(57)【要約】  本発明は、心筋機能不全を虚血の間鈍らせるための、および再潅流傷害を回復させるための、高用量の葉酸、またはその生物活性誘導体の１つの等用量の使用に関する。本発明は、特に、虚血の間における、少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の誘導体の適用による再潅流前における早期処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋機能不全を虚血の間鈍らせるための、および再潅流傷害を回復させるための、少なくとも２００ｍｇの高用量葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用。
【請求項２】
上記心筋機能不全が心筋収縮力を減少させる、請求項１に記載の少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用。
【請求項３】
上記心筋機能不全が心筋細胞死である、請求項１に記載の少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用。
【請求項４】
上記心筋機能不全が梗塞に誘導される不整脈である、請求項１に記載の少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用。
【請求項５】
再潅流前の虚血の間における早期処置としての、少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用。
【請求項６】
上記高用量が少なくとも６００ｍｇである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記高用量が経口的に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
上記用量の投与が筋肉内、静脈内、または経皮的である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
可能であれば薬学的に容認できる媒介物との組合せた、少なくとも６００ｍｇの葉酸、等用量の葉酸誘導体の一用量を含む医薬組成物。
【請求項１０】
ＡＴＰ/ＡＤＰレベルが減少する心血管系障害において減少した高エネルギーリン酸塩レベルを改善または回復させるための心保護薬または治療薬としての葉酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋機能不全を虚血の間鈍らせるための、および再潅流傷害を回復させるための、高用量の葉酸、またはその生物活性誘導体の１つの等用量の使用に関する。本発明は、特に、少なくとも２００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の誘導体を、虚血の間、再潅流前に適用する早期処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠閉塞の間は、心筋潅流および酸素運搬が活動的な筋収縮を維持するには不十分となる。虚血帯において、心筋の高エネルギーリン酸塩の含有量は低下し、無機リン酸の含有量が上昇し、組織はアシドーシス性となり、心筋の高エネルギーリン酸塩の含有量は低下し、無機リン酸の含有量が上昇し、組織はアシドーシス性となり（Jennings and Steenbergen, 1985）、結果的に局所的な運動障害および全身的な機能不全となる。虚血後の冠再潅流は、組織の損傷を制限するが、活性酸素種（ＲＯＳ）、カルパインのようなカルシウム依存性プロテアーゼ、筋原繊維の拘縮、微小血管の機能不全、および炎症性サイトカインから毒性をもたらす（Gross and Gross, 2006）。虚血の間のＡＴＰ枯渇も再潅流障害に寄与しているかもしれない(Gunduz .et al., 2006)。加えて、虚血 (Klawitter et al., 2002)、および再潅流 (Zweier and Talukder, 2006)の両者の間に産生されたＲＯＳは、中心的役割を果たしていると考えられ、この傷害を補うために多様な抗酸化戦略が試験されている。虚血／再潅流障害を制限するための１つの手段は、より長期間の曝露に先立って、心臓を短時間の虚血にさらすことである。この現象は、虚血性前条件付けと名付けられている。この現象は、プロテインキナーゼＣの活性化（Yamamura et al., 2005）、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの刺激、および一酸化窒素の合成（Jones and BoIIi, 2006）を含む多様なメカニズムに関し、後者は中心的な役割を果たしている。虚血‐再潅流後の梗塞のサイズは、ｅＮＯＳ欠損マウスにおいて大きくなる（Jones et al., 1999）が、ｅＮＯＳを過剰発現しているマウスでは減少する（Jones et al., 2004）。ＮＯ合成の減少とＮＯＳによるＲＯＳ産生の増加とは、ＮＯＳの必須の補因子であるテトラヒドロビオプテリン (ＢＨ４)の除去／酸化により、ＮＯＳに機能的な脱共役が生じた場合に起こる（Hevel and Marietta, 1992; Vasquez-Vivar ef al., 1998）。
【０００３】
ＩＲ傷害におけるＮＯＳの潜在的な役割は、インビトロにおけるＢＨ４の投与を含む、酵素機能を高める努力をもたらした（Wajima et al., 2006）。さらに安価な代替物は、通常のミトコンドリアタンパク質、および核酸合成にとって重要な葉酸（ＦＡ）、Ｂ−ビタミンかもしれない（Depeint et al., 2006）。しかし、これらはｅＮＯＳへの結合親和性を示すことによりＢＨ4を安定化し(Stroes et al., 2006; Hyndman et al., 2002)、酸化されて不活性なＢＨ２からＢＨ４の再産生を促進する。ＦＡ、またはその活性型代謝産物である５‐メチルテトラヒドロ葉酸塩(５−ＭＴＨＦ)は、上皮機能を改善する（Verhaar et al., 1998; Shirodaria et al., 2007; Moat et al., 2006）。
【０００４】
低用量のＦＡは、心筋系疾患の患者で試験されてきた。しかし、心血管リスクを減らすためのＦＡの実益を試験するために行われた最近の臨床試験では、いくらか残念な結果となり（Bazzano et al., 2006）、上記ＦＡの実益は間違いなく決定的ではない。加えて、ＦＡは、特に心血管疾患の患者において心血管リスクを低下させるための潜在能力について臨床試験において試験されてきた。例えば、Oster (1981 )は、通常の使用（４０〜８０ｍｇ／日）よりもはるかに高い用量での長期間（１０年間）の葉酸処置は、冠動脈疾患の患者において、心筋梗塞の発生率、狭心症、およびニトログリセリンの要求性を減少させることを示した。この知見は、プラセボコントロール試験によっては確認されず、メカニズムも探索されていない。ホモシステインを低下させるＦＡの能力に焦点を絞ったその他の研究においては、血清ホモシステイン中においてホモシステインを３μｍｏｌ/ｌ減少することが発見された（0.8ｍｇ/ｄを達成できる）。これらの陽性の結果を除けば、心血管予防における使用のための多様なＦＡ試験の集積分析は印象的ではなく(JAMA 2002; Wang et al., 2007; WaId et al., 2006)、用量、試験期間、標的集団、または他の要素が上記ＦＡの能力を説明するとすれば、それは不確かなままである。先行して行われた心血管介入試験（５〜２５ｍｇ／７０ｋｇ／ｄ）、または予防試験（５００μｇ〜１ｍｇ）において使用された用量は、本発明の用量に比べて低いものである。
【０００５】
ＷＯ０１３０３５２には、高ホモシステイン血症（hyperhomocystemia）を治療するための３０〜５００ｍｇ、好ましくは３０〜１００ｍｇの葉酸の用量が記載されている。しかし、高ホモシステイン血症は、心血管疾患の危険因子として考えられており、どれだけ高レベルのホモシステインが心血管疾患を引き起こすのかといったメカニズムは知られていない。また、そのような心血管疾患に効果のある適用用量は記載されていない。特に、患者が高ホモシステイン血症で苦しんでいない場合は記載されていない。
【０００６】
ＷＯ２００６１１３３８９には、被験者への葉酸の高用量（２０〜１００ｍｇ）の投与を含む血管拡張の改善方法が記載されている。また、ＷＯ２００６１１３３８９には、１日当たり２０〜１００ｍｇの用量が単一の心疾患の発達を遅らせ、または最小化し得ることがクレームされている。この処置により、虚血の間の微小血管の機能不全が鈍る、再潅流後の傷害が回復する、といった指摘はない。
【０００７】
驚くべきことに、我々は、再潅琉の前における虚血の間の高用量（被験者あたり少なくとも２００ｍｇ）のＦＡ前処置および／または処置がＩＲ傷害を回復できることを見出した。そして、我々はそのような効果のメカニズムを探求した。このデータは再潅琉後の恩恵を示すが、局所的、および心室の機能不全、ならびに虚血自体の間におけるＲＯＳ産生について、ＦＡ前処置の顕著かつ驚くべき効果をより直接的に明らかとする。この恩恵は、プリン分解における変質と虚血の間の高エネルギーリン酸塩レベルの保存との関与を明らかにする。
【０００８】
本研究において、我々は、高用量の葉酸の経口的な前処置が、冠閉塞の間における重度の虚血性機能不全を顕著に減少させること、および再潅流後に機能を向上させ、梗塞サイズを縮小させることを初めて証明した。これらの効果は、血流の減少にもかかわらず、虚血の間の高エネルギーリン酸塩の保存、全身および局所的な機能の改善、壊死および酸化ストレスの減少、ならびに再潅流下におけるｅＮＯＳ共役の保存に関与した。冠血流を実質的に減少させずに心筋収縮の持続を促進するためのＦＡ前処置の能力は、並外れたものである。また、上記能力は抗酸化作用の影響、および古典的な前期条件付け試薬とは全く異なるものである。 これらは、通常、虚血の間ほとんど影響しないが、心臓の再潅流後に恩恵がある。このため、梗塞サイズの減少におけるＦＡの恩恵は、虚血後に与えられ、始まるだけではなく、異なるメカニズムであることを示唆する。 
【０００９】
本発明の第一の態様は、心筋機能傷害を鈍らせるための、および／または再潅流後の傷害を回復させるための、少なくとも２００ｍｇ、好ましくは少なくとも６００ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも１０００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用である。本明細書において使用される葉酸は、当業者に公知であり、葉酸および５−メチルテトラヒドロ葉酸塩を含み、これらに限定されない。本明細書において使用される心筋機能障害は、心筋収縮力の減少、心筋細胞死、および／または不整脈に誘発される梗塞を含み、これらに限定されない。好ましい実施形態の１つは、高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用である。ここで、上記心筋機能障害は心筋収縮力を減少させる。他の好ましい実施形態は、高用量の葉酸、または葉酸誘導体の使用である。ここで、上記心筋機能障害は心筋細胞死である。また、他の好ましい実施形態は、高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用である。ここで、上記心筋機能傷害は、不整脈に誘発される梗塞である。好ましくは、上記高用量は単一用量として投与される。より好ましくは、上記用量は、再潅流の前で虚血の間に投与される。ある好ましい実施形態では、上記投与は経口投与である。他の好ましい実施形態では、上記用量は静脈内注射により投与される。また、上記用量は経皮的に、または筋肉内に注射することにより投与されてもよい。
【００１０】
本発明の他の態様は、再潅流前の虚血の間における早期処置としての、少なくとも２００ｍｇ、好ましくは少なくとも６００ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも１０００ｍｇの高用量の葉酸、または等用量の葉酸誘導体の使用である。本明細書において、早期処置とは、虚血の発生後であるが、再潅流の前に開始される処置を意味する。好ましくは、上記用量は単一用量として投与される。より好ましくは、上記用量は、再潅流前で虚血の間に投与される。ある好ましい実施形態では、上記投与は経口投与である。他の好ましい実施形態では、上記用量は静脈内投与により投与される。また、上記用量は、経皮的に、または筋肉内に注入されることにより投与されてもよい。
【００１１】
また、本発明の他の態様は、可能であれば薬学的に容認できる媒介物との組合せとして、少なくとも６００ｍｇの葉酸の単一用量、好ましくは少なくとも１０００ｍｇの葉酸の単一用量、または等用量の葉酸誘導体を含む医薬組成物である。本明細書における、医薬組成物は、注入に適した水溶性組成物、または経口摂取のための固体組成物であってもよい。また、本発明の他の態様は、ＡＴＰ/ＡＤＰレベルが減少する心血管系障害において減少した高エネルギーリン酸塩レベルを改善または回復させるための心保護薬または治療薬としての葉酸の使用である。好ましくは上記葉酸の使用は高用量の使用である。さらに好ましくは、上記用量は少なくとも２００ｍｇ、さらに好ましくは６００ｍｇである。本明細書における改善とは、処置により上記高エネルギーリン酸塩レベルが増加することを意味する。その増加は、健常人における通常のレベルまでではない。本明細書における回復とは、治療後の高エネルギーリン酸塩レベルが健常人と同等、またはより高くなることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】圧力／ボリューム−ループ分析による心機能の測定。（Ａ）プラセボ動物（上部）およびＦＡ前処置動物（下部）における、ベースライン（１）、虚血の最後（２）、および９０分間の再潅流における圧／容量−ループ分析の例。ＦＡ前処置は、虚血の間、およびそれに続く再潅流の両者において機能を改善した。（Ｂ）全ＩＲプロトコールの血行動態の概要は、収縮期、および弛緩期のパラメータの間の時間経過を示す（ｐ値は反復測定分散分析（repeated measures ANOVA）により、時間×処置相互作用／処置効果である）。
【図２】開胸心臓超音波検査。左上のパネルは、プラセボ群とＦＡ処置群についてベースライン、および３０分間の虚血後におけるＭモードエコーの例を示す。サマリープロットは、これらの心エコー図対時間から得られた結果を示す。駆出率、および中隔前壁厚の増大はプラセボ群において低下したが、ＦＡ群では変化しなかった（処置効果のｐ値はＲＭＡＮＯＶＡによる）。
【図３】高エネルギーリン酸塩(ＨＥＰ)代謝、および酸化還元状態のパラメータのＨＰＬＣ分析。ベースラインにおける条件下で、ＦＡの前処置は、ＨＥＰ（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）を変化させなかったが、イノシトール一リン酸塩（ＩＭＰ）およびその異化産物（オキシプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、および尿酸）を強く増加させた。虚血の３０分後、ＨＥＰレベルは、プラセボ群に比べてＦＡ処置された心臓ではよりよく維持された。プラセボ投与群において虚血後にオキシプリンが顕著に上昇したが、これはＦＡ処置されたラットでは観察されなかった。ｐ値は二元分散分析（2-way ANOVA）によるもので、１つ目の値は虚血の効果を指し、２つ目の値は投与群と虚血群との間の相互作用を指す。
【図４】心筋壊死における葉酸の効果。（Ａ）経口によるＦＡの前処置（７日間）は、インビボにおいて梗塞サイズを減少させた（＊：ｐ＜０．００１;マン・ホイットニー検定）。上部のパネル：リスク領域（ＡＡＲ）を全ての群の間で比較した。中央のパネル：全てのＦＡ処置群において％ＡＡＲとして表した梗塞サイズが顕著に減少した。下部のパネル：心筋壊死とＡＡＲとの間の個体的相関のプロット図である。  （Ｂ）インビボにおけるＦＡ前処置は、収縮帯の壊死を減少させる（＊ｐ＝０．００１）。（Ｃ）インビボにおけるＦＡ前処置はアポトーシスを減少させる（ＴＵＮＥＬ染色）(＊ｐ＝０．００５、およびｐ＝０．００１ )。（Ｄ）ＦＡ前処置は、インビボにおける実験で心臓の心筋壊死を８０％近く減少させる(＊ｐ＝０．００５、およびｐ＝０．００１)。（Ｅ）虚血−再潅流後に増加した再乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、１０〜２０分後にピークを迎えた。一方、ＦＡ前処置を受けた心臓では最小限のＬＤＨの放出しかなかった（ｐ＜０．００１）。
【図５】ＲＯＳ産生におけるＦＡ処置の効果。（Ａ）ルシゲニンに促進された過酸化物の検出は、虚血とＩＲとに誘導された過酸化物がＦＡ前処置により顕著に減少することを示す。（Ｂ）ＩＲ心臓に処置されたコントロールベヒクルにおけるＯ２−の生成は、ＢＨ４の急な添加によって顕著に抑制された。一方、この抑制は、ＦＡ前処置された心臓から得られた心筋抽出物では半分近く鈍くなった。（Ｃ〜Ｄ）ＤＨＥ染色、および（Ｅ）ＤＣＦ染色された心筋において、虚血、またはＩＲ心筋におけるＲＯＳ産生が増加したこと、ならびにＦＡ前処置を受けた心臓では、ＲＯＳ産生が実質的に減少したことを明らかとする。（Ｆ）ＦＡの直接の抗酸化作用をテンポールと比較した。ＦＡかテンポールのどちらかを多様な濃度で添加し、インビトロでキサンチン／キサンチン酸化酵素により産生された過酸化物をルシゲニンに促進された化学発光により測定した。
【図６】ＮＯ経路におけるＦＡ前処置の効果。（Ａ）ＳＤＳページのゲルは、ＩＲ心筋において、ｅＮＯＳモノマーが増加したことを示す。その増加は、ＦＡ前処置によってコントロールレベルまで減少した。（Ｂ〜Ｃ）パネルＡに示したゲル分析のサマリーデンシトメトリーのデータである。ＦＡ前処置は、モノマー／ダイマー比を減少させたが、全ｅＮＯＳタンパク質の発現においては効果がなかった。（Ｄ）ＩＲの前後におけるインビトロでの心臓へのブラジキニン投与は、内皮依存性の血流応答を減少させることを示した。この減少は、ＦＡの前処置により正常の応答に回復した。（Ｅ）ＦＡ処置は、ニトロプルシドナトリウムへの血流応答には影響を与えず、ブラジキニンで観察された不同は内皮依存性であることを裏付ける。
【実施例】
【００１３】
実施例の材料および方法
論理委員会
実験は米国国立保健研究所により発行され、アントワープ大学の米国論理委員会とジョンホプキンス医学研究所（Johns Hopkins Medical Institutions）とにより承認された実験動物の取扱および使用のガイド（NIH-Publication、N°85-23）に従った。
【００１４】
インビボ虚血モデル
虚血／再潅流（ＩＲ）実験に先立って成体のウィスターラットに、ＦＡ（別段に記述しない場合は１０ ｍｇ/ｄａｙ)、またはプラセボを経口胃管栄養法により７日間投与した。全部で１３１匹のラットを使用した。各動物において行えない多重アッセイのために要求される例数は、全体の群の異なる部分集合において得た。動物を麻酔し（ペントバルビタール６０ｍｇ／ｋｇ）、気管切開により挿管し、通気した（Harvard Apparatus, MA）。心電図（ＥＣＧ）で観察し、温度を３７．５℃に維持した。左下行動脈を４〜５番の肋間腔を介して暴露し、その周囲を縫合した。そして、９０分の再潅流を行い、一過性の冠動脈結紮を３０分間行った（ｎ＝８５）。また、９０分の再潅流を行わず、一過性の冠動脈結紮を３０分間行った（ｎ＝４６）。再潅流した動物の１つのサブグループ（ｎ＝９）では、冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）梗塞の発症後（すなわち、再潅流の２０分前）、ＦＡを静脈内ボーラス投与により１０分間与えた。
【００１５】
インビボにおける血行動態
ＬＶ機能は、虚血、およびそれに続く再潅流の両者の間にインビボで圧力／ボリューム−ループ分析により評価した。（Ａ）１．４Ｆ  圧力−ボリュームカテーテル(SciSense, London-Ontario, Canada)を心突部を通して進め、身体の軸線に沿って設置し、刺激／分析装置（stimulator/analyzer） (IOX 1.8.9.19, Emka Tech., Paris)に接続した。容量データは、ゲインを１として高張食塩液法を用いて計算した。虚血の間に二匹のラットのカテーテルの位置がずれ、その容量データは使用していない。記載したように、開胸心筋前壁運動も左室の傍胸骨視界にて、１５ＭＨｚリニアトランスディーサーを備えたSequoia -Acuson C256（Sequoia C256 Echocardiography System, Acuson Corporation, Mountain View, CA）を用いて測定した。
【００１６】
酸化還元およびエネルギー代謝の評価
前壁からの急速凍結サンプル（ｎ＝２４）（±ＦＡ 前処置;±３０分間の虚血、再潅流なし）を除タンパクし、組織の酸化還元、およびエネルギー状態を反映した水溶性低分子量化合物のＨＰＬＣ分析を行った。高エネルギーリン酸塩、オキシプリン（ヒポキサンチン、キサンチン、および尿酸）、ヌクレオサイド（イノシン、およびアデノシン）、マロンジアルデヒド、ならびに還元および酸化されたグルタチオンをイオン交換ＨＰＬＣにより測定した(Takimoto et al., 2005)。
【００１７】
心筋の血流量の測定
心筋の局所的な血流量は、虚血の５分後および３０分後に左心室にニュークリア−アクチベイテドマイクロスフィア（直径１５μＭ、BioPal, Worcester, MA）をベースラインで注入(２．５＊１０６ｓｐｈｅｒｅｓ/ｍｌにて０．３ｍｌ )することにより評価した（ｎ＝１２）（Reinhardt et al., 2001）。毎分あたりのカウント数（ｃｐｍ）は、体重で標準化し、虚血の前、および虚血の間の相対的な血流を得るために隔離領域で標準化した虚血領域から得た。
【００１８】
インビトロＩＲモデル
生体のウィスターラット（ｎ＝２８）を麻酔し（ペントバルビタール６０ｍｇ／ｋｇ）、心臓を迅速に切除し、一定の潅流圧で温め、酸素化されたクレブス−ヘンセレット溶液を用いた逆行性潅流システム (Emka, Paris, France)にマウントした。心臓を３００ｂｐｍで静置し、ロードしていない状態で維持した。冠状動脈血流をインラインウルトラソニックフロープローブ (Transonic Systems, Ithaca, NY, USA)により測定した。３０分の平衡化後、血管拡張剤（ブラジキニン、およびニトロプルシドナトリウム）をボーラス投与（すなわち５０ μｌ、１０−８〜１０−５．５ Ｍ ）により注入した。そして、一定の潅流圧で冠状動脈血流の逆行を評価した。ベースラインを再設定した後、心臓にＦＡ（すなわち４．５ １０−６Ｍ）、または賦形剤を与えた。その後、心臓を４０分間再潅流することで、冠状動脈血流を４０分間ゼロとした。冠状動脈の流出物を集め、濃縮し（Sartorius-Sipan, Lier, Belgium）、乳酸デヒドロゲナーゼを分析した(Vitros 950AT, O. C. D., Beerse, Belgium)。同じ２つの試薬に対する冠血管拡張薬の応答は、再潅流に続いて繰返された。
【００１９】
梗塞のサイズの分析と組織構造
３１匹のラットのリスク領域と梗塞のサイズは、冠閉塞の間に注入したエバンスブルーの陰性染色、および続いて心筋壊死を検出するためのＴＴＣ染色することにより決定した。ＬＶ (遊離壁＋隔膜全体)、 ＡＡＲ (エバンスブルー陰性)、および壊死領域（ＴＴＣ無色）は、プラニメータ（Soft Imaging system GmbH, Analysis pro version 3.00）により測定した。また、デジタル化された画像を明瞭さ、および鮮明度を向上させるために、均一のバックグラウンド、明度、およびコントラスト強度とした。インビトロの実験において、全身性虚血が生じたため、ＴＴＣ染色はエバンスブルー染色の前に行わなかった。収縮帯の壊死は、インビボでラットの心臓をカルノア溶液で固定し、マッソン三色染料で染色することで評価した。収縮帯が存在する心筋の割合を算出するために、連続する隣接領域を全ＬＶについて調査した。同様の分析はＴＵＮＥＬ陽性法（Chemicon Intern, Temecula, CA）により行い、ＬＶ領域の割合としても表した。
【００２０】
ＲＯＳの決定
過酸化物は、ルシゲニンが促進する蛍光ケミルミネッセンス（Beckman LS6000IC, ｎ＝２３）２２、および蛍光マイクロトポグラフィ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ＤＣＦ、ｎ＝１６、およびジヒドロエチジウム、ＤＨＥ、ｎ＝２４）により評価した（Gupte et al., 2005）。葉酸の直接の抗酸化効果は、インビトロでキサンチン／キサンチンオキシダーゼシステム（Antoniades et al., 2006）を使用して分析し、テンポールと比較した。
【００２１】
ｅＮＯＳモノマー／ダイマー構造と酵素活性
ＳＤＳに抵抗性のｅＮＯＳダイマーおよびモノマーは、以前に記載したような低温ＳＤＳページ(Takimoto .et al., 2005)を用いて、虚血／再潅流組織（ｎ＝１６）において分析した。ＮＯＳの酵素活性は、凍結した心筋（ｎ＝１５）から得た抽出物をアルギニン−シトルリン変換分析により評価した。
【００２２】
データ分析
データは、ｐ値＜０．０５を統計的有意差とし、平均値±標準誤差として表した。冠血流予備能（Coronary flow-reserve）、およびインビボにおける血行動態のデータは、反復測定分散分析により分析した。他の比較では、複数の独立した群を比較するために多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて一元分散分析、またはクラスカルウォルス検定を使用した。分析にはSPS6 version 11.0(Chicago, IL)を利用した。
【００２３】
＜実施例１＞
葉酸の前処置はＩ／Ｒにおける心筋機能を改善する
図１Ａは、ＦＡ（１０ｍｇ／ｄ）の前処置あり、または前処置なしにおける、心臓の収縮期、および弛緩期の心室機能についてＰＶ相関（PV relations）およびサマリーデータの例を表す。３０分の冠閉塞の間、および再潅流の９０分後に開胸ラットにおける初期のベースラインでデータを測定した。コントロールの心臓では、ＬＡＤ梗塞の３０分後、ＰＶループの右下方へのシフトとともに心筋機能の顕著な減少を示した。これは、再潅流後にも持続した。ＦＡ前処置では、虚血、および再潅流期間の間、収縮期、および弛緩期の機能はよりよく保存された（下部パネル）。サマリーデータ（図１Ｂ）はこれらの例を裏付けるものである。ＬＶ圧の最高点（すなわち、収縮期の血圧）は、ＦＡ前処置ラットにおいてはＬＡＤ梗塞にもかかわらずほとんど変化しなかったが、コントロールにおいては２５％近く低下した。同様の不同は、ｄＰ/ｄｔｍａｘにおいて観察された。心拍出量、および一回心仕事量も、特に遅発虚血および再潅流におけるＦＡ前処置動物において減少が小さくなった。従って、心機能は虚血期間および再潅流後にＦＡ前処置により促進された。
【００２４】
虚血の間の全身機能の相対的な保存は、いくらか驚きであり、ＦＡ前処置した心臓において冠梗塞にもかかわらず局所的な機能不全であることが示唆された。このことを試験するために、我々は、ＬＡＤ梗塞の３０分間の壁厚の増大と機能不全の時間経過とを測定するために開胸心エコーを行った（図２）。Ｍモードトレーシング実験（上部左パネル）では、コントロールにおいて虚血の間に前壁厚の増大が顕著に減少したことを示す。しかし、ＦＡ処置された動物では壁厚の増大は保存された。駆出率は虚血にもかかわらず非常に高かった（対プラセボ７２．８±１．２パーセント : ３０分後の時点で２７．４±２．２％、ｐ＜０．００１）。この結果は、ＰＶループの結果と一致した。中隔前壁厚の増大（３７. ±５．３％対プラセボ  ５．１±０．６％、ｐ＝０．００４）も同様であった。従って、ＦＡ前処置は、冠梗塞にもかかわらず虚血領域において局所的な機能不全を増加させた。また、この現象は、再潅流後に存続、またはさらに改善された。
【００２５】
＜実施例２＞
葉酸と心筋血流
ＦＡ前処置は、ＬＡＤ梗塞の間に局所的、または全身的な機能を改善するため、我々は、ＦＡ前処置が、虚血傷害自体を減少させ、心筋血流を改善するか否か試験した。しかし、ＬＡＤ結紮の５分後、心筋分析により得られた虚血／心筋潅流遠隔領域の割合は、プラセボ群、およびＦＡ前処置群の両者で同様に減少した（それぞれ、−７３．７±６．０％、および−７７．７±５．１％）。３０分の時点の時点において両群における血流は低いままであった（対プラセボで−７８．４±９．３％、遠隔領域と比較して−７１．２±１３．８％）。
【００２６】
＜実施例３＞
葉酸は高エネルギーリン酸塩の心筋内レベルを保存する
潅流が改善されることでは、ＦＡ前処置の効果を説明できなかったので、我々は、次にベースライン、および特に虚血の間にＦＡが高エネルギーリン酸塩（ＨＥＰ）代謝を改変するか否かを試験した。図３に示したように、ＦＡ前処置はベースラインにおいてＨＥＰを改変しなかったが、イノシトール一リン酸（ＩＭＰ）、およびその異化代謝産物（オキシプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、尿酸）のレベルを強く上昇させた。虚血の間、心筋のＡＴＰ、およびＡＤＰは、コントロールにおいて６６％以上減少した。このことは報告された変化と一致する。しかし、イノシトール一リン酸（ＩＭＰ）、およびその異化代謝産物は、ＦＡ前処置された心臓においても高いレベルを維持した（ＦＡ処置および虚血応答の相互作用の間、ｐ＜０．００１）。オキシプリンは、コントロールにおいて虚血の間に顕著に上昇した。このことは、減少したＨＥＰ、および促進されたＡＭＰ代謝に一致する。しかし、それらはＦＡ処置された心臓ではほとんど変化しないか、または減少した。最後に、我々は、マロンジアルデヒド（脂質の過酸化マーカー）を指標として酸化還元状態、および相対的な還元／酸化グルタチオン割合について試験した。どちらも心筋虚血の有る無しで、ＦＡ前処置によりほとんど変化しなかった。
【００２７】
＜実施例４＞
前処置された葉酸は心筋の梗塞サイズを減少させる
虚血の間の機能およびＨＥＰ代謝の両者の改善の潜在的な意義は、その後の梗塞サイズが減少することである。図４Ａに示したように、梗塞サイズ（リスク領域）はプラセボ処置動物においては６０．３±４．１％であって、それに対してＦＡ前処置動物では３．８±１．２％であった（ｐ＜０．００２）。他の研究において、我々は、梗塞サイズにおけるこの減少は、主なＦＡ用量の４０％、および１０％（すなわち１、および４ｍｇ／ｄ）での前処置により起こることを見出した。再潅流収縮帯の壊死は、ベヒクル処置された心臓においてＬＶ全体で２６．７±２．６％であったが、ＦＡ処置された心臓においては４．６％±１.２％であった（ｐ＝０．００１、図４Ｂ）。同様に、ＴＵＮＥＬ陽性筋細胞は、ベヒクル処置では優勢となった（ＬＶ領域の６３．０±５．８％）が、ＦＡ処置ではまばら（４．３±１．３％）となった（ｐ＝０．００１、図４Ｃ）。コントロールラットの３６．７％（ＦＡ処置ラットでは８．３％）において、虚血が致死性の心室性不整脈を引き起こした（ｐ＜０．０１）が、再潅流における不整脈は、コントロールラットの６．１％で起こり、ＦＡ処置動物ではまったく起こらなかった（ｐ＜０．０１）。インビボにおける再潅流後の梗塞サイズは、冠潅流の機能の共役に部分的に関連しているため、我々は、分離した心臓においてＦＡ前処置の影響も試験した。ＦＡは梗塞サイズを顕著に減少させた（それぞれ、７．７±２．８％対４１ .１±４．９％、ｐ＜０．０００１、図４Ｄ）。また、冠動脈の流出物において乳酸デヒドロゲナーゼはより少なく（図４Ｅ）、細胞の壊死の減少と一致した。
【００２８】
＜実施例５＞
葉酸の前処置対急性葉酸投与
９匹の動物の別のセットにおいて、ＦＡを冠梗塞の１０分後に投与した（血管内に１０ｍｇ）。上記の時間は、機能的な応答が最初の分岐を表した時間である（図１、２参照）。興味深いことに、ＡＡＲに関する梗塞サイズの減少(ｎ＝５; ３．０±２．２％、ｐ＜０．００１（対プラセボ）) における同様の利益が観察されが、ＡＡＲ自体はプラセボと同様であった（５２．４±５．５％）。組織学を４匹の動物に行い、ＴＵＮＥＬ染色（４．３±１．３％ ＬＶ、ｐ＜０．０００１（対プラセボ）)、および収縮帯壊死（５．１±０．７％ＬＶ、ｐ＜０．００１（対プラセボ））が減少したことが示された。したがって、梗塞の減少における上記ＦＡの効果は、古典的な前条件付けの効果には表れない。従って、虚血が起こった後のＦＡ処置により生じると考えられる。
【００２９】
＜実施例６＞
葉酸の前処置は心筋内のＲＯＳ産生を減少させる
虚血の間、および再潅流の９０分後にＦＡ前処置した動物において、心筋の過酸化物（ルシゲニンケミルミネッセンス）は、５０％近く減少した（図５Ａ）。抽出物を１００μＭのＢＨ４で前もってインキュベートした場合、Ｏ２−の産生は、ベヒクル処置された心臓において９０．９±０．７％減少したが、ＦＡ前処置された心臓ではそれほど減少しなかった（５２．１±１１．３％、ｐ＜０．０３、図５Ｂ）。このことは、ＢＨ４に引き起こされる抗酸化経路（たとえば、ＮＯＳ共役）がＦＡ前処置された心臓において失われたか、ＦＡ治療より前に回復したかのどちらかであることを示唆する。虚血、およびＩＲに誘導されるＲＯＳにおけるＦＡの効果は、さらに酸化蛍光マイクロトポグラフィ−により試験した。ＤＨＥ、およびＤＣＦの両者により染色された心筋スライスは、プラセボ群において顕著なＲＯＳ産生を示し、この産生はＦＡ前処置では減少した。図５Ｃ〜Ｅは、実験画像を示す。各群はｎ＝４で平均値を得、これらの実験で一致させた。ＦＡの潜在的な直接の抗酸化効果を試験するために、我々はキサンチン／キサンチンオキシダーゼＯ２−酸性システムを用いてインビトロ分析を行った（図５Ｆ）。ＦＡは、上記分析において実質的な抗酸化効果を有した。この効果は、疑似テンポール超酸化物不均化酵素（superoxide dismutase mimetic Tempol）にもたらされる効果と同様であった。
【００３０】
＜実施例７＞
葉酸の前処置は、ｅＮＯＳのダイマー化、および活性化、ならびに内皮機能を改善する
ＦＡ、およびその活性型代謝産物である５−ＭＴＨＦが、ＮＯＳに由来する過酸化物を含むＮＯＳ機能においてＢＨ４に仲介される改善に機械的に関与していると仮定して、我々は、ＦＡがＩ／Ｒ心臓におけるＮＯＳ共役に影響するか否かを試験した。図６Ａに、ｅＮＯＳモノマー（１４０ｋＤａ）、およびｅＮＯＳダイマー（２８０ｋＤａ）のバンドを示した免疫染色試験を示す。全ｅＮＯＳ（モノマーとダイマーとの合計）は、異なる条件の間で同様である（図６Ｂ）。しかし、ベヒクル処置されたＩＲ心臓において、ＮＯＳ脱共役の影響を受けてダイマー／モノマー比率は減少した（ｐ＜ ０．００１、図６Ｃ）が、ＦＡ前処置された心臓では正常に近かった。アルギニン−シトルリン変換により測定されたＮＯＳ活性は、ボーダーラインであったが、処置した心臓と処置しなかった心臓において有意に改善されなかった（ｐ＝０．０８、データは示していない）。冠血管内皮機能も、ＦＡ前処置により改善した。ブラジキニンは、分離された心臓における冠血流において最大で１０８．３±９．２％誘導された。しかし、ＩＲ後では６７．１±８．１％であった（ｐ＜０．００１、図６Ｄ）。このことは、基本的な拡張を変化させることなく、ＦＡによる心臓の前処置におけるコントロールレベルを回復させた（１２２．０±１１．３％）。各群の間でベースライン（プラセボ：１０．２±０．７ ｍｌ/ｍｉｎ、ＦＡ：１１．４±１３．８ ｍｌ/ｍｉｎ、ｐ＝０．５）、または虚血後（プラセボ：９．８±０．７ ｍｌ/ｍｉｎ、およびＦＡ：８．９±１．４ ｍｌ/ｍｉｎ、ｐ＝０．５）における冠血流には変化はなかった。ブラジキニン刺激に対して、先行する効果の内皮依存性を支えるニトロプルシドナトリウムでは、コントロール、および虚血条件において冠血流は同様に増加した（図６Ｅ）。
【００３１】
参考文献
１．Antoniades C, Shirodaria C, Warrick N, Cai S, de Bono J, Lee J, Leeson P, Neubauer S,
Ratnatunga C, Pillai R, Refsum H, Channon KM. 5-methyltetrahydrofolate rapidly improves endothelial function and decreases superoxide production in human vessels: effects on vascular tetrahydrobiopterin availability and endothelial nitric oxide synthase coupling. Circulation. 2006;1 14:1 193-1201.
２．Bazzano LA, Reynolds K, Holder KN, He J. Effect of folic acid supplementation on risk of cardiovascular diseases: a meta-analysis of randomized controlled trials. JAMA. 2006;296:2720-2726.
３．Depeint F, Bruce WR, Shangari N, Mehta R, O'Brien PJ. Mitochondrial function and toxicity: role of B vitamins on the one-carbon transfer pathways. Chem Biol Interact. 2006; 163:1 13-132.
４．Gross ER, Gross GJ. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovasc Res. 2006;70:212-221.
５．Gunduz D, Kasseckert SA, Hartel FV, Aslam M, Abdallah Y, Schafer M, Piper HM, Noll T, Schafer C. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc Res. 2006;71 :764-773.
６．Gupte SA, Kaminski PM, Floyd B, Agarwal R, AIi N, Ahmad M, Edwards J, WoNn MS. Cytosolic
NADPH may regulate differences in basal Nox oxidase-derived superoxide generation in bovine coronary and pulmonary arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;288:H13-H21.
７．Hevel JM, Marietta MA. Macrophage nitric oxide synthase: relationship between enzyme-bound tetrahydrobiopterin and synthase activity. Biochemistry. 1992;31 :7160-7165.
８．Hynd man M E, Verma S , Rosenfeld RJ , Anderson TJ , Parsons H G . I nteraction of 5- methyltetrahydrofolate and tetrahydrobiopterin on endothelial function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002;282:H2167-H2172.
９．JAMA: Homocysteine and risk of ischemic heart disease and stroke: a meta-analysis. JAMA. 2002;288:2015-2022.
１０．Jennings RB, Steenbergen C, Jr. Nucleotide metabolism and cellular damage in myocardial ischemia. Annu Rev Physiol. 1985;47:727-749. 
１１．Jones SP, BoIIi R. The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection. J MoI Cell Cardiol. 2006;40:16-23.
１２．Jones SP, Girod WG, Palazzo AJ, Granger DN, Grisham MB, Jourd'Heuil D, Huang PL, Lefer DJ. Myocardial ischemia-reperfusion injury is exacerbated in absence of endothelial cell nitric oxide synthase. Am J Physiol. 1999;276:H1567-H1573.
１３．Jones SP, Greer JJ, Kakkar AK, Ware PD, Turnage RH, Hicks M, van Haperen R, de Crom R, Kawashima S, Yokoyama M, Lefer DJ. Endothelial nitric oxide synthase overexpression attenuates myocardial reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286:H276- H282.
１４．Klawitter PF, Murray HN, Clanton TL, Angelos MG. Reactive oxygen species generated during myocardial ischemia enable energetic recovery during reperfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002;283:H1656-H1661.
１５．Moat SJ , Clarke ZL, Madhavan AK, Lewis MJ , Lang D. Folic acid reverses endothelial dysfunction induced by inhibition of tetrahydrobiopterin biosynthesis. Eur J Pharmacol. 2006;530:250-258.
１６．Oster K. Atherosclerosis treated with folic acid. FASEB J. 1981 ;40.
１７．Reinhardt CP, Dalhberg S, Tries MA, Marcel R, Leppo JA. Stable labeled microspheres to measure perfusion: validation of a neutron activation assay technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001 ;280: H 108-H 116.
１８．Shirodaria C, Antoniades C, Lee J, Jackson CE, Robson MD, Francis JM, Moat SJ, Ratnatunga C, Pillai R, Refsum H, Neubauer S, Channon KM. Global improvement of vascular function and redox state with low-dose folic acid: implications for folate therapy in patients with coronary artery disease. Circulation. 2007;1 15:2262-2270.
１９．Stroes ES, van Faassen EE, Yo M, Martasek P, Boer P, Govers R, Rabelink TJ. Folic acid reverts dysfunction of endothelial nitric oxide synthase. Circ Res. 2000;86:1129-1134.
２０．Takimoto E, Champion HC, Li M, Ren S, Rodriguez ER, Tavazzi B, Lazzarino G, Paolocci N, Gabrielson KL, Wang Y, Kass DA. Oxidant stress from nitric oxide synthase-3 uncoupling stimulates cardiac pathologic remodeling from chronic pressure load. J Clin Invest. 2005;1 15:1221-1231. 
２１．Vasquez-Vivar J, Kalyanaraman B, Martasek P, Hogg N, Masters BS, Karoui H, Tordo P, Pritchard KA, Jr. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9220-9225.
２２．Verhaar M C, Wever RM , Kastelei n JJ , van Dam T, Koomans HA, Rabel in k TJ . 5- methyltetrahydrofolate, the active form of folic acid, restores endothelial function in familial hypercholesterolemia. Circulation. 1998;97:237-241.
２３．Wajima T, Shimizu S, Hiroi T, lshii M, Kiuchi Y. Reduction of myocardial infarct size by tetrahydrobiopterin: possible involvement of mitochondrial KATP channels activation through nitric oxide production. J Cardiovasc Pharmacol. 2006;47:243-249.
２４．WaId DS, WaId NJ, Morris JK, Law M. Folic acid, homocysteine, and cardiovascular disease: judging causality in the face of inconclusive trial evidence. BMJ. 2006;333:11 14-1 117.
２５．Wang X, Qin X, Demirtas H, Li J, Mao G, Huo Y, Sun N, Liu L, Xu X. Efficacy of folic acid supplementation in stroke prevention: a meta-analysis. Lancet. 2007;369:1876-1882.
２６．Yamamura K, Steenbergen C, Murphy E. Protein kinase C and preconditioning: role of the sarcoplasmic reticulum. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289:H2484-H2490.
２７．Zweier JL, Talukder MA. The role of oxidants and free radicals in reperfusion injury. Cardiovasc Res. 2006;70:181-190. 
【図１】
2011511040.tif 000002
【図２】
2011511040.tif 000003
【図３】
2011511040.tif 000004
【図４】
2011511040.tif 000005
【図５】
2011511040.tif 000006
【図６】
2011511040.tif 000007
【国際調査報告】
2011511040.tif 000008
2011511040.tif 000009
2011511040.tif 000010