(57)【要約】  細胞培養物中で繁殖欠損水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法を提供する。この方法は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子をコードしているプラスミドベクターを細胞内に導入することと、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現させることと、繁殖欠損ＶＳＶを、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞内に導入することとを含む。この方法は、細胞を培養で成長させることと、繁殖欠損ＶＳＶを培養物から回収することとをさらに含む。【図１】2011507515.tif 000008
2011507515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法であって、
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むプラスミドベクターを細胞内に導入することと、
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現させることと、
ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を弱毒化したＶＳＶに感染させることと、
感染した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したＶＳＶを培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項２】
弱毒化したＶＳＶが繁殖欠損ＶＳＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感染ステップが、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入した細胞と同時培養することを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
電気穿孔によって細胞を形質移入する、請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスゲノムの長さのＲＮＡが、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドから転写される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターおよび支持プラスミドがＴ７プロモーターの制御下にある、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
支持プラスミドによってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質が、最適化されていないＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされている、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
支持プラスミドによってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質が、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされている、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が、機能的なｍＲＮＡを産生するＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される転写単位の制御下にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、インディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが転写終結配列に作動可能に連結している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがリボザイム配列に作動可能に連結している、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
弱毒化したＶＳＶが異種抗原をコードしている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
異種抗原が病原体由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
病原体が、麻疹ウイルス、サブグループＡおよびサブグループＢの呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、１型または２型のヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびトラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
弱毒化したＶＳＶが、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発することができる微生物病原体もしくは寄生生物のタンパク質から選択される、非ウイルス分子をさらにコードしている、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が適格な産生細胞である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がＶｅｒｏ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
弱毒化したＶＳＶがＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
弱毒化したＶＳＶの収量が、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
弱毒化したＶＳＶが、切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
弱毒化したＶＳＶの収量が、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
弱毒化したＶＳＶが、切断された細胞質尾部（ＣＴ）領域を有するＧタンパク質を発現する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
弱毒化したＶＳＶが、１個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ１）を発現する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
弱毒化したＶＳＶが、９個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ９）を発現する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
弱毒化したＶＳＶが、ウイルスゲノム中のその野生型の位置から下流に転座しているＮ遺伝子を含み、それによってＮタンパク質発現が低下している、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
弱毒化したＶＳＶが、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異（Ｍｎｃｐ）を含有し、前記突然変異は、内部ＡＵＧでタンパク質合成を開始すること、ＩＦＮ誘導に影響を与えること、核輸送に影響を与えること、またはその組合せによって、Ｍタンパク質のｍＲＮＡから発現される２つの重複するインフレームのポリペプチドの発現を低下させる、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法であって、
細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入することと、
形質移入した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したＶＳＶを培養物から救済することと、
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、救済された弱毒化したＶＳＶに感染させることと、
感染した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したＶＳＶを感染した細胞の培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項３２】
細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
弱毒化したＶＳＶが繁殖欠損ＶＳＶである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターおよび支持プラスミドがＴ７プロモーターの制御下にある、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ゲノムの長さのＲＮＡが、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドから転写される、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
支持プラスミドによってコードされているＧタンパク質が、最適化されていないＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされている、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が、機能的なｍＲＮＡを産生するＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される転写単位の制御下にある、請求項３１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、インディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
電気穿孔によって細胞を形質移入する、請求項３１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
弱毒化したＶＳＶが異種抗原をコードしている、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、請求項３１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
弱毒化したＶＳＶがＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）、請求項３１から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
弱毒化したＶＳＶの収量が、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
弱毒化したＶＳＶが、切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）、請求項３１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
弱毒化したＶＳＶの収量が、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
繁殖欠損水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のパッケージングを改善する方法であって、
ａ）最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子をコードしているプラスミドベクターを細胞内に導入することと、
ｂ）最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的に発現させることと、
ｃ）繁殖欠損ＶＳＶを、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的に発現する細胞内に導入することと、
ｄ）細胞を培養で成長させることと、
ｅ）パッケージングされたＶＳＶを培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項４８】
薬学的に許容できる担体中に、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法に従って産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したＶＳＶを含む免疫原性組成物。
【請求項４９】
弱毒化したＶＳＶが異種抗原をコードしている、請求項４８に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を細胞培養物中で産生するための組成物であって、
ａ）最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むベクターと、
ｂ）弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドと、
ｃ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているベクターと
を含む組成物。
【請求項５１】
構成要素ｃ）によってコードされているＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ｉ−Ｎタンパク質、
ｉｉ−Ｐタンパク質、
ｉｉｉ−Ｌタンパク質、
ｉｖ−Ｍタンパク質、および
ｖ−Ｇタンパク質
から選択されるＶＳＶタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持ベクターをさらに含む、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
ｂ）の弱毒化したＶＳＶが繁殖欠損ＶＳＶである、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むベクター
を含む、弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を細胞培養物中で産生するためのキット。
【請求項５５】
弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクターと、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているベクターと
をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
ｉ−Ｎタンパク質、
ｉｉ−Ｐタンパク質、
ｉｉｉ−Ｌタンパク質、
ｉｖ−Ｍタンパク質、および
ｖ−Ｇタンパク質
から選択されるＶＳＶタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持ベクターをさらに含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに関する。より詳細には、本発明は、細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーであり、したがって、セグメント化されていないマイナス鎖ＲＮＡゲノムを含有する外被に包まれたウイルスである。これは、連続して３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’に配置されている５個の遺伝子の領域からなる、比較的単純なゲノムである（図１）（ＲｏｓｅおよびＷｈｉｔｔ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第４版、第１巻．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１２２１〜１２４４、２００１）。
【０００３】
Ｎ遺伝子は、ゲノムのカプシド形成を司っているヌクレオカプシドタンパク質をコードしている一方で、Ｐ（リンタンパク質）およびＬ（大）コード配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットを特定する。マトリックスタンパク質（Ｍ）は、ビリオン成熟を促進し、ウイルス粒子の内部表面を裏打ちしている。ＶＳＶは、細胞付着タンパク質として役割を果たし、膜融合を媒介し、中和抗体の標的である、単一の外被糖タンパク質（Ｇ）をコードしている。
【０００４】
ＶＳＶは、数々の特性により、これがヒトで使用するための免疫原性組成物におけるベクターとして魅力的な候補となるため、ますますの集中的な研究および開発の努力の主題となっている（Ｂｕｋｒｅｙｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１０２９３〜３０６、２００６、Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２８：２３９〜２５３、２００６）。これらの特性には、１）ＶＳＶはヒトの病原体でないこと、２）ヒトにおけるその使用を妨害し得る既存の免疫がわずかしか存在しないこと、３）ＶＳＶは多くの細胞種に容易に感染すること、４）免疫原性組成物の製造に適した細胞系中で効率的に繁殖すること、５）遺伝的に安定している、６）組換えウイルスを産生することができる方法が存在すること、７）ＶＳＶは、１つまたは外来遺伝子挿入物を許容し、感染の際に高い発現レベルを誘導できること、ならびに８）ＶＳＶ感染は、細胞性および液性免疫の両方の効率的な誘導因子であることが含まれる。逆遺伝学方法（Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：４４７７〜８１、１９９５、Ｓｃｈｎｅｌｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３：４１９５〜２０３、１９９４）が開発された後、これにより組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ）を設計することが可能となり、最初のベクターは、必須の遺伝子間転写制御エレメントと共に、外来コード配列がＧおよびＬ遺伝子の間に挿入されて設計された（図１）。これらのプロトタイプベクターは、外来抗原に対して強力な免疫応答を誘発し、それらを試験した動物モデルにおいて良好に許容されたことが見出された（Ｇｒｉｇｅｒａら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ、６９：３〜１５、２０００、Ｋａｈｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５：１１０７９〜８７、２００１、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：３７２３〜３２、１９９９、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：４７０４〜１１、１９９８、Ｒｏｓｅら、Ｃｅｌｌ、１０６：５３９〜４９、２００１、Ｒｏｓｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：１０９０３〜１０、２０００、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：４６５２〜７、２０００）。注目すべきことに、Ｒｏｓｅらは、一方がＨＩＶ−１ｅｎｖをコードしており、他方がＳＩＶ  ｇａｇをコードしている２つのベクターの同時投与により、免疫化したマカクにおいて、病原性ＳＨＩＶを用いた誘発に対して保護した免疫応答が生じたことを見出している（Ｒｏｓｅら、Ｃｅｌｌ、１０６：５３９〜４９、２００１）。
【０００５】
プロトタイプウイルスによる有望な前臨床性能により、ヒトで使用するためのｒＶＳＶベクターの開発がもたらされた（Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、２８：２３９〜２５３、２００６）。高度に弱毒化したベクターの調査は、増強した安全性プロフィールを提供し得るため、相当な注目を受けている。このことは、検討中の多くの免疫原性組成物は、易感染性の免疫系を有する患者（すなわち、ＨＩＶに感染した対象）において使用する可能性があるため、特に関連性がある。
【０００６】
高度に弱毒化したベクターを開発する要望は、繁殖欠損ｒＶＳＶベクターに一部の注目を集中させている。理想的には、繁殖欠損ベクターは、感染後のウイルスの繁殖および伝播を遮断する遺伝的欠陥を有するが、遺伝子発現装置を最小限にしか妨害せず、保護的免疫応答を誘導するために十分な抗原合成を可能にして、設計する。この目的を念頭に置いて、繁殖欠損ｒＶＳＶベクターは、ウイルス付着タンパク質であるＶＳＶ  Ｇ（Ｇ、図２）の操作を通して生成されている。Ｇ遺伝子が完全に欠失している（ＶＳＶ−ΔＧ）、または切断されて細胞外ドメインのほとんどを欠くＧタンパク質をコードしている（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）、様々な抗原および分子アジュバントをコードしているベクターが開発されている（Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、２８：２３９〜２５３、２００６）、Ｋａｈｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５：１１０７９〜８７、２００１、Ｋｌａｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４：１４５１〜６１、２００６、Ｋｌａｓら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１８：５９〜７３、２００２、Ｍａｊｉｄら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８０：６９９３〜７００８、２００６、Ｐｕｂｌｉｃｏｖｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９：１３２３１〜８、２００５）（Ｗｙｅｔｈの未公開データ）。ＶＳＶ−ＧｓｔｅｍおよびＶＳＶ−ΔＧなどの繁殖欠損ベクターは、機能的な付着タンパク質をコードしておらず、Ｇタンパク質を発現する細胞内にパッケージングする必要がある。
【０００７】
ΔＧおよびＧｓｔｅｍベクターは有望であるが、ヒトに投与するための免疫原性組成物の製造を管理している規制に準拠した拡張可能な繁殖方法の開発が、依然として、臨床評価を正当化できる前に対処しなければならないハードルである。実行可能な産生方法は、感染性ウイルス粒子の形態形成または「パッケージング」を刺激するために、十分な量の機能的なＧタンパク質をトランスで提供する必要がある。満足できるレベルのＧタンパク質発現の達成は、Ｇが、膜融合を媒介することが部分的な原因で、細胞系に毒性があるという事実によって複雑となっている（ＲｏｓｅおよびＷｈｉｔｔ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第４版、第１巻．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１２２１〜１２４４、２００１）。この毒性により、ウイルス糖タンパク質を構成的に発現する補完細胞系の開発が妨げられる。同様に、誘導性プロモーターからＧタンパク質を発現する安定な細胞系の開発は、漏出発現頻度が毒性をもたらし、また、特に免疫原性組成物の製造に必要なスケールでは、誘導後に達成されるレベルは、多くの場合効率的なパッケージングを促進するためには不十分であるため、問題がある。１つの誘導性細胞系が記載されているが（Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｃｅｌｌ、９０：８４９〜５７、１９９７）、これは、しばしば、数継代後にＧタンパク質を発現するその能力を失い、また、ヒトに投与するための免疫原性組成物の産生に現在適格な細胞種ではないＢＨＫ細胞に由来する。形質移入したＢＨＫ（Ｍａｊｉｄら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８０：６９９３〜７００８、２００６）もしくは２９３Ｔ（Ｔａｋａｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４：１４７６４〜９、１９９７）細胞または電気穿孔したＶｅｒｏ細胞（Ｗｉｔｋｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３５：９１〜１０１、２００６）におけるＧタンパク質の一過性の産生も、繁殖欠損ＶＳＶの繁殖に使用されている。
【０００８】
本発明以前には、一過性Ｇタンパク質発現は、前臨床研究に必要な、比較的小スケールの量のｒＶＳＶ−ΔＧおよびｒＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍベクターを産生するために十分であることが証明された。しかし、公開された手順は、ヒトで使用するための産生に適格でない細胞系（すなわちＢＨＫ）を日常的に利用するか、または、プロトコルが大スケールでの製造に適応および最適化されていないため、これらの以前の方法は、現在臨床開発に不十分である。さらに、これらの以前の方法を用いたウイルス粒子の観察された収量は、一般に１×１０７ＩＵ／ｍｌ未満であり（データ示さず）、単一のヒト用量は少なくとも１×１０７ＩＵ／ｍｌであることが予測されることを考慮すると、ＶＳＶベクターの製造は、培地１ｍｌあたり１０７ＩＵより多くが産生される場合にのみ実用的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、回収される弱毒化したＶＳＶ粒子の収量が、免疫原性組成物の製造において有用であるために十分である、弱毒化したＶＳＶ粒子を産生する方法が当分野で必要である。また、そのような方法は、ヒトに投与するための産生に適格な細胞を用いる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法を提供する。この方法は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むプラスミドベクターを細胞内に導入することと、前記最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現させることと、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を弱毒化したＶＳＶに感染させることと、感染した細胞を培養で成長させることと、弱毒化したＶＳＶを培養物から回収することとを含む。本方法の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは繁殖欠損ＶＳＶである。
【００１１】
上述の方法の一実施形態では、感染ステップは、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入した細胞と同時培養することを含む。本方法の特定の実施形態では、細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する。一部の好ましい実施形態では、電気穿孔によって細胞を形質移入する。
【００１２】
本発明は、細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生するさらなる方法を提供する。この方法は、細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入することと（たとえば電気穿孔によって）、形質移入した細胞を培養で成長させることと、弱毒化したＶＳＶを培養物から救済することと、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、救済された弱毒化したＶＳＶに感染させることと、感染した細胞を培養で成長させることと、弱毒化したＶＳＶを感染した細胞の培養物から回収することとを含む。特定の実施形態では、ウイルス救済細胞を、ＶＳＶ  Ｍタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する。本方法の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは繁殖欠損ＶＳＶである。
【００１３】
また、本発明は、繁殖欠損水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のパッケージングを改善する方法も提供する。この方法は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子をコードしているプラスミドベクターを細胞内に導入することと（たとえば形質移入によって）、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的に発現させることと、繁殖欠損ＶＳＶを、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的に発現する細胞内に導入することと、細胞を培養で成長させることと、パッケージングされたＶＳＶを培養物から回収することとを含む。繁殖欠損ＶＳＶは、たとえば、そのような細胞を繁殖欠損ＶＳＶに感染させることによって、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的に発現する細胞内に導入し得る。一部の実施形態では、この感染は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、繁殖欠損ＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入した（たとえば電気穿孔によって）細胞と同時培養することによって達成する。特定の実施形態では、細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、適格な産生細胞である細胞を用いる。一部の実施形態では、適格な産生細胞はＶｅｒｏ細胞である。
【００１５】
本発明の方法の一部の実施形態では、ウイルスゲノムの長さのＲＮＡは、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドから転写される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写終結配列に作動可能に連結している。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、リボザイム配列に作動可能に連結している。
【００１６】
本発明の方法の一部の好ましい実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターおよび支持プラスミドはＴ７プロモーターの制御下にある。
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態では、支持プラスミドによってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質は、最適化されていないＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされている。他の実施形態では、支持プラスミドによってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされている。
【００１８】
本発明の方法の一部の実施形態では、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現は、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。本発明の方法の一部のさらなる実施形態では、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現は、機能的なｍＲＮＡを産生するＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される転写単位の制御下にある。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の方法で用いる最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、インディアナ型（Ｉｎｄｉａｎａ）ＶＳＶ血清型またはニュージャージー型（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）ＶＳＶ血清型に由来する。一部の実施形態では、本発明の方法で用いる最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明の方法によって産生される弱毒化したＶＳＶは、異種抗原をコードしている。異種抗原は、たとえば病原体由来であり得る。一部の実施形態では、病原体は、それだけには限定されないが、麻疹ウイルス、サブグループＡおよびサブグループＢの呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、１型または２型のヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびトラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）から選択され得る。
【００２１】
本発明の方法の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発することができる微生物病原体もしくは寄生生物のタンパク質から選択される、非ウイルス分子をさらにコードしている。
【００２２】
本発明の方法の一実施形態では、弱毒化したＶＳＶはＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）。特定の実施形態では、本発明の方法を用いたＶＳＶ−ΔＧの収量は、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える。
【００２３】
本発明の方法の一部の他の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）。特定の実施形態では、本発明の方法を用いたＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍの収量は、約１×１０６ＩＵ／培養物１ｍｌを超える。
【００２４】
本発明の方法の一部のさらなる実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、切断された細胞質尾部（ＣＴ）領域を有するＧタンパク質を発現する。特定の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、１個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ１）を発現する。他の特定の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、９個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ９）を発現する。
【００２５】
本発明の方法のさらなる実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、ウイルスゲノム中のその野生型の位置から下流に転座しているＶＳＶ  Ｎ遺伝子を含み、それによってＶＳＶ  Ｎタンパク質発現が低下している。本発明の方法のさらなる実施形態では、弱毒化したＶＳＶは非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異（Ｍｎｃｐ）を含有し、前記突然変異は、内部ＡＵＧでタンパク質合成を開始すること、ＩＦＮ誘導に影響を与えること、核輸送に影響を与えること、またはその組合せによって、Ｍタンパク質のｍＲＮＡから発現される２つの重複するインフレームのポリペプチドの発現を低下させる。
【００２６】
さらに、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明の方法のいずれかに記載のように産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したＶＳＶを含む免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは異種抗原をコードしている。
【００２７】
また、本発明は、弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を細胞培養物中で産生するための組成物も提供する。組成物は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むベクターと、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドと、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているベクターとを含む。別の実施形態では、組成物は、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、およびＧタンパク質から選択されるＶＳＶタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持ベクターをさらに含む。
【００２８】
組成物の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドによってコードされているＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。一部のさらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、繁殖欠損ＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしている。
【００２９】
また、本発明は、弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を細胞培養物中で産生するためのキットも提供する。キットは、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含むベクターを少なくとも含む。
【００３０】
キットは、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクターと、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているベクターとをさらに含有し得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態では、キットは、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、およびＧタンパク質から選択されるＶＳＶタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持ベクターをさらに含む。
【００３１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、天然のＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列（インディアナ血清型）であり、
配列番号２は、天然のＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列（ニュージャージー血清型）であり、
配列番号３は、コドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列（ｏｐｔ１、インディアナ血清型）であり、
配列番号４は、ＲＮＡを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列（ＲＮＡｏｐｔ、インディアナ血清型）であり、
配列番号５は、ＲＮＡを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列（ＲＮＡｏｐｔ、ニュージャージー血清型）であり、
配列番号６は、野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞質ドメインである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＲＮＡゲノムの模式図を示す図である。ＶＳＶゲノムは、ヌクレオカプシド（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）および大タンパク質（Ｌ）をコードしている。
【図２】本発明の方法で使用するために適切な、繁殖欠損ＶＳＶベクターの例（ＶＳＶ−ＧｓｔｅｍおよびＶＳＶ−ΔＧ）の模式図を示す図である。ＨＩＶ  Ｇａｇコード配列を外来遺伝子の例として使用している。
【図３】本明細書中に記載のＲＮＡ最適化方法によって得られた、インディアナ血清型のＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列を示す図である。小文字は、最適化中に行った置換を示す。Ｘｈｏ  Ｉ（５’）制限部位（すなわちｃｔｃｇａｇ）およびＸｂａ  Ｉ（３’）制限部位（すなわちｔｃｔａｇａ）を最適化中に付加した。ＥｃｏＲ  Ｉ（５’）制限部位（すなわちｇａａｔｔｃ）は最適化後に付加した。翻訳されたＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応するＲＮＡを最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子（インディアナ）の領域は、配列番号４によって表される。
【図４】本明細書中に記載のＲＮＡ最適化方法によって得られた、ニュージャージー血清型のＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列を示す図である。小文字は、最適化中に行った置換を示す。Ｘｈｏ  Ｉ（５’）およびＸｂａ  Ｉ（３’）制限部位を最適化中に付加した。ＥｃｏＲ  Ｉ（５’）制限部位は最適化後に付加した。翻訳されたＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応するＲＮＡを最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子（ニュージャージー）の領域は、配列番号５によって表される。
【図５】本明細書中に記載のコドン最適化方法（最適化１）によって得られた、インディアナ血清型のＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列を示す図である。Ｘｈｏ  Ｉ（５’）制限部位（すなわちｃｔｃｇａｇ）およびＸｂａ  Ｉ（３’）制限部位（すなわちｔｃｔａｇａ）を最適化中に付加した。ＶＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸配列（インディアナ血清型）を、Ｓｅｑ  Ｗｅｂ配列解析スイート（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）中に提供されるヒトコドン頻度表を用いて逆翻訳した。ＡＴＧ翻訳開始シグナル（四角で囲み、Ｋｏｚａｋ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６６：１９８６７〜７０、１９９１）、および翻訳ターミネーター（二重下線、Ｋｏｃｈｅｔｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４４０：３５１〜５、１９９８）の配列構成を示す。スプライシング部位のコンセンサスとの類似度を低下させるために、下線で示すように４個のコドンを改変した。改変したコドンは以下のとおりであった：１９０のＣＡＧからＣＡＡ（アクセプター部位）、２７７のＣＧＣからＣＧＧ（ドナー部位）、４００のＣＡＧからＣＡＡ（アクセプター部位）、および６２５のＡＣＣからＡＣＧ（アクセプター部位）。翻訳されたＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応するコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子（インディアナ）の領域は、配列番号３によって表される。
【図６】パネルＡは、ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーによって制御される、ＶＳＶ  Ｇタンパク質（インディアナ血清型）をコードしているプラスミドベクターの模式図である。ｐＣＭＶ−Ｇｉｎは、天然のＶＳＶ膜糖タンパク質（Ｇｉｎ）の遺伝子を含む一方で、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／Ｏｐｔ−１およびｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔは、本明細書中に記載のコドンを最適化する（Ｏｐｔ−１）またはＲＮＡを最適化する（ＲＮＡｏｐｔ）方法のどちらかによってそれぞれ得られた、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含む。パネルＢは、Ｖｅｒｏ細胞を、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／Ｏｐｔ１（それぞれレーン２および７）、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔ（それぞれレーン３および８）、またはｐＣＭＶ−Ｇｉｎ（それぞれレーン１および６）を用いて電気穿孔した２４時間および７２時間における、抗ＶＳＶポリクローナル抗血清を用いたＧタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す図である。偽形質移入したＶｅｒｏ細胞（陰性対照）の２４時間および７２時間でのＶＳＶタンパク質発現をそれぞれレーン４および９に示し、ＶＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞（陽性対照）のそれを、それぞれレーン５および１０に示す。
【図７】図の上部は、ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーによって制御される、インディアナ血清型に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質（Ｇｉｎ）をコードしているプラスミドベクターの模式図であり、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎは、天然のＶＳＶ膜糖タンパク質（Ｇｉｎ）の遺伝子を含み、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／Ｏｐｔ−１およびｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔは、本明細書中に記載のコドンを最適化する（Ｏｐｔ−１）およびＲＮＡを最適化する（ＲＮＡｏｐｔ）方法によってそれぞれ得られた、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含む。図の下部のグラフは、天然のＶＳＶ糖タンパク質Ｇｉｎのコード配列（１）、本明細書中に記載のＯｐｔ−１方法によって得られた、最適化したＶＳＶ  Ｇｉｎ遺伝子（２）または本明細書中に記載のＲＮＡ  Ｏｐｔ方法によって得られた、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子（３）を含めたＧ発現プラスミドを用いて電気穿孔した細胞から得られた、ｒＶＳＶ−Ｇａｇ１−ΔＧ（斜線のバー）またはｒＶＳＶ−Ｇａｇ１−Ｇｓｔｅｍ（ベタのバー）のパッケージング収量の比較を示すグラフである。
【図８】ニュージャージー血清型（Ｇｎｊ）またはインディアナ血清型（Ｇｉｎ）に由来する、天然のまたは最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列の一過性発現の比較を示すウエスタンブロット分析の図である。分析は、Ｖｅｒｏ細胞を、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ（それぞれレーン３および４）、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔ（それぞれレーン５および６）、ｐＣＭＶ−Ｇｎｊ（それぞれレーン８および９）、ならびにｐＣＭＶ−Ｇｎｊ／ＲＮＡｏｐｔ（それぞれレーン１０および１１）を用いて電気穿孔した２４時間および４８時間に、抗ＶＳＶポリクローナル抗血清を用いて行った。Ｖｅｒｏ偽形質移入細胞（陰性対照）のＶＳＶタンパク質発現をレーン２および７に示し、Ｖｅｒｏ−ＶＳＶに感染した細胞（陽性対照）のそれを、レーン１に示す。
【図９】図のパネルＡは、ニュージャージー血清型（Ｇｎｊ）またはインディアナ血清型（Ｇｉｎ）に由来する天然のまたは最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列をコードしているプラスミドベクターの模式図である。パネルＢは、パネルＡに示すＧタンパク質発現ベクターを用いて電気穿孔した細胞から得られたｒＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ−ｇａｇ１のパッケージング収量の比較を示す図であり、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ（ａ）、ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔ（ｂ）、ｐＣＭＶ−Ｇｎｊ（ｃ）、およびｐＣＭＶ−Ｇｎｊ／ＲＮＡｏｐｔ（ｄ）に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
明細書および特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形の言及が含まれる。たとえば、用語「細胞」には、その混合物を含めた複数の細胞が含まれる。
【００３４】
本明細書中で使用する用語「含む」とは、組成物および方法が列挙した要素を含むことを意味するが、他の要素を排除しないことを意図する。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「弱毒化したウイルス」などとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで成長または複製するその能力において制限されているウイルスをいう。
【００３６】
用語「ウイルスベクター」などとは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞内に送達するポリヌクレオチドが含まれる、組換えによって産生したウイルスまたはウイルス粒子をいう。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、ＤＮＡ分子ならびにＨｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含めた対応するＲＮＡ分子が含まれ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組換えＤＮＡ、ならびに完全にまたは部分的に合成のポリヌクレオチドが包含される。ＨｎＲＮＡ分子はイントロンを含有し、一般に１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する。ｍＲＮＡ分子は、イントロンを切り出したＨｎＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体、またはその任意の一部分からなり得る。作動可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチド断片を含む場合があり、したがって、「ポリヌクレオチド」の定義には、すべてのそのような作動可能なアンチセンス断片が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドに関与する技術は当分野で周知であり、たとえば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：３６３〜３７５、１９９５、およびＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ、２０：８３６〜８４８、１９９６に記載されている。
【００３８】
本明細書中で使用する「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスをいう。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合は、適切な真核宿主が選択された場合、発現にはｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【００３９】
用語「一過性発現」、「一過的に発現された」などとは、タンパク質またはＲＮＡ種を発現させる目的で細胞によって取り込まれるように、クローニングした遺伝子が細胞内に導入されることを意味することを意図し、発現は時間と共に減衰し、遺伝しない。形質移入は、クローニングしたＤＮＡを細胞内に導入する一手法である。ＤＮＡを細胞内に導入するために有用な形質移入剤には、たとえば、リン酸カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、および電気穿孔が含まれる。
【００４０】
用語「構成的発現」、「構成的に発現された」などとは、遺伝子産物の定発現を意味する。
【００４１】
用語「誘導可能な発現」とは、誘導性プロモーターからの遺伝子産物の発現を意味する。たとえば、誘導性プロモーターは、化学誘導因子または熱に応答して遺伝子産物の発現を促進し得る。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位として役割を果たす遺伝子の５’末端から短い距離の調節領域をいう。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「エンハンサー」とは、隣接プロモーターからの転写のレベルを上昇させることができるシス調節配列をいう。
【００４４】
用語「作動可能に連結している」とは、記載した構成要素が、その通常の機能が行われるように構成されている、エレメントの配置をいう。一部の例では、用語「作動可能に連結している」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上で２つ以上の核酸断片が会合していることをいう。たとえば、プロモーターは、調節タンパク質および適切な酵素が存在する場合、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合に、コード配列に作動可能に連結している。一部の例では、特定の制御エレメントは、その発現を誘導するように機能する限りは、コード配列と連続している必要はない。たとえば、介在性の非翻訳であるが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーターはそれでもコード配列に「作動可能に連結している」とみなすことができる。したがって、コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写し、これが、その後、トランスＲＮＡスプライシングされ、コード配列によってコードされているタンパク質へと翻訳される場合に、細胞中で転写および翻訳制御配列に「作動可能に連結している」。別の例として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの転写が転写終結配列によって終結されることができる場合に、転写終結配列に作動可能に連結している場合がある。さらに別の例として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの転写がリボザイム配列での切断に影響を与える場合に、リボザイム配列に作動可能に連結している場合がある。
【００４５】
用語「抗原」とは、動物において抗体もしくはＴ細胞応答、または両方の生成を刺激することができる化合物、組成物、または免疫原性物質をいい、動物に注射または吸収された組成物が含まれる。免疫応答は、全分子に対して、または分子の一部分（たとえば、エピトープもしくはハプテン）に対して生じさせ得る。この用語は、個々の巨大分子または抗原性巨大分子の同種もしくは異種の集団をいうために使用し得る。抗原は、特異的な液性および／または細胞性免疫の産物と反応する。用語「抗原」には、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、核酸、オリゴ糖、多糖類、有機または無機の化学物質または組成物などを含めた部分が、広く包含される。用語「抗原」には、すべての関連する抗原性エピトープが含まれる。所定の抗原のエピトープは、当分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａを参照されたい。たとえば、直鎖状エピトープは、たとえば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体担体上で同時に合成し、ペプチドが支持体に付着しているままでペプチドを抗体と反応させることによって、決定し得る。そのような技術は当分野で知られており、たとえば、すべてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第４，７０８，８７１号、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８〜４００２、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、たとえば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸の空間的な立体構造を決定することによって同定する。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照されたい。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持している限りは、天然の配列への、欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であり得る）が含まれるタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発、もしくは特定の合成手順、もしくは遺伝子操作手法などによる意図的なものであってよく、または、抗原を産生する宿主の突然変異などによる偶発的なものであってもよい。さらに、抗原は、任意のウイルス、細菌、寄生生物、原虫、または真菌に由来またはそれから得ることができ、全生物であり得る。同様に、核酸免疫化用途などにおける、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義内に含まれる。合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、隣接するエピトープ、および他の組換えまたは合成によって誘導した抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７〜２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２〜３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ��Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２〜４０８、Ｇａｒｄｎｅｒら、（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、スイスＧｅｎｅｖａ、１９９８年６月２８日〜７月３日）。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「異種抗原」とは、抗原がその生物に由来しないか、またはその正常な位置もしくはその天然の形態でコードされていない、核酸配列にコードされている抗原である。
【００４７】
本明細書中で使用する用語「最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子」、「最適化したＶＳＶ  Ｇコード配列」などとは、天然のＧタンパク質オープンリーディングフレームと比較して増加した量のＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現をもたらす、改変されたＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列をいう。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「Ｇタンパク質補完」とは、ウイルスを、補完細胞系、ヘルパーウイルス、形質移入または失われたＧ機能を提供する何らかの他の手段によって補完する方法をいう。
【００４９】
本明細書中で使用する用語「成長させること」とは、様々な種類の培地上またはその中における、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ繁殖をいう。実験室での細胞の維持および成長は、生命を支持し、微生物汚染および機械的ストレスなどの損傷を与える影響を回避する環境を再現することを含む。細胞は、通常、培養容器（接着細胞にはフラスコもしくは皿または懸濁液中の細胞には常に動かすボトルもしくはフラスコなど）内の成長培地中で成長させ、一定の温度、湿度および気体組成を有する細胞インキュベーター内で維持した。しかし、培養条件は細胞種に応じて変動することができ、また、細胞の変化を誘導するために変更することができる。本明細書中で使用する「拡大」などとは、細胞の増殖または分裂を意味することを意図する。
【００５０】
本明細書中で使用する用語「細胞」、「宿主細胞」などには、ベクターまたは外因性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質の取り込みのレシピエントであり得る、またはそうであった、任意の個々の細胞または細胞培養物が含まれることを意図する。また、単一の細胞の子孫も含まれることを意図する。しかし、子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異が原因で、元の親細胞と必ずしも完全に同一でなくてもよい（形態学またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において）。細胞は原核または真核であってよく、それだけには限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（たとえば、ネズミ、ラット、サルまたはヒト）が含まれる。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「適格な産生細胞」とは、細胞が首尾よく適格となっており、ヒトで使用するための免疫原性組成物または遺伝子治療ベクターを産生するために使用されていることを意味する。そのような細胞の例には、たとえば、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＩ−３８、ＰＥＲＣ．６、２９３−ＯＲＦ６、ＣＨＯ、ＦＲｈＬまたはＭＲＣ−５が含まれる。
【００５２】
用語「細胞変性効果」または「ＣＰＥ」とは、ウイルス感染が原因の、宿主細胞における任意の検出可能な変化として定義される。細胞変性効果は、細胞の円形化、混乱、腫脹または収縮、死滅、表面からの剥離などからなり得る。
【００５３】
用語「感染多重度」または「ＭＯＩ」とは、感染性因子（たとえばウイルス）対感染標的（たとえば細胞）の比である。
【００５４】
ＶＳＶの「感染性クローン」または「感染性ｃＤＮＡ」とは、感染性ウイルスまたはサブウイルス粒子のゲノムを生じるための鋳型として役割を果たすことができるゲノムまたはアンチゲノムウイルスＲＮＡへと転写されることができる、感染性ビリオン内に直接取り込まれることができる、合成または他の様式のｃＤＮＡまたはその産物、およびＲＮＡを意味する。
【００５５】
上述のように、ＶＳＶは多くの特徴を有し、それにより、これが免疫原性組成物の魅力的なベクターとなる。たとえば、ＶＳＶは、ヒトの病原体とみなされていない。また、ＶＳＶは細胞培養で安定して複製することができ、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれることも、遺伝的組換えを受けることもできない。さらに、複数のＶＳＶの血清型が存在し、プライム−ブースト免疫化戦略の可能性が許容される。さらに、目的の外来遺伝子をＶＳＶゲノム内に挿入し、ウイルス転写酵素によって豊富に発現させることができる。さらに、ヒト集団におけるＶＳＶに対する既存の免疫は稀である。
【００５６】
本発明は、細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法を提供する。本発明の方法は、弱毒化したＶＳＶにＧタンパク質補完を提供する。一部の実施形態では、Ｇタンパク質補完は、Ｇタンパク質を欠くまたは機能的でないＧタンパク質を発現する弱毒化したＶＳＶに、Ｇ機能を提供する。そのようなベクターは、Ｇタンパク質を発現する細胞内に「パッケージング」する必要がある。
【００５７】
本発明の方法は、プラスミドＤＮＡからのより高いレベルの一過性Ｇタンパク質発現の達成に基づいている。この方法は、１×１０６ＩＵ／ｍｌを超えて産生するＧｓｔｅｍおよびΔＧ  ｒＶＳＶベクターの生成に適用されている。
【００５８】
本発明の方法は、製造用に拡張可能である。一部の実施形態では、本発明の方法は、免疫原性組成物の産生の十分に特徴づけた基質であり、許可されているロタウイルスワクチン（Ｍｅｒｃｋ、ＲｏｔａＴｅｑ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｌｉｖｅ，Ｏｒａｌ，Ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ）ＦＤＡ．Ｏｎｌｉｎｅ、投函日２００６年、Ｓｈｅｅｔｓ，Ｒ．（Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＦＤＡ．Ｏｎｌｉｎｅ、投函日２０００年）を産生するために使用されている、Ｖｅｒｏ細胞を用いる。
【００５９】
一過性発現による遺伝子補完
本発明は、弱毒化したＶＳＶのパッケージング手順を提供する。本発明の方法は、ＶＳＶ−ΔＧおよびＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍなどの繁殖欠損組換えＶＳＶのパッケージングに適用されている。ＶＳＶ−ΔＧは、Ｇ遺伝子が完全に欠失しているベクターである一方で（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：３７２３〜３２、１９９９）、ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍは、Ｇ遺伝子が切断されて細胞外ドメインのほとんどを欠くＧタンパク質をコードしているベクターである（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ、ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：２２３９〜４６、２０００）。そのような事例では、失われたＧ機能を補償する手段としてＧタンパク質の一過性発現を提供することに基づいたベクターのパッケージング手順は、いくつかの基準が満たされている限りは、ＶＳＶベクター候補のさらなる臨床開発を支援する。
【００６０】
これらの基準には、とりわけ、すべての材料および手順が、ヒトに投与するための免疫原性組成物の産生を管理している規制に準拠しているべきであることがある。さらに、Ｇタンパク質発現プラスミドを細胞内に導入するために使用する方法は、製造に適応するために効率的かつ拡張可能であるべきである。さらに、Ｇタンパク質発現は、ＧｓｔｅｍまたはΔＧベクターの効率的なパッケージングを促進するために十分であるべきである。また、ウイルス粒子の収量は、好ましくは、日常的に１×１０６ＩＵ／ｍｌに達するまたはそれを超えるべきである。より好ましくは、ウイルス粒子の収量は、ほとんどの場合で日常的に１×１０７ＩＵ／ｍｌに達するまたはそれを超えるべきである。本発明の組成物および方法はこれらの基準を満たす。
【００６１】
本発明は、１×１０７ＩＵ／ｍｌが再現可能に得られる、拡張可能な一過性発現方法を提供する。候補ＶＳＶベクターの臨床開発に関して、一過性Ｇタンパク質発現は、安定な細胞系を利用する補完方法を越える２つの注目すべき利点を提供する。第１に、本発明の一過性発現方法は複数の細胞種に適応可能である。これにより、ベクター複製に許容される宿主であるべきである、細胞基質の選択に際して柔軟性が提供される。第２に、妥当性確認した細胞種は、大規模なさらなる認定または試験なしに、一過性発現に直接使用できる。安定な補完細胞系は、それを誘導した後に、産生で使用するための妥当性確認をするために、大規模な試験（すなわち、網羅的な偶発的薬剤の試験、核型分析、腫瘍原性の試験）を必要とする可能性が高い。
【００６２】
驚くべきことに、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有するプラスミドからのＧタンパク質の発現が、ΔＧおよびＧｓｔｅｍ繁殖欠損ベクターのどちらの収量も顕著に向上させたことが発見された。さらに、Ｇｓｔｅｍベクターの収量は、一般に、同等のΔＧベクターと比較して著しく高かった。これらを合わせると、Ｖｅｒｏ細胞の電気穿孔、最適化したＶＳＶ  Ｇ発現プラスミド、およびＧｓｔｅｍベクターを合わせた本発明の一実施形態は、収量を１×１０８ＩＵと高く押し上げ、繁殖欠損ＶＳＶベクターを製造する実現可能な道が提供される。
【００６３】
上述のように、本発明のパッケージング方法は、繁殖欠損ＶＳＶ  ＧｓｔｅｍおよびΔＧベクターの産生に有用であることが見出された。本発明の一過性Ｇタンパク質発現方法は、ＨＩＶ  ｇａｇをコードしているＧｓｔｅｍベクターをパッケージングした場合に、１×１０７ＩＵ／ｍｌを超えて産生することができた。また、ＨＩＶ  ｇａｇをコードしているＶＳＶΔＧベクターのパッケージングも、Ｇタンパク質発現の一過性方法で試験し、効率が下がることが見出されたが、それでも収量は一部の実験で１×１０７／ｍｌを超えた。本発明のパッケージング方法を用いて１×１０７ＩＵ／ｍｌを超える収量がどちらのベクターでも観察されたこと、およびこれがＶｅｒｏ細胞で達成されたことは、ＧｓｔｅｍおよびΔＧベクターを製造スケールで産生することが可能なことを示している。
【００６４】
本発明によるＶＳＶ  Ｇ補完の方法をＶＳＶ  ＧｓｔｅｍおよびΔＧベクターの産生に適用したが、本発明はこれらの実施形態に限定されない。たとえば、本発明の方法を他の弱毒化したＶＳＶ粒子の産生に適用することができる。様々な組換えＶＳＶベクターの例は、本明細書中に提供されている。
【００６５】
さらに、その天然の付着タンパク質を欠く他の繁殖欠損パラミクソウイルスまたはラブドウイルスベクター（すなわち、センダイウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、またはベシクロウイルス）は、本明細書中に記載の補完系を用いて、その表面上にＶＳＶ  Ｇタンパク質を有してパッケージングし得る。実際、ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、複製能力のある組換え麻疹ウイルスの付着タンパク質として機能することが示されており（Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：２１５０〜９、１９９８）、このことは、これが繁殖欠損モルビリウイルスベクターのコンテキストでも同様に機能するはずであることを示している。また、ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、レトロウイルス粒子を「偽型」にして、広範囲の細胞種の感染を媒介することができる付着タンパク質を提供するためにも幅広く使用されている（Ｃｒｏｎｉｎら、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、５：３８７〜９８、２００５、Ｙｅｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４３ＰｔＡ：９９〜１１２、１９９４）。本明細書中に記載の方法は、レトロウイルス粒子の産生に適応可能であるはずであり、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含有するウイルス粒子の産生を顕著に単純化し、その収量を改善させ得る。
【００６６】
本発明の補完方法は、Ｖｅｒｏ細胞におけるＶＳＶ  Ｇタンパク質発現のために開発されているが、この技術は、他のウイルス、細胞種、および補完タンパク質に容易に適用可能であろう。本明細書中に記載した方法によりＶＳＶ  Ｇの毒性性質が回避され、繁殖欠損ＶＳＶベクターの効率的なパッケージングが可能となったことは、特に注記するに値する。このことは、本方法が、トランスの毒性タンパク質の制御された発現を必要とする他の補完系に適応可能であろうことを示唆している。
【００６７】
水疱性口内炎ウイルスを回収する方法
本発明によるセグメント化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収するための一般手順は、以下のように要約することができる。所望のウイルスゲノムのクローニングしたＤＮＡ均等物（プラス鎖、メッセージセンスである）を、適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（たとえば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と自己切断リボザイム配列（たとえばデルタ型肝炎リボザイム）との間に配置し、これを適切な転写ベクター（たとえば繁殖可能な細菌プラスミド）内に挿入する。この転写ベクターは、容易に操作可能なＤＮＡ鋳型を提供し、これから、ＲＮＡポリメラーゼ（たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）が、正確またはほぼ正確な５’および３’末端を有するウイルスアンチゲノム（またはゲノム）の一本鎖ＲＮＡコピーを忠実に転写することができる。ゲノムのウイルスＤＮＡコピーならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の配向により、アンチゲノムまたはゲノムのＲＮＡ均等物のどちらが転写されるかが決定される。
【００６８】
また、本発明による新しいウイルス子孫の救済には、裸の一本鎖のウイルスアンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ転写物を機能的なヌクレオカプシド鋳型内に包むために必要な、ウイルスに特異的なトランス作用性支持タンパク質も必要である。これらには、一般に、ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ関連リンタンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質が含まれる。
【００６９】
機能的なヌクレオカプシドは、ゲノムの複製、すべてのウイルスｍＲＮＡの転写、およびウイルスタンパク質の蓄積の鋳型として役割を果たして、ウイルスのアセンブリおよび出芽を含めた、ウイルス複製サイクル中の後に続いて起こる事象を始動する。成熟ウイルス粒子は、感受性細胞におけるさらなる繁殖に必要なウイルスＲＮＡポリメラーゼを含有する。
【００７０】
本発明は、弱毒化したＶＳＶの回収を対象とする。救済に選択された特定の弱毒化したウイルスは、ウイルスのアセンブリおよび出芽のために、ＧおよびＭなどの支持タンパク質の付加を必要とする。たとえば、弱毒化したＶＳＶは、Ｇタンパク質全体（ΔＧ）またはＧタンパク質外部ドメインのほとんど（Ｇｓｔｅｍ）をコードしている配列の欠失を含む、繁殖欠損ＶＳＶベクターであり得る。ΔＧおよびＧｓｔｅｍは、どちらもｉｎ  ｖｉｖｏで一次感染細胞を越えて伝播することができない。その結果、トランス補完するＧタンパク質の存在下でのみ繁殖することができるウイルスがもたらされる。
【００７１】
また、典型的には、必ずしも排他的ではないが、セグメント化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスの救済には、ｃＤＮＡを含有する転写ベクターおよび支持タンパク質をコードしているベクターの転写を駆動するために、ＲＮＡポリメラーゼがウイルスｃＤＮＡを保有する宿主細胞中で発現されることも必要である。
【００７２】
本発明内では、弱毒化したＶＳＶの救済は、典型的には、宿主細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含有するウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、ならびにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入することを含む。ウイルス救済中に用いる支持プラスミドによってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質は、天然のＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされていてもよい。しかし、ウイルス救済中に使用する支持プラスミドのＶＳＶ  Ｇタンパク質が、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされていてもよいことも、十分に本発明の意図の範囲内にある。一部の実施形態では、細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでも形質移入する。形質移入した細胞を培養で成長させ、弱毒化したＶＳＶを培養物から救済する。その後、救済された物質は、以下にさらに詳述するように、さらなるウイルス拡大のためにプラーク拡大細胞と同時培養し得る。
【００７３】
ウイルス救済に使用する宿主細胞は、しばしば、さらなるウイルス拡大を支持するその能力が損なわれている。したがって、細胞培養物中で弱毒化したＶＳＶを産生する方法には、典型的には、プラーク拡大細胞を救済された弱毒化したＶＳＶに感染させることがさらに含まれる。本発明の一部の実施形態では、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞を、救済された弱毒化したＶＳＶに感染させ、感染した細胞を成長させ、弱毒化したＶＳＶを感染した細胞の培養物から回収する。
【００７４】
ウイルス救済の一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ発現ベクターからのＲＮＡ転写物の合成を誘導するための発現制御配列に作動可能に連結しているポリヌクレオチドが含まれる、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターの形態で細胞内に導入する。一部の実施形態では、発現制御配列は適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである（たとえば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）。
【００７５】
一部の実施形態では、支持プラスミドおよびウイルス救済中に使用するウイルスｃＤＮＡ発現ベクターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御下にある。たとえば、ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである実施形態では、支持プラスミドおよびウイルスｃＤＮＡ発現ベクターは、好ましくはＴ７プロモーターの制御下にある。
【００７６】
一部の他の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現は、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。前初期ヒトサイトメガロウイルス［ｈＣＭＶ］プロモーターおよびエンハンサーは、たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，１６８，０６２号に記載されている。
【００７７】
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶをｃＤＮＡから回収する方法は、対象ウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているウイルスｃＤＮＡ発現ベクターを宿主細胞内に導入することと、ＲＮＡポリメラーゼをコードしており、その発現を誘導するポリメラーゼ発現ベクターを協調的に導入することとを含む。このコンテキストにおいて有用なＲＮＡポリメラーゼには、それだけには限定されないが、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ファージポリメラーゼが含まれる。また、宿主細胞は、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターの協調的導入の前、その間、またはその後に、ポリメラーゼ発現ベクター、ならびに宿主細胞における成熟した弱毒化したＶＳＶ粒子の産生に必要なＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧ支持タンパク質も発現する。
【００７８】
典型的には、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターおよびポリメラーゼ発現ベクターを、支持タンパク質をコードしており、その発現を誘導する１つまたは複数の追加の発現ベクターと共に、宿主細胞内に協調的に形質移入する。支持タンパク質は、救済するウイルスの野生型もしくは突然変異タンパク質であってよく、または、異種のセグメント化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスの対応する支持タンパク質（複数可）から選択されてもよい。代替の実施形態では、追加のウイルスタンパク質、たとえば、ポリメラーゼ伸長因子（ＲＳＶにはＭ２−１など）、または、対象の方法および組成物内の回収を可能にするもしくは増強し得る、または他の所望の結果を提供し得る他のウイルスタンパク質を、宿主細胞中で同時発現させ得る。他の実施形態では、支持タンパク質のうちの１つまたは複数は、タンパク質（複数可）を宿主細胞中で構成的に発現させることによって、または、宿主細胞を、支持タンパク質（複数可）をコードしているヘルパーウイルスで同時感染させることによって、宿主細胞中で発現させ得る。
【００７９】
本発明のより詳細な態様では、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターは、ｃＤＮＡ発現ベクターからのウイルスＲＮＡ転写物の合成を誘導するための発現制御配列に作動可能に連結しているＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含む。ウイルスｃＤＮＡベクターを、ＲＮＡポリメラーゼならびに以下のＶＳＶ支持タンパク質：Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＧタンパク質を一過的に発現する宿主細胞内に導入する。ＲＮＡポリメラーゼならびにＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質のそれぞれは、１つまたは複数の形質移入した発現ベクターから発現させ得る。多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼおよび支持タンパク質のそれぞれは、別々の発現ベクター、一般的には一過性発現プラスミドから発現される。適切な条件下で十分な時間の後、アセンブルされた感染性の弱毒化したＶＳＶが宿主細胞から救済される。
【００８０】
ｃＤＮＡを発現したゲノムまたはアンチゲノムから感染性の弱毒化したＶＳＶ粒子を産生するために、ゲノムまたはアンチゲノムを、ＲＮＡ複製が可能なヌクレオカプシドを産生し、また、子孫に、ＲＮＡの複製および転写のどちらについてもコンピテントなヌクレオカプシドを与えるために必要なウイルスタンパク質で同時発現する。そのようなウイルスタンパク質には、Ｎ、ＰおよびＬタンパク質が含まれる。本発明では、失われたＧ機能を有する弱毒化したＶＳＶベクターも、Ｇウイルスタンパク質の付加を必要とする。さらに、生産的な感染のためにＭタンパク質も付加し得る。ＧおよびＭウイルスタンパク質は同時発現によって供給することができる。一部の実施形態では、ウイルス救済中に用いるＶＳＶ  Ｇ支持プラスミドは、最適化されていないＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有する。しかし、他の実施形態では、以下に記載のように、ウイルス救済中に用いるＶＳＶ  Ｇ支持プラスミドは、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有する。
【００８１】
本発明の特定の実施形態では、転写し、複製するウイルスヌクレオカプシド（すなわち、Ｌ、ＰおよびＮ）を生じるために必要なタンパク質、ならびにＭおよびＧタンパク質をコードしている補完配列は、発現プラスミドによって提供される。他の実施形態では、そのようなタンパク質は、１つまたは複数のヘルパーウイルスによって提供される。そのようなヘルパーウイルスは、野生型または突然変異体であり得る。特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、組換えウイルスｃＤＮＡによってコードされているウイルスとは、表現型で区別することができる。たとえば、ヘルパーウイルスとは免疫学的に反応するが、組換えウイルスｃＤＮＡによってコードされているウイルスと反応しないモノクローナル抗体を提供することが望ましい場合がある。そのような抗体は中和抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体を、ヘルパーウイルスを組換えウイルスから分離するためのアフィニティークロマトグラフィーで使用することができる。そのような抗体の獲得を支援するために、突然変異をウイルスｃＤＮＡ内に導入して、糖タンパク質遺伝子などにおけるように、ヘルパーウイルスからの抗原性の多様性を提供することができる。
【００８２】
組換えウイルスゲノムまたはアンチゲノムは、たとえば、クローニングしたｃＤＮＡセグメントをアセンブルして、全体として完全なゲノムまたはアンチゲノムを表すことによって、ウイルスｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡの逆転写されたコピーのポリメラーゼ連鎖反応など（ＰＣＲ、たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９０に記載）によって、本発明で使用するために構築し得る。たとえば、適切なプロモーター（たとえば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）にわたり、適切な発現ベクター（プラスミド、コスミド、ファージ、またはＤＮＡウイルスベクターなど）中でアセンブルされた、アンチゲノムの左側末端を含有するｃＤＮＡを含む、第１の構築体を作製し得る。ベクターは、アセンブリを容易にするために設計された唯一の制限部位を含有する合成ポリリンカーの突然変異誘発および／または挿入によって、改変し得る。アンチゲノムプラスミドの右側末端は、隣接するリボザイムおよび単一またはタンデム型のＴ７転写ターミネーターなど、所望に応じて付加配列を含有し得る。リボザイムは、単一の非ウイルスヌクレオチドを含有する３’末端を与えるハンマーヘッド型であるか、または、デルタ型肝炎ウイルスのもの（Ｐｅｒｒｏｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、３５０：４３４〜４３６、１９９１）など、非ウイルスヌクレオチドを含まない３’末端を与える他の適切なリボザイムのうちの任意のものであり得る。
【００８３】
ウイルスゲノムまたはアンチゲノムをコードしているｃＤＮＡを構築するための代替手段には、サブユニットｃＤＮＡ構成要素の数を、わずか１個または２個の部分まで低下させるための、改善されたＰＣＲ条件を用いた逆転写ＰＣＲが含まれる（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＣｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５６９５〜５６９９、１９９４に記載）。他の実施形態では、様々なプロモーターを使用することができる（たとえば、Ｔ３またはＳＰＱ）。様々なＤＮＡベクター（たとえばコスミド）を繁殖に使用して、より大きなゲノムまたはアンチゲノムにより良好に適合することができる。
【００８４】
上述のように、定義された突然変異は、様々な慣用技術（たとえばゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピー内への部位特異的突然変異誘発）によって、感染性ウイルスクローン内に導入することができる。完全なゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡをアセンブルするために、本明細書中に記載のようにゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡ細断片を使用することは、それぞれの領域を別々に操作できるという利点を有する一方で、小さなｃＤＮＡ構築体は、大きなｃＤＮＡ構築体よりも良好な操作の容易性をもたらし、その後、完全なｃＤＮＡ内に容易にアセンブルされる。
【００８５】
本発明の弱毒化したウイルスの特定のものは、組換えウイルスの成長の潜在性、複製能力、または感染力が制限されるように、構築または改変する。そのような弱毒化したウイルスおよびサブウイルス粒子はベクターおよび免疫原として有用であるが、他の場合で完全に感染性の（すなわち、ほぼ野生型の成長および／または複製能力のレベルを有する）ウイルスを宿主に投与した場合に伴う特定の危険性をもたらさない。弱毒化したとは、宿主細胞もしくは哺乳動物対象において成長または複製するその能力が制限されている、または他の様式で細胞内もしくは細胞間で感染および／もしくは繁殖するその能力が欠損している、ウイルスまたはサブウイルス粒子を意味する。例として、ΔＧおよびＧ  ｓｔｅｍは、繁殖欠損であるが複製能力を有する、弱毒化したウイルスである。多くの場合、弱毒化したウイルスおよびサブウイルス粒子は、本明細書中以下に詳述するように、「ベクター」として用いる。
【００８６】
したがって、弱毒化したＶＳＶ粒子を産生するための様々な方法および組成物を提供する。より詳細な実施形態では、弱毒化したウイルスは、対応する野生型または親ウイルスの成長、複製および／または感染力と比較して実質的に損なわれた成長、複製および／または感染力の特徴を示す。このコンテキストでは、成長、複製、および／または感染力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、野生型または親の成長、複製および／または感染力のレベルと比較して少なくとも約１０〜２０％、２０〜５０％、５０〜７５％および９５％まで、またはそれを超えて損なわれている場合がある。
【００８７】
一部の実施形態では、様々な度合の成長または複製の欠損を有するウイルスは、以下に詳述する組合せ熱ショック／Ｔ７−プラスミド救済系を用いて救済し得る。例示的な株には、以下に記載の改変（たとえば、Ｃ末端Ｇタンパク質切断、または転座した遺伝子）が取り込まれている、ＶＳＶの高度に弱毒化した株が含まれる（たとえば、それぞれが本明細書中に参考として組み込まれている、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５０６０〜５０７８、１９９７、Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１３５９〜１１３６５、１９９６、Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｃｅｌｌ、９０：８４９〜８５７、１９９７、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４７０４〜４７１１、１９９８、およびＲｏｓｅら、Ｃｅｌｌ、１０６：５３９〜５４９、２００１を参照）。
【００８８】
弱毒化したウイルスのさらなる例を、以下にさらに詳述する。弱毒化したウイルスは、たとえば、異種抗原決定基を組換えベクターゲノムまたはアンチゲノム内に取り込ませることによって、「ベクター」として有用である。具体的な例では、麻疹ウイルス（ＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の糖タンパク質、糖タンパク質ドメイン、または１つもしくは複数の抗原決定基が、ＶＳＶベクターまたは「主鎖」内に取り込まれる。
【００８９】
調製を容易にするため、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧウイルスタンパク質は、１つまたは複数の別々のベクター中でアセンブルすることができる。たとえば、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、欠損ウイルスベクター、いわゆる「レプリコン」（たとえば、シンドビスまたはベネズエラウマ脳炎レプリコン）ならびに一過性および／または構成的な発現の誘導に有用な他のベクターを含めた、ＲＮＡポリメラーゼおよび支持タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを取り込み、その発現を誘導するのに有用な、多くの適切な発現ベクターが当分野で知られている。ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに適用される場合はＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質の一過性発現は、ポリメラーゼおよび／または支持ベクター（複数可）と共に作動可能に組み込まれた一過性発現制御エレメントによって誘導される。例示的な一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼの一過性発現制御エレメントは、前初期ヒトサイトメガロウイルス［ｈＣＭＶ］プロモーターおよびエンハンサーによって例示される、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ調節領域である（たとえば米国特許第５，１６８，０６２号参照）。他の例示的な実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質のうちの１つまたは複数の一過性発現制御エレメントは、Ｔ７プロモーターなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。
【００９０】
ウイルスｃＤＮＡ、一過的に発現されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質をコードしているベクターは、形質移入、電気穿孔、機械的挿入、形質導入などを含めた、当分野で知られている様々な方法のうちの任意のものによって、適切な宿主細胞内に導入し得る。一部の好ましい実施形態では、対象ベクターは、電気穿孔によって細胞内に導入する。他の実施形態では、対象ベクターは、リン酸カルシウム媒介形質移入（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４：７２５、１９７８、Ｃｏｒｓａｒｏら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：６０３、１９８１、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、１９７３）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５、１９８２）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８７）、またはカチオン性脂質媒介形質移入（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ、１５：７３〜７９、１９９３）によって培養細胞内に導入する。代替の実施形態では、細胞によるＤＮＡの取り込みを増加させるために形質移入促進試薬を加える。これらの試薬の多くは当分野で知られている。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）が一般的な例である。これらの試薬は、ＤＮＡをコーティングし、細胞によるＤＮＡの取り込みを増強する、カチオン性脂質である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）は、ＤＮＡを取り囲むリポソームを形成する一方で、ＥＦＦＥＣＴＩＮＥ（登録商標）はＤＮＡをコーティングするがリポソームを形成しない。ＤＮＡの取り込みを促進する別の有用な市販試薬は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ−２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）である。
【００９１】
本発明内で使用するための適切な宿主細胞は、対象の弱毒化したＶＳＶの生産的な感染を支援することができ、また、必須のベクターおよびウイルス産生を支援するために必要なそのコードされている産物の発現を可能にする。本発明の方法で使用するための宿主細胞の例を、以下にさらに詳述する。
【００９２】
本明細書中に提供する方法および組成物内では、ＲＮＡポリメラーゼベクター、ウイルスｃＤＮＡクローン、および支持ベクター（複数可）（たとえば、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質をコードしているプラスミド（複数可））の宿主細胞内への協調的導入は同時である。たとえば、対象ＤＮＡのすべてを単一のＤＮＡ形質移入（たとえば電気穿孔）混合物中で合わせ、宿主細胞培養物に同時に加えて協調的な形質移入を達成し得る。代替の実施形態では、対象のポリメラーゼおよび支持ベクターおよびウイルスｃＤＮＡベクターのうちの任意の２つ以上で、別々の形質移入を行い得る。典型的には、別々の形質移入は、近い時系列で実施して、有効な同時形質移入手順においてポリメラーゼおよび支持ベクターおよびウイルスｃＤＮＡベクターを協調的に導入する。１つのそのような協調的形質移入プロトコルでは、ウイルスｃＤＮＡならびに／またはＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧ支持プラスミド（複数可）は、ＲＮＡポリメラーゼプラスミドの形質移入の前に宿主細胞内に導入する。他の実施形態では、ウイルスｃＤＮＡならびに／またはＮ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＰ支持プラスミド（複数可）は、ＲＮＡポリメラーゼプラスミドを細胞内に形質移入するのと同時またはその後であるが、宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼの実質的な発現が開始される前（たとえば、検出可能なレベルのＴ７ポリメラーゼが蓄積される前、またはＴ７プロモーターによって駆動されるプラスミドの発現を活性させるために十分なＴ７のレベルが蓄積される前）に、宿主細胞内に導入する。
【００９３】
一部の実施形態では、感染性の弱毒化したＲＮＡウイルスを産生する方法は、組換えウイルスの回収を増加させるための宿主細胞の追加の熱ショック処理を含み得る。ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターのうちの１つまたは複数ならびにＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の一過性発現ベクターを宿主細胞内に導入した後、宿主細胞を、組換えウイルスの回収を増加させる有効な熱ショック刺激に曝露し得る。
【００９４】
１つのそのような方法では、宿主細胞を、有効な熱ショック温度に、細胞の熱ショックを達成するために十分な時間曝露し、ひいてはこれが増強されたウイルス回収を刺激する。有効な熱ショック温度とは、対象ウイルスの救済を行うための、当分野で許容される、推奨されるまたは最適であるとみなされる温度よりも高い温度である。多くの場合では、有効な熱ショック温度は３７℃よりも高い。本発明の改変した救済方法を有効な熱ショック温度で実施する場合は、温度上昇の非存在下で救済を行った場合の組換えウイルスの回収レベルを超える、所望の組換えウイルスの回収の増加がもたらされる。有効な熱ショック温度および曝露時間は、使用する救済系に応じて変動し得る。そのような温度および時間の変動は、選択されたウイルスまたは宿主細胞種の差異から生じる場合がある。
【００９５】
温度は変動し得るが、有効な熱ショック温度は、特定の組換えウイルスを用いていくつかの試験救済手順を実施し、温度および曝露時間の変動に伴った所望の組換えウイルスの回収の割合パーセンテージを確立することによって、容易に確認することができる。もちろん、救済を行うための任意の温度範囲の上限は、形質移入体の構成要素が破壊される、またはそれらが形質移入体中で機能する能力が枯渇もしくは減衰する温度である。本発明の本態様内で使用するための例示的な有効な熱ショック温度の範囲は、約３７℃〜約５０℃、約３８℃〜約５０℃、約３９℃〜約４９℃、約３９℃〜約４８℃、約４０℃〜約４７℃、約４１℃〜約４７℃、約４１℃〜約４６℃である。多くの場合、選択された有効な熱ショック温度の範囲は約４２℃〜約４６℃である。より具体的な実施形態では、約４３℃、４４℃、４５℃または４６℃の有効な熱ショック温度を用いる。
【００９６】
選択された有効な熱ショック温度または温度範囲を確立するための試験の実施において、熱ショック手順を実施する有効な時間も選択することができる。有効な熱ショック温度を適用するために十分な時間とは、上述のように温度上昇の非存在下で救済を行った場合の組換えウイルスの回収レベルを超える、所望の組換えウイルスの回収の検出可能な増加が存在するためにかかる時間である。有効な熱ショック時間は、選択されたウイルスおよび宿主細胞を含めた救済系に応じて変動し得る。時間は変動し得るが、有効な熱ショック温度を適用する時間の量は、特定の組換えウイルスを用いていくつかの試験救済手順を実施し、温度および時間の変動に伴った所望の組換えウイルスの回収の割合またはパーセンテージを確立することによって、容易に確認することができる。救済を行うための任意の時間変数の上限は、形質移入体の構成要素が破壊される、またはそれらが形質移入体中で機能する能力が枯渇もしくは減衰する時間の量である。熱ショック手順の時間の量は、組換えウイルスの回収の所望の増加が得られる限りは、数分間から数時間まで変動し得る。本発明の本態様内で使用するための例示的な有効な熱ショック時間は、約５〜約５００分間、約５〜約２００分間、約１５〜約３００、約１５〜約２４０、約２０〜約２００、約２０〜約１５０分間である。多くの場合、有効な熱ショック時間は約３０分間〜約１５０分間である。
【００９７】
数々の手段を用いて、宿主細胞を有効な熱ショックに曝露することによる、組換えの弱毒化したＶＳＶの改善された回収のレベルを決定することができる。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を用いて、既知の方法による組換えウイルスの救済を監視することができる。レポーター遺伝子の対応する活性により、ベースラインおよび組換えウイルスの改善された発現レベルが確立される。他の方法には、得られた組換えウイルスのプラークの数を検出し、救済されたウイルスの産生を配列決定によって検証することが含まれる。改善された回収を決定する１つの例示的な方法は、いくつかの同じように形質移入した細胞培養物を調製し、それらを熱ショックの様々な条件（時間および温度の変数）に曝露し、その後、これらの培養物の回収値と対照細胞（たとえば、３７℃の一定温度で形質移入および維持した細胞）の対応する値とを比較することを含む。形質移入の７２時間後、形質移入した細胞を、約７５％コンフルエントなＶｅｒｏ細胞（または組換えウイルスのプラーク形成を決定するための選択された細胞種）の単層を含有する１０ｃｍのプレートに移し、プラークが可視となるまでインキュベーションを続ける。その後、プラークを計数し、対照細胞から得られた値と比較する。最適な熱ショック条件はプラークの数を最大にするはずである。
【００９８】
本発明のこれらの実施形態によれば、改善されたウイルス回収は、少なくとも約１０％または２５％、しばしば少なくとも約４０％である。特定の実施形態では、有効な熱ショックへの曝露に起因する回収された組換えウイルスの増加は、観察または回収された組換えウイルスの量の２倍、５倍、および１０倍までまたはそれを超える増加によって反映される。
【００９９】
プラーク拡大手順
本発明の一部の実施形態では、ウイルスｃＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼベクターおよび支持タンパク質をコードしている１つまたは複数のベクターが導入された宿主細胞を、「プラーク拡大」ステップに供する。この手順は、典型的には、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ならびにＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＧタンパク質をコードしており、その一過性発現を誘導する１つまたは複数の発現ベクターの発現を可能にするために十分な時間の後（たとえば形質移入後）に実施する。プラーク拡大を達成するために、多くの場合はさらなるウイルス拡大を支持するその能力が損なわれている宿主細胞を、同じまたは異なる細胞種のプラーク拡大細胞と同時培養する。同時培養ステップにより、ウイルスの活発な拡大をより受け入れやすいプラーク拡大細胞への救済されたウイルスの伝播が可能となる。典型的には、宿主細胞の培養物を、プラーク拡大細胞の１つまたは複数の層上に移す。たとえば、宿主細胞の培養物をプラーク拡大細胞の単層上に伝播させることができ、その後、弱毒化したＶＳＶがプラーク拡大細胞に感染し、その中でさらに拡大される。一部の実施形態では、宿主細胞は、プラーク拡大細胞と同じまたは異なる細胞種である。
【０１００】
特定の実施形態では、ウイルス救済に使用する宿主細胞およびプラーク拡大細胞は、どちらも最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列を一過的に発現する。他の実施形態では、ウイルス救済に使用する宿主細胞は、同時培養ステップ中に救済されたウイルスに感染させるプラーク拡大細胞が、最適化したＶＳＶ  Ｇコード配列を一過的または構成的に発現する限りは、機能的であるが最適化されていないＧコード配列（たとえば天然のＧコード配列）を発現し得る。一部の実施形態では、プラーク拡大細胞における最適化したＶＳＶ  Ｇ配列からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現は、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある。
【０１０１】
本発明のプラーク拡大方法および組成物は、それだけには限定されないが繁殖欠損ＶＳＶなどを含めた、弱毒化したＶＳＶを産生する改善された救済方法を提供する。典型的には、ウイルス救済方法は、宿主細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしている単離した核酸分子を含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクターと、ＲＮＡポリメラーゼをコードしており、その発現を誘導する発現ベクターと、機能的なＧタンパク質をコードしている核酸分子を含む発現ベクター（たとえば、最適化されていないまたは最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子）とで形質移入することを伴う。ウイルス救済方法は、宿主細胞内に、カプシド形成、転写および複製に必要なトランス作用性タンパク質（すなわち、ＶＳＶのＮ、ＰおよびＬタンパク質）をコードしている少なくとも１つの単離した核酸分子を含む１つまたは複数の他の支持発現ベクターを導入することをさらに含む。ウイルス救済方法は、生産的な感染のために、細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持ベクターで形質移入することをさらに含み得る。ベクターは、前記ベクターの同時発現および弱毒化した成熟ウイルス粒子の産生を可能にするために十分な条件下で、宿主細胞内に導入する。
【０１０２】
弱毒化したＶＳＶを救済し、その後、救済された物質を、好ましくはプラーク拡大細胞と同時培養する。これにより、感染によるプラーク拡大細胞への救済されたウイルスの伝播が可能となる。プラーク拡大細胞は、ウイルスの活発な拡大をより受け入れやすい。その後、弱毒化したＶＳＶを同時培養物から回収し得る。一部の実施形態では、ウイルス救済細胞を、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有するプラスミドで一過的に形質移入した、または最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を構成的に発現する、プラーク拡大細胞の少なくとも１つの層上に移す。
【０１０３】
プラーク拡大を達成するために、形質移入した細胞を、典型的には、プラーク拡大細胞の同時培養容器に移す。当分野で知られている様々なプレートまたは容器のうちの任意のものを、プラーク拡大ステップに用いることができる。特定の実施形態では、形質移入した細胞は、少なくとも約５０％コンフルエントであるプラーク拡大細胞の単層上に移す。あるいは、プラーク拡大細胞は、少なくとも約６０％コンフルエント、またはさらには少なくとも約７５％コンフルエントである。特定の実施形態では、プラーク拡大細胞の表面積は、形質移入したウイルスの調製に使用した表面積よりも大きい。２：１〜１００：１の増強した表面積比を所望に応じて用いることができる。少なくとも１０：１の増強した表面積が多くの場合望ましい。
【０１０４】
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子
繁殖欠損ウイルスは、ヒトで使用するための明らかな安全性の利点を提供する。これらのベクターは１回のラウンドの複製に限定されており、一次感染細胞を越えて伝播することができない。以下に詳述する１つのそのようなベクターは、Ｇ遺伝子全体が欠失しており（ΔＧ）、したがって、感染性ウイルス粒子がｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖するためにＧタンパク質トランス補完を必要とする。以下に詳述する別のベクターは、Ｇタンパク質外部ドメインのほとんどが欠失しており（Ｇｓｔｅｍ）、細胞質尾部（ＣＴ）領域、膜貫通ドメイン、および膜近位外部ドメインの４２個のアミノ酸を保持している。このベクターも繁殖欠損であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染性粒子の産生にトランスのＧタンパク質を必要とする。
【０１０５】
繁殖欠損ウイルスは安全性の利点を提供することが知られているが、本発明以前には、工業的スケールでの製造中に効率的なベクター増幅を可能にするために十分な量の補完Ｇタンパク質を提供することにおいて、問題があった。実施例中に詳述するように、最大のＧタンパク質発現を支援する条件を同定するために、本発明者らによって広範囲の研究が実施された。コード配列を最適化する２つの方法を分析して、これらがＶＳＶ  Ｇタンパク質の一過性発現が改善され得るかどうかを決定した。ＲＮＡ最適化（ＲＮＡｏｐｔ）として記載され、ＧＣ含有量を増加させ、核外移行を阻害する配列モチーフを破壊するために同義のヌクレオチド置換を使用した一方法は、翻訳を減少させる、またはｍＲＮＡを不安定にする（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７１：４８９２〜９０３、１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６６：７１７６〜８２、１９９２、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６６：１５０〜９、１９９２）。インディアナおよびニュージャージー血清型のＶＳＶ  Ｇ（ＲＮＡを最適化した）コード配列を、たとえば、それぞれ図３（配列番号４）および図４（配列番号５）に示し、小文字は最適化中に行った置換を示す。最適化の第２の方法は、以下の表１に詳述するコドン最適化方法である（Ｏｐｔ−１）。コドン最適化方法を用いて得られたＶＳＶ  Ｇコード配列（インディアナ血清型）を、たとえば図５（配列番号３）に示す。
【０１０６】
【表１】
2011507515.tif 000003
【０１０７】
実施例中にさらに詳述されているように、最適化したＶＳＶ  Ｇのコード配列を含有するプラスミドの電気穿孔により、天然のＧｉｎオープンリーディングフレームと比較して、Ｖｅｒｏ細胞中でより高いレベルのＧタンパク質発現が生じたことが判明した。その後、増加したＧの存在量が繁殖欠損ベクターのパッケージング収量を増強したかどうかを決定するために、研究を実施した。実施例および図７中にさらに詳述されているように、結果は、最適化したＶＳＶ  Ｇのコード配列を含有するどちらのプラスミドも（ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／Ｏｐｔ１およびｐＣＭＶ−Ｇｉｎ／ＲＮＡｏｐｔ）、天然のＧｉｎオープンリーディングフレームを含有するプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ）と比較して、より効率的なパッケージングを促進したことを示している。
【０１０８】
一部の実施形態では、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択される。
【０１０９】
細胞
１．ウイルス救済細胞
ウイルス救済に使用する宿主細胞は、原核細胞または真核細胞から選択することができる。適切な細胞には、Ｓｆ９およびＳｆ２１などの昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの適切なプロモーターを有する細菌細胞、ならびに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞が含まれる。宿主細胞は、典型的には、脊椎動物、たとえば霊長類の細胞から選択される。典型的には、生存可能なウイルスの救済が容易に検出され得るように、検出可能な細胞変性効果をもたらす細胞系を用いる。多くの場合、宿主細胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞などのヒト細胞に由来する。Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）、および多くの他の種類の細胞も宿主細胞として使用することができる。一部の例示的な実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞を宿主細胞として使用する。ＶＳＶの場合、ウイルスがＶｅｒｏ細胞上で迅速に伝播し、容易に検出可能なプラークを作製するため、形質移入した細胞をＶｅｒｏ細胞上で成長させる。さらに、Ｖｅｒｏ細胞は、ヒトに投与するための産生に適格である。他の適切な宿主細胞の例は以下のとおりである：（１）ヒト二倍体初代細胞系、たとえば、ＷＩ−３８およびＭＲＣ−５細胞、（２）サル二倍体細胞系、たとえば、Ｃｏｓ、アカゲザル胎児肺（ＦＲｈＬ）細胞、（３）準初代連続継代細胞系、たとえば、ＡＧＭＫ−アフリカミドリザル腎細胞、（４）ヒト２９３細胞（適格）ならびに（５）げっ歯類（たとえば、ＣＨＯ、ＢＨＫ）、イヌ科動物、たとえば、マディンダービーイヌ科腎臓（ＭＤＣＫ）、および原発性ニワトリ胚線維芽細胞。本発明の方法および組成物内で有用な例示的な具体的な細胞系には、ＨＥｐ−２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ（たとえばＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＲＣ−５、およびＶｅｒｏ細胞が含まれる。
【０１１０】
２．プラーク拡大細胞
本明細書中でさらに詳述するように、本発明による弱毒化したＶＳＶ粒子を産生する方法には、ウイルス粒子の救済に使用する宿主細胞をプラーク拡大細胞と成長させることが含まれ得る。プラーク拡大細胞への回収された弱毒化したＶＳＶ粒子の伝播が可能となる。一部の実施形態では、プラーク拡大細胞は、ウイルス救済に使用する宿主細胞と同じまたは異なる細胞種である。
【０１１１】
プラーク拡大細胞は、そのような細胞における天然のまたは組換えウイルスの成長の成功に基づいて選択する。多くの場合、形質移入の実施に用いる宿主細胞は、所望の組換えの弱毒化したウイルスの成長の最適な宿主ではない。したがって、形質移入した細胞からの組換えの弱毒化したウイルスの回収は、天然のウイルスまたは組換えウイルスが増強した成長を示すプラーク拡大細胞を選択することによって、増強することができる。前述の説明に従って、様々なプラーク拡大細胞を、本発明の本態様内で使用するために選択することができる。本発明の組換えの弱毒化したＶＳＶの回収および拡大を支援するために使用することができる、例示的な具体的なプラーク拡大細胞は、ＨＥｐ−２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＢＨＫ、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＲＣ−５、およびＶｅｒｏ細胞から選択される。本発明内で使用するための熱ショックおよびプラーク拡大方法に関するさらなる詳細は、本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ９９／６３０６４号に提供されている。
【０１１２】
一部の実施形態では、プラーク拡大細胞を、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含む発現プラスミドで一過的に形質移入する。その後、形質移入した細胞を、典型的には終夜、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションした後、ウイルス救済細胞との同時培養物を確立するために使用した。救済された弱毒化したウイルスは、同時培養ステップ中にプラーク拡大細胞に感染し、ウイルスはその中でさらに拡大する。一部の他の実施形態では、プラーク拡大細胞は、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を構成的に発現し得る。
【０１１３】
弱毒化した水疱性口内炎ウイルス
１．切断されたＧ細胞質尾部（ＣＴ）領域
特定の実施形態では、本発明で使用するための弱毒化したＶＳＶは、切断された細胞質尾部（ＣＴ）領域を有するＧタンパク質を発現する。たとえば、細胞質ドメインのカルボキシ末端を切断するＧ遺伝子の突然変異が、ＶＳＶの出芽に影響を与え、ウイルス産生を弱毒化することは、当分野で知られている（Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７（５）：１２８９〜１２９６、１９９８、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：３７２３〜３７３２、１９９９）。野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞質ドメインは、２９個のアミノ酸を含む（ＲＶＧＩＨＬＣＩＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ−ＣＯＯＨ、配列番号６）。
【０１１４】
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、１個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ１）を発現する。たとえば、弱毒化したＶＳＶは、細胞質ドメインの最後の２８個のアミノ酸残基が欠失しているＧタンパク質（配列番号６の２９個のアミノ酸の野生型細胞質ドメインからアルギニンのみを保持する）を発現し得る。
【０１１５】
一部の他の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、９個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ−９）を発現する。たとえば、弱毒化したＶＳＶは、細胞質ドメインの最後の２０個のカルボキシ末端のアミノ酸が欠失しているＧタンパク質（配列番号６の２９個のアミノ酸の野生型細胞質ドメインと比較して）を発現し得る。
【０１１６】
２．Ｇ遺伝子の欠失
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）。たとえば、本発明の弱毒化したＶＳＶは、ＶＳＶ  Ｇ遺伝子）がゲノムから欠失しているウイルスであり得る。この観点から、Ｒｏｂｅｒｔｓらは、Ｇタンパク質をコードしている遺伝子の全体が欠失しており（ΔＧ）、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質で置換されているＶＳＶベクターを記載しており、ＶＳＶベクター（ΔＧ−ＨＡ）は弱毒化した病因を実証した（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：３７２３〜３７３２、１９９９）。
【０１１７】
３．Ｇ−Ｓｔｅｍ突然変異
一部の他の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）。たとえば、本発明の弱毒化したＶＳＶには、Ｇ遺伝子中の突然変異が含まれていてもよく、コードされているＧタンパク質は、Ｇタンパク質外部ドメインの膜近位の基部領域中に突然変異を有し、Ｇ−ｓｔｅｍタンパク質と呼ばれる。Ｇ−ｓｔｅｍ領域は、Ｇタンパク質のアミノ酸残基４２１〜４６２を含む。以前の研究により、Ｇタンパク質のＧ−ｓｔｅｍ中の挿入および／または欠失（たとえば切断）の突然変異によってＶＳＶの弱毒化が実証されている（ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４（５）：２２３９〜２２４６、２０００、Ｊｅｅｔｅｎｄｒａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６（２３）：１２３００〜１１、２００２、Ｊｅｅｔｅｎｄｒａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７７（２３）：１２８０７〜１８、２００３）。
【０１１８】
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶとは、Ｇコード配列が、ＧのＣ末端の９１個のアミノ酸と融合したシグナル配列の１８個のアミノ末端残基のみをコードしている、改変された変形で置き換えられており、そのうちの約４２個の残基が切断された細胞外ドメイン（Ｇ−ｓｔｅｍ）を形成するものである。この種のＧ遺伝子改変は、ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４（５）：２２３９〜２２４６、２０００の方法を用いて構築し得る。
【０１１９】
４．遺伝子シャフリング突然変異
特定の実施形態では、本発明の弱毒化したＶＳＶは、そのゲノム中に遺伝子シャフリング突然変異を含む。本明細書中で定義する用語「遺伝子シャフリング」、「シャフリングされた遺伝子」、「シャフリングされた」、「シャフリング」、「遺伝子再配置」および「遺伝子転座」は、互換性があるように使用してよく、野生型ＶＳＶゲノムの順序の変化（突然変異）をいう。本明細書中で定義する、野生型ＶＳＶゲノムは、図１に示す、３’−ＮＰＭＧＬ−５’の遺伝子の順序を有する。
【０１２０】
３’プロモーターに対するＶＳＶ遺伝子の位置により発現レベルおよびウイルス弱毒化が決定されることは、当分野で知られている（それぞれ具体的に本明細書中に参考として組み込まれているＷｅｒｔｚらの米国特許第６，５９６，５２９号、およびＷｅｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：３５０１〜６、１９９８）。発現の勾配が存在し、３’プロモーターに近位の遺伝子は３’プロモーターに遠位の遺伝子よりも豊富に発現される。ＶＳＶ  Ｇ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、当分野で知られている（ＲｏｓｅおよびＧａｌｌｉｏｎｅ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、３９：５１９〜５２８、１９８１、Ｇａｌｌｉｏｎｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、３９：５２９〜５３５、１９８１）。たとえば、米国特許第６，５９６，５２９号は、Ｎタンパク質の遺伝子がその野生型プロモーターから転座した（シャフリングされた）遺伝子シャフリング突然変異（Ｎタンパク質発現を次々に低下させるために、近位の第１の位置から、次々にゲノム上のより遠位の位置）を記載している（たとえば、３’−ＰＮＭＧＬ−５’、３’−ＰＭＮＧＬ−５’、３’−ＰＭＧＮＬ−５’、それぞれＮ２、Ｎ３およびＮ４と呼ぶ）。位置シフトしたＶＳＶ突然変異体は、たとえばＢａｌｌらの米国特許第６，１３６，５８５号にも記載されている。
【０１２１】
したがって、特定の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、そのゲノム中に遺伝子シャフリング突然変異を含む。遺伝子シャフリング突然変異は、Ｎ遺伝子の転座（たとえば、３’−ＰＮＭＧＬ−５’または３’−ＰＭＮＧＬ−５’）を含み得る。たとえば、一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、ウイルスゲノム中のその野生型の位置から下流に転座しているＮ遺伝子を含み、それによってＮタンパク質発現が低下している。
【０１２２】
本明細書中では、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のうちの任意のものの３’側のＶＳＶゲノムに外来核酸配列（たとえばＨＩＶ  ｇａｇ）を挿入することにより、上記定義した「遺伝子シャフリング突然変異」が有効にもたらされることに言及したい。たとえば、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子を位置１（たとえば３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’）でＶＳＶゲノム内に挿入する場合、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬ遺伝子は、それぞれ、その野生型の位置からゲノム上のより遠位の位置に移動される。したがって、本発明の特定の実施形態では、遺伝子シャフリング突然変異には、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のうちの任意のものの３’側のＶＳＶゲノムに外来核酸配列を挿入することが含まれる（たとえば、３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’、３’−Ｎ−ｇａｇ２−ＰＭＧＬ−５’、３’−ＮＰ−ｇａｇ３−ＭＧＬ−５’など）。
【０１２３】
５．非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異
特定の他の実施形態では、本発明の弱毒化したＶＳＶには、Ｍ遺伝子中に非細胞変性性突然変異（Ｍｎｃｐ）が含まれる。ＶＳＶ（インディアナ血清型）Ｍ遺伝子は、２２９個のアミノ酸のＭ（マトリックス）タンパク質をコードしている。
【０１２４】
ＭのｍＲＮＡがＭ２およびＭ３と呼ばれる２つの追加のタンパク質をさらにコードしていることは、当分野で知られている（ＪａｙａｋａｒおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６（１６）：８０１１〜８０１８、２００２）。Ｍ２およびＭ３タンパク質は、２２９個のアミノ酸のＭタンパク質（Ｍ１と呼ぶ）をコードしているものと同じリーディングフレーム中で、下流のメチオニンから合成され、Ｍ１タンパク質の最初の３２個（Ｍ２タンパク質）または５０個（Ｍ３タンパク質）のアミノ酸を欠く。Ｍタンパク質を発現するがＭ２およびＭ３を発現しない組換えＶＳＶに感染した細胞は、（特定の細胞種で）遅延細胞変性効果の開始を示すが、それでも正常なウイルス収量を生じることが観察されている。
【０１２５】
したがって、特定の実施形態では、本発明の弱毒化したＶＳＶには、Ｍ遺伝子中に非細胞変性性の突然変異が含まれ、Ｍ遺伝子突然変異は、内部ＡＵＧでタンパク質合成を開始することによって、Ｍタンパク質のｍＲＮＡから発現される２つの重複するインフレームのポリペプチドの発現を低下させる。そのようなＭ遺伝子突然変異の結果、Ｍ２またはＭ３タンパク質を発現しないウイルスがもたらされる。また、これらの突然変異は、ＩＦＮ誘導、核輸送、および他の機能にも影響を与える。たとえば、ＪａｙａｋａｒおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６（１６）：８０１１〜８０１８、２００２を参照されたい。
【０１２６】
異種抗原
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶは、ＶＳＶがベクターとして役割を果たすように、異種抗原を発現する。たとえば、特定の実施形態では、弱毒化したＶＳＶには、複製に必須でないゲノムの部位内に挿入されたまたはそれを置き換える、別個の転写単位としての外来ＲＮＡ配列が含まれる場合があり、外来ＲＮＡ配列（マイナスのセンスである）は、ＶＳＶに感染した宿主細胞中で発現させることができるタンパク質の産生を誘導する。この組換えゲノムは、タンパク質をコードしている外来ＤＮＡをＶＳＶ  ｃＤＮＡ内に挿入することによって最初に産生する。特定の実施形態では、本発明の弱毒化したＶＳＶ中で融合または非融合タンパク質として発現させた場合に、単独でまたは同じもしくは異なるＶＳＶによって発現された他の抗原と組み合わせて、疾患または障害に対する予防的または治療的免疫を生じる免疫原性抗原をコードしている任意のＤＮＡ配列を単離し、本発明の免疫原性組成物で使用するためのＶＳＶベクター中に取り込ませる。
【０１２７】
特定の実施形態では、弱毒化した組換えＶＳＶによる抗原の発現は、病原性微生物に対する免疫応答を誘導する。たとえば、抗原は、疾患または障害の原因物質である細菌、寄生生物、ウイルス、または真菌上に見つかる抗原の免疫原性または抗原性を示し得る。一実施形態では、ヒトの病原体の抗原または他の目的抗原の抗原性または免疫原性を示す抗原を使用する。
【０１２８】
一部の実施形態では、弱毒化したＶＳＶによってコードされている異種抗原は、麻疹ウイルス、サブグループＡおよびサブグループＢの呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、１型または２型のヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびトラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のうちの１つまたは複数から選択される。
【０１２９】
抗体との結合を検出することによって免疫原性または抗原性を決定するために、それだけには限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫アッセイ（たとえば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いたもの）、ウエスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、中和アッセイなどの技術を用いた、競合的および非競合的アッセイ系を含めた、当分野で知られている様々な免疫アッセイを使用する。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって測定する。別の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬と一次抗体との結合を測定することによって検出する。さらなる実施形態では、二次抗体を標識する。免疫アッセイにおける結合を検出するための、多くの手段が当分野で知られている。免疫原性を検出する一実施形態では、Ｔ細胞媒介性応答を、標準方法、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞毒性アッセイ、四量体アッセイ、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏ遅延型過感受性アッセイによってアッセイする。
【０１３０】
弱毒化したＶＳＶによって発現されるエピトープ（抗原決定基）を発現する寄生生物および細菌（外来ＲＮＡが、寄生生物または細菌の抗原またはそのエピトープを含有するその誘導体の産生を誘導するもの）には、それだけには限定されないが、表２に記載のものが含まれる。
【０１３１】
【表２】
2011507515.tif 000004
【０１３２】
別の実施形態では、抗原は、線虫によって引き起こされる障害に対して保護するために、線形動物の抗原のエピトープを含む。別の実施形態では、組換えＶＳＶによって発現された場合に脊椎動物宿主中で免疫原性である、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）エピトープをコードしている任意のＤＮＡ配列を単離して、本発明によるＶＳＶ（−）ＤＮＡ内に挿入する。ＤＮＡ源として役割を果たすプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種には、それだけには限定されないが、ヒトマラリア寄生生物の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、および動物マラリア寄生生物のネズミマラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）、二日熱マラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、およびサルマラリア原虫（Ｐ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）が含まれる。さらに別の実施形態では、抗原は、コレラ毒素のβ−サブユニットのペプチドを含む。
【０１３３】
弱毒化したＶＳＶによって発現されるエピトープを発現するウイルス（外来ＲＮＡが、ウイルスの抗原またはそのエピトープを含むその誘導体の産生を誘導するもの）には、それだけには限定されないが、表３に記載のものが含まれ、これは、利便性のためにそのようなウイルスを科ごとに記載し、限定するものではない。
【０１３４】
【表３−１】
2011507515.tif 000005
【０１３５】
【表３−２】
2011507515.tif 000006
【０１３６】
具体的な実施形態では、弱毒化したＶＳＶによる宿主の感染の際に発現される、外来配列によってコードされている抗原は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質（Ｇ）、麻疹ウイルス赤血球凝集素または２型単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＤの抗原性または免疫原性を示す。
【０１３７】
弱毒化したＶＳＶによって発現される他の抗原には、それだけには限定されないが、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  Ｉの外被糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、ストレプトコッカス２４Ｍエピトープ、ＳｐｅＡ、ＳｐｅＢ、ＳｐｅＣまたはＣ５ａペプチダーゼ、および淋菌性ピリンの抗原の抗原性または免疫原性を示すものが含まれる。
【０１３８】
他の実施形態では、弱毒化したＶＳＶによって発現された抗原は、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、セルプリナ・ハイドディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）保護抗原、ウシウイルス性下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ赤血球凝集素、またはブタインフルエンザノイラミニダーゼの抗原性または免疫原性を示す。
【０１３９】
特定の実施形態では、弱毒化したＶＳＶによって発現された抗原は、それだけには限定されないが、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルスなどを含めた、イヌ科動物またはネコ科動物の病原体などに由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１４０】
特定の他の実施形態では、弱毒化したＶＳＶによって発現された抗原は、セルプリナ・ハイオディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ発熱ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（たとえば、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅもしくは糖タンパク質Ｇ）、または感染性喉頭気管炎ウイルス（たとえば、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇもしくは糖タンパク質Ｉ）に由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１４１】
別の実施形態では、抗原は、ラクロスウイルス、新生子ウシ下痢ウイルス、ベネズエラウマ科動物脳脊髄炎ウイルス、プンタトロウイルス、ネズミ白血病ウイルスまたはマウス乳癌ウイルスの糖タンパク質の抗原性または免疫原性を示す。
【０１４２】
他の実施形態では、抗原は、それだけには限定されないが、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（１型および／または２型）、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ならびに百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を含めた、ヒトの病原体の抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１４３】
弱毒化したＶＳＶによって発現される抗原として使用するための、潜在的に有用な抗原またはその誘導体は、病原体の感染力の中和における抗原の関与、種類または群の特異性、患者の抗血清もしくは免疫細胞による認識、および／または抗原に特異的な抗血清もしくは免疫細胞の保護効果の実証などの、様々な基準によって同定する。
【０１４４】
別の実施形態では、弱毒化したＶＳＶの外来ＲＮＡは、エピトープを含む抗原の産生を誘導し、これは、弱毒化したＶＳＶを所望の宿主内に導入した際に、エピトープを含有する部分によって引き起こされる状態または障害に対して保護する免疫応答を誘導する。たとえば、抗原は、腫瘍（たとえば悪性腫瘍）に対する保護的免疫応答を誘導するために、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。そのような腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原には、それだけには限定されないが、ＫＳ１／４汎癌腫（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、子宮癌抗原（ＣＡ１２５）、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原ｐ９７、黒色腫抗原ｇｐ７５、高分子量黒色腫抗原および前立腺特異的膜抗原が含まれる。
【０１４５】
弱毒化したＶＳＶ  ＤＮＡの非必須部位内に挿入される、抗原をコードしている外来ＤＮＡは、弱毒化したＶＳＶに感染した宿主において発現され、免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードしている外来ＤＮＡ配列を、さらに含んでいてもよい。たとえば、そのようなサイトカインには、それだけには限定されないが、インターロイキン１α、１β、２、４、５、６、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ならびに腫瘍壊死因子αおよびβが含まれる。
【０１４６】
免疫原性および医薬組成物
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明の方法に従って産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したＶＳＶ粒子を含む免疫原性組成物を対象とする。一部の実施形態では、少なくとも１つの外来ＲＮＡ配列は、複製に必須でないＶＳＶゲノムの領域内に挿入されている、またはそれを置き換える。
【０１４７】
本発明の弱毒化したＶＳＶ粒子は、哺乳動物対象（たとえばヒト）に投与するために配合する。そのような組成物は、典型的には、ＶＳＶベクターと薬学的に許容できる担体とを含む。本明細書中で以降使用する言葉「薬学的に許容できる担体」には、薬学的投与に適合している任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることが意図される。薬学活性のある物質用のそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。任意の慣用の媒体または薬剤がＶＳＶベクターと不適合である場合を除いて、そのような媒体を本発明の免疫原性組成物中で使用する。また、補助活性化合物も組成物中に取り込ませ得る。
【０１４８】
したがって、本発明のＶＳＶ免疫原性組成物は、その意図する投与経路に適合するように配合する。投与経路の例には、非経口（たとえば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内）および粘膜（たとえば、経口、直腸、鼻腔内、頬側、経膣、呼吸器）が含まれる。非経口、皮内、または皮下の施用に使用する液剤または懸濁液には、以下の構成要素が含まれる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌的な希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝液、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節する。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアルに封入することができる。
【０１４９】
注射使用に適した医薬組成物には、無菌的な水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌的な注射用液剤または分散液を即時調製するための無菌的な散剤が含まれる。静脈内投与では、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。これは製造および保存の条件下で安全でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒である。たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性が維持される。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などによって達成する。多くの場合、組成物中に等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされる。
【０１５０】
無菌的な注射用液剤は、所要量（または用量）のＶＳＶベクターを、適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって調製する。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものの中からの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル中に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用液剤を調製するための無菌的な散剤の場合は、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、事前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分および任意の追加の所望の成分の散剤が得られる。
【０１５１】
吸入による投与では、化合物は、適切な噴霧剤（たとえば、二酸化炭素または霧化剤などの気体）を含有する加圧容器またはディスペンサーから、エアロゾルスプレーの形態で送達する。また、全身投与は、粘膜または経皮手段によるものであり得る。粘膜または経皮投与では、透過させるバリアに対して適切な浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野で知られており、たとえば、粘膜投与では、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を使用することによって達成される。また、化合物は、坐薬（たとえば、カカオ脂および他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いて）または直腸送達のための保留浣腸の形態でも調製する。
【０１５２】
特定の実施形態では、投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口の組成物を単位剤形で配合することが有利である。本明細書中で以降使用する単位剤形とは、治療する対象の単位用量として適切な、物理的に別々の単位をいい、それぞれの単位は、所望の治療効果が生じるように計算した、事前に決定された量の活性化合物を、所要の薬学担体と会合して含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特徴および達成する特定の治療効果、ならびに個体を治療するための活性化合物などの、配合の分野に特有な制限によって指示され、それに直接依存する。
【０１５３】
本明細書中で引用するすべての特許および出版物は、本明細書中に参考として組み込まれている。
【実施例】
【０１５４】
（実施例１）
組換えＤＮＡの調製
Ｔ７  ＲＮＡＰをコードしているプラスミドベクター（ｐＣＭＶ−Ｔ７）は、ポリメラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内の、ｈＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサー領域の３’側にクローニングすることによって調製した。Ｔ７  ＲＮＡＰのＯＲＦを挿入する前に、ｐＣＩ−ｎｅｏを改変して複数クローニング部位の５’側に位置するＴ７プロモーターを除去して、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｂｃｌを作製した。Ｔ７  ＲＮＡＰコード配列を増幅するために使用したＰＣＲプライマー内に取り込ませたＥｃｏＲ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ制限部位を用いて、Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子をｐＣＩ−Ｎｅｏ−ＢＣｌ内に挿入した。翻訳に最適な配列構成を提供するために、コザック（Ｋｏｚａｋ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０８、２２９〜２４１、１９８９）コンセンサス配列を開始因子ＡＴＧの５’側に含めた。
【０１５５】
ＶＳＶ  Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧポリペプチドをコードしているプラスミドは、Ｐａｒｋｓら（Ｐａｒｋｓら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ、８３、１３１〜１４７、２００２）に記載のように、適切なＯＲＦを、プラスミドベクターｐＴ７中のＴ７バクテリオファージプロモーターおよび脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｊａｎｇら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６２、２６３６〜２６４３、１９８８、ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、３２０〜３２５、１９８８）の３’側に挿入することによって調製した。挿入されたコード配列は、３’末端がプラスミドにコードされているポリ−Ａ配列およびＴ７  ＲＮＡＰターミネーターに隣接している。ＶＳＶ  Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、および糖タンパク質（Ｇ）をコードしているプラスミドは、インディアナ血清型ゲノムｃＤＮＡクローン（Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２、４４７７〜４４８１、１９９５）またはニュージャージー血清型クローン（Ｒｏｓｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４、１０９０３〜１０９１０、２０００）に由来していた。
【０１５６】
ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサー（それぞれ、ｐＣＭＶ−ＧまたはｐＣＭＶ−Ｏｐｔ１、ｐＣＭＶ−ＲＮＡｏｐｔ）によって制御される、ＶＳＶ天然のＧまたはＶＳＶ最適化Ｇコード配列をコードしている発現プラスミドは、以下の実施例２に記載されている。これらのプラスミドは、トランスの糖タンパク質を提供する一方で、ＶＳＶΔＧまたはＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍベクターを繁殖させるために使用した。Ｇタンパク質のコード配列を、本実施例中で上述した改変したｐＣＩ−ｎｅｏベクター内にクローニングした。Ｇコード配列を増幅するために使用したＰＣＲプライマー内に取り込ませたＸｈｏ  Ｉ（５’）およびＸｂａ  Ｉ（３’）制限部位を用いて、Ｇコード配列を改変したｐＣＩ−ｎｅｏベクター内に挿入した。
【０１５７】
組換えＶＳＶゲノムクローンは、標準のクローニング手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）および出発物質としてインディアナ血清型ｐＶＳＶ−ＸＮ２ゲノムｃＤＮＡクローンを使用して、調製した（Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２、４４７７〜４４８１、１９９５）。Ｇ遺伝子を欠く（ΔＧ）ゲノムクローンは、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３、３７２３〜３７３２、１９９９）によって記載されたものに類似であった。第２の種類のＧ遺伝子改変は、Ｇコード配列が、Ｃ末端の９１個のアミノ酸と融合したシグナル配列の１８個のアミノ末端（Ｎ末端）残基のみをコードしている、改変された変形で置き換えられており、そのうちの約４２個の残基が切断された細胞外ドメイン（Ｇｓｔｅｍ）を形成するＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ（ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４、２２３９〜２２４６、２０００）の手法を用いて構築した。一部の組換えＶＳＶ構築体では、Ｇタンパク質遺伝子をニュージャージー血清型からの同等の遺伝子で置き換えた（Ｒｏｓｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４、１０９０３〜１０９１０、２０００）。
【０１５８】
（実施例２）
パッケージング方法の改善の調査
パッケージング方法の改善の調査では、方法中の２つの主要なステップに焦点をおいた：１）プラスミドＤＮＡによって駆動される一過性タンパク質の産生、および２）ビリオン形態形成の効率。以下の実施例３に記載する方法では、これらのステップの効率を改善させる改変を同定し、その結果、収量が日常的に１×１０７ＩＵ／ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地を超える手順がもたらされた。
【０１５９】
最大のＧタンパク質発現を支援する条件を同定するために、研究を実施した。以前に行った経験的研究により、電気穿孔が、プラスミドＤＮＡのＶｅｒｏ細胞内への、再現性のある効率的な導入を促進した方法として同定されており（Ｐａｒｋｓら、２００６、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ，ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ、公開米国特許出願第２００６０１５３８７０号、Ｗｉｔｋｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３５：９１〜１０１）、また、電気穿孔は拡張可能な技術であり（Ｆｒａｔａｎｔｏｎｉら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、５：２０８〜１０、２００３）、Ｖｅｒｏ細胞は、生ロタウイルスワクチンの産生に用いられている十分に特徴づけられた細胞基質であるため（Ｍｅｒｃｋ、ＲｏｔａＴｅｑ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｌｉｖｅ，Ｏｒａｌ，Ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ）ＦＤＡ．Ｏｎｌｉｎｅ、投函日２００６年、Ｓｈｅｅｔｓ，Ｒ．（Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＦＤＡ．Ｏｎｌｉｎｅ、投函日２０００年）、後の方法の洗練はこの発見に依存していた。
【０１６０】
この発見を改良するために、コード配列を最適化する２つの方法を分析して、ＶＳＶ  Ｇ（インディアナ血清型、Ｇｉｎ）の一過性発現が改善され得るかどうかを決定した。ＲＮＡ最適化（ＲＮＡｏｐｔ）として記載され、ＧＣ含有量を増加させ、核外移行を阻害する配列モチーフを破壊するために同義のヌクレオチド置換を使用する一方法は、翻訳を減少させる、またはｍＲＮＡを不安定にする（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７１：４８９２〜９０３、１９９７、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６６：７１７６〜８２、１９９２、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６６：１５０〜９）。最適化の第２の方法は、表１に詳述するコドン最適化方法である（Ｏｐｔ−１）。その後、改変したコード配列、および天然のＧｉｎオープンリーディングフレームを、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよび前初期領域１からのエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜３０、１９８５、ＭｅｉｅｒおよびＳｔｉｎｓｋｉ、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：３３１〜４２、１９９６）の３’側にクローニングして、３つのベクターを作製した（図６Ａ上部）。Ｇタンパク質の発現を比較するために、５０μｇのプラスミドＤＮＡを約１×１０７個のＶｅｒｏ細胞内に電気穿孔し（Ｗｉｔｋｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３５：９１〜１０１、２００６）、全細胞タンパク質を電気穿孔の２４または７２時間後に収集した。抗ＶＳＶポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット分析（図６Ｂ）により、どちらの最適化方法によってもＧタンパク質の存在量が顕著に増加したことが明らかになった。これらの結果により、電気穿孔（Ｗｉｔｋｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３５：９１〜１０１、２００６）を、最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列を含有するプラスミドの使用と組み合わせることによって、より高くより持続したＧタンパク質発現のレベルがＶｅｒｏ細胞で達成される可能性があることが実証された。
【０１６１】
最適化した遺伝子を含有するプラスミドの電気穿孔により、Ｖｅｒｏ細胞において高レベルのＧタンパク質発現が生じたことが発見された後、増加したＧの存在量がベクターのパッケージングを増強したかどうかを決定するために、研究を実施した。この実験でもやはり重要なことは、パッケージング収量の比較をΔＧおよびＧｓｔｅｍベクターで行ったことである（図２）。Ｇｓｔｅｍベクターは、ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ（ＲｏｂｉｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：２２３９〜４６、２０００）により、Ｇタンパク質の膜近位の細胞外の４２個のアミノ酸（基部領域）が粒子の形態形成を増強したことが実証されたため、開発された。したがって、細胞内ドメイン、膜貫通領域、および４２個のアミノ酸の細胞外ドメインからなる切断されたＧタンパク質（Ｇｓｔｅｍ）を発現するＶＳＶ発現ベクターが、より効率的な成熟を受け、パッケージング収量が改善される可能性があると仮定された。４つの独立した実験からの結果を図７に示す。細胞を、天然のＧ配列（ｐＣＭＶ−Ｇｉｎ、ベタもしくは斜線の＃１のバー）、Ｇｉｎ／Ｏｐｔ１（ベタもしくは斜線の＃２のバー）またはＧｉｎ／ＲＮＡｏｐｔ（ベタもしくは斜線の＃３のバー）を含有するプラスミドベクターを用いて電気穿孔し、電気穿孔の２４時間後に、単層を約０．１ＩＵのｒＶＳＶ−Ｇａｇ１−ΔＧ（斜線のバー）またはｒＶＳＶ−Ｇａｇ１−Ｇｓｔｅｍ（ベタのバー）に感染させた。この発見により、最適化した配列を含有するどちらのプラスミドも、より効率的なパッケージングを促進したことが明らかとなった。収量は、Ｓｃｈｎｅｌｌら（Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｃｅｌｌ、９０：８４９〜５７、１９９７）に記載されているプラーク滴定方法によって決定して、ΔＧまたはＧｓｔｅｍベクターのいずれについても０．５〜１．０ｌｏｇ１０ＩＵ増加した。さらに、Ｇｓｔｅｍベクターの収量は、ΔＧよりも０．２〜１ｌｏｇ１０単位高かった。これらの結果により、ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍベクターを、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有するプラスミドを用いて電気穿孔したＶｅｒｏ細胞中で繁殖させた場合に、１×１０８ＩＵと高いパッケージング収量が達成可能であったことが実証された。
【０１６２】
Ｇタンパク質に対する抗ベクター免疫の効果を減らすために、様々な血清型に由来するＧタンパク質をコードしている、生きた複製するＶＳＶベクターを作製することができる（Ｒｏｓｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：１０９０３〜１０、２０００）。同様に、ΔＧおよびＧｓｔｅｍベクターを、様々な血清型からのＧタンパク質と共にパッケージングすることができる。一過性発現パッケージング方法が、異なる株に由来する糖タンパク質で容易に作動するかどうかを決定するために、ニュージャージー血清型からのＶＳＶ  Ｇタンパク質（Ｇｎｊ）をコードしているプラスミドベクターを、天然のコード配列またはＲＮＡ最適化に供した配列のいずれかを用いて構築した。Ｇｎｊプラスミドベクターは、最初に、電気穿孔後の一過性タンパク質発現を評価することによって試験した。図８は、ニュージャージー血清型（Ｇｎｊ）またはインディアナ血清型（Ｇｉｎ）に由来する、天然のまたは最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質のコード配列の一過性発現の比較を示すウエスタンブロット分析である。ウエスタンブロット分析により、ＲＮＡ最適化がＧｎｊタンパク質の発現の規模を顕著に改善したことが示され（図８）、これは、ｐＣＭＶ−Ｇｎｊ／ＲＮＡｏｐｔがウイルスベクターのパッケージングを増強することを示唆している。ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ−ｇａｇ１のパッケージングを試験した場合（図９）、ＲＮＡ最適化は収量を約１０倍向上させ、粒子力価が１×１０８ＩＵ／ｍｌまで押し上げられた。
【０１６３】
（実施例３）
電気穿孔媒介の形質移入によるＶｅｒｏ細胞における水疱性口内炎ウイルスの救済
ＤＮＡの調製：
それぞれの電気穿孔について、以下のプラスミドＤＮＡを微量遠心チューブ中で合わせた：２５〜５０μｇの、Ｔ７（ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｂｃｌ−Ｔ７）を発現するプラスミド「ｈＣＭＶ−Ｔ７発現プラスミド」、１０μｇのＶＳＶ完全長プラスミド、８μｇのＮプラスミド、４μｇのＰプラスミド、１μｇのＬプラスミド、１μｇのＭプラスミドおよび１μｇのＧプラスミド。バイオセーフティーフード内で作業しながら、ＤＮＡの体積を、無菌的なヌクレアーゼを含まない水で２５０μｌに調節した。次に、５０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を加え、チューブの内容物を混合した。続いて、７５０μｌの１００％のエタノールを加え、チューブの内容物を混合した。これに続いて、−２０℃で１時間〜終夜のチューブのインキュベーションを行った。その後、微量遠心器内で、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、ＤＮＡをペレット化した。バイオセーフティーフード内で作業しながら、ＤＮＡペレットを乱さずに上清を廃棄した。残留エタノールをチューブから除去し、その後、ＤＮＡペレットをバイオセーフティーフード内で５〜１０分間空気乾燥させた。乾燥したＤＮＡペレットを、５０μｌの無菌的なヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させた。
【０１６４】
溶液
以下の溶液を細胞培養およびウイルス救済中に用いた：トリプシン／ＥＤＴＡ、ハンクス緩衝溶液、１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中で調製したダイズトリプシン阻害剤、および以下の表４に示す培地。
【０１６５】
【表４】
2011507515.tif 000007
【０１６６】
細胞培養およびウイルス救済
Ｖｅｒｏ細胞は、１０％の熱失活ウシ胎児血清（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１％のピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％の非必須アミノ酸および０．０１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＣｅｌｌｇｒｏ）からなる、完全ＤＭＥＭ中で維持した。これは培地３に対応する。細胞は、電気穿孔を実施する前日に継代培養を行い、３７℃、５％のＣＯ２中でインキュベーションした。
【０１６７】
ウイルス救済は、電気穿孔によってプラスミドＤＮＡをＶｅｒｏ細胞内に導入した後に開始した。電気穿孔の最適条件は、ｗｗｗ．ｂｔｘｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ（ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能なＤａｖｉｄ  Ｐａｓｃｏによるオンラインプロトコル０３６８でＶｅｒｏ細胞に推奨される条件から開始して、経験的に決定した。
【０１６８】
単一の電気穿孔では、ほぼコンフルエントな単層（Ｔ１５０フラスコ）からのＶｅｒｏ細胞を、約５ｍｌのハンクス緩衝溶液で１×洗浄した。その後、細胞を、４ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％のブタトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でフラスコから剥離した。具体的には、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を単層に加えた後、フラスコを振動させて溶液を均等に分配し、続いて、室温で３〜５分間インキュベーションした。その後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を吸引し、フラスコの側面を軽く叩いて細胞を外した。その後、培地１（１０ｍｌ）を用いて細胞をフラスコから収集し、細胞を５０ｍｌのコニカルチューブに移した。続いて、１ｍｌのトリプシン阻害剤（１ｍｇ／ｍｌ）を、細胞を含有するチューブに加え、内容物を穏やかに混合した。３００×ｇで５分間、室温で遠心分離することによって細胞を懸濁液から収集し、その後、上清を吸引し、ペレットを１０ｍｌの培地２に再懸濁させた。次に、１ｍｌのトリプシン阻害剤（１ｍｇ／ｍｌ）を細胞懸濁液に加え、懸濁液を穏やかに混合した。続いて、３００×ｇで５分間、室温で遠心分離することによって、懸濁液から細胞を収集した。上清を吸引し、細胞ペレットを０．７０ｍｌの培地２の最終体積に再懸濁させた。
【０１６９】
上述のように調製した、２５〜５０μｇの、Ｔ７（ｐＣＩ−Ｎｅｏ−Ｂｃｌ−Ｔ７）を発現するプラスミド「ｈＣＭＶ−Ｔ７発現プラスミド」、１０μｇのＶＳＶ完全長プラスミド、８μｇのＮプラスミド、４μｇのＰプラスミド、および１μｇのＬ、ＭおよびＧプラスミドのそれぞれを含有する、ヌクレアーゼを含まない水中の、５０μｌのＤＮＡ溶液を、０．７ｍｌの細胞懸濁液と合わせた。細胞およびＤＮＡを穏やかに混合し、混合物を電気穿孔キュベット（４ｍｍのギャップ、ＶＷＲまたはＢＴＸ）に移した。一部の実施形態では、Ｇプラスミドは、最適化されていないＶＳＶ  Ｇコード配列（たとえば天然のＧオープンリーディングフレーム）を含有する。一部の他の実施形態では、Ｇプラスミドは、本明細書中に記載のものなどの、最適化したＶＳＶ  Ｇコード配列を含有する。ＢＴＸ方形波電気穿孔器（ＢＴＸ  ＥＣＭ８２０または８３０、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞をパルスし（４回、１４０〜１４５Ｖ、７０ｍｓ）、その後、これらを室温で約５分間インキュベーションした後、１ｍｌの培地１を加え、キュベットの内容物を１０ｍｌの培地１を含有する無菌的な１５ｍｌの遠心チューブに移し、続いて穏やかに混合した。その後、３００×ｇで５分間、室温で遠心分離することによって電気穿孔した細胞を収集し、１０ｍｌの培地１に再懸濁させた後、２５ｍｌの培地１を含有するＴ１５０フラスコに移した。フラスコを終夜、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションした。翌日、培地を１５〜３０ｍｌの培地３に置き換えた。ＣＰＥが明白になるまで、定期的に培地を変えながら、インキュベーションを３７℃、５％のＣＯ２で続けた。ＶＳＶの複製は、典型的には、早くも３〜４日で明白であったが、一部の例では、６日と長くかかる場合があった。また、一部の例では、細胞変性効果（ＣＰＥ）が明白となる前に同時培養ステップが必要であった。
【０１７０】
同時培養は、１０ｍｌを残したすべての培地をフラスコから吸引し、その後、掻爬によって細胞を剥離することによって、電気穿孔の約４８〜７２時間後に開始した。細胞凝集体の大きさを最小にするために、剥離した細胞を複数回ピペット操作し、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子によってコードされているＶＳＶ  Ｇタンパク質を一過的または構成的に発現する、確立された５０％コンフルエントなＶｅｒｏ細胞の単層を含有するフラスコに移した。
【０１７１】
たとえば、機能的なＧタンパク質を欠く繁殖欠損ｒＶＳＶ（ΔＧおよびＧｓｔｅｍウイルス）の救済に用いた適切な同時培養方法では、最初に、最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子を含有する５０μｇのプラスミドベクター（たとえば、上記実施例１および２からのｐＣＭＶ−Ｏｐｔ１またはｐＣＭＶ−ＲＮＡｏｐｔ）を含むコンフルエントなＴ１５０フラスコからのＶｅｒｏ細胞を電気穿孔することによって調製した、同時培養単層を用いた。電気穿孔は上述のように行った。電気穿孔した細胞を洗浄した後、細胞を終夜、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションして、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現させた。同時培養物を確立する前に、培地を１５ｍｌの培地３で置き換えた。これらの細胞は、本明細書中で「プラーク拡大細胞」と呼び、先行する段落中に記載したウイルス救済細胞との同時培養物を確立するための単層として使用する。
【０１７２】
プラーク拡大細胞の単層は、同時培養ステップ中に、ウイルスを用いて、０．１〜０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）に感染させる。ＣＰＥが明白になるまで、同時培養物を３２〜３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションし、これは、一般に約２４〜４８時間かかった。その後、ウイルスを、当分野で周知の方法を用いて、スクロースクッションを通した遠心分離によって精製した。
【０１７３】
特許および特許出願を含めた、本明細書中で言及したすべての論文または参考文献は、すべての目的のためにその全体で本明細書中に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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