(57)【要約】  本発明は、クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合し及び／又はそれを溶解させることができる、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、誘導体又は融合体、及びそのフラグメント、バリアント、誘導体又は融合体がクロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージの天然リシンではないという条件で、それを製造する手段を提供する。本発明は、クロストリジウム・ディフィシレの細胞など細菌細胞を殺細胞し、それの感染に関連する疾患及び状態を診断、治療、そして予防する方法を更に提供する。本発明は、また、当該方法に使用するための診断キットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合し及び／又はそれを溶解させることができる、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、誘導体若しくは融合体。
【請求項２】
ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のバクテリオファージΦＣＤ１１９、バクテリオファージΦＣ２又はプロファージ１若しくは２のリシンではない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドであって、そのフラグメント、バリアント、誘導体又は融合体が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一性を示すポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、そのフラグメント、バリアント、誘導体又は融合体が、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージの天然リシンではないポリペプチド。
【請求項５】
クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項６】
クロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させることができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項７】
クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合し及び／又はそれを溶解させることができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列から成る、請求項８に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列のフラグメントを含み又はそれから成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離したポリペプチドであって、フラグメントが、配列番号１の少なくとも５０の隣接アミノ酸、例えば、配列番号１の少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０又は２６５の隣接アミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１２】
フラグメントが配列番号１の酵素（細胞溶解）ドメインを含み又はそれから成る、請求項１０又は１１に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１３】
フラグメントが配列番号１の細胞壁結合ドメインを含み又はそれから成る、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸配列のバリアント、又はそのフラグメントを含み又はそれから成る、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離したポリペプチドであって、バリアントが、配列番号１のアミノ酸配列、又はそのフラグメントに対して少なくとも６０％同一性、より好ましくは該配列に対して少なくとも７０％又は８０％又は８５％又は９０％同一性、そして最も好ましくは該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含み又はそれから成るポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１のアミノ酸配列の誘導体、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含み又はそれから成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸配列の融合体、又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体を含み又はそれから成る、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１のアミノ酸配列、又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体のＮ−及び／又はＣ−末端に挿入された１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸を含み又はそれから成る、請求項１７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１の細胞壁結合ドメイン及び配列番号１中のものと異なる酵素（細胞溶解）ドメインを含み又はそれから成る、請求項１７又は１８に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシレの複数株の細胞を溶解させることができる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが、バシラス種（例えば、バシラス・セレウス、枯草菌及び炭疽菌）、他のクロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・ソルデリ及びクロストリジウム・ビフェルメンタンス）及びリステリア種（例えば、リステリア・イバノビイ)の細胞から成る群から選択される1つ又はそれ以上の細胞型を溶解させることができる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが、クロストリジウム・レプツム、 クロストリジウム・ネキシル、クロストリジウム・コッコイデス、クロストリジウム・イノクーム、クロストリジウム・ラモスム及び／又はアネロコッカス・ヒドロジェナリスの細胞を溶解しない、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２３】
ポリペプチドがクロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞を溶解することができる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞に対して配列番号１のポリペプチドの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上の溶解活性を示す、請求項２３に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞に対して配列番号１のポリペプチドの少なくとも１００％、例えば、少なくとも、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、５００％又はそれ以上の溶解活性を示す、請求項２４に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが病原菌の細胞を選択的に溶解することができる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドが組み換えポリペプチドである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード化する単離した核酸分子。
【請求項２９】
核酸分子が配列番号２の核酸配列を含み又はそれから成る、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２８又は２９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３１】
ベクターが発現ベクターである、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
ベクターがｐＥＴ１５ｂ及びｐＡＣＹＣ１８４から成る群から選択される、請求項３０又は３１に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項２８又は２９に記載の核酸分子又は請求項３０又は３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞が請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現することができる、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が微生物細胞である、請求項３３又は３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞が細菌細胞である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
宿主細胞が非病原性である、請求項３５又は３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
宿主細胞が、大腸菌、ラクトコッカス種、バクテロイデス種、ラクトバシラス種、エンテロコッカス種及びバシラス種の細胞から成る群から選択される、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
宿主細胞が乳酸連鎖球菌細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
ポリペプチドを発現する条件下で請求項２８又は２９に記載の核酸分子、又は請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞集団を培養し、そこからポリペプチドを単離することを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項４１】
以下のもの：
（ａ）請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項２８又は２９に記載の核酸分子；
（ｃ）請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクター；
（ｄ）請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の宿主；及び／又は
（ｅ）本発明の第１の態様に記載のポリペプチドを発現することができるバクテリオファージ；
及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は医薬品添加剤を含む医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
経口投与のための、請求項４１又は４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
ポリペプチドがマイクロカプセル化された、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
ポリペプチドを胃腸管に送達することができる、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
請求項２８又は２９に記載の核酸分子及び／又は請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクターを含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現するように、そして胃腸管内の所定の場所に到達時に該ポリペプチドを放出するように、遺伝子組み換えした病原性細菌宿主細胞を含む、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現することができるバクテリオファージを含む、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
組成物が胃腸管内でポリペプチドの持続性又は徐放性放出を可能にする、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
医薬に使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
患者中の微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制するための薬剤の製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞が、クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項５３】
患者中の微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制に使用するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される、ポリペプチド又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージ。
【請求項５４】
患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態の治療又は予防のための薬剤製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項５５】
患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態の治療又は予防に使用するのための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される、ポリペプチド又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージ。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の使用であって、細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択される使用。
【請求項５７】
請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の使用であって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞が、クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項５８】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５９】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを患者に投与することを含む、患者中の微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制する方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法。
【請求項６１】
クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを患者に投与することを含む、患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態を治療又は予防する方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法。
【請求項６２】
請求項６０又は６１に記載の方法であって、細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択される方法。
【請求項６３】
請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法であって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法。
【請求項６４】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
インビトロ及び／又はエクスビボで微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項６７】
請求項６６に記載の使用であって、細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択される使用。
【請求項６８】
請求項６６又は６７に記載の使用であって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項６９】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７０】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを含む、試料中の微生物細胞の存在を検出するためのキットであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるキット。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキットであって、細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択されるキット。
【請求項７３】
請求項７１又は７２に記載のキットであって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるキット。
【請求項７４】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７５】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
ポリペプチドが表面に固定化されている、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７７】
試料が細胞試料である、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７８】
試料が微生物細胞による汚染の試験をするために表面から採取された拭い液由来である、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７９】
陰性対照試料を更に含む、請求項７１〜７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８０】
陽性対照試料を更に含む、請求項７１〜７９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される、微生物細胞に関連する疾患又は病態の診断薬の製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用。
【請求項８２】
クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される微生物細胞に関連する疾患又は病態診断に使用するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージ。
【請求項８３】
インビトロ及び／又はエクスビボで試料中の微生物細胞の存在を検出するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項８４】
請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の使用であって、細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択される使用。
【請求項８５】
請求項８１〜８４のいずれか１項に記載の使用であって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用。
【請求項８６】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８７】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを用いて試験するために患者の細胞試料を接触させ、そして試料中の細胞がそれにより溶解されるかどうかを測定することを含む、患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態を診断する方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法。
【請求項８９】
請求項８８に記載の方法であって、細胞溶解活性を有するポリペプチドが以下のもの：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０のプロファージ１及び２のリシン；
から成る群から選択される方法。
【請求項９０】
請求項８８又は８９に記載の方法であって、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドが請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法。
【請求項９１】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞である、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、単離したポリペプチド。
【請求項９４】
実質的に実施例に関連した本明細書に記載した通りの単離した核酸分子。
【請求項９５】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りのベクター。
【請求項９６】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの宿主細胞。
【請求項９７】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、請求項１〜２７のいずれか１項に記載したポリペプチドを製造する方法。
【請求項９８】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、医薬組成物。
【請求項９９】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制するためのポリペプチドの使用。
【請求項１００】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、微生物細胞に関連する疾患又は病態を治療又は予防するための薬剤製造におけるポリペプチドの使用。
【請求項１０１】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、試料中の微生物細胞の存在を検出するためのキット。
【請求項１０２】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、微生物細胞に関連する疾患又は病態の診断薬の製造におけるポリペプチドの使用。
【請求項１０３】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載した通りの、試料中の微生物細胞の存在を検出するためのポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium  difficile）のバクテリオファージからのエンドリシン由来新規ポリペプチド及びそれをコードする核酸分子、並びにその組成物に関する。本発明は、クロストリジウム・ディフィシレなどの微生物細胞に関連する病態及び疾患の診断及び治療における当該ポリペプチド及び核酸分子の使用をも提供する。特に、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージΦＣＤ２７由来エンドリシン活性を有する新規ポリペプチド及びその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシレに関連する高まりつつある問題、特に、抗生物質使用にしばしば関連する院内感染におけるその役割は十分裏付けられている（非特許文献１）。Ｃ.ディフィシレは、加熱、乾燥及び消毒剤に耐性を有する胞子形成能を有する嫌気性グラム陽性菌である。非塩素系の洗浄剤への露出は、実際に胞子形成を増加させるという幾つかの証拠がある。これらの特性は、この生物が病院環境中に生き残る能力に寄与し、それにより患者に感染する能力を有する病原体の貯蔵庫を維持する。Ｃ.ディフィシレ関連疾患（ＣＤＡＤ）は、その増大する速度及び深刻さの双方を伴い、ＵＫにおいても世界的にも高まりつつある問題である。イングランド及びウェールズでは、Ｃ.ディフィシレに関連する死亡が１９９９年の９７５人から２００４年の２，２４７人まで増加した。ＣＤＡＤの届出は、１９９９年の１０００人から２０００年の１５，０００人、そして２００３年の３５，５００人まで増加した(非特許文献２)。上記のヒトの健康への脅威に加えて、Ｃ.ディフィシレが、動物、特に子ウシ及びヒツジなどの家畜における罹患及び死亡の重大な原因でもあることを銘記すべきである。従って、ヒトにおけるこの問題に対処する方法に関する本明細書での開示は、同様に家畜対象にも当てはまると読み取るべきである。
【０００３】
特に重大な進展は、当初カナダとＵＳＡにおける、しかし現在はＵＫと幾つかの他のヨーロッパ諸国で著しい、Ｃ.ディフィシレの高毒性株の出現である。Ｃ.ディフィシレリボタイプ０２７と特定されたこの新菌株は、１７４例及び１９名の死亡にかかわる大流行において２００３年にＵＫで検出された。２００６年までに７５の病院からＣ.ディフィシレリボタイプ０２７の４５０の別のＵＫ分離株が認められた（非特許文献１）。
【０００４】
Ｃ.ディフィシレは土壌及び動物の腸管に広く分布している。それは、３％のヒト成人並びに８０％の健常新生児及び小児の便から培養することができる（非特許文献１）。病原性能力は、Ｃ.ディフィシレの強力な毒素を産生する能力に関連する；２つの主要な特徴的毒素は、３０８ｋＤａの外毒素の毒素Ａ（ＴｃｄＡ）及び２７０ｋＤａの細胞毒素の毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）であり、これらはアミノ酸レベルで６３％の相同性を共有する（非特許文献３）。これらの毒素をコード化する遺伝子は、病原性島ＰａＬｏｃ（非特許文献４）に関係し、そして菌株はこれらの２つの毒素を産生するそれらの能力の点で異なる。他の毒性因子も関与していると考えられ、そして別の２成分系毒素ＣＤＴが明らかにされている（非特許文献５、６）。
【０００５】
毒性Ｃ.ディフィシレ株の病原性能力は、胃腸管（ＧＩＴ）ミクロフローラが損なわれ又はアンバランスになっている場合に成り立ち、そしてこれは抗生物質治療の一般的な帰結である。このように、病院環境はヒトの病気を蔓延させ引き起こすＣ.ディフィシレの理想的な環境である（非特許文献１）。
【０００６】
ＣＤＡＤは、Ｃ.ディフィシレの病原性株が十分強い地位をＧＩＴミクロフローラ内で
獲得すると起こり、宿主上皮を損傷する１つ又は複数の毒素を産生する。ＧＩＴミクロフローラは病原性微生物に対する重要なバリアであり、宿主と有利な様式で相互作用しながらホメオスタシス平衡に維持される、凡そ５００から１０００の異なる種の複合群落を形成する。古典的な抗生物質治療は、程度の差はるが無差別的であり、それはＧＩＴの微生物群落の微妙なバランスを損なう可能性がある。従来の抗生物質治療又は他の要因の結果として、正常なミクロフローラの破壊はＣＤＡＤの発症の主な要因である。
【０００７】
それ故、複合ＧＩＴミクロフローラの保護能力を損傷しない、Ｃ.ディフィシレの制御に対する新しい処置法及び取り組み方法の必要性が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kuijper, E. J., Coignard, B. & Tull, P. (2006) Clin Microbiol Infect 12 Suppl 6, 2-18.
【非特許文献２】Anonymous (2006) Health Statistics Quarterly 30, 56-60.
【非特許文献３】Rupnik, M., Dupuy, B., Fairweather, N. F., Gerding, D. N., Johnson, S., Just, I., Lyerly, D. M., Popoff, M. R., Rood, J. I., Sonenshein, A. L., Thelestam, M., Wren, B. W., Wilkins, T. D. & von Eichel-Streiber, C. (2005) J Med Microbiol 54, 113-7.
【非特許文献４】Braun, V., Hundsberger, T., Leukel, P., Sauerborn, M. & von Eichel-Streiber, C. (1996) Gene 181, 29-38.
【非特許文献５】Goncalves, C., Decre, D., Barbut, F., Burghoffer, B. & Petit, J. C. (2004) J Clin Microbiol 42, 1933-9.
【非特許文献６】Popoff, M. R., Rubin, E. J., Gill, D. M. & Boquet, P. (1988) Infect Immun 56, 2299-306.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第１の態様は、クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合し及び／又はそれを溶解させることができる、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、誘導体若しくは融合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
下記のアミノ酸配列は、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージΦＣＤ２７の野生型（即ち、天然産）エンドリシンの配列である。
【化１】
2011504366.tif 000003
【００１１】
ＮＣＢＩ受入番号ＹＰ＿００２２９０９１０及びＡＣＨ９１３２５をも参照されたい。
【００１２】
１つの実施態様では、ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレ（ΦＣＤ２７以外の）のバクテリオファージの天然リシンではない。従って、本発明の第１の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含み又はそれから成る単離したポリペプチド、及びその非天然型フラグメント、バリアント、誘導体若しくは融合体を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、遺伝的にコード化された２０の標準アミノ酸及びそれらの対応する「Ｄ」型の立体異性体（天然の「Ｌ」型と比較して）、ω−アミノ酸及び他の天然アミノ酸、特殊アミノ酸（例えば、α，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）並びに化学誘導アミノ酸（下記を参照）を含む。
【００１４】
従って、アミノ酸を、「アラニン」又は「Ａｌａ」又は「Ａ」のように特別に羅列する場合、この用語は特に明示しない限りＬ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がそのポリペプチドにより保持される限り、他の特殊アミノ酸も本発明のポリペプチドの好適な成分であり得る。例示したペプチドに対して、コード化されたアミノ酸残基は、それぞれ、必要に応じて標準アミノ酸の慣用名に対応する単一文字記号表示によって表わされる。
【００１５】
好ましくは、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体は、Ｌ−アミノ酸を含み又はそれから成る。
【００１６】
「単離した」により、本発明のポリペプチド、特にバクテリオファージΦＣＤ２７の野生型エンドリシンが天然に見出されるもの以外の形態で提供されることを意味する。好ましくは、ポリペプチドはインタクトバクテリオファージを含まないで提供される。
【００１７】
１つの実施態様では、単離した形態で与えられるバクテリオファージΦＣＤ２７［配列番号１］の天然エンドリシンである。
【００１８】
先行技術において公知のクロストリジウム・ディフィシレバクテリオファージの他の天然リシンは、本発明の第１の態様に包含されない。特に、クロストリジウム・ディフィシレバクテリオファージの以下のリシンは、本発明の第１の態様の範囲から明確に除外される：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン（lysin）；
（ｂ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｃ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のプロファージ１及び２のリシン。
【００１９】
例えば、以下の公知のタンパク質（それらのＮＣＢＩ受入番号を参照することにより定義される）：
ＰｈｉＣ２推定エンドリシン：          ＹＰ＿００１１１０７５４；
ＣＤ６３０ファージエンドリシン：      ＹＰ＿００１０８７４５３；
ｐｈｉＣＤ１１９推定リシン：          ＹＰ＿５２９５８６；
ＱＣＤ−３２ｇ５８仮想タンパク質：    ＺＰ＿０１８０３３９８；
ＱＣＤ−３２ｇ５８仮想タンパク質：    ＺＰ＿０１８０３２２８；
は、本発明の第１の態様の範囲から明確に除外される。
【００２０】
１つの実施態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から成ることができる。
【００２１】
しかしながら、本発明の第１の態様は、クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合し及び／又はそれを溶解させることができる配列番号１のアミノ酸のフラグメント、バリアント、誘導体及び融合体にも及ぶ。
【００２２】
「クロストリジウム・ディフィシレの細胞に特異的に結合することができる」により、ポリペプチドがクロストリジウム・ディフィシレの細胞に優先的に結合することができることを意味する。しかし、当然のことながら、当該ポリペプチドは１つ又はそれ以上の更なる細胞型にも優先的に結合することができる。好ましくは、クロストリジウム種の細胞に排他的に結合する。当該細胞結合活性は、当技術分野で周知の方法を用いて測定することができる。
【００２３】
「クロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させることができる」により、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、誘導体若しくは融合体が、バクテリオファージΦＣＤ２７の野生型エンドリシンが細菌性細胞を溶解させる能力（少なくとも一部）を保持することを意味する。当然のことながら、当該溶解活性は、全細胞型に対する非特異的細胞毒性活性よりむしろ細胞特異的（例えば、クロストリジウム・ディフィシレの細胞に対して）であるべきである。当該細胞溶解活性は、以下の実施例に詳述される方法（Loessner et al. [37]をも参照されたい、その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている）など当技術分野で周知の方法を用いて測定することができる。好ましくは、ポリペプチドがクロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させる能力は新鮮細胞を用いて測定される。
【００２４】
好ましい実施態様では、ポリペプチドがクロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させる能力は、１１２０４菌株の細胞を用いて測定される。
【００２５】
当業者には当然のことながら、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、誘導体若しくは融合体は、細菌細胞を溶解させるバクテリオファージΦＣＤ２７の野生型エンドリシンの全能力を保持する必要はない。むしろ、該ポリペプチド、フラグメント、バリアント、誘導体又はその融合体は、細菌細胞を溶解するバクテリオファージΦＣＤ２７の野生型エンドリシンのただ単に少なくとも１０％の能力を保持する必要があるだけである。しかしながら、好ましくは、ポリペプチド、フラグメント、バリアント、誘導体又はその融合体は、少なくとも２０％の、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％又はそれ以上の、細菌細胞を溶解させるバクテリオファージΦＣＤ２７の野生型エンドリシンの能力を示す。
【００２６】
それ故に、本発明の第１の態様の実施態様では、ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させることができる、配列番号１のアミノ酸配列のフラグメントを含み又はそれから成る。
【００２７】
多くのバクテリオファージ・エンドリシンが２つの異なるドメイン（例えば、Sheehan et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 140:23-28を参照されたい、その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている）から成ることは十分立証されている。１つは細胞壁分解に関与する触媒ドメインであり、これらは幾つかの異なる形態で存在することが知られている。他のドメインは、細胞表面モチーフを認識する細胞壁結合ドメインであり、その標的細胞へのエンドリシンの付着を可能にする。
【００２８】
酵素ドメインは、同じタイプの溶解活性を共有する溶菌酵素の他の類似領域に対するそのアミノ酸相同性によって同定することができる。バクテリオファージΦＣＤ２７のエンドリシンの場合、酵素ドメインはＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼと同定されており、それはエンドリシンのアミノ末端領域を占有する（これは公知酵素ドメインによる配列番号1の並列解析によって、例えば、ＮＣＢＩＣＤＤ検索ツールを用いて確認することができる；Marchler-Bauer & Bryant, 2004, Nuc. Acids Res. 32[W]:327-331を参照されたい。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている）。細胞壁結合ドメインは、エンドリシンのカルボキシ末端領域を占有すると考えられる。
【００２９】
１つの実施態様では、酵素ドメインは配列番号１の１から１７５のアミノ酸内に含まれる。従って、酵素ドメインを含むフラグメントは、アミノ酸１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００のいずれかから開始し、そしてアミノ酸１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０又は１０５のいずれかで終了する配列番号１の配列から成ると考えられる。例えば、酵素ドメインを含むフラグメントは、配列番号１の１０から１４０までのアミノ酸、又は配列番号１の２５から１５５までのアミノ酸、又は上記の開始及び終点の他の可能な順列のいずれかからなると考えられる。
【００３０】
１つの実施態様では、細胞壁結合ドメインは配列番号１の１７５から２７０のアミノ酸内に含まれる。従って、細胞壁結合ドメインを含むフラグメントは、アミノ酸１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０のいずれかから開始し、そしてアミノ酸２７０、２６５、２６０、２５５、２５０、２４５、２４０、２３５、２３０又は２２５のいずれかで終了する配列番号１の配列から成ると考えられる。例えば、細胞壁結合ドメインを含むフラグメントは、配列番号１の１９５から２６５までのアミノ酸、又は配列番号１の１８０から２４０までのアミノ酸、又は上記の開始及び終点の他の可能な順列のいずれかからなると考えられる。
【００３１】
本発明の第１の態様のポリペプチドは、好ましくは酵素ドメイン及び細胞壁結合ドメインの両方に対応する、配列番号１のアミノ酸配列の１つ又はそれ以上のフラグメントを含み又はそれから成る。
【００３２】
しかしながら、当業者には当然のことながら、配列番号１の細胞壁結合ドメインは、代わりにクロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させることができる別の起源からの酵素（溶解）ドメインに融合するか又はそうでなければ結合してもよい。キメラ的なリシンの製造は、Sheehan et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 140:23-28に記載されており、その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている。従って、別の実施態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、細胞壁結合ドメインに対応する配列番号１のアミノ酸配列の１つ又はそれ以上のフラグメントを含み又はそれから成ることができる。
【００３３】
フラグメントは、配列番号１の少なくとも５０の隣接アミノ酸、例えば、配列番号１の、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０又は２６５の隣接アミノ酸を含み又はそれから成ることができる。
【００３４】
別の実施態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレの細胞を溶解させることができる、配列番号１のアミノ酸配列のバリアント、又はそのフラグメントを含み又はそれから成ることができる。
【００３５】
ポリペプチドの「バリアント」により、配列番号１のアミノ酸配列に関連して保存性であれ又は非保存性であれ、挿入、欠失及び／又は置換を含む。特に、バリアントポリペプチドは、非天然バリアントであってもよい。
【００３６】
例えば、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性、より好ましくは該配列に対して少なくとも７０％又は８０％又は８５％又は９０％の同一性、そして最も好ましくは該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３７】
当然のことながら、上記の配列同一性は配列番号１のアミノ酸配列の全長にわたり、又はその一部にわたってもよい。しかしながら、好ましくは、配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも５０のアミノ酸にわたり、例えば、その中の少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０又はそれ以上のアミノ酸にわたる。
【００３８】
同一性パーセントは、当技術分野で周知の方法、例えば、ExPASyファシリティウェブサイトでのLALIGNプログラム（Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357、その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている) :
www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html
を用いて、パラメーターとしてグローバルアラインメントオプション、スコアリングマトリックススBLOSUM62、開口ギャップペナルティ−１４、拡張ギャップペナルティ−４を用いて測定することができる。
【００３９】
或いはまた、２ポリペプチド間の配列同一性パーセントは、適切なコンピュータプログラム、例えば、AlignX, Vector NTI Advance 10 (Invitrogen Corporationから) 又はＧＡＰプログラム（University of Wisconsin Genetic Computing Groupから）を用いて測定してもよい。
【００４０】
当然のことながら、同一性パーセントは、その配列が最適にアラインメントされているポリペプチドに関して計算される。
【００４１】
配列番号１のアミノ酸配列のフラグメント及びバリアントは、当技術分野で周知のタンパク質工学及び部位特異的変異誘発の方法を用いて作製されてもよい（例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition（「分子クローニング：実験室マニュアル第３版」）, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている）。
【００４２】
当業者には当然のことながら、本発明のポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント若しくは融合体は、修飾又は誘導体化された１つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでもよい。従って、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の誘導体、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含み又はそれから成ることができる。
【００４３】
１つ又はそれ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能性側鎖基との反応により得ることができる。当該誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するそれらの分子を含む。遊離カルボキシル基は、誘導体化して塩、メチル及びエチルエステル又は他のタイプのエステル及びヒドラジドを形成してもよい。遊離のヒドロキシル基は、誘導体化してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。化学誘導体としては、２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むそれらのペプチドも含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換してもよい；５−ヒドロキシリジンは、リジンと置換してもよい；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換してもよい；ホモセリンはセリンと、そしてオルニチンはリジンと置換してもよい。誘導体は、また、必要活性が維持される限り、１つ又はそれ以上の付加又は欠失を含むペプチドをも含む。含まれる他の修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンによる）、などの末端修飾である。
【００４４】
当業者には更に当然のことながら、ペプチド模倣的化合物も有用であり得る。従って、「ポリペプチド」により、エンドリシン活性を呈するペプチド模倣的化合物を含む。用語「ペプチド模倣的」は、治療薬として特定のポリペプチドの立体配座及び所望の特徴を模倣した化合物を指す。
【００４５】
例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって結合される分子だけでなく、ペプチド結合が逆向きの分子も含む。当該逆反転ペプチド模倣体は、当技術分野で公知の方法、例えば、Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載の方法などを用いて作製してもよく、その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている。ＣＯ−ＮＨの代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含む当該逆反転ペプチド模擬体は、タンパク質分解に対して更にいっそう抵抗性である。或いはまた、本発明のポリペプチドは、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、通常のアミド結合の代わりに−γ（ＣＨ2ＮＨ）−結合によって結合したペプチド模倣的化合物であってもよい。
【００４６】
当然のことながら、ポリペプチドは、細胞外タンパク質分解消化に対する感受性を低減するのを助けるために、そのＮ−又はＣ−末端において、例えば、アミド化により都合よくブロックしてもよい。
【００４７】
上記のように、Ｄ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの様々な非コード又は修飾アミノ酸は、本発明のポリペプチドを修飾するのに使用してもよい。加えて、推定生物活性立体配座は、環化などの共有結合修飾により、又はラクタムの組み込み若しくは他のタイプの架橋によって安定化してもよい。ジスルフィド、スルフィド及びアルキレン架橋を含む、環状ホモデチックペプチド及び環状ヘテロデチックペプチドの合成方法は、米国特許第５６４３８７２号に開示されている。環化方法の他の例は、米国特許第６００８０５８号にて検討され開示されており、それらの文書における関連開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている。環状の安定化ペプチド模倣的化合物の合成への更なる取り組みは、閉環メタセシス（ＲＣＭ）である。
【００４８】
要約すれば、周知のような末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を低減させ、その結果、溶液中、特にプロテアーゼが存在すると考えられる生体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチド環化は、また、有用な修飾であり、環化によって形成される安定構造に因りそして環状ペプチドで認められる生物活性の点で好ましい。
【００４９】
従って、１つの実施態様では、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体は環状である。しかしながら、好ましい実施態様では、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体は線状である。
【００５０】
本発明の第１の態様の更なる実施態様では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列の融合体、又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体を含み又はそれから成る。
【００５１】
ポリペプチドの「融合体」は、その他のポリペプチドに融合したポリペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の内部に及び／又はＮ−及び／又はＣ−末端に挿入された１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸、又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体を含んでもよい。
【００５２】
従って上記のように、１つの実施態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、異なる起源の酵素ドメインがそれに融合した、細胞壁結合ドメイン（又はその細胞壁結合活性を保持するようなドメイン配列のバリアント）から成る配列番号１のフラグメントを含む。
【００５３】
他の好適な酵素ドメインの例は：
Ｌ−アラノイル−Ｄ−グルタミン酸エンドペプチダーゼ；Ｄ−グルタミル−ｍ−ＤＡＰエンドペプチダーゼ；ペプチド間架橋特異的エンドペプチダーゼ；Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（＝ムラモイルヒドロラーゼ）；Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ムラミダーゼ（＝リゾチーム）；溶菌性トランスグリコシラーゼを含む。
【００５４】
また、他の起源からのＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼも利用可能である（Loessner, 2005, Current Opinion in Microbiology 8: 480-487を参照されたい。その開示内容は参照することにより本明細書に組み入れられている）。
【００５５】
例えば、該ポリペプチドは、該ポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はタンパク質Ａのようなポリペプチドに融合してもよい。当該融合体の例は当業者に周知である。同様に、該ポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴヒスチジンタグに、又は周知のＭｙｃタグエピトープなどの抗体によって認識されるエピトープに融合してもよい。該ポリペプチドのいずれのフラグメント、バリアント又は誘導体に対する融合体も、本発明の範囲内に含まれる。当然のことながら、所望の特性、即ち、エンドリシン活性を保持する融合体（又はそのバリアント若しくは誘導体）が好ましい。融合体が本明細書に記載の方法に使用するのに好適なものであれば、それも特に好ましい。
【００５６】
例えば、融合体は、本発明の該ポリペプチドに所望の特性を賦与する更なる部分を含んでもよい；例えば、その部分はポリペプチドを検出又は単離し、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進し、又は細胞からのタンパク質の分泌を導くのに有用と考えられる。その部分は、当業者に周知の、例えば、ビオチン部分構造、放射性部分構造、蛍光部分構造、例えば、小分子蛍光プローブ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光プローブであってもよい。その部分構造は、当業者に周知の免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであってもよく、又は当業者に周知の、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進することができる親油性分子若しくはポリペプチドドメインであってもよい。
【００５７】
当業者には当然のことながら、本発明のポリペプチドは、また、上記ポリペプチドの薬学的に許容される酸又は塩基付加塩をも含む。本発明において有用な、上記の塩基化合物の薬学的に許容される酸付加塩を製造するために使用される酸は、非毒性酸付加塩、即ち、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酸性酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びとりわけ、パモエート[即ち、１，１′−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）]塩などの、薬学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成する酸である。
【００５８】
薬学的に許容される塩基付加塩も、また、ポリペプチドの薬学的に許容される塩の形態を生成するために使用してもよい。本来酸性の本発明化合物の、薬学的に許容される塩基塩を製造する試薬として使用してもよい化学塩基は、当該化合物と非毒性塩基塩を形成する塩基である。当該非毒性塩基塩は、アルカリ金属カチオン(例えば、カリウム及びナトリウム)及びアルカリ土類金属カチオン(例えば、カルシウム及びマグネシウム)、Ｎ−メチルグルカミン(メグルミン)などの、アンモニウム又は水溶性アミン付加塩、並びに、とりわけ、薬学的に許容される有機アミンの低級アルカノールアンモニウム及び他の塩基塩などの当該薬学的に許容されるカチオンから由来する塩を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体は、また、貯蔵のために凍結乾燥し、そして使用前に好適な担体中に再構成することもできる。いずれの好適な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）及び／又は再構成方法も採用することができる。当業者には当然のことながら、凍結乾燥及び再構成は様々な程度の活性ロスをもたらし、そした使用レベルはそれを補うために上方へ調整しなければならない。好ましくは、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチドは、再水和した場合、その活性（凍結乾燥する前）の、最高で約２０％、又は最高で約２５％、又は最高で約３０％、又は最高で約３５％、又は最高で約４０％、又は最高で約４５％、又は最高で約５０％を失う。
【００６０】
本発明のポリペプチドの本質的な特徴は、クロストリジウム・ディフィシレの細胞の溶解能力である。好ましくは、ポリペプチドはクロストリジウム・ディフィシレの複数の株の細胞を溶解することができる。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のΦＣＤ２７リシンによって溶解するクロストリジウム・ディフィシレの１つ又はそれ以上の菌株を溶解することができる（下の表１を参照）。
【００６１】
当然のことながら、本発明のポリペプチドは、また、バシラス種（例えば、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、枯草菌及び／又は炭疽菌）、他のクロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridium bifermentas））及び／又はリステリア種（例えば、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）)など他の細菌種の細胞を溶解することができる。
【００６２】
１つの実施態様では、本発明のポリペプチドは、健常な腸生理を維持するのに有用な細菌を実質的に溶菌することができない。例えば、ポリペプチドが、クロストリジウム・レプツム（Clostridium leptum）、 クロストリジウム・ネキシル（Clostridium nexile）、クロストリジウム・コッコイデス（Clostridium coccoides）、クロストリジウム・イノクーム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモスム（Clostridium ramosum）及び／又はアネロコッカス・ヒドロジェナリス（Anaerococcus hydrogenalis）の細胞を溶解しない場合、それは有益である。
【００６３】
最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、カナダ、ＵＳ及び現在全ヨーロッパで出現しているクロストリジウム・ディフィシレの高病原性株である、クロストリジウム・ディフィシレ株リボタイプ０２７の細胞を溶解することができる。例えば、ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞に対して、配列番号1のポリペプチドの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上の溶解活性を示すことができる。ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞に対して、配列番号1のポリペプチドより大きい溶解活性、例えば、少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、５００％又はそれ以上の溶解活性さえも示すことができる。
【００６４】
有利なことには、ポリペプチドは、病原性細菌の細胞を選択的に、即ち、非病原性細菌よりも大幅に溶解させることができる。
【００６５】
本発明の第１の態様において使用するポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体の製造方法は、当技術分野で周知である。好都合なことには、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体は、組み換えポリペプチドであり又はそれを含む。
【００６６】
このように、ポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体をコード化する核酸分子（又はポリヌクレオチド）は、好適な宿主及びそれから得られるポリペプチドに発現することができる。当該組み換えポリペプチドの好適な生産方法は、当技術分野で周知である（例えば、Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition（「分子クローニング、実験室マニュアル、第３版」）, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。その文書の関連する開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている）。
【００６７】
簡潔にいうと、発現ベクターは、適切な宿主内で核酸分子によりコード化されるポリペプチドを発現することができる核酸分子を含んで、構成することができる。
【００６８】
核酸分子、特にＤＮＡを、例えば、相補的凝集性末端経由で、操作可能的にベクターに結合する様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域は、ベクターＤＮＡに挿入するようにＤＮＡセグメントに付加することができる。次いで、ベクター及びＤＮＡセグメントは、相補的ホモポリマーの尾部間で水素結合により接続し、組み換えＤＮＡ分子を形成する。
【００６９】
１つ又はそれ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターへ接続する代替法を提供する。例えば、エンドヌクレアーゼ制限消化により生成するＤＮＡセグメントは、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性を有する突出３′−１本鎖末端を除去し、そしてそれらのポリメラーゼ活性を有する陥凹３′−末端を埋める酵素である、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理される。
【００７０】
従って、これらの活性の組み合わせは平滑末端ＤＮＡセグメントを産生する。次いで、平滑末端セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒することができる酵素の存在下に、大過剰モルのリンカー分子とインキュベートされる。このように、反応の生成物は、それらの末端に高分子リンカー配列を持っているＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは好適な制限酵素により切断され、そしてＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を生成する酵素で切断されている発現ベクターに連結される。
【００７１】
ＤＮＡ（又はレトロウイルスベクター、ＲＮＡ）は、次いで、好適な宿主に発現してポリペプチドを産生する。このように、ポリペプチドをコード化するＤＮＡは公知の方法に従って使用され、本明細書に含まれる教示を勘案して適切に修正されて発現ベクターを構築し、そのベクターは、次いで、本発明の化合物又はその結合部分を発現及び産生するように、適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。当該技術は当技術分野で周知である。
【００７２】
ポリペプチドをコード化するＤＮＡ（又はレトロウイルスベクターの場合には、ＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために多種多様な他のＤＮＡ配列に結合してもよい。相手のＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入様式、及びエピソームの保持又は統合が求められるかどうかによって決まる。
【００７３】
一般的に、ＤＮＡは、適正な方向に及び発現のための正しいリーディングフレームにおいて、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合し得るが、当該制御は一般的に発現ベクター中で実現可能である。次いで、ベクターは標準的方法を介して宿主に導入される。一般的に、全ての宿主がベクターにより形質転換されるわけではない。従って、形質転換宿主細胞を選択する必要性がある。１つの選択方法は、抗生物質耐性などの、形質転換細胞中の選択可能な形質をコードするあらゆる必要な制御要素によって、発現ベクターにＤＮＡ配列を組み込むことを含む。或いはまた、当該選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される別のベクター上にあり得る。
【００７４】
発現ベクターにより形質転換されている宿主細胞は、次いで、十分な時間そしてポリペプチドの発現を可能にする本明細書に開示の教示に照らして当業者に公知の適切な条件下で培養し、次いでこれを回収することができる。
【００７５】
多くの発現系が知られており、細菌（大腸菌、枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ）、糸状菌（例えば、アスペルギルス）、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。
【００７６】
代表的なベクターは、典型的には、ベクターが他の非原核生物細胞型における発現に使用される場合でも、原核生物中の増殖のためのＣｏｌＥ１複製起点（ori）などの原核生物レプリコンを含む。ベクターは、また、それによって形質転換した大腸菌などの細菌性宿主細胞における遺伝子の発現（転写及び転座）を導くことができる、原核生物プロモーターなどの適切なプロモーターをも含むことができる。
【００７７】
代表的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA) から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びPharmacia（Piscataway, NJ, USA） から入手できるｐＴｒｃ９９及びｐＫＫ２２３−３である。
【００７８】
代表的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway（NJ, USA） から入手できるｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を推進するＳＶ４０後期プロモーターを用いるが、発現の最高レベルはＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞において、見出されている。
【００７９】
誘導型哺乳動物ベクターの例は、Pharmaciaから同様に入手できるｐＭＳＧである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を推進するために、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスの長い末端反復のグルココルチコイド誘導プロモーターを用いる。
【００８０】
他のベクター及び発現系は、様々な宿主細胞を用いて使用するために当技術分野で周知である。
【００８１】
宿主細胞は原核細胞であっても又は真核細胞であってもよい。細菌細胞は、好ましい原核宿主細胞であり、そして一般的には、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc.（Bethesda, MD, USA）から入手できる大腸菌ＤＨ５株、及びAmerican Type Culture Collection (ATCC) （Rockville, MD, USA） (No. ATCC 31343）から入手できるＲＲ１などの大腸菌の１菌株である。好ましい真核宿主細胞は、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル又はヒト線維芽細胞及び腎細胞系などの脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞は、Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA 92037, USA）から一般に入手できるＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１を含む。好ましい哺乳動物宿主細胞は、ヒト胚性腎細胞であるＣＲＬ１６５８及び２９３細胞のようなATCCから入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。好ましい昆虫細胞はバキュロウイルス発現ベクターで形質転換し得るＳｆ９細胞である。
【００８２】
宿主細胞を培養しそして組み換えタンパク質を分離する方法は、当技術分野でで周知である。当然のことながら、宿主細胞によっては、産生される本発明のポリペプチドは異なってもよい。例えば、酵母又は細菌細胞などの特定の細胞は、違った方法で翻訳後修飾されると考えられる本発明の化合物の形態の産生をもたらす可能性のある、異なる翻訳後修飾系を有しないか又は有する。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、また、ウサギ網状赤血球溶血液又はコムギ胚芽溶解物（Promegaから入手できる）などの市販のインビトロ翻訳系を用いてインビトロで製造してもよい。好ましくは、翻訳系はウサギ網状赤血球溶血液である。都合の良いことには、翻訳系は、ＴＮＴ転写−翻訳系（Promega）などの転写系に連結されてもよい。この系は、翻訳と同じ反応でコード化ＤＮＡポリヌクレオチドからの好適なｍＲＮＡ転写物を産生する利点を有する。
【００８４】
CS Bio Company Inc.（Menlo Park, USA）から入手できるもののような、自動ポリペプチド合成機も、また、使用することができる。
【００８５】
従って、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のポリペプチドをコード化する単離した核酸分子を提供することである。
【００８６】
核酸分子はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡであってもよい。
【００８７】
好ましい実施態様では、核酸分子は図３に示されるヌクレオチド配列［配列番号２］を含み又はそれから成る。
【００８８】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様の核酸分子を含むベクターを提供することである。１つの実施態様では、ベクターは発現ベクターである。好ましくは、ベクターはｐＥＴ１５ｂ及びｐＡＣＹＣ１８４から成る群から選択される。
【００８９】
当業者には当然のことながら、発現ベクターの選択は宿主細胞の選択により決定してもよい。従って、乳酸連鎖球菌における本発明のポリペプチドの発現では、２成分制御系をコード化するnisR 及びnisK遺伝子をも発現する乳酸連鎖球菌のバックグランド株を用いて、本発明のポリペプチドがnisAオペロンのプロモーターの制御下に発現する、ナイシン（nisin）発現系を使用することができる。この系の下での発現は正に調節され、そして外因性ナイシンの供給により誘導される（Ruyter at el., 1996, Applied and Environmental Microbiology 62:3662-3667を参照されたい。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている）。
【００９０】
代わりの実施態様では、ナイシンの全生合成遺伝子クラスターは、インデューサーがその細胞によって合成される場合と同じ宿主細胞内にもたらされる。
【００９１】
更なる代わりの実施態様では、本発明のポリペプチドは、プラスミド系か又は染色体に組み込まれた系を用いて、ラクトース異化オペロンの制御下に乳酸連鎖球菌に発現してもよい（例えば、Payne et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 136: 19-24及びvan Rooijen et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: 2273-2280を参照されたい。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている）。
【００９２】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様の核酸分子又は本発明の第３の態様のベクターを含む宿主細胞を提供することである。１つの実施態様では、宿主細胞は微生物細胞、例えば、細菌細胞である。好ましくは、宿主細胞は非病原性である。
【００９３】
例えば、宿主細胞は、大腸菌、ラクトコッカス種、バクテロイデス種、ラクトバシラス種、エンテロコッカス種及びバシラス種から成る群から選択してもよい。
【００９４】
好ましい実施態様では、宿主細胞は乳酸連鎖球菌の細胞である。
【００９５】
或いはまた、宿主細胞は酵母細胞、例えば、サッカロミセス種であってもよい。
【００９６】
本発明の第５の態様は、ポリペプチドを発現させる条件下に、本発明の第２の態様の核酸分子又は本発明の第３の態様のベクターを含む宿主細胞集団を培養し、それからポリペプチドを単離することを含む、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供することである。
【００９７】
本発明の第６の態様は、以下のもの：
（ａ）本発明の第１の態様のポリペプチド；
（ｂ）本発明の第２の態様の核酸分子；
（ｃ）本発明の第３態様のベクター；
（ｄ）本発明の第４態様の宿主；及び／又は
（ｅ）本発明の第１の態様のポリペプチドを発現することができるバクテリオファージ；
及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は医薬品添加剤を含む、医薬組成物を提供することである。
【００９８】
本明細書で使用される「医薬組成物」は、本発明の方法に使用するための治療上有効な製剤を意味する。
【００９９】
本明細書で使用される「治療的有効量」、又は「有効量」、又は「治療的に有効な」は、所定の病態及び投与レジメンに対し治療的効果を与える量を指す。これは、所要の添加剤及び賦形剤、即ち、担体又は投与賦形剤と併せて、所望の治療的効果をもたらすように算出される活性物質の所定量である。更に、宿主の活動性、機能及び反応性の臨床的に重大な欠如を減少させ、そして最も好ましくはそれを予防するのに十分な量を意味することを意図している。或いはまた、治療的有効量は、宿主の臨床的に重大な病態の改善をもたらすのに十分な量である。当業者には当然のことながら、化合物の量はその比活性度によって変動してもよい。好適な用量は、所要の賦形剤と併せて所望の治療効果をもたらすように算出される活性組成物の所定量を含むことができる。本発明の組成物を製造するための方法及び使用では、活性成分の治療的有効量が供給される。治療的有効量は、当技術分野で周知のように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患など、患者の特性を基準にして通常の技量の医療又は獣医従事者により決定することができる。
【０１００】
本発明の１つの実施態様では、医薬組成物は、本発明の第１の態様のポリペプチドを含む。
【０１０１】
ポリペプチドは、使用されるポリペプチドの有効性／毒性に応じて種々の濃度で製剤化し得る。好ましくは、製剤は、０.１μＭと１ｍＭの間、より好ましくは１μＭと１００μＭの間、５μＭと５０μＭの間、１０μＭと５０μＭの間、２０μＭと４０μＭの間、及び最も好ましくは約３０μＭの濃度でポリペプチドを含む。インビトロ適用の場合は、製剤は類似濃度のポリペプチドを含むことができる（しかし、当然のことながら、より高濃度も使用してもよい）。
【０１０２】
従って、この医薬製剤は、当該細胞により感染し又は感染を起こし易い患者において、クロストリジウム・ディフィシレの細胞増殖を少なくとも部分的に阻害するのに十分な量のポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体を含むことができる。好ましくは、医薬製剤は、患者においてクロストリジウム・ディフィシレの細胞を死滅させるのに十分な量のポリペプチド、又はそのフラグメント、バリアント、融合体若しくは誘導体を含む。
【０１０３】
当業者には当然のことながら、本発明のポリペプチドは、一般的に、所定の投与経路及び標準的薬剤治療（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition（「薬学の科学及び実践、第１９版」）, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAを参照されたい。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている）に関して選択される好適な医薬品添加剤、賦形剤又は担体との混合物で投与される。
【０１０４】
例えば、ポリペプチドは、即時性、遅延性又は放出制御の適用のために、着香剤又は着色剤を含んでもよい錠剤、カプセル剤、腔坐剤、エリキシル剤、水剤又は懸濁剤の形態で、経口、口腔内又は舌下で投与することができる。ポリペプチドは、直接注射（例えば胃腸管へ）を経て投与してもよい。
【０１０５】
しかしながら、好ましくは、ポリペプチド及びその医薬組成物は、経口投与用である。
【０１０６】
好適な錠剤処方は、微結晶セルロース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシンなどの医薬品添加剤、澱粉（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカ澱粉）、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の複合珪酸塩などの崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシル−プロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、蔗糖、ゼラチン及びアラビアゴムなどの造粒結合剤を含んでもよい。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘナート及びタルクなどの滑沢剤が含まれ得る。
【０１０７】
類似タイプの固形組成物も、ゼラチンカプセル剤の充填剤として用いてもよい。この関連の好ましい医薬品添加剤は、ラクトース、澱粉、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールをも含むことができる。水性懸濁剤及び／又はエリキシル剤では、ポリペプチドは種々の甘味剤又は着香剤、着色料又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁剤と及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンなどの希釈剤、及びその組み合わせと併用してもよい。
【０１０８】
ポリペプチドは、非経口で、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下に投与してもよく、又は注入法で投与してもよい。それらは、他の物質、例えば、血液と等張溶液にするのに十分な塩又はグルコースを含有してもよい滅菌水溶液の形態での使用に最も適している。水溶液は、必要に応じて、好適に緩衝化（好ましくは３から９のｐＨに）すべきである。無菌状態での好適な非経口製剤の調剤は、当業者に周知の標準的調剤技術により容易に達成し得る。
【０１０９】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質を含有してもよい水溶性又は非水溶性無菌注射液；及び懸濁剤及び濃稠化剤を含有してもよい水溶性又は非水溶性滅菌懸濁液を含む。製剤は、１回用量又は多回用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアルで提供してもよく、そして使用直前に滅菌液体担体、例えば、注射用蒸留水の添加だけを必要とする凍結乾燥（凍乾）状態で保存してもよい。即時注射液及び懸濁液は、前記の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調剤してもよい。
【０１１０】
ヒトの患者への経口及び非経口投与では、ポリペプチドの日用量レベルは、通常成人当り１から１００ｍｇ（即ち、約０.０１５から１５ｍｇ／ｋｇ）であち、単回用量又は分割用量で投与される。例えば、３ｍｇ／ｋｇのような、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量が使用されてよい。
【０１１１】
本発明の別の実施態様では、医薬組成物は、ポリペプチドそのものを含まないで、代わりに該ポリペプチドを発現することができる核酸分子を含む。好適な核酸分子、発現ベクター、及び宿主は詳細に上述されている。
【０１１２】
例えば、組み換えプロバイオティックを使用してもよい（ＬＡＢ株、例えば、乳酸連鎖球菌又はラクトバシラス種）。
【０１１３】
本発明の更なる実施態様では、医薬組成物は、本発明の第１の態様のポリペプチドを発現することができるバクテリオファージを含む。例えば、本発明の第１の態様のポリペプチドを送達するために、野生型バクテリオファージΦＣＤ２７を使用してもよい。当該バクテリオファージに基づく治療を実施する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Watanabe et al., 2007, Antimicrobial Agents & Chemotherapy  51:446-452を参照されたい）。
【０１１４】
このように、本明細書に記載の細菌感染症の処置では、本発明のポリペプチドは、同種の（cognate）タンパク質として、核酸構築物、ベクター又は同種のタンパク質を発現する宿主細胞として、同種のタンパク質（バクテリオファージを含む）を発現する生物の一部として、又はその細菌標的とリシンの接触を達成するために、それがＣ. ディフィシレのような病原性細菌であれ、又は本明細書に更に記載される別の病原体若しくは潜在的病原体であれ、当技術分野で公知のその他簡便な方法によって投与してもよい。
【０１１５】
理想的には、タンパク質は保護された形態で胃腸管に送達される。これは当技術分野で公知の多種多様の方法によって達成され得る。例えば、適切な用量のリシンは、胃の酸性状態は切り抜けるが、腸に入るにつれてタンパク質を放出する形態でマイクロカプセル化される。送達は、乳酸連鎖球菌、ラクトバシラス種、ビフィドバクテリウム種又はバクテロイデスを含むがこれらに限定されない、胃腸管通過を切り抜ける非病原性微生物によって行われる。当業者は、本明細書に開示されるリシンなどの活性化合物の胃腸管送達のためのそのような手段に使用できる選択肢について熟知している。これらの手段は、細胞内産生、ｓｅｃＡ分泌又は別の分泌経路による分泌、及び制御溶解による送達を含む。好ましくは、タンパク質は一度に全て放出されるのではなく、投与されたボーラスが胃腸管を横断するにつれて漸増的に放出される。或いはまた、リシンは、胃腸管における適切な位置で又は適切なシグナルの受信時にリシンを発現する、良性細菌の一部として導入される。本明細書に開示の好ましい実施態様では、非病原性ラクトコッカスが、胃腸管の特定の位置に到達時にΦＣＤ２７リシンを発現するように処理される。発現シグナルは、ｐＨ感受性プロモーター、又はこの目的のために当技術分野で公知の別の手段によって規定することができる。
【０１１６】
送達の他の手段としては、以下：
（ａ）国際公開公報第２００６／１１１５５３号（ポリ尿素及び他の多層カプセル材）；
（ｂ）国際公開公報第２００６／１１１５７０号及び欧州特許第１７１５７３９号（シクロデキストリンカプセル化）；
（ｃ）国際公開公報第２００６／１００３０８号及び欧州特許第１７４２７２８号（酵母及び他の微生物細胞カプセル化技術）；
（ｄ）米国特許第５１５３１８２号、欧州特許第１４９９１８３号及び国際公開公報第０３／０９２３７８号；米国特許第６８３１０７０号（腸細胞発現による治療遺伝子産物送達）；
（ｅ）米国特許第７２０２２３６号（放出調節用医薬製剤）；
（ｆ）米国特許第５７６２９０４号（本発明のリシンを送達するために改変し得る、重合リポソームを用いるワクチンの経口デリバリー）；
（ｇ）米国特許第７１９５９０６号（本発明のリシンを発現させるために改変し得るビフィドバクテリウム）；及び
（ｈ）本明細書に引用された文献；
が含まれ、これらの全ては、本発明の新規な送達方法及び組成物を達成するために、当業者が本発明の開示内容を活用するのを可能にする目的で、参照することにより本明細書に組み入れられている。
【０１１７】
このように、本発明の医薬組成物の好ましい実施態様では、ポリペプチド、それをコード化する核酸分子などはマイクロカプセル化される（例えば、シクロデキストリン若しくは脂質二重層などの化学エンベロープ内で、又は処理したラクトコッカス細胞などの生存又は非生存微生物細胞内で）。このような方法で、ポリペプチド、核酸分子などは、胃腸管の作用部位への途中で胃の酸性状態に対して保護することができる。
【０１１８】
本発明の第７の態様は、医薬に使用するための、本発明の第１の態様のポリペプチド又は本発明の第６の態様の医薬組成物を提供することである。
【０１１９】
本発明の第８の態様は、患者中の微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制する薬剤の製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用を提供することである。
【０１２０】
当然のことながら、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を示すポリペプチドは、必ずしもクロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージから由来する必要はない。例えば、ポリペプチドは以下の群：
（ａ）バクテリオファージΦＣＤ２７のリシン；
（ｂ）バクテリオファージΦＣＤ１１９のリシン；
（ｃ）バクテリオファージΦＣ２のリシン；及び
（ｄ）クロストリジウム・ディフィシレ株６３０（ＣＤ６３０）のプロファージ１及び２のリシン；
から選択することができる。
【０１２１】
或いはまた、ポリペプチドは、クロストリジウム・ビフェルメンタンス又はクロストリジウム・ソルデリ（Clostridium sordelli）などの異なるクロストリジウム種のバクテリオファージから由来（例えば、コード化）してもよい。
【０１２２】
しかしながら、好ましい実施態様では、ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージから由来する。
【０１２３】
従って、本発明の第８の態様の使用は、本発明の第１の態様のポリペプチドに限定されるものではなく、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するいずれのポリペプチドの使用をも包含する (Goh et al., 2007, Microbiology 153:676-685に記載のΦＣ２のリシンを含む。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている)。
【０１２４】
本発明の関連する態様は、患者中の微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制するための、クロストリジウム・ディフィシルのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用を提供することである。
【０１２５】
本発明の更なる態様は、患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態の治療又は予防のための薬剤の製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用を提供することである。本発明の関連する態様は、患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態を治療又は予防するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用を提供することである。
【０１２６】
「患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態」には、クロストリジウム・ディフィシレによる患者の感染から生じ又は拮抗する疾患及び病態が包含される。当該疾患及び病態には、クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患（ＣＤＡＤ）が含まれる。
【０１２７】
本発明の上記の使用の１つの実施態様では、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、本発明の第１の態様のポリペプチドであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触により溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるポリペプチドである（下記の表１と２を参照）。
【０１２８】
好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレを含み又はそれから成る。このように、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレ細胞による感染に関連する疾患及び病態（クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、ＣＤＡＤなど）を治療又は予防するのに使用することができる。
【０１２９】
最も好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７細胞を含み又はそれから成る。
【０１３０】
従って、本発明は更に以下の方法：
（ａ）患者中の微生物細胞を殺滅し及び／又はその増殖を阻害／抑制するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを患者に投与することを含む方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法；
（ｂ）患者において微生物細胞に関連する疾患又は病態を治療又は予防するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若バクテリオファージを患者に投与することを含む方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法；
を提供する。
【０１３１】
本発明の上記の方法の１つの実施態様では、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは本発明の第１の態様のポリペプチドであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触により溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるポリペプチドである（下記の表１と２を参照）。好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ細胞を含み又はそれから成る。このように、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレ細胞による感染に関連する疾患及び病態（クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、ＣＤＡＤなど）を治療又は予防するのに使用することができる。最も好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞を含み又はそれから成る。
【０１３２】
当業者には更に当然のことながら、本発明の使用及び方法は医学及び獣医学分野の両方で有用性を有する。従って、本薬剤はヒト及び非ヒト動物（ウマ、ウシ、イヌ及びネコなど）の両方の治療に使用することができる。しかしながら、好ましくは、患者はヒトである。
【０１３３】
「治療」には、患者の治療的及び予防的治療法が含まれる。用語「予防的」は、患者又は対象におけるクロストリジウム・ディフィシレによる感染の可能性を防止するか低減する、本明細書に記載のポリペプチド又は製剤の使用を包含するように用いられる。
【０１３４】
上記のように、用語「有効量」は、治療する疾患又は病態の好ましい変化をもたらすのに使用することができる、本発明のポリペプチドの濃度又は量を記載するために本明細書で用いられるが、その変化が寛解、好ましい生理的結果、治療する病状又は病態の好転又は減弱、惹起している病態又は病状の可能性の予防又は低減であるかは、治療する疾患又は病態によって決まる。
【０１３５】
当然のことながら、本明細書に記載の薬剤は、１つ又はそれ以上の更なる治療薬との併用で患者に投与してもよい。
【０１３６】
例えば、本明細書に記載の薬剤は：
（ａ）１つ又はそれ以上の従来の抗生物質治療（β−ラクタム、アミノグリコシド及び／又はキノロン）；
（ｂ）１つ又はそれ以上の更なるリシン、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージ；
（ｃ）１つ又はそれ以上の抗生物質、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくは細菌；及び／又は
（ｄ）腸内のクロストリジウム・ディフィシレ細胞の細菌溶菌時に放出される毒素を中和する療法；
と併用して投与してもよい。好適な中和療法は、抗生物質（Babcock et al., 2006, Infect. Immun. 74:6339-6347を参照されたい）及びトレバマー（tolevamer）などの毒素吸収剤（Barker et al., 2006, Aliment. Pharmacol. Ther. 24:1525-1534を参照されたい）を含んでもよい。
【０１３７】
本発明の更なる態様は、インビトロ及び／又はエクスビボで微生物細胞を殺細胞し及び／又はその増殖を阻害／抑制するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用を提供することである。例えば、エンドリシン活性を有する該ポリペプチドは、そのような細菌細胞で汚染され易い病院、キッチンなどの表面を清浄化するのに使用することができる。
【０１３８】
好ましくは、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、本発明の第１の態様のポリペプチドであって、その微生物細胞が、クロストリジウム・ディフィシレ及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるポリペプチドである（下記の表１及び２を参照）。例えば、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ細胞を含み又はそれから成ってよい。最も好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７の細胞を含み又はそれから成る。
【０１３９】
本発明の更なる態様は、試料中の微生物細胞の存在を検出するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性及び／又は細胞結合特異性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージを含むキットであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるキットを提供することである。
【０１４０】
好ましい実施態様では、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、本発明の第１の態様のポリペプチドであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞からなる群から選択されるポリペプチドである（下記の表１及び２を参照）。例えば、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ細胞を含み及びそれから成ってよい。最も好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレリボタイプ０２７の細胞を含み又はそれから成る。
【０１４１】
本発明のキットの更なる実施態様では、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、マルチウェルプレートなどの好適な表面に固定化される。
【０１４２】
キットは、組織試料、細胞培養試料及び拭い液由来の細胞試料（例えば、微生物細胞による汚染を試験する表面から採取される）などの、いずれの好適な細胞試料と併せて使用してもよい。
【０１４３】
場合により、キットは、陰性対照試料（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ細胞を試験するための細胞型を含まない）及び／又は陽性対照試料（試験するための細胞を含む）を更に含む。
【０１４４】
本発明の関連する態様は、以下の使用及び方法：
（ａ）クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される、微生物細胞に関連する疾患又は病態の診断薬の製造における、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用；
（ｂ）クロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される、微生物細胞に関連する疾患又は病態を診断するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用；
（ｃ）インビトロ及び／又はエクスビボで試料中の微生物細胞の存在を検出するための、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージの使用であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される使用；及び
（ｄ）患者中の微生物細胞に関連する疾患又は病態を診断するための、試験すべき患者からの細胞試料をクロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合活性及び／又は細胞溶解活性を有するポリペプチド、又はそれを発現することができる核酸分子、ベクター、宿主細胞若しくはバクテリオファージに接触させ、そして試料中の細胞がそれにより溶解されるかどうかを測定することを含む方法であって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び該エンドリシンによる溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択される方法；
を提供することである。
【０１４５】
本発明の上記の使用及び方法の１つの実施態様では、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、本発明の第１の態様のポリペプチドであって、微生物細胞がクロストリジウム・ディフィシレ細胞及び配列番号１のポリペプチドとの接触時に溶解を起こし易い他の細菌細胞から成る群から選択されるポリペプチドである（下記の表１及び２を参照）。好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ細胞を含み又はそれから成る。このように、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞溶解活性を有するポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレ細胞による感染に関連する疾患及び病態（クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、ＣＤＡＤなど）を診断するのに使用することができる。最も好ましくは、微生物細胞は、クロストリジウム・ディフィシレ・リボタイプ０２７の細胞を含み又はそれから成る。
【０１４６】
当該診断のための使用及び方法では、細胞の溶解は当技術分野で周知の方法を用いて検出し得る。例えば、ＡＴＰのレベルは、細胞溶解の指標として測定し得る。
【０１４７】
本発明の上記の使用及び方法の他の実施態様では、ポリペプチドは、クロストリジウム・ディフィシレのバクテリオファージ由来エンドリシンの細胞壁結合ドメインを含み又はそれから成る。検出を可能にするために、このようなポリペプチドは、磁気ビーズに融合され又は好適なレポーター（例えば、緑色蛍光タンパク質）を含む融合タンパク質として使用してもよい。
【０１４８】
当該診断方法は、リステリアエンドリシンなど他の系由来のエンドリシンにて十分確立されている（例えば、Loessner et al., 2002, Mol Microbiol 44, 335-49; Kretzer et al., 2007, Applied Environ. Microbiol. 73:1992-2000を参照されたい。その開示内容は、参照することにより本明細書に組み入れられている; 好適な分析法も、また、例えばProfos, Germany [www.profos.de/content/view/164/69/lang,en/でそれらのウェブサイトを参照されたい]から市販されている） 。
【０１４９】
本発明の典型的な実施態様は、以下の図を参照しながら、以下の非限定的実施例にて記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ΦＣＤ２７の電子顕微鏡写真。試料は飽和酢酸ウラニル中でネガティブ染色された。
【図２】予測されたＯＲＦを示すΦＣＤ２７ゲノム地図。矢印は転写の方向を示す。提案された機能モジュールは、ＢＬＡＳＴ結果並びにΦＣＤ１１９、ΦＣ２、及びＣ.ディフィシレ株６３０プロファージの公表配列との類似性に基づいて表示される。
【図３】ΦＣＤ２７リシンのヌクレオチド配列、配列番号２。
【図４ａ−１】公表Ｃ.ディフィシレのバクテリオファージ（ΦＣ２（３２）；ΦＣＤ１１９（３１））、又はプロファージ（配列ゲノムからのＣＤ６３０プロファージ１及び２（３６））配列による、ΦＣＤ２７  ヌクレオチド配列のアラインメント。AlignX、Vector NTI Advance 10, Invitrogenにより行なわれたアラインメント。ΦＣＤ２７アミノ酸配列は配列番号２である。
【図４ａ−２】図４ａ−１の続きである。
【図４ａ−３】図４ａ−２の続きである。
【図４ｂ】公表Ｃ.ディフィシレのバクテリオファージ（ΦＣ２（３２）；ΦＣＤ１１９（３１））、又はプロファージ（配列ゲノムからのＣＤ６３０プロファージ１及び２（３６））配列による、ΦＣＤ２７推定アミノ酸配列のアラインメント。AlignX、Vector NTI Advance 10, Invitrogenにより行なわれたアラインメント。ΦＣＤ２７アミノ酸配列は配列番号２である。
【図５】ｐＥＴ１５ｂベクター（Novagen）のクローニング部位。
【図６ａ】（ａ）ΦＣＤ２７リシンを発現する大腸菌からの粗タンパク質溶解産物のゲル解析。レーン１は、SeeBlueマーカー(Invitrogen、サイズ１９１、９７、６４、５１、３９、２８及び１９ｋＤａ)、レーン２〜５は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１５ｂΦＣＤ２７Ｌ総蛋白質抽出物。レーン２〜４は、ＩＰＴＧ−２で３時間誘導した抽出物及び２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した３、プロテアーゼ阻害剤（Roche Complete mini EDTA-free）を含む３及び変性緩衝液（８Ｍの尿素、０.１ＭのＮａＨ2ＰＯ4、０.０１ＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で抽出した４。レーン５は２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した非誘導対照。レーン６及び７は、２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１５ｂΦＣＤ６３０Ｌ１総蛋白質抽出物、レーン６は、ＩＰＴＧで３時間誘導しただけの（ａ）６×Ｈｉｓ抗体による（ｂ）ゲルのウェスタン解析。
【図６ｂ】（ａ）ΦＣＤ２７リシンを発現する大腸菌からの粗タンパク質溶解産物のゲル解析。レーン１は、SeeBlueマーカー(Invitrogen、サイズ１９１、９７、６４、５１、３９、２８及び１９ｋＤａ)、レーン２〜５は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１５ｂΦＣＤ２７Ｌ総蛋白質抽出物。レーン２〜４は、ＩＰＴＧ−２で３時間誘導した抽出物及び２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した３、プロテアーゼ阻害剤（Roche Complete mini EDTA-free）を含む３及び変性緩衝液（８Ｍの尿素、０.１ＭのＮａＨ2ＰＯ4、０.０１ＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で抽出した４。レーン５は２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した非誘導対照。レーン６及び７は、２０ｍＭのＴｒｉＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１５ｂΦＣＤ６３０Ｌ１総蛋白質抽出物、レーン６は、ＩＰＴＧで３時間誘導しただけの（ａ）６×Ｈｉｓ抗体による（ｂ）ゲルのウェスタン解析。
【図７】ＮｉＮＴＡカラム精製Ｈｉｓタグ化ΦＣＤ２７リシンのゲル解析。レーン１は、SeeBlueマーカー（Invitrogen、サイズ１９１、９７、６４、５１、３９、２８及び１９ｋＤａ)、レーン２〜５は、ＩＰＴＧで誘導後のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ１５ｂΦＣＤ２７Ｌ総蛋白質抽出物、レーン１は、粗溶解産物、レーン２は、カラム流入、レーン３は、一次洗浄溶離液、レーン４は、洗浄二次溶離液、レーン５は、一次溶出液（Ｅ１、１ｍｌ）、レーン６は、二次溶出液（Ｅ２）。
【図８】エンド対数に増殖し、液体窒素中で急速冷凍し、次いでＰＢＳ中に再懸濁したＣ. ディフィシレ１１２０４の細胞によるBioscreen溶解試験。ΦＣＤ２７リシン及びＣＤ６３０リシンは大腸菌に発現し、そしてＮｉＮＴＡカラムでＨｉｓタグを用いて精製された（図６を参照）。２７０μｌの細胞をＥ１抽出物の３０μｌの希釈液に加えた。値は二重複分析の平均値＋／−標準偏差である。ＣＤ６３０Ｌ１抽出物による細胞溶解は、緩衝液だけの対照に見られるものと同等であった。
【図９】エンド対数に増殖し、４℃で遠心分離により採取し、次いでＰＢＳ中に再懸濁したＣ. ディフィシレ１１２０４の細胞によるBioscreen溶解試験は、１〜１.５の間のＯＤを与えた。ΦＣＤ２７リシンは大腸菌に発現し、そしてＮｉＮＴＡカラムでＨｉｓタグを用いて精製された（図６を参照）。２７０μｌの細胞を溶離緩衝液で希釈した溶出液１（Ｅ１）の３０μｌ試料に加えて、１分析当り１０.５μｇから０．３５ｎｇの範囲の濃度を与えた。新鮮細胞の使用は、緩衝液だけの対照において有意に少ない溶解を与えた。７０ｎｇ未満のＮｉＮＴＡ精製タンパク質で緩衝液だけの対照と差が見られなかった。
【図１０ａ】活性のスペクトルを試験するためにＣ.ディフィシル細胞に添加されたΦＣＤ２７リシンのBioscreen溶解試験。細胞を大腸菌から産生した３．５μｇＮｉＮＴＡ精製タンパク質（Ｅ１）とインキュベートした。試験した３０株のうち、宿主株１２７２７及びΦＣＤ２７非感受性株１１２０８及び高毒性リボタイプ０２７Ｒ２３６１３を含み、全てが感受性であった。インキュベーションは緩衝液（Ｂ）か又はリシン（Ｌ）を用いて二重複でなされた。
【図１０ｂ】活性のスペクトルを試験するためにＣ.ディフィシル細胞に添加されたΦＣＤ２７リシンのBioscreen溶解試験。細胞を大腸菌から産生した３．５μｇＮｉＮＴＡ精製タンパク質（Ｅ１）とインキュベートした。試験した３０株のうち、宿主株１２７２７及びΦＣＤ２７非感受性株１１２０８及び高毒性リボタイプ０２７Ｒ２３６１３を含み、全てが感受性であった。インキュベーションは緩衝液（Ｂ）か又はリシン（Ｌ）を用いて二重複でなされた。
【図１０ｃ】活性のスペクトルを試験するためにＣ.ディフィシル細胞に添加されたΦＣＤ２７リシンのBioscreen溶解試験。細胞を大腸菌から産生した３．５μｇＮｉＮＴＡ精製タンパク質（Ｅ１）とインキュベートした。試験した３０株のうち、宿主株１２７２７及びΦＣＤ２７非感受性株１１２０８及び高毒性リボタイプ０２７Ｒ２３６１３を含み、全てが感受性であった。インキュベーションは緩衝液（Ｂ）か又はリシン（Ｌ）を用いて二重複でなされた。
【図１１ａ−１】クロストリジウム種及び一般的な腸細菌に対するΦＣＤ２７リシンの活性。細胞を後期安定相で採取し、ＰＢＳ中で再懸濁し、大腸菌から産生した７μｇＮｉＮＴＡ精製タンパク質（Ｅ１）とインキュベートした。結果は、二重複分析の平均値＋／−標準偏差である。ΦＣＤ２７リシンは大部分の種において細胞溶解を誘導しなかった（ａ及び表２を参照）。例外として（ｂ及び表２を参照）、クロストリジウム・ビフェルメンタンスの迅速溶解、バシラス・セレウスの溶解、そして長い誘導期を有するＢ.サチリス、及びリステリア・イバノビイ（ｂ）に対する微弱作用が含まれる。
【図１１ａ−２】図１１ａ−１の続きである。
【図１１ａ−３】図１１ａ−２の続きである。
【図１１ａ−４】図１１ａ−３の続きである。
【図１１ｂ−１】クロストリジウム種及び一般的な腸細菌に対するΦＣＤ２７リシンの活性。細胞を後期安定相で採取し、ＰＢＳ中で再懸濁し、大腸菌から産生した７μｇＮｉＮＴＡ精製タンパク質（Ｅ１）とインキュベートした。結果は、二重複分析の平均値＋／−標準偏差である。ΦＣＤ２７リシンは大部分の種において細胞溶解を誘導しなかった（ａ及び表２を参照）。例外として（ｂ及び表２を参照）、クロストリジウム・ビフェルメンタンスの迅速溶解、バシラス・セレウスの溶解、そして長い誘導期を有するＢ.サチリス、及びリステリア・イバノビイ（ｂ）に対する微弱作用が含まれる。
【図１１ｂ−２】図１１ｂ−１の続きである。
【図１１ｂ−３】図１１ｂ−２の続きである。
【図１１ｂ−４】図１１ｂ−３の続きである。
【図１２】ΦＣＤ２７リシン活性のｐＨプロファイル。Ｃ.ディフィシレ１１２０４細胞を一定の範囲のｐＨに調整したＰＢＳで再懸濁し、そして大腸菌から産生したＮｉ−ＮＴＡ精製リシンＥ１の活性を前と同様にbioscreenで測定した。
【図１３Ａ】（ａ）ΦＣＤ２７リシンを発現する乳酸連鎖球菌由来の粗タンパク質溶解物のゲル分析。レーン１及び１０は、SeeBlue(Invitrogen、サイズ１９１、９７、６４、５１，３９、２８及び１９ｋＤａ)、レーン２〜５は、５時間（２、４）誘導又は非誘導（３、５）のｐｈｉＣＤ２７ＬｐＵＫ２００ＨＩＳ（２、３）又は空ベクターｐＵＫ２００ＨＩＳ対照（４、５）を含有する乳酸連鎖球菌ＵＫＬＣ１０。レーン６〜９は、全て４時間誘導した（レーン当り１０μｇ）ｐｈｉＣＤ２７ＬｐＥＴ１５ｂ（６、８、９）又は空ベクター対照（７）を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。全タンパク質を、レーン８（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８）及び９（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５）を除いて２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した。（ａ）６×Ｈｉｓ抗体による（ｂ）ゲルのウェスタン分析。
【図１３Ｂ】（ａ）ΦＣＤ２７リシンを発現する乳酸連鎖球菌由来の粗タンパク質溶解物のゲル分析。レーン１及び１０は、SeeBlue(Invitrogen、サイズ１９１、９７、６４、５１，３９、２８及び１９ｋＤａ)、レーン２〜５は、５時間（２、４）誘導又は非誘導（３、５）のｐｈｉＣＤ２７ＬｐＵＫ２００ＨＩＳ（２、３）又は空ベクターｐＵＫ２００ＨＩＳ対照（４、５）を含有する乳酸連鎖球菌ＵＫＬＣ１０。レーン６〜９は、全て４時間誘導した（レーン当り１０μｇ）ｐｈｉＣＤ２７ＬｐＥＴ１５ｂ（６、８、９）又は空ベクター対照（７）を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。全タンパク質を、レーン８（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８）及び９（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５）を除いて２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで抽出した。（ａ）６×Ｈｉｓ抗体による（ｂ）ゲルのウェスタン分析。
【図１４】エンプティーベクター対照からの抽出物と比較した、Ｃ．ディフィシレ株１１２０４の新鮮細胞とインキュベートしたｐｈｉＣＤ２７リシン発現大腸菌及び乳酸連鎖球菌由来の粗タンパク質抽出物のBioscreen分析。５０μｇタンパク質を各分析で使用し、結果は二重複分析の平均値＋／−標準偏差である。
【図１５】Zeba緩衝液交換カラム（Pierce）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０に通した分割量と比較した、元の抽出物の活性を示す大腸菌産生Ｎｉ−ＮＴＡ精製リシンＥ１のBioscreen分析。リシン及び緩衝液対照をＣ．ディフィシレ株１１２０４の急速冷凍細胞とインキュベートした。結果は二重複分析の平均値＋／−標準偏差である。
【図１６】ＬＭ４−ＣＤ２７Ｌ（レーン２）及びＬＭ４−ＣＤ２７ＬＥ（レーン３）の粗細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨｉｓタグ化タンパク質を強調表示する対応のウェスタンブロット。タンパク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０で抽出し、そして１０μｇ分割量をＭＯＰＳ緩衝液（Invitrogen）中の１０％Bis-TrisNuPageゲルで電気泳動した。レーン１は、SeeBlueマーカー。
【図１７】中期対数まで増殖し、次いで液体窒素中で急速冷凍したＣ．ディフィシレ株１１２０４細胞の溶解を示すBioscreen分析。細胞を１０μｇＮｉＮＴＡ精製Ｅ１（溶出液１）又は対照としての溶出緩衝液とインキュベートした。
【実施例】
【０１５１】
背景
抗菌薬としての細菌ウイルスの利用で、近年多少のルネサンスを経験している。一部において、これは、薬剤耐性病原体の継続的出現に続く従来型抗生物質の代替を見出す必要性を反映している。最近のレビューはこの可能性を強調しているが、バクテリオファージの使用に内在する限界をも強調している（７、８）。
【０１５２】
一般的に、バクテリオファージは顕著な系統差を示すことから、それらは限定範囲の個々の菌株に対して活性であることを意味する。バクテリオファージとその細菌宿主間の相互作用の動力学は、バクテリオファージ攻撃に抵抗性の宿主変異体の即時選択を含む。他の関連する問題は、宿主生菌によるバクテリオファージ製剤の汚染可能性、及びバクテリオファージが遺伝子流動及び毒性因子の拡大に寄与する可能性を含む（９）。バクテリオファージによる毒素遺伝子の輸送は特に十分立証されており、その例はコレラ毒素（１０）、ボツリヌス毒素（９）、志賀毒素（１１）及びジフテリア毒素（９）を含む。これらの限定にもかかわらず、バクテリオファージは、マウスモデルにおける大腸菌（１２）、黄色ブドウ球菌（１３）及びバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム（１４）を制御するのに実験的に使用されている。バクテリオファージ療法はニワトリにおけるカンピロバクター（１５）及び大腸菌（１６）の制御のために研究中である。クロストリジウムに関して、ハムスターモデルにおけるＣ．ディフィシレを標的とする研究が報告されている（１７）。更に、ＦＤＡは、最近全食品におけるリステリア制御のためのバクテリオファージ(LISTEX（登録商標）, EBI Food Safety) へのＧＲＡＳ承認を更に拡大した（１８）。
【０１５３】
インタクト・バクテリオファージの使用に加えて、抗菌薬としてバクテリオファージ・エンドリシスを使用する可能性がある。バクテリオファージ・ライフサイクルの最終段階は、新たに複製されたインタクト・バクテリオファージ粒子のプールを放出するための細菌宿主細胞の溶解を含む。一般的に、これは、膜破壊性ホリンの厳密な時限産生が、そのペプチドグリカン標的に細胞壁分解性エンドリシンが接近することを可能にする、２段階過程によって達成される。エンドリシン酵素は分泌されず、ホリンの作用により及び細胞壁を分解するそれ自体の能力により細胞から放出される。一度放出された場合、エンドリシンは細胞の外側からペプチドグリカンを攻撃することができ、この現象は初期のバクテリオファージ研究の時から観察されている：それを「外部からの溶解」と称する。最も特徴的なバクテリオファージ・エンドリシンの構造は、触媒ドメイン及び特徴的な細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）を有するモジュール構造である。触媒ドメインは変化することができ、そしてほとんどの場合それはアミダーゼか又はムラミダーゼである。ＣＢＤは細胞壁表面上の糖モチーフを認識するレクチン様能力を有し、そして関係する特異性の変動は、エンドリシンに特異的な分類群へのそれらの特徴的なターゲッティングをもたらす（１９、２０）。
【０１５４】
Gassonらは、新しい抗菌薬として及びモデル系としてのリステリア及びクロストリジウムを用いた新しい検出技術の基礎の両方で、バクテリオファージ・エンドリシンの開発の先駆者となった（２１）。その後、標的抗菌薬としてのエンドリシンの可能性が、炭疽菌（２３）、肺炎連鎖球菌（２４）及びエンテロコッカス・フェカーリスを標的とする公表例により広く認識されている（２２）。リステリアに関して、重要な更なる研究が Martin Loessner at ETH, Switzerlandにより行なわれている（１９、２０）。加えて、クロストリジウム・パーフリンジェンスに対して活性なエンドリシンが特徴付けられている（２６）。
【０１５５】
新しいバクテリオファージ・リシンの特徴付け及びその使用方法
テンペレート・バクテリオファージΦＣＤ２７は、クロストリジウム・ディフィシレ菌株保存株ＮＣＴＣ１２７２７から単離された。他の２５のＣ.ディフィシレ株に対してΦＣＤ２７を試験し、そしてタイプ株１１２０４を含む他の４株に対して有効なことが示された。バクテリオファージ・ゲノムＤＮＡを抽出して配列決定し、そしてＢＬＡＳＴ検索によりエンドリシン配列が同定された。その配列は、公表されたＣ.ディフィシレのバクテリオファージ・エンドリシン（ΦＣＤ１１９、ΦＣ２、配列決定されたＣ.ディフィシレＣＤ６３０におけるプロファージ１及び２）と明瞭なアミノ酸及びヌクレオチド相同性を示した。リシンはｐＥＴ１５ｂへサブクローニングされ、そして６×Ｈｉｓタグにより大腸菌に発現された。リシンはニッケルカラムで一部精製され、そしてファージ感受性及び非感受性株の両方を溶解することが、３７℃でインキュベーション時の光学密度の減少により証明された。試験した３０株のうち、毒性リボタイプ０２７株を含む全てが溶解することを示した。一連の菌属からの多数の他の細菌は、リシンに対して感受性を示さなかった。しかしながら若干の活性がＣ.ビフェルメンタンス、Ｃ.ソルデリ、セレウス菌、枯草菌に対して認められ、そしてリステリア・イバノビイに対して非常にわずかな活性が認められた。部分精製リシンの比活性は、Ｃ.ディフィシレ株によって変動した。従って、本明細書に開示されたリシンは、Ｃ.ディフィシレ病原性の治療及び検出に対する新しい強力な武器となる。
【０１５６】
本明細書で同定されそして特徴付けられたリシンは、Ｃ.ディフィシレ感染症、及びヒト及び動物の他の細菌感染症を治療するために使用できる新しい組成物である。本発明によれば、ΦＣＤ２７リシンは、当技術分野で公知の方法によって生産してもよい。それは、この目的のために増殖したウイルスから使用のために単離してもよい。しかしながら、好ましくは、それは本明細書に開示した組み換え法により、そして当業者に公知の代替法により生産される。この分子の関連サブポーションについて、細菌に特異的に結合し、それらの細菌を溶解するそれらの能力が特徴付けられた。これらの分子サブポーションは、天然分子として別々に又は同時に生産され、そして使用されてもよい。
【０１５７】
ΦＣＤ２７リシンの発見、クローニング及び活性
溶解物の生産及び活性分析は、記載のように行われた（２７）。Ｃ.ディフィシレ株ＮＣＴＣ１２７２７（the Health Protection Agency, Colindale, London から入手可能−糞便から単離され、１９９２年にS. Tabaqchali, St. Bart's Hospital, London により寄託）は、ＢＨＩ＋Ｃ（ビタミンＫ（１０μｌ、０.５容量％／ｌ）、ヘミン（５ｍｇ／ｌ）、レザズリン（１ｍｇ／ｌ）及びＬ−システイン（０.５ｇ／ｌ）を補充したＢＨＩ(Oxoid) ）中、３７℃で嫌気的に２４時間増殖させた。バクテリオファージ生産をマイトマイシンＣ（Sigma）により３μｇ／ｍｌの最終濃度で２４時間誘導した。培養液を４℃において４０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターユニット（Millipore) を通して濾過し、そして４℃で保存した。１５０μｌの一夜Ｃ.ディフィシレＢＨＩ＋Ｃ培養液を加えたＢＨＩ軟寒天（０.７５％）を重層化したＢＨＩプレート（１.５％寒天）上に、上清の２５μｌ部をスポットし、そして３７℃で一夜嫌気的にインキュベートした。培養液（表１を参照）を２重複で試験し、１２７２７上清からの明瞭なプラーク形成を、４株−Ｃ.ディフィシレ１１２０４（タイプ株）、１１２０５、１１２０７及び１１２０９で確認した。菌株１１２０４からのプラークは、滅菌パスツールピペットで２５０μｌＢＨＩ＋Ｃ中へ採取し、４℃で一夜インキュベートした。バクテリオファージ−ΦＣＤ２７の存在は電子顕微鏡で確認したが、それがカウドウイルス目に属することを示した（２８）（図１）。総数で２５のＣ.ディフィシレ株がマイトマイシンＣで誘導され、その上清は２５株全てに対して交差試験した。ΦＣＤ２７は、この方法で発見された唯一のプラーク形成単位であった。Ｃ.ディフィシレからのバクテリオファージ発見が稀なことはこれまでの刊行物にも示されており、それには９４分離株から２バクテリオファージ産生株（２９）又は５６分離株から３産生株（３０）が見出される。
【０１５８】
力価を増加させるために、１００μｌのプラーク溶出液を１００μｌのＣ.ディフィシレ２４時間培養液と５ｍｌＢＨＩ軟寒天中で混合し、ＢＨＩ寒天上に塗布した。３７℃での一夜の嫌気性培養は近似融合溶菌を与え、そして５ｍｌＢＨＩ＋Ｃで２時間の溶離は、２×１０6ｐｆｕ／ｍｌの力価を与えた。力価は、１１２０４の液体培養での連続インキュベーションにより増加し、初期から中期対数期まで２５ｍｌＢＨＩ＋Ｃ培養における細胞を増殖させ、バクテリオファージ：細胞の比を少なくとも４：１にする光学密度（ＯＤ）を与えた。この方法は、細菌懸濁液の完全透明化をもたらし、そして２代継代は２.５×１０11ｐｆｕ／ｍｌの力価を与えた。ＤＮＡ抽出のために、ＯＤ０.３の細胞をｃ.７.の感染の多重度まで濾過溶解物でインキュベートした。３時間のインキュベーションは完全溶解をもたらし、上清を上記のように採取して濾過し、そして２つの５０ｍｌ部をQiagen λ midikit (Qiagen)中で使用した結果、ｃ.１６０μｇのバクテリオファージのゲノムＤＮＡ収量を得た。
【０１５９】
バクテリオファージΦＣＤ２７ゲノムのシークエンシング及びアセンブリーを、Phred-Phrapプログラムを用いてBiochemistry DNA Sequencing Facility （University of Cambridge, UK）により実施した。循環ゲノムは５０，９３０ｂｐであり、７５の提案されたオープン・リーディング・フレーム（ｏｒｆ）を含んだ（図２）。これらの多くは、Ｃ.ディフィシレのバクテリオファージΦＣＤ１１９（３１）及びΦＣ２（３２）からのものを含み、同定したバクテリオファージＯＲＦに顕著な相同性を示した。ＯＲＦは、ＢＩＴＳ（Harpenden）を経て行なわれたArtemis （３３）及びBlastP 検索（３４，３５）により解析した。提案されたΦＣＤ２７リシン配列は８１６ｂｐであり、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに相同性を示す２７１アミノ酸予測タンパク質をコードした。ヌクレトチド及びアミノ酸配列（図３）の両方は、Ｃ.ディフィシレのバクテリオファージ及びプロファージ（図４）の公表配列に合っていたが、ΦＣ２に対してその最大相同性（９５.９％ヌクレオチド及びアミノ酸同一性）を有した。
【０１６０】
ΦＣＤ２７リシン配列はプライマーを用いてゲノムＤＮＡから増幅され、初めのＭｅｔ残基（プライマーＣＤ２７Ｌ＿ＮＤＥ、５’−ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧ［配列番号３］、Sigma Genosys）周囲のNdeI（ＣＡＴＡＴＧ）部位を、そしてコード配列（プライマーＣＤ２７Ｌ＿ＸＨＯ、５’−ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＡＣ［配列番号４］の下流にXhoI部位（ＣＴＣＧＡＧ）を作製し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Novagen）におけるサブクローニングを促進させた。増幅は、１×Phusion緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、０.５μＭの各プライマー、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型を含む５０μｌの反応液中、高性能PhusionＤＮＡポリメラーゼ（０．０２Ｕ／μｌ、Finnzymes）により実施した。増幅条件は、９８℃で３０秒間の初期変性、その後に３０サイクルの変性（９０℃で１０秒）、アニーリング（５８℃で３０秒）及び伸長（９０℃で１０秒）、次いで７２℃で５分間の最終伸長が続いた。平滑末端ＰＣＲ産物はSureClean (Bioline）を用いて精製し、そして７２℃で２０分間インキュベートして、１×AmpliTaq緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ及び１ＵのAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）を含む５０μｌの反応液中に３’Ａ−オーバーハングがもたらされた。生成物をSureCleanで精製し、次いでＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐＣＲ２.１に結合された。ライゲーション生成物は、ＴＯＰ１０化学的コンピーテント大腸菌（Invitrogen）中へ形質転換して、陽性菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬ寒天で選択し、そしてブルー・ホワイト選択のために４０ｍｇ／ｍｌＸ−ガル溶液の４０μｌで重層化した。プラスミドＤＮＡをプラスミドミニキット(Qiagen) を用いて抽出し、挿入部分をベクタープライマー及びBigDye v3.1シークエンシングキット（Applied Biosystems）を用いて配列決定した。リシン原配列と１００％配列相同性を示すが、付加したNdeI及びXhoI部位を有するクローンは挿入部分を放出するのが限定的であった。これはゲル精製され（Qiaex II, Qiagen）、そしてFast-Link ＤＮＡリガーゼ (Epicentre）を用いて、リシン配列がＩＰＴＧ誘導性lacオペレーターによる高発現Ｔ７プロモーターの制御下に６−ヒスチジンタグの下流に発現するように、ｐＥＴ１５ｂへと結合された。ライゲーション産物は、先ず配列確認のために ＴＯＰ１０細胞へ、次いでタンパク質発現のために化学的コンピーテントＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞 （Invitrogen）へ形質転換された。配列決定したＣ.ディフィシレ（３６）のプロファージ１からのリシン配列を、 ベクターｐＵＣ５７へとGenscript Corp. （Piscataway, USA）によって合成し、そしてプライマーＣＤ６３０Ｌ１＿ＮＤＥ（５’−ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＴＴＧ）［配列番号５］、及びXhoI部位を含む特定のベクターＤＮＡでリシンを増幅したＭ１３前方（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ）［配列番号６］を用いて、同様にＨｉｓ−タグ化発現のためにサブクローニングした。
【０１６１】
Ｈｉｓ−タグ化リシンは、メーカーにより示唆されたように、ＯＤ600０.４まで１００μｇ／ｍｌアンピシリンにより１０ｍｌＬブロス中に増殖したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に発現し、次いで０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Melford Biosciences）で３〜４時間誘導した。細胞を４０００×ｇで遠心分離することにより採取し、次いで１ｍｌの懸濁液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ）中４℃で２０分間再懸濁し、そして２ｍｌスクリューキャップチューブに移した。粗タンパク質溶解物は、FastPrep FP120 細胞破壊器（Savant）中の０.１ｍｍ酸洗浄ガラスビーズ（Sigma）を用いて、バースト間に５〜１０分間氷上でインキュベートしながら４×３０秒のバースト（速度１０）での細胞破壊によって得られた。破壊細片を１３，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離によりペレット化し、上清を４℃で保存した。粗溶解物は、ＩＰＴＧ誘導無しで増殖したリシンを含む細胞から、及び誘導の有り無しで増殖したｐＥＴ１５ｂ空ベクターを含む細胞からも製造された。タンパク質含量をBradford試薬（Bio Rad）を用いて測定し、１０μg部をＭＯＰＳ緩衝液（Invitrogen）中１０％NuPage Novex Bis Trisゲルで電気泳動した。Ｈｉｓ−タグ化リシンの存在は、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Novagen）を用いてウェスタンブロットにより確認した。タンパク質はNuPage緩衝液 (Invitrogen）を用いてＰＶＤＦ膜に移され、そして検出は二次抗体として抗マウスＩｇＧを用いてQiagen (Qiaexpress検出及び分析便覧)に記載のように行なわれ、そして比色検出はSigma FastBCIP/NBTアルカリ性ホスファターゼ基質でなされた。これにより、ＩＰＴＧ誘導溶解物におけるｃ.３３ｋＤａのＨｉｓタグ化バンドの高発現及び非誘導溶解物の低発現を証明した（図６）。
【０１６２】
粗溶解物によるＣ.ディフィシレの１１２０４及び１１２０７株細胞のリシスは、Loessner ら(３７)によって記載された方法を用いて評価した。１１２０４株細胞は、エンド対数期まで増殖し、１.８ｍｌ分割量をスクリューキャップチューブ（１３，０００×ｇ、２分）中への遠心分離によって採取し、そしてペレットは液体窒素中で急速冷凍して−２０℃で保存した。ペレットは９００μｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中氷上で再懸濁し、そして１００μｌの粗タンパク質溶解物を含むキュベットに加えて、その後ＯＤ600の低下を読み込み前に混合して１時間モニターした。この系で、Ｃ.ディフィシレ細胞は緩衝系中で一定量の溶解を示したが、ΦＣＤ２７リシン粗抽出物による溶解はより急速で多大であった。しかしながら、誘導ｐＥＴ１５ｂエンプティーベクター粗溶解物によるその後の試験は同等の溶解を示し、大腸菌リゾチームの活性を示唆した。この問題を回避するために、ΦＣＤ２７及びＣＤ６３０Ｌ１リシンをQiagenＮｉＮＴＡキットでアフィニティー精製した。ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５０ｍｌのＬブロス中でＯＤ600０.６まで増殖し、次いで１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧにより５時間誘導した。細胞を４０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離することにより採取して、−２０℃で保存した。タンパク質を自然条件で精製し、そして精製はNuPageゲル分析によって確認した（図７）。この方法は大部分がリシンの部分精製タンパク質を産生し、その収量は第１のΦＣＤ２７溶出液（Ｅ１）では２.３ｍｇ総タンパク質であり、第２（Ｅ２）では０.５ｍｇであった。Ｅ１溶出液の希釈液のインキュベーションは、同様に調製した細胞からの溶出液に比べて１１２０４株細胞の急速溶解を示したが、ｐＥＴ１５ｂ空ベクターを発現した。しかしながら、ＣＤ６３０Ｌ１Ｅ１溶出液は１１２０４株を溶解せずに、そしてΦＣＤ２７リシンとの相乗効果は見られなかった。
【０１６３】
溶解分析は、Bioscreen C (Labsystems）及び溶出緩衝液（EB, Qiagen）でのＮｉＮＴＡ部分精製リシン抽出物を用いたマルチウェルプレート中で継続した。初期分析は、分光光度計分析におけるように、３０μｌのＥＢ及び２７０μｌの細胞の全容積中の約（ｃ.）７μｇのタンパク質を用いた。分析は氷上にセットアップし、次いで３７℃に予熱されたBioscreen Cに移し、そしてプログラムは以下のように実施した：６００ｎｍの光学密度でサンプリング前に１０秒振盪して２分毎にサンプリングした。各分析は、緩衝液だけの２ウェル及びリシンの２ウェルで実施し、全部で４ウェルに同じ細菌細胞懸濁液から植菌した。この系では、感受性株のリシンウェル中の溶解は迅速であり−その差は５分以内で顕著であった。しかしながら、リシン誘導溶解よりもはるかに低速にもかかわらず、緩衝液だけの対照での溶解も顕著であった（図８）。
【０１６４】
Ｃ.ディフィシレ及び他の細菌細胞の両方は、エンド対数まで増殖して、凍結せずに氷上で採取し、次いで可及的速やかに分析した場合、緩衝液だけの溶解は減少し又は全体的に欠如しており（図９）、他の種全ての溶解は、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・ソルデリ、バシラス・セレウスを注目すべき例外として欠如しており、そして枯草菌及びリステリア・イバノビイイで若干欠如していた（図１１、表２）。胃腸管ミクロフローラのＡＴリッチクロストリジウム様成分の代表である更なる菌株について、ΦＣＤ２７リシンに対する感受性を試験した。表３に示されるように、試験したいずれもリシンに感受性ではなかった。
【０１６５】
新鮮細胞の使用は、１２分までの顕著な遅延を伴う、Ｃ.ディフィシレへの溶解の迅速開始の程度は小さかった（図９）。全てのＣ.ディフィシレ株を第２ＮｉＮＴＡカラムから単離した３.５μｇのリシンを用いて再試験した（第１精製と同等のリシスを示すことを試験した；図１０）。新鮮又は凍結細胞を用いたいずれの場合にも、感受性プロファイルは、リシンに対して明らかな感受性示す３０株全てで同様であった（表１）。
【０１６６】
ΦＣＤ２７リシンのｐＨプロファイルはを、感受性株１１２０４を用いて試験した−活性は、ｐＨ４.５、５.８、６.５、７.０、７．３（ＰＢＳの通常のｐＨ）、７．６及び８.３で試験して、かなりのｐＨ範囲内でほとんど変動を示さなかった。希釈系列は、３００μｌ分析において１０.５μgタンパク質での活性が最大であったが、良好な溶解は３.５μｇ及び０.７μgでも見られた。しかしながら、０．３５μgは緩衝液対照をわずかに下回る反応を示し、より低い量では４５分分析内で溶解を示さなかった。
【０１６７】
胃腸管へのΦＣＤ２７リシンの送達は、物理的カプセル化又は乳酸菌の１メンバーなどの組み換え片利共生微生物の使用により達成することができた。乳酸連鎖球菌はこの点で可能性を確立しており、それ故この種におけるΦＣＤ２７リシンのサブクローニング及び発現が実証された。ΦＣＤ２７リシン配列をベクターｐＵＫ２００Ｈｉｓへサブクローニングした。これは、NcoIによるｐＵＫ２００の制限、末端充填、次いでナイシン誘導性プロモーターから下流の６−ヒスチジンタグ（ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＣ）［配列番号７］をコード化するオリゴマーの挿入により構築される、nisA翻訳融合プラスミドｐＵＫ２００の誘導体である（３８）。再循環した場合、これはサブクローニングのためのNcoI部位を再作製した（Hornら、未発表）。ベクターｐＵＫ２００Ｈｉｓは、NcoIで制限され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）で末端充填されて、nisAプロモーターの制御下翻訳融合のための最初のＡＴＧコドンを作製した。phicd27l配列は、ｐＣＲ２．１（上記）においてサブクローニングされたＣＤ２７Ｌ−ＮＤＥ…ＣＤ２７Ｌ−ＸＨＯ  ＰＣＲ産物から増幅された。プライマーＣＤ２７ＬＣＯＤ２＿Ｆ（５’−ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＣＡＣ）［配列番号８］及びＭ１３前方（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ）［配列番号９］は、第２コドンＡＡＡからの完全配列、及びある種のベクター配列を増幅し、リシンコード配列のすぐ後にEcoRI部位を与えた。増幅は上記のようであったが、アニーリング温度は５６℃であった。ＰＣＲ産物及びNcoI-カットの、末端充填ｐＵＫ２００Ｈｉｓベクターは、EcoRIにより制限され、そして相互に連結されてnisAプロモーターの制御下にＨｉｓタグ化翻訳融合体が作製された。連結反応産物は、配列検証のためにエレクトロコンピテント大腸菌株ＭＣ１０２２に形質転換され、陽性形質転換体をクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）で選択した。次いで精製プラスミド調製品をエレクトロコンピテント乳酸連鎖球菌株ＦＩ１０６７６に形質転換し、そして５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＧＭ１７寒天で選択した。
【０１６８】
ｐＵＫ２００Ｈｉｓ−ｐｈｉＣＤ２７Ｌ又はｐＵＫ２００Ｈｉｓ空ベクター制御を発現する乳酸連鎖球菌株は、３０℃静置で５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにより１０ｍｌのＧＭ１７ブロス中で増殖した。１００μｌの一夜培養液を使用して予熱ブロスを植菌した結果、培養液は中間期対数（ＯＤ600０.５）まで増殖した。発現は３０℃で５時間１ｎｇ／ｍｌのナイシンで誘導し、粗タンパク質溶解物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭのＮａＣｌ中に大腸菌で記載のように産生した。ΦＣＤ２７リシンの乳酸菌発現の証明が、タンパク質ゲル解析で示された（図１３）。乳酸連鎖球菌に発現したΦＣＤ２７リシンに対するクロストリジウム・ディフィシレ株１１２０４の感受性が、図１４に示されるように粗タンパク質抽出物を用いて証明された。
【０１６９】
【表１】
2011504366.tif 000004
【０１７０】
【表２】
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【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
【表５】
2011504366.tif 000008
【０１７４】
上記に加えて、健常腸生理を維持するために、望ましくは有害でない片利共生生物株を代表する多くの追加菌株は、本発明のリシンとの接触により害されないことが知られている。ΦＣＤ２７に対して試験した以下のクロストリジウム種の全て、ＤＳＭＺからの全てにおいて、全てが溶解をもたらさなかった。これらの菌株は、Eckbergら(2005) Science 308 1635- 及び補充論文、及び Kikuchi ら (2002) Microbiol. Immunol. 46, 353 及び引用文献を参考にして、ヒトの腸に通常見られる主要クロストリジウム菌株群の代表であることを基準に、特異的に選択された。
【０１７５】
【表６】
2011504366.tif 000009
【０１７６】
全てのＣ.ディフィシレ株を、同じ方法で大腸菌に発現したＣ.ディフィシレ株６３０のプロファージ１リシンに対して試験し、その結果ＣＤ６３０Ｌ１リシンは溶解をもたらさなかった。
【０１７７】
細胞生存性
細胞生存性に対するｐｈｉＣＤ２７の効果を測定するために、反復分析が前還元（pre-reduced）緩衝液及び培地を用いて嫌気性条件下に設定された。細胞はエンド対数で増殖され、嫌気性条件下で遠心分離により採取し、次いでＰＢＳ緩衝液中ｐＨ７.３で再懸濁した。ＰＢＳ中でｃ.１×１０8細胞からｃ.１×１０3細胞まで１０倍希釈を行なった；各分析において細胞数の評価が可能なように、それらの１０μｌ分割量を０時点でＢＨＩ寒天上にスポットした。分析は２回ずつとし、１００μｇの部分精製エンドリシン（Ｅ１）か又は等量（５０μｌ）の緩衝液（ＥＢ）及び３００μｌの最終量までの細胞を含有した。連続的な穏やかな振盪による２時間のインキュベーション後、ＰＢＳ中の１０倍連続希釈で３０μｌの試料を採取した；これらの希釈液の１０μｌ分割量をＢＨＩ寒天上にスポットし、各２回ずつのペアの１つから残りの２７０μｌ分析量を細胞計数可能なように塗布した。
【０１７８】
０時点でｃ.１×１０8細胞を含む分析では、２時間のインキュベーション後１対数の低下を示したが、一方で１×１０7細胞又は１×１０6細胞が加えられた分析では、緩衝液対照に比べて２対数の低下を示した。低めの初期細胞数による分析では、リシンはより有効で、１×１０5細胞を植菌した分析からわずか４生存コロニーが回収されただけで、１×１０4細胞以下の分析では生存細胞は残っていなかった。
【０１７９】
次いで上記の生存性分析を、Ｎｉ−ＮＴＡ溶出緩衝液（ＥＢ）を２０ｍＭのｐＨ６リン酸緩衝液（ＮＰ）で置き換えるために、２ｍｌのZeba Desaltスピンカラム（Pierce）を用いて、緩衝液交換にかけていたＥ１の４００μｌの分割量を用いて繰り返した。ＮＰ緩衝液中のリシンは、クロストリジウム・ディフィシレ１１２０４の凍結細胞に対して元のＮｉＮＴＡＥ１と同等の活性を示した（図１５）。５０μｇのＥ１−ＮＰ又はＮＰ緩衝液対照及びｃ.１×１０6細胞を用いて、上記の生存性分析を繰り返した；リシンによる２時間インキュベーションは緩衝液対照に比べて３対数の低下をもたらした。
【０１８０】
上記データはその後公表科学論文原稿（Mayer et al., 2008, J. Bacteriol. 190:6734-6740）の基礎となったが、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１８１】
ドメイン交換
スプライス重複ＰＣＲによるΦＣＤ２７Ｌエンドリシン上への新しい酵素ドメインの設計
リステリア・モノサイトゲネスに対して活性なバクテリオファージΦＬＭ４からのエンドリシンＬＭ−４は、宿主細胞の有効な溶解をもたらすことが示された（英国特許公開公報第２２５５５６１（Ｂ）号）。エンドリシンは８６４ｂｐの長さで、ｐｆａｍ２５５７、ＶａｎＹ、蛋白質の始部のＤ−アラニル−Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ及びＣＯＧ５６３２、全配列にわたりＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（NCBI Blast）に相同性を示す２８７アミノ酸のタンパク質を与えた。提案酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）をコード化する配列の前半は、スプライス重複伸長ＰＣＲにより、ＣＤ２７Ｌ細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ、Ａｓｎ１８０から最終のＡｒｇ２７０）か又は全２７０アミノ酸酵素の上流に挿入された。ＬＭ４酵素ドメインは、ＬＭ４のＡＴＧのＮｄｅＩ部位を作製するために、プライマーＬＭ４Ｎｄｅ５’−ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  Ｇ［配列番号１０］、及び２つのスプライス重複プラマーの１つ：ＬＭ４  ＥＡＤ−ＣＤ２７Ｌ  ＥＡＤ−ＣＢＤを与えるために、ＣＤ２７Ｌ酵素の最初の１５ヌクレオチドに適合する尾部を有するＬＭ４配列の、ヌクレオチド４３９〜４５３、Ｔｈｒ１４７からＡｓｎ１５１を表わす、ＬＭ４−スプライス−ＣＤ２７ＬＥ  ５’−ＴＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＡＧＴ［配列番号１１］；又は、ＬＭ４  ＥＡＤ−ＣＤ２７Ｌ  ＣＢＤを与えるために、Ａｓｎ１８０からＡｒｇ２７０のＣＤ２７Ｌの提案Ｃ末端結合ドメインに適合する尾部を有するＬＭ４配列のヌクレオチド４３９〜４５３、Ｔｈｒ１４７からＡｓｎ１５１を表わす、ＬＭ４−スプライス−ＣＤ２７Ｌ  ５’−ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＡＧＴ［配列番号１２］、を用いてプラスミドｐＦＩ５６７ (Payne et al., 1996 FEMS Microbiology Letters 136: 19-24）からＰＣＲによって増幅した。同様に、ＣＤ２７Ｌ全配列又はＣＢＤは、ベクター、Ｔ７Ｔ  ５’−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ［配列番号１３］からのプライマー、及びＬＭ４  ＥＡＤ配列末端−そこでプライマーの最後の２０ｎｔがＭｅｔ１からのＣＤ２７Ｌ配列の始めをコード化する、全配列に対する、ＣＤ２７ＬＥスプライスＬＭ４  ５’−ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴ［配列番号１４］；及びプライマーの最後の１６ｎｔがＡｓｎ１８０からのＣＤ２７Ｌ配列の提案ＣＢＤをコード化する、ＣＢＤだけに対するＣＤ２７ＬスプライスＬＭ４  ５’−  ＣＴ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  Ｃ［配列番号１５］に適合する尾部を有したスプライシングプライマー、を用いてΦＣＤ２７Ｌ−ｐＥＴ１５ｂから増幅した。ＰＣＲを、元の鋳型に１００％適合を与えるスプライシングプライマー部分に適合するように５サイクルのアニーリング温度を用い、次いで２０サイクルは全スプライシングプライマーに適合するアニーリング温度にて、メーカー推奨の条件でPhusion (Finnzymes）により実施した。生成物は、SureClean (Bioline) を用いて精製し、５０μｌの容積に再懸濁した。これらの鋳型を１００倍希釈し、そ���て１μｌ分割量を、２配列のスプライシングを可能にするアニーリング温度（５４℃）で、元の外側プライマー−ＬＭ４Ｎｄｅ及びＴ７Ｔ−を用いてＰＣＲ反応に使用した。最終生成物をSureCleanで精製し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで制限し、そしてＨｉｓ−タグ化ＬＭ４−ＣＤ２７ＬＥ及びＬＭ４−ＣＤ２７Ｌを生産するために、ｐＥＴ１５ｂにサブクローニングした。次いでこれらのプラスミドは大腸菌に形質転換され、それらの配列が確認された。
【０１８２】
複合酵素の粗抽出物及びＮｉＮＴＡ精製抽出物の両方を生成して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法で解析し、そして前述のように分析した（図１６参照）。Ｈｉｓ−タグ化ＬＭ４−ＣＤ２７ＬＥ及びＬＭ４−ＣＤ２７Ｌの両方は、粗抽出物中に高レベルで存在した。Ｃ.ディフィシレ１１２０４の凍結細胞をＰＢＳ緩衝液中、ｐＨ５.８でインキュベートした場合、１０μｇのＮｉＮＴＡ精製抽出物は、緩衝液対照に比べて迅速溶解をもたらし（図１７参照）、ＬＭ４−ＣＤ２７ＬＥは天然のＣＤ２７Ｌと同様の溶解速度を示した。細胞希釈剤としてｐＨ７.３でＰＢＳ緩衝液を用いて等価活性が見られた。
【０１８３】
生存性分析において、ＬＭ４−ＣＤ２７ＬＥ及びＬＭ４−ＣＤ２７Ｌの両方のＮｉＮＴＡ精製溶出液は生存数の低下をもたらした（図１７参照）。５０μgＮｉＮＴＡＥ１を用いた、ｃ.１×１０4細胞を含む分析は、緩衝液対照に比べて２時間インキュベーション後に少なくとも１対数の減少を示した。この低下は天然酵素で見られたほどに大きくはなく、他の酵素ドメインの添加は、Ｃ.ディフィシレを死滅させる能力を有する活性な新しい酵素を生産することができるという原理を証明した。
【０１８４】
野生型ＬＭ４及びドメインを交換したリシンのヌクレオチド及びアミノ酸配列 
【化２】
2011504366.tif 000010
【０１８５】
【化３】
2011504366.tif 000011
【０１８６】
【化４】
2011504366.tif 000012
【０１８７】
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【図１】
2011504366.tif 000013
【図２】
2011504366.tif 000014
【図３】
2011504366.tif 000015
【図４ａ−１】
2011504366.tif 000016
【図４ａ−２】
2011504366.tif 000017
【図４ａ−３】
2011504366.tif 000018
【図４ｂ】
2011504366.tif 000019
【図５】
2011504366.tif 000020
【図６ａ】
2011504366.tif 000021
【図６ｂ】
2011504366.tif 000022
【図７】
2011504366.tif 000023
【図８】
2011504366.tif 000024
【図９】
2011504366.tif 000025
【図１０ａ】
2011504366.tif 000026
【図１０ｂ】
2011504366.tif 000027
【図１０ｃ】
2011504366.tif 000028
【図１１ａ−１】
2011504366.tif 000029
【図１１ａ−２】
2011504366.tif 000030
【図１１ａ−３】
2011504366.tif 000031
【図１１ａ−４】
2011504366.tif 000032
【図１１ｂ−１】
2011504366.tif 000033
【図１１ｂ−２】
2011504366.tif 000034
【図１１ｂ−３】
2011504366.tif 000035
【図１１ｂ−４】
2011504366.tif 000036
【図１２】
2011504366.tif 000037
【図１３Ａ】
2011504366.tif 000038
【図１３Ｂ】
2011504366.tif 000039
【図１４】
2011504366.tif 000040
【図１５】
2011504366.tif 000041
【図１６】
2011504366.tif 000042
【図１７】
2011504366.tif 000043
【配列表】
2011504366000001.app
【国際調査報告】
2011504366.tif 000044
2011504366.tif 000045
2011504366.tif 000046
2011504366.tif 000047
2011504366.tif 000048