(57)【要約】インフルエンザワクチン接種に対する現在のアプローチは、季節性株または汎流行性株のどちらかに焦点を当てている。現在の季節性ワクチンは、一般的に２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１とＨ３Ｎ２）と１種のインフルエンザＢ型株由来の抗原を含む。現在の汎流行性ワクチンは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株に焦点を当てている。本発明の目的は、季節性株および汎流行性株の両方に対して免疫を惹起することができるワクチンを製造するさらなる改善された方法を提供することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該第１容器中のＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ型抗原の各々の濃度が、２５〜３５μｇ／ｍｌ（赤血球凝集素）の範囲にあることを特徴とする、キット。
【請求項２】
前記第２容器中のＨ５Ｎ１抗原の濃度が、５〜２０μｇ／ｍｌ（赤血球凝集素）の範囲、例えば、１０〜２０μｇ／ｍｌ（赤血球凝集素）の範囲にある、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該第２容器中のＨ５Ｎ１赤血球凝集素抗原の濃度が、５〜２０μｇ／ｍｌであることを特徴とする、キット。
【請求項４】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該第１容器と第２容器中の水性ワクチンの容積が、実質的に同じであり、それぞれ約０．４ｍｌ〜約０．６ｍｌの範囲にあることを特徴とする、キット。
【請求項５】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該第１容器中の水性ワクチンの容積が、該第２容器中の水性ワクチンの容積の実質的に２倍であることを特徴とする、キット。
【請求項６】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該容器のそれぞれが、ホウケイ酸ガラス製バイアルであることを特徴とする、キット。
【請求項７】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットであって、該Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、クレード１、２または４に属することを特徴とする、キット。
【請求項８】
前記Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、クレード２．１、２．２または２．３に属する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第１容器がアジュバント無添加であるが、前記第２容器がアジュバントを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
第１容器および第２容器が、共にアジュバント無添加であるが、前記キットが、水中油型エマルジョンアジュバントを含む第３容器を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）水中油型エマルジョンアジュバントを含む第２容器、を含むキット。
【請求項１２】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む凍結乾燥された不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキット。
【請求項１３】
前記第２容器が、水中油型エマルジョンを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、インフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む凍結乾燥された不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）水中油型エマルジョンアジュバントを含む第２容器、を含むキット。
【請求項１５】
（ｉ）第１のチャンバーが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含み；ならびに（ｉｉ）第２のチャンバーが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む、複数の別々のチャンバーを含む注射器。
【請求項１６】
前記Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、前記Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、前記インフルエンザＢ型ウイルス株、および前記Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、すべて卵中で生育させられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキットまたは注射器。
【請求項１７】
前記Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、前記Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、前記インフルエンザＢ型ウイルス株、および前記Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、すべて細胞培養物で生育させられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキットまたは注射器。
【請求項１８】
前記容器が鳥類ＤＮＡ、オボアルブミンおよびオボムコイドを含まない、請求項１７に記載のキットまたは注射器。
【請求項１９】
前記Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、前記Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、および前記インフルエンザＢ型ウイルス株が、第１培養基中で生育させられ、前記Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、第２培養基中で生育させられ、ここで、前記培養基の１つが卵であり、他方の培養基が細胞培養物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキットまたは注射器。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスの４種の株（Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株）に対して患者において免疫応答を惹起するための方法であって、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む第１のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップ；（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスなどのＨ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス由来の抗原を含む第２のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップ；ならびに（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む第３のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップを含み、ここで、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）が、（ａ）同時に、または（ｂ）いずれかの順序で連続的にだが、ステップ（ｉｉｉ）の前に実施されてもよい、方法。
【請求項２１】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチンを患者に投与することを含む、患者において免疫応答を惹起するための方法であって、該患者が、以前に、（ａ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む３価インフルエンザウイルスワクチンと（ｂ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス由来の抗原を含む１価インフルエンザウイルスワクチンとの両方を別々に受けている、方法。
【請求項２２】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチンを患者に投与し、次いで、その後、（ａ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む３価インフルエンザウイルスワクチンと（ｂ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス由来の抗原を含む１価インフルエンザウイルスワクチンとを別々に投与することを含む、患者において免疫応答を惹起するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年６月１２日に出願された米国仮出願第６１／１３１，９１８号および２００９年３月３１日に出願された英国特許出願第０９０５５７０．８号（これらの両方の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、インフルエンザウイルス感染から防御するためのワクチン、特に現在の季節性株と汎流行性株に由来する抗原を含むワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザワクチン接種に対する現在のアプローチは、季節性株または汎流行性株のどちらかに焦点を当てている。現在の季節性ワクチンは、一般的に、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１とＨ３Ｎ２）と１種のインフルエンザＢ型株由来の抗原を含む。現在の汎流行性ワクチンは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株に焦点を当てている。
【０００４】
季節性株および汎流行性株の両方に対して免疫を惹起することができるワクチンは、参考文献１（特許文献１）に開示されている。本発明の目的は、季節性株および汎流行性株の両方に対して免疫を惹起することができるワクチンを製造するさらなる改善された方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０６８６３１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の開示
本発明は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、ここで、第１容器中のＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ抗原の各々の濃度が、２５〜３５μｇ／ｍｌの範囲、例えば、約３０μｇ／ｍｌ（一般的に１：１：１の質量比で）であることを特徴とする。第２容器中の汎流行性抗原の濃度は、理想的には、５〜２０μｇ／ｍｌの範囲、例えば、約１５μｇ／ｍｌである。これらの抗原濃度は、不活化インフルエンザワクチンにとって通常であるように、インフルエンザウイルス赤血球凝集素に関して表現される。
【０００７】
汎流行性ワクチンを季節性ワクチンと別々に、しかし、キット内で維持することにより、製造過程で４価のワクチンが処方されるよりも最終ワクチン株のプロファイルをより容易に改変することを可能とする。これは、汎流行性ウイルスの株の変動のために特に重要である。
【０００８】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、第２容器中の汎流行性抗原の濃度が、５〜２０μｇ／ｍｌの範囲、例えば、約１５μｇ／ｍｌであることを特徴とする。
【０００９】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、第１容器と第２容器中の水性ワクチンの容積が、実質的に同じであり、それぞれが約０．４ｍｌ〜約０．６ｍｌの範囲、例えば、約０．５ｍｌであることを特徴とする。
【００１０】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、第１容器中の水性ワクチンの容積が、第２容器中の水性ワクチンの容積の実質的に２倍であることを特徴とする。
【００１１】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、各容器は、ホウケイ酸ガラス製バイアルであることを特徴とする。各バイアルは、１用量または複数（例えば、１０）用量の材料を含み得る。バイアルは、ブチルゴム製のストッパーを有していてもよい。
【００１２】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株が、クレード１、２または４に属することを特徴とする。
【００１３】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供し、ここで、Ｈ５Ｎ１株は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４；Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４；Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｕｎａｎ／７９５／２００２；Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５；Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ−ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５；Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｉａ／ＮＩＶ３３４８７／２００６；  Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５；Ａ／Ｂａｒ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｏｏｓｅ／Ｑｕｉｇｈａｉ／１Ａ／２００５；Ａ／Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｅｙｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０３８／２００６；Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５；Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６；Ａ／ｄｕｃｋ／Ｌａｏｓ／３２９５／２００６；Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／Ｒ０４０５０５０／２００７；およびＡ／ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｇｐｉｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５０５２／２００７からなる群から選択されるか、あるいは前記群から選択される株由来の赤血球凝集素と交差反応する抗赤血球凝集素抗体を誘発する赤血球凝集素を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１容器はアジュバントを含むが、第２容器はアジュバント無添加（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）である。別の実施形態では、第１容器はアジュバントを含み、そして、第２容器もアジュバントを含む。別の実施形態において、第１容器はアジュバント無添加であるが、第２容器はアジュバントを含む。他の実施形態では、第１および第２容器の両方は共にアジュバント無添加であるが、キットは、抗原なしの水中油型エマルジョンアジュバントを含む第３容器を含む。別の実施形態では、第１および第２容器の両方はアジュバント無添加であるが、キットは水中油型エマルジョンアジュバントと非インフルエンザ抗原を含む第３容器を含む。適切なアジュバントの詳細は、以下に示される。
【００１５】
これらのキットを用いて、容器の内容物は、混合ワクチンとして患者への便利な投与の前に、使用時に混合することができる。内容物は、任意の適切な順序で混合することができる。例えば、容器がバイアルである場合、第２容器の内容物は、針によって注射器に取り出すことができ、それから第１容器に挿入することができる。混合後、混合内容物は、注射器（前と同じまたは異なるもの）に取り出される。採取針が注射のために使われてもよいし、あるいは廃棄して、注射用（例えば、ＩＭ注射）に適したものと置きかえてもよい。
【００１６】
本発明は、また、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、汎流行性インフルエンザＡ型ウイルス株（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株）、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）水中油型エマルジョンアジュバントを含む第２容器、を含むキットを提供する。
【００１７】
本発明は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む凍結乾燥された不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む第２容器、を含むキットを提供する。第２容器は、理想的には、水中油型エマルジョンを含む。
【００１８】
本発明は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、および汎流行性インフルエンザＡ型ウイルス株（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株）、インフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む凍結乾燥された不活化インフルエンザワクチンを含む第１容器；ならびに（ｉｉ）水中油型エマルジョンアジュバントを含む第２容器、を含むキットを提供する。
【００１９】
本発明は、また、複数の別々のチャンバーを含む注射器を提供し、そこでは、（ｉ）第１のチャンバーは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含み；そして、（ｉｉ）第２のチャンバーは、汎流行性株、例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５株由来の抗原を含む水性不活化インフルエンザワクチンを含む。したがって、２つの水性成分は、共に、しかし同じ注射器の中で別々に保持され、それらは、作用させる際には、成分が混合される。いくつかの実施形態において、第１のチャンバーは、アジュバントを含む。他の実施形態では、第２のチャンバーはアジュバントを含む。他の実施形態では、第３のチャンバーは、アジュバントを含む。複数のチャンバーを有する注射器は、公知である（例えば、参考文献２〜９、その他）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ワクチン調製
現在、さまざまな形のインフルエンザウイルスワクチンが入手可能であり、一般的に、ワクチンは生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかに基づいている。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロソームの形態で提供されてもよい。本発明は、これらのタイプのワクチンのいずれをも使用できるが、一般的に不活化ワクチンと共に使用されるであろう。
【００２１】
不活化ウイルスが用いられるとき、ワクチンは全ビリオン、スプリットビリオン、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）を含んでもよい。ウイルスを不活化するための化学的手段は、有効量の以下の薬剤の１つまたはそれ以上による処理を含む：洗浄剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組み合わせ。例えば、ＵＶ光またはガンマ線照射などの、ウイルス不活化の非化学的方法は、当該技術分野において公知である。
【００２２】
ビリオンは、さまざまな方法によってウイルスを含有する流体から採取できる。例えば、精製方法は、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いたゾーン遠心分離法を含んでもよい。次いで抗原は、任意の希釈の後、ダイアフィルトレーションによって精製されてもよい。
【００２３】
スプリットビリオンは、精製したビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を生成することによって得られ、これは「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解方法を含む。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、参考文献１０〜１５などを参照されたい。ウイルスの分解は、典型的には、ウイルス全体を破壊またはフラグメント化することによって行なわれ、分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の破壊濃度によって感染性または非感染性となる。破壊によってウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化がもたらされ、ウイルスの完全性を変える。好ましい分解剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）の界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡなど、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１など）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。有用な分解手順の１つは、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を用いており、分解は最初のビリオン精製の際に（例えば、スクロース密度勾配溶液の中で）起こり得る。よって、分解方法は、ビリオン含有材料の浄化（非ビリオン材料を除去するため）と、採取したビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を用いる）と、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離と、密度勾配遠心分離ステップにおける分解剤の使用によるビリオンの分解（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含有するスクロース勾配を用いる）と、その後のろ過（例えば、限外ろ過）による望ましくない材料の除去とを含んでもよい。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張食塩水に有効に再懸濁できる。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチンである。
【００２４】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原赤血球凝集素を含み、典型的には、ノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質を精製した形態で調製するための方法は、当該技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品が、その例である。
【００２５】
不活化インフルエンザ抗原の別の形態は、ビロソーム［１６］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、インフルエンザウイルスを洗浄剤で可溶化した後にヌクレオカプシドを除去し、ウイルスの糖タンパク質を含有する膜を再構築することによって調製できる。ビロソームを調製するための代替的な方法は、ウイルスの膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを与えることを含む。本発明は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  ＶＴＭおよびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品と同様にバルクのビロソームを保存するために用いられてもよい。
【００２６】
インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは、温度感受性であってもよい。インフルエンザウイルスは、低温適応されてもよい。これら３つの特徴は、生ウイルスを抗原として用いるときに特に有用である。
【００２７】
ＨＡは現行の不活化インフルエンザワクチンにおける主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定されたＨＡレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは、典型的には１株当り約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば子供用、または汎流行性状態のとき、あるいはアジュバントを使用するときなどには、もっと低用量のものを用いることができる。例えば、１／２（すなわち１株当り７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの部分的用量が用いられており、より高用量（例えば、３×または９×用量［１７、１８］）も用いられている。他に記載されている場合を除き、ワクチンはインフルエンザ１株当り０．１μｇから１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１μｇから５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含んでもよい。特定の用量は、１株当り、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。例えば、各株に対するＨＡの質量が、１株当たりの平均ＨＡ質量の１０％以内、好ましくは、その平均の５％以内にあるような汎流行性株を除き、ワクチンに含まれる各株に対して実質的に同じ質量のＨＡを使用することが好ましい。汎流行性株のＨＡの質量は、好ましくは非汎流行性株の平均質量の１／２または１／４である。
【００２８】
生ワクチンに対する用量は、ＨＡ含有量ではなく、メジアン組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株当たり１０６から１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【００２９】
本発明によって用いられる株は、野生型ウイルスにみられるような天然ＨＡを有するか、または修飾されたＨＡを有してもよい。例えば、鳥類種におけるウイルスの病原性を高める決定要因（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周囲の超塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾することは公知である。本発明と共に使用されるインフルエンザＢ型ウイルスの赤血球凝集素は、好ましくは、１９７位のアミノ酸にＡｓｎを有し、グリコシル化部位［１９］を提供する。
【００３０】
細胞株
ウイルス増殖の培養基としてＳＰＦ卵（ウイルスが鶏の卵の感染した尿膜腔液から採取される）を使用するよりも、インフルエンザウイルスの複製を支持する細胞株が使用される場合がある。この細胞株は典型的には哺乳動物に由来する。由来となる適切な哺乳動物細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌの細胞を含むがこれらに限定されず、霊長類の細胞の使用は好ましくない。さまざまな細胞型、例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などが用いられてもよい。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞、例えば、ベロ細胞株のような腎臓細胞などである［２０〜２２］。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞などである。
【００３１】
したがって、適切な細胞株は以下を含むが、それらに限定されない：ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；ＣＬＤＫ；ＨＫＣＣ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６［２３］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８；その他。適切な細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［２４］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２５］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）などから広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、種々の異なるベロ細胞をカタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞をカタログ番号ＣＣＬ−３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。
【００３２】
最も好ましい細胞株は、哺乳動物型のグリコシル化を伴う細胞株である。哺乳動物細胞株に対するそれより好ましくない代替法として、ウイルスは、カモ（例えば、カモ網膜）またはメンドリ由来の細胞株を含む鳥類の細胞株［例えば、参考文献２６〜２８］において生育させることができる。鳥類の細胞株の例としては、鳥類の胚性幹細胞［２６、２９］およびカモの網膜細胞［２７］が挙げられる。適切な鳥類の胚性幹細胞は、ニワトリ胚性幹細胞由来のＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４を含む［３０］。ニワトリ胚性繊維芽細胞（ＣＥＦ）もまた、使用されてもよい。しかし、鳥類の細胞を使用するよりもむしろ、哺乳動物細胞を使用することは、ワクチンが鳥類のＤＮＡおよび卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）を含まないようにできることを意味するため、アレルゲン性が低減される。
【００３３】
インフルエンザウイルスを生育するために最も好ましい細胞株は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞株［３１〜３４］である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞株の派生物が用いられてもよい。例えば、参考文献３１は、懸濁培養での生育に対して適合されたＭＤＣＫ細胞株を開示している（「ＭＤＣＫ３３０１６」、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９として寄託されている）。同様に、参考文献３５は、無血清培養の懸濁液中で生育するＭＤＣＫ由来の細胞株を開示している（「Ｂ−７０２」、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている）。参考文献３６は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示している。参考文献３７は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、非常に感染しやすいＭＤＣＫ細胞株を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞株のいずれをも使用することができる。
【００３４】
ウイルスは、接着培養または懸濁液の細胞において生育されてもよい。マイクロキャリア培養を用いることもできる。このように、いくつかの実施形態においては、細胞は懸濁液中での生育に対して適合され得る。
【００３５】
好ましくは、細胞株は無血清培地および／または無タンパク質培地中で生育される。ヒトまたは動物由来の血清からの添加剤を有しない培地は、本発明の文脈において、無血清培地と呼ばれる。こうした培養において生育する細胞は、当然その細胞自身のタンパク質を含有するが、無タンパク質培地とは、タンパク質、成長因子、その他のタンパク質添加剤および非血清タンパク質の排除によっても細胞の増加（例えば、感染前に）が起こるが、場合によりウイルスの生育に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができるような培地を意味することが理解される。
【００３６】
インフルエンザウイルスの複製を支持する細胞株は、好ましくはウイルスの複製の間に３７℃よりも低い温度［３８］（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で生育される。
【００３７】
培養細胞中でインフルエンザウイルスを増殖させるための方法は、通常、細胞の培養物に生育すべき株の接種物を接種するステップと、感染した細胞を、例えば、ウイルス力価または抗原発現などによって定められるウイルス増殖のための所定期間（例えば、接種後２４時間から１６８時間）、培養するステップと、増殖したウイルスを回収するステップとを含む。培養細胞は、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）対細胞の比が１：５００から１：１、好ましくは１：１００から１：５、より好ましくは１：５０から１：１０となるように接種される。ウイルスは、細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは２５℃から４０℃、好ましくは２８℃から３７℃において、少なくとも６０分、通常は３００分未満、好ましくは９０分から２４０分の間、細胞に吸収される。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、凍結−解凍によって、または採取された培養上清のウイルス含有量を増加させるための酵素作用によって除去されてもよい。採取された流体は、次いで不活化されるか、または凍結保存される。培養細胞は、約０．０００１から１０、好ましくは０．００２から５、より好ましくは０．００１から２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ」）にて感染されてもよい。さらにより好ましくは、細胞は約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染細胞は、感染後３０時間から６０時間で採取されてもよい。好ましくは、細胞は感染後３４時間から４８時間で採取される。さらにより好ましくは、細胞は感染後３８時間から４０時間で採取される。通常は、細胞培養の際にプロテアーゼ（典型的にはトリプシン）を加えることによって、ウイルスを放出させるが、このプロテアーゼは、例えば、接種前、接種と同時、または接種後など、培養中の任意の適切な段階で加えることができる［３８］。
【００３８】
好ましい実施形態において、特にＭＤＣＫ細胞について、細胞株はマスターワーキング細胞バンクから４０回の倍加レベルを超えては継代されない。
【００３９】
ウイルス接種物およびウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、これらのウイルスに対してテストされて、その混入に対する陰性の結果を与える）［３９］。単純ヘルペスウイルスが存在しないことが特に好ましい。
【００４０】
宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスが細胞株上で生育されるときには、ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最小化するために、最終ワクチン中の残存細胞株ＤＮＡの量を最小化することが標準的に行なわれる。
【００４１】
このように、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、１用量当り１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましいが、痕跡量の宿主細胞ＤＮＡが存在する場合がある。
【００４２】
０．２５ｍｌの容積当り＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンのように、１５μｇの赤血球凝集素当り、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。０．５ｍｌの容積当り、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンのように、５０μｇの赤血球凝集素当り、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンがより好ましい。
【００４３】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【００４４】
混入ＤＮＡは、例えば、クロマトグラフィーなどの標準的な精製手順を用いて、ワクチン調製の間に除去できる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮアーゼの使用などによるヌクレアーゼ処理によって高めることができる。宿主細胞ＤＮＡの混入を低減させるための便利な方法が、参考文献４０および４１に開示されており、この方法は、２ステップ処理を含み、最初にＤＮアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、このＤＮアーゼはウイルス生育の間に用いることが可能であり、次いでカチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用し、この洗浄剤はビリオン破壊の際に用いられてもよい。β−プロピオラクトン処理による除去を用いることもできる。
【００４５】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な規制要件であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、一般的に確証されたアッセイである［４２、４３］。確証されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目で記載することができ、そしてその考えられる誤差の供給源が同定される。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験されるであろう。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行なうことができる。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術を使用することができる：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［４４］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムなどのイムノアッセイ法［４５］；および定量的ＰＣＲ［４６］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［４５］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的な形成を含む。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献４７に見出すことができる。
【００４６】
株の選択
本発明によって生産されるワクチンは、少なくとも４種のインフルエンザウイルス株を含む。異なる株は一般的に別々に生育させられ、次いで、ウイルスが採取され、抗原が調製された後に混合される。このように、本発明の方法は、１つより多い数のインフルエンザウイルス株由来抗原を混合するステップを含み得る。
【００４７】
インフルエンザＡ型ウイルスは、現在、１６のＨＡサブタイプ（亜型）を示す：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈｌ０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６。本発明は、１つ以上のインフルエンザＡ型ウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９から防御し得る。本明細書におけるワクチンは、少なくともＨｌ株、Ｈ３株および汎流行性株を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ３株は、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する。他の実施形態では、Ｈ３株は、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する。
【００４８】
汎流行性インフルエンザ株の特性は、以下のとおりである：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して、新規の赤血球凝集素を含む（すなわち、１０年を超えてヒト集団において顕性でないもの（例えば、Ｈ２）か、またはヒト集団において先に全く見出されていないもの（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）であることにより、ワクチン受容者および一般的なヒト集団が、その株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである）；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得る；ならびに（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性である。汎流行性株としては、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株（例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７株）を挙げることができる。Ｈ５Ｎ１株が代表的である。本発明で使用するための他の汎流行性株は、２００９年に豚から人に移ったＨ１Ｎ１株に由来し得る。このように、汎流行性株は、配列番号１５より配列番号１４により密接に関連がある赤血球凝集素を有するＨ１株であり得る（すなわち、同じアルゴリズムとパラメータに整列させたとき、それは配列番号１５よりも配列番号１４に対してより高度の配列同一性を有する）。
【００４９】
インフルエンザＢ型ウイルスは、現在、異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢ型ウイルス株は、２つの異なる系統に分類される。これらの系統は、１９８０年代後半に出現し、抗原的および／または遺伝的に互いに区別され得るＨＡを有する［４８］。現在のインフルエンザＢ型ウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。これらの株は、通常、抗原的に識別されるが、アミノ酸配列の違いも、２つの系統を識別するために記述されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株が、しばしば（しかし、常にではなく）「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列と比較してナンバーリングされた１６４位におけるアミノ酸残基の欠失を伴うＨＡタンパク質を有する［４９］。いくつかの実施形態では、インフルエンザＢ型株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様である。他の実施形態では、インフルエンザＢ型株は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様である。
【００５０】
本発明で使用されるインフルエンザウイルスは、再集合体株であってもよく、そして逆遺伝学技術によって得ることができた。逆遺伝学技術［例えば、５０〜５４］は、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを、プラスミドを使用してインビトロで調製されるのを可能にする。一般的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全かつインタクトな感染性ビリオンの構築に至る。上記ＤＮＡは、好ましくは、上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法を用いることができ［５５〜５７］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、最大１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［５８］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献５８の方法の好ましい態様は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１  ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２  ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にすることができる。
【００５１】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージ・ポリメラーゼ・プロモーターを使用することが、可能である［５９］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターを便利に使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージ・ポリメラーゼ・プロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）に関してより好都合であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００５２】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために２重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが可能である［６０、６１］。
【００５３】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（典型的には、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２再集合体）を含み得る。それはまた、ワクチン調製のための再集合体ウイルスを産生するために有用な、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または任意の他のウイルス株由来の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。インフルエンザＡ型ウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０）からの６種より少ない数（すなわち０、１、２、３、４または５種）のウィルスセグメントを含み得る。インフルエンザＢ型ウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６）からの６種（より少ない数すなわち０、１、２、３、４または５種）のウィルスセグメントを含み得る。一般的に、本発明は、人から人への感染が可能である株から防御し、したがって、株のゲノムは、通常、哺乳類（例えば、人）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。それは、鳥類インフルエンザウイルスを起源としたＮＳセグメントを含み得る。
【００５４】
抗原が組成物に含まれることができる株は、抗ウイルス療法に対して耐性（例えば、オセルタミビル［６２］および／またはザナミビルに対して耐性）の場合がある（耐性汎流行性株［６３］を含む）。
【００５５】
特に有用な株は、患者からの単離と細胞培養システムの複製を含む間の任意の段階で卵により継代されなかった株である。ＭＤＣＫ細胞は、単離からウイルス複製までのすべてのステップについて排他的に使用できる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明で使われる株は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を有する。ヒトインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースにα−２，６結合したシアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵とベロ細胞は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞のヒトインフルエンザウイルスの生育は、卵継代と異なり、天然のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合を維持するために、赤血球凝集素への淘汰圧を提供する。
【００５７】
あるウイルスがＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合するかどうかを定めるために、さまざまなアッセイを使用することができる。例えば、参考文献６４は、親和性定数の高感度な量的測定を与える、インフルエンザウイルス受容体結合活性に対する固相酵素結合アッセイを記載している。参考文献６５が用いた固相アッセイにおいては、２つの異なるシアル酸糖タンパク質に対するウイルスの結合が評価されており（オボムコイド、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定基を有する；およびブタα２−マクログロブリン、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定基である）、さらに記載されるアッセイにおいては、以下の２つの受容体類似物に対するウイルスの結合が評価されている：遊離シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）。参考文献６６は、α２，３またはα２，６結合に対する受容体の優先性を明確に区別できるグリカンアレイを用いたアッセイを報告している。参考文献６７は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌのいずれかを含有するように酵素的に修飾されたヒト赤血球の凝集に基づいたアッセイを報告している。アッセイはそのタイプによって、ウイルス自体によって直接的に行われてもよく、またはウイルスから精製された赤血球凝集素によって間接的に行うことができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明で使われるインフルエンザ株は、卵由来ウイルスと異なるグリコシル化パターンの糖タンパク質（赤血球凝集素を含む）を有する。このように、糖タンパク質は、鶏卵では見られないグリコフォームを含む。
【００５９】
それから汎流行性株が使われる場合、他に明記した場合を除き、それは通常Ｈ５Ｎ１株などのＨ５赤血球凝集素サブタイプのインフルエンザＡ型ウイルスに由来するであろう。Ｈ５のサブタイプ内では、株はクレード０、１、２、３、４、５、６、７、８または９に属することができる。
【００６０】
２００３年以降、鳥類種に伝播している大多数のＨ５Ｎ１型ウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）配列は、２つの異なった系統学的クレードに分類される。カンボジア、タイおよびベトナムで伝播しているクレード１ウイルスは、２００４年と２００５年の間にそれらの国で、そして、２００６年にタイでヒト感染の原因となった。クレード２のウイルスは、２００３年以降中国とインドネシアで鳥類に伝播した；それらは、２００５年と２００６年の間に中東、ヨーロッパおよびアフリカへと西の方に広がった。２００５年後半から、クレード２ウイルスは、主にヒト感染の原因となった。クレード２の複数のサブクレードが識別された；これらのうちの３つ（サブクレード１、サブクレード２およびサブクレード３）は、地域分布において異なり、これまで主に人の症例の原因となった。さらなる再分割もまた知られており、例えば、クレード２．３内では、２．３．２と２．３．４を含む４つの分類がある。
【００６１】
２００６年８月と２００７年３月の間で、鳥類種で継続して伝播するか、あるいは再出現して、アフリカ、アジアおよびヨーロッパでの散発的なヒト感染を伴ったＨ５Ｎ１型ウイルスの大部分のＨＡ配列は、前に示した系統学的クレードとサブクレードに分類された。クレード１ウイルスは、タイとベトナムの鳥での発生の原因となり、タイでのヒト感染の原因となった。クレード２．１ウイルスは、家禽類で伝播し続け、インドネシアではヒト感染を引き起こす。クレード２．２ウイルスは、アフリカ、アジアおよびヨーロッパの数カ国で鳥類での発生を引き起こし、エジプト、イラクおよびナイジェリアでは人の感染を伴った。クレード２．３ウイルスは、アジアで散発的に単離されて、中国とラオス人民民主共和国でヒト感染の原因となった。
【００６２】
さらに、これらの分類の外に分類される２、３のウイルスは、アジアでの局地的な発生の過程で国内の家禽から分離された。これらのウイルスは、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６（クレード４）およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｘｉ／２／２００６（クレード７）によって表される新型クレードに分類される。現在、全体で０〜９の１０のクレードが定義されている。
【００６３】
本明細書で参考のために、各クレードに対する基本型株は、それらの赤血球凝集素遺伝子のコード配列と共に、以下の通りである：
【００６４】
【表１】
2011522874.tif 000002
Ｐｈｙｌｉｐパッケージ［６８］（例えば、Ｋｉｍｕｒａの２−パラメータ距離と正方行列を使う）で実行されるＤＮＡＤＩＳＴアルゴリズムを使用して評価されるとき、クレード１のＨ５ウイルスは、クレード０と２〜９のいずれかからの任意のコード配列（配列番号：２〜１０）よりも、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３株（配列番号：１）からのコード配列に、より密接に関連する赤血球凝集素コード配列を有するインフルエンザＡ型ウイルスとして系統学の用語で本明細書に定義され得る。同様に、クレード２ウイルスは、クレード０、１および３〜９のいずれかからの任意のコード配列（配列番号：１、および３〜１０）よりも、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号：２）からのコード配列に、より密接に関連する赤血球凝集素コード配列を有する。他のクレードは、同様に系統学的に定義される−配列番号：１〜１０の他の配列に関連するよりも、配列番号：１〜１０由来の関連コード配列に、より密接に関連する赤血球凝集素コード配列を有する。
【００６５】
クレード１ウイルスは、配列番号：２〜１０のいずれかよりも、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３株（配列番号：１）により大きな配列同一性を有する赤血球凝集素コード配列を有するインフルエンザＡ型ウイルスとして核酸配列用語で本明細書に定義され得る。他のクレードは、同様に定義される−配列番号：１〜１０の他の配列よりも、配列番号：１〜１０由来の関連コード配列に、より密接に関連する赤血球凝集素コード配列を有する。
【００６６】
Ｈ５ウイルスは、特徴的なＨＡ突然変異［６９］への言及によるアミノ酸配列の用語で特定のクレードとして本明細書に定義され得る。例えば、クレード３ウイルスは、以下のアミノ酸残基の１つ以上を有する場合があり、それはクレード１および２とは区別される：Ａｓｎ−４５；Ｓｅｒ−８４；Ａｓｎ−９４；Ａｓｎ−１２４；Ｌｅｕ−１３８；Ｓｅｒ−１４４；Ｇｌｕ−２１２；Ｓｅｒ−２２３；および／またはＡｒｇ−３２５。クレード２ウイルスは、Ａｓｐ−１２４を有することが可能であり、それは、クレード１と３では見られない。クレード１ウイルスは、クレード２および３と異なる以下のアミノ酸残基の１つ以上を有することが可能である：Ｓｅｒ−１２４；Ｌｅｕ−１２９。
【００６７】
クレード２の中では、少なくとも３つのサブクレードが認識されている：２．１、２．２および２．３。クレード２．１のＨ５ウイルスは、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株（配列番号：１１）またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（配列番号：１２）のどちらかよりも、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号：２）に、より密接に関連している赤血球凝集素コード配列を有するとして系統学の用語で本明細書に定義され得る。同様に、クレード２．２のＨ５ウイルスは、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（配列番号：１１）または、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号：２）のどちらかよりも、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５株（配列番号：１２）に、より密接に関連している赤血球凝集素コード配列を有するとして系統学の用語で本明細書に定義され得る。最後に、クレード２．３のＨ５ウイルスは、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（配列番号：１２）またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号：２）のどちらかよりも、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５株（配列番号：１１）に、より密接に関連している赤血球凝集素コード配列を有するとして系統学の用語で本明細書に定義され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、サブクレード２．２の株は、以下の配列の１つ以上を含むＨＡを有してもよい：Ｉｌｅ−２２３；Ｉｌｅ−２３０；Ｉｌｅ−５１７；ΔＳｅｒ−１３３；配列ＲＥＧＲＲＲＫＲを有する切断部位（配列番号：１３）。ＨＡ遺伝子は、１つ以上のヌクレオチドを含んでもよい：Ａ−４１；Ａ−１４２；Ａ−２０９；Ａ−２９５；Ｇ−４３３；Ａ−４６７；Ａ−４９６；Ｃ−６１０；Ａ−６２７；Ａ−６４３；Ｃ−６５８；Ｔ−６６１；Ｔ−６８９；Ｔ−７２７；Ｇ−８８０；Ｃ−９３７；Ｇ−１００６；Ｔ−１０１２；Ａ−１０１９；Ｔ−１１７７；Ａ−１２３５；Ｔ−１４０２；Ｃ−１４１５；Ｔ−１４８０；Ｃ−１５１０；Ｔ−１６１４；Ｃ−１６１５；Ａ−１６７２；Ｇ−１７０８（そのいずれかは、関連コドンに対してコード化されたアミノ酸を変更する場合もあるし、そうでない場合もある）。ＮＡ遺伝子は、ヌクレオチドＡ−７４３を含むことがあり、それは関連コドンに対してコード化されたアミノ酸を変更しない。
【００６９】
有用なことに、４価の混合物において、本発明は３つの異なるインフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素サブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５）由来の抗原を含むが、３つより少ない数の異なるインフルエンザＡ型ウイルス・ノイラミニダーゼ・サブタイプを含む（例えば、Ｎ１とＮ２の２つ）。この配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、共通のノイラミニダーゼサブタイプ（例えば、Ｈ１Ｎ１とＨ５Ｎ１）を共有する複数のインフルエンザＡ型ウイルス株を使うことから生じる。この共通のＮサブタイプは、交差防御能（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）［７０］を高めることができる。
【００７０】
医薬組成物
本発明のキットは、免疫原性医薬組成物（例えば、ワクチン）の即席の調製のために使用することができる。そのような組成物は、通常、インフルエンザ抗原の他に、成分を含む場合があり、例えば、それらの組成物は、典型的には、１つ以上の医薬担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献７１において入手可能である。多くの実施形態では、アジュバントが含まれてもよい。
【００７１】
組成物は、投与時点では一般に水性形態である。
【００７２】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことが可能である。好ましくは、ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）ようにすべきであり、例えば、チオメルサールを含まないようにすべきである［１４、７２］。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。コハク酸α−トコフェロールが、水銀化合物の代替品として含ませることができる［１４］。抗原がキットの２つ以上の容器中に存在するときは、いくつかの実施形態では、これらの容器のそれぞれは、保存剤を含むが、他の実施形態においては、唯一の抗原を含む容器だけが保存剤を含む。アジュバントが抗原とは別の容器中にあるときは、そのアジュバントは、理想的に水銀を含まない。しかし、混合後では、保存剤の出所は、通常、明らかではない。
【００７３】
張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、および／または塩化マグネシウムなどが挙げられる。アジュバントが抗原とは別の容器にあるときは、塩化ナトリウムが両方の容器中にあってもよい。
【００７４】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にあってよい。
【００７５】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、一般に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。アジュバントが抗原とは別の容器にあるときは、緩衝剤が両方の容器中にあってもよい。
【００７６】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを包含し得る。
【００７７】
組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量あたり、＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは１用量あたり、＜０．１ＥＵを含む。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００７８】
本発明の組成物は、洗浄剤を含んでもよく、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムなどを、特にスプリット抗原ワクチンまたは表面抗原ワクチンのために含んでもよい。洗浄剤は、痕跡量で存在していてもよい。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々を１ｍｇ／ｍｌ未満含んでもよい。その他の痕跡量の残余成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であってもよい。アジュバントが抗原とは別の容器中にあるときは、この洗浄剤は、通常、抗原含有容器（例えば、ポリソルベート８０とオクトキシノール１０と共になった抗原）中に存在する。
【００７９】
組成物は、単一の免疫化のための材料を含んでも、複数の免疫化のための材料を含んでもよい（すなわち「複数回用量」キット）。保存剤を含むことが、複数回用量の配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含ませることの代替（またはそれに加えるもの）として、組成物は材料の取出しのための無菌アダプターを有する容器内に含有されてもよい。
【００８０】
インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの用量容積で投与されるが、子供には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）が投与され得る。本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、高用量で、例えば、０．５ｍｌ容積を２つ混合した後に、例えば、約１ｍｌを投与することが可能である。
【００８１】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間に保存される。それらは凍結されるべきではない。それらに直接光が当らないようにされることが理想的である。
【００８２】
アジュバント
使用の際には、本発明の組成物は、アジュバントを有利に含むことが可能であり、それは、組成物を受ける患者で誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性の）を高めるために機能することができる。水中油型エマルジョンアジュバント（特にスクアレンを含むアジュバント）の存在は、季節性インフルエンザワクチン［７３］および汎流行性インフルエンザワクチン［７４、７５］に対する免疫応答の株の交差反応性を高めることが示された。
【００８３】
エマルジョンアジュバントは、３価の季節性キット成分、１価の汎流行性キット成分と共に、または別々のキット成分として含まれてもよい。
【００８４】
本発明で使用するための水中油型エマルジョンは、典型的には、少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤とを含み、その油（複数可）および界面活性剤（複数可）は生分解性（代謝性）であり、かつ生体適合性である。エマルジョン中の油の小滴は、一般的に直径が５μｍ未満であり、直径がミクロン以下となってもよく、こうした小さいサイズは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーによって得られる。２２０ｎｍ未満のサイズの小滴は、フィルタ滅菌できるために好ましい。
【００８５】
本発明は、油、例えば、動物（魚など）または植物供給源からの油を使用することができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀物を含む。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油は、最も一般的に入手可能な堅果油の例示である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油などを含む。穀物群のうちでは、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、他の穀類、例えば、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライコムギなどの油が使用されてもよい。グリセリンと１，２−プロパンジオールとの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油では天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することが可能である。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であるため、本発明の実施において用いられてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、ケン化およびその他の手段のための手順は、当該技術分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に採取され得る代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨ロウなど）は、本明細書において用いられ得る魚油のいくつかの例示である。多くの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されて、一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐鎖不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンの飽和類似体であるスクアランもまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であるし、当該技術分野において公知の方法によって得られてもよい。好ましいのはスクアレンである。
【００８６】
その他の有用な油は、トコフェロールであり、それは、高齢患者（例えば、６０才以上）で使用するためのワクチンに有利に含まれるが、その理由は、ビタミンＥはこの患者群での免疫応答に陽性の効果を有することが報告されているからである［７６］。それらは、また、エマルジョンを安定化させる助けとなり得る抗酸化特性を有する［７７］。いろいろなトコフェロール（α、β、γ、δ、εまたはξ）が存在するが、α型が通常使われる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替品として有用な保存剤であることが知られている［１４］。
【００８７】
例えば、スクアレンとα−トコフェロールの油の混合物を使用することができる。２〜２０％（容積）の範囲の油の含量が一般的である。
【００８８】
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性−親油性バランス）によって分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下を含むがそれらに限定されない界面活性剤とともに用いることができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（通常はＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；酸化エチレン（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／または酸化ブチレン（ＢＯ）のコポリマー、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売される、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど；オクトキシノール、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動可能であり、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）など；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズなど；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）など；ならびにソルビタンエステル（通常ＳＰＡＮとして公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートなど。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含ませるための最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ８０）である。
【００８９】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物などを用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステルとオクトキシノールの組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【００９０】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は次のとおりである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）が０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤など）が０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％。
【００９１】
スクアレン含有水中油型エマルジョン、特にポリソルベート８０を含むものが好ましい。本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むが、それらに限定されない：
・スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートのサブミクロンエマルジョン。容積でのエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５とすることができる。重量でいうと、これらの比率は４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知［７８〜８０］であり、参考文献８１の第１０章および参考文献８２の第１２章に、より詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００９２】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０のサブミクロンエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレンと、２〜１０％のトコフェロールと、０．３〜３％のポリソルベート８０とを有してもよく、より安定なエマルジョンを提供できるように、スクアレン：トコフェロールの重量比は、≦１（例えば、０．９０）であるのが好ましい。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比または約１１：５の重量比で存在してもよい。こうしたエマルジョンの１つは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を与え、次いでこの溶液９０ｍｌを混合物（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）と混合し、次いで混合物をマイクロ流動化することによって作製できる。得られたエマルジョンは、サブミクロンの油小滴を有してもよく、例えば、その小滴の平均直径は１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍであってもよい。エマルジョンは、また、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）を含んでもよい。この種の別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量当たり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含んでもよい［８３］。
【００９３】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンは、また、３ｄ−ＭＰＬを含んでもよい（下記を参照）。このエマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してもよい。
【００９４】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）で含んでもよく、これらの濃度には抗原由来のこれらの成分のどんな寄与も含まれるべきである。このエマルジョンは、また、スクアレンを含んでもよい。このエマルジョンは、また、３ｄ−ＭＰＬを含んでもよい。水相はリン酸緩衝液を含んでもよい。
【００９５】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水において処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに対する有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてスレオニル−ＭＤＰとともに用いられている［８４］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントのように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる［８５］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロ流動化が好ましい。
【００９６】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」など）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、および／または油小滴の少なくとも９０％（容積で）が２００ｎｍ未満のサイズである［８６］。このエマルジョンは、さらに、以下のうち１つまたはそれ以上を含んでもよい：アルジトール；凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなど））；および／またはアルキルポリグリコシド。このエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニスト［８７］を含んでもよい。こうしたエマルジョンは凍結乾燥されてもよい。
【００９７】
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［８８］のエマルジョン。アジュバントワクチンにおけるこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９８】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献８９に記載されるとおり、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの小滴サイズが有利である。
【００９９】
・非代謝性の油（例えば、軽油など）と、少なくとも１つの界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。添加剤、例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（例えば、参考文献９０に記載されるＧＰＩ−０１００など、これは脂肪族アミンをグルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に加えることによって生成される）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどが含まれてもよい。
【０１００】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が、らせん状のミセルとして会合しているエマルジョン［９１］。
【０１０１】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［９２］。
【０１０２】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［９２］。
【０１０３】
エマルジョンは、分離した形態にあるにせよ、あるいは、少なくとも１つの抗原と既に混合されているにせよ、送達の時に即座に別々の抗原含有成分と混合される。これらの２つの成分が液体の場合には、混合のための２つの液体の容積比は変動し得る（例えば、５：１〜１：５）が、一般的には約１：１である。
【０１０４】
抗原とアジュバントとが混合された後、赤血球凝集素抗原は、一般的に水溶液中に残るが、油／水界面の周囲に分布し得る。一般的に、赤血球凝集素がエマルジョンの油相に入るとしてもごくわずかである。
【０１０５】
キット成分の包装
本発明のキット成分に対する適切な容器は、バイアル、注射器（例えば、使い捨て注射器）などを含む。これらの容器は無菌であるべきである。容器は共に包装されて、例えば、同じボックス内にキットを形成することができる。
【０１０６】
成分がバイアルに配置される場合、そのバイアルは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製できる。バイアルは、好ましくは、組成物が添加される前に滅菌される。ラテックス過敏性の患者に伴う問題を避けるために、バイアルは好ましくはラテックスを含まないストッパーで密閉され、すべての包装材料にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、単回用量のワクチンを含んでもよいし、２回以上の用量、例えば１０回用量を含んでもよい（「複数回用量」バイアル）。有用なバイアルは無色のガラスから作製される。ホウ珪酸ガラスが、ソーダ石灰ガラスよりも好ましい。バイアルは、ブチルゴム製のストッパーを有してもよい。
【０１０７】
バイアルは、注射器がキャップに挿入できるように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有することができる。Ｖバイアルキャップは、シールまたはカバーの内側に位置することによって、キャップに接触する前にシールまたはカバーを除去する必要がある。バイアルは、特に複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有してもよい。
【０１０８】
成分が注射器に包装されるとき、その注射器には針が取り付けられていてもよい。針が取り付けられていないときには、分離された針が組み立ておよび使用のために注射器とともに供給されてもよい。こうした針はシースで覆われていてもよい。注射器中のプランジャーは、吸引の際にプランジャーが誤って外れることを防ぐためのストッパーを有してもよい。注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。使い捨て注射器は、単回用量のワクチンを含有する。注射器は、一般的に針の取付けの前に先端を密封するための先端キャップを有し、この先端キャップはブチルゴムでできていてもよい。注射器と針とが別々に包装されるとき、針はブチルゴムシールドを装着されていることが好ましい。有用な注射器は、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されている注射器である。
【０１０９】
例えば、子供への送達を容易にするために、容器には半分の用量容積を示す印が付けられてもよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌの容積を示す印を有してもよい。
【０１１０】
キットまたは組成物は、例えば、投与のための指示、ワクチン内の抗原の詳細などのワクチンの詳細を含むリーフレットとともに包装（例えば、同じ箱の中に）されてもよい。
【０１１１】
患者の投与のために必要とされるより、多くの物質を含むことは、多成分の製品では普通であるので、物質の移動におけるどんな非効率性にもかかわらず、十分な最終的な用量容積が得られる。このように、個々の容器は、５〜２０容積％の詰めすぎを含むことがある。
【０１１２】
処置方法およびワクチン投与
混合後、本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、本発明は、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、それは本発明の混合組成物を患者に投与するステップを含む。
【０１１３】
本発明は、また、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、それは、本発明のキットの容器（または注射器のチャンバー）の内容物を混合し、混合内容物を患者に投与するステップを含む。
【０１１４】
本発明は、また、医薬として使用するための本発明のキットを提供する。
【０１１５】
本発明は、また、患者において免疫応答を惹起するための医薬の生産におけるＡとＢの使用を提供し、ここに、上で定義されたように、Ａが第１容器の内容物であり、Ｂが第２容器の内容物である。その使用は、また、Ｃの使用を含み得、ここで、上で定義されたように、Ｃは第３容器の内容物である。
【０１１６】
これらの方法および使用は、抗体応答、好ましくは防御性の抗体応答を生じさせるために一般に用いられる。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該技術分野において周知である。ヒトにおける研究から、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価は、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染から約５０％の防御を与える）ことが示されている［９３］。抗体応答は、典型的に、赤血球凝集阻害、マイクロ中和（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ−ｒａｄｉａｌ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当該技術分野において周知である。
【０１１７】
本発明の組成物は、種々の方法で投与できる。最も好ましい免疫経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚への）であるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［９４〜９６］、経口［９７］、口腔、舌下、皮内［９８，９９］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１００］などが挙げられる。
【０１１８】
本発明に従って調製されたワクチンは、子供および成人の両方を処置するために使用され得る。現在、インフルエンザワクチンは、生後６カ月からの小児および成人の免疫化における使用が推奨されている。したがって、患者は１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。このワクチンを受けることが好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、低年齢者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍事関係者および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、ワクチンを受ける前の７日以内に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照）を服用した患者、卵アレルギーの人、および海外旅行者である。しかし、このワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、集団においてより一般的には使用され得る。
【０１１９】
本発明の好ましい組成物は、効能についてのＣＨＭＰ基準のうちの１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、その基準は以下のとおりである：（１）≧７０％の血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）においては、その基準は以下のとおりである：（１）≧６０％の血清防御；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴの増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検試験（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ  ｓｔｕｄｙ）に基づいている。
【０１２０】
処置は、単回用量計画または複数回用量計画によるものであってもよい。複数回用量は、一次免疫化計画および／またはブースター免疫化計画において用いられてもよい。複数回用量計画においては、さまざまな用量が同じ経路または異なる経路によって与えられてもよく、例えば、非経口の初回免疫および粘膜の追加免疫、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫などであってもよい。２回以上の用量（典型的には２用量）の投与は、免疫学的に未経験の患者において、例えば、過去にインフルエンザワクチンを受けたことがない人に対して、または新たなＨＡサブタイプに対するワクチンに対して、特に有用である。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１２１】
典型的な免疫化計画では、本発明の組成物（それは、Ａ−Ｈ３、Ａ−Ｈｌ、Ａ−Ｈ５およびＢを含む少なくとも４つのインフルエンザ株を含む）を受ける前に、患者は少なくとも１つの３価の季節性インフルエンザワクチン（Ａ−Ｈ３、Ａ−ＨｌおよびＢ抗原を含む）と、別に少なくとも１つの汎流行性インフルエンザワクチン（一般的に１価のＡ−Ｈ５ワクチン）を受けるであろう。４価のワクチンは、これらの免疫応答の両方を高めるのに用いられてもよい。このように、患者は、Ａ−Ｈ３、Ａ−Ｈｌ、ＢおよびＡ−Ｈ５赤血球凝集素の各々に対する抗体を分泌するプラスマ細胞に分化することができる記憶Ｂ細胞をすでに保持しているかもしれない。Ａ−Ｈ５ワクチンの少なくとも２つの先の投与が一般的にあったことになる。
【０１２２】
本発明は、インフルエンザウイルスの４種の株（Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、汎流行性インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株など）、およびインフルエンザＢ型ウイルス株）に対して患者において免疫応答を惹起するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む第１のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップ；（ｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスなどの汎流行性インフルエンザウイルス由来の抗原を含む第２のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップ；そして、（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、汎流行性インフルエンザウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含む第３のインフルエンザウイルスワクチンを投与するステップを含み、ここで、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）が、（ａ）同時に、または（ｂ）いずれかの順序で連続的に、しかし、ステップ（ｉｉｉ）の前に実施され得る。また、本発明は、この方法で使用するための第１ワクチンと第２ワクチンを提供する。第１ワクチンは、典型的には、３価であり、第２ワクチンは、１価であり、第３ワクチンは、４価となるであろう。
【０１２３】
本発明は、また、患者において免疫応答を惹起する（例えば、追加免疫）方法を提供し、該方法は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、汎流行性インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５インフルエンザＡ型ウイルス）、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチンを患者に投与することを含み、ここで、患者が、（ａ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチン（例えば、３価）と（ｂ）汎流行性インフルエンザウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチン（例えば、１価）との両方を以前に別々に受けている。
【０１２４】
本発明は、また、患者において免疫応答を惹起する（例えば、追加免疫）方法を提供し、該方法は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、汎流行性インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１などのＨ５インフルエンザＡ型ウイルス）、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチンを患者に投与し、次いで、その後、（ａ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス、およびインフルエンザＢ型ウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチン（例えば、３価）と（ｂ）汎流行性インフルエンザウイルス由来の抗原を含むインフルエンザウイルスワクチン（例えば、１価）とを別々に投与することを含む。
【０１２５】
本発明によって生産されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ医学的診察、または医療専門家もしくはワクチン接種センターへの訪問の際に）患者に投与されてもよく、例えば、麻疹ワクチン、耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、複合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌複合ワクチン（例えば、４価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器系合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌複合ワクチンなどと実質的に同時に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与することは、高齢の患者において特に有用である。
【０１２６】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性の抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、同じ医学的診察、または医療専門家への訪問の際に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス物質は、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などを含み、それらのエステル（例えば、エチルエステル）および塩（例えば、リン酸塩）も含まれる。好ましい抗ウイルス物質は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）であり、これはリン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である。
【０１２７】
第１および第２容器の特定の実施形態
いくつかの例では、第１容器（または注射器のチャンバー）は、インフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスのＨ１Ｎ１とＨ３Ｎ２株由来の抗原を有する３価のインフルエンザワクチンを含み、第２容器（または注射器のチャンバー）は、インフルエンザＡ型ウイルス（例えば、ＮＩＢＲＧ−１４などのＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１１９４／２００４株、またはＮＩＢＲＧ−２３などのＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５株）のＨ５Ｎ１株由来の抗原を有する１価のインフルエンザワクチンを含む。
【０１２８】
１つの実施形態では、３価のワクチンは、卵またはＭＤＣＫ細胞上で生育させられたウイルスから調製された精製表面抗原ワクチンであり、そして、１価のワクチンも、卵またはＭＤＣＫ細胞上で生育させられたウイルスから調製された精製表面抗原ワクチンである。３価のワクチンは、アジュバントを含まないが、１価のワクチンは、水中スクアレン型エマルジョンでアジュバント化されている。３価のワクチンは、１株当たり１５μｇのＨＡを含むが、１価のワクチンは７．５μｇのＨＡを含む。ヒトの用量は、３価ワクチンと１価ワクチンの用量を、例えば、１：１の容積比で混合して、例えば、１ｍｌの投薬量を与えることによって作製される。
【０１２９】
１価のワクチンは、０．２５ｍｌのエマルジョン（２×強度で）を０．２５ｍｌのバルク抗原と混合して、例えば、ＦＬＵＡＤＴＭに類似するが、しかし、Ｈ５Ｎｌ株の１／２抗原用量の所望の最終濃度を与えることにより作製される。
【０１３０】
別の実施形態では、３価のワクチンは、卵上で生育させられたウイルスから調製された不活化ワクチン（典型的には、スプリットワクチン）であり、１価のワクチンは、卵上で生育させられたウイルスから調製されたスプリットワクチンである。３価のワクチンは、アジュバントを含まず、そして１価のワクチンは、さらにアジュバントを含むが、両方のワクチンは、別々の水中スクアレン型エマルジョンと共に供給される。３価のワクチンは、１用量当たり１株につき１５μｇのＨＡを含むが、１価のワクチンは、１用量当たり３．７５μｇのＨＡを含む。したがって、４価の混合生成物は、１用量当たり、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢ型ウイルスの各々に対して１５μｇのＨＡと、Ｈ５Ｎ１型ウイルスに対して３．７５μｇのＨＡとを含む。１価の容器の抗原濃度は、１５μｇ／ｍｌとすることができる。１価のワクチンは、チメロサール（例えば、２０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）を含んでもよい。エマルジョンは、スクアレン、ＤＬ−α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を、それぞれ２．２：２．４５：１の重量比で、例えば、１０６８：１１８６：４８５で含む。ヒトの用量は、３価ワクチンと１価ワクチンの用量とエマルジョンを、例えば、０．５ｍｌの３価ワクチン、０．２５ｍｌの１価ワクチンおよび０．２５ｍｌのエマルジョンを混合することにより作製される。
【０１３１】
レジメン
本発明は、また、４価のインフルエンザワクチンの投与のためのレジメンを提供し、そこでは、患者は６ヵ月〜１８ヵ月の間隔をあけられた４価のワクチンの２用量を受ける。４価のワクチンは、上で示したように即座に調製されるか、あるいはあらかじめ混合されてもよい（例えば、製造者により４価混合ワクチンとして分配される）。
【０１３２】
したがって、本発明は、（ａ）第１の４価インフルエンザワクチンをヒトに投与し、１８０〜５４０日後に、（ｂ）第２の４価インフルエンザワクチンを同じヒトに投与するステップを含む、ヒトを免疫するための方法を提供する。
【０１３３】
本発明は、また、この方法によってヒトを免疫する際に使用するための、第１および第２の４価インフルエンザワクチンを提供する。
【０１３４】
本発明は、また、ヒトを免疫する際に使用するための医薬の製造における第１および第２の４価インフルエンザワクチンの使用を提供し、そこでは、第１ワクチンと第２ワクチンは、１８０〜５４０日の間隔をあけて同一のヒトに投与される。
【０１３５】
本発明は、また、１８０〜５４０日後に第２の４価インフルエンザワクチンを受けるヒトをあらかじめ免疫するための医薬の製造における第１の４価インフルエンザワクチンの使用を提供する。
【０１３６】
本発明は、また、ヒトを免疫するための医薬の製造における第２の４価インフルエンザワクチンの使用を提供し、そこでは、ヒトは、第１ワクチンを受けるよりも１８０〜５４０日早く第１の４価インフルエンザワクチンを受けている。
【０１３７】
第１の４価ワクチンは、以下からの免疫原を一般的に含む：（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株；ならびに（ｉｖ）インフルエンザＢ型ウイルス株。第２の４価ワクチンもまた、一般的に以下からの免疫原を含む：（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス株；ならびに（ｉｖ）インフルエンザＢ型ウイルス株。第１および第２のワクチンは同じであってもよいが、一般的には、それらは、少なくとも１つの株が異なり、例えば、それらは異なるＡ／Ｈ１Ｎ１株および／または異なるＡ／Ｈ３Ｎ２株および／または異なるＡ／Ｈ５Ｎ１株および／または異なるＢ型株由来の赤血球凝集素を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、唯一の赤血球凝集素が、第１の４価ワクチンと第２の４価ワクチンで同一である。いくつかの実施形態では、２つの赤血球凝集素だけが、第１の４価ワクチンと第２の４価ワクチンで同一である。いくつかの実施形態では、３つの赤血球凝集素だけが、第１の４価ワクチンと第２の４価ワクチンで同一である。それほど典型的でない実施形態では、全４つの赤血球凝集素は、第１の４価ワクチンと第２の４価ワクチンで同一である。
【０１３８】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスからの免疫原を含む代わりに、第１および第２のワクチンは、別の非Ｈ１と非Ｈ３インフルエンザＡ型サブタイプ；例えば、Ｈ２、Ｈ５（しかし、Ｈ５Ｎ１でない）、Ｈ７またはＨ９インフルエンザＡ型ウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１またはＨ７Ｎ７株）からの免疫原を含んでもよい。
【０１３９】
第１および第２の４価のワクチンは、通常同じタイプである。すなわち、両方とも生ウイルスワクチンであり、両方とも全ビリオンワクチンであるが、スプリット・ビリオン・ワクチンであり、両方とも精製された表面抗原ワクチンであるか、あるいは両方ともビロソームワクチンである。通常、第１および第２ワクチンは、両方とも不活化されるであろう。
【０１４０】
第１および第２の４価のワクチンは、両方ともアジュバントを加えてもよい。適切なアジュバントは、上記されている。いくつかの実施形態では、しかし、第１のワクチンだけにアジュバントが添加されている。それほど典型的でない他の実施形態では、両方ともアジュバントを含まない。
【０１４１】
２つのワクチンは、一般的に、連続したインフルエンザの季節に、例えば、１０〜１４カ月離れて（例えば、１１カ月、１２カ月または１３カ月離れて）与えられる。
【０１４２】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、例えば、Ｘ＋Ｙなど、何か付加的なものを含んでいてもよい。
【０１４３】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要なときには、「実質的に」という語を本発明の定義から削除してもよい。
【０１４４】
数値ｘに関係する「約」という用語は、自由選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４５】
特定的に述べられていない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいかなる特定の順序も必要としない。よって複数の成分はあらゆる順序で混合され得る。３つの成分があるときには、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組み合わせを第３の成分と組み合わせるなどしてもよい。
【０１４６】
細胞の培養において動物（特にウシ）の材料が用いられるときには、その材料は、伝播性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体的には、動物由来の材料がまったく存在しない条件下で細胞を培養することが好ましい。
【０１４７】
ある化合物が組成物の一部として体内に投与されるとき、その化合物は代替的に適切なプロドラッグによって置換されてもよい。
【０１４８】
細胞培養基が、遺伝子再集合もしくは逆遺伝学手順のために、または、ウイルス成長のために使われる場合、それは、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒの一般条項５．２．３のように、ヒトのワクチン製造で使用するために承認されたものが好ましい。
【０１４９】
図面の簡単な説明
図面はない。
【０１５０】
発明を実施するための様式
季節性インフルエンザワクチンは、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢ株からの精製表面糖タンパク質を含んで調製された。抗原濃度は、１ｍｌ当たり１株につき３０μｇ  のＨＡであり、それは１５μｇ／株／用量を与えた。
【０１５１】
プレ汎流行性ワクチンは、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１株（クレード１）由来の精製表面糖タンパク質に基づいて調製された。最終的な抗原濃度は、１ｍｌ当たり１５μｇのＨＡであり、７．５μｇ／用量を与えた。２×強度でのバルク抗原は、１：１の容積比でＭＦ５９の水中油型エマルジョンアジュバント（２×強度）と混合して最終的なワクチン（１×強度）を与えた。
【０１５２】
これらの２つのワクチンの各々の０．５ｍｌを使用時に混合し、組み合わせとして患者に１ｍｌの全容積で投与した。比較のために、他の患者は、異なる腕に別々に２つのワクチンを受ける。２つの対照群は、季節性ワクチンまたはプレ汎流行性ワクチンのいずれかを受けた。
【０１５３】
合計４０５人の健康な成人（１８〜４０歳）は、８つの処置群（４９〜５２人の対象／群）に等しくランダム化された。１日目に、３つの群は、プレ汎流行性ワクチンを１つの腕に、そして季節性ワクチンを同時に他方の腕に受けた（「ｃｏｎｃ」群）。そして、３つの他の群は、プレ汎流行性ワクチンと季節性ワクチンの即席混合物を受けた（「ｍｉｘ」群）。２２日目に、「ｃｏｎｃ」群および「ｍｉｘ」群からの群は、プレ汎流行性ワクチンのみを受けるか、混合ワクチンを受けるか、またはワクチンを受けなかった。２つの交差対照群は、１日目にプレ汎流行性ワクチンまたは季節性ワクチンを受けたが、２２日目に他のワクチンを受けるために切り替えられた。
【０１５４】
抗体は１日目、２２日目、および４３日目に赤血球凝集反応（ＨＩ）、マイクロ中和（ＭＮ）および一元放射溶血（ＳＲＨ）によって評価された。結果は、季節性ワクチン（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２１４／９６）の評価のためのＣＨＭＰ基準に関連して解釈された。
【０１５５】
ベースライン特性は、一般に、過去にインフルエンザワクチン接種を受けた対象の割合（全体平均：１５％）を除いて、試験群の間で類似していた。ＨＩ分析では、ワクチンの免疫学的有効性の全３つのＣＨＭＰ基準は、季節性ワクチンを受けた７つの群で、全３つの季節性株のための最初のワクチン接種の後に満たされた。Ｈ５Ｎ１株に対するＳＲＨアッセイ結果は、季節性ワクチンを共投与するのに用いられる方法にかかわらず、プレ汎流行性ワクチンの２用量を受けた４つの試験群で２回目のワクチン接種の後、すべてのＣＨＭＰ基準を満たした。匹敵する結果は、ＭＮ  Ｈ５Ｎ１アッセイに関して観測された。
【０１５６】
季節性インフルエンザワクチンと組み合わせて投与されるとき、アジュバント添加のＨ５Ｎ１プレ汎流行性ワクチンは、免疫原性であり、良好に許容される。季節性ワクチンが単独で、プレ汎流行性ワクチンと同時に、あるいはプレ汎流行性ワクチンと混合して投与されたかどうかにかかわらず、季節性インフルエンザウイルス株への免疫応答は類似している。
【０１５７】
別の研究では、１８〜４０歳の９９人の健康な成人は、より大規模な試験の一部として、季節性ワクチン（２００７年の季節）の１用量の３週間前または３週間後のいずれかにプレ汎流行性ワクチンの１用量を受けた。ブースターＨ５Ｎ１用量が、季節性ワクチン（２００８年の季節）と混合された異なる株（クレード２）由来の抗原を用いて、１年後に与えられた。両方のＨ５株に対する抗体は、ＨＩ、ＭＮおよびＳＲＨによる交差反応性を評価するために、１週間後、２週間後、および３週間後に測定されてセロコンバージョン（ＳＣ）と血清防御（≧４０、ＳＰ）を評価した。
【０１５８】
単回投与の初回免疫後、プレ汎流行性ワクチンは、ワクチン接種後３週間で同種ウイルスおよび異種ウイルスに対する類似したＳＣ（＞４０％）およびＳＰ（＞４０％）の割合を与えた。異種追加免疫は、既往免疫反応をもたらし、１週間以内に顕在化し、対象の９０％超で免疫記憶を示し、そして、完全な２用量の同種初回免疫後に見られるものに等しいＳＣとＳＰの割合となる。ＳＣとＳＰのＣＨＭＰ基準は、同種および異種の両方の株について満たされ、そして越えた。
【０１５９】
したがって、プレ汎流行性ワクチンの単回投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｈｏｔ）は、免疫記憶を初回免疫するのに十分であり、それは少なくとも１年間、持続する。さらにまた、異種追加免疫は、既往免疫反応をもたらし、これは認可のＣＨＭＰ基準を超えている。したがって、Ｈ５Ｎ１の異種株を、単回のプレ汎流行性初回免疫用量の１年後に追加免疫として季節性ワクチンと組み合わせて使用できる。
【０１６０】
本発明は、例示としてのみ記述されており、改変が、本発明の範囲と精神の内に維持されながら、なされ得ることが理解されるであろう。
【０１６１】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０１６２】
【化１】
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【０１６３】
【化２】
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【０１６４】
【化３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月22日(2011.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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