(57)【要約】開示される主題は、態様の１つにおいて、化合物及び組成物（たとえば、多糖及び多糖複合体）、及びそのような化合物及び組成物を提供し、使用する方法に関する。開示されるのは、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体を含む組成物であり、該多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。また開示されるのは、多糖又は多糖複合体を提供する方法であって、該方法は、クロレラ抽出物を提供する工程と、該抽出物を溶媒に接触させて沈殿物を提供する工程と、該沈殿物を追加の物質（たとえば、界面活性剤）と接触させる工程と、不溶分画を単離する工程と、不溶分画をサイズ分画する工程を含み、それによって多糖又は多糖複合体を提供する。また開示されるのは、開示された多糖及び多糖組成物を使用する方法である。【選択図】図１
2011522911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラから得られる多糖又は多糖複合体であって、
ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含み、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する多糖又は多糖複合体。
【請求項２】
多糖又は多糖複合体が、実質的に硫酸化を含まない請求項１に記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項３】
多糖又は多糖複合体が、実質的にウロン酸残基を含まない請求項１又は２に記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項４】
多糖又は多糖複合体が、Ｏ−３で結合するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル残基の反復単位を含む請求項１〜３のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項５】
多糖又は多糖複合体が、６−リン酸化β−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を含む請求項１〜４のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項６】
多糖又は多糖複合体が、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→を含む請求項１〜５のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項７】
図２６に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項８】
図２７に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項９】
図２８に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１０】
図２９に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１１】
図３０に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１２】
図３１に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１３】
図３２に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１４】
図３３に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１５】
図３４に係る多糖を含む請求項１〜６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１６】
クロレラにおける多糖又は多糖複合体に会合する１以上のタンパク質又は核酸をさらに含む請求項１〜１５のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１７】
多糖又は多糖複合体が、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃ．ｍａｒｉｎａ、Ｃ．ｓａｌｉｎａ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ａｎｉｔｒａｔａ、Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃ．ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃ．ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ又はこれらの混合物から得られる請求項１〜１６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１８】
多糖又は多糖複合体が、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから得られる請求項１〜１６のいずれかに記載の多糖又は多糖複合体。
【請求項１９】
組成物であって、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の添加剤成分を含み、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する組成物。
【請求項２０】
医薬組成物であって、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の薬学上許容可能な成分を含み、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する医薬組成物。
【請求項２１】
補完的栄養組成物であって、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の食べられる又は栄養のある成分を含み、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する補完的栄養組成物。
【請求項２２】
多糖又は多糖複合体が、硫酸化を実質的に含まない請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
多糖又は多糖複合体が、実質的にウロン酸残基を含まない請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
多糖又は多糖複合体が、Ｏ−３で結合するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル残基の反復単位を含む請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
多糖又は多糖複合体が、６−リン酸化β−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を含む請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
多糖又は多糖複合体が、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→を含む請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
図２６に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
図２７に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
図２８に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
図２９に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
図３０に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
図３１に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
図３２に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
図３３に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
図３４に係る多糖を含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
クロレラにおける多糖又は多糖複合体に会合する１以上のタンパク質又は核酸をさらに含む請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
多糖又は多糖複合体が、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃ．ｍａｒｉｎａ、Ｃ．ｓａｌｉｎａ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ａｎｉｔｒａｔａ、Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃ．ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃ．ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ又はこれらの混合物から得られる請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
多糖又は多糖複合体が、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから得られる請求項１９〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
炭水化物、脂肪、又は窒素の１以上の供給源をさらに含む請求項２１に記載の組成物。
【請求項４０】
ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ及び葉酸から選択される１以上の補完物をさらに含む請求項２１に記載の組成物。
【請求項４１】
魚油、藻類油、真菌油、魚類油、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、及びＥｃｈｉｎａｃｅａから選択される１以上の油をさらに含む請求項２１に記載の組成物。
【請求項４２】
多糖又は多糖複合体を調製する方法であって、
ａ）クロレラ抽出物を９５％のエタノールと接触させて沈殿物を形成することと；
ｂ）沈殿物を界面活性剤の水溶液と接触させて不溶分画を形成し、不溶分画を単離することと；
ｃ）約１×１０３〜約１×１０５Ｄａの分子量分画範囲を用いて不溶分画をサイズ分画することと；
ｄ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体を単離することを含み、
単離された多糖又は多糖複合体が約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する方法。
【請求項４３】
工程（ｂ）の後、沈殿物が脱色される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
脱色することが、沈殿物をクロロホルム／メタノールの混合物に接触させることから成る請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
界面活性剤が、四級アンモニウム化合物である請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
サイズ分画する工程が、クロマトグラフィ又は限外濾過を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
イオン交換クロマトグラフィによって多糖又は多糖複合体を分離することをさらに含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４２の方法によってクロレラから得られる多糖又は多糖複合体を含む組成物。
【請求項４９】
対象において免疫応答を調節する方法であって、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の有効量を対象に投与することを含み、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する方法。
【請求項５０】
対象における細菌感染又は真菌感染を治療する方法であって、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の有効量を対象に投与することを含み、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する方法。
【請求項５１】
対象にワクチン接種する方法であって、
ワクチンと、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の有効量とを対象に投与することを含み、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する方法。
【請求項５２】
クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の使用であって、
対象において免疫応答を調節するために薬物を作製するための、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む多糖又は多糖複合体の使用であり、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する使用。
【請求項５３】
クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の使用であって、
対象において細菌感染又は真菌感染を治療するための薬物を作製するための、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む多糖又は多糖複合体の使用であり、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する使用。
【請求項５４】
クロレラから得られる多糖又は多糖複合体の使用であって、
対象にワクチン接種するために薬物を作製するための、
（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む多糖又は多糖複合体の使用であり、
多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で開示されるのは、緑藻類クロレラから得られる多糖抽出物である。開示されるクロレラ多糖抽出物を含む医薬組成物及び栄養組成物も開示される。さらに、開示されるクロレラ多糖抽出物を抽出し、精製する方法が開示される。その上さらに哺乳類において免疫応答を調節する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、免疫応答を調節するように設計された投薬計画の使用を介してヒトの疾患や症状を治療するためのますます重要なアプローチになってきている。免疫療法は、免疫系が危うくなっている（たとえば、癌の間に）病態で特に重要であり得る。疾患モデル及び臨床試験で実施された検討は、対象の防御機構を増強することが、微生物感染、免疫不全、癌及び自己免疫疾患に対する治療及び予防に有用であり得ることを明らかにしている（Ｈａｄｄｅｎ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９３，  １４，  ２７５−２８０）。
【０００３】
免疫療法はまた、創傷治癒を促進するための有用性を有し得る。創傷治癒の間、免疫療法マクロファージは、細胞増殖と、新しい組織の形成と、組織の再生を調節することによって主要な役割を担うことができる。マクロファージはまた、創傷修復の血管新生の段階に影響を及ぼす貪食細胞、創面切除剤及び成長因子刺激剤としても機能する（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｋ．  Ｎｕｒｓ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  １９９７，  ２，  ２９１−２９６）。
【０００４】
細菌産物（溶解物及び粗分画）が最初に開発された免疫賦活剤だった。これらの産物には、ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、及びリポ多糖のような作用因子が含まれた（Ｈａｄｄｅｎ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９３，  １４，  ２７５−２８０，  Ｍａｓｉｈｉ，  Ｋ．  Ｎ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ２０００，  １４，  １８１−１９１）。毒性と副作用のためにこれらの作用因子は限定された成功しか収めなかったが、多くは、獣医学分野での免疫調節について米国農務省（ＵＳＤＡ）によって認可されている（Ｖａｎ  Ｋａｍｐｅｎ，  Ｋ．  Ｒ．  Ｓｅｍｉｎ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ｓｕｒｇ．  （Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍ．）  １９９７，  １２，  １８６−１９２）。
【０００５】
天然起源、化学合成、及び組換え技術によってそのほかの免疫療法剤が開発されている。天然起源の多数の免疫賦活剤は、高分子量の多糖類、糖タンパク質又は複合体ペプチドである（Ｈａｄｄｅｎ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９３，  １４，  ２７５−２８０  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （２００６），  ６，  ３１７−３３３）。たとえば、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  （シゾフィラン）、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ  （レンチナン）及びＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（クレスチン）に由来する３つの真菌多糖類は現在、生物反応修飾物質として日本で臨床使用されている（Ｆｒａｎｚ，  Ｇ．  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．  １９８９，  ５５，  ４９３−４９７）。別の多糖である、アセマンナン（アロエベラから単離された）は、イヌ及びネコの線維肉腫の治療のためにＵＳＤＡによって認可されている（Ｋｉｎｇ，  Ｇ．  Ｋ．；  Ｙａｔｅｓ，  Ｋ．  Ｍ．；  Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，  Ｐ．  Ｇ．；  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｋ．  Ｒ．；  Ｆｏｒｄ，  Ｃ．  Ｒ．；  ＭｃＡｎａｌｌｅｙ，  Ｂ．  Ｈ．；  Ｔｉｚａｒｄ，  Ｉ．  Ｒ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｓｐ．  Ａｓｓｏｃ．  １９９５，  ３１：４３９−４７）。グリコスフィンゴ脂質ＫＲＮ−７０００のような天然産物に由来する低分子量の免疫賦活剤が２、３ある。固形腫瘍の治療のための免疫賦活剤としてのＫＲＮ−７０００を用いた臨床試験が現在進行中である（Ｎａｔｏｒｉ，  Ｔ．；  Ｍｏｔｏｋｉ，  Ｋ．；  Ｈｉｇａ，  Ｔ．；  Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ．，  Ｉｎ  ”Ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｅａ；”  Ｆｕｓｅｔａｎｉ，  Ｎ．，  Ｅｄ．；  Ｋａｒｇｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０００；  ｐｐ  ８６−  ９７）。イソプリノシンやムラミルペプチドのような化合物を含む合成起源の免疫賦活剤も幾つか開発されている（Ｍａｓｉｈｉ，  Ｋ．  Ｎ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ２０００，  １４，  １８１−１９１）。最近、内因性起源の多数のそのほかの免疫調節剤が組換え技術を用いて開発され、これらの多くはＦＤＡの認可を得ている。これらの作用因子には、コロニー刺激因子、インターフェロン及び組換えタンパク質が挙げられる（Ｆｒａｎｋ，  Ｍ．  Ｏ．；  Ｍａｎｄｅｌｌ，  Ｇ．  Ｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｃｈ．  ３３，  ４ｔｈ  ｅｄ．；  Ｍａｎｄｅｌｌ，  Ｇ．  Ｌ．，  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｄｏｌｉｎ，  Ｒ．，  Ｅｄｓ．；  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５；  ｐｐ  ４５０−４５８）。しかしながら、これらの化合物は短い半減期を有することが多く、最適な投与量及び適当な併用を決定するのが困難であり得る。
【０００６】
最近、微小藻類に由来する免疫療法剤がますます関心を集めている。微小藻類は古代より栄養の濃い食物源として使用されており、歴史の記録は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのような微小藻類がアフリカのチャド湖周辺の部族及びメキシコのテスココ湖の近くに住むアステカ族によって消費されていたことを示している。ヒトの消費について及び家畜の飼料として食物等級の微小藻類の市販製品にますます関心が高まっている。商業的潜在力について探索された種々の微小藻類の中で、スピルリナ種、クロレラ種及びアファニゾメノン・フロス・アクア（ＡＦＡ）が上手く生産されている３つの主な種類である。
【０００７】
クロレラは、食用で、多数の望ましい免疫療法特性を有すると考えられる単細胞の緑色微小藻類であり、太陽が動力源の超栄養物と呼ばれている。クロレラは、創傷治癒、解毒、便秘解消及び成長刺激に有用であり得ることが知られている。多数の研究は、クロレラが試験管内及び生体内の双方で望ましい免疫賦活特性を有し得ることも示している。
【０００８】
クロレラは淡水及び海水の双方で見つけることができる。クロレラ属の種は生理学的特性及び生化学的特性の顕著な多様性を示す（Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｅ．  ”Ｐｈｙｃｏｔａｌｋ”  １９８９，  １  ：  １４１  −  １５３  ；  Ｖ．  Ｒａｓｔｏｇｉ  Ｐｕｂｌ．，  Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，  Ｉｎｄｉａ）。クロレラは、セルロースやそのほかの消化できない細胞壁物質をほとんど産生しないので、食物の新しい供給源の可能性として、特に供給原料として広範に検討されている（Ｌｅｅ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．  ”Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ”  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；  １９８９，  ｐａｇｅ  ２８１；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０００９】
クロレラは既知の植物のクロロフィルの最高含量を有すると考えられる。クロレラはまた、ビタミン、ミネラル、食物繊維、核酸、アミノ酸、酵素及びそのほかの生物学的物質も含有する。約９％を超える脂肪を含有し、この９％のうち、不飽和ポリ脂肪酸が約８２％を占める。ビタミン内容物は、プロビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、ナイアシン、Ｂ１２、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＫ、パントテン酸、葉酸、コリン、リポ酸、イノシトール及びＰＡＢＡを含む。クロレラに存在するミネラルには、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｚｎ及びＣｏが挙げられる。
【００１０】
クロレラの水性抽出物が、栄養的利益及びそのほかの健康上の利益のために使用されてきた。クロレラをさらに容易に消化可能にする方法が開発された１９７７年にそのような抽出物は健康食品として導入された。台湾クロレラ社は、世界最大のクロレラ供給者であり、以下の商品名、ＡＬＧＥＡ（商標）、ＢＩＯ−ＲＥＵＲＥＬＬＡ（商標）、ＧＲＥＥＮ  ＧＥＭ（商標）、ＧＲＥＥＮ  ＢＯＯＳＴ（商標）、ＧＲＥＥＮ  ＮＡＴＵＲＥ（商標）、ＧＲＥＥＮ  ＰＯＷＥＲ（商標）、ＪＯＹＡＵ  ＶＥＲＴ（商標）、及びＮＡＴＵＲＡＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）のもとで製品をアジア、ヨーロッパ及び北アメリカに販売している。
【００１１】
スイスハーバル（商標）及びネイチャーズウェイ（商標）による製品を含む多数のクロレラ抽出物も市販されている。タンパク質６１％、炭水化物２１．１％、脂肪１１．０％、クロロフィル２．８７％、ＲＮＡ２．９４％及びＤＮＡ０．２８％を含有する純粋なクロレラ破砕細胞としてスイスハーバル製品を特定する。
【００１２】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの経口投与は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを感染させたマウスにおいて、高いナチュラルキラー細胞活性及び顆粒球／マクロファージ前駆細胞の増加と相関している。しかしながら、これらの効果すべてについて、有効成分は結論的には立証されていない。生物活性を持つ多数の多糖類がクロレラの種から特定されている。特許文献１では、抗腫瘍と抗ウイルスの活性を示す酸性の多糖がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから単離された。この多糖についてのグリコシル組成は、少量のガラクトース、アラビノース、グルコース及びグルクロン酸を伴った大部分ラムノースであった。米国特許第４，８３１，０２０号に報告され、海洋性のＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａから単離された別の多糖は、腫瘍増殖阻害効果を有すると思われる。
【００１３】
特許文献２では、海洋性クロレラ種の脂質分画（糖脂質部分）が抗腫瘍特性を示した。幾つかの糖タンパク質もクロレラの種から単離されている。たとえば、特許文献３は、抗癌効果を有する４５，０００ダルトンの糖タンパク質を報告した。免疫増強特性及び抗腫瘍特性を有し得るそのほかの種々の糖タンパク質及びグリセロ糖脂質も科学文献で報告されている。
【００１４】
特許文献４は、熱湯抽出を用いてスピルリナ種から２５０，０００〜３００，０００ダルトンの間の分子量を持つ抗ウイルス性の多糖が単離されたことを開示している。この多糖は、ラムノース、グルコース、フルクトース、リボース、ガラクトース、キシロース、マンノース、グルクロン酸及びガラクツロン酸から構成される。１２，６００〜６０，０００ダルトンの間の範囲にある多数のそのほかの低分子量の多糖が最近、スピルリナ種から単離されている。
【００１５】
現在のクロレラに基づいた免疫賦活剤は期待を示すが、強力な作用因子を特定し、開発し、免疫療法に利用できる薬剤の備蓄を増やすニーズが依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４，５３３，５４８号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７８６，４９６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８２２，６１２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５８５，３６５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本明細書で具現化され、大まかに記載されるような、開示される物質、組成物、物品、装置及び方法の目的によれば、開示される主題は、態様の１つでは、化合物及び組成物（たとえば、多糖及び多糖複合体）並びにそのような化合物及び組成物を提供し、使用する方法に関する。本明細書で開示されるのは、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体を含む組成物であり、その際、該多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【００１８】
また本明細書で開示されるのは、多糖又は多糖複合体を提供する方法であって、クロレラ抽出物を提供することと、抽出物を溶媒と接触させて沈殿物を提供することと、沈殿物を追加の物質（たとえば、界面活性剤）と接触させることと、不溶性分画を単離することと、不溶性分画のサイズ分画を行うこととを含み、それによって多糖又は多糖複合体を提供する方法である。開示される多糖及び多糖組成物を使用する方法も開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ここで、微小藻類から得られた多糖は、細菌、酵母及び植物から得られたものとして詳細に特定されていないことが見い出された。本明細書で開示されるのは、グリコシルリン酸構造を含有する微小藻類起源から得られたホスホグリカン類である。α−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→単位の側鎖は、一部の酵母のホスホグリカン構造に類似する構造的特徴である。さらに開示されるのは、メチル化リン糖単位、３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→単位である。
【００２０】
追加の利点は、次に続く記載において部分的に示され、記載から部分的に明らかになり、又は以下に記載される態様の実践によって教示され得る。以下に記載される利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって実現され、達成されるであろう。前述の一般的記載及び以下の詳細な記載の双方は例及び説明となるのみであって、限定ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は以下に記載される幾つかの態様を説明する。
【図１】分画Ａ−Ｐ−８を得るのに使用することができる手順の例を提供するフローチャートの例を示す図である。
【図２】セファデックスＧ−１００における分画Ａ−Ｐの分画のサイズ排除クロマトグラフィのグラフを示す図である。
【図３】Ｑセファロースファストフローにおける分画Ａ−Ｐ−１の分画のアニオン交換クロマトグラフィのグラフを示す図である。
【図４】２７℃にてＤ２Ｏおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの２０２．５ＭＨｚの３１Ｐ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図５】２７℃にてＤ２Ｏおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図６】ＢｉｏＧｅｌＰ−２における分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰの分画のサイズ排除クロマトグラフィのグラフを示す図であり、見い出された分画は、Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１、Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−２及びＡ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−３である。
【図７】２７℃にてＤ２Ｏおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−３の１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図８】２７℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−２の１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図９】２７℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１０】５０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の５００．１ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１１】６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の８００ＭＨｚのＴＯＣＳＹのスペクトルを示す図である。
【図１２】６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の８００ＭＨｚのＯＣＳＹのスペクトルを示す図である。
【図１３】６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の８００ＭＨｚでの１Ｈ１３Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトルを示す図である。
【図１４】６０ミリ秒の混合時間を用いた２７℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の５００ＭＨｚでの１Ｈ１３Ｃ−ＨＭＢＣのスペクトルを示す図である。
【図１５】２００ミリ秒の混合時間を用いた６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の８００ＭＨｚのＮＯＥＳＹのスペクトルを示す図である。
【図１６】４．２３／４．７３ｐｐｍと４．２６／４．７３ｐｐｍでのＨ−４ｓ／Ｈ−１ｓＮＯＥの相関に一致するガラクトース上のグルコースの規則的な置換パターンの２つの配列を示す図であり、（ａ）規則的な変化；（ｂ）２つの隣接したガラクトースの遮断である。
【図１７】２７℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの５００．１ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１８】６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの８００ＭＨｚの１Ｈ１３Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトルを示す図である。
【図１９】６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの８００ＭＨｚでのＣＯＳＹのスペクトルを示す図である。
【図２０】６０ミリ秒の混合時間を用いた５０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの８００ＭＨｚでの１Ｈ１３Ｃ−ＨＭＢＣのスペクトルを示す図である。
【図２１】１５０ミリ秒の混合時間を用いた６０℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの８００ＭＨｚのＮＯＥＳＹのスペクトルを示す図である。
【図２２】８Ｈｚに調整した展開遅延を伴う２７℃にてＤ２Ｏにおける分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの１Ｈ３１Ｐ−ＨＳＱＣのスペクトルを示す図である。
【図２３】脱Ｏ−アセチル化分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ（上）及び脱Ｏ−アセチル化の効果を示す未処理の分画Ａ−Ｐ−８（下）の１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルの一部を示す図であり、強調したシグナルの形状と強度にさらに顕著な変化がある。
【図２４】ガラクトースのＣ−１とＣ−３のピーク形状と強度に関してＯ−２における脱Ｏ−アセチル化分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ（上）及び脱Ｏ−アセチル化の効果を示す未処理の分画Ａ−Ｐ−８（下）の１２５ＭＨｚの１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルの一部を示す図である。
【図２５】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの分画に由来する分画によるマウス起源の腹腔マクロファージの刺激を示す棒グラフである。
【図２６】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図２７】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図２８】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図２９】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図３０】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図３１】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図３２】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図３３】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【図３４】本開示に係るクロレラから得られた多糖又は多糖複合体の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
開示される主題の具体的な態様の以下の詳細な説明、及び本明細書に含まれる実施例及び図面を参照して本明細書に記載される物質、化合物、組成物、物品及び方法をさらに容易に理解することができる。
【００２３】
本物質、化合物、組成物、物品及び方法が開示され、記載される前に、以下で記載される態様は特定の合成方法又は特定の試薬に限定されることはなく、当然異なることができることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は特定の態様を記載するのみの目的であって、限定することは意図されないことも理解されるべきである。
【００２４】
また、この明細書の全体を通して種々の出版物が参照される。開示されることが関係する当該技術の状態をさらに完全に記載するために、これら出版物の開示は、その全体が参照によって本出願に組み入れられる。開示された参考文献も、参考文献が基にする文章で議論されるものに含有される物質について参照によって個々に及び具体的に本明細書に組み入れられる。
【００２５】
定義
本明細書及び後に続く特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるべきである多数の用語について参照が行われる。
【００２６】
本明細書の説明及び特許請求の範囲の全体を通して、語「含む」、その語のほかの形態、たとえば、「含むこと」及び「含む」は、含むがそれに限定されないことを意味し、たとえば、そのほかの添加物、成分、整数又は工程を排除することは意図されない。
【００２７】
説明及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、背景が明瞭に指示しない限り複数対象を含む。従って、たとえば、「化合物」への言及は、２以上のそのような化合物の混合物を含み、「作用因子」への言及は、２以上のそのような作用因子の混合物を含み、「部分」への言及は、２以上のそのような部分の混合物を含む、などである。
【００２８】
「任意の」又は「任意に」は、次に記載される事象又は状況が発生し得る又はし得ないこと、及び説明が、事象又は状況が発生する例及び発生しない例を含むことを意味する。
【００２９】
範囲は本明細書では、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、該１つの特定の値から及び／又はほかの特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行の「約」の使用によって特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの端点は、ほかの端点との関連で及びほかの端点とは無関係での双方で有意であることがさらに理解されるであろう。本明細書で開示される多数の値があり、各値は、値自体に特定の値を加える「約」として本明細書では開示されることも理解される。たとえば、値「１０」が開示されるのであれば、そのとき、「約１０」も開示される。値が開示される場合、「値以下」「値以上」及び値の間の可能な範囲も、熟練者に適宜理解されるように開示されることも理解される。たとえば、値「１０」が開示されるのであれば、そのとき、「１０以上」と同様に「１０以下」も開示される。本出願全体を通して、データは多数の様々な形式で提供され、このデータは終点及び出発点及びデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。たとえば、特定のデータ点「１０」と特定のデータ点「１５」が開示されれば、１０と１５より大きい、１０と１５以上、１０と１５より小さい、１０と１５以下、１０と１５に等しいは、１０と１５の間と同様に開示されたとみなされることが理解される。特定の２つの単位の間の各単位が開示されることも理解される。たとえば、１０と１５が開示されれば、そのとき１１、１２、１３及び１４も開示される。
【００３０】
本明細書及び結びの特許請求の範囲では、組成物における特定の要素又は成分の重量部に対する言及は、重量部が表現される組成物又は物品における該要素又は成分とほかの要素又は成分の間の重量関係を示す。従って、２重量部の成分Ｘと５重量部の成分Ｙを含有する化合物では、Ｘ及びＹは、２：５の重量比で存在し、追加の成分が化合物に含有されるか、されないかにかかわらず、そのような比率で存在する。
【００３１】
成分の重量％は、それとは反対に具体的に述べられなければ、成分が含まれる製剤又は組成物の総重量に基づく。
「四級アンモニウム界面活性剤」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも窒素原子１つが４つの原子に結合し（たとえば、カチオン性窒素）、以下の一般構造、
【００３２】
【化１】
2011522911.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは、１〜２６の炭素原子を含む置換基であり、Ｘ−は好適なアニオン（Ｂｒ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、ＣＯ３２−、ＨＣＯ３−、ＯＨ−、ＣｌＯ３−、ＣｌＯ４−、ＣｌＯ２−、ＣｌＯ−、ＣｒＯ４２−、Ｃｒ２Ｏ７２−、ＩＯ３−、ＮＯ３−、ＮＯ２−、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＭｎＯ４−、ＰＯ３３−、ＳＯ４２−、Ｓ２Ｏ３２−、ＨＳＯ４−、ＳＯ３２−、ＨＳＯ３−、ほかの無機アニオン、ほかの有機アニオンなど）であることができる）に相当する窒素化合物を意味する。
【００３３】
好適な四級アンモニウム化合物には、（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）（Ｃ１〜Ｃ２ジアルキル）ベンジルアンモニウム塩、Ｎ−（Ｃ１２〜Ｃ１８アルキル）へテロアリールアンモニウム塩、及びＮ−（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）（Ｃ１〜Ｃ２ジアルキル）へテロアリールアルキレンアンモニウム塩が挙げられる。（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）（Ｃ１〜Ｃ２ジアルキル）ベンジルアンモニウム塩の非限定例には、（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）ジメチルベンジル塩化アンモニウム、（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）ジメチルベンジル臭化アンモニウム及び（Ｃ１２〜Ｃ１４アルキル）ジメチルベンジル硫酸水素アンモニウムが挙げられる。Ｎ−（Ｃ１２〜Ｃ１８アルキル）へテロアリールアンモニウム塩の非限定例には、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルピリジニウム及び硫化水素セチルピリジニウムが挙げられる。Ｎ−（Ｃ１２〜Ｃ１８アルキル）へテロアリールアンモニウム塩については、そのほかのアニオンを使用することができる。
【００３４】
使用に好適な四級アンモニウム化合物のさらなる例には、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化イソステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ココイルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化イソステアリルラウリルジメチルアンモニウム、塩化ジセチルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジココイルジメチルアンモニウム、塩化γ−グルコンアミドプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム、塩化ジ［ポリオキシエチレン（２）］オレイルメチルアンモニウム、塩化ドデシルジメチルエチルアンモニウム、塩化オクチルジヒドロキシエチルメチルアンモニウム、塩化トリ［ポリオキシエチレン（５）］−ステアリルアンモニウム、塩化ポリオキシプロピレンメチルジエチルアンモニウム、塩化ラウリルジメチル（エチルベンジル）アンモニウム、塩化ベヘンアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２、３−ジヒドロキシプロピル）アンモニウム、二塩化タロウジメチルアンモニオプロピルトリメチルアンモニウム、及び塩化ベンザルコニウムが挙げられる。
【００３５】
「対象」は、本明細書で使用されるとき、個体を意味する。態様の１つでは、対象は霊長類のような哺乳類であり、別の態様では、対象はヒトである。用語「対象」はまた、愛玩動物（たとえば、ネコ、イヌなど）、家畜（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も包含する。
【００３６】
本明細書で提供されるとき、化合物又は組成物の、用語「有用量」は、非毒性で、しかし、所望の有用性を提供する、たとえば、免疫応答を軽減する、阻害する、防ぐ、又はさもなければ調節するのに十分な化合物の量を意味する。以下で指摘されるように、必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、及び一般症状、治療される症状又は疾患の重症度、使用される特定の化合物、その投与の方式、治療の持続時間、採用される特定の組成物との併用で又は同時に使用される薬剤、及び医療技術で周知の同様の因子によって対象ごとに変化する。従って、正確な「有効量」を特定するのは可能ではないが、適当な有効量は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定することができる。たとえば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものより低いレベルで組成物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やすことは十分に当該技術の技量の範囲内である。疾患の治療に注意を必要とする対象の状態を評価するのに有用であることが分かっている既往歴、兆候、症状及び目的の臨床検査の特定の態様も評価することができる。これらの兆候、症状及び目的の臨床検査は、そのような患者を治療する臨床医又はこの分野で実験を行う研究者に知られるように、治療される又は予防される特定の疾患又は症状によって変化する。たとえば、適当な対照群との比較及び／又は一般集団又は特定の個体における疾患の正常な進行の知識に基づけば、１）対象の身体的症状が改善されると示される、２）疾患又は症状の進行が安定化する、遅くなる又は反転すると示される、又は３）疾患又は症状を治療するためのほかの薬物の必要性を減らす又は未然に防ぎ、次いで特定の治療計画が有効であるとみなされる。所望であれば、有効な１日用量を投与目的で複数の用量に分割することができる。その結果、単回用量組成物はそのような量又はその約数を含有して１日の用量を構成することができる。禁忌の場合、投与量は個々の内科医又は対象によって調整することができる。投与量は異なることができ、１日に１回以上の投与で１〜数日間投与することができる。医薬製品の所与の部類についての適当な投与量に関する文献で指針を見い出すことができる。
【００３７】
免疫調節剤の用語「有効量」は、対象の防御機構を向上させるのに十分な免疫調節剤の量を指す。この量は投与の方式によってある程度変化し得る。１以上の免疫調節剤も使用することができる（たとえば、エキナセアと併用したクロレラ抽出物）。必要とされる正確な有効量は、対象の種、年齢及び一般的状態、治療される症状の重症度、投与の方式などによって対象ごとに変化し得る。適当な有効量は、日常的な実験のみ又は免疫調節剤技術の以前の知識を用いて当業者によって決定することができる。
【００３８】
用語「薬学上許容可能な」は、生物学的に又はそうでなくても望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、たとえば、望ましくない生物学的効果を引き起こさずに、又は含有される医薬組成物のほかの成分と有害な方法で相互作用することなく、精選されたクロレラの多糖と共に物質を個体に投与することができる。
【００３９】
用語「薬学上許容可能な誘導体」は、対象の免疫応答を調節する、本明細書で開示される化合物に相当するホモログ、類似体又は断片を指す。
【００４０】
本明細書にて限定せずに使用されるとき、用語「誘導体」は、本明細書で開示される化合物の構造に由来する構造を有し、その構造が本明細書で開示されるものに十分に類似し、その類似性に基づいて、請求される化合物と同一又は類似する活性及び有用性を呈することが当業者によって期待される化合物を指すのに使用される。
【００４１】
用語「アルキル」及び「脂肪族」は、本明細書で使用されるとき、１〜２４の炭素原子の分枝鎖又は非分枝鎖の飽和炭化水素基であり、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基は置換することもでき、又は非置換であることもできる。以下に記載するような、アルコール、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、ハロゲン化合物、ヒドロキサメート、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド又はチオールを含むが、これらに限定されない１以上の基によってアルキル基を置換することができる。用語「ハロゲン化アルキル」は具体的には、１以上のハロゲン化合物、たとえば、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素によって置換されるアルキル基を指す。用語「高級脂肪族」は、約６〜２４の炭素原子の脂肪族化合物を指すことができる。
【００４２】
本明細書で開示されるのは、核酸に基づく物質である。本明細書に記載される核酸の例には、ｃＤＮＡのようなＤＮＡ及びｍＲＮＡのようなＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。開示される核酸は、たとえば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体によって構成される。これらの及びほかの分子の非限定例が本明細書で議論される。たとえば、ベクターを細胞内で発現させる場合、発現されるｍＲＮＡは通常、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵで構成されることが理解される。
【００４３】
「ヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、塩基部分と、糖部分と、リン酸部分を含有する分子である。ヌクレオシド間連結を創製するそのリン酸部分と糖部分を介してヌクレオチドを連結することができる。用語「オリゴヌクレオチド」は２以上の一緒に連結されたヌクレオチドを含有する分子を指すのに使用されることがある。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）及びチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分はリボース又はデオキシリボースであり得る。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【００４４】
ヌクレオチド類似体は、塩基部分、糖部分及び／又はリン酸部分に対してある種の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当該技術で周知であり、たとえば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、及び２−アミノアデニン、並びに糖部分又はリン酸部分での修飾が挙げられる。
【００４５】
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに類似する機能的特性を有するが、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようにリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン・クリックの方法又はフーグスティーンの方法で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して連結される分子である。ヌクレオチド置換体は、適当な標的核酸と相互作用する場合、二重螺旋型の構造に適合することができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「置換された」は、有機化合物の差し支えないすべての置換基を含むことが企図される。大まかな態様では、差し支えない置換基には、有機化合物の非環式の及び環状の、分枝鎖の及び非分枝鎖の、炭素環式の及び複素環の、並びに芳香族の及び非芳香族の置換基が挙げられる。例となる置換基には、たとえば、以下に記載するものが挙げられる。差し支えない置換基は、適当な有機化合物について１以上（たとえば、「二置換された」「三置換された」などとも呼ぶ）であることができ、同一又は異なっていてもよい。本開示の目的で、たとえば、窒素及び酸素のようなヘテロ原子は、水素置換基、及び／又はヘテロ原子の価数を満たす、本明細書で開示される有機化合物の差し支えない置換基を有することができる。本開示は、有機化合物の差し支えない置換基による方法で限定されることを意図するものではない。また、用語「置換」又は「によって置換された」は、そのような置換が置換される原子及び置換基の可能な価数に従い、置換が結果的に安定な化合物を生じる、たとえば、再構成、環化、除去などによって自然に変換を受けない化合物を生じるという絶対的な条件を含む。また、本明細書で使用されるとき、「置換」又は「によって置換された」は、１つの置換基が別の置換基に融合される構成を包含することになっている。たとえば、アリール基によって置換されるアリール基（逆も同様）は、１つのアリール基が単一のシグマ結合を介して第２のアリール基に結合することを意味することができ、また、２つのアリール基が融合する、たとえば、一方のアルキル基の２つの炭素を他方のアリール基の２つの炭素と共有することを意味することができる。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫調節剤」は免疫応答を調節することができる作用因子を指す。用語「調節する」は、免疫系を調節する作用因子（たとえば、免疫調節剤）の能力を指す。調節するは、本明細書で使用されるとき、作用因子が免疫応答を高める又は低下させる過程を指すことができる。調節するは、免疫応答を直接又は間接的に調節する（たとえば、免疫調節剤が免疫応答の間に発生するメカニズムを調節することができ、それによって全体的な免疫応答を調節する）作用因子の能力を指す。調節するは、免疫応答がさもなければ高まる場合、作用因子が実質的に、高まった免疫応答を阻害する、安定化する、又は防ぐ過程を指すことができる。調節するはまた、免疫応答がさもなければ低下する場合、作用因子が実質的に、免疫応答を安定化する、高める、又は維持する過程を指すことができる。そのような調節は、たとえば、疾患の中でも種々の自己免疫疾患の治療に有用であり得る。調節するはまた、作用因子が免疫応答を誘導する又は免疫応答を実質的に妨げる過程を指すこともできる。
【００４８】
用語「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類（たとえば、ヒト）のいかなる治療も網羅し、（ｉ）疾患の素因を持ち得るが、未だそれに罹っていると診断されていない対象で疾患が発症するのを防ぐこと；（ｉｉ）疾患を阻害すること、すなわち、発症を停止させること；又は（ｉｉｉ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を起こすことを含む。
【００４９】
反対に述べられなければ、Ｖ字や点線ではなく実線でのみ示される化学結合を持つ式は、それぞれ可能な異性体、たとえば、エナンチオマー及びジアステレオマー、及び異性体の混合物、たとえば、ラセミ混合物又はスケールミック混合物を企図する。
【００５０】
ここで、その例が添付の実施例及び図面で説明される開示される物質、化合物、組成物、物品及び方法の具体的な態様に対して言及が詳細に行われる。
【００５１】
物質及び組成物
本明細書で開示されるのは、開示される方法、装置及び組成物に使用することができる、それと併用して使用することができる、それを調製するのに使用することができる、又はその生成物である物質、化合物、組成物及び成分である。これらの及びそのほかの物質が本明細書で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各種々の個々の及び全体的な組み合わせ及び順列の具体的な言及が明白に開示されなくてもよいが、それぞれが、本明細書で具体的に企図され、記載されることが理解される。たとえば、組成物が開示され、組成物の多数の成分又は残基に対して行うことができる多数の修飾が議論されるならば、可能であるそれぞれの及びあらゆる組み合わせ及び順列が、具体的にそれと反対に示されなければ、具体的に企図される。従って、成分又は残基ＡとＢとＣの部類が、成分又は残基ＤとＥとＦの部類と同様に開示され、組み合わせ化合物Ａ〜Ｄの例が開示されるならば、そのとき、それぞれが個々に記述されなくてもそれぞれは個々に及びまとめて企図される。従って、この例では、組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆのそれぞれが具体的に企図されるが、ＡとＢとＣ；ＤとＥとＦ；及び例の組み合わせＡ−Ｄの開示から開示されたとみなされるべきである。同様に、これらのサブセット又は組み合わせも具体的に企図され、開示される。従って、たとえば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブセットが具体的に企図され、ＡとＢとＣ；ＤとＥとＦ；及び例の組み合わせＡ−Ｄの開示から開示されたとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物を作製する方法及びそれを使用する方法の工程を含むが、これらに限定されない本開示のあらゆる態様に適用される。従って、行うことができる種々の追加の工程があるとすれば、これら追加の工程のそれぞれは、開示される方法の具体的な態様又は態様の組み合わせと共に実施することができ、そのような組み合わせのそれぞれが具体的に企図されるが、開示されたとみなされるべきであることが理解される。
【００５２】
本発明で開示される特定の物質、化合物、組成物及び成分は、商業的に入手することができ、又は当業者に一般的に知られる技法を用いて容易に合成することができる。たとえば、開示される化合物及び組成物を調製するのに使用される出発物質及び試薬は、商業的供給業者、たとえば、アルドリッチケミカル社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）、アクロスオーガニクス（ニュージャージー州、モリスプレインズ）、フィッシャーサイエンティフィック（ペンシルベニア州、ピッツバーグ）、又はシグマ（ミズーリ州、セントルイス）から入手可能であり、たとえば、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；及びＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，  １９８９）のような参考文献に示された手順に従って当業者に既知の方法によって調製される。
【００５３】
国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）によって推奨される命名法を用いて、具体的にその反対に述べられなければ、本明細書で開示される種々の多糖、多糖複合体、オリゴ糖類、及び単糖類に言及する。ＩＵＰＡＣによって行われた推奨は、以下の出版物、”Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  １９８０”、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  １９８３，  ２２０，  ３３０−３３２；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９８２，  １２６，  ４３９−４４１；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８２，  ２５７，  ３３５２−３３５４；  ＰｕｒｅＡｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８２，  ５４，  １５２３−１５２６に概説されており、それらは参照によって本明細書に組み入れられる。
【００５４】
クロレラから得られる免疫調節組成物は、それぞれその全体が参照によって本開示に組み入れられる米国特許第６，５５１，５９６号、同第６，９７４，５７６号及び同第６，９７７，０７６号、並びに米国特許公開第２００７／０２６４２７１号に開示されている。現在開示される本主題は、クロレラ及びクロレラ抽出物に関連する方法及び新規の組成物に関する。本明細書で開示される組成物は、とりわけ、免疫調節剤としての使用について企図される。クロレラ抽出物を提供する工程、抽出物から沈殿物を提供する工程、不溶分画を単離するように沈殿物を物質に接触させる工程、分子量分画を用いることによって不溶分画をサイズ分画する工程を含み、それによって多糖又は多糖複合体を提供する、本明細書で開示される組成物を提供する方法を本明細書で開示する。
【００５５】
本明細書で開示される方法から得られる組成物も開示される。具体的に開示されるのは、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体を含む組成物であって、該多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜１×１０５ダルトンの分子量を有する。開示された組成物（たとえば、免疫調節剤、医薬剤、栄養補助剤など）を使用する方法も開示される。
【００５６】
本明細書で開示される組成物は、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃ．ｍａｒｉｎａ、Ｃ．ｓａｌｉｎａ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ａｎｉｔｒａｔａ、Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃ．ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃ．ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、又はこれらの混合物からも得ることができる。
【００５７】
クロレラ
本明細書で開示されるのはクロレラ由来の抽出物である。それから抽出物を得ることができるクロレラ属の種には、限定しないで、ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、ｍａｒｉｎａ、ｓａｌｉｎａ、ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、ｖｕｌｇａｒｉｓ、ａｎｉｔｒａｔａ、ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、及びとりわけそれらの組み合わせが含まれる。これらの種及びそのほかの種の多数が、”Ｗｏｒｌｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ”  ２ｎｄ  Ｅｄ．、５８〜７４ページ；宮地他編；１９８９年；日本；学会出版センターに記載される。
【００５８】
天然に生じる又はたとえば、照射（たとえば、紫外線、Ｘ線）、化学的突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発によって人工的に生じるクロレラの変異株も開示される本主題と共に使用するために企図される。一例では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａとその変異体を使用することができる。別の例では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａとその変異体を使用することができる。
【００５９】
好適な培地と培養条件を用いて当該技術で既知の方法によってクロレラの培養を行うことができる（たとえば、Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９７２，  ２６４，  １１７−１２８を参照のこと）。クロレラの培養物の生理学的操作及び代謝的操作によって多糖の産生が影響を受け得ることが十分に理解されるべきである。さらに、増殖培地の組成が増殖速度に影響を与え、クロレラの細胞壁の厚さに変化をもたらし得る。クロレラに存在する増殖に関与する遺伝子を上方調節又は下方調節できることが十分に理解されるべきである。藻類変異体を選択する方法（たとえば、米国特許第５，８７１，９５２号を参照のこと）と同様に真核藻類（たとえば、クロレラ）を形質転換する方法は、既知であり（たとえば、米国特許第６，０２７，９００号を参照のこと）、そのような方法は開示される本主題と共に使用するために企図される。従って、種々の条件下での選択によって、クロレラから種々の生体ポリマー免疫調節剤を製造することができる。
【００６０】
培養された細胞又はスプレー乾燥させた細胞の熱湯抽出（米国特許第４，８３１，０２０号及び同第５，７８０，０９６号）及び溶媒抽出法（Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９７２，  ２６４：１１７−１２８；米国特許第３，４６２，４１２号）を始めとする当該技術で既知の方法によってクロレラの粗抽出物を調製することができる。粗抽出物は台湾クロレラ社からも入手することができる。ほかの抽出方法は、以前参照によって本明細書に組み入れた米国特許第６，５５１，５９６号、同第６，９７４，５７６号及び同第６，９７７，０７６号にさらに詳細に記載されている。
【００６１】
一例では、穏やかな撹拌のもとで水性媒体、好ましくは水又は有機酸、たとえば、酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、コハク酸、など若しくはその組み合わせの弱い酸性溶液によって細胞を処理することによりスプレー乾燥させたクロレラ細胞からクロレラの粗抽出物を調製することができる。約０〜約１００℃、又は約５０〜約９０℃の範囲にある種々の温度にて抽出工程を実行することができる。具体例では、クロレラ細胞（たとえば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）を蒸留水に浮遊させ、少なくとも約８０℃にて抽出することができる。抽出時間は好適な時間にわたって行うことができる。たとえば、約０〜約５時間の範囲にある抽出時間を用いることができる。具体例には約１時間続く抽出時間が挙げられる。
【００６２】
約１５０〜約１０，０００ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）による遠心分離によって残りの細胞及び細胞残渣を分離することができる。この工程を完了するのに必要とする時間は遠心力に関係する可能性があり、たとえば、１０，０００ｇでは約２０分が十分であり得る。次いで上清を微細濾過する。或いは、濾過を用いて細胞及び残渣全体を除くことができ、その場合、粗い濾過から出発して中程度を通り、最後に微細濾過を行う一連のフィルターの使用が有用である。クロスフロー濾過又は振動膜技術を用いて汚れを減らすことができる。濾過は特に温度及び抽出時間に感受性があることが十分に理解されるべきである。
【００６３】
遠心分離又は濾過の後、上清（又は濾液）を濃縮して及び／又は乾燥させて乾燥形態の生成物を得ることができる。乾燥は、凍結乾燥、真空下での上清の蒸発、冷却空気の循環又はスプレー乾燥によって達成することができる。抽出物の体積を先ず減らすことができ（たとえば、１０〜５０％に）、次いで好適な沈殿剤、たとえば、エタノール又は硫酸アンモニウムによって溶液から有効物質を沈殿させることができる。
【００６４】
種々のそのほかのクロレラ生成物（その一部は利用可能な予備処理されたもの）も開示される本主題と共に使用することができる。たとえば、市販のクロレラ製品を使用することができる。開示される本主題と共に使用することが企図される市販の製剤及び製品の例は、とりわけ、ＲＥＳＰＯＮＤＩＮ（商標）（カナダ、ノバスコシア州、ダートマスのオーシャン・ニュートリション・カナダ社）。ＳＵＮ  ＣＨＬＯＲＥＬＬＡ（商標）（米国、カリフォルニア州、トーランスのサンクロレラ）、及びクロレナジー（商標）（日本、筑後市、クロレラ工業株式会社）、及びこれらの組み合わせを含む。
【００６５】
クロレラ抽出物は、抽出物のクロレラ由来の総含量の分画として種々の異なった比率の多糖及び多糖複合体を含むことができる。比率は、少なくとも２４％（ｗ／ｗ）、少なくとも２６％（ｗ／ｗ）、少なくとも２８％（ｗ／ｗ）、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４５％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも６０％（ｗ／ｗ）であり得る。
【００６６】
本明細書で開示されるクロレラ及びクロレラ組成物は、本明細書で開示される種々の組成物、本明細書で開示される方法、本明細書で開示される生成物、及び開示される本主題の適用と組み合わせて使用することができることが理解される。
【００６７】
分画方法
本明細書で開示された前述の方法及び同様の方法に由来するクロレラの粗抽出物をさらに処理し、分画して抽出物の所望の成分を回収することができるが、それは本明細書では、「分画（単数）」又は「分画（複数）」と呼ばれる。たとえば、クロレラの粗抽出物を極性媒体に懸濁し、沈殿物を用いて粗抽出物をさらに分離することができる。沈殿を誘導する好適な水溶性有機溶媒が開示される本主題との使用について企図される。例には、とりわけ、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、硫酸アンモニウム、及びこれらの組み合わせが含まれる。具体例には、沈殿溶媒としての使用のための約９５％エタノールの選択が含まれる。沈殿溶媒のいかなる好適な体積も使用することができるが、一般に、体積は、さらに処理する所望の粗抽出物のサイズに左右され得る。
【００６８】
沈殿又は別の粗分画技法に続いて、追加の処理を用いて粗抽出物を処理することができる。たとえば、粗抽出物の懸濁した沈殿物を遠心分離し、透析し、及び／又は凍結乾燥して実質的に乾燥した沈殿物を得ることができる。さらに、当該技術で周知の方法を用いて沈殿物を脱色することができる。たとえば、脱色剤（たとえば、２−クロロエタノール）の混合物と共に沈殿物の懸濁液又は溶液を撹拌することによって沈殿物を脱色することができる。具体例には、沈殿物を脱色するためのＣＨ３Ｃｌ：ＣＨ３ＯＨの混合物（たとえば、２：１の混合物）の使用が含まれる。脱色した混合物を次いでさらに処理して沈殿物を所望の質に加工することができる。たとえば、脱色した混合物を透析し、及び／又は凍結乾燥して実質的に乾燥した沈殿物を製造することができる。
【００６９】
非多糖成分の除去によって多糖及び多糖複合体をさらに精製し、単離することができる。そのような非多糖成分には、核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質が含まれる。除去の方法の１つは、米国特許第６，５５１，５９６号に記載されたように、消化酵素を用いて非多糖成分を切断し、次いでサイズ分画を行って切断生成物を除くことである。当該技術で周知であり、種々の教科書に記載されているように、消化酵素には、プロナーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡ分解酵素、及びプロテアーゼが挙げられ、そのうちの一例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．である。関係のないタンパク質の消化に有用なプロテアーゼには、エンドペプチダーゼ、エクソペプチダーゼ、プロナーゼ、トリプシン、キモトリプシン及びスブチリシンのようなセリンプロテアーゼ、パパインのようなチオールプロテアーゼ、及びサーモリシンのようなカルシウムが必要なプロテアーゼが挙げられる。
【００７０】
或いは、親和性クロマトグラフィ、たとえば、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−結合のマトリクスの使用によって非多糖成分を除くことができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）。別の選択肢は、レクチンのような多糖結合マトリクスの使用によって混入成分から多糖及び多糖複合体を精製することである。別の例では、（ｉ）３以上のα−１，４−結合のＤ−グルコース単位；（ｉｉ）α−１，４−結合のグルコシド；（ｉｉｉ）α−１，４−結合のガラクトシド；又は（ｉｖ）α−１，４−結合のＤ−グルコースの切断を達成するのに十分な条件下と時間にて解糖酵素によって、本明細書で開示された抽出物を処理することができる。そのような処理の後、組成物はその免疫調節活性を保持することができる。
【００７１】
沈殿によって又はクロレラ粗抽出物で用いたそのほかの方法によって得られた分画をさらに分画し、精製することができる。たとえば、分画を界面活性剤で処理してさらなる分画を達成することができる。開示される本主題と共に使用するために企図される界面活性剤には、前に本明細書で開示されたような四級アンモニウム界面活性剤（たとえば、ラウリル硫酸アンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、そのほかのアルキルトリメチルアンモニウム塩）が含まれる。開示される本主題と共に使用するために企図される界面活性剤にはまた、とりわけ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、そのほかのアルキル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム）、アルキルベンゼンスルホン酸、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化タロウアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン、ココアンフォグリシネート及びこれらの組み合わせが含まれる。前述の界面活性剤の水溶液も用いてさらなる分画を達成することができる。界面活性剤と水の任意の割当重量対体積（ｗ／ｖ）の比又は重量対重量（ｗ／ｗ）の比を使用することができる。例には、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、及び約９０ｗ／ｖ（界面活性剤／水）の比が挙げられる。適当な分画を界面活性剤で処理した後、混合物をさらに処理し、沈殿させ、濾過し、透析し、及び／又は凍結乾燥して適当な亜分画を得ることができる。
【００７２】
本明細書で開示される方法及び組成物に従ってサイズ分画を用いることができる。たとえば、サイズ分画を用いて、クロレラ抽出物、クロレラ抽出物の成分、クロレラ抽出物の分画及び亜分画、クロレラ抽出物の沈殿物などをさらに分離することができる。サイズ排除クロマトグラフィ、沈降分析（たとえば、勾配遠心、及び限外濾過）を始めとする、当該技術で既知の方法によってサイズ分画を達成することができる。
【００７３】
クロレラ抽出物の好適な分画及び亜分画を得るためのサイズ分画は、分子篩の原理に基づくことができる。サイズ排除クロマトグラフィのそのような基礎的な原理は、当業者に周知であり、”Ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”８ｔｈ  ｅｄ．，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，  Ｒａｈｈｍｓ  Ｉ  Ｌｕｎｄ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎで説明されている。特定の範囲を分画するための適当なカラムは、容易に選択することができ、効果的に使用して所望の分画を分離することができ、たとえば、セファクリル（商標）Ｓ１００ＨＲ、セファクリル（商標）Ｓ２００ＨＲ、セファクリル（商標）Ｓ３００ＨＲ、セファクリル（商標）Ｓ４００ＨＲ及びセファクリル（商標）Ｓ５００ＨＲ又はそれらの同等物である。類似の方法では、セファロース（商標）媒体又はそれらの同等物、たとえば、セファロース（商標）６Ｂ、４Ｂ、２Ｂ、セファデックス（商標）Ｇ−１００を使用することができる。そのようなカラム及びカラム組成物は商業的供給業者（たとえば、スウェーデン、ウプサラのファルマシア）から入手可能である。
【００７４】
本明細書で開示される方法及び組成物に従ってアニオン交換クロマトグラフィも使用することができる。たとえば、アニオン交換クロマトグラフィを用いて、クロレラ抽出物、クロレラ抽出物の成分、クロレラ抽出物の分画及び亜分画、クロレラ抽出物の沈殿物などをさらに分離することができる。アニオン交換クロマトグラフィは、たとえば、Ｊａｍｅｓ  Ｓ．Ｆｒｉｔｚ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｔ．  Ｇｊｅｒｄｅによる”Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ−  ＶＣＨ，  ２０００）に記載されたもののような当該技術で既知の方法によって達成することができる。アニオン交換クロマトグラフィを用いて、クロレラ抽出物に存在する大きな分子量の種（たとえば、高分子量の炭水化物）をバルク組成物から容易に分離できることが十分に理解されるべきである。
【００７５】
クロレラ抽出物から回収した成分（たとえば、多糖及びタンパク質との多糖の複合体を含む多糖複合体）の精製及び/又は分離は、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィなどを含むそのほかのクロマトグラフィ技法を用いて達成することもできる。クロレラ抽出物成分の限外濾過は、適当な分子量切捨ての分子膜を用いて行うこともできる。分画を達成するのに使用される具体的な膜及び手順は当業者にとって利用可能である。
【００７６】
試料の限外濾過は、適当な分子量切捨ての分子膜を用いて行うことができる。分画を達成するのに使用される具体的な膜及び手順は当業者にとって広く利用可能である。
【００７７】
一例では、クロレラ抽出物物質を性状分析し、定量するのに使用される方法は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）／多角レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）／屈折率検出（ＲＩ）の組み合わせに基づくことができる。ハイブリッド技法（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ）では、Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＧＭＰＷＸＬ  ＳＥＣカラムを用いた均一溶媒のＨＰＬＣ実験を用いて分子サイズに従って混合物を分離することができる。オンラインＭＡＬＳは、溶出する成分の平均分子量分布を決定することができるので、分析の特異性を提供する。ＲＩ検出は、定量と、ＭＡＬＳデータを処理するのに必要とされる溶出特性を提供することの双方に使用することができる。
【００７８】
本明細書で開示される分画方法は、本明細書で開示される種々の組成物、本明細書で開示される方法、本明細書で開示される生成物、及び本明細書で開示される本主題の適用と組み合わせて使用することができることが理解される。本明細書で開示される方法から得られる組成物は、本明細書で開示される方法及び適用について企図されることも理解される。
【００７９】
分画の性状分析
当該技術で既知の好適な方法によって、クロレラ抽出物の炭水化物組成、核酸（たとえば、ＤＮＡ含量）及びアミノ酸の組成を決定することができる。
【００８０】
開示される抽出物の免疫活性は、グリコシド結合によって連結される単糖類から成る高分子として定義されるクロレラの多糖に関係し得る。多糖は、遊離の多糖又は複合体形成した多糖（すなわち、それ自体有意な免疫活性を有さない非多糖生体高分子と非共有結合で会合する多糖）の形態で抽出物に存在することができる。態様の１つでは、抽出物のタンパク質含量は、約２０％〜５０％又は２０％〜３０％であることができる。このタンパク質の比率のうち、約４０％〜６０％が多糖と会合することができる。
【００８１】
非多糖生体高分子には、抽出物の累積分子量に寄与することができるが、有意な免疫活性を有さない核酸高分子（たとえば、ＤＮＡ）、タンパク質及びＲＮＡが挙げられる。会合していないＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質、すなわち、多糖と複合体形成をしていないものは抽出物の免疫活性に必ずしも有意に寄与しない。本出願の目的で、会合していないＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質は、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）及びセリンとチオールの部類に共通するプロテアーゼによる切断に感受性があるＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質として機能的に定義される。従って、本明細書で開示される抽出物は、会合していないＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を本質的に含まない又は実質的に含まない。「本質的に含まない」によって、５％未満の会合していないＤＮＡ又はＲＮＡ及び１５％未満の会合していないタンパク質を意味する。「実質的に含まない」によって２％未満の会合していないＤＮＡ又はＲＮＡ及び１０％未満の会合していないタンパク質を意味する。
【００８２】
非多糖生体高分子自体は免疫活性を欠く一方で、多糖とのその会合は多糖の免疫活性に寄与することができるが、これは、多糖が免疫調節剤として有効に機能することを可能にする特定の立体的な又は極性の必要条件を複合体の非多糖生体高分子が満たすことができるからである。
【００８３】
前述の方法又は開示される本主題に係るそのほかの方法から得られる分画（単数）又は分画（複数）の性状分析を行って、分画の適当な物理的及び化学的な特性を明らかにすることができる。本明細書で開示される方法の実践を介して得られる修飾された又は修飾されていない分画で物理的及び化学的な性状分析の方法を用いることができる。
【００８４】
当該技術で既知の方法によって物理的及び化学的な特性（構造の情報を含む）を得ることができる。例には、溶液及び固相の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、赤外線分光法（ＩＲ）、質量分光法（ＭＳ）及び紫外線分光法の使用が挙げられる。具体的には、１Ｈ、１３Ｃ及び３１ＰのＮＭＲを用いて本明細書で開示される方法から得られる分画の化学的な及び構造的な特性を確認することができる。とりわけ、分極転移による無歪み増強（四級核のためのＤＥＰＴ及びＤＥＰＴＱ）、異核単一量子結合（ＨＳＱＣ）、異核多重結合相関（ＨＭＢＣ）、相関分光法（ＣＯＳＹ）、総合相関分光法（ＴＯＣＳＹ）及び核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）差異分光法を含む種々の１−Ｄ及び２−ＤのＮＭＲを用いることができる（任意の適当な核で）。これらの方法及びそのほかの方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．、Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ及びＦｒａｎｃｉｓ  Ｘ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．  Ｋｉｅｍｌｅによる”Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”７ｔｈ  ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００５）にさらに詳細に記載されている。
【００８５】
本明細書で開示される分画の化学修飾を行って官能基の存在及び／又は非存在を判定することができ、それによって構造情報をさらに解明する。脱リン酸化を用いてリン酸化された官能基を分画から取り除くことができる。脱リン酸化は、たとえば、酵素的に又は化学的に（たとえば、ＨＦによって）行うことができる。脱アセチル化（たとえば、脱Ｏ−アセチル化）は、適当な塩基（たとえば、ＮＨ４ＯＨ）を用いて行うことができる。
【００８６】
分画組成物
本明細書で開示される方法から得られる分画組成物は、多糖及び／又は多糖複合体を含むことができる。「多糖複合体」によって１以上の多糖が非多糖生体高分子と非共有結合で会合することが意味される。本明細書で開示される多糖が会合することができる非多糖生体高分子の例には、とりわけ、前に本明細書で開示された核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質が含まれる。そのような非共有結合で会合する非多糖生体高分子は、多糖の累積する分子量に寄与することができるが、そのような生体高分子は、多糖の免疫調節特性にほとんど又は全く影響を有さないと一般に考えられることが十分に理解されるべきである。
【００８７】
別の態様では、多糖及び多糖複合体は、リボース、核酸、リボ核酸及び会合していないタンパク質を実質的に含まない。多糖及び多糖複合体はまた、任意でＮ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンも含有することができる。
【００８８】
さらに別の態様では、開示された抽出物は、会合していない核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質を取り除く処理の際、免疫調節活性を保持する。そのような処理には、プロナーゼ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素及びプロテアーゼによる消化が挙げられる。
【００８９】
別の態様では、開示された抽出物は、特定のグリコシド結合の切断を達成する処理の際、免疫調節活性を保持し、結合は、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼ又はノノイタミダーゼによる切断への感受性によって定義される。そのような感受性のある結合には通常、（ｉ）３以上のα−１，４−結合のＤ−グルコース単位；（ｉｉ）α−１，４−結合のグルコシド；（ｉｉｉ）α−１，４−結合のガラクトシド；又は（ｉｖ）α−１，４−結合のＤ−グルコースが含まれる。
【００９０】
クロレラから得られる多糖又は多糖複合体は、約１×１０３〜約１×１０６Ｄａ又は約１×１０３〜約１×１０５Ｄａの分子量を有することができる。実施態様の１つでは、開示された多糖又は多糖複合体は、約１×１０３〜約３×１０３Ｄａの分子量を有することができる。別の実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約２×１０３〜約４×１０３Ｄａの分子量を有することができる。さらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約３×１０３〜約５×１０３Ｄａの分子量を有することができる。その上さらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約４×１０３〜約６×１０３Ｄａの分子量を有することができる。さらにその上さらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約５×１０３〜約７×１０３Ｄａの分子量を有することができる。さらにその上さらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約６×１０３〜約８×１０３Ｄａの分子量を有することができる。さらに別の実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約７×１０３〜約９×１０３Ｄａの分子量を有することができる。その上別の実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約８×１０３〜約１×１０４Ｄａの分子量を有することができる。別のさらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約９×１０３〜約２×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらに別のさらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約１×１０４〜約３×１０４Ｄａの分子量を有することができる。その上さらに別のさらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約２×１０４〜約４×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらなる実施態様の１つでは、開示された多糖又は多糖複合体は、約３×１０４〜約５×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらにさらなる実施態様の１つでは、開示された多糖又は多糖複合体は、約４×１０４〜約６×１０４Ｄａの分子量を有することができる。別の実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約５×１０４〜約７×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらなる実施態様の１つでは、開示された多糖又は多糖複合体は、約６×１０４〜約８×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらにその上さらなる実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約７×１０４〜約９×１０４Ｄａの分子量を有することができる。さらに別の実施態様では、開示された多糖又は多糖複合体は、約８×１０４〜約１×１０５Ｄａの分子量を有することができる。多糖又は多糖複合体の非限定例は、約１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、又は約１×１０５の分子量を有することができる。しかしながら、開示された多糖又は多糖複合体は、約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有することができることが理解される。
【００９１】
開示される多糖及び多糖複合体に存在することができる単糖類残基には、限定しないで、マンノース、ラムノース、グルコース、ガラクトース、アラビノース、及びこれらの組み合わせが含まれる。企図される多糖は、Ｄ型、ピラノース型及び/又はフラノース型で存在する単糖類残基を含む。さらに、単糖類は、α及び／又はβアノマー型で存在することができる。たとえば、α−Ｄ−マンノース及び／又はβ−Ｄ−ガラクトースは多糖に存在することができる。単糖類は適当な結合部位を介して一緒に連結され得る。例には、１→６、１→４及び１→３の結合を介して連結された単糖類が含まれる。単糖類残基は、Ｏ−メチル化、Ｏ−アセチル化、Ｏ−リン酸化及びその組み合わせを受けることができる。一例では、多糖は、ホスホジエステル結合を介して多糖の主鎖に連結された少なくとも２つの末端単糖類を含む。「末端の」よって、分枝鎖多糖の主鎖における分枝の端を意味する。ホスホジエステル結合は、多糖の１→６結合、たとえば、１−ＨＰＯ３→６結合を介して少なくとも２つの単糖類を一緒に連結することができる。
【００９２】
ほかの例には、第２のガラクトースごとに連結される（すなわち、結合される）グルコース側鎖を含む多糖及び多糖複合体が含まれる。多糖及び多糖複合体はまた、隣接するガラクトースに連結される２つの単一グルコースも含むことができる。
【００９３】
本多糖及び多糖複合体では、個々の糖残基間の比が存在することができる。例には、ガラクトースとグルコースの比が約２：１である多糖が含まれる。別の例には、ガラクトースとグルコースの比が約３：１である多糖が含まれる。ガラクトースとグルコースのそのほかの企図される比には、限定しないで、約１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１が含まれる。さらなる例には、限定しないで、１：１．２、１．３：１、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３を含むガラクトースとグルコースの比が含まれる。具体例には、ＮＭＲ分光法で決定されたガラクトースとグルコースの比が約２：１である多糖が含まれる。別の例には、酢酸アルジトールによる分析に従ってガラクトースとグルコースの比が約３：１である多糖が含まれる。
【００９４】
リン糖構造（ホスホグリカンと呼ばれる）を有する多糖類が、細菌の被膜、細菌及び酵母の細胞壁、同様にリーシュマニア原虫寄生虫の細胞外及び細胞表面のグリコポリマー、および一部の動物糖タンパク質のグリカン鎖において天然に存在することが見い出されている。
【００９５】
被膜の多糖類（多数の細菌では血清型特異的な一次抗原）及びグラム陰性細菌の細胞壁ＬＰＳからのＯ−特異的多糖鎖（体細胞抗原）は普通、ほかで概説されている高度に多様化した単糖類の発現を伴う規則的なポリ（グリコシルリン酸）構造を含有する。記載されるグリコシルリン酸単位の中で、α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−１−リン酸、α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−１−リン酸、α−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−１−リン酸、α−Ｄ−Ｇａｌｐ−リン酸、及びα−Ｄ−Ｒｈａｐ−１−リン酸は最も広く分布する。グラム陽性細菌の細胞壁は、テイコ酸と呼ばれるアルデトール−リン酸の繰り返し単位を含有することが知られるアニオン性のグリコポリマーも含有する。後者の群には、ポリ（リン酸グリセロール）、ポリ（リン酸エリスリトール）、ポリ（リン酸リビトール）、ポリ（リン酸アラビニトール）及びポリ（リン酸マンニトール）が挙げられ、ホスホジエステル結合は主として１級ヒドロキシル基間で生じる一方で、２級ヒドロキシルは置換されないか又はグリコシル化される。テイコ酸様のポリマーはどれもグリコシルリン酸単位を含有しない。
【００９６】
グリコシルリン酸塩残基を含有する細菌のホスホグリカンとは異なって、稀にしか見られない場合、酵母のホスホグリカンではα−Ｄ−Ｍａｎｐ−１−リン酸塩が一般的に見い出される。細菌のα−Ｍａｎｐ−１−リン酸塩を含有するグリコシルリン酸塩構造の唯一知られている報告は、グラム陰性細菌、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の細胞表面のホスホマンナンである。多糖は、α−Ｄ−Ｍａｎｐ、α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ及びα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→のＯ−２側鎖を持つ→６）α−Ｄ−Ｍａｎｐ残基の三糖反復単位から成る。
【００９７】
酵母におけるホスホマンナンは、酵母細胞に粘着性を提供する細胞内粘液を形成することができ、又は細胞壁の一部であり、それらは、細胞の抗原特異性を決定することが多い。細菌のホスホグリカンとは対照的に、酵母のホスホマンナンは稀に規則的であり、α−（１→２）、α−（１→３）及び時にβ−（１→２）グリコシド結合による種々の長さの側鎖を持つα−（１→６）結合のマンノピラノシル単位からほとんど成る。酵母ホスホマンナンの大半は、側鎖にα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→６）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→グリコシルリン二糖単位を持つ。
【００９８】
親水性及び疎水性のホスホグリカンはそれぞれ、リーシュマニアの前鞭毛体の培養上清及び細胞表面を構成することが示されているが、リーシュマニアは、ヒトにおいて種々の、衰弱させ致死性になることが多い疾患を引き起こす、サシチョウバエが媒介する原虫寄生虫の属である。親水性のホスホグリカンは、直鎖又は分枝鎖（種による）のガラクトマンノシルリン酸反復単位から成るポリ（グリコシルリン酸）構造を含有するが、疎水性のホスホグリカンでは、相当するポリ（グリコシルリン酸）は、イノシトールリン脂質アンカーに連結してリポホスホグリカン結合を作るグリカンの中心に鎖の還元末端で連結される。配列、α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→６）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→は、リーシュマニア寄生虫のホスホグリカンで最も頻繁に見られるグリコシルリン糖単位である。
【００９９】
グリコシルリン糖構造は、動物起源の糖タンパク質を構成することも見い出されている。配列、α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→６）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→は、一部の原形質膜の高マンノース型オリゴ糖鎖及び細胞質認識糖タンパク質の末端断片であることが見い出されているが、配列、α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１−ＰＯ３Ｈ→６）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→は、多数のリソソーム酵素の成分であることが見い出されている。
【０１００】
多様な起源の天然のホスホグリカンに見い出されるグリコシルリン酸単位の大半は、α−Ｄ−又はα−Ｌ−ヘキソピラノース配置を有することが見い出されており、リン酸基はＣ−１位にて軸の位置を占有し、それは、アノマー効果によって好まれることが知られる。
【０１０１】
微小藻類由来の多糖類は、細菌、酵母及び植物由来のものほど詳細には検討されていない。本明細書で開示されるのは、グリコシルリン酸構造を含有する微小藻類に由来するホスホグリカンである。α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→単位の側鎖は、一部の酵母のホスホグリカン構造に似る構造的特徴である。しかしながら、この場合メチル化リン糖単位、３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→の存在に関する報告はこれまでになく、それによって本明細書で報告される構造が独特のものになっている。
【０１０２】
グラム陰性細菌、Ｓｐｉｒｉｌｌａｐｌａｎｅｓ  （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）  ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓの細胞壁は、一部の６−リン酸化Ｎアセチルグルコサミン残基の３位（５０％）にて３−Ｏ−メチル−α−マンノピラノシル残基と共に６）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→６）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１−ＰＯ３Ｈ→反復単位から成るアニオン性ポリマーを含有することが見い出された。しかしながら、３−Ｏ−メチル−α−Ｍａｎｐのこの側鎖はリン酸化されるとは思われなかった。
【０１０３】
以下は、ＩＵＰＡＣ指名に従って提示される開示された多糖の非限定例である。これらの式は図２６〜３４でも言及される。
【０１０４】
【化２−１】
2011522911.tif 000004
【０１０５】
【化２−２】
2011522911.tif 000005
式中、添え字ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝ｎ。添え字ｎは本明細書上記で定義されたような開示された多糖又は多糖複合体の平均分子量を反映する。従って、添え字ｎは約５〜約５００である。実施態様の１つでは、ｎは約７〜約４００である。添え字ａ、ｂ、ｃ及びｄは約１〜約４５０のいずれかの値を有することができる。実施態様の１つでは添え字ａは、約１０〜約５０である。さらなる実施態様では、添え字ａは、約２０〜約７０である。別の実施態様では、添え字ａは、約３０〜約５０である。さらにさらなる実施態様では、添え字ａは、約５〜約１５である。実施態様の１つでは添え字ｂは、約１０〜約５０である。さらなる実施態様では、添え字ｂは、約２０〜約７０である。別の実施態様では、添え字ｂは、約３０〜約５０である。さらにさらなる実施態様では、添え字ｂは、約５〜約１５である。実施態様の１つでは添え字ｃは、約１０〜約５０である。さらなる実施態様では、添え字ｃは、約２０〜約７０である。別の実施態様では、添え字ｃは、約３０〜約５０である。さらにさらなる実施態様では、添え字ｃは、約５〜約１５である。実施態様の１つでは添え字ｄは、約１０〜約５０である。さらなる実施態様では、添え字ｄは、約２０〜約７０である。別の実施態様では、添え字ｄは、約３０〜約５０である。さらにさらなる実施態様では、添え字ｄは、約５〜約１５である。しかしながら、添え字ａ、ｂ、ｃ及びｄは５〜５００のいずれかの値を有することができる。
【０１０６】
開示される組成物の免疫調節特性
理論に束縛されることを望まないが、本明細書で開示される組成物及び化合物は、生物学的反応調節剤（免疫賦活剤又は免疫調節剤）であることができる。生物学的反応調節剤は、免疫系の刺激によって対象の生物学的反応を変え、その結果種々の治療効果を生じる作用因子として定義される。この部類に属する物質のカテゴリーの１つは免疫調節剤である。従って、開示される組成物を用いて免疫応答を調節することができる。開示される本主題の文脈において、そのような調節は、対象の免疫防御機構の向上であり得る。
【０１０７】
クロレラ抽出物はＢ細胞及びマクロファージの刺激剤である。Ｂ細胞免疫調節剤の利益の１つは、抗原に対する損傷された抗体応答を有する対象においてそれらが免疫機能を刺激できることである。また、Ｂ細胞刺激剤は、新しい感染に罹った際、抗体免疫応答の有効性を高めることができる。クロレラ抽出物は、予防的健康治療に関する安全で、有効な且つ費用効果のある選択肢を提供する。
【０１０８】
本明細書で開示されるのは、クロレラ抽出物がＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞の増殖及びマクロファージのＩＬ−６とＮＯ２の産生を刺激することを明らかにする試験管内の検討である。さらに本明細書で開示されるのは、クロレラ抽出物が、真菌Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓと同様にＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる感染を有意に低減することを示す生体内の検討である。
【０１０９】
腹腔マクロファージによるＮＯ産生に基づいた、本明細書で開示される組成物の免疫賦活活性の結果を図２５に示す。以後、「Ａ−Ｐ−１」及び「Ａ−Ｐ−２」と呼ばれる、サイズ排除クロマトグラフィを介して得られた２つの分画は免疫賦活剤として活性があった。分画Ａ−Ｐ−１のアニオン交換クロマトグラフィに由来する分画の免疫賦活活性が分子サイズと共に上昇し、それは免疫賦活剤として活性があるこのリン酸化多糖について、最小数の反復単位が好まれ得ることを示すことは注目に値することであることが十分に理解されるべきである。グラフはまた、多糖は、アセチル基とリン酸基の双方を失った（分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ）後、その免疫賦活効果を完全に失うことも示す。
【０１１０】
クロレラ抽出物について一連の３種の毒性学試験が完了した。ラットにおける２８日間の経口毒性試験の間、クロレラ抽出物の投与の影響は明らかではなかった。ラットにおける急性の経口毒性については、単回経口投与に従った最高の非致死性用量又は最低の致死性の用量を決定するために、試験によってクロレラ粗抽出物の最低致死用量は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重を超えることが見い出された。細菌の突然変異アッセイは、クロレラ抽出物は試験条件下で変異活性を呈さないことを示した。
【０１１１】
無作為化二重盲検プラセボ対照試験を行い、クロレラ抽出物がプラセボの対象に比べてインフルエンザのワクチンを受けた健常成人で有意な免疫賦活効果を明示することを示した（米国特許第６，５５１，５９６号を参照のこと）。ヒトの血液細胞による試験管内の実験は、マウスのモデルで見られたのと同様に、インターロイキンの産生の刺激を示す。
【０１１２】
組成物
本明細書で開示されるのは、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の添加剤成分を含む組成物であり、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１３】
従って、実施態様の１つでは、組成物は、
ａ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と
ｂ）１以上の添加剤成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１４】
さらなる実施態様では、組成物は、
ａ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の添加剤成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１５】
別の実施態様では、組成物は、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位；及び
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の添加剤成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、「添加剤成分」は、薬理学上活性があり得る又は不活性であり得る別の成分を意味する。たとえば、不活性成分は液体キャリア、固体賦形剤、安定剤、界面活性剤などであることができる。薬理学上活性がある添加剤は、鎮痛薬、オピオイド、免疫抑制剤、抗菌剤などであることができる。
【０１１７】
医薬組成物
本明細書で開示されるのは、
ａ）ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の薬学上許容可能な成分を含む医薬組成物であり、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１８】
従って、実施態様の１つでは、組成物は、
ａ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と
ｂ）１以上の薬学上許容可能な成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１１９】
さらなる実施態様では、組成物は、
ａ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の薬学上許容可能な成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１２０】
別の実施態様では、組成物は、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位；及び
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の薬学上許容可能な成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１２１】
本開示の目的で、用語「賦形剤」及び「キャリア」は、本開示の記載全体を通して相互変換可能に使用され、前記用語は、「安全で有効な医薬組成物を製剤化する実践で使用される成分」として本明細書で定義される。
【０１２２】
賦形剤は安全で、安定で、且つ機能的な医薬を送達するために主に用いられ、送達のための媒体の一部としてだけではなく、有効成分の受入者による有効な吸収を達成するための手段として役立つことを製剤作製者は理解するであろう。賦形剤は、不活性充填剤と同じくらい単純で直接的な役割を満たし、本明細書で使用されるとき、賦形剤は、ｐＨ安定剤の一部であってもよいし、胃への成分の送達を安全に保証するコーティングであってもよい。製剤作製者はまた、本開示の化合物が、経口バイオアベイラビリティを改善していると共に細胞性の潜在力、薬物動態特性を改善しているという事実を上手く利用することもできる。
【０１２３】
本明細書で開示されるクロレラの抽出物及び分画は、免疫応答の調節が所望される症状又は疾患の状態で使用するのに好適であり得る。一例では、開示された組成物は、有効量で粘膜ワクチン製剤の種々の形態、たとえば、経口投与におけるアジュバントとして使用することができる。
【０１２４】
本明細書で使用されるとき、用語「アジュバント」は、それ自体を与えた場合、直接的な効果があるとしても少ない一方で、ほかの作用因子（たとえば、薬剤、ワクチン、免疫抑制剤、又は生物学的に活性のある作用因子）の効果を加減する薬学上許容可能な成分、たとえば、薬理学的な又は免疫学的な作用因子を意味する。
【０１２５】
アジュバントは、局所の堆積物に隔離することによって迅速な分散から抗原を保護することができ、又は対象を刺激してマクロファージ及び免疫系のほかの成分にとって走化性である因子を分泌する物質を含有することができる。粘膜投与用の既知のアジュバントには、細菌毒素、たとえば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌熱不安定毒素（ＬＴ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａ及び百日咳毒素（ＰＴ）が挙げられる。高分子量の食用生成物であり、それ自体免疫刺激剤であるクロレラの抽出物及び分画は、経口ワクチンにおけるアジュバントとしての使用のための候補である。
【０１２６】
本開示はまた、本明細書で開示された組成物の有効量を対象（たとえば、ヒトを含む哺乳類）に投与することによって対象の免疫応答を調節する方法も提供する。そのような調節には、脾細胞の増殖の増加、サイトカイン、たとえば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０，ＩＮＦγ及びＴＮＦ−αの産生の上昇が挙げられ、有利に利用して細菌感染又は真菌感染を治療する又は予防することができる。
【０１２７】
抽出物を補完物としてワクチン接種計画にさらに投与し、免疫応答をさらに刺激することができる。たとえば、抽出物と共にインフルエンザワクチンを有利に使用することができる。抽出物はワクチンに対するアジュバントとして、特に経口ワクチンのアジュバントとして存在することができる。
【０１２８】
好適な医薬組成物は、薬学上許容可能な成分、たとえば、薬学上許容可能なキャリアと共に開示された多糖又は多糖複合体のいずれか及びそのほかの生物活性剤を含むことができる。一部の例では、本明細書で開示された組成物はそれ自体薬学上許容可能なキャリアであることができる。本明細書で開示される医薬製剤を治療的に又は予防的に用いることができる。
【０１２９】
「薬学上許容可能なキャリア」によって、生物学的に又はそうでなくても望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、たとえば、望ましくない生物学的効果を引き起こさずに、又は含有される医薬製剤のほかの成分と有害な方法で相互作用することなく、物質を対象に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを必然的に選択して有効成分の分解をできるだけ抑え、対象における有害な副作用をできるだけ抑える。
【０１３０】
医薬キャリアは当業者に既知である。これらはほとんど通常、ヒトに薬剤を投与するための、たとえば、無菌水、生理食塩水、生理的ｐＨに緩衝化された溶液のような溶液を含む標準的なキャリアである。好適なキャリア及びその製剤は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２００５に記載されているが、キャリア及び医薬製剤のその教示のためにそれを参照によって本明細書に組み入れる。通常、適当量の薬学上許容可能な塩を製剤に用いて製剤を等張にする。薬学上許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンガーの溶液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは約５〜約８（たとえば、約７〜約７．５）であることができる。さらなるキャリアには、徐放性調製物、たとえば、開示された化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられるが、マトリクスは、成形物品の形態、たとえば、フィルム、リポソーム、微粒子又はマイクロカプセルの形態である。たとえば、投与経路及び投与される組成物の濃度によって特定のキャリアがさらに好ましいことは当業者に明らかであろう。当業者によって使用される標準的な手順に従ってほかの化合物を投与することができる。
【０１３１】
医薬製剤は、本明細書で開示された化合物に加えて、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などと同様に追加のキャリアを含むことができる。医薬製剤はまた、１以上の追加の有効成分、たとえば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などを含むことができる。
【０１３２】
局所治療又は全身性治療のいずれが望ましいかによって、及び治療される領域によって、多数の経路で医薬製剤を投与することができる。投与は、局所（眼科的に、膣に、直腸に、鼻内にを含む）に、経口で、吸入によって、又は非経口で、たとえば、静脈内点滴によって、皮下の、腹腔内の若しくは筋肉内の注射によって行うことができる。開示された化合物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は経皮的に投与することができる。
【０１３３】
非経口投与用調整物には、無菌の水溶液又は非水性溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水性溶液の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、魚油、及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。水性キャリアには、生理食塩水及び緩衝化溶剤を始めとする水、アルコール性／水性溶液、及びエマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンガー溶液及び固定油が挙げられる。静脈内媒体には、流体及び栄養補液、電解質補液（たとえば、リンガーのデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤及びそのほかの添加剤、たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。また本明細書で提供されるのは、炭水化物、脂肪又は窒素であることができる少なくとも１つのエネルギー源と共にクロレラ抽出物を含有する栄養組成物である。
【０１３４】
栄養組成物
本明細書で開示されるのは、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位又は
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の食べられる成分又は栄養成分を含む組成物であり、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１３５】
従って、実施態様の１つでは、組成物は、
ａ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と
ｂ）１以上の食べられる成分又は栄養成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１３６】
さらなる実施態様では、組成物は、
ａ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の添加剤成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１３７】
別の実施態様では、組成物は、
ａ）（ｉ）式３−Ｏ−メチルα−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのメチル化されたリン糖単位；及び
（ｉｉ）式α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−ＰＯ３Ｈ→を有する少なくとも１つのリン糖単位を含む１以上の多糖又は多糖複合体と、
ｂ）１以上の食べられる成分又は栄養成分を含むことができ、その際、多糖又は多糖複合体は約１×１０３〜約１×１０６Ｄａの分子量を有する。
【０１３８】
用語「食べられる」が意味するものは、食べることができるどんなものでもであり、すなわち、食物である。開示された多糖又は多糖複合体は、相溶性である食べられる産物と組み合わせることができる。たとえば、開示された多糖又は多糖複合体を、飲料、すなわち、果実ジュース、野菜ジュース、コーラなどに添加することができる。多糖又は多糖複合体を、たとえば、果実、ヨーグルトと混合した固形食品と、又は栄養補助剤と組み合わせることができる。
【０１３９】
本明細書で開示されたクロレラの抽出物及び分画を含む栄養組成物及び医薬組成物は、経腸投与に好適な形態で、たとえば、経口投与又は経管栄養に好適な形態で製剤化され、投与され得る。栄養製剤及び医薬製剤は、たとえば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ、葉酸又はこれらの組み合わせを含むことができる。栄養製剤及び医薬製剤はまた、たとえば、魚油、真菌油、藻類油、魚類油、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ及びＥｃｈｉｎａｃｅａ、又はこれらの組み合わせも含むことができる。水性液体の形態で製剤を好都合に投与することができる。腸溶応用に好適な製剤は、水性形態、又は錠剤形態を含む粉末若しくは顆粒の形態であることができる。粉末又は顆粒は使用前に好都合に水に添加することができる。液体の形態では、組成物は通常、約０．１〜約５０重量％の固形分を有し得る。飲み物として、既知の方法によって、たとえば、クロレラの抽出物又は分画をたとえば、炭水化物、脂肪及び／又は窒素源のようなエネルギー源と混合することによって組成物を得ることができる。
【０１４０】
栄養組成物は、単独の栄養源として使用される場合、１日のカロリー、窒素、脂肪酸、ビタミン、ミネラル及び微量元素の要求が本質的にすべて満たされ得るように完全な調整食の形態（液体又は粉末の形態）であることができる。企図される栄養組成物は、とりわけ、本明細書で開示される多糖及び多糖複合体と１以上の炭水化物、脂肪、及び／又は窒素源（たとえば、タンパク質）を含むことができる。
【０１４１】
本明細書で開示された医薬組成物もまた、単回用量の形式又は複数回用量の形式に製剤化することができ、その際、それらはクロレラ抽出物と薬学上許容可能なキャリアを含む。そのような医薬組成物は、腸溶性の投与、たとえば、経口、鼻内及び直腸の投与に好適であり得る。経口投与用の医薬組成物には、粉末又は顆粒、水又は非水性媒体における懸濁液又は溶液、カプセル、ゲルキャップ、サシェ又は錠剤が挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい可能性がある。
【０１４２】
好適な組成物は液体の形態又は固体の形態であることができる。液体組成物の投与量は通常、約０．１〜約５０重量％又は約１〜約１０重量％のクロレラ抽出物又はクロレラ分画の範囲であり得る。固体組成物の投与量は通常、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。組成物はまた、錠剤、硬質カプセル及び軟質カプセル、及びサシェの形態でもあり得る。好適なキャリアは当該技術で既知である。それらには、たとえば、糖又はセルロースのような充填材、デンプンのような結合剤、及び必要であれば又は所望であれば、崩壊剤が含まれる。
【０１４３】
局所投与用の医薬製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末を挙げることができる。従来の医薬キャリア、水溶液、粉末又は油性基剤、増粘剤などが望ましい可能性がある。
【０１４４】
別の実施態様では、たとえば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸のような無機酸、並びにたとえば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、パモン酸及びフマル酸のような有機酸との反応によって、又はたとえば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基並びにたとえば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン及びアリールアミン及び置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成される薬学上許容可能な酸付加塩又は塩基付加塩として、開示される製剤を投与することができる。
【０１４５】
好適な手段を用いて、たとえば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、取り込み又は凍結乾燥の工程によって医薬組成物を製造してもよい。
【０１４６】
従って、本開示に従って使用するための医薬組成物は、薬学上使用することができる調整物に活性化合物を加工することを円滑にする賦形剤及び補助剤を含む、１以上の生理学的に又は薬学上許容可能なキャリア（媒体又は希釈剤）を用いた従来の方法において製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１４７】
注射、経粘膜、経口、吸入、眼内、直腸内、持続型埋め込み、リポソーム、エマルション又は徐放性の手段を含む本開示の治療の方法において患者に医薬組成物を投与する好適な方法を使用してもよい。
【０１４８】
注射については、本開示の作用因子を、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、たとえば、ハンクスの溶液、リンガーの溶液、又は生理学的な生理食塩水緩衝液において製剤化してもよい。経粘膜投与については、浸透すべきバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は当該技術で一般に知られる。眼内投与については、当該技術で周知のように、適当な生理食塩水溶液における懸濁液が使用される。
【０１４９】
経口投与については、当該技術で周知の薬学上許容可能なキャリアと活性化合物を組み合わせることによって化合物を容易に製剤化することができる。そのようなキャリアによって本開示の化合物は、治療される患者による経口摂取用の錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されるのが可能になる。経口使用のための医薬製剤は、得られた混合物を任意で粉砕し、顆粒の混合物を加工し、所望であれば、錠剤又は糖衣錠の芯を得るために好適な助剤を添加した後、固体の賦形剤として得ることができる。好適な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖のような充填剤；たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ゴムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物が挙げられる。所望であれば、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてもよい。
【０１５０】
糖衣錠の芯には好適なコーティングが提供される。この目的で、任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい濃縮された糖溶液を使用してもよい。識別のために、又は活性化合物の用量の様々な組み合わせを特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠のコーティングに加えてもよい。
【０１５１】
経口で使用することができる医薬製剤には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、同様にゼラチンとグリセロール又はソルビトールのような可塑剤とで出来た密閉軟質カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、任意で安定剤の混合物において有効成分を含有することができる。軟質カプセルでは、好適な液体、たとえば、脂肪油、流動パラフィン、又は液状ポリエチレングリコールに活性化合物を溶解してもよく、又は懸濁してもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用の製剤はすべて、そのような投与に好適な投与量とすべきである。
【０１５２】
頬内投与については、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はトローチ剤の形態を取ってもよい。
【０１５３】
吸入による投与については、本開示に従って使用するための化合物は、好適な高圧ガス、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はそのほかの好適なガスと共に、加圧パック又は噴霧器からのエアゾールスプレーの提示の形態で好都合に送達される。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計測量を送達するための弁を提供することによって決定されてもよい。吸入器又は吸い込み器で使用するための、たとえば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物とラクトース又はデンプンのような好適な粉末基剤とを含有して製剤化されてもよい。
【０１５４】
注射、たとえば、ボーラス注射又は連続点滴による非経口投与のために化合物が製剤化されてもよい。単位投与量形態、たとえば、添加した保存剤を伴った、アンプル又は複数回用量の容器にて注射用製剤が提示されてもよい。組成物は、懸濁液、溶液又は油性若しくは水性の媒体におけるエマルジョンのような形態を取ってもよく、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような製剤化剤を含有してもよい。
【０１５５】
非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態における活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに適当な油性注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液を調製してもよい。好適な親油性の溶媒又は媒体には、たとえば、ゴマ油のような脂肪油、又は、たとえば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランを含有してもよい。任意で、懸濁液は、好適な安定剤又は化合物の溶解性を高めて高度に濃縮された溶液の調整を可能にする作用因子も含有してもよい。
【０１５６】
或いは、有効成分は、使用前に好適な媒体、たとえば、無菌で発熱物質を含まない水と共に構築するための粉末の形態であってもよい。
【０１５７】
たとえば、ココアバター又はそのほかのグリセリドのような従来の座薬基剤を含有する座薬又は停留浣腸のような直腸内組成物において化合物を製剤化してもよい。
【０１５８】
前に記載された製剤化に加えて、デポー調整物として化合物を製剤化してもよい。埋め込み（たとえば、皮下に又は筋肉内に）又は筋肉内注射によってそのような持続型製剤を投与してもよい。従って、たとえば、好適なポリマー又は疎水性物質（たとえば、許容可能な油におけるエマルションとして）若しくはイオン交換樹脂と共に、又はやや溶けにくい誘導体として、たとえば、やや溶けにくい塩として化合物を製剤化してもよい。
【０１５９】
本開示の疎水性化合物のための医薬キャリアの１種は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー及び水性相を含む共溶媒系である。
【０１６０】
共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコールと、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤、ポリソルベート８０と、６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の溶液であって、無水エタノールで体積を合わせた溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１に希釈したＶＰＤから成る。この共溶媒系は疎水性の化合物を上手く溶解し、それ自体全身性投与の際、低毒性である。当然、共溶媒系の比率は、その溶解性及び毒性の特徴を壊すことなく、かなり変化してもよい。さらに、共溶媒成分の個性は変化してもよく：たとえば、ポリソルベート８０の代わりにほかの低毒性の非極性界面活性剤を使用してもよく；ポリエチレングリコールの分画サイズを変えてもよく；ほかの生体適合性のポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドンがポリエチレングリコールに取って代わってもよく；デキストロースについてほかの糖又は多糖が置換されてもよい。
【０１６１】
或いは、疎水性の医薬化合物のためのほかの送達系を採用してもよい。リポソーム及びエマルションは、疎水性薬剤のための送達媒体又は送達キャリアの周知の例である。特定の有機溶媒、たとえば、ジメチルスルホキシドも採用されてもよい。
【０１６２】
さらに、好適な徐放性方式、たとえば、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリクスを用いて化合物を送達してもよい。種々の徐放性物質が確立されており、当該技術で周知である。徐放性カプセルは、その化学的性質によって長い時間、化合物を放出する。治療試薬の化学的性質と生物学的安定性によって、化合物の安定化のために追加の戦略が採用されてもよい。
【０１６３】
医薬組成物はまた、好適な固体の又はゲル相のキャリア又は賦形剤も含んでもよい。各キャリア又は賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。
【０１６４】
本開示の作用因子の多くが、薬学上許容可能な対イオンとの塩として提供されてもよい。塩は、相当する遊離塩基の形態よりも水性溶媒又はそのほかのプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【実施例】
【０１６５】
以下の実施例は、本明細書で記載され、請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製され、評価され、純粋に例示を意図され、範囲を限定することを意図されないことの完全な開示及び説明を当業者に提供できるように提示される。数（たとえば、量、温度など）に関して精度を確保するように尽力が為されているが、一部の誤差や偏差が説明されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃におけるものであり、常温であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。条件、たとえば、成分の濃度、所望の溶媒、溶媒の混合物、温度、圧力及び本明細書に記載される方法を最適化するのに使用することができるそのほかの反応範囲及び条件の多数の変異や組み合わせがある。そのような工程条件を最適化するのに理に適った且つ日常的な実験のみが必要とされる。
【０１６６】
１．分画されたクロレラ粗抽出物の調製
約５Ｌの蒸留水にＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの凍結乾燥した細胞（１０００ｇ）を懸濁し、約８０℃にて約１時間抽出した。遠心分離（約４３００ｒｐｍ、３０分、４℃）した後、沈殿物を蒸留水（２．５Ｌ）に再懸濁し、同一条件下で抽出した。遠心分離の後、上清を合わせ、真空下で５００ｍＬに蒸発させ、粗抽出物（ＣＥ）を作製した。
【０１６７】
９５％のエタノールで順次ＣＥを沈殿させ、遠心分離、透析及び凍結乾燥の後、以後それぞれＡ、Ｂ及びＣと呼ばれる３種の沈殿物を作製した。約２：１（ｖ／ｖ）のＣＨ３Ｃｌ−ＣＨ３ＯＨ混合物（３×５００ｍＬ）と共に３０分間撹拌することによって「沈殿物Ａ」を脱色した。得られた「脱色物Ａ」を水に溶解し、透析し、凍結乾燥して分画「Ａ−ｄ」を作製した（図１）。
【０１６８】
界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）による処理によって分画Ａ−ｄを分画した。ＣＴＡＢの水溶液［１００ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ）］とＡ−ｄ［１Ｌ；１％（ｗ／ｖ）］を混合し、混合物を約４℃で一晩静置した。遠心分離の後、不溶性部分を約２ＬのＮａＣｌ水溶液に溶解し、透析し、凍結乾燥して「Ａ−Ｐ」と本明細書で呼ばれる分画を得た（図１）。
【０１６９】
２．Ａ−Ｐの分画
セファデックスＧ−１００カラム（カラムＸＫ５０／１００、アマシャムバイオサイエンシズ、ＰＱ、カナダ；総容積１８００ｍＬ）にてサイズ排除クロマトグラフィによって分画Ａ−Ｐを分離した。約０．２ＭのＮａＣｌ約２５ｍＬに試料を溶解し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、１３．２ｍＬの分画を回収しながら、約１．１ｍＬ／分の線形流速で同一移動相にてクロマト分画を行った。分離によって２つの分画を得て（図２）、本明細書では、「Ａ−Ｐ−１」（１．８ｇ）（さらなる分析に含める）と「Ａ−Ｐ−２」（２５０ｍｇ）（さらなる分析から除外する）と呼ぶ。
【０１７０】
高い炭水化物含量を含有する分画Ａ−Ｐ−１を、Ｑ−セファロースファストフローカラム（カラムＸＫ２６／４０、総容積１８５ｍＬ）にてアニオン交換カラムクロマトグラフィによってさらに分離した。試料を約１０ｍＬの蒸留水に溶解し、前述のように濾過し、約１．０ｍＬ／分の流速でカラムに投入した。総容積の８倍の蒸留水でカラムを洗浄することによって未結合の部分を取り除き、約１．０ｍＬ／分に調整した流速にて、段階的に移動相のイオン強度を高める（０〜０．４ＭのＮａＣｌ、〜イオン強度０．４）ことによって結合した部分を溶出した。この分離で９つの分画（Ａ−Ｐ−３〜Ａ−Ｐ−１１）を得た；後の６分画（Ａ−Ｐ−６〜Ａ−Ｐ−１１）を図３に示す。０．３ＭのＮａＣｌ水溶液の総容積の３倍をカラムに通した後、溶出された最高の収量（Ａ−Ｐ−８；１６０ｍｇ）で得られた分画を性状分析のために選択した。
【０１７１】
３．Ａ−Ｐ−８の性状分析
分画Ａ−Ｐ−８の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルは、糖に特徴的な化学シフト値を有する主要シグナルを示し、多糖がこの分画の主要成分であると思われることを示している。スペクトルはまた、１７３．８ｐｐｍにてカルボキシル基及び２１．０ｐｐｍにてメチル基のシグナルを示し、それによって多糖は部分的にＯ−アセチル化されたことを示す。多糖の試料を脱Ｏ−アセチル化した。１００ｍｇのＡ−Ｐ−８の試料を５０ｍＬの１２．５％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ水溶液で約３７℃にて約１６時間処理した。透析と凍結乾燥の後、脱−Ｏ−アセチル化分画（Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ；８６ｍｇ）を回収した。
【０１７２】
分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯのプロトンを切り離した３１Ｐ−ＮＭＲのスペクトル（図４）はおよそ−２．１ｐｐｍにて単一の共鳴を示す。これは、単離された多糖がリン酸化されていることを示すホスホジエステル基の特徴である。硫酸エステルの濁度に基づく分析はＯ−硫酸化の非存在を示す一方で、１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲスペクトルにおけるカルボキシルシグナルの欠如は（図５）、ウロン酸の非存在を示す。
【０１７３】
標準の酢酸アルジトール法を用いてこの単糖単離物の組成を決定した。この方法によって、分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯがガラクトース、グルコース、マンノース及び３−Ｏ−メチルヘキソースをそれぞれ１に対して４．５、１．５、１．５のモル比で含むことが示された。脱リン酸化工程に続いてこの方法を実施した場合、グルコース、マンノース及び３−Ｏ−メチルヘキソースの量に対するガラクトースの量は、１に対して１０、１．５、１．５に増加した。
【０１７４】
約４℃にて約４８時間保持する間に約４８％（ｖ／ｖ）のＨＦ水溶液約３ｍＬで処理することによって分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ（４０ｍｇ）の多糖を脱リン酸化した。窒素流のもとで蒸発によるＨＦの除去の後、乾燥した混合物を水に溶解し、凍結乾燥して脱リン酸化分画（Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ；３０ｍｇ）を得た。
【０１７５】
次いでバイオゲルＰ−２（米国カリフォルニア州、バイオ・ラッド）カラム（ＸＫ１６／４０、総容積７０ｍＬ）にてサイズ排除クロマトグラフィによって脱リン酸化混合物（Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ）を分離した。この試料を約１ｍＬの脱イオン水に溶解し、濾過し、約０．５ｍＬ／分の流速にて同一移動相でクロマト分画し、０．５ｍＬの分画を回収した。
【０１７６】
クロマト分画の分離によって３つの分画が得られたが（図６）、高分子量分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１（２０ｍｇ）を別にして、さらなる分析に用い、２つの分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−２（１．３ｍｇ）とＡ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−３（１．４ｍｇ）を含めた。これら２つの後者の分画は一部重なって、およそ１：１のモル比で溶出された。１Ｄと２ＤのＮＭＲデータ（図７及び図８に示す１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５スペクトル）の分析は、分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−３及びＡ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−２がそれぞれ、Ｄ−マンノースと３−Ｏ−メチル−マンノースの単糖形態で構成される（それぞれ表１及び表２に化学シフトを列記する）ことを示唆した。
【０１７７】
データは、脱リン酸化の際、放出される２種類の構造を提示している。第１の型では、２つの糖が、一方の残基のアノマー位から他方の単位の任意の位置（Ｏ−１以外）へホスホジエステル基を介して一緒に連結され、鎖はホスホジエステル結合を介して主鎖に連結される。第２の型では、ホスホジエステル結合を介して双方の断片が、多糖主鎖に連結される末端単糖単位（分枝鎖単位）として存在する。個々の単糖の重量からＤ−マンノースと３−Ｏ−メチルマンノースの比は１対１であると推察される。
【０１７８】
【表１】
2011522911.tif 000006
【０１７９】
【表２】
2011522911.tif 000007
分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲスペクトル（図９）は、１０３．６ｐｐｍにてアノマー炭素（Ｃ−１）についての主要シグナル１つと１０４．６ｐｐｍ（主）及び１０４．４（従）にて近接する２つのほかのアノマーシグナルを示す。５００ＭＨｚでの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトル（図１０）は、２セットのアノマープロトン（Ｈ−１）シグナルを示し、一方は４．５２ｐｐｍに中心があり（ｄ，３ＪＨ−１，Ｈ−２，〜７．９Ｈｚ、標識Ｂ）、もう一方は、４．７３ｐｐｍに中心がある広い二重のシグナル（標識Ａ）として現れ、約５．５Ｈｚのピーク分離を持つ。アノマーシグナルに加えて、３．３３ｐｐｍにおけるシグナルが上手く分離された。４．７３ｐｐｍにおけるシグナル対４．５２又は３．３３ｐｐｍにおけるシグナルの積分は、５００及び８００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルの双方において約２対１の比が得られた。前者のシグナルがガラクトースに起因する一方で、後者の２つのシグナルがグルコースに起因するということは、ガラクトースとグルコースのモル比が２対１であることを示す。１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルはまた、不純物に起因する多数の低強度のシグナルも含有する（図１０）。
【０１８０】
４．５２ｐｐｍにおけるＨ−１シグナルから開始して３．７７ｐｐｍ及び３．９７ｐｐｍにおけるＨ−６シグナルまでの、８００ＭＨｚでのＴＯＣＳＹのスペクトルにおけるトレース接続性によって残基Ｂのプロトンスピン系を完全に特定した（図１１）が、個々の１Ｈと１３Ｃの共鳴の配置はＣＯＳＹ（図１２）、１Ｈ１３Ｃ−ＨＳＱＣ（図１３）及びＨＭＢＣのデータ（図１４）の解析によって行った。環状プロトンすべてについて８〜１０Ｈｚ（表３）の範囲における大きさの大きいビシナルカップリング定数は、残基Ｂについてβ−グルコピラノシル配置を示す。βとしてのアノマー配位の配置は、１３ＣカップリングＨＳＱＣ実験での１０３．６ｐｐｍにおけるＣ１シグナルから測定された１６３Ｈｚの大きさの小さい１ＪＣ−１，Ｈ−１カップリングによって確認されたが、それは通常、軸配向のアノマー（Ｈ−１）プロトンである。置換されていないメチルβ−グルコピラノシドについて報告された値を持つ単糖（表３）の１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフトすべてについての値間での一致に基づいて置換されていない分枝鎖残基としてこのβ−グルコピラノシル残基を割り当てた。
【０１８１】
１３ＣカップリングＨＳＱＣ実験における１０４．６ｐｐｍと１０４．４ｐｐｍにおけるＣ−１シグナルから測定された１６３Ｈｚの１ＪＣ−１，Ｈ−１カップリングからのβとして、４．７３ｐｐｍに中心があるＨ−１シグナルを有するガラクトースのアノマー配位を割り当てた。８００ＭＨｚでのＣＯＳＹのスペクトル（図１２）では、Ｈ−１シグナルのこのセットは、Ｈ−２（ＨＳＱＣスペクトルからの７０．９ｐｐｍでのＣ−２）に割り当てられた３．８３ｐｐｍ（ｔ，Ｊ〜９．１）でのシグナルとの交差ピークを示した。後者のシグナルは、Ｈ−３（ＨＳＱＣスペクトルからの８２．５ｐｐｍと８２．６ｐｐｍでのＣ−３）に割り当てられた３．８９ｐｐｍ（ｔ，Ｊ〜９．４）でのシグナルとの交差ピークを示した。ＣＯＳＹのスペクトルにおける３．８９ｐｐｍでのＨ−３シグナルからの交差相関分析（図１２）は、一方が４．２３ｐｐｍにあり、もう一方が４．２６ｐｐｍにある、冷却プローブ（図１０）での５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける二重項（３ＪＨ−３，Ｈ−４  〜２．５Ｈｚ）として双方に出現する２つのＨ−４シグナル（ＨＳＱＣスペクトルからの６９．１ｐｐｍでのＣ−４）の存在を示した。
【０１８２】
参照のメチルヘキソピラノシドのそれとの１Ｈ／１３Ｃの化学シフトの比較と、９〜９．５Ｈｚの範囲におけるＨ−２及びＨ−３についての大きさの大きいビシナルカップリング定数と、それぞれ２．５Ｈｚの大きさの小さい３ＪＨ−３，Ｈ−４カップリングと、メチルβガラクトピラノシドのそれに関する８２．５と８２．６ｐｐｍ（＋８．７ｐｐｍ）でのＣ−３シグナルの反遮蔽に基づいて、４．７３ｐｐｍに中心があるＨ−１シグナルを持つ残基を１，３結合のβ−ガラクトピラノシル残基に割り当てた。これらの結果は、多糖の主鎖が、未だに議論されたことがない位置で置換されていないβ−グルコピラノシル分枝を持つ１，３結合のβ−ガラクトピラノシル反復単位から成ることを示している。
【０１８３】
８００ＭＨｚでのＣＯＳＹのスペクトル（図１２）では、Ｈ−５（ＨＳＱＣスペクトルからの７５．４ｐｐｍにおけるＣ−５）に割り当てられた３．７６ｐｐｍでのシグナルとの交差ピークを有するように４．２３ｐｐｍでのＨ−４シグナルが現れる。ＣＯＳＹのスペクトルにおける交差相関分析及びＨＳＱＣのスペクトル（図１３）の検討から、３．８１／６１．６ｐｐｍでの１Ｈ／１３Ｃの対をＨ−６／Ｃ−６に割り当てた。この残基はＡＩと名付けられ、６−非置換の１，３−結合ガラクトース単位である。
【０１８４】
他方、４．２６ｐｐｍにおけるＨ−４シグナルは３．９６ｐｐｍでのシグナル（Ｈ−５に割り当てられた）との交差ピークを示した。単位ＡＩについてのＨ−５の値に関してこのＨ−５（＋０．２ｐｐｍ）の反遮蔽は、このガラクトース残基が６位で置換されると思われることを示唆する。ＨＳＱＣのスペクトルでは、３．９６ｐｐｍにおけるＨ−５シグナルからの２つの１３Ｃシグナルへの相関が見い出され、７４．２ｐｐｍでの一方をＣ−５に割り当て、７０．０ｐｐｍでのもう一方をＣ−６に割り当てた（１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルでは陰性）。同様にＣＯＳＹのスペクトルでは３．９６ｐｐｍのシグナルに相関する４．０７ｐｐｍでのプロトンシグナルには、ＨＳＱＣのスペクトル（図１３）では７０．０ｐｐｍでのＣ−６シグナルが相関する。この後者の交差ピークは、２つのＨ−６間でのジェミナルカップリング又はＨ−６のＨ−５へのビシナルカップリングのいずれかから生じ得る。メチルβ−ガラクトピラノシドのそれに関するＣ−６シグナル（＋８．０ｐｐｍ）の反遮蔽に基づいてこの残基を１，３，６−結合のガラクトース単位に割り当て、ＡＩＩと名付けた。
【０１８５】
８００ＭＨｚで６０ミリ秒の混合時間にて記録されるＨＭＢＣのスペクトル（図１４）の解析によってガラクトースＡＩとＡＩＩ及びグルコース残基（Ｂ）の１Ｈと１３Ｃの化学シフトの配置を確認した。８２．５ｐｐｍと８２．６ｐｐｍにおけるガラクトースのＣ−３シグナルから、Ｈ−２ｓ（３．８３ｐｐｍ）とＨ−４ｓ（４．２３と４．２６ｐｐｍ）への２つの結合の残基内相関が見い出されたと共に、残基内経路も可能であるためにグリコシド結合に関与する残基間経路に明らかに割り当てることができないＨ−１ｓ（４．７３ｐｐｍ）への３つの結合の相関も見い出された。１０４．６ｐｐｍにおけるＣ−１シグナルから、３．８３ｐｐｍにおけるＨ−２ｓへの２つの結合の残基内相関が観察されたと共に、３．７６ｐｐｍにおける残基ＡＩのＨ−５と３．９６ｐｐｍにおける残基ＡＩＩのＨ−５に対する３つの結合の残基内経路からの相関も観察された。３．８９ｐｐｍにおけるＨ−３に対する３つの結合の相関も観察されたが、残基内又は残基間の経路に割り当てることはできなかった。
【０１８６】
それぞれ４．５２ｐｐｍと１０３．６ｐｐｍにおけるグルコース残基のＨ−１とＣ−１のシグナル間で及びそれぞれ７０．０ｐｐｍと３．９６ｐｐｍにおけるガラクトースＡＩＩのＣ−６とＨ−６のシグナル間で、スペクトルは交差ピークも示した（図１４）。これらの交差ピークをこれらの位置が関与する残基間経路に割り当て、非置換の分枝鎖β−グルコピラノシル残基（Ｂ）が、１，３，６−結合のβ−ガラクトピラノシル残基ＡＩＩに分枝するＯ−６を介して多糖の主鎖に連結することを立証する。
【０１８７】
８００ＭＨｚにて２００ミリ秒の混合時間のＮＯＥＳＹのスペクトルを記録することによって、非置換の分枝鎖β−グルコピラノシル、１，３結合の及び１，３，６結合のβ−ガラクトピラノシル残基としての個々の残基の配置、並びに結合パターンを確認した（図１５）。残基内経路を介したアノマープロトン（Ｈ−１）からのＨ−３ｓ及びＨ−５ｓへの空間を介した相関は、単糖残基すべてのβ−アノマー配位に一致する。ガラクトピラノシル残基については、β−（１→３）−グリコシド結合の結果としての残基間経路からＨ−１／Ｈ３の相関が生じてもよい。一方、４．５２ｐｐｍにおける非置換の分枝鎖β−グルコピラノシル残基のＨ−１から３．９６ｐｐｍにおける１，３，６結合のβ−ガラクトピラノシル残基のＨ−６シグナルへの空間を介した相関は、これらの位置が関与するグリコシド結合に明らかに割り当てられた（図１５）。
【０１８８】
【表３】
2011522911.tif 000008
主鎖ガラクトシル単位と分枝鎖グルコシル単位の２対１のモル比と、ＮＭＲデータの予備的解析からわずか２つのガラクトシル単位が存在するという事実に基づいて、以下に示すように、６位における非置換のβ−グルコピラノシル単位によるβ−（１→３）ガラクタン主鎖の規則的な交互の置換を有する脱リン酸化分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰの単純な構造。
【０１８９】
【化３】
2011522911.tif 000009
規則的な交互の置換の非存在下では、ガラクトース上でのグルコースの無作為な置換パターンを考慮に入れる極端なモデルは、各３つのガラクトース単位の８つの組み合わせをもたらす。理論的には、非還元末端及び還元末端からの６−置換ガラクトースへの接続は、異なった量によってガラクトース単位（中央のもの）の化学シフトに影響を及ぼすと予想されるので、８種類のガラクトース単位（中央のガラクトース、以下を参照）は同等の確率で観察される。これら８種の可能性を以下に示す。
組み合わせ１〜ＩＶ（中央の６−非置換ガラクトース残基）
【０１９０】
【化４】
2011522911.tif 000010
還元末端及び非還元末端から６−非置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９１】
【化５】
2011522911.tif 000011
非還元末端から６−置換Ｇａｌに及び還元末端から６−非置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９２】
【化６】
2011522911.tif 000012
非還元末端から６−非置換Ｇａｌに及び還元末端から６−置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９３】
【化７】
2011522911.tif 000013
還元末端及び非還元末端から６−置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
組み合わせＶ〜ＶＩＩＩ（中央の６−置換ガラクトース残基）
【０１９４】
【化８】
2011522911.tif 000014
還元末端及び非還元末端から６−非置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９５】
【化９】
2011522911.tif 000015
非還元末端から６−置換Ｇａｌに及び還元末端から６−非置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９６】
【化１０】
2011522911.tif 000016
非還元末端から６−非置換Ｇａｌに及び還元末端から６−置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
【０１９７】
【化１１】
2011522911.tif 000017
還元末端及び非還元末端から６−置換Ｇａｌに接続される中央のＧａｌ残基
ＮＯＥＳＹのスペクトル（図１５）の実験は、４．２６ｐｐｍにおけるシグナル（ＡＩＩのＨ−４）と、これらの位置が関与する残基間経路に割り当てられた３．７６ｐｐｍにおけるシグナル（ＡＩのＨ−５）との間での交差ピークの存在を明らかにしている。このことは、１，３，６−結合のガラクトース単位ＡＩＩが非還元末端から６−非置換の１，３−結合ガラクトース単位ＡＩに接続することを立証している。それぞれ、単位ＡＩとＡＩＩの４．２３ｐｐｍと４．２６ｐｐｍにおけるＨ−４シグナルが関与する残基間経路の相関は、置換パターンの優勢な型を立証するのに役立ったが、ＡＩとＡＩＩの双方が４．７３ｐｐｍにてＨ−１を有することを考えると、４．２６／４．７３ｐｐｍと４．２３／４．７３ｐｐｍの相関（図１５）を明らかに割り当てることはできなかった（図１６）。この理由で、単位ＡＩとＡＩＩの正確な配列を明らかにすることができず、解析のこの段階では、組織化された構造と無作為の構造の双方が可能である。
【０１９８】
ガラクタン主鎖における分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ（多糖全体）と、マンノース残基の２種類の結合パターンと、リン酸化の位置の構造的配置を以下のように決定した。先ず、９６．８／５．４６ｐｐｍ及び９６．８／５．４４ｐｐｍにおけるＣ−１／Ｈ−１の対から開始する２Ｄ−ＮＭＲスペクトルデータの解析（図１８〜２１）によって分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯにおける２種類のマンノース残基（表４に列記）に関係する１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲのシグナルすべてを直接的にはっきりと割り当てた。５．４６（ｄ，Ｊ〜８Ｈｚ）及び５．４４ｐｐｍ（ｄ，Ｊ〜８Ｈｚ）におけるアノマー（Ｈ−１）化学シフトの大きさ（図１７）は、２種類のマンノース残基についてのαアノマー配位（メチルα−及びβ−マンノピラノシドについて５．０５ｐｐｍ及び４．７７ｐｐｍ）と一致し、１３ＣカップリングＨＳＱＣ実験で観察された１７３Ｈｚの１ＪＣ−１，Ｈ−１によって確認した。α−マンノピラノースにおける３ＪＨ−１，Ｈ−２カップリングがおよそ１．８Ｈｚであることを考慮すると、３ＪＨ，Ｈのために、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１７）における５．４６と５．４４（各場合、８Ｈｚ）でのＨ−１シグナルで観察されたピーク分離は大きすぎるが、参照単糖誘導体、α−Ｄ−マンノピラノース一リン酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで観察された８．５Ｈｚの３ＪＨ，Ｐカップリングと一致する大きさである。参照単糖についての１ＪＣ−１，Ｈ−１の値は１７１Ｈｚだった。これらの観察は、２種類のマンノース残基がそのアノマー（Ｏ−１）位でリン酸化されることを示唆している。
【０１９９】
この観察に一致して、９６．８ｐｐｍ（２Ｃ）におけるＣ−１の化学シフト（図５）は１０１．９ｐｐｍでのメチルα−Ｄ−マンノピラノシドの値に比べて５．１ｐｐｍによって遮蔽され、９５．０ｐｐｍにおけるα−Ｄ−マンノピラノースにおける値に関して１．８ｐｐｍによって反遮蔽されるという事実がある。このことは、２種類のマンノース残基において、アノマー中心に対してβ位に位置する外置換基が、典型的なグリコシド結合のような炭素原子ではなく、代わりに、前の結論に一致してリン酸基に由来するリン原子であることを示している。
【０２００】
２種類のマンノース残基の結合パターンは、８Ｈｚに調整した展開遅延を持つ１Ｈ３１Ｐ−ＨＳＱＣ−ＮＭＲのスペクトルを記録する（図２２）ことによって解明した。スペクトルは、それぞれ、残基内の３つ及び４つの結合カップリングの結果、α−Ｄ−マンノース（それぞれ、５．４４ｐｐｍと４．００ｐｐｍ）及び３−Ｏ−メチル−α−マンノース（それぞれ、５．４６ｐｐｍと４．２４ｐｐｍ）双方のＨ−１ｓ及びＨ−２ｓと−２．１ｐｐｍにおける３１Ｐのシグナルとの間で強い相関を示した。これらの配置は、α−Ｄ−マンノピラノース一リン酸の１Ｈ３１Ｐ−ＨＳＱＣのスペクトルにおける３ＪＨ−１，Ｐと４ＪＨ−２，Ｐカップリングの観察に一致した。同調して、α−Ｄ−マンノピラノース一リン酸の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルでも示されるパターンである３ＪＣ−２，Ｐ残基内カップリングの結果、１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルにおける二重項（Ｊ，〜７．４Ｈｚ）（図５）としてα−Ｄ−マンノースと３−Ｏ−メチル−α−マンノースのＣ−２共鳴が現れる。各種類のマンノース残基のＯ−２におけるリン酸化が考慮されたが、両種類のマンノース残基のＣ−３シグナルの二重項への分流を生じることに基づいてこの可能性は却下され、このパターンは、１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルでは認められなかった（図５）。この証拠は、α−Ｄ−マンノースと３−Ｏ−メチル−α−マンノースが双方共、ホスホジエステル基を介してそれらのアノマー位から多糖の主鎖に連結される非置換の分枝鎖単糖の形態で存在することを示す。
【０２０１】
分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの１Ｈ３１Ｐ−ＨＳＱＣのスペクトルの解析によってガラクタン主鎖におけるリン酸化の位置も割り当てた（図２２）。スペクトルは、−２．１ｐｐｍにおける３１Ｐのシグナルと、残基間カップリングに割り当てられた４．０６ｐｐｍにおけるプロトンのシグナルとの間に相関を示し、これが多糖においてリン酸化される位置であることを示唆している。後者のプロトンのシグナルが、１Ｈ１３Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトル（図１８）において６５．４ｐｐｍでのヒドロキシメチル１３Ｃのシグナル（１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲスペクトルでは陰性）に相関するということは、リン酸化が６位で生じることを示している。２種類のマンノース残基が６位にて置換されていないことに基づいて、６５．４におけるリン酸化１３Ｃのシグナルをガラクトン主鎖のガラクトシル残基又は側鎖のグルコシル残基のいずれかのＣ−６に割り当てた。この配置がどのように作られたのかを以下で記載する。
【０２０２】
脱リン酸化の際得られた高分子量の分画、Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトル（図９）における６５．４ｐｐｍでのＣ−６シグナルの非存在によって６位におけるリン酸化を確認する。脱リン酸化の前に多糖においてリン酸基を持つ炭素（６５．４ｐｐｍ）は、β−グルコピラノシル残基及びβ−ガラクトピラノシル残基の双方の非置換Ｃ−６の特徴であるさらに遮蔽された値（６４．１〜６１．６ｐｐｍ、図９）にて分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルに現れる。
【０２０３】
分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯの２Ｄ−ＮＭＲのデータ（図１８〜２１）の検討によって、化学シフト（表４を参照）がすべて分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１（表３に列記）における非置換の分枝鎖β−Ｄ−グルコピラノシル単位（Ｂ）に似ているので、グルコシル側鎖は６位で置換されていないと推察されるということは、６５．４ｐｐｍにおけるリン酸基を持つＣ−６シグナルは、多糖主鎖における内部１，３−結合ガラクトース残基から生じることを示している。６５．４／４．０６ｐｐｍにおける化学シフト値は、３種の細菌のリポ多糖における６−リン酸化されたβ−Ｄ−ガラクトピラノシル単位のＣ−６／Ｈ−６の対について報告された値と一致する。
【０２０４】
たとえば、Ｓｅｎｃｈｅｎｋｏｖａ（Ｓｅｎｃｈｅｎｋｏｖａ，  Ｓ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００４），  ３３９，  １３４２  １３４７−５）は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓのＬＰＳ、Ｏ−６にてリン酸エタノールアミン置換基を持つ１，３−結合β−Ｄ−ガラクトピラノシル単位において。Ｃ−６とＨ−６の化学シフトはそれぞれ、６５．７ｐｐｍと４．０５ｐｐｍであることを見い出した。グラム陰性細菌Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｏ−３４に由来するＬＰＳの構造的検討に関するＫuｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．による報告（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒｏａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００６），，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６  ３６１，  ２９８０−８５を参照のこと）では、還元末端からβ−Ｄ−ガラクトサミン単位のＯ−３に連結するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル単位は、Ｏ−６にてリン酸化され、Ｃ−６とＨ−６についての化学シフトはそれぞれ６５．５ｐｐｍと４．０５ｐｐｍだった。別の研究では、Ｐｅｒｅｐｅｌｏｖ（Ｐｅｒｅｐｅｌｏｖ，  Ａ．  Ｖ．．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００４），  ３３９，  ２１４５−４９）と共同研究者は、Ｋuｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂに記載されたものと同型であるが、β−Ｄ−グルコピラノシル単位によってＯ−２で分枝するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル単位が、６５．３／４．００ｐｐｍにてＣ−６／Ｈ−６を有することを報告した。
【０２０５】
グルコース残基（１，３，６−結合のガラクトースと同数）と２種類のマンノース残基の合計（１，３−結合６Ｐガラクトースと同数）の比がおよそ１：１であることに基づいて、ここで、Ｏ−６にてＡ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の６−非置換１，３−結合のガラクトースＡＩのほとんどがα−マンノピラノシル一リン酸によって置換され、１，３，６−結合のガラクトースと１，３−結合のガラクトースの比はおよそ１：１である。この比は、それぞれ４．０８ｐｐｍと４．０６ｐｐｍでのＨ−６シグナルの積分から決定することができたが、５００ＭＨｚと８００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１７）ではこれらのシグナルが重なり合うので、これをこのように行うことはできなかった。
【０２０６】
４．６８〜４．７５ｐｐの範囲でのβ−ガラクトシル残基のＨ−１ｓからの交差相関解析によって開始する８００ＭＨｚにおけるＣＯＳＹスペクトルの解析（図１９）は、それぞれ、３．８２、３．８２、３．８１及び３．８０ｐｐｍにおけるＨ−２シグナルと共に４．６９（ＧＩ）、４．７１（ＧＩＩ）、４．７２（ＧＩＩＩ）及び４．７４ｐｐｍ（ＧＩＶ）における少なくとも４つのＨ−１シグナルの存在を示した。３．８０／３．９０ｐｐｍにおける２種類のマンノース残基のＨ−６ｓ間におけるジェミナルカップリングに由来する交差ピークもこの領域に出現するという事実のために３．９０ｐｐｍの領域における個々のガラクトースのＨ−３シグナルの配置は困難であった（図１９）。ガラクトースのＨ−３ｓとＨ−４ｓの間の交差ピークの領域の検討によって、４つのＨ−３シグナルが、３．８４（ＨＳＱＣの８２．４ｐｐｍにおけるＣ−３）ｐｐｍ、３．８７（ＨＳＱＣの８３．０ｐｐｍにおけるＣ−３）ｐｐｍ、３．８８（ＨＳＱＣの８２．５ｐｐｍにおけるＣ−３）ｐｐｍ及び３．９１（ＨＳＱＣの８１．８ｐｐｍにおけるＣ−３）ｐｐｍにて検出されたが、上記の理由のためにそれらをガラクトースＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ又はＧＩＶに対して明らかに割り当てることはできなかった。
【０２０７】
１Ｈ１３Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトル（図１８）から、Ｃ−６／Ｈ−６ｓ（７０．２／４．０８、３．９５ｐｐｍ）とＣ−５／Ｈ−５（７４．２／３．９４ｐｐｍ）の対の化学シフトを、脱リン酸化分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１における残基ＡＩＩで見い出された値（表３を参照）に一致して、１，３，６−結合のβ−ガラクトシル残基のそれらの位置に割り当てた。３．９０ｐｐｍにおけるＨ−５シグナルとリン酸基を持つ炭素に相当することが以前見い出された６５．４ｐｐｍにおけるＣ−６シグナルの間のＨＭＢＣのスペクトル（図２０）での２つの結合の残基内相関の観察に基づいて、同じスペクトルにおいて、７４．０／３．９０ｐｐｍにおける１３Ｃ／１Ｈの対を１，３−結合６Ｐ−β−ガラクトシル残基のＣ−５／Ｈ−５に割り当てた。
【０２０８】
多糖の脱リン酸化された部分について、構造は交互のガラクトースにおけるグルコースの規則的な置換を有するか、又は特定のガラクトースに隣接するガラクトース上の置換の化学シフト効果は観察されるには小さすぎることが結論付けられた。リン酸化された部分の構造は、ここでは、交互のグルコース単位とα−マンノピラノシル１−リン酸単位のガラクトースへの規則的な置換パターンも有することができた。これに基づいて、以下に示されるように、グルコース単位とα−マンノピラノシル１−リン酸単位の交互のＯ−６−置換を持つ単純な構造を描けばよい。
【０２０９】
【化１２】
2011522911.tif 000018
３−Ｏ−メチル−α−マンノピラノシル１−リン酸のメチル基が１，３−結合の６Ｐガラクトースの化学シフトに影響を有さない場合、この種の構造は、等量で１，３，６−結合６Ｐガラクトース及び１，３−結合６Ｐガラクトースの一方の種類を生じる。上記に記載された単純な図は観察されず；ガラクトースＨ−１ｓの４種及びガラクトースＨ−３ｓの少なくとも４種が観察された。
【０２１０】
Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯについてのガラクトースのさらなる種類の観察は、６−Ｏ−グルコピラノシル単位及び／又は６−Ｏ−リン酸ジエステルによる置換がこのさらに収縮したポリマーにおける近隣のガラクトースの化学シフトに影響を及ぼさない、すなわち、脱リン酸化分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１の構造について第２の場合が正しいことを示している。極端な無作為モデルは、ここで６−非置換１，３−結合ガラクトースが１，３−結合６Ｐガラクトースになることを除いて上記で考慮した３つのガラクトース単位の８つの組み合わせとまったく同じ種類をもたらす。
【０２１１】
７５．５／３．７４ｐｐｍにて見い出された交差ピークを、分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１における単位ＡＩで見い出された値に一致して、６−非置換１，３−結合ガラクトースのＣ５／Ｈ−５対に割り当てた。ＣＯＳＹのスペクトルでは（図１９）、それぞれ４．６９ｐｐｍと３．７８ｐｐｍにてＨ−１とＨ−２を持つガラクトース残基が認められたが、残りのプロトンのシグナルを追跡できなかったので、それを６−非置換１，３−結合ガラクトース残基に割り当てることができなかった。それにもかかわらず、この知見は、分画Ａ−Ｐ−１０−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１における６−非置換１，３−結合ガラクトースが分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯのＯ−６にてすべてリン酸化されるわけではないという指摘である。この残基の存在は、８つの可能な型のＯ−６分枝パターンの不規則性として解釈される。
【０２１２】
ＮＭＲの証拠から、構造は規則的に交代性であるわけではなく、無作為であってもよく、この段階では決定することができない一部の組織化（たとえば、ブロック）を有してもよく、また、６位にて置換されていない一部のガラクトース単位も含むことが結論付けられる。
【０２１３】
【表４】
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前者が、取り除かれて構造解析を円滑にし、Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯを提供するＯ−アセチル基を含有するという点で、分画Ａ−Ｐ−８の元々の多糖の構造は分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ−１のそれとは異なる。
【０２１４】
分画Ａ−Ｐ−８（脱Ｏ−アセチル化の前）とＡ−Ｐ−８−ｄｅＯ（脱Ｏ−アセチル化の後）の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５のスペクトルを比較することによってＯ−アセチル化の部位を割り当てた。脱Ｏ−アセチル化分画のスペクトルでは、最も顕著な変化は、１／３のピーク高さをもつ広がったピークの出現ではなく、７０．５ｐｐｍにおける隣接するマンノースのＣ−２シグナルに匹敵する強度を持つ単一ピークとして出現する７０．９ｐｐｍにおけるガラクトースのＣ−２シグナルに相当する（図２３）。これは、一部のガラクトースがＯ−２にてＯ−アセチル化されるという指摘である。非Ｏ−アセチル化Ｃ−２シグナルは割り当てられなかった。ガラクトースのＣ−１上のＣ−２におけるアセチル化の効果が明瞭に認められ；脱Ｏ−アセチル化の前では、Ｃ−１は広くて強度の低いシグナルとして出現するが、脱Ｏ−アセチル化の後では、２倍のピーク高さをもつ狭いシグナルが認められ；同様に、Ｃ−３に割り当てられたシグナルの群のピーク高さは脱Ｏ−アセチル化で倍加する（図２４）。
【０２１５】
脱Ｏ−アセチル化された分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯにおける１，３，６−結合ガラクトース単位のＣ−５に割り当てられたが、未処理の分画Ａ−Ｐ−８の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルには現れない７４．２ｐｐｍにおけるシグナル（図２３）は、これらの残基のＯ−４のＯ−アセチル化の結果である可能性が最も高い。ガラクトースの４位におけるＯ−アセチル化の存在は、ガラクトースのＣ−４の６９．０ｐｐｍの領域の検討によっては明らかに立証できなかった。それにもかかわらず、この領域における広いシグナルは、ピーク高さでおよそ倍加し、脱Ｏ−アセチル化で約０．８ｐｐｍから約０．６ｐｐｍに狭くなり、Ｏ−アセチル化の結果である可能性が最も高い（図２３）。
【０２１６】
７０．２ｐｐｍ及び特に６５．４ｐｐｍにおける１，３，６−結合及び１，３−結合の６ｐガラクトースのＣ−６のシグナルのピークの強度と形状はアセチル基の取り外しによって影響を受け；脱Ｏ−アセチル化の後、それらはさらに狭くなり、さらに強度が大きくなり、それは両者の残基のＯ−４ｓでのある程度のＯ−アセチル化の結果である可能性が最も高い。未処理の分画のスペクトルにおける６５．６ｐｐｍ、６４．７ｐｐｍ及び６４．３ｐｐｍにおける強度の小さいＣ−６のシグナルは脱Ｏ−アセチル化した多糖において６５．４ｐｐｍの１つのシグナルに縮合する（図２３）。
【０２１７】
８００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける２．１０ｐｐｍ領域（３の因数で割られる）でのアセチル基のメチルプロトンの積分と、４．７２ｐｐｍ領域でのガラクトースのアノマーシグナルの合計の比から、ガラクトース単位のおよそ３５パーセントがＯ−アセチル化されることが判定された。
【０２１８】
分画Ａ−Ｐ（Ａ−Ｐ−３〜Ａ−Ｐ−７、Ａ−Ｐ−９〜Ａ−Ｐ−１１）のアニオン交換クロマトグラフィ後の残りの分画（示さず）の１３Ｃ−ＤＥＰＴＱ１３５ＮＭＲのスペクトルも記録した。スペクトルすべてが類似したパターンのシグナルの位置及び強度を示したということは、多糖すべてが類似した反復単位から成るが、分子サイズが異なることを示している。
【０２１９】
Ａ−Ｐに由来するリン酸化された分画の投与の際の、マクロファージ細胞株による一酸化窒素の産生から測定された免疫学的試験の結果を図２５に示す。粗抽出物（分画ＬＷ−３−３８−１）に一致して、少ない用量の１．６７μｇ／ｍＬで投与されたＡ−Ｐ−２を除いて、分画Ａ−Ｐ−１とＡ−Ｐ−２の投与の際、産生された一酸化窒素のレベルは試験したすべての用量にて１５μＭを超えたという事実によって判断されるように、分画Ａ−ＰのセファデックスＧ−１００上でのサイズ排除クロマトグラフィの結果得られた分画Ａ−Ｐ−１（ホスホグリカンの混合物）とＡ−Ｐ−２（ホスホグリカン−タンパク質の複合体の混合物であると思われる）は、双方とも良好な免疫賦活剤である。
【０２２０】
分画Ａ−Ｐ−１のアニオン交換クロマトグラフィの結果生じた種々のホスホグリカンを含有する分画の免疫賦活活性も図２５に示す。ＮａＣｌの低濃度でアニオン交換カラムから溶出されたホスホグリカン（Ａ−Ｐ−３とＡ−Ｐ−５）は、貧弱な免疫賦活剤である。それに続く３つの分画、Ａ−Ｐ−６、Ａ−Ｐ−７及びＡ−Ｐ−８は用量の大きな１５．０μｇ／ｍＬで検出可能な一酸化窒素の産生を示すのみであった。３つの分画のうち、Ａ−Ｐ−８は、さらに高い濃度（０．３Ｍ）のＮａＣｌを用いてアニオン交換カラムから溶出されたが、ほかの２つの分画に比べて大きな用量でさらに大きな一酸化窒素の値を示したので最も活性があった。分画Ａ−Ｐ−９のホスホグリカンは、０．３ＭのＮａＣｌを用いて分画Ａ−Ｐ−８に続いてアニオン交換カラムから溶出された。後者の分画とは異なって、分画Ａ−Ｐ−９のホスホグリカンが、投与された中程度の用量（５．０μｇ／ｍＬ）で一酸化窒素の産生を誘導したということは、これがさらに良好な免疫賦活剤であることを示している（図２５）。他方、ホスホグリカンを含有し、それぞれ０．３５Ｍと０．４ＭのＮａＣｌを用いてアニオン交換カラムから溶出された分画Ａ−Ｐ−１０とＡ−Ｐ−１１は、試験した分画すべてのうちで最大の免疫賦活活性を示し、結果は粗抽出物（分画ＬＷ−３−３８−１）で認められたものに匹敵した（図２５）。これらの結果から、アニオン交換マトリクスからホスホグリカンを分離するのに用いた移動相のイオン強度と、マクロファージにおいて一酸化窒素の産生を誘導する能力との間の相関が明瞭に認められる。
【０２２１】
リン酸マンノシルとグルコシル及びガラクトシルの単位との比は、分画すべてについてほぼ同一であり（１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける相当するピークの積分）、それは、ホスホグリカンの分画がサイズで（したがって、アニオン性リン酸マンノシル鎖の数で）異なることを示し、それは、アニオン交換マトリクスへのそれらの親和性の差異及び免疫賦活活性における差異を説明している。
【０２２２】
試験した最高用量でのみ一酸化窒素産生を示した分画Ａ−Ｐ−８のホスホグリカンの脱リン酸化体（分画Ａ−Ｐ−８−ｄｅＯ−ｄｅＰ）の免疫学的試験が、脱リン酸化で得られた中性の高分子断片は免疫賦活活性を欠く（図２５）ことを反映したということは、α−マンノピラノシル１−リン酸の側鎖がこれらホスホグリカンの免疫賦活活性に決定的であることを示している。
【０２２３】
本明細書で開示されるのは、クロレラ抽出物を提供する工程と、該抽出物をエタノール（たとえば、９５％エタノール）に接触させて沈殿物を提供する工程と、該沈殿物を水性界面活性剤（たとえば、四級アンモニウム界面活性剤）に接触させる工程と、不溶分画を単離する工程と、約１×１０３〜約１×１０５Ｄａの分子量分画範囲を用いて不溶分画をサイズ分画する（たとえば、クロマトグラフィ、限外濾過及び／又はイオン交換クロマトグラフィによって）工程を含み、それによって多糖又は多糖複合体を提供する、本明細書で開示された組成物を提供する方法である。そのような方法から得られた沈殿物を脱色することができる（たとえば、沈殿物を２−クロロエタノールと接触させることによって）。方法はさらに、少なくとも約８０℃の温度でクロレラ細胞を水性媒体に懸濁する工程と、次いで媒体を遠心分離して沈殿物と上清を生じる工程と、その後、上清を濃縮してクロレラ抽出物を提供する工程を含むことができる。
【０２２４】
本明細書で開示された方法から得られる組成物も開示される。具体的に開示されるのは、クロレラから得られた多糖又は多糖複合体を含む組成物であり、該多糖又は多糖複合体は、約１×１０３〜約１×１０５ダルトンの分子量を有する。開示された組成物は、リン酸化された３−Ｏ−メチルマンノース残基及び／又はリン酸化されたＤ−マンノース残基を含む多糖又は多糖複合体を含むことができる。一部の態様では、多糖又は多糖複合体は硫酸化及び／又はウロン酸残基を実質的に含まなくてもよい。
【０２２５】
一部の態様では、多糖又は多糖複合体は、Ｏ−３で結合されるβ−ガラクトピラノシルの反復単位を含む。さらなる態様では、多糖又は多糖複合体は、Ｏ−６位でリン酸化された２つの３−結合β−Ｄ−ガラクトピラノシル単位とＯ−６位でグリコシル化（分枝化）された２つの３−結合β−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を含む。多糖又は多糖複合体は、本明細書で開示されるように、図２６〜３４に示す式を含むことができる。
【０２２６】
本明細書で開示されるのは、多糖又は多糖複合体と会合するタンパク質又は核酸を含む多糖又は多糖複合体でもある。
【０２２７】
本明細書で開示された組成物は、多糖又は多糖複合体及びそのほかの物質（たとえば、１以上の炭水化物、脂肪、窒素源、又はこれらの混合物）を含む栄養補完物としても使用することができる。企図される栄養補完物は、１以上の補完物、たとえば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ、葉酸、又はこれらの混合物も含むことができる。栄養補完物は、本明細書で企図されるように、さらに１以上の成分、たとえば、魚油、藻類油、真菌油、魚類油、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０２２８】
医薬製剤は、クロレラから得られる多糖又は多糖複合体と薬学上許容可能なキャリアを含むことができる。開示されるのは、対象において免疫応答を調節する方法であって、本明細書で開示された組成物、本明細書で開示された栄養補完物、又は本明細書で開示された医薬組成物又は製剤の有効量を対象に投与する工程を含む方法である。また開示されるのは、対象において細菌感染又は真菌感染を治療する方法であって、本明細書で開示された組成物、本明細書で開示された栄養補完物、又は本明細書で開示された医薬組成物又は製剤の有効量を対象に投与する工程を含む方法である。また開示されるのは、対象にワクチン接種する方法であって、ワクチンと、本明細書で開示された組成物、本明細書で開示された栄養補完物、又は本明細書で開示された医薬組成物又は製剤の有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
【０２２９】
さらに本明細書で開示されるのは、対象において免疫応答を調節するための薬物を作製するのに使用するための本明細書で開示されたような多糖又は多糖複合体の使用である。
【０２３０】
その上さらに本明細書で開示されるのは、対象において細菌感染又は真菌感染を治療するための薬物を作製するのに使用するための本明細書で開示されたような多糖又は多糖複合体の使用である。
【０２３１】
一層さらに本明細書で開示されるのは、対象にワクチン接種するための薬物を作製するのに使用するための本明細書で開示されたような多糖又は多糖複合体の使用である。
【０２３２】
本開示の範囲又は精神から逸脱することなく、本開示において種々の改変及び変異を行うことができることが当業者に明らかにであろう。本明細書で開示された主題の明細及び実践の考慮から開示のほかの実施態様が当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は、以下の特許請求の範囲によって示される本開示の真の範囲と精神と共に、例示のみとしてみなされることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ）】
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【図１６ｂ）】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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