(57)【要約】  本開示は、本明細書において述べた通りである構造式ＩＩからＶＩＩの実質的に立体異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物、それらの調製のための生体触媒法、およびそれらの方法に用いられる酵素を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式ＩＩ（ａ）、ＩＩ（ｂ）、ＩＩＩ（ａ）またはＩＶ（ａ）
【化１】
2011525533.tif 000059
による実質的に立体異性的に純粋な化合物（それらの塩および水和物を含む。）［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］。
【請求項２】
ＭおよびＭ’が存在せず、ならびにＡが、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＭおよびＭ’がＯであり、ならびにＡが−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＭおよびＭ’が−ＣＨ２−であり、ならびにＡが−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＭおよびＭ’が−ＣＨ２−であり、ならびにＡが−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＭおよびＭ’が存在しない、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＭおよびＭ’が−ＣＨ２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ａが−ＣＨ２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ａが−Ｃ（ＣＨ３）２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ａが−Ｃ（ＣＨ３）２−である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ａが−Ｃ（ＣＦ３）２−である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが−ＣＨ２−である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
実質的に立体異性的に純粋な化合物が
【化２】
2011525533.tif 000060
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
実質的に立体異性的に純粋な化合物が
【化３】
2011525533.tif 000061
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
実質的に立体異性的に純粋な化合物が
【化４】
2011525533.tif 000062
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
実質的に立体異性的に純粋な化合物が
【化５】
2011525533.tif 000063
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
実質的に立体異性的に純粋な化合物が
【化６】
2011525533.tif 000064
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１の実質的に立体異性的に純粋な化合物の対を含む混合物であって、化合物の対が（ｉ）構造式ＩＩ（ａ）およびＩＩ（ｂ）の化合物；（ｉｉ）構造式ＩＩＩ（ａ）およびＩＩＩ（ｂ）の化合物；ならびに（ｉｉｉ）構造式ＩＶ（ａ）およびＩＶ（ｂ）の化合物から選択される、混合物。
【請求項１９】
化合物の対が構造式ＩＩＩ（ａ）およびＩＩＩ（ｂ）の対であり、ならびに混合物中の構造式ＩＩＩ（ａ）の化合物の量が混合物中の構造式ＩＩＩ（ｂ）の化合物の量より多い、請求項１８の混合物。
【請求項２０】
構造式ＩＩＩ（ａ）の化合物の量と構造式ＩＩＩ（ｂ）の化合物の量の比が少なくとも５：１である、請求項１９の混合物。
【請求項２１】
化合物の対が構造式ＩＶ（ａ）およびＩＶ（ｂ）の対であり、ならびに混合物中の構造式ＩＶ（ａ）の化合物の量が混合物中の構造式ＩＶ（ｂ）の化合物の量より多い、請求項１８の混合物。
【請求項２２】
構造式ＩＶ（ａ）の化合物の量と構造式ＩＶ（ｂ）の化合物の量の比が少なくとも１０：１である、請求項２１の混合物。
【請求項２３】
構造式ＩＩ（ａ）
【化７】
2011525533.tif 000065
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に立体異性的に純粋な化合物（その塩および水和物を含む。）を調製する方法であって、
構造式Ｉ
【化８】
2011525533.tif 000066
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＩＩ（ａ）およびＩＩ（ｂ）について定義された通りである。］
によるアミン化合物を、モノアミンオキシダーゼ酵素が構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化する条件下でモノアミンオキシダーゼ酵素と補因子の存在下で酸素と接触させる段階を含む、方法。
【請求項２４】
補因子がモノアミンオキシダーゼ酵素と非共有結合で結合している、請求項２３の方法。
【請求項２５】
補因子が、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群から選択される、請求項２３の方法。
【請求項２６】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の酸素分子および水への不均化を触媒する成分をさらに含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】
成分が、Ｐｄ、Ｆｅおよびカタラーゼ酵素からなる群から選択される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）から得られるまたは由来である、請求項２３の方法。
【請求項２９】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号２の野生型Ａ．ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるまたは配列番号３２の野生型Ａ．オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３の方法。
【請求項３０】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３の方法。
【請求項３１】
構造式ＩＩＩ（ａ）による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物および構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物（それらの塩および水和物を含む。）
【化９】
2011525533.tif 000067
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
を含む混合物を調製する方法であって、構造式Ｉ
【化１０】
2011525533.tif 000068
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＩＩＩについて定義された通りである。］
によるアミン化合物を、構造式ＩＩＩ（ａ）による実質的に鏡像異性的アミノスルホネート化合物および構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に鏡像異性的アミノスルホネート化合物を含む混合物を生成する条件下で、補因子と結合したモノアミンオキシダーゼ酵素の存在下で酸素と、および重亜硫酸塩と接触させる段階を含む、方法。
【請求項３２】
重亜硫酸塩が、モノアミンオキシダーゼの前または同時に反応物に加えられる、請求項３１の方法。
【請求項３３】
重亜硫酸塩がモノアミンオキシダーゼの添加の後に加えられる、請求項３１の方法。
【請求項３４】
構造式Ｉによるアミン化合物が、重亜硫酸塩の添加の前に酸素および補因子と結合したモノアミンオキシダーゼ酵素と接触させられる、請求項３１の方法。
【請求項３５】
モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得られるまたは由来である、請求項３１の方法。
【請求項３６】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号２の野生型Ａ．ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるまたは配列番号３２の野生型Ａ．オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３１の方法。
【請求項３７】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３１の方法。
【請求項３８】
構造式ＩＶ（ａ）
【化１１】
2011525533.tif 000069
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物（その塩および水和物を含む。）を調製する方法であって、
構造式Ｉ
【化１２】
2011525533.tif 000070
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＩＶについて定義された通りである。］
によるアミン化合物を、以下の構造式ＩＩＩ（ａ）による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物および構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物
【化１３】
2011525533.tif 000071
を含む混合物を生成する条件下で、補因子と結合したモノアミンオキシダーゼ酵素の存在下で酸素と、および重亜硫酸塩と接触させる段階、ならびに
構造式ＩＩＩ（ａ）およびＩＩＩ（ｂ）による化合物を、構造式ＩＶ（ａ）による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階を含む、方法。
【請求項３９】
補因子がモノアミンオキシダーゼ酵素と非共有結合で結合している、請求項３８の方法。
【請求項４０】
補因子が、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４１】
モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得られるまたは由来である、請求項３８の方法。
【請求項４２】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号２の野生型Ａ．ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるまたは配列番号３２の野生型Ａ．オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３８の方法。
【請求項４３】
モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３８の方法。
【請求項４４】
構造式ＶＩ（ａ）
【化１４】
2011525533.tif 000072
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物（その塩を含む。）を調製する方法であって、
構造式ＩＶ（ａ）
【化１５】
2011525533.tif 000073
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＶＩのアミノ化合物について定義された通りである。］
による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４５】
構造式ＶＩ
【化１６】
2011525533.tif 000074
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物（その塩を含む）を調製する方法であって、
構造式ＩＩＩ（ａ）による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物を、
【化１７】
2011525533.tif 000075
構造式ＩＶ（ａ）
【化１８】
2011525533.tif 000076
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＶＩのアミノ化合物について定義された通りである。］
による実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階、ならびに
構造式ＩＶ（ａ）のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４６】
構造式Ｖ
【化１９】
2011525533.tif 000077
［式中、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に鏡像異性的に純粋な化合物（その塩を含む。）を調製する方法であって、
構造式ＶＩ
【化２０】
2011525533.tif 000078
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式Ｖのアミノ酸化合物について定義された通りである。］
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物を、構造式ＶＩによるアミノ酸化合物が構造式Ｖによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノエステル化合物に変換される条件下で酸ならびにＲ５−ＯＨおよびＲ５ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される化合物と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４７】
構造式Ｖ
【化２１】
2011525533.tif 000079
［式中、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］
による実質的に立体異性的に純粋なアミノエステル化合物（その塩を含む）を調製する方法であって、
構造式ＩＩＩ（ａ）による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物
【化２２】
2011525533.tif 000080
を、構造式ＩＶ（ａ）
【化２３】
2011525533.tif 000081
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＶＩのアミノ化合物について定義された通りである。］による実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階、ならびに
構造式ＩＶ（ａ）のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式Ｖによる実質的に立体異性的に純粋なアミノエステル化合物に変換される条件下で酸およびアルコールと接触させる段階を含む、方法。
【請求項４８】
構造式ＶＩＩ
【化２４】
2011525533.tif 000082
［式中、
Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、ならびにＸは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択され、
ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈであり、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ならびにＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、
（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、ならびに
（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、ならびに１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］による実質的に立体異性的に純粋なアミノアミド化合物（その塩を含む。）を調製する方法であって、
以下の構造式ＩＩＩ（ａ）による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式ＩＩＩ（ｂ）による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物
【化２５】
2011525533.tif 000083
を、構造式ＩＶ（ａ）
【化２６】
2011525533.tif 000084
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、構造式ＶＩのアミノ化合物について定義された通りである。］による実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階、ならびに
構造式ＩＶ（ａ）のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノアミド化合物に変換される条件下で酸と接触させる段階を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．技術分野
本開示は、構造式ＩＩからＶＩＩ
【０００２】
【化１】
2011525533.tif 000002
［式中、Ａ、Ｍ、Ｍ’およびＲ５は、本明細書において述べる通りである。］の実質的に立体異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物、それらの調製のための生体触媒法、およびそれらの方法に用いられる生体触媒酵素に関する。
【０００３】
２．配列一覧、表またはコンピュータプログラムへの言及
ファイル名ＣＸ２−０２０ＷＯ０１．ｔｘｔとしてコンピュータで読み込み可能な形式（ＣＲＦ）で３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に従って同時に電子的に提出された「配列一覧」は、参照により本明細書に組み込む。配列一覧の電子コピーは、２００９年６月２３に１１０Ｋバイトのファイルサイズで作成された。
【背景技術】
【０００４】
３．背景
二環式プロリン類似体は、ペプチド模倣薬の発見および開発に用いられている（Ａ．Ｔｒａｂｏｃｃｈｉら（２００８年）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（２００８）３４：１−２４頁）。Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤ボセプレビル（ＳＣＨ５０５０３４；（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−１−シクロブチル−３，４−ジオキソブタン−２−イル）−３−（（Ｓ）−２−（３−ｔｅｒｔ−ブチルウレイド）−３，３−ジメチルブタノイル）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボキサミド）（Ｍａｌｃｏｌｍら（２００６年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０（３）：１０１３  ２０頁）およびテラプレビル（ＶＸ９５０；Ｎ−（（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−（（Ｓ）−１−（（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−１−（（Ｒ）−３−（２−（シクロプロピルアミノ）−２−オキソアセチル）ヘキサノイル）ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロロ−２（１Ｈ）−イル）−３，３−ジメチル−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−２−オキソエチル）ピラジン−２−カルボキサミド）（Ｐｅｒｎｉら（２００６年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０（３）：８９９  ９０９頁）。
【０００５】
【化２】
2011525533.tif 000003
【０００６】
ボセプレビルおよびテラプレビルは、それぞれ下に示すシス型縮合二環式Ｌ−プロリン類似体（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸および（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸のエステルから調製される。
【０００７】
【化３】
2011525533.tif 000004
【０００８】
ＷＯ２０００／２０８２４およびＷＯ２０００／２１８３６９は、構造式ＶＩに対応する様々な縮合二環式Ｌ−プロリン類似体を組み込んだ他の多くのＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤を記載している。
【０００９】
有機化学の方法およびツールを用いたそのような錯体分子の合成の方法が報告されたが、それらの合成は、一般的に多段階であり、複雑であり、費用がかかり、非効率的であり、総収率が低い方法である。
【００１０】
Ｗｕら（ＷＯ２００７／０７５７９０）は、構造式
【００１１】
【化４】
2011525533.tif 000005
の対応するラセミ体イミンへのその酸化から開始する、構造式（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンの対応する対称（アキラル）二環式アミンからの二環式プロリン類似体（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸のメチルエステルの製造を開示している。
【００１２】
ラセミ体イミンをその後シアニドと反応させて、以下の構造式
【００１３】
【化５】
2011525533.tif 000006
のラセミ体アミノニトリルを得、
次にこれを酸およびメタノールと反応させて、以下の構造式
【００１４】
【化６】
2011525533.tif 000007
のラセミ体アミノ酸メチルエステルを得る。
【００１５】
最後に、これらの（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）（望ましくない）および（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）（望ましい）立体異性体メチルエステルをジアステレオマー塩分割により分離して、前者の鏡像異性体とのジ−ｐ−トリル−Ｄ−酒石酸塩または後者の鏡像異性体とのジ−ｐ−トリル−Ｌ−酒石酸塩を生成させる。
【００１６】
Ｔａｎｏｕｒｙら（ＷＯ２００７／０２２４５９）は、Ｎ−Ｂｏｃ誘導体を調製し、これを化学量論量を超えるバルキージアミンキレートの存在下で自燃性物質ｓｅｃ−ブチルリチウム次いで二酸化炭素（すべて−７０℃以下）と反応させて、下に示すラセミ体Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸を生成させることによる、対応する対称（アキラル）二環式アミンからのラセミ体（ｔ−ブトキシカルボニル）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸の合成を開示している。
【００１７】
【化７】
2011525533.tif 000008
【００１８】
これらのラセミＢｏｃ酸の（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）（望ましくない）および（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）（望ましい）立体異性体は、Ｓ−１−アミノテトラリンなどの単一鏡像異性体キラル塩基を用いてジアステレオマー塩分割により分離される。
【００１９】
アミノ酸誘導体の望ましい立体異性体はこれらの方法により得られるが、これらの二環式プロリン類似体の鏡像異性体の混合物の分割は、ラセミ混合物の製造に用いられるすべての物質（例えば、原材料、試薬、溶媒、触媒）の少なくとも半分の廃棄物を本質的に伴う。
【００２０】
（ｉ）Ｎ−アセチル−３−アザビシクロ［３．３．０］オクタンの陽極酸化（ＥＡ０００９０３６２）および（ｉｉ）チアゾリウムイリドアプローチ（Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００５）２（７）：４９７  ５０２頁）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４、５９、２７７３−８頁）を含む、アミノ酸（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸およびそのエステルの化学合成のさらなる方法が報告された。
【００２１】
ラセミ混合物の生成を回避する、構造式Ｉ（（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン）の対応する対称（アキラル）二環式アミンからの構造式（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸のアミノ酸および構造式Ｖのそのエステルを非対称的に生成させる方法ならびに鏡像異性体を分離する結果として生じる必要性は、上述の分割に基づく方法より効率がよく、無駄が少なく、費用対効果が高いことがあり得る。
【００２２】
モノアミンオキシダーゼ酵素は、酸素を用いて１つの鏡像異性体を対応するイミンに立体特異的に酸化することによってラセミキラルアミンを分割し、脱ラセミ化するために用いられた。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のフラビン依存性モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ  Ｎ）の誘導体（Ｓｈｉｌｌｉｎｇら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２４３：５２９  ３７頁）は、鏡像異性的に純粋な（９３％ｅｅ）（ｄ）αメチルベンジルアミンを得るための（ｄ／ｌ）αメチルベンジルアミンの脱ラセミ化に非特異的化学還元剤との併用で有用であると報告された（Ａｌｅｘｅｅｖａら（２００２年）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４１：３１７７−３１８０頁）。アスペルギルス・ニガーのフラビン依存性モノアミンオキシダーゼの誘導体は、鏡像異性的に純粋な（９８％ｅｅ）（Ｒ）−２−フェニルピロリジン（ｐｈｅｎｙｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）を得るための（Ｒ／Ｓ）−２−フェニルピロリジン（ｐｈｅｎｙｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）の脱ラセミ化にも用いられた（Ｃａｒｒら（２００５年）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、６：６３７  ３９頁；Ｇｏｔｏｒら、「Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｓｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００５年）１０５：３１３−５４頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第２０００／２０８２４号
【特許文献２】国際公開第２０００／２１８３６９号
【特許文献３】国際公開第２００７／０７５７９０号
【特許文献４】国際公開第２００７／０２２４５９号
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ａ．Ｔｒａｂｏｃｃｈｉら（２００８年）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（２００８）３４：１−２４頁
【非特許文献２】Ｍａｌｃｏｌｍら（２００６年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０（３）：１０１３  ２０頁
【非特許文献３】Ｐｅｒｎｉら（２００６年）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０（３）：８９９  ９０９頁
【非特許文献４】Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００５）２（７）：４９７  ５０２頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、５９、２７７３−８頁
【非特許文献６】Ｓｈｉｌｌｉｎｇら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２４３：５２９  ３７頁
【非特許文献７】Ａｌｅｘｅｅｖａら（２００２年）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４１：３１７７−３１８０頁
【非特許文献８】Ｃａｒｒら（２００５年）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、６：６３７  ３９頁
【非特許文献９】Ｇｏｔｏｒら、「Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｓｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００５年）１０５：３１３−５４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
したがって、実質的に鏡像異性的に純粋なキラル化合物、特に合成中間体として有用であるキラルアミン化合物を提供するだけではなく、それらの不斉合成のための効率的で、拡張性のある生体触媒法を提供することも望ましい。したがって、それらの生体触媒法に有用な酵素を提供することも望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
４．要旨
本開示は、立体的に定義された治療薬の合成における新規な中間体として特に有用である、それらの塩および水和物を含む、以下の構造式ＩＩ（ａ）の実質的に立体異性的に純粋な二環式イミン化合物（および構造式ＩＩ（ｂ）のそれらの二量体）
【００２７】
【化８】
2011525533.tif 000009
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］を提供する。
【００２８】
本開示は、鏡像異性的に定義された治療薬の合成における新規な中間体として特に有用である、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、それらの塩および水和物を含む、構造式ＩＩＩ（ａ）および構造式ＩＩＩ（ｂ）
【００２９】
【化９】
2011525533.tif 000010
による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物をさらに提供する。
【００３０】
さらに、本開示は、立体的に定義された治療薬の合成における新規な中間体として有用である構造式ＩＶ（ａ）の実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を提供する。以下の構造式ＩＶ（ａ）の実質的に鏡像異性的に純粋なトランスアミノニトリル化合物は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、それらの塩および水和物を含む、以下の構造式ＩＶ（ｂ）の実質的に鏡像異性的に純粋なシスアミノニトリル化合物を含む混合物としても提供することができる。
【００３１】
【化１０】
2011525533.tif 000011
【００３２】
本開示は、鏡像異性的に定義された治療薬の合成における中間体として特に有用である、それらの塩および水和物を含む、構造式Ｖ
【００３３】
【化１１】
2011525533.tif 000012
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りであり、Ｒ５は、保護基（例えば、ベンジルまたはトリメチルシリルなど）、−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択される。］の場合によって保護された実質的に鏡像異性的に純粋な化合物を提供する。特定の非限定的な実施形態において、Ｒ５は、メチル、エチルまたはｔ−ブチルである。
【００３４】
本開示はまた、それらの塩および水和物を含む、構造式Ｖ（ｂ）
【００３５】
【化１２】
2011525533.tif 000013
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りであり、Ｒ５は、保護基（例えば、ベンジルまたはトリメチルシリルなど）、−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択される。］の場合によって保護された実質的に鏡像異性的に純粋な化合物（構造式Ｖの化合物のシス鏡像異性体に相当する）を提供する。特定の非限定的な実施形態において、Ｒ５は、メチル、エチルまたはｔ−ブチルである。
【００３６】
本開示はまた、鏡像異性的に定義された治療薬の合成における中間体として特に有用である、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩ
【００３７】
【化１３】
2011525533.tif 000014
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りである。］の実質的に鏡像異性的に純粋なカルボキシル置換化合物を提供する。
【００３８】
本開示はまた、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩ（ｂ）
【００３９】
【化１４】
2011525533.tif 000015
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りである。］の場合によって保護された実質的に鏡像異性的に純粋な化合物（構造式ＶＩの化合物のシス鏡像異性体に相当する）を提供する。
【００４０】
さらに、本開示は、鏡像異性的に定義された治療薬の合成における中間体として特に有用である、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩＩ
【００４１】
【化１５】
2011525533.tif 000016
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りである。］の実質的に鏡像異性的に純粋な化合物を提供する。
【００４２】
本開示はまた、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩＩ（ｂ）
【００４３】
【化１６】
2011525533.tif 000017
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りである。］の場合によって保護された実質的に鏡像異性的に純粋な化合物（構造式ＶＩＩの化合物のシス鏡像異性体に相当する）を提供する。
【００４４】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の治療薬の合成のための中間体として有用な以下の縮合二環式プロリン化合物ならびに少なくとも以下の縮合二環式プロリン化合物の合成のための生体触媒法を提供する。
【００４５】
【化１７】
2011525533.tif 000018
【００４６】
本開示は、１つ以上の治療薬の合成のための中間体として有用な以下の縮合二環式プロリン化合物ならびに少なくとも以下の縮合二環式プロリン化合物の合成のための生体触媒法を提供する。
【００４７】
【化１８】
2011525533.tif 000019
【００４８】
他の特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の治療薬の合成のための中間体として有用な以下の化合物ならびにこれらの化合物の合成のための生体触媒法を提供する。
【００４９】
【化１９】
2011525533.tif 000020
【００５０】
このように、本開示は、１つ以上の治療薬の合成のための中間体として有用な縮合二環式プロリン化合物ならびにこれらの縮合二環式プロリン化合物の合成のための生体触媒法を提供する。
【００５１】
本開示はまた、構造式ＩＩからＶＩＩの実質的に立体異性的に純粋な化合物の生体触媒による合成の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、それらの塩を含む構造式ＩＩによる実質的に立体異性的に純粋なイミン化合物を調製する方法を提供する。該方法は、構造式Ｉ
【００５２】
【化２０】
2011525533.tif 000021
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである。］による対称（アキラル）二環式アミン化合物を、モノアミンオキシダーゼ酵素が構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物、式ＩＩ（ｂ）のその二量体およびそれらの混合物に酸化する条件下で補因子の存在下で酸素およびモノアミンオキシダーゼ酵素と接触させる段階を含む。特定の実施形態において、補因子は、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤからなる群から選択される。特定の実施形態において、補因子は、ＦＡＤである。特定の実施形態において、反応混合物は、スキーム２（下）に示すように、モノアミンオキシダーゼ触媒反応の過酸化水素副生成物の分子状酸素および水への不均化を促進するのに有用な成分をさらに含む。特定の実施形態において、この成分は、ＰｄおよびＦｅなどであるが、これらに限定されない化学物質から選択されるが、他の実施形態において、この成分は、カタラーゼ酵素などの酵素である。特定の実施形態において、反応混合物は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が分子状酸素および水に分解される、スキーム２に示す不均化反応を触媒するカタラーゼ酵素をさらに含む。
【００５３】
特定の実施形態において、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化することができるモノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス属の種から得られる。特定の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼであるが、他の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）モノアミンオキシダーゼである。いずれの場合においてもモノアミンオキシダーゼは、対応するアスペルギルス属種から精製することができ、またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などであるが、これに限定されない異種宿主において発現させた組換えタンパク質として分離することができる。
【００５４】
他の実施形態において、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化することができるモノアミンオキシダーゼは、複数のモノアミンオキシダーゼの部分、例えば、アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼのアミノ末端部分およびアスペルギルス・オリザモノアミンオキシダーゼのカルボキシ末端部分を含む融合またはハイブリッドタンパク質を含む。特定の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、アミノ末端３１４アミノ酸がアスペルギルス・ニガーのアミノ末端３１４アミノ酸（配列番号２）に相当し、カルボキシ末端１８１アミノ酸がアスペルギルス・オリザのカルボキシ末端１８１アミノ酸（配列番号３２）に相当する、４９５アミノ酸タンパク質（配列番号６）である。他の特定の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、それぞれが配列番号６のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６から選択される配列番号６の４９５アミノ酸タンパク質の誘導体である。
【００５５】
特定の実施形態において、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化することができるモノアミンオキシダーゼは、配列番号２のアスペルギルス属モノアミンオキシダーゼ由来であり、配列番号２のアスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼのアミノ酸配列と比較して２つ以上のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態において、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩの対応するイミン化合物に酸化することができるモノアミンオキシダーゼは、配列番号４または配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
他の実施形態において、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化することができるモノアミンオキシダーゼは、アミノ末端アミノ酸配列が第１のアスペルギルス属モノアミンオキシダーゼ由来であるが、カルボキシ末端アミノ酸配列が他のアスペルギルス属モノアミンオキシダーゼ由来である融合タンパク質である。特定の非限定的な実施形態において、そのような融合タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端部分の両方は、配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３４からなる群から選択されるものから独立に選択されることがあり得る。特定の実施形態において、融合タンパク質のアミノ末端部分は、配列番号３２のタンパク質由来であるが、融合タンパク質のカルボキシ末端部分は、配列番号２のタンパク質由来である。
【００５７】
特定の実施形態において、本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩および水和物を含む、構造式ＩＩＩ（ａ）またはＩＩＩ（ｂ）によるアミノスルホネート化合物を調製する方法を提供する。これらの方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによる対称二環式アミン化合物を、アミノスルホネート（イミン−重亜硫酸塩付加体）化合物を生成する条件下で酸素、モノアミンオキシダーゼ酵素および重亜硫酸塩と接触させる段階を含む。特定の実施形態において、酸化反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。
【００５８】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩および水和物を含む、構造式ＩＶ（ａ）による実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによる対称二環式アミン化合物を、アミノニトリル化合物を生成する条件下で、酸素、モノアミンオキシダーゼ酵素および重亜硫酸塩と接触させ、続いてシアニドと接触させる段階を含む。特定の実施形態において、酸化反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。
【００５９】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩を含む、構造式ＩＶによる実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによる対称二環式アミン化合物を、アミノニトリル化合物を生成する条件下で、構造式ＩＩ（ａ）のイミン、構造式ＩＩ（ｂ）のその二量体またはそれらの混合物を生成させるために酸素およびモノアミンオキシダーゼ酵素と接触させ、続いてシアニドと接触させる段階を含む。特定の実施形態において、酸化反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。
【００６０】
本開示は、構造式ＩＩ（ａ）（もしくは構造式ＩＩ（ｂ）の化合物）からまたは構造式ＩＶ（ａ）のアミノニトリル化合物から開始する、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩を含む、構造式ＶＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物を調製する方法も提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式ＩＶによる実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩのアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる段階を含む。
【００６１】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩および共結晶（例えば、ＮＨ４Ｃｌ）を含む、構造式ＶＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによる対称（アキラル）アミン化合物を、構造式ＩＶによる実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成するのに適する条件下で、酸素およびモノアミンオキシダーゼ酵素と接触させ、続いてシアニドと接触させる段階を含む。特定の実施形態において、酸化反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。そのように生成したアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩのアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる。
【００６２】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩および共結晶（例えば、ＮＨ４Ｃｌ）を含む、構造式ＶＩによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによる対称（アキラル）アミン化合物を、構造式ＩＶによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成するのに適する条件下で、酸素、モノアミンオキシダーゼ酵素および重亜硫酸塩と接触させ、続いてシアニドと接触させる段階を含む。特定の実施形態において、酸化反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。そのように生成したアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩのアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる。他の実施形態において、そのように生成したアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式Ｖのアミノエステル化合物に変換される条件下で酸およびアルコールと接触させる。
【００６３】
さらに、本開示は、本明細書で開示する新規な化合物および生体触媒法を含む方法を用いて、Ａ、Ｍ、Ｍ’およびＲ５が上述の通りである、その塩を含む、構造式Ｖによる実質的に立体異性的に純粋な保護アミノ酸化合物を調製する方法を提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式ＩＶによる実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式Ｖのアミノ酸エステル化合物に変換される条件下で酸およびアルコールと接触させる段階を含む。
【００６４】
本開示は、本明細書で開示する新規な化合物および生体触媒法を含む方法を用いて、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩を含む、構造式ＶＩによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノ酸化合物を調製する方法も提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式ＩＶによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩのアミノ酸化合物に変換される条件下で酸（例えば、ＨＣｌ）と接触させる段階を含む。
【００６５】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩および共結晶（例えば、ＮＨ４Ｃｌ）を含む、構造式ＶＩによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノ酸化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによるアミン化合物を、構造式ＩＶによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成するのに適する条件下で、酸素およびモノアミンオキシダーゼ酵素およびＮａＨＳＯ３と接触させ、続いてシアニドと接触させる段階を含む。特定の実施形態において、反応混合物は、カタラーゼ酵素をさらに含む。そのように生成したアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式ＶＩのアミノ酸化合物に変換される条件下でＨＣｌと接触させる。
【００６６】
さらに、本開示は、本明細書で開示する新規な化合物および生体触媒法を含む方法を用いて、Ａ、Ｍ、Ｍ’およびＲ５が上述の通りである、その塩を含む、構造式Ｖによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノ酸エステル化合物を調製する方法を提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式ＩＶによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式Ｖのアミノエステル化合物に変換される条件下で酸（例えば、ＨＣｌ）およびアルコールと接触させる段階を含む。
【００６７】
本開示は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、その塩を含む、構造式ＶＩＩによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノアミド化合物を調製する方法をさらに提供する。この方法は、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式Ｉによるアミン化合物を、Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、構造式ＩＶによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成するのに適する条件下で、酸素およびモノアミンオキシダーゼ酵素とならびに場合によってカタラーゼ酵素および重亜硫酸塩と接触させ、続いてシアニドと接触させ、その後、アミノニトリル化合物を構造式ＶＩＩのアミノ酸アミド化合物に変換させることができる条件下でＨＣｌおよび水と接触させる段階を含む。
【００６８】
構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩの対応するイミン化合物に酸化することができる、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２、配列番号３２および配列番号６のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有する。そのようなアミノ酸置換は、酵素活性の増大、立体選択性、熱安定性、溶媒安定性、生成物阻害の減少、基質阻害の減少または反応副生成物に対する感受性の低下などの１つ以上の改善された特性をモノアミンオキシダーゼに与える。そのようなアミノ酸置換は、例えば、Ｅ．コリ宿主細胞などであるが、これに限定されない異種宿主中の組換えにより発現させたタンパク質としての、宿主細胞中のモノアミンオキシダーゼの溶解度、安定性および発現レベルも改善し得る。
【００６９】
本開示は、そのようなモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドおよび開示した生体触媒法においてポリペプチドを用いる方法も提供する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示したモノアミンオキシダーゼは、それらの酵素活性の速度、すなわち、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩの対応するイミン化合物に変換するそれらの速度に関して配列番号２、配列番号３２または配列番号６の酵素と比較して改善されている。いくつかの実施形態において、開示したモノアミンオキシダーゼは、配列番号２、配列番号３２または配列番号６のモノアミンオキシダーゼによって示される速度の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍のまたは１００倍を超える速度で基質を生成物に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示したモノアミンオキシダーゼは、構造式Ｉのアミン化合物を少なくとも約９５％の鏡像異性体過剰率を有する構造式ＩＩの対応するイミン化合物に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列式に基づいており、それらと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。これらの差異は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそのような変化のいずれかの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列の差異は、非保存的、保存的アミノ酸置換ならびに非保存的および保存的アミノ酸置換の組合せを含み得る。そのような変化を起こすことができる様々なアミノ酸残基の位置は、本明細書で述べる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基９９ならびに配列番号３２の残基９７に対応するアミノ酸、グルタミンが酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このグルタミン残基は、グルタミン酸残基で置換されている。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基３６５ならびに配列番号３２の残基３６３に対応するアミノ酸、チロシンが異なる芳香族アミノ酸、すなわち、フェニルアラニンまたはトリプトファンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのチロシン残基は、トリプトファン残基で置換されている。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基３８２ならびに配列番号３２の残基３８０に対応するアミノ酸、フェニルアラニンが非極性アミノ酸、すなわち、バリン、イソロイシン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはロイシンで置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このフェニルアラニン残基は、ロイシン残基で置換されている。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基４６５ならびに配列番号３２の残基４６３に対応するアミノ酸、セリンが非極性アミノ酸、すなわち、バリン、イソロイシン、アラニン、メチオニン、ロイシンまたはグリシンで置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのセリン残基は、グリシン残基で置換されている。
【００７７】
他の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基１３５に対応するアミノ酸、トレオニンが他の極性アミノ酸、すなわち、セリン、グルタミンまたはアスパラギンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このトレオニン残基は、グルタミン残基で置換されている。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基２８４に対応するアミノ酸、アスパラギンが酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのアスパラギン残基は、グルタミン酸残基で置換されている。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の残基２８９に対応するアミノ酸が他の非極性アミノ酸、すなわち、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのアラニン残基は、バリン残基で置換されている。
【００８０】
他の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の残基３８４に対応するアミノ酸、リシンが他の極性アミノ酸、すなわち、セリン、トレオニンまたはグルタミンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのリシン残基は、グルタミン残基で置換されている。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガーのモノアミンオキシダーゼ（配列番号２）の相同体またはアスペルギルス・オリザのモノアミンオキシダーゼ（配列番号４４）の相同体であり、本明細書で開示したものに対応する１つ以上のアミノ酸置換を有するモノアミンオキシダーゼである。実例となる相同体は、モノアミンオキシダーゼ配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４などである。他の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４の酵素から選択され、本明細書で開示したものに対応する１つ以上のアミノ酸置換を有するモノアミンオキシダーゼである。
【００８２】
他の態様において、本開示は、本明細書で述べた操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドまたは高度緊縮条件下でそのようなポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、プロモーターおよびコードされた操作改変モノアミンオキシダーゼの発現に有用な他の調節要素を含むことができ、特定の所望の発現系について最適化されたコドンを利用することができる。具体例としてのポリヌクレオチドは、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、３１および３５を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
他の態様において、本開示は、本明細書で述べたポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、アスペルギルス属種、例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザもしくはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）であってよく、またはそれらは、異なる生物、例えば、Ｅ．コリもしくはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であってよい。この宿主細胞は、本明細書で述べた操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素の発現および分離のために用いることができ、または代わりに、それらは、基質の立体異性生成物への変換のために直接用いることができる。
【００８４】
全細胞、細胞抽出物もしくは精製モノアミンオキシダーゼを用いて方法を実施するかどうかにかかわりなく、単一モノアミンオキシダーゼを用いることができ、または代わりに、２つ以上のモノアミンオキシダーゼの混合物を用いることができる。
【００８５】
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼ酵素は、以下の構造式Ｉの化合物の構造式ＩＩ（ａ）の化合物への酸化を触媒することができる。
【００８６】
【化２１】
2011525533.tif 000022
【００８７】
特定の実施形態において、本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼ酵素は、以下の化合物（１）である（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンの以下の化合物（２）である（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンへの酸化を触媒することができる。
【００８８】
【化２２】
2011525533.tif 000023
【００８９】
他の特定の実施形態において、本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼ酵素は、以下の化合物（３）である（３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの以下の化合物（４）である（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールへの酸化を触媒することができる。
【００９０】
【化２３】
2011525533.tif 000024
【００９１】
構造式Ｉの化合物を構造式ＩＩ（ａ）の化合物に酸化する方法のいくつかの実施形態において、基質は、約９９％を超える立体異性体過剰率の生成物に酸化され、モノアミンオキシダーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または３６に対応する配列を含む。
【００９２】
構造式Ｉの化合物を構造式ＩＩ（ａ）の化合物に酸化する方法のいくつかの実施形態において、１−１００ｇ／Ｌの基質の少なくとも約１０−２０％が約１−１０ｇ／Ｌのポリペプチドにより約２４時間未満で生成物に変換され、ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または３６に対応するアミノ酸配列を含む。
【００９３】
基質を生成物に還元するこの方法のいくつかの実施形態において、約２５−５０ｇ／Ｌを超える基質および約１−５ｇ／Ｌ未満のポリペプチド（配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または３６に対応するアミノ酸配列を含む）を用いて行う場合、基質の少なくとも約９５％が約２４時間未満で生成物に変換される。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
５．詳細な記述
５．１  本開示の縮合二環式プロリン化合物
５．１．１  式ＩＩ（ａ）および（ｂ）の縮合二環式プロリン化合物
本開示は、それらの塩および水和物を含む、以下の構造式ＩＩ（ａ）の実質的に鏡像異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物およびそれらの二量体である構造式ＩＩ（ｂ）の化合物ならびにそれらの混合物
【００９５】
【化２４】
2011525533.tif 000025
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］を提供する。
【００９６】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【００９７】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【００９８】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【００９９】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１００】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１０１】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１０２】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１０３】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１０４】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１０５】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１０６】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−Ｏ−であり、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１０７】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−Ｏ−であり、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１０８】
ピロリジン化合物の多くのイミン（例えば、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール）は、環ひずみのため、二量体に加えて、または二量体の代わりに、熱力学的に有利な三量体を形成することが公知である。したがって、特定の実施形態において、式ＩＩ（ａ）の上の化合物のいずれかは、構造式ＩＩ（ｃ）
【０１０９】
【化２５】
2011525533.tif 000026
を有する二量体の形でも存在し得る。
【０１１０】
特定の実施形態において、本開示は、式ＩＩ（ａ）の化合物の二量体、例えば、構造式ＩＩ（ｃ）の化合物ならびに式ＩＩ（ａ）および／または式ＩＩ（ｂ）の化合物とのこれの混合物を提供する。
【０１１１】
５．１．２  構造式ＩＩＩのアミノスルホネート
本開示は、それらの塩、水和物および混合物を含む、構造式ＩＩＩ（ａ）および（ｂ）
【０１１２】
【化２６】
2011525533.tif 000027
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］の実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物をさらに提供する。
【０１１３】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【０１１４】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１１５】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【０１１６】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１１７】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１１８】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１１９】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１２０】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１２１】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１２２】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１２３】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−Ｏ−であり、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１２４】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−Ｏ−であり、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１２５】
５．１．３  構造式ＩＶのアミノニトリル化合物
さらに、本開示は、それらの塩、水和物および混合物を含む、構造式ＩＶ（ａ）および（ｂ）
【０１２６】
【化２７】
2011525533.tif 000028
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］の実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を提供する。
【０１２７】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【０１２８】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１２９】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【０１３０】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１３１】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１３２】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１３３】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１３４】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１３５】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１３６】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１３７】
５．１．４  構造式Ｖの縮合二環式プロリン化合物
本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式Ｖ
【０１３８】
【化２８】
2011525533.tif 000029
［式中、Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りであり、Ｒ５は、保護基（例えば、ベンジルまたはトリメチルシリルなど）、−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択される。］の縮合二環式プロリン化合物を提供する。特定の非限定的な実施形態において、Ｒ５は、それらの塩および水和物を含む、メチル、エチルまたはｔ−ブチルであり、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。
【０１３９】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【０１４０】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１４１】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【０１４２】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１４３】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１４４】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１４５】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１４６】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１４７】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１４８】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１４９】
一実施形態において、Ｒ５は、ベンジルである。
【０１５０】
一実施形態において、Ｒ５は、トリメチルシリルである。
【０１５１】
他の実施形態において、Ｒ５は、メチルである。
【０１５２】
さらなる実施形態において、Ｒ５は、エチルである。
【０１５３】
他の実施形態において、Ｒ５は、ｔ−ブチルである。
【０１５４】
５．１．５  構造式ＶＩの縮合二環式プロリン化合物
本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩ
【０１５５】
【化２９】
2011525533.tif 000030
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］による実質的に鏡像異性的に純粋な化合物も提供する。
【０１５６】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【０１５７】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１５８】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【０１５９】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１６０】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１６１】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１６２】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１６３】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１６４】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１６５】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１６６】
５．１．６  構造式ＶＩＩの縮合二環式プロリン化合物
さらに、本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式ＶＩＩ
【０１６７】
【化３０】
2011525533.tif 000031
［式中、Ａは、Ｏ、ＣＲ１Ｒ２、−Ｃ＝Ｃ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｘ、−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＸ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｘは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒから選択される。ＭおよびＭ’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ＭおよびＭ’の両方が存在する場合、ＭおよびＭ’は、同じであり、ＯおよびＣＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ３およびＲ４は、Ｈである、またはＭのＲ３もしくはＲ４およびＭ’のＲ３もしくはＲ４は、メチレン架橋を形成しており、但し、（ａ）ＭおよびＭ’がＯである場合、ＡはＯではなく、ＡがＯである場合、ＭおよびＭ’はＯではなく、（ｂ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４である場合、Ａは、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり得、（ｃ）ＭおよびＭ’がＣＲ３Ｒ４であり、１つ以上の立体中心を有する場合、ＭおよびＭ’の立体中心は、反対の立体化学を有する。］の実質的に鏡像異性的に純粋な複素二環式イミノ酸化合物を提供する。
【０１６８】
一実施形態において、Ｒ６およびＲ７は、両方ともＨである。
【０１６９】
一実施形態において、Ａは、−ＣＨ２−である。
【０１７０】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１７１】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ３）２−である。
【０１７２】
他の実施形態において、Ａは、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１７３】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）２−である。
【０１７４】
他の実施形態において、Ａは、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ３）−である。
【０１７５】
一実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−ＣＨ（ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２）−からなる群から選択される。
【０１７６】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、存在せず、Ａは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−からなる群から選択される。
【０１７７】
他の実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＦ２−、−ＣＣｌ２−、−ＣＢｒ２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−Ｃ（ＣＯＯＨ）２−、−ＣＨ（ＮＨ２）−および−Ｃ（Ｈ２）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２−からなる群から選択される。
【０１７８】
さらなる実施形態において、ＭおよびＭ’は、−ＣＨ２−であり、Ａは、−Ｏ−、−ＣＨ２−および−Ｃ（ＣＨ３）２−からなる群から選択される。
【０１７９】
５．２  本開示のモノアミンオキシダーゼ
構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩの対応するイミン化合物に酸化することができる、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２、配列番号６および配列番号３２のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有する。そのようなアミノ酸置換は、酵素活性の増大、立体選択性、熱安定性、溶媒安定性、生成物阻害の減少、基質阻害の減少または反応副生成物に対する感受性の低下などの１つ以上の改善された特性をモノアミンオキシダーゼに与える。そのようなアミノ酸置換は、例えば、Ｅ．コリ宿主細胞などであるが、これに限定されない異種宿主中の組換えにより発現させたタンパク質としての、宿主細胞中のモノアミンオキシダーゼの発現レベル、溶解度および／または安定性も改善し得る。一実施形態において、アミノ酸置換Ｓ４６５Ｇは、Ｅ．コリにおける本開示のモノアミンオキシダーゼの発現レベル、溶解度および／または安定性の実質的な増大をもたらす。
【０１８０】
本開示は、そのようなモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドおよび開示した生体触媒法においてポリペプチドを用いる方法も提供する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示したモノアミンオキシダーゼは、それらの酵素活性の速度、すなわち、構造式Ｉのアミン化合物を構造式ＩＩの対応するイミン化合物に変換するそれらの速度に関して配列番号２、配列番号６または配列番号３２の酵素と比較して改善されている。いくつかの実施形態において、開示したモノアミンオキシダーゼは、配列番号２、配列番号６または配列番号３２のモノアミンオキシダーゼによって示される速度の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍のまたは１００倍を超える速度で基質を生成物に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示したモノアミンオキシダーゼは、構造式Ｉのアミン化合物を少なくとも約９５％のジアステレオマー過剰率を有する構造式ＩＩの対応するイミン化合物に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３６に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列式に基づいており、それらと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。これらの差異は、アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそのような変化のいずれかの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列の差異は、非保存的、保存的アミノ酸置換ならびに非保存的および保存的アミノ酸置換の組合せを含み得る。そのような変化を起こすことができる様々なアミノ酸残基の位置は、本明細書で述べる。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基９９ならびに配列番号３２の残基９７に対応するアミノ酸、グルタミンが酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このグルタミン残基は、グルタミン酸残基で置換されている。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基３６５ならびに配列番号３２の残基３６３に対応するアミノ酸、チロシンが異なる芳香族アミノ酸、すなわち、フェニルアラニンまたはトリプトファンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このチロシン残基は、トリプトファン残基で置換されている。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基３８２ならびに配列番号３２の残基３８０に対応するアミノ酸、フェニルアラニンが非極性アミノ酸、すなわち、バリン、イソロイシン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはロイシンで置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このフェニルアラニン残基は、ロイシン残基で置換されている。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基４６５ならびに配列番号３２の残基４６３に対応するアミノ酸、セリンが非極性アミノ酸、すなわち、バリン、イソロイシン、アラニン、メチオニン、ロイシンまたはグリシンで置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このセリン残基は、グリシン残基で置換されている。
【０１８８】
他の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基１３５に対応するアミノ酸、トレオニンが他の極性アミノ酸、すなわち、セリン、グルタミンまたはアスパラギンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このトレオニン残基は、グルタミン残基で置換されている。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基２８４に対応するアミノ酸、アスパラギンが酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、そのアスパラギン残基は、グルタミン酸残基で置換されている。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２および配列番号６の残基２８９に対応するアミノ酸、アラニンが他の非極性アミノ酸、すなわち、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このアラニン残基は、バリン残基で置換されている。
【０１９１】
他の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の残基３８４に対応するアミノ酸、リシンが他の極性アミノ酸、すなわち、セリン、トレオニンまたはグルタミンで保存的に置換されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このリシン残基は、グルタミン残基で置換されている。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガーのモノアミンオキシダーゼ（配列番号２）の相同体またはアスペルギルス・オリザ（配列番号３２）の相同体であり、本明細書で開示したものに対応する１つ以上のアミノ酸置換を有するモノアミンオキシダーゼである。実例となる相同体は、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のモノアミンオキシダーゼなどである。したがって、特定の実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼは、本明細書で開示したものに対応する１つ以上のアミノ酸置換を有する、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４の酵素から選択されるモノアミンオキシダーゼである。
【０１９３】
定義
本明細書で用いているように、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【０１９４】
「モノアミンオキシダーゼ」は、構造式Ｉ（上記を参照）の化合物を構造式ＩＩ（上記を参照）の対応する生成物に酸化する酵素能を有するポリペプチドを意味する。このポリペプチドは、一般的に、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などであるが、これらに限定されない酸化補因子を利用する。特定の実施形態において、酸化補因子は、ＦＡＤである。モノアミンオキシダーゼは、本明細書で用いているように、天然に存在する（野生型）モノアミンオキシダーゼならびに人為的操作により生成する天然に存在しない操作改変ポリペプチドを含む。
【０１９５】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸をコードする核酸の部分（例えば、遺伝子）を意味する。
【０１９６】
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見い出される形を意味する。例えば、天然に存在するまたは野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然における源から分離することができ、人為的操作により意図的に修飾されなかった、生物に存在する配列である。
【０１９７】
「組換え」は、例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して用いる場合、天然に存在しないような方法で修飾された、またはそれと同じであるが、組換え技術を用いて合成材料から、および／または操作により、生成もしくは誘導された物質または該物質の自然もしくは天然形に対応する物質を意味する。非限定的な例は、とりわけ、天然（非組換え）形の細胞内で見出されない、または異なるレベルで発現する天然遺伝子を発現させる、組換え細胞発現遺伝子を含む。
【０１９８】
「配列同一性の百分率」および「相同性の百分率」は、本明細書において同義で用い、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を意味し、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列させた配列を比較することによって求めるものであり、２つの配列の最適な整列において、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの部分は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む可能性がある。この百分率は、両配列において同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を測定して、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることにより、算出することができる。あるいは、この百分率は、両配列において同じ核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在する、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと整列する位置の数を測定して、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることにより、算出することができる。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを十分に理解している。比較のための配列の最適な整列は、例えば、ＳｉｍｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２頁の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３頁の相同性整列アルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４頁の類似性の検索方法により、これらのアルゴリズム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行により、または目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）により行うことができる。配列同一性の百分率および配列類似性を測定するのに適するアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３８９−３４０２頁に記載されたＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを介して公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと並べたときに、いくつかの陽性評価閾値スコアＴと一致または満たす問い合わせ配列における長さ��の短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを必要とする。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを見い出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。累積整列スコアを増加させることができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡大させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基の対に対する罰則スコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアを算出する。累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘ減少する；１つ以上の負のスコアの残基整列の累積のため、累積スコアがゼロもしくはそれ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する場合、各方向におけるワードヒットの拡大を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：１０９１５頁を参照）。配列整列および配列同一性百分率の典型的な決定には、示したデフォルトパラメーターを用いた、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【０１９９】
「参照配列」は、配列の比較の基準として用いられる定義された配列を意味する。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列の部分であってよい。一般的に、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ（１）２つの配列の間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部）を含む可能性があり、（２）２つの配列の間で異なっている配列をさらに含む可能性があるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の比較は、配列の類似性の局所領域を特定し、比較するために２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較することによって一般的に実施される。
【０２００】
「比較ウインドウ」は、配列を少なくとも２０個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができる、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的な部分を意味し、比較ウインドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてよい。比較ウインドウは、２０個より長い連続した残基であってよく、場合によって３０、４０、５０、１００またはより長いウインドウを含む。
【０２０１】
「実質的同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウにわたる、しばしば少なくとも３０−５０残基のウインドウにわたる参照配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の同一性、８９から９５％配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味し、配列同一性の百分率は、参照配列を、比較ウインドウにわたり参照配列の総計２０％以下である欠失または付加を含む配列と比較することによって算出する。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、「実質的同一性」という用語は、デフォルトギャップ加重値を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同じではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２０２】
「に対応する」、「への参照」または「に対する」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの状況において用いる場合、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合の指定された参照配列の残基の番号付けに適用される。言い換えれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数で示される位置によるのではなく、参照配列を基準として指定される。例えば、操作改変モノアミンオキシダーゼのアミノ酸配列のような所定のアミノ酸配列は、２つの配列の間の残基の一致を最適化するためにギャップを導入することによって参照配列と整列させることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それが整列された参照配列を基準として行われる。
【０２０３】
「立体選択性」は、１つの立体異性体の化学または酵素反応における他のものと比べて優先的な形成を意味する。立体選択性は、１つの立体異性体の生成が他のものと比べて有利である場合には部分的であり得、または１つの立体異性体のみが生成する場合には完全であり得る。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、両方の総計における１つの鏡像異性体の割合（一般的に百分率として報告される）である、エナンチオ選択性と呼ばれる。それは、当技術分野で代わるべきものとして式［多量の鏡像異性体−微量の鏡像異性体］／［多量の鏡像異性体＋微量の鏡像異性体］に従って計算される鏡像異性体過剰率（ｅ．ｅ．）と一般的に報告される（一般的に百分率として）。立体異性体がジアステレオマーである場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマー割合（一般的に百分率として報告される）であり、また、代わるべきものとしてジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）と一般的に報告される。鏡像異性体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の類型である。
【０２０４】
「高度に立体選択的」は、基質を少なくとも約９９％の立体異性体過剰率を有する対応する生成物に変換することができるモノアミンオキシダーゼポリペプチドに適用される。
【０２０５】
「立体特異性」は、１つの立体異性体の化学または酵素反応における他のものと比べて優先的な変換を意味する。立体特異性は、１つの立体異性体の変換が他のものと比べて有利である場合には、部分的である可能性があり、または１つの立体異性体のみが変換される場合には完全である可能性がある。
【０２０６】
「化学選択性」は、１つの生成物の化学または酵素反応における他のものと比べて優先的な形成を意味する。
【０２０７】
「改善された酵素特性」は、参照モノアミンオキシダーゼと比較して酵素特性の改善を示すモノアミンオキシダーゼポリペプチドを意味する。本明細書で述べた操作改変モノアミンオキシダーゼポリペプチドについては、いくつかの実施形態において、参照モノアミンオキシダーゼは他の改善された操作改変モノアミンオキシダーゼであり得るが、比較は、一般的に野生型モノアミンオキシダーゼ酵素に対して行われる。改善が望ましい酵素特性は、酵素活性（基質の変換率により表すことができる）、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子の必要、阻害物質（例えば、生成物阻害）に対する無反応性、立体特異性、立体選択性（エナンチオ選択性を含む）、溶解度ならびに宿主細胞中の安定性および発現レベルを含むが、これらに限定されない。
【０２０８】
「酵素活性の増加」は、参照モノアミンオキシダーゼと比較して特異的活性（生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、規定の量のモノアミンオキシダーゼを用いた場合の規定の時間における出発量の基質の生成物への変換率）の増加によって表すことができる、操作改変モノアミンオキシダーゼポリペプチドの改善された特性を意味する。酵素活性を測定する具体例としての方法は、実施例に示す。変化が酵素活性の増加をもたらし得る、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔなどの古典的酵素特性を含む酵素活性に関連する特性が影響を受ける可能性がある。酵素活性の改善は、対応する野生型モノアミンオキシダーゼの酵素活性の約１．５倍から天然に存在するモノアミンオキシダーゼまたはモノアミンオキシダーゼポリペプチドが由来する他の操作改変モノアミンオキシダーゼより酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ以上まで高いものであり得る。触媒回転速度が必要とする補因子を含む基質の拡散速度を超えることができないような、あらゆる酵素の活性が拡散律速であることは、当業者によって理解される。拡散制限の理論的最大値、すなわちｋｃａｔ／Ｋｍは、一般的に約１０８から１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。したがって、モノアミンオキシダーゼの酵素活性の改善は、モノアミンオキシダーゼ酵素による作用を受ける基質の拡散速度に関連する上限を有する。モノアミンオキシダーゼの活性は、Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕら、「Ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５３：１６９−７４頁）およびＳｚｕｔｏｗｉｃｚら（Ｓｚｕｔｏｗｉｃｚら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ２，２’−Ａｚｉｎｏ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈａｉｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）ａｓ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ」、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：８６−９４頁）により開示されたものなどであるが、これらに限定されないモノアミンオキシダーゼを測定するための公表された方法またはその変法を用いて測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書でさらに詳細に述べるような酵素の定義された製剤、設定条件下での定義されたアッセイおよび１つ以上の定義された基質を用いて、または例えば、ＺｈｏｕおよびＳｚｕｔｏｗｉｃｚの方法を用いて行われる。一般的に、溶解物を比較する場合、宿主細胞により産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を用いると同時にアッセイした細胞の数およびタンパク質の量を測定する。
【０２０９】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的酸化を意味する。「変換百分率」は、指定された条件下である時間内に生成物に酸化された基質の百分率を意味する。したがって、モノアミンオキシダーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換百分率」として表すことができる。
【０２１０】
「熱安定性」は、非処理酵素と比較してある時間（例えば、０．５−２４時間）にわたる高温（４０−８０℃）への暴露後に同様な活性（例えば、６０％から８０％以上）を維持しているモノアミンオキシダーゼポリペプチドに適用される。
【０２１１】
「溶媒安定性」は、非処理酵素と比較してある時間（例えば、０．５−２４時間）にわたる種々の濃度（例えば、５−９９％）の溶媒（イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル等）への暴露後に同様な活性（例えば、６０％から８０％以上）を維持しているモノアミンオキシダーゼポリペプチドに適用される。
【０２１２】
「ｐＨ安定性」は、非処理酵素と比較してある時間（例えば、０．５−２４時間）にわたる高または低ｐＨ（例えば、４．５−６または８−１２）への暴露後に同様な活性（例えば、６０％から８０％以上）を維持しているモノアミンオキシダーゼポリペプチドに適用される。
【０２１３】
「熱安定性および溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性であるモノアミンオキシダーゼポリペプチドに適用される。
【０２１４】
「に由来する」は、操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素に関連して本明細書で用いているように、工学技術の基盤となる始発モノアミンオキシダーゼ酵素および／またはそのようなモノアミンオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子を特定する。例えば、配列番号８の操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素は、配列番号２のアスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子を多世代にわたって人為的に進化させることによって得られた。したがって、この操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素は、配列番号２の野生型モノアミンオキシダーゼ「に由来する」。
【０２１５】
「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５−１４２頁の標準化コンセンサス疎水性スケールに従ったゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）などである。
【０２１６】
「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれている場合に約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。酸性アミノ酸は、一般的に水素イオンの喪失のため生理的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされるアミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）などである。
【０２１７】
「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれている場合に約６を超えるｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。塩基性アミノ酸は、一般的に水素イオンとの会合のため生理的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされるアミノ酸は、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）などである。
【０２１８】
「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共有されている電子対がそれらの原子の１つによってより近接して保持されている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる極性アミノ酸は、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）などである。
【０２１９】
「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５−１４２頁の標準化コンセンサス疎水性スケールに従ったゼロを超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされるアミノ酸は、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）などである。
【０２２０】
「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香または複素芳香環を含む側鎖を有する親水性もしくは疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸は、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）などである。その複素芳香族窒素原子のｐＫａにより、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は時として塩基性残基として、またはその側鎖が複素芳香環を含むので、芳香族残基として分類されるが、本明細書ではヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束性残基」（下を参照）として分類される。
【０２２１】
「拘束性アミノ酸または残基」は、拘束性形状を有するアミノ酸または残基を意味する。本明細書において、拘束性残基は、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）などである。ヒスチジンは、比較的小さいイミダゾール環を有するため、拘束性形状を有する。プロリンは、これも５員環を有するため、拘束性形状を有する。
【０２２２】
「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで荷電されておらず、２つの原子によって共有されている電子対が一般的に２つの原子のそれぞれによって同等に保持されている結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）などである。
【０２２３】
「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）などである。
【０２２４】
「システイン」。アミノ酸Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、他の酸Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で異常である。「システイン様残基」は、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含む他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が還元遊離−ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形のペプチドに存在する能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）が正味の疎水性または親水性特性をペプチドに与えるかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）はＥｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、前出）の標準化コンセンサス疎水性スケールに従った０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的のためにＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自体の特有な群に分類されると理解すべきである。
【０２２５】
「小アミノ酸または残基」は、３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（α炭素および水素を除く）からなる側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。小アミノ酸または残基は、上の定義に従って脂肪族、非極性、極性または酸性小アミノ酸もしくは残基とさらに分類することができる。遺伝的にコードされる小アミノ酸または残基は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）などである。
【０２２６】
「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含むアミノ酸を意味する。遺伝的にコードされるヒドロキシル含有アミノ酸は、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）などである。
【０２２７】
「保存的」アミノ酸置換または変異は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味し、したがって、アミノ酸の同じまたは類似の定義されたクラス内のアミノ酸によるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換を一般的に含む。しかし、本明細書で用いているように、保存的変異が代わりに脂肪族残基から脂肪族残基への、非極性残基から非極性残基への、極性残基から極性残基への、酸性残基から酸性残基への、塩基性残基から塩基性残基への、芳香族残基から芳香族残基へのまたは拘束性残基から拘束性残基残基への置換であり得る場合、保存的変異は、親水性残基から親水性残基への、疎水性残基から疎水性残基への、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基へのまたは小残基から小残基への置換を含まない。さらに、本明細書で用いているように、Ａ、Ｖ、ＬまたはＩは、他の脂肪族残基または他の非極性残基に保存的に変異させることができる。下の表Ｉに具体例としての保存的置換を示す。
【０２２８】
【表１】
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【０２２９】
「非保存的置換」は、著しく異なる側鎖の特性を有するアミノ酸によるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換または変異を意味する。非保存的置換は、上に示す定義された群内ではなく、群間のアミノ酸を用いてよい。一実施形態において、非保存的変異は、（ａ）置換の範囲におけるペプチド主鎖の構造（例えば、グリシンに対するプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖のバルクに影響を及ぼす。
【０２３０】
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドの修飾を意味する。欠失は、操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素の酵素活性を保持および／または改善された特性を保持すると同時に、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸または２０以上のアミノ酸、参照酵素を作るアミノ酸の総数の１０％までまたはアミノ酸の総数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けることができる。種々の実施形態において、欠失は、連続した部分を含んでいてよく、または不連続であってよい。
【０２３１】
「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を意味する。いくつかの実施形態において、改善された操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素は、天然に存在するモノアミンオキシダーゼへの１つ以上のアミノ酸の挿入ならびに他の改善されたモノアミンオキシダーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部の部分におけるまたはカルボキシもしくはアミノ末端へのものであり得る。挿入は、本明細書で用いているように、当技術分野で公知である融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続した部分であってよく、または天然に存在するポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸によって分離されていてよい。
【０２３２】
指定された参照配列に関する「との差異」または「と異なる」は、参照配列と整列させたときの所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の差異を意味する。一般的に、２つの配列が最適に整列されている場合に、差異を決定することができる。差異は、参照配列と比較したアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む。
【０２３３】
「フラグメント」は、本明細書で用いているように、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が当該配列における対応する位置に同じであるポリペプチドを意味する。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはより長く、全長モノアミンオキシダーゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％であり得る。
【０２３４】
「分離ポリペプチド」は、それに自然に付随する他の混入物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されているポリペプチドを意味する。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビボ合成）から除去または精製されたポリペプチドを含む。改善されたモノアミンオキシダーゼは、細胞内に存在し、細胞培地中に存在していてよく、または溶解物もしくは分離調製物などの様々な形で調製することができる。したがって、いくつかの実施形態において、改善されたモノアミンオキシダーゼは、分離ポリペプチドであり得る。
【０２３５】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、該ポリペプチド種が存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量基準でそれが組成物中の他の個々の巨大分子種より豊富である）組成物を意味し、対象種が存在する巨大分子種の少なくとも約５０％（モルまたは重量％）を含む場合、一般的に実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋なモノアミンオキシダーゼ組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上（モルまたは重量％）を含む。いくつかの実施形態において、対象種は、本質的な均質になるまで精製され（すなわち、混入物種は、通常の検出方法によって組成物中に検出することができない）、組成物は、本質的に単一巨大分子種からなっている。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、巨大分子種とみなされない。いくつかの実施形態において、改善された分離モノアミンオキシダーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【０２３６】
「緊縮ハイブリッド形成」は、本明細書において核酸ハイブリッドが安定である条件に適用するために用いる。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を用いて計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１６８：７６１−７７７頁；Ｂｏｌｔｏｎら、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：１３９０頁；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：８８９３−８８９７頁；Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：９３７３−９３７７頁；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５：７８４０−７８４６頁；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１８：６４０９−６４１２頁（正誤表、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９：６９８頁）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１、Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ（Ｂｒｏｗｎら編）、６８３−６９３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ、１９９１、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２６：２２７−２５９頁を参照。すべての刊行物を参照により本明細書に組み込む）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示したポリペプチドをコードし、中等度緊縮または高度緊縮条件などの定義された条件下で本開示の操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素をコードする配列の相補体とハイブリッド形成する。
【０２３７】
「ハイブリッド形成緊縮性」は、核酸のそのような洗浄条件に関連する。一般的に、ハイブリッド形成反応は、より低い緊縮性の条件下で行わせ、続いて可変であるが、より高い緊縮性の洗浄を行う。「中等度に緊縮性のハイブリッド形成」という用語は、標的ＤＮＡを、標的ＤＮＡとの約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する、標的ポリヌクレオチドとの約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合させる条件に適用される。具体例としての中等度に緊縮性の条件は、４２℃における５０％ホルムアルデヒド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリッド形成の後の４２℃における０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に相当する条件である。「高緊縮ハイブリッド形成」は、定義されたポリヌクレオチド配列について溶液条件下で測定される熱的融解温度Ｔｍから約１０℃以下である条件に一般的に適用される。いくつかの実施形態において、高緊縮条件は、６５℃において０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリッド形成を可能にする条件を意味する（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書において予期されるように高緊縮条件下で安定ではない）。高緊縮条件は、例えば、４２℃における５０％ホルムアルデヒド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに相当する条件におけるハイブリッド形成の後の６５℃における０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄によってもたらすことができる。他の高緊縮ハイブリッド形成条件ならびに中等度に緊縮性の条件は、上で引用した参考文献に記載されている。
【０２３８】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術により宿主細胞に導入されるあらゆるポリヌクレオチドを意味し、宿主細胞から除去され、実験操作に供され、次に宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０２３９】
「最適化されたコドン」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、コードされるタンパク質が問題の生物において効率よく発現するように個々の生物において優先的に用いられるコドンに変化することを意味する。ほとんどのアミノ酸が「同義」または「同義語」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で、遺伝コードは、縮重しているが、個々の生物によるコドン使用頻度は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用頻度の偏りは、低コピー数タンパク質および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域と比べて所定の遺伝子、共通機能または先祖由来の遺伝子、高度に発現されるタンパク質に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物からの最適な産生のために最適化されたコドンであってよい。
【０２４０】
「好ましい最適な高コドン使用頻度バイアスコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりタンパク質コード領域において高い頻度で用いられるコドンと同義である。好ましいコドンは、単一遺伝子におけるコドン使用頻度、共通機能もしくは起源の一連の遺伝子、高度に発現する遺伝子、全生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度またはそれらの組合せに関連して決定することができる。頻度が遺伝子発現のレベルとともに増加するコドンは、一般的に発現に最適なコドンである。特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義語コドン使用頻度）およびコドン選択を決定するための、例えば、クラスター分析または対応分析および遺伝子において用いられるコドンの有効数を用いる多変量解析を含む、様々な方法が公知である。（ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ、Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ  Ｊ．Ｏ．、１９９８、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１４：３７２−７３頁；Ｓｔｅｎｉｃｏら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２２４３７−４６頁；Ｗｒｉｇｈｔ  Ｆ．、１９９０、Ｇｅｎｅ、８７：２３−２９頁を参照）。コドン使用頻度表は、生物の拡大しつつあるリストについて利用可能である（例えば、Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：２１１１−２１１８頁；Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２９２頁；Ｄｕｒｅｔら、前出；ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」、１９９６、Ｎｅｉｄｈａｒｄら編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０４７−２０６６頁を参照）。コドン使用頻度を得るためのデータの出所は、タンパク質をコードすることができる利用可能なヌクレオチド配列に依存する可能性がある。これらのデータセットは、タンパク質発現をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）またはゲノム配列の予測コード配列を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ  Ｄ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ  Ｅ．Ｃ．、１９９６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２５９−２８１頁；Ｔｉｗａｒｉら、１９９７、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｓｃｉ．、１３：２６３−２７０頁を参照）。
【０２４１】
「制御配列」は、本開示のポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を含むと本明細書において定義する。各制御配列は、天然またはポリペプチドをコードする核酸配列と異質であってよい。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写終結区を含むが、これらに限定されない。最小限、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域を有する制御配列の連結反応を促進する特異的制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてよい。
【０２４２】
「作動可能に連結された」は、制御配列がポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を誘導するようなＤＮＡ配列のコード配列に対する位置に制御配列が適切に配置されている構成と本明細書において定義する。
【０２４３】
「プロモーター配列」は、コード領域の発現について宿主細胞によって認識されている核酸配列である。制御配列は、適切なプロモーター配列を含み得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す、変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターを含む核酸配列であってよく、宿主細胞に対して同種または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０２４４】
「−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル」は、１個から１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルは、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニルおよび−ｎ−デシルなどである。分枝アルキルは、−メチル、−エチルまたは−プロピルなどの１つ以上の直鎖−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基が直鎖アルキルの−ＣＨ２−基における１つまたは両方の水素を置換していることを意味する。分枝非環状炭化水素は、−メチル、−エチルまたは−プロピルなどの１つ以上の直鎖−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル基が直鎖非環状炭化水素の−ＣＨ２−基における１つまたは両方の水素を置換していることを意味する。代表的な分枝−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルヘキシル、１，３−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、１，２−ジメチルヘプチル、１，３−ジメチルヘプチルおよび３，３−ジメチルヘプチルなどである。
【０２４５】
「−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」は、１個から６個の炭素原子を有する直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチルおよび−ｎ−ヘキシルなどである。代表的な分枝（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、−ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチルおよび３，３−ジメチルブチルなどである。
【０２４６】
「−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」は、１個から４個の炭素原子を有する直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルは、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピルおよび−ｎ−ブチルなどである。代表的な分枝−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルは、イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチルおよび−ｔｅｒｔ−ブチルなどである。
【０２４７】
「−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」は、１個から３個の炭素原子を有する直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルは、−メチル、−エチルおよび−ｎ−プロピルである。代表的な分枝−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルは、−イソプロピルなどである。
【０２４８】
「−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル」は、１個または２個の炭素原子を有する直鎖非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖−（Ｃ１−Ｃ２）アルキルは、−メチルおよび−エチルである。
【０２４９】
「−（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル」は、２個から１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。分枝アルケニルは、−メチル、−エチルまたは−プロピルなどの１つ以上の直鎖−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基が直鎖アルケニルの−ＣＨ２−または−ＣＨ＝基における１つまたは両方の水素を置換していることを意味する。代表的な直鎖および分枝（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、−ビニル、−アリル、１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デセニル、−２−デセニル、−３−デセニルなどである。
【０２５０】
「−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル」は、２個から６個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖および分枝−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルは、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニルなどである。
【０２５１】
「−（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル」は、２個から１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。分枝アルキニルは、−メチル、−エチルまたは−プロピルなどの１つ以上の直鎖−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基が直鎖アルキニルの−ＣＨ２−基における１つまたは両方の水素を置換していることを意味する。代表的な直鎖および分枝−（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルは、−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニル、−１−ヘプチニル、−２−ヘプチニル、−６−ヘプチニル、−１−オクチニル、−２−オクチニル、−７−オクチニル、−１−ノニニル、−２−ノニニル、−８−ノニニル、−１−デシニル、−２−デシニル、−９−デシニルなどである。
【０２５２】
「−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル」は、２個から６個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖および分枝（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルは、−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニルなどである。
【０２５３】
「−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ」は、１つ以上のエーテル基および１個から６個の炭素原子を有する直鎖または分枝非環式炭化水素を意味する。代表的な直鎖および分枝（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシは、−メトキシ、−エトキシ、−メトキシメチル、−２−メトキシエチル、−５−メトキシペンチル、−３−エトキシブチルなどである。
【０２５４】
「−（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル」は、３個から１２個の炭素原子を有する飽和単環式炭化水素を意味する。代表的な（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキルは、−シクロプロピル、−シクロブチル、−シクロペンチル、−シクロヘキシル、−シクロヘプチル、−シクロオクチル、−シクロノニル、−シクロデシルおよび−シクロドデシルである。
【０２５５】
「−（Ｃ４−Ｃ８）シクロアルキル」または「４−８員シクロアルキル環」は、４個から８個の炭素原子を有する飽和単環式炭化水素を意味する。代表的な−（Ｃ４−Ｃ８）シクロアルキルは、−シクロブチル、−シクロペンチル、−シクロヘキシル、−シクロヘプチルおよび−シクロオクチルである。
【０２５６】
「−（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル」は、３個から８個の炭素原子を有する飽和単環式炭化水素を意味する。代表的な−（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルは、−シクロプロピル、−シクロブチル、−シクロペンチル、−シクロヘキシル、−シクロヘプチルおよび−シクロオクチルなどである。
【０２５７】
「−（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル」は、３個から７個の炭素原子を有する飽和単環式炭化水素を意味する。代表的な（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルは、−シクロプロピル、−シクロブチル、−シクロペンチル、−シクロヘキシルおよび−シクロヘプチルなどである。
【０２５８】
「−（６−１０員）複素二環」または「−（６−１０員）二環式複素環」は、飽和、不飽和非芳香族または芳香族である６−１０員二環式複素環を意味する。−（６−１０員）複素二環は、第四級化することができる窒素；酸素；ならびにスルホキシドおよびスルホンを含む硫黄から独立に選択される１個から４個のヘテロ原子を含む。−（６−１０員）複素二環は、窒素または炭素原子を介して結合させることができる。代表的な−（６−１０員）複素二環は、−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン、−キノリニル、−イソキノリニル、−クロモニル、−クマリニル、−インドリル、−インドリジニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、−インダゾリル、−プリニル、−４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、−キノリル、−フタラジニル、−ナフチリジニル、−カルバゾリル、−β−カルボリニル、−インドリニル、−イソインドリニル、−１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル、−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、ピロロピロリルなどである。
【０２５９】
「−ＣＨ２（ハロ）」は、メチル基の水素の１つがハロゲンにより置換されたメチル基を意味する。代表的な−ＣＨ２（ハロ）基は、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒおよび−ＣＨ２Ｉなどである。
【０２６０】
「−ＣＨ（ハロ）２」は、メチル基の水素の２つがハロゲンにより置換されたメチル基を意味する。代表的な−ＣＨ（ハロ）２基は、−ＣＨＦ２、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨＢｒ２、−ＣＨＢｒＣｌ、−ＣＨｌＩおよび−ＣＨＩ２などである。
【０２６１】
「−Ｃ（ハロ）３」は、メチル基の水素のそれぞれがハロゲンにより置換されたメチル基を意味する。代表的な−Ｃ（ハロ）３基は、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３および−ＣＩ３などである。
【０２６２】
「−ハロゲン」または「−ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを意味する。
【０２６３】
「オキソ」、「＝Ｏ」などは、本明細書で用いているように、炭素または他の元素に二重結合した酸素を意味する。
【０２６４】
第１の基が「１つ以上の」第２の基「で置換」されている場合、第１の基の１つ以上の水素原子は、対応する数の第２の基で置換されている。第２の基の数が２つ以上である場合、各第２の基は、同じまたは異なっていることがあり得る。
【０２６５】
一実施形態において、第１の基は、３つまでの第２の基で置換されている。
【０２６６】
他の実施形態において、第１の基は、１つまたは２つの第２の基で置換されている。
【０２６７】
他の実施形態において、第１の基は、１つのみの第２の基で置換されている。
【０２６８】
本明細書で用いているように、「立体異性体」という用語は、空間におけるそれらの原子の配向のみが異なる個々の分子のすべての異性体に関する一般的用語である。これは、鏡像異性体および互いの鏡像ではない複数のキラル中心を有する化合物の異性体（「ジアステレオマー」）を含む。
【０２６９】
「キラル中心」という用語は、４つの異なる基が結合している炭素原子を意味する。
【０２７０】
「鏡像異性体」という用語は、その鏡像に重ね合わせることができず、したがって光学的に活性である（鏡像異性体は偏光面を１方向に回転させ、その鏡像は偏光面を反対の方向に回転させる）分子を意味する。
【０２７１】
「ラセミ体」という用語は、光学的に不活性である、等量の鏡像異性体の混合物を意味する。
【０２７２】
「分割」という用語は、分子の２つの鏡像異性体の１つの分離または濃縮または枯渇を意味する。
【０２７３】
「実質的に鏡像異性的に純粋」は、本明細書で用いているように、化合物の表示された鏡像異性体が、同じ化合物の他の鏡像異性体より大きい程度に存在することを意味する。したがって、特定の実施形態において、実質的に鏡像異性的に純粋な化合物は、同じ化合物の他の鏡像異性体と比べて８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の鏡像異性体過剰率で存在する。
【０２７４】
「実質的に立体異性的に純粋」は、本明細書で用いているように、化合物の表示された鏡像異性体またはジアステレオマーが、同じ化合物の他の鏡像異性体またはジアステレオマーより大きい程度に存在することを意味する。「立体選択性」について上で述べたように、鏡像異性体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の類型である。したがって、特定の実施形態において、実質的に立体異性的に純粋な化合物は、同じ化合物の他の鏡像異性体またはジアステレオマーと比べて８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の立体異性体過剰率で存在する。
【０２７５】
５．４  本開示の複素二環式化合物を調製する方法
本開示の複素二環式化合物は、本明細書で開示した生物学的触媒としてのモノアミンオキシダーゼを用いた下で開示する生体触媒法を用いて合成される。
【０２７６】
【化３１】
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【０２７７】
スキーム１に、第二級アミン、すなわち、構造式Ｉによる複素二環式化合物を構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化する、本開示のモノアミンオキシダーゼにより触媒される反応を示す。
【０２７８】
【化３２】
2011525533.tif 000034
【０２７９】
スキーム２に、一緒になってスキーム１に示す総括的な正味の反応を与える３つの素反応を示す。スキーム２の第１の反応において、第二級アミン、すなわち、構造式Ｉによる複素二環式化合物が本開示のモノアミンオキシダーゼ（フラビンアデニンヌクレオチド補因子（ＦＡＤ）と複合体を形成している）により構造式ＩＩ（ａ）の対応するイミン化合物に酸化されて、構造式ＩＩの対応する実質的に鏡像異性的に純粋なイミンおよび還元モノアミンオキシダーゼＦＡＤ複合体（酵素−ＦＡＤ−Ｈ２）が得られる。第２の段階において、還元モノアミンオキシダーゼ（酵素−ＦＡＤ−Ｈ２複合体）が分子状酸素により再酸化されて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が副生成物として生ずる。第３の反応（モノアミンオキシダーゼによって触媒されない）において、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が水と酸素に分解される。
【０２８０】
基質である構造式Ｉの第二級アミンは、市販されており、または当技術分野で公知もしくは当技術分野で公知の方法および試薬から本開示に照らして容易に適応される方法および試薬を用いて容易に合成される（例えば、Ｄｅｌａｌｕら（１９９９）、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．、３６、６８１頁；ＷＯ２００７／０２２４５９；およびＷＯ２００７／０７５７９０および本明細書で引用した参考文献を参照）。
【０２８１】
過酸化水素は、モノアミンオキシダーゼ酵素を不可逆的に不活性化することができる強い酸化剤である。したがって、特定の実施形態において、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が分子状酸素と水に分解される、上のスキーム２の段階３に示す不均化反応を促進するのに有用な化合物。特定の実施形態において、この成分は、Ｐｄ、Ｆｅなどであるが、これらに限定されない化学物質から選択され、一方、他の実施形態において、この成分は、カタラーゼ酵素などの酵素である。特定の実施形態において、反応混合物は、２分子の過酸化水素が分解されて、２分子の水と１分子の酸素が生ずる、スキーム２の段階３の不均化反応を触媒するカタラーゼ酵素をさらに含む。特定の実施形態において、カタラーゼは、約０．０１％から約１％（重量／容積）、約０．０５％から約０．５％（重量／容積）または約０．１％から約０．２％（重量／容積）の濃度で反応に含められるアスペルギルス・ニガーカタラーゼである。
【０２８２】
構造式Ｉの化合物が揮発性液体であるこれらの例において、扱いを容易にするために、それを塩として提供することができる。この実施例の一態様において、例えば、ヘプタンに溶解した遊離塩基の１０％溶液に１当量の酢酸を加えることによって、アミン基質は酢酸塩に変換される。沈殿した塩を収集し、溶媒（例えば、塩が析出した溶媒、例えば、ヘプタン）で洗浄し、室温（約２１℃）で減圧下で乾燥する。
【０２８３】
スキーム１に示したように、最終的酸化剤は、分子状酸素である。水に対する酸素の溶解度が限られたものであることを考慮し、温度および塩分濃度（溶質濃度）が増加するにつれて溶解度が低下することを考慮に入れると、反応のための溶液中の分子状酸素は、気相から気−液物質移動によって補給しなければならない。一般的に、実際的な反応速度を得るために供給される好ましいモノアミンオキシダーゼの活性および量は、反応が気−液物質移動の速度によって制限された状態になるのに十分である。周知のように、気−液物質移動の速度は、液体中のガスの分圧、液体中のガスの溶解度および気−液界面の面積に依存する。したがって、気−液物質移動律速反応の速度は、スパージングによるものを含む、攻撃的な気−液混合、中空インペラー吸引、向流気−液循環、垂直方向蛇行管状流などを行う、環境を工学的に操作することによって増加させることができる。さらに、環境の工学的操作において、酸素気−液物質移動律速反応の速度は、ガス全圧を増加させること、ガス中の酸素の分率を増加させること（濃縮など）、または両方の空気を精製酸素で置換することにより酸素の分圧を増加させることによって増加させることができる。特定の実施形態において、溶存酸素の濃度および／または気相からの酸素消費の速度を連続的にモニターし、有益な反応速度または完結までの総反応時間を得るために酸素供給速度、分圧、混合効率またはそれらの組合せを調節する。
【０２８４】
特定の実施形態において、反応混合物は、少なくとも１つの消泡剤も含んでいてよい。特定の実施形態において、消泡剤は、Ａｎｔｉｆｏｒｍ−２０４またはＡｎｔｉｆｏｒｍ  Ｙ−３０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）または同様のものなどであるが、これらに限定されない市販の物質である。他の実施形態において、反応物は、複数の消泡剤を含んでいてよい。消泡剤は、約０．０１％から約１％（固体の場合には重量／容積または液体の場合には容積／容積）、約０．０５％から約０．５％または約０．１％から約０．２％の濃度で反応物に含めることができる。
【０２８５】
特定の実施形態において、構造式ＩＩの酸化イミン化合物は、反応混合物から分離し、精製し、特性を評価することができる。下で述べる他の実施形態において、構造式ＩＩのイミン化合物は、他の付加体または中間体に変換し、分離または精製せずに後の段階に用いることができる。
【０２８６】
【化３３】
2011525533.tif 000035
【０２８７】
特定の実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、構造式ＩＩの生成物イミンにより阻害される可能性がある。したがって、特定の実施形態において、構造式Ｉの化合物が構造式ＩＩの化合物に酸化される反応は、構造式ＩＩのイミン化合物と反応して、スキーム３に示すように、本開示のモノアミンオキシダーゼを阻害する能力が低いまたは能力がない付加体を生成する物質をさらに含む。この実施形態の一態様において、この物質は、阻害量の構造式ＩＩのイミン化合物の蓄積を防ぐのに十分に高いが、酵素阻害量の当物質の蓄積を避けるのに十分に低い量で反応の開始時に加える、または完結的もしくは連続的に加える。一実施形態において、この物質は、水中で重亜硫酸ナトリウムに水和される、メタ重亜硫酸ナトリウムとして都合よく供給され得る重亜硫酸ナトリウムである。重亜硫酸塩と構造式ＩＩのイミン化合物との反応により、構造式ＩＩＩの重亜硫酸付加体が得られる。特定の実施形態において、重亜硫酸ナトリウムは、この試薬が「即時に」消費され、構造式ＩＩの潜在的に阻害性イミン生成物が構造式ＩＩＩのより低い阻害性または非阻害性の重亜硫酸付加体として「捕捉」される速度で反応物に連続的に加える。
【０２８８】
モノアミンオキシダーゼがイミン生成物により阻害されるか否かにかかわりなく、イミン生成物に反応する重亜硫酸塩の添加は、実際的方法に工学技術上の選択肢も与えるものである。本発明の特定のイミンは、高度に揮発性であり、それらのうち、一部のものは悪臭が強くおよび／または有毒である。遊離塩基としてのそれらの封じ込めには、ガス流のない閉鎖反応または化学的捕捉物の効率のよい凝縮（例えば、重亜硫酸塩溶液による）が必要である。それらの重亜硫酸付加体（アミノスルホネート）へのインサイツでの反応は、同じ反応容器中のシアニドとの後続反応を行う選択肢も提供すると同時にこれらの工学技術上の制約を取り除くものである。
【０２８９】
構造式ＩＩＩの重亜硫酸付加体の生成は、高いｐＨで逆転させることができ、それにより、構造式ＩＩの対応するイミンが再生される。したがって、特定の実施形態において、スキーム３の反応を、ｐＨを約１３に上昇させるための塩基、例えば、１０Ｎ  ＮａＯＨの添加によりクエンチさせて、例えば、メチルｔ−ブチルエーテル（「ＭＢＴＥ」）で抽出することができる構造式ＩＩのイミンを再生し、特定の実施形態において、蒸留により分離して、構造式ＩＩのイミンを無色の油として得る。
【０２９０】
特定の実施形態において、一部は構造式Ｉの化合物の構造式ＩＩの化合物への変換のための生体触媒として用いられるモノアミンオキシダーゼの基質および生成物阻害を最小限にするまたは未然に防ぐために、構造式Ｉの基質、封鎖剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム）およびｐＨ調節剤（例えば、ＮａＯＨ）の添加の速度をモニターし、制御する。
【０２９１】
【化３４】
2011525533.tif 000036
【０２９２】
他の実施形態において、スキーム４に示すように、ＮａＣＮをスキーム３の反応に加え、ｐＨを約１０に上昇させ、それにより、構造式ＩＩＩの重亜硫酸付加体を構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物に立体選択的に変換する。この実施形態の態様において、約１から約３当量、約１から約２、約１．０５から約１．５当量、または約１．１から約１．２当量のＮａＣＮ（構造式ＩＩのイミン化合物に対して）を反応物に加えて、構造式ＩＩＩの亜硫酸付加体を構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物に変換する。さらに、式ＩＩＩの化合物の反応は、構造式ＩＶ（ｂ）のシスアミノニトリル化合物を生成する。
【０２９３】
構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物は、例えば、２−メチルテトラヒドロフラン、ＭＴＢＥまたは酢酸イソプロピルを用いて反応混合物から抽出することができる（１：１有機溶媒：水性反応混合物）。トランスアミノニトリル化合物は、有機溶媒抽出物、例えば、有機抽出物から回収することができ、場合による中間体のさらなる清澄化を行い、減圧下で濃縮して、構造式ＩＶのアミノニトリル化合物を得ることができる。
【０２９４】
【化３５】
2011525533.tif 000037
【０２９５】
特定の実施形態において、構造式ＩＩのイミン化合物は、反応してスキーム５に示した二量体構造を形成し（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｋｉｎｅｔ．１９９８、３０（２）、１２９−１３６頁を参照）、それにより、本開示のモノアミンオキシダーゼの生成物阻害を最小限とするまたは未然に防ぐ。モノアミンオキシダーゼがイミン生成物により阻害されるか否かにかかわりなく、二量体化は、実際的方法に工学技術上の選択肢も与えるものである。二量体は、たとえそうであっても、対応するイミンよりはるかに揮発性が低く、混入物揮発性イミンを工学的に処理する必要性を実質的に軽減する。さらに、二量体は、ろ過、抽出または水蒸気蒸留により反応混合物から一般的に容易に回収することができ、一般的に本方法の後続段階に直接的に用いることができる。あるいは、二量体は、一般的に酸性溶液に溶解して、所望の二環式プロリン類似体および誘導体を生成する後続段階における使用に適する単量体イミン塩溶液を得ることができる。
【０２９６】
【化３６】
2011525533.tif 000038
【０２９７】
ある種の条件下で、ピロリジン単量体化合物のイミン（例えば、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール）は、二量体を形成し、次に熱力学的に有利な三量体構造を形成する。したがって、式ＩＩ（ａ）の特定の化合物は、二量体を形成するだけではなく、排他的に、または単量体および二量体化合物と若干の混合した状態で三量体（例えば、式ＩＩ（ｃ）の化合物）も続いて形成する。
【０２９８】
【化３７】
2011525533.tif 000039
【０２９９】
そのような三量体の形成の有利性は、置換基に依存し得る。しかし、式ＩＩ（ｃ）のそのような三量体化合物は、本開示の反応に用いる場合、二量体と比べて反応性の差をほとんど示さないと予想される。したがって、メカニズムによって拘束されずに、式ＩＩ（ｃ）の三量体の形成を受ける式ＩＩ（ａ）の化合物は、二量体と同等の反応性を示すと予想される。
【０３００】
溶媒、例えば、ＭＴＢＥまたはトルエン中への抽出後に、スキーム５により生成した二量体をＮａＣＮおよび酸（例えば、クエン酸、酢酸もしくは塩酸）とまたはＨＣＮ（０℃）と接触させて、構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物および式ＩＩ（ｂ）のシスアミノニトリル化合物を得ることができる。
【０３０１】
【化３８】
2011525533.tif 000040
【０３０２】
例えば、スキーム４またはスキーム６により調製された構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物は、水性酸（例えば、ＨＣｌまたはＨ２ＳＯ４）と接触させて、構造式ＶＩのアミノ酸を得ることができる。部分Ｒ５が−ｔ−ブチルである、構造式Ｖの対応するｔ−ブチルエステルは、スキーム７に示すように、構造式ＶＩのアミン化合物を酸（例えば、メタンスルホン酸）およびイソブチレンまたはｔ−ブチルエステル（例えば、酢酸ｔ−ブチル）と接触させることによって調製される。
【０３０３】
【化３９】
2011525533.tif 000041
【０３０４】
他の実施形態において、例えば、スキーム４またはスキーム６により調製された構造式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物は、スキーム８に示すように、ピンナー反応においてＨＣｌおよびメタノールと接触させて、部分Ｒ５が−ＣＨ３である、構造式Ｖのメチルエステルを得ることができる。
【０３０５】
【化４０】
2011525533.tif 000042
【０３０６】
スキーム９に、構造式ＩＩのイミン生成物が、構造式ＩＶのアミノニトリルへのその変換の途上で構造式ＩＩＩの亜硫酸付加体として水溶液中に保持されている、構造式Ｉの第二級アミンからの構造式ＶおよびＶＩによる化合物の調製の全過程を示す。
【０３０７】
【化４１】
2011525533.tif 000043
【０３０８】
スキーム１０に、構造式ＩＩのイミン生成物が、構造式ＩＶのアミノニトリルへのその変換の途上で構造式ＩＩ（ｂ）の化合物に二量体化されている、構造式Ｉの第二級アミンからの構造式ＶおよびＶＩによる化合物の調製の全過程を示す。
【０３０９】
【化４２】
2011525533.tif 000044
【０３１０】
スキーム１１に、スキーム４および７の反応を合わせた構造式Ｉの第二級アミンからの構造式ＶＩおよび構造式Ｖ（部分Ｒ５が−ｔ−ブチルである）による化合物の調製の全過程を示す。
【０３１１】
【化４３】
2011525533.tif 000045
【０３１２】
スキーム１２に、スキーム４および８の反応を合わせた構造式Ｉの第二級アミンからの構造式Ｖ（部分Ｒ５が−ＣＨ３である）による化合物の調製の全過程を示す。
【０３１３】
【化４４】
2011525533.tif 000046
【０３１４】
スキーム１３に、スキーム６および７の反応を合わせた構造式Ｉの第二級アミンからの構造式Ｖ（部分Ｒ５が−ｔ−ブチル−である）による化合物の調製の全過程を示す。
【０３１５】
【化４５】
2011525533.tif 000047
【０３１６】
スキーム１４に、スキーム６および８の反応を合わせた構造式Ｉの第二級アミンからの構造式Ｖ（部分Ｒ５が−ＣＨ３である）による化合物の調製の全過程を示す。
【０３１７】
【化４６】
2011525533.tif 000048
【０３１８】
スキーム１５に、スキーム４の反応を含む構造式Ｉの第二級アミンからの構造式ＶＩＩによる化合物の調製の全過程を示す。
【０３１９】
【化４７】
2011525533.tif 000049
【０３２０】
スキーム１６に、スキーム６の反応を含む、構造式Ｉの第二級アミンからの構造式ＶＩＩによる化合物の調製の全過程を示す。
【０３２１】
他の実施形態において、式ＩＶ（ａ）のトランスアミノニトリル化合物を含むスキーム７−１６の過程のいずれかは、式ＩＶ（ｂ）のシスアミノニトリル化合物を用いて実施することができる。スキーム７−１６に対応する反応を式ＩＶ（ｂ）のシスアミノニトリル化合物を用いて行う場合、構造式Ｖ（ｂ）、ＶＩ（ｂ）およびＶＩＩ（ｂ）の結果として生じるシスアミノ酸およびアミドが生成する。
【０３２２】
【化４８】
2011525533.tif 000050
【０３２３】
メカニズムに拘束されるものではないが、スキーム８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６の構造式Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩの化合物を生成する反応中にイミダート中間体が生成することが認識される。したがって、他の実施形態において、本開示は、Ｒ６がＨまたはアルキル基である、構造式ＶＩＩＩのイミダート化合物を提供する。
【０３２４】
【化４９】
2011525533.tif 000051
【０３２５】
したがって、上の方法のいくつかの実施形態において、構造式ＶＩＩＩのイミダート化合物は、構造式Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩの化合物の調製に用いることができる。
【０３２６】
５．５  モノアミンオキシダーゼ酵素
本開示は、基質である構造式Ｉの化合物を構造式ＩＩの化合物に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。特定の実施形態において、本開示は、基質である化合物（１）を化合物（２）に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。他の実施形態において、本開示は、基質である化合物（３）を化合物（４）に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。両方の例において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガー（配列番号２）もしくはアスペルギルス・オリザ（配列番号３２）もしくはそのハイブリッド（配列番号６）の天然に存在する野生型モノアミンオキシダーゼと比較したとき、または他の操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素（例えば、配列番号８の酵素）と比較したとき、改善された特性も示す。改善が望ましい酵素特性は、酵素活性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子の必要、阻害物質（例えば、生成物阻害）に対する無反応性、立体特異性、立体選択性、溶媒安定性、溶解度ならびに宿主細胞中の安定性および発現レベルを含むが、これらに限定されない。改善は、酵素活性などの単一酵素特性または酵素活性および立体選択性などの各種酵素特性の組合せに関するものであり得る。
【０３２７】
アスペルギルス・ニガーおよびアスペルギルス・オリザの天然に存在するモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列ならびにしたがって対応するアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニガーについてはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ３８８５８、アスペルギルス・オリザについてはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１８２２８３２から入手可能である。
【０３２８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示するモノアミンオキシダーゼは、モノアミンオキシダーゼの特性の改善をもたらす参照配列（例えば、天然に存在するポリペプチドまたは操作改変ポリペプチド）に対する多くの修飾を有し得る。そのような実施形態において、アミノ酸配列の修飾の数は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸または２０以上のアミノ酸、参照酵素配列のアミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％までまたはアミノ酸の総数の３０％までを含み得る。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの特性の改善をもたらす天然に存在するポリペプチドまたは操作改変ポリペプチドに対する修飾の数は、参照配列に対する約１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１５、１−２０、１−２１、１−２２、１−２３、１−２４、１−２５または約１−３０の修飾を含んでいてよい。修飾は、挿入、欠失、置換またはそれらの組合せを含み得る。
【０３２９】
いくつかの実施形態において、修飾は、参照配列に対するアミノ酸置換を含む。モノアミンオキシダーゼの特性の改善をもたらし得る置換は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸または２０以上のアミノ酸、参照酵素配列のアミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％までまたはアミノ酸の総数の３０％までであってよい。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの特性の改善をもたらす天然に存在するポリペプチドまたは操作改変ポリペプチドに対する置換の数は、参照配列の約１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１５、１−２０、１−２１、１−２２、１−２３、１−２４、１−２５または約１−３０のアミノ酸置換を含み得る。
【０３３０】
いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの野生型または他の操作改変ポリペプチドと比較して改善された特性は、その立体選択性の増大、すなわち、本明細書において、構造式Ｉの化合物の構造式ＩＩの化合物への酸化、または特定の実施形態において化合物（１）の化合物（２）への酸化もしくは変換、または化合物（３）の化合物（４）への酸化の生成物の立体異性体過剰率の増加に関してである。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの改善された特性は、より大きい割合の基質を生成物に変換または還元するその能力の増大に関してである。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの改善された特性は、基質の生成物への変換のその速度の増加に関してである。酵素活性のこの改善は、同じ量の生成物を酸化または変換するために野生型または他の参照配列と比較して少ない量の改善されたモノアミンオキシダーゼを使用する能力によって明らかにすることができる。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼの改善された特性は、その安定性または熱安定性に関してである。いくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、複数の改善された特性を有する。
【０３３１】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、少なくとも約９５％の立体異性体過剰率および配列番号２、配列番号３２または配列番号６のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと比べて改善されている速度で、基質（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））を（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（化合物（２））に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号４、８および１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０３３２】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、少なくとも約９５％のジアステレオマー過剰率および配列番号２、配列番号３２または配列番号６のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと比べて改善されている速度で、基質（３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））を（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（４））に変換することができる。そのような特性を有する具体例としてのポリペプチドは、配列番号１０、１４、１６、１８、２０および３６に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０３３３】
下の表２および３に本明細書で開示した配列番号と関連活性の一覧を示す。下の配列は、特に指定のない限り、野性型アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼ配列（配列番号１および２）に基づいている。下の表２および３において、各行に２つの配列番号を示し、奇数は、偶数によって示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を表す。変異（すなわち、残基の変化）の数を示す欄は、配列番号１および２の野性型アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼ配列と比較したアミノ酸置換の数を意味する。各表に各状況における記号「＋」「＋＋」「＋＋＋」および「＋＋＋＋」の意味を示す説明文が続く。
【０３３４】
【表２】
2011525533.tif 000052
【０３３５】
【表３】
2011525533.tif 000053
【０３３６】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の配列を含む参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、但し、このポリペプチドは、残基位置２８９に対応するアミノ酸残基がバリンであり、残基位置３４８に対応するアミノ酸残基がグルタミンであり、残基位置３８２に対応するアミノ酸残基がロイシンであり、残基４６５に対応するアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列の１つ以上の修飾を有し得る。修飾は、置換、欠失および挿入を含み得る。置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換の組合せであり得る。
【０３３７】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の配列を含む参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、但し、このポリペプチドは、残基位置２８９に対応するアミノ酸残基がバリンであり、残基位置３４８に対応するアミノ酸残基がグルタミンであり、残基位置３６５に対応するアミノ酸残基がトリプトファンであり、残基４６５に対応するアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、配列番号１４のアミノ酸配列の１つ以上の修飾を有し得る。修飾は、置換、欠失および挿入を含み得る。置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換の組合せであり得る。
【０３３８】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の配列を含む参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、但し、該ポリペプチドは、位置９９の残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、残基２８９に対応する残基がバリンであり、残基位置３４８に対応するアミノ酸残基がグルタミンであり、残基位置３６５に対応するアミノ酸残基がトリプトファンであり、残基４６５に対応するアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列の１つ以上の修飾を有し得る。修飾は、置換、欠失および挿入を含み得る。置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換の組合せであり得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の配列を含む参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、但し、該ポリペプチドは、残基位置９９に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、位置１３５に対応する残基がグルタミンであり、残基２８９に対応する残基がバリンであり、残基位置３４８に対応するアミノ酸残基がグルタミンであり、残基位置３６５に対応するアミノ酸残基がトリプトファンであり、残基４６５に対応するアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、配列番号１８のアミノ酸配列の１つ以上の修飾を有し得る。修飾は、置換、欠失および挿入を含み得る。置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換の組合せであり得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号２の配列を含む参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、但し、該ポリペプチドは、残基位置９９に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、位置１３５に対応する残基がグルタミンであり、位置２８４に対応する残基がアスパラギン酸であり、残基２８９に対応する残基がバリンであり、残基位置３４８に対応するアミノ酸残基がグルタミンであり、位置３５６に対応するアミノ酸残基がバリンであり、残基位置３６５に対応するアミノ酸残基がトリプトファンであり、残基位置４６５に対応するアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、配列番号２０のアミノ酸配列の１つ以上の修飾を有し得る。修飾は、置換、欠失および挿入を含み得る。置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換の組合せであり得る。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、改善されたモノアミンオキシダーゼは、表２および３に示すような配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または３６に対応するアミノ酸と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この改善されたモノアミンオキシダーゼは、表２および３のアミノ酸配列において示した指定されたアミノ酸置換の組合せのいずれか一組を含む。いくつかの実施形態において、これらのモノアミンオキシダーゼは、他のアミノ酸残基における約１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０または１−２０変異をさらに有し得る。変異は、挿入、欠失または置換またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態において、さらなる変異は、保存的置換を含む。
【０３４２】
当業者により十分に理解されるように、本明細書で開示したポリペプチドは、遺伝的にコードされるアミノ酸に制限されない。遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、本明細書で開示したポリペプチドは、全体または一部分においてに天然に存在するおよび／または合成非コード化アミノ酸を含んでいてよい。本明細書で開示したモノアミンオキシダーゼが含んでいてよい特定の一般的に遭遇する非コード化アミノ酸は、遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルカラニン（ｓＡｌａ）；オートリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−���エニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）；アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）；ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼが含んでいてよいさらなる非コード化アミノ酸は、当業者に明らかである（例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、３−７０頁およびすべてが参照により本明細書に組み込む当文献中で引用された参考文献に記載された様々なアミノ酸を参照）。これらのアミノ酸は、ＬまたはＤ立体配置であってよい。
【０３４３】
当業者は、本明細書で開示したモノアミンオキシダーゼは、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も含み得ることを認識する。この場合には芳香族カテゴリーに属するそのような保護アミノ酸の非限定的な例は、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）を含む（保護基をカッコ内に示す）が、これらに限定されない。
【０３４４】
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼが含んでいてよい立体配座上束縛されている非コード化アミノ酸は、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸を含み得るが、これらに限定されない。
【０３４５】
上述のように、操作改変モノアミンオキシダーゼを創出するために天然に存在するポリペプチドに導入される様々な修飾は、この酵素の特異的特性を標的とすることができる。
【０３４６】
５．６  操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド
他の態様において、本開示は、本明細書で開示した操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを創出するために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結することができる。操作改変モノアミンオキシダーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築体を適切な宿主細胞に導入して、対応するモノアミンオキシダーゼポリペプチドを発現させることができる。
【０３４７】
様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、タンパク質配列を利用できることが対象をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの記述を可能にするものである。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝コードの縮重は、そのすべてが本明細書で開示した改善されたモノアミンオキシダーゼをコードする、極めて多数の核酸が作られることを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に修飾することによってあらゆる数の異なる核酸を作ることができよう。この点について、本開示は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって作ることができるポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能な変形形態を具体的に企図するものであり、そのようなすべての変形形態は、表２および３に示すアミノ酸配列を含む本明細書で開示したポリペプチドについて具体的に開示することを考慮すべきである。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドは、本明細書で述べた参照操作改変モノアミンオキシダーゼのいずれかとの少なくとも約８０％以上の配列同一性、約８５％以上の配列同一性、約９０％以上の配列同一性、約９５％以上の配列同一性、約９６％以上の配列同一性、約９７％以上の配列同一性、約９８％以上の配列同一性または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するモノアミンオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または３６から選択されるアミノ酸配列を含む操作改変モノアミンオキシダーゼをコードする。
【０３４９】
様々な実施形態において、コドンは、好ましくはタンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において用いられる好ましいコドンは、細菌における遺伝子を発現させるために用いられ、酵母において用いられる好ましいコドンは、酵母における発現のために用いられ、哺乳動物において用いられる好ましいコドンは、哺乳類細胞における発現のために用いられる。例として、配列番号１のポリヌクレオチドは、Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化されたが、アスペルギルス・ニガーの天然に存在するモノアミンオキシダーゼを別にコードする。
【０３５０】
特定の実施形態において、天然配列は好ましいコドンを含み、好ましいコドンの使用がすべてのアミノ酸残基について必要であるとは限らないので、モノアミンオキシダーゼのコドンの使用を最適化するためにすべてのコドンを置換する必要があるわけではない。したがって、モノアミンオキシダーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上における好ましいコドンを含み得る。
【０３５１】
いくつかの実施形態において、操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または３５から選択される。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号５または３１を含むポリヌクレオチドと高度緊縮条件下でハイブリッド形成することができ、高度緊縮条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、機能的モノアミンオキシダーゼをコードする。
【０３５２】
他の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むが、操作改変モノアミンオキシダーゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約８０％以上の配列同一性、約８５％以上の配列同一性、約９０％以上の配列同一性、約９５％以上の配列同一性、約９８％以上の配列同一性または９９％以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、参照ポリヌクレオチドは、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または３５によって示されるポリヌクレオチド配列から選択される。
【０３５３】
改善されたモノアミンオキシダーゼをコードする分離ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を可能にするための様々な方法で操作することができる。ベクターへのその挿入の前の分離ポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターによって望ましいまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を用いるポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当技術分野で周知である。指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉｓａｔｅｓ、１９９８、ｕｐｄａｔｅｓ  ｔｏ  ２００６に記載されている。
【０３５４】
細菌宿主細胞については、本開示の核酸構築体の転写を誘導する適切なプロモーターとしては、Ｅ．コリｌａｃオペロン、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラ−ゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・サブチリスｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核ベータラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：３７２７−３７３１頁）から得られるプロモーターならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２１−２５頁）などがある。さらなるプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４頁およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されている。
【０３５５】
糸状菌宿主細胞については、本開示の核酸構築体の転写を誘導する適切なプロモーターとしては、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定性アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼおよびフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）の遺伝子から得られるプロモーターならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガー中性アルファ−アミラーゼおよびアスペルギルス・オリザトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）ならびにそれらの変異型、切断型およびハイブリッドプロモーターなどがある。
【０３５６】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子からのものであり得る。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、Ｙｅａｓｔ、８：４２３−４８８頁により記載されている。
【０３５７】
制御配列はまた、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列である、適切な転写終結区配列であってよい。該終結区配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されている。最適な宿主細胞において機能的であるあらゆる終結区を本明細書で開示した方法に用いることができる。
【０３５８】
例えば、糸状菌宿主細胞の具体例としての転写終結区は、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーアルファ−グルコシダーゼおよびフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。
【０３５９】
酵母宿主細胞の具体例としての終結区は、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエシトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロミセス・セレビシエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の他の有用な終結区は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出による記載されている。
【０３６０】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である、適切なリーダー配列であってよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結されている。最適な宿主細胞において機能的であるあらゆるリーダー配列を用いることができる。糸状菌宿主細胞の具体例としてのリーダーは、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニデュランストリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子およびサッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０３６１】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されるとき、転写済みｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってよい。最適な宿主細胞において機能的であるあらゆるポリアデニル化配列を本明細書で開示した方法に用いることができる。糸状菌宿主細胞の具体例としてのポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼおよびアスペルギルス・ニガーアルファ−グルコシダーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ、１９９５、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ、１５：５９８３−５９９０頁により記載されている。
【０３６２】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路内に誘導する、シグナルペプチドコード領域であってよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントに翻訳読み枠内で自然に連結されているシグナルペプチドコード領域を本質的に含んでいてよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列と異質であるシグナルペプチドコード領域を含んでいてよい。異質なシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を自然に含んでいない場合に必要であり得る。
【０３６３】
あるいは、異質なシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を促進するために、天然シグナルペプチドコード領域を単に置換していてよい。しかし、最適な宿主細胞の分泌経路内に発現ポリペプチドを誘導するあらゆるシグナルペプチドコード領域を本明細書で開示した方法に用いることができる。
【０３６４】
細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、バチルスＮＣｌＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスアルファ−アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスサブチリシン、バチルス・リケニフォルミスベータ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびバチルス・サブチリスｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ、１９９３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、５７：１０９−１３７頁により記載されている。
【０３６５】
糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼおよびフミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であり得る。
【０３６６】
酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエアルファ−因子およびサッカロミセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得ることができる。他の有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出により記載されている。
【０３６７】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってよい。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または場合によってチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒開裂によって成熟活性ポリペプチドに変換させることができる。プロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシエアルファ因子、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼおよびミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）の遺伝子から得ることができる。
【０３６８】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端に隣接して位置する。
【０３６９】
宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現の調節を可能にする、調節配列を付加することも望ましい可能性がある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現を開始または停止させるものである。原核宿主細胞において、適切な調節配列は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系などである。酵母宿主細胞において、適切な調節系は、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系などである。糸状菌において、適切な調節配列は、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモーターおよびアスペルギルス・オリザグルコアミラーゼプロモーターなどである。
【０３７０】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系において、これらは、メトトレキサートの存在下で増幅される、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属により増幅される、メタロチオネイン遺伝子などである。これらの場合において、本開示のモノアミンオキシダーゼをコードする核酸配列は、調節配列と作動可能に連結されることになる。
【０３７１】
したがって、他の実施形態において、本開示は、操作改変モノアミンオキシダーゼまたはこの変異体をコードするポリヌクレオチドならびにそれらが導入される宿主の種類によってプロモーターおよび転写終結区、複製起点等などの１つ以上の発現調節領域を含む組換え発現ベクターも対象とする。上述の様々な核酸および制御配列は、制限部位におけるポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする１つ以上の都合のよい制限部位を含み得る組換え発現ベクターを形成するために一緒に結合させることができる。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列または該配列を含む核酸構築体を発現のための適切なベクターに挿入することによって発現させることができる。発現ベクターを作製するに際して、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列をベクターに配置する。
【０３７２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ処置に都合よくかけることができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができるあらゆるベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってよい。ベクターの選択は、一般的に、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状または閉鎖環状プラスミドであってよい。
【０３７３】
発現ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち、複製が染色体複製と無関係である、染色体外存在物として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であってよい。ベクターは、自己複製を保証するための何らかの手段を含んでいてよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数以上）と一緒に複製されるものであってよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む単一ベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを用いることができる。
【０３７４】
本開示の発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つ以上の選択可能マーカーを含む。選択可能なマーカーは、その産物が生物致死剤またはウイルス耐性、重金属、原栄養体から栄養要求性突然変異体への耐性などを与える遺伝子である。細菌の選択可能マーカーの例は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与える、バチルス・サブチリスもしくはバチルス・リケニフォルミスのｄａｌ遺伝子またはマーカーである。酵母宿主細胞の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【０３７５】
糸状菌宿主細胞において用いられる選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの同等物を含むが、これらに限定されない。アスペルギルス属細胞において用いられる実施形態は、アスペルギルス・ニデュランスまたはアスペルギルス・オリザのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子を含む。
【０３７６】
本開示の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組込みまたはゲノムと独立に細胞中のベクターの自律性複製を可能にする要素（単数以上）を含む。宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列または相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへのベクターの組込みのためのベクターの他の任意の要素に依拠することができる。
【０３７７】
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組込みを誘導するための追加の核酸配列を含んでいてよい。追加の核酸配列は、ベクターが染色体（単数以上）における正確な位置（単数以上）において宿主細胞ゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な位置における組込みの可能性を増大させるために、組込み要素は、相同的組換えの確率を増大させるために対応する標的配列と高度に相同的である、１００から１００００塩基対、好ましくは４００から１００００塩基対、最も好ましくは８００から１００００塩基対などの十分な数の核酸を好ましくは含むべきである。組込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同的である配列であってよい。さらに、組込み要素は、非コードまたはコード核酸配列であってよい。一方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０３７８】
自律性複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製の起点をさらに含んでいてよい。細菌の複製の起点の例は、Ｐ１５Ａｏｒｉ（図５のプラスミドに示す）またはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（プラスミドがＰ１５Ａｏｒｉを有する）またはＥ．コリにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４およびバチルス属における複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０またはｐＡＭ．ｂｅｔａ．１の複製の起点である。酵母宿主細胞において用いられる複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せおよびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製の起点は、宿主細胞において機能温度感受性にする突然変異を有するものであってよい（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１４３３頁を参照されたい）。
【０３７９】
本開示の核酸配列の複数のコピーは、遺伝子産物の生産を増加させるために宿主細胞に挿入することができる。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加コピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことにより、または適切な選択可能物質の存在下で細胞を培養することによって選択可能マーカー遺伝子の増幅コピーを含む細胞およびしたがって核酸配列の追加コピーを選択することができる場合には、核酸配列を有する増幅性の選択可能マーカー遺伝子を含めることにより、得ることができる。
【０３８０】
本明細書で開示した方法において用いられる発現ベクターの多くは、市販されている。適切な市販の発現ベクターは、哺乳類宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位ならびにＥ．コリにおける増幅のための複製のｐＢＲ３２２起点およびアンピシリン耐性マーカーを含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）製のｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクターなどである。他の適切な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ  ＣＡ）により市販されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５７：１９３−２０１頁）に由来するプラスミドである。
【０３８１】
５．７  モノアミンオキシダーゼの発現のための宿主細胞
他の態様において、本開示は、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞における該モノアミンオキシダーゼの発現のために１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている。本開示の発現ベクターによりコードされるモノアミンオキシダーゼポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞は、当技術分野で周知であり、Ｅ．コリ、ラクトバシルス・ケフィル（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバシルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバシルス・マイノル（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ）、ストレプトミセス属およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上述の宿主細胞についての適切な培地および増殖条件は、当技術分野で周知である。
【０３８２】
モノアミンオキシダーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法により細胞に導入することができる。技術は、とりわけ、エレクトロポレーション、微粒子銃粒子ビオンバードメント、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合などである。ポリヌクレオチドを細胞に導入する様々な方法は、当業者に明らかである。
【０３８３】
具体例としての宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０である。発現ベクターは、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００中に改善されたモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結させることによって作製された。該発現ベクターは、複製のＰ１５ａ起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含んでいた。エシェリキア・コリＷ３１１０に対象ポリヌクレオチドを含む細胞は、細胞をクロラムフェニコール選択にかけることによって分離された。
【０３８４】
５．８  操作改変モノアミンオキシダーゼを生成する方法
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、酸化反応を触媒する天然に存在するモノアミンオキシダーゼをアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得る（または由来である）。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列は、指定された宿主細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を増大させるためにコドン最適化される。実例として、アスペルギルス・ニガーの野生型モノアミンオキシダーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて利用可能なアスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ３８８５８）の公知のアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから構築した。配列番号１と呼ぶ親ポリヌクレオチド配列は、Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化し、モノアミンオキシダーゼ遺伝子の発現をｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下において、コドン最適化ポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローニングした。Ｅ．コリにおける活性モノアミンオキシダーゼを発現するクローンを同定し、遺伝子の配列を決定して、それらの同一性を確認した。示された配列（配列番号２）は、アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼから進化させた操作改変モノアミンオキシダーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築の出発点として用いた親配列であった。
【０３８５】
５．８  操作改変モノアミンオキシダーゼは、上述のように、天然に存在するモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定向進化法に供することによって得ることができる。具体例としての定向進化法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９１：１０７４７−１０７５１頁；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されたような突然変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである。用いることができる他の定向進化法は、とりわけ、付着伸長法（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：２５８−２６１頁）、変異原性ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．、３：Ｓ１３６−Ｓ１４０頁）およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：３５２５−３５２９頁）などである。
【０３８６】
突然変異誘発処理後に得られるクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作改変モノアミンオキシダーゼについてスクリーニングする。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕら、「Ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５３：１６９−７４頁）およびＳｚｕｔｏｗｉｃｚら（Ｓｚｕｔｏｗｉｃｚら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ２，２’−Ａｚｉｎｏ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈａｉｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  Ｃｈｒｏｍｉｏｇｅｎ）、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：８６−９４頁」により開示されたものなどであるが、これらに限定されないモノアミンオキシダーゼを測定するための公表された方法またはその変法を用いてモノアミンオキシダーゼ活性を測定することができるような、しかしそれに限定されない標準的な生化学手法を用いて行うことができる。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に述べるように、または例えば、ＺｈｏｕおよびＳｚｕｔｏｗｉｃｚの方法を用いて、酵素の定義された調製物、設定条件下での定義されたアッセイおよび１つ以上の定義された基質を用いて行う。一般的に、溶解物を比較する場合、アッセイに供する細胞の数およびタンパク質の量ならびに宿主細胞により産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために同一の発現系および同一の宿主細胞の使用を決定する。所望の改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を規定の温度のもとにおいた後、熱処理後に残された酵素活性の量を測定することによって測定することができる。次いで、モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを分離し、配列を決定して、ヌクレオチド配列の変化（もしあるとすれば）を同定し、宿主細胞中で酵素を発現させるために用いる。
【０３８７】
操作改変ポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って標準的固相法により調製することができる。いくつかの実施形態において、最大約１００塩基のフラグメントを個別に合成し、次に結合させて（例えば、酵素もしくは化学的連結反応（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法またはポリメラーゼ媒介法により）、所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書で開示したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ、２２：１８５９−６９頁により記載された古典的ホスホルアミダイト法または例えば一般的に自動合成方法で実施されているようなＭａｔｔｈｅｓら、１９８４、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：８０１−０５頁により記載された方法を用いて化学合成により調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールし、連結し、適切なベクターにクローニングする。さらに、本質的にあらゆる核酸は、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡおよび多くの他社などの様々な商業的供給源のいずれかから入手することができる。
【０３８８】
宿主細胞において発現した操作改変モノアミンオキシダーゼは、とりわけ、リゾチーム処理、音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーなどのタンパク質精製のためのいずれか１つ以上の周知の技術を用いて、細胞おおび／または培地から回収することができる。Ｅ．コリなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出用の適切な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）のもとで商業的に入手可能である。
【０３８９】
モノアミンオキシダーゼの分離のためのクロマトグラフィー技術は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーなどである。特定の酵素を精製する条件は、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などの因子に一部依存するものであり、当業者に明らかである。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、アフィニティー法は、改善されたモノアミンオキシダーゼを分離するのに用いることができる。アフィニティークロマトグラフィー精製については、モノアミンオキシダーゼに特異的に結合する抗体を用いることができる。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに限定されない様々な宿主細胞を、化合物を注射することによって免疫化することができる。化合物は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合させたリンカーによりＢＳＡなどの適切な担体に結合させることができる。宿主種によって、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない様々なアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。
【０３９１】
５．９  操作改変モノアミンオキシダーゼおよびそれを用いて調製される化合物を使用する方法
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼは、各Ａ、ＭおよびＭ’が上述の通りである、以下の構造式Ｉの基質化合物の構造式ＩＩ（ａ）の立体異性体生成物への酸化を触媒することができる。
【０３９２】
【化５０】
2011525533.tif 000054
式中、各Ａ、ＭおよびＭ’は、上述の通りである。
【０３９３】
特定の実施形態において、本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼは、以下の化合物（１）である基質（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンの化合物（２）である立体異性体生成物（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンへの酸化を触媒することができる。
【０３９４】
【化５１】
2011525533.tif 000055
【０３９５】
基質である化合物（１）を生成物である化合物（２）に酸化するこの方法のいくつかの実施形態において、モノアミンオキシダーゼポリペプチドは、配列番号２の野生型Ａ．ニガー配列と比較して、少なくとも次のアミノ酸置換を有さなければならない：（１）残基４６５がグリシンであり、（２）残基２８９がバリンであり、（３）残基３８４がグルタミンであり、（４）残基３８２がロイシンである。
【０３９６】
他の特定の実施形態において、本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼは、以下の化合物（３）である基質（３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの、さらに二量体化を受けて化合物（５）を形成することができる化合物（４）である立体異性体生成物（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールへの酸化を触媒する。
【０３９７】
【化５２】
2011525533.tif 000056
【０３９８】
基質である化合物（３）を生成物である化合物（４）に酸化するこの方法の一実施形態において、モノアミンオキシダーゼポリペプチドは、配列番号１の野生型Ａ．ニガー配列と比較して、次のアミノ酸置換の少なくとも１つを有さなければならない：（１）残基４６５がグリシンであり、（２）残基２８９がバリンであり、（３）残基３８４がグルタミンであり、（４）残基３６５がトリプトファンである。基質である化合物（３）を生成物である化合物（４）に還元するこの方法の他の実施形態において、モノアミンオキシダーゼポリペプチドは、配列番号１の野生型Ａ．ニガー配列と比較して、次のアミノ酸置換の少なくとも２つを有さなければならない：（１）残基４６５がグリシンであり、（２）残基２８９がバリンであり、（３）残基３８４がグルタミンであり、（４）残基３６５がトリプトファンであり、（３）残基９９がグルタミン酸である。他の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、配列番号１の野生型Ａ．ニガー配列と比較して、次のアミノ酸置換の少なくとも３つを有さなければならない：（１）残基４６５がグリシンであり、（２）残基２８９がバリンであり、（３）残基３８４がグルタミンであり、（４）残基３６５がトリプトファンであり、（５）残基９９がグルタミン酸であり、（４）残基１３５がグルタミンである。さらなる実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、配列番号１の野生型Ａ．ニガー配列と比較して、少なくとも次のアミノ酸置換を有さなければならない：（１）残基４６５がグリシンであり、（２）残基２８９がバリンであり、（３）残基９９がグルタミン酸であり、（４）残基１３５がグルタミンであるおよび／または残基２４８がアスパラギン酸である。
【０３９９】
基質を生成物に酸化するこの方法の一実施形態において、基質は、約９９％を超える立体異性体過剰率の生成物に酸化され、モノアミンオキシダーゼは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に対応する配列を含む。
【０４００】
基質を生成物に還元するこの方法の他の実施形態において、約２５ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満のポリペプチドを用いて行う場合、基質の少なくも約５０％が約２４時間未満で生成物に変換され、ポリペプチドは配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に対応するアミノ酸配列を含む。
【０４０１】
他の実施形態において、本明細書に記載したモノアミンオキシダーゼのいずれか１つは、ウイルス感染の治療に有用なプロテアーゼ阻害剤であるＳｃｈｅｒｉｎｇ５０５０３４（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−１−シクロブチル−３，４−ジオキソブタン−２−イル）−３−（（Ｓ）−２−（３−ｔｅｒｔ−ブチルウレイド）−３，３−ジメチルブタノイル）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボキサミド））（Ｍａｌｃｏｌｍら（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０（３）：１０１３−２０頁）の合成の中間体の製造に用いることができる。Ｓｃｈｅｒｉｎｇ５０５０３４の合成における重要な段階は、構造式Ｉの化合物の構造式ＩＩの化合物への、またはより具体的には化合物（１）の化合物（２）への変換である。したがって、本開示は、本開示のモノアミンオキシダーゼポリペプチドを用いて化合物（１）を化合物（２）に変換する段階を含む、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ５０５０３４の製造の方法を提供する。Ｓｃｈｅｒｉｎｇ５０５０３４の製造のための本明細書で開示した方法は、上のスキーム３、４、５、６、８、９、１０、１２および１４に関して示し、述べた段階の１つ以上も含み得る。
【０４０２】
他の実施形態において、本明細書に記載したモノアミンオキシダーゼのいずれか１つは、ウイルス感染の治療に有用なプロテアーゼ阻害剤であるＶＸ−９５０（（Ｎ−（（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−（（Ｓ）−１−（（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−１−（（Ｒ）−３−（２−（シクロプロピルアミノ）−２−オキソアセチル）ヘキサノイル）ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−２（１Ｈ）−イル）−３，３−ジメチル−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−２−オキソエチル）ピラジン−２−カルボキサミド（Ｐｅｒｎｉら（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０（３）：８９９−９０９頁）の合成の中間体の製造に用いることができる。ＶＸ−９５０の合成における重要な段階は、構造式Ｉの化合物の構造式ＩＩの化合物への、またはより具体的には化合物（３）の化合物（４）への変換である。したがって、本開示は、本開示のモノアミンオキシダーゼポリペプチドを用いて化合物（３）を化合物（４）に変換する段階を含む、ＶＸ−９５０の製造の方法を提供する。ＶＸ−９５０の製造のための本明細書で開示した方法は、上のスキーム３、４、５、６、７、９、１０、１１および１３に関して示し、述べた段階の１つ以上も含み得る。
【０４０３】
当業者により公知であるように、モノアミンオキシダーゼ触媒オキシダーゼ反応は、一般的に補因子を必要とする。本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼにより触媒される酸化反応も一般的に補因子であるフラビン−アデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）を必要とする。本明細書で用いているように、「補因子」という用語は、モノアミンオキシダーゼと共同して作用する非タンパク質化合物を意味する。一般的に、モノアミンオキシダーゼに非共有結合または共有結合で結合することができる、酸化型の補因子を反応混合物に加える。酸化型ＦＡＤは、還元型ＦＡＤ−Ｈ２から分子状酸素により再生成させることができる。他の実施形態において、酸化型ＦＡＤは、ＦＡＤおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを得るようにＮＡＤ（Ｐ）により再生成させることができた。ＮＡＤ（Ｐ）は、次に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ケトンレダクターゼを用いてケトンのアルコールへの還元によって再生成させることができた。
【０４０４】
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼ触媒酸化反応は、一般的に溶媒中で行う。適切な溶媒は、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）およびイオン性液体（例えば、テトラヒドロホウ酸１−エチル４−メチルイミダゾリウム、テトラヒドロホウ酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、ヘキサフルオロリン酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムなど）などである。いくつかの実施形態において、水および水性共溶媒系を含む水性溶媒を用いる。
【０４０５】
具体例としての水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を有する。一般的に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがモノアミンオキシダーゼ酵素を完全に不活性化しないようなものを選択する。適切な共溶媒系は、本明細書で述べたものなどの酵素活性アッセイを用いて、候補溶媒系中で問題とする定義された基質を用いて特定の操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素の酵素活性を測定することによって容易に特定することができる。
【０４０６】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性を有し、単一液相をもたらすものであってよく、または水性成分と部分的に混和性を有しまたは非混和性を有し、２つの液相をもたらすものであってよい。一般的に、水性共溶媒系を用いる場合、水が有機溶媒中に分散するまたはその逆である、二相性であることを選択する。一般的に、水性共溶媒系を用いる場合、水相から容易に分離することができる有機溶媒を選択することが望ましい。一般的に、共溶媒系における水と有機溶媒との比は、一般的に約９０：１０から約１０：９０（容積／容積）までの有機溶媒対水および８０：２０から２０：８０（容積／容積）までの有機溶媒対水の範囲にある。共溶媒系は、反応混合物に加える前にあらかじめ形成させてよく、または反応容器中でインサイツで形成させてよい。
【０４０７】
水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝性または非緩衝性であってよい。一般的に、酸化は、約１０以下、通常約５から約１０の範囲内のｐＨで行うことができる。いくつかの実施形態において、酸化は、約９以下、通常約５から約９の範囲内のｐＨで行う。いくつかの実施形態において、酸化は、約８以下、しばしば約５から約８の範囲内、通常約６から約８の範囲内のｐＨで行う。酸化は、約７．８以下または７．５以下のｐＨでも行うことができる。あるいは、酸化は、中性ｐＨ、すなわち、約７で行うことができる。
【０４０８】
酸化反応の過程中、反応混合物のｐＨは変化し得る。構造式Ｉの一般的なアミンは中性ｐＨおよびその近くではプロトン化されているが、構造式ＩＩのイミン生成物は中性ｐＨおよびその近くでは一般的にプロトン化されていない。したがって、反応を中性ｐＨまたはその近くで行う一般的実施形態において、プロトン化アミンの非プロトン化イミンへの酸化により、プロトンが水溶液中に放出される。反応混合物のｐＨは、反応の過程において塩基を加えることによって所望のｐＨにまたは所望のｐＨ範囲内に維持することができる。あるいは、ｐＨは、緩衝剤を含む水性溶媒を用いることによって制御することができる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝剤は、当技術分野で公知であり、例えば、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤などである。緩衝または塩基添加の組合せも用いることができる。
【０４０９】
酸の中和用の適切な塩基は、有機塩基、例えば、アミン、アルコキシドなどならびに無機塩基、例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＰＯ４）などである。反応の過程にわたってアミンのイミンへの酸化により放出されるプロトンを中和するための好ましい塩基は、アミン基質自体である。変換の過程と同時の塩基の添加は、反応混合物のｐＨをモニターしながら手作業で、またはより好都合には自動滴定装置をｐＨスタットとして用いることにより、行うことができる。部分的緩衝能と塩基添加の組合せも過程の制御に用いることができる。一般的に、酸化の過程にわたり非緩衝または部分的緩衝反応混合物に添加される塩基は、水溶液中に添加する。
【０４１０】
本明細書で述べた立体選択的酸化反応を行うに際して、操作改変モノアミンオキシダーゼは、精製酵素、モノアミンオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換した全細胞および／または細胞抽出物および／またはこのような細胞の溶解物の形で反応混合物に加えることができる。操作改変モノアミンオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換した全細胞または細胞抽出物および／またはこの溶解物は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）または半固体（例えば、粗ペースト）などの種々の異なる形で用いることができる。
【０４１１】
細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）に続く凍結乾燥前の脱塩処置（例えば、限外ろ過、透析など）によって部分的に精製することができる。細胞調製物のいずれかは、例えば、グルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤を用いた架橋または固相（例えば、ＥｕｐｅｒｇｉｔＣなど）への固定化により安定化することができる。
【０４１２】
固体反応物（例えば、酵素、塩等）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、乳濁液、懸濁液などの種々の異なる形で反応に供給することができる。反応物は、当業者に公知である方法および装置を用いて容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液は、少しずつ−８０℃で凍結し、次に予冷された凍結乾燥チャンバーに加えた後、真空をかけることができる。試料からの水の除去の後に、真空の解除および凍結乾燥試料の回収の前に温度を一般的に２時間にわたり４℃に上昇させる。
【０４１３】
酸化反応に用いられる反応物の量は、所望の生成物の量および同時に用いられるモノアミンオキシダーゼ基質の量によって一般的に異なる。一般的に、基質は、約５０ｍｇ／リットルから約５ｇ／リットルのモノアミンオキシダーゼを用いて約５ｇ／リットルから５０ｇ／リットルの濃度で用いることができる。当業者は、所望の生産性のレベルおよび生産の規模に合うようにこれらの量をどのようにして変化させるかを容易に理解する。カタラーゼ、消泡剤および重亜硫酸ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの場合による物質の適切な量は、常用の実験によって容易に決定することができる。
【０４１４】
反応物を加える順序は重要ではない。反応物は、同時に一緒に溶媒（例えば、単相性溶媒、二相性水性共溶媒系など）に加えることができ、あるいは、反応物の一部を別個に加え、一部を異なる時点に一緒に加えることができる。特定の実施形態において、反応物の成分の１つ以上は、モノアミンオキシダーゼの基質および／または生成物阻害を最小限にするまたは未然に防ぐレベルで反応に連続的に加える（「供給する」）ことができる。特定の実施形態において、モノアミンオキシダーゼは、反応の過程にわたって間隔をおいて、例えば約１時間ごとに、約２時間ごとに、約３時間ごとに、または約４時間ごとに加えることができる。
【０４１５】
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼ触媒酸化反応を行う適切な条件は、操作改変モノアミンオキシダーゼと基質を実験的ｐＨおよび温度で接触させ、例えば本明細書に示す実施例で述べた方法を用いて生成物を検出することを含むが、これに限定されない常用の実験により容易に最適化することができる様々な条件を含む。
【０４１６】
モノアミンオキシダーゼ触媒酸化は、約５℃から約７５℃まで範囲の温度で一般的に行う。いくつかの実施形態において、反応は、約２０℃から約５５℃まで範囲の温度で行う。さらに他の実施形態において、反応は、約２０℃から約４５℃まで、約３０℃から約４５℃まで、または約４０℃から約４５℃までの範囲の温度で行う。反応はまた、周囲条件下（約２１℃）で行うことができる。
【０４１７】
酸化反応は、一般的に、基質の本質的に完全またはほぼ完全な酸化が得られるまで、進行させる。基質の生成物への酸化は、公知の方法を用いて基質および／または生成物を検出することによってモニターすることができる。適切な方法は、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどである。変換収率は、一般的に約５０％を超え、約６０％を超える可能性もあり、約７０％を超える可能性もあり、約８０％を超える可能性もあり、９０％を超える可能性もあり、しばしば約９７％を超える。
【０４１８】
６．  実施例
本開示の様々な特徴および実施形態は、例示するものであって、限定するものではない、以下の代表的な実施例で例示する。
【実施例１】
【０４１９】
野生型モノアミンオキシダーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
モノアミンオキシダーゼコード化遺伝子は、参照により本明細書に組み込む、米国仮出願第６０／８４８，９５０号の実施例１に記載されたモノアミンオキシダーゼの報告されたアミノ酸配列およびコドン最適化アルゴリズムに基づいてＥ．コリ（Ｗ３１１０ｆｈｕＡまたはＵＭ２）における発現のためにデザインした。遺伝子は、例えば、４２ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを用いて合成し、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号における図３に示されている）にクローニングした。該発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含む。得られたプラスミドを標準的方法を用いてＥ．コリＷ３１１０中に形質転換した。コドン最適化遺伝子の例およびコード化ポリペプチドも表４に示す。野生型モノアミンオキシダーゼの活性は、Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕら、「Ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５３：１６９  ７４頁）およびＳｚｕｔｏｗｉｃｚら（Ｓｚｕｔｏｗｉｃｚら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ２，２’  Ａｚｉｎｏ（３  ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈａｉｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）ａｓ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ」、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：８６−９４頁）により開示されたものを含む、当技術分野で公知の方法またはその変法を用いて確認した。酵素活性の比較は、本明細書で詳細にさらに述べたように、または例えば、ＺｈｏｕおよびＳｚｕｔｏｗｉｃｚの方法を用いて、酵素の定義された調製物、設定条件下での定義されたアッセイおよび１つ以上の定義された基質を用いて行った。一般的に、溶解物を比較する場合、宿主細胞により産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するのみならず、アッセイに供した細胞の数およびタンパク質の量も決定した。
【０４２０】
【表４】
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【０４２１】
本開示の操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを、Ｅ．コリＷ３１１０における発現のためにベクターｐＣＫ１１０９００に同様にクローニングする。
【実施例２】
【０４２２】
モノアミンオキシダーゼ粉末の製造；振とうフラスコ法
モノアミンオキシダーゼ粉末は、次のように振とうフラスコ培養から製造した：目的とするモノアミンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを含むＥ．コリの単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む５０ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロス中に接種する。恒温槽中で２５０ｒｐｍで振とうしながら細胞を３０℃で一夜（少なくとも１６時間）増殖させる。培養は、１リットルフラスコ中で２５０ｍｌの２ＸＹＴ（１６ｇ／ｌバクト−トリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中に０．２の６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）まで希釈し、３０℃で増殖させる。培養のＯＤ６００が０．６から０．８であるときにモノアミンオキシダーゼ遺伝子の発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導し、一夜（少なくとも１６時間）温置する。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）により収集し、上清を捨てる。細胞ペレットを等容積の冷（４℃）１００ｍＭトリエタノールアミン（塩酸塩）緩衝液、ｐＨ７．０（場合によって２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）を用いて再懸濁し、上のように遠心分離により収集する。洗浄済み細胞を２容積の冷トリエタノールアミン（塩酸塩）緩衝液、ｐＨ７．０に再懸濁し、温度を４℃に維持しながらＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに１２０００ｐｓｉで２回通す。細胞デブリを遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）により除去する。透明な溶解物上清を収集し、−２０℃で保存する。凍結透明溶解物の凍結乾燥によって、粗モノアミンオキシダーゼ酵素の乾燥粉末が得られる。
【実施例３】
【０４２３】
モノアミンオキシダーゼの製造；発酵法
モノアミンオキシダーゼ粉末は、次のように発酵により製造した：曝気撹拌１５Ｌ発酵槽中で、０．８８ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母エキス、０．０８３ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムならびに２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅七水和物、０．１ｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム四水和物および０．０２ｇ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム十水和物を含む８．３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を含む６．０Ｌの増殖培地を３０℃の温度にする。発酵槽に目的とするモノアミンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを含むＥ．コリＷ３１１０の後期指数培養を接種し、実施例３で述べたように振とうフラスコ中で０．５の開始ＯＤ６００から２．０に増殖させる。発酵槽を５００  １５００ｒｐｍで撹拌し、溶存酸素レベルを３０％以上の飽和度に維持するために空気を１．０−１５．０Ｌ／分で発酵容器に供給する。培養のｐＨは、２０容積／容積％水酸化アンモニウムの添加により７．０に制御する。培養の増殖は、５００ｇ／Ｌセレロース（ｃｅｒｅｌｏｓｅ）、１２ｇ／Ｌ塩化アンモニウムおよび１０．４ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物を含む供給溶液を加えることにより維持する。培養が５０のＯＤ６００に達したならば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることにより、モノアミンオキシダーゼの発現を誘導する。次いで、培養をさらに１４時間増殖させる。収集するまで培養を４℃に冷却し、４℃に維持する。Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機で４℃で、５０００Ｇで４０分間遠心分離することにより、細胞を収集する。収集した細胞は、次の下流回収工程に直接用いるまたはこのような使用まで４℃で保存する。
【０４２４】
細胞を下流回収工程に直接用いなければならない場合、細胞ペレットを、湿潤細胞ペーストの各容積に対して２容積の４℃の１００ｍＭトリエタノールアミン（塩酸塩）緩衝液、ｐＨ６．８に再懸濁する。２段階ホモジナイジングバルブアセンブリを取り付けたホモジナイザーに懸濁液を１２０００ｐｓｉｇの圧力を用いて通すことによって、細胞内モノアミンオキシダーゼを細胞から放出させる。破壊直後に細胞ホモジネートを４℃に冷却する。１０重量／容積％ポリエチレンイミンの溶液、ｐＨ７．２を溶解物に０．５重量／容積％の最終濃度まで加え、３０分間撹拌する。得られた懸濁液を標準的実験室用遠心分離機で５０００Ｇで３０分間遠心分離することにより清澄化する。透明な上清をデカントし、３０Ｋｄの分子量カットオフを有するセルロース限外ろ過膜を用いて１０倍濃縮する。最終濃縮物を浅い容器中に分注し、−２０℃で凍結し、粉末に凍結乾燥する。このモノアミンオキシダーゼ粉末は、−８０℃で保存する。
【実施例４】
【０４２５】
６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））の（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（化合物（２））への変換の分析方法
６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンの変換および６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン生成物の立体異性体純度を下で述べるキラルＧＣ法により決定した。溶出の順序は次の通りであった：基質（１）（保持時間約７分）、所望の（１Ｒ，２Ｓ）−イミン（２）（約１０．６分）、望ましくない（１Ｒ，２Ｓ）イミン（約１１．０分）；カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｂｅｔａｄｅｘ２２５（部品番号２４３４８）、．２５ｍｍ×３０ｍ×．２５ｕｍ；オーブン温度：８５℃等温；キャリヤー流量：１．１ｍｌ／分；注入量：４μＬ；注入スプリット：１００：１；注入部温度＝２００℃；ＦＩＤ検出。
【実施例５】
【０４２６】
オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））の（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（４））への変換の分析方法
オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの変換および生成物の立体異性体純度を下で述べるキラルＧＣ法により決定した。溶出の順序は次の通りであった：基質（３）（保持時間約２．７分）、所望の（３ａＳ，６ａＲ）イミン（４）（約５．５分）、望ましくない（３ａＲ，６ａＳ）−イミン（約５．８分）。イミン（４）のイミン二量体は、注入部口においてイミンに熱分解する。カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｂｅｔａｄｅｘ２２５（部品番号２４３４８）、．２５ｍｍ×３０ｍ×．２５ｕｍ；オーブン温度：１２０℃等温；キャリヤー流量：１．１ｍｌ／分；注入量：４μＬ；注入スプリット：１００：１；注入部温度＝２００℃；ＦＩＤ検出。
【実施例６】
【０４２７】
６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））の酸化に関する野生型モノアミンオキシダーゼの評価
本明細書で開示した野生型モノアミンオキシダーゼを、６，６ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））を６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（化合物（２））に酸化するそれらの能力についてスクリーニングした。空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ３．０リン酸カリウム緩衝液および３３０μＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。ｐＨを濃Ｈ３ＰＯ４により約７．３に調整した。ｐＨ調整済み溶液に６０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中１５０ｍｇの配列番号２（Ａ．ニガー）または配列番号３２（Ａ．オリザ）を有する野生型モノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２の振とうフラスコ法により調製した）を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌した。ｐＨは、１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．２に維持した。（アミン反応物は中性ｐＨにおいてプロトン化されており、イミン生成物はプロトン化されない。この作用により、ｐＨを維持するために中和されなければならないプロトンが放出される。）
【０４２８】
ｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせ、相分離のために遠心分離を用いて混合物をＣＤＣｌ３で抽出した。Ａ．ニガー野生型モノアミンオキシダーゼを用いた反応からのＣＤＣｌ３溶液の１Ｈ−ＮＭＲ分析で、アミン（１）のイミン（２）への約２０％の変換が示された。Ａ．オリザ野生型モノアミンオキシダーゼを用いた反応は、Ａ．ニガー野生型モノアミンオキシダーゼを用いた反応の約２倍の量のＮａＯＨ溶液を消費したことから、約２倍量のアミン（１）が変換されたことがわかった。
【０４２９】
実施例４の方法によるキラルＧＣ分析により、所望の（１Ｒ，５Ｓ）−イミン（２）が示された。望ましくない（１Ｓ，５Ｒ）−イミン鏡像異性体は検出されなかった。
【０４３０】
この実施例は、これらの野生型モノアミンオキシダーゼが６，６ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））に対して低い活性を有し、それを所望の（１Ｒ，５Ｓ）−イミン（２）に変換させることを示している。
【実施例７】
【０４３１】
オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））の酸化に関する野生型モノアミンオキシダーゼの評価
本明細書で開示した野生型モノアミンオキシダーゼを、（オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））を（３ａＳ，６ａＲ）１，３ａ，４，５，６，６ａヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール）（化合物（４））に酸化するそれらの能力についてスクリーニングした。空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液および３７５ｍｇのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩を加え、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを約７．３に調整した。ｐＨ調整済み溶液に６０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中１５０ｍｇの配列番号２（Ａ．ニガー）を有する野生型モノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２の振とうフラスコ法により調製した）を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌した。ｐＨは、１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．２に維持した。２４時間後にＮａＯＨ消費はほとんどまたは全く認められなかった。ｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせ、混合物をＣＤＣｌ３で抽出した。遠心分離（５分間６０００ｒｐｍ）により相分離した後、ＣＤＣｌ３溶液の１Ｈ−ＮＭＲ分析で、アミン（３）のイミン（４）への変換はほとんどまたは全く示されなかった。
【０４３２】
この実施例は、野生型モノアミンオキシゲナーゼが、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））に対するたとえあったとしても非常にわずかな活性を有することを示している。
【実施例８】
【０４３３】
６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（化合物（１））に対するモノアミンオキシダーゼ活性の高処理能力アッセイ
定向進化により得られ、進化モノアミンオキシゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドライブラリーをＥ．コリ中に形質転換し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上で平板培養する。３０℃で少なくとも１６時間温置した後、Ｑ−ｂｏｔ（商標）ロボットコロニー採取装置（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）を用いてコロニーを採取し、１８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）、１％グルコース、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む９６ウエルシャローウエルマイクロタイタープレート中に入れる。２００ｒｐｍで振とうしながら細胞を３０℃で一夜増殖させる。次いで、この培養の２０μＬを、３５０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４および３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含む９６ディープウエルプレート中に移す。２５０ｒｐｍで振とうしながらディープウエルプレートを３０℃で２．５から３時間温置した後（ＯＤ６００  ０．６−０．８）、イソプロピルβＤチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることにより、細胞培養による組換え遺伝子発現を誘導する。次いで、プレートを２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１５−２３時間温置する。
【０４３４】
細胞を遠心分離によりペレットにし、４００μＬの溶解緩衝液に再懸濁し、室温で少なくとも２時間振とうすることによって溶解した。溶解緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１ｍｇ／ｍＬリゾチームおよび５００μｇ／ｍＬ硫酸ポリミキシンＢを含んでいた。細胞デブリを遠心分離によりペレットにした。
【０４３５】
モノアミンオキシダーゼ活性は、２０μＬの適切に希釈された透明溶解物上清を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、４Ｕ／ｍｌ  Ａ．ニガーカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ｃ３５１５）および４０ｍＭ６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（この酢酸塩として供給された）を含む１８０μＬのアッセイ混合物を含む９６ディープウエルマイクロタイタープレートのウエルに移すことによって測定した。アッセイプレートを密封し、室温で４時間振とうした。５００μＬの１：１アセトニトリル：水を加えて反応をクエンチさせ、プレートを遠心分離した。遠心分離した後、実施例４による方法によるＨＰＬＣ分析のために１５０μＬの上清をシャロープレートに移した。
【０４３６】
ＨＰＬＣ条件：０．５ｍＬ／分の６０：４０  ４０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリルの移動相を用いた４０℃の２．１×７５ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ−１８  ３．５ミクロン粒子径カラム。イミンは、約１分（２５４ｎｍ）に溶出した。イミンのみを検出することができ、変異体の活性順位付けをイミンシグナルの絶対ピーク面積を用いて行った。
【０４３７】
あるいは、１００μＬの１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてアッセイ反応をクエンチさせ、１：１容積／容積ＭＴＢＥで抽出し、実施例４の方法によるキラルＧＣ分析にかけた。
【実施例９】
【０４３８】
オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））に対するモノアミンオキシダーゼ活性の高処理能力アッセイ
９６ウエルプレート上のモノアミンオキシダーゼ変異体を含む溶解物を実施例８で述べたように調製した。
【０４３９】
モノアミンオキシダーゼ活性は、５０μＬの透明溶解物を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、４Ｕ／ｍｌ  Ａ．ニガーカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ｃ３５１５）および５０ｍＭオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールを含む４５０μＬのアッセイ混合物を含む９６ディープウエルマイクロタイタープレートのウエルに移すことによって測定した。アッセイプレートを密封し、室温で１６時間振とうした。プレートを遠心分離し、実施例５によるＨＰＬＣ分析のために１００μＬの上清をシャローウエルプレートのウエル中の１００μＬのアセトニトリル中でクエンチさせた。
【０４４０】
１００μＬのアセトニトリルを加えることにより反応をクエンチさせ、プレートを遠心分離した。遠心分離した後、実施例４による方法によるＨＰＬＣ分析のために１００μＬの上清を１００μＬのアセトニトリルに加え、シャロープレートに移した。
【０４４１】
ＨＰＬＣ条件：０．５ｍＬ／分の７０：３０  ４０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリルの移動相を用いた４０℃の２．１×７５ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ−１８  ３．５ミクロン粒子径カラム。イミンは、約１．３分（２５４ｎｍ）に溶出した。イミンのみを検出することができ、変異体の順位付けをイミンシグナルの絶対ピーク面積を用いて行った。
【０４４２】
あるいは、１００μＬの１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてアッセイ反応をクエンチさせ、１：１容積／容積ＭＴＢＥで抽出し、実施例５のキラルＧＣ分析にかけた。
【０４４３】
この実施例は、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））の酸化について改善されたモノアミンオキシダーゼ変異体を同定するために用いられた方法を記載している。
【実施例１０】
【０４４４】
（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（化合物（２））の調製規模製造
３００ｒｐｍのオーバーヘッド撹拌機を取り付けた５００ｍＬ４頚フラスコに約２５℃の１５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１．２ｍＬ（約１．０ｇ；約９ｍモル）の６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが１１．８の均一溶液を得た。ｐＨが７．５に達するまでＮａ２Ｓ２Ｏ５を少しずつ加えた。無色溶液に３００μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）および６００μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）を加えて、ｐＨ７．５の無色溶液を得た。この溶液に配列番号１０を有する１．５ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３による発酵により製造）を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブを挿入したところ（空気流量約６０ｍＬ／分）、反応混合物のｐＨは直ちに低下し始めた。２Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御投与によりｐＨを維持した。約３０分後に、ｐＨは安定な状態のままであり、さらなる塩基の投与は行われなかった。さらに１０分（合計４０分）後に、１２０ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンＮａＨＳＯ３溶液（２０．８ｇの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを１５０ｍＬのｄＨ２Ｏに加え、ｐＨ７．２に達するのに十分なＮａ２Ｓ２Ｏ５を加えることによって調製した）を反応物に０．２５ｍＬ／分の速度で加えた。反応混合物のｐＨは直ちに低下し始め、２Ｎ  ＮａＯＨの投与が再開された。約８時間（９時間の合計反応時間）後に６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンおよびＮａＨＳＯ３の溶液の添加を完了した。塩基の添加を続け、基質の添加を完了した後に塩基の添加速度を増加させた。２００μＬの分割試料を採取し、２００μＬの８Ｎ  ＮａＯＨでクエンチし（アミノスルホネートを破壊して遊離イミンを得るため）、６００μＬのＣＤＣｌ３で抽出した。ＣＤＣｌ３抽出物の１Ｈ−ＮＭＲ分析により、基質（１）のアザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン化合物（２）への完全な変換が示された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）スペクトル：δ７．４２（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝Ｃ−Ｈ）、３．８１（ｄｄ；Ｊ＝６．１，１７．８；１Ｈ）、３．５０（ｄｄ；Ｊ＝２．１，１７．８；１Ｈ）、２．０６（ｍ；１Ｈ）、１．６２（ｍ，１Ｈ）、１．０３（ｓ，３）、０．８０（ｓ，３Ｈ））。
【０４４５】
キラルＧＣ分析により、（１Ｒ，５Ｓ）鏡像異性体（２）が示され、（１Ｓ，２Ｒ）鏡像異性体は検出できなかった。
【０４４６】
反応混合物は、アミノニトリルへのシアン化反応のために「そのままで」用いた。
【実施例１１】
【０４４７】
空気の静的ブランケットのもとでの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（１）の（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（２）へのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化
空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ３．０リン酸カリウム緩衝液および３３０μＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。濃Ｈ３ＰＯ４を用いてｐＨを約７．５に調整した。ｐＨ調整済み溶液に、６０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号４、６または８を有する１５０ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２による方法により調製）を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌した。ｐＨは、１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．４に維持した。次いで、ｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせた。混合物の試料をＣＤＣｌ３で抽出した。遠心分離（６０００ｒｐｍで５分間）による相分離後に、１Ｈ−ＮＭＲ分析により、アミン（１）のイミン（２）への少なくとも９５％の変換が示された。実施例４によるキラルＧＣ分析により、（１Ｒ，５Ｓ）−イミン鏡像異性体（２）が示された。（１Ｓ，２Ｒ）鏡像異性体は検出されなかった。
【実施例１２】
【０４４８】
酸素のブランケットのもとでの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（１）の（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エン（２）へのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化
空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ３．０リン酸カリウム緩衝液および３３０μＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。濃Ｈ３ＰＯ４を用いてｐＨを約７．５に調整した。ｐＨ調整済み溶液に、６０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号４、６または８の１５０ｍｇのポリペプチドのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２による方法により調製）を加えた。ヘッドスペースを酸素流でフラッシュし、得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌した。ｐＨは、１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．２に維持した。次いで、ｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせた。混合物の試料をＣＤＣｌ３で抽出した。遠心分離（６０００ｒｐｍで５分間）による相分離後に、１Ｈ−ＮＭＲ分析により、アミン（１）のイミン（２）への少なくとも９５％の変換が示された。実施例４によるキラルＧＣ分析により、（１Ｒ，５Ｓ）−イミン鏡像異性体（２）が示された。（１Ｓ，２Ｒ）鏡像異性体は検出されなかった。
【実施例１３】
【０４４９】
重亜硫酸塩の存在下での空気スパージングを用いた６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン（１）の（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンへのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化
１００ｍＬフラスコに４０ｍＬのｄＨ２Ｏおよび１．８ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが約１１．４の均一な溶液を得た。この溶液に２．７ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ５を加えて、均一な溶液とし、約１ｍＬの８Ｎ  ＮａＯＨを加えることによりｐＨを約７．５に調整した。この溶液に６０μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）、１２０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）および１０ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号８のポリペプチドの３００ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２による方法により調製）を加えた。空気をフリットガラスを通して反応混合物中にスパージングし、得られた淡黄色溶液を空気スパージングにより２４時間室温（約２１℃）で２４時間撹拌した。ｐＨは、１μＬずつの２．５Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．４に維持した。反応をクエンチさせ、イミン−重亜硫酸付加体（アミノスルホネート）をｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで破壊して遊離イミンを得て、生成物をＭＴＢＥ中への抽出により抽出分離した。相分離の後、蒸留により（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンは８６％の収率で分離された。ＣＤＣｌ３中１Ｈ−ＮＭＲによる分析（実施例１０と同様の）により、化合物（１）のイミン化合物（２）への変換が確認された。実施例４の方法によるキラルＧＣ分析により、（１Ｒ，５Ｓ）−イミン鏡像異性体（２）が示された。（１Ｓ，２Ｒ）鏡像異性体は検出されなかった。
【０４５０】
このようにして得られた（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンをＤ２Ｏ中１．０当量のＮａＨＳＯ３で処理した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、重亜硫酸付加体への定量的な変換が示された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）スペクトル：δ４．８（ｄ，Ｊ＝１，１Ｈ（ＮＣ（Ｈ）ＳＯ３；主要ジアステレオマー）、４．５（ｄ，Ｊ＝５，１Ｈ（ＮＣ（Ｈ）ＳＯ３；微量ジアステレオマー）、３．４−３．６（ｍ，２Ｈ；微量ジアステレオマー）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝３，１０，１Ｈ；主要ジアステレオマー）、３．０５（ｄｄ，１Ｈ；Ｊ＝１，１０；主要ジアステレオマー）、１．６５（ｍ，１Ｈ；主要および微量ジアステレオマー）、１．５５（ｍ，１Ｈ；主要および微量ジアステレオマー）、１．２２（ｓ，３Ｈ；微量ジアステレオマー）、１．１５（ｓ，３Ｈ；微量ジアステレオマー）、１．１０（ｓ，３Ｈ；主要ジアステレオマー）、１．００（ｓ，３Ｈ；微量ジアステレオマー）。
【実施例１４】
【０４５１】
空気スパージングならびに基質および重亜硫酸塩の同時添加を用いた６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンの（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンへのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化
３００ｒｐｍのオーバーヘッド撹拌機を取り付けた室温（約２１℃）の５００ｍＬ４頚フラスコに１５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１．２ｍＬ（約１．０ｇ；約９ｍモル）の６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが１１．８の均一溶液を得た。ｐＨが７．５に達するまでＮａ２Ｓ２Ｏ５を少しずつ加えた。無色溶液に３００μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）および６００μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）を加えて、ｐＨ７．５の無色溶液を得た。この溶液に配列番号８のポリペプチドの１．５ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３により調製）を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブを挿入し、空気を反応物中に約６０ｍＬ／分の速度でスパージングしたところ、反応混合物のｐＨは直ちに低下し始めたことが認められた。２Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加によりｐＨを維持した。約３０分後に、ｐＨは安定な状態のままであったので、さらなる塩基の添加は行わなかった。さらに１０分（合計４０分）後に、１２０ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン／ＮａＨＳＯ３溶液（２０．８ｇの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンと１５０ｍＬのｄＨ２ＯおよびｐＨ７．２に達するのに十分なＮａ２Ｓ２Ｏ５）を反応混合物に０．２５ｍＬ／分の速度で加えた。反応混合物のｐＨが直ちに低下し始め、２Ｎ  ＮａＯＨの添加が再開された。約８時間（９時間の合計反応時間）後に６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン／ＮａＨＳＯ３の添加を完了した。塩基の添加を続け、基質添加を完了した後に塩基の添加速度を増加させた。ｐＨを約１４に至らせる（およびイミン−重亜硫酸付加体を破壊する）１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせ、混合物をＭＴＢＥで抽出した。相分離後、ＭＴＢＥ溶液の蒸留により（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−２−エンが７２％の収率で分離された。ＣＤＣｌ３中１Ｈ−ＮＭＲ分析（実施例１０と同様に）により、化合物（１）のイミン化合物（２）への変換が確認された。実施例４の方法によるキラルＧＣ分析により、（１Ｒ，５Ｓ）−イミン鏡像異性体（２）が示された。（１Ｓ，２Ｒ）鏡像異性体は検出されなかった。
【実施例１５】
【０４５２】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製（静的基質モード）
１００ｍＬフラスコに４０ｍＬのｄＨ２Ｏおよび１．８ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが約１１．４の均一溶液を得た。この溶液に２．７ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ５を加えて、均一溶液とし、約１ｍＬの８Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを約７．５に調整した。この溶液に６０μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）、１２０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）および１０ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号８のポリペプチドの３００ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２による方法により調製）を加えた。空気をフリットガラスを通して反応混合物中に約１０ｍＬ／分の速度でスパージングし、得られた淡黄色溶液を空気中で２４時間室温（約２１℃）で２４時間撹拌した。終始、ｐＨを１μＬずつの２．５Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により７．４に維持した。２４時間後に、１．０ｇ（１．３当量）のＮａＣＮを（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−スルホネートを次いで含む反応混合物に加えた。室温（約２１℃）でさらに１５分間撹拌した後、混合物をＭＴＢＥで抽出した。（２−Ｍｅ−ＴＨＦも抽出に用いることができる。）相分離および溶媒除去後に、１．７８ｇ（収率９０％）の（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルが淡黄色固体として分離された。ＣＤＣｌ３中１Ｈ−ＮＭＲによる分析により、（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製が確認された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）スペクトル：δ３．９２（ｄ，Ｊ＝１．２，１Ｈ，ＮＣ（Ｈ）（ＣＮ））、３．２５（ｍ，１Ｈ）、２．９６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，１７．０）、１．４８（ｄｄ；Ｊ＝１，２，１２．２；１Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ）、１．１３（ｓ，３Ｈ）、１．１１（Ｓ，３Ｈ））。
【０４５３】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−スルホネートを含む反応混合物をこのようにして生成させ、室温で３．０当量のＮａＣＮで１２時間処理したとき、約２５％の望ましくないシス立体異性体（１Ｒ，２Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルが所望のトランス（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）立体異性体とともに混合物中に認められた。ＣＤＣｌ３中１Ｈ−ＮＭＲにより、シス−アミノニトリルメチンプロトンが４．２２ｐｐｍにおける二重線（Ｊ＝４．２）として示された。
【実施例１６】
【０４５４】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製（連続基質添加モード）
段階１。オーバーヘッド撹拌機（３００ｒｐｍ）を取り付けた室温（約２１℃）の５００ｍＬ４頚フラスコに１５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１．２ｍＬ（約１．０ｇおよび９ｍモル）の６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが１１．８の均一溶液を得た。ｐＨが７．５に達するまでＮａ２Ｓ２Ｏ５を少しずつ加えた。無色溶液に３００μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）および６００μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）を加えて、ｐＨ７．５の無色溶液を得た。この溶液に配列番号１２を有する３００ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製）を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブ（約６０ｍＬ／分の空気流速）を挿入したところ、反応混合物のｐＨは直ちに低下し始めた。２Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加によりｐＨを維持した。約４０分後に、ｐＨは安定な状態のままであり、さらなる塩基の添加は行われなかった。さらに１０分（合計５０分）後に、１５０ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンＮａＨＳＯ３溶液（２６．１ｇの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンと１６０ｍＬのｄＨ２ＯおよびｐＨ７．２に達するのに十分なＮａ２Ｓ２Ｏ５）を反応混合物に０．１２ｍＬ／分の速度で加えた。反応混合物のｐＨは直ちに低下し始め、２Ｎ  ＮａＯＨの添加が再開された。約２１時間（約２２時間の合計反応時間）後に６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン／ＮａＨＳＯ３の添加を完了した。塩基の添加を基質添加を完了した後に高い速度で続けた。２４時間後に、１ＨＮＭＲ分析により反応が完結したと判断された。
【０４５５】
段階２。２４時間後に、１Ｈ−ＮＭＲ分析により反応が完結したと判断され、１０．０ｇのＮａＣＮ（１．１１当量）を反応混合物に加えて、ｐＨ９．９の乳白色反応混合物を得た。２４時間後に、１１ＨＮＭＲ分析により反応が完結したと判断された。３０分後に、反応物を３００ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。下の水相を排出し（約２５０ｍＬ）、上の有機層を６ｇ（直径２”×高さ１／４”）のＣｅｌｉｔｅ（商標）を通してろ過した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）を３００ｍＬのＭＴＢＥで洗浄し、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）の洗浄に用いたＭＴＢＥを用いて、水相を抽出した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で４０℃で１時間濃縮して、白色固体を得た。白色固体をさらに減圧下で３０分間乾燥して、２３．９ｇ（収率９５％）の（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルを得た。
【実施例１７】
【０４５６】
６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸メチルエステルの調製
実施例１６または１７に従って調製した（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルを、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００７／０７５７９０に記載された手順により対応する実質的に鏡像異性的に純粋な（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸メチルエステルに変換する。
【実施例１８】
【０４５７】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製、アミノニトリルのトランス／シス比に対するＮａＣＮ当量および反応時間の影響
手順は、配列番号８のモノアミンオキシダーゼ粉末を実施例３の方法により調製したことを除いて、ＮａＣＮの添加まで実施例１５のものと同一である。２４時間後、表５に示すようにＮａＣＮを反応混合物に少しずつ加えた（１．０当量のＮａＣＮは７２０ｍｇの９５％ＮａＣＮであった）。各規定の時間間隔の後、２００μＬの分割試料を採取し、１ｍＬのＣＤＣｌ３で抽出し、次いで１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。（（１Ｒ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの所望の２Ｓおよび望ましくない２Ｒエピマーの間の比）間のトランス／シス比をアミノニトリルメチンプロトン共鳴の１Ｈ−ＮＭＲ積分（トランス＝３．９２ｐｐｍにおける二重線；シス＝４．２２ｐｐｍにおける二重線）により決定した。
【０４５８】
【表５】
2011525533.tif 000058
【０４５９】
最終分割試料を採取した後、反応混合物を１００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、粗砂を通してろ過して、透明相分離物を得た。２０ｍＬのヘプタンを有機相に加えた。４０℃で１時間のロータリー真空蒸発により、有機相を蒸発乾固した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、トランス／シス比が１２：１のままであったことが示された。
【実施例１９】
【０４６０】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製：方法の頑健性
段階１。オーバーヘッド撹拌機（３００ｒｐｍ）を取り付けた室温（約２１℃）の５００ｍＬ４頚フラスコに１５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１．２ｍＬ（約１．０ｇおよび９ｍモル）の６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンを加えて、ｐＨが１１．８の均一溶液を得た。ｐＨが７．５に達するまでＮａ２Ｓ２Ｏ５を少しずつ加えた。無色溶液に３００μＬのＡｎｔｉｆｏａｍ−２０４（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−６２２６）および６００μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）を加えて、ｐＨ７．５の無色溶液を得た。この溶液に配列番号１２を有する３００ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製）を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブ（約６０ｍＬ／分の空気流速）を挿入したところ、反応混合物のｐＨは直ちに低下し始めた。２Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加によりｐＨを維持した。約４０分後に、ｐＨは安定な状態のままであり、さらなる塩基の添加は行われなかった。さらに１０分（合計５０分）後に、１５０ｍＬの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンＮａＨＳＯ３溶液（２６．１ｇの６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサンと１６０ｍＬのｄＨ２ＯおよびｐＨ７．２に達するのに十分なＮａ２Ｓ２Ｏ５）を反応混合物に０．１２ｍＬ／分の速度で加えた。反応混合物のｐＨは直ちに低下し始め、２Ｎ  ＮａＯＨの添加が再開された。約２１時間（約２２時間の合計反応時間）後に６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン／ＮａＨＳＯ３の添加を完了した。塩基の添加を基質添加を完了した後に高い速度で続けた。２４時間後に、１ＨＮＭＲ分析により反応が完結したと判断された。
【０４６１】
段階２。２４時間後に、１３．５ｇのＮａＣＮ（１．５当量）を反応混合物に加えて、ｐＨ９．９の乳白色反応混合物を得た。混合物を室温で１５および４５分間撹拌した後に２００μＬの分割試料を採取した。分割試料を１ｍＬのＣＤＣｌ３で抽出し、抽出物を１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。シス立体異性体は、両時点において１Ｈ−ＮＭＲ検出限界未満であった。
【０４６２】
ＮａＣＮ添加以来約６０分後に、反応物を３００ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。下の水相を排出し（約２５０ｍＬ）、上の有機層を６ｇ（直径２”×高さ１／４”）のＣｅｌｉｔｅ（商標）を通してろ過した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）を３００ｍＬのＭＴＢＥで洗浄し、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）の洗浄に用いたＭＴＢＥを用いて、水相を抽出した。有機相を合わせ、ロータリー真空エバポレーターを用いて減圧下で４０℃で１時間濃縮して、白色固体を得た。白色固体をさらに減圧下で３０分間乾燥して、２２．５ｇ（収率９０％）の（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルを得た。シス（２Ｒ）エピマーは、１Ｈ−ＮＭＲ検出限界未満であった。
【０４６３】
この実施例は、このアミノニトリルがｐＨ９．９で、０．５当量過剰なシアニドの存在下で室温で１時間の後に立体異性的に純粋な形のままであることを示している。
【実施例２０】
【０４６４】
（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルの調製：方法の頑健性
段階１。手順は、実施例１８の段階１と同一である。
【０４６５】
段階２。２４時間後に、１１．０ｇのＮａＣＮ（１．２２当量）を反応混合物に加えて、ｐＨ９．９の乳白色反応混合物を得た。室温で１０分間撹拌した後に２００μＬの分割試料を採取し、１ｍＬのＣＤＣｌ３で抽出した。抽出物溶液の１Ｈ−ＮＭＲ分析により、トランスアミノニトリルである（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボニトリルへの完全な変換が示され、シス２Ｒ立体異性体は検出できなかった。
【０４６６】
反応混合物を室温でさらに１６時間撹拌した。１６時間後の１Ｈ−ＮＭＲ分析により、約１５：１のトランス／シスアミノニトリル比が示された（トランス／シス比は、アミノニトリルメチンプロトン：トランス＝３．９２ｐｐｍにおける二重線；シス＝４．２２ｐｐｍにおける二重線の１Ｈ−ＮＭＲ積分により決定した）。
【実施例２１】
【０４６７】
静的空気中でのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールへのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化
空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液および３７５ｍｇのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩を加えた後、１Ｎ  ＮａＯＨを加えることによってｐＨを約７．５に調整した。ｐＨ調整済み溶液に６０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号４を有する１５０ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２の方法により調製した）を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌し、この間に１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加によりｐＨを７．４に維持した。ｐＨを約１４に至らせる１０Ｎ  ＮａＯＨで反応をクエンチさせ、生成物をＣＤＣｌ３中への抽出によって分離し、変換を１Ｈ−ＮＭＲにより分析したところ、１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの生成が示された。
【０４６８】
この実施例において用いた配列番号４を有するモノアミンオキシダーゼを高処理能力スクリーニングにおいて同定したとき、実施例５のキラルＧＣアッセイ方法により、それがオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールを所望の（３ａＲ，６ａＳ）−イミン（４）に酸化したことが示された。（３ａＳ，６ａＲ）鏡像異性体は、検出されなかった。
【実施例２２】
【０４６９】
（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリルの調製
空気中の５０ｍＬ３頚フラスコに２５ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液および４００ｍｇのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩、５００ｍｇのＮａ２Ｓ２Ｏ５を加え、１０Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨを約７．５に調整した。ｐＨ調整済み溶液に３０μＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）およびｐＨ８．０リン酸カリウム緩衝液中配列番号１０を有する３００ｍｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例２の方法により調製した（を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で２４時間撹拌し、この間に１−５μＬずつの１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加によりｐＨを７．５に維持した。４８時間撹拌した後、３００ｍｇのＮａＣＮを反応混合物に加えたところ、ｐＨが約９．９に上昇した。室温（約２１℃）でさらに１時間撹拌した後、混合物を酢酸エチルで抽出した。相分離および溶媒蒸発後、３１６ｍｇのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリルが分離された（収率８２％）。１Ｈ−ＮＭＲにより、約９０％の（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）、「トランス」および約１０％の（１Ｒ，３ａＲ，６ａＳ）エピマー、「シス」が示された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）スペクトル：δ３．９５（ｄ，Ｊ＝６．６，シスアミノニトリルメチンＨ）、３．６２（ｄ，Ｊ＝１．２；トランスアミノニトリルメチンＨ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，２Ｈ）、２．６２（ｍ，１Ｈ）、１．６３−１．９３（ｍ，３Ｈ）、１．５５（ｍ，１Ｈ）、１．２２−１．４５（ｍ，３Ｈ））。
【実施例２３】
【０４７０】
（３ａＲ，６ａＳ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−シクロ−ペンタ［ｃ］−ピロール（化合物（４））およびこの対応する二量体（化合物（５））の調製規模製造
２０℃で、３００ｒｐｍで撹拌されたジャケット付き３Ｌ３頚フラスコに５００ｍＬのｄＨ２Ｏおよび２０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液を加えた。濃Ｈ３ＰＯ４でｐＨを約７．６に調整して、無色均一溶液を得た。この溶液に２．０ｍＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｃ−３５１５）および配列番号１６のポリペプチドの５．０ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製した）を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約０．２Ｌ／分の乾燥空気を通気した。反応物のｐＨは、３８０ｍＬが添加されるまで、２０−１００μＬずつの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により７．５に維持された。（中性溶液中のアミンはプロトン化されており、イミンはプロトン化されない。プロトンは、反応により放出され、ｐＨを維持するために中和されなければならない。この実施例においては、アミン自体がｐＨスタットの滴定剤として用いられる塩基である。）３８０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液が添加された後、ｐＨは、反応を完結させる（最初の５ｇ（４５ｍモル）の基質に対応するために１Ｎ  ＮａＯＨのフィードバック制御添加により維持された。さらなるＮａＯＨの消費が認められなくなった後、スラリーの分割試料を採取し、ろ過し、固体を風乾した。
【０４７１】
種々の溶媒に溶解させた固体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、溶液中種々の割合のイミン（３ａＲ，６ａＳ）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（４）およびこの二量体（５）を示した。Ｄ６−ＤＭＳＯ中１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）は、二量体を示し、遊離イミンは検出されなかった（スペクトル：δ３．１１（ｔ，Ｊ＝８．２；１Ｈ）、２．４５（ｍ，１Ｈ）、２．３３（ｍ，１Ｈ）、１．８５（ｄｄ，Ｊ＝７．２，８．１，１Ｈ）、１．３１−１．５８（ｍ，７Ｈ））。ＣＤＣｌ３中１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）は、イミンと二量体の混合物を示した（スペクトル：δ３．２２（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｍ，１Ｈ）、２．３０−２．４０（ｍ，２Ｈ）、１．８９（ｍ，１Ｈ）、１．５０−１．７０（ｍ，５Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ））。１７％Ｄ３ＰＯ４／Ｄ２Ｏ中１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）は、プロトン化イミン単量体のみを示した（スペクトル：δ７．６−８．２（ｂｒ，１Ｈ）、３．５−３．８（ｂｒ，１Ｈ）、２．８−３．５（ｂｒ，２Ｈ）、２．２−２．８（ｂｒ，１Ｈ）、０．５−１．７（ｂｒ，６Ｈ））。
【０４７２】
反応混合物の大部分に１００ｍＬの濃ＨＣｌを加えて、ｐＨが約０（二量体をプロトン化イミンに破壊しない）の黄色懸濁液を得た。黄色懸濁液を４℃で８０００で１０分間遠心分離した。得られた黄色上清をデカントし、反応容器に戻した。白色ペースト（遠心分離によりペレット化）を１００ｍＬのｄＨ２Ｏに再懸濁し、ろ紙でろ過した。残留物をｄＨ２Ｏ（１×１００ｍＬ）で洗浄した。（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩を含む、このようにして得られたすべての酸性水溶液を合わせ、アミノニトリルへのシアン化反応に直接用いた。
【０４７３】
この実施例で用いた配列番号１６を有するモノアミンオキシダーゼを高処理能力スクリーニングにおいて固定したとき、実施例５のキラルＧＣアッセイにより、それがオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールを所望の（３ａＲ，６ａＳ）−イミン（４）に酸化したことが示された。（３ａＳ，６ａＲ）鏡像異性体は、検出されなかった。
【実施例２４】
【０４７４】
静的空気または酸素中でのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールおよびこの対応する二量体へのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化；抽出による生成物の分離
２０℃で、３００ｒｐｍで撹拌されたジャケット付き３Ｌ３頚フラスコに５００ｍＬのｄＨ２Ｏおよび２０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液を加えた。濃Ｈ３ＰＯ４でｐＨを約７．６に調整して、無色均一溶液を得て、これに２．０ｍＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ；「Ｃａｔａｌｙｚｙｍｅ１０１」）および配列番号１６のポリペプチドの５．０ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製した）を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約０．２Ｌ／分の乾燥空気を通気した。反応物のｐＨは、３８０ｍＬが添加されるまで、２０−１００μＬずつの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により７．５に維持された。（中性溶液中のアミンはプロトン化されており、イミンはプロトン化されない。プロトンは、反応により放出され、ｐＨを維持するために中和されなければならない。この実施例においては、アミン自体がｐＨスタットの滴定剤として用いられる塩基である。）３８０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液が添加された後、ｐＨは、反応を完結させる（最初の５ｇ（４５ｍモル）の基質に対応する）ために１Ｎ  ＮａＯＨの添加により維持された。さらなるＮａＯＨの消費が認められなくなった後、１８００ｍＬのＭＴＢＥを、その後に４５℃に加熱した不均一反応混合物に加えた。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）によるろ過の後、下の水相を捨て、上の有機相を１０％クエン酸で抽出し、（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩を含む酸性水溶液を実施例２９の方法による（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸の調製に直接用いた。
【実施例２５】
【０４７５】
（３ａＲ，６ａＳ）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール（化合物（３））の二量体の調製規模製造
空気中３０℃で、３００ｒｐｍで撹拌されたジャケット付き５００ｍＬ３頚フラスコに１００ｍＬのｄＨ２Ｏおよび２．０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液（０．５ｇの基質）を加えた。濃Ｈ３ＰＯ４でｐＨを約７．８に調整して、無色均一溶液を得た。この溶液０．２ｍＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ；「Ｃａｔａｌｙｚｙｍｅ１０１」）および配列番号３６のポリペプチドの０．２５ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製した）を加えた。反応物のｐＨが直ちに低下し、ｐＨは、２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液のフィードバック制御添加によりｐＨ７．７に維持された。２時間後、さらに０．２５ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末を加えた。（３ａＲ，６ａＳ）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの二量体が反応物から沈殿し始め、反応混合物は、実験中に白色スラリーになった。さらに２時間（合計４時間）後に、ヘッドスペースに約０．６ｍＬ／分の酸素を通気し、酸素通気を実験中維持した。２４時間の合計反応時間の後、さらに０．５ｇのモノアミンオキシダーゼを加えた。４８．５時間の合計反応時間の後、合計３２．３ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液を加えた（反応した総基質は８．５８ｇであった）。反応混合物をショートパス蒸留ヘッド（ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｈ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｈｅａｄ）を取り付けた５００ｍＬ１頚フラスコに移し、一式を加熱マントルに入れた。加熱マントルを１６０℃に加熱することにより、二量体が氷浴中に浸漬したレシービングフラスコに水蒸気蒸留し始めた。蒸気相の温度は、約９６℃であった。約３０分後に、反応物の約１／２が蒸留し、蒸気相の温度は、約９８℃であった。この時点で蒸留を中止した。レシービングフラスコ中の白色固体の水中懸濁液を粗フリット漏斗によりろ過し、白色固体を２時間風乾して、７．１７ｇ（収率８４％）の（３ａＲ，６ａＳ）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの二量体を得た。
【実施例２６】
【０４７６】
静的空気中でのオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールおよびこの対応する二量体へのモノアミンオキシダーゼ触媒脱対称化；水蒸気蒸留による生成物の分離
２０℃で、３００ｒｐｍで撹拌されたジャケット付き３Ｌ３頚フラスコに５００ｍＬのｄＨ２Ｏおよび２０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液を加えた。濃Ｈ３ＰＯ４でｐＨを約７．６に調整して、無色均一溶液を得て、これに２．０ｍＬのＡ．ニガーカタラーゼ懸濁液（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ；「Ｃａｔａｌｙｚｙｍｅ１０１」）および配列番号１６のポリペプチドの５．０ｇのモノアミンオキシダーゼ粉末（実施例３の方法により調製した）を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約０．２Ｌ／分の乾燥空気を通気した。反応物のｐＨは、２０−１００μＬずつの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により７．５に維持された。（３ａＲ，６ａＳ）オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの二量体が反応物から沈殿し始め、反応混合物が白色スラリーになった。３８０ｍＬの２５重量％オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール水中溶液を加えた後、水蒸気蒸留（蒸留器ヘッド温度約９８℃）により生成物を反応混合物から分離した。レシーバーポットに（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールの二量体の水中懸濁液が含まれていた。１．１−１．２当量の濃ＨＣｌをレシーバーポットに加えて二量体を破壊し、（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩の水中均一溶液を得た。この溶液は、実施例２７において（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリルを調製するのに直接用いた。
【実施例２７】
【０４７７】
（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリルの調製
実施例２６で調製した（３ａＳ，６ａＲ）−１，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール塩酸塩の水性酸性溶液を０℃に冷却し、３００ｒｐｍで撹拌した。０℃の冷却溶液に３ｍＬ／分の１００ｍＬのｄＨ２Ｏ中５０ｇのＮａＣＮを加えた。（シアニドによる塩酸塩溶液の中和によってＨＣＮがインサイツで発生した。）ＮａＣＮの添加を開始してから２時間後に、１０００ｍＬのトルエン（氷浴中で予冷した）を加えて、二相性混合物を得、これにＫ２ＣＯ３の飽和溶液を、水相のｐＨが９．８に達するまで、１０ｍＬ／分の速度で加えた。次いで、下の水相をカニューレを用いて除去し、廃棄する前に漂白剤で処理した（残りのシアニドを破壊するため）。上の有機懸濁液／乳濁液をＣｅｌｉｔｅ（商標）５４５の２０ｇの床（高さ約１／４”×直径約３”）を通して室温（約２１℃）で約１５分間にわたりろ過して、約１０００ｍＬの無色有機相および約３００ｍＬの黄色水相ならびに約１００ｍＬの「ラグ相（ｒａｇ  ｐｈａｓｅ）」（上の有機相と下の水相との間にある中間層）を得た。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）パッドをトルエン２×１００ｍＬで洗浄した。溶液を分液漏斗中で合わせ、水相およびラグ層を排出させ、廃棄のために漂白剤で処理した。有機相から有機相の分割試料を採取し、蒸発乾固した。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）分析により、（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリル（「トランス」）およびこの１Ｒエピマー（「シス」）が約３０：１の比率で存在することが示された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）スペクトル：δ３．９５（ｄ，Ｊ＝６．６，シスアミノニトリルメチンＨ）、３．６２（ｄ，Ｊ＝１．２；トランスアミノニトリルメチンＨ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，２Ｈ）、２．６２（ｍ，１Ｈ）、１．６３−１．９２（ｍ，３Ｈ）、１．５５（ｍ，１Ｈ）、１．２２−１．４５（ｍ，３Ｈ））。有機相を約０℃に冷却し、２５０ｍＬの濃ＨＣｌ（氷浴中で予冷した）で２回抽出した。この後、完全で、即時的な相分割が起こった。（抽出が発熱性であったため、抽出溶液を予冷することが必要であった。溶液の温度は、約４℃からほぼ室温まで上昇した。（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリル塩酸塩を含む合わせた濃縮ＨＣｌ抽出物（合計約６００ｍＬ）を合わせ、実施例２８において（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩を作製するのに直接用いた。
【実施例２８】
【０４７８】
６．１  実施例２８（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩の調製
実施例２７からの（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボニトリル塩酸塩溶液を加熱して２４時間還流し、この後、約３００ｍＬの水／ＨＣｌを蒸留させ、残りの溶液を約５０−６０℃に冷却した。温溶液を５００ｍＬのトルエンに加え、残りの水（約１００−１２０ｍＬ）をトルエン共沸物として蒸留させた。すべての水が除去された後、得られた褐色固体および淡黄色トルエンの重質スラリー懸濁液を室温（約２１℃）に冷却した。固体をろ過漏斗上に収集し、トルエン（２×２００ｍＬ）で洗浄した。黄褐色固体を２時間風乾し、真空中でさらに一夜乾燥して、１５９ｇ（オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロールからの総収率７２％）の（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩をＮＨ４Ｃｌ副生成物との１：１混合物として得た。
【０４７９】
Ｄ２Ｏに溶解した塩混合物の１Ｈ−ＮＭＲにより、約１７：１のトランス／シス（１Ｓ／１Ｒ）比が示された（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）スペクトル：δ４．３２（ｄ，Ｊ＝５．５；シス−アミノ酸メチン）、３．８５（ｄ，Ｊ＝２．３；トランス−アミノ酸メチン）、３．５０（ｍ，１Ｈ）、３．６５−３．８８（ｍ，３Ｈ）、１．２０−１．８０（ｍ，６Ｈ））。
【実施例２９】
【０４８０】
６．２  実施例２９（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩からの（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルシュウ酸１：１塩の調製
段階１：磁気撹拌棒を備えた１６５０ｍＬ厚肉ガラス圧力ビン（Ａｃｅ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、８６４８−１５７）に実施例２８において調製した７５ｇ（３０６．９ｍモル）の（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩／塩化アンモニウム混合物、３７５ｍＬのジクロロメタンおよび４９７ｍＬの酢酸ｔ−ブチルを入れた。得られた混合物を周囲温度（約２１℃）で激しく撹拌し、大きい凝集物を破壊して自由撹拌懸濁液を得た。この懸濁液を食塩水−氷浴を用いて０℃の内部温度に冷却し、７５．４ｍＬ（１１６２ｍモル）のメタンスルホン酸を１５分間にわたって１滴ずつ加えた。この間に内部温度が５℃に上昇した。圧力ビンを密封し、反応混合物を１８時間にわたって激しく撹拌しながら周囲温度（約２１℃）に加温した。この間に反応混合物は、琥珀色溶液中白色無機塩の懸濁液になった。混合物を氷浴中で冷却し、圧力ビンに注意深く通気し、蓋を取り外した。混合物を３Ｌフラスコに移し、撹拌しながら氷浴中で冷却した。４００ｍＬの５０％（重量：重量）水中ＮａＯＨを、混合物の温度を２０℃未満に維持しながら、３５分間にわたって混合物に加えた。撹拌を停止し、相を分離させた。有機相（約８５０ｍＬ）を除去し、別個の容器に移した。残りの水相およびラグ層（ｐＨ１３、約８００ｍＬ）を３７５ｍＬのジクロロメタンで抽出した。有機相を合わせ（約１２５０ｍＬ）、水（２×２２５ｍＬ）で洗浄した。得られた有機相をろ過して、ラグ層および不溶性物質を除去し、ロータリー真空蒸発により溶媒を除去して、４８．３ｇの暗琥珀色の油を得た。油の１ＨＮＭＲスペクトルは、（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルを示した。
【０４８１】
同じ手順に従った第２の調製により、５０．６ｇのトランス−（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステル油が生成した。
【０４８２】
段階２：段階１による２回の調製からの９７．９ｇ（４６３．３ｍモル）の（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルを７５０ｍＬの酢酸ｔ−ブチルに溶解し、オーバーヘッド機械的撹拌、温度計、滴下漏斗および還流冷却器を装着した３Ｌ４頚フラスコに入れた。周囲温度（約２１℃）で撹拌しながら、４４．０ｇ（４８８．６ｍモル）のシュウ酸の７５０ｍＬの２−プロパノール中溶液を３７分間にわたって１滴ずつ加えた（混合物の温度は３１℃に上昇した）。約５０ｍＬのシュウ酸溶液の添加後に固体が沈殿し始め、４５０ｍＬの添加後に濃厚な懸濁液が生じた。５００ｍＬのシュウ酸溶液の添加後に、沈殿した固体が再溶解して、暗黄色溶液が得られた。固体が６００ｍＬのシュウ酸溶液の添加後に再び速やかに沈殿し、シュウ酸の添加の終了まで存続した。次いで、この懸濁液を７８℃に加熱して薄い懸濁液とし、これを撹拌しながら受動的に周囲温度（約２１℃）に冷却させた。冷却を開始してから１６時間後に、沈殿固体をろ過により収集し、イソプロパノール（４５０ｍＬ）、酢酸イソプロピル（４５０ｍＬ）およびメチルｔ−ブチルメチルエーテル（４５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。固体を真空オーブン（３０℃、２５”真空、Ｎ２流）中で乾燥して、１１８．１ｇの（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルシュウ酸１：１塩（（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩からの収率６４％）を高密度、黄褐色の自由流動性粉末（ＧＣ分析により純度９９．７％）として得た。これは、（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルシュウ酸（１：１）塩の予想された１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０４８３】
（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルシュウ酸（１：１）塩の再結晶化：上の段階２からの黄褐色粉末（１１８．１ｇ、３９１．９ｍモル）およびイソプロパノール（１９５０ｍＬ）を、機械的撹拌、温度計および還流冷却器を備えた３Ｌ４頚フラスコに入れた。懸濁液を撹拌し、７４℃に加熱し、塩を完全に溶解して、黄色溶液を得た。撹拌を遅くし、溶液を受動的に周囲温度（約２１℃）に冷却させた。冷却を開始してから２０時間後に、沈殿固体をろ過によって収集し、イソプロパノール（１Ｌ）、酢酸イソプロピル（１Ｌ）およびメチルｔ−ブチルメチルエーテル（１Ｌ）で連続的に洗浄した。固体を真空オーブン（４０℃、２８”真空、Ｎ２流）中で乾燥して、１１０．４５ｇの（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステルシュウ酸１：１塩（（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸塩酸塩からの収率５９．７％）をＧＣ分析による９９．９％純度の微細な灰色がかった白色の針状物として得た。キラルＧＣ分析により、所望の（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−立体異性体のみが示された。この（２Ｓ）−エピマーは、検出されなかった。
【０４８４】
本開示において引用したすべての特許、特許刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【配列表】
2011525533000001.app
【国際調査報告】
2011525533.tif 000085
2011525533.tif 000086