(57)【要約】本発明は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。一般的に、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料を第３のフラグメントに加えて、それを次に第２のフラグメントに、そして次に第１のフラグメントに溶液中で結合させる。あるいは、異なる第２のフラグメントを、第１のフラグメントに固相中で結合させる。次に、溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料を異なる第３のフラグメントに加える。後に、この異なる第３のフラグメントを、結合した第１の及び異なる第２のフラグメントに溶液相中で結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物などを形成するために非常に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表１５０】
2011506376.tif 000163
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）
【表１５１】
2011506376.tif 000164
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）
【表１５２】
2011506376.tif 000165
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）
【表１５３】
2011506376.tif 000166
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）
【表１５４】
2011506376.tif 000167
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１４）
【表１５５】
2011506376.tif 000168
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１５６】
2011506376.tif 000169
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１５７】
2011506376.tif 000170
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表１５８】
2011506376.tif 000171
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）
【表１５９】
2011506376.tif 000172
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）
【表１６０】
2011506376.tif 000173
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）
【表１６１】
2011506376.tif 000174
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）
【表１６２】
2011506376.tif 000175
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１６３】
2011506376.tif 000176
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１６４】
2011506376.tif 000177
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１６５】
2011506376.tif 000178
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の方法であって、以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表１６６】
2011506376.tif 000179
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５  Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表１６７】
2011506376.tif 000180
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；そして
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。
【請求項４】
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）
【表１６８】
2011506376.tif 000181
を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表１６９】
2011506376.tif 000182
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）
【表１７０】
2011506376.tif 000183
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）
【表１７１】
2011506376.tif 000184
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）
【表１７２】
2011506376.tif 000185
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）
【表１７３】
2011506376.tif 000186
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１７４】
2011506376.tif 000187
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１７５】
2011506376.tif 000188
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１７６】
2011506376.tif 000189
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項６】
請求項５記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表１７７】
2011506376.tif 000190
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）
【表１７８】
2011506376.tif 000191
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）
【表１７９】
2011506376.tif 000192
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）
【表１８０】
2011506376.tif 000193
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で固相中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）
【表１８１】
2011506376.tif 000194
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１８２】
2011506376.tif 000195
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１８３】
2011506376.tif 000196
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１８４】
2011506376.tif 000197
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項７】
請求項５又は請求項６記載の方法であって、以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表１８５】
2011506376.tif 000198
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５  Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表１８６】
2011506376.tif 000199
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。
【請求項８】
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）
【表１８７】
2011506376.tif 000200
を有する、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）
【表１８８】
2011506376.tif 000201
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）
【表１８９】
2011506376.tif 000202
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１９０】
2011506376.tif 000203
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）
【表１９１】
2011506376.tif 000204
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１９２】
2011506376.tif 000205
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項１０】
請求項９記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）
【表１９３】
2011506376.tif 000206
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）
【表１９４】
2011506376.tif 000207
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１９５】
2011506376.tif 000208
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）
【表１９６】
2011506376.tif 000209
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；そして
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１９７】
2011506376.tif 000210
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０記載の方法であって、以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表１９８】
2011506376.tif 000211
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５  Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表１９９】
2011506376.tif 000212
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；そして
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。
【請求項１２】
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）
【表２００】
2011506376.tif 000213
を有する、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸配列（配列番号１４）
【表２０１】
2011506376.tif 000214
のペプチドであって、
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
【請求項１４】
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項１３記載のペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列（配列番号１５）
【表２０２】
2011506376.tif 000215
のペプチドであって、
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
【請求項１６】
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表２０３】
2011506376.tif 000216
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメント（配列番号１６）
【表２０４】
2011506376.tif 000217
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
を溶液中で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表２０５】
2011506376.tif 000218
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表２０６】
2011506376.tif 000219
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
を含む方法。
【請求項１８】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：
ａ）（配列番号１８）
【表２０７】
2011506376.tif 000220
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメント（配列番号１８）
【表２０８】
2011506376.tif 000221
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
を溶液中で産生させること、
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法であって、以下の工程：
ｅ）（配列番号１８）
【表２０９】
2011506376.tif 000222
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメント（配列番号１８）
【表２１０】
2011506376.tif 000223
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
を溶液中で産生させること、
をさらに含む方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、以下の工程：
ｇ）（配列番号１０）
【表２１１】
2011506376.tif 000224
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
をさらに含む方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法であって、以下の工程：
ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表２１２】
2011506376.tif 000225
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
をさらに含む方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法であって、以下の工程：
ｉ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表２１３】
2011506376.tif 000226
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｈ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
をさらに含む方法。
【請求項２３】
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）
【表２１４】
2011506376.tif 000227
を有する、請求項１７〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸配列（配列番号１８）
【表２１５】
2011506376.tif 000228
のペプチドであって、
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
【請求項２５】
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項２４記載のペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列（配列番号１７）
【表２１６】
2011506376.tif 000229
を有するペプチドであって、
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；そして
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
【請求項２７】
Ｘ３５が、Ａｉｂである、請求項２６記載のペプチド。
【請求項２８】
アミノ酸配列（配列番号１６）
【表２１７】
2011506376.tif 000230
式中、
Ｂ’は、固相樹脂又は−ＯＨであり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；そして
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、
を有するペプチド。
【請求項２９】
Ｘ３５が、Ａｉｂである、請求項２８記載のペプチド。
【請求項３０】
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法及び本明細書において先に定義されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相プロセス及び液相プロセスを使用した、インシュリン分泌性ペプチド、特にグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）及びその対応物を調製するための方法に関する。本発明は、さらに、これらの方法において使用することができる中間体ペプチドフラグメントに関する。
【０００２】
ペプチド合成のための多くの方法が、文献において記載されている（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012；Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526；Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320；Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133；及びAndersson et al. (2000) Biopolymers 55: 227-250を参照のこと）。合成の種々の方法が、合成が起こる相の物理的状態（即ち、液相又は固相）により区別される。
【０００３】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、アミノ酸基又はペプチド基を、固体の支持体樹脂に結合させる。次に、連続アミノ酸基又はペプチド基を、目的のペプチド材料が形成されるまで、支持体結合ペプチドに付着させる。支持体結合ペプチドを次に、典型的には、支持体から切断して、さらなるプロセシング及び／又は精製に供する。一部の場合では、固相合成は成熟ペプチド産物を産生するし；他の場合では、支持体から切断されたペプチド（即ち、「ペプチド中間体フラグメント」）をより大きな成熟ペプチド産物の調製において使用する。
【０００４】
固相プロセスから生成されるペプチド中間体フラグメントを、固相又は液相合成プロセスにおいて一緒に結合させることができる（本明細書において「溶液相合成」と呼ぶ）。溶液相合成は、固相による有用な成熟ペプチドの合成が不可能である又は実用的ではない場合において特に有用でありうる。例えば、固相合成において、より長いペプチドが最終的に不規則な立体構造をとりながら、依然として固体支持体に付着していることがあり、追加のアミノ酸又はペプチド材料を成長鎖に付加することが困難になる。ペプチド鎖が支持体樹脂上で長くなるほど、プロセス工程（例えば、結合及び脱保護など）の効率は損なわれうる。これは、次には、出発材料（例えば、活性化可能なアミノ酸、共試薬、及び溶媒など）における増加性の損失に加えて、これらの問題を代償するためのより長いプロセシング時間を招きうる。これらの問題は、ペプチドの長さが増加するにつれて増加しうる。
【０００５】
従って、固相手順だけを使用して３０アミノ酸長より大きな成熟ペプチドが単一フラグメントにおいて合成されることを見出すことは比較的稀である。代わりに、個々のフラグメントを固相上で別々に合成し、そして次に固相及び／又は溶液相において結合させて、所望のペプチド産物を構築してよい。このアプローチは、フラグメント候補の慎重な選択を要求する。一部の一般的な原理によってフラグメント選択を導くことができるが、非常にしばしば、フラグメント候補の経験的なテストが要求される。１つの状況において上手くいくフラグメント戦略が、他において上手くいかないことがある。合理的なフラグメント候補が明らかにされている場合でさえ、プロセス革新が、依然として、合成戦略が商業的に合理的な条件下で上手くいくために必要とされうる。従って、ハイブリッドスキームを使用したペプチド合成はしばしば難しく、多くの場合において、合成スキームにおいて何が固有の問題であるのかを予測することは、実際の合成が実施されるまで困難である。
【０００６】
溶液相での結合では、２つのペプチド中間体フラグメント、又はペプチド中間体フラグメント及び反応性アミノ酸を、適切な溶媒中で、通常、結合反応の効率及び質を促進させる追加試薬の存在において結合させる。ペプチド中間体フラグメントを反応性に配置して、１つのフラグメントのＮ末端を他のフラグメントのＣ末端に結合させる、又は逆も同様である。また、側鎖保護基が、固相合成中に存在し、溶液相での結合中に共通してフラグメント上に保持されて、フラグメントの末端の特異的な反応性を保証する。これらの側鎖保護基は、典型的には、成熟ペプチドが形成されるまで除去されない。
【０００７】
全合成スキーム中の１つ又は複数の工程における適度の改善は、成熟ペプチドの調製における有意な改善に相当しうる。そのような改善は、時間及び試薬における大きな全節約を導くことができ、また、最終産物の純度及び収率を有意に改善することができる。
【０００８】
ハイブリッド合成における改善の重要性に関する考察を、これらの手順を使用して産生される任意の種類のペプチドに適用可能であり、それは、治療的に有用であり、及び、商業的な医学的使用のための規模で製造されるペプチドに関連して特に重要である。より大きな生体分子医薬品、例えば治療用ペプチドなどの合成は、非常に高価となりうる。他の要素に加えて、試薬の費用、合成時間、多くの合成工程のため、これらのより大きな生体分子医薬品の合成プロセスでは非常に小さな改善でも、そのような医薬品を産生することが経済的にも実行可能であるか否かに有意な影響を有しうる。そのような改善が、より大きな生体分子医薬品のためのこれらの高い産生費用のため必要であり、多くの場合において、これらのタイプのより大きな生体分子医薬品のための適した治療用代替物は（仮にあるとしても）少ないとの事実により裏付けられる。
【０００９】
このことは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びその対応物の場合において明らかに見られる。これらのペプチドは、２型インスリン非依存性糖尿病並びに関連する代謝障害、例えば肥満などの処置のための可能な治療剤として意味付けられてきた。Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994: 17: 1039-44。
【００１０】
Lopez et al.は、天然ＧＬＰ−１が３７個のアミノ酸残基長であることを決定した。Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80: 5485-5489 (1983)。この決定は、Uttenthal, L. O., et al., J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61: 472-479 (1985)の研究により確認された。天然ＧＬＰ−１は、表示ＧＬＰ−１（１−３７）により表わしてよい。この表示は、ペプチドが１（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）の全てのアミノ酸を有することを示す。天然ＧＬＰ−１（１−３７）は配列番号１：
【表１】
2011506376.tif 000002
のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
天然ＧＬＰ−１（１−３７）は、一般的に、インシュリン生合成を媒介することはできないが、しかし、このペプチドの生物学的に重要なフラグメントはインシュリン分泌特性を有する。例えば、配列番号２
【表２】
2011506376.tif 000003
の天然の３１アミノ酸長のペプチドＧＬＰ−１（７−３７）はインシュリン分泌性であり、天然ＧＬＰ−１の７（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）の位置のアミノ酸を有する。ＧＬＰ−１（７−３７）は末端グリシンを有する。このグリシンが存在しない場合、結果として生じるペプチドは依然としてインシュリン分泌的に活性であり、配列番号３：
【表３】
2011506376.tif 000004
のＧＬＰ−１（７−３６）と呼ばれる。
【００１２】
ＧＬＰ−１（７−３６）は、しばしば、Ｃ末端アルギニンと共にアミド化型で存在し、この型は、表示ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により表わしてよい。
【００１３】
ＧＬＰ−１（１−３７）は、一般的に、インシュリン分泌的に活性なその対応物にインビボで変換される。例えば、ＧＬＰ−１（１−３７）は、自然に、ＧＬＰ−１（７−３７）にインビボで変換される。このペプチドは、次には、Ｃ末端グリシンのタンパク質分解除去による追加のプロセシングも受け、ＧＬＰ−１（７−３６）を産生し、それはしばしばアミド化型ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２で存在する。それ故に、治療処置は、ＧＬＰ−１（１−３７）又はその対応物の投与を含んでよく、インシュリン分泌的に活性なその誘導体がインビボで形成することを期待する。より共通して、しかし、研究中の治療処置は、インシュリン分泌的に活性なＧＬＰ−１フラグメント自体の投与を含む。
【００１４】
ＵＳ  ６，８８７，８４９によると、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、及びＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２のインシュリン分泌活性は、膵臓ベータ細胞に特異的であるらしいが、ここでこれらのペプチドはインシュリンの生合成を誘導するらしい。これによって、これらのペプチド及び医薬的に許容可能なその対応物が、成人発症糖尿病の病因（インシュリン分泌の動態が異常である高血糖により特徴付けられる状態）の試験において有用になる。さらに、これらのグルカゴン様ペプチドは、この疾患の治療及び処置、並びに高血糖の治療及び処置において有用でありうる。ＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１によると、これらのペプチド又は医薬的に許容可能なその対応物は、他の型の糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧症、及び／又は食物摂取量の低下が望ましい障害を処置するためにも有用でありうる。
【００１５】
天然ＧＬＰ−１（１−３７）及び配列番号１〜３の天然のインシュリン分泌的に活性なその対応物は、代謝的に不安定であり、インビボでわずか１〜２分間の血漿中半減期を有する。外因的に投与されたＧＬＰ−１も迅速に分解される。この代謝的な不安定性によって、天然ＧＬＰ−１及びその天然フラグメントの治療潜在力は限定されてきた。
【００１６】
改善された安定性を伴うＧＬＰ−１ペプチドの合成対応物が、開発されてきた。例えば、配列番号４：
【表４】
2011506376.tif 000005
のペプチドがＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１において記載されている。
【００１７】
このペプチドは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基が、８及び３５の位置で、これらの位置の対応する天然アミノ酸の代わりに現れることを除き、天然ＧＬＰ−１（７−３６）と類似である。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸は、メチルアラニンとしても公知である。このペプチドは、化学式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）又は、アミド化形状で、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。
【００１８】
ＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１には、配列番号４のペプチド及びその対応物が、固相技術を使用して単一フラグメントとして構築することができることが記載されている。ＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１により示唆される単一フラグメント合成アプローチには問題がある。１つの問題として、このアプローチは、最終的なアミノ酸結合における高レベルのエピマー化（例えば（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）の場合におけるヒスチジン）を導きうる。また、不純物はクロマトグラフィー精製中に除去することが難しく、収率が低くなりすぎる傾向がありうる。結果的に、配列番号４のペプチドを合成するための改善された戦略が、このペプチド及びその対応物を商業的に許容可能な収率、純度、及び量で製造するために必要とされる。
【００１９】
これらの懸念に加えて、産物の回収及びペプチドの大規模産生のための産物の純度、並びに試薬の取扱い、保存、及び処分に関連する問題が、ペプチド合成スキームの実行可能性に大きく影響を及ぼしうる。このように、商業目的のペプチド材料を、大バッチ量で、改善された収率で効率的に産生することが可能なペプチド合成プロセスについての継続的な必要が存在する。
【００２０】
本願は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。１つの方法において、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料をフラグメントの１つに加える。フラグメントを、次に、溶液相において一緒に結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３６）並びにこれらの天然及び非天然対応物など、特にＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物を形成するために非常に有用である。
【００２１】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表５】
2011506376.tif 000006
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）
【表６】
2011506376.tif 000007
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）
【表７】
2011506376.tif 000008
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）
【表８】
2011506376.tif 000009
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）
【表９】
2011506376.tif 000010
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１０】
2011506376.tif 000011
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１１】
2011506376.tif 000012
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表１２】
2011506376.tif 000013
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００２２】
「Ｎ末端保護基」は、Ａｃｒ（アクリリル）、Ｂｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）、Ｔｒｔ（トリチル）Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシ−カルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］−エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｐｏｃ（２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）−エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］からなる群より選択される基を意味する。好ましいＮ末端保護基は、Ｆｍｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｐｏｃ、及びＢｏｃである。
【００２３】
「アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基」は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうるアミノ酸である。好ましくは、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）、２−メチルアラニン（Ａｉｂ）、及び２−フェニルメチル−フェニルアラニンからなる群より選択される。最も好ましくは、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基は、Ｇ又はＡｉｂから選択される。
【００２４】
好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表１３】
2011506376.tif 000014
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）
【表１４】
2011506376.tif 000015
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）
【表１５】
2011506376.tif 000016
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）
【表１６】
2011506376.tif 000017
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）
【表１７】
2011506376.tif 000018
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表１８】
2011506376.tif 000019
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表１９】
2011506376.tif 000020
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表２０】
2011506376.tif 000021
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００２５】
別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表２１】
2011506376.tif 000022
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表２２】
2011506376.tif 000023
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
【００２６】
さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）
【表２３】
2011506376.tif 000024
を有する。
【００２７】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表２４】
2011506376.tif 000025
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）
【表２５】
2011506376.tif 000026
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）
【表２６】
2011506376.tif 000027
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）
【表２７】
2011506376.tif 000028
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）
【表２８】
2011506376.tif 000029
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表２９】
2011506376.tif 000030
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表３０】
2011506376.tif 000031
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表３１】
2011506376.tif 000032
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００２８】
好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）
【表３２】
2011506376.tif 000033
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）
【表３３】
2011506376.tif 000034
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）
【表３４】
2011506376.tif 000035
式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）
【表３５】
2011506376.tif 000036
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）
【表３６】
2011506376.tif 000037
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表３７】
2011506376.tif 000038
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）
【表３８】
2011506376.tif 000039
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表３９】
2011506376.tif 000040
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００２９】
別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表４０】
2011506376.tif 000041
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表４１】
2011506376.tif 000042
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
【００３０】
さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）
【表４２】
2011506376.tif 000043
を有する。
【００３１】
「固相樹脂」は、固相ペプチド合成の実行において適した任意の型の支持体を意味し、１つ又は複数のポリマー、コポリマー、又はポリマー（例えば、ポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、ポリサッカライド、又はポリスチレンなど）の組み合わせから作ることができ、及び、典型的に、成長ペプチドが合成中に結合される連結成分を含む。好ましくは、固相樹脂は、２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアン酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固定基を伴うポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（ＰＳ樹脂）、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂からなる群より選択される。最も好ましくは、固相樹脂は２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂である。
【００３２】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）
【表４３】
2011506376.tif 000044
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）
【表４４】
2011506376.tif 000045
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表４５】
2011506376.tif 000046
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）
【表４６】
2011506376.tif 000047
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表４７】
2011506376.tif 000048
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００３３】
好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）
【表４８】
2011506376.tif 000049
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）
【表４９】
2011506376.tif 000050
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）
【表５０】
2011506376.tif 000051
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）
【表５１】
2011506376.tif 000052
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）
【表５２】
2011506376.tif 000053
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
【００３４】
別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表５３】
2011506376.tif 000054
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表５４】
2011506376.tif 000055
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
【００３５】
さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）
【表５５】
2011506376.tif 000056
を有する。
【００３６】
上の方法のいずれも、以下からなる群より選択されるＮ末端ヒスチジン保護基（Ｎ末端保護基）を用いてよい：Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］−エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］−カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］。ここで、Ｎ末端ヒスチジン保護基を、酸を使用した全体的な側鎖脱保護工程において除去してよい場合、Ｎ末端ヒスチジン保護基の先の除去は要求されない。
【００３７】
一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１４）
【表５６】
2011506376.tif 000057
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
【００３８】
別の局面において、本願は上のペプチドを提供し、ここで疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。
【００３９】
一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１５）
【表５７】
2011506376.tif 000058
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
【００４０】
別の局面において、本願は上のペプチドを提供し、ここで疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。
【００４１】
本願は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。一般的に、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料をフラグメントの１つに加える。フラグメントを、次に、溶液相において一緒に結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３６）並びにこれらの天然及び非天然対応物など、特にＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物を形成するために非常に有用である。
【００４２】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表５８】
2011506376.tif 000059
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表５９】
2011506376.tif 000060
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表６０】
2011506376.tif 000061
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表６１】
2011506376.tif 000062
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。
【００４３】
「Ｎ末端保護基」は、Ａｃｒ（アクリリル）、Ｂｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｐｏｃ（２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］からなる群より選択される。好ましいＮ末端保護基はＦｍｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｐｏｃ及びＢｏｃである。
【００４４】
好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表６２】
2011506376.tif 000063
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表６３】
2011506376.tif 000064
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表６４】
2011506376.tif 000065
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表６５】
2011506376.tif 000066
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。
【００４５】
一局面において、本願は、アミノ酸配列（配列番号１７）
【表６６】
2011506376.tif 000067
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；及び
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。
【００４６】
上のペプチドの１つの変異において、Ｘ３５はＡｉｂである。
【００４７】
一局面において、本願は、アミノ酸配列（配列番号１６）
【表６７】
2011506376.tif 000068
式中、
Ｂ’は、固相樹脂又は−ＯＨであり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；及び
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。
【００４８】
上のペプチドの１つの変異において、Ｘ３５はＡｉｂである。
【００４９】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１８）
【表６８】
2011506376.tif 000069
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表６９】
2011506376.tif 000070
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む。
【００５０】
好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１８）
【表７０】
2011506376.tif 000071
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表７１】
2011506376.tif 000072
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む。
【００５１】
一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表７２】
2011506376.tif 000073
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表７３】
2011506376.tif 000074
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表７４】
2011506376.tif 000075
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表７５】
2011506376.tif 000076
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）
【表７６】
2011506376.tif 000077
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表７７】
2011506376.tif 000078
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む方法を提供する。
【００５２】
好ましい局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表７８】
2011506376.tif 000079
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表７９】
2011506376.tif 000080
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表８０】
2011506376.tif 000081
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表８１】
2011506376.tif 000082
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）
【表８２】
2011506376.tif 000083
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表８３】
2011506376.tif 000084
式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む方法を提供する。
【００５３】
一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１０）
【表８４】
2011506376.tif 000085
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを第２のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む。
【００５４】
好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。
【００５５】
一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表８５】
2011506376.tif 000086
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表８６】
2011506376.tif 000087
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表８７】
2011506376.tif 000088
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表８８】
2011506376.tif 000089
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）
【表８９】
2011506376.tif 000090
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表９０】
2011506376.tif 000091
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）
【表９１】
2011506376.tif 000092
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む方法を提供する。
【００５６】
好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。
【００５７】
一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表９２】
2011506376.tif 000093
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表９３】
2011506376.tif 000094
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表９４】
2011506376.tif 000095
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表９５】
2011506376.tif 000096
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）
【表９６】
2011506376.tif 000097
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表９７】
2011506376.tif 000098
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）
【表９８】
2011506376.tif 000099
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表９９】
2011506376.tif 000100
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
を含む方法を提供する。
【００５８】
好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。
【００５９】
一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）
【表１００】
2011506376.tif 000101
式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）
【表１０１】
2011506376.tif 000102
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）
【表１０２】
2011506376.tif 000103
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）
【表１０３】
2011506376.tif 000104
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）
【表１０４】
2011506376.tif 000105
式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）
【表１０５】
2011506376.tif 000106
式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）
【表１０６】
2011506376.tif 000107
式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）
【表１０７】
2011506376.tif 000108
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｉ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）
【表１０８】
2011506376.tif 000109
式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｈ）により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む方法を提供する。
【００６０】
一局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）
【表１０９】
2011506376.tif 000110
を有する。
【００６１】
一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１８）
【表１１０】
2011506376.tif 000111
式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
【００６２】
上のペプチドの１つの変異において、疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。
【００６３】
一局面において、上の方法のいずれかで、以下からなる群より選択されるＮ末端ヒスチジン保護基（Ｎ末端保護基）を用いてよい：Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリル、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］。ここで、Ｎ末端ヒスチジン保護基を、酸を使用した全体的な側鎖脱保護工程において除去してよい場合、Ｎ末端ヒスチジン保護基の先の除去は要求されない。
【００６４】
以下に記載する本発明の実施態様は、包括的であること、又は、本発明を、以下の詳細な説明において開示する正確な形状に限定することを意図しない。むしろ、実施態様を選び、そして記載して、当業者が本発明の原理及び実行を評価及び理解することができる。
【００６５】
本発明は、固相及び／又は溶液相技術を使用した、ペプチド、例えばグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、並びに天然及び非天然のインシュリン分泌的に活性なその対応物を作るための合成方法に向けられる。本発明のペプチド分子は、保護、無保護、又は部分的に保護してよい。保護は、Ｎ末端保護、側鎖保護、及び／又はＣ末端保護を含みうる。本発明は、一般的に、これらのグルカゴン様ペプチド、それらの対応物、フラグメント及びそれらの対応物、並びにこれらの融合産物及びそれらの対応物の合成に向けられ、本明細書における発明の教示は、また、他のペプチド、特に、固相及び溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるものの合成に適用可能である。本発明は、また、不純物、特にピログルタミン酸不純物に関連するペプチド中間体フラグメントの合成に適用可能である。本発明の実行において有用である好ましいＧＬＰ−１分子は、天然及び非天然のＧＬＰ−１（７−３６）並びにその対応物を含む。
【００６６】
本明細書において使用する「アミノ酸配列を含む」という用語は、好ましくは「アミノ酸配列を有する」を意味する。
【００６７】
本明細書において使用する「対応物」は、ペプチドの天然及び非天然のアナログ、誘導体、融合化合物、塩、又は同様のものを指す。本明細書において使用するペプチドアナログは、一般的に、例えば、別のペプチド又はペプチド対応物と比べて、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、逆位、及び／又は付加などにより改変アミノ酸配列を有するペプチドを指す。置換は、１つ又は複数の天然又は非天然のアミノ酸を含みうる。置換は、好ましくは、保存的又は高度に保存的でありうる。保存的置換は、一般的に同じ正味の電子電荷並びに一般的に同じサイズ及び形態を有する別のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換を指す。例えば、脂肪族又は置換脂肪族アミノ酸側鎖を伴うアミノ酸は、それらの側鎖における炭素及びヘテロ原子の総数が約４個以下で異なる場合、おおよそ同じサイズを有する。それらは、それらの側鎖における分岐の数が約１又は２個以下で異なる場合、おおよそ同じ形態を有する。それらの側鎖においてフェニル又は置換フェニル基を伴うアミノ酸は、ほぼ同じサイズ及び形態を有すると考えられる。以下にアミノ酸の５グループを列挙する。化合物中のアミノ酸を、同じグループからの別のアミノ酸を用いて置換することによって、一般的に、保存的置換がもたらされる。
【００６８】
グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、及びＣ１−Ｃ４脂肪族又はＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖又は単一分岐）を伴う非天然アミノ酸。
【００６９】
グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸、及びカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。
【００７０】
グループＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、及びアミン又はグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。
【００７１】
グループＩＶ：グルタミン、アスパラギン、及びアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。
【００７２】
グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、及びトリプトファン。  
【００７３】
本明細書において使用する「対応物」という用語は、より好ましくはペプチドの塩、又はＣ末端でアミド化されたその誘導体を指す。
【００７４】
「高度に保存的な置換」は、側鎖中の同じ官能基並びにほとんど同じサイズ及び形態を有する別のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換である。脂肪族又は置換脂肪族アミノ酸側鎖を伴うアミノ酸は、それらの側鎖における炭素及びヘテロ原子の総数が約２個以下で異なる場合、ほとんど同じサイズを有する。それらは、同じ数の分岐をそれらの側鎖において有する場合、ほとんど同じ形態を有する。高度に保存的な置換の例は、バリンとロイシン、スレオニンとセリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、及びフェニルグリシンとフェニルアラニンを含む。
【００７５】
「ペプチド誘導体」は、一般的に、ペプチド、ペプチドアナログ、又はその側基の１つ又は複数の化学修飾を有する他のペプチド対応物、アルファ炭素原子、末端アミノ基、及び／又は末端カルボキシル酸基を指す。例として、化学修飾は、限定はされないが、化学的部分の付加、新たな結合の作成、及び／又は化学的部分の除去を含む。アミノ酸側基での修飾は、限定なしに、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミノを含む。末端アミノ基の修飾は、限定なしに、デス−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、及びＮ−アシル（例、−ＣＯ−低級アルキル）修飾を含む。末端カルボキシ基の修飾は、限定なしに、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、及び低級アルキルエステルの修飾を含む。このように、部分的に又は全体的に保護されたペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。
【００７６】
本発明の実行において、化合物は、それがホルモンインシュリンの合成又は発現を刺激する、又は刺激を起こす、又は刺激を起こす助けをすることができる場合、「インシュリン分泌」活性を有する。好ましい実行方法において、インシュリン分泌活性は、米国特許第６，８８７，８４９号及び第６，７０３，３６５号において記載されるアッセイに従って実証することができる。
【００７７】
好ましい実施態様において、本発明は、以下の化学式を有する合成（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号１９）：
【表１１１】
2011506376.tif 000112
（式中、位置８、１０及び３５の記号Ｘの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する）及びその対応物を合成するための方法論を提供する。Ｘ８、Ｘ１０及び／又はＸ３５残基のいずれかが、場合により、側鎖保護基を含みうる。この化学式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたＸ８及びＸ３５残基が、位置８及び３５で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然ＧＬＰ−１（７−３６）とは異なる。Ｘ１０残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルＸ８、Ｘ１０及びＸ３５アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素のリンカーとしてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム１において示され、以下でさらに記載される本発明の合成経路を促進することも発見した。
【００７８】
本発明の原理に従って合成されうる（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１１（７−３６）ペプチドの特に好ましい実施態様は、式（配列番号１２）：
【表１１２】
2011506376.tif 000113
（それは好ましくは（示す通り）Ｃ末端がアミド化されている）のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基をＸ８及びＸ３５の両方として使用し、好ましくはＣ末端にアミドを有し、１０の位置に天然Ｇの残基を使用し、式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Ａｉｂ」に対応するアミノ酸残基が、８及び３５の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号１２のペプチドがＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１において記載されている。８及び３５の位置でのＡｉｂ残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドよりもずっと安定にする。
【００７９】
本発明は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド、例えば（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２などを作るための改善された方法論を提供する。例として、スキーム１及びスキーム２は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド及びそれらの対応物を合成するための２つの例示的スキームを示す。スキーム１及びスキーム２は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドのスケールアップ合成に特に適すると考えられる。スケールアップ手順を典型的に実施して、商業的流通のために有用な量のペプチドを提供する。例えば、スケールアップ手順におけるペプチドの量は、５００g、又は１kg/バッチ、より典型的に数十kg〜数百kg/バッチ又はそれ以上でありうる。好ましい実施態様において、本発明の方法は、プロセシング（合成）時間における低下、産物の収率における改善、産物純度における改善、及び／又は要求される試薬及び出発材料の量の低下などの改善を提供することができる。
【００８０】
スキーム１において示す合成では、固相及び溶液相技術の組み合わせを使用し、ペプチド産物を調製する。
【００８１】
【化１】
2011506376.tif 000114
【００８２】
示す通り、スキーム１は、ペプチド中間体フラグメント１、２及び３を固相上で合成することを含む。フラグメント１は、配列番号２０：
【表１１３】
2011506376.tif 000115
（式中、Ｘ８及びＸ１０は上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はＸ８及びＸ１０残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント１２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｔｒｔ（トリチル）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｂｏｃ、ＣＢｚ、ＤＴＳ、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ）、Ａｌｌｏｃ、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルエステル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］−）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、及びＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、［（フェニルメトキシ）カルボニル］、［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。
【００８３】
フラグメント１は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの７から１０の位置におけるアミノ酸に対応する４個のアミノ酸残基を含み、従って、表示（Ｘ８，Ｘ１０）ＧＬＰ−１（７−１０）により表わしてよい。好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は配列番号２１：
【表１１４】
2011506376.tif 000116
のグリシンであるか又は１０の位置にＡｉｂ残基を含むその対応物である。配列番号７のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−１０）の８の位置の天然アラニンにおけるＡｉｂでの置換を記載する。
【００８４】
固相合成は、一般的に、フラグメント１のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ１０アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様にアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結しており、例えば、Ｎ末端ヒスチジン残基（Ｈ）が新生ペプチド鎖に加えられている。
【００８５】
配列番号２０及び２１のペプチドフラグメントの選択及び使用は、スキーム１内で有意な利点を提供する。第１に、Ｈ（ヒスチジン）は、少なくとも部分的にエピマー化の問題のために、成長中のペプチド鎖に付加することが困難なアミノ酸残基である傾向がある。しかし、フラグメント１は、これらの懸念の大部分を軽減するだけ十分に小さい。その上、フラグメント１は、２つのキラル中心を有するだけ十分に長い。このように、簡単な結晶化によってフラグメントを精製することが可能になる。フラグメント１がＡｉｂで終わる場合、フラグメントは１つだけキラル中心を有し、結果として、精製することがより困難になりうる。アキラルＧをＣ末端に位置づけることによっても、フラグメント１がキラルＥを伴うＣ末端で終わる場合に本来なら懸念になりうるラセミ化の懸念が回避される。要するに、ペプチド構築要素としてのフラグメント１の選択によって、フラグメントを構築し、それを精製し、そしてそれを他のペプチド材料に結合させることが簡単になる。フラグメント選択はＨの低ラセミ化も受ける。驚くべきことに、Ｈが、このフラグメントに、非常に低レベルのエピマー化（例、一部の実行方法において約０．５重量%）を伴い付加される。
【００８６】
フラグメント２は、配列番号２２：
【表１１５】
2011506376.tif 000117
（式中、記号Ｘ１７−１８により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基（以下でさらに定義する）である）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又は１７及び１８の位置にＸ１７−１８を含むその対応物である。フラグメント２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの１１から２２の位置におけるアミノ酸残基に一般的に対応するアミノ酸残基を含む（疑似プロリンジペプチド残基Ｘ１７−１８が、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の対応する１７及び１８位置を占めるＳＳ（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）残基の代わりに使用されることを除く）。
【００８７】
フラグメント２のアミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。配列番号２２のペプチドフラグメントは、表示（Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（１１−２２）により呼んでよく、１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒ残基についてＸ１７−１８疑似プロリン残基での置換を記載する。
【００８８】
本発明の実行において使用する疑似プロリンという用語は、ヒドロキシル機能的アミノ酸の残基（例えばＳｅｒ又はＴｈｒなど）を含むジペプチドを指し、それにおいてヒドロキシル機能的側鎖は、アルファ−アミノと側鎖ヒドロキシルの間のプロリン様のＴＦＡ不安定オキサゾリジン環として保護される。オキサゾリジン環の結果として、ジペプチドは可逆的プロリン模倣体として機能する。
【００８９】
一般的に、ペプチド中に組み入れられる典型的な疑似プロリン残基を、化学式
【化２】
2011506376.tif 000118
により表わしてよい。
式中、Φは任意のアミノ酸の残基を表わし、Ｒ１及びＲ２の各々は非依存的に適した二価の連結部分である。しばしば、Ｒ１は、化学式
【化３】
2011506376.tif 000119
（式中、Ｒ３及びＲ４の各々は非依存的に一価の部分（例えばＨなど）、又は低級アルキル（例えばメチルなど）である）の二価の部分である。Ｒ３及びＲ４も環状構造の共通メンバーでありうる。望ましくは、Ｒ３及びＲ４の各々はメチルである。オキサゾリジニン（oxazolidinine）環−保護Ｓｅｒの場合において、Ｒ２は二価の部分ＣＨ２であり、Ｔｈｒの場合において、Ｒ２は二価の部分（ＣＨ３）ＣＨである。
【００９０】
「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価アルキルラジカルを指す。この用語はさらに、ラジカル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチル、及び同様のものにより例示される。好ましい低級アルキル残基は、メチル及びエチルであり、メチルが特に好ましい。
【００９１】
脱保護中に、Ｒ１部分が切断されて、以下の化学式：
【化４】
2011506376.tif 000120
（式中、Φ及びＲ２は上に定義された通りである）のジペプチド残基が提供される。フラグメント２に適用される通り、疑似プロリン残基は、好ましくは、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ残基に対応し、ここでＣ末端により近接したＳｅｒは、オキサゾリジン環と共に保護され、以下：
【化５】
2011506376.tif 000121
の構造を有する。
【００９２】
Ｎ末端により近いＳｅｒのヒドロキシルを持つ側鎖が、例えばｔ−Ｂｕ保護基などにより保護される。保護オキサゾリジン環構造及びｔ−Ｂｕが切断されると、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ残基がもたらされる。
【００９３】
フラグメント２の合成における構築要素としてのそのようなプロリン模倣体の使用は、本発明に関連する有意な利点を提供する。第１に、フラグメント２の固相合成が著しく簡単になる。疑似プロリンがフラグメント２の固相合成の過程において使用されない場合、残基１３から１１までのＦｍｏｃ除去に有意な問題が存在しうる。この困難はベータシート形成に起因しうると考えられる。疑似プロリンの使用によって、これらのＦｍｏｃ除去が、恐らくはベータシート形成の程度を低下させることにより、ずっと簡単になる。第２に、フラグメント２からフラグメント３の後の溶液相結合（スキーム１において描写される）が大幅に簡単になる。疑似プロリン残基の非存在において、典型的な溶液相結合溶媒中でのフラグメントの溶解度は非常に悪い。疑似プロリンは、フラグメント２（及びフラグメント２を組み入れるより長いフラグメント）の溶解度の特徴を増強し、フラグメント１の後の溶液相結合を簡単にする。
【００９４】
固相合成は、一般的に、フラグメント１のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｇアミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。しかし、Ｘ１７−１８疑似プロリンジペプチドを、ＧＬＰ−１（７−３６）の１７及び１８の位置に対応する位置において成長鎖に加える（天然Ｓｅｒ残基の対を１７及び１８の位置に連続的に加える代わりに）。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端スレオニン残基（Ｔ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。
【００９５】
フラグメント３は、配列番号２３：
【表１１６】
2011506376.tif 000122
（式中、Ｘ３５は、上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２３から３５の位置におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。フラグメント３は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）により表わしてよい。
【００９６】
一部の実施態様において、ペプチドフラグメント３は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、側鎖、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。
【００９７】
好ましい実施態様において、Ｘ３５は配列番号２４：
【表１１７】
2011506376.tif 000123
のＡｉｂであるか、又は３５の位置にＡｉｂを含むその対応物である。配列番号１０のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の３５の位置の天然アミノ酸におけるＡｉｂでの置換を記載する。
【００９８】
配列番号２３及び２４のフラグメント３が、Ｃ末端の３６の位置においてＲ（Ａｒｇ）残基をまだ含まないことに留意すること。Ａｒｇは、後に、溶液相中で、好ましくは側鎖保護を伴わないＡｒｇを使用して、フラグメント３のＣ末端に結合される。この戦略は、スキーム１内で有意な利点を提供する。なぜなら、それは、保護Ａｒｇの使用の結果として生じる傾向のある望ましくない副反応を回避するからである。例えば、保護Ａｒｇの脱保護時、脱保護の副産物は、ペプチドの他の構成物（例、トリプトファン）と反応する傾向がありうる。これによって、精製のための粗精製物中で利用可能な所望のペプチドの量が低下する。
【００９９】
固相合成は、一般的に、フラグメント３のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ３５アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端グルタミン残基（Ｑ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。フラグメント３の合成において使用されるアミノ酸のいずれも、従来の実行に従って、側鎖保護を含みうる。
【０１００】
Ｘ３５添加支持体樹脂に近接した立体障害のため、リジン（３４）及びバリン（３３）の成長ペプチド鎖上への結合が問題になりうる。過剰のアミノ酸を用いても、これらの結合反応を強制的に完結させることは困難である。溶媒選び及び／又はエンドキャッピングは、この問題を軽減する助けとなりうる。結合溶媒の性質が、結合が完結する程度に影響を及ぼしうることが見出されている。一組の実験において、例えば、結合反応は３：１  ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１  ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１  ＤＭＦ／ＤＣＭ、及び３：１  ＤＭＦ／ＤＣＭにおいて行われた。これらの溶媒の組み合わせにおける比率は、容積ベースである。ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを指し、ＤＣＭはジクロロメタンを指し、そしてＤＭＦはジメチルホルムアミドを指す。結合反応は、１：１  ＤＭＦ／ＤＣＭを使用した場合、さらに先に完結まで進行することが見出された。
【０１０１】
リジン及びバリンの各々の結合後のエンドキャッピングを使用して、未反応の樹脂支持材料がさらなる結合反応において進行することを防ぐこともできる。エンドキャップされた材料は、精製中に必要に応じて、より簡単に除去される。従来のエンドキャッピング技術を使用してよい。
【０１０２】
継続してスキーム１を参照し、フラグメント１、２及び３を、Ａｒｇと共に組み立てて、所望のペプチドを完成させる。
【０１０３】
スキーム１は、Ａｒｇをフラグメント３のＣ末端に溶液相中で加えて、中間体フラグメント３’を産生することを示す。好ましくは、この方法でペプチドフラグメントに加えられたＡｒｇは、側鎖保護を含まない。フラグメント２を次にフラグメント３’に加えて、配列番号２５のアミノ酸残基を組み入れるより大きな中間体フラグメントを産生し、ここで１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒが、依然として、保護された疑似プロリン形状：
【表１１８】
2011506376.tif 000124
（式中、Ｘ３５を上に定義した通りであり、好ましくはＡｉｂであり、そしてＸ１７−１８は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である）にある。中間体フラグメントを表示（Ｘ１７−１８、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（１１−３６）により命名してよい。アミノ酸が側鎖保護を持つ範囲では、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。
【０１０４】
スキーム１はさらに、そのフラグメント１を次にこの中間体フラグメントに溶液中で加えて、所望のペプチド（配列番号２６）：
【表１１９】
2011506376.tif 000125
を産生する。
【０１０５】
代わりの好ましい実施態様では、本発明は、以下の式を有する合成（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号１９）：
【表１２０】
2011506376.tif 000126
（式中、位置８、１０及び３５の記号Ｘの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する）及びその対応物を合成するための方法論を提供する。Ｘ８、Ｘ１０及び／又はＸ３５残基のいずれも、場合により、側鎖保護基を含みうる。この式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたＸ８及びＸ３５残基が、位置８及び３５で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然ＧＬＰ−１（７−３６）とは異なる。Ｘ１０残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルＸ８、Ｘ１０及びＸ３５アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素としてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム１において示され、以下でさらに記載される本発明の容易な合成経路を促進することも発見されている。
【０１０６】
本発明の原理に従って合成されうる（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１１（７−３６）ペプチドの特に好ましい実施態様は、式（配列番号１２）：
【表１２１】
2011506376.tif 000127
（好ましくは（示す通り）Ｃ末端がアミド化されている）のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基をＸ８及びＸ３５の両方として使用し、好ましくはＣ末端にアミドを有し、１０の位置に天然Ｇの残基を使用し、式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Ａｉｂ」に対応するアミノ酸残基が、８及び３５の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号４のペプチドがＥＰ  １１３７６６７  Ｂ１において記載されている。８及び３５の位置でのＡｉｂ残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドよりもずっと安定にする。
【０１０７】
スキーム２において示す合成では、ペプチド産物を調製するための固相及び溶液相技術の組み合わせを使用する。
【０１０８】
【化６】
2011506376.tif 000128
【０１０９】
示す通り、スキーム２は、ペプチド中間体フラグメント１＋２、及び３を固相上で合成することを含む。フラグメント１＋２は、配列番号２７：
【表１２２】
2011506376.tif 000129
（式中、Ｘ８及びＸ１０は上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はＸ８及びＸ１０残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント１２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｔｒｔ（トリチル）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、及びＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。
【０１１０】
フラグメント１＋２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの７から２７の位置におけるアミノ酸に対応する２０個のアミノ酸残基を含み、従って、表示（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（７−２７）により表わしてよい。好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は配列番号２８：
【表１２３】
2011506376.tif 000130
のグリシンである。
又は１０の位置にＡｉｂ残基を含むその対応物である。配列番号２８のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ８、Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（７−２７）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の８の位置の天然アラニンにおけるＡｉｂでの置換を記載する。記号Ｘ１７−１８により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基（以下でさらに定義する）、又は１７及び１８の位置にＸ１７−１８を含むその対応物である。
【０１１１】
フラグメント２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの１１から２７の位置におけるアミノ酸残基に一般的に対応するアミノ酸残基を含む（疑似プロリンジペプチド残基Ｘ１７−１８が、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の対応する１７及び１８位置を占めるＳＳ（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）残基の代わりに使用されることを除く）。
【０１１２】
フラグメント２のアミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。配列番号２９
【表１２４】
2011506376.tif 000131
のペプチドフラグメント２は、表示（Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（１１−２７）により呼んでよく、１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒ残基についてＸ１７−１８疑似プロリン残基での置換を記載する。
【０１１３】
本発明の実行において使用する疑似プロリンという用語は、ヒドロキシル機能的アミノ酸の残基（例えばＳｅｒ又はＴｈｒなど）を含むジペプチドを指し、ここでヒドロキシル機能的側鎖は、アルファ−アミノと側鎖ヒドロキシルの間のプロリン様ＴＦＡ不安定オキサゾリジン環として保護される。オキサゾリジン環の結果として、ジペプチドは可逆的プロリン模倣体として機能する。
【０１１４】
フラグメント１＋２の合成における構築要素としてのそのようなプロリン模倣体の使用は、本発明に関連する有意な利点を提供する。第１に、フラグメント２の固相合成が著しく簡単になる。疑似プロリンがフラグメント２の固相合成の過程において使用されない場合、残基１３から１１までのＦｍｏｃ除去に有意な問題が存在しうる。この困難はベータシート形成に起因しうると考えられる。疑似プロリンの使用によって、これらのＦｍｏｃ除去が、恐らくはベータシート形成の程度を低下させることにより、ずっと簡単になる。疑似プロリン残基の非存在では、典型的な溶液相結合溶媒中でのフラグメントの溶解度は非常に悪い。疑似プロリンは、フラグメント２（及びフラグメント２、例えばフラグメント１＋２などを組み入れるより長いフラグメント）の溶解度の特徴を増強し、フラグメント１＋２の後の溶液相結合を簡単にする。
【０１１５】
固相合成は、一般的に、フラグメント１＋２のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｅ２７アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。しかし、Ｘ１７−１８疑似プロリンジペプチドを、ＧＬＰ−１（７−３６）の１７及び１８の位置に対応する位置において成長鎖に加える（天然Ｓｅｒ残基の対を１７及び１８の位置に連続的に加える代わりに）。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端スレオニン残基（Ｔ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。
【０１１６】
フラグメント３は、配列番号３０：
【表１２５】
2011506376.tif 000132
（式中、Ｘ３５は、上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２８から３５の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。配列番号３０のフラグメント３は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２８−３５）により表わしてよい。
【０１１７】
一部の実施態様において、ペプチドフラグメント３は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、側鎖、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。
【０１１８】
好ましい実施態様において、Ｘ３５は配列番号３１：
【表１２６】
2011506376.tif 000133
のＡｉｂである。
又は３５の位置にＡｉｂを含むその対応物である。配列番号３１のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２８−３５）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の３５の位置の天然アミノ酸におけるＡｉｂでの置換を記載する。
【０１１９】
配列番号３０及び３１のフラグメント３が、Ｃ末端の３６の位置においてＲ（Ａｒｇ）残基をまだ含まないことに留意すること。Ａｒｇは、後に、溶液相中で、好ましくは側鎖保護を伴わないＡｒｇを使用して、フラグメント３のＣ末端に結合される。この戦略は、スキーム２内で有意な利点を提供する。なぜなら、それは、保護Ａｒｇの使用の結果として生じる傾向のある望ましくない副反応を回避するからである。例えば、保護Ａｒｇの脱保護時、脱保護の副産物は、ペプチドの他の構成物（例、トリプトファン）と反応する傾向がありうる。これによって、精製のための粗精製物中で利用可能な所望のペプチドの量が低下する。
【０１２０】
配列番号３２：
【表１２７】
2011506376.tif 000134
（式中、Ｘ３５は上に定義する通りである）のフラグメント３’は、配列番号３２のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３’は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２８から３６の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。配列番号３２のフラグメント３’は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２８−３６）により表わしてよい。
【０１２１】
固相合成は、一般的に、フラグメント３のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ３５アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端グルタミン残基（Ｑ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。フラグメント３の合成において使用されるアミノ酸のいずれも、従来の実行に従って、側鎖保護を含みうる。
【０１２２】
Ｘ３５添加支持体樹脂に近接した立体障害のため、リジン（３４）及びバリン（３３）の成長ペプチド鎖上への結合が問題になりうる。過剰のアミノ酸を用いてでさえ、これらの結合反応を強制的に完結させることは困難である。溶媒選び及び／又はエンドキャッピングは、この問題を軽減する助けとなりうる。結合溶媒の性質が、結合が完結する程度に影響を及ぼしうることが見出されている。一組の実験において、例えば、結合反応は３：１  ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１  ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１  ＤＭＦ／ＤＣＭ、及び３：１  ＤＭＦ／ＤＣＭにおいて行われた。これらの溶媒の組み合わせにおける比率は、容積ベースである。ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを指し、ＤＣＭはジクロロメタンを指し、そしてＤＭＦはジメチルホルムアミドを指す。結合反応は、１：１  ＤＭＦ／ＤＣＭを使用した場合、さらに先に完結まで進行することが見出された。
【０１２３】
リジン及びバリンの各々の結合後のエンドキャッピングを使用して、未反応の樹脂支持材料がさらなる結合反応において進行することを防ぐこともできる。エンドキャップされた材料は、精製中に必要に応じて、より簡単に除去される。従来のエンドキャッピング技術を使用してよい。
【０１２４】
継続してスキーム２を参照し、フラグメント１、２及び３を、Ａｒｇと共に組み立てて、所望のペプチドを完成させる。
【０１２５】
スキーム２は、Ａｒｇをフラグメント３のＣ末端に溶液相中で加えて、配列番号３２
【表１２８】
2011506376.tif 000135
（式中、Ｘ３５は上に定義する通りであり、好ましくはＡｉｂである）の中間体フラグメント３’を産生することを示す。好ましくは、この方法でペプチドフラグメントに加えられたＡｒｇは、側鎖保護を含まない。
【０１２６】
フラグメント１＋２は、それにおいて１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒが、依然として、保護された疑似プロリン形状（配列番号２７）：
【表１２９】
2011506376.tif 000136
であり、表示（Ｘ１７−１８、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（１１−３６）により命名され、次にフラグメント３’に溶液相中で結合させる。他のアミノ酸が側鎖保護を持つ範囲で、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。フラグメント１＋２＋３を組み入れる、配列番号２６：
【表１３０】
2011506376.tif 000137
の所望のペプチドを次に形成させて、式中、好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は天然Ｇであり、そしてＸ１７−１８は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である。
【０１２７】
スキーム１及び２の反応スキームを行う際、固相及び溶液相合成は、工業において公知の標準的方法により行ってよい。代表的な実行方法において、ペプチドは固相中で、アミノ酸をＣ末端からＮ末端に付加する化学反応を使用して合成する。このように、特定のフラグメントのＣ末端に近接したアミノ酸基又はペプチド基が、樹脂に付加される第１のものである。これは、アミノ酸基又はペプチド基のＣ末端の官能性を、樹脂支持体上の相補的な官能性と反応させることにより生じる。アミノ酸基又はペプチド基のＮ末端側をマスクして、望ましくない副反応を防ぐ。アミノ酸基又はペプチド基は、望ましくは、側鎖保護も含む。次に、連続アミノ酸基又はペプチド基を、支持体結合ペプチド材料に、目的のペプチドが形成されるまで付着させる。これらの大半が、従来の実行に従って側鎖保護も含む。各々の連続結合を用いて、樹脂結合ペプチド材料のＮ末端のマスキング基を除去する。これを次に、Ｎ末端がマスクされた次のアミノ酸のＣ末端と反応させる。固相合成の産物は、このように、樹脂支持体に結合したペプチドである。
【０１２８】
フラグメントの質の差異（例えば、残留溶媒の量、残留ジベンゾフルベン、又はアッセイもしくは質における変異）の影響を最小限にするために、概念は、算出のための基礎として各フラグメントの全ペプチドアッセイを使用することであった。フラグメント２のペプチド性不純物の大半は、多かれ少なかれフラグメント２と同じ重量を有し、フラグメント２として反応し、そして、フラグメント３’のペプチド性不純物の大半は、多かれ少なかれフラグメント３’と同じ重量を有し、フラグメント３’として反応するため、全ペプチドの概念によって反応物の比率を調整することが可能になる。算出の目的のために、ジベンゾフルベンは一般的に考慮されない。なぜなら、それはペプチドではなく、質量に関して、そのＵＶシグナルにより大量に過大評価されるからである（フラグメントと同じ応答係数）。このように、フラグメントの全ペプチドアッセイを以下の通りに算出することができる：
ａ）アッセイ（%−mm）＊（１００−ジベンゾフルベンの量（%面積））／［質（%面積）］又は
ｂ）主成分及び全てのペプチド性不純物の合計（%−（w/w））−ジベンゾフルベン（%−（mm））（ペプチドと同じ応答係数）。
【０１２９】
固相ペプチド合成の実行において適した任意の型の支持体を使用することができる。好ましい実施態様において、支持体は、１つ又は複数のポリマー、コポリマー、又はポリマー（例えばポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、ポリサッカライド、又はポリスチレンなど）の組み合わせから作ることのできる樹脂を含む。ポリマー支持体は、また、ペプチド合成において使用される溶媒に十分に不溶性及び不活性である任意の固体でありうる。固体支持体は、典型的に、成長ペプチドを合成中に結合し、そして、所望の条件下で切断し、ペプチドを支持体から放出させることができる連結成分を含む。適した固体支持体は、光切断可能、ＴＦＡ切断可能、ＨＦ切断可能、フッ化物イオン切断可能、還元切断可能；Ｐｄ（Ｏ）切断可能；求核切断可能；又はラジカル切断可能なリンカーを有しうる。好ましい連結成分は、切断ペプチドの側鎖基が依然として実質的に、全体的に保護される条件下で切断可能である。
【０１３０】
１つの好ましい合成方法において、ペプチド中間体フラグメントは、トリチル基を含む酸感受性の固体支持体上で、より好ましくは、ペンダント塩素基を有するトリチル基を含む樹脂（例えば、２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂）上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30): 3943-3946）。例は、また、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアン酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂を含む。一部の好ましい固体支持体は、ポリスチレンを含み、それはジビニルベンゼンを用いてコポリマー化させて、反応基を固定させた支持体材料を形成することができる。
【０１３１】
固相合成において使用される他の樹脂は、「Ｗａｎｇ」樹脂（４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固定基を伴うスチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを含む）（Wang, S. S. 1973, J. Am. Chem. Soc.）、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706）を含む。Ｗａｎｇ、２−クロロトリチルクロリド、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えば、Calbiochem-Novabiochem Corp.（San Diego, California）から購入することができる。
【０１３２】
固相合成のための樹脂を調製するために、樹脂を適した溶媒中で予洗することができる。例えば、固相樹脂（例えば２−ＣＴＣ樹脂など）を、ペプチドチェンバーに加えて、適した溶媒を用いて予洗する。予洗溶媒を、結合反応において使用される溶媒（又は溶媒の混合物）の型に基づいて選んでよく、又は逆も同様である。洗浄、及びまた後の結合反応のために適した溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び同様のもの、ならびにこれらの試薬の混合物を含む。他の有用な溶媒は、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、及びその混合物を含む。一部の場合において、結合はバイナリー溶媒系、例えばＤＭＦ及びＤＣＭの混合物（容積比率９：１〜１：９の範囲、より共通して４：１〜１：４）などにおいて行うことができる。
【０１３３】
本発明の合成は、好ましくは、特に記載のない場合、適切な保護基の存在において行う。保護基の性質及び使用は、当技術分野において周知である。一般的に、適した保護基は、それが付着する原子又は成分（例、酸素又は窒素）が、プロセシング及び合成中に望ましくない反応に関与することを防ぐことを助けうる任意の種類の基である。保護基は、側鎖保護基及びアミノ保護基又はＮ末端保護基を含む。保護基は、また、カルボン酸、チオール、及び同様のものの反応又は結合を防ぐことができる。
【０１３４】
側鎖保護基は、側鎖の部分がペプチド合成、プロセシングなどの工程において使用される化学物質と反応することを防ぐことを助けるアミノ酸の側鎖（即ち、一般的なアミノ酸化学式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨ中のＲ基）に結合した化学部分を指す。側鎖保護基の選択は、種々の要素、例えば、実施される合成の型、ペプチドが供されるプロセシング、及び所望の中間産物又は最終産物に依存しうる。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般的に、固相合成中でのα−アミノ基の脱保護中に除去されない側鎖保護基が選ばれる。従って、α−アミノ保護基及び側鎖保護基は典型的に同じではない。
【０１３５】
一部の場合において、ならびに固相合成及び他のペプチドプロセシングにおいて使用される試薬の型に依存して、アミノ酸は側鎖保護基の存在を要求しないことがある。そのようなアミノ酸は、典型的に、反応性酸素、窒素、又は他の反応性部分を側鎖中に含まない。
【０１３６】
側鎖保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）及び２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル及びｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（ｃＢｚ又はＺ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃ１−Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、及び芳香族又は脂肪族ウレタン型保護基、光不安定基、例えばニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）など；及びフッ化物不安定基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などを含む。
【０１３７】
本発明の実行においてＧＬＰ−１ペプチドを合成するために共通して使用されるアミノ酸のための好ましい側鎖保護基を、以下の表Ａにおいて示す：
【０１３８】
【表１３１】
2011506376.tif 000138
【０１３９】
アミノ末端保護基は、アミノ酸のアルファアミノ基に結合した化学部分を含む。典型的に、アミノ末端保護基は、成長ペプチド鎖に加えられるべき次のアミノ酸の添加前での脱保護反応中に除去されるが、しかし、ペプチドが支持体から切断される際に維持させることができる。アミノ末端保護基の選択は、種々の要素、例えば、実施される合成の型及び所望の中間産物又は最終産物に依存しうる。
【０１４０】
アミノ末端保護基の例は、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、及びアセチル（Ａｃ）；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）及び置換Ｚなど、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど；（３）脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなど；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えば９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニルなど；及び（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニルなどを含む。好ましい保護基は、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。
【０１４１】
Ｆｍｏｃ又はＦｍｏｃ様化学は、固相ペプチド合成のために高度に好ましい（結果として生じるペプチドの保護された状態での切断を、比較的容易に弱酸性の切断剤を使用して行えるからである）。この種類の切断反応は、結果として生じる副産物、不純物などに関して比較的清浄であり、ペプチドを大規模ベースで膨潤及び収縮洗浄の両方から回収することを技術的及び経済的に実行可能にして、収率を増強する。本明細書において使用する、ペプチド合成に関する「大規模」は、一般的に、少なくとも５００g、より好ましくは少なくとも２kg/バッチの範囲のペプチド合成を含む。大規模合成は、典型的に、大きな反応容器、例えば鉄製反応容器など（試薬、例えば樹脂、溶媒、アミノ酸、結合及び脱保護反応のための化学物質などの分量を収容することができ、キログラムからメートルトンの範囲でのペプチド産生を可能にするサイズになっている）において実施される。
【０１４２】
また、Ｆｍｏｃ保護基は、側鎖保護基と比べて、ペプチドから選択的に切断することができ、側鎖保護が、Ｆｍｏｃ切断時にその場に残される。この種類の選択性は、側鎖反応を最小限にするためにアミノ酸結合中に重要である。また、側鎖保護基を選択的に切断して、Ｆｍｏｃと比べてそれらを除去して、Ｆｍｏｃをその場所に残すことができる。この後者の選択性は、非常に有利なことに、以下でさらに記載する精製スキーム中で信頼される。
【０１４３】
固相結合反応を、結合反応を増強又は改善する１つ又は複数の化合物の存在において実施することができる。反応の速度を増加させ、副反応の速度を低下させることができる化合物は、ホスホニウム塩及びウロニウム塩を含み、それらは、第３級塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ））の存在において、保護アミノ酸を活性種（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、及びＴＢＴＵ（ＨＯＢｔエステルを生成する）及びＤＥＰＢＴ（ＨＯＯＢｔエステルを生成する））に変換することができる。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化を防ぐことを助ける。これらの試薬は、加えられた補助求核剤（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、又はＨＯＳｕ）を伴うカルボジイミド（例えば、ＤＣＣ又はＷＳＣＤＩ）を含む。混合酸無水物法（クロロギ酸イソブチルを使用し、補助求核剤を加えて又は加えず）も、アジド法で可能なように、それに関連する低ラセミ化のため、利用してよい。これらの型の化合物も、カルボジイミド媒介性結合の速度を増加させ、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎ残基の脱水を防ぐことができる。
【０１４４】
結合が完結したことを判断した後、結合反応混合物を、溶媒を用いて洗浄し、結合サイクルを、ペプチド材料の後のアミノ酸残基の各々について繰り返す。次のアミノ酸を結合させるために、樹脂結合材料からのＮ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去は、典型的に、２０〜５０%（重量ベース）のピペリジンを溶媒（例えばＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など）中に含む試薬を用いた処理により達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、数回の洗浄を典型的に実施して、残留ピペリジン及びＦｍｏｃ副産物（例えばジベンゾフルベン及びそのピペリジン付加体など）を除去する。
【０１４５】
後のアミノ酸を、樹脂支持体上のペプチド材料の添加係数に関して、化学量論的に過剰のアミノ酸で利用することができる。一般的に、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、樹脂上の第１のアミノ酸の添加係数と少なくとも等しい（１当量又はそれ以上）。好ましくは、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、少なくとも１．３当量（０．３過剰）又はそれ以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）又はそれ以上である。一部の場合において、例えば、結合工程は、１〜３の範囲のアミノ酸と等しい量を利用する。
【０１４６】
最終結合サイクルに続き、樹脂を、溶媒（例えばＮＭＰなど）を用いて洗浄し、そして次に不活性な第２溶媒（例えばＤＣＭなど）を用いて洗浄する。合成されたペプチド材料を樹脂から除去するために、切断処理を、切断されたペプチド材料が依然として十分な側鎖基及び末端保護基を持つような様態で行う。保護基をその場所に残すことによって、樹脂切断中又は後でのペプチドフラグメントの望ましくない結合又は他の望ましくない反応を防ぐ助けとなる。Ｆｍｏｃ又は類似の化学反応を使用し、ペプチドを合成する場合において、保護された切断は、任意の所望の様式、例えば、比較的弱酸性の試薬（例えば酢酸又は希釈ＴＦＡなど）の溶媒（例えばＤＣＭなど）中での使用などにより達成してよい。０．５〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡのＤＣＭ中での使用が典型的である。例えば、米国特許第６，２８１，３３５号を参照のこと。
【０１４７】
ペプチド中間体フラグメントを固相樹脂から切断する工程は、例示のプロセスのラインに沿って進行することができ、以下の通りである。しかし、ペプチド中間体フラグメントを樹脂から効率的に切断する任意の適したプロセスを使用することができる。例えば、約５〜２０、好ましくは約１０容積の酸性切断試薬を含む溶媒を、樹脂結合ペプチド材料を含む容器に加える。樹脂は、典型的に、ビーズの形状であり、結果として試薬中に浸す。切断反応は、液体内容物を適した温度で適した時間にわたり撹拌する際に生じる。撹拌によってビーズが凝集することを防ぐ助けとなる。適した時間及び温度条件は、要素、例えば使用される酸性試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質、及び同様のものなどに依存する。一般的なガイドラインとして、約−１５℃〜約５℃、好ましくは約−１０℃〜約０℃で約５分間〜２時間、好ましくは約２５分間〜約４５分間の撹拌が適しうる。切断時間は、約１０分間〜約２時間の範囲、又はさらに１日でありうる。切断は、望ましくは、そのような冷却温度の範囲において行われ、典型的に反応中に生じうる発熱反応に順応させる。また、切断反応のより低い温度によって、酸感受性の側鎖保護基（例えばｔｒｔ基など）のこの段階での除去が防がれる。
【０１４８】
切断処理の終了時、反応をクエンチする。これは、例えば、切断試薬を適した塩基（例えばピリジン又は同様のものなど）と組み合わせ、かき混ぜ及び撹拌を追加期間、例えば追加の５分間〜２時間など、好ましくは約２０分間〜約４０分間にわたり継続することにより達成してよい。塩基を加えて、撹拌を継続することによって、容器の内容物の温度が増加する。撹拌の終了時、容器の内容物は、約０℃〜約１５℃、好ましくは約５℃〜約１０℃の範囲の温度でよい。
【０１４９】
ペプチド回収の局面を改善するために樹脂を膨潤又は収縮させるなどの要素を、場合により、全合成プロセス中に組み入れることができる。これらの技術は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１６４９１２  Ａ１号において記載されている。
【０１５０】
一部の局面において、切断されたペプチドフラグメントを、他のペプチドフラグメント及び／又はアミノ酸への溶液相結合のために調製することができる。溶液相中でのペプチド結合反応は、例えば、New Trends in Peptide Coupling Reagents；Albericio, Fernando； Chinchilla, Rafeal；Dodsworth, David J.；及びNajera, Armen；Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303において概説されている。
【０１５１】
ペプチド中間体フラグメントの他のフラグメント又はアミノ酸への溶液相中での結合は、ｉｎ  ｓｉｔｕ結合試薬、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホウ酸（ＨＡＴＵ）、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホスフェート（ＴＡＴＵ）、ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＣＴＵ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビオス（oxybios）−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｙＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−ワン（ＤＥＰＢＴ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、ｏ−（シアノ−エトキシカルボニル−メチレンアミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＯＴＵ）、又はｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ）を使用して行うことができる。他の結合技術では、事前に形成された活性エステル、例えばヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及びｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなど；事前に形成された対称無水物；非対称無水物、例えばＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）など；又は酸ハロゲン化物、例えばアシルフッ化物など、ならびにアシルクロリドを使用する。
【０１５２】
適した結合溶媒を、溶液相結合反応において使用することができる。使用される結合溶媒が、形成されるペプチド結合のラセミ化の程度；ペプチド及び／又はペプチドフラグメントの溶解度；及び結合反応速度に影響を及ぼしうることが理解される。一部の実施態様において、結合溶媒は、１つ又は複数の水混和性試薬を含む。水混和性溶媒の例は、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、又はそれらの混合物を含む。
【０１５３】
他の実施態様において、結合反応は、１つ又は複数の非水混和性試薬を含んでよい。例示的な非水混和性溶媒は、メチレンクロリドである。これらの実施態様において、非水混和性溶媒は、好ましくは、脱保護反応に適合する；例えば、非水混和性溶媒を使用する場合、好ましくは、それは脱保護反応に悪影響を及ぼさない。
【０１５４】
配列番号１０のペプチドが形成された後、産物を、脱保護、精製、凍結乾燥、さらなるプロセシング（例、融合タンパク質を形成するための別のペプチドとの反応）；これらの組み合わせ、及び／又は同様のものに、適宜、供することができる。
【０１５５】
例えば、本発明によると、側鎖保護基は、典型的に、固相合成の間中、また、溶液相結合反応へ、及び、それの間中、ペプチド中間体フラグメント上に保持される。一般的に、溶液相工程が完結した後、１つ又は複数の脱保護工程を実施して、１つ又は複数の保護基をペプチドから除去してよい。
【０１５６】
全体的な脱保護による側鎖保護基の除去では、典型的に、酸分解剤（acidolytic agent）を含む脱保護溶液を利用して、側鎖保護基を切断する。全体的な脱保護のために共通して使用される酸分解試薬は、ニート（neat）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ルイス酸（例えばＢＦ３Ｅｔ２Ｏ又はＭｅ３ＳｉＢｒなど）、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、トリフルオロメタンスルホン酸、及びそれらの組み合わせを含む。脱保護溶液は、また、１つ又は複数の適した陽イオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、ｐ−クレゾール、エタンジチオール、又はジメチルスルフィドを含む。脱保護溶液は水も含みうる。本明細書において使用する通り、脱保護組成物中に存在する試薬の量は、典型的に、比率で表わされ、ここで個々の成分の量は、「部」、例えば「重量部」又は「容積部」などの中の分子として表わされ、分母は組成物中の全部分である。例えば、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを９０：５：５（重量／重量／重量）の比率で含む脱保護溶液は、ＴＦＡを９０／１００重量部で、Ｈ２Ｏを５／１００重量部で、ＤＴＴを５／１００重量部で有する。
【０１５７】
析出は、典型的に、エーテル、例えば、ジエチルエーテル又はＭＴＢＥ（メチルタートブチルエーテル）を使用して行われる。析出後、ペプチドは、望ましくは、他の成分と組み合わせる前に単離及び乾燥させ、凍結乾燥し、容器に入れ、保存し、さらにプロセシングし、及び／又は別の方法で取り扱う。これは、任意の適した様式で達成してよい。適したアプローチによると、ペプチドを、ろ過を介して回収し、十分なＭＴＢＥ洗浄液を用いて洗浄し、最終塩含量を適したレベルにまで低下させ、そして次に乾燥させる。
【０１５８】
本発明は、また、広範囲のペプチド（ＧＬＰ−１ペプチド及びそれらの対応物を含む）を精製するための有用な技術を提供する。
【０１５９】
特に好ましい精製プロセスは、クロマトグラフィー媒体を通じた少なくとも２つの精製通過を含み、ここで少なくとも第１の通過が第１のｐＨで起こり、そして少なくとも第２の通過が第２のｐＨで起こる。より好ましくは、第１の通過は酸性ｐＨで起こり、第２の通過は塩基性ｐＨで起こる。好ましい実施態様において、酸性条件下での少なくとも１つの通過が、塩基性条件下で起こる通過の前に起こる。この精製アプローチを実行する例示的な方法を、完全に保護されたペプチド１１を精製する例示的な状況において記載することができる。最初に、ペプチドは全体的に脱保護される。Ｎ末端基及び側鎖保護基の両方が切断される。第１のクロマトグラフィー通過は、水／ＡＣＮ勾配において、ｐＨ約１〜５、好ましくは約２を提供するために十分なＴＦＡを使用して行われる。第２の通過は、次に、水／ＡＣＮ勾配において、ｐＨ約８〜９前後、好ましくは約８．５〜８．９を提供するために少量のアンモニア及び／又は酢酸アンモニウム、又は同様のものを使用して行われる。
【０１６０】
ｐＨ値は、酸性又は塩基性を問わず、均一なイオン種が各々の例において存在する点で均一性を促進させる。このように、酸性ｐＨは、望ましくは、十分に低く、ペプチド材料中の実質的に全てのアミノ酸残基がプロトン化される。塩基性ｐＨは、望ましくは、十分に高く、ペプチド材料中の実質的に全てのアミノ酸残基が脱プロトン化される。酸性及び塩基性のクロマトグラフィーは、任意の順番で行うことができる。酢酸ペプチドが所望の産物である場合、塩基性クロマトグラフィーを最後に行うことが便利である（酢酸がクロマトグラフィーの産物でありうるからである）。
【０１６１】
共通して使用される略語は以下を含む：アセチル（Ａｃ）、アゾ−ビス−イソブチリルニトリル（ＡＩＢＮ）、雰囲気（Ａｔｍ）、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ又はＢＢＮ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルピロカルボネート又はＢｏｃ無水物（ＢＯＣ２Ｏ）、ベンジル（Ｂｎ）、ブチル（Ｂｕ）、Chemical Abstracts Registration Number（ＣＡＳＲＮ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、ジエチルアミノ硫黄三フッ化物（ＤＡＳＴ）、ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）、（３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）（ＤＥＰＢＴ）、ジ−イソ−アゾジカルボン酸プロピル（ＤＩＡＤ）、ジ−イソ−ブチルアルミニウムヒドリド（ＤＩＢＡＬ又はＤＩＢＡＬ−Ｈ）、ジ−イソ−プロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、エチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，１’−ビス−（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、１，１’−ビス−（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（ｄｐｐｆ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、エチル（Ｅｔ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、２−エトキシ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステル（ＥＥＤＱ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート酢酸（ＨＡＴＵ）、酢酸（ＨＯＡｃ）、１−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＬｉＨＭＤＳ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、融点（ｍｐ）、ＭｅＳＯ２−（メシル又はＭｓ）、メチル（Ｍｅ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ｍ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）、質量スペクトル（ｍｓ）、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ピリジニウムクロロクロマート（ＰＣＣ）、ピリジニウムジクロマート（ＰＤＣ）、フェニル（Ｐｈ）、プロピル（Ｐｒ）、イソ‐プロピル（ｉ−Ｐｒ）、ポンド毎平方インチ（ｐｓｉ）、ピリジン（ｐｙｒ），（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、室温（ｒｔ又はＲＴ）、ｔｅｒｔ���ブチルジメチルシリル又はｔ−ＢｕＭｅ２Ｓｉ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ又はＥｔ３Ｎ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、トリフラート又はＣＦ３ＳＯ２−（Ｔｆ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，１’−ビス−２，２，６，６−テトラメチルヘプタン−２，６−ジオン（ＴＭＨＤ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリメチルシリル又はＭｅ３Ｓｉ（ＴＭＳ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（ＴｓＯＨ又はｐＴｓＯＨ）、４−Ｍｅ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ２−又はトシル（Ｔｓ）、Ｎ−ウレタン−Ｎ−カルボキシ無水物（ＵＮＣＡ）。接頭辞ノルマル（ｎ）、イソ（ｉ−）、第二級（sec−）、第三級（tert−）、及びネオを含む従来の命名法は、アルキル部分と使用された場合、それらの慣習的な意味を有する。（J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.）。
【０１６２】
本発明の原理を、ここで、以下の例示的な実施例に関してさらに説明する。以下において、全てのパーセント及び比率は、別に明確に記載しない場合、容積による。
【０１６３】
実施例
実施例１〜１８は、スキーム１において記載される結合反応スキーム及び本明細書におい定義されるフラグメント１、２、３、及び３’に関する。
【０１６４】
実施例１
Ｎ末端でのＦｍｏｓ保護、ならびにＨｉｓ及びＧｌｕでの側鎖保護を用いたフラグメント１の固相合成
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
最初に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【０１６５】
【表１３２】
2011506376.tif 000139
【０１６６】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、２５℃で膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０１６７】
床を排出させて、３５０mLのＤＭＦで１回そして１７５mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３５０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、２５０mLのＤＭＦで２回、そして次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量まで乾燥させて、３８．２０gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．１８mmol/gを示した。
【０１６８】
Ｂ．固相合成
この実施例１のパートＡにおいて調製された、０．１８mmol/gで添加された２０．０gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１６９】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへのＮＭＰで５回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１７０】
結合溶液を調製するために、アミノ酸（２．８５当量）及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、２．８５当量）を秤量し、２．５５×容積のＮＭＰ中に溶解させて、次にＤＩＥＡ（３．２５当量）と５℃〜１０℃で合わせた。ＴＢＴＵ（２．８５当量）を１．３×容積のＮＭＰ中に５℃〜１０℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。フラスコを、リアクター中に加えられた１．３×容積のＤＣＭでリンスして、それを次に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応が３時間後に未完了であった場合（ポジティブなカイザーテスト）、反応容器を排出させて、再結合を、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて実施した。結合反応の完了後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。次に、Ｆｍｏｃ保護基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０１７１】
活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨとＨ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣの間での結合反応の困難さ、及び、活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの不安定さのため、結合反応は、１時間後に反応溶液を排出させて、そして直ぐに、第２の新鮮な活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ溶液を用いて再結合反応を実施することにより強制的に完了させた。
この実施例のパートＢにおいて使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０１７２】
【表１３３】
2011506376.tif 000140
【０１７３】
樹脂結合ペプチドフラグメントを、ＮＭＰ（５容積）で４回、ＤＣＭ（６容積）で５回、ＩＰＡ（５容積）で３回、洗浄した。脱膨潤させた樹脂を、次に、３５℃で、真空下で乾燥させて、２２．５８gの樹脂及び樹脂結合ペプチドを得た。
【０１７４】
Ｃ．樹脂からのＦｍｏｃ及び側鎖保護フラグメントの切断。
上述の構築されたパートＢからの樹脂を、ＤＣＭ（使用された樹脂の重量と比べて１２．５容積；１２．５mlのＤＣＭ/樹脂のg又は１２．５リットル/kg）中で３０分間、２５℃で膨潤させて、そして次に、ＤＣＭで２回洗浄し（各々の洗浄で６．２５容積）、ＮＭＰ残基を除去した。樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１０容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）をリアクターに加えて、ＴＦＡを中和した。切断溶液をろ過除去して、フラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで７回（７．５容積）洗浄した。洗浄液を切断溶液と合わせた。ＤＣＭ切断溶液を水（７．５容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。ペプチドフラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計４．７３gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨが得られた。
【０１７５】
実施例２
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【０１７６】
【表１３４】
2011506376.tif 000141
【０１７７】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５容積）中の溶液Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡを加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０１７８】
樹脂床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回そして２００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３９０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１容積）溶液で１時間エンドキャップした。床を再び排出させて、３５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、そして３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を次に３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を、３５℃で、真空下で一定重量まで乾燥させて、４８．５１gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．５４mmol/gを示した。
【０１７９】
Ｂ．固相合成
０．５４mmol/gで添加された２７．５９gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（３００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１８０】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰで６回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１８１】
結合溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、４．６×容積のＮＭＰ中に溶解させて、次にＤＩＥＡ（１．９当量）と１０℃〜５℃で合わせた。ＴＢＴＵ（１．７当量）を２．２８×容積のＮＭＰ中に１０℃〜５℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。フラスコを、２．２８×容積のＤＣＭでリアクター中へリンスして、それを次に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応の完了後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。Ｆｍｏｃ保護基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０１８２】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０１８３】
【表１３５】
2011506376.tif 000142
【０１８４】
Ｃ．樹脂からのフラグメントの切断
構築された樹脂を、ＮＭＰ（５容積）で６回、そして次にＤＣＭ（６容積）で８回洗浄して、ＮＭＰ残基を除去した。樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させた後、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷（−５℃〜−１０℃）溶液（１０容積）を加えて、結果として生じたポット混合物を３０分間、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）をリアクターに充填して、ＴＦＡを中和した。切断溶液をフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（７．５容積）で１１回洗浄し、切断溶液中に排出させた。ＤＣＭ溶液を水（１０容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計１１．１２gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨ（７８．８%収率）が得られた。
【０１８５】
実施例３
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【０１８６】
【表１３６】
2011506376.tif 000143
【０１８７】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５容積）中の溶液Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡを加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０１８８】
床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３９０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、３５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、そして次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を４×２５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を、３５℃で、真空下で一定重量まで乾燥させて、５２．０２gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．７２mmol/gを示した。
【０１８９】
Ｂ．固相合成
０．７２mmol/gで添加された２４．４３gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１９０】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰを用いて６回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。
【０１９１】
結合溶液を調製するために、アミノ酸及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ）を秤量し、ＮＭＰ中に溶解させて、次にＤＩＥＡと５℃〜１０℃で合わせた。ＴＢＴＵをＮＭＰ中に５℃〜１０℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。フラスコを、ＤＣＭ（量については以下の表を参照のこと）でリアクター中へリンスして、それを２〜６時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応が３時間後に未完了であった場合（ポジティブなカイザーテスト）、反応容器を排出させて、再結合を、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて実施した。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。次に、Ｆｍｏｃ基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０１９２】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０１９３】
【表１３７】
2011506376.tif 000144
【０１９４】
Ｃ．樹脂からのフラグメントＦｍｏｃ−ＡＡ（７−１０）−ＯＨの切断
構築された樹脂を、ＮＭＰ（５容積）で６回、そしてＤＣＭ（６容積）で７回洗浄して、ＮＭＰを除去した。樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、樹脂床を、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷（−５℃〜−１０℃）溶液（１１．２６容積）で５分間、０℃で洗浄した。切断溶液をフラスコ中に回収して、そこにはピリジン（全ＴＦＡの１．３当量）が、ＴＦＡを中和するために加えられていた。次に、冷１%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（６．１４容積）の第２の部分がリアクターに加えられ、２分間、撹拌された。第２の切断溶液を、再び、回収フラスコ中に排出させた。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（８．２容積）で９回洗浄し、切断溶液中に排出させた。ＤＣＭ溶液を水（８．２容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計１４．０２gの配列番号７のＦｍｏｃ−（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨ（８６．６%収率）が得られた。分析は純度９４．３%  ＡＮを示した。
【０１９５】
実施例４
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ
ＧＰＡフラグメント２の固相合成
０．４３mmole/gで添加された２０．０gのＨ−Ｇｌｙ−２−ＣＴ樹脂を用いて開始し、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−２２）−ＯＨの固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。容積の全てのスケーリングは、最初の樹脂重量（２０．０g）又は樹脂上の添加アミノ酸のモル数（８．６mmole）と比べてである。
【０１９６】
結合溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、３．４容積のＮＭＰ中に溶解させ、次にＮＭＰ中のＨＢＴＵ（１．７当量）溶液（１．３２容積）と合わせ、そして次にＤＩＥＡ（３．５当量）を０℃〜５℃で加えることにより活性化させた。結果として得られた溶液を、樹脂を含む反応容器に加えて、活性化フラスコを、１．５７容積のＤＣＭでリアクター中へリンスし、それを次に４時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。４時間の結合反応混合物の撹拌後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で６容積）。樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。Ｆｍｏｃ基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｅｕ→Ｔｙｒ（ｔＢｕ）→Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）→Ｖａｌ→Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）→Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）→Ｐｈｅ→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）の順番で）。
【０１９７】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０１９８】
【表１３８】
2011506376.tif 000145
【０１９９】
構築された樹脂を、ＮＭＰ（６容積）で４回、そしてＤＣＭ（６容積）で７回洗浄した。
【０２００】
構築された樹脂からのフラグメント２（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−２２）−ＯＨ）の切断：
上述の構築された樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  v/v  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１０容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡと比べて１．３８当量）を切断レシーバーに加えて、ＴＦＡを中和させた。３０分間の撹拌後、切断溶液を切断レシーバー中に回収した。次に、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの別の冷溶液（５容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡへ１．３８当量）を切断容器に加えて、ＴＦＡを中和した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで６回（６容積）洗浄し、切断溶液レシーバー中に排出させた。結果として生じるＤＣＭ切断及び洗浄溶液を濃縮させて（７．５容積）、そして次に水（５容積）と合わせた。底のＤＣＭ層をさらに濃縮させて（１．５容積）、ヘプタン（２０容積）中に入れ、産物を析出させた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、残りのＤＣＭを除去した（３５０〜１００トール、２５℃）。フラグメント２が、ＤＣＭ除去時にヘプタンから析出した。フラグメント２をへプタンで洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計１４．３５gのＧＰＡ  Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−２２）−ＯＨ（純度８８．４%  ＡＮ）が得られた（収率８５．５%）。
【０２０１】
実施例５
上のバッチ構築を繰り返した。構築された樹脂からのフラグメント２の切断後、ＤＣＭ溶液を７．５容積まで濃縮して、水（各々５容積で３回）で洗浄した。底のＤＣＭ層を３．７５容積まで再び濃縮した。このＤＣＭ溶液を水（２０容積）と合わせて、残りのＤＣＭを、真空下で、２５℃で除去した。析出産物を次にろ過し、真空下で、３５℃で乾燥させた。これは、１４．９５gのフラグメント２（８９%収率、９３．１%  ＡＮ純度）を与えた。
【０２０２】
実施例６
側鎖保護されたＦｍｏｃ−（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨ（フラグメント３）の固相合成：
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【表１３９】
2011506376.tif 000146
【０２０３】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ及びＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０２０４】
床を排出させて、ＤＭＦ４００mLで１回そして２００mLで２回目の洗浄をした。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、４００mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させた。樹脂を、４５０mLのＤＭＦ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（４：０．９：０．１）で１回、２００mLのＤＭＦで１回、そして３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量まで乾燥させて、４５．１５gの添加樹脂を与えた。分析は添加係数０．２４mmol/gを示した。
【０２０５】
Ｂ．固相合成
１０．０１gのＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂（添加係数０．２４mmol/g）を反応容器に充填して、ＤＣＭ（１２０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。
【０２０６】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の５%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の５%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を４回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。
【０２０７】
結合溶液を調製するために、アミノ酸（１．８７５当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢＴ水和物、２．０７当量）を３．５×容積のＮＭＰ中に５℃〜１０℃で溶解させて、そして次にＮＭＰ中のＨＢＴＵ（２．０当量）の１６．１mL溶液（１．５×容積）と合わせた。次に、２．２mLのＤＩＥＡ（２．６３当量）を活性化容器に１０℃〜５℃で加えた。結果として生じた溶液を反応容器に移した。活性化容器を、１．５×容積のＤＣＭでリアクター中へリンスし、それを次に２時間、２５℃で撹拌した。反応容器を排出させた。結合反応を、活性化アミノ酸（１．８７５当量）の新鮮溶液を用いてもう１回繰り返した。第２の結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で６容積）。次に、Ｆｍｏｃ基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０２０８】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０２０９】
【表１４０】
2011506376.tif 000147
2011506376.tif 000148
【０２１０】
構築された樹脂を、ＮＭＰ（６容積）で４回、ＤＣＭ（６容積）で４回、そしてイソプロパノール（ＩＰＡ、６容積）で３回洗浄することにより単離した。構築された樹脂を、３５℃で、真空下で乾燥させた。１４．３gの構築された樹脂が得られた。
【０２１１】
Ｃ．構築された樹脂からの中間体フラグメントの切断
上述の構築された樹脂６．６gを、１０×容積のＤＣＭ中で３０分間、膨潤させて、そして−１０℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１２容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン（ＴＦＡの２〜３当量）を含むフラスコ中に回収した。２５℃まで温めながら、樹脂を１%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０×容積）と５分間撹拌し、ピリジン（２〜３当量）を加えた。さらに５分後、溶液を回収した。樹脂をＤＣＭで４回（１０容積）洗浄した。全てのＤＣＭ洗浄液を水と合わせた（水／ＤＣＭ＝１／４）。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。切断手順をもう１回繰り返した。合計２．３６gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨが得られた（９２%収率）。
【０２１２】
実施例７
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。この実施例において使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【０２１３】
【表１４１】
2011506376.tif 000149
【０２１４】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）中の溶液Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ及びＤＩＥＡを加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０２１５】
床を排出させて、４００mLのＤＭＦで洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、４００mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回、２００mLのＤＭＦで１回、そして３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量まで乾燥させて、４５．３２gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．３０mmol/gを示した。
【０２１６】
Ｂ．固相合成
０．３０mmole/gで添加された１５．０gのＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（１５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＤＣＭ（各々の洗浄で６容積）で２回、そしてＮＭＰ（各々の洗浄で６容積）で３回洗浄した。
【０２１７】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰ（各々の洗浄で６容積）を用いて６回洗浄した。
【０２１８】
結合溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、２．６×容積のＮＭＰ中に１０℃〜５℃で溶解させ、そして次にＤＩＥＡ（１．９〜３．０当量）と合わせた。ＴＢＴＵ又はＨＢＴＵ（１．７当量）を１．３３×容積のＮＭＰ中に１０℃〜５℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。混合フラスコを、１．３３×容積のＤＣＭでリアクター中へリンスして、それを次に樹脂と共に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応が３時間後に未完了であった場合（ポジティブなカイザーテスト）、反応容器を排出させて、再結合を、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて実施した。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で６容積）。次に、Ｆｍｏｃ基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０２１９】
２−メチルアラニン（Ａｉｂ）と２−ＣＴＣ樹脂の間での起こりうるバトレッシング効果（buttressing effect）のため、第１の２つのアミノ酸結合反応（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４及びＶａｌ−３３）を強制的に完了させるためにはかなりの困難が存在する。従って、（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４、Ｖａｌ−３３）のための両方の結合反応を、３回実施した（即ち、結合の後に２回の再結合が続いた）。また、無水酢酸を使用して、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４及びＶａｌ−３３の結合反応後に、未反応の樹脂結合材料をエンドキャップした。これによって後の精製の効率が改善されている（クロマトグラフィー精製中に不純物を所望の産物から遠く移動させることによる）。
【０２２０】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０２２１】
【表１４２】
2011506376.tif 000150
2011506376.tif 000151
【０２２２】
Ｃ．構築された樹脂からのフラグメントの切断
上述の構築された樹脂を、ＤＣＭで７回洗浄し（各々の洗浄で６容積）、ＮＭＰ残基を除去し、樹脂を最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１２容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（１０容積）で９回洗浄し、切断溶液中に排出させた。ＤＣＭ溶液を水（６容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。この実施例では、切断手順をもう１回繰り返した。合計６．７８gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨが得られた（６８．１%収率）（純度８７．３%  ＡＮ）。
【０２２３】
実施例８
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。この実施例において使用された試薬の量を以下の表に列挙する：
【０２２４】
【表１４３】
2011506376.tif 000152
【０２２５】
２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ及びＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。
【０２２６】
床を排出させて、４００mLのＤＭＦで洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、４００mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回洗浄し、２００mLのＤＭＦで１回洗浄し、そして３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量まで乾燥させて、４７．５６gの添加樹脂を与えた。分析は添加係数０．３７mmol/gを示した。
【０２２７】
Ｂ．固相合成
０．３７mmole/gで添加された２５．０gのＦｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＤＣＭ（各々の洗浄で６容積）で２回、そしてＮＭＰ（各々の洗浄で６容積）で３回洗浄した。
【０２２８】
樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰ（各々の洗浄で６容積）を用いて６回洗浄した。
【０２２９】
結合溶液を調製するために、アミノ酸及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ）を秤量し、３．２×容積のＮＭＰ（又はＬｙｓ−３４、Ｖａｌ−３３、及びＧｌｎ−２３ではＤＭＦ）中に溶解させ、次にＤＩＥＡと１０℃〜５℃で合わせた。ＴＢＴＵを１．６×容積のＮＭＰ（又はＬｙｓ−３４、Ｖａｌ−３３、及びＧｌｎ−２３ではＤＭＦ）中に１０℃〜５℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加え、フラスコを、１．６×容積のＤＣＭでリアクター中へリンスして、それを樹脂と共に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、反応の完了をチェックした。結合反応が３時間後に未完了であった場合（ポジティブなカイザーテスト）、反応容器を排出させて、再結合を、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて実施した。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、そして樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で６容積）。次に、Ｆｍｏｃ基の脱保護及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）の順番で）。
【０２３０】
２−メチルアラニン（Ａｉｂ）と２−ＣＴＣ樹脂の間での起こりうるバトレッシング効果のため、第１の２つのアミノ酸結合反応（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４及びＶａｌ−３３）を強制的に完了させるためにはかなりの困難が存在する。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４、Ｖａｌ−３３、及びＧｌｎ（ｔｒｔ）−２３のための結合条件を、アミノ酸と６−Ｃｌ−ＨＯＢＴの両方の使用量を１．７当量から２．５当量まで、及び、ＤＩＥＡを１．９当量から３．０当量まで増加させることにより改変した。結合反応のための溶媒も、結合反応を強制的に完了させるために、ＮＭＰからＤＭＦに変えた。また、この実施例において、無水酢酸を使用して、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−３４及びＶａｌ−３３の結合反応後に、未反応の樹脂結合材料をエンドキャップした。これによって後の精製の効率が改善されている（クロマトグラフィー精製中に不純物を所望の産物から遠く移動させることによる）。
【０２３１】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０２３２】
【表１４４】
2011506376.tif 000153
2011506376.tif 000154
【０２３３】
Ｃ．構築された樹脂からのフラグメントの切断。
上述の構築された樹脂を、ＤＣＭで６回洗浄し（各々の洗浄で６容積）、ＮＭＰを除去し、樹脂を最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１０容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで７回（６容積）洗浄し、切断溶液中に排出させた。ＤＣＭ溶液を水（１０容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。この実施例では、切断手順をもう１回繰り返して、完全な切断を達成した。合計１２．３６gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）−ＯＨが得られた（５９．３５%収率）（純度８４．３%  ＡＮ）。
【０２３４】
ＧＰＡフラグメント２＋３’、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−３６）−ＮＨ２の第１のＧＰＡ溶液相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２３５】
実施例９
ＧＰＡフラグメント３’の溶液相合成：
ＧＰＡフラグメント３、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−ＯＨ、（１０．０g、１．０当量）（Ｌｏｔ＃  ＢＯ７０５Ｐ００１）及びＬ−アルギニンアミドジヒドロクロリド（２．１４g、２．０当量）を、ＤＭＳＯ（４２mL）と混合して、２３℃〜２５℃で３０分間、撹拌した。この溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、２．０当量）及びＨＢＴＵ（２．０当量）（ＤＭＳＯ  ４２mL中）ならびにＤＩＥＡ（５．０当量）を充填した。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。２２時間後、反応が完了していた。次に、ピペリジン（５．０当量）を反応溶液に加えた。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、９５分後に２５℃で行った。ＭＴＢＥ（６０mL）及びヘプタン（６０mL）の溶液を加えて、反応溶液を抽出し、過剰なピペリジンを除去した。次に、この２相の混合物を水（２４０mL）に加えて、産物を２０℃〜２２℃で析出させた。沈降後、上のＭＴＢＥ／ヘプタン層を分離し、底の産物を伴う水性ＤＭＳＯ層をろ過し、追加のＭＴＢＥ／ヘプタンで洗浄した。３５℃での真空乾燥後、フィルタケーキは１１．１gのＧＰＡフラグメント３’を与えた。ＨＰＬＣ分析は、７２．９%  ＡＮフラグメント３’及び１７%ジベンゾフルベン（ＤＢＦ）を示した。
【０２３６】
実施例１０
ＧＰＡフラグメント２＋３’の溶液相合成
ＧＰＡフラグメント３’（５．０g）及びフラグメント２（４．３５g）をＤＭＦ（３０mL）中に溶解させた。この溶液に、ＨＯＢＴ水和物（１．５５当量）及びＨＢＴＵ（１．５６当量）の溶液（ＤＭＦ  ２０mL中）ならびにＤＩＥＡ（２．５５当量）を、ＤＭＦリンス（１０mL）と共に充填した。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。１４５分後、追加のフラグメント３’（０．５g）、ＨＢＴＵ（０．５当量）、及びＤＩＥＡ（１．３当量）を、ＤＭＦリンス（５mL）と共に加えた。反応は一晩の撹拌後に完了していた。ピペリジン（１．４g）を反応混合物に充填した。Ｆｍｏｃ除去を３時間後に行った。反応混合物を、水（１４０mL）を用いて１８℃〜２６℃でクエンチした。混合物を４０℃まで加熱し、次に２０℃に冷却した。形成した白色固体をろ過し、水（２回、各々１００mL）で洗浄した。フィルタケーキを空気乾燥させ、そして次にＭＴＢＥ／ヘプタン（１：１、１００mL）を用いて４０℃で１５分間撹拌した。２５℃まで冷却後、産物をろ過し、ＭＴＢＥ／ヘプタン（１：１、４×５０mL）で洗浄し、そして３５℃〜４０℃で真空乾燥させた。合計８．６４g（９７．７%収率）が、純度６７．３%  ＡＮで得られた。
【０２３７】
ＧＰＡフラグメント１＋２＋３’の溶液相合成及び全体的な脱保護：
実施例１１
フラグメント１（０．９３g）をＤＣＭ（２０mL）中に溶解させた。この溶液に、フラグメント２＋３’（４．０２g）を、ＤＣＭ（２０mL）リンスと共に加えた。ＨＯＢｔ水和物（０．２３g、１．５当量）及びＨＢＴＵ（０．５７g、１．５当量）をＤＣＭ（５mL）と共に充填した。次に、ＤＩＥＡ（０．９５mL、２．０当量）を、撹拌した反応混合物（懸濁液である）に充填した。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。１６時間後、反応完了チェックによって過剰のフラグメント２＋３’が示された。追加のフラグメント１（０．０８１g）及びＨＢＴＵ（０．０６８g）を、ＤＣＭ（５mL）リンスを使用して加えた。反応を、追加の６８時間にわたり撹拌した。結合反応が完了した後、ピペリジン（０．６mL）を反応混合物に充填した。１８時間の撹拌後、Ｆｍｏｃ除去は完了していた。ＤＣＭを、次に、真空下で、残留容積が〜１５mLになるまで、反応混合物から剥がした。濃縮混合物を、ＴＦＡ（４０mL）、ＤＴＴ（２．１g）、及び水（２．１mL）を含む溶液に１５℃で充填し、ＤＣＭリンス（２×５mL）が続いた。反応混合物を、６時間の撹拌後、＜５℃まで冷却した。冷ＭＴＢＥ（１６０mL、ドライアイス中で冷却）を、７分にわたり切断溶液に充填した。クエンチした反応混合物を、１５℃まで温めた。結果として生じた固体産物をろ過し、ＭＴＢＥ（３×３０mL）で洗浄し、そして一晩、周囲温度で空気乾燥させた。３．８２gのＧＰＡ粗精製物（２８．７３%  wt/wt）が、純度５９．７%  ＡＮ、１１３%の収率で得られた。
【０２３８】
代替フラグメント１の合成：
実施例１２
フラグメント１（Ｔｒｔ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ）
７．０gの前添加Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ−２−ＣＴ樹脂（０．４３mmol/g添加）を用いて開始し、標準的Ｆｍｏｃ化学反応を適用した。樹脂を、最初に、１０容積（樹脂重量と比べて）のＤＣＭ中で３０分間、膨潤させた。次に、ＤＣＭを排出させて、そして樹脂を１０容積のＮＭＰを用いて４回（各々で５分間）洗浄した。
【０２３９】
Ｆｍｏｃ除去は、１０容積の２０%（v/v）ピペリジン溶液（ＮＭＰ中）での２回の処理（１０及び２０分間）により達成された。ピペリジン／ＮＭＰ溶液を、各処理後に排出させた。樹脂を、次に、ＮＭＰにより６回洗浄した（１０容積、５分間／各々）。結合溶液を調製するために、アミノ酸及びＨＯＢｔを秤量して（２当量）、２５mLのＨＢＴＵを含むＮＭＰ（２当量）中に溶解させて、ＮＭＰ／ＤＣＭ（１０mL／１５mL）でリンスした。結果として生じた溶液をＮＭＰ（５mL）中のＤＩＥＡ（２当量）と合わせて、樹脂を含む反応容器に加えて、樹脂と３時間混合させた。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂を、ＮＭＰを用いて４回（１０×容積、５分間／各々）洗浄した。
【０２４０】
構築されたペプチド−樹脂をＤＣＭで洗浄し（４×７０mL、５分間／各々）、−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの溶液（７０mL、ドライアイス中で冷却）を加えて、１５分間、撹拌した。切断溶液を、ピリジン（２mL）を含むフラスコ中に回収した。２０℃まで温めながら、樹脂を、ドライアイスで冷却させた１%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（７０mL）を用いて２０分間にわたり洗浄し、ピリジン（４mL）を加えた。さらに１０分間の撹拌後、溶液を回収した。樹脂を、次に、ＤＣＭで洗浄した（４×７０mL、５分間／各々）。合わせた混合物（全ての洗浄液及び切断溶液）を、減圧下で、容積〜１００mLに達するまで蒸留した。結果として生じた溶液を水（１００mL）と混合させて、再び減圧で蒸留させた。ＤＣＭを除去した際に水から析出したペプチドフラグメントをろ過除去した。固体ペプチドフラグメントを水で洗浄し（３×５０mL）、一晩、周囲温度で空気乾燥させた。産物（代替フラグメント１）の重量は０．５８g（２０%収率）であった。
【０２４１】
ＧＰＡのＧＰＡ固相合成、樹脂上での全ての結合
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ
２ＣＴ樹脂上でのＧＰＡフラグメント３の固相合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−２−ＣＴ
【０２４２】
実施例１３
０．４６mmol/gで添加された１５．０gのＨ−Ａｉｂ−２−ＣＴ樹脂を用いて開始し、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−ＯＨの固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（１２０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。
【０２４３】
結合溶液を調製するために、アミノ酸及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）を秤量し、ＮＭＰ（Ｌｙｓ−３４、Ｖａｌ−３３、Ｌｙｓ−２６、Ａｌａ−２５、Ａｌａ−２４、及びＧｌｎ−２３では４容積；Ｌｅｕ−３２〜Ｇｌｕ−２７では４．２容積）中に溶解させ、次にＮＭＰ中のＨＢＴＵ溶液（１７８．４g/L）及びＤＩＥＡと−５℃〜０℃で合わせた。結果として生じた溶液を、樹脂を含む反応容器に加え、２容積のＤＣＭを伴うフラスコリンスをリアクターに加えて、それを樹脂と２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルを、カイザーテスト及び／又はＨＰＬＣのために引き、反応完了をチェックした。結合反応が完了した後（結合回数は変動する。以下の表を参照のこと）、結合溶液を排出させて、樹脂を、ＮＭＰを用いて４回洗浄した（各々で６容積）。（注意：Ｌｙｓ−３４及びＶａｌ−３３では、樹脂を、無水酢酸（５．０当量）及びＤＩＥＡ（１０当量）（ＮＭＰ  １００mL中）を用いて、結合後３時間、エンドキャップした）  樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。（注意：Ｇｌｕ−２７〜Ａｌａ−２４では、樹脂を、ＮＭＰ中の２０%ピペリジン３０%ＤＭＳＯで２回処理し（各々の処理で６容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した）第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ（又はピペリジン／ＤＭＳＯ／ＮＭＰ）処理後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で６容積）。次に、結合反応、４回のＮＭＰ洗浄、脱保護、及び９回のＮＭＰ洗浄サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔの順番で）。
【０２４４】
この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：
【０２４５】
【表１４５】
2011506376.tif 000155
2011506376.tif 000156
【０２４６】
上述の構築された樹脂を、ＮＭＰで４回（各々の洗浄で６容積）、ＤＣＭで７回（各々の洗浄で６容積）、そしてＩＰＡで３回（各々の洗浄で６容積）洗浄し、真空下で、３５℃で乾燥させた。それによって２７．０１gのＦｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂が、純度８８．７%  ＡＮ、７８．９%の収率（樹脂の重量増加に基づく）で産生された。
【０２４７】
ＧＰＡフラグメント１＋２＋３の固相合成
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ
【０２４８】
実施例１４
１２．０gのＦｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−Ｏ−２−ＣＴ樹脂を用いて開始し、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−３５）−ＯＨの固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（１２０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で４．１６容積）。
【０２４９】
樹脂を、次に、２０%ピペリジン３０%ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）（各々の処理で６容積）で４回（各々３０分間）処理し、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。４回目の２０%ピペリジン３０%ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）処置後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で４．１６容積）。
【０２５０】
フラグメント２のための結合溶液を調製するために：
フラグメント２（７．８３g、１．３当量）及び６−Ｃｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ；０．６９g、１．３当量）を秤量し、ＤＭＳＯ（４．１６容積）中に溶解させ、次にＮＭＰ中のＨＢＴＵ溶液（１０．７mLの１７４．０７g  ＨＢＴＵ/L溶液、１．３当量）及びＤＩＥＡ（１．９mL）と１５℃で、フラスコ中で合わせた。結果として生じた溶液を、樹脂を含む反応容器に加えて、フラスコをＤＣＭ（１１．１mL）でリアクター中へリンスし、それを２５℃で撹拌した。サンプルをＨＰＬＣのために引き、反応の完了をチェックした。１７時間の撹拌後、分析は、結合反応での７３．８%の変換を示した。ＨＢＴＵ（１．５８g）及びＤＩＥＡ（０．７０６g）のキッカー充填を加えて、ポット混合物を３０℃で撹拌した。さらに２５．５時間の撹拌後、反応サンプルのＨＰＬＣ分析は、結合反応が９２%完了していることを示した。結合溶液を排出させて、樹脂を、ＮＭＰを用いて４回洗浄した（各々の洗浄で４．１６６容積）。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０%（v/v）ピペリジン及び３０%（v/v）ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）（各々の処理で４．１６容積）を用いて２回処理することにより（各３０分間）達成された。第２の２０%ピペリジン３０%ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）処理後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で４．１６容積）。
【０２５１】
フラグメント１の結合溶液を調製するために：
フラグメント１（３．８１g、１．３当量）及び６−Ｃ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ；０．７０g、１．３当量）を秤量し、ＤＭＳＯ（４．１６容積）中に溶解させ、次にＮＭＰ中のＨＢＴＵ溶液（１０．７mLの１７４．０７g  ＨＢＴＵ／Ｌ溶液、１．３当量）及びＤＩＥＡ（１．９mL）と１５℃で、フラスコ中で合わせた。結果として生じた溶液を、反応容器に加えて、フラスコをリアクター中へＤＣＭ（１１．１mL）でリンスし、それを樹脂と共に２５℃で撹拌した。サンプルをＨＰＬＣのために引き、反応の完了をチェックした。１６．５時間の撹拌後、分析は、結合反応の完全な変換を示した。結合溶液を排出させて、樹脂を、ＮＭＰを用いて４回洗浄した（各々の洗浄で４．１６６容積）。
【０２５２】
上述の構築された樹脂を、ＤＣＭで７回洗浄し（各々の洗浄で４．１６容積）、ＮＭＰを除去し、樹脂を最後のＤＣＭを用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、２%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（５容積、−５℃〜０℃）を加えて、１５分間、０℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン（使用された全ＴＦＡと比べて１．３３当量）を含むフラスコ中に回収した。次に、別の２%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（５容積、−５℃〜０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。第２の切断溶液を、ピリジンを含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで７回（５容積）洗浄し、切断溶液レシーバー中に排出させた。ピリジン（使用された全ＴＦＡに対して０．３７当量）を、２回目のＤＣＭ洗浄中に切断容器に加えた。合わせたＤＣＭ溶液を１０容積まで濃縮し、水（５容積）で洗浄し、そして別の５容積の水と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。８．７６gのフラグメント１＋２＋３が得られた（Ｈ−Ａｉｂ−Ｏ−２ＣＴ樹脂から収率６３．３%又はＦｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂から実際の収率８０．２%）。分析は純度６４．６%  ＡＮを示した。
【０２５３】
フラグメント１＋２＋３’の合成及び全体的な脱保護
実施例１５ａ
ＧＰＡフラグメント１＋２＋３（４．４８g）をＤＭＳＯ（５０mL）中に溶解させた。この溶液に、Ｈ−Ａｒｇ（２ＨＣｌ）−ＮＨ２（０．９９g、４当量）、ＨＯＢｔ水和物（０．６１g、４当量）、ＨＢＴＵ（１．５２g、４当量）、及びＤＩＥＡ（０．８７mL、５当量）を充填した。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。一晩反応完了チェックは、結合が行われたことを示した。ピペリジン（１mL）を反応混合物に充填した。一晩撹拌後、Ｆｍｏｃ除去が行われた。反応混合物を、次に、水（１５０mL）を含む容器に１５℃で５分間にわたり充填した。クエンチした混合物を４０℃まで０．５時間温め、次に１５℃まで冷却した。固体をろ過し、水（３×３０mL）で洗浄し、空気乾燥させて、４．３４gの固体（９８%収率）を提供した。４．０gのこの固体をＤＣＭ（１８mL）中に溶解させた。この溶液に、ＴＦＡ（４０mL）、ＤＴＴ（２．１g）、及び水（２．１mL）を含む溶液を充填した。結果として生じた混合物を、−１℃に冷却する前に、１５℃で６時間撹拌した。冷ＭＴＢＥ（１６０mL、ドライアイス中で冷却）を、切断溶液に１５分間にわたり充填した。クエンチした反応混合物を１５℃に温めた。固体産物をろ過し、ＭＴＢＥ（３×３０mL）で洗浄し、そして一晩、周囲温度で空気乾燥させた。３．３３gのＧＰＡ粗精製物が得られ（１００%収率）（２３．０８%  wt/wt）、純度は４４．９%  ＡＮであった。
【０２５４】
フラグメント１＋２＋３’の合成及び全体的な脱保護
実施例１５ｂ
マグネチックスターラ及びアルゴン下の温度計を伴う１００mLフラスコに、１．４０gのフラグメント１（３０．０mLのＴＨＦ中）を加えた。２３２mgのＨＯＢｔ及び９１７．３mgのＨＢＴＵを次に加えた。４３６．５μＬのＤＩＥＡを次に加え、反応はわずかに発熱性であり、温度は約１℃上昇した。３．００gのフラグメント２＋３’（ＴＨＦ中）を次に加えた。別の３．００gのフラグメント２＋３’（ＴＨＦ中）を次に加えた。１．２mLのピペリジンを次に加え、反応はわずかに発熱性であり、温度は約１．５℃上昇し、透明な黄色溶液を形成し、それを一晩撹拌した。溶液を次に、４２℃／２００−１００mbarで、２５０mLフラスコ中で蒸留した。２６．２５mLのＤＣＭを次に加えて、溶液を４２℃／４００−１００mbarで蒸留した。２２．５mLのＤＣＭを次に２０分間にわたり除去した。５００〜１０００mLのダブルジャケットフラスコ中へ、４．３１３gのＤＴＴを、４．３１３mLの水及び７６．９mLのＴＦＡ溶液と共に加えた。溶液を次に１５℃に冷却させ、そしてＤＣＭ溶液を次に滴下して１０分間にわたり加えた。反応は発熱性であり、温度は１７℃に上昇し、白色の煙が発生し、そして溶液は強い黄色になった。３．７５mLのＤＣＭを次に加えてリンスした。混合物を次に１５℃で６時間撹拌した。析出が生じ、混合物を次にろ過し、０．２３７gのほとんど白色のペーストを与えた。３６０mLのＭＴＢＥを次に滴下して５分間にわたりフィルタケーキに加えて、白色の懸濁液を形成させ、温度は１８℃に上昇した。懸濁液を次に３０分間撹拌し、そして次にろ過した。２２５mLのＭＴＢＥを次にペーストに加え、再びろ過し、そして１４時間にわたり４２℃／２０mbarで乾燥させ、合計５．７８７gの産物を白色粉末として産生した。ＨＰＬＣ（分析）：５１．２%（ｍ／ｍ%）、７９．８%（面積%）水：：２．０%；エタノール：＜１００%、ＤＣＭ：＜６０ppm；ＭＴＢＥ：３．２%；ＴＨＦ：＜７０ppm；ＴＦＡ：８．４%。
【０２５５】
ＧＰＡフラグメント２＋３’、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−３６）−ＮＨ２のＧＰＡ溶液相合成：
Ｈ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２５６】
実施例１６
ＧＰＡフラグメント２＋３の固相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ
【０２５７】
１２．５３gのＦｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−Ｏ−２−ＣＴ樹脂を用いて開始し、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−３５）−ＯＨの固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（１００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で４．４容積）。
【０２５８】
樹脂を、次に、２０%ピペリジン３０%ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）を用いて２回（各々６０分間）処理し（各々で４．４容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２回目の２０%ピペリジン  ３０%ＤＭＳＯ（ＮＭＰ中）処置後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で４．４容積）。
【０２５９】
フラグメント２のための結合溶液を調製するために：フラグメント２（８．１０g、１．３当量）及び６−Ｃ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ；０．７４g、１．３当量）を秤量し、ＤＭＳＯ（２．６６容積）中に溶解させ、次にジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＶ；０．５２g、１．３当量）と１５℃で、フラスコ中で合わせた。結果として生じた溶液を、樹脂を含む反応容器に加えて、フラスコをＤＣＭ（１２．７mL）でリアクター中へリンスし、それを３０℃で撹拌した。サンプルをＨＰＬＣのために引き、反応の完了をチェックした。２５時間の撹拌後、分析は、結合反応での６５．６%の変換を示した。ＤＩＣ（０．５５g）のキッカー充填を加えて、撹拌を３０℃で継続した。さらに２１時間の撹拌後、反応サンプルのＨＰＬＣ分析は、結合反応が８６%完了していることを示した。結合溶液を排出させて、樹脂を、ＮＭＰを用いて４回洗浄した（各々の洗浄で４．１６６容積）。再結合反応を、次に、樹脂をフラグメント２（４．０４g、０．６５当量）、６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ（０．４３g；０．６５当量）（ＤＭＳＯ  ３３mL中）及びＤＩＣ（０．２６g．  ０．６５当量）（ＤＣＭ  １２．７mL中）の別の溶液を用いて３０℃で４８時間処理することにより実施した。ＨＰＬＣ分析は９０．８%の変換を示した。
【０２６０】
再結合溶液を排出後、上述の構築された樹脂を、ＮＭＰを用いて４回（各々で４．４容積）そしてＤＣＭを用いて７回（各々で４．４容積）洗浄し、ＮＭＰを除去し、樹脂を最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、２%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（４．９６容積、−５℃〜０℃）を加えて、１５分間、０℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン（使用した全ＴＦＡと比べて１．３当量）を含むフラスコ中に回収した。次に、別の２%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（４．９６容積、−５℃〜０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。第２の切断溶液も、ピリジンを含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで７回（各々で５容積）洗浄し、各々の洗浄液を切断溶液レシーバー中に排出させた。ピリジン（使用された全ＴＦＡに対して０．２５当量）を、２回目のＤＣＭ洗浄中に切断容器に加えた。合わせたＤＣＭ溶液を１０容積（１２５mL）まで濃縮し、水（４容積）で洗浄し、そして別の１０容積の水と混合させた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０−７５トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。８．１９gのフラグメント２＋３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−３５）−ＯＨ）が得られた（Ｈ−Ａｉｂ−Ｏ−２ＣＴ樹脂からの収率６４．２%又はＦｍｏｃ−ＡＡ（２３−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂からの実際の収率７９．５%）。分析は純度６４．７%  ＡＮを示した。
【０２６１】
実施例１７
ＧＰＡフラグメント２＋３’の溶液相合成：
Ｈ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２６２】
ＧＰＡフラグメント２＋３、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−３５）−ＯＨ（４．００g、１．０当量）、及びＬ−アルギニンアミドジヒドロクロリド（０．４９８g、２．０当量）を、ＤＭＳＯ（３０mL）と混合し、２３℃〜２５℃で３０分間撹拌した。この溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、２．０当量）及びＨＢＴＵ（２．０当量）（ＤＭＳＯ  １５mL中）ならびにＤＩＥＡ（５．５当量）を充填した。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。１６時間後、９．１%  ＡＮのフラグメント２＋３は依然として反応していなかった。アルギニンアミドジヒドロクロリド（０．１３６g）、ＨＢＴＵ（０．１９３g）、及びＤＩＥＡ（０．１６６g）のキッカー充填を反応溶液に加えて、それを次にさらに１５．３時間撹拌した。それによって結合反応の９７．６%の完了がもたらされた。次に、ピペリジン（７．７当量）を反応溶液に加えた。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、９０分後に２７℃で完了していた。反応混合物を、水（１００mL）を用いて１５℃〜２７℃でクエンチした。混合物を４０℃に加熱し、次に２５℃に冷却した。形成した白色固体をろ過し、水で洗浄した（２回、各々５０mL）。フィルタケーキを空気乾燥させ、次に、撹拌しながらＭＴＢＥ／ヘプタン（１：１、１００mL）で、２５℃で３時間洗浄した。ポット混合物を４０℃に加熱し、１５分間撹拌した。２５℃に冷却した後、産物をろ過し、ＭＴＢＥ／ヘプタン（１：１、２×５０mL）で洗浄し、そして３５℃〜４０℃で真空乾燥させた。合計４．２２g（実際の収率１０７．２%）が純度６３．７%  ＡＮで得られた。
【０２６３】
ＧＰＡフラグメント  ２＋３’、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１１−３６）−ＮＨ２のＧＰＡ溶液相合成：
実施例１８
フラグメント２（１５．０g、７．２１１mmol）（７．２１１mmolの全ペプチド、１．０当量）を、ＨＯＢＴ（０．１１０４g、０．７２１mmol）を７．２３mLのＤＭＦ中に含む７．３２mLの溶液を用いてリアクター中で処理し、１５０mLの２−メチル−テトラヒドロフラン（ＭｅＴＨＦ）中に室温で溶解させる。リアクターは、１０００mLの二重壁リアクター（底部に栓、スターラー、ＰＴ−１００温度計、ジャケットコイルコンデンサー、窒素ブランケット、滴下漏斗、及びサーモスタットを伴う）である。結果として生じた溶液を内部温度０℃〜５℃に冷却させ、撹拌し続ける。
【０２６４】
１３８mLのＤＭＦ及び３０mLのＭｅＴＨＦを含む別のリアクター中で、フラグメント３’（７．３５５mmolの全ペプチド、１．０２当量）を加えて、３５〜４０℃に加熱し、溶解するまで撹拌する。リアクターは、２５０mLの二重壁リアクター（底部に栓、スターラー、ＰＴ−１００温度計、窒素ブランケット、滴下漏斗、及びサーモスタットを伴う）である。結果として生じた溶液を内部温度０℃〜５℃に冷却させ、撹拌し続ける。
【０２６５】
溶液を、次に、内部温度０℃〜５℃の第１のリアクター中のフラグメント２を含む溶液に加えて、第２のリアクターを３０mLのＤＭＦでリンスする。冷溶液を、次に、ＨＢＴＵ（３．５６g、９．３７mmol）を含む１７．４５mLの溶液及び１４mLのＤＭＦを用いて１５分間にわたり、そして次に後にＤＩＥＡ（１．７２mL、１０．０９mmol）（３０mLのＤＭＦ中）を用いて１０分間にわたり処理し、ここでＦｍｏｃ保護された中間体が形成される。結果として生じた溶液を０℃〜５℃で３０分間、反応が完了するまで撹拌する。Ｆｍｏｃ保護基を、次に、ピペリジン（３．０６ｍＬ、３１．０mmol）を加えて、そして３５±２℃まで加熱することにより切断し、約１．５〜２時間、切断が完了するまで撹拌を続ける。
【０２６６】
クエンチし、抽出を行うために、３７５mLの水をリアクター中の調節（tempered）溶液に加えて、約５〜１５分間（ｐＨ約９．９）、内部温度２０℃〜２５℃で撹拌し、次に撹拌なしに少なくとも６０分間静置し、そして次に相を分離させる（有機相＝約１００mL）。下の水相を次に、２回目に、９０mLのメチル−ＴＨＦで処理し、混合物を約５〜１５分間（ｐＨ約９．９）、内部温度２５±２℃で撹拌し、そして次に撹拌なしに少なくとも６０分間静置し、そして２つの透明な相を次に分離させる（水相約６９０g）。
【０２６７】
２つの有機相を次に合わせて（約１８０〜２００mL）、そして減圧下（約１２０mbar）及び最高ジャケット温度４０℃で、残さが依然として液体である限り濃縮させる。残基を次に、内部温度２０℃〜４０℃及び最高ジャケット温度４０℃で、１８０mLのメチル−ＴＨＦ中に溶解させる。溶液を次に、減圧下（約１２０mbar）及び最高ジャケット温度４０℃で濃縮させ、残さは依然として液体である。残さを次に、内部温度２０℃〜４０℃及び最高ジャケット温度４０℃で、１８０mLのメチル−ＴＨＦ中に溶解させる。溶液を次に、減圧下（約１２０mbar）及び最高ジャケット温度４０℃で、残さが依然として十分に撹拌可能である限り（油）濃縮させる。残さを次に、内部温度２０℃〜４０℃及び最高ジャケット温度４０℃で、１３０mLのメチル−ＴＨＦ中に溶解させ、次に２５±２℃に冷却させて、サンプリングする。共沸蒸留、及びＭｅ−ＴＨＦでの希釈（上記）を、サンプルが一致するまで繰り返す。
【０２６８】
ｎ−ヘプタン（７５０mL）を次に晶析装置（１０００mL二重壁リアクター（底部に栓、スターラー、ＰＴ−１００温度計、ジャケットコイルコンデンサー、窒素ブランケット、蒸留ヘッド、滴下漏斗、及びサーモスタットを伴う））中に加えて、上で調製されたＭｅ−ＴＨＦ中の産物溶液（約２００mL）を内部温度又は２５±３℃で１〜２時間にわたり加える。産物が直ぐに析出し、トランスファーラインを最高１０mLのメチル−ＴＨＦでリンスする。混合物を次に少なくとも１時間、２５±３℃で撹拌する。産物を次に吸引フィルターを使用してろ過し、ｎ−ヘプタン（１５０ml）で洗浄し、そして産物を真空下で（＜２０mbar）、外部温度３５℃未満で１２時間乾燥させる。手順によって約３０〜３２gのわずかにオフホワイトの産物が与えられる。収率：フラグメント２から約７５%又はフラグメント３’から７７%。
【０２６９】
実施例１９〜２９は、スキーム２において記載する結合反応スキーム及び本明細書において定義するフラグメント１、２、３及び３’に関する。
ＧＰＡ代替フラグメント３、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨの固相合成
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ
【０２７０】
実施例１９
ＧＰＡ代替フラグメント３、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−２−ＣＴ樹脂
Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成をRoche Peptide Synthesizer上で行った。Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−２−ＣＴ樹脂（１５．０２g）（０．３６mmol/g添加）を反応容器に充填し、ＤＣＭ（１５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で９０mL）。
【０２７１】
樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護を、樹脂を２回、ＤＭＦ中の２０%（v/v）ピペリジンで処理し（各々の処理で９０mL）、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより行った。第２のピペリジン／ＤＭＦ処理後、樹脂を９回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で１００mL）。
【０２７２】
活性化エステル溶液を調製するために、アミノ酸及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏ）を秤量し、フラスコ中のＤＭＦ中に溶解させ、次にストックＨＢＴＵ溶液（０．５０３mmole/mL）（ＤＭＦ中）及びＤＩＥＡと０℃〜５℃で連続的に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えて、調製フラスコをＤＣＭでリアクター中へリンスし、それを次に樹脂と共に４〜１６時間、２５℃で撹拌した。サンプルをカイザーテスト又はＨＰＬＣ分析のために採取し、反応の完了を確認した。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で１００mL）。結合が１６時間後に未完了であった場合、樹脂を、無水酢酸及びＤＩＥＡ（ＤＭＦ中）ならびにＤＣＭを用いた３時間の反応によりエンドキャップした。一連のＦｍｏｃ基の除去及び次のアミノ酸の結合を、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅの順番で）。
【０２７３】
この実施例において使用された全ての試薬の量を以下の表に列挙する：
【０２７４】
【表１４６】
2011506376.tif 000157
【０２７５】
固相合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（４×１００mL）、ＤＣＭ（７×１００mL）、そしてイソプロパノール（３×１００mL）で洗浄した。次に構築された樹脂を真空乾燥させて（１９．３５g）、切断のために保持した。
【０２７６】
実施例２０
構築された樹脂からのＧＰＡ中間体フラグメントＦｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨの切断：
構築された樹脂１９．０g（実施例１９から）をＤＣＭ（１５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。次に混合物を−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、２%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液を用いて２回（２×７．５容積）、３０分間、０℃で撹拌しながら処理した。切断溶液を、ピリジン（使用した全ＴＦＡと比べて１．３当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで６回（１５０mL）洗浄して、レシーバー容器中に排出させた。ＤＣＭ溶液を合わせて、濃縮し、水（１５０mL）と混合した。結果として生じた混合物を再び減圧下で蒸留して、残りのＤＣＭを除去した（３５０−５０トール、２５℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。９２．７%収率のＧＰＡ代替フラグメント３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨ）が純度９５．２%  ＡＮで得られた。
【０２７７】
実施例２１
ＧＰＡ代替フラグメント３  Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｏ−２ＣＴ樹脂
Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成をRoche Peptide Synthesizer上で行った。Ｈ−Ａｉｂ−２−Ｏ−ＣＴ樹脂（２５．０１g）（０．５９mmol/g（バッチ  ＃  ＢＯ０６０１００５１）添加）を反応容器に充填し、ＤＣＭ（２５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で１５０mL）。
【０２７８】
樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護を、樹脂を２回、ＮＭＰ中の２０%（v/v）ピペリジンで処理し（各々の処理で１４０mL）、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより行った。第２のピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を９回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で１４０mL）。
【０２７９】
活性化エステル溶液を調製するために、Ｆｍｏｃアミノ酸及びＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏを秤量し、ＮＭＰ中に溶解させ、次にＨＢＴＵ溶液（０．４６mmole/mL）（ＮＭＰ中）及びＤＩＥＡと０℃〜５℃で連続的に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えて、フラスコをＮＭＰでリアクター中へリンスし、それを樹脂と共に４〜１６時間、２５℃で撹拌した。サンプルをカイザーテスト又はＨＰＬＣ分析のために採取し、反応の完了をチェックした。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で１４０mL）。結合が依然として１６時間目に未完了である場合、樹脂を洗浄し（４×１４０mL  ＮＭＰ）、無水酢酸及びＤＩＥＡを用いた２時間の反応によりエンドキャップし、次にＮＭＰを用いて４回洗浄した（各々の洗浄で１４０mL）。次に、一連のＦｍｏｃ基の除去、洗浄、結合反応、そして洗浄を、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ｖａｌ→Ｌｅｕ→Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ｉｌｅ→Ｐｈｅの順番で）。
【０２８０】
この実施例において使用された全ての試薬の量を以下の表に列挙する：
【０２８１】
【表１４７】
2011506376.tif 000158
【０２８２】
固相合成の完了後、樹脂をＮＭＰ（４×１５０mL）及びＤＣＭ（７×１５０mL）で洗浄した。
【０２８３】
構築された樹脂からのＧＰＡ代替フラグメント３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨ）の切断：
実施例２１からの構築された樹脂をＤＣＭ（１５０mL）中で３０分間にわたり−５℃に冷却した。次に、ＤＣＭを排出させて、樹脂を２回、２%  ＴＦＡ／ＤＣＭ（２×２５０mL）の冷溶液を用いて、撹拌しながら３０分間、０℃で処理した。切断溶液を、ピリジン（全ＴＦＡと比べて１．３当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで６回洗浄し（各々の洗浄で１５０mL）、洗浄液を切断溶液と合わせた。合わせたＤＣＭ溶液を真空下で濃縮し、水（１５０mL）と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０〜５０トール、２５℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。９６．９%収率のＧＰＡ代替フラグメント３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨ）が純度９６．１%  ＡＮで得られた。
【０２８４】
ＧＰＡ代替フラグメント１＋２、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨの固相合成
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ  ｐｒｏ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
【０２８５】
実施例２２
ＧＰＡ代替フラグメント１＋２、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ  ｐｒｏ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ樹脂
【０２８６】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成をRoche Peptide Synthesizer上で行った。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ樹脂（１０．０４g）（添加係数０．４１mmol/g（３９３−１５０））を反応容器に充填し、ＤＣＭ（１５０mL）を用いて３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で９０mL）。
【０２８７】
次に膨潤及び洗浄されたＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ樹脂をピペリジン（ＤＭＦ中）で脱保護させた。樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護を、樹脂を２回、２０%ピペリジン（ＤＭＦ中）（８０mL）を用いて３０分間処理し、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより行った。第２のピペリジン／ＤＭＦ処理（３０分）後、樹脂を９回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で９０mL）。
【０２８８】
結合溶液を調製するために、２．０当量のアミノ酸及び２．０当量のＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏを秤量し、フラスコ中のＤＭＦ中に溶解させて、次に２．０当量のＨＢＴＵ溶液（０．５０３mmole/mL）（ＤＭＦ中）及び４．５当量のＤＩＥＡと０℃〜５℃で連続的に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えて、フラスコをＤＣＭでリアクター中へリンスし、それを樹脂と共に４時間、２５℃で撹拌した。サンプルをカイザーテスト又はＨＰＬＣ分析のために採取し、反応の完了をチェックした。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で９０mL）。次に、Ｆｍｏｃ基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）→Ｇｌｙ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ｌｅｕ→Ｔｙｒ（ｔＢｕ）→Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）→Ｖａｌ→Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）→Ｓｅｒ（ｔＢｕ）→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）→Ｐｈｅ→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）→Ｆｒａｇ．１の順番で）。
【０２８９】
最終結合では、１．６当量のＧＰＡフラグメント１（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−１０）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ）、１．５当量のＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏ、１．５当量のＨＢＴＵ、及び３．３８当量のＤＩＥＡを使用した。この反応混合物を１６時間撹拌して、完了に達した。
【０２９０】
この実施例において使用された全ての試薬の量を以下の表に列挙する：
【０２９１】
【表１４８】
2011506376.tif 000159
2011506376.tif 000160
【０２９２】
固相合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（６×９０mL）、ＤＣＭ（７×９０mL）、そしてイソプロパノール（３×９０mL）で洗浄した。次に構築された樹脂を真空乾燥させて、切断のために保持した。
【０２９３】
実施例２３
構築された樹脂からのＧＰＡ中間体フラグメント１＋２  Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨの切断：
構築された樹脂（１８．２４g）（実施例２２から）をＤＣＭ（２００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。次に混合物を−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液を用いて３回（３×１００mL）、３０分間、０℃で撹拌することにより樹脂を処理した。切断溶液を、ピリジン（全ＴＦＡと比べて１．４当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（１００mL）で３回洗浄した。全てのＤＣＭ溶液を合わせ、濃縮し、そして水（１００mL）と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０〜５０トール、２５℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。６７．６%収率のＧＰＡ代替フラグメント１＋２（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨ）が純度８５．３%  ＡＮで得られた。
【０２９４】
実施例２４
ＧＰＡ代替フラグメント１＋２、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成：
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ  ｐｒｏ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ
【０２９５】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−Ｏ−２ＣＴ樹脂の固相合成を、Roche Peptide Synthesizer上で、２０．０gのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ樹脂（添加係数０．５０mmol/g（３９３−５３））のスケールで繰り返した。樹脂を、ＤＣＭ（２００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で１２０mL）。
【０２９６】
次に膨潤及び洗浄されたＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２ＣＴ樹脂をピペリジン（ＤＭＦ中）で脱保護させた。樹脂の全ての脱保護を、樹脂を２回、２０%ピペリジン（ＤＭＦ中）（各々の処理で１２０mL）を用いて３０分間処理し、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより行った。第２のピペリジン／ＤＭＦ処理（３０分）後、樹脂を９回、ＤＭＦで洗浄した（各々の洗浄で１２０mL）。
【０２９７】
結合溶液を調製するために、２．０当量のアミノ酸（又はＧＰＡフラグメント１）及び２．０当量のＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏを秤量し、ＤＭＦ中に溶解させて、次に２．０当量のＨＢＴＵ溶液（０．５０３mmole/mL）（ＤＭＦ中）及び４．５当量のＤＩＥＡと０℃〜５℃で連続的に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えて、フラスコを次にＤＣＭでリアクター中へリンスし、それを樹脂と共に４時間、２５℃で撹拌した。サンプルをカイザーテスト又はＨＰＬＣ分析のために採取し、反応の完了をチェックした。結合反応が完了した後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で１８０mL）。次に、Ｆｍｏｃ基の脱保護及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）→Ａｌａ→Ａｌａ→Ｇｌｎ（ｔｒｔ）→Ｇｌｙ→Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）Ｌｅｕ→Ｔｙｒ（ｔＢｕ）→Ｓｅｒ（（ｔＢｕ）Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）→Ｖａｌ→Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）→Ｓｅｒ（ｔＢｕ）→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）→Ｐｈｅ→Ｔｈｒ（ｔＢｕ）→Ｆｒａｇ．１の順番で）。
【０２９８】
わずか１．５当量のフラグメント１（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−１０）−ＯＨ）、ＨＯＢＴ．Ｈ２Ｏ、ＨＢＴＵ、及び３．３８当量のＤＩＥＡを最終結合のために使用した。この反応混合物を１６時間撹拌した。
【０２９９】
この実施例において使用された全ての試薬の量を以下の表に列挙する：
【０３００】
【表１４９】
2011506376.tif 000161
2011506376.tif 000162
【０３０１】
固相合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（４×１２０mL）及びＤＣＭ（８×１２０mL）で洗浄した。混合物を、切断のための調製における最後のＤＣＭ洗浄中に−５℃に冷却した。
【０３０２】
構築した樹脂からのＧＰＡ中間体フラグメントＦｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨの切断：
上からのＤＣＭ中の構築された樹脂のリアクター温度が−５℃に達した後、ＤＣＭを排出させて、樹脂を、１%  ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液で３回（３×２００mL）、３０分間、０℃で撹拌しながら処理した。切断溶液を、ピリジン（使用した全ＴＦＡに基づく１．４当量）を含むフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（各々２００mL）で５回洗浄した。全てのＤＣＭ溶液を合わせ、濃縮し、そして水（２００mL）及びイソプロパノール（８０mL）と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０〜５０トール、２５℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。７７．７%収率のＧＰＡ代替フラグメント１＋２（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨ）が純度８６．４%  ＡＮで得られた。
【０３０３】
ＧＰＡ代替フラグメント３’、Ｈ−ＡＡ（２８−３６）−ＮＨ２の溶液層合成：
Ｈ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０３０４】
実施例２５
代替フラグメント３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨ、６．１１g、４．４２mmole  実施例２０及びアルギニンアミドジヒドロクロリド（Ｈ−Ａｒｇ（２ＨＣｌ）−ＮＨ２、２．１８g、８．８４mmole、２当量）をＤＭＦ（４２mL）中に溶解させた。この溶液に、ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（０．６７g、１当量）及びＨＢＴＵ（３．３８g、２当量）の溶液（ＤＭＦ  ４２mL中）、ならびにＤＩＥＡ（３．４４mL、４当量）を、１５mLのＤＭＦと共に連続的に充填した。反応混合物を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。反応は２１時間の撹拌後に完了していた。次に、ピペリジン（２．２６g、６当量）を反応混合物に加えた。Ｆｍｏｃ除去は、３５℃で１時間の撹拌後に未完了であった。追加のピペリジン（２．３３g、６．２当量）を加えて、撹拌をさらに１．７５時間継続させた。反応混合物を水（２４０mL）でクエンチし、白色固体を形成させた。ピリジンヒドロクロリド（８．３３g、１６．３当量）を、析出した反応混合物に加え、ピペリジンを中和した。白色固体をろ過し、水（４００mL）で洗浄し、そして一晩、部分的に乾燥させた。湿ったフィルタケーキを１００mLのＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１：１＝容積：容積）で再スラリーさせ、ろ過し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１：１＝容積：容積；２×２５mL）で洗浄し、そして真空乾燥させ、ＧＰＡ代替フラグメント３’Ｈ−ＡＡ（２８−３６）−ＮＨ２（６．２２g、収率１０６．９%）を得た。ＨＰＬＣ分析は純度８７%  ＡＮを示した。
【０３０５】
実施例２６
代替フラグメント３（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２８−３５）−ＯＨ、６．１２g、４．４２mmole  実施例２１）及びアルギニンアミドジヒドロクロリド（Ｈ−Ａｒｇ（２ＨＣｌ）−ＮＨ２、２．１９g、８．８４mmole、２当量）をＤＭＦ（４２mL）中に溶解させた。この溶液に、ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（０．６７g、１当量）及びＨＢＴＵ（３．３８g、２当量）の溶液（ＤＭＦ  ４２mL中）、ならびにＤＩＥＡ（３．４４mL、４当量）を連続的に、１５mLのＤＭＦと共に加えた。反応を２５℃で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。反応を一晩（１６．３時間）行った。次に、ピペリジン（４．５２g、１２当量）を反応混合物に加えた。Ｆｍｏｃ除去は、２５℃で３５分間の撹拌後に完了した。反応混合物を水（２００mL）でクエンチした。ＤＣＭ（１８０mL）を加え、析出産物を抽出した。底のＤＣＭ層を水で２回洗浄し（２×１００mL）、容積５０mLに濃縮した。この濃縮ＤＣＭ溶液を、ヘプタン１５０mLに滴下して送り、産物を析出させた。ＤＣＭを真空下で蒸留した。ＭＴＢＥ（１２０mL）を析出混合物に加えた。形成した白色固体をろ過し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１：１＝容積：容積；２×５０mL）で洗浄し、そして真空乾燥させて、ＧＰＡ代替フラグメント３’Ｈ−ＡＡ（２８−３６）−ＮＨ２を得た（６．５４g、重量収率１１２．４%）。ＨＰＬＣ分析は純度９２．１%  ＡＮを示した。
【０３０６】
ＧＰＡ粗精製物の溶液相合成：
実施例２７
実施例２３からのＧＰＡフラグメント１＋２（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨ）（０．３８３g）及び実施例２４からのフラグメント３’（Ｈ−ＡＡ（２８−３６）−ＮＨ２）（０．２０３g）を、ＤＭＳＯ（２mL）及びＮＭＰ（４mL）の溶液に溶解させ、１時間撹拌した。この溶液に、ＨＯＢｔ水和物（０．０４０g）及びＨＢＴＵ（０．０９２g）を加えた。次に、ＤＩＥＡ（０．０８０mL）を反応混合物に加えた。反応を周囲温度で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。６８時間の撹拌後、反応完了チェックは、反応が行われたことを示した。ピペリジン（０．１mL）を反応混合物に加えた。１６時間の撹拌後、Ｆｍｏｃ除去を行った。反応混合物を、次に、水（４０mL）中に加えることによりクエンチした。３０分間の撹拌後、固体をろ過、水（２０mL）での洗浄、及び一晩の乾燥により単離した。単離固体を、次に、ＴＦＡ（４mL）、ＤＣＭ（１．５mL）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（０．２g）、及び水（０．２mL）を含む溶液に周囲温度で加えた。６時間の撹拌後、反応混合物を、冷（−２０℃）ＭＴＢＥ（４０mL）を加えることによりクエンチした。クエンチした反応混合物を３０分間撹拌した。固体産物をろ過し、ＭＴＢＥ（２×１０mL）で洗浄し、そして一晩、周囲温度で乾燥させた。０．４２gのＧＰＡ粗精製物（２８．２%  wt/wt）が、純度４９．５%  ＡＮ（Ｄ−Ｇｌｕ−２７アイソマー、７．９%）で得られた。
【０３０７】
実施例２８
バッチ実施例２３からのＧＰＡフラグメント１＋２（Ｆｍｏｃ−ＡＡ（７−２７）−ＯＨ）（０．３８２g）及び実施例２５からのフラグメント３’（Ｈ−ＡＡ（２８−３６）−ＮＨ２）（０．２０２g）を、ＤＭＳＯ（２mL）及びＮＭＰ（４mL）の溶液中に溶解させ、０．５時間撹拌した。この溶液に、ＨＯＢｔ水和物（０．０４１g）及びＤＥＰＢＴ（０．０８５g）を加えた。次に、ＤＩＥＡ（０．０８０mL）を反応混合物に加えた。反応を周囲温度で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。一晩反応完了チェックは、反応が完了したことを示した。ピペリジン（０．１mL）を反応混合物に加えた。６８時間の撹拌後、Ｆｍｏｃ除去を行った。反応混合物を、次に、水（４０mL）中に加えることによりクエンチした。１５分間の撹拌後、固体をろ過、水（２０mL）での洗浄、及び一晩の乾燥により単離した。単離固体を、次に、ＴＦＡ（４mL）、ＤＣＭ（１．５mL）、ＤＴＴ（０．２g）、及び水（０．２mL）を含む溶液に周囲温度で加えた。６時間の撹拌後、反応混合物を、冷（−２０℃）ＭＴＢＥ（４０mL）を加えることによりクエンチした。クエンチした反応混合物を３０分間撹拌した。固体産物をろ過し、ＭＴＢＥ（２×１０mL）で洗浄し、そして一晩、周囲温度で乾燥させた。重量０．４３gのＧＰＡ粗精製物（３１．４%  wt/wt）が、純度５１．３%  ＡＮ（Ｄ−Ｇｌｕ−２７エピマー、４．５%）で得られた。
【０３０８】
実施例２９
工程Ａ．フラグメント１＋２とフラグメント３’（ＴＨＦ中）とＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ及びＤＩＥＡの結合反応：
３７．５mLのＴＨＦを伴う１００mLの４ネックフラスコ（２２℃〜２７℃内部温度）中へ、フラグメント１＋２（６．２０g、２．３２mmol）を３部分に分けて１０分以内に加えた。２０mLの丸底フラスコ中へ、ＨＯＢｔ水和物（３０９ｍｇ、１．９８mmol）及びＨＢＴＵ（１２２３ｍｇ、３．１６mmol）を加えた。１０．０mLのＴＨＦを加えて、反応混合物を２２℃〜２７℃の内部温度で１０分間撹拌した。この結合試薬懸濁液をペプチド溶液に加えて、フラスコを３．０mLのＴＨＦでリンスし、そして反応混合物を１０分間撹拌した。ＤＩＥＡ（０．５８２mL、３．３１mmol）を次に加えて、１０分間撹拌した。１時間以内に、フラグメント３’（６．１０g、２．７２mmol）を３部分に分けて加えた。フラグメントの残りを１０．０mLのＴＨＦでリンスした。反応混合物を、強く、２５℃〜２７℃の内部温度で２４時間、撹拌した。
【０３０９】
工程Ｂ．ピペリジンでのＦＭＯＣ基の除去：
ピペリジン（１．６０mL、１６．０mmol）を次に加えて、反応混合物を強く６時間、２５℃〜２７℃の内部温度で撹拌した。反応混合物を、次に、２５０mL丸底フラスコに移し、溶媒を真空中で、４２℃の浴槽温度／２００−１００mbarで除去した。
【０３１０】
工程Ｃ．メチレンクロリドでの溶媒交換：
残さを次に３５．０mLのメチレンクロリド中に溶解させて、それを次に真空中で、４２℃の浴槽温度／４００−１００mbarで除去した。残さを次に３０．０mLのメチレンクロリド中に溶解させた。
【０３１１】
工程Ｄ．ＴＦＡ／ＤＴＴ／水での全体的な脱保護：
１０００mLのダブルジャケットフラスコ中へ、５．７５g（３７．１mmol）のＤＴＴ、５．７５mLのＨ２Ｏ、及び１０２．５mL（１２２０mmol）のＴＦＡを加えて、溶液を１５℃の内部温度に冷却した。ペプチド溶液を次に１０〜１５分以内に加えて、添加漏斗を５．０mLのメチレンクロリドでリンスした。強い黄色の反応溶液を１４℃〜１６℃の内部温度で１０．５時間撹拌した。
【０３１２】
工程Ｅ．ＭＴＢＥ添加時のペプチドの析出：
反応混合物を次に０℃の内部温度に冷却し、４８０mLのＭＴＢＥ（０〜５℃に予備冷却）を継続的に１０分以内に加え、内部温度を２２℃に上昇させた。懸濁液を次に２時間、１６℃〜１８℃の内部温度で撹拌し、次にろ過した。依然として湿ったフィルタケーキを３回、３００mLのＭＴＢＥで洗浄した（３×１００mL）。次に、フラスコをリンスし、フィルタケーキをスラリーとし、ろ過した。フィルタケーキを次に、最後の洗浄後に吸引乾燥させ、残さを一晩３８℃〜４２℃／２０〜３０mbarで乾燥させた（化学収率：５８〜６５%。アッセイ：３９〜４３%）。
【０３１３】
先行する記載、又は以下の特許請求の範囲において開示される特性（それらの特定の形状又は開示された機能を実施するための手段に関して表現される）、又は開示される結果を達成するための方法もしくはプロセスは、適宜、別々に、又はそのような特性の任意の組み合わせで、その多様な形状で発明を実現するために利用してよい。
【０３１４】
先行する発明は、明確さ及び理解の目的のために、例示及び実施例によりある程度詳細に記載されている。変化及び改変を、添付の特許請求の範囲の範囲内で実行してよいことは、当業者には明らかである。従って、上の記載が、例示的であり、制限的でないことを意図することを理解すべきである。本発明の範囲は、従って、上の記載を基準にしないで決定すべきであり、以下の添付の特許請求の範囲さらにはそのような特許請求の範囲が与える等価物の完全な範囲を基準にして決定すべきである。
【配列表】
2011506376000001.app
【国際調査報告】
2011506376.tif 000231
2011506376.tif 000232
2011506376.tif 000233
2011506376.tif 000234
2011506376.tif 000235