(57)【要約】  本発明は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)、特にカリシウイルス科のウイルス由来のRdRpを使用することによって、化学的に修飾されたRNAを酵素的に合成するための方法に関する。本発明の方法は、例えばin vivo適用のための、特にRNA分解に関して安定性が増加したRNA分子を調製するのに特に有用である。本発明のさらなる対象は、化学的に修飾されたRNAの酵素的合成を実施するためのキットに関する。
2011522552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に修飾されたRNAを酵素的に合成するための方法であって、
(a)ssRNAテンプレートを提供するステップと、
(b)リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、RNA合成に十分な条件下で、ssRNAテンプレートを、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するタンパク質と相互作用させて、化学的に修飾された二本鎖RNA(dsRNA)を提供するステップであって、前記化学的修飾の結果、前記dsRNAの検出に使用される放射性、蛍光および/または化学標識でdsRNAが標識されないステップと
を含む方法。
【請求項２】
(c)dsRNAをssRNAへと分離するステップ
をさらに含み、
任意選択で、以下のステップ(d)から(f)、
(d)ステップ(b)および(c)をn回反復し、nが少なくとも1の整数であるステップと、
(e)最終ステップ(b)を実施するステップと、
(f)反応を停止させるステップと
を実施することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
nが15から40の整数である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(c)が、熱変性、化学変性または酵素によって実施される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
dsRNAが、ヘリカーゼによってssRNAへと分離される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
RdRp活性を有するタンパク質が「右巻き配座」を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列が、
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
の配列モチーフを含み、
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
の意味を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が、カリシウイルス科のウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質が、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質が、ノロウイルス株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBankアクセッション番号AY741811)のRNA依存性RNAポリメラーゼ、サポウイルス株pJG-Sap01(GenBankアクセッション番号AY694184)のRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびベシウイルス株FCV/Dresden/2006/GE(GenBankアクセッション番号DQ424892)のRNA依存性RNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
ssRNAテンプレートが、15から30ヌクレオチド、好ましくは21から28ヌクレオチド、より好ましくは21から23ヌクレオチドの長さを有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化学的に修飾されたdsRNAが、修飾されていないアナログと比較して安定性が増加している、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸が、リボース部分に化学的修飾を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リボース部分の2'-OH基が、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基により置換され、RがC1〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロがF、Cl、BrまたはIである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、2'-O-メチル-シチジン-5'-三リン酸、2'-アミノ-2'-デオキシ-ウリジン、2'-アジド-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン酸、2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸および2'-O-メチル-5-メチル-ウリジン-5'-三リン酸からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、塩基部分に化学的修飾を有する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、5-アミノアリル-ウリジン-5'-三リン酸、6-アザ-ウリジン-5'-三リン酸、8-アザ-アデノシン-5'-三リン酸、5-ブロモ-ウリジン-5'-三リン酸、7-デアザ-アデノシン-5'-三リン酸、7-デアザ-グアノシン-5'-三リン酸、N6-メチル-アデノシン-5'-三リン酸、5-メチル-シチジン-5'-三リン酸、シュード-ウリジン-5'-三リン酸および4-チオ-ウリジン-5'-三リン酸からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオチドが、リン酸部分に化学的修飾を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸がホスホチオエートアナログである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
RdRp活性、好ましくはカリシウイルス科のウイルスのRdRp活性を有するタンパク質と、
RdRp活性を有するタンパク質によるRNA合成に十分な条件を提供するための緩衝液と、
rATP、rGTP、rCTP、rUTPと、
リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸であって、前記化学的修飾が、放射性、蛍光及び化学検出のための標識をもたらさないリボヌクレオシド三リン酸と、
任意選択で停止溶液と、
任意選択でヘリカーゼと
を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)、特にカリシウイルス科のウイルス由来のRdRpを使用することによって、化学的に修飾されたRNAを酵素的に合成するための方法に関する。本発明の方法は、例えばin vivo適用のための、特にRNA分解に関して安定性が増加したRNA分子を調製するのに特に有用である。本発明のさらなる対象は、化学的に修飾されたRNAの酵素的合成を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に修飾されたリボヌクレオチドを含むRNA分子は、科学および医学における種々の適用に有用である。特に、とりわけ骨格が修飾されたRNAは、例えばRNaseによる分解に関して安定性が増加していることが一般に知られており、このことは、例えば、アンチセンスリボヌクレオチドならびにRNA干渉(RNAi)のためのsiRNA(低分子干渉RNA)の場合のin vivo適用に、重要なものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公報WO-A-2007/012329
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Zamyatkinら、(2008)J.Biol.Chem.283:7705〜7712
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまで、このような修飾されたRNAは、固相化学合成方法によって一般に調製されている。しかし、このような化学的方法はいくつかの欠点を有しており、例えば、これには費用および時間がかかる。これらの欠点は、RNAi治療の広い普及にとって重大な制約である。実際、数トンものRNAi分子が、癌、ウイルス感染症および変性疾患(即ち、急性黄斑変性)などのこれまで治療できなかった疾患の治療のために、毎年必要となる可能性があることが予測される。これらのこれまで治療できなかった疾患は、RNAi治療から大きな利益を得ることができる。
【０００６】
したがって、特に治療への適用には、化学的に修飾されたRNA分子の製造のための代替的方法が実質的に必要とされている。
【０００７】
国際公報WO-A-2007/012329から、カリシウイルス科のウイルスが、RNA分子の増幅および/または標識に使用できることが知られている。この開示において、著者らは、カリシウイルスRdRpが、RNAの標識に使用される、蛍光カップリング、ビオチンカップリングまたは放射性カップリングNTPを使用できることも記載している。しかし、カリシウイルスRdRpがこのようなカップリングNTPを実際に組み込めるという明確な例は、完全に欠如している。さらに、国際公報WO-A-2007/012329中の用語NTPアナログは、蛍光放出、放射性放出、および/または例えばビオチンなどの化学的もしくは生物学的結合対のパートナー提供による標識化RNAの検出に使用できるこのようなアナログをもっぱら対象とするものであることは明らかである。したがって、国際公報WO-A-2007/012329で想定されたNTPアナログの組み込みは、このようなNTPアナログで標識したRNA分子の検出に使用されるカップリングNTPの検出をもっぱら対象とするものである。
【０００８】
さらに、別のグループは、ノロウイルスRdRpの阻害のための、化学的に修飾されたリボヌクレオチドの使用を最近提唱した(Zamyatkinら、(2008)J.Biol.Chem.283:7705〜7712)。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この技術的課題の解決は、特許請求の範囲に規定される本発明の実施形態によって提供される。
【００１０】
特に、本発明は、化学的に修飾されたRNAを酵素的に合成するための方法を提供し、この方法は、
(a)ssRNAテンプレート(一本鎖RNAテンプレート)を提供するステップと、
(b)リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、RNA合成に十分な条件下で、ssRNAテンプレートを、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するタンパク質と相互作用させて、化学的に修飾された二本鎖RNA(dsRNA)を提供するステップであって、化学的修飾の結果、dsRNAの検出に使用される放射性、蛍光および/または化学標識で前記dsRNAが標識されないステップと
を含む。
【００１１】
先行技術を考慮すると、RdRp、特にカリシウイルス科由来の対応する酵素が、一本鎖RNA(ssRNA)テンプレートに対して相補的な鎖を合成することによって、多様な化学的に修飾されたリボヌクレオチドをdsRNA中に実際に組み込むことができることは、非常に驚くべきことである。
【００１２】
RNA中への化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸の組み込みが、このような修飾されたRNAの大規模工業生産に使用されることが、本発明に従ってさらに企図される。したがって、化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を、さらなるステップ:
(c)dsRNAをssRNAへと分離し、任意選択で、以下のステップ(d)から(f)を実施するステップと、
(d)ステップ(b)および(c)をn回反復し、nが少なくとも1の整数であるステップと、
(e)最終ステップ(b)を実施するステップと、
(f)反応を停止させるステップと
を含む増幅反応で使用することが好ましい。
【００１３】
好ましくは、nは、10から50、より好ましくは15から40、最も好ましくは20から30の整数である。
【００１４】
ステップ(c)による鎖分離は、熱の適用(熱変性)により、化学変性により、または酵素、好ましくはヘリカーゼによって実施することができる。特に熱変性の場合、次のステップ(b)を実施するために、反応混合物にさらなるRdRp分子を添加することが望ましい。
【００１５】
さらに好ましくは、RdRp活性を有するタンパク質は「右巻き配座」を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列は、
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
の配列モチーフの保存された配置を含み、
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
の意味を有する。
【００１６】
いわゆる「右巻き配座」は、本明細書で使用する場合、タンパク質の三次構造(配座)が、ほとんどのテンプレート依存性ポリメラーゼで観察されるように、指、掌および親指を持つ右手のように折畳めることを意味する。
【００１７】
配列モチーフ「XXDYS」は、いわゆるAモチーフである。Aモチーフは、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの識別を担う。モチーフ「GXPSG」は、いわゆるBモチーフである。Bモチーフは、カリシウイルス科由来の対応するポリメラーゼのこのRdRpファミリーの全ての代表内で保存されている。モチーフ「YGDD」(Cモチーフ)は、この酵素の活性側を示す。このモチーフでは特に、最初のアスパラギン酸残基(太字、YGDD)は、Mg2+/Mn2+依存性触媒の間の金属イオンの配位において重要な役割を果たす。モチーフ「XXYGL」は、いわゆるDモチーフである。Dモチーフは、テンプレート依存性ポリメラーゼの特徴である。最後に、「XXXXFLXRXX」モチーフ(Eモチーフ)は、RNA依存性RNAポリメラーゼをDNA依存性RNAポリメラーゼから識別する、RNA依存性RNAポリメラーゼの特徴である。
【００１８】
上記型のRdRpの典型的な代表は、カリシウイルス科の対応する酵素である。カリシウイルス科のRdRpは、テンプレートとしてin vitroで異種のウイルス、真核生物および原核生物のテンプレートを含めて任意のssRNAテンプレートを使用して、相補鎖を合成することが可能である。このssRNAテンプレートは、ポジティブ鎖であってもネガティブ鎖であってもよい。
【００１９】
上で定義したRdRp活性を有するタンパク質は、対応するプライマーの伸長およびプライマーの非存在下での相補鎖のde novo合成の両方によって、ある鎖に対して相補鎖を合成することが可能である。プライマーは、必要に応じて、配列特異的プライマーであってもよく、ランダムプライマーであってもよく、オリゴTプライマーまたはオリゴUプライマーであってもよい。カリシウイルスRdRpの特徴的性質のさらなる詳細は、国際公報WO-A-2007/012329中に見出すことができる。
【００２０】
好ましくは、RNA依存性RNAポリメラーゼは、ヒトおよび/または非ヒトの病原体カリシウイルスのRdRpである。特に好ましくは、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのRdRpであり、例えば、ノロウイルス株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBankアクセッション番号AY741811)のRdRpもしくはサポウイルス株pJG-Sap01(GenBankアクセッション番号AY694184)のRdRpまたはベシウイルス株FCV/Dresden/2006/GE(GenBankアクセッション番号DQ424892)のRNA依存性RNAポリメラーゼである。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、このRdRpは、配列番号1(ノロウイルス-RdRP)、配列番号2(サポウイルス-RdRP)または配列番号3(ベシウイルス-RdRP)に従うアミノ酸配列を有するタンパク質である。当業者は、例えば、適切な発現ベクターおよび宿主生物を使用する組換え発現によって、このようなRdRPを調製することが容易に可能である(国際公報WO-A-2007/012329を参照のこと)。組換え発現におけるRdRpの精製を容易にするために、RdRpは、対応する配列のN末端またはC末端に適切なタグ(例えば、GSTまたは(His)6-タグ)をつけて発現させることが好ましい。例えば、ヒスチジンタグは、公知の様式でのニッケルまたはコバルトのカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を可能にする。ヒスチジンタグと融合したRdRpの実施形態の例は、配列番号4、配列番号5または配列番号6に従うアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号4は、ヒスチジンタグを有するノロウイルス-RdRPに対応する。配列番号5は、ヒスチジンタグを有するサポウイルス-RdRPのアミノ酸配列に対応する。配列番号6は、ヒスチジンタグを有するベシウイルス-RdRPのアミノ酸配列に対応する。
配列番号1:
【００２２】
【化１】
2011522552.tif 000003
【００２３】
配列番号2:
【００２４】
【化２】
2011522552.tif 000004
【００２５】
配列番号3:
【００２６】
【化３】
2011522552.tif 000005
【００２７】
配列番号4:
【００２８】
【化４】
2011522552.tif 000006
【００２９】
配列番号5:
【００３０】
【化５】
2011522552.tif 000007
【００３１】
配列番号6:
【００３２】
【化６】
2011522552.tif 000008
【００３３】
本発明の方法は、アンチセンス技術またはRNA干渉のいずれかによる遺伝子サイレンシングへの適用のための短いRNA分子を提供するのに特に有用である。
【００３４】
したがって、本発明の方法で使用されるssRNAテンプレートは、好ましくは、8から45ヌクレオチド、好ましくは15から30ヌクレオチド、好ましくは21から28ヌクレオチド、より好ましくは21から23ヌクレオチドの長さを有する。後者の長さの分子は、siRNAへの適用に特に有用である。本発明の方法の化学的に修飾されたRNA産物は、好ましくは、修飾されていないdsRNAアナログと比較して安定性が増加している。
【００３５】
特にこの目的で、RdRp活性によって相補鎖中に組み込まれる少なくとも1つの修飾されたリボヌクレオシド三リン酸の化学的修飾は、リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有しうる。安定性が増加した分子に関して、特にRNA分解酵素に関して、骨格、即ち、リボースおよび/またはリン酸部分での修飾が、特に好ましい。
【００３６】
リボースが修飾されたリボヌクレオシド三リン酸の好ましい例は、2'-OH基がH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基により置換され、RがC1〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロがF、Cl、BrまたはIであるアナログである。本発明に関連して、用語「修飾されたリボヌクレオシド三リン酸」または「修飾されたリボヌクレオチド」には、ある場合には「デオキシヌクレオチド」と称される場合もある2'-デオキシ誘導体も含まれることが明らかである。
【００３７】
2'位に修飾されたリボースを有するこのようなリボヌクレオチドアナログの典型的な例には、2'-O-メチル-シチジン-5'-三リン酸、2'-アミノ-2'-デオキシ-ウリジン、2'-アジド-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン酸、2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸および2'-O-メチル-5-メチル-ウリジン-5'-三リン酸が含まれる。
【００３８】
所望のdsRNA産物中のリン酸骨格修飾をもたらすリボヌクレオシド三リン酸の例は、ホスホチオエートアナログである。
【００３９】
本発明によれば、少なくとも1つの修飾されたリボヌクレオシド三リン酸は、塩基部分に化学的修飾を有するアナログから選択してもよい。このようなアナログの例には、5-アミノアリル-ウリジン-5'-三リン酸、6-アザ-ウリジン-5'-三リン酸、8-アザ-アデノシン-5'-三リン酸、5-ブロモ-ウリジン-5'-三リン酸、7-デアザ-アデノシン-5'-三リン酸、7-デアザ-グアノシン-5'-三リン酸、N6-メチル-アデノシン-5'-三リン酸、5-メチル-シチジン-5'-三リン酸、シュード-ウリジン-5'-三リン酸および4-チオ-ウリジン-5'-三リン酸が含まれる。
【００４０】
上記および他の化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸は、例えば、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、Munich、GermanyまたはTrilink technologies、USAから市販されている。
【００４１】
本発明によれば、用語「RNA合成に十分な条件」とは、特に緩衝液、温度、塩および金属イオン(該当する場合)の条件に関して、テンプレート鎖に対して相補的なRNA鎖をRdRpが合成するのを可能にする条件を意味する。適切な緩衝液、塩、金属イオン、還元剤(該当する場合)およびRdRpの他の条件は、当業者に公知である。カリシウイルスのRdRPに関しては、国際公報WO-A-2007/012329を参照されたい。したがって、ssRNAテンプレートは、例えば、50マイクロリットルの反応体積中、1マイクログラムから4マイクログラムの量で使用される。リボヌクレオシド三リン酸(修飾されたリボヌクレオシド三リン酸を含む)の濃度は、好ましくは、0.1マイクロモル/lから1マイクロモル/lの範囲内、例えば、0.4マイクロモル/lである。RdRpの濃度は、例えば、1マイクロモル/lから10マイクロモル/lであり得る。
【００４２】
典型的な緩衝液条件は、10から80mM、より好ましくは20から50mMのHEPES、pH7.0〜8.0、1から5mM、例えば3mMの酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マンガンまたは塩化マンガン、および1から5mMの還元剤、例えばDTTである。
【００４３】
典型的な停止溶液は、2から10mM、好ましくは4から8mMの酢酸アンモニウム、および50から200mM(例えば、150mM)のEDTAを含む。
【００４４】
(例えば、上で定義した)短いRNAテンプレートは通常、例えばTris-HCl 50mM、pH 8.0、NaCl 200mM、EDTA 1mMを含むアニーリング緩衝液を使用してin vitroで次にアニーリングされる、2つの別個の鎖の化学的合成によって調製される。ssRNAテンプレートを提供するための他の方法には、酵素的操作、例えば、選択された配列(いわゆる「プロモーター」)に依存するもしくは特異的プライマーを使用する転写開始、およびDNA鎖の分解後のDNA依存性RNAポリメラーゼによるRNA合成が含まれる。
【００４５】
好ましい反応体積は、20から200マイクロリットル、好ましくは50から100マイクロリットルの範囲である。典型的には、緩衝液条件および上で概説した他の条件は、適切なストック溶液(通常、5×または10×濃縮されたもの)を混合し、RdRPおよびssRNAテンプレートならびに再蒸留水または脱イオン水を、所望の最終反応体積になるまで添加することによって、提供される。
【００４６】
本発明のさらなる対象は、本発明の方法を実施するためのキットである。本発明のキットは、RdRp活性を有するタンパク質(好ましい例は上で定義したとおり)、リボヌクレオチド(rATP、rGTP、rCTP、rUTP、好ましくはストック溶液として)、少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸(上で定義したとおりであり、好ましくは上で概説した例から選択される)、適切な緩衝液(好ましくは上で定義したようなストック溶液として)、および任意選択で停止溶液(好ましくは上で定義したような停止溶液、より好ましくは5×または10×のストック溶液の形態)およびやはり任意選択でヘリカーゼを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】カリシウイルスRdRpを使用して合成された、修飾されたヌクレオチドがあるまたはない状態での、二本鎖RNAのエチジウムブロマイド染色後のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の写真表示を示す図である。M、二本鎖RNAについての分子サイズマーカー(Ambion/Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)が示される。一本鎖RNAテンプレートは、マーカーMの17bpのバンドの下にあるバンドである。カリシウイルスRdRpによって合成されたdsRNA産物は、マーカーMの25bpのバンドのあたりに見出される。
【図２Ａ】カリシウイルスRdRpによる酵素的合成に使用した一本鎖RNAテンプレートの精製を生じる溶出プロフィールのグラフ表示を示す図である。
【図２Ｂ】カリシウイルスRdRpを使用した酵素的合成の二本鎖RNA産物の精製を生じる溶出プロフィールのグラフ表示を示す図である。テンプレートssRNAに対する反応の産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって反応混合物から精製し、分画した。
【図２Ｃ】図2B中の示された画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真表示を示す図(破線の四角でマークした)である。M、示したとおりの二本鎖RNAについての分子サイズマーカー(Ambion/Applied Biosystem)。テンプレートssRNAは、17bpのマーカーフラグメントと一緒に移動する。カリシウイルスRdRpによる合成の産物も、約25bpのバンドとして見ることができる。
【図３Ａ】カリシウイルスRdRpを使用した酵素的合成の二本鎖RNA産物の精製を生じる溶出プロフィールのグラフ表示を示す図である。通常のdsRNA産物(上のパネル)、2-O-CH3-CMP (2'-O-メチル-シチジン-5'-一リン酸)を含むdsRNA産物(中央のパネル)および2-F-dGMP (2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-一リン酸)を含むdsRNAに対する反応の産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって反応混合物から精製し、分画した。
【図３Ｂ】図3A中の示された画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真表示を示す図(破線の四角でマークした)である。M、示したとおりの二本鎖RNAについての分子サイズマーカー(Ambion/Applied Biosystem)。修飾されていないヌクレオチドを使用した合成の産物(dsRNA産物)は、25bpのマーカーフラグメントと一緒に移動する。2'-O-メチル-シチジン-5'-三リン酸の組み込みを伴う合成の産物も、約25bpのバンドとして見出すことができる。同じことが、2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸を組み込む合成の産物についても当てはまり、これもまた約25bpのdsRNA産物として泳動する。
【図４】修飾されたリボヌクレオシド三リン酸の非存在下または存在下での、カリシウイルスRdRpによる酵素的合成の産物の融点分析の結果を示すグラフである。修飾されていないリボヌクレオチドを使用する合成の反応産物(dsRNA産物)、2'-O-CH3-CTPを使用する合成の反応産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)および2'-F-dGTPを使用する合成の反応産物(dsRNA産物+2'-F-dGMP)を、SYBR Green Iと共にインキュベートし、LightCycler(Roche diagnostics)を使用して産物の融点を決定した。これらの産物は、修飾されていないヌクレオチドと比較して、修飾されたヌクレオチドの組み込みによって生じる異なる融点を示す。
【図５Ａ】2'-O-CH3-CTPを使用する酵素的合成の産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)を含むHPLC画分の質量分析を示す図である。センス鎖(テンプレートssRNA、分子量7564.41)およびアンチセンス鎖(テンプレートssRNAに対して相補的な、合成された一本鎖RNA、分子量8080.73)の質量は、アンチセンス鎖における2'-O-CH3-CMPの予測された組み込みと一致する。A:センス鎖およびアンチセンス鎖(ピークを示した)を含むHPLC画分の溶出プロフィールのグラフ表示。
【図５Ｂ】2'-O-CH3-CTPを使用する酵素的合成の産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)を含むHPLC画分の質量分析を示す図である。センス鎖(テンプレートssRNA、分子量7564.41)およびアンチセンス鎖(テンプレートssRNAに対して相補的な、合成された一本鎖RNA、分子量8080.73)の質量は、アンチセンス鎖における2'-O-CH3-CMPの予測された組み込みと一致する。B:センス鎖画分の質量分析のグラフ表示。
【図５Ｃ】2'-O-CH3-CTPを使用する酵素的合成の産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)を含むHPLC画分の質量分析を示す図である。センス鎖(テンプレートssRNA、分子量7564.41)およびアンチセンス鎖(テンプレートssRNAに対して相補的な、合成された一本鎖RNA、分子量8080.73)の質量は、アンチセンス鎖における2'-O-CH3-CMPの予測された組み込みと一致する。C:アンチセンス鎖画分の質量分析のグラフ表示。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するものである。
【００４９】
(実施例)
修飾されたRNAの酵素的合成のための一般的プロトコル
一般的な反応混合物は以下のとおりである:
反応混合物は、
カリシウイルス由来のRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)
緩衝液(5倍):HEPES pH7.6、250mM;MnCl2 25mM;DTT 5mM
リボヌクレオシド三リン酸:X、Y、Z、W
一本鎖RNA(テンプレート);
配列:GCUGAUGCCGUCAAGUUUACCCCC(配列番号7)
蒸留水
からなる。
【００５０】
この反応混合物を、使用するRdRpに応じて、30から42℃で2時間インキュベートする。
【００５１】
X、Y、ZまたはWは、単独のまたは組み合わせた、以下のリボヌクレオシド三リン酸またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸のうち1つまたは複数に対応する:
【００５２】
【表１】
2011522552.tif 000009
【００５３】
(実施例1から14および比較例15)
実施例1から14および比較例15(修飾されていないrNTPのみを含む)の反応混合物を、以下のTable 2(表2)に従って設定した:
【００５４】
【表２】
2011522552.tif 000010
【００５５】
緩衝液(5×):HEPES pH7.6、250mM;MnCl2 25mM;DTT 5mM
ssRNAテンプレート(1μg/μl):ヘテロポリマー配列、19から25ヌクレオチドの長さ
修飾および/または非修飾リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、10mMのストック溶液として使用した。
カリシウイルスRdRp:サポウイルスRdRp(配列番号4)を、70μMのストック溶液から使用した。
【００５６】
RNA合成のために、実施例1から14および比較例15(修飾されたヌクレオチドが存在しない)に従う反応混合物を、30℃で2時間インキュベートした。
【００５７】
上記Table 2(表2)で使用した略号は、Table 3(表3)中に概説する以下のヌクレオチドを示す。
【００５８】
【表３】
2011522552.tif 000011
【００５９】
カリシウイルスRdRpを使用した、化学的に修飾されたdsRNAおよび修飾されていないdsRNAの合成
実施例1から14および比較例15の反応混合物を、PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって分析した。バンドを、エチジウムブロマイド染色によって検出した。図1に示されるように、実施例1から14の反応混合物は、修飾されていないヌクレオチドしか反応混合物中に含まれていない比較例15の反応混合物中にも存在する、dsRNAマーカー(レーンM)の25bpのフラグメントと同時移動する種を含む。
【００６０】
これらのデータは、カリシウイルス科のRdRpが、種々の化学的に修飾された構成単位からdsRNAを合成できることを示唆する。
【００６１】
カリシウイルスRdRpによって合成された化学的に修飾されたdsRNAおよび修飾されていないdsRNAの精製および特徴づけ
比較例15(修飾されていないdsRNA産物)、実施例1(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)および実施例13(dsRNA産物+2-F-dGMP)の反応混合物の産物を、イオン交換(IEX)クロマトグラフィーによって精製し、分画した。溶出プロフィールを図2および図3に示す。破線は、dsRNAを表すことが疑われる画分を示す。これらの画分をプールし、さらに分析した。酵素的に合成された(骨格が)修飾された二本鎖RNA(dsRNA産物+2-F-dGMPおよびdsRNA産物+2-O-CH3-CMP)または修飾されていない二本鎖RNA(dsRNA産物)の検出は、プールされた画分を用いて、エチジウムブロマイドによる染色およびUV透過照明後のPAGEによって実施した。比較のために、ssRNAテンプレート(図2Aおよび図2C中のssRNAテンプレート)およびdsRNAについてのマーカー(図2C中のレーンM)もまた、別個のレーン上でゲルに添加した。合成のためのテンプレートとして使用した一本鎖RNAは、マーカーの17bpのバンドの位置に移動する、より小さいバンドとして見出される。合成された修飾されていない二本鎖RNAは、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(dsRNA産物)。合成された2'-O-メチル-シチジン-5'-リン酸で骨格が修飾された二本鎖RNAは、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(図3B、dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)。合成された2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-リン酸で骨格が修飾された二本鎖RNAもまた、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(図3B、dsRNA産物+2-F-dGMP)。
【００６２】
カリシウイルスRdRpによって合成された化学的に修飾されたdsRNAおよび修飾されていないdsRNAの融点分析
比較例15(修飾されていないdsRNA産物)、実施例1(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)および実施例13(dsRNA産物+2-F-dGMP)の反応混合物の産物を、二本鎖RNAインターカレート剤(SYBR Green I)と共にインキュベートし、二本鎖RNA産物の融解曲線を、LightCycler機器(Roche Diagnostics)を使用して測定した。骨格が修飾されたRNA(dsRNA産物+2-O-CH3-CMPおよびdsRNA産物+2-F-dGMP、示されるとおり)および修飾されていないRNA(dsRNA産物、示されるとおり)は、図3中に示されるような種々の融点を示す。これらの異なる融解曲線は、RNA骨格中の修飾されたヌクレオチドの組み込みの結果得られる。重要なことに、一本鎖RNAテンプレートは融解曲線を示さず、一本鎖であり、したがってSYBR Green Iに結合できない。修飾されていない比較dsRNAに対する、骨格が修飾されたdsRNA産物の融点におけるシフトにより、修飾されたヌクレオチドをRdRpがdsRNA中に実際に組み込んだことが実証された。
【００６３】
2'-O-CH3-CMP組み込みを有する酵素的に合成された二本鎖RNAの質量分析的特徴づけ
2'-O-CH3-CTPを使用した酵素的合成の反応混合物の産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP;実施例1)をHPLCによって分析し、引き続いて二本鎖RNAを変性させることにより、センス(テンプレートssRNA)鎖およびアンチセンス(相補的ssRNA)鎖を溶出させた。センス(テンプレートssRNA、分子量7564.41)およびアンチセンス(テンプレートssRNAに対して相補的な合成された一本鎖RNA、分子量8080.73)の質量を、ESI/MSによって測定した。これらは、テンプレートssRNAの予測された質量およびアンチセンス鎖における2'-O-CH3-CMPの組み込みに、正確に対応することが見出された(図5Bおよび5C)。
【００６４】
センス(テンプレート)鎖およびアンチセンス(産物)鎖の配列:
ssRX21 順向:GCUGAUGCCGUCAAGUUUACCCCC(配列番号7)
ssRX21 逆向:5-P3-GGGGGUAAACUUGACGGCAUCAGC(配列番号8)
【００６５】
太字のC残基は、2'-O-CH3-CMP残基を示す。
【００６６】
計算された分子量(Da):ssRX21 順向:7564,6;ssRX21 逆向:8080,9
【００６７】
質量分析は、ガス除去装置、バイナリポンプ、温度制御可能なオートサンプラー、カラムオーブンおよびDAD検出器を備えるAgilent Technologies,Inc.(Santa Clara、CA、USA)の標準的HPLCシステムを使用して、LCMSによって実施した。DAD検出器からの流出物を、二重スプレーのエレクトロスプレー源を備えた精密質量Q-TOF質量分析器とオンラインで接続した。10mODの絶対量の総オリゴを、逆相クロマトグラフィーカラムに注入し、メタノール勾配を使用してオリゴヌクレオチドを分離した。
【図１】
2011522552.tif 000012
【図２Ａ】
2011522552.tif 000013
【図２Ｂ】
2011522552.tif 000014
【図２Ｃ】
2011522552.tif 000015
【図３Ａ】
2011522552.tif 000016
【図３Ｂ】
2011522552.tif 000017
【図４】
2011522552.tif 000018
【図５Ａ】
2011522552.tif 000019
【図５Ｂ】
2011522552.tif 000020
【図５Ｃ】
2011522552.tif 000021
【配列表】
2011522552000001.app
【国際調査報告】
2011522552.tif 000022
2011522552.tif 000023
2011522552.tif 000024
2011522552.tif 000025