(57)【要約】  本発明は疾患状態、特に癌疾患の治療、診断及び検査に有用なＭＳ４Ａ１２を伴う方法、及び、ＭＳ４Ａ１２を標的とする剤に関する。特に本発明は、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤、これらの剤を含む組成物、及び、ＥＧＦに対する細胞の応答性を低減、決定又は増大する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤。
【請求項２】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を前記低減又は前記阻害することが、前記細胞の成長、増殖、生存性、細胞周期の進行、遊走、化学走性及び／又は湿潤を低減又は阻害するものである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性が、ＥＧＦに対する前記細胞の応答性を増大し、又は、ＥＧＦに対して前記細胞を応答可能にし、ＥＧＦに対する前記細胞の応答性の増大は、好ましくは前記細胞のＥＧＦ誘起成長、ＥＧＦ誘起増殖、ＥＧＦ誘起細胞周期の進行、ＥＧＦ誘起遊走、ＥＧＦ誘起化学走性及び／又はＥＧＦ誘起湿潤を増大するものである、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
（ｉ）ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡを特異的に標的するｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸と選択的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸；
（ｉｉｉ）ＭＳ４Ａ１２に選択的に結合可能な抗体；及び
（ｉｖ）（ｉ）のｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）のアンチセンス核酸又は（ｉｉｉ）の抗体を発現可能な核酸分子；
からなる群から選択される請求項１乃至３いずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性が、前記細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入を増大又は可能にすることを含む、請求項１乃至４いずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか１項に記載の剤を含む、組成物。
【請求項７】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
医薬組成物である、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
医薬に使用するための請求項１乃至５いずれか１項に記載の剤、又は、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
癌又は癌転移を処置するための請求項１乃至５いずれか１項に記載の剤、又は、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至５いずれか１項に記載の剤に細胞を接触させるステップを含む、ＥＧＦに対する前記細胞の応答性を低減又は阻害する方法。
【請求項１２】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤に前記細胞を接触させるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１乃至５いずれか１項に記載の剤を患者に投与するステップを含む、前記患者の癌又は癌転移、好ましくは結腸癌又は結腸癌転移を処置する方法。
【請求項１４】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が前記患者の腫瘍成長、腫瘍湿潤及び／又は腫瘍転移を低減又は阻害する請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌細胞の少なくとも一部がＥＧＦに対して応答性を有する、請求項１３乃至１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現及び／又は活性のレベルを決定するステップを含む、ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法。
【請求項１８】
前記細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現のレベルを決定する前記ステップが、前記細胞におけるＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ及び／若しくはＭＳ４Ａ１２タンパク質の量を決定することを含み、及び／又は、前記細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定する前記ステップが、前記細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入を決定することを含み、前記ストア作動性Ｃａ２＋流入が、好ましくは前記細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び非存在下で決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞のストア作動性Ｃａ２＋流入を決定することが細胞内へのＣａ２＋又はＳｒ２＋流入の量及び／又は時間経過を決定することを含み、細胞内へのＣａ２＋又はＳｒ２＋流入の量及び／又は時間経過は、好ましくは細胞内Ｃａ２＋貯蔵が枯渇した後に決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が腫瘍細胞であり、好ましくは、ＥＧＦに対する腫瘍の応答性を決定し、及び／又は、抗ＥＧＦ腫瘍治療に対する腫瘍の応答性を決定する方法である、請求項１７乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を増大するステップを含む、ＥＧＦに対する細胞の応答性を増大する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患、特に癌疾患の治療、診断及び検査に有用な方法及び剤に関する。特に本発明は、例えば、癌患者の腫瘍細胞、特に結腸癌の細胞におけるＭＳ４Ａ１２活性の阻害及び決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
学際的なアプローチ及び古典的治療手順の徹底的な使用にもかかわらず、癌は依然死亡の主要な原因の１つである。
【０００３】
抗体を基盤とした癌治療が成功裏に臨床に導入され、過去１０年間にわたり、腫瘍学における最も有望な治療法として登場してきている（Ｇｌｅｎｎｉｅら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ８：５０３−１０（２００３））。血液悪性腫瘍は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく治療概念のために良好な実験場となった。これらの疾患では、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３及びＣＤ５２などの造血細胞の特定の系列のみで発現される抗原（Ｃｏｕｎｔｏｕｒｉｏｔｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２０：２１５−２９（２００２）；Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒａｃｔ．９：７１−８０（２００１）；Ｌｅｇｅｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：５４８−５１（１９９８））が有用な治療標的であることが判明している。これらのうちで最も顕著なものは抗ＣＤ２０ｍＡｂであり、リンパ腫患者の治療を改革している。キメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブは多発再発性緩徐進行型Ｂ細胞リンパ腫の患者においておよそ４０％〜６０％の応答率を達成しており、米国食品医薬品局により癌治療のために承認された最初のｍＡｂになっている（Ｌｅｇｅｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：５４８−５１（１９９８））。ＣＤ２０標的治療に好適なリンパ球増殖性障害のスペクトルは依然広がりつつある（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ  ３３５−９（２００５））。
【０００４】
抗体標的としてＣＤ２０の臨床上の成功には、２つの重要な特徴が寄与している。第１に、この標的が、Ｂ細胞系列に関する高度に選択的な分化マーカーとして、最適な治療域を提供する点である。ＣＤ２０発現により、いかなる正常な細胞型も、Ｂ細胞系列の幹細胞前駆体も検出されない（Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０４：２６３５−４２（２００４））。したがって、重篤な用量制限毒性がなく、正常なＢリンパ球レベルは最終的には標的陰性の幹細胞により回復する。Ｂ細胞悪性腫瘍は、通常この分化抗原の発現を保存するので、治療に成功することができる。第２の特徴は、造血性分化抗原に対するその他のｍＡｂと比較して、抗ＣＤ２０抗体の細胞破壊性効力が異常に高いという点である（Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−５２（２００３））。少なくともインビトロでは、抗ＣＤ２０抗体は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）の双方を媒介する。細胞性及び可溶性の免疫エフェクターの効率的な補充は、ＣＤ２０分子の特徴的な膜トポロジーに密接に連関し、抗体／抗原複合体を側方に動きやすくし、標的エピトープと脂質二重層との間の距離を短くする（Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−５２（２００３）；Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−４３（２００４）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０：３−８（２００３））。免疫エフェクターの補充に加えて、抗ＣＤ２０ｍＡｂは特定の細胞系において成長抑止及びアポトーシスを媒介することができる（Ｄｅａｎｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：１７６−８２（２００２）；Ｓｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：１６４４−５２（１９９８）；Ｓｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：６７３−８３（２０００）；Ｕｎｒｕｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１６：２２３−３２（２００５））。抗ＣＤ２０ｍＡｂが増殖及び生存に干渉するメカニズムは未知なままであったが、近年、Ｂ細胞受容体により活性化されるＳＯＣ流入経路の構成要素として、ＣＤ２０が確立された。
【０００５】
細胞内Ｃａ２＋は細胞機能の必須の調節因子である。成長受容体を介するシグナルにより細胞内ストアから細胞質へＣａ２＋が急速に放出される。ストア枯渇は細胞膜を横切るＣａ２＋流入を活性化し、空のストアを再び満たし、細胞質性の遊離Ｃａ２＋の濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の持続的に増大する。このＣａ２＋流入は容量性又はストア作動性Ｃａ２＋（ＳＯＣ）流入と称され、生存及び増殖を含む受容体媒介刺激に対する多様な細胞応答を調節するために不可欠である（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９９：２９１−３０６（１９９７）；Ｂｅｒｒｉｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：６４５−８（１９９８）；Ｂｅｒｒｉｄｇｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：１１−２１（２０００））。Ｃａ２＋シグナル伝達の調整におけるＣＤ２０の役割に合わせて、Ｃａ２＋流入は、リツキシマブ誘起の抗増殖及びアポトーシス効果に不可欠である（Ｓｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：６７３−８３（２０００）；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−９８（２００１）；Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２６：１３３−４３（２０００））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗ＣＤ２０抗体から学んだ教訓及び血液学的疾患において発達した原理は、依然、医学的必要性の高い固形癌の合理的なｍＡｂ治療の設計を促進することができる。しかしながら固形腫瘍に関しては、類似の潜在能力の標的は依然得られていない。
【０００７】
かかる標的構造を同定し、癌の治療、診断及び検査において利用することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は特許請求の範囲に記載された主題により達成される。
【０００９】
結腸癌の治療抗体の標的として利用可能な結腸上皮の分化遺伝子を発見するデータマイニング手法により、ＣＤ２０に密接に関係するＭＳ４Ａ１２に至った。本発明者らは、ＭＳ４Ａ１２がＳＯＣ流入に関与する結腸細胞特異的分化遺伝子であり、ＥＧＦＲシグナル伝達の新規モジュレーターとして機能することを知見した。本発明者らにより提供されたデータにより、結腸上皮細胞の生理学及びある癌疾患、特に結腸癌の生物学に予期されなかった見識が与えられ、かかる癌疾患の治療に新規標的が提供される。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を提供する。
【００１１】
好ましくは、その剤はＭＳ４Ａ１２に特異的である。「ＭＳ４Ａ１２に特異的な剤」なる用語は、それが別の遺伝子生成物の発現又は活性を低減又は阻害するよりも高い程度までＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を指す。好ましくは、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性は、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤により、その他の遺伝子産物の発現又は活性よりも少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍又は少なくとも１０００倍大きい程度まで低減又は阻害される。
【００１２】
「細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現を低減又は阻害する剤」は、ＭＳ４Ａ１２遺伝子の転写を低減若しくは阻害でき、ＭＳ４Ａ１２プレｍＲＮＡのプロセシングを低減若しくは阻害でき（例えばスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング等）、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの半減期を低減でき、及び／又は、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡのＭＳ４Ａ１２タンパク質への翻訳を低減若しくは阻害することができる。特に細胞においてＭＳ４Ａ１２遺伝子から合成されるＭＳ４Ａ１２タンパク質の量は、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現を低減又は阻害する剤の存在下で低減する。
【００１３】
「細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性を低減又は阻害する剤」は、ＭＳ４Ａ１２の１つ以上の活性を低減又は阻害することができる。「ＭＳ４Ａ１２の活性」なる用語は細胞におけるＭＳ４Ａ１２の何らかの活性に関する。
【００１４】
好ましくはＭＳ４Ａ１２の活性は、結腸癌及び結腸癌転移などの癌疾患に関連する。特に結腸腫瘍若しくは結腸腫瘍転移などの腫瘍若しくは腫瘍転移の形成、進行及び／又は維持が含まれる。好ましくは、ＭＳ４Ａ１２の活性は、細胞の成長、増殖、生存性、細胞周期の進行、遊走、化学走性及び湿潤を増大又は可能にすることからなる群から選択される。
【００１５】
具体的な実施態様では、ＭＳ４Ａ１２の活性は、細胞のストア作動性Ｃａ２＋流入を増大又は可能にすることを含む。
【００１６】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現の低減又は阻害により、好ましくは、上記で述べたように、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性が低減又は阻害されるものであると理解されるべきである。
【００１７】
特定の実施態様では、ＭＳ４Ａ１２の活性は、ＥＧＦに対する細胞の応答性を増大し、又は、ＥＧＦに対して細胞を応答可能にしている。本発明によれば、「ＥＧＦに対する細胞の応答性」とは、ＥＧＦとの接触時に１つ以上の応答を呈する細胞の能力を指す。応答は、生化学的応答のような何らかの応答であればよく、生化学的応答には、例えば、カルシウムイオンの分子濃度の変化、特に細胞内Ｃａ２＋貯蔵の枯渇若しくはストア作動性Ｃａ２＋流入などによる分子濃度の変化や、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、グリコシル化若しくは脱グリコシル化、核酸のメチル化若しくは脱メチル化といった分子修飾などがある。さらに、応答は、シグナル伝達経路の活性化又は阻害であってもよく、特に細胞内Ｃａ２＋貯蔵の枯渇やストア作動性Ｃａ２＋流入で生じるシグナル伝達経路の活性化、又は、例えばホルモンなどのシグナル分子の分泌であってもよい。応答のさらなる例としては、例えば発癌遺伝子の活性化又は癌抑制遺伝子の不活化のような遺伝子発現の活性化又は阻害など、遺伝子レベルでの応答がある。さらに応答は、細胞形態学における変化又は細胞の成長、増殖、細胞周期の進行、遊走、化学走性若しくは湿潤の増大などの１以上の細胞性特徴における変化であってもよい。
【００１８】
好ましいＥＧＦ誘起応答は、細胞のＥＧＦ誘起成長、ＥＧＦ誘起増殖、ＥＧＦ誘起細胞周期の進行、ＥＧＦ誘起遊走、ＥＧＦ誘起化学走性及びＥＧＦ誘起湿潤並びにその組み合わせである。
【００１９】
同様に「ＥＧＦに対して応答する細胞」は、ＥＧＦと接触させたときに、上記で記載されたいずれかの応答を呈する細胞である。
【００２０】
好ましい実施態様では、細胞はＭＳ４Ａ１２を発現する。さらに好ましい実施態様では、細胞はＥＧＦ受容体をも発現する。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、ヒトＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害し、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒトＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する。
【００２２】
１つの実施態様では、ＭＳ４Ａ１２遺伝子のタンパク質産物を生成しないか、又は、生成する量が低減されるように、特異的に標的し、ＭＳ４Ａ１２遺伝子からのｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘起分解を引き起こすｓｉＲＮＡを含む剤であり、このｓｉＲＮＡからなる剤が好ましい。
【００２３】
本発明によるｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、前記センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二重螺旋を形成すると好ましい。センスＲＮＡ鎖は、ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸が、約１９〜約２５個の隣接ヌクレオチドの標的配列に実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むことが好ましく、ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸としては、ＭＳ４Ａ１２をコードするｍＲＮＡが好ましい。本発明のｓｉＲＮＡは、単離されていることが好ましい。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡは２つの核酸フラグメントの組合せであり、１つのフラグメントは前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖を含み、第２のフラグメントは前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖を含む。本発明のｓｉＲＮＡのさらなる実施態様では、ＲＮＡ二重螺旋を形成するセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、例えば一本鎖ヘアピンにより共有結合により連結されている。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡは、さらに非ヌクレオチド材料を含むのが好ましい。本発明のｓｉＲＮＡのさらなる実施態様では、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。
【００２６】
本発明のｓｉＲＮＡは、さらに３'−オーバーハングを含むことが好ましく、１〜約６ヌクレオチドを含む３'−オーバーハングが好ましく、約２ヌクレオチドの３'−オーバーハングがより好ましい。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡの１つの実施態様では、センスＲＮＡ鎖は第１の３'−オーバーハングを含み、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖は第２の３'−オーバーハングを含み、第１及び第２の３'−オーバーハングは独立して１〜約６ヌクレオチドを含むことが好ましい。第１の３'−オーバーハングはジヌクレオチドを含み、かつ、第２の３'−オーバーハングはジヌクレオチドを含むことがより好ましく、ジヌクレオチドとしては、ジデオキシチミジル酸又はジウリジル酸が好ましい。
【００２８】
本発明のｓｉＲＮＡの１つの実施態様では、３'−オーバーハングはヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。
【００２９】
本発明のｓｉＲＮＡの特定の実施態様では、標的配列が、配列番号：１のヌクレオチド位置３４４−３６３のヌクレオチド配列、又は、配列番号：１のヌクレオチド位置２４７−２６６のヌクレオチド配列を有する。したがって、標的配列は、配列番号：３又は配列番号：６のヌクレオチド配列を有することができる。本発明のｓｉＲＮＡのさらに特定の実施態様では、センスＲＮＡ鎖は配列番号：４の配列を有し、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号：５の配列を有するか、又は、センスＲＮＡ鎖は配列番号：７の配列を有し、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号：８の配列を有する。
【００３０】
さらなる実施態様は、ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含む剤であり、このアンチセンス核酸からなる剤が好ましい。特にアンチセンス核酸は、ＭＳ４Ａ１２遺伝子及び／又はＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、これによりＭＳ４Ａ１２遺伝子の転写、及び／又は、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの翻訳が妨げられ、又は、低減する。
【００３１】
アンチセンス核酸は、ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸において約２０〜約３０の隣接ヌクレオチドの標的配列に対して実質的に相補的であることが好ましく、ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸としては、ＭＳ４Ａ１２をコードする遺伝子又はｍＲＮＡが好ましい。本発明のアンチセンス核酸は、単離されていることが好ましい。
【００３２】
標的配列は、望ましい効果が達成される限り、ＭＳ４Ａ１２遺伝子又はＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡのいかなる部分にも位置することができる。例えば、本発明のアンチセンス核酸は、ＭＳ４Ａ１２遺伝子のプロモーター若しくは転写開始部位、ＭＳ４Ａ１２プレｍＲＮＡのスプライシングドナー若しくはアクセプター部位、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡのリボソーム結合部位若しくは翻訳開始部位、又は、ＭＳ４Ａ１２コード領域にハイブリダイズしてもよい。
【００３３】
本発明のアンチセンス核酸は、さらに、非ヌクレオチド材料を含むことが好ましい。さらなる実施態様では、本発明のアンチセンス核酸は、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。
【００３４】
さらなる実施態様は、ＭＳ４Ａ１２に選択的に結合する抗体を含む剤であり、ＭＳ４Ａ１２に選択的に結合する抗体からなる剤が好ましい。ＭＳ４Ａ１２に結合することにより、抗体はＭＳ４Ａ１２の活性を低減又は阻害する。
【００３５】
ＭＳ４Ａ１２が細胞により発現される場合、抗体は、ＭＳ４Ａ１２の細胞外領域、すなわち、細胞外で接近可能であるＭＳ４Ａ１２の領域に結合することが好ましい。この点において「細胞外で接近可能」とは、抗体などの剤が細胞の細胞外環境に添加されたときに、細胞外標的に結合することができることを意味し、好ましくは、該細胞の細胞膜の中に侵入するか、又は横切ることなく、細胞外標的に結合することをいう。抗体は、配列番号：２のアミノ酸番号１１３〜１２６若しくは１８２〜２０１内のヒトＭＳ４Ａ１２の領域、又は、ヒトＭＳ４Ａ１２の誘導体、アイソフォーム、バリアント若しくはホモログにおける対応する領域に結合することが好ましい。
【００３６】
本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナルとすることができ、モノクローナルが好ましい。さらに本発明の抗体は、キメラ若しくはヒト化抗体、又は抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ若しくはＦｄフラグメントのような抗体のフラグメントでもよい。
【００３７】
別の実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、本発明のｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸又は抗体を発現可能な核酸分子であり、好ましくは組換え核酸分子である。この核酸分子は、本発明のｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸又は抗体を発現するために核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含むことが好ましく、プロモーターとしては、誘導プロモーター又は調節プロモーターが好ましい。核酸分子は、発現プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターが好ましい。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択することができる。
【００３８】
ｓｉＲＮＡを発現できる核酸分子は、ｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を発現するための核酸配列を含む単一のベクターであってもよいし、ｓｉＲＮＡセンスＲＮＡ鎖を発現するための核酸配列を含む１のベクターと、アンチセンスＲＮＡ鎖を発現するための核酸配列を含む１のベクターとを組み合わせた２のベクターであってもよい。
【００３９】
１つの実施態様では、核酸分子は宿主細胞に存在する。宿主細胞に存在する核酸分子は、本発明の抗体を発現可能であることが好ましい。好ましい実施態様では、核酸分子により発現される抗体は宿主細胞により分泌される。
【００４０】
別の実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害できるペプチド、タンパク質、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される化合物を含むものであり、これらの化合物からなる剤であることが好ましい。
【００４１】
例えば、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害できるペプチド、タンパク質、核酸及び低分子化合物は、当分野において知られる適当なスクリーニングアッセイにより同定することができる。スクリーニングアッセイには、異なるペプチド、タンパク質、核酸及び／又は低分子化合物のライブラリーを使用してもよい。ライブラリーは化学的に合成された化合物、天然由来化合物、又は、天然由来化合物から誘導した化合物から構成されてもよい。適当なライブラリーは当分野において知られている。例えばペプチド又はタンパク質ライブラリーは、その表面にペプチド又はタンパク質を提示するファージを含むファージディスプレイライブラリーでもよい。スクリーニングアッセイは、１以上の選択した工程を含む１以上の選択の繰り返しを含んでもよい。ライブラリーのメンバーは、ＭＳ４Ａ１２に対する結合、ＭＳ４Ａ１２の発現の低減若しくは阻害、及び／又は、ＭＳ４Ａ１２の活性の低減若しくは阻害に関してスクリーニングされてもよい。
【００４２】
さらなる実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、異なる剤の混合物である。この剤は、特に、上記で定義されたような２以上のｓｉＲＮＡの混合物、上記で定義されたような２以上のアンチセンス核酸の混合物、又は前記で定義されたような２以上の抗体の混合物であってもよいし、さらに、上記で定義されたような１以上のｓｉＲＮＡ、及び／又は上記で定義されたような１以上のアンチセンス核酸、及び／又は上記で定義されたような１以上の抗体の混合物であってもよい。
【００４３】
特定の実施態様では、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２遺伝子は、（ａ）配列番号：１の核酸配列、その一部又は誘導体；（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸を縮重した核酸配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸配列に相補的である核酸配列；並びに（ｅ）配列番号：２のアミノ酸配列、その一部、バリアント、アイソフォーム又はホモログをコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列；を含む。
【００４４】
さらに特定の実施態様では、ＭＳ４Ａ１２タンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列、その一部、バリアント、アイソフォーム又はホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、ＭＳ４Ａ１２発現又は活性の低減又は阻害が処置に有益な疾患の処置に有用であり、特に、癌及び癌転移の処置に有用であり、好ましくは結腸癌及び結腸癌転移の処置に有用である。特に本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、腫瘍成長、腫瘍湿潤及び／又は腫瘍転移を低減又は阻害することができる。１つの実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入を低減又は阻害することができる。
【００４６】
本発明は、さらに本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を含む組成物に関し、好ましくは、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性の低減又は阻害に有効な量及び／又は濃度で、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を含む組成物である。この組成物は、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を単独で含んでいてもよいし、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する異なる剤を組み合わせて含んでいてもよい。
【００４７】
１つの実施態様では本発明の組成物はさらに、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤を含む。
【００４８】
「細胞におけるＥＧＦ受容体の発現を低減又は阻害する剤」は、ＥＧＦ受容体遺伝子の転写を低減若しくは阻害することができ、ＥＧＦ受容体プレｍＲＮＡのプロセシング（例えばスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング等）を低減若しくは阻害することができ、ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの半減期を低減することができ、及び／又はＥＧＦ受容体ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減若しくは阻害することができる。特に、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現を低減又は阻害する剤の存在下で、細胞におけるＥＧＦ受容体遺伝子から合成されるＥＧＦ受容体タンパク質の量は、低減される。
【００４９】
「細胞におけるＥＧＦ受容体の活性を低減又は阻害する剤」はＥＧＦ受容体の１以上の活性を低減又は阻害することができる。「ＥＧＦ受容体の活性」なる用語は、ＥＧＦ受容体を持つ細胞がＥＧＦ受容体の活性化時に呈する何らかの応答を指し、特にＥＧＦがＥＧＦ受容体に結合することにより呈するものをいう。しかしながら下記にてさらに説明するように、本発明による細胞におけるＥＧＦ受容体の活性は、ＥＧＦ受容体がそのように干渉することにより低減又は阻害されてもよいし、のみならず、ＥＧＦのシグナル伝達に関与する何らかの構成要素により低減又は阻害されてもよい。
【００５０】
ＥＧＦ受容体の活性は、結腸腫瘍または結腸腫瘍転移のような腫瘍又は腫瘍転移の形成、進行及び／又は維持に伴うものであることが好ましい。ＥＧＦ受容体の活性は、細胞成長、増殖，生存性、細胞周期の進行、遊走、化学走性及び湿潤を増大又は可能にすることからなる群から選択されるものであることが好ましい。
【００５１】
細胞におけるＥＧＦ受容体の活性を低減又は阻害する剤は、ＥＧＦ受容体と直接相互作用することにより該活性を低減又は阻害することができる。例えば、剤は、ＥＧＦ受容体のリガンド結合部位を遮断でき、それによりＥＧＦは受容体への結合が妨げられる。この点に関して、ＥＧＦ受容体に特異的な抗体、拮抗性ＥＧＦ擬似物質又はリガンド結合部位に結合できる低分子化合物は、適当な剤である。さらに、ＥＧＦ受容体の二量体化を阻止できる剤であってもよい。かかる剤の例としては、ＥＧＦ受容体単量体の不活性バリアント、具体的には、その優性ネガティブバリアント、及びＥＧＦ受容体単量体の二量化相互作用の表面に結合する抗体又は低分子化合物があげられ、ＥＧＦ受容体のタンパク質チロシンキナーゼドメインを遮断できる剤、すなわちチロシンキナーゼ阻害剤であってもよく、低分子チロシンキナーゼ阻害剤が好ましい。また、ＥＧＦ受容体とその下流相互作用パートナーとの相互作用が遮断できる剤とすることができ、例えばＰＬＣγは、例えば相互作用パートナーに結合するＥＧＦ受容体の結合部位に結合することによって遮断することができる。
【００５２】
別の実施態様では、細胞におけるＥＧＦ受容体の活性を低減又は阻害する剤は、ＥＧＦ受容体と直接相互作用しない。具体的には、ＥＧＦと結合することで、ＥＧＦが受容体と結合することを妨げ、ＥＧＦの生成若しくは分泌を妨げ、又はＥＧＦを分解する剤とすることができる。ＥＧＦに特異的な抗体は、このような剤の一例である。さらに、剤は、ＥＧＦ受容体により誘起される１つ以上、好ましくは全てのシグナル伝達経路を低減又は阻害してもよく、具体的には、細胞内Ｃａ２＋貯蔵の枯渇及び／又はストア作動性Ｃａ２＋流入に至るシグナル伝達経路を低減又は阻害してもよい。例えば、剤は、ＰＬＣγのようなシグナル伝達経路に関与する１以上のタンパク質の発現又は活性を低減又は阻害するものであってもよい。このような剤の例として、こうしたタンパク質の発現を低減又は阻害するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸、並びにかかるタンパク質の１以上の活性（例えば、酵素活性又は相互作用パートナーに結合する能力）を低減又は阻害する抗体又は低分子化合物が挙げられる。
【００５３】
上記で考察したように、該細胞におけるＥＧＦ受容体の活性の低減又は阻害によっても、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現の低減又は遮断されることが好ましいと理解されるべきである。
【００５４】
好ましい実施態様では、ＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、細胞に存在する１以上のＥＧＦ受容体、好ましくは全ての異なるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する。ＥＧＦ受容体は好ましくは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＥｒｂＢ−１又はヒトＨＥＲ１のようなヒトＥＧＦ受容体である。しかしながら、ＥＧＦ受容体はこれらのヒトＥＧＦ受容体の種相同体であってもよい。
【００５５】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、好ましくは、（ｉ）ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的するｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）ＥＧＦ受容体をコードする核酸と選択的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸；（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体に選択的に結合可能な抗体；（ｉｖ）（ｉ）のｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）のアンチセンス核酸又は（ｉｉｉ）の抗体を発現可能な核酸分子；及び（ｖ）ＥＧＦ受容体に特異的なチロシンキナーゼ阻害剤；からなる群から選択される。
【００５６】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤の特定の例としては、抗体としてセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ及びマツズマブ、チロシンキナーゼ阻害剤としてゲフィチニブ、エルロチニブ及びラパチニブ（例えばＳｒｉｄｈａｒら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．４：３９７−４０６（２００３））がある。
【００５７】
１つの実施態様では、本発明の組成物は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、好ましくは、ＭＳ４Ａ１２の発現若しくは活性の低減若しくは阻害、及び／又は、ＥＧＦ受容体の発現若しくは活性の低減若しくは阻害が治療に有益である疾患に有用であり、具体的には、癌及び癌転移に有用であり、好ましくは、結腸癌及び結腸癌転移の治療に有用である。本発明の医薬組成物は、医薬的に混合できる担体を含むことができる。
【００５８】
本発明は、さらに本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤に細胞を接触させるステップを含む、ＥＧＦに対する細胞の応答性を低減又は阻害する方法に関するものであり、好ましくは、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害するのに有効な量及び／又は濃度で本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤に該細胞を接触させるものである。
【００５９】
１つの実施態様では、剤を細胞の細胞外環境に添加することにより細胞の接触をさせる。この実施態様では、上記で記載されたような抗体を剤とすると好ましい。別の実施態様には、剤を細胞に導入して細胞を剤と接触させるものがある。この実施態様では、上記で記載されたようなｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又は、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンス核酸を発現することが可能な核酸分子を剤とすると好ましい。剤の細胞への導入は、当分野において知られた何らかの方法により行えばよい。例えば、直接注入、リポソームのような脂質ベヒクルを使用する導入、エレクトロポレーション又は速度駆動トランスフェクション（ｖｅｌｏｃｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法（例えば遺伝子銃）が、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する何らかの剤の細胞導入に用いることができる。さらにプラスミドベクター若しくはウイルスベクターのようなベクターを使用するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、又はＤＥＡＥ−デキストラン若しくはポリエチレンイミンのようなカチオン性重合体への結合が、ｓｉＲＮＡ、抗原核酸、及び、ｓｉＲＮＡ、抗原核酸又は抗体を発現できる核酸分子などの核酸から構成される、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の導入に用いることができる。
【００６０】
ＥＧＦに応答する細胞は、ＭＳ４Ａ１２を発現することが好ましく、加えてＥＧＦ受容体を発現するとさらに好ましい。細胞は、腫瘍細胞（ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）のような新生物細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ）が好ましい。
【００６１】
１つの実施態様では、ＥＧＦに対する細胞の応答性を低減又は阻害する方法は、さらに、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤に該細胞を接触させるステップを含む。細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、好ましくは上記で記載されたような剤である。具体的には、該剤は、（ｉ）ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的するｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）ＥＧＦ受容体をコードする核酸に選択的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸；（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体に選択的に結合可能な抗体；（ｉｖ）（ｉ）のｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）のアンチセンス核酸又は（ｉｉｉ）の抗体を発現可能な核酸分子；及び（ｖ）ＥＧＦ受容体に特異的なチロシンキナーゼ阻害剤；からなる群から選択されることが好ましい。
【００６２】
細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤と細胞を接触させる前記ステップは、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤に関して上記で記載されたものと同様な方法で実行することができる。細胞は、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤、及び、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤に同時に接触させてもよいし、連続的に接触させてもよい。細胞を双方の剤に同時に接触させる場合、剤は１つの組成物中に存在させてもよいし、別個の組成物中に存在させてもよい。
【００６３】
１つの実施態様では、インビトロでＥＧＦに対する細胞の応答性を低減又は阻害する方法を実行する。この実施態様では、細胞は単離された細胞であってもよく、インビトロで培養された細胞が好ましい。さらに細胞は、組織試料中に含まれてもよいが、組織試料は、生物から単離されていることが好ましい。
【００６４】
別の実施態様では、インビボでＥＧＦに対する細胞の応答性を低減又は阻害する方法を実行する。この実施態様では、細胞は動物などの生物に存在し、動物としては、マウス若しくはラットのようなげっ歯類、霊長類又はヒトのような哺乳動物が好ましい。さらにこの実施態様では、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤に細胞を接触させる前記ステップ、及び、随意に、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤に細胞を接触させる前記ステップは、好ましくは該（複数の）剤を生物に投与することを含む。（複数の）剤の投与は、下記で記載するように実施してもよいし、及び／又は、（複数の）剤を前記で記載された細胞に導入する何らかの方法を含んでもよい。投与のための（複数の）剤には、本明細書に記載されるような医薬組成物中に存在していることが好ましい。
【００６５】
ＥＧＦに対する細胞の応答性を低減又は阻害する方法をインビボで実施する場合、癌及び／又は癌転移を処置するために実施されることが好ましい。
【００６６】
つまり、さらなる態様では、本発明は、癌及び／又は癌転移、具体的には、結腸癌及び／又は結腸癌転移を処置する方法に関する。治療は、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を患者に投与することを含む。具体的にその方法は、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤を、有効量、それを必要とする患者、好ましくは結腸癌又は結腸癌転移を有する患者に投与することを含む。その方法で、腫瘍成長、腫瘍湿潤及び／又は腫瘍転移が低減又は阻害されることが好ましい。
【００６７】
１つの実施態様では、癌及び／又は癌転移を処置する前記の方法は、さらに細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤を患者に投与することを含む。細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、上記で記載されたような剤であることが好ましい。具体的には、該剤は、（ｉ）ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）ＥＧＦ受容体をコードする核酸と選択的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸；（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体に選択的に結合可能な抗体；（ｉｖ）（ｉ）のｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）のアンチセンス核酸又は（ｉｉｉ）の抗体を発現可能な核酸分子；及び（ｖ）ＥＧＦ受容体に特異的なチロシンキナーゼ阻害剤；からなる群から選択されることが好ましい。好ましくは、細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤を有効量で投与する。
【００６８】
本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤、及び、随意に細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤を好ましくは本明細書に記載されるような医薬組成物で投与する。細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤、及び、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤は、同時に投与してもよいし、連続して投与してもよい。双方の剤を同時に投与する場合、１つの医薬組成物中に存在させてもよいし、別個の医薬組成物中に存在させてもよい。
【００６９】
本発明によれば、「癌」及び「癌転移」なる用語は、各々好ましくはＭＳ４Ａ１２の発現及び／又はＥＧＦ受容体の発現を特徴とする癌又は癌転移に関するものである。すなわち、本発明によれば、「癌」及び「癌転移」なる用語は、ＭＳ４Ａ１２を発現する癌若しくは癌転移の癌細胞の少なくとも一部、及び／又はＥＧＦ受容体を発現する癌細胞の少なくとも一部に関するものである。好ましい実施態様では、癌細胞の少なくとも一部はＥＧＦを発現及び／又は分泌する。
【００７０】
好ましくは、癌又は癌転移の癌細胞の少なくとも一部は、ＥＧＦに対する応答性を有する。ＥＧＦに対して応答性を有する細胞において、細胞の成長、増殖、生存性、細胞周期の進行、遊走、化学走性及び／又は湿潤がＥＧＦ存在下で増大することが好ましい。１つの実施態様では、癌または癌転移において腫瘍成長、腫瘍湿潤及び／又は腫瘍転移はＥＧＦ存在下で増大する。
【００７１】
本発明は、さらに細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性のレベルを決定するステップを含む、ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法に関する。この方法により、好ましくはＥＧＦの添加に対して細胞が応答するかどうか、及び、どの程度まで応答するかに関して、定性的及び／又は定量的な結果に結論を下すことが可能になる。
【００７２】
１つの実施態様では、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現のレベルを決定する前記ステップは、該細胞におけるＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ及び／又はＭＳ４Ａ１２タンパク質の量を決定することを含む。ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ及び／又はＭＳ４Ａ１２タンパク質の量の決定することには、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２タンパク質に特異的に結合する剤と細胞を接触し、剤とＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２タンパク質との間の複合体の量を決定することが含まれると好ましい。
【００７３】
本発明によれば、該ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブを使用してＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの量の決定を実行してもよいし、ＰＣＲ増幅により、該ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの選択的増幅してＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの量の決定を実行してもよい。１つの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブは該ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの６〜５０の隣接ヌクレオチドに相補的である配列を含み、具体的には、１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０の隣接ヌクレオチドに相補的である配列を含む。
【００７４】
本発明によれば、該ＭＳ４Ａ１２タンパク質に特異的に結合する抗体を使用してＭＳ４Ａ１２タンパク質の量の決定を実施してもよい。
【００７５】
ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法において、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ及び／又はＭＳ４Ａ１２タンパク質の量の決定に使用される剤は、検出可能な様式で標識されることが好ましく、具体的には、放射性マーカー、蛍光マーカー又は酵素マーカーなどの検出可能なマーカーにより標識されることが好ましい。
【００７６】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２タンパク質の存在は、細胞がＥＧＦに対して応答性を有することで示すことが好ましい。細胞におけるＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２タンパク質の量は、ＥＧＦに対する該細胞の予期される応答性のレベルと相関することが好ましい。したがって、細胞においてＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡまたはＭＳ４Ａ１２タンパク質の量が高くなるほど、ＥＧＦに対する該細胞の予期される応答性のレベルが高くなる。
【００７７】
細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定する前記ステップは、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の１以上の活性を決定することを含むことができる。
【００７８】
好ましい実施態様では、ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法は、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び／又は非存在下での細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定することを含み、具体的には、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び／又は非存在下での細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定することを含む。
【００７９】
ＭＳ４Ａ１２の活性の検出可能なレベルは、ＥＧＦに対する細胞の応答性の指標とすると好ましい。好ましくは、ＭＳ４Ａ１２の活性のレベルはＥＧＦに対する細胞の予期される応答性のレベルと相関する。
【００８０】
ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び／又は非存在下でＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定する場合、該剤の存在下でのＭＳ４Ａ１２の活性のレベルの低下は、ＥＧＦに対する細胞の応答性の指標である。該剤の存在下でのＭＳ４Ａ１２の活性のレベルにおける該低下の程度は、好ましくはＥＧＦに対する細胞の予期される応答性のレベルと相関する。
【００８１】
１つの実施態様では、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の活性のレベルを決定する前記ステップは、該細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入を決定することを含む。ストア作動性Ｃａ２＋流入が、ＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害できる剤の存在下及び非存在下で決定されることが好ましく、具体的には、本発明のＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び非存在下で決定することが好ましい。該剤は、（ｉ）ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡを特異的に標的するｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸と選択的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸；（ｉｉｉ）ＭＳ４Ａ１２に選択的に結合可能な抗体；及び（ｉｖ）（ｉ）のｓｉＲＮＡ又は（ｉｉ）のアンチセンス核酸を発現可能な核酸分子；からなる群から選択されることが好ましい。
【００８２】
１つの実施態様では、細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入を決定することは、細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の量及び／又は時間経過を決定することを含む。
【００８３】
細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の量を決定することは、好ましくは、測定の始めに細胞内Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度を決定し、測定の終わりに細胞内Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度を決定し、測定の終わりのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度と、測定の始めのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度との間の差を算出することを含み、前記差を細胞へのＣａ２＋及び／またはＳｒ２＋流入の量とするものである。
【００８４】
細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の時間経過を決定することは、好ましくは、一定時間の細胞内Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度をモニタリングすることを含み、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度の増大をＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋の流入の指標とし、低下をＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋の流出の指標とするものである。細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の時間経過から、所定の時間の間に細胞に流入したＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋の量とＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の速度とを算出することができる。
【００８５】
１つの実施態様では、細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の量及び／又は時間経過は、所定の細胞外Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度で決定される。ＣａＣｌ２及び／又はＳｒＣｌ２を細胞外環境に添加することにより、細胞外Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋を提供することができる。所定の細胞外Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋濃度は、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭが好ましく、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭがより好ましく、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭがさらに好ましく、約１ｍＭが最も好ましい。
【００８６】
Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の存在に感受性のある化合物によりＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入を測定することができる。この化合物は、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の非存在下及び存在下で変化する検出可能なシグナルを提供するものが好ましい。検出可能なシグナルは、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の濃度で変化するものが好ましく、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の濃度と相関し得るものがより好ましい。１つの実施態様では、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の存在に感受性のある化合物は、Ｃａ２＋感受性色素である。別の実施態様では、化合物を検出可能なマーカーで標識し、マーカーが検出可能なシグナルを提供する。検出可能なマーカーは、蛍光マーカー又は酵素マーカーが好ましい。
【００８７】
好ましい実施態様では、Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の存在に感受性のある化合物は、アッセイされるべき細胞に存在し、細胞の細胞質にのみ存在するとさらに好ましい。例えば、ＦＬＩＰＲカルシウム３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を製造者の説明書に従って使用することができる。顕微鏡を使用してストア作動性Ｃａ２＋流入を測定してもよい。
【００８８】
１つの実施態様では、細胞へのＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋流入の量及び／又は時間経過は、細胞内Ｃａ２＋貯蔵が枯渇した後に決定する。細胞内Ｃａ２＋貯蔵は、当分野において既知の任意の手段により枯渇させることができ、例えばタプシガルジンのような小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の阻害剤又はＥＧＦのようなＣａ２＋貯蔵を枯渇する天然の活性剤の投与により枯渇させてもよい。つまり、１つの実施態様では、さらに細胞をＥＧＦ及び／又はタプシガルジンと接触させることを含む。好ましくは、細胞内Ｃａ２＋貯蔵が細胞外Ｃａ２＋及び／又はＳｒ２＋の非存在下で枯渇し、該枯渇に続いてＣａ２＋及び／又はＳｒ２＋を細胞の細胞外環境に添加する。
【００８９】
ストア作動性Ｃａ２＋流入を決定するとき、Ｃａ２＋の代わりにＳｒ２＋を用いてもよいし、Ｓｒ２＋流入の量及び／又は時間経過は、Ｃａ２＋流入の量及び／又は時間経過としてみなしてもよい。
【００９０】
検出可能なストア作動性Ｃａ２＋流入は、ＥＧＦに対する細胞の応答性の指標とすると好ましい。ストア作動性Ｃａ２＋流入の程度は、ＥＧＦに対する細胞の予期される応答性のレベルに対応させることが好ましい。
【００９１】
ストア作動性Ｃａ２＋流入がＭＳ４Ａ１２の発現又は活性を低減又は阻害する剤の存在下及び非存在下で決定される場合、この剤の存在下におけるストア作動性Ｃａ２＋流入の減少がＥＧＦに対する細胞の応答性の指標である。該剤の存在下におけるストア作動性Ｃａ２＋流入の低下の程度は、好ましくはＥＧＦに対する細胞の予期される応答性のレベルに対応させる。
【００９２】
ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法の１つの実施態様では、細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性のレベルを決定した結果は、参照細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現又は活性のレベルを決定した結果と比較される。参照細胞のＥＧＦに対する応答性は既知であると好ましい。１つの実施態様では、参照細胞は腫瘍細胞である。分析されるべき細胞及び参照細胞は同じ種及び／又は同じ型のものであると好ましい。
【００９３】
ある実施態様では、ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法は、さらに細胞におけるＥＧＦ受容体の発現又は活性のレベルを決定することを含む。ＥＧＦ受容体の発現のレベルは、細胞において使用するＥＧＦ受容体ｍＲＮＡ及び／又はＥＧＦ受容体タンパク質の量を決定することによって決定されることが好ましく、例えば、ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸分子などのＥＧＦ受容体ｍＲＮＡに特異的に結合する剤、及び／又は、ＥＧＦ受容体タンパク質に特異的な抗体などのＥＧＦ受容体タンパク質に特異的に結合する剤を使用して、細胞におけるＥＧＦ受容体ｍＲＮＡ及び／又はＥＧＦ受容体タンパク質の量を決定することにより、ＥＧＦ受容体の発現のレベルを決定してもよい。ＥＧＦ受容体の酵素的活性を決定することにより、ＥＧＦ受容体の活性のレベルを決定してもよく、具体的には、標的タンパク質をリン酸化してその活性を決定してＥＧＦ受容体の活性のレベルを決定してもよい。
【００９４】
ＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法の１つの実施態様では、細胞は真核細胞であり、哺乳動物細胞が好ましく、ヒト細胞がさらに好ましい。細胞は腫瘍細胞が好ましい。１つの実施態様では、２以上の細胞のＥＧＦに対する応答性を同時に決定する。
【００９５】
好ましくは、インビトロでＥＧＦに対する細胞の応答性を決定する方法を実行する。１つの実施態様では、細胞は、腫瘍試料から誘導されるか、又は、腫瘍試料に存在する腫瘍細胞である。この実施態様では、方法は、誘導された腫瘍細胞から腫瘍細胞のＥＧＦに対する応答性を決定するために有用である。
【００９６】
腫瘍試料は播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞を含有するものであればいかなる試料であってもよい。腫瘍試料は、結腸腫瘍若しくは結腸腫瘍転移の試料が好ましく、及び／又は、腫瘍細胞は、結腸腫瘍若しくは結腸腫瘍由来の転移細胞であることが好ましい。腫瘍試料は腫瘍又は転移性腫瘍細胞を含有する組織の生検試料であってもよい。また、腫瘍試料は糞便のような生物学的試料であってもよい。好ましくは、腫瘍試料は、癌、好ましくは結腸癌を有すると診断されている患者から得られる。
【００９７】
ＥＧＦに対する腫瘍の応答性は、腫瘍が本発明の方法及び／又は別の抗ＥＧＦ腫瘍療法によって処置できることを意味し、特に、本明細書に記載されるようなＥＧＦ受容体の発現又は活性を低減又は阻害する剤の投与を含む腫瘍治療によって治療されることを意味する。したがって、本発明の方法により腫瘍がＥＧＦに対して応答するとして決定される場合、該腫瘍を有する患者は本発明の処置方法、及び／又は、別の抗ＥＧＦ腫瘍療法による処置の成功を予期することができる。
【００９８】
本発明はさらにＥＧＦに対する細胞の応答性を増大する方法に関する。この方法は該細胞におけるＭＳ４Ａ１２の発現及び／又は活性を増大することを含む。
【００９９】
１つの実施態様は、ＭＳ４Ａ１２タンパク質又はＭＳ４Ａ１２タンパク質を発現可能な核酸分子を細胞に導入することを含む方法である。核酸分子は発現プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターであることが好ましい。ＭＳ４Ａ１２タンパク質又はＭＳ４Ａ１２タンパク質を発現可能な核酸分子の細胞への導入は、当分野において知られた任意の方法により行えばよい。例えば直接注入、リポソームのような脂質ビヒクルを使用する導入、エレクトロポレーション又は速度駆動トランスフェクション（ｖｅｌｏｃｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法（例えば遺伝子銃）を使用することができる。例えばウイルストランスフェクションを使用するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱又はＤＥＡＥ−デキストラン若しくはポリエチレンイミンのようなカチオン性重合体に結合することにより、ＭＳ４Ａ１２タンパク質を発現可能な核酸分子を細胞に導入してもよい。
【０１００】
細胞はＥＧＦ受容体を発現することが好ましい。１つの実施態様では、ＥＧＦに対する細胞の応答性を増大する方法はさらに、該細胞におけるＥＧＦ受容体の発現及び／又は活性を増大することを含む。この実施態様は、好ましくはＥＧＦ受容体またはＥＧＦ受容体を発現可能な核酸分子を細胞に導入することを含む方法である。その導入はＭＳ４Ａ１２タンパク質又はＭＳ４Ａ１２タンパク質を発現可能な核酸分子の導入について上記で記載されたように実行することができる。
【０１０１】
ＥＧＦに対する細胞の応答性を増大する方法は、インビトロで実行してもよいし、インビボで実行してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】ＭＳ４Ａ１２発現は正常結腸粘膜及び結腸癌に限定される。  （Ａ）正常組織及び結腸癌におけるＭＳ４Ａ１２のエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ（左）及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（右）。各正常組織に関する５つまでの個々の組織標本の平均発現値を示す。エラーバー、ＳＴＤ；破線、発現カットオフ。
【図１Ｂ】（Ｂ）２つの個々のｓｉＲＮＡ二重螺旋でのトランスフェクション後４８時間のＬｏＶｏ結腸癌細胞におけるＭＳ４Ａ１２タンパク質発現のサイレンシング。ｎｓ−ｓｉＲＮＡ、非サイレンシングｓｉＲＮＡ（左）。正常組織及び結腸癌におけるＭＳ４Ａ１２タンパク質発現を抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端抗血清で検出した（右）。βアクチンを負荷対照として使用し、サイトケラチン１８（ＫＲＴ１８）を上皮細胞に特異的なマーカーとして使用した。
【図１Ｃ】（Ｃ）高（ＭＳ４Ａ１２＋＋＋）及び低（ＭＳ４Ａ１２＋）発現を伴う正常結腸及び結腸癌におけるＭＳ４Ａ１２タンパク質発現のＩＨＣ検出。
【図２】ＭＳ４Ａ１２はＣＤ２０様細胞膜タンパク質である。  （Ａ）ＭＳ４Ａ１２の予測される細胞膜トポロジー。ＣＤ２０に対して高い相同性を有する領域を灰色で囲む。  （Ｂ）抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端抗血清で染色されたＭＳ４Ａ１２−ｅＧＦＰでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＩＦ顕微鏡的分析。  （Ｃ）対照ｓｉＲＮＡ又はＭＳ４Ａ１２特異的ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後４８時間の抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端で染色されたＬｏＶｏ細胞のＩＦ顕微鏡的分析。  （Ｄ）Ｎ又はＣ末端ｅＧＦＰタグ化ＭＳ４Ａ１２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析。透過処理されていない細胞及び透過処理された細胞をウサギポリクローナル抗ｅＧＦＰ抗体及び抗ウサギＣｙ５−標識二次抗体で染色した。
【図３】ＭＳ４Ａ１２により媒介されるストア作動性カルシウム流入。（Ａ）Ｔｇ（３００ｎＭ）を用いたＣａ２＋貯蔵−枯渇の後、ＭＳ４Ａ１２又は対照としてベクター単独を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＣａ２＋（１ｍＭ）及びＳｒ２＋（１ｍＭ）流入を測定した。公知のＳＯＣ遮断薬Ｌａ３＋（２５μＭ）を用いた細胞の前処理なし（左）、前処理あり（右）。（Ｂ）Ｔｇ（３００ｎＭ）を用いたＣａ２＋貯蔵−枯渇の後のＬｏＶｏ細胞におけるＣａ２＋（１ｍＭ）流入、Ｌａ３＋（２５μＭ）での細胞の前処理なし（左）、前処理あり（右）。（Ｃ）ＥＧＦ（５０ｎＭ、上列；２ｎＭ、下列）に応答したＣａ２＋貯蔵−枯渇の後に測定されたＣａ２＋流入。Ｌａ３＋（２５μＭ）での細胞の前処理なし（左）、前処理あり（右）。（３検体ずつで３回の別個の実験の代表的な結果を示す。）
【図４】ＭＳ４Ａ１２サイレンシングがＬｏＶｏ結腸癌細胞の増殖を損なう。（Ａ）ｓｉＲＮＡ導入後４８時間のＬｏＶｏ細胞を５０ｎＭ  ＥＧＦを伴って４８時間培養した。新たに合成されたＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込んで、増殖を測定した。（Ｂ）異なる細胞周期状態の細胞分画の棒グラフとして示された、同じ条件下で培養されたＬｏＶｏ細胞の細胞周期分析。全実験を３検体ずつで行い、２回繰り返し、全実験の平均値＋／−ＳＴＤを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図５】ＭＳ４Ａ１２サイレンシングがＬｏＶｏ結腸癌細胞の運動性及び湿潤を損なう。（Ａ）上部及び下部チャンバーに添加された種々濃度のＥＧＦを伴ってトランスウェル遊走アッセイでケモキネシス（細胞運動性）を分析し、１２時間後に分析した。（Ｂ）化学誘引物質として種々濃度のＥＧＦを下部チャンバーに添加してしまった後２４時間のＭａｔｒｉｇｅｌへの化学走性湿潤の分析。各濃度のＥＧＦに関してトランスフェクトされていない対照細胞に対してデータを正規化して、ＭＳ４Ａ１２ノックダウンが低ＥＧＦ濃度で運動性及び湿潤に最も顕著な影響力を有することを強調する。全実験を３検体ずつで行い、２回繰り返し、全実験の平均値＋／−ＳＴＤを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図６】ｓｉＲＮＡを使用するＭＳ４Ａ１２転写ノックダウンの定量化。  ＭＳ４Ａ１２発現結腸癌細胞系ＬｏＶｏの細胞におけるＭＳ４Ａ１２転写ノックダウンは、２つの個々のＭＳ４Ａ１２特異的ｓｉＲＮＡ二重螺旋を用いてトランスフェクションした後４８時間にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量された。安定かつ再現性のある構成的ＭＳ４Ａ１２  ｍＲＮＡ発現が９０％まで低減したのが観察されたが、スクランブルされた非サイレンシング対照二重螺旋には影響しなかった。
【図７】正常組織におけるＭＳ４Ａ１２発現のＩＨＣ分析。  正常結腸粘膜以外の精巣及び胃腸管組織から得られた切片における抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端抗体での免疫組織化学は、これらの複合性器官組織内に存在するより小さな亜集団がこのタンパク質をまさに発現することを除いて、検出可能なＭＳ４Ａ１２染色を示さなかった。
【図８】ＭＳ４Ａ１２のアミノ酸配列アラインメント。（Ａ）ＣＤ２０ファミリーのその他のファミリーメンバーとのＭＳ４Ａ１２タンパク質配列のアラインメント。ＭＳ４Ａ１：配列番号：１７；ＭＳ４Ａ２：配列番号：１８；ＭＳ４Ａ３：配列番号：１９；ＭＳ４Ａ１２：配列番号：２。（Ｂ）ＭＳ４Ａ１２タンパク質配列のＣＤ２０ドメインとのアラインメント（ｐｆａｍ０４１０３；配列番号：２０）。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
本明細書における数値範囲に対する参照は、該範囲が含む個々の数値の各々を特定し、言及するためのものであると理解されるべきである。
【０１０４】
「ＭＳ４Ａ１２」なる用語は「膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１２」を指し、細胞により天然に発現され、又は、ＭＳ４Ａ１２遺伝子が導入された細胞により発現されるいかなるバリアントを含み、このバリアントとして、具体的には、ＭＳ４Ａ１２の任意のバリアント、特にスプライシングバリアント、立体構造、アイソフォーム及び種相同体が挙げられる。
【０１０５】
「ＭＳ４Ａ１２の核酸」、「ＭＳ４Ａ１２をエンコードする核酸」、「ＭＳ４Ａ１２をコードする核酸」、又は「ＭＳ４Ａ１２遺伝子」は、好ましくは、（ａ）配列番号：１の核酸配列、その一部又は誘導体；（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸の縮重配列；並びに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列に相補的な核酸配列；からなる群から選択される核酸に関する。その用語は、ＭＳ４Ａ１２をコードするｍＲＮＡも含むことができる。
【０１０６】
「ＭＳ４Ａ１２タンパク質」又は簡単に「ＭＳ４Ａ１２」は、好ましくは、前記で言及された核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号：２のアミノ酸配列、その一部又は誘導体からなる群から選択されるアミノ酸を含む。細胞において発現される場合、ＭＳ４Ａ１２タンパク質は好ましくは細胞膜に位置し、さらに好ましくは細胞膜に組み込まれている。好ましい実施態様では、そのアミノ末端及びカルボキシ末端は細胞質に位置し、１つのさらなる細胞質ドメイン、２つの細胞外ドメイン及び４つの膜貫通ドメインが存在するような様式でＭＳ４Ａ１２は細胞の細胞膜に組み込まれている。ＭＳ４Ａ１２の細胞外ドメインは、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１１３〜１２６及び１８２〜２０１、又は、ヒトＭＳ４Ａ１２の誘導体、アイソフォーム、若しくは、種相同体におけるアミノ酸番号に相当する。ＭＳ４Ａ１２の細胞外ドメインの境界は、またＭＳ４Ａ１２のアミノ酸配列において１、２、３、４又は５アミノ酸位置まで移行し得ると理解されるべきである。ＭＳ４Ａ１２は、図２Ａに示されるような細胞膜トポロジーを有することが好ましい。
【０１０７】
「ＭＳ４Ａ１２」なる用語はまた、細胞により天然に発現されるか、またはＭＳ４Ａ１２遺伝子が導入された細胞により発現されるヒトＭＳ４Ａ１２の翻訳後修飾されたバリアント、アイソフォーム及び種相同体をも含む。
【０１０８】
本発明によれば、核酸は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である。本発明による核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより生成され、化学的に合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖として存在してもよいし、二本鎖として存在してもよい。直鎖状で存在してもよいし、共有結合により環状に閉じた分子として存在してもよい。
【０１０９】
本明細書で使用される際には「ＲＮＡ」なる用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とはβ−Ｄ−リボフラノース部分の２'位置でヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。その用語は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより生成されたＲＮＡを含み、かつ、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然由来ＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含む。かかる改変には、非ヌクレオチド材料のＲＮＡの（複数の）末端への、又は内部的に、ＲＮＡの１以上のヌクレオチドの付加を含むことができる。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、また非天然由来ヌクレオチド若しくは化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのような非鎖状ヌクレオチドを含むことができる。これらの改変されたＲＮＡは、アナログ又は天然由来ＲＮＡのアナログとも称することができる。
【０１１０】
本明細書において核酸の量の検出又は決定を参照する場合、実際に検出されるべき核酸、又は、実際に決定されるべきその量は、好ましくはｍＲＮＡである。しかしながら、間接的にｍＲＮＡが検出される実施態様、又は、ｍＲＮＡの量が決定される実施態様も含まれてよいことは理解されるべきである。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡを検出したり、又は、ｃＤＮＡの量を決定したりすることもできる。本明細書ではｍＲＮＡはｃＤＮＡと均等であると考える。当業者には、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と均等であり、本明細書で同じ目的のために、例えば検出されるべき核酸にハイブリダイズするプローブの作成に使用できると理解されよう。したがって本明細書において配列表に示される配列を参照する場合、これには該配列のＲＮＡ均等物もまた含まれることになっている。
【０１１１】
本発明に従って記載される核酸は好ましくは単離されている。本発明によれば「単離された核酸」なる用語は、核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅された；（ｉｉ）クローニングにより組換えにより生成された；（ｉｉｉ）例えば切断及びゲル電気泳動分画化により精製された；または（ｉｖ）例えば化学合成により合成された；ことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
【０１１２】
本発明による縮重核酸は遺伝子コードの縮重のためにコドン配列において参照核酸とは異なる核酸である。
【０１１３】
本発明によれば、核酸の「誘導体」とは、１のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加が該核酸に存在すること、又は、少なくとも２、少なくとも４、あるいは、少なくとも６、かつ、好ましくは３以下、４以下、５以下、６以下、１０以下、１５以下、若しくは２０以下のような複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加が該核酸に存在することを意味する。さらに「誘導体」なる用語はまた、ヌクレオチド塩基、糖又はリン酸における核酸の化学的誘導体化をも含む。「誘導体」なる用語は、天然に生じないヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含有する核酸をも含む。さらにＲＮＡに関する「誘導体」なる用語は、また配列の安定化、キャッピング及び／又はポリアデニル化により修飾されているＲＮＡをも含む。
【０１１４】
本明細書に記載される具体的な核酸配列と、該具体的な核酸配列とハイブリダイズする、及び／又は該具体的な核酸配列に関して縮重する、該具体的な核酸配列の誘導体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％である。同一性の程度は好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域に関して与えられる。好ましい実施態様では、同一性の程度は配列表において与えられる核酸配列のような参照核酸配列の全長に対して与えられる。
【０１１５】
２つの配列がハイブリダイズし、互いに安定した二重螺旋を形成することが可能である場合、核酸は別の核酸に対して「相補的」であり、好ましくは、ハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド間で特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェント条件）下で実施される。ストリンジェント条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク）に記載され、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションがある。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡが移されている膜を例えば２×ＳＳＣ中室温で、次に０．１−０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
【０１１６】
相補性パーセントは第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子における隣接残基のパーセンテージを示す（例えば１０の核酸分子のうち、５、６、７、８、９、１０の隣接残基は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性である）。「完全に相補的」又は「十分に相補的」とは、核酸配列の全ての隣接残基が第２の核酸配列における同数の残基と水素結合するであろうことを意味する。好ましくは本発明による相補性の程度は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％である。最も好ましくは本発明による相補性の程度は１００％である。
【０１１７】
「配列類似性」は、同一であるか、又は、保存アミノ酸置換を表すかのいずれかである。２つのポリペプチド又は核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１１８】
「同一性パーセンテージ」なる用語は、比較されるべき２つの配列間で、最良のアラインメントの後に得られた同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを表示すると意図され、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差異は無作為、かつ、その全長にわたって分布される。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の配列比較を従来通りに、最適にそれらをアラインしてしまった後にこれらの配列を比較することにより実施し、局所領域の配列類似性を同定及び比較のために、セグメントにより、又は「比較のウィンドウ」により該比較を実施する。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加えてＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））により、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの局所相同性アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））により、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８））により、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５サイエンスドライブ、マジソン、ウィスコンシン州）により生成されてもよい。
【０１１９】
同一性パーセンテージは、比較される２つの配列間の同一位置の数を決定し、この数を比較された位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じることにより計算され、これら２つの配列間の同一性パーセンテージが得られる。
【０１２０】
本発明によるペプチド若しくはタンパク質をコードする核酸又はｓｉＲＮＡを発現可能な核酸又はアンチセンス核酸は単独で、又はその他の核酸、特に異種の核酸との組み合わせで存在し得る。好ましい実施態様では、核酸は、該核酸に関して同種又は異種でもよい発現制御配列又は調節配列と機能的に連結されている。コードする配列／発現配列の発現又は転写が該調節配列の制御下又は影響下にあるような方式で、コードする配列／発現配列及び調節配列が互いに共有結合により連結されている場合、それらは互いに「機能的に」連結されている。コードする配列が機能的タンパク質に翻訳されることになっている場合、次いで該コードする配列に機能的に連結された調節配列を用いて、該調節配列の誘導が該コードする配列の転写を招き、コードする配列又は望ましいタンパク質若しくはペプチドに翻訳できない該コードする配列におけるフレームシフトを引き起こさない。
【０１２１】
本発明による「発現制御配列」又は「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び遺伝子の発現を調節するその他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施態様では、発現制御配列により調節されることができる。調節配列の正確な構造は種又は細胞型の機能に応じて異なるが、一般的にはＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような転写及び翻訳の各々の開始に関与する５'非転写配列及び５'非翻訳配列を含む。さらに具体的には、５'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまたエンハンサー配列又は上流のアクチベーター配列を含み得る。
【０１２２】
本発明によれば、核酸はさらに、別の核酸と組み合わされて存在することができ、その核酸は、宿主細胞からの該核酸によりコードされたタンパク質又はペプチドの分泌を制御するペプチドをコードするものである。本発明によれば核酸はまた、コードされたタンパク質又はペプチドを宿主細胞の細胞膜上に繋留させるか、又は、該細胞の特定のオルガネラに区分化させるペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在させてもよい。同様に、レポーター遺伝子又は何らかの「タグ」を表す核酸との組み合わせが可能である。
【０１２３】
好ましい実施態様では、本発明による組換え核酸分子はベクターであり、プロモーターに適切な場合、それは核酸の発現を制御する。「ベクター」なる用語は本明細書ではその最も一般的な意味で用いられ、該核酸が例えば真核細胞及び／又は原核細胞に導入されること、及び、適切な場合、ゲノムに組み込まれることを可能にする、核酸のための任意の媒介ベヒクルを含む。この種類のベクターは、好ましくは細胞において複製され及び／又は発現される。媒介ベヒクルは、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルでのボンバードメント、リポソーム投与、アグロバクテリアを援用した移行、又は、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスを介する挿入における使用に適合させることができる。ベクターはプラスミド、ファゲミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。
【０１２４】
本明細書で使用される際には、「細胞」なる用語は、好ましくは真核細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を指す。
【０１２５】
本発明によれば、「宿主細胞」なる用語は、外因性核酸で形質転換又はトランスフェクトできる任意の細胞に関する。本発明による「宿主細胞」なる用語は、原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞及び昆虫細胞）を含む。特に好ましいのはヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類由来の細胞など哺乳動物細胞である。細胞は多様な組織型から誘導され、一次細胞及び細胞系を含むことができる。具体的な例としては、ケラチノサイト、抹消血白血球細胞、骨髄の幹細胞及び胚性幹細胞を含む。核酸は、単一のコピー又は２つ以上のコピーの形態で宿主細胞に存在でき、１つの実施態様では宿主細胞において発現される。宿主細胞はヒト身体の一部ではないことが好ましい。
【０１２６】
本発明によれば、「発現」なる用語はその最も一般的な意味で用いられ、ＲＮＡの生成、又は、ＲＮＡ及びタンパク質の生成を含み、核酸の部分的発現をも含む。さらに、一時的に又は安定して発現を行ってもよい。哺乳動物細胞における好ましい発現系は、ｐｃＤＮＡ３．１及びｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を含み、それは遺伝子にＧ４１８に対する抵抗性を付与する（したがって安定してトランスフェクトされた細胞系を選択することを可能にする）遺伝子のような選択マーカー及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー−プロモーター配列を含有する。
【０１２７】
核酸の発現を調節、特に低減するために「アンチセンス核酸」を使用することができる。本発明による「アンチセンス核酸」なる用語は、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド又は修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、生理学的条件下で特定の遺伝子を含むＤＮＡ、又は、該遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズし、それにより該遺伝子の転写及び／又は該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンス核酸は天然由来ｍＲＮＡと二重螺旋を形成し、したがってｍＲＮＡの蓄積又は翻訳を防御できる。別の可能性は核酸を不活化するためのリボザイムの使用である。
【０１２８】
本発明に従って好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０の隣接ヌクレオチドの配列を有し、標的核酸又はその一部に完全に相補的であると好ましい。
【０１２９】
好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳開始部位、転写開始部位又はプロモーター部位のようなＮ末端又は５'上流部位にハイブリダイズする。さらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは３'非翻訳領域又はｍＲＮＡスプライシング部位にハイブリダイズする。
【０１３０】
１つの実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡ又は本発明のアンチセンス核酸のようなオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はその組み合わせからなり、一方のヌクレオチドの５'末端及び他方のヌクレオチドの３'末端は、リン酸ジエステル結合により互いに連結されている。これらのオリゴヌクレオチドを従来の様式で合成するされてもよいし、組換えにより生成されてもよい。
【０１３１】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは「修飾された」オリゴヌクレオチドである。ここで、オリゴヌクレオチドは、その安定性や治療有効性等を増大させるため、その標的に結合する能力を損なわずに、かなり異なる方式で修飾されてもよい。本発明によれば、「修飾されたオリゴヌクレオチド」なる用語は、（ｉ）そのヌクレオチドの少なくとも２つは合成用のヌクレオシド間結合（すなわちリン酸ジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）により互いに連結されている；及び／又は（ｉｉ）通常、核酸に見出されない化学基が共有結合でオリゴヌクレオチドに連結されている；オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成用のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート、ホスホン酸アルキル、ホスホロジチオアート、リン酸エステル、チオホスホン酸アルキル、ホスホロアミダート、カルバマート、カルボナート、リン酸三エステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル及びペプチドである。
【０１３２】
「修飾されたオリゴヌクレオチド」なる用語は、また、共有結合により修飾された塩基及び／又は糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。「修飾されたオリゴヌクレオチド」は、例えば３'位のヒドロキシル基及び５'位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖残基をゆするオリゴヌクレオチドを含む。修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、２'−Ｏ−アルキル化リボース残基を含んでいてもよいし、リボースの代わりにアラビノースのような別の糖を含んでいてもよい。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドに関して上記で記載された全ての実施態様をポリヌクレオチドにも適用できることは理解されるべきである。
【０１３４】
ここで使用される「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、標準的なワトソン・クリック塩基対形成相互作用により共にアニーリングされている（以下「塩基対形成された」ともいう。）センスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む、分子又は複合体を意味する。ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、１０ヌクレオチド長より大きいことが好ましく、１５ヌクレオチド長より大きいとより好ましく、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長であると最も好ましい。１９〜２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡに最も好ましい大きさである。
【０１３５】
本発明によれば、標的遺伝子のタンパク質生成物が生成されないか、又は生成される量が低減されるように、ｓｉＲＮＡは特異的に標的し、標的遺伝子すなわち標的ｍＲＮＡからＲＮＡｉ誘起のｍＲＮＡの分解を引き起こす。
【０１３６】
本発明によるｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、又は組換えにより生成されたＲＮＡを含み、加えて、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然由来ＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含むことができる。かかる改変には、非ヌクレオチド材料の、例えばｓｉＲＮＡの（複数の）末端やｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへの付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾（例えば２'置換リボヌクレオチドの使用又は糖−リン酸骨格に対する修飾）；又はｓｉＲＮＡにおける１以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドとの置換；を含むことができる。さらに、ｓｉＲＮＡは、修飾されたオリゴヌクレオチドに関して上記で記載されたように、その安定性を増大するために修飾されていてもよく、具体的には、１以上のホスホロチオエート連結を導入してｓｉＲＮＡを修飾することができる。
【０１３７】
ｓｉＲＮＡの１又は双方の鎖はまた３'−オーバーハングを含むことができる。ここで使用される際には、「３'−オーバーハング」とは、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。つまり、１つの実施態様では、ｓｉＲＮＡは１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む）長の少なくとも１つの３'−オーバーハングを含み、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'−オーバーハングを含むことができる。ｓｉＲＮＡ分子の双方の鎖が３'−オーバーハングを含む実施態様では、オーバーハングの長さは各鎖で同じであってもよいし、異なっていてもよい。最も好ましい実施態様では、３'−オーバーハングはｓｉＲＮＡの双方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば本発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３'−オーバーハングを含むことができる。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、３'−オーバーハングを分解に対して安定化させることもできる。１つの実施態様では、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによりオーバーハングを安定化する。また、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば３'−オーバーハングにおけるウリジンヌクレオチドの２'−デオキシチミジンでの置換は、耐用性を有し、かつ、ＲＮＡｉ分解の効率に影響しない。特に２'−デオキシチミジンにおける２'−ヒドロキシルの不在は組織培養媒質中の３'−オーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性を有意に増強する。
【０１３９】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができるし、２つの相補的部分が塩基対形成され、一本鎖「ヘアピン」エリアにより共有結合により連結されている単一の分子を含むこともできる。すなわち、センス領域とアンチセンス領域とをリンカー分子を介して共有結合により接続することができる。リンカー分子は、ポリヌクレオチドとすることもできるし、非ヌクレオチドリンカーでとすることもできる。いかなる理論にも制約されることを望まないが、ｓｉＲＮＡ分子の後者の型のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（又はその均等物）により細胞内で切断されて、２つの個々の塩基対形成されたＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられている。
【０１４０】
ここで使用される「標的ｍＲＮＡ」とは、下方調節のための標的であるＲＮＡ分子を指す。当業者であれば、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と均等であり、本明細書において同じ目的、すなわちｓｉＲＮＡの生成のために使用できると理解されよう。
【０１４１】
最初に転写されるヌクレオチドがプリンである場合にｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現が効率的であるとだけ考えられているので、標的部位を変えずにｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターからｓｉＲＮＡを発現することができる。
【０１４２】
本発明によるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれかにおけるおよそ１９〜２５の隣接ヌクレオチドの任意のストレッチを標的とされることができる。ｓｉＲＮＡに関する標的配列を選択するための技術は、例えばＴｕｓｃｈｌ  Ｔ．ら、「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」２００２年１０月１１日改訂（その全開示を出典明示により本明細書の一部とする）にて与えられる。「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」はワールド・ワイド・ウェブのＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ（ロックフェラー大学、ＲＮＡ分子生物学研究室、ニューヨーク、米国）により管理されているウェブサイトで利用可能であり、ロックフェラー大学のウェブサイトにアクセスし、キーワード「ｓｉＲＮＡ」で検索することにより見出すことができる。したがって本ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡにおける約１９〜約２５ヌクレオチドの任意の隣接のストレッチに実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１４３】
一般的に標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、標的ｍＲＮＡに相当する所定のｃＤＮＡ配列から選択することができ、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流で始まる（すなわち３'−方向で）ｃＤＮＡ配列から選択することができる。しかしながら、標的配列は５'−又は３'−非翻訳領域に位置することもできるし、開始コドンの近くの領域に位置することもできる。例えばＭＳ４Ａ１２ｃＤＮＡ配列における適当な標的配列は、以下の群の標的配列から選択される：
（ｉ）ＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡ（配列番号：３）
（ｉｉ）ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡ（配列番号：６）
【０１４４】
配列（ｉ）を標的とし、各鎖に３'−オーバーハングを有する（オーバーハングを下線で示す）好ましいｓｉＲＮＡは：
５'      ｕｃａｕｇｇｕｕｇｇａｕｕｇａｕｇｃａＴＴ  ３'（配列番号：４）
３'  ＣＴａｇｕａｃｃａａｃｃｕａａｃｕａｃｇｕ      ５'（配列番号：５）
である。
【０１４５】
配列（ｉｉ）を標的とし、各鎖に３'−オーバーハングを有する（オーバーハングを下線で示す）好ましいｓｉＲＮＡは：
５'      ｃａａｃｃｇｇｇｕｃａａｇｇａａａｕａＴＡ  ３'（配列番号：７）
３'  ＣＡｇｕｕｇｇｃｃｃａｇｕｕｃｃｕｕｕａｕ      ５'（配列番号：８）
である。
【０１４６】
前記のリストでは、核酸配列における全てのデオキシリボヌクレオチドは大文字で表され（例えばデオキシチミジンは「Ｔ」である）、核酸配列におけるリボヌクレオチドは小文字で表される（例えばウリジンは「ｕ」である）。
【０１４７】
ここで与えられる標的配列はヒトＭＳ４Ａ１２  ｃＤＮＡに関するものであり、したがってこれらの配列は「Ｔ」により表されるデオキシチミジンを含有することは理解される。当業者であれば、ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡの実際の標的配列では、デオキシチミジンはウリジン（「ｕ」）により置き換えられることは理解されよう。同様に本発明のｓｉＲＮＡ内に含有される標的配列には、デオキシチミジンの代わりにウリジンも含まれよう。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡは、当業者に知られた多くの技術を用いて得ることができる。例えばｓｉＲＮＡは化学的に合成されることもできるし、Ｔｕｓｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号（その全開示を出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａインビトロ系のような当分野で知られる方法を用いて組換えにより生成することもできる。
【０１４９】
ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して化学的に合成することが好ましい。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として合成することができるし、２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することもできる。
【０１５０】
また、ｓｉＲＮＡは、任意の適当なプロモーターを使用して組換え環状ＤＮＡプラスミド又は組換え線状ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。かかる実施態様は、本明細書でｓｉＲＮＡの投与又はｓｉＲＮＡの医薬組成物への組み込みを参照する場合に、本発明に従って含まれる。本発明のｓｉＲＮＡをプラスミドから発現するために適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。
【０１５１】
その他の適当なプロモーターの選択は当分野の技術内である。組換えプラスミド又はウイルスベクターのようなｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を含む核酸分子は、特定の組織又は特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のため、誘導プロモーターや調節プロモーターを含むこともできる。
【０１５２】
組換えプラスミドから発現されたｓｉＲＮＡは、標準的な技術により培養細胞発現系から単離されるか、又は、細胞内で発現されるかいずれか行うことができる。ｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として発現することができるし、又は、２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子のいずれかとして発現することもできる。
【０１５３】
ｓｉＲＮＡを発現するのに適当なプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するために核酸配列をプラスミドに挿入するための方法、及び組換えプラスミドを目的の細胞に分配する方法は当分野の技術内である。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡは、細胞内インビボで組換えウイルスベクターから発現させることもできる。組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡをコードする配列、及び、ｓｉＲＮＡ配列を発現するために適当な任意のプロモーターを含む。組換えウイルスベクターはまた、特定の組織又は特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導プロモーター又は調節プロモーターを含むこともできる。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として、又は、２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現することができる。
【０１５５】
ヒトＭＳ４Ａ１２遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、当分野において周知の技術を用いて選択的スプライシング形態を分析することができる。かかる技術には逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１５６】
「ＲＮａｓｅ保護」と称される技術を用いて選択的スプライシングされたＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡを同定することもできる。ＲＮａｓｅ保護は、遺伝子配列の合成ＲＮＡへの転写を含み、その他の細胞（例えばＭＳ４Ａ１２の発現が誘起された細胞）から誘導されたＲＮＡにハイブリダイズされることである。次いでハイブリダイズされた細胞をＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予期されたフラグメントよりも小さいことは、選択的スプライシングされたｍＲＮＡの存在を示す。当推定上の選択的スプライシングｍＲＮＡは、当業者に周知の方法によりクローン化し、配列することができる。
【０１５７】
ＲＴ−ＰＣＲは、選択的スプライシングされたＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡを同定に使用することもできる。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＭＳ４Ａ１２を発現することが知られている細胞からのｍＲＮＡが当業者に周知の方法を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡに変換される。ｃＤＮＡの全コード化配列は、３'非翻訳領域に位置する順方向プライマー及び５'非翻訳領域に位置する逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲを介して増幅される。増幅された生成物は、増幅された生成物の大きさと通常的にスプライシングされたｍＲＮＡからの予期される生成物の大きさとを、アガロース電気泳動等により比較するなどにより、選択的スプライシング形態を分析することができる。増幅された生成物の大きさのいかなる変化も選択的スプライシングを示すことができる。
【０１５８】
変異体ＭＳ４Ａ１２遺伝子から生成されたｍＲＮＡは、選択的スプライシング形態を同定するための上記で記載された技術を用いて容易に同定することもできる。ここで使用される際には「変異体」ＭＳ４Ａ１２遺伝子又はｍＲＮＡは、本明細書で示されるＭＳ４Ａ１２配列とは配列で異なるヒトＭＳ４Ａ１２遺伝子又はｍＲＮＡを含む。したがって、ＭＳ４Ａ１２遺伝子の対立遺伝子形態、及びそれから生成されたｍＲＮＡは本発明の目的のための「変異体」と考えられる。
【０１５９】
「低減する」又は「阻害する」とは、本明細書で使用される際には、参照試料（例えばｓｉＲＮＡで処理されていない試料）と比較して、タンパク質又はｍＲＮＡ等のレベルの全体的な低下を引き起こす能力を意味し、２０％以上低下させると好ましく、５０％以上がさらに好ましく、最も好ましくは７５％、９０％又は９５％以上である。標的とされたｍＲＮＡ切断又は分解を通してＲＮＡ又はタンパク質の発現を低減又は阻害することができる。タンパク質発現又は核酸発現のためのアッセイは当分野において知られており、例えばＥＬＩＳＡ、タンパク質発現のためのウェスタンブロット分析、及びＲＮＡのためのノーザンブロッティング又はＲＮａｓｅアッセイを含む。ある実施態様では、「阻害する」又は「阻害」なる用語は完全な阻害、すなわちレベルの１００％低下を指す。
【０１６０】
「ペプチド」なる用語は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合により共有結合した２以上のアミノ酸を含む物質をいい、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上、好ましくは８以下、１０以下、２０以下、３０以下、４０以下又は５０以下、特に１００以下のアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」なる用語は大きなペプチド、好ましくは１００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般的に「ペプチド」及び「タンパク質」なる用語は同義語であり、ここでは互換的に使用される。
【０１６１】
本発明に従って記載されるタンパク質及びペプチドは単離されていると好ましい。「単離されたタンパク質」又は「単離されたペプチド」なる用語は、タンパク質又はペプチドがその天然の環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質又はペプチドは本質的に精製された状態でもよい。「本質的に精製された」なる用語は、タンパク質又はペプチドが、それが天然で又はインビボで随伴されるその他の物質を本質的に含んでいないことを意味する。
【０１６２】
かかるタンパク質及びペプチドは、例えば抗体の生成に用いられていもよいし、免疫学的アッセイ、診断アッセイ又は治療薬として使用されてもよい。本発明に従って記載されるタンパク質及びペプチドを組織又は細胞ホモジネートのような生物学的試料から単離してもよいし、非常に多数の原核生物又は真核生物発現系において組換えにより発現することもできる。
【０１６３】
本発明の目的のために、タンパク質、ペプチド、又はアミノ酸配列の「誘導体」はアミノ酸挿入バリアント、アミノ酸欠失バリアント及び／又はアミノ酸置換バリアントを含む。
【０１６４】
アミノ酸挿入バリアントは、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の融合に、さらに、特定のアミノ酸配列に１又は２以上のアミノ酸を挿入することも含む。得られる生成物の適切なスクリーニングで無作為挿入も可能になるが、挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、アミノ酸配列の特定の部位に１以上のアミノ酸残基を挿入する。
【０１６５】
アミノ酸欠失バリアントは、配列からの１以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【０１６６】
アミノ酸置換バリアントは、配列における少なくとも１の残基が除去されており、別の残基がその場所に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質若しくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置が修飾されること、及び／又は、アミノ酸が同様な特性を有する他のアミノ酸に置き換えられることが好ましい。
【０１６７】
好ましくは、タンパク質、ペプチド、又はアミノ酸配列の「誘導体」は、５０以下のアミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換されたバリアントに関し、より好ましくは２０以下、１５以下、１０以下、８以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１のみのアミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換されたバリアントとすることができる。
【０１６８】
「保存的置換」は、例えば、伴われる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいてなされてもよい。例えば：（ａ）無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ；（ｃ）正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ；（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。典型的には置換を（ａ）〜（ｄ）群内で行うことができる。加えて、グリシン及びプロリンは、α螺旋を乱すその能力に基づいて、相互に置換されてもよい。いくつかの好ましい置換が、以下の群の間で行われてもよい；（ｉ）Ｓ及びＴ；（ｉｉ）Ｐ及びＧ；並びに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ。熟練した科学者は、公知の遺伝子コード、並びに、組換えＤＮＡ技術及び合成ＤＮＡ技術が与えられると、保存的アミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１６９】
本明細書に記載される特定のアミノ酸配列と、該特定のアミノ酸配列の誘導体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％であり、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％であることが好ましい。類似性又は同一性の程度は、少なくとも約２０のアミノ酸の領域に関して与えられることが好ましく、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約２００又は２５０のアミノ酸の領域に関して与えられることが好ましい。好ましい実施態様では、類似性又は同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に関して与えられる。
【０１７０】
固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４）や類似の方法、又は組換えＤＮＡ操作などによる、公知のペプチド合成技術を用いることで、上記で記載されたアミノ酸バリアントは、容易に調製することができる。置換、挿入又は欠失を有するタンパク質及びペプチドを調製するＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細に記載されている。
【０１７１】
本発明によれば、タンパク質及びペプチドの「誘導体」は、炭水化物、脂質及び／又はタンパク質若しくはペプチドなどのタンパク質又はペプチドに結合する任意の分子を一又は複数置換、欠失及び／又は付加したものを含む。「誘導体」なる用語はまた該タンパク質及びペプチドの全ての機能的な化学的均等物にまでも及ぶ。
【０１７２】
本発明によれば、タンパク質又はペプチドの一部又は断片は、誘導されたタンパク質又はペプチドの機能的特性を有することが好ましい。かかる機能的特性は、抗体との相互作用、その他のペプチド又はタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合及び酵素活性を含む。タンパク質又はペプチドの一部又は断片は、タンパク質又はペプチドの隣接アミノ酸を少なくとも６含むことが好ましく、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０又は少なくとも５０含むことが好ましい。タンパク質又はペプチドの一部又は断片は、タンパク質又はペプチドの隣接アミノ酸を８以下含むことが好ましく、特に１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、３０以下、又は５５以下含むことが好ましい。タンパク質又はペプチドの一部又は断片は、非膜貫通タンパク質に相当する部分が好ましく、具体的には、タンパク質若しくはペプチドの細胞外部分、又はそれらが含まれていることが好ましい。
【０１７３】
タンパク質又はペプチドをコードする核酸の一部又は断片は、この発明によれば、上記で定義されたタンパク質若しくはペプチド、及び／又は該タンパク質若しくはペプチドの一部若しくは断片を少なくともコードする核酸の一部に関する。タンパク質又はペプチドをコードする核酸の一部又はフラグメントは、翻訳領域（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）に相当する核酸の部分であることが好ましい。
【０１７４】
本発明によれば、「結合」なる用語は、好ましくは特異的な結合に関する。「特異的な結合」とは、抗体などの剤が、エピトープなど別の標的に対する結合と比較して特異的である標的に、より強力に結合することを意味する。剤は、第２の標的に関する解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数（ＫＤ）を有する第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強力に結合する。剤が特異的に結合する標的の解離定数（ＫＤ）が、剤が特異的に結合しない標的の解離定数（ＫＤ）よりも１０倍を超えると好ましく、２０倍を超えると好ましく、より好ましくは５０倍を超え、さらに好ましくは１００倍を超えるが、２００倍、５００倍又は１０００倍未満が好ましい。
【０１７５】
本発明によれば、特異的抗体は、その標的に特異的に結合する抗体に関する。かかる特異的抗体は、例えば、その標的で免疫することによって得ることができ、例えばＭＳ４Ａ１２タンパク質又はその細胞外領域などその一部で免疫することにより得てもよい。
【０１７６】
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含有する抗血清は、種々の標準的な方法により調製することができる；例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ、ＩＳＢＮ０−１９−９６３７２２−９；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」、Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照。これによりその未変性の形態の複合膜タンパク質を認識するアファイン及び特異的抗体を作成することも可能である（Ａｚｏｒｓａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８（１９９９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４（１９８９）；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６（２０００））。このことは、特に治療的に使用されるべき抗体の調製に関係する。これに関して、生理学的に折り畳まれた形態で標的分子を発現する細胞と同様に、タンパク質全体で細胞外部分配列を免疫することができる。
【０１７７】
モノクローナル抗体は伝統的にハイブリドーマテクノロジーを用いて調製される（技術的な詳細に関しては：「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ、ＩＳＢＮ：０−１９−９６３７２２−９；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２；「Ｕｓｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」、Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。
【０１７８】
抗体分子の小部分であるパラトープのみが、そのエピトープへの抗体の結合に関与することが知られている（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）、Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード参照）。ｐＦｃ'及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ'領域が酵素により除去されている抗体、又はｐＦｃ'領域なく生成された抗体は、Ｆ（ａｂ'）２断片と称され、完全抗体の抗原結合部位を双方が担持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素により除去された抗体、又は、該Ｆｃ領域なく生成されている抗体は、Ｆａｂ断片と称され、インタクトの抗体分子の抗原結合部位を担持する。さらにＦａｂ断片は、共有結合した抗体の軽鎖と該抗体の重鎖との部分からなり、Ｆｄと称される。Ｆｄ断片は抗体特異性の主な決定因子であり（抗体の特異性を改変することなく、単一のＦｄ断片を１０以下の異なる軽鎖と結合させることができる）、Ｆｄ断片は単離された場合、エピトープに結合する能力を保持する。
【０１７９】
抗体の抗原結合部分内には、抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次元構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが位置している。Ｆｄ断片の重鎖とＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の双方が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により各々の状況で分離されている４つのフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含有する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、及び、とりわけ重鎖のＣＤＲ３領域が抗体特異性にかなりの程度、関与する。
【０１８０】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、元来の抗体のエピトープに関する特異性は保持されたまま、同じ又は異なる特異性を有する抗体の類似領域と置き換えることができることが知られている。これにより、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ'領域に共有結合により連結されて、機能的な抗体を生成する「ヒト化」抗体の開発が可能になった。
【０１８１】
別の実例として、国際公開第９２／０４３８１号パンフレットには、ネズミのＦＲ領域が少なくとも部分的にヒト由来のＦＲ領域と置き換えたヒト化ネズミＲＳＶ抗体の生成及び使用について記載されている。抗原結合能力を有するインタクト抗体の断片を含むこの種の抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【０１８２】
本発明によれば、「抗体」なる用語にはまた、抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄ断片、Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラ抗体、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦ（ａｂ'）２断片抗体、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦａｂ断片抗体、並びＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦｄ断片抗体が含まれる。また、「抗体」なる用語は「一本鎖」抗体を含む。
【０１８３】
抗体は、標的抗原を発現する細胞及び組織を表示する特異的なマーカー物質に結合させてもよいし、治療的に有用な物質に結合させてもよい。
【０１８４】
マーカー物質は、次の機能をする任意の標識を含む；（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して第１若しくは第２の標識により提供される検出可能なシグナルを修飾する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状若しくはその他の物理的パラメーターにより移動度、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす、又は（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原もしくはイオン性複合体形成を提供する。標識として適当なものは、蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位元素標識、同位体標識などの構造であり、好ましくは安定した同位体標識、等圧性標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンのような低分子量有機分子、受容体のリガンド又は細胞接着タンパク質若しくはレクチンのような結合分子、結合剤の使用により検出することができる核酸及び／又はアミノ酸残基を含む標識配列等がある。マーカー物質は、限定されないが、硫酸バリウム、イオセタム酸、イオパノ酸、イポダートカルシウム、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム及びフッ素−１８及び炭素−１１のような陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１及びインジウム−１１１のようなガンマ放射体を含む放射性診断薬、フッ素及びガドリニウムのような核磁気共鳴のための核種を含む。
【０１８５】
本発明によれば、「低分子化合物」は低分子量の化合物であり、好ましくは２０．０００Ｄａ以下、さらに好ましくは１５．０００Ｄａ以下、１０．０００Ｄａ以下、７．５００Ｄａ以下、５．０００Ｄａ以下、２．０００Ｄａ以下、又は１．０００Ｄａ以下の分子量を有する化合物である。好ましくは、低分子化合物は有機化合物である。低分子化合物は、修飾又は未修飾の天然由来化合物であってもよいし、化学的に合成された化合物であってもよい。好ましくは、低分子化合物はポリマー化合物ではない。しかしながら、低分子化合物はポリヌクレオチド又はポリペプチドであってもよい。
【０１８６】
本発明によれば、ＥＧＦ受容体は上皮成長因子（ＥＧＦ）が結合する受容体である。好ましくは、ＥＧＦ受容体は細胞膜に位置し、より好ましくは膜貫通タンパク質である。好ましくは、ＥＧＦ受容体はチロシンキナーゼ受容体であり、活性は標的タンパク質のリン酸化である。好ましいＥＧＦ受容体は、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＥｒｂＢ−１又はヒトＨＥＲ１である。しかしながら、ＥＧＦ受容体は、これらのヒトＥＧＦ受容体の種相同体であってもよい。
【０１８７】
本発明によれば、「治療上有用な物質」なる用語は、治療効果を奏し得る任意の分子を意味する。本発明によれば、治療上有用な物質には、抗癌剤、放射性ヨウ素標識された化合物、毒素、細胞分裂阻害薬又は細胞溶解薬等が含まれる。抗癌剤は例えばアミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン（ｃｙｔａｒａｂｉｄｉｎｅ）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、プロカルバジンＨＣｌ、チオグアニン、硫酸ビンブラスチン及び硫酸ビンクリスチンを含む。その他の抗癌剤は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第８版（１９９０）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、特に第５２章（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ及びＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素又はシュードモナス外毒素のようなタンパク質であってもよい。毒素残基はまたコバルト６０のような高エネルギー放出放射性核種であってもよい。
【０１８８】
本発明による「患者」なる用語はヒト、非ヒト霊長類又は別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、又はマウス及びラットのようなげっ歯類のような哺乳動物を意味する。特に好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【０１８９】
本発明による「増大した」又は「増大した量」なる用語は、好ましくは少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％又は少なくとも１００％の増大を指す。さらに「増大」なる用語はまた、増大されるべき効果又は量が増大の前に存在しなかった、すなわちゼロであったが、増大後に存在する、すなわちゼロよりも大きくなる状況もいう。
【０１９０】
本発明によれば、「癌」なる用語は任意の癌を含み、好ましくはＭＳ４Ａ１２の発現を特徴とする癌、すなわち癌の癌細胞の少なくとも一部がＭＳ４Ａ１２を発現する癌を指す。さらに好ましくは、ＥＧＦ受容体の発現を特徴とし、すなわち癌細胞の少なくとも一部がＥＧＦ受容体を発現する癌である。より好ましい実施態様では、ＥＧＦ受容体の発現及びＥＧＦ受容体の発現を特徴とする癌であり、すなわち癌の癌細胞の少なくとも一部がＭＳ４Ａ１２を発現し、癌細胞の少なくとも一部がＥＧＦ受容体を発現するものである。最も好ましくは、癌細胞の少なくとも一部がＭＳ４Ａ１２及びＥＧＦ受容体を発現する。
【０１９１】
本発明によれば、「癌」なる用語は癌の転移を含む。好ましい実施態様では、癌は結腸癌であり、癌転移は結腸癌転移、すなわち結腸癌から誘導された癌転移である。好ましくは、癌は結腸癌腫のような癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、特に結腸の腺癌のような腺癌（ａｄｅｂｉｃａｃｒｃｉｎｏｍａ）である。
【０１９２】
「結腸癌」及び「結腸直腸癌」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、結腸の癌及び直腸の癌を含む。同様に、「結腸腫瘍」及び「結腸癌腫」なる用語は、各々「結腸直腸腫瘍」及び「結腸直腸癌腫」をも含む。
【０１９３】
「腫瘍」（ｔｕｍｏｒ）とは、急速に制御なく細胞が増殖することにより成長し、新しい成長を開始した刺激が停止した後に成長を続ける細胞又は組織の異常な群を意味する。腫瘍は構造的構成及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常、組織の明確な腫瘤を形成し、良性又は悪性のいずれであってもよい。好ましくは本発明による腫瘍は、結腸腫瘍である。
【０１９４】
本発明によれば、「新生物細胞」（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ）は異常に増大した細胞増殖を示す細胞である。本発明によれば、「癌細胞」（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）は癌疾患に関与する細胞であり、腫瘍細胞（ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、白血病細胞及び転移の細胞を含む。本発明によれば、「腫瘍細胞」は腫瘍組織に存在する細胞である。好ましくは「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は新生物細胞である。「癌細胞の少なくとも一部」なる用語は、好ましくは癌細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％を指す。
【０１９５】
「転移」とはその起源の部位から身体の別の部分への癌細胞の広がりを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスの湿潤、体腔及び血管に侵入するための内皮基底膜の透過、そして、血液により輸送された後、標的器官の浸入によって決まる。最後に、標的部位での新しい腫瘍の成長は、血管形成によって決まる。腫瘍細胞又は構成要素は残存し、転移潜在能力が発達することもあるので、腫瘍転移は原発腫瘍の除去の後でさえもしばしば生じる。１つの実施態様では、本発明による「転移」なる用語は、原発腫瘍及び所属リンパ節系から離れている転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０１９６】
本発明によれば、「腫瘍試料」は１以上の腫瘍細胞を含有する試料である。腫瘍試料は、体液を含む組織試料及び／又は細胞試料でもよく、パンチ生検を含む組織生検や血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便又はその他の体液の採取など従来の様式で得ることができる。本発明によれば、「腫瘍試料」なる用語は、腫瘍試料の分画をも含む。好ましくは、腫瘍試料は腫瘍を有する患者から得られ、好ましくは該患者から単離される。
【０１９７】
本発明はまた核酸、タンパク質又はペプチドの投与を提供する。核酸、タンパク質及びペプチドは、それ自体、知られた様式で投与することができる。例えば、核酸はウイルス及び標的制御（ｔａｒｇｅｔ-ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）リポソームのようなベクターを使用することによりインビボで投与できる。本発明による核酸の投与又は医薬組成物への組み込みを参照する場合、核酸がかかるベクターに存在する実施態様が含まれる。
【０１９８】
好ましい実施態様では、核酸の投与のためのウイルス又はウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクチニアウイルス及び弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス及びＴｙウイルス様粒子からなる群から選択される。特に好ましいのは、アデノウイルス及びレトロウイルスである。レトロウイルスは典型的には複製欠損である（すなわちそれらは感染性粒子を作成することが不可能である）。
【０１９９】
核酸を細胞にインビトロ又はインビボで導入する方法は、核酸のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥに随伴される核酸のトランスフェクション、目的の核酸を担持する上記のウイルスでのトランスフェクション又は感染、リポソーム媒介トランスフェクション等を含む。具体的な実施態様において好ましいのは、核酸を特定の細胞に指向させることである。かかる実施態様では、核酸の細胞への投与のために用いられるキャリアー（例えばレトロウイルス又はリポソーム）は、結合標的制御分子を有していてもよい。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体などの分子、又は、標的細胞上の受容体のリガンドは、核酸キャリアーに組み込んでもよいし、付着させてもよい。リポソームを介する核酸の投与が望ましい場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的制御及び／又は取り込みを可能にするためにリポソーム処方物に組み込むことができる。かかるタンパク質には、特定の細胞型に特異的であるカプシドタンパク質又はその断片、内部移行するタンパク質に対する抗体、細胞内部位に向かうタンパク質等が含まれる。
【０２００】
本発明の治療用組成物は、医薬的に混合できる調製物で投与することができる。かかる調製物は通常、医薬的に混合できる濃度の塩、バッファー物質、保存剤、キャリアーを含有してもよく、アジュバントのような免疫強化物質（ＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＲＮＡ）や、適切な場合、その他の治療に活性な化合物を補充する。
【０２０１】
本発明の治療的に活性な剤は、注射又は注入を含む任意の従来の経路を介して投与することができる。投与は、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮又は直腸内に実施することができる。アンチセンス核酸は好ましくは緩徐な静脈内投与により投与される。
【０２０２】
本発明の組成物を有効量で投与する。「有効量」とは単独で、又はさらなる用量と一緒に望ましい反応又は望ましい効果を達成する量を指す。特定の疾患又は特定の症状の処置の場合、望ましい反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは疾患の進行を緩徐化すること、特に疾患の進行を妨害するか又は逆転させることを含む。疾患又は症状の処置における望ましい反応は、該疾患又は該症状の発症を遅らせ、又は、発症を妨げることあってもよい。本発明によれば、癌の処置には既に形成されているか又は形成されるであろう癌転移の処置も含まれ得る。本発明によれば、「処置」なる用語は、治療的処置、及び、予防的処置（すなわち予防）を含む。
【０２０３】
本発明の組成物の有効量は、処置されるべき症状、疾患の重篤度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む患者の個々のパラメーター、処置の継続期間、併用療法の型（存在する場合）、投与の具体的な経路及び同様な因子に依存するであろう。
【０２０４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、望ましい反応又は望ましい効果を生じるために有効量の治療的に活性な剤を含有する。
【０２０５】
本発明の組成物の投与される用量は、投与の型、患者の症状、望ましい投与の期間等のような種々のパラメーターにより決定してもよい。患者における反応が初期用量で不十分な場合には、高用量（異なる又はさらに局所化された投与の経路により達成される有効な高用量）を使用されてもよい。
【０２０６】
本発明の剤の用量は、一般的に１ｎｇ〜１ｍｇであるが、好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇを処方、投与し、処置又は免疫応答を作成又は増大する。ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸又は抗体をコードする核酸分子のような核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の投与が望ましい場合は、１ｎｇ〜０．１ｍｇが処方され、投与される。
【０２０７】
本発明の医薬組成物は、一般的に医薬的に混合できる量で、かつ、医薬的に混合できる組成物で投与される。「医薬的に混合できる」なる用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない無毒性の材料を指す。この種類の調製物は、通常、塩、バッファー物質、保存剤、キャリアーを含み、適切な場合、その他の治療的に活性な化合物を含有してもよい。医薬品で使用される場合、塩は医薬的に混合されるべきである。しかしながら、医薬的に混合しない塩は、医薬的に混合できる塩の調製のために用いられてもよく、本発明に含まれる。この種の薬理学的及び医薬的に混合できる塩は、限定するものではないが、以下の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。医薬的に混合できる塩をナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製することもできる。
【０２０８】
本発明の医薬組成物は医薬的に混合できる担体を含むことができる。本発明によれば、「医薬的に混合できる担体」なる用語は、ヒトへの投与のために適当である１つ以上の混合できる固体又は液体の充填剤、希釈剤又は被包物質を指す。「担体」なる用語は、天然又は合成の有機又は無機成分を指し、適用を促進するために活性成分が組み合わされる。本発明の医薬組成物の成分は、通常、望ましい医薬的有効性を実質的に損なう相互作用を生じないようなものである。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、酢酸の塩、クエン酸の塩、ホウ酸の塩及びリン酸の塩のような適当なバッファー物質を含有できる。
【０２１０】
医薬組成物は、適切な場合、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールのような適当な保存剤も含んでいてもよい
【０２１１】
医薬組成物は、通常、均一な投薬形態で提供され、それ自体既知の様式で調製することができる。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、坐剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルの形態で又はエマルジョンの形態でもよい。
【０２１２】
非経口投与に適当な組成物は、通常、活性化合物の無菌水性又は非水性調製物を含み、好ましくはレシピエントの血液と等張である。混合できる担体及び溶媒の例としては、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、通常、無菌の固定油を溶液又は懸濁液媒質として使用する。
【０２１３】
以下の図面及び実施例により本発明を詳細に記載するが、それらは例証目的のためだけに使用され、限定することを意図するものではない。記載及び実施例のために、同様に本発明に含まれるさらなる実施態様が当業者に利用可能である。
【実施例】
【０２１４】
本明細書で言及される技術及び方法はそれ自体既知の様式で実施され、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）に記載される。具体的に示さない場合、キット及び試薬の使用を含む全ての方法を製造者の情報に従って実施する。
【０２１５】
［腫瘍において異常に活性化された胎盤特異的遺伝子に関するスクリーニング］
＜組織及び細胞系＞
官許を得て、ラインラント・パラチナート（Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ−Ｐａｌａｔｉｎａｔｅ）の州政府の規則に従って組換えＤＮＡ作業を行った。新鮮凍結組織は、日常的な診断実務又は治療実務の間にヒト余剰材料として入手した。長時間の暴露を回避するように注意を払い、組織を−８０℃で用時まで貯蔵した。結腸癌細胞系ＬｏＶｏをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。
【０２１６】
＜発見のためのデータマイニング手法＞
最初の工程として、ｄｂＥＳＴレポートファイル（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｄｂＥＳＴ）の生物分野でキーワード「ホモサピエンス」を含有した全ての利用可能なライブラリーから一般的なヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）ファイルを創成した。アプローチの複雑さを低減するため、１００を超えるＥＳＴ、及び、既知の全長遺伝子をコードするＥＳＴのみを表すライブラリーのみを考慮した。次にライブラリー名、生物、組織型、器官又は細胞系分野で「結腸」なる用語を含有した一般的なファイルから全てのこれらのＥＳＴを抜き出すことにより、結腸組織特異的サブファイルを作成した。合計で、４，０２１のｃＤＮＡライブラリーで表された６，２８０，８８３のＥＳＴを分析した。いくつかのＥＳＴが同じ遺伝子から誘導され得るという事実を説明するために、配列同一性が高い１つ以上のストレッチを共有するＥＳＴを集めたクラスターに結腸組織ＥＳＴを群分けした。一覧表におけるヒトＥＳＴの全てに対して結腸組織ＥＳＴサブファイルで記録された各配列に関してＳ＝３００；Ｖ＝３００；Ｂ＝３００；ｎ＝−２０でセットされた相同性ストリンジェンシーを用いて配列相同性検索プログラムｂｌａｓｔｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を逐次的に実行した。結腸組織サブファイルからの各クエリーＥＳＴに関して、検索により一般的なＥＳＴファイルからＥＳＴ入力（ヒット）のリストが抜き出され、各々が由来する組織で注釈を付け、「エレクトロニックノーザン（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）」を提供した。かかるヒットリストで表された種々の非結腸組織の数を決定して、各個々のＥＳＴの結腸組織特異性の程度に関する測定値として使用した。この手順により得られた全ての候補物質は、ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｓｍａｒｔ）によるモチーフ及び構造分析に供して、潜在表面分子を同定した。この手順により得られた候補物質は、ＳＭＡＲＴによるモチーフ及び構造分析に供して、トポロジー的にＣＤ２０に類似した表面分子を同定した（最低要件：ＴＭＨＭＭに従って膜貫通ドメインと見なされる少なくとも４つの疎水性領域、及び少なくとも１つの細胞外ループの予測）。
【０２１７】
＜ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ＞
ＲＮＡ抽出、第１鎖ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以前に記載されたとおりに行った（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５９８８−９３（２００４））。簡単には、全細胞ＲＮＡを凍結組織標本からＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、ｄＴ１８オリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で製造者の説明書に従って逆転写した。得られたｃＤＮＡの完全性は、３０サイクルＰＣＲ（センス、５'−ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＣＧ−３'（配列番号：１５）；アンチセンス，５'−ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＡＧ−３'（配列番号：１６）；アニーリング温度６７℃）でｐ５３転写物の増幅により試験した。
【０２１８】
エンドポイント分析のために、ＭＳ４Ａ１２特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ−３'（配列番号：１１）；アンチセンス５'−ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＴＣ−３'（配列番号：１２）、６０℃アニーリング）を３５サイクルＲＴ−ＰＣＲで使用した。リアルタイム定量的発現分析は、４０サイクルＲＴ−ＰＣＲで３検体ずつ実施した。ＨＰＲＴ（センス５'−ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ−３'（配列番号：１３）；アンチセンス５'−ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ−３'（配列番号：１４）、６２℃アニーリング）に正規化した後、ΔΔＣＴ計算を用いて腫瘍試料中のＭＳ４Ａ１２転写物を正常な組織に相対して定量した。ＰＣＲ反応の特異性は、任意に選択された試料から、増幅生成物をクローニングし、配列を決定することにより確認した。
【０２１９】
＜抗血清、免疫蛍光及び免疫化学＞
ポリクローナル抗血清を組換えにより発現されたＭＳ４Ａ１２のフラグメント（アミノ酸１−６３）に対して上昇させ、カスタム抗体サービス（Ｓｑｕａｒｉｘ）によりアフィニティー精製した。組織凍結切片でＶＥＣＴＯＲ  ＮｏｖａＲＥＤ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を製造者の説明書に従って使用して、免疫組織化学を実施した。ウェスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した全タンパク質２０μｇを使用した。抽出物は還元試料バッファー（Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、引き続いてＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に電子伝達した。ＭＳ４Ａ１２、ＫＲＴ１８（Ａｂｃａｍ）及びβアクチン（Ａｂｃａｍ）に反応性を有する抗体で免疫染色した後、一次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ）で検出した。
【０２２０】
＜ｓｉＲＮＡ二重螺旋＞
ＭＳ４Ａ１２  ｍＲＮＡ配列（ＮＭ  ０１７７１６．１；配列番号：１）のヌクレオチド３４４−３６３（ｓｉＲＮＡ＃１、センス５'−ｒ（ＵＣＡ  ＵＧＧ  ＵＵＧ  ＧＡＵ  ＵＧＡ  ＵＧＣ  Ａ）ｄＴｄＴ−３'（配列番号：４）、アンチセンス５'−ｒ（ＵＧＣ  ＡＵＣ  ＡＡＵ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＵＧ  Ａ）ｄＴｄＣ−３'（配列番号：５））及びヌクレオチド２４７−２６６（ｓｉＲＮＡ＃２、センス５'−ｒ（ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＵ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＵ  Ａ）ｄＴｄＡ−３'（配列番号：７）、アンチセンス５'−ｒ（ＵＡＵ  ＵＵＣ  ＣＵＵ  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＧＵＵ  Ｇ）ｄＡｄＣ−３'（配列番号：８））を標的とする２つの個々のＭＳ４Ａ１２  ｓｉＲＮＡ二重螺旋（Ｑｉａｇｅｎ）を設計した。対照として非サイレンシングｓｉＲＮＡ二重螺旋（センス５'−ｒ（ＵＡＡ  ＣＵＧ  ＵＡＵ  ＡＡＵ  ＣＧＡ  ＣＵＡ  Ｇ）ｄＴｄＴ−５'（配列番号：９）、アンチセンス５'−ｒ（ＣＵＡ  ＧＵＣ  ＧＡＵ  ＵＡＵ  ＡＣＡ  ＧＵＵ  Ａ）ｄＧｄＡ−３'（配列番号：１０））を使用した。ＭＳ４Ａ１２サイレンシング研究のため、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、細胞に１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ二重螺旋を導入した。
【０２２１】
＜カルシウム造影＞
全ての緩衝液は１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。指示されたように、ＣａＣｌ２及びＳｒＣｌ２を最終濃度１ｍＭでバッファーに添加した。Ｃａ２＋フリー緩衝液は、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡを含有した。タプシガルジン、ＥＧＦ及びＬａ３＋を指示された濃度で使用した。ＦＬＩＰＲカルシウム３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して細胞のフルオロフォア標識を行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ−ＩＸ７１倒立顕微鏡及びＴＩＬＬｖｉｓＩＯＮソフトウェア（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使用して、細胞内カルシウムの変化を記録した。種々の試薬を灌流させながら５０セル超の視野の蛍光値を記録した。全てのアッセイを４検体ずつ行い、２回繰り返した。
【０２２２】
＜細胞増殖分析＞
ｓｉＲＮＡ二重螺旋を導入した２４時間後に、１×１０４セルを血清フリーの媒質中で１２時間培養した。媒質にＥＧＦ（５０ｎＭ）を補充し、４８時間後に、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用して、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組み込みを測定することにより、増殖を分析した。全てのアッセイを３検体ずつ行い、２回繰り返した。
【０２２３】
＜細胞周期分析＞
ｓｉＲＮＡ二重螺旋を導入した２４時間後に、１×１０５セルを血清フリーの媒質中で１２時間培養した。媒質にＥＧＦ（５０ｎＭ）を補充し、４８時間後に細胞を収集し、ＥｔＯＨ固定し、ヨウ化プロピジウムで染色して、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析した。細胞周期の異なる相の細胞をＦｌｏｗＪｏ（商標）（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して定量した。全てのアッセイを３検体ずつ行い、２回繰り返した。
【０２２４】
＜細胞遊走及びインビトロ侵襲アッセイ＞
８．０μｍ孔膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有するトランスウェルチャンバーで、種々の濃度のＥＧＦを伴う媒質中で培養された細胞を用いて細胞運動性（ケモキネシス）アッセイを行った。ｓｉＲＮＡ二重螺旋を導入した２４時間後に細胞を血清フリーの媒質中で１２時間培養し、４×１０４セルを上部チャンバーに添加した。上部及び下部双方のチャンバーが同等な濃度のＥＧＦ（５０、１０、２又は０．４ｎＭ）を含有した。２４時間後、膜の底側に遊走した細胞を氷冷メタノールに固定した。膜を切除し、顕微鏡スライドに載せ、蛍光顕微鏡用にＨｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ）に載置した。５つの無作為な視野の細胞（拡大率１００倍）を各膜に関して計数した。全ての実験を３検体ずつ行った。インビトロ侵襲アッセイ用に、血清フリーの媒質中１ｍｇ／ｍｌに希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌで上部チャンバーを調製した。ゲル化びため、チャンバーを３７℃で５時間インキュベートした。全てのアッセイを３検体ずつ行い、２回繰り返した。
【０２２５】
＜統計＞
腫瘍段階及びグレードを有する結腸癌試料における正規化されたＭＳ４Ａ１２  ｍＲＮＡ発現レベルの相関分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）でＫｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定を用いて行った。ＬｏＶｏ細胞の増殖、細胞周期の進行、遊走及び湿潤におけるＭＳ４Ａ１２サイレンシングの統計的有意性は、ｓｉＲＮＡ処理された細胞における効果を未処理細胞と比較してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）で不対ｔ検定を用い、ｓｉＲＮＡ処理された細胞における効果を未処理細胞と比較して計算した。
【０２２６】
［結果及び考察］
ゲノム規模のデータマイニング手法を結腸癌のモノクローナル抗体治療のための標的の検索に適用した。デジタルｃＤＮＡライブラリーサブトラクションに基づくアプローチにより、膜貫通ドメインと見なされる少なくとも４つの疎水性領域を伴うＣＤ２０タンパク質に構造的に類似し、結腸上皮細胞に精緻な特異性を有する分化遺伝子を発見した。かかる候補物質を引き続いてこの系列から誘導された癌における保存された発現に関して試験した。使用された検索基準に完全に適合するものをコンピュータースクリーニングし、ヒットしたものの１つがＭＳ４Ａ１２であった。この分子は、実際に、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、高親和性ＩｇＥ受容体β鎖（ＦｃεＲＩβ）（ＭＳ４Ａ２）及びＨＴｍ４（ＭＳ４Ａ３）のような構造的に関係する細胞表面タンパク質を含むＭＳ４Ａファミリーのメンバーである（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、Ｇｅｎｅ  ２６４：８７−９３（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：３５７−６８（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１１９−２７（２００１））。ＭＳ４Ａファミリーの大部分のメンバーは、造血性又はリンパ性細胞系列の分化遺伝子であることが以前に示されているが、これとは対照的に、ＭＳ４Ａ１２はかかる細胞では検出されていない（Ｌｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：３５７−６８（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１１９−２７（２００１））。
【０２２７】
どのヒト組織がＭＳ４Ａ１２を発現するかを決定するため、組織のタイプごとに５人までのドナーから、２７の異なる正常ヒト組織標本が包括的に準備され、特異的エンドポイント及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりプロファイリングされた。組織は、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲで可視的な増幅生成物がなかった場合において、全ての正常な非結腸組織試料における平均発現のカットオフ＋３ＳＴＤを超えないとき（９９％パーセンタイル値）は、陰性として分類された。ＭＳ４Ａ１２発現は、正常結腸粘膜に限局されることが見出された。全てのその他の正常組織では、転写物レベルは標準的な３５サイクルＲＴ−ＰＣＲの検出限界を下回り（図１Ａ、左）、微量のＭＳ４Ａ１２転写物のみが４０サイクルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの後に検出され（図１Ａ、右）、１／５精巣標本のみがわずかに発現カットオフを超えた（表１）。
【０２２８】
［表１］
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより型付けされた組織におけるＭＳ４Ａ１２の発現。２〜５人の異なる個体から得られた標本を正常組織型ごとに調査した。正常組織に関するカットオフは、結腸を除く正常組織における平均発現＋３ＳＴＤ（検出限界を１０倍超える相対発現）に設定した。腫瘍組織では検出限界を少なくとも１００倍超える発現値のみが陽性と採点された。
【０２２９】
【表１】
2011520781.tif 000002
【０２３０】
腫瘍標本のプロファイリングにより、４０のうち２５（６３％）の結腸癌がＭＳ４Ａ１２を発現することが示された。ｑＰＣＲにより測定されるような結腸癌試料におけるＭＳ４Ａ１２の発現の頻度を過大評価しないために、正常組織カットオフを少なくとも１０倍超える転写物レベルが陽性として分類された（表２）。
【０２３１】
［表２］
分析した結腸癌試料の特徴。ＭＳ４Ａ１２の組織学、ＵＩＣＣ臨床段階、等級（Ｇ）及び相対発現値。検出限界を少なくとも１００倍超える発現レベルを有する腫瘍試料のみを陽性とした。
【０２３２】
【表２】
2011520781.tif 000003
【０２３３】
試料集団内のＭＳ４Ａ１２の発現レベルは腫瘍段階又は腫瘍等級とは相関しなかった（ｐ＝０．６８及びｐ＝０．３６、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）。ＭＳ４Ａ１２は乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、腎細胞癌、悪性メラノーマ、肝細胞癌、白血病、頭頸部癌を含むいずれのその他のヒト腫瘍型でも検出されなかった（表１）。
【０２３４】
タンパク質発現の分析のため、ＭＳ４Ａ１２のＮ末端の６３のアミノ酸に対応する組換えにより発現されたポリペプチド（ＮＰ＿０６０１８６）に対して上昇させた、アフィニティー精製されたポリクローナルウサギ抗体（抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端）が使用された。抗体遺伝子の特異性を検証するため、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＭＳ４Ａ１２のサイレンシングを用いた。２つの個々のＭＳ４Ａ１２特異的ｓｉＲＮＡ二重螺旋を用いたＭＳ４Ａ１２発現結腸癌細胞系ＬｏＶｏのトランスフェクションにより、安定かつ再現性よく、９０％まで構成的ＭＳ４Ａ１２ｍＲＮＡ発現を低減させたが、スクランブルされた非サイレンシング対照二重螺旋では影響がなかった（図６）。この観察に合致して、ウェスタンブロットにおいて、ＬＯＶＯ細胞のライゼート中のＭＳ４Ａ１２の予測される大きさに従って検出されるおよそ３５ｋＤａのバンドは、完全に消失した（図１ｂ）。このことは、抗体が特異性を有することと、ＭＳ４Ａ１２タンパク質の発現が強力にノックダウンされたことを証明した。抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端を有する一次ヒト組織試料におけるＭＳ４Ａ１２タンパク質のウェスタンブロット染色により、結腸癌標本におけるＭＳ４Ａ１２タンパク質の発現が、正常組織で唯一ＭＳ４Ａ１２タンパク質を発現する正常結腸粘膜に匹敵するレベルであることが確認された。しかし、ＲＴ−ＰＣＲにより陰性と型付けされた組織では、ＭＳ４Ａ１２タンパク質の発現は確認されなかった。標本において上皮細胞部分が高いことの結果として、結腸癌に高いレベルのＭＳ４Ａ１２タンパク質が観察されることは、上皮細胞のマーカーであるサイトケラチン−１８（ＫＲＴ１８）に対する正規化により除外された。
【０２３５】
正常結腸粘膜上の抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端抗体での免疫組織化学により、正常結腸陰窩の上皮細胞の特徴的で明らかな頂端膜染色が認められた（図１Ｃ）。その他の胃腸管組織及び精巣から得られた切片では、これらの複合器官組織内に存在するより小さな亜集団がこのタンパク質をまさに発現することを除いて、ＭＳ４Ａ１２染色を検出することができなかった（図７）。結腸癌では新生物細胞集団のみが染色されたが、隣接する間質細胞及び非新生物性上皮細胞は陰性であった。さらなる細胞質免疫染色が観察されたが、腫瘍細胞の染色は細胞膜では明白に際立ち、ＭＳ４Ａ１２が細胞表面タンパク質であるという予測を立証した（Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１１９−２７（２００１））。染色した結腸癌試料の試験的なセットでは、同質の強い発現を有する腫瘍とともに、より異種性の弱い発現を有する標本が観察された（図１Ｃ）。
【０２３６】
ＣＤ２０の膜トポロジーは、ＭＳ４Ａファミリーの原型（プロトタイプ）の要素として広く特徴付けられている。ＣＤ２０は、細胞質性アミノ及びカルボキシ終端と、２つの細胞外ループを形成する４つの膜貫通ドメインとを有する２９７アミノ酸タンパク質である（Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０４：２６３５−４２（２００４））。ＭＳ４Ａファミリーメンバー間でかなりの配列同一性があるので（図８ａ）、その他のＭＳ４Ａタンパク質がＣＤ２０の表面局在及び特有のトポロジーを共有すると予測されている（Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１１９−２７（２００１））。ＣＤ２０ドメイン（ｐｆａｍ０４１０３）を有するＭＳ４Ａ１２タンパク質配列のアラインメントにより、アミノ酸レベルで４３％配列類似性が示された（図８Ｂ）。その他のＭＳ４Ａ１２ファミリーメンバーに関する報告に類似して、最初の３つの膜貫通ストレッチで最も高度な同一性が見出され（Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１１９−２７（２００１））、４回膜貫通トポロジーが予測された（図２Ａ）。細胞膜の位置は、ｅＧＦＰタグ化ＭＳ４Ａ１２構築物が導入されたＣＨＯ細胞の免疫蛍光顕微鏡により、実験的に確認された（図２Ｂ）。また、抗ＭＳ４Ａ１２／Ｎ末端抗体によりＭＳ４Ａ１２を構成的に発現するＬｏＶｏ結腸癌細胞が明確に細胞膜染色し、ＭＳ４Ａ１２のｓｉＲＮＡ誘起ノックダウン時にこれが喪失されることによって、さらに支持された（図２ｃ）。予測されたトポロジーを検証するため、ＣＨＯ細胞に、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでｅＧＦＰでタグ化されたＭＳ４Ａ１２構築物が導入され、ＰＦＡ固定の後、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した。Ｎ末端及びＣ末端双方に局在するｅＧＦＰは、サポニンでトランスフェクトされた細胞を透過処理した後のフローサイトメトリー分析によってのみ検出可能であったが（図２Ｄ）、抗体が細胞内への透過を害される条件下では検出されなかった。要約すると、これらのデータにより、Ｎ及びＣ末端の細胞内局在を有する予測されたトポロジーが支持されるとともにＭＳ４Ａ１２が細胞表面に局在することが支持される。
【０２３７】
ＣＤ２０はストア作動性Ｃａ２＋チャネル（ＳＯＣＣ）活性を保有することが示されているので（Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４２４２７−３４（２００３））、ＭＳ４Ａ１２もまた容量性のカルシウム流入にも関与し得ることが仮定された。ＭＳ４Ａ１２をコードするプラスミド又は対照として空のベクターのいずれかを導入したＣＨＯ細胞を小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の特異的阻害剤であるタプシガルジン（Ｔｇ）で処理して細胞内カルシウム貯蔵を枯渇させた（Ｔｈａｓｔｒｕｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２４６６−７０（１９９０））。Ｓｒ２＋流入は内因性及び外因性に発現されたＳＯＣチャネルを区別できる可能性があるので、Ｃａ２＋流入に加えてＳｒ２＋流入もまた試験した（Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４２４２７−３４（２００３）；Ｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１６４７−５１（２０００））。Ｃａ２＋感受性色素の蛍光検出により測定されるＣａ２＋レベルの基準値は、対照、及び、ＭＳ４Ａ１２発現ＣＨＯ細胞において同一であった（図３Ａ）。予測したように、双方の細胞系において、細胞外Ｃａ２＋の非存在下でＴｇははっきりと［Ｃａ２＋］ｃを増大した。多くは細胞膜での放出メカニズムのため、内部オルガネラに取り込まれることによって、［Ｃａ２＋］ｃは徐々に基準値レベルに戻った（Ｂｏｏｔｍａｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２：３−１０（２００１））。引き続くＳｒ２＋を用いた細胞の灌流は、ＭＳ４Ａ１２導入細胞においてかなりの蛍光増大を誘起した。これは、貯蔵枯渇に応答してＳｒ２＋の流入が生じたことを示唆している。ベクター導入細胞は、Ｓｒ２＋に応答しなかった。これは、内因性ＳＯＣチャネルが実験条件下でＳｒ２＋に対して不透過性であることを示している。貯蔵枯渇の前にＳｒ２＋流入が生じないことは、ＣＨＯ細胞のＭＳ４Ａ１２発現がＳｒ２＋に対する構成的透過性を付与しないことを示している。Ｓｒ２＋を取り除き、蛍光値が基準値に戻ってしまった後、Ｃａ２＋を灌流チャンバーに導入した。ベクター導入細胞にＣａ２＋が流入したことにより、Ｔｇ処理後にこれらの細胞が正常なＣａ２＋流入経路を維持していることが示された。ＭＳ４Ａ１２導入細胞へのカルシウム流入は、ベクター導入細胞で観察されたものを超えて有意に増大した。既知のＳＯＣチャネル遮断薬Ｌａ３＋で細胞を前処理することで、ＭＳ４Ａ１２導入細胞へのＣａ２＋流入は顕著に低減したが、対照細胞では、このような結果は全く検出されなかった（図３Ａ）。両細胞系におけるＳｒ２＋流入は、完全に無効にされた。まとめると、これらのデータにより、ＭＳ４Ａ１２は、ＳＯＣ流入経路を形成する能力、及び／又は、体系化する能力を有することが実証される。
【０２３８】
Ｃａ２＋フラックスは、受容体チロシンキナーゼの活性化に続く最も速い応答である（Ｍｕｎａｒｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：６７１−６（２００２）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３０：６８８−９７（２００５））。細胞膜上の受容体にＥＧＦのような成長因子が結合することにより、膜脂質を加水分解するホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）が活性化し、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を生成する。ＩＰ３はＥＲの膜に位置するＩＰ３受容体に結合し、細胞質へのＣａ２＋放出を刺激する。これが、順にＳＯＣ流入に関連付けられる。機能に関しては、Ｃａシグナルの延長が細胞成長などに重要な役割を果たすため、ＳＯＣ流入は、カルシウム伝達の主要な構成要素である（Ｂｅｒｒｉｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：６４５−８８（１９９８）；Ｂｅｒｒｉｄｇｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：１１−２１（２０００））。成長因子のシグナル伝達に応答したカルシウム流入におけるＭＳ４Ａ１２の役割を評価するため、高レベルの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現するＭＳ４Ａ１２陽性ＬｏＶｏ結腸癌細胞を使用した（Ｐａｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：２８９−９３（２００２））。上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いたＬｏＶｏ細胞の処置により、ＰＬＣγ依存してＳＯＣ流入が誘起されることが示されている（Ｍｕｎａｒｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：６７１−６（２００２）；Ｋｏｋｏｓｋａら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．４：１５０−６１（２０００）；Ｋｏｋｏｓｋａら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８８：９７−１０３（２０００）；Ｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１２：４７−５３（２００１））。ＭＳ４Ａ１２特異的ｓｉＲＮＡ又はスクランブルされた対照ｓｉＲＮＡを導入したＬｏＶｏ細胞は、Ｔｇ及び２つの異なる濃度のＥＧＦで処理された。基準の蛍光では、再度差異は検出されなかった。双方の細胞系で、Ｔｇ及びＥＧＦ双方においては、細胞外Ｃａ２＋の非存在下で明らかにに［Ｃａ２＋］ｃが増大した。しかしながら、ＭＳ４Ａ１２発現がノックダウンされた細胞では、ＳＯＣ流入が有意に害されたが、対照ｓｉＲＮＡ導入細胞ではＳＯＣ流入は害されなかった（図３Ａ、Ｃ）。双方の細胞系は、Ｌａ３＋で前処理することによりＳＯＣ流入が完全に阻害された。注目すべきことに、低濃度のＥＧＦ（２ｎＭ）で処理された細胞におけるＣａ２＋流入は、ＭＳ４Ａ１２サイレンシングによりほとんど完全に無効にされた。このデータに従って、ＬｏＶｏ細胞におけるＳＯＣ流入は少なくとも部分的にはＭＳ４Ａ１２により媒介された。ＭＳ４Ａ１２サイレンシング後に残留するＣａ２＋流入により、この細胞系におけるその他のＳＯＣＣの存在が示される。
【０２３９】
成長因子によって誘起されるシグナル伝達は、しばしば振動性パターンで体系化される（Ｍｕｎａｒｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：６７１−６（２００２））。反復性のカルシウムスパイクは、ＳＯＣＣを介する外部カルシウムの流入、及び、内部貯蔵からのカルシウム放出の双方を必要とする。これにより、休止細胞（Ｇ０）を再度細胞周期に入るように誘起する即初期遺伝子（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅｓ）を活性化する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １７：４９１−５００（１９９５））。最も興味深いことに、Ｃａ２＋流入阻害剤によりＳＯＣ流入を標的とする臨床試験では、ある癌の腫瘍成長阻止が観察される（Ｋｏｈｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６９−７３（１９９６）；Ｗａｓｉｌｅｎｋｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８：２５９−６４（１９９６））。そこで、ＥＧＦに応答したＬｏＶｏ細胞に及ぼすＭＳ４Ａ１２発現の影響力を評価した。ｓｉＲＮＡ媒介のＭＳ４Ａ１２のサイレンシングを有する細胞においては、対照細胞と比較して、成長因子に誘起される細胞増殖の有意な低減が観察された（図４Ａ）。細胞周期分析により、増殖遮断の根本の原因であるＭＳ４Ａ１２−ｓｉＲＮＡ導入細胞では、明確なＧ１／Ｓ抑止が示されたが（図４Ｂ）、細胞の生命力は影響されなかった。
【０２４０】
遊離の細胞質Ｃａ２＋を利用することにより厳格に調節される別の重要な細胞機能は、成長因子誘起細胞運動性及び遊走である（Ｂｅｒｒｉｄｇｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：１１−２１（２０００））。ＩｎｓＰ３が細胞内プールからＣａ２＋の放出を媒介することによって遊離細胞質Ｃａ２＋が増大すると、膜直下領域におけるアクチン細胞骨格が活性化され（Ｆｅｌｄｎｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２７２：９３−１０８（２００２））、これが細胞遊走の基本となる。成長因子が媒介する、ＬｏＶｏ細胞の運動性に及ぼすＭＳ４Ａ１２の影響力をトランスウェル遊走アッセイで調査した。装置の上部及び下部双方のチャンバーに種々の濃度のＥＧＦを添加することにより運動性（ケモキネシス）の基準値を評価した。ＭＳ４Ａ１２のノックダウンで運動性は有意に低減した（図５Ａ）。なお、細胞の化学侵襲活性は、Ｍａｔｒｉｇｅｌのバリアを突き破りＥＧＦグラジエントに沿って遊走する能力により測定され、ＭＳ４Ａ１２ノックダウンにより大いに影響を受け、実質的に害された（図５Ｂ）。興味深いことに、双方の細胞機能に及ぼすＭＳ４Ａ１２サイレンシングの影響力は、特に低濃度ＥＧＦに暴露された細胞において著しかった。ＭＳ４Ａ１２の発現により媒介されたＣａ２＋フラックスの増強により、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）経路の活性化に必要とされるＥＧＦの閾値濃度が低下する。
【０２４１】
まとめると、ＭＳ４Ａ１２の第１の機能的特徴付けを提示する。ＭＳ４Ａ１２は、ＳＯＣ流入の構成要素であり、結腸癌細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を調整することが示される。結腸細胞への発現の厳密な制限は、この組織のタイプにおけるＭＳ４Ａ１２の特殊化された役割を意味付ける。これは。さらにＥＧＦＲシグナル伝達の媒介に関与することにより支持される。それは腸上皮の連続性の発達及び維持に中心的な役割を有し、成長、治癒、接着及び細胞遊走のような種々の上皮細胞特性の制御に関与する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：１９３−２１６（１９７９）；Ｊｏｎｅｓら、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：３０３−９（１９９９）；Ｌａｃｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：７２−７（１９８８）；Ｔａｒｎａｗｓｋｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２７：１２−２０（１９９８））。これらの機能に関与するその他の成長因子及びペプチド（例えばＴＧＦα、腸トレフォイル因子）は全て、少なくとも部分的にＥＧＦＲ伝達経路を介して作用する（Ｇｉｒａｕｄ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：５０１−６（２０００））。一方、最も同族の受容体は上皮基底表面上にあるが、細胞保護的な三葉型ペプチドは粘膜の頂端表面に分泌される（Ｃｈｉｎｅｒｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１５：７７−８０（１９９５）；Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３２：１２２−６（１９９７））。頂端上皮単層におけるＭＳ４Ａ１２の発現を空間的に限定させることで、かかる因子の細胞保護的な作用に対するこれらの細胞の感受性をさらに高めるものと推測することができる。ＭＳ４Ａ１２発現は、悪性の形質転換時に維持され、結腸癌の有意な部分で検出することができる。ＥＧＦＲシグナル伝達のモジュレーターとしては、結腸癌における優性の腫瘍促進因子であるので、上記で記載されたｓｉＲＮＡデータにより支持されるように、ＭＳ４Ａ１２発現は、生存性、増殖及び運動性などの腫瘍表現型に寄与する特色に連関される。ＭＳ４Ａ１２の欠失により、かかるＥＧＦＲ依存性細胞機能を損なうが、ＭＳ４Ａ１２の発現により、ＥＧＦ誘発のＣａ２＋流入に関する閾値を下げるという観察は臨床的な影響力を有する。結腸癌患者のＭＳ４Ａ１２発現状態は、癌細胞のＥＧＦに対する感度及びその予後に影響を及ぼす。さらにエルビタックスのようなＥＧＦＲに対する抗体での処置に対する患者の応答は、その腫瘍のＭＳ４Ａ１２状態と相関すると予期される。
【０２４２】
さらにいくつかの知見により、ＭＳ４Ａ１２は、治療用抗体のための新規な標的候補物質として適している。
【０２４３】
第１に、ＭＳ４Ａ１２は、結腸上皮に高度に選択的な系列特異的マーカーであるため、その他の毒性に関連する正常組織に存在しない。正常結腸粘膜における発現に関わらず、結腸癌におけるｍＡｂを標的とする分化抗原は、正常粘膜に毒性の副作用を誘起することなく安全に投与することができ（Ｓｃｏｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：４８１０−７（２００５））、最も可能性が高いのは、結腸細胞の代謝回転が速くなり（Ｌｉｐｋｉｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４５：７２１−９（１９６３））、正常粘膜において抗体が蓄積するのを妨げるというものである。正常粘膜の最も頂端の領域におけるＭＳ４Ａ１２の発現パターンが空間的に狭くすることで、さらにＭＳ４Ａ１２を標的とする抗体の安全性が高められる。
【０２４４】
第２に、ＭＳ４Ａ１２発現は結腸癌の有意な部分で維持される。免疫組織化学による結腸癌標本の大規模分析により、ＭＳ４Ａ１２タンパク質発現の蔓延及び個体腫瘍標本におけるこの標的候補物質の均質性のさらなる評価が進行中である。
【０２４５】
第３に、ＭＳ４Ａ１２は表面分子であり、したがって抗体による新薬開発につながる可能性がある。他のＭＳ４Ａファミリーメンバーに対する配列類似性及び本発明者らの実験データにより、ＣＤ２０のようなＭＳ４Ａ１２は、２つの細胞外ループとともに細胞膜に組み込まれることが強く示唆される。この特定のトポロジーの結果から、（ｉ）抗原の脱落が防御される；（ｉｉ）細胞膜の小さな区域におけるｍＡｂの結合密度が高くなる；及び（ｉｉｉ）標的エピトープと細胞表面との間の距離が短い；ということである。これらの特徴は、ｍＡｂが細胞毒性免疫エフェクターメカニズムの効率的な補充を誘起する能力を増強すると報告されている（Ｂｉｎｄｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１５０７−１４（１９８８）；Ｂｏｒｓｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５０：５０５−６（１９６５）；Ｇｏｌａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：４４５−７（１９８２））。ＣＤ２０に対する構造類似性により、補体及びＦｃＲ陽性エフェクター細胞の補充を呈する抗体を操作できる可能性がある。ＥＧＦＲシグナル伝達との関連により、既に種々のｍＡｂ及び低分子化合物により対処されている経路にＭＳ４Ａ１２が位置付けられる。これらの治療のうちの多くが承認されるか、又は現在臨床開発が進んでおり、薬物標的としてのその魅力が高まっている。
【０２４６】
本明細書で提示されたデータにより特に、ＭＳ４Ａ１２が結腸癌において抗体標的としての治療的潜在能力を持つことが実証される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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