(57)【要約】  本発明は、血管形成を阻害する方法または個体における癌または癌の転移を治療または予防する方法に関する。この方法は血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の投与に基づく。ＶＡＰ−１の触媒活性を阻害することが、血管形成の阻害および癌または癌転移の治療または予防のために特に望ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成を阻害するための、または血管の成長を抑制することが有効な疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、個体において血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の使用。
【請求項２】
癌または癌転移の治療または予防に使用するための医薬組成物の製造のための、個体において血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の使用。
【請求項３】
前記疾患が、癌または癌の転移である請求項１記載の使用。
【請求項４】
癌の増殖が癌中の新血管形成を阻害することにより抑制される請求項２または３記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤が、ＶＡＰ−１抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤がＶＡＰ−１阻害剤、特にＶＡＰ−１の低分子阻害剤である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、ＶＡＰ−１に結合可能なペプチドにコンジュゲートされた低分子阻害剤を含む請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、ＶＡＰ−１の発現をダウンレギュレートする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、該ｓｉＲＮＡが約２１ヌレオクチドのアンチセンス配列であって、ＶＡＰ−１ｍＲＮＡの領域に相補的であるアンチセンス配列、および該アンチセンスの約１９ヌレオクチドの配列に相補的であるセンス配列を含む二本鎖である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が、請求項８記載のｓｉＲＮＡ二本鎖、または該二本鎖のアンチセンス鎖をコードする核酸を、個体の細胞内で該ｓｉＲＮＡ二本鎖またはアンチセンス鎖を発現可能な形で含有する発現ベクターである請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
癌がメラノーマまたはリンパ腫である請求項２〜９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体において、血管形成を阻害するための方法、または癌もしくは癌の転移を治療または予防する方法に関する。この方法は血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、もしくは発現をダウンレギュレートできる薬剤の投与に基づく。ＶＡＰ−１の触媒活性を阻害することは、血管形成の阻害、癌または癌転移の治療もしくは予防のために特に望まれる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において本発明の背景を説明するために使用される刊行物および他の資料、ならびに、とりわけ実践に関する付加的な詳細を提供するケースが参照により組み込まれる。
【０００３】
ＶＡＰ−１はヒトの内皮細胞接着分子であり、他の炎症に関する接着分子と区別できるいくつかの独特な性質をもつ。ＶＡＰ−１は独特かつ制限された発現パターンを有し、血管内皮へ結合するリンパ球を媒介する（Salmi, M.およびJalkanen, S., Science 257:1407-1409(1992)）。炎症は、白血球が皮膚、消化管および炎症性滑膜に入る際媒介となる血管内皮細胞の表面に対するＶＡＰ−１のアップレギュレーションを引き起こす（Salmi, M.およびJalkanen, S., Science 257:1407-1409(1992); Salmi, M.ら, J. Exp. Med 178:2255-2260(1993); Arvilommi, A.ら, Eur. J. Immunol 26:825-833(1996); Salmi, M.ら, J. Clin. Invest. 99:2165-2172(1997):（Salmi. M.およびJalkanen, S., J. Exp. Med. 183:569-579(1996); J. Exp. Med 186:589-600(1997)）。ＶＡＰ−１の最も興味深い特徴の１つは、モノアミン酸化酵素活性を含有する触媒細胞外ドメインである（Smith, D. J.ら, J. Exp. Med 188:17-27(1998)）。
【０００４】
ヒトＶＡＰ−１ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定は、ヒトＶＡＰ−１ｃＤＮＡが銅含有アミンオキシダーゼ（Ｅ.Ｃ.１．４．３．６）と呼ばれる酵素の種類にホモロジーを有する膜貫通タンパク質をコードすることを明らかにした。酵素アッセイにより、ＶＡＰ−１がモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）活性を有し、それがタンパク質の細胞外ドメインに存在することが示されている（Smith, D. J.ら, J. Exp. Med. 188:17-27(1998)）。ゆえに、ＶＡＰ−１はエクト型酵素である。ＶＡＰ−１ＭＡＯ活性の分析は、ＶＡＰ−１がセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）と呼ばれる膜結合性ＭＡＯの種類に属することを示した。これらは、広く分布しているミトコンドリアＭＡＯ−ＡおよびＢフラビンタンパク質とは、アミノ酸配列、補因子、基質特異性および特定の阻害剤への感受性の点で区別される。しかしながら、いくつかの基質および阻害剤はＳＳＡＯ活性とＭＡＯ活性との両方に共通している。
【０００５】
血液から組織への白血球輸送は、微生物に対する正常な免疫応答を発生させるための必要条件であるだけでなく、悪性形質転換細胞に対する免疫学的監視のためにも必要である。通常白血球は、白血球上および内膜上の両方にある多くの活性化分子および接着分子を含む多段階の管外遊出カスケードを用いて血液から出る。ＶＡＰ−１は１内皮分子であり、白血球中の多種多様なサブセットが炎症部位へローリングし（rolling）、堅固に接着し、遊出することを手助けしている（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:760-771）。ＶＡＰ−１はセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼに属し、アミンの対応するアルデヒドへの酸化的脱アミノ化を触媒する酵素であり、その反応においては過酸化水素およびアンモニウムも生成される。白血球輸送におけるＶＡＰ−１の接着的役割は、複数のインビトロおよびインビボ炎症モデルにおいて機能遮断ｍＡｂまたは酵素阻害剤を用いて阻害することができる（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:760-771）。抗ＶＡＰ−１抗体はＶＡＰ−１の酵素活性を阻害せず、酵素阻害剤はＶＡＰ−１のｍＡｂ規定表面エピトープを変質しない（Koskinen, K., P. J. Vainio, D. J. Smith, M. Pihlavisto, S. YlaHerttuala, S. Jalkanen,およびM. Salmi. 2004.  Blood 103:3388-3395; Bonder, C., M. G. Swain, L. D. Zbytnuik, M. U. Norman, J. Yamanouchi, P. Santamaria, M. Ajuebor, M. Salmi, S. Jalkanen,およびP. Kubes. 2005. Immunity 23:153-163）。それゆえＶＡＰ−１は従来の接着分子（ｍＡｂ規定エピトープ）として、および酵素（白血球の表面提示アミンと反応することで）として働くことで、白血球の管外遊出に関与していると考えられている（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:760-771）。
【０００６】
ＶＡＰ−１の活性を阻害するための多種多様な方法が開示されている。例えば、国際公開第９３／２５５８２号パンフレットはＶＡＰ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体を開示している。国際公開第２００３／０９３３１９号パンフレットはヒト化抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体を記載している。
【０００７】
また、ＶＡＰ−１は、阻害剤として低分子を使用することにより拮抗され得る。国際公開第２００２／０２０２９０号パンフレット、国際公開第２００２／００２５４１号パンフレット、国際公開第２００３／００６００３号パンフレットおよび国際公開第２００５／０８０３１９号パンフレットは、ＶＡＰ−１活性を調節する特異的ＶＡＰ−１ＳＳＡＯ阻害剤として有用な、いくつかのヒドラジノ化合物を開示している。これらの化合物は、急性および慢性の炎症状態や疾患、ならびに炭水化物代謝に関連した疾患、脂肪細胞の分化または機能における異常、平滑筋細胞機能における異常、ならびに様々な血管病の治療に有用であると述べられている。
【０００８】
国際公開第２００６／１２８９５１号パンフレットは、ＶＡＰ−１に結合できるペプチドへの低分子阻害剤のコンジュゲーションを開示しており、ここではペプチドは７〜９個のアミノ酸の配列を有し、少なくとも１つのリジン残基が配列の中央部分に位置する。
【０００９】
国際公開第２００６／１３４２０３号パンフレットは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用することでＶＡＰ−１の発現をダウンレギュレートすることを開示している。このｓｉＲＮＡは約２１ヌクレオチドのアンチセンス配列を含む二本鎖であり、該アンチセンスはＶＡＰ−１ｍＲＮＡの領域に対し相補的であり、センス配列は該アンチセンスの約１９ヌレオクチド配列に相補的である。
【００１０】
先行技術はＳＳＡＯ活性と血管形成との関係についてなにも開示していない。特に、ＶＡＰ−１活性の減少と腫瘍増殖の抑制との関係はこれまで公開されていない。Garpenstrandら, Medical Oncology, vol.2, no.3, 241-250, 2004は、非小細胞肺癌患者における、ＳＳＡＯ活性とＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）との相関を明らかにすることを目的とした研究を示している。血清中のＳＳＡＯ活性とＶＥＧＦとの相関が報告された。ＳＳＡＯ活性の増加は、ＶＥＧＦ濃度の減少に対応することが発見された。さらに、血清ＳＳＡＯ活性は肺癌患者の生存とは無関係であった。
【００１１】
意外にも、本発明者らは血管成長とＶＡＰ−１活性との間に肯定的な関係を見出した。結果的に、本発明者らはＶＡＰ−１活性の減少が腫瘍の増殖を阻害することも見出した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は本発明者らにより実施され、以下に詳細を示す研究に基づく。本発明者らはＶＡＰ−１欠損マウスにおけるメラノーマおよびリンパ腫の増殖は野生型対照と比較した場合、より緩やかであることを発見した。本発明者らは腫瘍に栄養を与える新しい血管の形成は、ＶＡＰ−１が存在しなければ遅延されることを観測した。特に、ＶＡＰ−１の酵素活性が低分子酵素阻害剤を用いて中和された場合、新血管形成ならびにメラノーマおよびリンパ腫の増殖もまた不完全であった。これらのデータは、ＶＡＰ−１が血管形成を制御する上で新たな役割を担っていることを示している。さらに、ＶＡＰ−１の阻害は腫瘍の増殖を阻止すると考えられる。
【００１３】
ゆえに一側面によれば、本発明は、血管形成を阻害するための、または血管の成長を抑制することが有効な疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、個体において血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、もしくはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の使用に関する。
【００１４】
他の側面によれば、本発明は、癌または癌転移の治療または予防に使用するための医薬組成物の製造のための、個体において血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）の影響を中和できる、もしくはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の使用に関する。
【００１５】
第三の側面によれば、本発明は、個体における、血管形成の阻害方法または血管成長の抑制が有効な疾患の治療または予防方法であって、ＶＡＰ−１の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤の有効量が該個体に投与される方法に関する。
【００１６】
第四の側面によれば、本発明は、個体における癌または癌転移の治療または予防方法であって、ＶＡＰ−１の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤が有効量、該個体に投与される方法に関する。
【００１７】
第五の側面によれば、本発明は血管形成を阻害するため、または血管の成長を抑制することが有効な疾患の治療または予防のための、個体におけるＶＡＰ−１の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤に関する。
【００１８】
第六の側面によれば、本発明は癌または癌転移の治療または予防における使用のための、個体におけるＶＡＰ−１の影響を中和できる、またはその発現をダウンレギュレートできる薬剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＶＡＰ−１欠損マウスにおけるメラノーマの増殖の減少。Ａ）ルシフェラーゼ発現Ｂ１６メラノーマ細胞がＶＡＰ−１欠損マウスおよび野生型マウスの側腹に注射された。腫瘍の増殖は生物発光イメージングを使用し１０日間追跡された（ｎ＝１５  ｗｔ、ｎ＝１４  ＶＡＰ−１ −／−マウス）。Ｂ）腫瘍の直径は電子キャリバー（electronic caliber）を用いて測定され、腫瘍の大きさの評価が計算された（ｎ＝１２  ｗｔ、ｎ＝１１ＶＡＰ−１ −／−マウス）。結果は、平均±ＳＥＭとして示す（*、ｐ＜０．０５）。
【図２】ｍＡｂまたはＶＡＰ−１阻害剤によるＶＡＰ−１の阻害はメラノーマの増殖を妨げる（Ａ）。野生型マウスは毎日陰性対照または抗ＶＡＰ−１ｍＡｂにより処置され、ルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞の増殖は生物発光を使用し追跡された（ｎ＝１５  ｗｔ、ｎ＝１４  ＶＡＰ−１−／−マウス）。野生型マウスは毎日ＶＡＰ−１阻害剤であるＳＺＥ５３０２（Ｂ）により処置を施され、腫瘍の直径が測定された（ｎ＝１２  ｗｔ、ｎ＝１１  ＶＡＰ−１−／−マウス）。結果は、平均±ＳＥＭとして示す（**、ｐ＜０．０１）。
【図３】ＶＡＰ−１阻害剤がメラノーマの腫瘍における新血管形成を妨げる。腫瘍は実験の最後（ｄ１０）にモノクローナル抗体処置群およびＶＡＰ−１阻害剤処置群から切除された。腫瘍内にある、ＣＤ３１陽性血管の数は免疫組織化学および顕微鏡による計数で決定した。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５マウス／群）として示す（**、ｐ＜０．０１）。ＨＰＦ＝高倍率視野（４００×倍率）。
【図４】ＶＡＰ−１非存在下での、腫瘍細胞含有マトリゲルプラグ内への新血管成長の減少。メラノーマ細胞を含有するマトリゲルプラグは野生型およびＶＡＰ−１欠損マウスに挿入された。１０日後、該プラグは切り出され、マトリゲルに侵入している血管の数がＨＥ染色切片から顕微鏡で決定された。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５マウス／群）として示す（*、ｐ＜０．０５）。ＨＰＦ＝高倍率視野（４００×倍率）。
【図５】ＶＡＰ−１欠損マウスにおける骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の遊走不全、血管形成、およびリンパ腫増殖（ａ、ｂ）。ＥＬ−４リンパ腫細胞は（ａ）野生型およびＶＡＰ−１欠損マウス、ならびに（ｂ）対照およびＳＺＥ５３０２処置マウスの皮下に注入され、リンパ腫の増殖（体積）が速度論的に測定された。対照およびＳＺＥ５３０２処置マウスにおけるＶＡＰ−１活性は酵素アッセイを用いて測定された（ｃ）。野生型およびＶＡＰ−１−／−マウスにおいて増殖したＥＬ−４リンパ腫中の腫瘍血管における、ＶＡＰ−１（ｄ）およびＣＤ３１（ｅ）の発現の免疫組織化学的染色である。いくつかの陽性血管が矢印により指摘されている。またリンパ腫細胞は、ＣＤ３１を低いレベルで発現する。バーは５０μｍ。（ｆ）ＣＤ３１陽性血管、および（ｇ）ＣＤ１１ｂ陽性細胞の数は免疫組織化学を用いて決定された。データ（平均±ＳＥＭ）は、１群につき５、６匹のマウスから得ている（*、ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【図６】ＶＡＰ−１はメラノーマ腫瘍において血管形成を促進する骨髄由来サプレッサー細胞の補充を選択的に支えている。ＣＤ１１ｂ陽性細胞は野生型およびＶＡＰ−１欠損マウスにおいて、ならびにビヒクルまたはＳＺＥ５３０２阻害剤により処置された野生型マウスにおいて顕微鏡の計測により定量された。データ（平均±ＳＥＭ）は、１群につき９匹のマウスから得ている（**ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「治療」または「治療する」という語は、疾患または障害の完全な治癒、ならびに該疾患または障害の改善または軽減も含むものであると理解される。
【００２１】
「予防」という語は、疾患または障害の完全な予防（prevention, prophylaxis）、ならびに該疾患または障害にかかる個体のリスクを低下させることも含むものであると理解される。
【００２２】
「個体」という語は、ヒトまたは動物の対象を意味する。
【００２３】
「有効量」という語は、特に動物またはヒトの対象に投与した場合、望ましい治療結果をもたらすのに充分な本発明による薬剤の任意の量を包含するものであると意図されている。
【００２４】
「阻害」または「阻害する」という語は、完全な阻害だけでなく、あらゆる程度の抑制をも含むものであると理解される。
【００２５】
［好ましい薬剤］
「血管接着タンパク質１の影響を中和できる薬剤」という語は、そのタンパク質を遮断する抗体、ならびに任意の阻害剤、特に酵素活性を阻害するのに有用な低分子阻害剤を含むものであると理解される。
【００２６】
「血管接着タンパク質１の発現をダウンレギュレートできる薬剤」という語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）、ならびにリボザイム、またはインビボでそれらもしくはそれらの必須部分を発現できるベクターを含むものであると理解される。
【００２７】
「抗体」という語は、モノクローナル抗体、ポリクノーナル抗体、およびそれらのあらゆる断片を含むものであると理解される。また、遺伝工学的に作製された抗体および断片も含まれる。ヒトの個体で使用するためには、ヒト化抗体またはキメラ抗体が好ましい。これらの抗体は例えば、国際公開第２００３／０９３３１９号パンフレットに記載されている。
【００２８】
癌の治療および血管形成の予防のためのＶＡＰ−１阻害の好ましい方法は、ＶＡＰ−１の酵素活性を遮断することである。実験データによれば、この方法は腫瘍の増殖の阻害において、抗体によりＶＡＰ−１の接着機能を遮断するよりも効果的である（図２）。アルデヒド、過酸化水素、アンモニウムの生成またはこれらいずれかの生成が、通常、新血管形成および／または腫瘍における他の増殖促進効果にとって必要であるという仮説をたてることができる。それゆえ、ＶＡＰ−１の酵素活性を阻害することによるそれらの生成の阻害が、新血管形成および／または腫瘍増殖の他の側面を害するということになる。
【００２９】
好ましい阻害剤は低分子阻害剤である。低分子ＶＡＰ−１阻害剤は例えば、本技術分野において開示されているものである（国際公開第２００２／０２０２９０号パンフレット、国際公開第２００２／００２５４１号パンフレット、国際公開第２００３／００６００３号パンフレットおよび国際公開第２００５／０８０３１９号パンフレットを参照されたい）。
【００３０】
好ましい低分子阻害剤は、ＳＺＥ５３０２と記号化された化合物（（１Ｓ、２Ｓ）−（１−メチルヒドラジノ）−１−インダノール）である（コードＢＴＴ２０５２としても既知）。該化合物は、例えば、Fumiko Marttila-Ichiharaら, Arthritis & Rheumatism, vol. 54, no. 9 Sep 2006, pp. 2852-2862に記載されている。別の好ましい低分子は、ＬＪＰ１５８６（［Ｚ−３−フルオロ−２−（４−メトキシベンジル）アリルアミン塩酸塩］）である。これらの低分子阻害剤は非制限的な例示としてのみ言及される。
【００３１】
低分子阻害剤などの阻害剤はそのままでも投与できるが、好ましくは適当な、薬学的に許容され得る担体と混合して、またはＶＡＰ−１酵素と結合できるペプチドとのコンジュゲーションとして投与される。このようなＶＡＰ−１結合ペプチドは国際公開第２００６／１２８９５１号パンフレットにおいて開示されている。該ペプチドは少なくとも７つのアミノ酸、好ましくは７〜９のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、該配列は配列の中心領域に少なくとも１つのリジン残基を有する中心領域、および好ましくはそれぞれ少なくとも２つの連続したグリシン残基を含む末端領域を含む。このようなペプチドの最も好ましい例は、国際公開第２００６／１２８９５１号パンフレットの請求項１３に挙げられている。ペプチドの低分子阻害剤への連結は、当該公報の８頁１６〜２６行に記されているよう行うことができる。
【００３２】
ＶＡＰ−１に結合できる他の有用なペプチドは、本技術分野において、例えばElina Kivi, Identification of ligands for endothelial receptor VAP-1 by using phage display. Master thesis, January 2007, Department of Biology, University of Turkuに記載されている。有用なＶＡＰ−１結合ペプチドは、例えば、配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）またはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）、もしくはこれらの配列と少なくとも４つの共通するアミノ酸を有するホモログである。ペプチドの特別な群は、ＳｉｇｌｅｃまたはＡＤＡＭ群、もしくはＣＤ５８糖タンパク質に属するタンパク質由来のものである。特定の例としては、ＣＡＲＬＳＬＳＷＲＧＬＴＬＣＰＳ（配列番号３）、ＣＡＴＬＳＷＶＬＱＮＲＶＬＳＳＣ（配列番号４）およびＣＬＥＮＦＳＫＷＲＧＳＶＬＳＲＲＣ（配列番号５）が挙げられた。
【００３３】
好ましくは、ＳＳＡＯ、特にＶＡＰ−１の発現をダウンレギュレートできる薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそのｓｉＲＮＡ二本鎖もしくは該二本鎖のアンチセンス鎖をコードする核酸を、哺乳類細胞内で該ｓｉＲＮＡ二本鎖もしくはアンチセンス鎖の発現を可能にする形で含有する発現ベクターである。このようなＶＡＰ−１のｓｉＲＮＡ二本鎖は国際公開第２００６／１３４２０３号パンフレットに記載されている。好ましくは、ｓｉＲＮＡは約２１ヌクレオチドのアンチセンス配列を含む二本鎖であって、該アンチセンスはＶＡＰ−１ｍＲＮＡの領域に相補的であり、センス配列は該アンチセンスの約１９ヌレオクチドの配列に相補的である。ＶＡＰ−１ｓｉＲＮＡ二本鎖の特に好ましい例は、国際公開第２００６／１３４２０３号パンフレットの図５に示されている。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの原理は文献において広範囲に記載されている。例として、米国特許第２００３／０１４３７３２号明細書、米国特許第２００３／０１４８５０７号明細書、米国特許第２００３／０１７５９５０、米国特許第２００３／０１９０６３５号明細書、米国特許第２００４／００１９００１号明細書、米国特許第２００５／０００８６１７号明細書および米国特許第２００５／００４３２６６号明細書が挙げられる。
【００３５】
ｓｉＲＮＡ二本鎖分子はアンチセンス領域とセンス鎖を含んでおり、該アンチセンス鎖は、ある特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列における標的領域に相補的な配列を含み、かつ該センス鎖は該アンチセンス鎖に相補的な配列を含む。したがって、ｓｉＲＮＡ二本鎖分子は、２つの核酸フラグメントから編成され、１つのフラグメントがアンチセンス鎖を含み、２つ目のフラグメントが前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、リンカー分子を介して共有結合的に結合することができ、該リンカー分子としてはポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーが使用され得る。アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さは、一般的にはそれぞれ約１９から２１ヌレオクチドである。通常、アンチセンス鎖およびセンス鎖はどちらも、少数の、一般的には２つのヌクレオチドの３’−末端突出部を含む。アンチセンスの５’−末端は一般的にはリン酸基（Ｐ）である。末端リン酸基（Ｐ）を有するｓｉＲＮＡ二本鎖は一本鎖アンチセンスよりも細胞内へ投与しやすい。細胞内において活性ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖が形成され、該アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの標的領域を認識する。これはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ＝ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）による標的ＲＮＡの切断を導き、またＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によるさらなるＲＮＡの合成において、ＤＩＣＥＲを活性化させ、さらなるｓｉＲＮＡ二本鎖分子をもたらし、それにより反応を増幅する。
【００３６】
「相補的」という語は、ヌクレオチド配列がワトソンクリックや他の塩基対の相互作用により、標的ＲＮＡ配列と水素結合を形成できることを意味する。この用語は１００％相補的でない配列も含むものであると理解される。より低い相補性もまた機能し得ると考えられている。しかしながら、１００％相補性であることが好ましい。
【００３７】
ｓｉＲＮＡは医薬品として使用される場合、当然標的細胞中に導入される。その送達は、主に２つの異なる方法：１）オリゴヌクレオチドの外因性送達、または２）オリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列がベクターに位置づけられているＤＮＡ配列の内因性転写により達成させることができる。
【００３８】
通常、非修飾ＲＮＡは、生細胞中に存在するリボヌクレアーゼ酵素による分解のため、生理的条件での安定性は低い。オリゴヌクレオチドが外因的に投与される場合、化学的分解および酵素的分解に対する安定性を強化するため、既知の方法により分子を修飾することが強く望まれる。
【００３９】
インビボで外因的に投与されるヌクレオチドの修飾は、本技術分野において広範囲に記載されている。主として、ヌクレオチドの全ての部分、すなわちリボース糖、塩基および／またはヌクレオチド間のホスホジエステルストランドが修飾され得る。
【００４０】
前述の修飾は非制限的な例に過ぎないということが強調されるべきである。
【００４１】
ＶＡＰ−１のｓｉＲＮＡ二本鎖およびベクターが国際公開第２００６／１３４２０３号パンフレットに記載されているが、標的ＲＮＡの他の標的領域に基づく別の有用なｓｉＲＮＡもまた使用できるということが強調される。有用な標的領域は、膨大な数の学術的または商業的に明らかにされたアルゴリズムであって、利用可能なｓｉＲＮＡ配列の場所を特定するために科学者を手助けするように開発されたアルゴリズムを使用することで簡単に特定できる。このようなソフトウェアシステムの例は、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（http://design.RNAi.jp/）（Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W124-9）; ＴＲＯＤ（T7 RNAi Oligo Designer（http://www.cellbio.unige.ch/RNAi.html; Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W121-3）; ＤＥＱＯＲ（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html; Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32: W113-20）、またはhttp://www.genscript.com; http://www.genscript.com/rnai.html#designもしくはhttp://www.genscript.com/sirna_ca.html#design; Bioinformatics 2004 Jul 22;20(11)1818-20で利用可能なプログラムが提示されている。それらのツールの絶対的な基準は標的でない遺伝子のサイレンシングを避け、哺乳類ＲＮＡ干渉に対する最大の標的特異性を有するｓｉＲＮＡを達成することである。これらのアルゴリズムにより同定された配列の有用性はいずれも、その後実験により実証されるべきである。
【００４２】
ＶＡＰ−１阻害を他の形の血管形成阻害薬（ＶＥＧＦ遮断抗体など）と併用することは、このような治療を必要とする患者に対して付加的または相乗的な効果を提供できる。
【００４３】
［治療に反応する疾患］
本発明による方法は、個体における血管成長を抑制することが有益であるあらゆる疾患の治療または予防に有用である。これらの疾患の非制限的な例としては、関節炎、網膜症、加齢性黄斑変性症、アテローム性動脈硬化症および全ての形態の癌が挙げられる。したがって、皮膚癌や結腸癌など、あらゆる良性または悪性腫瘍もしくは悪性腫瘍の転移を治療できる。また、白血病、リンパ腫および骨髄腫も治療できる。特に、メラノーマおよびリンパ腫は、当該治療に対して非常に良く反応することが示されている。
【００４４】
実施された実験にもとづき、本発明による方法は、例えば線維肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などのすべての種類の肉腫、中皮腫、髄膜腫、白血病、リンパ腫、ならびに、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、乳頭癌、嚢胞腺癌、気管支癌、メラノーマ、腎細胞癌、肝細胞癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮腫および胎生期癌などすべての種類の癌腫（carcinomas）の治療または予防に有用であると考えられる。
【００４５】
癌および癌の転移に有益な効果は、主に血管の成長抑制に基づくと考えられるが、他の機序も関与し得るということも留意すべきである。
【００４６】
［投与経路、製剤化、必要用量］
本発明で使用される医薬組成物は、それらが意図された目的を達成する任意の手段により投与することができる。例えば、非経口、皮下、静脈内、関節内、髄腔内、筋肉内、腹腔内もしくは皮内注射、または経皮、口腔、眼内経路、または吸入を介して投与できる。あるいは、経口によっても投与できる。低分子阻害剤にとって特に好ましいものは経口投与である。薬理学的に活性な化合物に加えて、化合物の医薬製剤は、活性化合物の薬学的に使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容され得る担体を含有する。
【００４７】
本発明での使用のためのｓｉＲＮＡ二本鎖は多種多様な方法により個体へ投与される。１つの方法によれば、該ｓｉＲＮＡは外的にそのまま投与されるか、例えばリポソーム、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、陽イオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体とのコンジュゲートなどの適切な担体と混合された医薬組成物の形態で投与される。しかしながら、他の担体も使用できる。ｓｉＲＮＡは全身もしくは局所に投与される。投与に適した経路として静脈内、筋肉内、皮下への注入、吸入、経口、局所、眼内、舌下、経鼻、直腸、腹腔内送達システム、および経皮送達システムが挙げられる。ｓｉＲＮＡを含有する組成物は、直接的注射を用いるかわりに、例えばカテーテルや薬物注入ポンプ、またはステントなどを使用することで投与することもできる。
【００４８】
細胞中で高濃度のｓｉＲＮＡを達成する他の方法はｓｉＲＮＡコード配列を発現ベクターに組み込み、そのようなベクターを個体に投与することである。本出願では、該発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはそのアンチセンス鎖のみのいずれかが、例えば短いヘアピンＲＮＡの形式で発現されるように構築される。この発現ベクターは、真核細胞の発現が可能なＤＮＡプラスミドのようなＤＮＡ配列や、ウイルス性ベクターがあり得る。このようなウイルス性ベクターは、好ましくは、アデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルスに基づくものである。好適には、該ベクターは上述のｓｉＲＮＡと同様の方法で患者に送達される。発現ベクターの送達は、静脈内、筋肉内、腹腔内投与などの全身性のものか、または後に患者に再導入される、患者由来の外植された標的組織または標的細胞への局所送達である。
【００４９】
ｓｉＲＮＡの静脈内の投与は優先的に肝臓の血管構造を標的とするため（Lewis DLおよびWolff JA, Methods Enzymol. 2005;392:336-50; Soutschek Jら, Nature. 2004 Nov 11;432(7014):173-8;およびSong Eら, Nat Med. 2003 Mar;9(3):347-51）、肝臓の疾患は介入に特に適した標的である。特にリポソーム中に包理されたｓｉＲＮＡは肝臓組織を標的にするために大変有用であるということが報告されている。有毒な副作用は報告されていない。
【００５０】
ゆえに、一般的な用量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１．０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量である。本発明で使用するための化合物は、日用量を単回投与してもよいし、または全日用量を１日に２〜４回の投与量に分割して投与してもよい。ｓｉＲＮＡが使用される場合、一般的な日用量は、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量である。適切な投与頻度は１日１回または２回であると考えられている。ＲＮＡｉが発現ベクターにより送達される場合、単回投与（または１週間に１度など、一定の間隔で繰り返される単回投与）で充分であると考えられている。
【００５１】
本発明は以下の非制限的な実施例に従って説明される。
【実施例】
【００５２】
ＶＡＰ−１機能の遮断は、インビボでの炎症性反応を効果的に軽減し、ＶＡＰ−１の阻害を目的とする療法は炎症性障害を治療するために活発に開発されている。しかしながら、ＶＡＰ−１が抗腫瘍免疫に関与しているかどうかは知られていない。インビトロでは以前から、ＮＫ細胞と腫瘍浸潤リンパ球が、凍結切片結合アッセイにおいて血管と結合するためにＶＡＰ−１を使用できるということが示されている（Irjala, H., M. Salmi, K. Alanen, R. Grenman,およびS. Jalkanen. 2001. J. Immunol. 166:6937-6943）。しかしながら、インビボでの腫瘍増殖におけるＶＡＰ−１の役割については何も知られていない。そこで、本発明者らは、ＶＡＰ−１欠損マウス、抗ＶＡＰ−１ｍＡｂおよびＶＡＰ−１阻害剤を用いて、メラノーマおよびリンパ腫におけるＶＡＰ−１の役割を研究した。本発明者らは、ＶＡＰ−１活性が正常な新血管形成および腫瘍の増殖に必要であるということを発見した。これらのデータはこれまで未知であった血管形成の制御におけるＶＡＰ−１の機能を明らかにし、ＶＡＰ−１の遮断が腫瘍の増殖を減じるために使用できることを示す。
【００５３】
［原料および方法］
腫瘍モデル
メラノーマモデルにおいて、年齢および性別を一致させたＶＡＰ−１欠損Ｃ５７／Ｂ１６マウスと野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスが使用された（Stolen, C.M., F. Marttila-Ichihara, K. Koskinen, G.G. Yegutkin, R. Turja, P. Bono, M. Skurnik, A. Hanninen, S. JalkanenおよびM. Salmi. 2005. Immunity 22:105-115）。ルシフィラーゼ含有Ｂ１６メラノーマ細胞はキセノゲン（Xenogen）社から購入された。腫瘍細胞（２００μｌ中４×１０5）はイソフルレンで麻酔されたマウスの側腹へ皮下注射された。その直後、ルシフィラーゼ用の基質（Ｄ−ルシフェリンナトリウム塩、シンケム（Synchem）社、カッセル、ドイツ；１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ.ｐ.）が注射され、１０分後に生物発光イメージング（ＩＶＩＳ５０ワークステーション、キセノゲン社）を使用して発せられた光が記録された。信号の強度はリビングイメージ（Living Image）ソフトウェア（ゼノジェン社）を使用する光子計測として定められた。光子計測は腫瘍細胞数の信頼性のある指標であることが示されている（キセノゲンおよびたとえば、Minn, A.J., Y. Kang, I. Serganova, G.P. Gupta, D.D. Giri, M. Doubrovin, V. Ponomarev, W.L. Gerald, R. BlasbergおよびJ. Massague. 2005. J. Clin. Invest. 115:44-55）。腫瘍の増殖はその後１０日間追跡され、表示時点で動物は生物発光イメージングに再度付された。腫瘍の直径もまた電子キャリバー（ミツトヨ社、日本）を用いて測定された。腫瘍の体積は式：０．５×（最大直径）×（最小直径）を用いて概算された。
【００５４】
リンパ腫モデルにおいては、ＥＬ−４細胞が腹部に注射された（２００μｌのＲＰＭＩ１６４０中、１０×１０6細胞／マウス）。腫瘍の増殖は電子キャリバーを用いて追跡された。
【００５５】
抗ＶＡＰ−１抗体およびＶＡＰ−１阻害剤の処置
腫瘍モデルは上記のように確立された。動物は２日おきに抗ＶＡＰ−１ｍＡｂ（７−１０６＋７−８８、各１００μｇ／マウス）または陰性対照ｍＡｂ ＨＢ１５１（２００μｇ／マウス、ｉｐ）で処置された（Merinen, M., H. Irjala, M. Salmi, I. Jaakkola, A. HanninenおよびS. Jalkanen. 2005. e. Am. J. Pathol. 166:793-800）。抗体は、血清およびＢＳＡ不含培地で産生され、濃縮され、ＰＢＳに対して透析された。もう一方のマウス群はＶＡＰ−１阻害剤ＳＺＥ５３０２（５０ｍｇ／ｋｇ、ip、毎日）またはビヒクル（生理食塩水）で処置した（Koskinen, K., P.J. Vainio, D.J. Smith, M. Pihlavisto, S. Yla-Herttuala, S. JalkanenおよびM. Salmi. 2004. Blood 103:3388-3395）。腫瘍の増殖はその後、上述のように生物光学イメージングまたは体積測定を用いて追跡された。
【００５６】
免疫組織化学
実験の最後に腫瘍はマウスから切除され、免疫組織化学的染色が行われた。抗マウスＣＤ３１ ｍＡｂ（ＭＥＣ１３．３、ＩＨＣ式、１：３００希釈；ファーミンゲン（pharmingen）社）および陰性対照ｍＡｂ（９Ｂ５）が間接的な免疫ペルオキシターゼ染色に用いられた。該切片はヘマトキシリン−エオシンで対比染色され、Ｄｅｐｅｘに固定された。特定の場合には、ホルマリンで固定され、パラフィンで包埋された切片がＨＥで染色された。ＣＤ３１陽性血管またはＨＥ染色切片の血管が４００×倍率を使用して腫瘍領域全体における血管数を計測することにより数えられた。切片はＣＤ１１ｂおよびＧｒ−１抗体でも染色された。ＦＡＣＳ結果は腫瘍中のＣＤ１１ｂ陽性細胞の＞７０％が、該細胞を骨髄由来サプレッサー細胞であると定義するＧｒ−１を共発現したことを示した（データは示されていない）。
【００５７】
マトリゲルプラグ
メラノーマ細胞（２００μｌ中４×１０5）がマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（３００μｌ；基底膜抽出物、ベクトン−デッキンソン（Becton-Dickinson）社）と混合され、製造者の取扱説明書に従って受容マウスの側腹に注入された。１０日後、そのプラグが切除され、プラグ中の新しい血管数が上述のようにＣＤ３１染色を用いて定量された。
【００５８】
統計的分析
独立両側スチューデントｔ−検定が統計的分析に用いられた。Ｐ値＜０．０５が有意とみなした。
【００５９】
［結果］
ＶＡＰ−１欠損マウスにおいて遅延したメラノーマの増殖
腫瘍増殖におけるＶＡＰ−１の役割を研究するため、本発明者らはルシフェラーゼ標識化Ｂ１６メラノーマ細胞を野生型マウスおよびＶＡＰ−１ＫＯマウスの皮下に注入した。メラノーマ細胞の増殖を生物発光イメージングを用いて速度論的に追跡すると、腫瘍は両方の遺伝子型で形成されることが判明した。同様の増殖があった最初の一定期間後、７日目にＶＡＰ−１欠損マウス中で該腫瘍の増殖が遅くなり始めた（図１Ａ）。１０日目、マウスを倫理上の理由から安楽死させなければならなくなった時、ＶＡＰ−１欠損マウスにおける腫瘍は、野生型の対照に比べて有意に小さかった。腫瘍の直径を測定することで腫瘍の体積の推定値が得られると、ＶＡＰ−１欠損マウスにおける同様の腫瘍増殖の減退が明らかとなった（図１Ｂ）。これらのデータはゆえに、メラノーマの増殖はＶＡＰ−１非存在下において妨げられるということを示す。
【００６０】
ＶＡＰ−１の酵素活性は腫瘍の増殖にとって重要である
ＶＡＰ−１の機能は抗ＶＡＰ−１ｍＡｂまたはＶＡＰ−１酵素阻害剤を使用することで治療的に阻害できる（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:760-771）。したがって、メラノーマ細胞をマウスへ注入し、その動物を機能遮断抗ＶＡＰ−１ｍＡｂまたはアイソタイプが適合する対照抗体で処置した（毎日ｉ.ｐ.注射）。ＶＡＰ−１の機能が抗体で遮断されると、該腫瘍細胞の数は増殖が遅くなる傾向となった（図２Ａ）ただしこの差異は統計学的有意には達していなかった。
【００６１】
マウスが選択的ＶＡＰ−１阻害剤ＳＺＥ５３０２で処置されると、腫瘍の増殖において有意な減少が観測された（図２Ｂ）。該阻害剤はルシフェラーゼに基づくアッセイを干渉するが、腫瘍の体積の物理的な測定は、ＳＺＥ処置マウスにおける有意な減少をすでに７日目で示した。１０日目でメラノーマはＶＡＰ−１活性がない場合明らかに小さかった。ゆえに、ＶＡＰ−１の触媒活性はメラノーマ腫瘍の増殖を支えている。
【００６２】
ＶＡＰ−１は腫瘍における新血管形成を支えている
ＶＡＰ−１は血管内の内皮、周皮細胞および平滑筋細胞で発現する（Salmi, Mら, J. Exp. Med 178:2255-2260 (1993); Salmi, M.およびJalkanen, S., Science 257:1407-1409(1992)）。それゆえＶＡＰ−１の中和が腫瘍中の血管構造を変えるのかという疑問が生じた。影響を確認するために、抗ＶＡＰ−１抗体または酵素阻害剤によって処理された、もしくは処理されていない野生型マウスにおいて増殖した腫瘍を免疫染色した。
【００６３】
本発明者らは、抗ＶＡＰ−１抗体処置は、腫瘍中の新しい血管の数に影響しないということを見出した。一方で、ＶＡＰ−１阻害剤処置マウスで増殖した腫瘍におけるＣＤ３１＋陽性血管は、対照マウスよりも顕著に少なかった（図３）。これらのデータはＶＡＰ−１の酵素活性が腫瘍における新しい血管形成の制御に関与していることを示す。
【００６４】
メラノーマ細胞を含有するマトリゲルプラグ中への新しい血管の増殖が、野生型マウスおよびＶＡＰ−１ＫＯマウスにおいて測定された。新血管の増殖はこの新血管形成モデルにおいても、ＶＡＰ−１非存在下で減ずるということが明らかとなった（図４）。
【００６５】
図６はＶＡＰ−１が存在しないメラノーマおよびＶＡＰ−１阻害剤ＳＺＥ５３０２で処置された野生型マウスにおいてもＭＤＳＣの数が大幅に減少したことを示す。このデータは、ＶＡＰ−１がメラノーマ腫瘍においてＭＤＳＣの遊走を調節することで血管形成を支えているということを示す。
【００６６】
ＶＡＰ−１はリンパ腫の部分増殖に必要である
本発明者らは、ＶＡＰ−１が異なるタイプの腫瘍細胞の通常の拡大にも必要とされるのかどうかも疑問であった。本発明者らは、ＩＬ−４細胞の皮下注入後、ＶＡＰ−１欠損マウスにおいて発達した腫瘍は、野生型の宿主と比べて１４日目と１７日目で有意に小さかった（図５ａ）。野生型マウスをＶＡＰ−１阻害剤ＳＺＥ５３０２で処置することも腫瘍の増殖を強く阻害した（図５ｂ、ｃ）。リンパ腫中の新血管は野生型においてＶＡＰ−１を発現した（図５ｄ）。特に、ＣＤ３１陽性血管の数は、ＶＡＰ−１非存在下でリンパ腫内において減少した（図５ｅ、ｆ）。最も重要なことは、ＭＤＳＣの数もまた、ＶＡＰ−１非存在下でリンパ腫内において大幅に減少した（７１±３％、ｎ＝５マウス／群、ｐ＜０．０００１）ということである（図５ｇ）。これらのデータは、ＶＡＰ−１がいくつかの腫瘍タイプにおいてＭＤＳＣの遊走を制御することで、新血管形成を支えているということを意味している。
【００６７】
結論
これらのデータはＶＡＰ−１がメラノーマおよびリンパ腫の通常の増殖に必要であることを示す。ＶＡＰ−１の機能が、遺伝的欠失により、または抗ＶＡＰ−１抗体もしくはＶＡＰ−１阻害剤の使用により阻害されると、メラノーマまたはリンパ腫細胞の増殖はインビボモデルにおいて減じられる。さらに、少なくともＶＡＰ−１欠損マウスおよびＶＡＰ−１阻害で処置された野生型動物においては、腫瘍主導の新血管形成は減じられた。これらのデータはＶＡＰ−１の治療的阻害またはダウンレギュレートが血管形成、特に腫瘍の血管新生およびそれに伴う腫瘍の増殖を阻害するために使用できることを意味している。
【００６８】
本発明の方法は多種多様な実施態様の形式に組み込むことができと考えられ、本明細書において開示されているのはそれら実施態様のほんの一部である。当業者にとって、他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱しないということは明らかである。ゆえに記載された実施態様は例証であり、制限的なものとして解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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