(57)【要約】  本発明は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的または治癒的に治療するための候補化合物をin vitroまたはin vivoでスクリーニングする方法であって、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの発現または活性を調節する化合物の能力を決定するステップを含む方法に関し、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を治療するための、これらの酵素のいずれかの発現または活性に対する調節剤の使用にも関する。本発明は、これらの病変をin vitroで診断またはin vitroで予後診断する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための候補化合物をin vitroまたはin vivoでスクリーニングする方法であって、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ(CROT)の発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を調節する化合物の能力を決定するステップを含む方法。
【請求項２】
a.少なくとも2種の生体試料または反応混合物を調製するステップと、
b.前記試料または反応混合物の1つを、試験化合物の1つまたは複数と接触させるステップと、
c.生体試料または反応混合物において、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を測定するステップと、
d.b)において処理された試料または混合物において、未処理試料または未処理混合物と比較して、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性の調節、またはそれらの遺伝子の発現の調節、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性の調節が測定される化合物を選択するステップと
を含む、請求項1に記載の、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための候補化合物をin vitroでスクリーニングする方法。
【請求項３】
ステップd)において選択される化合物が、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を阻害することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
生体試料が、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーターの全てまたは一部に機能的に連結しているレポーター遺伝子がトランスフェクトされた細胞であること、およびステップc)が、前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップを含むことを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現している細胞であること、およびステップc)が、前記遺伝子の発現を測定するステップを含むことを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。
【請求項６】
細胞が皮脂腺細胞である、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする異種核酸で形質転換された細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現が、前記遺伝子の転写レベルを測定することによって決定される、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子の発現が、前記遺伝子の翻訳レベルを測定することによって決定される、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップa)が、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素およびその酵素の基質をそれぞれが含む反応混合物を調製するステップを含む、ステップc)が、その酵素活性を測定するステップを含むことを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１１】
酵素活性を決定するステップが、生成した脂肪酸を抽出することによってトランスフェラーゼ活性を決定するステップを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の予防的かつ/または治癒的な治療に使用する医薬品を調製するための、請求項2から11のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるヒトのカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素の調節剤の使用。
【請求項１３】
調節剤が、酵素の阻害剤である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
調節剤が、酵素の触媒部位と相互作用し、それを遮断する化合物である、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
脂性皮膚を美的治療するための、ヒトのカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素の調節剤の化粧品としての使用。
【請求項１６】
個体におけるざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の発生をin vitroで診断またはモニタリングする方法であって、個体から得た生体試料における、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を、対照個体から得た生体試料と比較するステップを含む方法。
【請求項１７】
タンパク質の発現が、イムノアッセイによってそのタンパク質をアッセイすることによって決定される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
イムノアッセイがELISAアッセイである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子の発現が、対応するmRNA量を測定することによって決定される、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の発生に対する個体の感受性をin vitroで決定する方法であって、個体から得た生体試料における、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を、対照個体から得た生体試料と比較するステップを含む方法。
【請求項２１】
タンパク質の発現が、イムノアッセイによってそのタンパク質をアッセイすることによって決定される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
イムノアッセイがELISAアッセイまたはラジオイムノアッセイである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子の発現が、対応するmRNA量を測定することによって決定される、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を治療するためのPPARの候補調節剤をスクリーニングするためのマーカーとしての、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ遺伝子またはカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の使用。
【請求項２５】
カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を調節するPPAR調節剤の能力を決定するステップを含む、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
PPAR調節剤がPPARγ調節剤である、請求項24または25に記載の使用。
【請求項２７】
調節剤がPPAR受容体アゴニストである、請求項24から26のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、さらには皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を治療するための、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ(CROT)を調節する化合物の同定および使用に関する。本発明は、これらの病変をin vitroで診断またはin vitroで予後診断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脂漏性の脂性皮膚は、皮脂の過度の分泌および排出を特徴とする。従来、額で測定される皮脂レベルが200μg/cm2を超えると、脂性皮膚の特徴であるとみなされる。脂性皮膚は、多くの場合、落屑欠陥、ギラギラ光る顔色および厚い皮膚のきめを伴う。これらの美的障害に加えて、過剰な皮脂により、腐生細菌叢(特に、ざ瘡菌(P.acnes))の無秩序な発育が補助され、面皰および/またはざ瘡性損傷の出現が引き起こされる可能性がある。
【０００３】
この皮脂腺の産生への刺激は、アンドロゲンによって誘発される。
【０００４】
ざ瘡は、実際には、ホルモンによる制御下にある毛嚢脂腺濾胞の慢性疾患である。ざ瘡に対するホルモン療法は、女性に対する治療の1つの可能性であり、その目的は、皮脂腺に対するアンドロゲンの影響を予防することになっている。このような状況において、エストロゲン、抗アンドロゲン、または卵巣もしくは副腎からのアンドロゲンの産生を低減させる作用剤が一般に用いられる。ざ瘡の治療に用いられる抗アンドロゲンとしては、特に、スピロノラクトン、酢酸シプロテロンおよびフルタミドが挙げられる。しかし、これらの作用剤は、重篤化する可能性がある副作用を有する。したがって、特に、男の胎児に対して女性化の危険性があるため、どんな妊娠も絶対的に予防しなければならない。これらの作用剤は、男性患者には禁止されている。
【０００５】
脂漏性皮膚炎は、脂ぎった、黄色がかった鱗屑で覆われた赤色プラークの形で存在する一般的な炎症性皮膚病であり、大体痒疹性で、脂漏性領域において顕著である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2007/093747
【特許文献２】米国特許第4,921,844号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yeら、1997年、Skin Pharmacol、10(5-6)、288〜97頁
【非特許文献２】Boutら、1991年、Biochim Biophys Acta、1090(1)、43〜51頁
【非特許文献３】Antonenkov、1997年、272(41)、26023〜26031頁
【非特許文献４】Schramら、PNAS、1987年、84(8)、2494〜6頁
【非特許文献５】Goldfingerら、1986年、J Pediatr.、108(1)、25〜32頁
【非特許文献６】Ferdinandusseら、2002年、Am.J.Hum Genet.70、1589〜1593頁
【非特許文献７】Lopaschukら、2003年、Circ Res. 8月8日、93(3)、e33〜7頁
【非特許文献８】Onay-Besikci Aら、2007年、Can J Physiol. Pharmacol.、85(5)、527〜35頁
【非特許文献９】Aoyamaら、1998年、The Journal of Biological Chemistry、276巻、5678〜84頁
【非特許文献１０】KohlerおよびMilstein、Nature (London)、256、495〜497頁(1975)
【非特許文献１１】Shindo Yら、Biochem Pharmacol.、1978年、27(23)、2683〜8頁
【非特許文献１２】Venizelosら、Pediatr. Res.、1994年、36、111〜114頁
【非特許文献１３】Jayasena、1999年、Clinical Chemistry 45(9)、1628〜1650頁
【非特許文献１４】Xiaら、J Invest Dermatol.、1989年9月、93(3)、315〜21頁
【非特許文献１５】Rosenfieldら、J. Invest. Dermatol.、1999年、112、226〜32頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、これらの疾患に対して、副作用は低減させるが、治療プロファイルは同様のものを得るために、ステロイドホルモンの作用の下流のメディエーターを同定し、調節する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本出願人は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ(CROT)をコードする遺伝子は、表皮と比べてヒト皮脂腺において優先的に発現していることを発見した。
【００１０】
本出願人は、この同じ標的は、ざ瘡病理及び皮脂分泌過多に関連する動物の薬理学モデル(Fuzzyラット)に存在していることも実証している。
【００１１】
とりわけ、この発現は、PPARγ(5-{4-[2-(メチルピリジン-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン、(S)-2-エトキシ-3-{4-[6-(3-ヘプチル-1-メチルウレイド)ピリジン-2-イル]プロピオン酸、またはロシグリタゾン、6-(2-メトキシエトキシメトキシ)ナフタレン-2-カルボン酸[4'-(2,4-ジオキソチアゾリジン-5-イルメチル)ビフェニル-3-イルメチル]メチルアミド、1％)での局所処理に引き続き、皮脂腺のレベルでin vivoで調節されることを発見した。
【００１２】
その結果として、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害、特に、脂性皮膚外観を予防および/または改善するために、CROT遺伝子またはそれらの発現産物を標的とすることを提案する。
【００１３】
さらに、PPARアゴニストを用いた治療により、皮脂腺のサイズの大幅な減少およびアンドロゲン誘発皮脂分泌過多の低減が誘発されることも公知である(WO2007/093747)。
【００１４】
提案した標的は、PPAR受容体の下流であるので、皮脂腺および皮脂排出に対して観察される影響に関与している前記標的である。
【００１５】
したがって、PPARレセプターの下流で作用する同定された遺伝子は、PPAR調節剤として最も有効な化合物を同定、分類、および選択するために使用することができる。これに基づいて、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を治療するためのPPARの候補調節剤をスクリーニングするためのマーカーとしての、CROT遺伝子、またはそのCROTタンパク質の使用も提案している。より詳細には、CROTの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性に対する、PPAR調節剤の能力を決定することができる。
【００１６】
「ざ瘡」という用語は、ざ瘡の全ての形、すなわち、特に、尋常性ざ瘡、面皰性ざ瘡、多形ざ瘡、結節性嚢胞性ざ瘡、集簇性ざ瘡、あるいは日光性ざ瘡、薬物性ざ瘡または職業性ざ瘡などの二次ざ瘡を意味することを意図している。本出願人は、CROTの発現または活性のレベルを検出することに基づいた、in vitro、in vivoおよび臨床における診断または予後診断の方法も提案している。
【００１７】
CROT
用語「CROT」は、ペルオキシゾーマルカルニチン-O-オクタノイルトランスフェラーゼ、EC 2.3.1.137またはCOTとしても既知である、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼを表す。
【００１８】
カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼは、ＣｏＡとカルニチンの間の脂肪アシル基の可逆的移転を触媒する酵素である。動物では、この反応は、ペルオキシダーゼから細胞質及びミトコンドリアへの長鎖及び中鎖アシルＣｏＡの移転において必須の工程である。カルニチンアシルトランスフェラーゼの機能及び構造は、Van Leijら(2000, Molec Genet Metab, 71: 139-153)に記載されている。
【００１９】
CROT酵素は、多くの組織で発現されている(Westinら, 2008, Cell Mol Life Sci, 65(6): 983-990)。CROTの生理学的阻害剤はマロニルＣｏＡであり、そのCROTとの結合部位は、Morillasら, 2002 (J Biol Chem, 277(13): 11473-11480)によって研究された。
【００２０】
本発明の文脈では、用語「CROT遺伝子」または「CROT核酸」は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子または核酸配列を表す。目的とされる標的は好ましくはヒト遺伝子またはその発現産物であるが、本発明は、前記酵素をコードする外因性の核酸のゲノム挿入または一過的な発現による、異種カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼを発現する細胞にも所望し得る。
【００２１】
CROTのヒトcDNA配列を添付書類において再現する(配列番号1)。それは配列NM_021151(Genbank)であり、その読み取り枠は、3211塩基対を含む。
【００２２】
診断への適用
本発明の対象は、個体における、ざ瘡損傷、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の発生をin vitroで診断またはモニタリングする方法であって、個体から得た生体試料における、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ1(タンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を、対照個体から得た生体試料と比較するステップを含む方法に関する。
【００２３】
タンパク質の発現は、ウェスタンブロット、免疫組織化学、質量分析(Maldi-TOFおよびLC/MS分析)、ラジオイムノアッセイ(RIA)またはELISAまたは当業者に公知の任意の他の方法などの方法の1つに従って、CROTタンパク質をアッセイすることにより決定することができる。別の方法、特に、CROT遺伝子の発現を測定する方法は、対応するmRNA量を測定することである。CROTタンパク質の活性をアッセイすることも想定可能である。
【００２４】
診断において、「対照」個体は「健康な」個体である。
【００２５】
ざ瘡損傷、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の発生のモニタリングにおいて、「対照個体」は、異なる時間における同一個体を示し、治療の始め(T0)に相当することが好ましい。このCROTの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性の差異を測定することにより、特に、治療、特に、上記で想定したCROT調節剤を用いた治療、またはざ瘡、脂漏性皮膚炎、もしくは皮脂分泌過多に関連する皮膚障害に対する別の治療の有効性をモニタリングすることが可能になる。そのようなモニタリングにより、患者は、治療を続ける根拠が十分か、または治療を続ける必要があるかどうかについて再保証され得る。
【００２６】
本発明の別の態様は、ざ瘡損傷、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の発生に対する個体の感受性をin vitroで決定する方法であって、個体から得た生体試料における、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ1タンパク質(CROTタンパク質)の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を、対照個体から得た生体試料と比較するステップを含む方法に関する。
【００２７】
繰り返して述べるが、CROTタンパク質の発現は、イムノアッセイ、例えばELISAアッセイ、または上記の任意の他の方法によってこのタンパク質をアッセイすることにより決定することができる。別の方法、特に、CROT遺伝子の発現を測定する方法は、上記の任意の方法によって対応するmRNA量を測定することである。CROT活性をアッセイすることも想定可能である。
【００２８】
試験された個体は、この場合、皮脂分泌過多に関連する皮膚状態、脂漏性皮膚炎またはざ瘡を示していない無症候の個体である。この方法における「対照」個体は、「健康な」参照集団または個体を指す。この感受性を検出することにより、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害に伴う徴候の予防的治療および/またはモニタリングの増加を計画することが可能になる。
【００２９】
これらのin vitroにおける診断方法または予後診断方法において、試験される生体試料は、任意の生体液試料または生検試料であってよい。この試料は、例えば、落屑または生検によって得られた皮膚細胞の調製物であり得ることが好ましい。この試料は皮脂であってもよい。
【００３０】
スクリーニング方法
本発明の対象は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する任意の皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための候補化合物をin vitroまたはin vivoでスクリーニングする方法であって、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を調節する化合物の能力を決定するステップを含み、前記調節が、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する任意の皮膚障害を予防的または治癒的に治療するための化合物の有用性を示す方法である。したがって、この方法により、CROTの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を調節できる化合物を選択することが可能になる。
【００３１】
さらに特定すると、本発明の対象は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための候補化合物をin vitroでスクリーニングする方法であって、
a.少なくとも2種の生体試料または反応混合物を調製するステップと、
b.試料または反応混合物の1つを、試験化合物の1つまたは複数と接触させるステップと、
c.生体試料または反応混合物において、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を測定するステップと、
d.b)において処理された試料または混合物において、未処理試料または未処理混合物と比較して、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性の調節が測定される化合物を選択するステップと
を含む方法である。
【００３２】
in vivoスクリーニング法は、任意の実験動物、例えばげっ歯類において行うことができる。好ましい一実施形態によると、スクリーニング法は、試験化合物を、好ましくは局所的適用によって動物に投与し、次いで場合によって安楽死によって動物を犠牲にし、表皮剥離試料を取得した後、その表皮剥離における遺伝子発現を、本明細書に記載の任意の方法によって評価することを含む。
【００３３】
「調節」という用語は、酵素の発現もしくは活性、遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性に対する任意の影響、すなわち、場合によっては刺激、しかし好ましくは部分的または完全な阻害を意味することを意図している。したがって、上記のステップd)において試験される化合物は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼタンパク質の発現もしくは活性、それらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を阻害することが好ましい。試験される化合物において得られる発現の、この化合物の非存在下で行われる対照と比較した差は、25%以上から有意である。
【００３４】
本明細書を通して、他に特に指定がなければ、「遺伝子の発現」という用語は、mRNAの発現量を意味するものとし、
「タンパク質の発現」という用語は、そのタンパク質の量を意味するものとし、
「タンパク質の活性」という用語は、そのタンパク質の生物活性を意味するものとし、
「プロモーターの活性」という用語は、そのプロモーターの下流にコードされるDNA配列の転写を開始させる(したがって、対応するタンパク質の合成を間接的に開始させる)そのプロモーターの能力を意味するものとする。
【００３５】
試験化合物はどんな種類であってもよい。試験化合物は、天然由来であってよく、または化学合成によって作製されてもよい。これには、構造的に定義済みの化合物のライブラリー、特徴づけられていない化合物または物質、または化合物の混合物が含まれ得る。
【００３６】
特に、本発明は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を治療するための、PPARの候補調節剤のマーカーとしての、CROT遺伝子、またはそのタンパク質の使用を対象とする。より詳細には、CROTの発現もしくは活性、またはそれらの遺伝子の発現、またはそれらのプロモーターの少なくとも1つの活性を調節するためのPPAR調節剤またはAR調節剤の能力を決定する。この調節剤はPPARγ調節剤であることが好ましい。
【００３７】
PPAR調節剤はPPARのアゴニストまたはアンタゴニストであり、アゴニストであることが好ましい。
【００３８】
これらの化合物を試験し、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの発現または活性を調節する治療的に興味深い化合物を同定するために、種々の技法を使用することができる。
【００３９】
第1の実施形態によると、生体試料は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーターの全てまたは一部に機能的に連結しているレポーター遺伝子を用いてトランスフェクトした細胞であり、上記のステップc)は、前記レポーター遺伝子の発現を測定するステップを含む。
【００４０】
レポーター遺伝子は、特に、所与の基質の存在下で、CAT(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ)、GAL(ベータガラクトシダーゼ)またはGUS(ベータグルクロニダーゼ)などの着色産物の形成をもたらす酵素をコードし得る。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子またはGFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子であってもよい。このレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の活性のアッセイを、比色定量法、蛍光定量法または化学発光法などによって、従来の通り行う。
【００４１】
第2の実施形態によると、生体試料は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現している細胞であり、上記のステップc)は、前記遺伝子の発現を測定するステップを含む。
【００４２】
本発明で使用される細胞はどんな種類のものであってもよい。本発明で使用される細胞は、CROT遺伝子を内因的に発現している細胞、例えば肝細胞、または、さらに良いのは皮脂腺細胞であり得る。ヒトまたは動物由来の器官、例えば包皮腺、陰核腺、あるいは皮膚の皮脂腺も使用することができる。
【００４３】
本発明で使用される細胞は、好ましくはヒト、または哺乳動物のカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼをコードする異種核酸で形質転換された細胞であってもよい。
【００４４】
例えば、Cos-7細胞、CHO細胞、BHK細胞、3T3細胞またはHEK293細胞などの多種多様な宿主細胞系を使用することができる。核酸は、当業者に公知の任意の方法、例えば、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、リポソーム、ウイルス、電気穿孔または微量注入によって、安定にまたは一過性にトランスフェクトすることができる。
【００４５】
これらの方法において、CROT遺伝子またはレポーター遺伝子の発現は、前記遺伝子の転写レベルまたは前記遺伝子の翻訳レベルを評価することにより決定可能である。
【００４６】
「遺伝子の転写レベル」という表現は、対応するmRNAの産生量を意味することを意図している。「遺伝子の翻訳レベル」という表現は、タンパク質の産生量を意味することを意図している。当業者は、対象の遺伝子のmRNAを定量的または半定量的に検出するための技法に詳しい。mRNAと、特異的なヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づいた技法が最も一般的である(ノーザンブロット、RT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、定量的RT-PCR(qRT-PCR)、リボヌクレアーゼ保護)。蛍光性作用剤、放射性作用剤または酵素作用剤または他のリガンド(例えばアビジン/ビオチン)などの検出標識を用いることが有利であり得る。
【００４７】
特に、遺伝子の発現は、リアルタイムPCRまたはリボヌクレアーゼ保護によって測定することができる。「リボヌクレアーゼ保護」という用語は、標識プローブによる特異的ハイブリダイゼーションを用いて行うことができる、組織のポリ(A)-RNAの中での既知mRNAの検出を意味することを意図している。プローブは、探索されるメッセンジャーに相補的な、標識した(放射性)RNAである。プローブは、既知のmRNA、それをRT-PCR後にファージにクローニングしたcDNAから構築することができる。配列を探索する組織由来のポリ(A)-RNAを、液体培地中、緩やかなハイブリダイゼーション条件下で、このプローブと一緒にインキュベートする。探索されたmRNAとアンチセンスプローブとの間でRNA:RNAハイブリッドが形成される。次いで、ハイブリダイズした培地を、一本鎖RNAに特異的なリボヌクレアーゼの混合物と一緒にインキュベートし、その結果、プローブとハイブリッド形成されたもののみがこの消化に耐えられる。次いで消化産物を、除タンパクおよび再精製した後、電気泳動によって分析する。標識されたハイブリッドRNAをオートラジオグラフィーによって検出する。
【００４８】
遺伝子の翻訳レベルは、例えば、前記遺伝子の産物を免疫学的にアッセイすることにより評価する。この目的で使用される抗体は、ポリクローナル型またはモノクローナル型であってよい。抗体の産生には従来の技法を必要とする。抗CROTポリクローナル抗体は、とりわけ、ウサギまたはマウスなどの動物を、酵素全体を用いて免疫することによって得られる。抗血清を取得し、次いで当業者に本来公知の方法に従って除去する。モノクローナル抗体は、とりわけ、KohlerおよびMilsteinの従来法によって得られる(Nature (London)、256、495〜497頁(1975))。モノクローナル抗体を調製するための他の方法も公知である。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマからクローニングした核酸を発現させることによって作製される。抗体は、ファージ提示法によって、ファージの表面にV遺伝子ライブラリーを提示している典型的な繊維状ファージであるベクターに抗体cDNAを導入することによって作製することもできる(例えば、大腸菌(E.coli)に対するFUSE5)。
【００４９】
免疫学的アッセイは、固相または均一相において、非限定的な例として、サンドイッチ法または競合法で、1ステップまたは2ステップで行うことができる。好ましい一実施形態によると、捕捉抗体は固相上に固定される。固相の非限定的な例として、マイクロプレート、特にポリスチレンマイクロプレート、または固体粒子もしくは固体ビーズ、または常磁性ビーズを使用することができる。
【００５０】
形成された抗原/抗体複合体の存在を明らかにするために、ELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイまたは任意の他の検出法を使用することができる。
【００５１】
抗原/抗体複合体、より一般的には単離または精製された、また組換えのタンパク質(in vitroおよびin vivoで得られる)の特徴づけを、質量分析によって行うことができる。この同定は、タンパク質の酵素加水分解(一般にトリプシン)によって生成するペプチドを分析すること(質量の決定)によって可能になる。一般に、タンパク質は、酵素消化する前に、当業者に公知の方法に従って単離される。ペプチド(加水分解物の形)の分析は、そのペプチドの物理化学的性質に基づいてHPLC(ナノHPLC)によってペプチドを分離することにより行う(逆相)。このようにして分離されたペプチドの質量の決定は、ペプチドをイオン化し、質量分析を用いて(エレクトロスプレーESIモード)直接カップリングさせるか、当業者に公知のマトリックスの存在下で沈殿および結晶化した後カップリングさせるか(MALDIモードでの分析)のいずれかで行う。続いて適切なソフトウェア(例えばMascot)を使用することによってタンパク質を同定する。
【００５２】
第3の実施形態によると、上記のステップa)は、各々がCROT酵素、およびその酵素の基質を含む反応混合物を調製するステップを含み、上記のステップc)は、酵素活性を測定するステップを含む。
【００５３】
CROT酵素は、Cos-7細胞、CHO細胞、BHK細胞、3T3細胞またはHEK293細胞を用いて、通例の技法に従って作製することができる。CROT酵素は、細菌(例えば大腸菌(E.coli)もしくは枯草菌(B.subtilis))、酵母(例えばサッカロミセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia))などの微生物、またはSf9もしくはSf21などの昆虫細胞を用いて作製することもできる。
【００５４】
酵素活性の決定は、例えば生産された放射標識オクタノイルカルニチンの量を測定することによってトランスフェラーゼ活性を決定するステップを含むことが好ましい。
【００５５】
CROTの酵素活性のアッセイについては、文献に記載されている(例えば、Solbergら, 1972, Biochem Biophys Acta, 280(3): 422-433またはSinghら, 1996, J Lipid Res, 37(12): 2616-2626を参照されたい)。
【００５６】
かくして、上記Singhら, 1996は、以下の態様でのカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの活性の評価を記載する。
【００５７】
ペルオキシソームとペルオキシソーム膜をラット肝臓サンプルから単離し、ヒドロキシアパタイトカラムでそこからタンパク質を抽出する。50mMの塩水バッファー(PBS)、ｐＨ７、ジチオスレイトール(1mM)、L-[メチル-3H]カルニチン(25μCi/μmol、250μM)、アシルＣｏＡ(100μM)、及び酵素(1から5μg)で構成されたインキュベーション物を、0.1mlの全容量で調製する。活性試験を30度で5分間実施し、反応は1mlのイソブタノールを伴う。0.5mlの抽出混合物(0.2MのH3PO4を含む2M KCl)の添加により相を分離する。水性上相を取り出し、クロロホルム下相を0.5mlの抽出混合物で一度洗浄する。次いで生産されたオクタノイルカルニチンの放射活性を測定する。酵素を伴わないコントロール実験を実施し、0.1%未満の放射標識カルニチンをクロロホルム相で抽出することを示す。
【００５８】
本明細書で定義したスクリーニング方法によって選択された化合物は、続いて他のin vitroモデルおよび/またはin vivoモデル(動物またはヒトにおける)において、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害に対するその効果について試験され得る。
【００５９】
酵素の調節剤
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害の予防的かつ/または治癒的な治療に使用する医薬品を調製するための、上記の方法の1つによって得ることができるヒトカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素の調節剤の使用も、本発明の対象である。
【００６０】
ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための方法は、このように本明細書に記載されており、前記方法は、そのような治療を必要としている患者に、治療有効量の、ヒトカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素の調節剤を投与するステップを含む。
【００６１】
最終的に、本発明は、脂性皮膚を美的治療するための、ヒトカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ酵素の調節剤の化粧品としての使用を対象とする。
【００６２】
調節剤は酵素の阻害剤であることが好ましい。「阻害剤」という用語は、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼの酵素活性を除去または実質的に低減させる化合物または化学物質を指す。「実質的に」という用語は、少なくとも25%、好ましくは少なくとも35%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも70%または90%の低減を示す。さらに特定すると、阻害剤は、拮抗阻害型または非拮抗阻害型の化合物などの、酵素の触媒部位と相互作用し、それを遮断する化合物であってよい。
【００６３】
好ましい阻害剤は、阻害剤濃度が1μM未満、好ましくは0.1μM未満、より好ましくは0.01μM未満の溶液中で酵素と相互作用する。
【００６４】
調節剤化合物は、抗カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ阻害性抗体であってよく、モノクローナル抗体であることが好ましい。そのような阻害性抗体は、およそ0.01μg/ml〜およそ100μg/ml、好ましくはおよそ1μg/ml〜およそ5μg/mlの血漿濃度を得るのに十分な量を投与することが有利である。
【００６５】
調節剤化合物は、ポリペプチド、アンチセンスDNAポリヌクレオチドもしくはアンチセンスRNAポリヌクレオチド、siRNAまたはPNA(ペプチド核酸、プリン塩基およびピリミジン塩基で置換されたポリペプチド鎖、その空間的構造はDNAの空間的構造によく似ており、DNAにハイブリダイズさせることができる)であってもよい。
【００６６】
調節化合物は、アプタマーであってもよい。アプタマーは、分子認識の点で、抗体の代替物となる分子のクラスである。それらは、事実上全クラスの標的分子を高い親和性および特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなリガンドは、TuerkおよびGold、1990年による説明の通り、ランダム配列ライブラリーにおいて行う指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment)(SELEX)によって単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、DNAの組合せ化学合成によって得ることができる。このライブラリーにおいて、各メンバーは直鎖状の、場合によって化学修飾された、独自配列のオリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用および利点については、Jayasena、1999年、Clinical Chemistry 45(9)、1628〜1650頁に総説されている。
【００６７】
本発明は、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、または皮脂分泌過多に関連する皮膚障害を予防的かつ/または治癒的に治療するための、カルニチンオクタノイルトランスフェラーゼを阻害するそのような化合物の使用を含む。非制限的な態様で、ヒトCROTタンパク質の阻害剤として抗CROT抗体が挙げられる。
【００６８】
上記のスクリーニング方法によって同定される他の調節化合物も有用である。
【００６９】
調節化合物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物中に配合される。これらの組成物は、例えば、経口的、経腸的、非経口的、または局所的に投与することができる。医薬組成物は局所的に適用することが好ましい。経口投与に関しては、医薬組成物は、放出制御するための、錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルション、ミクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液または脂質または高分子ベシクルの形であってよい。非経口投与に関しては、医薬組成物は、点滴または注射するための溶液または懸濁液の形であってよい。
【００７０】
局所投与に関しては、医薬組成物は、さらに特定すると、皮膚および粘膜の治療に使用するためのものであり、軟膏、クリーム、ミルク、軟膏剤、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、噴霧剤、ローションまたは懸濁液の形であってよい。医薬組成物は、放出制御するための、ミクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液または脂質または高分子ベシクルまたは高分子パッチまたはヒドロゲルの形であってもよい。この局所適用するための組成物は、無水の形、水性の形、またはエマルションの形であってよい。好ましい変異型において、医薬組成物は、ゲル、クリームまたはローションの形である。
【００７１】
組成物は、CROT調節剤を、その組成物の全重量に対して0.001重量%〜10重量%、特に0.01重量%〜5重量%の範囲の含有量で含んでよい。
【００７２】
医薬組成物は、下記のような不活性添加物またはそれら添加物の組合せも含有してよい。
湿潤剤
調味料
パラヒドロキシ安息香酸エステルなどの保存料
安定剤
水分調整剤
pH調整剤
浸透圧調節剤
乳化剤
UV-A遮断剤およびUV-B遮断剤
アルファトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソールまたはブチルヒドロキシトルエン、スーパーオキシドジスムターゼ、ユビキノールまたはある種の金属キレート剤などの抗酸化剤
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示している。
【００７４】
(実施例)：実験データ
(実施例1)
ヒト皮脂腺およびヒト表皮におけるアセチルCoAアシルトランスフェラーゼ1の発現
双眼拡大鏡の下、ディスパーゼ(Dispase)を用いて処理し切開することにより、ヒト表皮からヒト皮脂腺を分離した。皮脂腺および表皮から全RNA試料を調製した。
【００７５】
Affymetrix station(マイクロ流体モジュール、ハイブリダイゼーションオーブン、スキャナ、コンピュータ)において、その会社によって供給されているプロトコルに従って遺伝子の発現を分析した。簡単に述べると、組織から単離した全RNAをcDNAに転写する。T7ポリメラーゼおよびビオチンにコンジュゲートさせたNTP前駆体を用いて、二本鎖cDNAからビオチン標識したcRNAを合成する。続いてこのcRNAを小さな断片に断片化する。酵素反応が非常に効率的であることを確認するために、全ての分子生物学的ステップをAgilentの「lab on a chip」システムを用いて検証する。Affymetrixチップをビオチン化cRNAとハイブリダイズさせ、すすぎ、続いてストレプトアビジンをコンジュゲートさせた蛍光体を用いて蛍光標識する。チップを洗浄した後スキャンし、結果をAffymetrixから供給されているMAS5ソフトウェアを用いて算出する。得られた値の有意性の指標として、各遺伝子について発現値を得た。発現量の有意性の算出は、所与遺伝子のcRNAと、完全に一致するオリゴヌクレオチド対オリゴヌクレオチドの中央部に単一のミスマッチを含有するオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に得られるシグナルの分析に基づく(Table1(表1)を参照されたい)。
【００７６】
【表１】
2011522518.tif 000002
【００７７】
(実施例2)
ラットの表皮における、PPARgアゴニストを用いた処理後のアセチルCoAアシルトランスフェラーゼ1の発現
ファジーラットの表皮剥離の発現データ
この研究は、研究開始時に10週齢である雌のファジーラット(Hsd:Fuzzy-fz)において行う。この動物を、(PPARgアゴニスト、ロシグリタゾンのアセトン溶液)1%の用量で1日1回、8日間処理する。最後の処理の2時間後、動物を安楽死により犠牲にし、背中の皮膚を切除する。ディスパーゼ中でインキュベートした後、真皮から皮脂腺を有する表皮を引き離す(表皮剥離)。試料を粉砕した後、Qiagenカラムを用いて、供給業者の説明書に従ってmRNAを調製する。このようにして調製された材料を、Affymetrixプラットフォームにおいて大規模トランスクリプトーム分析にかける。続いてデータを標準化し、統計分析後、生じた結果を、各データ断片に対して、転写の存在についての統計値が伴う恣意的な発現単位(以下を参照されたい)で表す(存在=1、非存在=0)。
【００７８】
【表２】
2011522518.tif 000003
【００７９】
(実施例3)
PPARγレセプターアゴニストで治療した後のラット皮脂腺における発現データ
材料と方法
動物：種：ラット
株：Ico：Hsd：FUZZY-fz
性：メス
齢：10週
バッチあたりの数：40（各群8匹）
処理：投与経路：局所的
化合物/バッチ：PPARγアゴニスト
−Ａ：5-{4-[2-(メチルピリジン-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン
−Ｂ：(2-メトキシエトキシメトキシ)ナフタレン-2-カルボン酸[4’-(2,4-ジオキソチアゾリジン-5-イルメチル)ビフェニル-3-イルメチル]メチルアミド、またはロシグリタゾン
−Ｃ：(S)-2-エトキシ-3-{4-[6-(3-ヘプチル-1-メチルウレイド)ピリジン-2-イル]フェニル}プロピオン酸
用量：1％
担体：アセトン(001)
継続時間：96時間
評価の方法：研究の開始時と終結時に動物を計量する。皮膚生検を採取し（ラットあたり採取される6の皮膚サンプル）、遺伝子の発現を分析する（RNA抽出、逆転写、及びリアルタイムPCR）。サンプルを4度で一晩貯蔵し、その後1Mの臭化ナトリウム(NaBr)で37℃で2時間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルを表皮または真皮に分類する。表皮サンプルを20度で貯蔵する。これらの条件下で、皮脂腺は表皮の破片に存在する。PCRを実施し、コントロールラットまたはPPARγアゴニストで処理されたラットから由来する皮脂腺を含む表皮破片から由来するcDNAで始める：mRNAをカラムを使用して抽出し、定性分析する。mRNAの量を測定し、18S/28S比によって表す。その結果を、非処理動物（担体群）に対する相対的な誘導として表される18Sに関して標準化する。修飾Monte Carlo統計分析に基づく内部ソフトウェアを使用して統計分析が得られる。
結果
【００８０】
【表３】
2011522518.tif 000004
【配列表】
2011522518000001.app
【国際調査報告】
2011522518.tif 000005
2011522518.tif 000006
2011522518.tif 000007
2011522518.tif 000008
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