(57)【要約】  本発明は、固相ペプチド合成法により調製されたペプチドを精製するための効率的な方法に関する。また、本発明は、前記方法用の試薬を含むキット、及び前記方法により得られた精製ペプチドも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相ペプチド合成により調製されたペプチドを精製する方法において、固相ペプチド合成により調製されたペプチドの粗抽出物を固体支持体と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
固相ペプチド合成が、アミノ末端保護基としてＦｍｏｃを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が粗ペプチド抽出物からジベンゾフルベンを除去する方法を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が熱可塑性ポリマーを含有する包装材を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
固体支持体が、容器、ペレット、粒子、及びフィルター支持体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
熱可塑性ポリマーがポリエチレン又はポリプロピレンである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）固相合成で得られた粗ペプチド抽出物を包装材に加える工程；
（ｂ）包装材中の抽出物をインキュベートする工程；
（ｃ）包装材から抽出物を除去する工程；及び
（ｄ）抽出物に標準的なペプチド分離を施す工程；
を含む、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）における標準的なペプチド分離が、イオン交換クロマトグラフィーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固体支持体がイオン交換クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体がアニオン交換クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）標準的なクロマトグラフィー条件下、固相合成から得られた粗ペプチド抽出物、又は実施例７の方法の工程（ａ）ないし（ｃ）から得られたペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し；
（ｂ）アルコールを用いて第１の溶出工程を実施し；及び
（ｃ）一又は複数のバッファーを用いて第２の溶出工程を実施する；
工程を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）で使用され得るバッファーが、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、ＴＡＰＳ(３-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、ビシン(Ｎ,Ｎ-ビス(２-ヒドロキシエチル)グリシン)、トリシン(Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)、ＨＥＰＥＳ(４-２-ヒドロキシエチル-１-ピペラジンエタンスルホン酸)、ＴＥＳ(２-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)、ＭＯＰＳ(３-(Ｎ-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、ＰＩＰＥＳ(ピペラジン-Ｎ,Ｎ'-ビス(２-エタンスルホン酸))、カコジル酸(ジメチルアルシン酸)、ＭＥＳ(２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸)又はアセテートを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）で使用されるアルコールがＣ１−５アルコールである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがグルカゴン様ペプチドである、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法により得られたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相ペプチド合成により調製されたペプチドを精製する方法、該方法用の試薬を含むキット、及び該方法により得られた精製ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、全ての主要な治療分野において、病気を処置するための医薬として、ますます使用されている。治療用途のポリペプチドは、患者への適用において、確実に有害事象を引き起こさないよう、また有効性のあるものとするために、高度に精製される。
治療用ペプチドを得るための一方法は固相ペプチド合成である。固相ペプチド合成の生成物は、不溶性の支持体に結合したペプチドである。ついで、この方法で合成されたペプチドは樹脂から切断され、切断されたペプチドが単離される。
【０００３】
固相ペプチド合成中の副反応を回避するために、カップリング反応中、アミン基は、アミノ酸のアルファアミノ基に主としてカップリングする化学部分を含むアミノ末端保護基(Ｎ末端保護基とも称される)でマスクされる。典型的には、アミノ末端保護基は、次のアミノ酸が成長ペプチド鎖に付加される前に脱保護反応において除去されるが、ペプチドが固相合成中に支持体から切断された場合は、保持されている。アミノ末端基は、さらにペプチドの洗浄又はプロセシング工程中にも保持可能である。
固相ペプチド合成からの粗ペプチド混合物は、多量の有機溶媒、試薬、及びプロセスに関連する不純物を含む。多くの場合、ペプチド混合物は、クロマトグラフィーコントロール中、インラインＵＶ測定に干渉する、高ＵＶ吸収を示す。さらに、多くの不純物はイオン交換の能力を低下させ、完全な除去が困難になる。従って、典型的には、所定レベルの不純物が精製後も存在する。
【０００４】
９-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)は、好ましいＮ末端保護基の一例である。Ｆｍｏｃは、塩基によりアミノ酸から脱カップリング可能な、塩基過敏性Ｎ末端保護基である。
ジベンゾフルベン(dibenzofulvene)(ＤＢＦ)は、保護基、例えばＦｍｏｃの切断中に生じ、続く、除去は困難で高価なものであることが知られている。よって、固相ペプチド合成の後の効果的な精製方法が、かなり必要とされている
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様は、固体支持体と、固相ペプチド合成により調製されたペプチドの粗抽出物とを接触させる工程を含む、固相ペプチド合成により調製されたペプチドを精製する方法を提供する。
本発明の第２の態様は、固相ペプチド合成キットであって、固相ペプチド合成用の試薬、ここに記載の固体支持体、及びここに記載の方法に従い、該キットを使用するための使用説明書を含むキットを提供する。
本発明の第３の態様は、ここに記載の方法により得られたペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、固相合成法により調製されたペプチドのコントロール精製により得られたクロマトグラムを表す。
【図２】図２は、ポリエチレンを含有する容器に、固相合成法により調製されたペプチドを保管した後に得られたクロマトグラムを表す。
【図３】図３は、１００％エタノールの存在下、固相合成法により調製されたペプチドをクロマトグラフ分離した後に得られたクロマトグラムを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
(発明の記述)
以下は、明細書に使用される用語の詳細な定義である。
ここで使用される場合「バッファー」なる用語は、クロマトグラフィー用溶液等の溶液のｐＨが経時的に変化する傾向を低減する化学化合物を称する。バッファーには、次の非限定的例：酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシルグリシン、グリシン、ヒスチジン、リジン、リン酸ナトリウム、ボラート、トリスヒドロキシメチル-アミノメタン、エタノールアミン、及びその混合物が含まれる。
【０００８】
ここで交換可能に使用される場合、「ポリペプチド」又は「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合した、少なくとも５つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであってよく、また遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。２２のコード化(タンパク新生とも称される)アミノ酸は：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンである。遺伝暗号によりコードされないが、ペプチド結合を介してペプチドに導入可能な天然アミノ酸は、天然の非タンパク質新生アミノ酸と称され、例えばγ-カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン及びＤ-グルタミンである。合成の非タンパク質新生アミノ酸には、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ-異性体、例えばＤ-アラニン及びＤ-ロイシン、Ａｉｂ(α-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(α-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、３-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、アミノ酸のベータアナログ、例えばβ-アラニン等、Ｄ-ヒスチジン、デス-アミノ(desamino)-ヒスチジン、２-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、３-ピリジルアラニン、２-ピリジルアラニン又は４-ピリジルアラニン、(１-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(１-アミノシクロブチル)カルボン酸、(１-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(１-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(１-アミノシクロへプチル)カルボン酸、又は(１-アミノシクロオクチル)カルボン酸が含まれる。
【０００９】
ポリペプチドは、単一のペプチド鎖を含むものであってもよく、１以上のペプチド鎖、例えば、２つの鎖がジスルフィド結合により結合しているヒトインスリンを含むものであってもよい。
【００１０】
ここで使用される場合「グルカゴン様ペプチド」なる用語は、エキセンディン類、例えばエキセンディン-３及びエキセンディン-４、並びにプレプログルカゴン遺伝子から誘導されたグルカゴン、すなわちグルカゴン様ペプチド１(ＧＬＰ-１)、グルカゴン様ペプチド２(ＧＬＰ-２)及びオキシントモジュリン(ＯＸＭ)、並びにそのアナログ及び誘導体に加えて、ホモログペプチドも称する。アメリカドグトカゲに見出されるエキセンディンは、ＧＬＰ-１に相同であり、さらにインスリン分泌効果に働きかける。エキセンディン類の例は、エキセンディン-４及びエキセンディン-３である。グルカゴン様ペプチドは、配列番号：１-６に示される配列を有する。
グルカゴン(配列番号：１)
ＧＬＰ-１(配列番号：２)
ＧＬＰ-２(配列番号：３)
エキセンディン-４(配列番号：４)
エキセンディン-３(配列番号：５)及び
ＯＸＭ(配列番号：６)
【００１１】
ペプチドを称する際にここで使用される場合、「アナログ」なる用語は、修飾されたペプチドを意味し、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基で置換されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基はペプチドから欠失しており、又は一又は複数のアミノ酸残基はペプチドに付加されている。アミノ酸残基のこのような付加又は欠失は、ペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で生じる可能性がある。多くの場合、アナログを記載するための２つの異なる簡単なシステムが使用される：例えばＡｒｇ３４-ＧＬＰ-１(７-３７)又はＫ３４Ｒ-ＧＬＰ-１(７-３７)は、ＧＬＰ-１アナログと命名され、ここでは、３４位で自然に生じたリジンはアルギニンで置換されている(アミノ酸の標準的な１文字又は３文字略語を、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ命名法に従い使用)。光学異性体が記載されない全てのアミノ酸は、Ｌ-異性体を意味すると理解される。
【００１２】
本発明の一実施態様において、最大１７のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大１５のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大１０のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大８のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大７のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大６のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大５のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大４のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大３のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、最大２のアミノ酸が修飾されている。本発明の一実施態様において、１のアミノ酸が修飾されている。
【００１３】
ペプチドに関してここで使用される場合、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたペプチド又はそのアナログを意味し、ここで少なくとも一の置換基がその未修飾のペプチド又はアナログ中に存在していない、すなわち共有結合的に修飾されたペプチドである。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等である。ＧＬＰ-１(７-３７)の誘導体の例は、Ｎε２６-((４Ｓ)-４-(ヘキサデカノイルアミノ)-カルボキシ-ブタノイル)[Ａｒｇ３４,Ｌｙｓ２６]ＧＬＰ-１-(７-３７)である。
【００１４】
ペプチドに関してここで使用される場合、「そのフラグメント」なる用語は、親ペプチドのアミノ酸の少なくとも２０％を有する、ペプチドの任意のフラグメントを意味する。よって、ヒト血清アルブミンにおいて、ヒト血清アルブミンが５８５のアミノ酸を有しているならば、フラグメントは少なくとも１１７のアミノ酸を有する。一実施態様において、フラグメントは親ペプチドのアミノ酸の少なくとも３５％を有する。他の実施態様において、フラグメントは親ペプチドのアミノ酸の少なくとも５０％を有する。他の実施態様において、フラグメントは親ペプチドのアミノ酸の少なくとも７５％を有する。
【００１５】
ペプチドに関してここで使用される場合、「変異体」なる用語は、親ペプチドのアナログ、親ペプチドの誘導体、又は親ペプチドのアナログの誘導体である、修飾されたペプチドを意味する。
ここで使用される場合「ＧＬＰ-１ペプチド」なる用語は、ＧＬＰ-１(７-３７)、ＧＬＰ-１(７-３７)のアナログ、ＧＬＰ-１(７-３７)の誘導体、又はＧＬＰ-１(７-３７)アナログの誘導体を意味する。
ここで使用される場合「ＧＬＰ-２ペプチド」なる用語は、ＧＬＰ-２(１-３３)、ＧＬＰ-２のアナログ、ＧＬＰ-２(１-３３)の誘導体、又はＧＬＰ-２(１-３３)アナログの誘導体を意味する。
ここで使用される場合「エキセンディン-４ペプチド」なる用語は、エキセンディン-４(１-３９)、エキセンディン-４アナログ、エキセンディン-４誘導体、又はエキセンディン-４アナログの誘導体を意味する。
【００１６】
ここで使用される場合、「血漿安定した」グルカゴン様ペプチドなる用語、例えばＧＬＰ-１、ＧＬＰ-２、グルカゴン、エキセンディン-３又はエキセンディン-４は、化学的に修飾されたグルカゴン様ペプチド、すなわち、以下の方法により測定されるように、ヒトにおいて少なくとも１０時間のインビボ血漿排出半減期を示す、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-２、グルカゴン、エキセンディン-３又はエキセンディン-４等のアナログ又は誘導体を意味する。ヒトにおけるグルカゴン様ペプチドの血漿排出半減期を測定する方法は次の通りである：本化合物を、等張バッファー、ｐＨ７．４、ＰＢＳ、又は任意の他の適切なバッファーに溶解させる。所定量を、末梢的に好ましくは腹腔又は上部大腿に注射する。活性化合物を測定するための血液サンプルを、頻繁な間隔、かつ、末端の排出部位を覆うのに十分な持続時間(例えば、投与前、投与後１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４(２日)、３６(２日)、４８(３日)、６０(３日)、７２(４日)及び８４(４日)時間)で取り出す。活性化合物の濃度の測定は、Wilkenら, Diabetologia 43(51):A143, 2000に記載されたようにして実施される。得られた薬物動態パラメータを、商業的に入手可能なソフトウェアWinNonlin Version 2.1 (Pharsight, Cary, NC, USA)を用いる、非コンパートメントモデルの使用により、個々の被験者に対する濃度-時間のデータから算出する。末端排出速度定数を、濃度-時間曲線の末端の対数線形部分における回帰から算出し、排出半減期を算出するのに使用する。
【００１７】
ここで使用される場合「インスリン分泌性剤」なる用語は、ヒトＧＬＰ-１レセプターのアゴニストである化合物、すなわち、ヒトＧＬＰ-１レセプターを含有する適切な媒体(このような媒体の一つは以下に開示される)において、ｃＡＭＰの形成を刺激する化合物を意味する。インスリン分泌性剤の効力は、以下に記載されるように、用量反応曲線から、ＥＣ５０値を算出することにより決定される。
【００１８】
クローンされたヒトＧＬＰ-１レセプターを発現するベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)細胞(ＢＨＫ-４６７-１２Ａ)を、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５％のウシ胎仔血清及び０．５ｍｇ／ｍＬのジェネテシンＧ-４１８(Life Technologies)が添加されたＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞を、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、ヴェルセンを用いて収集した。バッファー１(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ-Ｎａ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４)において、ウルトラトゥラックス(Ultraturrax)を用いてホモジナイズすることにより、細胞から細胞膜を調製した。ホモジネートを、４℃で１５分、４８０００ｘｇの遠心分離にかけた。バッファー２(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ-Ｎａ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４)においてホモジナイズすることにより、ペレットを懸濁させ、ついで、４℃で１５分、４８０００ｘｇの遠心分離にかけた。洗浄手順を１回以上繰り返した。最終ペレットをバッファー２に懸濁させ、直ちにアッセイに使用するか、又は−８０℃で保管した。
【００１９】
機能的レセプターアッセイを、インスリン分泌性剤による刺激に対する反応として、環状ＡＭＰ(ｃＡＭＰ)を測定することにより実施した。形成したｃＡＭＰを、アルファスクリーン(AlphaScreen)ＴＭｃＡＭＰキット(Perkin Elmer Life Sciences)により定量した。次の添加物：１ｍＭのＡＴＰ、１μＭのＧＴＰ、０．５ｍＭの３-イソブチル-１-メチルキサンチン(ＩＢＭＸ)、０．０１％のトゥイーン(Tween)-２０、０．１％のＢＳＡ、６μｇの膜調製物、１５μｇ／ｍＬのアセプタービーズ、２０μｇ／ｍＬのドナービーズで、６ｎＭのビオチニル-ｃＡＭＰとプレインキュベートされたものと共に、全用量５０μＬのバッファー３(５０ｍＭのトリス-ＨＣＩ、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４)内の、半領域の９６-ウェルマイクロタイタープレートにおいてインキュベートを実施した。アゴニスト活性についてテストされた化合物を、バッファー３に溶解し、希釈した。各実験について、ＧＴＰを新たに調製した。室温で３時間、ゆっくりと攪拌しつつ、暗所でプレートをインキュベートし、続いてフュージョン(Fusion)ＴＭ機器(Perkin Elmer Life Sciences)において計測した。個々の化合物について、濃度-反応曲線をプロットし、プリズム(Prism)バージョン４．０(GraphPad, Carlsbad, CA)を用いた、４つのパラメーターのロジスティックモデルを使用し、ＥＣ５０値を算出した。
【００２０】
ここで使用される場合、「ＤＰＰ-ＩＶ保護されたグルカゴン様ペプチド」なる用語は、血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ−４(ＤＰＰ-ＩＶ)に対して耐性のある前記グルカゴン様ペプチドとするために、天然ペプチドに対して、化学的に修飾されたグルカゴン様ペプチドを意味する。
【００２１】
ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解アッセイにより測定される：
ペプチドのアリコート(５ｎｍｏｌ)を、５ｍＵの酵素活性に相当する１μＬの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に、１０-１８０分、１００μＬの０．１Ｍトリエチルアミン-ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４において、３７℃でインキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸を５μＬ添加することにより、酵素反応を終了させ、ペプチド分解生成物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：
混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア(widepore)(３０ｎｍの孔、５μｍの粒子)２５０ｘ４．６ｍｍのカラムに適用し、Siegelら,  Regul. Pept. 1999；79；93-102及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993；214：829-35に従い、０．１％のトリフルオロ酢酸に直線段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０-２４％のアセトニトリル、１分間は２４-４８％のアセトニトリル)を、１ｍｌ／分の流量で溶出させる。ペプチドとその分解生成物は、２２０ｎｍ(ペプチド結合)又は２８０ｎｍ(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし、標準体に対するそれらのピーク領域を積分することにより定量してよい。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるペプチドの加水分解速度は、１０％未満のペプチドが加水分解されるインキュベート時間で概算される。
【００２２】
ここで使用される場合「免疫調節されたエキセンディン-４化合物」なる用語は、エキセンディン-４(１-３９)と比較して、ヒトにおいて低減した免疫応答性を有するエキセンディン-４(１-３９)のアナログ又は誘導体である、エキセンディン-４ペプチドを意味する。免疫応答を評価する方法は、患者の処置の４週間後に、エキセンディン-４化合物に反応する抗体の濃度を測定することである。
【００２３】
ここで使用される場合「インスリンペプチド」なる用語は、ヒトインスリン、ヒトインスリンアナログ又は化学的に修飾されたヒトインスリン、すなわちヒトインスリンの誘導体又はヒトインスリンアナログのいずれかであるペプチドを意味する。
【００２４】
ここで使用される場合、「ヒトインスリン」なる用語は、その構造及び特性がよく知られているヒトホルモンを意味する。ヒトインスリンは、システイン残基の間のジスルフィド架橋により結合した２つのポリペプチド鎖、すなわちＡ鎖及びＢ鎖を有する。Ａ鎖は２１のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は３０のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は３つのジスルフィド架橋で結合しており：第１はＡ鎖の６及び１１位にあるシステインの間、第２はＡ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、第３はＡ
鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインの間にある。
【００２５】
ここで使用される場合、「ポリペプチド生成物」なる用語は、製薬用組成物の製造に使用される精製されたペプチド生成物を意味する。よって、ポリペプチド生成物は、通常は、最終的な精製、乾燥又はコンディショニング工程から、生成物として得られる。生成物は、結晶、沈殿物、溶液又は懸濁液であってよい。また、ポリペプチド生成物は製剤原料、すなわち製薬用の活性成分として、当該技術で公知である。
【００２６】
ここで使用される場合、「等電点」なる用語は、ポリペプチド等の高分子の全体的な正味荷電が０であるｐＨ値を意味する。ポリペプチドには多くの荷電基が存在してよく、等電点においては、これら全ての荷電の合計が０になる。等電点を超えたｐＨでは、ポリペプチドの全体的な正味荷電は負であるのに対し、等電点以下のｐＨ値では、ポリペプチドの全体的な正味荷電は正となるであろう。
【００２７】
ここで使用される場合「製薬的に許容可能な」なる用語は、通常の製薬用途に適していること、すなわち患者に有害事象を引き起こさないことを意味している。
ここで使用される場合「賦形剤」なる用語は、製薬用組成物に通常添加される化学化合物、例えばバッファー、等張剤、防腐剤等を意味する。
ここで使用される場合「有効量」なる用語は、処置しない場合と比較して、患者を処置するのに十分有効な投与量を意味する。
【００２８】
ここで使用される場合「製薬用組成物」なる用語は、製薬用賦形剤、例えばバッファー、防腐剤、場合によっては浸透圧調節剤及び／又は安定剤と共に、活性化合物又はその塩を含有する生成物を意味する。よって、製薬用組成物は、製薬用処方物としても、当該技術で公知である。
ここで使用される場合「病気の処置」なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。処置の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。処置には、病気、病状又は疾患の除去又は制御、並びに病気、病状又は疾患に関連する症候群又は合併症を緩和するために、活性化合物を投与することを含む。
【００２９】
固相ペプチド合成が当業者によく知られていることは理解されているであろう。さらに、カップリング、後続するペプチドからの保護基の脱保護工程も、当業者にはよく知られている。
一実施態様において、固相ペプチド合成では、アミノ末端保護基としてのＦｍｏｃの使用を含む。さらなる実施態様において、本発明の精製方法は、粗ペプチド抽出物からジベンゾフルベンを除去する方法を含む。
一実施態様において、固相ペプチド合成生成物の脱保護工程は、塩基の使用を含む。さらなる実施態様において、塩基は第２級アミン及び／又は水素化分解可能な試薬から選択される。さらなる実施態様において、塩基は、ピペリジン、ジエチルアミン及びピペラジンから選択される。
【００３０】
一実施態様において、固相ペプチド合成生成物の脱保護工程は、溶媒、例えばＮ-メチルピロリドン(ＮＭＰ)、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)及びジクロロメタン(ＤＣＭ)において実施される。
一実施態様において、脱保護工程後に得られる粗ペプチド抽出物の精製は、固体支持体に粗ペプチド抽出物を適用し、そこから精製された生成物を溶出させることを含む。
【００３１】
一実施態様において、固体支持体はイオン交換クロマトグラフィーカラムを含む。さらなる実施態様において、固体支持体はアニオン性樹脂又はカチオン性樹脂を含む。らなる実施態様において、固体状樹脂は、ソース(Source)３０Ｑ、ポロス(Poros)５０ＨＱ、ＱセファロースＨＰ、Ｑセラミック・ハイパー(Hyper)Ｄ Ｆからなる群から選択される樹脂を含む。さらなる実施態様において、固体支持体はアニオン性樹脂(例えば、ソース３０Ｑ等の第４級アンモニウム樹脂)を含む。
【００３２】
本発明の一実施態様において、固体支持体がイオン交換クロマトグラフィーカラムを含む場合、本発明の精製工程は、次の：
(ａ)標準的なクロマトグラフィー条件下、固相合成から得られた粗ペプチド抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し；
(ｂ)アルコールを用いて溶出工程を実施し；及び
(ｃ)一又は複数のバッファーを用いてクロマトグラフ分離を実施する；
工程を含む。
【００３３】
一実施態様において、工程(ｂ)のアルコールはＣ１−５アルコール、すなわち１〜５の炭素原子を有するアルコールである。他の実施態様において、アルコールはＣ１−３アルコールである。一実施態様において、アルコールは：メタノール、エタノール、１-プロパノール(プロパノール)、２-プロパノール(イソプロピルアルコール)、２-メチル-１-プロパノール(イソブチルアルコール)、２-メチル-２-プロパノール(tert-ブチルアルコール)、１-ブタノール(ブタノール)、２-ブタノール、２-メチル-１-ブタノール、３-メチル-１-ブタノール、２-メチル-２-ブタノール、３-メチル-２-ブタノール、１-ペンタノール(ペンタノール)、２-ペンタノール及び３-ペンタノールからなる群から選択される非分枝状又は分枝状アルコールである。さらなる実施態様において、アルコールはエタノール及びプロパノールからなる群から選択される。一実施態様において、工程(ｂ)のアルコールは：７０％エタノール、８０％エタノール、９０％エタノール(水中にて)及び１００％エタノールからなる群から選択される。一実施態様において、工程(ｂ)のアルコールは１００％エタノールである。
【００３４】
本発明のこの実施態様では、溶出工程(工程(ｂ))にて、イオン交換カラムから不純物が効率よく除去されるという利点が提供される。例えば、ペプチド合成中、ＦｍｏｃがＮ末端保護基として使用される場合、驚くべきことに、この工程ではジベンゾフルベンが選択的に溶出されるということが見出された。その後、クロマトグラフ分離工程(工程(ｃ))にて、ここに示したような任意の残留不純物(例えば、ジベンゾフルベン)の不在下、精製されたペプチドが分離される。
【００３５】
工程(ｃ)で使用され得るバッファーの例には、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、ＴＡＰＳ(３-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、ビシン(Bicine)(Ｎ,Ｎ-ビス(２-ヒドロキシエチル)グリシン)、トリシン(Tricine)(Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)、ＨＥＰＥＳ(４-２-ヒドロキシエチル-１-ピペラジンエタンスルホン酸)、ＴＥＳ(２-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)、ＭＯＰＳ(３-(Ｎ-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、ＰＩＰＥＳ(ピペラジン-Ｎ,Ｎ'-ビス(２-エタンスルホン酸))、カコジル酸(ジメチルアルシン酸)、ＭＥＳ(２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸)又はアセテートが含まれる。一実施態様において、工程(ｃ)で使用されるバッファーにはトリスバッファー(例えば、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのトリスでｐＨ８．０に緩衝)が含まれる。
【００３６】
工程(ｃ)において、バッファーは、場合によっては、一又は複数の溶媒(例えばエタノール、特に５０％(ｗ／ｗ)エタノール)の存在下で使用されてよいことは理解されている。また、分離工程(ｃ)の条件は、典型的には、当業者に公知のものであると理解される。例えば、第１のバッファーを用いて平衡にした後、第１のバッファーから第２のバッファー(一又は複数の塩(例えば塩化ナトリウム、特に０．０６２５ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウム)が存在する以外は、第１のバッファーと典型的には同じ)への直線的勾配を適用して溶出させる。
【００３７】
一実施態様において、固体支持体は、熱可塑性ポリマー、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン又は類似の物質を含有するフィルター支持体、粒子、ペレット、容器等の包装材を含む。他の実施態様において、固体支持体は、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリスチレンを含有するフィルター支持体、粒子、ペレット、容器等の包装材を含む。さらなる他の実施態様において、固体支持体は、ポリエチレンを含有するフィルター支持体、粒子、ペレット、容器等の包装材を含む。
ここで使用される場合「容器」なる用語は、精製の前後で、精製されたペプチドを収容するのに使用される任意の手段を意味する。
【００３８】
本発明の実施態様において、固体支持体が熱可塑性ポリマーを含有する包装材を含む場合、本発明の精製工程は、次の：
(ａ)包装材に、固相合成で得られた粗ペプチド抽出物を添加し；
(ｂ)包装材において抽出物をインキュベートし；
(ｃ)包装材から抽出物を除去し；及び
(ｄ)抽出物を標準的なペプチド分離にかける；
工程を含む。
【００３９】
ここで使用される場合、「標準的なペプチド分離」なる用語は、不純物からペプチドを分離するのに適した、当該技術で公知の任意の分離方法、例えばクロマトグラフ分離(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又は逆相ＨＰペプチドＬＣ(高速液体クロマトグラフィー))、限外濾過(ＵＦ)、等電沈殿、又は任意の他の適切な分離方法を意味する。
一実施態様において、工程(ｄ)における標準的なペプチド分離は、イオン交換クロマトグラフィー、例えばアニオン交換クロマトグラフィーである。
【００４０】
「ポリエチレン」、「ポリプロピレン」等に対する参照には、エチレン(ＩＵＰＡＣ名、エテン)、プロピレン(ＩＵＰＡＣ名、プロテン)等の複数(すなわち１以上)のモノマー単位からなるポリマーに対する参照が含まれる。例として、ポリエチレンの一般構造を、式(Ｉ)の化合物として、以下に示し、ここでｎは整数である：
2011520844.tif 000002
【００４１】
ポリエチレンは、高密度ポリエチレン(ＨＤＰＥ)又は低密度ポリエチレン(ＬＤＰＥ)の形態であってよい。一実施態様において、ポリエチレンは高密度ポリエチレン(ＨＤＰＥ)である。ＨＤＰＥは分枝度が低く、よって分子間力及び引っ張り強さがより強力であり、０．９４１ｇ／ｃｍ３以上の密度であると定義される。ＬＤＰＥは０．９１０-０．９４０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度で定められる。
ポリプロピレンは、高密度ポリプロピレン(ＨＤＰＰ)又は低密度ポリプロピレン(ＬＤＰＰ)の形態であってよい。一実施態様において、ポリプロピレンは高密度ポリプロピレン(ＨＤＰＰ)である。
【００４２】
本発明のこの実施態様では、定められた包装材に粗ペプチド抽出物を添加することで、包装材の表面に不純物が付着するという利点が提供される。よって、本方法では、粗ペプチド抽出物から不純物が効率よく除去される。例えば、ペプチド合成中、ＦｍｏｃがＮ末端保護基として使用される場合、驚くべきことに、この工程ではジベンゾフルベンが、ここに示されるようなポリエチレン包装材の表面に、選択的に付着することが見出された。
【００４３】
一実施態様において、インキュベート工程(ｂ)は、典型的には２分〜１０時間の持続時間、周囲温度(例えば、室温)でインキュベートすることを含む。他の実施態様において、持続時間は２分〜２時間である。またさらなる実施態様において、持続時間は２分〜３０分である。
一実施態様において、工程(ｂ)は抽出物の撹拌をさらに含んでよい。
【００４４】
一実施態様において、工程(ｄ)は、典型的には、バッチ吸収、包装されたカラム又はフィルターを含んでよい公知の手順に従い、クロマトグラフ分離を含む。
一実施態様において、工程(ｄ)はクロマトグラフ分離を含み、ここでは、包装されたカラム又はフィルターが使用され、滞留時間は少なくとも０．１分である。他の実施態様において、滞留時間は少なくとも１分である。さらなる他の実施態様において、滞留時間は０．１分〜６０分である。またさらなる他の実施態様において、滞留時間は１分〜１０分である。
ここで使用される場合、「滞留時間」なる用語は、ペプチドが包装材と接触する平均時間、すなわちペプチドが、どのくらいの速さで包装材を移動するかと理解される。
【００４５】
本発明の一実施態様において、ポリペプチドはグルカゴン様ペプチドである。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはＤＰＰ-ＩＶ保護されたグルカゴン様ペプチドである。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは血漿安定したグルカゴン様ペプチドである。
【００４６】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはリジン残基、例えば１つのリジン残基を有しており、ここで場合によっては、脂質親和性置換基は、スペーサーを介して、該リジン残基のイプシロンアミノ基に結合している。
一実施態様において、脂質親和性置換基はアシル基を含む。アシル基は式Ｒ(Ｃ=Ｏ)-を有する。
本発明の一実施態様において、脂質親和性置換基は８〜４０の炭素原子、好ましくは８〜２４の炭素原子、例えば１２〜１８の炭素原子を有する。
【００４７】
一実施態様において、本発明は脂質親和性置換基を有するグルカゴン様ペプチドの誘導体を提供し、ここで脂質親和性置換基は、直鎖状又は分枝状のアルカンα,ω-ジカルボン酸を含む。
一実施態様において、本発明は上述した実施態様のグルカゴン様ペプチドを提供し、ここで脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-及びＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択される部分であるか又は含み；ここでＲはシクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルからなる群から選択されるシクロアルキルであり、４≦ｎ≦３８及び０≦ｍ≦４である。
一実施態様において、１２≦ｎ≦３６である。一実施態様において、１２≦ｍ≦２０である。
【００４８】
一実施態様において、脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択され；ここでＲはシクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルからなる群から選択されるシクロアルキルであり、４≦ｎ≦３８及び１≦ｍ≦４である。
一実施態様において、脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択され；ここでＲはシクロヘキシルであり、１２≦ｎ≦２０及び１≦ｍ≦２である。
【００４９】
一又は複数の脂質親和性置換基は、直接又は適切なスペーサーを介して、活性成分に結合していてもよい。一実施態様において、脂質親和性成分は適切なスペーサーを介して結合している。
一実施態様において、スペーサーが存在しており、少なくとも１のアミノ酸残基を含有する。
本発明の一実施態様において、スペーサーが存在しており、アミノ酸、例えばベータ-Ａｌａ、Ｌ-Ｇｌｕ又はアミノブチロイルから選択される。
一実施態様において、スペーサーが存在しており、γ-又はα-グルタミルリンカー、β-又はα-アスパルチルリンカー、α-アミノ-γ-グルタミルリンカー、又はα-アミド-β-アスパルチルリンカー、又はその組合せからなる群から選択される。
【００５０】
一実施態様において、スペーサーは一般式Ｉ
2011520844.tif 000003
[上式中、
ｎは０-４であり；
ｍは１-２であり；
Ｒ１は活性成分への結合部位を指定し；
Ｒ２はＣＯＲ３又はＨであり；及び
Ｒ３は、ＯＨ、ＮＨ２又はＣ１−１２アルキル、及びベンジルである]
のものである。
【００５１】
一実施態様において、スペーサーは一般式ＩＩ
2011520844.tif 000004
[上式中、
ｎは０-８であり；
Ｒ１はＣＯＯＲ３であり；
Ｒ２は活性成分への結合部位を指定し；及び
Ｒ３は、水素、Ｃ１−１２アルキル及びベンジルから選択される]
のものである。
【００５２】
本発明の一実施態様において、ポリペプチドは、グルカゴン、グルカゴンアナログ、グルカゴンの誘導体、又はグルカゴンアナログの誘導体である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１の誘導体又はＧＬＰ-１アナログの誘導体である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、２２〜４０のアミノ酸残基、好ましくは２６〜３６のアミノ酸残基、より好ましくは２９〜３３のアミノ酸残基を有するＧＬＰ-１ペプチドである。
【００５３】
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-１ペプチドはＧＬＰ-１アナログである。
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-１アナログはＡｒｇ３４-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、ＶａＩ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１(７-３６)-アミド、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１９Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｌｅｕ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１８Ｇｉｕ２２-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｈｉｓ３７-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２ｌｌｅ３３-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｉｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ａｉｂ８Ａｒｇ３４-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ３４-ＧＬＰ-１(７-３７)、[３-(４-イミダゾリル)プロピオニル]７Ａｒｇ３４ＧＬＰ-１-(７-３７)、Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ａｉｂ８Ａｒｇ３４Ｐｒｏ３７-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ａｉｂ８，２２，２７，３０，３５Ａｒｇ３４Ｐｒｏ３７-ＧＬＰ-１(７-３７)アミド、デスアミノＨｉｓ７Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３７-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)アミド、デスアミノＨｉｓ７Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ａｒｇ３４Ｐｈｅ(ｍ-ＣＦ３)２８-ＧＬＰ-１-(７-３７)アミド、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３０-ＧＬＰ-１-(７-３７)、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３１-ＧＬＰ-１-(７-３７)、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３１Ａｒｇ３４-ＧＬＰ-１-(７-３７)、デスアミノＨｉｓ７Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｇｌｕ３０Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)、Ａｉｂ８Ｌｙｓ２０Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｇｌｕ３０Ｐｒｏ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)アミド、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｇｌｕ３０Ｐｒｏ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)、デスアミノＨｉｓ７Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｇｌｕ３０Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)アミド、デスアミノＨｉｓ７Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３７-ＧＬＰ-１-(７-３７)アミド、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｇｌｕ３０Ｌｙｓ３６-ＧＬＰ-１-(７-３７)Ｇｌｕ-アミド、Ａｉｂ８Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３１ＧＬＰ-１-(７-３７)、そのアナログ、及びこれらの任意のものの誘導体からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、リジン残基を有するＧＬＰ-１の誘導体、又はＧＬＰ-１アナログの誘導体であり、ここで脂質親和性置換基は、スペーサーを介して、該リジン残基のイプシロンアミノ基に結合している。
【００５５】
一実施態様において、ＧＬＰ-１アナログ又は誘導体は、ＧＬＰ-１(７-３７)ペプチド又はそのアナログの７及び８位にある少なくとも１のアミノ酸残基で修飾されており、該ＧＬＰ-１アナログの２６位にあるリジン残基において、スぺーサーを介してイプシロンアミノ基に結合している脂質親和性置換基を有する。
本発明の一実施態様において、脂質親和性置換基は８〜４０の炭素原子、好ましくは８〜２４の炭素原子、例えば１２〜１８の炭素原子を有する。
【００５６】
実施態様において、本発明は脂質親和性置換基を有するＧＬＰ-１ペプチドの誘導体を提供し、ここで脂質親和性置換基は、直鎖状又は分枝状のアルカンα,ω-ジカルボン酸を含む。
一実施態様において、本発明は、脂質親和性置換基を有する上述した実施態様のＧＬＰ-１ペプチドを提供し、ここで脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-及びＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択される部分であるか又は含み；ここでＲはシクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルからなる群から選択されるシクロアルキルであり、４≦ｎ≦３８及び０≦ｍ≦４である。
一実施態様において、１２≦ｎ≦３６である。一実施態様において、１２≦ｍ≦２０である。
【００５７】
一実施態様において、脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択され；ここでＲはシクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルからなる群から選択されるシクロアルキルであり、４≦ｎ≦３８及び１≦ｍ≦４である。
一実施態様において、脂質親和性置換基は、ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)ｍ-Ｒ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-からなる群から選択され；ここでＲはシクロヘキシルであり、１２≦ｎ≦２０及び１≦ｍ≦２である。
【００５８】
一又は複数の脂質親和性置換基は、直接又は適切なスペーサーを介して、活性成分に結合していてもよい。一実施態様において、脂質親和性成分は適切なスペーサーを介して結合している。
一実施態様において、スペーサーが存在しており、少なくとも１のアミノ酸残基を含有する。
本発明の一実施態様において、スペーサーが存在しており、アミノ酸、例えばベータ-Ａｌａ、Ｌ-Ｇｌｕ又はアミノブチロイルから選択される。
一実施態様において、スペーサーが存在しており、γ-又はα-グルタミルリンカー、β-又はα-アスパルチルリンカー、α-アミノ-γ-グルタミルリンカー、又はα-アミド-β-アスパルチルリンカー、又はその組合せからなる群から選択される。
【００５９】
一実施態様において、スペーサーは一般式Ｉ
2011520844.tif 000005
[上式中、
ｎは０-４であり；
ｍは１-２であり；
Ｒ１は活性成分への結合部位を指定し；
Ｒ２はＣＯＲ３又はＨであり；及び
Ｒ３は、ＯＨ、ＮＨ２又はＣ１−１２アルキル、及びベンジルである]
のものである。
【００６０】
一実施態様において、スペーサーは一般式ＩＩ
2011520844.tif 000006
[上式中、
ｎは０-８であり；
Ｒ１はＣＯＯＲ３であり；
Ｒ２は活性成分への結合部位を指定し；及び
Ｒ３は、水素、Ｃ１−１２アルキル及びベンジルから選択される]
のものである。
【００６１】
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-１ペプチドはＤＰＰ-ＩＶ保護されたＧＬＰ-１ペプチドである。
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-１ペプチドは血漿安定したＧＬＰ-１ペプチドである。
【００６２】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは：Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６(Ｎε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎα−ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-１(７-３７)、Ｎ-ε２６-(１７-カルボキシヘプタデカノイル)-[Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)-ペプチド、Ｎ-ε２６-(１９-カルボキシノナデカノイル)-[Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)-ペプチド、Ｎ-ε２６-(４-{[Ｎ-(２-カルボキシエチル)-Ｎ-(１５-カルボキシペンタデカノイル)アミノ]メチル}ベンゾイル)[Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)、Ｎ-ε２６-[２-(２-[２-(２-[２-(２-[４-(１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-４(Ｓ)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)ペプチド、
Ｎ-ε３７-{２-[２-(２-{２-[２-((Ｒ)-３-カルボキシ-３-{[１-(１９-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-４-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノＨｉｓ７,Ｇｌｕ２２,Ａｒｇ２６,Ａｒｇ３４,Ｌｙｓ３７]ＧＬＰ-１(７-３７)アミド；
Ｎ-ε２０-{２-[２-(２-{２-[２-((Ｒ)-３-カルボキシ-３-{[１-(１９-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-４-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Ａｉｂ２,Ｌｅｕ１４,Ｌｙｓ２０,Ｇｌｎ２８,Ｓｅｒ(Ｏ-ベンジル)３９]エキセンディン-４(１-３９)アミド；
Ｎ-ε２６{２-[２-(２-{２-[２-((Ｒ)-３-カルボキシ-３-{[１-(１９-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-４-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノＨｉｓ７,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)；
Ｎ-ε２６-[(Ｓ)-４-カルボキシ-４-({トランス-４-[(１９-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)；
Ｎ-ε２６-{４-[(Ｓ)-４-カルボキシ-４-({トランス-４-[(１９-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ブチリル}[Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)；Ｎ-ε３７-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[(Ｓ)-４-カルボキシ-４-({トランス-４-[(１９-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノＨｉｓ７,Ｇｌｕ２２,Ａｒｇ２６,Ａｒｇ３４,Ｌｙｓ３７]ＧＬＰ-１-(７-３７)及び
[Ａｉｂ８,Ｇｌｕ２２,Ａｒｇ２６,Ｇｌｕ３０,Ｐｒｏ３７]ＧＬＰ-１-((７-３７)Ｌｙｓ(２-(２-(３-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-[４-(Ｓ)-カルボキシ-４-(４-(Ｓ)-カルボキシ-４-(４-{４-[１６-(テトラゾール-５-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ}ブタノイルアミノ)ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)ペプチド；
からなる群から選択される、ＧＬＰ-１アナログの誘導体である。
【００６３】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ-２、ＧＬＰ-２アナログ、ＧＬＰ-２の誘導体、又はＧＬＰ-２アナログの誘導体である。
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-２の誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体はリジン残基、例えば１つのリジン残基を有しており、ここで場合によっては、脂質親和性置換基は、スペーサーを介して、該リジン残基のイプシロンアミノ基に結合している。
本発明の一実施態様において、脂質親和性置換基は８〜４０の炭素原子、好ましくは８〜２４の炭素原子、例えば１２〜１８の炭素原子を有する。
本発明の一実施態様において、スペーサーが存在しており、アミノ酸、例えばベータ-Ａｌａ、Ｌ-Ｇｌｕ又はアミノブチロイルから選択される。
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-２ペプチドは２７〜３９のアミノ酸残基、好ましくは２９〜３７のアミノ酸残基、さらに好ましくは３１〜３５のアミノ酸残基を有する。
【００６４】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、Ｌｙｓ１７Ａｒｇ３０-ＧＬＰ-２(１-３３)又はＡｒｇ３０Ｌｙｓ１７(Ｎε-(β-Ａｌａ(Ｎα-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-２(１-３３)である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはＧｌｙ２-ＧＬＰ-２(１-３３)である。
【００６５】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、エキセンディン-４、エキセンディン-４アナログ、エキセンディン-４の誘導体、又はエキセンディン-４アナログの誘導体である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはエキセンディン-４である。
本発明の一実施態様において、エキセンディン-４の誘導体又はエキセンディン-４アナログの誘導体は、アシル化ペプチド又はペグ化ペプチドである。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは安定したエキセンディン-４化合物である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはＤＰＰ-ＩＶ保護されたエキセンディン-４化合物である。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは免疫調節されたエキセンディン-４化合物である。
【００６６】
本発明の一実施態様において、エキセンディン-４の誘導体又はエキセンディン-４アナログの誘導体はリジン残基、例えば１つのリジン残基を有しており、ここで場合によっては、脂質親和性置換基は、スペーサーを介して、該リジン残基のイプシロンアミノ基に結合している。
本発明の一実施態様において、脂質親和性置換基は８〜４０の炭素原子、好ましくは８〜２４の炭素原子、例えば１２〜１８の炭素原子を有する。
本発明の一実施態様において、スペーサーが存在しており、アミノ酸、例えばベータ-Ａｌａ、Ｌ-Ｇｌｕ又はアミノブチロイルから選択される。
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、３０〜４８のアミノ酸残基、３３〜４５のアミノ酸残基、好ましくは３５〜４３のアミノ酸残基、さらに好ましくは３７〜４１のアミノ酸残基を有するエキセンディン-４ペプチドである。
【００６７】
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-２ペプチドは：
Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｓ５Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｓ７Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ８Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｅ９Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｍ１０Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ１１Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｔ１２Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｉ１３Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｌ１４ＫＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ１５Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ１６Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｌ１７Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ａ１８Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ２１Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ２４Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｑ２８Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｓ５Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｓ７Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ８Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｅ９Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｍ１０Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ１１Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｔ１２Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｉ１３Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｌ１４Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ１５Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ１６Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｌ１７Ｋ／Ｋ３０ＲＧＬＰ-２(１-３３)；Ａ１８Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ２１Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｎ２４Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｑ２８Ｋ／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｋ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｓ５Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｓ７Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｄ８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｅ９Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｍ１０Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｎ１１Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｔ１２Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／ｌ１３Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｌ１４Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｄ１５Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｎ１６Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ａ１８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｄ２１Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｎ２４Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；Ｄ３Ｅ／Ｑ２８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；及びその誘導体からなるリストから選択される。
【００６８】
本発明の一実施態様において、ＧＬＰ-２誘導体は
Ｓ５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｓ７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｅ９Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｍ１０Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ１１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｔ１２Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｉ１３Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ１５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ１６Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(デカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)４-カルボキシ-４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２１(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ〜−カルボキシ４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌｌ７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ヘプタデカノイルアミノ(amir1o))ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ａ１８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ２１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ２４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｑ２８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｓ５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｓ７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｅ９Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｍ１０Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ１１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｔ１２Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｉ１３Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ１５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ１６Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(デカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(３-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-カルボキシ-４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-カルボキシ４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-カルボキシ-４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３ＯＲ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｌ１７Ｋ(４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ａ１８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ２１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｎ２４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｑ２８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｓ５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｓ７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｄ８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｅ９Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｍ１０Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｎ１１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｔ１２Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｉ１３Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｄ１５Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｎ１６Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(デカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／ＬＩ７Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(３-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｅ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｅ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ((Ｓ)-４-カルボキシ-４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(デカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７  Ｋ(４-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ(４-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ａ１８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｄ２１Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
Ｄ３Ｅ／Ｎ２４Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；及び
Ｄ３Ｅ／Ｑ２８Ｋ(３-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ-ＧＬＰ-２(１-３３)；
からなる群から選択される。
【００６９】
ＧＬＰ-２、そのアナログ、並びにＧＬＰ-２誘導体を調製する方法は、WO 99/43361及にびWO 00/55119に見いだすことができる。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様において、グルカゴン様ペプチドは、エキセンディン-４(１-３９)のインスリン分泌性アナログ、例えばＳｅｒ２Ａｓｐ３-エキセンディン-４(１-３９)であり、２及び３位のアミノ酸残基は、それぞれセリン及びアスパラギン酸で置き換えられている(この特定のアナログは当該技術でエキセンディン-３としても公知)。
本発明のさらなる実施態様において、グルカゴン様ペプチドはエキセンディン-４誘導体であり、ここで、導入される置換基は、アミド類、炭水化物、アルキル基、エステル及び脂質親和性置換基から選択される。エキセンディン-４(１-３９)及びそのアナログのインスリン分泌性誘導体は、Ｔｙｒ３１-エキセンディン４(１-３１)-アミドである。
【００７１】
本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは安定したエキセンディン-４化合物である。本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドはＤＰＰ-ＩＶ保護されたエキセンディン-４化合物である。本発明の一実施態様において、グルカゴン様ペプチドは免疫調節されたエキセンディン-４化合物である。
エキセンディン-４、そのアナログ、並びにエキセンディン-４誘導体を調製する方法は、例えばWO 99/43708、WO 00/41546及びWO 00/55119に見いだすことができる。
【００７２】
本発明の精製されたグルカゴン様ペプチドを含有する製薬用組成物は、典型的には、種々の製薬用賦形剤、例えば防腐剤、等張剤及び界面活性剤を含有する。製薬用組成物の調製法は当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 1grn版, 1995が挙げられる。
本発明の精製されたグルカゴン様ペプチドを含有する製薬用組成物は、このような処置を必要とする患者に、非経口的に投与されてよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射で実施されてよい。また投与は、例えば注入ポンプを使用する、注入により実施されてもよい。
【００７３】
以下、本発明の実施態様の列挙である。
１．固体支持体と、固相ペプチド合成により調製されたペプチドの粗抽出物とを接触させる工程を含む、固相ペプチド合成により調製されたペプチドを精製する方法。
２．固相ペプチド合成が、アミノ末端保護基としてＦｍｏｃを使用することを含む、実施態様１の方法。
３．前記方法が粗ペプチド抽出物からジベンゾフルベンを除去する方法を含む、実施態様１又は２の方法。
【００７４】
４．固体支持体が熱可塑性ポリマーを含有する包装材を含む、実施態様１ないし３のいずれかの方法。
５．固体支持体が、容器、ペレット、粒子、及びフィルター支持体からなる群から選択される、実施態様４の方法。
６．熱可塑性ポリマーがポリエチレン又はポリプロピレンである、実施態様４又は５の方法。
７．熱可塑性ポリマーがポリエチレンである、実施態様６の方法。
【００７５】
８．次の：
(ａ)包装材に、固相合成で得られた粗ペプチド抽出物を添加し；
(ｂ)包装材において抽出物をインキュベートし；
(ｃ)包装材から抽出物を除去し；及び
(ｄ)抽出物を標準的なペプチド分離にかける；
工程を含む、実施態様４ないし７のいずれかの方法。
９．ポリエチレンが高密度ポリエチレン(ＨＤＰＥ)である、実施態様８の方法。
１０．インキュベート工程(ｂ)が、２分〜１０時間の持続時間、周囲温度でインキュベートすることを含む、実施態様８又は９の方法。
１１．インキュベート工程(ｂ)が、室温でインキュベートすることを含む、実施態様８ないし１０のいずれかの方法。
１２．工程(ｂ)が抽出物の撹拌をさらに含む、実施態様８ないし１１のいずれかの方法。
【００７６】
１３．工程(ｄ)における標準的なペプチド分離が、バッチ吸収、包装されたカラム又はフィルターを含むクロマトグラフ分離を含む、実施態様８ないし１２のいずれかの方法。
１４．工程(ｄ)における標準的なペプチド分離がクロマトグラフ分離を含み、ここで、包装されたカラム又はフィルターが使用され、滞留時間が少なくとも０．１分である、実施態様８ないし１３のいずれかの方法。
１５．工程(ｄ)における標準的なペプチド分離が、イオン交換クロマトグラフィーである、実施態様８ないし１４のいずれかの方法。
【００７７】
１６．固体支持体がイオン交換クロマトグラフィーカラムを含む、実施態様１ないし３のいずれかの方法。
１７．固体支持体がアニオン性樹脂を含む、実施態様１６の方法。
１８．アニオン性樹脂が第４級アンモニウム樹脂である、実施態様１７の方法。
【００７８】
１９．次の：
(ａ)標準的なクロマトグラフィー条件下、固相合成から得られた粗ペプチド抽出物、又は実施態様８の方法の工程(ａ)ないし(ｃ)から得られたペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し；
(ｂ)アルコールを用いて第１の溶出工程を実施し；及び
(ｃ)一又は複数のバッファーを用いて第２の溶出工程を実施する；
工程を含む、実施態様１６ないし１８のいずれかの方法。
【００７９】
２０．工程(ｃ)で使用され得るバッファーに、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、ＴＡＰＳ(３-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸)、ビシン(Ｎ,Ｎ-ビス(２-ヒドロキシエチル)グリシン)、トリシン(Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)、ＨＥＰＥＳ(４-２-ヒドロキシエチル-１-ピペラジンエタンスルホン酸)、ＴＥＳ(２-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)、ＭＯＰＳ(３-(Ｎ-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、ＰＩＰＥＳ(ピペラジン-Ｎ,Ｎ'-ビス(２-エタンスルホン酸))、カコジル酸(ジメチルアルシン酸)、ＭＥＳ(２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸)又はアセテートが含まれる、実施態様１９の方法。
２１．工程(ｃ)で使用されるバッファーがトリスバッファーである、実施態様２０の方法。
【００８０】
２２．工程(ｂ)で使用されるアルコールがＣ１−５アルコールである、実施態様１９ないし２１のいずれかの方法。
２３．工程(ｂ)で使用されるアルコールが：メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、２-メチル-１-プロパノール、２-メチル-２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール、２-メチル-１-ブタノール、３-メチル-１-ブタノール、２-メチル-２-ブタノール、３-メチル-２-ブタノール、１-ペンタノール、２-ペンタノール及び３-ペンタノールからなる群から選択される非分枝状又は分枝状アルコールである、実施態様１９ないし２２のいずれかの方法。
２４．工程(ｂ)で使用されるアルコールがエタノール又はプロパノールである、実施態様１９ないし２３のいずれかの方法。
２５．工程(ｂ)で使用されるアルコールが、７０％エタノール、８０％エタノール、９０％エタノール又は１００％エタノールからなる群から選択される、実施態様１９又は２４のいずれかの方法。
２６．工程(ｂ)で使用されるアルコールが１００％エタノールである、実施態様１９又は２５のいずれかの方法。
【００８１】
２７．ポリペプチドがグルカゴン様ペプチドである、上述した実施態様のいずれかの方法。
２８．ポリペプチドが、グルカゴン、グルカゴンアナログ、グルカゴンの誘導体、又はグルカゴンアナログの誘導体である、実施態様２７の方法。
２９．グルカゴン様ペプチドが、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１の誘導体又はＧＬＰ-１アナログの誘導体である、実施態様２７の方法。
【００８２】
３０．固相ペプチド合成キットであって、固相ペプチド合成用の試薬、実施態様１ないし２９のいずれかの固体支持体、及び実施態様１ないし２９のいずれかの方法に従い、該キットを使用するための使用説明書を含むキット。
３１．実施態様１ないし２９のいずれかの方法により得られたペプチド。
【００８３】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈すべきでない。
その全ての可能性のある変形例における、上述した要素の任意の組合せは、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、本発明に含まれる。
【００８４】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
ここで他に示されない限りは、ここでの値の範囲の記述は、単に、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に称する省略方法として提供することを意図しているものであって、ここで個々に列挙されているかのように、それぞれの別個の値が明細書に導入される。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
ここに記載されている全ての方法は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順番で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての実施例、又は例示的言語（例えば、「等」）の使用は、単に本発明をより例証することを意図しており、他に示されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明確に記載していない限りは、明細書中の如何なる語句も、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
【００８５】
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の処方物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる処方物を記載すると理解されるべきである)。
この発明は、適用される法律に容認される最大範囲まで、ここに提供される態様又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
【００８６】
本発明を以下の実施例によりさらに例証するが、何らの方法によっても、保護の範囲を限定することを意図したものではない。上述の記載及び以下の実施例に開示されている特徴は、双方とも別個に、またその任意の組合せにおいて、様々な形態で本発明を実践するための構成要素でありうる。
【実施例】
【００８７】
装置：
室温でＡＫＴＡエクスプローラー１００
バッファー：
バッファーＡ：５０％(ｗ／ｗ)のＥｔＯＨ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのトリス、ｐＨ８．０
バッファーＢ：５０％(ｗ／ｗ)のＥｔＯＨ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのトリス、
０．０６２５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
再生１：      １ＭのＮａＯＨ
再生２：      ２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ、ｐＨ３．０
エタノール：  １００％エタノール
樹脂：
ソース３０Ｑ
出発物質：
固相合成及びアシル化により生成された、Ｎ-イプシロン２６-[２-(２-[２-(２-[２-(２-[４-(１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-４(Ｓ)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-[７-３７]。
【００８８】
実施例１
コントロール精製手順
出発物質の調製
出発物質を１＋９にＨ２Ｏ(ＷＦＩ)を用いて希釈し、０．６／０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
出発物質の保管
出発物質を充填前にガラス容器に保管した。
方法：
カラム：ＨＲ１０／１０(３．５・１．０ｃｍ)２．８ｍＬ
流量：  １５ＣＶ／ｈ(０．７ｍＬ／分)
【００８９】
2011520844.tif 000007
【００９０】
標準的分離の結果を、図１のクロマトグラムに示し、ここで、クロマトグラムには２８０ｎｍでの吸光度、２５４ｎｍでの吸光度、理論的勾配及び伝導率を示す。図１の結果には、ＤＢＦピークが生成物の前に溶出するが、生成物下には「痕跡」があり、よって移動が困難であることが示されている。
【００９１】
実施例２
ＰＥ処理後のアニオン交換による精製(ＰＥ-容器からのＤＢＦの溶出を含む)
出発物質の調製
出発物質を実施例に記載したようにして調製した。
出発物質の保管
出発物質を、充填前にＨＤＰＥ(高密度ポリエチレン)容器(Emballatorから得られた「Mellerud容器」)に保管した。
【００９２】
方法：
本方法を実施例１に記載したように実施し、結果を図２に示し、ここで、クロマトグラムには２８０ｎｍでの吸光度、２５４ｎｍでの吸光度、理論的勾配及び伝導率を示す。図１の結果には、ＤＢＦピークが生成物の前に溶出するが、生成物下には「痕跡」があり、よって移動が困難であることが示されている。サンプルの保管条件を除けば、実施例１と同一の実験であるという事実に鑑み、充填前にＨＤＰＥ容器に出発物質を保管すると、ＤＢＦピークが存在しなくなることが明らかとなった。
ＤＢＦはＰＥに対して疎水的に結合しており、よって疎水性の液体でＤＢＦを除去可能であると推測されるため、出発物質を除去した後、Mellerud容器を１００％エタノールで洗浄した。洗浄溶液の吸光度測定で、ＤＢＦが容器に結合し、１００％エタノールにより、容器から脱着又は「溶出」可能であることが、明確に示された。
【００９３】
実施例３
充填後にエタノール洗浄を用いたアニオン交換精製
出発物質の調製
Ｈ２Ｏにおいて１０倍希釈(１０ｇの出発物質から１ｇの出発物質)し、ＮａＯＨを用いてｐＨ６〜ｐＨ８．０にｐＨ調整。ついで、出発物質を０．２２μｍのフィルターを使用して濾過した。
出発物質の保管
出発物質を充填前にガラス容器に保管した。
方法：
カラム：１５・１．０ｃｍ)１１．８ｍＬ
流量：  １５ＣＶ／ｈ(０．７ｍＬ／分)
【００９４】
2011520844.tif 000008
【００９５】
結果を図３に示し、ここで、クロマトグラムには２８０ｎｍでの吸光度、２５４ｎｍでの吸光度、理論的勾配及び伝導率を示す。結果には、ＤＢＦピークがエタノール洗浄中に溶出することが示されている。
【図１】
2011520844.tif 000009
【図２】
2011520844.tif 000010
【図３】
2011520844.tif 000011
【配列表】
2011520844000001.app
【国際調査報告】
2011520844.tif 000012
2011520844.tif 000013
2011520844.tif 000014
2011520844.tif 000015