(57)【要約】改良型の安定性及び速やかな作用発現を有する注射可能インスリン製剤が本明細書に記載される。この製剤は、皮下投与、皮内投与、又は筋肉内投与用とすることができる。この製剤は、キレート化剤及び溶解剤、並びに必要に応じて追加の添加剤と組み合わせたインスリンを含む。好ましい実施形態では、この製剤は、ヒトインスリンと、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート化剤と、クエン酸などの溶解剤とを含む。これらの製剤は皮下注射によって投与されると、血流中に速やかに吸収される、好ましい実施形態では、インスリンは滅菌されたバイアルに入った乾燥粉体として提供される。これは、投与の少し前に、又は投与のときに、水などの医薬用として許容可能な担体、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート化剤、及びクエン酸などの溶解剤を含む希釈剤と混合される。別の実施形態では、インスリンは、解凍後すぐに使用可能な凍結合剤として保存される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンと、
亜鉛キレート化剤及びＨＣｌと組合せたインスリンと比較して上皮細胞を通過する該インスリンの吸収及び輸送を促進するために有効な量の溶解剤及び亜鉛キレート化剤と
を含む注射可能インスリン組成物。
【請求項２】
薬剤がヒトインスリン及びインスリン類似体からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該薬剤がヒトインスリンである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
該キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
該溶解剤が、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、アスパラギン酸、マレイン酸、フマル酸、及びアジピン酸からなる群から選択される酸である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
該溶解剤がクエン酸である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
該キレート化剤が、２．４２×１０−４Ｍ〜９．６８×１０−２ＭのＥＤＴＡに相当する濃度範囲で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
該溶解剤が、９．３７×１０−４Ｍ〜９．３７×１０−２Ｍのクエン酸に相当する濃度範囲で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該亜鉛キレート化剤がＥＤＴＡであり、該溶解剤がクエン酸であり、該キレート化剤が２．４２×１０−４Ｍ〜９．６８×１０−２Ｍの濃度のＥＤＴＡで存在し、該溶解剤が９．３７×１０−４Ｍ〜９．３７×１０−２Ｍの濃度のクエン酸で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
該インスリンが第１の容器に入った乾燥粉体で提供され、該キレート化剤及び該溶解剤の少なくとも１つが希釈剤を含む第２の容器に入って提供される請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
糖尿病患者の治療のための凍結した医薬用として許容可能な薬剤として提供される請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
インスリンと、
亜鉛キレート化剤及びＨＣｌと組合せたインスリンと比較して上皮細胞を通過する該インスリンの吸収及び輸送を促進するために有効な量の溶解剤及び亜鉛キレート化剤と
を含む有効な量の注射可能インスリン組成物を注射することを含む、糖尿病の個体を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年１０月９日に、Ｒｏｄｅｒｉｋｅ  ＰｏｈｌとＳｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．  Ｓｔｅｎｅｒにより米国特許庁において出願された米国特許出願第１１／８６９，６９３号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、注射可能即効型薬物送達インスリン製剤の全般的な分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病の概要
グルコースは、エネルギーを産生し、生命を維持するために、全ての体細胞が使う単糖である。ヒトは生き続けるために常に血中に最小限のグルコース濃度が必要である。体が血糖を産生する主な方法は食物の消化による産生である。ヒトがこのグルコースを食物の消化から得ていないとき、グルコースは組織内の貯蔵物から産生され、肝臓から放出される。体のグルコース濃度はインスリンによって調節される。インスリンは膵臓が自然に分泌するペプチドホルモンである。インスリンは、生命維持に必要なエネルギー源を供給するためにグルコースが体細胞に入るのを助ける。
【０００４】
健康な個体が食事を始めると、膵臓は、第１相インスリン放出と呼ばれる自然なインスリンスパイクを放出する。食事の消化によって血中に移動して行くグルコースを処理するのに十分なインスリンを供給することに加えて、第１相インスリン放出は、食事が消化されている間はグルコースの産生を止めるように肝臓に指示するシグナルとして作用する。肝臓がグルコースを産生せず、消化によって産生されたグルコースを処理するのに十分なインスリンが追加されるので、健康な個体の血糖値は比較的一定な状態を持続し、その血糖値が過度に高くなることはない。
【０００５】
糖尿病は、異常に高い血糖値及び不適切なインスリン濃度を特徴とする疾病である。糖尿病には２つの主要な型、即ち１型及び２型がある。１型糖尿病では体はインスリンを産生しない。２型糖尿病の初期段階では、膵臓はインスリンを産生するのだが、必要なときに体がインスリンを産生しないか、又は体細胞がインスリンを無視する、インスリン抵抗性として知られている状態であるかのどちらかである。
【０００６】
何か他の症状が発現する前であっても、２型糖尿病の最初の影響の１つとして、食事が誘発する第１相インスリン放出が発生しなくなる。第１相インスリン放出がない状態では、グルコースの産生を止めるようにとのインスリンからのシグナルを肝臓が受け取ることはない。従って、食事の消化によって体が新たなグルコースを産生し始めるときにも、肝臓はグルコースを産生し続けることになる。その結果、糖尿病患者の血糖値は食後に過度に高くなり、高血糖として知られている状態になる。高血糖は、グルコースが血中のいくつかのタンパク質に不自然に付着する原因となり、小血管の整合性を維持するというタンパク質の正常な機能を遂行する能力を阻害する。毎食後に高血糖が発現すると、ついには毛細血管が破壊し、漏出する。高血糖の長期的な有害作用は、失明、腎機能の喪失、神経障害及び感覚消失、並びに末梢循環の低下を含み、四肢の切断が必要となる場合もある。
【０００７】
未治療の糖尿病患者の血糖は、食後２〜３時間の間に過度に上昇するので、膵臓は、異常に大量のインスリンの分泌を促すシグナルを受け取る。初期の２型糖尿病の患者においては、まだ膵臓が反応することができ、この大量のインスリンを分泌する。しかし、これは消化がほとんど終わって血糖値が下がり始めるべき頃に発生する。この異常に大量のインスリンには２つの有害作用がある。第１に、既に障害のある膵臓に極端に過度な要求を与えるので、膵臓の悪化をさらに早め、ついには膵臓をインスリン産生不能にすることがある。第２に、消化後にインスリンが過度に多く分泌されると体重増加につながり、それが病状をさらに悪化させる場合がある。
【０００８】
現在の糖尿病治療及びその限界
１型糖尿病患者はインスリンを産生しないので、１型糖尿病の主な治療は連日の集中的なインスリン療法である。２型糖尿病の治療は、通常、食事と運動の管理で開始する。食事と運動のみによる治療は短期的には有用であるが、大多数の２型糖尿病患者にとって長期的に有効な解決策ではない。食事と運動による治療がもはや十分でなくなると、さまざまな非インスリン経口薬による治療が始められる。こうした経口薬は、膵臓が産生するインスリンの量の増加、インスリン感受性細胞の感受性の増幅、肝臓のグルコース放出の減少、又はこれらの機序のいくつかの組合せによって作用する。これらの治療はこの疾病を効果的に管理する能力に限界があり、一般的に体重増加、高血圧などのかなりの副作用がある。この非インスリン治療の限界が理由で、多くの２型糖尿病患者が時間の経過とともに悪化し、ついには代謝を維持するためにインスリン療法が必要になる。
【０００９】
インスリン療法は、糖尿病の治療のために８０年以上用いられている。この治療は通常インスリン注射を毎日数本投与することを伴う。これらの注射は、長時間作用型基礎注射を１日当たり１回又は２回、及び速効型インスリン注射を食事のときに投与することからなる。この治療計画は有効であると認められているが、限界がある。第１に、一般的に患者は、その不便さ及び針による痛みのため、自分でインスリン注射を打つことを好まない。従って、患者は指定された治療計画に適切に従わない傾向があり、投薬が不適切になることが多い。
【００１０】
さらに重要なのは、投薬が適切に実施されたときでさえ、インスリン注射は、インスリンの自然な時間作用プロフィルを再現しないことである。詳細には、糖尿病に罹患していないヒトにおいては、第１相インスリン放出の自然なスパイクは、食事によって産生されたグルコースが血液中に入って数分以内に血中インスリン濃度を上昇させる。対照的に、注射されたインスリンは血液中にゆっくりと入り、インスリン濃度がピークとなるのは、ヒトレギュラーインスリンの注射後８０〜１００分以内となる。
【００１１】
見込みのある解決策は、食事を取る直前に糖尿病患者の静脈内に直接インスリン注射を打つことである。インスリンの静脈内注射に関する研究では、食後３〜６時間の間、血糖のより効果的な制御が患者に現れた。しかしさまざまな医学的理由により、毎食前のインスリン静脈内注射は実用的な療法ではない。
【００１２】
インスリン治療における重要な改善の１つは、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）、Ａｐｉｄｒａ（登録商標）などの即効型インスリン類似体を１９９０年代に採用したことであった。しかし、これらの即効型インスリン類似体であっても、インスリン濃度がピークとなるのは、通常、注射後５０〜７０分以内である。即効型インスリン類似体が第１相インスリン放出を適切に模倣しないので、インスリン療法を用いている糖尿病患者は、食事を始めたときのインスリン濃度は不適切で、食間に出るインスリンは過度に多いという状態が続くことになる。このインスリン送達の遅延によって、食事開始後の早い時間に高血糖となる可能性がある。さらに、食間に過度のインスリンが出現することによって、低血糖として知られている、異常に低い血糖値となることもある。低血糖によって、精神的明瞭度の欠如、混乱、心拍数の増加、空腹感、発汗及び失神型めまいが発生することがある。グルコース濃度が非常に低い状態では、低血糖は、意識消失、昏睡及び死さえも引き起こす場合がある。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、即ちＡＤＡによると、インスリンを用いている糖尿病患者は、１年に平均１．２回重症の低血糖イベントを発症し、多くの場合患者を病院の救急治療室に運ぶ必要がある。
【００１３】
全般的なグルコースの制御において、血液へのインスリン送達の時間経過がこれほどに重要な役割を果たすので、即効型インスリン類似体よりも速く血液に到達するインスリン注射可能インスリンが強く求められている。
【００１４】
従って、本発明の目的は、改良型の安定性及び速やかな作用発現を有する即効型注射可能インスリン組成物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
改良型の安定性及び速やかな作用発現を有する注射可能インスリン製剤が本明細書に記載される。この製剤は、皮下投与、皮内投与、又は筋肉内投与用とすることができる、好ましい実施形態では、この製剤は皮下注射によって投与される。この製剤は、キレート化剤及び溶解剤、並びに必要に応じて追加の添加剤と組み合わせたインスリンを含む。好ましい実施形態では、この製剤は、ヒトインスリンと、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート化剤と、クエン酸などの溶解剤とを含む。これらの製剤は皮下注射によって投与されると、血流中に速やかに吸収される。
【００１６】
好ましい実施形態では、インスリンは滅菌されたバイアルに入った乾燥粉体として提供される。これは、投与の少し前に、又は投与のときに、水などの医薬用として許容可能な担体、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート化剤、及びクエン酸などの溶解剤を含む希釈剤と混合される。別の実施形態では、インスリンは、解凍後すぐに使用可能な凍結合剤として保存される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】暴露された表面が荷電し、荷電遮蔽するのに適切な大きさの分子（「溶解剤及びキレート剤」）で表面が覆われたインスリンの３次元概略図である。
【図２】供液室１２から０．１ミクロンのフィルター１６上の４〜５層の不死化口腔上皮細胞１４を通過して受液室１８内へ入るインスリン吸収を測定するために用いるトランスウェル装置１０の概略図である。
【図３】図３Ａは、０．４５ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌ含有及び不含で、図２のトランスウェルシステム内の口腔上皮細胞を通過するインビトロのインスリン輸送（累積インスリン、マイクロユニット）を、溶解剤として選択された酸の機能別に比較するグラフである。ＥＤＴＡは０．４５ｍｇ／ｍＬで一定であったが、酸の濃度は以下の通りさまざまであった。図３Ａでは、アスパラギン酸（０．４７ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．７４ｍｇ／ｍＬ）、コハク酸（０．４１ｍｇ／ｍＬ）、アジピン酸（０．７３ｍｇ／ｍＬ）及びクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍＬ及び０．５６ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ範囲３．２〜３．８。比較分析用に２つの時間（１０分及び３０分）を選択した。結果は測定された平均値プラス又はマイナス標準誤差、ｎ＝４で示す。図３Ｂは、０．４５ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌ含有及び不含で、図２のトランスウェルシステム内の口腔上皮細胞を通過するインビトロのインスリン輸送（累積インスリン、マイクロユニット）を、溶解剤として選択された酸の機能別に比較するグラフである。ＥＤＴＡは０．４５ｍｇ／ｍＬで一定であったが、酸の濃度は以下の通りさまざまであった。図３Ｂでは、マレイン酸（０．３２ｍｇ／ｍｌ）、フマル酸（１．２８ｍｇ／ｍＬ）及びシュウ酸（０．３２ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ領域２〜３。比較分析用に２つの時間（１０分及び３０分）を選択した。結果は測定された平均値プラス又はマイナス標準誤差、ｎ＝４で示す。
【図４】図４Ａは、図２に示したトランスウェルシステム内の口腔上皮細胞を通過するインビトロのインスリン輸送（累積インスリン、マイクロユニット）を示すグラフであり、０．５６ｍｇ  ＥＤＴＡ／ｍＬ含有及び不含で、種々の溶解剤を比較したものである。酸は以下の等モル（１．５０×１０−３Ｍｏｌ）濃度である。アスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）及びクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍｌ）（図４Ａ）。比較分析用に２つの時間（１０分及び３０分）を選択した。図４Ｂは、図２に示したトランスウェルシステム内の口腔上皮細胞を通過するインビトロのインスリン輸送（累積インスリン、マイクロユニット）を示すグラフであり、０．５６ｍｇ  ＥＤＴＡ／ｍＬ含有及び不含で、種々の溶解剤を比較したものである。酸は以下の等モル（１．５０×１０−３Ｍｏｌ）濃度である。１．８０ｍｇ／ｍＬのクエン酸（図４Ｂ）。比較分析用に２つの時間（１０分及び３０分）を選択した。
【図５】図２のトランスウェルシステムを用いて口腔上皮細胞を通過するインビトロのインスリン輸送を示し、種々のキレート化剤の有効性を比較するグラフである。グルタミン酸、クエン酸又はＨＣｌを含み、モル濃度の等しい（４．８４×１０−３Ｍｏｌ）種々のキレート化剤を添加した溶液から口腔上皮細胞を通過するインスリン（１ｍｇ／ｍＬ）輸送を測定した（累積インスリン、マイクロモル）。キレート化剤は、キレート化剤不含（対照）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＭＳＡ、ＣＤＴＡ、及びＴＳＣであった。
【図６】ヒト対象において、クエン酸及びＥＤＴＡ（１２Ｕ）で調製されたインスリンのインビボの薬力学的効果を示すグラフであり、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（１２Ｕ）及びＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）（１２Ｕ）と比較し、平均ＧＩＲ／ｋｇを測定したものである。
【図７】ヒトにおいてクエン酸及びＥＤＴＡで調製されたインスリンのインビボの薬物動態学的効果を示すグラフであり、ＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）と比較し、経時的（分）にインスリン濃度（マイクロユニット／ｍｌ）を測定したものである。平均値（±ＳＥＭ、ｎ＝１０）インスリン投与量は１対象当たり１２Ｕであった。
【図８】１６名の２型糖尿病患者において、クエン酸及びＥＤＴＡで調製されたインスリンのインビボの薬力学的効果を示すグラフであり、ＨＵＭＵＬＩＮ  Ｒ（登録商標）及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較し、経時的（分）に血糖（ｍｇ／ｄｌ）をグラフ化したものである。患者の治験に用いた１回分の投与量は患者に特定であり、現在受けているインスリン療法に基づいて各患者用に調整した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に記載される注射可能ヒトインスリンのインスリン製剤は、食事の直前又は食事終了のときに投与される。好ましい実施形態では、製剤は、組み換え型ヒトインスリンを、一般的にＦＤＡが安全であると見なしている特定の成分と組み合わせる。この製剤は、現在市販されている即効型インスリン類似体より速く血液中に吸収されるように設計されている。このインスリン製剤の重要な特徴の１つは、インスリンを、６分子、即ち六量体インスリンから解離、即ち分解して単一分子、即ち単量体インスリンにすることが可能であり、再会合して六量体形態になるのを防止することである。人体は、所望の生物学的な効果を生成するために、インスリンが体内に吸収されうる前に単一分子の形態になることを必要とするので、この製剤は、単量体が有利に働いて、血液中へのインスリン送達をより速くすることができると考えられている。注射用として市販されているヒトインスリンの大部分は六量体である。インスリン六量体はまず二量体に解離し、その後単量体に解離しなければならないので、このことは体がインスリンを吸収するのをより困難にしている。
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「インスリン」という用語は、特記なき限り、ヒトインスリン若しくは非ヒトインスリン、組み換え型インスリン、精製インスリン若しくは合成インスリン、又はインスリン類似体を意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる「ヒトインスリン」という用語は、天然供給源からの分離、遺伝子改変微生物による生成を問わず、膵臓から分泌されるヒトペプチドホルモンを意味する。本明細書で用いられる「非ヒトインスリン」は、ヒトインスリンと同じものであるが、ブタ又はウシなどの動物由来のものである。
【００２１】
本明細書で用いられるインスリン類似体は、膵臓から分泌されるインスリンとは異なり、改変を加えたインスリンであるが、それでも自然のインスリンと同様の作用を発揮するので体に利用可能である。基本的なＤＮＡの遺伝子操作によって、インスリンのアミノ酸配列を変えてそのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、及び排泄）の特性を改変することができる。例えばインスリンリスプロ、インスリングラルギン、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンデテミルなどがある。インスリンは化学的に、例えばアセチル化によって修飾する事もできる。本明細書で用いられるヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンと同様の作用を発揮することができる改変ヒトインスリンのことである。
【００２２】
本明細書で用いられる「キレート化剤（Ｃｈｅｌａｔｏｒ）」又は「キレート剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、亜鉛イオンと１つ以上の結合を形成する能力を有する化合物を意味する。この結合は通常イオン結合又は配位結合である。キレート化剤は無機化合物であってもよいし有機化合物であってもよい。キレート錯体とは、金属イオンがキレート剤の２つ以上の原子に結合している錯体のことである。
【００２３】
本明細書で用いられる「溶解補助剤」という用語は、溶媒中の材料、例えば水溶液中のインスリン、の溶解度を高める化合物を意味する。溶解補助剤の例としては、界面活性剤（ＴＷＥＥＮＳ（登録商標））、エタノールなどの溶媒、オキシエチレンモノステアレートなどのミセル形成化合物、及びｐＨ調整剤などがある。
【００２４】
本明細書で用いられる「溶解剤」という用語は、以下の実施例に記載した上皮細胞トランスウェルプレートアッセイを用いて測定すると、インスリン及びＥＤＴＡに添加したとき、同じｐＨのＨＣｌ及びＥＤＴＡと比較して、インスリンの輸送及び吸収を促進する酸を意味する。ＨＣｌは溶解剤ではないが、溶解補助剤である可能性がある。クエン酸はこのアッセイでの測定によると溶解剤である。
【００２５】
本明細書で用いられる「添加剤」という用語は、インスリン用の担体として用いられるか、又は製品の製造プロセスを助けるために用いられる、キレート化剤でも溶解剤でもない不活性物質を意味する。このようなケースでは、活性物質は添加剤に溶解するか、又は添加剤と混合する。
【００２６】
ＩＩ．製剤
製剤は、インスリン、キレート化剤及び溶解剤（類）を含み、必要に応じて１種以上の他の添加剤を含む。好ましい実施形態では、製剤は皮下投与に好適であり、皮下脂肪組織内に速やかに吸収される。溶解剤及びキレート化剤の選択、溶解剤とキレート化剤の両方の濃度、並びに製剤が調整されるｐＨ、これら全てがこの系の有効性に大きな影響を与える。有効性を有する組合せは多いが、この好ましい実施形態は、安全性、安定性、規制に適合する特性（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）、及び効能を含む多くの理由で選択される。
【００２７】
この好ましい実施形態では、活性薬剤上のどのような荷電も遮蔽するために、少なくとも１種以上の製剤成分が選択される。これによってインスリンの膜貫通輸送が容易になり、その結果、インスリンの作用発現と生物学的利用能の両方を高めることができる。成分は、水性媒体中で速やかに溶解する組成物を形成するためにも選択される。好ましくは、インスリンは速やかに吸収されて血漿へと輸送され、速やかな作用発現を提供する（好ましくは投与後約５分以内に発現し、投与後約１５〜３０分でピークに達する）。
【００２８】
ＥＤＴＡなどのキレート化剤は、インスリン中の亜鉛をキレート化し、それによってインスリン溶液から亜鉛を取り除く。このためインスリンは二量体及び単量体の形を獲得し、六量体の状態への再構築を阻止する。これら２つの形が濃度に影響される平衡状態中に存在するので、単量体が吸収されるにつれて、さらに多くの単量体が形成される。従って、インスリン単量体が皮下組織を通過して吸収されるにつれて、追加の二量体が崩壊してさらに多くの単量体を形成する。単量体の分子量は六量体の分子量の６分の１未満であり、そのため、インスリン吸収の速度と量の両方を著しく高める。キレート化剤（ＥＤＴＡなど）及び／又は溶解剤（クエン酸など）がインスリンと水素結合している限りにおいては、インスリン上の荷電を遮蔽し、インスリンの膜貫通輸送を容易にし、それによってインスリンの作用発現と生物学的利用能の両方を高めると考えられている。
【００２９】
インスリン
インスリンは、組み換え型であっても自然供給源由来の精製物であってもよい。インスリンはヒトインスリンであっても非ヒトインスリンであってもよい。好ましくはヒトインスリンがよい。最も好ましい実施形態では、インスリンは組み換え型ヒトインスリンである。組み換え型ヒトインスリンは多数の供給源から入手可能である。インスリンは、ヒトインスリンのアミノ酸配列に基づいているが、１つ以上のアミノ酸の差異を有する可能性のあるインスリン類似体、又は化学修飾したインスリン若しくは化学修飾したインスリン類似体であってもよい。
【００３０】
１回分のインスリン投与量はインスリンの生物学的利用能及び治療を受ける患者によって異なる。インスリンは通常、１回分の投与量中に、ヒト用量で１．５〜１００ＩＵ、好ましくは３〜５０ＩＵの範囲で含まれる。
【００３１】
溶解剤
図１に示すように、いくつかの酸はインスリン上の荷電を遮蔽し、取り込み及び輸送を促進するようである。以下の実施例に記載するトランスウェルアッセイで測定すると、塩酸と比較して溶解剤として効果的な酸は、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、及びアジピン酸を含む。例えば、活性薬剤がインスリンである場合、好ましい溶解剤はクエン酸である。塩酸はどのような製剤との組合せにおいてもｐＨ調整剤として使用できるが、溶解剤ではない。
【００３２】
溶解剤の量の範囲は、インスリン及びＥＤＴＡとの組合せにおいて有効なクエン酸の量に相当し、９．３７×１０−４Ｍ〜９．３７×１０−２Ｍのクエン酸である。
【００３３】
キレート化剤
好ましい実施形態において、亜鉛キレート化剤が活性薬剤と混合される。キレート化剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。好適なキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ：ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸：１，２−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＴＳＣ）を含む。塩酸はｐＨ調整のためにＴＳＣと併せて用いられ、そのプロセスにおいて溶解剤であるクエン酸の形成を生じさせる。
【００３４】
好ましい実施形態では、キレート化剤はＥＤＴＡである。例えば、活性薬剤がインスリンであるとき、キレート化剤はインスリンから亜鉛を捕捉し、それによってインスリンの二量体が六量体より有利に働いて、投与部位の周囲の組織（例えば粘膜又は脂肪組織）によるインスリンの吸収を容易にすることがわかっている。さらに、キレート化剤の水素は活性薬剤と結合することもでき、それによって活性薬剤の荷電遮蔽を助け、活性薬剤の膜貫通輸送を容易にする。
【００３５】
キレート化剤の量の範囲は、インスリン及びクエン酸との組合せにおいて有効なＥＤＴＡの量に相当し、２．４２×１０−４Ｍ〜９．６８×１０−２ＭのＥＤＴＡである。
【００３６】
添加剤
医薬組成物は、上記活性化合物を医薬として使用可能な製剤に加工するのを容易にする添加剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容可能な担体を用いる従来の方法で製剤化することができる。薬物の製剤化については、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５）、及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）において論じられている。
【００３７】
好ましい実施形態では、水性媒体中での速やかな溶解を促進するために、１種以上の溶解補助剤がインスリン薬剤とともに含まれる。好適な溶解補助剤としては、ポリソルベート類、グリセリン、及びポロキサマー類などの湿潤剤、非イオン性及びイオン性界面活性剤、食用酸及び塩基（例えば、重炭酸ナトリウム）、アルコール類、並びにｐＨ調節用緩衝塩が挙げられる。
【００３８】
安定剤は、例えば酸化反応を含む薬物分解反応を抑制又は遅延させるために用いられる。多くの安定剤を用いることができる。好適な安定剤としては、セルロース、セルロース誘導体などの多糖類、グリセロールなどの単純アルコール類、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンなどの静菌剤、塩化ナトリウム、グリセロール、グルコースなどの等張剤、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン又は大豆レシチン）、合成又は半合成レシチン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、又はジステアロイル−ホスファチジルコリンなどのレシチン類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルエタノールアミン類、ジステアロイル−ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジアラキドイルホスパーチジルセリン（ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）などのホスファチジルセリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類などが挙げられる。１つの例では、上記安定剤は、グリセロール、静菌剤、及び等張剤を組み合わせたものとすることもできる。
【００３９】
ＩＩ．製剤の作製方法
注射可能製剤はインスリン、キレート化剤、および溶解剤を含む。好ましい実施形態では、注射可能製剤は、インスリン、ＥＤＴＡ、クエン酸、並びに生理食塩水及び／又はグリセロールを含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、皮下注射可能製剤は以下のように作製される。生理食塩水及び／又はグリセロール、クエン酸並びにＥＤＴＡを混合して溶液にし、この溶液（「希釈剤」と称される）を滅菌する。それとは別にインスリンは、滅菌水に添加され、溶液にする。これが濾過され、複数の別個の滅菌注射ボトルの各々の中に指定量が充填される。インスリン溶液は凍結乾燥され、粉体にする。安定性を保持するためには、希釈剤と別に保存しなければならない。投与の前にインスリンの注射ボトルに希釈剤が添加される。所定量のインスリンが患者に皮下注射された後、残ったインスリン溶液は、好ましくは冷蔵によって、保存してもよい。
【００４１】
別の実施形態では、インスリンは希釈剤と混合し、濾過滅菌して複数回使用の注射にし、使用する前に凍結する。
【００４２】
ＩＩＩ．製剤の使用方法
製剤は皮下投与であっても筋肉内注射であってもよい。この製剤は、急速に吸収されて全身への送達のため血漿へ運ばれるように設計される。
【００４３】
インスリンを活性薬剤として含む製剤は、食前又は食事の途中に、１型又は２型糖尿病患者に投与することができる。この組成物は速やかに吸収されるので、肝臓内でのグリコーゲンからグルコースへの転換を阻止することができ、それによって糖尿病の合併症及び２型糖尿病の最初の症状の主な原因である高血糖を防止する。現在入手可能で標準的なヒトインスリンの皮下注射は、インスリンの吸収が非常に遅いので肝臓内のグルコースの産生を阻止できないため、食事の半時間前から１時間前に投与しなければならず、所望以下の効果しか得られない。上記の皮下インスリン組成物なら、さらに、疾病進行の十分初期の頃に投与すれば、２型糖尿病の進行を遅くし、または阻止することができるであろう。
【００４４】
本発明は以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
上皮細胞トランスウェルアッセイを用いた溶解剤の関数としてのインスリンの吸収及び輸送のインビトロ比較
材料及び方法
図２に示すように、口腔上皮細胞は複数の（４〜５層の）細胞層が形成されるまで２週間トランスウェルインサートで増殖させた。輸送実験は、供液ウェルに適切な溶液を添加し、１０分後に受液ウェルから試料を取り出すことにより行った。溶液は、水、＋／−ＥＤＴＡ（０．４５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＣｌ（０．８５％ｗ／ｖ）、１ｍｇ／ｍｌのインスリン及びｐＨを３．８に維持するために十分な量の酸からなる。受液ウェル内のインスリン量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００４６】
結果
図３Ａ及び図３Ｂに示した結果は、上皮細胞を通過するインスリンの吸収及び輸送をより効果的に促進する酸があることを示す。これらは容易に試験することができ、ＨＣｌを用いて得られた結果と比較することができる。従って、どの酸を試験し、溶解液として確定できる（即ち、ＨＣｌと比較して吸収及び輸送を促進する）のか、または確定できないのかに対する基準となる。
【００４７】
ｐＨ範囲が３．２〜３．８の酸を用いて得られた結果は図３Ａに分類している。さらに強い酸（ｐＨ＜３）は図３Ｂに分類している。
【００４８】
この結果により、キレート化剤の濃度が同じである場合に、酸の選択が、細胞培養物を通過するインスリンの輸送に大きく影響するということが証明される。好ましい酸はクエン酸である。
【００４９】
（実施例２）
上皮細胞トランスウェルアッセイを用いた溶解剤の濃度の関数としてのインスリンの吸収及び輸送のインビトロ比較
材料及び方法
実施例１の材料及び方法を用いて、さまざまな濃度の試薬を加えた。この実験では、等モル濃度の酸及びキレート化剤を添加した。溶液は、水、＋／−ＥＤＴＡ（０．５６ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ（０．８５％ｗ／ｖ）、１ｍｇ／ｍＬのインスリン、及び酸、即ちアスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（０．２０ｍｇ／ｍｌ）からなるものとした。クエン酸はキレート化剤含有及び不含で、さらに高濃度の１．８ｍｇ／ｍＬで試験した。このデータは細胞供液室に投薬してから１０分後及び３０分後の２つの時間で示している。
【００５０】
結果
アスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍｌ）を用いて得られた結果が図４Ａに示されている。このケースでは、キレート化剤を添加しても、有意な差は観察されなかった。
【００５１】
対照的に、さらに高濃度の１．８０ｍｇ／ｍＬのクエン酸を用いた実験では、溶液にキレート化剤を添加すると、有意に増加している（ｔ検定比較、片側検定）。図４Ｂを参照されたい。これは、吸収及び輸送を最適化するために両方の成分の濃度が重要であることを示している。
【００５２】
（実施例３）
上皮細胞トランスウェルアッセイを用いたキレート化剤の関数としてのインスリンの吸収及び輸送のインビトロ比較
材料及び方法
口腔上皮細胞は複数の（４〜５層の）細胞層が形成されるまで２週間トランスウェルインサートで増殖させた。輸送実験は、供液ウェルに適切な溶液を添加し、１０分後、２０分後、及び３０分後に受液ウェルから試料を取り出すことにより行った。
【００５３】
溶液は以下の方法でトランスウェル実験の直前に調製した。１．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸を０．８５％ｗ／ｖの生理食塩水中で溶解し、その後この溶液に、以下のキレート化剤の１つを次に示す濃度で添加した。即ち、ＥＤＴＡを１．８０ｍｇ／ｍｌ、ＥＧＴＡを１．８４ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＡを０．８８ｍｇ／ｍｌ、ＴＳＣを１．４２ｍｇ／ｍｌとした。ＣＤＴＡは液状で用いたので、クエン酸をＣＤＴＡに直接添加した。これらのケースのそれぞれにおいて、キレート化剤の濃度は４．８４×１０−３モルで一定とした。
【００５４】
その後インスリンを１ｍｇ／ｍｌで添加し、必要に応じてｐＨを３．８に再調整した。ｐＨ調整のためにＨＣｌのみを用いた対照試料一式が比較用に含まれている。アルギン酸はｐＨ３．８で凝固するので、この実施例における比較用としては含めなかった。供液ウェルに各溶液を０．２ｍｌずつ添加してトランスウェル実験を実施した。
【００５５】
受液ウェル内のインスリン量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００５６】
結果
３０分後のインスリンのデータのグラフを図５に示している。ＴＳＣ（クエン酸三ナトリウム）を用いて得られた結果と比較した場合を除いて、クエン酸又はグルタミン酸を用いたとき、細胞を通過して送達されるインスリンが有意に多かった。ＴＳＣのケースでは、ｐＨ調整用にＨＣｌを用いた。このｐＨ調整がクエン酸を産生し、このことでこの結果の説明がつく。
【００５７】
この結果が示すように、吸収及び輸送の促進はキレート化剤の選択によって決まる。
【００５８】
（実施例４）
クエン酸ベースのインスリン製剤中のキレート化剤のブタにおける前臨床評価
材料及び方法
公表された研究、Ａ．Ｐｌｕｍ，Ｈ．Ａｇｅｒｓｏ  ａｎｄ  Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇ，  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｓｐａｒｔ，  ｉｎ  ｒａｔｓ，  ｄｏｇｓ，  ａｎｄ  ｐｉｇｓ，  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｓｐａｒｔ  ｉｎ  ｐｉｇｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．，  ２８（２）：  １５５−６０  （２０００）に合わせて、排出半減期をインスリン吸収の適切な判断要素にすることにした。排出の遅延は注射部位からの吸収がより遅いことを意味するからである。従って、個々の排出半減期について、ＰＫ／ＰＤパラメーターを調べるためにミニブタの実験のノンコンパートメント解析を実施した。
【００５９】
糖尿病ブタに、４つのインスリン製剤の１つを皮下注射した。３つの製剤はキレート化剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、又はＴＳＣ）を含み、第４の対照はヒトレギュラーインスリンのＨｕｍｕｌｉｎ  Ｒ（登録商標）のみを含み、キレート化剤は含めなかった。キレート化剤を含む製剤全てに、酸としてクエン酸（１．８ｍｇ／ｍｌ）を使用し、全てのケースに等張性及び製剤の滅菌のためＮａＣｌ及びｍ−クレゾールを添加した。キレート化剤は全て、４．８４×１０−３モルの等モル濃度とした。
【００６０】
ブタは一夜絶食させ、ＥＤＴＡを含む用量０．１２５Ｕ／ｋｇのヒトインスリン（ｎ＝３）、又はＥＧＴＡ若しくはＴＳＣを含む０．０８Ｕ／ｋｇのヒトインスリン（ｎ＝２）を皮下投与した。さらに高用量では過度の血糖低下となるため、投与量は少なくした。血糖値及びインスリン濃度は投与から８時間後まで継続して測定した。
【００６１】
同一の体重を有するノンコンパートメントモデルを用いて、薬物動態学的モデリングをＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって実施した。表１で排出半減期を比較した。
【００６２】
【表１】
2011500581.tif 000002
このブタを用いた予備実験でのヒトレギュラーインスリンの排出半減期（１２０分）は、文献で発表されているものと一致し、データを検証するための試験ポイントとして使用した。静脈内投与後の時間がかなり長いので、この数字は、注射後の注射部位からの吸収が遅い状態が継続していることを裏付けている。クエン酸を用いた製剤中のキレート化剤は、このパラメーターにおける減少を明確に示し、これら３つのキレート化剤が、程度は異なるが、ヒトレギュラーインスリンの吸収を促進するのに有効であることを示している。
【００６３】
（実施例５）
ヒト臨床試験におけるＥＤＴＡ−クエン酸インスリン製剤とヒトレギュラーインスリンとの比較
材料及び方法
この実験の目的は、クエン酸及びＥＤＴＡ、即ち「ＣＥ」（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ＥＤＴＡ）と組み合わせたインスリンを含む試験製剤の薬力学的な（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ：ＰＤ）特性を評価することであった。５つの正常血糖グルコースクランプ試験（Ｂｉｏｓｔａｔｏｒ；目標血糖値９０ｍｇ／ｄｌ）を１０名の絶食中の健康な志願者（平均年齢４０（年齢幅２０〜６２）；ＢＭＩ２２．５（１９．２〜２４．９）ｋｇ／ｍ２）に対して実施した。処置の順序を固定したクロスオーバーデザインを用いて、１２ＩＵのレギュラーインスリン及び１２ＩＵのＣＥインスリン製剤を腹部に皮下注射した。
【００６４】
結果
この結果は図６及び図７に示されている。ＣＥの皮下注射は、グルコースの消費においてヒトレギュラーインスリンより有意に速い上昇を発生させる時間作用プロフィールを示す結果となった（図６）。薬物動態学的平均データは、ＰＤの結果を裏付けている（図７）。
【００６５】
この実験からは、ヒトレギュラーインスリンにクエン酸及びＥＤＴＡを添加すると、ヒトレギュラーインスリンのみと比較した場合に最高濃度に達する時間が速く（図７）、作用発現が早くなる（図６）ことからもわかるように、インスリンの吸収速度を速めることがわかる。
【００６６】
（実施例６）
１型糖尿病患者に食事の直前に皮下注射した場合の、ＣＥインスリン、インスリンリスプロ及びヒトレギュラーインスリンの薬物動態学的及び薬力学的特性
背景と目的：
この実験の目的は、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（上記でＣＥと称したクエン酸及びＥＤＴＡと組み合わせた超即効型ヒトレギュラーインスリン（ｒｅｇｕｌａｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ：ＲＨＩ）製剤）、ＲＨＩ、及びインスリンリスプロ（Ｌｉｓｐｒｏ）が、１型糖尿病患者が標準食を取った後、食後血糖（ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ：ＢＧ）値の可動域に及ぼす作用を測定することであった。
【００６７】
材料及び方法
９名の患者（男性５名及び女性４名、年齢４０±１０歳、ＢＭＩ２４．０±２．０ｋｇ／ｍ２）のＢＧを、食事が消化される前にグルコースクランプによって安定化させた（目標ＢＧ値１２０ｍｇ／ｄｌ）。標準食及びインスリン投与の前に、このグルコース注入を止めた。処置の順序を固定したクロスオーバー実験デザインを用いて、同一患者に特定の用量のＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（ＣＥ）、Ｌｉｓｐｒｏ又はＲＨＩを食事の直前に皮下注射した。その後食後のグルコース可動域は８時間連続的にモニターし、ＢＧ＜６０ｍｇ／ｄｌとなった場合にはグルコース注入を再開した。血漿インスリン濃度については本実験を通して測定した。
【００６８】
結果
平均プラス又はマイナス標準偏差で表２に示した結果では、２型糖尿病患者に、食後、ヒトレギュラーインスリン、インスリンプラスクエン酸及びＥＤＴＡ（ＣＥ）並びにリスプロを皮下注射した後のインスリン最高血中濃度到達時間を比較している。表３の結果は、同じ被験者らの血糖を比較している。
【００６９】
【表２】
2011500581.tif 000003
【００７０】
【表３】
2011500581.tif 000004
注射後３〜８時間での低血糖イベント（グルコース注入を必要とする時間）の総計は、ＲＨＩで１３、Ｌｉｓｐｒｏで１１、ＣＥ製剤で４であった。この時間中に低血糖を防ぐために注入されたグルコースの平均総量は、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（ＣＥ）と比較して、ＲＨＩで６倍多く、Ｌｉｓｐｒｏで２倍であった。標準的な血糖値目標域の上及び下の範囲（ＢＧ  ＡＵＣ１４０ｍｇ／ｄＬ超及び８０ｍｇ／ｄＬ未満）の、全患者のグループ毎の総計は、ＲＨＩで８１，８９５ｍｇ／ｄＬ＊分、Ｌｉｓｐｒｏで５７，４２３ｍｇ／ｄＬ＊分、及びＶＩＡｊｅｃｔ（商標）で３８，７４０ｍｇ／ｄＬ＊分であった。平均血糖値は図８に示されている。
【００７１】
結論として、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（ＣＥ）は、標準食の後の血糖の上昇を逆行させるのが最も速かった。ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）で処置された患者らは食後の血糖の可動域が減少した。対照的にＲＨＩは血糖の可動域が最も高かった。このことはＲＨＩでは吸収速度がより遅いことと整合している。グルコース濃度のばらつき（最高値と最低値間の平均差）はＬｉｓｐｒｏよりＶＩＡｊｅｃｔ（商標）の方が有意に少なく、この１型糖尿病患者らに対してＶＩＡｊｅｃｔによる血糖の制御がより優れていることを示した。
【００７２】
本発明の変更形態及び変形形態は、上述の説明から当業者には明白であり、添付されている特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されるものである。
【図１】
2011500581.tif 000005
【図２】
2011500581.tif 000006
【図３】
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【図４】
2011500581.tif 000008
【図５】
2011500581.tif 000009
【図６】
2011500581.tif 000010
【図７】
2011500581.tif 000011
【図８】
2011500581.tif 000012
【国際調査報告】
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2011500581.tif 000014
2011500581.tif 000015