(57)【要約】  ケラチノサイト棘融解を伴う皮膚疾患の予防および／または処置のために、特に天疱瘡の予防および／または処置のために、ヒトＦａｓリガンド（ＣＤ９５ＬもしくはＡｐｏ１Ｌとも名付けられる、以下ＦａｓＬと略する）に対して作られたＦａｓＬアンタゴニスト（例えばヒト化抗体）の使用に関する開示。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前記重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ（配列番号１）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号２）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号３）もしくは
（ｄ1）配列番号１、２および／もしくは３のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列であり、
および／または前記軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ（配列番号４）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ（配列番号５）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ（配列番号６）もしくは
（ｄ2）配列番号４、５および／もしくは６のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列である、
ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントを、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のために用いる使用。
【請求項２】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０４５としてのハイブリドーマ細胞によって産生されるヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそれに由来する抗体もしくは抗体フラグメントを、
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のために用いる使用。
【請求項３】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前記重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ（配列番号７）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｍｅｔ  ＩＩｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号８）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号９）もしくは
（ｄ1）配列番号７、８および／もしくは９のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列であり、
および／または前記軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ（配列番号１０）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ（配列番号１１）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号１２）もしくは
（ｄ2）配列番号１０、１１および／もしくは１２のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列である、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントを、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のために用いる使用。
【請求項４】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４および／もしくはＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５としてのハイブリドーマ細胞によって産生されるヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントまたはそれに由来する抗体もしくは抗体フラグメントを、
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のために用いる使用。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、部分的にヒト化もしくは完全にヒト化された抗体、部分的にヒト化もしくは完全にヒト化された単鎖抗体またはそのフラグメントから選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記皮膚疾患がアポトーシス経路の活性化および／またはデスモグレインの切断と関連する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記皮膚疾患が天疱瘡である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記皮膚疾患に対して有効なさらに少なくとも１種類の療法との併用療法での、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
さらに少なくとも１つの免疫抑制薬と、特にさらに少なくとも１つのステロイドと併用する、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＦａｓリガンド（ＣＤ９５ＬまたはＡｐｏ１Ｌとも名付けられる、以下ＦａｓＬと省略する）のアンタゴニストの使用、より具体的には、ケラチノサイト棘融解を伴う皮膚疾患の予防および／または治療のための、特に天疱瘡の予防および／または治療のためのＦａｓＬに対するヒト化抗体の使用に関する。
【０００２】
天疱瘡は、接着斑タンパク質（デスモグレイン、ｄｓｇ）に対して作られる自己抗体のために、ケラチノサイト接着の損失を特徴とする自己免疫性水疱性皮膚病である。天疱瘡は、年間、１００，０００人あたり約１〜５人の発生率で世界的な分布を有し、かつ女性に多い。
【０００３】
天疱瘡は、棘融解として既知のプロセスでまとめられる基底層直上ケラチノサイトの接着の損失を特徴とする。抗デスモグレイン抗体に加えて、新しい一群の抗コリン作動性受容体抗体が棘融解を誘発し得る（Ｋａｌｉｓｈ，  ２０００）という主な理由から、天疱瘡の病変形成は抜本的な見直しを受けている。さらに、抗原抗体結合で水疱形成することを立体障害だけでは説明できないことが実証されてきた（Ｋｉｔａｊｉｍａ，  ２００２）。さらに、天疱瘡自己抗体（ＰＶＩｇＧ）が天疱瘡に結合することによって接着斑形成は抑制されないが、ＰＶＩｇＧを用いる処置から２４〜３６時間後に接着斑の結合を解離することが示された。この間に、ＰＶＩｇＧによって引き起こされる一連のシグナル伝達ステップが起こる。
【０００４】
これらの観察から、天疱瘡でのアポトーシスの役割が示唆される。実際に、天疱瘡は細胞接着の欠如に起因する疾患であり（Ｐａｙｎｅ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ，  １９７８）、アポトーシスは細胞解離に付随して起こり得る（Ｍａｒｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。これらの概念は、天疱瘡病変皮膚でアポトーシスを検出することによって十分に確認される。特に、棘融解細胞はアポトーシスの主要なマーカーを表す（Ｗａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。さらに興味深いことに、ＴＵＮＥＬ標識核も水疱蓋に付着した状態で見出され、解離前に病変周囲の皮膚にアポトーシス細胞が存在することを示唆している。さらに、Ｉｇおよび活性化カスパーゼ−８を示すアポトーシス細胞は、病変の縁、すなわち細胞間接触の破壊が見られない領域で検出される（Ｗａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。これらのデータは、天疱瘡において、棘融解前にアポトーシスがケラチノサイトで起こることを明確に示している。
【０００５】
アポトーシスは、細胞恒常性の調節において基本的な役割を果たし、かつ多くの病態生理学的プロセスに関与している。アポトーシスは、細胞間解離（Ｒｅｚｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００；  Ｂｅｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）および細胞マトリックス相互作用の損失（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  １９９９）の双方に続くことがある。
【０００６】
Ｆａｓ（またはＦａｓＲ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員であり、多くの細胞系においてＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）と結合するとアポトーシスを引き起こす（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。アポトーシスに誘発されるＦａｓ−ＦａｓＬの細胞内シグナル伝達は、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ結合デスドメイン）およびＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ様ＩＣＥ、カスパーゼ−８）等の多くのアダプタ分子を動員することによって作用する。これは順々にＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ抑制タンパク質）によって抑制される（Ｊｕｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８）。Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用は、ＡＩＤＳ（Ｂａｈｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）と全身性エリテマトーデス（Ｋｏｖａｃｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）等のいくつかの免疫性炎症および感染症の病理機序に関与する。Ｆａｓ−ＦａｓＬ経路の関連を特徴とする皮膚疾患としては、急性移植片対宿主病、中毒性表皮壊死症およびメラノーマが挙げられる（Ｗｅｈｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。さらに、ＰＶＩｇＧおよび抗ＦａｓＲの双方で処置された培養ケラチノサイトで棘融解様病変が観察され、一方ＰＶＩｇＧが病変形成の数時間前に細胞膜上でのＦａｓＲ、ＦａｓＬ、およびカスパーゼ−８のクラスター形成を誘発することが報告された（Ｗａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。さらに、カスパーゼ−１様インヒビターは、天疱瘡マウスモデルにおいて水疱形成を有意にブロックしたと報告された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。まとめると、ＦａｓＬおよび外因性アポトーシス経路が棘融解の根底にある機序で重大な役割を果すことをこれらのデータは示している。
【０００７】
天疱瘡自己抗体の性質がどうであろうと、棘融解の数時間前にＰＶＩｇＧに曝露すると、ＦａｓＬを含むいくつかのプロアポトーシス遺伝子の発現を上方制御する。さらに、静注用ＩｇＧ（ＩＶＩｇＧ）は、ケラチノサイトでＰＶＩｇＧに誘発されるＦａｓＬおよびアポトーシスの上方制御を阻止する。ＩＶＩｇＧは、棘融解とアポトーシスをｉｎ  ｖｉｖｏでも阻止する（Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。
【０００８】
処置をしないと、尋常性天疱瘡の死亡率は、１００％に近似する。天疱瘡を制御するには、早期の全身治療が必要であるが、主な合併症は全身治療からの副作用である。処置には、副腎皮質ステロイド、金を含有する薬剤、抗炎症薬ダプソンまたは免疫系を抑制する薬剤（例えばアザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、シクロホスファミドまたはミコフェノール酸モフェチル）の投与が挙げられる。天疱瘡の最も一般的な処置は、現在ではステロイドであり、これは生涯投与を必要とし、かつ重篤な副作用を起こす可能性がある。大部分の天疱瘡患者は、これらの副作用で死亡する。抗生物質のなかには、有効なものもあり、特にミノサイクリンおよびドキシサイクリンがある。静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は時折用いられる。血漿交換法は、抗体を含有する血漿を血液から除去して、静脈内輸液または献血された血漿と交換する方法である。全身薬剤に加えて血漿交換法を用いて、血流中の抗体量を減少させることも可能である。いくつかの新しい分子も開発中である。すなわち、ミコフェノール酸モフェチル、ＰＩ−０８２４、ＰＲＴＸ−１００、抗ＣＤ２０は、Ｔ細胞およびＢ細胞に働く免疫抑制薬である。
【０００９】
現在の死亡率は、依然として５〜２５％にわたる。感染は、最も頻度の高い死因であり、長期間の免疫抑制療法（主に副腎皮質ステロイド）は、依然として高死亡率をもたらしている特筆すべき要因の一つである。免疫グロブリンは、多少の短期改善をもたらし得るが、持続する寛解を誘発するとは思われず、長期間使用はその費用から非実用的になる。
【００１０】
血漿交換法を用いる際にはいくつかの警告も存在する。プレドニゾンまたは他の免疫抑制剤で抑制され、かつ血漿交換法を受けている患者は、敗血症からより高い突然死のリスクにさらされている。さらに、この療法は極めて費用がかかり、この療法を投与するために２週間の入院期間が必要である。したがって、敗血症からの突然死のリスクと高額費用のために、患者がこの疾患自体から死のリスクを明らかにさらされている難治例においてのみ血漿交換法が指示される。
【００１１】
本発明の目的は、天疱瘡の治療薬を提供することである。ＦａｓＬをブロックする新薬を開発することで、細胞解離および皮膚病変の形成を完全に阻止することができる。
【００１２】
概して、本発明は、ＦａｓＬアンタゴニストを投与することによって、ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患を処置することに言及する。ＦａｓＬアンタゴニストは、抗ＦａｓＬ抗体、特にヒト化抗体もしくはヒト抗ＦａｓＬ抗体、Ｆａｓ発現の核酸エフェクター分子（例えばアンチセンス分子、またはｓｉＲＮＡ分子等のＲＮＡ干渉ができる分子）、可溶性Ｆａｓ受容体分子、アンタゴニストなＦａｓＬ変異タンパク質、およびＦａｓ−ＦａｓＬ相互作用を抑制する低分子量化学物質から選択されてもよい。ＦａｓＬアンタゴニストは、ケラチノサイトアポトーシスおよびそれに続く細胞間解離（棘融解）を阻止する。したがって、ＦａｓＬアンタゴニストは、天疱瘡の予防および／または処置（例えば粘膜皮膚型天疱瘡の予防および／または処置）に特に適している。
【００１３】
本発明は、ＦａｓＬの生物学的作用を抑制する少なくとも１つの化合物を含有する薬物に関する。本明細書で用いる表現「ＦａｓＬの生物学的作用を抑制する化合物」は、ＦａｓＬの生物学的作用を十分にまたは少なくとも実質的に抑制または中和することができるすべての化合物に関する。例えば、抑制作用または中和作用は、ＦａｓＬとそれ自体の自然の受容体との結合を抑制すること、したがってこのようにして引き起こされるシグナル伝達を抑制することに基づくこともある。これは、例えばＦａｓＬそれ自体に結合する抗体またはＦａｓもしくはアンタゴニストなＦａｓＬ変異タンパク質を模倣する可溶性受容体に結合する抗体を使用することによって、このようにしてＦａｓＬと細胞受容体との結合をブロックすることによって達成することができる。ｓｉＲＮＡによってＦａｓまたはＦａｓＬの発現に干渉することで、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系をブロックする。
【００１４】
ＦａｓＬアンタゴニスト療法は、単剤療法、または天疱瘡もしくは他の皮膚疾患（詳しくは上述するように）の処置に適している他の薬物との併用のいずれかで行われる。例えば、ＦａｓＬアンタゴニストとステロイドの併用療法は、ステロイド投与量の大幅な減少を可能にすることもある。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、有効成分としてヒトＦａｓリガンドに対する抗体、またはその活性フラグメントを含む、天疱瘡の治療薬を提供する。この抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗ＦａｓＬ抗体または抗原結合フラグメントもしくは誘導体（例えば組換え単鎖抗体）が好ましい。必要に応じて、この抗体は、エフェクター分子（例えば細胞増殖抑制化合物、細胞傷害性化合物および／または放射性化合物）に抱合させてもよい。
【００１６】
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（本発明によれば特に天疱瘡）の処置に適している好ましいヒト化抗体は、国際公開第１９９７／００２２９０Ａ１号（「抗Ｆａｓリガンド抗体および該抗体を用いる測定方法」）に記述されている、または国際公開第１９９８／０１００７０Ａ１号（「Ｆａｓリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロブリンもしくはその活性フラグメント並びにＦａｓリガンドヒト型化抗体に由来するアポトーシス誘導領域」）に記述されており、この内容を参考として本明細書で援用する。さらに、ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（本発明によれば特に天疱瘡）の処置に適している好ましいヒト化抗体は、米国特許第７，２６２，２７７号（「アンタゴニストな抗ｈＦａｓリガンドヒト抗体およびそのフラグメント」）に記述されており、この内容も参考として本明細書で援用する。
【００１７】
ヒト抗体またはヒト化抗体は、ヒトの治療で用いるマウス抗体および場合によってはキメラ抗体に対して、少なくとも３つの潜在的利点を有する。すなわち、１）そのエフェクター部分がヒトエフェクターであるため、それは、ヒト系の他の部分とより良く相互作用し得る；２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたはＣ領域を異物として認識しないはずであり、したがってそのような注入される抗体に対する抗体応答は、完全に異物のマウス抗体または部分的に異物のキメラ抗体に対するよりも少ないはずである；３）注入されるヒト化抗体は、自然発生的ヒト抗体のそれにむしろ近い半減期を有すると推定され、投与されるべき投与量をより少なくかつ低い頻度にすることが可能になる。
【００１８】
さらに好ましいＦａｓＬアンタゴニストは、Ｆａｓ受容体の細胞外可溶部分を含む可溶性ＦａｓＲ分子、または競合的なアンタゴニストな活性もしくは非競合的なアンタゴニストな活性を有する修飾型アンタゴニストＦａｓＬ分子である。ＦａｓＬが可溶性受容体の類似体に結合する、またはアンタゴニストなＦａｓＬ分子が天然受容体に結合し、それによってこの天然の受容体への生物活性のあるＦａｓＬの結合を減少もしくは除去するという点において、これらの分子はＦａｓＬ／ＦａｓＲ相互作用を抑制する。ｓｉＲＮＡを用いる処置の間、Ｆａｓタンパク質および／もしくはＦａｓＬタンパク質またはＲＮＡレベルの分析を用いて、被験者を処置する際の処置の型および治療過程を決定することができる。Ｆａｓタンパク質および／もしくはＦａｓＬタンパク質またはＲＮＡレベルのモニタリングを用いて、処置成績を予測し、かつ形質、状態、または疾患と関連する特定のＦａｓタンパク質および／もしくはＦａｓＬタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する化合物および組成物の有効性を決定することができる。
【００１９】
特に好ましい態様では、本発明は以下の使用に言及する。
【００２０】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ（配列番号１）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号２）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号３）もしくは
（ｄ1）配列番号１、２および／もしくは３のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列であり、
および／または前述の軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ（配列番号４）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ（配列番号５）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ（配列番号６）もしくは
（ｄ2）配列番号４、５および／もしくは６のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列である、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００２１】
特に好ましい第２の態様では、本発明は以下の使用に関する。
【００２２】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０４５としてのハイブリドーマ細胞またはそれに由来する抗体もしくは抗体フラグメントによって産生される、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントまたは
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００２３】
特に好ましい第３の態様では、本発明は以下の使用に言及する。
【００２４】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ（配列番号７）、
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｍｅｔ  ＩＩｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号８）、
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号９）もしくは
（ｄ1）配列番号７、８および／もしくは９のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列であり、
および／または前述の軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ2）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ（配列番号１０）、
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ（配列番号１１）、
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号１２）もしくは
（ｄ2）配列番号１０、１１および／もしくは１２のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列である、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００２５】
好ましい第４の態様では、本発明は以下の使用に言及する。
【００２６】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４および／もしくはＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５としてのハイブリドーマ細胞またはそれに由来する抗体もしくは抗体フラグメントによって産生される、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメント、または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、本発明は、米国特許第７，２６２，２７７号に記述されるように、１つの軽鎖可変領域および／または１つの重鎖可変領域を含む抗ＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分の使用に関する。この米国特許の内容は、参考として本明細書で援用する。特に、本発明による、ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患の処置に適している好ましい抗ＦａｓＬヒト抗体は、米国特許第７，２６２，２７７号（参考として本明細書で援用する）の配列番号２に示される配列を有するポリペプチドを含む１つの軽鎖可変領域を含み、さらに米国特許第７，２６２，２７７号（参考として本明細書で援用する）の配列番号１０または１８に示される配列を有するポリペプチドを含む１つの重鎖可変領域を含む。さらに具体的には、本発明は、米国特許第７，２６２，２７７号（参考として本明細書で援用する）に記述されるように抗ｈＦａｓヒト抗体３Ｅ１および／または４Ｇ１１についての、ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用に言及する。
【００２８】
さらに好ましい態様では、本発明は以下の使用に関する。
【００２９】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナルヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ1）ＣＤＲ  Ｈ１：Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ（配列番号１３）もしくは
（ａ2）ＣＤＲ  Ｈ１：Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ（配列番号１４）
（ｂ1）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ（配列番号１５）もしくは
（ｂ2）ＣＤＲ  Ｈ２：Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ（配列番号１６）
（ｃ1）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号１７）もしくは
（ｃ2）ＣＤＲ  Ｈ３：Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号１８）もしくは
（ｄ1）配列番号１３、１４、１５、１６、１７および／もしくは１８のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列であって、
および／または前述の軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が、
（ａ3）ＣＤＲ  Ｌ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ（配列番号１９）、
（ｂ3）ＣＤＲ  Ｌ２：Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｔｈｒ（配列番号２０）、
（ｃ3）ＣＤＲ  Ｌ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号２１）もしくは
（ｄ3）配列番号１９、２０および／もしくは２１のアミノ酸のうちの１つ、２つ、もしくは３つを置換することによって得られる配列である、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナルヒト抗体またはその抗原結合フラグメント
または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００３０】
さらに好ましい態様では、本発明は以下の使用に言及する。
【００３１】
（ｉ）ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメントであって、前述のモノクローナル抗体が、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７および／またはＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８としてのハイブリドーマ細胞またはそれに由来する抗体もしくは抗体フラグメントによって産生される、ヒトＦａｓリガンドタンパク質（ＦａｓＬ）に特異的なモノクローナル抗体またはその抗体結合フラグメント、または
（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じヒトＦａｓＬ上の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントについての、
ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患（特に天疱瘡）の予防および／または治療のための医薬品の製造のための使用。
【００３２】
本発明の薬物は、医薬上許容される担体と共に医薬組成物として提供してもよい。好ましくは、この医薬組成物は、例えば静脈内に、動脈内に、皮下に、腹腔内に注射もしくは注入によってまたは他の適切な方法によって投与する。この組成物は、局所的または全身的に投与してもよい。この組成物は、全身的に投与することが好ましい。
【００３３】
本発明の使用に適している医薬組成物は、意図する目的を達成するために、有効量の活性薬剤を含む。本発明の薬剤の有効量は、投与経路に依存して、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲で、総量約１ｇまでにしてもよい。この医薬組成物は、毎日（例えば１回もしくは数回で）もしくは２〜４日ごとに、毎週または隔週で投与してもよい。この薬物は、１回もしくは数回の薬物投与からなる単回処置周期で、または１回もしくは数回の薬物投与からなる複数回処置周期で投与してもよい。各処置周期は、１日〜数週間、数ヵ月、または数年まででさえ継続期間を有することもある。
【００３４】
したがって本発明によれば、この薬物は、ケラチノサイト棘融解と関連する皮膚疾患に、特に天疱瘡に有効なさらに少なくとも１種類の療法との併用療法で用いてもよい。免疫抑制剤の用量を減少させるためおよび／またはその慢性副作用を軽減するために、この薬物を、単体または他の免疫抑制薬（特にステロイド）との併用のいずれかで使用する。併用で使用する場合、この薬物を月単位で投与することが好ましい。単体で使用する場合、個々の症例に依存する期間内に連続的に投与することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、未処置の天疱瘡患者に由来する凍結切片の病変周囲皮膚の表皮にアポトーシスが存在するかを、ＴＵＮＥＬ染色で評価するための共焦点レ−ザ走査顕微鏡写真である。
【図２】図２は、天疱瘡病変においてアポトーシスを確認するための、ホルマリン固定パラフィン包埋試料をナフトールホスファート基質で可視化した写真である。
【図３】図３は、天疱瘡血清が正常なヒトケラチノサイトでアポトーシスを誘発することができるかどうかを探究したデータを示す。
【図４】図４は、天疱瘡患者に由来する血清におけるＦａｓＬレベルを二部位酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した結果を示している。
【図５】図５は、その同族受容体であるＦａｓＲの発現を調べた結果を示している。
【図６】図６は、ＦａｓＬは、外因性アポトーシス経路を活性化させるカスパーゼ−８の主要誘因の一つであるため、この経路が天疱瘡アポトーシスで役割を果しているかどうかを評価した結果を示す。
【図７】図７は、カスパーゼ−８が、未処置細胞と比較すると、天疱瘡血清で処置したケラチノサイトでは著しく活性化されたが、カスパーゼ−８切断が、抗ＦａｓＬ抗体で前処置することで部分的に抑制されたという結果を示している。
【図８】図８は、Ｆａｓ／ＦａｓＬに誘発されるアポトーシス経路も、接着斑分離の原因であるかどうかを評価した結果を示している。
【図９】図９は、培養物由来のタンパク質抽出物を、抗Ｄｓｇ１抗体および抗Ｄｓｇ３抗体を用いるウエスタンブロット法で解析した結果を示している。
【図１０】図１０は、天疱瘡の病変形成においてＦａｓＬが重要な役割を果していることを前提として、抗ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ２、ＮＯＫ２ハイブリドーマ細胞系によって産生された抗体、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０４５）をテストした結果を示している。
【図１１】図１１は、他の抗ＦａｓＬ抗体（Ｆ９１８−７−３、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体；Ｆ９１８−７−４、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体；Ｆ９１９−９−１８、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体）を用いたＦａｓＬの中心的役割をさらに確認した結果を示している。
【図１２】図１２は、外因性アポトーシス経路がｄｓｇ切断の原因であるかどうかを調べた結果を示している。
【図１３】図１３は、ＰＶＩｇＧで処置したマウスのみに水疱が発現し、正常なヒトＩｇＧで処置したマウスでは発現しなかったこと示すヘマトキシリン−エオシン染色である。
【図１４】図１４は、ＦａｓＬのｉｎ  ｖｉｖｏ役割を評価するために、ＰＶＩｇＧまたはＰＶＩｇＧプラス抗ＦａｓＬ抗体（ＭＦＬ３クローン、マウスに特異的）でマウスを処置した結果を示している。
【００３６】
さらに、本発明を、以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
【００３７】
実施例
未処置の天疱瘡患者に由来する凍結切片の病変周囲皮膚の表皮にアポトーシスが存在するかを、まず、ＴＵＮＥＬ染色で評価した。共焦点レ−ザ走査顕微鏡で、蛍光試料を分析した。病変周囲表皮に由来する基底層直上層では、正常な皮膚と比較すると、大部分のケラチノサイトはアポトーシスであった（図１）。
【００３８】
天疱瘡病変においてアポトーシスを確認するために、ホルマリン固定パラフィン包埋試料を用いて、カスパーゼ−３の活性型を検出した。ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  ＬＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＡＰ  ＰｏｌｙｍｅｒおよびＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）による染色プロトコールを、製造業者の説明書に従って行った。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄタブレットを用いて、ナフトールホスファート基質で可視化を得た。天疱瘡の試料で、病変周囲の表皮では陽性になる細胞があり、カスパーゼ−３フラグメントが水疱蓋および水疱底の双方に位置していることを見出した（図２）。棘融解を引き起こすケラチノサイトの解離前にケラチノサイトの細胞死が起こることを、この結果が示すと思われる。
【００３９】
天疱瘡ではアポトーシスケラチノサイトが極めて多数あらわれるので、天疱瘡血清が正常なヒトケラチノサイトでアポトーシスを誘発することができるかどうかを探究することにした。この目的のために、ケラチノサイトをチャンバースライドに播種し、無血清培地（ＫＧＭ）でプレコンフルエンスに達するまで培養した。次いで、ケラチノサイト基本培地で細胞を培養し、未処置患者または全身性副腎皮質ステロイドで処置した患者のいずれかに由来する２５％の血清を加えて、４８時間、処置した。健常被験者に由来する血清を対照として使用した。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスを評価した。無作為に選択したフィールドで、約１００の細胞を評価し、次いでＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を計算した。天疱瘡由来の血清はヒトケラチノサイトでアポトーシスを誘発したが、健常被験者またはステロイド処置を受けている患者に由来する血清は、ヒトケラチノサイトでアポトーシスを誘発しなかった（図３Ａ、Ｂ）。
【００４０】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ系は、多くのアポトーシスプロセスにおよび皮膚レベルでも関連している（Ｗｅｈｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）ので、天疱瘡患者に由来する血清におけるＦａｓＬレベルを二部位酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。組換えヒトＦａｓＬ標準タンパク質に対して４５０ｎｍの吸光度を用いて、血清濃度を測定した。ＦａｓＬレベルは、未処置患者に由来する血清では極めて高く、副腎皮質ステロイドで処置した患者に由来する血清または健常被験者に由来する血清では検出限度を下回った。ＨＢＶ患者に由来する血清を、陽性対照として使用した（図４Ａ）。ある患者では、ＦａｓＬレベルは、全身性ステロイド治療と共に徐々に低下した（図４Ｂ）。
【００４１】
天疱瘡血清にはＦａｓＬが高含有量で含まれているので、その同族受容体であるＦａｓＲの発現を調べた。この目的のために、ホルマリン固定パラフィン包埋試料を用いた。ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  ＬＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＡＰ  ＰｏｌｙｍｅｒおよびＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）による染色プロトコールを、製造者の説明書に従って行った。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄタブレットを用いて、ナフトールホスファート基質で可視化を得た。ＦａｓＲは正常な皮膚では基底ケラチノサイトのみに発現されるが、活性の天疱瘡病変ではＦａｓＲは基底細胞および基底層直上細胞の双方で検出される。さらに興味深いことに、粘膜皮膚型天疱瘡（ＰＭＣ）ではＦａｓＲは表皮層にわたり、および水疱が形成される前でも発現されると思われる（図５）。
【００４２】
ＦａｓＬは、外因性アポトーシス経路を活性化させるカスパーゼ−８の主要誘因の一つである。したがって、この経路が天疱瘡アポトーシスで役割を果しているかどうかを評価したかった。この目的のために、抗ＦａｓＬ中和抗体またはカスパーゼ−８インヒビターで患者の血清を前処置し、次いでケラチノサイト培養物に加えた。ケラチノサイトをＫＧＭ中で培養し、次いで天疱瘡血清または未処置患者由来の血清で処置した。抗ＦａｓＬ中和抗体（ｍｌあたり２．５ｍｇを３０分間）またはカスパーゼ−８インヒビターＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（１００μＭを３０分間）をもちいて血清を前処置した。ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスを評価した。抗ＦａｓＬ中和抗体またはカスパーゼ−８インヒビターを加えると、天疱瘡血清に誘発されるケラチノサイトアポトーシスが部分的に阻止された（図６）。
【００４３】
さらに、図６のように、ケラチノサイトを処置して、抗ＦａｓＬ抗体または不適切な免疫グロブリンのいずれかを与えた。次いでウエスタンブロット解析のために、ＲＩＰＡ緩衝液中で細胞をホモジナイズした。抗ヒトカスパーゼ−８抗体または抗β−アクチン抗体で膜をインキュベートした。オートラジオグラム上のバンドの相対強度を、レーザーデンシトメトリーを走査することで定量化した。カスパーゼ−８は、未処置細胞と比較すると、天疱瘡血清で処置したケラチノサイトでは著しく活性化されたが、カスパーゼ−８切断は、抗ＦａｓＬ抗体で前処置することで部分的に抑制されたことをこの結果は示している（図７）。
【００４４】
まとめると、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系によって引き起こされる外因性アポトーシス経路を介して、天疱瘡血清がケラチノサイトアポトーシスを誘発することを、これらのデータは示唆している。
【００４５】
上皮の接着結合におけるカドヘリン−カテニン接着複合体の成分は、アポトーシスの間カスパーゼによって標的にされることを近年の研究は示している（Ｗｅｉｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）。Ｆａｓ／ＦａｓＬに誘発されるアポトーシス経路も、接着斑分離の原因であるかどうかを評価するために、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下のＫＧＭ中で培養したコンフルエントなケラチノサイトを、治療または未治療の天疱瘡血清を用いて７２時間処置した。培養物由来のタンパク質抽出物を、抗Ｄｓｇ１抗体および抗Ｄｓｇ３抗体を用いるウエスタンブロット法で解析した。β−アクチンを内部標準として使用した。天疱瘡血清がＤｓｇ１およびＤｓｇ３を切断できることがわかった。特に、未処置患者由来の血清は、著しくＤｓｇ１およびＤｓｇ３を切断するが、ステロイド治療中の患者由来の血清は著しくはなかった（図８）。
【００４６】
最も重要なことに、ＦａｓＬの量を増加させる（０．１、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）７２時間のケラチノサイトの処置では、用量依存的様式でｄｓｇを切断した。培養物由来のタンパク質抽出物を、抗Ｄｓｇ１抗体および抗Ｄｓｇ３抗体を用いるウエスタンブロット法で解析した。これらの用量は、天疱瘡血清で検出したものと一致している（図９）。
【００４７】
天疱瘡の病変形成においてＦａｓＬが重要な役割を果していることを前提として、抗ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ２、ＮＯＫ２ハイブリドーマ細胞系によって産生された抗体、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０４５）をテストした。１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2を加えたＫＧＭ中で培養したコンフルエントなケラチノサイトを以下と共に７２時間処置した。すなわち、１．ＫＧＭ単体；２．抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２、１５μｇ／ｍｌ）抗体；３．ＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）；４．ＦａｓＬ＋抗ＦａｓＬ抗体。抗ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ２）がＦａｓＬ誘発ｄｓｇ切断を阻止する証拠を示す。抗ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ２）がカスパーゼ−８に誘発されるアポトーシスを抑制することも示す（図１０Ａ）。抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２）抗体が、ＦａｓＬに誘発される細胞間解離、すなわち棘融解を阻止することを、図１０Ｂに示す。
【００４８】
ＦａｓＬの中心的役割をさらに確認するために、他の抗ＦａｓＬ抗体（Ｆ９１８−７−３、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体；Ｆ９１８−７−４、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体；Ｆ９１９−９−１８、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体）を用いた。１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2を加えたＫＧＭ中で培養したコンフルエントなケラチノサイトを以下と共に７２時間処置した。すなわち、ＫＧＭ単体；組換えＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）；ＫＧＭ中で１：１に希釈したハイブリドーマ培地；ＫＧＭ中で異なる希釈でのＦａｓＬ＋ハブリドーマ培地。抗ＦａｓＬ抗体が、用量依存的様式でＦａｓＬに誘発されるｄｓｇ切断を阻止し（図１１Ａおよび図１１Ｂ）、カスパーゼ−８に誘発されるアポトーシス活性を抑制する（図１１Ａ）証拠を示す。ハイブリドーマ細胞系ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５由来の培地に含まれるＦａｓＬ抗体が、ＦａｓＬに誘発される細胞間解離、すなわち棘融解を阻止することを、図１１Ｃに示す。
【００４９】
外因性アポトーシス経路がｄｓｇ切断の原因であるかどうかを調べるために、カスパーゼ−８インヒビターＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（１００μＭで３０分間）または抗ＦａｓＬ（ＮＯＫ２、１５μｇ／ｍｌ）抗体を用いてコンフルエントな ケラチノサイトを前処置した。次いで、健常血清または未処置の天疱瘡血清を用いて、細胞を７２時間インキュベートした。培養物由来のタンパク質抽出物を、抗Ｄｓｇ３抗体および抗カスパーゼ−８抗体を用いるウエスタンブロット法で解析した。内部標準としてビンキュリンを使用した（図１２Ａ）。細胞解離（すなわち棘融解）が抗ＦａｓＬ抗体またはカスパーゼ−８インヒビターによって阻止されることを図１２Ｂに示す。抑制ＦａｓＬまたはカスパーゼ−８活性化アポトーシス経路がカスパーゼ−８活性化およびｄｓｇ切断の双方を阻止し、したがって棘融解をブロックすることをこれらの結果は示している。
【００５０】
結論として、カスパーゼ−８に仲介される外因性アポトーシス経路およびｄｓｇ切断の双方を活性化することによる二重活性をＦａｓＬが発揮することを我々は示した。我々の研究と一致して、アポトーシスが天疱瘡の現象の原因であり得ることをＷａｎｇと共同研究者らは示唆していた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）。ＰＶ−ＩｇＧおよびＦａｓ受容体に対する抗体（抗ＦａｓＲ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで同様に病変を誘発し、（１）可溶性ＦａｓＬの分泌；（２）ＦａｓＲ、ＦａｓＬ（可溶性および膜の）、Ｂａｘおよびｐ５３のタンパク質の細胞含量の増加；（３）細胞Ｂｃｌ−２レベルの低下；（４）カスパーゼ−８内の濃縮、およびカスパーゼ−１と３の活性化；（５）膜の細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）でのＦａｓＬおよびＦａｓＲのパスパーゼ−８との共凝集を引き起こすことを、Ｗａｎｇらは示した。したがって、Ｆａｓに仲介される細胞死シグナル伝達経路は、病変形成に関与していると思われる。
【００５１】
天疱瘡の研究のために、確立した動物モデルが長くかつ広く使われてきた。ＰＶＩｇＧを新生仔マウスに受動移入すると、細胞解離および水疱形成を誘発する。このモデルを用いて、天疱瘡の病変形成におけるアポトーシスおよびＦａｓＬの関与が評価した。患者血清から精製したＰＶＩｇＧ（５ｍｇ／ｇ／体重）を、新生仔Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＩマウスに、皮下注入した。健常個体の血清から精製したＩｇＧ（ＮＩｇＧ）で処置した正常な新生仔マウスを対照として使用した。注入から２０時間後、動物を屠殺した。
【００５２】
ＰＶＩｇＧで処置したマウスのみに水疱が発現し、正常なヒトＩｇＧで処置したマウスでは発現しなかったことをヘマトキシリン−エオシン染色は示している（図１３Ａ）。ＴＵＮＥＬまたはカスパーゼ−３活性化のいずれかによって、ＰＶＩｇＧで処置したマウスのみにアポトーシスを検出した（図１３Ｂ）。
【００５３】
ＦａｓＬのｉｎ  ｖｉｖｏ役割を評価するために、ＰＶＩｇＧまたはＰＶＩｇＧプラス抗ＦａｓＬ抗体（ＭＦＬ３クローン、マウスに特異的）でマウスを処置した。ＰＶＩｇＧを注入してから３時間後、抗ＦａｓＬ（４０μｇ／マウス）を投与した。Ｈ＆Ｅ染色で示すように、マウスでは水疱形成が阻止されていた。さらに、抗ＦａｓＬで処置したマウスにおけるクレフトの長さは、著しく減少した（図１４）。
【００５４】
結論として、カスパーゼ−８に仲介される外因性アポトーシス経路およびｄｓｇ切断の双方を活性化することによる二重活性をＦａｓＬが発揮することを示した。最も重要なことに、ＦａｓＬをブロックすることで、棘融解からｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで保護する。
【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
2011506371.tif 000004
【００５８】
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【００５９】
2011506371.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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