(57)【要約】  血管新生、癌治療又は該状態に関連した炎症経路に関する多重標的プロテインキナーゼ調節のための組成物及び方法を開示する。開示する化合物及び方法は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物に基づくものである。【選択図】  図１
2011506464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌の治療方法であって、該哺乳動物に置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、及びテトラヒドロ−アドフムロンから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
調節されるプロテインキナーゼが、Abl(T315I)、Aurora-A、染色体X中の骨髄チロシンキナーゼ遺伝子(Bmx)、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ−Ｉ(CaMKI)、CaMKIδ、大腸癌キナーゼ−２／サイクリンＡ(CDK2/cyclinA)、CDK3/サイクリンE、CDK9/サイクリンTl、カゼインキナーゼ−１(y) (CK1(y))、ＣＫ１γ１、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３、ＣＫ１δ、ｃＳＲＣ、死関連プロテインキナーゼ−１(DAPKl)、DAPK2、DRAKl、エフリン受容体−Ａ２(EphA2)、EphA8、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＦＥＲ(Fer)、繊維芽細胞成長因子受容体−２(FGFR2)、FGFR3、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＦＧＲ(Fｇr)、チロシン−プロテインキナーゼ受容体ＦＬＴ４(Flt4)、ｃ−ＪｕｎＮＨ２−末端キナーゼ−３(JNK3)、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ (PI3K)、癌原遺伝子セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ−１(Pim-1)、Pim-2、プロテインキナーゼＡ(PKA)、PKA(b)、プロテインキナーゼＢ−β(PKBβ)、PKBα、PKBγ、ｐ３８−調節／活性化プロテインキナーゼ(PRAK)、ヒトＸ染色体コード化プロテインキナーゼＸ (PrKX)、Ｒｏｎ、リボソームＳ６キナーゼ−１(Rskl)、リボソームＳ６キナーゼ−２(Rsk２)、セリン／スレオニン−キナーゼ−２(SGK2)、脾臓チロシンキナーゼ(Syk)、免疫グロブリンとＥＧＦリピートを有するチロシンキナーゼ−２(Tie2)，TrkA、及びTrkBから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
キナーゼ調節に応答する癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌及び子宮癌から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物を、コーティング剤、等張性及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される、製薬的に受容される賦形剤をさらに含む組成物として投与する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該組成物が、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、及び炭水化物から成る群から選択される１つ以上のメンバーをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項７】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物を、化学療法剤と組み合わせて投与する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態の治療方法であって、該哺乳動物に、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項９】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、ジヒドロ−（ρ）イソα酸；テトラヒドロイソα酸；ヘキサヒドロイソα酸；β酸；それらの個々の類似体；及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、及びテトラヒドロ−アドフムロンから成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
調節されるプロテインキナーゼが、ＡＴＫ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ｐ３８−調節／活性化プロテインキナーゼ(ＰＲＡＫ)、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ (ＰＩ３Ｋ)、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ（ＧＳＫ）、上皮増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＢＴＫ、ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ）、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）、マイトジェン−及びストレス−活性化プロテインキナーゼ（ＭＳＫ）及び１−ｋＢキナーゼ−ｂ（ＩＫＫｂ）から成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物を、コーティング剤、等張性及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される、製薬的に受容される賦形剤をさらに含む組成物として投与する、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
該組成物が、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、及び炭水化物から成る群から選択される１つ以上のメンバーをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物を、血管新生抑制剤と組み合わせて投与する、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療するための組成物であって、唯一の置換１，３−クロペンタジオン化合物としてのシス−ｎ−テトラヒドロ−イソα酸（ＴＨ５）の治療有効量を組成物中に含み；前記治療有効量が癌関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項１６】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療するための組成物であって、組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｎ）類似体と場合によっては、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ａｄ）類似体との治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量が癌関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項１７】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療するための組成物であって、組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｃｏ）類似体の治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量が癌関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項１８】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療するための組成物であって、唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物としてのシス−ｎ−テトラヒドロ−イソα酸（ＴＨ５）の治療有効量を組成物中に含み；前記治療有効量が血管新生関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項１９】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療するための組成物であって、組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｎ）類似体と場合によっては、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ａｄ）類似体との治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量が血管新生関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項２０】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療するための組成物であって、組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｃｏ）類似体の治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量が血管新生関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項２１】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療するための組成物であって、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の唯一の類似体の治療有効量を含み；前記治療有効量が癌関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項２２】
それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療するための組成物であって、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の唯一の類似体の治療有効量を含み；前記治療有効量が血管新生関連プロテインキナーゼを調節する組成物。
【請求項２３】
置換１，３−シクロペンタジオン化合物の類似体が、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）シスρｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、（６Ｓ）トランスρｎイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、テトラヒドロシスｎイソα酸、テトラヒドロトランスｎイソα酸、テトラヒドロシスｎイソα酸、テトラヒドロトランスｎイソα酸、テトラヒドロシスｃｏイソα酸、テトラヒドロトランスｃｏイソα酸、テトラヒドロシスｃｏイソα酸、テトラヒドロトランスｃｏイソα酸、テトラヒドロシスａｄイソα酸、テトラヒドロトランスａｄイソα酸、テトラヒドロシスａｄイソα酸、テトラヒドロトランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、  ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ルポロン、コルプロン、アドルプロン、プレルプロン、ポストルプロン、及びキサントフモールから成る群から選択される、請求項２１又は請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
[001]本特許出願は、米国仮出願No.61/012,506（2007年12月10日出願）に対する優先権を主張する。該優先権出願の内容は、あたかもそれらが完全に本明細書に記載されているかのように、それらの全体で本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
[002]本発明は、一般的に、癌、血管新生(angiogenesis)を治療若しくは抑制するため、そしてプロテインキナーゼ調節に影響されやすい、それらの関連炎症経路をモジュレートするために用いることができる方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【０００３】
関連技術の説明
[003]シグナル伝達は、正常なホメオスタシスを維持するために重要な、又は、調整不全である場合には(if dysregulated)、数多くの疾患病理学及び状態に関連した原因的若しくは寄与機構として作用するために重要な、包括的な調節機構を提供する。細胞レベルにおいては、シグナル伝達は、細胞内部での又は細胞外部から細胞内部へのシグナル若しくはシグナリング部分の移動を意味する。シグナルは、その受容体標的に達すると、多くの細胞イベントに必要なリガンド−受容体相互作用を開始することができ、それらの一部はさらにその後のシグナルとして作用することができる。このようなシグナル相互作用は、一連のカスケードとして役立つのみでなく、ホメオスタシス・プロセスの微調整された制御をもたらすことができる、シグナル・イベントの複雑な相互作用ネットワーク若しくはウェブの一部でもある。しかし、このネットワークは調整不全になる可能性があり、それによって、その結果として、細胞活性の変化及び対応細胞内で発現される遺伝子プログラムの変化を生じる可能性がある。例えば、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を調節する該相互作用キナーゼの単純化バージョンを表示する図１を参照のこと。
【０００４】
[004]シグナル伝達受容体は一般に３クラスに分類される。第１クラスの受容体は、細胞膜に浸透する受容体であり、幾らかの固有酵素活性(some intrinsic emzymatic activity)を有する。固有酵素活性を有する、典型的な受容体は、チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦ、インスリン、ＥＧＦ及びＦＧＦ受容体）、チロシンホスファターゼ（例えば、Ｔ細胞及びマクロファージのＣＤ４５［クラスター・デターミナント−４５］タンパク質）、グアニル酸シクラーゼ（例えば、ナトリウム利尿ペプチド受容体）及びセリン／スレオニンキナーゼ（例えば、アクチビン及びＴＧＦ−β受容体）である受容体類を包含する。固有チロシンキナーゼ活性を有する受容体は、他の基質のリン酸化だけでなく自己リン酸化が可能である。
【０００５】
[005]第２クラスの受容体は、細胞内部で、ＧＴＰ結合タンパク質及びＧＴＰ加水分解タンパク質（Ｇ−タンパク質類と呼ばれる）にカップリングする受容体である。Ｇ−タンパク質類と相互作用する、このクラスの受容体は、７つの膜貫通ドメインを特徴とする構造を有する。これらの受容体は、セルペンチン受容体と呼ばれる。このクラスの例は、アドレナリン受容体、嗅覚受容体、及びある一定のホルモン受容体（例えば、グルカゴン、アンギオテンシン、バソプレッシン及びブラジキニン）である。
【０００６】
[006]第３クラスの受容体は、細胞内に見出され、リガンドと結合すると、核に移動する受容体として記載されることができ、核において該リガンド−受容体複合体は直接に遺伝子転移に影響を及ぼす。
【０００７】
[007]受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として機能するタンパク質類は、４つの主要なドメインを含有する、これらのドメインは（ａ）膜貫通ドメイン、（ｂ）細胞内リガンド結合ドメイン、（ｃ）細胞内制御ドメイン、及び（ｄ）細胞内チロシンキナーゼ・ドメインである。ＲＴＫのアミノ酸配列は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのアミノ酸配列によって高度に保存される（ＡＴＰ及び基質結合領域内で）。ＲＴＫタンパク質は、それらの細胞外部分における構造特徴に基づいて、システイン富化ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、カドヘリン・ドメイン、ロイシン富化ドメイン、Kringleドメイン、酸性ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート(fibronectin type III repeats)、ジスコイジンＩ様ドメイン、及びＥＧＦ様ドメインを包含するファミリーに分類される。これらの多様な細胞外ドメインの存在に基づいて、ＲＴＫｓは少なくとも１４の異なるファミリーに細分されている。
【０００８】
[008]リン酸化時に固有チロシンキナーゼ活性を有する、多くの受容体は、シグナル伝達カスケードの他のタンパク質と相互作用する。該他のタンパク質は、ｃ−Ｓｒｃ癌原遺伝子内で最初に同定されたドメインに相同であるアミノ酸配列のドメインを含有する。これらのドメインは、ＳＨ２ドメインと呼ばれる。
【０００９】
[009]ＳＨ２ドメイン含有タンパク質とＲＴＫｓ若しくは受容体関連チロシンキナーゼとの相互作用は、ＳＨ２含有タンパク質のチロシンリン酸化を生じる。生じたリン酸化は、その活性の変化（有利に又は不利に）をもたらす。固有酵素活性を有する、幾つかのＳＨ２含有タンパク質は、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）、癌原遺伝子ｃ−Ｒａｓ関連ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ｒａｓＧＡＰ）、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）、並びにタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）のＳｒｃファミリーのメンバーを包含する。
【００１０】
[0010]非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、概して、それ自体酵素活性を有さない細胞受容体にカップリングする。タンパク質相互作用を介しての受容体−シグナル伝達の例は、インスリン受容体（ＩＲ）を包含する。この受容体は、固有チロシンキナーゼ活性を有するが、自己リン酸化後に、酵素活性な、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質（例えば、PＩ３ＫまたはＰＬＣ−γ）と直接には相互作用しない。その代わりに、主要なＩＲ基質は、ＩＲＳ−１と呼ばれるタンパク質である。
【００１１】
[0011]ＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体は、プロトタイプ受容体セリン／スレオニン・キナーゼ（ＲＳＴＫ）を代表する。ＴＧＦ−βスパーファミリーの多機能タンパク質は、アクチビン、インヒビン及び骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）を包含する。これらのタンパク質は細胞の増殖又は分化を誘導及び／又は阻害して、種々な細胞タイプの移動及び接着を調節することができる。ＴＧＦ−βの１つの主要な効果は、細胞サイクルを通しての進行の調節である。さらに、ＴＧＦ−βに対する細胞の応答に関与する核タンパク質の１つは、ｃ−Ｍｙｃであり、これは、Ｍｙｃ結合要素を内蔵する遺伝子の発現に直接影響を及ぼす。ＰＫＡ、ＰＫＣ及びＭＡＰキナーゼは、非受容体セリン／スレオニン・キナーゼの３つの主要なクラスを表す。
【００１２】
[0012]キナーゼ活性と疾患状態との関係が、多くの実験室において現在研究されている。このような関係は、疾患自体の原因であるか又は疾患関連症状の発現若しくは進行に密接に関連するかのいずれかである。リウマチ性関節炎、自己免疫疾患は、キナーゼと疾患との関係が現在研究されている、１つの例を提供する。
【００１３】
[0013]リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、自己免疫疾患のなかで最も一般的で、最もよく研究されている疾患であり、世界の人口の約１％がこれに罹患しており、この疾患は、他の自己免疫疾患と同様に、不明の理由から増加中である。ＲＡは、関節の進行性の骨及び軟骨破壊を生じる慢性的滑膜炎症を特徴とする。サイトカイン、ケモカイン及びプロスタグランジンは、炎症の重要なメディエーターであり、活性な疾患を有する患者の関節及び血液の両方に豊富に見出される。例えば、ＰＧＥ２は、ＲＡ患者の滑液中に豊富に存在する。ＰＧＥ２レベルの上昇は、炎症部位におけるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の誘導によって仲介される。［例えば、van der Kraan PM 及び van den Berg WB．変形性関節炎におけるタンパク同化性及び破壊性メディエーター，Curr Opin Clin Nutr Metab Care,3:205-21 1 , 2000； Choy EHS 及び Panayi GS．リウマチ性関節炎におけるサイトカイン経路と関節炎症，N Eng J Med. 344:907-916, 2001； 及び Wong BR, et al.アレルギー性及び自己免疫性障害の治療としてのターゲッティングＳｙｋ，Expert Opin Investig Drugs 13:743-762, 2004.を参照のこと。]
[0014]ヒトにおけるＲＡの病因と病変形成はまだあまり理解されていないが、３段階で進行すると見なされる。初期段階は、樹状細胞が自己抗原を自己反応性Ｔ細胞に与える場合に生じる。Ｔ細胞は、サイトカインを介して自己反応性Ｂ細胞を活性化して、結果として自己抗体の産生を生じ、次に、これらの自己抗体が関節において免疫複合体を形成する。エフェクター段階では、該免疫複合体がマクロファージ及びマスト細胞上のＦｃｆ受容体に結合して、結果として、炎症及び痛みの原因と成るサイトカイン及びケモカインを放出させる。最終段階では、サイトカイン及びケモカインが、プロテアーゼ、酸、及びＲＯＳ（例えば、Ｏ２−）を放出する滑膜繊維芽細胞、破骨細胞及び多形核好中球を活性化して、補充し、結果として、軟骨及び骨の不可逆的な破壊を生じる。
【００１４】
[0015]コラーゲン誘導ＲＡの動物モデルでは、該疾患の開始にはＴ細胞とＢ細胞の参加が必要である。Ｂ細胞活性化は、抗原受容体誘発後に脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）及びホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介してシグナルを発する[Ward SG, Finan P. 治療剤としてのアイソフォーム特異的ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤，Curr Opin Pharmacol.Aug;3(4):426-34,(2003)]。Ｂ細胞上の抗原受容体と結合した後に、Ｓｙｋは３つのチロシン上でリン酸化される。Ｓｙｋは、多重の下流シグナル経路への免疫認識受容体のカップリングに重要な役割を果たす７２ｋＤａタンパク質−チロシンキナーゼである。この機能は、その触媒活性と、ＳＨ２ドメイン含有エフェクタータンパク質との相互作用に参加するその能力との両方の性質である。Ｔｙｒ−３１７、−３４２及び−３４６のリン酸化は、多重のＳＨ２ドメイン含有タンパク質に対するドッキング部位を作製する。[Hutchcroft, J. E., Harrison, M. L. & Geahlen, R. L. (1992). Association of ７２ｋＤａタンパク質−チロシンキナーゼ（Ｐｔｋ７２）とＢ細胞抗原受容体との会合，J. Biol. Chem. 267: 8613-8619, (1992) 及び Yamada, T., Taniguchi, T., Yang, C, Yasue, S., Saito, H. & Yamamura, H. Ｂ細胞抗原・細胞抗原受容体とタンパク質−チロシンキナーゼ−Ｐ７２（Ｓｙｋ）との会合及び膜ＩｇＭの結合による活性化，Eur. J. Biochem. 213: 455-159,(1993)]。
【００１５】
[0016]Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）とマクロファージ若しくは好中球Ｆｃ受容体との結合を含めた、多様なシグナルに応じたＰＩ３Ｋの活性化にＳｙｋが必要であることが判明している。[Crowley, M. T., et al,. J. Exp. Med. 186: 1027-1039, (1997); Raeder, E. M., et al,, J. Immunol. 163, 6785-6793, (1999); 及び Jiang, K., et al, Blood 101 , 236-244, (2003)を参照のこと]。Ｂ細胞では、ＰＩ３Ｋのｐ８５制御サブユニットに対する結合部位を作製する、アダプタータンパク質（例えば、ＢＣＡＰ、ＣＤ１９又はＧａｂ１）のリン酸化を介して、ＰＩ３ＫのＢＣＲ刺激活性化が達成されうる。多くのＩｇＧ受容体によって伝達されるシグナルは、ＳｙｋとＰＩ３Ｋの両方の活性及びクラスター化受容体の部位へのそれらの補充(recruitment)を必要とする。好中球及び単球では、ＰＩ３Ｋと、ＦｃｇＲＩＩＡ上のリン酸化免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ配列との会合が、該受容体へのＰＩ３Ｋ補充の機構として提案されている。そして最近では、ＳｙｒとＰＩ３Ｋとの直接分子相互作用が報告されている。[Moon KD, et al, Ｓｙｋタンパク質−チロシンキナーゼとホスファチド３−キナーゼとの直接相互作用の分子的基礎，J. Biol. Chem. 280, No. 2, Issue of January 14, pp. 1543-1551, (2005)]。
【００１６】
[0017]ＮＳＡＩＤｓの化学防御効果の正確な機構はまだ知られていない、しかし、これらの薬物が細胞増殖の阻害、血管新生の阻害及びアポトーシスの誘導を誘起しうることは周知である。[7 Shiff, S. J., and Rigas, B. (1997) Gastroenterology 113, 1992-1998 及び Elder, D. J. E., and Paraskeva, C. (1999) Apoptosis 4, 365-372]。
【００１７】
[0018]ＮＳＡＩＤｓの最も特徴的な標的は、アラキドン酸からのプロスタグランジン合成を触媒するシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）である。２種類の知られたＣＯＸアイソフォーム、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２が存在する。ＣＯＸ−１は、大抵の組織中に見出される、構成的発現型酵素であり、結腸直腸腺癌中で変化しないで留まるが、ＣＯＸ−２発現は結腸直腸腺腫及び腺癌中で多様なサイトカイン、ホルモン、ホルボールエステル及び癌遺伝子によってアップレギュレートすることができる[Eberhart,C.E.,Coffey,R.J., Radhika,A.,Giardiello,F.M.,Ferrenbach,S.,及びDuBois,R. N. (1994) Gastroenterology 107, 1 183-1 188]。
【００１８】
[0019]大腸癌に対するＮＳＡＩＤｓの化学防御効果の分子的基礎は、アポトーシスに対する癌細胞の感受性を誘導することによるＣＯＸ−２の阻害に少なくとも一部は帰因するとされている[Rigas, B., and Shiff, S. J. (2000) Med. Hypotheses 54, 210-215]。家族性腺腫ポリポーシスのマウスモデルにおいてＣＯＸ−２の無発現変異（null mutation）は、アポトーシスを修復し、結腸直腸腺腫のサイズと数を減少させた [Oshima, M., Dinchuk, J. E., Kargman, S. L., Oshima, H., Hancock, B., Kwong, E., Trzaskos, J. M., Evans, J. F.,及び Taketo, M. M. (1996) Cell 87, 803-809]。ＮＳＡＩＤスリンダクによるＭｉｎマウスの治療によって、腺腫の同様な退縮が観察されている[Labayle, D., Fischer, D., Vielh, P., Drouhin, F., Pariente, A., Bories, C.,Duhamel, O., Trousset, M., 及びAttali, P. (1991) Gastroenterology 101,635-639]。
【００１９】
[0020]しかし、ＮＳＡＩＤｓのアポトーシス促進性効果に関する観察は、矛盾した結論を導き、ＮＳＡＩＤｓがＣＯＸ依存性及び非依存性機構によって作用することを示すことになる[Rigas, B., and Shiff, S. J. (2000) Med. Hypotheses 54, 210-215]。例えば、ＣＯＸ活性を有さない大腸癌細胞系に外因性プロスタグランジンを添加しても、スリンダク硫化物（スリンダク由来の代謝産物）のアポトーシス促進性効果を逆転させることはできない [Hanif, R., Pittas, A., Feng, Y., Koutsos, M. L, Qiao, L., Staiano-Coico, L., Shiff, S. I.及びRigas, B. (1996) Biochem. Pharmacol. 52, 237-245]。
【００２０】
[0021]さらに、ＣＯＸｓを阻害しない、もう１つのスリンダク代謝産物であるスリンダク・スルホンは、動物モデルにおいて腫瘍成長に影響を及ぼす[Piazza, G. A., Alberts, D. S., Hixson, L. J., Paranka, N. S., Li, H., Finn, T.,Bogert, C, Guillen, J. M., Brendel, K., Gross, P. H., Sped, G., Ritchie, J.,Burt, R. W., Ellsworth, L., Ahnen, D. J., and Pamukcu, R. (1997) CancerRes. 57, 2909-2915]、そしてＣＯＸｓを発現する培養された癌細胞において又は発現しない培養された癌細胞においてもアポトーシスを誘発する。
【００２１】
[0022]このため、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の他にＮＳＡＩＤｓの分子標的が存在することを実証する、非常に多くの証拠が今や存在して、癌細胞に対するＮＳＡＩＤｓの化学防御効果とＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ発現レベルとを関連づけている。最近の研究は、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２シグナリングを含めたシグナリング経路に主として関与する、ＮＳＡＩＤｓの一連の新しい分子標的を同定している[Rice, P. L., Goldberg, R. J., Ray, E. C, Driggers, L. J., 及び Ahnen, D. J. (200l)Camer Res. 61, 1541-1547), NF-_B (21. Kopp, E., 及び Ghosh, S. (1994) Science 265, 956-959), p70S6 kinase ( Law, B. K., Waltner-Law, M. E., Entingh, A. J., Chytil, A., Aakre, M. E., Norgaard, P., 及び Moses, H. L. (2000) J. Biol. Chem. 275, 38261-38267), p21ras signaling (Herrmann, C, Block, C, Geisen, C, Haas, K., Weber, C, Winde, G., Moroy, T.,及び Muller, O. (1998) Oncogene 17, 1769-1776), 並びに Akt/PKB kinase (Hsu, A. L., Ching, T. T., Wang, D. S., Song, X., Rangnekar, V. M., 及び Chen, C. S. (2000) J. Biol. Chem. 275, 11397-11403]。
【００２２】
[0023]ＣＯＸ−２活性の阻害剤が結果としてＰＧＥ２産生の減少を生じ、例えばＲＡのような慢性関節炎状態を有する患者の痛覚緩和に有効であることを、多くの研究が示している。しかし、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２の両方が例えば胃腸系及び心臓血管系のような組織における重要な維持機能に関与するので、ＣＯＸ酵素活性を阻害する作用剤の不利な効果に関する懸念が高まっている。それ故、これらの患者における痛覚緩和のための安全な長期間治療アプローチの設計が必要である。ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳ合成のインデューサーはＳｙｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８、ＥＲＫ１／２及びＮＦ−ｋＢ依存性経路を通してシグナルを伝達するので、これらの経路の阻害剤は自己免疫状態及び特に、ＲＡ患者の炎症性及び変形性関節に治療的である可能性がある。
【００２３】
[0024]疾患症状とのそれらの関連に関して現在研究されている他のキナーゼは、Ａｕｒｏｒａ、ＦＧＦＲ、ＭＳＫ、Ｒｓｅ及びＳｙｋを包含する。
【００２４】
[0025]Ａｕｒｏｒａ−細胞分割の重要な調節剤−は、ＡｕｒｏｒａＡ、Ｂ及びＣを包含するセリン／スレオニンキナーゼのファミリリーである。ＡｕｒｏｒａＡキナーゼとＡｕｒｏｒａＢキナーゼは、有糸分裂に直接的な、但しそれぞれ異なる役割を有すると同定されている。これらの３アイソフォームの過剰発現は、白血病、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ及び子宮頚部癌を含めた、多様な範囲のヒト腫瘍種類に関連付けられている。
【００２５】
[0026]繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼである。この受容体における突然変異は、受容体ダイマー化、キナーゼ活性化、及びＦＧＦのアフィニティ上昇によって構成的活性化をもたらす可能性がある。ＦＧＦＲは、軟骨形成不全、血管新生及び先天的疾患に関係付けられている。
【００２６】
[0027]ＭＳＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）１及びＭＳＫ２は、in vivoでＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）１／２又はｐ３８ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路のいずれかの下流で活性化されるキナーゼであり、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）及びヒストンＨ３のリン酸化のために必要である。
【００２７】
[0028]Ｒｓｅは、主に脳において高度に発現される。Ｂｒｔ、ＢＹＫ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ３、Ｓｋｙ、Ｔｉｆ又はｓｅａ関連受容体チロシンキナーゼとしても知られる受容体チロシンキナーゼであり、その主要な役割は、ニューロンをアポトーシスから保護することである。Ｒｓｅ、Ａｘｌ、及びＭｅｒは、細胞接着分子関連の受容体チロシンキナーゼの新たに同定されたファミリーに属する。ＧＡＳ６は、このチロシンキナーゼ受容体、Ｒｓｅ、Ａｘｌ、及びＭｅｒのリガンドである。ＧＡＳ６は、安定期のＥＣにより産生されて、炎症促進刺激がＥＣの接着促進機構(pro-adhesive machinery of EC)を始動させるときに枯渇する、生理学的な抗炎症剤として機能する。
【００２８】
[0029]２つのアイソフォームで存在するグリコゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、グリコゲン代謝の制御に関与する酵素として同定されて、細胞増殖及び細胞死の調節剤として作用する可能性がある。多くのセリン−スレオニンプロテインキナーゼと違って、ＧＳＫ−３は、構成的に活性であり、インスリン又は増殖因子に応答して阻害される。筋肉グリコゲン合成のインスリン刺激におけるその役割が、それを糖尿病及び代謝症候群における治療介入の魅力的な標的としている。
【００２９】
[0030]ＧＳＫ−３調節不全（dysregulation）は、インスリン抵抗性の発症における焦点であることが示されてきた。ＧＳＫ３の阻害は、グルコース処理速度の増加によるだけでなく、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ及びグルコース−６−ホスファターゼのような糖新生遺伝子の肝細胞における阻害により、インスリン抵抗性を改善する。さらに、選択的ＧＳＫ３阻害剤は、グルコース輸送のインスリン依存的な活性化と筋肉における利用を in vitro と in vivo で増強する。ＧＳＫ３はまた、インスリン受容体基質−１のセリン／スレオニン残基を直接リン酸化して、それによりインスリンシグナル伝達の障害をもたらす。ＧＳＫ３は、インスリンシグナル伝達経路において重要な役割を担っていて、それは、インスリンの不存在下で、グリコゲンシンターゼをリン酸化して阻害する［Parker, P. J., Caudwell, F. B., and Cohen, P. (1983) Eur. J. Biochem. 130: 227-234］。増大する証拠は、骨格筋のグルコース輸送活性の調節におけるＧＳＫ−３の負の役割を裏付ける。例えば、インスリン抵抗性の齧歯動物を選択的ＧＳＫ−３阻害剤で急性治療すると、全身のインスリン感受性と筋肉グルコース輸送に対するインスリン作用が改善される。インスリン抵抗性のプレ糖尿病肥満Ｚｕｃｋｅｒラットを特異的なＧＳＫ−３阻害剤で慢性治療すると、経口グルコース耐性と全身インスリン感受性が高められて、脂質異常症の回復と骨格筋におけるＩＲＳ−１依存性インスリンシグナル伝達の改善が付随して生じる。これらの結果は、筋肉におけるＧＳＫ−３の選択的標的指向が肥満関連のインスリン抵抗性の治療に有効な介入法になり得るという証拠を提供するものである。
【００３０】
[0031]Ｓｙｋは、Ｂ細胞受容体及びＩｇＥ受容体からのシグナル伝達に関わるＺＡＰ−７０に関連した非受容体チロシンキナーゼである。Ｓｙｋは、これら受容体内のＩＴＡＭモチーフへ結合して、Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、及びＰＬＣｇシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を始動させる。Ｓｙｋは、細胞内シグナル伝達において不可欠の役割を担うので、炎症疾患及び呼吸障害の重要な標的になる。
【００３１】
[0032]血管新生は、新たな毛細血管の発生を含む組織の血管形成のプロセスである。血管新生の調節及び制御は、黄斑変性及び糖尿病性網膜症のような眼障害に関連した、多くの疾患状態にとって重要である。さらに、血管新生は、転移癌の汎発と残存の成功のために重要な要素である。
【００３２】
[0033]多くのプロテインキナーゼが、血管新生プロセスに関連付けられている。例えば、最近の研究は、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ＰＴＥＮシグナリング・ノード(signaling/node)を脳腫瘍における血管新生を制御するためのインターセプト点(an intercept point)として同定している[Castellino RC and Durden DL., 疾患の機構：ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ＰＴＥＮシグナリング・ノード−脳腫瘍における血管新生を制御するためのインターセプト点.Nat Clin Pract Neurol. 3(12):682-93, 2007]。さらに、[Blackburn JS, et al., マトリックス・メタロプロテイナーゼのＲＮＡ干渉阻害は、腫瘍コラゲナーゼ活性及び血管新生を減ずることによって、メラノーマ転移を予防する。Cancer Res. 67(22): 10849-58 2007]も参照のこと。さらに、例えば、Ｌｅｅらは、ヒト胃結腸癌モデルにおけるＡＫＴ血管新生の関与を実証している[Lee, BL., et al., Ａｋｔによる低酸素誘導因子−１の低酸素非依存性アップレギュレーションは、ヒト胃癌における血管新生を助長するCarcinogenesis. 2007 Nov 4.]。
【００３３】
[0034]それ故、単数又は多数の選択キナーゼの発現又は活性を調節させ得る方法及び組成物を同定することは有用であろう。様々なプロテインキナーゼ及びキナーゼ経路の間の関連性やそれらの間の相互作用の複雑性を理解することは、多数のキナーゼ又は多数のキナーゼ経路に対して有益な活性を有するプロテインキナーゼ調節剤、調整剤、又は阻害剤として作用することが可能な医薬剤を開発することへの緊急ニーズを高めるものである。１つのキナーゼ又は１つのキナーゼ経路に特異的に標的指向する単剤のアプローチは、例えば、糖尿病や代謝症候群のような、非常に複雑な疾患、状態、及び障害を治療するには不十分であろう。さらに、多数のキナーゼの活性を調節することは、単一のキナーゼ調節では獲得不能な相乗的な治療効果をもたらす可能性がある。
【００３４】
[0035]このような調節及び使用は、慢性状態への連続使用を要求しても、例えば、それ自身の状態として、又は多くの疾患及び状態の必須要素としての炎症において必要とされるように、間欠使用を要求してもよい。追加的に、キナーゼの調節剤として作用する組成物は、哺乳動物の身体における多種多様な障害に影響を及ぼすことができる。
【００３５】
[0036]現在、疾患状態のための多重標的指向の治療様式の開発を支持して、それによって、単一標的に対するアグレッシブな治療に伴う可能な有害性を減ずるという可能性を付随して、応答性を強化する可能性を提供する傾向がある。[Arbiser, JL.,標的指向治療法は進行癌では何故作用していないのかJ. Clin. Invest., 1 17(10): 2762-65, 2007,及びMa, WW と Hildalgo, M., 胃腸癌における新規な分子標的の利用. World J Gastroenterol. 13(44): 5845 - 56,2007]を参照のこと。本発明は、多くのキナーゼの活性を調整して、それにより数多くの疾患関連症状を治療する手段を提供すると同時に生命の質を高めるために使用することができる置換１，３−シクロペンタジオン化合物について記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３６】
【非特許文献１】van der Kraan PM 及び van den Berg WB.著：変形性関節炎におけるタンパク同化性及び破壊性メディエーター，Curr Opin Clin Nutr Metab Care,3:205-21 1 , 2000；
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【非特許文献５】Hutchcroft, J. E., Harrison, M. L. & Geahlen, R. L.著(1992). ７２ｋＤａタンパク質−チロシンキナーゼ（Ｐｔｋ７２）とＢ細胞抗原受容体との会合，J. Biol. Chem. 267: 8613-8619, (1992)；
【非特許文献６】Yamada, T., Taniguchi, T., Yang, C, Yasue, S., Saito, H. & Yamamura, H.著：Ｂ細胞抗原・細胞抗原受容体とタンパク質−チロシンキナーゼ−Ｐ７２（Ｓｙｋ）との会合及び膜ＩｇＭの結合による活性化，Eur. J. Biochem. 213: 455-159,(1993)；
【非特許文献７】Crowley, M. T., et al,. J. Exp. Med. 186: 1027-1039, (1997);
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【非特許文献９】Jiang, K., et al, Blood 101 , 236-244, (2003)；
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【非特許文献１１】7 Shiff, S.J.,及び Rigas, B.著：(1997) Gastroenterology 113, 1992-1998；
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【非特許文献１３】Eberhart,C.E., Coffey,R.J., Radhika,A., Giardiello,F.M., Ferrenbach,S.,及びDuBois,R. N.著：(1994) Gastroenterology 107, 1 183-1 188；
【非特許文献１４】Rigas, B.,及び Shiff, S. J.著 (2000) Med. Hypotheses 54, 210-215；
【非特許文献１５】Crowley, M. T., et al著：J. Exp. Med. 186: 1027-1039, (1997);
【非特許文献１６】Raeder, E. M., et al,著：J. Immunol. 163, 6785-6793, (1999);
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【非特許文献１８】Oshima, M., Dinchuk, J. E., Kargman, S. L., Oshima, H., Hancock, B., Kwong, E., Trzaskos, J. M., Evans, J. F.,及び Taketo, M. M.著：(1996) Cell 87, 803-809；
【非特許文献１９】Labayle, D., Fischer, D., Vielh, P., Drouhin, F., Pariente, A., Bories, C.,Duhamel, O., Trousset, M., 及びAttali, P.著：(1991) Gastroenterology 101,635-639；
【非特許文献２０】Rigas, B.,及び Shiff, S. J.著：(2000) Med. Hypotheses 54, 210-215；
【非特許文献２１】Hanif, R., Pittas, A., Feng, Y., Koutsos, M. L, Qiao, L., Staiano-Coico, L., Shiff, S. I.及びRigas, B.著：(1996) Biochem. Pharmacol. 52, 237-245；
【非特許文献２２】Piazza, G. A., Alberts, D. S., Hixson, L. J., Paranka, N. S., Li, H., Finn, T.,Bogert, C, Guillen, J. M., Brendel, K., Gross, P. H., Sped, G., Ritchie, J.,Burt, R. W., Ellsworth, L., Ahnen, D. J.,及び Pamukcu, R.著：(1997) CancerRes. 57, 2909-2915；
【非特許文献２３】Rice, P. L., Goldberg, R. J., Ray, E. C, Driggers, L. J., 及び Ahnen, D. J.著：(200l)Camer Res. 61, 1541-1547)；
【非特許文献２４】NF-_B (21. Kopp, E., 及び Ghosh, S.著：(1994) Science 265, 956-959)；
【非特許文献２５】p70S6 キナーズ ( Law, B. K., Waltner-Law, M. E., Entingh, A. J., Chytil, A., Aakre, M. E., Norgaard, P., 及び Moses, H. L.著：(2000) J. Biol. Chem. 275, 38261-38267)；
【非特許文献２６】p21ras シグナリング(Herrmann, C, Block, C, Geisen, C, Haas, K., Weber, C, Winde, G., Moroy, T.,及び Muller, O.著：(1998) Oncogene 17, 1769-1776)；
【非特許文献２７】Akt/PKB キナーズ (Hsu, A. L., Ching, T. T., Wang, D. S., Song, X., Rangnekar, V. M., 及び Chen, C. S.著：(2000) J. Biol. Chem. 275, 1 1397-1 1403；
【非特許文献２８】Parker, P. J., Caudwell, F. B.,及び Cohen, P.著：(1983) Eur. J. Biochem. 130: 227-23444；
【非特許文献２９】Castellino RC 及び Durden DL.著： 疾患の機構：ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ＰＴＥＮシグナリング・ノード−脳腫瘍における血管新生を制御するためのインターセプト点.Nat Clin Pract Neurol. 3(12):682-93, 2007；
【非特許文献３０】Blackburn JS, et al.著：マトリックス・メタロプロテイナーゼのＲＮＡ干渉阻害は、腫瘍コラゲナーゼ活性及び血管新生を減ずることによって、メラノーマ転移を予防する。Cancer Res. 67(22): 10849-58 2007；
【非特許文献３１】Lee, BL., et al.著： Ａｋｔによる低酸素誘導因子−１の低酸素非依存性アップレギュレーションは、ヒト胃癌における血管新生を助長するCarcinogenesis. 2007 Nov 4；
【非特許文献３２】Arbiser, JL.著：標的指向治療法は進行癌では何故作用していないのかJ. Clin. Invest., 1 17(10): 2762-65, 2007；
【非特許文献３３】Ma, WW と Hildalgo, M.著：胃腸癌における新規な分子標的の利用. World J Gastroenterol. 13(44): 5845 - 56,2007。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
[0037]本発明は、プロテインキナーゼ調節を受けやすい血管新生、癌及びそれらに関連した炎症性経路を治療する又は阻害するために用いることができる方法及び組成物に概して関する。より具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【００３８】
[0038]本発明の第１実施態様は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療する方法について記載する。該方法は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む。
【００３９】
[0039]本発明の第２実施態様は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌を治療するための組成物について記載する、この場合、該組成物は置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を含み、該治療有効量は癌関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４０】
[0040]本発明の第３実施態様は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答するする血管新生状態を治療する方法について記載する。該方法は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む。
【００４１】
[0041]本発明のさらなる実施態様は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療するための組成物について記載する、この場合、該組成物は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を含み、該治療有効量は血管新生関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４２】
[0042]別の実施態様は、癌又は血管新生に関連する炎症を調節する方法について記載する。該方法は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む。
【００４３】
[0043]血管新生又は癌に関連した炎症を治療するための組成物を、本発明の別の実施態様に記載する。この場合、該組成物は置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を含み、該治療有効量は炎症関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４４】
[0044]１実施態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌又は血管新生状態を治療するための組成物について記載する、前記組成物は、該組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物としてのシス−ｎ−テトラヒドロ−イソα酸（ＴＨ５）の治療有効量を含み；該治療有効量は癌関連プロテインキナーゼ又は血管新生関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４５】
[0045]１実施態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌又は血管新生状態を治療するための組成物について記載する、前記組成物は、該組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｎ）類似体及び任意に、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ａｄ）類似体の治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量は癌関連プロテインキナーゼ又は血管新生関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４６】
[0046]１実施態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌又は血管新生状態を治療するための組成物について記載する、前記組成物は、該組成物中の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｃｏ）類似体の治療有効量から本質的に成り；前記治療有効量は癌関連プロテインキナーゼ又は血管新生関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４７】
[0047]１実施態様では、本発明は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌又は血管新生状態を治療するための組成物について記載する；前記組成物は置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つのみの類似体の治療有効量を含み；前記治療有効量は癌関連プロテインキナーゼ又は血管新生関連プロテインキナーゼを調節する。
【００４８】
[0048]１実施態様では、本発明は、それを必要としている哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する癌又は血管新生状態を治療するための組成物について記載する；前記組成物は、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｒ）シスρｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｎイソα酸、（６Ｓ）トランスρｎイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、  ρ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ρ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ρ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ρ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、テトラヒドロシスｎイソα酸、テトラヒドロトランスｎイソα酸、テトラヒドロシスｎイソα酸、テトラヒドロトランスｎイソα酸、テトラヒドロシスｃｏイソα酸、テトラヒドロトランスｃｏイソα酸、テトラヒドロシスｃｏイソα酸、テトラヒドロトランスｃｏイソα酸、テトラヒドロシスａｄイソα酸、テトラヒドロトランスａｄイソα酸、テトラヒドロシスａｄイソα酸、テトラヒドロトランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｎイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスｃｏイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）シスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｓ）トランスａｄイソα酸、ヘキサヒドロ（６Ｒ）トランスａｄイソα酸、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、プレルプロン、ポストルプロン、及びキサントフモールから成る群から選択された、１つ以上の置換１，３−シクロペンタジオン化合物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】[0049]図１は、癌、血管新生及び炎症に関連するＮＦ−κＢを調節するキナーゼネットワークの一部を図解的に図示する。
【図２】[0050]図２は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃを形成する個々のメンバーの化学的構造を図示する。
【図３】[0051]図３は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ組成物の典型的なクロマトグラムを図示する。トップ・パネルは、混合物のＭｅｔａ−ＴＨｃ成分を含むクロマトグラフィー・ピークを同定するが、その後のパネルは、ピークを構成する単離画分のクロマトグラフィー・プロフィルを示す。
【図４】[0052]図４は、癌、血管新生及び炎症に関連するＰＩ３Ｋ及び多種多様なキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃの阻害効果を図示する。
【図５】[0053]図５は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃによる、ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２及び一酸化窒素産生の阻害をグラフで示す。
【図６】[0054]図６は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃによる、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２タンパク質発現の阻害をグラフで示す。
【図７】[0055]図７は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃが、予め作製されたＣＯＸ−２ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞によるＰＧＥ２産生を阻害しなかったことを実証するグラフ表示を提供する。
【図８】[0056]図８は、ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞核抽出物におけるＮＦ−κＢ結合のＭｅｔａ−ＴＨｃによる阻害を示す典型的なウェスタンブロット分析を提供する。
【図９】[0057]図９は、ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞系におけるＴＮＦα及びＩＬ１−β誘導ＭＭＰ−１３発現のＭｅｔａ−ＴＨｃによる阻害をグラフで示す。
【図１０】[0058]図１０は、ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２及び一酸化窒素産生に対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の阻害効果をグラフで表示する。
【図１１】[0059]図１１は、ＭＡＰＫ１キナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の阻害効果を示すグラフ表示を提供する。
【図１２】[0060]図１２は、炎症関連キナーゼのパネルに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の阻害効果を示すグラフ表示である。
【図１３】[0061]図１３は、ＧＳＫキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の阻害効果を示すグラフ表示を提供する。
【図１４】[0062]図１４は、血管新生関連キナーゼＡｒｇチロシンキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の効果を示すグラフ表示である。
【図１５】[0063]図１５は、大腸癌進行に関与するキナーゼのパネルに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の効果を示す。
【図１６】[0064]図１６は、リウマチ性関節炎のマウス・モデルにおける関節炎指標に対するＭｅｔａ−ＴＨｃの効果をグラフで示す。
【図１７】[0065]図１７は、ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２及びＳＷ４８０大腸癌細胞系の増殖に対するＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体の効果をグラフで示す。
【図１８】[0066]図１８は、ヒトにおけるＭｅｔａ−ＴＨｃ９４０ｍｇ摂取後の血清中のＭｅｔａ−ＴＨｃ検出を経時的にグラフで示す。
【図１９】[0067]図１９は、血清中の検出可能なＭｅｔａ−ＴＨｃのプロフィルを対照と対比して示す。
【図２０】[0068]図２０は、ＣＹＰ２Ｃ９＊１によるＭｅｔａ−ＴＨｃの代謝を示す。
【図２１】[0069]図２１は、β酸：ルプロン、コルプロン、アドルプロン、プレルプロン及びポストルプロンの化学構造を示す。
【図２２】[0070]図２２は、キサントフモールの化学構造を示す。
【図２３】[0071]図２３は、種々なＴＨｓ（テトラヒドロイソα酸）のジニ係数を示す。
【図２４】[0072]図２４は、２００を超えるヒト・プロテインキナーゼに対するＴＨ１−７と他のキナーゼ薬物とのジニ係数の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
[0073]本発明は、一般に、プロテインキナーゼ調節に影響されやすい血管新生、癌及びそれらの関連炎症経路を治療又は阻害するために用いられる方法及び組成物に関する。さらに具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【００５１】
[0074]本明細書に引用した特許、公開出願及び科学文献は、当業者の知識を確実なものとして、あたかもそれぞれが具体的かつ個別に援用されることが示唆されるかのように同程度まで、それらの全体で本明細書に援用される。本明細書に引用するあらゆる参考文献と本明細書の具体的な教示との間の如何なるコンフリクトも、後者に有利なように解決されよう。同様に、当該技術分野で理解されている単語又は語句の定義と本明細書で具体的に教示される単語又は語句の定義との間の如何なるコンクリフトも、後者に有利なように解決されよう。
【００５２】
[0075]本明細書に使用する技術及び科学の用語は、他に定義されなければ、本発明が関連する当該技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。本明細書では、当業者に知られている様々な方法論及び材料を参照する。組換えＤＮＡ技術の一般原理を説明する標準の参考資料には、Sambrook et al,,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（1989）；Kaufman et al. 監修「医薬のバイオロジーにおける分子及び細胞の方法の手引き（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine）」ＣＲＣプレス、ボカラトン（1995）；McPherson 監修「定方向突然変異誘発：実践アプローチ（Directed Mutagenesis: A Practical Approach）」ＩＲＬプレス、オックスフォード（1991）が含まれる。薬理学の一般原理を説明する標準の参考資料には、「グッドマン・アンド・ギルマンの治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics）」第１１版、マクグローヒルカンパニーズ社、ニューヨーク（2006）が含まれる。
【００５３】
[0076]本明細書と付帯の特許請求項において、単数形には、前後関係が明らかに他のやり方で指定しなければ、複数の指示対象(referents)が含まれる。本明細書で使用するかぎり、単数形の冠詞（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）には、特に、前後関係が明らかに他のやり方で指定しなければ、それらが指示する用語の複数形が含まれる。追加的に、本明細書に使用するかぎり、具体的に他のやり方で指定しなければ、単語「又は（ｏｒ）」は、「及び／又は」の「包含的な」意味で使用されて、「どちらか一方」の「排他的な」意味では使用しない。用語「約」は、本明細書において、「おおよそ」又は「ほぼ」の範囲で「概ね」を意味するために使用する。用語「約」を数的範囲と一緒に使用する場合、それは、示した数値の上下の境界を広げることによって、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、本明細書において、述べた数値の上下の数値を２０％の変動だけ修飾するために使用する。
【００５４】
[0077]本明細書に使用するかぎり、ある変数に対する数的範囲の記載（recitation）は、本発明がその範囲内の数値のいずれにも等しい変数で実施し得ることを伝えるためのものである。このように、本来的に不連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの整数値にも等しいことができ、その範囲の末端点も含まれる。同様に、本来的に連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの実数値にも等しいことができ、その範囲の末端点も含まれる。例として、０と２の間の数値を有すると記載される変数は、本来的に不連続である変数では、０、１、又は２であり得て、本来的に連続である変数では、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は任意の他の実数値であることができる。
【００５５】
[0078]以下、本発明の特定の態様について詳細に言及する。これら特定の態様に関連して本発明を記載しても、本発明をそのような特定の態様に限定することが意図されるものではないことは理解されよう。むしろ、付帯の特許請求項により定義されるような、本発明の要旨及び範囲内に含まれうるような代替物、修飾物及び同等物を包含することが意図される。以下の記載では、本発明の完全な理解をもたらすために、数多くの特定の詳細を示す。本発明は、これらの特定の詳細の一部又は全部がなくても、実施することが可能である。他の例では、本発明を不必要にわかりにくくしないように、周知のプロセス操作については詳しく記載していない。
【００５６】
[0079]本発明の実施には、当業者に知られた、任意の好適な物質及び／又は方法を利用することができる。しかし、好ましい材料及び方法について記載する。以下の記載及び実施例において言及する材料、試薬、等は、他に記載しないかぎり、商業的供給源より入手可能である。
【００５７】
[0080]本明細書で使用するかぎり、「疾患関連キナーゼ」は、疾患の直接の原因であるか、又はその活性化が問題の疾患の症状を増悪させることに役立つ経路に関連している、個別のプロテインキナーゼ又はキナーゼの群若しくはファミリーを意味する。
【００５８】
[0081]語句「プロテインキナーゼ調節は、対象の健康に有益である」は、キナーゼ調節（アップ又はダウンいずれかのレギュレーション）が疾患の症状を軽減する、予防する、及び／又は逆転させることを生じるか、又は二次治療モダリティの活性を増強する事例を意味する。
【００５９】
[0082]語句「プロテインキナーゼ調節に応答する癌」は、本発明の化合物の投与が（ａ）癌細胞においてキナーゼを直接調節し、該調節が結果として対象の健康に有益な効果（例えば、標的癌細胞にアポトーシス若しくは増殖抑制）を生じる；（ｂ）二次キナーゼを調節し、該調節が対象の健康に有益な効果を生じるキナーゼ調節にカスケードする若しくは該キナーゼ調節を与える；又は（ｃ）調節された標的キナーゼは癌細胞を二次治療モダリティ（例えば、化学療法若しくは放射線療法）に影響されやすいものにするような事例を意味する。
【００６０】
[0083]本明細書で使用するかぎり、移行句においても、又は特許請求項の本体においても、用語「含む(comprise(s))」及び「含んでなる(comprising)」は、制限のない意味(an open-ended meaning)を有するものと解釈するべきである。即ち、この用語は、「少なくとも有する」又は「少なくとも包含する」と同義に解釈すべきである。プロセスに関連して使用する場合、用語「含んでなる」は、該プロセスが引用した工程を少なくとも含むが、追加の工程を包含することも可能であることを意味する。化合物又は組成物に関連して使用する場合、用語「含んでなる」は、化合物又は組成物が列挙した特徴又は化合物を少なくとも含むが、付加的な特徴又は化合物をも含むことができることを意味する。
【００６１】
[0084]本明細書で使用するかぎり、用語「置換１，３−シクロペンタジオン化合物」は、ジヒドロ−（ρ）イソα酸；テトラヒドロイソα酸；ヘキサヒドロイソα酸；β酸；キサントフモール；それらの個々のの類似体；及びそれらの混合物から成る群から選択される化合物を意味する。置換１，３−シクロペンタジオン化合物は化学的に新規に（de novo）合成する又は天然供給源（例えば、ホップ若しくはホップ化合物）から抽出若しくは誘導することができる。
【００６２】
[0085]本明細書で使用するかぎり、用語「誘導体」又は「誘導された」物質は、別の物質に構造的に関連して、理論的にはそれより入手可能な化学物質、即ち、別の物質より作製することができる物質を意味する。誘導体には、化学反応を介して入手される化合物を含めることができる。
【００６３】
[0086]本明細書で使用するかぎり、「ジヒドロ−イソα酸」又は「ρ−イソα酸」は、表１に示すような、ρ−イソα酸の類似体（イソフムロン（ｎ−）、イソコフムロン（ｃｏ−）及びイソアドフムロン（ａｄ−）類似体のシス形及びトランス形を包含する）又はそれらの混合物を意味する。例えば、ρ−イソα酸は、ジヒドロ−イソフムロン、ジヒドロ−イソコフムロン、ジヒドロ−アドフムロンの１つ以上の混合物を意味する。
【００６４】
[0087]本明細書で使用するかぎり、「テトラヒドロ−イソα酸」又は「Ｍｅｔａ−ＴＨｃ」は、表２に示すような、テトラヒドロ−イソα酸の類似体（イソフムロン（ｎ−）、イソコフムロン（ｃｏ−）及びイソアドフムロン（ａｄ−）類似体のシス形及びトランス形を包含する）又はそれらの混合物を意味する。例えば、テトラヒドロ−イソα酸又はＭｅｔａ−ＴＨｃは、テトラヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−イソフムロンの１つ以上の混合物を意味する。
【００６５】
[0088]本明細書で使用するかぎり、「ヘキサヒドロ−イソα酸」は、表３に示すような、ヘキサヒドロ−イソα酸の類似体（イソフムロン（ｎ−）、イソコフムロン（ｃｏ−）及びイソアドフムロン（ａｄ−）類似体のシス形及びトランス形を包含する）又はそれらの混合物を意味する。例えば、ヘキサヒドロ−イソα酸は、ヘキサヒドロ−イソフムロン、ヘキサヒドロ−イソコフムロン、テトラヒドロ−アドフムロンの１つ以上の混合物を意味する。
【００６６】
[0089] 本明細書で使用するかぎり、「β酸」は、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、プレルプロン、ポストルプロン又はそれらの類似体の１つ以上の任意の混合物を意味する。
【００６７】
[0090]本明細書で使用するかぎり、「テトラヒドロ−イソフムロン」はさらに、表２に示すような、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形又は（ｎ−）化合物を当然意味するであろう。
【００６８】
[0091]本明細書で使用する「テトラヒドロ−イソコフムロン」は、表２に示すような、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形又は（ｃｏ−）化合物を意味する。
【００６９】
[0092] 本明細書で使用する「テトラヒドロ−アドフムロン」は、表２に示すような、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形又は（ａｄ−）化合物を当然意味するであろう。
【００７０】
[0093]本明細書で使用するかぎり、「化合物」は、それらの化学構造、化学名又は慣用名のいずれかによって同定することができる。化学構造と化学名又は慣用名が矛盾する場合には、化学構造が化合物のアイデンティティの決定詞になる。本明細書に記載する化合物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を含有することができ、それ故、例えば、二重結合異性体（即ち、幾何異性体）、エナンチオマー又はジアステレオマーのような立体異性体として存在することができる。したがって、本明細書に図示した化学構造は、立体異性体的に純粋な形（例えば、幾何異性体的純粋な、エナンチオマー的純粋な若しくはジアステレオマー的純粋な）並びにエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物を含めた、図示した又は同定した化合物のあらゆる可能なエナンチオマー及び立体異性体を包含するものである。エナンチオマー混合物及び立体異性体混合物は、当業者に周知の分離方法又はキラル合成方法を用いて、それらの構成要素のエナンチオマー又は立体異性体に分割することができる。該化合物は、エノール形、ケト形及びそれらの混合物を含めた、幾つかの互変異性体形で存在することもできる。したがって、本明細書に図示した化学構造は、図示した又は同定した化合物のあらゆる可能な互変異性体形を包含する。記載する化合物には、１つ以上の原子が天然で慣用的に見出される原子量とは異なる原子量を有する同位体標識化合物も含まれる。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例には、非限定的に、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、等が含まれる。化合物は、非溶媒和形だけでなく、水和形が含まれる溶媒和形において、そしてＮ−オキシドとして存在することができる。一般に、化合物は、水和形、溶媒和形、又はＮ−オキシドであることができる。ある種の化合物は、多数の結晶形又は非結晶形で存在することができる。また、本発明の範囲内には、化合物の同属体（congeners）、類似体、加水分解産物、代謝産物、及び前駆体若しくはプロドラッグも包含される。一般に、他に指定しないかぎり、すべての物理形態は、本明細書において考慮する使用について同等であり、本発明の範囲内に含まれるように意図される。
【００７１】
[0094]本発明による化合物は、塩として存在することができる。特に、化合物の医薬的に受容される塩が考慮される。本発明の「医薬的に受容される塩」は、本発明の化合物と、該化合物と塩（例えば、本明細書において「Ｍｇ」又は「Ｍａｇ」として示されるマグネシウム塩）を形成し、治療条件下の対象により耐容される酸又は塩基のいずれかとの組合せである。一般に、本発明の化合物の医薬的に受容される塩は、１以上の治療指数（最低有毒量の最低治療有効量に対する比）を有するものである。当業者は、最低治療有効量が対象毎に、そして適応症毎に変動するので、それに応じて調整されるものであることを理解するであろう。
【００７２】
[0095]本発明による化合物は、、周知の医薬的に受容されるキャリヤー（希釈剤及び賦形剤を包含する）のいずれとも一緒に、医薬的に受容されるビヒクル中で任意に製剤化される[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, 1995参照]。本発明の組成物を作製するのに用いられる、医薬的に受容されるキャリヤー／ビヒクルの種類は、該組成物の哺乳動物への投与の形式に依存して変化するものであるが、一般には、医薬的に受容されるキャリヤーは、生理学的に不活性であり、無毒である。本発明による組成物の製剤は、本発明の化合物の１つより多い種類、並びに治療される症状／状態の治療に有用な他のあらゆる薬理学的に有効な成分を含有することができる。
【００７３】
表１
ρジヒドロ−イソα酸
【００７４】
【化１】
2011506464.tif 000003
【００７５】
【化２】
2011506464.tif 000004
【００７６】
【化３】
2011506464.tif 000005
【００７７】
【化４】
2011506464.tif 000006
【００７８】
表２
テトラヒドロ−イソα酸
【００７９】
【化５】
2011506464.tif 000007
【００８０】
【化６】
2011506464.tif 000008
【００８１】
表３
ヘキサヒドロ−イソα酸
【００８２】
【化７】
2011506464.tif 000009
【００８３】
【化８】
2011506464.tif 000010
【００８４】
【化９】
2011506464.tif 000011
【００８５】
[0096]用語「調節する(modulate)」又は「調節(modfulation)］は、本明細書では、酵素の発現又は活性をそれに関連する化合物、成分、等によりアップ又はダウンレギュレーションすることを意味するために用いられる。
【００８６】
[0097]本明細書に使用するかぎり、用語「プロテインキナーゼ」は、ドナー分子由来のリン酸基をタンパク質のアミノ酸残基へ移すことができるトランスフェラーゼ・クラスの酵素を表す。プロテインキナーゼとファミリー／群の命名法の詳細な考察については、その全体で本明細書に援用される、Kostich, M., el ah, Human Members of the Eukaryotic Protein Kinase Family, Genome Biology 3(9):researchOO43.1-0043.12, 2002 を参照のこと。
【００８７】
[0098]キナーゼの典型的な、非限定的例は、Abl, Abl(T3151), ALK, ALK4, AMPK, Arg, Arg, ARK5, ASKl, Aurora-A, Axl, Blk, Bmx, BRK, BrSKl , BrSK2, BTK, CaMKI, CaMKII, CaMKIV, CDKl/cyclinB, CDK2/cyclinA, CDK2/cyclinE, CDK3/cyclinE, CDK5/p25, CDK5/p35, CDK6/cyclinD3, CDK7/cyclinH/MATl, CDK9/cyclin Tl, CHKl, CHK2, CKl(y), CK1δ, CK2, CK2α2, cKit(D816V), cKit, c-RAF, CSK, cSRC, DAPKl , DAPK2, DDR2, DMPK, DRAKl , DYRK2, EGFR, EGFR(L858R), EGFR(L861Q), EphAl, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA7, EphA8, EphBl, EphB2, EphB3, EphB4, ErbB4, Fer, Fes, FGFRl , FGFR2, FGFR3, FGFR4, Fgr, Fltl , Flt3(D835Y), Flt3, Flt4, Fms, Fyn, GSK3β, GSK3α, Hck, HIPKl, HIPK2, HIPK3, IGF-1R, IKKβ, IKKα, IR, IRAKI , IRAK4, IRR, ITK , JAK2, JAK3, JNKlαl , JNK2α2, JNK3, KDR, Lck, LIMKl, LKBl, LOK, Lyn, Lyn, MAPKl, MAPK2, MAPK2, MAPKAP-K2, MAPKAP-K3, MARK l, MEKl, MELK, Met, MINK, MKK4, MKK6, MKK7β, MLCK, MLKl, Mnk2, MRCKβ, MRCKα, MSKl, MSK2, MSSKl, MSTl , MST2, MST3, MuSK, NEK2, NEK3, NEK6, NEK7, NLK , p70S6K, PAK2, PAK3, PAK4, PAK6, PAR-lBα, PDGFRβ, PDGFRα, PDKl, PI3Kβ, PI3Kδ, PI3Kγ, Pim-1, Pim-2, PKA(b), PKA, PKBβ, PKBα, PKBγ, PKCμ, PKCβI, PKCβII, PKCα, PKCγ, PKCδ, PKCε, PKCζ, PKCη, PKCθ, PKCι, PKD2, PKGlβ, PKGlα, Plk3, PRAK, PRK2, PrKX, PTK5, Pyk2, Ret, RIPK2, ROCK-I, ROCK-II, ROCK-II, Ron, Ros, Rse, Rskl, Rskl, Rsk2, Rsk3, SAPK2a, SAPK2a(T106M), SAPK2b, SAPK3, SAPK4, SGK, SGK2, SGK3, SIK, Snk, SRPKl, SRPK2, STK33, Syk, TAKl, TBKl, Tie2, TrkA, TrkB, TSSKl, TSSK2, WNK2, WNK3, Yes, ZAP-70, ZIPKを包含する。幾つかの実施態様では、該キナ−ゼは ALK, Aurora-A, Axl, CDK9/cyclin Tl, DAPKl, DAPK2, Fer, FGFR4, GSK3β, GSK3α, Hck, JNK2α2, MSK2, p70S6K, PAK3, PI3Kδ, PI3Kγ, PKA, PKBβ, PKBα, Rse, Rsk2, Syk, TrkA,及びTSSKlであることができる。さらに他の実施態様では、該キナーゼは、ABL, AKT, AURORA, CDK, DBF2/20, EGFR, EPH/ELK/ECK, ERK/MAPKFGFR, GSK3, IKKB, INSR, JAK DOM 1/2, MARK/PRKAA, MEK/STE7, MEKK/STE1 1 , MLK, mTOR, PAK/STE20, PDGFR, PI3K, PKC, POLO, SRC, TEC/ATK,及び ZAP/SYKから成る群から選択される。
【００８８】
[0099]本発明の方法及び組成物は、本発明の方法の利益を享受する可能性がある、如何なる哺乳動物による使用のためにも意図される。そのような哺乳動物の中で最も重要なのはヒトであるが、本発明は、そのように限定されることを意図せず、獣医学の使用に適用可能である。このように、本発明によれば、「哺乳動物」又は「必要としている哺乳動物」には、ヒトだけでなく非ヒト哺乳動物、特に、非限定的に、ネコ、イヌ、及びウマを含めた家畜動物が包含される。
【００８９】
[00100]本明細書で使用するかぎり、「癌」は、未分化細胞(anaplastic cells)の増殖を特徴とする、種々な良性若しくは悪性の新生物のいずれをも意味し、該未分化細胞は、悪性の場合には、周囲組織に浸潤して、新たな身体部位に転移する。本発明の範囲内で考慮される、癌の典型的な非限定的例は、脳癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、及び前立腺癌を包含する。本発明の範囲内で考慮される、癌関連プロテインキナーゼの典型的な非限定的例は、ABL, AKT, AMPK, Aurora, BRK, CDK, CHK, EGFR, ERB, FGFR, IGFR, KIT, MAPK, mTOR, PDGFR, PI3K, PKC,及び SRCを包含する。
【００９０】
[00101]用語「血管新生」は、新しい血管の成長−身体内で生じる重要な自然のプロセスを意味する。多くの重篤な疾患状態において、身体は血管新生を制御することができず、時には病的な血管新生として知られる状態になる。新しい血管が過剰に成長すると、血管新生依存性疾患が生じる。血管新生関連障害の例は、慢性炎症（例えば、リウマチ性関節炎若しくはクローン病）、糖尿病（例えば、糖尿病性網膜症）、黄斑変性、乾癬、子宮内膜症、眼障害及び癌を包含する。「眼障害」（例えば、角膜及び網膜の新血管新生）は、発育異常、疾患、損傷、年齢又は毒素に由来する、眼の構造又は機能の障害を意味する。本発明の範囲内で考慮される、眼障害の典型的な非限定的例は、網膜症、黄斑変性、又は糖尿病性網膜症を包含する。眼障害関連キナーゼは、非限定的に、AMPK, Aurora, EPH, ERB, ERK, FMS, IGFR, MEK, PDGFR, PI3K, PKC, SRC, 及び VEGFRを包含する。
【００９１】
[00102]病的な血管新生に関連する又は.病的な血管新生に由来する又は新血管新生によって促進される、如何なる状態又は障害（例えば、新血管新生に依存する腫瘍）も、置換１，３−シクロペンタジオン化合物による治療を受け入れることができる。
【００９２】
[00103]治療を受け入れることができる状態及び障害は、非限定的に、癌；増殖性網膜症（例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑障害、後水晶体線維増殖症）；慢性関節炎に見られるような、過剰な血管結合組織増殖；乾癬；及び血管形成異常（例えば、血管腫）等を包含する。
【００９３】
[00104]本発明の組成物及び方法は、原発性及び転移性の両方の充実性腫瘍（癌腫、肉腫、白血病及びリンパ腫を包含する）の治療に有用である。血管新生の部位に生じる腫瘍の治療が興味深い。このように、該方法は、非限定的に、胸部、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢と胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱及び尿路上皮を包含する）、女性生殖管（子宮頸管、子宮及び卵巣並びに絨毛癌及び妊娠性トロホブラスト疾患を包含する）、男性生殖管（前立腺、精嚢、精巣及び胚細胞腫瘍を包含する）、内分泌腺（甲状腺、副腎及び下垂体を包含する）及び皮膚の癌腫、並びに血管腫、メラノーマ、肉腫（骨及び軟組織から生じる肉腫並びにカポジ肉腫）及び脳、神経、眼及び髄膜の腫瘍（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫及び髄膜腫を包含する）を含めた、あらゆる新生物の治療に有用である。本発明の方法はさらに、例えば白血病のような造血器悪性腫瘍（即ち、緑色腫、プラズマ細胞腫、及び菌状息肉腫のプラークと腫瘍及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病）から生じる充実性腫瘍の治療のため並びにリンパ腫（ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の両方）の治療にも有用である。さらに、本発明の方法は、単独で用いた場合又は放射線療法、他の化学療法及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて場合のいずれにしろ、上記腫瘍からの転移を低減するために有用である。
【００９４】
[00105]本明細書で使用するかぎり、「治療する」とは、本発明の化合物を投与された個人の症状を、本発明によって治療されなかった個人の症状と比較して、緩和する、予防する及び／又は逆転することを意味する。本明細書に記載する化合物、組成物及び方法は、その後の療法を決定するために熟練した開業医（医師又は獣医）によって臨床的評価を続けながら、用いるべきであることを開業医は理解するであろう。そのため、開業医は、治療後に、肺の炎症の治療に何らかの改善があるか否かを標準的方法論に従って評価するであろう。このような評価は、特定の治療用量、投与形式等を増大する、軽減する又は続けるかどうかの評価を助けて、知識を与えるであろう。
【００９５】
[00106]本発明の化合物を投与される対象が特定の外傷性状態(traumatic state)に苦しむ必要がないことは、理解されるであろう。実際に、本発明の化合物は、症状が発現する前に、予防的に投与することができる。用語「治療的」、「治療的に」及びこれらの用語の置換は、治療的、緩和的並びに予防的使用を包含するために用いられる。従って、本明細書で使用するかぎり、「症状を治療する又は緩和すること」は、本発明の化合物が投与された個人の症状を、そのような投与を受けていない個人の症状と比較して、抑制する、予防する、及び／又は逆転させることを意味する。
【００９６】
[00107]用語「医薬的に受容される」は、本発明の化合物が、該組成物の他の成分と適合して、そのレシピエントに有害でないという意味で用いられる。
【００９７】
[00108]用語「治療有効量」は、求める治療結果を達成するのに有効な投与量での治療を示すために用いられる。さらに、当業者は、本発明の化合物の治療有効量は、微調整によって、及び／又は本発明の化合物の１つより多くを投与することによって、又は本発明の化合物を別の化合物とともに投与することによって低下又は増加させてよいことを理解するであろう。例えば、Meiner, C. L.「臨床治験：設計、実施、及び解析（Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis）」疫学及び生物統計学の研究論文（Monographs in Epidemiology and Biostatistics）第８巻、オックスフォード大学出版局、アメリカ（1986）を参照のこと。それ故、本発明は、所与の哺乳動物に固有の、特別な緊急事態(particular exigencies)に合わせて投与／治療を調整するための方法を提供する。以下の実施例に例示するように、治療有効量は、例えば、比較的少ない量で開始することによって、そして有益な効果を同時に評価しながら、段階的に増加することによって経験的に容易に決定することができる。
【００９８】
[00109]当業者には、本発明による化合物の投与の回数は、例えば、年齢、体重、及び該哺乳動物の状態、及び選択する投与経路といったような、他の臨床要因を包含する、任意の所与時点におけるその患者の特別な医学的状態に基づいて、患者毎に変動するものであることが理解されよう。
【００９９】
[00110]本明細書で使用するかぎり、「症状」は、患者により体験されて、特別な疾患に関連している、身体機能のあらゆる感覚又は変化、即ち、「Ｘ」に付随して、「Ｘ」の存在の指標とみなされるものを意味する。症状が、疾患毎に、又は状態毎に変化するものであることは認められて、理解される。非限定的な例を挙げれば、自己免疫障害に関連した症状には、疲労、眠気、不定愁訴、臓器若しくは組織の大きさの増加（例えば、グレイブス病における甲状腺肥大）、又は臓器若しくは組織の機能低下をもたらす臓器若しくは組織の破壊（例えば、糖尿病では、膵臓の島細胞が破壊される）が含まれる。
【０１００】
[00111]本明細書に使用する「炎症」又は「炎症状態」は、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱、疼痛、腫脹、及びしばしば機能喪失を特徴として、有害な作用体や傷害された組織の排除を始動させる機序として役立つ、細胞損傷に対する局所応答を意味する。炎症又は炎症状態の代表的な症状には、関節に限定すれば、発赤、触ると温かい腫脹関節、関節の疼痛及び硬直、及び関節機能の損失が含まれる。全身性の炎症応答は、例えば、発熱、悪寒、疲労／体力喪失、頭痛、食欲喪失、及び筋肉硬直のような、「風邪様の(flu-like)」症状をもたらす可能性がある。
【０１０１】
[00112]本発明の第１態様は、それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する癌の治療方法を提供する、この場合、該方法は、該哺乳動物に置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を投与することを含む。本発明の幾つかの実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、ジヒドロ−(ρ)イソα酸；テトラヒドロイソα酸；ヘキサヒドロイソα酸；β酸；それらの個々の類似体；及びそれらの混合物から成る群から選択される。この態様の他の実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、及びテトラヒドロ−アドフムロンから成る群から選択される。
【０１０２】
[00113] この態様の他の実施態様では、調節されるプロテインキナーゼは、Abl(T315I), Aurora-A, Bmx, BTK, CaMKI, CaMKIδ, CDK2/cyclinA, CDK3/cyclinE, CDK9/cyclin Tl, CKl (y), CKlγl, CKlγ2, CKlγ3, CKlδ, cSRC, DAPKl, DAPK2, DRAKl, EphA2, EphA8, Fer, FGFR2, FGFR3, Fgr, Flt4, JNK3, PI3K, Pim-1 , Pim-2, PKA, PKA(b), PKBβ, PKBα, PKBγ, PRAK, PrKX, Ron, Rskl, Rsk2, SGK2, Syk, Tie2, TrkA, 及びTrkBから成る群から選択される。
【０１０３】
[00114]さらに他の実施態様では、キナーゼ調節に応答する癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌から成る群から選択される。本発明の方法によって治療可能な、他の癌種類は、上述してある。
【０１０４】
[00115]本発明の第２態様は、それを必要とする哺乳動物におけるプロテインキナーゼ調節に応答する血管新生状態を治療する方法について記載する。該方法は、該哺乳動物に置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を投与することを含む。本発明の幾つかの実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、ジヒドロ−(ρ)イソα酸；テトラヒドロイソα酸；ヘキサヒドロイソα酸；β酸；それらの個々の類似体；及びそれらの混合物から成る群から選択される。この態様の他の実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、及びテトラヒドロ−アドフムロンから成る群から選択される。
【０１０５】
[00116]この態様の１実施態様では、調節されるプロテインキナーゼは、非限定的に、ATK, MAPK, PRAK, PI3K, PKC, GSK, FGFR, BTK, PDK, SYK, MSK 及び IKKbを包含する、血管新生の制御に関連したプロテインキナーゼである。
【０１０６】
[00117]この第２態様の別の実施態様では、該方法は一般に、哺乳動物に血管新生を低減するための有効量で置換１，３−シクロペンタジオン化合物を投与することを含む。in vivoで血管新生を低減するための有効量は、治療されない（例えば、プラセボ治療された）対照に比較して、血管新生を少なくとも約５％〜１００％低減する任意の量である。
【０１０７】
[00118]血管新生が低減されるかどうかは、任意の既知方法を用いて、判断することができる。血管新生に対する作用剤の効果を判断する方法は、当該技術分野で知られており、このような方法には、非限定的に、血管形成因子と共に植え付けられた移植片中への新血管新生の阻害；角膜若しくは前眼房における血管成長の阻害；in vitroでの内皮細胞の増殖、遊走若しくは管形成の阻害；ニワトリ絨毛尿膜アッセイ；ハムスター頬嚢(cheek pouch)アッセイ；ポリビニルアルコール・スポンジディスク・アッセイが包含される。このようなアッセイは当該技術分野で周知であり、例えば、Auerbach et al. (Pharmacol. Ther. 51(1): 1-1 1(1991))及びこれに引用された参考文献を含めた、多くの刊行物に記載されている。
【０１０８】
[00119]本発明の第１態様及び第２態様の両方に関する別の実施態様では、本発明はさらに、病的な血管新生に関連した又は病的な血管新生に起因する状態又は障害の治療方法を提供する。癌療法に関連して、本発明の方法による血管新生の低減は、腫瘍サイズの縮小及び腫瘍転移の減少をもたらす。腫瘍サイズの縮小が達成されるかどうかは、例えば、標準的映像方法のような方法を用いて腫瘍のサイズを測定することによって決定することができる。転移が減少するかどうかは、任意の既知方法を用いて知ることができる。腫瘍サイズに対する作用剤の効果を評価する方法は、周知であり、例えば、コンピューター化断層撮影方法及び磁気共鳴映像方法のような映像方法を包含する。この実施態様によると、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の有効量をそれを必要とする哺乳動物に投与して、治療されない（例えば、プラセボ治療された）対照に比較して、in vivoで腫瘍サイズの少なくとも約５％以上の縮小を生じる。
【０１０９】
[00120]本発明の第３態様は、癌又は血管新生に関連した炎症を調節する方法について記載する。該方法は、哺乳動物に置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を投与することを含む。１実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の有効量をそれを必要とする哺乳動物に投与して、治療されない（例えば、プラセボ治療された）対照に比較して、炎症又は炎症関連症状（例えば、疼痛）の少なくとも約１０％以上の緩和を生じる。炎症の緩和が達成されたかどうかは、例えば、臨床的観察によって、或いはＰＧＥ２、一酸化窒素又は炎症の種々なＤＮＡ若しくはタンパク質マーカーの調節又は阻害を測定することによって判断することができる。
【０１１０】
[00121]本発明の第４態様は、それを必要とする哺乳動物においてプロテインキナーゼ調節に応答する若しくは影響されやすい血管新生、癌及び／又はそれらの関連炎症経路を治療する又は阻害する組成物について記載する。該組成物は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の治療有効量を含み；この場合、該治療有効量が血管新生関連プロテインキナーゼ、癌関連プロテインキナーゼ及び／又は炎症関連プロテインキナーゼを調節する。本発明のこの態様の幾つかの実施態様では、ジヒドロ−（ρ）−イソα酸；テトラヒドロイソα酸；ヘキサヒドロイソα酸；β酸；それらの個々の類似体；及びそれらの混合物から成る群から、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を選択する。この態様の他の実施態様では、テトラヒドロ−イソフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン、及びテトラヒドロ−アドフムロンから成る群から、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を選択する。
【０１１１】
[00122]この態様に用いる組成物は、アンチオキシダント、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪及び炭水化物から成る群から選択される１つ以上のメンバー、又はコーティング、等張剤、吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、甘味剤、吸収剤(absorbants)、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される、医薬的に受容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０１１２】
[00123]この第４態様の他の実施態様では、該組成物は、コーティング、等張剤、吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される、医薬的に受容される賦形剤をさらに含む。
【０１１３】
[00124]本発明の方法を実施するには、上記化合物を経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸から、鼻腔から、膣から、又は埋め込みリザーバー(an implanted reservoir)を介して投与することができる。
【０１１４】
[00125]経口投与用組成物は、非限定的に、カプセル剤、錠剤、粉末、エマルジョン並びに水性懸濁液、分散系及び溶液を包含する、任意の経口的に受容される投与形であってよい。経口用の錠剤の場合には、一般に用いられるキャリヤーは、ラクトース及びコーンスターチを包含する。例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も、典型的に加えられる。カプセル形での経口投与のためには、有用な希釈剤はラクトース及び乾燥コーンスターチを包含する。水性懸濁液又はエマルジョンを経口投与する場合は、有効成分を油相中に乳化剤又は懸濁化剤と共に懸濁又は溶解させることができる。必要な場合には、ある種の甘味剤、フレーバー剤又は着色剤を加えることができる。
【０１１５】
[00126]治療用組成物中のキャリヤーは、該組成物の有効成分と適合可能である（そして好ましくは、該組成物を安定化することができる）そして治療される対象に有害でない意味で「受容可能」でなければならない。例えば、１，３−シクロペンタジオン化合物と特有の高溶解性複合体を形成する可溶化剤（例えば、シクロデキストリン）又は１種類以上の可溶化剤を、融合二環式複素環式化合物をデリバリーするための医薬的賦形剤として用いることができる。他のキャリヤーの例には、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム及びＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ＃１０が包含される。
【０１１６】
[00127]本発明に関連して対象、特にヒトへの本発明の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の投与量は、対象における血管新生、腫瘍サイズ／進行又は炎症を妥当な期間にわたって治療的に緩和するために充分であるべきである。該投与量は、他にも考慮すべき事柄があるが、用いる特定の置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効力、対象の状態並びに治療される対象の体重によって、決定されるであろう。
【０１１７】
[00128]例えば、血管新生の低減における置換１，３−シクロペンタジオン化合物の有効量を決定するには、投与経路、放出系（例えば、ピル、ゲル又は他のマトリックス）の動力学及び置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効力が、所望の血管新生抑制効果を不利な副作用を最少にして達成するために考慮される。置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、治療される対象に、該治療される対象の臨床状態に合わせて、典型的に１日から数週間までの範囲の期間にわたって投与される。
【０１１８】
[00129]当業者に容易に明らかであるように、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の投与量は、標準(standard)に比較した、それらの効力(potency)及び／又は有効性(efficacy)に従って調節される。例えば、実施例１７を参照のこと。投与量は、１日に１〜２０回と仮定して、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、又は約０．１〜１００ｍｇ、又は約０．５〜５０ｍｇ、又は約１〜２５ｍｇの範囲内であることができ、そして約０．１ｍｇ〜１００００ｍｇの総１日量に至るまでであることができる。全身効果のために局所適用する場合には、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、又は約０．１〜１００ｍｇ、又は約０．５〜５０ｍｇ、又は約１〜２５ｍｇの範囲内の用量を全身デリバリーするように、パッチ又はクリームを設計する。局所用製剤（例えば、クリーム）の目的が、局所的な血管新生抑制効果を与えるためである場合には、該用量は、一般に、約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ又は約０．０１〜１０ｍｇ又は約０．１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内である。
【０１１９】
[00130]投与経路に関係なく、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の用量を適当な期間にわたって、例えば、１〜２４時間の間に、１日〜数日間、等にわたって、投与することができる。さらに、複数の用量を、選択した期間にわたって投与することができる。適当な用量を１日当たりの適当な分割用量(subdoses)で、特に予防的投与計画では、投与することができる。正確な治療レベルは、治療される対象の反応に依存するであろう。
【０１２０】
[00131]本発明の全ての態様に係わる幾つかの実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を単独で、又は１つ以上の他の置換１，３−シクロペンタジオン及び／又は他の治療剤（血管新生の阻害剤を包含する）；及び任意に癌化学療法剤との組み合わせ療法で投与する。
【０１２１】
[00132]１実施態様では、組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物として、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の個々の（ｎ）、（ｃｏ）及び（ａｄ）類似体の１つ以上を含有する組成物の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与する。置換１，３−シクロペンタジオン化合物の（ｎ）、（ｃｏ）及び（ａｄ）類似体は表１〜３に表示する。例えば、組成物は、組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物として、ＴＨ５（（ｎ）類似体）のみを含むことができる。別の組成物は、組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物として、シス−ＴＨ５及びトランス−ＴＨ７（両方ともテトラヒドロ−イソα酸の（ｎ）類似体）を含むことができる。別の組成物は、組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物として、ＴＨ１及びＴＨ２（両方ともテトラヒドロ−イソα酸の（ｃｏ）類似体）を含むことができる。別の組成物は、組成物中の唯一の置換１，３−シクロペンタジオン化合物として、ＴＨ４及びＴＨ６（両方ともテトラヒドロ−イソα酸の（ａｄ）類似体）を含むことができる。図２は、ＴＨ化合物の化学構造を示す。
【０１２２】
[00133]別の実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ｎ）類似体を含有する組成物の有効量を、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の（ａｄ）類似体と組み合わせて、本発明の方法に従って投与する。例えば、組成物は、ＴＨ４（（ａｄ）類似体）とＴＨ５（（ｎ）類似体）を含むことができる。１００μｇ／ｍｌでのＴＨ４とＴＨ５がＢＭＸキナーゼをほぼ完全に阻害することが判明している。他の組成物は、ＴＨ５とＴＨ６；ＴＨ７とＴＨ４；及びＴＨ７とＴＨ６を含有することができる。
【０１２３】
[00134]組成物中に置換１，３−シクロペンタジオン化合物の１つ以上の類似体を用いることの利点は、一定の標的に対して活性の低い類似体を用いることの有害な副作用なしに、特定の類似体の高用量を用いることができることである。別の利点は、選択性又は特異性が達成されることである。例えば、テトラヒドロ−イソコフムロン（即ち、ＴＨ１）は、動物とin vitro炎症モデルの両方においてあまり好ましくない。しかし、ＴＨ１とＴＨ２は、ある一定の癌の治療において、高いジニ係数（図２３〜２４参照）を有するために、より特異的であり、好ましい。ジニ係数は、キナーゼのパネルに対するキナーゼ阻害剤の選択性の尺度である(Craczyk P., J Med Chem. Nov. 15:50(23)5773-9 (2007))。簡単に説明すると、非選択性阻害剤は、零に近いジニ係数を特徴とするが、高選択性化合物は、１に近いジニ係数を示す。さらに、ＴＨ４とＴＨ５はＢＭＸの阻害において１００μｇ／ｍｌで高活性である（ＢＭＸをほぼ完全に阻害する）が、ＴＨ１、ＴＨ２はこれに比べて約５０％の活性を有することが観察されている。これと同じタイプの選択性がTRKB, PrKX, CKl delta, BTK, JAK3, RSK l, CDK2/cyclinE, EGFR(L858R), NEK, PKB β, Arg, Src(l- 530), TrkA, Rsk4に関しても観察される。さらに、図２３に示すように、ＴＨ７のジニ係数プロフィルは中程度であるが、ＴＨ７は、該投与量範囲にわたって、ＴＨ４及びＴＨ５によく似た作用を有することが観察されている。ＴＨ１〜７のジニ係数はまた、抗癌性薬物又は血管新生抑制薬物として機能することが知られた化合物類のジニ係数と比較されている（図２４）。これらのデータはさらに、ＴＨ１〜７が個々に、それらの混合物であるＴＨＩＡＡよりも高選択性のプロテインキナーゼ阻害剤であることを示している。置換１，３−シクロペンタジオン化合物の２つ以上の類似体の組成物を用いることの別の利点は、単独のみの類似体を用いる場合よりも多くのキナーゼ標的を調節すること(modulation of more kinase targets)である。
【０１２４】
[00135]したがって、本発明の全ての態様に係わる幾つかの実施態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の類似体の下記典型的な組み合わせを検討する、これらの組み合わせは、各組み合わせの後ろの括弧内に記入した利点を有すると期待される：（ｉ）テトラヒドロ−イソフムロン  シスとトランス：ＴＨ５＋ＴＨ７（利点：多くの標的）；（ｉｉ）テトラヒドロ−イソアドフムロン  シスとトランス：ＴＨ４＋ＴＨ６（利点：多くの標的）；（ｉｉｉ）（ｎ）ファミリーと（ａｄ）ファミリー：ＴＨ５＋ＴＨ４；ＴＨ５＋ＴＨ６；ＴＨ７＋ＴＨ４；ＴＨ７＋ＴＨ６（利点：多くの標的）；（ｉｖ）テトラヒドロ−イソコフムロン  シスとトランス：ＴＨ１＋ＴＨ２（利点：高いジニ係数）；及び（ｖ）（ｎ）ファミリーと（ｃｏ）ファミリー：ＴＨ１＋ＴＨ５；ＴＨ２＋ＴＨ５；ＴＨ１＋ＴＨ７；ＴＨ２＋ＴＨ７（利点：多くの標的）。
【０１２５】
[00136]他の組み合わせ療法に関しては、本発明の置換１，３−シクロペンタジオン化合物を、非限定的に、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン）；ＤＮＡ鎖破壊剤（例えば、ブレオマイシン）；ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（インターカレーター、例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンを包含する）；非インターカレーティング・トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド及びテニポシド）；ＤＮＡマイナーグルーブバインダー  プリカマイシン；アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタードを包含する）；アジリジン（例えば、チオテーパ）；メタンスルホネートエステル（例えば、ブスルファン）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）；白金錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）；生体内還元性アルキレーター（例えば、マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン及びアルトレタミン）；代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート及びトリメトレキセートのような葉酸拮抗薬を包含する）；ピリミジン拮抗薬（例えば、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン）；フロクスウリジン・プリン拮抗薬（メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンを包含する）；糖改質類似物質（シクトラビン、フルダラビンを包含する）；リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（ヒドロキシ尿素を包含する）；チューブリン相互作用剤（ビンクリスチン、ビンブラスチン及びパクリタキセルを包含する）；副腎コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、デクサメタゾン、メチルプレドニゾロン及びプロドニゾロン）；ホルモン遮断薬（エストロゲン、結合型エストロゲン、エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセン及びイデネストロールを包含する）；プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロン カプロエート、メドロキシプロゲステロン及びメゲストロール）；アンドロゲン（例えば、テストステロン、テストステロン プロピオネート）; フルオキシメステロン、メチルテストステロン  エストロゲン、結合型エストロゲン及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセン及びイデネストロール；プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロン カプロエート、メドロキシプロゲステロン及びメゲストロール）；アンドロゲン（例えば、テストステロン、テストステロン プロピオネート）; フルオキシメステロン、メチルテストステロン；等を包含する適当な化学療法剤と組み合わせて用いることができる。
【０１２６】
[00137]置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、他の血管新生抑制剤と組み合わせて投与することができる。さらに、本発明の置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、非限定的に、血管新生抑制ステロイド（例えば、ヘパリン誘導体及びグルココルチコステロイド）；トロンボスポンジン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）；フマギリンとその合成誘導体（例えば、ＡＧＭ１２４７０）；インターフェロン−α；エンドスタチン；溶解性成長因子受容体；成長因子に指向される中和モノクローナル抗体；等を包含する血管新生抑制剤と組み合わせて用いることができる。
【０１２７】
[00138]下記実施例は、本発明のある一定の好ましい実施態様を詳しく説明することを意図するものであり、本発明を決して限定するものではない。当業者は、定型的な実験だけを使用して、本明細書に記載の特定の物質及び手順に対する数多くの同等物を認識するか、又は確認することができるであろう。
【実施例１】
【０１２８】
プロテインキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃの効果
[00139]上述したように、キナーゼは、リン酸基をドナー分子（通常は、ＡＴＰ）からタンパク質（通常は、スレオニン、セリン又はチロシン）のアミノ酸残基に移す、転移酵素クラスの酵素を意味する。キナーゼは、酵素制御のためのシグナル伝達に用いられる、即ち、これらは、例えば、コレステロール生合成、アミノ酸形質転換又はグリコーゲン代謝回転に関与する酵素のような酵素を阻害又は活性化することができる。大抵のキナーゼはリン酸化に関して単独種類のアミノ酸残基に特殊化されているが、幾つかのキナーゼは、それらが２種類の異なるアミノ酸をリン酸化することができるという点で、二重の活性を示す。
【０１２９】
[00140]方法：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃ製剤のキナーゼ阻害（対照の％として報告）に関する用量反応性を、以下の表１に示すような、８６種の選択したキナーゼに対して、約１、１０、２５及び５０μｇ／ｍｌにおいて試験した。ヒトキナーゼ活性に対する本発明の方法の阻害効果を、Kinase ProfilerTM Assay (Upstate Cell Signaling Solutions, Upstate USA, Inc.,Charlottesville, VA., USA)において試験した。特定のキナーゼに関するアッセイ・プロトコルは、本明細書に援用されるwww.upstate.com/img/pdf/kp protocols full.pdfに要約されている。
【０１３０】
[00141]結果：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、試験したキナーゼの多くに関してキナーゼ活性の用量依存性阻害を示し、それぞれ、１、５、２５及び５０μｇ／ｍｌにおいて７％、１６％、７７％及び９１％のＦＧＦＲ２阻害を示した。ＦＧＦＲ３及びＴｒｋＡに対しても、それぞれ、１、５、２５及び５０μｇ／ｍｌにおいて同様な結果［即ち、ＦＧＦＲ３（０％、６％、６１％及び８４％）及びＴｒｋＡ（２４％、４５％、９３％及び９４％）］が観察された。
【０１３１】
[00142]検査したキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃの阻害効果を下記表４に示す。
【０１３２】
【化１０】
2011506464.tif 000012
【０１３３】
【化１１】
2011506464.tif 000013
【０１３４】
【化１２】
2011506464.tif 000014
【実施例２】
【０１３５】
Ｍｅｔａ−ＴＨｃ成分の単離と同定
[00143]Ｍｅｔａ−ＴＨｃサンプルの成分を単離し、同定するために、高速向流分離を行なった。テトラヒドロイソα酸を含有する修飾ホップ抽出物は、Hopsteiner (Yakima, WA)から純粋な固体として入手した。この物質を希薄なＨ２ＳＯ４（ａｑ）ｐＨ＝２．０とヘキサンとに分配して、ヘキサンによって数回抽出した。ヘキサンを回収して、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して、Ｎａ２ＳＯ４を除去し、真空濃縮して、ワックス状固体を得た。
【０１３６】
[00144]高速向流（ＨＳＣＣＣ）装置：  半分取用遠心分離コイル(semi-preparative centrifuge coils)（総容量３２５ｍｌ）を組み込んだPharma-Tech Research Corporation CCC-1000モデル向流クロマトグラムで分離を行なった。Rheodyne手動注入器を１０．０ｍｌサンプル・ループと共に用いて該系にサンプルを注入した。Shimadzu LC-20AT Pump（４溶媒の間で切り替え可能）をShimadzu CBM-20A 系コントローラと共に用いた。Pharma-Tech CCC-1000 からの流れはShimadzu SPD-lOAVvp UV-VIS 検出器(２５４ｎｍでモニターリング)を通過して、大規模分画キット（１，０００ｍｌまでの画分量を可能にする）を組み込んだShimadzu FRC-1OA 画分回収器に達した。
【０１３７】
[00145]ＣＣＣ−１０００は、頭−尾配置及び下降式で操作した。上部固定相（酢酸メチル）を下部固定相（０．１Ｍトリエタノールアミン−ｐＨ７．４）を通して１．０ｍｌ／分の流速度で、該コイルの回転を６８０ＲＰＭに一定に維持しながら、汲み出した。サンプルを下部固定相１０．０ｍｌ中に溶解して、直接、系に注入した。
【０１３８】
[00146]二相溶媒系の調製：  脱イオン水１．０Ｌ中にトリエタノールアミン１３．２５ｍｌを溶解することによって、０．１Ｍトリエタノールアミン−ｐＨ７．４緩衝液を調製した。希薄な塩酸によって、ｐＨを７．４に調節した。大型分離ロートを用いた混合と沈降を繰り返して、水性緩衝液に酢酸メチルを完全に混合し、上部相に下部相の少量を加え、この逆も行なって、溶液が確実に飽和されるようにした。
【０１３９】
[00147]結果：  図３は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ組成物の典型的なクロマトグラムを示す。上部パネルは、混合物のＭｅｔａ−ＴＨｃ成分を含むクロマトグラフィー・ピークを同定し、その後のパネルは、ピークを構成する単離画分のクロマトグラフィー・プロフィルを説明する。
【０１４０】
[00148]各画分の均質性％、各画分中に単離された量及びＨＳＣＣＣ精製にかけられた物質の初期量を基準とした回収％を以下の表５に示す。
【０１４１】
【化１３】
2011506464.tif 000015
【実施例３】
【０１４２】
プロテインキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃの効果
[00149]方法：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃ製剤及び個々の成分のキナーゼ阻害（対照の％として報告）に関する用量反応性を、以下の表１に示すような、１９０種の選択したキナーゼに対して、約１、５、２５、５０及び１００μｇ／ｍｌにおいて試験した。ヒトキナーゼ活性に対する本発明の阻害効果を、Kinase ProfilerTM Assay (Upstate Cell Signaling Solutions, Upstate USA, Inc.,Charlottesville, VA., USA)において試験した。特定のキナーゼに関するアッセイ・プロトコルは、http://www.upstate.com/img/pdf/kp protocols full.pdf（２００６年６月１２日に最後の訪問）に要約されている。
【０１４３】
[00150]結果：  試験したキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃの阻害効果を、以下の表６〜１１に示す。
【０１４４】
【化１４】
2011506464.tif 000016
【０１４５】
【化１５】
2011506464.tif 000017
【０１４６】
【化１６】
2011506464.tif 000018
【０１４７】
【化１７】
2011506464.tif 000019
【０１４８】
【化１８】
2011506464.tif 000020
【０１４９】
【化１９】
2011506464.tif 000021
【０１５０】
【化２０】
2011506464.tif 000022
【０１５１】
【化２１】
2011506464.tif 000023
【０１５２】
【化２２】
2011506464.tif 000024
【０１５３】
【化２３】
2011506464.tif 000025
【０１５４】
【化２４】
2011506464.tif 000026
【０１５５】
【化２５】
2011506464.tif 000027
【０１５６】
【化２６】
2011506464.tif 000028
【０１５７】
【化２７】
2011506464.tif 000029
【０１５８】
【化２８】
2011506464.tif 000030
【０１５９】
【化２９】
2011506464.tif 000031
【０１６０】
【化３０】
2011506464.tif 000032
【０１６１】
【化３１】
2011506464.tif 000033
【０１６２】
【化３２】
2011506464.tif 000034
【０１６３】
【化３３】
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【０１６４】
【化３４】
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【０１６５】
【化３５】
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【０１６６】
【化３６】
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【０１６７】
【化３７】
2011506464.tif 000039
【０１６８】
【化３８】
2011506464.tif 000040
【０１６９】
【化３９】
2011506464.tif 000041
【０１７０】
【化４０】
2011506464.tif 000042
【０１７１】
【化４１】
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【０１７２】
【化４２】
2011506464.tif 000044
【実施例４】
【０１７３】
ＰＩ３Ｋ活性に対するＭｅｔａ−ＴＨｃの効果
[00151]ヒトＰＩ３Ｋ−β、ＰＩ３Ｋ−γ及びＰＩ３Ｋ−δ活性に対するＭｅｔａ−ＴＨｃの阻害効果を実施例１の手順及びプロトコルに従って試験した。全ての化合物を１、５、２５及び５０μｇ／ｍｌで試験した。結果は、癌、血管新生及び炎症における付加的なプロテインキナーゼ関与に対する試験結果と比較して、ＰＩ３Ｋ活性のキナーゼ阻害を比較する図４として、グラフに示す。
【実施例５】
【０１７４】
Ｍｅｔａ−ＴＨｃによるＰＧＥ２及び一酸化窒素の阻害
[00152]ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞を培地中のＰＧＥ２及び一酸化窒素に関して分析した。
【０１７５】
[00153]物質：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃとその類似体は、Metagenics(San Clemente, CA)から提供された。ＬＰＳは、Sigma(Sigma,St.Louis,MO)から購入した。Ｍｅｔａ−ＴＨｃの濃度は、３種類の主要なｎ−、ａｄ−及びｃｏ−Ｍｅｔａ−ＴＨｃ類似体の各々のシス及びトランス・ジアステレオマーの活性に基づいて算出した。他の化学物質は全て、Sigma(St.Louis,MO)から購入された分析用グレードであった。
【０１７６】
[00154]細胞培養と刺激：  マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系は、ＡＴＣＣ(Manassas,VA)から購入して、それらの使用説明書に従って維持した。熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシン溶液、及びダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Mediatech(Herndon,VA)から購入した。９６ウェル・プレートにおいて８ｘ１０４細胞／ウェルの密度で、細胞を増殖させ、継代培養して、翌日には９０％コンフルエンスに達した。試験化合物を無血清培地中の細胞に、０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終濃度で加えた。試験化合物と共に１時間インキュベーションした後に、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＤＭＥＭ培地のみを該細胞に加えて、インキュベーションを指示された時間続けた。ＬＰＳによって４時間刺激した後に、培地を回収し、ＰＧＥ２を測定した(Assay Designs, Ann Harbor,MI)。一酸化窒素産生の測定のためには、ＬＰＳ刺激の２０時間後に、培地を回収して、硝酸／亜硝酸レベル(nitratate/nitrite levels)を測定した(Cayman Chemicals, Ann Harbor,MI)。
【０１７７】
[00155]結果：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２及び一酸化窒素産生を阻害した、これを図５に示す。
【実施例６】
【０１７８】
Ｍｅｔａ−ＴＨｃによる直接的ＣＯＸ−２阻害の欠如
[00156]この目的は、ＣＯＸ−２酵素活性の直接阻害を判定することであった。
【０１７９】
[00157]物質：  試験化合物は、ＤＭＳＯ中に用意して、−２０℃において保存した。Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、Metagenics(San Clemente, CA)から提供された。セレコキシブの商業的製剤(Celebrex（登録商標）, G. D. Searle & Co., Chicago, IL)を用いた、そして全ての濃度は活性物質に基づくものであったが、レシピエントも含めて考慮された。ＬＰＳはSigma-Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。
【０１８０】
[00158]細胞培養：  マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系は、ＡＴＣＣ(Manassas,VA)から購入して、それらの使用説明書に従って維持した。９６ウェル・プレートにおいて８ｘ１０４細胞／ウェルの密度で、細胞を継代培養して、９０％コンフルエンスに達しさせた。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＤＭＥＭ単独を細胞培地に加えて、２０時間インキュベートした。試験化合物をＬＰＳと共に無血清培地中の細胞に、０．１％ＤＭＳＯの最終濃度で加えた。試験化合物と共に１時間インキュベートした後に、細胞培地を取り出して、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）と共に試験化合物を含む新鮮な培地と交換して、１時間インキュベートした。培地をウェルから取り出して、ＰＧＥ２合成に関して分析した。
【０１８１】
[00159]ＰＧＥ２分析：  ＰＧＥ２の定量には、商業的な非放射性手段を用いた(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)。サンプルをＥＩＡ緩衝液で１０倍に希釈して、製造業者の勧める手段を改変せずに用いた。ＰＧＥ２濃度はピコグラム（ｐｇ）／ｍｌで表した。このアッセイについての製造業者の仕様書は、＜１０％のアッセイ内変動係数、１％未満のＰＧＤ２及びＰＧＦ２との交差反応性、及び１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲にわたる直線性を包含する。
【０１８２】
[00160]結果：  結果は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃが特異的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないことを示唆する、これらの結果は図６に示す。
【実施例７】
【０１８３】
Ｍｅｔａ−ＴＨｃによるＣＯＸ−２タンパク質の阻害
[00161]ＬＰＳによって刺激したＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞抽出物を、ウェスタン・ブロットによってＣＯＸ−２タンパク質に関して分析した。
【０１８４】
[00162]物質：  試験化合物は、ＤＭＳＯ中に用意して、−２０℃において保存した。Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、Metagenics(San Clemente, CA)から提供された。ＣＯＸ−２に対して発生した抗体は、Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)から購入した。アクチンに対して発生した抗体は、Sigmaから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体は、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)から購入した。
【０１８５】
[00163]細胞培養：  マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系は、ＡＴＣＣ(Manassas,VA)から購入して、それらの使用説明書に従って維持した。試験化合物を無血清培地中の細胞に、０．１％ＤＭＳＯの最終濃度で加えた。試験化合物と共に１時間インキュベートした後に、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＤＭＥＭのみを細胞ウェルに加えて、インキュベーションを１６時間続けた。
【０１８６】
[00164]ＣＯＸ−２のウェスタン・ブロット分析：  細胞を冷ＰＢＳで洗浄して、溶解緩衝液(Bio-Rad)１００μｌで溶解した。変性(denaturing)後に、サンプルをＳＤＳ−ＰＧＥ上で分離させ、ニトロセルロース膜に移した。一次抗体と共に、続いて二次抗体と共にのインキュベーションは、室温において、それぞれ１時間行なった。化学発光をPierce Biotechnology(Rockford, IL)からのSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いて行なった。ウェスタン・ブロット画像はオートラジオグラム(Kodak, BioMax film)を用いて現像した。デンシトメトリーはKodak（登録商標）ソフトウェアを用いて行なった。
【０１８７】
[00165]結果：  結果は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃがＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞においてＣＯＸ−２タンパク質発現を阻害したことを示した。これらの結果は、図７にグラフで示す。
【実施例８】
【０１８８】
ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合
[00166]ＬＰＳによって２時間刺激したＲＡＷ２６４．７細胞からの核抽出物をＮＦ−κＢ活性に関して分析した。
【０１８９】
[00167]物質：  試験化合物は、ＤＭＳＯ中に用意して、−２０℃において保存した。Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、Metagenics(San Clemente, CA)から提供された。パルテノライドはSigma-Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。
【０１９０】
[00168]細胞培養：  マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞系は、ＡＴＣＣ(Manassas,VA)から購入して、それらの使用説明書に従って維持した。細胞は、６ウェル・プレートにおいて１．５ｘ１０６細胞／ウェルの密度で継代培養して、約２日間で９０％コンフルエンスに達しさせた。試験化合物を無血清培地中の細胞に、０．１％ＤＭＳＯの最終濃度で加えた。試験化合物と共に１時間インキュベーションした後に、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＤＭＥＭのみを細胞培地に加えて、インキュベーションをさらに２時間続けた。
【０１９１】
[00169]ＮＦ−κＢ結合：  核抽出物を、本質的にDignam et al[Nucl Acids Res 1 1 :1475-1489, (1983)]が述べているように、調製した。簡単に説明すると、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄して、次に緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＫＣｌ；０．１％ＮＰ−４０；アプロチニン５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン５μｇ／ｍｌ；フェニルメタンスルホニルフルオリド  １ｍＭ）を加えて、氷上に１５分間静置させた。緩衝液Ａによって溶解工程を繰り返した。４℃における５分間の１０，０００ｘｇでの遠心分離後の上清は細胞質画分であった。残りのペレットは緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１．５ｍＭ  ＫＣｌ；４２０ｍＭ  ＫＣｌ；２５％グリセロール；０．２Ｍ  ＥＤＴＡ；アプロチニン５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ  １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン５μｇ／ｍｌ；フェニルメタンスルホニルフルオリド  １ｍＭ）中に再懸濁させて、超音波処理した（５秒間隔で、５ｘ２秒間）。核抽出物画分は、４℃における５分間の１０，０００ｘｇでの遠心分離後の上清として回収した。核抽出物のＤＮＡ結合活性を、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）をＡＴＰ（ｐ３２）標識ＮＦ−κＢコンセンサス・オリゴヌクレオチド配列(5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGGC)と共に用いて評価した。ゲルに対してオートラジオグラフィを行なった。
【０１９２】
[00170]結果：  結果は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃがＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＦ−κＢの核転位を阻害したことを示した。これらの結果は、図８に示す。
【実施例９】
【０１９３】
ＭＭＰ−１３発現の阻害
[00171]ヒト軟骨肉腫細胞を、培地中でのＭＭＰ−１３分泌に関して分析した。
【０１９４】
[00172]物質：  ヒトＴＮＦαとＩＬ−１βは、Sigma(St.Louis, MO)から入手した。Ｍｅｔａ−ＴＨｃの濃度は、３種類の主要なｎ−、ａｄ−及びｃｏ−Ｍｅｔａ−ＴＨｃ類似体の各々のシス及びトランス・ジアステレオマーの活性並びに他のマイナーなＲＩＡＡ類似体の活性に基づいて算出した。ＭＭＰ−１３測定のためのアッセイ・キットは、Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)から購入した。
【０１９５】
[00173]細胞培養：  ヒト軟骨肉腫細胞系、ＳＷ１３５３を、ＡＴＣＣ(Manassas,VA)から購入して、製造業者の使用説明書に従って、１０％血清の存在下のＬ−１５培地中で維持した。９６ウェル・プレートにおいて８ｘ１０４細胞／ウェルの密度で細胞を増殖させ、継代培養して、一晩かけて約８０％コンフルエンスに達しさせた。培地中の試験化合物を０．１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に加えた。試験化合物と共に１時間インキュベートした後に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）又は培地のみを細胞ウェルに加えて、インキュベーションを２０〜２４時間続けた。その後に、上清培地をＭＭＰ−１３測定のために回収した（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
【０１９６】
[00174]結果：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃは、ＳＷ１３５３細胞においてＴＮＦα及びＩＬ−１β誘導ＭＭＰ−１３発現を用量依存的に阻害した。これらの結果は図９に示す。
【実施例１０】
【０１９７】
Ｍｅｔａ−ＴＨｃ類似体によるＰＧＥ２及び一酸化窒素の阻害
[00175]ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞を培地中でＰＧＥ２及び一酸化窒素に関して分析した。
【０１９８】
[00176]物質：  実施例５に記載したとおり。
【０１９９】
[00177]細胞培養と刺激：  実施例５に記載したとおり。
【０２００】
[00178]結果：  Ｍｅｔａ−ＴＨｃ類似体は、ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２及び一酸化窒素産生を阻害した。結果は図１０に示す。
【実施例１１】
【０２０１】
炎症関連キナーゼのＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体阻害
[00179]この目的は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ成分が炎症関連キナーゼを阻害するかどうかを判定することであった。
【０２０２】
[00180]物質：  実施例１に記載したとおり。
【０２０３】
[00181]結果：  選択したキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ成分の用量依存的阻害効果を図１１〜１３に示す。
【実施例１２】
【０２０４】
血管新生関連ＡｒｇチロシンキナーゼのＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体阻害
[00182]この目的は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ成分が血管新生関連Ａｒｇチロシンキナーゼを阻害するかどうかを判定することであった。
【０２０５】
[00183]物質：  実施例１に記載したとおり。
【０２０６】
[00184]結果：  選択したキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ成分の用量依存的阻害効果を図１４に示す。
【実施例１３】
【０２０７】
大腸癌関連キナーゼのＭｅｔａ−ＴＨｃ類似体阻害
[00185]この目的は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ成分が大腸癌関連キナーゼを阻害するかどうかを判定することであった。
【０２０８】
[00186]物質：  実施例１に記載したとおり。
【０２０９】
[00187]結果：  選択したキナーゼに対するＭｅｔａ−ＴＨｃ成分の用量依存的阻害効果を図１５に示す。
【実施例１４】
【０２１０】
コラーゲン誘導リウマチ性関節炎マウスモデルにおける試験化合物の効果
[00188]この実施例は、リウマチ性関節炎モデルでの炎症及び関節炎症状の軽減におけるＭｅｔａ−ＴＨｃの効力を実証した、このような炎症及び症状は、一部は、幾らかのプロテインキナーゼによって仲介されることが知られている。
【０２１１】
[00189]モデル：  雌ＤＢＡ／Ｊマウス（１０／グループ）を明暗の標準的条件下で収容して、任意に食餌を摂らせる。０日目に、スクアレン中にＩＩ型コラーゲン１００μｇと結核菌(Mycobacterium tuberculosis)１００μｇを含有する混合物をマウスに皮内注射した。２１日目に追加免疫注射を繰り返した。２２〜２７日目にマウスを関節炎徴候に関して検査して、反応していないマウスは試験から除去した。マウスを、２８日目に開始して４２日目に終了する１４日間にわたって、胃管栄養法によって１日１回、試験化合物によって処理した。この実施例で用いる試験化合物は、１０ｍｇ／ｋｇ（ｌｏ）、５０ｍｇ／ｋｇ（ｍｅｄ）若しくは２５０ｍｇ／ｋｇ（ｈｉ）でのＭｅｔａ−ＴＨｃ；２０ｍｇ／ｍｌでのセレコキシブ；及び１０ｍｇ／ｋｇでのプレドニゾロンであった。
【０２１２】
[00190] 関節炎の総体症状を、以下に記載するような関節炎指標を用いて、各足に関して評価した（０〜４にスコア化）。この関節炎指標では、０＝関節炎の徴候なし；１＝浮腫及び／又は紅斑：１本の指；２＝浮腫及び／又は紅斑：２つの関節；３＝浮腫及び／又は紅斑：２つより多い関節；並びに４＝関節強直と変形を付随する、全ての足及び指の重度な関節炎。
【０２１３】
[00191]組織学的検査：  該実験の終了時に、マウスを安楽死させ、肢１本を摘出し、緩衝化ホルマリン中に入れて保存した。関節炎指標の分析が有望であると分かった後に、Ｈ＆Ｅ染色による組織学的分析のために、各処置グループから無差別に２匹を選択した。軟組織、関節及び骨の変化を、４のスコアが重度の損傷を意味する４点スケールでモニターした。
【０２１４】
[00192]サイトカイン分析：  該実験の終了時に、サイトカイン分析のために、マウスから血清を回収した。低い（約０．２〜０．３ｍｌ／マウス）サンプル量で、１０匹のマウスからのサンプルを無差別に、それぞれ５匹の２プールに配分した。これは、反復分析が可能であるように行なった；各分析は少なくとも２回行なった。マウス特異的試薬( R&D Systems, Minneapolis,MN)を製造業者の使用説明書に従って用いて、ＴＮＦα及びＩＬ−６を分析した。２６プールのうちの５プールのみが、ＴＮＦαの検出可能なレベルを生じた；ビヒクル処置対照動物グループはそれらのうちにあった。
【０２１５】
[00193]結果：  図１６は、関節炎指標に対するＭｅｔａ−ＴＨｃの効果を示す。ここでは、セレコキシブに関しては有意な低減が観察された（３２日目〜４２日目）、２５０ｍｇ／ｋｇのＭｅｔａ−ＴＨｃ（３４日目〜４２日目）及び５０ｍｇ／ｍｌのＭｅｔａ−ＴＨｃ（３４日目〜４０日目）も、抗関節炎剤としてのＭｅｔａ−ＴＨｃの有効性を実証した。
【実施例１５】
【０２１６】
in vitroでの癌細胞増殖に対する試験化合物の効果
[00194]この実験は、本発明の幾らかのＭｅｔａ−ＴＨｃ試験化合物に関して、in vitroでの癌細胞増殖に対する直接の阻害効果を実証した。
【０２１７】
[00195]方法：  結腸直腸癌細胞系ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２及びＳＷ４８０を９６ウェルプレート中に３ｘ１０３細胞／ウェルで接種し、一晩インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。試験物質の各濃度を８回繰り返した。７２時間後に、CyQUANT（登録商標） Cell Proliferation Assay キットを用いて、細胞を生存細胞総数に関して分析した。ＤＭＳＯ溶媒対照と相対的な生存細胞減少率を算定した。グラフに示した値は、８回観察の平均値±９５％信頼区間である。
【０２１８】
[00196]結果：  図１７は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ化合物の阻害効果をグラフで示す。
【実施例１６】
【０２１９】
経口投与後の血清中のＭｅｔａ−ＴＨｃ検出
[00197]この実験の目的は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃが経口投与後にヒトにおいて代謝されるかどうか、そして検出可能であるかどうかを決定することであった。
【０２２０】
[00198]方法：  投与前の血液採取後に(following a predose blood draw)、遊離酸としてＭｅｔａ−ＴＨｃ９４０ｍｇをデリバリーするソフトゲル（ＴＨＩＡＡ１８８ｍｇ／ソフトゲル）(PR Tetra Standalone Softgel. OG# 2210 KP-247. Lot C42331111)５個を服用させ、直後に、フルーツヨーグルト１容器を食べさせた。カフェイン抜きコーヒーを例外として、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ摂取後の次の４時間にわたって、追加の食物は食べさせなかった。凝固促進剤を含まないCorvac Serum Separator管中に４５分間間隔でサンプルを採取した。サンプルを室温において４５分間凝固させ、１８００ｘｇでの遠心分離によって、４℃において１０分間、血清を分離した。血清０．３ｍｌに、０．５％ＨＯＡｃを含むＭｅＣＮ０．９ｍｌを加えて、−２０℃に４５〜９０分間維持した。該混合物を１５０００ｘｇで、４℃において１０分間、遠心分離した。遠心分離後に、二相が明白であった；ＨＰＬＣ分析のために、上部相０．６ｍｌをサンプリングした。分析物添加サンプル(spiked samples)を用いて、回収率を決定した、回収率は９５％超であった。
【０２２１】
[00199]  結果：  結果は、図１８〜２０にグラフで示す。図１８は、Ｍｅｔａ−ＴＨｃ９４０ｍｇの摂取後の時間にわたって、血清中のＭｅｔａ−ＴＨｃの検出をグラフで示す。図１９は、摂取から２２５分間後に、in vitroで試験した、そのようなＭｅｔａ−ＴＨｃレベルに匹敵するレベルで、Ｍｅｔａ−ＴＨｃが血清中で検出されたことを実証する。図２０は、ＣＹＰ２Ｃ９＊１によるＭｅｔａ−ＴＨｃの代謝を示す。
【実施例１７】
【０２２２】
ホップ誘導体の血管新生抑制活性の評価
[00200]ex vivoでのラット大動脈輪血管新生アッセイ
[00201]試験物質と化学物質：  試験物質のイソα酸（ＩＡＡ）、ρ−イソα酸（ＲＩＡＡ）、テトラヒドロイソα酸（ＴＨＩＡＡ）、ヘキサヒドロイソα酸（ＨＨＩＡＡ）、β酸（ＢＡ）及びキサントフモール（ＸＮ）は、Metaproteomics, Gig Harbor, WA.によって提供された。全ての標準的化学物質、培地及び試薬は、特に指定しないかぎり、Sigma, St.Louis, MOから購入した。
【０２２３】
[00202]方法：  清潔にしたラット大動脈輪をラット尾間質のＩ型コラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌ）中に包埋した。この最終コラーゲン溶液は、Ｉ型コラーゲン(2 mg/ml, Collagen R; Serva, Heidelberg, Germany)７．５量に、１０倍濃縮ＤＭＥＭ１量、炭酸水素ナトリウム溶液（１５．６ｍｇ／ｍｌ）１．５量及び、ｐＨを７．４に調節するための水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）０．１量を混合することによって得た。コラーゲン包埋ラット大動脈輪をシリンダ型アガロース・ウェル中で処理して、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１％グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した無血清ＭＣＤＢ−１３１(Invitrogen)８ｍｌを含有する６０ｍｍ細菌学的ポリスチレン皿中に３通りに入れた。これらのex vivo有機型培養物(organo-typic cultures)を単一化合物によって処置した。空気−ＣＯ２（９５％：５％）雰囲気下、３７℃において９日間培養した後に、該大動脈輪を光学顕微鏡(25 拡大率, Carl Zeiss AxioCam HR Workstation, KSlOO 3.0 ソフトウェア)下で写真撮影した。新血管新生を、観察された血管新生応答のマーカーとして評価した。
【０２２４】
[00203]統計的分析：  対照と、ジメチルスルホキシド対照に合わせて標準化した後の２つの試験濃度とに対して、処置あたり６回観察で、変動分析を行なった。第１種誤差の確率を公称５％レベルに設定した。
【０２２５】
【化４３】
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【０２２６】
[00204]結果：  ＲＩＡＡとＴＨＩＡＡの両方は２０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌ［これは５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌであるべきでは？］において血管増殖を有効に阻害したが、ＨＨＩＡＡとＢＡは２０μｇ／ｍｌ濃度のみにおいて有効であった。キサントフモールはこのアッセイにおいて有効ではなく、ＩＡＡは高濃度では血管増殖を実際に増加させた。
【０２２７】
[00205]遊走創傷治癒アッセイ
[00206]方法：  該アッセイの１日前に、５ｘ１０５内皮細胞を６ウェルプレートに蒔いて、適当な完全培地中で一晩増殖させた。次に、コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層を引っ掻いて、傷を付けた。次に、各薬物２０μｇ／ｍｌで細胞を処置した。傷を付けた後そして６時間後に、各傷の２つの異なる場を位相差顕微鏡によって写真撮影した。各傷の幅の測定を各実験条件下で行なった。実験の開始時に、傷サイズを測定して、１００％とスコアを付けた。６時間後に、残留する傷の幅を測定して、平均の傷閉鎖率(average percent wound closure)を計算した。
【０２２８】
【化４４】
2011506464.tif 000046
【０２２９】
[00207]結果：  ６試験物質のうち、ＨＨＩＡＡのみが創傷閉鎖の阻害に失敗した。試験物質のうちで最も活性であったのはＸＮであり、これにＴＨＩＡＡ、ＢＡ、ＩＡＡ及びＲＩＡＡが続いた。
【０２３０】
[00208]増殖アッセイ
[00209]方法：  該アッセイの１日前に、１ｘ１０４内皮細胞を２４ウェルプレートに４通りに蒔いて、適当な完全培地中で一晩増殖させた。次に、各薬物の１０μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌで細胞を処置した。６時間、４８時間及び７２時間後に、次に細胞をＰＢＳ２００μｌ中に再懸濁させて、超音波処理した。該超音波処理サンプル１００μｌを９６ウェルマイクロプレートに移して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（２μｇ／ｍｌ）１００μｌを加えた。標準曲線作成のために、０．３１２５、０．６２５，１．２５、２．１５、５、１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度を有するＤＮＡ標準試薬１００μｌを用いた。染料の希釈と濃縮を選択して、ＤＮＡ定量アッセイの最大の直線性と感度を得るために重大である、適当な染料／塩基対比率を得た。約１０分間のインキュベーション時間後に、蛍光強度を測定した。全ての研究は一般に、室温において、溶液を光から保護して行なった。蛍光分光分析測定をSpectramax Gemini XSによって行なった。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を３６０ｎｍにおいて励起させ、蛍光発光を４５８ｎｍにおいて検出した。ＤＮＡ標準較正曲線の蛍光強度に応じて、蛍光値をＤＮＡ濃度に換算した。
【０２３１】
【化４５】
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【０２３２】
[00210]結果：  ＨＨＩＡＡは、試験作用剤のなかで最も活性であり、両方の濃度及び全ての時点において増殖を阻害した。ＴＨＩＡＡとＸＮは７２時間までに同じような阻害を生じ、これに続く阻害をＲＩＡＡが生じた。ＢＡもＩＡＡも、このアッセイにおいて増殖を有効に阻害しなかった。
【０２３３】
[00211]結論
【０２３４】
【化４６】
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【０２３５】
[00212]６試験物質のうちで、３物質が３アッセイの全てにおいて血管新生抑制活性を示した（表１５）。ＴＨＩＡＡが該３物質のうちで最も有効であり、これにＲＩＡＡとＢＡが続いた。
【０２３６】
[00213]本発明をここで詳しく説明してきたが、付帯請求項の要旨又は範囲から逸脱することなく、これに多くの変化及び変更がなされうることは、当業者に明らかであろう。
【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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