(57)【要約】本発明は、１つまたは複数の欠失；天然アミノ酸、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体（ペプチド結合イソスターを含む）による付加および／または置換；アミノ酸延長部分；および／または、例えばポリエチレングリコールおよび疎水性酸などの他の化学部分を含むＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体を提供する。ＣＮＰ変異体は、例えば、骨格異形成症および軟骨無形成症などの骨関連障害、ならびに、例えば、再狭窄およびアテローム動脈硬化症などの血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに反応性を示す疾患の治療用の治療薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、以下の式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５０）［式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分；腎クリアランスを減少させる部分；親水性ポリマー；１つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列；炭水化物；疎水性酸；およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは天然アミノ酸、非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体であり、前記Ｐｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位がハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているか、あるいは前記Ｐｈｅ類似体の前記ベンゼン環が他のアリール基またはヘテロアリール基で置換されている、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ），Ａｓｎおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択される］
を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体であって、
ＣＮＰ−５３でない、ＣＮＰ変異体。
【請求項２】
（ｂ）がＣｙｓであり、
（ｃ）がＰｈｅであり、
（ｄ）がＧｌｙであり、
（ｅ）がＬｅｕであり、
（ｇ）がＬｅｕであり、
（ｈ）がＩｌｅであり、
（ｉ）がＧｌｙであり、
（ｊ）がＭｅｔであり、
（ｋ）がＬｅｕである、
請求項１に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３】
（ａ）および（ｆ）が独立にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、請求項１または２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項４】
（ａ）がＡｒｇであり、（ｆ）がＬｙｓまたはＡｒｇである、請求項３に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項５】
前記ペプチド結合イソスターが
−ＣＨ２−ＮＨ−；
アミド基が次のＲ基：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−；
−ＣＨ２−Ｓ−；
ｎが１または２である−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−；
−ＣＨ２−ＣＨ２−；
−ＣＨ＝ＣＨ−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−；
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−；および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項６】
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、以下の式：
（ｘ）−（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｆ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４２）［式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分；腎クリアランスを減少させる部分；親水性ポリマー；１つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列；炭水化物；疎水性酸；およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
（ｙ）は、非存在であってよく、あるいはＣＮＰ−２２の１〜５位に対応する配列Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５のうちの１〜５個のアミノ酸であり、これらの５アミノ酸のいずれが天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で、場合によって置換されていてもよい１〜５個のアミノ酸を含んでいてよく、
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよい］
を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体であって、
ＣＮＰ−５３でない、ＣＮＰ変異体。
【請求項７】
（ｙ）がＣＮＰ−２２のＬｙｓ４に対応する位置にＬｙｓでなく、Ａｒｇを含む、請求項６に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項８】
（ｆ）がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、請求項６または７に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項９】
前記骨もしくは軟骨ターゲティング部分が、ビスホスホネート；ヒドロキシアパタイト；グルコサミン；Ｘ型コラーゲン；ポリＡｓｐ；ポリＧｌｕ；ならびにオステオクリン、オステポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の骨ターゲティングドメイン由来のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１０】
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下で負に荷電する少なくとも１つの官能基を含む親水性ポリマーである、請求項１から９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１１】
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下でカルボキシル基（複数可）、硫酸基（複数可）、リン酸基（複数可）またはその組合せを生成する官能基（複数可）を含むポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーである、請求項１０に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１２】
前記親水性ポリマーがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーまたはその誘導体である、請求項１から１１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１３】
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が約０．４ｋＤａ〜約２．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する、請求項１２に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１４】
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が約０．６ｋＤａ〜約１．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する、請求項１３に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１５】
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が単分散性である、請求項１２から１４のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１６】
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチド由来であり、前記アミノ酸配列が、前記ナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／または置換（複数可）を場合によって含んでいてよい、請求項１から１５のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１７】
前記ナトリウム利尿ポリペプチドが、ＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ＮＰＰＡ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂ（ＮＰＰＢ）からなる群から選択される、請求項１６に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１８】
前記非ナトリウム利尿ポリペプチドが、アルブミン、免疫グロブリン、ヒスチンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）からなる群から選択される、請求項１６に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項１９】
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａの機能的ドメイン由来である、請求項１８に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２０】
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列が１〜４０個のアミノ酸を含む、請求項１から１９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列が１〜２０個のアミノ酸を含む、請求項２０に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２２】
前記疎水性酸が天然脂肪酸および線状または分枝、飽和または不飽和Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸からなる群から選択される、請求項１から２１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２３】
（ｘ）が１〜２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である、請求項１から２２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２４】
（ｘ）が、ＣＮＰ−２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前の位置に２つの連続する塩基性アミノ酸を含まない、請求項２３に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２５】
（ｘ）のＮ末端がＧｌｙで終わる、請求項２３または２４に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２６】
ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が前記変異体のＮ末端に結合しており、前記変異体が、１つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸配列を含む（ｘ）基を含んでいても、含んでいなくてもよい、請求項１から２５のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２７】
ＣＮＰ−２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前にＡｒｇ残基を含む、請求項１から２６のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項２８】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド２２（ＣＮＰ−２２）（配列番号１）活性を保持しており、ＣＮＰ−２２と比較して循環中で少なくとも５倍長い半減期を示す、ＣＮＰ−２２の変異体であって、
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、
配列番号１のアミノ酸６〜２２と少なくとも７０％相同のアミノ酸配列を含み、
ＣＮＰ−５３でない、
ＣＮＰ−２２の変異体。
【請求項２９】
アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンまたはナトリウム利尿ペプチドのうちの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２８に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３０】
前記ナトリウム利尿ペプチドがＡＮＰ、ＢＮＰまたはＣＮＰ−５３である、請求項２９に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３１】
ＣＮＰ−５３（配列番号４）のアミノ酸１〜３２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項３０に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３２】
親水性ポリマーを含む、請求項２８に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３３】
前記親水性ポリマーがＰＥＧである、請求項３２に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３４】
明細書における表１、２、３および４（配列番号１〜６および配列番号３４〜１４４）に記載の以下のＣＮＰ変異体：
Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；および
ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（配列番号１４４）
からなる群から選択され、
ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−１７、ＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３またはＡＮＰでない、
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
【請求項３５】
Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（類似体ＡＺ）（配列番号４１）；
ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（類似体ＡＹ）（配列番号３６）；
ＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＡ）（配列番号６１）；
ＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＢ）（配列番号６２）；
ＤＬＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＣ）（配列番号６３）；
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＦ）（配列番号７９）；
ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（ＣＮＰ３７、類似体ＢＬ）（配列番号６０）；
ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（類似体ＤＢ）（配列番号７５）；
ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＥ）（配列番号８１）；
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＱ）（配列番号７６）；
ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＰＫ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＳ）（配列番号７１）；
ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＱＫ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＴ）（配列番号１３０）；
ＧＡＨＨＰＨＥＨＤＴＨＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＲ）（配列番号７７）；
ＧＱＴＨＳＳＧＴＱＳＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（類似体ＣＮ）（配列番号８７）；
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＮＰ１７−ＫＶＬＲＲＨ（類似体ＣＤ）（配列番号６８）；
ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（配列番号１４４）；
ＰＥＧ１Ｋ−ＣＮＰ２２（配列番号１）；
ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２２（配列番号１）；
ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）；
ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）；
ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）；
ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）；
ＰＥＧ１Ｋ−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）；および
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）
からなる群から選択される、請求項３４に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３６】
（ａ）親水性ポリマー、および
（ｂ）ＣＮＰ２２（配列番号１）、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）、またはＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）のいずれか
を含み、
前記親水性ポリマーがＮ末端、Ｃ末端もしくは内部部位、またはそれらの組合せにおいてペプチドに結合している、
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
【請求項３７】
ＣＮＰ−２２のＣｙｓ６およびＣｙｓ２２に対応する位置の残基間におけるジスルフィド結合により形成された環状構造を有する、請求項１から３６のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３８】
約８．０〜約１０．５の範囲のｐＩを有する、請求項１から３７のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項３９】
約８．５〜約１０．０の範囲のｐＩを有する、請求項３８に記載のＣＮＰ変異体。
【請求項４０】
約２．８ｋＤａ〜約６．０ｋＤａの範囲の総質量を有する、請求項１から３９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項４１】
中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）切断に対する感受性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて野生型ＣＮＰ−２２より少なくとも２倍長い半減期を有する、請求項１から４０のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項４２】
野生型ＣＮＰ−２２の同じ濃度のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する、請求項１から４１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
【請求項４３】
請求項１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルド症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト（Kniest）異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症からなる群から選択される骨格異形成症の治療用の医薬の調製における請求項１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体の使用。
【請求項４５】
前記骨格異形成症が軟骨無形成症である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性水腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療用の医薬の調製における請求項１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００７年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／９８９，４９７号、および２００８年６月１３日に出願されたに米国仮特許出願第６１／０６１，４８８号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／９８９，４９７号および同第６１／０６１，４８８号のそれぞれの開示は、その全体が、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、一般的に、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体、ＣＮＰ変異体を含む組成物、ならびに骨格異形成症（例えば、軟骨無形成症）などの骨関連障害および血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに反応性を示す障害を治療するためのＣＮＰ変異体を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、次の３つの構造的に関連するペプチドからなっている：心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿００６１６３、ＡＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＡ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿００２１５、ＢＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＢ）およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（非特許文献１、（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿０７７７２０、ＣＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＣ）（Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１０巻、９０７〜９１２頁（１９９２年））。これらの小さい一本鎖ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）は、１７アミノ酸ループ構造を有し（Ｌｅｖｉｎら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３９巻、８６３〜８７０頁（１９９８年））、複数の生物学的過程において重要な役割を有する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣ−Ａ）とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルをもたらす。同様に、ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）と相互作用して、ｃＧＭＰの産生を刺激する（非特許文献２）。第３のタイプの受容体ＮＰＲ−Ｃは、ナトリウム利尿ペプチドのそれぞれに高い親和力で結合し、細胞外コンパートメントからペプチドを捕捉するために主として機能し、上記ペプチドをリソソーム内に蓄積させ、そこでそれらが分解される（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻、６７５〜６７８頁（１９８７年））。ＡＮＰおよびＢＮＰは、主として心臓の筋肉細胞内で産生され、心血管恒常性に重要な役割を有すると考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻、１２０〜１２３頁（１９９１年））。ＣＮＰは、中枢神経系内、生殖器官内、骨内および血管内皮内を含めた、より広い範囲で発現される（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトにおいて、ＣＮＰは、最初にナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）遺伝子により一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドとして産生される（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１６８巻、８６３〜８７０頁（１９９０年））。シグナルペプチドの除去により、プロＣＮＰが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生成し、これが分泌され、未知の酵素による切断を再び受けて、成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−２２）が生成する（Ｗｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７８巻、２５８４７〜８５２頁（２００３年））。ＣＮＰ−５３とＣＮＰ−２２は、それらの分布が異なり、ＣＮＰ−５３は組織中で優勢であるが、ＣＮＰ−２２は主として血漿および脳脊髄液中に認められる（Ｊ．  Ａｌｆｏｎｚｏ、Ｒｅｃｅｐｔ．  Ｓｉｇｎａｌ．  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．  Ｒｅｓ．、２６巻、２６９〜２９７頁（２００６年））。軟骨中の優勢なＣＮＰの形は不明である。ＣＮＰ−５３とＣＮＰ−２２は、両方ともＮＰＲ−Ｂに同様に結合する。さらに、それらは両方とも用量依存的かつ同様の様態でｃＧＭＰの産生を誘導する（ＶＴ  Ｙｅｕｎｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１７巻、１０１〜１０６頁（１９９６年））。
【０００５】
天然ＣＮＰ遺伝子およびポリペプチドは、以前に記載された。米国特許第５，３５２，７７０号は、ヒトＣＮＰと配列が同一のブタ脳から分離され、精製されたＣＮＰ−２２および心血管適応症の治療におけるその使用を開示している。米国特許第６，０３４，２３１号は、プロＣＮＰ（１２６アミノ酸）のヒト遺伝子およびポリペプチドならびにヒトＣＮＰ−５３の遺伝子およびポリペプチドを開示している。
【０００６】
細胞外間隙からのＣＮＰのクリアランスは、ＣＮＰを速やかに分解する、膜結合中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）の作用（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２９１巻（Ｐｔ１）、８３〜８８頁（１９９３年））と、ＣＮＰに結合し、かつＣＮＰをリソソーム中に蓄積させる（そこでＣＮＰが分解される）ＮＰＲ−Ｃとを介して起こる。ＣＮＰは、正常人において２．６分のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することが示された（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、７８巻、１４２８〜３５頁（１９９４））。ＣＮＰの血漿濃度が低いこと（Ｊ．  Ｂｏｎｅ．  Ｍｏｎｅｒ．  Ｒｅｓ．、１９（補１）巻、Ｓ２０頁（２００４年））および多くの組織においてそれがＮＰＲ−Ｂと共発現することから、ＣＮＰは、主としてオートクリン／パラクリンメカニズムにより機能することが示唆される。
【０００７】
上述のように、ＣＮＰは、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルをもたらす。ｃＧＭＰの産生により媒介される下流シグナリングは、軟骨内骨化を含む種々の生物学的過程に影響を及ぼす。したがって、この経路におけるいずれかの成分の上昇または抑制は、異常な骨成長につながる可能性がある。例えば、マウスモデルにおけるＣＮＰまたはＮＰＲ−Ｂのノックアウトは、より短縮した長骨および椎骨を伴う矮小化表現型を有する動物をもたらす。適切なＣＮＰシグナリングを遮断するヒトＮＰＲ−Ｂの突然変異が同定され、小人症をもたらす（Ｏｌｎｅｙら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、９１巻（４号）、１２２９〜１２３２頁（２００６年）、Ｂａｒｔｅｌｓら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、７５巻、２７〜３４頁（２００４年））。これに対して、ＣＮＰのレベルの上昇をもたらすように遺伝子工学により改変したマウスは、延長した長骨および椎骨を示す。
【０００８】
軟骨無形成症は、軟骨形成の異常を引き起こす、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）の遺伝子における常染色体優性突然変異の結果である。ＦＧＦＲ−３は、通常、軟骨細胞の成長、そして、したがって、骨の成長に対する負の調節効果を有する。軟骨無形成症において、ＦＧＦＲ−３の突然変異形は、構成的に活性であり、骨の著しい短縮をもたらす。軟骨細胞の増殖および分化は、妨げられ、著しく短い成長板軟骨につながる（Ｐ．  Ｋｒｅｊｃｉら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１８巻、５０８９〜５１００頁（２００５年））。軟骨内骨化は、長骨の縦方向の成長を調節する過程である。成長板には、静止、増殖、肥大および石灰化帯という４つの帯域が存在する。成長板において、ＮＰＲ−Ｂは増殖性細胞により発現されるが、ＮＰＲ−Ｃは肥大性細胞により発現される（Ｙａｍａｓｈｉｔｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２７巻、１７７〜１７９頁（２０００年））。正常な軟骨内骨成長において、軟骨細胞は、柱に組織化し、成長板の増殖帯において増殖する。これらの柱は、軟骨無形成症患者では組織崩壊している。さらに、肥大帯は、細胞が大きくなり、最終的にアポトーシスされ（溶解し）、骨細胞の侵入および鉱質化につながる場所である。肥大軟骨細胞および肥大帯の全体的な大きさは、軟骨無形成症患者において正常患者よりはるかに小さい。ＣＮＰは、軟骨細胞および骨の成長の正の調節因子であるＮＰＲ−Ｂのアゴニストである。ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂの下流シグナリングは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のレベルにおけるＦＧＦＲ−３経路を阻害する。ＭＡＰＫにおける阻害は、成長板の増殖帯および肥大帯における軟骨細胞の増殖および分化を促進し、骨の成長をもたらす。
【０００９】
ヒトにおいて、ＦＧＦＲ−３の活性化突然変異が遺伝的小人症の主な原因である。活性化ＦＧＦＲ−３を有するマウスは、骨格異形成の最も一般的な形である軟骨無形成症のモデルとしての役割を果たし、ＣＮＰの過剰発現は、これらの動物を小人症から救出するものである。したがって、ＣＮＰおよびＣＮＰの機能的変異体は、種々の骨格異形成の治療のための可能な治療薬である。
【００１０】
ＣＮＰの治療における使用は、ヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで２．６分であることが示された（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、７８巻、１４２８〜３５頁（１９９４年））、その短い血漿半減期により現在のところ制限されている。ヒト血漿中に一般的に認められる内在性レベル（約５ｐＭ）以上にＣＮＰ濃度を高くするために、全身投与ＣＮＰを用いたすべてのヒトおよび動物試験において持続注入が必要であった。より長いｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を有し、野生型ＣＮＰと同様または改善された活性を示すＣＮＰ変異体は、持続可能な治療戦略のために重要である。ＣＮＰの半減期をヒト血漿中において短縮させる２つのメカニズムは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）による分解およびナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）によるクリアランスである（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ．  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．、１６巻、Ｓ６〜Ｓ１４頁（２００６年））。ペプチドの改変により、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼ切断に対する抵抗性を改善することができると報告されている（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、３０巻、３５１〜３６７頁（２００６年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、６３８〜６４２頁（２００６年））。
【００１１】
ＣＮＰの種々の類似体および誘導体の生物学的活性が評価された。Ｃｙｓ６およびＣｙｓ２２の代わりにＳ−メチルＣｙｓを用いることにより、Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ２２ジスルフィド結合によるペプチドの環化が、ｃＧＭＰの産生の刺激におけるＣＮＰの活性に重要であることが報告により示された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、１８３巻、９６４〜９６９頁（１９９２年）、ＣＮＰの機能性に重要なアミノ酸を同定するためにアラニンスキャニングも用いる）。活性のさらなる有意な増大は、アミノ酸Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０およびＬｅｕ１１の組み合わせられた存在に起因すると報告されている。米国特許第５，４３４，１３３号は、アミノ酸が６位におけるＣｙｓまたはＰｍｐ（ペンタシクロメルカプトプロピオン酸）、７位におけるＰｈｅ、４−クロロＰｈｅ、４−フルオロＰｈｅ、４−ニトロＰｈｅまたはＣｈａ（３−シクロヘキシルＡｌａ）、９位におけるＧｌｙ、Ｖａｌ、ＡｉｂまたはｔＬｅｕ、１１位におけるＬｅｕまたはＩｌｅ、および２２位におけるＣｙｓまたはＰｍｐから選択される、アミノ酸６、７、９、１１または２２位における置換を有するＣＮＰ−２２を含むＣＮＰ類似体を記載している。
【００１２】
米国特許公開第２００４／０１３８１３４号（現在は米国特許第７，２７６，４８１号）は、９、１０、１１、１６、１７、１９または２０位における他の天然アミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、ＣＮＰ−２２のアミノ酸Ｃｙｓ６〜Ｃｙｓ２２を含むＣＮＰ変異体（「ＣＮＰ−１７」）、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間の報告されたＮＥＰ切断の主要な部位におけるＨｉｓ残基の付加などの挿入および欠失によるＣＮＰ変異体、ならびに異常な骨における骨成長板のサイズの増加および異常な骨の延長のためのそのような変異体を使用する方法を述べている。しかし、ｃＧＭＰの生成により測定される活性の有意な増加はこれらの変異体において得られず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞を用いた方法で認められたように、活性はほぼすべての変異体で低下した（実施例６）。さらに、ＣＮＰ類似体の主張されたＮＥＰ抵抗性およびＮＰＲ−Ｃ抵抗性を実証する、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性または薬物動態（ＰＫ）の改善のｉｎ  ｖｉｖｏでの測定などの裏づけデータは提供されなかった。米国特許第６，７４３，４２５号は、ＮＰＲ−Ｂ／ＧＣ−Ｂを活性化し、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドＣＮＰ−２２およびＣＮＰ−５３を含む、ペプチドまたは低分子量化合物である軟骨無形成症の治療用の物質を開示している。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２０５３４は、ジスルフィドまたは二重結合の形成に起因する限られた数のアミノ酸置換および環状キメラペプチドである、バソナトリンペプチド（ｖａｓｏｎａｔｒｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＶＮＰ）と呼ばれるＣＮＰ−２２およびＡＮＰの５アミノ酸Ｃ末端のキメラを開示している。
【００１３】
他のナトリウム利尿ペプチドファミリーメンバーの半減期を改善するためのアプローチは、ＮＰＲ−Ｃに対するＡＮＰの親和性を低下させること（米国特許第５，８４６，９３２号）、ＮＰＲ−Ｃのペンタペプチドアンタゴニストを利用すること（ＷＯ００／６１６３１）およびチオルファンおよびカンドキサトリルなどのＮＥＰ阻害剤を併用投与すること（Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２５巻、９８６〜９９１頁（１９９７年）、Ｈｙｐｅｒｔｅｎ．、３０巻、１８４〜１９０頁（１９９７年））などである。ＷＯ２００４／０４７８７１は、ＢＮＰおよびＢＮＰ変異体と、ポリアルキレングリコール部分、糖部分、ポリソルベート部分、ポリカチオン性部分および循環中の半減期の改善を示すと報告され、急性鬱血性心不全の治療に有用であると報告されている他の親水性ポリマー部分との結合体を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１６８巻、８６３〜８７０頁（１９９０年）
【非特許文献２】Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１０巻、１１１１〜１１１４頁（１９９２年）
【非特許文献３】Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、４９巻、４１９〜４２６頁（２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、その機能性を保持すると同時に、ＮＥＰに対して抵抗性のあるＣＮＰを調製することに成功した戦略に関する公表された報告は存在していなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症）および血管平滑筋障害の治療に有用であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体に関する。本発明は、ＣＮＰの機能性を保持すると同時に、例えば、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に結合する能力の低下、ＮＥＰによるタンパク質分解に対するより大きい抵抗性および／またはクリアランスナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）に対する親和性の低下の結果としての長い血清半減期を有するＣＮＰ変異体を含む。
【００１７】
ＣＮＰ−２２（本明細書では「ｗｔＣＮＰ２２」または「ＣＮＰ２２」と呼ぶ）の野生型配列を下に示す。
（Ｎ末端）Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２（配列番号１）
ＣＮＰ２２の６〜２２位は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２との間のジスルフィド結合により環状ドメインを形成している。１７アミノ酸環状構造は、ＮＰＲ−ＢへのＣＮＰの結合に重要であることが示された（Schiller、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１３８巻、８８０〜８８６頁（１９８６年））。ＣＮＰ２２の６〜２２位のアミノ酸配列は、本明細書では「ＣＮＰ１７」と呼ぶ（配列番号２）。
【００１８】
ＣＮＰは、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０などの多くの部位におけるＮＥＰ切断を受けやすい。１つの実施形態において、本発明は、（１）その全体的なサイズもしくは分子量を、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４ｋＤａ、４．２ｋＤａ、４．４ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．８ｋＤａ、５ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．４ｋＤａ、５．６ｋＤａ、５．８ｋＤａ、６ｋＤａ、６．２ｋＤａ、６．４ｋＤａまでもしくは約７ｋＤａ、７．２ｋＤａもしくは約８．２ｋＤａまでの範囲に増加させるために改変され、かつ／または（２）上に示した部位の１、２、３、４、５つもしくは６つすべてにおけるＮＥＰ切断に対するその感受性を低下させるために改変されているＣＮＰ変異体を含む。ＣＮＰ変異体のサイズまたは分子量は、様々な手段により、例えば、追加のアミノ酸および／または他の種類の化学（例えば、天然もしくは合成ポリマー）基を例えばＮ末端、Ｃ末端および／または側鎖におけるペプチド配列に結合させることにより、かつ／またはよりかさばった側鎖を有する天然アミノ酸、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体を用いることにより、増加させることができる。ＣＮＰ変異体は、他の機能または構造部分に場合によってさらに結合させることができる。本明細書で述べる実施形態のいずれかと場合によって組み合わせて、（１つまたは複数の）突然変異（例えば、（１つまたは複数の）置換、（１つまたは複数の）付加および／または（１つまたは複数の）欠失）をＣＮＰ２２の特定の（１つまたは複数の）位置に導入して、ＮＰＲ−Ｃに対するＣＮＰ変異体の親和性を低下させることができる。ＮＥＰ抵抗性またはＣＮＰ活性に影響を及ぼすことのないさらなる改変、例えば、保存的置換、または当技術分野で公知の他の改変を行うことができる。
【００１９】
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、次の一般式：（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５）により表すことができ、ここで、
ＣＮＰ変異体は、次のＣＮＰ残基：Ｇｌｙ１、Ｌｙｓ４、Ｇｌｙ５、Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｌｅｕ２０およびＧｌｙ２１の１つまたは複数に対応する位置における修飾ペプチド結合（例えば、ペプチド結合イソスターの使用による）をもたらす可能性がある１つまたは複数の修飾アミノ酸を含み、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、またはナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ）もしくは非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩｇＧ等）であってよい。
【００２０】
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、（１）ＣＮＰ２２の６、７または８位（Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７またはＧｌｙ８）の１つに対応するアミノ酸位置における改変、（２）１〜５位におけるアミノ酸（Ｇｌｙ１、Ｌｅｕ２、Ｓｅｒ３、Ｌｙｓ４およびＧｌｙ５）のいずれかまたはすべての場合によって欠失、付加および／または置換ならびに（３）６〜２２位に対応する位置における場合によって１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までのさらなる改変（欠失、付加および／または置換）（そのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個が保存的置換または本明細書で述べるもしくは当技術分野で公知の他の置換であってよい）を含む。
【００２１】
数による特定のアミノ酸位置への言及（例えば、ＣＮＰ２２の７位）は、当該ＣＮＰ変異体における当該位置の数が先行する挿入または欠失のために変化したとしても、いずれかのＣＮＰ変異体における対応するアミノ酸位置を意味する。例えば、「７位」または「Ｐｈｅ７」への言及は、最初の５つのアミノ酸が欠失したＣＮＰ変異体の対応する２位を意味する。同様に、「７位」への言及は、１つのアミノ酸がＮ末端に付加されたＣＮＰ変異体の対応する８位を意味する。
【００２２】
本明細書で述べる実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の６および２２に対応する位置の間の共有結合により環化させることができる。当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて共有結合を形成させることが考えられる。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、該ペプチドのＮ末端におけるまたはＮ末端の方にあるアミノ酸とＣ末端におけるまたはＣ末端の方にあるアミノ酸との間に形成される共有結合により環化させることができる（この目的のために「末端」アミノ酸と呼ぶ）。１つの実施形態において、共有結合は、２つの末端アミノ酸の側鎖またはＣＮＰ２２の６および２２の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成させる。他の実施形態において、共有結合は、１つの末端アミノ酸の側鎖と他の末端アミノ酸の末端基との間で、または各末端アミノ酸の末端基との間で形成させる。例えば、ヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッド、または側鎖−テール結合が、末端アミノ酸の間、またはＣＮＰ２２の６および２２の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成される共有結合について可能である。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＮＰの機能性（例えば、ｃＧＭＰの産生の刺激）を保持すると同時に、ＮＥＰに対する低い親和性、および／またはＮＥＰによる切断に対するより大きい抵抗性および／または長いｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰは、その活性部位の空洞のサイズが限られているため、約３ｋＤａより小さい物質を選択的に認識する（Oefner、J. Mol. Biol.、２９６巻、３４１〜３４９頁（２０００年））。１つの実施形態において、例えば、約０．６〜約５ｋＤａのアミノ酸、親水性もしくは水溶性ポリマー、疎水性酸（脂肪酸を含む）および／または糖を付加することにより、全体的な分子量を例えば、約２．６もしくは２．８ｋＤａから約４、４．６、５、５．２、５．８、６、６．４もしくは約７ｋＤａまでの範囲に増加させるためにＣＮＰ変異体を改変する。特定の具体例としての実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約２．６ｋＤａ〜約７ｋＤａ、または約２．８ｋＤａ〜６ｋＤａ、または約２．８ｋＤａ〜５．８ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の総分子量を、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４ｋＤａ、４．２ｋＤａ、４．４ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．８ｋＤａ、５ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．４ｋＤａ、５．６ｋＤａ、５．８ｋＤａ、６ｋＤａ、６．２ｋＤａ、７．２ｋＤａ、８．２ｋＤａもしくはより高い値までの範囲まで増加させるために、少なくとも約０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６もしくは１．８ｋＤａ、または２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８もしくは５ｋＤａまでを加える。いくつかの実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のアミノ酸６〜２２と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一または相同であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、他の天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体との１、２、３、４、５、６もしくは７個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。保存的および非保存的置換または挿入がいずれかの位置において想像されるが、非保存的置換は、改変に耐性があることが以前に示された領域において行うことができるが、改変の導入は、例えば、ＣＮＰ活性またはＮＰＲ−Ｂ結合に関与すると当技術分野で同定された領域における保存的置換によって始まる可能性がある。
【００２４】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２の間の完全な環化部分、ならびに約１〜４０、１〜２０、５〜４０、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、５〜３１、１０〜３１、もしくは１５〜３１個のアミノ酸を含み、ＣＮＰポリペプチドおよび／または非ＣＮＰポリペプチド由来の断片であるＮ末端および／またはＣ末端テールを有するＣＮＰを含む。１つの実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、約２．８ｋＤａ〜約４、４．６、５、５．２、５．８、６、６．４または７ｋＤａの範囲の分子量を有する。そのようなＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、ヒトもしくは他の種のナトリウム利尿ペプチド前駆体配列（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰもしくはＣＮＰ）由来のＮ末端および／またはＣ末端延長部分を有する、野生型ＣＮＰ２２または１つもしくは複数のアミノ酸置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）を有するＣＮＰ２２、アミノ酸置換、付加および／または欠失を有するナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）変異体（例えば、ＣＮＰ変異体は、約２．８ｋＤａ〜５．８ｋＤａの分子量を有するペプチドをもたらすＣＮＰ−５３の短縮体であってよい）、あるいは例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧタンパク質などの他の非ＣＮＰポリペプチド（例えば、ＣＮＰ変異体は、ヒトもしくは他の種の血清アルブミンまたはＩｇＧの断片を含むＣＮＰキメラであってよい）などがある。
【００２５】
１つの実施形態において、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大を意図した、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するＣＮＰ変異体は、以下の一般式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号６）により表され、式中、
（ｘ）は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とも呼ばれる）であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、１〜３５アミノ酸を含み、ＮＰＰＣまたは置換および／もしくは欠失を有するその変異体、ＡＮＰ、ＢＮＰ、あるいは例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）などの他の非ＣＮＰ（ポリ）ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、ＰＥＧであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧ）由来のアミノ酸配列であり、
（ｂ）および（ｈ）は、独立にそれぞれ、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＧｌｕもしくはＳｅｒを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよい。１つの実施形態において、（ｂ）はＡｒｇである。他の実施形態において、ＮＥＰ抵抗の改善のために、（ｂ）はＧｌｙでない。他の実施形態において、（ｈ）はＡｒｇでない。
【００２６】
ＮＰＰＣまたはその変異体由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
【００２７】
Arg、
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号７）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg（配列番号８）、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg（配列番号９）、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln（配列番号１０）、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser（配列番号１１）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln（配列番号１２）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Met（配列番号１３）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr（配列番号１４）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser（配列番号１５）、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala（配列番号１６）、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg（配列番号１７）、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg（配列番号１８）、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号１９）、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg、（配列番号２０）
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号２１）、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg（配列番号２２）。
【００２８】
例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、血清アルブミンおよびＩｇＧなどの非ＣＮＰポリペプチド由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
【００２９】
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser（配列番号２３）；
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr（配列番号２４）；
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly（配列番号２５）；
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly（配列番号２６）；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr（配列番号２７）；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His（配列番号２８）；
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg（配列番号２９）；
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr（配列番号３０）；
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln（配列番号３１）；および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser（配列番号３２）。
【００３０】
１つの実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、独立に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分に結合させることができる。１つの実施形態において、アミノ酸延長部分は、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ５３、ＡＮＰまたはＢＮＰ由来である。特定の実施形態において、アミノ酸延長部分は、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３３）である。関連実施形態において、この１５アミノ酸延長部分をＮ末端に付加して、式Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号３４）のＣＮＰ変異体を得る。
【００３１】
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、それらの全体的な分子サイズを約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４、５、６もしくは７ｋＤａまでの範囲に増加させるためにＮ末端および／またはＣ末端において親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に結合させたｗｔＣＮＰ２２またはその変異体（例えば、（１つまたは複数の）付加、（１つまたは複数の）欠失および／または例えば、Ｋ４Ｒ置換などの（１つまたは複数の）置換を有する）（配列番号３５）を含む。そのようなＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端において、例えば、アミノ酸、糖、疎水性酸および／またはリン脂質を含むポリマー基に場合によってさらに結合される。その非限定的な例は、１〜３５、または５〜３１個のアミノ酸を含むＮ末端アミノ酸延長部分である。１つの実施形態において、少なくとも約０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６もしくは１．８ｋＤａ、または２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８もしくは５ｋＤａまでの親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）部分をｗｔＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端に付加させる。
【００３２】
本明細書で示すように、ＣＮＰ２２またはその変異体への約０．６ｋＤａまたはそれ以上の親水性または水溶性ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーの結合により、ＮＥＰ切断に対する抵抗性が著しく増加する。しかし、ｗｔＣＮＰ２２に０．６ｋＤａと小さくてもＰＥＧを付加させると、ＣＮＰの機能性（例えば、ｃＧＭＰシグナリングの刺激）が低下する可能性があり、ＣＮＰ２２またはその変異体に約２または３ｋＤａを超えるＰＥＧを付加させると、ＣＮＰの機能活性がサイズ依存的に低下する可能性がある。しかし、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａまで、または場合によっては約２ｋＤａまでのＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーを、例えば、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４））（配列番号３６）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４））（配列番号３７）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（配列番号３８）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）、Ｒ−ＣＮＰ２２（配列番号４０）およびＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）などの、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも１つの比較的に大きいアミノ酸（例えば、アルギニン）がＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前にある、Ｎ末端アミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体に結合される場合、ＣＮＰの機能性（ｗｔＣＮＰ２２の機能性と少なくとも同等の）が保持される。
【００３３】
したがって、１つの実施形態において、ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体（例えば、Ｋ４Ｒ置換を有するもの）のＮ末端に少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分を含んでおり、この場合に、ＰＥＧポリマーは、ＮＥＰ切断に対する抵抗性の増大のための例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を得るためにアミノ酸延長ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合させる。１つの実施形態において、ＣＮＰの機能性の向上のために、そのようなペグ化アミノ酸延長ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前にある、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも１つの比較的に大きい天然または非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペグ化アミノ酸延長ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前に少なくとも１つのアルギニン残基を含む。
【００３４】
Ｎ末端および／またはＣ末端において例えばＰＥＧ（もしくはＰＥＯ）などの親水性もしくは水溶性ポリマーに結合したＣＮＰ変異体に加えて、本発明は、内部部位においてそのようなポリマーに結合したＣＮＰ変異体を含む。ここで簡潔さの目的のために、ＰＥＧ（もしくはＰＥＯ）は、親水性もしくは水溶性ポリマーの代表的な例として用いることとする。（１）Ｎ末端のみにおけるＰＥＧ化、（２）Ｃ末端のみにおけるＰＥＧ化、（３）内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみにおけるＰＥＧ化、（４）Ｎ末端およびＣ末端におけるＰＥＧ化、（５）Ｎ末端および内部部位におけるＰＥＧ化、ならびに（６）Ｃ末端および内部部位におけるＰＥＧ化を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰ変異体のＰＥＧ化の種々の部位が可能である。ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大およびＣＮＰの機能性の保持のために、特定の実施形態において、ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の総質量は、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約４、５、６もしくは７ｋＤａまでの範囲の本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる。特定の実施形態において、ＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７（下で定義する）またはその変異体（アミノ酸付加、置換および／または欠失を有するものを含む）は、Ｎ末端においてのみＰＥＧ化されている。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみにおいてＰＥＧ化されている。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）においてＰＥＧ化されている。他の実施形態において、より良好な機能性を得るために、ＣＮＰ変異体は、環状ドメイン内（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２に対応する）の部位（例えば、Ｌｙｓ１０）においてＰＥＧ化させない。内部部位におけるＰＥＧ化を防ぐために、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０は、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはシトルリン（Ｃｉｔ）などの側鎖に反応性第一級アミノ基を含まない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体で置換することができる。特定の実施形態において、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０をＡｒｇで置換する。他の実施形態において、Ｌｙｓ１０をＡｒｇで置換しない。
【００３５】
本発明は、種類（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダム、交互またはブロックコポリマー；線状または分枝；単分散性または多分散性）、結合（例えば、アミド、イミン、アミナール、アルキレンまたはエステル結合などの加水分解性または安定結合）、結合部位（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端における；好ましくはＣＮＰの環化領域における残基（ＣＮＰ２２の残基６〜２２に対応する）のいずれにおけるものでない）、ならびに長さ（例えば、約０．２、０．４または０．６ｋＤａ〜約２、３、４または５ｋＤａ）が異なっていてよい親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）の使用を予期する。親水性または水溶性ポリマーは、当技術分野で公知であるような、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはアルデヒドベースの化学または他の化学によりＣＮＰペプチドに結合させることができる。そのようなＣＮＰ変異体は、例えば、ｗｔＣＮＰ−２２（２．２ｋＤａ）、ｗｔＣＮＰ２２の環化領域（残基６〜２２）のみを保持するＣＮＰ−１７、ＣＮＰ２２のＮ末端および／またはＣ末端におけるアミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体、あるいはアミノ酸置換、付加および／または欠失を有する変異体、例えば、ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、Ｒ−ＣＮＰ２２、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＥＲ−ＣＮＰ２２およびＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）を用いて生成させることができる。１つの実施形態において、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＨＳもしくはアルデヒドベースの化学によりＮ末端および／またはＣ末端において結合した単分散性線状ＰＥＧ（ＰＥＯ）基、あるいはＮＨＳベースの化学によりＮ末端および／またはＣ末端において結合した２アームもしくは３アーム分枝ＰＥＧ基を含む。本発明は、カルボキシル化、硫酸化およびリン酸化化合物を含むが、これらに限定されない、腎クリアランスの減少を意図した負に荷電したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体をさらに予期する。
【００３６】
関連実施形態において、本発明は、ｎが１２〜５０の整数であり、ＰＥＧポリマーが分子量約２．５ｋＤａまでのものである、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＮＨＳまたはアルデヒドベースのＰＥＧを含むＰＥＧ−ＣＮＰ結合体を予期する。特定の実施形態において、ｎは１２または２４である。１つの実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基でキャップされている。特定の実施形態において、キャッピング基は、アルキル基、例えば、メチルなどの低級アルキル基である。
【００３７】
さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーまたはその誘導体は、約０．４ｋＤａ〜約２．５ｋＤａ、または約０．６ｋＤａ〜約１．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する。
【００３８】
さらなる実施形態において、ｗｔＣＮＰまたはＣＮＰ変異体ペプチドを、例えば、ビスホスホネート、糖、疎水性酸（脂肪酸など）またはアミノ酸配列などの部分に結合させる。そのようなアミノ酸配列は、例えば骨／軟骨ターゲティングに有用なポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどであるか、あるいは例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質またはその誘導体であってよい。ＣＮＰ２２またはその変異体が骨もしくは軟骨ターゲティング部分に結合している本明細書で述べる実施形態において、ペプチドが軟骨細胞上のＮＰＲ−Ｂに結合し、活性化することができる場合、そのような部分は、改変ＣＮＰペプチドを骨成長板の軟骨細胞に到達させることを促進するように設計されている。
【００３９】
他の実施形態において、本発明は、ＮＥＰを含むペプチダーゼによる切断を受けにくいペプチド結合を有するＣＮＰ変異体を提供する。本発明は、エンドペプチダーゼ切断の部位に少なくとも１つの改変残基を含むＣＮＰ変異体を含む。１つの実施形態において、ＣＮＰにおけるＮＥＰ切断部位のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７ペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスターのいずれかで置換することができる。
【００４０】
−ＣＨ２−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−（ここで、アミド基が次のＲ基のいずれかによりアルキル化されている：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル）、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、
−ＣＨ２−Ｓ、
ｎが１または２である−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＨ＝ＣＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−、
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
他の実施形態において、Ｐｈｅ７をその鏡像異性体Ｄ−Ｐｈｅで置換する。他の実施形態において、Ｄ鏡像異性体をｗｔＣＮＰ−２２内の１つまたは２２位置すべてまでの複数の位置に導入する。さらなる実施形態において、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸などのβ−アミノ酸でＰｈｅ７を置換し、これにより、側鎖の長さを減少させると同時に、主鎖の長さを増加させる。他の実施形態において、本発明は、ホモシステイン、ペニシラミン、２−メルカプトプロピオン酸および３−メルカプトプロピオン酸を含むが、これらに限定されない、Ｃｙｓ６位置におけるＣｙｓ類似体を予期する。
【００４１】
Ｃｙｓ６とＰｈｅ７の間のＮＥＰ抵抗性結合の存在下でさえも、Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０などの他のペプチド結合は、ＮＥＰにより加水分解され得る。したがって、本発明は、ＣＮＰ類似体の主鎖における複数の位置にペプチド結合イソスターを含むＣＮＰ類似体を含む。１つの実施形態において、ＣＮＰ類似体または変異体は、複数のペプチダーゼ切断部位に改変を含む。さらなる実施形態において、そのような変異体は、ＮＥＰ活性部位に対する結合に重要なアミノ酸残基における置換を有し、それにより、ＮＥＰ分解に対する抵抗を増大させるＣＮＰを含む。Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｙ１９および／またはＧｌｙ２１を含むが、これらに限定されない１つまたは複数のＮＥＰ結合性残基をより大きいサイズの天然または非天然アミノ酸残基で置換して、ＮＥＰ活性部位に対する親和性を低下させる。他の実施形態において、Ｐｈｅ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｍｅｔ１７およびＬｅｕ２０を含むが、これらに限定されない、ＮＥＰ認識に必須の１つまたは複数の疎水性残基を、ＮＥＰ結合性を減少させる天然もしくは非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体で置換する。他の実施形態において、ＣＮＰの最初の５個のアミノ酸の１〜５個を欠失させるか、または他の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣体で置換することができ、あるいは１つまたは複数の天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体をＣＮＰの最初の５つの位置のいずれか１つまたはすべてに付加することができる。
【００４２】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰに対する抵抗性の増大のための約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４６）により表され、式中、
（ｘ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列；例えば、荷電ＰＥＧ分子などの腎クリアランスを減少させるポリマーまたは非ポリマー分子；ならびに例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧｓ）、糖、疎水性酸（脂肪酸を含む）および／またはアミノ酸を含む延長部分からなる群から選択されてよく、そのようなアミノ酸延長部分は、例えば、１〜３１、もしくは１〜３５、もしくは５〜３５、もしくは１０〜３５、もしくは１５〜３５個のアミノ酸残基を含んでいてよく、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ、例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧなどの他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、あるいは置換、付加および／または欠失、またはその組合せを有する前述のポリペプチドの変異体由来であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメインのアミノ酸配列、ならびに例えば、ＡＮＰまたはＢＮＰなどの非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｒｅｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【００４３】
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９および／または２０位の１つまたは複数における改変を含み、本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変を場合によって有していてよい。
【００４４】
ＣＮＰ２２またはその変異体を疎水性酸に結合させることができる、本明細書で述べる実施形態において、ＣＮＰペプチドを１つまたは複数の疎水性酸に結合させることができる。疎水性酸の非限定的な例としては、直鎖または分枝飽和または不飽和Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸（例えば、ペンタン酸、ヘプタン酸等）および天然脂肪酸などがある。疎水性酸は、１つまたは複数のアミノ酸残基のＮ末端、Ｃ末端および／または側鎖に結合させることができる。１つの実施形態において、疎水性酸をＮ末端に結合させる。１つの実施形態において、疎水性酸へのＣＮＰ２２またはその変異体の結合は、とりわけ、改変ＣＮＰペプチドと血清アルブミンとの非特異的相互作用を促進し、それにより、ＣＮＰペプチドのサイズを増加させ、例えば、ＮＥＰなどのプロテアーゼによる切断からそれを保護するように設計する。疎水性酸結合ＣＮＰペプチドとアルブミンの間の相互作用は、改変ＣＮＰペプチドが軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、ＮＰＲ−Ｂに結合し、活性化することができるように、強すぎないように設計する。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、（ｂ）６、（ｃ）７および／または（ｄ）８位に少なくとも１つの改変アミノ酸を含み、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４７）により表されるＣＮＰ変異体を提供し、式中、
（ｘ）は、非存在であってよく、あるいは、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または本明細書で述べたような非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ、ＩｇＧ、骨ターゲティングタンパク質等）に由来する１〜５個のアミノ酸を含むペプチド配列であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の融合タンパク質またはペプチド配列などの、骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質およびその誘導体；例えば、荷電ＰＥＧｓなどの腎クリアランスを減少させる分子；ならびに本明細書で述べたようなＮＥＰ媒介性分解に対するＣＮＰの抵抗性を増大させる分子からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓまたは脱カルボキシシステインであってよく、あるいは（ｂ）６−（ｃ）７ペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスター
−ＣＨ２−ＮＨ−；
アミド基が次のＲ基：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−；
−ＣＨ２−Ｓ−、
ｎが１または２である、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−；
−ＣＨ２−ＣＨ２−；
−ＣＨ＝ＣＨ−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−；
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−；または
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
のいずれか１つで置換されていてよく、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体などの、Ｐｈｅのペプチド結合イソスター；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体であり、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【００４６】
さらなる実施形態において、本発明は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大のための例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４８）により表され、
（ｘ）は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、１〜３５個のアミノ酸を含み、ＮＰＰＣまたは置換および／もしくは欠失を有するその変異体、ＡＮＰ、ＢＮＰ、または例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチンリッチ糖タンパク質フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたはＦＧＦ２などの非ＣＮＰ（ポリ）ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
（ｙ）は、非存在であってよく、あるいは、Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５（ＣＮＰ２２の１〜５位に対応する）の１つまたは複数のアミノ酸および／または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の１つもしくは複数における置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）であってよく、
（ｈ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｈ）はＡｒｇでなく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、ＰＥＧであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧ）由来のアミノ酸配列である。
【００４７】
１つの実施形態において、（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）は、ともに約１０〜約４０個、または約１５〜約３５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、（ｘ）は、１〜４０個のアミノ酸、または１〜２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。
【００４８】
ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、以下の式
（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２（配列番号１３８）を含むＣＮＰ変異体がさらに予期され、式中、
（ｙ）は、Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５から選択される１つまたは複数のアミノ酸および／または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の１つもしくは複数における置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）を含み、０．６ｋＤａ〜約５ｋＤａの分子量の親水性もしくは水溶性ポリマーをさらに含む。１つの実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーをそのようなアミノ酸延長ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合させる。特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。
【００４９】
他の実施形態において、本発明は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激するＣＮＰ変異体を提供し、該ＣＮＰ変異体は、１〜１５個のアミノ酸を含むＮ末端および／またはＣ末端ペプチド延長部分を含み、親水性もしくは水溶性ポリマーに結合している。１つの実施形態において、ペプチド延長部分は、５〜１０個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、ペプチド延長部分は、５個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明のＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）由来の少なくとも１５個のアミノ酸断片を含み、該断片は、同じ数のアミノ酸残基を含む野生型ＮＰＰＣの配列と少なくとも７０％相同である。
【００５１】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ抵抗性の増加のために例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４９）により表され、式中、
（ｘ）は、非存在であって（すなわち、−ＮＨ２基を有するＮ末端）、あるいはＧｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５からの１、２、３、４または５個のアミノ酸の配列；例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメイン；荷電ＰＥＧ分子を含むが、これに限定されない、親水性もしくは水溶性ポリマーなどの腎クリアランスを減少させる分子；およびＰＥＧ、糖、疎水性酸、アミノ酸またはその組合せを含む部分からなる群から選択されてよく、そのような部分は、ＮＰＰＣまたは例えば、ＢＮＰ、ＡＮＰ、血清アルブミンもしくはＩｇＧなどの非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨ターゲティングタンパク質由来のアミノ酸配列；および本明細書で述べたような、ＮＰＰＣまたは非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Lｅuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｒｅｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【００５２】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ抵抗性の増加のために例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５０）により表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、あるいは例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列およびその誘導体；例えば、荷電ＰＥＧ分子などの親水性または水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない、腎クリアランスを減少させる部分；ならびに例えば、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、糖、疎水性酸および／またはアミノ酸を含む部分などの合成骨ターゲティング化合物からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール基（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ａｓｎおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Cｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【００５３】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の１〜２２位のいずれかの１つまたは複数の位置における（１つまたは複数の）アミノ酸置換を有し得る。１つの実施形態において、Ｇｌｙ１がＡｒｇまたはＧｌｕで置換されている。他の実施形態において、Ｌｙｓ４がＡｒｇで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ５がＡｒｇ、ＧｌｎまたはＳｅｒで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ１５がＳｅｒ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＣｉｔで置換されている。さらなる実施形態において、Ｇｌｙ１９がＳｅｒ、ＡｒｇまたはＡｓｎで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ２１がＳｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇで置換されている。
【００５４】
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＧＬＳＫＧＣ（ＣＨ２ＮＨ）ＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（脱カルボキシ−Ｃｙｓを用いて生成させた）（配列番号５６）、ＧＬＳＫＧＣ−（Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ）−ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５７）、ＧＬＳＫＧＣ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１３６）、ＧＬＳＫＧＣＦ−（ｔＢｕＧ）−ＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５８）、ＧＬＳＫＧＣ−（３−Ｃｌ−Ｐｈｅ）−ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１３７）およびＧＬＳＫＧＣ−［ＮＨＣＨ２ＣＨ（Ｐｈ）ＣＯ］−ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸を用いて生成させた）（配列番号５９）からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ジスルフィド結合が、Ｃｙｓ６、脱カルボキシＣｙｓまたはＣｙｓ６位における他のスルフヒドリル含有システイン類似体と本明細書で述べるいずれかのＣＮＰ変異体のＣｙｓ２２との間に存在する。
【００５５】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端における
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ−５３）（配列番号４）；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ−３７、類似体ＢＬ）（配列番号６０）；
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＡ）（配列番号６１）；
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＢ）（配列番号６２）；
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＣ）（配列番号６３）；
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号４０）；
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号３８）；
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６４）；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６５）；
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６６）；
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６７）；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号１４４）；および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH（類似体ＣＤ）（配列番号６８）（ＢＮＰ由来のＮ末端およびＣ末端テールを有するＣＮＰ１７）を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分を含む。
【００５６】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の４位におけるＫ４Ｒ置換を有する。ＣＮＰ（Ｋ４Ｒ）変異体の非限定的な例としては、
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４））（類似体ＡＹ）（（配列番号３６）；
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４））（類似体ＣＩ）（配列番号３７）；
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＡＺ）（配列番号４１）；
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＢＡ）（配列番号３９）；
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＨ）（配列番号６９）；および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＧ）（配列番号７０）などがある。
【００５７】
１つの実施形態において、Ｎ末端にＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分およびアミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前の位置にアルギニンを含む。そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大、血清アルブミンに対する結合の減少およびＣＮＰ機能活性の増大（例えば、ｃＧＭＰシグナリングの活性化）のために設計されている。そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２、およびＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２などがあり、ＰＥＯ２４は、単分散性の１．２ｋＤａのＰＥＧポリマーであり、ＰＥＯ１２は、単分散性の０．６ｋＤａのＰＥＧポリマーである。１つの実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーは、ＣＮＰ変異体のＮ末端に付加されている。
【００５８】
さらなるＣＮＰ変異体は、
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＳ）（配列番号７１）；GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＴ）（配列番号７２）；GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＵ）（配列番号７３）；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＷ）（配列番号７４）；および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＤＢ）（配列番号７５）。
を含むが、これらに限定されない、フューリンプロテアーゼに対するｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗性を改善するためにフューリン切断部位（下線付き）に突然変異を有し、かつ／またはピログルタミン酸塩の生成を防ぐためにグルタミンの前にグリシン（下線付き）を有するＣＮＰ３７の誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＱ）（ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７６）；
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＲ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７７）；
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＸ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７８）；
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＦ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７９）；
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＹ）（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８０）；
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＥ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８１）；
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＺ）（オステオクリン「ＮＰＲ  Ｃ阻害剤」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８２）；および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＤＡ）（ＦＧＦ２「ヘパリン結合ドメイン」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８３）
を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰ２２およびＮ末端ペプチド断片を含むキメラである。
【００６０】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＫ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８４）；
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＬ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８５）
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＭ）（フィブロネクチン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８６）；
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＮ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８７）；
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＯ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８８）；および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＰ）（亜鉛フィンガー断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８９）
を含むが、これらに限定されない、Ｎ末端ペプチド断片およびアルギニンがＣＮＰ２２のＬｙｓ４と置換されているＣＮＰ２２（「ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）」）を含むキメラである。
【００６１】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単量体または二量体であってよい。関連実施形態において、二量体ＣＮＰ変異体の単量体は、リンカーを介して、またはリンカーなしにＮ末端をＮ末端に、リンカーを介して、またはリンカーなしにＮ末端をＣ末端に、あるいはリンカーを介して、またはリンカーなしにＣ末端をＣ末端に結合させることができる。
【００６２】
ＩｇＧおよびＣＮＰ２２またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。ＨＳＡの表面断片を含むＣＮＰキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リシン、非アルギニンである配列をＮ末端に含むＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２およびＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増大のために設計されている。オステオクリン断片を含むキメラは、プロテアーゼ（例えば、フューリン）切断により、オステオクリン断片を骨成長板において放出し、そこで該断片がクリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃを阻害するように計画されている。ＦＧＦ２ヘパリン結合断片を含むキメラに関しては、断片に結合したヘパリンは、キメラを分解から保護し、それにより、より長い血清半減期を与えるように計画されている。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含むキメラは、他の有利な特徴の中で特に、血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。
【００６３】
理論に束縛されるものではないが、ｗｔＣＮＰ２２と比較してＮＥＰ分解に対する高い抵抗性または改善された機能性（例えば、ＮＰＲ−Ｂへの結合およびｃＧＭＰシグナリングの刺激）を有する約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの分子量のＣＮＰ変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質に強固に結合しなければ、より有効である可能性がある。血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）に強固に結合しないＣＮＰ変異体は、軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、ＮＰＲ−Ｂに結合し、ｃＧＭＰシグナリングのためにそれを活性化するのにより有効である可能性がある。１つの実施形態において、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体およびＩｇＧのペプチド断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）およびポリペプチド（例えば、ＩｇＧ、ＨＳＡ、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド等）の断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、親水性または水溶性ポリマーに結合したＣＮＰ２２またはその変異体を含む。１つの実施形態において、親水性または水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。他の実施形態において、親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、例えば、カルボキシル、硫酸もしくはリン酸基、またはその組合せなどの生理的条件下でポリマーに負電荷を与える１つまたは複数の官能基により官能基化されている。
【００６４】
本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２と実質的に同じまたはそれより良好な生物学的活性を有する可能性がある。例えば、ＣＮＰ変異体は、例えば、ｃＧＭＰの産生を刺激するためのＮＰＲ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）との相互作用に関して、野生型ＣＮＰ２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、ＣＮＰ２２より大きい活性を有する可能性がある。あるいは、またはさらに、ＣＮＰ変異体は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞分化、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＥＫ（Ｒａｆ−１）キナーゼシグナリング経路の阻害、および軟骨内骨化の促進を含むが、これらに限定されない、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の調節に関して、野生型ＣＮＰ２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、ＣＮＰ２２より大きい活性を有する可能性がある。本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２のアミノ酸６〜２２または１〜２２と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を含む可能性がある。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＰＲ−Ｂに結合し、それを活性化する能力を保持すると同時に、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対するより低い親和性を有するＣＮＰ２２の変異体を提供する。本発明は、詳細な説明で述べるようなＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ複合体の相同性に基づく構造モデルから生成させた、または生成させることができる変異体を含む。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃと比べてＮＰＲ−Ｂに対する結合に関するそれらの特異性を増大させる可能性がある、立体配座の柔軟性を減少させるための１、５、８、１５、１９および２１位における１つまたは複数のＧｌｙ部位における置換を有する。ＮＰＲ−Ｃに対する潜在的に低い親和性を有するＣＮＰの変異体は、次の置換の１つまたは複数を有するものを含むが、それらに限定されない：Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｅ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｑ、Ｇ５Ｓ、Ｆ７Ｙ、Ｇ８Ｔ、Ｇ８Ｓ、Ｇ８Ｖ、Ｇ８Ｎ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ｋ１０Ｃｉｔ、Ｋ１０Ｑ、Ｋ１０Ｓ、Ｉ１４Ｎ、Ｇ１５Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｎ、Ｇ１５Ｃｉｔ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｖ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｓ、Ｇ１９Ｒ、Ｇ１９Ｎ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２０Ｓ、Ｇ２１Ｓ、Ｇ２１ＴおよびＧ２１Ｒ。
【００６６】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、５、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１９、２０および２１位の１つまたは複数における改変および／または置換を有し、また本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変および／または置換を場合によって有していてよい。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、例えば、骨／軟骨ターゲティングを促進し、腎クリアランスを減少させ、かつ／またはＮＥＰ分解に対する抵抗性を増大させるためにＮおよび／またはＣ末端に（１つまたは複数の）結合部分または（１つまたは複数の）延長部分を場合によって有していてよい。そのような（１つまたは複数の）結合部分または（１つまたは複数の）延長部分は、例えば、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ、骨もしくは軟骨ターゲティングペプチド、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質、ＰＥＧｓ、糖、疎水性酸、ＮＰＰＣもしくは非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、またはその組合せから形成される、または由来する分子または配列を含んでいてよい。
【００６７】
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、適切な場合に置換および／または付加されている（１つまたは複数の）天然もしくは非天然アミノ酸または（１つまたは複数の）ペプチド模倣体を用いて標準的な固相ペプチド合成法により調製する。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体のＰＥＧ化は、ＮＨＳもしくはアルデヒドベースの化学または当技術分野で公知の化学により行わせる複合反応によるペプチド合成の後またはその一部で起こる。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ジスルフィド結合を含む。関連実施形態において、該ジスルフィド結合は、環状ペプチドを形成する。特定の実施形態において、該ジスルフィド結合は、ＣＮＰ２２の６および２２位に対応する位置におけるシステイン残基の間に形成される。
【００６８】
ＣＮＰ変異体を、例えば、ヘプタン酸、ペンタン酸または脂肪酸などの疎水性ポリマーまたは非ポリマー部分に結合させることができることがさらに予期される。疎水性部分は、リシン、セリン、トレオニンを含むが、これらに限定されないアミノ酸残基の側鎖に結合させることができ、あるいは、ＣＮＰ変異体のＮ末端および／またはＣ末端に結合させることができる。
【００６９】
１つの実施形態において、本明細書で述べるＣＮＰ変異体は、約８〜約１０．５または約８．５〜約１０の範囲のｐＩを有する。
【００７０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＮＰ変異体、場合によって他の生物学的に活性な物質、および場合によって薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、注射に適する滅菌済み医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、実質的に純粋な、例えば、少なくとも９０％または９５％純粋なＣＮＰ変異体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満の他のヒトタンパク質、ブタタンパク質またはＣＮＰ５３もしくはその断片（所望のＣＮＰ変異体以外）などの混入物を含む。
【００７１】
本発明のＣＮＰ変異体は、有利なことにＣＮＰ活性を保持し、血清半減期の増加を示す。ＣＮＰ活性の保持は、例えば、所望のｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的効果の保持、または同じ濃度（例えば、１μＭのＣＮＰペプチドまたはＥＤ８０を超える）のもとでのＣＮＰ２２のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％の保持として示すことができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２と比較して血清半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍または４０倍の増加を示す。
【００７２】
他の実施形態において、本発明は、治療上有効な量のＣＮＰ変異体または前述のものを含む組成物をそれを必要とする被検体に投与することを含む、ＣＮＰに反応性を示す状態または障害を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＣＮＰに反応性を示す障害は、骨格異形成症および線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）突然変異に伴う障害などの遺伝的骨格奇形を含むが、これらに限定されない骨成長の障害である。特定の実施形態において、（１つまたは複数の）ＦＧＦＲ−３突然変異に伴う障害は、軟骨無形成症である。他の実施形態において、ＣＮＰに反応性を示す障害は、血管平滑筋細胞および組織に関連する障害である。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、骨（例えば、肢骨）の成長板のサイズを増加させるのに有用である。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、骨を延長または長骨の成長を増大させるのに有用である。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を増大させるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ２２結合体の、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの耐性の程度を示す図である。
【図２】Ｎ末端にアミノ酸の延長を有するＣＮＰ変異体のＮＥＰ耐性の程度を表す図である。図２のＣＮＰ２７は、ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）すなわちＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）である。
【図３】Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ１７およびＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＮＥＰ耐性の程度を表す図である。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｃＧＭＰ産生を刺激する、Ｎ末端にアミノ酸の延長を有するＣＮＰ変異体の、能力を示す図である。結果を、１ｕＭのＣＮＰ２２の存在下で産生されたｃＧＭＰのレベルと比較した。図４のＣＮＰ２７はＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）である。
【図５】ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｃＧＭＰ産生を刺激する、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ１７およびＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）の能力を示す図である。
【図６】ｃＧＭＰ産生についての、ＣＮＰ２２のＮ末端をＰＥＧ化することによる効果を例示する図である。
【図７】ラット軟骨肉腫細胞をＣＮＰ２２に１日１回、１時間または１日１回、２時間曝露することが、ＦＧＦ２により誘導された軟骨細胞の成長停止の逆転において、ＣＮＰ２２に対する連続曝露と実質的に同様の有効性を有することを実証する図である。
【図８】エクスビボのマウス器官モデルにおいて野生型大腿骨の縦成長を刺激することにおける、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）の有効性を示す図である。
【図９】ラットに静脈内（ｉ．ｖ．）投与されたＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）が、血漿中でＣＮＰ２２より非常に長い半減期および非常に大きな生体内利用率を有することを示す図である。
【図１０】ラットに皮下（ｓ．ｃ．）投与されたＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）もまた、血漿中でＣＮＰ２２より非常に長い半減期および非常に大きな生体内利用率を有することを例示する図である。
【図１１】ｉ．ｖ．投与されたＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）が、ラットにおいてＣＮＰ２２より非常に高いレベルでｃＧＭＰ産生を刺激することを実証する図である。
【図１２】ｓ．ｃ．投与されたＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、およびそれほどではないがＣＮＰ３７が、ラットにおけるｃＧＭＰ産生の刺激において、ＣＮＰ２２より実質的により有効であることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、ＮＥＰおよび／またはＮＰＲ−Ｃに対する低い親和性、ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する低い感受性を有するＣＮＰの新規な変異体、そのようなＣＮＰ変異体を含む医薬組成物、ならびに軟骨無形成症などの骨関連障害および血管平滑筋細胞および組織に関連する障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに反応性を示す障害を治療するためにそのようなＣＮＰ変異体を使用する方法に関する。
【００７５】
Ａ．定義
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲を含む本願書で用いる以下の用語は、下に示す定義を有する。
【００７６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いているように、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈上他の状態が明確でない限り、複数ならびに単数の言及した事柄を含む。
【００７７】
「約」または「おおよそ」という用語は、値を測定または求める方法に一部依存する、当業者が測定する個々の値の許容できる誤差を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、１、２、３または４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、所定の値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。
【００７８】
標準的な化学用語の定義は、CareyおよびSundberg、AdvancedOrganic Chemistry、第３版、ＡおよびＢ巻（Plenum Press、New York、１９９２年）を含む参考図書に見いだすことができる。本発明の実施は、特に示さない限り、当分野の技術の範囲内の合成有機化学、質量分析、分取および分析用クロマトグラフィー、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術ならびに薬理学の従来の方法を用いるものである。例えば、T.E. Creighton、Proteins: Structures and Molecular Properties（W. H. Freeman andCompany、１９９３年）；A. L. Lehninger、Biochemistry（Worth Publishers, Inc.、第４版、２００４年）；Sambrookら、MolecularCloning: A Laboratory Manual（第２版、１９８９年）；Methods In Enzymology（S. ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press, Inc.）；Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版（Easton、Pennsylvania、MackPublishing Company、１９９０年）を参照のこと。
【００７９】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、上か下かにかかわりなく、それらの全体として参照により組み込まれている。
【００８０】
以下のアミノ酸の略語を本文を通して用いる。
【００８１】
【数１】
2011504506.tif 000002
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはペプチド結合イソスターにより結合した、アミノ酸残基からなるポリマー、関連する天然に存在する変異体およびその合成非天然類似体を意味する。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、生成物の最小の長さに限定されない。「タンパク質」という用語は、一般的に大きいポリペプチドを意味する。「ペプチド」という用語は、一般的に短いポリペプチドを意味する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは、当定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片は、当定義に含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然配列への欠失、付加、置換（本質的に保存的であってよく、あるいはヒトタンパク質に一般的に存在する２０アミノ酸のいずれか、または他の天然もしくは非天然もしくは非定型アミノ酸による置換を含んでいてよい）および化学改変（例えば、ペプチド模倣体の付加またはそれによる置換）を含み得る。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発または化学構成成分を除去もしくは結合させるためのアミノ酸の化学改変によるような意図的なものであったり、あるいはタンパク質を産生する宿主により生ずる突然変異またはＰＣＲ増幅による過誤によるような偶発的なものであり得る。
【００８２】
ポリペプチド配列を示すために本明細書では従来の表記法を用い、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
【００８３】
「保存的置換」は、機能的、構造的または化学的に類似な天然または非天然アミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を意味する。１つの実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
【００８４】
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００８５】
他の実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
【００８６】
（１）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；および
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）。
【００８７】
他の実施形態において、アミノ酸は、下に示すように分類することができる。
【００８８】
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）主鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【００８９】
１つの実施形態において、本明細書で述べるペプチドまたはポリペプチドは、ＣＮＰ変異体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて組換え手段により生成させる。したがって、本発明は、本明細書で述べるＣＮＰ変異体のいずれかをエンコードするポリヌクレオチド、発現制御配列に場合によって連結された、そのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞またはベクター、および本発明のＣＮＰ変異体を生成させるためのそのようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を用いる方法を含む。そのようなポリヌクレオチドにより発現されるＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体をエンコードするポリヌクレオチドの発現に適する条件下で培地中で宿主細胞を増殖させる段階、および発現産物を宿主または培地から分離する段階を含む方法により産生させることができる。実際の発現産物は、翻訳後処理によってエンコードされたタンパク質産物とわずかに異なる可能性がある。
【００９０】
「ポリヌクレオチド」は、核酸単位により構成されているポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然に存在する核酸ならびに核酸類似体を含む。「核酸」という用語は、一般的に大きいポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に約５０ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを一般的に意味する。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表す場合、ヌクレオチド配列は、「Ｔ」を「Ｕ」で置換したＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことは理解されるであろう。「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖形のｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡを意味する。
【００９１】
「発現制御配列」は、それに作用できるように連結されるヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。「作用できるように連結される」は、１つの部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が他の部分に対する作用（例えば、配列の転写）をもたらす、２つの部分の間の機能上の関係を意味する。発現制御配列は、例えば、かつ制限なしに、プロモーター（例えば、誘導または構成）、エンハンサー、転写ターミネータ、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナルおよび停止コドンを含み得る。
【００９２】
「組換えポリヌクレオチド」は、天然では結合しない配列を有するポリヌクレオチドを意味する。増幅または集合組換えポリヌクレオチドを適切なベクターに含めることができ、ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次いで、遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させて、例えば、「組換えポリペプチド」を産生させる。組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製の起点、リボソーム結合部位等）も果たすことができる。
【００９３】
「キメラ」は、本明細書で用いているように、当技術分野で一般的に公知の技術、例えば、組換え発現または化学的架橋を用いて結合または連結させた少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列（すなわち、異なる供給源由来または天然に存在する配列として互いに関連性がない）を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
【００９４】
２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における「同一」または「同一性」の割合という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、同じである、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定の割合を有する２つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列を意味する。
【００９５】
２つの核酸またはポリペプチドにおける「実質的に相同」または「実質的に同一」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の同一性を有する２つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列を一般的に意味する。特定の実施形態において、実質的な同一性は、長さが少なくとも約２５、５０、１００または１５０残基である配列の領域にわたって存在する。他の実施形態において、配列は、いずれかまたは両比較生体高分子の全長にわたって実質的に同一である。
【００９６】
配列の比較の場合、一般的に１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合に部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して（１つまたは複数の）試験配列の配列同一性の割合を計算する。
【００９７】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv.Appl. Math.、２巻、４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８巻、４４３頁（１９７０年）の相同性アライメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、８５巻、２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、または目視検査により行うことができる。有用なアルゴリズムの１例は、FengおよびDoolittle、J.Mol. Evol.、３５巻、３５１〜３６０（１９８７年）の漸進的アライメント法の簡略化を用いるＰＩＬＥＵＰであり、HigginsおよびSharp、CABIOS、５巻、１５１〜１５３頁（１９８９年）により記載された方法と類似している。配列の多重アライメントを発生させるのに有用な他のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Thompsonら、NucleicAcids Research、２２巻、４６７３〜４６８０頁（１９９４年））である。配列同一性の割合および配列類似性を測定するのに適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Altschulら、J.Mol. Biol.、２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年）；HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻、１０９１５頁（１９８９年）；KarlinおよびAltschul、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、９０巻、５８７３〜５７８７頁（１９９３年））。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公式に入手可能である。
【００９８】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる徴候は、第１の核酸によりエンコードされるポリペプチドが、下で述べるように、第２の核酸によりエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと一般的に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという他の徴候は、２つの分子が、下で述べるように、緊縮条件下で互いにハイブリッド形成することである。
【００９９】
「実質的に純粋な」または「分離された」は、対象となる種が存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、組成物中の他の個々の巨大分子種より豊富である）ことであり、実質的に精製された画分は、対象となる種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む、組成物である。１つの実施形態において、実質的に純粋な組成物は、問題とする種がモルまたは重量基準で組成物中に存在する巨大分子種の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上を含むことを意味する。組成物が単一巨大分子種から本質的になっている場合、対象となる種は、本質的な均質性になるまで精製されている（混入物種が従来の検出方法により組成物中に検出することができない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えば、ＢＳＡ）および元素イオン種は、この定義の目的のために巨大分子種とみなされない。１つの実施形態において、本発明の化合物は、実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本発明の化合物は、それらの合成に用いられる巨大分子出発物質に関して実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤、および場合によって、他の生物学的に活性な物質と混合された実質的に純粋または分離されたＣＮＰ変異体を含む。
【０１００】
物体に適用される「天然に存在する」は、物体を天然で見いだすことができることを意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室で人間により意図的に改変されなかったポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。１つの実施形態において、「天然に存在する」物質は、ヒト由来のものである。
【０１０１】
「野生型」（ｗｔ）は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を含む、天然形態を意味する用語である。野生型形態は、（１つまたは複数の）遺伝的突然変異により生ずるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の突然変異型と区別される。
【０１０２】
１つの実施形態において、第２のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドとの少なくとも約５０％、６０％または７０％の配列相同性を有するが、１００％未満の配列相同性を有するポリペプチドである。そのような類似体、変異体または誘導体は、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンを制限なしに含む天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基により構成されていてよい。そのような類似体、変異体または誘導体は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基により構成されていてもよく、またペプチド模倣体または２つもしくはそれ以上のアミノ酸もしくはペプチド模倣体残基間の非ペプチド結合などのペプチド結合イソスターを含んでいてもよい。他の実施形態において、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドの公知の切断生成物でなく、または第２のポリペプチドの公知の前駆体でない場合、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと１００％の配列相同性を有するか、または野生型配列を有していたとしても、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である。
【０１０３】
１つの実施形態において、「に由来する」という用語は、本明細書で用いているように、野生型または天然に存在するポリペプチドまたはペプチド配列に基づき、１つもしくは複数の欠失、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体による付加および／または置換を有していてよい、ポリペプチドまたはペプチド配列を意味する。１つの実施形態において、誘導体配列は、野生型または天然に存在する配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％または７０％の、しかし１００％未満の配列類似性を共有している。他の実施形態において、誘導体は、ポリペプチドの断片であってよく、断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸の長さにわたって野生型ポリペプチドと実質的に相同である（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相同）。他の実施形態において、ポリペプチドが野生型ポリペプチドに存在しない、それに結合した部分（例えばＰＥＧなどの、例えばポリマー）を有する場合、両ポリペプチドがそれらのアミノ酸配列における１００％の相同性を共有しているとしても、ポリペプチドは、野生型ポリペプチド「に由来」する。
【０１０４】
本明細書で用いているように、「ＮＰＰＣ由来」ポリペプチドは、一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドであり、切断により、最終的にｗｔＣＮＰ２２をもたらす、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）ポリペプチドに由来するポリペプチドである。ＮＰＰＣからの単一ペプチドの除去により、プロＣＮＰが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生成し、これが分泌され、未知の酵素により再び切断して、成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ、またはＣＮＰ−２２）が生成する。したがって、ＣＮＰ２２自体は、ＮＰＰＣに由来することにより、「ＮＰＰＣ由来」ポリペプチドである。１つの実施形態において、ＮＰＰＣ由来ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基にわたり野生型ＮＰＰＣと少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相同である。ＮＰＰＣ由来ペプチドは、ＮＰＰＣポリペプチドの約１〜約５３、または１〜３７、または１〜３５、または１〜３１、または１〜２７、または１〜２２、または１０〜３５、または約１５〜約３７残基を含むことがさらに予期される。１つの実施形態において、ＮＰＰＣ由来ポリペプチドは、ＮＰＰＣポリペプチドに由来する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３アミノ酸の配列を含んでいてよい。
【０１０５】
「有効な量」という用語は、被検体の健康状態、病状もしくは疾患に関する、または診断目的のための所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味する。所望の結果は、用量の受容者における主観的または客観的な改善を含んでいてよい。「治療上有効な量」は、健康に対する意図する有用な効果をもたらすのに有効な薬剤の量を意味する。あらゆる個別の例における適切な「有効な」量は、常法による実験を用いて当業者が決定することができる。個々の患者に対する個別の用量および投与頻度は、異なる可能性があり、用いる個々の化合物の活性；当化合物の生物学的利用能、代謝安定性、排泄速度および作用の持続時間；該化合物の投与の方法および時間；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性および食事；ならびに個々の状態の重症度などの様々な因子に依存することは理解されよう。
【０１０６】
「治療」は、予防的治療または治療処置または診断的治療を意味する。特定の実施形態において、「治療」は、治療、予防または診断の目的のために被検体に化合物または組成物を投与することを意味する。
【０１０７】
「予防的」治療は、健康異常を発現するリスクを低減する目的のために、疾患の徴候を示さない、または疾患の初期の徴候を示す被検体に適用する処置である。本発明の化合物または組成物は、健康異常を発現する可能性を低減するため、または発現した場合に健康異常の重症度を最小限にするために予防処置として投与することができる。
【０１０８】
「治療」処置は、健康異常の徴候または症状を示す被検体に対して、それらの徴候または症状を減弱させるまたは消失させる目的のために適用する治療である。徴候または症状は、生化学的、細胞、組織学的、機能的、主観的または客観的であってよい。本発明の化合物は、治療処置として、または診断のために投与することもできる。
【０１０９】
「診断」は、健康異常の状態の存在、程度および／または性質を特定することを意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性が異なっている。特定の診断方法は状態の明確な診断を可能にしないことがあるが、該方法が診断の助けとなる陽性徴候を示すならば、十分である。
【０１１０】
「医薬組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む対象動物における薬学的用途に適する組成物を意味する。医薬組成物は、治療上有効な量のＣＮＰ変異体、場合によって他の生物学的に活性な物質、および場合によって薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む。１つの実施形態において、医薬組成物は、（１つまたは複数の）有効成分および担体を構成する（１つまたは複数の）不活性成分、ならびに２つまたはそれ以上の成分の組合せ、錯体形成または凝集により、あるいは１つまたは複数の成分の解離により、あるいは１つまたは複数の成分の他の種類の反応または相互作用により、直接または間接的に生ずる生成物を含む。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを混合することにより調製されるあらゆる組成物を含む。
【０１１１】
「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロースの５％水溶液および乳剤（例えば、油／水または水／油型乳剤）などの標準的な医薬用担体、緩衝剤などのいずれかを意味する。賦形剤の非限定的な例は、アジュバント、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、流動促進剤、甘味料、着香料および着色剤などである。適切な医薬用担体、賦形剤および希釈剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１９版（Mack Publishing Co.、Easton、１９９５年）に記載されている。好ましい医薬用担体は、活性薬の投与方法に依存する。一般的な投与方法は、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射；または局所、経皮または経粘膜投与）などである。
【０１１２】
「薬学的に許容される塩」は、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアもしくは有機アミンの塩を含むが、これらに限定されない、医薬用の複合物に製剤化することができる塩である。
【０１１３】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、生物学的に、または他の点で望ましくない物質を意味する。すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、あるいはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと、または個体の身体上または体内に存在するいずれかの成分と有害な様態で相互作用することなく、個体に投与することができる。
【０１１４】
「単位剤形」という用語は、各単位が、あらかじめ定められた量の計算された本発明の化合物を所望の効果をもたらすのに十分な量で、場合によって、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体または媒体と共に含む、ヒトおよび動物被検体用の単位用量として適する物理的に不連続な単位を意味する。本発明の新規な単位剤形の仕様は、用いられる個々の化合物、達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【０１１５】
「生理的条件」は、動物（例えば、ヒト）の体内の条件を意味する。生理的条件は、体温ならびに生理的イオン強度、ｐＨおよび酵素の水性環境を含むが、これらに限定されない。生理的条件はまた、大多数の被検体に存在する「正常な」条件と異なる、例えば、約３７℃の正常なヒト体温と異なる、または約７．４の正常なヒト血液ｐＨと異なる特定の被検体の体内の条件を含む。
【０１１６】
「生理的ｐＨ」または「生理的範囲内のｐＨ」は、約７．０〜８．０（７．０と８．０を含む）の範囲、より一般的には約７．２〜７．６（７．２と７．６を含む）の範囲のｐＨを意味する。
【０１１７】
本明細書で用いているように、「被検体」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、哺乳類綱のメンバー：ヒト、チンパンジーなどのヒト以外の霊長類、および他の無尾サルおよびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物；ウサギ、イヌおよびネコなどの家畜；ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含むが、これらに限定されない。非哺乳動物の例は、鳥、魚などを含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性を表さない。
【０１１８】
「ポリエチレングリコール」、「ＰＥＧ」、「ポリエチレンオキシド」および「ＰＥＯ」という用語は、特に示さない限り、本明細書では同義で用いる。数ｎに関連する「ＰＥＯｎ」ポリマーにアミノ基を介して結合したＣＮＰペプチド（ＣＮＰ２２またはその変異体）は、一般的に式ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、ｎは、エチレンオキシド単位の数であり、Ｒは、ペプチドの残りを表す。「ＰＥＯｎ」ポリマーは、アルキレン基（ＣＨ２）ｎを場合によって有していてよく、ｎは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の１〜５の整数である。そのような「ＰＥＯｎ」（例えば、ＰＥＯ１２またはＰＥＯ２４）ポリマーは、単分散性、すなわち、特定の分子量の単一の分離した分子である。同様に、数ｎＫに関連する「ＰＥＧｎＫ」ポリマーにアミノ基を介して結合したＣＮＰペプチドは、一般的に式ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、ｐは、１より大きい整数である。「ＰＥＧｎＫ」ポリマーもアルキレン基（ＣＨ２）ｎを場合によって有していてよく、ｎは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の１〜５の整数である。しかし、そのような「ＰＥＧｎＫ」（例えば、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋ）ポリマーは、多分散性、すなわち、分子量の分布を有するポリマーの混合物を含み、数ｎＫは、キロダルトン単位のポリマー数平均分子量（Ｍｎ）を表す。例えば、ＣＮＰペプチドに結合している「ＰＥＧ２Ｋ」は、約２ｋＤａのポリマー数平均分子量を有する多分散性ＰＥＧポリマーである。
【０１１９】
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の質量の範囲が与えられている場合（例えば、ｋＤａ単位の）、範囲は、特に示さない限り、ポリマー数平均分子量の範囲を意味するのであって、多分散性混合物中の複数のポリマーの分子量の範囲を意味するものではない。
【０１２０】
「ハロゲン」、「ハロゲン化物」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素および／またはヨウ素を意味する。
【０１２１】
「アルキル」という用語は、線状または分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味し、アルキルは、本明細書で述べるように１つまたは複数の置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。特定の実施形態において、アルキルは、１〜２０個（Ｃ１−２０）、１〜１５個（Ｃ１−１５）、１〜１２個（Ｃ１−１２）、１〜１０個（Ｃ１−１０）または１〜６個（Ｃ１−６）の炭素原子を有する線状飽和一価炭化水素遊離基であるか、または３〜２０個（Ｃ３−２０）、３〜１５個（Ｃ３−１５）、３〜１２個（Ｃ３−１２）、３〜１０個（Ｃ３−１０）または３〜６個（Ｃ３−６）の炭素原子を有する分枝飽和一価炭化水素遊離基である。本明細書で用いているように、線状Ｃ１−６および分枝Ｃ３−６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含むすべての異性体を含む）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含むすべての異性体を含む）、ペンチル（すべての異性体を含む）ならびにヘキシル（すべての異性体を含む）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｃ１−６アルキルは、１〜６個の炭素原子の線状飽和一価炭化水素遊離基または３〜６個の炭素原子の分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味する。
【０１２２】
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を意味する。特定の実施形態において、アルコキシ基は、本明細書で述べるように１つまたは複数の置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。
【０１２３】
「ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されているアルキル基を意味する。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、１、２、３，４，５または６個のハロゲン原子で置換されている。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、本明細書で述べるように１つまたは複数のさらなる置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。
【０１２４】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で述べるように１つまたは複数のさらなる置換基Ｑで場合によって置換されていてよい、環状飽和架橋および／または非架橋一価炭化水素遊離基を意味する。特定の実施形態において、シクロアルキルは、３〜２０個（Ｃ３−２０）、３〜１５個（Ｃ３−１５）、３〜１２個（Ｃ３−１２）、３〜１０個（Ｃ３−１０）または３〜７個（Ｃ３−７）の炭素原子を有する。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニルおよびアダマンチルを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」という用語は、単環式非芳香環系または１つまたは複数の非芳香環を含む多環式系を意味し、１つまたは複数の非芳香環原子は、Ｏ、ＳまたはＮから独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの非芳香環原子は、炭素原子である。特定の実施形態において、ヘテロシクリルまたはヘテロ環式基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個または５〜６個の環原子を有する。特定の実施形態において、ヘテロシクリルは、縮合または架橋環系を含んでいてよく、窒素または硫黄原子が場合によって酸化されていてよく、窒素原子が場合によって第四級化されていてよく、一部の環が部分的もしくは完全に飽和されているか、または芳香族であってよい、単環式、二環式、三環式または四環式環系である。ヘテロシクリルは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。ヘテロ環式基の例は、アクリジニル、アゼピニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、ジオキソラニル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、１，４−ジチアニル、フラノニル、フラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサジアゾリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキサゾロピリジニル、オキサゾリル、オキシラニル、ペルイミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノオキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリドピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノオキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラ���ル、テトラヒドロチエニル、テトラゾリル、チアジアゾロピリミジニル、チアジアゾリル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリルおよび１，３，５−トリチアニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロ環式基は、本明細書で述べるように１つまたは複数の置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。
【０１２６】
「アリール」という用語は、単環式芳香族基または少なくとも１つの芳香族炭化水素環を含む多環式一価芳香族基を意味する。特定の実施形態において、アリールは、６〜２０個（Ｃ６−２０）、６〜１５個（Ｃ６−１５）または６〜１０個（Ｃ６−１０）の環原子を有する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニルおよびテルフェニルを含むが、これらに限定されない。アリールは、二環式または三環式炭素環も意味し、環の少なくとも１つは、芳香族であり、他は、飽和、部分的に不飽和または芳香族、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニルおよびテトラヒドロナフチル（テトラリニル）であってよい。特定の実施形態において、アリール基は、本明細書で述べるように１つまたは複数の置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。
【０１２７】
「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つの芳香環がＯ、ＳおよびＮから独立に選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む、単環式芳香族基または多環式芳香族基を意味する。ヘテロアリール基の各環は、１つもしくは２個のＯ原子、１つもしくは２個のＳ原子および／または１〜４個のＮ原子を含んでいてよく、ただし、各環におけるヘテロ原子の総数は、４個またはそれ未満であり、各環は、少なくとも１個の炭素原子を含む。ヘテロアリールは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。特定の実施形態において、ヘテロアリールは、５〜２０個、５〜１５個または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニルおよびトリアジニルを含むが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基の例は、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピリジニル、チエノピリジニル、ジヒドロイソインドリルおよびテトラヒドロキノリニルを含むが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリール基の例は、カルバゾリル、ベンゾインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニルおよびキサンテニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、本明細書で述べるように１つまたは複数の置換基Ｑで場合によって置換されていてよい。
【０１２８】
「場合によって置換された」は、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールなどの基が１つまたは複数の置換基Ｑ（１つの実施形態において、１つ、２つ、３つまたは４つの置換基Ｑ）で置換されていてよいことを意味し、各Ｑは、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅおよび−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇからなる群から独立に選択され、各Ｒｅ、Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈは、独立に水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリールもしくはヘテロアリールであり、またはＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒になってヘテロシクリルを形成している。
【０１２９】
Ｂ．ＣＮＰ変異体
ＣＮＰ２２の治療薬としての使用は、血漿中でのその半減期の短さから限られている（J.Clin. Endocrinol. Metab.、７８巻：１４２８〜３５頁（１９９４年））。ヒト血漿中で、ＣＮＰ２２の濃度は通常５ピコモル未満である。ＣＮＰ２２は、ヒトにおいてＮＥＰおよびＮＰＲ−Ｃにより分解され、循環から取り除かれる。（GrowthHormone & IGF Res.、１６巻：Ｓ６〜Ｓ１４頁）。全身投与されたＣＮＰ２２を使用したすべてのヒトおよび動物の研究において、対象中のＣＮＰ２２濃度を上昇させるために持続注入が使用されている。長い半減期および少なくとも同様のレベルの機能性を有するＣＮＰペプチドは、ＣＮＰに基づく治療戦略に有益であると思われる。
【０１３０】
本発明は、ＮＥＰおよび／またはＮＰＲ−Ｃに対して親和性が低下し、ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する感受性が減少しているが、野生型ＣＮＰ２２と実質的に同じまたはそれより優れた機能性を有するＣＮＰ変異体を提供する。
【０１３１】
ＮＥＰの天然基質は低分子であり、ナトリウム利尿ペプチド（約２．２から約３．２ｋＤａ）は最も高分子の天然基質である。Ｘ線結晶解析によれば、ＮＥＰの活性部位は、中心腔内部に深く埋もれており、基質分子のサイズは、約３ｋＤａ以下に効果的に制限される（Oefnerら、J. Mol. Biol.、２９６巻：３４１〜３４９頁（２０００年））。ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達の研究に基づいて、ＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２の環状ドメインのＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２のみを保有する）およびＣＮＰ−５３（Ｎ末端において３１個のアミノ酸延長を有するＣＮＰ−２２）などのＣＮＰ−２２の変異体は、なお２．２ｋＤａのｗｔＣＮＰ−２２と同様にＮＰＲ−Ｂに結合でき、ＮＰＲ−Ｂを活性化できる。したがって、本発明は、ＣＮＰ２２変異体あるいはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端において天然ポリマー（例えばペプチド）および／または合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に接合されたCNP変異体を包含し、これらはＮＥＰ耐性の上昇を示すが、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達受容体に結合し、活性化する能力を保有している。
【０１３２】
一実施形態において、本発明は、一般式：
（ｘ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１３９）、または
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４０）、
で表されるＣＮＰ変異体を包含し、式中、
（ｘ）および（ｚ）は、本明細書に記載のように、個々に独立して天然ポリマー（例えば、少なくとも１個のアミノ酸を含有するペプチド配列）および／または合成ポリマー（例えばＰＥＧ）であり、ＣＮＰ変異体の総質量が、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする。一実施形態において、残基Ｃｙｓ６からＣｙｓ２２は、環状部分を形成する。ある実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＮＰＰＣまたは非ＣＮＰポリペプチド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＩｇＧなど）に由来するアミノ酸延長を含み、この延長は、１から４０、１から３５、１から３１、５から３５、５から３１または５から１５個のアミノ酸を含有する。別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の以下の位置：Ｇｌｙ１、Ｌｙｓ４、Ｇｌｙ５、Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｌｅｕ２０およびＧｌｙ２１の１つまたは複数に、別の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および／またはペプチド結合イソスターによる１つまたは複数の改変および／または置換を含む。
【０１３３】
別の実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有するＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加させるために設計され、以下の一般式：
（ｘ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４１）、または
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号６）、で表され、式中、
（ｘ）は、合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の限定されない例はＰＥＧ（またはＰＥＯ）であり、天然ポリマー基の限定されない例は、１から３５個のアミノ酸を含有し、置換および／または欠失を有するＮＰＰＣもしくはその変異体に由来するアミノ酸配列、ＡＮＰ、ＢＮＰあるいは他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、例えば血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である。
【０１３４】
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであってよく、合成ポリマー基の限定されない例はＰＥＧであり、天然ポリマー基の限定されない例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰまたはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧ）に由来するアミノ酸配列であり、
（ｂ）および（ｈ）は、独立して、上記位置で野生型Ｌｙｓであってもよく、あるいは保存的アミノ酸置換により置き換えられていてもよく、あるいは天然または非天然のアミノ酸あるいは限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒを含む、側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体であってもよい。一実施形態において、（ｂ）はＡｒｇである。別の実施形態において、ＮＥＰ耐性の改善のために、（ｂ）はＧｌｙではない。さらに別の実施形態において、（ｈ）はＡｒｇではない。
【０１３５】
ＮＰＰＣまたはその変異体に由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Arg、
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号７）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg（配列番号８）、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg（配列番号９）、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln（配列番号１０）、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser（配列番号１１）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln、（配列番号１２）
Gly-Ala-Asn-Arg-Met、（配列番号１３）
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr（配列番号１４）、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser（配列番号１５）、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala（配列番号１６）、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg（配列番号１７）、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg（配列番号１８）、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号１９）、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg（配列番号２０）、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys（配列番号２１）、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg（配列番号２２）を含む。
【０１３６】
非ＣＮＰポリペプチド、例えばＡＮＰ、ＢＮＰ、血清アルブミンおよびＩｇＧなどに由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser（配列番号２３）；
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr（配列番号２４）；
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly（配列番号２５）；
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly（配列番号２６）；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr（配列番号２７）；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His（配列番号２８）；
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg（配列番号２９）；
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr（配列番号３０）；
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln（配列番号３１）；および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser（配列番号３２）
を含む。
【０１３７】
ある実施形態において（ｘ）および／または（ｚ）の基を有する任意のＣＮＰ変異体の、Ｎ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基は、本明細書において記載のように、もしあれば、少数の酸性の天然または非天然アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を含有するアミノ酸配列を独立して含む。別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＣＮＰ２２（ｐＩ８．９）のｐＩと同様のアルカリのｐＩを維持するために、塩基性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ）に富んでいる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体のｐＩは約８から約１０．５の範囲であり、ＣＮＰ変異体が骨成長板の軟骨細胞周辺の細胞外マトリックスを介してより容易に拡散できるように設計される。より狭い範囲の実施形態において、ＣＮＰ変異体のｐＩは約８．５から約１０．５または約８．５から約１０または約９から約１０である。
【０１３８】
まだ別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は極性の天然または非天然アミノ酸に富んでおり、水溶解度を増加するために設計される。さらに別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、もしあれば、少数の疎水性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔ）を含有する。
【０１３９】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体のＮ末端は少なくとも１個のグリシン残基で終結し、血清半減期を増加するために設計される。関連する実施形態において、ピログルタミン酸の形成を防ぐために、ＣＮＰ変異体のＮ末端は、グルタミン酸で終結しない場合、グリシン残基で終結する。一実施形態において、（ｘ）基はＮ末端が少なくとも１個のグリシン残基で終結するアミノ酸の延長を含有する。別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、２つの隣接する塩基性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇ）を含有せず、プロテアーゼのフューリンによる切断に対する感受性が減少するように設計される。ある実施形態において、（ｘ）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前に２つの隣接する塩基性アミノ酸を含有しない。
【０１４０】
さらに別の実施形態において、ＣＮＰ変異体の（ｘ）基および／または（ｚ）基は、ＮＰＰＣに由来するアミノ酸配列（例えば、ＣＮＰ５３由来）を含む。ある実施形態において、（ｘ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＮ末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、（ｚ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＣ末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、非ナトリウム利尿ポリペプチド、例えば、ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、ＦＧＦ−２および骨ターゲティングタンパク質、（例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など）に由来するアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
ＣＮＰ２２またはその変異体が、Ｎ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基を有する、本明細書に記載の任意の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、独立して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の機能的ドメインに由来するアミノ酸配列を含有することができる。ＢＭＰの機能的ドメインに由来するＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸延長は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とするＣＮＰ変異体の総質量を増加することによって、ＮＥＰ耐性およびしたがってＣＮＰ変異体の血清半減期を増加させることができる。さらに、特定のＢＭＰは、骨および軟骨の形成を誘導する成長因子およびサイトカインであるので、ＢＭＰの機能的ドメインに由来する断片は、ＣＮＰ２２またはその変異体の環状ドメインによりＮＰＲ−Ｂのグアニル酸シクラーゼ機能の活性化とは異なる機序により、軟骨細胞、軟骨または骨の成長を促進できる。骨の形成および発達、軟骨の形成および発達、および／または骨芽細胞分化を促進するＢＭＰの限定されない例は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａを含む。ある実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａのＣ末端部分の最後の１４０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列と独立して接合する。
【０１４２】
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端におけるアミノ酸延長は、限定するものではないが、
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ−５３）（配列番号４）；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ−３７、類似体ＢＬ（配列番号６０））；
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＡ）（配列番号６１）；
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＢ）（配列番号６２）；
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＣ）（配列番号６３）；
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号４０）；
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号３８）；
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６４）；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６５）；
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６６）；
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号６７）；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（配列番号１４４）；および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH（類似体ＣＤ）（ＢＮＰに由来するＮ末端およびＣ末端のテールを有するＣＮＰ１７）（配列番号６８）
を含む。
【０１４３】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の４位においてＫ４Ｒ置換を有する。ＣＮＰ（Ｋ４Ｒ）変異体の限定されない例は、
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４））（類似体ＡＹ）（配列番号３６）；
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４））（類似体ＣＩ）（配列番号３７）；
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＡＺ）（配列番号４１）；
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＢＡ）（配列番号３９）；
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＨ）（配列番号６９）；および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＧ）（配列番号７０）
を含む。
【０１４４】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２およびＮ末端ペプチド断片を含むキメラであり、限定するものではないが、
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＱ）（ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７６）；
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＲ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７７）；
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＸ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７８）；
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＦ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７９）；
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＹ）（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８０）；
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＥ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８１）；
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＺ）（オステオクリン「ＮＰＲ  Ｃ阻害剤」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８２）；および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＤＡ）（ＦＧＦ２「ヘパリン結合ドメイン」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８３）
を含む。
【０１４５】
まだ別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端ペプチド断片およびアルギニンがＣＮＰ２２のＬｙｓ４と置換されたＣＮＰ２２（「ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）」）を含むキメラであり、限定するものではないが、
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＫ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８４）；
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＬ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８５）；
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＭ）（フィブロネクチン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８６）；
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＮ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８７）；
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＯ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８８）；および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＰ）（亜鉛フィンガー断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８９）
を含む。
【０１４６】
ＩｇＧおよびＣＮＰ２２またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、ＮＥＰ分解に対する耐性の増加および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。ＨＳＡの表面断片を含むＣＮＰキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リジン、非アルギニンである配列をＮ末端に含有するＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２およびＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）のキメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増加のために設計される。オステオクリン断片を含有するキメラは、プロテアーゼ（例えば、フューリン）による切断に対して、この断片がクリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃを阻害すると思われる骨成長板において、オステオクリン断片を放出するために設計される。ＦＧＦ２ヘパリン結合断片を含むキメラに関して、断片に結合するヘパリンは、キメラを分解から保護するために設計され、その結果、より長い血清半減期を提供する。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含有するキメラは、他の特徴に加えて血清アルブミンに対する結合を減少させるために設計される。
【０１４７】
理論に縛られることを意図するものではないが、ＮＥＰ分解に対する耐性が増加し、ｗｔＣＮＰ２２と比較して同様または改善された機能性（例えば、ＮＰＲ−Ｂに対する結合およびｃＧＭＰシグナル伝達の刺激）を有する、分子量約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａのＣＮＰ変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質と堅く結合しない場合、より有効であり得る。血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）と堅く結合しないＣＮＰ変異体は、軟骨を介した骨成長板の軟骨細胞に至る拡散およびｃＧＭＰシグナル伝達のためのＮＰＲ−Ｂへの結合および活性化においてより有効であり得る。一実施形態において、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）への結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体およびＩｇＧ由来のペプチド断片を含むキメラである。別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）およびポリペプチド（例えば、ＩｇＧ、ＨＳＡ、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチドなど）由来の断片を含むキメラである。まだ別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、親水性または水溶性のポリマーに接合されたＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一実施形態において、親水性または水溶性のポリマーはＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。別の実施形態において、親水性または水溶性のポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、生理的条件下でポリマーに負の電荷を付与する、１つまたは複数の官能基、例えばカルボキシル基、硫酸基またはリン酸基あるいはそれらの組合せにより官能化される。
【０１４８】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体はＣＮＰ３７の誘導体であり、これは、ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（配列番号６０）である。ＣＮＰ３７変異体は、ＣＮＰ３７の３７位のいずれか１つまたは複数において、アミノ酸の付加、欠失および／または天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体（例えば、ペプチド結合イソスター）との置換を含有し得る。ＣＮＰ３７において実施され得る置換の限定されない例は、ＣＮＰ２２のナンバリングに基づいて、Ｋ４Ｒ、Ｇ５Ｓ、Ｇ５Ｒ、Ｇ８Ｓ、Ｋ１０Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｒおよびそれらの組合せを含む。ある実施形態において、ＣＮＰ３７誘導体は、メチオニンの硫黄原子の酸化を避けるために一部設計された、Ｍｅｔ１７と、天然（例えば、アスパラギン）または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。別の実施形態において、ＣＮＰ３７変異体は、アルブミン結合を減少させるため一部に設計された、（ＣＮＰ３７のＮ末端からのナンバリングに基づいて）Ｌｙｓ８、Ｌｙｓ１０、Ｌｙｓｌ４および／またはＬｙｓ１５と、非塩基性の天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。
【０１４９】
さらにまたは代替的には、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換のために、ＣＮＰ３７誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部部位において、本明細書に記載の任意の部分に接合でき、これらは限定するものではないが、骨または軟骨ターゲティング部分（例えば、骨ターゲティングペプチドドメイン）、腎クリアランスを減少させる部分（例えば、負に荷電したＰＥＧ部分）、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、１つまたは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列（例えば、オステオクリン「ＮＰＲ−Ｃ阻害因子」断片）、糖（例えば、骨成長板の細胞表面上の受容体によって認識される糖）、疎水性の酸（例えば、Ｃ５〜Ｃ１２のカルボン酸および天然脂肪酸）およびそれらの組合せを含む。
【０１５０】
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、フューリンプロテアーゼに対するｉｎ  ｖｉｖｏの耐性を改善するためにフューリン切断部位（下線）に突然変異／置換を有する、および／または血漿安定性の改善およびピログルタミン酸形成の阻止のためにＮ末端にグリシン（下線）を含有する、改変ＣＮＰ３７ペプチドである。このようなＣＮＰ３７変異体は、限定するものではないが、
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＳ）（配列番号７１）；GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＴ）（配列番号７２）；GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＵ）（配列番号７３）；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＣＷ）（配列番号７４）；および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（類似体ＤＢ）（配列番号７５）
を含む。
【０１５１】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端において細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の転座を容易にする部分に接合したＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一実施形態において、ＣＮＰ変異体はＮ末端および／またはＣ末端において、活性ペプチド輸送体経由を含む、細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の輸送を容易にするペプチド配列に接合する。
【０１５２】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、化学的部分、例えば、天然および／または合成のポリマーなどに接合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする改変ＣＮＰペプチドの総質量を増加させる。一実施形態において化学的部分は、生体適合性のある、親水性または水溶性の天然ポリマー（例えば、ペプチド、糖）または合成ポリマー（例えばＰＥＧ（またはＰＥＯ））である。
【０１５３】
特定の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端はＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに接合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量をもたらす。ＣＮＰ２２またはその変異体のＰＥＧ化は、とりわけ、免疫原性の低下および腎クリアランスの減少による半減期の改善およびプロテアーゼ耐性の増加のために設計される。ＰＥＧ部分は、限定するものではないが、ＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２の環状部分）、ＣＮＰ３７およびＮ末端および／またはＣ末端にアミノ酸延長、アミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を有するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７の変異体を含む、ＣＮＰ２２または本明細書に記載の任意の変異体のＮ末端および／またはＣ末端に結合できる。ある実施形態において、ＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７あるいはそれらの変異体のＬｙｓ４および／またはＬｙｓ１０残基は、天然または非天然アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＣｉｔ）または側鎖に反応性第一級アミンを含有しないペプチド模倣体により置換され、これらのリジン残基のＰＥＧ化の可能性はいずれも排除される。一実施形態において、ＣＮＰペプチドのＬｙｓ４および／またはＬｙｓ１０残基は、Ａｒｇにより置換される。別の実施形態において、Ｌｙｓ１０残基は、Ａｒｇにより置換されない。
【０１５４】
さらなる実施形態において、Ｎ末端にＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分およびアミノ酸延長を有するＣＮＰ変異体（ＣＮＰ２２およびその変異体を含む）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前にアルギニンを含有する。このようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する耐性の増加、血清アルブミンに対する結合の減少およびＣＮＰの機能的活性（例えば、ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化）の増強のために設計される。このようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の限定されない例は、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２およびＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２，を含み、ＰＥＯ２４は、単分散の１．２ｋＤａのＰＥＧポリマーであり、ＰＥＯ１２は単分散の０．６ｋＤａのＰＥＧポリマーである。一実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーは、ＣＮＰ変異体のＮ末端に接合する。
【０１５５】
本発明は、型（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダムコポリマー、交互コポリマーまたはブロックコポリマー；線状または分枝；単分散または多分散）、結合（例えば、加水分解性またはアミド、イミン、アミナール（ａｍｉｎａｌ）、アルキレンまたはエステル結合などの安定性の結合）、結合部位（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端、（ＣＮＰ２２の残基６〜２２に対応する）ＣＮＰの環状領域中の任意の残基ではないことが好ましい）および長さ（例えば、約０．２、０．４または０．６ｋＤａから約２、３、４または５ｋＤａ）を変化させることができる親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の使用を企図する。親水性または水溶性ポリマーは、Ｎ−ヒドロキシ酸スクシンイミド（ＮＨＳ）あるいはアルデヒドに基づく化学物質または他の化学物質を用いてＣＮＰペプチドに接合でき、このことは当分野において公知である。このようなＣＮＰ変異体は、例えばｗｔＣＮＰ２２（２．２ｋＤａ）、ｗｔＣＮＰ２２の環状領域（残基６〜２２）のみを保有するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端にアミノ酸延長を有するＣＮＰ変異体あるいはアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有する変異体、例えば、ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）、ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）、Ｒ−ＣＮＰ２２、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＥＲ−ＣＮＰ２２およびＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）などを使用して作製できる。ある実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有するＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づく化学物質を介してＮ末端および／またはＣ末端に接合する、単分散の線状ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分あるいはＮＨＳに基づく化学物質を介してＮ末端および／またはＣ末端に接合する、２アームまたは３アームの分枝ＰＥＧ部分を含有する。本発明は、腎クリアランスの減少のために設計された、負に荷電したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体もまた包含し、限定するものではないが、カルボキシ化、硫酸化およびリン酸化化合物を含む（Caliceti、Adv. Drug Deliv. Rev.、５５巻：１２６１〜７７頁（２００３年）； Perlman, J.Clin. Endo. Metab.、８８巻：３２２７〜３５頁（２００３年）；Pitkin、Antimicrob. Ag. Chemo.、２９巻：４４０〜４４４頁（１９８６年）；Vehaskari,Kidney Int'l、２２巻：１２７〜１３５頁（１９８２年））。一実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、カルボキシル基、硫酸基および／またはリン酸基を含有する。
【０１５６】
ある実施形態において、本発明は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）に、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づく化学物質を介して接合するＣＮＰ２２またはその変異体を包含し、式中、ｎは約６から約１００までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａまでである。別の実施形態において、ｎは、約１２から約５０までの整数であり、ＰＥＧポリマーは約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａまでである。まだ別の実施形態において、ｎは、約１２から約２４までであり、ＰＥＧポリマーは約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａまでである。さらに別の実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基である。
【０１５７】
さらなる実施形態において、本発明は、１つまたは複数のペプチド結合または中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）を含むペプチダーゼによる切断に対する感受性が減少したペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰは、高分子疎水性残基のアミノ末端において、基質のペプチド結合を切断する、膜結合亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。したがって、非天然のペプチドまたは非ペプチド結合に対する、ＮＥＰに関する切断部位におけるペプチド結合の改変は、ＮＥＰ切断の有効性をなくす、または減少させることができる。
【０１５８】
ＡＮＰおよびＣＮＰに関しては、ＮＥＰによる切断が、まず環状領域内のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合に発生し、その後構造の残りの他のいたるところにおいて発生することが報告されている。ＢＮＰに関しては、切断はまずペプチドのＮ末端において発生し、その後環状構造内において発生することが報告されている。ＣＮＰ上の第１のＮＥＰ切断部位は、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合であることが報告されているが、ｗｔＣＮＰ２２がｉｎ  ｖｉｔｒｏで２．５分ＮＥＰ消化に曝露された場合、すべての候補部位は予想に反して加水分解され、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７およびＧｌｙ８−Ｌｅｕ９のペプチド結合は、実施例２に記載のように、若干最も不安定であった。
【０１５９】
ＮＥＰの基質特異性は、２つの基質結合サブ部位、Ｓ１’およびＳ２’により主に決定される（Oefner ら、J. Mol. Biol. ２９６巻：３４１〜３４９頁（２０００年））。Ｓ１’部位は、Ｎ末端ペプチド結合が加水分解される高分子の疎水性Ｐ１’残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＭｅｔ）を受容する。Ｓ２’部位は、一般的により低分子の残基が好ましく、Ｐ２’（例えば、ＧｌｙまたはＳｅｒ）と呼ばれる。ＣＮＰの場合、Ｐｈｅ７は、ＮＥＰのＳ１’部位に関して好ましいＰ１’残基であるが、一方Ｇｌｙ８は、Ｓ２’部位に関して好ましいＰ２’残基であることが報告されている。これらの２つのサブ部位は、特定の総サイズの側鎖とだけ一緒になって適合するので、ＣＮＰのＰ１’−Ｐ２’残基の総サイズの増加はいずれもＮＥＰ結合を崩壊させ得る可能性がある。例えば、Ｐ１’  Ｐｈｅ７芳香族環の３位における塩素原子の付加（すなわち、３−Ｃｌ−Ｐｈｅ７）は、ＣＮＰと、ＮＥＰ切断部位、例えばＳ１’サブ部位との間の相互作用を改変（例えば、安定性を損なう）し得る可能性がある。３級ブチル基の、より低分子のＰ２’残基のＧｌｙ８への付加（すなわちｔＢｕ−Ｇｌｙ８）は、ＣＮＰと、Ｓ２’サブ部位との相互作用を崩壊し得る可能性がある。
【０１６０】
したがって、一実施形態において、本発明のＣＮＰ変異体は、活性部位において基質認識に干渉し、ＮＥＰ切断に対する感受性を減少させるために、Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８などのサイズが大きくなったＰ１’−Ｐ２’残基を有するＣＮＰを含む。天然アミノ酸、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体部分は、限定するものではないが、Ｐｈｅ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｍｅｔ１７およびＬｅｕ２０を含む、１つまたは複数の大きなＰ１’疎水性残基および／または限定するものではないが、Ｃｙｓ６、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６およびＧｌｙ１９を含む、１つまたは複数のより小さなＰ２’残基に置換される。
【０１６１】
本発明は、基質認識および／またはＮＥＰよる切断に関連する少なくとも１つの残基に、少なくとも１つの修飾アミノ酸および／または少なくとも１つの修飾ペプチド結合を含むＣＮＰ変異体を包含し、修飾アミノ酸および修飾ペプチド結合は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および／またはペプチド結合イソスターであり得る。一実施形態において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間のＣＮＰ上のＮＥＰ切断部位は改変される。関連する実施形態において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスター：
−ＣＨ２−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−、式中、アミド基は以下の任意のＲ基によりアルキル化される：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、
−ＣＨ２−Ｓ−、
−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−、式中ｎは１または２である、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＨ＝ＣＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−、
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
の１つと置き換えられる。
【０１６２】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号９０）で表され、
式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など（Wangら、Adv. Drug Delivery Rev.、５７巻：１０４９〜７６頁（２００５年））；腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に荷電したＰＥＧなど；ならびに天然ポリマー（例えば、アミノ酸、脂肪酸および／または糖を含有するもの）およびＣＮＰ変異体の総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増加させることによってＮＥＰ分解に対するＣＮＰ変異体の耐性を増加させる合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）；からなる群から選択されてもよく；
（ｂ）および（ｃ）は、野生型Ｃｙｓ６およびＰｈｅ７、別の天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってもよく、あるいはＮＥＰ切断に対する耐性を増加させるために本明細書に記載のペプチド結合イソスターを含有してもよく；
（ｄ）は、野生型Ｇｌｙ８であってもよく、あるいはＮＥＰへの結合を減少させるためにより高分子の天然または非天然（例えば、ｔ−Ｂｕ−Ｇｌｙ）アミノ酸またはペプチド模倣体であってもよい。
【０１６３】
一実施形態において、このようなＣＮＰ変異体は、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）に少なくとも１つの修飾アミノ酸を含有する。
【０１６４】
Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０の各結合を含む、ＣＮＰ内の他のペプチド結合は、ＣＮＰ２２またはその変異体がＮＥＰ耐性ペプチド結合またはペプチド結合イソスターをＣｙｓ６−Ｐｈｅ７に有していたとしても、切断され得る。したがって、本発明は、ペプチド結合イソスターを、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７に加えて１つまたは複数の他のＮＥＰ切断部位に有するＣＮＰ変異体を包含し、ペプチド結合イソスターは、本明細書に記載のものを含む。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、限定するものではないが、ホモシステイン、ペニシラミン、２−メルカプトプロピオン酸および３−メルカプトプロピオン酸を含む、システイン類似体を、Ｃｙｓ６および／またはＣｙｓ２２に有するＣＮＰ変異体を包含する。ある実施形態において、このようなＣＮＰ変異体は、野生型Ｃｙｓ６または類似体とＣｙｓ２２または類似体との間のジスルフィド結合により形成された環状ドメインを有する。
【０１６６】
まだ別の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体の１つまたはすべての残基までの複数の残基は、Ｄ−アミノ酸により置換される。Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸による置換は、側鎖をそのもともとの位置から本質的に約１２０°動かし、その結果、ＣＮＰペプチドとＮＥＰとの結合を崩壊させる可能性がある。具体的な実施形態において、Ｐｈｅ７のＬ−Ｐｈｅは、そのＤ−光学異性体のＤ−Ｐｈｅで置換される。
【０１６７】
さらに別の実施形態において、βアミノ酸、例えば、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸（または２−フェニル−β−アラニン）により、野生型αアミノ酸のＰｈｅ７が置き換えられる。βアミノ酸の使用は、１つのメチレン単位によりペプチド骨格の長さを有効に延長する。プロテアーゼ耐性は、基質立体配座の変化またはアミノ酸側鎖間の距離の増加によりもたらされ得る。
【０１６８】
非天然α−アミノ酸、β−アミノ酸またはペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ２２の変異体の限定されない例は、
GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC（類似体Ａ）（配列番号５６）、
GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC（類似体Ｂ）（配列番号５７）、
GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC（類似体Ｅ）（配列番号１３６）、
GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC（類似体Ｆ）（配列番号５８）、
GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC（類似体Ｇ）（配列番号１３７）、および
GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC（類似体Ｈ、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸を使用して形成される）（配列番号５９）を含む。
【０１６９】
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有し、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加するために設計され、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４６）で表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など；腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に荷電したＰＥＧなど；アミノ酸、疎水性酸および／または糖を含有するポリマー；ならびに合成親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧなど；からなる群から選択されてもよく；
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、ここで一実施形態において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、ＣｙｓおよびＣｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合イソスター、例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨからなる群から選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであるＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリールおよびヘテロアリール（限定するものではないが、例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロフェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群から選択される１つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環が、別のアリール基（限定されない例は、１−および２−ナフチルアラニンを含む）またはヘテロアリール基（限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む）により置き換えられ得るＰｈｅ類似体；からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、一実施形態において、（ｆ）はＡｒｇではない；
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−ＧｌｙおよびＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、β−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され；
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【０１７０】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有し、ＮＥＰ切断に対する耐性を増加するために設計され、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４３）で表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネートなど；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列およびそれらの誘導体、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などの融合タンパク質またはペプチド配列；限定するものではないが、親水性または水溶性ポリマー例えば、荷電ＰＥＧ分子などを含む、腎クリアランスを減少させる部分、ならびに、例えばＰＥＧ、アミノ酸、糖および／または疎水性の酸を含む部分；からなる群から選択されてもよく；
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、一実施形態において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、ＣｙｓおよびＣｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合イソスター、例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨからなる群から選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであるＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体、；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール（限定するものではないが、例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロフェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群から選択される１つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環が、別のアリール基（限定されない例は、１−および２−ナフチルアラニンを含む）またはヘテロアリール基（限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む）により置き換えられ得るＰｈｅ類似体；からなる群から選択され、；
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｆ）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、ＧｌｎおよびＳｅｒからなる群から選択され；
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ａｓｎおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、β−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され；
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
【０１７１】
ＣＮＰ変異体の、骨関連障害（例えば、骨系統疾患）の標的部位への送達を改善するために、ＣＮＰ変異体は、骨または軟骨ターゲティング部位に（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端で）結合することができる。骨または軟骨ターゲティング部位の限定されない例は、ビスホスホネート；ヒドロキシアパタイト；グルコサミン；コラーゲン（例えば、Ｘ型コラーゲン）；ポリＡｓｐ；ポリＧｌｕ；および骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などを含む。
【０１７２】
ＮＥＰ切断に対する感受性が低下することに加えて、ＣＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対する親和性が低下する可能性があるが、一方、ＣＮＰの機能性は保有する。ＮＥＰにより仲介される分解のほかに、ＣＮＰ２２の半減期は、クリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃにより影響され、ＮＰＲ−Ｂの細胞外ペプチド結合ドメインと５８％の配列相同性を共有する。ＣＮＰ２２は、ＮＰＲ−Ｂ（親和性７〜３０ｐＭ）と堅く結合するだけではなく、ＮＰＲ−Ｃ（１１〜１４０ｐＭ）とも堅く結合する（Bennett, B.D.ら、J. Biol. Chem.、２６６巻：２３０６０〜６７頁（１９９１年）；Koller K. J.& Goeddel, D.V.、Circulation、８６巻：１０８１〜８８頁（１９９２年）；Suga, S.ら、Endocrinology、１３０巻：２２９〜３９頁（１９９２年））。ＮＰＲ−Ｂの結晶構造は未だに報告されていないにもかかわらず、ＮＰＲ−ＣとＮＰＲ−Ａとの結晶構造の間の配列相同性ならびに類似性（He,X. -L.ら、Science、２９３巻（５５３５号）：１６５７〜６２頁（２００１年）；Ogawa, H.ら、J. Biol. Chem.、２７９巻（２７号）：２８６２５〜３１頁（２００４年）；He,X.-L.、J. Mol. Biol.、３６１巻（４号）：６９８〜７１４頁（２００６年））は、ＮＰＲ−Ｂにより、全体的な構造の折りたたみが類似であると推定されることを示唆している。
【０１７３】
したがって、ＮＰＲ−Ｂ相同モデルは、構造に基づく配列アライメントおよび以下の関連系：ＮＰＲ−Ｃに結合したＣＮＰ、ＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰおよびＮＰＲ−Ｃに結合したＡＮＰ、の結晶構造に基づいて構築された（He, X.-L.ら、Science、２９３巻（５５３５号）：１６５７〜６２頁（２００１年）；Ogawa, H.ら、J. Biol.Chem.、２７９巻（２７号）：２８６２５〜３１頁（２００４年）；He, X.-L.、J. Mol. Biol.、３６１巻（４号）：６９８〜７１４頁（２００６年））。受容体が、結合したペプチドの立体配座を決定すると思われるという観察およびＮＰＲ−Ｂが一次構造および機能特性に関して最もＮＰＲ−Ａに近いという観察に基づいて、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰの相同モデルを、ＮＰＲ−Ａ／ＡＮＰ結晶構造をモデルとして用いて構築した。ＣＮＰ変異体の公開されたシグナル伝達データ（米国特許第５，４３４，１３３号および米国特許出願第２００４／０１３８１３４Ａ１号）およびもはやＮＰＲ−Ｃに結合していないＡＮＰ変異体の公開されたシグナル伝達データ（Cunningham、EMBO１３巻（１１号）２５０８〜１５頁、１９９４年）を使用して、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰモデルを改良し、解明した。
【０１７４】
本発明は、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ複合体の相同性に基づく構造モデルに基づいて、ＮＰＲ−Ｂの選択性の改善のために設計されたＣＮＰ変異体を包含する。公開され機能データを有する様々な受容体に結合したナトリウム利尿ペプチドの、実験的構造データおよびコンピュータ的な構造データを組み合わせることにより、ＮＰＲ−Ｂに結合し続けるが、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対する親和性が低下し得る可能性のあるＣＮＰ変異体を作製した。例えば、ＮＰＲ−Ｃは、ペプチド結合部位のループ構造中に唯一の挿入を有し、そのループ残基を、ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂ中のそれぞれのループ残基と比較して、ＣＮＰ  Ｇｌｙ８（またはＡＮＰ  Ｇｌｙ９）のようなペプチド残基により近く配置している。先行する研究は、ＡＮＰにおけるＧ９Ｔ突然変異が、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性の低下に寄与し、その結果、ＮＰＲ−Ａの選択性が改善されることを示した（Cunningham、EMBO J.、１３巻（１１号）：２５０８〜１５頁（１９９４年））。したがって、ＣＮＰ変異体を、対応するＧｌｙ８残基を、より高分子の残基（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎ）に置き換えて作製し、ＣＮＰとＮＰＲ−Ｃとの結合を、ＮＰＲ−Ｂに対する結合に影響を与えることなく崩壊させた。さらに、１つまたは複数の突然変異を、受容体／ペプチド複合体の詳細な構造解析に基づいて、受容体特異的残基と相互作用することが予測される、Ｇｌｙ１５からＧｌｙ２１を包含するＣＮＰのＣ末端に導入した。例えば、ＣＮＰ２２中のＧ１９Ｒの突然変異は、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達活性の有意な喪失をもたらさない。しかし、この突然変異は、近隣残基の立体配座を変えることなく、ＮＰＲ−Ｃ／ＣＮＰの利用可能な結晶構造にモデル化できない。これらの観察は、Ｇ１９Ｒの突然変異が、ＣＮＰと、特定の受容体、例えばＮＰＲ−Ｃとの結合を選択的に崩壊させ得ることを示唆する。
【０１７５】
ある実施形態において、ＣＮＰ変異体は、１、５、８、１５、１９および２１位の１つまたは複数のＧｌｙ部位に置換を有し、立体配座の柔軟性を低下させ、その結果受容体の特異性を増加させる。ＮＰＲ−ＣおよびＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰの結晶構造の比較分析（Ogawa, H.ら、J. Biol. Chem.、２７９巻：２８６２５〜３１頁（２００４年）；He, X.-L.、J. Mol.Biol.、３６１巻：６９８〜７１４頁（２００６年））は、ＡＮＰの立体配座の柔軟性が、受容体の選択性の決定において非常に重要な役割を果たし得ることを示す。
【０１７６】
一実施形態において、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性が低下した可能性のある、機能性ＣＮＰ変異体は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数を有する：Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｅ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｑ、Ｇ５Ｓ、Ｆ７Ｙ、Ｇ８Ｔ、Ｇ８Ｓ、Ｇ８Ｖ、Ｇ８Ｎ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ｋ１０Ｃｉｔ、Ｋ１０Ｑ、Ｋ１０Ｓ、Ｉ１４Ｎ、Ｇ１５Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｎ、Ｇ１５Ｃｉｔ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｖ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｓ、Ｇ１９Ｒ、Ｇ１９Ｎ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２０Ｓ、Ｇ２１Ｓ、Ｇ２１ＴおよびＧ２１Ｒ。ある実施形態において、ＣＮＰ変異体は、１、５、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１９、２０および／または２１位にマルチポイントの置換を有し、場合により変異体のペプチド配列の任意の他の位置に改変を有することができる。
【０１７７】
さらなる実施形態において、本明細書に記載のＣＮＰ変異体は、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部部位において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量までの部分に接合し、骨／軟骨ターゲティングを容易にし、ＮＰＲ−Ｃおよび腎クリアランスを減少させ、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加させ、および／またはＣＮＰの機能性を改善させることができる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、環状領域（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）内のポリマー部分に結合されない。ＣＮＰ変異体に結合できるポリマー部分または非ポリマー部分の限定されない例は、合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨／軟骨ターゲティングペプチド配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するペプチド配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など；骨形成タンパク質の機能ドメインに由来するペプチド配列、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａなど；ナトリウム利尿起源のポリペプチドに由来するペプチド配列、例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰおよびＢＮＰなど；他の天然ポリマーまたは非ポリマー部分、例えば、糖、脂肪酸およびリン脂質；生体適合性合成親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）など；疎水性のポリマー部分または非ポリマー部分、例えば、ヘプタン酸およびペンタン酸；およびそれらの組合せを含む。
【０１７８】
本明細書に記載のＣＮＰ変異体は、例えば、ｃＧＭＰ産生およびシグナル伝達の刺激に関して、ＣＮＰ２２と実質的に同様またはそれより優れた機能活性を有することができる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２と同じ濃度（例えば、１ｕＭ）において産生されたｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生を、ｉｎ  ｖｉｖｏで刺激する。特定の実施形態において、変異体は、野生型ＣＮＰ２２のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保有する。別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２と比較して改善されたｃＧＭＰ刺激活性を有する。
【０１７９】
具体的に開示された任意のナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体ならびに限定するものではないが、米国特許第５，４３４，１３３号、米国特許第６，０３４，２３１号、米国特許第６，０２０，１６８号、米国特許第６，７４３，４２５号、米国特許第７，２７６，４８１号、ＷＯ９４／２０５３４号、ＷＯ０２／０４７８７１号、ＷＯ２００５／０９８４９０号、ＷＯ２００４／０４７８７１号、ＥＰ０４９７３６８号、ＥＰ０４６６１７４号、およびFuruyaら、Biochem. Biophys. Res. Comm. １８３巻：９６４〜９６９頁（１９９２年）を含む、本明細書に参照された任意の先行文献中において実際に作製された任意のナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体は、本発明から場合により除外する。このような文献はすべて、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１８０】
一実施形態において、本発明は、野生型ＣＮＰ５３、野生型ＣＮＰ２２、野生型ＣＮＰ１７、野生型ＢＮＰおよび野生型ＡＮＰを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質切断により作製されたＮＰＰＣまたはＣＮＰ５３の断片を、場合により除外する。さらにまた別の実施形態において、以下の野生型ＣＮＰ５３の切断断片：ＣＮＰ５０、ＣＮＰ４６、ＣＮＰ４４、ＣＮＰ３９、ＣＮＰ２９およびＣＮＰ２７を、場合により本発明から除外する。
【０１８１】
ある実施形態において、本発明は、米国特許第７，２７６，４８１号に具体的に開示の配列番号１〜４および６〜７１のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、米国特許第７，２７６，４８１号に一般的に開示された配列番号５のペプチドを場合により除外し、このようなペプチドは、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９および／またはＬｅｕ２０において少なくとも１つの天然アミノ酸置換を有するＣＮＰ１７変異体である。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ１７またはその変異体がＮ−Ｍｅ−Ｐｈｅ７またはＮ−Ｍｅ−Ｐｈｅ７とＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕ１１とを含有するＣＮＰ１７変異体を、場合により除外する。さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第７，２７６，４８１号に開示の、配列番号５のＣＮＰ１７変異体を場合により除外し、これらは成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）または甲状腺ホルモン（ＴＨ）に融合または結合する。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ２２がＧＨ、ＩＧＦ−１またはＴＨと融合する、あるいはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してＧＨ、ＩＧＦ−１またはＴＨに結合する、ＣＮＰ２２変異体を、場合により除外する。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ１７またはその変異体が、Ｎ末端またはＣ末端においてビオチンまたはフルオレセインに結合するＣＮＰ１７変異体を、場合により排除する。
【０１８２】
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第５，４３４，１３３号に具体的に開示された、化合物番号１〜２７および配列番号１〜１７、２２〜２４、３０、３１および４０〜４２のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、米国特許第５，４３４，１３３号に一般的に開示された配列番号１８〜２１および２５〜２９のペプチドを場合により除外する。さらに別の実施形態において、本発明は、ＷＯ９４／２０５３４号に具体的に開示された配列番号１〜４および９のペプチドを、場合により除外する。
【０１８３】
しかし、一部の実施形態において、本発明は、本明細書において場合により除外されたナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体の使用方法、ならびにナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体を含む医薬組成物（滅菌医薬組成物を含む）は、依然として包含する。
【０１８４】
Ｃ．ＣＮＰ変異体の合成および精製
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、当分野において一般的に公知の技術を使用して、組換え体の発現を介して生産される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor、N.Y.（１９８９年））； DNA Cloning: A Practical Approach、I およびII巻、D. N. Glover、編（１９８５年）；およびCurrentProtocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.（１９９４年）を参照されたい。
【０１８５】
組換えＣＮＰ変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現調節配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターにおいて発現される。発現ベクターは、十分な発現のためのシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系によって補うことができる。発現ベクターは、限定するものではないが、コスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに包含された）および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルスを含む、当分野において公知のすべてのベクターを含む。発現ベクターは、当分野において公知の技術を使用して、形質転換または形質移入を介してポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために、適切な宿主細胞に挿入される。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A LaboratoryManual、第２版、Cold Spring Harbor、N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年を参照されたい。
【０１８６】
本明細書に記載のＣＮＰ変異体を作製するために使用する宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、非哺乳動物の脊椎動物または哺乳動物の細胞であってよい。哺乳動物細胞は、限定するものではないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒトの細胞を含む。宿主細胞は、不死化細胞（細胞系）または非不死化（初代または第２代）細胞であってもよく、任意の広範囲の細胞型、例えば、限定するものではないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の生成成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞および他の骨由来細胞ならびにこれらの体細胞の前駆体であってよい。ＣＮＰ変異体のＤＮＡまたはＲＮＡを含有する宿主細胞は、細胞の成長、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現およびＣＮＰ変異体を発現する細胞の同定／選択に適切な条件下で培養される。
【０１８７】
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Atherton およびSheppard、SolidPhase Peptide Synthesis: a Practical Approach、IRL Press（Oxford、England（１９８９年））の方法に従って合成および精製される。
【０１８８】
ペプチドは、例えば、ＣＮＰの以下のペプチド配列：Ｇ１ＬＳ（ＫまたはＲ）ＧＣ６Ｆ７Ｇ８Ｌ（ＫまたはＲまたはＮｌｅまたは６−ＯＨ−ＮＩｅ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ２２に基づいて合成できる。
【０１８９】
例示的ＣＮＰ変異体は、限定するものではないが、
類似体Ａ（ＧＬＳＫＧＣ（ＣＨ２ＮＨ）ＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５６）、骨格のＣ６の「−Ｃ＝Ｏ」基を「−ＣＨ２」基に変換することによって作製した；
類似体Ｂ（ＧＬＳＫＧＣ（Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５７）、骨格のＦ７の「−ＮＨ」基を「−Ｎ−ＣＨ３」基に変換することによって作製した；
類似体Ｅ（ＧＬＳＫＧＣ（Ｄ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号１３６）、Ｆ７のＤ−Ｐｈｅを使用して作製した；
類似体Ｆ（ＧＬＳＫＧＣＦ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）ＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５８）、Ｇ８のｔｅｒｔｉａｒｙ−ブチル−Ｇｌｙを使用して作製した；
類似体Ｇ（ＧＬＳＫＧＣ（３−Ｃｌ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号１３７）、Ｆ７のフェニル環のメタの位置に塩素原子を付加することによって作製した（同様の変異体を、Ｐｈｅ７のフェニル環のオルト、メタおよび／またはパラをＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、ＯＨおよび／またはＣＨ３で置換することによって作製できる）；および
類似体Ｈ（ＧＬＳＫＧＣ［ＮＨＣＨ２ＣＨ（Ｐｈ）ＣＯ］ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５９）、Ｆ７の（±）−３−（アミノ）−２−フェニルプロピオン酸を使用して作製した、
を含む。
【０１９０】
例えば、天然または非天然アミノ酸またはペプチド結合イソスターによるアミノ酸の延長、置換および／またはポリマーまたは疎水性部分との結合を有する、ＣＮＰ変異体の例は、限定するものではないが、
【０１９１】
【数２】
2011504506.tif 000003
および
１、２、３、４、または５までのさらなる改変を含む、配列番号１から６および３４から１４４およびそれらの変異体
を含む。
【０１９２】
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２との間にジスルフィド結合を形成することを介して環化される。Ｃｙｓ６は、例えば、ホモシステインまたはペニシラミンなどのシステイン類似体であり得る。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体はヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッドまたは側鎖−テールにより形成された共有結合により環化できる。ある実施形態において、共有結合は、ペプチドのＮ末端の、またはＮ末端の前のアミノ酸と、Ｃ末端のまたはＣ末端の前のアミノ酸（本文脈において、「末端」アミノ酸と称される）との間に形成される。別の実施形態において、共有結合は、２つの末端アミノ酸の側鎖の間に形成される。まだ別の実施形態において、共有結合は、１つの末端アミノ酸の側鎖と、他の末端アミノ酸の末端基との間、あるいは２つの末端アミノ酸の末端基の間に形成される。
【０１９３】
末端アミンと末端カルボキシル基とのヘッド−テール環化は、多くの方法、例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アジド法、混合無水物法、ＨＡＴＵ、ＨＯＢｔ、ＨＯＮＳｕまたはＨｏＡｔなどの触媒を用いたカルボジイミド（例えば、ＤＩＣ、ＥＤＣまたはＤＣＣ）または樹脂上環化を使用して実施できる。
【０１９４】
さらに、環状構造は、ＣＮＰ変異体のアミノ酸残基および／または末端アミノ酸残基の側鎖を含む架橋基を介して形成されてもよい。架橋基は、ペプチドの２つの部分を環化できる化学的部分である。架橋基の限定されない例は、アミド、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カーバメート、スルホンアミドなどを含む。このような架橋基を有する単位の組み込みに関する様々な方法が、当分野において公知である。例えば、ラクタム架橋（すなわち、環状アミド）は、Ｎ末端アミノ基または側鎖上のアミノ基と、Ｃ末端カルボン酸または側鎖、例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖およびグルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖上のカルボキシル基との間に形成できる。チオエステルは、Ｃ末端カルボキシル基または側鎖上のカルボキシル基と、システインまたはシステイン類似体の側鎖上のチオール基との間に形成できる。
【０１９５】
代替的には、架橋はランチオニン（チオジアラニン）残基を組み込み、チオエステル結合により共有結合されるアラニン残基と連結することによって形成できる。別の方法において、架橋剤、例えば、ジカルボン酸（例えば、スベリン酸（オクタン二酸））は、アミノ酸側鎖の官能基、例えば、遊離のアミノ基、ヒドロキシル基、およびチオール基を連結できる。
【０１９６】
酵素により触媒された環化もまた使用できる。例えば、チロシジン合成酵素のチオエステラーゼドメインを使用して、チオエステル前駆体を環化でき、スブチリシン突然変異体を利用して、ペプチドグリコール酸フェニルアラニルアミドエステルを環化でき、抗体リガーゼ１６Ｇ３を用いてｐ−ニトロフェニルエステルを環化できることが報告されている。ペプチドの環化の概説に関しては、Davies、J. Peptide Sci.、９巻：４７１〜５０１頁（２００３年）を参照されたく、その全体は参照により本明細書に援用される。
【０１９７】
特定の実施形態において、最終環化産物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも約９９％の純度を有する。
【０１９８】
Ｄ．化学改変ＣＮＰ変異体
ＣＮＰ２２またはその変異体の化学改変により、改変ＣＮＰペプチドに有利な特性、例えば、安定性および半減期の増加、免疫原性の低下などをもたらし得る可能性がある（治療用タンパク質の化学改変の一般的議論に関しては、Pharmazie、５７巻（１号）：５〜２９頁（２００２年）を参照されたい）。例えば、ＣＮＰペプチドの総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増加させるために、天然または合成のポリマー部分または非ポリマー部分（例えば、ＰＥＧ）と、ＣＮＰペプチドとの結合により、修飾ペプチドの、エキソペプチダーゼおよび／またはエンドペプチダーゼ（例えば、ＮＥＰ）によるｉｎ  ｖｉｖｏの切断に対する感受性を低下させることができる。ＰＥＧ化、グリコシル化および他の化学誘導化手法、例えば、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化による改変に加えて、および酸付加塩、アミド、エステルおよびＮアシル誘導体の生成は、免疫原性領域および／またはタンパク質分解感受性領域をマスクできる可能性もある（Science、３０３巻：４８０〜４８２頁（２００４年））。
【０１９９】
化学改変の例は、限定するものではないが、安定性およびプロテアーゼ耐性の改善ならびに免疫原性の低下のためのＢｅｄｎａｒｓａｋｉのポリマー付加法およびＡｌｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの架橋法を含む。Ｂｅｄｎａｒｓａｋｉは、ポリマー付加が、タンパク質の温度安定性を改善できることを示し（J. Am. Chem. Soc.、１１４巻（１号）：３７８〜３８０頁（１９９２年））、Ａｌｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を改善できることを発見した。
【０２００】
ポリペプチドの化学改変は、非特異的方法（誘導化種の混合をもたらす）または部位特異的方法（例えば、野生型巨大分子の反応性特異的誘導化および／または部位特異的変異誘発および化学改変の組合せを使用する部位選択改変に基づく）で、あるいは、発現タンパク質連結方法を使用して実施できる（Curr. Opin. Biotechnol.、１３巻（４号）：２９７〜３０３頁（２００２年））。
【０２０１】
ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体
一実施形態において、安定性（例えば、ＮＥＰ分解に対する耐性）の増加のために、ＣＮＰ２２またはその変異体（アミノ酸の付加、置換および／または欠失を有する変異体を含む）を親水性の天然または合成のポリマーに接合し、改変ＣＮＰペプチドの総質量を、約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約４、５、６、７またはそれより大きいｋＤａの範囲に増加させる。特定の実施形態において、付加された親水性ポリマーは、約０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、または約５ｋＤａの総質量を有する。
【０２０２】
ある実施形態において、親水性ポリマーは、結合されたＣＮＰペプチドが水性（例えば、生理的）環境中で沈殿しないように水溶性である。さらに、親水性ポリマーは生体適合性である、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで損傷、毒性または免疫反応を起こさない。
【０２０３】
親水性ポリマーは、分枝または非分枝であってよい。一実施形態において、親水性ポリマーは分枝ではない。
【０２０４】
親水性ポリマーに対するＣＮＰ２２またはその変異体の様々な接合部位は、限定するものではないが、：（１）Ｎ末端のみ；（２）Ｃ末端のみ；（３）内部部位のみ（例えば、Ｌｙｓ４）；（４）Ｎ末端およびＣ末端の両方；（５）Ｎ末端および内部部位；ならびに（６）Ｃ末端および内部部位、を含む。一実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体は、Ｎ末端のみにおいて親水性ポリマーに結合される。別の実施形態において、結合は内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみである。なお別の実施形態において、接合はＮ末端および内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）である。さらに別の実施形態において、より優れた機能性のためにＣＮＰペプチドは、環状ドメイン内（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）の部位（例えば、Ｌｙｓ１０）において親水性ポリマーと結合しない。親水性ポリマーとの結合が、ＣＮＰペプチド上の反応性第一級アミノ基との結合形成に基づく場合、内部部位（例えば、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０）における結合は、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０を、天然または非天然アミノ酸または側鎖（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはシトルリン（Ｃｉｔ））に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体と置換することによって妨害できる。特定の実施形態において、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０は、Ａｒｇと置き換えることができる。別の実施形態において、Ｌｙｓ１０は、Ａｒｇと置き換えることはできない。
【０２０５】
親水性ポリマーの限定されない例は、カルボン酸担持モノマー（例えば、メタクリル酸（ＭＡ）およびアクリル酸（ＡＡ））から形成されるポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシル担持モノマー（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよび３−トリメチルシリルプロピルメタクリレート（ＴＭＳＰＭＡ））から形成されるポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、モノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ−ＰＥＧ（例えば、モノメトキシ−ＰＥＧ）、トレシルモノメトキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧアクリレート（ＰＥＧＡ）、ＰＥＧメタクリレート、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ｂｉｓ−スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン（ＭＰＣ）およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）のコポリマー、ヒドロキシ官能性ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ＳＩＳ−ＰＥＧ（ＳＩＳは、ポリスチレン−ポリイソブチレン−ポリスチレンブロックコポリマーである）、ポリスチレン−ＰＥＧ、ポリイソブチレン−ＰＥＧ、ＰＣＬ−ＰＥＧ（ＰＣＬは、ポリカプロラクトンである）、ＰＬＡ−ＰＥＧ（ＰＬＡは、ポリ乳酸である）、ＰＭＭＡ−ＰＥＧ（ＰＭＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）である）、ＰＤＭＳ−ＰＥＧ（ＰＤＭＳは、ポリジメチルオキサノン）、ＰＶＤＦ−ＰＥＧ（ＰＶＤＦは、ポリフッ化ビニリデンである）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＴＭ界面活性剤（ポリプロピレンオキシド−ｃｏ−ポリエチレングリコール）、ポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＬＬ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＶＰ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＥＩ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＶＰ）、ＰＬＬ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＶＰ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＶＰ、セルロースおよびその誘導体（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸およびその誘導体（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エラスチン、キトサン、アクリル硫酸、アクリルスルホン酸、アクリルスルファミン酸、メタクリル硫酸、メタクリルスルホン酸、メタクリルスルファミン酸、それらのポリマーおよびコポリマーならびにそれらの組合せのポリマーおよびコポリマーを含む。
【０２０６】
特定の実施形態において、親水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とも呼ばれる。本明細書において使用する場合、「ＰＥＧ」または「ＰＥＯ」という用語はＰＥＧのすべての形態、分枝および非分枝を包含し、これらはポリペプチドを誘導化するために使用でき、限定するものではないが、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧおよびアリールオキシ−ＰＥＧを含む。
【０２０７】
一実施形態において、ＰＥＧ−ＣＮＰ結合体は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーを含み、式中、ｎは約６から約１００までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａである。別の実施形態において、ｎは約１２から約５０までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａである。なお別の実施形態において、ｎは約１２から約２４までであり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａである。さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基であるので、ＰＥＧポリマーはアルコキシ基で終結する。ある実施形態において、ＰＥＧポリマーは非分枝である。別の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体は、ＰＥＧポリマーとＮ末端のみで接合する。
【０２０８】
ＰＥＧおよびＰＥＯは、分子量の分散した分子を含む可能性があり、すなわち、それらが調製される手法によって、多分散である可能性がある。ポリマー調製物のサイズ／質量分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）によって統計的に特徴づけることができ、その比は、多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。ＭｗおよびＭｎは、質量分光法によって測定できる。１．５ｋＤａより大きいＰＥＧ部分に結合したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、親ＰＥＧ分子の多分散性により、様々な分子量を示すことがある。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−０２０ＨＳ、ＮＯＦ  Ｃｏ．）の場合、ＰＥＧ分子の分子量は、約１．５ｋＤａから約３ｋＤａの範囲にわたって分散しており、多分散指数は１．０３６である。それに反して、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によるＭＳ（ＰＥＧ）ｎ試薬（ｎ＝４、８、１２または２４、例えば「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」として表示される）を使用して、ＣＮＰ２２またはその変異体に接合されたＰＥＧは単分散であり、個別の鎖長および規定分子量を有する。
【０２０９】
ＰＥＧ部分を含むポリペプチドの作製方法は、当分野において公知である（例えば、米国特許第５，８２４，７８４号を参照されたい）。ＰＥＧ化ＣＮＰペプチドの調製方法は、（ａ）ＣＮＰペプチド（例えばＮ末端において）にＰＥＧを結合するために適切な条件下でＰＥＧ化試薬を使用して、ＣＮＰ２２またはその変異体を反応させるステップ、および（ｂ）反応産物を得るステップ、を一般的に含む。ＣＮＰペプチドのＰＥＧ化は、ＰＥＧ部分のサイズおよびＰＥＧ化の位置次第でＮＰＲ−Ｂに対するその結合を有意に改変できるので、様々な種類のＰＥＧおよびＰＥＧ化の反応条件を調査できる。ＣＮＰペプチドのＰＥＧ化に使用できる化学は、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳ−エステルを使用する、ペプチドの反応性第一級アミンのアシル化を含む。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡを用いたアシル化は、元の第一級アミンの任意の電荷を排除するアミド連結をもたらす。記号「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」と名付けられるＰＥＧ−ＣＮＰペプチドならびに記号「ＰＥＧ１Ｋ」、「ＰＥＧ２Ｋ」、「ＰＥＧ５Ｋ」または「ＰＥＧ２０Ｋ」と名付けられたＰＥＧ−ＣＮＰペプチドは、ＮＨＳエステル活性化の、メトキシ末端キャップ化ＰＥＧ試薬を用いた、ペプチド上の第一級アミノ基の反応を介したＰＥＧ化である。ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、他の方法、例えば、ペプチド上の第一級アミノ基およびＰＥＧアルデヒド、例えば、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドなど、あるいはそれらのモノ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体に関与する還元アミノ化により調製できる（米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。
【０２１０】
リボソームタンパク質合成とは異なって、合成ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端へと進む。したがって、（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含有する）Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ＰＥＧを、ペプチドのＣ末端に結合する１つの方法である（R. B. Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、８５巻（１４号）：２１４９〜２１５４頁（１９６３年））。代替的には、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を用いることができる（E.Atherton および R.C. Sheppard、Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach、IRLPress（Oxford、England （１９８９年））。
【０２１１】
ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体を調製するための本方法は、ポリマー−タンパク質結合体の実質的に均一な混合物を提供する。精製後、個別のＰＥＧ−ＣＮＰ調製物は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物特性を試験するために十分に純粋である。本明細書において実証されるように、特定のＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ切断に対する感受性の低下および実質的に同様またはより優れた機能性（例えば、ｃＧＭＰ産生の刺激）を示す。
【０２１２】
本明細書に記載のように、適切なＰＥＧ化試薬／ＣＮＰペプチドの比および反応条件を使用する、ＣＮＰ２２またはその変異体のＰＥＧ化反応は、ＰＥＧ−ＣＮＰ誘導体を提供する。ＰＥＧ化の特性および範囲は、例えば、ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ解析を使用して確定できる。特定の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、Ｎ末端においてモノＰＥＧ化される。ＣＮＰペプチドの生物特性についての、ＰＥＧ化の有益な効果を最適化するために、ポリマーの長さ、立体配座（例えば、分枝または線状）および／またはＰＥＧ部分の官能化（例えば、負に荷電した基の付加）を変化させることができる。ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ耐性、薬物動態および生物活性（例えば、ＮＰＲ−Ｂに対する結合能およびｃＧＭＰ生成の刺激能）に関して試験される。ＮＥＰ耐性の改善およびＣＮＰ２２のｃＧＭＰ−刺激活性の少なくとも約５０％を示すＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、例えば、ラットの軟骨肉腫細胞に基づく軟骨無形成症モデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびマウス軟骨無形成症動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで、さらに試験され得る。
【０２１３】
Ｅ．ＣＮＰ変異体の使用法、ＣＮＰ変異体の医薬組成物および投与経路
ＣＮＰ変異体の使用法
骨関連障害
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、骨形成において重要な役割を果たし、ＦＧＦ受容体遺伝子（ＦＧＦＲ１、２および３）における突然変異は、様々な遺伝性骨格形成異常を引き起こす（Curr. Biol.、５巻：５００〜５０７頁（１９９５年））。特に、ＦＧＦＲ−３における突然変異の活性化は、ヒト遺伝性小人症の最も一般的な形態の軟骨無形成症（Nature、３７１巻：２５２〜２５４頁（１９９４年）;Cell、７８巻：３３５〜３４２頁（１９９４年））、より軽症の軟骨低形成症（Ann. N.Y. Acad. Sci.、７８５巻：１８２〜１８７頁（１９９６年））およびより重篤な新生致死の致死性骨異形成（ＴＤ）Ｉ型およびＩＩ型（Hum.Mol. Genet.、５巻：５０９〜５１２頁（１９９６年）；Nat. Genet.、９巻：３２１〜３２８頁（１９９５年））を含む長骨の障害に関与する。ＦＧＦ−２を過剰発現し、ＦＧＦＲ−３を連続活性化するマウスモデルは、長骨の短縮および大頭を示す（Mol.Biol. Cell、６巻：１８６１〜７３頁（１９９５年））。このモデルに一致して、マウスのＦＧＦＲ−３における欠損は、成長板が広くなる著しい骨格の過剰成長を示す（NatureGenet.、１２巻：３９０〜３９７頁（１９９６年））。
【０２１４】
ＣＮＰ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃを用いた補足実験により、受容体に対応するペプチドリガンドと、骨成長との間の関連性が示唆される。トランスジェニックマウス中のＣＮＰの血漿濃度の上昇によるＮＰＲ−Ｂの活性化は、ＦＧＦＲ−３ノックアウトマウスの成長板軟骨の過剰成長（Nat. Genet.、４巻：３９０〜３９７頁（１９９６年））と組織学的に類似の、骨格の過剰成長（Nat. Med.、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））を引き起こす。ＮＰＲ−Ｃノックアウトマウスにおいて、ＣＮＰのＮＰＲ−Ｃ−仲介クリアランスは、除外されるべきであり、この予測に一致して、ノックアウト動物は、長骨の延長および脊柱後弯症を伴う椎骨の延長を示す（Proc.Natl. Acad. Sci. USA９６巻：７４０３〜０８頁（１９９９年））。反対に、ＣＮＰノックアウトマウスは、長骨および椎骨の短縮、軟骨無形成症の表現型と組織学的に類似の表現型により発育が止まり、不正咬合および小型の胸部による肺の制限の結果として死亡率が増加する（Proc.Natl. Acad. Sci. USA、９８巻：４０１６〜４０２１頁（２００１年））。ＮＰＲ−Ｂの活性化因子としてのＣＮＰの提唱された役割に一致して、ＮＰＲ−Ｂノックアウトマウスは、ＣＮＰノックアウトマウスと同じ発育が停止した骨格表現型および死亡率の増加を有する（Proc.Natl. Acad. Sci USA、１０１巻：１７３００〜０５頁（２００４年））。さらに、軟骨においてＦＧＦＲ−３が活性化された、軟骨無形成症のマウスモデルにおいて、軟骨細胞中のＣＮＰのターゲティングされた過剰発現は、小人症と反対に作用する（Yasodaら、Nat.Med.、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））。さらに、ＣＮＰは、限定するものではないが、軟骨細胞の増殖および分化、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＥＫ（Ｒａｆ−１）キナーゼシグナル伝達経路の阻害および軟骨内骨化の促進（Yasodaら、Nat.Med.、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））を含む、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の制御において役目を果たすことが示されている。これらの結果は、ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂ系の活性化が、ヒト軟骨無形成症の治療のための治療戦略である可能性を示唆している。
【０２１５】
マトリックスの産生、軟骨細胞の増殖および分化および長骨成長の増加を刺激することによって、本発明のＣＮＰ変異体は、例えば、骨格形成異常などの骨関連障害を患う、ヒトを含む哺乳動物の治療のために有用である可能性がある。ＣＮＰ−応答骨関連障害の限定されない例は、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルト症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト（Ｋｎｉｅｓｔ）異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症を含む。
【０２１６】
ＣＮＰ変異体は、変形性関節炎の治療にもまた、使用できる可能性がある。変形性関節炎は、関節の軟骨の変性疾患であり、高齢者にしばしば発生する。変形性関節炎は、関節成分の破壊によりもたらされる軟骨の破壊および骨および軟骨の増殖性変化に関与し、この変化は二次性関節炎（例えば、滑膜炎）をもたらす。変形性関節炎では、軟骨の機能エンティティである細胞外マトリックスタンパク質が減少し、軟骨細胞の数が減少する（Arth. Rheum.４６巻（８号）：１９８６〜１９９６頁（２００２年））。マトリックスの産生、軟骨細胞の成長および分化を促進することによって、ＣＮＰ変異体は、変形性関節炎の治療において有用であり得る可能性がある。
【０２１７】
血管平滑筋の障害
ＣＮＰおよび他の血管作用ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰおよびウロジラチンを含む）は血管拡張および利尿特性を有し、心血管の恒常性において重要な役割を果たす（J. Cardiovasc. Pharmacol.、１１７巻：１６００〜０６頁（１９９８年）；Kidney Int.、４９巻：１７３２〜３７頁（１９９６年）；Am.J. Physiol.、２７５巻：Ｈ１８２６〜１８３３頁（１９９８年））。ＣＮＰは、心血管系において広範囲に分布し、特に、血管内皮細胞において高濃度である（J.Cardiovasc. Pharmacol.、１１７巻：１６００〜０６頁（１９９８年））。ＣＮＰは、血管平滑筋、特に冠循環においての強力な弛緩薬であり（Biochem.Biophys. Res. Commun.、２０５巻：７６５〜７７１頁（１９９４年））、平滑筋細胞増殖の阻害剤である（Biochem. Biophys.Res. Commun.、１７７巻：９２７〜９３１頁（１９９１年））。ＣＮＰの血管拡張効果はＡＮＰの血管拡張効果より低いが（約１：１００）（Hypertens.Res.、２１巻：７〜１３頁（１９９８年）、Am. J. Physiol.、２７５巻：Ｌ６４５〜Ｌ６５２頁（１９９８年））、ＣＮＰｍＲＮＡはせん断応力に対する応答において増加し（FEBSLett.、３７３巻：１０８〜１１０頁（１９９５年））、ＣＮＰの血漿レベルは、炎症性心血管病理において上昇する （Biochem. Biophys. Res.Commun.、１９８巻：１１７７〜１１８２頁（１９９４年））。ＣＮＰは、ウサギの負傷した頸動脈においてマクロファージの侵入の阻害を介して炎症を抑制し（Circ.Res.、９１巻：１０６３〜１０６９頁（２００２年））、ＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰ−依存性経路を介して心臓線維芽細胞増殖を直接阻害する（Endocrinology、１４４巻：２２７９〜２２８４頁（２００３年））ことが示されている。
【０２１８】
ＣＮＰの心血管作用は、ＮＰＲサブタイプ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃの活性化を介して仲介され（Endocrinology、１３０巻：２２９〜２３９頁（１９９２年））、後者はｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるＮＰＲの９５％を占める（Science、２９３巻：１６５７〜１６６２頁（２００１年））。ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂ経路は、心血管系の安定した第２メッセンジャーであるｃＧＭＰの上昇をもたらす。Ｃ末端由来のＮＰＲ−Ｃの３７−アミノ酸部分は、ヘテロ三量体のＧタンパク質Ｇｉと相互作用するコンセンサス配列を有し（J.Biol. Chem.、２７４巻：１７５８７〜１７５９２頁（１９９９年））、これはアデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼＣの活性を制御することが示されている（J.Biol. Chem.、２７６巻：２２０６４〜７０頁（２００１年）；Am. J. Physiol.、２７８巻：Ｇ９７４〜９８０頁（２０００年）；J.Biol. Chem.、２７１巻：１９３２４〜１９３２９頁（１９９６年））。ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｃの活性化を介して、平滑筋の過分極および弛緩ならびにＧタンパク質により制御された、内部修正Ｋ＋チャネルの開放を仲介する（Proc.Natl. Acad. Sci. USA、１００巻：１４２６〜１４３１頁（２００３年））。同様に、ＣＮＰは、心臓線維芽細胞において重要な抗増殖効果を有し、ＮＰＲ−Ｃとの相互作用を介して、平滑筋細胞の過分極化によって局所血流および全身血圧を制御する（R.Rose and W. Giles, J. Physiol.５８６巻：３５３〜３６６頁（２００８年））。
【０２１９】
血管平滑筋細胞上のＮＰＲ−Ｂと結合することによって、ＣＮＰ２２は、ｃＧＭＰ産生を刺激し、ｃＧＭＰは、細胞内第２メッセンジャーとして作用し、最終的に血管の弛緩を引き起こす。ＣＮＰの降圧作用に基づいて、本発明ＣＮＰ変異体は、高血圧、鬱血性心不全、心臓性浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性および慢性の腎不全などの治療にとって有用である可能性がある。さらに、ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化は、血管平滑筋細胞の成長を抑制する。したがって、本発明のＣＮＰ変異体は、限定するものではないが、再狭窄および動脈硬化を含む、血管平滑筋細胞の異常成長による病態および疾患の治療に使用できる可能性がある。
【０２２０】
上記の研究は、ＣＮＰが血管平滑筋弛緩およびリモデリングのための治療候補であり得る可能性を示唆している。特定の障害に関するＣＮＰの薬理学的効果は、一部、血管拡張活性ではなく血管保護効果に起因すると考えられている（Am. J. Respir. Crit. Care Med.、１７０巻：１２０４〜１２１１頁（２００４年））。したがって、本発明のＣＮＰ変異体は、病態、例えば、ＣＮＰが、限定するものではないが、平滑筋弛緩の誘導および心臓組織へのマクロファージの侵入の阻害を含む血管保護効果を有すると思われる、血管平滑筋障害の治療に使用し得る可能性がある。一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、限定するものではないが、急性非代償性心不全および急性鬱血性心不全を含む心不全の治療に使用される。
【０２２１】
ＣＮＰ変異体の医薬組成物
本発明のさらなる実施形態は、有効量のＣＮＰ変異体、場合により別の生理活性物質ならびに１種または複数種の医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、安定剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物を対象とする。このような組成物は、様々な緩衝液内容（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ、ベンジルアルコール）および充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含むことができる。医薬組成物の製剤における賦形剤、希釈剤、担体などの使用は、当分野において公知である；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、１４３５〜１７１２頁、Mack PublishingCo.（Easton、Pennsylvania（１９９０年））を参照されたく、これは参照によりその全体を本明細書に援用される。有効量の活性成分は、治療的に、予防的にまたは診断的に有効な量であり、これは、体重、年齢および治療の目的などの因子を考慮に入れることによって、当業者により容易に決定できる。
【０２２２】
ＣＮＰ変異体を含む組成物は、所望の範囲内の溶液のｐＨを維持するために、さらに緩衝剤も含むことができる。例示的剤は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む。これらの緩衝剤の混合物もまた使用できる。組成物に有用な緩衝剤の量は、使用する特定の緩衝液および溶液の所望のｐＨに大きく依存する。例えば、酢酸塩は、ｐＨ６よりもｐＨ５においてより有効であり、したがって、ｐＨ５の溶液は、ｐＨ６の溶液より使用量を少なくできる。一実施形態において、本発明の組成物のｐＨ範囲は、約ｐＨ３から約ｐＨ７．５である。
【０２２３】
本発明の組成物は、溶液を等張のより注射に適合した状態にするために、等張性調整剤をさらに含むことができる。ある実施形態において、この物質は、０〜１５０ｍＭの範囲の濃度内の塩化ナトリウムである。
【０２２４】
本明細書に記載の治療方法は、ＣＮＰ変異体ならびに１種または複数種の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、担体および／または媒体、ならびに場合により他の治療および／または予防成分を含む医薬組成物を使用する。賦形剤の限定されない例は、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸,エタノール、シクロデキストリン、改変シクロデキストリン（すなわち、スルホブチルエーテルシクロデキストリン）などの液体を含む。非液体製剤用の適切な賦形剤もまた、当業者に公知である。
【０２２５】
医薬として許容可能な塩を本発明の組成物に使用でき、例えば、無機酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、など、ならびに有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、などを含む。医薬として許容可能な賦形剤および塩の徹底的な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company、（Easton、Pennsylvania（１９９０年））において入手可能である。
【０２２６】
補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、生理的緩衝化物質、界面活性剤などは、媒体中に存在させることもできる。生理的緩衝液は、薬理学的に許容可能であり、所望のｐH、すなわち生理的に許容可能な範囲のｐＨの製剤を提供する、実際上任意の溶液であってよい。緩衝液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、Ｈａｎｋ緩衝生理食塩水などを含む。
【０２２７】
医薬組成物は、組成物の所望の投与様式に合わせることができる。経口投与に関しては、組成物は、錠剤、カプセルまたはソフトゲルカプセルの形態をとることができ、あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液またはシロップであってよい。経口投与用の錠剤およびカプセルは、一般的に使用される1種または複数種の担体、例えばラクトースおよびコーンスターチを含むことができる。ステアリン酸マグネシウムまたはフマル酸ステアリルナトリウムなどの平滑剤もまた添加できる。液体懸濁液を使用する場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と混合できる。所望であれば、香味剤、着色剤および／または甘味剤もまた、固体製剤および液体製剤に添加できる。経口製剤に組み込むための他の任意選択の成分は、限定するものではないが、保存料、懸濁化剤、増粘剤などを含む。
【０２２８】
固体組成物に関しては、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、活性物質および任意選択の医薬アジュバントを、賦形剤、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに溶解、分散、懸濁し、溶液または懸濁液を形成することによって調製できる。所望であれば、医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、等張化剤などの微量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンラウリン酸モノエルテル、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどもまた、含有できる。固体および液体の剤形の調製方法は公知、または当業者には明らかであると思われる（例えば、上に参照したRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい）。
【０２２９】
非経口製剤は、従来の形態、例えば、液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶液化または懸濁するために適切な固体形態あるいは乳化剤として調製できる。例えば、滅菌注射可能な懸濁液を、適切な担体、分散剤、湿潤剤、懸濁化剤などを使用して、当分野において公知の技術に従って製剤化できる。滅菌の注射可能な製剤は、非毒性、非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液であってよい。用いることができる許容可能な媒体および溶媒の１つは水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油、脂肪酸エステルおよび／またはポリオールを、溶媒または懸濁媒体として用いることができる。
【０２３０】
本発明は、滅菌の注射可能な組成物を含む容器、例えば、バイアル、チューブ、ビンなどをさらに提供する。このような組成物を含むキットは、使用指示書および場合によりエアゾール分配装置、注射器および／または針などの分配装置をさらに含むことができる。一部の実施形態において、組成物は、注射器内に包装済である。
【０２３１】
医薬組成物は、所望の期間、例えば、１週間、２週間または１ヶ月にわたって、比較的一定レベルの用量を維持するための徐放性、制御放出および持続放出系として処方できる。徐放性、制御放出または持続放出組成物は、例えば、生分解性ポリマー系を使用して調製でき、例えば、当分野において公知の微粒子の形態をとることができる。
【０２３２】
用量
本明細書において使用する場合、活性物質（例えば、ＣＮＰ変異体）の「治療有効量」という用語は、患者に治療的有用性を提供する量を指す。この量は、個人ごとに変化してよく、患者の全生理的状態を含む多くの因子に依存することができる。ＣＮＰ変異体の治療有効量は、公的に入手可能な材料および手法を使用して、当業者により容易に確定できる。例えば、治療に使用するＣＮＰ変異体の量は、０〜１７歳の軟骨無形成症の小児（２１４例の女児および１８９例の男児）に関する、年齢に対する身長、頭囲および部分的成長が記載された成長表に基づく成長の許容率が示されるべきである（Horton WA ら、Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr.、９３巻：４３５〜８頁（１９７８年））。ＣＤＣ表は、年齢に対する体重および身長に対する体重または年齢に対するＢＭＩを評価するために使用できる。事実上、より慢性である過程を有する二次的な結果もまた測定できる。
【０２３３】
野生型ＣＮＰ２２より長い血清半減期を有するので、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２より投与の頻度を少なくできる可能性がある。特定の個人のための投与頻度は、治療すべき障害ならびに治療に対する個人の病態および応答を含む様々な因子に依存して変えることができる。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体を含有する医薬組成物は、１日に約１回、２日に１回、３日に１回または週に１回対象に投与される。一実施形態において、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常）の治療のために、ＣＮＰ変異体の毎日の用量または毎週の用量を、成人になるまで、および／または成人の間、患者に投与する。
【０２３４】
本明細書に記載のＣＮＰ変異体を、治療有効用量で患者に投与し、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常）および病態（例えば、血管平滑筋障害）を、治療、改善または予防でき、ＣＮＰは、血管保護効果を提供できる。ＣＮＰ変異体の安全性および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な薬理学的手法によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することによって決定できる。毒性と、治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。高い治療指数を示す活性物質が、普通好ましい。
【０２３５】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを使用して、ヒトにおいて使用する用量範囲を処方できる。容量は、普通、ＥＤ５０を含み、毒性がほとんどないまたは最小である循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化する可能性がある。治療有効用量は、細胞培養アッセイおよび動物実験から決定できる。
【０２３６】
投与方法
ＣＮＰ変異体またはそれらを含む医薬組成物は、様々な方法、例えば、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内に注射によって、対象に投与できる。ある実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単一の皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内の注射を１日に１回投与される。ＣＮＰ変異体は、疾患部位に、またはその近くに直接注射によってもまた、投与できる。さらに、ＣＮＰ変異体は、作用の標的部位（例えば、異常または異形成の骨）にデポーを埋め込むことによって投与できる。代替的には、ＣＮＰ変異体は、舌下（例えば、舌下錠）または肺への吸入（例えば、吸入器またはエアゾールスプレー）によって、鼻腔への送達（例えば、鼻腔内スプレー）によって、眼への送達（例えば、点眼薬）によって、または経皮送達（例えば、皮膚へのパッチを用いて）によって投与できる。ＣＮＰ変異体は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム  （非荷電、または荷電した（例えば、カチオン性））、ポリマー微粒子（例えば、ポリアミド）、マイクロエマルジョンなどの形態でも経口投与できる。組成物が他の様式でも投与できることは当業者には明らかであり、組成物の最も有効な様式の決定は、当業者の範囲内である。
【０２３７】
投与の意図される様式に依存して、医薬組成物は固体、半固体または液体の剤形、例えば、錠剤、坐薬、丸薬、カプセル、散剤、液体、懸濁液、クリーム、軟膏、ローションなどの、好ましくは、正確な用量の単回投与に適切な単位剤形の形態であり得る。組成物は、有効量のＣＮＰ変異体および１種または複数種の医薬として許容し得る賦形剤、担体または希釈剤（例えば、緩衝液）を含み、場合により、他の原料、例えば、アジュバントなどを含むことができる。ＣＮＰ変異体に加えて、組成物は、場合により、別の活性物質をさらに含むことができ、これはＣＮＰ変異体の効果を増強できるか、またはＣＮＰ変異体の薬理学的効果に加えて他の薬理学的効果を発揮できる。
【０２３８】
一般的に、ＣＮＰ変異体は、経口（頬および舌下を含む）、直腸内、鼻腔内、局所、肺内、膣内または非経口（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下および静脈内を含む）投与に適切な医薬製剤を含む医薬製剤として、あるいは吸入または吹入による投与に適切な形態で投与できる。投与の一方法は、簡便な毎日または毎週の投与計画を使用する皮下投与であり、これは苦痛の度合いに従って調整できる。投与のさらなる方法は、浸透圧ポンプまたはミニポンプによる投与であり、これにより医薬製剤を所定の期間にわたって調節された連続送達ができる。
【０２３９】
投与のさらなる方法は、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚｅｔポンプ）またはミニポンプによる投与であり、これにより医薬製剤を所定の期間にわたって調節された連続送達ができる。浸透圧ポンプまたはミニポンプは、皮下または標的部位（例えば、手足の長骨、骨端など）の近くに埋め込むことができる。
【０２４０】
上に説明したように、ＣＮＰ変異体は、限定するものではないが、再狭窄および動脈硬化を含む、血管平滑筋細胞の異常成長により引き起こされる病態および疾患の治療に使用できる可能性がある。ＣＮＰ変異体を疾患にかかった体内の管（例えば、血管）に局所送達するために、ＣＮＰ変異体は、疾患部位に埋め込まれた医療装置（例えば、ステント）を用いて送達できる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体を、ポリマーマトリックスまたはステント上のポリマーコーティング中に含浸させる。別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ステントの本体内に形成された容器またはチャネルに含有され、ＣＮＰ変異体が拡散できる多孔質ポリマー膜または層により覆われる。当分野において公知のように、ポリマーマトリックス、コーティング、膜または層は、少なくとも1種の生分解性（例えば、親水性）ポリマーを含むことができる。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ステントの本体の微小孔に含有され得る。ＣＮＰ変異体は、バースト放出、パルス放出、制御放出または持続放出あるいはそれらの組合せによって、ステントから送達され得る。例えば、ステントは、ＣＮＰ変異体を疾患部位にバースト放出によって局所的に送達し、その後持続放出が続く。持続放出は、約２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年までの期間にわたることができる。
【０２４１】
併用治療
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は治療に有用な１種または複数種の他の活性物質を組み合わせて使用して、例えば、骨関連障害（例えば、骨格形成異常）および血管平滑筋障害などのＣＮＰ応答性病態または障害を改善または予防できる。他の活性物質は、ＣＮＰ変異体の効果を増強でき、またはＣＮＰ変異体の効果に加えて、他の薬理学的効果を発揮できる。本明細書に記載のＣＮＰ変異体と組み合わせて使用できる活性物質の限定されない例は、他のナトリウム利尿ペプチド（例えば、ＢＮＰ）およびペプチダーゼ（例えば、ＮＥＰおよびフューリン）、ＮＰＲ−Ｃおよびチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ−３）の阻害剤（例えば、拮抗薬）である。ＣＮＰ変異体のＮＥＰ切断を予防することによって、ＮＥＰ阻害剤は変異体の半減期を増加できる。ＮＥＰ阻害剤の例は、限定するものではないが、チオルファンおよびカンドキサトリルを含む。ＮＰＲ−Ｃ阻害剤の同時使用もまた、ＮＰＲ−Ｃによる変異体のクリアランスの阻害を介してＣＮＰ変異体の半減期を増加できる。ＮＰＲ−Ｃ阻害剤の限定されない例は、断片ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲ（配列番号８２）であり、これは、ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲ−ＣＮＰ２２キメラ（類似体ＣＺ）（配列番号８２）またはＣＮＰ２２の変異体（例えば、ＣＮＰ２２に関してアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含有する変異体）を含む類似のキメラのタンパク質分解切断についての標的部位（例えば、骨成長板）において放出される。チロシンキナーゼ阻害剤の同時使用は、軟骨細胞および骨成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体ＦＧＦＲ−３を阻害することによって、ＣＮＰ療法の効果を強化することができる。チロシンキナーゼ阻害剤の限定されない例は、米国特許第６，３２９，３７５号および第６，３４４，４５９号に開示されたチロシンキナーゼ阻害剤を含む。
【０２４２】
併用治療において適切な治療結果を達成するために、所望の治療結果（例えば、骨成長の回復）を生み出すために有効な量で組み合わせたＣＮＰ組成物および他の治療薬を、一般に対象に投与するであろう。この過程は、ＣＮＰ組成物および他の治療薬を同時に投与するステップを含むことができる。同時投与は、ＣＮＰ変異体および他の治療薬の双方を含む単一組成物または薬理学的タンパク質製剤を投与することによって達成することができる。代替的には、他の治療薬を、ＣＮＰ変異体の薬理学的製剤（例えば、錠剤、注射または飲み物）とほぼ同時に別々に摂取できる。ＣＮＰ変異体はさらに、接種に適したブラウニー、パンケーキまたはケーキなどの食品に処方することもできる。
【０２４３】
他の選択肢において、ＣＮＰ変異体の投与は、数分から数時間の範囲の間隔で他の治療薬の投与の前後に実施できる。他の治療薬およびＣＮＰ組成物を別々に投与する実施形態において、一般的に、ＣＮＰ変異体および他の治療薬の双方が、相乗的または相加的に、患者において有益な効果を発揮できるように、ＣＮＰ変異体および他の治療薬を、互いに適切な時間内に投与することを確実にするであろう。例えば、ＣＮＰ組成物を、他の治療薬の（前後）約０．５〜６時間内に投与できる。一実施形態において、ＣＮＰ組成物を、他の治療薬の（前後）約１時間内に投与する。
【０２４４】
患者集団の特定およびモニター
ＣＮＰ療法に適切な対象を特定し、所与の患者がＣＮＰ療法に応答するかどうかを決定するプロトコルを確立できる。例えば、骨関連障害の治療のために、子宮内および新生児の長骨成長の測定ならびにＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＣｏｌｌａｇｅｎＩＩ、オステオカルシンおよび増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）などの骨成長のバイオマーカーの測定などの成長の指標を測定できる。
【０２４５】
本発明の追加の態様および詳細は、以下の実施例により明らかであり、これらは限定ではなく例示目的である。
【実施例】
【０２４６】
（実施例１）
ＣＮＰ変異体の合成
ＣＮＰ変異体を、本明細書に記載の方法を使用して調製した。表１〜３（実施例２に示す）に示すように、天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を、ＣＮＰ２２の野生型配列のそれぞれのアミノ酸残基において実施した。特定の変異体において、さらなるアミノ酸を、野生型ＣＮＰ２２配列の全体または一部のＮ末端および／またはＣ末端に付加した（表３を参照されたい）。
【０２４７】
さらに、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分がＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端に接合されたＣＮＰ変異体を調製した（実施例２に示す表４を参照されたい）。ＰＥＧ化試薬は、表５に示す商業的供給源から得ることができる。
【０２４８】
【表５】
2011504506.tif 000004
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から購入したＰＥＧ（ＰＥＯとも呼ばれる）ポリマーは単分散である、すなわち、それらは特定の分子量の単一分離ポリマーを含有する。対照的に、ＮＯＦ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔ）から購入したＰＥＧポリマーは、多分散である、すなわち、それらは分子量の分散したポリマーの混合物を含有する。
【０２４９】
ＣＮＰ２２またはその変異体をＰＥＧ化するために、反応条件および精製条件を、ＰＥＧ−ＣＮＰの接合ごとに最適化する。一般的なＰＥＧ化手法に従って、反応混合物は、約１ｍＭのＣＮＰ２２またはその変異体および約１から５ｍＭのＮＨＳ−活性化ＰＥＧを、ｐＨが約５．０から６．５の間のリン酸カリウム緩衝液中に含有する。ペプチドのＮ末端において選択的にモノＰＥＧ化し、内部部位（例えば、ＣＮＰ２２のＬｙｓ４）においてＰＥＧを最小化するために、ＰＥＧ化反応を、より酸性の条件下（例えば約５．５から６．５の間のｐＨ）において実施し、リジン側鎖上のより塩基性の第一級アミノ基を選択的にプロトン化し、したがって非活性化することができる。室温において１〜３時間インキュベート後、水性グリシン緩衝液を加えることによって、ＰＥＧ化反応を停止させる。その後、反応産物を、各ＰＥＧ−ＣＮＰ結合体に関して最適化した逆相ＨＰＬＣによって分離する。分画試料を、スピードバックで乾燥させ、１ｍＭのＨＣｌ中で再構成／製剤化する。各ＰＥＧ−ＣＮＰ産物の特定および純度は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって決定する。
【０２５０】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの中性エンドペプチダーゼによるＣＮＰ変異体の切断
中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）切断に対するＣＮＰ変異体の感受性についての、アミノ酸置換、アミノ酸延長、骨格改変、側鎖改変およびＰＥＧ化の効果を決定するために、ペプチド切断アッセイを、非切断ＣＮＰ変異体の消失をモニターしたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して実施した。
【０２５１】
組換えヒトＮＥＰ（最終濃度１ｕｇ／ｍＬ）を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で希釈した１００ｕＭのＣＮＰ変異体に加えた。反応混合物を、様々な時間の間３７℃においてインキュベートし、ＥＤＴＡ（最終１０ｍＭ）を用いて停止させ、その後熱変性させた。反応混合物を還元し、その後反応産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析を使用して分析した。ＣＮＰ変異体の半減期を、時間に伴う完全なＣＮＰ変異体の消失に基づいて計算した。消化ＣＮＰ変異体に関する結果を、平行したｗｔＣＮＰ２２の消化と比較し、１ｍｇ／ｍＬのＮＥＰにより消化された１００ｕＭのＣＮＰ２２に関する結果に対して正規化した（ｔ１／２＝８０分）。
【０２５２】
表１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づいて、骨格または側鎖に改変を有する様々なＣＮＰ変異体の半減期を載せている。類似体Ｌの６つのＮＥＰ切断部位の３つを除去することにより、それにもかかわらず有意に短縮された半減期がもたらされる。ＮＥＰ切断に対する最も優れた耐性は、類似体Ｎおよび類似体Ｍにより示され、類似体Ｎは、ＣＮＰ２２の２２のアミノ酸すべてのＤ−光学異性体を含有し、類似体Ｍは、Ｎ−メチル化アミド結合をＬｅｕ９およびＬｅｕ１１の双方に有する。しかし、類似体ＮおよびＭの双方は、ｃＧＭＰ産生を刺激できなかった（下を参照されたい）。
【０２５３】
類似体Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨに関して、半減期が類似体ＥおよびＧより約１．５から約２．５倍長いことを決定した。これらの６種すべての類似体は、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合における切断に対する耐性または改善された耐性を示した（データ非掲載）。半減期に基づき、１ｕｇ／ｍｌのＮＥＰに対する類似体の耐性の順位は、類似体Ｇ（３−Ｃｌ−Ｐｈｅ）≧類似体Ｅ（Ｄ−Ｐｈｅ）＞類似体Ｈ（「β−２Ｐｈｅ」）、類似体Ｂ（Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ）および類似体Ｆ（ｔ−Ｂｕ−Ｇｌｙ）＝ｗｔＣＮＰ２２＞類似体Ａ（Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨ）である。類似体ＥおよびＧは、ｗｔＣＮＰ２２と比較して約１．５倍長い半減期を有する。Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合の切断に対する耐性のほかに、類似体Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、１ｕｇ／ｍＬＮＥＰの存在下でＧｌｙ８−Ｌｅｕ９結合の切断に対する耐性もまた示した（データ非掲載）。これらの結果は、Ｃｙｓ６およびＧｌｙ８の間で骨格または側鎖に改変を有するＣＮＰ変異体は、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合および／またはＧｌｙ８−Ｌｅｕ９結合のＮＥＰ切断に対して耐性であり得るが、ＮＥＰに対する全体的耐性の改善またはＣＮＰ２２より長い半減期は、必ずしも有していないことを示す。この結果は、ＮＥＰが、ＣＮＰ２２のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合を最初に切断し、その後他の場所を切断するという、文献の報告に反するように思われる。
【０２５４】
【表１】
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表２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＮＥＰ切断アッセイに基づく、天然および／または非天然アミノ酸によるアミノ酸置換を有する様々なＣＮＰ変異体の半減期を載せている。ＮＥＰ切断に対する最も優れた耐性は、Ｋ４ＲおよびＧ１５Ｓに置換を有する類似体ＢＫならびにＫ４ＲおよびＧ１５Ｎに置換を有する類似体ＢＪにより示された。
【０２５５】
【表２】
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表３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づく、アミノ酸延長部分を含む、Ｎ末端および／またはＣ末端の改変を有するＣＮＰ変異体の半減期を載せている。類似体ＡＺ、ＣＣ、ＣＦ、ＢＬ、ＣＳ、ＣＫおよびＣＬは、ＮＥＰ消化に対して最も耐性が高かった。
【０２５６】
【表３−１】
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【０２５７】
【表３−２】
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【０２５８】
【表３−３】
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表４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＮＥＰ切断アッセイに基づく、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに、Ｎ末端で接合したＣＮＰ変異体の半減期を載せている。試験し、表４に示した全ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２と同じ半減期を有したＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ｐｒｏ４）（すなわち、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））を除いてＮＥＰ切断に対する耐性または強化された耐性を表した。興味深いことに、Ｋ４Ｇ置換を有するＣＮＰ２２のＮ末端ＰＥＧ化は、ＮＥＰ耐性において有意な改善を与えるようには思われない。例えば、ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｇ）は、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ切断に対する耐性はわずかに高いだけであり（データ非掲載）、一方、ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２は、ＣＮＰ２２よりｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に長い半減期を有した。
【０２５９】
【表４】
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図１は、ＣＮＰ２２の５つのＮ末端ＰＥＧ化結合体のＮＥＰ耐性プロファイルを示す。質量が増加した、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに接合したＣＮＰ２２ペプチドは、ＮＥＰ分解に対する耐性の上昇を示した。特に、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２、ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２およびＰＥＧ５Ｋ−ＣＮＰ２２は、１６０分間のアッセイの期間にわたってＮＥＰ分解に対して耐性であった。
【０２６０】
図２は、Ｎ末端のアミノ酸延長を有するＣＮＰ変異体であるＣＮＰ３７、ＣＮＰ５３およびＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）（すなわち、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））のＮＥＰ耐性プロファイルを示す。明確に分かるように、ＣＮＰ３７およびＣＮＰ５３の双方は、このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＥＰ分解に対して耐性であったが、ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、ＮＥＰ加水分解に対してＣＮＰ２２と同じ不安定性を有した。
【０２６１】
図３は、Ｎ末端においてＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分と接合されたＣＮＰ１７およびＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＮＥＰ耐性プロファイルを表す。ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＰＥＧ化は、このＣＮＰ変異体のＮＥＰ耐性を非常に改善し、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、１６０分間のアッセイの期間にわたってＮＥＰ切断に対して完全に耐性であった。約０．６ｋＤａ（ＰＥＯ１２）から約１．２ｋＤａ（ＰＥＯ２４）にＰＥＯ部分の質量が増加することにより、ＰＥＧ化ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＮＥＰ耐性は改善された。多分散ＰＥＧ１Ｋ部分ではなく単分散ＰＥＯ２４部分にＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）がＰＥＧ化されることにより、ＮＥＰ耐性はさらに改善された。最終的に、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）およびＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ１７の双方は、同様の総質量を有するが（ＰＥＧ２Ｋは多分散であることに留意されたい）、前者は、有意に優れたＮＥＰ耐性を表す。
【０２６２】
（実施例３）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生のＣＮＰ変異体による刺激
ＣＮＰ変異体の機能活性を決定するために、ＧＭＰの産生を、ＣＮＰ変異体に曝されたＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定した。マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＣＮＰシグナル伝達受容体のＮＰＲ−Ｂを内因的に発現し、これは、９８％のタンパク質配列同一性をヒトＮＰＲ−Ｂと共有する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地において、３７℃で、５％ＣＯ２中で培養した。シグナル伝達の２４から４８時間前に、細胞を、１２ウェルプレートに、２〜５×１０５細胞の密度／ウェルでアッセイ時に継代した。ＣＮＰ変異体を、１ｍＭＨＣｌに、ストック濃度１ｍｇ／ｍＬ（ｗｔＣＮＰ２２に関して４５５ｕＭ）に再懸濁し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、３０ｕＭの使用ストック溶液に希釈した。１０倍連続希釈を、リン酸緩衝生理食塩水で調製した。培養培地を細胞から取り除き、０．７５ｍＭのイソブチルメチルキサンチンを含有する０．４ｍＬのＰＢＳ／ダルベッコ改変イーグル培地（５０／５０、ｖ／ｖ）に置き換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において１５分間インキュベートし、その後、ＰＢＳ中０．２ｍＬのＣＮＰ変異体を添加し、３７℃で、１５分インキュベートを続けた。反応を、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ  ｃＧＭＰアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で供給されている０．２ｍＬの溶解緩衝液を加えることによって停止させ、ｃＧＭＰ産生をＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ  ｃＧＭＰ  Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて決定した。すべての刺激実験を２重に実施した。
【０２６３】
表１〜４は、それぞれ、骨格または側鎖のアミノ酸置換、Ｎ末端アミノ酸延長および／またはＮ末端ＰＥＧ化改変を有するＣＮＰ変異体の、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｃＧＭＰ産生を刺激する能力を要約している。４つの表すべてにおいて、１０ｎＭまたは１ｕＭのＣＮＰ変異体に曝されたＮＩＨ３Ｔ３におけるｃＧＭＰ産生に関する値を、１ｕＭのｗｔＣＮＰ２２の存在下の細胞数およびｃＧＭＰ産生に対して正規化した。
【０２６４】
表１の結果に関して、７位に３−Ｃｌ−Ｐｈｅを有する類似体Ｇのみが、実質的に１ｕＭのｗｔＣＮＰ２２と同じＮＰＲ−Ｂ刺激活性を表した。表２に関しては、類似体ＢＯ、ＡＢ、ＢＨ、ＢＫ、ＢＺ、ＢＸおよびＢＲを含む、アミノ酸置換を有する様々なＣＮＰ変異体が、ｗｔＣＮＰ２２と実質的に類似のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を示した。Ｋ４Ｒ置換を有する類似体ＡＨが、ｗｔＣＮＰ２２より有意に優れたｃＧＭＰ産生を刺激したことは、注目に値する。
【０２６５】
表３の結果を考慮すれば、アミノ酸延長を含む、Ｎ末端および／またはＣ末端の改変を有する多くのＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２に匹敵するＮＰＲ−Ｂ刺激活性を示す。機能性ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端においてヘプタン酸に結合したＣＮＰ２２（Ｇ１Ｅ）である類似体ＢＢおよびＢＮＰのＮ末端およびＣ末端「テール」に接合したＣＮＰ２２（Ｃｙｓ６からＣｙｓ２２の配列を保有する「ＣＮＰ１７」）の環状ドメインである類似体ＣＤを含む。図４は、ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）（すなわち、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））、ＣＮＰ３７およびＣＮＰ５３はすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてｗｔＣＮＰ２２と同等のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したことを例示している。
【０２６６】
表３において注目すべきことは、ＣＮＰの機能性およびＮＥＰ耐性の双方に関して分析されたＣＮＰ変異体の中で、類似体ＡＺ（Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））、類似体ＣＡ、類似体ＣＢ、類似体ＣＣ、類似体ＣＦ、類似体ＢＬ（ＣＮＰ３７）、類似体ＣＥ、類似体ＣＳおよび類似体ＣＤ（Ｎ末端およびＣ末端にＢＮＰテールを有するＣＮＰ１７）はすべて、ＣＮＰ２２に匹敵するＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したが、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ切断に対して耐性が高いことである。
【０２６７】
表４の結果に関しては、１ｕＭにおいて８種のＮ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２によって達成されるレベルの少なくとも７０％にｃＧＭＰ産生を刺激した。いくつかの興味深い態様が、表４に現れている。第１に、単分散ＰＥＯポリマー（ＰＥＯ１２は約０．６ｋＤａ、ＰＥＯ２４は約１．２ｋＤａである）によるＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＮ末端ＰＥＧ化は、多分散ＰＥＧポリマー（ＰＥＧ１Ｋは、ほぼ１ｋＤａのポリマー数平均分子量（Ｍｎ）を有し、ＰＥＧ２Ｋはほぼ２ｋＤａ）によるＮＰＲ−Ｂ機能性よりも有意に優れたＮＰＲ−Ｂ機能性をもたらした（さらに図５を参照されたい）。第２に、ｗｔＣＮＰ２２の、Ｍｎの増加した多分散ＰＥＧポリマー（ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ５ＫおよびＰＥＧ２０Ｋ）による、またはより質量の大きい単分散ＰＥＯポリマー（ＰＥＯ１２およびＰＥＯ２４）によるＮ末端ＰＥＧ化は、それに応じてＣＮＰ変異体のＮＰＲ−Ｂ活性化能力（さらに、図６を参照されたい）が減少した。第３に、Ｎ末端にＧＡＮＲＲの延長を有するＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）より有意に優れたｃＧＭＰ産生を刺激した。さらに注目すべきは、ＣＮＰの機能性およびＮＥＰ耐性の双方に関して分析されたＮ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の中で、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）はすべて、ＣＮＰ２２と実質的に同じＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有するが、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ分解に対してはるかに耐性が高いことである。
【０２６８】
（実施例４）
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに関する結合特異性
シグナル伝達競合アッセイ
クリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃに関する、ＣＮＰ変異体の結合特異性を決定するために、シグナル伝達競合アッセイを実施する。ヒトＮＰＲ−Ｃ（ＯｒｉＧｅｎｅより購入）のための発現プラスミドが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において一時的に発現される。形質移入の２４時間後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、実施例３に記載のＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰ刺激アッセイのために処理した。ｗｔＣＮＰ２２の添加により、内因性ＮＰＲ−Ｂおよび一時的に発現したＮＰＲ−Ｃの双方に結合することが予想され、ｃＧＭＰ産生の減少および用量反応曲線の右へのシフトがもたらされる。ＮＰＲ−Ｃに対する親和性が低下したＣＮＰ変異体は、用量反応曲線においてシフトを誘導しないこと、またはより小さいシフトを誘導することが予想される。
【０２６９】
代替的には、ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに対するＣＮＰ変異体の相対的親和性は、シグナル伝達競合アッセイにおいて決定される（米国特許第５，８４６，９３２号；B. Cunningham、EMBO J.１３巻（１１号）：２５０８〜２５１５頁（１９９４年）；H. Jinら、J. Clin.Invest. ９８巻（４号）：９６９〜９７６頁（１９９６年））。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または適切に形質移入可能な別の細胞系（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）に、ＮＰＲ−Ａ（ＯｒｉＧｅｎｅ）またはＮＰＲ−Ｂ（標準的分子生物学技術を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化されたｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のための発現プラスミドを、ＮＰＲ−Ｃ（ＯｒｉＧｅｎｅ）と共に、またはＮＰＲ−Ｃ（ＯｒｉＧｅｎｅ）なしで一時的に形質移入する。
【０２７０】
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに対する結合親和性（Ｋｉ）の決定
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに対するＣＮＰ変異体の結合親和性（Ｋｉ）を、異種競合結合アッセイにおいて決定する（米国特許第５，８４６，９３２号；B. Cunningham、EMBO J.１３巻（１１号）：２５０８〜２５１５頁（１９９４年）；H. Jinら、J. Clin.Invest. ９８巻（４号）：９６９〜９７６頁（１９９６年））。ヒトＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ｃを発現するＨＥＫ２９３細胞由来または適切に形質移入可能な別の細胞系（例えば、ＨｅＬａ細胞）の膜を、放射標識リガンド結合アッセイのために調製する。膜の調製物を適切な緩衝液中で希釈し、濃度を変えたｗｔＣＮＰ２２またはＣＮＰ変異体（競合因子）をＩ１２５標識ｗｔＣＮＰ２２（Ｂａｃｈｅｍ）に加える。試料を室温でインキュベートし、リガンド／受容体を平衡させ、結合ペプチドを、ＰＶＤＦフィルター膜を介したろ過によって遊離のペプチドから分離する。フィルターを洗浄し、その後シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を加え、シンチレーションカウンターにより計測する。結合は、競合因子ペプチドの各濃度に関して二重に測定した。ＣＮＰ変異体の親和性（Ｋｉ、平衡解離定数）およびＢｍａｘ（受容体数）を、非線形回帰分析および／またはＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの式により計算する。
【０２７１】
（実施例５）
ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞の成長およびＲＣＳ細胞におけるｃＧＭＰ産生についてのＣＮＰ変異体の効果
骨成長を刺激するＣＮＰ変異体の能力を評価するために、ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）により治療することによって、細胞培養において骨格形成異常を刺激し、線維芽細胞増殖因子２は、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）を活性化し、成長の停止を誘導する（Krejci ら、J. Cell Sci.、１１８巻（２１号）：５０８９〜５１００頁（２００５年））。
【０２７２】
最適なＣＮＰ治療のパラメーターは、ＣＮＰ濃度（０．０５、０．１、０．２および０．５ｕＭ）ならびに治療期間および間隔（連続；１日１回、２．５分、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、および８時間、；１日２回、２．５分、１０分、３０分、１時間、２時間、および４時間）を変えることによって決定される。７２時間後、細胞を、自動細胞計測器を使用して計測し、細胞外マトリックスの量を、アルシアンブルー染色を使用して評価する。
【０２７３】
その後、ｗｔＣＮＰ２２を用いた成長実験により決定された最適条件を使用して、ＲＣＳ細胞をＣＮＰ変異体で処理する。ｃＧＭＰの濃度を、未処理ＲＣＳ細胞、ＣＮＰで処理したＲＣＳ細胞およびＣＮＰ変異体で処理したＲＣＳ細胞に関して、競合ＥＬＩＳＡによって測定する。ＣＮＰ変異体による処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成をさらにモニターし、ＣＮＰ処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成と比較する。
【０２７４】
ヒト細胞培養系におけるＣＮＰ変異体の効果を評価するために、アルギン酸ビーズ中の初代再分化ヒト軟骨細胞を、ｗｔＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体を用いて処理し、ｃＧＭＰ濃度を、有効なＣＮＰシグナル伝達の指標として競合的ＥＬＩＳＡによって決定する。
【０２７５】
本明細書に記載の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのｃＧＭＰ産生およびラット軟骨肉腫細胞の成長を刺激する、ＣＮＰ変異体の能力を評価するために用いることができる。
【０２７６】
（実施例６）
ラット軟骨肉腫細胞における用量反応研究
軟骨細胞成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）は、軟骨無形成症対象において構成的に作用している。ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）に連続して曝すことで、ＦＧＦＲ−３を活性化することおよび増殖の停止を誘導することによって、細胞培養における軟骨無形成症を刺激する（Krejciら、J. Cell Sci.、１１８巻（２１号）：５０８９〜５１００頁（２００５年））。ＣＮＰ変異体の用量および骨細胞の十分な成長を刺激する投与の頻度を決定するために、用量反応研究を、実施例５に記載のＲＣＳ細胞アッセイを使用して実施した。
【０２７７】
ＲＣＳ細胞を、２４ウェルプレートに、１０×１０３細胞／ウェルで播種し、２４時間増殖させ、７２時間処理し、その後計測した。ＲＣＳ細胞を、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍＬ）に連続して曝し、構造的活性化ＦＧＦＲ−３を刺激し、これは、細胞増殖の停止を誘導する（図７の、５番目の棒グラフを参照されたい）。野生型ＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）を、毎日１時間または毎日２時間連続培養した（７２時間）。全刺激物質は毎日交換した。ＲＣＳ細胞を、５．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２の存在下で０．２ｕＭのＣＮＰ２２に連続して曝すことにより、ＦＧＦ２誘導性増殖停止が部分的に逆転し、ＣＮＰ２２の不在下でおよそ１００×１０３細胞／ウェル（図７の５番目の棒グラフ）と比較して、およそ２００×１０３細胞／ウェル（図７の６番目の棒グラフ）の細胞増殖をもたらす。
【０２７８】
１日に１回、１時間のＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）曝露、および１日に１回、２時間のＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）曝露は双方とも軟骨細胞成長についての連続ＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）曝露の効果の約８４％を達成した（図７の７番および８番目の棒グラフ）。これらの結果は、増殖停止軟骨細胞のＣＮＰ２２への連続曝露は、細胞増殖停止の逆転には必要ないことを実証する。さらに、細胞外マトリックスの組織学的分析および細胞形態分析は、ＣＮＰ２２処理が、軟骨肉腫細胞外マトリックスのＦＧＦ２により仲介された損失を無効にし、マトリックス合成を増加することを示した（データ非掲載）。
【０２７９】
類似の用量反応研究を、本明細書に記載のＣＮＰ変異体を用いて実施し、ＲＣＳ細胞のＦＧＦ２誘導性増殖停止を逆転するためのそれらの有効用量を決定できる。
【０２８０】
（実施例７）
頸骨および大腿骨の成長の刺激についてのＥｘ  Ｖｉｖｏ研究
マウス頸骨器官培養モデルは、骨の縦成長を刺激する野生型ＣＮＰ２２の有効性を実証するために使用されている。野生型頸骨を、１０−８、１０−７または１０−６ＭのＣＮＰ２２で６日間処理することにより、それぞれ縦成長が３１％、４０％および４２％増加した。組織学的評価は、さらに肥大部位の膨張、例えば、成長板中の肥大軟骨細胞の数およびサイズの増加もまた示した（Agoston ら、BMC Dev. Biol.７巻：１８頁（２００７年））。同様の発見が、ＦＧＦＲ３Ａｃｈマウスから単離された頸骨において観察された（Yasodaら、Nat. Med.１０巻：８０〜８６頁（２００４年））。
【０２８１】
骨の縦成長を刺激するＣＮＰ変異体の有効性を決定するために、ＣＮＰ変異体を、野生型およびＦＧＦＲ３ｗｔ／Ａｃｈ（ヘテロ結合体）マウスにおいて軟骨内骨成長のマウス器官培養モデルで試験した。手短に言うと、野生型ＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体の薬理学的活性を、野生型およびＦＧＦＲ３ｗｔ／Ａｃｈ同腹子から単離した胎児または新生児マウスの頸骨の器官培養モデルにおいて比較する。全体の骨成長および成長板内の組織学的変化を評価する。馴化培養培地を、ＣＮＰならびに細胞内シグナル伝達（ｃＧＭＰ）、軟骨代謝（ＩＩ型コラーゲン、他のコラーゲン、アグリカン、硫酸コンドロイチン）、骨代謝（骨アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン［Ｃ−テロペプチド、Ｎ−テロペプチド］）および炎症（インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−１１）のバイオマーカーに関して評価する。さらに野生型ＣＮＰ２２の様々な処理計画の効果を比較し、骨の縦成長を増強するための最適な条件を決定する。
【０２８２】
有効なＣＮＰ変異体を、ｃＧＭＰ産生および骨の縦長の増加および成長板の肥大帯における細胞の膨張により測定される、骨成長を刺激するそれらの能力により同定する。
【０２８３】
大腿骨の縦成長を刺激するｗｔＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）（すなわち、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））の有効性を、マウス器官培養モデルにおいて評価した。これらの実験のために、大腿骨を２〜３日齢の野生型マウスから単離し、０．２％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、４０単位のペニシリン／ｍＬおよび４０ｕｇストレプトマイシン／ｍＬを補給したαＭＥＭにおいて８日間、ビヒクル、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ変異体の存在下で培養した。処理は０日目から開始し、その後２日ごとに、培地を変えることで繰り返した。骨を処理前およびその後２日ごとに、１ｃｍの接眼レンズ網目を取り付けた解剖用顕微鏡を使用して測定した。馴化培地を、バイオマーカー分析に使用した。８日目に、骨を、４％のパラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、５％のギ酸中で２４時間脱灰し、パラフィン中で脱水および包埋した。骨を、５ｕｍ（ミクロン）に切片化し、次いでこれを脱パラフィン化、再水和し、アルシアンブルーで３０分間（ｐＨ２．５；ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ）およびファン−ギーソン（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で５分間染色した。アルシアンブルーは軟骨を青く染色し、ファン−ギーソンは類骨（非石灰化骨）を赤く染色する。染色した切片を、明視野顕微鏡により視覚化し、写真撮影した。成長板軟骨の肥大領域の厚さを、画像分析により決定した。
【０２８４】
図８は、ＣＮＰペプチドを用いて２日ごとに処理した、３日齢の野生型大腿骨の縦成長についてのｗｔＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）の効果を例示している。結果を、処理前の測定結果（０日目）に対して正規化した。この研究は、３重（媒体）または４重（ＣＮＰペプチド）に実施した。図８に示すように、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）ならびにＣＮＰ２２が、大腿骨の縦成長を刺激することにおいて有効であり、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体が最も有効であった。
【０２８５】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣＮＰ変異体の血清／血漿における安定性
薬物動態（ＰＫ）研究のための調製において、血清および／または血漿におけるＣＮＰ変異体の安定性を評価する。
【０２８６】
簡潔に言うと、検体を、２％トリクロロ酢酸沈殿または１：３の血清：アセトニトリル沈殿のいずれかによって、血清または血漿のタンパク質を除去することによって単離する。沈降混合物を、１４，０００ｒｐｍで５分間ボルテックスにかけ、上清部分を除去し、水で希釈し、その後分析用のシラン処理したオートサンプラーバイアルに移す。次いで、血清抽出物を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析する。ＣＮＰ変異体に関して特異的であることが示された、単一質量（ｍ／ｚ）を、定量目的でモニターする。
【０２８７】
まず、分析安定性および回収率を決定する。分析（ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ）パラメーターを、マトリックス標準（検体の後期沈殿により強化された血清抽出物）の分析を介して最適化する。最適化後、分析回収率を、公知の濃度の血清試料をスパイクし、検体反応と、同様の濃度で調製したマトリックス標準の反応とを比較することによって決定する。血清抽出物中の検体安定性をさらに決定し、血清沈殿の後および実際の分析の前に有意な損失がないことを確実にする。血清安定性についての凍結の効果を試験するために、２周期の凍結／解凍研究もまた実施する。この研究において、血清試料を、ＣＮＰ変異体をスパイクし、分析後、−２０℃において一晩凍結する。次いで、試料を室温において解凍し、再分析する。この過程を、第２の凍結／解凍周期のために反復する。
【０２８８】
ＣＮＰ変異体の血清安定性を、血清／血漿試料に、ＣＮＰ変異体を１０ｕｇ／ｍＬの濃度でスパイクすることによって決定する。試料を３７℃のウォーターバスに、３時間配置する。３０分間隔で血清のアリコートを２重に取り出し、分析する。検体の急速な損失（３０分の間に５０％を超える）が明らかな場合、研究を１０分の時点で反復してもよい。
【０２８９】
マウス血漿中におけるＣＮＰ変異体の安定性を決定する例示的方法において、ＣＮＰ変異体（約２．５〜５．０ｍｇ／ｍＬのストック溶液の１０ｕＬ）、ヘパリン化マウス血漿（５０ｕＬ、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、ＣＤ−１  Ｌｉｔｈ  Ｈｅｐ  ６２２３１）および５ＭのＮａＣｌ（１０ｕＬ）の混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、０〜５時間インキュベートし、次いで、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（１５ｕＬ、ＳｉｇｍａＰ２７１４）を用いて反応を停止させる。抽出のために、１５０ｕＬのＭｅＯＨ／０．１％のＦＡを８５ｕＬの反応混合物に加え、得られた混合物を１分間ボルテックスにかけ、次いで１５℃で１５分間遠心分離器にかけた。７５ｕＬの上清を３００ｕＬの０．１％の水性ＦＡに加える。得られた混合物の少量を、ＬＣ／ＭＳによる分析に供する。
【０２９０】
（実施例９）
ラットおよびマウスにおける薬物動態およびｃＧＭＰ産生
正常なラットにおいて研究を実施し、ＣＮＰペプチドの単回の静脈内（ｉ．ｖ．）投与または皮下（ｓ．ｃ．）投与後の、ＣＮＰ２２および特定のＣＮＰ変異体の薬物動態（ＰＫ）プロファイルおよび血漿ｃＧＭＰ濃度の継時変化を評価した。血漿ＣＮＰの免疫活性を、抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体を用いた競合放射免疫測定（ＲＩＡ）を使用して決定した。血漿ｃＧＭＰ濃度を、市販のキット（ＹＡＭＡＳＡ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、ＹＡＭＡＳＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＲＩＡにより決定した。
【０２９１】
７〜８週齢の正常なオスのラットを使用した。組換え野生型ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）（すなわち、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））を評価した。個々のＣＮＰペプチドの２０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を、５％マンニトール中の溶液として、尾の静脈に１回注射、または個々のＣＮＰペプチドの５０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を、ｌ％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコールおよび１０％（ｗ／ｖ）スクロースを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中の溶液として、背中に１回皮下注射した。
【０２９２】
血漿ＣＮＰ免疫活性を、抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体を使用して、競合RIAにより決定した。標準およびＱＣ試料を調製した。５０ｕＬの標準、ＱＣおよびアッセイ試料を、５０ｕＬのＲＩＡ緩衝液を含有する試験管にそれぞれ加えた。希釈した抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体（１００ｕＬ）を管に加えた。ＡＵ管を、一晩４℃に保った。１２５Ｉ−［Ｔｙｒ０］−ＣＮＰ２２溶液（１００ｕＬ）およびウサギＩｇＧ溶液（１００ｕＬ）を加え、およそ４℃において一晩放置した。１０％ポリエチレングリコールを含有する１ミリリットルの抗ウサギＩｇＧヤギ血清を加え、ボルテックスにかけ、およそ４℃において少なくとも１時間放置し、次いで、不溶性分画を、遠心分離により沈殿させた。上清の吸引後、堆積物中の放射線（γ線）量を、ガンマカウンターにより測定した。各試料を２重に測定し、平均を決定値として採用した。
【０２９３】
ｉ．ｖ．投与後５、３０、６０および９０分、またはｓ．ｃ．投与後５、３０、６０、１２０および１８０分の試料中の血漿ｃＧＭＰ濃度を、抗ｃＧＭＰモノクロナール抗体を使用して競合ＲＩＡにより決定した。標準試料を調製した。１００ｕＬのアッセイ試料（較正曲線のための標準溶液またはｃＧＭＰ決定のための希釈血漿試料）を、試験管に移した。次いで、１００ｕＬの抗ｃＧＭＰモノクロナール抗体溶液および１００ｕＬの１２５Ｉ標識スクシニルｃＧＭＰチロシンメチルエステル溶液を、それぞれ管に加えた。すべての管を、一晩４℃に保った。５００ｕＬのデキストランチャコール溶液を加えた後、管をボルテックスにかけ、次いで、氷上に１０分間配置した。反応混合物を、遠心分離器にかけ、５００ｕＬの上清を、各試料から新しい試験管に移した。上清中の放射線（γ線）の量を、γカウンターにより測定した。各試料を２重に測定し、平均を決定値として採用した。
【０２９４】
血漿ＣＮＰ免疫活性を、薬物動態（ＰＫ）分析のために用いた。ＰＫ分析を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。ｉ．ｖ．投与後の、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＰＫプロファイルを、０時間の濃度（Ｃ０：外挿法、ｐｍｏｌ／ｍＬ）、全身クリアランス（ＣＬｔｏｔ：ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）、定常状態における分布容積（Ｖｄｓｓ：ｍＬ／ｋｇ）、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ：ｐｍｏｌ−分／ｍＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ：分）および半減期（Ｔ１／２：分）などのＰＫパラメーターを使用して計算した。ｓ．ｃ．投与後のＣＮＰペプチドのＰＫプロファイルは、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ：ｐｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃｍａｘに至るまでの時間（Ｔｍａｘ：分）、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ：ｐｍｏｌ−分／ｍＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ：分）および半減期（Ｔ１／２：分）などのＰＫパラメーターを使用して計算した。
【０２９５】
血漿スパイク回収率実験において、ＲＩＡによりＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）が同様に検出された（データ非掲載）。
【０２９６】
上記と同様の手法を用いて、マウスにおいてＣＮＰ２２およびその変異体のＰＫプロファイルならびにｃＧＭＰ産生を刺激するそれらの能力を研究する。
【０２９７】
ｉ．ｖ．投与後の、３匹のラットにおけるＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）のＰＫプロファイルを図９に例示する。図９に示されたように、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、ＣＮＰ２２より非常に長い半減期および非常に大きい生体内利用率を有した。半減期、Ｔ１／２（分）は、ＣＮＰ２２に関して１．４２（±０．４５）、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）に関して２２．３（±１．５）およびＣＮＰ３７に関して４９．５（±２８．０）である。曲線下面積、ＡＵＣ（ｐｍｏｌ−分／ｍＬ）は、ＣＮＰ２２に関して３２０（±５４）、ＣＮＰ３７に関して１５５９（±５６８）およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）に関して２０８４（±４２４）である。
【０２９８】
ｓ．ｃ．投与後の、３匹のラットにおける３種のＣＮＰペプチドのＰＫプロファイルを、図１０に表す。ＣＮＰ２２と比較して、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、非常に長い半減期（７８．１分（±１６．４）対１０．０（±５．０））および非常に大きい生体内利用率（６０％（±６％）対１９％（±９％））を有した。
【０２９９】
ｉ．ｖ．投与後の、３匹のラットにおける３種のＣＮＰペプチドの血漿ｃＧＭＰ濃度の継時変化を、図１１に表示する。図１１は、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）の投与が、ＣＮＰ２２のｉ．ｖ．投与より、３０、６０および９０分において、はるかに高いｃＧＭＰの血漿レベルをもたらすことを明らかに実証する。
【０３００】
ｓ．ｃ．投与後の、３匹のラットにおける３種のＣＮＰペプチドの血漿ｃＧＭＰ濃度の時間プロファイルを、図１２に示す。ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）およびＣＮＰ３７の皮下投与は、ＣＮＰ２２の皮下投与より実質的にはるかに高いｃＧＭＰ血漿濃度をもたらし、ＣＮＰ２２と比較した差は、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）に関しては時間とともに増加するが、ＣＮＰ３７に関しては時間とともに減少する。
【０３０１】
ラットの研究は、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、ＣＮＰ変異体のＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的により長い半減期を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的により大きな生体内利用率を有し、長期間ではｉｎ  ｖｉｖｏでｃＧＭＰ産生が実質的により高いレベルで刺激されたことを示している。ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２７（Ａｒｇ４）の、ＮＥＰ分解に対する耐性は、ｉｎ  ｖｉｖｏのより長い血漿半減期と相関しており、これは、順に、ｉｎ  ｖｉｖｏのＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰシグナル伝達の延長と相関する。これらの結果は、ＣＮＰ２２とは異なり、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射により投与された（例えば、１日１回）本発明のＣＮＰ変異体が、骨関連障害および血管平滑筋障害などのＣＮＰ−関連病態または障害の治療に有効であり得る可能性があることを示している。
【０３０２】
（実施例１０）
マウスにおける薬物動態研究
ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス（実施例１１を参照されたい）における有効性研究に関して、ＮＥＰ耐性が上昇したＣＮＰ変異体を決定するために、ＣＮＰ変異体と野生型ＣＮＰ２２との薬物動態特性を比較する薬物動態（ＰＫ）研究を実施した。ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスは、ＦＶＢマウスのバックグラウンドに単一のトランス遺伝子を含有する、軟骨無形成症の突然変異マウスモデルである。
【０３０３】
野生型ＣＮＰ２２またはその変異体を、単回静脈内（ｉ．ｖ．）用量として、６週齢の野生型ＦＶＢマウスに投与する。例示的ＰＫ研究を、ｗｔＣＮＰ２２を使用して実施した。６週齢のＦＶＢ／Ｎマウスに、ｗｔＣＮＰ２２を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量で静脈内投与した。ＣＮＰ２２の平均血漿レベルを計算し、ＣＮＰ２２の推定半減期を、０．７６分から１．０３分であると決定した。
【０３０４】
ＮＥＰ分解に対して優れた耐性を表すＣＮＰ変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで時間とともに血清濃度の上昇およびより長い半減期を示すことが予測される。
【０３０５】
（実施例１１）
軟骨無形成症のマウスモデルにおける有効性
成長の増強、軟骨無形成症の修正におけるＣＮＰ２２およびその変異体の有効性を、軟骨無形成症のマウスモデルで、突然変異ヒトＦＧＦＲ−３遺伝子（ＦＧＦＲ３ａｃｈ）を発現するトランスジェニックマウスの系統を使用して試験する（Wangら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、９６巻（８号）：４４５５〜４４６０頁（１９９９年）；Naskiら、DevelopmentUSA、１２５巻：４９７７〜４９８８頁（１９９８年）；米国特許第６，２６５，６３２号および第６，１３６，０４０号）。
【０３０６】
３週齢の、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスおよびそれらの野生型同腹子を、２．５％のＡｖｅｒｔｉｎによって麻酔にかけ、側面全身Ｘ線画像をＦａｘｉｔｒｏｎにより得、以下の処理群に、体重によりランダム化する（ｎ＝８／群）：（１）野生型／媒体、（２）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／媒体、（３）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／ＣＮＰ２２、（４）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／第１のＣＮＰ変異体、（５）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／第２のＣＮＰ変異体および（６）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／第３のＣＮＰ変異体。マウスに、１日に１回設計した被験物質を、５週間皮下投与する。サテライト群（ｎ＝３）を使用して、１日目の単回皮下投与の後に各被験物質の曝露を確認する。
【０３０７】
３７日目に、全マウスを、最終麻酔によって屠殺し、全動物を撮影し、ＦａｘｉｔｒｏｎによりＸ線画像を撮る。左右の頸骨、大腿骨、上腕および尺骨を回収し、デジタルキャリパーを使用して測定する。個々の骨の左部分を、組織学的に処理し、右部分を保存のために急速凍結する。骨から得た試料を使用し、軟骨内骨成長についてのＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体の効果を評価および比較する。
【０３０８】
（実施例１２）
ＣＮＰ変異体の臨床評価
以下の実施例は、本発明の治療方法における、ＣＮＰ２２またはその変異体を含む組成物の臨床評価のために使用されるパラメーターに関するガイダンスを提供する。本明細書において議論されるように、ＣＮＰ２２またはその変異体は、骨および血管平滑筋の障害を含む、ＣＮＰに反応した障害の治療に使用されるであろう。安全性、薬物動態ならびに代替および定義された臨床的エンドポイントの両方の、初期反応のための、ＣＮＰ２２またはその変異体の投与量の評価を提供するであろう、臨床実験を実施することになる。実験は、必ずしも限定されないが、最低でも２４週間実施し、約１００例の評価可能な患者についての十分な安全性情報を収集する。実験のための初回投与量は、約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋｇ／週までで変更することがある。この範囲の初期投与量が有意な直接臨床的有益性を生み出さない事象において、投与量を、必要に応じてこの範囲内またはこれを超える範囲で増加し、必ずしも限定されないが、さらに最低でも２４週間持続し、安全性を確立し、さらに有効性を評価するべきである。
【０３０９】
安全性の測定結果は、有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎機能および肝機能を含む）、尿検査および差次的ＣＢＣを含む。さらに、臨床的有益性に関する他のパラメーターをモニターする。本実施例は、ＣＮＰ２２またはその変異体の、吸収、分布、代謝、排出ならびに血中の半減期および生体利用性を含む薬物動態パラメーターの決定をさらに含む。このような分析が臨床反応に対する関連投与量を手助けする。
【０３１０】
方法
患者は、基本的病歴および健康診断ならびに臨床検査の標準セット（ＣＢＣ、Ｐａｎｅｌ２０、ＣＨ５０およびＵＡを含む）を受けることになる。患者は、毎週の診療所への訪問に厳密に従うことになる。患者は、治療期間の終了１週間後、完全な評価のために診療所に再来することになる。投与量の増加が必要であれば、患者は、上に概説した同じスケジュールに従うことになる。安全性は、実験を通してモニターする。
【０３１１】
診断および試験対象患者基準
患者は、ＣＮＰ反応性障害の可能性の診断が確認された、男性であっても、または女性であってもよい。ＣＮＰ反応性の、骨関連障害可能性のある具体例は軟骨無形成症であり、このことは、遺伝子診断およびＦＧＦＲ−３の突然変異または機能障害の他の徴候により確認できる。軟骨無形成症患者の理想の年齢範囲は、幼児（１歳未満）から思春期直前（１３歳未満）までであろう。患者が、妊娠しているまたは授乳中である；研究開始前３０日以内に試験研究中の薬を飲んでいる；あるいは内科的疾患、重篤な併発疾患または研究のコンプライアンスを有意に損ね得る他の酌量すべき状況を有する場合、患者はこの研究から除外されることになる。
【０３１２】
安全性
研究過程の間に有意な急性または慢性の薬物反応が起こらなかった場合、ＣＮＰ２２またはその変異体による治療は、安全であると決定されることになる。臨床検査、臨床検査室または他の適切な研究において、有意な異常が観察されなかった場合、薬剤の長期投与は、安全であることが決定されるであろう。
【０３１３】
野生型ＣＮＰ２２と比較して、本発明の特定のＣＮＰ変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＥＰ分解に対してはるかに耐性であり、ラットにおいて非常に長い血漿半減期および生体利用性を有し、ラットにおいてはるかに高いレベルのｃＧＭＰ産生を刺激し、野生型マウス由来の大腿骨の大量の骨成長を誘導することが示されている。さらに、ＣＮＰ２２を用いた短期間の投薬計画治療が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの軟骨細胞成長のＦＧＦ２誘導性停止を逆転することにおいて、連続ＣＮＰ２２治療とほとんど同じ程度に有効であることが示されている。これらの結果は、ＣＮＰ関連病態または障害例えば、骨関連障害および血管平滑筋障害などの治療において、本発明のＣＮＰ変異体使用の可能性を実証する。
【０３１４】
本明細書に記載の、本発明の個々の実施形態が、場合により本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができることは理解されるべきである。本明細書に引用された、個々の特許文献および個々の非特許文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０３１５】
本明細書に記載の実施形態および例示的実施例において説明したような、本発明に対する多くの改良および変形を、当業者が思いつくことが予測される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に現れることのみに限定されるべきである。
（項目１）
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、以下の式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５０）［式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分；腎クリアランスを減少させる部分；親水性ポリマー；１つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列；炭水化物；疎水性酸；およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは天然アミノ酸、非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体であり、前記Ｐｈｅ類似体のベンゼン環の１つもしくは複数のオルト、メタおよび／またはパラ位がハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているか、あるいは前記Ｐｈｅ類似体の前記ベンゼン環が他のアリール基またはヘテロアリール基で置換されている、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ），Ａｓｎおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択される］
を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体であって、
ＣＮＰ−５３でない、ＣＮＰ変異体。
（項目２）
（ｂ）がＣｙｓであり、
（ｃ）がＰｈｅであり、
（ｄ）がＧｌｙであり、
（ｅ）がＬｅｕであり、
（ｇ）がＬｅｕであり、
（ｈ）がＩｌｅであり、
（ｉ）がＧｌｙであり、
（ｊ）がＭｅｔであり、
（ｋ）がＬｅｕである、
項目１に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３）
（ａ）および（ｆ）が独立にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、項目１または２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目４）
（ａ）がＡｒｇであり、（ｆ）がＬｙｓまたはＡｒｇである、項目３に記載のＣＮＰ変異体。
（項目５）
前記ペプチド結合イソスターが
−ＣＨ２−ＮＨ−；
アミド基が次のＲ基：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−；
−ＣＨ２−Ｓ−；
ｎが１または２である−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−；
−ＣＨ２−ＣＨ２−；
−ＣＨ＝ＣＨ−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−；
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−；および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
からなる群から選択される、項目１から４のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目６）
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、以下の式：
（ｘ）−（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｆ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４２）［式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分；腎クリアランスを減少させる部分；親水性ポリマー；１つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列；炭水化物；疎水性酸；およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
（ｙ）は、非存在であってよく、あるいはＣＮＰ−２２の１〜５位に対応する配列Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５のうちの１〜５個のアミノ酸であり、これらの５アミノ酸のいずれが天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で、場合によって置換されていてもよい１〜５個のアミノ酸を含んでいてよく、
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよい］
を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体であって、
ＣＮＰ−５３でない、ＣＮＰ変異体。
（項目７）
（ｙ）がＣＮＰ−２２のＬｙｓ４に対応する位置にＬｙｓでなく、Ａｒｇを含む、項目６に記載のＣＮＰ変異体。
（項目８）
（ｆ）がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕである、項目６または７に記載のＣＮＰ変異体。
（項目９）
前記骨もしくは軟骨ターゲティング部分が、ビスホスホネート；ヒドロキシアパタイト；グルコサミン；Ｘ型コラーゲン；ポリＡｓｐ；ポリＧｌｕ；ならびにオステオクリン、オステポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の骨ターゲティングドメイン由来のアミノ酸配列からなる群から選択される、項目１から８のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目１０）
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下で負に荷電する少なくとも１つの官能基を含む親水性ポリマーである、項目１から９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目１１）
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下でカルボキシル基（複数可）、硫酸基（複数可）、リン酸基（複数可）またはその組合せを生成する官能基（複数可）を含むポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーである、項目１０に記載のＣＮＰ変異体。
（項目１２）
前記親水性ポリマーがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーまたはその誘導体である、項目１から１１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目１３）
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が約０．４ｋＤａ〜約２．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目１２に記載のＣＮＰ変異体。
（項目１４）
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が約０．６ｋＤａ〜約１．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目１３に記載のＣＮＰ変異体。
（項目１５）
前記ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が単分散性である、項目１２から１４のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目１６）
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチド由来であり、前記アミノ酸配列が、前記ナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／または置換（複数可）を場合によって含んでいてよい、項目１から１５のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目１７）
前記ナトリウム利尿ポリペプチドが、ＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ＮＰＰＡ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂ（ＮＰＰＢ）からなる群から選択される、項目１６に記載のＣＮＰ変異体。
（項目１８）
前記非ナトリウム利尿ポリペプチドが、アルブミン、免疫グロブリン、ヒスチンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）からなる群から選択される、項目１６に記載のＣＮＰ変異体。
（項目１９）
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａの機能的ドメイン由来である、項目１８に記載のＣＮＰ変異体。
（項目２０）
１つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列が１〜４０個のアミノ酸を含む、項目１から１９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目２１）
前記アミノ酸配列が１〜２０個のアミノ酸を含む、項目２０に記載のＣＮＰ変異体。
（項目２２）
前記疎水性酸が天然脂肪酸および線状または分枝、飽和または不飽和Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸からなる群から選択される、項目１から２１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目２３）
（ｘ）が１〜２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である、項目１から２２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目２４）
（ｘ）が、ＣＮＰ−２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前の位置に２つの連続する塩基性アミノ酸を含まない、項目２３に記載のＣＮＰ変異体。
（項目２５）
（ｘ）のＮ末端がＧｌｙで終わる、項目２３または２４に記載のＣＮＰ変異体。
（項目２６）
ＰＥＧポリマーまたはその誘導体が前記変異体のＮ末端に結合しており、前記変異体が、１つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸配列を含む（ｘ）基を含んでいても、含んでいなくてもよい、項目１から２５のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目２７）
ＣＮＰ−２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前にＡｒｇ残基を含む、項目１から２６のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目２８）
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド２２（ＣＮＰ−２２）（配列番号１）活性を保持しており、ＣＮＰ−２２と比較して循環中で少なくとも５倍長い半減期を示す、ＣＮＰ−２２の変異体であって、
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有し、
配列番号１のアミノ酸６〜２２と少なくとも７０％相同のアミノ酸配列を含み、
ＣＮＰ−５３でない、
ＣＮＰ−２２の変異体。
（項目２９）
アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンまたはナトリウム利尿ペプチドのうちの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、項目２８に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３０）
前記ナトリウム利尿ペプチドがＡＮＰ、ＢＮＰまたはＣＮＰ−５３である、項目２９に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３１）
ＣＮＰ−５３（配列番号４）のアミノ酸１〜３２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、項目３０に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３２）
親水性ポリマーを含む、項目２８に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３３）
前記親水性ポリマーがＰＥＧである、項目３２に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３４）
明細書における表１、２、３および４（配列番号１〜６および配列番号３４〜１４４）に記載の以下のＣＮＰ変異体：
Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；および
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＳＳ−ＣＮＰ２２；
からなる群から選択され、
ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−１７、ＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３またはＡＮＰでない、
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
（項目３５）
Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（類似体ＡＺ）（配列番号４１）；
ＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＡ）（配列番号６１）；
ＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＢ）（配列番号６２）；
ＤＬＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＣ）（配列番号６３）；
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＦ）（配列番号７９）；
ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（ＣＮＰ３７、類似体ＢＬ）（配列番号６０）；
ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＥ）（配列番号８１）；
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＱ）（配列番号７６）；
ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＰＫ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＳ）（配列番号７１）；
ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＱＫ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＴ）（配列番号１３０）；
ＧＡＨＨＰＨＥＨＤＴＨＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（類似体ＣＲ）（配列番号７７）；
ＧＱＴＨＳＳＧＴＱＳＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（類似体ＣＮ）（配列番号８７）；
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＮＰ１７−ＫＶＬＲＲＨ（類似体ＣＤ）（配列番号６８）；
ＰＥＧ１Ｋ−ＣＮＰ２２（配列番号１）；
ＰＥＯ１２−ＣＮＰ２２（配列番号１）；
ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）；
ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）；
ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）；
ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）；
ＰＥＧ１Ｋ−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）；
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）；
ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）；および
ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）
からなる群から選択される、項目３４に記載のＣＮＰ変異体。
（項目３６）
（ａ）親水性ポリマー、および
（ｂ）ＣＮＰ２２（配列番号１）、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）、またはＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号６９）のいずれか
を含み、
前記親水性ポリマーがＮ末端、Ｃ末端もしくは内部部位、またはそれらの組合せにおいてペプチドに結合している、
約２．６ｋＤａ〜約７．０ｋＤａの範囲の総質量を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
（項目３７）
ＣＮＰ−２２のＣｙｓ６およびＣｙｓ２２に対応する位置の残基間におけるジスルフィド結合により形成された環状構造を有する、項目１から３６のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目３８）
約８．０〜約１０．５の範囲のｐＩを有する、項目１から３７のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目３９）
約８．５〜約１０．０の範囲のｐＩを有する、項目３８に記載のＣＮＰ変異体。
（項目４０）
約２．８ｋＤａ〜約６．０ｋＤａの範囲の総質量を有する、項目１から３９のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目４１）
中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）切断に対する感受性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて野生型ＣＮＰ−２２より少なくとも２倍長い半減期を有する、項目１から４０のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目４２）
野生型ＣＮＰ−２２の同じ濃度のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する、項目１から４１のいずれかに記載のＣＮＰ変異体。
（項目４３）
項目１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
（項目４４）
軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルド症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト（Kniest）異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症からなる群から選択される骨格異形成症の治療用の医薬の調製における項目１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体の使用。
（項目４５）
前記骨格異形成症が軟骨無形成症である、項目４４に記載の使用。
（項目４６）
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性水腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療用の医薬の調製における項目１から４２のいずれかに記載のＣＮＰ変異体の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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