(57)【要約】  本願発明は、ヒトのインターロイキン−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）に特異的に結合する結合性タンパク質およびその抗原結合性断片を提供する。当該結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ−２１Ｒ活性のアンタゴニストとして作用することができ、それにより一般的な免疫応答、および特にＩＬ−２１Ｒにより媒介される免疫応答、を調節する。開示した組成物および方法は、例えば、ＩＬ−２１Ｒが関連する疾患、例えば炎症性弛緩、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、癌、およびその他の免疫系疾患、の診断ならびに／または治療に用いてもよい。
2011523849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、抗体である、請求項１に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＨである、請求項１に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＬである、請求項１に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＣＤＲである、請求項１に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、抗体である、請求項７に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ｓｃＦｖである、請求項７に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＨである、請求項７に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＬである、請求項７に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＣＤＲである、請求項７に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、抗体である、請求項１３に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ｓｃＦｖである、請求項１３に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＨである、請求項１３に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＶＬである、請求項１３に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１８】
結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＣＤＲである、請求項１３に記載の単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２〜１９５、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含み、そして
ここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号６、８、１０、１２、１６３、１６４、１６９、１７０、１９４および１９５からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、
前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含み、そして
ここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号５、７、９および１１からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、
前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
請求項１９に記載の結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２〜１９５、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含み、そして
ここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号６、８、１０、１２、１６３、１６４、１６９、１７０、１９４および１９５からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、
前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２２】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ここで該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は軽鎖および重鎖を含み、そしてここで該重鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、６８、７０、７２、８８、９０、９２、９４、２１３、２１８、２１９、２４０および２４２からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ここで該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は軽鎖および重鎖を含み、そしてここで該軽鎖は、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、２１４〜２１７、２２０〜２２９、２４４、２４６、および２４８からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項２４】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、そしてここでＶＨドメインが配列番号１４、１６、１８、および２０からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項２５】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、そしてここでＶＬドメインが配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、２１５、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７および２２９からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項２６】
重鎖が配列番号８８、９０、９２、９４、２１３、２１８、２１９、２４０、および２４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖が配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、２１４、２１６、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２４４、２４６および２４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２または２３に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項２７】
単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ＡｂＡ−ＡｂＷ、Ｈ３−Ｈ６、Ｌ１−Ｌ６、Ｌ８−Ｌ２１、およびＬ２３−Ｌ２５からなる群より選択される結合性タンパク質によって認識されるＩＬ−２１Ｒエピトープに結合し、ここで、当該結合性タンパク質または抗原結合断片は、ＡｂＡ−ＡｂＷ、Ｈ３−Ｈ６、Ｌ１−Ｌ６、Ｌ８−Ｌ２１、およびＬ２３−Ｌ２５からなる群より選択される結合性タンパク質のヒトＩＬ−２１Ｒへの結合を競合的に阻害する、前記結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項２８】
配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６および２４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖、軽鎖、またはＦｖ断片を含む、請求項２７に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項２９】
配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５および２４７からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖、軽鎖またはＦｖ断片を含む、請求項２７に記載の結合性タンパク質またはその抗原結合性断片。
【請求項３０】
結合性タンパク質または抗原結合性断片のヒトＩＬ−２１Ｒに対する結合定数が、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１である、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３１】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、ＩＬ−２１により媒介されるＢａＦ３細胞の増殖を、約１．７５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する、そしてここで当該ＢａＦ細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３２】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、ＩＬ−２１により媒介されるＴＦ１細胞の増殖を、約１４．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する、そしてここで当該ＴＦ１細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３３】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、ＩＬ−２１により媒介される初代ヒトＢ細胞の増殖を、約１．９ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する、そしてここで当該Ｂ細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３４】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、ＩＬ−２１により媒介される初代ヒトＣＤ４＋細胞の増殖を、約１．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する、そしてここで当該ＣＤ４＋細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３５】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号２中の少なくとも１００の連続したアミノ酸であるいずれかの配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３６】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が、ＩＬ−２１ＲへのＩＬ−２１の結合を阻害する、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３７】
結合性タンパク質または抗原結合断片がＩｇＧ１である、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３８】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がヒトのものである、請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性タンパク質。
【請求項３９】
請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片をコードする単離された核酸。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４３】
宿主細胞が細菌、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞である請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
請求項１、２、１９または２０のいずれか１項に記載の結合性タンパク質または抗原結合性断片を含む診断用キット。
【請求項４５】
結合性タンパク質または抗原結合性断片が抗体である、請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項４６】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がｓｃＦｖである、請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項４７】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がＶＨである、請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項４８】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がＶＬである、請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【請求項４９】
結合性タンパク質または抗原結合性断片がＣＤＲである、請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、２００８年５月２３日出願の米国仮特許出願第６１／０５５，５００号の優先権の恩典を請求し、当該出願の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
[0002]本発明は、インターロイキン−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、特にヒトＩＬ−２１Ｒに結合する結合性タンパク質およびその抗原結合性断片、ならびにＩＬ−２１Ｒが関連する活性を制御する際のその使用に関する。本明細書に開示する結合性タンパク質は、例えば、ＩＬ−２１Ｒが関連する障害、例えば炎症性障害、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、血液の過剰増殖障害、および他の免疫系障害の治療および／または診断に有用である。
【背景技術】
【０００３】
[0003]抗原は、免疫応答を開始し、そしてリンパ球の２つの最大集団：Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化する。抗原と出会った後、Ｔ細胞は増殖し、そしてエフェクター細胞に分化し、一方、Ｂ細胞は増殖し、そして抗体を分泌する形質細胞に分化する。これらのエフェクター細胞は、リンパ球および他の細胞種によって分泌される小タンパク質（約３０ｋＤａ未満）である、サイトカインを分泌し、そして／またはサイトカインに応答する。
【０００４】
[0004]ヒトＩＬ−２１は、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１５に配列相同性を示すサイトカインである（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：５７−６３）。インターロイキン・サイトカイン間では配列相同性が低いにもかかわらず、サイトカインは、ファミリーを代表する「４−ヘリックスバンドル」構造への共通のフォールディングを共有する。大部分のサイトカインは、クラスＩまたはクラスＩＩサイトカイン受容体のいずれかに結合する。クラスＩＩサイトカイン受容体には、ＩＬ−１０およびインターフェロンの受容体が含まれ、一方、クラスＩサイトカイン受容体には、ＩＬ−２からＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５、ならびに造血増殖因子、レプチン、および成長ホルモンの受容体が含まれる（Ｃｏｓｍａｎ（１９９３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５：９５−１０６）。
【０００５】
[0005]ヒトＩＬ−２１ＲはクラスＩサイトカイン受容体である。ヒトＩＬ−２１およびその受容体（ＩＬ−２１Ｒ）をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、国際出願公報第ＷＯ  ００／０５３７６１号および第ＷＯ  ０１／０８５７９２号；  Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記；ならびにＯｚａｋｉら（２０００）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１１４３９−４４に記載される。ＩＬ−２１Ｒは、ＩＬ−２受容体β鎖およびＩＬ−４受容体α鎖に対して最も高い配列相同性を有する（Ｏｚａｋｉら（２０００）上記）。リガンド結合に際して、ＩＬ−２１Ｒは、共通のガンマ・サイトカイン受容体鎖（γｃ）と会合し、このγｃは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−１５の受容体複合体によって共有される（Ｏｚａｋｉら（２０００）上記；  Ａｓａｏら（２００１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：１−５）。
【０００６】
[0006]ＩＬ−２１Ｒは、リンパ系組織において、特に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ上に発現され（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記）、これによって、これらの細胞がＩＬ−２１に応答することが可能になる（ＬｅｏｎａｒｄおよびＳｐｏｌｓｋｉ（２００５）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：６８８−９８）。ＩＬ−２１Ｒが広くリンパ系に分布していることは、ＩＬ−２１が免疫制御に重要な役割を果たすことを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、ＩＬ−２１が、Ｂ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞の機能を有意に調節することが示されてきている（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記；  Ｋａｓａｉａｎら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：５５９−６９）。最近の証拠によって、ＩＬ−２１により媒介されるシグナル伝達が、抗腫瘍活性を有することが可能であり（Ｓｉｖａｋｕｍａｒら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１２：１７７−８２）、そしてＩＬ−２１が、マウスにおいて抗原が誘導する喘息を防止しうる（Ｓｈａｎｇら（２００６）Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４１：６６−７４）ことが示唆されている。
【０００７】
[0007]自己免疫において、ＩＬ−２１遺伝子の破壊および組換えＩＬ−２１の注射が、それぞれ、実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を調節することが示されてきている（Ｋｉｎｇら（２００４）Ｃｅｌｌ  １１７：２６５−７７；  Ｏｚａｋｉら（２００４）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５３６１−７１；  Ｖｏｌｌｍｅｒら（２００５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：２６９６−２７０１；  Ｌｉｕら（２００６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７６：５２４７−５４）。これらの実験系において、ＩＬ−２１により媒介されるシグナル伝達を操作すると、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、およびＮＫ細胞の機能が直接改変されることが示唆されてきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】第ＷＯ  ００／０５３７６１号
【特許文献２】第ＷＯ  ０１／０８５７９２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：５７−６３
【非特許文献２】Ｃｏｓｍａｎ（１９９３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５：９５−１０６
【非特許文献３】Ｏｚａｋｉら（２０００）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１１４３９−４４
【非特許文献４】Ａｓａｏら（２００１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：１−５
【非特許文献５】ＬｅｏｎａｒｄおよびＳｐｏｌｓｋｉ（２００５）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：６８８−９８
【非特許文献６】Ｋａｓａｉａｎら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：５５９−６９
【非特許文献７】Ｓｉｖａｋｕｍａｒら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１２：１７７−８２
【非特許文献８】Ｓｈａｎｇら（２００６）Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４１：６６−７４
【非特許文献９】Ｋｉｎｇら（２００４）Ｃｅｌｌ  １１７：２６５−７７
【非特許文献１０】Ｏｚａｋｉら（２００４）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５３６１−７１
【非特許文献１１】Ｖｏｌｌｍｅｒら（２００５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：２６９６−２７０１
【非特許文献１２】Ｌｉｕら（２００６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７６：５２４７−５４
【発明の概要】
【００１０】
[0008]本発明は、ヒトおよびネズミＩＬ−２１Ｒに特異的に結合する、結合性タンパク質、例えばヒト抗体およびその断片の単離および性質決定を記載する。本明細書記載の結合性タンパク質は、米国特許第７，４９５，０８５号に開示される抗体１８Ａ５に由来し、当該特許の全体は本明細書に援用される。本発明の結合性タンパク質は、親１８Ａ５抗体よりも、ヒトおよび／またはネズミＩＬ−２１Ｒに対してはるかにより高い度合いのアフィニティを有する。
【００１１】
[0009]本発明は、少なくとも部分的に、ＩＬ−２１Ｒ、特にヒトＩＬ−２１Ｒに、高いアフィニティおよび特異性で結合する、ＩＬ−２１Ｒ結合性剤（結合性タンパク質およびその抗原結合性断片など）を提供する。本発明の結合性タンパク質およびその抗原結合性断片はまた、本明細書において、それぞれ、「抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質」および「その断片」とも称される。１つの態様において、結合性タンパク質またはその断片は、ＩＬ−２１Ｒ活性を減少させるか、阻害するか、またはアンタゴナイズする。こうした結合性タンパク質を用いて、ＩＬ−２１Ｒ活性をアンタゴナイズすることによって、免疫応答またはＩＬ−２１Ｒが関連する障害を制御してもよい。他の態様において、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を診断に、あるいはＩＬ−２１Ｒ発現細胞に療法剤または細胞傷害剤を送達するためのターゲティング結合性タンパク質として、用いてもよい。したがって、本発明の抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質は、ＩＬ−２１Ｒが関連する障害、例えば炎症性障害、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、過剰増殖障害、および他の免疫系障害を診断し、そして治療するのに有用である。
【００１２】
[0010]したがって、１つの側面において、本発明の結合性タンパク質は、ＩＬ−２１Ｒ、特にヒトＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質（例えば単離された抗体）またはその抗原結合性断片を特徴とする。特定の態様において、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質（例えば抗体）は、１以上の以下の特性を有してもよい：（１）モノクローナル性または単一特異性結合性タンパク質である；（２）ヒト結合性タンパク質である；（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成結合性タンパク質である；（４）ｉｎ  ｖｉｖｏ生成（例えばトランスジェニックマウス系）結合性タンパク質である；（５）ＩＬ−２１ＲへのＩＬ−２１の結合を阻害する；（６）ＩｇＧ１である；（７）少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１の結合定数でヒトＩＬ−２１Ｒに結合する；（８）少なくとも約５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１の結合定数でネズミＩＬ−２１Ｒに結合する；（９）約１０−３ｓ−１またはそれ未満の解離定数でヒトＩＬ−２１Ｒに結合する；（１０）約１０−２ｓ−１またはそれ未満の解離定数でネズミＩＬ−２１Ｒに結合する；（１１）約１．７５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ヒトＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒトＩＬ−２１Ｒ発現性ＢａＦ３細胞の増殖を阻害する；（１２）約０．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ネズミＩＬ−２１Ｒにより媒介されるネズミＩＬ−２１Ｒ発現性ＢａＦ３細胞の増殖を阻害する；（１３）約１４．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ヒトＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒトＩＬ−２１Ｒ発現性ＴＦ１細胞の増殖を阻害する；（１４）約１．９ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒト初代Ｂ細胞の増殖を阻害する；（１５）約１．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１により媒介されるヒト初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を阻害する；および（１６）約５．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１により媒介されるネズミ初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【００１３】
[0011]本発明の結合性タンパク質の限定されない例示的な態様（用語「結合性タンパク質」はまた、適切なように、その抗原結合性断片も含み、そして当該断片も指す）は、本明細書において、ＡｂＡ〜ＡｂＺと称され、そしてこれらの用語と、米国仮特許出願第６１／０５５，５００号で用いる用語の相関を表２Ａに示す。本発明の結合性タンパク質の他の例示的態様、すなわちｓｃＦｖは、本明細書において、表２Ｂに詳述されるように、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５と称される。
【００１４】
[0012]本発明の１つの態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、例えば、抗体、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲであってもよい。
【００１５】
[0013]本発明の別の態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５、および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。
【００１６】
[0014]本発明のさらなる態様は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含む、単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。
【００１７】
[0015]本発明のさらに別の態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２〜１９５、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含み、そしてここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号６、８、１０、１２、１６３、１６４、１６９、１７０、１９４、および１９５からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。
【００１８】
[0016]本発明のさらに別の態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５、および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含み、そしてここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号５、７、９、および１１からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５、および２４７、からなる群より選択されるヌクレオチド配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。
【００１９】
[0017]さらに、本発明のさらなる態様は、単離された結合性タンパク質または抗原結合性断片であって、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２〜１９５、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含み、ここで当該結合性タンパク質または抗原結合性断片が、配列番号６、８、１０、１２、１６３、１６４、１６９、１７０、１９４、および１９５からなる群より選択される配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列を含む場合は、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８、からなる群より選択されるアミノ酸配列（単数または複数）と少なくとも約９５％同一である少なくとも１のアミノ酸配列をも含まなければならない、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。
【００２０】
[0018]本発明の別の態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ここで当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は軽鎖および重鎖を含み、そしてここで当該重鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、６８、７０、７２、８８、９０、９２、９４、２１３、２１８、２１９、２４０、および２４２からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列、または実質的にそれと同一である配列（例えば、実質的にそれと同一である配列には、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより同一である配列が含まれる）、または実質的にそれと相同である配列（例えば、実質的にそれと相同である配列には、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより同一である配列が含まれる）を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。さらなる態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片はＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、そして当該ＶＨドメインが配列番号１４、１６、１８、および２０からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列、あるいはそれと実質的に同一または相同である配列を含む。本発明の別の態様は、ＩＬ−２１Ｒに結合する単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ここで当該結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は軽鎖および重鎖を含み、そしてここで当該軽鎖は、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、２１４〜２１７、２２０〜２２９、２４４、２４６、および２４８からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列、あるいはそれと実質的に同一または相同である配列を含む、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。さらなる態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片はＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、そして当該ＶＬドメインが配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、２１５、２１７、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸配列、あるいはそれと実質的に同一または相同である配列を含む。さらに別の態様において、当該重鎖は配列番号８８、９０、９２、９４、２１３、２１８、２１９、２４０、および２４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして当該軽鎖は配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、２１４、２１６、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２４４、２４６、および２４８からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいはそれと実質的に同一または相同である配列を含む。
【００２１】
[0019]本発明の結合性タンパク質、例えば抗体は、生殖系列化されていてもまたはされていなくてもよい。これらは、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、またはＬ２３〜Ｌ２５が結合するのと同じＩＬ−２１Ｒエピトープまたは類似のエピトープ（例えば重複するエピトープ）に特異的に結合してもよい。他の態様において、当該結合性タンパク質は、ＩＬ−２１Ｒの断片、例えば、配列番号２または４に示すアミノ酸配列、あるいは当該配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより同一である配列に連続した、少なくとも１０、２０、５０、７５、１００、１５０、または２００アミノ酸の断片に特異的に結合する。
【００２２】
[0020]本発明の別の態様は、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５からなる群より選択される結合性タンパク質によって認識されるＩＬ−２１Ｒエピトープに結合する、単離された結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５からなる群より選択される結合性タンパク質のヒトＩＬ−２１Ｒへの結合を競合的に阻害する、前記結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６５〜１６８、１７１〜１９３、２１３〜２２９、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは当該配列に実質的に同一または相同である配列を含む、重鎖、軽鎖、またはＦｖ断片を含む。さらに別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、２３９、２４１、２４３、２４５、および２４７からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは当該配列に実質的に同一または相同である配列を含む重鎖、軽鎖またはＦｖ断片を含む。
【００２３】
[0021]さらに他の態様において、当該結合性タンパク質は、これらのＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、１またはそれより多い、２またはそれより多い、３またはそれより多い、４またはそれより多い、あるいは５またはそれより多い連続したＣＤＲ（例えばフレームワーク領域（ＦＲ）またはリンカーによって分離された２またはそれより多いＣＤＲ）または連続しないＣＤＲ（例えば少なくとも１つの他のＣＤＲおよび例えばＦＲ（単数または複数）によって分離された２またはそれより多いＣＤＲ））を含む。例えば、結合性タンパク質には、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの１つ、２つ、３つまたはそれより多いＣＤＲが含まれてもよい。
【００２４】
[0022]本開示は、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５のＶＨおよびＶＬドメイン由来の核酸配列を提供する。やはり意図されるのは、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む核酸配列である。本開示はまた、こうした核酸を含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【００２５】
[0023]本発明の結合性タンパク質は、全長であってもよい（例えば少なくとも１つの完全重鎖および少なくとも１つの完全軽鎖を含む）し、または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲ、または抗原に特異的に結合する能力を保持する全長結合性タンパク質の他の断片）のみを含んでもよい。当該結合性タンパク質には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子のいずれかから選択される定常領域、またはその一部が含まれてもよい。例えば、多様なアイソタイプの重鎖定常領域を用いてもよく、これには：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥが含まれる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダから選択可能である。当該結合性タンパク質はＩｇＧであってもよく、あるいはまた、ＩｇＧ１κまたはＩｇＧ１λであってもよい。
【００２６】
[0024]本明細書記載の抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を誘導体化するか、または別の機能分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質、例えばＦａｂ断片）に連結してもよい。例えば、本発明の結合性タンパク質を、少なくとも１つの他の分子実体、例えばとりわけ、別の結合性タンパク質（例えば二重特異性または多重特異性結合性タンパク質）、毒素、放射性同位体、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤に、機能的に連結してもよい（例えば化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方式によって）。
【００２７】
[0025]本発明の１つの態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片のヒトＩＬ−２１Ｒに対する結合定数は、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１である。別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、ＩＬ−２１により媒介されるＢａＦ３細胞の増殖を、約１．７５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害し、そして当該ＢａＦ３細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む。別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、ＩＬ−２１により媒介されるＴＦ１細胞の増殖を、約１４．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害し、そして当該ＴＦ１細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む。別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、ＩＬ−２１により媒介される初代ヒトＢ細胞の増殖を、約１．９ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害し、そして当該Ｂ細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む。さらに別の態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片は、ＩＬ−２１により媒介される初代ヒトＣＤ４＋細胞の増殖を、約１．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害し、そして当該ＣＤ４＋細胞はヒトＩＬ−２１Ｒを含む。
【００２８】
[0026]１つの態様において、本発明は、配列番号２の少なくとも１００の連続したアミノ酸であるいずれかの配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列に特異的に結合する結合性タンパク質または抗原結合性断片を提供する。別の態様は、ＩＬ−２１ＲへのＩＬ−２１の結合を阻害する、結合性タンパク質または抗原結合性断片を提供する。少なくとも１つの態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合断片はＩｇＧ１である。少なくとも１つの態様において、当該結合性タンパク質または抗原結合性断片はヒトのものである。
【００２９】
[0027]別の側面において、本発明は、少なくとも１つの抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質および医薬的に許容されうるキャリアーを含む、医薬組成物を特徴とする。医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質および少なくとも１つの他の療法剤（例えば、本明細書により詳細に記載するような、サイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、またはその組み合わせ）を含んでもよい。抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質および療法剤（単数または複数）の組み合わせもまた、本発明の範囲内である。本発明の組成物および組み合わせを用いて、例えばＩＬ−２１Ｒシグナル伝達を調節することによって、ＩＬ−２１Ｒが関連する免疫障害を制御してもよい。
【００３０】
[0028]１つの態様において、本発明の結合性タンパク質は抗体である。さらなる態様において、抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、非特異性、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成、および／または多重特異性（例えば少なくとも２つの損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体から形成される二重特異性抗体）である。
【００３１】
[0029]本発明の他の態様には、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質をコードする単離核酸、当該核酸を含む発現ベクター、および当該ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞であってもよい。
【００３２】
[0030]結合性タンパク質は、結合したまたは結合していない結合性タンパク質の検出を促進するため、検出可能物質で直接または間接的に標識されていてもよい。適切な検出可能物質には、限定されるわけではないが、多様な酵素、補欠分子族（prosthetic group）、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が含まれる。
【００３３】
[0031]別の側面において、本発明は、剤、例えば療法剤または細胞傷害剤を、ＩＬ−２１Ｒ発現性細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するかまたはターゲティングするための方法を提供する。当該方法には、ＩＬ−２１Ｒへの結合性タンパク質の結合を可能にする条件下で、被験体に抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を投与する工程が含まれる。当該結合性タンパク質を、第二の療法部分、例えば毒素にカップリングしてもよい。
【００３４】
[0032]別の態様において、本発明は、本発明の結合性タンパク質または抗原結合性断片を含む、診断キットを提供する。
[0033]本開示のさらなる側面は、一部は、説明に示され、そして一部は、説明から明らかであろうし、または本発明を実施することによって学ぶことも可能である。本発明は、請求項において示され、そして特に指摘され、そして本開示は、請求項の範囲を限定すると見なされてはならない。以下の詳細な説明には、本発明の多様な態様の例示的な提示が含まれ、これは請求されるような本発明を制限するものではない。付随する図は、本明細書の一部を構成し、そして説明と併せて、態様を例示するためのみにはたらき、そして本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】[0034]図１（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）（Promega Corporation, Madison, WI）により測定した。
【図１ｂ】図１（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）（Promega Corporation, Madison, WI）により測定した。
【図１ｃ】図１（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）（Promega Corporation, Madison, WI）により測定した。
【図２ａ】[0035]図２（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図２ｂ】図２（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図２ｃ】図２（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図３ａ】[0036]図３（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図３ｂ】図３（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図３ｃ】図３（ａ−ｃ）は、ｓｃＦｖによるマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、次に４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１とインキュベートした。４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）により測定した。
【図４ａ】[0037]図４（ａ−ｃ）は、マウスＩＬ−２１Ｒへの結合についての、親抗体１８Ａ５ＩｇＧとｓｃＦｖの競合を示している。ｓｃＦｖをビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆと混合し、混合物を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化した抗体１８Ａ５に加えた。ｍＩＬ−２１Ｒの捕捉は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出し、ｍＩＬ−２１Ｒへの結合についての競合はＡ４５０シグナルの減少により示されている。
【図４ｂ】図４（ａ−ｃ）は、マウスＩＬ−２１Ｒへの結合についての、親抗体１８Ａ５ＩｇＧとｓｃＦｖの競合を示している。ｓｃＦｖをビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆと混合し、混合物を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化した抗体１８Ａ５に加えた。ｍＩＬ−２１Ｒの捕捉は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出し、ｍＩＬ−２１Ｒへの結合についての競合はＡ４５０シグナルの減少により示されている。
【図４ｃ】図４（ａ−ｃ）は、マウスＩＬ−２１Ｒへの結合についての、親抗体１８Ａ５ＩｇＧとｓｃＦｖの競合を示している。ｓｃＦｖをビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆと混合し、混合物を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化した抗体１８Ａ５に加えた。ｍＩＬ−２１Ｒの捕捉は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出し、ｍＩＬ−２１Ｒへの結合についての競合はＡ４５０シグナルの減少により示されている。
【図５ａ】[0038]図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ａ−ｃ）に対して実施した。
【図５ｂ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ａ−ｃ）に対して実施した。
【図５ｃ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ａ−ｃ）に対して実施した。
【図５ｄ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図５ｄ−ｆ）に対して実施した。
【図５ｅ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図５ｄ−ｆ）に対して実施した。
【図５ｆ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図５ｄ−ｆ）対して実施した。
【図５ｇ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ｇ−ｉ）に対して実施した。
【図５ｈ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ｇ−ｉ）に対して実施した。
【図５ｉ】図５は、２１の重鎖／軽鎖対によるＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。図に示されている抗体を細胞に加えた。ＩＬ−２１を続けて加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ｇ−ｉ）に対して実施した。
【図６ａ】[0039]図６は、ヒトＩＬ−２１Ｒ（図６ａ−ｃ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｂ】図６は、ヒトＩＬ−２１Ｒ（図６ａ−ｃ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｃ】図６は、ヒトＩＬ−２１Ｒ（図６ａ−ｃ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｄ】図６は、ラットＩＬ−２１Ｒ（図６ｄ−ｆ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｅ】図６は、ラットＩＬ−２１Ｒ（図６ｄ−ｆ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｆ】図６は、ラットＩＬ−２１Ｒ（図６ｄ−ｆ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｇ】図６は、カニクイザルＩＬ−２１Ｒ（図６ｇ−ｉ）一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｈ】図６は、カニクイザルＩＬ−２１Ｒ（図６ｇ−ｉ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｉ】図６は、カニクイザルＩＬ−２１Ｒ（図６ｇ−ｉ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｊ】図６は、ヒトガンマ共通鎖（図６ｊ−ｌ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｋ】図６は、ヒトガンマ共通鎖（図６ｊ−ｌ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図６ｌ】図６は、ヒトガンマ共通鎖（図６ｊ−ｌ）を一過性に発現しているＣＨＯ細胞に対する２１の抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの結合を示している。ＣＨＯ細胞をＩＬ−２１Ｒ又は対照ガンマ共通鎖で一過性にトランスフェクトし、細胞に基づいたＥＬＩＳＡにおいて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで結合を検出した。
【図７ａ】[0040]図７（ａ−ｃ）は、特定の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（図７ａ、ＡｂＳ；図７ｂ、ＡｂＱ、ＡｂＴ、ＡｂＯ；図７ｃ、ＡｂＲ、ＡｂＰ、及びＡｂＵ）の結合特異性を示しており、表面プラズモン共鳴により測定した。抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は抗ヒトＩｇＧ上に捕捉され、マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−１３−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−２Ｒβ、又はヒト可溶性ＩＬ−４Ｒへの続いての結合は、BIACORE（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）装置で測定した。図７ｄは、ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒが、それぞれ特異的抗ＩＬ−２Ｒβ及び抗ＩＬ−４Ｒ抗体により捕捉されることを示している（対照）。
【図７ｂ】図７（ａ−ｃ）は、特定の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（図７ａ、ＡｂＳ；図７ｂ、ＡｂＱ、ＡｂＴ、ＡｂＯ；図７ｃ、ＡｂＲ、ＡｂＰ、及びＡｂＵ）の結合特異性を示しており、表面プラズモン共鳴により測定した。抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は抗ヒトＩｇＧ上に捕捉され、マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−１３−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−２Ｒβ、又はヒト可溶性ＩＬ−４Ｒへの続いての結合は、BIACORE（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）装置で測定した。図７ｄは、ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒが、それぞれ特異的抗ＩＬ−２Ｒβ及び抗ＩＬ−４Ｒ抗体により捕捉されることを示している（対照）。
【図７ｃ】図７（ａ−ｃ）は、特定の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（図７ａ、ＡｂＳ；図７ｂ、ＡｂＱ、ＡｂＴ、ＡｂＯ；図７ｃ、ＡｂＲ、ＡｂＰ、及びＡｂＵ）の結合特異性を示しており、表面プラズモン共鳴により測定した。抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は抗ヒトＩｇＧ上に捕捉され、マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−１３−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−２Ｒβ、又はヒト可溶性ＩＬ−４Ｒへの続いての結合は、BIACORE（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）装置で測定した。図７ｄは、ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒが、それぞれ特異的抗ＩＬ−２Ｒβ及び抗ＩＬ−４Ｒ抗体により捕捉されることを示している（対照）。
【図７ｄ】図７（ａ−ｃ）は、特定の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（図７ａ、ＡｂＳ；図７ｂ、ＡｂＱ、ＡｂＴ、ＡｂＯ；図７ｃ、ＡｂＲ、ＡｂＰ、及びＡｂＵ）の結合特異性を示しており、表面プラズモン共鳴により測定した。抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は抗ヒトＩｇＧ上に捕捉され、マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−１３−Ｈ／Ｆ、ヒトＩＬ−２Ｒβ、又はヒト可溶性ＩＬ−４Ｒへの続いての結合は、BIACORE（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）装置で測定した。図７ｄは、ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒが、それぞれ特異的抗ＩＬ−２Ｒβ及び抗ＩＬ−４Ｒ抗体により捕捉されることを示している（対照）。
【図８ａ】[0041]図８（ａ−ｄ）は、ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。示されたヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ａ〜ｂ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ｃ−ｄ）の濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。
【図８ｂ】図８（ａ−ｄ）は、ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。示されたヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ａ〜ｂ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ｃ−ｄ）の濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。
【図８ｃ】図８（ａ−ｄ）は、ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。示されたヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ａ〜ｂ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ｃ−ｄ）の濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。
【図８ｄ】図８（ａ−ｄ）は、ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。示されたヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ａ〜ｂ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（図８ｃ−ｄ）の濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。
【図９ａ】[0042]図９は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。ヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体ＡｂＳ及びＡｂＴは、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。図９ａは、ＡｂＳへのカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ結合を示している。
【図９ｂ】図９は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。ヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体ＡｂＳ及びＡｂＴは、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。図９ｂは、ＡｂＳへのヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ結合を示している。
【図９ｃ】図９は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。ヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体ＡｂＳ及びＡｂＴは、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。図９ｃは、ＡｂＴへのカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ結合を示している。
【図９ｄ】図９は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒに対する抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合を示している。ヒト抗ＩＬ−２１Ｒ抗体ＡｂＳ及びＡｂＴは、BIACORE（商標）チップに固定化された抗ヒトＩｇＧ上に捕捉された。ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの濃度を変動させることでチップから流れ出させ、結合及び解離をモニターした。図９ｄは、ＡｂＴへのヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ結合を示している。
【図１０ａ】[0043]図１０は、ＩＬ−２１Ｒ抗体のエピトープ評価を示している。図１０ａ（Ｙ軸の左の説明も参照されたい）に示した実験において、マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ（Ｈｉｓ−Ｆｌａｇ融合タンパク質）はBIACORE（商標）チップ上に固定化された抗ＩＬ−２１Ｒ抗体ＡｂＳにより捕捉された。追加の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（ＡｂＳ、ＡｂＴ、Ｄ５（Ｄ５−２０、中和抗マウスＩＬ−２１Ｒ抗体）及び７Ｃ２（非中和抗マウスＩＬ−２１Ｒ対照抗体））をチップ上に流し、捕捉されたＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへのそれらの結合をモニターした。
【図１０ｂ】[0043]図１０は、ＩＬ−２１Ｒ抗体のエピトープ評価を示している。図１０ｂに示した実験において、ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／ＦはBIACORE（商標）チップ上に固定化された抗ＩＬ−２１Ｒ抗体により捕捉された。追加の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体（ＡｂＳ、ＡｂＴ、及び９Ｄ２（非中和抗ヒトＩＬ−２１Ｒ対照抗体））をチップ上に流し、捕捉されたＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへのそれらの結合をモニターした。
【図１１ａ】[0044]図１１は、示された抗体による、ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞及びマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞の増殖の中和を示している。抗体を細胞に加えた。続いてＩＬ−２１を加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図１１ａ）、について実施した。
【図１１ｂ】図１１は、示された抗体による、ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞及びマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞の増殖の中和を示している。抗体を細胞に加えた。続いてＩＬ−２１を加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、２００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図１１ｂ）について実施した。
【図１１ｃ】[0044]図１１は、示された抗体による、ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞及びマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞の増殖の中和を示している。抗体を細胞に加えた。続いてＩＬ−２１を加え、４８時間後、増殖をCELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図１１ｃ）について実施した。
【図１２ａ】[0045]図１２は、ヒト初代Ｂ細胞のＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。示された抗体を、抗ＣＤ４０抗体及びヒトＩＬ−２１とともにヒト初代Ｂ細胞に加えた。３Ｈチミジンの取り込みを３日後に測定した。図１２ａは、ＡｂＱ、ＡｂＲ、ＡｂＳ、ＡｂＴ、ＡｂＵ、ＩＬ−１３三重変異体及び１８Ａ５親抗体間の比較を示している。
【図１２ｂ】図１２は、ヒト初代Ｂ細胞のＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。示された抗体を、抗ＣＤ４０抗体及びヒトＩＬ−２１とともにヒト初代Ｂ細胞に加えた。３Ｈチミジンの取り込みを３日後に測定した。図１２ｂは、ＡｂＴ、ＡｂＶ、ＡｂＷ、ＡｂＵ及びヒトＩｇＧ１対照（ｈＩｇ１）間の比較を示している。
【図１３】[0046]図１３は、ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。示された抗体をヒトＩＬ−２１とともに、活性化ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞へ加え、３Ｈチミジンの取り込みを３日後に測定した。
【図１４】[0047]図１４は、マウス初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２１依存性増殖の中和を示している。示された抗体をヒトＩＬ−２１とともに、活性化初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞に加え、３Ｈチミジンの取り込みを３日後に測定した。
【図１５】[0048]図１５は、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体により誘発された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の測定を示している。示された抗ＩＬ−２１Ｒ抗体でコートされたＣＦＳＥ標識ＢＪＡＢ細胞のＰＢＭＣ依存性死滅は、ヨウ化プロピジウムの取り込みにより測定した。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（RITUXAN(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA)を陽性対照として含ませ、抗ＩＬ−１３抗体を陰性対照として含ませた。
【図１６】[0049]図１６は、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体による相補的Ｃｌｑ結合を示している。示された抗ＩＬ−２１Ｒ抗体をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ヒト血清とのインキュベーション後、Ｃｌｑ結合をニワトリ抗ヒトＣｌｑ及びＨＲＰコンジュゲート抗ニワトリＩｇＹ抗体で測定した。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））を陽性対照として含ませ、抗ＩＬ−１３抗体を陰性対照として含ませた。
【図１７ａ】[0050]図１７（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＱのアミノ酸配列を示している。
【図１７ｂ】図１７（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＱのアミノ酸配列を示している。
【図１７ｃ】図１７（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＱのアミノ酸配列を示している。
【図１８ａ】[0051]図１８（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＲのアミノ酸配列を示している。
【図１８ｂ】図１８（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＲのアミノ酸配列を示している。
【図１８ｃ】図１８（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＲのアミノ酸配列を示している。
【図１９ａ】[0052]図１９（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＷのアミノ酸配列を示している。
【図１９ｂ】図１９（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＷのアミノ酸配列を示している。
【図１９ｃ】図１９（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＷのアミノ酸配列を示している。
【図２０ａ】[0053]図２０（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＳのアミノ酸配列を示している。
【図２０ｂ】図２０（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＳのアミノ酸配列を示している。
【図２０ｃ】図２０（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＳのアミノ酸配列を示している。
【図２１ａ】[0054]図２１（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＴのアミノ酸配列を示している。
【図２１ｂ】図２１（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＴのアミノ酸配列を示している。
【図２１ｃ】図２１（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＴのアミノ酸配列を示している。
【図２２ａ】[0055]図２２（ａ−ｃ）はＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＯのアミノ酸配列を示している。
【図２２ｂ】図２２（ａ−ｃ）はＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＯのアミノ酸配列を示している。
【図２２ｃ】図２２（ａ−ｃ）はＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＯのアミノ酸配列を示している。
【図２３ａ】[0056]図２３（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＰのアミノ酸配列を示している。
【図２３ｂ】図２３（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＰのアミノ酸配列を示している。
【図２３ｃ】図２３（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＰのアミノ酸配列を示している。
【図２４ａ】[0057]図２４（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３、Ｌｌ、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＵのアミノ酸配列を示している。
【図２４ｂ】図２４（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３、Ｌｌ、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＵのアミノ酸配列を示している。
【図２４ｃ】図２４（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３、Ｌｌ、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＵのアミノ酸配列を示している。
【図２５ａ】[0058]図２５（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＶのアミノ酸配列を示している。
【図２５ｂ】図２５（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＶのアミノ酸配列を示している。
【図２５ｃ】図２５（ａ−ｃ）は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）及び定常領域を含むＡｂＶのアミノ酸配列を示している。
【図２６ａ】[0059]図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｂ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｃ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｄ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｅ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｆ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２６ｇ】図２６（ａ−ｇ）は、図５、１１、１２、１３及び１４（上記）に示した結果を得るために実施された研究と同様に実施された、追加の研究からの結果を示している。
【図２７ａ】[0060]図２７は、マウスＩＬ−２１Ｒへの結合についての抗体ＡｂＴとＩＬ−２１サイトカインの競合を示している。ビヒクル又は量を増加させたＩＬ−２１を、ビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧと混合し、混合物をＥＬＩＳＡプレートに固定化されたＡｂＴに加えた。ｍＩＬ−２１Ｒの捕捉をＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出し、ｍＩＬ−２１Ｒへの結合についての競合は、Ａ４５０シグナルの減少により示されている。
【図２７ｂ】
【図２８】
【発明を実施するための形態】
【００３６】
[0061]本発明の結合性タンパク質は、最初に親抗体１８Ａ５に由来したが、重鎖および／または軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の部分のアミノ酸配列が１８Ａ５とは異なる。さらに、本発明の結合性タンパク質は、同等の形式（例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ）の１８Ａ５と比較した際、ヒトおよびネズミＩＬ−２１Ｒの両方に結合し、そしてこれらを中和する強度の改善を示す。単一の結合性タンパク質による、両種（ヒトおよびマウス）由来のＩＬ−２１Ｒの高い強度の中和は、以前は報告されてきていない。親抗体よりも高い中和強度を有する本発明の結合性タンパク質は、先に記載される剤に比較した際、より高い効率で翻訳されうる。さらに、ＶＨおよびＶＬフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒトゲノム配列にコードされる配列にマッチするように改変されてきており、それによって、本発明の結合性タンパク質で治療される患者において、ヒト抗ヒト抗体応答の潜在的可能性が減少してきている。
【００３７】
定義
[0062]本発明がより容易に理解可能になるように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体および本明細書の別の箇所に示される。
【００３８】
[0063]用語「結合性タンパク質」には、本明細書において、抗原、ターゲットタンパク質、またはペプチド、あるいはその断片（単数または複数）に結合する、任意の天然存在、組換え、合成、または遺伝子操作されたタンパク質、あるいはその組み合わせが含まれる。本発明の結合性タンパク質には、抗体が含まれてもよく、または当該結合性タンパク質は、少なくとも１つの抗体断片に由来してもよい。当該結合性タンパク質には、天然存在タンパク質および／または合成的に操作されたタンパク質が含まれてもよい。本発明の結合性タンパク質は、抗原またはその断片に結合して、複合体を形成し、そして生物学的応答を誘発する（例えば特定の生物学的活性をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする）ことも可能である。結合性タンパク質には、単離抗体断片、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれてもよい。結合性タンパク質断片にはまた、抗体の機能性断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、および抗体の単一可変ドメイン（ｄＡｂ）なども含まれてもよい。結合性タンパク質は、二重鎖または一本鎖であってもよく、そして単一結合性ドメインまたは多重結合性ドメインを含んでもよい。
【００３９】
[0064]結合性タンパク質にはまた、結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質も含まれてもよく、免疫グロブリン・ヒンジまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合したかまたは別の方式で連結された結合性ドメインポリペプチドが含まれ、これは次に、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖由来の１以上の天然または操作定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域を含む領域に融合したかまたは別の方式で連結される（より完全な説明に関しては、例えばＬｅｄｂｅｔｔｅｒら、米国特許公報２００５／０１３６０４９を参照されたい）。結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質にはさらに、ヒンジ領域ポリペプチドに融合したかまたは別の方式で連結された天然または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ３）、およびＣＨ２定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ３）に融合したかまたは別の方式で連結された天然または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ４）を含む領域が含まれてもよい。典型的には、こうした結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体に依存し細胞に媒介される細胞傷害性、補体結合、および／またはターゲット、例えばターゲット抗原への結合からなる群より選択される、少なくとも１つの免疫学的活性が可能である。本発明の結合性タンパク質は、限定されるわけではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含む、任意の種に由来してもよい。
【００４０】
[0065]用語「抗体」は、本明細書において、指定されたタンパク質またはペプチドあるいはその断片に反応性である免疫グロブリンを指す。適切な抗体には、限定されるわけではないが、ヒト抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、移植コンジュゲート化抗体（すなわち他のタンパク質、放射標識、細胞毒素にコンジュゲート化されたかまたは融合した抗体）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体が含まれる。抗体は、限定されるわけではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの抗体、ならびに抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に由来してもよい。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４より選択される重鎖定常領域を有してもよい。抗体はまた、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）より選択される軽鎖も有してもよい。本発明の抗体は、限定されるわけではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含む任意の種に由来してもよい。抗体の定常領域を改変して、例えば突然変異させて、抗体の特性を修飾してもよい（例えば：Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能の１以上を増加させるかまたは減少させてもよい）。典型的には、抗体は、あらかじめ決定される抗原、例えば障害、例えば炎症性、免疫、自己免疫、神経変性性、代謝性および／または悪性腫瘍障害と関連する抗原に特異的に結合する。
【００４１】
[0066]用語「単一ドメイン結合性タンパク質」には、本明細書において、抗原、タンパク質、またはポリペプチドに結合する、任意の単一ドメイン結合性足場が含まれる。単一ドメイン結合性タンパク質には、抗原またはその断片に結合して、複合体を形成し、そして生物学的応答を誘発する（例えば特定の生物学的活性をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする）、任意の天然、組換え、合成、または遺伝子操作タンパク質足場、あるいはその組み合わせが含まれてもよい。単一ドメイン結合性タンパク質は、天然存在タンパク質または抗体に由来してもよいし、あるいはこれらは組換え技術によって合成的に操作されるかまたは産生されてもよい。単一ドメイン結合性タンパク質は、当該技術分野にある任意のものまたは任意の将来の単一ドメイン結合性タンパク質であってもよく、そして限定されるわけではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含む、任意の種に由来してもよい。本発明のいくつかの態様において、単一ドメイン結合性タンパク質足場は、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域由来であってもよく、例えばサメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であってもよい。ＮＡＲの可変領域由来の単一ドメイン結合性足場（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法が、国際出願公報第ＷＯ  ０３／０１４１６１号およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １４（１１）：２９０１−０９に記載される。
【００４２】
[0067]他の態様において、単一ドメイン結合性タンパク質は、当該技術分野において、軽鎖を欠く重鎖抗体と記載されてきている、天然存在単一ドメイン結合性タンパク質である。こうした単一ドメイン結合性タンパク質は、例えば、国際出願公報第ＷＯ  ９４／００４６７８号に開示される。明確にするため、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体由来の可変ドメイン結合性タンパク質は、本明細書において、四鎖免疫グロブリンの慣用的なＶＨと区別するため、ＶＨＨまたは「ナノボディ」として知られる。こうしたＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）、アルパカ、およびグアナコ（ｇｕａｎａｃｏ）において作製された抗体由来であってもよい。また、ラクダ科以外の他の科を用いて、天然に軽鎖を欠く重鎖結合性タンパク質を産生してもよい。ＶＨＨ分子は、伝統的なＩｇＧ分子よりもおよそ１０倍小さい。これらは単一ポリペプチドであり、そして非常に安定で、極端なｐＨおよび温度条件に耐性である。さらに、これらは、プロテアーゼの作用に耐性であり、これは慣用的な抗体には当てはまらない。さらに、ＶＨＨをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させると、適切にフォールディングされた、高収量の機能性ＶＨＨが生じうる。さらに、ラクダ科で生成される結合性タンパク質は、抗体ライブラリーを介して、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫を介して生成される抗体によって認識されるもの以外のエピトープを認識してもよい（例えば、どちらも本明細書に援用される、国際出願公報第ＷＯ  ９７／０４９８０５号および第ＷＯ  ９４／００４６７８号を参照されたい）。
【００４３】
[0068]用語「抗原結合性ドメイン」および「抗原結合性断片」は、結合性タンパク質および抗原間の特異的結合の原因となるアミノ酸を含む、結合性タンパク質の部分を指す。結合性タンパク質によって特異的に認識されそして結合される抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合性ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよい；が、両方を含まなければならないわけではない。例えば、Ｆｄ断片は、２つのＶＨ領域を有し、そしてしばしば、損なわれていない抗原結合性ドメインの抗原結合性機能を保持する。結合性タンパク質の抗原結合性断片の例には、限定されるわけではないが：（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片である、Ｆａｂ断片；（２）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（３）２つのＶＨおよび１つのＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照されたい）；（６）単離されたＣＤＲ；ならびに（７）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子にコードされているが、組換え法を用い、ＶＬおよびＶＨ領域を対形成させて一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって、これらを連結することも可能である（ｓｃＦｖとして知られる）（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照されたい）。当業者に知られる慣用的技術を用いてこれらの結合性ドメイン断片を得て、そして損なわれていない結合性タンパク質、例えば抗体などの場合と同じ方式で、機能に関して断片を評価する。
【００４４】
[0069]用語「中和」は、シグナル伝達経路または抗原、例えばＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒシグナル伝達経路またはＩＬ−２１Ｒ抗原の活性を減少させるかまたは遮断する、結合性タンパク質またはその抗原結合性断片（例えば抗体）を指す。
【００４５】
[0070]用語「有効量」は、ＩＬ−２１Ｒ活性を制御して、臨床的症状の重症度を回復させるかまたは減少させる、あるいは所望の生物学的帰結、例えばＴ細胞および／またはＢ細胞活性の減少、自己免疫の抑制、移植片拒絶の抑制を達成するのに十分である、投薬量または量を指す。
【００４６】
[0071]用語「ヒト結合性タンパク質」には、当該技術分野に知られるヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変および定常領域を有する結合性タンパク質が含まれ、例えば、Ｋａｂａｔら（第５版  １９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  米国保険社会福祉省，  ＮＩＨ公報第９１−３２４２号に記載されるものが含まれる。本発明のヒト抗体には、例えばＣＤＲ、そして特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞突然変異によって導入される突然変異）が含まれてもよい。ヒト抗体は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多い位が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換されていてもよい。
【００４７】
[0072]句、ＩＬ−２１Ｒ活性およびその同族を「阻害する」、「アンタゴナイズする」、「遮断する」または「中和する」は、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体への結合によるＩＬ−２１Ｒの少なくとも１つの活性の減少、阻害、または別の方式での縮小を指し、ここで、減少は、同じ抗体の非存在下でのＩＬ−２１Ｒの活性に対する。ＩＬ−２１Ｒ活性は、当該技術分野に知られる任意の技術を用いて測定可能である。阻害またはアンタゴニズムは、ＩＬ−２１Ｒ生物学的活性の完全な除去を必ずしも示さない。活性減少は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くてもよい。
【００４８】
[0073]用語「インターロイキン−２１受容体」または「ＩＬ−２１Ｒ」等は、ＩＬ−２１リガンドに結合する、クラスＩサイトカインファミリー受容体を指し、ＭＵ−１（例えば、米国特許出願第０９／５６９，３８４号、ならびに米国出願公報第２００４／０２６５９６０号；第２００６／０１５９６５５号；第２００６／００２４２６８号；および第２００８／０２４１０９８号を参照されたい）、ＮＩＬＲまたはザルファ（ｚａｌｐｈａ）１１（例えば、国際出願公報第ＷＯ  ０１／０８５７９２号；  Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記；  Ｏｚａｋｉら（２０００）上記を参照されたい）としても知られる。ＩＬ−２１Ｒは、ＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体、ならびにＩＬ−４αに共有されるβ鎖に相同である（Ｏｚａｋｉら（２０００）上記）。リガンドが結合すると、ＩＬ−２１Ｒは、共通のガンマサイトカイン受容体鎖（γｃ）と相互作用し、そしてＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３（Ａｓａｏら（２００１）上記）またはＳＴＡＴ５（Ｏｚａｋｉら（２０００）上記）のリン酸化を誘導することが可能である。ＩＬ−２１Ｒは、広範囲のリンパ組織分布を示す。用語「インターロイキン−２１受容体」または「ＩＬ−２１Ｒ」等はまた、ＩＬ−２１（好ましくは哺乳動物起源のＩＬ−２１、例えばネズミまたはヒトＩＬ−２１）と相互作用することが可能であり、そして以下の特徴の少なくとも１つを有する、ポリペプチド（好ましくは哺乳動物起源のもの、例えばネズミまたはヒトＩＬ−２１Ｒ）、または文脈が必要とする場合、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す：（１）天然存在哺乳動物ＩＬ−２１Ｒポリペプチドのアミノ酸配列またはその断片、例えば配列番号２（ヒト−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（米国保険社会福祉省、メリーランド州ベセスダ）寄託番号ＮＰ ０６８５７０に対応する）もしくは配列番号４（ネズミ−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号ＮＰ ０６８６８７に対応する）に示すアミノ酸配列、またはその断片；（２）配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列に実質的に相同である、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同であるアミノ酸配列、またはその断片；（３）天然存在哺乳動物ＩＬ−２１Ｒヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列またはその断片（例えば配列番号１（ヒト−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号ＮＭ ０２１７９８に対応する）もしくは配列番号３（ネズミ−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号ＮＭ ０２１８８７に対応する）、またはその断片）；（４）配列番号１もしくは配列番号３に示すヌクレオチド配列に、実質的に相同である、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片；（５）天然存在ＩＬ−２１Ｒヌクレオチド配列もしくはその断片、例えば配列番号１もしくは配列番号３に縮重しているヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片；あるいは（６）ストリンジェントな条件、例えば非常にストリンジェントな条件下で、前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列。さらに、他の非ヒトお��び非哺乳動物ＩＬ−２１Ｒが、開示する方法において有用と意図される。
【００４９】
[0074]用語「インターロイキン−２１」または「ＩＬ−２１」は、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１５に配列相同性を示し（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記）、そしてＩＬ−２１Ｒに結合するサイトカインを指す。こうしたサイトカインは、ファミリーを代表する「４−ヘリックスバンドル」構造への共通のフォールディングを共有する。ＩＬ−２１は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞において主に発現され、そしてＮＫ、ＢおよびＴ細胞に対して影響を有すると報告されてきている（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）上記；  Ｋａｓａｉａｎら（２００２）上記）。ＩＬ−２１がＩＬ−２１Ｒに結合すると、ＩＬ−２１Ｒが活性化されて、例えばＳＴＡＴ５またはＳＴＡＴ３シグナル伝達につながる（Ｏｚａｋｉら（２０００）上記）。用語「インターロイキン−２１」または「ＩＬ−２１」はまた、ＩＬ−２１Ｒ（好ましくは哺乳動物起源のもの、例えばネズミまたはヒトＩＬ−２１Ｒ）と相互作用することが可能であり、そして以下の特徴の少なくとも１つを有する、ポリペプチド（好ましくは哺乳動物起源のもの、例えばネズミまたはヒトＩＬ−２１）、または文脈が必要とする場合、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも指す：（１）天然存在哺乳動物ＩＬ−２１のアミノ酸配列またはその断片、例えば配列番号２１２（ヒト）に示すアミノ酸配列、またはその断片；（２）配列番号２１２に示すアミノ酸配列に実質的に相同である、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同であるアミノ酸配列、またはその断片；（３）天然存在哺乳動物ＩＬ−２１ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列またはその断片（例えば配列番号２１１（ヒト）、またはその断片）；（４）配列番号２１１に示すヌクレオチド配列に、実質的に相同である、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片；（５）天然存在ＩＬ−２１ヌクレオチド配列に縮重しているヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片；あるいは（６）ストリンジェントな条件、例えば非常にストリンジェントな条件下で、前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００５０】
[0075]用語「ＩＬ−２１Ｒ活性」等（例えば「ＩＬ−２１Ｒの活性」、「ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ活性」）は、ＩＬ−２１Ｒ結合の結果として開始されるかまたは中断される、少なくとも１つの細胞プロセスを指す。ＩＬ−２１Ｒ活性には、限定されるわけではないが：（１）リガンド、例えばＩＬ−２１ポリペプチドとの相互作用、例えば該分子への結合；（２）シグナル伝達（また「シグナリング」とも呼ばれ、特定の刺激に応答して生じる細胞内カスケードを指す）およびシグナル伝達分子（例えばガンマ鎖（γｃ）およびＪＡＫ１）との会合または活性化、ならびに／あるいはＳＴＡＴタンパク質、例えばＳＴＡＴ５および／またはＳＴＡＴ３のリン酸化および／または活性化の刺激；ならびに（３）増殖、分化、エフェクター細胞機能、細胞溶解活性、サイトカイン分泌、および／または免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および巨核球の生存の調節が含まれる。
【００５１】
[0076]本明細書において、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体」は、可変領域のすべてまたは一部（例えば少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞選択（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏファージディスプレイ、タンパク質チップ、または抗原に結合する能力に関して候補配列を試験可能である任意の他の方法）で生成される抗体を指す。
【００５２】
[0077]用語「単離された」は、天然環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、由来する細胞または組織供給源由来の細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。当該用語はまた、単離されたタンパク質が、医薬組成物のために十分に純粋であるか、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも９０〜９５％（ｗ／ｗ）純粋、あるいは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である、調製物を指す。
【００５３】
[0078]句「同一パーセント」または「同一性パーセント」は、少なくとも２つの異なる配列間の類似性を指す。この同一性パーセントは、標準的整列アルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら（（１９９０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０）によって記載されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−５３）のアルゴリズム；またはＭｅｙｅｒｓら（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ４：１１−１７）のアルゴリズムによって決定可能である。パラメータセットは、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を伴うＢｌｏｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスであってもよい。また、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントも決定可能である。同一性パーセントは通常、類似の長さの配列を比較することによって計算される。
【００５４】
[0079]用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に完全にまたは部分的に由来する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。当該配列（単数または複数）は、重鎖のＶ、Ｄ、およびＪセグメント、ならびに軽鎖のＶおよびＪセグメントのｉｎ  ｖｉｖｏでの再編成によって生成されうる。あるいは、再編成が起こる、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に反応した細胞から、配列（単数または複数）が生成されうる。あるいは、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、または他の方法によって、配列（単数または複数）の一部またはすべてを得てもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。レパートリーには、１つの配列のみが含まれてもよいし、または遺伝的に多様なコレクション中のものを含む、多数の配列が含まれてもよい。
【００５５】
[0080]用語「特異的結合」、「特異的に結合する」等は、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。通常、中程度から高い容量で低いアフィニティを有する非特異的結合とは区別されるように、特異的結合は、高いアフィニティおよび低いか中程度の容量によって特徴付けられる。典型的には、結合は、結合定数Ｋａが約１０６Ｍ−１ｓ−１より高い場合、特異的と見なされる。必要な場合、結合条件を変化させることによって、特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく、非特異的結合を減少させることも可能である。適切な結合条件、例えば、結合性タンパク質の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合のために許される時間、ブロッキング剤（例えば血清アルブミンまたはミルク・カゼイン）の濃度等は、ルーチンの技術を用いて、当業者によって改善可能である。例示的な条件を本明細書に示すが、一般の当業者に知られる他の条件が、本発明の範囲内に属する。
【００５６】
[0081]本明細書において、用語「ストリンジェント」、「ストリンジェンシー」等は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。本発明の単離されたポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション・プローブおよびプライマーとして用いて、開示するポリヌクレオチドをコードするものと同一または類似の配列を有する核酸を同定し、そして単離してもよい。したがって、この方式で単離されたポリヌクレオチドを用いて、ＩＬ−２１Ｒに対する結合性タンパク質を産生するかまたはこうした結合性タンパク質を発現する細胞を同定してもよい。核酸を同定し、そして単離するためのハイブリダイゼーション法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションが含まれ、そしてこれらは当業者に周知である。
【００５７】
[0082]異なるストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーション反応を行ってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズすることの困難さ、およびこれらがハイブリダイズしたままであろう条件が含まれる。好ましくは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドは各々、減少したストリンジェンシー条件下、より好ましくはストリンジェントな条件下、そして最も好ましくは非常にストリンジェントな条件下で、対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は当業者に知られ、そして例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク（１９８９）６．３．１−６．３．６に見出されうる。水性および非水性法が、この参考文献中に記載され、そしてどちらを用いてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約４５℃での６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、その後、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５０℃での少なくとも１回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５５℃、６０℃、または６５℃での洗浄（単数または複数）でも達成される。非常にストリンジェントな条件には、例えば、０．５Ｍリン酸ナトリウム／７％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．２ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ、６５℃での少なくとも１回の洗浄が含まれる。ストリンジェンシー条件のさらなる例を以下の表１に示す：非常にストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば条件Ａ〜Ｆと同程度にストリンジェントなものであり；ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば条件Ｇ〜Ｌと同程度にストリンジェントなものであり；そして減少したストリンジェンシーの条件は、少なくとも、例えば条件Ｍ〜Ｒと同程度にストリンジェントである。
【００５８】
表１：ハイブリダイゼーション条件
【００５９】
【表１−１】
2011523849.tif 000003
【００６０】
【表１−２】
2011523849.tif 000004
【００６１】
１ハイブリッド長は、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブリダイズした領域（単数または複数）に関して予期されるものである。ポリヌクレオチドを未知の配列のターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長は、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのものと仮定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、そして最適配列相補性の単数または複数の領域を同定することによって、決定可能である。
【００６２】
２ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を用いてもよい；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間行う。
【００６３】
ＴＢ＊〜ＴＲ＊：長さ５０塩基対未満であると予期されるハイブリッドに関しては、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなくてはならず、ここでＴｍは、以下の等式にしたがって決定される。長さ１８塩基対未満であるハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さ１８〜４９塩基対の間のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｎａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そしてＮａ＋は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣに関して、Ｎａ＋＝０．１６５Ｍ）。
【００６４】
ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件のさらなる例は、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第９章および第１１章，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  セクション２．１０および６．３−６．４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９５）に提供される。
【００６５】
[0083]本発明の単離されたポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション・プローブおよびプライマーとして用いて、開示するポリヌクレオチドのアレル変異体をコードする配列を有するＤＮＡを同定し、そして単離してもよい。アレル変異体は、開示するポリヌクレオチドの天然存在代替型であり、開示するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと同一であるか、または該ポリペプチドに有意な類似性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、アレル変異体は、開示するポリヌクレオチドと、少なくとも約９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約９５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも約９９％の同一性）を有する。また、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション・プローブおよびプライマーとして用いて、開示するポリヌクレオチドと相同のポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定し、そして単離してもよい。これらの相同体は、開示するポリペプチドおよびポリヌクレオチドのものと異なる種より単離されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドであるか、または同じ種内であるが、開示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドと有意な配列類似性を持つものである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、開示するポリヌクレオチドと、少なくとも約５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約７５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性）を有し、一方、ポリペプチド相同体は、開示する結合性タンパク質／ポリペプチドと、少なくとも約３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約４５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも約６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は、哺乳動物種より単離されるものである。本発明の単離されたポリヌクレオチドをさらに、ハイブリダイゼーション・プローブおよびプライマーとして用いて、本発明の結合性タンパク質を発現する細胞および組織、ならびに当該タンパク質が発現される条件を同定してもよい。
【００６６】
[0084]句「実質的に示すように」、「実質的に同一の」、および「実質的に相同な」は、適切なアミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、ＣＤＲ（単数または複数）、ＶＨ、またはＶＬドメイン（単数または複数））が、示すような配列に比較して、同一であるかまたは（例えば保存されるアミノ酸置換を通じて）わずかな（ｉｎｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）相違しか持たないであろうことを意味する。わずかな相違には、重要でないアミノ酸変化、例えば、明記する領域の５つのアミノ酸配列中の１つまたは２つの置換が含まれる。抗体の場合、第二の抗体は、第一の抗体と同じ特異性を有し、そして第一の抗体のアフィニティの少なくとも約５０％を有する。
【００６７】
[0085]本明細書に開示する配列に実質的に同一または相同である配列もまた、本出願の一部である。いくつかの態様において、配列同一性は、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高くてもよい。あるいは、核酸セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、実質的な同一性または相同性が存在する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、あるいは実質的に精製されたかまたは実質的に純粋な型で存在してもよい。
【００６８】
[0086]用語「療法剤」等は、医学的障害またはその症状を治療するかまたは治療を補助する物質である。療法剤には、限定されるわけではないが、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の使用を補足する方式で、免疫細胞または免疫応答を調節する物質が含まれてもよい。本発明の１つの態様において、療法剤は、療法的抗体、例えば抗ＩＬ−２１Ｒ抗体である。本発明の別の態様において、療法剤は、療法的結合性タンパク質、例えば抗ＩＬ−２１Ｒナノボディである。療法剤の限定されない例および使用を本明細書に記載する。
【００６９】
[0087]本明細書において、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質（例えば抗体）の「療法的有効量」は、単回または多数回用量を被験体（例えばヒト患者）に投与した際、障害の少なくとも１つの症状または再発性障害を治療し、防止し、治癒させ、遅延させ、その重症度を減少させ、そして／または回復させるか、あるいはこうした治療の非存在下で予期されるよりも、被験体の生存を延長させるのに有効である結合性タンパク質の量を指す。
【００７０】
抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質
[0088]本出願の開示は、新規抗原結合性断片を含む新規抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を提供する。結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を得るために、当業者に知られる多くの方法が利用可能である。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて、抗体を含む抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を産生してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。また、既知の方法にしたがって、ハイブリドーマを生成することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９９を参照されたい）。次いで、標準法、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）分析を用いて、この方式で形成されるハイブリドーマをスクリーニングして、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。明記する抗原の任意の型、例えば組換え抗原、天然存在型、その任意の変異体または断片、およびその抗原性ペプチドを免疫原として用いてもよい。
【００７１】
[0089]抗体を含む結合性タンパク質を作製する１つの例示的な方法には、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；  Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１７；  Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−２８；  Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−９７；ならびに国際出願公報第ＷＯ  ９２／０１８６１９号；第ＷＯ  ９１／０１７２７１号；第ＷＯ  ９２／０２０７９１号；第ＷＯ  ９２／０１５６７９号；第ＷＯ  ９３／００１２８８号；第ＷＯ  ９２／００１０４７号；第ＷＯ  ９２／００９６９０号；および第ＷＯ  ９０／００２８０９号に記載される。
【００７２】
[0090]ディスプレイライブラリーの使用に加えて、明記する抗原を用いて、非ヒト動物、例えばカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、ニワトリ、またはげっ歯類（例えばマウス、ハムスター、またはラット）を免疫してもよい。１つの態様において、非ヒト動物には、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部が含まれる。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の巨大断片を用いて、マウス抗体産生が欠損しているマウス系統を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を持つ遺伝子に由来する、抗体などの抗原特異的モノクローナル結合性タンパク質を産生し、そして選択してもよい（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  カリフォルニア州サウザンドオークス）；  Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１；米国特許第７，０６４，２４４号；ならびに国際出願公報第ＷＯ  ９６／０３４０９６号および第ＷＯ  ９６／０３３７３５号を参照されたい）。
【００７３】
[0091]本発明の１つの態様において、当該結合性タンパク質は、非ヒト動物から得られ、そして次いで、当該技術分野に知られる組換えＤＮＡ技術を用いて修飾される（例えばヒト化、脱免疫化、またはキメラ）モノクローナル抗体である。キメラ抗体を作製するための多様なアプローチが記載されてきている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１（２１）：６８５１−５５；  Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１０）：４５２−５４；米国特許第４，８１６，５６７号および第４，８１６，３９７号；欧州出願公報第ＥＰ  ０  １７１  ４９６号および第ＥＰ  ０  １７３  ４９４号；ならびに英国特許第ＧＢ  ２  １７７  ０９６号を参照されたい）。また、例えば、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することが出来ないトランスジェニックマウスを用いて、ヒト化結合性タンパク質を産生してもよい。Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）は、本明細書記載のヒト化結合性タンパク質を調製するのに使用可能な、例示的なＣＤＲ移植法を記載する。特定のヒト結合性タンパク質のＣＤＲをすべて、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と交換してもよいし、またはいくつかのＣＤＲのみを非ヒトＣＤＲと交換してもよい。あらかじめ決定された抗原に対するヒト化結合性タンパク質の結合に必要な数のＣＤＲを交換すればよい。
【００７４】
[0092]ヒトＦｖ可変ドメイン由来の同等な配列との抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を交換することによって、ヒト化結合性タンパク質またはその断片を生成してもよい。ヒト化結合性タンパク質またはその断片を生成するための例示的な方法は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−０７；  Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；ならびに米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号；および第６，４０７，２１３号に提供される。これらの方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも１つ由来の免疫グロブリンＦｖ可変ドメインのすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、そして発現する工程が含まれる。上述のように、あらかじめ決定されたターゲットに対する抗体を産生するハイブリドーマから、ならびに他の供給源から、こうした核酸を得てもよい。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを適切な発現ベクター内にクローニングしてもよい。
【００７５】
[0093]特定の態様において、ヒト化結合性タンパク質は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換および／または逆突然変異の導入によって改善される。こうした改変された免疫グロブリン分子は、当該技術分野に知られるいくつかの技術のいずれによって作製してもよい（例えば、Ｔｅｎｇら（１９８３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：７３０８−７３；  Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ４：７２７９；  Ｏｌｓｓｏｎら（１９８２）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９２：３−１６）；国際出願公報第ＷＯ  ９２／００６１９３号；および欧州特許第ＥＰ  ０  ２３９  ４００号を参照されたい）。
【００７６】
[0094]また、例えば、国際出願公報第ＷＯ  ９８／０５２９７６号および第ＷＯ  ００／０３４３１７号に開示される方法により、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失または「脱免疫化」によって、結合性タンパク質またはその断片を修飾してもよい。簡潔には、結合性タンパク質（例えば抗体由来の結合性タンパク質など）の重鎖および軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析してもよく；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際出願公報第ＷＯ  ９８／０５２９７６号および第ＷＯ  ００／０３４３１７号に定義されるようなもの）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のため、「ペプチド・スレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と称されるコンピュータモデリングアプローチを適用してもよく、そしてさらに、国際出願公報第ＷＯ  ９８／０５２９７６号および第ＷＯ  ００／０３４３１７号に記載されるような、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフに関して、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチドのデータベースを検索してもよい。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれにも結合し、そしてしたがって、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または単一アミノ酸置換によって、検出された潜在的なＴ細胞エピトープを取り除いてもよい。典型的には、保存的置換を行う。排他的にではないが、しばしば、ヒト生殖系列抗体配列中の位に一般的なアミノ酸を用いてもよい。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−９８；  Ｃｏｏｋら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １６（５）：２３７−４２；  Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７９９−８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：４６２８−３８に開示される。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  英国ケンブリッジによってコンパイルされた）を提供する。これらの配列を、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲに関するヒト配列の供給源として用いてもよい。また、コンセンサスヒトフレームワーク領域を、例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されるように、用いてもよい。
【００７７】
[0095]特定の態様において、結合性タンパク質は、改変された免疫グロブリン定常またはＦｃ領域を含有してもよい。例えば、本明細書の解説にしたがって産生される結合性タンパク質は、エフェクター分子、例えば補体および／またはＦｃ受容体に、より強くまたはより特異性を持って結合可能であり、これが、エフェクター細胞活性、溶解、補体により媒介される活性、結合性タンパク質クリアランス、および結合性タンパク質半減期などの、結合性タンパク質のいくつかの免疫機能を調節しうる。結合性タンパク質（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体には、限定されるわけではないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃＲｎサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型が含まれる。Ｆｃ受容体は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−９２；  Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１に概説される。さらなる結合性タンパク質／抗体産生技術に関しては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｈａｒｌｏｗら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。本発明は、必ずしも、いかなる特定の供給源、産生法、あるいは結合性タンパク質または抗体の他の特別な性質にも限定されない。
【００７８】
[0096]抗体（免疫グロブリン）を含む結合性タンパク質は、典型的には、各々およそ２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖および各々およそ５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖で構成される、四量体グリコシル化タンパク質である。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と称される２つのタイプの軽鎖が抗体中で見られうる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを５つの主なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることも可能であり、そしてこれらのいくつかをさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることも可能である。各軽鎖には、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）が含まれる。各重鎖には、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域が含まれる。ＶＨに最も近位のＣＨドメインをＣＨ１と称する。ＶＨおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）からなり、これがＣＤＲと呼ばれる超可変配列の３つの領域のための足場を形成する。ＣＤＲは、抗体と抗原の特異的相互作用に関与する残基の大部分を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３（また、本明細書において、それぞれ、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３とも呼ばれる）と呼ばれ、一方、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３（また、本明細書において、それぞれ、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３とも呼ばれる）と呼ばれる。
【００７９】
[0097]ＣＤＲ３は、典型的には、抗原結合性部位内の分子多様性の最大の供給源である。ＣＤＲ  Ｈ３は、例えば、２アミノ酸残基と同程度に短くてもよいし、または２６アミノ酸より大きくてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、当該技術分野に周知である。抗体構造の概説に関しては、例えば、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８）上記を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造は、活性断片、例えば抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニットの部分、すなわち抗原結合性断片、または例えば、Ｆｃ受容体および／または補体に結合しそして／またはこれを活性化するＣＨサブユニットの部分を含むことを認識するであろう。ＣＤＲは、典型的には、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記に記載されるようなもの）を指す。抗原結合性部位を性質決定するための別の基準は、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）上記、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）上記に記載されるような超可変ループに注意を向けることである。さらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる「ＡｂＭ」定義である（一般的には、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）ＤｕｅｂｅｌおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ監修，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ハイデルベルグ中を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループまたはＡｂＭ定義ループに関して記載されるのと類似の関係を用いて、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに関して記載される態様を実行してもよい。
【００８０】
[0098]Ｆａｂ断片は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合される、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインからなる。Ｆｖ断片はより小さく、そして非共有的に連結されたＶＨおよびＶＬドメインからなる。非共有的に連結されたドメインが解離する傾向を克服するため、ｓｃＦｖを構築してもよい。ｓｃＦｖは、（１）ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に、あるいは（２）ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結する、柔軟なポリペプチドを含有する。例えば、１５量体（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドがリンカーとして使用可能であるが、他のリンカーが当該技術分野に知られる。
【００８１】
[0099]アセンブリーおよび体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は、非常に多様であり、そしてこれらの多様な遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると概算される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ（第２版  １９９５）Ｊｏｎｉｏら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ）。
【００８２】
[0100]本発明の特定の態様において、結合性タンパク質は、単一ドメイン結合性タンパク質である。単一ドメイン結合性タンパク質には、ＣＤＲが単一ドメインポリペプチドの一部である、結合性タンパク質が含まれる。例には、限定されるわけではないが、重鎖結合性タンパク質、天然に軽鎖を欠く結合性タンパク質、慣用的な四鎖抗体由来の単一ドメイン結合性タンパク質、操作結合性タンパク質、および抗体由来のもの以外の単一ドメインタンパク質足場が含まれる。単一ドメイン結合性タンパク質には、当該技術分野に知られる任意のもの、ならびに将来決定されるかまたは学ばれる単一ドメイン結合性タンパク質が含まれる。
【００８３】
[0101]単一ドメイン結合性タンパク質は、任意の種に由来してもよく、こうした種には、限定されるわけではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシが含まれる。本発明の１つの側面において、単一ドメイン結合性タンパク質は、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域由来であってもよく、例えばサメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来である。ＮＡＲの可変領域由来の単一ドメイン結合性タンパク質（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法が、国際出願公報第ＷＯ  ０３／０１４１６１号およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １４：２９０１−０９に記載される。単一ドメイン結合性タンパク質にはまた、当該技術分野において、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られる、天然存在単一ドメイン結合性タンパク質も含まれる。天然に軽鎖を欠く重鎖抗体由来のこの可変ドメインは、本明細書において、四鎖免疫グロブリンの慣用的なＶＨと区別するため、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。こうしたＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコで作製された抗体由来であってもよく、そしてときに、ラクダ科またはラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメインと呼ばれる（例えば、本明細書に援用される、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４（４）：２７７−３０２を参照されたい）。ラクダ科のもの以外の他の種もまた、天然に軽鎖を欠く重鎖結合性タンパク質を産生しうる。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。これらは単一ポリペプチドであり、そして非常に安定で、極端なｐＨおよび温度条件に耐性である。さらに、これらは、プロテアーゼの作用に耐性であり、これは慣用的な抗体には当てはまらない。さらに、ＶＨＨをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させると、適切にフォールディングされた、高収量の機能性ＶＨＨが生じうる。さらに、ラクダ科で生成される結合性タンパク質は、抗体ライブラリーを介して、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫を介して生成される抗体によって認識されるもの以外のエピトープを認識するであろう（例えば、本明細書に援用される、国際出願公報第ＷＯ  ９７／０４９８０５号および第ＷＯ  ９４／００４６７８号を参照されたい）。
【００８４】
[0102]「二重特異性」または「二重官能性」結合性タンパク質は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合性部位を有する、人工的なハイブリッド結合性タンパク質である。ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む多様な方法によって、二重特異性結合性タンパク質を産生してもよい（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５−２１；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−５３を参照されたい）。１つの態様において、二重特異性結合性タンパク質は、免疫グロブリン定常領域を介して、第二の結合性ドメインポリペプチドに連結された、第一の結合性ドメインポリペプチド、例えばＦａｂ’断片を含む。
【００８５】
[0103] 本発明記載の別の結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン・ヒンジまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合したかまたは別の方式で連結され、これが続いて、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖由来の１以上の天然または操作定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡ１のＣＨ２およびＣＨ３領域またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域に融合したか、または別の方式で連結された、結合性ドメインポリペプチドを含む結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質を含んでもよい（より完全な説明に関しては、例えば、本明細書に援用される、米国出願公報第２００５／０１３６０４９号を参照されたい）。結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質には、さらに、ヒンジ領域ポリペプチドに融合したか、または別の方式で連結された天然または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ３）、および当該ＣＨ２定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ３）に融合したか、または別の方式で連結された、天然または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（あるいはＩｇＥに完全にまたは部分的に由来する構築物の場合、ＣＨ４）を含む領域が含まれてもよい。典型的には、こうした結合性ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体結合、および／またはターゲット、例えばヒトＩＬ−２１Ｒなどのターゲット抗原からなる群より選択される、少なくとも１つの免疫学的活性が可能である。
【００８６】
[0104]本発明の結合性タンパク質はまた、ペプチド模倣体も含んでもよい。ペプチド模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣する、ペプチド含有分子である（例えば、本明細書にその全体が援用される、Ｊｏｈｎｓｏｎら，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９３）Ｐｅｚｚｕｔｏら監修，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  ニューヨークを参照されたい）。ペプチド模倣体の使用の背後にある論理的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖が、抗体および抗原間のものなどの分子相互作用を容易にする方式で、主にアミノ酸側鎖を配向させるために存在することである。ペプチド模倣体は、天然分子に類似の分子相互作用を可能にするよう期待される。これらの原理を用いて、本明細書に開示するターゲティングペプチドの天然特性の多くを有するが、改変され、そして潜在的に改善された特性を持つ、第二世代分子を操作してもよい。
【００８７】
[0105]本発明を実施するのに有用な結合性タンパク質の他の態様には、融合タンパク質が含まれる。これらの分子は、一般的に、Ｎ末端またはＣ末端で、第二のポリペプチドまたはタンパク質のすべてまたは一部に連結された、ターゲティングペプチド、例えばＩＬ−２１Ｒまたは抗ＩＬ−２１Ｒ抗体のすべてまたは実質的な部分を有する。例えば、融合タンパク質は、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするため、他の種由来のリーダー（またはシグナル）配列を使用してもよい。例えば、リーダー（またはシグナル）配列を含む、本発明の結合性タンパク質およびその抗原結合性断片のアミノ酸配列、またはこうしたアミノ酸配列をコードする核酸配列を、配列番号８７〜１０９および２３９〜２４８から選択してもよい。別の有用な融合体には、融合タンパク質の精製を容易にする、結合性タンパク質エピトープなどの、免疫学的活性ドメインの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位が含まれると、精製後の外来性ポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合には、機能ドメイン、例えば酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域の連結が含まれる。融合タンパク質内に取り込まれてもよいタンパク質またはペプチドの例には、限定されるわけではないが、細胞分裂阻害タンパク質、細胞破壊性タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管形成剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬剤、抗体、抗体のＦａｂ断片、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合性タンパク質が含まれる。融合タンパク質を生成する方法は、当業者に周知である。こうしたタンパク質は、例えば、二重官能性架橋試薬を用いて化学的に付着させることによって、完全融合タンパク質をｄｅ  ｎｏｖｏ合成することによって、あるいはターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を、第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に付着させた後、損なわれていない融合タンパク質を発現することによって、産生可能である。
【００８８】
[0106]１つの態様において、２つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠く、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えばＦｃ断片に、ターゲティングペプチド、例えばＩＬ−２１Ｒを融合させる（例えば本明細書に援用される、米国特許第６，０１８，０２６号および第５，７５０，３７５号を参照されたい）。Ｆｃ領域は、天然存在Ｆｃ領域であってもよいし、または特定の品質、例えば療法的品質、循環時間、凝集減少が改善されるように改変されていてもよい。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、典型的には、融合されない対応物よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏでより高い半減期を示す。さらに、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。
【００８９】
[0107]本発明の１つの側面は、ＩＬ−２１Ｒに結合する結合性タンパク質およびその抗原結合性断片を含む。本開示は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに由来する新規ＣＤＲを提供する。ＣＤＲを所持するために一般的に用いられるタンパク質構造は、抗体重鎖または軽鎖あるいはその一部であり、ここでＣＤＲは、天然存在ＣＤＲと会合する領域に位置する。可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔら（（１９９１）上記）に記載されるように決定可能である。
【００９０】
[0108]本発明の結合性タンパク質（およびその抗原結合性断片）の例示的態様は、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５と同定される。本発明の抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の限定されない例示的態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列番号５〜１９５、２１３〜２２９、および２３９〜２４８に示す。本発明の抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質のいくつかの例示的な態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、そのｓｃＦｖ断片、ＶＨおよびＶＬドメイン、およびＣＤＲ、ならびにその現在のコードおよび以前の名称を含めて、図１７〜２５、および表２Ａおよび２Ｂに示す。
【００９１】
表２Ａ：現在の抗体コードおよび以前の名称の相関
【００９２】
【表２−１】
2011523849.tif 000005
【００９３】
表２Ｂ：本発明の例示的な結合性タンパク質のＶＨおよびＶＬドメイン、ｓｃＦｖ、ならびにＣＤＲのアミノ酸およびヌクレオチド配列
【００９４】
【表２−２】
2011523849.tif 000006
【００９５】
【表２−３】
2011523849.tif 000007
【００９６】
【表２−４】
2011523849.tif 000008
【００９７】
[0109]本発明の抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質は、抗体定常領域またはその一部を含んでもよい。例えば、ＶＬドメインが、そのＣ末端で、ＣκまたはＣλのような軽鎖定常ドメインに付着していてもよい。同様に、ＶＨドメインまたはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびに任意のアイソタイプサブクラスのような、重鎖のすべてまたは一部に付着していてもよい。定常領域は当該技術分野に知られる（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）上記を参照されたい）。したがって、本発明の範囲内の結合性タンパク質には、当該技術分野に知られる定常領域と組み合わされた、ＶＨおよびＶＬドメイン、またはその一部が含まれる。
【００９８】
[0110]特定の態様は、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、および／またはＬ２３〜Ｌ２５由来のＦｖ断片のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはその組み合わせを含む。さらなる態様は、ＶＨおよびＶＬドメイン由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを含む。ＣＤＲ配列（単数または複数）が、配列番号５〜１９５、２１３〜２２９、および２３９〜２４８に示す配列内に存在する１以上のＣＤＲ配列（単数または複数）と同じであるかまたは類似である（すなわち不十分にしか異ならない）結合性タンパク質が、本発明の範囲内に含まれる。
【００９９】
[0111]特定の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは生殖系列であってもよく、すなわち、これらのドメインのＦＲは、生殖系列細胞によって産生されるものとマッチするように、慣用的な分子生物学的技術を用いて、突然変異される。他の態様において、ＦＲ配列は、コンセンサス生殖系列配列から異なったままである。
【０１００】
[0112]１つの態様において、突然変異誘発を用いて、結合性タンパク質を１以上の生殖系列配列により類似のものにする。これは、突然変異が、体細胞突然変異誘発を通じて、またはエラープローンＰＣＲを通じて、結合性タンパク質（例えば抗体）のＦＲ内に導入される場合、望ましい可能性もある。ＶＨおよびＶＬドメインの生殖系列配列は、ＶＢＡＳＥデータベース（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、英国）に対してアミノ酸および核酸配列整列を行うことによって、同定可能である。ＶＢＡＳＥは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）およびＥＭＢＬデータライブラリーの現在のリリース中のものを含む、千の公開された配列に渡ってコンパイルされたすべてのヒト生殖系列可変領域配列の包括的ディレクトリである。いくつかの態様において、ｓｃＦｖのＦＲは、ＶＢＡＳＥデータベース中の最も近いマッチと一致して突然変異されており、そしてＣＤＲ部分は損なわれないままである。
【０１０１】
[0113]特定の態様において、本発明の結合性タンパク質は、これらが、ヒトＩＬ−２１ＲへのＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、またはＬ２３〜Ｌ２５の結合を競合的に阻害するように、ＡｂＡ〜ＡｂＺ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、またはＬ２３〜Ｌ２５によって認識されるエピトープと同じエピトープと、特異的に反応する。こうした結合性タンパク質を、競合的結合アッセイにおいて決定してもよい。１つの態様において、ヒトＩＬ−２１Ｒに関するこれらの結合性タンパク質の結合定数（ＫＡ）は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１である。当該技術分野に知られる技術、例えばＥＬＩＳＡ、バイオセンサー技術（生物特異的相互作用分析など）または本出願に記載するものを含む他の技術を用いて、結合アフィニティを決定してもよい。
【０１０２】
[0114]本発明の結合性タンパク質は、他のタンパク質、例えばＩＬ−２１Ｒのすべてまたは一部を含む組換えタンパク質などに結合してもよい。
[0115]一般の当業者は、開示する結合性タンパク質を用いて、ＩＬ−２１Ｒと幾分異なるタンパク質を検出し、測定し、そして／または阻害することも可能であることを認識するであろう。例えば、これらのタンパク質は、ＩＬ−２１Ｒの相同体であってもよい。抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質は、配列番号２または４に示す配列中の少なくとも１００、８０、６０、４０、または２０の連続アミノ酸の任意の配列に、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより同一である配列を含むタンパク質に結合すると予期される。
【０１０３】
[0116]配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９６）Ｍｏｒｒｉｓ監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、ならびに二次および三次構造分析を行って、ここに開示する結合性タンパク質および抗原との複合体によって仮定される特異的３Ｄ構造を同定してもよい。こうした方法には、限定されるわけではないが、ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １１：７−１３）および本発明の結合性タンパク質のバーチャル提示のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋら（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中）が含まれる。
【０１０４】
[0117]本開示は、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を得るための方法を提供する。当該方法は、本明細書開示の配列から改変されたＶＨおよび／またはＶＬ配列（単数または複数）を持つ結合性タンパク質を生成する工程を含む。こうした結合性タンパク質は、当該技術分野に知られる技術を用いて、当業者によって得られうる。例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加を、ＦＲおよび／またはＣＤＲ領域中に導入してもよい。ＦＲ変化は、通常、結合性タンパク質の安定性および免疫原性を改善するように設計され、一方、ＣＤＲ変化は、典型的には、その抗原に対する結合性タンパク質のアフィニティを増加させるよう設計される。１以上のＣＤＲ配列を改変し、そしてターゲットに対する結合性タンパク質のアフィニティを測定することによって、アフィニティを増加させる変化を試験してもよい（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版  １９９５）Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【０１０５】
[0118]ＣＤＲ配列が、配列番号５〜１９５、２１３〜２２９、および２３９〜２４８に示すか、またはこれらの配列内に含まれるものと、わずかにしか異ならない結合性タンパク質が、本発明の範囲内に含まれる。典型的には、こうしたわずかな相違（単数または複数）は、アミノ酸を、類似の電荷、疎水性、または立体化学特性を有するアミノ酸で置換することを伴う。結合性タンパク質の結合特性に不都合に影響しない（例えば非置換結合性タンパク質に比較した際、５０％より多くアフィニティを減少させない）ならば、ＣＤＲ領域とは対照的に、ＦＲ領域において、より徹底的な置換もまた行ってもよい。また、結合性タンパク質を生殖系列化するため、またはその抗原結合性部位を安定化させるために、置換を行ってもよい。
【０１０６】
[0119]保存的修飾は、こうした修飾を行う分子のものと類似の機能的および化学的特性を有する分子を生じるであろう。対照的に、分子の機能的および／または化学的特性における実質的な修飾は、（１）例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての、置換領域中の分子主鎖の構造、（２）ターゲット部位での分子の電荷または疎水性、および／または（３）分子のサイズ、を維持する際の効果が有意に異なる、アミノ酸配列中の置換を選択することによって、達成可能である。
【０１０７】
[0120]例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたはまったく影響がないように、天然アミノ酸残基を規範的残基で置換することを伴ってもよい（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら（１９９８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．  ６４３：５５−６７；  Ｓａｓａｋｉら（１９９８）Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５：１−２４を参照されたい）。
【０１０８】
[0121]望ましいアミノ酸置換は（保存的であれまたは非保存的であれ）、置換が所望される時点の当業者によって、決定可能である。例えば、アミノ酸置換を用いて、分子配列の重要な残基を同定するか、あるいは本明細書記載の分子のアフィニティを増加させるかまたは減少させることも可能である。例示的なアミノ酸置換には、限定されるわけではないが、表３に示すものが含まれる。
【０１０９】
表３．例示的なアミノ酸置換
【０１１０】
【表３】
2011523849.tif 000009
【０１１１】
[0122]特定の態様において、保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成よりも、典型的には化学的ペプチド合成によって取り込まれる、非天然存在アミノ酸残基も含む。
【０１１２】
[0123]１つの態様において、変異体ＶＨドメインを作製するための方法は、開示するＶＨドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を付加するか、欠失させるか、または置換し、あるいは開示するＶＨドメインを少なくとも１つのＶＬドメインと組み合わせて、そしてＩＬ−２１Ｒ結合またはＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１活性の調節に関して、変異体ＶＨドメインを試験する工程を含む。
【０１１３】
[0124]変異体ＶＬドメインを作製するための類似の方法は、開示するＶＬドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を付加するか、欠失させるか、または置換し、あるいは開示するＶＬドメインを少なくとも１つのＶＨドメインと組み合わせて、そしてＩＬ−２１Ｒ結合またはＩＬ−２１Ｒ活性の調節に関して、変異体ＶＬドメインを試験する工程を含む。
【０１１４】
[0125]いくつかの別の態様において、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を、化学的架橋または組換え法によって、タンパク質（例えばアルブミン）に連結してもよい。また、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４，１７９，３３７号に示される方式で、開示する結合性タンパク質を、多様な非タンパク質性ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）に連結してもよい。結合性タンパク質を、例えばポリマーに共有コンジュゲート化することによって化学的に修飾して、血液循環中の半減期を増加させてもよい。例示的なポリマーおよび付着法が、米国特許第４，７６６，１０６号；第４，１７９，３３７号；第４，４９５，２８５号；および第４，６０９，５４６号に示される。
【０１１５】
[0126]開示する結合性タンパク質を修飾してグリコシル化を改変してもよく；すなわち少なくとも１つの炭水化物部分を除去するかまたは当該結合性タンパク質に付加してもよい。グリコシル化部位の欠失または付加は、当該技術分野に周知のグリコシル化コンセンサス部位が欠失するかまたは生成されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、達成可能である。炭水化物部分を付加する別の手段は、結合性タンパク質、例えば抗体のアミノ酸残基にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることである（例えば、国際出願公報第ＷＯ  ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎら（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２：２５９−３０６を参照されたい）。また、炭水化物部分の除去を化学的または酵素的に達成してもよい（例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２；  Ｅｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：１３１；およびＴｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０を参照されたい）。Ｆｃドメインのアミノ酸を変化させると、医薬組成物の免疫原性が増進される可能性もあるため、炭水化物構造の修飾が好ましい可能性もある（例えば、国際出願公報第ＷＯ  ２００８／０５２０３０号を参照されたい）。免疫グロブリン分子に関して、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７へのＮ連結炭水化物の付着は、ＡＤＣＣ活性に非常に重要であることが立証されてきている。酵素的にまたはＮ連結コンセンサス部位の突然変異によってこれを除去すると、ＡＤＣＣ活性は、ほとんどまたはまったくなくなる。糖タンパク質において、炭水化物は、トリペプチドモチーフ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ中のアスパラギン側鎖のアミド窒素原子に付着しうる。Ｎ連結グリコシル化と称されるこのタイプのグリコシル化は、小胞体（ＥＲ）で始まり、複数の単糖をドリコールリン酸に付加して、１４残基分枝炭水化物複合体を形成する。次いで、この炭水化物複合体は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）複合体によってタンパク質にトランスファーされる。糖タンパク質がＥＲ管腔を離れる前に、１４残基オリゴ糖から３つのグルコース分子が除去される。酵素ＥＲグルコシダーゼＩ、ＥＲグルコシダーゼＩＩおよびＥＲマンノシダーゼがＥＲプロセシングに関与する。続いて、当該ポリペプチドは、ゴルジ複合体に輸送され、ここでＮ連結糖鎖が多くの異なる方式で修飾される。ゴルジ複合体のシス区画および中間区画において、元来の１４糖Ｎ連結複合体は、マンノース（Ｍａｎ）残基の除去を通じて切り取られ、そしてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）および／またはフコース（Ｆｕｃ）残基の付加を通じて伸長される。多様な型のＮ連結炭水化物は、一般的に、共通して、３つのマンノースおよび２つのＮ−アセチルグルコサミン残基からなる五糖コアを有する。最後に、トランスゴルジにおいて、他のＧｌｃＮａｃ残基が付加される可能性もあり、その後、ガラクトース（Ｇａｌ）および末端シアル酸（Ｓｉａｌ）が続く。ゴルジ複合体における炭水化物プロセシングは、ＥＲで行われる「コアグリコシル化」と区別するため、「��端グリコシル化」と称される。最終複合体炭水化物単位は、多くの型および構造を取ることも可能であり、このうちあるものは、２つ、３つまたは４つの分枝（二分岐、三分岐または四分岐と称される）を有する。多くの酵素がゴルジプロセシングに関与し、これには、ゴルジマンノシダーゼＩＡ、ＩＢおよびＩＣ、ＧｌｕｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、ゴルジマンノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼが含まれる。
【０１１６】
[0127]結合性タンパク質の定常領域（例えば抗体の定常領域など）を改変するための方法が当該技術分野に知られる。定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置換することによって、改変された機能（例えば、細胞上のＦｃＲまたは補体のＣ１構成要素などのエフェクターリガンドに対する改変されたアフィニティ）を持つ結合性タンパク質を産生してもよい（例えば、欧州出願公報第ＥＰ  ０  ３８８  １５１号、ならびに米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号を参照されたい）。結合性タンパク質のネズミまたは他の種に適用された場合、類似の機能を減少させるかまたは除去するであろう、類似のタイプの改変を記載することも可能である。
【０１１７】
[0128]例えば、ＦｃＲ（例えばＦｃガンマＲ１）またはＣ１ｑに対する、結合性タンパク質（例えばヒトＩｇＧなどのＩｇＧ）のＦｃ領域のアフィニティを改変することが可能である。少なくとも１つの明記する残基を、側鎖上に適切な官能性を有する少なくとも１つの残基で置換することによって、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの荷電官能基、またはおそらくフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンもしくはアラニンなどの芳香族非極性残基を導入することによって、アフィニティを改変することも可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。
【０１１８】
[0129]例えば、ＩｇＧ定常領域中の残基２９７（アスパラギン）をアラニンで置換すると、エフェクター細胞の補充が有意に阻害される一方、ＣＩｑに対するアフィニティはわずかにしか減少しない（約３倍弱い）（例えば米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。重鎖中の残基の番号付けは、ＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記を参照されたい）。この改変によって、グリコシル化部位が破壊され、そして、炭水化物の存在がＦｃ受容体結合に必要であると考えられる。グリコシル化部位を破壊する、この部位でのいかなる他の置換も、溶解活性の類似の減少を引き起こすと考えられる。他のアミノ酸置換、例えば、残基３１８（Ｇｌｕ）、３２０（Ｌｙｓ）および３２２（Ｌｙｓ）の任意の１つのＡｌａへの変化もまた、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域へのＣ１ｑ結合を無効にすることが知られる（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。
【０１１９】
[0130]Ｆｃ受容体との相互作用が減少した、修飾された結合性タンパク質を産生してもよい。例えば、ヒトＦｃガンマＲ１受容体に結合するヒトＩｇＧ３において、Ｌｅｕ２３５をＧｌｕに変化させると、受容体との相互作用が破壊されることが示されてきている。また、結合性タンパク質のヒンジ連結領域中の隣接するまたは近接する部位に対する突然変異（例えば残基２３４、２３５および２３７のＡｌａでの置換）を用いて、ＦｃガンマＲ１受容体に対する結合性タンパク質アフィニティに影響を及ぼしてもよい。重鎖中の残基の番号付けは、ＥＵインデックスに基づく（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記を参照されたい）。したがって、本発明のいくつかの態様において、本発明の結合性タンパク質のＦｃ領域は、例えば、２３４位でのＬｅｕからＡｌａへの変化（Ｌ２３４Ａ）、２３５位でのＬｅｕからＡｌａへの変化（Ｌ２３５Ａ）、および／または２３７位でのＧｌｙからＡｌａへの変化（Ｇ２３７Ａ）などの、少なくとも１つの定常領域突然変異を含有する。１つの態様において、結合性タンパク質のＦｃ領域は、２つの定常領域突然変異、Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａを含有する（すなわち「二重突然変異体」または「ＤＭ」）。別の態様において、結合性タンパク質のＦｃ領域は、３つの定常領域突然変異、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを含有する（すなわち「三重突然変異体」または「ＴＭ」）。例えば、ヒトＩｇＧ定常領域三重突然変異体を配列番号１９６に示す。
【０１２０】
[0131]例えばＣＨ２ドメインのＮ末端領域中の少なくとも１つのアミノ酸を改変することによって、結合性タンパク質の溶解活性を改変するためのさらなる方法が、国際出願公報第ＷＯ  ９４／０２９３５１号および米国特許第５，６２４，８２１号に記載される。
【０１２１】
[0132]本発明の結合性タンパク質を、検出可能または官能性標識でタグ化してもよい。これらの標識には、放射標識（例えば１３１Ｉおよび９９Ｔｃ）、酵素標識（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）、および他の化学的部分（例えばビオチン）が含まれる。
【０１２２】
[0133]本発明はまた、ＩＬ−２１Ｒ、特にヒトＩＬ−２１Ｒに結合する、単離結合性タンパク質またはその抗原結合性断片も特徴としてもよい。特定の態様において、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質は、以下の特性の少なくとも１つを有してもよい：（１）モノクローナル性または単一特異性結合性タンパク質である；（２）ヒト結合性タンパク質である；（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成結合性タンパク質である；（４）ｉｎ  ｖｉｖｏ生成結合性タンパク質（例えばトランスジェニックマウス系）である；（５）ＩＬ−２１ＲへのＩＬ−２１の結合を阻害する；（６）ＩｇＧ１である；（７）少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１の結合定数でヒトＩＬ−２１Ｒに結合する；（８）少なくとも約５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１の結合定数でネズミＩＬ−２１Ｒに結合する；（９）約１０−３（１／ｓ）またはそれ未満の解離定数でヒトＩＬ−２１Ｒに結合する；（１０）約１０−２（１／ｓ）またはそれ未満の解離定数でネズミＩＬ−２１Ｒに結合する；（１１）約１．７５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ヒトＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒトＩＬ−２１Ｒ発現性ＢａＦ３細胞の増殖を阻害する；（１２）約０．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ネズミＩＬ−２１Ｒにより媒介されるネズミＩＬ−２１Ｒ発現性ＢａＦ３細胞の増殖を阻害する；（１３）約１４．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ヒトＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒトＩＬ−２１Ｒ発現性ＴＦ１細胞の増殖を阻害する；（１４）約１．９ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１Ｒにより媒介されるヒト初代Ｂ細胞の増殖を阻害する；（１５）約１．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１により媒介されるヒト初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を阻害する；および（１６）約５．０ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で、ＩＬ−２１により媒介されるネズミ初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【０１２３】
[0134]当業者は、上述の修飾が排他的でないことを認識するであろうし、そして本開示の解説を踏まえると、当業者には多くの他の修飾が明らかであろう。
核酸、クローニングおよび発現系
[0135]本開示は、開示する結合性タンパク質をコードする単離核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、そしてこれらは合成（完全または部分的）であってもまたは組換え（完全または部分的）であってもよい。本明細書に示すようなヌクレオチド配列に対する言及は、特定された配列を含むＤＮＡ分子を含み、そしてＵがＴに置換された特定された配列を含むＲＮＡ分子を含む。
【０１２４】
[0136]やはり意図されるのは、本明細書に開示するように、１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメインのコード配列、またはその組み合わせ、あるいは当該配列に実質的に同一の配列（例えば、当該配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性の配列、あるいは当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列）を含む核酸である。
【０１２５】
[0137]１つの態様において、単離核酸は、配列番号１６３〜１９５のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、あるいは本明細書記載の配列から１つまたは２つまたは３つまたは４つのアミノ酸が異なるＣＤＲをコードする配列を有する。
【０１２６】
[0138]核酸は、軽鎖または重鎖可変領域のみをコードしてもよいし、あるいは対応する可変領域に機能可能であるように連結された結合性タンパク質軽鎖または重鎖定常領域をコードしてもよい。１つの態様において、軽鎖可変領域は、カッパまたはラムダ定常領域から選択される定常領域に連結される。軽鎖定常領域はまた、ヒト・カッパまたはラムダ型であってもよい。別の態様において、重鎖可変領域は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥより選択される結合性タンパク質アイソタイプの重鎖定常領域に連結される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１）アイソタイプであってもよい。
【０１２７】
[0139]本発明の核酸組成物は、修飾制限部位等を除いて、しばしば天然配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡあるいはその混合物）であるが、これを標準技術にしたがって突然変異させて、遺伝子配列を提供してもよい。コード配列に関しては、これらの突然変異は、望ましいように、アミノ酸配列に影響を及ぼしうる。特に、本明細書記載の天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他のこうした配列に実質的に同一であるか、または該配列に由来する、ヌクレオチド配列が意図される（「由来する」が、配列が別の配列と同一であるかまたは別の配列から修飾されていることを示す場合）。
【０１２８】
[0140]１つの態様において、核酸は提供する配列のものと（例えば、１０、２０、３０、または４０ヌクレオチド未満であるが、少なくとも１つ；対象核酸中のヌクレオチドの１％、５％、１０％または２０％未満であるが少なくとも１つ）異なる（例えば置換、挿入、または欠失により異なる）。この分析のために必要であれば、配列を、最大相同性のために整列させなければならない。欠失または挿入、あるいはミスマッチにより「ループ」状にはみ出した配列は、相違と見なされる。相違は、非必須残基（単数または複数）をコードするヌクレオチド（単数または複数）の箇所であってもよいし、また相違は、保存的置換（単数または複数）であってもよい。
【０１２９】
[0141]本開示はまた、本明細書に記載するような少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、および転写または発現カセットの形の核酸構築物も提供する。
[0142]本開示はさらに、本明細書記載の少なくとも１つの核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１３０】
[0143]やはり提供するのは、本明細書記載の配列（単数または複数）を含む核酸（単数または複数）から、コードされるタンパク質（単数または複数）を作製する方法である。当該方法は、細胞が核酸からタンパク質を発現するのに適した条件下で、宿主細胞を培養する工程を含む。発現および産生後、任意の適切な技術を用いて、ＶＨまたはＶＬドメイン、あるいは特異的結合メンバーを単離し、そして／または精製してもよい。当該方法にはまた、ｓｃＦｖをコードする核酸を、結合性タンパク質のＦｃ部分をコードする核酸と融合させ、そして細胞において、融合した核酸を発現させる工程も含まれてもよい。当該方法にはまた、生殖系列化工程も含まれてもよい。
【０１３１】
[0144]抗原結合性断片、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコードする核酸分子およびベクターを、実質的に純粋なまたは均質な型で、あるいは核酸の場合、必要な機能を持つポリペプチドをコードする配列以外の起源核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まずに、天然環境から単離し、そして／または精製してもよい。
【０１３２】
[0145]多様な宿主細胞において、ポリペプチドをクローニングしそして発現するための系が当該技術分野に知られる。結合性タンパク質を産生するのに適した細胞は、例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載される。簡潔には、適切な宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）が含まれる。異種ポリペプチド発現のため、当該技術分野で入手可能な哺乳動物細胞には、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳＯ）、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、卵母細胞、およびトランスジェニック動物由来の細胞、例えば乳腺上皮細胞が含まれる。他の態様において、本発明の結合性タンパク質をコードする核酸を、組織特異的プロモーター（例えば乳腺特異的プロモーター）の調節下に置き、そして結合性タンパク質をトランスジェニック動物において産生する。例えば、結合性タンパク質は、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはげっ歯類のミルク中に分泌される。
【０１３３】
[0146]プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む、適切な制御配列を含有するように、適切なベクターを選択するかまたは構築してもよい。ベクターはまた、プラスミドまたはウイルス主鎖も含有してもよい。詳細に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版  １９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ＤＮＡの操作、調製、突然変異誘発、配列決定、およびトランスフェクションを含めて、ベクターとともに用いる多くの確立された技術が、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版  １９９２）Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載される。
【０１３４】
[0147]本開示のさらなる側面が、核酸を宿主細胞内に導入する方法を提供する。真核細胞に関しては、適切なトランスフェクション技術には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（単数または複数）、例えばワクシニアまたはバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれてもよい。細菌細胞に関しては、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれてもよい。ＤＮＡ導入の後に、選択法（例えば薬剤耐性）を行って、核酸を含有する細胞を選択してもよい。
【０１３５】
抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の使用
[0148]ＩＬ−２１Ｒに対するアンタゴニストとして作用する抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質を用いて、少なくとも１つのＩＬ−２１Ｒ媒介性免疫応答、例えば細胞増殖、サイトカイン発現または分泌、ケモカイン分泌、およびＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または滑膜細胞の細胞溶解活性の１以上を制御してもよい。したがって、本発明の結合性タンパク質を用いて、免疫または造血細胞（例えば骨髄系、リンパ系、または赤血球系譜の細胞、あるいはその前駆細胞）の活性（例えば増殖、分化、および／または生存）を阻害してもよく、そしてしたがって、当該タンパク質を用いて、多様な免疫障害および血液の過剰増殖障害を治療してもよい。治療可能な免疫障害の例には、限定されるわけではないが、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、アレルギー（例えばアトピー性アレルギー）、および自己免疫疾患が含まれる。自己免疫疾患には、糖尿病、関節炎障害（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、および強直性脊髄炎を含む）、脊椎関節症、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎）、乾癬、シェーグレン症候群、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、喘息（内因性喘息およびアレルギー性喘息を含む）、強皮症および血管炎が含まれる。
【０１３６】
併用療法
[0149]１つの態様において、少なくとも１つの抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質および少なくとも１つの療法剤を含む医薬組成物を、併用療法で投与する。当該療法は、免疫および炎症性障害などの病的状態または障害を治療するのに有用である。用語「併用」は、この文脈において、結合性タンパク質組成物および療法剤が、同時にまたは連続してのいずれかで、実質的に同時期に投与されることを意味する。連続して投与される場合、第二の化合物の投与開始時に、２つの化合物の第一のものは、治療部位に、有効濃度で検出可能なままであってもよい。
【０１３７】
[0150]例えば、併用療法には、少なくとも１つのさらなる療法剤と同時配合され、そして／または同時投与される、少なくとも１つの抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質、例えば抗ＩＬ−２１Ｒ抗体が含まれてもよい。さらなる剤には、少なくとも１つのサイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞傷害剤、および／または細胞分裂阻害剤が含まれてもよい。こうした併用療法は、投与される療法剤をより少ない投薬量で好適に利用することも可能であり、したがって、多様な単一療法に関連するありうる毒性または合併症を回避することも可能である。さらに、本明細書に開示する療法剤は、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ経路とは異なる経路に作用し、そしてしたがって、抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の効果を増進し、そして／または当該効果と相乗作用すると期待される。
【０１３８】
[0151]本発明の別の側面は、他の療法剤との抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質の併用投与を実行するためのキットに関する。１つの態様において、当該キットは、医薬キャリアー中で配合された少なくとも１つの抗ＩＬ−２１Ｒ結合性タンパク質、および１以上の別個の医薬調節物中で適切なように配合された少なくとも１つの療法剤を含む。
【０１３９】
診断使用
[0152]また、本発明の結合性タンパク質を用いて、生物学的試料中のＩＬ−２１Ｒの存在を検出してもよい。これらのタンパク質の存在またはレベルを、医学的状態と相関させることによって、当業者は、関連する医学的状態を診断することも可能である。例えば、刺激されたＴ細胞は、ＩＬ−２１Ｒの発現を増加させ、そして関節においてＴ細胞が異常に高濃度のＩＬ−２１Ｒを発現していれば、関節の炎症およびおそらく関節炎の指標となりうる。本発明の結合性タンパク質によって診断されうる例示的な医学的状態には、限定されるわけではないが、多発性硬化症、関節リウマチ、および移植片拒絶が含まれる。
【０１４０】
[0153]結合性タンパク質に基づく検出法、例えば抗体に関して一般的に用いられるものは、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫沈降、および他の関連技術が含まれる。ＩＬ−２１Ｒを検出するこれらの方法の少なくとも１つを取り込む診断キットにおいて、当該結合性タンパク質を提供してもよい。当該キットは、他の構成要素、パッケージング、説明書、試薬、ならびに／あるいはタンパク質の検出およびキットの使用を補助する他の材料を含有してもよい。
【０１４１】
[0154]リガンド基（例えばビオチン）、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、高電子密度試薬、または酵素を含む検出可能マーカーを用いて、結合性タンパク質を修飾してもよい。酵素は活性によって検出される。例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量化可能な青い色素に変換する能力によって検出される。他の適切な結合性パートナーには、ビオチンおよびアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該技術分野に知られる他の受容体−リガンド対が含まれる。
【０１４２】
[0155]また、結合性タンパク質を、少なくとも１つの他の分子実体、例えば、とりわけ、別の結合性タンパク質（例えば二重特異性または多重特異性結合性タンパク質）、毒素、放射性同位体、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤に機能可能であるように連結してもよい（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有会合、またはその他によって）。他の順列および可能性は、一般の当業者に明らかであり、そしてこれらは本発明の範囲内で同等と見なされる。
【０１４３】
医薬組成物および投与法
[0156]本発明の特定の態様には、開示する結合性タンパク質を含む組成物が含まれる。当該組成物は、医薬使用および患者への投与に適していてもよい。当該組成物は、本発明の結合性タンパク質および医薬賦形剤を含む。本明細書において、「医薬賦形剤」には、医薬投与と適合する、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。医薬的に活性である物質のためのこれらの剤の使用が当該技術分野に周知である。当該組成物はまた、補充的、追加的、または増進された療法機能を提供する他の活性化合物も含有してもよい。医薬組成物はまた、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれていてもよい。
【０１４４】
[0157]本発明の医薬組成物は、投与の意図される経路と適合するように配合される。投与を達成する方法は、一般の当業者に知られる。医薬組成物は、局所または経口投与されてもよいし、あるいは粘膜を渡って透過可能であってもよい。医薬組成物の投与例には、口腔摂取または吸入が含まれる。投与はまた、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下、皮膚、または経皮であってもよい。
【０１４５】
[0158]皮内または皮下適用に用いる溶液または懸濁物には、典型的には、以下の構成要素の少なくとも１つが含まれる：水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性剤。当該技術分野に知られる方法によって、酸または塩基を用いて、ｐＨを調整してもよい。こうした調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、または多数用量バイアル中に封入されてもよい。
【０１４６】
[0159]静脈内投与に用いる溶液または懸濁物には、生理学的生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ社、ドイツ・ルートヴィヒスハーフェン）、エタノール、またはポリオールなどのキャリアーが含まれる。すべての場合で、組成物は無菌であり、そして容易に注射可能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）であるために液体でなければならない。適切な流動性は、しばしば、レシチンまたは界面活性剤を用いて得られうる。組成物はまた、製造および保存の条件下で安定でなければならない。微生物の防止は、抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等で達成可能である。多くの場合、等張剤（糖）、多価アルコール（例えばマンニトールおよびソルビトール）、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれてもよい。吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを添加することによって、組成物の持続性吸収を達成してもよい。
【０１４７】
[0160]経口組成物には、不活性希釈剤または食用キャリアーが含まれる。経口投与のため、結合性タンパク質を賦形剤とともに取り込んで、そして例えば、錠剤、トローチ、カプセル、またはゼラチン中に入れてもよい。医薬的に適合しうる結合剤またはアジュバント物質が組成物中に含まれてもよい。当該組成物は、（１）微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；（２）デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、（３）アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；（４）ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；（５）コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；および／または（６）甘味剤またはフレーバー剤を含有してもよい。
【０１４８】
[0161]また、当該組成物を経粘膜または経皮経路によって投与してもよい。例えば、Ｆｃ部分を含む結合性タンパク質（例えば抗体）は、腸、口、または肺における粘膜を横断することも可能でありうる（Ｆｃ受容体を介する）。ロゼンジ、鼻スプレー、吸入装置、または座薬によって、経粘膜投与を達成してもよい。当該技術分野に知られる軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ジェル、またはクリームを含有する組成物を用いて、経皮投与を達成してもよい。経粘膜または経皮投与のため、浸透しようとするバリアに適した浸透剤を用いる。吸入による投与には、噴霧剤（例えば液体または気体）を含有する加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧装置から、エアロゾルスプレー中で、当該結合性タンパク質を送達してもよい。
【０１４９】
[0162]特定の態様において、本発明の結合性タンパク質をキャリアーとともに調製して、体からの迅速な除去に対して、当該結合性タンパク質を保護する。生体分解性ポリマー（例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）がしばしば用いられる。こうした配合物の調製法が当業者に知られる。リポソーム懸濁物もまた、医薬的に許容されうるキャリアーとして使用可能である。当業者に知られる確立された方法にしたがって、リポソームを調製してもよい（例えば米国特許第４，５２２，８１１号を参照されたい）。
【０１５０】
[0163]本発明の結合性タンパク質または結合性タンパク質組成物を、記載するように療法的有効量で投与する。療法的有効量は、被験体の年齢、状態、性別、および医学的状態の重症度にしたがって多様でありうる。臨床的徴候に基づいて、医師が適切な投薬量を決定してもよい。最長の期間に渡って結合性タンパク質の循環レベルを最大にするため、結合性タンパク質または組成物をボーラス用量として投与してもよい。連続注入もまた使用可能である。
【０１５１】
[0164]本明細書において、用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むよう意図される。被験体には、ＩＬ−２１Ｒを発現する細胞、例えば癌細胞または免疫細胞によって特徴付けられる障害を有するヒト患者が含まれてもよい。用語、本発明の「非ヒト動物」には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのすべての脊椎動物が含まれる。
【０１５２】
[0165]被験体に投与可能な投薬量範囲の例は：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ（またはそれより高い）より選択可能である。投薬量、投与法、治療しようとする障害または症状（単数または複数）、および個々の被験体の特性に応じて、これらの投薬量を毎日、毎週、隔週、毎月、またはそれより頻繁でなく、例えば隔年で投与してもよい。
【０１５３】
[0166]特定の状況において、投与の容易さおよび投薬の均一性のため、投薬単位型で、組成物を配合することが好適でありうる。投薬単位型は、本明細書において、患者に適した物理的に別個の単位を指す。各投薬量単位は、キャリアーと会合して療法効果を生じるよう計算された、あらかじめ決定された量の結合性タンパク質を含有する。投薬単位は、結合性タンパク質の特性および達成しようとする特定の療法効果に応じる。
【０１５４】
[0167]組成物の毒性および療法有効性は、細胞培養または実験動物において、標準的医薬的方法によって決定可能であり、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において療法的に有効である用量）を決定することによる。毒性および療法効果の間の用量比は療法指数であり、そしてこれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表されうる。大きな療法指数を示す結合性タンパク質は、より毒性でなく、そして／またはより療法的に有効でありうる。
【０１５５】
[0168]細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いて、ヒトにおける投薬範囲を配合してもよい。これらの化合物の投薬量は、血液中の循環結合性タンパク質濃度の範囲内にあることも可能であり、これにはほとんどまたはまったく毒性がないＥＤ５０が含まれる。投薬量は、使用する投薬組成物型および投与経路に応じて、この範囲内で多様でありうる。本発明で用いる任意の結合性タンパク質に関して、まず細胞培養アッセイを用いて、療法的有効用量を概算してもよい。動物モデルにおいて、用量を配合して、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する結合性タンパク質濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成してもよい。任意の特定の投薬量の効果を適切なバイオアッセイによって監視してもよい。適切なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基づくアッセイ、遺伝子発現アッセイ、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ結合アッセイ、および他の免疫学的アッセイが含まれる。
【０１５６】
[0169]本出願全体に引用するすべての参考文献、特許出願、および特許の全内容は、本明細書に援用される。
【実施例】
【０１５７】
[0170]本発明は、以下の非制限例によりさらに例示されるであろう。これらの実施例は本発明の理解を助けるために示されており、決してその範囲を制限すると解釈してはならない。本実施例は、当業者には公知であろう従来の方法の詳細な記述は含んでいない。
実施例１：ファージディスプレイによる結合タンパク質の作成
[0171] 米国特許第７、４９５、０８５号（本明細書において参照文献として組み入れられる）に記載されているｓｃＦｖ親クローン１８Ａ５は、ラウンド１及び３において標的としてヒトＩＬ−２１Ｒを発現するＢａＦ３細胞を、及びラウンド２において標的としてビオチン化ＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を使用し、標準ファージディスプレイ法によりＣＳヒトｓｃＦｖライブラリーから得た。
実施例２：ライブラリー構築
[0172]ファージディスプレイライブラリーは、ｓｃＦｖがその３’末端で無傷の遺伝子ＩＩＩに融合されているｐＣＡＮＴＡＢβベクターを使用した親１８Ａ５  ｓｃＦｖに基づいていた。種々のＣＤＲ３配列は当該技術分野では既知の技術を使用して誘導された。
【０１５８】
[0173]六つの連続したコドンの二つの重複しているブロックを、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３中にランダム化し、総計で四つのライブラリーを生成させた：Ｈ３Ｂ１、Ｈ３Ｂ２、Ｌ３Ｂ１、及びＬ３Ｂ２。以下は同定された各々のヌクレオチド及びアミノ酸配列である：ＩＬ−２１Ｒ：１８Ａ５  ＶＨＣＤＲ３［配列番号１９９及び２００］；Ｈ３Ｂ１（ライブラリーサイズ１．４０ｘ１０９）［配列番号２０１及び２０２］；Ｈ３Ｂ２（ライブラリーサイズ１．００ｘ１０９）［配列番号２０３及び２０４］；ＩＬ−２１Ｒ：１８Ａ５  ＶＬＣＤＲ３［配列番号２０５及び２０６］；Ｌ３Ｂ１（ライブラリーサイズ９．００ｘ１０９）［配列番号２０７及び２０８］；Ｌ３Ｂ２（ライブラリーサイズ６．４０ｘ１０９）［配列番号２０９及び２１０］。
実施例３：ファージ選択
[0174]１８Ａ５の全ての誘導体は、溶液相でビオチン化ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインＨｉｓ−Ｆｌａｇ融合タンパク質（“ビオチン−ｈＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ”）及びビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインＨｉｓ−Ｆｌａｇ融合タンパク質（“ビオチン−ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ”）に結合可能なファージの選択により、上記ｓｃＦｖライブラリーから単離され；選択に関する全ての手順及び技術は当業者には公知である。総計で２７の抗ＩＬ−２１Ｒ  ｓｃＦｖがファージ選択法により単離された。
実施例４：ライブラリースクリーニング
[0175]ｓｃＦｖフォーマットで生じた結合タンパク質は、ビオチン−ｈＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ及びビオチン−ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへの結合についてのヒトＩｇＧ１フォーマットにおいて、親１８Ａ５と競合する、ヒトＩＬ−２１Ｒを発現している遺伝子工学処理された細胞株のｈＩＬ−２１依存性増殖及びマウスＩＬ−２１Ｒを発現している遺伝子工学処理された細胞株のｍＩＬ−２１依存性増殖を妨げる、それらの能力に基づいて選択された。
実施例４．１：スクリーニングアッセイにおける使用のための粗ペリプラスム材料（“ｐｅｒｉ−ｐｒｅｐｓ”）の調製
[0176]使用した増殖条件に依存し、ｓｃＦｖを細菌ペリプラスム空間中の溶液に発現し得る。ペリプラスム内へのｓｃＦｖの放出を誘導するため、０．１％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む９９０μｌの２ｘＴＹ培地を含有する９６深底ウェルプレートに、ＱＰｉｘ２コロニーピッカー（Genetix, New Milton, England）を使用して、融解したグリセロール保存液を接種し（ウェル当たり１クローン）、３７℃（９９９ｒｐｍ）で約４時間増殖させた。培養物を、０．０２ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧで誘導し、３０℃（９９９ｒｐｍ）で一晩増殖させた。細菌ペリプラスム（ｐｅｒｉ−ｐｒｅｐｓ）の内容物は浸透圧ショックにより放出させた。簡単に言えば、プレートを遠心分離し、ペレットを１５０μｌのＴＥＳペリプラスム緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）／２０％ スクロース）に再懸濁し、続いて１５０μｌの１：５  ＴＥＳ：水を加え、氷上で３０分インキュベートした。プレートを遠心分離し、ｓｃＦｖ含有上清を採取した。
実施例４．２：ライブラリースクリーニングのためのエピトープ競合アッセイ
[0177]ヒト又はマウスＩＬ−２１Ｒへの結合について親１８Ａ５抗体と競合することができるｓｃＦｖは、均一時間分解蛍光（HTRF（登録商標））アッセイにより、選択されたファージから同定した。HTRF（登録商標）クリプテート標識キット（Cisbio, Bedford, MA）の使用説明書に従い、精製した親１８Ａ５抗体を、ユーロピウムの誘導体であるクリプテートと共有結合で結合させた。ｓｃＦｖのｐｅｒｉ−ｐｒｅｐｓを前述のように調製し、ＰＢＳ／０．４Ｍフッ化カリウム／０．１％ＢＳＡ（ＨＴＲＦ（登録商標）緩衝液）で０．２５％に希釈した；次に、混合物の１０μｌを黒色３８４−浅底ウェルプレート（Nunc, Rochester, NY）に移した。次に５μｌのクリプテートコンジュゲート１８Ａ５抗体、続いて、１：８００希釈したストレプトアビジン−ＸＬ６６５コンジュゲート（Cisbio）及び４．８ｎＭビオチン−ｈＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆあるいは４０ｎＭビオチン−ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆの混合物５μｌを各ウェルに加えた。混合物を室温で２時間インキュベートし、時間分解蛍光測定を行った（３４０ｎｍ励起、６１５ｎｍ及び６６５ｎｍ発光）。１８Ａ５抗体との競合は、６６５ｎｍでの発光及び６１５ｎｍでの発光のバックグラウンド補正比の減少により示された。
【０１５９】
[0178]総計で８２８０の、独立して単離されたｓｃＦｖを、ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆを使用するHTRF（登録商標）アッセイにおいてスクリーニングし、ビオチン−ｈＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへの結合について親１８Ａ５抗体と競合することができる３７６クローンを、さらなる分析のために選択した。
実施例５：ライブラリー由来ｓｃＦｖのＤＮＡ配列分析−配列分析のためのｓｃＦｖ領域のＰＣＲ増幅
[0179]親１８Ａ５  ｓｃＦｖ分子よりも改良されたＩＬ−２１Ｒ結合を有する２８７の１８Ａ５ｓｃＦｖ変異体の配列を決定し、各位置に見出されたアミノ酸の頻度を決定した。ＶＨクローンの中で、二つ（１．７％）のみが、例えば、配列番号１６９の最後の六つのアミノ酸（ＶＨ  ＣＤＲ３のＣ末端での）が変異したライブラリーに由来しており、一方、残りは、例えば、配列番号１６９の最初の六つのアミノ酸が変異したライブラリーに由来していた。ＶＬクローンの中で、一つ（０．６％）のみが、例えば、配列番号１７０の最後の六つのアミノ酸（ＶＬ  ＣＤＲ３のＣ末端での）が変異したライブラリーに由来しており、一方、大多数は、例えば、配列番号１７０の最初の六つのアミノ酸（ＶＬ  ＣＤＲ３のＮ末端での）の変化に由来していた。
【０１６０】
[0180]ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅は、製造元の使用説明書に従い、ＨＮ緩衝液（Epicentre Biotechnologies, Madison, WI）中、VENT（登録商標）ＤＮＡ ポリメラーゼ（New England Biolabs, Ispwich, MA）を使用して実施した。定常期バクテリア培養物の１：１０希釈液５μｌを、２０μｌの最終反応容量の鋳型として使用した。使用したサイクリング条件は、９４℃で２分の加熱開始、９４℃（１分）での変性、５５℃でのプライマーアニーリング（２分）及び７２℃での伸長（１分）を３０サイクル、続いての７２℃（５分）での最終伸長であった。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動法により検証し、Ｍ１３ｒｅｖプライマーでの配列決定に先だって、ＥｘｏＩ／ＳＡＰ（エビアルカリホスファターゼ）で精製した。
【０１６１】
[0181]２７ｓｃＦｖのＣＤＲ３配列の配列番号については表４に記載されている。これらのｓｃＦｖを、実施例６に記載のアッセイに基づいたさらなる分析に使用した。
【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
実施例６：ライブラリー由来ｓｃＦｖの特徴付け
実施例６．１：定量分析のための精製ｓｃＦｖの調製
[0182]個々のｓｃＦｖクローンはPHYTTP（登録商標）カラム（PhyNexus, Inc., San Jose, CA）でのＮｉ−ＮＴＡ精製により小規模に精製した。単一コロニーは、５０ｍｌ円錐チューブ中、０．１％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２０ｍｌの２ｘＴＹ培地において、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて中期対数増殖期まで増殖させた。ｓｃＦｖの発現は０．０２ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧで誘導し、培養物を３０℃で一晩増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、１ｍｌのＴＥＳペリプラスム緩衝液に再懸濁し、続いて１ｍｌのＴＥＳ：水  １：５溶液を加え、氷上で３０分インキュベーションした。溶菌液を３２００ｒｐｍで１０分、４℃にて遠心分離し、上清を２ｍＭ  ＭｇＣｌ２とした。ｓｃＦｖは、Perkin Elmer (Waltham, MA) MINITRAK（商標）ＩＸ液体処理ロボットを用いた上清のPHYTIP（登録商標）繰り返し通過によりＮｉ−ＮＴＡ PHYTTP（登録商標）（PhyNexus）上に捕捉し、続いてＩＭＡＣ洗浄緩衝液で洗浄し、２００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出した。緩衝液をＰＢＳ内に１：１０で３サイクル希釈することによりＰＢＳに交換し、続いて、１０、０００分子量カットオフフィルタープレート（Millipore MULTISCREEN（登録商標）ULTRACEL（商標）９６ウェル限外濾過プレート、Millipore, Billerica, MA）上に濃縮した。製造元のウシ血清アルブミン標品を用いるMicro BCA（商標）キット（Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL）を使用して試料を定量した。
実施例６．２：ヒト又はマウスＩＬ−２１Ｒを過剰発現している細胞のＩＬ−２１依存性増殖についてのアッセイ
[0183]１８Ａ５由来結合タンパク質（ｓｃＦｖ及びＩｇＧ）で阻害アッセイを実施し、ヒト又はマウスＩＬ−２１Ｒでトランスフェクトされた細胞株のＩＬ−２１依存性増殖のそれらの遮断を測定した。マウス前Ｂ細胞株であるＢａＦ３細胞、及びヒト赤血球細胞株であるＴＦｌ細胞に、ＩＬ−２１Ｒ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をレトロウイルスにより形質導入した。細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．０００３６％β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０中でルーチン的に増殖させた。ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞培養液には、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を補給し；マウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞培養液には、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−３を補給し；ＴＦｌ細胞培養液には、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補給した。アッセイに先だって、増殖因子を補給していないアッセイ培地で細胞を３回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁し、３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。アッセイプレートを調製するには、５０００細胞を９６ウェル平底白色組織培養プレート（Thermo Scientific, Waltham, MA）の中央の６０ウェルに、５５μｌ／ウェルの容量で加えた。試験ｓｃＦｖ又はＩｇＧ試料は、保存試料をアッセイ培地に希釈することにより調製し、連続的に３倍希釈した。２５μｌの結合タンパク質試料を細胞に加え、３７℃／５％ＣＯ２で３０分インキュベートした。１００−４００ｐｇ／ｍｌのヒト又はマウスＩＬ−２１を含有する２０μｌのアッセイ培地を各ウェルに加え、細胞をさらに４８時間インキュベートした。プレートを室温とし、１５μｌ／ウェルのCELLTITER-GLO（登録商標）を添加し、室温で１０分インキュベートし、Perkin Elmer ENVISION（商標）プレートリーダーで発光を測定することにより増殖を測定した。PhyNexus IMACチップで精製後、１０８のｓｃＦｖを、三つすべての細胞株のＩＬ−２１依存性増殖の中和について試験した。すべて、親１８Ａ５  ｓｃＦｖのＩＣ５０より低い又は同等の値でヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞の中和を示した。一部は、マウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞増殖及びヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞の強い中和を示した。２７の最も強力なクローンからのデータが図１−３に示されており、表５に要約されている。
【０１６４】
[0184]図１−３は、ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図ｌａ−ｃ）；ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図２ａ−ｃ）及びマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図３ａ−ｃ）のｓｃＦｖによる増殖の中和を示している。細胞を示されたｓｃＦｖと混合し、１００ｐｇ／ｍｌ（図１−２）又は４００ｐｇ／ｍｌ（図３）のヒトＩＬ−２１とインキュベートした。
実施例６．３：定量的エピトープ競合アッセイ
[0185]精製したｓｃＦｖは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）においてマウスＩＬ−２１Ｒへの結合について、親１８Ａ５抗体と競合するそれらの能力を定量的に分析した。９６ウェル Nunc MAXISORP（登録商標）プレートを、ＰＢＳ中０．７５μｇ／ｍｌの濃度の親１８Ａ５抗体を用いて、４℃で一晩コートした。プレートはＰＢＳを使用して３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ツイーン２０中、室温で３時間ブロックした。ｓｃＦｖを、３６ｎＭビオチン化ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆと混合し、室温で１０分インキュベートした。ブロックしたプレートはＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルのｓｃＦｖ／ＩＬ−２１Ｒ混合物を適したプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Southern Biotech, Birmingham, AL）二次抗体の１：６０００希釈液を添加し、結合されたビオチン化ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆを検出した。プレートを次に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで７回洗浄した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用してシグナルを発生させ、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、ENVISION（商標）プレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。PhyNexus  IMACチップにより精製された１０８のｓｃＦｖをこのアッセイで試験し、ほとんどが、親１８Ａ５  ｓｃＦｖのＩＣ５０より低い値で、ビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへの結合について親１８Ａ５抗体と競合した。細胞に基づいた中和アッセイにおいて、最も高い効力を有する２７のクローンについてのエピトープ競合データが図４ａ−ｃに示されており、表５に要約されている。
【０１６５】
【表５】
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【０１６６】
実施例７：親１８Ａ５  ＩｇＧの生殖細胞系列（germline）配列への変換
[0186]修飾されたＶＬ領域を有する以下の１５のｓｃＦｖを、生殖細胞系列化親１８Ａ５  ＶＬとともに（以下を参照されたい）、完全長ヒトＩｇＧラムダ：Ｌ２、Ｌ３、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１１、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｌ２４及びＬ２５への変換に選択した。修飾されたＶＨ領域を有する４つのｓｃＦｖ、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６を、生殖細胞系列化親１８Ａ５  ＶＨとともに（以下を参照されたい）、完全長ヒトＩｇＧ１への変換に選択した。
[0187]親１８Ａ５抗体のＶＨ及びＶＬアミノ配列は、ＣＤＲ領域の外側の配列が最も近いヒト生殖細胞系列配列と一致するように修飾された：ＶＨの場合、ＤＰ６７／ＶＨ４Ｂ＋（ＶＢＡＳＥ ＡＡ：ＷＡＰ００ＣＥＡＺ １）及びＪＨ１／ＪＨ４／ＪＨ５、そしてＶＬの場合、ＤＰＬ１６／ＶＬ３．１（ＶＢＡＳＥ ＡＡ：ＷＡＰ００ＣＥＭＩ １）。修飾は、GENEART(Regensburg, Germany)での遺伝子合成及びＰＣＲにより導入される部位特異的変異の組み合わせにより行った。加えて、配列は、それらの独自方法を使用するGENEARTにより、哺乳類細胞での発現にコドン最適化された。親１８Ａ５配列及び生殖細胞系列修正１８Ａ５配列のアラインメントが以下に示されている：
１８Ａ５重鎖比較
【０１６７】
【化１】
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【０１６８】
【化２】
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【０１６９】
【化３】
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【０１７０】
１８Ａ５軽鎖比較
【０１７１】
【化４】
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【０１７２】
【化５】
2011523849.tif 000016
【０１７３】
【化６】
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【０１７４】
生殖細胞系列修正ＶＨ配列（親配列からの変化はボールド体であり、そして下線が付けられている）
【０１７５】
【化７】
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【０１７６】
生殖細胞系列修正ＶＬ配列（親配列からの変化はボールド体であり、そして下線が付けられている）
【０１７７】
【化８】
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【０１７８】
実施例８：ライブラリー由来ｓｃＦｖのＩｇＧへの変換
[0188]改良された１８Ａ５  ｓｃＦｖ誘導体のＶＬ及びＶＨドメインのＣＤＲ３領域を、ＰＣＲ及び下記の方法による親１８Ａ５の生殖細胞系列修正ＶＬ及びＶＨフレームワーク内にサブクローン化することにより増幅した。生殖細胞系列化１８Ａ５  ＶＨ遺伝子の５’部分を包含するＰＣＲ断片は、プライマーＢｓｓＨＩＩ ＩＩ ＶＨ Ｆ（５’−ＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’）［配列番号２３０］及びＧＶＨ Ｒ ｆｏｒ ＢｓｓＨＩＩ（５’−ＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧ−３’）［配列番号２３１］でのプラスミドｐＳＭＥＤ２ ＯＰ１８Ａ５Ｇ ｈｕＩｇＧ１の増幅により発生させた。改良されたｓｃＦｖクローンＶＨ３からのＶＨ遺伝子の３’部分を包含するＰＣＲ断片は、以下のプライマーで増幅した：Ｇ ＶＨ Ｅ ｆｏｒ ＳａｌＩ（５’−ＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧ−３’）［配列番号２３２］及びｓｃＦｖ ＳａｌＩ ＶＨ Ｒ（５’−ＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣ−３’）［配列番号２３３］。断片をゲル精製し、次に二つを混合し、外側プライマーセットＢｓｓＨＩＩ Ｇ ＶＨ Ｆ及びＳａｌＩ ＶＨ Ｒで増幅して完全ＶＨ遺伝子断片を発生させた。これをＢｓｓＨＩＩ及びＳａｌＩで消化し、三重変異体ヒンジ領域を有するヒトＩｇＧ１の定常領域を含有するベクター内へライゲートした。挿入物は、ＶＨＪセグメントのコード配列を変化させるため、ＢｓｓＨＩＩ ＩＩ ＶＨ Ｆ及び新規プライマー（Ｓａｌ ＶＨ Ｒ ＲＪ（５’−ＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧ−３’））［配列番号２３４］で再増幅し、ＪＨｌ生殖細胞系列配列を一致させ、そしてヒトＩｇＧｌ−三重変異体定常領域ベクター内にライゲートした。
【０１７９】
[0189]改良されたｓｃＦｖからのＶＬ遺伝子は、同様の方法によりサブクローン化した。１８Ａ５  ＶＬ遺伝子の５’部分を包含するＰＣＲ断片は、プライマーＢｓｓＨＩＩ ＩＩ ＶＬ Ｆ（５’−ＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’）［配列番号２３５］及びｓｃＦｖ ＶＬ Ｒ ｆｏｒ ＢｓｓＨＩＩ（５’−ＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ−３’）［配列番号２３６］でのプラスミドｐＳＭＥＮ２ ＯＰ１８Ａ５Ｇ ｈｕラムダの増幅により発生させた。改良されたｓｃＦｖクローンからのＶＬ遺伝子の３’部分を包含するＰＣＲ断片は、プライマーＧＶＬ Ｆ ｆｏｒ ＸｂａＩ（５’−ＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣ−３’）［配列番号２３７］及びｓｃＦｖ ＸｂａＩ ＶＬ Ｒ（５’−ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＴＴＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＡＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＴＣ−３’）［配列番号２３８］で増幅した。断片をゲル精製し、次に各遺伝子の５’及び３’部分に相当する断片を混合し、外側プライマーセットＢｓｓＨＩＩ ＩＩ ＶＬ Ｆ及びｓｃＦｖ ＸｂａＩ ＶＬ Ｒで増幅して、完全ＶＬ遺伝子断片を発生させた。これらをＢｓｓＨＩＩ及びＸｂａＩで消化し、ヒトラムダ遺伝子の定常領域を含有するベクター内にライゲートした。
実施例９：インビトロでの改良ＩｇＧの特徴付け
実施例９．１：結合タンパク質の一過性小規模発現
[0190]クローンは、ｃｏｓ−７細胞での一過性発現後、完全ＩｇＧ形式で機能について試験した。１６の試験配列（生殖細胞系列化親１８Ａ５  ＶＬ及びＬ２、Ｌ３、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１ｌ、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｌ２４及びＬ２５）の組における各軽鎖を５つの試験配列（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６、ならびにＶＨ Ｐ、生殖細胞系列化親１８Ａ５ＶＨドメイン）の組における各重鎖と対を形成させた。各対の各プラスミド（１．４μｇ）を製造元の使用説明書に従って、TRANSIT（登録商標）トランスフェクション試薬（Minis, Madison, WI）と混合し、ＤＮＡ：TRANSIT（登録商標）試薬複合体を、６−ウェル組織培養プレート中、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％熱不活性化ウシ胎仔血清／ペニシリン／ストレプトマイシン／２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で増殖しているｃｏｓ−７細胞の単層に加えた。２４時間後、培養液を無血清培地（ＲｌＣＤｌ）と交換し、４８時間後に採取した。現在では完全長抗体を含む結合タンパク質を抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより定量した。
実施例９．２：細胞増殖の中和における抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧの活性
[0191] 血清を含まない条件培地中の８０の一過性に発現されたＩｇＧは、上記の３つの細胞株でのＩＬ−２１依存性増殖アッセイにおける活性について試験した：（１）ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞、（２）マウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞、及び（３）ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞。８０対すべてがヒトＩＬ−２１Ｒ発現ＢａＦ３細胞の増殖の中和を示し、ＶＨ４を含んでいるものを除いたすべての対がヒトＩＬ−２１Ｒ発現ＴＦ１細胞の中和を示した（データは示さない）。８０対すべてがマウスＩＬ−２１Ｒ発現ＢａＦ３細胞の増殖の中和も示し、最も強い中和は一般に親重鎖と対形成した軽鎖と関係し、そして最も弱い中和は一般にＶＨ４重鎖と関係していた（データは示さない）。最も強力な２１のＩｇＧ組み合わせ（ＡｂＡ−ＡｂＵ）は図５に示されており、ＩＣ５０データは、表６に要約されている。
【０１８０】
[0192]アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ａ−ｃ）、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図５ｄ−ｆ）、又は、４００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図５ｇ−ｉ）に対して実施した。ＩＬ−２１は示された抗体の後で細胞に加えた；増殖は４８時間後、CELLTITER-GLO（登録商標）で測定した。図２６ａ−ｃは、同一の３細胞株において同様の阻害を示している追加の研究である。
実施例９．３：一過性に発現されたラット及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒへの抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧ結合
[0193]結合タンパク質のサブセットを、ＣＨＯ−ＰＡ−Ｄｕｋｘ細胞の表面上に一過性に発現されたラット、カニクイザル、ヒトＩＬ−２１Ｒ又はヒトＩＬ−２Ｒ−γ共通サブユニットへの結合について試験した。細胞はアッセイの４８時間前にトランスフェクトした。アッセイの日に、細胞を自動プレート洗浄器（Titertek, Huntsville, AL）を使用し、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＣａＭｇ）で穏やかに５回洗浄し、ＰＢＳ／ＣａＭｇ／５％脱脂粉乳中、室温で１時間ブロックした。一過性に発現された抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧからの条件培地をブロッキング緩衝液に連続的に希釈し、ブロックされたプレート中の細胞に室温で１時間加えた。細胞をＰＢＳ／ＣａＭｇで５回洗浄し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧと、室温で１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳ／ＣａＭｇで１０回洗浄し、すべての洗浄緩衝液を除去した。発色反応が飽和に達するまで、細胞を１００μｌ  ＴＭＢとインキュベートし、１００μｌの０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、Perkin Elmer ENVISION（商標）プレートリーダー上、Ａ４５０で読み取った。
【０１８１】
[0194]２１のＩｇＧすべてが、ヒト（図６ａ−ｃ）、ラット（図６ｄ−ｆ）又はカニクイザル（図６ｇ−ｉ）ＩＬ−２１Ｒを一過性に発現しているＣＨＯ細胞に結合した。大部分は、ＣＨＯ細胞上に一過性に発現された対照タンパク質（ヒトガンマ（γ）共通鎖）へのバックグラウンドを超える結合を示さなかったが、ＩｇＧのサブセット（ＡｂＤ、ＡｂＥ、ＡｂＦ、ＡｂＨ、ＡｂＬ、及びＡｂＭ）は、バックグラウンドを超え１３ｎＭ又はより上で結合した（図６ｊ−ｌ）。データは、表６に要約されている。
【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
実施例９．４：ヒトＩＬ−２１Ｒへの抗ＩＬ−２１Ｒ  ＩｇＧ結合の選択性のBIACORE（商標）分析
[0195]一過性に発現された抗ＩＬ−２１Ｒ結合タンパク質（ここでは抗体）のサブセットの結合特異性は、BIACORE（商標）２０００表面プラズモン共鳴装置で試験した。抗ヒトＩｇＧ、抗マウス免疫グロブリン抗体及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆを、標準アミンカップリングを使用してリサーチグレードのカルボキシメチルデキストランチップ（ＣＭ５）上に固定化した。センサーチップ表面を、２０μｌ／分の流量で７分、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した。第一のフローセルは容積屈折率、マトリックス効果及び非特異的結合を補正するための参照表面として使用した。捕捉抗体（フローセル２の抗ヒトＦｃ抗体（Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA）の７，１５０レゾナンスユニット（ＲＵ）及びフローセル３の抗マウスＦｃ抗体の７，５００ＲＵ）は、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１０μｇ／ｍｌまで希釈し、活性化表面に注入した。残存活性化基は、１．０Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）でブロックした。抗ヒトＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧの分子量は、両方とも１５０ｋＤであり、ＩＬ−２１Ｒモノマーの分子量は、２７ｋＤであった。
【０１８４】
[0196]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体及び抗体対照（マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒβ及びマウス抗ヒトＩＬ−４Ｒ（R&D Systems, Minneapolis, MN）；ヒト抗ヒトＩＬ−１３（Wyeth, Cambridge, MA））を含有する条件培地は、０．２％ウシ血清を補給したＨＢＳ／ＥＰ緩衝液で希釈し、BIACORE（商標）チップの４つすべてのフローセルに注入し、種に適した捕捉抗体上に５００−７００（ＲＵ）の抗体を捕捉させた。５秒の洗浄時間に続き、陽性対照タンパク質（マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ）、ＩＬ−２１Ｒに関連する２つのヒトタンパク質（ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒトｓＩＬ−４Ｒ（R&D Systems））の５０ｎＭ溶液、又は非関連Ｈｉｓ／ＦＬＡＧタグ付けタンパク質（ヒトＩＬ−１３−Ｈ／Ｆ）を、チップ上の捕捉された抗体の上に注入した。会合及び解離フェーズは、それぞれ１２０及び１８０秒モニターし、続いてグリシン（ｐＨ１．５）５μｌを２回注入して、完全に活性な捕捉表面を再生させた。すべての結合実験はＨＢＳ／ＥＰ緩衝液中、２５℃で行った。ブランク及び緩衝液効果は、二重参照を使用し、各センサーグラムについて差し引いた。
【０１８５】
[0197]試験された抗ＩＬ−２１Ｒ抗体のすべて（１８Ａ５抗体及びＡｂＡ−ＡｂＵ）が、マウスＩＬ−２１Ｒへの明白な結合を示したが、ＩＬ−２１Ｒ関連タンパク質ヒトＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒには、又は非関連Ｈｉｓ／ＦＬＡＧタグ付けタンパク質ヒトＩＬ−１３−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧには結合しなかった（図７ａ−ｃ）。対照は、ＩＬ−２Ｒβ及びヒト可溶性ＩＬ−４Ｒが特異的抗ＩＬ−２Ｒβ及び抗ＩＬ−４Ｒ抗体により捕捉され得ることを示した（図７ｄ）。
実施例９．５：一過性に発現された抗体の精製
[0198]７抗体（ヒトＩｇＧ１三重変異体バージョン：ＡｂＳ、ＡｂＴ、ＡｂＯ、ＡｂＰ、及びＡｂＵ；及び二重変異体バージョン：ＡｂＱ及びＡｂＲ）をｃｏｓ−７細胞中で一過性に発現させ、さらなる分析のために精製した。加えて、Ｆｃレセプター結合の異なったレベルを有すると予測される、ヒトＩｇＧテイルを有するＡｂＴの３つのバージョン（野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ１二重変異体）も作製した。８つのＴ−１７５フラスコ中の各々の細胞をトランスフェクトするため２５μｇの各プラスミドを使用することを除いて、上記TRANSIT（登録商標）プロトコルに従った。条件培地の第一の採取に続いて、新鮮なＲ１ＣＤ１を加え、さらに７２時間後、採取した。条件培地をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。抗体をプロテインＡ樹脂にロードし、２０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）で溶出し、トリス（ｐＨ８．５）で中和し、ＰＢＳ内に透析した。
実施例９．６：ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒへの抗体結合のBIACORE（商標）分析
[0199]ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへの抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の結合の動力学は、BIACORE（商標）表面プラズモン共鳴装置で試験した。抗ヒトＩｇＧ抗体（Invitrogen Corporation）は、標準アミンカップリングを使用してリサーチグレードのカルボキシメチルデキストランチップ（ＣＭ５）上に固定化した。表面を、２０μｌ／分の流量で７分、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した。第一のフローセルは容積屈折率、マトリックス効果及び非特異的結合を補正するための参照表面として使用した。抗ヒトＦｃ抗体は、２０μｇ／ｍｌに１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈し、２９５０−３４０５レゾナンスユニット（ＲＵ）を４つのフローセルの各々に捕捉させた。残存活性化基は、１．０Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロックした。
【０１８６】
[0200]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、０．２％ウシ血清アルブミンを補給したＨＢＳ／ＥＰ緩衝液で０．１−０．２μｇ／ｍｌに希釈し、BIACORE（商標）チップにロードした。短い洗浄時間に続き、０−１００ｎＭヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ又は１０−５００ｎＭマウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆの溶液を５０μｌ／分の流量でチップ上に注入した。会合フェーズをヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒ動力学について３分間実施し、そしてｈＩＬ−２１Ｒについては１５分及びｍＩＬ−２１Ｒについて５分間解離フェーズをモニターし、続いてグリシン（ｐＨ１．５）１０μｌの２回注入及び３０μｌの１回注入により、完全に活性な捕捉表面を再生した。すべての結合実験はＨＢＳ／ＥＰ緩衝液中２５℃で実施し、試料ラックは１５℃に維持した。ブランク及び緩衝液効果は、二重参照を使用し、各センサーグラムについて差し引いた。センサーグラムは図８ａ−ｂ（ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ）及び８ｃ−ｄ（マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ）に示されている。結合動力学的パラメータは、表７Ａに示されており、反復した実験からの追加の動力学的データは表７Ｂに示されている。
【０１８７】
[0201]加えて、上記プロトコルにより、カニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧへの結合動力学についてＡｂＳ及びＡｂＴを試験した。ヒト及びカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆの結合プロファイルはＡｂＳ及びＡｂＴ両方について同様であった（図９）。図９は、ＡｂＳ（９ａ）及びＡｂＴ（９ｃ）に対するカニクイザルＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの結合；及びＡｂＳ（９ｂ）及びＡｂＴ（９ｄ）に対するヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧの結合を示している。
【０１８８】
【表７Ａ】
2011523849.tif 000021
【０１８９】
【表７Ｂ】
2011523849.tif 000022
【０１９０】
実施例９．７：BIACOREエピトープ競合アッセイ
[0202]抗体ＡｂＳ及びＡｂＴ及び親抗体１８Ａ５を直接ＣＭ５  BIACORE（商標）チップ上に固定化した。マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ（１００ｎＭ）を３００秒間チップ上に流し、続いて洗浄し（１００秒）、そして次にＡｂＳ、ＡｂＴ、Ｄ５あるいは非中和抗ｍＩＬ−２１Ｒ抗体（７Ｃ２）の５μｇ／ｍｌ溶液を表面に流した。ＡｂＳ、ＡｂＴ及びＤ５では追加の結合は観察されず、ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆ上のそれらの結合部位がＡｂＳ、ＡｂＴ又は１８Ａ５抗体への同時発生的結合によりブロックされたことを示している（図１０ａ）。対照的に、非中和対照抗ＩＬ−２１Ｒ抗体７Ｃ２は、ＡｂＳ、ＡｂＴ又は１８Ａ５抗体上に捕捉されたｍＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆに結合することが可能であり、この対照抗体は捕捉抗体により結合されたエピトープとは異なったエピトープで結合することを示している。
【０１９１】
[0203]同様に、ＡｂＳ及びＡｂＴは、ＣＭ５  BIACORE（商標）チップ上に固定化されたＡｂＳ又はＡｂＴにより捕捉されたヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへ結合しないが、一方、対照抗ヒトＩＬ−２１Ｒ抗体（９Ｄ２）はＡｂＳ又はＡｂＴにより捕捉されたヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｈ／Ｆへ結合することが可能であった（図１０ｂ）。この観察は、ＡｂＳのための結合部位が、ＡｂＴによる同時発生的結合によりブロックされることを示しており、逆の場合も同様である。
実施例９．８：細胞に基づいた増殖アッセイ
[0204]精製したＩｇＧは、前記の３細胞株：ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞、マウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞及びヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞における、ＩＬ−２１依存性増殖アッセイでの活性を試験した。すべてが、ヒト及びマウスＩＬ−２１Ｒ−依存性増殖両方の強力な阻害を示し、親１８Ａ５  ＩｇＧの阻害よりも大きな効力であった（図１１、表８）。アッセイは、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図１１ａ）、２００ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２１を加えたマウスＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞（図１１ｂ）及び１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２１を加えたヒトＩＬ−２１Ｒ−ＴＦ１細胞（図１１ｃ）で実施した。図２６ｄは、ヒトＩＬ−２１Ｒ−ＢａＦ３細胞に対するこれらの抗体の効果の追加の研究結果を示している。
【０１９２】
【表８】
2011523849.tif 000023
【０１９３】
実施例９．９：初代ヒトＢ細胞増殖アッセイ
[0205]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体を、初代ヒトＢ細胞のＩＬ−２１依存性増殖を阻害するそれらの能力について試験した。健常ヒトドナーからのバフィーコート（buffy coat）細胞はMassachusetts General Hospital (Boston, MA)から得た。該細胞をROSETTESEP（商標）Ｂ細胞濃縮カクテル（StemCell Technologies, Vancouver, Canada）とインキュベートし、製造元の使用説明書に従ってＢ細胞を単離した。得られた集団（６０〜８０％ＣＤ１９＋Ｂ細胞）は、９６ウェル平底プレートにおいて、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ中、ｌｘ１０５／ウェルで培養した。Ｂ細胞は、５％ＣＯ２に調整した３７℃インキュベーターにおいて３０分、連続的に希釈した抗ヒトＩＬ−２１Ｒ抗体で前処理した。処理したＢ細胞は、５％ＣＯ２に調整した３７℃インキュベーターにおいて３日間、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０ｍＡｂ（BD Biosciences,San Jose, CA）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１サイトカインで刺激した。３日目、培養液を０．５μＣｉ／ウェル３Ｈ−チミジン（Perkin Elmer (NEN)）で瞬間標識し、５時間後、ガラス繊維フィルターマット上に回収した。３Ｈ−チミジン取り込みは、液体シンチレーション計測により決定した。改良された抗体のすべてが親１８Ａ５抗体より強い効力でＩＬ−２１依存性増殖を中和した（図１２ａ−ｂ、表９；図２６ｅも参照されたい）。
【０１９４】
【表９】
2011523849.tif 000024
【０１９５】
実施例９．１０：初代ヒトＴ細胞増殖アッセイ
[0206]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体を、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２１依存性増殖を阻害するそれらの能力について試験した。健常ヒトドナーからのバフィーコート細胞はMassachusetts General Hospitalから得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造元の使用説明書に従ってROSETTESEP（商標）ＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カクテル（StemCell Technologies）を使用する陰性選択により単離した。得られた集団は、〜８０−９０％ＣＤ４＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞であった。濃縮したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、５％ＣＯ２に調整した３７℃インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及びＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ中、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコートしたミクロスフェアで３日間活性化した。活性化後、ミクロスフェアを除去し、細胞を洗浄し、培地中、およそ１ｘ１０６細胞／ｍｌで一晩静止させた。静止させた細胞は次に、アッセイプレートへの添加に先だって再度洗浄した。抗ヒトＩＬ−２１レセプター抗体の連続希釈を平底９６ウェルプレート中の培地で行い、続いてヒトＩＬ−２１（２０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）及び活性化及び静止ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）を逐次添加した。プレートは次にさらに３日間インキュベートし、アッセイの最後の６時間の間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Perkin Elmer (NEN)）で瞬間標識した。細胞をガラス繊維フィルターマット上に回収し、３Ｈ−チミジン取り込みは、液体シンチレーション計測により決定した。改良された抗体のすべてが親１８Ａ５抗体より強い効力でＩＬ−２１依存性増殖を中和した（図１３、表１０Ａ；図２６ｆも参照されたい）。
【０１９６】
【表１０Ａ】
2011523849.tif 000025
【０１９７】
実施例９．１１：初代マウスＴ細胞増殖アッセイ
[0207]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体を、初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２１依存性増殖を阻害するそれらの能力について試験した。１２週齢メスＢＡＬＢ／Ｃマウスからの膝窩、腋窩、上腕及び鼠径リンパ節及び脾臓を採取した。脾臓細胞の単細胞懸濁液は、０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌを含有する０．０１７Ｍトリス（ｐＨ７．４）を使用し、赤血球を枯渇させた。脾臓及びリンパ節細胞をプールし、マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット（R&D Systems）を使用してＣＤ８＋細胞を濃縮した。マウスＣＤ８＋細胞（３ｘ１０４；１０％ウシ胎仔血清を含有し、そして０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補給したＤＭＥＭに懸濁）を９６ウェル、抗ｍＣＤ３活性化プレート（BD Biosciences）に蒔き；ｍＩＬ−２１（５０ｎｇ／ｍｌ）を、すべてのウェルに加えた。試験抗体は２０μｇ／ｍｌから始めて、三重に力価を測定した。細胞は、３７℃／１０％ＣＯ２インキュベーター中で３日間増殖させた。培養の最後の５時間の間に細胞を０．５μＣｉのメチル−３Ｈ−チミジン／ウェル（GE Healthcare）で標識した。細胞をMach IIIセルハーベスター（TomTec, Hamden, CT）で採取し、Triluxマイクロベータカウンター（Perkin Elmer）で計数した。ＡｂＰは別として、改良された抗体のすべてが、親１８Ａ５抗体より強い効力でＩＬ−２１依存性増殖を中和した（図１４、表１０Ｂ；図２６ｇも参照されたい）。
【０１９８】
【表１０Ｂ】
2011523849.tif 000026
【０１９９】
実施例９．１２：ＡＤＣＣアッセイ
[0208]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体は、標的細胞に結合した場合に抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発するそれらの能力について試験した。実験の前日、バフィーコートをＰＢＳで１：１に希釈し、それをFICOLL（登録商標）（GE Healthcare）に層積し、１２００ｇで２０分遠心分離することによりＰＢＭＣを単離した。FICOLL（登録商標）層の上層からＰＢＭＣを除き、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２（R&D Systems）で一晩刺激した。実験当日、遠心分離によりＰＢＭＣを回収し、１ｘ１０８細胞／ｍｌで培地に再懸濁した。ＢＪＡＢ細胞は、０．５μＭ  ＣＦＳＥ（MOLECULAR PROBES(登録商標),Invitrogen Corporation）を用いて３７℃で１０分標識し、次にウシ胎仔血清で１回及びＰＢＳで２回洗浄した。細胞は次に、１００μｌの培地中、２ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに蒔いた。５０μｌの４ｘ抗体、続いて５０μｌの５ｘ１０６ＰＢＭＣをＢＪＡＢ細胞に加えると、最終１：２５標的：エフェクター細胞比を得た。細胞を３７℃で６時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色して、死滅した及び死にかかっている細胞を標識した。標的細胞の死滅（ＣＦＳＥ＋）は、FACSCALIBUR（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）においてＰＩ染色を測定することにより評価した。野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を有するただ一つの抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、ＡｂＺのみが、標的細胞結合しない対照抗ＩＬ−１３抗体により示されたバックグラウンドレベルより上のＡＤＣＣを示した。ヒトＩｇＧ４（ＡｂＹ）を有する形態及びヒトＩｇＧ１の二重変異体（ＡｂＸ）及び三重変異体（ＡｂＴ）を有する形態を含み、ＡｂＺと同一の可変ドメインを有するすべての抗体が、ＡＤＣＣのバックグラウンドレベルしか示さなかった（図１５）。試験された他の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体のすべてがヒトＩｇＧ１の三重変異体形を含んでおり、バックグラウンドＡＤＣＣを示した。陽性対照抗体、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））は、すべての実験においてＡＤＣＣを誘発した。
【０２００】
実施例９．１３：Ｃｌｑ  ＥＬＩＳＡ
[0209]抗ＩＬ−２１Ｒ抗体による細胞表面結合が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を導き易いかどうかを決定するため、ＥＬＩＳＡにおいて、相補的成分Ｃｌｑへ結合するそれらの能力について抗体を試験した。ＩＬ−２１Ｒ抗体及びリツキシマブ（RITUXAN（登録商標））をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈した。希釈した抗体（１００μｌ）でCOSTAR（登録商標）高結合ＥＬＩＳＡプレート（Corning Life Sciences, Lowell, MA）を４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で３回洗浄し、室温にて１時間、２００μｌのブロッキング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＰＯ４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン、０．０１％ツイーン）でブロックした。Ｃｌｑを含むと前もって決定されたヒト血清（Quidel, San Diego, CA）をＰＢＳで１：５０に希釈した。１時間のブロッキング後、プレートを洗浄し、１００μｌの希釈血清を各ウェルに加え、振盪機上、室温で２時間インキュベートした。３回の洗浄に続き、１００μｌの０．１μｇ／ｍｌニワトリポリクローナル抗ヒトＣｌｑ抗体（AbCam, Cambridge, MA）を、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、１：４０００に希釈したニワトリＩｇ−Ｙ−ＨＲＰ（AbCam）に対する１００μｌのウサギポリクローナル抗体と、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢで５分発色させ、続いて５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読み取った。野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を有するただ一つの抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、ＡｂＺのみが、Ｃｌｑ結合を欠くことが以前に示されている三重変異体ヒトＩｇＧ１定常領域を有する対照抗体により示されたバックグラウンドレベルより上のＣｌｑ結合を示した。ヒトＩｇＧ４（ＡｂＹ）を有する形態及びヒトＩｇＧ１の二重変異体（ＡｂＸ）及び三重変異体（ＡｂＴ）を有する形態を含む、ＡｂＺと同一の可変ドメインを有するすべての抗体が、Ｃｌｑ結合のバックグラウンドレベルしか示さなかった（図１６）。試験された他の抗ＩＬ−２１Ｒ抗体のすべてがヒトＩｇＧ１の三重変異体形を含んでおり、バックグラウンドＣｌｑ結合を示した。
【０２０１】
実施例９．１４：サイトカイン競合アッセイ
[0210]抗体ＡｂＴがマウスＩＬ−２１ＲにＩＬ−２１サイトカインと競合する様式で結合することを立証するため、サイトカイン競合アッセイを実施した。１μｇ／ｍｌの抗体ＡｂＴでＥＬＩＳＡプレートをコートし、次に１％ＢＳＡのＰＢＳ／．０５％ツイーン溶液でブロックした。単独であるいは濃度を増加させたマウスＩＬ−２１の存在下で、ウェルにビオチン化マウスＩＬ−２１Ｒ−Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（１．５ｎｇ／ｍｌ）を加え、固定化された抗体へのレセプターの結合を、ＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジンそしてその後のＴＭＢ検出試薬とのインキュベーションで検出した。マウスＩＬ−２１は４ｎｇ／ｍｌより上でほとんど完全にＡｂＴへのｍＩＬ−２１Ｒの結合をブロックすることができ、該抗体及び該サイトカインがマウスＩＬ−２１Ｒへの結合について競合することを示している（図２７）。
【０２０２】
均等物
当業者は、ルーチン実験程度を使用して本明細書に記載した発明の具体的態様の多くの均等物を認識する、あるいは確認することができるであろう。こうした均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１ａ】
2011523849.tif 000027
【図１ｂ】
2011523849.tif 000028
【図１ｃ】
2011523849.tif 000029
【図２ａ】
2011523849.tif 000030
【図２ｂ】
2011523849.tif 000031
【図２ｃ】
2011523849.tif 000032
【図３ａ】
2011523849.tif 000033
【図３ｂ】
2011523849.tif 000034
【図３ｃ】
2011523849.tif 000035
【図４ａ】
2011523849.tif 000036
【図４ｂ】
2011523849.tif 000037
【図４ｃ】
2011523849.tif 000038
【図５ａ】
2011523849.tif 000039
【図５ｂ】
2011523849.tif 000040
【図５ｃ】
2011523849.tif 000041
【図５ｄ】
2011523849.tif 000042
【図５ｅ】
2011523849.tif 000043
【図５ｆ】
2011523849.tif 000044
【図５ｇ】
2011523849.tif 000045
【図５ｈ】
2011523849.tif 000046
【図５ｉ】
2011523849.tif 000047
【図６ａ】
2011523849.tif 000048
【図６ｂ】
2011523849.tif 000049
【図６ｃ】
2011523849.tif 000050
【図６ｄ】
2011523849.tif 000051
【図６ｅ】
2011523849.tif 000052
【図６ｆ】
2011523849.tif 000053
【図６ｇ】
2011523849.tif 000054
【図６ｈ】
2011523849.tif 000055
【図６ｉ】
2011523849.tif 000056
【図６ｊ】
2011523849.tif 000057
【図６ｋ】
2011523849.tif 000058
【図６ｌ】
2011523849.tif 000059
【図７ａ】
2011523849.tif 000060
【図７ｂ】
2011523849.tif 000061
【図７ｃ】
2011523849.tif 000062
【図７ｄ】
2011523849.tif 000063
【図８ａ】
2011523849.tif 000064
【図８ｂ】
2011523849.tif 000065
【図８ｃ】
2011523849.tif 000066
【図８ｄ】
2011523849.tif 000067
【図９ａ】
2011523849.tif 000068
【図９ｂ】
2011523849.tif 000069
【図９ｃ】
2011523849.tif 000070
【図９ｄ】
2011523849.tif 000071
【図１０ａ】
2011523849.tif 000072
【図１０ｂ】
2011523849.tif 000073
【図１１ａ】
2011523849.tif 000074
【図１１ｂ】
2011523849.tif 000075
【図１１ｃ】
2011523849.tif 000076
【図１２ａ】
2011523849.tif 000077
【図１２ｂ】
2011523849.tif 000078
【図１３】
2011523849.tif 000079
【図１４】
2011523849.tif 000080
【図１５】
2011523849.tif 000081
【図１６】
2011523849.tif 000082
【図１７ａ】
2011523849.tif 000083
【図１７ｂ】
2011523849.tif 000084
【図１７ｃ】
2011523849.tif 000085
【図１８ａ】
2011523849.tif 000086
【図１８ｂ】
2011523849.tif 000087
【図１８ｃ】
2011523849.tif 000088
【図１９ａ】
2011523849.tif 000089
【図１９ｂ】
2011523849.tif 000090
【図１９ｃ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２６ｄ】
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【図２６ｅ】
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【図２６ｆ】
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【図２６ｇ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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