(57)【要約】  リツキシマブ以外の抗ＣＤ２０抗体をＲＡを治療するために有効な量で患者に投与することを含む、リツキシマブ抵抗性関節リウマチ(ＲＡ)患者の治療方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リツキシマブに反応しない関節リウマチ(ＲＡ)患者の治療方法であって、ＲＡを治療するために有効な量の抗ＣＤ２０抗体を患者に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体が、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ、(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ、(３)配列番号：１１を含む免疫薬剤、(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体、又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である方法。
【請求項２】
抗ＣＤ２０抗体がオファツムマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オファツムマブが配列番号：４の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オファツムマブが配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の方法。 
【請求項５】
抗ＣＤ２０抗体がベルツズマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ベルツズマブが配列番号：８の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ベルツズマブが配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗ＣＤ２０抗体が免疫薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０-結合抗体である、請求項１に記載の方法。 
【請求項１０】
ＣＤ２０-結合抗体が、配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列とを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ２０-結合抗体が、配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ２０-結合抗体が配列番号：１９を含んでなる、請求項９に記載の方法。 
【請求項１３】
抗ＣＤ２０抗体がヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＣＤ２０抗体が細胞障害性剤とコンジュゲートしていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＣＤ２０抗体が静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＣＤ２０抗体が皮下に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＣＤ２０抗体の有効量により、圧痛又は腫脹関節の数を評価するか、患者の包括的な臨床評価を行うか、赤血球沈降速度を評価するか、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価するか、または、疾患活動性の複合計測を使用することによって定まる臨床状態の改善が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＣＤ２０抗体がおよそ５０から４０００ｍｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
用量がおよそ７５から３０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
用量がおよそ１００から２０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
用量がおよそ１００から１０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
用量がおよそ１５０から１０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
用量がおよそ２００から１０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
用量がおよそ２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ又は２０００ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＣＤ２０抗体がおよそ１か月の期間以内で１〜４の用量の頻度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＣＤ２０抗体が２〜３の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
抗ＣＤ２０抗体がおよそ２〜３週の期間以内で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
更に、有効量の一又は複数の第二医薬を抗ＣＤ２０抗体と共に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体は第一医薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
第二医薬が複数の医薬である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第二医薬が、免疫抑制因子、疾患変更抗リウマチ薬(ＤＭＡＲＤ)、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、疼痛制御薬剤、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はその組合せである、請求項２７に記載の方法。 
【請求項３１】
第二医薬がＤＭＡＲＤである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＤＭＡＲＤが、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、注射用ゴールド、経口用ゴールド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシンおよびメトトレキセートからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。 
【請求項３３】
第二医薬がＮＳＡＩＤである、請求項３０に記載の方法。 
【請求項３４】
ＮＳＡＩＤが、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫抑制剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。  
【請求項３６】
第二医薬が、抗α４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット、エファリズマブ、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＮＦκＢリガンドの抗レセプター活性化因子(抗ＲＡＮＫＬ)、ＮＦκＢ-Ｆｃの抗レセプター活性化因子(ＲＡＮＫ-Ｆｃ)、パミドロン酸、アレンドロネート、アクトネル、ゾレンドロネート、クロドロネート、メトトレキセート、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、スルファサラジン(ＳＳＺ)、プレドニソロン、リツキシマブ、２Ｈ７抗体、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
第二医薬が、インフリキシマブ、メトトレキセート(ＭＴＸ)、ＭＴＸとインフリキシマブとの組合せ、エタネルセプト、副腎皮質ステロイド、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、ＭＴＸおよびＳＳＺとプレドニソロンとの組合せ、ＳＳＺおよびＨＣＱとＭＴＸとの組合せ、アザチオプリンおよびＨＣＱとシクロホスファミドとの組合せ、およびＭＴＸとアダリムマブとの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
副腎皮質ステロイドが、プレドニゾン、プレドニソロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコーチゾン又はデキサメサゾンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第二医薬がＭＴＸである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＭＴＸが経口的に又は非経口的に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者が一又は複数の抗腫瘍壊死因子-α阻害薬に対して不十分な応答を表した、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
抗体が単回用量として又は２回用量として投与され、各々の用量がおよそ２００ｍｇから１０００ｍｇである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、治療の開始の１日目と１５日目に、およそ２００ｍｇ×２、およそ３００ｍｇ×２、およそ５００ｍｇ×２、およそ７００ｍｇ×２、又はおよそ１０００ｍｇ×２の用量で投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＡが早期ＲＡ又は初発ＲＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
更に、有効量の抗体を患者に投与することによって患者を再治療することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
再治療が、抗体の第一投与の少なくともおよそ２４週間後に始められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
更なる再治療が始められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
更なる再治療が、抗ＣＤ２０抗体の第二投与の少なくともおよそ２４週間後に始められる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
再治療の後に、関節損傷が軽減した、請求項４５に記載の方法。 
【請求項５０】
再治療の前に、臨床上の改善が患者に観察される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
臨床上の改善が、圧痛又は腫脹関節の数を評価するか、患者の包括的な臨床評価を実行するか、赤血球沈降速度を評価するか、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価するか、または、疾患活動性の複合計測を使用することによって決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
リツキシマブに反応しない被検体の関節損傷の治療方法であって、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列とを含むオファツムマブ、(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列とを含むベルツズマブ、(３)配列番号：１１を含む免疫薬剤、(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列とを含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体、又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列とを含むヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である、抗ＣＤ２０抗体を被検体に投与することを含み、このとき抗ＣＤ２０抗体の量が関節損傷の軽減を達成するために有効である方法。
【請求項５３】
Ｘ線検査を用いて関節損傷軽減の程度が決定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
試験が抗体の投与後少なくともおよそ１か月に実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
試験が抗体の投与後少なくともおよそ２か月に実施される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
抗ＣＤ２０抗体がオファツムマブである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
オファツムマブが配列番号：４の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
オファツムマブが配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５６に記載の方法。 
【請求項５９】
抗ＣＤ２０抗体がベルツズマブである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
ベルツズマブが配列番号：８の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ベルツズマブが配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
抗ＣＤ２０抗体が免疫薬剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０-結合抗体である、請求項５２に記載の方法。 
【請求項６４】
ＣＤ２０-結合抗体が、配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列とを含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＣＤ２０-結合抗体が、配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列とを含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
ＣＤ２０-結合抗体が配列番号：１９を含んでなる、請求項６３に記載の方法。 
【請求項６７】
抗ＣＤ２０抗体がヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
更に、有効量の一又は複数の第二医薬を抗ＣＤ２０抗体と共に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体が第一医薬である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６９】
第二医薬が複数の医薬である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
第二医薬が、免疫抑制剤、疾患変更性抗リウマチ薬(ＤＭＡＲＤ)、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はその組合せである、請求項６７に記載の方法。 
【請求項７１】
抗ＣＤ２０抗体又はその薬学的に許容される組成物の広告方法であって、対象とする視聴者に、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列とを含むオファツムマブ、(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列とを含むベルツズマブ、(３)配列番号：１１を含む免疫薬剤、(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列とを含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体、又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列とを含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ２０抗体、又はその製薬組成物の、リツキシマブに反応しない関節リウマチ患者を治療するための使用を促すことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の説明）
本出願は、米国特許法規則１．５３(ｂ)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９条(ｅ)に基づき２００７年１２月２１日出願の米国特許仮出願番号６１／０１６２８１の優先権を主張するものであり、その内容が出典明記により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明はリツキシマブ抵抗性関節リウマチ(ＲＡ)患者を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球は、造血過程の間に骨髄において生産される多種ある白血球のうちの１つである。リンパ球の２つの主な分類は、Ｂリンパ球(Ｂ細胞)とＴリンパ球(Ｔ細胞)である。
Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する骨髄を放出する。ナイーブＢ細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分離し、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞(形質細胞、plasma cell)」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型の抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
【０００４】
Ｂ細胞関連の疾患には自己免疫性疾患が含まれる。医師および科学者は、ＲＡ、多発性硬化症(ＭＳ)、血管炎、免疫関連糖尿病、及び全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)等のループスを含む７０以上のの臨床上異なる自己免疫性疾患を同定した。これらの疾患の慢性性質により巨大な社会的及び財政的な負荷が生じている。
Ｂ細胞表面抗原を標的とする細胞障害性剤はＢ細胞関連の癌療法の重要な焦点である。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５２を含むこのようなＢ細胞表面抗原は、リンパ腫の治療のための治療上の標的となりうる。
【０００５】
ＣＤ２０抗原(ヒトＢリンパ球限定分化抗原、Ｂｐ３５又はＢ１とも称される)は、４回貫通の、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量を有するグリコシル化された内在性膜タンパク質である。また、抗原は、９０％を超えるＢ細胞非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)上で発現されるが、造血性幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常組織には見られない。ＣＤ２０は、細胞-周期開始および分化のための活性化プロセスの早い段階(一又は複数)を制御し、おそらくカルシウムイオンチャネルとして機能する。活性化されたＢ細胞においてリン酸化が起こると、ＣＤ２０はプレＢ細胞段階のＢリンパ球の表面に現れ、成熟およびメモリーＢ細胞上で見られるが、プラズマ細胞では見られない。ＣＤ２０は、カルシウムチャンネル活性を有し、Ｂ細胞の発達での役割を有しうる。インビトロでの周辺ＣＤ２０＋Ｂ細胞の細胞溶解とインビボでのリツキシマブ活性との関係は不明である。リツキシマブは、インビトロでの抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を示す。また、強力な補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)活性は、リンパ腫細胞および細胞株に対する、そして、特定のマウス異種移植片モデルにおけるリツキシマブについて観察された。リツキシマブを含むいくつかの抗ＣＤ２０抗体は、二次抗体又は他の手段により架橋されると、インビトロでアポトーシスを誘導することが示された。
【０００６】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫の「標的とする(ターゲティング)」ための候補となりうる。基本的に標的とするとは以下のことを言う：Ｂ細胞のＣＤ２０表面抗原に特異的な抗体を患者に投与する。これらの抗ＣＤ２０抗体は、正常及び悪性のＢ細胞(表面上)のＣＤ２０抗原に特異的に結合する；ＣＤ２０表面抗原に結合する抗体は、腫瘍性Ｂ細胞を破壊及び減少に至らしめることができる。さらに、腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬品又は放射性標識は抗ＣＤ２０抗体にコンジュゲートさせて、作用剤が腫瘍性Ｂ細胞に特異的に「運ばれる」ようにすることができる。方法にかかわりなく、主たる目的は、腫瘍を破壊することである。特定の方法は、使用する特定の抗ＣＤ２０抗体により測定することができ、ゆえに、ＣＤ２０抗原を標的とする有用な方法はかなり異なる。
【０００７】
リツキシマブ(rituximab)(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))抗体は、一般的にＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは米国特許第５７３６１３７号(Anderson et al.)において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキシマブは、再発性又は低抵抗性(refractory low-grade)又は濾胞性(follicular)の、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞ＮＨＬ患者の治療のためのものである。インビトロの作用メカニズム研究により、リツキシマブは、ヒト補体に結合し、ＣＤＣによりリンパ系Ｂ細胞系統を溶解することが示された。加えて、ＡＤＣＣのためのアッセイにおいても有意な活性がある。リツキシマブは、トリチウムチミジン-取込みアッセイにおいて抗増殖効果を有すること、そして直接アポトーシスを誘導することが示されたが、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２０抗体はそうではない。リツキシマブは、ドキソルビシンおよび他の毒素の細胞毒性に対する、薬剤耐性ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株の感度を高める。インビボ前臨床研究は、リツキシマブがカニクイザルの末梢血、リンパ節および骨髄からＢ細胞を減少させることを示した。  
リツキシマブは、４回の用量として毎週３７５ｍｇ／ｍ２の用量で、再発したか又は抵抗性の低悪性度ないしは濾胞性ＣＤ２０＋Ｂ細胞ＮＨＬである患者の治療のために、１９９７年１１月に米国で承認された。２００１年４月に、リツキシマブは、低悪性度ＮＨＬの再治療(週４回の用量)および付加的な用量投薬計画(週８回の用量)について米国で承認された。承認以降、患者は、単一療法としてないしは免疫抑制剤又は化学療法剤と併用してリツキシマブに曝されている。また、患者は、維持療法として最高２年間リツキシマブで治療されている。リツキシマブは悪性及び非悪性プラズマ細胞障害の治療にも用いられている。
また、リツキシマブは、様々な非悪性自己免疫性疾患において調べられている。このような疾患には、ＲＡ、狼瘡、免疫血小板減少性紫斑病、純粋な赤血球形成不全、自己免疫性貧血症、寒冷凝集素疾患、重症インシュリン耐性のタイプＢ症候群、混合クリオグロブリン血症、重症筋無力症、ヴェゲナー肉芽腫症、抵抗性尋常性天疱瘡、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、活動性ＩＩ型混合クリオグロブリン血症、尋常性天疱瘡、自己免疫性神経障害、傍腫瘍性眼球クローヌス症候群、及び再発寛解型多発性硬化症(ＲＲＭＳ)が含まれる。
【０００８】
第ＩＩ相試験(ＷＡ１６２９１)を関節リウマチ(ＲＡ)患者で行い、リツキシマブの安全性及び有効性に関する４８週フォローアップデータを得ている。患者は、４つの治療アーム：メトトレキセート、リツキシマブ単独、リツキシマブとメトトレキセート、及びリツキシマブとシクロホスファミドについて均等にランダム化した。リツキシマブの治療投薬計画は、第１日目と第１５日目に１ｇを静脈内に投与された。ほとんどのＲＡ患者はリツキシマブを注入すると、十分な耐性となり、初めの注入の間でさえ少なくとも一の有害症状を経験するものは３６％に上る(これに対してプラシーボ投与患者は３０％)。概して、大多数の有害症状は、重症度が軽度から中程度のものであると考えられ、すべての治療群全体で等しかった。４８週間の４アーム全体の中に合計１９の重度の有害症状があった。それはリツキシマブ／シクロホスファミド群においてわずかに頻度が多かった。感染の発病は、すべての群全体で等しかった。このＲＡ患者集団の深刻な感染の平均率は年間１００患者につき４．６６であった。それは地域に密着した疫学研究で報告されたＲＡ患者の入院を必要とする感染率より低い(年間１００患者につき９．５７)。
【０００９】
ＤＡＮＣＥＲ第ＩＩｂ相試験は、第１日及び第１５日目の５００ｍｇ又は１０００ｍｇの用量のリツキシマブにより、疾患変更性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)耐性ＲＡ患者におけるリツキシマブとメトトレキセートの有効性を評価した。リツキシマブの両用量についてのＡＣＲ応答は、６か月のプラセボよりも統計学的に優れていた。２つのリツキシマブ用量の間に差異はみられず、経口副腎皮質ステロイドの有用性の分析ではＡＣＲ応答に対する有意な影響は現れなかった。
ＲＥＦＬＥＸ第３相試験により、１０００ｍｇの用量のリツキシマブによって、抗ＴＮＦα療法に十分に応答しないＲＡ患者におけるリツキシマブおよびメトトレキセートの有効性が評価された。試験条件下でリツキシマブにより治療された患者は、活動中の疾患の兆候及び症状が改善され、６か月にわたって有意な利益を得た。
【００１０】
自己免疫性神経障害、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群およびＲＲＭＳを含む、少数の神経学的な疾患患者において報告されたリツキシマブの安全性プロファイルは、腫瘍学又はＲＡにおいて報告されたものと類似していた。ＲＲＭＳ患者においてインターフェロンβ又は酢酸グラチラマーと併用したリツキシマブの実施中の調査者主催の試験(ＩＳＴ)では、１０人のうちの１人の治療を受けた患者はリツキシマブの最初の注入後に中程度の発熱と硬直を経験し観察のために一晩入院したが、その他の９人の患者は報告された有害事象もなく４回の注入投薬計画を完了した。
抵抗性ＡＮＣＡ関連血管炎(ＡＡＶ)患者は、静脈内シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン又はレフルノミドのような免疫抑制医薬と共にリツキシマブを投与したところ、見かけの有効性を示した。抵抗性全身性血管炎患者に、１用量につき３７５ｍｇ／ｍ２で静脈内シクロホスファミドとともに４用量のリツキシマブを与えた。９人のＡＡＶ患者は、５００ｍｇのリツキシマブの週２又は４用量によって成功裏に治療された。１１人の抵抗性ＡＡＶ患者では、３７５ｍｇ／ｍ２／用量の週４用量によるリツキシマブ治療又は再治療により、Ｂ細胞枯渇による寛解が誘導された。
【００１１】
他の抗ＣＤ２０抗体には、例えば、「Ｙ２Ｂ８」(ＺＥＶＡＬＩＮ(登録商標))(Biogen-Idec, Inc.)と称される９０Ｙ標識２Ｂ８マウス抗体(例えば米国特許第５７３６１３７号、Anderson et al.；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ11388)；「１３１Ｉ−Ｂ１」又は「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体(ＢＥＸＸＡＲＴＭ)(Corixa; Coulter Pharmaceutical, Inc.) (例として米国特許第５５９５７２１号、Kaminski et al.)を製造するために場合によって１３１Ｉにて標識されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」又は「トシツモマブ」；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(例えば、Press et al. Blood, 69(2): 584-591 (1987)およびその変異体、例えば、「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(例えば国際公開２００３／００２６０７、Leung；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０)；マウスキメラ２Ｈ７抗体(例として米国特許第５６７７１８０号、Robinson et al.)；ヒト化２Ｈ７抗体、例えばｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７および他のバージョン(Genentech, Inc.)(例えば、国際公開２００４／０５６３１２、Adams et al.および以下に記した他の文献)；２Ｆ２、ＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ又はオファツムマブと称されるＣＤ２０を標的とするヒト抗体(GlaxoSmithKline; GenMab A/S)(例えば、Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today, 8:503-510 (2003)；Cragg et al., Blood, 101:1045-1052 (2003)；及び米国公開特許２００４／０１６７３１９、Teeling et al.)；ＣＤ２０に対するヒトモノクローナル抗体(GenMab A/S/Medarex, Inc.)(例えば、国際公開２００４／０３５６０７および国際公開２００５／１０３０８１、Teeling et al.)；Ｆｃ領域に結合した複合体Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有するＣＤ２０に対する抗体(Kyowa Hakko)(例えば、米国公開特許２００４／００９３６２１、Shitara et al.)；ＣＤ２０の細胞外エピトープに結合するキメラ化又はヒト化モノクローナル抗体(Biomedics Inc.)(例えば、国際公開２００６／１０６９５９、Numazaki et al.)；ＨＢ２０-３、ＨＢ２０-４、ＨＢ２０-２５およびＭＢ２０-１１のような、ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体ないしは断片(国際公開２００５／０００９０１、Tedder et al.)；ＴＲＵ-０１５を含むＣＤ２０に結合する小モジュラー免疫製薬(ＳＭＩＰｓ)(Wyeth, Trubion Pharmaceuticals, Inc.)(例えば、米国公開特許２００５／０１８６２１６；米国公開特許２００５／０２０２５３４；米国公開特許２００５／０２０２０２８；米国公開特許２００５／１３６０４９；及び米国公開特許２００５／０２０２０２３、Ledbetter et al.及び米国公開特許２００７／００５９３０６、Grosmaire et al.)；ＡＭＥ３３(例えば、米国公開特許２００５／００２５７６４、Watkins et al.)及びＡＭＥ１３３及びＡＭＥ１３３ｖ抗体(例えば、米国公開特許２００５／０１３６０４４、Watkins and Pancook)(また例として国際公開２００４／１０３４０４および米国公開特許２００６／０２５１６５２、Watkins et al.を参照)、及び、Ｆｃ突然変異を有する抗体(例として国際公開２００５／０７０９６３、Allan et al.)といった抗体のＡＭＥシリーズを含むＣＤ２０結合抗体(Eli Lilly and Co., Applied Molecular Evolution, Inc.)；国際公開２００５／０１６９６９および米国公開特許２００５／００６９５４５(Carr et al.)において記載されるものなどのＣＤ２０結合分子；国際公開２００５／０１４６１８ (Chang et al.)において記載される二重特異性抗体；ヒト化ＬＬ２および類似の抗体(Immunomedics, Inc.)(例えば米国特許第７１５１１６４号および米国公開特許２００５／０１０６１０８、Hansen)；キメラＡ２０(ｃＡ２０)又はヒト化Ａ２０抗体(ｈＡ２０、ＩＭＭＵＮ-１０６ＴＭ、ベルツズマブ(veltuzumab))(例えば、米国公開特許２００３／０２１９４３３、Hansen et al.)などのＡ２０抗体(Immunomedics, Inc.)；ＣＤ２０に対する完全ヒト抗体(Amgen/AstraZeneca)(例えば、国際公開２００６／１３０４５８、Gazit et al.)；ＣＤ２０に対する抗体(Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd.)(例として国際公開２００６／１２６０６９、Morawala)；ＧＡ１０１のようなＣＤ２０に対するキメラ又はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体(Roche/GlycArt Biotechnology AG)(例えば、国際公開２００５／０４４８５９；米国公開特許２００５／０１２３５４６；米国公開特許２００４／００７２２９０；及び米国公開特許２００３／０１７５８８４、Umana et al.)；そして、International Leukocyte Typing Workshopから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ−Ｃ１又はＮＵ−Ｂ２(例としてValentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))。この一覧は代表的な抗ＣＤ２０抗体を提供するするものであって、網羅的でない。
【００１２】
リツキシマブはＢ細胞リンパ腫の治療に有効であるにもかかわらず、およそ５０％の再発性／抵抗性ＣＤ２０＋濾胞性リンパ腫患者がリツキシマブによる最初の治療に反応せず(先天性の耐性)(McLaughlin et al., J Clin Oncol., 16:2825-2833 (1998))、そして、６０％近くの従来のリツキシマブ反応患者は、リツキシマブによる再治療から利益を受けなくなる(獲得抵抗性) (Davis et al., J Clin Oncol., 18:3135-3143 (2000))ことが報告されている。リツキシマブ耐性のこれらの様式が、悪性のＢ細胞の適応性の性質によるものであるのか、又は障害された宿主の免疫エフェクターメカニズムによるものであるのかは不明である。
Bello and Sotomayor, Hematology, 1:233-242 (2007)は、腫瘍及び宿主が関連するメカニズムに関する文献を検討及び調査し、リツキシマブ耐性を説明している。抗ＣＤ２０療法に対するこれらの障害を克服するために治療的方策を提案する際、彼らはＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１、オファツムマブおよびベルツズマブを含むモノクローナル抗体の新規な生成に取り組んでいおり、これらの開発により抗ＣＤ２０モノクローナル抗体療法の使用の普及に拍車がかけられた。
【００１３】
リツキシマブ抵抗性のリンパ腫(例えばＢ細胞リンパ腫および無痛性のＮＨＬ)を記載している他の文献には、米国公開特許２００５／００２５７６４ (Watkins et al.)；米国公開特許２００５／０２０２０２３ (Ledbetter et al.)；米国公開特許２００６／０２４６００４(Lowman)；米国特許第６４５５０４３号；米国公開特許２００３／００２６８０４；米国公開特許２００３／０２０６９０３ (last three Grillo-Lopez)；米国公開特許２００４／０１９２９００ (Kunz et al.)；国際公開２００６／０９４１９２ (Goldenberg et al.)；米国公開特許２００７／００５９３０６および国際公開２００７／１４２７８ (Grosmaire et al.)；及び国際公開２００７／１４２３８(Bruge)が含まれる。Fleischmann R. et al. "Safety and Efficacy in Rheumatoid Arthritis (RA) Patients (Pts) Treated With Rituximab who develop Human Anti-Chimeric Antibodies (HACA)" (ACR Late Breaker Abstract 2007)は、Ｂ細胞枯渇に干渉するように見えた高力価抗リツキシマブ抗体(ＨＡＣＡ)を引き起こしている少数のＲＡ患者を報告している。
リツキシマブによる治療に耐性であるか、抵抗性であるか又は反応しない患者におけるＲＡ及び関節障害を治療するための有効な手段が求められている。
【発明の概要】
【００１４】
したがって、本発明は、リツキシマブに応答しないＲＡおよび関節損傷患者を治療するための手段を提供する。本発明は特許請求の範囲の通りである。
一態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない関節リウマチ(ＲＡ)患者の治療方法であって、ＲＡを治療するために有効な量の抗ＣＤ２０抗体を患者に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体が、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ；(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ；(３)配列番号：１１を含む免疫製薬；(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体；又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である方法を提供する。
【００１５】
他の態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない関節リウマチ(ＲＡ)患者の治療方法であって、ＲＡを治療するために有効な量の抗ＣＤ２０抗体を患者に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体が、(１)それぞれ配列番号：２及び４、又はそれぞれ配列番号：２及び５の軽鎖及び重鎖の可変領域を有するオファツムマブ；(２)それぞれ配列番号：７及び８、又はそれぞれ配列番号：７及び９の軽鎖及び重鎖の可変領域を有するベルツズマブ；(３)配列番号：１１を有する免疫製薬；(４)それぞれ配列番号：１３及び１５の軽鎖及び重鎖の可変領域を有するか、又はそれぞれ配列番号：１７及び１８の軽鎖及び重鎖の可変領域を有するか、又は配列番号：１９を有するＣＤ２０結合抗体；又は(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、それぞれ配列番号：２１及び２３の軽鎖及び重鎖の可変領域を有する、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である方法を提供する。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない関節リウマチ患者を治療するための薬学的組成物の製造における、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ；(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ；(３)配列番号：１１を含む免疫製薬；(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体；又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である抗体の使用に関する。
【００１７】
一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブである。最も好ましくは、オファツムマブは配列番号：４の可変重鎖アミノ酸配列を含む。あるいは、配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブである。ある特定の態様では、ベルツズマブは配列番号：８の可変重鎖アミノ酸配列を含む。他の特定の態様では、ベルツズマブは配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、抗ＣＤ２０抗体は免疫製薬(すなわちＴＲＵ-０１５)である。
なお更なる実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、配列番号：１３及び１５、又は配列番号：１７及び１８、又は配列番号：１９を含むＣＤ２０-結合抗体である。一態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含む。他の態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含む。更なる態様では、ＣＤ２０-結合抗体は配列番号：１９を含む。
【００１８】
第５の一般的な実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である。
好適な態様では、抗ＣＤ２０抗体は細胞障害性剤とコンジュゲートしていない。
他の好適な態様では、抗ＣＤ２０抗体は静脈内に又は皮下に投与される。特定の態様では皮下に投与される。
他の好適な実施態様では、抗ＣＤ２０抗体の有効量により、圧痛又は腫脹関節の数を評価するか、患者の包括的な臨床評価を実行するか、赤血球沈降速度を評価するか、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価するか、または、疾患活動性の複合計測を使用することによって定まる臨床状態の改善が生じる。
例えば、臨床パラメータに応じて、抗ＣＤ２０抗体は、重量に基づくか一定の用量で投与される。一定用量が好まれる。一定用量の好適な態様では、抗ＣＤ２０抗体は、およそ５０から４０００ｍｇ、より好ましくはおよそ７５から３０００ｍｇ、より好ましくはおよそ１００から２０００ｍｇ、より好ましくはおよそ１００から１０００ｍｇ、更により好ましくはおよそ１５０から１０００ｍｇ、更により好ましくはおよそ２００から１０００ｍｇの用量で投与され、そして最も好ましくは、用量はおよそ２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ又は２０００ｍｇである。  
他の好適な実施態様では、抗体は、およそ１か月の期間以内で１〜４の用量の頻度で投与される。他の好適な態様では、抗体は２〜３の用量で投与される。なお更なる態様では、抗体はおよそ２〜３週の期間内に投与される。
【００１９】
他の態様では、方法は更に、有効量の一又は複数の第二医薬を抗体と共に投与することを含み、このとき該抗体は第一医薬である。第二医薬は１つの医薬又は複数の医薬である。第二医薬は、免疫抑制因子、ＤＭＡＲＤ、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、疼痛制御薬剤、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はその組合せであるのが望ましい。
一態様では、第二医薬はＤＭＡＲＤであり、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、注射用ゴールド、経口用ゴールド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシンおよびメトトレキセート(ＭＴＸ)からなる群から選択されるのが好ましい。
他の態様では、第二医薬はＮＳＡＩＤであり、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンからなる群から選択されるのが好ましい。
更なる態様では、第二医薬は、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される免疫抑制因子である。
【００２０】
なお更なる態様では、第二医薬は、抗α４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット(kinaret)、エファリズマブ、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＮＦκＢリガンドの抗レセプター活性化因子(抗ＲＡＮＫＬ)、ＮＦκＢ-Ｆｃの抗レセプター活性化因子(ＲＡＮＫ-Ｆｃ)、パミドロン酸、アレンドロネート、アクトネル、ゾレンドロネート、リツキシマブ、２Ｈ７抗体、クロドロネート、ＭＴＸ、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、スルファサラジン(ＳＳＺ)、プレドニソロン、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンからなる群から選択される。
さらに他の態様では、第二医薬は、インフリキシマブ、ＭＴＸ、ＭＴＸとインフリキシマブとの組合せ、エタネルセプト、副腎皮質ステロイド、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、ＭＴＸおよびＳＳＺとプレドニソロンとの組合せ、ＳＳＺおよびＨＣＱとＭＴＸとの組合せ、アザチオプリンおよびＨＣＱとシクロホスファミドとの組合せ、およびＭＴＸとアダリムマブとの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、副腎皮質ステロイドは、プレドニゾン、プレドニソロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコーチゾン又はデキサメサゾンである。
最も好適な第二医薬はＭＴＸである。ＭＴＸは、経口的に、または、非経口的に投与されるのが好ましい。
【００２１】
本明細書中の方法の他の好適な態様では、患者は、一又は複数の抗腫瘍壊死因子-α阻害薬に十分に反応しない。このような方法において、抗体は、好ましくは単回用量としてか又は２回用量、より好ましくは各々およそ２００ｍｇから１０００ｍｇの用量で投与される。更により好ましくは、用量は、好ましくは静脈内又は皮下に、治療の開始の１日目と１５日目に、およそ２００ｍｇ×２、およそ３００ｍｇ×２、およそ５００ｍｇ×２、およそ７００ｍｇ×２、又はおよそ１０００ｍｇ×２である。
他の好ましい実施態様では、ＲＡは早期ＲＡ又は初発ＲＡである。
更なる態様では、方法は更に、有効量の抗ＣＤ２０抗体を患者に投与することによって患者を再治療することを含む。好ましくは、再治療は、抗体の第一投与の少なくともおよそ２４週後に開始される。他の実施態様では、更なる再治療は、抗ＣＤ２０抗体の第二投与の少なくともおよそ２４週後に開始されるのが好ましい。
好ましくは、関節損傷は再治療の後に軽減され、および／または、再治療前の患者に臨床状態の改善が観察される。好ましくは、このような臨床状態の改善は、圧痛又は腫脹関節の数を評価するか、患者の包括的な臨床評価を実行するか、赤血球沈降速度を評価するか、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価するか、または、疾患活動性の複合計測を使用することによって決定される。
【００２２】
他の態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない被検体の関節損傷の治療方法であって、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ；(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ；(３)配列番号：１１を含む免疫製薬；(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体；又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含むヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である抗ＣＤ２０抗体を被検体に投与することを含み、このとき抗ＣＤ２０抗体の量が関節損傷の軽減を達成するために有効である。
【００２３】
他の態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない被検体の関節損傷を治療するための薬学的組成物の製造における、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ；(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ；(３)配列番号：１１を含む免疫製薬；(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体；又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である抗体の使用に関する。
【００２４】
この方法では、好ましくは、Ｘ線検査を用いて、関節損傷軽減の範囲を決定する。この試験は、好ましくは、抗ＣＤ２０抗体の投与後少なくともおよそ１か月に、より好ましくは抗体の投与後の少なくともおよそ２か月に実施される。
特定の態様では、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブ、又はベルツズマブ、又は免疫製剤、配列番号：１３と１５又は配列番号：１７と１８又は配列番号：１９を含むＣＤ２０結合抗体、又はヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である。
より好ましくは、オファツムマブは、配列番号：４の可変重鎖アミノ酸配列を含む。あるいは、配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ベルツズマブは配列番号：８の可変重鎖アミノ酸配列を含む。他の特定の態様では、ベルツズマブは配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含む。一態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含む。他の態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含む。更なる態様では、ＣＤ２０-結合抗体は配列番号：１９を含む。
【００２５】
好ましくは、関節損傷治療方法は更に、有効量の一又は複数の第二医薬を抗ＣＤ２０抗体と共に投与することを含み、このとき該抗ＣＤ２０抗体は第一医薬である。第二医薬は複数の医薬であってもよい。第二医薬は、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はその組合せであるのが好ましい。
なお更なる実施態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体又はその薬学的に許容される組成物の広告方法であって、対象とする視聴者に、(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ；(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ；(３)配列番号：１１を含む免疫製薬；(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体；又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である抗体、又はその製薬組成物の、リツキシマブに反応しない関節リウマチ患者を治療するための使用を促すことを含む方法を提供する。
【００２６】
また、本明細書中の本発明は、リツキシマブに反応しないＲＡ又は関節損傷患者における骨又は軟組織の関節損傷の治療のモニター方法であって、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の有効量を被検体に投与し、その投与の少なくともおよそ３か月後、好ましくはおよそ２４週間後にＭＲＩ又はＸ線検査といった画像技術によって、骨又は軟組織の関節損傷が投与前の基準より低減したか否かを測定することを含み、このとき治療後の被検体において基準よりも低減している場合に該抗ＣＤ２０抗体が関節損傷に対して有効であることが示される方法も考慮される。好ましくは、基準に対する低減の程度は、抗ＣＤ２０抗体の投与後の二度目に計量される。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない骨又は軟組織関節損傷を有する被検体に対して本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の投与を継続するべきか否かを決定する方法であって、初回の抗ＣＤ２０抗体の投与後にＸ線検査及び／又はＭＲＩといった画像技術を用いて、被検体における関節損傷の低減を測定し、２回目の抗ＣＤ２０抗体の投与後にＸ線検査及び／又はＭＲＩといった画像技術を用いて、被検体における関節損傷の低減を測定し、１回目と２回目の被検体の画像所見を比較し、そしてスコアが１回目のときよりも２回目に低い場合には、抗ＣＤ２０抗体の投与を継続することを含む方法を提供する。 
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「Ｂ細胞」は骨髄内で成熟するリンパ球であり、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、又はエフェクターＢ細胞(プラズマ細胞)などがある。本明細書中のＢ細胞は正常又は非悪性のＢ細胞でもよい。  
「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を伴う悪性腫瘍である。例として、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むホジキン病；ＮＨＬ；濾胞性中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；形質細胞様リンパ球性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；エイズ又はＨＩＶ関連のリンパ腫；多発性骨髄腫；中枢神経系(ＣＮＳ)リンパ腫；移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(リンパ形質細胞性リンパ腫)；粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫；及び周辺帯リンパ腫／白血病などがある。
「ＣＤ２０」抗原又は「ＣＤ２０」は、末梢血又はリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％以上の表面にみられるおよそ３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞だけでなく悪性のＢ細胞上にも存在し、幹細胞には発現しない。ＣＤ２０を意味する文献中での他の名称には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」などがある。ＣＤ２０抗原は、例としてClark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:1766 (1985)に記載されている。好適なＣＤ２０抗原はヒトＣＤ２０である。
【００２９】
本明細書中の「抗体」は最も広義に用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２のインタクトな抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を表す限りにおける抗体断片を包含する。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５％を超える抗体、ある実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３０】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００３１】
本明細書中で用いられる「抗ＣＤ２０抗体」は、(１) リツキシマブとは異なるＣＤ２０エピトープに結合するＩｇＧ１κヒトＭＡｂである、オファツムマブ(ＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ)；(２) マウス起源の相補性決定領域(ＣＤＲ)と、エピラツズマブ(ヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ１抗体)に同一なヒトフレームワーク領域の９０％を有するヒト化操作抗体である、ベルツズマブ(ＩＭＭＵＮ-１０６ＴＭ又はｈＡ２０)；(３) 配列番号：１１を有する小さい、モジュラー免疫薬剤(ＳＭＩＰ)(本明細書中では、免疫薬剤と称する)(別名ＴＲＵ-０１５)；(４) 配列番号：１３および１５(Lilly AME 33)又は配列番号：１７および１８(Lilly AME 133)又は配列番号：１９(Lilly AME 133v、ＬＹ２４６９２９８としても知られる、Ｆｃ ＲＩＩＩａ(ＣＤ１６)に対して結合親和性が増加している)を含む抗体である、ＣＤ２０結合分子；そして、(５) グリコ操作されたＦｃ部位(Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物)とエルボーヒンジとを有する、アイソタイプＩｇＧ１のヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体(ＧＡ１０１としても知られる)を指す。完全長又はその可変領域配列を含むこれらの抗体の全ては、以下及び記した文献に更に記載されている。
【００３２】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣへの抗体の関与を示す。
【００３３】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
【００３４】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
本明細書中の「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００３５】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００３６】
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３７】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００３８】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
【００３９】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
【００４０】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また例としてVaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；米国特許第6982321号及び同第7087409号も参照のこと。
【００４１】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【００４２】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)であるＨＶＲは配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(上掲のKabat et al.)。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット    ＡｂＭ      Chothia     接触
L1      L24-L34     L24-L34     L26-L32     L30-L36
L2      L50-L56     L50-L56     L50-L52     L46-L55
L3      L89-L97     L89-L97     L91-L96     L89-L96
H1      H31-H35B    H26-H35B    H26-H32     H30-H35B  (カバット番号付け)
H1      H31-H35     H26-H35     H26-H32     H30-H35   (Chothia番号付け)
H2      H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58
H3      H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101
【００４３】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら拡大ＨＶＲの各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４４】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる表現及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００４５】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順により生産されてよい。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例としてBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００４６】
「増殖阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を妨げるか又は低減するものである。例えば、抗体は、インビトロおよび／またはインビボのＢ細胞の増殖を妨げる又は低減しうる。
「アポトーシスを誘発する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス性本体と呼ばれる)といった、標準的なアポトーシスアッセイにより決定される、例えばＢ細胞のプログラムされた細胞死を誘発するものである。
【００４７】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
【００４８】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat et al.のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中の定義に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
【００４９】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の配列同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【００５０】
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合集団を包含しうる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 例としてRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。
【００５１】
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)：国際公開２００４／９２２１９(Hinton et al.)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００５２】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００５３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００５４】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更して(変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド)Ｃ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、例として米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００５５】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に結合親和性を測定するための具体的な例示的実施態様を記載する。
【００５６】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する(例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、マイクロタイタープレート(DYNEX Technologies, Inc.)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレートに、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをTopcountＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
【００５７】
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に低減する」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
【００５８】
本明細書中の「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝的に操作したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、米国特許第５７３６１３７号に記載の「Ｃ２Ｂ８」を表すものであり、ＣＤ２０を結合する能力を有するその断片を含む。
単に本明細書中の目的のため、また特に明記しない限り、「２Ｈ７」又は「２Ｈ７抗体」は、後述する、及び／又は米国公開特許２００６／００３４８３５および国際公開２００４／０５６３１２(いずれもLowman et al.)；米国公開特許２００６／０１８８４９５ ( Barron et al.)；及び米国公開特許２００６／０２４６００４ (Adams et al.)に記載される配列を有するヒト化抗ＣＤ２０抗体を指す。簡単にいうと、マウス抗ヒトＣＤ２０抗体のヒト化、２Ｈ７(ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ)を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス２Ｈ７抗体可変領域配列とマウスＶとヒトＣのキメラ２Ｈ７は、例えば米国特許第５８４６８１８号及び同第６２０４０２３号に記載されている。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列(米国特許第５８４６８１８号に開示)を既知の抗体の配列と比較することにより同定された(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ed. 5 (Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991))。軽鎖と重鎖のＣＤＲは配列高頻度可変性(上掲のKabat et al.)に基づいて定まる。合成オリゴヌクレオチドを用いて、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)）を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶκＩ,ＶＨＩＩＩ(ＶＬカッパサブグループＩ，ＶＨサブグループＩＩＩ)に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ ＣＤＲ領域を導入した(国際公開２００４／０５６３１２の図２を参照)。さらに、Ｖ領域(ＣＤＲおよび／またはＦＲ)の修飾は、部位特異的突然変異によってファジミドｐＶＸ４に施された。キメラ２Ｈ７ Ｆａｂ並びにヒト化Ｆａｂバージョン２〜６のＶＬ及びＶＨドメインを、哺乳動物の細胞発現のための既に記載されている(Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech., 2:3-10 (1990))ｐＲＫベクターにサブクローニングすることによって、完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドを構築した。
【００５９】
以下の２Ｈ７抗体は、本明細書中の定義に含まれる。
(1) ＶＬ配列：
2011507897.tif 000002
及びＶＨ配列：
2011507897.tif 000003
を含むヒト化抗体。
【００６０】
(2) ＶＬ配列：
2011507897.tif 000004
及びＶＨ配列：
2011507897.tif 000005
を含むヒト化抗体。
【００６１】
(3) ＶＬ配列：
2011507897.tif 000006
及びＶＨ配列：
2011507897.tif 000007
を含むヒト化抗体。
【００６２】
(4) 配列番号：２９の配列を有する完全長軽(Ｌ)鎖と、配列番号：３０、配列番号：３１又は配列番号：３８のうちの１の配列を有する完全長重(Ｈ)鎖とを含むヒト化抗体。配列は以下に示す。
【００６３】
(5) 配列番号：３２の配列を有する完全長軽(Ｌ)鎖と、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６又は配列番号：３７のうちの１の配列を有する完全長重(Ｈ)鎖とを含むヒト化抗体。配列は以下に示す。
配列番号：２９： 
2011507897.tif 000008
配列番号：３０：
2011507897.tif 000009
配列番号：３１：
2011507897.tif 000010
【００６４】
配列番号：３２：
2011507897.tif 000011
配列番号：３３：
2011507897.tif 000012
配列番号：３４：
2011507897.tif 000013
【００６５】
配列番号：３５：
2011507897.tif 000014
配列番号：３６：
2011507897.tif 000015
【００６６】
配列番号：３７：
2011507897.tif 000016
配列番号：３８：
2011507897.tif 000017
【００６７】
マウスの抗ヒトＣＤ２０抗体であるｍ２Ｈ７は、以下の可変領域配列を含む。 
ＶＬ配列： 
2011507897.tif 000018
ＶＨ配列： 
2011507897.tif 000019
【００６８】
Ｆｃ領域を含む抗ＣＤ２０抗体において、Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うところの残基４４７)は、例えば、抗体の精製中に、または、抗体ポリペプチドをコードする核酸の組換え操作によって取り除かれてもよい。例えば、ｈＡ２０は、Ｋ４４７残基を含むＦｃ領域又はすべてのＫ４４７残基が除去されたＦｃ領域、又はＫ４４７残基を有するＦｃ領域と有さないＦｃ領域を有する抗体の混合を含みうる。
一実施態様では、本明細書中で有用な抗ＣＤ２０抗体は更に、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変化を含み、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくともおよそ６０倍、好ましくは少なくともおよそ７０倍、より好ましくは少なくともおよそ８０倍、より好ましくは少なくともおよそ１００倍、より好ましくは少なくともおよそ１２５倍、最もより好ましくは少なくともおよそ１５０倍からおよそ１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
ＩｇＧ中のＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にある。本明細書中の治療方法における使用のための、Ｆｃ領域を有する本明細書中の何れかの望ましい抗ＣＤ２０抗体の組成物も包含され、ここで組成物中の抗体の約８０〜１００％(好ましくは約９０〜９９％)は糖タンパク質のＦｃ領域に結合したフコースを欠くか、又はフコース含量が減少している成熟コア糖鎖構造を含む。
【００６９】
治療のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭のおよび家畜用動物、および動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、などを含む哺乳類として分類される何れかの動物を指す。哺乳動物はヒトであることが望ましい。
「有効量」なる表現は、ＲＡ又は関節損傷を治療するために有効である医薬の量を指す。これには、例えばＸ線検査又は他の試験によって決定されるように、ある量の投与の前の基準値と比較してＲＡ又は関節損傷の低減が達成されるために有効である量が含まれるであろう。第二医薬の有効量は、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体と協働してＲＡ又は関節損傷を治療するために与えられるだけでなく、付随するないしは原因となる疾患又は障害などの、ＲＡ又は関節損傷に付随する症状や他の状態又は副作用を含む望ましくない効果を治療するために与えられてよい。
【００７０】
本明細書中で用いる「関節リウマチ」又は「ＲＡ」は、ＲＡの分類のために２０００年に改訂された米国リウマチ協会判定基準又は任意の類似の判定基準に従って診断されうる認識された疾患状態を指す。この用語には、以下に定義するように活性及び早期ＲＡだけでなく初発のＲＡも含まれる。ＲＡの生理学的指標は対称性の関節腫脹を含み、この腫脹は関節リウマチに不変ではないが特徴的である。手の近位指節間(ＰＩＰ)関節だけでなく中手指節間関節(ＭＣＰ)の紡錘形腫脹、手首、肘、膝、足首および中足指節間(ＭＴＰ)関節が共通して罹患し、腫脹は容易に検出される。受動運動に対する痛みは、関節炎症について最も感度が高い検査であり、炎症および構造的な奇形により罹患した関節の関節可動域が制限されることが多い。代表的な視覚的変化には、ＭＣＰおよびＰＩＰ関節のＭＣＰ関節、過伸展又は過屈曲にある指の尺骨の偏差、肘の屈曲拘縮、および手根骨および足指の亜脱臼が含まれる。リツキシマブに耐性があることに加えて、ＲＡを有する被検体は、症状の治療に際してＤＭＡＲＤが有効でないか十分に有効でないという点で、ＤＭＡＲＤに耐性があるかもしれず、又、毒性ないしは不十分な有効性のために、ＴＮＦインヒビター、例えばエタネルセプト、インフリキシマブ及び／又はアダリムマブによる以前ないしは現在の治療(例えば、週２回２５ｍｇ、３か月間のエタネルセプト、又は３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブの少なくとも４回の注入)に対して不十分な反応を示してもよい。
【００７１】
「活動性の関節リウマチ」患者は、ＲＡの活動的であり、潜在的でない症状を有する患者を意味する。「早期活動性の関節リウマチ」を有する被検体は、１９８７年に改訂されたＲＡの分類のためのＡＣＲ判定基準に従って、少なくとも８週間、４年以下の間診断された活動性ＲＡ被検体である。
「早期関節リウマチ」を有する被検体は、１９８７年に改訂されたＲＡの分類のためのＡＣＲ判定基準に従って、少なくとも８週間、４年以下の間診断されたＲＡ被検体である。ＲＡには、例えば、若年性発症ＲＡ、若年性突発性の関節炎(ＪＩＡ)又は若年性ＲＡ(ＪＲＡ)が含まれる。
「初発(incipient)ＲＡ」患者は、ＲＡの診断のためのＡＣＲ判定基準を十分に満たしていない早期多発性関節炎を有する。初発ＲＡ患者には、多発性関節炎が存在するが、ＲＡと診断されてはおらず、公式のＡＣＲ判定基準ＲＡを進行させ続ける高いリスクにある(９５％の確率)、抗環状シトルリン化ペプチド(抗ＣＣＰ)抗体がポジティブである患者が含まれる。
【００７２】
「関節損傷」は広義の意味で用いられ、結合組織および軟骨を含む一又は複数の関節のいずれか一部への損傷又は部分的ないしは完全な破壊を指し、この損傷には、何らかの原因による構造的および／または機能的損傷が含まれ、そして、関節痛／arthalgiaが生じる場合もあるし生じない場合もある。限定するものではないが、関節損傷には、炎症関節疾患並びに非炎症性関節疾患に伴う関節損傷、又は炎症関節疾患並びに非炎症性関節疾患から生じる関節損傷が含まれる。この損傷は、何か状態も、例えば自己免疫性疾患、特に関節炎および最も特にＲＡによって生じてもよい。例示的な前記症状には、急性及び慢性の関節炎、若年性発症ＲＡ、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)又は若年性ＲＡ(ＪＲＡ)を含むＲＡ、および関節リウマチ滑膜炎などの段階、痛風又は痛風の関節炎、急性の免疫学的な関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、タイプＩＩコラーゲン誘導性関節炎、感染性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、慢性関節炎progrediente、変形性関節炎、慢性多発性関節炎primaria、反応性関節炎、更年期性関節炎、エストロゲン-枯渇関節炎、及び強直性脊椎炎／リウマチ様脊椎炎、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫性疾患、およびＲＡに伴う有意な全身併発(血管炎、肺線維形成又はフェルティー症候群を含む)が含まれる。本明細書中において、関節は、関節を囲み支持する部位を有する(動物などの脊椎動物の)骨格の構成成分間の接点であって、限定するものではないが、例えば、腰部、脊椎の脊柱間の関節、脊椎と骨盤(仙腸関節)間の関節、腱および靭帯が骨に付着する関節、肋骨と脊椎間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足首および足指が含まれるが、特に手および足の関節を含む。
【００７３】
本明細書中の「自己免疫性疾患」は、個体の自己組織ないしは臓器又は同時分離したものに対する及びそれらから生じる疾患又は症状、又はその徴候又は結果として生じるその症状である。これら多くの自己免疫性及び炎症性疾患において、多くの臨床用及び研究用のマーカーが存在してもよく、限定するものではないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原−抗体複合体蓄積、副腎皮質ステロイド又は免疫抑制性治療の利点、及び、影響を受けた組織中のリンパ系細胞の凝集塊が含まれうる。Ｂ細胞が媒介する自己免疫性疾患に関して何か一つの理論に限定されるものではないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状及びＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、及び病巣への異所性新リンパ形成を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。各々のこれらの経路は、自己免疫性疾患の病状の程度の違いに寄与しうる。
【００７４】
「自己免疫性疾患」は、臓器特異的疾患(すなわち、免疫応答が、内分泌系、造血系、皮膚、循環器系、胃腸及び肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などといった臓器系に対して特異的である)又は、複数の臓器系に影響しうる全身性疾患(例えば全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、関節リウマチ、多発性筋炎など)でありうる。好ましい前記疾患には、自己免疫性リウマチ学疾患(例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬の関節炎など)、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患(例えば、炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病)、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、及び小児脂肪便病など)、血管炎(例えば、チャング-シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症及び顕微鏡的多発血管炎を含むＡＮＣＡ-ネガティブ血管炎及びＡＮＣＡ-関連血管炎)、自己免疫性神経学的疾患(例えば、多発性硬化症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発性神経炎など)、腎臓疾患(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルガー病など)、自己免疫性皮膚科疾患(例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、及び皮膚紅班性狼瘡など)、血液系疾患(例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病、及び自己免疫溶血性貧血など)、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例えば、内耳疾患及び聴力障害など)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫性内分泌系疾患(例えば、インスリン依存型糖尿病(ＩＤＤＭ)などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患(例えばグレーブス病及び甲状腺炎)など)が含まれる。より好ましい前記疾患には、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が含まれる。
【００７５】
本明細書中の被検体の「治療」は、治療的処置および予防又は防止的な手段を指す。治療を必要とするものには、ＲＡ又は関節損傷を既に有するものだけでなくＲＡ又は関節損傷ないしはＲＡ又は関節損傷の進行が予防されるべきであるものが含まれる。したがって、被検体は、ＲＡ又は関節損傷があると診断されていてもよく、又はＲＡ又は関節損傷の素因があるないしは罹りやすくてもよく、又はおそらく治療をしなかった場合に進行するＲＡ又は関節損傷を有していてもよい。ＲＡ又は関節損傷が軽減されるかまたは治癒される、あるいは、兆候及び症状及び構造的な損傷を含めＲＡ又は関節損傷の進行が投与前の被検体の状態と比較して停止するか緩徐化する場合、治療は本明細書において成功している。
成功した治療には更に、ＲＡの、または、関節又は構造上の損傷の発達の完全もしくは部分的な防止が含まれる。本明細書中の目的では、ＲＡ又は関節損傷ないしは関節損傷の進行の緩徐化や低減は、ＲＡ又は関節損傷の静止、減少又は逆反応と同様である。方法におけるＲＡの治療の有効性は、例えば、ＲＡ患者のＡＣＲおよび／または関節リウマチに対するヨーロッパ連盟(ＥＵＬＡＲ)臨床効果パラメーターを用いて、または、患者のＲＡの程度の分子的要因をアッセイすることによって測定されてもよい。
臨床医は、当該分野で既知の任意のいくつかの方法を使用して、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の特定の投与計画の有効性を測定しうる。例えば、Ｘ線技術を使用し、患者における関節破壊及び損傷の程度を決定することができ、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、及びＡＣＲ７０のスケールを使用し、治療に対する相対的有効反応性を決定することができる。最適な所望する反応(例えば治療反応)が得られるように、投与計画は調節しうる。例えば、一回で投与されてもよく、時間をかけて、数回に分けて投与されてもよく、又は治療状況の危急に応じて、比例的に投与量を増加又は低減してもよい。
【００７６】
本明細書中の抗ＣＤ２０抗体による治療に対する、患者の「有効な反応(応答)」又は患者の「反応性」及び類似の言い回しは、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体を有する治療から、または、その治療の結果として、リツキシマブに反応しないＲＡ患者に与えられる臨床上又は治療上の利点を指す。このような利点には、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体による治療から、または、その治療の結果として、患者の後の再発との、細胞性又は生物学的応答、完全寛解、部分的な応答、疾患の安定(進行又は再発がない)又は応答が含まれる。例えば、有効な応答は患者のＡＣＲ５０の上昇であってもよい。
【００７７】
本明細書中の「被検体」は、例えば新たに診断されたか既に診断されているかにかかわらず、ＲＡ又は関節損傷の一又は複数の兆候、症状又は他の指標を表すか、表した被検体、及びリツキシマブ治療から再発又は逆戻りなどの反応していない被検体など、治療に望ましい、患者を含む任意の単独のヒト被検体である。臨床研究試験に従事する任意の被検体も、被検体として包含される。被検体は、本明細書中の治療が開始されるときに用いられる第二医薬に対してナイーブであってもよい。すなわち、例えば「基準値の」(すなわち、治療が開始される前に被検体をスクリーニングする日などの、本明細書中の治療方法における一の抗ＣＤ２０抗体の初回用量の投与前のときのある時点での)メトトレキセート(ＭＴＸ)といった免疫抑制剤によって既に治療されていなくてよい。このような「ナイーブ」被検体は一般に、第二医薬による治療の候補であるとみなされる。
【００７８】
「臨床上の改善」とは、ＲＡ又は関節損傷のさらなる進行の予防、または、Ｘ線検査を含む様々な検査によって測定されるときの処置の結果としてのＲＡ又は関節損傷の任意の改善のことをいう。従って、臨床上の改善は、例えば、疼痛又は腫脹のある関節数、乾癬評価重篤度指標（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）、被検体の全般的な臨床上の評価、赤血球沈降速度、または、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価することによって測定され得る。
本明細書中の目的で、被検体が、ＲＡ又は活性な関節損傷の症状、例えば、本明細書中において開示される方法によって検出可能な症状を有さず、かつ、基準値または処置中のある特定の時点において評価されるときにＲＡ又は関節損傷が進行していない場合に、その被検体は「緩解」状態である。緩解状態ではない被検体としては、例えば、ＲＡ又は関節損傷が悪化または進行している被検体が挙げられる。活性なＲＡ又は関節損傷を含む症状が戻っているような被検体は、「再燃」した被検体または「再発」した被検体である。
【００７９】
リツキシマブ(又は本明細書中において前述したような応答しない他の薬剤)に対する被検体又は患者の反応を指すときの「応答しない(反応しない)」なる表現は、リツキシマブ(又は他の薬剤)の投与によりＲＡの治療の何らか又は十分な兆候を表さなかった、又はリツキシマブ(又は他の薬剤)に対して臨床上許容できないほどの高い程度の毒性を表わした、又はリツキシマブ(又は他の薬剤)の初回の投与の後に治療の兆候を維持しなかった被検体又は患者を表わす。ここで「治療」なる言葉は本明細書中で定義される文脈で用いられる。「応答しない」というフレーズには、既に投与されたリツキシマブ(又は他の薬剤)に対して耐性がある及び／又は不応性である被検体の記載、そして被検体又は患者が投与されているリツキシマブ(又は他の薬剤)を摂取しているにもかかわらず進行する状況、そして被検体又は患者がもはや応答しないリツキシマブを伴う投薬計画を実施した後６か月(より好ましくは６か月)以内に進行した状況が含まれる。
そして、リツキシマブ(または、他の薬剤)に対して「応答しない(反応しない)」には、過去又は現在の治療後にも活動性の疾患が続いている被検体が含まれる。例えば、患者は、患者が反応しないリツキシマブ(又は他の薬剤)によるおよそ１〜３か月の治療の後に、活動中の疾患を有してもよい。このような反応性は、問題の疾患を治療することに熟練した臨床医によって評価されてもよい。また、「反応しない」なる記述は、第一ラウンドリツキシマブ(又は他の薬剤)には反応したが再治療投薬計画における該薬剤の第二又は後のクールに反応しない応答者を指す。一次臨床エンドポイントには反応するが、二次エンドポイントには反応しない二次不応答者も包含される。Ｂ細胞を減少させたが、例えばリツキシマブ治療に反応しない患者、並びにＢ細胞を減少させなかった患者も包含される。また、例えば第２４週又はそれよりも後の週にＡＣＲ反応のおよそ２０％未満の改善を示す患者も包含される。
【００８０】
医薬(一又は複数)に対して不応答である場合、過去又は現在の一又は複数の医薬(ＴＮＦαインヒビターなど)による治療から臨床上許容できないほどの高いレベルの毒性を体験する被検体が、例えば血清に対する酵素結合免疫吸着アッセイ(Prometheus Laboratories, San Diego, CA) (例としてBaert et al., N Engl J Med, 348:601-608 (2003)を参照)など、文献における標準的な検査によって決定されるところの、例えば自己抗体及びヒト抗キメラ抗体(ＨＡＣＡ)の発達を含む免疫反応などの熟練した臨床医が有意であるとみなす一又は複数の副作用ないしは関連の有害事象、重症感染症、鬱血性心不全、髄鞘脱落(ＭＳに至る)、有意な過敏症、神経病理学的現象、高い程度の自己免疫状態、子宮体癌のような癌、ＮＨＬ、結核、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、メラノーマなどを体験する。
ＲＡ又は関節損傷の「症状」は、被検体が経験し、そして、圧痛又は腫脹のある関節をはじめとした上で述べたものなどのＲＡ又は関節損傷を表する、任意の病的徴候または構造、機能もしくは感覚における正常からの逸脱である。
「改変Ｓｈａｒｐ総合スコア」とは、Genant, Am. J. Med., 30: 35-47 (1983)によって改変されたＳｈａｒｐに従った方法を用いたＸ線写真の評価のために得たスコアのことを意味する。主な評価は、スクリーニングからのＳｈａｒｐ−Ｇｅｎａｎｔ総合スコアの変化である。Ｓｈａｒｐ−Ｇｅｎａｎｔスコアは、手と肢の両方の糜爛スコアと関節腔狭小化スコアとを組み合わせたものである。関節損傷は、基準値(本明細書中において抗ＣＤ２０抗体の１回目の投与の前に患者をスクリーニングするか、または試験するとき)におけるスコアより小さいという変化による試験スコア付けにおいて判断される。
【００８１】
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害又は阻止、及び／又は細胞の破壊をもたらす物質を表す。この用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【００８２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANTM)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロラムブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；他の抗生物質、例えばアクラシノマイシン(aclacinomycin)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン；６-チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；XELODA(登録商標)(カペシタビン)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラミシン類；カペシタビン；及び上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００８３】
補助治療について本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；ＮＳＡＩＤ；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイドアナログ、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ＳＯＬＵ-ＭＥＤＲＯＬ(登録商標)琥珀酸メチルプレドニゾロンナトリウムなど、及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；抗マラリア剤、例えばクロロキンおよびヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインアンタゴニスト、例えば、抗インターフェロン-α、-β、又は-γ抗体、抗ＴＮＦ-α抗体(インフリキシマブ(ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標))又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗ＴＮＦ-β抗体、抗インターロイキン-２(ＩＬ-２)抗体および抗ＩＬ-２レセプター抗体、及び抗ＩＬ-６レセプター抗体及びアンタゴニスト(例えばＡＣＴＥＭＲＡＴＭ(トシリズマブ))を含むサイトカイン抗体ないしはサイトカインレセプター抗体；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(国際公開１９９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；形質転換増殖因子-β(ＴＧＦ-β)；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；クロランブシル；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen et al.、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；ＢＡＦＦ抗体及びＢＲ３抗体などのＢＡＦＦアンタゴニスト及びｚＴＮＦ４アンタゴニスト(概要は、Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)を参照)；ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドに対するブロック抗体(例としてDurie et al., Science, 261: 1328-30 (1993)；Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995))及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ(Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994))を含む、抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)といった、Ｔ細��ヘルパーシグナルを干渉する生物学的な薬剤；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。また、本明細書中のいくつかの免疫抑制剤はＭＴＸなどのＤＭＡＲＤである。本明細書中の好適な免疫抑制剤の例には、シクロホスファミド、クロランブシル、アザチオプリン、レフルノミド、ＭＭＦ又はＭＴＸが含まれる。
【００８４】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１ｂ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、及びＩＬ-１５等のインターロイキン(ＩＬ)、例えば、PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及び白血球阻害因子(ＬＩＦ)及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。「サイトカインアンタゴニスト」は、例えばサイトカインに対する抗体、サイトカインレセプターに対する抗体、及びイムノアドヘシンを含む、任意のメカニズムによってサイトカインを阻害するか又は拮抗する分子である。
【００８５】
「インテグリン」なる用語は、細胞の細胞外基質への結合と応答の両方をさせるレセプタータンパク質であり、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞のホーミング及びアポトーシスなどの様々な細胞性機能に関与するものを表す。これらは細胞-細胞外基質及び細胞間相互作用に関与する細胞接着レセプターの大きなファミリーの一部である。機能的なインテグリンは、α及びβと称する２つの膜貫通性グリコプロテインサブユニットから成り、非共有的に結合している。βサブユニットのように、αサブユニットはすべて互いにいくらかの相同性がある。レセプターは常に１のα鎖及び１のβ鎖を含有する。例として、α６β１、α３β１、α７β１、α４β１などのα４鎖、α４β７および／またはαＥβ７のβ７インテグリンサブユニットなどのβ７鎖、ＬＦＡ-１などがある。本明細書中で用いられる、インテグリンなる用語には、天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列インテグリンの生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。
【００８６】
「インテグリンアンタゴニスト」は、例えばインテグリンに対する抗体を含む、任意のメカニズムによってインテグリンを阻害するか又は拮抗する分子である。本明細書中の「インテグリンアンタゴニスト又は抗体」の例として、ＬＦＡ-１抗体、例としてGenentechから市販のエファリズマブ(RAPTIVA(登録商標))、又は他のＣＤ１１／１１ａ及びＣＤ１８抗体、又はα４インテグリン抗体、例としてBiogenから入手可能なナタリズマブ(ANTEGREN(登録商標))、又は、ジアザサイクリックフェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／８９４１０号)、フェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／７０７０９号、国際公開第２００２／２８８３０号、国際公開第２００２／１６３２９号及び国際公開第２００３／５３９２６号)、フェニルプロピオン酸誘導体(国際公開第２００３／１０１３５号)、エナミン誘導体(国際公開第２００１／７９１７３号)、プロパン酸誘導体(国際公開第２０００／３７４４４号)、アルカノン酸誘導体(国際公開第２０００／３２５７５号)、置換型フェニール誘導体(米国特許第６６７７３３９号及び同第６３４８４６３号)、芳香族アミン誘導体(米国特許第６３６９２２９号)、ＡＤＡＭディスインテグリンドメインポリペプチド(米国公開公報２００２／００４２３６８号)、αｖβ３インテグリンに対する抗体(欧州特許第６３３９４５号)、抗β７抗体、例えばｒｈｕＭＡｂβ７(米国公開特許２００６／００９３６０１)およびＭＬＮ−０２(Millennium Pharmaceuticals)、抗α４抗体、例えばＴＹＳＡＢＲＩ(登録商標)(Biogen-IDEC-Elan)、Ｔ００４７(GSK/Tanabe)、ＣＤＰ-３２３(経口)(UCB)、アザ架橋された二環式アミノ酸誘導体(国際公開第２００２／０２５５６号)などが含まれる。
【００８７】
本明細書中の「腫瘍壊死因子α」又は「ＴＮＦ-α」は、Pennica et al., Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal et al., J. Biol. Chem., 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含むヒトＴＮＦ-α分子を指す。本明細書中の「ＴＮＦ-α阻害薬(インヒビター)」は、一般にＴＮＦ-αに結合してその活性を中和することによって、ある程度は、ＴＮＦ-αの生物学的機能を阻害する薬剤である。本明細書中の具体的に意図されるＴＮＦ-α阻害薬は、エタネルセプト(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標))、インフリキシマブ(ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標))およびアダリムマブ(ＨＵＭＩＲＡＴＭ)である。 
「疾患変更性抗リウマチ剤」又は「ＤＭＡＲＤ」の例には、ヒドロキシクロロキノン、スルファサラジン、メトトレキセート(ＭＴＸ)、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ(プラス経口及び皮下用メトトレキセート)、アザチオプリン、Ｄ-ペニシラミン、ゴールド塩類(経口)、ゴールド塩類(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリンＡ及び局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ(Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197, (9), p1125-39 (2003))、これらの塩類及び誘導体を含むものなどがある。本明細書中の好適なＤＭＡＲＤはＭＴＸである。
【００８８】
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例として、アスピリン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ＣＯＸ-２インヒビター、例としてセレコキシブ(celecoxib) (CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾロ-１-イル) ベンゼンスルホンアミド及びバルデコキシブ(valdecoxib) (BEXTRA(登録商標))、及びメロキシカム(MOBIC(登録商標))、これらの塩類及び誘導体などがある。好ましくは、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン又はトルメチンである。 
「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何か一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロン、例としてＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ(登録商標) メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムを含む)、デキサメサゾン又はデキサメサゾントリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、及びベタメサゾンが含まれる。本明細書中の好適な副腎皮質ステロイドは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン又はデキサメサゾンである。
【００８９】
「医薬」は、ＲＡ又は関節損傷ないしはＲＡ又は関節損傷の兆候ないし症状ないし副作用を治療するための活性な薬剤である。
「薬学的製剤」なる用語は、医薬の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される被検体に対して許容できない毒性がある付加的化合物を含まない無菌の調製物を指す。
「無菌の」製剤はすべての生きている微生物及びそれらの胞子を含まないで無菌である。
【００９０】
「パッケージ挿入物」は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌、パッケージされている製品と併用される他の医薬品、及び／又はその医薬品又は医薬の用途に関する警告などについての情報を含む、医薬品又は医薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指すために用いられる。
「キット」は、ＲＡ又は関節損傷の治療のための少なくとも一の医薬を具備する任意の製造品(例えば、パッケージ又は容器)である。製造品は、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝され、流通され、又は市販されることが好ましい。
【００９１】
「標的視聴者」は、特に特定の使用、治療又は症状について、マーケティングする又は宣伝することによって、特定の医薬が販売促進される、ないしは販売促進されることを意図する対象となる集団又は施設であり、例えば、個々の患者、患者集団、新聞、医学文献及び雑誌の読者、テレビ又はインターネットの視聴者、ラジオ又はインターネット視聴者、医師、製薬会社などである。 
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。この用語は、プローブ又は抗体に検出可能な物質をカップリング(すなわち物理的な連結)させることによるプローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識される他の試薬との反応によるプローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意図する。間接的な標識の例には、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出されるように、蛍光標識した二次抗体とビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識を用いた一次抗体の検出が含まれる。 
【００９２】
ＩＩ．本発明を実施するための様式：
本明細書中の被検体又は患者は、ＲＡを治療するために既にリツキシマブを投与されており、そのリツキシマブ治療に応答しなかったものである。
本発明は、一実施態様では、特定の群から選択されるリツキシマブ以外の抗ＣＤ２０抗体によって、前記の不応答ＲＡ患者を治療するための方法を提供する。この群は以下からなる。
(１) オファツムマブ(以下に示す一の軽鎖可変領域と二の何れかの重鎖可変領域の配列を有する)、
(２) ベルツズマブ(以下に示す一の軽鎖と二つの重鎖可変領域の何れか一の配列とを有する)、
(３) 小モジュラー免疫薬剤(ＳＭＩＰ)(別名、免疫医薬又はＴＲＵ-０１５)(以下の配列を有する)、
(４) ３つのＣＤ２０-結合抗体のうちの一(別名、ＡＭＥ３３、ＡＭＥ１３３およびＡＭＥ１３３ｖ)(始めの２つの抗体については以下に示す軽鎖及び重鎖の可変領域配列、そして第３の抗体については完全配列を有する)、そして、
(５) Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有するヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体(別名、ＧＡ１０１)(以下に示す軽鎖及び重鎖の可変領域配列を有する)。
【００９３】
他の態様では、本発明は、リツキシマブに反応しない被検体の関節損傷の治療方法であって、被検体に上記何れかの抗ＣＤ２０抗体を投与することを含み、このとき投与された抗ＣＤ２０抗体の量が関節損傷の軽減を達成するために有効である方法を提供する。
場合によって、このような方法では、投与後少なくともおよそ１か月、好ましくは少なくともおよそ２か月、より好ましくは少なくともおよそ５２週に、被検体は、関節損傷の軽減について試験される。例えば、被検体は、被検体が成功裏に治療されたことを示す、投与前の基準値と比較して関節損傷の軽減を測定する画像検査(例えばＸ線検査)が施され、好ましくはこの検査は改変Ｓｈａｒｐ総合スコアを測定するものである。
他の好適な実施態様では、関節損傷は、関節炎、好ましくはＲＡ、より好ましくは、早期又は初発のＲＡによって生じるものである。好ましくは、およそ第５２週の評価に関するこの方法では、第二医薬は有効量で投与され、このとき抗ＣＤ２０抗体が第一医薬である。一態様では、第二医薬は複数の医薬である。他の態様では、第二医薬は、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はこれら組合せを含む、前記の何れかであり、最も好ましくはメトトレキセートである。
【００９４】
更なる態様では、本明細書中の治療方法はさらに、抗ＣＤ２０抗体の前の投与の効果と比較して、ＲＡの治療又は関節損傷の軽減の継続ないしは維持が達成されるための有効量の本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の、患者又は被検体への更なる投与によって、患者又は被検体を再治療することを含む。好ましくは、再治療は、抗体の第一投与の少なくともおよそ２４週後に始まる。他の好適な実施態様では、より好ましくは抗体の第二投与の少なくともおよそ２４週後に、一又は複数の更なる再治療が始められる。この実施態様の一態様では、前回の投与後のＲＡ検査又は他の画像検査のときに被検体に臨床上の改善がない場合であっても、最初の再治療の後に抗ＣＤ２０抗体が被検体に更に投与される。しかしながら、好適な態様では、画像評価などの再治療の後の第一評価の後のＲＡ又は関節損傷の程度と比較して、第二又はその後の再治療の後に、ＲＡ又は関節損傷は軽減された。 
【００９５】
ＩＩＩ．抗ＣＤ２０抗体の解説：
オファツムマブ(ＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ)
オファツムマブの軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000020
オファツムマブの軽鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000021
【００９６】
オファツムマブの第一(及び好適な)重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000022
オファツムマブの第一(及び好適な)重鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000023
オファツムマブの第二重鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000024
また、開示内容が出典明記によって本明細書中に特別に援用される、米国公開特許２００４／０１６７３１９の配列番号：１−４として記載される、オファツムマブ(ＨｕＭａｘ-ＣＤ２０ＴＭ(２Ｆ２))の可変領域についての配列を参照のこと。特に、第一可変重鎖領域配列(本明細書で定義される)は特許出願の配列番号：１および２(それぞれヌクレオチド及びアミノ酸)であり、可変軽鎖領域配列は配列番号：３および４(それぞれヌクレオチド及びアミノ酸)である。また、第二重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、一定のＣＤＲ領域を有する米国公開特許２００４／０１６７３１９の図５３に示される。
【００９７】
ベルツズマブ：
ベルツズマブの(１)すべての可変領域のシグナルペプチド、(２)軽鎖可変領域、および(３) ２つの代替的重鎖可変領域を表すポリペプチドの配列を以下に示す：
軽鎖および重鎖可変領域のシグナル配列：  
2011507897.tif 000025
軽鎖可変領域：
2011507897.tif 000026
(下線部分は順にそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である)
重鎖可変領域１：
2011507897.tif 000027
(下線部分は順にそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である)
重鎖可変領域２：
2011507897.tif 000028
(下線部分は順にそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である)
また、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００３／０２１９４３３のそれぞれ図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃも参照のこと。
【００９８】
免疫薬剤(ＴＲＵ-０１５)：
ポリペプチドＴＲＵ-０１５をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000029
ポリペプチドＴＲＵ-０１５は、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000030
また、ＴＲＵ-０１５のヌクレオチド配列とアミノ酸配列については、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００７／００５９３０６の、それぞれ配列番号：３及び４も参照のこと。
【００９９】
ＣＤ２０-結合抗体：
ＡＭＥ３３：
ＡＭＥ３３抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000031
ＡＭＥ３３抗体の軽鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000032
ＡＭＥ３３抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000033
ＡＭＥ３３抗体の重鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000034
また、軽鎖及び重鎖の可変領域のヌクレオチドとアミノ酸ＡＭＥ３３配列については、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００５／００２５７６４及び米国公開特許２００６／０２５１６５２の、図２−３並びに配列番号：５９−６２も参照のこと。
【０１００】
ＡＭＥ１３３：
ＡＭＥ１３３抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000035
ＡＭＥ１３３抗体の軽鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000036
ＡＭＥ１３３抗体の重鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000037
また、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国公開特許２００５／０１３６０４４では、それぞれ配列番号：１９７及び１９８として示されるＡＭＥ１３３の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列も参照のこと。
【０１０１】
ＡＭＥ１３３ｖ：
変更したＢＣｈＥ変異体Ｌ５３０に融合したＡＭＥ１３３Ｆａｂ領域から調製される融合タンパク質である、ＡＭＥ１３３ｖを表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000038
2011507897.tif 000039
また、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国公開特許２００５／０１３６０４４の配列番号：２０２および図１９も参照のこと。
【０１０２】
糖鎖操作したＦｃ領域を有するヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体：
ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体(ＧＡ１０１)の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000040
ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体(ＧＡ１０１)の軽鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000041
【０１０３】
ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体(ＧＡ１０１)の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000042
ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体(ＧＡ１０１)の重鎖可変領域を表すポリペプチドは、以下の配列を有する：
2011507897.tif 000043
また、フレームワーク領域上のマウスＢ−ｌｙ１のＣＤＲ配列を完全ヒトＩｇＧ１-κ生殖細胞系配列と繋ぎ合わせることによってヒト化した、ＢＨＨ２-ＫＶ１-ＧＥ(ＧＡ１０１)について、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国公開特許２００５／０１２３５４６も参照のこと。米国公開特許２００５／０１２３５４６の図７は、Ｂ−ｌｙ１の予測されるＣＤＲ領域の選別の一覧を示す。ＧＡ１０１(重鎖可変領域)のＢＨＨ２成分の配列は、配列番号：３１(ヌクレオチド)および３２(アミノ酸)として表２および３に示される。ＫＶ１成分(軽鎖可変領域)は、配列番号：７５(ヌクレオチド)および７６(アミノ酸)として表２および３に示される。見かけの可変重鎖および軽鎖のシグナル配列もまた、配列番号：７３(可変重鎖、ヌクレオチド)、７４(可変重鎖、アミノ酸)、７７(可変軽鎖、ヌクレオチド)および７６(可変軽鎖、アミノ酸)としてこれらの表に記載される。
【０１０４】
ＢＨＨ２-ＫＶ１-ＧＥ(ＧＡ１０１)の全体の配列情報は、以下のように予測される：
可変軽鎖領域(全体)：
-配列番号：７５および７６、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変軽鎖領域(予測される) ＣＤＲ１： 
-配列番号：８および１８、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変軽鎖領域(予測される) ＣＤＲ２：
-配列番号：９および１９、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変軽鎖領域(予測される) ＣＤＲ３：
-配列番号：１０および２０、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変重鎖領域(全体)：
-配列番号：３１および３２、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変重鎖領域(予測される) ＣＤＲ１： 
-配列番号：５−７および１５−１７の何れか、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変重鎖領域(予測される) ＣＤＲ２：
-配列番号：２１−２３および２５−２７の何れか、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
可変重鎖領域(予測される) ＣＤＲ３：
-配列番号：２４および２８、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸
【０１０５】
抗ＣＤ２０抗体およびその特定の実施態様の概要：
ゆえに、要約すると、本明細書中のある治療方法で使われうる抗ＣＤ２０抗体は以下の通りである。(１)配列番号：２の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：４又は配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含むオファツムマブ、(２)配列番号：７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：８又は配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含むベルツズマブ、(３)配列番号：１１を含む免疫製薬、(４)配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１９を含む、ＣＤ２０結合抗体、又は、(５)Ｆｃ領域に二分した非フコシル化炭水化物を有し、配列番号：２１の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：２３の可変重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体。
一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブである。最も好ましくは、オファツムマブは、配列番号：４の可変重鎖アミノ酸配列を含む。しかしながら、他の実施態様では、配列番号：５の可変重鎖アミノ酸配列を含む。
他の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブである。ある特定の態様では、ベルツズマブは、配列番号：８の可変重鎖アミノ酸配列を含む。他の特定の態様では、ベルツズマブは、配列番号：９の可変重鎖アミノ酸配列を含む。
更なる態様では、抗ＣＤ２０抗体は、免疫薬剤(ＴＲＵ-０１５の等価物)である。
なお更なる実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、配列番号：１３および１５又は１７および１８、又は配列番号：１９を含むＣＤ２０-結合抗体である。第一の態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１３の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１５の可変重鎖アミノ酸配列を含む(ＡＭＥ３３)。他の態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１７の可変軽鎖アミノ酸配列と配列番号：１８の可変重鎖アミノ酸配列を含む(ＡＭＥ１３３)。更なる態様では、ＣＤ２０-結合抗体は、配列番号：１９を含む(ＡＭＥ１３３ｖ)。
第５の全体の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である。
患者又は被検体が治療されうるこれらの抗ＣＤ２０抗体は、本明細書中の以下に記載されるもの及び実施例のものを含め、何れかの好適な方法を用いて製造されてよい。
【０１０６】
ＩＶ．抗ＣＤ２０抗体の産生
本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は、以下の通りに一般に製造される。
オファツムマブ(ＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ)
オファツムマブ(２Ｆ２)は、例えば、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００４／０１６７３１９において記述される手順に従って調製されてよい。オファツムマブについて本明細書中に挙げる第一可変重鎖領域配列は配列番号：１及び２(それぞれヌクレオチド及びアミノ酸)に示し、オファツムマブについて本明細書中に挙げる可変軽鎖領域配列は本特許出願の配列番号：３及び４(それぞれヌクレオチド及びアミノ酸)に示す。また、第二重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、所定のＣＤＲ領域と共に米国公開特許２００４／０１６７３１９の図５３に示される。
米国公開特許２００４／０１６７３１９の実施例１−３は、２Ｆ２の調製の詳細を開示する。具体的には、ＣＤ２０に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体遺伝子を発現するＨＣｏ７およびＫＭマウスを使用して調製された。
【０１０７】
ＫＭマウス株では、Chen et al., EMBO J., 12:811-820 (1993)に記載されるように、内在性マウスκ軽鎖遺伝子がホモ接合的に破壊されており、国際公開２００１／０９１８７の実施例１に記載されるように、内在性マウス重鎖遺伝子はホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)に記載されるように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子であるＫＣｏ５を保持する。また、このマウス株は、国際公開２００２／４３４７８に記載されるように、第１４染色体断片ｈＣＦ(ＳＣ２０)からなるヒト重鎖トランス染色体を保持する。
ＨＣｏ７マウスは、その内在性軽鎖(κ)遺伝子にＪＫＤ破壊を(上掲のChen et al.に記載される)、その内在性重鎖遺伝子(国際公開２００１／１４４２４の実施例１に記載される)、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子(上掲のFishwild et al.に記載される)およびＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子(米国特許第５７７０４２９号に記載される)にＣＭＤ破壊を有する。
ＨＣｏ７およびＫＭマウスは、ヒトＣＤ２０形質移入ＮＳ／０細胞にて免疫化した。第一免疫化のために、１マウスにつき、１×１０７細胞を含む１５０μｌのＰＢＳを、完全フロイントアジュバントと１：１で混合し、腹膜内(i.p.)に注射した。その後の腹腔内免疫処置はアジュバントを含まない同量の細胞を使用して行った。融合の３及び２日前に、マウスは、リン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)に懸濁した０．５×１０７細胞にて、静脈内投与により追加免役した。
マウスの血清中のヒトＣＤ２０に対する抗体の存在は、ヒトＣＤ２０形質移入ＮＳ／０細胞並びにＣＤ２０陰性親ＮＳ／０細胞を用いて、ＦＡＣＳ分析を用いたフローサイトメトリーによってモニターした。 
【０１０８】
マウス脾細胞をＨＣｏ７およびＫＭマウスから単離し、標準的なプロトコールに基づいてマウス骨髄腫細胞株に対してＰＥＧにて融合した。次いで、結果として生じたハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧκ産生について、そしてＦＡＣＳ分析によってヒトＣＤ２０形質移入ＮＳ／０およびＳＫＢＲ３細胞を用いてＣＤ２０特異性についてスクリーニングした。免疫マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を、１／４量の非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１)に、５０％ＰＥＧ(Sigma)にて融合させた。細胞は、平底マイクロタイタープレートにおよそ１×１０５／ウェルでプレーティングし、その後、１０％胎児ウシ血清、１０％のＰ３８８Ｄ１(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ ＴＩＢ-６３)条件培地、ＤＭＥＭ(Mediatech、ＣＲＬ１００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびナトリウムピルベートを有する)プラス５ｍＭ ＨＥＰＥＳ中に３〜５％のオリジン(IGEN)、０．０５５ｍＭ ２‐メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ(Sigma、ＣＲＬ Ｐ−７１８５)を含む選択培地中でおよそ２週間インキュベートした。１〜２週間後に、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で培養した。次いで、個々のウェルを、ヒト抗ＣＤ２０モノクローナルＩｇＧ抗体についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。いったんハイブリドーマが広く増殖すると、通常１０〜１４日後に培地をモニターした。抗体を分泌するハイブリドーマを再度プレーティングし、再度スクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧについてポジティブである場合には、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を限界希釈によってサブクローニングした。次いで、安定サブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのために組織培養培地中で少量の抗体を生成させた。親細胞の反応性を維持した１つのクローンを各々のハイブリドーマから(ＦＡＣＳにより)選択した。各クローンについて５−１０のバイアル細胞バンクを生成し、液体窒素に保存した。
【０１０９】
抗体のアイソタイプは、アイソタイプＥＬＩＳＡを実行することによって決定した。マイクロタイタープレートのウェルを、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトκ軽鎖、ＰＢＳ中５０μｌ／ウェルにてコートし、４℃で終夜インキュベートした。５％ニワトリ血清にてブロックした後、プレートを上清と反応させ、アイソタイプコントロールを精製した。次いで、プレートを室温で１〜２時間インキュベートした。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４特異的西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートプローブと反応させた。プレートを反応させ、上記の通りに分析した。
生成されたハイブリドーマ細胞株のうちの１つは、２Ｆ２、米国公開特許２００４／０１６７３１９のヌクレオチド配列、配列番号：１及び３とアミノ酸配列、配列番号：２及び４とを有するヒトモノクローナルＩｇＧ１κ抗体を発現した。
次いで、ＶＬおよびＶＨ領域を、米国公開特許２００４／０１６７３１９に開示される、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のプライマーおよびオリゴヌクレオチドを使用して配列決定した。
【０１１０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析した後、この産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット(Qiagen, Westburg, Leusden, Netherlands)にて精製した。ＶＨ及びＶＬ領域各々の２つの別々に増幅されたＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコール(1999, version 6)に従って、ｐＧＥＭＴ-ベクターシステムＩＩ(Promega)にクローニングした。 
大腸菌ＪＭ１０９への形質転換の後、個々のコロニーをＴ７およびＳＰ６プライマー、５５℃での３０アニーリングサイクルを用いたコロニーＰＣＲにより、スクリーニングした。コロニーからのプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰＴＭキット(Qiagen)を使用して精製した。さらに、ＶＨおよびＶＬ領域は、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１(NE Biolabs, Westburg, Leusden, Netherlands)を消化することによって分析し、アガロースゲル上で分析した。
Ｖ領域領域は、ｐＧＥＭＴ-ベクターシステムＩＩでのクローニングの後に配列決定した。配列決定はＢａｓｅｃｌｅａｒ(Leiden, Netherlands)で行った。配列は、Ｖｂａｓｅ (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)の生殖細胞系Ｖ遺伝子配列を整列配置することによって分析した。http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901。
【０１１１】
２Ｆ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ＧＳ定常領域ベクターであるｐＣＯＮγ１ｆおよびＰＣＯＮκ(Lonza)内に断片をクローニングするために最適なＫｏｚａｋ配列および適切な制限酵素部位を含むプライマーを使用して、標準的なクローニングベクターであるｐＧｅｍ-５Ｚｆ(Promega)から、ＰＣＲを用いて増幅した。
増幅の後、断片を精製し、クローニングのための制限酵素によって消化し、２つのベクターにライゲーションした。重鎖可変断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩにて消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩにて消化されたｐＣＯＮγ１ｆベクターにライゲーションし、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化した。軽鎖可変断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩにて消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩにて消化されたＰＣＯＮκベクターにライゲーションし、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化した。形質転換した大腸菌コロニーはコロニーＰＣＲによって検査し、重鎖(ＨＣ)および軽鎖(ＬＣ)それぞれのコンストラクトのうち２つの陽性コロニーをプラスミド単離のために増殖させた。これらの４つのクローンの単離されたプラスミドを配列決定し、配列を確認した。ＨＣクローンの両方及びＬＣクローンのうちの１つは、適切な配列を有することが明らかとなった。
【０１１２】
２つのＨＣおよび１つのＬＣコンストラクトを組合せ、ＬＣ−ＨＣの２つの組合せを作製し、ＣＨＯ-Ｋ１細胞に過渡的に同時形質移入し、２Ｆ２抗体の適切な産生についてコンストラクトを調べた。この発現実験のすべての組合せについて正常な産生レベルが達成され、ＨＣおよびＬＣコンストラクトの各々１つのクローンを二重遺伝子ベクターの構築のために選択した。 
標準的なクローニング手順を用いて、重鎖ベクターであるｐＣＯＮγ１ｆ／可変重鎖からの完全な発現カセットを、軽鎖ベクターであるｐＣＯＮκ／可変軽鎖にライゲーションすることによって、ｐＣＯＮγ１ｆ／κ ２Ｆ２と称する二重遺伝子クローニングベクターにＨＣ及びＬＣコンストラクトを組み合わせた。 
このコンストラクトを、ＣＨＯ-Ｋ１細胞の一過性の形質移入において再度機能的に試験し、正常な発現レベルを示した。ｐＣＯＮγ１ｆ／κ ２Ｆ２プラスミドの可変領域を配列決定し、正確な配列を再確認した。
【０１１３】
線状プラスミドは、発現に不可欠な外側の領域を切断する特定の制限酵素ＰｖｕＩによってｐＣＯＮγ１ｆ／κ ２Ｆ２を消化することによって、安定形質移入のために調製した。完全な線状化はアガロースゲル電気泳動によって確認し、ＤＮＡを精製し、使用まで−２０℃に保存した。 
上記の線状ＤＮＡプラスミドを用いたプラスミドＤＮＡによるエレクトロポレーションによって、ＮＳ／０宿主細胞の６つの形質移入を行った。形質移入後、細胞を９６ウェルプレートに分配し、インキュベートした。Ｓ選択培地(１０％透析胎仔ウシ血清(ｄＦＣＳ)および１０μＭのＧＳ−インヒビターＬ−メチオニンスルホキシイミンを含有するが、グルタミンを欠く)を添加し、プレートをモニターして、形質移入していない細胞が死に形質移入細胞の巣が残った時を決定した。ＧＳベクター系に関する詳細については国際公開１９８７／０４４６２を参照のこと。形質移入したプレートはおよそ３週間インキュベートして、コロニー形成を得た。結果として生じたコロニーを顕微鏡で調べ、コロニーがアッセイに適するサイズであること(ウェルの底の６０％超を覆う)、そして各ウェルに１つのコロニーのみがあることを確認した。４３６の形質移入体の細胞上清は、ＩｇＧκ-ＥＬＩＳＡによってアセンブルされた抗体についてスクリーニングした。
【０１１４】
このデータを使用して、１１１の形質移入体を、静置培養における進行および更なる評価のために選択した。選択された細胞株の培養物を拡げ、低血清添加培地(ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を含み、１％ｄＦＣＳ添加)にさらし、静置培養における生産性の更なる評価を行った(ＥＬＩＳＡおよびパーセンテージコンフルエンスの測定)。６５の最も高いものに分類された細胞株は進行について選択した。選択された細胞株の生産性の事前評価は、低血清添加培地(ＢＳＡを含み１％ｄＦＣＳを添加)におけるバッチ振とうフラスコ懸濁培養において行った。(ＥＬＩＳＡによる)回収抗体濃度および許容範囲内の増殖特性に基づいて、３０の細胞株は、バッチ振とうフラスコ懸濁培養を用いた無血清培地において更なる評価について選択した。
さらに、最も高い抗体濃度を生産した１０の細胞株を、無血清培地中の２通りのフェドバッチ(fed-batch)振とうフラスコ懸濁培養において評価した。周知の標準的な方法に従って、回収時の生成物濃度をプロテインＡ高性能液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)によって測定した。
【０１１５】
ＩＭＭＵ-１０６(ｈＡ２０又はベルツズマブ)
米国公開特許２００３／０２１９４３３の図５は、ｈＡ２０軽鎖Ｖ遺伝子(ｈＡ２０Ｖｋ)(図５Ａ)および重鎖Ｖ遺伝子、ｈＡ２０ＶＨ１(図５Ｂ)およびｈＡ２０ＶＨ２(図５Ｃ)のヌクレオチド配列、並びにＶＫｐＢＲ２(図５Ａ)およびＶＨｐＢＳ２(図５Ｂおよび５Ｃ)ステージングベクターの近接した隣接配列を開示する。非翻訳ヌクレオチド配列は小文字で表す。サブクローニングのために使用する制限部位は下線を付して示す。分泌シグナルペプチド配列は二重下線によって示す。アミノ酸配列は対応するヌクレオチド配列の下に一文字コードとして示す。アミノ酸残基にカバット番号付けスキームを用いた。文字にて番号を付したアミノ酸残基は、カバットに従って挿入残基を表し、前の残基と同じ数字を付する。
ベルツズマブの構築方法は、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、例えば米国公開特許２００３／０２１９４３３において記述される。ある特定の調製方法では、例えば、抗体は以下のように構築され、調製される。
【０１１６】
各可変鎖は場合によって、それぞれ「Ａ」及び「Ｂ」と称する５'-及び３'-ハーフの２つの部分に構築される。各ハーフは場合によって、Ｔａｑポリメラーゼを用いて、２つの短い隣接プライマーによる一本鎖合成オリゴヌクレオチド鋳型のＰＣＲ増幅によって生産される。まず、増幅された断片は、Invitrogen (Carlsbad, Calif.)のｐＣＲ４ ＴＡクローニングベクターにクローニングし、ＤＮＡ塩基配列決定を行ってよい。鋳型およびプライマー対は米国公開特許２００３／０２１９４３３に列挙される。
完全長Ｖκ軽鎖のアセンブリは、適切な５'-及び３'-酵素による各断片の制限酵素消化と、既にＰｖｕＩＩおよびＢｃｌＩにて消化したＶＫｐＢＲ２ベクターへのライゲーション(ＢｃｌＩ−消化末端はＢｇｌＩＩの末端と適合する)によって達成されうる。結果として生じるライゲーションされた生成物は、ＰｖｕＩＩ部位にライゲートされたＡ断片、ＢｃｌＩ部位にライゲートされたＢ断片及び、ＢｓｔＢＩ部位で一つに連結されたＡおよびＢ断片を含む。ＶＫｐＢＲ２は、ＸｂａＩ制限酵素部位が翻訳開始コドンの上流の１４塩基に導入されているＶＫｐＢＲ(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))の変性ステージングベクターである。ＤＮＡ塩基配列決定による正確なオープンリーディングフレームの確認により、ＶＫｐＢＲ２からＸｂａＩ−ｔｏ−ＢａｍＨＩ断片として完全な鎖が取り除かれ、ｐｄＨＬ２発現ベクターにライゲートされる。Ｖκ配列のみを含有するベクターをｈＡ２０ＶκｐｄＨＬ２と称する。ベクターｐｄＨＬ２は、ＩｇＨエンハンサー及びＭＴＩプロモーターの制御下にヒトＩｇＧ１ Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびヒンジ領域とヒトκ鎖Ｃｋの発現カセット、並びにトランス遺伝子の形質移入及び同時増幅の選択のためのマーカーとして弱いＳＶ４０プロモーターによって制御されるマウスｄｈｆｒ遺伝子を含む(Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125:191 (1989)及びLosman et al., Cancer, 80:2660 (1997))。ｐｄＨＬ２のＶκおよびＶＨ部分を置換することによって、異なるキメラ又はヒト化Ａｂが発現されうる。
【０１１７】
重鎖の構築のために、適切なオリゴヌクレオチドをそれぞれのプライマー対によってＰＣＲ増幅する。両タイプのＶＨについて、Ｖκについて行った方法と同じ構築方法を行うが、以下の変更を加えた。Ａ断片の５'末端制限酵素部位はＰｓｔＩであり、Ｂ断片の３'末端制限酵素部位はＢｓｔＥＩＩである。これらの断片を共に、ＶＨｐＢＳ２ベクターのＮｃｉＩ部位でのライゲーションにより連結して完全長ＶＨ配列(米国公開特許２００３／０２１９４３３の図１Ｂおよび２Ｃに示される)とし、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認する。ＶＨｐＢＳ２は、翻訳開始コドンの上流１６塩基にＸｈｏＩ制限酵素部位が導入されているＶＨｐＢＳの変更ステージングベクターである(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))。アセンブルされたＶＨ遺伝子は、Ｖκ配列、ｈＡ２０Ｖκ ｐｄＨＬ２を含有する発現ベクターに、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素断片としてサブクローニングする。ｐｄＨＬ２の重鎖領域はＢａｍＨＩ制限酵素部位を欠いているので、このライゲーションはＨＮＢリンカー(その配列は米国公開特許２００３／０２１９４３３に記載される)の使用を必要とし、可変鎖のＢａｍＨＩ部位とｐｄＨＬ２ベクターに存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の架橋を提供する。
【０１１８】
ｈＡ２０抗体の形質移入および発現は場合によって、以下の通りに実施される。およそ３０μｇのｈＡ２０用の発現ベクターは、ＳａｌＩによる消化によって線状化し、エレクトロポレーション(４５０Ｖおよび２５μＦ)によってＳｐ２／０-Ａｇ１４細胞に形質移入する。形質移入した細胞は９６ウェルプレートに２日間播き、次いで０．０２５μＭ終濃度のＭＴＸを培地に添加することによって薬剤耐性について選択する。ＭＴＸ耐性コロニーは、２〜３週間でウェルに現れることが予測される。選別に生き残ったコロニーからの上清を、ＥＬＩＳＡアッセイによってヒト抗体分泌についてスクリーニングする。  
簡単にいうと、１００μｌの上清を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ(ＧＡＨ-ＩｇＧ),Ｆ(ａｂ')２断片特異的抗体にて予めコートしたマイクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。結合していないタンパク質は、洗浄バッファ(０．０５％ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ２０ＴＭ界面活性剤を含むＰＢＳ)にて３回洗浄することによって除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)-コンジュゲートＧＡＨ-ＩｇＧ,Ｆｃ断片特異的抗体をウェルに添加する。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄する。結合したＨＲＰコンジュゲート抗体は、４ｍＭ ｏ−フェニレンジアミン二塩化水素化物(ＯＰＤ)および０．０４％Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を添加した後にＡ４９０ｎｍを読み取ることによって明らかにする。ポジティブ細胞クローンを拡げ、プロテインＡカラム上の親和性クロマトグラフィによって細胞-培養物上清からｈＡ２０抗体を精製する。
【０１１９】
免疫薬剤
ＣＤ２０特異的ＳＭＩＰは、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００３／１３３９３９、２００３／０１１８５９２および２００５／０１３６０４９に一般に記述される。例示的なＣＤ２０特異的ＳＭＩＰ、ＴＲＵ-０１５の産生は、例えば、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００７／００５９３０６に記述される。 
ＴＲＵ-０１５は、ＣＤ２０抗原に結合する組換え(マウス／ヒト)単鎖タンパク質である。結合ドメインは、公的に利用できるヒト抗ＣＤ２０抗体配列に基づいた。結合ドメインは、変性ＣＳＳヒンジ領域により、ヒトＩｇＧ１のエフェクタードメイン、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結される。ＴＲＵ-０１５は溶液中で二量体として存在し、この二量体はおよそ１０６０００ダルトンの理論上の分子量を有する。ＴＲＵ-０１５をコードするヌクレオチド配列とＴＲＵ-０１５のアミノ酸配列はそれぞれ上記の配列番号：１０及び１１に示される。
【０１２０】
配列番号：１１に示されるアミノ酸配列に関して、ＴＲＵ-０１５は、アミノ酸１−２３の２ｅ１２リーダーペプチドクローニング配列と、可変領域の残基１１(位置３４に反映される)にリジンからセリンへ(ＶＨＬ１１Ｓ)のアミノ酸置換を有する２Ｈ７マウス抗ヒトＣＤ２０軽鎖可変領域と、カセットシャフリングのためにＳａｃＩ制限酵素部位を組み込むように末端に更なるセリンを有する残基１２９で始まるリンカーと、重鎖領域の末端のセリン残基を欠く２Ｈ７マウス抗ヒトＣＤ２０重鎖可変領域と、(ＣＳＳ)配列を含む変性ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと、野生型ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含む。
ＴＲＵ-０１５は、適切な培地を用いたバイオリアクター中で培養され、次いで例えばウイルス減数フィルターを用いた工程を含む一連のクロマトグラフィおよび濾過工程を用いて精製されてよい。次いで、材料は、適切な生理的に許容可能なｐＨ、例えばｐＨ６−７、より好ましくは６．０の、例えばリン酸ナトリウム(例えば２０ｍＭ)およびスクロース(例えば２４０ｍＭ)といった適切な賦形剤にて濃縮され、調製されてよい。次いで、組成物は、充填前に、例えば１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ガラスバイアルなどのバイアルに濾過されてよい。各ガラスバイアルは、例えば５ｍＬのＴＲＵ-０１５(５０ｍｇ／バイアル)を含んでよい。
【０１２１】
ＣＤ２０-結合抗体
ＣＤ２０-結合抗体ＡＭＥ３３は、例えば、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００５／００２５７６４および米国公開特許２００６／０２５１６５２にに記載されるように調製される。ＡＭＥ３３の重鎖および軽鎖の可変領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２−３(配列番号：５９−６２)として両方の出願に示される。ＡＭＥ３３の軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１３及び１５として上記する。
米国公開特許２００５／００２５７６４の実施例１は、各可変ドメインのＣＤＲ領域の記載を含め、詳細にＡＭＥ３３の調製を記述する。ＣＤ２０-結合分子ＡＭＥ３３の軽鎖および重鎖の可変領域は、軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わされ、Ｆａｂ又は完全な抗体(例えばＩｇＧ)として発現されうる。例えば、米国公開特許２００５／００２５７６４の図１０および１１は、ＡＭＥ３３の完全な軽鎖および重鎖を示し、これには軽鎖及び重鎖の定常領域が含まれ、図１０Ａおよび１１Ａではこの領域に下線が付される。あるいは、ＡＭＥ３３は、Ｆｃ領域にアミノ酸置換を有することを除き、それら２つの図に示される重鎖定常領域を含んでもよい。特に、その特許出願の図１１に示される重鎖定常領域は、Ｄ２８０Ｈ突然変異又はＫ２９０Ｓ突然変異を含んでもよい(図１１Ａは突然変異なしで位置２８０および２９０を太字で示す)。図１１Ｂは「ＧＡＣ」を太字と下線で示す。
【０１２２】
特に、図１０Ａは、ＡＭＥ３３完全軽鎖アミノ酸配列は以下の通りであることを示す。定常領域を下線で示す。
2011507897.tif 000044
図１１Ａは、ＡＭＥ３３完全重鎖アミノ酸配列は以下の通りであることを示す。定常領域を下線で示す。
2011507897.tif 000045
【０１２３】
ＣＤ２０-結合抗体ＡＭＥ１３３は、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、例えば、実施例ＶＩＩを含む米国公開特許２００５／０１３６０４４に開示されるように、調製される。ＡＭＥ１３３の軽鎖可変領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、米国公開特許２００５／０１３６０４４において配列番号：１９７及び１９８として示される。ＡＭＥ１３３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１７として示される。ＡＭＥ１３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１８として示される。
ＣＤ２０-結合抗体ＡＭＥ１３３ｖ(ＬＹ２４６９２９８)は、例えば、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される、米国公開特許２００５／０１３６０４４に開示されるように、調製される。この抗体の生成は、例えば２４頁の１７５段落に記述される。ＡＭＥ１３３ Ｆａｂ領域から調製され、修飾ＢＣｈＥ変異体Ｌ５３０に融合させた融合タンパク質である。ＡＭＥ１３３ｖのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、米国公開特許２００５／０１３６０４４の図１９に示され、ポリペプチド配列は米国公開特許２００５／０１３６０４４の配列番号：２０２および本明細書中の配列番号：１９である。
【０１２４】
ＡＭＥ１３３及びＡＭＥ１３３ｖに関して、最適化された変異体残基を組み込んでいる抗体−酵素融合タンパク質はライブラリスクリーニングによって同定され、ＣＰＴ−１１によるＡＤＥＰＴにおける最適化されたＢＣｈＥの使用の実行可能性はＣＤ２０を標的化することによって確認された。抗原はヒトＢリンパ腫株上に豊富に発現されており(３．２×１０５分子／細胞)、抗体結合時に有意な内部移行を経ないので、ＣＤ２０はＡＤＥＰＴにおける最適化されたＢＣｈの使用の実行可能性を試験するための有用な標的抗原である。ＡＭＥ１３３は、定向進化方策を用いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎにて生成される、完全ヒト生殖細胞系フレームワーク領域を有するヒト化抗ＣＤ２０であり、一価性Ｆａｂは極めて高い親和性で(１×１０−９Ｍ)ＣＤ２０に結合する。例示的なモデル融合タンパク質(抗ＣＤ２０−ＢＣｈＥ.４−１(配列番号：２０２))は、ＣＨ１重鎖ドメインのＣ末端で修飾ＢＣｈＥ変異体Ｌ５３０のＮ末端に融合したＡＭＥ１３３ Ｆａｂからなる。ＢＣｈＥ変異体はアミノ酸５３０で切断されて、四量体への正常なアセンブリを無効にする。単量体バージョンの酵素は、天然に生じる四量体形態の各サブユニットの等価な活性を示し、Blong et al., Biochem. J., 327 (Pt 3): 747-57 (1997)に記載されるようなアロステリック効果によって活性が損なわれない。
ＡＭＥ１３３ｖでは、非付着性ＨＥＫ２９３細胞を無血清低タンパク質培地(UltraCULTURE, BioWhittaker)の懸濁培養物に適応させ、融合タンパク質ＡＭＥ１３３ｖを過渡的に形質移入し、２〜４ｍｇ／Ｌの収率が得られた。二工程精製手順は、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＱＴＭ培地上のアニオン交換クロマトグラフィの後、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ培地上の疎水性相互作用クロマトグラフィ工程を用いて開発した。これにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、一つの主要な混入物バンドと＞９０％の純度の生成物が検出された。
【０１２５】
当分野で公知の多くの手順を用いて、本明細書中のＣＤ２０-結合分子を発現させてよい。例えば、３つのＣＤ２０-結合抗体は、単一ベクター又は二重ベクターシステムのいずれかを使用した哺乳動物又は他の(細菌、真菌および植物を含む)発現系においてＦａｂ又はＩｇＧとして発現されてよい。単一ベクターにおける発現のために、重鎖および軽鎖は製造されるか又は、発現に必要なすべての調節因子を含む発現カセット内にクローニングされる。２つのベクターを使用する発現は、異なるプラスミドにおいて２つの発現カセットを使用する。単一のプラスミド又は併用プラスミドは一般に、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又は網膜細胞株ＰｅｒＣ６といった宿主細胞株に形質移入され、選択され、次いで拡がり、培養されて、当業者に公知であるようなＦａｂ又はＩｇＧタンパク質を発現する。
細菌発現系はＦａｂの産生に好ましい。一例は、Ｍ１３ウイルス発現系内のＦａｂ挿入と発現である。そのようにして発現されたＦａｂは、細菌の細胞膜周辺腔に分泌され、当分野で公知の低張性ショックおよび凍結融解手順といった様々な方法によってそこから放出させてもよい。また、Ｆａｂは場合によって、パパインなどのプロテアーゼを用いたタンパク分解性切断によって、完全な(インタクトな)ＩｇＧから生成される。切断生成物のＦａｂ部分は、切断生成物のＦｃ部分から精製されうる。
Ｆａｂおよび抗体は、多くのクロマトグラフィや当分野で公知の特定の吸着技術を使用して精製されてもよい(上掲のHarlow et al.を参照)。例えば、抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィの後にＭＯＮＯ ＳＴＭカチオン−交換クロマトグラフィを用いて特異的に結合させることにより、細胞上清から容易に精製されうる。
【０１２６】
糖鎖操作したＦｃ領域を有するヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体
分子ＧＡ１０１は、ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体である。これは、マウスモノクローナル抗体Ｂ−ｌｙ１のＣＤＲ配列を、完全ヒトＩｇＧ１-κ生殖細胞系配列を有するフレームワーク領域に融合させることによってヒト化される。また、この抗体のＦｃ領域-糖鎖は、国際公開２００４／０６５５４０(この開示内容は出典明記によって特別に本明細書中に援用される)に記述されるＧＬＹＣＯＭＡＢＴＭ技術を用いて糖鎖(グリコ)操作され、二分した非フコシル化Ｆｃ領域-糖鎖となる。ＧＡ１０１はＢＨＨ２-ＫＶ１-ＧＥであり、その調製は、例えば、開示内容が出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国公開特許２００５／０１２３５４６において記述される。特にその実施例２を参照。
ＢＨＨ２成分(重鎖可変領域)の配列は、米国公開特許２００５／０１２３５４６の表２および３に、配列番号：３１(ヌクレオチド)および３２(アミノ酸)として示される。ＫＶ１成分(軽鎖可変領域)は表２および３に、配列番号：７５(ヌクレオチド)および７６(アミノ酸)として示される。また、分子はヒトＩｇＧ１定常領域を含有する。
【０１２７】
ＧＡ１０１産生のために、ヒト生殖細胞系配列のコレクションに対してマウスＢ−Ｌｙ１タンパク質配列を整列配置し、最も高い配列同一性を示したヒトの配列を選別することによって、高い相同性抗体レセプターフレームワーク検索を行った。ＶＢａｓｅデータベースの配列ＶＨ１＿１０を重鎖フレームワークアクセプター配列として選択し、ＶＫ＿２＿４０配列を軽鎖のフレームワークアクセプターとなるように選択した。これら２つのアクセプターフレームワークに、マウス重鎖及び軽鎖の可変ドメインの３つのＣＤＲを融合した。フレームワーク４領域は生殖細胞系Ｖ遺伝子の可変領域の一部でないので、その位置のアラインメントは別々に行った。ＪＨ４領域を重鎖のために選択し、ＪＫ４領域を軽鎖のために選択した。設計された免疫グロブリンドメインの分子モデリングにより、ＣＤＲの外でヒトの残基の代わりにマウスのアミノ酸残基を必要とする可能性のある１つのスポットが明らかになった。ヒトフレームワークにマウスのアミノ酸残基を再導入することによりいわゆる逆突然変異が生成されうる。例えば、カバット位置２７のヒトアクセプターアミノ酸残基は、チロシン残基に逆変異させた。逆突然変異を含むか又は省いたヒト化抗体変異体が設計された。ヒト化抗体軽鎖は逆突然変異を全く必要としなかった。タンパク質配列を設計した後に、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下のように合成した。 
【０１２８】
ヒトアクセプターフレームワークの重要な(良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要な)アミノ酸残基位置に逆突然変異を導入することを避けるために、全フレームワーク領域１(ＦＲ１)又はフレームワーク領域１(ＦＲ1)と２(ＦＲ２)のいずれが、天然のヒト生殖細胞系配列の重要な位置で、ドナー残基を既に有するヒト抗体配列又は機能的な等価物に置き換えられるのかを調べた。この目的のために、マウスＢｌｙ１配列のＶＨフレームワーク１および２を、ヒト生殖細胞系配列に別々に整列配置した。ここで、アクセプターフレームワークを選択するために、最も高い配列同一性は重要ではなく、使われなかったが、いくつかの重要な残基の一致の方が重要であると思われた。その重要な残基は、残基２４、７１および９４(カバット番号付け)、また位置２７、２８および３０(カバット番号付け)の残基を含む。これらはカバットによるＣＤＲ１定義の外に位置するが、抗原結合に関与することが多い。ＩＭＧＴ配列ＶＨ＿３＿１５を適切なものとして選択した。タンパク質配列を設計した後に、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下のように合成した。この手法を使用すると、軽鎖又は重鎖のいずれにも逆突然変異は必要とされず、良好なレベルの抗原結合が維持された。
【０１２９】
ヒト化抗体Ｖ領域のアミノ酸配列が設計されたあと、ＤＮＡ配列を生成した。個々のフレームワーク領域のＤＮＡ配列データは、ヒト生殖細胞系配列のデータベースに見られる。ＣＤＲ領域のＤＮＡ配列は、対応するマウスｃＤＮＡデータから取り出した。これらの配列により、全ＤＮＡ配列は実質的にアセンブリされた。このＤＮＡ配列データを用いて、サイレント突然変異を導入し、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を作製することによって、診断用制限酵素部位を仮想配列に導入した。物理的なＤＮＡ鎖を得るために、遺伝子合成を行った。このとき、一連のオリゴヌクレオチドがコード鎖由来であり、他の連が非コード鎖由来となるように、オリゴヌクレオチドを対象の遺伝子から設計した。各オリゴヌクレオチドの３'及び５'末端(列の最初と最後を除く)は常に、逆の鎖から得られる２つのプライマーに対して相補的な配列を示す。任意の熱安定ポリメラーゼに適切な反応バッファにこれらオリゴヌクレオチドを置き、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを加えると、各オリゴヌクレオチドは３'末端から伸展する。次いで、一方のプライマーの新しく形成された３'末端はその逆の鎖の次のプライマーとアニールし、鋳型依存的なＤＮＡ鎖伸長に適切な条件下でさらに配列を伸展する。終末産物は、大腸菌における増殖のために従来のベクターにクローニングした。
【０１３０】
ヒトの重鎖および軽鎖の(分泌のための)リーダー配列を上記の可変領域配列の上流に加え、次いで、標準的な分子生物学的技術を用いて、これらをそれぞれヒトＩｇＧ１κ定常重鎖および軽鎖配列の上流に連結した。結果として生じるフィル抗体の重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、哺乳動物ベクター(軽鎖のために１つ、重鎖のために１つ)のＭＰＳＶプロモーターの制御下かつ合成ポリＡ部位の上流にサブクローニングた。この各々のベクターはＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を有する。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡを哺乳動物抗体重鎖及び軽鎖の発現ベクターにて同時形質移させ、形質移入の５〜７日後に条件培養培地を回収し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィの後にカチオン交換クロマトグラフィと最終サイズ排斥クロマトグラフィの工程によって分泌された抗体を精製して、純粋な単量体ＩｇＧ１抗体を単離することによって、抗体を製造した。抗体は、２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の１００ｍＭ グリシン溶液において調製した。抗体発現ベクターを共に、ＧｎＴ-ＩＩＩグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターにより、又はＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクターとゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクターにより、同時形質移入することによって、ヒト化抗体変異体の糖鎖操作(glycoengineered)変異体を製造した。抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。
【０１３１】
溶液中の抗体のためのオリゴ糖放出のために、４０から５０μｇの抗体を、２．５ｍＵのＰＮＧａｓｅＦ (Glyko, U.S.A.)を含む２ｍＭのＴＲＩＳバッファ, ｐＨ７．０と混合し(終体積２５μｌ)、この混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
放出されたオリゴ糖を含む酵素消化物は、酢酸を添加して１５０ｍＭの終濃度とした後に室温でさらに３時間インキュベートし、その後、マイクロ−ビオ−スピンクロマトグラフィカラム(BioRad, Switzerland)に詰め込んだ０．６ｍｌのカチオン交換樹脂(ＡＧ５０Ｗ-Ｘ８樹脂、水素型、１００−２００メッシュ、BioRad, Switzerland)に通して、陽イオンとタンパク質を除去した。結果として生じた試料の１μｌを、ステンレス鋼ターゲットプレートに適用し、１μｌのｓＤＨＢ基質とプレート上で混合した。１ｍｌのエタノール／１０ｍＭ 水溶性塩化ナトリウム１:１(ｖ／ｖ)中に、２ｍｇの２,５−ジヒドロキシ安息香酸と０．１ｍｇの５−メトキシサリチル酸を溶解することによってｓＤＨＢ基質を調製した。試料を空気乾燥させ、０．２μｌのエタノールを加え、最終的に試料を空気下で再結晶させた。
【０１３２】
質量スペクトルを得るために使用するＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析機はVoyager Elite (Perspective Biosystems)とした。計測機は線形構成で操作し、２０ｋＶの加速と８０ｎｓの遅延とした。オリゴ糖標準物質を用いた外的較正をイオンの質量決定に用いた。２００のレーザー発射のスペクトルを合計して、最終的なスペクトルを得た。 
精製した、単量体ヒト化抗体変異体は、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して、ＲａｊｉＢ細胞リンパ腫標的細胞上のヒトＣＤ２０への結合について試験した。
【０１３３】
ＣＤ１６−及びＣＤ５６-ポジティブ細胞についてのネガティブ選別濃縮に用いるために、新たに単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からヒトＮＫ細胞を単離した(MACS system, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Germany)。ＣＤ５６発現により測定される純度は８８〜９５％であった。新たに単離したＮＫ細胞は、カルシウム及びマグネシウムイオン(３×１０５細胞／ｍｌ)を含まないＰＢＳ中で３７℃、２０分間インキュベートし、ＮＫ細胞関連のＩｇＧを取り除いた。１０６細胞／ｍｌの細胞を、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ中、異なる濃度の抗ＣＤ２０抗体(０、０．１、０．３、１、３、１０μｇ／ｍｌ)でインキュベートした。いくつかの洗浄抗体の結合は、１:２００ＦＩＴＣコンジュゲートＦ(ａｂ')２ヤギ抗ヒト,Ｆ(ａｂ')２特異的ＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa./USA)と抗ヒトＣＤ５６-ＰＥ(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)と共にインキュベートすることによって検出した。抗ＦｃγＲＩＩＩＡ ３Ｇ８ Ｆ(ａｂ')２断片(Ancell, Bayport, Minn./USA)を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加して、抗体グリコ変異体(３μｇ／ｍｌ)の結合に競合させた。結合した抗体変異体に関する蛍光強度は、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ機(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)にてＣＤ５６ポジティブ細胞について決定した。ＣＨＯ細胞は、エレクトロポレーション(２８０Ｖ、９５０μＦ、０．４ｃｍ)によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｖａｌ１５８α-鎖およびγ-鎖のための発現ベクターにて形質移入した。６μｇ／ｍｌピューロマイシンの添加によって形質移入体を選択し、１０６細胞のために１０μｌのＦＩＴＣ−コンジュゲート−抗ＦｃγＲＩＩＩ３Ｇ８モノクローナル抗体(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)を用いたＦＡＣＳによって安定クローンを分析した。ＦｃγＲＩＩＩＡ-Ｖａ１１５８発現ＣＨＯ細胞に対するＩｇＧ１の結合は、ＮＫ細胞結合と同様に行った。
【０１３４】
ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体の重要な性質は、Cragg and Glennie, Blood, 103(7): 2738-2743 (2004)に定義されるようなＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であるということである。したがって、この目的のためにPolyak and Deans, Blood, 99(9): 3256-3262 (2002)に記載されるアッセイを用いたところ、ＣＤ２０への結合により、ＣＤ２０＋ヒト細胞の表面からのＣＤ２０の非イオン性界面活性剤抽出物に対して何らかの有意な耐性を誘導しなかった。米国公開特許２００５／０１２３５４６によると、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｃ２Ｂ８抗体(リツキシマブと同一の配列を有する他の抗ＣＤ２０抗体、米国公開特許２００３／０００３０９７、Reffを参照)よりも、ＣＤ２０の非イオン性界面活性剤抽出物に対してほとんど耐性を誘導しなかった。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に期待されるように、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１は何らかの有意な補体媒介性細胞溶解活性を有さなかったヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ホモタイプな凝集アッセイでは非常に強かった。このアッセイでは、ＣＤ２０ポジティブヒト細胞であるダウディ細胞を、１ｍｌ当たり１μｇの濃度の抗体、並行して１ｍｌ当たり５μｇの濃度の抗体と共に、哺乳動物細胞恒温糟中で５％ＣＯ２大気中、３７℃で最大２４時間、細胞培養培地中でインキュベートした。Ｃ２Ｂ８コントロール抗体の添加により誘導されたものよりも大きな凝集が報告された。さらに、抗ＣＤ２０ ＩＩ型である抗体と一致して、ＣＤ２０ポジティブヒト細胞が共にインキュベートされると、Ｃ２Ｂ８キメラＩｇＧ１抗体を用いた同一条件下のコントロールと比較して、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は高いレベルのアポトーシスを誘導したことが報告された。
【０１３５】
ヒト化抗体のグリコ操作変異体は、ＧｎＴＩＩＩグリコシルトランスフェラーゼと抗体遺伝子とを哺乳動物細胞において共に発現させることによって、作製した。国際公開２００４／０６５５４０(図１７−１９)に記載されたような、二分した非フコシル化オリゴ糖を含む抗体のＦｃ領域に付着した非フコシル化オリゴ糖の分画の増加が生じた。グリコ操作抗体は、非グリコ操作抗体及びＣ２Ｂ８抗体と比較して、有意に高いレベルのヒトＦｃγＲＩＩＩレセプターへの結合とＡＤＣＣ活性を有した。また、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、全血液アッセイにおいて、コントロールＣ２Ｂ８抗体よりもヒトＢ細胞枯渇の誘導に強力であった。これは、非グリコ操作Ｂ−Ｌｙ１抗体についてもそのグリコ操作バージョンについても事実であった。グリコ操作抗体は、全血液アッセイにおけるＢ細胞枯渇において、Ｃ２Ｂ８コントロール抗ＣＤ２０抗体よりもおよそ１０００倍強力であった。
【０１３６】
定常領域
可変領域配列のみによって同定される本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、該抗体を記載し、出典明記によって本明細書中に援用される上記の特許出願の何れかに開示される、定常領域と組み合わされる。一般的に、定常領域は軽鎖及び重鎖の定常領域からなり、抗体はＦｃを有する完全な抗体である。これらの配列はリーダー配列に連結されるのが好ましく、あるリーダー配列の例は米国公開特許２００５／００２５７６４の本文に示される。特定の抗体に応じて、任意のヒト定常領域アロタイプ鎖が用いられてよい。例えば、ＡＭＥ３３は、Ｆｃ領域内のアミノ酸置換を除き、米国公開特許２００５／００２５７６４の図１０および１１に示される軽鎖および重鎖の定常領域(本明細書中の配列番号：４１及び４２の下線を付した残基)を含んでもよい。特に、米国公開特許２００５／００２５７６４の図１１に示される重鎖定常領域は、Ｄ２８０Ｈ突然変異又はＫ２９０Ｓ突然変異を含みうる(図１１Ａは位置２８０および２９０を太字で示し、突然変異を持たない)。米国公開特許２００５／００２５７６４の図１１Ｂは、「ＧＡＣ」を太字かつ下線で示す。この「ＧＡＣ」は、Ｄ２８０Ｈ突然変異をコードするために「ＣＡＴ」に変えられてもよい。
【０１３７】
Ｖ．薬剤的製剤  
本発明にしたがって使用される抗体の治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、凍結乾燥又は水溶液の形態に調製されて保存される。製剤に関する一般的な情報については、Gilman et al. , (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press；A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.；Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York；Lieberman et al.., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York；及びLieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York、Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekkerを参照のこと。
【０１３８】
許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１３９】
例示的な抗ＣＤ２０抗体製剤は、開示内容のすべてが出典明記によって特別に本明細書中に援用される、本明細書中の背景技術の項において引用したものなどの、本明細書中の抗体を記載している前記の特許出願において記載されている。
皮下投与に適する凍結乾燥製剤は、例えば、米国特許第６２６７９５８(Andya et al.)において記述される。このような凍結乾燥製剤は適切な希釈液により高タンパク濃度に再編成され得、再編成された製剤は本明細書中において治療される哺乳動物の皮下に投与されてよい。
抗体の結晶化形態もまた考えられる。例えば米国特許公開公報第２００２／０１３６７１９号(Shenoy et al.)を参照。
【０１４０】
本明細書に記載の製剤はまた、二以上の活性化合物(上述したような第二の医薬)、好適には互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含みうる。このような医薬の種類及び有効量は、例えば製剤中に存在する抗ＣＤ２０抗体の量、被検体の臨床上のパラメーターに依存する。このような第二医薬の好適なものは上述したとおりである。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達システム(例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンの、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ-(メチルメタアシレート)マイクロカプセルに封入されうる。このような技術は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１４１】
本明細書において適切な持続放出調製物の例は、抗ＣＤ２０抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスを含み、該マトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニル酢酸塩、非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。  
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。これは、除菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
【０１４２】
ＶＩ．抗体による治療
本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は、患者を治療するために有効となる任意の用量で投与されてよい。当分野の通常の技術を有する医師は、しようする特定の抗ＣＤ２０抗体、使用する抗ＣＤ２０抗体について文献に公開された先の臨床経験、患者の特徴と病歴、ＲＡ及び関節損傷の種類と重症度、投与される他の医薬、及び予測される任意の副作用に応じて、必要とする薬剤組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで薬剤組成物に用いた抗ＣＤ２０抗体の用量から始め、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加してよい。所定の用量又は抗ＣＤ２０抗体の治療投薬計画の有効性は、例えば、ＲＡの標準的な有効性測定値を用いて、患者における兆候および症状を評価するおよび／または構造的損傷ないしはＸ線検査上の進行の阻害を評価することによって決定されてよい。
用量は、重量又は一定用量、好ましくは重量に関係なく一定用量によるものであってよい。加重用量の例は毎週３７５ｍｇ／ｍ２×４である。一般的な計画として、非経口的に投与される抗体の用量当たりの有効量は、一又は複数の用量によって、体重当たりの用量に換算しておよそ２０ｍｇからおよそ５０００ｍｇの範囲であろう。総用量は、およそ５０から４０００ｍｇ、好ましくはおよそ７５から３０００ｍｇ、より好ましくはおよそ１００から２０００ｍｇ、より好ましくはおよそ１００から１０００ｍｇ、より好ましくはおよそ１５０から１０００ｍｇ、より好ましくはおよそ２００から１０００ｍｇであり、およそ２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇおよび２０００ｍｇの用量を含む。これらの用量は、単回用量として、または、複数の用量、例えば２〜４の用量として投与されてよい。例えば、このような用量は注入されてもよい。より好ましくは、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は、単回用量として又は２回の用量としておよそ２００から１０００ｍｇの用量で投与される(好ましくは、用量は注入である)。より好ましい実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、およそ２００ｍｇ×１又は２、３００ｍｇ×１又は２、４００ｍｇ×１又は２、５００ｍｇ×１又は２、６００ｍｇ×１又は２、７００ｍｇ×１又は２、８００ｍｇ×１又は２、９００ｍｇ×１又は２、又は１０００ｍｇ×１又は２で投与される。２回の用量で投与される場合、一実施態様の薬剤は治療の開始の第１日目及び第１５日目に、好ましくは静脈内投与される。
好ましくは、複数用量の形式の場合には投薬の頻度は、およそ１か月の期間以内におよそ２〜４回の用量、又はおよそ２〜３週の期間以内におよそ２〜３回の用量である。
【０１４３】
しかしながら、上記したように、抗体のこれらの提案された量は多くの治療的選択に従う。上記のように、適切な用量および日程計画を選択する際の重要な因子は得られた結果である。例えば、相対的に高い用量は、進行中かつ急性のＲＡ又は関節損傷の治療のために最初に必要とされてよい。最も効果的な結果を得るために、抗体は、ＲＡ又は関節損傷の第一徴候、診断、出現ないしは発症のできるだけ近く、または、ＲＡ又は関節損傷の寛解の間に投与される。
本明細書中のすべての方法において、ＲＡは好ましくは早期又は初発のＲＡである。本明細書中の被検体又は患者は、リウマチ因子(ＲＦ)又は抗ＣＣＰ陽性又は陰性であってよい。これらの自己抗体は強く相関するが、ＲＡの異なる臨床サブセットを表しうる。好ましくは、被検体又は患者は、これらの自己抗体の一方または両方について陽性、最も好ましくは両方とも陽性である。
【０１４４】
本明細書中の記載されるすべての本発明の方法において、ネイキッド抗体のような抗ＣＤ２０抗体はコンジュゲートしていなくてもよいし、又は、例えば半減期を向上させるといった更なる有効性のために他の分子とコンジュゲートしてもよい。
本明細書中のすべての方法の他の実施態様では、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は、ＲＡ又は関節損傷を治療するために被検体に投与される唯一の医薬である。
代替態様では、上記したように、本明細書中の抗体と共に第二医薬を投与してもよい。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬学的製剤を用いての同時投与、および何れかの順番での連続的な投与が含まれ、両方(または全て)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を発揮する期間があることが好ましい。
【０１４５】
第二医薬には、例えば、免疫抑制剤、第一医薬以外のＣＤ２０に対する抗体(つまり抗ＣＤ２０抗体が第一医薬である)、サイトカインアンタゴニストのようなサイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト(例えば抗体)、副腎皮質ステロイド又はその何かの組合せが含まれる。このような第二医薬の種類は、ＲＡ又／又は関節損傷の種類、ＲＡ及び／又は関節損傷の重症度、被検体の状態と年齢、使用した第一医薬の種類と用量などの様々な因子に依存する。
そのような付加的な医薬の例として、免疫抑制剤(例として、ミトキサントロン(ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ(登録商標))、メトトレキセート、シクロホスファミド、クロランブシル、レフルノミドおよびアザチオプリン)、静脈性免疫グロブリン(γグロブリン)、リンパ球枯渇治療(例としてミトキサントロン、シクロホスファミド、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ抗体、抗ＣＤ４、クラドリビン、リツキシマブ、２Ｈ７抗体、自己応答性Ｂ細胞のＩｇレセプターによって特異的に認識される、脱免疫化、自己反応性抗原又はその断片を含有する少なくとも２つのドメインを有するポリペプチドコンストラクト(国際公開公報２００３／６８８２２)、全身照射、骨髄移植)、インテグリンアンタゴニスト又は抗体(例えば、Genentechから市販されているエファリズマブ／ＲＡＰＴＩＶＡ(登録商標)などのＬＦＡ-１抗体、又はBiogenから入手可能なナタリズマブ／ＡＮＴＥＧＲＥＮ(登録商標)などのα４インテグリン抗体、又は他の上記したもの)、本明細書中に記載のものなどのＲＡ及び／又は関節損傷の二次症状又は関連する症状を治療するための薬剤、ステロイド、例として副腎皮質ステロイド(例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、例として注射用ＳＯＬＵ-ＭＥＤＲＯＬ(登録商標) メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、低用量プレドニゾンなどのプレドニゾン、デキサメサゾン、又は、例えば全身性副腎皮質ステロイド治療を含む関節注射を介した糖質ステロイド)、非リンパ球枯渇性免疫抑制療法(例えばＭＭＦ又はシクロスポリン)、ＴＮＦαに対する抗体などのＴＮＦαインヒビター、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、血漿分離交換法又は血漿交換、トリメトプリム-スルファメトキサゾール(ＢＡＣＴＲＩＭＴＭ、ＳＥＰＴＲＡＴＭ)、ミコフェノール酸モフェチル、Ｈ２ブロッカー又はプロトンポンプインヒビター(潰瘍誘発の可能性がある免疫抑制療法の使用の間)、レボチロキシン、シクロスポリンＡ(例えばＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ(登録商標))、ソマタスタチンアナログ、ＤＭＡＲＤ又はＮＳＡＩＤ、抗体などのサイトカインアンタゴニスト、代謝拮抗物質、免疫抑制剤、リハビリ手術、放射性ヨード、甲状腺除去、抗ＩＬ-６レセプターアンタゴニスト／抗体(例えばＡＣＴＥＭＲＡＴＭ(トシリズマブ))、又はＢＲ３-Ｆｃのような他のＢ細胞アンタゴニスト、ＴＡＣＩ-Ｉｇ、抗ＢＲ３抗体、抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドをブロックする薬剤、エピラツズマブ(抗ＣＤ２２抗体)、ルミリキシマブ(抗ＣＤ２３抗体)、又はリツキシマブ以外のヒトＣＤ２０に対する抗体、又は２Ｈ７抗体などの本明細書中で用いられる抗ＣＤ２０抗体などがある。
【０１４６】
好適なこのような医薬には、γグロブリン、インテグリンアンタゴニスト、抗ＣＤ４、クラドリビン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール、Ｈ２遮断薬、プロトンポンプ阻害剤、シクロスポリン、ＴＮＦ−α阻害薬、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ(例えば、筋骨格系症状を治療するため)、レボチロキシン、サイトカインアンタゴニスト(サイトカインレセプターアンタゴニストを含む)、アンチメタボライ、免疫抑制剤、例えばＭＴＸ又は副腎皮質ステロイド、ビスホスホネート、およびＢ細胞表面マーカーに対する他のアンタゴニスト、例えばＣＤ２０に対する小分子、ＣＤ２２抗体、ＢＲ３抗体、ルミリキシマブ(抗ＣＤ２３抗体)、ＢＲ３-Ｆｃ又はＴＡＣＩ-Ｉｇが含まれる。
より好適な前記医薬は、免疫抑制剤、例えばＭＴＸ又は副腎皮質ステロイド、ＤＭＡＲＤ、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート又はこれらの組合せである。
【０１４７】
ある具体的な好適な実施態様では、第二医薬はＤＭＡＲＤであり、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、注射用のゴールド、経口用のゴールド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシンおよびＭＴＸからなる群から好ましくは選択される。
別の実施態様では、第二医薬はＮＳＡＩＤであり、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラクおよびインドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンからなる群から好ましくは選択される。
このような更なる実施態様では、第二医薬は、免疫抑制剤であり、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリン、ＭＴＸおよびシクロホスファミドからなる群から好ましくは選択される。
他の好適な実施態様では、第二医薬は、抗α４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット(kinaret)、エファリズマブ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ-Ｆｃ、抗ＲＡＮＫＬ、パミドロネート(パミドロン酸)、アレンドロネート、アクトネル、ゾレンドロネート、リツキシマブ、２Ｈ７抗体、クロドロネート、ＭＴＸ、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、ＳＳＺ、プレドニソロン、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンからなる群から選択される。
より好適な実施態様では、第二医薬は、ＭＴＸ、インフリキシマブ、ＭＴＸとインフリキシマブの組合せ、エタネルセプト、副腎皮質ステロイド、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、ＭＴＸおよびＳＳＺとプレドニソロンの組合せ、ＳＳＺおよびＨＣＱとＭＴＸの組合せ、アザチオプリンおよびＨＣＱとシクロホスファミドの組合せ、およびＭＴＸとアダリムマブの組合せからなる群から選択される。第二医薬が副腎皮質ステロイドである場合、好ましくは、プレドニゾン、プレドニソロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコーチゾン又はデキサメサゾンである。また、好ましくは、副腎皮質ステロイドは、抗ＣＤ２０抗体が副腎皮質ステロイドにて治療される被検体に投与されない場合に用いられるよりも低い量で、投与される。最も好ましくは、第二医薬はＭＴＸである。
【０１４８】
これらすべての第二の医薬は、第一の医薬とともに互いにないしはそれら自体で組み合わせて用いてもよく、したがって、本明細書で用いる「第二医薬」なる表現は、それぞれ第一医薬以外の唯一の医薬であることを意味するものではない。したがって、第二の医薬は一つの医薬である必要はないが、一つ以上の薬剤からなるか、一つ以上の薬剤を含有する。
本明細書中に記載の第二の医薬は一般に、ここに示したのと同じ用量および投与経路、またはここで用いられる用量の約１〜９９％量で用いられる。第二の医薬が多少なりとも用いられる場合、起こりうる副作用を除去するか減少するために、特に第一医薬の初回服用以降の後の投与において第一の医薬がない場合よりも少ない量で用いられるのが好ましい。
【０１４９】
本明細書において記載される再治療方法では、第二医薬が抗体曝露によって有効量投与される場合、例えば１回の曝露によって、又は２回以上の曝露によって、任意の回数の曝露によって投与されてもよい。一実施態様では、第二医薬は初回曝露によって投与される。他の実施態様では、第二医薬は初回及び第二の曝露によって投与される。より更なる実施態様では、第二医薬はすべての曝露によって投与される。ステロイドなどの初回曝露の後、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン及びシクロホスファミドなどの副作用を有する薬剤に被検体が曝されることを減少するために、このような第二の医薬の量を減少するか、用いないのが好ましい。
第二の医薬の併用投与には、別々の製剤又は単一の製剤を用いた共投与(同時投与)、及び好ましくは両(すべての)活性剤(医薬)が生物学的な活性を同時に示す期間があるような何れかの順番での連続投与が含まれる。
【０１５０】
本明細書中の抗ＣＤ２０抗体は任意の好適な方法、例えば非経口的、局所的、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び／又は、病巣内投与などによって投与される。非経口的注入には、筋肉内、静脈内(i.v.)、動脈内、腹腔内又は皮下(s.c.)の投与などがある。また、くも膜下腔内投与も考慮される(例えば、ＣＤ２０抗体のくも膜下腔デリバリーに関しては、米国公開公報２００２／０００９４４４(Grillo-Lopez)を参照)。加えて、抗ＣＤ２０抗体は、例えば漸減用量の抗ＣＤ２０抗体のパルス注入によって好適に投与されうる。好ましくは静脈内または皮下的に投与される。静脈内又は皮下の何れの投与であるかは、使用する抗ＣＤ２０抗体の種類、患者の病歴、特定の投薬および投薬計画などを含む多くの因子に依存するであろう。いくつかの症例においては、静脈内投与よりむしろ皮下投与により抗体が投与されるのが好ましい。
抗ＣＤ２０抗体の複数回の曝露が供給される場合、それぞれの曝露は同じまたは異なる投与方法を用いて供給されてもよい。一実施態様では、それぞれの曝露は静脈内投与による。他の実施態様では、それぞれの曝露は皮下投与による。更なる他の実施態様では、曝露は静脈内投与および皮下投与の両方による。
一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は静脈内パルスやボーラスでなくゆっくりとした静脈内注入で投与する。例えば、プレドニゾロン又はメチルプレドニゾロンなどのステロイド(例えば、およそ８０〜１２０ｍｇ静脈内投与、より具体的にはおよそ１００ｍｇ静脈内投与)を任意の抗ＣＤ２０抗体の注入のおよそ３０分前に投与する。例えば、抗ＣＤ２０抗体は専用ラインを介して注入される。
【０１５１】
抗ＣＤ２０抗体への複数回の曝露の初回用量では、またはただ１回の用量を伴う曝露の場合の単回用量には、およそ５０ｍｇ／時間の速度で注入が開始されることが好ましい。例えば５０ｍｇ／時間の速度から最高およそ４００ｍｇ／時間までおよそ３０分ずつ上げていってもよい。しかしながら、被検体が注入関連の反応を感じている場合には、注入速度を、現行速度の半分、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間までに、低減するのが好ましい。このような用量の抗ＣＤ２０抗体の注入(例えばおよそ１０００ｍｇの総用量)は、およそ２５５分(４時間１５分)で完了するのが好ましい。場合によっては、被検体は、注入の開始前およそ３０分から６０分に、アセトアミノフェン／パラセタモール(例えばおよそ１ｇ)およびジフェンヒドラミンＨＣｌ(例えばおよそ５０ｍｇ又は同種の薬剤の等量用量)の予防治療を経口で受けることが好ましい。
抗ＣＤ２０抗体を複数回注入(用量)して総曝露を成す場合、この注入実施態様の第二またはそれ以降の抗ＣＤ２０抗体注入は、初回注入より速い速度で、例えばおよそ１００ｍｇ／時間で開始されるのが好ましい。この速度は、例えばおよそ１００ｍｇ／時間の速度から最高およそ４００ｍｇ／時間までおよそ３０分ずつ上げていってもよい。被検体が注入関連の反応を感じている場合には、注入速度を、現行速度の半分、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間までに、低減するのが好ましい。このような第二またはその後の用量の抗ＣＤ２０抗体の注入(例えばおよそ１０００ｍｇの総用量)は、およそ１９５分(３時間１５分)で完了するのが好ましい。
【０１５２】
上記のような従来の経路による本明細書中の一の抗ＣＤ２０抗体の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関しては、国際公開１９９６／０７３２１を参照のこと。
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために、インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０１５３】
現在好適なインビボでの核酸移入技術には、ウイルスベクター(アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)によるトランスフェクションが含まれる。場合によっては、標的細胞に特異的な薬剤、例えば標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどにより核酸供給源を提供するのが好ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関係する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の種類の細胞に対するキャプシドタンパク質ないしはその断片、循環への内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、並びに、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を上げるタンパク質は、ターゲティングのため及び／又は取込を促すために用いられてもよい。レセプターが媒介するエンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)、及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールは、例えばAnderson等, Science 256:808-813 (1992)及び国際公開１９９３／２５６７３により記載されている。
【０１５４】
抗ＣＤ２０抗体による処置に対して最も反応した患者集団が同定されると、本明細書中の抗体単独又は他の医薬との組合せを用いた処置により、その兆候又は症状を含む、ＲＡ又は関節損傷が改善される。例えば、このような処置により、第二薬剤(例えばＭＴＸなどの免疫抑制剤)のみを用いて処置された患者と比較して、ＡＣＲ測定においては改善がもたらされ、及び／又はＡＣＲにより測定された場合、目的とする反応が(部分的又は完全に、好ましくは完全に)もたらされる。さらに、本明細書中の抗体と少なくとも一の第二薬剤とを組合せることにより、好ましくは付加的な、より好ましくは相乗的な(すなわち、相加的なもの以上の)治療的有益性が患者にもたらされる。好ましくは、この併用方法において、第二薬剤の少なくとも一の投与と、本明細書中の抗体の少なくとも一の投与との間のタイミングは、約１か月又はそれ以下、好ましくは約２週間又はそれ以下である。
本明細書中の方法では、治療の成功は前述のように決定される。臨床上の改善は、圧痛又は腫脹関節の数を評価するか、患者の包括的な臨床評価を実行するか、赤血球沈降速度を評価するか、Ｃ反応性タンパク質レベルの量を評価するか、または、ＤＡＳ−２８、ＡＣＲ−２０、−５０又は−７０スコアなどの疾患活動性(疾患反応)の複合計測を使用することによって決定されるのが好ましい。
【０１５５】
本明細書中の治療方法のために、任意の工程には、投与工程後の処置に対する被検体の応答を試験して、応答のレベルがＲＡ又は関節損傷を治療するために有効であることを決定することが含まれる。例えば、ある工程には、場合によって、投与後に画像(Ｘ線検査および／またはＭＲＩ)スコアを試験して、投与前に得られた基準となる画像結果と比較して、変化したかそしてどの程度変化したかを測定することによって処置が有効であるか否かを決定することが含まれる。この試験は、投与後の様々な予定されたないしは予定されていない間隔で繰り返され、任意の部分的又は完全な寛解の維持を決定してもよい。
あるいは、本明細書中の方法は、投与前に被検体を試験し、一又は複数のバイオマーカー又は症状がＲＡ又は関節損傷について存在するか否かを見る工程を含む。他の方法では、ある工程には、例えば、被検体への抗体投与の前に、被検体の状態の原因、例えば主因として感染や悪性腫瘍を除外するために、先に詳述したような被検体の病歴を検査することが含まれうる。好ましくは、関節損傷は原発性(すなわち主要な疾患)であり、固形か液体かの腫瘍にかかわらず、感染又は悪性腫瘍に対して二次的などの、二次的なものではない。
【０１５６】
本明細書中のすべての方法の更なる実施態様では、被検体は、ＲＡを治療するための抗ＴＮＦ−α阻害薬、例えば抗ＴＮＦ−α又は抗ＴＮＦ−αレセプター抗体、又はＲＡないし関節損傷を治療するための免疫抑制剤(一又は複数)のような、リツキシマブ以外の一又は複数の薬剤(一又は複数)を以前に投与されたことがない、および／またはリツキシマブ以外のＢ細胞表面マーカーに対するアンタゴニストにより以前に処置されたことがない(例えば、２Ｈ７抗体又はＣＤ２２ないしＢＲ３抗体によって以前に処置されたことがない)。
この態様の具体的な実施態様では、被検体は、インテグリンアンタゴニスト、例えば抗α４インテグリン抗体又は副刺激モジュレーター、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、抗炎症剤、例えばＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤでＭＴＸ以外のもの、さらにアザチオプリン及び／又はレフルノミドを除き、治験薬を含む細胞枯渇治療(例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ２２、又はＢＬｙｓ／ＢＡＦＦ)、ベースラインの前２８日以内の生／弱毒化ワクチン、又はコルチコステロイド類、例えばベースライン前の４週間以内の関節内又は非経口グルココルチコイドにて、以前に処置されていない。
【０１５７】
さらに好ましくは、被検体は、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、ＤＭＡＲＤ、又はＮＳＡＩＤで処置されていない。より好ましくは、被検体は、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、又はＮＳＡＩＤで処置されていない。最も好ましくは、本明細書中の本発明のすべての方法では、被検体は、抗ＣＤ２０抗体の第一用量の投与の前に、免疫抑制剤にて処置されていない。
あるいは、被検体又は患者はリツキシマブを除く他の薬剤を以前に投与されており、一実施態様では、被検体又は患者はＲＡ又は関節損傷を治療するための薬剤に応答しなかった。被検体が非応答となりうる前記薬剤(リツキシマブ以外)には、例えば、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、鎮痛剤、又はＣＤ２０に対する抗体以外のＢ細胞表面マーカーに対するアンタゴニストが含まれる。好ましくは、Ｂ細胞表面マーカーに対するこのようなアンタゴニストは抗体又はイムノアドヘシンでなく、例えば、小分子阻害薬、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は拮抗性ペプチドである。より詳しくは、被検体が非応答となりうる薬剤には、免疫抑制剤、例えばＭＴＸ、ＤＭＡＲＤ又はＴＮＦα阻害薬が含まれる。
【０１５８】
先に示した方法の特に好ましい実施態様では、被検体は一又は複数の抗ＴＮＦ−α阻害薬に不十分な応答を表し、および／または、ＭＴＸは抗ＣＤ２０抗体とともに被検体に投与される。
他の実施態様では、被検体又は患者は、ＲＡ又は関節損傷のためのリツキシマブ以外の治療に応答する。
他の好適な態様では、被検体は、治療の基準値又は始まりより前にＭＴＸを投与された。より好ましくは、ＭＴＸはおよそ１０〜２５ｍｇ／週の用量で投与された。また、好ましくは、ＭＴＸは基準時前の少なくともおよそ１２週間投与され、より好ましくは、ＭＴＸは基準時前の４週間の間安定用量で投与された。他の実施態様では、ＭＴＸは経口的又は非経口的に投与された。
なお更なる態様では、リツキシマブに非応答であること以外に、被検体は、ＲＡ又は関節損傷を再発したか、あるいは最初の又はその後の本明細書中の抗ＣＤ２０抗体の暴露後を含む、上述した任意の方法で処置される前に、腎障害などの臓器損傷に罹っていてもよい。しかしながら、被検体は、リツキシマブ以外の任意の薬剤によりＲＡ又は関節損傷を再発していないのが好ましく、少なくとも最初の処置の前にこのような再発がないのがより好ましい。
【０１５９】
更なる態様では、被検体は、Ｂ細胞悪性腫瘍、固形腫瘍、血液系腫瘍、又は上皮内癌(切除又は治療された皮膚の基底細胞及び扁平細胞の細胞腫を除く)を含む悪性腫瘍を患っていない。
更なる実施態様では、被検体は、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫疾患、又はＲＡに対して二次的な重症の全身性病変(血管炎、肺線維症、又はフェルティ症候群を含むが、限定されるものではない)を患っていない。他の実施態様では、被検体は、ＲＡの機能状態のＡＣＲ分類により定められる機能的クラスＩＶを患っていない。さらなる実施態様では、被検体は、ＲＡ以外の炎症性関節疾患(痛風、反応性関節炎、乾癬性関節炎、血清反応陰性脊椎関節症、又はライム病を含むが、限定されるものではない)、又は他の全身性自己免疫疾患(ＳＬＥ、炎症性腸疾患、強皮症、炎症性筋疾患、混合性結合組織病、又は任意のオーバーラップ症候群を含むが、限定されるものではない)を患っていない。他の実施態様では、被検体は、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)、若年性ＲＡ(ＪＲＡ)、及び／又は１６才前のＲＡを患っていない。他の実施態様では、被検体は、重症の及び／又は制御できない心疾患又は肺疾患(閉塞性肺疾患を含む)、又は重症の合併症で、神経系、腎臓、肝臓、内分泌、又は胃腸の疾患を含むが、限定されないもの、ＨＩＶ感染の公知の病歴を含む、原発性又は続発性免疫不全(その病歴又は現在の活性)を患っていない。他の態様では、被検体は、任意の有効性評価に影響を与えるおそれのある、任意の神経(先天性又は後天性)、血管又は全身性の疾患、特に関節痛及び関節腫腸(例えば、パーキンソン病、脳性麻痺、又は糖尿病性神経障害)を患っていない。さらなる実施態様では、被検体はＭＳを患っていない。さらなる態様では、被検体は、ループス又はシェーグレン症候群を患っていない。さらなる他の態様では、被検体は、ＲＡ以外の自己免疫疾患を患っていない。本発明の他の態様では、被検体における任意の関節損傷は、自己免疫疾患又はＲＡ以外の自己免疫疾患に伴わないか、又は自己免疫疾患又はＲＡ以外の自己免疫疾患の発症の危険性を伴わない。 
他の実施態様では、被検体は、二次性のシェーグレン症候群又は二次性の限局性皮膚血管炎を有するが、その原発型を有さない。
【０１６０】
ＶＩＩ．製造品
本明細書において、上記のＲＡ又は関節損傷の治療に有用な材料を具備する製造品が提供される。。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。この態様では、パッケージ挿入物は容器上にあるか、ないしは容器に付随する。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、注射器などが含まれる容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、ＲＡ又は関節損傷の治療に有効である抗ＣＤ２０抗体を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は抗ＣＤ２０抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、抗体の用量と間隔及び提供される他の医薬に関する具体的な説明書きにより、組成物が治療にふさわしい被検体のＲＡ又は関節損傷を治療するために用いられることを示す。
更に、製造品は、薬学的に許容可能な希釈バッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備しうる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０１６１】
また、本発明のキット及び製造品は、組成物は患者がリツキシマブによる治療に応答しない場合にＲＡ又は関節損傷を治療するために用いられることを示す、例えばパッケージ挿入物又はラベルの形態の情報を含む。挿入物又はラベルは、紙又は電子メディア、例えば磁気的に記録されたメディア(例えばフロッピーディスク)又はＣＤ−ＲＯＭなどの任意の形態でよい。また、ラベル又は挿入物は、キット又は製造品中の薬剤組成物および用量様式に関する他の情報を含んでもよい。
一般に、このような情報は、患者および医師が効果的かつ安全に同封の薬剤組成物および用量様式を使用するのを援助する。例えば、抗体に関する、薬物動態学、薬力学、臨床研究、有効性パラメーター、指標および使用、禁忌、警告、予防措置、有害反応、過剰投与、適当な用量および投与、供給される方法、適当な貯蔵条件、比較および特許情報などの情報は、挿入物に示されてよい。
【０１６２】
本発明の特定の実施態様は、本明細書中の一の抗ＣＤ２０抗体を含む薬剤組成物と、薬学的に受容可能な担体と、薬剤組成物がリツキシマブ治療に応答しないＲＡ患者の治療に用いられることを記しているラベルを一緒に内包して具備する製造品である。同じラベルは関節損傷患者の治療に応用される。
好適な実施態様では、本明細書中の製造品は更に、第二医薬を収容する容器を具備し、このとき抗体は第一医薬であり、製造品は更に有効量の第二医薬による患者の治療についてのパッケージ挿入物上の指示を具備する。第二医薬は上記のものの何れかでよく、例示的な第二医薬は、免疫抑制剤、副腎皮質ステロイド、ＤＭＡＲＤ、第一医薬とは異なるＣＤ２０に対する抗体、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホネート、又はこれらの組合せを含む上記のものであり、より好ましくはＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト又は免疫抑制剤である。最も好ましくは、第二医薬はＭＴＸである。
他の態様では、本発明は、本明細書中の抗ＣＤ２０抗体又はその薬剤組成物の製造方法であって、抗体ないしは薬剤組成物と、抗ＣＤ２０抗体又は薬剤組成物がリツキシマブに応答しないＲＡないし関節損傷患者の治療に用いられることを記しているラベルとをパッケージ内に組み合わせることを含む方法を提供する。
【０１６３】
ＶＩＩＩ．宣伝方法
本発明には、本明細書中の一の抗ＣＤ２０抗体の薬学的に許容可能な組成物の宣伝方法であって、標的とする視聴者に対し、リツキシマブに応答しないＲＡ又は関節損傷を有する患者を治療するために、有効量の組成物の使用を促すことを含む方法も含まれる。
宣伝は、通常、スポンサーが特定されてメッセージがコントロールされる非個人的媒体を通した有料の通信である。ここでの目的のための宣伝には、公報、広告、製品の提供、後援、査定、及び販売促進が含まれる。この用語にはまた、多くの対象者に訴えて、本発明の購入、後援、又は承認の好ましいパターンに向かって、説得、通知、促進、動機付け又はそれ以外の方法で行動させるように設定された、いずれかの活字媒体に登場するスポンサーによる情報の公示を含む。
【０１６４】
本明細書中の治療方法の宣伝及び促進は、いずれの手段で行ってもよい。これらのメッセージを伝えるために使用される宣伝媒体の例には、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット及び看板が含まれ、電波媒体に登場するメッセージであるコマーシャルも含まれる。宣伝には、食品カートの座部、空港の通路の壁、及びバスの側面上の広告、電話の保留中に流れるメッセージで流れる広告、店舗のＰＡシステムや、目に見えるか耳に聞こえる通信が行われるあらゆる場所も含まれる。 促進又は宣伝の具体的な手段の例は、テレビ、ラジオ、映画、ウェブキャスト及びウェビナー等のインターネット、同時に複数のユーザーと通信することを意図した双方向性のコンピューターネットワーク、固定の又は電子看板及びその他公の表示、ポスター、雑誌及び新聞のような伝統的又は電子的文献、例えばｅメール、電話、インスタントメッセージ、郵便、宅配便、一括送信メール、キャリアメール(carrier mail)、個人的訪問等によるその他のメディア出口、提示又は個人的接触を含む。
使用する広告の種類は、例えば、届ける標的対象者の性質、例えば病院、保険会社、クリニック、医師、看護婦および患者、並びに費用検討および医薬及び診断薬の宣伝を統括する関連する管轄法律及び規則に依存するであろう。広告は、役務相互作用及び／又は使用者の統計及び地理的場所などの他のデータによって明確化される使用者の特徴に基づいて個々に区別されるか又はカスタマイズされてもよい。
【０１６５】
本発明に関する技術分野において利用可能な例えばマニュアル、教科書及びウェブサイトに記載されるような、当分野で公知の多くの代替的実験方法は、本発明の実施において本明細書中に具体的に記載される方法と上手く置き換えられてよい(例えば、Using Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, E. and Lane, D., eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1999)；Roe et. al., DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series) (John Wiley & Sons, 1996)；Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins, Abelson et al., eds. (Academic Press, 2000)；Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, by Sambrook and MacCallum, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et. al., eds. (John Wiley & Sons, 1987)および定期的更新；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994)；Current Protocols in Protein Science, Coligan, ed. (John Wiley & Sons, 2003)；及びMethods inEnzymology: Guide to Protein Purification, Vol. 182, Deutscher, ed. (Academic Press, Inc., 1990))。
さらに、本発明の詳細は、以下の非限定的な実施例により例示される。本明細書中のすべての引用の開示内容は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１６６】
実施例１  リツキシマブ抵抗性ＲＡの治療
リツキシマブに十分に応答しない活動中のＲＡをもつ患者を他の抗ＣＤ２０抗体にて治療する。このとき、この抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブ、ベルツズマブ、配列番号：１１を有する免疫薬剤(すなわちＴＲＵ-０１５)、ＣＤ２０-結合抗体(すなわちＡＭＥ３３、ＡＭＥ１３３又はＡＭＥ１３３ｖ)、又はＧＡ１０１である。
この実施例に記載の治療の候補には、毒性又は有効性が不十分であるためにリツキシマブによる過去又は現在の治療に十分に応答しなかった者が含まれる。過去又は現在の治療において、リツキシマブは各１ｇの１ないし２の用量で患者に投与される。２用量である場合、２週間おいて投与される。
患者は、スクリーニング及びランダム化時に、腫脹関節計数(ＳＪＣ)≧８(６６関節計数)、および疼痛関節計数(ＴＪＣ)≧８(６８関節計数)、Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)≧１．５ｍｇ／ｄｌ(１５ｍｇ／Ｌ)又は赤血球沈降速度(ＥＳＲ)≧２８ｍｍ／ｈの何れか、および／または中央の読み取り部位によって定まるＲＡに起因する明確な浸食を有する少なくとも一つの関節のＸ線検査所見(手、手首又は足のいずれかの関節は、手の遠位性指節間関節(ＤＩＰ)関節を除いて考慮されてよい)を有しうる。
【０１６７】
患者は、１００ｍｇ×１−４、２００ｍｇ×１−４、３００×１−４、４００ｍｇ×１−４、５００ｍｇ×１−４、６００ｍｇ×１−４、７００ｍｇ×１−４、８００ｍｇ×１−４、９００ｍｇ×１−４、１０００ｍｇ×１−４又は２０００ｍｇ×１−４から選択される投薬計画を用いて、オファツムマブ、ベルツズマブ、ＴＲＵ-０１５、ＡＭＥ３３、ＡＭＥ１３３、ＡＭＥ１３３ｖ、又はＧＡ１０１にて治療される。複数用量は、一か月内で１、２週間あけて投与する。
また、患者は、抗ＣＤ２０抗体の注入の３０分前のメチルプレドニゾロン１００ｍｇ静注と、第２−７日目に６０ｍｇ経口、第８−１４日目に３０ｍｇ経口、１６日目まで基準用量に戻すプレドニゾンからなる副腎皮質ステロイド投薬計画と共に、同時のＭＴＸ(経口(p.o.)又は非経口につき１０−２５ｍｇ／週)を摂取してもよい。また、患者は、単回用量か又は日当たりの分量として投与される葉酸塩(５ｍｇ／週)を摂取してもよい。患者は、場合によって、治療期間全体にわたって任意のバックグラウンド量の副腎皮質ステロイド(≦１０ｍｇ／ｄのプレドニゾン又は等価物)を摂取し続ける。また、患者は、抗ＣＤ２０抗体と共にリツキシマブ(例えば１ｇ×１−２のリツキシマブ(２用量の場合には１週間おき))を摂取してもよい。
【０１６８】
一次エンドポイントは、グループ差を比較してＲＦ及び領域について調整するために、Cochran-Mantel-Haenszel(ＣＭＨ)検査を用いて第２４週にＡＣＲ２０反応を有する患者の割合としてもよい。  
潜在的な二次エンドポイントは以下を含む。 
１．第２４週にＡＣＲ５０及び７０反応を有する患者の割合。一次エンドポイントのために特定されるように、分析してもよい。 
２．第２４週目までのスクリーニングからの疾患活性スコア(ＤＡＳ)の変化。これらは、基本のＤＡＳ、ＲＦ及び治療をモデルの条件として有するＡＮＯＶＡモデルを用いて評価してもよい。
３．第２４週での分類別のＤＡＳ応答者(ＥＵＬＡＲ反応)。ＲＦについて調整したＣＭＨ試験を用いて評価してもよい。
４．ＡＣＲコアセット(ＳＪＣ、ＴＪＣ、患者の及び医師のグローバル評価、健康状態質問票(ＨＡＱ)、疼痛、ＣＲＰ及びＥＳＲ)のスクリーニングからの変化。これらのパラメータについて記述統計学を報告してもよい。
５．ＳＦ−３６のスクリーニングからの変化。８つの領域スコア及び精神的及び物理的な成分スコアについて記述統計学を報告してもよい。加えて、精神的及び物理的な成分スコアを、更に分類及び分析してもよい。
６．変更ＳｈａｒｐＸ線撮影総スコア(Sharp radiographic total score)、侵食スコア(erosion score)及び関節空間狭小化スコア(joint space narrowing score)の変化。これらは連続的又は分類別の方法論を用いて適当に分析してもよい。
【０１６９】
試験エンドポイントおよび分析。 
第８、１２、１６、２０、２４週及びそれ以降にわたるＤＡＳ反応の変化及びＡＣＲ(２０／５０／７０及びＡＣＲ  ｎ)を、二元又は連続した繰り返し計測モデルを用いて適当に評価するであろう。第２４週及びそれ以降に侵食性の進行がない患者の割合を含む試験的なＸ線撮影分析を評価してもよい。
更に、試験的エンドポイント(例えば、明らかな臨床反応、疾患のない期間)を延長した観察期間の一部として記述的に分析するであろう。  ＦＡＣＩＴ−Ｆ作業(FACIT-F fatigue)のスクリーニングからの変化を記述的統計学によって分析するであろう。 
上記のリツキシマブ療法に対して十分に反応しないＲＡ患者は、上記のようなオファツムマブ、ベルツズマブ、ＴＲＵ-０１５、ＡＭＥ３３、ＡＭＥ１３３、ＡＭＥ１３３ｖ又はＧＡ１０１にて治療されると、本明細書において示すエンドポイントのいずれか一又は複数に従って有益な臨床効果を表すことが予測される。
【配列表】
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【国際調査報告】
2011507897.tif 000046
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