(57)【要約】  本願明細書にて、アルデヒド、アルカンおよびアルケンを製造するための組成物および方法が記載される。該アルデヒド、アルカンおよびアルケンは、バイオ燃料にて使用され得る。
2011522525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞にて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体を生じさせる工程、および該宿主細胞から炭化水素を単離する工程を含む、方法。
【請求項２】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞にて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６に対して少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを生じさせる工程、および該宿主細胞から炭化水素を単離する工程を含む、方法。
【請求項３】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞にて、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生じさせる工程を含み、該ポリペプチドはデカルボニラーゼ活性を有する、方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、１つまたはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６のアミノ酸配列を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞にて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させる工程、および該宿主細胞から炭化水素を単離する工程を含む、方法。
【請求項６】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞にて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３もしくは３５の相補物またはそのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドを発現させる工程を含み、該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６を含むポリペプチドと同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、方法。
【請求項７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがラン藻に由来する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
炭化水素を製造するための方法であって、宿主細胞を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換する工程、および該宿主細胞から炭化水素を単離する工程を含む、方法。
【請求項９】
組換えベクターが前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
大腸菌細胞が大腸菌細胞Ｂ株、Ｃ株、Ｋ株またはＷ株である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が前記組換えベクターのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを生じさせる、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
炭化水素が宿主細胞によって分泌される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
炭化水素がアルカンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
アルカンがＣ１３−Ｃ２１アルカンを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アルカンがトリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカンおよびメチルペンタデカンからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞を前記ポリペプチドまたは前記ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのための少なくとも１つの生物学的基質の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
基質が脂肪酸誘導体である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞を飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
飽和脂肪酸誘導体がＣ１４−Ｃ２２飽和脂肪酸誘導体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
飽和脂肪酸誘導体が２−メチルイコサナール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクタデカナール、ステアルアルデヒド、パルミトアルデヒドおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
炭化水素がアルケンである、請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
アルケンがＣ１３−Ｃ２１アルケンを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
アルケンがペンタデセン、ヘプタデセン、メチルペンタデセンおよびメチルヘプタデセンからなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞を、不飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
不飽和脂肪酸誘導体がＣ１４−Ｃ２２不飽和脂肪酸誘導体である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
不飽和脂肪酸誘導体がオクタデセナール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナールおよびメチルオクタデセナールからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子組換え微生物であって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの上流に該微生物のゲノムＤＮＡに安定に組込まれた外来性調節配列を含み、ここで、該微生物は野生型微生物と比較して増加したレベルの炭化水素を生じる、微生物。
【請求項３０】
微生物がラン藻である、請求項２９記載の微生物。
【請求項３１】
遺伝子発現に適切な条件下で請求項２９記載の微生物を培養する工程を含む、炭化水素を製造するための方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８および３１のいずれか１項記載の方法によって製造された炭化水素。
【請求項３３】
請求項３２記載の炭化水素を含むバイオ燃料。
【請求項３４】
ディーゼル、ガソリンまたはジェット燃料である、請求項３３記載のバイオ燃料。
【請求項３５】
炭化水素が約−１５．４またはそれ以上のδ１３Ｃを有する、請求項３３記載のバイオ燃料。
【請求項３６】
炭化水素が少なくとも約１．００３のｆＭ１４Ｃを有する、請求項３３記載のバイオ燃料。
【請求項３７】
炭化水素の製造方法であって、基質を、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体、または（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその変異体と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３８】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルカンを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
炭化水素がトリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカンおよびメチルペンタデカンからなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
基質が２−メチルイコサナール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクタデカナール、ステアルアルデヒド、パルミトアルデヒドおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルケンを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
炭化水素がペンタデセン、ヘプタデセン、メチルペンタデセンおよびメチルヘプタデセンからなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
基質がオクタデセナール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナールおよびメチルオクタデセナールからなる群より選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
炭化水素を製造するための方法であって、該方法は、宿主細胞にて、
（ｉ）配列番号３７もしくは配列番号３８もしくは配列番号３９；または
（ｉｉ）配列番号４０、ならびに（ａ）配列番号３７、（ｂ）配列番号３８および（ｃ）配列番号３９のいずれか１つ；または
（ｉｉｉ）配列番号４１もしくは配列番号４２もしくは配列番号４３もしくは配列番号４４
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生じさせる工程を含み、
ここで、該ポリペプチドはデカルボニラーゼ活性を有する、方法。
【請求項４５】
ポリペプチドがラン藻に由来する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞が哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項４４または４５記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
炭化水素が宿主細胞によって分泌される、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルカンを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
炭化水素がトリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカンおよびメチルペンタデカンからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
宿主細胞を前記ポリペプチドについての少なくとも１つの生物学的基質の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項４４〜４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
基質が脂肪酸誘導体である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞を飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
飽和脂肪酸誘導体が２−メチルイコサナール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクタデカナール、ステアルアルデヒド、パルミトアルデヒドおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルケンを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５６】
炭化水素がペンタデセン、ヘプタデセン、メチルペンタデセンおよびメチルヘプタデセンからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項５７】
宿主細胞を不飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
不飽和脂肪酸誘導体がオクタデセナール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナールおよびメチルオクタデセナールからなる群より選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
炭化水素の製造方法であって、該方法は、基質を
（ｉ）配列番号３７もしくは配列番号３８もしくは配列番号３９；または
（ｉｉ）配列番号４０、ならびに（ａ）配列番号３７、（ｂ）配列番号３８および（ｃ）配列番号３９のいずれか１つ；または
（ｉｉｉ）配列番号４１もしくは配列番号４２もしくは配列番号４３もしくは配列番号４４
のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程を含み、
ここで、該ポリペプチドはデカルボニラーゼ活性を有する、方法。
【請求項６０】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルカンを含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
炭化水素がトリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカンおよびメチルペンタデカンからなる群より選択される、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
基質が脂肪酸誘導体である、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
基質が飽和脂肪酸誘導体である、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
基質が２−メチルイコサナール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクタデカナール、ステアルアルデヒド、パルミトアルデヒドおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
炭化水素がＣ１３−Ｃ２１アルケンを含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６６】
炭化水素がペンタデセン、ヘプタデセン、メチルペンタデセンおよびメチルヘプタデセンからなる群より選択される、請求項５９記載の方法。
【請求項６７】
基質が不飽和脂肪酸基質である、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
基質がオクタデセナール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナールおよびメチルオクタデセナールからなる群より選択される、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５の５００ヌクレオチド以下からなる単離核酸。
【請求項７０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３または３５のヌクレオチドの９０％以下からなる単離核酸。
【請求項７１】
核酸がデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項６９または７０記載の核酸。
【請求項７２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６の２００アミノ酸以下からなる単離ポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６のアミノ酸の９０％以下からなる単離ポリペプチド。
【請求項７４】
ポリペプチドがデカルボニラーゼ活性を有する、請求項７２または７３記載の単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、出典明示により全体を本明細書に取り込まれる２００８年５月１６日提出の米国仮出願第61/053955号の利益を享受するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油は、液体、ガス、または固体形態において地中で見出された、限られた天然資源である。石油は、主に、炭素と水素からなる炭化水素から構成される。それはまた、異なる形態で、窒素、酸素、または硫黄のごときその他の構成成分のかなりの量を含む。
【０００３】
石油は、貴重な資源であるが、石油産物は、金銭上と環境上の両方の大きなコストで開発される。まず、石油の供給源が発見されなくてはならない。石油の発掘は、費用がかかり、リスクの高い投資である。深層の井戸を発掘するコストは、１００万ドルを超えうる。さらに、これらの井戸が石油を含有することの保障はない。採掘された井戸のわずか４０％が商業規模の炭化水素を生じる産出力のある井戸につながると見積もられている。経済的な費用に加えて、石油の発掘は、高い環境的なコストを抱える。例えば、海洋探査は、周辺の海洋環境を害する。
【０００４】
産出力のある井戸が発見されると、石油は、莫大な費用で地球から抽出されなくてはならない。一次回収の間、自然の地圧が井戸における石油の約２０％を抽出するのに十分である。この自然の圧力が落ちてくると、経済性が成り立つならば、二次回収法が用いられる。一般に、二次回収は、例えば、水噴射、天然ガス噴射、またはガスリフトにより井戸の圧力を上昇させることに関する。二次回収法を用いると、さらに５％から１５％の石油が回収される。二次回収法が使い尽くされると、経済性が成り立つならば、三次回収法が用いられ得る。三次法は、石油の粘度を減少させることにより抽出をより簡単にすることに関する。三次回収法を用いると、さらに５％から１５％の石油が回収される。それゆえ、最良の状況下でさえ、井戸中の石油のわずか５０％しか抽出され得ない。石油の抽出はまた、環境的なコストを抱える。例えば、石油の抽出は、水面まで上昇する石油の大規模な浸出を生じうる。さらに、海洋掘削は、周辺の海洋環境を害するか、または破壊する海底の浚渫に関する。
【０００５】
石油鉱床は、地球上で一律に見出されていないため、石油は、石油産出地域から石油消費地域まで長距離を輸送されなくてはならない。輸送費に加えて、壊滅的な石油流出の環境的なリスクも存在する。
【０００６】
その天然形態において、地中から抽出された原油は、いくつかの商業的な用途を有する。それは、長さと複雑さが様々である炭化水素の混合物（例えば、パラフィン（もしくはアルカン）、オレフィン（もしくはアルケン）、アルキン、ナフテン（もしくはシクロアルカン）、脂肪族化合物、芳香族化合物など）である。さらに、原油は、その他の有機化合物（例えば、例えば、窒素、酸素、硫黄などを含有する有機化合物）および不純物質（例えば、硫黄、塩、酸、金属など）を含有する。
【０００７】
それゆえ、原油は、商業的に使用されうる前に精製され、浄化されなくてはならない。その高いエネルギー密度とその容易な輸送可能性から、ほとんどの石油は、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料など）、灯油、液化石油ガスなどのごとき燃料に精製される。
【０００８】
原油はまた、石油化学製品の原料の主な供給源である。石油に由来する原料の２つの主要なクラスは、短鎖オレフィン（例えば、エチレンおよびプロピレン）および芳香族（例えば、ベンゼンおよびキシレン異性体）である。これらの原料は、接触分解、水蒸気分解、または触媒改質のごとき様々な方法を用いて多大な費用をかけて分解することにより、原油中のより長い鎖の炭化水素から得られる。これらの原料は、単量体、溶媒、界面活性剤、または接着剤のごとき原油から直接精製することができない石油化学製品を製造するのに用いられる。
【０００９】
原油に由来する原料の１つの例は、エチレンである。エチレンは、ポリエチレン、エタノール、エチレンオキシド、エチレングリコール、ポリエステル、グリコールエーテル、エトキシラート、ビニルアセタート、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、塩化ビニル、および塩化ポリビニルのごとき石油化学製品を製造するのに用いられる。原料のさらなる例は、プロピレンであり、イソプロピルアルコール、アクリロニトリル、ポリプロピレン、酸化プロピレン、プロピレングリコール、グリコールエーテル、ブチレン、イソブチレン、１，３−ブタジエン、合成エラストマー、ポリオレフィン、アルファ−オレフィン、脂肪アルコール、アクリル酸、アクリル酸ポリマー、塩化アリル、エピクロロヒドリン、およびエポキシ樹脂を製造するのに用いられる。
【００１０】
これらの石油化学製品は、プラスティック、樹脂、繊維、エラストマー、潤滑油、またはゲルのごとき特殊な化学製品を調製するのに用いることができる。石油化学原料から製造することができる特定の特殊な化学製品は、脂肪酸、炭化水素（例えば、長鎖、分岐鎖、飽和、不飽和など）、脂肪アルコール、エステル、脂肪アルデヒド、ケトン、潤滑油などである。
【００１１】
特殊な化学製品は、多くの商業的な用途を有する。脂肪酸は、界面活性剤として、例えば、洗剤およびせっけん中で商業的に用いられる。それらはまた、燃料、潤滑油、塗料、ラッカー、ろうそく、サラダ油、ショートニング、化粧品、および乳化剤中で添加剤として用いることができる。さらに、脂肪酸は、ゴム製品中の促進活性剤として用いられる。脂肪酸はまた、メチルエステル、アミド、アミン、酸塩化物、無水物、ケテン二量体、ならびにペルオキシ酸およびエステルを製造するための原料として用いることができる。
【００１２】
炭化水素は、商業的な用途を有する。例えば、より短い鎖のアルカンは燃料として用いられる。メタンおよびエタンは、天然ガスの主な構成物質である。（例えば、５から１６個の炭素に由来する）より長い鎖のアルカンは、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル、またはジェット燃料）として用いられる。１６個より多い炭素原子を有するアルカンは、燃料油および潤滑油の重要な構成物質である。さらにより長いアルカンは、室温で固体であり、例えば、パラフィンろうとして用いることができる。約３５個の炭素を含有するアルカンは、ビチューメン中に見出され、道路表面に用いられる。さらに、より長い鎖のアルカンは、商業的に有用なより短い鎖の炭化水素を製造するために分解することができる。
【００１３】
短鎖アルカンに類似して、短鎖アルケンは、輸送燃料に用いられる。より長い鎖のアルケンは、プラスティック、潤滑油、および合成潤滑油に用いられる。さらに、アルケンは、アルコール、エステル、可塑剤、界面活性剤、第三級アミン、高められた油回収剤（oil recovery agent）、脂肪酸、チオール、アルケニルコハク酸無水物、エポキシド、塩化アルカン、塩化アルケン、ワックス、燃料添加剤、および抵抗流動低減剤（drag flow reducer）を製造する原料として用いられる。
【００１４】
脂肪アルコールは、多くの商業的な用途を有する。より短い鎖の脂肪アルコールは、乳化剤、皮膚軟化剤、および増粘剤として化粧品および食品産業で用いられる。それらの両親媒性により、脂肪アルコールは、洗剤として有用である非イオン界面活性剤として作用する。加えて、脂肪アルコールは、ワックス、ゴム、樹脂、医薬軟膏およびローション、潤滑油添加剤、繊維帯電防止および表面処理剤、可塑剤、化粧品、工業用溶媒、および脂肪用溶媒に用いられる。
【００１５】
エステルは、多くの商業的な用途を有する。例えば、代替燃料であるバイオディーゼルは、エステル（例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステルなど）から構成される。いくつかの低分子量エステルは、心地よい香りの揮発性物質であり、フレグランスまたは芳香剤として有用である。さらに、エステルは、ラッカー、塗料、およびワニスの溶媒として用いられる。その上、ワックス、脂肪、および油のごときいくつかの天然に存在する基質は、エステルから構成される。エステルはまた、樹脂およびプラスティック中の柔軟剤、可塑剤、難燃剤、ならびにガソリンおよび油中の添加剤として用いられる。さらに、エステルは、ポリマー、フィルム、繊維、染料、および医薬品の製造において用いることができる。
【００１６】
アルデヒドは、多くの特殊な化学製品を製造するのに用いられる。例えば、アルデヒドは、ポリマー、樹脂（例えば、ベークライト）、染料、香味料、可塑剤、香料、医薬品、およびその他の化学製品を製造するのに用いられる。いくつかは、溶媒、保存剤、または崩壊剤として用いられる。ビタミンおよびホルモンのごときいくつかの天然または合成化合物は、アルデヒドである。さらに、多くの糖は、アルデヒド基を含む。
【００１７】
ケトンは、溶媒として商業的に用いられる。例えば、アセトンは、溶媒として頻繁に用いられるが、ポリマーを製造するための原料でもある。ケトンはまた、ラッカー、塗料、爆薬、香料、および繊維の加工において用いられる。さらに、ケトンは、アルコール、アルケン、アルカン、イミン、およびエナミンを製造するのに用いられる。
【００１８】
さらに、原油は、潤滑油の供給源である。石油に由来する潤滑油は、典型的に、オレフィン、特に、ポリオレフィンおよびアルファオレフィンから構成される。潤滑油は、原油から精製されるか、あるいは原油から精製された原料を用いて製造されるかのいずれかであり得る。
【００１９】
原油からこれらの特殊な化学製品を得ることは、莫大な金融投資ならびに大量のエネルギーを必要とする。それはまた、多くの場合、原油中の長い鎖の炭化水素がより小さいモノマーを産生するのに分解されることから、非効率なプロセスである。次いで、これらのモノマーは、より複雑な特殊な化学製品を製造する原料として用いられる。
【００２０】
石油を発掘し、抽出し、輸送し、および精製する問題に加えて、石油は、限定された減少していく供給源である。世界の石油消費のある見積もりでは、年間３００億バレルである。ある見積もりによると、現在の産出レベルでは、世界の石油は、２０５０年以前に涸渇されうることが予想されている。
【００２１】
結局、燃料による石油の燃焼は、温室効果ガス（例えば、二酸化炭素）およびその他の形態の空気汚染物（例えば、一酸化炭素、二酸化硫黄など）を放出する。世界の石油の需要が増加するにつれて、温室効果ガスおよびその他の形態の空気汚染物の排出もまた増加する。空気中の温室効果ガスの蓄積は、地球温暖化の増加を招く。それゆえ、環境を局所的に破壊すること（例えば、石油流出、海洋環境の浚渫など）に加えて、石油の燃焼はまた、地球規模で環境を破壊する。
【００２２】
石油がもたらす固有の問題により、石油のように長期間にわたり採掘され、抽出され、輸送され、あるいは十分に精製されることが必要とされない再生可能な石油供給源が必要とされている。石油産業および石油に基づいた燃料の燃焼により生じた環境破壊のタイプを作り出すことなく、経済的に産生することができる再生可能な石油供給源もまた、必要とされている。同様の理由により、典型的に、石油に由来する化学製品の新しい供給源
もまた、必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、少なくとも部分的に、炭化水素生合成ポリペプチドをコードするシアノバクテリア遺伝子の同定を基づくものである。したがって、１の態様において、本発明は、炭化水素を製造する方法であって、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの変異体を宿主細胞において生じさせ、この宿主細胞から炭化水素を単離することを含む方法を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
いくつかの具体例において、ポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの具体例において、ポリペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加、挿入、もしくは欠失を有する配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ（decarbonylase）活性を有する。さらに他の具体例において、ポリペプチドは、１個またはそれ以上の保存性アミノ酸置換を有する、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含む。例えば、ポリペプチドは、１個またはそれ以上の下記の保存性アミノ酸置換を含む：アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンのごとき脂肪族アミノ酸と別の脂肪族アミノ酸との置換；スレオニンとセリンとの置換；アスパラギン酸およびグルタミン酸のごとき酸性残基と別の酸性残基との置換；アスパラギンおよびグルタミンのごときアミド基を保有する残基とアミド基を保有する別の残基との置換；リジンおよびアルギニンのごとき塩基性残基と別の塩基性残基との置換；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンのごとき芳香族残基と別の芳香族残基との置換。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００２６】
その他の具体例において、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号：３７または配列番号：３８または配列番号：３９；あるいは（ｉｉ）配列番号：４０および（ａ）配列番号：３７、（ｂ）配列番号：３８、および（ｃ）配列番号：３９のうちのいずれか１つ；あるいは（ｉｉｉ）配列番号：４１または配列番号：４２または配列番号：４３または配列番号：４４のアミノ酸配列を含む。一定の具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、炭化水素を製造する方法であって、宿主細胞において、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることを含む方法を特徴とする。いくつかの具体例において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５である。いくつかの具体例において、前記方法は、さらに、宿主細胞から炭化水素を単離することを含む。
【００２８】
その他の具体例において、ヌクレオチド配列は、例えば、低いストリンジェント、中程度のストリンジェント、高いストリンジェント、または非常に高いストリンジェントの条件下で、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５の相補物あるいはそのフラグメントに対してハイブリダイズする。
【００２９】
その他の具体例において、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列；あるいは（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、１個またはそれ以上の保存性アミノ酸置換を有する配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００３０】
その他の具体例に置いて、ヌクレオチド配列は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同一の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの具体例において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５あるいはそのフラグメントである。その他の具体例において、ヌクレオチド配列は、例えば、低いストリンジェント、中程度のストリンジェント、高いストリンジェント、または非常に高いストリンジェント下で、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５の相補物に対して、あるいはそのフラグメントに対してハイブリダイズする。いくつかの具体例において、生物学的活性は、デカルボニラーゼ活性である。
【００３１】
いくつかの具体例において、前記方法は、宿主細胞を、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて形質転換することを含む。いくつかの具体例において、組み換えベクターは、さらに、ヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターを含む。いくつかの具体例において、プロモーターは、発生的に調節された、器官特異的、組織特異的、誘導性、構成性、または細胞特異的なプロモーターである。特定の具体例において、組み換えベクターは、（ａ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合された調節配列；（ｂ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合された選択マーカー；（ｃ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合されたマーカー配列；（ｄ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合された精製部分；（ｅ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合された分泌配列；ならびに（ｆ）ヌクレオチド配列に作動可能に結合された標的配列からなる群から選択された少なくとも１つの配列を含む。一定の具体例において、ヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに安定に取り込まれ、ヌクレオチド配列の発現は、調節されたプロモーター領域の制御下にある。
【００３２】
本明細書に記載される態様のいずれかにおいて、宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、および細菌細胞からなる群から選択されうる。
【００３３】
いくつかの具体例において、宿主細胞は、グラム陽性細菌の細胞である。その他の具体例において、宿主細胞は、グラム陰性細菌の細胞である。
【００３４】
いくつかの具体例において、宿主細胞は、Escherichia、Bacillus、Lactobacillus、Rhodococcus、Pseudomonas、Aspergillus、Trichoderma、Neurospora、Fusarium、Humicola、Rhizomucor、Kluyveromyces、Pichia、Mucor、Myceliophtora、Penicillium、Phanerochaete、Pleurotus、Trametes、Chrysosporium、Saccharomyces、Stenotrophamonas、Schizosaccharomyces、Yarrowia、またはStreptomyce属から選択される。
【００３５】
特定の具体例において、宿主細胞は、Bacillus lentus細胞、Bacillus brevis細胞、Bacillus stearothermophilus細胞、Bacillus licheniformis細胞、Bacillus alkalophilus細胞、Bacillus coagulans細胞、Bacillus circulans細胞、Bacillus pumilis細胞、Bacillus thuringiensis細胞、Bacillus clausii細胞、Bacillus megaterium細胞、Bacillus subtilis細胞、またはBacillus amyloliquefaciens細胞である。
【００３６】
その他の具体例において、宿主細胞は、Trichoderma koningii細胞、Trichoderma viride細胞、Trichoderma reesei細胞、Trichoderma longibrachiatum細胞、Aspergillus awamori細胞、Aspergillus fumigates細胞、Aspergillus foetidus細胞、Aspergillus niduls細胞、Aspergillus niger細胞、Aspergillus oryzae細胞、Humicola insolens細胞、Humicola luginose細胞、Rhodococcus opacus細胞、Rhizomucor miehei細胞、またはMucor michei細胞である。
【００３７】
さらにその他の具体例において、宿主細胞は、Streptomyces lividans細胞またはStreptomyces細胞である。その他の具体例において、宿主細胞は、Actinomycetes細胞である。
【００３８】
いくつかの具体例において、宿主細胞は、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、CvI細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、またはPC12細胞である。
【００３９】
特定の具体例において、宿主細胞は、系統B、系統C、系統K、または系統Wの大腸菌細胞である。
【００４０】
その他の具体例において、宿主細胞は、シアノバクテリア宿主細胞である。特定の具体例において、シアノバクテリア宿主細胞は、表１に列挙される細胞である。
【００４１】
いくつかの具体例において、炭化水素は、宿主細胞付近から分泌される。
【００４２】
一定の具体例において、宿主細胞は、本明細書に記載される物質を過剰発現する。いくつかの具体例において、前記方法は、さらに、宿主細胞を本明細書で記載される酵素をコードする核酸で形質転換することを含み、宿主細胞は、本明細書に記載される物質を過剰発現する。その他の具体例において、前記方法は、さらに、宿主細胞を本明細書に記載される少なくとも１つの物質の存在下で培養することを含む。いくつかの具体例において、物質は、脂肪酸誘導体、アシル−ＡＣＰ、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、または脂肪エステルである。
【００４３】
いくつかの具体例において、脂肪酸誘導体基質は、不飽和脂肪酸誘導体基質、一価不飽和脂肪酸誘導体基質、または飽和脂肪酸誘導体基質である。その他の具体例において、脂肪酸誘導体基質は、直鎖脂肪酸誘導体基質、分岐鎖脂肪酸誘導体基質、または環状部分を含む脂肪酸誘導体基質である。
【００４４】
本明細書に記載される態様の一定の具体例において、製造される炭化水素はアルカンである。いくつかの具体例において、アルカンは、Ｃ３〜Ｃ２５アルカンである。例えば、アルカンは、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１４、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、またはＣ２５アルカンである。いくつかの具体例において、アルカンは、トリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、へプタデカン、メチルへプタデカン、ペンタデカン、またはメチルペンタデカンである。
【００４５】
いくつかの具体例において、アルカンは、直鎖アルカン、分岐鎖アルカン、または環状アルカンである。
【００４６】
一定の具体例において、前記方法は、さらに、宿主細胞を飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養することを含み、製造された炭化水素は、アルカンである。一定の具体例において、飽和脂肪誘導体は、Ｃ６〜Ｃ２６脂肪酸誘導体基質である。例えば、脂肪酸誘導体基質は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、またはＣ２６脂肪酸誘導体基質である。特定の具体例において、脂肪酸誘導体基質は、２−メチルイコサナール（methylicosanal）、イコサナール（icosanal）、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクトデカナール、ステアアルデヒド（stearaldehyde）、またはパルミトアルデヒド（palmitaldehyde）である。
【００４７】
いくつかの具体例において、前記方法は、さらに、アルカンを宿主細胞から、または培養した培地から単離することを含む。その他の具体例において、前記方法は、さらに、アルカンをクラッキングし、または精製することを含む。
【００４８】
本明細書に記載される態様の一定の具体例において、製造される炭化水素はアルケンである。いくつかの具体例において、アルケンは、Ｃ３〜Ｃ２５アルケンである。例えば、アルケンは、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、またはＣ２５アルケンである。いくつかの具体例において、アルケンは、ペンタデセン、へプタデセン、メチルペンタデセン、またはメチルへプタデセンである。
【００４９】
いくつかの具体例において、アルケンは、直鎖アルケン、分岐鎖アルケン、または環状アルケンである。
【００５０】
一定の具体例において、前記方法は、さらに、不飽和脂肪酸誘導体の存在下で宿主細胞を培養することを含み、製造される炭化水素はアルケンである。一定の具体例において、不飽和脂肪酸誘導体は、Ｃ６〜Ｃ２６脂肪酸誘導体基質である。例えば、脂肪酸誘導体基質は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、またはＣ２６不飽和脂肪酸誘導体基質である。特定の具体例において、脂肪酸誘導体基質は、オクタデセナール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナール、またはメチルオクタデセナールである。
【００５１】
別の具体例において、本発明は、微生物のゲノムＤＮＡに安定に取り込まれた外部の調節配列を含む遺伝学的に改変された微生物を特徴とする。１の具体例において、調節配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも約７０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの上流に組み込まれる。いくつかの具体例において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性を有する。いくつかの具体例において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５である。
【００５２】
いくつかの具体例において、ポリヌクレオチドは、微生物に対して内在性である。いくつかの具体例において、微生物は、野生型微生物と比較して増加したレベルの炭化水素を発現する。いくつかの具体例において、微生物は、シアノバクテリウムである。
【００５３】
別の態様において、本発明は、炭化水素を製造する方法であって、本明細書に記載される遺伝学的に改変された微生物を、遺伝子発現に適する条件下で培養し、前記炭化水素を単離することを含む方法を特徴とする。
【００５４】
別の態様において、本発明は、炭化水素を製造する方法であって、基質を、（ｉ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、あるいはそれらの変異体；（ｉｉ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、あるいはそれらの変異体；（ｉｉｉ）配列番号：３７、３８、または３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｖ）配列番号：４０ならびに（ａ）配列番号：３７、（ｂ）配列番号：３８、および（ｃ）配列番号：３９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；あるいは（ｖ）配列番号：４１、４２、４３、または４４と接触させることを含む方法を特徴とする。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００５５】
いくつかの具体例において、ポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有する。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を有する。
【００５６】
いくつかの具体例において、ポリペプチドは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５を有するヌクレオチド配列によりコードされる。
【００５７】
いくつかの具体例において、生物学的基質は、脂肪酸誘導体、アシル−ＡＣＰ、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルである。
【００５８】
いくつかの具体例において、基質は、飽和脂肪酸誘導体であり、炭化水素は、例えば、Ｃ３〜Ｃ２５アルカンである。例えば、アルカンは、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１４、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、またはＣ２５アルカンである。いくつかの具体例において、アルカンは、トリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、へプタデカン、メチルへプタデカン、ペンタデカン、またはメチルペンタデカンである。
【００５９】
いくつかの具体例において、アルカンは、直鎖アルカン、分岐鎖アルカン、または環状アルカンである。
【００６０】
いくつかの具体例において、飽和脂肪酸誘導体は、２−メチルイコサノール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、２−メチルオクトデカナール、ステアアルデヒド、またはパルミトアルデヒドである。
【００６１】
その他の具体例において、生物学的基質は、不飽和脂肪酸誘導体であり、炭化水素は、アルケン、例えば、Ｃ３〜Ｃ２５アルケンである。例えば、アルケンは、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、またはＣ２５アルケンである。いくつかの具体例において、アルケンは、ペンタデセン、へプタデセン、メチルペンタデセン、またはメチルへプタデセンである。
【００６２】
いくつかの具体例において、アルケンは、直鎖アルケン、分岐鎖アルケン、または環状アルケンである。
【００６３】
いくつかの具体例において、不飽和脂肪酸誘導体は、オクタデサノール、ヘキサデセナール、メチルヘキサデセナール、またはメチルオクタデセナールである。
【００６４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法または微生物のいずれかにより製造される炭化水素を特徴とする。特定の具体例において、炭化水素は、約−１５．４またはそれより大きいδ１３Ｃを有するアルカンまたはアルケンである。例えば、アルカンまたはアルケンは、約−１５．４から約−１０．９、例えば、約−１３．９２から約−１３．８４のδ１３Ｃを有する。その他の具体例において、アルカンまたはアルケンは、少なくとも約１．００３のｆＭ１４Ｃを有する。例えば、アルカンまたはアルケンは、少なくとも約１．０１または少なくとも約１．５のｆＭ１４Ｃを有する。いくつかの具体例において、アルカンまたはアルケンは、約１．１１１から約１．１２４のｆＭ１４Ｃを有する。
【００６５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法または微生物のいずれかにより製造される炭化水素を含むバイオ燃料を特徴とする。特定の具体例において、炭化水素は、約−１５．４またはそれより大きいδ１３Ｃを有するアルカンまたはアルケンである。例えば、アルカンまたはアルケンは、約−１５．４から約−１０．９、例えば、約−１３．９２から約−１３．８４のδ１３Ｃを有する。その他の具体例において、アルカンまたはアルケンは、少なくとも約１．００３のｆＭ１４Ｃを有する。例えば、アルカンまたはアルケンは、少なくとも約１．０１または少なくとも約１．５のｆＭ１４Ｃを有する。いくつかの具体例において、アルカンまたはアルケンは、約１．１１１から約１．１２４のｆＭ１４Ｃを有する。いくつかの具体例において、バイオ燃料は、ディーゼル、ガソリン、またはジェット燃料である。
【００６６】
別の態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５の約５００個未満のヌクレオチドからなる単離された核酸を特徴とする。いくつかの具体例において、核酸は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５の約３００個未満のヌクレオチド、約３５０個未満のヌクレオチド、約４００個未満のヌクレオチド、約４５０個未満のヌクレオチド、約５５０個未満のヌクレオチド、約６００個未満のヌクレオチド、または約６５０個未満のヌクレオチドからなる。いくつかの具体例において、核酸は、デカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６７】
別の態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５のヌクレオチドの約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満からなる単離された核酸を特徴とする。いくつかの具体例において、核酸は、デカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６８】
別の態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６の約２００個未満、約１７５個未満、約１５０個未満、または約１００個未満のアミノ酸からなる単離されたポリペプチドを特徴とする。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００６９】
別の態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６の約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満のアミノ酸からなる単離されたポリペプチドを特徴とする。いくつかの具体例において、ポリペプチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００７０】
定義
明細書を通して、省略された遺伝子名またはポリペプチド名を用いて援用されうるが、かかる省略された遺伝子名またはポリペプチド名は、遺伝子またはポリペプチドの種類を表す。かかる遺伝子名は、同一のポリペプチドおよび同じ生理学的機能を有するポリペプチドをコードする全ての遺伝子を含む。ポリペプチド名は、同じ活性を有する（例えば、同じ基本的な化学反応を触媒する）全てのポリペプチドを含む。
【００７１】
本明細書で参照される受入番号は、米国の国立衛生研究所により管理されているＮＣＢＩデータベース（National Center for Biotechnology Information）に由来する。特に示されない限り、受入番号は、２００９年４月時点のデータベースに基づいて提供されるものである。
【００７２】
ＥＣ番号は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（NC-IUBMB）により定められている（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/から利用可能である）。本明細書で使用されるＥＣ番号は、一部東京大学により提供を受ける京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics）により管理されているＫＥＧＧリガンドデータベースに由来する。特に示されていない限り、ＥＣ番号は、２００８年３月時点のデータベースに基づいて提供される。
【００７３】
用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、文法上の対象の１つまたは１つより多いもの（すなわち、少なくとも１つ）を意味するように用いられる。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは１つより多くのエレメントを意味する。
【００７４】
用語「約」は、所定の数値の値±２０％を意味するように用いられる。それゆえ、「約６０％」は、６０±（６０の２０％）（すなわち、４８と７０の間）の値を意味する。
【００７５】
本明細書で用いられるように、「アルデヒド」は、不飽和カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）により特徴付けられる式ＲＣＨＯを有する炭化水素を意味する。好ましい具体例において、アルデヒドは、脂肪酸または脂肪酸誘導体から生成されるいずれかのアルデヒドである。１の具体例において、Ｒ基は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素の長さである。
【００７６】
本明細書で用いられるように、「アルデヒド生合成遺伝子」または「アルデヒド生合成ポリヌクレオチド」は、アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする核酸である。
【００７７】
本明細書で用いられるように、「アルデヒド生合成ポリペプチド」は、アルデヒドの生合成経路の一部であるポリペプチドである。かかるポリペプチドは、生物学的基質に作用してアルデヒドを製造する。いくつかの例において、アルデヒド生合成ポリペプチドは、還元酵素活性を有する。
【００７８】
本明細書で用いられるように、「アルカン」は、わずか１つの炭素−炭素結合を含む炭化水素を意味する。
【００７９】
本明細書で用いられるように、「アルカン生合成遺伝子」または「アルカン生合成ポリヌクレオチド」は、アルカン生合成ポリペプチドをコードする核酸である。
【００８０】
本明細書に用いられるように、「アルカン生合成ポリペプチド」は、アルカンの生合成経路の一部であるポリペプチドである。かかるポリペプチドは、生物学的基質に作用してアルカンを製造する。いくつかの例において、アルカン生合成ポリヌクレオチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００８１】
本明細書で用いられるように、「アルケン生合成遺伝子」または「アルケン生合成ポリヌクレオチド」は、アルケン生合成ポリペプチドをコードする核酸である。
【００８２】
本明細書で用いられるように、「アルケン生合成ポリペプチド」は、アルケンの生合成経路の一部であるポリペプチドである。かかるポリペプチドは、生物学的基質に作用してアルケンを製造する。いくつかの例において、アルケン生合成ポリヌクレオチドは、デカルボニラーゼ活性を有する。
【００８３】
本明細書で用いられるように、用語「減弱する」は、弱まる、減少する、または減退することを意味する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドを改変してその活性を減少させることにより（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変することにより）減弱されうる。
【００８４】
本明細書で用いられるように、用語「バイオディーゼル」は、石油に由来する、ディーゼルの代わりとなり得るバイオ燃料を意味する。バイオディーゼルは、純粋な形で、または石油に基づくディーゼルとのいずれかの濃度における混合物としてのいずれかで内燃機関油に用いることができる。バイオディーゼルは、アルデヒドおよびアルカンのごときエステルまたは炭化水素を含むことができる。
【００８５】
本明細書で用いられるように、用語「バイオ燃料」は、バイオマスに由来する燃料のいずれかを意味する。バイオ燃料は、石油に基づく燃料に取って代わることができる。例えば、バイオ燃料は、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料など）、暖房用燃料、および発電燃料を包括する。バイオ燃料は、再生可能なエネルギー源である。
【００８６】
本明細書で用いられるように、用語「バイオマス」は、生物学的原料に由来する炭素源を意味する。バイオマスは、バイオ燃料に変換することができる。バイオマスの１つの典型的な供給源は、植物である。例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスは、バイオマスとして用いることができる。バイオマスの別の非限定的な例は、動物、例えば、牛糞肥料である。バイオマスはまた、工業、農業、林業、および家庭からの廃棄物を含む。バイオマスとして用いることができるかかる廃棄物の例は、発酵廃液、麦、木材、下水、生ゴミ、および食品廃棄物である。バイオマスはまた、炭水化物のごとき炭素源（例えば、単糖類、二糖類、または多糖類）を含む。
【００８７】
本明細書で用いられるように、用語「炭素源」は、原核生物または単一の真核生物の増殖のための炭素源として用いられるのに適する基質または化合物を意味する。炭素源は、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド、およびガス（例えば、ＣＯおよびＣＯ２）を含むが、これらだけに限られない様々な形態であり得る。これらは、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、およびガラクトースなどの様々な単糖類；フルクト−オリゴ糖およびガラクト−オリゴ糖などのオリゴ糖類；キシロースおよびアラビノースなどの多糖類；スクロース、マルトース、およびフラノースなどの二糖類；メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系材料；コハク酸エステル、乳酸塩、および酢酸などの飽和または不飽和脂肪酸エステル；エタノールまたはその混合物などのアルコールを含む。炭素源はまた、グルコースを含むが、これだけに限らない光合成の生成物であり得る。好ましい炭素源はバイオマスである。別の好ましい炭素源はグルコースである。
【００８８】
本明細書で用いられるように、「曇り点低下添加剤」は、溶液の曇り点を減少もしくは低下させる組成物に加えられる添加剤である。
【００８９】
本明細書で用いられるように、用語「液体の曇り点」は、溶解固形物がもはや完全に溶解する温度を意味する。この温度より低いと、固形物は、液体に混濁を与える第二相として沈殿し始める。石油工業において、曇り点は、固形材料またはその他の重い炭化水素が原油、精製油、または燃料中で結晶化して曇り点を形成する温度より低い温度を意味する。固形材料の存在は、その液体の流動性、石油フィルター、注入装置などを塞ぐ液体の性質、冷表面上の固形材料の蓄積（例えば、ピペリンまたは熱交換器の汚れ）、ならびに水を有するその液体のエマルション性質に影響を与える。
【００９０】
ヌクレオチド配列は、２つの配列の塩基の各々が適合する場合（すなわち、ワトソンクリック塩基対を形成できる場合）、別のヌクレオチド配列に対して「相補的」である。用語「相補鎖」は、用語「相補物」と本明細書において置換可能に用いられる。核酸鎖の相補物は、コーディング鎖の相補物または非コーディング鎖の相補物であり得る。
【００９１】
本明細書で用いられるように、用語「発現可能にするのに十分な条件」は、宿主細胞に、本明細書に記載されるポリペプチド、アルデヒド、またはアルカンなどの所望の産物を生成することを可能にするいずれかの条件を意味する。適する条件は、例えば、発酵条件を含む。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、および培地組成物などの多くのパラメータを含むことができる。これらの条件の各々は、個別におよび組み合わせて、宿主細胞を増殖させることができる。典型的な培地は、ブロスまたはゲルを含む。一般に、培地は、グルコース、フルクトース、セルロース、またはその類似物などの炭素源を含み、宿主細胞により直接代謝され得る。さらに、酵素は、培地で用いられて代謝（例えば、デンプンまたはセルロースの脱多量体化による発酵性糖）および炭素源のその後の代謝を容易にすることができる。
【００９２】
条件が発現できるのに十分であるかを調べるために、宿主細胞は、例えば、約４、８、１２、２４、３６、または４８時間培養することができる。培養の間および／または後、試料が得られ、解析されて、条件が発現を可能にするかどうかを調べることができる。例えば、試料または培地中の増殖した宿主細胞は、所望の産物の存在について試験することができる。生成物の存在を試験する際に、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ／ＦＩＤ、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、ＭＳなどであるが、これらだけに限られないアッセイが用いられ得る。
【００９３】
本明細書に記載されるポリペプチドは、ポリペプチドの機能に実質的な効果を有さないさらなる保存性もしくは非必須アミノ酸置換を有してもよいと認識される。ある置換が許容されるかどうか（すなわち、脱カルボキシラーゼ活性のごとき所望の生物学的特性に悪影響を及ぼさないかどうか）は、Bowie et al., Science (1990) 247:1306 1310に記載されるごとく調べることができる。「保存性アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当該技術分野で定義されている。これらの群は、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプロファン）、ベータ分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）であるアミノ酸を含む。
【００９４】
本明細書で用いられるように、「調節エレメント」は、転写調節エレメントを意味する。調節エレメントは、プロモーターおよびエンハンサーを含む。用語「プロモーターエレメント」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」は、遺伝子の発現を活性化するスイッチとして機能するＤＮＡ配列を意味する。遺伝子が活性化すると、転写されるか、または転写に関与するものとされる。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成に関連する。それゆえ、プロモーターは、転写調節エレメントとして供され、遺伝子のｍＲＮＡへの転写の開始部位をも提供する。調節エレメントは、転写に関連する細胞のタンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al, Science 236:1237, 1987）。
【００９５】
本明細書で用いられるように、用語「エステルシンターゼ」は、脂肪エステルを生成することができるペプチドを意味する。より具体的には、エステルシンターゼは、チオエステルを脂肪エステルに変換するペプチドである。好ましい具体例において、エステルシンターゼは、チオエステル（例えば、アシル−ＣｏＡ）を脂肪エステルに変換する。
【００９６】
代替的な具体例において、エステルシンターゼは、基質としてチオエステルおよびアルコールを用いて脂肪エステルを生成する。エステルシンターゼは、基質として短鎖および長鎖チオエステルを用いることができる。さらに、エステルシンターゼは、基質として短鎖および長鎖アルコールを用いることができる。
【００９７】
エステルシンターゼの非限定的な例は、ワックスシンターゼ、ワックス−エステルシンターゼ、アシルＣｏＡ：アルコールトランスアシラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、および脂肪アシル補酵素Ａ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼである。典型的なエステルシンターゼは、酵素分類番号EC2.3.1.75において分類される。典型的なＧｅｎＢａｎ受入番号は、図４０に供される。
【００９８】
本明細書で用いられるように、用語「脂肪酸」は、式ＲＣＯＯＨを有するカルボキシル酸を意味する。Ｒは、脂肪族基、好ましくは、アルキル基を表す。Ｒは、約４個および約２２個の間の炭素原子を含むことができる。脂肪酸は、飽和、単不飽和、または多価不飽和されうる。好ましい具体例において、脂肪酸は、脂肪酸生合成経路から生成される。
【００９９】
本明細書で用いられるように、用語「脂肪酸生合成経路」は、脂肪酸を生成する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、本明細書に記載されるように、改変されて脂肪酸を生成することができる脂肪酸酵素を含み、いくつかの具体例において、さらなる酵素で発現されて所望の炭素鎖の特徴を有する脂肪酸が生成されうる。
【０１００】
本明細書で用いられるように、用語「脂肪酸誘導体」は、生成宿主生物の脂肪酸生合成経路から部分的に作り出された生成物を意味する。「脂肪酸誘導体」はまた、アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＡＣＰ誘導体から部分的に作り出された生成物を含む。脂肪酸生合成経路は、本明細書に記載されるように改変されて脂肪酸誘導体を生成することができる脂肪酸シンターゼを含み、いくつかの例において、さらなる酵素で発現されて所望の炭素鎖の特徴を有する脂肪酸誘導体が生成されうる。典型的な脂肪酸誘導体は、例えば、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、炭化水素、脂肪アルコール、およびエステル（例えば、ワックス、脂肪酸エステル、または脂肪エステル）を含む。
【０１０１】
本明細書で用いられるように、用語「脂肪酸誘導酵素」は、脂肪酸誘導体の生成において発現され、あるいは過剰発現されうる全ての酵素を意味する。これらの酵素は、本明細書において、脂肪酸誘導酵素と総称される。これらの酵素は、脂肪酸生合成経路の一部であってもよい。脂肪酸誘導酵素の非限定的な例は、脂肪酸シンターゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡ還元酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールアシルトランスフェラーゼ、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡ還元酵素、エステルシンターゼ、アルデヒド生合成ポリペプチド、およびアルカン生合成ポリペプチドを含む。脂肪酸誘導酵素は、基質を脂肪酸誘導体に変換する。いくつかの例において、基質は、脂肪酸誘導酵素が異なる脂肪酸誘導体に変換させる脂肪酸誘導体であってもよい。
【０１０２】
本明細書で用いられるように、用語「脂肪アルコール形成ペプチド」は、アシル−ＣｏＡの脂肪アルコールへの変換を触媒することができるペプチドを意味し、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡ還元酵素（FAR,EC1.1.1.*）、アシル−ＣｏＡ還元酵素（EC1.2.1.50）、またはアルコースデヒドロゲナーセ（EC1.1.1.1）を含む。さらに、当業者は、いずれかの脂肪アルコール形成ペプチドがその他の反応も同様に触媒することを認識する。例えば、いずれかのアシル−ＣｏＡ還元酵素ペプチドは、脂肪酸に加えて別の基質を受容する。それゆえ、かかる非特異的なペプチドも含まれる。脂肪アルコール形成ペプチドをコードする核酸配列は、当該技術分野で知られ、かかるペプチドは、公的に入手可能である。典型的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、図４０で提供される。
【０１０３】
本明細書で用いられるように、「脂肪酸酵素」は、脂肪酸生合成に関連する酵素のいずれかを意味する。脂肪酸酵素は、宿主細胞で発現され、あるいは過剰発現されて脂肪酸を生成することができる。脂肪酸酵素の非限定的な例は、脂肪酸シンターゼおよびチオエステラーゼを含む。
【０１０４】
本明細書で用いられるように、「脂肪エステル」は、エステルを意味する。好ましい具体例において、脂肪エステルは、脂肪酸から作り出されるいずれかのエステル、例えば、脂肪酸エステルである。１の具体例において、脂肪エステルは、Ａ側（すなわち、カルボン酸酸素に結合した炭素鎖）およびＢ側（すなわち、親のカルボン酸を含む炭素鎖）を含む。好ましい具体例において、脂肪エステルが脂肪酸生合成経路に由来する場合、Ａ側はアルコールにより提供され、Ｂ側は脂肪酸により提供される。いずれかのアルコールは、脂肪エステルのＡ側を形成するのに用いることができる。例えば、アルコールは、脂肪酸生合成経路に由来しうる。あるいは、アルコールは、非脂肪酸生合成経路を介して生成されうる。さらに、アルコールは、外部から提供されうる。例えば、アルコールは、脂肪エステルが生物により生成される場合に発酵ブロスで供給されうる。あるいは、脂肪酸または酢酸などのカルボン酸は、脂肪エステルがアルコールも生成することができる生物により生成される場合に外部から供給されうる。
【０１０５】
Ａ側またはＢ側を含む炭素鎖は、いずれの長さでありうる。１の具体例において、エステルのＡ側は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、または１８個の炭素の長さである。エステルのＢ側は、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６個の炭素の長さである。Ａ側および／またはＢ側は、直鎖または分岐鎖でありうる。分岐鎖は、分岐の１つまたはそれ以上の点を有してもよい。さらに、分岐鎖は、環状分岐を含んでもよい。
さらに、Ａ側および／Ｂ側は、飽和または不飽和であり得る。不飽和の場合、Ａ側および／またはＢ側は、不飽和の１つまたはそれ以上の点を有しうる。
【０１０６】
１の具体例において、脂肪エステルは、生合成的に生成される。この具体例において、最初に、脂肪酸が「活性化」される。「活性化」された脂肪酸の非限定的な例は、アシル−ＣｏＡ、アシル−ＡＣＰ、およびアシルリン酸である。アシル−ＣｏＡは、脂肪酸生合成または分解の直接の生成物であり得る。さらに、アシル−ＣｏＡは、遊離の脂肪酸、ＣｏＡ、またはアデノシンヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ）から合成することができる。アシル−ＣｏＡを生成する酵素の例は、アシル−ＣｏＡシンターゼである。
【０１０７】
脂肪酸が活性化されると、それはレシピエントの求核試薬に容易に移行することができる。典型的な求核試薬は、アルコール、チオール、またはリン酸である。
【０１０８】
１の具体例において、脂肪エステルはワックスである。ワックスは、長鎖アルコールおよび長鎖脂肪酸に由来し得る。別の具体例において、脂肪エステルは、脂肪アシル−チオエステルおよびアルコールに由来し得る。別の具体例において、脂肪エステルは、脂肪酸エステル、例えば、脂肪エステル補酵素Ａ（ＣｏＡ）である。その他の具体例において、脂肪エステルは、脂肪アシルパントテン酸、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、または脂肪リン酸エステルである。脂肪エステルは、多くの用途を有する。例えば、脂肪エステルは、バイオ燃料として用いることができる。
【０１０９】
本明細書で用いられるように、「標準（modern）炭素のフラクション」または「ｆＭ」は、国立標準技術研究所（NIST）により定義されるように、シュウ酸標準物質ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとしてそれぞれ知られる標準物質（SRM）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃと同じ意味を有する。基本的な定義は、（ＡＤ１９５０を対照として）０．９５倍の１４Ｃ／１２Ｃ同位体比ＨＯｘＩに関する。これは、減退補正された産業革命以前の木とおよそ等価である。現在生存している生物圏（植物）においては、ｆＭは約１．１である。
【０１１０】
２つの配列間の「相同性」の算出は、以下のとおりに行うことができる。配列が最適な比較のために並べられる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの１つまたは両方に導入され、非相同的な配列が比較のために無視されうる）。好ましい具体例において、比較のために並べられる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、それらの分子は、その位置で同一である（本明細書で用いられるように、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントが導入されるのに必要とされるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して、配列により占有される同じ位置数の関数である。
【０１１１】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。好ましい具体例において、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、Needleman and Wunsch (1970), J. MoI. Biol. 48:444 453、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト（gap weight）および１、２、３、４、５、または６の長さウェイト（length weight）を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラムに取り入れられたアルゴリズムを用いて決定される。なお別の好ましい具体例において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント相同性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。特に好ましいパラメータのセット（および実施者が、分子が特許請求の範囲の相同性の限度内であるかどうか調べるのに実行されるべきパラメータについて不確かである場合に用いられるべきもの）は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを備えるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【０１１２】
本明細書で用いられるように、「宿主細胞」は、本明細書に記載される産物（例えば、本明細書に記載されるアルデヒドまたはアルカン）を生成するのに用いられる細胞である。宿主細胞は、選択された遺伝子を発現もしくは過剰発現するか、あるいは選択された遺伝子の減弱された発現を示すように改変することができる。宿主細胞の非限定的な例は、植物、動物、ヒト、細菌、酵母、または糸状菌細胞を含む。
【０１１３】
本明細書で用いられるように、用語「低いストリンジェント、中間のストリンジェント、高いストリンジェント、または非常に高いストリンジェント下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実行するための手引きは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。水性法および非水性法がこの文献に記載されており、いずれの方法も用いることができる。本明細書で参照される特定のハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：１）約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで少なくとも５０℃（洗浄の温度は、低いストリンジェント条件においては５５℃まで上げることができる）で０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回の洗浄である低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件；２）約４５℃で６ＸＳＳＣ、次いで６０℃で０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上の洗浄である中間のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件；３）約４５℃で６ＸＳＳＣ、次いで６５℃で０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上の洗浄である高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件；および好ましくは４）非常に高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、次いで６５℃で０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上の洗浄。非常に高いストリンジェントな条件（４）は、他に示されていない限り好ましい条件である。
【０１１４】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で記載される用語「単離された」は、核酸の自然源に存在するその他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を意味する。さらに、「単離された核酸」は、天然に存在しないフラグメントなどの核酸フラグメントを含む。用語「単離された」はまた、その他の細胞タンパク質から単離され、および精製された内在性ポリペプチドおよび組み換えポリペプチドの両方を包含するポリペプチドを意味するように本明細書で用いられる。本明細書で用いられる用語「単離された」はまた、組み換えＤＮＡ技術により生成される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地から実質的に解離されている核酸またはポリペプチドを意味する。本明細書で用いられる用語「単離された」はまた、化学的に合成される場合、前駆的化学物質またはその他の化学物質から実質的に解離されている核酸またはポリペプチドを意味する。
【０１１５】
本明細書で用いられるように、「細胞における遺伝子発現レベル」は、ｍＲＮＡレベル、ｍＲＮＡ前駆体の新生転写物、転写プロセッシング中間体、成熟ｍＲＮＡ、および／または細胞中で遺伝子によりコードされる分解産物を意味する。
【０１１６】
本明細書で用いられるように、用語「微生物」は、古細菌、細菌および真核生物に由来する原核および真核微生物種を意味し、真核生物は、酵母および糸状菌、原生生物、藻類、または高等な原生生物を含む。用語「微生物細胞」は、本明細書で用いられるように、微生物に由来する細胞を意味する。
【０１１７】
本明細書で用いられるように、用語「核酸」は、デオキシ核酸（ＤＮＡ）、必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味する。用語はまた、ヌクレオチドアナログから作り出されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに記載される具体例のとおり、一本（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチド、ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含む。
【０１１８】
本明細書で用いられるように、用語「作動可能に連結された」は、（例えば、本明細書で記載されるポリヌクレオチドをコードする）選択されたヌクレオチド配列がプロモーターに近接することによりそのプロモーターが選択されたヌクレオチド配列の発現を調節できることを意味する。さらに、プロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択されたヌクレオチド配列の上流に局在される。「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列および調節配列が、適当な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合する場合に遺伝子発現が可能となるように結合していることを意味する。
【０１１９】
用語「または」は、他に明確に示されていない限り、用語「および／または」を意味するように本明細書で用いられ、相互に交換可能に用いられる。
【０１２０】
本明細書で用いられるように、「過剰発現する」は、対応する野生型細胞で通常発現されるよりも高い濃度において、細胞で核酸、ポリペプチド、または炭化水素を発現するか、または発現されることを引き起こすことを意味する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドが同一種の非組み換え宿主細胞における濃度より組み換え宿主細胞においてより高い濃度で存在する場合に、組み換え宿主細胞において「過剰発現」することができる。
【０１２１】
本明細書で用いられるように、「分配係数」または「Ｐ」は、水相（例えば、発酵ブロス）における平衡濃度により割られた有機相の化合物の平衡濃度として定義される。本明細書に記載される二相系の１の具体例において、有機相は、生成プロセス間にアルデヒドまたはアルカンにより生成される。しかしながら、いくつかの例において、有機相は、オクタンの層を提供することなどにより提供されて生成物が分離されやすくなりうる。二相系を記載する場合、化合物の分配特性がｌｏｇＰとして記載されうる。例えば、１のｌｏｇＰを有する化合物は、有機相に対して１０：１に分配する。−１のｌｏｇＰを有する化合物は、有機相に対して１：１０に分配する。適当な発酵ブロスおよび有機相を選択することにより、高いｌｏｇＰ値を有するアルデヒドおよびアルカンは、発酵容器中で非常に低い濃度であっても有機相に分離しうる。
【０１２２】
本明細書で用いられるように、用語「精製する」、「精製された」、または「精製」は、その環境からの分子の除去または単離、例えば、単離または分離を意味する。「実質的に精製された」分子は、それらが結合しているその他の構成成分から少なくとも約６０％解離、好ましくは少なくとも約７５％解離、およびより好ましくは少なくとも約９０％解離している。本明細書で用いられるように、これらの用語はまた、試料からの混入物質の除去を意味する。例えば、混入物質の除去は、試料中のアルデヒドまたはアルカンの割合の上昇を生じうる。例えば、アルデヒドまたはアルカンが宿主細胞で生成される場合、アルデヒドまたはアルカンは、宿主細胞タンパク質の除去により精製されうる。精製後、試料中のアルデヒドまたはアルカンの割合は上昇する。
【０１２３】
用語「精製する」、「精製された」および「精製」は完全な精製を必要とされない。それらは、相対的な用語である。それゆえ、例えば、アルデヒドまたはアルカンが宿主細胞で生成される場合、精製されたアルデヒドまたは精製されたアルカンは、その他の細胞構成成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、またはその他の炭化水素）から実質的に分離されるものである。別の例において、精製されたアルデヒドまたは精製されたアルカン調製物は、アルデヒドまたはアルカンが、発酵後に存在しうるもののごとき混入物質から実質的に解離されたものである。いくつかの具体例において、アルデヒドまたはアルカンは、アルデヒドまたはアルカンは、試料の少なくとも約５０重量％がアルデヒドまたはアルカンからなる場合に精製される。その他の具体例において、アルデヒドまたはアルカンは、試料の少なくとも約６０重量％、７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９２重量％、９５重量％、９８重量％、または９９重量％またはそれ以上がアルデヒドまたはアルカンからなる場合に精製される。
【０１２４】
本明細書で用いられるように、用語「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ技術により生成されるポリペプチドを意味し、前記組み換えＤＮＡ技術は、一般に、発現されるポリペプチドまたはＲＮＡをコードするＤＮＡが適する発現ベクターに導入され、それを用いて宿主細胞を形質転換させてポリペプチドまたはＲＮＡを生成する。
【０１２５】
本明細書で用いられるように、用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、（例えば、同様の側鎖、例えば、保存的アミノ酸置換を有する）十分な数の同一または等価のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味するのに用いられる。
【０１２６】
本明細書で用いられるように、用語「シンターゼ」は、合成プロセルを触媒する酵素を意味する。本明細書で用いられるように、用語シンターゼは、シンターゼ、合成酵素、およびリガーゼを含む。
【０１２７】
本明細書で用いられるように、用語「トランスフェクション」は、核酸を介在した遺伝子導入による核酸（例えば、発現ベクターを介した）のレシピエント細胞への導入を意味する。
【０１２８】
本明細書で用いられるように、「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性の核酸の細胞内への取り込みの結果として変化するプロセスを意味する。
この結果、ＲＮＡまたはポリペプチドの組み換え形態を発現する形質転換された細胞を生じうる。導入された遺伝子からのアンチセンス発現の場合、天然に存在する形態のポリペプチドの発現が妨げられる。
【０１２９】
本明細書で用いられるように、「輸送タンパク質」は、１つまたはそれ以上の化合物の細胞器官および／または細胞の中および／または外への動きを促進するポリペプチドである。
【０１３０】
本明細書で用いられるように、ポリペプチドＸの「変異体」は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が変化しているポリペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異体は、保存性変化または非保存性変化を有しうる。アミノ酸残基が、生物学的活性に影響を与えることなく置換、挿入、または欠失されうることの決定に関する手引きは、当該技術分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出されうる。
【０１３１】
用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列に関して用いられる場合、遺伝子またはそのコーディング配列の変異体に関するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」の変異体を含んでもよい。スプライス変異体は、参照配列に対して顕著な同一性を有するが、一般に、ｍＲＮＡプロセッシング間のエクソンの選択的なスプライシングにより、多数または少数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、さらなる機能ドメインまたはドメインの非存在を保有してもよい。種の変異体は、ある種から別の種間で変化したポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは、一般に、互いに比較して顕著なアミノ酸同一性を有する。多型の変異体は、ある種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変化である。
【０１３２】
本明細書で用いられるように、用語「ベクター」は、結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。有用なベクターの１つのタイプは、エピソーム（すなわち、染色体外の複製ができる核酸）である。有用なベクターは、それらに結合している核酸の自律的な複製および／または発現ができるものである。作動可能に結合している遺伝子の発現を指揮できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技術において実用的な発現ベクターは、多くの場合、「プラスミド」の形態であり、「プラスミド」は、一般に、それらのベクター形態において、染色体に結合しない環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であることから、交換可能に用いられる。しかしながら、同等の機能を提供し、後に当該技術分野で知られることになる発現ベクターのかかるその他の形態も含まれる。
【０１３３】
他に定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、本発明の属する当業者により一般に理解されることと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と同様または同等なものが本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の文献は、出典明示により本明細書に取り込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定されるものではない。
【０１３４】
本発明のその他の特徴および有利な点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１Ａは、Prochlorococcus marinus CCMP1986細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図１Ｂは、図１Ａの７．５５分におけるピークの質量断片化パターンである。
【図２】図２Ａは、Nostoc punctiforme PCC73102細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図２Ｂは、図２Ａの８．７３分におけるピークの質量断片化パターンである。
【図３】図３Ａは、Gloeobaceter violaceus ATCC29082細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３Ｂは、図３Ａの８．７２分におけるピークの質量断片化パターンである。
【図４】図４Ａは、Synechocystic sp.PCC6803細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図４Ｂは、図４Ａの７．３６分におけるピークの質量断片化パターンである。
【図５】図５Ａは、Synechocystis sp.PCC6803野生型細胞により生成される炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図５Ｂは、sll0208およびsll0209遺伝子の欠失を有するSynechocystis sp.PCC6803細胞により生成される炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図６】図６Ａは、大腸菌 MG1655野生型細胞により生成される炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図６Ｂは、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成される炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図７】図７は、Cyanothece sp.ATCC51142cce_1430（YP_001802846）（配列番号：６９）を発現する大腸菌細胞により生成される炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図８】図８Ａは、Synechococcus elongatus PCC7942YP400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびSynechococcus elongatus PCC7942 YP_400610（Synpcc7942_1593）（配列番号：１）を発現する大腸菌細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図８Ｂは、図８Ａおよびペンタデカンの６．９８分におけるピークの質量断片化パターンを表す。図８Ｃは、図８Ａおよび８−へプタデセンの８．１２分におけるピークの質量断片化パターンを表す。
【図９】図９は、Synechococcus elongatus PCC7942YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびNostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：５）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１０】図１０は、Synechococcus elongatus PCC7942YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびSynechocystis sp.PCC6803 sll0208（NP_442147）（配列番号：３）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１１】図１１は、Synechococcus elongatus PCC7942YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびNostoc sp.PCC7210 alr5283（NP_489323）（配列番号：７）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１２】図１２は、Synechococcus elongatus PCC7942YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたAcaryochloris marina MBIC11017AM1_4041（YP_001518340）（配列番号：４６）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１３】図１３は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたThermosynechococcus elongatus BP-I tll1313（NP_682103）（配列番号：４７）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１４】図１４は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたSynechococcus sp.JA-3-3Ab CYA_0415（YP_473897）（配列番号：４８）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１５】図１５は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびGloeobacter violaceus PCC7421 gll3146（NP_926092）（配列番号：１５）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１６】図１６は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたProchlorococcus marinus MIT9313 PMT1231（NP_895059）（配列番号：４９）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１７】図１７は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびProchlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532（NP_892650）（配列番号：１９）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１８】図１８は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたProchlorococcus mariunus NATL2A PMN2A_1863（YP_293054）（配列番号：５１）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図１９】図１９は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたSynechococcus sp.RS9917 RS9917_09941（ZP_01079772）（配列番号：５２）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２０】図２０は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびコドンが最適化されたSynechococcus sp.RS9917 RS9917_12945（ZP_01080370）（配列番号：５３）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２１】図２１は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびCyanothece sp.ATCC51142 cce_0778（YP_001802195）（配列番号：２７）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２２】図２２は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびCyanothece sp.PCC7425 Cyan7425_0398（YP_002481151）（配列番号：２９）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２３】図２３は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびCyanothece sp.PCC7425 Cyan7425_2986（YP_002483683）（配列番号：３１）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２４】図２４Ａは、Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533（NP_892651）（配列番号：７１）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図２４Ｂは、Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533（NP_892651）（配列番号：７１）およびProchlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532（NP_892650）（配列番号：１９）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２５】図２５Ａは、大腸菌 MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図２５Ｂは、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびAcaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041（YP_001518340）（配列番号：９）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２６】図２６Ａは、Synechocystis sp.PCC6803 S110209（NP_442146）（配列番号：６７）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図２６Ｂは、Synechocystis sp.PCC6803 sll0209（NP_442146）（配列番号：６７）およびSynechocystis sp.PCC6803 sll0208（NP_442147）（配列番号：３）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２７】図２７Ａは、M.smegmatis strain MC2 155 MSMEG_5739（YP_889972）（配列番号：８５）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadD lacZ::Ptrc-‘tesA細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図２７Ｂは、M.smegmatis strain MC2 155 MSMEG_5739（YP_889972）（配列番号：８５）およびNostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：５）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadD lacZ::Ptrc-‘tesA細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図２８】図２８は、Nostoc sp.PCC7120 alr5283（配列番号：７）、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（配列番号：５）、P.mariunus CCMP1986 PMM0532（配列番号：１９）、G.violaceus PCC7421 gll3146（配列番号：１５）、Synechococcus sp.RS9917_09941（配列番号：２３）、Synechococcus sp.RS9917_12945（配列番号：２５）、またはA.marina MBICl1017 AM1_4041（配列番号：９）と単独または組み合わせのいずれかでM.smegmatis strain MC2 155 MSMEG_5739（YP_889972）（配列番号：８５）を発現する大腸菌 MG1655 ΔfadD lacZ::Ptrc-‘tesA細胞により生成された炭化水素の図である。
【図２９】図２９Ａは、クラスＩリボヌクレアーゼ還元酵素サブユニットβタンパク質、ＲＮＲβの三次構造の図である。図２９Ｂは、Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231（NP_895059）（配列番号：１７）の三次構造の図である。図２９Ｃは、Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231（NP_895059）（配列番号：１７）の活性部位の三次構造の図である。
【図３０】図３０Ａは、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：５）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３０Ｂは、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）Y123F変異体を発現する大腸菌 MG1655細胞図３０Ｃは、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）Y126F変異体を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３１】図３１は、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：６）およびオクタデカナール（Ａ）；Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：６）、オクタデカナール、ホウレンソウフェレドトキシン還元酵素、およびＮＡＤＰＨ（Ｂ）；オクタデカナール，ホウレンソウフェレドトキシン、ホウレンソウフェレドトキシン還元酵素、およびＮＡＤＰＨ（Ｃ）；またはＮpun02004178（ZP_00108838）（配列番号：６）、ホウレンソウフェレドトキシン、およびホウレンソウフェレドトキシン（Ｄ）を用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースを表す。
【図３２】図３２は、Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：６）、ＮＡＤＰＨ、オクタデカナール、ならびに（Ａ）ホウレンソウフェレドトキシンおよびホウレンソウフェレドトキシン還元酵素；（Ｂ）N.punctiforme PCC73102 Npun02003626（ZP_00109192）（配列番号：８８）およびN.punctiforme PCC73102 Npun02001001（ZP_00111633）（配列番号：９０）；（Ｃ）Npun02003626（ZP_00109192）（配列番号：８８）およびN.punctiforme PCC73102 Npun02003530（ZP_00109422）（配列番号：９２）；または（Ｄ）Npun02003626（ZP_00109192）（配列番号：８８）およびN.punctiforme PCC73102 Npun02003123（ZP_00109501）（配列番号：９４）のいずれかを用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースを表す。
【図３３】図３３Ａは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）、ＮＡＤＨ、およびＭｇ２＋を用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３３Ｂは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）、ＮＡＤＰＨ、およびＭｇ２＋を用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３３Ｃは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）およびＮＡＤＰＨを用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３４】図３４Ａは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、標識されたＮＡＤＰＨ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）、および標識されていないＮＡＤＰＨを用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３４Ｂは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、標識されたＮＡＤＰＨ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）、およびＳ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨを用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。図３４Ｃは、オクタデカノイル−ＣｏＡ、標識されたＮＡＤＰＨ、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６６）、およびＲ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨを用いてインビトロで生成された炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３５】図３５は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）を発現するＣｈｅ−９培地中の大腸菌 MG1655 ΔfadＥ細胞により生成された細胞遊離上澄み液における炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３６】図３６は、Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）およびNostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838）（配列番号：５）を発現するＣｈｅ−９培地中の大腸菌 MG1655 ΔfadE細胞により生成された細胞遊離上澄み液における炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３７】図３７は、Nostoc sp.PCC7120 alr5283（NP_489323）（配列番号：７）およびNostoc sp.PCC7120 alr5284（NP_489324）（配列番号：８１）を発現する大腸菌 MG1655細胞により生成された細胞遊離上澄み液における炭化水素のＧＣ／ＭＳトレースである。
【図３８】図３８は、メタゲノムデータベース由来のSynechococcus elongatus PCC7942 YP_400610（Synpcc7942_1593）（配列番号：１）のホモログの例の列挙である。
【図３９】図３９は、メタゲノムデータベース由来のSynechococcus elongatus PCC7942 YP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号：６５）のホモログの例の列挙である。
【図４０】図４０は、特定の基質の生成を増加させるように発現され、過剰発現され、あるいは妨げられうる様々な遺伝子を同定する表である。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
本発明は、基質、例えば、（例えば、出典明示により特に本明細書に取り込まれるPCT/US08/058788に記載されるごとき）アリル−ＡＣＰ、脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、または脂肪アルコール基質からアルデヒド、脂肪アルコール、および（アルカン、アルケン、およびアルキンなどの）炭化水素を生成する組成物および方法を提供する。かかるアルデヒド、アルカン、およびアルケンは、バイオ燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料などの代替物）、特殊な化学物質（例えば、潤滑油、燃料添加剤など）、またはさらなる化学変化のための原料（例えば、燃料、ポリマー、プラスティック、繊維製品、溶媒、接着剤など）として有用である。本発明は、部分的に、アルデヒド、アルカン、およびアルケン生合成に関連する遺伝子の同定に基づく。
【０１３７】
かかるアルカンおよびアルケン生合成遺伝子は、例えば、Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1593（配列番号：１）、Synechocystis sp.PCC6803 sll0208（配列番号：３）、Nostoc punctiforme PCC 73102 Npun02004178（配列番号：５）、Nostoc sp.PCC 7120 alr5283（配列番号：７）、Acaryochloris marina MBICl 1017 AM1_4041（配列番号：９）、Thermosynechococcus elongatus BP-1 tll1313（配列番号：１１）、Synechococcus sp.JA-3-3A CYA_0415（配列番号：１３）、Gloeobacter violaceus PCC7421 gU3146（配列番号：１５）、Prochlorococcus marinus MIT9313 PM123（配列番号：１７）、Prochlorococcus marinus subsp.pastoris str.CCMP1986 PMM0532（配列番号：１９）、Prochlorococcus marinus str.NATL2A PMN2A_1863（配列番号：２１）、Synechococcus sp.RS9917 RS9917_09941（配列番号：２３）、Synechococcus sp. RS9917 RS9917_12945（配列番号：２５）、Cyanothece sp.ATCC51142 cce_0778（配列番号：２７）、Cyanothece sp.PCC7245 Cyan7425DRAFT_1220（配列番号：２９）、Cyanothece sp.PCC7245 cce_0778（配列番号：３１）、Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323043（Ava_2533）（配列番号：３３）、およびSynechococcus elongatus PCC6301 YP_170760（syc0050_d）（配列番号：３５）を含む。その他のアルカンおよびアルケン生合成遺伝子は、表１および図３８に記載される。
【０１３８】
アルデヒド生合成遺伝子は、例えば、Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1594（配列番号：６５）、Synechocystis sp.PCC6803 S110209（配列番号：６７）、Cyanothece sp.ATCC51142 cce_1430（配列番号：６９）、Prochlorococcus marinus subsp.pastoris str.CCMP1986 PMM0533（配列番号：７１）、Gloeobacter violaceus PCC7421 NP_96091（gU3145）（配列番号：７３）、Nostoc punctiforme PCC73102 ZP_00108837（Npun02004176）（配列番号：７５）、Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323044（Ava_2534）（配列番号：７７）、Synechococcus elongatus PCC6301 YP_170761（syc0051_d）（配列番号：７９）、およびNostoc sp.PCC 7120 alr5284（配列番号：８１）を含む。その他のアルデヒド生合成遺伝子は、表１および図３９に記載される。
【０１３９】
本明細書に記載される方法を用いて、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のアルデヒド、アルカン、および／またはアルケン生合成遺伝子またはポリペプチド、これらの変異体を用いて宿主細胞または細胞を用いない方法を利用して調製することができる。
【表１】
2011522525.tif 000003
【０１４０】
アルデヒド、アルカン、およびアルケン生合成遺伝子および変異体
本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５のヌクレオチド配列を有するアルカンまたはアルケン生合成遺伝子、ならびにそれらのポリヌクレオチド変異体を含む。いくつかの例において、アルカンまたはアルケン生合成遺伝子は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のアミノ酸モチーフをコードする。例えば、アルカンまたはアルケン生合成遺伝子は、配列番号：３７、３８、３９、４１、４２、４３、または４４を含むポリペプチドをコードすることができる。アルカンまたはアルケン生合成遺伝子はまた、配列番号：４０および配列番号：３７、３８、または３９のいずれか１つも含むポリペプチドを含むことができる。
【０１４１】
本明細書に記載される方法および組成物はまた、例えば、配列番号６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、または８１のヌクレオチド配列を有するアルデヒド生合成遺伝子、ならびにそれらのポリヌクレオチド変異体を含む。いくつかの例において、アルデヒド生合成遺伝子は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のアミノ酸モチーフをコードする。例えば、アルデヒド生合成遺伝子は、配列番号：５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４を含むポリペプチドをコードすることができる。
【０１４２】
変異体は、天然に存在するか、またはインビトロで作り出すことができる。特に、かかる変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ランダム化学物質突然変異誘発法、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法、および一般的なクローニング技術のごとき遺伝子工学技術を用いて作り出すことができる。あるいは、かかる変異体、フラグメント、アナログ、または誘導体は、化学的な合成または修飾方法を用いて作り出すことができる。
【０１４３】
変異体を調製する方法は、当該技術分野でよく知られている。これらは、天然の単離物から得られた核酸配列が改変されることにより、工業または実験用にそれらの価値が高まる特徴を持つポリペプチドをコードする核酸が作り出される手法を含む。かかる手法において、天然の単離物から得られた核酸に関して１つまたはそれ以上のヌクレオチドの相違を有する多くの変異配列が作り出され、特徴付けられている。典型的に、これらのヌクレオチドの相違は、天然の単離物に由来する核酸によりコードされるポリペプチドに関してアミノ酸の変化を生じる。
【０１４４】
例えば、変異体は、変異性ＰＣＲを用いて作り出すことができる(例えば、Leung et al., Technique 1:11-15, 1989；およびCaldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992を参照のこと）。変異性ＰＣＲにおいて、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低く、その結果、ＰＣＲ産物の全長において高い頻度で点変異が得られる条件下で行われる。簡単に説明すると、かかる方法では、変異が導入される核酸（例えば、アルデヒドまたはアルカン生合成ポリヌクレオチド配列）は、ＰＣＲ産物の全長において高い割合で点変異を入れるためにＰＣＲプライマー、反応バッファー、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、およびｄＮＴＰの適当な濃度で混合される。例えば、反応は、２０ｆモルの変異が導入される核酸（例えば、アルデヒドまたはアルカン生合成ポリヌクレオチド配列）、３０ｐモルの各ＰＣＲプライマー、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、および０．０１％  ゼラチンを含む反応バッファー、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ、および１ｍＭ  ｄＴＴＰを用いて行うことができる。ＰＣＲは、１分間９４℃、１分間４５℃、次いで１分間７２℃の３０サイクルで行うことができる。しかしながら、これらのパラメータは適宜変えることができる。次いで、変異が導入された核酸は、適切なベクターにクローン化され、変異が導入された核酸によりコードされるポリペプチドの活性が評価される。
【０１４５】
変異体はまた、オリゴヌクレオチド突然変異誘発を用いて目的のクローン化されたＤＮＡのいずれかに部位特異的変異を作り出すことができる。オリゴヌクレオチド突然変異誘導は、例えば、Reidhaar-Olson et al, Science 241 :53-57, 1988に記載される。簡単に説明すると、かかる方法において、クローン化ＤＮＡに導入される１つまたはそれ以上の変異を保有する多くの二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異が導入されるクローン化ＤＮＡに挿入される（例えば、アルデヒドまたはアルカン生合成ポリヌクレオチド配列）。変異が導入されたＤＮＡを含むクローンが回収され、それらがコードするポリペプチドの活性が測定される。
【０１４６】
変異体を作り出す別の方法は、アセンブリＰＣＲである。アセンブリＰＣＲは、小さいＤＮＡフラグメントの混合物に由来するＰＣＲ産物の組み立てに関する。ある反応の産物が別の反応の産物を呼び起こしながら、多くの異なるＰＣＲ反応が同じバイアル内で平行して生じる。アセンブリＰＣＲは、例えば、米国特許第5965408号に記載される。
【０１４７】
変異体を作り出すさらに別の方法は、セクシャル（sexual）ＰＣＲ突然変異誘発法である。セクシャルＰＣＲ突然変異誘発法では、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダム断片化の結果として、インビトロで強制的な相同組み換えが、異なるが極めて関連性の高いＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間で生じる。その後、ＰＣＲ反応においてプライマー伸長による交差（crossover）の固定が生じる。セクシャルＰＣＲは、例えば、Stemmer, PNAS, USA 91 :10747-10751, 1994に記載される。
【０１４８】
変異体はまた、インビボ突然変異誘発により作り出すことができる。いくつかの具体例において、核酸配列におけるランダム変異は、ＤＮＡ修復経路の１つまたはそれ以上に変異を有する大腸菌株のごとき細菌株における配列を増殖することにより作り出される。かかる「突然変異誘発因子（mutator）」株は、野生型と比較してより高いランダム変異率を有する。これらの株の１つにおけるＤＮＡ配列（例えば、アルデヒドまたはアルカン生合成ポリヌクレオチド配列）の増殖は、最終的に、ＤＮＡ内のランダム変異を作り出す。インビボ突然変異誘発法の使用に適する突然変異誘発因子株は、ＰＣＴ公開第WO91/16427号に記載される。
【０１４９】
変異体はまた、カセット変異導入法を用いて作り出すことができる。カセット変異導入法では、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域が元々の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」に置換される。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全におよび／または部分的にランダム化された元々の配列を含む。
【０１５０】
再帰的アンサンブル突然変異誘発はまた、変異体を作り出すのに用いることができる。再帰的アンサンブル突然変異誘発は、アミノ酸配列が異なるが、表現形に関連がある変異体の多くの集団を産生するために開発されたタンパク質工学のアルゴリズム（すなわち、タンパク質の突然変異誘発）である。この方法は、組み合わせカセット変異導入法の連続回数を制御するフィードバックメカニズムを用いる。再帰的アンサンブル突然変異誘発は、例えば、Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992に記載される。
【０１５１】
いくつかの具体例において、変異体は、指数関数的（exponential）アンサンブル突然変異誘発を用いて作り出される。指数関数的アンサンブル突然変異誘発は、ユニークかつ機能的な変異体を高い割合で有する組み合わせライブラリーを作成するためのプロセスであって、少数の残基は、それぞれの変化した位置において、機能的なタンパク質を導くアミノ酸を同定するのと同時にランダム化される。指数関数的アンサンブル突然変異誘発は、例えば、Delegrave et al., Biotech. Res. 11: 1548-1552, 1993に記載される。ランダムおよび部位特異的突然変異誘発法は、例えば、Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993に記載される。
【０１５２】
いくつかの具体例において、変異体は、例えば、米国特許第5965408号および第5939250号に記載されるごとく、異なるポリペプチドをコードする複数の核酸の一部が一緒に融合されてキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が作り出されるものであるシャッフリング法を用いて作り出される。
【０１５３】
ポリヌクレオチド変異体はまた、核酸アナログを含む。核酸アナログは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾されて、例えば、核酸の安定性、バイブリダイゼーション、または溶解性を改善することができる。塩基部分の修飾は、デオキシチミジンに対するデオキシウリジンおよびデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンを含む。糖部分の修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリルの糖を形成するためにリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含む。デオキシリボースのリン酸骨格は、モルホリノ核酸を生成するのに修飾することができ、各塩基部分が、６員のモルホリノ環、またはペプチド核酸に連結されるものであり、デオキシリン酸骨格が、擬ペプチド骨格により置換され、４つの塩基が保持されるものである（例えば、Summerton et al., Antisense Nucleic Acid DrugDev. (1997) 7:187-195；およびHyrup et al, Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:5-23を参照のごと）。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト（phosphoramidite）、あるいはアルキルホスホトリエステル骨格で置換することができる。
【０１５４】
アルデヒドおよびアルカン生合成ポリペプチドSynpcc7942_1594（配列番号：６６）およびSynpcc7942_1593（配列番号：２）は、その他のシアノバクテリア（非限定的な例が表１に列挙される）においてホモログを有する。それゆえ、表１に記載されるホモログをコードするポリヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの変異体は、本明細書で記載される方法においてアルデヒドまたはアルカン生合成ポリヌクレオチドとして用いることができる。表１に列挙される各シアノバクテリウムは、両方の遺伝子のコピーを有する。遺伝子産物の配列同一性レベルは、Synpcc7942_1594（配列番号：６６）については、６１％から７３％の範囲であり、Synpcc7942_1593（配列番号：２）については、４３％から７８％の範囲である。
【０１５５】
アルデヒド生合成ポリペプチドSynpcc7942_1594（配列番号：６６）のさらなるホモログは図３９に列挙され、図３９に列挙されるホモログをコードするポリヌクレオチド配列、またはこれらの変異体は、本明細書に記載される方法においてアルデヒド生合成ポリヌクレオチドとして用いることができる。アルカン生合成ポリペプチドSynpcc7942_1593（配列番号：２）のさらなるホモログは、図３８に列挙され、図３８に列挙されるホモログをコードするポリヌクレオチド配列のいずれか、またはこれらの変異体は、本明細書に記載される方法においてアルカン生合成ポリヌクレオチドとして用いることができる。
【０１５６】
一定の例において、アルデヒド、アルカン、および／またはアルケン生合成遺伝子は、特定の宿主細胞における発現についてコドンが最適化される。例えば、大腸菌の発現においては、１つまたはそれ以上のコドンは、例えば、Grosjean et al., Gene 18:199-209 (1982)に記載されるごとく最適化することができる。
【０１５７】
アルデヒド、アルカン、およびアルケン生合成ポリペプチドおよび変異体
本明細書に記載される方法および組成物はまた、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を有するアルカンまたはアルケン生合成ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチド変異体を含む。いくつかの例において、アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸モチーフの１つまたはそれ以上を含むものである。例えば、アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチドは、配列番号：３７、３８、３９、４１、４２、４３、または４４アミノ酸配列を含むことができる。アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチドはまた、配列番号：４０のアミノ酸配列、および配列番号：３７、３８、または３９のいずれか１つをも含む。
【０１５８】
本明細書に記載される方法および組成物はまた、配列番号：６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、または８２のアミノ酸配列を有するアルデヒド生合成ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチド変異体を含む。いくつかの例において、アルデヒド生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸モチーフの１つまたはそれ以上を含むものである。例えば、アルデヒド生合成ポリペプチドは、配列番号：５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１５９】
アルデヒド、アルカン、およびアルケン生合成ポリペプチド変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存性または非保存性アミノ酸残基（好ましくは、保存性アミノ酸残基）で置換される変異体であり得る。かかる置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされないものであってもよい。
【０１６０】
保存性置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特徴の別のアミノ酸により置換することである。典型的な保存性置換は、以下の置換である：アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸への置換；セリンのスレオニンへの置換あるいはその逆の置換；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基の別の酸性残基への置換；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド基を保有する残基のアミド基を保有する別の残基への置換；リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基の別の塩基性残基への交換；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンなどの芳香族残基の別の芳香族残基への置換。
【０１６１】
その他のポリペプチド変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものである。なおその他のポリペプチド変異体は、ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるような化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物に結合しているものである。
【０１６２】
さらなるポリペプチド変異体は、さらなるアミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列、またはポリペプチドの精製、濃縮、または安定化を容易にする配列のごときポリペプチドに融合しているものである。
【０１６３】
いくつかの例において、アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチド変異体は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同一の生物学的機能を保持し（例えば、アルカンまたはアルケン生合成活性を保持する）、これらと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１６４】
その他の例において、アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチド変異体は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％より高い相同性を有する。別の具体例において、ポリペプチド変異体は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０個の保存性アミノ酸を含むこれらのフラグメントを含む。
【０１６５】
いくつかの例において、アルデヒド生合成ポリペプチド変異体は、配列番号：６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、または８２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同一の生物学的機能を保持し（例えば、アルデヒド生合成活性を保持する）、これらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【０１６６】
さらに他の例において、アルデヒド生合成ポリペプチド変異体は、配列番号：６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、または８２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％より高い相同性を有する。別の具体例において、ポリペプチド変異体は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０個の保存性アミノ酸を含むこれらのフラグメントを含む。
【０１６７】
ポリペプチド変異体またはこれらのフラグメントは、それらをコードする核酸を本明細書に記載される技術を用いて単離することにより、あるいはそれらをコードする合成核酸を発現させることにより得ることができる。あるいは、ポリペプチド変異体またはこれらのフラグメントは、生化学的な濃縮または精製方法を介して得ることができる。ポリペプチド変異体またはフラグメントの配列は、タンパク分解、ゲル電気泳動、および／またはマイクロシークエンシング（microsequencing）により決定することができる。さらに、アルカンまたはアルケン生合成ポリペプチド変異体またはフラグメントの配列は、本明細書に記載されるプログラムのいずれかを用いて、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のアミノ酸配列と比較することができる。アルデヒド生合成ポリペプチド変異体またはフラグメントの配列は、本明細書に記載されるプラグラムのいずれかを用いて、配列番号：アミノ酸配列と比較することができる。
【０１６８】
ポリペプチド変異体およびこれらのフラグメントは、常法を用いて、アルデヒド−、脂肪アルコール−、アルカン−、および／またはアルケン生成活性についてアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド変異体またはフラグメントは、ポリペプチド変異体を機能できる条件下で基質（例えば、本明細書に記載される脂肪酸誘導体基質またはその他の基質）と接触させることができる。基質レベルの減少またはアルデヒド、アルカン、もしくはアルケンのレベルの増加は、アルデヒド−、脂肪アルコール、アルカン−、またはアルケン−生成活性をそれぞれ調べるのに測定されうる。
【０１６９】
抗−アルデヒド、抗−脂肪アルコール、抗−アルカン、および抗−アルケン生合成ポリペプチド抗体
本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケン生合成ポリペプチドはまた、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケン生合成ポリペプチドに対する抗体を産生するのに用いることができる。かかる抗体は、例えば、当該技術分野に公知の方法を用いて、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、またはアルケン生合成ポリペプチドの発現を検出するのに用いることができる。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体またはこれらの抗原結合フラグメント；キメラ抗体、再構成抗体（reshaped antibody）、ヒト化抗体、またはこれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）などの修飾された抗体；あるいは生合成抗体、例えば、単鎖抗体、単一領域抗体（single domain antibody）（ＤＡＢ）、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはその類似物でありうる。
【０１７０】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製し、使用する方法は、例えば、Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (December 1, 1998)に記載される。修飾された抗体および抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単一領域抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、およびそれらの類似物）を調製する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag（December 15, 2000; 1st edition）で見出すことができる。
【０１７１】
基質
本明細書に記載される組成物および方法は、適当な基質からアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、および／またはアルケンを生成するのに用いることができる。特定の理論に拘束されることなく、本明細書に記載されるアルカンまたはアルケン生合成ポリペプチドは、デカルボニル化メカニズムを介して基質からアルカンまたはアルケンを生成する。いくつかの例において、基質は、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アルデヒドであり、例えば、ある特徴を有する脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アルデヒドから生成することができる、特定の分岐パターンおよび炭素鎖の長さを有するアルカンである。その他の例において、基質は、不飽和脂肪酸誘導体、例えば、不飽和脂肪アルデヒドであり、特定の分岐パターンおよび炭素鎖長を有するアルケンは、不飽和脂肪酸誘導体から生成することができる。
【０１７２】
特定の理論に拘束されることなく、本明細書に記載されるアルデヒド生合成ポリペプチドは、還元メカニズムを介して基質からアルデヒドを生成すると考えられる。特定の例において、基質はアシル−ＡＣＰである。
【０１７３】
特定の理論に拘束されることなく、本明細書に記載される脂肪アルコールは、還元メカニズムを介して基質から生成される。特定の例において、基質は、脂肪アルデヒドである。
【０１７４】
それゆえ、これらの基質の生成を生じる生合成経路の各ステップは、目的の基質を生成または過剰生成するように修飾することができる。例えば、脂肪酸生合成経路、脂肪アルデヒド経路、および脂肪アルコール経路に関連する公知の遺伝子は、宿主細胞において発現、過剰発現、または減弱されて所望の基質が生成されうる（例えば、特に出典明示により本明細書に取り込まれるPCT/US08/058788をご参照）。典型的な遺伝子は図４０にて提供される。
【０１７５】
基質の合成
脂肪酸シンターゼ（FAS）は、アシル鎖の開始および延長を触媒するポリペプチドの一群である（Marrakchi et al., Biochemical Society, 30: 1050-1055, 2002）。アシルキャリアタンパク質（ACP）は、ＦＡＳ経路において酵素と一緒に、生成される脂肪酸誘導体の長さ、飽和の程度、および分岐を制御する。脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡに関連する。この経路のステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）の酵素およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（acc）遺伝子ファミリーにより触媒される（例えば、Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)を参照のこと）。
【０１７６】
宿主細胞は、アセチル−ＣｏＡおよび／またはマロニル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を組み換え技術により発現または過剰発現させることにより脂肪酸誘導体基質を発現するように改変することができる。例えば、アセチル−ＣｏＡ生成を増加させるために、以下の遺伝子の１つまたはそれ以上が宿主細胞で発現させることができる：pdh、panK、（ピルビン酸のＥ１ｐデヒドロゲナーゼ構成要素およびＥ２ｐデヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ構成要素ならびに２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする）aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP、およびfabF。これらの遺伝子の典型的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、pdh（BAB34380、AAC73227、AAC73226）、panK（coaAとしても知られる、AAC76952）、aceEF（AAC73227、AAC73226）、fabH（AAC74175）、fabD（AAC74176）、fabG（AAC74177）、acpP（AAC74178）、fabF（AAC74179）である。さらに、fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA、および／またはackBの発現レベルは、対応する遺伝子のヌルまたは欠失変異を含む条件付き複製または非複製プラスミドを用いる形質転換により、あるいはプロモーターまたはエンハンサー配列を置換することにより改変された宿主細胞において減弱またはノックアウトすることができる。これらの遺伝子の典型的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、fadE（AAC73325）、gspA（AAC76632）、ldhA（AAC74462）、pflb（AAC73989）、adhE（AAC74323A）、pta（AAC75357）、poxB（AAC73958）、ackA（AAC75356）、およびackB（BAB81430）である。生じる宿主細胞は、適当な環境で増殖されると増加したアセチル−ＣｏＡ生成レベルを示す。
【０１７７】
マロニル−ＣｏＡ過剰発現は、accABCD（例えば、受入番号AAC73296、EC 6.4.1.2）を宿主細胞に導入することにより生じることができる。脂肪酸は、宿主細胞にリパーゼ（例えば、受入番号CAA89087、CAA98876）をコードするＤＮＡ配列を導入することにより、宿主細胞においてさらに過剰発現されうる。
【０１７８】
さらに、PlsBの阻害は、経路の初期ステップ（例えば、accABCD、fabH、およびfabI）を抑制する長鎖アシル−ＡＣＰレベルの増加を生じさせることができる。plsB（例えば、受入番号AAC77011）D311E変異は、利用できるアシル−ＣｏＡの量を増加させるのに用いることができる。
【０１７９】
さらに、宿主細胞は、sfa遺伝子（fabAの抑制因子、例えば、受入番号AAN79592）を過剰発現させてモノ不飽和脂肪酸の生成を増加させるように改変されうる（Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996）。
【０１８０】
いくつかの例において、宿主細胞は、チオエステラーゼを発現させ、過剰発現させ、あるいはチオエステラーゼの発現を減弱させて脂肪酸基質生成を増加させるように改変されうる。脂肪酸基質の鎖の長さは、チオエステラーゼにより制御される。いくつかの例において、tesまたはfat遺伝子は過剰発現されうる。別の例において、Ｃ１０脂肪酸は、Ｃ１８：１−ＡＣＰを用いるチオエステラーゼＣ１８（例えば、受入番号AAC73596およびP0ADA1）を減弱させ、Ｃ１０−ＡＣＰを用いるチオエステラーゼＣ１０（例えば、受入番号Ｑ３９５１３）を発現させることにより生成することができる。これは、１０の炭素鎖長を有する脂肪酸の比較的均一な集団を生じる。さらに他の例において、Ｃ１４脂肪酸は、非Ｃ１４脂肪酸を生成する内在性チオエステラーゼを減弱させ、Ｃ１４−ＡＣＰ（例えば、受入番号Q39473）を用いるチオエステラーゼを発現させることにより生成することができる。いくつかの例において、Ｃ１２脂肪酸は、Ｃ１２−ＡＣＰ（例えば、受入番号Q41635）を用いるチオエステラーゼを発現させ、非Ｃ１２脂肪酸を生成するチオエステラーゼを減弱させることにより生成されうる。アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、および脂肪酸の過剰発現は、当該技術分野で公知の方法を用いて、例えば、細胞溶解後の放射性前駆体、ＨＰＬＣ、およびＧＣ−ＭＳを用いることにより、確認することができる。本明細書に記載される方法で用いることができるチオエステラーゼの非限定的な例は、表２に記載される。
【表２】
2011522525.tif 000004
【０１８１】
分岐したアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケンの生成
分岐点を含むアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケンは、基質として分岐した脂肪酸誘導体を用いることにより生成することができる。例えば、大腸菌は、直鎖脂肪酸誘導体（ｓＦＡｓ）を自然に生成するが、大腸菌は、大腸菌にて分岐した前駆体（例えば、bkd、ilv、icm、およびfab遺伝子ファミリー）を提供する遺伝子を導入し、発現または過剰発現させることにより、分岐鎖脂肪酸誘導体（brFAs）を生成するように改変することができる。さらに、宿主細胞は、brFA（例えば、ACP、FabFなど）の伸長のためのタンパク質をコードする遺伝子を発現または過剰発現させ、および／または通常sFAを生じる対応する宿主細胞遺伝子を欠失または減弱させるように改変することができる。
【０１８２】
ｂｒＦＡを生成する最初のステップは、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによる対応するα−ケト酸の生成である。宿主細胞がかかる酵素をコードする遺伝子を内在的に含むか、またはかかる遺伝子が組み換え技術により導入されうる。大腸菌は、例えば、内在的に、IlvE（EC 2.6.1.42；ＧｅｎＢａｎｋ受入YP_026247のごとき酵素を発現する。いくつかの宿主細胞において、異種性分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは発現され得ない。しかしながら、大腸菌 IlvEまたはいずれかの他の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、Lactococcus lactisに由来するIlvE（ＧｅｎＢａｎｋ受入AAF34406）、Pseudomonas putidaに由来するIlvE（ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_745648）、またはStreptomyces coelicolorに由来するIlvE（ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_629657））は、内在性でない場合、導入され、組み換え技術により発現されうる。
【０１８３】
２番目のステップは、対応する分岐鎖アシル−ＣｏＡに対するα−ケト酸の酸化脱カルボキシル化である。この反応は、Ｅ１α／β（脱カルボキシラーゼ）、Ｅ２（ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ（dihydrolipoyl transacylase））、およびＥ３（ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ）サブユニットからなる分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（bkd;EC 1.2.4.4.）により触媒されうる（Denoya et al., J. Bacteriol. 177:3504, 1995）。これらの分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体に類似している。brFAを有し、および／または分岐鎖アミノ酸上で増殖するいずれかの微生物は、宿主細胞、例えば、大腸菌における発現のためのｂｋｄ遺伝子を単離する供給源として用いることができる。さらに、大腸菌は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部としてのＥ３構成要素（Ipd、EC 1.8.1.4、ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_414658）を有する。それゆえ、Ｅ１α／βおよびＥ２ｂｋｄ遺伝子のみを発現させるのに十分であり得る。表３は、宿主細胞に組み換え技術により導入され、発現されて分岐鎖アシル−ＣｏＡ前駆体を提供することができる数種類の微生物に由来するｂｋｄ遺伝子の非限定的な例を記載する。
【表３】
2011522525.tif 000005
【０１８４】
別の例において、イソブチリル−ＣｏＡは、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素（Ccr、EC 1.6.5.5,1.1.1.1）およびイソブチリル−ＣｏＡムターゼ（大型サブユニットIcmA、EC 5.4.99.2；小型サブユニットIcmB、EC 5.4.99.2）の共発現を介して宿主細胞、例えば、大腸菌にて作り出すことができる（Han and Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997）。クロトニル−ＣｏＡは、大腸菌およびその他の微生物における脂肪酸生合成の中間体である。選択された微生物に由来するccrおよびicm遺伝子の非限定的な例は、表４に記載される。
【表４】
2011522525.tif 000006
【０１８５】
ｂｋｄ遺伝子の発現に加えて、brFA生合成の開始は、分岐鎖アシル−ＣｏＡに対する特異性とともにβ−ケトアシル−アシル−キャリア−タンパク質シンターゼＩＩＩ（FabH、EC 2.3.1.41）を利用する。（Li et al,, J. Bacteriol. 187:3795-3799, 2005）．かかるFabH酵素の非限定的な例は、表５に記載される。brFAを含有するいずれかの微生物の脂肪酸生合成に関連するfabH遺伝子は、宿主細胞において発現されうる。天然にbrFAを作り出さない宿主細胞に由来するBkdおよびFabH酵素は、brFA生成を支持しないかもしれない。それゆえ、bkdおよびfabHは、組み換え技術により発現され得る。bkdおよびfabH遺伝子を含むベクターは、かかる宿主細胞に挿入することができる。同様に、BkdおよびFabH生成の内在的なレベルは、brFAを生成するのに十分ではないかもしれない。この場合、それらは過剰発現され得る。さらに、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰｓ）およびβ−ケトアシル−アシル−キャリア−タンパク質シンターゼＩＩ（fabF、EC 2.3.1.41）のごとき脂肪酸生合成経路のその他の構成要素は、発現または過剰発現され得る（候補の非限定的な例は、表５に記載される）。これらの遺伝子を発現させることに加えて、内在性脂肪酸生合成経路におけるいくつかの遺伝子は、宿主細胞にて減弱され得る（例えば、大腸菌遺伝子fabH（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号NP_415609）および／またはfabF（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号NP_415613））。
【表５】
2011522525.tif 000007
【０１８６】
環状アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケンは、基質として環状脂肪酸誘導体を用いることにより生成することができる。環状脂肪酸有黄体基質を生成するために、環状前駆体（例えば、ans、chc、およびplm遺伝子ファミリー）を提供する遺伝子が宿主細胞に導入され、発現されて環状前駆体から脂肪酸生合成の開始を可能にしうる。例えば、大腸菌のごとき宿主細胞をω−環状脂肪酸誘導体（cyFA）を合成することができるものに変換するために、環状前駆体シクロヘキシルカルボニル−ＣｏＡ（ＣＨＣ−ＣｏＡ）を提供する遺伝子（Cropp et al., Nature Biotech. 18:980-983, 2000）が宿主細胞に導入され、発現され得る。大腸菌にてCHC-CoAを提供する遺伝子の非限定的な例は、S.collinus、S.avermitilis、またはS.coelicolorに由来するｃｈｃＢ遺伝子（Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000）と一緒のStreptomyces collinusのアンサトリエニン（ansatrienin）遺伝子クラスターに由来するansJ、ansK、ansL、chcA、およびansM（Chen et al., Eur. J. Biochem. 261 : 98-107, 1999）またはStreptomyces sp.HK803のホスラクトマイシン（phoslactomycin）Ｂ遺伝子クラスターに由来するplmJ、plmK、plmL、chcA、およびplmM（Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003）を含む（表６参照）。そして、表５に記載される遺伝子は、発現されてω−環状脂肪酸の開始および伸長を可能にしうる。あるいは、同種の遺伝子は、cyFAを作り出す微生物から単離され、宿主細胞（例えば、大腸菌）にて発現されうる。
【表６】
2011522525.tif 000008
＊chcAのみがＧｅｎＢａｎｋ登録U72144で注釈され、ansJK、L、Mは、Chen et al. (Eur. J. Biochem. 261:98-107, 1999)による。
【０１８７】
表５に記載される遺伝子（fabH、ACP、およびfabF）は、広い基質特異性によりω−環状脂肪酸誘導体の開始および伸長を可能にする。これらの遺伝子のいずれかの表６記載の遺伝子との共発現がcyFAを生じない場合、cyFAを作り出す微生物（例えば、表７に記載されるもの）に由来するfabH、ACP、および／またはfabＦホモログは、（例えば、縮重ＰＣＲプライマーまたは異種性ＤＮＡ配列プローブを用いることにより）単離され、共発現され得る。
【表７】
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＊cyFA生合成に関する前駆体としてシクロヘプチルカルボニル−ＣｏＡを用いるが、シクロヘキシルカルボニル−ＣｏＡを用いない
【０１８８】
アルデヒド、脂肪アルコール、およびアルケン飽和レベル
脂肪酸誘導体における飽和の程度は、脂肪酸誘導体中間体の飽和の程度を調節することにより制御することができる。sfa、gns、およびfab遺伝子ファミリーは、発現または過剰発現されて脂肪酸の飽和を制御することができる。図４０は、本明細書に記載される方法および宿主細胞に用いられ得るこれらの遺伝子ファミリーにおける遺伝子の非限定的な例を記載する。
【０１８９】
宿主細胞は、宿主細胞を改変してfabBを過剰発現させることにより、あるいは低温（例えば、３７℃より低い）で宿主細胞を増殖させることにより、不飽和脂肪酸を生成するように改変することができる。FabBは、ｃｉｓ−デセノイル−ＡＣＰに対する選択性を示し、大腸菌において不飽和脂肪酸の生成を生じる。fabBの過剰発現は、不飽和脂肪酸の顕著な割合の生成を生じる（de Mendoza et al., J. Biol. Chem. 258:2098-2101, 1983）。遺伝子fabBは、天然にその遺伝子を有さない宿主細胞に導入され、発現されてもよい。それゆえ、これらの不飽和脂肪酸誘導体は、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、またはアルケンなどの脂肪酸誘導体を生成するように改変される宿主細胞において中間体として用いることができる。
【０１９０】
別の例において、脂肪生合成の抑制因子、例えば、fabR（ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_418398）は、大腸菌において欠失され、不飽和脂肪酸の生成の増加を生じうる（Zhang et al., J. Biol. Chem. 277: 15558, 2002）。同様の欠失は、その他の宿主細胞においても作り出されてもよい。不飽和脂肪酸誘導体のさらなる増加は、例えば、fabM（ｔｒａｎｓ−２，ｃｉｓ−３−デセノイル−ＡＣＰイソメラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ受入DAA05501）を過剰発現し、Streptococcus pneumoniaeに由来するfabK（ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素ＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_357969）の制御された発現と（Marrakchi et al, J. Biol Chem. 277: 44809, 2002）、一方で大腸菌 fabI（ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素、ＧｅｎＢａｎｋ受入NP_415804）を欠失することにより達成されてもよい。いくつかの例において、内在性fabF遺伝子が減弱され、それにより生成されるパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の割合が増加しうる。
【０１９１】
その他の基質
本明細書に記載される方法においてアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケンを生成するのに用いることができるその他の基質は、アシル−ＡＣＰ、アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、または脂肪アルコールであり、例えば、PCT/US08/058788に記載される。宿主細胞にてこれらの基質を発現または過剰発現するように変化されうる典型的な遺伝子は、図４０に記載される。その他の典型的な遺伝子は、PCT/US08/058788に記載される。
【０１９２】
アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、およびアルケンを生成する宿主細胞への遺伝子操作
様々な宿主細胞は、本明細書に記載されるごとく、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、および／またはアルケンを生成するのに用いることができる。宿主細胞は、原核生物または真核生物の細胞のいずれかであり得る。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、（大腸菌などの）細菌細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Cvl細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、またはPC12細胞などの）哺乳類細胞）にて発現され得る。その他の典型的な宿主細胞は、Escherichia、Bacillus、Lactobacillus、Rhodococcus、Pseudomonas、Aspergillus、Trichoderma、Neurospora、Fusarium、Humicola、Rhizomucor、Kluyveromyces、Pichia、Mucor、Myceliophtora、Penicillium、Phanerochaete、Pleurotus、Trametes、Chrysosporium、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia、またはStreptomyces属のファミリーに由来する細胞を含む。なお他の典型的な宿主細胞は、Bacillus lentus細胞、Bacillus brevis細胞、Bacillus stearothermophilus細胞、Bacillus licheniformis細胞、Bacillus alkalophilus細胞、Bacillus coagulans細胞、Bacillus circulans細胞、Bacillus pumilis細胞、Bacillus thuringiensis細胞、Bacillus clausii細胞、Bacillus megaterium細胞、Bacillus subtilis細胞、Bacillus amyloliquefaciens細胞、Trichoderma koningii細胞、Trichoderma viride細胞、Trichoderma reesei細胞、Trichoderma longibrachiatum細胞、Aspergillus awamori細胞、Aspergillus fumigates細胞、Aspergillus foetidus細胞、Aspergillus nidulans細胞、Aspergillus niger細胞、Aspergillus oryzae細胞、Humicola insolens細胞、Humicola lanuginose細胞、Rhizomucor miehei細胞、Mucor miehei細胞、Streptomyces lividans細胞、Streptomyces murinus細胞、またはActinomycetes細胞であり得る。
【０１９３】
宿主細胞のその他の非限定的な例は、表１に記載されるものである。
【０１９４】
好ましい具体例において、宿主細胞は大腸菌細胞である。より好ましい具体例において、宿主細胞は大腸菌株B、C、K、またはWに由来する。その他の適する宿主細胞は当業者に公知である。
【０１９５】
当該技術分野で周知である様々な方法は、宿主細胞を遺伝学的に操作してアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、および／またはアルケンを生成するのに用いることができる。前記方法は、ベクター、好ましくは、本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、および／またはアルケン生合成ポリペプチド、あるいはそのポリペプチド変異体またはフラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターの使用を含む。本明細書で用いられるように、用語「ベクター」は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、さらなるＤＮＡ断片が連結されうる環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡ断片がウイルスゲノムに連結され得る。一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞にて自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入に応じて宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、発現ベクターのごとき一定のベクターは、作動可能に連結している遺伝子の発現を指揮することができる。一般に、組み換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。しかし、ウイルスベクターなど（例えば、複製欠失レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ベクター）の発現ベクターの他の形態もまた用いることができる。
【０１９６】
本明細書に記載される組み換え発現ベクターは、宿主細胞にて核酸の発現に適する形態で本明細書に記載される核酸を含む。組み換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて１つまたはそれ以上の制御配列を含むことができる。制御配列は、発現される核酸配列に作動可能に連結される。かかる制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).に記載される。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指揮するものおよび一定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列（例えば、組織特異的調節配列）の発現を指揮するものを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることが当業者に評価されるであろう。本明細書に記載される発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、本明細書に記載される核酸によりコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドが産生されうる。
【０１９７】
組み換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞）におけるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、および／またはアルケン生合成ポリペプチドまたは変異体の発現について設計され得る。適する宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)にてさらに記載される。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いることにより、インビトロで転写され、翻訳され得る。
【０１９８】
原核生物、例えば、大腸菌におけるポリペプチドの発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指揮する構成的または誘導的プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそこでコードされるポリペプチドに、通常、組み換えポリペプチドのアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的に、３つの目的を供する：（１）組み換えポリペプチドの発現を増加させること；（２）組み換えポリペプチドの溶解性を増加させること；および（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組み換えポリペプチドを精製すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が融合部分と組み換えポリペプチドの接合部に導入される。これは、融合ポリペプチドの精製後に組み換えポリペプチドの融合部分からの分離を可能にする。かかる酵素、およびそれらの同種認識配列の例は、因子Ｘａ、スロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、pGEX（Pharmacia Biotech Inc; Smith et al, Gene (1988) 67:31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）、およびpRITS（Pharmacia, Piscataway, N. J.）を含み、それらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡそれぞれを標的組み換えポリペプチドに融合するものである。
【０１９９】
誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例は、pTrc（Amann et al, Gene (1988) 69:301-315)およびpET 11d（Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）を含む。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（T7 gn1）により介在されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下にあるT7gn1遺伝子を保有する固有のλプロファージに由来する宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により供給される。
【０２００】
組み換えポリペプチド発現を最大にする１つのストラテジーは、組み換えポリペプチドをタンパク質分解切断する能力を欠失した宿主細胞においてポリペプチドを発現させることである（Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128参照のこと)。別のストラテジーは、発現ベクターに挿入される核酸配列を、各アミノ酸に対する各コドンが宿主細胞で選択的に利用されるものに変えることである（Wada et al, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118）。核酸配列のかかる変化は、一般的ＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【０２０１】
別の具体例において、宿主細胞は酵母細胞である。この具体例において、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例は、pYepSec1（Baldari et al, EMBO J. (1987) 6:229-234）、pMFa（Kurjan et al, Cell (1982) 30:933-943）、pJRY88（Schultz et al, Gene (1987) 54:113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif）、およびpicZ（Invitrogen Corp, San Diego, Calif）を含む。
【０２０２】
代替的に、本明細書に記載されるポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現され得る。培養される昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現のためのバキュロウイルスベクターは、例えば、pAc系（Smith et ah, MoI. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165)およびpVL系（Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39）を含む。
【０２０３】
なお別の具体例において、本明細書に記載される核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞において発現され得る。哺乳類発現ベクターの例は、pCDM8（Seed, Nature (1987) 329:840）およびpMT2PC（Kaufman et ah, EMBO J. (1987) 6:187-195）を含む。哺乳類細胞で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントにより提供することができる。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。その他の原核生物および真核生物の両方の細胞に適する発現システムは、Sambrookら編Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989のチャプター１６および１７に記載される。
【０２０４】
ベクターは、慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物または真核生物の細胞に導入されうる。本明細書で用いられるように、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外部の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認知されている技術を意味し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに適する方法は、例えば、Sambrookら（上述）にて見出すことができる。
【０２０５】
細菌細胞の安定な形質転換に関して、用いられる発現ベクターおよび形質転換技術に応じて、ほんのわずかなフラクションの細胞が発現ベクターを利用し、複製することが知られている。これらの形質転換体を同定し、選択するために、選択マーカー（抗生物質に対して耐性）をコードする遺伝子は、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入され得る。選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの薬剤に対して耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするものと同一のベクターの宿主細胞に導入されうるか、または別々のベクターに導入されうる。導入される核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込まれた細胞が生き残るが、一方でその他の細胞は死滅する）。
【０２０６】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションに関して、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ほんのわずかなフラクションの細胞が外部のＤＮＡをそれらのゲノムに組み込みうることが知られている。これらの組み込み体を同定し、選択するために、選択マーカー（抗生物質に対して耐性）をコードする遺伝子が目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入され得る。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬剤に対して耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするものと同一のベクターの宿主細胞に導入されうるか、または別々のベクターに導入されうる。導入される核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込まれた細胞が生き残るが、一方でその他の細胞は死滅する）。
【０２０７】
一定の方法において、アルデヒド生合成ポリペプチドおよびアルカンまたはアルケン生合成ポリペプチドは、単一の宿主細胞において共発現される。代替的な方法において、アルデヒド生合成ポリペプチドおよびアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドが単一の宿主細胞において共発現される。
【０２０８】
輸送タンパク質
輸送タンパク質は、宿主細胞の外へポリペプチドおよび炭化水素（例えば、アルデヒド、アルカン、および／またはアルケン）を運び出すことができる。多くの輸送および流出タンパク質は、様々な化合物の分泌を提供し、特定のタイプの炭化水素に選択的に天然で修飾され得る。
【０２０９】
適する輸送タンパク質の非限定的な例は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送タンパク質、流出タンパク質、および脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ）である。適する輸送タンパク質のさらなる例は、Caenorhabditis elegans、Arabidopsis thalania、Alkaligenes eutrophus、およびRhodococcus erythropolisなどの生物に由来するＡＢＣ輸送タンパク質を含む。用いることができる典型的なＡＢＣ輸送タンパク質は、図４０に記載される（例えば、CER5、AtMRP5、AmiS2、およびAtPGP1）。宿主細胞はまた、炭化水素を分泌する内在性の能力について選択され得る。宿主細胞環境（例えば、培養培地、発酵ブロス）への炭化水素の生成および分泌の効率は、細胞内産物の細胞外産物への割合として表すことができる。いくつかの例において、割合は、約５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
【０２１０】
発酵
アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンの生成および単離は、有益な発酵技術を採用することにより高めることができる。生成を最大にするが、コストを抑える１つの方法は、炭化水素生成物に変換される炭素源の割合を増加させることである。
【０２１１】
通常の細胞のライフサイクルでは、炭素は、脂質、糖、タンパク質、有機酸、および核酸を生成するなどの細胞機能で用いられる。増殖に関連する活性に必要な炭素量の減少は、炭素源の生成物への変換効率を増加させることができる。これは、例えば、最初に宿主細胞を所望の密度（例えば、増殖の対数期のピークに達する密度）まで増殖させることにより達成することができる。かかる時点において、複製チェックポイント遺伝子は、細胞の増殖を停止するのに利用され得る。特に、（Camilli et al., Science 311 :1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006；および Reading et al., FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11, 2006で総説される）クオラムセンシングメカニズムは、ｐ５３、ｐ２１、またはその他のチェックポイント遺伝子などチェックポイント遺伝子を活性化するのに用いることができる。
【０２１２】
大腸菌における細胞複製および増殖を停止するのに活性化され得る遺伝子は、umuDC遺伝子を含む。umuDC遺伝子の過剰発現は、定常期から対数期への進行を停止する（Murli et al, J. ofBact. 182:1127, 2000）。UmuCは、ほとんどのＵＶおよび化学変異原誘発の基本メカニズムである非コード損傷に対する損傷乗り越え合成を実行することができるＤＮＡポリメラーゼである。umuDC遺伝子産物は、損傷乗り越え合成のプロセスに関わり、ＤＮＡ配列損傷チェックポイントとしても提供される。umuDC遺伝子産物は、UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2、およびUmuD2を含む。同時に、産物を生成する遺伝子が活性化され、それにより用いられる複製および維持経路の必要性を最小にする一方で、アルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンが作り出されうる。宿主細胞はまた、prpBCDEプロモーター系のもとで、適当な最終産物生成遺伝子を有するこの遺伝子のデノボ合成を介してpBAD24の大腸菌に由来するumuCおよびumuDを発現させるように改変されうる。
【０２１３】
アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンに変換される入力炭素の割合は、コスト推進要因であり得る。プロセスが効率的であればあるほど（すなわち、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンに変換される入力炭素の割合が高いほど）、そのプロセスは費用がかからなくなる。酸素を含有する炭素源（例えば、グルコースおよびその他の炭水化物に基づく供給源）に関して、酸素は、二酸化炭素の形で遊離されなければならない。毎回遊離される２つの酸素原子において、炭素源はまた、（脂肪酸誘導生成物について）約３４％（ｗ／ｗ）の最大理論代謝効率を生じて遊離される。しかしながら、この数値は、他の炭化水素生成物および炭素源において変化する。文献における典型的な効率は、だいたい５％より低い。アルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンを生成するように改変された宿主細胞は、約１、３、５、１０、１５、２０、２５、および３０％より高い効率を有しうる。１の例において、宿主細胞は、約１０％から約２５％の効率を示すことができる。別の例において、かかる宿主細胞は、約２５％から約３０％の効率を示すことができる。別の例において、宿主細胞は、３０％より高い効率を示すことができる。
【０２１４】
宿主細胞は、さらに、ＰＣＴ出願番号PCT/US2007/003736に記載されるごとく、組み換えセルロソームを発現させるように改変することができる。これらのセルロソームは、宿主細胞に、炭素源としてセルロース物質を用いることを可能にしうる。例えば、宿主細胞は、スクロースが炭素源として用いることができるように、インベルターゼ（EC3.2.1.26）を発現するようにさらに改変されうる。同様に、宿主細胞は、宿主細胞が効率的に炭素を同化し、炭素源としてセルロース物質を用いることができるように、米国特許番号5,000,000；5,028,539；5,424,202；5,482,846；および5,602,030を用いて改変され得る。
【０２１５】
１の例において、発酵室は、連続還元を受けている発酵物を囲い込むことができる。この例において、安定な還元環境が作り出されうる。電子バランスは、二酸化炭素の（ガス形態での）遊離により維持され得る。ＮＡＤ／ＨおよびＮＡＤＰ／Ｈバランスを増加させる試みはまた、電子バランスの安定化を促進する。細胞内ＮＡＤＰＨの有効性はまた、宿主細胞をＮＡＤＨ：ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼを発現するように改変することにより高めることができる。１つまたはそれ以上のＮＡＤＨ：ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼの発現は、解糖系で生成されるＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換し、アルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンの生成を高めることができる。
【０２１６】
小規模の生成に関して、改変された宿主細胞は、例えば、約１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、または１０Ｌのバッチで増殖され；発酵され；次いで、誘導されて、適当なプラスミドにおいてコードされる特異的な遺伝子に基づいて所望のアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンが発現されうる。（アンピシリン耐性およびアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、またはアルケン合成経路を有する）pBAD24を保有する大腸菌 BL21（DE3）細胞ならびに（カナマイシン耐性およびアセチルＣｏＡ／マロニルＣｏＡ過剰発現系を有する）pUMVC1は、７５μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した５００ｍＬ  ＬＢ培地中で＞２００ｒｐｍで振蘯させながら、培地が＞０．８のＯＤ６００に達するまで、２Ｌ  フラスコで３７℃において一晩インキュベートされ得る。＞０．８のＯＤ６００に達したら、細胞は、２５ｍＭ  プロピオン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を添加することにより生成のために改変された遺伝子システムが活性化され、UmuCおよびUmuDタンパク質を活性化することにより細胞増殖が停止され得る。誘導は、３０℃で６時間行われうる。インキュベーション後、培地は、ＧＣ−ＭＳを用いてアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンについて試験されうる。
【０２１７】
大規模の生成に関して、改変された宿主細胞は、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、またはそれ以上のバッチで増殖され；発酵され；誘導されて、適当なプラスミドにおいてコードされる特異的な遺伝子に基づいて所望のアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンが発現されうる。（アンピシリン耐性およびアルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、またはアルケン合成経路を有する）pBAD24を保有する大腸菌 BL21（DE3）細胞ならびに（カナマイシン耐性およびアセチルＣｏＡ／マロニルＣｏＡ過剰発現系を有する）pUMVC1は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび７５μｇ／ｍＬのアンピシリンを有するＬＢ培地（グリセロールなし）中で１０Ｌ発酵に対して５００ｍＬ（１００Ｌ発酵に対して５Ｌなど）の種培養からインキュベートし、培地が＞０．８のＯＤ６００に達するまで（典型的には１６時間）、＞２００ｒｐｍで振蘯されうる。培地が２５ｍＭ  プロピオン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を維持するように継続的に添加されることにより生成のために改変された遺伝子系が活性化され、umuCおよびumuDタンパク質を活性化することにより細胞増殖が停止されうる。培地がグルコースと一緒に添加されて濃度２５ｇ／１００ｍＬが維持され得る。
【０２１８】
最初の誘導後、合計の細胞体積の１０％より少ないアリコートが毎時間回収され、撹拌することなく静置することによりアルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンを表面に生じさせ、自然に生じる層の分離を起こさせることができる。次いで、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケン成分が収集され得、水相が反応チャンバーに返される。反応チャンバーは、継続的に操作されうる。ＯＤ６００が０．６以下に落ちると、細胞は、種培養から増殖された新しいバッチに置き換えられ得る。
【０２１９】
細胞を含まない方法を用いるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよびアルケンの生成
本明細書に記載されるいくつかの方法において、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、本明細書に記載される精製されたポリペプチドおよび本明細書に記載される基質を用いて生成され得る。例えば、宿主細胞は、本明細書に記載されるごとくアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／または生合成ポリペプチドまたは変異体を発現するように改変され得る。宿主細胞は、ポリペプチドの発現を可能にするのに適する条件下で培養され得る。次に、細胞を含まない抽出物は、公知の方法を用いて作成され得る。例えば、宿主細胞は、界面活性剤を用いて、または超音波処理により溶解され得る。発現されたポリペプチドは、公知の方法を用いて精製され得る。細胞を含まない抽出物を得た後、本明細書に記載される基質は、細胞を含まない抽出物に添加され、基質のアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンへの変換を可能にする条件下で維持され得る。次いで、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、公知の技術を用いて分離され、精製され得る。
【０２２０】
生成後プロセッシング
発酵の間に生成されたアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、発酵培地から分離され得る。アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを水性培地から分離するためのいずれかの公知な技術が用いられ得る。１つの典型的な分離プロセスは、二相（二相性）分離プロセスである。このプロセスは、遺伝学的に改変された宿主細胞を、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを生成するのに十分な条件下で発酵させ、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを有機相において収集できるようにし、有機相を発酵ブロスから分離することに関する。この方法は、バッチおよび継続的な発酵環境の両方で実施され得る。
【０２２１】
二相分離は、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンの相対的な非混和性を利用して分離を促進する。非混和性は、水に溶解する化合物の相対的不能を意味し、化合物の分配係数により定義される。当業者は、発酵ブロスおよび有機相を選択することにより、生成されるアルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンは高いｌｏｇＰ置を示すように、アルデヒド、アルカンおよび／またはアルケンは、発酵管において非常に低い濃度でされ、有機相に分離することができる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法により生成されたアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、発酵ブロスならびに細胞質において相対的に混和し得ない。それゆえ、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、細胞内または細胞外のいずれかで有機相において収集することができる。有機相中の生成物の収集は、細胞機能におけるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンの影響を弱めることができ、宿主細胞をより多くの生成物を生成することを可能にする。
【０２２３】
本明細書に記載される方法は、均一な化合物を生成することができ、生成されたアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンの少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、約６個の炭素より少なく、約４個の炭素より少なく、あるいは約２個の炭素より少なく異なる炭素鎖の長さを有する。これらの化合物はまた、飽和の比較的均一な程度で生成され得る。これらの化合物は、燃料、燃料添加剤、特殊化学製品、その他の化学化合物（例えば、ポリマー、界面活性剤、プラスティック、繊維、溶媒、接着剤など）の生成のための出発物質、またはパーソナルケア製品添加物として直接用いることができる。これらの化合物はまた、その他の製品を作り出すための後の反応、例えば、水素化、（水素化、熱分解、またはその両方を介する）接触分解のための原料として用いることができる。
【０２２４】
いくつかの具体例において、本明細書に記載される方法を用いて生成されたアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、約５０％から約９０％の炭素；または約５％から約２５％の水素を含み得る。その他の具体例において、本明細書に記載される方法を用いて生成されたアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、約６５％から約８５％の炭素；または約１０％から約１５％の水素を含み得る。
【０２２５】
燃料組成物および特殊化学化合物
本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、燃料として用いられ得るかまたは変換され得るか、あるいは特殊化学製品として用いられ得る。当業者は、燃料または特殊化学製品の用途に応じて、異なるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンが生成され、用いられ得ると評価するであろう。例えば、分岐アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、寒冷気候で用いられることが意図される自動車燃料において所望され得る。さらに、本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンが燃料または特殊化学製品の原料として用いられる場合、当業者は、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケン原料の特徴が生成される燃料または特殊化学製品の特徴に影響すると評価するであろう。それゆえ、燃料または特殊化学製品の特徴は、原料としての用途のための特定のアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを生成することにより選択され得る。
【０２２６】
本明細書に記載される方法を用いて、所望される燃料の品質を有するバイオ燃料は、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンから生成され得る。生物学的に生成されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、ジェット燃料、ディーゼル、またはガソリンとして用いることができるバイオ燃料の新しい供給源を示す。アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを用いて作り出されたいくつかのバイオ燃料は、再生可能な供給源から生成されるものではなく、新しい組成物に関するものである。これらの新しい燃料または特殊化学製品は、二重炭素同位体フィンガープリンティング（dual carbon-isotopic fingerprinting）を基にする石油化学の炭素に由来する燃料または特殊化学製品とは区別され得る。さらに、生物を起源とする炭素の特殊な供給源（例えば、グルコース対グリセロール）は、二重炭素同位体フィンガープリンティングにより調べることができる（例えば、米国特許第716588号、特に、第４欄第３１行目から第６欄第８行目参照のこと）。
【０２２７】
アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケン、ならびに関連するバイオ燃料、特殊化学製品、および混合物は、１４Ｃ（ｆＭ）および二重炭素同位体フィンガープリンティングに基づいて石油化学に由来する同等物とは区別され得る。いくつかの例において、バイオ燃料組成物中のアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、例えば、少なくとも約１．００３、１．０１０、または１．５のわずかな標準（modern）炭素（ｆＭ１４Ｃ）を示しうる。
【０２２８】
いくつかの例において、バイオ燃料組成物は、約−１５．４から約−１０．９のδ１３Ｃを有するアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンを含んで作られ、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、組成物中で生物を起源とする（すなわち、バイオマス、セルロース物質および糖などの再生可能な供給源に由来する）原料の少なくとも約８５％の割合を占める。
【０２２９】
これらの生物に由来する製品を区別する能力は、商業目的のためにこれらの物質を追跡する際に利益的である。例えば、生物に由来する炭素と石油に基づく炭素の同位体プロファイルの両方を含む燃料または特殊化学製品は、石油に基づく物質のみからなる燃料および特殊化学製品とは区別され得る。それゆえ、本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、それらの独特のプロファイルに基づいてバイオ燃料として、商業目的に従うか、または商業目的に同定され得る。さらに、その他の競合する物質は、生物に由来するもの、または石油化学供給源に由来するものとして同定され得る。
【０２３０】
燃料添加物は、燃料またはエンジンの性能を高めるために用いられる。例えば、石油添加物は、凝固／ゲル化点、曇り点、潤滑性、粘度、酸化安定度、発火性、オクタンレベル、および／または引火点を変化させるのに用いることができる。アメリカ合衆国では、全ての燃料添加物は、環境保護庁で登録されなければならない。燃料添加物を販売する燃料添加物および会社の名称は、ＥＰＡに連絡することにより、あるいは庁のウェブサイトを閲覧することにより公的に利用可能である。当業者は、本明細書に記載されるアルデヒド−および／またはアルカン−に基づくバイオ燃料が１つまたはそれ以上の燃料添加物と混合されて所望の品質が授けられ得ることを評価するであろう。
【０２３１】
本明細書に記載されるアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンおよび／またはアルケンは、エタノールおよびブタノールなどの様々なアルコールのごときその他の燃料、ならびに、ガソリン、ディーゼル、またはジェット燃料のごとき石油に基づく生成物と混合され得る。
【０２３２】
いくつかの例において、混合物は、アルデヒド、脂肪アルコール、アルカンまたはアルケンの少なくとも約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約３０重量％、約４０重量％、約５０重量％、または約６０重量％を含むことができる。別の例において、バイオ燃料組成物は、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個の炭素の長さである炭素鎖を含むアルデヒド、脂肪アルコール、アルカンまたはアルケンの少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％を含んで調製され得る。かかるバイオ燃料組成物は、さらに、曇り点を約５℃または０℃より低下させることができる曇り点低下剤；界面活性剤；マイクロエマルション；トリグリセリドに由来する少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のディーゼル燃料；石油に由来するガソリン；あるいは石油に由来するディーゼル燃料から選択される少なくとも１つの添加剤を含むことができる。
【実施例】
【０２３３】
本発明を以下の実施例にてさらに説明するが、実施例は特許請求の範囲記載の本願発明の範囲を限定するものではない。
【０２３４】
実施例１．選択されたラン藻類でのアルカン生合成の検出および検証
７つのラン藻類（その完全ゲノム配列は公的に利用可能である）をアルカン生合成の検出および検証のために選択した:Synechococcus elongatus PCC7942、Synechococcus elongatus PCC6301、Anabaena variabilis ATCC29413、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC73102、Gloeobacter violaceus ATCC 29082、およびProchlorococcus marinus CCMP1986。このリストのはじめの３つのラン藻株のみ、アルカンを含むことが報告されていた（Han et al., J. Am. Chem. Soc. 91:5156-5159 （1969）；Fehler et al., Biochem. 9:418-422（1970））。株は、振盪フラスコ中、１００ｍＬの適切な培地（表８に列挙する）にて、３〜７日間、３０℃、約３，５００ルクスの高度で光独立栄養的に増殖させた。細胞をアルカン検出について以下のとおり抽出した：  １ｍＬの培養体積由来の細胞を、１分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞ペレットをメタノールに再懸濁し、１分間ボルテックスし、次いで、３０分間超音波処理した。３分間、１３，０００ｒｐｍでの遠心分離の後で、上清を新たなバイアルに移し、ＧＣ−ＭＳによって分析した。サンプルを３０ｍ  ＤＰ−５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍの内径）または３０ｍ  高温ＤＰ−５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍの内径）にて、以下の方法を使用して分析した。
【０２３５】
ＧＣ／ＭＳカラムへの１μＬのスプリットレス注入（３００℃に保たれた注入口温度）の後で、オーブンを１００℃で３分間保持した。温度を３２０℃まで２０℃／分の速度で上昇させた。オーブンを３２０℃でさらに５分間保持した。担体ガスヘリウムの流速は１．３ｍＬ／分であった。ＭＳ四極子を５０〜５５０ｍ／ｚからスキャンした。産物のピークの保持時間および断片化パターンを標品と比較して、ピークの同一性を確認した。
【０２３６】
７つの株のうち、６つがヘプタデカンを主に生じ、および１つ（P. marinus CCMP1986）はペンタデカンを生じ;これらの株のうち１つは、メチル-ヘプタデカンをヘプタデカンと一緒に生じた（A.variabilis ATCC29413）（表8を参照のこと）。したがって、従来報告されていた３つのラン藻におけるアルカン生合成を検証し、およびアルカン生じることが従来知られていなかった４つのラン藻類にてアルカン生合成を検出した: P. marinus  CCMP1986（図１を参照のこと）、N.punctiforme PCC73102（図２を参照のこと）、G.violaceus  ATCC 29082（図３を参照のこと）およびSynechocystis sp. PCC6803（図４を参照のこと）。
【０２３７】
図１Ａが、メタノール中で抽出したProchlorococcus marinus CCMP1986細胞のＧＣ／ＭＳトレースを示す。７．５５分でのピークは、ペンタデカン（Sigma）と同じ保持時間を有した。図１Ｂにて、ペンタデカンピークの質量断片化パターンを示す。２１２のピークは、ペンタデカンの分子量に対応する。
【０２３８】
図２Ａは、メタノールで抽出したNostoc punctiforme PCC73102細胞のＧＣ／ＭＳトレースを示す。８．７３分でのピークは、ヘプタデカン（Sigma）と同じ保持時間を有した。図２Ｂでは、ヘプタデカンピークの質量断片化パターンを示す。２４０のピークはヘプタデカンの分子量に対応する。
【０２３９】
図３Ａは、メタノールで抽出したGloeobacter violaceus ATCC29082細胞のＧＣ／ＭＳトレースを示す。８．７２分でのピークは、ヘプタデカン（Sigma）と同じ保持時間を有した。図３Ｂにて、ヘプタデカンピークの質量断片化パターンを示す。２４０のピークは、ヘプタデカンの分子量に対応する。
【０２４０】
図４Ａは、メタノールで抽出したSynechocystic sp. PCC6803細胞のＧＣ／ＭＳトレースを示す。７．３６分でのピークは、ヘプタデカン（Sigma）と同じ保持時間を有した。図４Ｂにて、ヘプタデカンピークの質量断片化パターンを示す。２４０のピークはヘプタデカンの分子量に対応する。
【０２４１】
【表８】
2011522525.tif 000010
【０２４２】
ゲノム分析によってアルカン産生株にて存在した２つの遺伝子が得られた。これらの遺伝子のSynechococcus elongatus PCC7942ホモログを表９に示し、それぞれSynpcc7942_1593（配列番号１）およびSynpcc7942_1594（配列番号６５）である。
【０２４３】
【表９】
2011522525.tif 000011
【０２４４】
実施例２．Synechocystis sp. PCC6803におけるsll0208およびsll0209遺伝子の欠失は、アルカン生合成の消失をもたらす。
Synechocystis sp. PCC6803の推定上のデカルボニラーゼ（sll0208; NP_442147）（配列番号３）およびアルデヒド産生酵素（sll0209; NP_442146）（配列番号６７）をコードする遺伝子を、以下のとおり欠失させた。ＤＮＡに隣接する上流および下流の約１ｋｂを、プライマーsll0208/9-KO1（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＴ）をプライマーsll0208/9-KO2（ＣＡＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧＴＴＣＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＡＣＡＧＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧ）と一緒に、およびプライマーsll0208/9-KO3（ＧＴＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＡＧＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧ−ＣＧＴＧＴ）をプライマーsll0208/9-KO4（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＧＧ）と一緒にそれぞれ使用して、増幅した。ＰＣＲ産物をクロスオーバーＰＣＲにてプライマーsll0208/9-KO1およびsll0208/9-KO4と一緒に使用して、約２ｋｂのsll0208/sll0209欠失カセットを増幅して、クローニングベクター pUC19のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。次いで、カナマイシン抵抗性カセット（aph、KanR）を、プラスミドｐＲＬ２７（Larsen et al., Arch. Microbiol. 178:193 （2002））からプライマーKan-aph-F（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧ）およびKan-aph-R（ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡ）を使用して増幅して、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを用いて切断し、sll0208/sll0209欠失カセットのＮｃｏＩおよびＡｖｒＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１９中にsll0208/sll0209-欠失KanR-挿入カセットを作製した。カセットを含むベクター（ラン藻類にて複製しない）をSynechocystis sp. PCC6803に形質転換し（Zang et al., 2007, J. Microbiol., vol. 45, pp. 241）、形質転換体（例えば、二重の相同組換えによる染色体組込み体）を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＢＧ−１１寒天プレートにて、光源を備えた３０℃のインキュベーターにて選択した。カナマイシン抵抗性のクローンを再度ストリークし、次いで診断用のプライマーを用いたＰＣＲを使用する遺伝子型分析に供した。
【０２４５】
確認された欠失−挿入変異体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１２ｍＬのＢＧ１１培地にて、４日間、３０℃で、光源を備えた振盪インキュベーターでインキュベートした。次いで、１ｍＬのブロスを遠心分離（１分間、１３，０００ｇで）し、細胞ペレットを０．１ｍＬのメタノールで抽出した。抽出後に、サンプルを再度遠心分離し、上清を実施例１に記載するＧＣ−ＭＳ分析に供した。
【０２４６】
図５に示すように、sll0208およびsll0209遺伝子を欠失させたSynechocystis sp. PCC6803株は、ヘプタデセンおよびオクタデセナールを産生する能力を失っていた。この結果は、Synechocystis sp. PCC6803におけるsll0208およびsll0209遺伝子、ならびに他のラン藻類におけるオルソロガス遺伝子（表１を参照のこと）が、これらの生物におけるアルカンおよび脂肪アルデヒド生合成の原因であることを示す。
【０２４７】
実施例３．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594の異種発現による大腸菌での脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールの産生
Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594（YP_400611；推定上のアルデヒド産生酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-80（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。得られた構築物（「OP80-PCC7942_1594」）を大腸菌MG1655に形質転換して、細胞を３７℃で、１％（ｗ／ｖ）グルコースを炭素源として含み、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンが補充されたＭ９最少培地にて増殖させた。培養物が０．８〜１．０のＯＤ６００に達した時、１ｍＭ  ＩＰＴＧでそれを誘導し、細胞をさらに１８〜２０時間、３７℃で増殖させた。０．５ｍＬの培養物由来の細胞を０．５ｍＬの酢酸エチルで抽出した。６０分間の超音波処理の後で、サンプルを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒層を実施例１に記載するＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２４８】
図６に示すように、Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594を有するベクターで形質転換した大腸菌細胞は、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じた: ヘキサデカナール、オクタデセナール、テトラデセノール、ヘキサデセノール、ヘキサデカノールおよびオクタデセノール。この結果は、PCC7942 orf159４は、（ｉ）アルデヒドをインビボで脱カルボニルの考え得る基質生じ、および（ｉｉ）野生型大腸菌細胞における最も豊富な形態の活性化脂肪酸であるアシル−ＡＣＰを基質として還元することを示す。そのため、酵素をアシル−ＡＣＰ還元酵素と名付けた。インビボにて、脂肪アルデヒドは、明らかに、内在性の大腸菌アルデヒド還元酵素活性によって対応する脂肪アルコールにさらに還元されている。
【０２４９】
実施例４．Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430の異種発現による大腸菌における脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールの産生
Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430（YP_001802846; 推定上のアルデヒド産生酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号69）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御化のベクターOP-80  （pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。得られた構築物を大腸菌ＭＧ１６５５に形質転換し、細胞を３７℃で、１％（ｗ／ｖ）グルコースを炭素源として含み、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンが補充されたＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載するＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２５０】
図７に示すように、Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430を有するベクターで形質転換した大腸菌細胞は、以下の脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを産生した:ヘキサデカナール、オクタデセナール、テトラデセノール、ヘキサデセノール、ヘキサデカノールおよびオクタデセノール。この結果は、ATCC51142 cce_1430が、（ｉ）インビボにてアルデヒドを脱カルボニルについての考え得る基質として生じ、（ｉｉ）野生型大腸菌細胞における最も豊富な形態の活性化脂肪酸であるアシル−ＡＣＰを基質として還元することを示す。そのため、この酵素はまた、アシル−ＡＣＰ還元酵素である。
【０２５１】
実施例５．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびSynechococcus elongatus PCC7942 orf1593の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Synechococcus elongatus PCC7942 orf1593（YP_400610;推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号1）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクター  OP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をＯＰ８０−ＰＣＣ７９４２＿１５９４と一緒に大腸菌ＭＧ１６５５に同時形質転換して、細胞を３７℃で１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３のように細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２５２】
図８に示すように、S.elongatus PCC7942_1594およびS. elongatusPCC7942_1593を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載するような脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じたが、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌でのPCC7942_1593がヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、そのため、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２５３】
実施例６．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびNostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Nostoc punctiformePCC73102 Npun02004178（ZP_00108838；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号５）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２５４】
図９に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびN. punctiforme PCC73102 Npun02004178を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンを生じた。この結果は、大腸菌でのNpun02004178が、テトラデカナール、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをトリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２５５】
実施例７．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびSynechocystis sp. PCC6803 sll0208の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Synechocystis sp. PCC6803 sll0208（NP_442147；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号３）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２５６】
図１０に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびSynechocystis sp. PCC6803 sll0208を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるNpun02004178が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２５７】
実施例８．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびNostoc sp. PCC7210 alr5283の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Nostoc sp. PCC7210 alr5283（NP_489323；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号7）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し。細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２５８】
図１１に示しように、S. elongatus PCC7942_1594およびNostoc sp. PCC7210 alr5283を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンを生じた。この結果は、大腸菌におけるalr5283がヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２５９】
実施例９．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびAcaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041（YP_001518340；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号9）をコードするゲノムＤＮＡのコドンを、大腸菌での発現のために最適化し（配列番号４６）、合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２６０】
図１２に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびA.marina MBIC11017 AM1_4041を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンを生じた。この結果は、大腸菌におけるAM1_4041が、テトラデカナール、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをトリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２６１】
実施例１０.Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびThermosynechococcus elongatus BP-1 tll1313の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Thermosynechococcus elongatus BP-1 tll1313（NP_682103；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号１１）のゲノムＤＮＡのコドンを大腸菌での発現のために最適化し（配列番号４７）、合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２６２】
図１３に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびT. elongatus BP-1 tll1313を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるtll1313が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２６３】
実施例１１．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびSynechococcus sp. JA-3-3Ab CYA_0415の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Synechococcus sp. JA-3-3Ab CYA_0415（YP_473897；推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号１３）のコドンを大腸菌での発現のために最適化し（配列番号４８）合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクター  OP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２６４】
図１４に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびSynechococcus sp. JA-3-3Ab CYA_0415を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載するもの同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるNpun02004178が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２６５】
実施例１２．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびGloeobacter violaceus PCC7421 gll3146の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Gloeobacter violaceus PCC7421 gll3146（NP_926092；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号１５）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２６６】
図１５に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびG. violaceus PCC7421 gll3146を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例３に示すものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるgll3146がヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２６７】
実施例１３．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびProchlorococcus marinus MIT9313 PMT1231の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231（NP_895059；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号１７）をコードするゲノムＤＮＡのコドンを大腸菌での発現のために最適化し（配列番号４９）、合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２６８】
図１６に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびP.marinus MIT9313 PMT1231を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるPMT1231がヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２６９】
実施例１４．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびProchlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532（NP_892650；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号１９）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594を用いて大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２７０】
図１７に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびP. marinus CCMP1986 PMM0532を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるPMM0532が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２７１】
実施例１５．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびProchlorococcus mariunus NATL2A PMN2A_1863の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Prochlorococcus mariunus NATL2A PMN2A_1863（YP_293054；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号２１）をコードするゲノムＤＮＡのコドンを大腸菌での発現のために最適化し（配列番号５１）、合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌 MＧ１６５５に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２７２】
図１８に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびP. mariunus NATL2A PMN2A_1863を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例３に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるPMN2A_1863が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒド デカルボニラーゼであることを示す。
【０２７３】
実施例１６．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびSynechococcus sp. RS9917 RS9917_09941の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Synechococcus sp. RS9917 RS9917_09941（ZP_01079772;推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号２３）をコードするゲノムＤＮＡのコドンを大腸菌での発現のために最適化し（配列番号５２）、合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２７４】
図１９に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびSynechococcus sp. RS9917 RS9917_09941を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるRS9917_09941が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２７５】
実施例１７．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびSynechococcus sp. RS9917 RS9917_12945の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Synechococcus sp. RS9917 RS9917_12945（ZP_01080370；推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号２５）のコドンを大腸菌（配列番号５３）での発現のために最適化し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に形質転換し、細胞を３７℃で１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増幅させた。実施例３に記載のように、細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２７６】
図２０に示すように、S.elongatus PCC7942_1594およびSynechococcus sp. RS9917 RS9917_12945を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒド脂肪アルコールを生じ、また、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるRS9917_12945が、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２７７】
実施例１８．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびCyanothece sp. ATCC51142 cce_0778の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Cyanothece sp. ATCC51142 cce_0778（YP_001802195；推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号２７）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２７８】
図２１に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびCyanothece sp. ATCC51142 cce_0778を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるATCC51142 cce_0778が、テトラデカナール、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをトリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンをそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２７９】
実施例１９．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびCyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_0398の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_0398（YP_002481151；推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号２９）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２８０】
図２２に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびCyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_0398を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるCyan7425_0398が、テトラデカナール、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをトリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよび ヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２８１】
実施例２０．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびCyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986（YP_002483683；推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号３１）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655に同時形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２８２】
図２３に示すように、S.elongatus PCC7942_1594およびCyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、実施例3に記載のものと同じ脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じ、また、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンも生じた。この結果は、大腸菌におけるCyan7425_2986が、テトラデカナール、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールをトリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンにそれぞれ変換し、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼであることを示す。
【０２８３】
実施例２１．Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533およびProchlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
P.mariunus CCMP1986 PMM0533（NP_892651；推定上のアルデヒド産生酵素）（配列番号７１）およびProchlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532（NP_892650；推定上のデカルボニラーゼ）（配列番号１９）をコードするゲノムＤＮＡを増幅し、ベクター  OP-80のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位およびベクターOP-183のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にそれぞれクローニングした。得られた構築物を別々におよび同時に大腸菌ＭＧ１６５５に形質転換し、細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２８４】
図２４Ａに示すように、P.mariunus CCMP1986 PMM0533を有するベクターでのみ形質転換した大腸菌細胞は、いずれの脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールも生じなかった。しかしながら、PMM0533およびPMM0532を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、ヘキサデカノール、ペンタデカンおよびヘプタデセンを生じた（図２４Ｂ）。この結果は、PMM0533は、PMM0532などのデカルボニラーゼと相互作用した場合、脱カルボニル反応のための脂肪アルデヒド基質を提供するのみであることを示す。
【０２８５】
実施例２２．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびAcaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041の異種発現による脂肪アシル-ＣｏＡ-産生大腸菌株におけるアルカンおよびアルケンの産生
Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041（YP_001518340；推定上の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号９）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物をOP80-PCC7942_1594と一緒に大腸菌MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadDに同時形質転換した。この株は、大腸菌チオエステラーゼの細胞質バージョン、‘TesA、および大腸菌アシル-ＣｏＡシンセターゼ、FadDをＰｔｒｃプロモーター制御下で発現し、そのため、脂肪アシル-ＣｏＡを生じる。細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２８６】
図２５に示すように、S. elongatus PCC7942_1594およびA. marina MBIC11017 AM1_4041で同時形質転換した大腸菌細胞もまた、アルカンおよび脂肪アルコールを生じた。この結果は、S. elongatus PCC7942_1594がアシル-ＣｏＡを基質として使用して、ヘキサデセナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールを生じ、これらの物質は次いでペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセンにA. marina MBIC11017 AM1_4041によってそれぞれ変換されることを示す。
【０２８７】
実施例２３．Synechocystis sp. PCC6803 sll0209およびSynechocystis sp. PCC6803 sll0208の異種発現による脂肪アシル-ＣｏＡ産生大腸菌株におけるアルカンおよび アルケンの産生
Synechocystis sp. PCC6803 sll0208（NP_442147；推定上の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号３）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。Synechocystis sp. PCC6803 sll0209（NP_442146；アシル-ACP還元酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６７）を合成し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。得られた構築物を大腸菌MG1655 ΔfadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadDに一緒に同時形質転換した。この株は、大腸菌チオエステラーゼの細胞質バージョン、‘TesA、および大腸菌アシル-ＣｏＡシンセターゼ、FadDをＰｔｒｃプロモーター制御下で発現し、そのため、脂肪アシル-ＣｏＡを生じる。細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例２６に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２８８】
図２６に示すように、Synechocystis sp. PCC6803 sll0209で形質転換したこれらの大腸菌細胞は、いずれの脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールも生じなかった。しかしながら、Synechocystis sp. PCC6803 sll0208およびsll0209を一緒に同時形質転換した場合、それらはアルカン、脂肪 アルデヒドおよび脂肪アルコールを生じた。この結果は、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼと一緒に同時形質転換した場合のみであるが、Synechocystis sp. PCC6803 sll0209がアシル-ＣｏＡを基質として使用して、テトラデカナール、ヘキサデカナールおよびオクタデセナールといった脂肪アルデヒドを産生し得ることを示す。脂肪アルデヒドは明らかに、内在性の大腸菌アルデヒド還元酵素活性によって、対応する脂肪アルコール、テトラデカノール、ヘキサデカノールおよびオクタデセノールにさらに還元される。この実験では、オクタデセナールがSynechocystis sp. PCC6803 sll0208によってヘプタデセンに変換された。
【０２８９】
実施例２４．Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178およびいくつかのそのホモログの異種発現による脂肪アルデヒド産生大腸菌株におけるアルカンおよびアルケンの産生
Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838；推定上の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。Mycobacterium smegmatis株MC2 155 orf MSMEG_5739（YP_889972、推定上のカルボン酸還元酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号８５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターＯＰ−１８０（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。２つの得られた 構築物を大腸菌MG1655 ΔfadD lacZ::Ptrc-‘tesAに同時形質転換した。この株において、脂肪アルデヒドが、遊離脂肪酸（‘TesAの作用によって形成される）を脂肪アルデヒドに還元するMSMEG_5739によって提供された。細胞を３７℃で、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００  μｇ／ｍＬ  カルベニシリンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出し、実施例１に記載のＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０２９０】
図２７に示すように、N. punctiformePCC73102 Npun02004178およびM. smegmatis株MC2 155 MSMEG_5739を有するベクターで同時形質転換したこれらの大腸菌細胞は、トリデカン、ペンタデセンおよびペンタデカンを生じた。この結果は、大腸菌におけるNpun02004178が、カルボン酸還元酵素MSMEG_5739によって提供されたテトラデカナール、ヘキサデセナールおよびヘキサデカナールをトリデカン、ペンタデセンおよびペンタデカンに変換することを示す。図28に示すように、同じ実験の設定において、大腸菌MG1655 ΔfadD lacZ::Ptrc-‘tesAにて発現させた場合、以下の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼもまた、MSMEG_5739によって提供された脂肪アルデヒドを対応するアルカンに変換した：Nostoc sp. PCC7210 alr5283（配列番号７）、P. mariunus CCMP1986 PMM0532（配列番号１９）、G. violaceusPCC7421 gll3146（配列番号１５）、Synechococcus sp. RS9917_09941（配列番号２３）、Synechococcus sp. RS9917_12945（配列番号２５）、およびA. marina  MBIC11017 AM1_4041（配列番号９）。
【０２９１】
実施例２５：ラン藻脂肪アルデヒドデカルボニラーゼは、非ヘム二鉄タンパク質のクラスに属する。Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178における保存されたヒスチジンのフェニルアラニンへの部位指向性変異原性は、その触媒機能を無効にする。
実施例１３にて考察したように、Prochlorococcus marinus MIT9313由来の仮定上のタンパク質PMT1231（配列番号１８）は、活性な脂肪アルデヒドデカルボニラーゼである。PMT1231の三次元構造（1.8Åの分解能で入手可能）（pdb2OC5A）（図２９Ｂを参照のこと）に基づいて、ラン藻脂肪アルデヒドデカルボニラーゼは、非ヘム二鉄タンパク質、特に、クラスＩリボヌクレアーゼ還元酵素サブユニットβタンパク質、RNRβと構造上の類似性を有する（Stubbe and Riggs-Gelasco, TIBS 1998, vol. 23., pp. 438）（図29Aを参照のこと）。クラスIaおよびIb RNRβは、ＲＮＲαの触媒活性（リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元）を媒介する二第二鉄チロシルラジカルを含む。大腸菌RNRβにおいて、このチロシンは位置１２２にあり、かつ活性な部位の鉄分子の１つにごく接近している。構造アラインメントは、PMT1231がRNRb tyr122と同じ位置にフェニルアラニンを含むことを示しラン藻脂肪アルデヒドデカルボニラーゼについての異なる触媒機構を示唆している。しかしながら、全てのデカルボニラーゼのアライメントは、２つのチロシン残基が全ての配列にて完全に保存されていることを示した（PMT1231についてtyr135およびtyr138、tyr135は活性な部位の鉄分子の１つにごく接近している（５．５Å）（図２９Ｃを参照のこと）。２つの保存されたチロシン残基のいずれかがラン藻脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの触媒機構に関与しているかどうか検討するために、Npun02004178において、以下のとおり、これらの残基をフェニルアラニンに置換した（tyr123およびtyr126）。
【０２９２】
S. elongatus PCC7942 ORF1594をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６５）を、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-80（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。また、N. punctiforme PCC73102 Npun02004178をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）をＰｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC177誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。後者の構築物をデカルボニラーゼ  タンパク質の位置１２３および１２６に変異を導入するための鋳型として使用し、プライマーｇｔｔｔｔｇｃｇａｔｃｇｃａｇｃａｔｔｔａａｃａｔｔｔａｃａｔｃｃｃｃｇｔｔｇｃｃｇａｃｇおよびｇｔｔｔｔｇｃｇａｔｃｇｃａｇｃａｔａｔａａｃａｔｔｔｔｃａｔｃｃｃｃｇｔｔｇｃｃｇａｃｇをそれぞれ使用して、チロシンをフェニルアラニンに変化させた。次いで、得られた構築物を大腸菌MG1655に形質転換した。細胞を３７℃で、１％グルコース（ｗ／ｖ）、ならびに１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよびスペクチノマイシンを補充したＭ９最少培地にて増殖させた。実施例３に記載のように細胞を培養し、抽出した。
【０２９３】
図３０に示すように、２つのNpun02004178タンパク質変異体（ＴｙｒからＰｈｅへ）は、活性なであり、S. elongatus PCC7942 ORF1594と共発現させた場合、アルカンを生じた。この結果は、クラスIaおよびIb RNRβタンパク質とは対照的に、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの触媒機構がチロシルラジカルを含まないことを示す。
【０２９４】
実施例２６：Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178の生化学的特徴付け
N. punctiforme PCC73102 Npun02004178をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）を、Ｔ７プロモーター制御下のベクターpET-15bのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られたNpun02004178タンパク質は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグを含む。大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）（Invitrogen）をプラスミドで定法の化学的形質転換技術によって形質転換した。タンパク質の発現を、大腸菌株のコロニーを５ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを補充した）にまず接種することによって実施し、一晩、３７℃で振盪し、出発培養物を得た。この出発培養物を使用して、０．５ＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン）に接種した。培養物を３７℃でＯＤ６００の値が０．８に達するまで振盪し、次いで、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭまで添加した。次いで、培養物を３７℃でさらに約３時間振盪した。次いで、培養物を２０分間、３，７００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。次いで、ペレットを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む緩衝液１０ｍＬ（Bacterial ProteaseArrest（GBiosciences）を補充した）に再懸濁した。次いで、細胞を１２Ｗ、氷上で９秒間超音波処理した（１．５秒間の超音波処理の後で１．５秒間の休止）。これらの手順を各超音波処理サイクルの間に１分間のインターバルをおいて、５回繰り返した。無細胞の抽出物を、１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen）を上清に添加し、混合物を穏やかに４℃で撹拌した。スラリーをカラムに通し、ライセートからレジンを取り出した。次いで、レジンを３０ｍＬの緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および３０ｍＭイミダゾールを含む）で洗浄した。最後に、タンパク質を１０ｍＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質溶液を２００倍体積の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（２０％グリセロールを含む）で透析した。タンパク質濃度をBradfordアッセイ（Biorad）を使用して決定した。５．６ｍｇ／ｍＬのNpun02004178タンパク質を得た。
【０２９５】
デカルボニラーゼ反応のためのオクタデカナールを合成するために、５００ｍｇのオクタデカノール（Sigma）を２５ｍＬのジクロロメタンに溶解した。次いで、200mgのクロロクロム酸ピリジニウム（TCI America）を溶液に添加し、一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥させて、ジクロロメタンを除去した。残った生成物をヘキサンに再懸濁し、Whatman濾紙を介して濾過した。次いで、濾液を減圧下で乾燥させ、５ｍＬのヘキサンに再懸濁し、シリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。混合物をヘキサン中自重送りカラム（gravity fed column）にロードし、次いで、カラムの２倍体積のヘキサンで洗浄した。次いで、オクタデカナールをヘキサンおよび酢酸エチルの８：１の混合物で溶出した。オクタデカナールを含むフラクションをプールし、下記のＧＣ／ＭＳ法を使用して分析した。この方法で決定した最終産物の純度は、９５％であった。
【０２９６】
脱カルボニル活性についてNpun02004178タンパク質を試験するために、以下の酵素アッセイを行った。２００μＬの反応を、以下の成分をそれぞれの終濃度で含む１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．２）にて行った：３０μＭ精製Npun02004178タンパク質、２００μＭオクタデカナール、０．１１μｇ／ｍＬホウレンソウフェレドキシン（Sigma）、０．０５ユニット／ｍＬホウレンソウフェレドキシン還元酵素（Sigma）、および１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（Sigma）。ネガティブコントロール反応は、Npun02004178を含まない上記反応物、オクタデカナールを含まない上記反応物、ならびにホウレンソウフェレドキシン、フェレドキシン還元酵素およびＮＡＤＰＨを含まない上記反応物を含んだ。各反応物を３７℃で２時間インキュベーションし、１００μＬの酢酸エチルを用いて抽出した。サンプルを、以下のパラメーターを使用するＧＣ／ＭＳによって分析した：実行時間：１３．１３分間；カラム:HP-5-MS Part No. 19091S-433E（３０メートルの長さ；Ｉ．Ｄ．：０．２５ｍｍ  ナロボア；フィルム：０．２５ｉＭ）；インジェクト：１  ｉｌ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８５０  注入口；注入口：３００Ｃスプリットレス；担体ガス：ヘリウム；流量：１．３ｍＬ／分間；オーブン温度：７５℃で５分間保持、３２０で４０℃／分、３２０で２分間；デット（ｄｅｔ）：Agilent 5975B VL MSD；デット．温度：３３０℃；スキャン：50-550 M/Z。Sigma社製のヘプタデカンを化合物保持時間および断片化パターンを決定するための標品として使用した。
【０２９７】
図３１に示すように、オクタデカナールのヘプタデカンへのインビトロでの変換が、Npun02004178の存在下で観察された。Npun02004178によるオクタデカナールの酵素脱カルボニルは、ホウレンソウフェレドキシン還元酵素、フェレドキシンおよびＮＡＤＰＨに依存した。
【０２９８】
次いで、ラン藻フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素がインビトロでの脂肪  アルデヒドデカルボニラーゼアッセイにおいてホウレンソウタンパク質と代わり得るかどうか決定した。以下の４つの遺伝子を別々に、pET-15bのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした：N.punctiforme PCC73102 Npun02003626（ZP_00109192、Ｎ末端アロフィコシアニンリンカードメインを有しないフェレドキシン酸化還元酵素petH）（配列番号８７）、N. punctiforme PCC73102 Npun02001001（ZP_00111633、フェレドキシン1）（配列番号８９）、N.punctiforme PCC73102 Npun02003530（ZP_00109422、フェレドキシン２）（配列番号９１）およびN. punctiforme PCC73102 Npun02003123（ZP_00109501、フェレドキシン３）（配列番号９３）。上記のように、４つのタンパク質を発現させ、精製した。１ｍｇ／ｍＬの各フェレドキシンおよび４ｍｇ／ｍＬのフェレドキシン酸化還元酵素を得た。ラン藻フェレドキシン酸化還元酵素を用いて、以下の変更を含む上記酵素のセットアップを使用して、３つのラン藻フェレドキシンを試験した。フェレドキシン還元酵素の終濃度は６０μｇ／ｍＬであり、フェレドキシンは５０μｇ／ｍＬであった。抽出した酵素反応物を、ＧＣ／ＭＳ（以下のパラメーターを使用する）によって分析した：実行時間：６．３３分間；カラム：Ｊ＆Ｗ  １２２−５７１１  ＤＢ−５ｈｔ（１５メートルの長さ；Ｉ．Ｄ．：０．２５ｍｍナロボア；フィルム：０．１０μＭ）；インジェクト：１μＬ  Agilent 6850注入口；注入口：３００℃スプリットレス；担体ガス：ヘリウム；流量：１．３ｍＬ／分；オーブン温度：１００℃で０．５分間保持、２６０で３０℃／分、２６０で０．５分間；デット：Agilent 5975B VL MSD；デット．温度：２３０℃；スキャン：50-550 M/Z。
【０２９９】
図３２に示すように、オクタデカナールのヘプタデカンへのNpun02004178依存的なインビトロでの変換が、ＮＡＤＰＨおよびラン藻フェレドキシン酸化還元酵素および３つのラン藻  フェレドキシンのいずれかの存在下で観察された。
【０３００】
実施例２７．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594の生化学的特徴付け
S. elongatus PCC7492 orf1594をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６５）を、Ｔ７プロモーター制御下のベクターｐＥＴ−２８ｂのＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られたPCC7942_orf1594タンパク質は、C末端His-タグを含んだ。実施例２２に記載のように、大腸菌BL21株（DE3）（Invitrogen）をプラスミドで形質転換して、PCC7942_orf1594 タンパク質を発現させ、精製した。タンパク質溶液を、以下の緩衝液にて保存した：５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＨＰ、１０％グリセロール。Bradfordアッセイ（Biorad）を使用して、タンパク質濃度を決定した。２ｍｇ／ｍＬのPCC7942_orf1594タンパク質を得た。
【０３０１】
アシル-ACPまたはアシル-ＣｏＡ還元酵素活性についてPCC7942_orf1594タンパク質を試験するために、以下の酵素アッセイを行った。１００μＬの反応を、以下の成分を各終濃度で含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った：１０μＭ精製PCC7942_orf1594タンパク質、０．０１〜１ｍＭ  アシル-ＣｏＡまたはアシル-ACP、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２〜２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ。反応物を１時間、３７℃でインキュベーションし、１００μＬの酢酸エチル（５ｍｇ／ｌ  １−オクタデセンを内部標準として含む）を添加して停止させた。サンプルを１５分間ボルテックスし、層分離のために、最大速度で３分間遠心分離した。８０μＬの最上層をＧＣガラスバイアルに移し、実施例２６に記載するＧＣ／ＭＳによって分析した。形成されたアルデヒドの量を、内部標準に基づいて算出した。
【０３０２】
図３３に示すように、PCC7942_orf1594は、オクタデカノイル-ＣｏＡをオクタデカナールに還元し得た。還元酵素活性は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋またはＦｅ２＋などの二価の陽イオンおよびＮＡＤＰＨを必要とする。ＮＡＤＨは、還元酵素活性を支持しなかった。PCC7942_orf1594は、オクタデセノイル-ＣｏＡおよびオクタデセノイル-ACPをオクタデセナールに還元できた。２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ存在下でのオクタデカノイル−ＣｏＡ、オクタデセノイル−ＣｏＡおよび  オクタデセノイル−ＡＣＰの還元についてのＫｍ値を、４５±２０μＭ、８２±２２μＭおよび７．８±２μＭとしてそれぞれ決定した。これらの結果は、PCC7942_orf1594が、インビトロにて、アシル-ＣｏＡおよびアシル-ACPの両方を還元し、また、酵素がおそらく、アシル-ＣｏＡと比べてアシル-ACPに対してより高い親和性を有することを示す。PCC7942_orf1594についての０．５ｍＭ  オクタデカノイル−ＣｏＡ存在下におけるＮＡＤＰＨのＫｍ値は、４００±８０μＭとして決定された。
【０３０３】
次いで、PCC7942_orf1594によって触媒される、ＮＡＤＰＨから脂肪アルデヒドへの立体特異的な水素移動を検討した。Deutero-NADPHを、以下のプロトコルにしたがって調製した。５ｍｇのＮＡＤＰ＋および３．６ｍｇのＤ−グルコース−１−ｄを、２．５ｍＬの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。標識化されたＮＡＤＰＨの酵素による産生を、Ｒ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨの産生のためのBacillus megaterium（USB Corporation）またはＳ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨの産生のためのThermoplasma acidophilum（Sigma）由来のグルコース脱水素酵素  ５ユニットを添加することによって開始させた。反応物を、１５分間、３７℃でインキュベーションし、10KDa MWCO Amicon Ultra遠心機フィルター（Millipore）を使用して、遠心濾過し、ドライアイス上で瞬間凍結させ、-80℃で保存した。
【０３０４】
インビトロアッセイ反応は、１００μＬの全体積で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１０μＭの精製PCC7942_orf1594タンパク質、１ｍＭ  オクタデカノイル-ＣｏＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μＬ  ｄｅｕｔｅｒｏ−ＮＡＤＰＨ（上記のとおり調製）を含む。１時間のインキュベーションの後で、上記のとおり、酵素による反応の産物を抽出し、分析した。ＧＣ／ＭＳによって検出され得られた脂肪アルデヒドは、オクタデカナールであった（図３４を参照のこと）。ＮＡＤＰＨからの水素移動は立体特異的であるので、Ｒ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨおよびＳ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨの両方が合成された。Ｓ−（４−２Ｈ）ＮＡＤＰＨのみを使用し、さらに１ユニットのマス（ｍａｓｓ）を有するオクタデカナールを観察した。脂肪アルデヒドが標識化されていた事実は、重水素化された水素が標識化されたＮＡＤＰＨから標識化された脂肪アルデヒドに移動したことを示す。これは、ＮＡＤＰＨが酵素による反応にて使用されること、およびPCC7942_orf1594によって触媒される水素移動が立体特異的であることを示す。
【０３０５】
実施例２８．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594の異種発現による大腸菌での脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールの細胞内および細胞外産生
Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594（YP_400611;アシル-ACP還元酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-80（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。得られた構築物を大腸菌MG1655 ΔfadEに形質転換し、細胞を３７℃で、３％  （ｗ／ｖ）  グルコースを炭素源として含み、１００μｇ／ｍＬ  スペクチノマイシンおよびカルベニシリンをそれぞれ補充したＣｈｅ−９最少培地  １５ｍＬにて増殖させた。培養物が０．８〜１．０のＯＤ６００に達した場合に、上記遺伝子の発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、細胞をさらに２４〜４８時間、３７℃で増殖させた。Ｃｈｅ−９最小培地を以下に定義する：６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１１ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、２７ｍｇ／Ｌ  Ｆｅ３Ｃｌ×６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ×４Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、１．９ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１ｍｇ／Ｌ  チアミン、２００ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２５）および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００。培養物が１．０〜１．２のＯＤ６００に達した場合、上記遺伝子の発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、細胞をさらに４０時間、３７℃で増殖させた。０．５ｍＬの培養物由来の細胞を、実施例２６に記載の総炭化水素産生のために、０．５ｍＬの酢酸エチルで抽出した。さらに、細胞および上清を遠心分離（４，０００ｇ、１０分間の保持時間）によって分離し、別々に抽出した。
【０３０６】
培養物は、６２０ｍｇ／Ｌ  脂肪アルデヒド（テトラデカナール、ヘプタデセナール、ヘプタデカナールおよびオクタデセナール）、ならびに１６７０ｍｇ／Ｌ  脂肪アルコール（ドデカノール、テトラデセノール、テトラデカノール、ヘプタデセノール、ヘプタデカノールおよびオクタデセノール）を生じた。図３５は、抽出した上清のクロマトグラフを示す。７３％の脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールが無細胞の上清中に存在することが決定された。
【０３０７】
実施例２９．Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594およびNostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178の異種発現による大腸菌におけるアルカンおよびアルケンの細胞内および細胞外産生
Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594（YP_400611;アシル-ACP還元酵素）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号６５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-80（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178（ZP_00108838;脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物を大腸菌MG1655 ΔfadEに同時形質転換し、細胞を３７℃で、３％（ｗ／ｖ）グルコースを炭素源として含み、１００μｇ／ｍＬ  スペクチノマイシンおよびカルベニシリンをそれぞれ補充したＣｈｅ９最少培地  １５ｍＬにて増殖させた。実施例２８の記載のとおり、細胞を増殖させ、ブロスから分離し、抽出し、分析した。
【０３０８】
培養物は、３２３ｍｇ／Ｌ  アルカンおよびアルケン（トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカンおよびヘプタデセン）、３６７ｍｇ／Ｌ  脂肪アルデヒド（テトラデカナール、ヘプタデセナール、ヘプタデカナールおよびオクタデセナール）、ならびに８１９ｍｇ／Ｌ  脂肪アルコール（テトラデカノール、ヘプタデセノール、ヘプタデカノールおよびオクタデセノール）を生じた。図３６は、抽出した上清のクロマトグラフを示す。８６％のアルカン、アルケン、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールが無細胞の上清に存在することが決定された。
【０３０９】
実施例３０．Nostoc sp. PCC7210 alr5284およびNostoc sp. PCC7210 alr5283の異種発現による大腸菌でのアルカンおよびアルケンの産生
Nostoc sp. PCC7210 alr5284 （NP_489324;推定上のアルデヒド産生酵素） をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号８１）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-80（pCL1920誘導体）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。Nostoc sp. PCC7210 alr5283（NP_489323;推定上のデカルボニラーゼ）をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号７）を増幅し、Ｐｔｒｃプロモーター制御下のベクターOP-183（pACYC誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物を大腸菌ＭＧ１６５５に同時形質転換し、細胞を３７℃で、３％（ｗ／ｖ）グルコースを炭素源として含み、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよびカルベニシリンをそれぞれ補充したＣｈｅ９最少培地１５ｍＬにて増殖させた（実施例２８に記載のとおり）。実施例３の記載のとおり、０．５ｍＬの培養物由来の細胞を抽出し、分析し、実施例２６に記載のとおり、ＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０３１０】
図３７に示すとおり、Nostoc sp. PCC7210 alr5284およびNostoc sp. PCC7210 alr5283を有するベクターで同時形質転換した大腸菌細胞は、トリデカン、ペンタデセン、ペンタデカン、テトラデカノールおよびヘキサデカノールを生じた。この結果は、Nostoc sp. PCC7210 alr5284およびalr5283の共発現が、大腸菌が脂肪アルコール、アルカンおよびアルケンを生じる上で十分であることを示す。
【０３１１】
他の実施態様
本発明は詳細な説明と併せて記載されるものの、上記記載は本発明の範囲（特許請求の範囲に記載される）を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図３９−４】
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【図３９−５】
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【図３９−６】
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【図３９−７】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４０−４】
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【図４０−５】
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【図４０−６】
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【図４０−７】
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【図４０−８】
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【図４０−９】
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【図４０−１０】
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【図４０−１１】
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【図４０−１２】
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【図４０−１３】
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【図４０−１４】
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【図４０−１５】
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【図４０−１６】
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【図４０−１７】
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【図４０−１８】
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【図４０−１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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