(57)【要約】  本発明は、Ｍ１３ファージのｐＩＸに由来する操作されたハイブリッドファージベクターを用いて非抗体ペプチド若しくはタンパク質、タンパク質又はペプチドを産生するために、ｐＩＸファージディスプレイライブラリを作成及び使用するための組成物及びその方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された生物学的に活性なリガンドに結合するファージディスプレイ融合ペプチド又はタンパク質を発現するための、操作された組換え核酸ファージベクターであって、
ａ．以下に操作可能に連結する、組換えｐＶＩＩファージコード核酸配列、
ｂ．以下に操作可能に連結する、組換えファージリーダーコード核酸配列、
ｃ．以下に操作可能に連結する、組換え制限部位、
ｄ．ａに操作可能に連結する、ペプチドリンカーをコードする核酸配列、
ｅ．生物学的に活性なリガンドに選択的に結合する第１外因性ペプチド又はタンパク質をコードする配列、
ｆ．天然ｐＩＸをコードする核酸配列、
ｇ．成熟ｐＶＩＩＩをコードする核酸配列、及び
ｈ．成熟ｐＩＩＩをコードする核酸配列、
を含む、操作された組換え核酸ファージベクター。
【請求項２】
前記ファージリーダーコード配列が、ｐｅｌＢ配列である、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項３】
組換えタグ又は選択配列が、ＨＡタグ配列である、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項４】
組換えタグ又は選択配列が、配列番号３、４から選択される、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項５】
前記ペプチドリンカーが、配列番号６、７及び８から選択される、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項６】
前記外因性第１ペプチド又はタンパク質が、推定の生物学的に活性なタンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項７】
前記生物学的に活性なリガンドが、少なくとも１つの生物学的インビボ活性をもたらす、請求項７に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、少なくとも１つのファージコートタンパク質と融合した第２の外因性ペプチド又はタンパク質をコードする、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の操作された核酸ファージベクターを含む、細菌宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細菌宿主細胞によって発現する、生物学的に活性な融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記融合タンパク質に由来する、生物学的に活性な外因性ペプチド又はタンパク質。
【請求項１２】
請求項１に記載の複数の操作された核酸ファージベクターを含む、細菌宿主細胞のファージライブラリ。
【請求項１３】
前記第１の外因性ペプチド又はタンパク質の変異体を発現する、請求項１２に記載のファージライブラリ。
【請求項１４】
所望の生物活性を有する外因性ペプチド又はタンパク質を得るためにファージペプチド又はタンパク質ライブラリをスクリーニングする方法であって、（ａ）請求項１３に記載のファージライブラリから外因性ペプチド又はタンパク質を発現する工程と、（ｂ）前記所望の生物活性を有する外因性ペプチド又はタンパク質を発現する細菌細胞を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法から得た、外因性ペプチド又はタンパク質をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ１３ファージのｐＩＸに由来する操作されたハイブリッドファージベクターを用いて非抗体ペプチド若しくはタンパク質、タンパク質又はペプチドを産生するために、ｐＩＸファージディスプレイライブラリを作成及び使用するための組成物及びその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファージディスプレイは、ポリペプチドをアフィニティに基づいて選択するために確立された手段である。代表的なファージディスプレイ選択では、ポリペプチドのライブラリは、繊維状ファージＭ１３のコートタンパク質のうちの１つの末端と遺伝学的に融合している。ファージ粒子は、前記ライブラリの各ポリペプチド員とそれをコードする遺伝子との間に物理的な連結をもたらす。その後、所望の標的分子と結合するライブラリのそれら構成員のために、ファージライブラリをアフィニティ選択又はパニングすることができる。ライブラリを標的と混合し、未結合のファージ粒子を洗い出し、残りのファージを溶出させ、大腸菌細胞内で培養することによって増殖させる。
【０００３】
異物ポリペプチドのディスプレイはＭ１３の各コートタンパク質によって達成されてきたが、このうち最も一般的な融合パートナーはｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩである。ｐＩＩＩは、大腸菌へのファージ感染に関与する、４２ｋＤのマイナーコートタンパク質である。各ファージ粒子は、その表面に、ファージの一端に集結したｐＩＩＩタンパク質の複製を５つまで含有している。ＰＶＩＩＩは、ファージの主要なコートタンパク質であり、ｐＶＩＩＩ（分子量５ｋＤ）の何千もの複製は、一本鎖ウィルス性ゲノムの周囲に規則正しく配列されてファージキャプシドを構成する。Ｍ１３は、ｐＩＩＩに加えて、１２ｋＤのタンパク質であるｐＶＩ、並びに短いタンパク質（それぞれ、アミノ酸３３個及び３２個）であるｐＶＩＩ及びｐＩＸの、３つの別のマイナーコートタンパク質も有しており、これらはアセンブリの開始と安定性の維持とに関与している。ｐＶＩタンパク質の５つの複製は、ｐＩＩＩと同じ側のファージ末端に位置し、一方、それとは反対側のファージ末端には、ｐＶＩＩ及びｐＩＸの複製がそれぞれ５つ存在している。
【０００４】
ｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩとの融合をディスプレイするファージライブラリは、多くの場合、産出力があることが分かっており、一方、ファージによってディスプレイされるポリペプチドは、特定の生物学的な制限を受けている。例えば、８以上のアミノ酸長の大部分のペプチドは、ｐＶＩＩＩへの融合ほど十分にディスプレイされない。更に、ファージタンパク質自体と相互作用するか、ないしは別の方法でｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩの発現、取り込み又は活性に影響を及ぼすポリペプチドは、それらをディスプレイするファージが十分に成長しないことから、ライブラリではディスプレイ不十分となる。最終的に、ｐＩＩＩはかなり大きなタンパク質であるため、特定の標的部位（例えば、タンパク質表面上の深くて狭い裂け目）へのｐＩＩＩディスプレイされたポリペプチドの接近又は多重結合形態で最も効果的に機能するポリペプチドの的確なアセンブリが、立体的に妨害される可能性がある。したがって、他のコートタンパク質を利用するファージライブラリからの選択物であって、異なる構造や生物学的機能を有する故に、ディスプレイされるポリペプチドに様々な制限を与えると予想される可能性のあるものは、配列多様性の上限の調査を確保するのに役立つということになる。構想上の実験の証明では、ｐＶＩＩ及びｐＩＸを抗体断片及びペプチドの両方のディスプレイに利用できることが分かった。ポリペプチドとｐＶＩＩ及びｐＩＸのＮ末端との融合がこれらコートタンパク質を非機能性にすることが以前の研究から示唆されいたため、これらの結果は特に注目すべきことであった。
【０００５】
ファージ上での異物ポリペプチドのディスプレイは、ファージ、ファージミド又はハイブリッドベクターを利用して行われる。ファージベクターを用いると、対象とする遺伝子は、天然のコートタンパク質遺伝子を含むフレーム内融合物としてファージゲノムに導入される。これらベクターは、十分機能的なファージとして別々に増殖し、異物ポリペプチドの多重コピーをディスプレイする。一方、ファージミドベクターは、細菌由来の複製に加えて、ファージ由来の複製及びパッケージシグナルを含有するプラスミドである。ファージミドは、コートタンパク質遺伝子の組換えコピーと融合された対象遺伝子を運搬し、ヘルパーファージによる助けに応じて、ファージコートに組み込まれたディスプレイポリペプチドと共に子孫ウィルスにパッケージされる。ヘルパーファージの要件は、ファージベクターよりもファージミドベクターに多大な労力をかけさせて、任意の特定試料中に存在するファージの数を定量化し難くすることである。更に、ファージ粒子は、野生型コートタンパク質と融合コートタンパク質の両方をアセンブリに活用する可能性があるため、得られるファージの何割かは、対象のポリペプチド配列をディスプレイせず、その結果、ディスプレイ効率の低下をもたらす。ハイブリッドベクターは、融合タンパク質をファージゲノムに運搬するがヘルパーファージを必要としないという点でファージベクターと類似しているだけでなく、それらは、ゲノムが融合タンパク質の野生型コピーをも運搬するという点でファージミド系とも類似している。ｐＩＸファージディスプレイについての過去の報告には、ファージミドベクターと関連のある融合が記載されているが、ハイブリッド又はファージベクターからｐＩＸ上にポリペプチドをディスプレイすることについては、これまでに報告されていない。ファージベクター由来ｐＶＩＩ上でのポリペプチドのディスプレイについては、近年報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
高アフィニティ及び活性、高産生力、良好な溶液特性並びに人間に投与したときに低免疫反応傾向のヒト治療用ペプチド及びタンパク質の決定的要素を同時に送達する、合成の非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリ及び方法を提供する必要がある。更には、合成ライブラリからの非抗体ペプチド又はタンパク質の単離効率を現行の方法よりも向上させて、非抗体ペプチド又はタンパク質の発見に関する資源コストを削減し、生物学的評価のための非抗体ペプチド又はタンパク質の送達を加速させる必要もある。本発明のライブラリ及び方法は、総合的設計とアセンブリ技術とファージｐＩＸペプチド又はタンパク質ディスプレイとを合わせることによってこれら要求に応じるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、操作されたｐＩＸファージベクターであって、例えば、所望によりインライン成熟と共に突然変異誘発技術又は他の多様性形成法を利用して、Ｍ１３ファージ由来ｐＩＸを用いてペプチド又はタンパク質ライブラリを作成するためにｐＶＩＩ及びｐＩＸファージディスプレイで使用することで、ペプチド若しくはタンパク質又は非抗体ペプチド若しくはタンパク質断片の産生及び治療用の非抗体ペプチド又はタンパク質の選択に有効で迅速なプラットフォームを供給する、操作されたｐＩＸファージベクターを提供する。本発明によれば、上流のシグナルペプチド及び誘導プロモーターと連結した第２の組換えｐＩＸコード領域を含むように操作されたハイブリッドファージベクターが提供される。
【０００８】
本発明は、ペプチド及びタンパク質を、例えばこれらに限定されないが、スクリーニング、選択、操作、成熟などの用途、又は例えば有望な治療用若しくは診断用ペプチド又はタンパク質を供給する他の用途において、かかるペプチド又はタンパク質をペプチド又はタンパク質ライブラリとして発現する際に使用するためにｐＩＸ又はｐＶＩＩファージタンパク質との融合物としてディスプレイするための、ファージベクターを提供する。天然遺伝子ＩＸの調節及びコード領域がｐＶＩＩ及びｐＶＩＩＩの調節及びコード領域と重なり合うため、この遺伝子の末端との単純な融合は、ファージを不活性化するであろう（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．４４：３２〜４６，１９８２）。現行のベクターは、融合を含むと同時に、天然のコートタンパク質の調節領域を保つ。ファージミドよりむしろこのベクターを使用することにより、ヘルパーファージを必要としなくなり、選択及び分析中にファージを培養するのに要する時間及び労力がかなり軽減される。更に、これらのディスプレーシステムの多価性質は、低アフィニティ結合剤の検出をより容易にする。
【０００９】
したがって、本発明は、ポリペプチドアレイの構築においてペプチド又はタンパク質をｐＩＸファージディスプレイ方式で発現する際に使用するための、新規ベクター構成体を提供する。特に、本発明は、融合ポリペプチドをコードする第２の組換えｐＩＸコード配列を含む、操作されたｐＩＸファージベクターについて記載しており、融合ポリペプチドには、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端と融合した外因性ポリペプチドが含まれている。好ましくは、ファージ粒子は、ファージ粒子の表面に発現された融合タンパク質を含んでいる。
【００１０】
態様により、本発明は、選択された生物学的に活性なリガンドに結合するファージディスプレイ融合ペプチド又はタンパク質を発現するための、操作された核酸ファージベクターであって、（ａ）以下に操作可能に連結する、組換えファージリーダーコード核酸配列、（ｂ）以下に操作可能に連結する、組換えタグ、プロモーター、又は選択コード核酸配列、（ｃ）以下に操作可能に連結する、組換えｐＩＸ又はｐＶＩＩをコードする核酸配列、（ｄ）以下に操作可能に連結する、組換え制限部位、（ｅ）ａに操作可能に連結する、ペプチドリンカーをコードする核酸配列、（ｆ）生物学的に活性なリガンドに選択的に結合する第１外因性ペプチド又はタンパク質をコードする配列、（ｇ）ｐＶＩＩをコードする核酸配列、（ｈ）天然ｐＩＸをコードする核酸配列、（ｉ）ｐＩＩＩをコードする核酸配列、及び（ｊ）ｐＶＩをコードする核酸配列、を含む、操作された核酸ファージベクターを提供する。
【００１１】
かかる操作された核酸ファージベクターは、前記ファージリーダーコード配列がｐｅｌＢ配列であるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、組換えタグ又は選択配列がＦＬＡＧタグ配列であるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、組換えタグ又は選択配列が、配列番号３、４、５又は６から選択されるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記ＦＬＡＧタグ配列が配列番号２を含むものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記プロモーターが誘導プロモーターであるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記誘導プロモーターがｌａｃプロモーターであるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記ペプチドリンカーが配列番号７及び８から選択されるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記第１外因性ペプチド又はタンパク質が、推定の生物学的に活性なタンパク質又はペプチドであるものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記生物学的に活性なリガンドが少なくとも１つの生物学的なインビボ活性をもたらすものを含むことができる。かかる操作された核酸ファージベクターは、前記ベクターが、少なくとも１つのファージコートタンパク質と融合した第２外因性ペプチド又はタンパク質をコードするものを含むことができる。
【００１２】
本発明は、操作された核酸ファージベクターを含む細菌宿主細胞を更に含む。宿主細胞は、生物学的に活性な融合タンパク質を発現することができる。
【００１３】
本発明は、本発明による細菌宿主細胞によって発現された、生物学的に活性な融合タンパク質にも関連する。本発明は、前記融合タンパク質に由来する生物学的に活性な外因性ペプチド又はタンパク質にも関連する。
【００１４】
本発明は、本発明による複数の操作された核酸ファージベクターを含む、細菌宿主細胞のファージライブラリにも関する。ファージライブラリには、前記第１外因性ペプチド又はタンパク質の変異体を発現するものを含むことができる。
【００１５】
本発明は、所望の生物活性を有する外因性ペプチド又はタンパク質を得るためにファージペプチド又はタンパク質ライブラリをスクリーニングする方法であって、（ａ）ファージライブラリから外因性ペプチド又はタンパク質を発現する工程と、（ｂ）前記所望の生物活性を有する外因性ペプチド又はタンパク質を発現する細菌細胞を選択する工程と、を含む、方法を更に提供する。本発明は、かかる方法から得た外因性ペプチド又はタンパク質をコードする核酸も提供する。
【００１６】
一実施形態では、ファージベクターは第２融合ポリペプチドを更にコードしており、第２融合ポリペプチドには、ｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質のアミノ末端と融合した第２外因性ポリペプチドが含まれており、また、第１融合ポリペプチド内の第１外因性ポリペプチドは、ｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質のアミノ末端と融合している。一実施形態では、第１及び第２融合ポリペプチドが結合することで、ヘテロ二量体タンパク質複合体、例えば、標的タンパク質、受容体、核酸結合タンパク質、又は酵素を形成することができる。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、融合タンパク質を発現するためのカセットを含む繊維状ファージの表面で融合タンパク質を発現するためのベクターについて説明している。カセットには、挿入断片ＤＮＡの定方向性連結に適したヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーを介して操作可能に連結された上流及び下流の翻訳可能なＤＮＡ配列が含まれており、上流の配列は、原核生物の分泌シグナルをコードし、下流の配列は、ｐＶＩＩ又はｐＩＸ繊維状ファージタンパク質をコードする。翻訳可能なＤＮＡ配列は、翻訳可能なＤＮＡ配列を融合ポリペプチドの一部分として発現するために一連のＤＮＡ発現シグナルと操作可能に連結されている。好ましい変形形態では、ベクターは、所望により、繊維状ファージの表面に第２融合タンパク質を発現するための第２カセットを更に含んでおり、第２カセットは、第１融合タンパク質発現カセットがｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質をコードし及び／あるいは第２融合タンパク質発現カセットがｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質をコードするという条件で、第１カセットの構造を有する。ベクターをファージゲノムとして利用することで、ヘテロ二量体の２つの外因性ポリペプチドが第１及び第２ファージタンパク質ｐＶＩＩ及び／又はｐＩＸとの融合によってファージ粒子に固定されているヘテロ二量体タンパク質複合体をファージ粒子の表面に発現する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、ライブラリ中の代表的な粒子がそれぞれ異なる融合タンパク質をディスプレイする、操作されたｐＩＸファージベクターに基づく本発明によるファージ粒子のライブラリ、すなわちコンビナトリアルライブラリについても検討している。粒子がヘテロ二量体タンパク質複合体をディスプレイする場合、ライブラリには、Ｆｖ分子のライブラリの形態の非抗体ペプチド又はタンパク質のような、ヘテロ二量体のコンビナトリアルライブラリが含まれている。好ましいライブラリは、少なくとも１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13又はこの中の任意の範囲若しくは値の融合ペプチド又はタンパク質の組み合わせ多様性を有する。
【００１９】
関連する実施形態には、本発明の操作されたｐＩＸファージベクターから発現した第１及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが外因性タンパク質であり、第２ポリペプチドが繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質であり、外因性タンパク質が繊維状ファージタンパク質のアミノ末端と融合している、融合タンパク質が記載されている。
【００２０】
更に本発明は、本発明の操作されたｐＩＸファージベクターから発現したタンパク質又はペプチドを、ファージのコンビナトリアルライブラリを作成するために発現する様々な方法についても検討しており、外因性ポリペプチドをコードする遺伝子レパートリーを本発明のベクターにクローニングすること、ライブラリ中の外因性ポリペプチドの構造を突然変異誘発によって、第１及び第２融合タンパク質ライブラリ集団の無作為な組み合わせによって、標的及びアフィニティの選択（「パニング」）によって変性してライブラリの多様性を変更すること等が挙げられる。
【００２１】
改善された又は新規の機能を有するタンパク質の設計は、様々な医療用途、工業用途、環境用途及び基本調査用途にとっては重要な目標である。操作されたｐＩＸファージベクターを用いて非抗体ペプチド又はタンパク質のコンビナトリアルライブラリを作成した後に続く、効果的な次の工程は、人工的な非抗体ペプチド又はタンパク質構成体並びに二量体種が未変性であるか又は機能的であり得る他のタンパク質モチーフへの進化である。
【００２２】
本発明は、単量体又は二量体ペプチド種又はタンパク質種を発現する融合タンパク質をディスプレイするためにｐＶＩＩ及び／又はｐＩＸが使用されるポリペプチドのコンビナトリアルアレイの構築において、操作したｐＩＸファージベクターを用いたファージディスプレイ方式を提供することにより、これら課題に取り組むものである。
【００２３】
単量体又は二量体の相互作用に関与し得る様々なタンパク質をディスプレイする能力は、前記技術の範囲及び能力に特有のものである。これらには、非抗体ペプチド又はタンパク質だけでなく、幾つかの酵素、ホルモン及びホルモン受容体類、並びにＤＮＡ−結合タンパク質も含まれる。本明細書に記載のディスプレイ技術は、非抗体ペプチド又はタンパク質フレームワーク領域をコンビナトリアル技術で変更するために、及び非抗体ペプチド又はタンパク質の構造を再編成し小型化するために、又はレプレッサー等のＤＮＡ結合タンパク質を臨床上及び治療上重要な特定のＤＮＡ配列と比較して選択するためのヘテロ二量体のライブラリとしてディスプレイするために、利用することができる。
【００２４】
したがって、本発明の技術は、ペプチド又はタンパク質のライブラリや、構成員が単量体アレイ、ホモ二量体アレイ又はヘテロ二量体アレイからなるコンビナトリアルライブラリをディスプレイ及び選択するために提供する。
【００２５】
上記の概要及び以下の「発明を実施するための形態」はいずれも、単に例として説明するためのものであって、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】Ｍ１３−９ベクター中の組換えＨＡ−ｐＩＸ融合タンパク質の発現を得るための、合成ＤＮＡの挿入部分。
【図１Ｂ】Ｍ１３−９ベクター中の組換えＨＡ−ｐＩＸ融合タンパク質の発現を得るための、合成ＤＮＡの挿入部分。
【図１Ｃ】Ｍ１３−９ベクター中の組換えＨＡ−ｐＩＸ融合タンパク質の発現を得るための、合成ＤＮＡの挿入部分。
【図１Ｄ】Ｍ１３−９ベクター中の組換えＨＡ−ｐＩＸ融合タンパク質の発現を得るための、合成ＤＮＡの挿入部分。
【図２】天然ファージコートタンパク質遺伝子の位置と挿入された組換えｐＩＸ遺伝子の位置とを表す、ｐＭＯＭ  ６０のマップ。
【図３】天然ファージコートタンパク質遺伝子の位置と挿入されたｐｅｌＢシグナル配列及びＨＡエピトープの位置とを表す、Ｍ１３−９のマップ。
【図４Ａ】Ｍ１３−９ファージ上での、それぞれの抗体の、ＨＡ〜ｐＩＸ融合物との特異的結合を表す、ＥＬＩＳＡ。
【図４Ｂ】Ｍ１３−９ファージ上での、それぞれの抗体の、ＦＬＡＧ−ｐＩＸ融合物との特異的結合を表す、ＥＬＩＳＡ。
【図４Ｃ】Ｍ１３−９ファージ上での、それぞれの抗体の、Ｈｉｓ−６−ｐＩＸ融合物との特異的結合を表す、ＥＬＩＳＡ。
【図４Ｄ】Ｍ１３−９ファージ上での、ｓＥＧＦＲ−ミメティボディの、ＰＨＰＥＰ  １９０−ｐＩＸとの特異的結合を表す、ＥＬＩＳＡ。
【図４Ｅ】Ｍ１３−９ファージ上での、ｓＥＧＦＲ−ミメティボディの、ＥＧＦ−ｐＩＸ融合物との特異的結合を表す、ＥＬＩＳＡ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、操作されたｐＩＸファージベクターであって、例えば、所望によりインライン成熟と共に突然変異誘発技術又は他の多様性形成法を利用して、Ｍ１３ファージ由来ｐＩＸを用いてペプチド又はタンパク質ライブラリを作成するためにｐＶＩＩ及びｐＩＸファージディスプレイで使用することで、ペプチド若しくはタンパク質又は非抗体ペプチド若しくはタンパク質断片の産生及び治療用の非抗体ペプチド又はタンパク質の選択に有効で迅速なプラットフォームを供給する、操作されたｐＩＸファージベクターを提供する。本発明によれば、上流のシグナルペプチド及び誘導プロモーターと連結した第２の組換えｐＩＸコード領域を含むように操作された、ハイブリッドファージベクターが提供される。
【００２８】
本発明は、ペプチド及びタンパク質を、例えばこれらに限定されないが、スクリーニング、選択、操作、成熟などの用途、又は例えば有望な治療用若しくは診断用ペプチド又はタンパク質を供給する他の用途において、かかるペプチド又はタンパク質をペプチド又はタンパク質ライブラリとして発現する際に使用するためにｐＩＸ又はｐＶＩＩファージタンパク質との融合物としてディスプレイするための、ハイブリッドベクターを提供する。天然遺伝子ＩＸの調節及びコード領域がｐＶＩＩ及びｐＶＩＩＩの調節及びコード領域と重なり合うため、この遺伝子の末端との単純な融合は、ファージを不活性化するであろう（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．４４：３２−４６，１９８２）（８）。それどころか、Ｍ１３ｍｐ１９の誘導体は、操作することで、上流のシグナルペプチド及び誘導プロモーターと連結した第２の組換えｐＩＸコード領域を含んでいた。ファージミドよりむしろこのベクターを使用することにより、ヘルパーファージを必要としなくなり、選択及び分析中にファージを培養するのに要する時間及び労力がかなり軽減される。更に、このベクターを用いて成長させたファージの数は、ファージミドから成長させたファージの数よりも容易に測定できる。
【００２９】
したがって、本発明は、ポリペプチドアレイの構築においてペプチド又はタンパク質をｐＩＸファージディスプレイ方式で発現する際に使用するための、新規ベクター構成体を提供する。特に、本発明は、融合ポリペプチドをコードする第２の組換えｐＩＸコード配列を含む、操作されたｐＩＸファージベクターについて記載しており、融合ポリペプチドには、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端と融合した外因性ポリペプチドが含まれている。好ましくは、ファージ粒子は、ファージ粒子の表面に発現された融合タンパク質を含んでいる。
【００３０】
本明細書に記載のかかる操作されたｐＩＸファージベクターを用いて作成されるヒトペプチド又はタンパク質の新たな（de novo）ライブラリは、Ｍ１３遺伝子ファージのｐＩＸ遺伝子を介してそれをディスプレイすることによる現行の非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリ最新技術とは異なる。
【００３１】
繊維状ファージ
本発明は、本明細書に記載の操作されたｐＩＸファージベクターを、少なくとも１つの組換え融合ペプチド又はタンパク質をコードするｐＩＸ又はｐＶＩＩファージと共に用いることを意図している。融合タンパク質は、繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端と融合した外因性ポリペプチド部分を含む。
【００３２】
「外因性」とは、ファージタンパク質に融合したポリペプチドが、野生型の繊維状ファージ中のファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質と通常は関与しておらず、正常なファージタンパク質と無関係であることを指す。
【００３３】
好ましい実施形態では、繊維状ファージは、第１及び／又は第２融合タンパク質をコードするゲノムを封入しており、第１融合タンパク質には、ｐＶＩＩ又はｐＩＸと融合した第１外因性ポリペプチドが含まれており、第２融合タンパク質には、ｐＩＸ又はｐＩＸと融合した第２外因性ポリペプチドが含まれている。
【００３４】
繊維状ファージは、本明細書に記載されているように、ファージ粒子の表面にディスプレイされた融合タンパク質（類）を更に含有する。したがって、少なくとも第１融合タンパク質及び第２融合タンパク質が存在する場合、ファージはこれらタンパク質を、第１外因性ポリペプチドと第２外因性ポリペプチドとがヘテロ二量体として相互に作用することでファージ表面に機能的な２本鎖タンパク質複合体が形成され得るような機能的方式でディスプレイすることができる。
【００３５】
本発明のファージに存在する融合タンパク質において、外因性ポリペプチドと繊維状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質との間の「融合」には、一般的なアミド連結が含まれてもよく、又は実施例に記載されているようなリンカーポリペプチド（すなわち、「リンカー」）が含まれてもよい。一般に一続きの約５〜５０アミノ酸長の任意の種類のリンカーを使用することができる。特に好ましいリンカーは、そのリンカーの位置で融合タンパク質に対して大きな可動度を付与する。
【００３６】
ライブラリ設計：従来の合成ライブラリは、次の性質のうち幾つかを組み込んでいたが、全てを包括的に包含しているものはなかった。
【００３７】
配列多様性の位置及びと性質。配列多様性は、高いアフィニティの選択的結合実体をもたらすヒトタンパク質が内生的に供給される方法を証明するものである。この配列多様性の発生及び累積は無作為ではない。ゲノム配列のヌクレオチド突然変異の部位と種類は、ＤＮＡ配列及び機序によって影響されるが、結合及び機能上の利点を与える突然変異だけが、多くの場合は中性の置換基と共に、選択されて蓄積される。機序からは予想され難いが、既知のヒトペプチド又はタンパク質配列のデータベース及び構造−機能解析により、タンパク質とペプチドと小さな分子の抗原との差異化を含む所望の標的又は抗原の認証と最も頻繁に結びつく位置及びアミノ置換基が確認される。本発明のライブラリは、設計された縮重オリゴヌクレオチドを利用して、発現するペプチド又はタンパク質配列の推定の結合領域及び機能的領域に置換基を組み込むことによって、この自然なヒト多様性がもたらされる。
【００３８】
発現、並びに生化学的及び生物物理学的性質。好ましいヒト非抗体ペプチド又はタンパク質は、所望の生物活性及び結合活性を有しているだけでなく、様々な宿主からも効率良く産生され、安定であり、また、優れた溶液特性をも有している。高頻度の生殖細胞系遺伝子の利用（１ｄ）も、哺乳類系での良好な発現を示唆している。その上、バクテリアファージディスプレイ法の選択又はスクリーニングによってライブラリから回収された非抗体ペプチド又はタンパク質は、細菌宿主内で十分に発現するはずである。本発明のライブラリは、標準的な組換え哺乳類宿主（例えば、ＨＥＫ  ２９３及びＣＨＯ細胞）並びに細菌宿主から十分に発現して精製されたヒト生殖細胞由来のテンプレートを基礎としており、高い安定性と優れた溶液特性とを有する。
【００３９】
ライブラリアセンブリ技術。多様性が高度であり（＞１０10）、調整し易く、アセンブルが容易で、しかも不要な配列のバックグラウンドが低い、新たな非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリが好ましい。これらバックグラウンド配列には、親テンプレート、及び目標値を低く設定した多様性が含まれる。以下の手法を併用することで、ライブラリアセンブリが加速され、低バックグラウンドとなる：（ａ）クンクル法による（Kunkle-based）一本鎖突然変異誘発、（ｂ）制限部位によるパリンドローム（Palindromic）ループ、（ｃ）メガプライマー。
【００４０】
ｐＩＸペプチド又はタンパク質ファージディスプレイ。先行する繊維状の新たなヒト非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリはいずれも、ディスプレイのためにｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩファージコートタンパク質を利用する。ｐＩＸと、選択されたペプチド又はタンパク質テンプレートとの組み合わせは、ｍＡｂｓ及びその他の関連分子への転換後にそれらの選択された特性を維持している非抗体ペプチド又はタンパク質を回収するのに更に有効な選択システムである。
【００４１】
ペプチド又はタンパク質ディスプレイ。ペプチド又はタンパク質は、ヒト非抗体ぺプチド又はタンパク質の天然セグメントであり、それらは、完全な非抗体のぺプチド又はタンパク質に操作されたときに、それらの活性をより高度に再現する。ペプチド又はタンパク質の効率の良い繊維状ディスプレイには、細菌宿主内での良好な発現以上の特性が要求されることがある。本発明のライブラリで使用したペプチド配列は、ｐＩＸによって繊維状ファージ上に効率良くディスプレイするために選択された。
【００４２】
ファージミドディスプレイ。ペプチド又はタンパク質分子は、ファージｐＩＸコートタンパク質よりも大きい場合があるため、細菌細胞内で産生される全てのｐＩＸタンパク質と連結すると、組換えファージ粒子のアセンブリを妨害する可能性がある。この妨害を回避する１つの方法は、ｐＩＸファージミド系を利用することであり、それによって、野生型のｐＩＸタンパク質とペプチド又はタンパク質と連結したｐＩＸタンパク質とを共に組換えファージ粒子中に組み込むことができる。好ましい応用では、本発明のライブラリは、ファージミド系内でｐＩＸによってディスプレイされる。
【００４３】
ディスプレイ用のファージコートタンパク質ｐＩＸ。ｐＩＩＩと同様に、ｐＩＸは、少ない複製数でファージ上に存在しており、ディスプレイされたペプチド又はタンパク質のアフィニティ選択の影響を受け易い。しかし、ｐＩＩＩタンパク質は、感染過程に非常に関与しており、このタンパク質上にディスプレイされるタンパク質が、感染効率を妨害する可能性がある。それに加えて、重鎖Ｆｄ又は軽鎖セグメントのどちらかが、ディスプレイ用のｐＩＸと融合する可能性がある。ｐＩＸタンパク質上にディスプレイされる本発明のライブラリは、効率良く複製され、選択及び／又はスクリーニングのために提示されると予想される。
【００４４】
ペプチド又はタンパク質−ｐＩＸの発現。ファージライブラリから回収されたペプチド又はタンパク質をスクリーニングする１つの方法は、ディスプレイのためにペプチド又はタンパク質分子と連結しているファージコートタンパク質を取り除くことである。小さな寸法のｐＩＸタンパク質は、この工程を利用しないで直接ペプチド又はタンパク質をスクリーニングするという、製造に関する選択肢を与える。
【００４５】
ファージ構造。好適なＭ１３又は似た種類のファージベクターは、本発明に従って操作されたまま使用することができる。このようなベクターは、好適な調節部位、選択部位、制限部位、並びにその他の必要とされる部位及び配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、リーダー（例えばｐｅｌＢ）、リボソーム結合部位（例えば、シャイン・ダルガノ（Shine-Delgano））、タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ）、転写ターミネーター（例えばｔｒｐＡ）、選択部位（例えばＬＡＣＺ）、制限部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ）、ペプチドリンカー等）によってｐＩＸ又はｐＶＩＩ融合タンパク質をコードするものであり、既知の方法に従って変性することで、上流のシグナルペプチドをコードする配列及び誘導プロモーター（例えばＬａｃＺａ）と連結した第２のｐＩＸ及び／又はｐＶＩＩをコードする配列を更に含む。この操作は、ヘルパーファージの必要性をなくし、更には、選択及び／又は解析工程中にファージを培養又は成長させるのに要する時間及び労力をも大きく削減する。その上、成長させる（groan）のに必要なファージの数も、他のベクターを利用するよりも容易に求めることができる。
【００４６】
非限定例として、Ｍ１３ｍｐ１９の誘導体であるＭ１３ＫＥは、組換えｐＩＸ遺伝子を挿入することによって本発明の操作されたｐＩＸファージベクターを供給するために使用可能な、既知のファージベクターである。組換え領域は、ファージゲノムの遺伝子間領域では、例えばＭ１３ｍｐ１９のｌａｃＺα領域に挿入可能であるため、ｌａｃプロモーターにより、組換え遺伝子ＩＸ融合物の転写が促進される。挿入断片（図１）は、シャイン・ダルガノ配列（リボソーム−結合部位）、ペクチン酸リアーゼＢ（ｐｅｌＢ）からのシグナル配列、今後のクローン化のための二重ＢｂｓＩ制限酵素認識部位、ｐＩＸコード領域、及びｔｒｐＡ転写ターミネーターを含むことができる。ＦＬＡＧタグペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫ、及び５アミノ酸長のリンカー（Ｍ１３−９９：ＧＧＴＫＴ）又は９アミノ酸長のリンカー（Ｍ１３−９９Ｌ：ＳＧＧＳＧＧＴＫＴ）が、ｐｅｌＢと遺伝子ＩＸとの間に含まれていた。
【００４７】
様々な長さ及び電荷を有する追加のペプチド（限定されないが、例えば、表１中のもの）を、９アミノ酸長のリンカーによってｐＩＸのアミノ末端にディスプレイすることで、特定のポリペプチドを発現するためにどのリンカーが最も好適であるかを見つけ出すことも可能である。その上、１つ以上の外因性融合タンパク質がｐＩＸ又はｐＶＩＩ上にディスプレイされる。
【００４８】
最終ファージベクターは、例えばＥＬＩＳＡ実験では、ペプチドタグをディスプレイするために組換えｐＩＸ遺伝子を含有させて分析することができる。固定標的ペプチド又はタンパク質と結合したファージは、抗Ｍ１３／標的複合体を用いて又は外因性の発現ペプチドのいずれかの他の検出により、検出することもできる。
【００４９】
利点。ｐＩＸ上のペプチド及びタンパク質をディスプレイするためのファージシステムは、既に開発されたファージミドシステムに比べて、結合活性、速度、及び便宜性といった利点を提供する。結合活性効果により、ファージミド又はハイブリッドシステムのいずれと比べても、結合シグナルは有意に増大する。そのため、これは、大きな供給源から弱い結合剤を識別するのに理想的なシステムとして機能し得る。このような結合シグナルの増幅は、アフィニティ成熟がなければ本質的に弱いアフィニティを有する傾向がある、ペプチドには極めて重要であり得る。異なる長さ、電荷、線状、及び環状のペプチド並びに小型球状タンパク質のｐＩＸ上へのディスプレイが成功し、本明細書に開示される。また、ファージベクターの時間の節約も有意である。ファージは、宿主細胞に感染させて、午後に、本質的に単一工程で増幅することができる。一方、ファージミドの増幅には、ファージミドの感染と増殖、規定の培養密度でのヘルパーファージによる重複感染、及び取り出したファージの増幅が必要である。したがって、手順には、追加工程、オペレータ入力、及び（最低でも）一晩の培養が必要となる。反復選択サイクル及び一般的な選択実験に伴う多重スクリーニング期間にわたり、ファージシステムの時間節約は有意である可能性がある。更に、ファージシステムによってヘルパーファージ感染の必要性が無くなるため、ファージ粒子にパッケージ可能な一種類のファージゲノムのみが存在する。これによってファージの均質集団が生じて、融合ゲノムを含有するウィルス粒子の精密測定を可能にする。
【００５０】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００５１】
実施例１：代表的な操作されたファージベクター構造
タイプ−９ファージベクターの構成：Ｍ１３ｍｐ１９の誘導体であるＭ１３ＫＥファージゲノム内のｐＶＩＩ遺伝子とｐＩＸ遺伝子との間に挿入された、ペクチン酸リアーゼＢ（ｐｅｌＢ）からのシグナル配列、及び今後のクローン化のための二重ＢｂｓＩ制限酵素認識部位を含有する、Ｍ１３−９ベクターの試作品、ＰＨＰＥＰ２０８が構成された。未変性の（unmodified）Ｍ１３ＫＥファージゲノム内では、ｐＶＩＩ遺伝子の最後のアミノ酸コドンの末端ヌクレオチド塩基は、ｐＩＸのＡＴＧ開始コドンの最初のヌクレオチド塩基である。この、ｐＶＩＩとｐＩＸ遺伝子との間の最後及び最初のヌクレオチドの共有は、ＰＨＰＥＰ  ２０８において、ｐＶＩＩ遺伝子とｐｅｌＢシグナル配列のＡＴＧ開始コドンとの間に保存された。インフルエンザ（ＨＡ）ペプチドＹＰＹＤＶＰＤＹＡ及び９アミノ酸長のリンカーＳＧＧＳＧＧＴＫＴが、ｐｅｌＢシグナル配列と遺伝子ｐＩＸとの間に含まれていた。様々の長さ及び電荷を有する３つの他のペプチド（表１）並びに小型球状タンパク質、上皮成長因子（ＥＧＦ）（配列番号６）、がＰＨＰＥＰ２０８にサブクローン化され、９アミノ酸長のリンカーを有するｐＩＸのアミノ末端上にディスプレイされた。
【００５２】
方法。ＢｓｒＧＩ及びＢｓｐＨＩ酵素認識部位が側面に配置された、ｐＶＩＩ−ＰｅｌＢ−ＨＡ−ｐＩＸカセットをコードするＤＮＡ（図１ｄ）は、Ｎ−末端及びＣ−末端断片を得るためにＨＡカセット（ＭＯＭ  ６０）を含有するＭ１３−９９ファージゲノムから２つのシリーズのＰＣＲ増幅によって生成された。次いで、２つの断片が重複ＰＣＲ組換え反応によって結合された。ＭＯＭ  ６０は、Ｍ１３ｍｐ１９の誘導体であるファージゲノムＭ１３ＫＥに挿入された組換えｐＩＸ遺伝子を含有する（図２）。組換え領域は、ファージゲノムの遺伝子間領域内にある、Ｍ１３ｍｐ１９のｌａｃＺα領域に挿入されたため、ｌａｃプロモーターが組換え遺伝子ＩＸ融合の転写を促進する。
【００５３】
挿入断片には、シャイン・ダルガノ配列（リボソーム−結合部位）、ペクチン酸リアーゼＢ（ｐｅｌＢ）からのシグナル配列、今後のクローン化のための二重ＢｂｓＩ制限酵素認識部位、ｐＩＸコード領域、及びｔｒｐＡ転写ターミネーターが含まれていた。ＨＡペプチドＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２）及び９アミノ酸長のリンカーＳＧＧＳＧＧＴＫＴ（配列番号７）が、ｐｅｌＢと遺伝子ＩＸとの間に含まれていた。Ｎ−末端断片を生成するために、ＢｓｒＧＩ部位及びｐＶＩＩ遺伝子を含む一続きのＤＮＡがＭＯＭ６０ゲノムからＰＣＲ増幅された（図１ａ）。次いで、ｐｅｌＢシグナル配列の一部がそのＣ−末端終端にＰＣＲ増幅によって追加され、それによって１８−ｂｐ相補的塩基対合部位がその後のＣ−末端断片との組換え反応のために提供された（図１ｂ）。Ｃ−末端断片は、ｐｅｌＢシグナル配列、ＨＡエピトープ、及びＭＯＭ６０ファージゲノムのＨＡカセットからのｐＩＸ遺伝子の組換えコピーを含有する一続きのＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成された（図１ｃ）。逆オリゴヌクレオチドプライマーはＢｓｐＨＩ制限部位を含有していた。
【００５４】
Ｎ及びＣ−末端ＰＣＲ断片は相補的領域で共にアニールされ、ＰＣＲによって増幅された（図１ｄ）。カセットはＢｓｒＧＩ及びＢｓｐＨＩ酵素によって制限消化され、ＢｓｒＧＩ及びＢｓｐＨＩで消化されたＭ１３ＫＥ  ＲＦ  ＤＮＡに結合された。最終ファージベクターであるＭ１３−９（配列番号１）を図３に示す。その他のペプチドでは、優遇（complimentary）オリゴを一緒にアニールして、適切なＤＮＡ配列を生成した。アニールしたオリゴは、ペプチドタグＤＮＡ及びベクターの結合を可能にする、ＢｂｓＩ消化したＭ１３−９ベクターに相当する適合性オーバーハングを含有していた。ＰＨＰＥＰ  １９０は、可溶性ＥＧＦＲ受容体に対してアフィニティを有するペプチドである。８つのアミノ酸残基がジスルフィド結合に抑制されたループ内にある。ＥＧＦは、ＰＣＲ法で増幅し、ＢｂｓＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＢｂｓＩ消化したＭ１３−９に結合された。組換えファージは、ＸＬ−１ブルー（XL-1 Blue）大腸菌宿主細胞（ストラタジーン（Stratagene））の菌叢にプレーティングしてシングルプラークを単離した。ファージプラークを培地に再懸濁し、ファージを寒天から拡散させた。ファージをＸＬ−１ブルーに感染させ、３７℃で４．５時間培養した。ファージを成長させて誘発させた後、細菌を遠心分離によって除去し、培養上清から４％のＰＥＧ−８０００と０．５ＭのＮａＣｌとを用いてファージを沈殿させ、４℃で一晩インキュベートした。ファージ粒子を遠心分離によって回収し、ファージペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。
【００５５】
ディスプレイされたペプチドの解析。ペプチド又はタンパク質を含有したファージを、ディスプレイに関してＥＬＩＳＡ実験で試験した。固定モノクローナル抗体又は可溶性ＥＧＦＲ−ミメティボディに結合したファージが、抗Ｍ１３／ＨＲＰ複合体で検出された。ＨＡ挿入断片を有するＭ１３−９は、抗ｆｌａｇ抗体よりも抗ＨＡ抗体に特異的に結合することが確認されたことから、組換えｐＩＸ（図４ａ）上でのＨＡタグのディスプレイに成功したことが示された。他のペプチド及びＥＧＦのＥＬＩＳＡデータが、図４ｂ、４ｃ、４ｄ、及び４ｅに示される。抗ｈｉｓ及び抗ｆｌａｇ抗体は適切なファージの標的として機能した。可溶性ＥＧＦＲ−ミメティボディがＰＨＰＥＰ  １９０ペプチド及びＥＧＦタンパク質のディスプレイを試験するために使用された。ヒトＩｇＧ１  ＦｃスカフォールドがＰＨＰＥＰ  １９０及びＥＧＦファージＥＬＩＳＡの陰性対照として使用された。これらの結果は、これらのペプチド及びＥＧＦタンパク質も組換えｐＩＸ上へのディスプレイに成功したことを示す。
【００５６】
方法。マキシソープ（Maxisorp）ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ製）のウェルに５００ｎｇのモノクローナル抗体又は可溶性ＥＧＦＲ−ミメティボディをＰＢＳ中５μｇ／ｍＬで、４℃において一晩コーティングした。ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で２回すすぎ、スターティングブロック（Starting Block）（ピアース（Pierce）製）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ウェルを再度すすいだ。スターティングブロック（Starting Block）に希釈したＰＥＧ沈殿ファージ（１０8〜１０10ｐｆｕ）をウェルに加え、振盪させながら室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ−Ｔで３回すすぎ、そのウェルにスターティングブロック（Starting Block）で１：５０００に希釈した抗Ｍ１３／西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）製）を加えて、振盪させながら室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回すすぎ、ＰＯＤ化学発光基板（ロシェ（Roche）製）を追加して、テカン（Tecan）プレートリーダーで検出した。
【００５７】
【表１】
2011507521.tif 000002
【００５８】
参考文献
１．Ｋｅｈｏｅ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ．２００５．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １０５：４０５６．
２．Ｉａｎｎｏｌｏ，Ｇ．，Ｏ．Ｍｉｎｅｎｋｏｖａ，Ｒ．Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ，ａｎｄ  Ｇ．Ｃｅｓａｒｅｎｉ．１９９５．Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｃａｐｓｉｄ：ｌｉｍｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：８３５．
３．Ｇａｏ，Ｃ．，Ｓ．Ｍａｏ，Ｃ．Ｈ．Ｌｏ，Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ，ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ．１９９９．Ｍａｋｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｆｏｒｍａｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ａｒｒａｙｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６：６０２５．
４．Ｇａｏ，Ｃ．，Ｓ．Ｍａｏ，Ｇ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ，ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ．２００２．Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐＩＸ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：１２６１２．
５．Ｇａｏ，Ｃ．，Ｓ．Ｍａｏ，Ｈ．Ｊ．Ｄｉｔｚｅｌ，Ｌ．Ｆａｒｎａｅｓ，Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ，ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ．２００２．Ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐＶＩＩ−ｐＩＸ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １０：４０５７．
６．Ｅｎｄｅｍａｎｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｍｏｄｅｌ．１９９５．Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｍｉｎｏｒ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５０：４９６．
７．Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｇ．Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ．１９８２．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｆ１  ＤＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：３２．
【図１Ａ】
2011507521.tif 000003
【図１Ｂ】
2011507521.tif 000004
【図１Ｃ】
2011507521.tif 000005
【図１Ｄ（ａ）】
2011507521.tif 000006
【図１Ｄ（ｂ）】
2011507521.tif 000007
【図２】
2011507521.tif 000008
【図３】
2011507521.tif 000009
【図４Ａ】
2011507521.tif 000010
【図４Ｂ】
2011507521.tif 000011
【図４Ｃ】
2011507521.tif 000012
【図４Ｄ】
2011507521.tif 000013
【図４Ｅ】
2011507521.tif 000014
【配列表】
2011507521000001.app
【国際調査報告】
2011507521.tif 000015
2011507521.tif 000016
2011507521.tif 000017