(57)【要約】  本発明は、細胞浸透性ペプチドならびに細胞浸透性ペプチドおよびカーゴ分子のコンジュゲートを開示する。
2011523557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配置：
Ｎ末端［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］Ｃ末端
を有する、少なくとも３つのドメインで構成される一次配列構造を有するペプチドであって：
（ｉ）ドメイン１が：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］
ＲＢＲＲＸＲＲＢＲ［配列番号８２］、または
ＲＸＲＲＸＲ［配列番号７４］
より選択される配列を含み、
（ｉｉ）ドメイン２が：
ＩＬＦＱ［配列番号８６］、または
ＩＬＩＱ［配列番号２０２］
より選択される配列を含み、
（ｉｉｉ）ドメイン３が：
ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１５９］
ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１６２］
ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１６１］
ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１６０］
ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１６３］
ＭＫＷＨＫ［配列番号２０３］、または
ＷＫＷＨＫ［配列番号２０４］
より選択される配列を含む
式中、Ｘ＝アミノヘキシル、Ｂ＝ベータアラニン
前記ペプチド。
【請求項２】
ドメイン２がＩＬＦＱＹ［配列番号８８］、またはＩＬＩＱＹ［配列番号２９６］より選択される配列を含む、請求項１のペプチド。
【請求項３】
ドメイン２が：
Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４［配列番号８９］、または
Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４［配列番号２９７］
より選択される配列を含む
式中、Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし、Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし、Ｚ４＝ＮまたはＹ
請求項１または２のペプチド。
【請求項４】
ドメイン３が：
Ｚ７Ｚ８ＭＫＷＨＫ［配列番号２９８］、または
Ｚ７Ｚ８ＷＫＷＨＫ［配列番号２９９］
より選択される配列を含む
式中、Ｚ７＝Ｒ、ｄＲ、ＫまたはｄＫ（式中、ｄ＝Ｄ−アミノ酸）
Ｚ８＝Ｒ、ＨまたはＫ
請求項１〜３のいずれか一項のペプチド。
【請求項５】
ドメイン３が：
ｄＲＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１１］
ｄＲＨＭＫＷＨＫ［配列番号１５５］
ｄＲＲＷＫＷＨＫ［配列番号１５７］
ｄＫＲＭＫＷＨＫ［配列番号１５６］、または
ｄＫＨＷＫＷＨＫ［配列番号１５８］
より選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項のペプチド。
【請求項６】
ドメイン１が：
（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３または４［配列番号７４〜７６］、または
ＲＸＲＲＸＲＩｄＲ［配列番号８０］
より選択される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項のペプチド。
【請求項７】
天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基を含めて、最大長３０残基を有する、請求項１〜６のいずれか一項のペプチド。
【請求項８】
ドメイン１が６〜１１残基の長さを有し、ドメイン２が４〜９残基の長さを有し、そしてドメイン３が４〜１５残基の長さを有し、長さに天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基が含まれる、請求項１〜７のいずれか一項のペプチド。
【請求項９】
配列番号２４２〜２９５（図２５）の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１０】
配列番号２４２〜２９５（図２５）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１１】
Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊまたはＰｉｐ−５ｌ（配列番号２３０、２３４または２３６）の１つのドメイン１〜３またはドメイン１〜４の配列、あるいはＰｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊまたはＰｉｐ−５ｌ（配列番号２３０、２３４または２３６）の１つのドメイン１〜３またはドメイン１〜４の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１２】
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１８３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１８４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１８５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１８６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１８７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１８８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１８９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９０］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１９１］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１９２］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１９３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１９４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１９５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１９７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１９８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１９９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号２００］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号２０１］
式中：
Ｚ１＝（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （ＲＢＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （Ｒ）ｍ  式中、ｍ＝５、６、７または８；  ＲＸＲＲＸＲＩｄＲ［配列番号８０］；  ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］；またはＲＢＲＲＸＲＲＢＲ［配列番号８２］；
Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし
Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし
Ｚ４＝Ｎ、Ｙ
Ｚ５＝ＲまたはｄＲ、ＫまたはｄＫ  
式中、ｄ＝Ｄ−アミノ酸
の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１３】
配列番号３４〜７３（図１６）の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１４】
配列番号３４〜７３（図１６）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項のペプチド。
【請求項１５】
Ｃ末端にリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項のペプチド。
【請求項１６】
リンカー配列がＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、ＢＸ、またはＸＢより選択される、請求項１５のペプチド。
【請求項１７】
カーゴ分子に化学的にコンジュゲート化されている、請求項１〜１６のいずれか一項のペプチド。
【請求項１８】
コンジュゲート化がペプチドのＣ末端である、請求項１６のペプチド。
【請求項１９】
カーゴ分子が、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ロック化核酸（ＬＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬剤より選択される、請求項１７または１８のペプチド。
【請求項２０】
カーゴ分子が５，０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１９のペプチド。
【請求項２１】
カーゴ分子が、ＰＮＡＤＭＤ［配列番号１１５］またはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］あるいはＰＮＡＤＭＤ［配列番号１１５］またはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］の一方に少なくとも９０％の配列同一性を有する分子である、請求項１９または２０のペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチドを含む、薬学的組成物または薬剤。
【請求項２３】
薬学的に許容されうる希釈剤、アジュバントまたはキャリアーをさらに含む、請求項２２の薬学的組成物または薬剤。
【請求項２４】
疾患の治療法において使用するための請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項２５】
疾患の治療において使用するための薬剤の製造における、請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項２６】
患者に、請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチドを投与する工程を含む、治療が必要な患者における疾患の治療法。
【請求項２７】
疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型痴呆症、パーキンソン症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン−グリフォード早老症症候群、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）、または癌より選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項のペプチド、使用または方法。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチドまたはペプチド−カーゴ・コンジュゲートをコードする、単離核酸。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか一項記載のペプチドまたはペプチドカーゴ・コンジュゲートをコードする核酸に機能可能であるように連結された制御配列を有する、核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド、排他的にではないが、特に、細胞浸透性ペプチドに、そして細胞浸透性ペプチドおよびカーゴ分子のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
必須ＲＮＡ配列を標的化するオリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、細胞における遺伝子発現の調節において、そして潜在的な療法剤として、多くの適用が見出されている１、２。ＲＮアーゼＨ誘導性アンチセンスＯＮおよびＲＩＳＣ誘導性ｓｉＲＮＡ試薬に勝る、立体障害性ＯＮの機械的な利点は、特異性がより高いことであり、これは、正しくないＲＮＡへのＯＮの結合が、望ましくないオフターゲット生物学的影響を誘発する可能性が低いためである。第二に、はるかにより広い範囲の合成ＯＮ類似体が使用可能であり、これは宿主ＲＮＡ切断酵素による分子認識の必要がないためである。
【０００３】
立体障害性剤として有用なＯＮ類似体の中で最も主要なものは、非荷電主鎖を持つもの、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）３およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）４である。ＰＮＡおよびＰＭＯ  ＯＮはどちらも、療法剤の開発に向けたＲＮＡターゲティング適用のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられてきている５。細胞培養において、ＰＮＡおよびＰＭＯはどちらもかなり劣ってしか細胞に進入しないことが観察され、そしてしたがって、細胞送達を増進する方法を開発することに多くの努力が払われてきた。特に有用であったのは、ＰＮＡまたはＰＭＯにコンジュゲート化した際、ペプチドとしてのこれらの観察される細胞転位置力を利用可能であることが期待される、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、例えばペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン、および（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４（Ａｈｘ＝アミノヘキシル）の付着である６−９。
【０００４】
立体障害性ＯＮの活性を評価するのに有用なアッセイは、Ｋｏｌｅおよび同僚らによって確立されたものであり、これはＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞の核において１８マーの合成ＯＮによって異常なサラセミアβグロビンイントロン（７０５部位）をスプライス修正（ｓｐｌｉｃｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）し、そして続いてレポーター・ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼを上方制御することを伴う１０。このアッセイは、非常に高いダイナミックレンジを有するため、非常に低い活性レベルさえ、陽性発光読み取り値として測定可能である。７０５スプライス部位をターゲティングするＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートがこのアッセイで試験されてきており、そして添加されるトランスフェクション剤の非存在下で、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞とＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートをインキュベーションすると、いくつかの異なるＣＰＰに関して中程度の活性レベルが報告されている一方、ＰＮＡ単独では不活性である１１−１３。本発明者らの研究室では、アッセイにおける有意な活性を見るためには、Ｔａｔ−ＰＮＡまたは（Ｌｙｓ）８−ＰＮＡコンジュゲートは、エンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｉｔｃ）剤である１００μＭクロロキンとの同時インキュベーションを必要とする一方、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡおよび（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯ構築物では、クロロキンの非存在下で、μＭ範囲の活性を得ることが可能であることが見出された７、１６。
【０００５】
本発明者らはまた、既知のＣＰＰペネトラチンのＮ末端に６つのＡｒｇ残基が付加された新規ＣＰＰも報告している１７、１８。ＨＩＶ−１のトランス活性化応答要素ＲＮＡに相補的なＰＮＡにジスルフィド・コンジュゲート化されたＲ６−ペネトラチン（Ｒ６Ｐｅｎ）は、ルシフェラーゼ発現を阻害するために核送達およびＴＡＲ  ＲＮＡへの結合を必要とする、Ｔａｔ依存性トランス活性化阻害のＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、有意な活性を示した１８。
【０００６】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、主に、ジストロフィン遺伝子におけるナンセンスまたはフレームシフト突然変異によって引き起こされるＸ連鎖筋障害であり、生存男性出生３５００のうち、約１の頻度で生じ、そして可能性がある療法が非常に必要とされている２９。ＤＭＤ患者が、重度で進行性の筋萎縮を患う一方、より穏やかなベッカー型筋ジストロフィーは、インフレーム欠失によって引き起こされ、短くなったが部分的に機能を有するタンパク質の発現を生じる。配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）が、突然変異ジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームを修正するターゲティングエクソンスキッピングを誘導して、ベッカー型筋ジストロフィーのものと類似の活性を持つ、より短いジストロフィン型が産生されるようにすることが示されてきている３０、３１。細胞モデルにおいて、エクソン２３中にナンセンス突然変異を含有するｍｄｘジストロフィー性マウスモデル３１−３３において、そしてイヌモデルにおいて、エクソンスキッピングアプローチに関して極めて有望であることを示す研究が行われている。ＯＮが筋細胞核中のジストロフィン・プレｍＲＮＡに結合する結果、「立体障害」機構によって、スプライシングパターンの改変を引き起こす、生物学的活性が達成される。
【０００７】
エクソンスキッピングの効率を決定する最も重要な要因の１つは、ＯＮ化学である。最も広く用いられているのは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（２’ＯＭｅＰＳ）である。この主鎖は、筋内注射を伴って、ＤＭＤ患者におけるジストロフィン・プレｍＲＮＡのエクソン５１をターゲティングする第Ｉ相臨床試験で用いられている３４。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を用いて、類似の第Ｉ相試験が行われている３５。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、２’ＯｍｅＰＳに比較して、ＰＭＯを用いると、より高いレベルのエクソンスキッピングおよびジストロフィン発現の回復があることが示唆されてきている３５。ＰＭＯは非イオン性分子であり、そしてターゲット細胞の細胞内分子と望ましくない相互作用を形成する可能性がより低いと見なされる。
【０００８】
ＹｉｎおよびＷｏｏｄは、ｍｄｘマウスへの筋内注射によって、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる別の非イオン性類似体を調べており、そしてエクソンスキッピングおよびジストロフィン産生の有意な誘導を見出した２３。ＰＭＯおよびＰＮＡはどちらも、高い配列特異性を持つ非毒性ＯＮ類似体と見なされ、薬剤開発のための重要な潜在能力を有する。これまでのところ、ＰＭＯのみが臨床試験使用を認可された型で産生されており、そしてＰＮＡの療法的開発は立ち後れている。
【０００９】
いくつかの研究グループが、非イオン性ＯＮ（ＰＮＡまたはＰＭＯなど）とコンジュゲート化された際、細胞内への送達を補助し（しかし、イオン性型では補助しない）、そしてしたがって、ＯＮの生物学的活性をブーストする、ＣＰＰ（ときに、膜転位置ペプチドと呼ばれる）の設計に携わっている。ＰＭＯの場合、天然および非天然アミノ酸両方を含有するペプチド、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−Ａｈｘ−Ｂが、ＰＭＯとコンジュゲート化されると、多くの細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、より高いレベルの立体障害活性が生じることが開示されてきている３６。これは、マウスｍｄｘ  ＤＭＤ研究において調べられている３７。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ適用に有用であるためには、有効なスプライス修正、例えばＫｏｌｅらのスプライス修正ルシフェラーゼアッセイによって測定された際の約０．９０μＭ以下のＥＣ５０を可能にするために、ＣＰＰが、特に、ＰＮＡまたはＰＭＯなどのカーゴに付着した際に、細胞および核膜に有効に浸透することが立証されることが好ましい。さらに、細胞浸透前の分解に抵抗するため、ＣＰＰは優れた血清安定性を持たなければならない。療法的適用のため、ＣＰＰはまた、低毒性でなければならない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、一連の有望な細胞浸透性ペプチドを同定した。該ペプチドは、細胞および核膜を渡るカーゴの移動を促進する、キャリアー部分として作用しうる。ペプチド−カーゴ・コンジュゲートもまた提供する。
【００１２】
５つの新規ペプチドシリーズを調製し、そしてこれらをペプチド−ＰＮＡおよびペプチド−ＰＭＯカーゴ・コンジュゲートとして試験した。ペプチドおよび付着したカーゴを、図１５、１６、１７、１８および２５に示し、そして以下に要約する：
Ｐｉｐ−１［配列番号１０〜２０］；
Ｐｉｐ−２ａ、Ｐｉｐ−２ｂ、Ｐｉｐ−２ｃ［配列番号２１〜２３］；
Ｐｉｐ−３ａ、Ｐｉｐ−３ｂ［配列番号２４〜２５］；
Ｐｉｐ−４ａ、Ｐｉｐ−４ｂ、Ｐｉｐ−４ｃ、Ｐｉｐ−４ｄ、Ｐｉｐ−４ｅ、Ｐｉｐ−４ｆ、Ｐｉｐ４ｇ、Ｐｉｐ−４ｈ［配列番号２６〜３１および２１６〜２２１］；
Ｐｉｐ−５ａ、Ｐｉｐ−５ｂ、Ｐｉｐ−５ｃ、Ｐｉｐ−５ｄ、Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｆ、Ｐｉｐ−５ｇ、Ｐｉｐ−５ｈ、Ｐｉｐ５ｊ、Ｐｉｐ−５ｋ、Ｐｉｐ−５ｌ、Ｐｉｐ−５ｍ、Ｐｉｐ−５ｎ、Ｐｉｐ−５ｏ［配列番号２２２〜２２９および２３０〜２３９］。
【００１３】
Ｐｉｐ−２ａ［配列番号２１］、Ｐｉｐ−２ｂ［配列番号２２］、Ｐｉｐ−３ａ［配列番号２４］、Ｐｉｐ−４ｂ［配列番号２７］、Ｐｉｐ−４ｃ［配列番号２８］、Ｐｉｐ−５ａ［配列番号２２２］、Ｐｉｐ−５ｂ［配列番号２２３］、およびＰｉｐ−５ｃ［配列番号２２４］はすべて、ＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおいて、高レベルのスプライス修正を示し（図１５）、ペプチド−ＰＮＡコンジュゲートが核に浸透し、そしてＰＮＡ分子が機能することを示す。
【００１４】
Ｐｉｐ−２ａ［配列番号２１］、Ｐｉｐ−２ｂ［配列番号２２］およびＰｉｐ−３ａ［配列番号２４］は、高い血清安定性を示す（血清とともにインキュベーションした際、タンパク質分解に耐性である）。
【００１５】
Ｐｉｐ−５シリーズ（ａ〜ｏ）は、ＰＮＡＤＭＤおよびＰＭＯＤＭＤ両方を用いて、マウスｍｄｘ筋管において高いエクソンスキッピング活性を示した（図１７および１８）。
したがって、ＣＰＰ−ＰＮＡまたはＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートの細胞浸透性ペプチド構成要素、ならびに実質的に類似の配列同一性および構造を有するペプチドは、ＰＮＡ、ＰＭＯを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチドおよびタンパク質、ならびに小分子などのカーゴの、細胞および核浸透を促進する際に有用であると期待される。
【００１６】
したがって、本発明は、細胞膜、例えば哺乳動物細胞の形質膜および／または哺乳動物細胞の核膜に渡る、こうしたカーゴの取り込みを促進する際に有用なペプチドを提供する。該ペプチドは、「細胞浸透性ペプチド」と称することも可能であり、そして膜を渡るカーゴの輸送を促進するため、該ペプチドをカーゴにコンジュゲート化することも可能である。
【００１７】
本発明記載のペプチドは、化学的に隣接する単一分子である配列を有する。ペプチド配列は、アミノ酸および場合による非アミノ酸、例えばアミノヘキシルスペーサーで構成されてもよい。例えば、ペプチドのある部分では、アミノヘキシルスペーサーが第一のアミノ酸のＣ末端および第二のアミノ酸のＮ末端に化学的に結合され、それによって２つのアミノ酸を化学的に連結していてもよい。
【００１８】
ペプチドには、修飾および非天然存在アミノ酸が含まれてもよい。
各ペプチドは、以下の直線配置：
Ｎ末端［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］−［ドメイン４］Ｃ末端
の４つのドメインを含むか、または該ドメインからなる。
【００１９】
各ドメインは、共通の配列特性を有するが、各ドメインの正確な配列は、変動および修飾が可能である。したがって、各ドメインには、ある範囲の配列が可能である。ありうるドメイン配列各々の組み合わせによって、本発明の一部を形成する、ある範囲のペプチド配列が生じる。
【００２０】
コアペプチド配列は、ドメイン１〜３の隣接アミノ酸（および場合によるスペーサー）配列によって示される。ドメイン４は、カーゴへの連結を可能にするように配置される、場合によるリンカー配列である。いくつかの態様において、ドメイン４は存在しなくてもよく、例えば配列がなくてもよい。
【００２１】
以下の説明において、標準的一文字アミノ酸暗号を用いる。非天然アミノ酸およびスペーサー分子は、以下の一文字暗号を用いて称される。
Ｘ＝アミノヘキシル、β−アラニル、ｐ−アミノベンゾイル、イソニペコチル、または４−アミノブチリル
Ｂ＝ベータアラニン
ｈＲ＝ホモアルギニン
ｄ＝Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸によって置き換え可能である）
ドメイン１は、アルギニンリッチ配列であり、そして長さ４、５、６、７、８またはそれより多いアミノ酸であってもよい。好ましくは、ドメイン１は６アミノ酸を有する。好ましくは、これらはスペーサー基（例えばアミノヘキシル）によって間隔が空けられる。場合によって、これらのスペーサーは、ドメイン中に存在するアミノ酸の数には算入されない。スペーサー基には、アミノヘキシル、β−アラニル、ｐ−アミノベンゾイル、イソニペコチルおよび４−アミノブチリルなどの非天然メチレンリッチスペーサーが含まれてもよい。
【００２２】
好ましくは、ドメイン１は、陽イオン性アミノ酸のいくつかを分離する疎水性アミノ酸またはスペーサー基を伴う２以上の陽イオン性アミノ酸を有する。好ましい態様において、陽イオン性アミノ酸はアルギニン（Ｒ）である。好ましくは、ドメイン１は、少なくとも３つのアルギニン残基、より好ましくは少なくとも４つのアルギニン残基を有する。いくつかの態様において、ドメイン１は、５、６またはそれより多いアルギニン残基を含有する。
【００２３】
ドメイン１は、好ましくは、１２残基未満、より好ましくは１０残基未満の最大長、および６残基の最小長を有する（それぞれの長さには、場合によって、スペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸が含まれてもよい）。好ましいドメイン１配列は：
（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３または４；  ［配列番号７４〜７６］
（ＲＢＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３または４；  ［配列番号７７〜７９］
ＲＸＲＲＸＲＩｄＲ；  ［配列番号８０］
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ；  ［配列番号８１］
ＲＢＲＲＸＲＲＢＲ；または［配列番号８２］
（Ｒ）ｍ  式中、ｍ＝５、６、７または８；  ［配列番号８２〜８５］
の群より選択される。
【００２４】
ドメイン２は、アミノ酸配列ＩＬＦＱ［配列番号８６］、またはＩＬＩＱ［配列番号２０２］を含有する。より好ましくは、ドメイン２は、アミノ酸配列ＩＬＦＱＮ［配列番号８７］またはＩＬＦＱＹ［配列番号８８］、ＩＬＩＱＮ［配列番号２９９］またはＩＬＩＱＹ［配列番号２９６］を含有する。ＩＬＦＱまたはＩＬＩＱ配列は、配列のＮまたはＣ末端の一方または両方に、１、２、３、４または５つのさらなるアミノ酸を含有してもよい。好ましくは、Ｎ末端にはアミノ酸がないか、１つまたは２つのアミノ酸があり、そしてＣ末端にはアミノ酸がないか、１つまたは２つのアミノ酸がある。こうしたものとして、ドメイン２は、長さ４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸であってもよい。ドメイン２は、好ましくは疎水性ドメインである。
【００２５】
ドメイン２は、好ましくは１０残基未満、より好ましくは７残基未満の最大長、および３残基、より好ましくは４残基の最小長を有する（それぞれの長さには、場合によって、スペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸が含まれてもよい）。
【００２６】
さらなるアミノ酸は、任意のタイプであってもよい。ドメイン２のＮ末端では、好ましい配列には、ＩｄＫ、ＩＨ、ＩＲ、ＩｄＲ、例えば１つの疎水性および１つの陽イオン性アミノ酸が含まれる。ドメイン２配列のＣ末端では、好ましいアミノ酸には、ＮおよびＹ、例えば陽イオン性でもまた疎水性でもないものが含まれる。
【００２７】
ドメイン２の一般的な配列表示を以下に提供する：
ドメイン２＝Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４［配列番号８９］
ドメイン２＝Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４［配列番号２９７］
Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし
Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし
Ｚ４＝Ｎ、Ｙ。
【００２８】
したがって、好ましいドメイン２配列は：
配列番号                      配列番号
ＩＫＩＬＦＱＮ    ９０        ＩＫＩＬＦＱＹ    ９１
ＩｄＫＩＬＦＱＮ  ９２        ＩｄＫＩＬＦＱＹ  ９３
ＩＨＩＬＦＱＮ    ９４        ＩＨＩＬＦＱＹ    ９５
ＩＲＩＬＦＱＮ    ９６        ＩＲＩＬＦＱＹ    ９７
ＩＩＬＦＱＮ      ９８        ＩＩＬＦＱＹ      ９９
ＫＩＬＦＱＮ      １００      ＫＩＬＦＱＹ      １０１
ｄＫＩＬＦＱＮ    １０２      ｄＫＩＬＦＱＹ    １０３
ＨＩＬＦＱＮ      １０４        ＨＩＬＦＱＹ    １０５
ＲＩＬＦＱＮ      １０６        ＲＩＬＦＱＹ    １０７
ＩＬＦＱＮ        １０８        ＩＬＦＱＹ      １０９
の群、または：
配列番号                      配列番号
ＩＫＩＬＩＱＮ    １３５      ＩＫＩＬＩＱＹ    １３６
ＩｄＫＩＬＩＱＮ  １３７      ＩｄＫＩＬＩＱＹ  １３８
ＩＨＩＬＩＱＮ    １３９      ＩＨＩＬＩＱＹ    １４０
ＩＲＩＬＩＱＮ    １４１      ＩＲＩＬＩＱＹ    １４２
ＩＩＬＩＱＮ      １４３      ＩＩＬＩＱＹ      １４４
ＫＩＬＩＱＮ      １４５      ＫＩＬＩＱＹ      １４６
ｄＫＩＬＩＱＮ    １４７      ｄＫＩＬＩＱＹ    １４８
ＨＩＬＩＱＮ      １４９      ＨＩＬＩＱＹ      １５０
ＲＩＬＩＱＮ      １５１      ＲＩＬＩＱＹ      １５２
ＩＬＩＱＮ        １５３      ＩＬＩＱＹ        １５４
の群より選択される。
【００２９】
ドメイン３は陽イオン性ドメインであり、そして好ましくは：
ＲＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１０］
ｄＲＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１１］
ｄＲＨＭＫＷＨＫ［配列番号１５５］、
ｄＫＲＭＫＷＨＫ［配列番号１５６］、
ｄＲＲＷＫＷＨＫ［配列番号１５７］、
ｄＫＨＷＫＷＨＫ［配列番号１５８］、
ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１５９］、
ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１６０］、
ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１６１］、
ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１６２］、
ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１６３］、または
（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３または４；［配列番号７４〜７６］
より選択される配列を有する。
【００３０】
好ましくは、ドメイン３は、陽イオン性アミノ酸のいくつかを分離する疎水性アミノ酸またはスペーサー基を伴う２以上の陽イオン性アミノ酸を有する。好ましい態様において、陽イオン性アミノ酸はアルギニン（Ｒ）である。好ましくは、ドメイン３は、少なくとも３つのアルギニン残基、より好ましくは少なくとも４つのアルギニン残基を有する。いくつかの態様において、ドメイン３は、４、５、６またはそれより多いアルギニン残基を含有する。
【００３１】
いくつかの態様において、ドメイン３は、４アミノ酸の最小長および１５アミノ酸の最大長を有する（場合によって、スペーサー基、例えばＸ、および非天然アミノ酸を除く）。いくつかの態様において、スペーサー基を含む最小長は５以上であり、そしてスペーサー基を含む最大長は９以下である。
【００３２】
ドメイン１および３におけるアミノヘキシルおよびベータアラニンの使用は、ペプチドの免疫原性を最小限にするのを補助する点で好適である。
ドメイン４は、カーゴへのペプチドの化学的連結を可能にするよう配置されたリンカー配列である。ドメイン４配列はまた、カーゴからペプチドのドメイン１〜３部分を分離するスペーサーとしても作用しうる。ある範囲のリンカー配列が可能であり、これには、ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール−マレイミド連結の形成を可能にするＣ末端システイン残基を有する配列が含まれる。カーゴにペプチドを連結する他の方法には、オキシムを形成するＣ末端アルデヒドの使用、ペプチド上の塩基性アミノ酸とのモルホリノ連結のクリック反応または形成が含まれ、これに、ＸまたはＢまたはＸＢまたはＢＸを含むドメイン３前のスペーサー配列が続いてもよい。
【００３３】
ドメイン４リンカー配列は、長さ１、２、３、４または５あるいはそれより多いアミノ酸であってもよい（スペーサー基を含む）。ドメイン４リンカー配列は：ＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸまたはＸＢの群より選択されてもよい。任意のＢまたはＸを別のスペーサーによって置換してもよく、これは例えば、４−アミノブチリル（Ａｉｂ）およびイソニコペコチルより選択可能である。
【００３４】
ドメイン４のリンカー配列は、ペプチドが付着されるカーゴの一部を形成してもよい。いくつかの態様において、カーゴは、ドメイン３配列のＣ末端に直接付着する。こうしたものとして、いくつかの態様において、ドメイン４配列はまったく必要でないか、またはカーゴおよびドメイン３配列の連結によって提供される。
【００３５】
上記にしたがって、本発明記載のペプチドは以下のように表されることも可能であり：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫＺ６［配列番号１１２］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫＺ６［配列番号１６４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫＺ６［配列番号１６５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫＺ６［配列番号１６６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲＺ６［配列番号１６７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲＺ６［配列番号１６８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＲＸＲＺ６［配列番号１６９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲＺ６［配列番号１７０］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲＺ６［配列番号１７１］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＺ６［配列番号１７２］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫＺ６［配列番号１７３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫＺ６［配列番号１７４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫＺ６［配列番号１７５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫＺ６［配列番号１７６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲＺ６［配列番号１７７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲＺ６［配列番号１７８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＲＸＲＺ６［配列番号１７９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲＺ６［配列番号１８０］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲＺ６［配列番号１８１］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＺ６［配列番号１８２］
そして好ましいペプチドは配列：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１８３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１８４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１８５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１８６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１８７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１８８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１８９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９０］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１９１］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１９２］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１９３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１９４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１９５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１９７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１９８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１９９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号２００］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号２０１］
式中：
Ｚ１＝（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （ＲＢＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （Ｒ）ｍ  式中、ｍ＝５、６、７または８；  ＲＸＲＲＸＲＩｄＲ［配列番号８０］；  ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］；あるいはＲＢＲＲＸＲＲＢＲ［配列番号８２］；
Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし
Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし
Ｚ４＝Ｎ、Ｙ
Ｚ５＝ＲまたはｄＲ、ＫまたはｄＫ
Ｚ６＝リンカー
を有する。
【００３６】
好ましいペプチドは、配列番号１０〜３３または配列番号２０８〜２１０（図１５）、配列番号３４〜７３（図１６）または配列番号２４２〜２９５（図２５）、配列番号１１２または１１３または配列番号１６４〜２０１の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなってもよい。好ましいペプチドは、Ｃ末端に、ＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓまたはＸＢＣｙｓ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸまたはＸＢの１つのドメイン４リンカー配列を有してもよい。
【００３７】
本発明記載のペプチドは、配列番号３４〜７３または配列番号２４２〜２９５のいずれか１つより選択されてもよい。
カーゴ分子を除いて、本発明記載のペプチドは、３０アミノ酸、より好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸の１つの最大長、および１０アミノ酸、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸の１つの最小長を有してもよい（最大長および最小長は、場合によって、いかなるスペーサー分子、例えばアミノヘキシル基も除くが、非天然または修飾アミノ酸を含む）。
【００３８】
本発明記載のペプチドは、ペプチドが、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれか、好ましくはＣ末端で、ペプチドに化学的に連結した（好ましくは共有結合した）カーゴ分子をさらに含む、ペプチド−カーゴ・コンジュゲートとして提供されてもよい。化学連結は、ジスルフィド結合、チオエーテルまたはチオール−マレイミド連結を介してもよい。
【００３９】
カーゴ分子は、任意の小分子、例えば、小分子薬剤、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、薬学的剤または療法剤であってもよい（例えば５，０００Ｄａ未満、好ましくは３０００Ｄａ未満または１０００Ｄａ未満の分子量）。カーゴ分子は、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＮＡ、ＰＭＯ、ＬＮＡなど）、またはｓｉＲＮＡであってもよい。好ましいカーゴ分子は、ＰＮＡまたはＰＭＯなどの電気的に中性なオリゴヌクレオチド類似体である。
【００４０】
１つの態様において、カーゴはＰＮＡ７０５（配列番号１１４）である。別の態様において、カーゴはＰＮＡＤＭＤ（配列番号１１５）である。別の態様において、カーゴはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］である。カーゴ分子は、ＰＮＡＤＭＤ［配列番号１１５］またはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］の１つに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。リジン残基をこれらのＰＮＡまたはＰＭＯ分子の一端または両端に付加して、水溶性を改善してもよい。Ｎ末端にシステインを付加して、チオエーテルコンジュゲート化のためのジスルフィド結合形成またはブロモアセチル化を可能にしてもよい。
【００４１】
本発明記載のペプチドを、カーゴ分子を伴いまたは伴わず、単離または精製型で提供してもよい。
ペプチドの誘導体もまた、本発明の一部を形成する。ペプチド誘導体には、所定のペプチド配列（例えば、配列番号１０〜３３または配列番号２０８〜２１０または配列番号３４〜７３または配列番号２４２〜２９５の１つ）の変異体であって、全長ペプチドに対して実質的なアミノ酸配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）を有し、そして好ましくは同じかまたはより優れたスプライス修正活性および／または血清安定性を有する前記変異体が含まれる。ペプチド誘導体は、配列番号１０〜３３または配列番号２０８〜２１０または配列番号３４〜７３または配列番号２４２〜２９５の１つより、１、２または３多いかまたは少ない、アミノ酸またはスペーサー分子を有してもよい。
【００４２】
配列同一性パーセント（％）は、配列を整列させ、そして最大配列同一性を達成するために必要であればギャップを導入した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、所定の列挙した配列（配列番号によって称される）中の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基（場合によってスペーサー基を含む）の割合と定義される。配列同一性は、好ましくは、それぞれの配列の全長に渡って計算される。
【００４３】
アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当業者に知られる多様な方式で達成可能であり、これには例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２、Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いるものがある。こうしたソフトウェアを用いる場合、好ましくは、例えば、ギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関するデフォルトパラメータを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２のデフォルトパラメータは：タンパク質ギャップオープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【００４４】
ペプチド誘導体はまた、例えば、以下の群内のアミノ酸間であってもよい、保存的アミノ酸置換も含んでもよい：
（ｉ）グリシン、アラニン、セリン、スレオニン；
（ｉｉ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；
（ｉｉｉ）アルギニン、ヒスチジンおよびリジン；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミン；
（ｖ）イソロイシン、ロイシンおよびバリン；
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００４５】
本発明記載のペプチドは、好ましくは、ＫｏｌｅらのＨｅＬａ細胞スプライシング修正モデル１０において、高い活性を示す。好ましくは、このアッセイで確立されるＥＣ５０は、１μＭ未満、より好ましくは０．９μＭ未満、より好ましくは０．８μＭ未満、さらにより好ましくは０．７μＭ未満、さらにより好ましくは０．６μＭ未満である。本発明記載のペプチドは、好ましくは、Ｒ６Ｐｅｎまたは（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４の１つと比較して、ＨｅＬａ細胞スプライシング修正モデルにおいて、より高いかまたは同じ活性を示す（すなわちペプチドはより低いかまたは同じＥＣ５０を有する）。
【００４６】
本発明記載のペプチドは、好ましくは、Ｒ６Ｐｅｎと比較して、血清（例えばマウスまたはヒト血清）中で、１時間後、血清安定性増加を示し、そして好ましくは、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４と同等かまたはそれより高い血清安定性を示す。０、１５、３０、６０および１２０分で採取し、そして５０μＬのＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）中の１０％  ＤＣＡで希釈した１０μＬアリコットを含み、２０％マウス血清を含有するＰＢＳ中、３７℃で血清安定性を測定してもよい。試料を混合し、そして−２０℃で維持して、沈殿した血清タンパク質を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）によって分離して、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってペプチド分解に関して上清を分析する。
【００４７】
本発明のペプチドおよびペプチドコンジュゲートにおいて、アミノ酸、アミノ酸スペーサーおよびカーゴ分子はすべて、好ましくは、共有結合によって化学的に連結される。
本発明記載のペプチドおよびペプチド−カーゴ・コンジュゲートは、医学的治療法において使用するために提供されてもよい。医学的治療は、好ましくは、細胞および場合によって細胞の核内へのカーゴ分子の送達を必要としうる。
【００４８】
したがって、疾患の治療において使用するため、ペプチドおよび／またはペプチド−カーゴ・コンジュゲートを提供する。疾患の治療のための薬剤の製造におけるペプチドおよび／またはペプチド−カーゴ・コンジュゲートの使用もまた提供する。疾患状態の治療が必要な患者または被験体の治療法であって、患者または被験体に、療法的有効量のペプチドおよび／またはペプチド−カーゴ・コンジュゲートを投与する工程を含む、前記方法もまた提供する。好ましくは、ペプチド−カーゴ・コンジュゲートのカーゴ構成要素は、疾患を治療するか、防止するかまたは軽減することが可能な活性剤（例えば薬学的剤）を含む。
【００４９】
治療すべき疾患には、薬学的または療法的分子による細胞および／または核膜の浸透改善が、療法効果改善につながりうるいかなる疾患も含まれうる。治療すべき疾患には、（全体にまたは部分的に）スプライシング不全によって引き起こされる疾患状態、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、メンケス病３８、β−サラセミア３９、前頭側頭型痴呆症、パーキンソン症および脊髄性筋萎縮症を軽減するタウタンパク質のスプライス修正３９、ハンチントン−グリフォード早老症症候群４０、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）４１、または癌が含まれてもよい。こうした場合、ペプチドカーゴは、スプライシング欠陥を防止するかまたは修正し、そして／または正しくスプライシングされたｍＲＮＡ分子の産生（例えばその数）を増加させることが可能な、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＰＭＯまたはＬＮＡを含んでもよい。
【００５０】
ＰＮＡＤＭＤまたはＰＭＯＤＭＤのいずれかにコンジュゲート化された本発明記載のペプチドは、心臓および腹筋においてスプライス修正の優れた有効性を示し、ジストロフィン線維の産生を導くことが示された。ＤＭＤを患う患者においては、心不全および肺不全が主な死因であるため、本発明記載のペプチドは、エクソンスキッピングを誘導して、正常なジストロフィンの産生を導くことが可能なオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡまたはＰＭＯ）にコンジュゲート化させることによって、ＤＭＤの治療に特に有用である。さらに、ＰＭＯＤＭＤは、ＰＮＡＤＭＤに対して、エクソンスキッピングアッセイにおいて、均一により高い活性を示すため、ペプチド−ＰＭＯＤＭＤコンジュゲートは、ＤＭＤの治療に特に有用であると見なされる。
【００５１】
治療すべき患者または被験体は、任意の動物またはヒトであってもよい。患者または被験体は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒト患者である。患者または被験体は、男性または女性であってもよい。
【００５２】
本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物を、いくつかの経路による投与のために配合してもよく、経路には、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内、口腔および鼻が含まれる。薬剤および組成物を液体または固体型で配合してもよい。液体配合物は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与のために配合されてもよい。
【００５３】
投与は好ましくは、個体に対して利益を示すのに十分な量である、「療法的有効量」である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療中の疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量に関する決定などは、開業医および他の医師の責任内であり、そして典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第２０版，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【００５４】
ペプチドおよびペプチド−カーゴ・コンジュゲートはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するためにも提供される。例えば、スプライス修正アッセイまたは血清安定性アッセイにおけるペプチドおよび／またはペプチド−カーゴ・コンジュゲートの使用を提供する。
【００５５】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた実験を含むよう意図され、一方、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）多細胞生物を用いた実験を含むよう意図される。
【００５６】
本発明記載のペプチドをコードする核酸もまた提供する。本発明記載のペプチドをコードする核酸に機能可能であるように連結された制御配列、例えばプロモーターを有する核酸ベクター、例えばプラスミドもまた提供する。ベクターは、好ましくは、適切な細胞、例えば哺乳動物、細菌または真菌細胞内にトランスフェクションされた際、ペプチドを発現可能である。核酸を単離または精製型で提供してもよい。
【００５７】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結された」には、制御配列の影響または調節下で、ヌクレオチドコード配列の発現を行う方式で、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列が共有結合した状況が含まれてもよい。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部またはすべてを形成するヌクレオチドコード配列の転写を達成可能であるならば、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されている。適切な場合、生じた転写物を次いで、所望のペプチドに翻訳してもよい。
【００５８】
上記にしたがって、本発明の以下の側面および態様を提供する。
本発明の１つの側面において、配置：
Ｎ末端［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］Ｃ末端
を有する、少なくとも３つのドメインで構成されるアミノ酸配列構造を有するペプチドであって：
１．ドメイン１が少なくとも４つのアルギニン残基および１以上のＸまたはＢ残基を含み；
２．ドメイン２が、配列ＩＬＦＱ［配列番号８６］、またはＩＬＩＱ［配列番号２０２］を含み；
３．ドメイン３が、少なくとも３つのアルギニン残基および１以上のＸまたはＢ残基を有する配列を含むか、あるいは配列ＭＫＷＨＫ［配列番号２０３］、またはＷＫＷＨＫ［配列番号２０４］を含むかいずれかである
前記ペプチドを提供する。
【００５９】
ドメイン１および３において、アルギニン残基は、好ましくは、ドメイン１および３の各々の隣接一次配列中で２より多いアルギニン残基が隣接しないように、１つまたは２つの疎水性残基、例えば配列Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＸＢまたはＢＸ中の１つまたは２つのアミノヘキシル（Ｘ）またはベータアラニン（Ｂ）残基によって間隔を空けられている。
【００６０】
本発明の別の側面において、配置：
Ｎ末端［ドメイン１］−［ドメイン２］−［ドメイン３］Ｃ末端
を有する、少なくとも３つのドメインで構成される一次配列構造を有するペプチドであって：
（ｉ）ドメイン１が：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］
ＲＢＲＲＸＲＲＢＲ［配列番号８２］、または
ＲＸＲＲＸＲ［配列番号７４］
より選択される配列を含み
（ｉｉ）ドメイン２が：
ＩＬＦＱ［配列番号８６］、または
ＩＬＩＱ［配列番号２０２］
より選択される配列を含み
（ｉｉｉ）ドメイン３が：
ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１５９］
ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１６２］
ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１６１］
ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１６０］
ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１６３］
ＭＫＷＨＫ［配列番号２０３］、または
ＷＫＷＨＫ［配列番号２０４］
より選択される配列を含む
式中、Ｘ＝アミノヘキシル、Ｂ＝βアラニン
前記ペプチドを提供する。
【００６１】
いくつかの態様において、ドメイン２は、ＩＬＦＱＹ［配列番号８８］、またはＩＬＩＱＹ［配列番号２９６］より選択される配列を含む。いくつかの態様において、ドメイン２は、Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４［配列番号８９］、またはＺ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４［配列番号２９７］、式中、Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし、Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし、Ｚ４＝ＮまたはＹ、より選択される配列を含む。
【００６２】
いくつかの態様において、ドメイン３は、Ｚ７Ｚ８ＭＫＷＨＫ［配列番号２９８］、またはＺ７Ｚ８ＷＫＷＨＫ［配列番号２９９］、式中、Ｚ７＝Ｒ、ｄＲ、ＫまたはｄＫ（式中、ｄ＝Ｄ−アミノ酸）、およびＺ８＝Ｒ、ＨまたはＫ、より選択される配列を含む。いくつかの態様において、ドメイン３は： 
ｄＲＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１１］
ｄＲＨＭＫＷＨＫ［配列番号１５５］、
ｄＲＲＷＫＷＨＫ［配列番号１５７］、
ｄＫＲＭＫＷＨＫ［配列番号１５６］、または
ｄＫＨＷＫＷＨＫ［配列番号１５８］
より選択される配列を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、ドメイン１は、（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３または４；［配列番号７４〜７６］、またはＲＸＲＲＸＲＩｄＲ［配列番号８０］より選択される配列を含む。
【００６４】
いくつかの態様において、ペプチドは、天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基を含めて、３０残基の最大長を有する。いくつかの態様において、ドメイン１は６〜１１残基の長さを有し、ドメイン２は４〜９残基の長さを有し、そしてドメイン３は４〜１５残基の長さを有し、長さには、天然アミノ酸、ＸおよびＢ残基が含まれる。
【００６５】
いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２４２〜２９５（図２５）の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号２４２〜２９５（図２５）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる。
【００６６】
いくつかの態様において、ペプチドは、Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊまたはＰｉｐ−５ｌ（配列番号２３０、２３４または２３６）の１つのドメイン１〜３またはドメイン１〜４の配列、あるいはＰｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊまたはＰｉｐ−５ｌ（配列番号２３０、２３４または２３６）の１つのドメイン１〜３またはドメイン１〜４の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる。
【００６７】
いくつかの態様において、ペプチドは：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１１３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１８３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１８４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１８５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１８６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１８７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１８８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１８９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９０］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＦＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号１９１］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＭＫＷＨＫ［配列番号１９２］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＭＫＷＨＫ［配列番号１９３］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＲＷＫＷＨＫ［配列番号１９４］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４Ｚ５ＨＷＫＷＨＫ［配列番号１９５］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号１９６］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＸＲＸＲ［配列番号１９７］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＲＸＲ［配列番号１９８］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＢＲＸＲＢＲ［配列番号１９９］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸＲ［配列番号２００］
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＩＬＩＱＺ４ＲＸＲＢＲＸ［配列番号２０１］
式中：
Ｚ１＝（ＲＸＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （ＲＢＲ）ｎ  式中、ｎ＝２、３、または４；  （Ｒ）ｍ  式中、ｍ＝５、６、７または８；  ＲＸＲＲＸＲＩｄＲ［配列番号８０］；  ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］；またはＲＢＲＲＸＲＲＢＲ［配列番号８２］；
Ｚ２＝Ｉまたはアミノ酸なし
Ｚ３＝Ｋ、ｄＫ、Ｈ、Ｒまたはアミノ酸なし
Ｚ４＝Ｎ、Ｙ
Ｚ５＝ＲまたはｄＲ、ＫまたはｄＫ  
式中、ｄ＝Ｄ−アミノ酸
の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる。
【００６８】
いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３４〜７３（図１６）の１つより選択される配列を含むか、または該配列からなる。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号３４〜７３（図１６）の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または該配列からなる。
【００６９】
いくつかの態様において、ペプチドは、Ｃ末端にリンカー配列をさらに含む。リンカー配列は、ＢＣｙｓ、ＸＣｙｓ、Ｃｙｓ、ＧＧＣｙｓ、ＢＢＣｙｓ、ＢＸＣｙｓ、ＸＢＣｙｓ、ＢＸ、またはＸＢより選択されてもよい。
【００７０】
いくつかの態様において、ペプチドは、カーゴ分子に化学的にコンジュゲート化されている。コンジュゲート化はペプチドのＣ末端であってもよい。
カーゴ分子は、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ロック化核酸（ＬＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬剤より選択されてもよい。カーゴ分子は５，０００Ｄａ未満の分子量を有してもよい。いくつかの態様において、カーゴ分子は、ＰＮＡＤＭＤ［配列番号１１５］またはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］あるいはＰＮＡＤＭＤ［配列番号１１５］またはＰＭＯＤＭＤ［配列番号２０６］の一方に少なくとも９０％の配列同一性を有する分子である。
【００７１】
本発明のさらなる側面において、本発明記載のペプチドを含む、薬学的組成物または薬剤を提供する。薬学的組成物または薬剤は、薬学的に許容されうる希釈剤、アジュバントまたはキャリアーをさらに含んでもよい。
【００７２】
本発明の別の側面において、疾患の治療法において使用するための本発明記載のペプチドを提供する。本発明の別の側面において、疾患の治療において使用するための薬剤の製造における、本発明記載のペプチドの使用を提供する。
【００７３】
本発明のさらなる側面において、患者に、本発明記載のペプチドを投与する工程を含む、治療が必要な患者における疾患の治療法を提供する。
ペプチド模倣体
既知の薬学的または生物学的活性化合物に対する模倣体の設計は、「リード」化合物に基づく薬学的剤および療法剤の開発に対する既知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難であるかまたは高価である場合、あるいは特定の投与法には望ましくない場合に、望ましい可能性もあり、例えばいくつかのペプチドは、消化管中のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるため、口腔組成物には適していない活性剤でありうる。模倣体設計、合成および試験は、ターゲット特性に関して、多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するため、一般的に用いられる。
【００７４】
所定のターゲット特性を有する化合物から模倣体を設計する際に、一般的に取られるいくつかの工程がある。第一に、ターゲット特性を決定する際に必須であり、そして／または重要である、化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変化させることによって、例えば各残基を順に置換することによって、実行可能である。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られる。
【００７５】
ファルマコフォアが発見されたならば、ある範囲の供給源、例えば分光学的技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ由来のデータを用いて、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび／または電荷にしたがって、構造をモデリングする。コンピュータ分析、類似性マッピング（原子間の結合よりも、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデリングする）および他の技術が、このモデリングプロセスにおいて使用可能である。
【００７６】
このアプローチの変形として、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造をモデリングする。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが、結合した際に、コンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、模倣体設計において、モデルがこれを考慮することが可能になる。
【００７７】
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基を移植可能であるテンプレート分子を選択する。テンプレート分子およびその上に移植される化学基は、好適には、模倣体の合成が容易であり、模倣体が薬理学的に許容されうる可能性が高く、そして模倣体がｉｎ  ｖｉｖｏで分解されない一方、リード化合物の生物学的活性を維持するように、選択可能である。次いで、このアプローチで発見された単数または複数の模倣体をスクリーニングして、これらがターゲット特性を有するかどうか、またはどの程度の度合いでこれを示すかを見てもよい。次いで、さらなる最適化または修飾を行って、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは臨床試験のための、１以上の最終模倣体に到達してもよい。
【００７８】
本発明に関して、ペプチド構造を修飾し、場合によってその後、スプライス修正アッセイまたはエクソンスキッピングアッセイにおいて、および／または血清安定性アッセイにおいて、修飾ペプチドを試験する工程を含む方法を提供する。ペプチドまたはペプチド模倣体のこの修飾プロセスを、所望に応じて、所望のスプライス修正またはエクソンスキッピング活性および／または血清安定性を有するペプチドが同定されるまで、何回でも反復してもよい。
【００７９】
使用する修飾工程は、ペプチドまたはペプチド模倣体の長さの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）（これはより短い長さのペプチドまたはペプチド模倣体を合成する工程を含んでもよい）、１以上のアミノ酸残基または化学基の置換、ならびに／あるいは安定性、分解に対する耐性、細胞膜を渡る輸送および／または体からのクリアランスに対する耐性を増加させるためのペプチドまたはペプチド模倣体の化学的修飾を含んでもよい。
【００８０】
本発明には、こうした組み合わせが明らかに許容されえないかまたは明白に回避される場合を除いて、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
本明細書で用いるセクション見出しは、構造化の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定すると見なされないものとする。
【００８１】
本発明の側面および態様は、ここで、付随する図を参照することによって、例示されるであろう。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本文中に言及されるすべての文書が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の原理を例示する態様および実験が、ここで、付随する図を参照して、論じられるであろう：
【図１】ＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートのスプライス修正活性。コンジュゲートの非存在下でＯｐｔｉＭＥＭ中でインキュベーションした対照ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞から生じた発光と比較した、ＯｐｔｉＭＥＭおよび１μＭのコンジュゲート１ａ〜１ｅ（Ａ）または２ａ〜２ｇ（Ｂ）（表１−図３を参照されたい）中で４時間インキュベーションしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞から生じた発光の倍増加として、活性レベルを示す。先に報告されるように、トランスフェクション２０時間後に、ルシフェラーゼ発現を定量化した１９。提示するデータは、少なくとも３つの実験からの平均であり、そしてエラーバーを示す。
【図２】ＡＴＰ枯渇（ＡＴＰ）または低温（４℃）の効果によって測定されるように、エネルギー依存機構による内在化を示す、Ｒ６Ｐｅｎ−ＰＮＡコンジュゲート、Ｒ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ３（ジスルフィド連結）およびＲ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｃ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ３（安定連結）のスプライス修正活性。細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中、４℃または３７℃で３０分間（温度依存性）、あるいは１０ｍＭ  ＮａＮ３および６ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコースを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中、３７℃で（ＡＴＰ枯渇）プレインキュベーションし、そして適切なように４℃または３７℃で、１μＭコンジュゲートと１時間さらにインキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、そしてＤＭＥＭ完全培地中で２３時間、インキュベーションを続け、そしてルシフェラーゼアッセイを、図１におけるように実行した。
【図３】表１−ＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートの命名、配列（配列番号１１６〜１２８）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データ。
【図４】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、２０％血清中に１時間置いた（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４Ｃ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ６９４４．３６）の安定性、コンジュゲートがこれらの条件下で大部分安定であったことを示す。
【図５】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、２０％血清中に１時間置いたＲ６ＰｅｎＣ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８５２４．１４）の安定性、コンジュゲートがこれらの条件下で完全に切断されたことを示す。
【図６】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、２０％血清中に１時間置いたＰｉｐ１−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８３９１．１６）の安定性、コンジュゲートがこれらの条件下で完全に切断されたことを示す。
【図７】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、２０％血清中に１時間置いたＰｉｐ２ｂ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８４８０．１７）の安定性、コンジュゲートがこれらの条件下で大部分安定であったことを示す。
【図８】ペプチド−ＰＮＡコンジュゲートによるルシフェラーゼ活性の用量依存性上方制御。ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞を、増加する濃度（０．３〜０．４〜０．６〜０．８〜１．２μＭ）のＰｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５（別名、Ｐｉｐ−２ｂ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ、図７を参照されたい）およびＰｉｐ−３ａ−ＰＮＡ７０５コンジュゲートと４時間インキュベーションした。ルシフェラーゼ発現を２０時間後に定量化し、そして未処理細胞に対して標準化して、発光の倍増加値を生じた。
【図９】ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって判断した際の用量依存性スプライシング修正。上部バンドは異常なＲＮＡ転写物であり、そして下部バンドはスプライシング修正されたＲＮＡ転写物である。ＵＴは未処理ＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡを示す。
【図１０】ペプチド−ＰＮＡコンジュゲート、Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５およびＰｉｐ−３ａ−ＰＮＡ７０５に関して、図９中のゲル（ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）をスキャニングすることによってＥＣ５０がどのように決定されるかを示すグラフ。
【図１１Ａ】（Ａ）ジストロフィンＲＮＡに関する入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた、増加する濃度のＰｉｐ−３ａ−ＰＮＡＤＭＤで処理した分化マウスｍｄｘ筋芽細胞で見られるエクソンスキッピング。
【図１１Ｂ】（Ｂ）（Ｒ−Ｘ−Ｒ）４−ＰＮＡＤＭＤ、Ｐｉｐ−１−ＰＮＡＤＭＤ、Ｐｉｐ−３ａ−ＰＮＡＤＭＤで処理した分化マウスｍｄｘ筋芽細胞におけるエクソンスキッピング活性の比較。すべての構築物は安定なチオエーテル連結を有する。
【図１２】１μＭ濃度のＣＰＰ−ＰＮＡ７０５コンジュゲート：Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡ７０５、および（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４Ａｈｘ−βＡｌａ−ＰＭＯでのＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞の処理を伴って発光測定によって判断した際のルシフェラーゼ産生の倍増加。
【図１３】ＰＮＡＤＭＤおよび多様なＣＰＰ−ＰＮＡＤＭＤ構築物をｍｄｘマウスの前脛骨筋に注射した後、ｎｍｏｌｅあたりのジストロフィン陽性線維数を示すグラフ。
【図１４】Ｒ６Ｐｅｎ−ＰＮＡ７０５、Ｐｉｐ−１−ＰＮＡ７０５、Ｐｉｐ−２ａ−ＰＮＡ７０５、Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５および（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡ７０５候補ＣＰＰ−ＰＮＡに関する、３７℃および４℃での、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞におけるスプライス修正アッセイ由来のルシフェラーゼ発現（相対光単位／μｇタンパク質）。
【図１５Ａ】ドメイン１〜４およびＰＮＡ７０５またはＰＮＡＤＭＤカーゴに関するペプチド配列を含む、試験したペプチドコンジュゲートを示す表。ＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおける、コンジュゲートに関するＥＣ５０を提供する。１時間の安定性を血清安定性アッセイにおいて評価した。
【図１５Ｂ】ドメイン１〜４およびＰＮＡ７０５またはＰＮＡＤＭＤカーゴに関するペプチド配列を含む、試験したペプチドコンジュゲートを示す表。ＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおける、コンジュゲートに関するＥＣ５０を提供する。１時間の安定性を血清安定性アッセイにおいて評価した。
【図１５Ｃ】ドメイン１〜４およびＰＮＡ７０５またはＰＮＡＤＭＤカーゴに関するペプチド配列を含む、試験したペプチドコンジュゲートを示す表。ＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおける、コンジュゲートに関するＥＣ５０を提供する。１時間の安定性を血清安定性アッセイにおいて評価した。
【図１５Ｄ】ドメイン１〜４およびＰＮＡ７０５またはＰＮＡＤＭＤカーゴに関するペプチド配列を含む、試験したペプチドコンジュゲートを示す表。ＨｅＬａ細胞ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおける、コンジュゲートに関するＥＣ５０を提供する。１時間の安定性を血清安定性アッセイにおいて評価した。
【図１６】本発明記載のドメイン１〜３ペプチド配列を示す表。
【図１７Ａ】マウスｍｄｘ筋管における、ＰＮＡＤＭＤカーゴにコンジュゲート化されたある範囲のＰｉｐペプチドに関するエクソンスキッピング活性を示す表。
【図１７Ｂ】マウスｍｄｘ筋管における、ＰＮＡＤＭＤカーゴにコンジュゲート化されたある範囲のＰｉｐペプチドに関するエクソンスキッピング活性を示す表。
【図１８】マウスｍｄｘ筋管における、ＰＭＯＤＭＤカーゴにコンジュゲート化されたある範囲のＰｉｐペプチドに関するエクソンスキッピング活性を示す表。
【図１９】前脛骨筋（ＴＡ）、四頭筋、腓腹筋（ｇａｓ）、二頭筋、横隔膜筋（ｄｉａｐｈ）、心筋（心臓）および腹壁筋（腹部）における、ＰＮＡＤＭＤにコンジュゲート化されたＰｉｐ−２ｂおよび（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４に関するジストロフィン陽性線維数の定量化を示すチャート。これは、心臓および腹部により多数のジストロフィン陽性線維があることを示す。
【図２０】ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲート化における工程を例示する図。
【図２１】ジストロフィンＲＮＡに関する入れ子ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた、Ｂペプチド−ＰＭＯＤＭＤ、Ｐｉｐ−５−ＰＭＯＤＭＤおよびＰｉｐ−５ｆ−ＰＮＡＤＭＤの１または２μＭ濃度で処理した分化マウスｍｄｘ筋芽細胞で見られるエクソンスキッピング。
【図２２】Ｐｉｐ−５ｅ−ＰＭＯＤＭＤ（上部）またはＰｉｐ−５ｆ−ＰＭＯＤＭＤ（下部）をｍｄｘマウスに筋内注射した後の、前脛骨筋における非常に強いジストロフィン染色を示す顕微鏡写真。
【図２３】ＰＭＯＤＭＤのある範囲のＰｉｐコンジュゲートをｍｄｘマウスの前脛骨筋に筋内注射した後のジストロフィン陽性線維の平均パーセントを示すチャート。バーは標準誤差を示す。Ｂは「Ｂペプチド」ＰＭＯコンジュゲート対照を示す。
【図２４】Ｂペプチドに比較した、Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊ、Ｐｉｐ−５ｌ、Ｐｉｐ−５ｎおよびＰｉｐ−２ｂによって産生されるジストロフィンの相対量を示すウェスタンブロット。野生型マウス（１００％ｃ５７）およびｍｄｘマウスの対照もまた示す。
【図２５】本発明記載のドメイン１〜３ペプチド配列を示す表。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明の１以上の態様の詳細を、例として、本発明を実行するために本発明者らによって意図される最適な様式の特定の詳細を含めて、以下の付随する説明に示す。当業者には、本発明がこれらの特定の詳細に限定されることなく実行可能であることが明らかであろう。
【００８４】
本発明者らは、改善された細胞浸透性ペプチドを設計しようとしてきた。特に、本発明者らは、ａ）タンパク質分解に対して安定化され、そしてしたがってｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適しており、ｂ）ルシフェラーゼ・モデル・イントロンをターゲティングするＰＮＡ配列にコンジュゲート化された際、ＨｅＬａ細胞核活性モデルにおいて、Ｒ６Ｐｅｎおよび（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４よりも増進した活性を有し、そしてｃ）マウスｍｄｘモデルにおいて、エクソン２３をターゲティングするＰＮＡにコンジュゲート化された際、裸のＰＮＡよりも増進した活性を示すＣＰＰを探し求めてきた。
【００８５】
これを考慮して、本発明者らは、以前開示されたＲ６Ｐｅｎといくつかの重要な側面が異なる、ＰＮＡ内在化ペプチド（Ｐｉｐ）と呼ばれる一連のペプチドを設計してきた。
１）ＨｅＬａ細胞スプライシング修正モデルにおけるＰＮＡ７０５コンジュゲートとしてのこれらの活性はより高く（μＭ未満）、
２）これらはタンパク質分解に対して有意な耐性を有し（（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４Ｃ−ＫＰＮＡ７０５Ｋと同様）、そして
３）これらは、マウスｍｄｘモデルにおいて、ａ）分化マウス筋芽細胞とのインキュベーションおよびｂ）ｍｄｘマウスの前脛骨筋への直接注射によって、ＰＮＡＤＭＤコンジュゲートとしての活性を有する。
【００８６】
これらの特性はいずれもＲ６Ｐｅｎには当てはまらない。エクソン２３をターゲティングするＰＮＡのＰｉｐ−２ａおよびＰｉｐ−２ｂコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性は、裸のＰＮＡ、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４にコンジュゲート化されたＰＮＡ、またはＰｉｐ１（生物学的に不安定なペプチド）にコンジュゲート化されたＰＮＡに比較して２〜３倍高い。
【００８７】
Ｐｉｐ２ｂ−ＰＮＡは、細胞取り込みにおいてエネルギー依存性であるようであり、そして他の陽イオン性ペプチド、例えば（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４と同じかまたは類似のエンドソーム経路を通じて、細胞に進入する可能性が高い。
【００８８】
Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５の活性は、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡ７０５または（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯ７０５のいずれよりも、ＨｅＬａ細胞モデルにおいて、数倍高い。
【００８９】
ペプチド
ある範囲の候補細胞浸透性ペプチドを構築し、そしてＰＮＡカーゴにコンジュゲート化した。
【００９０】
ルシフェラーゼアッセイのためのＰＮＡカーゴは、１８マー塩基配列ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡ［配列番号１１４］を有するＰＮＡ７０５であり、そしてジスルフィド結合によってペプチドに連結されている。
【００９１】
ｍｄｘマウスにおけるエクソン２３スキッピングのためのＰＮＡカーゴは、２０マー塩基配列ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ［配列番号１１５］を有するＰＮＡＤＭＤであり、そしてチオエーテル連結によってペプチドに連結されている。
【００９２】
これらのコア配列は、Ｎ末端ＣＫおよびＣ末端ＫまたはＫＫＫなどのさらなるＮおよび／またはＣ末端配列を有して、例えば以下のカーゴ：ＣＫ−ＰＮＡ７０５−ＫまたはＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ３を生じてもよい。さらなるＮ末端配列は、ペプチドのドメイン４とのジスルフィドまたはチオエーテル連結を可能にしうる。アミノ酸のさらなるＣ末端配列は、コンジュゲートの水溶性を増進しうる。
【００９３】
ＰＮＡおよびＣＰＰのコンジュゲート化は、ジスルフィド結合形成またはチオエーテルコンジュゲート化のいずれかによった。
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞におけるスプライス修正
ＣＰＰ−オリゴヌクレオチド・コンジュゲートの活性を評価するのに有用なアッセイが、Ｋｏｌｅらによって確立されてきている１０。アッセイは、１８マー合成オリゴヌクレオチドによる異常なβ−グロビンイントロンのスプライス修正（７０５部位）およびそれに続くホタル・ルシフェラーゼの上方制御を伴う。アッセイは複雑でなく、そして高いダイナミックレンジを有する。
【００９４】
コンジュゲートを、指数関数的に増殖しているＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞を含む１ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で４時間インキュベーションした（２４ウェルプレート中、１．２５ｘ１０５細胞／ウェルで植え付け、そして一晩培養した）。次いで、コンジュゲートを除去し、そして完全培地（ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清）中で２０時間インキュベーションを続けた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして３００μＬのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。ルシフェラーゼアッセイ系基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、１０μＬの細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を定量化した。ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、細胞タンパク質濃度を測定した。すべての実験を３つ組で行った。３つの複製物に渡って、各データ点を平均した。
【００９５】
Ｒ６Ｐｅｎペプチドのいくつかの変異体、ならびにＨｉｓ、ＰｈｅおよびＡｒｇ残基を含有するいくつかの複合ペプチドのＰＮＡ７０５コンジュゲートのスプライス修正活性をまず報告する（図１および表１、図３）。
【００９６】
一連の修飾Ｒ６Ｐｅｎペプチドを合成し、そして先に記載されるのと同じ方式で１９、ＫＰＮＡ７０５Ｋ３にジスルフィドコンジュゲート化し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって性質決定した（表１−図３）。Ｒ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ３（１ａ）は、１μＭで、バックグラウンドの１２０倍の発光増加を示した（図１Ａ）。ペプチドのＣ末端の二重グリシンスペーサーの欠失（ドメイン４）（１ｂ）は、活性に非常にわずかな影響しかなかった（１００倍増加）。対照的に、Ｎ末端の６アルギニン残基内に３つのＡｈｘスペーサーを挿入すると（ドメイン１）（１ｃ）、活性の有意な増加が生じた（２００倍まで）。ＧＧスペーサー（ドメイン４）を加えたＲＲＭＫＷＫＫ塩基性領域（ドメイン３）を（Ｒ−Ａｈｘ）４で置換すると（１ｅ）、活性を維持するが増加させず（１１０倍）、しかし塩基性領域のみをＳＶ４０由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＰＫＫＫＲＫＶ）で置換すると（１ｄ）、幾分有害であった（６０倍）。ペプチド部分のＣ末端の塩基性ドメインおよびＧＧリンカー（ドメイン３に加えて４）が（Ｒ−Ａｈｘ）４によって置換されているさらなる変異体（１ｅ）は、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５スプライス修正アッセイにおいて、優れた活性を維持した。これらの結果によって、２つの塩基性領域内には絶対的な配列必要性はなく、そして活性レベルはより微妙な要因、例えば陽イオン性電荷間隔および疎水性配列の部分に応じる可能性があることが示される。ＳＶ４０  ＮＬＳ配列の負の効果は、核孔複合体への結合のためである可能性もあった。
【００９７】
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５スプライス修正アッセイにおいて、ＰＭＯの活性を増進させることが報告された別のペプチドは、Ｒ９Ｆ２である２１。しかし、Ｒ９Ｆ２−ＰＭＯ７０５の活性レベルは、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯ７０５に比較して穏やかであることが見出された１６。両親媒性ペプチドにおいてヒスチジン残基を付加すると、細胞内へのＤＮＡ送達が促進されることが示されてきている２２。本発明者らは、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＡｈｘ残基のブロックに各側が囲まれたＲ９Ｆ２モチーフを含有する一連のペプチドを合成し、これらをＰＮＡ７０５にジスルフィドコンジュゲート化した（表１−図３）。この場合、ＰＮＡの各端には、１つのさらなるＬｙｓ残基しか存在しなかった。興味深いことに、Ｒ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ（２ａ）に比較すると、Ｈ２Ｆ２Ｒ９Ｆ２−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ（２ｂ）は、１μＭ濃度のスプライス修正アッセイにおいて、類似の優れた活性を有することが見出された（１２０倍、図１Ｂ）。対照的に、より多数のＨｉｓ残基および／またはＡｈｘスペーサーを含有する、合成された他のペプチド−ＰＮＡコンジュゲート（２ｃ〜２ｇ）はすべて、より低い活性レベルを有した（２５〜７５倍増加）。したがって、Ｈ２Ｆ２Ｒ９Ｆ２モチーフは、妥当なＣＰＰであり、そしてＫＰＮＡ７０５Ｋとのジスルフィド連結コンジュゲートは、例えば（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋより有意に高い活性（１μＭでおよそ１０倍の増加、データ未提示）を示す。しかし、こうしたモチーフは、十分に高い活性を示さず、そして多くの隣接Ｒ残基があるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に十分に安定である可能性は低い。この研究によって、ＨｅＬａ細胞スプライス修正アッセイにおいて妥当な活性を有するいくつかのペプチドが、ありうる療法的使用の候補として、より好ましくないことがわかる。
【００９８】
（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯが、エネルギー依存性機構で、ＨｅＬａ細胞によって内在化することが以前報告されてきており、これはスプライス修正アッセイの活性が４℃で消滅したためであった１６。本発明者らが、ジスルフィド連結Ｒ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ３または安定連結Ｒ６Ｐｅｎ−Ｓ−Ｃ−ＫＰＮＡ７０５Ｋ３１９に関して、４℃でスプライス修正アッセイを行うと、どちらの場合でも、３７℃での活性に比較して、活性の劇的な喪失があった（図２）。また、細胞のＡＴＰが枯渇すると、活性の実質的な減少が見られた。低温での類似の活性喪失が、Ｈ２Ｆ２Ｒ９Ｆ２−Ｓ−Ｓ−ＫＰＮＡ７０５Ｋに関して見られた（データ未提示）。これらのデータは、エネルギー依存性エンドサイトーシス経路を通じて、これらのコンジュゲートが細胞内在化されることを暗示するが、経路の正確な性質は、各場合で、まだ決定されていない。
【００９９】
したがって、一連の新規ペプチド（ＰＮＡ内在化ペプチド、Ｐｉｐ）を設計した。
図８は、Ｐｉｐ−２ｂおよびＰｉｐ−３ａ  ＰＮＡ７０５コンジュゲートによるルシフェラーゼ活性の用量依存性上方制御を示す。未処理細胞に比較した発光の倍増加として活性を示す。
【０１００】
図１２は、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡ７０５および（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４ＡｈｘＢ−ＰＭＯ７０５コンジュゲートに比較した際のホタル・ルシフェラーゼ上方制御アッセイにおけるＰｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５コンジュゲートの高レベルの活性を示す。活性は、未処理細胞に比較した発光の倍増加として示される。
【０１０１】
以下のプロトコルにしたがって行ったＨｅＬａ細胞スプライス修正アッセイを用いて、図１４に示す結果を得た。
指数関数的に増殖しているＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞（２４ウェルプレート中、１．７５ｘ１０５細胞／ウェルで植え付け、そして一晩培養したもの）を、ＯｐｔｉＭＥＭ中、３７℃または４℃で３０分間プレインキュベーションした。
【０１０２】
次いで、１μＭの多様なペプチド−ＰＮＡコンジュゲートの存在下、３７℃（白色バー）または４℃（グレーのバー）で１時間、細胞をインキュベーションした。２３時間後にルシフェラーゼ発現を定量化し、そしてＲＬＵ／μｇタンパク質として表した。各実験を３つ組で行い、そしてエラーバー（標準偏差）を示す。
【０１０３】
結果を図１４に示す。Ｐｉｐ−１、Ｐｉｐ−２ａおよびＰｉｐ−２ｂ  ＰＮＡ７０５コンジュゲートは、対照Ｒ６Ｐｅｎおよび（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４ＰＮＡ７０５と比較して、３７℃で、かなりより高いルシフェラーゼ上方制御を示した。しかし、４℃では、すべてのＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートがその活性の大部分を失った。これは、これらのペプチド−ＰＮＡのすべてがエネルギー依存経路によって内在化されることを示し、これはエンドサイトーシスと一致する。しかし、ペプチドのＰｉｐシリーズは、Ｒ６Ｐｅｎに比較してＰＮＡ７０５にコンジュゲート化した際、このアッセイにおいて、はるかにより高い活性レベルを示し、そしてこれは次に、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４ＰＮＡ７０５よりはるかに高い活性を有する。
【０１０４】
スプライス修正のＲＴ−ＰＣＲ分析
また、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＫｏｌｅらのＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５ルシフェラーゼ・スプライス修正アッセイにおいてスプライス修正を評価してもよい。
【０１０５】
スプライス修正のＲＴ−ＰＣＲ分析を行うため、１ｍＬのＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、各コンジュゲート濃度に対応する３つ組ウェル由来の、合わせた細胞溶解物３００μＬ（３ｘ１００μＬ）から総ＲＮＡを抽出した。順方向プライマー５’ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＣ３’［配列番号１３３］および逆方向プライマー５’ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＣＧ３’［配列番号１３４］によってプライミングし、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを伴うＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、０．５μｇ  ＲＮＡテンプレートを含む２５μＬ中で、ＲＴ−ＰＣＲを行った。最初のｃＤＮＡ合成を５５℃で３０分間行って、その後、９５℃３０秒間、５８℃１分間および６８℃１分間を３０周期分、行った。２％アガロースゲル上で産物を分析し（図９）、そしてＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ分析ソフトウェア（ＳｙｎＧｅｎｅ）を用いたスキャニングの後、異常なＰＣＲ産物のグラフ分布からＥＣ５０値を計算した（図１０）。
【０１０６】
図９は、Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡ７０５およびＰｉｐ−３ａ−ＰＮＡ７０５に関するＲＴ−ＰＣＲによって決定した際の、ＨｅＬａ  ｐＬｕｃルシフェラーゼアッセイにおける用量依存性スプライス修正を示す。ＥＣ５０測定を図１０に示す。
【０１０７】
結果は図８に示すルシフェラーゼ上方制御アッセイ結果と一致する。
ＰＮＡ７０５とのＰｉｐ−２ａからＰｉｐ−５ｃコンジュゲートに関するスプライス修正のＥＣ５０値を図１５に示す。Ｐｉｐ−２ａ、Ｐｉｐ−２ｂ、Ｐｉｐ−２ｃ、Ｐｉｐ−３ａ、Ｐｉｐ−４ｂ、Ｐｉｐ−４ｃ、Ｐｉｐ−５ａ、Ｐｉｐ−５ｂおよびＰｉｐ−５ｃコンジュゲートはすべて、０．８μＭ未満のＥＣ５０値を示し、一方、Ｐｉｐ−３ｂ−ＰＮＡ７０５はわずかにより悪く、そしてＰｉｐ−４ａ−ＰＮＡ７０５およびＰｉｐ−４ｄ−ＰＮＡ７０５はかなりより悪かった。これらの結果は、ドメイン２が配列特異性を有することをさらに立証する。最適な配列は、ドメイン２中にＩＬＦＱＮまたはＩＬＦＱＹのいずれかを含有する。
【０１０８】
血清安定性アッセイ
２０％マウス血清＊を含有するＰＢＳ中、３７℃で、ＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲート（２０μＭ）をインキュベーションした。０、１５、３０、６０および１２０分で１０μＬのアリコットを採取し、そして５０μＬのＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）中の１０％  ＤＣＡで希釈した。試料を混合し、そして−２０℃で維持した。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）によって沈殿血清タンパク質を分離し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって上清を分析した。
【０１０９】
＊雌Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の新鮮血餅の遠心分離（３ｘ３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃）によってマウス血清を調製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による１時間の２０％血清中の（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４Ｃ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ６９４４．３６）安定性を図４に示し、これは、これらの条件下では、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４Ｃ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋの軽度の血清タンパク質分解のみがあることを示す。
【０１１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による１時間の２０％血清中のＲ６ＰｅｎＣ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８５２４．１４）安定性を図５に示す。これは、Ｒ６Ｐｅｎが、１時間以内に該ペプチド内の少なくとも１つの内部位置で完全に切断されて、主要なおよびいくつかの少量の産物を生じることを示す。該ペプチドのさらなる分解が１時間後に起こる。ＰＮＡカーゴ構成要素は安定である。
【０１１１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による１時間の２０％血清中のＰｉｐ１−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８３９１．１６）安定性を図６に示す。これは、Ｐｉｐ１ペプチドがＲ６Ｐｅｎに比較して十分な安定性を獲得しておらず、そしてなお１時間後には完全に切断されることを示す。
【０１１２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による１時間の２０％血清中のＰｉｐ２ｂ−ｓｓ−ＣＫ−ＰＮＡ７０５−Ｋ（ｍ／ｚ  ８４８０．１７）安定性を図７に示す。これは、Ｐｉｐ２ｂは、１時間後には主に改変されず、そして少量の切断産物しかないことを示す。したがって、安定性は、これらの条件下で、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡと類似である。
【０１１３】
これらの結果は、Ｐｉｐ２ｂ−ＰＮＡが、血清タンパク質分解に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究の候補となるのに十分な安定性を有することを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって判断した際、血清タンパク質分解に対する類似の安定性は、Ｐｉｐ−２ａ−ＰＮＡ、Ｐｉｐ−３ａ−ＰＮＡおよびＰｉｐ−３ｂ−ＰＮＡに関してもまた見られた（データ未提示）。
【０１１４】
分化Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞におけるエクソンスキッピング
ＹｉｎおよびＷｏｏｄは、ＰＮＡおよびＰＮＡコンジュゲートを用いて、トランスフェクション剤の存在下で、培養マウスｍｄｘ筋芽細胞におけるエクソン２３のある程度のスキッピングを達成した２３。同じアプローチを行って、本発明記載のペプチドの、ペプチド−ＰＮＡコンジュゲートの細胞浸透に対する効果を評価してもよい。この場合、ペプチド−ＰＮＡコンジュゲートのインキュベーションは、トランスフェクション剤の非存在下である。
【０１１５】
ＤＭＤ  ｍｄｘモデルにおけるエクソン２３スキッピング実験で用いるべきＰＮＡ  ２０マーは：ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ［配列番号１１５］（ＰＮＡＤＭＤ）である。
【０１１６】
血清枯渇（５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ）の２日後、ゼラチンコーティング２４ウェルプレート中に植え付けた集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞から筋管を得た。ＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートを０．５ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ中で４時間、筋管とインキュベーションし、そして次いで、１ｍＬのＤＭＥＭ／５％ウマ血清培地と交換してさらにインキュベーションした。２０時間後、筋管をＰＢＳで２回洗浄し、そして０．５ｍＬのＴＲＩ試薬で総ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ分析前に、ＲＮＡ調製物をＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（２Ｕ）およびプロテイナーゼＫ（２０μｇ）で処理した。順方向プライマー５’ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＡＧ３’［配列番号１２９］および逆方向プライマー５’ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣ３’［配列番号１３０］によってプライミングし、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを伴うＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇ  ＲＮＡテンプレートを含む２５μＬ中で、ＲＴ−ＰＣＲを行った。最初のｃＤＮＡ合成を５５℃で３０分間行って、その後、９５℃３０秒間、５５℃１分間および６８℃８０秒間を３０周期分、行った。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ産物（１μＬ）を鋳型として用い、０．５Ｕ  Ｓｕｐｅｒ  ＴＡＱポリメラーゼ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２５μＬ中で、そして順方向プライマー５’ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ３’［配列番号１３１］および逆方向プライマー５’ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴ３’［配列番号１３２］によってプライミングして、二次ＰＣＲを行った。周期条件は、９５℃１分間、５７℃１分間および７２℃８０秒間を２５周期であった。２％アガロースゲル電気泳動によって産物を調べ、そしてＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ分析ソフトウェア（ＳｙｎＧｅｎｅ）を用いたスキャニングの後。エクソン２２スキッピングの相対量を、コンジュゲートの所定の濃度で、３回の実験の複製物に渡って平均した割合として表した。
【０１１７】
図１１Ａは、Ｐｉｐ３ａ−ＰＮＡＤＭＤの用量を増加させつつ、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した際の、分化マウスｍｄｘ筋芽細胞における、エクソン２３スキッピングおよびエクソン２２、２３二重スキッピングの増加を示す。図１１Ｂは、Ｐｉｐ３ａ−ＰＮＡＤＭＤに関してＲＴ−ＰＣＲによって決定した際の分化マウスｍｄｘ筋芽細胞におけるエクソン２３スキッピングを示す。同等のコンジュゲート濃度では、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡＤＭＤに関しては活性はまったく見られず、そしてＰｉｐ−１−ＰＮＡＤＭＤに関しては、非常に弱いエクソン２３スキッピングが見られた（しかしエクソン２２、２３二重スキッピングは見られなかった）。
【０１１８】
これらの結果は、Ｐｉｐ−３ａ−ＰＮＡＤＭＤが、このモデルにおいて優れた活性を有することを示す。Ｐｉｐ−２ａ−ＰＮＡＤＭＤおよびＰｉｐ−２ｂ−ＰＮＡＤＭＤに関して、類似の結果が予測される。
【０１１９】
アガロースゲルのスキャニングによって、１μｍおよび２μＭで添加されたコンジュゲートで、エクソンスキッピングレベル（スキッピングされないものに比較したエクソン２３欠失の％）を決定し、そして結果を図１７に示す。ＰＮＡＤＭＤのチオエーテルコンジュゲートとしてのＰｉｐ−２ａ、Ｐｉｐ−２ｂ、Ｐｉｐ−４ｂ、Ｐｉｐ−４ｃ、Ｐｉｐ−４ｅ、Ｐｉｐ−４ｆ、Ｐｉｐ−４ｇおよびＰｉｐ−４ｈはすべて、２μＭで３０％以上、そして１μＭで１６〜２７％のエクソンスキッピングを示した。改変されたドメイン２を持つＰｉｐ−３ａおよびＰｉｐ−３ｂコンジュゲートは、わずかにより活性でなかった。再び、最適ペプチドはすべて、ドメイン２に配列ＩＬＦＱＮまたはＩＬＦＱＹを含有した。ドメイン１は、間隔が空いた５つまたは６つのＡｒｇ残基を含有し、そして結果は、いくつかのアミノヘキシル（Ｘ）スペーサーをベータ−Ａｌａ（Ｂ）またはＩｌｅ（Ｉ）のいずれかによって置換可能であることを示した。
【０１２０】
ＰＮＡＤＭＤのコンジュゲートとして、さらなるＰｉｐペプチドシリーズを合成した（Ｐｉｐ−５ａ〜Ｐｉｐ−５ｇ）。Ｐｉｐ−５ａ〜Ｐｉｐ−５ｇはすべて、ＲＸＲＲＢＲＲＸＲ［配列番号８１］のドメイン１およびＩＬＦＱＹ［配列番号８８］またはＩＬＩＱＹ［配列番号２９６］（Ｐｉｐ−５ｇ）のドメイン２を有した。Ｐｉｐ−５ａ〜Ｐｉｐ−５ｄおよびＰｉｐ−５ｇは各々、ドメイン３の配列中にわずかな変動を有するが、最初の２つの位で２つの塩基性残基を、第三の位でＭまたはＷを維持し、その後、各場合で、ＫＷＨＫが続いた。Ｐｉｐ−５ｅおよびＰｉｐ−５ｆの場合、ドメイン３が有意に改変されて、ＸまたはＢ残基のいずれかによって間隔を空けられた４つのＡｒｇ残基を生じた。Ｐｉｐ−５ａ、Ｐｉｐ−５ｂ、Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｆおよびＰｉｐ−５ｇ  ＰＮＡＤＭＤコンジュゲートはすべて、２μＭで３０％以上の優れたエクソンスキッピングを示した。Ｐｉｐ−５ｃおよびＰｉｐ−５ｄコンジュゲートはわずかに劣っていた。これらの結果は、ドメイン３が、間隔が空いたＡｒｇ残基からなってもよく、そしてドメイン２がＩＬＦＱＹまたはＩＬＩＱＹであってもよいことを示した。
【０１２１】
Ｐｉｐ−５ｈは、より短いドメイン１および３を含有し、各場合で間隔が開いた４つのＡｒｇ残基のみ（ＲＸＲＲＸＲ［配列番号７４］）を含有する一方、最適なドメイン２（ＩＬＦＱＹ［配列番号８８］）を維持した。Ｐｉｐ−５ｈ−ＰＮＡＤＭＤは、例えばＰｉｐ−５ｅ−ＰＮＡＤＭＤと比較した際、それぞれ、１および２μｍの両方で、エクソンスキッピング％に関して、より低い活性を示した。この結果は、ドメイン１の４つのＡｒｇ残基が、ｍｄｘ筋肉細胞における最適エクソンスキッピングには不十分であることを示す。
【０１２２】
したがって、合成が単純であるため（異なるアミノ酸が最小数であり、そしてＬｙｓまたはＨｉｓ残基あるいはＤ−アミノ酸をまったく含まない）、Ｐｉｐ−５ｅおよびＰｉｐ−５ｆが最適な配列である。
【０１２３】
ｍｄｘマウスにおけるＰＮＡによるエクソンスキッピングおよびジストロフィン発現の回復
ＹｉｎおよびＷｏｏｄは、ｍｄｘマウスの前脛骨筋内へのＰＮＡおよびＰＮＡ−コンジュゲートの単回筋内注射によって、ｍｄｘマウスにおいて、エクソン２３の効率的なスキッピングを達成した２３。同じアプローチで、Ｐｉｐ−ＰＮＡＤＭＤコンジュゲートの効果を評価した。
【０１２４】
ＤＭＤ  ｍｄｘモデルにおけるエクソン２３スキッピング実験で、ＰＮＡ２０マーＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ［配列番号１１５］（ＰＮＡＤＭＤ）を用いた。
ＹｉｎおよびＷｏｏｄのプロトコル２３にしたがってエクソンスキッピングが評価可能であり、該プロトコルは以下のように要約可能である。
【０１２５】
８週齢の雄ｍｄｘマウス（数は３匹）に、生理食塩水および水中の５μｇのＰＮＡまたはＣＰＰ−ＰＮＡコンジュゲートを投与し；総体積は、前脛骨筋内への４０μｌ筋内注射である。注射３週間後に組織を採取した。
【０１２６】
ウサギポリクローナル抗体（ジストロフィンタンパク質のＣ末端をターゲットとする）を用いた免疫組織化学によって組織をアッセイし、そして核をＤＡＰＩで対比染色する。Ａｌｅｘ  ｖｉｓｉｏｎ  ＬＥソフトウェアを用いて、蛍光顕微鏡によって、ジストロフィン陽性線維を計数する。
【０１２７】
最初の結果を図１３に示す。ＰＮＡとのＰｉｐ２ａおよびＰｉｐ２ｂコンジュゲート［配列番号３２および３３］は、Ｐｉｐ−１−ＰＮＡＤＭＤ、（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＮＡＤＭＤまたは裸のＰＮＡＤＭＤよりも、ｍｄｘマウス中でかなり優れたエクソンスキッピング活性を示す。
【０１２８】
（Ｒ−Ａｈｘ−Ｒ）４−ＰＭＯコンジュゲートが、腹腔内投与後のｍｄｘマウスにおいて、いくつかの筋肉タイプで、有意な活性を示すことに注目すべきである２４。したがって、ＰＮＡＤＭＤに対するＰｉｐ−２ａおよびＰｉｐ−２ｂコンジュゲート、およびそれに続いてＰｉｐ−３およびＰｉｐ−４コンジュゲートが、直接筋肉注射以外の送達経路、例えば腹腔内または静脈内経路によって、有意な活性を示す可能性が高いと推定するのが合理的であり、そしてしたがって、こうした実験が進行中である。
【０１２９】
最終用量２５ｍｇ／ｋｇで生理食塩水を用いた８０μｌ用量のＰＮＡ−ペプチドコンジュゲート（Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡＤＭＤまたは（ＲＸＲ）４−ＰＮＡＤＭＤ）を、ｍｄｘマウスに注射した。ＣＯ２吸入によって、注射２週間後にマウスを屠殺し、そして組織を取り除き、そして液体窒素で冷却したイソペンタン中で瞬間凍結し（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）、そして−８０℃で保存した。
【０１３０】
免疫組織化学およびジストロフィン陽性線維計数：
１００μｍ間隔で、前脛骨筋（ＴＡ）、四頭筋、腓腹筋、二頭筋、腹壁および横隔膜筋および心筋の筋肉長の少なくとも２／３から、８μｍの切片を切り出した。次いで、ジストロフィン・カルボキシル末端領域に対するポリクローナル抗体２１６６を用いて、ジストロフィン発現に関して切片を調べた（抗体は、Ｋａｙ  Ｄａｖｉｅｓ教授のご厚意によって提供された）。Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ蛍光顕微鏡を用いて、１つの切片中のジストロフィン陽性線維の最大数を計数した。介在する筋肉部分をＲＴ−ＰＣＲ分析およびウェスタンブロットのため、または免疫組織化学のための連続切片としてのいずれかで収集した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒｏ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、英国）によって、ポリクローナル抗体を検出した。
【０１３１】
タンパク質抽出およびウェスタンブロット
収集した部分を１．５ｍｌのポリプロピレン・エッペンドルフ試験管（Ａｎａｃｈｅｍ、英国）中、ドライアイス上に置いた。１２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝６．８）、１０％ドデシル硫酸ナトリウム、２ｍｏｌ／ｌ尿素、２０％グリセロール、および５％  ２−メルカプトエタノールを含有する、１５０μｌのタンパク質抽出緩衝液で、組織部分を溶解した。混合物を５分間煮沸し、そして遠心分離した。上清を収集し、そしてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｓｉｇｍａ、英国）によって、タンパク質濃度を定量化した。陽性対照としての正常Ｃ５７ＢＬ６マウス由来の多様な量のタンパク質、および処置または未処置ｍｄｘマウスの筋肉由来の対応する量のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（４％スタッキング、６％分離）上に装填した。試料を８０ｍＡで４時間電気泳動し、そして５０Ｖ、４℃で一晩、ニトロセルロースにトランスファーした。次いで、膜を洗浄し、そして５％スキムミルクでブロッキングし、そしてジストロフィンタンパク質を検出するため、ＤＹＳ１（ジストロフィンＲ８反復に対するモノクローナル抗体、１：２００、ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ、英国）で、そして装填対照としてβ−アクチニン（モノクローナル抗体、１：５０００、Ｓｉｇｍａ、英国）で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ウサギ抗マウスＩｇＧおよびＥＣＬウェスタンブロッティング分析系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）によって、結合一次抗体を検出した。処置ｍｄｘ筋肉から得たバンドの強度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって測定し；定量化はバンド強度および面積に基づき、そしてこれをＣ５７ＢＬ６マウスの正常筋肉由来のものと比較する。
【０１３２】
結果は、どちらのコンジュゲートも、ＴＡ、四頭筋、腓腹筋、二頭筋および横隔膜において、中央部有核筋肉線維数の類似の増加を誘導するが、Ｐｉｐ−２ｂ−ＰＮＡＤＭＤは心臓および腹部で有意により高い線維数を有することを示した（図１９）。
【０１３３】
別のカーゴＰＭＯオリゴヌクレオチドのＰｉｐコンジュゲートの合成
ＰＭＯ  ２５マーＭ２３Ｄ（＋７−１８）（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’［配列番号２０６］）（ＰＭＯＤＭＤ）は、ｍｄｘマウスにおけるエクソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられる３７、４２、４３、４４。これらの例の多くでは、Ｂペプチド（配列ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ［配列番号２０７］）をＰＭＯＤＭＤにコンジュゲート化し、そして裸のＰＭＯＤＭＤに比較して、ｍｄｘマウスにおいて筋内または静脈内送達によるエクソンスキッピングおよびジストロフィン産生が有意に増進されることが示された。Ｂペプチド（（ＲＸＲ）４ＸＢとは、Ｂ単位によるＸの２つの置換によってのみ異なる）は、現在、ＤＭＤ治療のためのＰＭＯと組み合わせたコンジュゲート化の臨床試験開発に関して、主要な候補ペプチドである４３。
【０１３４】
本発明者らは、Ｍｏｕｌｔｏｎら４５によって記載される方法に基づいた、チオエーテル（チオマレイミド）連結を介したＰＭＯオリゴヌクレオチドのペプチドコンジュゲートの調製法を開発した。この方法は、一端に、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを、そしてもう一端にスルフィドリル反応性マレイミド基を含有する、ヘテロ二重官能性クロスリンカーであるＮ−［γ−マレイミドブチリルオキシエステル（ＧＭＢＳ）の使用を伴う。まず、５’−アミノ連結２５マーＰＭＯＤＭＤ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  Ｉｎｃ）の５’−一級アミンを、ＧＭＢＳとの反応によって活性化した（図２０）。続いて、ＰＭＯリンカー中間体を、チオマレイミド連結を通じてペプチドに付着させた。しかし、精製は、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）緩衝液の使用を伴う単回ＨＰＬＣ分離を使用しており、Ｍｏｕｌｔｏｎら４５によって記載されるものよりもはるかにより単純であった。
【０１３５】
したがって、２０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１００μｌ中に１０００ｎｍｏｌｅのＰＭＯＤＭＤを溶解した（１０ｍＭストックになる）。１００ｍＭ  ＧＭＢＳストック溶液をＤＭＳＯ中で調製した。１．５ｍｌ微量遠心管中の１０μｌの１０ｍＭ  ＰＭＯＤＭＤ溶液に、２０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１３μｌを添加した。２μｌのＧＭＢＳ溶液（２倍モル過剰）を添加し、混合物をボルテックスし、そして暗所中、室温で１時間インキュベーションした。７５０μｌの冷アセトン（３０倍過剰）を添加して産物を沈殿させ、これを室温で１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して収集した。デカンテーションによってアセトンを取り除き、そして残渣を空気中で３０分間乾燥させた。２０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３０μｌ中で、ＰＭＯ−リンカー産物を溶解させた（１００％回収されると仮定すると、２ｍＭ溶液になる）。２０μｌの１０ｍＭペプチドチオール（２倍モル過剰）を添加し、試験管をボルテックスし、そして暗所中、室温で２時間インキュベーションした。必要であれば、反応混合物を４℃で一晩保存してもよい。次いで、緩衝液Ａ、水中の０．１％ＨＦＢＡ、および緩衝液Ｂ、０．１％ＨＦＢＡ中の９０％アセトニトリル（勾配：２０分間に３８〜５０％Ｂ）を用いた、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０ｘ１０ｍｍ）上、２６０ｎｍでの検出を用いて、産物を精製した。産物を収集し、凍結乾燥し、そして滅菌水中で溶解した。メタノール／クエン酸二アンモニウム中２，６−ジヒドロキシアセトフェノン（２０ｍｇ／ｍｌ）のマトリックスを用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって産物を分析した。
【０１３６】
Ｐｉｐ−５ｅ〜Ｐｉｐ−５ｏ、Ｐｉｐ−２ｂおよび対照ＢペプチドをＰＭＯＤＭＤのコンジュゲートとして合成した（図１８）。
分化Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞におけるエクソンスキッピング（ＰＭＯコンジュゲート）
分化Ｈ２Ｋ  ｍｄｘマウス細胞に０．５μＭ、１μｍおよび２μＭで添加されたコンジュゲートで、エクソンスキッピングレベル（スキッピングされないものに比較したエクソン２３欠失の％）を決定し、そしてＰｉｐ−ＰＮＡに関して記載される方法によって、アガロースゲルをスキャニングした。
【０１３７】
最初の観察は、ＰＭＯコンジュゲートに関するエクソン２３スキッピングのレベルが、同じＰｉｐペプチドが付着したＰＮＡコンジュゲートに関するものの少なくとも２倍であることである（例えば、Ｐｉｐ−５ｆ−ＰＮＡＤＭＤに比較したＰｉｐ−５ｆ−ＰＭＯＤＭＤ、図２１）。３つの濃度レベルすべての結果を考慮して、特に活性が高いコンジュゲートは、Ｐｉｐ−５ｅ−ＰＭＯＤＭＤおよびＰｉｐ−５ｊ−ＰＭＯＤＭＤであるが、Ｐｉｐ−５ｍ−ＰＭＯＤＭＤを除くコンジュゲートはすべて、２μＭ濃度で非常に高いエクソンスキッピング活性を有した。Ｂペプチド−ＰＭＯＤＭＤは、優れたＰｉｐ−５ｅ−ＰＭＯＤＭＤおよびＰｉｐ５ｊ−ＰＭＯＤＭＤコンジュゲートよりわずかにより活性でなかった。エクソンスキッピングレベルを図１８に示す。
【０１３８】
ｍｄｘマウスにおける、ＰＭＯ−コンジュゲートによるエクソンスキッピングおよびジストロフィン発現回復
筋内注射によって、Ｐｉｐ−ＰＭＯコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を決定した。生理食塩水（４０μｌ）中、５μｇのＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートをｍｄｘマウスの前脛骨筋内に注射し、そして上述のように注射した２週間後に組織を採取した。
【０１３９】
試験したＰＭＯＤＭＤコンジュゲートのすべて（Ｐｉｐ−２ｂ、Ｐｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｆ、Ｐｉｐ−５ｊ、Ｐｉｐ−５ｋ、Ｐｉｐ−５ｌ、Ｐｉｐ−５ｍ、Ｐｉｐ−５ｎおよびＰｉｐ−５ｏ、ならびにＢペプチド対照）は、ジストロフィン陽性線維に関して有意な染色を示した（例えば、Ｐｉｐ−５ｅおよびＰｉｐ−５ｆ、図２２）。ジストロフィン陽性線維の平均パーセントの計算によって、Ｐｉｐコンジュゲートのいくつかは、Ｂペプチドコンジュゲートよりも有意により高い値を有することが示され、特にＰｉｐ−５ｅおよびＰｉｐ−５ｊならびにＰｉｐ−５ｌおよびＰｉｐ−５ｎがそうであった（図２３）。
【０１４０】
正常対照と比較して、ウェスタンブロッティングによって、産生されたジストロフィン量を定量化し、そしてＰｉｐ−５ｅ、Ｐｉｐ−５ｊ、Ｐｉｐ−５ｌおよびＰｉｐ−２ｂは、ＢペプチドまたはＰｉｐ−５ｎよりもはるかにより高いレベルのジストロフィンタンパク質産生を示した（図２４）。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲによって、すべての構築物に関して、エクソンスキッピングの有意なレベルが見られた（データ未提示）。
静脈内投与
また、ｍｄｘマウスの尾静脈内への静脈内注射によって、エクソンスキッピングを評価してもよい４２。ｍｄｘマウスに、最終用量２５ｍｇ／ｋｇで、生理食塩水とともに８０μｌ用量のＰＭＯ−ペプチド・コンジュゲート（Ｐｉｐ５ｅ−ＰＭＯＤＭＤまたはＢ−ＰＭＯＤＭＤ）を注射した。ＣＯ２吸入によって、注射１週間後にマウスを屠殺し、そして組織を取り除き、そして液体窒素で冷却したイソペンタン中で瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１４２】
上述のように免疫組織化学および線維計数を行った。特に、心臓組織において、ほとんどすべての心筋細胞は、免疫染色によって、そしてＲＮＡレベルで、修正されていることが期待された。
【０１４３】
心筋において、Ｐｉｐ−５ｅ−ＰＭＯＤＭＤがＢ−ＰＭＯＤＭＤよりも有意により高いジストロフィン産生を有することを示す、予備的データが得られた（データ未提示）。
環状抗癌ペプチドに対するＰｉｐペプチドのコンジュゲート化
Ｐｉｐペプチドは、ペプチドカーゴの細胞送達を増進するのに適切である。
【０１４４】
キナーゼＣＤＫ４は、キナーゼ活性自体に関連しないようである、癌発展に非常に重要な役割を有する。癌細胞において、ＣＤＫ１がＣＤＫ４とほぼ同等に同時発現されるという最近の発見４６のため、この関係は、何らかの点で、癌細胞において重要であるが、正常細胞においては重要でないという仮説が導かれている。
【０１４５】
ＣＤＫ４の疎水性領域を模倣するペプチドが設計されており（Ｔｈｅｒｙｔｅ  Ｌｔｄ）、そしてこれらは弱い抗癌活性を有し、そして癌細胞死を引き起こすことが示されてきている（Ｔｈｅｒｙｔｅの開示されないデータ）。さらなる構造活性研究後、活性化合物、シクロ−［ＰＲＰｖａｌｋｌｃｌｋｌａｌＰＲＧ］（［配列番号３００］−１７マーの環状ペプチド、式中、括弧内の小文字はＤ−アミノ酸であり、そして大文字はＬ−アミノ酸である）を持つＴＨＲ−８７が生じてきている。ＣＤＫ４の位置は細胞核中であると予期されるため、細胞送達そしてしたがって抗癌活性を増進させる目的で、本発明者らは、癌細胞において試験するため、単一Ｄ−ｃｙｓ残基からジスルフィド連結を通じて、ＴＨＲ−８７をＰｉｐ−５ｆペプチドにコンジュゲート化した。
【０１４６】
５ｍＭの濃度でＨＰＬＣ等級の水中に環状ペプチドを溶解することによって、ＴＨＲ−８７のＣ末端Ｃｙｓを活性化した。水性炭酸水素アンモニウム溶液（１Ｍ）を添加して、０．１Ｍ緩衝液の全体濃度にした。次いで、１０当量の２−アルドリチオール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、溶液をボルテックスし、そして室温で２時間放置した。緩衝液Ａ、水中の０．１％ＴＦＡ、および緩衝液Ｂ、０．１％ＴＦＡ中の９０％アセトニトリル（勾配：２０分間に５％〜３５％Ｂ）を用いた、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８逆相カラム（２５０ｘ１０ｍｍ）上、２１８ｎｍでの検出を用いて、産物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。産物を凍結乾燥し、そして次いで、０．１％ＴＦＡ中に溶解した。アセトニトリル／３％水性トリフルオロ酢酸溶液中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（１０ｍｇ／ｍｌ）のマトリックスを用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって産物を分析した。Ｐｉｐ−５ｆをＴＨＲ−８７にコンジュゲート化するため、０．１％ＴＦＡ中の１０μｌ（１００ｎｍｏｌｅ）の１０ｍＭ  ＴＨＲ−８７溶液を微量遠心管中に入れた。次いで、ホルムアミド（２５０μｌ）を添加し、そして試験管をボルテックスした。チオール活性化ペプチド（２００ｎｍｏｌｅ）をＴＨＲ−８７溶液に添加し、そしてボルテックスし、そして次いで、５０μｌの酢酸アンモニウム（１０ｍＭ）を添加した。試験管をボルテックスし、そして室温で１時間放置した。緩衝液Ａ、水中の５ｍＭ  ＨＣｌ、および緩衝液Ｂ、９０％アセトニトリル、１０％水、５ｍＭ  ＨＣｌ（勾配：２０分間に１０％〜５０％Ｂ）を用いた、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０ｘ１０ｍｍ）上、２１８ｎｍでの検出を用いて、産物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。産物を凍結乾燥し、そして次いで、水中に溶解した。高速真空を用いて、溶液を乾燥させた（３回）。滅菌水中に残渣を溶解し、そして０．２２μｍフィルターを通過させた。アセトニトリル／３％水性トリフルオロ酢酸中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（１０ｍｇ／ｍｌ）のマトリックスを用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって産物を分析した。アミノ酸分析によってペプチド濃度を決定した。
【０１４７】
Ｐｉｐ−５ｆ−ＴＨＲ−８７コンジュゲートは、増進された抗癌活性を有すると予期される。
参考文献
【０１４８】
【化１−１】
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【０１４９】
【化１−２】
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【０１５０】
【化１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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