径を算出した。有効径として粒系を示し、これは対数正規分布を呈する。ＺｅｔａＰＡＬＳ電位分析ソフトを用いて２５℃で平均電気泳動移動度を測定し、水性懸濁液についてＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｙモデルを用いてゼータ電位を算出した。
【０２１９】
例１１：ＨｅＬａ細胞培養
ＨｅＬａ、ヒト子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）をＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０２２０】
例１２：キャリアおよびｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体のｐＨ依存性膜破壊
溶血を用いて、エンドソームの輸送を模倣するｐＨにおいて遊離ポリマーおよびｓｉＲＮＡ／ポリマー結合体の両方の可能性のあるエンドソーム溶解活性を測定した（細胞外ｐＨ＝７．４、初期エンドソームｐＨ＝６．６、および終期エンドソームｐＨ＝５．８）。手短に言えば、ＥＤＴＡを含む真空容器にヒト血液の全体を収集した。血液を遠心分離し、血漿を吸引し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で３度洗浄し、赤血球細胞（ＲＢＣ）を単離した。ＲＢＣをｐＨ７．４、ｐＨ６．６またはｐＨ５．８のリン酸緩衝液（ＰＢ）に再懸濁した。次に、ポリマー（１０μｇ／ｍＬ）またはポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を３７℃で１時間、３つのｐＨ値でＲＢＣによりインキュベートした。次に、そのままのＲＢＣを遠心分離し、上清へ放出されるヘモグロビンをｐＨ依存性のＲＢＣ膜溶解の指標として５４１ｎｍの吸収により測定した。
【０２２１】
例１３：キャリア媒介性のｓｉＲＮＡの取り込みの測定
ｓｉＲＮＡ／ポリマーの細胞内取り込みをフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ ｂｅｎｃｈｔｏｐ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて測定した。Ｈｅｌａｓを１５，０００細胞／ｃｍ２播種し、一晩付着させた。ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレシン）標識したｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を理論上の電荷比４：１、室温で３０分に亘りポリマーと複合体形成させ、次に培養したＨｅＬａｓを最終ｓｉＲＮＡ濃度２５ｎＭに添加した。複合体により４時間インキュベーションした後、細胞をトリプシン処理し、０，５％ＢＳＡおよび０．０１％トリパンブルーを含むＰＢＳに再懸濁した。細胞外蛍光のクエンチおよび細胞により取り込まれた複合体の識別について前述した通り、トリパンブルーを用いた。１０，０００細胞をサンプルごとに分析し、処理を受けていないサンプルおよびＦＡＭ章式されたｓｉＲＮＡにより錯体形成されていないポリマーを用いて蛍光ゲーティング（gating）について決定した。
【０２２２】
例１４：ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の細胞毒性
ｓｉＲＮＡ／ポリマー錯体の細胞毒性を、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）毒性検知キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。ＨｅＬ細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり１２，０００細胞の密度で播種し、一晩付着させた。複合体をポリマー（０．１ｍｇ／ｍＬ原液）をＧＡＰＨ ｓｉＲＮＡに電荷比４：１で添加することにより形成し、２５ｎＭ ｓｉＲＮＡ／ウェルの濃度で得た。複合体（電荷比＝４：１）を三重にウェルに添加した。細胞をポリマー複合体により２４時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２度洗浄した。次に細胞を溶解緩衝液（１００μＬ／ウェル，２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，1ｍＭ Na２ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ，２．５ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム，１ｍＭ β−グリセロホスフェート，１ｍＭ オルソバナデートナトリウム）、４℃で１時間溶解した。ピペット操作により混合した後、２０μＬの細胞溶解産物をＰＢＳ中１：５に希釈し、１００μＬのＬＤＨ基質溶液と混合することにより乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量した。色素形成のための１０〜２０分のインキュベーションの後、６５０ｎｍでのリファレンスセットにより吸収を４９０ｎｍで測定した。
【０２２３】
例１５：ＧＡＰＤＨタンパク質およびｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体による遺伝子ノックダウンの評価
ｓｉＲＮＡ送達のための一連のポリマーの有効性についてＧＡＰＤＨ活性アッセイ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてスクリーニングした。ＨｅＬａｓ（１２，０００細胞／ｃｍ２）を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、１０％血清の存在下、複合体（電荷比＝４：１）を最終ｓｉＲＮＡ濃度２５ｎＭで細胞に添加した。４８時間の形質移入後、ｓｉＲＮＡ媒介性ＧＡＰＤＨタンパク質還元の程度を評価した。ポジティブコントロールとして、製造元の条件に従いＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて並行したノックダウン実験を行った。残ったＧＡＰＤＨ活性を、製造元により記載される通り、動力学的蛍光増加法を用いて５分間測定し、以下の式に従って算出した：残存する発現％＝Δ蛍光，ＧＡＰＤＨ／Δ蛍光，未処理、式中、Δ蛍光= 蛍光５分−蛍光１分。ｓｉＲＮＡの非標的配列を用いる場合、形質移入の手順はＧＡＰＤＨ発現に有意な影響を与えない。
【０２２４】
もっとも強いｓｉＲＮＡ媒介性ＧＡＰＤＨノックダウンを生じるキャリアを特定するための初期スクリーニングの後、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて直接的にｓｉＲＮＡの送達を評価する。上記形成された複合体によりインキュベーションの４８時間後、細胞をＰＢＳでリンスした。Ｑｕｉａｇｅｎ ＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて全てのＲＮＡを単離した。同じサンプル中のいずれかの残渣の遺伝子ＤＮＡを消化し（ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ，Ｑｉａｇｅｎ）、製造元の説明書に従い、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＲＮＡを定量した。
【０２２５】
Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。２５ｎｇの全ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に用い、予め設計したプライマーおよびプローブセット（Ａｓｓａｙｓ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ７０００を用いてＰＣＲを行った。１０μＬの２Ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１μＬのプライマー／プローブ、２μＬのｃＤＮＡからなる反応（全部で２０μｌ）を、ヌクレアーゼを含まない水（Ａｍｂｉｏｎ）により２０μＬにした。以下のＰＣＲパラメータを用いた：９５℃、９０秒、その後９５℃、３０秒を４５サイクル、５５℃を６０秒。サイクルの閾値（ＣＴ）分析を用いて、ＧＡＰＤＨを定量し、β−アクチンに規格化し、未処理ＨｅＬａｓの発現と比較した。
【０２２６】
例１６：ｓｉＲＮＡと複合体形成したポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の粒形の動的光散乱（ＤＬＳ）測定（図１５）
以下の例により、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６が、単独で大きさ４５ｎｍまたはｓｉＲＮＡに結合した後に大きさ４７ｎｍの均一な粒子を形成することが証明された。
【０２２７】
ポリマー単独またはポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の粒径を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。凍結乾燥したポリマーを１００％エタノールに１０〜５０ｍｇ／ｍＬで溶解し、次にリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で１０倍に希釈した。
【０２２８】
リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で、理論上の電荷比４：１、ポリマー上の正電荷
：ｓｉＲＮＡ上の負電荷、で１ｍｇ／ｍＬでＰＲｘ０７２９ｖ６単独または０．７ｍｇ／ｍＬで１ｕＭ ＧＡＰＤＨ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ２１ｍｅｒ−ｓｉＲＮＡ （Ａｍｂｉｏｎ）と複合体形成したＰＲｘ０７２９ｖ６ポリマーについて測定した。ＰＲｘ０７２９ｖ６単独（４５ｎｍ）およびｓｉＲＮＡと複合体形成したＰＲｘ０７２９ｖ６（４７ｎｍ）（図１５）は、ほぼ一様な分布、ＰＤＩ＜０．１の同様の粒子径を示す。
【０２２９】
例１７：種々の電荷比でのポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６／ｓｉＲＮＡ複合体のゲルシフト分析（図１６）
以下の例により、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６がｓｉＲＮＡに種々の電荷比で結合し、還元された電気泳動移動度を有する複合体を生じることが証明された。
【０２３０】
ポリマーｓｉＲＮＡ結合をゲル電気泳動で分析し（図１６）、ポリマーへの完全なｓｉＲＮＡ結合が、ポリマー／ｓｉＲＮＡの４：１およびそれより高い電荷比で生じることを立証した。
【０２３１】
例１８：ミセルとｓｉＲＮＡの結合
Ａ．チオール含有ブロックコポリマーと二重鎖ｓｉＲＮＡの結合
５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２または他のアミン緩衝液、例えば、ＮＨＳエステル修飾に適した範囲のｐＨ（ｐＨ７〜９）のホウ酸塩、Ｈｅｐｅｓ、重炭酸塩に、１０ｍｇ／ｍＬのアミノ−ｓｉＲＮＡを溶解することによりｓｉＲＮＡ−ピリジルジスルフィドを調製した。ＳＰＤＰを濃度６．２ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ（２０ｍＭ 原液）に溶解し、２５ｕｌのＳＰＤＰ原液を修飾すべき１ｍｌずつのアミノ−ｓｉＲＮＡに添加した。溶液を混合し、少なくとも３０分、室温で反応させた。より長い反応時間（一晩のものを含む）によっては、修飾は不利な影響を受けなかった。５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を用いて修飾したＲＮＡ（ピリジルジスルフィド）を反応副生成物から透析（またはゲル透過）により精製した。ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６（ω末端に遊離チオールを含む）により、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中１０〜５０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、調製されたｓｉＲＮＡ−ピリジルジスルフィドを１：５のモル比で反応させた。ピリジン−２−チオンの放出およびゲル電気泳動により分光学的に反応の程度を測定した。
【０２３２】
Ｂ．第２鎖のアニーリング前のポリマーと１本鎖ＲＮＡの結合
１本鎖のアミノ修飾されたＲＮＡにより開始する上記手順の例を用いて、１本鎖ＲＮＡピリジルジスルフィド結合体を調製した。ブロックコポリマーミセルとＲＮＡピリジルジスルフィドのカップリング後、相補的なＲＮＡストレン（strain）を反応混合物に添加し、２本鎖ＲＮＡのＴｍよりも低い約２０℃の温度で１時間、２つの鎖をアニールさせる。
【０２３３】
例１９：ｓｉＲＮＡのノックダウン活性−培養した動物細胞中のミセル複合体（図１７および図１８）
ＰＲｘ０７２９ｖ６：ｓｉＲＮＡ複合体による２４時間の処理の後、特異的な遺伝子発現を
ｓｉＲＮＡ／ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６複合体のノックダウン（ＫＤ）活性を９６ウェルフォーマットで分析した。ポリマーおよびＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を２５ｕＬ中で混合し、種々の電荷比および最終的な形質移入濃度の５倍の濃度を得て、３０分間複合体形成し、１９％ＦＢＳを含む１００ｕＬの標準培地中にＨｅＬａ細胞を添加する。最終ｓｉＲＮＡ濃度を１００、５０、２５および１２．５ｎＭで評価した。ポリマーを４：１、２：１または１：１のいずれかの電荷比、または１８、９、４．５および２．２μｇ／ｍＬの固定ポリマー濃度で添加し、最も高いＫＤ活性をもたらす条件を決定した。電荷比（図１７Ａ）、より高い濃度で複合体を調製し、３０分間インキュベーションし、次に細胞の添加直前にグラフに示される濃度の５倍に連続希釈した。固定されたポリマー濃度（図１７Ｂ）について、グラフに示される５倍の濃度でｓｉＲＮＡおよびポリマーを複合体形成させ、３０分インキュベーションし、次に示される最終濃度について細胞を添加した。図１７Ｃはネガティブコントロールである。全てのＲＮＡを処理の２４時間後に単離し、定量的ＰＣＲを用いて２つのＧＡＰＤＨ発現を２つの内部標準遺伝子、ＲＰＬ１３ＡおよびＨＰＲＴと比較して測定した。図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃおよび図１８Ａおよび図１８Ｃは、９μｇ／ｍＬおよびより高い濃度で、試験された全てのｓｉＲＮＡ濃度でＰＲｘ０７２９ｖ６により得た＞６０％ＫＤ活性（影付き）を示す。この濃度は、粒径分析からの安定化ミセル形成と合致した。高いＫＤ活性は、より低い濃度（４．５μｇ／ｍＬの固定ポリマー濃度）での複合体形成と比較して複合体が高い濃度で調製され、連続希釈された場合（電荷比４：１）のみ、４．５μｇ／ｍＬ ＰＲｘ０７２９ｖ６／１２．５ｎＭ ｓｉＲＮＡで観察された。さらに、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡおよび４．５μｇ／ｍｌ ＰＲｘ０７２９ｖ６は、高いＫＤ活性を示す一方、より低いｓｉＲＮＡ濃度の場合はＫＤ活性を示さなかった。まとめると、ＰＲｘ０７２９ｖ６ミセルは、１０μｇ／ｍｌまでの希釈に対して安定であり、５μｇ／ｍｌ未満でＫＤ活性を失い、これは安定なミセルが良好なＫＤ活性を必要とすることを示す。
【０２３４】
例２０：培養哺乳動物細胞中のダイサー基質ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体のノックダウン活性
ＧＡＰＤＨ特異的ダイサー基質ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体のノックダウン（ＫＤ）活性は、ポリマー：GAPDH ダイサーｓｉＲＮＡ複合体で２４時間処理した後のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を測定することにより、９６ウェルフォーマットで分析する。ＧＡＰＤＨダイサーｓｉＲＮＡ配列は：
センス鎖：rGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC、
アンチセンス鎖： rGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrUである。ポリマーおよびＧＡＰＤＨターゲティングｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を２５ｕＬ中で混合し、種々の電荷比および最終的な形質移入濃度の５倍以上の濃度を得て、１０％ＦＢＳを含有する１００ｕL標準培地中にＨｅＬａ細胞を加える前に３０分間複合体形成させた。最終的なｓｉＲＮＡ濃度は、１００、５０、２５、および１２．５ｎMで評価する。ポリマーを、４：１、２：１または１：１の電荷比または４０、２０、１０、および５μg／ｍＬの固定されたポリマー濃度のいずれかで加え、最高のＫＤ活性を生じる条件を測定する。全てのＲＮＡを処理の２４時間後に単離し、ＧＡＰＤＨ発現は、定量的ＰＣＲにより、２つの内部標準遺伝子、ＲＰＬ１３ＡおよびＨＰＲＴと比較して測定する。結果は、試験した全てのｓｉＲＮＡ濃度において、１０μg／ｍｌ以上のポリマー濃度で、６０％を超えるＫＤ活性を示す。このポリマー濃度は、粒径分析による安定なミセル形成と一致する。
【０２３５】
例２１：培養哺乳類細胞のＡｐｏＢ１００ ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体のノックダウン活性
ポリマー：ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ複合体による処理の２４時間後、ＡｐｏＢ１００特異的なｓｉＲＮＡまたはポリマーに複合体形成したダイサー基質のノックダウン（ＫＤ）活性を、９６ウェルフォーマットで分析した。ＡｐｏＢ１００ ｓｉＲＮＡ配列は：
センス鎖：5'-rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-3'、
アンチセンス鎖：5'-rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3'である。ＡｐｏＢ１００ダイサー基質ｓｉＲＮＡ配列は：
センス鎖： 5'- rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA、
アンチセンス鎖：5'-rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3'である。ポリマーおよびＡｐｏＢ標的ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を２５ｕＬ中で混合し、種々の電荷比および最終的な形質移入濃度の５倍の濃度を得て、３０分間、複合体形成し、１０％ＦＢＳを含む１００ｕＬ標準培地中でＨｅｐＧ２へ添加する。最終ｓｉＲＮＡ濃度を１００、５０、２５および１２．５ｎＭで試験する。ポリマーを添加し、４：１、２：１または１：１の電荷比、または４０、２０、１０および５μｇ／ｍＬの固定濃度のいずれかで添加し、最高ＫＤ活性を生ずる条件を決定する。全てのＲＮＡを処理の２４時間後に単離し、定量的ＰＣＲによりＡｐｏＢ１００発現を２つの内部標準遺伝子、ＲＰＬ１３ＡおよびＨＰＲＴと比較して測定した。結果は、試験した全てのｓｉＲＮＡ濃度において、１０μｇ／ｍＬおよびより高い濃度のポリマーにより得られた＞６０％のＫＤ活性を示す。このポリマー濃度は、粒径分析による安定なミセル形成と一致する。
【０２３６】
例２２：マウスモデルにおけるＡｐｏＢ１００ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体のノックダウン活性
ＡｐｏＢ１００特異的ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体のノックダウン活性を、マウスモデル中、肝臓細胞中のＡｐｏＢ１００の発現およびコレステロールレベルを測定することにより測定した。尾静脈を介して、１：１、２：１または４：１の電荷比（ポリマー：ｓｉＲＮＡ）でポリマーと複合体形成した１、２、または５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡを、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに静脈内投与する。最後の投与の４８時間後、マウスを屠殺し、血液および肝臓を単離する。コレステロールレベルを血清中で測定する。肝臓から全ＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ１００発現を１つの内部標準遺伝子、ＨＰＲＴおよびＧＡＰＤＨと比較して、定量的ＰＣＲにより測定する。結果は、２ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ用量で肝臓中のＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルが＞６０％減少することを示す。この減少は、５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量が８０％のＫＤを示し、その１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量が〜５０％のＫＤを示すため、用量依存的である。血清コレステロールレベルの減少も、用量依存的な様式で観察される（生理食塩水のコントロールに比較して〜３０−５０％の減少）。
【０２３７】
例２３：培養哺乳細胞におけるＡｐｏＢアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド−ポリマー複合体のノックダウン活性
ポリマーと複合体形成したＡｐｏＢ１００特異的アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドによるノックダウン（ＫＤ）の可能性は、ポリマー：ＡｐｏＢアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド複合体による処理の２４時間後のＡｐｏＢ遺伝子発現を測定することにより分析した。マウスＡｐｏＢに特異的な２つのＡｐｏＢ１００アンチセンスオリゴヌクレオチドは：
5'-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3'，コード領域の５４１位、および
5'-ATGTCAATGCCACATGTCCA-3'，コード領域の５３１位である。
【０２３８】
ポリマーおよびＡｐｏＢ標的アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはネガティブコントロールＤＮＡオリゴヌクレオチド（スクランブル配列）を２５ｕＬ中で混合し、種々の電荷比および最終的な形質移入濃度の５倍を超える濃度を得て、３０分間複合体形成し、１０％ＦＢＳを含む１００ｕＬの標準培地中にＨｅｐＧ２を添加する。最終的なオリゴヌクレオチド濃度を１００、５０、２５、および１２．５ｎＭで試験する。ポリマーを４：１、２：１もしくは１：１の電荷比、または４０、２０、１０および５μｇ／ｍＬの固定ポリマー濃度のいずれかで添加し、最高ＫＤ活性を生じる条件を決定する。全てのＲＮＡを処理の２４時間後に単離し、ＡｐｏＢ１００発現を２つの内部標準遺伝子、ＲＰＬ１３ＡおよびＨＰＲＴと比較して、定量的ＰＣＲにより測定する。
【０２３９】
例２４：ミセルおよびそれらのｓｉＲＮＡ複合体の膜不安定化活性の証明（図１９）
ｐＨ応答性の膜不安定化活性を、ポリマー単独またはＰＲｘ０７２９ｖ６：ｓｉＲＮＡ複合体を、ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）に滴定することにより分析し、ヘモグロビン放出により膜溶解活性を測定した（５４０ｎｍでの吸収の読み取り）。３つの異なるｐＨ条件を用い、エンドソームｐＨ環境を模擬する（細胞外ｐＨ＝７．４、初期エンドソーム＝６．６、終期エンドソーム＝５．８）。ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）を遠心分離により、ＥＤＴＡを含む真空容器に回収した全血液を単離する。ＲＢＣを生理食塩水で３度洗浄し、特定のｐＨ（５．８、６．６または７．４）でＰＢＳ中、最終濃度２％のＲＢＣにした。ＰＲｘ０７２９ｖ６単独またはＰＲｘ０７２９ｖ６／ｓｉＲＮＡ複合体を、示す通り臨界安定濃度（ＣＳＣ）より上および下の濃度で試験した（図１９）。ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体について、２５ｎＭ ｓｉＲＮＡを１：１、２：１、４：１および８：１の電荷比（ポリマー単独の場合と同じ濃度）でＰＲｘ０７２９ｖ６に添加した。ポリマー単独またはポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の溶液を２０Ｘの最終分析濃度で３０分間、形成し、各々のＲＢＣ配合物に希釈した。調製の日から４℃で保存された２つの異なるＰＲｘ０７２９ｖ６ポリマー原液の配合物を、調製の９日および１５日後に活性の安定化について比較した。ポリマーを単独で含むＲＢＣ（図１９Ａ）またはポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体（図１９Ｂ）を６０分間、３７℃でインキュベートし、無処置のＲＢＣを除去した。上清をキュ別途に移動し、５４０ｎｍで吸収を測定した。溶血の割合をＡ５４０サンプル／Ａ５４０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理したＲＢＣとして表わす（１００％溶解のコントロール）。結果は、ＰＲｘ０７２９ｖ単独またはＰＲｘ０７２９ｖ／ｓｉＲＮＡ複合体がｐＨ７．４で非溶血性であり、エンドソームに関係するより低いｐＨおよびより高いポリマー濃度で次第に溶血性を増すことを示す。
【０２４０】
例２５：ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の細胞取り込みおよび細胞内分布の蛍光顕微鏡（図２０）
この例は、ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６が、脂質ベースの形質移入剤よりも、より効率的な蛍光標識ｓｉＲＮＡの細胞取り込みおよびエンドソーム放出を媒介し得ることを証明する。
【０２４１】
ＨｅＬａ細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバーカバーガラス上に播種した。一晩のインキュベーションの後、１００ｎＭ ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００または１００ｎＭ ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡのいずれかにより、ポリマー−ｓｉＲＮＡ４：１の電荷比で細胞を形質移入した。複合体をｐＨ７．４のＰＢＳ中で３０分間、５Ｘ濃度で形成し、最終１Ｘ濃度の細胞に添加し、一晩インキュベートした。１０分間細胞を染色し、次に３．７％ホルムアルデヒド−１ＸＰＢＳ中に５分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡でサンプルを撮像した。図２０Ｂは、リポフェクタミンと比較したポリマー−ｓｉＲＮＡの細胞取り込みおよび細胞内分布の蛍光顕微鏡を示す（図２０Ａ）。リポフェクタミン−ｓｉＲＮＡ複合体の粒状染色は、エンドソームの位置を示唆し、一方、ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の広範細胞質製染色は、それらがエンドソームから細胞質へ放出されたことを示す。
【０２４２】
例２３：ポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６ミセルへの疎水性低分子の取り込み
この例は、疎水性低分子が、主にポリマーＰＲｘ０７２９ｖ６の疎水性ミセル中心により取り込まれることを証明する。ｓｉＲＮＡを含むかまたは含まないポリマーミセルの形成は、ピレン（Ｃ１６Ｈ１０、ＭＷ＝２０２）を用いる蛍光プローブ技術により確認し、ここでピレンのミセル中心への分割を、ピレンのスペクトルの２つの発光極大の割合を用いて決定し得る。
【０２４３】
ポリマーミセル溶液中のピレンの蛍光発光スペクトルを、３９５ｎｍの固定の励起波長を用いて、6×10-7 Mの一定ピレン濃度により、３００〜３６０ｎｍで測定する。１００ｎＭ ｓｉＲＮＡを含む場合と含まない場合について、０．００１％〜２０％（ｗ／ｗ）でポリマーを変化させた。Ｖａｒｉａｎ蛍光分光光度計を用いてスペクトルデータを得た。全ての蛍光実験は、25℃で行った。ポリマー濃度の関数として強度比Ｉ３３６／Ｉ３３３をプロットすることにより、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を決定した。
【０２４４】
同様に、モデル低分子薬、ジピリダモール（２−｛［９−（ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)−２，７−ビス(1−ピペリジル)−３，５，８，１０−テトラザビシクロ［４．４．０］デカ−２，４，７，９，１１−ペンタエン−４−イル]−（２−ヒドロキシエチル)アミノ}エタノール；Ｃ２４Ｈ４０Ｎ８Ｏ４，ＭＷ＝５０５)を、以下に示す通り、ＰＲｘ０７２９ｖ６のミセル中心に組み込む。ポリマー（１．０ｍｇ）およびジピリダモール（ＤＩＰ）（０．２ｍｇ）をＴＨＦ（０．５ｍＬ）に溶解する。脱イオン化水（１０ｍＬ）を滴下し、溶液を５０℃で６時間撹拌し、薬剤をミセルの疎水性コアに組み込む。溶液（２．５ｍＬ）を分取し、２５℃および３７℃で、紫外可視分光光度計により４１５ｎｍのジピリダモール吸収を測定する。コントロールの測定は、コポリマーの非存在下、脱イオン化水中、ジピリダモール吸収の時間依存的減少を測定することにより行った。２５℃および３７℃の両方で、吸収を各時間点で測定し、その値を溶液において観察された値から減算する。
【０２４５】
例２６：標的リガンドとポリヌクレオチドをコポリマーに結合する方法
以下の例は、標的リガンド（例えば、ガラクトース）またはポリヌクレオチド治療剤（例えばｓｉＲＮＡ）をジブロックコポリマーに結合する方法を示す。（１）可逆的付加開裂連鎖反応（ＲＡＦＴ）（Chiefari et al. Macromolecules. 1998;31(16):5559-5562）を用いてポリマーを調製し、Ｒ基置換基としてガラクトースを含む連鎖移動剤を用いてガラクトース末端が官能化されたジブロックコポリマーを形成する。（２）ジブロックコポリマーの第１ブロックをメチルアクリル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＭＡＡ（ＮＨＳ））を含むポリマーとして調製し、ここでガラクトース−ＰＥＧ−アミンをＮＨＳ基に結合するか、またはアミノ−ジスルフィドｓｉＲＮＡをＮＨＳに結合するか、またはピリジルジスルフィドアミンをＮＨＳ基と反応させ、次にチオール化ＲＮＡと反応してポリマーＲＮＡ結合体を形成するピリジルジスルフィドを形成する。
【０２４６】
例２６．１：ガラクトース−ＰＥＧ−アミンおよびガラクトース−ＣＴＡの調製
スキーム１は、ガラクトース−ＰＥＧ−アミン（化合物３）およびガラクトース−ＣＴＡ（連鎖移動剤）（化合物４）の合成スキームを図示する。
【０２４７】
化合物１：ペンタアセテートガラクトース（１０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）oおよび２−［２−（２−クロロエトキシ)エトキシ]エタノール（５．６ｍＬ，３８．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（６４ｍＬ）に溶解し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。ＢＦ３．ＯＥｔ２（９．５ｍｌ，７６．８ｍｍｏｌ）を氷浴中、1時間に亘って、前記混合物に滴下した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応後、３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を添加し反応液を希釈した。飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）で有機層を中和し、塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４により乾燥した。ＣＨ２Ｃｌ２を減圧除去し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、淡黄色の油として最終生成物1を得た。収率 ：５５％ＴＬＣ（Ｉ２およびｐ−アニスアルデヒド)：ＥＡ／Ｈｅｘ：１／１（Ｒｆ：β= ０．３３；α＝０．３２；未反応Ｓ．Ｍ０．３０）。
【０２４８】
化合物２：化合物１（１．４６ｇ，２．９ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶解し、ＮａＮ３（１．５ｇ，２３．２ｍｍｏｌ）を室温で混合物に加えた。反応混合物を８５〜９０℃で一晩加熱した。反応後、ＥＡ（１５ｍＬ）を溶液に加え、水（５０ｍＬ）を用い、有機層を５回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４により乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油として化合物２を得た。収率：８０％、ＴＬＣ（Ｉ２およびｐ−アニスアルデヒド）：ＥＡ／Ｈｅｘ：１／１（Ｒｆ：０．３３）。
【０２４９】
化合物３：化合物２（１．０３４ｇ，２．０５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２４ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で１０分間泡立たせ、次にＰｄ／Ｃ（１０％）（９０ｍｇ）およびＴＦＡ（８０ｕＬ）を前記溶液に添加した。再び反応混合物をＨ２により３０分間泡立たせ、次に反応液をＨ２下、室温でさらに３時間撹拌した。セライトによりＰｄ／Ｃを除去し、ＭｅＯＨを蒸発させ、粘着性のゲルとして化合物３を得た。化合物３は、さらに精製することなし使用することができる。収率：９５％。ＴＬＣ（ｐ−アニスアルデヒド）： ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２：１／４（Ｒｆ：０．０５）。
【０２５０】
化合物４：ＥＣＴ（０．５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（０．３３ｇ，２．８５ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（０．４５ｇ，２．１９ｍｍｏｌ）を０℃でＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）に溶解した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中の化合物３（１．１３ｇ，１．９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．２８ｍＬ，２．００ｍｍｏｌ）を、前記反応液に０℃で緩徐に加えた。反応混合物を室温で一晩、連続的に撹拌した。ＣＨ３Ｃｌを減圧除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、黄色のゲルとして化合物４を得た。収率（３５％）。ＴＬＣ：ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２：１／９（Ｒｆ：０．７５）。
【化７】
2011520901.tif 000011
【０２５１】
例２６．２：［ＤＭＡＥＭＡ］−［ＢＭＡ−ＰＡＡ−ＤＭＡＥＭＡ］の合成
Ａ．ＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡの合成
重合：２０ｍＬガラスバイアル（隔壁キャップ（septa cap）を有する）に、３３．５ｍｇＥＣＴ（ＲＡＦＴ ＣＴＡ）、２．１ｍｇＡＩＢＮ（メタノールから２回再結晶させた）、３．０ｇＤＭＡＥＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，９８％，使用する直前に小アルミナカラムを通過させ、阻害剤を除去する)、および３．０ｇＤＭＦ（阻害剤を含まず、高純度）を添加した。隔壁キャップでガラスバイアルを閉じ、乾燥窒素を３０分間パージした（撹拌下、氷浴中で行った）。反応バイアルを、予め７０℃に加熱した反応ブロック中に置いた。反応混合物を２時間４０分撹拌した。隔壁キャップを開き、混合物を氷浴中のバイアルにおいて２〜３分間撹拌し、重合反応を停止させた。
【０２５２】
精製：３ｍＬのアセトンを反応混合物に添加した。３００ｍＬビーカーに、２４０ｍＬへキサンおよび６０ｍＬエーテル（８０／２０（ｖ／ｖ））を添加し、撹拌しながら反応混合物をビーカーに一滴ずつ加えた。初めに、濁った溶液を遠心沈降させることにより回収される油を生成する；収率＝１．３５ｇ（４５％）。アセトン溶液からヘキサン／エーテル（８０／２０（ｖ／ｖ））混合溶媒に、数回沈殿を行った（例えば６回）。最後に、ポリマーを室温で８時間、減圧乾燥した；収量≒１g。
【０２５３】
まとめ：（４５％の変換で、Ｍｎ，理論＝１１，０００ｇ／ｍｏｌ）
【表３】
2011520901.tif 000012
【０２５４】
Ｂ．ＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡからの［ＢＭＡ−ＰＡＡ−ＤＭＡＥＭＡ］合成
全ての化学物質および試薬は、特に示さない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）（９９％）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）（９８％）を、塩基性アルミナのカラム（１５０ メッシュ）に通し、重合阻害剤を除去した。阻害剤を含まない２−プロピルアクリル酸（ＰＡＡ）（＞９９％）を購入し、そのまま使用した。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（９９％）をメタノールから再結晶し、真空下で乾燥した。上述した通り、ＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡを合成し、精製した（Ｍｎ〜１００００；ＰＤＩ〜１．３；＞９８％）。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（９９．９９％)（ＥＭＤから購入）は試薬グレードであり、そのまま使用した。ヘキサン、ペンタンおよびエーテルをＥＭＤから購入し、それらはポリマー生成のため、そのままの状態で使用した。
【０２５５】
重合：ＢＭＡ（２．１ｇ，１４．７ｍｍｏｌｅｓ）、ＰＡＡ（０．８３８９ｇ，７．５ｍｍｏｌｅｓ）、ＤＭＡＥＭＡ（１．１５６ｇ，７．３５ｍｍｏｌｅｓ）、マクロＣＴＡ（０．８ｇ，０．０８１６ｍｍｏｌｅｓ）、ＡＩＢＮ（１．３４ｍｇ，０．００８１６ｍｍｏｌｅｓ； ＣＴＡ：ＡＩＢＮ１０：１）およびＤＭＦ（５．３４ｍｌ）を窒素下、封をしたバイアルに添加した。使用したＣＴＡ：モノマーの比は、１：３６０であった（５０％の変換を想定）。モノマー濃度は３Ｍであった。混合物中で３０分間窒素を泡立てることにより混合物を脱気し、次にヒーターブロック中に置いた（温度計：６７℃；ディスプレイ：７０〜７１；撹拌スピード３００〜４００ｒｐｍ)。６時間反応を続行し、バイアルを氷中に置き、次に混合物を空気に曝露することにより反応を停止させた。
【０２５６】
精製：ポリマー精製は、アセトン／ＤＭＦ１：１からヘキサン／エーテル７５／２５中に行った（３回）。結果として得たポリマーを少なくとも１８時間真空下、乾燥した。ＮＭＲスペクトルは、ポリマーが高純度であることを示した。ビニル基は観察されなかった。ポリマーをエタノールから２回脱イオン化水に対して４日間透析し、その後凍結乾燥した。以下の条件を用いて、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)によりポリマーを分析した：溶媒：ＤＭＦ／ＬｉＢｒ１％、流速：０．７５ｍｌ／ｍｉｎ、注入容積：１００μｌ。
【０２５７】
カラム温度：６０℃。ポリ（スチレン）を用いて検出器を校正した。結果として得たポリマーのＧＰＣ分析：Ｍｎ＝４０８８９ｇ／ｍｏｌ。ＰＤＩ＝１．４３。ｄｎ／ｄｃ＝０．０４９９６７。
【０２５８】
例２６．３．ｇａｌ−［ＤＭＡＥＭＡ］−［ＢＭＡ−ＰＡＡ−ＤＭＡＥＭＡ］の合成
合成は、例２０．２に記載した通り行った。まず、連鎖移動剤としてＥＣＴの代わりにガラクトース−ＣＴＡ（例２０．１，化合物４）を使用したことを除き、ガラクトース−ＤＭＡＥＭＡマクロ−ＣＴＡを調製した（例２０．２．Ａ．）。これにより、末端がガラクトースで官能化されたポリＤＭＡＥＭＡを得た（図１３）。その後、例２０．２．Ｂに記載した通り、ガラクトース−［ＤＭＡＥＭＡ］−マクロ−ＣＴＡを使用し、第２ブロック［ＢＭＡ−ＰＡＡ−ＤＭＡＥＭＡ］を合成した。合成後、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で２時間インキュベーションすることにより、ガラクトース上のアセチル保護基を除去した。ＮＭＲ分光法を用いて、ポリマー上の脱保護されたガラクトースの存在を確認した。
【０２５９】
例２６．４．［ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］およびＤＭＡＥＭＡ−ＭＭＡ（ＮＨＳ）−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ジブロックコポリマーの調製および特性決定
例２０．２に記載される通り（および図５にまとめる通り）、所望の組成の第１ブロックコポリマーを得るためのモノマー供給率を用いてポリマー合成を行った。図６に、第１ブロックのモノマーのコポリマー比７０：３０の［ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーの合成および特性決定についてまとめる。
【０２６０】
例２６．５．ガラクトース−ＰＥＧ−アミンとＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）の結合による［ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（Ｇａｌ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーの作製
図２２は、ガラクトース官能化されたＤＭＡＥＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）またはＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）ジブロックコポリマーの調製について説明する。ポリマー[ＤＭＡＥＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）]−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］または［ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］を１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解した。例２０．１（化合物３）で記載した通り調製したガラクトース−ＰＥＧ−アミンを１〜２等量のトリエチルアミンにより中和し、アミン：ポリマー ５：１の比で反応混合物に添加した。反応を３５℃で６〜１２時間行い、その後、同じ量のアセトンを添加し、脱イオン水で１日透析し、凍結乾燥した。
【０２６１】
例２６．６．ｓｉＲＮＡとＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＮＨＳ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］の結合による ［ＰＥＧＭＡ−ＭＡＡ（ＲＮＡ）］−［Ｂ−Ｐ−Ｄ］ポリマーの作製
図２３Ａおよび図２３Ｂは、ＮＨＳ含有ポリマーに結合し得る２つの修飾されたｓｉＲＮＡの構造を示す。ｓｉＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から得た。図２３Ｃは、ＮＨＳ含有ポリマーを誘導体化してチオール化ＲＮＡ（図２３Ｂ）の結合に対するジスルフィド反応基を提供するピリジルジスルフィドアミンの構造を示す（２３Ｂ）。
【０２６２】
ＮＨＳ含有ポリマーのアミノ−ジスルフィド−ｓｉＲＮＡとの反応。この反応は、有機溶媒からなる標準的な条件下（例えば、ＤＭＦもしくはＤＭＳＯ、または混合溶媒ＤＭＳＯ／緩衝液ｐＨ７．８。)、３５℃で４〜８時間行い、等容量のアセトンを加え、脱イオン化水で１日透析し、凍結乾燥した。
【０２６３】
NHS含有ポリマーのピリジル−ジスルフィド−アミンおよびチオール化ｓｉＲＮＡとの反応。ピリジルジスルフィドアミンとＮＨＳ含有ポリマーの反応を行う。続いて、凍結乾燥したポリマーをエタノール中に５０ｍｇ／ｍｌ溶解し、ｐＨ８の炭酸水素ナトリウム緩衝液中に１０倍に希釈する。チオール化ｓｉＲＮＡ（図２３Ｂ)を、ポリマーＮＨＳ基に対して過剰な２〜５モル濃度で、３５℃、４〜８時間反応させ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析する。
【０２６４】
例２７．ミセル凝集数の決定（ミセルあたりのポリマー鎖）
ミセルの重量平均分子量（Ｍｗ）および凝集数（Ｎaggr）は、デバイプロット（Ｄｅｂｙｅ ｐｌｏｔ）を用いて静的光散乱（ＳＬＳ）測定により決定した。この方法は、以下の式に示す通り、粒子が生産する散乱光の強度が粒子の重量平均分子量および濃度に比例すると仮定する：
【数１】
2011520901.tif 000013
【０２６５】
式中、Ｒ０はレイリー比（サンプルの散乱光対入射光の比）；Ｍはサンプルの分子量；Ａ２は第２ウイルス係数；Ｃは濃度；Ｋは
【数２】
2011520901.tif 000014
【０２６６】
として定義される光学定数であり、ここでＮＡはアボガドロ数；λ０はレーザー波長；ｎ０は溶媒屈折指数；ｄｎ／ｄｃはミセル（０．２０７６ｍｌ／ｇ）増加分の微分屈折係数である。
【０２６７】
ある角度における種々の濃度（Ｃ）のポリマーの散乱光の強度（Ｋ／ＣＲ）の測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器を用いて行い、基準（即ち、トルエン）から生じた散乱と比較した。デバイプロットは、直線であり、ミセルの絶対分子量を決定し、これは濃度ゼロでプロットのｙ切片である（Ｋ／ＣＲ＝１／Ｍｗ（ダルトン））。ミセルの分子量（デバイプロットから決定する）を１つのポリマー鎖（ＧＰＣ−トリプル検出法により決定する）で割ることにより、凝集数を算出した。典型的な値の範囲は、ジブロックポリマーについて３０〜５０、例えば［Ｄ］１０Ｋ−[Ｂ５０−Ｐ２５−Ｄ２５]２０−６６Ｋである。
【０２６８】
本発明の好ましい実施形態がここで示され記載されるが、当業者にとって前記実施形態が例としてのみ提供されることは明らかだろう。当業者は、本発明から離れることなく、数の変動、変化および置換を想到するだろう。ここで記載される本発明の実施形態の種々の変更が本発明を実施するのに用いられてよいことは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれと同等のものがそれに含まれるものとする。
【図１】
2011520901.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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