(57)【要約】本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば病原性配座異性体に試薬を結合させる条件下で接触させるステップと；試料中に病原性配座異性体がある場合、試薬へのその結合によって病原性配座異性体の存在を検出するステップと；によって、試料中の非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法を提供し、病原性配座異性体特異的結合試薬は通例プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。コンフォメーション病を診断する方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項２】
前記非プリオン病原性配座異性体がアミロイド疾患に関連する配座異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミロイド疾患が全身性アミロイドーシス、タウオパチー、およびシヌクレイノパチーから成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非プリオン病原性配座異性体が、アルツハイマー病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、およびＩＩ型糖尿病から成る群より選択される疾患に関連する配座異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非プリオン病原性配座異性体がアルツハイマー病配座異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルツハイマー病配座異性体がアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルツハイマー病配座異性体がタウタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が、ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０、配列番号６８、
【化３５】
2011520108.tif 000060
【化３６】
2011520108.tif 000061
【化３７】
2011520108.tif 000062
【化３８】
2011520108.tif 000063
から成る群より選択される化合物に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検または剖検から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血漿または脳脊髄液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プリオンタンパク質断片がＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０および配列番号６８から成るペプチドの群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プリオンタンパク質断片が、ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、配列番号１４、配列番号５０および配列番号６８から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号１４、配列番号５０および配列番号６８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号１４、配列番号５０および配列番号６８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が、
（ａ）配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１；
（ｂ）配列番号２２９、２３０、２３２、２３３、２３７、２３８、２３９、または２４０；
（ｃ）配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０；
（ｄ）配列番号２４０；
（ｅ）
【化３９】
2011520108.tif 000064
【化４０】
2011520108.tif 000065
【化４１】
2011520108.tif 000066
【化４２】
2011520108.tif 000067
【化４３】
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【化４４】
2011520108.tif 000069
から成る群より選択されるペプトイド試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が生理学的ｐＨにおいて少なくとも３の正味の正電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬が生理学的ｐＨにおいて少なくとも４の正味の正電荷を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が検出可能に標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬がビオチンによって検出可能に標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬が固体担体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記固体担体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、および磁気応答性ビーズから成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記複合体にコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、結合を可能にする条件下で接触させるステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬へのその結合によって、前記非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項２３】
前記方法が、前記複合体の形成後に非結合試料物質を除去するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が標識抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記非プリオン病原性配座異性体がＡβタンパク質であり、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が抗Ａβ抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；
非結合試料物質を除去するステップと；
前記非プリオン病原性配座異性体を前記第１の複合体から解離させて、それにより解離された非プリオン病原性配座異性体を提供するステップと；
前記解離された非プリオン病原性配座異性体に第１のコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、結合を可能にする条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記第２の複合体の形成を検出することによって、前記非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項２７】
前記第２の複合体の形成が、検出可能に標識された第２のコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を使用することによって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病原性配座異性体特異的試薬が固体担体にカップリングされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が固体担体にカップリングされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記非プリオン病原性配座異性体が、前記第１の複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露することによって、前記第１の複合体から解離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記非プリオン病原性配座異性体が、前記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって、前記第１の複合体から解離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記解離後に高ｐＨまたは低ｐＨを中和するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非プリオン病原性配座異性体がＡβタンパク質であり、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が抗Ａβ抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ａβタンパク質が、前記複合体を高ｐＨ条件に曝露することによって、前記第１の複合体から解離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記高ｐＨ条件が約８０℃にて約０．１Ｎ  ＮａＯＨである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に第１の病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記第１の試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる前記試料に、検出可能な標識を含む第２の病原性配座異性体特異的結合試薬を、前記第１の複合体中の前記非プリオン病原性配座異性体への前記第２の試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；
試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記第２の試薬へのその結合によって、前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
を含み、前記第１および第２の病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項３７】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
（ａ）前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料にコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
（ｂ）非結合試料物質を除去するステップと；
（ｃ）前記複合体に、検出可能な標識を含む病原性配座異性体特異的結合試薬を、前記非プリオン病原性配座異性体への前記病原性配座異性体特異的結合試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって、前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項３８】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
病原性配座異性体特異的結合試薬を含む固体担体を提供するステップと；
前記固体担体に検出可能に標識されたリガンドを結合させるステップであって、前記病原性配座異性体特異的結合試薬の前記検出可能に標識されたリガンドに対する結合親和性は、前記試薬の前記非プリオン病原性配座異性体に対する結合親和性よりも弱い、ステップと；
試料に前記固体担体を、前記試料中に存在するときに前記非プリオン病原性配座異性体が前記試薬に結合して前記リガンドを置換するのを可能にする条件下で、結合させるステップと；
前記試薬と前記試料からの前記非プリオン病原性配座異性体との間に形成された複合体を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項３９】
非プリオン病原性配座異性体と非プリオン非病原性配座異性体とを区別する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記病原性配座異性体の前記試薬への結合によって、前記非プリオン病原性配座異性体と前記非プリオン非病原性配座異性体とを区別するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項４０】
非プリオンコンフォメーション病を診断する方法であって、
非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記試薬へのその結合によって、前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
前記非プリオン病原性配座異性体が検出された場合にコンフォメーション病を診断するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、方法。
【請求項４１】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬が配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１を含むペプトイド領域を含む、方法。
【請求項４２】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記非プリオン病原性配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記試料中に前記非プリオン病原性配座異性体がある場合、前記病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって前記非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬が、
【化４５】
2011520108.tif 000070
【化４６】
2011520108.tif 000071
【化４７】
2011520108.tif 000072
【化４８】
2011520108.tif 000073
から選択される、方法。
【請求項４３】
病原性アルツハイマー病配座異性体の存在を検出する方法であって、
前記病原性アルツハイマー病配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば前記病原性アルツハイマー病配座異性体への前記試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；
前記複合体にコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、結合を可能にする条件下で接触させるステップと；
前記試料中に前記病原性アルツハイマー病配座異性体がある場合、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬へのその結合によって、前記病原性アルツハイマー病配座異性体の存在を検出するステップと；
を含み、前記病原性配座異性体特異的結合試薬が
【化４９】
2011520108.tif 000074
である、方法。
【請求項４４】
前記病原性アルツハイマー病配座異性体がＡβタンパク質であり、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が抗Ａβ抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記病原性アルツハイマー病配座異性体がタウタンパク質であり、前記コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬が抗タウ抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記病原性配座異性体特異的結合試薬が磁気ビーズにカップリングされる、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００８年４月３０日に出願された米国仮出願番号第６１／０４９，３９６号の利益を主張し、上記仮出願の内容は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
タンパク質コンフォメーション病は、正常タンパク質の病原性配座異性体への異常なコンフォメーション変化から生じる多種多様の臨床的に関連のない疾患、たとえば伝染性海綿状脳症、アルツハイマー病、ＡＬＳ、および糖尿病を含む。この変化は次に、病原性配座異性体の自己会合とその結果として起こる組織沈着を生じる可能性があり、周囲組織の損傷を生じることが仮定されている。これらの疾患は、臨床症状の類似点、通例は、様々な長さの潜伏期の後の診断から死亡までの急速な進行を共有する。
【０００３】
生存している被験体中および生存している被験体から採取した試料中のコンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体の検出は、困難であることが判明している。生存している患者の病原性配座異性体の存在を確認する現在の技法は、未完成で侵襲的である。たとえば組織病理学的検査には、被験体にとって危険な生検が必要である。組織病理学は本質的に病変としてサンプリング誤差を受けやすく、アミロイド沈着は、生検が採取された範囲に応じて消失する可能性がある。それゆえ、被験体の死亡前のこれらの状態についての確定診断および対症処置は、実質的に対処されていない課題のままである。
【０００４】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）凝集体、主にＡβ１−４０（Ａβ４０）および１−４２（Ａβ４２）の沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）に完全に関連しており、疾患に対して判断基準となるマーカーと見なされる。しかし、ＡＤの唯一の決定的な試験は、死後脳試料からのＡβプラークの免疫組織化学染色である。現在、ＡＤのＦＤＡ承認死前診断試験はない。血漿またはＣＳＦ試料は、死前試験に使用することができる。いくつかの死前ＡＤ試験は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に焦点を合わせており、溶解性Ａβ４２の定量を試みている。しかし、このバイオマーカーは、ＡＤの間接測定としてのみ役立つ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
凝集ＡβをＣＳＦまたは血漿などの他の体液から直接特異的に検出できる試験は、大きな利点を有する。凝集Ａβの早期検出によって、アルツハイマー病のより迅速でより効率的な診断および潜在的療法の評価が可能となる。
【０００６】
他のコンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体を検出できる試験も、それによってこれらのコンフォメーション病のより迅速でより効率的な診断および潜在的療法の評価も可能となるため、望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（好ましい実施形態の簡潔な概要）
本発明は、一部は、病原性プリオンタンパク質および他の非プリオン病原性配座異性体の両方と優先的に相互作用する病原性配座異性体特異的結合試薬に関する。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬はＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）およびＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）などのプリオンタンパク質断片に由来する。他の実施形態において、病原性配座異性体特異的結合試薬は：配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６および配列番号２４７のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
他の実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片のペプトイド類似体である。いくつかの実施形態において、ペプトイド類似体は、以下の構造：
【０００９】
【化１】
2011520108.tif 000003
【００１０】
【化２】
2011520108.tif 000004
【００１１】
【化３】
2011520108.tif 000005
【００１２】
【化４】
2011520108.tif 000006
の１つを有する。
【００１３】
好ましい実施形態において、病原性配座異性体特異的結合試薬は、生理学的ｐＨにおいて少なくとも３の、または生理学的ｐＨにおいて少なくとも４の正味の正電荷を有する。
【００１４】
一態様において、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法が提供される。検出方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を含み、病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００１５】
試薬によって検出される非プリオン病原性配座異性体は、アミロイド疾患、たとえば全身性アミロイドーシス、タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）、またはシヌクレイノパチーに関連する配座異性体であり得る。たとえば、非プリオン病原性配座異性体は、アルツハイマー病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、またはＩＩ型糖尿病に関連し得る。
【００１６】
好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬で検出される非プリオン病原性配座異性体は、アルツハイマー病配座異性体、たとえばアミロイド−βまたはタウタンパク質である。このような場合、好ましい病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオン断片ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０、または配列番号６８に由来して、
【００１７】
【化５】
2011520108.tif 000007
【００１８】
【化６】
2011520108.tif 000008
【００１９】
【化７】
2011520108.tif 000009
【００２０】
【化８】
2011520108.tif 000010
を含む。
【００２１】
試験される試料は、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生検または剖検であり得る。好ましい実施形態において、試料は血漿または脳脊髄液である。
【００２２】
本発明の方法では、病原性配座異性体特異的結合試薬は通例、たとえばビオチンによって検出可能に標識される。試薬は通例、固体担体、たとえばニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ化紙（ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄ  ｐａｐｅｒ）、ナイロン膜、活性化ビーズ、および磁気応答性ビーズに結合される。
【００２３】
別の態様において、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する他の方法も提供される。本方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を病原性配座異性体特異的結合試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；複合体をコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬と、結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップと；を含むことがあり、病原性配座異性体特異的結合試薬はプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は、標識抗体であることが可能である。非プリオン病原性配座異性体がＡβタンパク質であるとき、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は抗Ａβ抗体である。
【００２４】
一実施形態において、本方法は、複合体形成後に、非結合試料物質を除去するステップをさらに含む。
【００２５】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する他の方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を病原性配座異性体特異的結合試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非結合試料物質を除去するステップと；非プリオン病原性配座異性体を第１の複合体から解離させて、それにより解離された非プリオン病原性配座異性体を提供するステップと；解離された非プリオン病原性配座異性体をコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬と、結合を可能にする条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、第２の複合体の形成を検出することによって、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップと；を少なくとも含み、病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００２６】
第２の複合体の形成は、検出可能に標識された第２のコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を使用して検出することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、病原性配座異性体特異的結合試薬および／またはコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は固体担体にカップリングされる。
【００２８】
非プリオン病原性配座異性体は、（ＰＣＳＢ試薬との）第１の複合体から、複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露すること、複合体を水酸化ナトリウムに曝露すること、または複合体を高ｐＨもしくは低ｐＨに曝露して、いくつかの場合では、解離後に高ｐＨまたは低ｐＨを中和することによって解離させることができる。
【００２９】
非プリオン病原性配座異性体がＡβである実施形態において、タンパク質は好ましくは、水酸化ナトリウムなどの高ｐＨ条件への曝露によって、好ましくは約８０℃の約０．１Ｎ  ＮａＯＨにて、複合体から解離される。
【００３０】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するための別の方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を第１の病原性配座異性体特異的結合試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への第１の試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を、検出可能な標識を含む第２の病原性配座異性体特異的結合試薬と、第１の複合体中の非プリオン病原性配座異性体への第２の試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、第２の試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を少なくとも含み、第１および第２の病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００３１】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するためのまた別の方法は、（ａ）非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料をコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体へのＣＤＰＳＢ試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；（ｂ）非結合試料物質を除去するステップと；（ｃ）複合体を、検出可能な標識を含む病原性配座異性体特異的結合試薬と、非プリオン病原性配座異性体への病原性配座異性体特異的結合試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を少なくとも有し、病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００３２】
非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するためのなおまた別の方法は、病原性配座異性体特異的結合試薬を含む固体担体を提供するステップと；固体担体を検出可能に標識されたリガンドと結合させるステップであって、病原性配座異性体特異的結合試薬の検出可能に標識されたリガンドに対する結合親和性は、非プリオン病原性配座異性体に対する結合親和性よりも弱い、ステップと；非プリオン病原性配座異性体が試料中に存在するときに、試薬に結合させて、リガンドを置換させる条件下で、試料を固体担体に結合させるステップと；試薬と試料からの非プリオン病原性配座異性体との間に形成された複合体を検出するステップと；を少なくとも有し、病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００３３】
非プリオン病原性配座異性体と非プリオン非病原性配座異性体とを区別する方法も提供される。方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試薬に対する病原性配座異性体への結合によって、非プリオン病原性配座異性体と非プリオン非病原性配座異性体とを区別するステップ；を少なくとも有し、病原性配座異性体特異的結合試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００３４】
非プリオンコンフォメーション病を診断する方法も提供される。方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；非プリオン病原性配座異性体が検出された場合に、コンフォメーション病を診断するステップと；を少なくとも有し、病原性配座異性体特異的結合試薬がプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップとを少なくとも有し；病原性配座異性体特異的結合試薬が配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１を含むペプトイド領域を含む、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法を提供する。
【００３６】
なおまた別の態様において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップとを少なくとも有し；病原性配座異性体特異的結合試薬が：
【００３７】
【化９】
2011520108.tif 000011
【００３８】
【化１０】
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【００３９】
【化１１】
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【００４０】
【化１２】
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から選択される、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、正常試料ではなくアルツハイマー試料のパネルでのミスフォールドＡβ４０およびＡβ４２の蓄積と、Ａβ  ＥＬＩＳＡによってこれらのミスフォールドＡβペプチドが変性後のみに認識されることを示す。正常またはアルツハイマー病個人からの１０％（ｗ／ｖ）脳ホモジネート（ＢＨ）を、水（天然、白色棒）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、黒色棒）のどちらかによって室温にて３０分間処理してから、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈して、試料１００μＬ当り１０％ＢＨ  １００ｎＬを各ＥＬＩＳＡウェルに加えるようにした。ＥＬＩＳＡ捕捉プレートは（１Ａ）１１Ａ５０−Ｂ１０抗体（Ａβ４０のＣ末端に特異的）または（１Ｂ）１２Ｆ４抗体（Ａβ４２のＣ末端に特異的）によって、各ウェルを２．５μｇ／ｍＬでコーティングした。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴで４回洗浄して、結合したＡβペプチドを、ＴＢＳＴ＋０．１％ウシ血清アルブミンで希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化４Ｇ８検出抗体（Ａβの残基１７−２４を認識する）０．２μｇ／ｍｌで検出した。３７℃にて１時間後、プレートを再度、ＴＢＳＴで４回洗浄した。ＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓは、化学発光基質であった。正常者（３２０、３２６、３２７、３２８）およびアルツハイマー患者（残りの番号が付けられた試料）の患者識別番号は示された通りである。緩衝液対照（ｂｋｇｄ）を使用して、ＥＬＩＳＡのバックグラウンドシグナルを決定した。
【図２】図２は、ミスフォールドＡβ４２が遠心分離によってペレット化することができる不溶性凝集形態であることと、凝集体の変性によって溶解性が生じ、説明したＥＬＩＳＡによる検出が行われることを示す。１０％ＢＨ  １００ｎｌを、ＴＢＳＴ  １００μｌで希釈する前に、水（天然、白色棒）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、黒色棒）のどちらかによって室温にて３０分間処理した。１セットの試料をサンドイッチＥＬＩＳＡ（全試料）に直接利用した。別のセットは１３５，５２０ｇで１．５時間、４℃にて遠心分離した。ペレット画分を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ中で３０分間、室温にて変性させて、１００μｌ  ＴＢＳＴで希釈した。次に上清およびペレット画分の両方をＥＬＩＳＡに利用した。Ａβ４２ペプチドは上述のように、１２Ｆ４抗体で捕捉して、４Ｇ８−ＡＰ検出抗体によって検出した。
【図３】図３は、血漿中のＡβ４２凝集体のＰＳＲ１結合（すなわちプルダウン）がビーズではなくペプトイドＸＩＩｂに起因し得ることを示す。正常者またはアルツハイマー病患者からの１０％ＢＨ  ７５ｎＬをＴＢＳＴＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％Ｔｗｅｅｎ−２０；１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中の８０％血漿１００μＬにスパイクした。ＢＨスパイク溶液をＰＳＲ１または陰性ビーズ（ＧＬＵＴ）のどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートして、次にＴＢＳＴで５回洗浄した。捕捉物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて変性させて、ＴＢＳＴで希釈してから、１２Ｆ４（Ａβ４２のＣ末端を認識）捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。正常者（３２０、３２６、３２７、３２８）およびアルツハイマー患者（残りの番号が付けられた試料）の患者識別番号は示された通りである。緩衝液対照（ｂｋｇｄ）を使用して、ＥＬＩＳＡのバックグラウンドシグナルを決定した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって検出された正常ヒト血漿中の内因性可溶性Ａβ４０およびＡβ４２レベルを示す。濃度漸増プールヒト血漿をＴＢＳＴ緩衝液で希釈し、１１Ａ５０−Ｂ１０（４Ａ）または１２Ｆ４（４Ｂ）プレートに適用してＡβ４０およびＡβ４２をそれぞれ捕捉した。捕捉されたペプチドは上述のように、４Ｇ８−ＡＰ検出抗体によって検出した。
【図５−１】図５（Ａ〜Ｆ）は、ＰＳＲ１がＡβ４０およびＡβ４２凝集体を結合するが、変性剤によって可溶化されているＡβ凝集体は認識しないことを示す。図５Ａは、変性された合成Ａβ４２を１２Ｆ４コートＥＬＩＳＡプレートに適用することによって作成したＡβ４２の標準曲線である。図５Ｂは、量漸増天然または変性アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）からのＡβ４２の検出である。ＢＨは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してからＴＢＳＴ  １００μｌで希釈し、１２Ｆ４（Ａβ４２のＣ末端に特異的）捕捉プレートに適用してＢＨ中のＡβのレベルを査定した。図５Ｃは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈して、ＰＳＲ１（三角形）または陰性（ＧＬＵＴ、丸）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートされた、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４２の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴで希釈して、１２Ｆ４捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。図５Ｄは、各種濃度の合成Ａβ４０を変性させて、１１Ａ５０−Ｂ１０コート（Ａβ４０のＣ末端に特異的）ＥＬＩＳＡ捕捉プレートに適用することによって作成したＡβ４０の標準曲線である。図５Ｅは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してから、ＴＢＳＴ  １００μｌで希釈した、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）中で検出されたＡβ４０の量を示す。試料を１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに直接適用して、ＢＨ中のＡβ４２のレベルを査定した。図５Ｆは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈し、ＰＳＲ１または陰性（ＧＬＵＴ）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートした、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４０の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴに希釈して、１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。
【図５−２】図５（Ａ〜Ｆ）は、ＰＳＲ１がＡβ４０およびＡβ４２凝集体を結合するが、変性剤によって可溶化されているＡβ凝集体は認識しないことを示す。図５Ａは、変性された合成Ａβ４２を１２Ｆ４コートＥＬＩＳＡプレートに適用することによって作成したＡβ４２の標準曲線である。図５Ｂは、量漸増天然または変性アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）からのＡβ４２の検出である。ＢＨは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してからＴＢＳＴ  １００μｌで希釈し、１２Ｆ４（Ａβ４２のＣ末端に特異的）捕捉プレートに適用してＢＨ中のＡβのレベルを査定した。図５Ｃは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈して、ＰＳＲ１（三角形）または陰性（ＧＬＵＴ、丸）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートされた、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４２の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴで希釈して、１２Ｆ４捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。図５Ｄは、各種濃度の合成Ａβ４０を変性させて、１１Ａ５０−Ｂ１０コート（Ａβ４０のＣ末端に特異的）ＥＬＩＳＡ捕捉プレートに適用することによって作成したＡβ４０の標準曲線である。図５Ｅは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してから、ＴＢＳＴ  １００μｌで希釈した、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）中で検出されたＡβ４０の量を示す。試料を１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに直接適用して、ＢＨ中のＡβ４２のレベルを査定した。図５Ｆは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈し、ＰＳＲ１または陰性（ＧＬＵＴ）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートした、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４０の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴに希釈して、１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。
【図５−３】図５（Ａ〜Ｆ）は、ＰＳＲ１がＡβ４０およびＡβ４２凝集体を結合するが、変性剤によって可溶化されているＡβ凝集体は認識しないことを示す。図５Ａは、変性された合成Ａβ４２を１２Ｆ４コートＥＬＩＳＡプレートに適用することによって作成したＡβ４２の標準曲線である。図５Ｂは、量漸増天然または変性アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）からのＡβ４２の検出である。ＢＨは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してからＴＢＳＴ  １００μｌで希釈し、１２Ｆ４（Ａβ４２のＣ末端に特異的）捕捉プレートに適用してＢＨ中のＡβのレベルを査定した。図５Ｃは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈して、ＰＳＲ１（三角形）または陰性（ＧＬＵＴ、丸）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートされた、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４２の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴで希釈して、１２Ｆ４捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。図５Ｄは、各種濃度の合成Ａβ４０を変性させて、１１Ａ５０−Ｂ１０コート（Ａβ４０のＣ末端に特異的）ＥＬＩＳＡ捕捉プレートに適用することによって作成したＡβ４０の標準曲線である。図５Ｅは、水（天然、白色三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸）によって３０分間室温にて処理してから、ＴＢＳＴ  １００μｌで希釈した、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）中で検出されたＡβ４０の量を示す。試料を１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに直接適用して、ＢＨ中のＡβ４２のレベルを査定した。図５Ｆは、水（天然、白色丸および三角形）または５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（変性、灰色丸および三角形）のどちらかによって３０分間、室温にて処理してから、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％ヒト血漿１００μｌで希釈し、ＰＳＲ１または陰性（ＧＬＵＴ）ビーズのどちらかと１時間、３７℃にてインキュベートした、アルツハイマー１０％ＢＨ（患者番号２９１）から捕捉されたＡβ４０の量を示す。プルダウンの後、ビーズをＴＢＳＴで５回洗浄して、結合物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって３０分間、室温にて溶離させた。試料をＴＢＳＴに希釈して、１１Ａ５０−Ｂ１０捕捉プレートに適用した。捕捉物質は、先に記載したように、４Ｇ８−ＡＰによって検出した。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ｖＣＪＤ試料中のＰｒＰＳｃについての各種の病原性配座異性体特異的結合試薬（６つの異なるペプチドおよびＰＳＲ１）の捕捉プロフィールを、緩衝液または５０％血漿を含有するＡＤ試料中のＡβ凝集体の捕捉プロフィールと比較して、それによりＰＳＲ１およびプリオン由来ペプチドが緩衝液および血漿中のＰｒＰＳｃおよびＡβ凝集体を結合することを示す。ビオチン化ペプチドをＭ２８０−ストレプトアビジンビーズにコートしてから、試料とインキュベートした。ＰＳＲ１ペプトイドをＤｙｎａｌ  Ｍ２７０−カルボン酸ビーズに結合させた。ｖＣＪＤ実験では、１０％ｖＣＪＤ  ＢＨ  １００ｎＬをＴＢＳＴＴ（８Ａ、上パネル）またはＴＢＳＴＴ中５０％血漿（８Ｂ、上パネル）１００μＬで希釈して、表示した病原性配座異性体特異的結合試薬と１時間、３７℃にてインキュベートした。ビーズをＴＢＳＴで６回洗浄して、０．１Ｍ  ＮａＯＨによって１０分間、室温にて溶離させた。溶離液を０．３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で５分間、室温にて中和させてから、３Ｆ４コート捕捉プレート（２．５μｇ／ｍＬ  ３Ｆ４抗体、ヒトＰｒＰ配列の残基１０９−１１２を認識）に適用した。物質を１時間、３７℃にて捕捉して、ＴＢＳＴで６回洗浄し、ＴＢＳＴ中の０．０１×カゼインブロッカー中のＡＰ結合体化ＰＯＭ２抗体（プリオンオクタリピート配列を認識）によって検出した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、プレートを再度洗浄して、ＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ基質で検出した。ＡＤ実験では、１０％ＡＤ  ＢＨ  ５０ｎＬをＴＢＳＴＴ（８Ａ、下パネル）またはＴＢＳＴＴ中５０％血漿（８Ｂ、下パネル）に同様にスパイクした。試料を配座異性体特異的結合試薬によって同様にプルダウンさせて、６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮで３０分間、室温にて溶離し、ＴＢＳＴで希釈した。溶離液を１２Ｆ４捕捉プレートに適用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化４Ｇ８によって検出した。ｖＣＪＤのデータは、Ｌａｕ，Ａ．Ｌ，ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０４（２８）：１１５５１−１１５５６（２００７）のように、先に公開されている。
【図７】図７は、ＴＢＳＴＴ中の５０％ＣＳＦにスパイクしたＡＤ  ＢＨからの凝集Ａβ４２に対する、同じパネルのプリオン由来ペプチドおよびＰＳＲ１の捕捉プロフィールを示す。プルダウンおよびＡβ４２特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ検出を上述のように実施した。
【図８】図８は、ＡＤ脳ホモジネート対正常脳ホモジネート（ＮＢＨ）中のＡβ４２の変性の最適化のための、ＮａＯＨ濃度用量設定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）および温度スクリーニングを示す。
【図９】図９、パネルＡ〜Ｆは、本明細書に記載するＰＣＳＢの試薬のいずれかを調製するために行うことができる例示的なペプトイド置換を示す。ペプトイドは、各パネルで丸が付けられており、プロリン残基（残基８）がＮ置換グリシン（ペプトイド）残基によって置換された、本明細書に記載される例示的な試薬（ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧ、配列番号２５０）に示されている。パネルＡは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシン；パネルＢは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン；パネルＣは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシン；パネルＤは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−（イソプロピル）グリシン；パネルＥは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシン；およびパネルＦは、プロリン残基がペプトイド残基によって置換されたペプチド試薬を示す：Ｎ−ブチルグリシン。
【図１０】図１０は、本明細書に記載する例示的なＰＥＧ結合病原性配座異性体特異的結合試薬の構造を示す。
【図１１】図１１は、ＰＳＲ１およびＰｒＰ２３−３０によるＡβの捕捉が、βシートブロッカーによる捕捉よりも優れていることを示す。ＡＬ３０は、Ａβ２０−１６逆配列（Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用する）であり、以下の構造：ビオチン−ＡＨＸ−Ｄ（ＦＦＶＬＫ）−ＣＯＮＨ２（配列番号２５２）を有する。ＡＬ３２はＡβ２０−１６であり、以下の構造：ビオチン−ＡＨＸ−ＦＦＶＬＫ−ＣＯＮＨ２（配列番号２５３）を有する。ＡＬ３３はＡβｌ６−２０−ＮｍｅＬであり、以下の構造：ビオチン−ＡＨＸ−ＫＬＶＦＦ−ＮｍｅＬ−ＣＯＮＨ２（配列番号２５４）を有する。ＮｍｅＬは、大半のペプチドカスタム合成会社から入手できる「標準」アミノ酸修飾のＮ−メチル化リジンである。ＡＬ３４は、Ａβ（１６−２０−ＮｍｅＬ）２であり、以下の構造：ビオチン−ＡＨＸ−ＫＬＶＦＦ−ＮｍｅＬ−ＡＨＸ−ＫＬＶＦＦ−ＮｍｅＬ−ＣＯＮＨ２（配列番号２５５）を有する。
【図１２】図１２は、有意なレベルの全タウが正常脳およびアルツハイマー病脳の両方で検出されることを示す。正常脳（患者ＩＤ番号３２０、３２６、３２７、３２８）またはＡＤ脳（患者ＩＤ番号３２５、３３４、３２５、２６４−１、２３０−１、２１８−２、２２１−１、２０１−２、１８４−１、１７７−１、および２９１）ホモジネートは、処置無し（天然、白色棒）であるか、または３Ｍ  ＧｎＳＣＮ（黒色棒）で処置するかのどちらかであった。全タウは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅタウイムノアッセイキットを使用して定量した。
【図１３】図１３は、対照グルタチオンビーズとは対照的に、ＰＳＲ１ビーズに特異的に結合するタウの量を示す。正常脳（患者ＩＤ番号３２０、３２６、３２７、３２８）またはＡＤ脳（患者ＩＤ番号３２５、３３４、３２５、２６４−１、２３０−１、２１８−２、２２１−１、２０１−２、１８４−１、１７７−１、および２９１）ホモジネートは、緩衝液で希釈して、Ｍ２７０−グルタチオン（白色棒）またはＰＳＲ１（黒色棒）のどちらかとインキュベートした。
【図１４】図１４は、ＰＳＲ１がタウ凝集体を結合するが、変性剤によって可溶化されているタウ凝集体は認識しないことを示す。正常脳（患者ＩＤ番号３２０、３２６）またはＡＤ脳（患者ＩＤ番号３３４、２３０）は、水（Ｎ）または５Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ（Ｄ）のどちらかで処置して、ＴＢＳＴＴ中２５％血漿で希釈し、次にＭ２７０グルタチオン対照ビーズ（白色棒）またはＰＳＲ１（黒色棒）のどちらかとインキュベートした。プルダウン後、ビーズをＴＢＳＴＴで洗浄して、ＧｄｎＳＣＮとインキュベートした。捕捉したタウは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅタウイムノアッセイキットを使用して定量した。
【図１５Ａ】図１５ＡおよびＢは、モノマー性可溶性ＡβのサンドイッチＥＬＩＳＡおよび凝集ＡβのＰＳＲ１プルダウンについて、ＬＯＤを計算するために使用したデータを示す。図１５Ａでは、様々な量の合成可溶性Ａβ（ｐｇ／ｍＬ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出される。図１５Ｂでは、プール正常ヒトＣＳＦ  ２００ｕｌにスパイクされた様々な量の１０％ＡＤ脳ホモジネートがＰＳＲ１プルダウンに供され、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出される。黒丸は、Ａβ４０を表す。白丸は、Ａβ４２を表す。
【図１５Ｂ】図１５ＡおよびＢは、モノマー性可溶性ＡβのサンドイッチＥＬＩＳＡおよび凝集ＡβのＰＳＲ１プルダウンについて、ＬＯＤを計算するために使用したデータを示す。図１５Ａでは、様々な量の合成可溶性Ａβ（ｐｇ／ｍＬ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出される。図１５Ｂでは、プール正常ヒトＣＳＦ  ２００ｕｌにスパイクされた様々な量の１０％ＡＤ脳ホモジネートがＰＳＲ１プルダウンに供され、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出される。黒丸は、Ａβ４０を表す。白丸は、Ａβ４２を表す。
【図１６】図１６は、ＡＤ  ＢＨ中のＡβ４２凝集体の全量（正方形）を、ＰＳＲ１に結合されたＡβ４２凝集体（三角形）と比較する。
【図１７】図１７は、モノマー性Ａβ４２（三角形）および凝集Ａβ４２（丸）の結合に対する血漿の濃度上昇の効果を示す。
【図１８】図１８は、各種解離条件でのＮＢＨ（正常脳ホモジネート、白色棒）およびＡＤ（アルツハイマー病患者からの脳ホモジネート、黒色棒）のシグナルを比較する。
【図１９】図１９は、全タウ（Ａ＆Ｂ）、Ｐ−タウ２３１（Ｃ＆Ｄ）およびＰ−タウ１８１（Ｅ＆Ｆ）のＥＬＩＳＡおよびＰＳＲ１ビーズプルダウンのＬＯＤを計算するために使用したデータを示す。図１９Ａは、タウＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。図１９Ｂは、ＡＤ  ＢＨスパイクＣＳＦ（２００ｕｌアッセイ）でのタウプルダウンを示す。図１９Ｃは、Ｐ−タウ２３１  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。図１９Ｄは、ＡＤ  ＢＨスパイクＣＳＦ（７０ｕＬ  ＣＳＦ）でのＰ−タウ２３１プルダウンを示す。図１９Ｅは、Ｐ−タウ１８１  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。図１９Ｆは、ＡＤ  ＢＨスパイクＣＳＦ（７０ｕＬ  ＣＳＦ）でのＰ−タウ１８１プルダウンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（表の簡単な説明）
表１は、例示的なコンフォメーション病および関連するコンフォメーション病タンパク質を示す。
【００４３】
表２は、さらなるコンフォメーション病タンパク質および関連するコンフォメーション病を示す。
【００４４】
表３は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに使用される例示的なペプチド配列を示す。
【００４５】
表４は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに好適な、例示的なペプトイド領域を示す。
【００４６】
表５は、表４で使用した省略形のキーを示す。
【００４７】
表６は、表４に示した各配列の関連構造を与える。
【００４８】
表７は、ＰＳＲ１のプルダウン効率を定量する。
【００４９】
表８は、実施例１０で測定したタウレベルを定量化する。
【００５０】
表９は、実施例１１で測定したタウレベルを定量化する。
【００５１】
表１０は、アルツハイマー病でない個人のＣＳＦからのＡβ４０および４２のＰＳＲ１ビーズへの結合を定量化する。
【００５２】
表１１は、濃度漸増血漿の存在下でのＰＳＲ１のモノマー性および凝集Ａβへの結合を定量化する。
【００５３】
（配列リストの簡単な説明）
配列番号１〜１１は、異なる種からのプリオンタンパク質のアミノ酸配列を提供する：ヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、ヒト（配列番号３）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号４）、ウシ（配列番号５）、ヒツジ（配列番号６）、マウス（配列番号７）、ヘラジカ（配列番号８）、ダマジカ（ファロウ（ｆａｌｌｏｗ））（配列番号９）、ミュールジカ（ラバ）（配列番号１０）、およびオジロジカ（ホワイト（ｗｈｉｔｅ））（配列番号１１）。
【００５４】
配列番号１２〜２２８は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに使用される例示的なペプチド配列のアミノ酸配列を提供する。
【００５５】
配列番号２２９〜２４１は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに使用される例示的なペプトイド領域の修飾アミノ酸配列を提供する。
【００５６】
配列番号２４２〜２４９は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに使用される例示的なプリオンタンパク質断片のアミノ酸配列を提供する。
【００５７】
配列番号２５０は、ＰＣＳＢ試薬を生成するのに使用される例示的なペプチド配列のアミノ酸配列を提供する。
【００５８】
配列番号２５１は、配列番号１で示されるようなヒトプリオンタンパク質のアミノ酸配列残基１９〜３０を提供する。
【００５９】
配列番号２５２〜２５５は、βシートブレイカーＡＬ３０、ＡＬ３２、ＡＬ３３、およびＡＬ３４のアミノ酸配列を提供する。
【００６０】
配列番号２５６〜２６１は、実施例３で試験を行った修飾プリオンタンパク質断片のアミノ酸配列を提供する。
【００６１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用するＰＣＳＢ試薬が、アルツハイマー病、糖尿病、全身性アミロイドーシスなどの他のコンフォメーション病の病原性配座異性体とも優先的に相互作用するという、驚くべきかつ予想外の発見に関するものである。これらのＰＣＳＢ試薬は通例、プリオンタンパク質断片に由来する。
【００６２】
これらのＰＣＳＢ試薬が非プリオン病原性配座異性体とも優先的に相互作用するという発見によって、プリオン以外のコンフォメーション病およびコンフォメーション病タンパク質ならびにプリオン関連疾患に対してこれらのＰＣＳＢ試薬を利用する検出アッセイ、診断アッセイ、および精製または単離方法の開発が可能となる。
【００６３】
いずれの理論にも束縛されたくはないが、これらのＰＣＳＢ試薬が非プリオン病原性配座異性体を優先的に結合して、それらを検出する能力は、ある病原性配座異性体に共通の構造モチーフの存在によることが考えられる。本明細書に含まれているかのように参照により本明細書に援用される、Ｌａｕ，Ａ．Ｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０４（２８）：１１５５１−１１５５６（２００７）は、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬とＰｒＰＳｃとの間の相互作用が正電荷に大きく依存することを示唆している。相互作用は、配列をスクランブルすることによって影響されないように思われるが、正電荷以外の個々のアミノ酸の特性も相互作用に何らかの役割を果たしているように思われる。これらの研究は、これらＰＣＳＢ試薬が疾患に関連するＰｒＰＳｃの直鎖状配列ドメインよりも、構造モチーフを結合すること示唆している。
【００６４】
アミロイドを形成する多くの病原性配座異性体が、同様の物理的特性を共有している。たとえばプリオンタンパク質の病原性配座異性体であるＰｒＰＳｃは、以下の特徴：βシート含有率の増加（ＰｒＰＣでの約３％からＰｒＰＳｃでの＞４０％）を示し、ＰｒＰＳｃ線維は、線維軸に沿って垂直に配向されたβシートで構成されている。出願人らは、すべてのアミロイド形成タンパク質に共通の構造モチーフの１つへの結合は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する試薬が非プリオンタンパク質の病原性配座異性体とも優先的に相互作用する機構であると考えている。
【００６５】
これらのＰＣＳＢ試薬は、病原性配座異性体とのこのような優先的な相互作用を示すために、より大型の構造または他の種類の骨格分子の一部である必要はない。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、これらのＰＣＳＢ試薬は、病原性配座異性体への結合は許容するが、非病原性配座異性体への結合は許容しないコンフォメーションを自発的に取るように思われる。例示されたＰＣＳＢ試薬によって本発明の方法で有用なＰＣＳＢ試薬にとっての出発点（たとえばサイズまたは配列特徴に関して）が与えられるが、より所望の属性（たとえばより高い親和性、より高い安定性、より高い溶解度、より低いプロテアーゼ感受性、より高い特異性、合成がより容易であることなど）を備えたＰＣＳＢ試薬を生産するために多くの修飾が行えることが、当業者に明らかになる。
【００６６】
一般に、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、病原性配座異性体に優先的に相互作用することができる。それゆえこれらの試薬によって、たとえば、疾患形成タンパク質を整理、凝集またはそうでなければ次に検出可能である状態まで誘導することによる、病原性配座異性体の存在の即時の検出、したがって生存しているかまたは死亡した脳、脊髄、脳脊髄液または他の神経組織系はもちろんのこと、血液および脾臓も含む、本質的にいずれの生物または非生物試料中の病原性配座異性体の診断も可能となる。ＰＣＳＢ試薬は、広範囲の単離、精製、検出、診断および治療用途に有用である。
【００６７】
本発明の方法で使用するＰＣＳＢ試薬は、参照により本明細書に援用されるＷＯ０５／０１６１３７およびＷＯ０７／０３０８０４でさらに詳細に説明されている。
【００６８】
本発明の実施には、別途指摘しない限り、当該分野の範囲内で化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法が使用される。このような技法は、文献で十分に説明されている。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌらｅｄｓ．，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍらｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ），Ｆｉｅｌｄｓら（ｅｄｓ．），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照。
【００６９】
本発明の試薬および方法は、特定の処方またはプロセスパラメーターに限定されず、したがってもちろん変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語が本発明の特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、制限するものではないことも理解されるべきである。
【００７０】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００７１】
（Ｉ．定義）
本発明の理解を容易にするために、この出願で使用する選択された用語を下で議論する。
【００７２】
本明細書で使用するように、「病原性」という用語は、タンパク質もしくは配座異性体が疾患を実際に引き起こすことを意味し得るか、または「病原性」という用語は、タンパク質もしくは配座異性体が疾患と関連しており、したがって疾患が存在するときに存在することを単に意味し得る。それゆえ、本開示と関連して使用されるような病原性タンパク質または配座異性体は、必ずしも疾患の特異的原因因子であるタンパク質ではなく、したがって感染性であってもなくてもよい。「病原性配座異性体」という用語は、より具体的には、疾患に関連するタンパク質のコンフォメーションおよび／またはβシートに富むコンフォメーションを指すために使用される。「病原性配座異性体」は、そのコンフォメーションがミスフォールド配座異性体、凝集形のミスフォールド配座異性体、または２つの混合物であるか否かにかかわらず、疾患に関連するタンパク質の任意のコンフォメーションである。「非病原性」および「細胞の」という用語は、コンフォメーション病タンパク質または配座異性体に関して使用されるときに、その存在が疾病と関連していないタンパク質の正常な配座異性体を指すために互換的に使用される。特定の疾患、たとえばアルツハイマー病に関連する病原性配座異性体は、「病原性アルツハイマー病配座異性体」と呼ばれることがある。
【００７３】
「病原性配座異性体特異的結合試薬」または「ＰＣＳＢ試薬」という用語は、これに限定されるわけではないが、親和性または特異性の上昇により、非病原性配座異性体とは対照的に病原性配座異性体と優先的に相互作用する、ペプチドおよびペプトイドを含む任意の種類の試薬を指す。優先的相互作用は、各ペプチドの特異的アミノ酸残基および／またはモチーフの間の相互作用を必ずしも必要としない。たとえば、ある実施形態において、本明細書に記載する病原性配座異性体特異的結合試薬は、病原性配座異性体と優先的に相互作用するが、それにもかかわらず、非病原性配座異性体を弱いが、検出可能なレベル（たとえば興味のあるポリペプチドで示される結合の１０％以下）で結合することも可能であり得る。通例、弱い結合、すなわちバックグラウンド結合は、たとえば適切な対照の使用によって、興味のある病原性配座異性体との優先的相互作用から容易に識別できる。一般に、本発明の方法で使用する病原性配座異性体特異的結合試薬は、過剰な非病原性形態の存在下で病原性配座異性体を結合する。
【００７４】
病原性配座異性体特異的結合試薬は、別のペプチドまたはタンパク質と、特異的に、非特異的に、または特異的および非特異的結合のある組合せで結合する場合に、「相互作用する」といわれる。試薬は、病原性配座異性体と、病原性配座異性体に対して非病原性配座異性体に対してよりも高い親和性および／または高い特異性で結合する場合に、「優先的に相互作用する」と言われる。「優先的に相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）」、「優先的に相互作用する（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔ）」、「選択的に結合する（ｂｉｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ）」、および「選択的に捕捉する」という用語は、本明細書で互換的に使用される。優先的相互作用は、各ペプチドの特異的アミノ酸残基および／またはモチーフの間の相互作用を必ずしも必要としないことが理解されるべきである。たとえば、ある実施形態において、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、病原性配座異性体と優先的に相互作用するが、それにもかかわらず、非病原性配座異性体を弱いが、検出可能なレベル（たとえば興味のあるポリペプチドで示される結合の１０％以下）で結合することが可能であり得る。通例、弱い結合、すなわちバックグラウンド結合は、たとえば適切な対照の使用によって、興味のある化合物またはポリペプチドとの優先的相互作用から容易に識別できる。一般に、本明細書に記載する試薬は、１００倍過剰を超える非病原性配座異性体の存在下で、病原性配座異性体を結合する。
【００７５】
本明細書に記載する方法で利用されるＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、プリオンタンパク質の病原性形態と優先的に相互作用する。「プリオンタンパク質断片に由来する」用語は、本明細書で使用するように、プリオンタンパク質断片の化学構造に基づく化学構造を有する試薬を指す。このような試薬は、天然プリオンタンパク質配列を有するペプチド断片、保存的アミノ酸置換を持つ天然プリオンタンパク質配列を有するペプチド断片、またはプリオンタンパク質のペプチド断片のペプトイド類似体であり得る。
【００７６】
「プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する」という用語は、本明細書で使用するように、先に定義した特性を組合せて有する試薬を指す。一例として、このような試薬は、上で定義したようなプリオンタンパク質断片の化学構造に基づく化学構造を有し、また病原性プリオンタンパク質に対して非病原性プリオンタンパク質に対してよりも高い親和性および／または高い特異性で結合する。
【００７７】
「非プリオン病原性配座異性体」という用語は本明細書で使用するように、本明細書で定義するようなプリオン疾患に関連するものではなく、コンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体を指す。
【００７８】
「コンフォメーション病タンパク質」は、β−プリーツシートとの関連で望ましくない原線維またはアミロイド重合などの異常なコンフォメーションを生じるように、タンパク質の構造が変化（たとえばミスフォールド）した、コンフォメーション病に関連するタンパク質の病原性および非病原性配座異性体を指す。コンフォメーション病タンパク質の例は、制限なく、アルツハイマー病タンパク質、たとえばＡβおよびタウ；プリオンタンパク質、たとえばＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣ、ならびに糖尿病タンパク質アミリンを含む。２つ以上の異なるコンフォメーションが想定されるタンパク質に関連する、疾患の非制限的なリストを下、
【００７９】
【表１】
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に示す。
「コンフォメーション病タンパク質」は本明細書で使用するように、本明細書に記載する配列と同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。この用語が、同定済みのまたは未同定の種または疾患（たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病など）のいずれによるコンフォメーション病タンパク質も含むことは、容易に明らかとなる。当業者は、本開示および当該分野の教示を考慮して、たとえば配列比較プログラム（たとえばＢＬＡＳＴおよび本明細書に記載する他のもの）または構造特性もしくはモチーフの同定およびアライメントを使用して、任意の他のプリオンタンパク質の図に示した配列に対応する領域を決定することができる。
【００８０】
「コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬」または「ＣＤＰＳＢ試薬」は、他のコンフォメーション病タンパク質および他の種類のタンパク質とは対照的に、特定のコンフォメーション病タンパク質と優先的に相互作用する任意の種類の試薬を指す。好ましくは、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は、コンフォメーション病タンパク質の病原性および非病原性配座異性体の両方に結合する。しかし多くの例で、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は、コンフォメーション病タンパク質の可溶性形態のみに結合でき、したがって凝集体／ミスフォールド病原性配座異性体を結合できない。この場合、不溶性病原性配座異性体を検出されるように変性させることが必要であり得る。通例、このような試薬はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【００８１】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」という用語は、病原性配座異性体（スクラピータンパク質、病原性タンパク質形態、病原性アイソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃと様々に呼ばれる）および非病原性配座異性体（細胞タンパク質形態、細胞アイソフォーム、非病原性アイソフォーム、非病原性プリオンタンパク質、およびＰｒＰＣと様々に呼ばれる）の両方はもちろんのこと、病原性コンフォメーションまたは正常細胞コンフォメーションのどちらも有し得ないプリオンタンパク質の変性形態および各種の組み換え形態も指すために、本明細書で互換的に使用される。病原性配座異性体は、ヒトおよび動物の疾患状態（海綿状脳症）に関連している。非病原性配座異性体は通常、動物細胞に存在して、適切な条件下で病原性ＰｒＰＳｃコンフォメーションに変換され得る。プリオンは、ヒト、ヒツジ、ウシおよびマウスを含む多種多様の哺乳動物種で自然に産生される。ヒトプリオンタンパク質の代表的なアミノ酸配列は、配列番号１として示される。マウスプリオンタンパク質の代表的なアミノ酸配列は、配列番号２として示される。他の代表的な配列は、配列番号３〜１１として提供される。プリオンタンパク質の断片は、実際の配列に対応する配列番号によって、または断片の最初および最後のアミノ酸のアミノ酸位置を示すことによって指定される。別途指摘しない限り、断片の最初および最後のアミノ酸を示すことによって呼ばれる断片は、配列番号１によって示されるようなヒトプリオンタンパク質の配列に基づく。たとえば「ＰｒＰ１９−３０」という用語は、ＬＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧの配列（配列番号２５１）を有するペプチドを指す。
【００８２】
「アルツハイマー病（ＡＤ）タンパク質」または「ＡＤタンパク質」という用語は、病原性配座異性体（病原性タンパク質形態、病原性アイソフォーム、病原性アルツハイマー病タンパク質、およびアルツハイマー病配座異性体と様々に呼ばれる）および非病原性配座異性体（正常細胞形態、非病原性アイソフォーム、非病原性アルツハイマー病タンパク質と様々に呼ばれる）の両方はもちろんのこと、病原性コンフォメーションまたは正常細胞コンフォメーションのどちらも有し得ないアルツハイマー病タンパク質の変性形態および各種の組み換え形態も指すために、本明細書で互換的に使用される。例示的なアルツハイマー病タンパク質は、Ａβおよびタウタンパク質を含む。
【００８３】
「アミロイドベータ」、「アミロイド−β」、「Ａベータ」、「Ａβ」、「Ａβ４２」、「Ａβ４０」、および「Ａβ４０／４２」という用語はすべて、本明細書で使用するように、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断によって形成された３９〜４３アミノ酸長の断片である、アミロイド−βペプチドを指す。Ａβという用語は、任意の形態のアミロイド−βペプチドを一般に指すために使用される。「Ａβ４２」という用語は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４２に対応する断片を指す。「Ａβ４０」という用語は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４０に対応する断片を指す。Ａβ４０／４２という用語は、Ａβ４０およびＡβ４２アイソフォームの両方を指すために使用される。
【００８４】
「糖尿病タンパク質」という用語は、病原性配座異性体（病原性タンパク質形態、病原性アイソフォーム、病原性糖尿病タンパク質と様々に呼ばれる）および非病原性配座異性体（正常細胞形態、非病原性アイソフォーム、非病原性糖尿病タンパク質と様々に呼ばれる）の両方はもちろんのこと、病原性コンフォメーションまたは正常細胞コンフォメーションのどちらも有し得ない糖尿病タンパク質の変性形態および各種の組み換え形態も指すために、本明細書で使用される。例示的なＩＩ型糖尿病タンパク質はアミリンであり、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）としても公知である。
【００８５】
「断片」は本明細書で使用するように、自然界で見出されるような無傷の全長タンパク質および構造の一部のみから成るペプチドを指す。たとえば断片は、タンパク質のＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含むことができる。通例、断片は、それが由来する全長ポリペプチド配列の機能の１つ、いくつかまたはすべてを保持する。通例、断片は、天然タンパク質の少なくとも５の連続アミノ酸残基を；好ましくは少なくとも約８の連続アミノ酸残基を；さらに好ましくは、天然タンパク質の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続アミノ酸残基を含む。
【００８６】
「単離された」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指すときに、示された分子が、その分子が自然界で見出され、生物全体から分離され別個であること、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが自然界に見出されないときには、そのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドがその所期の目的に使用できるのに足るほど、他の生物学的高分子を含んでいないことを意味する。
【００８７】
「ペプトイド」は、少なくとも１つの、好ましくは２つ以上のアミノ酸置換、好ましくはＮ置換グリシンを含有するペプチド模倣体を指すために一般に使用される。ペプトイドは特に、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。本明細書で使用するように、「ペプトイド試薬」は、アミノ末端領域と、カルボキシ末端領域と、アミノ末端領域とカルボキシ末端領域との間の少なくとも１つの「ペプトイド領域」とを有する分子である。アミノ末端領域は、通例いずれのＮ置換グリシンも含有しない、試薬のアミノ末端側の領域を指す。アミノ末端領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドなどであることが可能である。カルボキシ末端領域は、いずれのＮ置換グリシンも含有しない、ペプトイドのカルボキシ末端の領域を指す。カルボキシ末端領域は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどを含むことができる。
【００８８】
「ペプトイド領域」は、アミノ末端に最も近いＮ置換グリシンから開始してそのＮ置換グリシンを含み、カルボキシ末端に最も近いＮ置換グリシンで終了してそのＮ置換グリシンを含む領域である。ペプトイド領域は、その中のアミノ酸の少なくとも３つがＮ置換グリシンによって置換された試薬の部分を一般に指す。
【００８９】
「生理学的に関連するｐＨ」は、約５．５〜約８．５；または約６．０〜約８．０；または通常は約６．５〜約７．５のｐＨを指す。
【００９０】
「脂肪族」は、直鎖または分枝炭化水素部分を指す。脂肪族基は、ヘテロ原子およびカルボニル部分を含むことができる。
【００９１】
「アルキル」は、単独で使用されても、または別の基の一部として使用されても、脂肪族炭化水素鎖を指し、これに限定されるわけではないが、別途明示的に規定しない限り、１〜６個の、１〜５個の、１〜４個の、または１〜３個の炭素原子を含有する直鎖および分枝鎖を含む。たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどは、「アルキル」という用語に含まれる。
【００９２】
「アルケニル」は、たとえばこれに限定されるわけではないが、ビニル、アリル、２−メチル−アリル、４−ｂｕｔ−３−ｅｎｙｌ、４−ｈｅｘ−５−ｅｎｙｌ、３−メチル−ｂｕｔ−２−ｅｎｙｌなどを含む、少なくとも１個の２重結合、たとえば２〜７個の、２〜６個の、２〜５個の、または２〜４個の炭素原子を含有するアルキル基を示すことを意図する。
【００９３】
「アルキニル」は、少なくとも１個の３重炭素間結合、たとえば２〜７個の、２〜６個の、２〜５個の、または２〜４個の炭素原子を有するアルキル基を示すことを意図する。例示的なアルキニル基は、エチニル、プロピニルなどを含む。
【００９４】
「アルコキシ」は、単独で使用されても、または別の基の一部として使用されても、式−Ｏ−アルキル、たとえばメトキシの基の通常の意味を有し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【００９５】
「ハロ」または「ハロゲン」は、単独でまたは別の基の一部として使用されるとき、第ＶＩＩ族元素、たとえばＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩの通常の意味を有する。
【００９６】
「アリール」は、単独でまたは別の基の一部として使用されるとき、たとえば１、２または３環の、たとえば６〜２０個の、６〜１４個の、または６〜１０個の環炭素原子の芳香族炭化水素系たとえばフェニル、ベンジル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレニル、アントラセニル、ピレニルなどを意味する。アリールの定義には、１個以上の縮合非芳香族カルボシクリルまたはヘテロシクリル環を含有する芳香族系、たとえば１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンおよびインダンも含まれる。縮合非芳香環を含有するアリール基は、芳香族部分または非芳香族部分を介して結合できる。
【００９７】
「アリール−アルキル」または「アラルキル」は、式−アルキル−アリールの基を意味し、ここでアリールおよびアルキルは本明細書における定義を有する。
【００９８】
「アリールオキシ」は、式−Ｏ−アリールの基、たとえばヒドロキシフェニルのその通常の意味を有し、ここでアリールは、本明細書で定義する通りである。
【００９９】
「アラルコキシ」は、式−Ｏ−アルキル−アリールの基、たとえばメトキシフェニルのその通常の意味を有し、ここでアルコキシおよびアリールは本明細書で定義する通りである。
【０１００】
「シクロアルキル」は単独で使用されてもまたは別の基の一部として使用されても、環式アルキル、アルケニル、またはアルキニル基、たとえば３〜１０個の炭素原子の単環、２環式、３環式、縮合、架橋またはスピロ飽和炭化水素部分、たとえばシクロプロピルのその通常の意味を有する。「シクロアルキル−アリール」という用語は、式−アリール−シクロアルキルの基を示すことを意図し、ここでアリールおよびシクロアルキルは、本明細書で定義する通りである。「シクロアルキアルキル（ｃｙｃｌｏａｌｋｙａｌｋｙｌ）」は、式−アルキル−シクロアルキルの基、たとえばシクロプロピルメチルまたはシクロヘキシルメチル基を示すことを意図し、ここでアルキルおよびシクロアルキルは、本明細書で定義する通りである。
【０１０１】
本明細書で使用するように、「ヘテロアリール」基は、硫黄、酸素、または窒素などの少なくとも１個のヘテロ原子環員を有する芳香族複素環を指す。ヘテロアリール基は、単環式および多環式（たとえば２、３または４個の縮合環を有する）系を含む。ヘテロアリール基の例は、制限なく、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フリル（フラニル）、キノリル、イソキノリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、インドリル、ピリル、オキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インダゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、プリニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリニルなどを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は１〜約２０個の炭素原子を、さらなる実施形態において、約３〜約２０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、３〜約１４個の、３〜約７個の、または５〜６個の環形成原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、１〜約４個の、１〜約３個の、または１〜２個のヘテロ原子を有する。
【０１０２】
本明細書で使用するように、「ヘテロシクロアルキル」は、環形成炭素原子の１個以上がＯ、Ｎ、またはＳ原子などのヘテロ原子によって置換された環化アルキル、アルケニル、アルキニル基を含む、非芳香族複素環を指す。例示的な「ヘテロシクロアルキル」基は、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，３−ベンゾジオキソール、ベンゾ−１，４−ジオキサン、ピペリジニル、ピロリジニル、イソキサゾリジニル、イソチアゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリジニルなどを含む。ヘテロシクロアルキルの定義には、非芳香族複素環式環に縮合された（すなわち共通の結合を有する）１個以上の芳香環を有する部分、たとえばフタルイミジル、ナフタルイミジル、ならびにインドレンおよびイソインドレン基などの複素環のベンゾ誘導体も含まれる。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキル基は、１〜約２０個の炭素原子を、さらなる実施形態において、約３〜約２０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキル基は、３〜約１４、３〜約７、または５〜６個の環形成原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキル基は、１〜約４個の、１〜約３個の、または１〜２個のヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキル基は０〜３個の２重結合を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキル基は、０〜２個の２重または３重結合を含有する。
【０１０３】
「ヘテロアリールアルキル」は、式−アルキル−ヘテロアリールの基を指し、ここでアルキルおよびヘテロアリールは、本明細書で定義する通りである。
【０１０４】
「アシル」は、式−Ｃ（Ｏ）−アルキルの基を指す。いくつかの実施形態において、アシル基は、１〜１０個、１〜８個、１〜６個、または１〜４個の炭素原子を有する。
【０１０５】
「アミノアシル」は、式−Ｃ（Ｏ）−アルキル−アミノの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１０６】
「アルキルアミノ」は、式−ＮＨ−アルキルの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１０７】
「ジアルキルアミノ」は、式−Ｎ（アルキル）２の基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１０８】
「ハロアルキル」は、１個以上のハロゲンによって置換されたアルキル基を指し、ここでアルキルおよびハロゲンは本明細書で定義する通りである。
【０１０９】
「アルコキシアルキル」は、式−アルキル−アルコキシの基を指し、ここでアルキルおよびアルコキシは本明細書で定義する通りである。
【０１１０】
「カルボキシアルキル」は、式−アルキル−ＣＯＯＨの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１１】
「カルバミル」は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の基を指す。
【０１１２】
「カルバミルアルキル」は、式−アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１３】
「グアニジノアルキル」は、式−アルキル−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１４】
「チオール」は、式−ＳＨの基を指す。
【０１１５】
「アルキルチオール」は、式−Ｓ−アルキルの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１６】
「アルキルチオアルキル」は、式−アルキル（ａｌｋｌｙ）−Ｓ−アルキルの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１７】
「イミダゾリルアルキル」は、式−アルキル−イミダゾリルの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１８】
「ピペリジルアルキル」は、式−アルキル−ピペリジニルの基を指し、ここでアルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１１９】
「ナフチルアルキル」は、式−アルキル−ナフチルの基、たとえば（８’−ナフチル）メチルを意味し、ここでナフチルはその通常の意味を有し、アルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１２０】
「インドリルアルキル」は、式−アルキル−インドールの基、たとえば３’−インドリルエチル、および３’−インドリルメチルを意味し、ここでインドールはその通常の意味を有し、アルキルは本明細書で定義する通りである。
【０１２１】
「Ｎ含有ヘテロシクリル」は、少なくとも１個の環形成Ｎ原子を含有する任意のヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基を指すことを意図する。例示的なＮ含有ヘテロシクリル基は、ピリジニル、イミダゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリル、インドリル、などを含む。
【０１２２】
「Ｎ含有ヘテロシクリルアルキル」は、Ｎ含有ヘテロシクリルアルキルによって置換されたアルキルを指すことを意図する。
【０１２３】
「アミノ」および「１級アミノ」は、ＮＨ２を指す。「２級アミノ」はＮＨＲを指し、「３級アミノ」はＮＲ２を指し、ここでＲは任意の好適な置換基である。
【０１２４】
「アンモニウム」は基−Ｎ（Ｒ）３＋を指すことを意図し、ここでＲはアルキル、シクロアルキル、アリール、シクロアルキルアルキル、アリールアルキルなどの任意の適切な部分であり得る。
【０１２５】
「アミノ酸」は、２０個の天然に存在しかつ遺伝的にコードされたα−アミノ酸またはその保護誘導体のいずれも指す。アミノ酸の保護誘導体は、アミノ部分、カルボキシ部分、または側鎖部分に１個以上の保護基を含有することができる。アミノ保護基の例は、ホルミル、トリチル、フタルイミド、トリクロロアセチル、クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、およびウレタン型ブロック基、たとえばベンジルオキシカルボニル、４−フェニルベンジルオキシカルボニル、２−メチルベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−フルオロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、３−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、３−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−シアノベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、２−（４−キセニル）−イソプロポキシカルボニル、１，１−ジフェニルエチ−１−イルオキシカルボニル、１，１−ジフェニルプロパ−１−イルオキシカルボニル、２−フェニルプロパ−２−イルオキシカルボニル、２−（ｐ−トルイル）−プロパ−２−イルオキシカルボニル、シクロペンタニルオキシ−カルボニル、１−メチルシクロペンタニルオキシカルボニル、シクロヘキサニルオキシカルボニル、１−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−（４−トルイルスルホニル）−エトキシカルボニル、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル、２−（トリフェニルホスフィノ）−エトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エニルオキシカルボニル、５−ベンズイソキサリルメトキシカルボニル、４−アセトキシベンジルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−エチニル−２−プロポキシカルボニル、シクロプロピルメトキシカルボニル、４−（デシクロキシ）ベンジルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、１−ピペリジルオキシカルボニルなど；ベンゾイルメチルスルホニル基、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィンオキシドおよび同様のアミノ保護基を含む。カルボキシ保護基の例は、メチル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、３，４−メチレンジオキシベンジル、ベンズヒドリル、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル、２，２’，４，４’−テトラメトキシベンズヒドリル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４”−トリメトキシトリチル、２−フェニルプロパ−２−イル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェナシル、２，２，２−トリクロロエチル、ベータ−（ジ（ｎ−ブチル）メチル���リル）エチル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、４−ニトロベンジルスルホニルエチル、アリル、シンナミル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エン−３−イルおよび同様の部分を含む。使用される保護基の種は、分子の残りを破壊することなく、誘導体化保護基を適切な箇所で選択的に除去できる限り、重要ではない。保護基のさらなる例は、Ｅ．Ｈａｓｌａｍ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，ｅｄ．，１９７３），ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２；ならびにＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９９１），ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７に見出され、そのそれぞれの開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
「Ｎ置換グリシン」は、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の残基を指し、ここで各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、Ｎ含有ヘテロシクリル、Ｎ含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、炭素原子４〜１０個のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、炭素原子５〜１０個のピペリジルアルキル、インドリル、炭素原子９〜１５のインドリルアルキル、ナフチル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択されるものなどの非水素部分であり；ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。
【０１２７】
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のいくつかの実施形態において、Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、イミダゾリル、炭素原子４〜１０個のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、炭素原子５〜１０個のピペリジルアルキル、インドリル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、ナフチル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、および（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。
【０１２８】
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のいくつかの実施形態において、Ｒは、ハロゲン、ヒドロキシまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって置換される、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【０１２９】
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のいくつかの実施形態において、Ｒは、生理学的に関連するｐＨにて荷電した部分である。生理学的に関連するｐＨにて正に荷電したＲの例はたとえば、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｎ含有ヘテロシクリル、およびＮ含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルを含み、ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３メトキシ、およびＣ１−Ｃ３アルキルから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。
【０１３０】
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のいくつかの実施形態において、Ｒは生理学的に関連するｐＨにおいて中性の部分である。生理学的に関連するｐＨにて中性のＲの例はたとえば、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルを含む。さらなる例は、エチル、プロパ−１−イル、プロパ−２−イル、１−メチルプロパ−１−イル、２−メチルプロパ−１−イル、３−フェニルプロピ−１−イル、３−メチルブチル、ベンジル、４−クロロ−ベンジル、４−メトキシ−ベンジル、４−メチル−ベンジル、２−メチルチオエチ−１−イル、および２，２−ジフェニルエチルを含む。
【０１３１】
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のいくつかの実施形態において、Ｒはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（たとえばアミノブチル）である。
【０１３２】
さらなる例示的なＮ置換グリシンは、Ｒがエチル、プロパ−１−イル、プロパ−２−イル、１−メチルプロパ−１−イル、２−メチルプロパ−１−イル、３−フェニルプロピ−１−イル、３−メチルブチル、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−クロロ−ベンジル、４−メトキシ−ベンジル、４−メチル−ベンジル、２−ヒドロキシエチル、メルカプトエチル、２−アミノエチル、３−プロピオン酸、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、２−メチルチオエチ−１−イル、カルボキシメチル、２−カルボキシエチル、カルバミルメチル、２−カルバミルエチル、３−グアニジノプロパ−１−イル、イミダゾリルメチル、２，２−ジフェニルエチルまたはインドール−３−イル−エチルであるものを含む。
【０１３３】
Ｎ置換グリシンの塩、エステル、および保護形態（たとえばＦｍｏｃまたはＢｏｃなどによりＮ保護されたもの）も含まれる。
【０１３４】
Ｎ置換グリシンを含むアミノ酸置換基を生成する方法は、特に、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，８１１，３８７号に開示されている。
【０１３５】
「モノマー」または「サブユニット」は、鎖を形成するために他のモノマーに結合できる分子、たとえばペプチドを指す。アミノ酸およびＮ置換グリシンは例示的なモノマーである。他のモノマーと結合したとき、モノマーは「残基」と呼ばれ得る。
【０１３６】
（ＩＩ．コンフォメーション病）
本発明は、非プリオンコンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体を検出する方法およびこのようなタンパク質に関連する疾患を診断する方法に関する。コンフォメーション病タンパク質およびその対応する疾患は、下の表
【０１３７】
【表２】
2011520108.tif 000016
に示す疾患を含む。
【０１３８】
本発明のコンフォメーション病は、プリオンに関連する疾患以外の、２つ以上の異なるコンフォメーションを形成するタンパク質に関連する任意の疾患を含む。本明細書で特に興味のある疾患は、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシス、タウオパチー、およびシヌクレイノパチーなどの、すべてクロスベータシート特徴を呈するアミロイド疾患を含む。興味のある他の疾患は、糖尿病およびポリグルタミン病である。
【０１３９】
本発明の方法のある実施形態において、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬（「ＣＤＰＳＢ試薬」）は、非病原性および病原性配座異性体の両方の捕捉または検出のどちらかを行うために使用される。使用される特定のＣＤＰＳＢ試薬は、検出される病原性配座異性体に依存する。たとえば診断されるコンフォメーション病がアルツハイマー病である場合、ここでＣＤＰＳＢ試薬は、アルツハイマー病タンパク質Ａβの非病原性および病原性配座異性体の両方を認識する抗体であり得る。
【０１４０】
（ＩＩＩ．本発明の方法で使用される試薬）
本発明で使用される病原性配座異性体特異的結合試薬（「ＰＣＳＢ試薬」）は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する試薬である。
【０１４１】
通例、ＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片に由来する。好ましくは、このようなＰＣＳＢ試薬は、ペプチドまたはペプトイドとして一般に公知であるものを含む修飾ペプチドのどちらかである。
【０１４２】
ある実施形態において、このようなＰＣＳＢ試薬はポリカチオン性である。最も好ましくは、ＰＣＳＢ試薬は、生理学的ｐＨにおいて少なくとも３または４の正味の正電荷を有する。理論に束縛されたくはないが、出願人らは、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬がＰｒＰＳｃに結合する機構に類似した機構によって、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬が非プリオン病原性配座異性体に結合して、したがって同様の結合特性を示すと考えている。Ｌａｕらは（本明細書の上で引用した）、血漿および緩衝液の両方においてＰｒＰＳｃへの結合に必要なコアペプチド配列が４個の正に荷電したアミノ酸を有することを示している。正に荷電したアミノ酸残基を３個しか含有しないペプチドは、緩衝液中のみでＰｒＰＳｃを結合できる。さらに、血漿および緩衝液の両方においてＰｒＰＳｃを結合するペプチドのアラニンスキャニング（ｓｃａｎｎｉｎｇ）は、正に荷電したアミノ酸のいずれか１個を除去することによって、バックグラウンドレベルに低下する。
【０１４３】
（Ａ．好ましいプリオンタンパク質断片）
ＰＣＳＢ試薬は好ましくは、あるプリオンタンパク質断片のアミノ酸配列に由来する。これらの好ましい領域は、マウスプリオン配列（配列番号２）およびヒトプリオン配列（配列番号１）の両方に関して例示される。本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬は好ましくは、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用することが公知の他のＰＣＳＢ試薬の基礎として作用するプリオンタンパク質断片に由来するが、生じるＰＣＳＢ試薬が病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用できる限り、いずれのプリオンタンパク質断片から由来していてもよい。特に好ましい配列を下に記載する。
【０１４４】
本発明で使用されるＰＣＳＢ試薬は、いずれの種または改変体のアミノ酸配列の断片からも由来し得る。ヒト、マウス、ヒツジおよびウシを含む多くの異なる種によって産生されたプリオンタンパク質のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知である。これらの配列の改変体もそれぞれの種に存在する。たとえばある実施形態において、本明細書に記載するペプチドＰＣＳＢ試薬は、配列番号１−１１で示される配列のいずれかに由来する。本明細書で具体的に開示されるＰＣＳＢ試薬の配列は、マウスまたはヒトプリオン配列のどちらかに基づくが、当業者は、適切な場合には、他の種による対応する配列を容易に代用することができる。
【０１４５】
ＰＣＳＢ試薬が由来可能であるプリオンタンパク質断片の好ましい長さは、長さが３〜５の残基、長さが６〜１０（またはその間の任意の整数）の残基、長さが１１〜２０（またはその間の任意の整数）の残基、長さが２１〜７５（またはその間の任意の整数）の残基、長さが７５〜１００（またはその間の任意の整数）の残基、または長さが１００の残基を超えるポリペプチドを含む。好ましくは、ペプチドは長さが約３〜１００の残基である。一般に当業者は、本明細書の教示を考慮して、最大長を容易に選択することができる。さらに、本明細書に記載するような試薬、たとえば合成ペプチドは、標識、リンカー、または他の化学的部分（たとえばビオチン、コントロールレッドまたはチオフラビンなどのアミロイド特異性色素）などのさらなる分子を含み得る。このような部分は、ＰＣＳＢ試薬と病原性配座異性体との相互作用および／または病原性配座異性体のさらなる検出をさらに向上させ得る。
【０１４６】
好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用することが公知のプリオンタンパク質断片、たとえば以下のヒトプリオンタンパク質断片：ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０および配列番号６８に対応する配列を有する断片に由来する。
【０１４７】
（Ｂ．ＰＣＳＢペプチド試薬）
プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片の正確なアミノ酸配列を有し得るか、またはプリオンタンパク質断片の変形または修飾形態であり得る。本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬は好ましくは、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用することが公知の他のＰＣＳＢ試薬の基礎として作用するプリオンタンパク質断片に由来するが、生じる試薬が病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用できる限り、いずれのプリオンタンパク質断片から由来していてもよい。
【０１４８】
ＰＣＳＢ試薬は、１つ以上の非天然型アミノ酸を含む、１つ以上の置換、付加および／または欠失を有する、プリオンタンパク質断片のアミノ酸配列の誘導体を含む。好ましくは、誘導体は、任意の野生型または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性を、好ましくは少なくとも約７０％の同一性を、さらに好ましくは、本明細書に記載する任意の野生型または参照配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す。配列（またはパーセント）同一性は、後述する方法などの、当業者に公知の任意の方法を使用して決定できる。このような誘導体は、ポリペプチドの発現後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含むことができる。
【０１４９】
アミノ酸配列の類似性またはパーセント同一性を決定する技法は、当該分野で周知である。一般に「類似性」とは、適切な場所における２つ以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の比較で、アミノ酸が同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの同様の化学的および／もしくは物理的特性を有することを意味する。そしていわゆる「パーセント同一性」と呼ばれるもの（ｓｏ−ｔｅｒｍｅｄ）は、比較されたポリペプチド配列の間で決定できる。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定する技法も、当該分野で周知であり、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を（通常、ｃＤＮＡ中間体を介して）決定することと、それによりコードされたアミノ酸配列を決定することと、これを第２のアミノ酸配列と比較することとを含む。一般に「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。
【０１５０】
２つ以上のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列は、その「パーセント同一性」を決定することによって比較できる。「パーセント同一性」は、配列を整列させて、２つの整列した配列間の正確な一致数をカウントし、参照配列の長さで割り、結果に１００を掛けることにより、２つの分子間の配列情報の直接比較（参照配列および参照配列に対する％同一性が不明の配列）によって決定することができる。ペプチド分析のためにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１のＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを適合させた、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣなどの容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用して分析に役立てることができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するプログラム、たとえばまたＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存した、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できる）で入手できる。これらのプログラムは、製作者によって推奨され、上で触れたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメーターによって容易に利用される。たとえば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対するパーセント同一性は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトのスコアリング表および６ヌクレオチド部位のギャップペナルティと共に使用して決定することができる。
【０１５１】
本発明の状況においてパーセント同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を所有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、多くの供給源、たとえばインターネットから入手可能である、ＭＰＳＲＣＨＴＭパッケージプログラムを使用することである。この１組のパッケージから、デフォルトパラメーターがスコアリング表に使用されている（たとえばギャップオープンペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ１、およびギャップ６）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる。生成されたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、一般に当該分野で公知であり、たとえば，別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターと共に使用されるＢＬＡＳＴである。たとえば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して使用できる：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は容易に入手できる。
【０１５２】
ＰＣＳＢ試薬は、ポリペプチドが所望の活性を保持する限り、天然プリオンタンパク質配列に対する修飾、たとえば欠失、付加および置換（一般に自然界では保存的）を備えたＰＣＳＢ試薬も含むことができる。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸のファミリー内で起きるその側鎖に関連する置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは場合により、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。たとえばロイシンとイソロイシンもしくはバリンとの、アスパラギン酸のグルタミン塩との、トレオニンとセリンとの孤立置換（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、またはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様の保存的置換は、生物活性に対して大きな効果を有しないと合理的に予測可能である。このような修飾は、部位特異的変異誘発によるなど計画的であり得るか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーによるなど偶発的であり得る。さらに、以下の効果：毒性の低下；病原性配座異性体に対する親和性および／または特異性の向上；細胞プロセシングの促進（たとえば分泌、抗原提示など）；ならびにＢ細胞および／またはＴ細胞への提示の促進の１つ以上を有する修飾が行われ得る。
【０１５３】
ＰＣＳＢ試薬は、アミノ酸の１つ以上の類似体（たとえば非天然アミノ酸などを含む）、置換された結合を有するペプチドはもちろんのこと、天然型および非天然型（たとえば合成）の両方の、当該分野で公知の他の修飾も含有し得る。それゆえ合成ペプチド、ダイマー、マルチマー（たとえばタンデムリピート、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態、直鎖状結合ペプチド）、環化、分枝分子などは、ペプチドと見なされる。これは、１個以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）および他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子も含む。（ペプトイドの説明については、たとえば米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら（２０００）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３−４７３；ならびにＳｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７−９３７１を参照）。
【０１５４】
これらおよび他のアミノ酸類似体ならびにペプチドミメティックの一般的な総説については、Ｎｇｕｙｅｎら（２０００）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３−４７３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照。Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（総説），Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，（３月、１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（総説），ｐｐ．４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ，１４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ．ＥＰ４５６６５ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）も参照；そのそれぞれは参照により本明細書に援用される。
【０１５５】
天然アミノ酸および非天然アミノ酸類似体の任意の組合せが本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬を生成するために使用できることも明らかになる。遺伝子コードされていない一般に見られるアミノ酸類似体は、これに限定されるわけではないが、オルニチン（Ｏｒｎ）；アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ベンゾチオフェニルアラニン（ＢｔＰｈｅ）；アルビッジイン（Ａｂｚ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）；フェニルグリシン（ＰｈＧ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）；２−チエニルアラニン（２−Ｔｈｉ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）；ホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｎα−メチルアルギニン（Ｎ−ＭｅＡｒｇ）；ホスホチロシン（ｐＴｙｒまたはｐＹ）；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）；４−フルオロフェニルアラニン（４−ＦＰｈｅ）；１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１−ＮＣＰＣ）；およびサルコシン（Ｓａｒ）を含む。ＰＣＳＢ試薬で使用されるアミノ酸のいずれもＤ−または、より通例にはＬ−異性体のどちらかであり得る。
【０１５６】
本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬を形成するために使用され得るアミノ酸の他の非天然型類似体は、生物機能的同等物であり、本発明の化合物においても有用であり、同配体によって場合により置換された１個以上のアミド結合を有する化合物を含む、アミノ酸のスルホン酸アナログおよびボロン酸アナログなどのペプトイドおよび／またはペプチドミメティック化合物を含む。本発明の状況において、たとえば−−ＣＯＮＨ−−は、同配体によって結合されたラジカルが−−ＣＯＮＨ−−によって結合されたラジカルと同様の配向で保持されるように、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＮＨＣＯ−−、−−ＳＯ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｏ−−、−−ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２ＳＯ−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−−（シスまたはトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および１，５−２置換（ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）テトラゾールによって置換され得る。本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬の１個以上の残基はペプトイドを含み得る。
【０１５７】
それゆえ試薬は、１個以上のＮ置換グリシン残基も含み得る（１個以上のＮ置換グリシン残基を有するペプチドは、「ペプトイド」と呼ばれ得る）。たとえばある実施形態において、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬のいずれの１個以上のプロリン残基もＮ置換グリシン残基によって置換される。この点で好適である特定のＮ置換グリシンは、これに限定されるわけではないが、Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシン；Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシン；Ｎ−（イソプロピル）グリシン；Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシン；およびＮ−ブチルグリシンを含む。他のＮ置換グリシンも、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬配列内の１個以上のアミノ酸残基を置換するのに好適であり得る。
【０１５８】
本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、モノマー、マルチマー、環化分子、分枝分子、リンカーなどであり得る。本明細書に記載する配列のいずれのマルチマー（すなわちダイマー、トリマーなど）またはその生物機能性同等物も予期される。マルチマーは、ホモマルチマーであること、すなわち同一のモノマーで構成されることが可能であり、たとえば各モノマーは同じペプチド配列である。代わりに、マルチマーはヘテロマルチマーであることが可能であり、ヘテロマルチマーとは、マルチマーを構成するすべてのモノマーが同一とは限らないことを意味する。
【０１５９】
マルチマーは、モノマーの相互への、または、たとえば多抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（たとえば対称的ＭＡＰＳ）、ポリマー骨格、たとえばＰＥＧ骨格に結合されたペプチドおよび／またはスペーサー単位を用いてかもしくは用いずに直列に結合されたペプチドを含む基質への、直接結合によって形成することができる。
【０１６０】
代わりに、結合基をモノマー性配列に付加して、モノマーを共に結合させて、マルチマーを形成することができる。結合基を使用するマルチマーの非制限的な例は、グリシンリンカーを使用するタンデムリピート；リンカーを介して基質に結合されたＭＡＰＳおよび／またはリンカーを介して骨格に結合された直鎖状結合ペプチドを含む。結合基は、当業者に公知であるような２官能性スペーサー単位（ホモ２官能性またはヘテロ２官能性）の使用を含み得る。一例としてであり、制限するものではないが、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなどの試薬を使用して共に結合するペプチドに、このようなスペーサー単位を含める多くの方法は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌ．）に記載されており、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）からも入手可能であり、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，ＶＣＫ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８９）に記載されている。モノマー性配列を共に結合するために使用され得る結合基の一例は、−−Ｙ１−−Ｆ−−Ｙ２であり、ここでＹ１およびＹ２は、同じまたは異なり、炭素原子０〜２０個の、好ましくは０〜８個の、さらに好ましくは０〜３個のアルキレン基であり、Ｆは、−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ−−Ｓ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−Ｏ−−などの１個以上の官能基である。Ｙ１およびＹ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、カルボキシル、カルボキシアルキルなどによって場合により置換され得る。モノマーの任意の適切な原子が結合基に結合可能であることは理解されるべきである。
【０１６１】
さらに、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は直鎖状、分枝状または環化状であり得る。モノマー単位は、環化され得るか、または共に結合され得て、マルチマーを直鎖または分枝方式で、環の形で（たとえば大員環）、星の形で（デンドリマー）またはボールの形で（たとえばフラーレン）で与える。当業者は、本明細書に開示したモノマー性配列から形成することができる多数のポリマーを容易に認識する。ある実施形態において、マルチマーは環式ダイマーである。上と同じ用語を使用すると、ダイマーはホモダイマーまたはヘテロダイマーであることが可能である。
【０１６２】
環式形態は、モノマーまたはマルチマーにかかわらず、これに限定されるわけではないが、たとえば：（１）窒素とＣ末端カルボニルとの間の直接アミド結合形成、またはたとえばイプシロン−アミノカルボン酸との縮合などによるスペーサー基の仲介のどちらかによる、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボン酸による環化；（２）たとえばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖とリジン側鎖との間にアミド結合を形成することによる、または２個のシステイン側鎖間もしくはペニシラミン側鎖とシステイン側鎖との間もしくは２個のペニシラミン側鎖間でのジスルフィド結合形成による、２個の残基の側鎖間の結合の形成による環化；（３）側鎖（たとえばアスパラギン酸またはリジン）とＮ末端アミンまたはＣ末端カルボキシルのどちらかそれぞれとの間のアミド結合の形成による環化；および／または（４）短い炭素スペーサー基の仲介による２個の側鎖の結合；などの上に記載した結合のいずれかによって生成できる。
【０１６３】
さらに、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、さらなるペプチド成分または非ペプチド成分も含み得る。さらなるペプチド成分の非制限的な例は、スペーサー残基、たとえば２個以上のグリシン（天然または誘導体化）残基または一端もしくは両端上のアミノヘキサン酸リンカーまたはペプチド試薬の可溶化を補助し得る残基、たとえばアスパラギン酸などの酸性残基（ＡｓｐまたはＤ）を含む。ある実施形態において、たとえばペプチド試薬は、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。通例、ペプチド試薬の複数のコピー（たとえば２〜１０コピー）は、分枝リジンなどのＭＡＰ担体または他のＭＡＰ担体コアに直接合成される。たとえばＷｕら、２００１  １２３（２８）：６７７８−８４；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら（１９９５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５（１）：７８−８５を参照。
【０１６４】
本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬に含まれ得る非ペプチド成分（たとえば化学部分）の非制限的な例は、１つ以上の検出可能な標識、タグ（たとえばビオチン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、オリゴヌクレオチド）、色素、結合対のメンバーなどをペプチド試薬の末端または内部のどちらかに含む。非ペプチド成分も、定量的構造活性データおよび／または分子モデリングによって非干渉性であることが予測される化合物上の位置に、直接またはスペーサー（たとえばアミド基）を介して（たとえば１つ以上の標識の共有結合を介して）結合され得る。本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、アミロイド特異的色素（たとえばコンゴーレッド、チオフラビンなど）などのプリオン特異的化学部分も含み得る。化合物の誘導体化（たとえば標識化、環化、化学部分の結合など）は、試薬の結合特性、生物機能および／または薬理学的活性を実質的に干渉（および向上させることさえ）すべきでない。
【０１６５】
上述のペプチドは、これに限定されるわけではないが、組換え構築物からの発現およびペプチド合成を含む、当業者に公知の標準方法を使用して調製できる。
【０１６６】
（Ｃ．ＰＣＳＢ試薬の基礎として使用される好ましいペプチドの例）
本発明の病原性配座異性体特異的結合試薬を生成するのに有用なペプチドの非制限的な例は、好ましくは、表３に示す配列に由来する。表のペプチドは、慣習的な１文字のアミノ酸コードによって表され、左側のそのアミノ末端および右側のカルボキシ末端と共に示される。Ｘは、任意のアミノ酸をその位置に配置できることを示す。
【０１６７】
表の配列
【０１６８】
【表３−１】
2011520108.tif 000017
【０１６９】
【表３−２】
2011520108.tif 000018
【０１７０】
【表３−３】
2011520108.tif 000019
【０１７１】
【表３−４】
2011520108.tif 000020
【０１７２】
【表３−５】
2011520108.tif 000021
【０１７３】
【表３−６】
2011520108.tif 000022
【０１７４】
【表３−７】
2011520108.tif 000023
【０１７５】
【表３−８】
2011520108.tif 000024
のいずれも、アミノおよび／またはカルボキシ末端にＧｌｙリンカー（Ｇｎ、ここでｎ＝１、２、３、または４）を場合により含み得る。角カッコ内のアミノ酸は、別のペプチドにおいてその位置で使用できる代わりの残基を示す。丸カッコは残基がペプチド試薬に存在してもよく、または存在しなくてもよいことを示す。「２」が続く二重丸カッコ（たとえば配列番号１１１）は、配列が二重カッコの間のペプチドのコピーを２個含むことを示す。コピー回数の表示に続く残基（たとえば配列番号１１１では「Ｋ」）は、二重カッコ間のペプチドの各コピーが伸長する残基を示す。それゆえ配列番号１１１は、そのカルボキシ末端がリジンのａ−およびｅ−アミノ官能基を介してリジン（Ｋ）残基にそれぞれ結合された、ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮペプチド配列（すなわち配列番号１４）のダイマーである。「ＭＡＰＳ」を含む配列は、多抗原性部位を備えたペプチドを示す。「分枝」という用語に先行する数字は、コピー数を示す。それゆえ配列番号１１２は、各末端にＧｌｙリンカーを備えた配列番号６７である、ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを４コピー含有するが、配列番号１１３は、また各末端にＧｌｙリンカーを備えた配列番号６７である、ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを８コピー含有する。
【０１７６】
ある実施形態において、ペプチド断片は、それぞれが本明細書にその全体が援用される、すべて“Ｐｒｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ”という名称で、２００４年８月１３日に出願された共有に係る特許出願の米国特許出願番号第１０／９１７，６４６号、２００５年２月１１日に出願された米国特許出願番号第１１／０５６，９５０号、および２００４年８月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３６３の、配列番号２に示すマウスプリオン配列に従って番号付けした、残基２３−４３または８５−１５６に対応する領域のいずれからも由来することができる（たとえば２３−３０、８６−１１１、８９−１１２、９７−１０７、１１３−１３５、および１３６−１５６）。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１４、５０、５１、５２、１２、７２、６８または１１５から２１９までのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１４、５０、５１、５２、または１６１から２１９までのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１２、７２、６８または１１５から１６０までのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、ペプチド断片は、配列番号１４、５０、または６８のいずれか１つから選択される。
【０１７８】
（Ｄ．ペプトイドＰＣＳＢ試薬）
特に好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬はペプトイドである。通例、ＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片に由来する。好ましいペプトイドを下に記載する。
【０１７９】
（ペプトイドの設計）
開始点として、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、ペプチド断片の配列内のアミノ酸残基のＮ置換グリシンによる置換の実施、米国特許第５，８１１，３８７号；同第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；同第５，９７７，３０１号；同第６，０７５，１２１号；同第６．２５１，４３３号；および同第６，０３３，６３１号はもちろんのこと、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７に記載された方法を使用する修飾ペプチドの合成（これらの刊行物はその全体が参照により本明細書に援用される）、および本明細書に記載する方法による病原性配座異性体への結合についての修飾ペプチドの試験によって、上述のプリオンタンパク質断片の配列またはそのような断片の改変体のいずれかに基づいて設計することができる。さらなる置換は、好適な試薬が実現されるまで、下の置換スキームに従って行うことができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、
ａ）プリオンタンパク質のペプチド断片を提供して、ペプチド断片の第１のアミノ酸をＮ置換グリシンによって、以下の：
ｉ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＶａｌは、Ｎ−（アルキル）グリシン、Ｎ−（アラルキル）グリシン、またはＮ−（ヘテロアリールアルキル）グリシンによって置換され；
ｉｉ）Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＴｈｒは、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシ）グリシン、Ｎ−（アミノアルキル）グリシン、またはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンによって置換され；
ｉｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは、Ｎ−（アラルキル）グリシン、Ｎ−（ヘテロアリールアルキル）グリシン、Ｎ−（ヒドロキシアラルキル）グリシン、またはＮ−（アルコキシアラルキル）グリシンによって置換され；
ｉｖ）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓは、Ｎ−（アミノアルキル）グリシン、またはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンによって置換される、置換スキームにより置換するステップと；
ｂ）ペプチド断片の第２のアミノ酸を、ステップａ）によるＮ置換グリシンによって置換するステップと；
ｃ）ペプチド断片の第３のアミノ酸をステップａ）によるＮ置換グリシンによって置換するステップと；
ｄ）場合により、ステップｃ）を１〜２７回反復して、それにより３〜３０個のＮ置換グリシンを含む、設計したペプトイドＰＣＳＢ試薬を提供し；そして設計したペプトイドＰＣＳＢ試薬を合成するステップ
とによって設計される。
【０１８１】
修飾したペプチドは、本明細書に記載する方法に従って、病原性配座異性体への結合について試験することができる。上のスキームによるアミノ酸モノマーのＮ置換グリシンによるさらなる置換は、好適な結合が得られるまで、実施および再試験することができる（すなわちプリオンの病原性形態と優先的に相互作用するＰＣＳＢ試薬）。
【０１８２】
ペプトイドを生成する方法は、米国特許第５，８１１，３８７号および同第５，８３１，００５号に開示されており、それぞれは、本明細書に開示する方法と同様に、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１８３】
本発明の方法で使用される病原性配座異性体特異的結合試薬は、
Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂ
の式を有し得、式中：
各Ｑは独立して、アミノ酸またはＮ置換グリシンであり、−（Ｑ）ｎ−はペプトイド領域を定義し；
Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００アミノ酸のポリペプチドであり、ここでＸａは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換され；
Ｘｂは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、２〜約１００アミノ酸のポリペプチドであり、ここでＸｂは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換され；
ｎは、３〜約３０であり（すなわちｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０、またはそれ以上である）；
ここでペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％は、これに限定されるわけではないが、Ｎ置換グリシンを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、Ｎ置換グリシンである。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂの式を有し、式中、ｎは、約４〜約３０、好ましくは約５〜約３０であり、ここでペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％は、これに限定されるわけではないが、Ｎ置換グリシンを含み、ただしペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが：
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；から独立して選択される少なくとも１つのサブ領域を含むという条件であり、ここでＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれ異なるＮ置換グリシンである。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、Ｘａは、それぞれリンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換される、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルである。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、Ｘａは、それぞれリンカー部分を介して場合により結合される架橋または結合試薬から選択される結合体化部分によってそれぞれ場合により置換される、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルである。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、Ｘａは、リンカー部分を介して場合により結合されるビオチンまたはメルカプトから選択される結合体化部分によってそれぞれ場合により置換される、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルである。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換されるアミノ酸である。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノである。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、Ｘｂはアミノである。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、ｎは、約５〜約１５；５〜約１０；または６である。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ｎは、４〜１０、４〜８、５〜７または６である。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、結合体化部分によって場合により置換されるアミノ酸であり、ｎは６である。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、リンカー部分は、式−｛ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）｝ｐ−を有する領域を含有する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、ｍは１〜１０である。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ｍは１〜８である。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ｍは５である。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ｐは１〜５である。
【０２００】
いくつかの実施形態において、ｐは１〜３である。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ｐは１または２である。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換されるアミノ酸であり、ｎは６である。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−６）アシル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ酸、またはアミノ保護基であり、ここでＸａは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換され；ｎは６である。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−６）アシル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ酸またはアミノ保護基であり、ここでＸａは、リンカー部分を介して場合により結合される、架橋剤または結合剤から選択される結合体化部分によって置換され；ｎは６である。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸またはアミノ保護基であり、ここでＸａは、リンカー部分を介して場合により結合される、ビオチンまたはメルカプトを含む結合体化部分によって置換され、リンカー部分の少なくとも一部は式−｛ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）｝ｐ−を有し；ｎは６であり；ｍは１〜１０であり；ｐは１〜５である。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、アミノ酸または式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有するＮ置換グリシンであり、式中、各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、Ｎ含有ヘテロシクリル、Ｎ含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、炭素原子４〜１０個のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、炭素原子５〜１０個のピペリジルアルキル、インドリル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、ナフチル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキルおよびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、アミノ酸または式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有するＮ置換グリシンであり、式中、各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、イミダゾリル、炭素原子４〜１０個のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、炭素原子５〜１０個のピペリジルアルキル、インドリル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、ナフチル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、アミノ酸または式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のＮ置換グリシンであり、式中、各Ｒは、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって置換される、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択される。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、アミノ酸であるか、またはＮ−（４−アミノブチル）グリシン、Ｎ−（ｌ−フェニルエチル）グリシン、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（２−［４−メトキシフェニル］エチル）グリシン、Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）グリシン、もしくはＮ−ベンジルグリシンから選択されるＮ置換グリシンである。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、アミノ酸であるか、またはＮ−（４−アミノブチル）グリシンもしくはＮ−ベンジルグリシンから選択されるＮ置換グリシンである。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、各Ｑは独立して、Ｎ置換グリシンである。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて荷電された少なくとも３個のまたは少なくとも４個のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、電荷は正である。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシンは、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて荷電された２〜６個の、３〜５個の、または４個のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、電荷は正である。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシンは、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の２個のＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電され、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の３個のＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電され、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の４個のＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電され、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の５個のＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電され、ペプトイド領域の残りのＮ置換グリシン残基は、生理学的に関連するｐＨにて中性である。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにてポリイオン性である。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにてポリカチオン性である。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにてポリアニオン性である。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにて少なくとも３＋の正味電荷を有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにて少なくとも４＋の正味電荷を有する。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにて２＋〜６＋の正味電荷を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにて３＋〜５＋の正味電荷を有する。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理学的に関連するｐＨにて４＋の正味電荷を有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電された、少なくとも３個のＮ置換グリシンを含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電された、少なくとも４個のＮ置換グリシンを含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電された、２〜６個のＮ置換グリシンを含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電された、３〜５個のＮ置換グリシンを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電された、４個のＮ置換グリシンを含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−のＮ置換グリシンは式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中、Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、炭素原子２〜１０個のアルキルチオアルキル、Ｎ含有ヘテロシクリル、Ｎ含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、炭素原子４〜１０個のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、炭素原子５〜１０個のピペリジルアルキル、インドリル、炭素原子９〜１５個のインドリルアルキル、ナフチル、炭素原子１１〜１６個のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換され、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、これに限定されるわけではないが少なくとも３個の、少なくとも４個の、２〜６個の、３〜５個の、または、４個のＮ置換グリシンを含み、ここでＲは、生理学的に関連するｐＨにて荷電される部分である。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域のすべてのＮ置換グリシンは隣接している。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、少なくとも１個の結合体化部分を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、リンカー部分を介して結合された少なくとも１個の結合体化部分を含む。
【０２３５】
好ましい実施形態において、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域、およびアミノ末端領域とカルボキシ末端領域との間に少なくとも１個のペプトイド領域を含み、ここでペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが約３〜約３０個のＮ置換グリシンおよび場合により１個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが約４〜約３０個の、または約５〜約３０個のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが約４〜約３０個の、または約５〜約３０個のＮ置換グリシンおよび：
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−から選択されるペプトイドサブ領域を含み；
ここでＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれ異なるＮ置換グリシンであり、各サブ領域は、アミノ末端からカルボキシ末端方向へ左から右へ読み取られる。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが約５０〜約１００％の、約７５〜約１００％の、または１００％のＮ置換グリシンを含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、長さが約５〜約５０個の、約５〜約３０個の、約５〜約１５個の、約５〜約７個の、または６個のサブユニットである。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、ペプトイド試薬は、サブユニットが約５〜約５０個の、約５〜約３０個の、約５〜約１５個の、または約６〜約９個の全長を有する。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのペプトイド領域は、ペプトイド試薬の全長の約５０％より大きく、約７５％より大きく、または約９０％より大きい。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、すべてのＮ置換グリシンは、ペプトイド領域内で隣接している。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域のＮ置換グリシンは、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中、Ｒは本明細書を通じて定義する通りである。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにてポリイオン性であり、荷電したペプトイド領域について本明細書を通じて記載する実施形態のいずれかに従う特徴を有する。
【０２４３】
他の実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、３〜１５個の隣接Ｎ置換グリシンを有するペプトイド領域を含み、ここでペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにて正味電荷を有する。いくつかの実施形態において、正味電荷は、生理学的に関連するｐＨにて少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味電荷などの正味正電荷である。いくつかの実施形態において、試薬自体は、生理学的に関連するｐＨにて、２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味電荷を有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域の隣接Ｎ置換グリシンの少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個は、生理学的に関連するｐＨにて荷電される。さらなる実施形態において、ペプトイド領域の隣接Ｎ置換グリシンの少なくとも２個は、１級アミノ、２級アミノ、３級アミノ、アンモニウム（４級アミノ）、グアニジノ、アミジノ、またはＮ含有ヘテロシクリルから選択される少なくとも１個の部分を含む。
【０２４５】
またさらなる実施形態において、ペプトイド領域の隣接Ｎ置換グリシンの少なくとも２個は、これに限定されるわけではないが、１級アミノ、２級アミノ、アンモニウム、グアニジノ、アミジノ、またはＮ含有ヘテロシクリルから選択される少なくとも１個のＮ置換基を含む。
【０２４６】
またさらなる実施形態において、隣接Ｎ置換グリシンの少なくとも２個は、本明細書で与えた定義に従うＲ基であるＮ置換基を含む。
【０２４７】
またさらなる実施形態において、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、６個の隣接Ｎ置換グリシンのペプトイド領域を含み、ペプトイドＰＣＳＢ試薬自体は、生理学的に関連するｐＨにて３＋または４＋の正味電荷を有する。
【０２４８】
「ペプトイド試薬」は、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域、およびアミノ末端領域とカルボキシ末端領域との間の少なくとも１つの「ペプトイド領域」を有する分子である。アミノ末端領域は、通例いずれのＮ置換グリシンも含有しない、試薬のアミノ末端側の領域を指す。アミノ末端領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドなどであることが可能である。いくつかの実施形態において、アミノ末端領域は、Ｘａに相当する。カルボキシ末端領域は、いずれのＮ置換グリシンも含有しない、ペプトイドのカルボキシ末端の領域を指す。カルボキシ末端領域は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどを含むことができる。いくつかの実施形態において、カルボキシ末端領域は、Ｘｂに相当する。いくつかの実施形態において、ペプトイドＰＣＳＢ試薬は、約５〜約５０個のサブユニット；約５〜約３０個のサブユニット；約５〜約１５個のサブユニット；または約６〜約９個のサブユニットの全長を有する。いくつかの実施形態において、ペプトイドはカルボキシ末端アミドである。ペプトイド領域は、その中のアミノ酸の少なくとも３つがＮ置換グリシンによって置換されているＰＣＳＢ試薬の部分を一般に指す。
【０２４９】
「ペプトイド領域」（本明細書では「−（Ｑ）ｎ−」とも呼ばれる）は、アミノ末端に最も近いＮ置換グリシンから開始してそのＮ置換グリシンを含み、カルボキシ末端に最も近いＮ置換グリシンで終了してそのＮ置換グリシンを含む領域として同定され得る。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが、少なくとも約５０％の、少なくとも約６０％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが約２５〜約１００％の；約５０〜約１００％の；約７５〜約１００％のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、これに限定されるわけではないが、１００％のＮ置換グリシンを含む。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、ペプトイドＰＣＳＢ試薬の全長の約５０％より大きい（たとえば約５０〜１００％）。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、ペプトイド試薬の全長の約６０％を超える（たとえば約６０〜１００％）。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、ペプトイド試薬の全長の約７５％を超える（たとえば約７５〜１００％）。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、ペプトイド試薬の全長の約９０％を超える（たとえば約９０〜１００％）。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、試薬の全長の１００％である。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、少なくとも３個のＮ置換グリシンを含有する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、少なくとも４個のＮ置換グリシンを含有する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、少なくとも５個のＮ置換グリシンを含有する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、少なくとも６個のＮ置換グリシンを含有する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、３〜約３０個の；約５〜約３０個のＮ置換グリシン；および場合により１個以上のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、サブユニットが約５〜約５０個の、５〜約３０個の、５〜約１５個の、５〜約１０個の、５〜約９個の、５〜約８個の、または５〜約７個の長さである。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、サブユニットが約３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さである。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域はサブユニットが６個の長さである。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域内のＮ置換グリシンのすべてが近接している。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域のサブユニットのすべてがＮ置換グリシンである。
【０２５１】
さらなる実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、４〜１２個の、４〜１０個の、４〜９個の、４〜８個の、５〜７個の、または６個の隣接Ｎ置換グリシンのペプトイド領域を含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態により、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにてポリイオン性であることが可能である。「ポリイオン性」という用語は、ペプトイド領域が生理学的に関連するｐＨにて荷電される２個以上の残基を含有することを意味する。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにてポリカチオン性またはポリアニオン性である。さらなる実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにて少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味電荷を有する。またさらなる実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにて２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味電荷を有する。
【０２５３】
荷電されるＮ置換グリシン残基の非制限的な例は、Ｎ−（５−アミノペンチル）グリシン、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン、Ｎ−（３−アミノプロピル）グリシン、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（５−グアニジノペンチル）グリシン、Ｎ−（４−グアニジノブチル）グリシン、Ｎ−（３−グアニジノプロピル）グリシン、およびＮ−（２−グアニジノエチル）グリシンを含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電される少なくとも３個または少なくとも４個のＮ置換グリシンを含有する。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、生理学的に関連するｐＨにて正に荷電される２〜６個の、３〜５個の、または４個のアミノＮ−置換グリシンを含有する。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有する残基を含有し、式中、残基の少なくとも３個、少なくとも４個、２〜６個、３〜５個、または４個が生理学的に関連するｐＨにて荷電される。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域の荷電された残基は、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中、Ｒは、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｎ含有ヘテロシクリルおよびＮ含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され、ここで各Ｒ部分は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３メトキシ、およびＣ１−Ｃ３アルキルから独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換される。いくつかの実施形態において、Ｒは、アミノブチルなどのアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、生理学的に関連するｐＨにて少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味電荷を有する。またさらなる実施形態において、試薬は、生理学的に関連するｐＨにて２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味電荷を有する。
【０２５９】
本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬のペプトイド領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個またはそれ以上の残基の連続Ｎ置換グリシンの配列を指す、少なくとも１つのペプトイドサブ領域を含有することができる。いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は：
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から独立して選択される少なくとも１つのペプトイドサブ領域を含有し、
Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ、異なるＮ置換グリシンを表す。たとえばサブ領域で生じる各Ａは、特定のＮ置換グリシンを指し、サブ領域で発生する各Ｂは、別の特定のＮ置換グリシンを指すが、ＡおよびＢは互いに異なっている。したがって、Ｃは、ＡまたはＢのどちらとも異なるＮ置換グリシンである。サブ領域配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右へ読み取られることを意味する。いくつかの実施形態において、Ａが疎水性残基のときに、Ｂは親水性残基であり、逆もまた同じである。いくつかの実施形態において、ペプトイドサブ領域は同種であり、すなわち１種類のＮ置換グリシンのみを含有する。いくつかの実施形態において、Ａが脂肪族残基のとき、Ｂは環式残基である。いくつかの実施形態において、Ｂが脂肪族残基であるとき、Ａは環式残基である。いくつかの実施形態において、ＡおよびＢの両方が脂肪族である。いくつかの実施形態において、ＡおよびＢは脂肪族であり、Ｃは環式である。いくつかの実施形態において、全てのＮ置換グリシンは、たとえばサブ領域−ＡＡＢＡ−では脂肪族である（たとえば−（Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン）２−Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン）−、ここでＡはＮ−（２−メトキシエチル）グリシンであり、ＢはＮ−（４−アミノブチル）グリシンである）。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、ペプトイド領域は、トリペプトイド、すなわち３個の隣接したＮ置換グリシンを含有する。例示的なトリペプトイドペプトイドサブ領域は、−（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）グリシン）２−Ｎ−（４−グアニジノブチル）グリシン−、−Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｖ）２−を含み、ここでＶは、Ｎ−ベンジルグリシンまたはＮ−（２−メトキシエチル）グリシン、−Ｎ−ベンジルグリシン−Ｗ−Ｎ−ベンジルグリシン−であり、ここでＷは、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシンまたはＮ−（２−メトキシエチル）グリシン、および−Ｎ−（４−アミノエチル）グリシン−（Ｎ−（２−（４−メトキシフェニル）エチル）グリシン）２−である。いくつかの実施形態において、トリペプトイドサブ領域は、少なくとも１個の脂肪族残基および少なくとも１個の環式残基を含有する（たとえば（Ａ）２−Ｂ、Ｂ２−Ａ、またはＢ−Ａ−Ｂ、ここでＡは脂肪族残基であり、Ｂは環式残基である）。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、ペプトイドサブ領域は、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｓ）−Ｎ−（１−フェニルエチル）グリシンジペプトイドなどのジペプトイドである。
【０２６２】
本発明の方法で有用なＰＣＳＢ試薬は、モノマー、マルチマー、環化分子、分枝分子、リンカーなどを含む。本明細書に記載する配列のいずれのマルチマー（すなわちダイマー、トリマーなど）またはその生物機能性同等物も予期される。マルチマーは、ホモマルチマーであること、すなわち同一のモノマーで構成されることが可能である。代わりに、マルチマーはヘテロマルチマーであることが可能であり、すなわちマルチマーを構成するすべてのモノマーが同一とは限らない。
【０２６３】
マルチマーは、モノマーの相互への、または、たとえば多抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（たとえば対称的ＭＡＰＳ）、ポリマー骨格、たとえばＰＥＧ骨格に結合されたペプチドおよび／またはスペーサー単位を用いてかもしくは用いずに直列に結合されたペプチドを含む基質への、直接結合によって形成することができる。代わりに、リンカーをモノマーに付加して、それらを結合させてマルチマーを形成することができる。リンカーを使用するマルチマーの非制限的な例は、たとえば、グリシンリンカーを使用するタンデムリピート、リンカーを介して基質に結合されたＭＡＰＳおよび／またはリンカーを介して骨格に結合された直鎖状結合ペプチドを含む。リンカー部分は、当業者に公知であるような２官能性スペーサー単位（ホモ２官能性またはヘテロ２官能性のいずれか）の使用を含み得る。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、コンフォメーション病タンパク質の非病原性形態の親和性よりも、少なくとも約２倍；５倍；１０倍；２０倍；５０倍；１００倍；２００倍；５００倍；または１０００倍大きい親和性で、病原性配座異性体と相互作用する。いくつかの実施形態において、親和性は、コンフォメーション病タンパク質の非病原性形態の親和性よりも少なくとも約１０倍大きい。いくつかの実施形態において、親和性は少なくとも１００倍大きい。
【０２６５】
本発明の検出方法は、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬のいずれも利用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の検出方法は、
Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂ
の式を有するＰＣＳＢ試薬を利用し、式中：
各Ｑは独立して、アミノ酸またはＮ置換グリシンであり、−（Ｑ）ｎ−はペプトイド領域を定義し；
Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００アミノ酸のポリペプチドであり、ここでＸａは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換され；
Ｘｂは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、２〜約１００アミノ酸のポリペプチドであり、ここでＸｂは、リンカー部分を介して場合により結合される結合体化部分によって場合により置換され；
ｎは、３〜約３０であり；ここでペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％が、これに限定されるわけではないが、Ｎ置換グリシンを含む。
【０２６６】
いくつかのこのような実施形態において、ｎは、約４〜約３０、好ましくは約５〜約３０であり、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は：
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から独立して選択される少なくとも１つのサブ領域を含み、ここでＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれ異なるＮ置換グリシンである。
【０２６７】
検出方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域、およびアミノ末端領域とカルボキシ末端領域との間に少なくとも１個のペプトイド領域を含有し、ここでペプトイド領域は、約３〜約３０個のＮ置換グリシンおよび場合により１個以上のアミノ酸を含有する。いくつかのこのような実施形態において、ペプトイド領域は：
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；および
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から選択されるペプトイドサブ領域を有し、ここでＡ、Ｂ、およびＣはそれぞれ、異なるＮ置換グリシンである。
【０２６８】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、プリオンタンパク質の３〜３０アミノ酸ペプチド断片のペプトイド類似体を含み、ペプチド断片は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３５、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、または２２８であり、ここで：
（ａ）ペプチド断片の少なくとも１個の非プロリン残基は、Ｎ置換グリシンによって置換されて、ペプトイド類似体を形成し；または
（ｂ）ペプチド断片の少なくとも５アミノ酸残基は、Ｎ置換グリシンによってそれぞれ置換され、ペプトイド類似体を形成する。
【０２６９】
上の方法のいくつかの実施形態において、ペプチド断片の任意の１個以上のアミノ酸残基のＮ置換グリシンによる置換は、以下の置換スキームに相当する：
ｉ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＶａｌは、Ｎ−（アルキル）グリシン、Ｎ−（アラルキル）グリシン、またはＮ−（ヘテロアリールアルキル）グリシンによって置換され；
ｉｉ）Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒは、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシ）グリシン、Ｎ−（アミノアルキル）グリシン、またはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンによって置換され；
ｉｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは、Ｎ−（アラルキル）グリシン、Ｎ−（ヘテロアリールアルキル）グリシン、Ｎ−（ヒドロキシアラルキル）グリシン、またはＮ−（アルコキシアラルキル）グリシンによって置換され；
ｉｖ）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓは、Ｎ−（アミノアルキル）グリシンまたはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンによって置換される。
【０２７０】
いくつかのこのような実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、上述のプリオンタンパク質の５〜３０アミノ酸ペプチド断片のペプトイド類似体である。
【０２７１】
（好ましいペプトイド領域の配列）
表４は、本発明で使用するＰＣＳＢ試薬を調製するのに好適な、例示的なペプトイド領域（アミノからカルボキシ方向）を示す。表５は、表１で使用した省略形のキーを示す。表６は、各配列の関連構造を与える。
【０２７２】
【表４】
2011520108.tif 000025
【０２７３】
【表５】
2011520108.tif 000026
【０２７４】
【表６−１】
2011520108.tif 000027
【０２７５】
【表６−２】
2011520108.tif 000028
具体的なＰＣＳＢ試薬の調製は以下で説明する。
【０２７６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、本明細書に記載するような配列、たとえば、配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、配列番号２２９、２３０、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２２９、２３０、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法で使用するＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２２９、２３６、２３１、２３２、２３３、２３４または２３５から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２３０、２３７または２４０を含む。いくつかのこのような実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２４０を含む。
【０２７７】
（Ｅ．好ましいペプトイドの例）
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用される病原性特異的配座異性体結合試薬は、プリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用する試薬、たとえば実施例４において記載されるＩ、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、またはＸＩＩｂで示される試薬の１つ以上である。
【０２７８】
好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、ヒトプリオンタンパク質断片ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）ペプチド、配列番号１４、配列番号５０、または配列番号６８に由来するペプトイドである。
【０２７９】
特に好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、
【０２８０】
【化１３】
2011520108.tif 000029
の構造を含む。
【０２８１】
（Ｆ．本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬の同定）
本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用する。この特性は、任意の公知の結合アッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの標準イムノアッセイ；標識ペプチド；ＥＬＩＳＡ様アッセイ；および／または細胞ベースアッセイ、特に「病原性配座異性体のＰＣＳＢ試薬への結合による病原性配座異性体の検出」に関して以下の節で説明されているアッセイを使用して試験することができる。
【０２８２】
本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬の特異性を試験する１つの好都合な方法は、病原性および非病原性配座異性体の両方を含有する試料を選択することである。通例、このような試料は、罹患した動物からの組織を含む。病原性形態に特異的に結合することが公知である、本明細書に記載するようなＰＣＳＢ試薬は、（当該分野で周知であり、以下でさらに説明される方法によって）固体担体に結合され、他の試料成分から病原性配座異性体を分離（「プルダウン」）して、固体担体における試薬−タンパク質結合相互作用の数に直接関連する定量値を得るために使用される。この結果を結合特異性が不明のＰＣＳＢ試薬の結果と比較して、このような試薬が病原性配座異性体と優先的に相互できるか否かを判定することができる。
【０２８３】
これらのアッセイは、病原性配座異性体が一般に、あるプロテアーゼ、たとえばプロテイナーゼＫに対して耐性であるという事実を利用し得る。同じプロテアーゼは、コンフォメーション病タンパク質の非病原性配座異性体を分解することができる。したがってプロテアーゼを使用するときに、試料を２つの等量に分け得る。プロテアーゼを第２の試料に添加して、同じ試験を実施することができる。第２の試料中のプロテアーゼによって任意の非病原性配座異性体が分解されるため、第２の試料の任意の試薬−タンパク質結合相互作用は、病原性配座異性体に起因し得る。
【０２８４】
（ＩＶ．病原性配座異性体のＰＣＳＢ試薬への結合による病原性配座異性体の検出）
記載したＰＣＳＢ試薬は、試料（たとえば、血液、脳、脊髄、ＣＳＦまたは器官試料などの生物学的試料）をスクリーニングするために、たとえばこれらの試料でのコンフォメーション病タンパク質の病原性形態の存在または非存在を検出するために、多種多様のアッセイで使用することができる。多くの現在の診断試薬とは異なり、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、血液試料、血液製剤、ＣＳＦ、または生検試料を含む、実質的にいずれの種類の生物学的または非生物学的試料での検出も可能である。検出方法はたとえば、立体配座タンパク質疾患を診断する方法においておよび病原性配座異性体の存在または非存在を知ることが重要であるその他の任意の状況において使用することができる。
【０２８５】
（捕捉試薬または検出試薬のどちらかとしての病原性配座異性体特異的結合試薬の使用）
本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬は通例、プリオンタンパク質断片に由来し、またプリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用する。これらのＰＣＳＢ試薬の少なくともいくつかが、優先的に病原性プリオンおよび他の病原性配座異性体の両方と同程度まで優先的に相互作用することが予想される。１より多くのコンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体を含有することが予想される試料では、または存在する病原性配座異性体の種類を判定することが方法の目的ために重要である場合、病原性配座異性体特異的結合試薬は、異なる種類のコンフォメーション病タンパク質に対して異なる結合特異性および／または親和性を有するＣＤＰＳＢ試薬と組合せて、検出に使用すべきである。たとえば、病原性配座異性体特異的結合試薬が捕捉試薬として使用される場合、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、検出試薬として使用するべきであり、逆もまた同様である。しかしアッセイされる特定の試料が１種類の病原性配座異性体のみを含有することが予想される場合、または病原性配座異性体が存在することを判定することが方法の目的にとって重要でない場合、ここでＰＣＳＢ試薬は、捕捉および検出試薬の両方として使用できる。
【０２８６】
本発明の方法で使用されるいくつかのＰＣＳＢ試薬は、検出アッセイが非プリオン病原性配座異性体のみの検出を可能にする方式で実施できるように、他の病原性配座異性体と比較して、病原性プリオンと異なる程度で優先的に相互作用する。この場合、ＰＣＳＢ試薬は、捕捉および検出試薬の両方として使用できる。
【０２８７】
（病原性配座異性体特異的結合試薬を捕捉剤として使用する方法）
好ましい実施形態において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料に病原性配座異性体特異的結合試薬を、存在するならば病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に病原性配座異性体がある場合、試薬へのその結合によって病原性配座異性体の存在を検出するステップとによって；試料中の非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法を提供し、ここで病原性配座異性体特異的結合試薬はプリオンタンパク質断片に由来して、プリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用する。
【０２８８】
本発明の方法の使用では、試料は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが公知である、または疑われるいずれのものでもよい。試料は、生物学的試料（すなわち生存している生物またはかつて生存していた生物から調製した試料）または非生物学的試料であることが可能である。好適な生物学的試料は、これに限定されるわけではないが器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、器官、および／または生検もしくは剖検を含む。好ましい生物学的試料は、血漿およびＣＳＦを含む。
【０２８９】
試料は、ＰＣＳＢ試薬の病原性配座異性体への結合を、試料中に病原性配座異性体が存在する場合に可能にする条件下で、本明細書に記載する１つ以上のＰＣＳＢ試薬と接触させる。本明細書の開示に基づく特定の条件を判定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。通例、試料およびＰＣＳＢ試薬を、ほぼ中性のｐＨの好適な緩衝液（たとえばｐＨ７．５のＴＢＳ緩衝液）中で、好適な温度（たとえば約４℃）にて好適な期間（たとえば約１時間〜一晩）にわたって共にインキュベートして、結合を起こさせる。
【０２９０】
本方法のこのような実施形態において、病原性配座異性体特異的結合試薬は捕捉試薬であり、試料中の病原性配座異性体の存在は、病原性配座異性体特異的結合試薬へのその結合によって検出される。捕捉後、病原性配座異性体の存在は、捕捉および検出試薬として同時に作用する、まさに同じ病原性配座異性体特異的結合試薬によって検出され得る。代わりに、異なる病原性配座異性体特異的結合試薬、または好ましくは、１つ以上のコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬のどちらかであり得る、別個の検出試薬が存在することがある。好ましい実施形態において、捕捉ステップの後に、非結合試料は除去され、病原性配座異性体は、それが捕捉試薬と形成した複合体から解離されて、検出のために変性される。捕捉試薬は、好ましくは固体担体に結合される。
【０２９１】
（検出試薬として病原性配座異性体特異的結合試薬を使用する方法）
他の実施形態において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料にコンフォメーション病タンパク質の病原性形態および非病原性形態の両方に結合するコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を、存在するならばコンフォメーション病タンパク質へのＣＤＰＳＢ試薬の結合を可能する条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；第１の複合体にＰＣＳＢ試薬を、試料中に病原性配座異性体がある場合、結合を可能にする条件下で接触させて、ＰＣＳＢ試薬へのその結合によって、病原性配座異性体の存在を検出するステップとによって、試料中の非プリオン病原性配座異性体の存在を検出する方法を提供し、ここでＰＣＳＢ試薬はプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【０２９２】
（Ａ．病原性配座異性体を捕捉する試薬）
好ましい実施形態において、捕捉試薬は、プリオンタンパク質断片に由来してプリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用する、病原性配座異性体特異的結合試薬である。他の実施形態において、捕捉試薬は、コンフォメーション病タンパク質の病原性形態および非病原性形態の両方を結合する、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬である。
【０２９３】
捕捉試薬は、試料中の任意の非プリオン病原性配座異性体を試薬に結合させて、複合体を形成する条件下で試料と接触する。このような結合条件は、当業者によって容易に決定され、本明細書にさらに記載される。通例、方法は、マイクロタイタープレートのウェル内で、または小容量のプラスチック管内で実施されるが、いずれの好都合な容器も好適である。試料は一般に、液体試料または懸濁物であり、捕捉試薬の前または後に反応容器に添加され得る。
【０２９４】
捕捉試薬は好ましくは、以下の節でさらに詳細に記載される固体担体に結合される。いくつかの実施形態において、固体担体は試料の適用前に結合される。固体担体（たとえば磁気ビーズ）は最初に、本明細書に記載するような捕捉試薬と、捕捉試薬が担体に十分に固定されるように反応させる。捕捉試薬が結合された固体担体は次に、病原性配座異性体を含有することが疑われる試料と、捕捉試薬の病原性配座異性体への結合を可能にする条件下で接触させる。
【０２９５】
代わりに捕捉試薬を、固体担体へ結合させる前に、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料と最初に接触させて、次に固体担体への捕捉試薬の結合を続けてもよい（たとえば、試薬をビオチン化して、固体担体はアビジンまたはストレプトアビジンを含むことが可能である）。
【０２９６】
ある実施形態において、捕捉試薬と病原性配座異性体との間に複合体が作られた後に、非結合試料物質（すなわち、任意の非結合病原性配座異性体を含む、捕捉試薬に結合されていない試料の任意の成分）を除去することができる。たとえば捕捉試薬が固体担体に結合されている場合、非結合物質は固体担体を（非結合試料物質を含有する）反応溶液からたとえば遠心分離、沈殿、濾過、磁力などで分離することによって減少させることができる。方法の次のステップを実施する前に、複合体を有する固体担体を１回以上の洗浄ステップに場合により供し、任意の残留試料物質を除去してもよい。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、非結合試料物質の除去および任意の洗浄の後に、結合した病原性配座異性体を複合体から解離させて、任意の公知の検出方法を使用して検出する。代わりに、複合体中の結合した病原性配座異性体は、捕捉試薬から解離させずに検出される。
【０２９８】
（Ｂ．病原性配座異性体の解離および変性）
捕捉試薬に結合して複合体を形成した後、病原性配座異性体は、病原性配座異性体の検出を容易にするために処理され得る。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、非結合物質は除去され、次に病原性配座異性体が複合体から解離される。「解離」は、病原性配座異性体を捕捉試薬とは別に検出できるようにする、病原性配座異性体の捕捉試薬からの物理的分離を指す。病原性配座異性体の複合体からの解離は、たとえば低濃度（たとえば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジニウムヒドロクロライドまたはグアニジニウムイソチオシアネートを使用して実現できる。
【０３００】
本方法で使用されるＣＤＰＳＢ試薬が変性タンパク質のみを検出できる場合、解離した病原性配座異性体も変性されている。「変性」とは、ポリペプチドの天然コンフォメーションを破壊することを指す。たとえば、試薬が、試薬と病原性配座異性体とを共有結合する活性化可能反応基（たとえば光反応基）を含有する場合、試薬から解離することなく変性を達成することができる。
【０３０１】
好ましい実施形態において、病原性配座異性体は同時に解離および変性される。
【０３０２】
病原性配座異性体は、高濃度の塩またはカオトロピック剤、たとえば約３Ｍ〜約６Ｍのグアニジニウムチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）、またはグアニジニウムＨＣｌ（ＧｄｎＨＣｌ）などのグアニジニウム塩を使用して、同時に解離および変性され得る。カオトロピック剤は検出試薬の結合に干渉し得るため、カオトロピック剤は好ましくは、検出が実施される前に除去または希釈される。
【０３０３】
他の実施形態において、ｐＨを変化させることによって、たとえばｐＨを１２もしくはそれより上に上昇させる（「高ｐＨ］）かまたはｐＨを２もしくはそれより下に低下させる（「低ｐＨ」）ことによって、病原性配座異性体は、同時に、捕捉試薬との複合体から解離および変性される。複合体の高いｐＨへの曝露が好ましい。一般に、１２．０〜１３．０のｐＨが十分である；好ましくは、１２．５〜１３．０のｐＨが；さらに好ましくは、１２．７〜１２．９のｐＨが；最も好ましくは１２．９のｐＨが使用される。代わりに、複合体の低ｐＨへの曝露を使用して、病原性プリオンタンパク質を試薬から解離および変性させることができる。この代案には、１．０〜２．０のｐＨが十分である。いくつかの実施形態において、病原性配座異性体は、ｐＨ１２．５〜１３．２で、好適な時間にわたって、たとえば９０℃（Ｃ）で１０分間処理される。
【０３０４】
第１の複合体の高ｐＨまたは低ｐＨどちらかへの曝露は一般に、ごく短時間、たとえば６０分間にわたって、好ましくは１５分間以下で、さらに好ましくは１０分間以下で実施される。いくつかの実施形態において、曝露は室温より上で、たとえば約６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃にて実施される。病原性配座異性体を解離させるのに十分な時間の曝露後、酸性試薬（高ｐＨ解離条件が使用される場合）または塩基性試薬（低ｐＨ解離条件が使用される場合）のどちらかの添加によって、ｐＨを容易に中性（すなわち約７．０〜７．５のｐＨ）に再調整することができる。当業者は適切なプロトコルを容易に決定することが可能であり、例が本明細書に記載されている。
【０３０５】
一般に高ｐＨ解離条件を生じさせるためには、約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度までのＮａＯＨの添加で十分である。好ましくは、ＮａＯＨを約０．０５Ｎ〜約０．１５Ｎの濃度で添加する；さらに好ましくは、約０．１Ｎ  ＮａＯＨが使用される。解離が完了すると、ｐＨは、好適な量の酸性溶液、たとえばリン酸、リン酸一ナトリウムの添加によって、中性（すなわち約７．０〜７．５）に再調整できる。
【０３０６】
一般に低ｐＨ解離条件を生じさせるためには、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度までのＨ３ＰＯ４の添加で十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４を０．３Ｍ〜０．６Ｍの濃度で添加する；さらに好ましくは、０．５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４が使用される。解離が完了すると、ｐＨは、好適な量の塩基性溶液、たとえばＮａＯＨまたはＫＯＨの添加によって、中性（すなわち約７．０〜７．５）に再調整できる。
【０３０７】
所望ならば、病原性配座異性体の複合体からの解離は、タンパク質を変性させることなく、たとえば低濃度（たとえば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジニウムヒドロクロライドまたはグアニジニウムイソチオシアネートを使用して実施することもできる。タンパク質を変性させることなく、病原性配座異性体を複合体から解離させるためのさらなる条件については、ＷＯ２００６０７６４９７（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１０９０）を参照。代わりに、たとえば試薬が試薬と病原性配座異性体とを共有結合するために使用できる活性化可能反応基（たとえば光反応基）を含有するように修飾される場合、捕捉された病原性配座異性体はまた、試薬からの解離無しに変性させられ得る。
【０３０８】
解離の後、病原性配座異性体は次に捕捉試薬から分離される。この分離は、非結合物質を含有する部分（現在は解離された病原性配座異性体）が保持され、捕捉試薬を含有する部分が廃棄されることを除いて、上述の非結合試料物質の除去と同様の方式で実施することができる。
【０３０９】
（Ｃ．捕捉された病原性配座異性体の検出）
病原性配座異性体の検出は、コンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬を使用して実施され得る。好ましい実施形態において、ＣＤＰＳＢ試薬は、コンフォメーション病タンパク質上のエピトープを認識する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）である。
【０３１０】
試料中の捕捉された病原性配座異性体の検出も、ＰＣＳＢ試薬を使用することによって実施され得る。このような試薬は、捕捉試薬が同じかもしくは異なる病原性配座異性体特異的結合試薬またはコンフォメーション病タンパク質特異的結合剤のどちらかである実施形態で使用され得る。
【０３１１】
方法が第１の病原性配座異性体特異的結合試薬および第２の病原性配座異性体特異的結合試薬を利用するとき、第１および第２の試薬は同じでも異なっていてもよい。「同じ」とは、第１および第２の試薬が第２の試薬中の検出可能な標識の包含のみで異なることを意味する。第１および第２の試薬は、たとえばそれらが異なる構造を有するか、またはプリオンタンパク質の異なる領域からの断片に由来する場合に、「異なる」。
【０３１２】
（一般的な検出方法）
次に任意の好適な検出手段を使用して、捕捉試薬と病原性配座異性体との間の結合を同定することができる。
【０３１３】
結合の検出に使用するのに好適な分析方法は、ＵＶ／可視分光法、ＦＴＩＲ、核磁気共鳴分光法、ラマン分光法、質量分析法、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法、表面プラズモン共鳴分光法、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）などの方法、または当該分野で公知の他の任意の方法を含む。
【０３１４】
結合は、しばしばＥＬＩＳＡの形態で、標識試薬または抗体の使用によっても検出され得る。本発明の使用に好適な検出可能な標識は、これに限定されるわけではないが、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、蛍光半導体ナノ結晶、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（たとえばビオチン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）またはハプテン）などを含む、検出可能な任意の分子を含む。さらなる標識は、これに限定されるわけではないが、検出可能な範囲で蛍光を呈することができる物質またはその部分を含む、蛍光を使用する標識を含む。本発明で使用され得る標識の詳細な例は、これに限定されるわけではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびβ−ガラクトシダーゼを含む。さらに検出可能な標識は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、分枝ＤＮＡ（ｂ−ＤＮＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などを含む核酸検出方法によって検出することができる、オリゴヌクレオチドタグを含み得る。好ましい検出可能な標識は、酵素、特にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および蛍光化合物を含む。当該分野で周知であるように、酵素は、検出可能な基質、たとえば、発色基質または蛍光発生基質と組合せて利用され、検出可能なシグナルを生成する。
【０３１５】
標識された検出試薬の使用（上述）に加えて、病原性配座異性体に結合された試薬を分離させるために免疫沈降が使用され得る。好ましくは、免疫沈降は、沈降促進剤の添加によって促進される。沈降促進剤は、タンパク質に結合されている試薬の沈降を促進または増加することができる部分を含む。このような沈降促進剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａなどを含む。タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａが沈降促進剤として使用される場合、タンパク質は場合によりビーズ、好ましくは磁気ビーズに結合され得る。沈降は、遠心分離の使用または磁力の使用によってさらに促進することができる。このような沈降促進剤の使用は、当該分野で公知である。
【０３１６】
たとえばウェスタンブロットは、通例、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦに電気的にブロットされた、「プルダウン」アッセイ（本明細書に記載するような）から得た試料において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから変性タンパク質を検出するタグ化１次抗体を利用する。次に１次抗体は、タグに対するプローブ（たとえばストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬、および／または増幅可能なオリゴヌクレオチド）によって検出（および／または増幅）される。結合は、親和性タグに対するプローブ（たとえばストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬、または増幅可能なオリゴヌクレオチド）によって標識および増幅される親和性タグ（たとえばビオチン）を有するペプチドなどの検出試薬を使用しても評価することができる。
【０３１７】
たとえば病原性配座異性体が個々の細胞で直接検出される場合（たとえば特異的に標識された細胞の蛍光ベースの細胞選別、カウント、または検出を可能にする蛍光標識試薬を使用して）、細胞ベースアッセイも使用することができる。
【０３１８】
検出試薬からのシグナルを増幅するアッセイも公知である。その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および媒介イムノアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡアッセイである。さらなる例は、シグナル増幅のための分枝ＤＮＡの使用（たとえば米国特許第５，６８１，６９７号；同第５，４２４，４１３号；同第５，４５１，５０３号；同第５，４５４７，０２５号；および同第６，２３５，４８３号を参照）；ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅのインベーダーなどの標的増幅技法の利用（Ａｒｒｕｄａら、２００２  Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２：４８７；米国特許第６０９０６０６号，同第５８４３６６９号，同第５９８５５５７号，同第６０９０５４３号，同第５８４６７１７号）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど（米国特許第６，５１１，８０９号；ＥＰ  ０５４４２１２Ａ１）；および／または免疫−ＰＣＲ技法（たとえば米国特許第５，６６５，５３９号；国際公開ＷＯ９８／２３９６２；ＷＯ００／７５６６３；およびＷＯ０１／３１０５６を参照）を含む。
【０３１９】
さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡに類似したマイクロタイタープレート手順が使用され得、たとえば本明細書に記載するような病原性配座異性体特異的結合試薬またはコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬は、タンパク質を固体担体（たとえばマイクロタイタープレートのウェル、ビーズなど）に固定化するのに使用され、さらなる検出試薬（これに限定されるわけではないが、別の病原性配座異性体特異的結合試薬またはコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬（結合体化アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬、または増幅可能なオリゴヌクレオチドなどの親和性および／または検出標識を有する）を含み得る）は、病原性配座異性体を検出するために使用される。
【０３２０】
（解離した捕捉病原性配座異性体を検出するための好ましい方法）
捕捉試薬と結合された病原性配座異性体とが検出前に解離された場合、解離された病原性配座異性体は、下でさらに十分に説明する、直接ＥＬＩＳＡまたは抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイのどちらかとしての、ＥＬＩＳＡ型アッセイで検出することができる。「ＥＬＩＳＡ」という用語は、抗体による検出を説明するために使用されるが、アッセイは抗体が「酵素結合」されているアッセイに限定されない。検出抗体は、本明細書に記載され、イムノアッセイの分野で周知である検出可能な標識のいずれによっても標識できる。Ｌａｕら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４（２８）：１１５５１−１１５５６（２００７）に記載されているようなＥＬＩＳＡは、捕捉試薬から解離した病原性配座異性体の量を定量するために実施できる。
【０３２１】
解離した病原性配座異性体は、固体担体表面にそれを受動的コーティングすることによって、標準ＥＬＩＳＡ用に調製することができる。このような受動的コーティングの方法は周知であり、通例、ｐＨ８の１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中で、約３７℃にて数時間、または４℃にて一晩実施される。他のコーティング緩衝液（たとえば５０ｍＭカーボネートｐＨ９．６、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、または１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２）が周知である。固体担体は、本明細書に記載されているか、または当該分野で周知である固体担体のいずれでもよいが、好ましい固体担体はマイクロタイタープレート、たとえば９６ウェルポリスチレンプレートである。高濃度のカオトロピック剤を使用して解離が実施された場合、カオトロピック剤の濃度は、固体担体へのコーティングの前に、少なくとも約２倍に希釈することによって低下される。高または低ｐＨを使用して解離が実施されその後中和された場合、解離された病原性配座異性体は、さらなる希釈を一切行わずにコーティングに使用できる。プレート（単数または複数）を洗浄して、非結合物質を除去できる。
【０３２２】
標準ＥＬＩＳＡが実施される場合、次に検出可能に標識された結合分子、たとえばコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬または病原性配座異性体特異的結合試薬（捕捉に使用したのと同じ試薬または異なる試薬のどちらか）が添加される。この検出可能に標識された結合分子を任意の捕捉された病原性配座異性体と反応させて、当該分野で周知の方法を使用して、プレートを洗浄し、標識分子の存在を検出する。捕捉試薬が病原性形態に対して特異的である限り、検出分子は、病原性形態に対して特異的である必要はないが、両方の形態に結合してよい。好ましい実施形態において、検出可能に標識された結合分子は抗体である。このような抗体は、周知である抗体はもちろんのこと、病原性配座異性体またはコンフォメーション病タンパク質の病原性形態および非病原性形態の両方に対して特異的である周知の方法によって産生される抗体も含む。
【０３２３】
代わりの実施形態において、解離した病原性配座異性体は、抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して検出される。この実施形態において、解離した病原性配座異性体は、病原性配座異性体またはコンフォメーション病タンパク質に特異的な第１の抗体を有する固体担体に「再捕捉」される。病原性配座異性体が再捕捉された固体担体は、場合により洗浄して任意の非結合物質を除去し、次にコンフォメーション病タンパク質または病原性配座異性体に特異的な第２の抗体と、第２の抗体を再捕捉された病原性配座異性体への結合を可能にする条件下で接触させる。
【０３２４】
第１および第２の抗体は通例、異なる抗体であり、好ましくはコンフォメーション病タンパク質の異なるエピトープを認識する。たとえば第１の抗体は、コンフォメーション病タンパク質のＮ末端のエピトープを認識し、第２の抗体はＮ末端以外のエピトープを認識し、または逆も同様である。第１および第２の抗体の他の組合せは容易に選択できる。本実施形態において、第１の抗体ではなく、第２の抗体が検出可能に標識される。
【０３２５】
試薬からの病原性配座異性体の解離がカオトロピック剤を使用して実施されるとき、検出アッセイを実施する前にカオトロピック剤を除去するか、または少なくとも１５倍に希釈すべきである。高または低ｐＨおよび中和を使用して解離を生じさせるとき、解離された病原性配座異性体は、さらなる希釈を行わずに使用できる。検出を実施する前に解離した病原性配座異性体が変性されているとき、第１および第２の抗体はどちらも変性配座異性体に結合する。
【０３２６】
（非解離の捕捉された病原性配座異性体を検出する好ましい方法）
他の例示的なアッセイにおいて、捕捉試薬と結合された病原性配座異性体とは検出前に解離していない。たとえば固体担体（たとえばマイクロタイタープレートのウェル）は、病原性配座異性体特異的結合試薬に結合される。次に非プリオン病原性配座異性体を含有する、またその含有が疑われる試料を固体担体に添加する。任意の病原性配座異性体が試薬に結合するのに十分なインキュベーション期間の後、固体担体を洗浄して非結合部分を除去することが可能であり、検出可能に標識された、上述のような第２の結合分子、たとえばコンフォメーション病タンパク質特異的結合試薬または第２の同じかもしくは異なる病原性配座異性体特異的結合試薬が添加される。代わりに、コンフォメーション病タンパク質特異的結合を固体担体に結合させて（たとえばマイクロタイタープレートのウェルをコーティング）、病原性配座異性体特異的検出試薬を使用して検出を実施することができる。
【０３２７】
（病原性アルツハイマー病配座異性体の好ましい検出方法）
本発明の方法の好ましい実施形態において、病原性アルツハイマー病配座異性体が検出されるとき、サンドイッチＥＬＩＳＡが使用される。ＰＣＳＢ試薬を使用した試料からの病原性アルツハイマー病配座異性体の捕捉および非結合試料の除去の後、捕捉された病原性アルツハイマー病配座異性体は通例、たとえばチオシアン酸グアニジンによるインキュベーションまたは高ｐＨ解離条件によって、解離および変性される。好ましい実施形態において、病原性アルツハイマー病配座異性体がＡβである場合、Ａβは、約０．０５Ｎ  ＮａＯＨまたは約０．１Ｎ  ＮａＯＨによって、約９０℃または約８０℃にて、ＰＣＳＢ試薬との複合体から解離し変性される。特に好ましい実施形態において、Ａβは、約０．１Ｎ  ＮａＯＨで約８０℃にて約３０分間で解離および変性される。
【０３２８】
病原性アルツハイマー病配座異性体を再捕捉するために、アルツハイマー病タンパク質に特異的な抗体によって、固体担体をコーティングすることができる。この捕捉された病原性アルツハイマー病配座異性体は次に、検出可能に標識されているアルツハイマー病タンパク質に特異的な別の抗体を使用して検出することができる。特に好ましい抗体は、Ａβ４０のＣ末端に特異的な抗体である１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβ４２のＣ末端に特異的な抗体である１２Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβアミノ酸１７〜２４に特異的な４Ｇ８；Ａβアミノ酸１〜１０に特異的な２０．１；およびＡβアミノ酸３〜８に特異的な６Ｅ１０を含む。好ましい実施形態において、２０．１は捕捉抗体であり、１２Ｆ４または１１Ａ５０−Ｂ１０は検出抗体として使用される。
【０３２９】
（Ｄ．アッセイで使用される固体担体）
ある実施形態において、ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、固体担体上で提供される。ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、試料との接触前に固体担体上に提供することができるか、または試薬は、試料との接触およびその中の任意の病原性配座異性体への結合の後に、固体担体への結合に適応させることができる（たとえばビオチン化試薬およびアビジンまたはストレプトアビジンを含む固体担体を使用することによる）。
【０３３０】
本発明の目的では、固体担体は、不溶性マトリクスである任意の物質であり得、興味のある分子（たとえば本発明の試薬、コンフォメーション病タンパク質、抗体など）を連結または結合させることができる剛性または半剛性表面を有することができる。例示的な固体担体は、これに限定されるわけではないが、基質、たとえばニトロセルロース、ポリ塩化ビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、ポリサッカライド、ポリフッ化ビニル、ジアゾ化紙、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、ならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよび他のこのような用途に一般に使用される任意の材料を含む。担体は、微粒子であり得、または連続表面の形態にあり得、膜、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、中空ではない繊維、ゲル（たとえばシリカゲル）およびビーズ（たとえばポアガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンによって場合により架橋されたポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、Ｎ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンによって場合により架橋されたジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングされたガラス粒子）を含む。
【０３３１】
本明細書に記載するようなＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、吸着（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、カップリングにより、または結合対の使用によって、たとえば共有的に、ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬を結合する標準技法を使用して、固体担体に容易に結合することができる。
【０３３２】
担体への固定化は、（たとえばタンパク質がより良好な固相結合特性を有するとき）ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬をタンパク質へ最初にカップリングすることによって強化され得る。好適なカップリングタンパク質は、これに限定されるわけではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、および当業者に周知の他のタンパク質などの高分子を含む。分子を担体に結合するために使用できる他の試薬は、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどを含む。このような分子およびこれらの分子をタンパク質にカップリングする方法は、当業者に周知である。たとえばＢｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照。
【０３３３】
所望ならば、固体担体に添加されるＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、容易に官能化されてスチレンまたはアクリレート部分を生成することが可能であり、それゆえポリスチレン、ポリアクリレートまたは他のポリマー、たとえばポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、シリカガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどへの分子の包含を可能とする。好ましい実施形態において、固体担体は、磁気ビーズ、さらに好ましくはポリスチレン／酸化鉄ビーズである。
【０３３４】
ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、分子の結合対の相互作用によって固体担体に結合させることができる。このような結合対は周知であり、本明細書の別の箇所で例が記載されている。結合対の一方のメンバーは、上述の技法によって固体担体にカップリングされ、結合対の他方のメンバーは試薬に（合成の前、間、または後に）結合される。このように修飾されたＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬は、試料と接触させることが可能であり、病原性配座異性体との相互作用は、存在する場合、溶液中で発生することが可能であり、その後、固体担体を試薬（または試薬−タンパク質複合体）と接触させることができる。本実施形態の好ましい結合対は、ビオチンおよびアビジン、ならびにビオチンおよびストレプトアビジンを含む。ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンに加えて、本実施形態の他の好適な結合対は、たとえば抗原−抗体、ハプテン−抗体、ミメトープ−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、タンパク質Ａ−抗体Ｆｃを含む。このような結合対は、周知であり（たとえば米国特許第６，５５１，８４３号および同第６，５８６，１９３号を参照）、当業者は、好適な結合対を選択して、それらを本発明での使用のために適応させる能力を有する。捕捉試薬が上述のような担体への結合に適しているとき、捕捉試薬が担体に結合される前かまたはされた後に、試料を捕捉試薬に接触させることができる。
【０３３５】
代わりに、ＰＣＳＢ試薬またはＣＤＰＳＢ試薬を、当該分野で周知の結合化学を使用して、固体担体に共有結合させることができる。たとえばＰＣＳＢまたはＣＤＰＳＢ試薬を含有するチオールを、当該分野で公知の標準方法を使用して、固体担体、たとえばカルボキシル化磁気ビーズに直接結合させることができる（たとえばＣｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．およびＯ’Ｆｅｒｒａｌｌ，Ｃ．Ｅ．（１９９６）．Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｆｉｌｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（１５），３０３１−３０３９；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ，Ｔ．，Ａｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．およびＮｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．（１９８０）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（４），１１３０−１１３５を参照）。カルボキシル化磁気ビーズは、カルボジイミド化学を使用して、マレイミド官能基を含有するヘテロ２官能性架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．によるＢＭＰＨ）に、最初にカップリングされる。チオール化ＰＣＳＢまたはＣＤＰＳＢ試薬は次に、ＢＭＰＨコートビーズのマレイミド官能基に共有的にカップリングされる。本発明の検出方法の実施形態で使用されるときに、固体担体は、非結合試料からの試薬および病原性配座異性体を含む複合体の分離を補助する。チオールカップリングに特に好都合な磁気ビーズは、ＤｙｎａｌによるＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ  Ｍ−２７０カルボン酸である。ＰＣＳＢまたはＣＤＰＳＢ試薬は、リンカー、たとえば１つ以上のアミノヘキサン酸部分も含み得る。
【０３３６】
（Ｅ．好ましい検出方法）
好ましい実施形態を下に記載する。
【０３３７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書に記載するようなペプトイド試薬を含む、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬を使用して非プリオン病原性配座異性体を捕捉および検出し、前記方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料にＰＳＣＢ試薬を、非プリオン病原性配座異性体が存在するならば非プリオン病原性配座異性体へのＰＣＳＢ試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、ＰＣＳＢ試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を含む。非プリオン病原性配座異性体の結合は、たとえば複合体を解離させて、非プリオン病原性配座異性体をＣＤＰＳＢ試薬によって検出することにより検出できる。
【０３３８】
一実施形態において、捕捉される非プリオン病原性配座異性体は、アルツハイマー病に関連する病原性配座異性体、たとえばＡβ４０、Ａβ４２、またはタウである。このような場合、試料は好ましくは、血漿または脳脊髄液である。ＰＣＳＢ試薬は、好ましくはＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０、配列番号６８に由来して、
【０３３９】
【化１４】
2011520108.tif 000030
【０３４０】
【化１５】
2011520108.tif 000031
【０３４１】
【化１６】
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【０３４２】
【化１７】
2011520108.tif 000033
などのペプトイド試薬を含む。
【０３４３】
他の好ましい実施形態において、本発明の方法は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書に記載するようなペプトイド試薬を含む、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬を使用して非プリオン配座異性体を捕捉して、ＣＤＰＳＢ試薬を使用して非プリオン配座異性体を検出する。方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料にＰＣＳＢ試薬を、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；第１の複合体をＣＤＰＳＢ試薬と、結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、ＣＤＰＳＢ結合試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップとを含む。通例、非結合試料は、第１の複合体を形成した後、第１の複合体をＣＤＰＳＢ試薬と接触させる前に除去される。ＣＤＰＳＢ結合試薬は、標識化抗コンフォメーション病タンパク質抗体であることが可能である。
【０３４４】
他のなおまた別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、病原性プリオンタンパク質およびＣＤＰＳＢ試薬と優先的に相互作用する、本明細書に記載するようなペプトイドを含む、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬を使用して、非プリオン病原性配座異性体を捕捉して、その存在を検出する。方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料をＰＣＳＢ試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体へのＰＣＳＢ試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非結合試料物質を除去するステップと；非プリオン病原性配座異性体を第１の複合体から解離させて、これにより解離された非プリオン病原性配座異性体を提供するステップと；解離された非プリオン病原性配座異性体をＣＤＰＳＢ試薬と、結合を可能にする条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、第２の複合体の形成を検出することによって、非プリオン病原性配座異性体の存在を検出するステップとを含む。第２の複合体の形成は、検出可能に標識された第２のＣＤＰＳＢ試薬を使用して好ましくは検出され、ＰＣＳＢ試薬は、磁気ビーズに好ましくはカップリングされる。
【０３４５】
代案において、本発明は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書に記載するペプトイド試薬を含む、プリオンタンパク質断片に由来する第１のＰＣＳＢ試薬を使用して非プリオン病原性配座異性体を捕捉して、本明細書に記載するような第２のＰＣＳＢ試薬を使用して非プリオン病原性配座異性体を検出する方法を提供する。方法は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を第１のＰＣＳＢ試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への第１の試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を、検出可能な標識を有する第２のＰＣＳＢ試薬と、第１の複合体中の非プリオン病原性配座異性体への第２の試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、第２の試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を含む。
【０３４６】
また別の代案において、本発明は、ＣＤＰＳＢ試薬を使用して非プリオン病原性配座異性体を捕捉して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書に記載するようなペプトイド試薬を含む、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬を使用して非プリオン病原性配座異性体を検出する方法を提供する。方法は、（ａ）非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料をＣＤＰＳＢ試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；（ｂ）非結合試料物質を除去するステップと；（ｃ）複合体を検出可能な標識を含むＰＣＳＢ試薬と、非プリオン病原性配座異性体へのＰＣＳＢ試薬の結合を可能にする条件下で接触させるステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、ＰＣＳＢ試薬へのその結合によって、非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；を含み、ＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【０３４７】
上の方法すべてにおいて、「非結合試料」は、接触ステップで捕捉されていない試料中の成分を指す。非結合試料は、当該分野で周知の方法によって、たとえば洗浄、遠心分離、濾過、磁気分離およびこれらの技法の組合せによって除去され得る。好ましくは、本発明の方法において、非結合試料は、複合体の緩衝液による洗浄および／または磁気分離によって除去される。
【０３４８】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、全身性アミロイドーシス、タウオパチー、およびシヌクレイノパチーを含む、アミロイド疾患の検出に使用される。
【０３４９】
（Ｆ．アルツハイマー病の検出方法）
Ａβ４０、Ａβ４２、またはタウなどの病原性アルツハイマー病配座異性体の検出方法が提供される。
【０３５０】
特に好ましい実施形態において、これらの方法は、病原性アルツハイマー病配座異性体を、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書に記載するペプトイド試薬を含む、プリオンタンパク質断片に由来するＰＣＳＢ試薬によって捕捉し、捕捉された配座異性体をＣＤＰＳＢ試薬によって検出する。
【０３５１】
特に、方法は、病原性アルツハイマー病配座異性体を含有することが疑われる試料をＰＣＳＢ試薬と、存在するならば病原性アルツハイマー病配座異性体へのＰＣＳＢ試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非結合試料物質を除去するステップと；病原性アルツハイマー病配座異性体を第１の複合体から解離させて、それにより解離された病原性アルツハイマー病配座異性体を提供するステップと；解離された病原性アルツハイマー病配座異性体をＣＤＰＳＢ試薬と、結合を可能にする条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと；試料中に病原性アルツハイマー病配座異性体がある場合、第２の複合体の形成を検出することによって、病原性アルツハイマー病配座異性体の存在を検出するステップと；を含む。第１の複合体中の病原性アルツハイマー病配座異性体は好ましくは、約０．０５Ｎ  ＮａＯＨまたは約０．１Ｎ  ＮａＯＨによって約９０℃または約８０℃にて、ＣＤＰＳＢ試薬に接触する前に解離および変性される。病原性アルツハイマー病配座異性体がＡβ４０またはＡβ４２であるとき、病原性アルツハイマー病配座異性体は好ましくは、約０．１Ｎ  ＮａＯＨで約８０℃にて約３０分間にわたって解離および変性される。
解離および／または変性は、ＩＶ（Ｂ）節に記載した方法を使用して実施することができる。通例、病原性アルツハイマー病配座異性体は、ｐＨを低いｐＨから高いｐＨへ、または高いｐＨから低いｐＨへ変化させることによって、同時に解離および変性される。
【０３５２】
好ましい実施形態において、ＰＣＳＢ試薬は、磁気ビーズなどの固体担体にカップリングされた、ＰｒＰ１９−３０（配列番号２４２）、ＰｒＰ２３−３０（配列番号２４３）、ＰｒＰ１００−１１１（配列番号２４４）、ＰｒＰ１０１−１１０（配列番号２４５）、ＰｒＰ１５４−１６５（配列番号２４６）、ＰｒＰ２２６−２３７（配列番号２４７）、配列番号１４、配列番号５０、配列番号６８、または
【０３５３】
【化１８】
2011520108.tif 000034
【０３５４】
【化１９】
2011520108.tif 000035
【０３５５】
【化２０】
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【０３５６】
【化２１】
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に由来する。
【０３５７】
ＣＤＰＳＢ試薬は好ましくは、マイクロタイタープレートなどの固体担体にカップリングされた抗アルツハイマー病タンパク質抗体であり、第２の複合体の形成は好ましくは、第２の検出可能に標識されたＣＤＰＳＢ試薬を使用して検出される。病原性アルツハイマー病配座異性体がＡβ４０またはＡβ４２であるとき、好ましい抗アルツハイマー病タンパク質抗体は、Ａβ４０のＣ末端に特異的な抗体である１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβ４２のＣ末端に特異的な抗体である１２Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβアミノ酸１８〜２２に特異的な４Ｇ８；Ａβアミノ酸１〜１０に特異的な２０．１；およびＡβアミノ酸３〜８に特異的な６Ｅ１０を含む。特に好ましい実施形態において、２０．１がＥＬＩＳＡプレート上の捕捉抗体であり、１２Ｆ４または１１Ａ５０−Ｂ１０は、第２の検出可能に標識されたＣＤＰＳＢ試薬として使用される。試料は好ましくは、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【０３５８】
それゆえ、特に好ましい実施形態において、病原性アルツハイマー病配座異性体の存在を検出する方法は、これに限定されるわけではないが：病原性アルツハイマー病配座異性体を含有することが疑われる血漿またはＣＳＦの試料を、磁気ビーズにカップリングされたペプトイドＸＩＩｂと、存在するならば病原性アルツハイマー病配座異性体へのペプトイドＸＩＩｂの結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成するステップと；非結合試料物質を除去するステップと；ｐＨを変化させることによって病原性アルツハイマー病配座異性体を第１の複合体から解離させて、解離した病原性アルツハイマー病配座異性体を提供するステップと；解離した病原性アルツハイマー病配座異性体を固体担体に結合した抗アルツハイマー病タンパク質抗体と、結合を可能にする条件下で接触させて、第２の複合体を形成するステップと；第２の標識された抗アルツハイマー病タンパク質抗体とインキュベートすることによって、第２の複合体の形成を検出するステップと；を含む。
【０３５９】
（Ｇ．競合アッセイ）
いくつかの態様において、本発明の方法は、競合的結合によって病原性配座異性体を検出する。検出手段は、ＰＣＳＢ結合試薬に弱く結合するリガンドが病原性配座異性体によって置換されるときを判定するために使用され得る。たとえばＰＣＳＢ試薬は、固体担体に吸着され得る。続いて、固体担体を、病原性配座異性体がＰＣＳＢ試薬に結合するよりも弱い結合親和性でＰＣＳＢ試薬に結合する、検出可能に標識されたリガンドに結合させる。リガンド−ＰＣＳＢ試薬複合体が検出される。次に試料を添加する。検出可能に標識されたリガンドの結合親和性は、ＰＣＳＢ試薬に対する病原性配座異性体の結合親和性よりも弱いため、病原性配座異性体は標識リガンドを置換し、ＰＣＳＢ試薬に結合した標識リガンドの検出量の減少によって、ＰＣＳＢ試薬と試料中の病原性配座異性体との間に複合体が形成したことが示される。
【０３６０】
それゆえ、ある実施形態において、非プリオン病原性配座異性体の存在は、ＰＣＳＢ試薬を含む固体担体を提供するステップと；固体担体を検出可能に標識されたリガンドと結合させるステップであって、ＰＣＳＢ試薬の検出可能に標識されたリガンドに対する結合親和性が、ＰＣＳＢ試薬の非プリオン病原性配座異性体に対する結合親和性よりも低い、ステップと；非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料を固体担体に、試料中に非プリオン病原性配座異性体が存在するときに非プリオン病原性配座異性体をＰＣＳＢ試薬に結合させてリガンドを置換させる条件下で、結合させるステップと；ＰＣＳＢ試薬と試料からの非プリオン病原性配座異性体との間に形成された複合体を検出するステップと；によって検出し、ＰＣＳＢ試薬はプリオンタンパク質断片から由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【０３６１】
（Ｖ．他の方法）
一般に、本明細書に記載するＰＣＳＢ試薬は、コンフォメーション病タンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用することが可能である。それゆえ、これらの試薬によって、生存している脳または死亡脳、脊髄、および他の神経系組織はもちろんのこと、血液も含む、実質的に任意の生物学的または非生物学的試料における病原性配座異性体の存在の即時の検出が可能となる。試薬は、それゆえ広範囲の単離、精製、検出、診断および治療用途に有用である。
【０３６２】
たとえば、本明細書に記載する試薬は、親和性担体を使用して病原性配座異性体を単離するために使用され得る。試薬がその病原性配座異性体選択的結合活性を保持するように、試薬はたとえば吸着、共有結合などによって固体担体に結合させることができる。たとえば試薬の結合部位が引き続きアクセス可能であるように、場合によりスペーサー基が含まれることがある。固定化された分子は次に、生物学的試料、たとえば血液、血漿、脳、脊髄、および他の組織からの病原性配座異性体を結合するために使用することができる。結合された試薬または複合体は、たとえばｐＨの変化によって担体から回収され、すなわち病原性配座異性体は複合体から解離され得る。
【０３６３】
それゆえ、ある実施形態において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料をＰＣＳＢ試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；病原性配座異性体の試薬への結合によって、非プリオン病原性配座異性体と非プリオン非病原性配座異性体とを区別するステップと；によって、非プリオン病原性配座異性体と非プリオン非病原性配座異性体とを区別する方法を提供し；ＰＣＳＢ試薬は、プリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【０３６４】
他の実施形態において、本発明は、非プリオン病原性配座異性体を含有することが疑われる試料をＰＣＳＢ試薬と、存在するならば非プリオン病原性配座異性体への試薬の結合を可能にする条件下で接触させて、複合体を形成するステップと；試料中に非プリオン病原性配座異性体がある場合、試薬へのその結合によって非プリオン病原性配座異性体を検出するステップと；非プリオン病原性配座異性体が検出された場合に、コンフォメーション病を診断するステップと；によって、非プリオンコンフォメーション病を診断する方法を提供し、ＰＣＳＢ試薬はプリオンタンパク質断片に由来して、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
【０３６５】
本明細書に記載する試薬を使用する複数の変形および組合せが、本発明の方法で利用され得る。以下の非制限的な実施例は、例証のために記載されている。
【実施例】
【０３６６】
（実施例）
（実施例１：ＰＳＲ１はＰｒＰＳｃに優先的に結合する）
本実施例は、ＰＳＲ１（磁気ビーズ（ストレプトアビジンＭ−２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に結合されたペプトイド試薬ＸＩＩｂ）が、ＰｒＰＳｃを選択的にプルダウンすることを示す。
【０３６７】
ｖＣＪＤまたは正常脳ホモジネート（ＢＨ）を、１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）中の５０％プール正常ヒト血漿中にスパイクした。対照試料にはＢＨを添加しなかった。各試料１００μＬ（１０％ＢＨ  １０ｎＬを含有または含有しない）をＸＩＩｂビーズ３μＬ（３０ｍｇ／ｍＬ）と混合して、得られた混合物を７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料物質は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳＴでビーズを４回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴを添加して、磁力を使用してビーズを収集し、洗浄緩衝液を除去した。ビーズに結合したＰｒＰＳｃを、０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって解離した。変性したプリオンタンパク質をその後０．３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４によって中和し、ＥＬＩＳＡプレートに移した。
【０３６８】
プルダウン効率は、プルダウン試料からのシグナルを、プルダウンを一切伴わずにグアニジニウムチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）によって変性させた同じ試料からのシグナルと比較することによって計算した。ｖＣＪＤまたは正常脳からのプリオンタンパク質は、同量の５％ＢＨおよび６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮと混合することによって変性させて、室温にて１０分間インキュベートした。次に試料をＴＢＳＴによってプルダウン試料と同じ濃度まで希釈し、ＴＢＳＴのみを対照とした。各直接変性試料１００μＬをその後プルダウン試料と同じＥＬＩＳＡプレートに移した。
【０３６９】
ＥＬＩＳＡプレートは、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中２．５ｕｇ／ｍＬの抗プリオン抗体３Ｆ４によってコーティングした。コーティング手順は４℃にて一晩実施し、次にＴＢＳＴで３回洗浄した。プレートを次に、ＴＢＳ中の１％カゼインで３７℃にて１時間ブロックした。プルダウン試料および直接変性試料の両方からのプリオンタンパク質を、３Ｆ４を含むＥＬＩＳＡプレート内で３００ｒｐｍで常時振とうしながら３７℃にて１時間インキュベートして、プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化検出抗体をＴＢＳＴ中０．１％のカゼインで０．１μｇ／ｍＬまで希釈して、次にＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートをその後３７℃にて１時間インキュベートして、ＴＢＳＴで６回洗浄した。強化Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ化学発光基質を使用してシグナルを発生させて、ルミノメーターで相対光単位（ＲＬＵ）として読み取った。
【０３７０】
結果を下に示す。
【０３７１】
【表７】
2011520108.tif 000038
脳組織からのプリオンタンパク質は、３Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによって完全に変性され得、抗プリオン抗体によって検出することができる。この実験では、発明者らは、ＸＩＩｂビーズを使用したプリオンタンパク質プルダウンによって生成されたシグナルをＧｄｎＳＣＮによる直接変性タンパク質から得たシグナルと比較した。データは、プルダウン試料および直接変性試料のバックグラウンド（ＢＨなし）はそれぞれ９．０および７．７ＲＬＵであることを示した。１０％正常ＢＨの直接変性１０ｎＬは、１４．６ＲＬＵのシグナルを有し、これは、正常脳でのＰｒＰｃレベルを反映していた。一方で、プルダウン法によって検出された１０％正常ＢＨの１０ｎＬは、９．９ＲＬＵの読取値を示し、これはそのバックグラウンドと同様であった。このことは、ペプトイドＸＩＩｂの特異性を示した。１０ｎＬの１０％ｖＣＪＤ試料をプルダウン法および直接変性法によって試験したときに、データは５３．０および５６．３ＲＬＵを示し、このことはＸＩＩｂビーズのプルダウン効率がほぼ１００％に達したことを意味する。
【０３７２】
（実施例２  ＰＳＲ１はまた、凝集アミロイドベータタンパク質（Ａβ）と優先的に相互作用する）
本実施例は、
【０３７３】
【化２２−１】
2011520108.tif 000039
ＰＳＲ１はまた、凝集Ａβと優先的に相互作用することを示す。
【０３７４】
本実施例は、複数のアルツハイマー病脳での不溶性凝集Ａβ４０／４２の存在と、これらの凝集体の検出が、凝集体中でマスクされていた抗体エピトープが変性により露出した後でのみ達成できることとを示す。これらの脳からの凝集ＡβのＰＳＲ１捕捉は特異的であり、プルダウンビーズではなく、ペプトイドＸＩＩｂが媒介する。本実施例によって、ＰＳＲ１は、ＰＳＲ１によって認識されない可溶性Ａβ４０／４２を含有する試料マトリクスである、血漿中にスパイクされた凝集Ａβ４０／４２を選択的に捕捉することを示す。最終的に、本実施例は、プルダウン前の化学変性剤による試料の変性によって捕捉が妨害されたことを示すことによって、ＰＳＲ１が凝集Ａβ４０／４２を捕捉することを示している。
【０３７５】
（アルツハイマー病脳および正常脳における全Ａβ４０／４２の定量）
脳中の全Ａβ４０／４２は、Ｃｏｖａｎｃｅから市販されている抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量した。９６ウェル捕捉プレートの個々のウェルをｍＡｂ  １１Ａ５０−Ｂ１０（可溶性Ａβ４０のみを検出）またはｍＡｂ  １２Ｆ４（可溶性Ａβ４２のみを検出）のどちらかの抗体でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートに捕捉されたＡβ４０またはＡβ４２を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合体化されたｍＡｂ４Ｇ８（配列ＶＦＦＡＥを含有するＡβのすべての形態を認識する）によって検出した。Ｌｕｍｉｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を化学発光基質として使用した。化学発光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）で読み取った。
【０３７６】
ＡＤ（患者識別番号３２５−１、３３４、３２５、２６４、２３０、２１８、２２１、２０１、１８４、１７７、２９１）および対照（患者３２０、３２６、３２７、３２８）脳ホモジネートのＡβ４０およびＡβ４２レベルは、このサンドイッチＥＬＩＳＡ検出系を使用して決定した。脳ホモジネートの５．４Ｍ  ＧｄｎＳＣＮによる変性は、Ａβペプチドの大半を検出するために必要であった（図１、５Ｂ、および５Ｅ）。抗体が凝集物質中でコンフォメーション的に改変またはマスキングされているエピトープに結合しないであろうことは、十分に認められている。この特性は、プリオンおよび他のアミロイドタンパク質を認識するいくつかの抗体で以前に観察されている。ＥＬＩＳＡデータは、ＡＤ脳において病原性凝集Ａβが蓄積しているが、年齢適合非ＡＤ対照脳においては蓄積していないことを示す。対照脳は、いずれのＡβ形態（可溶性または凝集）もそれほど高レベルで含有していなかったが、Ａβ４０およびＡβ４２のいずれもをＡＤ患者試料から容易に検出した（図１）。
【０３７７】
標準曲線（変性合成Ａβペプチド）と並行した、ＥＬＩＳＡによって検出された１つのＡＤ脳ホモジネート（患者番号２９１）の用量設定によって、この脳ホモジネート中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度の決定が可能となり（図５Ａ、Ｂおよび５Ｄ、Ｅ）、それぞれ１０および２４０μｇ／ｍＬと計算した。
【０３７８】
（ＡＤ脳中のＡβ４０／４２が凝集される）
ＥＬＩＳＡ前の変性剤による処理によってサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出が向上したために、ＡＤ  ＢＨからのＡβが凝集されていると見なした（図１）。このＡβが不溶性（凝集体の別の特徴）を示すか否かを試験するために、ＡＤ  ＢＨを遠心分離にかけ、上清およびペレット画分をＥＬＩＳＡに利用した（図２）。未変性ＡＤ  ＢＨでは、Ａβシグナルの大半がペレット画分中にあった。しかし、ＢＨのＧｄｎＳＣＮによる前処理によって、Ａβシグナルは上清画分に移動した。この実験によって、ＡＤ  ＢＨで見出されるＡβ凝集体が発明者らの遠心分離条件では不溶性であることと、化学変性剤による前処理によってＡβが可溶性になることとを示す。したがって、ＡＤ  ＢＨ中のＡβの物理的特性を直接調べることによって、発明者らはＡＤ  ＢＨからのＡβペプチドの大半が凝集されていることを確認している。このことは、アミロイド疾患として説明される、あるクラスの疾病で観察されている周知の現象である。２、３例を挙げるとすれば、プリオン病（たとえばＣＪＤ）、ＡＤ、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、および全身性アミロイドーシスが挙げられるこれらの疾患は、規則的凝集タンパク質の存在およびいくつかのタンパク質の正常なコンフォメーションからβシートコンフォメーションへの変換に関連している。
【０３７９】
（ＡβへのＰＳＲ１結合は、ペプトイド試薬ＸＩＩｂが媒介する）
ＰＳＲ１は、ＴＢＳＴＴ緩衝液中の８０％血漿にスパイクしたＡＤ脳ホモジネートからＡβを捕捉した（図３）。ＡＤ脳および対照脳からの脳ホモジネートをＰＳＲ１ビーズまたは対照グルタチオンビーズ（ペプトイドＸＩＩｂなし）と共にインキュベートした。ビーズを洗浄して、捕捉物質を６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮでビーズから解離および変性させた。磁石を使用してビーズを除去して、変性試料を希釈し、抗Ａβ４２抗体１２Ｆ４によって事前にコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた。検出は、ＡＰ標識４Ｇ８抗体を用いて実施した。ＰＳＲ１はＡＤ試料からＡβを捕捉したが、対照ビーズ（マレイミドおよびグルタチオンと反応したＭ２７０−カルボン酸ビーズ（所内で産生したＭ２７０−グルタチオン））は、いずれの脳試料からも検出可能な量のＡβを捕捉することができなかった。本実験により、Ａβを捕捉する能力はビーズ自体によるのではなく、ビーズに共有結合したペプトイドＸＩＩｂによることを確証する。
【０３８０】
（ＰＳＲ１は、可溶性Ａβの存在下で凝集Ａβに選択的に結合する）
血漿は、著しいレベルの可溶性Ａβ４０およびＡβ４２を含有している。したがって、ＰＳＲ１が、可溶性Ａβの存在下で凝集Ａβに選択的に結合できるか否かを査定するために、ＡＤ患者番号２９１からの脳ホモジネートを血漿中にスパイクして、ＰＳＲ１プルダウンに供した。
【０３８１】
図４Ａおよび４Ｂは、ＴＢＳＴで希釈した濃度漸増血漿（市販の供給源による正常ヒト血漿）における、発明者らのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した、内因性Ａβレベルの定量を示す。可溶性Ａβ４０およびＡβ４２レベルは、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲にあることを見出した。
【０３８２】
最初に、ＥＬＩＳＡを天然および変性ＡＤ  ＢＨ患者番号２９１試料に実施して、試料中に存在する凝集Ａβ４０／４２の量を査定した（図５Ｂ−Ａβ４２；図５Ｄ−Ａβ４０）。
【０３８３】
次に、血漿（ＴＢＳＴＴ緩衝液中８０％血漿）中にスパイクされた量漸増ＡＤ脳ホモジネートを有する試料を、ＰＳＲ１プルダウンに供した。ＰＳＲ１は、スパイクされたＡＤ脳ホモジネート（１０、２０、５０ｎＬスパイク）からＡβ４２およびＡβ４０を選択的に捕捉することができたが、血漿単独（０ｎＬスパイク）からはいずれの可溶性Ａβ４２もＡβ４０も捕捉しなかった（図５ＣおよびＦ、白三角形：ＰＳＲ１−天然Ａβを参照）。このことは、ＰＳＲ１がアルツハイマー病脳に見出される凝集Ａβペプチドのみを捕捉し、血漿に見出される可溶性Ａβは捕捉しないことを示唆している。この結果はまた、血漿成分（これは、高濃度の各種のタンパク質、脂質、およびイオンを含む）は、ＰＳＲ１結合に干渉しないことも示している。
【０３８４】
（ＰＳＲ１捕捉は、プルダウン前の試料の可溶化によって妨害される）
同じＡＤ脳ホモジネートを、血漿およびＰＳＲ１とのインキュベーション前に、凝集体を可溶化するために５．４  ＧｄｎＳＣＮによって変性したとき、Ａβを検出しなかった。（図５ＣおよびＦ−灰色三角形：ＰＳＲ１−変性Ａβを参照）。このことは、ＰＳＲ１が、変性によって可溶化することができる、ＡＤ試料で見出されたＡβのミスフォールド凝集特性を認識するが、ＡＤ由来Ａβペプチドに特異的な別の決定因子を認識しないという考えを支持する。
【０３８５】
（実施例３  プリオンタンパク質断片に由来するペプチドが、緩衝液または血漿中にスパイクされた罹患脳ホモジネートからの病原性プリオンタンパク質および凝集Ａβについて同様の捕捉プロフィールを有する）
ＷＯ０５／０１６１３７、ＷＯ０７／０３０８０４は、プリオンタンパク質の病原性配座異性体と優先的に相互作用するプリオンタンパク質断片に由来する各種のペプチドおよびペプトイドについて記載している。本実験は、これらの試薬が病原性プリオンを捕捉するのと同様の機構によって、これらの試薬がＡβを捕捉することを示唆している。
【０３８６】
３つの異なる捕捉プロフィールを有するプリオン断片に由来する、６つの異なるペプチドを試験した。各ペプチドのアミノ酸配列は、ヒトプリオンタンパク質配列の断片に相当し、以下に記載する。下付文字は、断片の最初および最後のアミノ酸のアミノ酸位置を示す。
【０３８７】
【数１】
2011520108.tif 000040
１）グループ１：ＰｒＰ１９−３０およびＰｒＰ１００−１１１、これらは、血漿中および緩衝液中の両方でＰｒＰＳｃを捕捉する。
２）グループ２：ＰｒＰ１５４−１６５およびＰｒＰ２２６−２３７、これらは、緩衝液中でのみＰｒＰＳｃを捕捉できる。
３）グループ３：ＰｒＰ３７−４８およびＰｒＰ１８１−１９２、これらは、ＰｒＰＳｃを捕捉できないペプチドである。ＰｒＰ３７−４８およびＰｒＰ１８１−１９２はＰｒＰ１５４−１６５およびＰｒＰ２２６−２３７と同様の物理化学特性を有するが、異なるアミノ酸配列を有するペプチドであるため、これらを負の対照として選択した。
【０３８８】
結果は非常に驚くべきものであった。ペプチドによって捕捉された凝集Ａβ４２の活性プロフィールは、プリオンベース疾患であるクロイツフェルト‐ヤーコプ病に罹患した患者からの捕捉ＰｒＰＳｃのプロフィールとほぼ同じであった（図６）：グループ１のペプチドは、血漿または緩衝液のどちらにスパイクした凝集Ａβ４２も捕捉した；グループ２のペプチドは、緩衝液にスパイクした凝集Ａβ４２は捕捉したが、血漿中にスパイクした凝集Ａβ４２は捕捉しなかった；グループ３のペプチドは、どちらのＡβ４２も捕捉しなかった。この結果は、試験を行ったＰＣＳＢ試薬およびＰｒＰＳｃの結合と、ＰＣＳＢ試薬およびＡβ凝集体の結合との間の結合機構が同様であるということの非常に強力な証拠である。最も有望な相互作用ドメインは、タンパク質アミノ酸配列にかかわらず、共通であり、一般的アミロイド構造の一部であるモチーフである。
【０３８９】
（概要）
本実施例および実施例２は共に、病原性プリオンと優先的に相互作用することができる試薬は、凝集Ａβとも優先的に相互作用できることを示している。これらの試薬が病原性プリオンおよび凝集Ａβの両方にこのような同様の結合特徴で結合する能力は、全く予想されていなかった。
【０３９０】
これらの試薬の凝集タンパク質を捕捉する能力によって、アルツハイマー病関連Ａβタンパク質凝集体の直接検出が可能となる。このことは、ＡＤ疾患のより間接的なマーカーの試験と比較して好都合である。このことはまた、非凝集Ａβに特異的に結合する抗Ａβ抗体などの試薬と比較しても好都合である。このような抗体は、正常者およびＡＤ患者に存在し、ある生物学的流体中でのその濃度がＡＤ疾患の唯一の間接的マーカーである、可溶性Ａβとのみ会合することができる。凝集Ａβを検出するためにこのような試薬を使用するには、天然試料を、凝集体を可溶化するために処理された試料と比較することが必要である。都合の悪いことに、この分析は、ごく低レベルの凝集体を含有する試料では役に立たず、Ａβレベルを検出可能な限界を超えて希釈しがちである試料操作を必要とする。
【０３９１】
（実施例４  凝集Ａβ４２のプルダウンに対する試料マトリクスの効果）
凝集Ａβ４２のプルダウンに対する試料マトリクスの効果は、ＰＳＲ１および上述のペプチドを、３つの異なるアルツハイマー病脳試料：１）緩衝液中にスパイクした脳ホモジネート；２）血漿中にスパイクした脳ホモジネート；および３）ＣＳＦ中にスパイクした脳ホモジネートを用いて試験することによって評価した（図７を参照）。
【０３９２】
試料を調製して、図６に記載するように処理した。ＣＳＦ中にスパイクした脳ホモジネートは、ＢＨ  ５０ｎＬをＴＢＳＴＴ緩衝液中５０％血漿１００マイクロリットル中にスパイクすることによって調製した。
【０３９３】
本実験は、ＰＳＲ１が血漿の存在下で凝集Ａβ４２と優先的に相互作用することを示す他の研究を確認し、ＰＳＲ１はまたＣＳＦの存在下でも凝集Ａβ４２と優先的に相互作用することを示している。
【０３９４】
試験を行ったペプチドは、種々の捕捉プロフィールを示した。緩衝液、血漿、およびＣＳＦ中での捕捉挙動の相違は、結合機構を妨害する干渉成分が血漿およびＣＳＦ中にあることを示唆する。より広範囲の試薬が、血漿中と比較して、ＣＳＦ中で凝集Ａβ４２を捕捉することができる。血漿の存在下でＡβ４２を捕捉することができるＰｒＰ１９−３０およびＰｒＰ１００−１１１は、ＣＳＦの存在下でもＡβ４２を捕捉することができる。しかし、血漿の存在下でＡβを捕捉できないＰｒＰ１５４−１６５およびＰｒＰ２２６−２３７はＣＳＦの存在下ではＡβを捕捉できる。この知見は、ＣＳＦが血漿よりも低いタンパク質濃度を有し、より複雑でない試料マトリクスであるという事実と一致する。したがって、試薬と凝集Ａβとの間の相互作用に干渉し得る成分をあまり含有しそうにない。
【０３９５】
要約すると、これらの実験は、正に荷電した試薬ＰＳＲ１、ＰｒＰ１９−３０、およびＰｒＰ１００−１１１は、単純緩衝液（ＴＢＳＴＴ）はもちろんのこと、アルツハイマー病の死前診断により適用可能な体液、たとえばＣＳＦおよび血漿においても、凝集Ａβと相互作用可能であったことを示す。
【０３９６】
（実施例５  ＥＬＩＳＡのためのＡβの解離および変性−ＮａＯＨ濃度およびインキュベーション温度の最適化）
正常者またはアルツハイマー病（ＡＤ）患者からの脳ホモジネート（ＢＨ）を正常ヒト血漿（ＮＨＰ）中にスパイクして、ＰＳＲ１ビーズによって捕捉した。洗浄後、ビーズをＰＣＲ薄壁管にてＮａＯＨ（０．０１Ｎ−０．３Ｎ）によって再懸濁して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒで６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃にて１０分間インキュベートした。変性したＡβ試料を約ｐＨ７．５まで中和して、次にサンドイッチＥＬＩＳＡ検出に進んだ。
【０３９７】
結果は、Ａβを０．０５Ｎ  ＮａＯＨで９０℃にて変性させたときに最大のシグナルを示したが、ダイナミックレンジは小さかった（図８を参照）。８０℃にて変性させたときに、ＡβシグナルはＮａＯＨの０．０５Ｎから０．１５Ｎまででプラトーに達し、０．１Ｎ  ＮａＯＨは２番目に大きいシグナルを示した。したがって、さらなる試験は、８０℃にて０．１Ｎ  ＮａＯＨによってＡβを変性させることに集中した。
【０３９８】
Ａβは、プリオンタンパク質よりも高温、長期間インキュベーションでのＮａＯＨ変性が必要である。Ａβには８０℃での３０分間の０．１Ｎ  ＮａＯＨによるＡβの変性が良好に機能するのに対して、プリオンには室温での１０分間の０．１Ｎ  ＮａＯＨが良好に機能する。
【０３９９】
（実施例６  アミロイドベータ検出のためのＰＳＲ１捕捉／サンドイッチＥＬＩＳＡ）
本実施例は、ＰＳＲ１を病原性配座異性体特異的結合（ＰＣＳＢ）試薬として使用するＡβの検出プロトコルについて説明する。アッセイは、３つの基本ステップ：１）ＰＣＳＢ試薬を使用する、試料からのＡβ凝集体の捕捉、２）カオトロピック剤を使用する、ＰＣＳＢ試薬からの結合物質の変性および解離、ならびに３）市販の抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを有する。ＥＬＩＳＡで検出試薬として４Ｇ８−ＡＰを使用すると、４Ｇ８−ＨＲＰより優れた線形応答が得られる。
【０４００】
（試料の調製）
１０％脳ホモジネート（ＢＨ）１００ｎＬを以下の１００μＬ／アッセイ中にスパイクする：ａ）５０％正常ヒト血漿（ＮＨＰ）および１×ＴＢＳＴＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％Ｔｗｅｅｎ−２０；１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）；ｂ）５０％正常ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）および１×ＴＢＳＴＴ；またはｃ）０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１×ＴＢＳＴＴ。
【０４０１】
（ビーズ捕捉）
これらの試料を、３０ｍｇ／ｍＬで、Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０−カルボン酸ビーズに共有カップリングされたＰＳＲ１ペプトイド３μＬ／アッセイに添加して、振とうしながら３７℃にて１時間インキュベートする。代わりに、試料をビオチン化ＰＳＲ１ペプトイドでコーティングされたＭ２８０−ストレプトアビジンビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ／アッセイに添加する。
【０４０２】
ビーズをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２７５μＬで４回洗浄する。各洗浄ごとに、洗浄したビーズを磁石で収集して、洗浄緩衝液を除去する。
【０４０３】
次に２μＬ／アッセイの６Ｍチオシアン酸グアニジンを添加し、試料を室温にて３０分間インキュベートして、捕捉した物質を溶離および変性させる。次にＴＢＳＴ  ９８μＬ／アッセイを添加してチオシアン酸グアニジンを希釈する。
【０４０４】
正確な量の６Ｍチオシアン酸グアニジンを添加するために、試料調製およびビーズ捕捉はバルクで行う（１個のチューブまたはウェルでの複数反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））。ＧｄｎＳＣＮを希釈した後に、プロトコルの残りのために試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。
【０４０５】
ビーズを磁気分離によって除去して、上清を捕捉プレートに移す。
【０４０６】
（検出）
捕捉プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＭｉｃｒｏｌｉｔｅ  ２＋）を、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃ末端抗体；Ａβｌ−４０を特異的に結合）またはｍＡｂ  １２Ｆ４（Ｃ末端抗体；Ａβ１−４２を特異的に結合）のどちらか２．５μｇ／ｍＬでコーティングする。どちらの抗体もＣｏｖａｎｃｅより市販されている。
【０４０７】
上清を捕捉プレート上で３７℃にて１時間インキュベートする。捕捉プレートをＴＢＳＴ  ２７５μＬ／ウェルで４回洗浄する。
【０４０８】
０．１％  ＢＳＡおよびＴＢＳＴ中でアルカリホスファターゼに結合体化した０．２μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ４Ｇ８を検出のために捕捉プレートに添加する。精製抗体はＣｏｖａｎｃｅより入手できる。ＡＰ結合体は、Ｃｏｖａｎｃｅによる開始物質（抗体）を使用して所内で作製する。
【０４０９】
次に捕捉プレートを検出抗体と共に３７℃にて１時間インキュベートして、ＴＢＳＴ  ２７５μＬ／ウェルで４回洗浄する。
【０４１０】
強化Ｌｕｍｉｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ（検出のための化学発光基質Ｌｕｍｉｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ  １ｍＬ当り９１μＬの比で０．５５％  ＳＤＳを添加）１００μＬを捕捉プレートに添加する。次に、捕捉プレートを３７℃にて３０分間インキュベートし、プレートをＬｕｍｉｎｏＳｋａｎで読み取る。
【０４１１】
（実施例７  本発明の方法で使用されるＰＣＳＢ試薬の合成）
プリオンタンパク質のペプチド断片は、本質的にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６９）Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２：２２１ならびにＨｏｌｍおよびＭｅｄａｌ（１９８９），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ．２０８Ｅ，ＢａｙｅｒおよびＧ．Ｊｕｎｇ（ｅｄ．），Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９８８，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎ．Ｙ．に記載されているような標準ペプチド合成技法を使用して化学合成した。ペプチドをＨＰＬＣで精製して、配列を質量分析法によって検証した。
【０４１２】
ある場合では、合成したペプチドは、ＮまたはＣ末端にさらなる残基、たとえばＧＧＧ残基を含んでいたか、および／または野生型配列と比較して１個以上のアミノ酸置換を含んでいた。
【０４１３】
（Ａ．ペプトイド置換）
ペプトイド置換を、配列番号１４（ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮ、配列番号２の残基９７〜１０７に相当）、配列番号６７（ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧ、配列番号２の残基２３〜３６に相当）および配列番号６８（ＫＫＲＰＫＰＧＧ、配列番号２の残基２３〜３０に相当）で表されるペプチド内でも行った。特に、これらのペプチドの１個以上のプロリン残基を、各種のＮ置換ペプトイドによって置換した。図９または任意のプロリンを置換できるペプトイドを参照。ペプトイドは、どちらも参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，８７７，２７８号および同第６，０３３，６３１号；Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７に記載されているように調製および合成した。
【０４１４】
（Ｂ．マルチマー化）
あるペプチド試薬は、たとえばタンデムリピート（ＧＧＧなどのリンカーによるペプチドの複数のコピーの結合）、多抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）および／または直鎖状結合ペプチドを調製することによって、マルチマーとしても調製した。
【０４１５】
特に、ＭＡＰＳは、本質的にＷｕら（２００１）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００１  １２３（２８）：６７７８−８４；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら（１９９５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５（１）：７８−８５に記載されているような標準技法を使用して調製した。
【０４１６】
直鎖および分枝ペプチド（たとえばＰＥＧリンカーマルチマー化）もポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを使用して、標準技法を使用して調製した。特に、分枝マルチペプチドＰＥＧ骨格は、以下の構造を用いて生成した：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド対照なし）およびビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）。さらに、ペプチドからＬｙｓへの結合を調製した：Ｌｙｓ−イプシロン−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃｙｓ−ペプチド。図１０Ｃを参照。
【０４１７】
（Ｃ．ビオチン化）
ペプチドを、合成および精製後に、標準技法を使用してビオチン化した。ビオチンをペプチドのＮまたはＣ末端に添加した。
【０４１８】
（実施例８  ＰＣＳＢペプトイド試薬）
以下のＰＣＳＢペプトイド試薬を、Ｎ置換グリシン残基を含有するペプトイド分子の調製のための合成方法、たとえば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，８１１，３８７号；同第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；同第５，９７７，３０１号；同第６，０７５，１２１号；同第６，２５１，４３３号；および同第６，０３３，６３１号はもちろんのこと、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７にも開示されている手順などを使用して調製した。
【０４１９】
（ペプトイド試薬Ｉ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２２９を含む。
【０４２０】
【化２２−２】
2011520108.tif 000041
計算質量：１０５４．４２；実測質量（Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  Ｍａｓｓ）：１０５４．２。実測質量の測定は全て、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ  ＬＣ／ＭＳシステムで測定した。
【０４２１】
（ペプトイド試薬ＩＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３０を含む。
【０４２２】
【化２３】
2011520108.tif 000042
計算質量：１２９０．７０；実測質量：１２９０．８。
【０４２３】
（ペプトイド試薬ＩＩＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３１を含む。
【０４２４】
【化２４】
2011520108.tif 000043
計算質量：１８６１．３０；実測質量：１８６１．６。
【０４２５】
（ペプトイド試薬ＩＶ）
下のペプトイド試薬
【０４２６】
【化２５】
2011520108.tif 000044
は、これに限定されるわけではないが配列番号２３２を含む。
【０４２７】
（ペプトイド試薬Ｖ）
下のペプトイド試薬
【０４２８】
【化２６】
2011520108.tif 000045
は、これに限定されるわけではないが配列番号２３３を含む。
【０４２９】
（ペプトイド試薬ＶＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３４を含む。
【０４３０】
【化２７】
2011520108.tif 000046
計算質量：１９５６．４９；実測質量：１９５６．２。
【０４３１】
（ペプトイド試薬ＶＩＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２３５を含む。
【０４３２】
【化２８】
2011520108.tif 000047
計算質量：１８９６．３９；実測質量：１８９６．４。
【０４３３】
（ペプトイド試薬ＶＩＩＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３６を含む。
【０４３４】
【化２９】
2011520108.tif 000048
計算質量：１７３２．１８；実測質量：１７３２．４。
【０４３５】
（ペプトイド試薬ＩＸ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３７を含む。
【０４３６】
【化３０】
2011520108.tif 000049
計算質量：１２４８．６５；実測質量：１２４８．４。
【０４３７】
（ペプトイド試薬Ｘ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが配列番号２３８を含む。
【０４３８】
【化３１】
2011520108.tif 000050
計算質量：１２４８．６５；実測質量：１２４８．４。
【０４３９】
（ペプトイド試薬ＸＩａおよびＸＩｂ）
下のペプトイド試薬ＸＩａおよびＸＩｂは、配列番号２３９を含む。
【０４４０】
【化３２】
2011520108.tif 000051
ＸＩａ：計算質量：１３０４．７６；実測質量：１３０４．６。
ＸＩｂ：計算質量：１１６６．５９；実測質量：１１６６．２。
【０４４１】
（ペプトイド試薬ＸＩＩａおよびＸＩＩｂ）
下のペプトイド試薬の式ＸＩＩａおよびＸＩＩｂは、配列番号２４０を含む。
【０４４２】
【化３３】
2011520108.tif 000052
ＸＩＩａ：計算質量：１２７６．７１；実測質量：１２７６．６。
【０４４３】
（ペプトイド試薬ＸＩＩＩ）
下のペプトイド試薬は、これに限定されるわけではないが、配列番号２４１を含む。
【０４４４】
【化３４】
2011520108.tif 000053
計算質量：１２５６．５８；実測質量：１２５６．６。
【０４４５】
（実施例９  ＰＳＲ１およびＰｒＰ２３−３０は、βシートブロッカーより優れたＡβの捕捉を示す）
βシートブレイカーは、凝集を媒介するＡβの領域に結合することによってＡβ線維化プロセスを妨害すると考えられている小型分子である。本実施例は、ＡβのＰＳＲ１捕捉がβシートブレイカーによる捕捉よりも優れていることを示す（図１１を参照）。
【０４４６】
ＰＳＲ１、ＰｒＰ２３−３０、Ｍ２８０ＳＡビーズのみ、ならびにβシートブレイカーＡＬ３０、ＡＬ３２、ＡＬ３３、およびＡＬ３４（その構造は下の表で詳説されている）
【０４４７】
【数２】
2011520108.tif 000054
を使用するＡβの捕捉、および、４Ｇ８−ＨＲＰ試薬を用いたＥＬＩＳＡによる検出は、実施例２に記載した方法を使用して実施した。
【０４４８】
（実施例１０  ＰＳＲ１は凝集全タウを捕捉する）
凝集タウの全レベル（リン酸化、非リン酸化、または過剰リン酸化）は、アルツハイマー病と関連している。過剰リン酸化凝集タウは、アルツハイマー病に特に強い関連があるようだ。
【０４４９】
Ａβ凝集および酸化ストレスよって引き起こされるタウ過剰リン酸化は、ＡＤ発症に関与すると考えられている（Ｆｏｒｍｉｃｈｉ，Ｐ．ら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０８−１：３９−４６，２００６）。過剰リン酸化タウタンパク質は、高い自己凝集活性を有し、神経変性疾患の脳で見出される対らせん状細線維および神経細線維もつれを形成する（Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：４６０−４６５，１９９３；Ｉｑｂａｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  ５３：１６９−１８０，１９９８）。Ｔｈｒ１８１および２３１におけるタウのリン酸化は、ＣＳＦ中のＡＤバイオマーカーとして試験されている。Ａβ４２に対するｐ−タウの比は、ＡＤを有する患者を健常な対照および他の認知症と区別するため、高い診断上の価値を有する（Ｂｕｅｒｇｅｒら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５９：１２６７−１２７２，２００２；Ｍａｄｄａｌｅｎａら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６０：１２０２−１２０６，２００３）。
【０４５０】
本実施例は、ＰＳＲ１がＡＤ関連凝集タウを捕捉することを示す。
【０４５１】
（正常脳およびアルツハイマー病脳の全タウレベルの測定）
正常ヒトおよびアルツハイマー病脳ホモジネートを、室温にて１時間、３Ｍ  ＧｎＳＣＮで処置した（変性）かまたは処置しなかった（天然）。１０％脳ホモジネート１００ｎＬを各ＥＬＩＳＡウェルに分注した（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  ＴａｕイムノアッセイキットＫＨＢ００４２／ＫＨＢ００４１）。全タウ標準物を、０．００６Ｍ  ＧｎＳＣＮを含む希釈溶液によって希釈した。
【０４５２】
各ＥＬＩＳＡプレートを被覆して、室温にて一晩インキュベートした。２日目に、ＥＬＩＳＡプレートをウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄し、ウサギ抗タウ抗体１００ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。機能する抗ウサギＨＲＰ  １００ｕＬを各ウェルに添加した。次にプレートを室温にて３０分間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、１００ｕＬのＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎを添加した。次にプレートを暗所で室温にて３０分間インキュベートした。反応を、停止液１００ｕＬをすべてのウェルに添加して停止させて、４５０ｎｍで読み取った。
【０４５３】
有意なレベルのタウを正常およびアルツハイマー病脳の両方で検出した（図１２）。プリオンおよびＡβ凝集体とは異なり、タウの変性は、検出可能なタウレベルに対して有意な効果を有さず、このことは、タウ抗体結合エピトープはタウの病原性アイソフォームにおいてコンフォメーション的に変更されていないことを示唆した。
【０４５４】
（ＰＳＲ１によるプルダウン）
１０％正常またはアルツハイマー病脳ホモジネート４００ｎＬを各プルダウン反応のためにＴＢＳＴＴ  １００ｕＬで希釈した。反応当り３ｕＬのＭ２７０−グルタチオンまたはＰＳＲ１ビーズを５００ｕＬ丸底コーニングプレートに入れた（ｐｌａｔｅ）。反応物を７５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃にて１時間インキュベートした。次にビーズをＢｉｏＴｅｋ  ＢＬｘ４０５においてＴＢＳＴによって洗浄した。残留溶液を除去した後、６Ｍ  ＧｎＳＣＮ  ５ｕＬを添加して、ビーズと共に７５０ｒｐｍで振とうしながら室温にて１時間インキュベートして、タンパク質を解離させた。Ｈ２Ｏ  １２０ｕＬを各ウェルに添加した。
【０４５５】
次に、各プルダウン試薬によって捕捉されたタウの量を定量した。ウェル当り５０ｕＬの標準希釈緩衝液をタウＥＬＩＳＡプレートに添加した。プルダウンプレートを磁気スタンドに２分間置き、溶液５０ｕＬ／ウェルをタウＥＬＩＳＡプレートに移した（１６０ｎＬ  １０％ＢＨ／ウェルに相当）。タウ標準物を０．１２Ｍ  ＧｎＳＣＮを含む希釈溶液によって希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを被覆して、室温で一晩インキュベートした。２日目に、ＥＬＩＳＡプレートをウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。ウサギ抗タウ抗体１００ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。機能する抗ウサギＨＲＰ  １００ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温にて３０分間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。１００ｕＬのＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎを添加した。プレートを暗所で室温にて３０分間インキュベートした。反応を、停止液１００ｕＬをすべてのウェルに添加して停止させて、４５０ｎｍで読み取った。
【０４５６】
大半のアルツハイマー病脳試料において、ＰＳＲ１は、正常脳試料においてよりも有意に多いタウを結合し、このことは、ＰＳＲ１が凝集タウに選択的に結合することを示唆した（図１３）。対照グルタチオンビーズのプルダウン試料においては、ごくわずかのタウしか検出しなかった。
【０４５７】
検出されたタウレベルを下の表８、
【０４５８】
【表８】
2011520108.tif 000055
で定量する。
【０４５９】
（実施例１１  解離した凝集タウは、ＰＳＲ１ビーズによって、もはやプルダウンされない（図１４））
正常またはアルツハイマー脳ホモジネートを、５Ｍ  ＧｎＳＣＮを用いて、または用いずに室温にて１時間インキュベートした。１０％正常またはアルツハイマー病脳ホモジネート４００ｎＬを各プルダウン反応のために２５％ヒト血漿−ＴＢＳＴＴ  ２００ｕＬで希釈した。
【０４６０】
反応当りＭ２７０−グルタチオンまたはＰＳＲ１ビーズ３ｕＬを５００ｕＬ丸底コーニングプレートに入れた。反応物は７５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃にて１時間インキュベートした。次にビーズをＢｉｏＴｅｋ  ＢＬｘ４０５においてＴＢＳＴによって洗浄した。残留溶液を除去した後、６Ｍ  ＧｎＳＣＮ  １０ｕＬを添加して、ビーズと共に７５０ｒｐｍで振とうしながら室温にて１時間インキュベートして、タンパク質を解離させた。Ｈ２Ｏ  １２０ｕＬを各ウェルに添加した。
【０４６１】
プルダウンプレートを磁気スタンドに２分間置き、溶液５０ｕＬ／ウェルをタウＥＬＩＳＡプレートに移した（１６０ｎＬ  １０％ＢＨ／ウェルに相当）。ＥＬＩＳＡプレートを被覆して、室温で一晩インキュベートした。２日目に、ＥＬＩＳＡプレートをウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。ウサギ抗タウ抗体１００ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。機能する抗ウサギＨＲＰ  １００ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温にて３０分間インキュベートして、ウェル当り４００ｕＬの希釈洗浄緩衝液で４回洗浄した。１００ｕＬのＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎを添加した。プレートを暗所で室温にて３０分間インキュベートした。反応を、停止液１００ｕＬをすべてのウェルに添加して停止させて、４５０ｎｍで読み取った。
【０４６２】
解離した凝集タウを、ＰＳＲ１はもはや結合しなかった（図１４を参照）。
【０４６３】
【表９】
2011520108.tif 000056
現在までに発明者らは、３種類の異なるタンパク質；プリオン、Ａβ、およびタウの不溶性規則的タンパク質凝集体がＰＳＲ１および他のＰＣＳＢ試薬を結合することを示している。これらの凝集体の変性によって、溶解性が生じ、ＰＳＲ１および他のＰＣＳＢ試薬へのその結合を除去する。この観察結果は、タンパク質アミノ酸配列とは無関係の規則的アミロイド構造を特徴とする相互作用ドメインの存在をさらに支持する。
【０４６４】
（実施例１２  ヒトＣＳＦ中のＡＤ  Ａβ凝集体に対するＰＳＲ１ビーズプルダウンアッセイの検出限界（ＬＯＤ）（図１５））
ＰＳＲ１ビーズプルダウンアッセイの検出限界（ＬＯＤ）を、バックグラウンドを超えて検出可能な凝集Ａβの最小量を決定することにより評価した。
【０４６５】
モノマー可溶性Ａβを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの感度を、メソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ））技術を使用して評価した（図１５Ａ）。標準合成Ａβ４０または４２は、ＡβのＣ末端に特異的なｍＡｂによって捕捉して、ｍＡｂ  ４Ｇ８によって検出した。シグナル／雑音比が２の検出限界（ＬＯＤ）は、Ａβ４０では１．６ｐｇ／ｍＬであり、Ａβ４２では１２ｐｇ／ｍＬであった。
【０４６６】
アルツハイマー病（ＡＤ）脳ホモジネート（ＢＨ）中でＡβ４０および４２凝集体を検出するＰＳＲ１感度を測定した（図１５Ｂ）。１０％ＡＤ  ＢＨをプール正常ヒトＣＳＦ  ２００ｕＬ中にスパイクして、ＰＳＲ１ビーズ  ３ｕＬによって捕捉した。捕捉されたＡβを８０℃にて０．１Ｎ  ＮａＯＨによってモノマーＡβに解離して、上述のようなサンドイッチＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによって検出した。シグナル／雑音比が２の検出限界（ＬＯＤ）は、Ａβ４０では１ｐｇ／ｍＬであり（１０％ＡＤ  ＢＨ  １１．４ｎＬをＣＳＦ  １ｍＬ中にスパイク）、Ａβ４２では１ｐｇ／ｍＬであった（１０％ＡＤ  ＢＨ  ０．３ｎＬをＣＳＦ  １ｍＬ中にスパイク）。
【０４６７】
（実施例１３  ヒト血清中にスパイクされたＡβ４２凝集体のＰＳＲ１回収（結合効率）（図１６））
ＰＳＲ１によるＡβ凝集体の回収効率を、ＡＤ  ＢＨ中の全凝集Ａβ４２の量をＰＳＲ１プルダウンによって捕捉された量と比較することによって評価した。
【０４６８】
１０％ＡＤ  ＢＨを希釈正常ヒト血清（ＴＢＳで２００倍希釈）２００ｕＬ中にスパイクして、ＰＳＲ１ビーズ  ３ｕＬによって捕捉した（図１６、四角形）。捕捉されたＡβ４２凝集体を８０℃にて０．１Ｎ  ＮａＯＨによって解離して、実施例１２に記載したようなサンドイッチＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０４６９】
ＰＳＲ１捕捉に供されなかった同量のＡＤ  ＢＨを８０℃にて０．１ＮａＯＨによって変性させて、実施例１２に記載したように全Ａβ４２をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した（図１６、三角形）。
【０４７０】
Ａβの濃度は、実施例１２に記載するように合成Ａβを使用して標準曲線から計算した。
【０４７１】
ＰＳＲ１によって捕捉されたＡβ４２凝集体の量は、ＡＤ  ＢＨ中の全Ａβ４２凝集体と等しく、このことは、ＰＳＲ１回収が約１００％であり、ＰＳＲ１が非常に効率的な捕捉試薬であることを示した。
【０４７２】
（実施例１４  ＰＳＲ１ビーズプルダウンアッセイによる正常ＣＳＦからのＡβ４０および４２の検出）
アルツハイマー病に罹っていない個人からのＣＳＦ中のＡβモノマーを結合するＰＳＲ１の能力をモニターするために、濃度漸増ＰＳＲ１（３０ｍｇ／ｍＬストックからの３、９、１５ｕＬ）を２×ＴＢＳＴＴ（１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）５０ｕＬと混合した、ＣＳＦロット４１０またはロット４１１  ５０ｕＬに添加した。得られた混合物を６００ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料は、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）でビーズを６回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴの添加後に、磁力を使用してビーズを収集し、ＴＢＳＴを除去した。ビーズ結合タンパク質は、７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、８０℃にて０．１Ｎ  ＮａＯＨによって３０分間にわたって解離させた。０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／０．４％Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用して溶液を中和した。上清をＥＬＩＳＡプレートに移して、Ａβ４０および４２を測定した。読取値をＡβ４０および４２標準曲線のＥＬＩＳＡと比較して定量した。ＥＬＩＳＡは、ＭＳＤ９６ウェルＭＵＬＴＩ＿ＳＰＯＴヒト／げっ歯類４Ｇ８  Ａβ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に従って実施した。表１０の結果は、漸増ビーズ量と共に、Ａβ４０および４２のＰＳＲ１ビーズへの結合をｐｇ／ｍｌおよび全体のパーセントで示す。すべてのビーズ濃度でＡβ４０のごくわずかな結合が明らかである。検出された量は、正常ＣＳＦに存在する全Ａβ４０の１％未満に相当する。Ａβ４２の結合は明らかであり、正常ＣＳＦ中に存在する全てのＡβ４２の１〜５％に相当する。
【０４７３】
観察された結合は、正常ＣＳＦ中でのオリゴマー性Ａβの存在を示し得る。
【０４７４】
【表１０】
2011520108.tif 000057
または、これらの知見は、ＰＳＲ１がモノマー性Ａβを低い親和性で結合できることを示唆し得る。
【０４７５】
（実施例１５  Ａβ４２モノマーのＰＳＲ１への結合は、低濃度の血漿によってブロックすることができる（図１７））
モノマー性Ａβおよび凝集Ａβに対するＰＳＲ１結合の親和性を、血漿の濃度漸増の効果を調べることによって評価した。
【０４７６】
ＰＳＲ１に対するモノマー性Ａβ結合のブロックを試験するために、ビーズを濃度漸増血漿の存在下で、大過剰のモノマー性Ａβ４２（２５ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした（図１７、三角形）。血漿濃度の上昇につれて、モノマー結合の量が減少した。２０パーセントの血漿は、モノマーに対するＰＳＲ１結合の９０％超を阻害した。
【０４７７】
ＰＳＲ１に対する凝集Ａβ結合のブロックを試験するために、ビーズを濃度漸増血漿の存在下で、２００ｍＬ／ｍＬ  ５％ＡＤ脳ホモジネートと共にインキュベートした（図１７、丸）。モノマー性Ａβとは対照的に、凝集Ａβの結合に、最大８５％の血漿は影響しなかった。
【０４７８】
これらの知見
【０４７９】
【表１１】
2011520108.tif 000058
は、モノマー性Ａβは、低い親和性でＰＳＲ１を結合するが（これは、他のタンパク質によってブロックされる可能性がある）、凝集ＡβはＰＳＲ１をより高い親和性で結合することを示唆している。
【０４８０】
（実施例１６  ＨＣｌは凝集タウタンパク質とＰＳＲ１−ビーズとの結合を解離させる（図１８））
ＰＳＲ１結合凝集体の効率的な免疫検出を実施するためには、凝集体を溶離させて、ＥＬＩＳＡに適合するタンパク質モノマーに解離すべきである。解離のカオトロピック強度は、凝集体の物理化学特性に依存する。凝集タウのＰＳＲ１からの解離を最適化するために、以下の酸性条件
【０４８１】
【数３】
2011520108.tif 000059
を試験した。
【０４８２】
正常またはアルツハイマー病（ＡＤ）からの脳ホモジネート（ＢＨ）をＴＢＳＴＴ（１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）中にスパイクした。各試料１００ｕＬをＰＳＲ１−ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）３ｕＬと混合した。得られた混合物を７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料物質は、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）でビーズを６回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴの添加後に、磁力を使用してビーズを収集し、ＴＢＳＴを除去した。凝集タウとビーズとの結合は、７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、種々の条件（表に表示）で解離させた。解離反応物は３つの異なる温度の、３つの別個のプレートに置いた。６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮをＨ２Ｏで希釈し、ＨＣｌはＮａＯＨによってｐＨ７．５まで中和した。上清を磁力上の同じＥＬＩＳＡプレートに移した。タウはヒトタウ（全）ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）によって定量した。
【０４８３】
結果を図１８に示す。結果は、室温（ＲＴ）および５０℃の０．２５Ｎ  ＨＣｌによってＡＤ  ＢＨからの凝集タウとＰＳＲ１−ビーズとの結合が解離されることを示す。これらの解離条件は、ＲＴでの６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮと同じ効率を有する（ＲＴでの６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮは、タンパク質への損傷を伴わずに凝集タンパク質を解離させるため、標準である）。８０℃の０．２５Ｎ  ＨＣｌによる解離によって、ＥＬＩＳＡのタウシグナルが除去され、この除去はおそらくタウタンパク質の損傷によるものである。ｐＨ２．３における１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．１Ｎ  ＨＣｌ−グリシンでは、６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮと同じ解離効率を達成できなかった。正常ＢＨでは、シグナルはすべての解離条件で同じレベルであった。条件３（７５０ｒｐｍで振とうしながら室温にて０．２５Ｎ  ＨＣｌで３０分間）は、ＰＳＲ１ビーズからの凝集タウの好ましい解離条件である。
【０４８４】
（実施例１７  ＡＤ  ＢＨによってスパイクした正常ヒトＣＳＦ中の全タウ、Ｐ−タウ２３１、およびＰ−タウ１８１に対するＰＳＲ１ビーズプルダウンアッセイの検出限界（図１９Ａ〜Ｆ））
（全タウの検出限界）
アルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤ  ＢＨ）を正常ヒトＣＳＦ中にスパイクした。各試料２００ｕＬを５×ＴＢＳＴＴ（１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）５０ｕＬおよびＰＳＲ１−ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）１２ｕＬと混合した。得られた混合物を５５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料物質は、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）でビーズを６回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴの添加後に、磁力を使用してビーズを収集し、ＴＢＳＴを除去した。ビーズ結合凝集タウは、７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、室温にて０．２５Ｎ  ＨＣｌによって３０分間にわたって解離させた。０．２５Ｎ  ＮａＯＨを使用して溶液を中和した。上清を磁力上のＩＮＮＯＴＥＳＴ  ｈＴＡＵ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡプレートに移した。ＩＮＮＯＴＥＳＴ  ｈＴＡＵ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡを、ＰＳＲ１−ビーズプルダウンアッセイから最終試料量を合成するために、反応当り１７５ｕＬに変更した。
【０４８５】
アッセイ検出限界は、２以上のＳ／Ｎ（シグナル対アッセイバックグラウンド）比を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイバックグラウンドを、緩衝液のみでのシグナルと見なした。プルダウンアッセイのバックグラウンドを、ＡＤ  ＢＨをスパイクしなかったＣＳＦのシグナルと見なした。１７５ｕＬ  ＩＮＮＯＴＥＳＴ  ｈＴＡＵ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡの検出限界は、アッセイ当り０．０３２ｆｍｏｌ、すなわち０．３２ｐＭであった。タウＰＳＲ１ビーズプルダウンアッセイの検出限界は、アッセイ当り０．０３８ｆｍｏｌ、すなわち０．１９ｐＭであった。
【０４８６】
（Ｐ−タウ２３１の検出限界）
アルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤ  ＢＨ）を正常ヒトＣＳＦ中にスパイクした。７０ｕＬの各試料を３．３×ＴＢＳＴＴ（１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）３０ｕＬおよびＰＳＲ１−ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）３ｕＬと混合した。得られた混合物を７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料物質は、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）でビーズを６回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴの添加後に、磁力を使用してビーズを収集し、ＴＢＳＴを除去した。ビーズ結合凝集タウは、７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、室温にて０．２５Ｎ  ＨＣｌによって３０分間にわたって解離させた。０．２５Ｎ  ＮａＯＨを使用して溶液を中和した。上清を磁力上のヒトタウ［ｐＴ２３１］ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に移した。
【０４８７】
アッセイ検出限界は、２以上のＳ／Ｎ（シグナル対アッセイバックグラウンド）比を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイバックグラウンドを、緩衝液のみでのシグナルと見なした。プルダウンアッセイのバックグラウンドを、ＡＤ  ＢＨをスパイクしなかったＣＳＦのシグナルと見なした。ヒトタウ［ｐＴ２３１］ＥＬＩＳＡの検出限界は、アッセイ当り０．０９ｆｍｏｌ、すなわち１．７２ｐＭであった。タウ［ｐＴ２３１］プルダウンアッセイの検出限界は、アッセイ当り０．２０ｆｍｏｌ、すなわち２．７１ｐＭであった。
【０４８８】
（Ｐ−タウ１８１の検出限界）
アルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤ  ＢＨ）を正常ヒトＣＳＦ中にスパイクした。７０ｕＬの各試料を３．３×ＴＢＳＴＴ（１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）３０ｕＬおよびＰＳＲ１−ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）３ｕＬと混合した。得られた混合物を７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。非結合試料物質は、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）でビーズを６回洗浄することによって除去した。各洗浄ごとに、ＴＢＳＴの添加後に、磁力を使用してビーズを収集し、ＴＢＳＴを除去した。ビーズ結合凝集タウは、７５０ｒｐｍにて常時振とうしながら、室温にて０．２５Ｎ  ＨＣｌによって３０分間にわたって解離させた。０．２５Ｎ  ＮａＯＨを使用して溶液を中和した。上清を磁力上のＩＮＮＯＴＥＳＴ  ＰＨＯＳＰＨＯ−ＴＡＵ（１８１Ｐ）ＥＬＩＳＡプレートに移した。
【０４８９】
アッセイ検出限界は、２以上のＳ／Ｎ（シグナル対アッセイバックグラウンド）比を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイバックグラウンドを、緩衝液のみでのシグナルと見なした。プルダウンアッセイのバックグラウンドを、ＡＤ  ＢＨをスパイクしなかったＣＳＦのシグナルと見なした。ＩＮＮＯＴＥＳＴ  ＰＨＯＳＰＨＯ−ＴＡＵ（１８１Ｐ）ＥＬＩＳＡの検出限界は、アッセイ当り０．０４ｆｍｏｌ、すなわち０．５４ｐＭであった。タウ［ｐＴ２３１］プルダウンアッセイの検出限界は、アッセイ当り０．０３ｆｍｏｌ、すなわち０．４４ｐＭであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図９（Ｃ）】
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【図９（Ｄ）】
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【図９（Ｅ）】
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【図９（Ｆ）】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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