(57)【要約】本発明は、マクロファージ刺激タンパク質受容体（ＭＳＰ−ＲまたはＲＯＮ）に特異的な、ヒト抗体を含む、抗体またはそのフラグメントを提供し、それは、ＲＯＮ活性化を阻害する。ＲＯＮを阻害する方法、特に癌のような疾患を処置するためのＲＯＮ抗体の使用もまた提供される。
2011504176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９からなる群から選択されるＣＤＲを含む、ＲＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３３を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号６に少なくとも７５％同一である可変領域を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号８に少なくとも７５％同一である可変領域を含む、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号６および配列番号８を含む、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２に少なくとも７５％同一である可変領域を含む、請求項９に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号４に少なくとも７５％同一である可変領域を含む、請求項１０に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２および配列番号４を含む、請求項１１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
前記抗体またはそのフラグメントが、約１×１０−９Ｍ−１以下のＫｄを有するＲＯＮに対して特異的である、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
前記抗体またはそのフラグメントが、約１×１０−１０Ｍ−１以下のＫｄを有するＲＯＮに対して特異的である、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
前記抗体またはそのフラグメントが、約１×１０−１１Ｍ−１以下のＫｄを有するＲＯＮに対して特異的である、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
前記抗体またはそのフラグメントが、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二重特異性抗体、および三重特異性抗体からなる群から選択される構造を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
前記抗体またはそのフラグメントが、ＲＯＮ６  ＶＨ、ＲＯＮ６  ＶＬ、ＲＯＮ８  ＶＨ、ＲＯＮ８  ＶＬおよびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも２つの抗体可変ドメインに由来するＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
前記抗体またはそのフラグメントが、ＲＯＮ６  ＶＨ、ＲＯＮ６  ＶＬ、ＲＯＮ８  ＶＨ、ＲＯＮ８  ＶＬおよびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも３つの抗体可変ドメインに由来するＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
前記抗体またはそのフラグメントが、ＩｇＧ構造を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントが、ＲＯＮ６またはＲＯＮ８を含む、請求項２０に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離された核酸を含む組換えベクター。
【請求項２４】
前記核酸が、前記核酸の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結される、請求項２３に記載の組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の宿主細胞を、前記抗体の発現を可能にする条件下で培養することを含む、ＲＯＮ抗体を産生する方法。
【請求項２７】
前記方法は前記抗体を精製することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的に許容され得るキャリア、および請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物。
【請求項２９】
別の治療有効化合物をさらに含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント、および化学療法剤を含むキット。
【請求項３１】
前記化学療法剤が、タキソール、ドキソルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、メトトレキセート、イリノテカン（ＣＰＴ−ｌｌ）、ゲムシタビン、オキシプラチン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコウリン（ＬＵ）、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、エポチロン、シスプラチン／カルボプラチン、およびペグ化されたアドリアマイシンからなる群から選択される、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
哺乳動物において、血管形成、腫瘍成長、腫瘍細胞の増殖、腫瘍細胞の移動、腫瘍細胞の浸潤、ＲＯＮ活性化、あるいはＲＯＮ、ＭＡＰＫ、および／またはＡｋｔのリン酸化を阻害する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、有効量の請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む方法。
【請求項３３】
哺乳動物において癌を処置する方法であって、哺乳動物に、有効量の請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む方法。
【請求項３４】
別の抗癌処置を前記哺乳動物に施すことをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗癌処置が、抗血管形成剤、別のＦＧＦＲ−３アンタゴニスト、化学療法剤、放射線、別の抗体、抗新生物薬、および小分子からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗癌処置が、化学療法剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学療法剤が、タキソール、ドキソルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、メトトレキセート、イリノテカン（ＣＰＴ−ｌｌ）、ゲムシタビン、オキシプラチン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコウリン（ＬＵ）、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、エポチロン、シスプラチン／カルボプラチン、およびペグ化されたアドリアマイシンからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗癌処置が放射線である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗癌処置が別の抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、ＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲ抗体、ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ＰＤＧＦＲα抗体、およびＰＤＧＦＲβ抗体からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、別の分子に結合体化される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌が、結腸、膵臓、前立腺、胃、肺、肝臓、卵巣、腎臓、胸部、および脳に由来する腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞が結腸に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍細胞が、上皮由来または神経内分泌由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＯＮが、野生型ＲＯＮまたは変異体ＲＯＮである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＲＯＮが変異体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
サンプルにおいてＲＯＮを検出する方法であって、前記サンプルを、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントと接触させて、特異的結合を得ること、およびそのような結合を検出することを含む方法。
【請求項４８】
哺乳動物において炎症を予防または処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、請求項１の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む方法。
【請求項４９】
哺乳動物において、肝臓、胆道、胆管、および胆嚢の疾患からなる群から選択される状態を予防または処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、有効量の請求項１の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む方法。
【請求項５０】
前記抗体またはそのフラグメントが、注射、注入、経口、非経口、皮下、筋肉内、または静脈内に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体またはそのフラグメントが、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で前記哺乳動物に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体またはそのフラグメントが、約３ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１１月２１日に出願された米国仮出願ＵＳＳＮ６０／９８９５５８の利益を主張し、その全内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒトマクロファージ刺激タンパク質受容体（「ＭＳＰ−Ｒ」または「ＲＯＮ」（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ））を阻害するための方法および組成物に関する。本発明は、ＲＯＮ活性化を阻害する、ＲＯＮに特異的な抗体または抗体フラグメントの投与を含む、哺乳動物における腫瘍および他の疾患の処置のための方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
以降、「ＲＯＮ」とも呼ばれるマクロファージ刺激タンパク質受容体は、受容体チロシンキナーゼのｃ−ｍｅｔファミリーに属する。ＲＯＮは、細胞外α鎖および膜貫通β鎖で構成された、ヘテロ二量体タンパク質である。ＲＯＮは最初に、１本鎖前駆体として発現され、その後α鎖およびβ鎖に切断される（１）。β鎖は、そのリガンドであるマクロファージ刺激タンパク質（「ＭＳＰ」；別称ＨＧＦ様タンパク質）が受容体へ結合するのに必要であり、そして、ＭＳＰのクリングルドメイン２および３は、ＲＯＮ／ＭＳＰ相互作用に必要であると考えられる（特許文献１）。ＲＯＮの細胞外ドメインは、ｃ−ｍｅｔファミリー受容体の対応するドメインとほとんど相同性を有さないと思われる。実際、ｃ−ｍｅｔファミリーにおいて他の受容体を刺激する肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）のＲＯＮ受容体への結合は、チロシンキナーゼ活性を刺激しない（特許文献２）。
【０００４】
ＲＯＮは、細胞移動、形状変化および腫瘍による組織の浸潤において役割を有すると考えられる（１）。しかしながら、以前の刊行物は、変質を誘導するＲＯＮの限定された役割を報告するが、ＲＯＮ活性化による侵襲性増殖の促進を記載する（１６）。
【０００５】
突然変異、欠失、遺伝子再配列および代替的ｍＲＮＡスプライシングは、いかなるリガンド結合も伴わずにＲＯＮの活性化を引き起こし得る（１）。ＲＯＮのチロシンキナーゼドメインの変化は、ＲＯＮの活性化において重要な役割を果たし得る（１）。様々な癌細胞株由来のＲＯＮのクローニングは、ＲＯＮをコードするｍＲＮＡの様々な欠損に起因するＲＯＮ活性化を示している。
【０００６】
ＭＳＰは、クリングルドメインプラスミノーゲン関連タンパク質ファミリーの一員である（１）。その名前が示すように、ＭＳＰは、様々な手段によってマクロファージを刺激することが最初に見出された（概説について、２、３を参照のこと）。例えば、あるＲＯＮ発現マクロファージへのＭＳＰの添加は、形状変化、走化性、マクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、および免疫メディエイタ産生を誘導した（４、５、６）。ＲＯＮはまた、ＭＳＰがＲＯＮをリン酸化することが示されている角化細胞のような上皮細胞において発現され、そして細胞接着／移動性、抗アポトーシス、および増殖反応を誘起する多くのシグナル伝達経路を活性化することも認められた（７，８）。最近数年間に、ＲＯＮの過剰発現が、いくつかの上皮腫瘍および細胞株（例えば、結腸（９、１０、１１）、肺（１２）、胸部（１３））において観察されている。最近の研究において、肺腫瘍が、その肺にＲＯＮを過剰発現するように改変されたトランスジェニックマウスにおいて発生した（１４、１５）。
【０００７】
ＲＯＮは、様々なヒト癌細胞株において発現される。ＲＯＮに対する抗体は、受容体（リン酸化されたＲＯＮ）の活性化、ならびにこれらの癌細胞株の多くにおける下流のシグナル伝達分子であるリンＭＡＰＫおよびリンＡＫＴの活性化を阻害することができる。本明細書中下記に例示される抗ＲＯＮ抗体（ＲＯＮ６およびＲＯＮ８）の両方は、いくつかの癌細胞由来細胞株（ＨＴ−２９  結腸、Ｈ−２９２  肺、ＢｘＰＣ３  膵臓、ＪＩＭＴ−１  胸部）がヌードマウス中に注入されたときに腫瘍を形成する能力を有意に妨害することが示されている。これは、ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼの阻害がこれらの癌細胞の増殖に負に影響を与えることを確認し、そして、例えば、結腸癌、肺癌、膵臓癌、および乳癌においてＲＯＮを阻害することの有用性を強調している。従来のウエスタンブロット処置およびフローサイトメトリー処置を使用して、ＲＯＮは、様々な癌に由来する多くのヒト細胞株、すなわち結腸（ＨＴ−２９、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−１、Ｓｗ４８０、Ｓｗ６２０）、膵臓（ＢＸＰＣ−３、ＣＡＰＡＮ−２、ＡＳＰＣ−１、ＨＰＡＦ−ＩＩ、Ｌ３．７ｐ１＃７、Ｈｓ７６６Ｔ）、前立腺（ＤＵ−１４５、ＰＣ−３）、胃（ＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７）、肺（Ａ５４９、Ｈ５９６）、肝臓（ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ−１８２）、および胸部（ＪＩＭＴ１、ＤＵ４４７５、ＡＵ５６５）において発現されることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国公開番号第２００３／００７３６５６号
【特許文献２】国際出願公開第ＷＯ０２／０８３０４７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特異的ＲＯＮエピトープを含むＲＯＮ標的の特定に基づき、様々な疾患の治療法、特に癌の治療法を開発する継続的必要性が、当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、以前に利用可能であった公知の抗ＲＯＮ抗体よりも実質的に高い特異的結合を有する抗ＲＯＮ抗体を提供する。その抗体は、単離および／または精製され得る。本発明の抗体は、典型的にヒト個体群において見出される野生型ＲＯＮ対立遺伝子によってコードされているＲＯＮであるか、または変異体ＲＯＮタンパク質、例えば、少ない変異または突然変異を有するがＲＯＮ活性を保持するものであるかにかかわらず、ＲＯＮへの結合に有用である。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＲＯＮに特異的であり、約１×１０−９Ｍ−１以下のＫｄ（すなわち、抗体と抗原の解離についての平衡定数）を有する。他の実施形態において、本発明の精製された抗体は、約１×１０−１０Ｍ−１以下または約１×１０−１１Ｍ−１以下であるＫｄを示す。さらに他の実施形態において、本発明の抗体またはその機能的フラグメントは、事実上完全なヒト抗体である。
【００１１】
本発明は、例えば、ＲＯＮ６  ＶＨ、ＲＯＮ６  ＶＬ、ＲＯＮ８  ＶＨ、ＲＯＮ８  ＶＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗体可変ドメインに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ＲＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、ＲＯＮ６  ＶＨのＣＤＲは、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１であり；ＲＯＮ６  ＶＬのＣＤＲは、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７であり；ＲＯＮ８  ＶＨのＣＤＲは、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３３であり；ならびにＲＯＮ８  ＶＬのＣＤＲは、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９である。可変ドメインに含まれる各々は、３つのＣＤＲを寄与し得る。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＲＯＮ６  ＶＨ、ＲＯＮ６  ＶＬ、ＲＯＮ８  ＶＨ、ＲＯＮ８  ＶＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体可変ドメインの少なくとも２つに由来するＣＤＲを含み得る。より好ましくは、本発明の抗体は、ＲＯＮ６  ＶＨ、ＲＯＮ６  ＶＬ、ＲＯＮ８  ＶＨ、ＲＯＮ８  ＶＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体可変ドメインの少なくとも３つに由来するＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態において、抗体はＲＯＮ６またはＲＯＮ８である。
【００１３】
本発明は、その抗体をコードする単離された核酸、ならびに、最適な宿主細胞における核酸の発現を可能にする１つ以上の制御配列に作動可能に連結された核酸を含む組換えベクターをさらに提供する。その組換えベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【００１４】
本発明は、抗体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、および任意選択的に作製された抗体を精製することを含む、本発明のＲＯＮ抗体を作製する方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体、および薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、１種以上の他の治療効果的な薬剤をさらに含み得る。
【００１６】
本発明のＲＯＮ抗体を、単独または他の薬剤、例えば化学療法剤と組み合わせて含むキットが、本明細書中で意図される。
【００１７】
本発明の抗体を使用する方法もまた提供され、例えば、癌を処置し、血管形成、腫瘍の成長、移動、ＲＯＮを発現する腫瘍細胞の増殖または浸潤を阻害する方法であって、哺乳動物に本発明の抗体またはそのフラグメントの有効量を投与して、ＲＯＮの活性化を阻害することを含む方法が提供される。腫瘍細胞は、例えば、結腸、膵臓、前立腺、胃、肺、肝臓、卵巣、腎臓、胸部、および脳に由来する腫瘍細胞、あるいは上皮または神経内分泌由来の腫瘍細胞である。
【００１８】
本発明の方法は、他の薬剤、例えば有機小分子を、抗体と共に投与することをさらに含み、ここで、他の薬剤は、限定されないが、化学療法剤、抗血管形成剤、またはＲＯＮの活性化の阻害を含み得る。任意選択的に、抗体は、他の薬剤、例えば有機小分子に結合体化され得る。
【００１９】
本発明の抗体は、少なくとも１種の他の抗癌治療、例えば、抗血管形成剤、ＦＧＦＲ−３アンタゴニスト、化学療法剤、放射線、抗腫瘍剤、小分子、または他の抗体と共に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、腫瘍を阻害する少なくとも１種のさらなる抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，ＮＹ）のような抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与され得る。
【００２０】
本発明の抗体は、野生型ＲＯＮまたは変異体ＲＯＮを標的とすることができ、または野生型ＲＯＮまたは変異体ＲＯＮに結合することができる。
【００２１】
本発明の方法は、サンプルを本発明の抗体と接触させて特異的結合を得ること、およびそのような結合を検出することを含む、サンプル中のＲＯＮを検出する方法をさらに包含する。
【００２２】
哺乳動物に本発明の抗体の有効量を投与することを含め、予防または処置を必要とする哺乳動物の炎症を予防または処置する方法もまた提供される。
【００２３】
哺乳動物に本発明の抗体の有効量を投与することを含め、予防または処置を必要とする哺乳動物の疾患、例えば肝臓、胆道、胆管、および胆嚢の疾患を予防または処置する方法もまた提供される。
【００２４】
哺乳動物に本発明の抗体の有効量を投与することを含め、阻害を必要とする哺乳動物のＲＯＮ、ＭＡＰＫ、および／またはＡｋｔのリン酸化を阻害する方法もまた提供される。
【００２５】
前述の方法に関して、いくつかの実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントは、哺乳動物に、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与され得る。他の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、約３ｍｇ／Ｋｇ〜約８ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ６  ＶＨ領域のＤＮＡ（配列番号１）および翻訳された配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ６  ＶＬ領域のＤＮＡ（配列番号３）および翻訳された配列（配列番号４）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ８  ＶＨ領域のＤＮＡ（配列番号５）および翻訳された配列（配列番号６）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ８  ＶＬ領域のＤＮＡ（配列番号７）および翻訳された配列（配列番号８）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、完全ＲＯＮ６−Ｌ（ヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩ）のＤＮＡ（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＲＯＮ６−Ｌ分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；κ定常領域（修飾されていない）。
【図２Ｅ】図２Ｅは、完全ＲＯＮ６−Ｌ（ヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩ）のＤＮＡ（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＲＯＮ６−Ｌ分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；κ定常領域（修飾されていない）。
【図３Ａ】図３Ａは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、完全ＲＯＮ８−ＬのＤＮＡ（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；κ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、完全ＲＯＮ８−ＬのＤＮＡ（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；κ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｈ−２９２マウス異種移植モデルにおける、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６の投与後の、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ６抗体が、マウス異種移植系においてＨ−２９２腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｈ−２９２マウス異種移植モデルにおける、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ８の投与後の、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体が、マウス異種移植系においてＨ−２９２腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＴ−２９マウス異種移植モデルにおける、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ６抗体が、マウス異種移植系においてＨＴ−２９腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＨＴ−２９マウス異種移植モデルにおける、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体が、マウス異種移植系においてＨＴ−２９腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＲＯＮ８抗体単独、ＲＯＮ８抗体＋Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（ＥＲＢ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）単独、およびコントロールＩｇＧ（ｈｕｌｇＧ抗体）と組み合わせたＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を有するＢｘＰＣ３マウス異種移植モデルにおいて、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体（図４Ｅ）単独で、マウス異種移植系においてＢｘＰＣ３腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。この図はまた、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）との組み合わせで、腫瘍の退縮または阻害の傾向があることも示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＲＯＮ８抗体がヌードマウスの胸部腫瘍異種移植片の成長を阻害することを示す。ＪＩＭＴ−１乳癌細胞をヌードマウス中に皮下注射し、およそ２５０ｍｍ３まで増殖させた。腫瘍体積は、コントロール（生理食塩水）、ＲＯＮ８抗体（６０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、ドセタキセル、またはドセタキセル＋ＲＯＮ８抗体の組み合わせで処置し、プロットする。
【図５Ａ】図５Ａは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。、ＮＩＨ３Ｔ３−ＲＯＮ細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。Ｈ−２９２細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図５Ｃ】図５Ｃは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。ＨＴ−２９細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図６Ａ】図６Ａは、ＲＯＮ８抗体の固相ブロッキング特性を示す。ＥＬＩＳＡを使用して、固定化された組換えヒトＭＳＰと組換えヒトＲＯＮタンパク質との相互作用をブロックするのに必要なＲＯＮ８抗体のＩＣ５０値を決定した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｈ５９６肺癌細胞の細胞移動を阻害するＲＯＮ８抗体の能力を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＢＸＰＣ３膵臓癌細胞において、ＲＯＮ８抗体によるＭＳＰ誘導ＤＮＡ合成の阻害を示す。図６Ｃ（１）は、ＤＮＡ合成の指標である［３Ｈ］−チミジン取り込みへのＭＳＰ刺激を示す。図６Ｃ（２）は、細胞を、ＭＳＰの添加の前に１時間ＲＯＮ８抗体で前処理した系を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、有用性、例えば、診断目的のためにＲＯＮタンパク質を検出するためのアッセイにおける有用性、および治療目的のためにＲＯＮ活性を阻害する方法における有用性を有する抗ＲＯＮ抗体を提供する。さらに、本発明の抗ＲＯＮ抗体は、治療有効量、例えば、ＲＯＮを発現するあらゆる腫瘍細胞の成長、増殖、転移活性（すなわち、移動および／または浸潤）を阻害するのに有効な量で、動物、例えばヒトのような哺乳動物に投与され得る。本発明はまた、開示された抗ＲＯＮ抗体、またはそのフラグメントを含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒトＲＯＮ受容体チロシンキナーゼに結合する完全ヒト抗体を提供する。そのような抗体は、限定されないが、例示されたＲＯＮ６およびＲＯＮ８、ならびにその活性または機能的フラグメントおよび誘導体を含む。
【００２８】
記載を明確にするために、上記で提供された背景技術の節で詳述されるように、標的タンパク質がＲＯＮと呼ばれ、そして本明細書中で例示された好ましい抗ＲＯＮ抗体がそれぞれ「ＲＯＮ６」および「ＲＯＮ８」と表わされることが理解されるべきである。スクリーニング処理を使用して、本発明の抗ＲＯＮ抗体は、数百の候補抗ＲＯＮ抗体から選択された。本発明の抗体は、以下の実施例において詳細に説明されるように、以前に利用可能であった抗ＲＯＮ抗体に比べて、予想外に望ましいＲＯＮ結合特性を示す。特に、新しいＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体は、以前にファージライブラリー系から産生された完全ヒト抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ１より１００倍大きなＲＯＮ受容体に対する親和性を有する。具体的には、ＲＯＮ６およびＲＯＮ８は、それぞれ４．１×１０−１１および３．２×１０−１１ＭのＫＤでＲＯＮに結合し、一方、ＲＯＮ１は、７．７×１０−９ＭのＫＤでＲＯＮに結合する。ＲＯＮ１は、本明細書において参照によって組み込まれる国際特許公開番号ＷＯ２００５１２０５５７に記載される、当該分野において現在指定される公知の抗体である。
【００２９】
本明細書中で参照されるように、本発明の方法で使用される本明細書において開示されるＣＤＲ配列情報は、抗体可変ドメインのあらゆる考えられ得る供給源からの配列情報に「由来」、すなわち、基づき、それから作製され、またはそれから得られるものであり、それには、野生型または変異形態、ならびに天然に存在するか、または当業者によく知られている方法によって合成的に産生されるものが含まれる。
【００３０】
本明細書における「腫瘍」への言及は、一般的には癌、そしてそうでないことが明記されていない限り悪性および非悪性の両方の疾患を含むことが意図される。本明細書において意図されるように、悪性の腫瘍は原発性腫瘍および二次性腫瘍を含む。原発性腫瘍は、それらが見出される組織から直接的に生じる。二次性腫瘍、または転移癌は、身体の他の場所に由来するが、遠隔器官に広がってしまった腫瘍である。転移の一般的な経路は、血管系またはリンパ系を介して広がり、かつ組織平面および体腔（ｂｏｄｙ  ｓｐａｃｅ）（腹膜液、脳脊髄液など）に沿って進み、隣接構造へ直接成長する。
【００３１】
本発明の方法を使用する考えられ得る処置のために含まれ得る、原発性または二次性いずれかの癌または悪性腫瘍の特定の種類は、限定されないが、白血病、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、咽頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、潰瘍性および乳頭型の両方の有棘細胞癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胆石、ランゲルハンス島細胞腫、原発性の脳腫瘍、急性および慢性のリンパ球性腫瘍および顆粒球性腫瘍、毛様細胞性腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫（ｍｕｃｏｓａｌ  ｎｅｕｒｏｎｍｓ）、腸管神経節神経腫（ｇａｎｇｌｌｏｎｅｕｒｏｍａｓ）、過形成角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体型腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ  ｈａｂｉｔｕｓ  ｔｕｍｏｒ）、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頚部形成異常および上皮内癌、神経芽腫、網膜芽腫、柔組織肉腫、悪性カルチノイド、局所的皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性およびその他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、多形性膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌ならびに他の癌腫および肉腫を含む。
【００３２】
明確にするために、説明の便宜上の単数形の使用は、それに限定することを全く意図していないこともまた意図されている。したがって、例えば、「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「１つの腫瘍（ａ  ｔｕｍｏｒ）」への言及は、１つ以上のそのような抗体または腫瘍への言及を含む。複数形の用語の使用もまた、そうでないことが明記されていない限り、それに限定することを意図しない。
【００３３】
ＲＯＮに対して特異的な本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮ受容体の活性化を中和する。本明細書で使用される場合、受容体を中和するとは、受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化してシグナルを変換することを意味する。ＲＯＮの中和についての信頼性のあるアッセイは、受容体リン酸化の阻害である。
【００３４】
本発明は、ＲＯＮ中和のいかなる特定の機構によっても限定されない。そのような中和は、例えば、リガンドへの特定のエピトープのアクセスをブロックする抗体によって、またはリガンド、特にＭＳＰが受容体に結合できても受容体を活性化できない特定の様式で、ＲＯＮの立体配座を変化させることによって生じ得る。米国特許第６１６５４６４号は、リガンド自身に結合する抗体、受容体をダウンレギュレートする抗体、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する抗体、または細胞障害性反応を引き起こす抗体を含む、そのような中和のための種々の考えられ得る機構を列挙する。ダウンレギュレーションは、ＲＯＮを発現する細胞、特にＲＯＮを過剰発現（特異的発現を含む）する細胞が、それらの表面のＲＯＮ受容体チロシンキナーゼの数を減少させるときに生じ得る。したがって、中和は、阻害、縮小、不活性化、および／または成長（増殖および分化）の途絶、血管形成（血管の補充、浸潤、および転移）、ならびに細胞の移動性および転移（細胞接着および細胞侵襲性）を含む種々の効果を有する。
【００３５】
抗ＲＯＮ抗体によるＲＯＮの中和はまた、リガンド結合無しで活性であるか、またはリガンドに結合しかつその結果非活性化しない、変異体ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼの中和も含み得る。したがって、ＲＯＮ中和は、野生型ＲＯＮおよび／または変異体ＲＯＮ（点変異、欠失、選択的スプライシングなど）の中和を含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用される用語ＲＯＮの「変異体」は、任意選択的に、野生型ＲＯＮより短いかまたは長いＲＯＮタンパク質を含み、そして任意選択的に、アミノ酸置換を含有するアナログを含むだろう。ＲＯＮの変異体はまた、選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的ｍＲＮＡイニシエーション、および／または点変異に由来する場合がある。
【００３７】
抗ＲＯＮ抗体によるＲＯＮ中和の度合いの１つの有用な指標は、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を使用して、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然または合成基質のリン酸化を測定することによって、決定できる。したがって、リン酸化アッセイは、本発明に照らして抗体の中和を決定するのに有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロットでホスホチロシンに特異的な抗体を使用して検出できる。チロシンキナーゼ活性についてのいくつかのアッセイが、Ｐａｎｅｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙらＬｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２：１４３−５０（１９９８）に記載されている。
【００３８】
ＲＯＮ中和の別の指標は、ＲＯＮの下流基質のリン酸化の阻害である。それにより、例えば、ＭＡＰＫまたはＡｋｔのリン酸化のレベルが測定できる。
【００３９】
天然に存在する抗体は、典型的には、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を有し、各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合されており、そして複数のジスルフィド結合は、２つの重鎖を互いにさらに結合させている。個々の鎖は、類似の大きさ（１１０個〜１２５個のアミノ酸）および構造を有するが異なる機能を有するドメインへと折り重なることができる。軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および／または１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含むことができる。重鎖もまた、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および／または、抗体のクラスまたはアイソタイプに依存して、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含むことができる。ヒトにおいて、アイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡとＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１−２およびＩｇＧ１−４）にさらに細分類される。
【００４０】
一般的に、可変ドメインは、抗体間に、特に抗原結合部位において、かなりのアミノ酸配列変動性を示す。超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域は、ＶＬおよびＶＨの各々に見出され、それらは、フレームワーク可変領域と呼ばれるより変動の少ない領域によって支持される。
【００４１】
例示されるような本発明の抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体を含む。本発明による「抗体」（単数または複数）が、抗体フラグメントまたは改変された形態を含み得ることもまた意図されている。例えば、Ｆｖフラグメント、または、代替的構造形態に新しい本発明の抗体の利点を提供するため、例示された抗体のＣＤＲおよび／または可変ドメインが、単鎖抗原結合タンパク質、二重特異性抗体および／または三重特異性抗体として改変されたタンパク質である。
【００４２】
簡単に言うと、ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる抗体の一部は、Ｆｖ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）として設計され、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖまたはＳＣＡ）は、ポリペプチド鎖上にＶＬドメインおよびＶＨドメインを含有する抗体フラグメントであり、ここで１つのドメインのＮ末端および他方のドメインのＣ末端は、可変性リンカーによって結合される（例えば、米国特許番号第４９４６７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）；ＷＯ  ８８／０９３４４（Ｈｕｓｔｏｎら）を参照のこと）。ＷＯ  ９２／０１０４７（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）は、バクテリオファージのような可溶性組換え遺伝表示パッケージの表面のｓｃＦｖフラグメント表示を記載する。
【００４３】
単鎖抗体を産生するために使用されるペプチドリンカーは、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの適切な３次元折り畳みの発生を確実にするように選択される可変性ペプチドであってもよい。リンカーは、一般的には１０個〜５０個のアミノ酸残基である。好ましくは、リンカーは、１０個〜３０個のアミノ酸残基である。より好ましくは、リンカーは、１２個〜３０個のアミノ酸残基である。最も好ましいのは１５個〜２５個のアミノ酸残基のリンカーである。そのようなリンカーペプチドの例は、４個のグリシンとそれに続くセリンの繰返しである。
【００４４】
単鎖抗体は、それが由来する全抗体の定常ドメインの一部または全てを欠く。したがって、それは、全抗体の使用に伴って生じる問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生物学的分子との間の特定の望ましくない相互作用を含まない傾向がある。さらに、単鎖抗体は、全抗体よりもかなり小さく、全抗体よりも大きな透過性を有すことができ、従って、単鎖抗体が局在し、そしてより効率的に標的抗原結合部位に結合するこのを可能にする。さらに、単鎖抗体は、比較的小さなサイズであるので、全抗体よりも、レシピエントにおける望ましくない免疫応答の誘発が少ない。
【００４５】
各単鎖が第１のペプチドリンカーによって共有結合された１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを有する、複数の単鎖抗体は、少なくとも１つ以上のペプチドリンカーによって共有結合され、単一特異性または多特異性である多価単鎖抗体を形成できる。多価単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントを含み、少なくとも１つの他の鎖に、ペプチドリンカーによって連結される。ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基の最大数は、約１００個である。
【００４６】
２つの単鎖抗体は、結合されて、二価二量体としても知られる二重特異性抗体を形成することができる。二重特異性抗体は、２つの鎖および２つの結合部位を有し、単一特異性または多特異性であることができる。二重特異性抗体の各鎖は、ＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む。それらのドメインは十分短いリンカーで連結されているので、同じ鎖上のドメイン間の対合を防止し、したがって異なる鎖上の相補的ドメイン間の対合を促進し、２つの抗原結合部位を再作成する。簡単に言うと、例として、本発明による二重特異性抗体は、二重特異性であり、かつＲＯＮ６およびＲＯＮ８結合ドメインの両方を含み得る。
【００４７】
３つの単鎖抗体は、結合されて、三価二量体としても知られる三重特異性抗体を形成することができる。三重特異性抗体は、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのカルボキシル末端に直接的に融合されたＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸末端で、すなわちリンカー配列無しで構成される。三重特異性抗体は、環状の頭尾様式で配置されたポリペプチドを備える３つのＦｖヘッドを有する。三重特異性抗体の考えられ得る立体配座は、互いに１２０度の角度で１つの平面に位置決めされた３つの結合部位を備える平面的なものである。三重特異性抗体は、単一特異性、二重特異性、または三重特異性であることができる。
【００４８】
Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）は、ＶＬ  ＣＬ  ＶＨ  ＣＨ１ドメインからなる抗体のフラグメントを指す。単にパパイン消化によって産生されたものはＦａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化の後、重鎖ヒンジを保持する種々のＦａｂが産生される。鎖間ジスルフィド結合を備えたままであるそれらのフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれ、一方、単一のＦａｂ’は、ジスルフィド結合が保持されないときに生じる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、一価のＦａｂフラグメントよりも高い、抗原に対するアビディティを有する。
【００４９】
Ｆｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）は、対合重鎖定常ドメインを含む抗体の部分またはフラグメントの名称である。ＩｇＧ抗体において、例えば、Ｆｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体のＦｃは、ＣＨ４ドメインをさらに含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介細胞障害性、および抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の活性化に関連する。複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭのような抗体では、複合体の形成は、Ｆｃ定常ドメインを必要とする。
【００５０】
最後に、ヒンジ領域は、抗体のＦａｂ部分とＦｃ部分を分け、Ｆａｂ間、およびＦｃに対するＦａｂの移動性を提供し、ならびに２つの重鎖の共有結合のために複数のジスルフィド結合を含む。
【００５１】
したがって、ＲＯＮに特異的な抗体は、限定されないが、天然に存在する抗体およびそのフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、単に例として、ＲＯＮに特異的に結合する（Ｆａｂ）２のような二価のフラグメント、Ｆａｂのような一価のフラグメント、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体を含む。好ましくは、そのようなフラグメントは、本明細書中に例示されるＲＯＮ６抗体および／またはＲＯＮ８抗体の１つ以上のＣＤＲを含む。本発明による抗体の定義は、任意選択的に、抗原に特異的に結合する多価単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体などのような、ＲＯＮに特異的に結合する改変抗体をさらに含む。好ましくは、そのような多価の改変抗体は、本明細書中に例示されるＲＯＮ６抗体および／またはＲＯＮ８抗体の１つ以上のＣＤＲを含む。
【００５２】
本発明の抗体の各ドメインは、重鎖または軽鎖可変ドメインを備える完全抗体であることができ、またはそれは、天然に存在するドメインと機能的に同じであるか、あるいは天然に存在するドメインの変異体または誘導体であり、あるいは例えば、インビトロでＷＯ  ９３／１１２３６（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）に記載されるような技術を使用して構築された合成ドメインであることができる。例えば、少なくとも１個のアミノ酸を欠く抗体可変ドメインに対応するドメインを結合することは可能である。重要な特徴的特性は、相補ドメインと結合して抗原結合部位を形成する各ドメインの能力である。したがって、可変重鎖および軽鎖フラグメントと言う用語は、特異性に重要な影響を及ぼす変異体を除くとみなされるべきではない。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「抗体」および「抗体フラグメント」は、ＲＯＮ受容体に対する特異性を保持する修飾を含む。そのような修飾は、限定されないが、化学療法剤（例えば、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン）または細胞毒（例えば、タンパク性または非タンパク性の有機化学療法剤）のようなエフェクター分子への結合体化を含む。抗体は、検出可能なレポーター部分への結合体化によって修飾できる。また、半減期のような非結合特性（例えば、ポリエチレングリコールポリマーへの結合体化）に影響する変更を備えた抗体もそれに含まれる。
【００５４】
タンパク性および非タンパク性の薬剤は、当該分野において公知の方法によって抗体に結合体化され得る。結合体化方法は、直接結合、共有結合したリンカーを介した結合、および特異的結合対メンバー（例えば、アビジン−ビオチン）を介した結合を含む。そのような方法は、例えば、ドキソルビシンの結合体化について、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０，６６００−６６０７（１９９０）によって記載されたもの、ならびに白金化合物の結合体化について、Ａｒｎｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３，７９−９０（１９９１）によって記載されたもの、およびＫｉｓｅｌｅｖａら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５，５０８−５１４（１９９１）によって記載されたものを含む。
【００５５】
抗体「特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるか、そうでない場合分子と相互作用することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または炭水化物、あるいは糖の側鎖のような分子の化学的に活性な表面集団からなり、かつ、一般的に、特異的な３次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。エピトープは、「線状」または「立体配座」であり得る。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用する分子（例えば、抗体）との間の相互作用点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に現れる。立体配座のエピトープにおいて、相互作用点は互いに分離したタンパク質上のアミノ酸残基、すなわち、タンパク質の三次折り畳みによって近接して並べられた非連続アミノ酸にわたって現れる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への暴露によっても保持され、一方、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理によって失われる。
【００５６】
エピトープは、典型的には、少なくとも３個、通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を、固有の空間的立体配座に含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が他の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を単純な免疫アッセイによって示すことにより確認できる。
【００５７】
いったん、抗原上の所望のエピトープが決定されると、そのエピトープに対する抗体を産生することが、例えば、本発明において記載される技術を使用して可能である。あるいは、発見の過程で、抗体の産生および特徴付けが、所望のエピトープについての情報を明らかにし得る。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するための１つのアプローチは、交差競合研究を実施して、互いに競合的に結合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見つけることである。
【００５８】
（エピトープマッピングおよび関連技術）
特定のエピトープ（例えば、ＩｇＥの高親和性の受容体への結合をブロックするエピトープ）に結合する抗体についてスクリーニングするために、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（１９９０）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されるアッセイのような所定の交差ブロッキングアッセイが実施できる。他の方法としては、アラニン走査突然変異、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）、またはペプチド切断分析が含まれる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法が利用できる（Ｔｏｍｅｒ，２０００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：９：４８７−４９６、その全体が、参照によって本明細書中に具体的に組み込まれる）。
【００５９】
（機能分析）
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる、修飾を使ったプロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原の表面に対する各抗体の結合プロフィールの類似性にしたがって、同じ抗原に対して向けられた大量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（米国特許公開第２００４／０１０１９２０号、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって示されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重複する固有のエピトープを示す。この技術は、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にし、その結果、遺伝的に異なる抗体に特徴付けを集中できる。ハイブリドーマのスクリーニングに適用された場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明のＲＯＮ６抗体およびＲＯＮ８抗体を異なるエピトープに結合できる抗体のグループに分類するのに使用できる。
【００６０】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、単一特異性または二重特異性であることができる。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原結合特異性または抗原結合部位を有する抗体である（米国公開番号第２００４／０２５９１５６号、２００４年２月１３日出願を参照のこと）。抗体が１つより多い特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原または１つより多い抗原と結合されることができる。したがって、本発明は、ＲＯＮに対する少なくとも１つの特異性を備える、２つの異なる抗原に結合する２重特異性抗体、またはそのフラグメントを提供する。
【００６１】
ＲＯＮに対する抗体またはそのフラグメントの特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定できる。抗体との抗原の解離についての平衡定数（「Ｋｄ」）によって表わされる親和性は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。アビディティは、抗体とその抗原との間の結合の強度の指標である。アビディティは、エピトープとその抗体上の抗原結合部位との間の親和性、および特定のエピトープの抗原結合部位の数を示す抗体価の両方に関連する。抗体は、典型的には、約１０−５〜約１０−１１ｌ／ｍｏｌの解離定数（Ｋｄ）で結合する（例えば、ＫＤ＜１００ｎＭ）。約１０−４ｌ／ｍｏｌ未満のいかなるＫｄも、一般的には、非特異性の結合を示すと考えられる。Ｋｄの値が小さければ小さいほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度は強い。
【００６２】
ＲＯＮは、種々の供給源、例えば、ＲＯＮを発現する結腸、膵臓、前立腺、胃、肺、肝臓、卵巣、腎臓、胸部、および脳の細胞、ならびに一般的な上皮細胞および神経内分泌細胞から単離されて、免疫応答を生じ得る。また、合成受容体ペプチドを、市販の機械および対応するアミノ酸配列を使用して得てもよい。さらなる選択肢は、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントのようなＲＯＮタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングおよび発現させ、生じたポリペプチドを回収して免疫原として使用し、本発明の抗体を得てもよい。抗体を作製するためのＲＯＮタンパク質またはそのフラグメントを調製するため、ＲＯＮをコードする核酸分子、またはその部分、特にその細胞外部分（具体的には、αおよびβ部分）を、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して公知のベクターに挿入し、宿主細胞で発現させてもよい。同様に、ＲＯＮのリガンド、特にＭＳＰに対する抗体が調製され得る。
【００６３】
ＲＯＮおよびそのリガンドＭＳＰの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに公開されており（ＲＯＮアクセッション番号Ｘ７００４０およびＭＳＰアクセッション番号ＮＭ  ０２０９９８、両方の引用が参照によって本明細書中に組み込まれる）、抗体の調製のために容易に使用できる。抗体はまた、ＲＯＮまたはＭＳＰの変異体／突然変異体に対しても産生され得る。変異体および突然変異体の細胞外ドメイン上に存在するエピトープに対する抗体が興味深い。細胞外ドメインにおける１０９アミノ酸のインフレーム欠失による改変ＲＯＮ受容体は、構成的に活性化されることが示されている（１）。抗体は、例えば、そのような改変されたＲＯＮ受容体に対して産生できる。
【００６４】
ＲＯＮに特異的な抗体は、哺乳動物をＲＯＮで免疫処置することによって調製され得る。可溶性受容体は、それ自体で免疫原として、またはキャリアタンパク質かビーズ、すなわちセファロースビーズのような他の物体に付着されて使用され得る。哺乳動物が抗体を産生した後で、脾細胞のような抗体産生細胞の混合物が単離される。モノクローナル抗体は、個々の抗体産生細胞を混合物から単離し、例えば、それらをミエローマ細胞のような腫瘍細胞と融合させることによって不死化することにより産生され得る。生じたハイブリドーマは、培養物中で保存され、モノクローナル抗体を発現し、それは培養培地から回収される。
【００６５】
さらに、本発明の抗体および抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を産生するトランスジェニックマウスを使用する標準的なハイブリドーマ技術（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ編、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８）、参照によって本明細書中に組み込まれる）によって得ることができる。好ましい実施形態において、ヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分をマウスのゲノムに挿入し、内因性のマウス抗体の産生を欠失させる。そのようなマウスは、完全フロイントアジュバント中のＲＯＮで皮下（ｓ．ｃ．）に免疫処理され得る。本発明の抗体は、さらなるアミノ酸残基に融合させることができる。そのようなアミノ酸残基は、単離を容易にするため、ペプチドタグであってもよい。抗体を特定の器官または組織にホーミングするための他のアミノ酸残基もまた意図されている。
【００６６】
本発明による抗ＲＯＮ抗体は、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子から構築されたライブラリーのようなファージディスプレイライブラリーから単離できる。例えば、本発明の可変ドメインは、再配列された可変領域遺伝子を含有する末梢血リンパ球から得ることができる。あるいは、ＣＤＲ領域およびＦＷ領域のような可変ドメイン部分は、異なるヒト配列から得ることができる。
【００６７】
ＲＯＮに特異的な抗体は、好ましくは約１×１０−９Ｍ−１以下、より好ましくは約１×１０−１０Ｍ−１以下、そして最も好ましくは約１×１０−１１Ｍ−１以下のＫｄでＲＯＮに結合する。
【００６８】
ＲＯＮに特異的な抗体またはそのフラグメントは、受容体の活性化を阻害する。受容体を阻害することは、受容体の内因性のキナーゼ活性の活性化を防止してシグナルを変換することを意味する。ＲＯＮについての信頼性のあるアッセイは、受容体リン酸化の阻害である。
【００６９】
本発明は、ＲＯＮ阻害のいかなる特定の機構によっても限定されない。そのような阻害は、例えば、リガンドによる特定のエピトープへのアクセスをブロックする抗体によって、またはリガンド、特にＭＳＰが受容体に結合できても受容体を活性化できない様式で、ＲＯＮの立体配座を変化させることによって生じ得る。米国特許第６１６５４６４号は、リガンド自身への結合、受容体をダウンレギュレートすること、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害すること、または細胞障害性反応を引き起こすことを含む、そのような阻害のための種々の考えられ得る機構を列挙する。ダウンレギュレーションは、ＲＯＮを発現する細胞、特にＲＯＮを過剰発現（特異的発現を含む）する細胞が、それらの表面のＲＯＮ受容体チロシンキナーゼの数を減少させるときに生じ得る。腫瘍細胞の浸潤および転移において機能するマトリクスメタロプロテアーゼもまた、本発明の抗体によってダウンレギュレートされ得る。
【００７０】
ＲＯＮ阻害は、成長（増殖および分化）、血管形成（血管の補充、浸潤、および転移）、ならびに細胞の移動性および転移（細胞接着および細胞侵襲性）の阻害、縮小、不活性化、および／または途絶を含む種々の効果を有する。
【００７１】
本発明はまた、リガンド結合無しで活性な変異体または突然変異したＲＯＮ受容体チロシンキナーゼに結合し、不活性にする抗体も意図する。ＲＯＮ関連疾患に罹患している哺乳動物は、例えば、野生型および変異体ＲＯＮの両方を発現し得る（発現した変異体受容体は不釣合いな量である）。Ｗａｎｇ（１）（９）によって開示されるように、細胞外ドメイン内の欠失を有するもののような、細胞外ドメインが異なる変異体／突然変異体の配列が興味深い。したがって、ＲＯＮ阻害は、野生型および／または変異体ＲＯＮ（点突然変異、欠失、選択的スプライシングなど）を含み得る。
【００７２】
ＲＯＮ活性化は、ｃ−ｍｅｔまたはＥＧＦＲのような他のＲＴＫでの二量化または活性化によって起こり得る。したがって、ＲＯＮ阻害は、ＲＯＮとＥＧＦＲまたはｃ−ｍｅｔのような他の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）との間のヘテロ二量化の阻害もまた含み得る。そのような阻害はまた、例として、形成されたＲＯＮとＥＧＦまたはｃ−ｍｅｔのヘテロ二量体によるシグナル伝達の阻害も含み得る。そのような二量化は、例えば、受容体に結合して二量化を誘導するＭＳＰ、ＨＧＦ、またはＥＧＦにより、リガンド依存性の様式で誘導され得る。
【００７３】
ＲＯＮ阻害の１つの指標は、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を使用して、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然または合成の基質のリン酸化を測定することによって決定できる。したがって、リン酸化アッセイは、本発明に照らして抗体の阻害を決定するのに有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロットでホスホチロシンに特異的な抗体を使用して検出できる。チロシンキナーゼ活性についてのいくつかのアッセイが、Ｐａｎｅｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｍ．２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ  Ｓｄ．６２：１４３−５０（１９９８）［５２］に記載される。さらに、タンパク質発現の検出のための方法が、ＲＯＮ阻害を決定するのに利用できる。これらの方法は、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合的放射リガンド結合アッセイ、ノーザンブロットおよびサザンブロットのような固体マトリクスブロッティング技術、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびＥＬＩＳＡを含む。
【００７４】
ＲＯＮ阻害の別の指標は、ＲＯＮの下流基質のリン酸化のレベルを含む。したがって、例えば、ＭＡＰＫまたはＡｋｔのリン酸化のレベルが測定できる。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明の抗体の１個、２個、３個、４個、５個、または６個全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＲＯＮに特異的な抗体が、哺乳動物に投与される。別の実施形態において、投与された抗体は、本発明の抗体の可変領域を有する。図２Ａ〜２Ｅは、本発明の抗体の配列を提供する。理論に束縛されることを意図しないが、ＲＯＮ６およびＲＯＮ８は、ＲＯＮのβ細胞外ドメインに結合するが、そのような特異性はまた、ＲＯＮの他のドメインに結合することによって生じるか、または同じドメインの異なるエピトープに結合することによっても生じ得ると考えられる。ＲＯＮ６抗体およびＲＯＮ８抗体のＣＤＲは本発明によって単離され、以下を含む。
【００７６】
【化１】
2011504176.tif 000003
【００７７】
【化２】
2011504176.tif 000004
【００７８】
【化３】
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【００７９】
【化４】
2011504176.tif 000006
【００８０】
ＲＯＮに特異的な抗体および抗体フラグメントの機能的変異体はまた、本発明の抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に類似のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。実質的に同じアミノ酸配列は、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８（１９８８）に従うＦＡＳＴＡ検索方法によって決定されるように、比較されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％相同な配列として本明細書中で定義され、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％、９５％、または９９％同一な配列、およびそれらの間の全ての部分的な範囲を含む。そのような抗体は、実質的に同じＣＤＲを有する本発明の抗体と、同じかまたは類似の、結合、リガンドブロッキング、および受容体阻害の活性を有する。
【００８１】
ＲＯＮに特異的な抗体および抗体フラグメントの変異体はまた、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する抗体も含む。保存的アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、あるいはそれらのフラグメントの１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の変化によるアミノ酸組成の変化として定義される。置換は、一般的には、類似の性質（例えば、酸性、塩基性、芳香性、大きさ、正または負の電荷、極性、非極性）を備えるアミノ酸間の置換であり、その結果、その置換は実質的にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の特性（例えば、電荷、等電点、親和性、アビディティ、立体配座、可溶性）または活性を変更しない。そのような保存的アミノ酸置換に関して実施され得る典型的な置換は、以下のアミノ酸群間であり得る：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン、（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、およびイソロイシン（Ｉ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、およびアルギニン（Ｒ）；アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）。
【００８２】
保存的アミノ酸置換は、例えば、分子の選択的および／または特異的結合特性に主に寄与する超可変領域に隣接する領域、ならびに分子の他の部分、例えば可変重鎖カセットで行うことができる。
【００８３】
抗体またはそのフラグメントはまた、直接変異、親和成熟法、ファージディスプレイ法、または鎖シャッフリング法によってそれらの結合特性が改善されるものも含む。
【００８４】
親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはＦＷ残基の変異、ならびに所望の特性を有する抗原結合部位のスクリーニングにより、修飾または改善されることができる（例えば、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９５）２５４：３９２−４０３を参照のこと）。１つの方法は、本来は同一の抗原結合部位の集団において、２〜２０個のアミノ酸のサブセットが特定の位置で見出されるように、個々の残基または残基の組合せを無作為化することである。あるいは、変異は、エラープローンＰＣＲ法によってある残基の範囲にわたって誘導できる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，（１９９２）２２６：８８９−９６を参照のこと）。別の例において、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発株で増殖できる（例えば、Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９６）２５０：３５９−６８を参照のこと）。これらの突然変異誘発方法は、当業者に公知の多くの方法を例示したものである。
【００８５】
本発明の抗体の親和性を増大する別の方法は、鎖シャッフリングを実行することであり、ここで、重鎖または軽鎖は、無作為に他の重鎖または軽鎖と対合されて、より高い親和性の抗体が調製される。この抗体の様々なＣＤＲはまた、他の抗体における対応するＣＤＲとシャッフリングされ得る。
【００８６】
さらに、本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびに発現配列に作動可能に連結されたこれらのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。これらのヌクレオチドは、図１Ａ〜１Ｄ、２Ａ〜２Ｅ、および３Ａ〜３Ｅに列挙される。本発明の抗体またはそのフラグメントを発現する１つ以上の発現ベクターを含む組換え宿主細胞もまた提供される。これらの細胞を、抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で培養することを含む、抗体またはそのフラグメントを産生するための方法もまた提供される。抗体またはそのフラグメントは、次いで、細胞または細胞培養培地から精製できる。
【００８７】
図１Ａ〜１Ｄ、２Ａ〜２Ｅ、および３Ａ〜３Ｅに列挙されるヌクレオチドの変異体は、本発明の抗体と同じ機能、すなわち、ＲＯＮの活性化をブロックまたは阻害する機能を有する抗体または抗体フラグメントをコードするものを含む。そのような変異体は、野生型ＲＯＮと少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％同一な配列を有する。本発明はまた、抗体融合タンパク質も提供する。これらの融合タンパク質は、酵素、蛍光タンパク質、ポリペプチドタグ、または発光マーカー、および／またはそれらの組み合わせをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合された図１Ａ〜１Ｄ、２Ａ〜２Ｅ、および３Ａ〜３Ｅのヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００８８】
本発明のヌクレオチド配列は、以下も含む：（ａ）図１Ａ〜１Ｄ、２Ａ〜２Ｅ、および３Ａ〜３Ｅに示された抗体ＤＮＡ配列；（ｂ）（ｉ）ストリンジェント条件下、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃での、フィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、ｐ．２．１０．３）で、（ａ）に記載されたヌクレオチド配列の補体にハイブリダイズし、かつ（ｉｉ）実質的に同じ機能性を有する抗体または抗体フラグメントをコードする、任意のヌクレオチド配列；ならびに、（ｃ）中程度にストリンジェントな条件のような、より低いストリンジェント条件下、例えば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前掲）で、図２Ａ〜２Ｅ、および３Ａ〜３Ｅに示された抗体配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズするが、依然同じ機能性を実質的に有する抗体または抗体フラグメントをコードする、任意のヌクレオチド配列。本発明の抗体の機能性は、ＲＯＮの活性化をブロックすることである。
【００８９】
本発明はまた、制御配列に作動可能に連結された本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする核酸を含有する発現ベクター、ならびにそのような発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞は、本発明の抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする特定の条件下で培養でき、そして抗体は、次いで、宿主細胞から精製できる。
【００９０】
標準的な組換え技術および公知の発現ベクターが使用されて、本発明の抗体を発現する。細菌、タンパク質を発現するためのベクター、特にＥ．Ｃｏｌｉが公知である。そのようなベクターは、ＤｉｅｃｋｍａｎｎおよびＴｚａｇｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，１５１３−１５２０（１９８５）によって記載されたＰＡＴＨベクターを含む。これらのベクターは、アントラニル酸合成酵素（ＴｒｐＥ）をコードするＤＮＡ配列、それに続くカルボキシ末端のポリリンカーを含有する。他の発現ベクター系は、β−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；λＰＬ；マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；および、グルタチオンＳ−転移酵素（ｐＧＳＴ）に基づく。Ｇｅｎｅ  ６７，３１（１９８８）およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，１６７（１９９０）を参照のこと。
【００９１】
酵母において有用なベクターが利用可能である。好適な例は、２Ｄプラスミドである。哺乳動物細胞における発現に好適なベクターもまた公知である。そのようなベクターは、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列の周知の誘導体、および上記のもののような機能的哺乳動物ベクターの組合せに由来したシャトルベクター、ならびに機能性プラスミドおよびファージＤＮＡを含む。
【００９２】
さらに、真核発現ベクターが、当該技術分野において公知である（例えば、Ｐ．Ｊ．ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ．Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１（１９８２）；Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４（１９８１）；Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６２１（１９８２）；Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６６４（１９８２）；Ｓ．Ｉ．Ｓｃａｈｉｌｌら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，４６５４−４６５９（１９８３）；Ｇ．ＵｒｌａｕｂおよびＬ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，４２１６−４２２０，（１９８０））。
【００９３】
本発明において有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含有する。制御配列は、クローニングされたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、ベクター中に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、ならびに、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびシミアンウイルス由来のプロモーター、例えば初期および後期プロモーターまたはＳＶ４０、ならびに、原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他の配列、またはそれらの組合せである。
【００９４】
ベクター（組換えベクターおよび発現ベクター）は、本明細書中に提供されるような用途のために意図されている。例えば、本発明の抗体またはその抗体フラグメントをコードするもののような、制御シグナルおよび発現されるべきＤＮＡを含有する発現ベクターが、発現のために宿主細胞に挿入される。いくつかの有用な発現宿主細胞は、周知の原核細胞および真核細胞を含む。いくつかの好適な原核宿主は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＧ−９３６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  １０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ２２８２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＭＲＣｌなどのＥ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなＢａｃｉｌｌｕｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。好適な真核細胞は、酵母および他の真菌、昆虫、動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、リンパ腫、ミエローマのようなリンパ球起源の細胞株（例えばＮＳＯ）、およびＣＨＯ細胞、組織培養物におけるヒト細胞および植物細胞を含む。
【００９５】
抗体を産生する方法が提供される。この方法は、好適な発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含み、ここで、発現ベクターは、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチド、例えば、そのような抗体あるいはそのフラグメントまたは改変変異体の重鎖または軽鎖をコードする１個以上の核酸分子を含む。好適な培地で維持された宿主細胞における発現後、発現されたポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法によって培地から単離され、精製され得る。ポリペプチドまたはペプチドが培養培地へ分泌されない場合は、宿主細胞は、単離および精製の前に溶解される。精製された抗体は、同定され、ならびにその天然の環境の成分から分離および／または回収されたものである。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用と干渉し得、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る物質であり、一般には除去される。
【００９６】
したがって、例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、培養培地または腹水から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｌｙａｐａｔｉｔｅ）クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような、従来の免疫グロブリン精製法により単離または精製されるサブクローンによって分泌される。
【００９７】
別の実施形態において、ＲＯＮに特異的な本発明の抗体は、トランスジェニック動物において、抗体を含む軽鎖および／または重鎖、またはそのアナログをコードする１つ以上の核酸を発現することにより産生され、その結果、抗体を発現させ、回収することができる。例えば、抗体は、回収および精製を容易にする組織特異的様式で発現させることができる。１つのそのような実施形態において、本発明の抗体は、授乳時に分泌のために乳腺で発現する。トランスジェニック動物は、限定されないが、マウス、ヤギ、およびウサギを含む。任意の他の公知のトランスジェニック系、例えば、鳥の卵（例えば、鶏卵）の卵白における発現が利用できる。
【００９８】
本発明は、本発明の抗ＲＯＮ抗体を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物は、本明細書中に例示されたＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗ＲＯＮ抗体の１種以上を含み得る。本発明の抗ＲＯＮ抗体は、予防または処置の目的で哺乳動物において使用される場合、薬学的に許容され得るキャリアを追加的に含む組成物の形態で投与されるであろうことが理解される。好適な薬学的に許容され得るキャリアは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせの１種以上を含む。薬学的に許容され得るキャリアは、結合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を増強する少量の助剤物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤をさらに含むことができる。注射用組成物は、当該分野においてよく知られているように、哺乳動物への投与後に、活性成分の迅速な、持続型の、または遅延型の放出を提供するように処方されることができる。
【００９９】
本明細書中で使用される「キャリア」は、利用される投与量および濃度で、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または安定化剤を含む。生理学的に許容され得るキャリアは、水性のｐＨ緩衝液であることが多い。生理学的に許容され得るキャリアの例は、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオンを形成する塩；ならびに／または、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のような、非イオン性界面活性剤である。
【０１００】
活性成分はまた、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて、例えば、界面重合により調製されたマイクロカプセル中、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、それぞれ、取り込まれ得る。インビボ投与に使用される製剤は、滅菌しなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により、容易に実現される。
【０１０１】
徐放性調製物もまた調製され得る。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許番号第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成された注射可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間以上の分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。
【０１０２】
カプセル封入された抗体が、長期間体内に残留する場合は、それらは、３７℃で水分に曝露された結果として、変性または凝集し得、生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性を生じる。関連メカニズムに基づいて（例えば、凝集メカニズムが分子間であることが分った場合など）、安定化のための理論的戦略を考慮してもよい。
【０１０３】
例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適当な添加剤の使用、および特異的ポリマーマトリクス組成物の開発により、実現され得る。
【０１０４】
本発明は、単独療法として、または他の処置オプションとの組み合わせで、ＲＯＮに特異的な抗体またはそのフラグメントの治療有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む処置の方法を提供する。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。そのような抗体は、様々な技術によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、マウス、ウサギ、およびヒトの抗体を含み得る。別の実施形態において、投与された抗体はヒト抗体である。別の実施形態において、前記抗体は、ＲＯＮ６またはＲＯＮ８の少なくとも１個のＣＤＲ配列を含む。これらの方法が有用である状態は、ＲＯＮを発現する腫瘍、炎症性疾患、過増殖性疾患、ならびに肝臓、胆道、胆管、胆嚢、および関連する肝胆汁系の疾患を含む。
【０１０５】
本明細書中で議論されるように、本発明の抗ＲＯＮ抗体は、単独療法として、および／または他の治療剤との組み合わせで、限定されないが、腫瘍性の状態または非腫瘍性の状態を含む、任意の病理学的状態を処置するために使用され得ることが意図されている。特定の状態、例えば、癌の処置に関して、抗体が、第一線の処置戦略として（例えば、新規に診断された癌患者における処置の最初の治療として）または第二処置戦略として（例えば、他の薬剤を使用して以前に処置されたが、第１の薬剤に反応しなかったか、またはそれに対して耐性になった癌患者の処置）、単独または他の処置薬剤と組み合わせて使用され得ることがさらに意図されている。
【０１０６】
処置は、哺乳動物における疾患の任意の処置を意味し、以下を含む：（１）疾患に罹患する傾向にあるが、まだ疾患の症状を経験もしくは提示していない哺乳動物における疾患発生の予防；例えば、臨床症状の突発の予防；（２）疾患の阻止、例えば、その発症の停止；または、（３）疾患の緩和、例えば、疾患の症状の退縮。
【０１０７】
本発明の方法において、本発明の抗体の治療有効量が、それを必要とする哺乳動物に投与される。本明細書中で使用される用語「投与する」は、本発明の抗体を哺乳動物に、求められる結果を達成することができる任意の方法によって送達することを意味する。それらは、例えば、静脈内または筋肉内に投与できる。本発明のヒト抗体はヒトへの投与に特に有用であるが、それらは同様に他の哺乳動物にも投与できる。本明細書中で使用される用語「哺乳動物」は、限定されないが、ヒト、実験動物、ペット、および家畜を含むことが意図される。「治療有効量」は、哺乳動物に投与される場合、キナーゼ活性の阻害または腫瘍成長の阻害のような所望の治療効果を生じるのに有効である本発明の抗体の量を意味する。
【０１０８】
本発明の抗ＲＯＮ抗体は、腫瘍または病理学的状態の進行を予防、阻害、または軽減するのに十分な量で、腫瘍または血管形成に関連する病理学的状態に罹患している患者への治療処置のために投与されることができる。進行は、例えば、腫瘍または病理学的状態の成長、侵襲、転移、および／または再発を含む。これを実現するために適当な量が、治療有効量として定義される。この用途のために有効な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するだろう。投薬スケジュールもまた、病態および患者の状態により変動し、典型的には単回ボーラス投与または連続注入から、１日の複数回投与（例えば、４〜６時間毎）までの範囲であるか、または担当医および患者の状態により指示されるものであろう。しかしながら、本発明が特定の投与量に限定されないことは注意されるべきである。
【０１０９】
本発明の抗体の好適な投与量は、本発明において例示されたインビボデータに基づいて決定され得る。インビボ実験は、３日毎に約１ｍｇ／２０ｇの投与量を使用した。マウスの平均は約０．０２ｋｇであり、その体積は約０．００８ｍ２である。ヒトの平均は約７０ｋｇであり、その体積は約１．８５ｍ２である。約２００ｍｇ／ｍ２の投与量は、マウスにおいて約４０ｍｇ／ｋｇに相当し、ヒトにおいてはおおまかに約２．６ｍｇ／ｋｇである。この投与量を正しく判断するために、別の抗体Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を、約２５０ｍｇ／ｍ２、１週間当たり１回投与した。これはヒトにおいて約６．５ｍｇ／ｋｇである。これらの計算および実験に基づいて、ヒトに投与される投与量は、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ（１回投与量／週）である。この投与量は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）についての投与量、例えば、約６ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇに類似し得る。
【０１１０】
本発明の１つの実施形態は、本発明の抗体によるＲＯＮのインビボ阻害が腫瘍成長を阻害することを意図する。図４Ｄに示されるように、ＲＯＮ抗体は、ヌードマウスにおいて増殖したＨＴ−２９細胞を皮下投与で阻害する。種々の実施形態において、腫瘍成長は、少なくとも約２０％、または少なくとも約４０％抑制される。図４Ｄは、ＨＴ−２９腫瘍成長の約５０〜６０％の減少を４０日間にわたって示す。
【０１１１】
本発明による抗ＲＯＮ抗体は、種々の実施形態において、ＲＯＮ、ＭＡＰＫ、およびＡＫＴ（例えば、ＨＴ−２９、Ｃｏｌｏ２０５、ＡＧＳ、およびＤＵ１４５）のＭＳＰ誘導リン酸化の、少なくとも約６０％、約８０％、または約１００％をブロックすることができる。図５Ａにおいて、レーン１および３のバンドは、ほぼ同一であり、そのようなリン酸化の完全ブロッキングを示す。ＭＡＰＫおよびＡＫＴのリン酸化は、細胞の増殖（経時的な細胞数の増加）、移動（薬剤、特にＭＳＰへの細胞の移動、すなわち化学誘引）、浸潤（新たな組織を通って移動する能力）、および生存に重要であると考えられる。接着ＨＴ−２９細胞およびＣｏｌｏ２０５細胞の増殖は、ＲＯＮ抗体および１０％血清の存在下で、約２０％〜約３０％、または約２５％阻害され得る。さらに、ＨＴ−２９およびＣｏｌｏ２０５が、ＲＯＮ抗体および１０％血清の存在下で軟寒天において増殖される場合、コロニー形成は、ＨＴ−２９について約６０％〜約８０％、より典型的には約７５％、そしてＣｏｌｏ２０５については約５０％〜約７０％、より典型的には６０％阻害され得る。
【０１１２】
本発明は、ＲＯＮ特異的抗体が、軟寒天において癌細胞の増殖を阻害し、そして増殖を阻害すると同時に、細胞培養条件において接着細胞として成長させすることができるという知見に基づく。ＲＯＮ抗体は、ヌードマウスに注射された場合に、癌細胞株の腫瘍を形成する能力を著しく遅延させることができ、それは、ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼの阻害が、結腸癌細胞の増殖に負に作用することを実証する。
【０１１３】
従来のウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー手法を使用して、ＲＯＮが、多くのヒト腫瘍細胞株において発現することが見出された：結腸（ＨＴ−２９、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−Ｉ、Ｓｗ４８０、Ｓｗ６２０）、膵臓（ＢＸＰＣ−３、ＣＡＰＡＮ−２、ＡＳＰＣ−Ｉ、ＨＰＡＦ−ＩＩ、Ｌ３．７ｐｌ＃７、Ｈｓ７６６Ｔ）、前立腺（ＤＵ−１４５、ＰＣ−３）、胃（ＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７）、肺（Ａ５４９、Ｈ５９６）、肝臓（ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ−１８２）、および胸部（ＪＩＭＴ１、ＤＵ４４７５、ＡＵ５６５）。したがって、種々の細胞型に由来した腫瘍が、ＲＯＮ抗体の治療標的である。
【０１１４】
処置される腫瘍は、原発性腫瘍および転移性腫瘍、ならびに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独、またはそれらの組合せでの処置に反応しないか、またはその処置に耐性である腫瘍を含む。難治性腫瘍はまた、そのような薬剤による処置によって阻害されるが、処置が中断されて５年以内に、時には最大１０年またはそれ以降に再発すると思われる腫瘍も包含する。
【０１１５】
処置され得る腫瘍は、脈管化されていない腫瘍、またはまだ実質的に脈管化されていない腫瘍、ならびに脈管化された腫瘍を含む。処置され得る固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫およびリンパ腫を含む。そのような腫瘍のいくつかの例は、類表皮腫、扁平上皮腫、例えば、頭部および頸部の腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、小細胞肺腫瘍および非小細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および肝臓腫瘍を含む。他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫、および脳転移、黒色腫、胃腸管および腎臓の癌腫および肉腫、横紋筋芽細胞腫、膠芽腫、好ましくは多形性膠芽腫、および平滑筋肉腫を含む。
【０１１６】
特に治療的に興味深いのは、結腸、膵臓、前立腺、胃、肺、および肝臓の癌であるが、しかしながら、本発明の抗体の投与が治療利益をもたらし得る、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患を含む病理学的状態のあらゆる形態が、本発明の範囲内に含まれることが本明細書中で意図される。前記病理学的状態は、当業者によって、かつ本明細書中に提供される教示に照らして、容易に決定され得る。
【０１１７】
したがって、ヒト抗ＲＯＮ抗体は、脈管化された腫瘍もしくは新生物または血管形成疾患を有する対象の処置に有効であり得る。そのような腫瘍および新生物は、例えば、芽細胞腫、癌腫または肉腫、ならびに高度に脈管化された腫瘍および新生物のような悪性腫瘍および新生物を含む。本発明の方法によって処置され得る癌は、例えば、膀胱、副腎、精巣、ＣＮＳおよび末梢神経系、脳、尿生殖路、リンパ系、胃、腎臓系、結腸、喉頭、肺および骨の癌を含む。非限定的例は、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部および頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腺癌ならびに小細胞肺腫瘍および非小細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および肝臓腫瘍をさらに含む。この方法はまた、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、およびヒト悪性角化細胞のような悪性角化細胞の増殖を抑制することによって処置することができる皮膚癌を含む、脈管化された皮膚癌の処置のためにも使用される。処置され得る他の癌は、上皮間充織転換（ＥＭＴ）、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物（神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移）、黒色腫、胃腸管および腎臓の乳頭状癌を含む腎臓の癌腫および肉腫、横紋筋芽細胞腫、多形性膠芽腫を含む膠芽腫、および平滑筋肉腫を含む。
【０１１８】
本発明の別の態様において、抗ＲＯＮ抗体は、腫瘍関連血管形成を阻害する。受容体チロシンキナーゼによる血管内皮細胞の刺激は、腫瘍の脈管化に関連する。典型的には、血管内皮は、パラクリン様式で刺激される。
【０１１９】
抗ＲＯＮ抗体の投与は、単独療法を構成する。他の意図される実施形態において、抗ＲＯＮ抗体が、抗新生物薬または所定の病理学的状態に対して活性な他の薬剤と組み合わせて投与される併用療法が含まれ得る。
【０１２０】
抗新生物薬は、ＲＯＮ抗体と別個に、またはＲＯＮ抗体の結合体として投与され得る。現在当該分野において公知または評価されている抗新生物薬は、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレーション抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存（ａｎｔｉ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）剤、生物学的反応修飾剤、抗ホルモン薬、および抗血管形成剤を含む、様々なクラスに分類できる。
【０１２１】
本発明による「有機小分子」は、従来の抗新生物薬として定義され、例えば、抗体または核酸分子のような比較的大きな生体分子ではないものである。例えば、公知の抗新生物薬の多くは、特にトポイソメラーゼ阻害剤のような有機小分子である。したがって、本発明の実施形態は、任意選択的に、トポイソメラーゼ阻害剤が、ＲＯＮに結合する抗体と組み合わせて投与される方法を含む。阻害剤は、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩの阻害剤であってもよい。トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン（ＣＰＴ−ＩＩ）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカンを含む。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）を含む。他の物質が、トポイソメラーゼ阻害活性および抗新生物薬としての有効性に関して現在評価されている。任意選択的に本発明の抗体と同時に投与される他の有機小分子抗新生物薬または化学療法剤は、アルキル化剤または代謝拮抗剤であってもよい。アルキル化剤の例は、限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンを含む。さらなる有機小分子は、タキソール、ドキソルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、メトトレキセート、ゲムシタビン、オキシプラチン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコウリン（ＬＵ）、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−ＩＩ）、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、エポチロン、シスプラチン／カルボプラチン、およびペグ化されたアドリアマイシンなどの、細胞毒および／または化学療法剤を含む。有機小分子は、以下のような組合せで投与され得る：（ＣＰＴ−ＩＩ；５−ＦＵ；ＬＵ）；（パクリタキセル；５−ＦＵ）；および、（ＣＰＴ−ＩＩ；５−ＦＵ；ＬＵ）。
【０１２２】
抗新生物薬は、放射線も含む。抗新生物薬が放射線である場合、放射線の供給源は、処置される患者の外部（外部ビーム放射線療法−ＥＢＲＴ）または内部（近接照射療法−ＢＴ）のいずれかであることができる。投与される抗新生物薬の投与量は、例えば、薬剤の種類、処置される腫瘍の種類および重篤度、ならびに薬剤の投与経路を含む、多くの因子に依存する。しかしながら、本発明は、いかなる特定の投与量に限定されるものではないことは強調されるべきである。放射線は、他の抗新生物薬と組合せて使用され得る。
【０１２３】
本発明の別の態様において、抗ＲＯＮ抗体または抗体フラグメントは、特に、抗体が取り込まれる場合に、抗腫瘍薬または検出可能なシグナル発生薬に化学的または生合成的に連結させることができる。抗体に連結された抗腫瘍薬は、その抗体が結合している腫瘍、あるいはその抗体が結合している細胞の環境にある腫瘍を破壊または損傷する任意の薬剤を含む。例えば抗腫瘍薬は、化学療法剤および放射性同位元素のような毒物である。好適な化学療法剤は、当業者に公知であり、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メトトレキセート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、およびカリケアミシンを含む。化学療法剤は、従来の方法を用いて抗体に結合体化される（例えば、ＨｅｒｍｅｎｔｉｎおよびＳｅｉｌｅｒ、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８２：１９７−２１５（１９８８）を参照のこと）。
【０１２４】
ＲＯＮ抗体はまた、癌患者に放射性同位元素と共に投与され得る。抗腫瘍薬としての使用に好適な放射性同位元素はまた、当業者に公知である。例えば、１３１Ｉまたは２１ＩＡｔが使用され得る。これらの同位体は、従来の技術を用いて抗体に付着される（例えば、Ｐｅｄｌｅｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８，６９−７３（１９９３）を参照のこと）。あるいは、抗体に付着された抗腫瘍薬は、プロドラッグを活性化する酵素であり、この方法において、いったん抗体複合体が投与されると、腫瘍部位へ到達するまでは不活性型であり続け、腫瘍部位でその細胞毒型へと変換されるプロドラッグが投与される。実際に、抗体酵素結合体が患者に投与され、処置される組織の領域内で局在化させることが可能である。次いで、プロドラッグが、細胞毒薬物への転換が処置される組織の領域で生じるように、患者へ投与される。あるいは、抗体に結合体化された抗腫瘍薬は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような、サイトカインである。抗体は、サイトカインで腫瘍を標的化し、その結果サイトカインは、他の組織に影響を及ぼすことなく、腫瘍の損傷または破壊を媒介する。サイトカインは、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＤＮＡレベルで抗体に融合される。インターフェロンもまた使用され得る。
【０１２５】
本発明はまた、本発明の抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の非癌性過増殖性疾患を処置する方法も提供する。本明細書中で開示される「過増殖性疾患」は、受容体のＲＯＮファミリーのメンバーを発現する非癌細胞の過剰な増殖により引き起こされる状態と定義される。過増殖性疾患により生成された過剰な細胞は、ＲＯＮを正常レベルで発現するか、ＲＯＮを過剰発現し得る。
【０１２６】
本発明によって処置できる過増殖性疾患の種類は、ＲＯＮのリガンドまたはそのようなリガンドの突然変異体によって刺激される任意の過増殖性疾患である。過増殖性疾患の例は、乾癬、光線性角化症、および脂漏性角化症、疣、ケロイド瘢痕、および湿疹を含む。パピローマウイルス感染症のような、ウイルス感染により引き起こされた過増殖性疾患もまた含まれる。例えば、乾癬は、多くの異なる変形および重篤度で生じる。様々な種類の乾癬は、膿様疱疹（膿疱性乾癬）、皮膚の重度の腐肉（紅皮症性乾癬）、液滴様斑点（滴状乾癬）、および平坦な炎症病巣（インバース乾癬）のような特徴を示す。あらゆる種類の乾癬（例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、紅斑性乾癬、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症）の処置が、本発明により意図される。
【０１２７】
過増殖性疾患の処置のために、上記で記載される本発明の抗体の投与は、任意の従来の治療薬の投与と組合せることができる。例えば過増殖性疾患が乾癬である場合、様々な従来の全身性および局所性薬剤が利用可能である。乾癬の全身性薬剤は、メトトレキサート、ならびにアシトレチン、エトレチネート、およびイソトレチノインのような経口レチノイドを含む。他の乾癬の全身性治療は、ヒドロキシ尿素、ＮＳＡＩＤ、スルファサラジン、および６−チオグアニンを含む。抗生物質および抗微生物薬を使用し、乾癬を引き起こし悪化させる感染を処置または予防できる。乾癬の局所用薬剤は、アントラリン、カルシポトリエン、コールタール、コルチコステロイド、レチノイド、角質溶解剤、およびタザロテンを含む。局所用ステロイドは、軽度から中等度の乾癬のために処方される最も一般的な治療法の１つである。局所用ステロイドは、皮膚の表面に塗布されるが、一部は乾癬病巣中に注射される。
【０１２８】
過増殖性疾患の処置は、光線療法と組合せた抗ＲＯＮ抗体の投与をさらに含む。光線療法は、過増殖性疾患の症状を軽減する任意の波長の光の投与、ならびに、化学療法剤の光活性化（光線化学療法）を含む。過増殖性障害の処置のさらなる議論については、ＷＯ  ０２／１１６７７（Ｔｅｕｆｅｌら、表皮増殖因子受容体アンタゴニストでの過増殖性疾患の処置を記載する）を参照のこと。
【０１２９】
本発明において、任意の好適な方法または経路を使用して本発明の抗ＲＯＮ抗体を投与し、そして任意選択的に、他の薬剤、例えば、抗新生物薬および／または他の受容体のアンタゴニストを同時投与することができる。本発明によって利用される抗新生物薬の養生法は、患者の新生物状態の処置のために最も好適であると考えられる養生法を含む。別の悪性疾患は、特異的な抗腫瘍抗体および特異的な抗新生物薬の使用を必要とする場合があり、これは患者毎に決定されるであろう。投与の経路は、例えば、注射投与、非経口投与、注入投与、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む。投与されるアンタゴニストの投与量は、例えば、アンタゴニストの種類、処置される腫瘍の種類および重篤度ならびにアンタゴニストの投与経路を含む、多くの要因に依存する。しかしながら、本発明が、投与の特定の方法または経路に限定されないことは強調されるべきである。
【０１３０】
特に癌の処置のために、抗ＲＯＮ抗体は、腫瘍成長もしくは腫瘍関連血管形成に関与するＲＴＫまたはそれらに関連した下流のシグナル伝達エレメントの活性を阻害する、細胞内ＲＴＫアンタゴニストと共に投与できる。細胞内ＲＴＫアンタゴニストは、好ましくは小分子である。小分子のいくつかの例は、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、ならびに無機化合物を含む。小分子中の原子は、共有結合およびイオン結合を介して互いに連結される。前者は、小分子チロシンキナーゼ阻害剤のような有機小化合物に典型的であり、後者は、無機小化合物に典型的である。有機小分子中の原子の配置は、鎖、例えば、炭素−炭素鎖または炭素−ヘテロ原子鎖を表すか、または炭素原子を含む環、例えば、ベンゼンもしくは多環式系、または炭素およびヘテロ原子の組合せ、すなわちピリミジンまたはキナゾリンのようなヘテロ環を表し得る。小分子は、任意の分子量を有することができるが、それらは一般的に、分子量が６５０Ｄを超えないことを除いて、他の点では生物学的分子と考えられる分子を含む。小分子は、ホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質、およびそれらの誘導体のような天然に見出される化合物、ならびに、伝統的な有機合成、生物媒介合成、またはそれらの組合せのいずれかにより合成的に作製された化合物の両方を含む。例えば、Ｇａｎｅｓａｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ７（１）：４７−５５（Ｊａｎ．２００２）；Ｌｏｕ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，６（２４）：１２８８−１２９４（Ｄｅｃ．２００１）を参照のこと。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明による細胞内ＲＴＫアンタゴニストとして使用されるべき小分子は、キナーゼドメインを有するＥＧＦＲの細胞内結合領域、またはＥＧＦＲ活性化のシグナル伝達経路に関連したタンパク質への結合に関してＡＴＰと競合する細胞内ＲＯＮアンタゴニストである。そのようなシグナル伝達経路の例は、ｒａｓ−マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）経路、およびシグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）経路を含む。そのような経路に関連したタンパク質（およびそれに本発明による小分子ＲＯＮアンタゴニストが結合することができるタンパク質）の非限定的な例は、ＧＲＢ−２、ＳＯＳ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含む。
【０１３２】
特に癌のための、本明細書に記載される処置の方法はまた、他の抗体の投与と併せて実行され得る。例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）のようなＥＧＦＲに対する抗体も、特に結腸癌を処置する場合に投与され得る。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）ＭＡｂは、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合する、組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は、ＥＧＦＲアンタゴニストであり、それはＥＧＦＲへのリガンド結合をブロックし、受容体の活性化を防止し、そしてＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は、難治性であるかまたはイリノテカンベースの化学療法を許容できない、上皮増殖因子受容体発現の転移性結腸直腸癌患者の処置において、イリノテカンと組合せたまたは組合せない使用が承認されている。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）はまた、乾癬の処置にも有効であることが示されている。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）に加えて、他の抗体、例えば、ＶＥＧＦ抗体、ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ＰＤＧＦＲα抗体、およびＰＤＧＦＲβ抗体が使用され得る。
【０１３３】
併用のための他の抗体は、ヘルセプチン（トラスツマブ）（ＨＥＲ２を発現する乳癌細胞、または他の癌細胞でのＨＥＲ２発現に対する抗体）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシツマブ）（血管形成を阻害する抗体）を含む。組み合わせのための他の抗体は、例えば、２００５年２月２４日に公開された国際特許出願ＷＯ２００５／０１６９７０（例えば、１８頁、表１を参照のこと）に記載されるような、抗体２Ｆ８およびＡ１２を含む、ヒトインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦＲ）に特異的に結合する抗体であり、それは以下のＣＤＲ配列を有する：
【表１】
2011504176.tif 000007
【０１３４】
本明細書に記載される処置の方法はまた、他のペプチドの投与と共に実行され得る。例えば、ＭＳＰの変異体は、この変異体がＲＯＮに結合するが、ＲＯＮを活性化しないか、または少なくともＭＳＰを競合的に阻害する場合に投与され得る。例えば、米国公開出願番号第２００３／００７３６５６号を参照のこと。
【０１３５】
他の抗体および／または有機小分子と組み合わせたＲＯＮ抗体の投与は、同時に、または別個に、同じまたは異なる経路により起こり得る。
【０１３６】
本発明の抗ＲＯＮ抗体は、ＲＯＮアンタゴニスト、および／またはＲＴＫリガンドをブロックするかまたはＲＴＫを阻害する抗体のような他のＲＴＫのアンタゴニストと共に投与できる。他のそのようなＲＴＫの例は、ＥＧＦＲ、ｃ−ｍｅｔ、およびＶＥＧＦＲを含む。
【０１３７】
本発明の１つの実施形態において、抗ＲＯＮ抗体は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストと組合せて使用される。例えば、Ｗｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；１２（２１）６５７３−６５８４（２００６）に記載されるようなＶＥＧＦＲアンタゴニストＩＭＣ−１８Ｆ１である。本発明の１つの実施形態において、抗ＲＯＮ抗体は、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ受容体と特異的に結合する受容体アンタゴニストと組合せて使用される（１９９２年２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０１３００；Ｔｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６７７−１６８３（１９９１））。別の実施形態において、抗ＲＯＮ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ／Ｆｉｔ−Ｉ受容体に特異的に結合する受容体アンタゴニストと組合せて使用される（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５，５１９−５２４（１９９０））。特に好ましいのは、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインに結合し、かつリガンド（ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ）による結合をブロックし、かつ／またはＶＥＧＦ誘導活性化もしくはＰｌＧＦ誘導活性化を阻害する抗原結合タンパク質である。例えば、Ｍａｂ  ＩＭＣ−１１２１は、可溶性の細胞表面に発現さしたＫＤＲに結合する。Ｍａｂ  ＩＭＣ−１１２１は、ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーから得られたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む（ＷＯ  ０３／０７５８４０を参照のこと）。別の例において、ＳｃＦｖ  ６．１２は、可溶性の細胞表面に発現したＦｉｔ−Ｉに結合する。ＳｃＦｖ  ６．１２は、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ  ６．１２のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。ＭＡｂ  ６．１２を産生するハイブリドーマ細胞株は公知であり、Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  １０４（９），２８９３−２９０２（２００４）に報告されている。
【０１３８】
このようなＲＴＫの別の例は、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）である。特定の腫瘍細胞において、ＲＴＫ機能の阻害は、他の増殖因子受容体シグナル伝達経路のアップレギュレーションにより、特にＲＯＮ刺激により補償できる。さらに、ＩＧＦＲシグナル伝達の阻害は、特定の治療薬に対する腫瘍細胞の感度を増大させる。ＲＯＮまたはＩＧＦＲのいずれかの刺激は、Ａｋｔおよびｐ４４／４２を含む、共通の下流シグナル伝達分子のリン酸化を生じるが、程度は異なる。したがって、本発明の実施形態において、ＩＧＦＲアンタゴニスト（例えば、ＩＧＦまたはＩＧＦＲに結合し、その受容体を阻害する抗体）は、本発明の抗体と同時投与され、それによって、共通の下流シグナル伝達経路の二次インプットをブロックする（例えば、Ａｋｔおよび／またはｐ４４／４２の活性化を阻害する）。ＩＧＦＲに特異的なヒト抗体の例は、ＩＭＣ−Ａ１２である（ＷＯ  ２００５／０１６９７０号を参照のこと）。
【０１３９】
ＲＯＮと組合せて標的化され得る別の受容体は、ＥＧＦＲである。ＥＧＦＲは、上記で記載されるようなＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）のような抗体で、または有機小分子で、標的化され得る。小分子ＲＴＫアンタゴニストの一例は、ＩＲＥＳＳ  Ａ（商標）（ＺＤ  １９３９）であり、それは、ＥＧＦＲを阻害するためにＡＴＰ擬態として機能するキノザリン誘導体である。米国特許番号第５６１６５８２号（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）；ＷＯ  ９６／３３９８０（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の４頁を参照のこと；また、Ｒｏｗｉｎｓｋｙら、３７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＳＣＯ（サンフランシスコ，ＣＡ，２００１年５月１２−１５日）で示されたＡｂｓｔｒａｃｔ  ５を参照のこと；Ａｎｉｄｏら、３７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＳＣＯ（サンフランシスコ，ＣＡ，２００１年５月１２−１５日）で示されたＡｂｓｔｒａｃｔ  １７１２を参照のこと。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの別の例は、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（ＯＳＩ−７７４）であり、それは４−（置換フェニルアミノ）キノザリン誘導体［６，７−ビス（２−メトキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニル−フェニル）アミン塩酸塩］ＥＧＦＲ阻害剤である。ＷＯ  ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）の例えば２頁１２行から４頁３４行および１９頁１４−１７行を参照のこと。また、Ｍｏｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４８３８−４８（１９９７）；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２９１：７３９−４８（１９９９）を参照のこと。ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）は、ｐ２７媒介細胞周期停止を生じるＥＧＦＲ、ならびにその下流ＰＩ３／ＡｋｔおよびＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼシグナル伝達経路のリン酸化を阻害することによって機能し得る。Ｈｉｄａｌｇｏら、３７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＳＣＯ（サンフランシスコ，ＣＡ，２００１年５月１２−１５日）で示されたＡｂｓｔｒａｃｔ  ２８１を参照のこと。上記有機小分子もまた、ＲＯＮを阻害し得る。
【０１４０】
腫瘍形成に関連した増殖因子受容体の他の例は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の受容体である。これらの受容体は、ＲＯＮと組み合わせて標的化され得る。
【０１４１】
別の実施形態において、抗ＲＯＮ抗体は、１種以上の好適なアジュバント、例えばサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）、または限定されないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドのような他の免疫刺激因子と組合せて投与できる。
【０１４２】
併用療法において、抗ＲＯＮ抗体は、他の物質による治療の開始の前、治療中、実質的に治療と同時、または治療後、ならびにそれらの組合せ、すなわち抗新生物薬療法の開始の前および治療中、治療の開始の前および治療後、治療中および治療後、または治療の開始の前、治療中、および治療後に投与される。例えば、抗ＲＯＮ抗体は、放射線療法の開始前１〜３０日、または３〜２０日、または５〜１２日の間投与できる。本発明の１つの実施形態において、化学療法は、抗体療法と同時に、または抗体療法に続けて施される。
【０１４３】
本発明は、標的部分またはレポーター部分が連結される本発明のＲＯＮ抗体または抗体フラグメントをさらに意図する。標的部分は、結合対の第一のメンバーである。抗腫瘍薬は、例えば、そのような対の第二のメンバーに結合体化され、それによって、抗原結合タンパク質が結合される位置に向けられる。このような結合対の一般的な例は、アビジンおよびビオチンである。好ましい実施形態において、ビオチンは、本発明の抗原結合タンパク質に結合体化され、それによってアビジンもしくはストレプトアビジンに結合体化された抗腫瘍薬または他の部分に標的を提供する。あるいは、ビオチンまたは他のそのような部分は、本発明の抗原結合タンパク質に連結されて、そして、例えば、検出可能なシグナル産生物質がアビジンまたはストレプトアビジンに結合体化された診断システムでレポーターとして使用される。
【０１４４】
検出可能なシグナル生成物質は、診断目的のためにインビボおよびインビトロで有用である。シグナル生成物質は、通常、電磁気放射線照射の指標である、外部手段によって検出可能な測定可能なシグナルを生じる。シグナル生成物質は、大抵、酵素もしくは発色団であるか、または蛍光、リン光もしくは化学発光により光を放出する。発色団は、紫外または可視領域の光を吸収する色素を含み、基質または酵素触媒された反応物の分解産物であってよい。
【０１４５】
さらに、本発明の範囲内に、当該分野において周知である、研究方法または診断方法のためのインビボおよびインビトロでの本発明の抗体の使用が含まれる。診断方法は、本発明の抗体を含有するキットを含む。そのようなキットは、個体の細胞上のＲＯＮの過剰発現を検出して、特定の種類の癌の危険性のある個体を特定するのに有用である。さらに、本発明の抗体は、ＲＯＮを同定する能力のゆえに研究用に実験室において使用され得る。
【０１４６】
本発明はまた、キット、例えば、治療的有効量のヒト抗ＥＧＦＲ抗体を含む、腫瘍成長および／または腫瘍関連血管形成を阻害するキットも含む。キットは、例えば、腫瘍形成または血管形成に関連した別の増殖因子受容体（例えば、上記で記載される、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲなど）の任意の好適なアンタゴニストをさらに含有できる。あるいは、または加えて、本発明のキットは、抗新生物薬をさらに含むことができる。本発明の文脈において好適な抗新生物薬の例は、本明細書中に記載されている。本発明のキットは、アジュバントをさらに含むことができ、その例も上記に記載されている。
【０１４７】
本発明は、ＲＯＮ６またはＲＯＮ８と同じ機能を有する抗体、またはそのフラグメントを同定および単離する方法をさらに提供し、ここで、ライブラリーのスクリーニングは、固形支持体に結合したリガンド結合機能を有するＲＯＮを含有する親和性マトリクスを提供すること、親和性マトリクスを抗体フラグメントのライブラリーと接触させること、および親和性マトリックスに結合しない抗体フラグメントから親和性マトリックスに結合した抗体フラグメントを分離することを含む。
【０１４８】
固形支持体は、ＲＯＮが接着することができる非水性マトリクスを意味する。本明細書中に包含される固相の例は、ガラス（例えば、制御多孔性ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコンで一部または全体が形成されたものを含む。特定の実施形態において、状況に応じて、固相は、アッセイプレートのウェルを含むことができ、他の場合には精製カラム（例えば、親和性クロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、米国特許番号第４２７５１４９号に開示されたもののような、ばらばらの粒子の不連続固相も含む。
【０１４９】
本発明はまた、本発明において提供されるもの以外のＲＯＮ抗体が使用される場合の処置の方法も提供する。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態が、本明細書で詳細に述べられている。本発明は、これらの特定の実施形態と併せて記載されるが、本発明をそのような特定の実施形態に限定することが意図されていないことは理解されるだろう。反対に、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神および範囲内に含まれ得る代替物、変更物、および等価物をカバーすることが意図されている。この記載において、数多くの特定の詳細が本発明の完全な理解を提供するために記載されている。本発明は、これらの特定の詳細の一部または全てが無くても実施され得る。他の例では、周知のプロセス操作は、本発明を不必要に分かりにくくしないために、詳細には記載されていない。
【０１５１】
本明細書において参照される上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、および外国の特許、外国の特許出願の全ては、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１５２】
明細書中に引用された全ての刊行物は、本発明が属する当該分野における当業者のレベルを示す。これらの刊行物は、まるで各刊行物が参照によって組み込まれることを具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が全て参照によって本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１５３】
下記実施例は、単に例証目的で提供され、決して本発明の範囲を限定することは意図されていない。この実施例は、ベクターおよびプラスミドの構築、そのようなベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードしている遺伝子の挿入、またはプラスミドの宿主細胞への導入において利用される方法のような、従来の方法の詳細な説明は含まない。そのような方法は、当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを含む、多くの刊行物に記載されている。
【０１５４】
（材料および方法）
（２種の抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８の開発および特徴）
（実施例１：抗ＲＯＮ抗体の産生）
ヒト抗ＲＯＮモノクローナル抗体（本明細書においてＲＯＮ６およびＲＯＮ８とも呼ばれる）を、ヒト免疫グロブリンγ重鎖およびκ軽鎖を産生する、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、標準的なハイブリドーマ技術（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ編，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８），参照によって本明細書中に組み込まれる）によって産生した。ＨｕＭＡｂマウスを、ＲＯＮ細胞外ドメインフラグメント、完全フロイントアジュバントにおいてヒトＲＯＮ受容体を過剰発現するＲＥ７細胞およびＭＤＣＫ細胞で皮下に（ｓ．ｃ．）免疫処理した。動物を、融合の前に、不完全フロイントアジュバント中の同じＲＯＮタンパク質で３回腹腔内に（ｉ．ｐ．）追加抗原処理した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の２５μｇＲＯＮタンパク質のｉ．ｐ．追加抗原処理を最終的に行う前に、動物を１ヶ月間休息させた。４日後、免疫処理したマウスから脾細胞を回収し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ：１４５０ＫＤ）を使用してＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３  Ｂｃｌ−２形質転換体形質細胞腫細胞と融合させた。融合の後、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地に再懸濁し、ハイブリドーマ細胞の確立のために、１ウェルにつき２００μｌの密度で９６ウェルプレートに分配した。融合の６日後に、培地の１００μｌを吸引し、１００μｌの新しい培地と置き換えた。
【０１５５】
１８０個のハイブリドーマクローンを、１つの融合物からｒｈｕ−ＲＯＮタンパク質と反応性の抗体を産生した陽性クローンとして特定したことに注意すべきである。１８０個の結合陽性クローンのうち、たった５種のクローンのみをブロッキング活性を有すると特定した。これら５種のうち、たった２種、ＲＯＮ６およびＲＯＮ８を、それらの優れた結合特性に基づいて、さらなる開発のために選択した。
【０１５６】
ブロッキング活性を示すこれらのハイブリドーマクローンのサブクローニングを、ＲＯＮに対するｍＡｂを産生するモノクローナルハイブリドーマ細胞株を確立するために３回実施した。
【０１５７】
ブロッキング活性を備えるクローンを、より強いブロッキング活性の選択のためにさらに確認した。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８として表わされるクローンは、ＥＬＩＳＡおよび高親和性（ＫＤ値＝それぞれ４５および２３ｐＭ）において測定されたように、２〜３ｎＭのＩＣ５０のより強いブロッキング活性を有した。これら２種のクローンを、さらなる開発のために選択した。
【０１５８】
ＲＯＮ６抗体およびＲＯＮ８抗体はＩｇＧ抗体であり、それぞれの重鎖および軽鎖は配列が決定されている。各抗体の構造は以下の図面および対応する配列から容易に理解される。
【０１５９】
（ＲＯＮ６の構造）
ＲＯＮ６抗体は、配列番号９のＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号１０として、それぞれ図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃによって一緒に示される、２つの重鎖を含む。図２Ａの最初の１９残基／コドントリプレットが、成熟抗体鎖には存在しない分泌シグナル配列を表すことに注意すべきである。
【０１６０】
ＲＯＮ６抗体はまた、配列番号１１のＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号１２として、それぞれ図２Ｄ〜２Ｅによって一緒に示される、２つの軽鎖を含む。図２Ｄの最初の１９残基／コドントリプレットが、成熟抗体鎖には存在しない分泌シグナル配列を表すことに注意すべきである。
【０１６１】
（ＲＯＮ８の構造）
ＲＯＮ８抗体は、配列番号１３のＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号１４として、それぞれ図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃによって一緒に示される、２つの重鎖を含む。図３Ａの最初の１９残基／コドントリプレットが、成熟抗体鎖には存在しない分泌シグナル配列を表すことに注意すべきである。
【０１６２】
ＲＯＮ８抗体はまた、配列番号１５のＤＮＡ配列によってコードされる、配列番号１６として、それぞれ図３Ｄ〜３Ｅによって一緒に示される、２つの軽鎖を含む。図３Ｄの最初の１９残基／コドントリプレットが、成熟抗体鎖には存在しない分泌シグナル配列を表すことに注意すべきである。
【０１６３】
（実施例２：実施例１からの抗ＲＯＮ抗体は、ＲＯＮに結合し、かつそのリガンド（ＭＳＰ）へのＲＯＮ結合を阻害する）
結合ＥＬＩＳＡ：融合の１０〜１２日後に、ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡベースの結合およびブロッキングアッセイで、抗体産生ならびにｒｈ−ＲＯＮタンパク質と培養上清の特異的結合活性についてスクリーニングした。Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ  ９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、室温で１．５時間、（１μｇ／ｍｌ×１００μｌの）ｒｈ−ＲＯＮタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆した。ウェルの洗浄後、それらを、３％  ＰＢＳ／ミルクでブロックした。ハイブリドーマ上清由来の抗ＲＯＮ抗体を、次いで、被覆されたウェルに添加し、１．５時間室温でインキュベートした。数回の洗浄後、陽性結合を検出するために、１：１０００希釈の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を、１．５時間室温でプレートに添加した。陽性ハイブリドーマを、モノクローナルハイブリドーマの確立のために、限界希釈培養によって３回サブクローニングした。
【０１６４】
ＭＳＰ／ＲＯＮ相互作用をブロックする抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ：Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐ  ９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、室温で１．５時間、（１μｇ／ｍｌ×１００μｌの）ＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆した。ウェルの洗浄後、それらを、３％  ＰＢＳ／ミルクでブロックした。ハイブリドーマ上清由来の抗ＲＯＮ抗体を、まず、ｒｈ−ＲＯＮと共に１時間室温でインキュベートし、次いで、ＭＳＰ被覆ウェルに添加した。１．５時間室温でインキュベートした後、数回洗浄し、どの抗ＲＯＮ抗体がＭＳＰ／ＲＯＮ相互作用をブロックできたか検出するために、１：１０００希釈の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化抗体を、１．５時間室温でプレートに添加した。
【０１６５】
ＲＯＮへのＭＳＰ結合のＲＯＮ８ブロッキングを検出するためのＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇ／ウェルのキャリア不含ＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上で、４℃で一晩被覆した。プレートを、０．２％  ＰＢＳ／Ｔで１回洗浄し、１５０μＬ／ウェル  ３％ミルクにより、３７℃で２時間ブロックした。ＲＯＮ８の１５μｇ／ｍＬ希釈物を調製して、別のＥＬＩＳＡプレートを連続的に希釈した。ＲＯＮ８に、１００ｎｇ／ウェル組換えヒトＭＳＰＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。ＲＯＮ８／ｒｈ−ＭＳＰＲ複合体を、ロッカー上で、室温で２時間形成させた。次に、ＭＳＰ被覆ＥＬＩＳＡプレートを、０．２％ＰＢＳ／Ｔで１回洗浄し、１００μＬのＲＯＮ８／ｒｈ−ＭＳＰＲ複合体をウェルごとに添加した。室温で１．５時間インキュベーションした後、プレートを、０．２％  ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄し、組換えヒトＭＳＰＲタンパク質上でＨｉｓタグを認識する、１：２，０００希釈の抗ＨｉｓタグＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１時間インキュベートした。プレートを、０．２％  ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄し、黄色が現れるまで１００−ＡＬ基質をウェルごとに添加した。反応を、５０μＬの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、４５０ｎｍでの吸光度を標準的なプレートリーダーで測定した。その結果を、ＲＯＮ８の固相ブロッキング特性を描く図６Ａによって示す。ＥＬＩＳＡデータは、固定化組換えヒトＭＳＰと組換えヒトＲＯＮタンパク質との相互作用をブロックするのに必要なＲＯＮ８のＩＣ５０値を決定した。
【０１６６】
細胞移動：ＲＯＮ８が、ＭＳＰによって誘導されるＨ５６９肺癌細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の移動をブロックできたかどうかを決定するために、本発明者らは、多孔性の半透明ポリエチレンテレフタレートトラックエッチング膜（８．０Ａｍ細孔径；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ）を含有する２４ウェル細胞培養挿入物を使用した。アッセイが実施される前に、多孔性膜の裏面を、それらを７００μｌのＶｉｔｒｏｇｅｎ−１００精製コラーゲン溶液（２５μｇ／ｍＬ；Ｃｏｈｅｓｉｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で満たされた２４ウェルＦａｌｃｏｎプレート中に入れることによって、コラーゲンで被覆した。挿入物を、４℃で１時間そのままにし、次いで、新しい２４ウェルプレートに入れた。次に、２４時間血清飢餓状態にした６×１０５個の生存細胞を、ＰＢＳで１回洗い流し、次いで、３００μＬの血清不含培地中の細胞培養挿入物の上部チャンバー中に播種した。ＭＳＰを、７００μｌの血清不含培地中の下部チャンバーに、３７℃で２４時間添加し、コラーゲン被覆多孔性膜を通る細胞移動を誘導した。０％血清を陰性コントロールとして使用し、１０％血清を細胞移動についての陽性コントロールとして使用した。ＭＳＰの添加の前に、ＲＯＮ８を上部チャンバーのいくつかに１時間添加し、それがＨ５９６細胞のＭＳＰ誘導移動を阻害できたかどうか決定した。アッセイの終わりに、コラーゲン被覆膜の裏面に接着している移動した細胞を、ヘキスト色素（２μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色し、１００倍の拡大率で蛍光顕微鏡検査法によって撮像し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して計数した。図６Ｂは、ＲＯＮ８がＨ５６９肺癌細胞の細胞移動を阻害する能力を示す。
【０１６７】
ＲＯＮ８の、インビトロでの創傷治癒アッセイにおいて移動を阻害する能力：擦過傷を、Ｈ２９２肺癌細胞の単層に作成した。ＲＯＮ８を添加して、それが、創傷を満たす細胞の移動を誘導するＭＳＰの能力を阻害できたかどうかを決定した。Ｈ２９２肺癌細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ６ウェル細胞培養プレートに、２．５×１０５個の細胞／ウェルで播種し、コンフルエンスまで一晩増殖させた。細胞を、４８時間血清飢餓状態にした。ＭＳＰの添加の前に、いくつかのウェルを、創傷を与える前に、１時間ＲＯＮ８抗体で前インキュベートした。アッセイの開始時に、小さな創傷を、２００μｌプラスチックピペットチップに与えた。次に、細胞を、血清不含培地＋ＲＯＮ８抗体中のＭＳＰの存在の有りまたは無しで、２４時間インキュベートした。０％血清を陰性コントロールとして使用し、１０％血清を創傷への細胞移動についての陽性コントロールとして使用した。２４時間のインキュベーション後、細胞を４０倍の拡大率で明視野顕微鏡法によって撮像した。１００ｎＭのＲＯＮ８が、創傷を満たす細胞の移動を阻害したことが観察され、それによって、ＲＯＮ８の、インビトロモデルにおける細胞移動を阻害する能力を示した。
【０１６８】
ＲＯＮ８の、増殖を阻害する能力：図６Ｃは、ＢＸＰＣ３膵臓癌細胞におけるＭＳＰ誘導ＤＮＡ合成のＲＯＮ８阻害を示す。図６Ｃ（１）は、ＤＮＡ合成の指標である［３Ｈ］−チミジン取り込みのＭＳＰ刺激を示す。腫瘍細胞（１ウェルにつき１０，０００個）を、９６ウェル組織培養プレートに平板培養し、静止状態にした。細胞を、ＭＳＰで２０時間刺激した。［３Ｈ］−チミジン（０．２５ｍＣｉ）を、各ウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。放射能を取り込んだＤＮＡを、シンチレーション計数器で決定した。点は重複サンプルの平均、棒はＳＤである。図６Ｃ（２）は、細胞を、ＭＳＰの添加の前に、ＲＯＮ８で１時間前処理した系を示す。
【０１６９】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析：ＲＯＮタンパク質への抗体の結合速度を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによって決定した。組換えＲＯＮ−Ｆｃを、センサーチップ上に固定化し、抗体を様々な濃度で注入した。センサーグラム（Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を得、速度定数を決定するためにＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０ソフトウェアを使用して評価した。親和定数ＫＤを、速度定数Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比から計算した。相互作用の「Ｋｏｎ，Ｍ−１．Ｓ−１」および「Ｋｏｆｆ，Ｓ−１」速度を用いて、抗体／受容体相互作用の親和性（Ｋｄ，Ｍ）を決定した。ＲＯＮ６についてのＫｄ、Ｋｏｎ、およびＫｏｆｆ速度は、４．１ｅ−１１、２．２ｅ６、および８．６ｅ−５であった。ＲＯＮ８については、それらは３．２ｅ−１１、６．１ｅ６、および２．０ｅ−４であった。
【０１７０】
ＲＯＮ細胞表面発現のフローサイトメトリー：接着性癌細胞株由来の１，０００，０００個の細胞を、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ中で、５μｇのＲＯＮ８と共に、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋５％ＦＣＳで洗浄後、細胞を、抗ヒトＩｇＧフィコエリスリン結合体化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋５％ＦＣＳで洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ  ＳＥフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用する、フローサイトメトリーで分析した。
【０１７１】
ウエスタンブロッティングおよび免疫沈降：細胞を、１０ｃｍまたは６ウェル培養皿に平板培養し、７０〜８０％コンフルエンスになるまで増殖した。単層を、ＰＢＳで２回洗浄し、血清不含培地中で一晩培養した。次いで、抗体を添加し、３７℃で６０〜１２０分間インキュベートした。細胞を、ＭＳＰリガンドで１０分間刺激し、次いで、氷上に配置し、氷冷したＰＢＳで洗浄した。細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン中で、氷上で１０分間溶解した。溶解液を、４℃での遠心分離により澄ませた。次いで、可溶化したＲＯＮを、この溶解液から免疫沈降した。抗体ＲＯＮ、クローンＣ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）またはＲＯＮ６およびＲＯＮ８を、４μｇ／ｍｌの溶解液４００μｌと共に４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡ−アガロースビーズを４℃で２時間添加して免疫複合体を沈降させ、ペレット化し、溶解緩衝液で３回洗浄した。プロテインＡ−アガロースビーズに結合した免疫沈降物を、変性ゲルサンプル緩衝液に揮散した。溶解液または免疫沈降物を、変性ゲル電気泳動のために処理し、４〜１２％アクリルアミドゲル上に流し、ウエスタンブロットによりニトロセルロース膜にブロッティングした。チロシンリン酸化タンパク質を、抗ホスホＲＯＮ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）および抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体を使用して、ブロット上で検出した。ＲＯＮは、モノクローナル抗体ＲＯＮ  Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により検出した。ホスホ−Ａｋｔおよび総Ａｋｔ抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＭＡＰＫリン酸化について、ホスホ−ｐ４４／４２および総ｐ４４／４２抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。バンドは、Ｘ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上で、増強された化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により視覚化した。
【０１７２】
（ＩＣ５０値およびＥＤ５０値の決定のためのＥＬＩＳＡ）
抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８の、組換えヒトＲＯＮ受容体に結合する能力およびＭＳＰ／ＲＯＮ相互作用をブロックする能力を、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＥＬＩＳＡプレート上に固定された受容体を用いた場合、ＲＯＮ６およびＲＯＮ８のＲＯＮへの結合のＥＤ５０値は、各々、４．２ｐＭおよび２．１ｐＭであった。同じＥＬＩＳＡフォーマットを使用し、２種の抗体を、それらのＭＳＰ／ＲＯＮ相互作用をブロックする能力について試験した。測定されたＩＣ５０値は、ＲＯＮ６について４６ｐＭ、ＲＯＮ８について６２ｐＭであった。
【０１７３】
ヒト腫瘍異種移植片モデル：腫瘍異種移植片を、マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と混合した５×１０６個の細胞を、５〜６週齢のメス無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の左側腹へ皮下注射することにより確立した。腫瘍を、１５０〜３００ｍｍ３の大きさまで大きくし、次いで、マウスを無作為に各群１２匹の動物群に分けた。マウスを、コントロール抗体（ヒトＩｇＧ）またはＲＯＮ６抗体およびＲＯＮ８抗体により、３日毎の腹腔内注射により処置した。動物の処置は、研究の間継続した。腫瘍を、カリパーで毎週２回測定し、腫瘍体積を次式により計算した：（π／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２））。式中、ｗ１は最大腫瘍直径を表し、ｗ２は最小腫瘍直径を表す。腫瘍体積は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を使用して解析し、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（バージョン２．０３；Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｒａｆｅａｌ，ＣＡ）の統計学的パッケージを用いてコンピュータ解析した。
【０１７４】
（実施例３：ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍阻害の確認）
インビボで、腫瘍成長を抑制するＲＯＮ６およびＲＯＮ８の有効性を、上記実施例２によって記載されるマウス異種移植片法を利用することによって４つの異なる腫瘍細胞において確認した。腫瘍細胞は以下の通りである。肺腫瘍に由来し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られるＨ−２９２細胞。結腸腫瘍に由来し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られるＨＴ−２９細胞。膵臓腫瘍に由来し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られるＢｘＰＣ３細胞。胸部腫瘍に由来し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られるＪＩＭＴ細胞。
【０１７５】
上記に記載される異種移植片法を使用して、Ｈ−２９２細胞を、合計２４匹のマウスに注射した。１２匹のマウスを、６０ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ６抗体で処置し、１２匹のマウスを、コントロールとしての生理食塩水で処置した。図４Ａに示されるように、コントロールに比べて、腫瘍体積の有意な阻害を観察した。実験を、生理食塩水、ならびに６０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ８抗体でそれぞれ処置した４群に分けた４０匹のマウスでも実施した。図４Ｂに示されるように、コントロールに比べて、腫瘍体積の有意な阻害を観察した。図４Ｂからわかるように、この実験はまた、応答が抗体の投与量により増大されることを確認した。
【０１７６】
上記に記載される異種移植片法を使用して、ＨＴ−２９細胞を、合計２４匹のマウスに注射した。１２匹のマウスを、６０ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ６抗体で処置し、１２匹のマウスを、生理食塩水で処置した。図４Ｃに示されるように、コントロールに比べて、腫瘍体積の有意な阻害を観察した。同じ実験を、生理食塩水、または６０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ８抗体でそれぞれ処置した４群に分けた別の４０匹のマウスでも実施した。図４Ｄに示されるように、コントロールに比べて、腫瘍体積の有意な阻害を観察した。図４Ｄからわかるように、この実験はまた、応答が抗体の投与量により増大されることを確認した。
【０１７７】
上記に記載される異種移植片法を使用して、ＢｘＰＣ３細胞を、合計６０匹のマウスに注射した。マウスを、５群（１２匹／群）に分け、以下のように処置した：生理食塩水、６０ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ８、６０ｍｇ／ｋｇのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手）、６０ｍｇ／ｋｇのＲＯＮ８と６０ｍｇ／ｋｇのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、および６０ｍｇ／ｋｇのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）と６０ｍｇ／ｋｇのｈｕｌｇＧ（コントロールＩｇＧ、Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）。図４Ｅによって示される結果は、ＲＯＮ８が、膵臓ＢｘＰＣ３モデルにおけるセツキシマブの抗腫瘍効果を増大することを確認する（片側反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値０．０６）。
【０１７８】
上記に記載される異種移植片法を使用して、ＪＩＭＴ−１乳癌細胞を、ヌードマウスに皮下注射し、およそ２５０ｍｍ３まで増殖させた。腫瘍体積を、コントロール（生理食塩水）、ＲＯＮ８（６０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、ドセタキセル、またはドセタキセル＋ＲＯＮ８の組み合わせで処置する間プロットした。平均＋／−ＳＥＭがプロットされている。図４Ｆによって示される結果は、ＲＯＮ８が、胸部ＪＩＭＴ−１モデルにおいて、ヌードマウスおける胸部腫瘍異種移植片の成長を阻害することを確証した。
【０１７９】
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１５）Ｃｈｅｎ  ＹＱ，Ｚｈｏｕ  ＹＱ，Ｆｕ  ＬＨ，Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｗａｎｇ  ＭＨ．（２００２）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｄｅｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＲＯＮ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２３，１８１１−１８１９．
１６）Ｓａｎｔｏｒｏ  ＭＭ，Ｃｏｌｌｅｓｉ  Ｃ，Ｇｒｉｓｅｎｄｉ  Ｓ，Ｇａｕｄｉｎｏ  Ｇ，Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  Ｐ（１９９６）．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＯＮ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．，ｐ．７０７２−７０８３．
１７）Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ｊ．Ｍ．，Ｒａｂｅｎａｕ  Ｋ．Ｅ．，Ｂｕｒｎｓ  Ｋ．，Ｌｕ  Ｄ．，Ｍａｎｇａｌａｍｐａｌｌｉ  Ｖ．，Ｂａｌｄｅｒｅｓ  Ｐ．，Ｃｏｖｉｎｏ  Ｎ．，Ｂａｓｓｉ  Ｒ．，Ｐｒｅｗｅｔｔ  Ｍ．，Ｇｏｔｔｆｒｅｄｓｅｎ  Ｋ．Ｊ．，Ｔｈｏｂｅ  Ｍ．ｎ．，Ｃｈｅｎｇ  Ｙ．，Ｌｉ  Ｙ．，Ｈｉｃｋｌｉｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｚｈｕ  Ｚ．，Ｗａｌｔｚ  Ｓ．Ｅ．，Ｈａｙｍａｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｄ．Ｌ．およびＰｅｒｅｉｒａ，Ｄ．Ｓ．（２００６）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＮ），ａ  ｃ−ＭＥＴ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：（１８），９１６２−９１７０．
１８）Ｐａｔｔｏｎ  ＫＴ，Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ  ＭＳ，Ｙａｏ  ＪＬ，Ｐａｐａｖｅｒｏ  Ｖ，Ｈｕｏ  Ｌ，Ａｄｌｅｙ  ＢＰ，Ｗｕ  Ｇ，Ｈｕａｎｇ  Ｊ，Ｐｉｎｓ  ＭＲ，Ｔｅｈ  ＢＴ，Ｙａｎｇ  ＸＪ．（２００４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＯＮ  Ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｏｎｃｏｃｙｔｏｍａ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．，Ａｕｇ  ２８（８）：１０４５−５０．
１９）Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｈ，Ｍａｃｈｉｄｅ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．（２００８）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＨＧＦ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＬＰ）／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＳＰ）  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ．Ａｐｒ；２９（２）：７７−８４．
２０）Ｇａｕｄｉｎｏ  Ｇ，Ａｖａｎｔａｇｇｉａｔｏ  Ｖ，Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  Ａ，Ａｃａｍｐｏｒａ  Ｄ，Ｓｉｍｅｏｎｅ  Ａ，Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ（１９９５）Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ＲＯＮ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ，ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｄｅｃ  ２１；１１（１２）：２６２７−３７．
【図１Ａ】
2011504176.tif 000008
【図１Ｂ】
2011504176.tif 000009
【図１Ｃ】
2011504176.tif 000010
【図１Ｄ】
2011504176.tif 000011
【図２Ａ】
2011504176.tif 000012
【図２Ｂ】
2011504176.tif 000013
【図２Ｃ】
2011504176.tif 000014
【図２Ｄ】
2011504176.tif 000015
【図２Ｅ】
2011504176.tif 000016
【図３Ａ】
2011504176.tif 000017
【図３Ｂ】
2011504176.tif 000018
【図３Ｃ】
2011504176.tif 000019
【図３Ｄ】
2011504176.tif 000020
【図３Ｅ】
2011504176.tif 000021
【図４Ａ】
2011504176.tif 000022
【図４Ｂ】
2011504176.tif 000023
【図４Ｃ】
2011504176.tif 000024
【図４Ｄ】
2011504176.tif 000025
【図４Ｅ】
2011504176.tif 000026
【図４Ｆ】
2011504176.tif 000027
【図５Ａ】
2011504176.tif 000028
【図５Ｂ】
2011504176.tif 000029
【図５Ｃ】
2011504176.tif 000030
【図６Ａ】
2011504176.tif 000031
【図６Ｂ】
2011504176.tif 000032
【図６Ｃ】
2011504176.tif 000033
【配列表】
2011504176000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月27日(2010.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＴ（配列番号２９）を有するＣＤＲＨ１、配列ＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３１）を有するＣＤＲＨ２、配列ＤＧＹＳＳＧＲＨＹＧＭＤＶ（配列番号３３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡ（配列番号３５）を有するＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号３７）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＲＳＮＷＰＲＴ（配列番号３９）を有するＣＤＲＬ３を含む、ヒトＲＯＮタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＬＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＤＧＹＳＳＧＲＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＩＶＳＳ（配列番号６）を有する重鎖可変領域、および配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＬＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＤＧＹＳＳＧＲＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５０）を有する重鎖、および配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５１）を有する軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または安定剤と共に含む、癌を処置するための医薬組成物。
【請求項５】
化学療法剤ドセタキセルをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が、結腸癌、膵臓癌、肺癌、または乳癌である、請求項４に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ６  ＶＨ領域のＤＮＡ（配列番号１）および翻訳された配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ６  ＶＬ領域のＤＮＡ（配列番号３）および翻訳された配列（配列番号４）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ８  ＶＨ領域のＤＮＡ（配列番号５）および翻訳された配列（配列番号６）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、１本の下線で示されるＣＤＲを有するＲＯＮ８  ＶＬ領域のＤＮＡ（配列番号７）および翻訳された配列（配列番号８）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、完全ＲＯＮ６−Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブグループＩ）のＤＮＡ（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、完全ＲＯＮ６−Ｌ（ヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩ）のＤＮＡ（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＲＯＮ６−Ｌ分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；κ定常領域（修飾されていない）。
【図２Ｅ】図２Ｅは、完全ＲＯＮ６−Ｌ（ヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩ）のＤＮＡ（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＲＯＮ６−Ｌ分泌シグナル配列（イタリック）；可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；ＣＤＲドメイン（１本の下線）；κ定常領域（修飾されていない）。
【図３Ａ】図３Ａは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。分泌シグナル配列を有さない完全ＲＯＮ８−Ｈアミノ酸配列は、配列番号５０である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。分泌シグナル配列を有さない完全ＲＯＮ８−Ｈアミノ酸配列は、配列番号５０である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、完全ＲＯＮ８−ＨのＤＮＡ（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線）；γ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。分泌シグナル配列を有さない完全ＲＯＮ８−Ｈアミノ酸配列は、配列番号５０である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、完全ＲＯＮ８−ＬのＤＮＡ（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；κ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。分泌シグナル配列を有さない完全ＲＯＮ８−Ｌアミノ酸配列は、配列番号５１である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、完全ＲＯＮ８−ＬのＤＮＡ（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示す。分泌シグナル配列（イタリック）；ＣＤＲ（下線）を有する可変領域（二重下線、ＣＤＲドメインを除く）；κ定常領域（修飾されていない）。アスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。分泌シグナル配列を有さない完全ＲＯＮ８−Ｌアミノ酸配列は、配列番号５１である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｈ−２９２マウス異種移植モデルにおける、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６の投与後の、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ６抗体が、マウス異種移植系においてＨ−２９２腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｈ−２９２マウス異種移植モデルにおける、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ８の投与後の、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体が、マウス異種移植系においてＨ−２９２腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＴ−２９マウス異種移植モデルにおける、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ６抗体が、マウス異種移植系においてＨＴ−２９腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＨＴ−２９マウス異種移植モデルにおける、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体が、マウス異種移植系においてＨＴ−２９腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＲＯＮ８抗体単独、ＲＯＮ８抗体＋Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（ＥＲＢ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）単独、およびコントロールＩｇＧ（ｈｕｌｇＧ抗体）と組み合わせたＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を有するＢｘＰＣ３マウス異種移植モデルにおいて、腫瘍体積  対  時間のプロットを示す。この図は、ＲＯＮ８抗体（図４Ｅ）単独で、マウス異種移植系においてＢｘＰＣ３腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。この図はまた、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）との組み合わせで、腫瘍の退縮または阻害の傾向があることも示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＲＯＮ８抗体がヌードマウスの胸部腫瘍異種移植片の成長を阻害することを示す。ＪＩＭＴ−１乳癌細胞をヌードマウス中に皮下注射し、およそ２５０ｍｍ３まで増殖させた。腫瘍体積は、コントロール（生理食塩水）、ＲＯＮ８抗体（６０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、ドセタキセル、またはドセタキセル＋ＲＯＮ８抗体の組み合わせで処置し、プロットする。
【図５Ａ】図５Ａは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。、ＮＩＨ３Ｔ３−ＲＯＮ細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。Ｈ−２９２細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図５Ｃ】図５Ｃは、抗ＲＯＮ抗体であるＲＯＮ６およびＲＯＮ８による、ＭＳＰ誘導リン酸化の阻害を確認するウエスタンブロットを示す。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８抗体はそれぞれ、ＲＯＮ受容体のＭＳＰ依存性活性化およびＲＯＮ受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが確認される。ＨＴ−２９細胞を一晩飢餓状態にし、表示された抗体濃度で２時間処理し、次いで、１０ｎＭ  ＭＳＰで１０分間刺激した。刺激の後、細胞を溶解し、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表示された抗体でプローブした。
【図６Ａ】図６Ａは、ＲＯＮ８抗体の固相ブロッキング特性を示す。ＥＬＩＳＡを使用して、固定化された組換えヒトＭＳＰと組換えヒトＲＯＮタンパク質との相互作用をブロックするのに必要なＲＯＮ８抗体のＩＣ５０値を決定した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｈ５９６肺癌細胞の細胞移動を阻害するＲＯＮ８抗体の能力を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＢＸＰＣ３膵臓癌細胞において、ＲＯＮ８抗体によるＭＳＰ誘導ＤＮＡ合成の阻害を示す。図６Ｃ（１）は、ＤＮＡ合成の指標である［３Ｈ］−チミジン取り込みへのＭＳＰ刺激を示す。図６Ｃ（２）は、細胞を、ＭＳＰの添加の前に１時間ＲＯＮ８抗体で前処理した系を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011504176000001.app
【国際調査報告】
2011504176.tif 000034
2011504176.tif 000035
2011504176.tif 000036
2011504176.tif 000037
2011504176.tif 000038