(57)【要約】  本発明は、遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補的なリボ核酸鎖を含むマイクロRNA(miRNA）分子と細胞を接触させることによって、その細胞内での遺伝子産物の発現を増加させるための組成物、医薬製剤、キットおよび方法を提供する。
2011507554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の発現を増加させるのに十分な量のｍｉＲＮＡ分子を哺乳類細胞に導入する工程であって、
前記ｍｉＲＮＡ分子が、
前記遺伝子のノンコーディング配列と相補性を有する５’領域、および
前記ノンコーディング配列と非相補的である少なくとも１つのヌクレオチドを有する３’末端領域を含むリボ核酸鎖を含み、
前記導入が前記遺伝子の発現の増加をもたらす工程を含む、
ＣＳＤＣ２、ＮＰＭ１、ＮＵＰＬ２、ＢＦＡＲ、ＩＲＡＫ３、ＧＡＡ、ＮＳＵＮ７、ＲＡＧＥ、ＦＯＸＰ２、ＲＢＫＳ、ＡＣＯＴ６、ＳＩＲＰＤ、およびＣＣＮＢ１からなる群から選択される遺伝子の発現を増加させるための方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって前記哺乳類細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記相補性を有する領域が約２０〜約２５塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子がＣＳＤＣ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リボ核酸鎖がＣＳＤＣ２−６７０（配列番号１１）の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲＮＡ分子の有効量を投与する工程であって、
前記ｍｉＲＮＡ分子が、
細胞増殖を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング配列と相補性を有する５’領域、および
前記ノンコーディング配列と非相補的である少なくとも１つのヌクレオチドを有する３’末端領域を含むリボ核酸鎖を含み、
前記投与が、前記ポリペプチドの発現増加および細胞増殖の減少を提供する工程、
を含む、細胞の増殖を減少させる方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって前記哺乳類細胞に導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが腫瘍抑制因子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記相補性を有する領域が約１９〜約２５塩基対を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡ分子の有効量を投与する工程であって、
前記ｍｉＲＮＡ分子が、
細胞増殖を増加させるポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング配列と相補性を有する５’領域、および
前記ノンコーディング配列と非相補的である少なくとも１つのヌクレオチドを有する３’末端領域を含むリボ核酸鎖を含み、
前記投与が、前記ポリペプチドの発現増加および細胞増殖の増加を提供する工程、
を含む、細胞の増殖を増加させる方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって前記哺乳類細胞に導入される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが増殖因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記相補性を有する領域が約１９〜約２５塩基対を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ｍｉＲＮＡ分子の有効量を投与する工程であって、
前記ｍｉＲＮＡ分子が、
アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング配列と相補性を有する５’領域、および
前記ノンコーディング配列と非相補的である少なくとも１つのヌクレオチドを有する３’末端領域を含むリボ核酸鎖を含み、
前記投与が、前記ポリペプチドの発現増加およびアポトーシスの増加を提供する工程、
を含む、アポトーシスを増加させる方法。
【請求項２１】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍｉＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって前記哺乳類細胞に導入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記相補性を有する領域が約１９〜約２５塩基対を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする前記遺伝子が、Ｂａｘ、ＳＭＡＣ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、ＢｃＩ−Ｘｓ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｎｏｘａ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡおよびＥｇｌ−１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
単離された組成物であって、
ｍｉＲＮＡ分子が、ＣＳＤＣ２遺伝子の転写を活性化するのに十分な、ＣＳＤＣ２遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補性を有する領域を含む、第１のリボ核酸鎖を含む組成物。
【請求項２７】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ｍｉＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記リボヌクレオチド鎖が、３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドの前記ノンコーディング核酸配列と非相補的である領域を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記相補性を有する領域が約１９〜約２５塩基対を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記リボ核酸鎖がｄｓＣＳＤＣ２−６７０（配列番号１１）の配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】
ｍｉＲＮＡ分子が、Ｅ−カドヘリン遺伝子の転写を活性化するのに十分な、Ｅ−カドヘリン遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補性を有する領域を含む、第１のリボ核酸鎖を含むキット。
【請求項３４】
活性化されたＥ−カドヘリン遺伝子の転写を増加させるのに十分な、Ｅ−カドヘリン遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補性を有する領域を含む、第１のリボ核酸鎖を含む、少なくとも１つの他のｍｉＲＮＡ分子をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記リボ核酸鎖が配列番号１４のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからなる、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記ｍｉＲＮＡが核酸ベクター上にコードされる、請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
前記リボ核酸鎖がｄｓＥｃａｄ−６４０（配列番号５）の配列からなる、請求項３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記リボ核酸鎖がｄｓＥｃａｄ−２１５（配列番号１３）の配列からなる、請求項３３に記載のキット。
【請求項３９】
前記キットが、薬剤的に許容可能な担体、薬剤的に許容可能な希釈剤、薬剤的に許容可能な賦形剤および薬剤的に許容可能なアジュバンドの少なくとも１種をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項４０】
ＣＳＤＣ２遺伝子の転写を活性化するのに十分な、ＣＳＤＣ２遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補性を有する領域を含む、リボ核酸鎖を含む、ｍｉＲＮＡ分子を含むキット。
【請求項４１】
前記ｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記ｍｉＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記リボヌクレオチド鎖が、３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドの前記ノンコーディング核酸配列と非相補的である領域を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
前記相補性を有する領域が約１４〜約３０塩基対を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４５】
前記相補性を有する領域が約１９〜約２５塩基対を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４６】
前記リボ核酸鎖がｄｓＣＳＤＣ２−６７０（配列番号１１）の配列を含む、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた連邦補助金第R01CA101844号、第R01CA111470号、第T32DK007790号、および米国国防総省からの与えられた連邦補助金第R21CA131774号による政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
相互参照
本出願は、2007年12月28日に出願された米国特許仮出願第61/017,449号、および2008年1月25日に出願された米国特許仮出願第61/023,793号の利益を請求し、これら仮出願は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
小さな2本鎖RNA(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)のトリガーであると知られている(Fire et al., (1998) Nature 391 : 806-11 ; Elbashir et al., (2001 ) Nature 411 : 494-8.)。マイクロRNA(miRNA)は、内在性のdsRNA源としての役割を果たす一群の小さなノンコーディングRNAである。RNAiとの類似の方法により、細胞はmiRNAを利用し、標的mRNAの翻訳を抑制するか、標的mRNAの配列特異的な分解を指示することにより遺伝子発現を負に制御する (Zeng et al.,(2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100: 9779-84; Lee et al., (1993) Cell 75, 843-54)。この点において、miRNAは遺伝子発現の主要制御因子であると考えられている。
【０００４】
最近では、miRNAは、標的遺伝子の発現を抑制することによってその効果を引き出すと考えられている(He et al., (2004) Nat Rev Genet 5, 522-31 )。マイクロRNA(miRNA)は、発生、増殖、およびアポトーシスを含む細胞の様々なプロセスにおいて重要な役割を担う(Carrington et al., (2003) Science 301 , 336-8)。ガン発生もまた、miRNAの発現パターンの変化と関連づけられている(Lu et al., (2005) Nature 435, 834-8, O'Donnell et al., (2005) Nature 435, 839-43, He et al., (2005) Nature 435, 828-33)。
【０００５】
プロモーター領域を標的とする合成dsRNAが遺伝子発現を誘導する（この現象はRNA活性化（RNAa）と称される）ことが以前に報告された(Li et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17337-42)。それ以来、他の人々が類似の結果を観察している（Janowski, et al., (2007) Nat Chem Biol 3, 166-73）。RNAaは、標的化された遺伝子誘導に反応して、表現型に予測できる変化を誘導し、下流の遺伝子発現に影響を与える(Li et al., supra; Janowski et al., supra)。RNAiとよく似て、RNAaは遺伝子発現を操作することができ、細胞経路を変え、細胞生理を変化させる。RNAaと類似の方法で、miRNAもまた遺伝子発現を正に制御するように機能し得る。miRNAと高度に相補的な配列について遺伝子プロモーターを入念に調べることにより、特定のmiRNA、miR-373の標的部位がE-カドヘリンおよびCSDC2（タンパク質C2を含むコールドショックドメイン）のプロモーターで発見された。miR-373がE-カドヘリンおよびCSDC2両方のロバストな発現を誘導することが発見され、遺伝子活性化におけるmiRNAの新しい潜在的な機能が同定された。
【０００６】
一般に、miRNAの適用は、遺伝子発現抑制または遺伝子発現の減少に限定されており、遺伝子活性化には適用されていない。従って、なお、遺伝子発現を活性化し得る化合物に対するニーズ、およびそのような化合物を遺伝性疾患の研究および治療のために用いる方法に対するニーズがある。本発明は、これらのおよび他のニーズに取り組む。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補的なリボ核酸鎖を含むmiRNA分子と細胞を接触させることによって、その細胞内で遺伝子産物の発現を増加させるための組成物、医薬品、キットおよび方法を提供する。
【０００８】
本発明のこれらのおよび他の利点は、下記の発明を実施するための形態から明らかとなる。
【０００９】
本発明は、添付の図面と共に読むと、以下の発明を実施するための形態から最も良く理解される。一般的な方法に従って、図面の様々な特徴を正確な縮尺で製図していないことを強調する。それどころか、様々な特徴の寸法は、明瞭にするために適宜拡大または縮小されている。図面には以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】パネルAは、E-カドヘリンプロモーターおよびそのCpGアイランドの概略図である。miR-373の標的部位の位置を示している。パネルBは、転写開始部位に対して5’方向の-645ヌクレオチドに位置するmiR-373標的部位の配列の図である。太字の塩基は、プロモーターDNAのセンス鎖にある標的部位を示す。その標的部位と相補的な配列を実線で示す。miR-373とE-カドヘリンの間で、G:U/T揺らぎ塩基対合が生じる標的部位内の配列をコロンで示す。上段の配列は、E-カドヘリン遺伝子(配列番号1)の野生型のプロモーター配列である。下段の配列はmiR-373AS(配列番号3)である。パネルCは、miR-373およびdsEcad-640の配列と構造を示す。miR-373の両鎖に存在する小文字は、ネイティブの2塩基の3’オーバーハングに相当する。その標的配列と相補的な配列をダッシュで示す。miR-373のリボ核酸鎖間でG:U/T揺らぎ塩基対合が生じる配列をコロンで示す。このページの左側の配列の上の鎖はmiR-373S(配列番号2)である。このページの左側の配列の下の鎖はmiR-373AS(配列番号3)である。本発明の配列を表すとき、本明細書で使用される「S」とはセンス鎖を表し、「AS」はアンチセンス鎖を表す。このページの右側の配列の上の鎖はdsEcad-640S(配列番号4)である。このページの右側の配列の下の鎖はdsEcad-640AS(配列番号5)である。パネルDは、PC-3細胞を図に示されるdsRNAでトランスフェクションした後のE-カドヘリン発現量を示すゲルの写真である。miR-373およびdsEcad-640(miR-373 + dsEcad-640)の併用処理を、同量の各dsRNAを用いて行った。模擬サンプルを、dsRNAなしにトランスフェクションした。E-カドヘリンおよびGAPDHのmRNA発現量を、GAPDHをローディングコントロール（loading control）として用いる標準的なRT-PCRによって評価した。パネルEは、リアルタイムPCRによって決定したE-カドヘリンの相対発現量（4回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差）を示すグラフである。E-カドヘリンの値をGAPDHで標準化した。パネルFは、E-カドヘリンポリペプチドの誘導を示すウエスタンブロットである。GAPDHもまた検出され、ローディングコントロールとして役割を果たした。
【図２】パネルAは、miR-373のヘアピンRNA前駆体(Pre-miR-373)の配列の図を示す。Pre-miR-373は、ヘアピン様構造を形成する61個のヌクレオチドRNA分子(配列番号14)である。パネルBは、PC-3細胞をpre-miR-Con、pre-miR-373、またはmiR-373でトランスフェクションした後のE-カドヘリン発現量を示すゲルの写真である。E-カドヘリンおよびGAPDH mRNA発現量を、標準的なRT-PCRによって評価した。パネルCは、リアルタイムPCRによって決定した相対発現量（4回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差）を示すグラフである。E-カドヘリンの値をGAPDHで標準化した。パネルDは、E-カドヘリンポリペプチド量およびGAPDHポリペプチド量を示すウエスタンブロットである。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。
【図３】パネルAは、pre-miR373がmiR-373にプロセシングされることを示すmiR-373の細胞内量のグラフであり、共に同レベルで検出され得る。パネルBは、個々の細胞株内の内在性miR-373の相対量を示す。
【図４】パネルAは、PC-3細胞をダイサー-PMO（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）またはCon-PMO（コントロール）で処理した後のダイサーに与える影響を示すウエスタンブロットである。細胞を、最初にPMO処理した後、miR-373またはpre-miR-373でトランスフェクションした。全タンパク質を抽出し、ダイサーおよびGAPDHの量を免疫ブロット解析によって決定した。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。パネルBは、PC-3細胞をダイサー-PMOまたはCon-PMOがある場合または無い場合で処理した後の、E-カドヘリン発現量を示すゲルの写真である。次の日、細胞を、pre-miR-Conまたはpre-miR-373でトランスフェクションした。E-カドヘリンおよびGAPDHのmRNA発現量を標準的なRT-PCRによって評価した。パネルCは、PC-3細胞を図に示されるPMO分子で処理した後のE-カドヘリン量を示すゲルの写真である。次の日、細胞を、dsコントロールまたはmiR-373でトランスフェクションした。E-カドヘリンおよびGAPDHのmRNA発現量を標準的なRT-PCRによって評価した。
【図５】パネルAは、CSDC2プロモーター内の転写開始部位に対して5’方向の-787ヌクレオチドに位置するmiR-373標的部位の配列の図である。太字の塩基はプロモーターDNAのセンス鎖にある推定標的部位を示す。その標的部位と相補的なmiR-373の塩基をダッシュで示す。miR-373とCSDC2標的配列の間でG:U/T揺らぎ塩基対合が生じるmiR-373の塩基をコロンで示す。上段の配列は、CSDC2プロモーター領域の野生型の配列(配列番号28)である。下の鎖はmiR-373AS(配列番号3)である。パネルBは、PC-3細胞をdsコントロールまたはmiR-373でトランスフェクションした後のCSDC2発現量を示すゲルである。CSDC2およびGAPDHの発現を標準的なRT-PCRによって決定した。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。パネルCは、模擬トランスフェクション、pre-miR-Conトランスフェクションまたはpre-miR-373トランスフェクション後の、PC-3細胞内のCSDC2およびGAPDHの発現量を示すゲルの写真である。パネルDは、リアルタイムPCRによって決定したCSDC2の相対発現量（4回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差）を示すグラフである。CSDC2の値をGAPDHで標準化した。
【図６】miR-373標的化プロモーターの位置でのRNApIIの濃縮を示すゲルの写真である。PC-3細胞を、模擬、dsコントロール、またはmiR-373を用いてトランスフェクションした。DNAの転写活性領域を免疫沈降するために、RNApII特異的な抗体を用いてChIPアッセイを行った。バックグラウンドの増幅を同定するために、抗体を含まない(No AB)実験が役割を果たした。インプットDNAをローディングコントロールとして増幅した。
【図７】パネルAは、miR-373の最初または最後の4つのヌクレオチドに変異を起こし、それぞれmiR-373-5MMおよびmiR-373-3MMになることを示す配列の図である。変異させた塩基を太字で示す。パネルAの一番上の配列の上の鎖はmiR-373S(配列番号2)で、パネルAの一番上の配列の下の鎖はmiR-373AS(配列番号3)である。パネルAの中央の配列の上の鎖はmiR-373-5MMS(配列番号6)である。パネルAの中央の配列の下の鎖はmiR-373-5MMAS(配列番号7)である。パネルAの一番下の配列の上の鎖はmiR-373-3MMS(配列番号8)である。パネルAの一番下の配列の下の鎖はmiR-373-3MMAS(配列番号9)である。パネルBは、図に示された各miRNA2本鎖で細胞をトランスフェクションした後のE-カドヘリンおよびCSDC2発現を示すゲルの写真である。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。パネルCは、標的遺伝子のみの発現を特異的に誘導するE-カドヘリン(dsEcad-215)プロモーターまたはCSDC2(dsCSDC2-670)プロモーターのいずれか一方に存在する特異的部位を標的化するmiRNAを示すゲルの写真である。
【図８】パネルAは、anti-miR-373がmiR-373によって誘導される遺伝子発現を抑制することを示すゲルの写真である。パネルAは、anti-miR-Conまたはanti-miR-373と併用して、細胞をmiR-373でトランスフェクションした後のCSDC2およびE-カドヘリンの転写量を示す。パネルBは、pre-miR-373およびanti-miR-Conまたはpre-miR-373およびanti-miR-373で、細胞を同時トランスフェクションした後のCSDC2およびE-カドヘリンの転写量を示す。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。
【図９】パネルAは、PC-3細胞にmiR-373およびdsEcad-215を組み合わせてトランスフェクションすると、E-カドヘリン量が相加的に増加し得ることを示すゲルの写真である。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。パネルBは、リアルタイプPCRによって決定されたE-カドヘリンの相対発現量のグラフで、2つのmiRNAの付加的増加を示し、dsEcad-215の発現量の約2倍の発現量を生み出している。
【図１０】マウスのCcnb1遺伝子プロモーターを標的にするdsRNAがCcnb1遺伝子発現を誘導することを示す。パネルAは、Ccnb1プロモーター内における転写開始部位からのdsRNAの位置を示す概略図である。パネルBは、72時間、50nMのdsコントロールまたはdsCcnb1でトランスフェクションしたNIH/3T3細胞を示す。Ccnb1のmRNA発現を、リアルタイムRT-PCRによって解析し、β-アクチンのmRNA発現で標準化した。模擬サンプルを、dsRNAが無い状態でトランスフェクションした。データを、3回の独立した実験の平均値±標準誤差で表す。パネルCは、パネルBと同様にトランスフェクションしたNIH/3T3細胞を示し、Ccnb1のタンパク質量をウエスタンブロット解析によって調べた。
【図１１】マウスCcnb1遺伝子プロモーターを標的にするmiRNAがCcnb1遺伝子発現を誘導することを示す。パネルAは、Ccnb1プロモーター内における転写開始部位からのmiRNAの位置を示す概略図である。パネルBは、72時間、30nMのpre-miRNAコントロール、miR-744、またはmiR-1186でトランスフェクションしたNIH/3T3細胞を示す。Ccnb1のmRNA発現を、リアルタイムRT-PCRによって解析し、β-アクチンのmRNA発現量で標準化した。データを、3回の独立した実験の平均値±標準誤差で表す。パネルCは、パネルBと同様にトランスフェクションしたNIH/3T3細胞を示し、Ccnb1のタンパク質量をウエスタンブロット解析によって調べた。パネルDおよびEは、50nMのコントロールsiRNAまたはダイサー（Dicer）に対抗するsiRNA(パネルD)およびドローシャ（Drosha）に対抗するsiRNA(パネルE)でトランスフェクションしたNIH/3T3細胞を示す。ノックダウン効率をリアルタイムRT-PCRで調べた。パネルFは、Ccnb1遺伝子発現に対するドローシャおよびダイサーのノックダウンの効果をリアルタイムRT-PCRで解析した結果を示す。
【図１２】Ago1が、NIH/3T3細胞内においてCcnb1転写活性化を仲介することを示す。パネルAは、Ago1またはEGFPを過剰発現しているNIH/3T3の安定発現株の確立を示す。Ago1およびEGFPの両方とも、N末端HA-エピトープタグを所有するようにクローン化した。Ago1またはEGFPの安定した過剰発現を、HA-エピトープタグに特異的な抗体を用いた免疫ブロット解析によって確かめた。GAPDHはローディングコントロールとして役割を果たした。示したプロモーター部位におけるAgo1量を測定するために、定量的リアルタイムPCRを使用した。HA抗体存在下(+HA)のAgo1量を抗体コントロールが存在しない(-HA)バックグラウンド量で割ることでAgo1濃縮を決定した。パネルBは、EGFP-NIH/3T3細胞株およびAgo1-NIH/3T3細胞株におけるCcnb1遺伝子発現のリアルRT-PCR解析を示す。発現量をβ-アクチンで標準化した。データは、3つの生体サンプルの平均値±標準誤差を表す。パネルCおよびDは、siRNAを用いることでNIH/3T3細胞株内でAgo1がノックダウンされることを示す。Ago1を枯渇させたNIH/3T3細胞内におけるAgo1（パネルC)およびCcnb1（パネルD）の発現をリアルタイムPCRによって解析した。
【図１３】Ago1がマウスCcnb1の近位プロモーター領域と結合することを示す。Ago1-DNA相互作用を調べるために、ChIP実験を、NIH3T3-Ago1細胞およびNIH3T3-EGFP細胞内で抗HA抗体を用いて行った。パネルAは、Ccnb1の2kbの近位プロモーター領域に結合するAgo1を入念に調べるために使用されるプライマーの概略図を示す。転写開始部位に対するフォワードプライマーの開始位置を示す。パネルBは、ネガティブコントロール（ACTBおよびGAPDH）に対するAgo1の濃縮率を定量的PCRによって決定した結果を示す。データをインプットDNAで標準化した。エラーバーは、3回の独立した実験における平均値の標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補的なリボ核酸鎖を含むmiRNA分子と細胞を接触させることによって、その細胞内でのコード化遺伝子の転写活性を通して遺伝子産物の活性を増加させるための組成物、医薬品、および方法を提供する。本発明の対象の方法を実行するための複数のキットも提供する。
【００１２】
本発明について詳細を述べる前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、もちろん変更し得るということが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的で使用され、限定的であるようには意図されないということも理解されるべきである。
【００１３】
値の範囲が提供される場合、本文が特に明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限の間の各介在値もまた、下限の単位の小数第1位まで、明確に開示されるということが理解される。表示範囲の任意の表示値または介在値と、その表示範囲の任意の他の表示値または介在値の間にあるより小さい各範囲は、本発明の中に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれるか除かれ得、上限もしくは下限のどちらか、または上限と下限の両方ともがそのより小さい範囲の中に含まれる各範囲、または上限もしくは下限のどちらもそのより小さい範囲の中に含まれない各範囲もまた本発明の中に含まれ、その表示範囲の中の特異的に取り除かれた任意の制限に制約される。その表示範囲がその制限の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる制限のどちらかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１４】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似または同等の任意の方法および物質が、本発明を実行するまたは試験する際に使用され得るが、その例示的な方法および物質を本明細書に記載する。本明細書で述べる全ての公表文献は参照により本明細書に組み込まれ、それらが引用されることと関連してそれらの方法および/または物質を開示し記載する。本開示は、ある程度矛盾が存在する程度まで、組み込まれた公表文献の任意の開示にとって代わることが理解される。
【００１５】
本明細書または添付の請求項の範囲において、単数形「a」、「an」、および「the」は、本文が特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むということを言及しなければならない。従って、例えば、「サンプル（a sample）」への言及は、当業者が知る複数のそのようなサンプルを含み、「分子(the molecule)」への言及は、当業者が知る一つもしくは複数の分子およびその同等物の言及などを含む。
【００１６】
本明細書で考察される公表文献には、本出願提出日より以前に開示されたもののみが提供される。本発明が先願発明を理由にこのような公表文献に先行する資格は与えられないということの承認として解釈されるべきものは、本明細書の中にはなにもない。さらに、提供される公表の日付は、実際の公表日とは異なる可能性があり、独立して確かめる必要があり得る。
【００１７】
定義
本明細書で使用される「単離された」という用語は、所望の化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）が自然界に生じ得る環境とは異なる環境の中に存在する化合物を記載することが意図される。
【００１８】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、化合物が産生された環境から取り除かれた化合物を表し、その化合物と自然界で結合するまたは化合物の産生中に別の方法で結合する他の構成要素が少なくとも60％無い状態、好ましくは75％無い状態、および最も好ましくは90％無い状態である。
【００１９】
「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を表す。塩基対は、一般的には、逆平行のポリヌクレオチド鎖の中のヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン‐クリックの方法（例えば、AとT、AとU、CとG）で、または2本鎖の形成を可能にする任意の他の方法で、塩基対を形成することができる。「完全相補性」つまり「100％相補性」は、1つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、「ミスマッチ」無しに、第2のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合をすることができる状況を表す。完全相補性に満たないということは、2つの鎖のヌクレオチド単位の全てが、必ずしも互いに水素結合をし得るわけではない状況を表す。例えば、2つの20塩基に対して、各鎖にある2つの塩基対だけが互いに水素結合をすることができる場合、そのポリヌクレオチド鎖は10％の相補性を示す。同様の例において、各鎖にある18塩基対が互いに水素結合をすることができる場合、そのポリヌクレオチド鎖は90％の相補性を示す。実質的な相補性とは、約79％、約80％、約85％、約90％、約95％、またはそれより高い相補性を表す。従って、例えば、2本鎖領域が27塩基に及ぶようにそれぞれ3' 末端にdi-dTを含み、かつ各鎖にある2本鎖領域の27塩基中26塩基が相補的であるような29ヌクレオチド単位の2つのポリヌクレオチドの各々は、di-dTオーバーハングを除くと、それらは96.3％の相補性を有するので実質的に相補的である。相補性の決定においては、オーバーハング領域は除かれる。
【００２０】
「コンジュゲート（conjugate）」という用語は、安定性を増加させるようなポリヌクレオチドの物理的特性を変えるおよび/またはmiRNAそれ自体の細胞内取り込みを促進する分子または成分と、共有結合するまたは非共有結合するポリヌクレオチドを表す。「末端コンジュゲート（terminal conjugate）」は、ポリヌクレオチドまたは2本鎖ポリヌクレオチドの3'および/または5'末端にリンカーを介して直接または間接的に結合した分子または成分を有し得る。内部コンジュゲート（internal conjugate）は、塩基に、リボースの2'位に、またはワトソン‐クリック塩基対合と干渉しない他の位置（例えば5-アミノアリルウリジン）に、リンカーを介して直接または間接的に結合した分子または成分を有し得る。
【００２１】
2本鎖ポリヌクレオチドでは、該2本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド鎖の1つのもしくは両方の5'末端、および/または該2本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド鎖の1つのもしくは両方の3'末端は、コンジュゲート分子またはコンジュゲート部分を有し得る。
【００２２】
コンジュゲートには、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのようなポリマー、ならびにこれらの種類の全ての物質の類似体または誘導体が含まれ得る。コンジュゲートの追加例は、コレステロールのようなステロイド類、リン脂質類、ジアシルグリセロール類およびトリアシルグリセロール類、脂肪酸類、不飽和または置換を含んでも含まなくてもよい炭水化物類、酵素基質類、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類である。なお他の例として、ヘキシル-S-トリチルチオールのようなチオエーテル類、チオコレステロール、ドデカンジオール基またはウンデシル基のようなアシル鎖類、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールのようなリン脂質類、トリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸塩、ポリアミン類、ポリエチレングリコール、酢酸アダマンタン、パルミチル成分、オクタデシルアミン成分、ヘキシルアミノカルボニル-オキシ-コレステロール、ファルネシル成分、ゲラニル成分およびゲラニルゲラニル成分が挙げられる。
【００２３】
コンジュゲートは検出可能な標識も含み得る。例えば、コンジュゲートは、フルオロフォアに共有結合したポリヌクレオチドであり得る。コンジュゲートは、TAMRA、BODIPYのようなフルオロフォア、Cy3もしくはCy5のようなシアニン誘導体、ダブシル、または当該技術分野において知られる他の適切なフルオロフォアを含み得る。
【００２４】
コンジュゲート分子または部分は、便利で、それを有するポリヌクレオチドの所望の活性と実質的に干渉しない末端ヌクレオチドの任意の位置、例えば、リボシル糖の3'位または5'位に結合し得る。トランスフェクション後24時間の時点で機能性を測定する、培養細胞を用いるインビトロアッセイにおいて、コンジュゲート分子または部分が、遺伝子の活性化を仲介するmiRNAの能力を、80％超減少させるような悪影響をmiRNAの機能性に与える場合、コンジュゲート分子または部分はmiRNAの所望の活性を実質的に妨げる。
【００２５】
「有効濃度」という語句は、細胞内の所望の遺伝子の転写を増加させるのに有効な細胞内のmiRNAの濃度を表す。基準の発現量に対して標的配列活性の少なくとも約45％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約75％以上、約80％以上の増加を提供する有効濃度が特に興味深い。標的配列活性は当該技術分野で知られる任意の方法によって測定され得る。例えば、標的配列がプロモーターである場合、転写量、（タンパク質の転写がそのプロモーターと作用可能に連結もしくは関連づけられている）タンパク質量、または（タンパク質の転写がそのプロモーターと作用可能に連結もしくは関連づけられている）タンパク質活性、または、マーカー遺伝子（例えば、そのプロモーターに作用可能に連結されたlacZ、蛍光ポリペプチド（例えば、GFP、YFP、BFP、RFPなど）のファミリーの１つ、もしくはルシフェラーゼ）の検出によって、標的配列活性は測定され得る。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを表し、規則的にまたは不規則に交互なデオキシリボシル部分とリボシル部分（すなわち、この中では交互のヌクレオチド単位は、糖部分の2'位に-OH、次に-H、その次に-OH、その次に-Hなどを有する）のポリヌクレオチド鎖を含むDNA、RNA、もしくはDNA/RNAハイブリッドの1本鎖または2本鎖分子、およびこれらの種類のポリヌクレオチドの修飾（この中では、様々な実体もしくは部分を任意の位置のヌクレオチド単位へ置換するまたは結合させることが含まれ、自然界に生じるもしくは自然界には生じない骨格も含まれる）が含まれるが、それらに限定されない。
【００２７】
「ポリリボヌクレオチド」という用語は、2つ以上の修飾されたもしくは修飾されないリボヌクレオチドおよび/またはそれらの類似体を含むポリヌクレオチドを表す。
【００２８】
「リボヌクレオチド」という用語および「リボ核酸」（RNA）というフレーズは、自然界に生じるもしくは自然界には生じない（人工の、合成の）、修飾されたもしくは修飾されないヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを表す。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の1'位にN-グリコシド結合で結合した窒素含有塩基を有するリボシル部分の2'位に結合した酸素、および他のヌクレオチドへ結合させることができるまたは結合させない部分を含む。本明細書で使用される「リボ核酸」とは、自然界に生じるまたは（例えば、合成の技法によって産生されるような）修飾されたリン酸骨格を有し得、自然界に生じるもしくは自然界には生じない残基、遺伝子的にコード化できるもしくは遺伝的にコード化できない残基を含み得る。
【００２９】
「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、糖部分の2'位および/もしくは3'位にOH基がないヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを表す。そのかわり、2'位および/または3'位炭素への水素結合を有する。
【００３０】
本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」は、自然界に生じるまたは（例えば、合成の技法によって産生されるような）修飾されたリン酸骨格を有し得、自然界に生じるもしくは自然界には生じない残基、遺伝子的にコード化できるもしくは遺伝的にコード化できない残基を含み得る。
【００３１】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、適した宿主細胞に存在するとき、遺伝子産物の産生を促進する核酸配列を含む。「遺伝子」は、タンパク質をコードする核酸配列、および（例えばプロモーターまたはエンハンサーのような）タンパク質をコードしない配列を含み得、宿主細胞にとって内在性の遺伝子または（例えば、プロモーターをコードする外来性のポリヌクレオチドおよびコード配列の宿主細胞内への導入、または内在性のコード配列に隣接した異種のプロモーターの宿主細胞内への導入が原因の）完全なもしくは部分的な組み換え体の遺伝子を含む。例えば、「遺伝子」という用語は、エクソンおよびイントロンから構成され得る核酸を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと停止コドンの間のオープンリーディングフレームに存在するエクソン内に含まれる配列である。本明細書で使用される「遺伝子」は、他の遺伝子がコーディング配列を含もうとノンコーディング配列を含もうと、例えば、別の遺伝子の転写、発現、または活性を制御するプロモーター、エンハンサーおよび当該技術分野で知られる全ての他の配列のような制御配列を含む核酸を表し得る。一つのコンテキストにおいて、例えば、「遺伝子」は、プロモーターまたはエンハンサーのような制御配列を含む機能性核酸を記載するために使用され得る。組み換え遺伝子の発現は、1つもしくは複数の異種の制御配列によって制御され得る。「異種」とは、通常、全く関係のない2つの要素を表す。
【００３２】
「標的遺伝子」は、例えば、miRNAが発現の活性をもたらす目的で指示され得るプロモーターまたはエンハンサーのような配列を含む核酸である。「遺伝子」および「標的遺伝子」のいずれか一方または両方は、生物の中で自然に生じる核酸配列、導入遺伝子、ウイルスもしくは細菌の配列、染色体配列もしくは染色体外配列、ならびに/または細胞および/もしくはそのクロマチンに一過的にもしくは慢性的にトランスフェクションされたもしくは組み込まれた配列であり得る。「標的遺伝子」はmiRNA媒介型活性の際、（転写、翻訳、発現、または遺伝子のタンパク質産物の存在もしくは活性によって測定されるように）タンパク質をコードする遺伝子のような別の「遺伝子」の活性を抑制し得る。別の例では、「標的遺伝子」はエンハンサーを含み、エンハンサーのmiRNA媒介型活性化は作用可能に連結したまたは作用可能に関連づけられたプロモーターの機能性を増加させ、それにより、その増強させられたプロモーターおよび/またはエンハンサーに作用可能に連結された、タンパク質をコードする遺伝子のような別の「遺伝子」の活性を増加させ得る。
【００３３】
「制御要素」は、制御要素が作用可能に連結もしくは作用可能に関連づけられた核酸配列によってコードされるタンパク質もしくはRNAの転写、翻訳を制御する、誘導する、抑制する、または別の方法で媒介する核酸配列である。一般的に、制御要素または制御配列が、転写、翻訳および/もしくは発現を制御する1つもしくは複数の制御因子の存在および/もしくは不在に反応して、タンパク質をコードする核酸配列の転写、翻訳もしくは発現量を媒介する場合、例えば、エンハンサー配列もしくはリプレッサー配列のような制御要素または配列は、タンパク質もしくはRNAをコードする核酸配列と作用可能に連結もしくは作用可能に関連づけられる。制御因子は、例えば、転写因子を含む。制御配列はイントロンの中で見出され得る。
【００３４】
制御配列つまり制御要素には、例えば、「TATAA」ボックス、「CAAT」ボックス、分化特異的要素、cAMP結合タンパク質応答要素、ステロール制御要素、血清応答要素、グルココルチコイド応答要素、例えばSPI結合要素のような転写因子結合要素などが含まれる。「CAAT」ボックスは、一般的に、タンパク質またはRNAをコードする真核生物の核酸配列の開始コドンから（5'方向の）上流に位置する。他の制御配列の例として、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナルなどが挙げられる。制御配列を含む核酸配列のさらなる例として、ラウス肉腫ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列が挙げられる。組織特異的転写を制御する制御配列の例は、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および膵臓の組織とは対照的に、胎盤、気管、および子宮の組織に存在するタンパク質をコードし、作用可能に連結された配列の産生を優先的に誘導するインターフェロン-ε制御配列である。非常にたくさんの制御配列が当該技術分野で知られており、前述のものは単にほんの数例に過ぎない。
【００３５】
「エンハンサー」という用語、および「エンハンサー配列」という語句は、エンハンサー配列の方向を問わずに、または、エンハンサーが作用可能に連結または関連づけられたタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター、転写開始部位、もしくは最初のコドンからの距離または空間の位置を問わずに、転写の効率を増加させることができる様々な制御配列を表す。
【００３６】
「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードしない核酸配列を表し、作用可能に連結もしくは作用可能に関連づけられたタンパク質をコードする核酸配列またはRNAをコードする核酸配列の転写がプロモーターによって制御されるように、タンパク質をコードするまたはRNAをコードする核酸配列へ作用可能に連結または作用可能に関連づけられた核酸配列を表す。一般的に、真核生物のプロモーターは100〜5000の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」という用語に関して限定するようには意図されない。一般的に、プロモーターは、それに作用可能に連結または作用可能に関連づけられたタンパク質をコードする核酸配列の5'側に見出されるが、イントロン配列の中にも見出され得る。
【００３７】
「プロモーター」という用語は、プロモーターと作用可能に連結または作用可能に関連づけられる同じタンパク質またはRNAをコードする配列と作用可能に連結または作用可能に関連づけられる制御配列を含むことを意図する。プロモーターは、制御要素を含む多くの要素を含み得る。
【００３８】
「プロモーター」という用語は誘導性のプロモーターを含み、そこでは、タンパク質をコードする作用可能に連結された核酸配列の転写が、誘導剤に反応して増加する。「プロモーター」という用語は、恒常的で、誘導剤に制御されないプロモーターも含み得る。
【００３９】
「作用可能に関連づけられる」および「作用可能に連結される」という語句は、機能的に関連する核酸配列を表す。例として、制御配列がコード化タンパク質の発現に作用を発揮することができる場合、制御配列はタンパク質をコードする核酸配列と作用可能に連結または作用可能に関連づけられる。別の例として、プロモーターがコード化タンパク質の転写を制御することができる場合、プロモーターは、タンパク質をコードする核酸配列と作用可能に連結または作用可能に関連づけられる。作用可能に関連づけられたまたは作用可能に連結された核酸配列は、それらが制御する核酸配列と隣接し得るが、「作用可能に関連づけられる」および「作用可能に連結される」という語句は、制御配列が制御する核酸配列と制御配列が隣接する状況に限定されることは意図しない。
【００４０】
「ノンコーディング標的配列」または「ノンコーディング核酸配列」という語句は、エクソン内に含まれないまたは制御配列である所望の核酸配列を表す。
【００４１】
「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの類似体を表す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにそれらの誘導体および類似体）およびピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにそれらの誘導体および類似体）を含む種を含む。
【００４２】
「ヌクレオチド類似体」には、ピリミジンの5-位の修飾、プリンの8-位の修飾、シトシンの環外アミンの修飾、および5-ブロモウラシルの置換；ならびに（2'-OHがH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNのような基によって置換され、、式中、Rは本明細書で定義されるアルキル部分である糖‐修飾リボヌクレオチドを含むが、それらに限定されない）糖の2'位の修飾を含むが、それらに限定されない塩基、糖および/またはリン酸の化学構造に修飾を有するヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド類似体は、イノシン、キューオシン、キサンチンのような塩基、2'-メチルリボースのような糖、メチルホスホン酸、ホスホロチオエートのような自然界には存在しないリン酸ジエステル結合およびペプチドを有するヌクレオチドを含むことも意図する。
【００４３】
「修飾された塩基」とは、例えば、1つもしくは複数の原子または基の置換または付加によって修飾されたアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンのようなヌクレオチド塩基を表す。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを構成し得る修飾の種類のいくつかの例として、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、もしくはアセチル化された塩基のそれぞれまたはそれらを組み合わせたものが挙げられるが、それらに限定されない。より具体的な例として、例えば、5-プロピニルウリジン、5-プロピニルシチジン、6-メチルアデニン、6-メチルグアニン、N,N,-ジメチルアデニン、2-プロピルアデニン、2-プロピルグアニン、2-アミノアデニン、1-メチルイノシン、3-メチルウリジン、5-メチルシチジン、5-メチルウリジンおよび5位に修飾を有する他のヌクレオチド、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ハロシチジン、5-ハロウリジン、4-アセチルシチジン、1-メチルアデノシン、2-メチルアデノシン、3-メチルシチジン、6-メチルウリジン、2-メチルグアノシン、7-メチルグアノシン、2,2-ジメチルグアノシン、5-メチルアミノエチルウリジン、5-メチルオキシウリジン、7-デアザ-アデノシンのようなデアザヌクレオチド、6-アゾウリジン、6-アゾシチジン、6-アゾチミジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジンおよび4-チオウリジンおよび2-チオシチジンのような他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチル基および置換型ナフチル基、N6-メチルアデノシンのような任意のO-およびN-アルキル化プリンならびに任意のO-およびN-アルキル化ピリミジン、5-メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン5-オキシ酢酸、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、アミノフェノールまたは2,4,6-トリメトキシベンゼンのようなフェニル基および修飾されたフェニル基、G-クランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、8位置換型アデノシンおよびグアニン、5位置換型ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、ならびにアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾されたヌクレオチドは、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、およびリボシルではない糖を有するヌクレオチドまたはそれらの類似体も含む。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4'-チオリボース、および他の糖、ヘテロ環、または炭素環であり得るまたはそれらに基づき得る。ヌクレオチドという用語は、普遍的な塩基として当該技術分野で知られるものを含むことも意図する。例として、普遍的な塩基には、3-ニトロピロール、5-ニトロインドール、またはネブラリンが含まれるがそれらに限定されない。「ヌクレオチド」という用語は、リボシル3'位の酸素をアミン基と置換することで生じるN3'‐P5'ホスホロアミド酸を含むことも意図する。
【００４４】
さらに、「ヌクレオチド」という用語には、例えば、ヌクレオチドに結合した放射性部分もしくは蛍光性部分、または質量標識のような検出可能な標識を有するヌクレオチドの種類も含まれる。
【００４５】
「安定化」という用語は、機能性を維持しながら分解に対してmiRNAが抵抗する能力を表し、例えば、血清のような生体物質の存在下、その半減期について測定され得る。例えば、血清中のmiRNAの半減期は、miRNAの50％が分解されるのに要する時間として表される。
【００４６】
「2本鎖領域」という語句は、相補的または十分に相補的であるポリヌクレオチド鎖間で2本鎖を形成できるように、ワトソン‐クリック塩基対合または任意の他の方法のいずれかにより、互いに塩基対を形成する2つの相補的なまたは実質的に相補的なポリヌクレオチドの中の領域を表す。例えば、21ヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖は、別の21ヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖と塩基対を形成することができ、さらに、各鎖の19塩基のみが相補的または実質的に相補的であるとき、「2本鎖領域」は19塩基対から成る。例えば、残りの塩基対は5'および3’オーバーハングとして存在し得る。さらに、該2本鎖領域の中では、100％相補性である必要はなく、実質的な相補性が2本鎖領域の中で許される。一般的に、実質的な相補性は、少なくとも約79％、約80％、約85％、約85%、約90％、約95％以上の相補性を表す。例えば、19塩基対から成る2本鎖領域の中の1つのミスマッチ（すなわち、18塩基対と1つのミスマッチ）は約94.7％の相補性となり、その2本鎖領域を実質的に相補的にさせる。別の例では、19塩基対から成る2本鎖領域の中の3つのミスマッチ（すなわち、16塩基対と3つのミスマッチ）は約84.2％の相補性となり、その2本鎖領域を実質的に相補的にさせる。
【００４７】
「オーバーハング」という用語は、一方の鎖が2本鎖ポリヌクレオチドの中のもう一方の鎖を越えて伸びることから生じる末端（5'または3'）の塩基対を形成しないヌクレオチドを表す。塩基対の水素結合を介して2本鎖を形成することができる2つのポリヌクレオチドの１つまたは両方は、2つのポリヌクレオチドによって共有される3'および/または5'末端の相補性を越えて伸びる5'および/または3'末端を有し得る。2本鎖の3'および/または5'末端を越えて伸びる1本鎖領域は、オーバーハングと称される。
【００４８】
「遺伝子発現抑制」という語句は、細胞内または生物システム内の転写量、mRNA量、酵素活性、メチル化の状態、クロマチン状態もしくはクロマチン構造、翻訳量、または核酸の活性もしくは状態の他の基準によって測定されるような核酸の転写、翻訳または発現または活性の減少を表す。そのような活性または状態は、直接的にまたは間接的にアッセイされ得る。「遺伝子発現抑制」とは、そのような抑制が起こるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する核酸配列の能力、転写される能力、翻訳されタンパク質の発現をもたらす能力のような核酸配列と関連する活性の減少または回復を表す。
【００４９】
本明細書で使用される「遺伝子の活性化（gene activating）」、「遺伝子を活性化する（activating a gene）」、または「遺伝子活性化（gene activation）」という用語は互換性があり、細胞内または生物システム内の転写量、mRNA量、酵素活性、メチル化の状態、クロマチン状態もしくはクロマチン構造、翻訳量、または核酸の活性もしくは状態の他の基準によって測定されるような核酸の転写、翻訳または発現または活性の増加を表す。そのような活性または状態は、直接的にまたは間接的にアッセイされ得る。さらに、「遺伝子の活性化」、「遺伝子を活性化する」、または「遺伝子活性化」とは、そのような活性化が起こるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する核酸配列の能力、転写される能力、翻訳されタンパク質の発現をもたらす能力のような核酸配列と関連する活性の増加を表す。
【００５０】
「RNA干渉」という語句および「RNAi」という用語は、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含むポリヌクレオチドまたは2本鎖ポリヌクレオチドが、遺伝子発現の破壊を介して生物学的プロセスに影響を与えるプロセスを表す。このプロセスには、mRNAの分解による、miRNA による、tRNA、rRNA、hnRNA、cDNAおよびゲノムDNAとの相互作用による、ならびにDNAのメチル化および補助的なタンパク質による遺伝子発現抑制が含まれるがそれらに限定されない。
【００５１】
「siRNA」という用語および「低分子干渉RNA」という語句は、RNAiを行うことができ、長さが18〜30塩基対（すなわち、18〜30塩基対の2本鎖領域）である2本鎖核酸を表す。さらに、siRNAという用語および「低分子干渉RNA」という語句には、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド間の結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび上記のヌクレオチドの類似体を含むがそれらに限定されないリボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が含まれる。一般的に、siRNAの2本鎖を作り出すリボ核酸鎖の中で、siRNAは高い相補性（一般的に100％）を有する。さらに、一般的に、そのsiRNAはその標的配列と高度に相補的である。
【００５２】
本明細書で使用される「pri-miRNA」という用語はmiRNA前駆体を表す。特定の場合において、pri-miRNAはpoly Aテールおよび5'末端キャップ構造を有するRNAの1次転写物として遺伝子から転写される。pri-miRNAは、核内でRNase IIIタイプ酵素ドローシャにより核内でプロセシングされ、本明細書で「pre-miRNA」と称される中間体に変換される。本明細書で使用される「pre-miRNA」はヘアピン構造を有する2本鎖のリボヌクレオチド鎖で、2次構造にG:U/T揺らぎ塩基対合およびバルジを含み得、そのことを以下に記載する。プロセシング後、該pre-miRNAは分子エクスポーチン-5により細胞質に輸送される。該pre-miRNAはRNase IIIタイプ酵素ダイサーによりプロセシングされ、2本鎖のMicroRNAつまりmiRNAを産生する。該miRNA2本鎖は分離され、一方の鎖はmiRNAとなり、もう一方の鎖は分解される。本明細書で使用される「miRNA」は2本鎖型または1本鎖型のどちらかで表され得る。特定の場合において、そのmiRNAは19〜27ヌクレオチドの長さの配列を有する。例えば、miRNA miR373は23ヌクレオチドの長さを有する。miRNAは、miRNAの個々のリボ核酸鎖間が非相補的であることを可能にするG:U/T揺らぎ塩基対合を含む。例えば、これは図1パネルCに示され、G:U/T塩基対合はmiR-373の個々の鎖の間で生じ、コロンで示される。miRNAは、その2次構造にバルジも含み得る。これは、個々のリボ核酸鎖間で非相補的な領域がある場合に起こる。例えば、図1パネルCにおいて、miR-373の個々のリボ核酸鎖はグアニン（G）塩基間で非相補的であり、miR-373の2次構造にバルジを生み出す（その鎖の上と下に「G」塩基として示される）。さらに、miRNAは、miRNAと標的配列の間にG:U/T揺らぎ塩基対合を提供し得る。例えば、これは図1パネルBに示され、miR-373とE-カドヘリン配列の間のG:U/T揺らぎ塩基対合はコロンで示される。miRNAと標的配列の間の相互作用もまた、その2次構造におけるバルジの存在を認める。例えば、図1パネルBにおいて、ダッシュまたはコロンの無い領域は非相補的である。非相補的なこの領域は、miR-373とE-カドヘリン標的配列の間の2次構造にバルジを作り出す可能性がある（図1パネルAにおいて、持ち上がったバルジとして示される）。さらに、「miRNA」という用語には、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド間の結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび上記のヌクレオチドの類似体を含むがそれらに限定されないリボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が含まれる。さらに、「pri-mRNA」、「pre-miRNA」、および「miRNA」は、これらの分子が産生される方法に限定されず、（例えば、上記のような細胞ベースのシステム内または単離した酵素を用いた無細胞システム内での）組み換え手段または化学合成によって作製され得る。
【００５３】
「哺乳類細胞」という語句は、ヒトを含む任意の哺乳類の細胞を表す。この語句は、例えば、生物内または生物の臓器内のようなインビボ細胞を表す。この語句は、例えば、細胞培養で維持される細胞のようなインビトロ細胞も表す。
【００５４】
「メチル化」という用語は、メチル基（-CH3）を別の分子に結合させることを表す。一般的には、DNAがメチル化されるとき、メチル基はヌクレオチドを有する（一般にCpG配列にある）シトシンに加えられるが、メチル化は他の部位に同様に生じ得る。
【００５５】
「脱メチル化」という用語は、メチル基（-CH3）を別の分子から取り除くことを表す。一般的には、DNAが脱メチル化されるとき、メチル基はヌクレオチドを有する（一般にCpG配列にある）シトシンから取り除かれるが、脱メチル化は他の部位に同様に生じ得る。
【００５６】
「薬剤的に許容可能な担体」という語句には、miRNAの細胞内への導入を促進する組成物を表し、溶媒または分散剤、被覆剤、抗感染剤、等張剤、発明のポリヌクレオチドおよび2本鎖ポリヌクレオチドの吸収時間または放出を仲介する薬剤が含まれるがそれらに限定されない。「薬剤的に許容可能な担体」の例として、中性またはカチオン性であり得、クロロキンおよび1,2-ジオレオイル-L-α-グリセロ-3-フォスファチジル-タノラミン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidyle-thanolamine）のような分子も含み得るリポソームが挙げられ、それはエンドソームを不安定化するのを補助し、その結果、細胞核を含む細胞内へのリポソームの中身の送達を助けることができる。他の薬剤的に許容可能な担体の例として、当該技術分野で知られるポリ-L-リシン、ポリアルキルシアノアクリレートのナノ粒子、ポリエチレンイミン、および例えば、エチレンジアミンコアのような様々なコア、ならびに、例えば、カチオンおよびアニオン官能基、アミン、エタノールアミン、アミノデシルのような様々な表面官能基を有する任意の適切なPAMAMデンドリマー（ポリアミドアミン）が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用される「アポトーシス」という用語は、限定された寿命を有するように遺伝的にプログラムされているまたは損傷をうける特定の細胞（例えば、上皮細胞および赤血球）内での自己破壊のプロセスである。アポトーシスは、照射または毒物のような刺激によって、抑制因子の除去によって、またはアポトーシス促進遺伝子の活性化のいずれかによって誘導され得る。その細胞は分解され膜結合粒子になり、その後、ファゴサイトーシスによって除去される。これはプログラム細胞死としても知られる。
【００５８】
概要
本発明は、miRNAを細胞の中に導入することによって遺伝子を活性化するための方法および組成物を提供し、そこでは、このmiRNA分子は、遺伝子のノンコーディング核酸配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含む1本鎖リボ核酸鎖を含み、この相補性のある領域は、対応する遺伝子の転写の増加を提供するために選択される。特定の場合において、このmiRNAは、細胞にトランスフェクトされ得る2本鎖分子またはヘアピン前駆体（pre-miRNA）のどちらか一方として提供され得る。
【００５９】
この発明は、一部分において、miRNA分子の細胞への導入が哺乳類細胞における配列特異的な転写の活性化をもたらすという驚くべき発見に基づいている。
【００６０】
実施例により詳細に記載されるように、本発明は、E-カドヘリンプロモーター、CSDC2プロモーターまたはCcnb1プロモーターを標的とするmiRNAがmRNAの高い発現量および翻訳されるポリペプチドの随伴する量を誘導するという発見に基づいている。
【００６１】
メカニズム的に、および理論に縛られることなく、miRNAによる遺伝子発現の活性化の1つのモデルには、標的化されたDNA配列に対する相補性が必要とされ、遺伝子活性化と関連するクロマチンに変化をもたらす(Li et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17337-42; Janowski, et al., (2007) Nat Chem Biol 3, 166-73)。もしくは、miRNAによって誘導される遺伝子発現メカニズムの別のモデルには、遺伝子発現を誘導するために、miRNAが遺伝子プロモーターの中の相補的なDNAに直接結合するということが含まれる。この点において、miRNAは、遺伝子プロモーターの相補的なモチーフを標的にする転写因子のように機能し得る。さらに別のモデルでは、細胞が、標的プロモーター領域のRNAのコピーを産生し得る。相補的miRNAは、プロモーターRNA転写物と相互作用し、下流の遺伝子発現をもたらす。さらに別のモデルでは、このmiRNAがRNAポリメラーゼII(RNApII)をこのプロモーター領域に呼び寄せるように作用すると、RNApIIのこの部位での密度が増加し、それにより形成される転写複合体の数が増加し、転写物の増加を促進することができる。
【００６２】
これらの観察は、ゲノム構造および機能を調節するというmiRNAの基本的な役割を支持し、標的遺伝子を活性化（例えば、遺伝子発現を増加）させるmiRNAを治療に使用できるということを明らかにする。
【００６３】
一態様において、本発明は、哺乳類細胞にmiRNA分子を導入する（これは、細胞にこのmiRNAを直接送達すること（例えば、マイクロインジェクション）によって達成され得る）ことによって、または細胞に導入されたDNAからの発現の結果として、遺伝子の発現を増加させる（すなわち、遺伝子の活性化の）方法であって、このmiRNA分子が遺伝子のノンコーディング核酸配列の領域と相補性のある鎖を有し、この導入がこの遺伝子の発現の増加をもたらす方法を提供する。遺伝子発現を増加させることは、例えば、腫瘍抑制遺伝子が細胞増殖の阻害、細胞の形質転換の阻害および細胞遊走の阻害（例えば、抗ガン剤として）をするという状況で有用であり得る。遺伝子発現を増加させることは、例えば、アポトーシス促進遺伝子が急速に分裂中のガン細胞における細胞死のプログラムを刺激するという状況で有用であり得る。遺伝子発現を増加させることは、内在性遺伝子または発現が減少した導入遺伝子（例えば、遺伝子治療）のいずれかの低発現遺伝子の長期発現が望まれる場合に有用であり得る。別の態様において、本発明は、少なくともmiRNAの1分子を含む組成物および医薬品を提供する。
【００６４】
本発明を、より詳細にここで記載する。
【００６５】
組成物
上記のように、本発明は、遺伝子のノンコーディング核酸配列（例えば、制御配列）の領域を標的にすることによって、哺乳類細胞で遺伝子活性化（例えば、遺伝子発現の増加）を行うことに使用するmiRNA分子を提供する。
【００６６】
本明細書で使用される「miRNA」という用語は、本明細書では、遺伝子活性化を促進することができ、遺伝子のノンコーディング核酸配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含むリボ核酸鎖を構成し得るリボ核酸分子を表す。miRNA分子は、通常、約10〜約50塩基対、約12〜約48塩基対、約14〜約46塩基対、約16〜約44塩基対、約18〜約42塩基対、約20〜約40塩基対、約22〜約38塩基対、約24〜約36塩基対、約26〜約34塩基対、約28〜約32塩基対、通常、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50塩基対の長さである。さらに、miRNAという用語には、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド間の結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび上記のヌクレオチドの類似体を含むがそれらに限定されないリボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が含まれる。
【００６７】
本明細書で使用される「遺伝子の活性化（gene activating）」「遺伝子を活性化する（activating a gene）」、または「遺伝子活性化（gene activation）」という用語は互換性があり、細胞内または生物システム内の転写量、mRNA量、酵素活性、メチル化状態、クロマチン状態もしくはクロマチン構造、RNAポリメラーゼIIの動員または核酸の活性もしくは状態の他の基準によって測定されるような転写に関して遺伝子発現を増加させることを表す。さらに、「遺伝子の活性化（gene activating）」「遺伝子を活性化する（activating a gene）」、または「遺伝子活性化（gene activation）」という用語は、そのような活性化が起こるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する核酸配列の能力、転写される能力、翻訳されタンパク質の発現をもたらす能力のような核酸配列と関連すると知られる活性の増加を表す。
【００６８】
本発明のmiRNA化合物は2本鎖であり得、別々の鎖を構成し得、または、例えば、約4〜約23以上のヌクレオチド、約5〜約22、約6〜約21、約7〜約20、約8〜約19、約9〜約18、約10〜約17、約11〜約16、約12〜約15、約13〜約14ヌクレオチドと同じくらいの長さのループを有する短いヘアピンRNA、ステムループバルジを有するRNA、および短い一時的な(short temporal）RNAを形成するpre-miRNAを含み得る。ループまたはヘアピンループを有するRNAは、このループが柔軟性のあるリンカーのようなリンカーによってステムと結合する構造を含み得る。柔軟性のあるリンカーが効果的なステム要素の分子内ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さおよび物質からできている限り、柔軟性のあるリンカーは多種多様な化学構造から選択され得る。一般的に、その全長は少なくとも約10〜24原子である。
【００６９】
本発明のmiRNA分子は、隣接するコーディング配列の転写の活性化を提供するために、適切な長さをもつ遺伝子のノンコーディング領域と相補的な領域を含む。miRNA分子は、一般的に、ノンコーディング配列と相補的ではない3'末端ヌクレオチドも含む。例として、miR-373はその3'末端に2ヌクレオチドオーバーハングを含む（図1、パネルC）。一般的に、miRNAは、10ヌクレオチドより長く50ヌクレオチドより短い、通常は約12ヌクレオチドより長く48ヌクレオチドより短い長さを含み、例えば、約14ヌクレオチド〜約46ヌクレオチドの長さ、約16ヌクレオチド〜約44ヌクレオチドの長さ、約18ヌクレオチド〜約42ヌクレオチドの長さ、約20ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドの長さ、約22ヌクレオチド〜約38ヌクレオチドの長さ、約24ヌクレオチド〜約36ヌクレオチドの長さ、約26ヌクレオチド〜約34ヌクレオチドの長さ、約28ヌクレオチド〜約32ヌクレオチドの長さを含む。特定の場合において、このmiRNA分子は、約14ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドの長さ、例えば、約15ヌクレオチド〜約29ヌクレオチドの長さ、約16ヌクレオチド〜約28ヌクレオチドの長さ、約17ヌクレオチド〜約27ヌクレオチドの長さ、約18ヌクレオチド〜約26ヌクレオチドの長さ、約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドの長さ、約20ヌクレオチド〜約24ヌクレオチドの長さ、約21ヌクレオチド〜約23ヌクレオチドの長さ、または約22ヌクレオチドの長さを含む。
【００７０】
本発明のmiRNA分子は、一般的に、約10塩基対より長く約50塩基対より短い相補性のある領域を含む。いくつかの実施形態において、このmiRNA分子は、約12塩基対〜約48塩基対の長さ、例えば、約14塩基対〜約46塩基対の長さ、約16塩基対〜約44塩基対の長さ、約18塩基対〜約42塩基対の長さ、約20塩基対〜約40塩基対の長さ、約22塩基対〜約38塩基対の長さ、約24塩基対〜約36塩基対の長さ、約26塩基対〜約34塩基対の長さ、約28塩基対〜約32塩基対の長さの2本鎖領域を含む。代表的な実施形態において、このmiRNA分子は、約15塩基対〜約30塩基対の長さ、例えば、約16塩基対〜約29塩基対の長さ、約17塩基対〜約28塩基対の長さ、約18塩基対〜約27塩基対の長さ、約19塩基対〜約26塩基対の長さ、約20塩基対〜約25塩基対の長さ、約21塩基対〜約24塩基対の長さ、約22塩基対〜約23塩基対の長さの2本鎖領域を含む。例えば、ヒトE-カドヘリン遺伝子の発現を誘導するmiR-373は、E-カドヘリンのノンコーディング領域と相補性のある20ヌクレオチドの領域を含み、全長は23ヌクレオチドである。
【００７１】
代表的な実施形態において、このmiRNA分子は、ノンコーディング核酸配列または遺伝子（例えば、プロモーターのような制御配列）の一部と相補的な鎖を含む。いくつかの実施形態において、この鎖は、その遺伝子のノンコーディング核酸配列と100％相補的であり、その遺伝子のノンコーディング核酸配列と約99％相補的、約98％相補的、約97％相補的、約96％相補的、約95％相補的、約94％相補的、約93％相補的、約92％相補的、約91％相補的、約90％相補的、約85％相補的、約80％相補的、約75％相補的、約70％相補的であることを含む。
【００７２】
上記により詳細に記載したように、本発明のmiRNA分子は、ノンコーディング核酸配列または遺伝子（例えば、プロモーターのような制御配列）の一部と相補的な鎖を含む。本発明のmiRNA分子の相補鎖（例えば、ノンコーディング核酸配列または遺伝子の一部と相補的なmiRNA分子の鎖）を設計するとき、その配列は任意のCpGアイランド領域との相補性を避けるように選択される。「CpGアイランド領域」とは、ジヌクレオチド「CG」（シトシン‐グアニン）が豊富な任意の核酸領域を意味する。そのジヌクレオチドのシトシンのメチル化は、細胞分裂を経て維持され、遺伝子発現を抑制することによって隣接する遺伝子の転写の程度に影響を与え、遺伝子発現の発生制御において重要である。ある場合において、CpGアイランドを避けることは、CpGアイランド領域のシトシン残基のメチル化を避け、それによって、隣接する遺伝子の発現を抑制する役割を果たす。これは、例えば、図1、パネルAに図で示される。
【００７３】
さらに、本発明のmiRNA分子の相補鎖（例えば、遺伝子のノンコーディング核酸配列の一部と相補的なmiRNA分子の鎖）を設計するとき、その配列は任意のGC-リッチ領域との相補性を避けるように選択される。「GC-リッチ」とは、核酸が存在するゲノムの残りの部分にあるグアニンおよびシトシン残基の平均数と比べると、チミンおよびアデニン塩基対に対して、より多くのグアニンおよびシトシン塩基対を含む任意の核酸の領域を意味する。
【００７４】
CpGアイランド領域つまりGC-リッチ領域は、例えば、ワールドワイドウェブ上のebi.ac.uk/emboss/cpgplot/で利用可能なCpGPIot/CpGReport/lsochoreプロトコールまたはワールドワイドウェブ上のurogene.org/methprimer/index1.htmlで利用可能なMethPrimerプロトコールのような予測プロトコールを用いることによって見つけ出され得る。例えば、ワールドワイドウェブ上のregrna.mbc.nctu.edu.twで見つけられ得るRegRNAソフトウェアを用いることによって、または台湾の国立Chiao Tung大学バイオインフォマティクス研究所の生命科学技術学部とコンタクトをとることによって、E-カドヘリンおよびCSDC2遺伝子のノンコーディングプロモーター領域を入念に調べることができる。
【００７５】
さらに、本発明のこれらのmiRNA分子は、一般的に、GC含量が約50％より多いまたは約30％より少ない遺伝子のノンコーディング核酸配列を避けるように設計される。いくつかの実施形態において、本発明のこのmiRNA分子は、約32％のGC含量、約34％のGC含量、約36％のGC含量、約38％のGC含量、約40％のGC含量、約42％のGC含量、約44％のGC含量、約46％のGC含量、約48％のGC含量、約50％のGC含量を含む約30％より多いまたは約50％より少ないGC含量を含むように設計される。
【００７６】
同様に、本発明のこれらのmiRNA分子は、一般的に、約50％より多く約80％より少ないAT含量を含むように設計される。特定の実施形態において、本発明のこれらのmiRNA分子は、約52%のAT含量、約54%のAT含量、約56%のAT含量、約58%のAT含量、約60%のAT含量、約62%のAT含量、約64%のAT含量、約66%のAT含量、約68%のAT含量、約70%のAT含量、約72%のAT含量、約74%のAT含量、約76%のAT含量、約78%のAT含量、約80%のAT含量を含むように設計される。
【００７７】
さらに、本発明のこれらのmiRNA分子は、一般的に、一塩基多型（SNP）部位を含む遺伝子のノンコーディング核酸配列を避けるように設計される。理論に縛られることなく、GCリッチ領域、リピート、および複雑ではない配列を避けることは、標的配列と2本鎖を形成するとき、このmiRNAの「ずれ（slippage）」を避ける役割を果たす（例えば、GC-リッチ配列は、標的配列と相補的な所望の全領域に悪影響を与えるような方法で、このmiRNAを標的配列にアニールさせ得る）。
【００７８】
本発明のこれらのmiRNA分子は、ノンコーディング標的核酸配列と相補性のある領域を含む。ノンコーディング標的核酸配列とは、エクソン内に含まれないまたは制御配列である所望の核酸配列を表す。一般的に、このようなノンコーディング標的配列は、その標的遺伝子の転写開始部位から約2kb上流にある核酸配列で、約1.9kb、約1.8 kb、約1.7kb、約1.6kb、約1.5kb、約1.4kb、約1.3kb、約1.2kb、約1.1kb、約1kb、約950bp、約900bp、約850bp、約800bp、約750bp、約700bp、約650bp、約600bp、約550bp、約500bp、約450bp、約400bp、約350bp、約300bp、約250bp、約200bp、約150bp、約100bp、約50bpなどまで上流にある配列を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、このノンコーディング標的核酸配列は、その標的遺伝子の転写開始部位から約5kb（約4.5kb、約4kb、約3.5kb、約3kb、約2.5kb、約2kb、約1.5kbなどを含む）上流の領域内に任意のエンハンサー配列を含み得る。他の実施形態において、このノンコーディング標的核酸配列は、その標的遺伝子の転写開始部位の下流にある最初のイントロン配列を含み得る。
【００８０】
このmiRNA分子の鎖は、2本鎖ポリヌクレオチド内の一方の鎖がもう一方の鎖を越えてのびることから起こる、塩基対を形成しないヌクレオチドである任意の長さの末端（5'または3'）オーバーハング領域を含み得る。さらに、このオーバーハング領域は、また、遺伝子のノンコーディング配列と相補的ではない（非相補的領域）。miRNA分子の鎖がオーバーハング領域を有する場合、代表的な実施形態において、これらの領域は、8ヌクレオチドまたはそれより短い長さ、7ヌクレオチドまたはそれより短い長さ、6ヌクレオチドまたはそれより短い長さ、約5ヌクレオチドの長さ、約4ヌクレオチドの長さ、約3ヌクレオチドまたはそれより短い長さ、約2ヌクレオチドの長さ、および約1ヌクレオチドの長さである。そのような実施形態において、これらの領域は、さらに以下の式によって記載される：
3'-N(1+n)-miRNA-5'、または
5'-N(1+n)-miRNA-3'
式中、Nは、自然界に生じるまたは自然界に生じない、遺伝的にコード化できるまたは遺伝的にコード化できない残基を含む任意のヌクレオチドで、nは0〜7のいずれかの整数である。このmiRNAのヌクレオチド、または2本鎖miRNAの少なくとも一方の鎖は、所望の特徴を提供するために修飾され得る。
【００８１】
当該miRNAは、miRNA分子を安定化すると現在知られるまたは知られるようになる任意の方法によって、および、この開示を読むことから、当業者が本発明と関連して有用であると結論づける任意の方法によって合成され得る。例えば、当業者は、Dharmacon, Inc.が独自に開発したACE（登録商標）テクノロジーを用いる方法のような化学合成の方法を用いることができる。もしくは、当業者は、テンプレート依存的な合成方法も用いることができる。合成は、本明細書で開示されるような修飾塩基または非修飾塩基、天然の塩基または非天然の塩基を用いて実行され得る。さらに、合成は、本明細書で開示される、修飾核酸骨格または非修飾核酸骨格を用いてまたは用いずに実行され得る。
【００８２】
さらに、これらのmiRNA分子は、宿主細胞内でmiRNA分子を合成すると現在知られるまたは知られるようになる任意の方法によって、宿主細胞内で合成され得る。さらに、このmiRNA分子はpre-miRNAとして合成され、さらに、宿主細胞によってプロセシングされ、miRNAが提供され得る。例えば、miRNA分子またはpre-miRNA分子は、任意の適切なプロモーターを用いて、組み換え環状DNAベクターまたは直鎖DNAベクターから発現され得る。本発明のmiRNA分子またはpre-miRNA分子をベクターから発現させるための適切なプロモーターは、例えば、U6 RNAポリメラーゼIIIプロモーター配列またはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は当該技術分野の範囲内にある。本発明と共に用いるための適切なベクターは、米国特許第5,624,803号に記載されているベクターを含み、その開示は本明細書に全体が組み入れられる。本発明の組み換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境の中でmiRNA分子を発現させるための誘導できるプロモーターまたは制御できるプロモーターも含み得る。
【００８３】
本発明のmiRNAを発現させるのに適したベクターの選択、miRNAまたはpre-miRNAのいずれかを発現させるための核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および所望の細胞へ組み換えベクターを送達する方法は当該技術分野の範囲内にある。例えば、Tuschl et al., (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448；Brummelkamp et al., (2002), Science 296: 550-553；Miyagishi et al., (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500；Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958；Lee et al., (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505；およびPaul et al., (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508を参照されたい。これらの開示全体は、参照することにより、本明細書に組み入れられる。本発明の使用に適した送達および細胞内発現の他の方法は、例えば、米国特許公開第20040005593号、第20050048647号、第20050060771号に記載されており、その開示全体は、参照することにより、本明細書に組み入れられる。
【００８４】
方法
本発明は、哺乳類細胞にmiRNA分子を導入することを含む遺伝子発現を増加させる方法であって、このmiRNA分子は、遺伝子のノンコーディング核酸配列の領域と相補的な鎖を有し、この導入は遺伝子の発現の増加をもたらす方法を提供する。一般的に、「遺伝子発現の増加」とは、そのような活性化が起こるメカニズムに関わらず、転写される遺伝子の能力、翻訳されタンパク質の発現をもたらす能力の増加を表す。
【００８５】
特定の場合、本発明の方法は、miRNA分子と細胞を接触させることによって実行され、このmiRNA分子は、遺伝子のノンコーディング核酸配列と相補的なリボヌクレオチド配列を含むリボ核酸鎖を含み、この導入は遺伝子の発現の増加をもたらす。
【００８６】
特定の場合、核酸配列と関連する転写において、遺伝子発現の増加は、コントロール（すなわち、miRNA分子が無い場合）を超える検出可能な増加またはそれより多い増加をもたらす。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の増加は、少なくとも約2倍以上の増加、少なくとも約2.5倍以上の増加、少なくとも約3倍以上の増加、少なくとも約3.5倍以上の増加、少なくとも約4倍以上の増加、少なくとも約4.5倍以上の増加、少なくとも約5倍以上の増加、少なくとも約5.5倍以上の増加、少なくとも約6倍以上の増加、少なくとも約6.5倍以上の増加、少なくとも約7倍以上の増加、少なくとも約7.5倍以上の増加、少なくとも約8倍以上の増加、最高約10倍までまたはそれより多い増加、約15倍以上の増加、約20倍以上の増加、約25倍以上の増加をもたらす。遺伝子発現または遺伝子活性の増加は、当該技術分野でよく知られた任意の様々な方法によって測定され得る。遺伝子発現または遺伝子活性を調べる適切な方法は、細胞内または生物システム内の核酸の転写量、mRNA量、翻訳されるポリペプチド量、酵素活性、メチル化状態、クロマチン状態もしくはクロマチン構造、または核酸の活性もしくは状態の他の基準を測定することを含む。miRNA分子を細胞に導入した後、この導入は、miRNAによって標的化されたプロモーター領域のRNAポリメラーゼII(RNApII)の密度の増加をもたらすことができ、遺伝子発現または遺伝子活性を調べる代替方法である。
【００８７】
miRNAまたはpre-miRNAのいずれか一方としての機能を保持する本発明のmiRNAの能力は、このmiRNAが導入される細胞種または種が限定されないため、本発明は、ヒトを含むがそれに限定されない広範囲の哺乳類に渡って適用できる。本発明は、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌのような哺乳類、ハムスター、マウス、ラットのようなげっ歯類、ならびに、例えば、ゴリラ、チンパンジーおよびヒトのような霊長類に使用すると特に便利である。トランスジェニック哺乳類（例えば、キメラ遺伝子配列を有する哺乳類）も利用され得る。トランスジェニック動物の作製方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第5,614,396号を参照されたい。
【００８８】
本発明は、生殖細胞株および体細胞の細胞種を含む様々な細胞種と共に有利に使用され得る。これらの細胞は幹細胞または分化した細胞であり得る。例えば、これらの細胞種は、胚細胞、卵母細胞、精細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌腺または外分泌腺の細胞であり得る。
【００８９】
本発明は、ヒトゲノムの遺伝子（例えば、糖尿病、アルツハイマー病およびガンのような疾患に関わる遺伝子）、および前述の生物のゲノムの中の全遺伝子を含むがそれらに限定されない広範囲な遺伝子の活性化（発現を増加させること）のための使用に適用できる。本発明のこれらのmiRNAは、遺伝子を活性化することにおける、薬剤（例えば、タンパク質成長ホルモン、EPOまたはインシュリン）の製造または商業的に望まれるタンパク質（例えば、血清タンパク質、ラクターゼなど）の製造に有用であり得る。本発明は、例えば、腫瘍抑制遺伝子の発現を含むガンの分野に適用できる。類似の態様において、プログラム細胞死によって、集団から細胞（例えば、ガン細胞）の特定の集団を取り除くことが望まれるとき、本発明のmiRNAは、アポトーシス促進遺伝子（例えば、Bax）の活性化に有用であり得る。さらに、本発明の組成物および方法は、核酸またはウイルスベクター上に導入された遺伝子のような組み換え遺伝子を標的とするためにも使用され得る。
【００９０】
本発明の組成物および方法は、現在知られるまたは知られるようになる任意の方法によって、およびこの開示を読むことから、当業者が本発明と関連して有用であると結論づける任意の方法によって細胞へ投与または適用され得る。例えば、当該miRNAは、細胞に受動的に送達され得る。修飾miRNAの受動的取り込みは、例えば、センス鎖の5'末端にあるポリエチレングリコール部分またはコレステロール部分のようなコンジュゲートの存在によって、および/または適切な環境の中で薬剤的に許容可能な担体の存在によって調節され得る。
【００９１】
当該miRNAは、現在知られるまたは知られるようになる任意の方法によって、およびこの開示を読むことから、miRNAが細胞膜および/または核膜を通過することができるということにおいて、当業者が本発明と関連して有用であろうと決定する任意の方法によって細胞へ送達され得る。これらの方法には、例えば、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム、カチオン性脂質/リポソーム、ミセル、圧力操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーション、ウイルス（例えば、RNAウイルス）のようなベクターの使用、プラスミド、細胞融合、および抗体、抗原、もしくはレセプターのような特異的なコンジュゲートまたはリガンドへのポリヌクレオチドの結合、受動的導入、当該miRNAの取り込みを促進させる部分を当該miRNAに付加することなどを用いるトランスフェクションのような、任意のトランスフェクションの方法が含まれるがそれらに限定されない。
【００９２】
本発明のこれらのmiRNAは、基礎研究、創薬および薬剤開発、診断および治療を含むがそれらに限定されない多様なセットの適用に使用され得る。例えば、本発明は、遺伝子産物が創薬または薬剤開発の標的物であるかどうかを検証するために使用され得る。この適用において、所望の標的核酸配列は活性化（例えば、遺伝子発現の増加）について確認される。例えば、細胞がmiRNAと接触し、その後、例えば、遺伝子の転写または翻訳のような任意の増加した活性の程度がそのような増加した活性の効果と共に評価され、活性が増加している場合、所望の核酸配列は創薬または薬剤開発の標的物であるという決定がなされる。この方法によって、表現型的に望ましい効果は、所望の特定の標的核酸配列のmiRNA活性化と関連し得、適切な場合において、毒性研究および薬物動態研究が試みられ、治療製剤が開発され得る。
【００９３】
本発明は、例えば、疾患または障害の動物モデルを提供するために所望の疾患または障害の原因または因子であると考えられている所望の標的核酸配列の活性の増加により（例えば、転写または翻訳の増加により）、生物の疾患または障害の一過的状態または永久状態を誘導する適用にも使用され得る。所望の標的核酸配列の増加した活性は、場合によっては、その疾患または障害をより悪くさせ得るか、所望の疾患または障害を回復させるもしくは治癒させる傾向があり得る。同様に、場合によっては、所望の標的核酸配列の増加した活性は、疾患または障害を引き起こすか、それをより悪くさせるか、回復もしくは治癒させる傾向があり得る。
【００９４】
所望の標的核酸配列はゲノムもしくは染色体の核酸またはウイルス核酸のような染色体外核酸を含み得る。所望の標的核酸配列は、例えば、ノンコーディングDNA、制御DNA、反復DNA、逆方向のリピート、セントロメアDNA、ユークロマチン領域のDNA、ヘテロクロマチン領域のDNA、プロモーター配列、エンハンサー配列、イントロン配列、エクソン配列などのような核酸の全種類を含み得る。
【００９５】
なお、さらに、本発明は、診断、予防薬、および治療のような適用に使用され得る。これらの適用に対して、所望の特定標的核酸配列の操作による調節を受け入れられる疾患または障害を有すると疑われる生物は、miRNA投与によって治療される。このmiRNA治療の結果は、特定の疾患または障害の改善につながり得る、一時的に改善し得る、予防となり得る、および/または診断となり得る。代表的な実施形態において、希釈剤とともにまたは希釈剤なしで、このmiRNAは薬剤的に許容可能な担体と共に、薬剤的に許容可能な方法で投与される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させることが望ましい。そのような遺伝子の遺伝子活性を増加させるように作用する薬剤は、細胞増殖性疾患（例えば、細胞（例えば、ガン）の制御できない増殖に起因する任意の病態、疾患もしくは障害、またはそのような病態、障害、もしくは疾患の徴候）の治療に有用である。ガンは、本発明の化合物を用いて治療できる病態の例である。細胞増殖性疾患の治療に使用するための第2の化合物と併用して本発明のこのmiRNAを使用することは、とくに興味の対象となる。本方法を用いた治療に適する例示的なガンには、結腸直腸ガン、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、卵巣ガン、乳ガン、頭頸部ガン、腎細胞ガンなどが含まれる。
【００９７】
例示的な腫瘍抑制遺伝子には、p53、p21、BRCA1、BRCA2、APC、RB1、CDKN2A、DCC、DPC4 (SMAD4)、MADR2/JV18 (SMAD2)、MEN1、MTS1、NF1、NF2、PTEN、VHL、WRN、およびWT1が含まれるがそれらに限定されない。他の所望の遺伝子には、NOS1(nNOS)およびNOS3(eNOS)を含む一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子、E-カドヘリン、増殖因子（例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)、神経細胞増殖因子(NGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)など）が含まれるがそれらに限定されない。
【００９８】
さらなる例示的所望の遺伝子として、CSDC2/PIPPIN(C2を含むコールドショックドメイン)、NPM1(ヌクレオフォスミン1)、NUPL2(ヌクレオポリン様タンパク質2)、BFAR(2機能性アポトーシス調節因子)、IRAK3(インターロイキン-1受容体関連キナーゼ3)、GAA(リソソームα-グルコシダーゼ前駆体)、NSUN7(NOL1/NOP1/Sunドメインファミリーメンバー7)、RAGE(腎臓腫瘍抗原1)、FOXP2(フォークヘッドボックスP2)、RBKS(リボキナーゼ)、ACOT6(アシル-CoAチオエステラーゼ6)、SIRPD(シグナル制御タンパク質δ)、およびCCNB1(サイクリンB)が含まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、アポトーシス促進遺伝子の発現の増加が望ましい。したがって、そのような遺伝子の遺伝子活性を増加させるように作用する薬剤は、細胞増殖性疾患（例えば、細胞（例えば、ガン）の制御できない増殖に起因する任意の病態、疾患もしくは障害、またはそのような病態、障害、もしくは疾患の徴候）の治療に有用である。アポトーシスの増加は、細胞死の量を増加させ、ガンに見られる制御できない増殖細胞の数を減少させる。ガンは本発明の化合物を用いて治療できる病態の例である。細胞増殖性疾患の治療に使用するための第2の化合物と併用して本発明のこのmiRNAを使用することは、とくに興味深い。本方法を用いた治療に適する例示的なガンには、結腸直腸ガン、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、卵巣ガン、乳ガン、頭頸部ガン、腎細胞ガンなどが含まれる。特定の場合、アポトーシス促進遺伝子には、Bax、SMAC、Bak、Diva、BcI-Xs、Bik、Bim、Bad、Bid、Noxa、BID、PUMAおよびEgl-1が含まれるがそれらに限定されない。
【０１００】
miRNAが関与する本発明の方法を用いた治療に適する対象には、腫瘍性疾患（例えば、ガン）のような細胞増殖性疾患を患う個体が含まれる。細胞増殖性疾患は、腫瘍性の病態（例えば、ガン）を含むがそれらに限定されない細胞の望ましくない増殖によって特徴づけられる。細胞増殖性疾患の例として、内皮細胞の異常刺激（例えば、アンテローム性動脈硬化）、固形ガンおよび腫瘍転移、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫）、血管機能不全、異常創傷治癒、炎症障害および免疫障害、ベーチェット病、痛風または痛風性関節炎、例えば、リウマチ性関節炎に伴って起こる異常血管形成、乾癬、糖尿病性網膜症、（水晶体後方繊維芽細胞の）時期尚早の網膜症のような他の眼の血管新生疾患、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障（ｎｅｕｒｏｓｃｕｌａｒ  ｇｌａｕｃｏｍａ）およびオスラー・ウェーバー症候群、乾癬、再狭窄、真菌感染、寄生虫感染および（サイトメガロウイルス感染のような）ウイルス感染が含まれるがそれらに限定されない。本発明の方法により治療される対象には、上記の任意の障害を患う任意の個体が含まれる。
【０１０１】
本発明は、細胞増殖性疾患を患う患者の治療にのみ限定されるように解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、本発明の方法から利益を得る可能性のある特定遺伝子の発現低下と関連する病態または疾患を患う患者の治療を含むと解釈されるべきである。
【０１０２】
そのような対象は、本主題のmiRNAの活性および有効性をアッセイするために検査され得る。1つもしくは複数のパラメーターの顕著な改善は、有効性の指標である。様々な因子（例えば、疾患の重症度などのような患者に依存的な因子、投与される化合物など）に従って、患者に最適な利益を提供するために投薬計画および投薬量を調製することは、十分普通の医療従事者（例えば、臨床医）の技術の範囲内である。
【０１０３】
本発明の化合物を含む医薬品
上で記載された本主題のmiRNA化合物の医薬品も本発明によって提供される。本主題のmiRNA化合物は、様々な経路によって、治療的投与のための様々な処方に組み入れられ得る。より詳細には、本発明の化合物は、適切な、薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および/またはアジュバンドと組み合わせることによって錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射、吸入剤および噴霧剤のような固形の、半固形の、液体のまたはガスの形態で、、医薬品組成物に処方され、滅菌バイアル瓶またはシリンジの中の製剤に処方され得る。その処方が経皮投与用である場合、望ましくは、これらの化合物は、検出可能なDMSOの無い状態または担体とDMSOのある状態のいずれか一方の状態で処方される。その処方物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などを含むいくつかの異なる経路を経て、その処方物を必要としている対象または患者に投与するために設計され得る。その投与は全身的送達であり得、または、治療を必要としている部位への処方物の局所的送達、例えば、腫瘍への局所的送達であり得る。
【０１０４】
例えば、ビヒクル、アジュバンド、担体または希釈剤のような、本発明と共に使用できる薬剤的に許容可能な賦形剤は、一般に、容易に入手できる。さらに、pH調製剤および緩衝剤、浸透圧調製剤、安定剤、湿潤剤などのような薬剤的に許容可能な補助物質は、一般に、容易に入手できる。
【０１０５】
適切な賦形剤のビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または同種のもの、およびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、そのビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤のような少量の補助物質を含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は当業者に知られているか、明らかとなる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A.R. Gennaro, (2000) Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい。投与される組成物つまり処方物は、いずれにしても、治療される対象において所望の状態を達成するのに適切な薬剤の量を含む。
【０１０６】
本発明の化合物の剤形
薬剤の剤形において、本発明の対象miRNA化合物は、それらの薬剤的に許容可能な塩の形態で投与され得るか、それらはまた、単独で、または他の薬剤的活性化合物と適切に結合して、および他の薬剤的活性化合物と組み合わせて使用され得る。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、全く制限されない。
【０１０７】
当該薬剤は、従来薬の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路（全身性または局所経路を含む）を用いて宿主に投与され得る。一般的に、本発明によって考えられる投与経路には、腸の、非経口の、または肺内送達または鼻腔内送達のような、吸入の経路が含まれるが必ずしもそれらに制限されない。
【０１０８】
従来のおよび薬剤的に許容可能な投与経路には、鼻腔内の、肺内の、筋肉内の、気管内の、腫瘍内、皮下の、皮内の、局所適用の、静脈内の、直腸の、経鼻の、経口のおよび他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、その薬剤および/またはその所望の効果に応じて、組み合わせられ得るか、必要に応じて、調整され得る。その組成物は、単回投与または複数回投与で投与され得る。
【０１０９】
経口剤に対して、対象miRNA化合物は、錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを作るために単独で使用される得る、または適切な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊薬；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤；ならびに必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤と組み合わせて使用され得る。
【０１１０】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所経路、経皮的経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、関節内経路、髄腔内経路、胸骨内経路、静脈内経路、すなわち、消化管経由以外の任意の投与経路、および所望の腫瘍内または腫瘍周辺の注射（特に、腫瘍は固形または半固形腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など））を含む局所注射が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。生物のコンパートメント（例えば、前立腺、卵巣、心臓の領域（例えば、心膜によって画定される心膜腔）、髄腔内空間、滑膜腔など）を画定する組織への局所注射も、興味深い。非経口投与は、その薬剤の全身送達または局所送達をもたらすように運ばれ得る。全身送達が望まれる場合、投与は、一般的に医薬製剤の侵襲性または全身吸収性局所投与または粘膜投与が含まれる。
【０１１１】
皮膚または粘膜を通る当該薬剤の投与方法には、適切な医薬製剤の局所的適用、経皮的透過、注射および表皮性投与が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。経皮的透過には、吸収促進剤またはイオン泳動が適切な方法である。イオン泳動透過は、数日以上の間、傷ついていない皮膚を通る電気パルスによって、連続的に「パッチ」の産物を送達する市販の「パッチ」を使用することによって達成され得る。
【０１１２】
本発明の対象miRNA化合物は、植物性オイルまたは他の類似のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールエステル、コラーゲン、コレステロールのような水性溶媒または非水性溶媒の中で、ならびに必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤のような従来の添加剤と共に、miRNA化合物を溶解、懸濁または乳化することによって注射のための製剤に処方され得る。
【０１１３】
本発明のmiRNA化合物は、また、腸内投与によって対象へ送達され得る。腸内投与経路には、経口送達および（例えば、坐薬を使用した）直腸送達が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。
【０１１４】
さらに、対象miRNA化合物は、乳化基剤または水溶性基剤のような様々な基剤と混合することによって、坐薬にし得る。本発明の当該化合物は、坐薬によって直腸に投与され得る。この坐薬は、体温で融解するが、室温では凝固するカカオバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビヒクルを含み得る。
【０１１５】
本発明の化合物の投薬量
治療される対象および病態ならびに投与経路に応じて、対象miRNA化合物は、例えば、1日に0.1μg〜100mg/体重kgの投薬量で投与され得る。特定の実施形態において、治療的投与は、所望の効果が達成されるまで繰り返される。同様に、投与の方法は投薬量に多大な影響を与え得る。従って、例えば、経口投薬量は、注射投薬量の約10倍であり得る。より多い量の投薬は、局所的な送達経路に使用され得る。
【０１１６】
標準的な投薬量は、静脈投与に適した溶液；1日に2〜6回服用される錠剤、または1日に1回服用され、比例的により高い含有量の有効成分を含む、一度に放出されるカプセルもしくは錠剤などであり得る。持続放出型の効果は、異なるpH値で溶解するカプセルの物質によって、浸透圧によってゆっくり放出するカプセルによって、または任意の他の既知の制御された放出方法によって得られ得る。
【０１１７】
当業者は、投薬量が特定化合物、症状の重篤度および対象の副作用に対する感受性に応じて変化し得ることを容易に理解する。与えられる化合物の投薬量は、様々な手段によって当業者により容易に決定される。
【０１１８】
使用される投薬量は達成されるべき臨床の目標に応じて変化するが、適切な投薬量の範囲は、対象動物の症状を減らすため、約1μg〜約1,000μgまたは約10,000μgまでの対象組成物を提供する範囲である。
【０１１９】
シロップ、エリキシル剤、および懸濁液のような経口または直腸投与の単位剤形が提供され、ここで、各々の投薬量単位、例えば、ティースプーン、テーブルスプーン、錠剤または坐薬は、本発明の１つもしくは複数の化合物を含む、規定量の組成物を含む。同様に、注射または静脈投与の単位剤形は、滅菌水の溶液、生理食塩水または他の薬剤的に許容可能な担体として組成物の中の化合物を含み得る。
【０１２０】
本発明の化合物を用いた併用療法
本主題の方法の使用に対して、対象化合物は、化学療法剤のような生化学的活性を活性化または抑制する他の薬剤を含む他の薬学的活性剤と共に処方され得るか、そうでなければそれらと組み合わせて投与され得る。対象化合物は、医薬品のような他の化学薬品の有効性の増加、または所望の生物学的効果を生み出すのに必要な医薬品のような他の化学薬品の量の減少を提供するために使用され得る。
【０１２１】
併用療法で使用するための化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソウレア（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２２】
さらに、本発明のmiRNA化合物は、他のmiRNA分子との併用療法でも使用され得る。そのような実施形態において、これらのmiRNA分子は、第1の遺伝子の活性化（活性化RNA-RNAa）を増加させるために投与され、遺伝子発現を減少させるように設計された第2のRNAi（抑制性RNA-RNAi）分子は、第2の遺伝子の発現を抑制するために投与され得る。例えば、本発明のmiRNA分子は、腫瘍抑制遺伝子またはアポトーシス促進遺伝子の活性を増加させるために投与され、そのRNAi分子は腫瘍遺伝子の発現を抑制するために投与され得る。
【０１２３】
本発明の化合物との併用療法で使用するための、本明細書記載の化合物は、本発明の化合物が投与されるのと同じ投与経路（例えば、肺内、経口、腸など）により投与され得る。別の方法では、本発明の化合物との併用療法で使用するための化合物は、当該化合物が投与される投与経路と異なる投与経路により投与され得る。
【０１２４】
キット
対象化合物の単位用量（通常、経口または注射可能な用量）を有するキットが提供される。このようなキットの中には、単位用量を含む容器に加えて、情報の添付文書には、所望の病態を治療する際の薬剤の使用および付随の利点について記載してある。代表的な化合物および単位用量は、本明細書の上記のものである。
【０１２５】
1つの実施形態において、そのキットは、滅菌バイアル瓶または滅菌シリンジの中にmiRNA処方物を含み、その処方は哺乳類、特にヒト、に注射するのに適し得る。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、当業者に本発明の作製法および使用法の完全な開示および記載を提供するために出され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲に制限するようには意図されず、以下の実験が行われる全てまたは唯一の実験であるということを表すようにも意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差は説明されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度、および圧力は大気圧またはその付近の圧力である。
【実施例１】
【０１２７】
miRNAはE-カドヘリンプロモーターを特異的に標的とする
RegRNAプログラムを、コンピューターでプロモーター領域を入念に調べるために使用した。このソフトウェアは、制御モチーフおよびmiRNA標的部位のためのインプットRNA配列を入念に調べるように設計されている。しかしながら、プロモーター配列を操作することによって、このソフトウェアは、DNA鎖の中に既知のmiRNAと相補的な推定部位を同定し得る。走査解析は、E-カドヘリンプロモーターの転写開始部位に対して5'方向の-645ヌクレオチドの位置にある配列が、miR-373と高度に相補的であることを明らかにした（図1、パネルAおよび図1、パネルB）。miR-373のネイティブの2本鎖、および推定miR-373標的部位（図1、パネルC）と完全に（100％）相補的である他のdsRNA分子（dsEcad-640）を合成した。全ての既知のヒト配列と高い相同性を有しないコントロールdsRNA（dsControl）を合成した。各dsRNA2本鎖をPC-3前立腺ガン細胞にトランスフェクションし、E-カドヘリン発現を72時間後に解析した。
【０１２８】
PC-3、LNCaP、およびHCT-116細胞を10% FBS、2mMのL-グルタミン、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充したRPMI 1640培地の中で、37℃、CO2濃度5%の湿気のある環境で維持した。Tera-1細胞を、10% FBS、2mMのL-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したMcCoy's 5A培地で培養した。dsRNAトランスフェクション前日に、細胞を、約50%〜60%の密度になるように、抗生物資を含まない増殖培地に蒔いた。dsRNAのトランスフェクションを、製品の手順書に従い、リポフェクトアミン（Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad CA)）を用いて行った。
【０１２９】
miRNA、ネイティブmiR-373、miR-373のミスマッチ誘導体（例えば、miR-373-5MMおよびmiR-373-3MM）、プロモーター特異的dsRNAs（例えば、dsEcad-640、dsEcad-640、dsEcad-215、およびdsCSDC2-670）、ならびに非特異的コントロールdsRNA(dsControl)の調製品は、インビトロジェン（Invitrogen (Carlsbad, CA)）が合成した。全てのdsRNA/miRNA2本鎖は2-ヌクレオチド3’オーバーハングを有した。miR-373前駆体(pre-miR-373)は、ダーマコン（Dharmacon (Lafayette, CO)）が合成した。Pre-miR（登録商標）ネガティブコントロール#1 (pre-miR-Con)はアンビオン（Ambion (Austin, TX)）から購入し、非特異的な成熟前のmiRNAコントロールとして役割を果たした。Anti-miR-miR-373阻害オリゴヌクレオチド(Anti-miR-373)およびAnti-miR（登録商標）ネガティブコントロール#1(Anti-miR-Con)もアンビオンから手に入れた。例示的な配列を以下に挙げる。
配列(5'-3')
miR-373S       5'ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC 3'       配列番号2
miR-373SA      5'GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU 3'      配列番号3
dsEcad-640S    5'CCUGAAAUCCUAGCACUUU[dT][dT]3'  配列番号4
dsEcad-640AS   5'AAAGUGCUAGGCUUUCAGG[dT][dT]3'   配列番号5
miR-373-5MMS   5'ACUCAAAAUGGGGGCUAGAUCC 3'       配列番号6
miR-373-5MMAS  5'GUCUAGCUUCGAUUUUGGGGUGU 3'      配列番号7
miR-373-3MMS   5'GGUGAAAAUGGGGGCGCUUUCC 3'       配列番号8
miR-373-3MMAS  5'GAAGUGCUUCGAUUUUGCACCGU 3'      配列番号9
dsCSDC2-670S   5'GUUCACCUGUGCACCUUCA[dT][dT] 3'  配列番号10
dsCSDC2-670AS  5'UGAAGGUGCACAGGUGAAC[dT][dT] 3'  配列番号11
dsEcad-215S    5'AACCGUGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] 3'  配列番号12
dsEcad-215AS   5'UUAUGGGACCUGCACGGUU[dT][dT] 3'  配列番号13
pre-miR-373   5'ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCCUUUUUGUCUGUACUGGGAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU 3'   配列番号14
RT-PCR プライマー  配列(5'-3')
E-カドヘリンS     5'CCTGGGACTCCACCTACAGA 3'   配列番号15
E-カドヘリンAS    5'GGATGACACAGCGTGAGAGA 3'   配列番号16
CSDC2S             5'GTTCAAGGGCGTCTGTAAGC 3'   配列番号17
CSDC2AS            5'AGCTGAGTGAGCACCACCTC 3'   配列番号18
GAPDHS             5'TCCCATCACCATCTTCCA 3'      配列番号19
GAPDHAS            5'CATCACGCCACAGTTTCC 3'      配列番号20
PMO               配列(5'-3')
ダイサー-PMO       5'AGCAGGGCTTTTCATTCATCCAGTG 3' 配列番号 21
ChIPプライマー    配列(5'-3')
E-カドヘリンS    5'ATAACCCACCTAGACCCTAGCAA3'     配列番号22
E-カドヘリンAS   5'CTCACAGGTGCTTTGCAGTTC3'       配列番号23
CSDC2S            5'AAGCAGGGACTACAAATTCTCATC3'    配列番号24
CSDC2AS           5'CTCTGTCTCTCTCTGGCTCGTG3'      配列番号25
GAPDHS             5'TACTAGCGGTTTTACGGGCGCACGT3'  配列番号26
GAPDHAS            5'TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGAA3'  配列番号27
【０１３０】
E-カドヘリンmRNA発現解析は、miR-373およびdsEcad-640トランスフェクション後のE-カドヘリン量の顕著な増加を明らかにした（図1、パネルD）。模擬のトランスフェクションと比較して、miR-373およびdsEcad-640の両方は、E-カドヘリンmRNA量を約7倍増加させた（図1、パネルE）。miR-373およびdsEcad-640の組み合わせのトランスフェクションがE-カドヘリン発現をさらに増加させなかったことは、両方のdsRNA分子が、実際、同じ部位を標的としていることを示す（図1、パネルDおよび図1、パネルE）。E-カドヘリンポリペプチドの量は、免疫ブロット解析によって裏付けられたように、E-カドヘリンmRNA発現の誘導と一致する。図1、パネルFに示すように、E-カドヘリンポリペプチドの増加量は、E-カドヘリンmRNA発現の増加と強く相関する。従って、これらの結果は、miRNAは遺伝子発現を抑制しかしないという以前の考えに反して、遺伝子のノンコーディング領域（例えば、プロモーター）を標的にするmiRNAは発現を誘導し得ることを示す。
【実施例２】
【０１３１】
pre-miRNAの生合成は、E-カドヘリン誘導に必要である
上記のように、RNase III酵素ダイサーにより、miRNAはmiRNAヘアピン前駆体（pre-miRNA）からプロセシングされる(Ketting et al., (2001) Genes Dev 15, 2654-9)。miR-373前駆体(pre-miR-373)からmiRNAへのプロセシングがE-カドヘリン誘導を促進することができるのかどうかを決定するため、pre-miR-373のRNA配列（図2、パネルA）を、実施例1に記載された方法を用いて、PC-3細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、非特異的pre-miRNA(pre-miR-Con)をトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、miR-373をトランスフェクションした細胞で見られたE-カドヘリン誘導と同様に、pre-MiR-373細胞でE-カドヘリンmRNA発現の顕著な誘導があった（図2、パネルB）。模擬トランスフェクションと比較して、pre-miR-373およびmiR-373は、E-カドヘリンmRNA量をそれぞれ約5.5倍および約7倍増加させた（図2、パネルC）。
【０１３２】
免疫ブロット解析も、E-カドヘリンポリペプチド量のロバストな増加を明らかにした（図2、パネルD）。これは、miR-373によって誘導されるmRNA発現の増加が、タンパク質量の増加と相関することを示す。概して、模擬コントロール、dsControlコントロール、またはpre-miR-Conコントロールでトランスフェクションした細胞では、E-カドヘリン発現に変化は検出されなかった。
【０１３３】
miRNAを含む全RNAを、製品の手順書に従って、miRNeasyミニキット(Qiagen, Velencia, CA)を用いて抽出した。200ngの全RNAを含む逆転写反応を、miR-373-特異的プライマーと組み合わせて、TaqMan（登録商標）MicroRNA逆転写キット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。GAPDH発現解析のため、全RNAの1μgもoligo(dT)プライマーを用いて逆転写した。miR-373発現を定量化するため、リアルタイムPCRを、TaqMan（登録商標）miRNAアッセイキット(Applied Biosystems)を用いて行った。GAPDHの増幅は、miR-373発現データを標準化するために使用される内在性コントロールして役割を果たした。各サンプルを4通り解析した。逆転写反応で利用されたmiR-373-特異的プライマーは、miR-373およびpre-miR-373の両方を認識することに留意すべきである。従って、結果は、miR-373およびpre-miR-373の合わせた細胞内量の定量的測定である。
【０１３４】
トランスフェクションした細胞内のmiR-373を定量化するため、miR-373の細胞内量をリアルタイムPCRによって解析した。miR-373およびpre-miR-373でトランスフェクションした細胞で検出されたmiR-373の量は、図3、パネルAに示すように、コントロールサンプルよりもトランスフェクションした細胞で約30,000倍多かった。これは、ダイサーによるpre-miR-373のmiR-373への効果的な変換があったことを示す。トランスフェクションした細胞で見られるmiR-373の量は、野生型のmiR-373を内生的に産生する細胞株のmiR-373の量と同じである。図3、パネルBは、miR-373を発現しないPC-3細胞および野生型miR-373を発現するTera-1細胞におけるmiR-373の量のグラフである。miR-373、pre-miR-373およびTera-1細胞におけるmiR-373がおよそ同じ量であることは、pre-miR373によるトランスフェクション後、miR-373が類似の細胞内量に近づき、PC-3細胞におけるE-カドヘリンの誘導と相関することを示す。
【０１３５】
pre-miR373からmiR-373へのプロセシングは、活性のあるダイサーポリペプチドを大抵必要とするので、ダイサーのmRNAの転写開始部位を標的とするアンチセンスのホスホロジアミダートモルフォリノオリゴヌクレオチド(PMO)を合成した。このPMOは、タンパク質合成を妨害する役割を果たし、miRNAによって誘導される遺伝子発現にも必要とされ得る任意の内在性の酵素的な機構を利用することなく、ダイサーの機能をノックダウンさせる。
【０１３６】
アンチセンスPMO分子（ダイサー-PMO）を、ダイサーmRNAの転写開始部位に対して設計および合成した(Gene Tools, LLC, Corvallis, OR)。標準コントロールオリゴもGene Toolから購入し、それは非特異的コントロールPMO(Con-PMO)として役割を果たした。ダイサータンパク質合成を遮断するために、半集密的PC-3細胞を、Endo-Porter送達系(Gene Tools, LLC)を用いて15μMのダイサー-PMOを実施例１に記載のようにトランスフェクションした。コントロール処理の細胞を、PMO分子なしにトランスフェクションした。次の日、処理した細胞を約50%〜60%の集密度で再び蒔き、リポフェクトアミン（Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA)）を用いて、miRNAを用いてまたはmiRNAなしにすぐにトランスフェクションした。miRNAトランスフェクション後72時間、全ての処理が進んだ。
【０１３７】
図4、パネルAに示すように、免疫ブロット解析は、アンチセンスPMO（ダイサー-PMOレーン）によるダイサーポリペプチドの減少を示している。PMOで処理した後のE-カドヘリン発現解析は、pre-miR-373トランスフェクション後、ダイサー-PMOがE-カドヘリン誘導を完全に阻害したことを示している（図4、パネルB）。対照的に、ダイサーによるプロセシングを必要としない、トランスフェクションしたmiR-373は、E-カドヘリン発現を十分に誘導する能力を保持した（図4、パネルC）。これらのデータは、ダイサーによるpre-miR-373生合成がE-カドヘリン発現を誘導できるmiR-373を産生すること、それにより本発明のmiRNAはダイサーを含む細胞で発現を誘導するために使用され得ること、およびmiRNAはダイサーを有しない細胞で利用され得ることを示す。
【実施例３】
【０１３８】
miRNAはCSDC2の発現を誘導する
miRNAは、複数の遺伝子の発現を活性化する遺伝子プロモーター内の類似の配列を標的とし得る。誰もが使用できるmiRNA標的予測アルゴリズムのmiRanda(Enright et al., (2003) Genome Biol 5, R1)を、miR-373と高度に相補的な部位について、ヒトゲノムの全ての遺伝子のプロモーター配列の1kbを入念に調べるために使用した。その結果、miR-373と相補的なプロモーター配列を有する372を超える遺伝子が得られた。その遺伝子のそれぞれのプロモーター部位において、全体的な配列がmiR-373と一番相補的で、既知の機能を有する12遺伝子をリストから選択した。その12の代表的な遺伝子は、CSDC2/PIPPIN(C2を含むコールドショックドメイン)、NPM1(ヌクレオフォスミン1)、NUPL2(ヌクレオポリン様タンパク質2)、BFAR(2機能性アポトーシス調節因子)、IRAK3(インターロイキン-1受容体関連キナーゼ3)、GAA(リソソームα-グルコシダーゼ前駆体)、NSUN7(NOL1/NOP1/Sunドメインファミリーメンバー7)、RAGE(腎臓腫瘍抗原1)、FOXP2(フォークヘッドボックスP2)、RBKS(リボキナーゼ)、ACOT6(アシル-CoAチオエステラーゼ6)、SIRPD(シグナル制御タンパク質δ)である。
【０１３９】
PC-3細胞をmiR-373またはpre-miR-373でトランスフェクションし、その12の代表的な遺伝子の1つであるCSDC2の発現増加についてmRNA解析を行った。図5、パネルAに示すように、相補性を有するmiR-373領域は、CSDC2プロモーターの転写開始部位に対して5'方向の-787ヌクレオチドに位置する。図5、パネルBおよび図5、パネルCに示すように、miR-373およびpre-miR-373はCSDC2の発現を容易に誘導した。模擬トランスフェクションコントロールと比較して、miR-373およびpre-miR-373は、それぞれ、CSDC2の発現量を約5倍および約5.2倍誘導した（図5、パネルD）。これらの結果は、遺伝子プロモーター内の類似の標的配列が、本発明のmiRNAに複数の遺伝子の発現を誘導させ得ることを示す。従って、本発明の少数のmiRNAを注意深く選択することで、複数の遺伝子の遺伝子発現を誘導させることができ、個々のプロモーター領域に対するmiRNAを産生するのに必要な時間および物質を節約することができる。
【実施例４】
【０１４０】
miRNA標的化遺伝子プロモーターにおけるRNAポリメラーゼIIの濃縮
標的化遺伝子プロモーターにおけるRNAポリメラーゼII(RNApII)の濃縮がmiR-373によって誘導される遺伝子発現と関連するかどうかを決定するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを使用した。
【０１４１】
72時間、100mmのデッシュの中で、細胞をmiR-373でトランスフェクションした。ChIPアッセイを、メーカーの取り扱い説明書に従って、ChIPアッセイキット(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)を用いて行った。RNApIIのC末端ドメインに特異的な抗体(Millipore, Billerica, MA)を、DNAの転写活性領域を免疫沈降するために使用した。E-カドヘリン、CSDC2またはGAPDH転写開始部位に特異的なPCRプライマーを使用して、ChIPアッセイで単離したDNAを増幅した。PCRは、95℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で30秒を25〜32サイクル行なった(Okino et al., (2007) MoI Pharmacol 72, 1457-65を参照されたい)。
【０１４２】
E-カドヘリン、CSDC2またはGAPDHの転写開始部位に相当する3領域を、ChIPアッセイによりマッピングした。GAPDHプロモーターは、RNApIIが結合する内部コントロールとして役割を果たした。図6に示すように、模擬コントロールおよびdsControl処理では、RNApIIの結合が低い量であったのに対し、miR-373のトランスフェクション後のRNApII密度は、E-カドヘリンおよびCSDC2の転写開始部位で増加した。GAPDHコアプロモーターの位置のRNApII量は、いかなる処理においても変化がなかった（図6）。これらの結果は、標的化遺伝子プロモーターにおけるRNApIIの濃縮が、miR-373によって誘導される遺伝子発現と関連することを示す。
【実施例５】
【０１４３】
miRNAによる遺伝子誘導の配列特異性
遺伝子誘導の特異性を決定するために、2つのmiRNA変異体を合成した。miR-373の（アンチセンス鎖に対して）5'末端または3'末端の4塩基を変え、それぞれ変異誘導体miR-373-5MMおよびmiR-373-3MMを得た（図7、パネルA）。図7、パネルBに示すように、miR-373-5MMまたはmiR-373-3MMのいずれも、E-カドヘリンまたはCSDC2発現を誘導することができなかった。特異的に結合し、miR-373配列活性を抑えるように、相補的オリゴヌクレオチド(anti-miR-373)との共トランスフェクションを設計した。非特異的コントロールオリゴヌクレオチド(anti-miR-Con)のトランスフェクションは、miR-373によって誘導される遺伝子発現に影響を与えなかったが、anti-miR-373は、miR-373およびpre-miR-373によるE-カドヘリンおよびCSDC2誘導を遮断した（図8、パネルAおよび図8、パネルB）。総合すると、これらの結果は、E-カドヘリンおよびCSDC2の誘導はmiR-373の配列に特異的であるということを示す。
【０１４４】
本発明のmiRNAの特異性をさらに特定するために、異なる部位のE-カドヘリン(dsEcad-215)またはCSDC2(dsCSDC2-670)プロモーターを特異的に標的にする2つのdsRNA分子を合成した。本願の発明者は、dsEcad-215が、E-カドヘリンプロモーターの転写開始部位に対して5'方向の-215ヌクレオチドの配列を標的にすることによって、E-カドヘリンの発現を容易に誘導したことを以前に証明していた(Li et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17337-42)。dsRNA設計に類似の基準を用いて、CSDC2プロモーターの転写開始部位に対して5'方向の-670ヌクレオチドの位置を標的とし、CSDC2発現を誘導するように、miRNA dsCSDC2-670を設計した。図7、パネルCは、miR-373のトランスフェクションは両遺伝子の発現を容易に誘導したが、一方、dsEcad-215およびdsCSDC2-670は、それぞれE-カドヘリンおよびCSDC2の発現のみを活性化したことを示す。両プロモーターの多岐に渡る部位を標的にすることによって、遺伝子誘導を、標的遺伝子にのみ特異的に限定した。これらの結果は、miR-373が両遺伝子のプロモーターにある類似配列を特異的に標的にするため、E-カドヘリンおよびCSDC2の活性化が起こることを示す。miR-373およびdsEcad-640の共トランスフェクション（図1、パネルDおよび図1、パネルE）と対照的に、miR-373およびdsEcad-215の共トランスフェクションは、E-カドヘリン量を相加的に高めた（図9、パネルAおよび図9、パネルB）。E-カドヘリンプロモーターの異なる部位を標的にすることによって、miR-373およびdsEcad-215の両方はE-カドヘリン誘導に寄与し、E-カドヘリン量をおよそ倍の量にした。
【０１４５】
従って、本発明のmiRNAは、さらに遺伝子発現の誘導の量を決めるために使用され得る。本明細書において説明したように、1つのmiRNA(miR-373)を使用すると遺伝子発現を誘導できる。異なる部位を対象とする別のmiRNAの付加は、遺伝子発現の誘導をより多い量へと増加させるのに有用であることを証明し得る。上で説明したように、miRNAが遺伝子発現を抑制することが以前に示された。本願は、本発明のmiRNAが遺伝子発現を誘導することを示す。その結果、特定の遺伝子の発現をより低くするまたは抑制するための抑制性miRNA（RNAi）および、アポトーシスを誘導するまたはガン細胞の増殖を減少させるような有益な効果を提供するために、他の遺伝子の発現を増加させる（例えば、腫瘍抑制遺伝子またはアポトーシス促進性遺伝子を増加させる）ため活性化するmiRNAを利用することが可能であり得る。
【実施例６】
【０１４６】
マウスのサイクリンB1（Ccnb1）遺伝子プロモーターを標的にするdsRNAにより誘導されるCcnb1のmRNAおよびタンパク質発現
RNAaがマウスの細胞内で保存されるかどうかを決定するために、マウスのCcnb1プロモーターの特定の部位に相補的な2つのdsRNA分子（Ccnb1転写開始部位に対して-303の位置を標的にするdsCcnb1-303ならびに-487および-1596に位置する繰り返し配列を標的にするdsCcnb1-487/-1596）を設計した（図10、パネルA）。不死化したマウスNIH/3T3胎児繊維芽細胞を、dsCcnb1-303、dsCcnb1-487/-1596、または非特異的コントロールdsRNA(dsCon)のいずれかで、72時間トランスフェクションし、Ccnb1発現量をリアルタイムPCRによって評価した。模擬トランスフェクションと比較して、dsCcnb1-303とdsCcnb1-487/-1596の両方は、Ccnb1のmRNA発現を2倍に誘導した（図10、パネルB）。Ccnb1タンパク質の誘導量が、免疫ブロット解析によって確認された（図10、パネルC）。総合すると、これらの結果は、Ccnb1はマウス細胞内のRNAaの影響を受けやすいことを示す。
【実施例７】
【０１４７】
マウスCcnb1遺伝子プロモーターを標的にするmiR-744およびmiR-1186により誘導されるCcnb1遺伝子発現
miRNが、同様にマウス細胞内でRNAaを指示し得るかどうかを調べるために、miRANDAアルゴリズムを用いて既知のmiRNAと相補的な部位についてCcnb1プロモーターの2kbを入念に調べた。走査分析により、Ccnb1転写開始部位に対して、mmu-miR-744(miR-774)は-183に位置する部位と相補的であり、mmu-miR-1186(miR-1186)は-698および-1698に位置する2つの推定標的部位を有することが明らかとなった（図11、パネルA）。Ccnb1のmRNA発現量を評価するために、合成miR-744およびmiR-1186をNIH/3T3細胞にトランスフェクションし、リアルタイムPCRを行った。模擬トランスフェクションと比較して、miR-744およびmiR-1186はCcnb1のmRNA量をわずかに増加させた（図11、パネルB）。免疫ブロット解析も、miR-744およびmiR-1186によるCcnb1タンパク質量の増加を裏付けた（図10、パネルC）。
【０１４８】
miRNA成熟遺伝子であるダイサーまたはドローシャを枯渇させると、内在性のmiRNAの全細胞内量を減少させることが知られている。内在性のmiRNAがCcnb1発現を正に制御し得るのかどうかを決定するために、siRNAによりDicerおよびDroshaをノックダウンし、Ccnb1発現量を評価した。ダイサーおよびドローシャのノックダウン効率を、リアルタイムPCRをによって評価した（図11、パネルDおよびE）。ダイサーsiRNAまたはドローシャsiRNAの存在下、模擬トランスフェクションと比較して、Ccnb1量は約20〜30%減少した（図11、パネルF）。このデータは、内在性miRNAがCcnb1遺伝子発現を正に制御していることを示す。
【実施例８】
【０１４９】
Ago1はCcnb1の転写活性化を仲介する
発明者は、アルゴノート(Ago)タンパク質、特にAgo2が、合成dsRNAによって仲介されるRNAaに関わることを以前に示した(Li et al., PNAS (2006) 103:17337-17342)。Ago2は、活性を促進するために、siRNAのような合成dsRNAと結合することが知られているが、Ago1は主にmiRNAと相互作用することが知られている。さらに、Ago1は、遺伝子プロモーターにおいて、miRNAを含むdsRNAによる転写遺伝子抑制(TGS)を指示することが知られている。従って、発明者は、Ago1もmiRNAに仲介される遺伝子活性化に関わるかどうかを決定することにした。哺乳類発現ベクターのHA-エピトープタグの下流にAgo1のcDNAをクローン化し（HA-Ago1）、HA-Ago1を過剰発現する安定発現株をNIH/3T3細胞から確立した(Ago1-NIH/3T3、図12、パネルA)。コントロールとして、HA-タグEGFP(HA-EGFP)を過剰発現する安定なNIH/3T3細胞も確立した。図12、パネルBに示すように、コントロールHA-EGFP細胞株と比較すると、HA-Ago1過剰発現はCcnb1量を約1.5倍増加させた。逆に、siRNAによりAgo1をノックダウンすると（図12、パネルC）、NIH/3T3細胞におけるCcnb1の顕著な下方制御が引き起こされた（図12、パネルD）。これらの結果は、Ago1がNIH/3T3細胞におけるCcnb1発現を正に制御することを示す。
【実施例９】
【０１５０】
Ago1はCcnb1の近位プロモーター領域と結合する
Ago1がNIH/3T3細胞内でCcnb1プロモーターと結合するかどうかを決定するために、HA-エピトープタグに特異的な抗体を利用して、HA-Ago1安定発現株のクロマチン免疫沈降（ChIP）実験を行った。ネガティブコントロールとして、HA-特異的抗体を用いたHA-EGFP細胞株のChIPアッセイも行った。リアルタイムPCRによってAgo1濃縮を定量化するために、Ccnb1プロモーターの厳選した領域に対応する7つのプライマー対を使用した（図13、パネルA）。インプットサンプルの増幅シグナルに対してデータを標準化した。HA抗体(+HA)の存在下で獲得された標準化シグナルを、抗体を含まないコントロール(-HA)で増幅したバックグラウンド量で割り算することにより、何倍濃縮されたかを決定した。Ago1を欠いていることが予想され、ACTBおよびGAPDHに対応する遺伝子内領域も、シグナル濃縮のネガティブコントロールとして評価した。図13、パネルBに示すように、Ccnb1転写開始部位に対して-275〜+3領域間にあるAgo1の濃縮が約1.5〜2倍であることを検出した。厳選した領域のHA-EGFPサンプルにおいてシグナルの濃縮は観察されず、遺伝子内のACTBおよびGAPDH部位においてもAgo1濃縮は見られなかった。これらの結果は、Ago1が、Ccnb1遺伝子活性化と相関する、NIH/3T3細胞内のCcnb1プロモーターに結合することを示唆する。このデータは、さらに、RNAaが、miRNAによって促進される内在性の細胞機構であり、それは細胞内にmiRNAの同族プロモーターを導入することによって遺伝子発現を高めるために利用され得るという証拠も提供する。
【０１５１】
前述のことは、単に、本発明の原理を説明するに過ぎない。本明細書に明確に記載または示されていないが、当業者が本発明の原理を具体化し、本発明の精神および範囲に含まれる様々な計画を、考案することができることが理解される。さらに、本明細書で列挙する全ての実施例および条件付きの専門用語は、主に、読み手が本発明の原則を理解するのを助けるように意図され、発明者によってその概念はその技術の促進に貢献し、このように具体的に列挙される実施例および条件には制限がないように解釈されるべきである。さらに、本発明の原則、態様、実施形態およびその具体的な実施例を列挙している本明細書の全ての記載は、その構造的および機能的同等物の両方を含むように意図される。さらに、このような同等物は、現在知られている同等物および将来開発される同等物（すなわち、構造に関わらず、同じ機能を果たす任意の開発された要素）の両方を含むと意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示されたおよび記載された例示的な実施形態に制限されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は添付の請求項によって具体化される。
【図１】
2011507554.tif 000003
【図２】
2011507554.tif 000004
【図３】
2011507554.tif 000005
【図４】
2011507554.tif 000006
【図５】
2011507554.tif 000007
【図６】
2011507554.tif 000008
【図７】
2011507554.tif 000009
【図８】
2011507554.tif 000010
【図９】
2011507554.tif 000011
【図１０】
2011507554.tif 000012
【図１１】
2011507554.tif 000013
【図１２】
2011507554.tif 000014
【図１３】
2011507554.tif 000015
【配列表】
2011507554000001.app
【国際調査報告】
2011507554.tif 000016
2011507554.tif 000017