(57)【要約】  本発明は、(a)シトシンベースの抗癌剤および/またはプリンベースの抗癌剤ならびに(b)チミジンホスホリラーゼ阻害剤およびモリクテス（Mollicutes）に対する抗生物質を含む群から選択される治療薬を含む、治療薬の組合せに関する。  本発明は、哺乳動物、特にヒトの癌治療のために、同時に、別々にまたは連続して、該組合せを使用することにも関連する。  本発明は、癌、好ましくはモリクテス・バクテリアに感染した哺乳動物の癌治療法にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）シトシンベースの抗癌剤および/またはプリンベースの抗癌剤ならびに
（b）チミジンホスホリラーゼ阻害剤およびモリクテス（Mollicutes）に対する抗生物質を含む群から選択される治療薬
を含む治療剤の組合せ。
【請求項２】
請求項１に記載の組合せ（ここで、該シトシンベースの抗癌剤は、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビンを含む群から選択される）。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組合せ（ここで、該プリンベースの抗癌剤は、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンから選択される）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ（ここで、該治療薬（b）はウラシル誘導体、溶媒和物またはその医薬的に許容される塩であり、該ウラシル誘導体は構造式（I）によって表される
【化１】
2011520845.tif 000013
［式中、
R1は塩素、臭素、ヨウ素、シアノまたはC1-4アルキルから選択され；
R2は、C1-4アルキル、イミノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、メタンスルホニロキシ、アミノおよびニトロからなる群より選択される、1以上の置換基で独立して置換されていてもよい、1、2または3の窒素原子を有する4〜8員の複素環式基である；または
R2はアミジノチオ基である（ここで、該アミジノチオ基の有する窒素原子は、それぞれ独立して、C1-4アルキルで置換されていてもよい）；または
R2はグアニジノ基である（ここで、該グアニジノ基の窒素原子は、それぞれ独立して、C1-4アルキルまたはシアノで置換されていてもよい）；または
R2はC1-4アルキルアミジノである；または
R2はアミノ、モノC1-4アルキルアミノまたはジC1-4アルキルアミノである；または
R2は構造式-CH2N(Ra) Rbの基である（ここで、RaおよびRbは独立して、水素もしくはC1-4アルキルであるか、またはRaおよびRbは、それらが結合した窒素原子と共にピロリジン環を形成し得る）；または
R2は構造式-NH-(CH2)m-Zの基である（ここで、Zはシアノ、アミノ、モノC1-4アルキルアミノまたはジC1-4アルキルアミノであり、mは0〜3の整数である）；または
R2は構造式NRc(CH2)n-OHの基である（ここで、Rcは水素原子またはC1-4アルキルであり、nは1〜4の整数である）；または
R2は構造式-X-Yの基である（ここで、XはSまたはNHであり、Yは2-イミダゾリン-2-イル、2-イミダゾリル、1-メチルイミダゾール-2-イル、1,2,4-トリアゾール-3-イル、2-ピリミジルおよび2-ベンズイミダゾリル基からなる群より選択される）；または
R2はウレイドまたはチオウレイド基である（ここで、該ウレイドまたは該チオウレイド基の窒素原子は、それぞれ独立して、C1-4アルキル基により置換されていてもよい）；］。
【請求項５】
前記構造式（I）中、R2が2-イミノピロリジン-1-イル、1-アゼチジニル、1-ピロリジニル、2-ピロリン-1-イル、3-ピロリン-1-イル、1-ピロリル、1-ピラゾリジニル、2-ピラゾリン-1-イル、3-ピラゾリン-1-イル、4-ピラゾリン-1-イル、1-ピラゾリル、1-イミダゾリジニル、2-イミダゾリン-1-イル、3-イミダゾリン-1-イル、4-イミダゾリン-1-イル、1-イミダゾリル、1,2,3-トリアゾール-1-イル、1,2,4-トリアゾール-1-イル、ピペリジノ、1-ピペラジル、モルホリノ、1-ペルヒドロアゼピニル、1-ペルヒドロアゾシニル、アミジノチオ、N-メチルアミジノチオ、N,N'-ジメチルアミジノチオ、1-グアニジノ、1-メチルグアニジノ、3-メチルグアニジノ、2,3-ジメチルグアニジノ、2-シアノ-3-メチルグアニジノ、アセトアミジノ、N-メチルアミノ、N,N-ジメチルアミノ、N-エチルアミノ、N,N-ジエチルアミノ、N-プロピルアミノ、N-イソプロピルアミノ、N-メチルアミノメチル、N,N-ジメチルアミノメチル、1-ピロリジニルメチル、N,N-ジメチルヒドラジノ、N-(2-アミノエチル)アミノ、N-(2-(N,N-ジメチル)アミノエチル)アミノ、N-(3-アミノプロピル)アミノ、N-(2-シアノエチル)アミノ、N-(2-ヒドロキシエチル)-N-メチルアミノ、N-(3-ヒドロキシプロピル)アミノ、N-(4-ヒドロキシブチル)アミノ、2-イミダゾリン-2-チオ、2-イミダゾリン-2-アミノ、イミダゾール-2-チオ、1-メチルイミダゾール-2-チオ、1,2,4-トリアゾール-3-チオ、ピリミジン-2-チオ、ベンズイミダゾール-2-チオおよび3-メチルチオウレイドからなる群より選択される、請求項４に記載の組合せ。
【請求項６】
前記構造式（I）中、R1が臭素、シアノまたはメチルである請求項４または請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
前記ウラシル誘導体、溶媒和物またはその医薬的に許容される塩が、5-クロロ-6-(1-[2-イミノ-ピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、）5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項８】
前記治療薬（b）がチミジンホスファターゼ阻害剤からなる群より選択され、ここでの前記シトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）および前記治療薬（b）間のモル比が25：１〜0.01：１の範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項９】
シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、ネララビン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンからなる群より選択されるシトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）と5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩の組合せである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１０】
前記モリクテス・バクテリアに対する抗生物質が、プラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリンまたはミノサイクリンを含むテトラサイクリン；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシンまたはレボフロキサシンを含む（フルオロ）キノロン；アジスロマイシン、エリスロマイシンまたはクラリスロマイシンを含むマクロライド；リンコマイシンからなる群より選択される請求項１〜９のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１１】
前記シトシンまたはプリンベースの抗癌剤および前記モリクテス・バクテリアに対する抗生物質間のモル比が10：１〜0.01：１の範囲である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１２】
前記モリクテス・バクテリアに対する抗生物質が、マイコプラズマ特異的抗生物質である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１３】
１以上の医薬的に許容される担体または賦形剤および、活性成分として、治療に有効な量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の治療薬の組合せを含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組合せまたは請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
治療薬（b）を投与した後、シトシンまたはプリンベースの抗癌剤を投与する、連続投与による該治療に使用するための、請求項１４に記載の組合せまたは医薬組成物。
【請求項１６】
前記治療薬（b）投与の１〜４日後に前記シトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）を投与する、連続投与による該治療に使用するための、請求項１５に記載の組合せまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける癌治療のために、同時に、別々にまたは連続して使用するための複合製剤としての治療剤の組合せに関する。本発明は、モリクテス・バクテリアに感染したヒトにおける癌治療方法にも関する。
【発明の概要】
【０００２】
いくつかのプリンおよびピリミジンベースの薬剤は、様々な固形腫瘍および白血病/リンパ腫に対して抗癌活性を発揮することが示されている。
【０００３】
ピリミジンベースの薬剤には、デオキシシチジン類似体のシタラビン（以下araCという）、ゲムシタビン（2',2'-ジフルオロシチジン）、ならびに前臨床のトロキサシタビンおよびサパシタビン（2'-シアノ-2'-デオキシ-araCのN4-パルミトイルプロドラッグ）；ウラシルベースの5-フルオロウラシル（以下FUという）ならびにそのプロドラッグであるカペシタビンおよびフトラフールがある。
【０００４】
２つのさらなる5‐置換ウラシルベースのヌクレオシド類似体（例えば、5-フルオロ-dUrd（以下FdUrdという））および5-トリフルオロチミジン（以下TFTという）はまだ臨床用に承認されていない。
【０００５】
プリンベースの類似体は、6-チオグアニン（以下6TGという）、6-メルカプトプリン（以下6MPという）およびそのプロドラッグであるアザチオプリン；ならびにデオキシアデノシン類似体のフルダラビン、クラドリビンおよびクロファラビンがある。
【０００６】
デオキシグアノシン誘導体であるネララビン（araGの水可溶性プロドラッグ）および2',2'-ジフルオログアノシン（以下dFdGという）はまだ正式に臨床用に承認されていない。
【０００７】
これらの薬剤の標的となる異なった癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球白血病、毛様細胞性白血病、良性リンパ腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、腎臓癌、皮膚癌、前立腺癌、胃腸癌および結腸直腸癌を含む。
【０００８】
これらのプリン‐およびピリミジン‐ベースの薬剤は、（チミジンホスホリラーゼ、以下TPという、のような）ホスホリラーゼ、および（チミジンキナーゼ、以下TKという、のような）キナーゼのようなヒト（しばしば癌関連の）代謝（活性化および不活性化）酵素により、高度に代謝されることが知られている。
【０００９】
その結果として起こる抗代謝性癌薬剤の細胞増殖抑制活性は、血漿および腫瘍細胞内に存在する活性化および不活性化酵素間のバランスに大きく依存している。
【００１０】
実際に、5'-ヌクレオチダーゼ（以下5'-Nuという）、ピリミジンおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下PNPという）、ピリミジンおよびプリンヌクレオシドおよびヌクレオチドデアミナーゼならびにヌクレオチドトリホスファターゼのような哺乳動物（特にヒト）の異化酵素は、ヌクレオシド薬剤がそれらの活性化する代謝産物に効率的に変換されるのを阻害し、それらの結果として起こる細胞毒性/抗癌活性を阻害し得る。
【００１１】
いくつかの報告は、5'-Nuの増加により、癌患者におけるクラドリビン、フルダラビン、araCおよびゲムシタビンの効力が低下することを明確に証明している。
【００１２】
芽細胞に高レベルの5'-Nuを発現している急性骨髄性白血病（以下AMLという）の患者が、通常レベルの5'-Nuを発現する患者に比べて、より悪い予後を送ることも見出されている。
【００１３】
5FdUrdおよびTFTの不活性化は、主にTPにより調節され、次いでジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（以下DPDという）が5FUおよびTFチミンをさらに異化する。
【００１４】
DPD発現の増加は、5FUおよびフルオロピリミジンヌクレオシドへの耐性に関連のある患者で見出された。
【００１５】
シタラビンは、シチジンデアミナーゼにより非毒性のaraUに分解され、ara-CMPは細胞質の5'-ヌクレオシチダーゼにより脱リン酸化される。
【００１６】
ピリミジン/プリンベース薬剤はそれぞれ、異化作用対同化作用酵素への感受性およびそれらの薬剤耐性の分子メカニズムに関して独特の特性を示す。
【００１７】
これら個々の薬剤の性質は、それらを特定の種類の腫瘍に対して選択的に有効な、かつ他種の腫瘍および非形質転換細胞に対して無効なまたは乏しい細胞毒性にさせる。
【００１８】
抗腫瘍性物質のプロドラッグの開発には、
（i）異化酵素による分解を回避することにより、および/または
（ii）より多くの腫瘍選択性を与えることにより、および/または
（iii）毒性を有する副作用を低減させることにより、
それらの薬理的性質および抗癌活性を最大化するための努力が奉げられてきた。
【００１９】
例えば、カペシタビンは5FUの経口製剤であり、胃腸管から吸収された後、酵素カスケードにより5FUに代謝される。
【００２０】
最近、TAS-102と呼ばれる哺乳動物TP［5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩（以下TPiという）］とTFTの強力な阻害剤の組合せが開発中である（Emura Tら、in Int. J.Oncol. (2004) 25:571-8 および EP-1,849,470-A）。
【００２１】
TFTの細胞増殖抑制作用のメカニズムは、モノホスフェートとしてチミジレートシンターゼ（以下TSという）を阻害し、トリホスフェート代謝産物に変換後、DNAに薬剤が結合することに基づいている（Emura Tら、Int J Mol Med 2004; 13:249-55）。
【００２２】
しかしながら、TFTは、TFTをその不活性型塩基に変換するヒトTPにより、急速に不活性化される。したがって、TFTおよびTPiを含む新たな医薬製剤が開発されている。
【００２３】
現在、TAS-102は様々な固形腫瘍の治療に関して、臨床試験フェーズＩで評価されている。したがって、TPはフルオロピリミジンベースの化学療法で不明瞭な役割を有している。一方ではカペシタビンなどのように5FUプロドラッグの抗腫瘍性質を高めることができ、他方ではTFTなどのようにピリミジン-2'-デオキシウリジン誘導体を不活性化し得る。
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
しかしながら、より強力な抗癌治療またはより副作用の少ない抗癌治療のためにまだ大きなニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つのシトシンベースの抗癌剤または少なくとも１つのプリンベースの抗癌剤と組み合わされた少なくとも１つのチミジンホスホリラーゼ阻害剤（以下TPIという）の組合せが、癌、特にモリクテス・バクテリアに感染した哺乳動物の癌に対して使用されたとき、これらの薬剤の細胞毒性を回復（restore）させることを見出した。
【００２６】
この組合せは、哺乳動物の癌治療、好ましくは該哺乳動物がマイコプラズマ（Mycoplasma）属、アケロプラズマ（Acheloplasma）属、ウレアプラズマ（Ureaplasma）属、ファイトプラズマ（Phytoplasma）属およびスピロプラズマ（Spiroplasma）属からなる群より選択されるモリクテス・バクテリアに感染している場合に有用である。
【００２７】
実際に、シトシンおよびプリンベースの両抗癌剤は、それらが全く異なるクラスに属する化合物であるため、TPの基質であることが期待されない薬剤であり、TPによる分解に感受性であることは、今まで報告されていない。TP酵素はチミジンおよびデオキシウリジン類似体に対して選択的に作用することが示されている。
【００２８】
したがって、本発明の第１の態様は、
（a）シトシンベースの抗癌剤および/またはプリンベースの抗癌剤、ならびに
（b）チミジンホスホリラーゼ阻害剤およびモリクテス・バクテリアに対する抗生物質からなる群より選択される治療剤
を含む治療剤の組合せに関する。
本発明は、
（a）少なくとも１つのシトシンベースの抗癌剤および/またはプリンベースの抗癌剤、ならびに
（b）チミジンホスホリラーゼ阻害剤およびモリクテス・バクテリアに対する抗生物質からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬を含む組成物にも関連する。
【００２９】
本発明の第２の観点は、活性成分としての上記で定義された治療薬の組合せと共に、１以上の医薬的に許容される担体もしくは賦形剤を含むか、またはそれらからなる医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明のさらなる観点は、哺乳動物の癌治療、好ましくはモリクテス・バクテリアに感染した哺乳動物の癌治療に使用するための、上記の組合せまたは組成物に関する。
【００３１】
本発明は、哺乳動物の癌治療、好ましくはモリクテス・バクテリアに感染した哺乳動物の癌治療用薬剤製造のための、上記の組合せの使用にも関連する。
【００３２】
上記の組合せは、上記の治療薬（b）の投与後に、シトシンまたはプリンベースの抗癌剤を投与する、連続投与による癌治療に使用されてもよい。
【００３３】
好ましくは、治療薬（b）はシトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）の１〜４日前に投与される。ある実施態様では、上記のモリクテス・バクテリアは、マイコプラズマ属、アケロプラズマ属、ウレアプラズマ属、ファイトプラズマ属およびスピロプラズマ属からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の一つの実施態様は、シトシンベースの抗癌剤がシタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビンからなる群より選択される組合せに関する。
【００３５】
本発明の一つの実施態様は、プリンベースの抗癌剤が、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシド（6-メチルプリン-β-D-リボシドまたは6-メチルプリン-アルファ-D-リボシド）およびフルダラビンから選択される組合せに関する。
【００３６】
本発明の一つの実施態様は、治療薬（b）がウラシル誘導体、その溶媒和物または医薬的に許容される塩であり、該ウラシル誘導体が構造式（I）で表される組合せに関する：
【化１】
2011520845.tif 000002
［式中、
R1はクロロ、ブロモ、ヨード、シアノまたはC1-4アルキルから選択され；
R2は、1、2または3窒素原子を有する4〜8員の複素環式基であり、C1-4アルキル、イミノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、メタンスルホニルオキシ、アミノおよびニトロからなる群より選択される1以上の置換基で任意に置換されていてもよい；あるいは
R2はアミジノチオ基であり、該アミジノチオ基の窒素原子はそれぞれ独立してC1-4アルキルで置換されていてもよい；あるいは
R2はグアニジノ基であり、該グアニジノ基の窒素原子はそれぞれ独立してC1-4アルキルまたはシアノで置換されていてもよい；あるいは
R2はC1-4アルキルアミジノである；あるいは
R2はアミノ、モノC1-4アルキルアミノまたはジC1-4アルキルアミノである；あるいは
R2は構造式-CH2N(Ra) Rbを有する基（ここで、RaおよびRbは独立して、水素もしくはC1-4アルキルであるか、またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素原子と共にピロリジン環を形成していてもよい）；あるいは
R2は構造式-NH-(CH2)m-Zの基である（ここで、Zはシアノ、アミノ、モノC1-4アルキルアミノまたはジC1-4アルキルアミノであり、mは0〜3の整数である）；あるいは
R2は構造式NRc(CH2)n-OHの基である（ここで、Rcは水素またはC1-4アルキルであり、nは1〜4の整数である）；あるいは
R2は構造式-X-Yの基である（ここで、XはSまたはNHであり、Yは2-イミダゾリン-2-イル、2-イミダゾリル、1-メチルイミダゾール-2-イル、1,2,4-トリアゾール-3-イル、2-ピリミジルおよび2-ベンズイミダゾリル基からなる群より選択される）；あるいは
R2はウレイドまたはチオウレイド基であり、該ウレイドまたはチオウレイド基の窒素原子は、それぞれ独立して、C1-4アルキルで置換されていてもよい）］。
【００３７】
本発明の一つの実施態様は、上記の構造式（I）において、R2が2-イミノピロリジン-1-イル、1-アゼチジニル、1-ピロリジニル、2-ピロリン-1-イル、3-ピロリン-1-イル、1-ピロリル、1-ピラゾリジニル、2-ピラゾリン-1-イル、3-ピラゾリン-1-イル、4-ピラゾリン-1-イル、1-ピラゾリル、1-イミダゾリジニル、2-イミダゾリン-1-イル、3-イミダゾリン-1-イル、4-イミダゾリン-1-イル、1-イミダゾリル、1,2,3-トリアゾール-1-イル、1,2,4-トリアゾール-1-イル、ピペリジノ、1-ピペラジル、モルホリノ、1-ペルヒドロアゼピニル、1-ペルヒドロアゾシニル、アミジノチオ、N-メチルアミジノチオ、N,N'-ジメチルアミジノチオ、1-グアニジノ、1-メチルグアニジノ、3-メチルグアニジノ、2,3-ジメチルグアニジノ、2-シアノ-3-メチルグアニジノ、アセトアミジノ、N-メチルアミノ、N,N-ジメチルアミノ、N-エチルアミノ、N,N-ジエチルアミノ、N-プロピルアミノ、N-イソプロピルアミノ、N-メチルアミノメチル、N,N-ジメチルアミノメチル、1-ピロリジニルメチル、N,N-ジメチルヒドラジノ、N-(2-アミノエチル)アミノ、N-(2-(N,N-ジメチル)アミノエチル)アミノ、N-(3-アミノプロピル)アミノ、N-(2-シアノエチル)アミノ、N-(2-ヒドロキシエチル)-N-メチルアミノ、N-(3-ヒドロキシプロピル)アミノ、N-(4-ヒドロキシブチル)アミノ、2-イミダゾリン-2-チオ、2-イミダゾリン-2-アミノ、イミダゾール-2-チオ、1-メチルイミダゾール-2-チオ、1,2,4-トリアゾール-3-チオ、ピリミジン-2-チオ、ベンズイミダゾール-2-チオおよび3-メチルチオウレイドからなる群より選択される組合せに関する。好ましくは、R2は2-イミノピロリジン-1-イルである。
【００３８】
本発明の一つの実施態様は、上記の構造式（I）において、R1がブロモ、シアノまたはメチルである組合せに関する。
【００３９】
好ましくは、上記のウラシル誘導体、その溶媒和物または医薬的に許容される塩は5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される。
好ましくは、該ウラシル誘導体は5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシルまたは6-イミダゾリルメチル-5-クロロウラシルである。
より好ましくは、該ウラシル誘導体は5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩である。
【００４０】
本発明の一つの実施態様は、上記の治療薬（b）がチミジンホスホリラーゼ阻害剤からなる群より選択され、シトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）と該治療薬（b）とのモル比が25：１〜0.01：１の範囲にある組合せに関する。
【００４１】
本発明の一つの実施態様は、該シトシンベースの抗癌剤がシタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビンからなる群より選択され、チミジンホスホリラーゼ阻害剤が5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される組合せに関する。
【００４２】
好ましくは、該シトシンベースの抗癌剤は、シタラビン、ゲムシタビンおよびトロキサシタビンからなる群より選択され、チミジンホスホリラーゼ阻害剤は5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、）5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される。
【００４３】
好ましくは、シトシンベースの抗癌剤はシタラビンまたはゲムシタビンであり、チミジンホスホリラーゼ阻害剤は5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される。
【００４４】
本発明の一つの実施態様は、プリンベースの抗癌剤が6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシド（6-メチルプリン-ベータ-D-リボシドまたは6-メチルプリン-アルファ-D-リボシド）およびフルダラビンから選択され、チミジンホスホリラーゼ阻害剤が5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノ-イミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される組合せに関する。
【００４５】
好ましくは、プリンベースの抗癌剤は、アザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンから選択され、チミジンホスホリラーゼ阻害剤は、5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される。
【００４６】
好ましくは、プリンベースの抗癌剤は、アザチオプリン、ネララビン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンから選択され、チミジンホスホリラーゼ阻害剤は、5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩、6-イミダゾリルメチル-5-フルオロウラシル、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される。
【００４７】
本発明の一つの実施態様は、5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩と、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、ネララビン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンからなる群より選択されるシトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）とを含む組合せに関する。
【００４８】
モリクテスに対する抗生物質は、
（i）マクロライド系抗生物質類（より具体的にはエリスロマイシン、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシン）、
（ii）テトラサイクリン類（より具体的にはドキシサイクリンまたはミノサイクリン）、および
（iii）フルオロキノロン類（より具体的にはシプロフロキサシンまたはレボフロキサシン）
から選択され得る。
【００４９】
本発明のもう一つの実施態様では、抗生物質は、フィトプラズマ、ウレアプラズマ、エントモプラズマ、アネロプラズマ、スピロプラズマ、マイコプラズマ・マイコイデス、マイコプラズマ・ピルム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、アコレプラズマ・ライドラウィイ、マイコプラズマ・ペネトランス、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・ニューモニアエ、マイコプラズマ・オビニューモニアエ、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエまたはマイコプラズマ・ヒオリニスのうちの少なくとも一つに対して、活性（例えば、IC50＜100 μg/mL）を有する抗生物質から選択され得る。
【００５０】
本発明の一つの実施態様は、モリクテス・バクテリアに対する抗生物質がマイコプラズマ特異的抗生物質である組合せに関する。
【００５１】
好ましくは、モリクテス・バクテリアに対する該抗生物質は、プラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリンまたはミノサイクリンを含むテトラサイクリン類；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシンまたはレボフロキサシンを含む（フルオロ）キノロン類；アジスロマイシン、エリスロマイシンまたはクラリスロマイシンを含むマクロライド類；およびリンコマイシンからなる群より選択される。
【００５２】
本発明の一つの実施態様は、シトシンまたはプリンベースの抗癌剤とモリクテス・バクテリアに対する抗生物質とのモル比が、10：１〜0.01：１の範囲内にある組合せに関する。
【００５３】
本発明の一つの実施態様は、シトシンベースの抗癌剤が、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビンからなる群より選択され、モリクテス・バクテリアに対する抗生物質が、プラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリンまたはミノサイクリンを含むテトラサイクリン類；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシンまたはレボフロキサシンを含む（フルオロ）キノロン類；アジスロマイシン、エリスロマイシンまたはクラリスロマイシンを含むマクロライド類；およびリンコマイシンから選択される。
【００５４】
好ましくは、シトシンベースの抗癌剤は、シタラビン、ゲムシタビンまたはトロキサシタビンからなる群より選択され、かつモリクテス・バクテリア抗生物質は、プラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリン、ミノサイクリン；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン；アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン；およびリンコマイシンからなる群より選択される。
【００５５】
より好ましくは、シトシンベースの抗癌剤はシタラビンまたはゲムシタビンであり、かつモリクテス抗生物質はプラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリン、ミノサイクリン；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン；アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン；およびリンコマイシンからなる群から選択される。
【００５６】
本発明の一つの実施態様は、プリンベースの抗癌剤が6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシド（6-メチルプリン-ベータ-D-リボシドまたは6-メチルプリン-アルファ-D-リボシド）およびフルダラビンから選択され、かつモリクテス抗生物質がプラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリンまたはミノサイクリンを含むテトラサイクリン類；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシンまたはレボフロキサシンを含む（フルオロ）キノロン類；アジスロマイシン、エリスロマイシンまたはクラリスロマイシンを含むマクロライド類；およびリンコマイシンから選択される組合せに関する。
【００５７】
好ましくは、プリンベースの抗癌剤はアザチオプリン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンから選択され、かつモリクテス抗生物質はプラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリン、ミノサイクリン；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン；アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン；およびリンコマイシンからなる群より選択される。
【００５８】
好ましくは、プリンベースの抗癌剤はアザチオプリン、ネララビン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンから選択され、かつモリクテス抗生物質はプラスモシン；ヘルビコリンA；ドキシサイクリン、ミノサイクリン；シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン；アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン；およびリンコマイシンからなる群より選択される。
【００５９】
本発明の実施態様は、プラスモシンと、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、サパシタビン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、ネララビン、2-クロロアデニン、2-フルオロアデニン、2',2'-ジフルオログアノシン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）、クロファラビン、クラドリビン、6-メチルプリンリボシドおよびフルダラビンからなる群より選択される、シトシンまたはプリンベースの抗癌剤（a）とを含む組合せに関する。
【００６０】
本発明のさらなるもう一つの態様は、医薬組成物の形態にある治療有効量の上記で定義された治療薬の組合せを１以上の医薬的に許容される担体と共に、それを必要とする動物（より具体的には哺乳動物またはヒト）に供給および/または投与することを含む、該動物の癌の予防または治療のための方法に関する。
【００６１】
この方法の具体的な実施態様では、抗癌剤（a）および阻害剤または抗生物質（b）は、動物に同時に投与される。
【００６２】
この方法のもう一つの具体的な実施態様では、抗癌剤（a）および阻害剤または抗生物質（b）は、動物に連続して投与される。好ましくは、阻害剤または抗生物質（b）は、抗癌剤（a）の相当期間前に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１Aは、MCF-7およびMCF-7/HYORの細胞抽出物中のM.ヒオリニスに対するPCR分析を示す写真を表す。レーン１はテンプレート非添加コントロールを示す；レーン２は未感染のMCF-7抽出物を示す；レーン３は感染したMCF-7/HYOR抽出物を示す。  図１Bは、コントロールのMCF-7（a）、MCF-7/HYOR（b）、および10 μM TPiで処理したMCF-7/HYOR細胞（c）における、Hoechst 33342を用いたDNA染色を表す写真を示す。矢印は、核酸に富んだ粒子が細胞質中に存在することを示す。
【図２】図２は、ヒトTPに対してポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析を示す。ヒトTP遺伝子でトランスフェクトしたMCF-7の細胞溶出物中で55kDaのバンドが検出できた。MCF-7またはマイコプラズマに感染したMCF-7/HYOR細胞の細胞抽出物中でヒトTPは検出されなかった。
【図３】図３は、M.ヒオリニスに感染したMCF-7細胞培養液の上清によるdThdのチミンへの変換の経時変化を示すグラフを表す。MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞の培地を、200 μM dThdと共に37℃でインキュベートした。  異なった時点でアリコートを回収し、dThdのチミンへの変換をHPLC分析で定量した。ポジティブコントロールとして、0.025 Uの組換えE.コリTPを用いた。  あるアッセイでは、MCF-7/HYOR細胞の培地を0.1 μmシリンジフィルターを通して濾過した。MCF-7/HYOR細胞とは対照的に、MCF-7細胞の培地、TPi処理したMCF-7/HYOR細胞培養液または濾過したMCF-7/HYOR細胞の培地では、dThdの変換は観察されなかった。値は３回の別々の実験の平均±S.E.M.を表す。
【図４】図４は、10 μM TPi添加または非添加時の、dThd、チミン、2'-デオキシウリジンおよびフルオロピリミジンヌクレオシド類似体の核酸への結合を示すグラフを表す。  MCF-7およびMCF7-HYOR細胞を1 μCiの放射能標識化合物と共に一晩インキュベートした。翌日、核酸に結合した放射能標識化合物量を測定した。値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。*コントロールのMCF-7細胞に比べて、p＜0.01。
【図５】図５は、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞内のゲムシタビン代謝産物分布の比較を示すグラフである。MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞を1 μCiの放射能標識ゲムシタビン（dFdC）と共に24時間インキュベートした。異なった代謝産物の分布は、HPLC分析により決定した。dFdCMP：ゲムシタビンモノホスフェート；dFdCDP：ゲムシタビンジホスフェート；dFdCTP：ゲムシタビントリホスフェート。
【００６４】
本発明をさらに詳細に記述する。
【００６５】
以下では、本発明の異なる観点がより詳細に定義される。これまでに定義されたそれぞれの観点は、反対であることが明確に示されない限り、他の如何なる観点とも組み合わされ得る。特に、好ましいとか、有利であると示された如何なる特徴も、好ましいとか、有利であると示された如何なる特徴とも組み合わされ得る。
【００６６】
本発明を記述する際、使用される用語は、前後の文脈で他の意味を指さない限り、次の定義に従って解釈されるものとする。
【００６７】
略語：  BrdUrd：5-ブロモ-2'-デオキシウリジン；
CldUrd：5-クロロ-2'-デオキシウリジン；
5'DFUR：5-フルオロ-5'-デオキシウリジン；
DPD：ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ；
dThd：チミジン；
dUrd：2'-デオキシウリジン；
FdUMP：5-フルオロ-2'-デオキシウリジン-5'-モノホスフェート；
FdUrd：5-フルオロ-2'-デオキシウリジン；
5FU：5-フルオロウラシル；
IC50：50%阻害濃度；
IdUrd：5-ヨード-2'-デオキシウリジン；
MCF-7/HYOR：M.ヒオリニス感染MCF-7細胞；
PD-ECGF：血小板由来内皮細胞成長因子；
TFT：5-トリフルオロチミジン；
Thy：チミン；
TK：チミジンキナーゼ；
TP：チミジンホスホリラーゼ；
TPI：チミジンホスホリラーゼ阻害剤；
TPi：5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩；
TS：チミジンシンターゼ；
Ura：ウラシル。
【００６８】
本文中で用いられる用語「ヌクレオシドベースの抗癌剤」は、プリンまたはピリミジン構造を含み、ヌクレオシド、ヌクレオチド、DNAまたはRNAの合成、修復または細胞増殖に必要な変化を阻害する抗癌剤（現時点においてヒトへの使用を公式に認可されているか否かに拘らず、抗癌作用を有する物質）を指す。それらはプリンまたはピリミジンベースの抗癌剤に分類することができる。
【００６９】
本文中で用いられる用語「シトシンベースの抗癌剤」は、任意に置換された4-アミノピリミジン-2-オン構造を含み、ヌクレオシド、ヌクレオチド、DNAまたはRNAの合成、修復または細胞増殖に必要な変化を阻害する抗癌剤を指す。好ましくは、該シトシンベースの抗癌剤は、シチジン立体異性体、ハロゲン化されたシチジン、ハロゲン化されたデオキシシチジン、それらのシアノ誘導体、それらのアルキルカルボニル誘導体などのようなシチジン誘導体である。好ましいシトシンベースの抗癌剤の非限定的な例は、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビンまたはサパシタビンを含む。
【００７０】
本文中で用いられる用語「プリンベースの抗癌剤」は、アザチオプリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、2,2-ジフルオロデオキシグアノシン、2-クロロアデニンおよび2-フルオロアデニンなどのような、プリン構造を含み、ヌクレオシド、ヌクレオチド、DNAまたはRNAの合成、修復または細胞増殖に必要な変化を阻害する抗癌剤を指す。
【００７１】
本文中で用いられる用語「ヌクレオシド代謝酵素の阻害剤」は、ヌクレオシドの分解を担う酵素を阻害する化合物または薬剤（現時点でヒトへの使用を公式に認可されているか否かを問わない）を指す。
【００７２】
本文中で用いられる用語「モリクテス・バクテリアに対する抗生物質」は、少なくとも１つのモリクテス・バクテリア（例えばマイコプラズマ属細菌の１種）に対して100 μg/mLを下回るMICを有する抗生物質（現時点でヒトへの使用を公式に認可されているか否かに拘らない抗細菌性物質）を指す。
【００７３】
１つの基または基の一部としての用語「C1-4アルキル」は、式CnH2n+1（ここで、nは1〜4の数である）の炭化水素基を指す。概して、本発明のアルキル基は、1〜4の炭素原子、好ましくは1〜3の炭素原子、より好ましくは1〜2の炭素原子を含む。アルキル基は直鎖または分子鎖状でもよく、本文中で示されるように置換されていてもよい。したがって、C1-4アルキルは例えばメチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、2-メチルエチル、ブチルおよびその異性体（例えばn-ブチル、i-ブチルおよびtert-ブチル）などを含む。
【００７４】
１つの基または基の一部としての、用語「アミジノチオ」は、式：
【化２】
2011520845.tif 000003
［式中、Rd、ReおよびRgは、それぞれ独立して水素またはC1-4アルキルから選択される］
の基を指す。
【００７５】
１つの基または基の一部としての、用語「グアニジノ」は、式：
【化３】
2011520845.tif 000004
［式中、Rd、Re、RgおよびRhは、それぞれ独立して水素またはC1-4アルキルから選択される］
の基を指す。
【００７６】
１つの基または基の一部としての、用語「イミノ」は=NH基を指す。
【００７７】
１つの基または基の一部としての、用語「C1-4アルキルアミジノ」は、式：
【化４】
2011520845.tif 000005
［式中、Rd、ReおよびRgは、それぞれ独立して水素またはC1-4アルキルから選択され、Rd、ReまたはRgのうちの少なくとも１つは、ここで定義されたC1-4アルキルである］
の基を指す。
【００７８】
１つの基または基の一部としての用語「モノまたはジC1-6アルキルアミノ」は、式：
N(Rd)Re
［式中、RdおよびReは、それぞれ独立して水素原子またはC1-4アルキルから選択され、RdまたはReのうち少なくとも１つは、ここで定義されたC1-4アルキルである］
の基を指す。
【００７９】
１つの基または基の一部としての用語「ウレイド」は、式：
NRh -CO-N(Rd)Re
［式中、Rd、ReおよびRhは、それぞれ独立して水素原子またはC1-4アルキルから選択される］
の基を指す。
【００８０】
１つの基または基の一部としての用語「チオウレイド」は、式：
NRh -CS-N(Rd)Re
［式中、Rd、ReおよびRhは、それぞれ独立して水素原子またはC1-4アルキルから選択される］
の基を指す。
【００８１】
本明細書および付随の特許請求の範囲の中で用いられる限りにおいては、単数形の「a」、「an」および「the」は、前後の文脈で明確に他の意味を指定しない限り、複数の指示対象も含む。例として、「シトシンベースの抗癌剤」は、「１つのシトシンベースの抗癌剤または２以上のシトシンベースの抗癌剤」を意味する。すなわち、それは「少なくとも１つのシトシンベースの抗癌剤」を指す。
【００８２】
上記の用語および明細書で使用される他の用語は、当業者によく知られている。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
以下は、本発明の実施態様である。
【００８４】
ある実施態様では、本発明は、少なくとも１つの
（a）ヌクレオシドベースの抗癌剤ならびに
（b）ヌクレオシド代謝酵素阻害剤およびモリクテス・バクテリアに対する抗生物質から選択される物質を含む治療薬の組合せを提供する。
【００８５】
本発明は、活性成分として上記で定義された治療薬の組合せと共に、１以上の医薬的に許容される担体もしくは賦形剤を含むまたはからなる医薬組成物も提供する。
【００８６】
本発明は、医薬組成物の形態にある有効量の上記で定義された治療薬の組合せを、１以上の医薬的に許容される任意の担体と共に、それを必要とする動物（より具体的には哺乳動物またはヒト）に供給および/または投与することからなる、癌の予防または治療のための方法も提供する。
【００８７】
この方法の具体的な実施態様では、抗癌剤（a）および阻害剤または抗生物質（b）が動物に同時に投与される。この方法の別の具体的な実施態様では、抗癌剤（a）および阻害剤または抗生物質（b）が動物に連続的に投与され、好ましくは阻害剤または抗生物質（b）は抗癌剤（a）の相当期間前に投与される。
【００８８】
本発明における治療薬の組合せおよび医薬組成物は、カペシタビン、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン（5'-DFUR）またはフトラフールの場合のように、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはデアミナーゼのような哺乳動物（例えばヒト）の細胞酵素を活性化するのに必要とするヌクレオシドベースの抗癌剤（a）を含まない。
【００８９】
本発明の異なった観点での具体的な実施態様では、医薬組成物は、癌（腫瘍形成、成長および/または転移を含む）の治療または予防のために、同時に、別々にまたは連続して使用される組合せ製剤である。
【００９０】
本発明の異なった観点でのもう一つの具体的な実施態様では、ヌクレオシドベース抗癌剤（a）は、
（i）ピリミジンベースの抗癌剤（すなわち、5-フルオロウラシルおよびシトシンのようなピリミジン構造部分を含む）および
（ii）プリンベースの抗癌剤（すなわち、アザチオプリン、2-クロロアデニンおよび2-フルオロアデニンなどのように、プリン構造部分を含む）
から選択され得る。
【００９１】
より具体的な実施態様では、本発明で有用なプリンベースの抗癌剤（a）は、（置換もしくは非置換の6-アミノプリン構造を含む）アデニン誘導体、および（置換もしくは非置換の2-アミノプリン-6-オン構造を含む）グアニン誘導体から選択され得る。
【００９２】
さらに具体的な実施態様では、プリンベースの抗癌剤（a）は、メルカプトプリン（6MP）、チオグアニン（6TG）、アザチオプリン、フルダラビン、クラドリビン、クロファラビン、9-β-D-アラビノシルグアニン（araG）および2',2'-ジフルオログアノシン（dFdG）から選択され得る。
【００９３】
もう一つのより具体的な実施態様では、本発明で有用なピリミジンベースの抗癌剤（a）は、（置換もしくは非置換の5-メチルピリミジン-2,4-ジオン構造を含む）チミン誘導体、（置換もしくは非置換の4-アミノピリミジン-2-オン構造を含む）シトシン誘導体、および（置換もしくは非置換のピリミジン-2,4-ジオン構造を含む）ウラシル誘導体から選択され得る。
【００９４】
もう一つのより具体的な実施態様では、本発明で有用なピリミジンベースの抗癌剤（a）は、シタラビン（araC）、ゲムシタビン（dFdC）、5-フルオロウラシル（FU）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（5FdUrd）および5-トリフルオロチミジン（TFT）から選択され得る。
【００９５】
本発明の観点でのもう一つの実施態様では、ヌクレオシド代謝酵素阻害剤（b）は、
（i）TP阻害剤（以下TPI）およびウリジンホスホリラーゼ（UP）阻害剤のようなピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；
（ii）ヌクレオチダーゼ阻害剤（より具体的には、(S)-1[2'-デオキシ -3',5'-O-(1-ホスホノ)ベンジリデン-ベータ-d-スレオ-ペントフラノシル]チミン（DPB-T）、(+/-)-1-トランス-(2-ホスホノメトキシシクロペンチル)ウラシル（PMcP-U）、バニリン酸、ケルセチン、ヘパリン、コンドロイチンスルフェートなどから選択される）；
（iii）Ado-ホスホリラーゼ（AP）阻害剤のようなプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNPase）阻害剤（より具体的には、イムニリン-H（フォロデシン、BCX-1777、1-(9-デアザヒポキサンチン)-1,4-ジデオキシ-1,4-イミノ-D-リビトール）、DADMe-イムニリン-Hおよびそれらのアゼチジン類似体）のようなイムニリン類から選択される）；
から選択され得る。
【００９６】
本発明の観点でのもう一つの実施態様では、モリクテスに対する抗生物質（b）は、
（i）マクロライド系抗生物質類（より具体的にはエリスロマイシン、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシン）、
（ii）テトラサイクリン類（より具体的にはドキシサイクリンまたはミノサイクリン）、および
（iii）フルオロキノロン類（より具体的にはシプロフロキサシンまたはレボフロキサシン）
から選択され得る。
【００９７】
本発明の別の実施態様では、抗生物質（b）は、フィトプラズマ、ウレアプラズマ、エントモプラズマ、アネロプラズマ、スピロプラズマ、マイコプラズマ・マイコイデス、マイコプラズマ・ピルム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、アコレプラズマ・ライドラウィイ、マイコプラズマ・ペネトランス、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・ニューモニアエ、マイコプラズマ・オビニューモニアエ、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエまたはマイコプラズマ・ヒオリニスのうちの少なくとも１つに対して（例えば、IC50＜100 μg/mLで）活性を有する抗生物質から選択され得る。
【００９８】
本発明は：
（a）酵素（A）による不活性化に感受性のヌクレオシドベースの抗癌剤（ここで、該酵素（A）はモリクテス綱に属する細菌（B）により発現され、該酵素（A）はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびデアミナーゼからなる群より選択される）および
（b）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ヌクレオチダーゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、デアミナーゼ阻害剤および該細菌（B）に対する抗生物質からなる群より選択される治療薬
を含み、該細菌（B）に感染した哺乳動物の癌の治療に使用するための、治療薬の組合せにも関する。
【００９９】
ただし、（カペシタビン、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン（5'-DFUR）またはフトラフールなどの）該ヌクレオシドベース抗癌剤（a）は、哺乳動物の酵素（A）のホモログによる活性化を必要としないか、または具体的な実施態様によれば、ヒトチミジンホスホリラーゼを活性化に必要としない。
【０１００】
本発明は：
（a）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびデアミナーゼからなる群より選択される酵素（A）による不活性化に感受性のヌクレオシドベースの抗癌剤、および
（b）モリクテス綱に属する細菌（B）に対する抗生物質
を含む治療薬の組合せにも関する。
【０１０１】
後者の組合せは、該細菌（B）に感染した哺乳動物の癌治療に有用である。
【０１０２】
上記の治療薬の組合せの重要な観点によれば、治療されるべき癌は、該酵素（A）を発現しない腫瘍を含む癌であり得る。
【０１０３】
本発明による上記の治療薬の組合せの重要な観点は、１以上の次の特徴を含む。
【０１０４】
‐ヌクレオシドベースの抗癌剤（a）が、トロキサシタビン、サパシタビン、5-フルオロウラシル、5-トリフルオロチミジン、5-フルオロ-dUrd、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、クロファラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、フルダラビンおよび5-ハロゲノ-dUrd誘導体からなる群より選択される治療薬の組合せ；
【０１０５】
‐治療薬（b）がチミジンホスホリラーゼ阻害剤である治療薬の組合せ；
【０１０６】
‐治療薬（b）が5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩である治療薬の組合せ；
【０１０７】
‐治療薬（b）が5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩以外のウラシル誘導体、溶媒和物またはその医薬的に許容される塩である治療薬の組合せ。
【０１０８】
上記のウラシル誘導体は、構造式（I）：
【化５】
2011520845.tif 000006
［式中、
R1は塩素、臭素、ヨウ素、シアノまたはC1-4アルキルであり；
R2は、C1-4アルキル、イミノ、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、メタンスルホニルオキシ、アミノおよびニトロからなる群より独立して選択される1以上の置換基で置換されていてもよい、1、2もしくは3の窒素原子を有する4〜8員の複素環式基であるか；または
R2はアミジノチオ基であり、その窒素原子はそれぞれ独立して、C1-4アルキルで置換されていてもよい；または
R2はグアニジノ基であり、その窒素原子はそれぞれ独立して、C1-4アルキルまたはシアノにより置換されていてもよい；または
R2はC1-4アルキルアミジノである；または
R2はアミノ、モノC1-4アルキルアミノもしくはジC1-4アルキルアミノである；または
R2は構造式-CH2N(Ra) Rbの基である（ここで、RaおよびRbは独立して、水素もしくはC1-4アルキルであるか、またはRaおよびRbはそれらが結合している窒素原子と共にピロリジン環を形成していてもよい）；または
R2は構造式-NH-(CH2)m-Zの基である（ここで、Zはシアノ、アミノ、モノC1-4アルキルアミノもしくはジC1-4アルキルアミノであり、mは0〜3の整数である）；または
R2は構造式NRc(CH2)n-OHである（ここで、Rcは水素またはC1-4アルキルであり、nは1〜4の整数である）；または
R2は構造式-X-Yの基である（ここで、XはSまたはNHであり、Yは2-イミダゾリン-2-イル、2-イミダゾリル、1-メチルイミダゾール-2-イル、1,2,4-トリアゾール-3-イル、2-ピリミジルおよび2-ベンズイミダゾリル基からなる群より選択される）；または
R2はウレイドもしくはチオウレイド基であり、その窒素原子はそれぞれ独立して、C1-4アルキルで置換されていてもよい）］
で表される。
【０１０９】
‐上記の構造式（I）において、R2が1-アゼチジニル、1-ピロリジニル、2-ピロリン-1-イル、3-ピロリン-1-イル、1-ピロリル、1-ピラゾリジニル、2-ピラゾリン-1-イル、3-ピラゾリン-1-イル、4-ピラゾリン-1-イル、1-ピラゾリル、1-イミダゾリジニル、2-イミダゾリン-1-イル、3-イミダゾリン-1-イル、4-イミダゾリン-1-イル、1-イミダゾリル、1,2,3-トリアゾール-1-イル、1,2,4-トリアゾール-1-イル、ピペリジニル、1-ピペラジル、モルホリノ、1-ペルヒドロアゼピニル、1-ペルヒドロアゾシニル、アミジノチオ、N-メチルアミジノチオ、N,N'-ジメチルアミジノチオ、1-グアニジノ、1-メチルグアニジノ、3-メチルグアニジノ、2,3-ジメチルグアニジノ、2-シアノ-3-メチルグアニジノ、アセトアミジノ、N-メチルアミノ、N,N-ジメチルアミノ、N-エチルアミノ、N,N-ジエチルアミノ、N-プロピルアミノ、N-イソプロピルアミノ、N-メチルアミノメチル、N,N-ジメチルアミノメチル、1-ピロリジニルメチル、N,N-ジメチルヒドラジノ、N-(2-アミノエチル)アミノ、N-(2-(N,N-ジメチル)アミノエチル)アミノ、N-(3-アミノプロピル)アミノ、N-(2-シアノエチル)アミノ、N-(2-ヒドロキシエチル)-N-メチルアミノ、N-(3-ヒドロキシプロピル)アミノ、N-(4-ヒドロキシブチル)アミノ、2-イミダゾリン-2-チオ、2-イミダゾリン-2-アミノ、イミダゾール-2-チオ、1-メチルイミダゾール-2-チオ、1,2,4-トリアゾール-3-チオ、ピリミジン-2-チオ、ベンズイミダゾール-2-チオおよび3-メチルチオウレイドからなる群より選択される治療薬の組合せ；
【０１１０】
‐上記の構造式（I）において、R1がブロモ、シアノまたはメチルである治療薬の組合せ；
【０１１１】
‐上記の構造式（I）において定義された前記のウラシル誘導体、溶媒和物またはそれらの医薬的に許容される塩が、5-クロロ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-ピロリジニルメチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-アゼチジニルメチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル塩酸塩、5-シアノ-6-(1-(2-イミノピロリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-ブロモ-6-(1-(2-イミノイミダゾリジニル)メチル)ウラシル、5-クロロ-6-(1-イミダゾリルメチル)ウラシル塩酸塩、2-(5-クロロウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩、2-(5-シアノウラシル-6-イルメチル)イソチオウレア塩酸塩および5-クロロ-6-(1-グアニジノ)メチルウラシル塩酸塩からなる群より選択される治療薬の組合せ；
【０１１２】
‐前記の治療薬（b）が、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ヌクレオチダーゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤およびデアミナーゼ阻害剤からなる群より選択され、ヌクレオシドベースの抗癌剤（a）と該治療薬（b）とのモル比が約25：１〜0.01：１、例えば約20：１〜0.1：１、例えば約20：１〜４：１の範囲である治療薬の組合せ；
【０１１３】
‐前記の細菌（B）がマイコプラズマ属、アケロプラズマ属、ウレアプラズマ属、フィトプラズマ属およびスピロプラズマ属からなる群より選択される治療薬の組合せ；
【０１１４】
‐該細菌（B）に対する抗生物質が、マイコプラズマ特異的抗生物質である治療薬の組合せ；
【０１１５】
‐細菌（B）に対する該抗生物質が、プラスモシン、ヘルビコリンA、テトラサイクリン類（例えば、ドキシサイクリンまたはミノサイクリン）、（フルオロ）キノロン類（例えば、シプロフロキサシン、エンロフロキサシンまたはレボフロキサシン）；マクロライド類（例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシンまたはクラリスロマイシン）およびリンコマイシンからなる群より選択される治療薬の組合せ；
【０１１６】
‐5-トリフルオロチミジン、5-フルオロウラシル、5-フルオロ-dUrd、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、トロキサシタビン、サパシタビン、アザチオプリン、ネララビン、2',2'-ジフルオログアノシン、クロファラビン、クラドリビン、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、5-ハロゲノ-dUrd誘導体からなる群より選択される抗癌剤（a）とプラスモシンの組合せ；
【０１１７】
‐上記のヌクレオシドベースの抗癌剤（a）と細菌（B）に対する上記の抗生物質（b）とのモル比が、約10：１〜0.01：１、例えば約５：１〜0.1：１、例えば約５：１〜１：１の範囲である治療薬の組合せ；
【０１１８】
‐上記の治療薬（b）をヌクレオシドベースの抗癌剤（a）より先に、特に治療薬（b）をヌクレオシドベースの抗癌剤（a）より１〜５日、例えば１〜４日前に投与する、連続投与による治療に使用するための組合せ。
【０１１９】
本発明のもう一つの観点は：
（A）酵素がピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびデアミナーゼからなる群より選択される酵素-ネガティブな哺乳動物の腫瘍細胞系、および
（B）モリクテス綱に属する細菌
の共培養に関する。
【０１２０】
本発明の上記の共培養の重要な実施態様は、１以上の次の特徴を含む：
【０１２１】
‐上記の細菌（B）がピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびデアミナーゼからなる群より選択される酵素を発現させることができる共培養；
【０１２２】
‐上記の腫瘍細胞系（A）が肉腫、癌腫、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される共培養；
【０１２３】
‐上記の腫瘍細胞系（A）がMCF-7哺乳動物癌細胞系、PC3前立腺癌細胞系ならびに頭部および頚部側頭鱗癌細胞系からなる群より選択される共培養；
【０１２４】
‐前記の細菌（B）がマイコプラズマ属、アケロプラズマ属、ウレアプラズマ属、フィトプラズマ属およびスピロプラズマ属からなる群より選択される共培養；
【０１２５】
‐上記の腫瘍細胞系（A）がMCF-7哺乳動物癌腫細胞系であり、細菌（B）がマイコプラズマ・ヒオリニスである共培養；
【０１２６】
‐抗腫瘍薬剤のスクリーニング手段として用いられる共培養（特に、該薬剤は、
（a）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオチダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびデアミナーゼからなる群より選択される酵素による不活性化に感受性のヌクレオシドベースの抗癌剤、および
（b）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ヌクレオチダーゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、デアミナーゼ阻害剤、および該酵素を発現し、かつモリクテス綱に属する細菌（B）に対する抗生物質からなる群より選択される治療薬
を含む組合せである）。
【０１２７】
ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、癌の治療において化学療法剤として広く用いられている。数種の癌が、たくさんのヌクレオシド代謝酵素を含むマイコプラズマ属（すなわち、マイコプラズマ・ヒオリニス）を含むことが報告されている。
【０１２８】
5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FdUrd）、5-トリフルオロチミジン（TFT）および5位をハロゲン化2'-デオキシウリジンのような、ピリミジンヌクレオシド類似体は、チミジンホスホリラーゼ（TP）によりそれらの不活性塩基に分解され得る。
【０１２９】
我々は、マイコプラズマに感染したMCF-7乳癌腫細胞（MCF-7/HYOR）において、マイコプラズマのコードするヌクレオシド代謝酵素が抗癌性化合物の細胞増殖抑制活性を大幅（20〜150倍）に減少させることを見出した。
【０１３０】
細胞増殖抑制活性の減少は、酵素阻害剤の存在下で十分に回復させることができた。この観察結果は、感染していないMCF-7細胞と比較して、MCF-7/HYOR細胞において活性代謝産物の形成（すなわち、FdUrdに対するFdUMP）が著しく減少したこと、または薬剤の（すなわちTFTおよび5-ブロモ-2'-デオキシウリジンの）核酸への結合が減少したことに合致している。抗代謝産物形成は阻害剤の存在下で十分に回復される。
【０１３１】
対照的に、カペシタビンの中間代謝産物5-フルオロ-5'-デオキシウリジン（5'DFUR）は、MCF-7/HYOR細胞において、マイコプラズマのコードする酵素によるこのプロドラッグの活性化により、感染していない細胞より顕著に細胞増殖を抑制した。
【０１３２】
したがって、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤（カペシタビンおよびフトラフールおよび5'DFUR抗癌治療を除く）が、マイコプラズマのヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素阻害剤または抗マイコプラズマ抗生物質と組合さった、複合的癌治療における使用を提供する。
【０１３３】
本発明は、マイコプラズマの感染がフルオロピリミジン類似体のような数種の抗癌剤の細胞増殖抑制作用に強く影響を及ぼすことを明確に示す。その結果は、マイコプラズマのコードする酵素が細胞増殖抑制性ヌクレオシド代謝産物の腫瘍細胞への蓄積を有意に減少させ、これらの化合物の細胞増殖抑制活性を著しく下方調節していることを明らかにする。
【０１３４】
抗癌ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体と共に、特定のマイコプラズマ酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質を投与することで、マイコプラズマ感染細胞培養組織の細胞増殖抑制活性を十分に回復することができる（Bronckaersら、2008; 76:188-197; Liekensら、2009; Lancet Oncol. in press）。
【０１３５】
本発明は、少なくとも
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、ならびに
（b）マイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質から選択される薬剤
を含む製品にも関連する。
【０１３６】
本発明は、少なくとも
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベース抗癌剤ならびに
（b）（i）マイコプラズマヌクレオシドまたはヌクレオチド代謝タンパク質の阻害剤および
（ii）マイコプラズマ抗生物質
から選択される薬剤
を含む製品にも関連する。
【０１３７】
本発明は、医薬的に許容される担体、および活性成分として上記の製品を含む医薬組成物にも関連する。該医薬組成物は、癌（腫瘍の形成、成長および転移を含む）の治療または予防用に同時に、別々にまたは連続して使用される組合せ製剤として提供され得る。
【０１３８】
一つの実施態様において、医薬組成物は、少なくとも
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、および
（b）マイコプラズマヌクレオシド代謝酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質から選択される薬剤
を癌治療に同時に、別々にまたは連続して使用される組合せ製剤としてを含む。
【０１３９】
ただし、ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤は、カペシタビンまたはフトラフールのようなヒト細胞酵素の活性化を必要とする抗癌剤ではない。また、マイコプラズマヌクレオシド代謝酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質から選択される薬剤がTPIであるとき、ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤はTFTではない。
好ましくは、医薬組成物は
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、および
（b）マイコプラズマ抗生物質
を含む。
【０１４０】
本発明は、有効な量の医薬組成物の製品を動物（より特に哺乳動物またはヒト）に提供および投与することを含む、該動物の癌の予防または治療のための方法にも関する。
【０１４１】
本発明は、医薬的に許容される担体ならびに活性成分として、
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベース抗癌剤および
（b）マイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質から選択される薬剤
を含む医薬組成物の有効量を動物（より具体的には哺乳動物またはヒト）に供給および/または投与することからなる、該動物の癌の予防または治療のための方法にも関する。
【０１４２】
具体的な実施態様では、
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、および
（b）マイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素の阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質
は、動物に同時に投与される。
【０１４３】
もう一つの具体的な実施態様では、動物（より具体的には哺乳動物またはヒト）における癌の予防または治療の方法は、有効量の医薬組成物を該動物に提供することおよび投与することを含み、該医薬組成物は医薬的に許容される担体、ならびに活性成分としての、
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、および
（b）マイコプラズマ抗生物質
を含み、ここでマイコプラズマ抗生物質は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤の投与の少なくとも１日前、好ましくは３日前のような１〜５日前、または同時に投与される。
【０１４４】
本発明は、マイコプラズマ代謝酵素により分解される抗癌剤に対してのみ有用であり、（マイコプラズマもしくはヒト）代謝酵素によって分解されないか、または活性化すらされる抗癌剤では有用でないことから、本発明の物質および医薬組成物は、（例えば、ヒト）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベース代謝酵素の活性化を必要とする、カペシタビン、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン（5'DFUR）またはフトラフールのようなヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤を含まない。
【０１４５】
マイコプラズマヌクレオシドまたはヌクレオチド代謝タンパク質の阻害剤が、ヒトまたは哺乳動物のヌクレオシドまたはヌクレオチド代謝酵素ホモログの阻害剤としても活性である場合には、特にそうである。
【０１４６】
本発明は、
（a）ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤、および
（b）マイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素の阻害剤および/またはマイコプラズマ抗生物質から選択される薬剤
を、本発明の物質もしくは医薬組成物を製造するか、または癌の予防もしくは治療のための薬剤を製造するために使用することにも関する。
【０１４７】
TFTおよびTP阻害剤の組合せも組合せ治療として既に適用されているため、本発明の物質および医薬組成物は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤TFTと、マイコプラズマヌクレオシド代謝タンパク質の阻害剤、より具体的にはTPiとの組合せも含まない。
【０１４８】
TFTとTPiの組合せは、TFTがヒト代謝酵素により高度に代謝されるという事実に基づいている。マイコプラズマ代謝酵素がTFTまたは他の抗癌剤の失活に関与するという事実については言及されていない。
【０１４９】
本発明で用いられるヌクレオシドまたはヌクレオチドベースの抗癌剤は、
（i）ピリミジンベースの抗癌剤（5-フルオロウラシルのようなピリミジン構造を含む薬剤を意味する）、および
（ii）プリンベースの抗癌剤（アザチオプリンまたはアデニンのようなプリン構造を含む薬剤を意味する）
から選択され得る。
【０１５０】
プリンベースの抗癌剤は、アデニン誘導体（置換もしくは非置換の6-アミノプリン構造を含む）およびグアニン誘導体（置換もしくは非置換の2-アミノプリン-6-オン構造を含む）から選択される。
【０１５１】
プリンベースの抗癌剤の例は、メルカプトプリン（6MP）、チオグアニン（6TG）、アザチオプリン、フルダラビン、クラドリビンおよびクロファラビン、araGおよびdFdGから選択される。
【０１５２】
ピリミジンベースの抗癌剤は、チミン誘導体（置換もしくは非置換の5-メチルピリミジン-2,4-ジオン構造を含む）、シトシン誘導体（置換もしくは非置換の4-アミノピリミジン-2-オン構造を含む）、およびウラシル誘導体（置換もしくは非置換のピリミジン-2,4-ジオン構造を含む）から選択され得る。
【０１５３】
ピリミジンベースの抗癌剤の例は、シタラビン（araC）、ゲムシタビン（dFdC）、フルオロウラシル（FU）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（5FdUrd）、トリフルオロチミジン（TFT）、カペシタビン、5'DFURおよびフトラフールから選択される。
【０１５４】
本発明によれば、次の組合せが用いられ得る：
・5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩（以下、TPi）のようなTP阻害剤と、5-ハロゲノ-dUrdまたはaraCまたはゲムシタビンまたはクラドリビンまたはクロファラビン；
・イムシリンHのようなアデノシンホスホリラーゼ阻害剤またはPNPaseおよびクラドリビンまたはクロファラビン。
【０１５５】
マイコプラズマヌクレオシド代謝酵素の阻害剤は、
（i）チミジンホスホリラーゼ（TP）阻害剤（より具体的にはTPiから選択される）およびウリジンホスホリラーゼ（UP）阻害剤のようなピリミジンホスホリラーゼ阻害剤、
（ii）ヌクレオチダーゼ阻害剤（より具体的には、(S)-1[2'-デオキシ -3',5'-O-(1-ホスホノ)ベンジリデン-ベータ-d-スレオ-ペントフラノシル]チミン（DPB-T）、(+/-)-1-トランス-(2-ホスホノメトキシシクロペンチル)ウラシル（PMcP-U）、バニリン酸、ケルセチン、ヘパリン、コンドロイチンスルフェートから選択される）、および
（iii）Ado-ホスホリラーゼ阻害剤のようなプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNPase）阻害剤（より具体的にはイムシリン-H（フォロデシン、BCX-1777、1-(9-デアザヒポキサンチン)-1,4-ジデオキシ-1,4-イミノ-D-リビトール）、DADMe-イムシリン-Hおよびそれらのアゼチジン類似体のようなイムシリン類から選択される）
のような、公知の阻害剤またはそれらのタンパク質から選択され得る。
【０１５６】
マイコプラズマ抗生物質は、（マイコプラズマ・マイコイデス、M.ピルム、M.ペネトランス、M.フェルメンタンス、M.ニューモニアエおよびM.ヒオリニスのような）少なくとも１つのマイコプラズマ種に対して阻害または致死活性を有する抗菌性物質から再度選択され得る。
【０１５７】
その例は、
（i）マクロライド抗生物質類、より具体的にはアザリドマクロライド抗生物質類（より具体的にはエリスロマイシン、アジスロマイシンおよびクラリスロマイシン）、
（ii）テトラサイクリン類（より具体的にはドキシサイクリンおよびミノサイクリン）、
（iii）フルオロキノロン類（より具体的にはシプロフロキサシンおよびレボフロキサシン）
である。
【０１５８】
マイコプラズマ類は細胞壁を含まないため、マイコプラズマ抗生物質は、抗菌活性の作用機序が細胞壁に関する抗生物質からは選択されない。
【０１５９】
先行技術で公知の抗癌剤代謝機構のいくつかの例、および本発明の効果を、詳細に記述する。
【０１６０】
フルオロピリミジンである5-フルオロウラシル（5FU）は、乳、食道および結腸癌腫を含む様々な固形腫瘍に対してうまく用いられる。5FUは、主にDNA合成の速度制限をする酵素であるチミジンシンターゼ（TS）を阻害することにより、その抗腫瘍活性を誘導する。これには、5FUが、TSを阻害する5-フルオロ-2'-デオキシウリジン 5'-モノホスフェート（FdUMP）に変換されることを必要とする。しかしながら、［ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPD）により］急速に分解されること、および経口生体利用効率が乏しいことにより、5FUの臨床的効能は制限されている。
【０１６１】
したがって、経口5FUプロドラッグの開発に努力がなされてきた。ドキシフルリジン（5'-デオキシ-5-フルオロウリジン、5'DFUR）は、5FUに変換される１段階にチミジンホスホリラーゼ（TP）を必要とする5FUプロドラッグである。しかしながら、5'DFUR治療は、胃腸への毒性のため、投与量が制限されるという結果に終わった。
【０１６２】
カペシタビン（N4-ペンチロキシカルボニル-5'-デオキシ-5-フルオロシチジン、Xeloda（登録商標））は5FUを腫瘍へより選択的に運搬することにより、この毒性を回避することを指向したものである。
【０１６３】
カペシタビンは、３つの識別可能な段階を経て、5FUに変換される。まず、肝臓でカルボキシルエステラーゼにより5'-デオキシ-5-フルオロシチジンへ、その後シチジンデアミナーゼにより5'-デオキシ-5-フルオロウリジン（5'DFUR）へ、最後にTPにより5FUへと変換される。現在、カペシタビンは、転移性乳癌および結腸直腸癌の治療に用いられている。
【０１６４】
TPは、ピリミジンヌクレオシドサルベージ経路でカギとなる酵素であるだけではない；それは抗アポトーシス性血管由来因子である血小板由来内皮細胞成長因子と同一でもある。TPレベルの上昇は、いくつかの固形腫瘍で見られ、高率の血管新生、転移の増加および哀れな予後と相関がある。
【０１６５】
それにも拘わらず、高TPレベルは5FUプロドラッグに基づいた化学療法の効用を改善する。
【０１６６】
良好な治療結果にも拘らず、多くの患者は最終的に5FUに基づいた化学療法に耐性を獲得する。フルオロピリミジンヌクレオシドである5-トリフルオロチミジン（TFT）がこの耐性を回避することが証明された。
【０１６７】
TFTの細胞増殖抑制作用機構は、そのモノホスフェートとしてのTS阻害およびそのトリホスフェート代謝産物への変換後の薬剤のDNAへの結合に基づいている。しかしながら、TFTをその不活性型塩基へ変換するTPにより、TFTは急速に不活化される。
【０１６８】
したがって、TFTおよびTAS-102と呼ばれる強力な哺乳動物TP阻害剤［5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩（TPi）］を含む新規製剤が開発された。現在、TAS-102は、様々な固形腫瘍の治療のために、臨床試験フェーズＩで評価されている。従って、TPはフルオロピリミジンに基づいた化学療法で不明瞭な役割を有している。一方ではカペシタビンなどの5FUプロドラッグの抗腫瘍性を高め得るか、他方ではTFTなどのピリミジン-2'-デオキシウリジン誘導体を不活性化し得る。
【０１６９】
TP活性は腫瘍において上方制御されるだけではなく、マイコプラズマ・マイコイデスおよびM.ピルムのようないくつかのマイコプラズマ種によっても発現する。マイコプラズマ種は最小の自己複製可能な細菌であり、重要なヒト病原菌である。
【０１７０】
それらは深刻な呼吸器および尿生殖器疾患を引き起こし得る。しかしながら、多くの人々が明らかな臨床的症状を伴わずに、慢性的にマイコプラズマに感染していると考えられているため、多くのマイコプラズマ性疾患は未特定のままである。
【０１７１】
マイコプラズマ種と白血病との関連の可能性は、1960年代に既に示されていた（Haflick Lら、Nature 1965; 205:713-4; Cimolai N.ら、Can J Microbiol 2001; 47:691-7）。
【０１７２】
さらに、近年、高感度のPCR-ELISAを用いて、卵巣および子宮頚癌の組織からマイコプラズマ類が検出された（Kidder Mら、Gynecol Oncol 1998; 71:254-7; Chan PJら、Gynecol Oncol 1996; 63:258-60）。さらに、マイコプラズマ・ペネトランスとカポジ肉腫に関係があることが見出された。
【０１７３】
癌腫組織の免疫組織学的分析により、M.ヒオリニスの存在と胃および結腸癌との間に有意な相関があることが証明された。マイコプラズマ類が癌を引き起こすのか、それらの存在が癌による結果なのかどうかについては、未だ定かではない。
【０１７４】
したがって、癌におけるマイコプラズマの存在に焦点を当てた研究が数多くなされてきたが、マイコプラズマ類と癌腫との間に臨床上重要な原因となる関連は解明されていない。
【０１７５】
M.ペネトランスおよびM.フェルメンタンスによる慢性的なマイコプラズマ感染は、C3Hハツカネズミ胚細胞の染色体不安定性を誘導し、アポトーシスを妨害し、かつ32D造血細胞の悪性形質転換を引き起こした。ヌードマウスに注射すると、コントロール細胞では起こらなかった一方、これらの形質転換された32D細胞は迅速に腫瘍を形成した。
【０１７６】
M.フェルメンタンスの数株による感染は、ヒト末梢血液単核細胞培養組織の不死化を促進させた。マイコプラズマ・ヒオリニスは、インビトロで前立腺およびメラノーマ細胞系の侵襲性を増加させるタンパク質である、p37を発現することが見出された。このタンパク質は、前立腺癌細胞系PC-3およびDU145の遺伝子発現、成長および転移能も変化させた。最近のデータは、MMP-2の活性化および表皮成長因子受容体のリン酸化により、p37が癌細胞の侵襲性および転移を促進させることを示している。
【０１７７】
今日までに、抗マイコプラズマ剤またはマイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素を標的とする薬剤を用いた癌治療は確立されていない。
【０１７８】
我々の研究は、M.ヒオリニスなどのマイコプラズマ種が、FdUrdおよびTFTなど一定のヌクレオシド系薬剤の細胞増殖抑制活性を低下させるだけでなく、カペシタビンなどのTP依存性5FUプロドラッグの細胞増殖抑制活性を緩和することにも、このようにはるかに過小評価された有害な役割を果たしていることを明らかにした。
【０１７９】
さらに、我々は、特定のヒトTP阻害剤（例えばTPi）がこのマイコプラズマのコードする酵素を効率的に阻害でき、活性が改善されたピリミジンヌクレオシド類似体の代謝産物形成および付随して薬剤の細胞増殖抑制能を完全に回復させることを示した。
【０１８０】
TFTおよびTPiの組合せであるTAS-102は、現在様々な固形腫瘍の治療に関して臨床試験フェーズＩの対象である。この治療法は抗腫瘍性を向上させ、かつTFTの毒性を緩和させると考えられる。
【０１８１】
この複合的治療法のさらなる利点は、治療される癌と関係があり得るマイコプラズマ種のTPも阻害でき、したがってマイコプラズマに感染した癌患者のヒトプラズマおよび/または腫瘍組織でTFTの早期分解を妨げると考えられることである。
【０１８２】
マイコプラズマによる汚染は、細胞培養組織の使用において頻発する問題である。研究は10〜80％の細胞培養組織がマイコプラズマに感染することを指摘した。M.ヒオリニスだけでなく、M.オラレ、M.アルギニニ、M.フェルメンタンスおよびアケロプラズマ・ライドラウィイがこのような細胞培養組織からよく発見された。
【０１８３】
マイコプラズマによる細胞培養組織の汚染源は、通常、培養試薬（ウシ胎児血清）、感染細胞培養組織からの二次汚染および研究スタッフから発生する感染である[51]。マイコプラズマによる細胞培養組織の感染が信頼できない実験結果を導き得ることは、数多くの報告により陳述されてきた[37、51]。
【０１８４】
例えば、それらは細胞の代謝、タンパク質合成、RNAおよびDNA合成、細胞膜組成ならびに細胞形態を変化させることができ、かつそれらは細胞死を引き起こすことができる[51]。
【０１８５】
我々のデータは、マイコプラズマによる感染が種々のヌクレオシド類似体の最終的に起こる細胞増殖抑制活性をも妨害し得ることを証明している。
【０１８６】
したがって、ヌクレオシド類似体の抗癌性を調査する研究機関は、細胞培養組織からマイコプラズマを一掃し、日常的に使用できる効率的なマイコプラズマのスクリーニングプログラムを確立するのがよい。
【０１８７】
我々の発見は、FdUrdおよびTFTなどのヌクレオシド系抗癌剤を用いた癌治療と高い関連性を有する。M.ヒオリニスは、胃、結腸、食道、肺および乳癌の組織でしばしば見られるが、類似する非発癌性組織では見られない。我々のデータは、マイコプラズマ類の存在がいくつかのヌクレオシドベース化学療法剤の細胞増殖抑制率を著しく緩和させることを明らかにする。
【０１８８】
我々は、ヌクレオシドベースの抗癌化学療法が、プラズマ中および腫瘍部位での薬剤の早期不活化を妨げるために、マイコプラズマ酵素阻害剤および/またはマイコプラズマ類指向型の特定の抗生物質と組合せるのがよいことを証明する。
【実施例】
【０１８９】
本発明はTPに関する第一の実例に焦点を当てることにより確立された。TPは、チミジンおよびホスフェートをチミンおよび2-デオキシ-D-リボース-1-ホスフェートへ変換する可逆反応を触媒する、ピリミジンヌクレオシドサルベージ経路の酵素である。
【０１９０】
以前、マイコプラズマ種であるマイコプラズマ・ピルムおよびマイコプラズマ・マイコイデスにおいてTP活性が検出されている。[3H]-チミジンのDNAへの結合がマイコプラズマ種で汚染された細胞培養組織において改善することが報告されており、これはマイコプラズマ種由来TPの活性により、チミジンが酵素により開裂することを示す。
【０１９１】
本研究で、我々は、M.ヒオリニスもTP活性を有することを報告する。さらに、我々は、このマイコプラズマ種がコードするTPがチミジンのチミンへの変換を触媒するだけでなく、公知のE.コリおよび哺乳動物TP基質であるFdUrd、TFTおよび5'DFURも効率的に認識することを示す。
【０１９２】
TPの酵素活性は可逆的であるが、この反応の平衡は核酸塩基を指向しており、ピリミジンヌクレオシドを指向するものではない。60分以内にほとんどすべてのチミジンがチミンに分解された（図３）。これらの結果は、以前報告されたE.コリTPおよびヒト血小板から抽出されたTPの明白な加リン酸分解と合致する。
【０１９３】
MCF-7/HYOR細胞の細胞溶出物のウェスタンブロット解析により証明されたとおり（図２）、TP-ネガティブのMCF-7細胞のM.ヒオリニスによる感染は、ヒトTPの発現を誘導しなかった。したがって、M.ヒオリニス感染MCF-7細胞培養組織で観察された効果は、マイコプラズマ特異的TPの発現によるものであり、ヒトTPの上方制御または誘導によるものではなかった。
【０１９４】
M.ヒオリニスにより生産されたTPは、FdUrd、TFTおよび他の5位をハロゲンで置換されたdUrd類似体の抗細胞増殖活性への、MCF-7細胞の感受性を有意に減少させた。
【０１９５】
MCF-7/HYOR細胞培養組織において、これらの細胞増殖抑制性化合物の抗細胞増殖活性の減少は、広く公知のTP阻害剤であるTPiを添加することだけでなく、薬剤を添加する３日前に抗マイコプラズマ抗生物質であるプラスモシン（25 μg/ml）を細胞に添加することによっても、十分に回復させることができた。
【０１９６】
プラスモシンは、マイコプラズマのDNA複製およびタンパク質合成を効率的に阻害する（plasmocin.com）。これらの観察結果は、マイコプラズマのコードする（１以上の）酵素（すなわちTP）がヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制作用を著しく緩和し得ることを再度証明する。
【０１９７】
したがって、M.ヒオリニスTPは、FdUrd、TFTおよび他の5位をハロゲンで置換されたdUrdを、それら各々の遊離型ピリミジン塩基へ効率的に変換する。しかしながら、以前には、ヒトTPをMCF-7およびKB細胞にトランスフェクトすることで、FdUrdの細胞毒性活性を有意に変化させないという報告がされている。
【０１９８】
したがって、MCF-7/HYOR細胞培養組織のFdUrd（およびTFT）の細胞増殖抑制活性への感受性の著しい減少は、M.ヒオリニスTPが、形質転換されたMCF-7/TP細胞のヒトTPよりも、より良いFdUrd基質親和性および/またはより高率の触媒活性を有することを示し得る。
【０１９９】
より好ましくは、我々のデータは、取り込みよりも十分に迅速に、細胞外培地中でのM.ヒオリニスTPによる薬剤の不活性化が起こっていること、およびMCF-7細胞内で同化作用を有する細胞性チミジンキナーゼにより活性化されることをも指摘し得る。問題を明らかにするためにはさらなる研究が必要である。
【０２００】
dThd、TFTおよびBrdUrdのMCF-7/HYOR核酸への結合の著しい減少およびMCF-7/HYOR細胞におけるFdUrd 5'-モノホスフェート形成の減少は、M.ヒオリニスのコードするTPがこれらの薬剤の細胞増殖抑制活性を妨げる（図４、表４）という我々の発見に合致している。
【０２０１】
したがって、種々の腫瘍で見られる現象である、マイコプラズマ感染腫瘍組織は、ピリミジンヌクレオシドベースの抗癌治療に著しく低い効果を与え得る。その代わり、TP依存性フルオロピリミジンプロドラッグであるカペシタビンは、TP-ネガティブなMCF-7/HYOR腫瘍細胞において、マイコプラズマTPにより効率的に活性化される（表２）。
【０２０２】
実際に、カペシタビンの中間代謝産物である5'DFURは、マイコプラズマ感染MCF-7/HYOR細胞において、より顕著な細胞増殖抑制性であった。MCF-7/HYOR細胞培養組織における5'DFURの細胞増殖抑制活性の増加は、TPiにより効率的に無効化された。
【０２０３】
MCF-7、KB、HT-29およびPC-9のような癌細胞系へのヒトTP遺伝子のトランスフェクションも、親細胞系と比較して5'DFUR感受性を増加させることが証明されており、5'DFUR感受性におけるTPの役割を示す直接的な証拠を提供している。このように、カペシタビン治療の首尾よい結果は、腫瘍のTP活性に大きく依存する。
【０２０４】
したがって、タキサンおよびX線照射など、TP発現を上方制御する臨床治療は、カペシタビンの効用を改善させることを証明した。M.ヒオリニスなどのマイコプラズマ種は豊富にTPを発現するため、マイコプラズマ類を含む腫瘍組織においては、カペシタビン感受性はさらに増加し得る。
【０２０５】
本発明者らは、M.ヒオリニス感染が、シチジン類似体であるゲムシタビン（2',2'-ジフルオロデオキシシチジン）の抗増殖効果を、腫瘍細胞系の性質に依存して10〜70倍まで、有意に減少させることも証明する（Liekensら、Lancet Oncology, in press, 2009）。
【０２０６】
例えば、ヒト食道肉腫（OST.TK-）および乳癌腫（MDA-MB-231およびMCF-7）細胞系のM.ヒオリニス感染は、ゲムシタビンの細胞増殖抑制活性を、それぞれ70、40および10倍減少させる結果となった。フローサイトメトリーにより、濃度0.2 μMでMCF-7のS期における細胞周期アレストを引き起こすことが証明された。
【０２０７】
対照的に、MCF-7/HYOR細胞において、似通った効果を引き起こすには、25倍高い濃度のゲムシタビンが必要であった。放射能標識ゲムシタビンを用いて、その活性代謝産物の、MCF-7およびMCF-7/HYORのDNAへの結合を比較した。MCF-7/HYORのDNAでは、15〜60倍のゲムシタビン−トリホスフェート結合の減少が観察された。
【０２０８】
HPLC分析により、腫瘍細胞培養組織におけるマイコプラズマ種の存在がゲムシタビン代謝を阻害することが明らかとなり、最終的にその活性型トリホスフェート代謝産物の回収量を著しく減少させる結果となった。異なったヒト腫瘍細胞系におけるゲムシタビンの細胞増殖抑制活性は、マイコプラズマ感染により、劇的に阻害されることが証明された。
【０２０９】
本発明者らは、マイコプラズマ特異的抗生物質またはマイコプラズマ酵素阻害剤の共投与が、ゲムシタビンなどのシトシン類似体を用いた癌化学療法の効果を有意に高めることを証明する。
【０２１０】
実施例１：インビトロおよび細胞実験のための材料および方法
試薬および材料
強力なTP阻害剤であるTPi（5-クロロ-6-(1-[2-イミノピロリジニル]メチル)ウラシル塩酸塩）は、文献（Fukushima M.ら、Biochem Pharmacol 2000; 59:1227-36）で記述されている。5-フルオロ-5'-デオキシウリジン（5'DFUR）、5-トリフルオロチミジン（TFT）、チミジン（dThd）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FdUrd）、5-クロロ-2'-デオキシウリジン（CldUrd）、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdUrd）、5-ヨード-2'-デオキシウリジン（IdUrd）および5-フルオロウラシル（5FU）は、Sigma（St-Louis, MO）より入手した。
【０２１１】
ゲムシタビン（dFdC）およびクラドリビンはMcGuigan教授（Cardiff, UK）より購入した。[CH3-3H]-チミン、[6-3H]-TFT、[2-14C]-TF-チミン、[6-3H]-BrdUrd、[6-3H]-FdUrd、[6-3H]-dUrd、[5-3H]-ウラシル、[6-3H]-5FUおよび[5-3H]-dFdCは、Moravek Biochemicals（Brea, CA）より入手した。また、[CH3-3H]-dThdはMP Biomedicals（Solon, OH）より入手した。プラスモシンはInvivogen（San Diego, CA）より購入した。抗βアクチン抗体はSigmaより、抗TPポリクローナル抗体（クローンG19）はSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）より入手した。
【０２１２】
細胞培養組織
TP-ネガティブMCF-7乳癌腫細胞は、G.J.Peters教授（Amsterdam, The Netherland）の好意により分譲を受けた（Lopez LRら、Eur J Cancer 1994; 30A:1545-9）。細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）（Harlan, Sera-Lab Ltd, Loughborough, UK）および10 mM Hepes（Invitrogen）を増補したDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）（Invitrogen, Carlsbad, CA）で保持した。
【０２１３】
細胞は5％CO2気層と共に給湿したインキュベータ内で37℃で生育させた。S. Akiyama教授（Haraguchi M.ら、Cancer Res 1993; 53:5680-2）の好意により分譲を受けたTP/PD-ECGF完全長cDNA発現ベクターでMCF-7をトランスフェクトすることにより、ヒトTPを過剰発現するMCF-7細胞を得た。
【０２１４】
M.ヒオリニスの培養
M.ヒオリニス（ATCC 17981）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手した。凍結乾燥細菌は、1 mlのDMEMを加えることにより復元した。MCF-7細胞は、10％FBS（マイコプラズマ‐スクリーン済）を含むDMEM中で20,000細胞/cm2で植菌した。２日後、MCF-7細胞培養組織を、新たに復元したマイコプラズマ種を500μl加えることにより、M.ヒオリニスに感染させた。MCF-7細胞およびM.ヒオリニスの共培養は、感染していないMCF-7細胞と同じ条件下で保持した。
【０２１５】
PCRによるM.ヒオリニスの同定
MCF-7細胞のM.ヒオリニスによる感染を確認するために、Kongら（Kong F.ら、Appl Environ Microbiol 2001; 67:3195-200）により記述されているようにして、M.ヒオリニス種特異的PCRを行った。すべてのPCR反応は、Taqポリメラーゼ（Sphaero Q, Leiden, The Netherland）を用いて行った。PCRに用いたプライマーは、616 bp長のPCR断片を産生するHYR+（5'-catgatgagtaatagaaaggagcttcacagcttc-3'）およびUNI-（5'-ccagggtatctaatcctgtttgctccc-3'）であった（Haraguchi M.ら、Cancer Res 1993; 53:5680-2）。PCR増幅は、40サイクルの１秒間96℃における変性、１秒間68℃におけるアニーリングおよび10秒間74℃における伸長により構成した。
【０２１６】
Hoechst 33342を用いたDNA染色
10,000細胞/cm2（MCF-7およびMCF-7/HYOR）を８ウェルチェンバースライド（Nunc, Roskilde, Denmark）に植菌した。24時間後、10 μM TPiを加え、細胞をさらに72時間インキュベートした。次いで、細胞をカルノア固定液（氷酢酸１に対し、純粋なメタノール３）で10分間固定し、空気乾燥し、室温で濃度0.5 μg/mlのDNA結合染料Hoechst 33342（Sigma）に15分間さらした。次いで、細胞を脱イオン水で２回洗浄し、mounting medium（‘glycergel’, Dako,Glostrup, Denmark）およびカバーグラスで覆った。Leica TCS SP5共焦点顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）で、蛍光を可視化した。
【０２１７】
ウェスタンブロットアッセイ
MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞を8,000細胞/cm2で植菌した。48時間後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、前記（Liekens S.ら、Mol Pharmacol 1999; 56:204-13）のようにして溶解した。溶解物を遠心分離でクリアし、上清のタンパク質濃度を測定した。１mlの培養培地を1,200 rpmで５分間遠心分離した。上清を超音波分解し、カット-オフサイズ5,000Daのvivaspin concentrator（Sartorius AG, Goettingen, Germany）を用いて10倍に凝縮した。40 μgの細胞溶解物および20 μlの凝縮済培地のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、次いでHybond-Pポリビニリデンジフルオライドメンブレン（GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK）にタンパク質を転写した。メンブレンをブロッキングバッファー（0.1％ Tween 20を含むPBS中の5％脱脂粉乳）中で、１時間室温でインキュベートし、その後βアクチン（1/5000）またはTP（1/1000）を検出する一次抗体と共にブロッキングバッファー中で１時間インキュベートした。洗浄後、メンブレンを、ブロッキングバッファー中の対応する西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体（抗マウス、1/2000; Dako）と共に、25分間室温でインキュベートした。次いで、メンブレンを広範囲にわたって洗浄した。免疫反応性タンパク質をchemiluminescence（ECLplus; GE Healthcare）で検出した。ポジティブコントロールとして、ヒトTP遺伝子をトランスフェクトしたMCF-7細胞（MCF-7/TP）からの細胞溶解物をゲル上にロードした。
【０２１８】
酵素活性アッセイ
M.ヒオリニスのTP活性およびdThd、FdUrd、5'DFURおよびTFTのそれぞれチミン、5FU、5FUまたはTF-チミンへの変換は、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）分析により測定した。MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞を、10％ FBSを含むDMEM中に20,000細胞/cm2の密度で植菌した。４日後、培地を回収し、1,400 rpmの遠心分離でクリアした。いくつかの実験のために、MCF-7/HYOR細胞の培地を0.1 μm マイクロフィルタ（Acrodisc syringe filter, PALL Corporation, East Hills, NY）を用いて濾過し、培地からマイコプラズマ種を除去した。600 μlの培地を、10 μM TPiの存在または不存在下において、200 μMの基質（dThd、5'DFUR、TFTまたはFdUrd）と共に37℃でインキュベートした。
【０２１９】
異なった時点（すなわち、0、15、30、60、120分および16時間）において、100 μlのアリコートを回収し、エッペンドルフチューブに移し、３分間95℃で加熱した。次いで、サンプルを氷上で迅速に冷却し、200 μlの氷冷メタノールに20分間さらし、15分間15,000rpmの遠心分離によりクリアした。ポジティブコントロールとして、E.コリTP（Sigma）で酵素活性アッセイを行った。この反応のために、0.025 UのTPを全量600 μlのTPバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、2 mM リン酸カリウムおよび150 mM NaCl）中の200 μMの基質と共にインキュベートした。
【０２２０】
いくつかの時点において、反応液から100 μlのアリコートを回収し、上記のとおり処理した。逆相RP-8カラム（Merck, Darmstadt, Germany）上でヌクレオシドをそれらのヌクレオベースから分離し、HPLC分析（Aliance 2690, Waters, Milford, MA）により定量した。分離は、100％バッファーB（50 mM NaH2PO4および5 mMヘプタンスルホニックアシッド、pH 3.2）から20％バッファーBおよび80％アセトニトリルへの線形勾配により行った。チミンおよびチミジンの保持時間は、それぞれ5.1および10.8分であった。すべてのヌクレオシドのUVに基づいた検出は、267 nmで行った。
【０２２１】
腫瘍細胞増殖アッセイ
MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞は、48ウェルプレート中に10,000細胞/cm2で植菌した。24時間後、IC50を測定するため、異なった濃度（例えば、250 μM、50 μM、10 μM、2 μM、0.4 μMおよび0.08 μM）で試験した。値は、10 μM TPiの添加または不添加時における試験化合物の少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。細胞をさらに４日間インキュベートし、トリプシン処理し、コールターカウンター（Analis, Suarlee, Belgium）でカウントした。いくつかの実験では、抗生物質プラスモシンは、試験化合物添加の１または３日前に添加した。
【０２２２】
ヌクレオチド結合アッセイ
MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞を10,000細胞/cm2で植菌した。48時間後、10 μM TPiの添加または不添加時において、1 μCiの3H標識ヌクレオシドで細胞を処理した。16時間後、培地を除去し、細胞をPBSで２回洗浄した。次いで、細胞をトリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、10分間1,400 rpmで遠心分離した。ペレットを1 mlの純粋な氷冷メタノールに再懸濁し、20分間氷上で保持した。20分間13,000 rpmで遠心分離後、ペレットをメタノールで２回洗浄し、メタノールに再懸濁し、9 mlの高引火点液体シンチレーション試薬（‘Hisafe 3’, Perkin Elmer, Waltham, MA）を含むシンチレーションバイアルに移した。液体シンチレーション分析器（2300 TR, Packard, Canberra, Australia）で放射活性を測定した。
【０２２３】
ヌクレオシド代謝実験
MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞を植菌し、上記のとおりTPiの添加および不添加時において、1 μCiヌクレオシドで処理した。16時間後、培地を回収し、細胞をPBSで２回洗浄した。次いで、細胞を0.5 mlの純粋な氷冷メタノール中でインキュベートし、20分間氷上で保持した。20分間13,000 rpmで遠心分離後、上清をHPLC分析にかけた。上清中のヌクレオベース、ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、早期に記述（Balzarini J.ら、AIDS 2002; 16:2159-63）されるとおり、Partisphere 10 SAXアニオン交換カラム（Whatmann International Ltd.、Maidstone、England）で分離した一方、回収した培地中に存在するヌクレオベースおよびヌクレオシドは、RP-8カラムを用いて分離した。核酸に結合した化合物の量は、上記のようにして測定した。
【０２２４】
実施例２：MCF-7/HYOR細胞培養組織におけるM.ヒオリニス感染の同定
MCF-7細胞のM.ヒオリニスによる生産的感染は、MCF-7/HYOR細胞抽出物において616 bpのPCRバンドが検出される種特異的PCRにより確認した（図１A）。感染していないMCF-7細胞抽出物またはテンプレート不添加コントロールでは、PCRバンドは検出されなかった。MCF-7細胞のM.ヒオリニス感染は、細胞および細菌のDNAをHoechst 33342染料で染色することによっても評価した（図１B）。核酸豊富な分子は、TPi（10 μM）で３日間処理したMCF-7/HYOR細胞およびMCF-7/HYOR細胞の細胞質において可視化することができ、MCF-7細胞培養組織中のM.ヒオリニス生育にTPiが阻害的でないことを示している。
【０２２５】
実施例３：MCF-7およびMCF-7/HYORの細胞抽出物および細胞培養組織培地中のヒトTPの検出
抗ヒトTPポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析では、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞抽出物においてタンパク質は検出されなかった（図２）。しかしながら、ヒトTPは、ヒトTP遺伝子をトランスフェクトしたMCF-7細胞からの抽出物においては豊富に検出することができた。これはMCF-7細胞がヒトTPを発現しないことを確実にし、M.ヒオリニス感染がMCF-7細胞におけるヒトTPの発現を誘導しないことを示す。また、ヒトTPは、感染していないMCF-7およびM.ヒオリニス感染MCF-7/HYOR細胞の培地中では検出されなかった（データ不表示）。このアッセイで用いられたポリクローナル抗体は、MCF-7/HYOR細胞培養培地中に存在するマイコプラズマTPと交差反応を示さなかった。
【０２２６】
実施例４：MCF-7/HYOR細胞培養培地上清のTP酵素活性アッセイ
TP酵素活性および酵素反応の経時変化を、４日齢のMCF-7/HYOR細胞培養培地で測定した（表１、図３）。71％のdThd（200 μM）が２時間以内にチミンに変換した。すべてのdThdは、16時間後に反応液から消失した。ピリミジンヌクレオシド類似体であるFdUrd、5'DFURおよびTFTも、本来の基質であるdThdより少ない程度ではあるものの、それぞれのピリミジン塩基に変換された（表１）。MCF-7/HYOR培養培地では、すべての化合物（200 μM dThd、TFT、FdUrdおよび5'DFUR）のそれらそれぞれの遊離型塩基への変換は、10 μM TPi（ヒトおよびE.コリTPの強力な阻害剤）の存在下で完全に阻害された。
【０２２７】
対照的に、感染していないMCF-7細胞の培地では、インキュベーションの24時間後でさえもdThd、TFT、FdUrdまたは5'DFURの変換は観察されなかった（データ不表示）。興味深いことには、MCF-7/HYOR細胞培養培地のフィルタ（0.1 μm）済上清ではTP活性が見られなかった。このように、培地からマイコプラズマ種を除去することにより、細胞培養組織培地中のTP活性は失われ、測定されたTP活性は細菌に関係するものであり、マイコプラズマ種により細胞外に分泌されるのではないことを示す。
【０２２８】
TP活性の経時曲線は最初の誘導期を示す（図３）。これは、dThdがチミンに変換され得る前に、まず培地中に存在する無傷の（intact）マイコプラズマ種により取り込まれなければならないことを示し得る。
表１：MCF-7/HYOR細胞培地中のTP活性（ヌクレオシドの遊離型ピリミジン塩基への変換％）または0.025 Uの組換えE.コリTPの存在下。値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。
【表１】
2011520845.tif 000007
【０２２９】
実施例５：マイコプラズマ抗生物質またはマイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素阻害剤と組合せたヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性
5'DFUR、TFT、FdUrd、CldUrd、BrdUrdおよびIdUrdの細胞増殖抑制活性は、TPiの存在または不存在下におけるMCF-7およびMCF-7/HYORの両細胞培養組織で測定した（表２）。5'DFURを除き、ヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性は、MCF-7コントロール細胞と比べて、感染したMCF-7/HYOR細胞培養組織では20〜150倍低かった。MCF-7/HYOR細胞培養組織で観察されたヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性の減少は、TPi（10 μM）の共投与により完全に回復させることができた（表２）。これらの結果は、M.ヒオリニスのコードするTPがピリミジンヌクレオシド類似体をそれらそれぞれのピリミジン塩基へ変換し、これらの化合物の細胞増殖抑制活性を減少させる結果となることを示す。
【０２３０】
対照的に、感染したMCF-7/HYOR細胞では5'DFURはより顕著な細胞増殖抑制性であり、マイコプラズマのコードするTPがこのプロドラッグを5FUへ効率的に変換することを示す。親化合物である5FUのIC50値は、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞培養組織で有意に異なっていなかった。これは明らかに5FUのその活性型代謝産物（FdUMP）へのTP非依存的変換によるものである。
表２：TPi存在または不存在下におけるM.ヒオリニスに感染したまたは感染していないMCF-7細胞に対するピリミジンヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性。値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。
【表２】
2011520845.tif 000008
a50％阻害濃度または腫瘍細胞の増殖を50％阻害するのに必要な化合物の濃度。
bTPi不在下におけるIC50とTPi存在下におけるIC50の比を表す(1)/(2)の比。
【０２３１】
実施例６：抗癌剤とプラスモシンの組合せ
抗生物質プラスモシン（25 μg/ml）（ここで、該プラスモシンは、試験化合物添加の１日または３日前に、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞に添加した）の存在下におけるTFT、FdUrd、BrdUrd、5'DFURおよび5FUの細胞増殖抑制活性も調べた（図３）。
【０２３２】
MCF-7細胞へのプラスモシン添加は、試験化合物のIC50値を変化させなかった（データ不表示）。しかしながら、抗生物質と共にMCF-7/HYOR細胞培養組織を１日間前培養すると、試験化合物の細胞増殖抑制活性の減少は部分的に回復した一方、プラスモシンとの３日間の前培養はTFT、FdUrdおよびBrdUrdの抗増殖活性を完全に回復した。ところが、プラスモシンで前処理したMCF-7/HYOR細胞培養組織では、細胞増殖抑制活性を失った5FU、5'DFURの活性に、プラスモシンは影響を与えなかった。
表３：試験化合物添加の１日または３日間前にプラスモシンで前処理した、M.ヒオリニスに感染したMCF-7および感染していないMCF-7細胞に対するピリミジンヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性
【表３】
2011520845.tif 000009
a50％阻害濃度または腫瘍細胞増殖を50％阻害するのに必要な化合物の濃度。IC50は当該技術で公知のようにして測定した。抗癌化合物は、IC50を測定するために、次の濃度で試験した：250 μM、50 μM、10 μM、2 μM、0.4 μMおよび0.08 μM。
値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。
【０２３３】
実施例７：代謝およびピリミジンヌクレオシド類似体の核酸への結合
多くのピリミジンヌクレオシド類似体は、チミジレートシンターゼを阻害することにより、および/または腫瘍細胞の核酸に結合することによって、それらがDNAおよび/またはRNA合成を阻害するため、細胞増殖抑制性である。
【０２３４】
dThd、BrdUrd、TFTおよびdUrdの核酸への結合は、感染していないMCF-7細胞と比べて、感染したMCF-7/HYOR細胞ではそれぞれ85、45、40および３倍減少した（図４）。放射能標識した薬剤にさらしたMCF-7/HYOR細胞培養組織へのTPiの添加は、結合の欠陥を通常レベルまで完全に回復した。
【０２３５】
これらの結果は、M.ヒオリニスのコードするTPが、おそらくは遊離型ピリミジン塩基を開放することにより、したがってピリミジンヌクレオシド類似体のそれらがリン酸化された代謝産物への正確な同化作用を妨げることにより、薬剤がそれらの活性型代謝産物に変換するのを著しく妨げることを証明する。感染および非感染MCF-7細胞間で、遊離型ピリミジン塩基であるチミン、ウラシル、5FUおよびTFチミンの核酸への結合に差はなかった。興味深いことには、これらのピリミジン塩基の結合は非常に少なく、おそらくTPの誘導するそれらそれぞれのヌクレオシド誘導体への変換が、しいていえば不十分なことによる。
【０２３６】
細胞増殖のデータから期待され得たこととは異なって、M.ヒオリニス感染は、FdUrdの核酸への結合に影響を与えなかった。FdUrdは、その5'-モノホスフェート誘導体であるFdUMPとしてチミジレートシンターゼを阻害することにより、その細胞増殖抑制活性を誘導する。したがって、リン酸化されたFdUrd代謝産物の形成を調査し、dThd、BrdUrdおよびTFTの代謝産物と比較した（表４）。
【０２３７】
MCF-7/HYOR細胞では、しいていえば顕著に低レベルのdThd、BrdUrd、FdUrdおよびTFTのジおよびトリホスフェート誘導体が検出された。しかしながら、TPiの存在下では、TFT-5'-モノホスフェートのレベルが2.7倍まで増加した一方、FdUrd 5'-モノホスフェートのレベルは18倍まで顕著に増加した。これらのデータは、FdUrdの細胞増殖抑制作用の主なメカニズムとしてTSを強く暗示するものであるのに対して、TFTを含む他の薬剤は核酸への結合と同時にそれらの細胞増殖抑制活性を主に発揮し得る。
【０２３８】
TPiの存在下では、FdUrdではない66％のTFTが核酸に結合した一方、ほとんどすべてのdThdまたはBrdUrdが核酸に結合した。これは明らかに、dThdおよびBrdUrdがTFTおよびFdUrdよりも良い細胞TK基質であるという事実による。
【０２３９】
表４のデータは、MCF-7/HYOR細胞内ですべてのヌクレオシドがそれらの不活性型塩基に分解されるのに対して、細胞培養組織へのTPi投与がこの触媒活性を阻害することを再確認させる。
表４：MCF-7/HYOR細胞培養組織に添加した薬剤由来（すなわちTFT、FdUrd、BrdUrdおよびdThdからの）放射能標識のパーセンテージ。値は少なくとも３回の独立した実験の平均として表す。S.E.M.は、値の５％未満でなければ示していない。
【表４】
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【０２４０】
実施例８：インビボ実験‐マイコプラズマ抗生物質またはマイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素と組合せたヌクレオシド類似体の抗腫瘍活性
a）動物モデルの構築
細胞培養組織
FM3A細胞は、10 mM Hepes（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）および10％ウシ胎児血清（FBS, Harlan Sera-Lab Ltd., Loughborough, UK）を増補したDulbecco's modified minimum essential medium（DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD）中で生育させる。細胞は、細胞培養組織に「感染した」培地を添加することによりマイコプラズマ・ヒオリニスに感染させる。FM3A細胞培養組織中のM.ヒオリニスの存在は、種特異的PCRにより確認する。
【０２４１】
動物
約20 g重量のメスの深刻な複合免疫不全（SCID）マウスをすべての実験で用いる。動物は、K.U.Leuvenの動物施設で養育される。
【０２４２】
動物実験
マイコプラズマ・ヒオリニス（10.106または2.106細胞/200 μl DMEM（血清を含まない））に感染したFM3A細胞は、SCIDマウスに腹腔内注射される。細胞接種後異なった時点において、マウスを解剖し、腫瘍、腹水、血液およびいくつかの器官を回収する。回収したサンプルからDNAを抽出し、M.ヒオリニスの存在を確認するために、PCR分析のための処理をする。
（a）マイコプラズマ抗生物質または
（b）マイコプラズマヌクレオシドもしくはヌクレオチド代謝酵素インヒビター
と組合せたヌクレオシドまたはヌクレオチドベース抗癌剤を用いた実験は動物に行い、腫瘍の生育および体積を測定する。
【０２４３】
実施例９：チミジンホスホリラーゼ阻害剤と組合せたシチジン類似体の細胞増殖抑制活性
TPiの存在または不存在下において、MCF-7およびMCF-7/HYOR両細胞培養組織中の、シタラビン（araC）およびゲムシタビンの細胞増殖抑制活性を測定した（表５）。
【０２４４】
シチジン類似体の細胞増殖抑制活性は、MCF-7コントロール細胞と比べて、感染したMCF-7/HYOR細胞培養組織では約14〜約20倍低かった。MCF-7/HYOR細胞培養組織で観察されたシチジン類似体の細胞増殖抑制活性の減少は、TPi（10 μM）の共投与により回復できた（表５）。
表５：TPiの存在または不存在下における、M.ヒオリニス感染および非感染MCF-7細胞に対するシチジン類似体の細胞増殖抑制活性。値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。
【表５】
2011520845.tif 000011
a50％阻害濃度または腫瘍細胞の増殖を50％阻害するのに必要な化合物の濃度。
bTPi不存在下におけるIC50とTPi存在下におけるIC50の比を表す(1)/(2)の比。
【０２４５】
実施例１０：チミジンホスホリラーゼ阻害剤と組合せたプリン類似体の細胞増殖抑制活性
TPiの存在または不存在下において、MCF-7およびMCF-7/HYORの両細胞培養組織でクラドリビン（プリン類似体）の細胞増殖抑制活性を測定した（表６）。
【０２４６】
ヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性は、MCF-7コントロール細胞と比べて、感染したMCF-7/HYOR細胞培養組織では約30倍低かった。MCF-7/HYOR細胞培養組織で観察されたプリン類似体の細胞増殖抑制活性の減少は、TPi（10 μM）の共投与により回復できた（表６）。
表６：TPiの存在または不存在下における、M.ヒオリニス感染および非感染MCF-7細胞に対するプリンヌクレオシド類似体の細胞増殖抑制活性。値は少なくとも３回の独立した実験の平均±S.E.M.として表される。
【表６】
2011520845.tif 000012
a50％阻害濃度または腫瘍細胞の増殖を50％阻害するのに必要な化合物の濃度。
bTPi不存在下におけるIC50とTPi存在下におけるIC50の比を表す(1)/(2)の比。
【０２４７】
実施例１１−代謝ならびにシチジンおよびプリンヌクレオシド類似体の核酸への結合
ゲムシタビン（dFdC）の細胞増殖抑制活性は、MCF-7/HYOR細胞と比べて、MCF-7/HYORでは14倍減少した（表５）。したがって、これらの細胞系におけるdFdCの異なった代謝産物の分布を調べた。MCF-7細胞では、ゲムシタビンは既に、dFdCモノホスフェート、（dFdCジホスフェート）および特にdFdCトリホスフェートへと活性化され（リン酸化され）ている。対照的に、M.ヒオリニスに感染したMCF-7細胞では、ゲムシタビンはその添加の24時間後もそのまま存在し、活性型代謝産物は検出できなかった（図５参照）。これらのデータは、マイコプラズマ感染がdFdCの活性化およびその結果として細胞増殖抑制活性を阻害することを示す。
【０２４８】
本発明者らは、予期しなかったことに、ゲムシタビン（シチジン類似体）およびクラドリビン（プリン類似体）と組合せたTPiがこれらの抗癌剤に対してマイコプラズマを傷害する効果を逆転させ、これらの抗癌剤の細胞毒性を完全に回復させることを見出した。
【０２４９】
実際に、ゲムシタビンおよびクラドリビンは共に、完全に異なる２つの化合物のクラスに属し、それらがTPによる分解に感受性であることがこれまでに証明されていないため、TP基質となることが期待されない薬剤である。TP酵素それ自体は、チミジンおよびデオキシウリジン類似体に作用することだけが証明されており、シチジンおよびアデノシン（プリン）類似体への作用は証明されていない。
【０２５０】
実施例１２−シトシンまたはプリンベースの抗癌剤およびプラスモシンの組合せ
抗生物質プラスモシン（25 μg/ml）（ここで、該プラスモシンは試験化合物添加の１日または３日前に、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞に添加した）の存在下におけるゲムシタビン、クラドリビンおよびシタラビンの細胞増殖抑制活性も調べた。
【０２５１】
MCF-7細胞へのプラスモシンの添加は、試験化合物のIC50値を変化させなかった。しかしながら、MCF-7/HYOR細胞培養組織を抗生物質と共に１日間前培養すると、試験化合物の細胞増殖抑制活性の減少が部分的に回復した一方、プラスモシンと共に３日間前培養すると、ゲムシタビン、クラドリビンおよびシタラビンの抗増殖活性が回復した。
【０２５２】
実施例１３−シトシンまたはプリンベースの抗癌剤およびドキシサイクリンの組合せ
抗生物質ドキシサイクリン（該ドキシサイクリンは試験化合物添加の１日または３日前に、MCF-7およびMCF-7/HYOR細胞に添加した）存在下におけるゲムシタビン、クラドリビンおよびシタラビンの細胞増殖抑制活性も調べた。
【０２５３】
MCF-7細胞へのドキシサイクリンの添加は、試験化合物のIC50値を変化させなかった。しかしながら、MCF-7/HYOR細胞培養組織を抗生物質と共に１日間前培養すると、試験化合物の細胞増殖抑制活性の減少が部分的に回復した一方、ドキシサイクリンと共に３日間前培養すると、ゲムシタビン、クラドリビンおよびシタラビンの抗増殖活性が回復した。
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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