(57)【要約】  本発明は、以下の位置：配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置；及び／又は配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置；及び／又は配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の少なくとも１つに点変異を有する、複製に有効な、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ５Ｂタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の位置：
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置；及び／又は
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置；及び／又は
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置
の少なくとも１つに点変異を有する、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ５Ｂタンパク質であって、
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基がイソロイシンである場合；又は
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基がイソロイシンであり、かつ、配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基がシステインである場合を除く、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項２】
以下の位置：
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置において、配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基がイソロイシンでない；及び／又は
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置；及び／又は
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置において、配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基がシステインでない、
の少なくとも１つに点変異を有することを特徴とする、請求項１に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項３】
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基が、バリン、ロイシン、イソロイシン、若しくはシステインでなく；及び／又は
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置の残基がプロリンでなく；及び／又は
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基が、アスパラギン、システイン、若しくはヒスチジンでない、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項４】
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基がアラニンであり；及び／又は
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置の残基がセリンであり；及び／又は
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基がアスパラギン酸塩若しくはアスパラギン酸である、
ことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項５】
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置におけるアラニン；及び
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置におけるセリン；及び
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置におけるアスパラギン酸、
を有することを特徴とする、請求項４に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項６】
配列番号３の配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項に規定の少なくとも１つの変異を含む、ＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質の断片。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質又は請求項７に記載のタンパク質の断片をコードする、核酸配列。
【請求項９】
配列番号５の配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の核酸配列。
【請求項１０】
ヒト起源であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質、又は請求項７に記載のタンパク質の断片、又は請求項８及び９のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、レプリコン。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクター又は請求項１２に記載のレプリコンを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
蚊、有利にはヤブカ属の蚊に由来する細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤブカ（Ａｅｄｅｓ）族の蚊で増幅するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ５Ｂタンパク質に存在する新規変異の同定に関する。
【０００２】
効果的な複製に関連する、その様な変異の同定は、特にレプリコンに有望である。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型で発症する肝炎に関与するものとして同定され、肝臓の肝硬変などの慢性の悪性病変又は幹細胞癌にまで発展することが多い。世界の人口の約３％がＨＣＶに感染しており、１年毎に３から４百万人の感染者が増加していると推定されている（Ｎｅｕｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００４】
ＨＣＶは、エンベロープを有する単鎖ＲＮＡウイルスであり、最も重要なもののみ述べると黄熱（ＹＦ）、デング熱（ＤＥＮ）及びデング出血熱（ＤＨＦ）、日本脳炎（ＪＥ）、セントルイス脳炎（ＳＬＥ）、西ナイル熱（ＷＮ）などの主要な感染性疾患に関与するウイルスを含む、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属の一員である。
【０００５】
フラビウイルスの大半は、非常に異なる疫学的方法によって、媒介昆虫により伝染する。ある疾患は、典型的にはヒトのものであり、動物には影響を与えない、ＤＥＮ及びＤＨＦなどのものである。他の感染症は、そうではなく、人畜共通感染性であり、多かれ少なかれヒトに影響を及ぼすことがある、ＪＥ、ＳＬＥ、及びＷＮなどのものである。最後にあるフラビウイルスは、ヒト及び動物の集団の双方に流行して広がる（ＷＮ）。これらの異なる疫学的方法は、それにもかかわらず、昆虫細胞中におけるウイルス増幅などの共通の基礎的因子を有する。
【０００６】
ＨＣＶに関しては、今日よく確立されている伝染経路は、本質的には、血液製品を介する伝染、薬物中毒を介する伝染、及び院内における伝染である。それにもかかわらず、３０から４０％の今日記録されるヒトＨＣＶ感染は、上記の条件には合致せず、起源が説明されていない（Ｎｅｕｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００７】
ＨＣＶのゲノムは、約３０００アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする約９６００塩基の単鎖ＲＮＡからなる。このポリタンパク質は、以下の順序：Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂのウイルスタンパク質からなる。
【０００８】
非構造タンパク質のうち、ＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）であり、例えば、文献ＷＯ ９６／３７６１９に開示されている。
【０００９】
細胞培養物中におけるＨＣＶの効果的な複製は、複製の有効性を大きく増大させる、特にＮＳ５Ｂをコードする遺伝子において同定される、適応変異と関連している。かくして、文献ＷＯ ２００５／０４７４６３は、当該配列を組み込むレプリコンの有効性を増大する、遺伝子型２ｂ ＨＣＶのＮＳ５Ｂにおける３つの変異（２４位におけるセリン、３１位におけるイソロイシン、及び３９２位におけるロイシン）を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ ９６／３７６１９
【特許文献２】ＷＯ ２００５／０４７４６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、Ｃ型肝炎ウイルスに対しては、治療及び効果的なワクチンの開発を阻害する大きな障害として、インビトロにおけるウイルスの高度の複製を可能にする系が存在しないことがある。したがって、その系、とりわけ有効なレプリコンを開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願人は、ヤブカ属の蚊におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のインビボ増殖を得ることに成功した。
【００１３】
好ましくは、使用したウイルス量は、有利にはヒト起源、例えば、遺伝子型１ｂのＨＣＶにより生じた慢性肝炎を有する患者の、血清に由来する。
【００１４】
平均２１日間にわたって継続する増殖の後に、効果的に複製したＨＣＶのゲノムの分析によって、ＮＳ５Ｂにおける変異の存在を明らかにした。
【００１５】
かくして、第一の態様によれば、本発明は、良好な複製性能を有する変異Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）のＮＳ５Ｂタンパク質に関する。
【００１６】
「ＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質」は、ウイルスゲノムをコードする領域の３’末端によってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を意味すると解される。
【００１７】
変異する傾向があるが、当該タンパク質は、５９１残基又はアミノ酸からなるものとして特徴付けられた。このサイズは、特に、上述の先行技術文献において開示されている遺伝子型１ｂ又は２ｂのウイルス由来のＮＳ５Ｂタンパク質においても保存されている。
【００１８】
ＥＦ５０７５０４の番号でデータベースにおいて得られる配列を、参考例として選択した。その配列は、遺伝子型１ｂの全ゲノムに相当する。対応するポリタンパク質のＣ末端領域は、本願の配列番号１のＮＳ５Ｂタンパク質を含有する。
【００１９】
かくして、本発明では、「ＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質」は、配列番号１に対して、有利には、少なくとも７０％、有利には、８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するタンパク質を意味する。そのタンパク質は、有利には、配列番号１の配列と機能的に同等であり、１９９７年に公開の文献であるＬｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌに開示されている試験を使用して、その酵素活性は容易に試験することができる。
【００２０】
かくして、本発明に係る目的のタンパク質は、以下の位置：
−  配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置；及び／又は
−  配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置；及び／又は
−  配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置
の少なくとも１つに変異を有することを決定した。
【００２１】
これらの変異は当該タンパク質の活性部位に位置するという特徴を有することに注意すべきである。事実、Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）は、ＨＣＶのＮＳ５Ｂポリメラーゼの活性に必須の４アミノ酸パターンを示した。特に、２２０位のアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、２８３位のグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、又は３１８位のアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）の置換は酵素活性を完全に破壊することが示された。本発明の対象とする３残基は、この重要な領域に位置していることが認められる。
【００２２】
実際には、この定義は、
−  ３つの変異（２６２；２６５；３１６）；
−  ３つの二重変異（２６２＋２６５；２６２＋３１６；２６５＋３１６）；
−  １つの三重変異（２６２＋２６５＋３１６）
を含む。
【００２３】
有利には、配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置におけるイソロイシンでの単一変異（Ｉ２６２）は除かれる。
【００２４】
同様に、配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置におけるイソロイシン（Ｉ３１６）及び配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置におけるシステインでの二重変異（Ｉ２６２／Ｃ３１６）が除かれる。
【００２５】
有利には、配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置における残基は、以下の群：バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、及びシステイン（Ｃｙｓ又はＣ）から選択されるアミノ酸、特にイソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）ではない。より有利には、配列番号１の２６２番目の残基に相当する位置の残基はアラニン残基（Ａｌａ又はＡ）である。
【００２６】
有利には、配列番号１の２６５番目の残基に相当する位置の残基はプロリン（Ｐｒｏ又はＰ）ではない。より有利には、前記残基はセリン（Ｓｅｒ又はＳ）である。
【００２７】
有利には、配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基は、以下の群：アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）から選択されるアミノ酸、特にシステイン（Ｃｙｓ又はＣ）ではない。より有利には、配列番号１の３１６番目の残基に相当する位置の残基は、アスパラギン酸又はアスパラギン酸塩残基（Ａｓｐ又はＤ）である。
【００２８】
配列番号１の配列では、２６２位の残基はバリン（Ｖａｌ又はＶ）であり、２６５位の残基はプロリン（Ｐｒｏ又はＰ）であり、３１６位の残基はアスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）であるようである。
【００２９】
これらの残基は、位置の相違があるにしても、感染の０日目（Ｄ０）のウイルスゲノムによってコードされるＮＳ５Ｂの２１６から３４５残基に相当する配列番号２の４７、５０、及び１０１位においても認められる。
【００３０】
用語「残基に相当する位置」は、アミノ酸の正確な番号付けが配列に依存して変化し得ることを示す。かくして、相当する位置は、配列をアラインメントして、関連する位置の周囲で最も高い相同性を得ることによって同定することができる。
【００３１】
事実、文献に報告があるＮＳ５Ｂ配列は、確かに強い相同性を示すが、相違点も示すことに注意すべきである。
【００３２】
かくして、参考文献ＷＯ ９６／３７６１９では、より正確には、ＮＳ５Ｂに相当する当該文献の配列番号１の配列では、２６５位及び３１６位の残基は、事実、プロリン及びアスパラギンの各々である。一方、２６２位はイソロイシンでありバリンではないが、本発明のようなアラニンではない。
【００３３】
参考文献ＷＯ ２００５／０４７４６３では、より正確には、遺伝子型２ｂ ＨＣＶ由来のＮＳ５Ｂに相当する当該文献の配列番号１の配列では、２６２位及び２６５位の残基はバリン及びプロリンの各々である。一方、３１６位はシステインでありアスパラギンではないが、本発明のようなアスパラギン酸ではない。
【００３４】
本出願人の知る限りにおいて、ここで同定した特定の位置における変異は本願が初めて報告したものである。
【００３５】
有利な実施態様によれば、本発明に係るＮＳ５Ｂタンパク質は、上述の３つの変異を有する。
【００３６】
事実、ＮＳ５Ｂの２１６から３４５アミノ酸の領域を０日目（Ｄ０）と２１日目（Ｄ２１）とで比較すると、すなわち、配列番号２と配列番号３とを比較すると、これら３つの位置における３つの残基のみが相違する。
【００３７】
かくして、好ましい実施態様によれば、本発明に係るＮＳ５Ｂタンパク質は、配列番号３の配列を含有する。換言すると、「野生型」のＮＳ５Ｂタンパク質から開始して、２６２、２６５、及び３１６位における残基をアラニン、セリン、及びアスパラギン酸の各々で置換するか、又は２１６から３４５の領域を配列番号３で置換することができる。
【００３８】
ＮＳ５Ｂタンパク質の断片も本発明の対象であり、前記断片は、本発明について同定した３つの重要な位置の１つにおいて、少なくとも１つの点変異を含有する。有利には、前記断片は、１９９７年に公開された文献であるＬｏｈｍａｎｎ ｅｌ ａｌに開示されている試験を使用して容易に試験することができるＲｄＲｐ活性を有する機能性断片である。
【００３９】
本発明の他の態様は、上述のように変異したＮＳ５Ｂタンパク質をコードする核酸の配列に関する。
【００４０】
「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかを意味すると解される。本発明に示す核酸配列はＤＮＡに相当するが、対応するＲＮＡ配列は、ＵでＴを置換することによって当業者に容易に推定される。
【００４１】
さらに、本発明に係る核酸配列は、上述の変異を含有する完全ＨＣＶゲノムについては、ＮＳ５Ｂをコードする部分に厳密に対応する。
【００４２】
有利には、ＮＳ５Ｂの２６２位に相当する残基をコードするコドンは、アラニンをコードする必要があり、したがって、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、又はＧＣＴであり得る。
【００４３】
有利には、ＮＳ５Ｂの２６５位に相当する残基をコードするコドンは、セリンをコードする必要があり、したがって、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＡＧＣ、又はＡＧＴであり得る。
【００４４】
有利には、ＮＳ５Ｂの３１６位に相当する残基をコードするコドンは、アスパラギン酸をコードする必要があり、したがって、ＧＡＣ又はＧＡＴであり得る。
【００４５】
説明のために、０日目（Ｄ０）のＨＣＶのＮＳ５Ｂの２１６から３４５位の部分をコードする配列を配列番号４として提示する。
【００４６】
対して、２１日目（Ｄ２１）の同じ部分をコードする配列を配列番号５として提示する。
【００４７】
（配列番号２及び３の配列の４７位又は配列番号１の２６２位における残基をコードする）配列番号４及び５の１３９から１４１位において、バリンをコードするＧＴＣコドン（配列番号４）が、アラニンをコードするＧＣＣコドン（配列番号５）になることが認められる。
【００４８】
同様に、（配列番号２及び３の配列の５０位又は配列番号１の配列の２６５位における残基をコードする）配列番号４及び５の１４８から１５０位において、プロリンをコードするＣＣＣコドン（配列番号４）が、セリンをコードするＴＣＣコドン（配列番号５）になる。
【００４９】
最後に、（配列番号２及び３の１０１位又は配列番号１の３１６位に相当する）配列番号４及び５の３０１及び３０３位において、アスパラギンをコードするＡＡＣコドン（配列番号４）が、アスパラギン酸をコードするＧＡＣコドン（配列番号５）になる。
【００５０】
典型的には、本発明に係る核酸配列は、かくして、配列番号５の配列を含み得る。
【００５１】
有利には、本発明に開示するタンパク質、核酸配列、及びそれらの断片は、ヒト起源である。
【００５２】
本願では、ＨＣＶ複製を改善する可能性がある３つの適応変異を開示する。開示した配列は、多数の用途、特にベクター又はレプリコンのための用途を有する。
【００５３】
かくして、本発明の他の態様は、本発明に係る核酸配列を含むベクターに関する。有利には、当該配列は、発現を確実にすることができる調節配列、特にプロモーターの制御下に挿入する。特に、当該実施態様は、上述の少なくとも１、２、又は３つの変異すらも含有する変異ＮＳ５Ｂタンパク質を生産することを可能にする。
【００５４】
他の態様によれば、それは本発明に係る配列を含むレプリコンである。ＨＣＶレプリコンは、細胞培養物中の自律複製及び検出可能なレベルの１又は複数のウイルスタンパク質の生産を可能にする核酸分子である。ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶ由来の複製機構の成分を発現し、細胞培養物中における複製に必要とされる成分を含む。
【００５５】
ＨＣＶレプリコンは、既に存在し、例えば、文献ＥＰ １ ６６６ ５９８に開示されているものがある。したがって、上述の変異を使用して、前記位置で、当該レプリコンにおいてＮＳ５Ｂをコードする配列を修飾することができる。代替的には、ＮＳ５Ｂをコードするレプリコンの領域は、本発明に係る配列によって置換することができる。次いで、キメラレプリコンが得られる。かくして、既に存在するレプリコンの有効性を増大することができる。
【００５６】
上述のベクター又はレプリコンを含有する宿主細胞も本発明の対象である。好ましくは、これらの細胞は蚊に由来し、有利にはヤブカ属に由来する。いずれの理論に結びつけることを意図しないが、これらの変異は蚊における選択に由来するので、この宿主と本発明に係る変異ＮＳ５Ｂタンパク質の組み合わせが特に有利な複製系をもたらすはずであると思われる。
【００５７】
インビトロ複製系は、多数の予期される用途を提供する。当該系によって、複製活性を阻害する化合物の能力を試験することができ、そのため、抗ＨＣＶ治療分子のスクリーニングツールを作製することができる。
【００５８】
本発明及び本発明による利益は、以下の実施例及び添付の図面を参照することによってよりよく説明される。しかしながら、これらの実施例は限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ウイルスを蚊に接触させた２１日後の、ＨＣＶ複製についての蚊の能力を示す。前記能力は、蚊の属に依存する。イエカ（Ｃｕｌｅｘ）属ではなく、ヤブカ属の蚊においてウイルスをインキュベートした２１日後に、ＨＣＶゲノムをｐＲＴ−ＰＣＲ２１によって検出した。
【図２】図２は、蚊の体及び頭におけるウイルスゲノムの検出の進展を示す。全トランスクプトーム増幅（ＷＴＡ）の後に、全ＲＮＡ抽出物をｐＲＴ−ＰＣＲ後に分析した。１５日目から、ＷＴＡ−ｐＰＣＲの組み合わせによって、蚊の頭におけるＨＣＶゲノムの存在が明らかになった。
【図３】図３は、ＮＳ５Ｂ増幅領域の配列のアラインメントを表わす。陽性の蚊のＮＳ５Ｂの８２２８−８６２８領域は２１日目（Ｄ２１）に配列決定して、０日目（Ｄ０）の感染した蚊のものと比較した。ＥＦ４０７５０４配列に対応するＮＳ５Ｂ配列を参考例として使用した。三角形は２１日目に変異したアミノ酸（２６２ Ｖａｌ／Ａｌａ、２６５Ｐｒｏ／Ｓｅｒ、３１６ Ａｓｎ／Ａｓｐ）を示す。配列決定されることが多く、かつ、系統発生学的に情報が多いため、配列分析はウイルスゲノムの２つの領域に関する。５’ＵＴＲ領域は非常に保存された領域であるが、ＮＳ５Ｂ遺伝子は、感染の急性期の間に適応変異によって特に影響を受けることが報告されている。
【実施例】
【００６０】
（Ｉ）実験的感染
（１）試験する種の繁殖
試験する個体は、アカイエカ（Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ）種についてはマルセイユの市街地で回収し、キンイロヤブカ（Ａｅｄｅｓ ｖｅｘａｎｓ）及びアエデスカスピウス（Ａｅｄｅｓ ｃａｓｐｉｕｓ）についてはＴｏｕｒ ｄｕ Ｖａｌｅｔ ｅｎ Ｃａｍａｒｇｕｅ保護地において回収した蚊（タマゴ、幼虫、及び成虫）から繁殖させた。繁殖は、Ｓａｌｏｎ ｄｅ ＰｒｏｖｅｎｃｅのＤｏｍａｉｎｅ ｄｕ ＭｅｒｌｅにあるＥＮＳＡＭ施設で実施した。繁殖は、繁殖の基準にしたがった古典的な昆虫飼育室で実施した。幼虫にパン酵母及び魚肉を餌として与え、成虫にはスクロース溶液を餌として与えた。イエカ及びヤブカの血液の食餌は、洗浄したヒツジの赤血球から構成されており、この洗浄の目的は血液成分による干渉を排除することであった。
【００６１】
（２）安全な実験室（レベル２＋）への蚊の導入
Ｄ−１の日に、メスの蚊を複数の群に分け、各ボックスに湿らせた脱脂綿を入れた飽血ボックスに入れて、安全な実験室に導入した。調節した温度及び湿度条件下に蚊を維持した（Ｔ＝２５℃±２、ＲＨ ８０％±１０）。
【００６２】
（３）ＨＣＶのＬ２＋実験室への導入
Ｄ０の日に、ＨＣＶウイルスを含むウイルス溶液（２６コピー／ｍｌの慢性肝炎を有する患者由来の血清）を、特別なキャリアによって、蚊を置いたＬ２＋に持ち込んだ。前記ウイルス溶液は、ＧｒｅｎｏｂｌｅにあるＡｌｂｅｒｔ−Ｍｉｃｈａｌｌｏｎ大学病院のウイルス学研究所によって提供された。ウイルス溶液は−８０℃のＬ２＋のフリーザーに維持した。
【００６３】
（４）感染した血液溶液の調製
Ｄ０の日に、洗浄した非感染赤血球（ヒツジの血液）及びウイルス溶液を混合して、蚊を感染させるのに十分な力価を獲得した（〜１５００コピー／蚊）。ＡＴＰを添加して、血液をより魅力的なものにして、それに対するメスの欲求を増大させた。各蚊は１回の血液の食餌あたりに３から５μｌを摂取した。
【００６４】
（５）メスの群の感染
Ｄ０の日に、３７℃に温めた感染した血液を含有するエンゴルガー（ｅｎｇｏｒｇｅｒ）を、２４時間にわたってグルコース飢餓状態にしたメスに提供した。エンゴルガーを各ボックスに置いて、摂取する血液の食餌として約４時間にわたって放置した。同時に、非感染血液を含有するエンゴルガーをネガティブコントロールのメスのバッチに与えた。メスの飽血の期間が終わったら、それらをマウスアスピレーター（ｍｏｕｔｈ ａｓｐｉｒａｔｏｒ）を使用して回収し、クロロホルム蒸気を使用して麻酔して、双眼顕微鏡で見ながら分類した。飽血したメスをカゴに戻した。産卵するメスのために各金属カゴの人工繁殖領域を放置した（ヤブカのメスのためには水おけ、及びイエカのメスには湿った土）。この日から、蚊が屠殺されるまで、飽血したメスを含有する金属カゴを開かず、かつ、触れなかった。
【００６５】
（６）メスの群のケア
メスの群は、少なくとも７０％の調整湿度で約２８℃の一定温度に維持した。毎日、金属カゴにいれた１０％グルコース溶液で湿らせた綿でメスに餌を与えた。繁殖領域は洗浄ビンでカゴを通じて湿気を与えた。
【００６６】
（７）メスの処理
サンプルを回収する日に、金属カゴを冷やすことによって、蚊を屠殺した。次いで、蚊を別個に１．５ｍｌチューブに移し、ラベルを貼付し、ＰＣＲの前のＲＮＡ抽出工程までフリーザーに入れた。ウイルスを含有していない血液で飽血させたネガティブコントロールの群も屠殺した。Ｄ０の日に屠殺して−８０℃のフリーザーに入れた蚊の群は、飽血、ウイルスＲＮＡの抽出及び増幅のＤ０のポジティブコントロールとした。
【００６７】
（ＩＩ）ウイルスＲＮＡの検出
（８）感染起源についてのＲＮＡの抽出
Ｒｏｃｈｅ社によって販売されている「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ」を使用して、蚊の組織に由来するＨＣＶ ＲＮＡの抽出をフードで実施した。
【００６８】
（９）ウイルスＲＮＡの増幅
使用するプライマー及びプローブ（ｑＰＣＲのためのもの）は、ウイルスゲノムの５’非コード末端の保存領域を増幅するために設計した。ヌクレオチド−２８９とヌクレオチド−２６９との間に位置するセンスプライマー２ＣＨ（５’−ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＡＡ−３‘）（配列番号６）、及びヌクレオチド−７０とヌクレオチド−９０との間に位置するアンチセンスプライマー１ＴＳ（５’ ＧＣＧ ＡＣＣ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＡＣ ＴＣＧ ＧＣＴ−３’）（配列番号７）を使用した。ｑＰＣＲに使用したプローブは、ヌクレオチド−１３７とヌクレオチド−１１９との間に位置するＴＭ４１６（５’−６Ｆａｍ−ＡＡＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ Ａ−Ｔａｍｒａ−３’）（配列番号８）であった。
【００６９】
古典的なＲＴ−ＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲのための反応混合物の組成を下表にまとめている。
【表１】
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【００７０】
ＲＴ−ＰＣＲは、以下の条件：５０℃で３０分間にわたる逆転写、続いて逆転写酵素の失活工程（９５℃で１５分）、次いで伸長工程（６３℃で１分）及び変性工程（９０℃で３０秒）を交互に実施する４５のＰＣＲサイクルで実施した。
【００７１】
（１０）Ｄ０及びＤ２１における陽性の蚊から抽出したウイルスゲノムのＩＲＥＳに相当する領域（５２−２７１）及びＮＳ５ｂ遺伝子の一部に相当する領域（８２２８−８６２８）の配列決定
上記（８）に記載のプロトコールにしたがって、ウイルスＲＮＡを抽出した。
【００７２】
ＨＣＶゲノムを含有する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって同定した蚊に由来する全ＲＮＡ抽出物から配列決定を実施した。
【００７３】
配列決定工程は、以下の順序で実施した：
ａ）増幅：配列決定する領域をまずｑＲＴ−ＰＣＲによって適当なプライマーを使用して増幅した。ＩＲＥＳの５３−２７１の領域については、上述のプライマー１ＴＳ（配列番号７）及び２ＣＨ（配列番号６）を使用した。ＮＳ５ｂ遺伝子のヌクレオチド８２２８−８６２８の領域については、使用したプライマーは、２００３年にＳａｎｄｒｅｓ−Ｓａｕｎｅ ｅｔ ａｌによって参考文献において開示された１ＰＲ及び２ＰＲであった。
ｂ）ゲル上の移動：増幅産物は１％アガロースゲルで分子量マーカーとともに移動させた。移動が終わったら、ＥｔＢｒを使用して増幅産物を検出した。目的のバンドを切り出して、バンドに含まれる配列をゲルから抽出した。
ｃ）クローニング：クローニングをｐＵＣ１８ベクターで実施した。挿入を実施できるようにするために、ｐＵＣ１８ベクターに存在するが、増幅産物には存在しない制限酵素認識部位（制限酵素に相当するもの）を決定する必要があった。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を選択した。新しいペアのプライマーを上述のプライマーから選択して、一方はＥｃｏＲｉ制限酵素認識部位を含み、他方はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位である、２つの短い配列をその両端に付加して、増幅産物をベクターに導入し、開放し、脱リン酸化できるようにした。
ｄ）形質転換：クローニング産物をＴＯＰ１０コンピテント細菌に導入した。次いで、細菌をＬＢアガロース−アンピシリンを含有するペトリ皿に播種した。最後に、それらを一晩にわたって３７℃でインキュベートした。
ｅ）クローニングの品質管理：増殖した細菌が挿入を含んでいるか調べるために、細菌に直接ＰＣＲを実施した。１０μｌチップの先で増殖したクローンを移し、マスターミックス（上記組成参照）を入れたＰＣＲチューブに予め浸して、次いで、ＬＢアガロース−アンピシリン含有ペトリ皿に播種するために使用した。移す工程が終わったら、ＰＣＲを開始し、ペトリ皿を３７℃で一晩にわたってインキュベートした。
ｆ）ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分子量マーカーとともに移動させた。移動が終わったら、ＥｔＢｒを使用して増幅産物を検出した。正しいサイズのバンドを含有するバンドを含有するクローンを増幅させて、配列決定に十分なプラスミドを生産した。
ｇ）少量調製：プラスミドを細菌から抽出した。
ｈ）配列決定：配列決定はＭＷＧ社によって自動的に実施した。Ｍ１３ユニバーサルプライマーを使用した。よりよい正確性及び信頼性のために読み取りは双方向から行った。
【００７４】
結果
３つの実験を実施した。
【００７５】
（ｉ）実験１
メスのキンイロヤブカを幼虫の段階で回収して、１０日齢未満で試験した。約２０匹の蚊に１ミリリットルあたり１０６コピーのＨＣＶの懸濁物を与えた。２１日間にわたって成長させた後に、蚊を凍結して、ＲＮＡを抽出した。エンドポイントＲＴ−ＰＣＲは、５匹のうち３匹の蚊において、ＨＣＶゲノムの存在に相当する陽性シグナルを有していた（結果示さず）。
【００７６】
（ｉｉ）実験２
属特異性を試験するために、３６匹のヤブカ種及び１５匹のアカイエカに、１ミリリットルあたり８．３×１０５コピーのＨＣＶを含有する懸濁物を与えて、２１日間にわたって成長させた。２１日目に相当する蚊の抽出物に実施したｑＲＴ−ＰＣＲは、ヤブカの蚊の３３％（２／６）においてＨＣＶゲノムの存在を示した。対照的に、ＨＣＶ ＲＮＡはイエカの蚊では検出されなかった（図１）。
【００７７】
ＲＮＡウイルス複製に共通の特徴は、適応変異の存在である。これを試験するために、感染後２１日目（Ｄ２１）の陽性の蚊から抽出したＨＣＶのＲＮＡ配列を、０日目のサンプル（Ｄ０）と比較した。ＨＣＶゲノムの２つの領域：５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）の２２０ヌクレオチド（領域５２−２７１）及び非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ又はＲｄＲｐ［ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ］）をコードする部分の４００ヌクレオチド（８２２８−８６２８領域）を選択した。５’ＵＴＲ領域から分析した２２０ヌクレオチドでは変異が認められなかった。一方、活性部位に相当するＲｄＲｐの４００ヌクレオチドには、３つの適応変異（２６２Ｖａｌ／Ａｌａ、２６５Ｐｒｏ／Ｓｅｒ、及び３１６Ａｓｎ／Ａｓｐ）を同定した（図３）。
【００７８】
（ｉｉｉ）実験３
１２４匹のアエデスカスピウス及び８５匹のキンイロヤブカに、１ミリリットルあたり１．２×１０６コピーのＨＣＶを含有する懸濁物を与えて、１５日間にわたって成長させた。全ての蚊を解体して、頭（唾液腺を含む）及び体（腸間膜を含む）に分けた。ＨＣＶの存在を０、４、８、及び１５日目のサンプルで調べた。より大きい感度を得るために、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の前にＷＴＡ（全トランスクリプトーム増殖）を実施した。これらの条件下で、ＨＣＶのＲＮＡが、１５日目の蚊の頭でのみ検出された（図２）。ＷＴＡ及びｑＰＣＲを使用しても、ウイルスゲノムが初日（Ｄ０）の蚊の頭にも存在しなかったため、残存するウイルスによる陽性シグナルはなかったのであろう。
【００７９】
宿主において複製するために寄生体によって必要とされる時間として定義されるＨＣＶの外因性サイクルは、２５℃の環境温度で１５日より長いと推定された。現段階では、摂取されたＨＣＶは、ｉ）蚊の腸間膜組織を通過し、ｉｉ）他の組織、特に唾液腺で複製すると仮説を立てることができる。
【００８０】
同定した適当変異とともに考慮すると、これらの結果は、ある蚊、特にアエデスカスピウス及びキンイロヤブカにおける天然のＨＣＶを複製する能力の初めての証拠を提供するものである。
（参考文献）
Kuntzen, T. et al. Viral Sequence Evolution in Acute Hepatitis C Virus Infection. J Virol. 81 (21), 11658-11668 (2007).
Lohmann, V. et al. Biochemical properties of Hepatitis C Virus NS5B RNA-dependent RNA Polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity J. Virol. 71(11), 8416-8428 (1997).
Neumayr, G., Propst, A., Schwaighofer, H., Judmaier, G. & Vogel, W. Lack of evidence for the heterosexual transmission of hepatitis C. Q J Med. 92, 505-508 (2000).
Sandres-Saune K. et al. Determining Hepatitis C Genotype by analyzing the sequence of the NS5B region. J Virol. Methods 109 (2), 187-93 (2003).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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