(57)【要約】  修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドが提供される。ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、それぞれ対応する未修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の未修飾型治療用ポリペプチドとは異なる物理的特性及び活性を示す。また、これらのポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。さらに、上記ポリペプチドを用いた治療及び診断方法が提供される。
2011520472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相異する糖化部位により遮蔽された遮蔽ｉｓ−ＨＩＴ残基における２つのアミノ酸修飾、及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基における１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含み、かつ前記修飾は、Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ１５３Ｖ／Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；及びＥ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉのうちから選択されないものである、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記修飾は、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ； 及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎのうちから選択される、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項３】
前記修飾は、Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；及びＫ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎのうちから選択される、請求項１または２に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項４】
Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；及びＫ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖのうちから選択された２つ以上のアミノ酸修飾を、未修飾型ＥＰＯポリペプチドにおいて含む、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化されたものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは部分的に糖化されるか、糖化部位Ｎ２４、Ｎ３８、またはＮ８３のうちの１つ以上で、１つ以上の追加のアミノ酸修飾により脱糖化されたものであり、前記追加のアミノ酸修飾は前記糖化部位で糖化を除去するものである、請求項５に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項７】
前記修飾は、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｈ、Ｎ２４Ｋ、Ｎ３８Ｋ、及びＮ８３Ｋのうちから選択されたアミノ酸置換である、請求項６に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項８】
Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ；及びＲ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎのうちから選択された２つ以上のアミノ酸修飾を、未修飾型ＥＰＯポリペプチドで含む、修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項９】
ＥＰＯポリペプチドにおいて２つ以上の修飾を含み、かつ前記修飾のうちの１つ以上は配列番号２または配列番号２３７に記載されたアミノ酸残基に対応するＲ４Ｈである、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項１０】
前記１つ以上の追加のアミノ酸修飾は、Ｐ２Ｓ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｈ、Ｋ４５Ｔ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｔ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｄ１６５Ｈ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑのうちから選択される、請求項９に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１１】
前記追加のアミノ酸修飾は、Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｐ９０Ｓ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｄ９６Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１３１Ｑ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｄ１３６Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；Ｌ１６Ｉ；Ｌ１６Ｖ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖのうちから選択される、請求項１０に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１２】
前記追加のアミノ酸修飾は、Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｌ１６Ｉ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖのうちから選択される、請求項１１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１３】
前記修飾型ＥＰＯは、Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ、及びＲ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎのうちから選択される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１４】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６個のアミノ酸長を有する、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列、または配列番号２または２３７で記載された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１６】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは追加で修飾され、その修飾は、カルボキシ化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、アルブミン化、酸化、またはポリエチレン（ＰＥＧ）グリコールへの接合のうちの１つ以上である、請求項１から１６のいずれかに記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、免疫原性、カルボキシ化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、酸化、ＰＥＧ化、またはポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性の変化に寄与する１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２３】
前記細胞は、原核細胞または真核細胞である、請求項２１または２２に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、液体、溶液、懸濁液、エアゾール、錠剤、トローチ錠、またはカプセルの形態である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、錠剤またはカプセルの形態である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記錠剤またはカプセルは、腸溶コーティングされたものである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記組成物は、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、口腔、吸入、筋肉内、直腸、または局所投与用に剤形化されている、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、経口投与用に剤形化されている、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、胃腸管への経口投与用に剤形化されている、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）で治療できる疾病または障害の治療のために、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物は経口投与される、請求項３１に記載の治療方法。
【請求項３３】
前記疾病または障害は、腎不全、ＡＩＤＳ、悪性及び慢性炎症、手術前後処置、鉄過剰症、止血異常、組織保護療法、神経学的疾患、及び自家輸血のための献血に伴われる貧血症のうちから選択される、請求項３１または３２に記載の治療方法。
【請求項３４】
前記貧血症は、地中海性貧血、鎌状赤血球性貧血、未熟児貧血、及びcis-platinumを用いた化学療法（cis-platinum chemotherapy）に伴われる貧血、及び集中的な放射線療法及び／または化学療法及び骨髄移植後の貧血のうちから選択される、請求項３３に記載の治療方法。
【請求項３５】
修飾型治療用ポリペプチド、または修飾を含む前記ポリペプチドの活性断片を含む経口投与用に剤形化した医薬組成物であって、
前記治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、１つ以上の糖化部位を含むポリペプチドであり、
前記治療用ポリペプチドまたはその活性断片は遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上のアミノ酸修飾を含み、
前記治療用ポリペプチドまたはその活性断片は前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まない未修飾型治療用ポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表すものである、医薬組成物。
【請求項３６】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、前記ポリペプチド上の糖化部位から０乃至２５Å以内に位置したｉｓ−ＨＩＴ残基のうちから選択される請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、前記ポリペプチドの上の糖化部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５Å以内に位置したｉｓ−ＨＩＴ残基のうちから選択される、請求項３５または３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記修飾型治療用ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化されたものである、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記治療用ポリペプチドはサイトカインである、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記治療用ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−ベータ（ＩＦＮ−β）、インターロイキン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のうちから選択される、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記治療用ポリペプチドは、配列番号２、２３７、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、及び３０６、その活性断片、または配列番号２、２３７、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、及び３０６のうち、いずれか１つに記載されたポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する変異体のうちから選択される、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記治療用ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含み、
前記２つのアミノ酸修飾は、相異する糖化部位により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基に位置する、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記治療用ポリペプチドは、配列番号２または配列番号２３７に記載されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド、または配列番号２または配列番号２３７に記載された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する変異体である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、Ｎ２４、Ｎ３８、Ｎ８３、及びＳ１２６のうちから選択された１つ以上の糖化部位での糖化により遮蔽された残基から選択される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、配列番号２または配列番号２３７のアミノ酸残基に該当するアミノ酸残基Ｒ１４、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｋ２０、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ３１、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｐ４２、Ｄ４３、Ｅ６２、Ｗ６４、Ｌ６７、Ｌ６９、Ｌ７０、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ８７、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、Ｄ９６、Ｋ９７、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｒ１３１、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、及びＹ１４５うちから選択される、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記遮蔽されたＨＩＴ残基は、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉのうちから選択された１つ以上のアミノ酸修飾により修飾型ものである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、Ｋ２０Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｐ９０Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ１２３Ｎ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｎ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１４３Ｈ、及びＲ１４３Ｑのうちから選択された１つ以上のアミノ酸修飾により修飾型ものである、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、Ｋ２０Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、及びＲ１３９Ｈのうちから選択された１つ以上のアミノ酸修飾により修飾型ものである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記治療用ポリペプチドは、Ｒ１３９Ｈ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；及びＫ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖのうちから選択された修飾型ＥＰＯである、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記治療用ポリペプチドは、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｈ／Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ、及びＲ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉのうちから選択された修飾型ＥＰＯである、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記治療用ポリペプチドは、遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上のアミノ酸残基を追加で含むものである、請求項３５から５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記治療用ポリペプチドはエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであり、前記遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基は配列番号２または２３７に該当するアミノ酸残基であるＰ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｃ７、Ｄ８、Ｒ１０、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｙ１５、Ｃ２９、Ｋ４５、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｌ１０５、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｋ１５２、Ｌ１５３、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５９、Ｒ１６２、Ｄ１６５、及びＲ１６６のうちから選択されるものである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基に位置した追加の修飾は、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｑ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑのうちから選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基に位置した追加の修飾は、Ｒ４Ｈ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｒ１５０Ｈ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；及びＬ１５３Ｖのうちから選択される、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基に位置した追加の修飾は、Ｒ４Ｈ、Ｋ５２Ｎ、Ｌ１５３Ｖ、及びＥ１５９Ｎのうちから選択される、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記治療用ポリペプチドは、Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２
０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎのうちから選択された修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドである、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記治療用ポリペプチドは、Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ； Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９
Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎのうちから選択された修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドである、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記治療用ポリペプチドは、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎのうちから選択された修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドである、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記治療用ポリペプチドは、Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎのうちから選択された修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドである、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
糖化部位であるＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３のうちの１つ以上で１つ以上のアミノ修飾を含み、その修飾は前記部位の糖化を除去するものである、請求項４３から５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記修飾は、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｈ、Ｎ２４Ｋ、Ｎ３８Ｋ、及びＮ８３Ｋのうちから選択されたアミノ酸置換である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６個のアミノ酸長を有する、請求項４３から６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項４３から６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記修飾型治療用ポリペプチドは追加で修飾され、その修飾はカルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、アルブミン化、酸化、またはエチレングリコール（ＥＰＯ）部分への接合のうちの１つ以上である、請求項３５から６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記修飾型治療用ポリペプチドは、その免疫原性、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、ＰＥＧ化、またはタンパク質分解酵素抵抗性の変化に寄与する１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含む、請求項３５から６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記組成物は錠剤またはカプセルに剤形化される、請求項３５から６５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記錠剤またはカプセルは腸溶コーティングされたものである、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記組成物は液体で剤形化される、請求項３５から６７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
治療用ポリペプチドで治療できる疾病または障害の治療のために、請求項３５から６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を経口投与することを含む、治療方法。
【請求項７０】
前記医薬組成物の修飾型治療用ポリペプチドは修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）であり、前記疾病または障害は、腎不全、ＡＩＤＳ、悪性及び慢性炎症、手術前後処置、鉄過剰症、止血異常、組織保護療法、神経学的疾患、及び自家輸血のための献血に伴われる貧血症のうちから選択される、請求項６９に記載の治療方法。
【請求項７１】
前記貧血症は、地中海性貧血、鎌状赤血球性貧血、未熟児貧血、cis-platinumを用いた化学療法（cis-platinum chemotherapy）に伴われる貧血、及び集中的な放射線療法及び／または化学療法及び骨髄移植以後の貧血のうちから選択される、請求項７０に記載の治療方法。
【請求項７２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドまたは治療用ポリペプチドで治療できる疾病または状態の治療のための医薬の剤形化のための請求項２４から請求項３０、または請求項３５から６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドまたは治療用ポリペプチドで治療できる疾病または状態を治療するための請求項２４から３０、または請求項３５から６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Thierry  Guyon、  Gilles  Borrelly、  Xavier  Gallet、  Lila  Drittanti、及びManuel  Vegaを出願人にして２００８年５月２９日付で出願されたものであって、発明の名称が“増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す修飾型エリスロポエチン及びその組成物”である米国仮出願第６１／１３０，３７６号の優先権を主張する。許容される場合、上記出願の要旨は全体的に本明細書に参照として使用する。
【０００２】
本出願は、Thierry  Guyon、  Gilles  Borrelly、  Xavier  Gallet、  Lila  Drittanti、及びManuel  Vegaを出願人にして２００７年１１月２８日付で出願されたものであって、発明の名称が“修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びその用途”である米国出願第１１／９９８，３８７号と関連があり、またThierry  Guyon、  Gilles  Borrelly、  Xavier  Gallet、  Lila  Drittanti、及びManuel  Vegaを出願人にして発明の名称が“修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びその用途”である国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４５２０号と関連があるが、上記２つの出願は２００６年１１月２８日付で出願された米国仮出願第６０／８６１，６１５号の優先権を主張している。
【０００３】
また、本出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“高い安定性のためのサイトカインの合理的進化、上記サイトカイン及びこれをコードする核酸分子”であって、２００５年７月６日付で出願され、米国出願公開番号２００６−００２０１１６号として公開された米国出願第１１／１７６，８３０号と関連があるが、上記の米国出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“高い安定性のためのサイトカインの合理的進化、上記サイトカイン及びこれをコードする核酸分子”であって、２００３年９月８日付で出願され、米国出願公開ＵＳ−２００４−０１３２９７７−Ａ１号として公開された米国出願第１０／６５８，８３４号の継続出願である。また、本出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Hugo Cruz Ramos、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“二次元的合理的変異誘発(Two-Dimensional Rational Mutagenesis)スキャニングを用いた合理的に方向付けられたタンパク質進化”であって、２００５年８月２日付で出願され、米国出願公開ＵＳ−２００６−００２０３９６−Ａ１号として公開された米国出願第１１／１９６，０６７号と関連があるが、上記米国出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Hugo Cruz Ramos、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“二次元的合理的変異誘発スキャニングを用いた合理的に方向付けられたタンパク質進化”であって、 ２００３年９月８日付で出願され、米国出願公開ＵＳ２００５−０２０２４３８号として公開された米国出願第１０／６５８，３５５号の継続出願である。
【０００４】
また、本出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“高い安定性のためのサイトカインの合理的進化、上記サイトカイン及びこれをコードする核酸分子”であって、２００３年９月８日付で出願された米国出願第１０／６５８，８３４号及び公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０２２５９３号とも関連がある。また、本出願は、Rene Gantier、Thierry Guyon、Hugo Cruz Ramos、Manuel  Vega、及びLila Drittantiを出願人にして発明の名称が“二次元的合理的変異誘発スキャニングを用いた合理的に方向付けられたタンパク質進化”であって、２００３年９月８日付で出願された米国出願第１０／６５８，３５５号及び国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００４／０２２７４７号と関連がある。
【０００５】
本明細書では前述した出願の各々の主題を完全に参考にして引用する。
【０００６】
本発明は、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドを提供する。上記ＥＰＯポリペプチドは、相応する未修飾型ＥＰＯポリペプチドと相異する物理的特性及び活性を表すように修飾される。また、これらポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。また、上記ポリペプチドを用いた治療及び診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００７】
臨床用治療学的タンパク質の有効な伝達は薬剤科学の難題である。血流において、これらのタンパク質は、腎臓のろ過（例えば、糸球体）または血中タンパク質分解などのタンパク質除去のための正常経路を用いた除去だけではなく、代謝作用を含む、異なる生理学的過程により短時間内に循環から持続的に除去される。胃腸管内腔において、このようなタンパク質は内腔タンパク質分解酵素により持続的に分解される。後者は、経口投与、皮下投与、及び静脈内または筋肉内注射時に治療剤として用いられたタンパク質の半減期に影響を及ぼす制限的経路である。このようなタンパク質の投与経路と関連する問題は既に公知されており、このような問題を解決するための試みとして様々な戦略が利用されてきた。さらに、多くの治療用タンパク質は糖化されており、糖化型治療用タンパク質の産生には高額がかかり、極めて可変的であり、しかも、産生し難くなることが頻繁に発生する。そのようなタンパク質の非糖化型の産生がタンパク質の分解に起因して不可能になることが頻繁に発生する。
多くの臨床研究の集中を受け、且つ、投与及び生物同化を向上させるために努力してきたタンパク質ファミリーは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むサイトカインファミリーである。組換え的に産生されたＥＰＯポリペプチドは、腎不全、慢性炎症、癌及び後天性免疫欠（ＡＩＤＳ）により誘発される様々な貧血の治療を目的に承認された。しかしながら、依然としてさらに安定した形態の治療用エリスロポエチンに対する切迫した要求が残されている。エリスロポエチンは相対的に短い血漿内半減期を有している（Spivak, J. L. and Hogans, B. B., Blood 73(1): 90-99 (1989); McMahon, F. G.,et. al., Blood 76(9): 1718-1722(1990)）。これにより、治療的血漿濃度が速く消失されて、反復的な静脈投与が行われることを余儀なくされる。天然発生型変異体は、不所望の副作用だけではなく、投与、生体利用性及び短い半減期の問題まで有する恐れがあるため、生物学的治療剤として使用するためにＥＰＯの特性を向上させる必要がある。したがって、本願の目的の一つは、増強された治療学的特性を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の治療学的ポリペプチドを提供することにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Spivak, J. L. and Hogans, B. B., Blood 73(1): 90-99 (1989)
【非特許文献２】McMahon, F. G.,et. al., Blood 76(9): 1718-1722(1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は経口投与用に剤形化した医薬組成物を提供する。上記組成物は、修飾型治療用ポリペプチド、または修飾を含む上記修飾型ポリペプチドの活性断片を含む。上記修飾型治療用ポリペプチド及びその活性断片は、糖化または部分的糖化できるか、または糖化部分の除去、糖化の抑制、及び上記ポリペプチドを糖化しないバクテリア宿主などの宿主での発現などにより脱糖化（即ち、糖化されない）できる。上記治療用ポリペプチドまたはその活性断片は１つ以上の糖化部位を含有するポリペプチドであって、タンパク質分解酵素抵抗性（protease resistance）のために同定された、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基（masked is-HIT residue）と命名される１つ以上のアミノ酸修飾を含み、上記治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、上記１つ以上のアミノ酸修飾を含まない、未修飾型治療用ポリペプチド、またはその活性断片と比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。上記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、上記ポリペプチド上の糖化部位から０−２５Å以内、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５Å以内で発生するｉｓ−ＨＩＴ残基でありうる。上記医薬組成物の修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上のアミノ酸修飾を含有できる。これは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上のアミノ酸修飾を含有できる。上記医薬組成物の幾つかの実施態様において、上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、相異する糖化部位により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基で２つ以上のアミノ酸修飾を含有する。
上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、サイトカインまたはその活性断片でありうる。サイトカインには、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などがあるが、これに限定されない。このような治療用ポリペプチドの例には、配列番号２、２３７、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、及び３０６のうち、いずれかの配列を含むポリペプチド、その活性断片、または配列番号２、２３７、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、及び３０６のうち、いずれかの配列番号に記載された配列を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体のうちから選択されたものがある。
【００１０】
上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、配列番号２または２３７に記載されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド、あるいはその対立遺伝子変異体または種変異体、あるいは配列番号２または２３７に記載された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する他の 変異体である。上記ＥＰＯポリペプチドの遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は、Ｎ２４、Ｎ３８、Ｎ８３、及びＳ１２６のうちから選択された１つ以上の糖化部位での糖化により遮蔽される残基に位置できる。このような遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基には、配列番号２または配列番号２３７のアミノ酸残基に該当するか、または対立遺伝子変異体または種変異体内の相応する残基、または他の残基に位置するＲ１４、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｋ２０、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ３１、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｐ４２、Ｄ４３、Ｅ６２、Ｗ６４、Ｌ６７、Ｌ６９、Ｌ７０、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ８７、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、Ｄ９６、Ｋ９７、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｒ１３１、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、及びＹ１４５があるが、これに限定されない。遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基が修飾されているポリペプチドの例には、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、 Ｒ１
３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉ、例えば、Ｋ２０Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｐ９０Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ１２３Ｎ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｎ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１４３Ｈ、及びＲ１４３Ｑ、またはＫ２０Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、及びＲ１３９Ｈ、及び対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体の内の相応する修飾のうちから選択された１つ以上のアミノ酸修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは活性断片がある。例えば、上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、その修飾がＲ１３９Ｈ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；及びＫ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ、例えばＲ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｈ／Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ、及びＲ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、及び対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体の内の相応する修飾のうちから選択される修飾型ＥＰＯでありうる。
【００１１】
上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上のアミノ酸修飾を追加で含む他にも、タンパク質分解酵素抵抗性を増加させるか、上記ポリペプチドの更に他の特性または活性を変化させる他の修飾を追加で含むことができる。上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片がエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドの場合、代表的な遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基は、アミノ酸残基配列番号２または２３７に該当するアミノ酸残基であるＰ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｃ７、Ｄ８、Ｒ１０、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｙ１５、Ｃ２９、Ｋ４５、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｌ１０５、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｋ１５２、Ｌ１５３、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５９、Ｒ１６２、Ｄ１６５、及びＲ１６６、及び対立遺伝子変異体、種変異体、及び他の変異体の内の相応する修飾のうちから選択できる。遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基に位置する代表的な修飾には、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｑ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６
Ｑ、例えばＲ４Ｈ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｒ１５０Ｈ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；及びＬ１５３Ｖ、またはＲ４Ｈ、Ｋ５２Ｎ、Ｌ１５３Ｖ、及びＥ１５９Ｎ、及び対立遺伝子変異体、種変異体、及び他の変異体の内の相応する修飾がある。そのような修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片の代表的な例には、Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９
Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ、例えば、Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３
９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ、またはＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ
１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ、特に、Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ、及び対立遺伝子変異体、種変異体、及び他の変異体の内の相応する修飾のうちから選択された修飾を有するものが含まれる。
【００１２】
経口投与用に剤形化した上記医薬組成物の修飾型ＥＰＯポリペプチドまたはその活性断片は、糖化部位であるＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３のうち、１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸修飾を追加で含むことができるが、その修飾は上記部位で糖化を除去するものである。そのような修飾には、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｈ、Ｎ２４Ｋ、Ｎ３８Ｋ、及びＮ８３Ｋのうちから選択された残基に位置したアミノ酸置換、対立遺伝子変異体、種変異体、及び他の変異体の内の相応する修飾がある。
【００１３】
また、本発明は特定の修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供する。活性断片が提供される場合、上記活性断片の内に修飾が発生する。上記修飾型ポリペプチドは、経口投与、非経口投与、または任意の適当な投与経路用組成物を含んだ医薬組成物で剤形化できる。上記修飾型ＥＰＯポリペプチド及び／またはその活性断片は、ＥＰＯで治療できるどの疾病または障害を治療するために使用できる。本発明で提供される上記修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドは、下記に記載した修飾の他にも、糖化部位であるＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３のうち、１つ以上の部位で１つ以上のアミノ修飾を含むこともできるが、その修飾は上記部位で糖化を除去するものであり、その例には、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｈ、Ｎ２４Ｋ、Ｎ３８Ｋ、及びＮ８３Ｋのうちから選択されたアミノ酸置換がある。 
【００１４】
本発明で提供される上記修飾型ＥＰＯポリペプチドには、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６個のアミノ酸長を有するものがある。上記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有するか、含有するポリペプチドでありうるか、配列番号２または２３７に記載された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体でありうる。上記修飾型ＥＰＯポリペプチドまたはその活性断片は、上記未修飾型ポリペプチドの１つ以上の活性を維持することができる。上記修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドは、下記に記載したもの以外の修飾を含むことができるが、その修飾は、カルボキシル化、水酸化、ハシル化（hasylation）、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、アルブミン化、酸化、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分への接合のうちの１つ以上である。上記修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドは、下記に記載したもの以外の修飾を含むことができるが、その追加のアミノ酸修飾は上記修飾型治療用ポリペプチドの免疫原性、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、酸化、ＰＥＧ化（PEGylation）、またはタンパク質分解酵素抵抗性の変化に寄与するものである。
【００１５】
また、本発明はＥＰＯポリペプチド、その対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体内の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供するが、上記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基にある１つ以上のアミノ酸修飾は、配列番号２または２３７に記載された残基に該当するＲ１４Ｈ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、及びＹ１４５Ｈのうちから選択され、上記修飾型ＥＰＯポリペプチドは、上記１つ以上のアミノ酸修飾を含まない未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。上記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基のうちのいずれでの修飾は単一修飾でありうる。
【００１６】
また、本発明は、ＥＰＯポリペプチド、その対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体の内の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で２つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供するが、上記２つ以上のアミノ酸修飾は配列番号２または２３７に記載された残基に該当するＲ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉのうちから選択された遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基に位置し、上記修飾型ＥＰＯポリペプチドは、上記２つ以上のアミノ酸修飾を含まない未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。そのようなポリペプチドの例には、下記の修飾のうちのいずれかの修飾を含むものがある：Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；、及びＫ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ。
【００１７】
また、本発明はＥＰＯポリペプチド、その対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体の内の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上のアミノ酸修飾を含み、遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基で追加の修飾を含む修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるＥＰＯポリペプチドを提供するが、上記遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基にある１つ以上のアミノ酸修飾は、配列番号２または２３７に記載された残基に該当するＲ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉのうちから選択され、上記遮蔽されていない残基にある１つ以上のアミノ酸修飾は、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、
Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｑ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑのうちから選択され、上記修飾型ＥＰＯポリペプチドは、上記２つ以上のアミノ酸修飾を含まない未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。そのようなポリペプチド及びその活性断片の例には、Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０
Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ、例えば、Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎのうちから選択された修飾を含むものがある。
【００１８】
また、本発明はエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチド、あるいはその対立遺伝子変異体、種変異体、あるいは他の変異体内で１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供するが、上記修飾は、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０U／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８
０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ；、及びＫ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎのうちから選択される。
【００１９】
また、本発明は、ＥＰＯポリペプチド、あるいはその対立遺伝子変異体、種変異体、あるいは他の変異体内で２つ以上の修飾を含む修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供するが、この際、１つ以上の修飾は配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸残基に該当するＲ４Ｈである。上記他の修飾のうちの更に他の修飾は、Ｐ２Ｓ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｈ、Ｋ４５Ｔ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｔ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５
９Ｎ、 Ｄ１６５Ｈ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６ＱのようなＫ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｐ９０Ｓ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｄ９６Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１３１Ｑ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｄ１３６Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；Ｌ１６Ｉ；Ｌ１６Ｖ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖ、またはＫ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｌ１６Ｉ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖのうちから選択できる。代表的なＥＰＯポリペプチド及びその活性断片は、Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ、及びＲ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎに位置するか、またはそれに該当する修飾を有するものである。
【００２０】
また、本発明は配列番号２または２３７のポリペプチドで、あるいはその対立遺伝子変異体、種変異体、あるいは他の変異体内の位置で修飾を有する修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドを提供する。
【００２１】
ＥＰＯポリペプチド、あるいはその対立遺伝子変異体、種変異体、あるいは他の変異体で１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾型ＥＰＯポリペプチドは、Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎのうちから選択される。
【００２２】
また、本発明は、本発明で提供される修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチドのうち、いずれかをコードする核酸分子を提供する。また、本発明は上記核酸分子を含むベクター、及び上記ベクター及び／または核酸分子を含む細胞を提供する。上記細胞は哺乳動物細胞及び藻類（algal）細胞を含んだ原核または真核細胞でありうる。
【００２３】
また、本発明は、本発明で提供される上記修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド及び／またはその活性断片であるポリペプチド及び／または上記核酸、ベクター及び／または細胞を含有する医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は任意の投与経路用に剤形化できるが、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、口腔（buccal）、吸入、筋肉内、直腸、または局所投与用に剤形化できる。例えば、上記組成物は、液体、溶液、懸濁液、エアゾール、錠剤、トローチ錠(lozenge)、またはカプセル、例えば腸溶コーティング錠剤、またはカプセルの形態でありうる。上記医薬組成物は、胃腸管への経口投与用に剤形化できる。
【００２４】
上記医薬組成物、方法、及び修飾型ポリペプチドを含んだ全ての実施態様において、下記の実施態様が選択できる。上記修飾型治療用ポリペプチドがＥＰＯの場合、これは１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６個のアミノ酸長を有することができる。上記未修飾型ポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドでありうる。上記増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す修飾型治療用ポリペプチドは、上記未修飾型治療用ポリペプチドが完全に糖化される場合を始めとして、上記修飾型治療用ポリペプチドと同一な条件下で上記未修飾型ポリペプチドの１つ以上の活性または他の特性を維持することができる。上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、消化管のタンパク質分解酵素に対して増加された抵抗性を表すことができる。上記増加されたタンパク質分解酵素抵抗性は、上記修飾型治療用ポリペプチドが経口投与されるか、または消化管に存在する場合に表れることができる。上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、例えばカルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、アルブミン化、酸化、またはポリエチレングリコール（ＰＥＯ）部分への接合のうちの１つ以上を含んだ追加の修飾を含むことができる。上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片は、その免疫原性、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、酸化、ＰＥＧ化、またはタンパク質分解酵素抵抗性の変化に寄与する１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含むことができる。
【００２５】
上記医薬組成物は、固体、液体、ゲル、または他の形態に剤形化できる。組成物が経口投与用に剤形化される場合、これは腸溶コーティング錠剤、または腸溶コーティングカプセルのような錠剤またはカプセルに剤形化できる。
【００２６】
また、本発明は、本発明で提供される任意の医薬組成物を特定の治療用ポリペプチドにより治療できる疾病または障害を有する治療対象に投与する治療方法を提供する。上記組成物は、皮下のような非経口投与及び消化管内に経口投与を含んだ、どんな適当な経路で投与できるか、口腔または鼻を通じた粘膜投与用に剤形化できる。上記修飾型治療用ポリペプチドまたはその活性断片が修飾エリスロポエチン（ＥＰＯ）の場合、ＥＰＯで治療できる疾病または障害には、腎不全、ＡＩＤＳ、悪性及び慢性炎症、手術前後処置（perioperative surgeries）、鉄過剰症、異常止血、組織保護療法、神経学的疾患、及び自家輸血のための献血に伴われる貧血症が含まれる。上記貧血症は、地中海性貧血、鎌状赤血球性貧血、未熟児貧血、cis-platinumを用いた化学療法（cis-platinum chemotherapy）に伴われる貧血、及び集中的な放射線療法及び／または化学療法、及び骨髄移植以後の貧血を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】エリスロポエチン構造の２つの形態（ＡとＢ）をリボンモデル（ribbon representation）で表す。Ｎ２４、Ｎ３８、そしてＮ８３の３個のＮ−結合糖化部位とタンパク質分解酵素抵抗性のための修飾のために選択された代表的な相応する残基（各々、Ｋ２０Ｑ、Ｒ１３９Ｈ、そしてＬ８０Ｉ）は、空間充填モデルで表す。タンパク質分解酵素抵抗性のために選択された追加的な残基もまた空間充填モデル（space filling representation）で図示される（例：Ｒ４Ｈ、Ｌ１５３Ｖ、Ｅ１５９Ｎ）。
【図２】遮蔽されていない及び遮蔽された、タンパク質分解酵素抵抗性のために同定されたｉｓ−ＨＩＴ残基を示す。上記遮蔽されていない残基は、タンパク質分解についての露出部位にあり、タンパク質分解に対して増加された抵抗性を与えるために変異される部位でありうる。上記遮蔽された残基は、糖化により正常に遮蔽される部位であるが、ポリペプチドの脱糖化時には露出される部位である。上記遮蔽された残基は、タンパク質分解に対して増加された抵抗性を与えるように変異できる部位であって、ポリペプチドが脱糖化または部分的糖化される状況下で（例えば、糖化部位の変異、糖化できない宿主での発現、及び／またはインビボ投与時のグリコシダーゼへの露出）、タンパク質分解酵素による分解からポリペプチドを保護する。上記図面は、例示 のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を示すが、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基は、任意の糖化された治療用ポリペプチドでも確認できる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
概要
Ａ．定義
Ｂ．エリスロポエチン（ＥＰＯ）
Ｃ．増加されたタンパク質安定性を表す修飾型ＥＰＯポリペプチド
１．タンパク質分解酵素の耐性
ａ．セリンタンパク質分解酵素
ｂ．マトリックスメタロプロテイナーゼ
ｃ．タンパク分解部位の除去によるタンパク分解に対する増加された耐性
ｄ．増加されたタンパク質分解酵素の耐性を表す修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチド
２．スーパー−ＬＥＡＤｓ
３．他のＥＰＯ修飾
ａ．免疫原性
ｂ．糖化
ｃ．追加のまたは代替的な修飾
Ｄ．治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素の耐性修飾による欠如された糖化の補償
１．遮蔽された残基を確認する方法
２．遮蔽された部位でタンパク質分解酵素の耐性修飾を含むＥＰＯポリペプチド
３．遮蔽された部位でタンパク質分解酵素の耐性修飾を含む他の治療用ポリペプチド
ａ．ＧＭ−ＣＳＦ
ｂ．Ｍ−ＣＳＦ
ｃ．Ｇ−ＣＳＦ
ｄ．ＬＩＦ
ｅ．インターロイキン１
ｆ．インターロイキン２
ｇ．インターロイキン３
ｈ．インターロイキン４
ｉ．インターロイキン５
ｊ．インターロイキン６
ｋ．オンコスタチンＭ
ｌ．幹細胞因子
ｍ．インターフェロンβ
ｎ．インターフェロンγ
４．治療用ポリペプチドの他の修飾
ａ．溶解度を増加させるための修飾
Ｅ．ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを進化または修飾する方法
１．非制限合理的変異誘発一次元（１Ｄ）−スキャニング（Non-Restricted Rational Mutagenesis One-Dimensional (1D)-Scanning）
２．二次元（２Ｄ）合理的スキャニング（制限合理的変異誘発）(Two Dimensional (2) Rational Scanning (Restricted Rational Mutagenesis))
ａ．イン−シリコでＨＩＴを確認
ｂ．置換アミノ酸を確認
ｃ．変異タンパク質の作製及び生物学的アッセイ
３．三次元的（３Ｄ）スキャニング
ａ．相同性
ｂ．３Ｄ−スキャニング（構造的相同性）方法
４．スーパー−ＬＥＡＤｓ及び付加的な方向付けれた変異誘発（Additive Directional Mutagenesis：ＡＤＭ）
５．多重−重複プライマー伸張
Ｆ．タンパク質分解酵素に対して増加された耐性を有するＥＰＯ変異体の評価
Ｇ．ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの生成
１．発現系
ａ．原核細胞発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫及び昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
２．精製
３．融合タンパク質
４．ポリペプチド修飾
５．ヌクレオチド配列
Ｈ．修飾型ＥＰＯポリペプチド特性及び活性評価
１．インビトロ分析
２．非ヒト動物モデル
３．臨床分析
Ｉ．剤形化／包装／投与
１．修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの投与
２．修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
Ｊ．治療用途
１．貧血
２．組織保護療法
Ｋ．診断用途
Ｌ．併合療法
Ｍ．製品及びキット
Ｎ．修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドに対する抗体
Ｏ．実施例
【００２９】
Ａ．定義
特に断わりのない限り、本願明細書で使用されたあらゆる技術及び科学用語は、本発明が属する当業界における熟練者が通常、理解しているところと同じ意味を有する。この明細書の全体に亘って言及された全ての特許、特許出願、公開された出願及び公報、GenBank配列、ウェブサイト及び他の公開された資料は、特に断わりのない限り、その全文が参照として取り込まれる。本願の用語に対する定義が多数存在する場合には、このセクションにある定義が優先する。ＵＲＬまたは他のこのような識別子またはアドレスを参照した場合、このような識別子は変更可能であり、インターネット上の特定の情報が変わることもあるが、インターネットまたは他の情報源を検索して同等な情報を見出すことが可能であるということを理解しなければならない。これを参照することは、このような情報の入手容易性及び大衆的普及性を証明する。
【００３０】
本願明細書で使用される、「治療用ポリペプチド」は、疾病や障害の治療のためにヒトなどの動物に投与するポリペプチドである。治療用ポリペプチドは、当業界に知られているように、通常、サイトカイン（例えば、エリスロポエチン）のようにインビボにおいて活性を有するポリペプチドである。そのようなポリペプチドはいかなる方法でも産生可能であり、従って、組換えにより産生されたり、合成により産生されたり、細胞または組織及び他の供給源から抽出した治療用ポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない。ある供給源から精製または産生されたかまたは治療用成熟ポリペプチドは、長さの面で不均一であることがある。治療用ポリペプチドの不均一性は、治療用ポリペプチドの供給源に応じて異なってくる。このため、治療用ポリペプチドに対する言及は、産生または精製された不均一な集合体を意味する。均一な試料が意図されたときにはそのように明記される。本願明細書で使用される治療用ポリペプチドの標準物質は、それらの単量体、二量体またはその他の適切な多重体を意味する。
【００３１】
ヒト治療用ポリペプチドは、対立遺伝子型変異体アイソフォーム、コードする核酸分子から産生された合成分子、ヒトの組織と細胞から精製されたタンパク質、合成タンパク質、及びこれらの修飾型を含む。未修飾ヒト治療用成熟ポリペプチドの代表例としては、未修飾天然型（すなわち、野生型）治療ポリペプチド、シグナルペプチド及び／またはプロペプチドを含む未修飾天然型前駆体治療用ポリペプチド、及び多形の天然型治療用ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。その他の例示的なヒト治療用ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端が切断されたものである。
【００３２】
また、治療用ポリペプチドの言及は、治療用ポリペプチドの対立遺伝子型または種間変異体、及びその切断形態または断片、そしてタンパク質分解酵素抵抗性を向上させる修飾にさらなる修飾を含む形態を含む。治療用ポリペプチドは、ヒトと他の哺乳動物などの非ヒト動物種を含むが、これに限定されない動物を含む他の種から由来した相同性ポリペプチドを含む。ヒト治療用ポリペプチドの場合と同様に、非ヒト治療用ポリペプチドもまた、全長（フルレングス）の成熟ポリペプチドの少なくとも１種の活性を有する適当な領域を含むか、あるいは、十分な長さを有する治療用ポリペプチドの不均一な長さ、断片または部分を含む。
【００３３】
非ヒト治療用ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、対立遺伝子型変異体アイソフォーム、ヌクレオチドから準備した合成分子、非ヒト組織または細胞から精製されたタンパク質、そしてそれらの修飾型を含む。ヒト由来ではない治療用ポリペプチドは、牛、羊、豚、馬、ネズミ、兔、犬、猫、鳥類、及びチンパンジーや日本猿などその他の霊長類を含むが、限定されない供給源から由来する。
【００３４】
本願明細書で使用される、「天然型治療用ポリペプチド」は、ヒトまたはその他の動物を含む自然にある生物体に存在し、自然的に発生する遺伝子によりコードされる治療用ポリペプチドを意味する。天然型治療用ポリペプチド中には、コードされた前駆体ポリペプチド、その断片、翻訳前や翻訳後修飾だけではなく、シグナル配列が除去された成熟形態のような加工された形態またはそれらの修飾型が含まれる。また、天然型治療用ポリペプチドは、糖化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、及びリン酸化による修飾を含むが、これに限定されるものではなく、翻訳後に修飾型ものも含む。
【００３５】
本願明細書で使用される、非糖化型ポリペプチドは、糖化を持たないポリペプチドである（すなわち、当該タンパク質内の糖化部位に付いた炭水化物残基を有していないものである）。そのような非糖化型ポリペプチドは、ポリペプチドを糖化させない原核生物宿主などの宿主における発現により産生されるか、または、全ての糖化部位を除去（例えば、糖化部位の変異）することにより産生される。
【００３６】
本願明細書で使用される、糖化部位は、炭水化物残基が付着可能なポリペプチド内のアミノ酸位置を意味する。通常、糖化型タンパク質は、アスパラギンやセリンなどの炭水化物残基の付着のための１以上のアミノ酸残基を有している。
【００３７】
本願明細書で使用される、完全糖化型ポリペプチドは、当該ポリペプチド内の全ての天然糖化部位が糖化されたポリペプチドである。
【００３８】
本願明細書で使用される、脱糖化型ポリペプチドは、それが変異により最大には全ての糖化部位が除去されて、より少数のポリペプチドに付着された炭水化物残基を有しているため、天然型糖化型タンパク質と比べて減少された糖鎖を有している。また、脱糖化型ポリペプチドは、化学的または酵素的な分解により除去されたかまたは部分的に除去された１以上の炭水化物残基を有するポリペプチドをも含む。
【００３９】
本願明細書で使用される、天然糖化部位は、天然型ポリペプチドが天然的に生成されたときにその天然型ポリペプチドに炭水化物残基が付着されたアミノ酸を意味する。
【００４０】
本願明細書で使用される、「天然型ポリペプチド」は、ヒトやその他の動物を含む自然にある生物体に存在する遺伝子から自然的に生成される遺伝子によりコードされるポリペプチドを意味する。
【００４１】
本願明細書で使用される、「同じ条件下において産生された」の意味は、それぞれのポリペプチドを生成するために同じ産生方法を用いて２以上のポリペプチドを産生することを意味する。
本願明細書で使用される、「エリスロポエチン」ポリペプチド（本願において、ＥＰＯとも言及される）は、任意のエリスロポエチンポリペプチドも意味し、組換え方法により生成されたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、天然型ＥＰＯポリペプチド、そして細胞や組織から抽出されたエリスロポエチンポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ここで、組織は、脾臓、肝、尿及び血液を含むが、これらに限定されない。エリスロポエチンと相互交換的に使用される代替名は、エポエチンを含む。エリスロポエチンに対する略語は、ＥＰＯ、ｈＥＰＯ（ヒトエリスロポエチン）、及びｒｈｕＥＰＯ（組換えヒトエリスロポエチン）を含む。
【００４２】
エリスロポエチンは、他の種から由来した関連ポリペプチドを含み、他の種はヒトと非ヒト由来を含むが、これに限定されるものではない。ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は、エリスロポエチン、対立遺伝子型変異体アイソフォーム、核酸由来の合成分子、ヒト組織及び細胞から精製されたタンパク質、およびそれらの修飾型を含む。修飾されていない成熟ヒトエリスロポエチンポリペプチドの例示は、未修飾天然型のエリスロポエチンポリペプチド（配列番号２または２３７に示される配列を含むポリペプチドなど）とシグナル配列を含む未修飾天然型前駆体エリスロポエチンポリペプチド（例えば、配列番号１に示される前駆体ＥＰＯポリペプチド）を含むが、これに限定されるものではない。当業界における当業者であれば、成熟エリスロポエチンポリペプチド（配列番号２）の参照位置が、シグナルペプチド配列を有しているエリスロポエチンポリペプチドである前駆体ＥＰＯポリペプチド（配列番号１）と比較したとき、アミノ酸残基２７個分の差があるということが認識できるであろう。このため、配列番号２の最初のアミノ酸残基は、配列番号１の２８番目のアミノ酸残基に「対応する」。尚、「エリスロポエチン」という用語は、Ｃ末端のアルギニンアミノ酸残基がタンパク質分解により切断された成熟ＥＰＯポリペプチド（配列番号２）から、または、Ｃ末端アルギニンが除去された組換えＥＰＯポリペプチド（配列番号２３６（前駆体）および２３７（成熟体）に示される）から産生されたエリスロポエチンポリペプチドをも含む。本願で提供されるＥＰＯポリペプチドは、化学的修飾や翻訳後修飾などによりさらに修飾可能である。そのような修飾は、ＰＥＧ化、アルブミン化、糖化、ファルネシル化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、そして当業界に既知のその他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。本願で提供されるＥＰＯポリペプチドは、１以上のアミノ酸の除去、追加または置換によりその１次アミノ酸配列が修飾されることによりさらに修飾可能である。
【００４３】
本願明細書で使用される、エリスロポエチンは、ヒトと非ヒト種を含む任意の種から由来したエリスロポエチンをも含む。非ヒト由来のＥＰＯポリペプチドは、ネズミ、犬、猫、兔、鳥類、牛、羊、豚、馬、魚類、蛙及び他の霊長類ＥＰＯポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない。非ヒト由来のＥＰＯポリペプチドの代表例としては、例えば、日本猿（Macaca mulatta,  e.g.、配列番号２０２）、マウス（Mus musculus,e.g.、配列番号２０３）、ラット（Rattus norvegicus,e.g.、配列番号２０４）、豚（Sus scrofa,e.g.、配列番号２０５）、犬（Canis familiaris,e.g.、配列番号２０６）、猫（Felis catus,e.g.、配列番号２０７）、兔（Oryctolagus  cuniculus,e.g.、配列番号２０８）、黄牛（Bos taurus,e.g.、配列番号２０９）、馬（Equus caballus,e.g.、配列番号２１０）、羊（Ovis aries,e.g.、配列番号２１１）、チンパンジー（Pan troglodytes,e.g.、配列番号２１２）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio,e.g.、配列番号２１３）、日本河豚（Takifugu rubripes,e.g.、配列番号２１４）、オランウ―タン（Pongo pygmaeus,  e.g.、配列番号２２５）、ゴリラ（Gorilla gorilla,e.g.、配列番号２２６）その他の（e.g.、配列  番号２１５−２２４）を含む。通常、ヒトＥＰＯポリペプチドの種変異体は、ヒトＥＰＯポリペプチドと比べて、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。
【００４４】
ヒト及び非ヒトＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯポリペプチド、対立遺伝子型変異体アイソフォーム、組織特異的なアイソフォーム、及びそれらの対立遺伝子型変異体、１以上のアミノ酸変異、置換、欠失、挿入、または追加を有する合成変異体、核酸を翻訳することにより製造された合成分子、ヒト及び非ヒト組織と細胞から抽出したタンパク質、キメラＥＰＯポリペプチド及びそれらの修飾型を含む。さらに、ヒト及び非ヒトＥＰＯは、十分な長さを有するか、あるいは、全長の成熟ポリペプチドの少なくとも一つの活性を維持する適切な部位を含むＥＰＯの断片または部分を含む。加えて、本願明細書で使用される、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの断片または部分は、本願明細書に記述された１以上のアミノ酸修飾を構成する（例えば、表３に示すアミノ酸修飾）。
【００４５】
本願明細書で使用される、「成熟エリスロポエチン」は、シグナル配列を有さないＥＰＯポリペプチドを意味する。通常、シグナル配列は、小胞体−ゴルジ体経路に沿ってタンパク質が分泌されるようにし、翻訳中に小胞体内に入った後に切断されることになる。このため、成熟ＥＰＯポリペプチドは一般的に分泌されたタンパク質であり、一実施例において、成熟ヒトＥＰＯポリペプチドは配列番号２に示されている。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号２が配列番号１の残基１から２８を含むシグナル配列を有していない点において、配列番号１に示される前駆体ポリペプチド配列とは異なる。
【００４６】
本願明細書で使用される、「天然型エリスロポエチン」は、ヒトまたは他の動物を含む自然系内の生物体に存在する自然的に発生するＥＰＯ遺伝子からコードされているＥＰＯポリペプチドを意味する。天然型ＥＰＯポリペプチド中には、コードされた前駆体ポリペプチド、それらの断片、及び翻訳前または翻訳後に加工された任意のものだけではなく、シグナルペプチドが除去された成熟型などの加工された形態、またはそれらの修飾型が含まれる。例えば、ヒトはＥＰＯを発現させる。天然ヒトＥＰＯ配列の代表例は、配列番号１（シグナルペプチド付き前駆体ＥＰＯ）と配列番号２（シグナルペプチド無し成熟ＥＰＯ）に示されている。天然型ＥＰＯポリペプチド中には、翻訳後修飾型ものであり、これは、糖化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化及びリン酸化による修飾が含まれるが、これらに限定されない。天然型ＥＰＯポリペプチドは、また、配列番号２のＲ１６６位置がタンパク質分解反応により切断されたものを含む。他の動物も天然型ＥＰＯを産生し、この動物には霊長類、マウス、ラット、豚、犬、猫、兔、鶏、牛、羊、蛙及び魚を含むが、これに限定されたものではない。他の動物から由来した天然型ＥＰＯ配列の代表例は、配列番号２０２−２２６に示されている。
【００４７】
本願明細書で使用される、「タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチド」は、天然型または野生型ポリペプチドと比べてそのアミノ酸１次配列に１以上の修飾を有しており、且つ、１以上のアミノ酸修飾がない天然型または野生型のポリペプチドと比べてタンパク質分解に対して増強された抵抗性を示すタンパク質である。
【００４８】
本願明細書で使用される、１次構造における変化によりタンパク質分解酵素抵抗性を示す修飾型ポリペプチドは、そのポリペプチドの１次配列上の１以上のアミノ酸残基において修飾されてタンパク質分解酵素抵抗性を付与するポリペプチドを意味する。これらの中では、その位置の翻訳後修飾に変化をもたらさない変化もある。
【００４９】
タンパク質分解酵素に対する増強された抵抗性は、胃腸管内及び／または血清内に存在する特定のタンパク質分解酵素に露出させた後に活性を評価することにより分析することができる。通常、タンパク質分解酵素抵抗性の向上は、その抵抗性を付与するアミノ酸配列上の変化がない同じポリペプチドと比較したとき、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上である。他の例において、本願で提供される経口型製剤として使用するための変異体ポリペプチドのタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、その抵抗性を付与するアミノ酸配列上の変化がない同じポリペプチドと比較したときに、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上に増加される必要がある。
【００５０】
本願明細書で使用される、「タンパク質分解に対する抵抗性」は、タンパク質分解酵素などのタンパク質分解性物質によるポリペプチドの減少の度合いを意味する。これは、特定のタンパク質分解酵素により切断され易いポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基を同じタンパク質分解酵素により同じ条件下において修飾されないポリペプチドの切断と比べて、切断に左右されないように修飾することにより達成可能である。タンパク質分解に対して増強された抵抗性を示す修飾型ポリペプチドは、そのアミノ酸修飾がない同じポリペプチドと比較したとき、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のタンパク質分解に対する抵抗性を示す。
【００５１】
本願明細書で使用される、「タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）」、「プロテイナーゼ」または「ペプチダーゼ」は、共有結合性ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を意味するために相互交換的に用いられる。例えば、タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼとマトリックスメタロプロテイナーゼを含む。セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、その酵素の活性中心にセリン残基が存在すると特徴付けられる一分類のペプチダーゼを構成する。セリンプロテアーゼは、血液凝固、炎症反応だけではなく、原核生物及び真核生物における消化酵素を含む、体内において広い領域の機能に関与する。「セリンプロテアーゼ」による切断の作用機序は、セリンによる標的化されたペプチド結合の親電子性攻撃に基づく。システイン、トレオニン、またはアスパルテートと結合した水分子または金属もまた、このような役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、アスパルテートの残基の配列された側鎖はほとんどのセリンプロテアーゼにおいて一般的な触媒３重体を形成する。セリンプロテアーゼの活性位置は、ポリペプチド基質が結合する割れ目の形状を呈している。アミノ酸残基は、ポリペプチド基質のＮ末端からＣ末端へ向かって表記されている（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．、Ｐｊ）。それぞれの結合の下位位置は（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）と表記されている。切断は、Ｐ１とＰ１’との間において触媒される。
【００５２】
本願明細書で使用される、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外基質（ＥＣＭ）構成物を分解する亜鉛などの金属依存的なエンドペプチダーゼの群のいずれかを意味する。ＭＭＰは、４個のクラスを含む：コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロプロテイナーゼ及びゼラチナーゼである。ＭＭＰのタンパク質分解活性とプラスミノゲン活性因子、およびその阻害剤は、ＥＣＭの周全性を維持するの上で重要である。細胞とＥＣＭとの相互作用は、種々の細胞の増殖、分化、吸着、及び移動を含む広範な過程に影響を及ぼして媒介する。また、ＭＭＰは多数の細胞表面サイトカイン、受容体、及び他の受容性タンパク質を処理し、傷治癒、妊娠、及び血管新生などの組織リモデリング過程にも関連している。インビボの生理的な条件下において、ＭＭＰは、不活性型の前駆体（チモーゲン）として合成され、切断されて活性形態で産生される。加えて、それらの酵素はマトリックスメタロプロテアーゼ組織抑制剤（tissue inhibitors of matrix metallo- proteinases（ＴＩＭＰｓ））と呼ばれる内在的な阻害剤により特異的に調節される。
【００５３】
本願明細書で使用される、「対応する残基」は、対立遺伝子型変異体、種間変異体または他のアイソフォームであるポリペプチドの間で比較される残基を意味する。当業界における熟練者であれば、それらのポリペプチドから対応する残基を容易に把握することができる。例えば、当業界における熟練者であれば、保存的であり、且つ、同じアミノ酸残基をガイドとしてＥＰＯポリペプチドの配列を整列することにより、対応する残基を同定することができる。例えば、配列番号２（成熟エリスロポエチン）のＡ１は、配列番号１（シグナルペプチド配列を有している前駆体エリスロポエチン）のＡ２８に対応する。他の例として、対応する部位が同定可能である。また、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基をガイドとしてヒトと非ヒト配列との間で対応するアミノ酸残基を見出すことができる。例えば、配列番号１の前駆体ヒトＥＰＯにあるＰ１４８残基は配列番号２０３の前駆体マウスＥＰＯのＰ１４７に対応する。
【００５４】
本願明細書で使用される、エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの「活性部分または断片」は、本願で提供される少なくとも１以上の修飾を含み、全長のポリペプチドの一つ、それ以上の活性、または他の活性を示すポリペプチドの部分を意味する。例えば、ＥＰＯポリペプチドの場合、そのような活性は赤血球生成または組織保護的な活性を含むが、これらに限定されない。活性は、全長のポリペプチドの活性の任意のパーセント（以上または以下）になりえ、全長の活性と比べて、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を含むが、これに限定されるものではなく、そのような活性は実験的に決定可能である。ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの修飾型の機能や活性を決定するアッセイ法は、当業界における熟練者に既知の方法を含み、例示的なアッセイ法が本願に含まれる。ＥＰＯポリペプチドに対するアッセイ法は、例えば、赤血球細胞、増殖分析法、細胞生存分析法または治療効果を測定するための臨床的アッセイ法を含むが、これに限定されるものではない。さらに、活性は、全長のポリペプチドや未修飾型ＥＰＯポリペプチドが有していないＥＰＯポリペプチドの断片、修飾型、または、他の修飾型治療用ポリペプチドの活性を含む。
【００５５】
本願明細書で使用される、「未修飾ターゲットタンパク質」、「未修飾型タンパク質」、「未修飾型ポリペプチド」、「未修飾型ＥＰＯ」、「未修飾型治療用ポリペプチド」、及びその文法的な修飾は、本願で提供される修飾のために選択された開始ポリペプチドを意味する。開始標的ポリペプチドは自然的に発生可能であり、ポリペプチドの野生型である。加えて、開始標的ポリペプチドは、変化または変異され、天然型（野生型）のアイソフォームとは異なるが、それにも拘わらず、本願においてさらに修飾型ポリペプチドに対する相対的な概念として、本願においては開始未修飾標的タンパク質と呼ぶ。このため、未修飾標準タンパク質と比べて特定の活性または特性が意図的に増強または減少された当業界に周知の既存のタンパク質は開始未修飾標的タンパク質として選択されて使用可能である。例えば、１以上の単一アミノ酸変化によりその天然型から修飾され、増強または減少した意図された特性（例えば、減少された免疫原性）を有するか（米国登録特許第２００４−００６３９１７号、第２００５−０２２０８００号、第２００６−０３５３２２号、及び第２００６−００７３５６３号参照）、または糖化を変更する一つのアミノ酸残基または残基において変化を有するタンパク質が同一であるかまたは異なる特性のさらなる修飾のための（本願において未修飾と言及される）標的タンパク質でありうる。当業界に既知の例示的な修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えば、米国特許番号第４、７０３、００８号、第４、８３５、２６０号、第５、４５７、０８９号、第５、６１４、１８４号、第５、８５６、２９８号、第６、８３１、０６０号、第６、５５５、３４３号、第６、８３１、０６０号、及び第７、０４１、７９４号、米国特許公開番号第２００４−００６３９１７号、第２００５−０１０７５９１号、第２００５−０１７６６２７号、第２００６−０２９０９４号、及び第２００６−０００８８７２号、さらに、国際特許公開番号ＷＯ８６０３５２０、ＥＰ０６４０６１９、ＷＯ０４００３１７６、ＥＰ１２２８２１４、ＷＯ０５１０３０７６、ＷＯ９４２４１６０ＷＯ９０１２８７４に記述されているいかなるＥＰＯポリペプチドも含む。
【００５６】
修飾されないか、または、標準タンパク質と比べて特定の生物学的活性または特性においてこの増強または減少などの好適な修飾を有するように修飾した従来の当業界に既知のタンパク質を、本願においては、他の構造的に相同な標的タンパク質上の構造的に相同な位置の同定に選択または利用した。例えば、１以上の単一アミノ酸置換により修飾し、且つ、意図された特性または活性（例えば、タンパク質分解に対する抵抗性）が増強または減少されたタンパク質は、本願で提供される方法により、構造的に相同な標的タンパク質上の、適当な置換アミノ酸に置換され意図された活性が増強または減少したかを試験可能な対応する構造的に相同な位置を同定するのに利用可能である。
【００５７】
本願明細書で使用される、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの「活性」または「機能的な活性」は、当該ポリペプチドにより現れる任意の活性を意味する。そのような活性は実験的に決定可能である。ＥＰＯポリペプチドの場合には、そのような活性は赤血球生成または組織保護的な活性を含むが、これに限定されるものではない。活性は、インビトロやインビボにおいて認識されたアッセイ法を用いて評価可能である。例えば、ＥＰＯポリペプチドの場合に、インビトロやインビボにおいて赤血球の細胞増殖を測定することにより活性を評価することができる。ポリペプチドの活性を示すそのようなアッセイ法の結果は、インビボにおけるそのポリペプチドの活性に関連付けられ、インビボ活性は治療活性または生物学的活性を意味する場合がある。修飾型ポリペプチドの活性は未修飾型ポリペプチドのあるレベルの活性のパーセントであってもよく、未修飾型ポリペプチドの活性と比べて、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性でありうるが、これらに限定されない。ＥＰＯの修飾型の機能性または活性を決定する分析法は当業界に公知されている。ＥＰＯポリペプチドの活性測定の代表的分析は、赤血球増殖を測定し、実施例に記述された赤血球生成分析を含む。
【００５８】
本願明細書で使用された「治療活性」とは、治療用ポリペプチドのインビボ活性を意味する。一般的に、治療活性は、疾病や状態を治療するのに用いられる活性である。修飾型ポリペプチドの治療用活性は、未修飾型ポリペプチドと比べて、未修飾治療活性に対するパーセントのレベルにて表示することができ、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上であるが、これらに限定されない。
【００５９】
本願明細書で使用される、「治療用活性のために糖化が必要となる」とか、「治療用活性のために重要である」とかは、そのポリペプチドの糖化型が治療用ポリペプチドの脱糖化型または非糖化型（すなわち、バクテリア宿主において発現されたポリペプチドのような非糖化型のポリペプチド）よりも高い治療用活性（投与したときのインビボ活性）を有するということを意味する。例えば、もし、糖化型ポリペプチドの治療用活性が非糖化型（特に、治療的に使用できないとき）と比べて治療用活性が高いのであれば、糖化は治療用活性のために必要となる。そのような活性の違いは当該タンパク質に依存的であるが、当業界における熟練者であれば、特定のタンパク質が治療用の用途に適しているかどうかを認識することができる。そのようなタンパク質の代表例はエリスロポエチン（ＥＰＯ）であり、これは糖化型タンパク質であり、糖化型タンパク質として治療用に投与される。糖化型治療用タンパク質と非糖化型治療用タンパク質との間の活性差は、上述したように、当該タンパク質に依存的であるが、１５％、２５％、３０％、５０％、１００％、それ以上であってもよく、脱糖化型または非糖化型治療用ポリペプチドの治療用活性よりも少なくともまたは約１倍、少なくとも限または略２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上の倍数でさらに高いものを含む。
【００６０】
本願明細書で使用される、「少なくとも一つの活性を示す」または「少なくとも一つの活性を維持する」とは、修飾を含まないポリペプチドと比較した場合に、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドなどの修飾型ポリペプチドにより示される活性を意味する。
【００６１】
未修飾型ポリペプチドの活性を維持している修飾型ポリペプチドは、増強された活性または維持された活性（例えば、ＥＰＯポリペプチドに対して赤血球細胞生成促進または組織保護効果）を示すことができる。場合によっては、修飾型ポリペプチドが未修飾型ポリペプチドと比べて増強された活性を維持することができる。ある場合には、修飾型ポリペプチドが未修飾型ポリペプチドと比べて減少された活性を有することがある。修飾型ポリペプチドの活性は、未修飾型ポリペプチドと比べて、未修飾型ポリペプチドの活性に対するパーセントのレベルであり、任意のレベルであってもよく、その活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上を含むが、これに限定されるものではない。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドの活性と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の活性を維持する。他の例においては、活性の変化は、未修飾型ポリペプチドと比べて少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上に高い。活性維持のためのアッセイ法は、維持さるべき活性に依存的である。そのようなアッセイ法は、インビトロやインビボにおいて行うことができる。活性は、例えば、当業界に既知のアッセイ法を利用し、細胞増殖及び細胞生存活性測定法などの下記の実施例に記述された方法により測定可能であるが、これに限定されるものではない。また、未修飾型ポリペプチドと比べて、修飾型ポリペプチドの活性は、インビボ治療用、生物学的な活性、または当該ポリペプチドを投与後の結果により分析することもできる。例えば、ＥＰＯポリペプチドの場合には、そのような活性は、血球数値の変化、網状赤血球数値、赤血
球の重さ、血漿内鉄転換率、骨髄転移時間またはヘモグロビン濃度（ヘモグロビンＣ合成促進）または網状赤血球反応の刺激などを含むが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本願明細書で使用される、エリスロポエチンポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの「特性」とは、エリスロポエチンポリペプチドまたは治療用ポリペプチドにより現れる任意の特性を意味する。そのような特性としては、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、立体安定性、熱耐性、及びｐＨ条件に対する耐性などを含むが、これらに限定されるものではない。特性の変化は当該ポリペプチドの「活性」の変化をもたらすことができる。例えば、治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素に対する抵抗性の変化は、インビボ治療用ポリペプチドを変えることができる。
【００６３】
本願明細書で使用される、「タンパク質安定性」は、タンパク質分解酵素への露出、上昇した温度、特定のｐＨ条件及び／または変性成分への露出を含むが、これらに限定されない１以上の条件下においてタンパク質半減期が増加されたことを意味する。ポリペプチドにより現れる増強されたタンパク質安定性は、増強されたタンパク質分解酵素抵抗性、または、温度、ｐＨ、変性成分などに対する増強された抵抗性など増強された立体安定性により明らかになる。
【００６４】
インビトロやインビボにおいて増強されたタンパク質安定性を示す修飾型ポリペプチドは、例えば、未修飾型ポリペプチドと比べて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上に安定している。ポリペプチドのタンパク質安定性は、例えば、タンパク質分解酵素抵抗性または立体安定性（すなわち、温度変化による抵抗性）のアッセイ法により評価可能であり、下記の実施例に記述されたように、当該ポリペプチドの活性が変化したかにより決定することができる。例えば、野生型ポリペプチドと比べて修飾型ポリペプチドのタンパク質分解酵素（例えば、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びトリプシン）による酵素的切断に対する抵抗性は、当該ポリペプチドをタンパク質分解酵素と一緒に処理して経時的に残っている機能的な活性（例えば、赤血球生成または組織保護的な活性など）を試験することにより実験的に試験可能である。
【００６５】
本願明細書で使用される、「血清安定性」とは、血清内におけるタンパク質安定性を意味する。
【００６６】
本願明細書で使用される、「タンパク質分解に対する抵抗性」とは、タンパク質分解酵素などのタンパク質分解性物質によりポリペプチドの切断がいかに減少されるかの度合いを意味する。これは、特定のタンパク質分解酵素により切断され易い特定のアミノ酸残基を変更し、同じ条件下及び同じタンパク質分解酵素による切断と比べて、切断に対する感受性をより低減することにより達成可能である。タンパク質分解に対して増強された抵抗性を示す修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて、タンパク質分解の抵抗性が、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上である。
【００６７】
本願明細書で使用される、「タンパク質分解酵素に対して感受性を有する位置」とは、特定のタンパク質分解酵素により切断され易いポリペプチド内におけるアミノ酸位置を意味する。タンパク質分解酵素に対して感受性を有する位置は、本願明細書において、タンパク質分解酵素の認識位置またはタンパク質分解酵素の切断位置と混用可能である。
【００６８】
本願明細書で使用される、「立体安定性」とは、変性に対するポリペプチドの任意の量の増強された抵抗性も意味する。これは、変性条件に脆弱な特定のアミノ酸残基を変更し、同じ条件下において変性に対する感受性をより低減することにより達成可能である。立体安定性は、ポリペプチドの温度またはｐＨに対する抵抗性などの変性条件に対する抵抗性または感受性を評価することにより決定することができる。増強された立体安定性を発現させる修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の変性に対する抵抗性を有する。
【００６９】
本願明細書で使用される、「変性」とは、タンパク質の構造における任意の非共有結合性変化を意味する。この変化は、当該ポリペプチド分子の２次、３次、及び／または４次構造を変更することができる。ポリペプチドの変性は、例えば、ウレア及びグアニジンヒドロクロリドなどのカオトロピック物質、洗剤、温度、ｐＨ、及びジチオトレイトールまたはジチオトレイトールなどのジスルフィド結合を切断する試薬への露出により惹起可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本願明細書で使用される、「熱耐性」とは、タンパク質安定性の変化に影響されるかまたは依存的な任意の温度を意味する。例えば、増強された温度耐性などの変化は、同じ条件下において変化した（特に増強された）温度に露出された後に、ポリペプチドの変性が減少された量にて反映可能である。増強された温度耐性を示す修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて、様々な温度下において、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の安定性を有する。例えば、修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて、対象体に投与したときに増強されたインビボの温度耐性を示すことができ、その結果、増強された血清内半減期が示される。
【００７１】
本願明細書で使用される、「ＥＣ５０」とは、最大反応の１／２を示すのに必要とされる治療用ポリペプチドの有効濃度を意味する。本願の目的から、測定される反応はＥＰＯポリペプチドの任意の活性であり、ここにはエリスロポイエチックアッセイ法、または組織保護アッセイ法における活性などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
本願明細書で使用される、「半減期」とは、ポリペプチド分子の効能、活性、及び有効濃度などの測定されたパラメータに対して要求されるその最初のレベルから半分へと低下するのに要される時間を意味する。これは、０時間におけるその元の効能または効果濃度の１／２を意味する。このため、ポリペプチド分子の効能、活性または有効濃度などのパラメータは経時的に測定される。本願の目的から、半減期は、インビボまたはインビトロにおいて測定可能である。例えば、治療用ポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチドの半減期は、特定の条件（例えば、タンパク質分解酵素やまたは温度やｐＨの変性条件など）下において経時的に培養した後、その活性（例えば、赤血球生成活性、または組織保護活性）を評価することによりインビトロにおいて測定可能である。他の例において、治療用ポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチドの半減期は、インビボにおいて、ヒトまたは他の動物にポリペプチドを投与（例えば、血管、皮下、十二指腸内、経口）した後、時間による血液採取により血液試料内にポリペプチドの残存有効濃度及び／または活性を測定することにより決定することができる。
【００７３】
本願明細書で使用される、「治療用ポリペプチド媒介の疾病または障害」とは、治療用ポリペプチド（または、修飾型治療用ポリペプチド）の治療（処置）が当該疾病や障害の任意の症状や発現を緩和させるような疾病や障害を意味する。
【００７４】
本願明細書で使用される、「エリスロポエチンまたはＥＰＯ媒介の疾病または障害」は、エリスロポエチン（または、修飾型エリスロポエチン）が当該疾病や障害に処方されたときに任意の症状や発現を緩和させるような疾病や障害を意味する。エリスロポエチン媒介の疾病や障害の代表例は、慢性炎症貧血などの貧血、腎不全、後天性免疫欠乏症、及び癌、または傷害に対する保護または反応する哺乳動物細胞、組織、または器官に対する損傷後の機能回復に対するＥＰＯポリペプチドの組織保護的活性を利用する疾病または疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
本願明細書で使用される、患者の疾病や状態を「治療する」ことは、患者の症状が部分的にまたは完全に緩和されたかまたは治療後に静的に維持されたということを意味する。このため、治療は、予防、治療、及び／または治癒を含む。予防は、潜在的な疾病または条件の防止及び／または症状悪化または疾病や状態の進展の防止を含む概念である。疾病や状態の防止は、疾病や状態の発展に対する１以上の危険因子を緩和または除去することを含む。尚、治療は、修飾型治療用ポリペプチドと本願で提供される経口型組成物の任意の医薬的な使用も含む概念である。
【００７６】
本願明細書で使用される、治療は、予防、治療、及び／または治癒を含む。例えば、治療は、本願で提供される任意の修飾型エリスロポエチンまたは他の治療用ポリペプチド及び組成物の任意の医薬用途も含む。
【００７７】
本願明細書で使用される、予防は、潜在的な疾病及び／または症状悪化の予防または疾病の進展を予め防止することを意味する。
【００７８】
本願明細書で使用される、防止は、特定の疾病または障害の絶対的な防止を意味する。通常、特定の疾病や障害が絶対に発達されなかったと確信することは不可能であるため、防止はまた、疾病または障害を発達させるかまたは所有の危険を減少させる概念も含む。
【００７９】
本願明細書で使用される、外部から添加するタンパク質分解酵素を含まない組成物は、タンパク質分解酵素が添加されずに製剤化された組成物である。組成物に存在する付加的なタンパク質分解酵素は、いかなるものであっても、製剤化方法から起源したものである。
【００８０】
本願明細書で使用される、「投与された治療学的有効量」または「治療的に有効な投与量」は、単位製剤において、薬剤、化合物、物質の患者に少なくとも治療的な効果を与えるのに十分な量である。通常、その量は、血中において治療的に有効な量に達するのに十分に高い量である。血中において到達しようとする治療的に有効な量は、未修飾型タンパク質に対して有効量が確立された方法及び単位製剤に使われた多くの治療用ポリペプチドに対して知られている。その修飾型タンパク質に対して、その投与量は、同じ効果を達成するために選択可能である。治療用途のタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの治療的に有効な量は、治療される特定の状態、治療を受ける患者の年齢及び物理的な条件、状態の重症度、治療の期間、併用療法の性質、処方される特定のタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチド、医薬的に許容される特定の賦形剤及び／または担当医師の知識と熟練度により異なってくる。
【００８１】
本願明細書で使用された「医薬的に許容される賦形剤」という用語は、当業界において周知の生理学的に不活性であり、且つ、薬物学的に不活性な物質を含み、これは使用のために選択される特定のタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの物理及び化学的特徴と両立可能である。医薬的に許容される賦形剤は、ポリマー、レジン、可塑剤、充填剤、潤滑剤、溶媒、溶媒、バッファー系、界面活性剤、保存剤、甘味剤、香料、医薬純度の染料及び色素、及び粘増剤などを含むが、これらに限定されるものではない。本願明細書に記述された医薬組成物に含有される全部または一部の医薬的に許容される賦形剤は、腸溶コーティングの一部になりうる。
【００８２】
本願明細書で使用される、治療用ポリペプチドの「経口投与」または「経口伝達」は、治療用ポリペプチドの胃腸管内への摂取による投与を意味する。通常、本願で提供される経口投与のための組成物は、当該ポリペプチドを血流に吸収させるために下部の腸管内に伝達されるという点で、本願で提供される粘膜伝達とは区別される。
【００８３】
本願明細書で使用される、「下部胃腸管」は、小腸と大腸を意味する。
【００８４】
本願明細書で使用される、治療用ポリペプチドの「粘膜投与」または「粘膜伝達」は、治療用ポリペプチドの鼻腔、肺、膣、肛門、尿道、及び舌下または口腔伝達を含む粘膜表面に投与することを意味する。
【００８５】
本願明細書で使用される、「経口粘膜の」とは、経口及び／または鼻腔咽頭内を覆っている粘膜組織を意味する。
【００８６】
本願明細書で使用される、「腸溶コーティング」は、タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドに適用、該ポリペプチドと組合せた、該ポリペプチドと混合した、または該ポリペプチドに添加される医薬的に許容される賦形剤の混合物と関連がある。腸溶コーティングは、下部腸管においてタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの放出に影響を及ぼすかまたは錠剤、カプセルまたは他の経口投薬剤形の初期消化または分解を防止する。コーティングは、圧縮錠剤、ゼラチンカプセル、及び／またはビーズ、顆粒、粒子、またはタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの凍結乾燥粉末に適用することができ、これらは、澱粉またはゼラチンカプセルにカプセル化可能であるか、あるいは、錠剤に圧縮可能である。
【００８７】
このため、腸溶コーティングは、顆粒、粒子、またはタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの凍結乾燥粉末をはじめとする圧縮錠剤に適用可能であるが、顆粒及び粒子が錠剤に圧縮される前に自体的に腸溶コーティングされる場合には、圧縮錠剤の腸溶コーティングは選択的である。尚、腸溶コーティングは、澱粉またはゼラチンカプセルにカプセル化可能な治療用ポリペプチドのビーズまたは小粒子に適用可能である。好ましくは、カプセル剤は、腸溶コーティングによりコーティング可能である。腸溶コーティングにより、これらの経口製剤は、上部胃腸管内、特に、口、咽喉及び食道の上部胃腸管粘膜及び上皮組織へのタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの不所望の伝達を防止することができる。さらに、コーティングは、コーティングを構成する賦形剤、その剤形及び／または厚さを選択することにより、当業者により操作可能な下部胃腸管内地点への伝達を達成する。
【００８８】
本願明細書で使用される、「遅延型放出」という用語は、タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの伝達を意味する。これは、医薬組成物のタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製剤化することにより行われ、治療用ポリペプチドの伝達にいかなる変更もなかったら達成できなかった筈のさらに末端の下部腸管の一般的に予測可能な任意の位置において放出を達成する。活性成分の遅延型放出に影響を及ぼす代表的な方法は、腸管内特定の目的部位に達するまで活性成分を放出するために腸管内液により未吸収または未分解の物質により活性成分をコーティング（または、その他カプセル化）することを含む。本願の用途のための遅延型放出製剤の代表的な剤形は、通常の小腸のｐＨでは分解されるものの、通常の口腔、咽喉、食道または胃のｐＨでは分解されないｐＨ依存性物質と一緒に活性成分の錠剤、カプセル、または粒子、顆粒またはビーズをコーティングすることにより得られる。しかしながら、タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを含む医薬組成物を経口投与を通じて大腸または小腸から始まる腸管内全長への局所伝達に影響を与えることを目指すのであれば、コーティング物質及び／またはコーティング方法またはタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドと、選択されるコーティング物質または医薬的に許容される賦形剤との組み合わせ方法は、本願明細書に記述されたようにして、または当業者に周知な任意の方法でも多様化または変更可能である。
【００８９】
本願明細書で使用される、「治療用効果」または「治療用利点」は、症状治療の肯定的な結果を意味し、痛症減少、疲労減少、増強された活力または幸福感の促進などの対象体の指標だけではなく、例えば、ＥＰＯポリペプチド治療の場合に、赤血球細胞数（red blood cell count（ＲＢＣ））、血小板数、ヘマクリット（hematocrit（ＨＣＴ））、ヘモグロビン数値（hemoglobin level（hemoglobin Ｃ））などの臨床指標の有益な変化を含む。
【００９０】
本願明細書で使用される、「反応性細胞」は、修飾型治療用ポリペプチドへの露出によりその機能または生存力が維持、促進、向上、再生または任意の方式でも有益化される動物細胞を意味する。
【００９１】
本願明細書で使用される、治療の対象となる「対象体」には、ヒト及びヒトまたは非ヒト動物が含まれる。哺乳動物には、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ及び猿）と、家畜（例えば、犬、馬、猫、豚、山羊、牛）と、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター 及びアレチネズミ）などが含まれる。
【００９２】
本願明細書で使用される、治療の対象となる「患者」または「対象体」には、ヒト及びヒトまたは非ヒト動物が含まれる。哺乳動物には、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ及び猿）と、家畜（例えば、犬、馬、猫、豚、山羊、牛）と、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター 及びアレチネズミ）が含まれる。
【００９３】
本願明細書で使用される、「directed evolution method（方向付けられた進化方法）」は、天然タンパク質または合成タンパク質を含むタンパク質またはタンパク質ドメインが、変化した特徴（例えば、異なるまたは現存する天然または人工の化学的または生物学的環境において作用する能力及び／または新たな機能を誘導する能力及び／または与えられた活性を増減させる能力及び／または与えられた特徴を調節する能力など）を有するように「適合」させる方法を意味する。代表的なdirected evolution methodには、特に、米国公開出願第ＵＳ２００３−０１３４３５１Ａ１号、第ＵＳ−２００４−０１３２９７７Ａ１号に開示のrational directed evolution method（合理的に方向付けられた進化方法）が含まれる。
【００９４】
本願明細書で使用される「２次元合理的変異誘発スキャニング（２Ｄスキャニング）」は、特定のタンパク質配列を２次元でスキャンする、本願で提供された方法を意味する：（１）１次元は、異なるアミノ酸に置換する特定のアミノ酸残基（ｉｓ−ＨＩＴ標的位置と称する。）をタンパク質配列により同定することであり、（２）２次元は、特定のｉｓ−ＨＩＴ標的を置換するために選別されたアミノ酸のタイプ（置換アミノ酸と称する。）である。
【００９５】
本願明細書で使用される、「インシリコ」は、コンピュータを用いて行う研究及び実験を意味する。インシリコ方法には、分子モデリング研究及び生体分子的ドッキング実験が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
本願明細書で使用される、「ｉｓ−ＨＩＴ」は、ｉ）進化させる特定のタンパク質特性、ii）アミノ酸のタンパク質配列及び／または、iii）個々のアミノ酸の公知特性に基づいて同定された、標的タンパク質配列中の、インシリコにて同定されたアミノ酸位置を意味する。タンパク質配列上のこのようなｉｓ−ＨＩＴ位置は、実験的生物学的方法を使用せずに同定される。例えば、一旦最適化させるタンパク質特徴が選別されると、様々な情報源または先行知識（すなわち、タンパク質１次、２次または３次構造、文献、特許）を活用して異なるアミノ酸に置換することにより、タンパク質適合性を向上させるのに適したアミノ酸位置を決定する。この工程は、タンパク質分析「インシリコ」を使用する。進化させる特徴と関連付けられる標的タンパク質の１次配列によるあらゆる候補アミノ酸位置は、本願において、「インシリコＨＩＴ」（「ｉｓ−ＨＩＴ」）と称する。この工程中に、同定された全てのｉｓ−ＨＩＴの集合（ライブラリー）は、本願で提供される２次元スキャニング方法の１次元（標的残基の位置）を示す。
【００９７】
本発明で使われる用語“遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ”は、治療用ポリペプチドの三次元的構造を基準に、糖化部位から０−２５Å以内に位置するものであって、特定の特性または活性（例えば、タンパク質分解酵素抵抗性）を基準に確認されるｉｓ−ＨＩＴ位置をいう。一般に、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基は１つ以上の糖化残基、時々に２つ以上の糖化残基から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５Åの位置にある。
【００９８】
本発明で使われる用語“遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ”は、治療用ポリペプチドの三次元的構造を基準に、糖化部位から０−２５Å内に位置しないものであって、特定の特性または活性（例えば、タンパク質分解酵素抵抗性）を基準に確認されるｉｓ−ＨＩＴ位置をいう。したがって、遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基は糖化により遮蔽されず、ポリペプチドが糖化される場合にも上記ポリペプチドの表面に露出されるものでありうる。
【００９９】
本発明で使われるものであって、ｉｓ−ＨＩＴを同定するという文脈で使われる構文“進化した予め求めた特性または活性をもたらすことができる”は、イン−シリコ分析に基づいて、置換した場合に希望する進化した活性をもたらす特性または特徴を有するものと考えられる、タンパク質上のアミノ酸位置をいう。置換アミノ酸を同定する文脈で使われる構文“進化した予め求めた特性または活性をもたらすことができる”は、イン−シリコ分析に基づいて、未修飾型出発タンパク質の本来のアミノ酸を置換するために使われた場合に希望する活性または予め選択された活性の進化をもたらす特性または特徴を有するものと考えられる特定のアミノ酸形態をいう。
【０１００】
本願明細書で使用される、「ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ：High-Throughput  Scree- ning）」は、関心対象の構造を同定するか、あるいは、変異体タンパク質またはこれを含有する細胞と相互作用する検査化合物を同定するために、検査タンパク質試料または関心対象のタンパク質をコードする核酸を含有する細胞試料などの多数の試料を検査する方法を意味する。ＨＴＳ作動は自動化に適しており、通常コンピュータ化されてサンプル製造、アッセイ過程及びその後の大量のデータの処理を行う。
【０１０１】
本願明細書で使用される、「制限された」という用語は、アミノ酸置換のために選別されたタンパク質のアミノ酸残基中のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸の位置の同定及び／または置換アミノ酸の同定と関連し、タンパク質骨格上の全てのアミノ酸よりも少数のアミノ酸がアミノ酸置換のために選別及び／または未修飾の開始タンパク質に存在する元のアミノ酸を置換するのに利用可能な残りの１９個のアミノ酸全てよりも少数のアミノ酸が置換のために選別されるということを意味する。本願で提供される方法の特定の態様において、ｉｓ−ＨＩＴアミノ酸の位置はタンパク質骨格上の全てのアミノ酸よりも少数のアミノ酸がアミノ酸置換のために選別されるように制限される。他の態様において、置換アミノ酸は、未修飾の開始タンパク質に存在する天然アミノ酸を置換するのに利用可能な残りの１９個のアミノ酸全てよりも少数のアミノ酸が置換アミノ酸として選別されるように制限される。代表的な態様において、ｉｓ−ＨＩＴアミノ酸の位置及び置換アミノ酸を同定するためのスキャンは、いずれも、タンパク質骨格上の全てのアミノ酸よりも少数のアミノ酸がアミノ酸置換のために選別され、天然アミノ酸を置換するのに利用可能な残りの１９個のアミノ酸全てよりも少数のアミノ酸が置換のために選別されるように制限される。
【０１０２】
本願明細書で使用される、「候補ＬＥＡＤ」は、変更が意図された化学的、物理的または生物学的特性または活性が通常的に予め決定されるかまたは予め選別された特性、活性または他の属性において潜在的に変更されるように講じられた変異タンパク質である。変更は、ポリペプチドの特性、活性、または他の属性を追加、変更、除去または変化させることができる。本願の方法において、候補ＬＥＡＤは、一般的に、タンパク質またはこのドメインのｉｓ−ＨＩＴ位置を、通常、例えば、ＰＡＭ分析を用いて得られるなどの、残りの１９個のアミノ酸の制限されたサブセットまたは全部を用いて体系的に置換することにより生成される。候補ＬＥＡＤは、本願のハイスループット方法により検査された当業者に公知の他の方法により生成可能である。
【０１０３】
本願明細書で使用される、「ＬＥＡＤ」は、特性、活性または他の属性が変更、最適化、向上、追加、除去された「候補ＬＥＡＤ」である。本願の目的から、「ＬＥＡＤ」は、通常、そのような活性または特性を発現させる未修飾型ポリペプチドにおいて関心対象である特性または活性に対して未修飾型ポリペプチドまたは未修飾型及び／または野生型（天然型）タンパク質が有する活性または属性と１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の異なる活性を有する。特定の態様において、活性の変化は、未修飾天然型タンパク質の活性よりも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上である。活性の増強または減少でありうる目的とする変更は、関心ある機能または特性により異なってくる（例えば、約１０％、約２０％など）。ＬＥＡＤを同じタンパク質分子上の多数（２以上）の「ｉｓ−ＨＩＴ」標的位置の置換によりさらに最適化させて「スーパーＬＥＡＤ」を生成することができる。
【０１０４】
本願明細書で使用される、「スーパーＬＥＡＤ」という用語は、２以上のＬＥＡＤ分子に存在する単一変異を単一タンパク質分子内に加えることにより得られたタンパク質変異体（変異体）を意味する。このため、本願で提供される修飾型タンパク質と関連し、「１以上の単一アミノ酸置換を含むタンパク質」という文言は、一つのそれぞれのタンパク質に対して本願明細書に記述された２以上の変異を加えることを含む。例えば、１以上の単一アミノ酸置換を含有する本願で提供される修飾型タンパク質は、公開された置換位置に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のうち任意の数のアミノ酸置換を有することができる。スーパーＬＥＡＤ変異分子の集合は、可能なアレイにおいて１つずつ生成され、検査され、表現型的に特徴づけされる。スーパーＬＥＡＤ変異分子は、様々な数及び種類のＬＥＡＤ変異を含有する分子である。進化する特定の特徴に対してさらに向上された適合性を示すこれらの分子をスーパーＬＥＡＤと称する。スーパーＬＥＡＤは、当業者に公知の他の方法により生成することができ、本願のハイスループット方法により検査することができる。本願の目的から、スーパーＬＥＡＤは、通常、関心対象の機能に対してＬＥＡＤの変化した活性（または、新規活性または除去された活性）と目的とする量に見合う分だけ、例えば、これが由来するＬＥＡＤ変異体よりも少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の異なる活性を有する。ＬＥＡＤでのように、スーパーＬＥＡＤに対する活性の変化は、「進化する」活性により異なってくる。活性の増減でありうる目的とする変更は、関心対象の機能または特性により異なってくる。目的とする変更は、特性または活性の追加であっても除去であってもよい。
【０１０５】
本願明細書で使用される、「変化した位置」という文言は、異なる置換アミノ酸に置換されて目的とする表現型または活性が変化した、ＬＥＡＤまたはスーパーＬＥＡＤ内のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置を意味する。
【０１０６】
本願明細書で使用される、「露出された残基」は、表面の１５％以上が溶媒に露出された残基を示す。
【０１０７】
本願明細書で使用される、「構造的相同性」という文言は、２以上のタンパク質骨格間の空間的一致の度合いを意味する。同じタンパク質構造を取り、維持し、空間において３次元構造の重ね合わせに類似性を示すタンパク質骨格は構造的に相同であると考えられる。構造的相同性は、配列相同性によるものではなく、３次元相同性によるものである。両タンパク質間の構造的相同性により相同であると言える２つの異なるタンパク質にある２つのアミノ酸が必ずしも配列に基づく相同性領域に存在する必要はない。例えば、お互いのある空間位置または規定した領域での平方根平均乗（ＲＭＳ）の偏差が３．５、３．０、２．５、２．０、１．７または１．５Å未満であるタンパク質骨格は、その領域において構造的に相同であると考えられ、本願において、骨格間「高い一致性」を有するという。本願は、一定の程度の構造的相同性を共有する２以上の異なるタンパク質配列上に位置する実質的に同等な（例えば、「構造的関連性がある」）アミノ酸位置は類似する機能的任務を有すると考慮され：本願において、「構造的に相同な位置」とも呼ばれる。このような２つのアミノ酸は、配列を整列したときにアミノ酸配列上のこれらの正確な直鎖上の位置が互いにマッチしていないとしても、互いに「構造的に類似するか」、あるいは、「構造的に関連する」といえる。「構造的に関連する」アミノ酸は、伝統的な配列相同性の規則に即して配列を整列させると、１次タンパク質配列において互いに遠くに離れていることができる。
【０１０８】
本願明細書で使用される、「構造的相同体」は、構造的相同性により認知されるタンパク質である。代表的なＥＰＯの構造的相同体は、他の多数のサイトカイン、例えば、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、Ｆｌｔ３リガンド及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。
【０１０９】
本願明細書で使用される、２つのＥＰＯポリペプチドまたはＥＰＯの構造的相同体である他のポリペプチドなどの２以上のポリペプチド上の「対応する構造的に関連する」位置は、ポリペプチド間の３次元重畳を最大化させる構造的相同性により決定されるアミノ酸位置を言う。
【０１１０】
本願明細書で使用される、「変異体」、「治療用ポリペプチド変異体」、「修飾型治療用ポリペプチド」及び「修飾型治療用タンパク質」は、未修飾型治療用ポリペプチドと比べて１以上の変異を有する治療用ポリペプチドを意味する。「エリスロポエチン変異体」、「修飾型エリスロポエチンポリペプチド」及び「修飾型エリスロポエチンタンパク質」は、未修飾型エリスロポエチンポリペプチドと比べて１以上の変異を有するＥＰＯポリペプチドを意味する。１以上の変異は、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失及びこれらの任意の組み合わせでありうる。通常、修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて１次配列に１以上の修飾の有する。例えば、本願で提供される修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の変異を有することができる。天然型ポリペプチドと関連し、少なくとも１以上の活性を示す結果、ポリペプチドの長さ分の任意の長さのポリペプチドが考慮される。
【０１１１】
本願明細書で使用される、「単一アミノ酸置換」は、一つのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されることを意味する。天然アミノ酸または非天然アミノ酸により置換可能である。タンパク質内において一つのアミノ酸が他のアミノ酸により置換される場合、タンパク質の合計のアミノ酸数は変化しない。
【０１１２】
本願明細書で使用される、「単一のアミノ酸置換がそれぞれの標的タンパク質において起こる」という文言は、単一アミノ酸の変化により標的タンパク質の未修飾型と異なる標的タンパク質の修飾を意味する。例えば、一態様において、タンパク質骨格上の単一のｉｓ−ＨＩＴ標的位置において単一アミノ酸残基を置換することにより変異誘発を行って（例えば、アドレス可能なアレイにおいて「１つずつ」）、生成された個々の変異体がそれぞれの単一変異誘発反応の単一生成物となるように行う。それぞれのｉｓ−ＨＩＴ標的位置において選別されたそれぞれの置換アミノ酸に対して単一アミノ酸置換変異誘発反応を反復して行う。このため、多数の変異タンパク質分子が産生され、これにより、それぞれの変異タンパク質は単一のｉｓ−ＨＩＴ標的位置にしか単一アミノ酸置換を含有しない。
【０１１３】
単一または多重アミノ酸置換と関連し、本願明細書で使用された「疑似野生型」という文言は、あるアミノ酸位置において元（例えば、天然）のアミノ酸と異なるが、特定のタンパク質活性の測定可能な変化をもたらさずに、上記の位置において天然アミノ酸を置換可能なアミノ酸である。
【０１１４】
変異分子の集合をコードする核酸分子のセットの集団（ライブラリー）を生成させ、表現型的に特徴づけて、元のアミノ酸と異なるアミノ酸配列を有するものの、元のタンパク質と実質的に同じレベル（すなわち、タンパク質により少なくとも約１０％、５０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以上）及び目的とする活性のタイプを依然として有するタンパク質を選別する。集団（または、ライブラリー）は、２、３、４、５、１０、５０、１００、５００、１０００、１０３、１０４個またはそれ以上の修飾型治療用ポリペプチドを含有する。
【０１１５】
本願明細書で使用される、タンパク質の「位置において、または、アミノ酸位置に対応する位置において」は、特定の標準タンパク質と配列及び／または構造的アライメント（整列）により相互に対応すると決定されるアミノ酸位置を意味する。例えば、配列番号２に示されるヒトＥＰＯのアミノ酸位置に対応する位置は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を関心対象の特定のＥＰＯポリペプチドと一緒に整列することにより実験的に決定することができる。当業者であれば、手動によるアライメントまたは利用可能な多数のアライメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）を用いて対応する位置を決定することができる。また、対応する位置は、例えば、タンパク質構造のコンピュータによってシュミレーションされたアライメントを使用することによる構造的アライメントに基づく。ポリペプチドのアミノ酸が公開された配列のアミノ酸に対応するということは、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的なアライメントアルゴリズムを用いて同一性または相同性が最大化される（保存アミノ酸が整列される）ように公開された配列と一緒にポリペプチドを整列時に同定されるアミノ酸を意味する。
【０１１６】
本願明細書で使用される、「〜に対応する位置において」は、他の標準核酸分子またはタンパク質の位置に相対的な核酸分子またはタンパク質の関心対象の位置（すなわち、塩基番号または残基番号）を意味する。他の標準タンパク質における位置に対する関心対象の位置は、例えば、前駆体タンパク質、対立遺伝子型変異体、異種タンパク質、他の種（すなわち、種変異体）の同じタンパク質由来のアミノ酸配列などにありうる。配列を比較し、且つ、整列して対応するヌクレオチドまたは残基の数を、例えば、配列間の同一性が９５％を越え、好ましくは、９６％を超え、より好ましくは、９７％を超え、さらに好ましくは９８％を超え、最も好ましくは、９９％を超えるように最大化させることにより、対応する位置を決定することができる。次いで、標準核酸分子にアサインされた番号を関心対象の位置に付与する。
【０１１７】
本願明細書で使用される、「相同性」及び「同一性」という用語は相互交換的に使用されるが、タンパク質の相同性には保存的アミノ酸変化が含まれうる。一般的に、対応する位置を同定するためにアミノ酸配列を整列して最も高い整合度を得る（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al., (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。
【０１１８】
本願明細書で使用される、「配列同一性」は、検査及び標準ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較において同じアミノ酸（または、ヌクレオチド塩基）の数を意味する。相同性ポリペプチドは同一または相同のアミノ酸残基の所定の数を意味する。相同性には、同じ残基だけではなく、保存的アミノ酸置換も含まれる。配列同一性は、各供給者によって設定されたデフォルトギャップペナルティ（default gap penalties）を用いて使用される標準的なアライメントアルゴリズムプログラムによって測定することができる。相同核酸分子は同一または相同のヌクレオチドの所定の数を意味する。相同性には、同じ残基だけではなく、コードされたアミノ酸を変化させない置換（例えば、「サイレント置換」）が含まれる。実質的に相同の核酸分子は、通常、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーで、関心対象の核酸の全長にわたってまたは全長核酸分子の約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％に亘ってハイブリダイズする。また、ハイブリダイズした核酸分子のコドンの代わりに縮退性コドンを含有する核酸分子も考慮される（タンパク質の相同性の測定のために、同じアミノ酸だけではなく、保存的アミノ酸も整列させることができ、この場合に、同一性のパーセント及び相同性のパーセントが異なってくる）。任意の２つの核酸分子（または、任意の２つのポリペプチド）が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同じ」ヌクレオチド配列（または、任意の両ポリペプチドが有するアミノ酸配列）を有するかどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて、例えば、文献（［Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］）におけるデフォルトパラメータを用いて決定することができる  （他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ [Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)参照）、BLASTP, BLASTN, FASTA（[Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), and Carillo et al.,  SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)参照)が含まれる）。  例えば、 National Center for Biotechnology InformationデータベースのＢＬＡＳＴ機能を用いて同一性を測定することができる。市販または公衆入手可能な他のプログラムには、DNAStar  「Meg  Align」プログラム（Madison,WI）及び University of Wisconsin Genetics Computer Group（UWG）「Gap」プログラム（Madison WI）が含まれる。タンパク質及び／または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより測定することができる（Needleman et al.,  J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), as revised by Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)参照）。簡略に説明すれば、ＧＡＰプログラムは類似する整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうち短い配列の記号の総数で割った値であり、類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータは、（１）１進法比較マトリックス（等しい場合には１の値、等しくない場合には０の値を含む）及び文献（Gribskov et al., Nucl. Acids Res. 14:6745(1986)参 照）の重み付け比較マトリックス（これは、  文献（Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biome  dical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)参照）に記述さ れている）、（２）それぞれのギャップの場合
に３．０のペナルティ及びそれぞれのギャップにある各記号の場合に付加的な０．１０ペナルティを含むことができ、（３）末端ギャップの場合にペナルティを含まないこともある。
【０１１９】
このため、本願明細書で使用される、「同一性」という用語は、検査及び標準ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を示す。一つの非制限的実施例において、「〜と少なくとも９０％同じ」は、標準ポリペプチドに対する９０〜１００％のパーセント同一性を意味する。９０％以上レベルの同一性は、例示目的に１００個のアミノ酸長の検査及び標準ポリヌクレオチドを比較すると想定するとき、検査ポリペプチドの１０％（すなわち、１００個のうち１０個）以下のアミノ酸が標準ポリペプチドのアミノ酸と異なるということを示す。検査及び標準ポリヌクレオチド間の類似する比較を行うことができる。このような差は、アミノ酸配列の全長に亘ってランダムに分布された点変異として現れるか、あるいは、許容される最大長さ（例えば、１０／１００アミノ酸差（約９０％同一性））以下の様々な長さの１以上の位置に密集している。差は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５から９０％以上の相同性または同一性のレベルにおいて、結果はプログラム及びギャップパラメータセットと独立的である必要があり、このような高い同一性レベルは時々ソフトウェアに依存せずに容易に評価可能である。
【０１２０】
本願明細書で使用される、「配列関連タンパク質」という文言は、互いに少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または相同性を有するタンパク質を意味する。
【０１２１】
本願明細書で使用される、非関連タンパク質または「配列非関連タンパク質」の群は、互いに５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満のアミノ酸同一性または相同性を有するタンパク質を意味する。
【０１２２】
本願明細書で使用される、「実質的に同じ」または「類似する」という用語は、当業者による理解範疇により異なってくるということを理解する必要がある。
【０１２３】
本願明細書で使用される、「ネイキッドポリペプチド鎖(naked polypeptide chain)」は、翻訳後に修飾されるかまたは別途に化学的に修飾されず、単に共有結合されたアミノ酸のみを含有するポリペプチドを意味する。
【０１２４】
本願明細書で使用される、ポリペプチド複合体には、化学的修飾または翻訳後修飾により産生されるポリペプチドが含まれる。このような修飾には、ＰＥＧ化、アルブミン化、糖化、ファルネシル化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化及び当業界に公知の他のポリペプチド修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
本願明細書で使用される、「アウトプットシグナル」は、経時的に追跡して任意に定量化可能なパラメータを意味する。例えば、組換えタンパク質を細胞内に導入する場合、組換えタンパク質を含有する細胞は多くの変化を経る。モニターして形質転換または形質感染を評価するのに使用可能な任意のこのような変化がアウトプットシグナルであり、当該細胞をレポータ細胞と称し、コード核酸をレポータ遺伝子と称し、コード核酸を含む製作物はレポータ製作物である。アウトプットシグナルには、酵素活性、蛍光、発光、産物の産生量及び他のこのようなシグナルが含まれるが、これらに限定されるものではない。アウトプットシグナルには、プラスミドウィルス内に挿入された異種遺伝子（トランス遺伝子）を含む、遺伝子または遺伝子産物の発現が含まれる。アウトプットシグナルは、時間（「ｔ」）の関数であり、組成物に用いられるタンパク質の量と関連する。より高濃度のタンパク質の場合、アウトプットシグナルはより高くてもよく、より低くてもよい。任意の特定濃度の場合、アウトプットシグナルはプラトウに達するまで時間の関数として増加する。尚、アウトプットシグナルは、細胞間及び異種遺伝子の発現及び生物学的製剤間の相互作用を測定することができる。
【０１２６】
本願明細書で使用される、変異体の集合（ライブラリー）をコードする核酸分子のセットの集団は、遺伝子変異体を保有（すなわち、コードする）するプラスミドまたは他のベヒクルの集合を意味する。このため、個々のプラスミドまたは他の個々のベヒクルは、個々の遺伝子変異体を保有する。集合の各要素（または、構成要素）は適切なアドレス可能なアレイにおいて互いに物理的に分離されており、独立した変異誘発反応の単一産物として生成される。このようなタンパク質の集合（または、ライブラリー）が考慮される場合、これも同様である。集合（または、ライブラリー）は、３、４、５、１０、５０、１００、５００、１０００、１０３、１０４個、またはそれ以上の修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチドを含む。
【０１２７】
本願明細書で使用される、「レポータ細胞」は、条件に対して反応して変化する細胞である。例えば、タンパク質またはウィルスへの露出、または外部若しくは内部環境の変化に対して反応して、レポータ細胞は、「報告する」（すなわち、変化を表示または発現する）。
【０１２８】
本願明細書で使用される、「レポータ」または「レポータ残基」は、細胞により発現されるタンパク質などの関心対象の分子を検出可能にする任意の残基を意味する。レポータ残基には、蛍光タンパク質（例えば、赤色、青色及び緑色蛍光タンパク質）、ＬａｃＺ及び他の検出可能なタンパク質及び遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞における発現の場合、レポータ残基をコードする核酸は、関心対象のタンパク質と一緒に融合タンパク質として発現されるか、あるいは、関心対象のプロモータの制御下で発現可能である。
【０１２９】
本願明細書で使用される、表現型は、遺伝子型（遺伝子の配列）の物理的、生理学的または他の発現を意味する。本願の方法において、遺伝子型の変更から惹起される表現型が評価される。
【０１３０】
本願明細書で使用される、培養培地は、エクスビボでの哺乳動物の生存力、成長及び／または分化を支持するのに適した任意の培地である。任意のこのような培地は当業者に公知されている。培養培地の例には、X-Vivo15（BioWhittaker）、RPMI1640、ＤＭＥＭ、Ham's F12、McCoys 5A及びMedium199が含まれるが、これらに限定されるものではない。培地には、血清、血清タンパク質、成長抑制物質及び成長促進物質（例えば、ミトゲンモノクローナル抗体）及び遺伝的に操作または変形された細胞を選別するための選別剤を含む付加成分が補充可能である。
【０１３１】
本願明細書で使用される、本願で提供される様々なアミノ酸配列に示されるアミノ酸は、公知の３文字または１文字の略語により識別される（表１）。様々な核酸断片に現れるヌクレオチドは、当業界において汎用される標準１文字名称と命名する。
【０１３２】
本願明細書で使用される、「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２以上のアミノ酸を含む。本願の目的から、アミノ酸には、２０個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸及びアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。
【０１３３】
本願明細書で使用される、任意の保護基、アミノ酸及び他の化合物に対する略語は、特に断わりのない限り、これらの通常の用法、公認された略語またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature ((1972) Biochem. 11: 1726）による。それぞれの天然Ｌ−アミノ酸は、標準３文字コード（または、１文字コード）またはpreEPO「L-」が付く標準３文字コード（または、１文字コード）により識別され、preEPO「D-」は、アミノ酸の立体異性形態がＤであるということを示す。
【０１３４】
本願明細書で使用される、「アミノ酸残基」は、ペプチド結合においてポリペプチドの化学的分解（加水分解）時に形成されるアミノ酸を意味する。本願明細書に記述されたアミノ酸残基は、「Ｌ」異性形態であると想定する。「Ｄ」と命名された「Ｄ」異性形態の残基は、ポリペプチドが目的とする機能的特性を保有する限り、任意のＬ−アミノ酸残基に置換可能である。「ＮＨ２」は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。「ＣＯＯＨ」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。文献（J. Biol. Chem., 243:3552-3559(1969)参照）に記述され、且つ、37 C.F.R. mm3 1.821-1.822に採択された標準ポリペプチド命名法により、アミノ酸残基に対する略語を表１に示す：
【０１３５】
【表１】
2011520472.tif 000003
【０１３６】
公式により本願に示す全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう伝統的な方向に従って、左側から右側に向かって配向するという点に留意すべきである。また、「アミノ酸残基」という文言は、対応表（表１）に列記するアミノ酸及び独特な修飾アミノ酸（例えば、本願に参照として取り込まれた37 C.F.R. mm3 1.821-1.822に示すアミノ酸）を含むと広範に定義される。しかも、アミノ酸残基配列の先頭または末端におけるダッシュは、ＮＨ２などのアミノ末端基またはＣＯＯＨなどのカルボキシ末端基に対する、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合を示すという点に留意すべきである。
【０１３７】
本願明細書で使用される、「天然アミノ酸」は、ポリペプチドに現れる２０個のＬ−アミノ酸を意味する。
【０１３８】
本願明細書で使用される、「非天然アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸と類似の構造を有するものの、構造的に改変されて天然アミノ酸の構造及び反応性を模倣するような有機化合物を意味する。このため、非天然アミノ酸には、例えば、２０個の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸類似体が含まれ、アミノ酸のＤ−イソ立体異性体が含まれるが、これらに限定されるものではない。代表的な非天然アミノ酸は本願明細書に記述されており、且つ、当業者に公知されている。
【０１３９】
本願明細書で使用される、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質核酸（ＰＮＡ）及びその混合物を含むその類似体が含まれる。核酸は、一重鎖であっても二重鎖であってもよい。プローブまたはプライマー（検出可能な標識（例えば、蛍光または放射性標識）により任意に標識された）を言及する場合、一重鎖分子が考慮される。このような分子は、通常、ライブラリーをプロービングまたはプライミングするために、統計学的に低いコピー数（通常的に５個未満、一般的に３個未満）の特徴を有するような長さである。一般的に、プローブまたはプライマーは、関心対象の遺伝子に対して相補的であるかまたは同一の少なくとも１０、１５、２０、２５または３０個以上の連続した配列を含む。プローブ及びプライマーは、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上、２０個またはそれ以上、３０個またはそれ以上、５０個またはそれ以上、１００個またはそれ以上の核酸長でありうる。
【０１４０】
本願明細書で使用される、異種または外来核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は相互交換的に用いられ、これが存在するゲノムの一部として自然的に発生しないか、あるいは、自然に存在するゲノム内の位置または位置と異なる位置または位置において発見されるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。異種核酸には、これが導入される細胞に対して内因性ではなく、他の細胞から得られたか、あるいは、合成により製造された核酸が含まれる。一般的に、必須的ではないが、このような核酸はこれが発現される細胞により一般的に産生されないＲＮＡ及びタンパク質をコードする。本願において、異種ＤＮＡは、これが発現される細胞または位置に対して異種または外来のものとして当業者が認識若しくは考慮する任意のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。さらに、異種ＤＮＡ及びＲＮＡは、転写、翻訳または他の調節可能な生化学的過程に影響を与えることにより内因性ＤＮＡの発現を媒介または変更するＲＮＡまたはタンパク質をコードすることができる。異種核酸の例には、追跡可能なマーカータンパク質（例えば、薬物抵抗性を付与するタンパク質）をコードする核酸、治療学的に有効な物質（例えば、抗癌剤）をコードする核酸、酵素及びホルモンをコードする核酸、及び他の種類のタンパク質（例えば、抗体）をコードするＤＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。このため、本願の異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡには、ゲノムにおいて発見される対応物ＤＮＡ分子と正確な配向及び位置に存在しないＤＮＡ分子が含まれる。これはまた、他の有機体または種からの（すなわち、外因性の）ＤＮＡ分子を意味することがある。
【０１４１】
本願明細書で使用される、「核酸分子、ポリペプチドまたは他の生物分子と関連して分離された」は、核酸またはポリペプチドが当該ポリペプチドまたは核酸を得た遺伝的環境から分離されたということを意味する。これはまた、自然状態から変化したことを意味することもある。例えば、当該用語が本願明細書で使用される、生きている動物に自然的に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「分離された」ものではないが、この天然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「分離された」ものである。このため、組換え宿主細胞内に産生され、及び／または、含有されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは分離されたものと考慮する。また、組換え宿主細胞または天然供給源から部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドが「分離されたポリペプチド」または「分離されたポリヌクレオチド」として意図される。例えば、組換えにより産生された化合物バージョンは、文献［Smith et al., Gene, 67:31-40(1988)参照］に記述された一段階法により実質的に精製することができる。分離された及び精製されたという用語は相互交換的に使用することができる。
【０１４２】
このため、「分離された」は、核酸が有機体の天然ゲノムにおいて（もし、あるとすれば）、関心対象の核酸をコードする遺伝子の直ぐ側面に位置する遺伝子のコード配列を含有しないことを意味する。分離されたＤＮＡは一重鎖であっても二重鎖であってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡまたは合成ＤＮＡでありうる。これは、開始ＤＮＡ配列と同じであるか、あるいは、１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換により上記の配列と異なる。
【０１４３】
生物学的細胞または宿主から製造された「精製された」製剤は、関心対象のＤＮＡまたはタンパク質の未精製抽出物を含む提示ＤＮＡまたはタンパク質を含有する細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された製剤は個々の技術または一連の製造用または生化学的技術により得られ、関心対象のＤＮＡまたはタンパク質はこのような製剤に様々な度合いの純度をもって存在することができる。前記方法には、アンモニウムサルフェイト分画化、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離及び電気泳動が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
「実質的に純粋な」または「分離された」ＤＮＡまたはタンパク質の製剤は、天然に存在する物質を実質的に含まない製剤であって、このようなＤＮＡまたはタンパク質は通常は天然に関連しており、一般的には、５％以下の他の混入物質を含む。
【０１４５】
関心対象のＤＮＡまたはタンパク質を含有している細胞抽出物は、関心対象のタンパク質を発現させるか、あるいは、関心対象のＤＮＡを含有する細胞から得られた均質な製剤または細胞非含有製剤を意味する。「細胞抽出物」という用語は、培養培地、特に細胞が除去された使用済み培養培地を含むものと意図される。
【０１４６】
本願明細書で使用される、「標的化剤」は、抗体、受容体またはリガンドなどの他の標的分子に結合可能な任意の分子を意味する。
【０１４７】
本願明細書で使用される、「受容体」は、他の分子に（または、他の分子と）特異的に結合する生物学的に活性を示す分子を意味する。「受容体タンパク質」という用語を用いて特定の受容体のタンパク質性性質をさらに具体的に表わすことができる。
【０１４８】
本願明細書で使用される、「組換え体」は、遺伝子操作の結果として形成された任意の子孫を意味する。
【０１４９】
本願明細書で使用される、「プロモータ領域」は、これが作動的に結合されたＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの一部分を意味する。プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合及び転写開始に十分なＤＮＡの特定配列が含まれる。このようなプロモータ領域の一部分を「プロモータ」と称する。また、プロモータ領域にはこのようなＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列が含まれる。調節の性質により、プロモータは構成的であるか、あるいは、シス作用またはトランス作用因子により調節可能である。
【０１５０】
本願明細書で使用される、核酸分子に関連して「操作的に結合された」という文言は、配列または断片が一重鎖型または二重鎖型のＤＡＮ断片に共有結合されることにより、１本の断片上の制御または調節配列が他の断片の発現または複製または他のこのような制御を調節または許容することを意味する。２本の断片は必ずしも連続したものであるとは限らない。遺伝子発現の場合、ＤＮＡ配列及び調節配列は、適切な分子（例えば、転写活性化剤タンパク質）がこのような調節配列に結合されれば遺伝子発現を制御または許容するように結合される。
【０１５１】
本願明細書で使用される、「組換えＤＮＡ方法を用いた組換え手段による産生」は、クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質を発現させるための周知の分子生物学方法の使用を意味し、ここには遺伝子のクローニング発現及び方法が含まれる。
【０１５２】
本願明細書で使用される、スプライシング変異体は、１種類以上のｍＲＮＡを生成するゲノムＤＮＡの１次転写体のディファレンシャルなプロセッシングにより産生された変異体を意味する。
【０１５３】
本願明細書で使用される、組成物は、２種類以上の生成物または化合物（例えば、製剤、修飾因子、調節因子など）の任意の混合物を意味する。これは、溶液剤、懸濁液剤、液剤、散剤、ペースト剤、水性、非水性製剤またはこられの任意の配合物でありうる。
【０１５４】
本願明細書で使用される、組み合わせ（複合剤）は、２以上のアイテム間の任意の会合を意味する。対象体投薬のための複合剤アイテムは、それぞれ別々にまたは一緒に投与可能であり、同時にまたは連続して使用可能であり、一緒にまたはそれぞれ別々に包装可能である。本願明細書で使用される、「製品」は、製造されて市販される産物である。この明細書の全体に亘って使用される、当該用語は、包装された製品に含有された、本願明細書に記述された修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチド及び／または核酸である医薬組成物を含むものと意図される。
【０１５５】
本願明細書で使用される、「キット」は、本願明細書に記述するように、本願で提供される医薬組成物と投薬、診断、及び本願明細書に記述されたポリペプチドの活性または特性評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを提供する修飾型ポリペプチドまたは核酸分子の組み合わせを意味する。キットは選択的に使用説明書を含む。
【０１５６】
本願明細書で使用される、「生成物と実質的に同じ」は、関心対象の特性が十分に変わらない程度に十分に類似であることから実質的に同じ生成物を生成物の代わりに使用することができるということを意味する。
【０１５７】
本願明細書で使用される、「ベクター」という用語は、ここに結合された他の核酸を輸送可能な核酸分子を意味する。代表的なベクターの１種類はエピソームであり、すなわち、染色体の外部において複製可能な核酸である。代表的なベクターは、自律的な複製が可能であり、及び／または、結合されている核酸が発現可能なものである。このようなベクターは、通常、複製オリジンを含む。また、ベクターは、宿主染色体内に取り込まれるように考案可能である。ベクターと作動的に結合された遺伝子の発現を指示可能なベクターは、本願において「発現ベクター」と称する。発現ベクターは時々「プラスミド」型であり、これは、一般的に、環状二重鎖ＤＮＡループを意味し、これは、これらのベクター型において染色体に結合されていない。プラスミドはベクターとして最も汎用されて、「プラスミド」及び「ベクター」として相互交換的に使用する。発現ベクターの他のこのような形態は同等な機能を提供し、これに関して当業界に公知されている。
【０１５８】
本願明細書で使用される、ベクターは、「ウィルスベクター」または「ウィルス性ベクター」を含む。ウィルス性ベクターは、外因性遺伝子を細胞内に伝達するために外因性遺伝子に作動的に結合された（ベヒクルまたはシャトルとして）操作されたウィルスである。
【０１５９】
本願明細書で使用される、「対立遺伝子」は、本願において「対立遺伝子変異体」と相互交換的に用いられ、集団の中で遺伝子またはその一部の代替的な形態を意味する。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占有する。対象体が遺伝子に２つの同じ対立遺伝子を有する場合、対象体は当該遺伝子または対立遺伝子に対して同型接合性であると言う。対象体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子有する場合、対象体は当該遺伝子に対して異種接合性であると言う。特定の遺伝子の対立遺伝子は単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドにおいて互いに異なっていてもよく、ヌクレオチドの置換、欠失及び挿入を含むことができる。遺伝子の対立遺伝子型はまた、変異を含有する遺伝子の形態でありうる。一般的に、対立遺伝子変異体は、少なくとも野生型及び／または同じ種から主な形態と８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。
【０１６０】
本願明細書で使用される、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、オープンリーディングフレームを含有し、少なくとも１以上のエクソン及び任意にイントロンコード配列を含む核酸分子を意味する。遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。遺伝子にはコード領域に先行する領域及びそれに続く領域（リーダー及びトレーラー(trailer)）が含まれうる。
【０１６１】
本願明細書で使用される、「イントロン」は、遺伝子に存在するがｍＲＮＡの成熟化中にスプライシングされるＤＮＡ断片を意味する。
【０１６２】
本願明細書で使用される、「配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」は、特定の配列番号１を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を意味する。
【０１６３】
「相補鎖」という用語は、本願において「相補体」という用語と相互交換的に使用される。核酸鎖の相補体は、コーディング鎖の相補体であっても非−コーディング鎖の相補体であってもよい。二重鎖核酸を言及する場合、特定の配列番号１に示される配列を有するアミノ酸残基を含有するポリペプチドをコードする核酸の相補体は、特定の配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする鎖の相補鎖または特定の核酸配列の相補鎖のヌクレオチド配列を含む任意の核酸分子を意味する。ヌクレオチド配列を含む一重鎖核酸分子を言及する場合、前記核酸の相補体は、特定の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸である。
【０１６４】
本願明細書で使用される、「コード配列」という用語は、タンパク質に存在するアミノ酸配列をコードする遺伝子部分を意味する。
【０１６５】
本願明細書で使用される、「コード配列」という用語は、タンパク質に存在するアミノ酸配列をコードする遺伝子の部分を意味する。
【０１６６】
本願明細書で使用される、「センス鎖」という用語は、二重鎖核酸分子によりコードされたアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの配列を有する二重鎖核酸分子の鎖を意味する。
【０１６７】
本願明細書で使用される、「アンチセンス鎖」という用語は、二重鎖核酸分子によりコードされたアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの配列の相補体である二重鎖核酸分子の鎖を意味する。
【０１６８】
本願明細書で使用される、「アレイ」は、３つまたはそれ以上の構成要素を含む核酸分子などの要素の集合を意味する。アドレス可能なアレイは、通常、固相支持体上の位置により、または、色、蛍光、電気的シグナル（すなわち、ＲＦ、マイクロ波または関心対象の分子の相互作用を実質的に変形させない周波数）、バーコードまたは他の記号、化学的または他のこのような標識などの同定または検出可能な標識により、アレイの構成要素を同定可能なアレイである。特定の態様において、アレイの構成要素は、固相の表面上に分離された同定可能な位置に固定されているか、直接的または間接的に同定可能な標識に結合されているか、あるいは、結合されるが、例えば、微細球体または他の微粒子支持体（本願において、ビーズと称する。）に付着されており、溶液に懸濁されているか、または、表面上に塗布されている。
【０１６９】
本願明細書で使用される、「支持体」（例えば、マトリックス支持体、マトリックス、不溶性支持体または固体支持体など）は、関心対象の分子（例えば、生物学的分子、有機分子または生物特異的リガンド）が結合または接触される任意の固体、半固体または不溶性支持体を意味する。このような物質には、化学的及び生物学的分子合成及び分析のためのアフィニティマトリックスまたは支持体として用いられる任意の物質が含まれ、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デッキストラン、キチン、砂、 軽石、アガロス、多糖類、デンドリマー、ブキーボール（buchyball）、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、及び固相合成、アフィニティ分離及び精製、ハイブリダイズ反応、免疫アッセイ及び他のこのような適用のための支持体として用いられる他の物質があるが、これらに限定されない。本願のマトリックスは、微粒子であってもよく、連続的表面（例えば、マイクロタイターディッシュまたはウェル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュまたは他のこのような物質）の形態で存在しうる。微粒子である場合、通常、粒子は５〜１０ｍｍの範囲またはさらに小さな１次元以上を有する。本願において「ビーズ」と総称するこのような粒子は時々球状であるが、必ずしもその限りではない。しかしながら、このような言及はマトリックスの幾何学を制限せず、これは、ランダム状、針状形、繊維形及び延長形をはじめとする任意の形状でありうる。液相中で使用可能な略球状の「ビーズ」、特に微細球体も考慮される。付加成分が本願の方法及び分析を妨げない限り、「ビーズ」には磁性または常磁性粒子（例えば、ダイナビーズ（製造：Dynal, Oslo, Norway）などの付加成分が含まれて、磁石を用いて分離することができる。
【０１７０】
本願明細書で使用される、マトリックスまたは支持体粒子は、分離された粒子の形態で存在するマトリックス物質を意味する。粒子は、任意の形状と次元を有するが、通常、１００ｍｍまたはそれ以下、５０ｍｍまたはそれ以下、１０ｍｍまたはそれ以下、１ｍｍまたはそれ以下、１００またはそのμm以下、５０μm以下である１次元以上を有し、通常、１００ｍｍ３またはそれ以下、５０ｍｍ３またはそれ以下、１０ｍｍ３またはそれ以下及び１ｍｍ３以下、またはその１００μm3以下のサイズを有し、μm3の次数でありうる。このような粒子を「ビーズ」と総称する。
【０１７１】
本願明細書で使用される、「対照群」は、試験パラメータで処理されない場合は除いて、試料と実質的に同一な試料をいうものであって、対照群が血漿試料の場合、これは関連状態を受けない正常志願者から得たものでありうる。
【０１７２】
本願明細書で使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、明らかに異なると明記する場合以外は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、“細胞外ドメイン”を含む化合物に対する言及は１つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
【０１７３】
本願明細書で使用される、範囲及び量は特定の値または範囲を“約”と表すことができる。また、約はその正確な量を含む。したがって、“約５個の塩基”は“約５個の塩基”だけでなく、“５個の塩基”も意味する。
【０１７４】
本願明細書で使用される、「任意的」または「任意的に」は、その後に記載されるイベントまたは状況が起こる、または起こらないということを意味するものであって、その記載が上記イベントまたは状況が起こる場合及び起こらない場合を含むということを意味する。例えば、任意的に置換された基はその基が置換されない、または置換されることを意味する。
【０１７５】
本願明細書で使用される、任意の保護基、アミノ酸及び他の化合物に対する略語は、特に断わりのない限り、この通常の用法、公認された略語またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ（Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem., 11: 942-944）による。
【０１７６】
ｂ．エリスロポエチン（ＥＰＯ）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、ホルモンとして作用する造血成長因子群の１種である。これは、赤血球細胞産生調節、および適切な範囲における身体の赤血球量調節に関与する。ＥＰＯ産生は、腎臓動脈循環において減少された酸素含量により刺激され、酸素に感受性を有する転写因子により媒介される。ＥＰＯは、腎臓の細尿管毛細血管コーティング細胞において主として産生される。分泌されたＥＰＯは骨髄赤血球前駆体表面のＥＰＯ受容体に付着され、その結果、急激な複製と機能的な赤血球細胞に成熟する。この刺激により赤血球細胞数が急増され、その結果、ヘマトクリット（血中赤血球細胞の％）（D'andrea et al., (1989) Cell  57: 277-285; Lodish et al., (1995) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60: 93-104）において上昇する。
【０１７７】
最近、幾つの証拠はサイトカインスーパーファミリーに属するエリスロポエチンがエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）との相互作用を通じて媒介される他の重要な生理学的機能を遂行することを表している。そのような作用には、有糸分裂誘発、平滑筋細胞、及び神経細胞へのカルシウム流入の調節、赤血球生成、血小板過活性化、血小板生成、及び中間代謝に対する効果がある。エリスロポエチンは、低酸素性細胞の微細環境を改善する機能の他にも、代謝性ストレスによる予定された細胞死を調節する補償反応を提供することと判断される。したがって、赤血球生成活性の他にも、ＥＰＯは組織保護活性を表す。また、そのような組織保護活性はその造血機能と独立していると考えられている。
【０１７８】
ヒトＥＰＯは、Lin et. al., (1985) Proc Nat Acad Sci USA82: 7582-4とJacobs et al., (1985) Nature 313: 806-810により最初にクローニングされ、アミノ酸配列が報告された。ヒトＥＰＯは約３０、４００ダルトンの分子量を有する酸性糖タンパク質である。ヒトＥＰＯの前駆体配列は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列でアミノ酸残基１乃至２７に該当する２７個アミノ酸のシグナル配列を含んだ、１９３個アミノ酸のポリペプチド（配列番号１に記載）である。成熟したポリペプチドは、カルボキシペプチダーゼによるアルギニン残基１６６の切断を含む翻訳後、修飾により１６５個アミノ酸のポリペプチド（配列番号２３７に記載）となるように処理される１６６個アミノ酸の単一ポリペプチド鎖（配列番号２に記載）から構成される。したがって、ＥＰＯは１６５個アミノ酸の形態で存在するが、１６６個アミノ酸の形態、または１６５または１６６個アミノ酸のヘテロジーニアスな分子にて存在することもできる。ＥＰＯは、内部ジスルファイド結合を形成する４個のシステイン残基（配列番号２に記載された成熟タンパク質の位置７、２９、３３、及び１６１にある）を含む（Lai et al. (1986) J Biol Chem 261:3116-3121;Recny et al.(1987) J Biol Chem 262:17156  -17163）。これは、内部のジスルフィド結合を形成する（Lai et al., (1986) J Biol Chem 261: 3116-312 1 ; Recny et al., (1987) J Biol Chem262: 17156-17163）４個のシステイン残基（７位、２９位、３３位、１６１位）を含む１６５個のアミノ酸から構成されている。７番及び１６１番のシステイン間のジスルフィド結合は赤血球生成活性に重要である。ヒトＥＰＯの構造はCheethamらにより報告及び記述された（Cheetham et al.(1988) Nat Struct Biol 5:861-866 and Syed et al., (1998) Nature 395:511-516）。ヒトＥＰＯは造血成長因子群の代表的な種類であり、４個のヘリックスの束からなる。
【０１７９】
生体内では、ＥＰＯは糖化により翻訳後修飾される。ＥＰＯの炭水化物部分はアスパラギン２４、３８及び８３の３個のＮ結合型糖鎖と、セリン１２６の一つのＯ結合型糖から構成されている（Browne et al., (1986) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51: 693-702; Egrie et al., (1986) Immunbiology 172: 213-224参照）。ＥＰＯに付着された炭水化物の構造は様々であり、この特徴は微細異質性(microheterogeneity)と呼ばれる。炭水化物残基部分の差は、分枝状、様々なサイズと電荷の観点からＥＰＯの薬物動態学及び薬力学に深い影響を与える。異なる糖化パターンの影響が広く研究されている（例えば、Darling et al., (2002) Biochemistry 41: 14524-14531; Storring et al., (1998) Br J Haematol 100: 79-89; Halstenson et al., (1991 Clin Pharmacol Ther 50: 702-712; Takeuchi et al., (1990) J Biol Chem 265: 12127-12130）。
【０１８０】
一般に、タンパク質の糖化は、溶解度、安定性、免疫攻撃に対する保護、及び全体生物学的活性にとって重要である。ＥＰＯの場合、例えば、糖タンパク質内の糖化部位は、活性、生合成、及び加工、半減期に関与して活性形態を維持し、骨髄への糖タンパク質の進行、及び糖タンパク質の生物学的活性に関与する（Dube et al. (1988) J Biol. Chem., 263:17516-17521; Cointe et al. (2000) Glycobiology, 10:511-519）。例えば、増加された炭水化物含量を有するＥＰＯポリペプチドのアイソフォームは一般的に増加された血清半減期を表す。ＣＨＯ細胞で生成されたＥＰＯポリペプチドの血清半減期は、分単位で測定された半減期を有する非糖化ＥＰＯと異なり、約２時間である。ＥＰＯの糖化形態の半減期は、相変わらず比較的短い半減期を表す。したがって、改善された半減期を有するＥＰＯポリペプチドを発生するための努力がなされてきた。
【０１８１】
ＥＰＯは胎児段階の間、肝細胞により生成され、腎臓繊維芽細胞及び神経細胞によっても生成される。ヒト尿ＥＰＯ及び細胞で組換え手法により生成される組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は同一な一次配列を共有するが、その糖化形態が異なる。また、相異するｒＨｕＥＰＯは、これを生成するために使われた細胞株に従って相異する糖化形態を含む。ｒＨｕＥＰＯは、ＣＨＯ細胞（即ち、後述するエポエチンアルファ及びベータ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；即ち、エポエチンオメガ）；ＲＰＭＩ １，７８８ヒトリンパ様細胞、ＣＯＳアフリカ緑色サル腎臓、ＭＤＣＫイヌ科動物腎臓、Ｌ９２９マウス繊維芽細胞、及びＣ１２７マウス乳房で再組合操作により発生されて来た（Jelkmann et al. (2004) Internal Medicien, 43:649-659）。相異するＥＰＯ剤形の糖化の差は治療薬で投与時、ＥＰＯのインビボの生存に影響を及ぼす。
【０１８２】
ＥＰＯは世界的に３兆ＵＳドルを超える市場を有する主要な生物医薬製品である。これは、患者で赤血球形成を増加させて、慢性腎不全、癌化学療法、ＨＩＶ感染、小児使用、早熟幼児と関連した貧血を治療し、非心臓手術及び非血管手術を受ける貧血患者で血液輸血の必要性を減少させるために主に使われる。ｒＨｕＥＰＯ療法に対する他の徴候は、自家免疫疾患、ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、鬱血性心不全、または手術と関連した貧血症でありうる。ヒトの場合、ＥＰＯの投与を通じた治療は安全で、かつよく許容されることと確認されて来た。
【０１８３】
商業的に利用可能な種々のＥＰＯポリペプチドが存在する。多くのＥＰＯポリペプチドはヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）と同一なアミノ酸配列を有し、これらの製造及び糖化方法の差により区別される。エポエチンα（染色体ＤＮＡから生成される）及びエポエチンβ（ｃＤＮＡから生成される）は、米国特許登録第４、７０３、００８号及び第５、９５５、４２２号に記述されている。これらのポリペプチドは、ヒトＥＰＯと同じアミノ酸配列を有しており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から産生される。エポエチンαはプロクリット（Procrit（登録商標） Ortho Biotech）、エプレックス（Epr ex（登録商標） Johnson & Johnson）、エポジン（epogin（登録商標） Chugai）またはエポジェン（epogen（登録商標） Amgen）の商品名として用いられる。エポエチンβはネオレコモンまたはレコモン（Neorecormon（登録商標） or Re cormon（登録商標） Hoffmann-La Roche）の商品名として用いられる。これは、ジェネティクス研究所において腎臓疾患と連関する貧血治療のために開発された。米国特許第５、６８８、６７９号に記述されたエポエチンωはヒトＥＰＯと同じアミノ酸配列を有し、べービーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）において産生された。エポエチンωはエポマックス（epomax（登録商標） Elanex）という商品名として用いられる。一般に、ｒＨｕＥＰＯアルファ及びｒＨｕＥＰＯベータは、静脈内、または皮下投与時、６乃至８時間の半減期を表す。Ｄｙｎｅｐｏ（Epoetin δ、Ａventis Pharmaと共にTranskaryotic Therapiesにより開発された）は腎不全患者で貧血の治療のためのものであって、ヒト細胞培養を通じて製造された遺伝子−活性化されたヒトエリスロポエチンである。
【０１８４】
ポリペプチドの半減期及び生体利用率を増加させるための試みとして他のＥＰＯポリペプチドが開発されて来た。ダルベポエチンα（新規な赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）と知られている）は、アムジェン社により開発されてアラネスプ（Aranesp（登録商標） Macdougall (2002) Kidney Int Suppl. 80:55-61）という商品名として用いられる。これは、５個のＮ結合型炭水化物鎖（ｒｈＥＰＯよりも２つ多い）を有するものとして考案された。アラネスプのアミノ酸配列は５個のアミノ酸の置換（Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、Ｐ９０Ｔ）によりｒｈＥＰＯの配列とは異なるため、３０位及び８８位のアスパラギン残基に付加多糖が付着可能である。炭水化物含量の増加により、アラネスプは高い分子量（３０、４００ダルトンと比べて３７、１００ダルトン）、シアル酸含量（１４シアル酸残基と比べて２２個）、及び増加された陰電荷の結果としてのｒｈＥＰＯとは異なる。アラネスプの増加された炭水化物含量は、静脈注射（i.v.）や皮下注射（s.c）を通じて投与したときに特に他の残存エリスロポエチンよりも３倍以上長い循環半減期の独特な生化学的及び生物学的特性を決定付ける。しかしながら、相対的ＥＰＯ受容体結合力は炭水化物含量と反比例し、且つ、ｒｈＥＰＯに対するＥＰＯ受容体の結合力に比べて４．３倍低い相対的結合力を示す。皮下投与後、アラネスプの吸収は遅くて速度制限的であり、平均５４時間後に最高の血清濃度に達する。最高濃度までの時間が報告されたｒｈＥＰＯのそれよりも長くなったことは、おそらく、アラネスプの増加された分子サイズに起因する。最近、アラネスプの延びた循環半減期は、アラネスプの服用頻度の減少により、プロクリット（登録商標）を超えるような重要な臨床的利点となる。
【０１８５】
また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との化学的結合を通じてＥＰＯの半減期を増加させるための他の試みもなされてきた。ＰＥＧ化された（PEGlated）ＥＰＯは半減期がより長いが、ＰＥＧ化されていないＥＰＯと比較して変化された構造及び減少された機能を表す。例えば、連続したエリスロポエチン受容体活性子（ＣＥＲＡ；ロシュ社により開発）、すなわちＲ−７４４は、化学治療療法と連関する貧血の潜在的治療のための２世代エリスロポエチンである。ＣＥＲＡは、この薬品の半減期を延ばす約３０キロダルトンの１つのメトキシポリエチレングリコール重合体を含む。半減期を増加させる他の方法には、アルブミンのような運搬体タンパク質にＥＰＯの連結、連結ペプチド（３乃至１７個アミノ酸）の利用、種々の試薬を用いた化学的架橋、または融合タンパク質としてヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ断片とＥＰＯ分子の結合を通じた２つの完全なＥＰＯ分子のホモ二量体（homodimerization）の形成があるが、これに限定されない。そのような方法は各々天然ＥＰＯと比較して変化された活性を有するＥＰＯポリペプチドを提供する。
【０１８６】
ＥＰＯは、経口、全身、口腔、経皮、静脈、筋肉及び皮下で投与可能であり、典型的には複数回投与が治療方法として利用される。一般に、商業的に利用可能なＥＰＯ治療剤は、皮下、静脈内、及び腹膜内注射を通じて投与される。代表的に、皮下投与がより効果的であるが、天然ＥＰＯの生体利用率は皮下投与の場合、せいぜい２６％である。比較的短い半減期によって、天然ＥＰＯは一週間に３回注射して投与されなければならない。また、製剤は、一般的に活性維持のために冷蔵（２−８℃）条件で保管される。このため、改善されたＥＰＯ安定性（半減期）は、血清における安定性などの投薬条件（インビボ）及びインビトロ（すなわち、産生期間中、精製及び貯蔵条件）において薬としての活用と効力を改善することができる。
【０１８７】
Ｃ．増加されたタンパク質安定性を表す修飾型ＥＰＯポリペプチド
本発明は、タンパク質分解酵素（血液、腸等）に対する抵抗性により評価した場合に改善された安定性を表すＥＰＯポリペプチドの変異体を提供する。ＥＰＯポリペプチドの増加された安定性は、例えば、タンパク質分解酵素標的残基または配列を破壊して、投与、精製、または保管時、ポリペプチドがタンパク質分解酵素による分解に抵抗性を有するようにすることにより達成できる。上記ポリペプチドは、タンパク質分解酵素により分解できる部位でこれらの一次配列の変化によってタンパク質分解酵素に抵抗性があるように修飾される。例えば、タンパク質分解酵素標的残基または配列のアミノ酸置換は、上記タンパク質分解酵素標的残基または配列の直接破壊をもたらす。したがって、本発明は、翻訳後修飾または他の修飾を追加で必要とせず、タンパク質分解酵素に対して増加された抵抗性を有するように一次アミノ酸配列が修飾されている修飾型ＥＰＯポリペプチドを提供する。
【０１８８】
本発明で提供されるタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、ポリペプチドの一次配列で幾つのアミノ酸変化（多くの場合、１つの変化）のみを通じて修飾される。一次配列の変異そのものにより、ポリペプチドがタンパク質分解酵素に対して抵抗性があるようになる。また、上記ポリペプチドは幾つの変化のみを含むため、上記変異のない同一ポリペプチドの活性と同一であるか、または一部の場合はより高い水準までその活性を維持する。これは、幾つの理由により長所がある。第１に、これは、治療効果の達成に必要なポリペプチドの量（即ち、投与量）がポリペプチドの活性の任意の変化（即ち、減少）により限定されないということを意味する。このことは、ＰＥＧ化されたポリペプチドのような多くの治療用ポリペプチドの問題であり、ポリペプチドに対する修飾によりタンパク質の活性がより低くなっていた。したがって、治療効果を達成するために、そのような治療用ポリペプチドはより高い投与量で投与されなければならなかった。
【０１８９】
第２に、上記ポリペプチドの一次配列のみに対して変化させるということは、他のプロセッシングが必要でなく、またはタンパク質分解酵素抵抗性または血流内にポリペプチドの吸収を達成するために、製剤内の治療タンパク質を他の化合物と混合することが必要でないことを意味する。したがって、投与製剤の製造が簡単である。例えば、凍結乾燥タンパク質のみを含有する錠剤が経口投与用に製造できる。即ち、上記タンパク質分解酵素抵抗性タンパク質は、その自体で経口に投与できる。また、特に胃腸管内に経口投与時、タンパク質分解酵素に対するポリペプチドの抵抗性を増加させるために、腸溶コーティングにポリペプチドを含めることが有利であることがある。
【０１９０】
上記修飾型ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質分解酵素に対する抵抗性により評価されたように、改善された安定性を表すことによって、そのような特性を表す修飾型ＥＰＯポリペプチドはインビトロまたはインビボで増加されたタンパク質半減期を有する。上記修飾型ＥＰＯポリペプチド（本願では変異体ともいう）は、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較してより安定的である。 本願は、インビトロ（例えば、産生、精製、保管中に）またはインビボ（例えば、対象への投与後）において増加された半減期を導いてタンパク質安定性の増強を示す修飾型ＥＰＯポリペプチドを提供する。例えば、増加された半減期は、ヒトなどの対象に前記ポリペプチドを投与後に発生可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドの増加された半減期は、未修飾型ＥＰＯポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上に増加可能である。一部のケースにおいて、修飾型ＥＰＯポリペプチドの増加された半減期は、未修飾型ＥＰＯポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍及び１０００倍、またはそれ以上に増加可能である。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、血清中の十分な薬物レベルを維持するために必要とされる注射回数を減少させるメリットを付与して、例えば、対象体によるより高い満足性及び許容性をもたらし、同等な生物学的効果をもたらすのに必要なより低い投与量をもたらし、さらに副次的な効果の減少をもたらす。
【０１９１】
上記改善された安定性を表すＥＰＯ変異体は、血流、胃腸管、口腔、喉のような投与条件及び／または保管条件で増加された安定性を有する。安定性（即ち、インビボタンパク質の半減期）を増加させれば、血清内で充分な薬物濃度を維持するために必要とする注射頻度数を減少させて、ｉ）治療対象、特にヒト対象者に対する満足度及び服用便宜性を増加させ、ii）同等な生物学的効果の達成に必要とする投与量を減少させ、iii）その結果、（投与量−依存的な）副次的な効果を低減させる。また、タンパク質分解酵素に対する抵抗性は、ポリペプチドを経口投与に適するようにするが、これは胃腸管で確認されるタンパク質分解酵素による消化に対する感受性を弱めるためである。
【０１９２】
したがって、胃腸管でのタンパク質分解酵素に対する抵抗性のため、本発明で提供されるＥＰＯ変異体は経口投与用に剤形化できる。その一次配列の変化によりタンパク質分解酵素抵抗性を有するように修飾されていない治療用タンパク質の場合、治療的有効量の天然または野生型ポリペプチドの血流への伝達を達成する経口経路に投与できない。これは、上記ポリペプチドが胃腸管内で胃腸管タンパク質分解酵素により分解されるためである。ＥＰＯのような天然ポリペプチドは、腸内伝達のためのコーティングを用いて剤形化できるが、これは胃腸管内でタンパク質分解酵素に対する抵抗性を達成して血流内への放出を可能にするには不充分である。腸溶コーティングが溶解され、天然ポリペプチドが胃腸管の内腔内に放出されれば、上記ポリペプチドの高い水準のタンパク質分解は腸から血液内にポリペプチドの効率的な吸収を妨害する。本発明で提供されるＥＰＯタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、胃腸管タンパク質分解酵素のようなタンパク質分解酵素による分解に抵抗性があるため、血液内への吸収に利用できる。胃腸管の内腔内に放出されれば、上記タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは腸内タンパク質分解酵素に対する抵抗性のため、高濃度で存在する。したがって、治療的有効量のポリペプチドが腸から血流内に吸収できる。また、消化管及び血流でタンパク質分解に対する抵抗性は、上記タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの持続的な吸収を可能にする。したがって、上記タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、長時間に亘って血流で治療的に有効な濃度で吸収及び維持できる。したがって、上記タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは経口投与できる。本発明で記載したように、そのようなタンパク質分解酵素抵抗性ＥＰＯポリペプチドは、錠剤またはカプセルとして経口投与用に剤形化できる。好ましくは、これらポリペプチドは胃腸のｐＨ条件に対して保護し、より低い消化管にポリペプチドの効率的な伝達を可能にする腸溶コーティングを含む。
【０１９３】
タンパク質分解酵素抵抗性を増加させる修飾は、糖化できない宿主でのタンパク質の生成及び事後的な投与及びタンパク質分解酵素の糖分解作用への露出によって生じうるＥＰＯポリペプチドの糖化の欠乏を補う。したがって、糖化により正常に遮蔽されるタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位の修飾は、ＥＰＯポリペプチドに保護手段を提供する。何故ならば、これら部位が遮蔽されず、タンパク質分解酵素（即ち、血清、血液、腸等）に露出されるようになり、そのような修飾を含まないポリペプチドと比較して増加された安定性を提供するからである。したがって、糖化部位はタンパク質分解酵素からタンパク質を保護して上記ポリペプチドの半減期を増加させることができる一方、糖化されない、または、部分的に糖化されるＥＰＯポリペプチドはそのように保護されない。したがって、特に糖化により遮蔽される部位でＥＰＯポリペプチドを修飾して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表すようにすることによって、上記ポリペプチドは保護された形態で提供されるか、または完全に糖化されたＥＰＯポリペプチドより更に保護される。
【０１９４】
１．タンパク質分解酵素抵抗性
患者への安定したペプチド及びタンパク質薬物の伝達は、薬剤産業の主な挑戦である。人体内において、このような形態の薬は、内在化、糸球体ろ過及びタンパク質分解などの異なる生理学的過程により絶えず排出されたり循環液から除去される。後者は、時々経口投与及び静脈または筋肉注射時に治療薬物として用いられるタンパク質の半減期に影響を及ぼす制限段階である。このため、タンパク質分解酵素による消化に対する増強された抵抗性として現れるタンパク質安定性を増強させる治療用タンパク質は興味深いものである。治療用タンパク質のための修飾の中では、治療剤として、または治療用活性を破壊または除去することなくタンパク質分解酵素に対する保護を向上させるものがある。このような変化は、持続性治療用タンパク質の産生に有用である。このため、本発明の一局面においては、本願で提供されるＥＰＯポリペプチドはタンパク質分解に対する抵抗性が増強されるように修飾され、それにより、インビトロ（例えば、産生、加工、貯蔵、分析など）またはインビボ（例えば、血清安定性）において修飾型ＥＰＯポリペプチドの半減期が増加される。タンパク質分解酵素（血液、破砕物、腸、血清等）に対するタンパク質安定性を増加させれば、特定タンパク質分子の場合、より長いインビボ半減期を提供して、対象者に必要な投与の頻度数を減少させることと判断される。また、タンパク質分解酵素抵抗性を与えることによって、タンパク質分解酵素安定性を増加させれば、経口投与できるポリペプチドが得られることと判断される。
【０１９５】
タンパク質分解酵素、プロテイナーゼまたはペプチダーゼは、ペプチド共有結合の加水分解を促進する。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、唾液、血液、血清、腸、胃、血液、細胞溶解物及び細胞などを含むが、これらに限定されない体液及び組織内において発生するものを含む、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解に対する増強された抵抗性を示す。例えば、セリンプロテイナーゼとマトリックスメタロプロテイナーゼなどの全てのタンパク質分解酵素を含む。
【０１９６】
ＥＰＯポリペプチドの修飾は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、加水分解酵素、ＮＳ３、エラスターゼ、血液凝固因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ及びＰＳＡなどを含むが、これらに限定されない１以上のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を含むことができる。
【０１９７】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、特に、血清、血液、腸、口腔及び他の体液に存在する酵素による、タンパク質分解に対して増強された抵抗性を示す。このような抵抗性の増強は、１以上のタンパク質分解酵素を含むインビボ（ヒト血液、ヒト血清、唾液、消化液、腸管など）またはインビトロ混合物における未修飾型または野生型ＥＰＯポリペプチドと比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上増加されたＥＰＯポリペプチドの半減期として現れる。一般的に、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのインビトロやインビボ半減期は、１以上のタンパク質分解酵素を含む血液、血清またはインビトロ混合物における未修飾型または野生型ＥＰＯの半減期と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上増加される。
【０１９８】
一般的に、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型または野生型ＥＰＯと比べて実質的に変化しない（１％、５％、または１０％未満の変化）少なくとも一つの活性を示す。一部のケースにおいて、活性は未修飾型ＥＰＯと比べて増強される。例えば、活性は、赤血球生成活性または組織保護活性を含み、これは、成熟した野生天然型ＥＰＯポリペプチド（配列番号２または２３７）、野生型前駆体ＥＰＯポリペプチド（配列番号１または２３６）、または他のＥＰＯポリペプチドなど出発物質として用いられる未修飾型ポリペプチドと比較可能である。
【０１９９】
ａ．セリンタンパク質分解酵素（セリンプロテアーゼ）
セリンタンパク質分解酵素は、原核生物及び真核生物の両方において、血液凝固、炎症だけではなく、消化酵素を含む体内の広範な機能に関与する。セリンタンパク質分解酵素は配列特異的である。タンパク質分解酵素活性化のカスケードは、血液凝固及び補体を制御する一方、他のタンパク質分解酵素は異なる細胞または細胞外区画においてシグナル伝達経路、酵素活性化及び分解機能に関与する。
【０２００】
セリンタンパク質分解酵素には、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、ＮＳ３、血液凝固因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ及びＰＳＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。キモトリプシン、トリプシン及びエラスターゼは膵腺房細胞により合成され、小腸に分泌され、ペプチド結合の加水分解を触媒する役割を果たす。これらの３酵素は、いずれも、Ｘ線構造により判明されたように、構造が類似している。これらの消化性セリンタンパク質分解酵素は、それぞれ切断部位周辺のアミノ酸残基及び側鎖に基づいて、ポリペプチド鎖の異なる領域を標的とする。セリンタンパク質分解酵素の活性部分は、ポリペプチド基質が結合する割れ目などの形状を有する。アミノ酸残基は、ポリペプチド基質（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．、Ｐｊ）及びこれらのそれぞれの結合のサブサイト（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）のＮ末端からＣ末端へと標識される。切断は、Ｐ１とＰ１’との間において触媒される。キモトリプシンは、巨大な疎水性アミノ酸残基が側面に位置するペプチド結合を加水分解する。特定の残基にはフェニルアラニン、トリプトパン及びチロシンが含まれ、これはぴったりの疎水性ポケット中に当てはまる。トリプシンは、陽電荷を帯びるアミノ酸残基が側面に位置するペプチド結合を加水分解する。キモトリプシンの疎水性ポケットを有する代わりに、トリプシンはポケットの裏面にアスパラギン酸残基を有しており、これは、アルギニン及びリシンなどの陽電荷を帯びる残基と相互作用可能である。エラスターゼは、アラニン、グリシン及びバリンなどの小さな中性アミノ酸残基が側面に位置するペプチド結合を加水分解する。トリプシン及びキモトリプシンとは対照的に、エラスターゼは、バリン及びトレオニンが整列されていて単純な窪みを作り、これは、このような小さなアミノ酸残基を受け入れることができる。セリンタンパク質分解酵素は原核性生物及び真核性生物に偏在し、止血、繊維素分解、補体形成及び食餌タンパク質の消化などの重要で且つ様々な生物学的機能をする。
【０２０１】
セリンタンパク質分解酵素群に属するエラスターゼは、トリプシン、キモトリプシンなどの周知の他のセリンタンパク質分解酵素と広い範囲の配列相同性を示す。セリンエラスターゼは、通常、アラニン、バリン及びメチオニンに、より少ない程度には、ルシン及びイソルシンなどの脂肪族アミノ酸残基に隣接しているポリペプチドを選択的に切断する。人間は、エラスターゼ１（ＥＬＡ−１、膵臓エラスターゼ、ＰＥとも知られている。）、エラスターゼ２（好中球エラスターゼ、ＮＥ、ＰＭＮエラスターゼ骨髄セリンタンパク質分解酵素、メジュラシン、ヒト白血球エラスターゼ、ＨＬＥとも知られている。）、エラスターゼ２Ａ（ＥＬＡ−２Ａ）、エラスターゼ２Ｂ（ＥＬＡ−２Ｂ）、エラスターゼ３Ａ（ＥＬＡ−３Ａ、エラスターゼＩＩＩＡ、タンパク質分解酵素Ｅ）、及びエラスターゼ−３Ｂ（ＥＬＡ−３Ｂ、エラスターゼＩＩＩＢ、タンパク質分解酵素Ｅ）のように構造的に類似するタンパク質をコードする６個のエラスターゼ遺伝子を有している。エラスターゼ活性を有している他のセリンタンパク質分解酵素には、プロテイナーゼ−３（ＰＲ−３）、内因性血管エラスターゼ（ＥＶＥ）、及び内皮細胞エラスターゼ（ＥＣＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
好中球１次アズール顆粒(neutrophil primary azurophil granules)は、好中球の活性化時に分泌されるＮＥ（ＥＬＡ−２）とＰＲ−３を運搬する。ＮＥは、エラスチン、軟骨プロテオグリカン、コラゲン、フィブロネクチンの破壊及び食作用により細胞内に取り込まれた物質の消化を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の破壊に関与する。ＮＥはまた、免疫グロブリンと表面活性芽細胞タンパク質などのタンパク質の消化を助ける。ＮＥは、選択的にＶａｌ−Ｘ結合と、より少ない程度には、Ａｌａ−Ｘ結合を切断する。ＮＥの異常放出または過量放出は、結合組織寿命、関節炎及び炎症において欠陥に関連する。ＮＥと同様に、ＰＲ−３もメタロプロテイナーゼとＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）などのサイトカインなどの前酵素を活性化する機能をする。
【０２０２】
膵臓エラスターゼ（ＥＬＡ−１）は、選択的にＡｌａ−Ｘ結合を切断し、皮膚ケラチノサイトにおいて主に発現される。ＥＬＡの発現は、その発現によりしばしば膵臓癌診断のために利用されるものの、成人膵臓において一般的に発見されることはない。正常的膵臓のエラスターゼ活性は、ＥＬＡ−２ＡとＥＬＡ−２Ｂに起因する。ＥＬＡ−２ＡとＥＬＡ−２Ｂは、選択的にＬｅｕ−Ｘ、Ｍｅｔ−Ｘ及びＰｈｅ−Ｘ結合を切断する。
【０２０３】
いくつかの病理学状態は、エラスターゼとその内因性抑制剤との間の不釣合いの結果であると信じられている。好中球エラスターゼ、特に、ＥＬＡ−２による未調節タンパク質加水分解は、肺気腫、急性呼吸不全症候群、敗血症ショック、多発性器官不全、リウマチ性関節炎及び嚢胞性繊維症などの多数の病理学的条件に密接な影響を与えてきた。
【０２０４】
高濃度のエラスターゼは、胃腸と血管において発見可能である。このため、このような経路で投与さるべき効果的な治療は、エラスターゼ切断位置の修飾を通じて達成可能である。
【０２０５】
ｂ．マトリックスメタロプロテイナーゼ
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外基質（ＥＣＭ）の成分を分解するＺｎ＋２及びカルシウム依存的なエンドペプチダーゼのファミリーである。また、ＭＭＰは、多くの細胞表面サイトカイン、受容体及び他の可溶性タンパク質をプロセッシングすることができる。これらは、傷治癒、妊娠及び血管新生などの正常組織リモデリング過程に関連している。生理学的な条件下において、ＭＭＰは不活性前駆体（ザイモゲン）として生成され、プロセッシングされて活性型となる。加えて、前記酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織抑制剤（ＴＩＭＰ）と呼ばれる内因性抑制剤により特異的に調節される。ＭＭＰのタンパク質分解活性は、生理学的及び病理学的な条件下において組織リモデリングのエフェクター機構として作用し、炎症の調節因子として作用する。このようなタンパク質の過剰合成及び産生はＥＣＭ分解の加速化を誘導するが、これは、例えば、骨恒常性、関節炎、癌、多発性硬化症及びリウマチ関節炎などの様々な疾病及び状態と関連する。神経炎症性疾患の範疇において、ＭＭＰは、（ａ）血液−脳関門（ＢＢＢ）及び血液神経関門を開けること、（ｂ）血液由来の免疫細胞による神経組織の浸透、（ｃ）サイトカイン及びサイトカイン受容体の低減、及び（ｄ）抹消及び中枢神経系疾患における直接的な細胞損傷などの過程に関連している（Leppert et al., Brain Res. Rev. 36(2-3): 249-57 (2001); Borkakoti et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 70(1): 73-94 (1998)参照）。
【０２０６】
ＭＭＰファミリーの構成要素は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、マトリルリシン及び膜結合ＭＭＰを含む。ほとんどのＭＭＰは不活性化された前酵素の形態で分泌される。分泌された前酵素ＭＭＰは、種々の酸化剤、エラスターゼ、プラスミン及びトリプシンなどのタンパク質分解酵素、そして他のＭＭＰなどの炎症誘発物質により活性化可能である（Cuzner and Opdenakker. J. Neuroimmunol. 94(1-2): 1-14 (1999)参照）。組織において、生理的ＭＭＰ活性化剤は、組織または血漿タンパク質分解酵素または日和見感染細菌のタンパク質分解酵素を含む。例えば、ウロキナーゼ（ｕ−Ｐａ）及び組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔ−Ｐａ）により偏在するプラスミノゲンを含む、プラスミノゲン活性化剤／プラスミン系は、病理学的状態において、ｐｒｏ−ＭＭＰの活性化剤として極めて重要である。ＭＭＰ活性は、メタロプロテイズ（ＴＩＭＰ）の組織抑制剤、セリンタンパク質分解酵素抑制剤（セルピン）、及び２−マクログロブリンなどの非特異的タンパク質分解酵素抑制剤により抑制可能である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの活性亜鉛結合位置の非共有的な結合を通じてＭＭＰ活性を抑制する。
【０２０７】
ＭＭＰ及びプラスミノゲン活性化剤のタンパク質分解活性、及びこれらの抑制剤は、細胞−ＥＣＭ相互作用が広範な過程（例えば、様々なタイプの細胞の増殖、分化、付着及び移動）に影響を与えて媒介するため、ＥＣＭの完全性を維持する上で重要である。マトリックスメタロプロテイナーゼの過剰産生は、組織損傷及び傷治癒、炎症障害、増殖障害及び自家免疫疾患に関連している（St-Pierre et al., Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2(3): 206-215 (2003); Opdenakker, G. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 59(6): 489-514 (1997)参照）。
【０２０８】
ｃ．タンパク質分解部位の除去によるタンパク質分解に対する増加された抵抗性
下記の段落Ｄで記載されたような当業者に知られた任意の方法を用いてＥＰＯポリペプチドを修飾させてタンパク質分解酵素の抵抗性を増加させることができる。例えば、本発明の実施例で記載したように、２Ｄスキャニング方法は、タンパク質分解酵素（血液、胃腸管など）、血液溶解物または血清への露出時に安定性の増強をもたらすｈＥＰＯにおいてアミノ酸変化を同定するのに利用された。本願において、タンパク質分解酵素（血液、溶解物、腸血清など）に対するタンパク質安定性の増強は、特別なタンパク質分子に対するインビボにおいてさらに長い半減期を有するようにして、対象体に対する投与回数を低減できるように考えられた。タンパク質分解酵素に抵抗性を示すｈＥＰＯの考案において、最初の段階には、タンパク質配列によりタンパク質分解に脆弱な位置を同定することが含まれる。考慮される選択された血液、腸または任意の他のタイプのタンパク質分解酵素のリスト（表２）に基づいて、先ず、このようなタンパク質分解酵素により標的化可能なｈＥＰＯ内の全てのアミノ酸及びアミノ酸配列のリストをインシリコにて決定した。タンパク質分解酵素標的（ｈＥＰＯポリペプチドのアミノ酸またはアミノ酸配列）をインシリコＨＩＴ（ｉｓ−ＨＩＴ）と命名する。体内タンパク質分解酵素混合物は組成物の中で極めて複雑であるため、与えられたタンパク質配列内のほとんどの残基がタンパク質分解に対して標的化できると予想可能である。
【０２０９】
タンパク質分解に対して抵抗性を示すｈＥＰＯ変異体の考案において、第２段階には、適切な置換アミノ酸を同定することが含まれて、これらがｉｓ−ＨＩＴにおいてｈＥＰＯ内の天然アミノ酸を置換した場合、タンパク質が、（ｉ）タンパク質分解に対して抵抗性を有し、（ｉｉ）野生型ｈＥＰＯポリペプチドと少なくとも類似する活性レベルを誘導することになる。置換アミノ酸の選択は、特定のタンパク質分解酵素に対する広範な標的特異性及びｈＥＰＯに必須的な残基の疎水性、電荷、及び極性などの物理化学的活性（例えば、触媒、結合活性など）を保存する必要性を考慮しなければならない。
【０２１０】
「Point Accepted Mutation」（PAM Dayhoff et. al., 1978）を２Ｄスキャニングアプローチの一部分として使用することができる。タンパク質配列をアライメントさせるために開発されたＰＡＭ値は、アミノ酸間の進化的距離を反映する確率マトリックスの形態で利用可能である。参照配列内の残基の保存的置換とは、対応する参照残基と物理的及び機能的に類似する置換のことを言うが、すなわち、類似するサイズ、形状、電気的電荷及び／または化学的特性（例えば、共有結合または水素結合及び他のこのような相互作用を形成する能力）を有する置換である。保存的置換は、accepted point mutationの形態におけるＰＡＭマトリックス基準に見合う最高スコアを示す。ＰＡＭ２５０マトリックスを２Ｄスキャニングのフレームにおいて用いて、タンパク質機能に影響を与えない保存的変異を生成するための、ｉｓ−ＨＩＴに対する候補置換アミノ酸を同定する。保存的置換またはaccepted point mutationに対応するＰＡＭ２５０マトリックスにおいて最高値を有する２以上のアミノ酸をそれぞれのｉｓ−ＨＩＴにおける置換のために選別した。アミノ酸をシステイン残基に置換することは明らかに回避されるが、このような変化が潜在的に分子間ジスルフィド結合の形成を誘導するためである。
【０２１１】
簡略に説明すると、アルゴリズムＰＲＯＴＥＯＬ（infobiogen.fr and bioinfo.hku.hk/services /analyseq/cgi-bin/proteol_in.plでのオンライン）を用いて、表２のタンパク質分解酵素（血液、腸など）に対する基質として認識可能な、１６６個のアミノ酸の成熟ｈＥＰＯポリペプチド（配列番号２）による残基リストを確立した。当該アルゴリズムは、入力するタンパク質分解酵素、タンパク質分解酵素のタンパク質分解感受性及びポリペプチドアミノ酸配列のリストに基づいてタンパク質分解性分解マップを生成する。表２に、選択されたタンパク質分解酵素及び化学的処理を用いたタンパク質分解に対して標的となるアミノ酸位置のインシリコによる同定を示す
【０２１２】
【表２】
2011520472.tif 000004
【０２１３】
ｉｓ−ＨＩＴを同定し、ＥＰＯのタンパク質分解に対するより高い抵抗性のためのＬＥＡＤを生成させた。タンパク質分解に対する増強された抵抗性のためのそれぞれのｉｓ−ＨＩＴ位の天然アミノ酸及び置換アミノ酸には、Ｙ、Ａ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｑ及びＭのいずれか１種のアミノ酸をＥ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ及びＴのいずれか１種のアミノ酸に置換することが含まれるが、これらに限定されるものではない。ｉｓ−ＨＩＴ及びＬＥＡＤにはタンパク質分解に対して感受性を有する領域における修飾が含まれる。
【０２１４】
ｄ．増加されたタンパク質分解酵素の抵抗性を表す修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチド
上記修飾型ＥＰＯポリペプチド（本願ではＥＰＯ変異体ともいう）は、タンパク質分解酵素分解に一般的に感受性を有する部位で一次配列の１つ以上のアミノ酸配列修飾により増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。代表的に、修飾には本発明で記載されるアミノ酸残基の置換、付加、欠失、またはこれらの組合せが含まれる。本発明で提供される修飾型Ｌｅａｄ ＥＰＯポリペプチドには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の修飾される位置を有するものがある。任意の２以上のＬＥＡＤ修飾を組合せて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の個々のＬＥＡＤ変異を有するスーパー−Ｌｅａｄ ＥＰＯポリペプチドを生成することができる。一般に、上記修飾は未修飾型ＥＰＯポリペプチドの赤血球生成または組織保護活性のような１つ以上の活性を喪失せず（即ち、本願で定義した１つ以上の活性を維持する）、安定性を増加させる。ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える任意のＬＥＡＤまたはＳｕｐｅｒ−Ｌｅａｄポリペプチドは、上記ポリペプチドがＬＥＡＤまたはＳｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドと比較してタンパク質分解に対する抵抗性を維持し、未修飾型出発ポリペプチドの１つ以上の活性を維持する場合、ＥＰＯポリペプチドに対する追加の修飾を含むことができる。
【０２１５】
本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有する成熟ＥＰＯポリペプチドのような成熟ＥＰＯポリペプチドのアミノ酸位置に相応する１つ以上のアミノ酸位置で修飾される。ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１または２に各々記載されたアミノ酸配列を有する前駆体または成熟ＥＰＯポリペプチドと比較して修飾できる。ＥＰＯポリペプチドは、Ｃ−末端アルギニンが除去された、例えば配列番号２３６または２３７に記載されたアミノ酸配列を有する前駆体または成熟ＥＰＯポリペプチドと比較して修飾できる。したがって、修飾型ＥＰＯポリペプチドにはその成熟形態で１６５または１６６個のアミノ酸長を有するものが含まれる。また、修飾型ＥＰＯポリペプチドには、その活性を維持する場合、配列番号２または２３７に記載されたＥＰＯポリペプチドの断片のような任意のＥＰＯポリペプチドの断片が含まれる。上記ＥＰＯポリペプチドを製造するために使われた方法に従って、上記修飾型ＥＰＯポリペプチドには長さが不均一なもの、翻訳後修飾（例えば、糖化）を含むもの、または翻訳後修飾が欠如（即ち、バクテリアでの製造によって糖化されない）されたものが含まれる。
【０２１６】
上記ＥＰＯポリペプチドは任意のヒト組織または細胞タイプ起源としうる。本発明で提供されるＥＰＯポリペプチドには、非ヒト起源のＥＰＯの変異体も含まれる。そのようなアライメント及び位置選択は、任意のＥＰＯポリペプチドをｈＥＰＯとアライメントさせ、修飾のための相応する位置を選択することによって遂行できる。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは非ヒトＥＰＯの変異体であることがあり、そのような変異体には、マウス、ネズミ、モルモット、牛、羊、犬、猫、ニワトリ、豚、うさぎ、魚、及びチンパンジーのＥＰＯがあるが、これに限定されない。代表的な未修飾型非ヒトＥＰＯポリペプチドは、配列番号２０２乃至２２６に記載されたアミノ酸配列を有する。また、修飾型ＥＰＯポリペプチドには、組換え方法によって製造された、合成された、または構築されたポリペプチドに基づいて当業界に知られた他の方法により製作した合成ＥＰＯポリペプチドが含まれる。
【０２１７】
安定性を増加させるために、ＥＰＯポリペプチドを修飾することは未修飾型ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して活性を変化させないように保ちながら達成できる。代替的には、ＥＰＯ安定性を修飾することは、未修飾型、または野生型治療用ポリペプチドと比較して活性を増加させつつ達成できる。一般に、修飾型ＥＰＯポリペプチドは未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１つ以上の活性を維持する。例えば、本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯまたは野生型であるＥＰＯと比較して実質的に変化されない（１％、５％、または１０％未満の変化）１つ以上の活性を表す。他の例で、修飾型ＥＰＯポリペプチドの活性は未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して増加または減少される。活性の例には、赤血球生成活性または組織保護活性があるが、これに限定されない。活性はインビボまたはインビトロで評価されることができ、未修飾型ＥＰＯポリペプチド、例えば、成熟した野生型天然ＥＰＯポリペプチド（配列番号２または２３７）、野生型前駆体ＥＰＯポリペプチド（配列番号１）、または出発物質として使われる当業者に知られた任意の他のＥＰＯポリペプチドと比較できる。
【０２１８】
上記修飾型ＥＰＯポリペプチドの他の修飾には、炭水化物、燐酸塩、硫黄、ヒドロキシ、カルボキシ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加が含まれることができる。したがって、本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えば糖化、燐酸化、硫酸化、水酸化、カルボキシル化、及び／またはＰＥＧ化により追加で修飾できる。そのような修飾はインビボまたはインビトロで実施できる。また、本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドには未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す場合、天然発生ＥＰＯ（ｈＥＰＯ）変異体を追加で含有するものが含まれる。代表的なｈＥＰＯ変異体には、アミノ酸修飾がＣ７Ｈ、Ｙ１５Ｆ、Ｄ４３Ｎ、Ｙ４９Ｆ、Ｇ７７Ｓ、Ｓ１２０Ｃ、Ｙ１４５Ｆである成熟ｈＥＰＯポリペプチドのアミノ酸位置Ｃ７、Ｙ１５、Ｄ４３、Ｙ４９、Ｇ７７、Ｓ１２０、Ｙ１４５で発生する変異体がある（例えば、米国特許４，７０３，００８号、及び７，０４１，７９４号；配列番号２３８乃至２４３参照）。本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのうちのいずれのものはそのような修飾を含むことができる。
【０２１９】
未修飾型ＥＰＯと比較してｉｓ−ＨＩＴ位置で単一アミノ酸変化を含む増加された安定性を表す修飾型ＥＰＯはＬＥＡＤと命名する。ＥＰＯポリペプチド候補であるＬＥＡＤポリペプチドは、前述したＰＡＭ分析を用いて得たもののような、本願に記載されるか、当業界に知られた方法を用いて選択されたｉｓ−ＨＩＴのいずれか１つ以上の位置でアミノ酸置換を含むことができる。増加されたタンパク質分解酵素抵抗性により増加されたタンパク質抵抗性を表す代表的なＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチドは、関連した米国出願公開ＵＳ２００５−０２０２４３８号に記載されている。タンパク質分解酵素抵抗性と関連してタンパク質安定性の増加に寄与できるそのような代表的なアミノ酸修飾は表３に記載されている。下記の表３においては、配列識別子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は各々の置換の次に括弧で表示される。そのような変異の位置は配列番号２及び２３７を参照にして記載されるが、配列番号２、２３７、２２７、２２８、２３８−２４３、３０９、及び３１０に記載されたもののような任意の変異ＥＰＯポリペプチドでも実施できる。
【０２２０】
本発明及び米国特許公開ＵＳ ２００５−０２０２４３８号に記載された方法を用いて、ＥＰＯポリペプチドのタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位を除去するために、下記のｉｓ−ＨＩＴ位置を同定した：２、３、４、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２９、３１、３５、３７、４２、４３、４５、４８、４９、５１、５２、５３、５４、５５、６２、６４、６７、６９、７０、７２、７５、７６、８０、８１、８７、８８、８９、９０、９１、９３、９６、９７、１０２、１０３、１０５、１０８、１０９、１１０、１１２、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６２、１６５、及び１６６。上記アミノ酸置換は、下記の位置に該当するいずれか１つ以上の位置に存在するか、または配列番号２または２３７に記載された成熟ＥＰＯの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体、または配列番号２または２３７に記載された成熟ＥＰＯポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するＥＰＯポリペプチド内の相応する位置に存在できる：配列番号２または２３７に記載された成熟ＥＰＯポリペプチドのＰ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｃ７、Ｄ８、Ｒ１０、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｒ１４、Ｙ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｋ２０、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｃ２９、Ｅ３１、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｐ４２、Ｄ４３、Ｋ４５、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｅ６２、Ｗ６４、Ｌ６７、Ｌ６９、Ｌ７０、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ８７、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、Ｄ９６、Ｋ９７、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｌ１０５、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｒ１３１、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、Ｙ１４５、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｋ１５２、Ｌ１５３、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５９、Ｒ１６２、
Ｄ１６５、及びＲ１６６。
【０２２１】
一実施態様において、位置は代表的に次のように置換される：ＮまたはＱとのＤの置換、Ｈ、Ｑ、またはＮとのＥの置換、ＩまたはＶとのＦの置換、ＱまたはＮとのＫの置換、ＩまたはＶとのＬの置換、ＩまたはＶとのＭの置換、ＱまたはＳとのＮの置換、ＡまたはＳとのＰの置換、ＨまたはＱとのＲの置換、ＨまたはＳとのＷの置換、ＩまたはＨとのＹの置換、Ｑ、Ｈ、またはＮとのＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、またはＶの置換。
【０２２２】
一実施態様において、ＥＰＯに該当する位置が選択され（ｉｓ−ＨＩＴＳ）、アミノ酸置換はタンパク質分解に対して増加された抵抗性を有するようになされて（ＬＥＡＤｓ）、上記置換には、配列番号２または配列番号２３７に記載されたアミノ酸配列に該当する表３に記載されたものがあるが、これに限定されない。表３はタンパク質分解に対する抵抗性を増加させてタンパク質安定性を増加させるものであって、成熟ＥＰＯポリペプチドのアミノ酸位置に該当するアミノ酸置換を提供する。
【０２２３】
そのような変異と関連して、最初のアミノ酸（１つの文字からなる略字）は置換されるアミノ酸に該当し、その数字は配列番号２または２３７に対するＥＰＯポリペプチド配列内の位置に該当し、２番目のアミノ酸（１つの文字からなる略字）は、その位置で最初のアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に該当する。表３においては、配列識別子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）は各々の置換の以後に括弧で表す。修飾に用いられるＥＰＯポリペプチドは、他の哺乳動物ＥＰＯポリペプチドを含んだ任意のＥＰＯポリペプチドでありうる。適切なアライメントにより評価した相応する位置は本発明に記載した通り、確認及び修飾される。
【０２２４】
【表３】
2011520472.tif 000005
【０２２５】
増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表すようにデザインされた候補ＬＥＡＤ ＥＰＯポリペプチドは、Ｐ２Ｓ（即ち、成熟ヒトＥＰＯ（例えば、配列番号２または２３７）のアミノ酸位置２に該当する位置でＳによるＰの置換）、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｎ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｅ７２Ｎ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｑ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８
Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑのうち、いずれか１つ以上の修飾に該当するアミノ酸修飾を含むことができる。
【０２２６】
特に、増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドは、下記の修飾のうち、いずれか１つ以上の修飾に該当するアミノ酸修飾を含むことができる：Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｐ９０Ｓ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｄ９６Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１３１Ｑ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｄ１３６Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；Ｌ１６Ｉ；Ｌ１６Ｖ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖ、特にＲ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｌ１６Ｉ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖ。
【０２２７】
上記修飾のうちのいずれかは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有するＥＰＯ、または配列番号２または２３７に記載された成熟ヒトＥＰＯポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する成熟ヒトＥＰＯの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体のような未修飾型ＥＰＯポリペプチドでありうる。代表的な修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤ候補ポリペプチドは、配列番号３乃至２０１のうちのいずれか１つに記載されており、１６６個アミノ酸を有するものの他にも１６５個アミノ酸を有し、Ｃ−末端アルギニンが欠損されたものを含む。
【０２２８】
そのような修飾型ＬＥＡＤポリペプチドは、経口、全身、口腔、経皮、静脈内、筋肉内、及び皮下経路などを含んだどの経路で投与できる。例えば、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える１つ以上の修飾を含む修飾型ＥＰＯポリペプチドは皮下に投与される。タンパク質分解に対する上記ポリペプチドの感受性が低いほど、血清内の持続性が長い。上記ポリペプチドは完全に糖化された形態で投与できるか、脱糖化されたポリペプチドの形態で投与できる。後述するように、タンパク質分解に対して増加された抵抗性を表すポリペプチドは、ポリペプチドの糖化の欠如を補い、糖化されていない（即ち、部分的糖化または脱糖化された）修飾を含まないポリペプチドと比較して増加された半減期を表す。しかしながら、代表的に、皮下投与されるＥＰＯポリペプチドは、ポリペプチドが糖化されるようにする哺乳動物発現系または他の発現系を用いてポリペプチドの糖化を達成するように製造される。
【０２２９】
また、前述したような修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比較して追加の修飾を含むことができる。一般に、得られる修飾型ＥＰＯポリペプチドは未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１つ以上の活性を維持することができる。
【０２３０】
２．スーパー−ＬＥＡＤｓ
本発明は、表３または関連した米国出願公開２００５−０２０２４３８号で記載したような個々のＬＥＡＤポリペプチドの修飾のうち、２つ以上を含むＳｕｐｅｒＬＥＡＤポリペプチドを提供する。上記修飾型ＳｕｐｅｒＬＥＡＤ ＥＰＯポリペプチドには、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の修飾された位置を有するものがある。得られる修飾型ポリペプチドは、ＬＥＡＤ修飾のうちの２つ以上、例えば、タンパク質分解酵素（血液、腸等）に対する抵抗性を修飾させる２つ以上の修飾を含む。上記ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較してタンパク質分解酵素抵抗性を表す場合、追加の修飾を含むことができる。
【０２３１】
本発明で提供されるＳｕｐｅｒＬＥＡＤは、前述したような個々のＬＥＡＤ修飾のうちの２つ以上を含む。したがって、修飾型ＥＰＯ ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドは、各々の修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチドのうち、２つ以上に存在する単一アミノ酸変異の組合である。したがって、修飾型ＥＰＯ ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドは、各々の修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチドのうち、２つ以上から由来した単一アミノ酸置換のうちの２つ以上を有する。後述するように、本発明で提供する修飾型ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質分解に対する増加された抵抗性により立証されるように、増加されたタンパク質抵抗性を表す。代表的に、生成される修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤポリペプチドは、１つのｉｓ−ＨＩＴ位置で単一アミノ酸置換の修飾により非修飾ポリペプチドに関して最適化された性能を有するものである。修飾型ＥＰＯ ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドは、相異するｉｓ−ＨＩＴ位置で２つ以上のＥＰＯ ＬＥＡＤ修飾を含むように製造される。タンパク質分解抵抗性を増加させる修飾は、本発明で提供されるか、タンパク質分解抵抗性を増加させるものであって、当業界に知られた他の修飾に付加できる。また、タンパク質分解酵素抵抗性を増加させる修飾は、活性を含んだ他の機能性を変化させるＥＰＯに対する修飾、翻訳後修飾に影響を及ぼす修飾、及び当業界に知られたどの他の修飾に付加されることもできる。
【０２３２】
例えば、一旦修飾型ＬＥＡＤポリペプチドが２Ｄスキャニング方法により同定されると、スーパーＬＥＡＤは、組換え、変異、及びＤＮＡシャッフリングなど公知の方法を用いた２以上のそれぞれのＬＥＡＤの組み合わせにより、且つ、上記したように付加的な方向付けされた変異、３Ｄスキャニング、及び多重重複されたプライマー伸張により生成可能である。
【０２３３】
その例として、タンパク質安定性が増強された修飾型ＥＰＯスーパーＬＥＡＤポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比べて２以上のアミノ酸修飾を含むことができる。一例として、ＥＰＯポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の修飾位置を含む。一般に、得られるＥＰＯポリペプチドは、増加されたタンパク質分解酵素抵抗性により立証されるように、増加されたタンパク質安定性を表し、未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１つ以上の活性を維持する。修飾型ＥＰＯポリペプチドは、上記表３に示す２以上のアミノ酸修飾を含むことができる。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２に示される成熟ＥＰＯポリペプチドのＰ２Ｓ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｎ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｅ７２Ｎ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２
Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｑ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ及びＲ１６６Ｑからなる群より選択される２以上の修飾に対応する２以上のアミノ酸修飾を含むことができる。場合によっては、前記修飾は、配列番号２３７に示されるアミノ酸配列を有する未修飾型ＥＰＯポリペプチド内にある。
【０２３４】
増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を有する修飾型ＥＰＯ ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドの例には、位置４、１６、２０、４５、４８、５２、８０、９０、９３、９６、１１６、１２３、１３１、１３６、１３９１４３、１５０、１５９、１６５、及び１６６のうち、いずれかの位置に該当する２つ以上のアミノ酸修飾を含むものがある。置換には、Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｐ９０Ｓ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｄ９６Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１３１Ｑ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｄ１３６Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；Ｌ１６Ｉ；Ｌ１６Ｖ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；、及びＬ１５３Ｖのうちの２つ以上の修飾、特にＲ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｌ１６Ｉ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖのうちの２つ以上の置換、特にＲ４Ｈ及びＲ１３９Ｈが含まれるが、これに制限されるのではない。
【０２３５】
一例で、本発明で提供される代表的な修飾型Ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドは、位置４で修飾、例えば、Ｒ４ＨまたはＲ４Ｑ、及び上記の表３で表したように、増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表すようにデザインされた１つ以上の追加のＬＥＡＤポリペプチドに相応する修飾を含む。例えば、追加のＬＥＡＤ修飾の例には、位置１６、２０、４５、４８、５２、８０、９０、９３、９６、１１６、１２３、１３０、１３１、１３６、１３９、１４３、１５０、１５３、１５９、１６５、及び１６６のうち、どの位置に該当するｉｓ−ＨＩＴ位置の置換があるが、これに限定されない。代表的な置換アミノ酸には、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｋ５２Ｎ、Ｋ５２Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｐ９０Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ１１６Ｔ、Ｄ１２３Ｎ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｎ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１４３Ｑ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１５０Ｈ、Ｌ１５３Ｖ、Ｅ１５９Ｎ、Ｄ１５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、及びＲ１６６Ｈがあるが、これに制限されるのではない。
【０２３６】
Ｓｕｐｅｒ−ＬｅａｄはＲ４での修飾及び更に他のＬＥＡＤ修飾の任意の組合を含むことができる。例えば、本発明で提供されるＳｕｐｅｒ−ＬＥＡＤは、位置Ｒ４での修飾（例えば、Ｒ４ＨまたはＲ４Ｑ）、１つの追加的なＬＥＡＤ修飾；または位置Ｒ４での修飾（例えば、Ｒ４ＨまたはＲ４Ｑ）、２つの追加的なＬＥＡＤ修飾；または位置Ｒ４での修飾（例えば、Ｒ４ＨまたはＲ４Ｑ）、及び３つの追加的なＬＥＡＤ修飾を含むことができる。一般に、位置Ｒ４での修飾及び１つ以上の追加的なＬＥＡＤ修飾は、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える修飾である。また、ＥＰＯ Ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドが未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素の耐性を表す場合、下記の段落３で記載したようなＥＰＯ Ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドには追加の修飾が含まれることができる。本発明で提供される代表的なＳｕｐｅｒ−ＬＥＡＤ ＥＰＯポリペプチドは、Ｒ４Ｈである少なくとも１つの修飾を含む。
【０２３７】
したがって、１つ以上の修飾を含む本発明で提供される代表的な修飾型ＥＰＯ Ｓｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドには、Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ、及びＲ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎなどがあるが、これに限定されない。そのようなポリペプチドは、配列番号３１１乃至３４２に記載されている。上記ＥＰＯポリペプチドには、１６６個アミノ酸の長さを有するもの、及び活性断片が修飾を含む場合、配列番号３１１乃至３４２に記載された活性断片がある。例えば、ＥＰＯポリペプチドには、１６５個アミノ酸の長さを有し、配列番号３１１乃至３４２のうちのいずれかでＣ−末端アルギニンが欠失されたものがある。
【０２３８】
上記修飾のうちのいずれかは、配列番号２または２３７で記載したアミノ酸配列を有するＥＰＯのような未修飾型ＥＰＯポリペプチドに存在するか、または配列番号２または２３７で記載した成熟ヒトＥＰＯポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体に位置できる。代表的な修飾型ＥＰＯ ＬＥＡＤ候補ポリペプチドは、配列番号３乃至２０１のうちのいずれか１つに記載されており、１６６個のアミノ酸を有するものの他にも、１６５個のアミノ酸を有し、Ｃ末端アルギニンが欠失されたものが含まれる。
【０２３９】
そのような修飾型ＬＥＡＤポリペプチドは、経口、全身、口腔、経皮、静脈内、筋肉内、及び皮下投与を含んだ任意の経路で投与できる。一般的に、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える１つ以上の修飾を含む修飾型ＥＰＯポリペプチドは、皮下投与されることと考えられる。タンパク質分解に対するポリペプチドの感受性が低いほど血清内の持続性が長くなる。上記ポリペプチドは、完全に糖化された形態、部分的に糖化された形態、または脱糖化されたポリペプチド形態で投与できる。後述するように、皮下投与の場合にも、タンパク質分解に対して増加された抵抗性を表すポリペプチドは、その糖化の欠失を補うことによって修飾がないものと比較して増加された半減期を表すことができることと判断される。しかしながら、代表的に、皮下投与される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えばポリペプチドが糖化されるようにする哺乳動物発現系、または他の発現系を用いてポリペプチドの糖化を達成するように製造される。
【０２４０】
また、前述したような修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比較して追加の修飾を含むこともできる。一般に、得られる修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１つ以上の活性を維持する。
【０２４１】
３．他のＥＰＯ修飾
本願で提供される１以上のアミノ酸修飾に加えてさらに修飾型ＥＰＯポリペプチドはまた、ＰＥＧ化、高糖化(hyperglycosylation)、脱免疫原化、及び他の方法など当業者に公知のものを含む１以上のさらなる修飾を含むが、これに限定されない（例えば、米国特許番号第５、８５６、２９８号、米国特許公開番号第２００３−０１２００４５号、第２００４−００６３９１７号、第２００５−０２２０８００号、第２００５−０１０７５９１号、第２００６−００３５３２２号、及び第２００６−００７３５６３号及びＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０１／８１４０５号参照）。一般的に、修飾は、未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１以上の活性、例えば、赤血球細胞生成または組織保護活性を失うことなく（すなわち、本願における定義のように、少なくとも一つの活性が維持される。）、増強された安定性をもたらす。例えば、ＥＰＯポリペプチドにおける他のさらなる修飾は、１以上の付加的なアミノ酸修飾及び／または１以上の化学的な修飾を含む。このような修飾は、免疫原性、糖化、活性、またはＥＰＯポリペプチドの他の公知の特性を変更することを含むが、これらに限定されない。他の例として、化学的な修飾は、タンパク質翻訳後修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化（例えば、アセチル化またはサクシニル化、メチル化、リン酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、プレニル化、酸化、グアニジル化、アミジン化、カルバミル化（例えば、カルバモイル化）、トリニトロフェニル化、窒酸化、ＰＥＧ化、またはこれらの組み合わせを含む。加えて、タンパク質修飾はまた、ポリペプチドの検出、精製、及び分析開発を容易化させるための修飾、例えば、タンパク質の１次アミンへの共有結合のためのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンとポリペプチドの修飾、または、蛍光、非同位性または放射性標識のための他の類似する修飾を含むことができる。代表的なＥＰＯポリペプチドにさらなる修飾は、後述する。さらに、接合及び／または標識された修飾型ポリペプチドが提供される。例えば、本願は、ＰＥＧ部位と接合されたか、または、ポリペプチド上における１以上の糖化部位に共有結合された炭水化物部位を含む修飾型ポリペプチドを提供する。
【０２４２】
他の実施態様として、ＥＰＯポリペプチドの他の公知の特性を、本願で提供される任意の１以上のアミノ酸修飾に加えて、修飾することができる。このような修飾は、ＥＰＯポリペプチドの赤血球細胞生成または組織保護活性の変更を含むが、これに限定されない。生成された修飾型ＥＰＯポリペプチドは、本願明細書に記述された任意の分析法を用いて、タンパク質安定性（例えば、タンパク質分解酵素に対する抵抗性の増強）などのポリペプチド特性、または赤血球細胞産生または組織保護活性などのポリペプチド活性などのポリペプチド活性を評価するための１以上のパラメータとして評価可能である。
【０２４３】
ａ．免疫原性
治療用タンパク質の効能は、多くの場合、治療用タンパク質に対する不所望の免疫反応により制限される。ＥＰＯなどの治療用タンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスIIペプチド提示経路により起こる。外来性タンパク質はのみ込まれてＤＲ、ＤＱ、またはＤＰ型のＭＨＣクラスII分子と関連して提示のために加工される。ＭＨＣクラスII分子は、マクロファージと樹脂状細胞などの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により発現される。ＣＤ４分子などの任意の他の共受容体への交差結合と共に、Ｔ細胞の表面にあるＴ細胞受容体によるＭＨＣクラスIIペプチド複合体の結合は、Ｔ細胞内活性化された状態を誘導する。活性化はサイトカインの排出をもたらし、さらに、Ｂ細胞などの他のリンパ球を活性化させて抗体を産生したり、全体的な細胞性免疫反応としてＴキラー細胞を活性化させる。
【０２４４】
ＡＰＣ表面における提示のためのＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド（Ｔ細胞エピトープ）の能力は、種々の要因のうち、最も顕著には、その１次配列により決定される。一次配列は、タンパク質分解的切断に対する傾向、及びＭＨＣクラスII分子のペプチド結合隙間内における結合についてのアフィニティに影響を与えると予想される。ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスII／ペプチド複合体は、前記ペプチド及びＭＨＣクラスII分子の露出された残基により提供された決定子を認識可能な特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する結合表面を提示する。
【０２４５】
治療用ＥＰＯポリペプチドの抑制抗体の形成は、この分野に周知な事実である（例えば、Casad evall et. al., (2002) N. Engl.J.Med.346:469-475; Macdougall (2004) Curr. Med. Res. Opin 20:83-86; Verhelst et. al., (2004) Lancet 363:1768-1771; Locatelli And Del Vecchio (2003) J.Nephrol. 16:461-466）。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの全体的な免疫原性を減少させるための修飾を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドの組み合わせは、ＥＰＯポリペプチドの治療的特性を増強させることができる。Ｔ細胞エピトープの確認は、この分野に周知な方法により行うことができ（例えば、米国特許公開番号第２００４−００６３９１７号、第２００５−０２２０８００号、第２００６−００３５３２２号、及び第２００６−００７３５６３号）、ＭＨＣクラスII分子へのＥＰＯペプチドの結合傾向を確認する上で使用可能である。
【０２４６】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのさらなる修飾は、タンパク質からの１以上のＴ細胞エピトープの活性の実質的な減少または除去、すなわち、ポリペプチドの脱免疫化をもたらす１以上のアミノ酸残基の修飾を含むことができる。任意のＭＨＣクラスIIリガンドの特定の位置における１以上のアミノ酸修飾は、ヒト宿主などの宿主に治療剤として投与したとき、減少された免疫原性を有する脱免疫原化されたＥＰＯポリペプチドをもたらすことができる。
【０２４７】
Ｔ細胞エピトープ及びこれにより減少された免疫原性潜在力を有する脱免疫原化型ＥＰＯポリペプチドの修飾のための代表的なアミノ酸位置は、次の位置に対応する１以上のアミノ酸の修飾を含む：配列番号２または２３７に示される成熟ＥＰＯポリペプチドのＲ４、Ｌ５、Ｉ６、Ｄ８、Ｓ９、Ｒ１０、Ｖ１１、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｒ１４、Ｙ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ａ１９、Ｋ２０、Ｅ２１、Ａ２２、Ｅ２３、Ｎ２４、Ｉ２５、Ｔ２７、Ｇ２８、Ａ３０、Ｃ３３、Ｌ３５、Ｎ３８、Ｉ３９、Ｔ４０、Ｖ４１、Ｄ４３、Ｖ４６、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４Ａ、Ｍ５４Ｃ、Ｍ５４Ｄ、Ｍ５４Ｅ、Ｍ５４Ｇ、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｖ５６、Ｇ５７、Ｑ５８、Ｑ５９、Ａ６０、Ｖ６１、Ｅ６２、Ｖ６３、Ｗ６４、Ｑ６５、Ｇ６６、Ｌ６７、Ａ６８、Ｌ６９Ｐ、Ｌ７０、Ｓ７１、Ｅ７２、Ａ７３Ｑ、Ａ７３、Ｖ７４、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｇ７７、Ａ７９、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｖ８２、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｌ９１、Ｑ９２、Ｌ９３、Ｈ９４、Ｖ９５、Ｄ９６、Ｋ９７、Ａ９８、Ｖ９９、Ｓ１００、Ｇ１０１、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｓ１０４、Ｌ１０５、Ｔ１０７、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｇ１１３、Ａ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ａ１１８、Ａ１１８Ｋ、Ｉ１１９、Ｓ１２０、Ａ１２４、Ａ１２５、Ａ１２７、Ｌ１３０、Ｉ１３３、Ａ１３５、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、Ｖ１４４、Ｙ１４５、Ｓ１４６、Ｎ１４７、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｇ１５１、Ｋ１５２、Ｌ１５３Ｅ、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｔ１５７、Ｇ１５８、Ｅ１５９、Ａ１６０、Ｃ１６１、Ｒ１６２、Ｔ１６３及びＧ１６４。
【０２４８】
Ｔ細胞エピトープを修飾することにより減少された免疫原性を有する脱免疫化されたＥＰＯポリペプチドを提供する代表的なアミノ酸置換には、下記のアミノ酸修飾がある：修飾されるアミノ酸位置がアミノ酸配列２または２３７に記載された配列を有する成熟ヒトＥＰＯポリペプチドに該当するか、配列番号２または２３７に記載された成熟ヒトＥＰＯポリペプチドに少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体の内の相応する位置にあるものであるＲ４Ａ、Ｒ４Ｃ、Ｒ４Ｇ、Ｒ４Ｐ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｃ、Ｌ５Ｄ、Ｌ５Ｅ、Ｌ５Ｇ、Ｌ５Ｈ、Ｌ５Ｋ、Ｌ５Ｎ、Ｌ５Ｐ、Ｌ５Ｑ、Ｌ５Ｒ、Ｌ５Ｓ、Ｌ５Ｔ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｃ、Ｉ６Ｄ、Ｉ６Ｅ、Ｉ６Ｇ、Ｉ６Ｈ、Ｉ６Ｋ、Ｉ６Ｎ、Ｉ６Ｐ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｒ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｍ、Ｉ６Ｗ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｃ、Ｄ８Ｇ、Ｄ８Ｐ、Ｓ９Ｐ、Ｓ９Ｔ、Ｒ１０Ａ、Ｒ１０Ｃ、Ｒ１０Ｇ、Ｒ１０Ｐ、Ｖ１１Ａ、Ｖ１１Ｃ、Ｖ１１Ｄ、Ｖ１１Ｅ、Ｖ１１Ｇ、Ｖ１１Ｈ、Ｖ１１Ｋ、Ｖ１１Ｎ、Ｖ１１Ｐ、Ｖ１１Ｑ、Ｖ１１Ｒ、Ｖ１１Ｓ、Ｖ１１Ｔ、Ｖ１１Ｆ、Ｖ１１Ｉ、Ｖ１１Ｍ、Ｖ１１Ｗ、Ｖ１１Ｙ、Ｌ１２Ａ、Ｌ１２Ｃ、Ｌ１２Ｄ、Ｌ１２Ｅ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｈ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｎ、Ｌ１２Ｐ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｒ、Ｌ１２Ｓ、Ｌ１２Ｔ、Ｌ１２Ｆ、Ｌ１２Ｉ、Ｌ１２Ｍ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｗ、Ｌ１２Ｙ、Ｅ１３Ａ、Ｅ１３Ｃ、Ｅ１３Ｇ、Ｅ１３Ｐ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｃ、Ｒ１４Ｇ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｐ、Ｒ１４Ｔ、Ｙ１５Ａ、Ｙ１５Ｃ、Ｙ１５Ｄ、Ｙ１５Ｅ、Ｙ１５Ｇ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｋ、Ｙ１５Ｎ、Ｙ１５Ｐ、Ｙ１５Ｑ、Ｙ１５Ｒ、Ｙ１５Ｓ、Ｙ１５Ｔ、Ｌ１６Ａ、Ｌ１６Ｃ、Ｌ１６Ｄ、Ｌ１６Ｅ、Ｌ１６Ｇ、Ｌ１６Ｈ、Ｌ１６Ｋ、Ｌ１６Ｎ、Ｌ１６Ｐ、Ｌ１６Ｑ、Ｌ１６Ｒ、Ｌ１６Ｓ、Ｌ１６Ｔ、Ｌ１６Ｗ、Ｌ１６Ｙ、Ｌ１７Ａ、Ｌ１７Ｃ、Ｌ１７Ｄ、Ｌ１７Ｅ、Ｌ１７Ｇ、Ｌ１７Ｈ、Ｌ１７Ｋ、Ｌ１７Ｎ、Ｌ１７Ｐ、Ｌ１７Ｑ、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１７Ｓ、Ｌ１７Ｔ、Ｌ１７Ｆ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｍ、Ｌ１７Ｖ、Ｌ１７Ｗ、Ｌ１７Ｙ、Ｅ１８Ａ、Ｅ１８Ｃ、Ｅ１８Ｇ、Ｅ１８Ｐ、Ｅ１８Ｔ、Ａ１９Ｈ、Ａ１９Ｐ、Ａ１９Ｔ、Ｋ２０Ｈ、Ｋ２
０Ｐ、Ｋ２０Ｔ、Ｅ２１Ａ、Ｅ２１Ｃ、Ｅ２１Ｇ、Ｅ２１Ｐ、Ａ２２Ｃ、Ａ２２Ｄ、Ａ２２Ｅ、Ａ２２Ｇ、Ａ２２Ｈ、Ａ２２Ｋ、Ａ２２Ｎ、Ａ２２Ｐ、Ａ２２Ｑ、Ａ２２Ｒ、Ａ２２Ｓ、Ａ２２Ｔ、Ｅ２３Ｐ、Ｅ２３Ｔ、Ｎ２４Ａ、Ｎ２４Ｃ、Ｎ２４Ｇ、Ｎ２４Ｐ、Ｉ２５Ａ、Ｉ２５Ｃ、Ｉ２５Ｄ、Ｉ２５Ｅ、Ｉ２５Ｇ、Ｉ２５Ｈ、Ｉ２５Ｋ、Ｉ２５Ｎ、Ｉ２５Ｐ、Ｉ２５Ｑ、Ｉ２５Ｒ、Ｉ２５Ｓ、Ｉ２５Ｔ、Ｔ２７Ａ、Ｔ２７Ｃ、Ｔ２７Ｇ、Ｔ２７Ｐ、Ｇ２８Ｈ、Ｇ２８Ｔ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｐ、Ｃ３３Ｈ、Ｃ３３Ｔ、Ｌ３５Ａ、Ｌ３５Ｃ、Ｌ３５Ｄ、Ｌ３５Ｅ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｈ、Ｌ３５Ｋ、Ｌ３５Ｎ、Ｌ３５Ｐ、Ｌ３５Ｑ、Ｌ３５Ｒ、Ｌ３５Ｓ、Ｌ３５Ｔ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ３５Ｗ、Ｌ３５Ｙ、Ｎ３８Ｔ、Ｉ３９Ａ、Ｉ３９Ｃ、Ｉ３９Ｄ、Ｉ３９Ｅ、Ｉ３９Ｇ、Ｉ３９Ｈ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｎ、Ｉ３９Ｐ、Ｉ３９Ｑ、Ｉ３９Ｒ、Ｉ３９Ｓ、Ｉ３９Ｔ、Ｔ４０Ｄ、Ｔ４０Ｈ、Ｖ４１Ａ、Ｖ４１Ｃ、Ｖ４１Ｄ、Ｖ４１Ｅ、Ｖ４１Ｇ、Ｖ４１Ｈ、Ｖ４１Ｋ、Ｖ４１Ｎ、Ｖ４１Ｐ、Ｖ４１Ｑ、Ｖ４１Ｒ、Ｖ４１Ｓ、Ｖ４１Ｔ、Ｖ４１Ｉ、Ｖ４１Ｙ、Ｄ４３Ｔ、Ｖ４６Ａ、Ｖ４６Ｃ、Ｖ４６Ｄ、Ｖ４６Ｅ、Ｖ４６Ｇ、Ｖ４６Ｈ、Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、Ｖ４６Ｐ、Ｖ４６Ｑ、Ｖ４６Ｒ、Ｖ４６Ｓ、Ｖ４６Ｔ、Ｖ４６Ｍ、Ｖ４６Ｗ、Ｖ４６Ｙ、Ｆ４８Ａ、Ｆ４８Ｃ、Ｆ４８Ｄ、Ｆ４８Ｅ、Ｆ４８Ｇ、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｋ、Ｆ４８Ｎ、Ｆ４８Ｐ、Ｆ４８Ｑ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｓ、Ｆ４８Ｔ、Ｆ４８Ｍ、Ｆ４８Ｗ、Ｙ４９Ａ、Ｙ４９Ｃ、Ｙ４９Ｄ、Ｙ４９Ｅ、Ｙ４９Ｇ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｋ、Ｙ４９Ｎ、Ｙ４９Ｐ、Ｙ４９Ｑ、Ｙ４９Ｒ、Ｙ４９Ｓ、Ｙ４９Ｔ、Ｙ４９Ｍ、Ｙ４９Ｗ、Ｗ５１Ａ、Ｗ５１Ｃ、Ｗ５１Ｄ、Ｗ５１Ｅ、Ｗ５１Ｇ、Ｗ５１Ｈ、Ｗ５１Ｋ、Ｗ５１Ｎ、Ｗ５１Ｐ、Ｗ５１Ｑ、Ｗ５１Ｒ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｔ、Ｋ５２Ａ、Ｋ５２Ｃ、Ｋ５２Ｇ、Ｋ５２Ｈ、Ｋ５２Ｐ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｅ、Ｋ５２Ｄ、Ｒ５３Ａ、Ｒ５３Ｃ、Ｒ５３Ｇ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｐ、Ｒ５３Ｑ、Ｒ５３Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｓ、Ｒ５３Ｅ、Ｒ５３Ａ、Ｒ５３Ｄ、Ｍ５４Ａ、Ｍ５４Ｃ、Ｍ５４Ｄ、Ｍ５４Ｅ、Ｍ５４Ｇ、Ｍ５４Ｈ、Ｍ５４Ｋ、Ｍ５４Ｎ、Ｍ５４Ｐ、Ｍ５４Ｑ、Ｍ５４Ｒ、Ｍ５４Ｓ、Ｍ５４Ｔ、Ｍ５４Ｆ、Ｍ５４Ｉ、Ｍ５４Ｌ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｗ、Ｍ５４Ｙ、Ｅ５５Ａ、Ｅ５５Ｃ、Ｅ５５Ｇ、Ｅ５５Ｐ、Ｅ５５Ｔ、Ｖ５６、Ｖ５６
Ａ、Ｖ５６Ｃ、Ｖ５６Ｄ、Ｖ５６Ｅ、Ｖ５６Ｇ、Ｖ５６Ｈ、Ｖ５６Ｋ、Ｖ５６Ｎ、Ｖ５６Ｐ、Ｖ５６Ｑ、Ｖ５６Ｒ、Ｖ５６Ｓ、Ｖ５６Ｔ、Ｖ５６Ｆ、Ｖ５６Ｉ、Ｖ５６Ｌ、Ｖ５６Ｗ、Ｖ５６Ｙ、Ｇ５７Ｃ、Ｇ５７Ｄ、Ｇ５７Ｅ、Ｇ５７Ｈ、Ｇ５７Ｋ、Ｇ５７Ｎ、Ｇ５７Ｐ、Ｇ５７Ｑ、Ｇ５７Ｒ、Ｇ５７Ｓ、Ｇ５７Ｔ、Ｑ５８Ａ、Ｑ５８Ｃ、Ｑ５８Ｇ、Ｑ５８Ｐ、Ｑ５９Ａ、Ｑ５９Ｃ、Ｑ５９Ｇ、Ｑ５９Ｈ、Ｑ５９Ｐ、Ｑ５９Ｔ、Ｑ５９Ｋ、Ｑ５９Ｒ、Ｑ５９Ｍ、Ｑ５９Ｗ、Ｑ５９Ｌ、Ｑ５９Ｙ、Ｑ５９Ｆ、Ｑ５９Ｎ、Ｑ５９Ｅ、Ｑ５９Ｉ、Ｑ５９Ａ、Ａ６０Ｃ、Ａ６０Ｄ、Ａ６０Ｅ、Ａ６０Ｇ、Ａ６０Ｈ、Ａ６０Ｋ、Ａ６０Ｎ、Ａ６０Ｐ、Ａ６０Ｑ、Ａ６０Ｒ、Ａ６０Ｓ、Ａ６０Ｔ、Ｖ６１Ａ、Ｖ６１Ｃ、Ｖ６１Ｄ、Ｖ６１Ｅ、Ｖ６１Ｇ、Ｖ６１Ｈ、Ｖ６１Ｋ、Ｖ６１Ｎ、Ｖ６１Ｐ、Ｖ６１Ｑ、Ｖ６１Ｒ、Ｖ６１Ｓ、Ｖ６１Ｔ、Ｖ６１Ｗ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｐ、Ｅ６２Ｓ、Ｅ６２Ｔ、Ｖ６３Ａ、Ｖ６３Ｃ、Ｖ６３Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｇ、Ｖ６３Ｈ、Ｖ６３Ｋ、Ｖ６３Ｎ、Ｖ６３Ｐ、Ｖ６３Ｑ、Ｖ６３Ｒ、Ｖ６３Ｓ、Ｖ６３Ｔ、Ｖ６３Ｆ、Ｖ６３Ｉ、Ｖ６３Ｍ、Ｖ６３Ｗ、Ｖ６３Ｙ、Ｗ６４Ａ、Ｗ６４Ｃ、Ｗ６４Ｄ、Ｗ６４Ｅ、Ｗ６４Ｇ、Ｗ６４Ｈ、Ｗ６４Ｋ、Ｗ６４Ｎ、Ｗ６４Ｐ、Ｗ６４Ｑ、Ｗ６４Ｒ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｔ、Ｑ６５Ａ、Ｑ６５Ｃ、Ｑ６５Ｇ、Ｑ６５Ｐ、Ｇ６６Ｄ、Ｇ６６Ｅ、Ｇ６６Ｈ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｎ、Ｇ６６Ｐ、Ｇ６６Ｑ、Ｇ６６Ｒ、Ｇ６６Ｓ、Ｇ６６Ｔ、Ｌ６７Ａ、Ｌ６７Ｃ、Ｌ６７Ｄ、Ｌ６７Ｅ、Ｌ６７Ｇ、Ｌ６７Ｈ、Ｌ６７Ｋ、Ｌ６７Ｎ、Ｌ６７Ｐ、Ｌ６７Ｑ、Ｌ６７Ｒ、Ｌ６７Ｓ、Ｌ６７Ｔ、Ｌ６７Ｆ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｈ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６７Ｗ、Ｌ６７Ｙ、Ａ６８Ｃ、Ａ６８Ｄ、Ａ６８Ｅ、Ａ６８Ｇ、Ａ６８Ｈ、Ａ６８Ｋ、Ａ６８Ｎ、Ａ６８Ｐ、Ａ６８Ｑ、Ａ６８Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ａ６８Ｔ、Ｌ６９Ａ、Ｌ６９Ｃ、Ｌ６９Ｄ、Ｌ６９Ｅ、Ｌ６９Ｇ、Ｌ６９Ｈ、Ｌ６９Ｋ、Ｌ６９Ｎ、Ｌ６９Ｐ、Ｌ６９Ｑ、Ｌ６９Ｒ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｔ、Ｌ６９Ｆ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｌ６９Ｗ、Ｌ６９Ｙ、Ｌ７０Ａ、Ｌ７０Ｃ、Ｌ７０Ｄ、Ｌ７０Ｅ、Ｌ７０Ｇ、Ｌ７０Ｈ、Ｌ７０Ｋ、Ｌ７０Ｎ、Ｌ７０Ｐ、Ｌ７０Ｑ、Ｌ７０Ｒ、Ｌ７０Ｓ、Ｌ７０Ｔ、Ｌ７０Ｙ、Ｓ７１Ａ、Ｓ７１Ｃ、Ｓ７１Ｇ、Ｓ７１Ｈ、Ｓ７１Ｐ、Ｓ７１Ｔ、Ｅ７２Ｈ、Ｅ７２Ｐ、Ｅ７２Ｔ、Ａ７３Ｅ、Ａ７３Ｈ、Ａ７３Ｐ、Ａ７３
Ｑ、Ａ７３Ｔ、Ｖ７４Ａ、Ｖ７４Ｃ、Ｖ７４Ｄ、Ｖ７４Ｅ、Ｖ７４Ｇ、Ｖ７４Ｈ、Ｖ７４Ｋ、Ｖ７４Ｎ、Ｖ７４Ｐ、Ｖ７４Ｑ、Ｖ７４Ｒ、Ｖ７４Ｓ、Ｖ７４Ｔ、Ｖ７４Ｆ、Ｖ７４Ｉ、Ｖ７４Ｗ、Ｖ７４Ｙ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｃ、Ｌ７５Ｄ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｇ、Ｌ７５Ｈ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｎ、Ｌ７５Ｐ、Ｌ７５Ｑ、Ｌ７５Ｒ、Ｌ７５Ｓ、Ｌ７５Ｔ、Ｌ７５Ｆ、Ｌ７５Ｉ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｗ、Ｌ７５Ｙ、Ｒ７６Ａ、Ｒ７６Ｃ、Ｒ７６Ｇ、Ｒ７６Ｐ、Ｇ７７Ｈ、Ｇ７７Ｐ、Ｇ７７Ｔ、Ａ７９Ｈ、Ａ７９Ｐ、Ｌ８０Ａ、Ｌ８０Ｃ、Ｌ８０Ｄ、Ｌ８０Ｅ、Ｌ８０Ｇ、Ｌ８０Ｈ、Ｌ８０Ｋ、Ｌ８０Ｎ、Ｌ８０Ｐ、Ｌ８０Ｑ、Ｌ８０Ｒ、Ｌ８０Ｓ、Ｌ８０Ｔ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８０Ｙ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８１Ｃ、Ｌ８１Ｄ、Ｌ８１Ｅ、Ｌ８１Ｇ、Ｌ８１Ｈ、Ｌ８１Ｋ、Ｌ８１Ｎ、Ｌ８１Ｐ、Ｌ８１Ｑ、Ｌ８１Ｒ、Ｌ８１Ｓ、Ｌ８１Ｔ、Ｖ８２Ａ、Ｖ８２Ｃ、Ｖ８２Ｄ、Ｖ８２Ｅ、Ｖ８２Ｇ、Ｖ８２Ｈ、Ｖ８２Ｋ、Ｖ８２Ｎ、Ｖ８２Ｐ、Ｖ８２Ｑ、Ｖ８２Ｒ、Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｔ、Ｗ８８Ａ、Ｗ８８Ｃ、Ｗ８８Ｄ、Ｗ８８Ｅ、Ｗ８８Ｇ、Ｗ８８Ｈ、Ｗ８８Ｋ、Ｗ８８Ｎ、Ｗ８８Ｐ、Ｗ８８Ｑ、Ｗ８８Ｒ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｔ、Ｅ８９Ａ、Ｅ８９Ｃ、Ｅ８９Ｇ、Ｅ８９Ｐ、Ｌ９１Ａ、Ｌ９１Ｃ、Ｌ９１Ｄ、Ｌ９１Ｅ、Ｌ９１Ｇ、Ｌ９１Ｈ、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｎ、Ｌ９１Ｐ、Ｌ９１Ｑ、Ｌ９１Ｒ、Ｌ９１Ｓ、Ｌ９１Ｔ、Ｌ９１Ｆ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｍ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９１Ｗ、Ｌ９１Ｙ、Ｑ９２Ａ、Ｑ９２Ｃ、Ｑ９２Ｇ、Ｑ９２Ｐ、Ｌ９３Ａ、Ｌ９３Ｃ、Ｌ９３Ｄ、Ｌ９３Ｅ、Ｌ９３Ｇ、Ｌ９３Ｈ、Ｌ９３Ｋ、Ｌ９３Ｎ、Ｌ９３Ｐ、Ｌ９３Ｑ、Ｌ９３Ｒ、Ｌ９３Ｓ、Ｌ９３Ｔ、Ｌ９３Ｍ、Ｌ９３Ｗ、Ｌ９３Ｙ、Ｈ９４Ｐ、Ｈ９４Ｔ、Ｖ９５Ａ、Ｖ９５Ｃ、Ｖ９５Ｄ、Ｖ９５Ｅ、Ｖ９５Ｇ、Ｖ９５Ｈ、Ｖ９５Ｋ、Ｖ９５Ｎ、Ｖ９５Ｐ、Ｖ９５Ｑ、Ｖ９５Ｒ、Ｖ９５Ｓ、Ｖ９５Ｔ、Ｖ９５Ｆ、Ｖ９５Ｉ、Ｖ９５Ｍ、Ｖ９５Ｗ、Ｖ９５Ｙ、Ｄ９６Ａ、Ｄ９６Ｃ、Ｄ９６Ｇ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｐ、Ｄ９６Ｔ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９７Ｃ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｐ、Ａ９８Ｃ、Ａ９８Ｄ、Ａ９８Ｅ、Ａ９８Ｈ、Ａ９８Ｋ、Ａ９８Ｎ、Ａ９８Ｐ、Ａ９８Ｑ、Ａ９８Ｒ、Ａ９８Ｓ、Ａ９８Ｔ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｃ、Ｖ９９Ｄ、Ｖ９９Ｅ、Ｖ９９Ｇ、Ｖ９９Ｈ、Ｖ９９Ｋ、Ｖ９９Ｎ、Ｖ９９Ｐ、Ｖ９９Ｑ、Ｖ９９Ｒ、Ｖ９９Ｓ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｗ、Ｖ９９Ｙ、Ｓ１０
０Ｄ、Ｓ１００Ｈ、Ｓ１００Ｎ、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｑ、Ｇ１０１Ｄ、Ｇ１０１Ｅ、Ｇ１０１Ｈ、Ｇ１０１Ｋ、Ｇ１０１Ｎ、Ｇ１０１Ｐ、Ｇ１０１Ｑ、Ｇ１０１Ｒ、Ｇ１０１Ｓ、Ｇ１０１Ｔ、Ｌ１０２Ａ、Ｌ１０２Ｃ、Ｌ１０２Ｄ、Ｌ１０２Ｅ、Ｌ１０２Ｇ、Ｌ１０２Ｈ、Ｌ１０２Ｋ、Ｌ１０２Ｎ、Ｌ１０２Ｐ、Ｌ１０２Ｑ、Ｌ１０２Ｒ、Ｌ１０２Ｓ、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０２Ｆ、Ｌ１０２Ｉ、Ｌ１０２Ｗ、Ｌ１０２Ｗ、Ｌ１０２Ｙ、Ｒ１０３Ｄ、Ｒ１０３Ｅ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｎ、Ｒ１０３Ｐ、Ｒ１０３Ｑ、Ｒ１０３Ｓ、Ｒ１０３Ｔ、Ｒ１０３Ｋ、Ｒ１０３Ｉ、Ｒ１０３Ｍ、Ｓ１０４Ｈ、Ｓ１０４Ｐ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ｔ、Ｌ１０５Ａ、Ｌ１０５Ｃ、Ｌ１０５Ｄ、Ｌ１０５Ｅ、Ｌ１０５Ｇ、Ｌ１０５Ｈ、Ｌ１０５Ｋ、Ｌ１０５Ｎ、Ｌ１０５Ｐ、Ｌ１０５Ｑ、Ｌ１０５Ｒ、Ｌ１０５Ｓ、Ｌ１０５Ｔ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｙ、Ｌ１０５Ｖ、Ｔ１０７Ｈ、Ｔ１０７Ｋ、Ｔ１０７Ｒ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｄ、Ｔ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０８Ｃ、Ｌ１０８Ｄ、Ｌ１０８Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｌ１０８Ｈ、Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｎ、Ｌ１０８Ｐ、Ｌ１０８Ｑ、Ｌ１０８Ｒ、Ｌ１０８Ｓ、Ｌ１０８Ｔ、Ｌ１０８Ｗ、Ｌ１０８Ｙ、Ｌ１０９Ａ、Ｌ１０９Ｃ、Ｌ１０９Ｄ、Ｌ１０９Ｅ、Ｌ１０９Ｇ、Ｌ１０９Ｈ、Ｌ１０９Ｋ、Ｌ１０９Ｎ、Ｌ１０９Ｐ、Ｌ１０９Ｑ、Ｌ１０９Ｒ、Ｌ１０９Ｓ、Ｌ１０９Ｔ、Ｌ１０９Ｆ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｍ、Ｌ１０９Ｖ、Ｌ１０９Ｗ、Ｌ１０９Ｙ、Ｒ１１０Ａ、Ｒ１１０Ｃ、Ｒ１１０Ｇ、Ｒ１１０Ｐ、Ｒ１１０Ｋ、Ｒ１１０Ｎ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｒ１１０Ｔ、Ｒ１１０Ｄ、Ｒ１１０Ｙ、Ｌ１１２Ａ、Ｌ１１２Ｃ、Ｌ１１２Ｄ、Ｌ１１２Ｅ、Ｌ１１２Ｇ、Ｌ１１２Ｈ、Ｌ１１２Ｋ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｐ、Ｌ１１２Ｑ、Ｌ１１２Ｒ、Ｌ１１２Ｓ、Ｌ１１２Ｔ、Ｌ１１２Ｆ、Ｌ１１２Ｉ、Ｌ１１２Ｍ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｗ、Ｌ１１２Ｙ、Ｇ１１３Ｈ、Ｇ１１３Ｔ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｄ、Ａ１１４Ｅ、Ａ１１４Ｇ、Ａ１１４Ｈ、Ａ１１４Ｋ、Ａ１１４Ｎ、Ａ１１４Ｐ、Ａ１１４Ｑ、Ａ１１４Ｒ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１４Ｔ、Ｑ１１５Ｐ、Ｑ１１５Ｔ、Ｋ１１６Ａ、Ｋ１１６Ｃ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｐ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｐ、Ｅ１１７Ｔ、Ａ１１８Ｃ、Ａ１１８Ｄ、Ａ１１８Ｅ、Ａ１１８Ｇ、Ａ１１８Ｈ、Ａ１１８Ｋ、Ａ１１８Ｎ、Ａ１１８Ｐ、Ａ１１８Ｑ、Ａ
１１８Ｒ、Ａ１１８Ｓ、Ａ１１８Ｔ、Ｉ１１９Ａ、Ｉ１１９Ｃ、Ｉ１１９Ｄ、Ｉ１１９Ｅ、Ｉ１１９Ｇ、Ｉ１１９Ｈ、Ｉ１１９Ｋ、Ｉ１１９Ｎ、Ｉ１１９Ｐ、Ｉ１１９Ｑ、Ｉ１１９Ｒ、Ｉ１１９Ｓ、Ｉ１１９Ｔ、Ｉ１１９Ｗ、Ｉ１１９Ｙ、Ｓ１２０Ｐ、Ｓ１２０Ｔ、Ａ１２４Ｄ、Ａ１２４Ｈ、Ａ１２４Ｐ、Ａ１２５Ｐ、Ａ１２５Ｔ、Ａ１２７Ｈ、Ａ１２７Ｐ、Ａ１２７Ｔ、Ｌ１３０Ａ、Ｌ１３０Ｃ、Ｌ１３０Ｄ、Ｌ１３０Ｅ、Ｌ１３０Ｇ、Ｌ１３０Ｈ、Ｌ１３０Ｋ、Ｌ１３０Ｎ、Ｌ１３０Ｐ、Ｌ１３０Ｑ、Ｌ１３０Ｒ、Ｌ１３０Ｓ、Ｌ１３０Ｔ、Ｌ１３０Ｍ、Ｌ１３０Ｗ、Ｌ１３０Ｙ、Ｉ１３３Ａ、Ｉ１３３Ｃ、Ｉ１３３Ｄ、Ｉ１３３Ｅ、Ｉ１３３Ｇ、Ｉ１３３Ｈ、Ｉ１３３Ｋ、Ｉ１３３Ｎ、Ｉ１３３Ｐ、Ｉ１３３Ｑ、Ｉ１３３Ｒ、Ｉ１３３Ｓ、Ｉ１３３Ｔ、Ｉ１３３Ｗ、Ｉ１３３Ｙ、Ａ１３５Ｈ、Ａ１３５Ｐ、Ｄ１３６Ｐ、Ｄ１３６Ｔ、Ｆ１３８Ａ、Ｆ１３８Ｃ、Ｆ１３８Ｄ、Ｆ１３８Ｅ、Ｆ１３８Ｇ、Ｆ１３８Ｈ、Ｆ１３８Ｋ、Ｆ１３８Ｎ、Ｆ１３８Ｐ、Ｆ１３８Ｑ、Ｆ１３８Ｒ、Ｆ１３８Ｓ、Ｆ１３８Ｔ、Ｆ１３８Ｍ、Ｆ１３８Ｗ、Ｆ１３８Ｙ、Ｒ１３９Ａ、Ｒ１３９Ｃ、Ｒ１３９Ｇ、Ｒ１３９Ｐ、Ｒ１３９Ｔ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｋ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１３９Ｎ、Ｒ１３９Ｄ、Ｒ１３９Ｅ、Ｒ１３９Ｄ、Ｒ１３９Ｓ、Ｒ１３９Ａ、Ｋ１４０Ａ、Ｋ１４０Ｃ、Ｋ１４０Ｇ、Ｋ１４０Ｐ、Ｋ１４０Ｄ、Ｋ１４０Ｅ、Ｌ１４１Ａ、Ｌ１４１Ｃ、Ｌ１４１Ｄ、Ｌ１４１Ｅ、Ｌ１４１Ｇ、Ｌ１４１Ｈ、Ｌ１４１Ｋ、Ｌ１４１Ｎ、Ｌ１４１Ｐ、Ｌ１４１Ｑ、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｓ、Ｌ１４１Ｔ、Ｌ１４１Ｆ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｈ、Ｌ１４１Ｖ、Ｌ１４１Ｗ、Ｌ１４１Ｙ、Ｆ１４２Ａ、Ｆ１４２Ｃ、Ｆ１４２Ｄ、Ｆ１４２Ｅ、Ｆ１４２Ｇ、Ｆ１４２Ｈ、Ｆ１４２Ｋ、Ｆ１４２Ｎ、Ｆ１４２Ｐ、Ｆ１４２Ｑ、Ｆ１４２Ｒ、Ｆ１４２Ｓ、Ｆ１４２Ｔ、Ｆ１４２Ｗ、Ｒ１４３Ａ、Ｒ１４３Ｃ、Ｒ１４３Ｇ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｐ、Ｒ１４３Ｍ、Ｒ１４３Ｌ、Ｒ１４３Ｋ、Ｒ１４３Ｑ、Ｒ１４３Ｅ、Ｒ１４３Ｗ、Ｒ１４３Ｄ、Ｒ１４３Ｎ、Ｒ１４３Ａ、Ｒ１４３Ｔ、Ｒ１４３Ｓ、Ｖ１４４Ａ、Ｖ１４４Ｃ、Ｖ１４４Ｄ、Ｖ１４４Ｅ、Ｖ１４４Ｇ、Ｖ１４４Ｈ、Ｖ１４４Ｋ、Ｖ１４４Ｎ、Ｖ１４４Ｐ、Ｖ１４４Ｑ、Ｖ１４４Ｒ、Ｖ１４４Ｓ、Ｖ１４４Ｔ、Ｙ１４５Ａ、Ｙ１４５Ｃ、Ｙ１４５Ｄ、Ｙ１４５Ｅ、Ｙ１４５Ｇ、Ｙ１４５Ｈ
、Ｙ１４５Ｋ、Ｙ１４５Ｎ、Ｙ１４５Ｐ、Ｙ１４５Ｑ、Ｙ１４５Ｒ、Ｙ１４５Ｓ、Ｙ１４５Ｔ、Ｙ１４５Ｗ、Ｓ１４６Ｄ、Ｓ１４６Ｈ、Ｓ１４６Ｐ、Ｓ１４６Ｔ、Ｓ１４６Ｆ、Ｓ１４６Ｌ、Ｓ１４６Ｙ、Ｓ１４６Ｅ、Ｓ１４６Ｗ、Ｓ１４６Ａ、Ｓ１４６Ｍ、Ｓ１４６Ｋ、Ｓ１４６Ｑ、Ｓ１４６Ｇ、Ｓ１４６Ｎ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｄ、Ｆ１４８Ａ、Ｆ１４８Ｃ、Ｆ１４８Ｄ、Ｆ１４８Ｅ、Ｆ１４８Ｇ、Ｆ１４８Ｈ、Ｆ１４８Ｋ、Ｆ１４８Ｎ、Ｆ１４８Ｐ、Ｆ１４８Ｑ、Ｆ１４８Ｒ、Ｆ１４８Ｓ、Ｆ１４８Ｔ、Ｆ１４８Ｍ、Ｌ１４９Ａ、Ｌ１４９Ｃ、Ｌ１４９Ｄ、Ｌ１４９Ｅ、Ｌ１４９Ｇ、Ｌ１４９Ｈ、Ｌ１４９Ｋ、Ｌ１４９Ｎ、Ｌ１４９Ｐ、Ｌ１４９Ｑ、Ｌ１４９Ｒ、Ｌ１４９Ｓ、Ｌ１４９Ｔ、Ｌ１４９Ｆ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｈ、Ｌ１４９Ｖ、Ｌ１４９Ｗ、Ｌ１４９Ｙ、Ｒ１５０Ａ、Ｒ１５０Ｃ、Ｒ１５０Ｄ、Ｒ１５０Ｇ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｐ、Ｒ１５０Ｔ、Ｒ１５０Ｋ、Ｒ１５０Ｅ、Ｒ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｔ、Ｇ１５１Ａ、Ｋ１５２Ａ、Ｋ１５２Ｃ、Ｋ１５２Ｄ、Ｋ１５２Ｇ、Ｋ１５２Ｎ、Ｋ１５２Ｐ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｓ、Ｋ１５２Ｔ、Ｌ１５３Ａ、Ｌ１５３Ｃ、Ｌ１５３Ｄ、Ｌ１５３Ｅ、Ｌ１５３Ｇ、Ｌ１５３Ｈ、Ｌ１５３Ｋ、Ｌ１５３Ｎ、Ｌ１５３Ｐ、Ｌ１５３Ｑ、Ｌ１５３Ｒ、Ｌ１５３Ｓ、Ｌ１５３Ｔ、Ｌ１５３Ｆ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｍ、Ｌ１５３Ｖ、Ｌ１５３Ｗ、Ｌ１５３Ｙ、Ｋ１５４Ａ、Ｋ１５４Ｃ、Ｋ１５４Ｄ、Ｋ１５４Ｅ、Ｋ１５４Ｇ、Ｋ１５４Ｈ、Ｋ１５４Ｎ、Ｋ１５４Ｐ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｓ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｆ、Ｋ１５４Ｗ、Ｋ１５４Ｌ、Ｋ１５４Ｍ、Ｋ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｎ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｙ１５６Ａ、Ｙ１５６Ｃ、Ｙ１５６Ｄ、Ｙ１５６Ｅ、Ｙ１５６Ｇ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｋ、Ｙ１５６Ｎ、Ｙ１５６Ｐ、Ｙ１５６Ｑ、Ｙ１５６Ｒ、Ｙ１５６Ｓ、Ｙ１５６Ｔ、Ｙ１５６Ｍ、Ｙ１５６Ｗ、Ｙ１５６Ｙ、Ｔ１５７Ａ、Ｔ１５７Ｃ、Ｔ１５７Ｆ、Ｔ１５７Ｇ、Ｔ１５７Ｉ、Ｔ１５７Ｌ、Ｔ１５７Ｍ、Ｔ１５７Ｐ、Ｔ１５７Ｖ、Ｔ１５７Ｗ、Ｔ１５
７Ｙ、Ｔ１５７Ｎ、Ｔ１５７Ｄ、Ｔ１５７Ｅ、Ｇ１５８Ｃ、Ｇ１５８Ｄ、Ｇ１５８Ｅ、Ｇ１５８Ｆ、Ｇ１５８Ｈ、Ｇ１５８Ｉ、Ｇ１５８Ｋ、Ｇ１５８Ｍ、Ｇ１５８Ｎ、Ｇ１５８Ｐ、Ｇ１５８Ｑ、Ｇ１５８Ｒ、Ｇ１５８Ｓ、Ｇ１５８Ｔ、Ｇ１５８Ｖ、Ｇ１５８Ｗ、Ｇ１５８Ｙ、Ｅ１５９Ａ、Ｅ１５９Ｃ、Ｅ１５９Ｆ、Ｅ１５９Ｇ、Ｅ１５９Ｉ、Ｅ１５９Ｌ、Ｅ１５９Ｍ、Ｅ１５９Ｐ、Ｅ１５９Ｔ、Ｅ１５９Ｖ、Ｅ１５９Ｋ、Ｅ１５９Ｙ、Ａ１６０Ｄ、Ａ１６０Ｆ、Ａ１６０Ｈ、Ａ１６０Ｉ、Ａ１６０Ｌ、Ａ１６０Ｐ、Ａ１６０Ｖ、Ａ１６０Ｗ、Ａ１６０Ｙ、Ｃ１６１Ｄ、Ｃ１６１Ｅ、Ｃ１６１Ｆ、Ｃ１６１Ｈ、Ｃ１６１Ｉ、Ｃ１６１Ｋ、Ｃ１６１Ｌ、Ｃ１６１Ｎ、Ｃ１６１Ｐ、Ｃ１６１Ｑ、Ｃ１６１Ｒ、Ｃ１６１Ｓ、Ｃ１６１Ｔ、Ｃ１６１Ｖ、Ｃ１６１Ｗ、Ｃ１６１Ｙ、Ｒ１６２Ｔ、Ｔ１６３Ａ、Ｔ１６３Ｃ、Ｔ１６３Ｆ、Ｔ１６３Ｇ、Ｔ１６３Ｉ、Ｔ１６３Ｌ、Ｔ１６３Ｍ、Ｔ１６３Ｐ、Ｔ１６３Ｖ、Ｔ１６３Ｗ、Ｔ１６３Ｙ、Ｇ１６４Ｆ、Ｇ１６４Ｈ、Ｇ１６４Ｉ、Ｇ１６４Ｎ、Ｇ１６４Ｐ、Ｇ１６４Ｑ、Ｇ１６４Ｓ、Ｇ１６４Ｔ、Ｇ１６４Ｖ、Ｇ１６４Ｗ、及びＧ１６４Ｙ。ＥＰＯポリペプチドの免疫原性を減少させるのに寄与可能な代表的なアミノ酸修飾は、配列番号２または２３７に示される成熟ＥＰＯポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、表４に示す１以上の修飾に対応する任意の１以上のアミノ酸修飾を含む。
【０２４９】
【表４Ａ】
2011520472.tif 000006
【表４Ｂ】
2011520472.tif 000007
【表４Ｃ】
2011520472.tif 000008
【０２５０】
ｂ．糖化
治療的活性を有する多くのタンパク質は、１以上の糖化部位、すなわち、真核細胞により糖化されるアミノ酸配列を含む。例えば、アミノ酸配列は、真核細胞により糖化される。治療用タンパク質の糖化の度合いは、１）免疫原性減少、２）タンパク質投与回数の減少、３）血清内半減期の増加などのタンパク質安定性の増強、及び４）炎症反応などの副作用の減少のために変更可能である 。糖化部位は、糖化能がある真核細胞において対象ポリペプチドが産生されるときに糖化される対象ポリペプチドに炭水化物部位の結合のための位置を提供する。ＥＰＯポリペプチドのさらなる糖化は、血清半減期増加、免疫原性減少、インビボ半減期増加、胃腸管条件、例えば、胃腸管タンパク質分解酵素による分解減少及び腸上皮細胞の吸収率増加を含む１以上のメリットを付与する。腸上皮細胞による吸収率増加と胃腸管条件による分解減少は、ＥＰＯポリペプチドの腸溶（例えば、経口）製剤において重要である。
【０２５１】
糖化は、安定性、溶解性増加とタンパク質の免疫原性減少によりポリペプチドの血清内半減期を増加させることができる。糖化は、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解を減少させてタンパク質の安定性を増強させ、熱変性、変性化剤への露出、酸素フリーラジカルによる損傷、及びｐＨ変化からタンパク質を保護することができる。糖化はまた、標的タンパク質が細胞表面受容体を含む他のタンパク質との結合を含む除去メカニズムを回避するようにできる。シアル酸を含む炭水化物部位は、タンパク質の溶解性に影響を与えうる。シアル酸部位は、標的タンパク質の疎水性残基を遮蔽することができる。これは、標的タンパク質の沈殿と凝集を減少させる。減少された凝集はまた、標的タンパク質に対抗する免疫反応の回避を助ける。炭水化物は、さらに、免疫体系から免疫原性配列を遮蔽することができる。炭水化物部位により占められた空間の体積は、免疫体系により監視される利用可能な表面地域を減少させることができる。このような特徴は、標的タンパク質の免疫原性を減少させる。
【０２５２】
タンパク質の糖化は、ポリペプチドにオリゴ糖の共有結合に起因する糖タンパク質の形成をもたらす。糖タンパク質において発見された炭水化物修飾は、Ｏ−グリコシド結合またはＮ−グリコシド結合を通じて前記タンパク質構成要素と結合される。哺乳動物細胞の糖タンパク質における主な炭水化物の付着は、Ｎ−グリコシド結合による。Ｎ−グリコシド結合は、アスパラギンのアミド基の窒素による。Ｎ結合糖タンパク質の炭水化物の付着位置は、アミノ酸共通配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ内において発見され、ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。Ｎ結合糖化においてタンパク質に直接的に付着する炭水化物は、１４残基のオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である。糖転移酵素は、結果的に付着したオリゴ糖を改変させて成熟Ｎ−グリカンを形成する。Ｎ結合オリゴ糖は、マンノース、Ｎ−アセトグルコサミンを含み、典型的にいくつかの炭水化物枝を含み、それぞれは陰電荷を帯びるシアル酸残基により終結される。タンパク質２次構造は、糖化のための目標として共通位置の利用可能性に影響を与えることができる。糖化は宿主細胞に極めて依存的であると知られているため、タンパク質のＮ結合糖化と関連する糖鎖は異なりうる（(Kagawa et. al.,(1998) JBC 263:17508-17515）。Ｏ−グリコシド結合は、セリン、トレオニン、またはヒドロキシリシンの水酸基において起こる。ＳｅｒまたはＴｈｒ型Ｏ結合糖タンパク質においてタンパク質に直接的に付着した炭水化物は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）またはガラクトースなどの単糖類である。糖転移酵素は、結果的に修飾型残基に付加的な炭水化物部位を付けて成熟Ｏ−グリカンを形成し、これは、典型的に、１〜４個の糖残基を有する。Ｏ結合糖化は、典型的に、拡張されたベータターンなどのタンパク質２次構造により定められた位置において起こる。Ｏ結合糖化部位の数は当業界に公知されている（例えば、Ten Hagen et. al., (1999) J.Biol. Chem., 274:27867-74; Hanish et. al., (2001) Glycobiology, 11:731-740; and Ten Hagen et. al., (2003) Glycobiology, 12:1R-16R参照）。
【０２５３】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型ＥＰＯポリペプチドにおいて発見されない少なくとも一つの非天然糖化部位に共有結合された炭水化物部位、または未修飾型ＥＰＯポリペプチドにおいて発見されるものの糖化されない少なくとも一つの天然糖化部位に共有結合された炭水化物部位に起因して、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比べてさらに糖化可能である。ＥＰＯポリペプチドは１以上の位置において修飾されてポリペプチドの糖化に影響を与えることができる（すなわち、高糖化）。高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、Ｏ結合糖化、Ｎ結合糖化及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。場合によっては、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは糖化１、２、３、４、５以上の炭水化物部位を含むことができ、それぞれは他の糖化部位に結合される。他の例において、高糖化型ポリペプチドは１個の非天然糖化部位において糖化可能である。他の例として、高糖化型ポリペプチドは非天然糖化部位において糖化可能である。例えば、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、１、２、３、４、５以上の非天然糖化部位において糖化可能である。ＥＰＯポリペプチドに糖化部位を生成、修飾、除去または再配列することができる。例えば、天然糖化部位は糖化を増減するかまたは糖化を防ぐために修飾可能であり、これに対し、ＥＰＯポリペプチドの他の位置は、新たな糖化部位を生成したり、存在する位置の糖化を増減させるために修飾可能である。場合によっては、ＥＰＯポリペプチドの炭水化物含量は変化可能である。例えば、ＥＰＯポリペプチドに追加された炭水化物部位の炭水化物結合の位置番号、結合強度、構造及び組成（すなわち、炭水化物のグリコシド結合または枝の特性に基づく炭水化物の構造）を変えることができる。このような特性は、異なる公知の組換えエリスロポエチン、例えば、エポエチン−α、エポエチン−β、エポエチン−ω及びエポエチン−δ、尿ヒトエリスロポエチン間において様々である。一例として、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのシアル酸部位の数は変更された。
【０２５４】
本願で提供される糖化型ＥＰＯポリペプチドのシアル酸含量を含む炭水化物含量は当業界に周知な任意の方法により変更可能であり、この方法には、他の糖化パターンの産生のためのＥＰＯポリペプチド１次配列の修飾、酵素によるまたは化学的な修飾、他の宿主細胞または修飾型宿主細胞における産生、及び特定の糖化プロファイルを有するＥＰＯポリペプチドを豊富化させるための精製方法を含むが、これらに限定されるものではない。このような方法は当業界に周知であり、例えば、米国特許出願番号第２００４−０１３７５５７号、第２００５−０１５３８７９号、第２００５−０１８１３５９号、第２００５−０１９２２１１号、第２００５−０２８８２２０号、第２００６−００８８９０６号及び第２００６−０１２１６１１号に記載のものなどの修飾型ＥＰＯポリペプチドを含む。加えて、宿主細胞が修飾型ＥＰＯポリペプチドを発現させる増殖条件（例えば、培地組成）を変更し、糖化、特に、シアル酸含量の変化をもたらすことができる（例えば、米国特許出願番号第２００４−０１１５７６８号参照）。
【０２５５】
例えば、糖化部位の数を変化させたり、糖化パターンまたはＥＰＯポリペプチドに付着した炭水化物成分の含量を変化させることによりＥＰＯポリペプチドの糖化が異なるＥＰＯポリペプチドを含む商業的な製品が、開発されてきた。例えば、エポジェン（アムジェン）は分子量が３０,４００ダルトン、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生された２２個のシアル酸残基を有するα−糖化型であり、ネオレコモン（登録商標）（または、リコモン（登録商標）ロシュ）はさらに多くの分子量及びさらに低い数のシアル酸化グリカン残基を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において産生されたＥＰＯのｂ糖化型であり、エポマックス（登録商標）（エラネックス）、またはエポエチン−ωは分子量が３５ｋＤａであり、ＢＨＫ細胞において産生され、糖化の量、特に異なるシアル酸化の量においてα及びβ型と異なる。
【０２５６】
場合によっては、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、天然糖化部位において糖化される。例えば、ＥＰＯ、例えば、配列番号２または２３７に示されるアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯは、配列番号２または２３７に示される成熟ＥＰＯポリペプチドと関連してＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３にＮ結合糖化部位を有し、Ｓ１２６にＯ結合糖化部位を含む。ＥＰＯポリペプチドは、単一またはそれ以上の天然糖化部位において糖化可能である。ＥＰＯポリペプチドは一つの天然糖化部位において、または１以上の天然糖化部位、例えば、１、２、３、４、５以上の天然糖化部位において糖化可能である。高糖化型ＥＰＯポリペプチドはまた、天然糖化部位と非天然糖化部位において糖化可能である。さらに、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、多数の天然型及び非天然型糖化部位において糖化可能である。
【０２５７】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドはＮ及び／またはＯ結合タンパク質糖化可能な真核細胞において合成されるときに、未修飾型ＥＰＯポリペプチドにおいて発見されない少なくとも一つの付加的な炭水化物部位を有することができる。このため、例えば、高糖化型修飾型ＥＰＯポリペプチドは未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれ以上の付加的な炭水化物部位を有することができる。例えば、未修飾型ＥＰＯポリペプチドが一つの共有結合された炭水化物部位を有する場合、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の共有結合された炭水化物部位を有することができる。場合によっては、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、非天然糖化部位に共有結合する炭水化物部位を欠失しており、代わりに、天然糖化部位に付着可能な少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、それ以上の付加的な炭水化物部位を有している。他の例として、高糖化型ＥＰＯポリペプチドは、天然糖化部位に共有結合する炭水化物部位を欠失し、代わりに、非天然糖化部位に付着可能な少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の炭水化物部位を有している。
【０２５８】
炭水化物部位を付着するための、糖化部位修飾のための本願において考慮された代表的なアミノ酸位置は、配列番号２または２３７に示される成熟ＥＰＯポリペプチドのＮ２４、Ｎ３８、Ｎ８３及びＳ１２６などの天然位置に対応する位置を含む。場合によっては、修飾型ＥＰＯポリペプチドは全ての糖化部位または１個、２個、３個または４個の天然糖化部位を除去する１以上の修飾を有している。糖化を防いだり、新たな糖化部位を生成したり、既存の位置に糖化を増減させたり、またはそれらの組み合わせのために修飾可能なアミノ酸置換または置換が当業界に知られている。例えば、アミノ酸修飾は、下記の１以上の非制限的な例を含むことができる：配列番号２または２３７に示される成熟ＥＰＯポリペプチドのＮ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ２０Ｑ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｌ８０Ｉ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ、Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ、Ｌ１５３Ｖ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ａ３０Ｎ、Ｗ５１Ｎ、Ｇ５７Ｎ、Ｌ６９Ｎ、Ｗ８８Ｎ、Ｅ８９Ｎ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８
Ｎ、Ｋ５２Ｎ／Ｍ５４Ｔ、Ｒ５３Ｎ／Ｅ５５Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ａ１２５Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｒ５３Ｎ／Ｅ５５Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ、Ｑ８６Ｎ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｔ、Ｐ８７Ａ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｓ、Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｅ８９Ｇ／Ｐ９０Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｒ５３Ｎ／Ｅ５５Ｔ、Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｒ５３Ｎ／Ｅ５５Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ａ１２４Ｐ／Ａ１２５Ｔ／Ｓ１２６Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｅ５５Ｎ／Ｇ５７Ｔ／Ａ１１４Ｎ／Ｋ１１６Ｔ／Ａ１２４Ｐ／Ａ１２５Ｔ／Ｓ１２６Ｔ、Ｒ４Ｎ／Ｉ６Ｓ、Ｓ９Ｎ／Ｖ１１Ｓ、Ｌ６９Ｎ、Ａ１２４Ｎ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２７Ｓ、Ｔ１６３Ｎ／Ｄ１６５Ｓ、Ａ１２５Ｔ、Ａ１２５Ｔ／Ａ１２４Ｐ、Ｌ６９Ｎ／Ｓ７１Ｔ、Ｌ６９Ｎ／Ａ６８Ｓ／Ｓ７１Ｔ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２７Ｔ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２７Ｔ／Ｒ１３１Ｔ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２４Ｐ／Ａ１２７Ｓ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２４Ｐ／Ａ１２７Ｔ、Ａ１２５Ｔ／Ｓ１２６Ｔ、Ａ１２５Ｔ／Ａ１２４Ｐ／Ｓ１２６Ｔ／Ｒ１３１Ｓ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｗ５１Ｎ／Ｒ５３Ｔ、Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｅ８９Ｇ／Ｐ９０Ｔ、Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ｑ９２Ｔ、Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ／Ｒ１６２Ａ、Ｌ６９Ｎ／Ｓ７１Ｔ／Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｌ６９Ｎ／Ｓ７１Ｔ／Ｐ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｅ８９Ｎ／Ｐ９０Ｉ／Ｌ９１Ｔ、Ｐ８７Ｓ／Ｅ８９Ｎ／Ｐ９０Ｉ／Ｌ９１Ｔ、Ｄ１３６Ｎ／Ｆ１３８Ｔ、Ｆ１３８Ｎ／Ｋ
１４０Ｔ、Ａ１２５Ｔ、Ａ１２４Ｐ／Ａ１２５Ｔ、Ｎ２４Ｑ／Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｎ３８Ｑ／Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ、Ｎ８３Ｑ／Ｐ８７Ｓ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ（例えば、米国特許番号第５、８５６、２９８号、米国特許公開番号第２００３−０１２００４５号、国際特許公開番号ヨーロッパ第０６４０６１９号）。場合によっては、アミノ酸修飾はＮ３、８などの天然糖化部位を成熟ＥＰＯのＷ５１、Ｇ５７、Ｌ６９、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｄ１３６、またはＦ１３８などの他の位置に再配置することができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／８１４０５参照）。具体例を挙げると、修飾型ＥＰＯポリペプチドの高糖化に貢献するアミノ酸置換または置換は、アスパラギン（Ｎ）やトレオニン（Ｔ）による置換である。アミノ酸修飾の他の特別な例は、次の修飾のいずれか一つまたは全てから選択可能である：Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ及びＰ８７Ｖ／Ｗ８８Ｎ／Ｐ９０Ｔ（Elliot et. al., (2004) J. Biol. Chem. 279(16): 16854-16862; Elliott et. al., (2003) Nat. Biotechnol. 21: 414-421.）。本願で提供される任意の修飾は、高糖化型エリスロポエチン類似体を生成する任意の修飾と組み合わせ可能である。一つの非制限的な高糖化エリスロポエチン類似体は新たな赤血球細胞生成刺激タンパク質であり（ＮＥＳＰ）、アミノ酸修飾Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、Ｐ９０Ｔを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２４８９３、アラネスプ（登録商標）（アムジェン））。
【０２５９】
対象となるＥＰＯポリペプチドがＮ結合及び／またはＯ結合糖化を有しているかどうかは、標準技術を用いて容易に決定することができる。例えば、酵素処理、電気泳動分析、等電点電気泳動、及び免疫組織化学（例えば、「Techniques in Glycobiology」 R. Townsend and A. Hotchkiss, eds. (1997) Marcel Dekker; and 「Glycoanalysis Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 76)」 E. Hounsell, ed. (1998) Humana Press.参照）。化学的または酵素的な脱糖化処理（例えば、エンドグリコシダーゼ、及び／またはエクソグリコシダーゼ）前後のタンパク質の電気泳動による移動の変化は、一般的に、タンパク質の糖化状態を決定するのに用いられる。酵素的脱糖化は次を含む様々な酵素を用いて行うが、これに限定されない：ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グリコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３、（２、６、８、９）ニューラミニダーゼなど。例えば、ＰＮＧａｓｅＦによる前処理タンパク質、あるいは、未処理タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が行われる。ＰＮＧａｓｅＦ処理後、移動位置の変化及びバンド幅の顕著な減少は、Ｎ結合糖化の特徴として考慮される。糖化型タンパク質の炭水化物含量は、タンパク質ブロット（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ナイロンメンブレインなどの支持体に伝達されたタンパク質）のレクチン分析を用いて検出することができる。様々な植物組織に由来する炭水化物結合タンパク質であるレクチンは糖タンパク質グリカンにおける様々な糖エピトープに対して高い親和力及び狭い特異性を有している（Cummings (1994) Methods in Enzymol. 230:66-86）。レクチンは検出するように標識されて（直接または間接）、糖化型タンパク質の炭水化物へのレクチン結合の検出を可能にする。例えば、ビオチンやジオキシジェニンとコンジュゲートさせた場合は、糖化型タンパク質に結合されたレクチンは、検出可能な生成物質を得るためにアルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素とコンジュゲートさせたアビジンや抗ジオキシジェニン抗体を用いた反応を通じたメンブレインブロットで容易に同定可能である。明らかにされた特異性を有する一連のレクチンを用いたスクリーニングは、糖タンパク質の炭水化物補充に関する情報を提供する。
【０２６０】
上述したように、糖化型または高糖化型組換えＥＰＯ型を含む糖化型または高糖化型ＥＰＯポリペプチドが商業的に開発された。このような糖化型は、非糖化型ＥＰＯポリペプチドと比べてインビボにおいてさらに高いインビボ増殖活性を有することが見出され、これは、非糖化型の急速な除去に起因する（例えば、Lukowsky and Painter (1972) Can. J. Biochem. 60: 909-917; Goldwasser et. al., (1974) J. Biol. Chem. 249, 4202-4206; Sasaki (1987) Methods Enzymol. 147: 328-340; Goto et. al., (1988) Bio/technology 6: 67-71）。それにも拘わらず、糖化が減少されたか糖化のないＥＰＯポリペプチドの一部の形態はインビボにおいてさらに低い増殖活性を示すが、野生型糖化型ＥＰＯと他の糖化型のＥＰＯと比べてインビトロアッセイにおいてさらに高い増殖活性及びＥＰＯ受容体に対するさらに大きな結合を有することが報告された。（例えば、Yamaguchi et. al., (1991) 266 (30): 20434-20439）。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯの発現のためのシステム（例えば、バクテリア、ＣＨＯまたはＢＨＫなどの哺乳動物細胞）を、ＥＰＯポリペプチドの適用を考慮して、特定のＥＰＯ糖化または非糖化を産生するために選択することができる。非糖化型修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えば、ＥＰＯ対照群としてインビトロ分析、ＥＰＯ受容体濃度の検出のために有効に用いられ、またはＥＰＯ阻害剤の分析またはスクリーニングに用いられる。
【０２６１】
ｃ．追加のまたは代替的な修飾
本発明で提供されるポリペプチドの追加のまたは代替的な修飾には、ポリペプチドの化学的誘導体化を含み、アセチル化及びカルボキシル化、ＰＥＧ化または他の変更に感受性を有するタンパク質を生成したりＥＰＯポリペプチドの特性を変えるアミノ酸配列の変更を含むが、これに限定されない。ＥＰＯポリペプチドの修飾のための部位は、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの重合体、カルボキシメチルセルローズ、デキストラン、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリジンまたはポリプロリンを含んで考慮されるが、これに限定されない（Abuchowski et. al., (1981); Newmark et. al., (1982); and Katre et. al., (1987)）。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは１以上のポリエチレングリコール成分を用いて修飾（ＰＥＧ化）可能である。活性化されたＰＥＧ誘導体はＥＰＯポリペプチドと直接的に反応するために使用可能であり、カルボン酸またはカルボネート誘導体の活性エステル、特に、離脱基がＮ−ヒドロキシサクシンイミド、ｐ−ニトロフェノル、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものを含む。スルフヒドリル基の修飾のためにマレイミドまたはハロアセチル基を含むＰＥＧ誘導体を使用することができ、炭水化物グループの過ヨード酸の酸化により生成されたアルデヒドを修飾するためにヒドラジンまたはヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬を使用することができる。場合によっては、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは減少された血清除去を有するＰＥＧ誘導体化されたポリペプチドを提供可能に操作された１以上の非天然発生ＰＥＧ化位置を含むことができる。ＰＥＧ化を誘導するための代表的なアミノ酸修飾は、成熟ＥＰＯポリペプチドのＡ１Ｃ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３Ｃ、Ｒ４Ｃ、Ｄ８Ｃ、Ｓ９Ｃ、Ｎ２４Ｃ、Ｉ２５Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｔ２７Ｃ、Ｇ２８Ｃ、Ａ３０Ｃ、Ｅ３１Ｃ、Ｈ３２Ｃ、Ｓ３４Ｃ、Ｎ３６Ｃ、Ｎ３８Ｃ、Ｉ３９Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｄ４３Ｃ、Ｔ４４Ｃ、Ｋ４５Ｃ、Ｎ４７Ｃ、Ａ５０Ｃ、Ｋ５２Ｃ、Ｅ５５Ｃ、Ｇ５７Ｃ、Ｑ５８Ｃ、Ｇ７７Ｃ、Ｑ７８Ｃ、Ａ７９Ｃ、Ｎ８３Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ８５Ｃ、Ｑ８６Ｃ、Ｗ８８Ｃ、Ｅ８９Ｃ、Ｔ１０７Ｃ、Ｒ１１０Ｃ、Ａ１１１Ｃ、Ｇ１１３Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ｑ１１５Ｃ、Ｋ１１６Ｃ、Ｅ１１７Ｃ、Ａ１１８Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｐ１２１Ｃ、Ｐ１２２Ｃ、Ｄ１２３Ｃ、Ａ１２４Ｃ、Ａ１２５Ｃ、Ａ１２７Ｃ、Ａ１２８Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１５４Ｃ、Ｔ１５７Ｃ、Ｇ１５８Ｃ、Ｅ１５９Ｃ、Ａ１６０Ｃ、Ｔ１６３Ｃ、Ｇ１６４Ｃ、及びＤ１６５Ｃを含むが、これらに限定されない（例えば、米国特許公開番号第２００５−０１０７５９１号及び国際特許公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。加えて、ＰＥＧ部位などの作用基付着のための自由チオール基を産生するためにＥＰＯポリペプチドにＮ末端システインを付加することができる（例えば、米国特許公開番号第２００５−０１７０４５７号参照）。
【０２６２】
また、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンなどのリン酸化されたアミノ酸残基を有する修飾型ＥＰＯポリペプチド配列が考慮される（例えば、米国特許番号第６、３３５、１７６号参照）。
【０２６３】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの他の適切な付加の修飾は、タンパク質分解酵素による分解抵抗性を向上させたり、溶解性を最適化させたり、治療剤としての適合性をさらに増加させるための通常の化学的技術を用いて修飾型ポリペプチドである。例えば、安定性を高めるためにペプチドの骨格を環化することができる（例えば、Friedler et. al., (2000) J. Biol. Chem. 275:237 83-23789参照）。他の代表的な修飾として、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドへのヒドロキシアルキルスターチ（ＨＡＳ）部位の添加が挙げられる。ＥＰＯポリペプチドのハシル化の代表的な方法は当業界に周知であり、例えば、米国特許出願番号第２００６−００１９８７７号に記述されている。しかしながら、他の代表的な修飾は、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのＮ末端アミノ酸またはアミノ酸の１次アミンのカルバミル化を含む。ＥＰＯポリペプチドのカルバミル化の代表的な方法は当業界に周知であり、例えば、米国特許出願番号第２００６−０１３５７５４号に記述されている。
【０２６４】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドに非天然アミノ酸が結合可能である。本願において確認されたタンパク質分解酵素抵抗性を増強させるための位置に非天然アミノ酸が挿入可能である。天然発生Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然発生合成アミノ酸を含む類似体を使用することができる。代表的な非天然発生合成アミノ酸は次を含むが、これらに限定されない：チロシンアミノ酸の非天然型類似体、グルタミンアミノ酸の非天然型類似体、フェニルアラニンアミノ酸の非天然型類似体、セリンアミノ酸の非天然型類似体、トレオニンアミノ酸の非天然型類似体、アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオール酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロシクリック、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換アミノ酸またはそれらの組み合わせ、光活性化可能なクロスリンカーを有するアミノ酸、スピン標識されたアミノ酸、蛍光性アミノ酸、非天然型官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有または非共有結合するアミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、光ゲージ(photocaged)及び／または光異性化可能(photoisomerizable)なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、糖化または炭水化物修飾アミノ酸、ケトを含むアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能であるかまたは光分解可能なアミノ酸、延びた側鎖を有するアミノ酸、毒性基を含むアミノ酸、糖置換されたアミノ酸、例えば、糖置換セリンなど、炭素結合された糖含有アミノ酸、酸化還元に活性なアミノ酸、α−水酸基付き酸、アミノチオ酸を含むアミノ酸、α、α二重置換アミノ酸、β−アミノ酸、及びプロリン以外の環化したアミノ酸。例えば、非天然アミノ酸は、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、ａ４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ
−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）、Ｌ−ジフルオロメチオニン（ＤＦＭ）、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２６５】
非天然アミノ酸は、次を含む当業界に公知の任意の方法により本願で提供されるＥＰＯポリペプチド内に混入可能であるが、これに限定されない：反応性側鎖付きアミノ酸の誘導体化、化学合成、酵素によるライゲーション、天然の化学的ライゲーション結紮、抑制子ｔＲＮＡが化学的または酵素的に非天然アミノ酸でアシル化されるインビトロ生合成方法、リプレッサーｔＲＮＡを非天然のアミノ酸で化学的または酵素によりアシル化するインビトロ方法、リプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸と選択的圧組み込み(selective pressure incorporation)によってアシル化するインビボ方法、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させる校正メカニズムを有する合成酵素の変形、タンパク質に非天然アミノ酸を組み込ませるｔＲＮＡマイクロインジェクション技術、またはオルトゴナルｔＲＮＡ合成酵素を用いた非天然アミノ酸を輸送する修飾オルトゴナルｔＲＮＡのインビボ合成法（Dawson and Kent, (2000) Annu. Rev. Biochem. 69: 923; Cor nish et. al., (1995) Chem. Int. Ed. Engl. 34:621; Nor en et. al., (1989) Science 244: 182-188; Bain et. al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-801 4 ; Budisa et. al., (1999) FASEB J., 13:41; Nowak et. al., (1995) Science 268: 439; Dougherty (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 645; Brunner (19993) Chem. Soc. Rev. 22: 183 - 89; 米国特許出願番号２００６−０２３３７４４および２００６−０１５３８６０参照）。
【０２６６】
本願で提供されるＥＰＯポリペプチド修飾はまた、ＥＰＯポリペプチドの翻訳後プロセッシングを改善するための修飾と組合せることができる。例えば、ＥＰＯは、上記で論議されたように、糖化などの翻訳後修飾を改善するか、あるいは、シグナル配列のタンパク質分解的切断を改善するために修飾可能である。
【０２６７】
本願で提供されるＥＰＯポリペプチドの修飾は、ＥＰＯポリペプチドの安定性、結合特性、及び血清半減期をさらに増加させるためのアミノ酸修飾と組み合わせ可能である。例えば、さらなる修飾は、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）または２次受容体などのＥＰＯ受容体と結合するＥＰＯポリペプチドの能力に影響を与える変異を含むことができる。例えば、アミノ酸修飾は、ＥＰＯポリペプチドとその受容体との間の分子の接触領域において起こりうる。これらの修飾は、受容体との相互作用を増減させたり、またはＥＰＯによる受容体の活性化を増減させることができる。ＥＰＯと受容体との相互作用に影響を及ぼす代表的なアミノ酸修飾には、次の任意の非制限的な例を含むことができる：Ｃ７Ａ、Ｒ１４Ａ／Ｙ１５Ａ、Ｌ１６Ａ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｙ４９Ａ、Ｔ１３２Ａ、Ｉ１３３Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｐ１４８Ａ、Ｒ１５０Ａ、Ｋ１５２Ｗ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５８Ａ、Ｃ１６１Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｆ４８Ｖ、Ｆ１３８ＶＦ１４２Ｖ、Ｆ１４８ＶＤ８Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｎ、Ｒ１０Ａ、Ｅ１３Ａ、Ｒ１４Ｌ、Ｙ１５Ｆ、Ｌ１６Ａ、Ｌ１６Ｓ、Ｌ１７Ａ、Ｌ１７Ｓ、Ｋ２０Ａ、Ｋ２０Ｉ、Ｋ２０Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｋ４５Ｒ、Ｎ４７Ａ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ｙ４９Ｓ、Ｋ５２Ｓ、Ｋ５２Ｒ、Ｋ５２Ｑ、Ｑ７８Ａ、Ｑ７８Ｅ、Ｑ７８Ｒ、Ｄ９６Ａ、Ｋ９７Ｒ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１０３Ｋ、Ｔ１０７Ａ、Ｔ１０７Ｌ、Ｔ１０７Ｓ、Ｒ１１０Ｔ、Ｒ１３１Ｔ、Ｋ１４０Ａ、Ｋ１４０Ｒ、Ｋ１４０Ｍ、Ｋ１４０Ｔ、Ｒ１４３Ｅ、Ｋ１５４Ａ、Ｋ１５４Ｒ、Ｋ１５４Ｓ、Ｒ１０Ｉ、Ｖ１１Ｓ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｉ、Ｋ２０Ｅ、Ｔ４４Ｉ、Ｋ４５Ｉ、Ｋ４５Ｄ、Ｖ４６Ａ、Ｆ４８Ｇ、Ｋ５２Ｅ、Ｄ９６Ｒ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｅ、Ｓ１００Ｔ、Ｓ１０３Ａ、Ｓ１０３Ｅ、Ｓ１０３Ｈ、Ｓ１０３Ｎ、Ｓ１０３Ｑ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ｉ、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０８Ｋ、Ｒ１１０Ｅ、Ｒ１４３Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｋ、Ｒ１５０Ａ、Ｒ１５０Ｑ、Ｒ１５０Ｅ、Ｇ１５１Ａ、Ｌ１５５Ａ、及びＬ１５５Ｎ（米国特許公開番号２００４−０１２２２１６、２００５−０１７６６２７、２００６−０００８８７２、Syed(1998) Nature 395:511-516参照）。
【０２６８】
本願で提供されるＥＰＯポリペプチドの修飾は、ＥＰＯポリペプチドの特性を改善可能なカルボキシル末端の延長と組み合わせ可能である。非制限的な一例を挙げると、ヒト絨毛膜の性線刺激ホルモンのＣ末端終結から誘導されたタンパク質（ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、米国特許公開番号２００３−０１２００４５参照）の延長である。他の非制限的な例を挙げると、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのカルボキシル基末端地域への陽電荷に帯電された塩基性アミノ酸の添加は、ＥＰＯの生物学的活性を増強することができる（米国特許５４５７０８９参照）。非制限的な例として、１以上のアルギニンまたはリシン残基が本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのＣ末端に付加される（例えば、Ｒ１６６／Ｒ１６７、Ｒ１６６／Ｒ１６７／Ａ１６８、Ｒ１６６／Ｒ１６７／Ｋ１６８／Ｒ１６９、Ｒ１６６／Ｒ１６７／Ｋ１６８／Ｒ１６９／Ａ１７０、Ｒ１６６／Ｒ１６７−１７６（多重リシン）、Ｒ１６６／Ｒ１６７−１７６（多重リシン）／Ａ１７７）。
【０２６９】
本願で提供されるＥＰＯポリペプチド修飾はまた、安定性の増強、血清内半減期の増加、純度増加、または赤血球生成活性または組織保護活性の変更を含む活性を改善したＥＰＯポリペプチドを生成する他の修飾とも組み合わせ可能である。次の修飾を含むが、これらに限定されない：Ｉ６Ａ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｈ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ａ、Ｒ１０Ｉ、Ｖ１１Ｓ、Ｌ１２Ａ、Ｅ１３Ａ、Ｒ１４Ａ、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１４Ｅ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｆ、Ｙ１５Ａ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ａ、Ｌ１７Ａ、Ｅ１８Ａ、Ｋ２０Ａ、Ｋ２０Ｅ、Ｅ２１Ａ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ３８Ｑ、Ｎ２４Ｋ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｙ、Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｃ３３Ｓ、Ｃ３３Ｙ、Ｎ３８Ｋ、Ｐ４２Ｎ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｔ４４Ｉ、Ｋ４５Ａ、Ｋ４５Ｄ、Ｖ４６Ａ、Ｎ４７Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｓ、Ｙ４９Ａ、Ｙ４９Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ｙ４９Ａ、Ａ５０Ｓ、Ａ５０Ｓ、Ｗ５１Ｆ、Ｗ５１Ｎ、Ｗ５１Ｓ、Ｋ５２Ａ、Ｋ５２Ｓ、Ｍ５４Ｌ、Ｑ５９Ａ、Ｑ５９Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｔ、Ｗ６４Ａ、Ｑ６５Ａ、Ｇ６６Ａ、Ｌ６７Ｓ、Ｌ６９Ａ、Ｌ７０Ａ、Ｓ７１Ａ、Ｅ７２Ａ、Ａ７３Ｇ、Ｒ７６Ａ、Ｑ７８Ａ、Ｎ８３Ｋ、Ｎ８３Ｑ、Ｑ９２Ａ、Ｌ９３Ａ、Ｈ９４Ａ、Ｖ９５Ａ、Ｄ９６Ｒ、Ｄ９６Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｅ、Ｓ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｇ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ａ、Ｒ１０３Ａ、Ｒ１０３Ｄ、Ｒ１０３Ｎ、Ｒ１０３Ｅ、Ｒ１０３Ｑ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｌ、Ｒ１０３Ｋ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ｉ、Ｌ１０５Ａ、Ｔ１０６Ａ、Ｔ１０６Ｉ、Ｔ１０７Ａ、Ｔ１０７Ｌ、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０９Ａ、Ｋ１１６Ａ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１２６Ａ、Ｓ１２６Ｔ、Ｓ１２６Ｇ、Ｔ１３２Ａ、Ｉ１３３Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｄ１３６Ａ、Ｒ１３９Ａ、Ｒ１３９Ｃ、Ｋ１４０Ａ、Ｆ１４２Ｉ、Ｒ１４３Ａ、Ｙ１４５Ｆ、Ｙ１４５Ａ、Ｓ１４６Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｋ、Ｆ１４８Ｙ、Ｌ１４９Ａ、Ｒ１５０Ａ、Ｒ１５０Ｅ、Ｇ１５１Ａ、Ｋ１５２Ａ、Ｋ１５２Ｗ、Ｌ１５３Ａ、Ｋ１５４Ａ、Ｌ１５５Ａ、Ｙ１５６Ａ、Ｙ１５６Ｆ、Ｔ１５７Ａ、Ｇ１５８Ａ、Ｅ１５９Ａ、Ｃ１６０Ｓ、Ｃ１６１Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｒ１６６Ｇ、Ｋ４５Ｄ／Ｓ１００Ｅ、Ａ３０Ｎ／Ｈ３２Ｔ、Ｋ４５Ｄ／Ｒ１５０Ｅ、Ｒ１０３Ｅ／Ｌ１０８Ｓ、Ｋ１４０Ａ／Ｋ５２Ａ、Ｋ１４０Ａ／Ｋ５２Ａ／Ｋ４５Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｋ１５２Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｋ１５２Ａ／
Ｋ４５Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｋ１５２Ａ／Ｋ４５Ａ／Ｋ５２Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｋ１５２Ａ／Ｋ４５Ａ／Ｋ５２Ａ／Ｋ１４０Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｋ１５２Ａ／Ｋ４５Ａ／Ｋ５２Ａ／Ｋ１４０Ａ／Ｋ１５４Ａ、Ｎ２４Ｋ／Ｎ３８Ｋ／Ｎ８３Ｋ、Ｎ２４Ｋ／Ｙ１５Ａ、Ｃ３３Ｘ／Ｒ１３９Ｃ／ΔＲ１６６、Ｒ１３９Ｃ／ΔＲ１６６（米国特許番号第４、７０３、００８号、第４、８３５、２６０号、第５、４５７、０８９号、第５、６１４、１９５号、第６、０４８、９７１号、第６、４８９、２９３号、米国特許公開番号第２００５−０１７６６２７号、国際特許公開番号ＷＯ８６／０３５２０、ＷＯ９４／２５０５５、ＷＯ９４／２４１６０、ＷＯ２００１／３６４８９、ＷＯ２００４／００３１７６、ＷＯ２００５／１０３０７６参照）。
【０２７０】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのさらなる修飾は、少なくとも一つのＥＰＯポリペプチド活性を維持する修飾型ＥＰＯポリペプチドの欠失を含む。このような欠失は、ペプチドの任意の末端における切断または内部欠失を含む。このような欠失は公知されており、例えば、ＥＰＯポリペプチドのＣ末端（例えば、Ａ１６０、Ｃ１６１、Ｒ１６２、Ｔ１６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、Ｒ１６６残基）、ＥＰＯポリペプチドのＮ末端（例えば、Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｉ６残基）における切断及び内部欠失（例えば、Ｔ２７〜Ｅ５５）を含む（米国特許第４、７０３、００８号、第５、４５７、０８９号参照）。
【０２７１】
当業界に周知な赤血球細胞生成活性または組織保護活性などのＥＰＯポリペプチドの特性または活性を変化させる任意のさらなる修飾は、本願で提供される修飾と組み合わせ可能である。ＥＰＯポリペプチドの１以上の特性は、一つの修飾または修飾法の組み合わせの結果として変更可能である。非制限的な例として記載された赤血球細胞生成活性を増強するＥＰＯ受容体との結合位置の修飾を含み、これらの一部は上記に掲載されている。
【０２７２】
本願で提供されるＥＰＯポリペプチドの修飾はまた、天然発生ＥＰＯ変異体と組み合わせられるか、ＥＰＯのＳＮＰｓから誘導可能である。代表的な天然変異体は、例えば、Ｃ７Ｈ、Ｙ１５Ｆ、Ｙ４９Ｆ、Ｙ１４５Ｆ、Ｓ１２６Ｍ、Ｄ４３Ｎ、Ｇ７７Ｓ、及びＳ１２０Ｃを含む（米国特許第４、７０３、００８号、第５、９５５、４２２号及び第７、０４１、７９４号参照）。
【０２７３】
Ｅ．治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性修飾によって糖化の欠失が補われる
本発明は、インビトロまたはインビボ（例えば、血清、血液、消化管等）でタンパク質分解酵素に対して増加されたポリペプチド抵抗性を与える１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾型ＥＰＯポリペプチドのような、インビボで正常に糖化される修飾型治療用ポリペプチドを提供する。一般に、糖化された治療用タンパク質は、効果的なインビボ投与のために糖化を必要とする。糖化された治療用タンパク質は、アスパラギン（Ｎ−結合）、またはセリン（Ｏ−結合）アミノ酸残基のような特定の部位でタンパク質に炭水化物部分を付着するための１つ以上の部位を含む。代表的に、糖化はタンパク質の製造の間の分泌経路のタンパク質分解酵素、または分泌後の細胞外のタンパク質分解酵素による分解から天然タンパク質を保護する。また、糖化は治療的投与後、血液または消化器系のタンパク質分解酵素による分解から治療用ポリペプチドを保護する。
【０２７４】
糖化されていない治療用ポリペプチドは、インビボで増加されたタンパク質分解によってたびたび部分的に不安定である。例えば、炭水化物部分の全部または一部を除去すれば、タンパク質分解攻撃にタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位が露出されることとなり、タンパク質分解酵素の分解に対する治療用ポリペプチドの感受性が増す。ポリペプチドの糖化形態においては、糖化はこのようなタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位を遮蔽または保護することによって、分解から治療用ポリペプチドを保護することができる。例えば、糖化は、炭水化物部分による物理的干渉によってまたはタンパク質構造の変化によってタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位に接近することを防止することができる。
【０２７５】
しかしながら、インビボ投与時、糖化された治療用タンパク質の脱糖化は、循環器または消化器系統の細胞外グルコシダーゼ（例えば、ラクターゼ、ニューラミニダーゼ、アミラーゼ）への露出によりインビボで生じうる。これは、グルコシダーゼ及び他の消化酵素が豊富な消化管の場合に特にそうであることと判断される。したがって、ＥＰＯのような治療用タンパク質の糖化は、皮下または静脈内注射による投与時、ある程度増加された半減期を提供できるが、糖化は経口投与時、より小さな保護効果を表す。したがって、治療用糖タンパク質を含んだ治療用タンパク質は、経口投与時、恐らく消化器タンパク質分解酵素による分解により効率的に吸収されない。したがって、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える修飾は、経口投与時、ポリペプチドの増加された安定性及び吸収後に血流内で増加された生体利用率を提供することができる。
【０２７６】
特に、ポリペプチドの糖化により正常に遮蔽されるタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位は、修飾のための主な標的となる。例えば、糖化により遮蔽または保護されるため、このような感受性を有する部位は、その脱保護または脱遮蔽時、タンパク質分解酵素に露出される。したがって、このような部位はグルコシダーゼによる作用時、タンパク質分解酵素攻撃を特に受けやすい。タンパク質分解酵素に対して抵抗性があるようにこのような部位を修飾することによって、ポリペプチドは糖の除去時、タンパク質分解からの保護のための追加の保護物を得る。遮蔽された残基で修飾を有するポリペプチドは、投与後、１つ以上の炭水化物部分のインビボ除去によって、分解に抵抗性がある糖化された治療用ポリペプチドの製造を可能にする。ＥＰＯに対して上記の表３で記載したような他のタンパク質分解酵素抵抗性修飾は、タンパク質分解に対する追加の保護を提供するように露出または非遮蔽された部位でなされることができる。したがって、糖化されたタンパク質の投与時、上記提供される修飾は治療用タンパク質がインビボで脱糖化される場合、分解からタンパク質を保護するようになる。
【０２７７】
また、本発明で提供される変異体は、脱糖化されたポリペプチドまたは部分的に脱糖化されたポリペプチドの形態で投与されるポリペプチドの保護を増加させることと判断される。例えば、ニューラミニダーゼのようなシアリダーゼにより末端シアル酸が除去されれば、ガラクトース残基が露出され、循環から糖タンパク質の除去を媒介する肝細胞においてガラクトース−特異的、及び他の糖−特異的受容体（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、及びホスホマンノース）により認識及び結合される（Ashwell and Harford(1982) Ann. Rev. Biochem. 51:531）。したがって、そのような除去は投与時、特に経口投与時、糖タンパク質の半減期の減少にも寄与できる。しかしながら、糖化されていないポリペプチドを投与すれば、炭水化物部分を通常認識するこのような除去機作による分解から、逃れることができる。治療効果に充分な半減期及び生体利用率を表す脱糖化されたポリペプチドを投与するための能力によって、効果的な糖化が考慮されないタンパク質製造の代替的なな方法の使用が可能となる。例えば、バクテリアのような宿主細胞は、タンパク質製造の哺乳類形態より費用の面で効果的な治療用ポリペプチドの製造に使用できる。
【０２７８】
また、真核細胞で糖化タンパク質を製造すれば、たびたび糖残基で高度の変異性がもたらされる。群（group）内の不均一性は、インビボ投与時、希望しない抗体生成に寄与する可能性がある。したがって、タンパク質分解酵素抵抗性を増加させる修飾により増加された半減期を有する糖化されていないポリペプチドを投与するための能力は、治療用生成物の均一性を増加させる作用をする。より均一な治療用生成物を製造するための能力は、生成物の免疫原性を減少させる他にも、治療用ポリペプチドの製造費用を減少させることができる。
【０２７９】
したがって、本発明は糖化により正常に遮蔽されるアミノ酸残基で１つ以上の修飾を含有する修飾型治療用ポリペプチドを提供する。上記修飾型残基は、ポリペプチドの一次配列でポリペプチドの糖化によって正常に遮られる残基に存在し、変異によってポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与える修飾を含む。一般に、ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、またはその以上の糖化部位を含有する。したがって、上記１つ以上の修飾は、一般的に糖化により遮蔽された残基にある１つの修飾であり、必要の場合、相異する糖化部位で相異する糖化により遮蔽された他の残基にある追加の修飾である。修飾型治療用ポリペプチドには、１つ以上、一般的には２つ以上の修飾が糖化により遮蔽された残基に存在する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の修飾型位置を有するものがある。例えば、上記ポリペプチドが２つの修飾を含む場合、１つの修飾は１つの糖化により遮蔽された残基に存在し、２番目の修飾は第２の相異する糖化により遮蔽された残基に存在する。更に他の例で、上記ポリペプチドが３個の修飾を含む場合、１つの修飾は１つの糖化により遮蔽された残基に存在し、２番目のものは第２の相異する糖化により遮蔽された相異する残基に存在し、３番目のものは第３の相異する糖化により遮蔽された更に他の相異する残基に存在する修飾である。追加の例で、上記ポリペプチドが４個の修飾を含む場合、４番目のものは相異する第４の糖化により遮蔽された第４の残基に存在する。しかしながら、糖残基は巨大で、一部の残基は１つ以上の糖化により遮蔽できることと理解される。そのような残基は、これを遮蔽する糖化残基のうちのいずれかに対する遮蔽された残基であると判断される。代表的な修飾型治療用ポリペプチドは、少なくとも２つの遮蔽された残基（即ち、相異する部位で相異する糖化により遮蔽された２つの残基）、及び代表的には少なくとも３個の遮蔽された残基で修飾を含有する。
【０２８０】
遮蔽された部位で１つ以上、一般的には２つ以上の修飾を含む治療用ポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性を与える追加の修飾を含むように修飾できる。例えば、可能なタンパク質分解酵素に対する感受性を有するｉｓ−ＨＩＴ位置により確認される多くの修飾は糖化により遮蔽または保護されない。このような部位のうち、多くのものは露出されて、タンパク質分解酵素分解を受けることができる部位として作用する。したがって、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性が与えられるように遮蔽されていない部位に追加の修飾がなされることができる。このような遮蔽されていない部位は下記の段落Ｃで記載され、遮蔽された残基（糖化部位から０乃至２５Å超過の範囲にある遮蔽されていない残基は除外）を確認するために、本願に記載されたような方法を用いて確認することができる。本発明で提供される代表的な治療用ポリペプチド変異体は、タンパク質分解酵素抵抗性を与える部位で１つ以上、一般的には２つ以上の修飾、及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ部位で１つ以上の追加の修飾を含む。本発明に記載したように、ポリペプチドが増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表し、治療活性を保有する場合、当業界に知られた追加の変異体が治療用ポリペプチドに作られることもできる。
【０２８１】
遮蔽された部位で修飾を含む得られる治療用ポリペプチドは、上記修飾を含まないタンパク質の完全糖化、部分的糖化、及び／または脱糖化された形態と比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。タンパク質分解酵素抵抗性は、脱糖化、部分的糖化、または完全糖化された未修飾型治療用ポリペプチドの半減期と比較して少なくとも、または少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはその以上の量だけ増加できる。上記治療用ポリペプチドは、インビボ投与時、脱糖化または部分的に糖化されるため、タンパク質分解酵素抵抗性は同様に脱糖化、または部分的糖化される修飾を含有しない治療用ポリペプチドと比較できることと判断される。例えば、これは試験されたポリペプチドが製造時に糖化できないようにポリペプチドの知られた糖化部位を変異させることによって、インビトロで達成できる。また、１つ以上の遮蔽された修飾を含有する上記治療用ポリペプチドは、このような修飾を含まない完全に糖化された治療用タンパク質と比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表すことができる。実際に、遮蔽された残基で修飾を有するＥＰＯのような治療用ポリペプチドは、糖化されていない形態で提供される場合にも完全糖化されたＥＰＯポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。
【０２８２】
変異体は、完全糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造及び投与できる。例えば、本発明で提供されるポリペプチド変異体は、タンパク質を糖化させることができる系、例えば、哺乳動物発現系で製造することによって糖化形態で提供できる。
【０２８３】
糖化されていないポリペプチドが要求される場合、変異体の製造はタンパク質を糖化できない系で修飾治療用ポリペプチドを発現させるか、または治療用ポリペプチドが糖化できないように治療用ポリペプチドを追加で修飾することによって達成できる。例えば、上記治療用ポリペプチドは、バクテリア（例えば、大腸菌）のような原核生物で製造できる。このような系は本発明で詳細に記載されている。また、上記治療用ポリペプチドは、タンパク質の糖化を防止する１つ以上のアミノ酸修飾を通じて修飾できる。例えば、上記治療用ポリペプチドは、治療用ポリペプチド内の糖化のための１つ以上の付着部位（例えば、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ））を含んだ１つ以上の糖化部位で修飾できる。一例で、上記修飾型治療用ポリペプチドは修飾型ＥＰＯポリペプチドであり、修飾型ＥＰＯポリペプチドはＮ２４、Ｎ３８、Ｎ８３、及びＳ１２６のうちの１つ以上で追加で修飾される。更に他の例で、上記修飾型治療用タンパク質は修飾型ＥＰＯタンパク質であり、Ｎ２４、Ｎ３８、及びＮ８３が修飾される。更に他の特定の例で、ＥＰＯポリペプチドのＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３残基がヒスチジン（Ｈ）に置換される（例えば、配列番号３０７または３０８）。更に他の特定の例で、ＥＰＯポリペプチドのＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３残基がリシン（Ｋ）として置換される（例えば、配列番号３０９または３１０）。このような修飾型ＥＰＯポリペプチドを用いて、修飾のためのタンパク質分解酵素敏感性部位を確認することができる。
【０２８４】
一般に、修飾型治療用ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドの１つ以上の治療活性を維持する。一部の場合、１つ以上の炭水化物部分を除去（脱糖化部位の変異またはインビボグリコシダーゼの作用により）すれば、タンパク質の活性が影響を受けることができる（例えば、受容体との相互作用のようなタンパク質−タンパク質相互作用が増加または減少）。このような場合、このような効果を補償するために追加の修飾が治療用ポリペプチドの内に導入できる。このような修飾は当業界に知られており、本発明で提供される（例えば、その受容体とのＥＰＯ相互作用を増加させることができる代表的なアミノ酸修飾が本発明で提供される）。
【０２８５】
遮蔽された残基で修飾を含む治療用ポリペプチドは、経口、全身、口腔、経皮、静脈内、筋肉内、及び皮下を含んだ全ての経路で投与できる。代表的に、遮蔽された部位は消化管にグリコシダーゼが豊富であるため、経口投与時、タンパク質分解酵素分解に対して増加された感受性を有し、したがって、このような修飾型治療用ポリペプチドを経口投与すれば、治療用ポリペプチドの半減期及び生体利用率がどの経口投与された治療用ポリペプチドに対して現在存在するものより非常に大きく増加できる。したがって、本発明は遮蔽された残基で１つ以上のタンパク質分解酵素抵抗性修飾を含む治療用ポリペプチドを経口投与する方法及び用途を提供する。しかしながら、このようなポリペプチドの投与経路は経口投与に限定されないことと理解される。
【０２８６】
したがって、経口投与時、本発明で提供される修飾型治療用タンパク質は、治療用タンパク質の糖化がないか（例えば、大腸菌などのバクテリアのような原核生物でタンパク質の製造）、または除去（例えば、インビボで１つ以上の糖化部位の修飾または炭水化物除去）されている場合、タンパク質分解酵素に対して増加された抵抗性を表す。例えば、治療用ポリペプチドの糖化形態で提供される変異体の場合、上記修飾は１つ以上の炭水化物部分が投与後にインビボでタンパク質から除去される場合、ポリペプチドを分解から保護することができる。このようなポリペプチドは治療に効果的であるように充分の活性を維持する。
【０２８７】
１．遮蔽された残基を確認する方法
１つ以上のタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位が糖化により保護される糖化された治療用タンパク質におけるタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位の標的化された確認及び修飾方法が当業界に知られている。代表的な方法が本発明で提供される。上記の方法は、糖化のような翻訳後、修飾により隠されるタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位の確認及び修飾を可能にする。
【０２８８】
糖化により正常に遮蔽される修飾についてのタンパク質分解酵素に対して感受性を有する候補部位を同定するために、まず全ての可能なｉｓ−ＨＩＴ位置のリストをポリペプチドのイン−シリコ分析に基づいて同定する。ｉｓ−ＨＩＴ位置を同定する方法が本発明に記載されている。一例で、アルゴリズムＰＲＯＴＥＯＬ（オンラインinfobiogen.fr and at bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/proteol_in.pl）を用いて、タンパク質分解酵素（血液、腸等）に対する基質として認識されうる成熟ポリペプチド中の残基のリストを提供することができる。これは、ＥＰＯに対する上記の表２に記載されている。本発明で記載され、関連米国出願公開Ｎｏ．２００５０２０２４３８号で記載したように、他の治療用ポリペプチドに対する類似なｉｓ−ＨＩＴ残基が同定されている。上記アルゴリズムは、タンパク質分解酵素のリスト、タンパク質分解酵素のタンパク質分解特異性、及び導入されるポリペプチドアミノ酸配列を基準にしてタンパク質分解マップを作成する。本発明において、修飾のための糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴの選択は、天然ポリペプチドの炭水化物付着部位からの特定の距離内で発生するタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位を同定することに基づく。代表的に、上記タンパク質分解酵素活性部位は、糖化部位から約０−２５Å内に位置する。治療用ポリペプチドの三次元的構造を用いて、糖化部位からの特定の距離以内に位置する可能なタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位を同定することができる。これは、ＥＰＯに対する実施例８で例示されている。例えば、各々の糖化部位から１０Å以内、または１５Å以内で発生するＥＰＯで可能なタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位が同定された。修飾のための置換アミノ酸が確認されることができ、１９個の他のアミノ酸残基の全て、またはより小さなサブセットを含むことができる。有効なタンパク質分解酵素に対して感受性を有する部位（ＬＥＡＤ）の修飾の初期リストは、本発明に記載されるように、２Ｄ−及び３Ｄ−スキャニング方法のような同定方法を用いて調製できる。糖化部位から定義された距離以内で発生するＬＥＡＤを選択してテストすることができる。
【０２８９】
例えば、糖化されていない治療用ポリペプチドにおけるタンパク質分解酵素抵抗性を増加させる修飾を同定するために、まず治療用ポリペプチドを糖化部位で修飾させて、その部位での糖化を防止する。一般に、上記糖化部位は炭水化物部分の炭水化物部分の付着のためのアミノ酸を置換することによって修飾される。代表的に、上記置換アミノ酸はその置換がタンパク質の構造的完全性を変化させないように選択される。例えば、Ｎ−結合糖化部位のアスパラギンが一般的にヒスチジンまたはリシンに置換される。
【０２９０】
次に、各々の選択されたＬＥＡＤ修飾を、変異糖化部位を有するポリペプチド中に導入する。次に、各々の修飾型治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を本発明の実施例に記載された方法を用いて測定し、糖化部位変異及び／または完全に糖化された治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性と比較する。脱糖化されたタンパク質の増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を与える修飾が同定されれば、上記修飾型ポリペプチドはタンパク質分解酵素抵抗性修飾を単独に、または糖化部位修飾との組合により利用して生成できる。候補ＬＥＡＤポリペプチドのタンパク質分解に対する抵抗性を、遮蔽された部位で修飾を含まない脱糖化、部分的脱糖化、または完全糖化された治療用タンパク質と比較することができる。これは、ＥＰＯに対する本発明の実施例９で例示される。
【０２９１】
特定の治療用ポリペプチドが多数の糖化部位を有する場合、上記方法の段階は各糖化部位に対して別々に、同時に、または順次に実施できる。例えば、２つ以上の糖化部位を同時に変異させることができ、多数の糖化変異を含む治療用ポリペプチドに対してタンパク質分解酵素抵抗性のための修飾をテストすることができる。更に他の例で、最初の糖化部位を治療用ポリペプチド内で変異させることができ、相応する最初のタンパク質分解酵素抵抗性変異を確認する。次に、２番目の糖化部位の変異は二重変異に導入されることができ、相応する２番目のタンパク質分解酵素抵抗性変異が確認される。更に他の例で、最初の糖化部位が治療用ポリペプチドで変異され、相応する最初のタンパク質分解酵素抵抗性変異体が確認される。次に、２番目の糖化部位が別個の治療用ポリペプチドで変異されることができ、相応する２番目のタンパク質分解酵素抵抗性変異体が確認される。各々の糖化部位に対するタンパク質分解酵素抵抗性変異体の確認後、上記修飾を含有する修飾型治療用ポリペプチドが発生できる。一部の例では、タンパク質分解酵素抵抗性のための修飾及び糖化部位変異を用いて治療用ポリペプチドを発生する。他の例では、タンパク質分解酵素抵抗性のみのための修飾を用いて治療用ポリペプチドが発生される。
【０２９２】
２．遮蔽された部位でタンパク質分解酵素抵抗性修飾を含むＥＰＯポリペプチド
本発明は、糖化により遮蔽されたアミノ酸残基で１つ以上、一般的には２つ以上、例えば２、３、または４個の修飾を含む変異ＥＰＯポリペプチドを提供する。前述したように、ＥＰＯは４個の糖化部位を含有する。即ち、配列番号２または配列番号２３７の残基に該当する残基であるＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３にある３個のＮ−糖化部位、及びアミノ酸残基Ｓ１２６にある１つのＯ−結合糖化部位を含有する。これら糖化部位のうちの１つ以上での糖化により遮蔽される任意のアミノ酸残基が本発明に従って修飾できる。このような残基の例は、実施例７に記載されており、Ｎ−糖化部位で糖化により遮蔽されるアミノ酸残基が含まれる。Ｎ２４での糖化により遮蔽された残基の例には、Ｒ１４、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｋ２０、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ３１、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、Ｋ９７、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、及びＹ１４５がある。例えば、Ｎ２４により遮蔽された残基での代表的なタンパク質分解酵素抵抗性修飾には、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉなどがあるが、これに限定されない。Ｎ３８での糖化により遮蔽された残基の例には、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｐ４２、Ｄ４３、Ｌ６９、Ｌ７０、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｒ１３１、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、及びＦ１４２がある。例えば、Ｎ３８により遮蔽される残基での代表的なタンパク質分解酵素抵抗性修飾には、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、
Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、及びＦ１４２Ｖなどがあるが、これに限定されない。Ｎ８３での糖化により遮蔽される残基の例には、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ８７、Ｗ８８、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、及びＤ９６がある。例えば、Ｎ８３で糖化により遮蔽された残基での代表的なタンパク質分解酵素抵抗性修飾には、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、及びＤ９６Ｈなどがあるが、これに限定されない。Ｓ１２６で糖化により遮蔽される残基の例には、Ｌ６９、Ｅ７２、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｐ４２、Ｅ６２、Ｗ６４、Ｌ６７、Ｌ７０、Ｌ７５、Ｒ７６、及びＲ１３１がある。Ｓ１２６で糖化により遮蔽された残基での代表的なタンパク質分解酵素抵抗性修飾には、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｒ１３１Ｈ、及びＲ１３１Ｑなどがあるが、これに限定されない。
【０２９３】
Ｎ２４で糖化により遮蔽された修飾の例には、Ｋ２０Ｑ、Ｐ９０Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１４３Ｈ、及びＲ１４３Ｑがあり、特にＮ２４で糖化により遮蔽された修飾には、Ｒ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ、Ｌ９３Ｉ、及びＬ９３Ｖがある。Ｎ３８で糖化により遮蔽された修飾の例には、Ｌ８０Ｉ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｎ、Ｒ１３９Ｈ、及びＲ１３９Ｑがあり、特にＮ３８で糖化により遮蔽された修飾には、Ｒ１３９Ｈ及びＬ８０Ｉがある。Ｎ８３で糖化により遮蔽された修飾の例には、Ｌ８０Ｉ、Ｄ９０Ｓ、及びＤ９６Ｑがあり、特にＮ８３で糖化により遮蔽された修飾にはＬ８０Ｉがある。Ｓ１２６で糖化により遮蔽された修飾の例には、Ｄ１２３Ｎ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、及びＲ１３１Ｑがある。
【０２９４】
したがって、遮蔽された残基で１つ以上の修飾を含むＥＰＯ変異体には、Ｎ２４での糖化により遮蔽された残基、Ｎ３８の糖化により遮蔽された残基、Ｎ８３の糖化により遮蔽された残基、Ｓ１２６の糖化により遮蔽された残基、またはこれら残基のいずれかの組合の修飾を含むポリペプチドがある。したがって、遮蔽された部位で修飾を含む本発明で提供されるＥＰＯ変異体には、Ｎ２４、Ｎ３８、またはＮ８３単独により遮蔽された部位で１つの修飾を含むもの、Ｎ２４／Ｎ３８、Ｎ２４／Ｎ８３、またはＮ３８／Ｎ８３により遮蔽された２つの修飾を含むもの、またはＮ２４／Ｎ３８／Ｎ８３により遮蔽された三個の修飾を含むものがある。また、修飾型ＥＰＯは、Ｓ１２６単独またはいずれかとの組合での糖化により遮蔽された残基の修飾、またはＮ２４、Ｎ３８、またはＮ８３での糖化により遮蔽された修飾を含む。一部の例で、修飾型ＥＰＯは同一部位により遮蔽された２つ以上の修飾を含む遮蔽された部位で修飾を含む。一般に、修飾型ＥＰＯは上記修飾のうち、２つ以上が相異する糖化部位により遮蔽された残基に存在する場合、２つ以上の修飾を含む。例えば、遮蔽された部位でＥＰＯポリペプチドの修飾には、Ｎ２４での１つ以上の修飾、即ち、Ｒ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ、Ｌ９３Ｉ、及びＬ９３Ｖ；Ｎ３８での１つ以上の修飾、即ちＲ１３９Ｈ及びＬ８０Ｉ；及び／またはＮ８３での１つ以上の修飾、即ちＬ８０Ｉを含む。代表的な修飾が下記の表５に記載されている。後述するように、上記修飾は、位置Ｎ２４、Ｎ３８、またはＮ８３でポリペプチドを脱糖化する１つ以上の修飾を含むバックボーンに提供できる。例えば、完全に脱糖化されたポリペプチドは、これら部位（例えば、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、またはＮ３８Ｈ）の各々で修飾を有することができる。また、完全に脱糖化された（ＮＨ３）変異体に対する配列番号が下記の表５に記載されている。
【０２９５】
【表５】
2011520472.tif 000009
【０２９６】
上記修飾のうちのいずれかは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有するＥＰＯのような未修飾型ＥＰＯポリペプチドに位置するか、または配列番号２または２３７に記載された成熟ヒトＥＰＯポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体に位置できる。上記ＥＰＯポリペプチドには、配列番号１８６、７６、３５１、３６７、３７１、３７３、３８３、４０１、４１７、４１９、４２１、１９、４３２、６６、７５、４８６、及び４８８のうち、いずれかに記載されたように、１６６個のアミノ酸長を有するものが含まれ、また活性断片が修飾を含む場合には、配列番号１８６、７６、３５１、３６７、３７１、３７３、３８３、４０１、４１７、４１９、４２１、１９、４３２、６６、７５、４８６、及び４８８のうち、いずれかに記載された活性断片が含まれる。例えば、ＥＰＯポリペプチドには１６５個のアミノ酸長を有するもの及び配列番号１８６、７６、３５１、３６７、３７１、３７３、３８３、４０１、４１７、４１９、４２１、１９、４３２、６６、７５、４８６、及び４８８のうちのいずれかでＣ−末端アルギニンが欠失されたものが含まれる。
【０２９７】
タンパク質分解酵素抵抗性を与える遮蔽された残基で１つ以上の修飾を含む本発明で提供されるＥＰＯポリペプチドのうちのいずれかは、タンパク質分解酵素抵抗性を与える遮蔽されていない部位で１つ以上の修飾を追加で含むこともできる。このような残基には糖化部位から０−２５Å以内に位置しないどの残基が含まれる。上記の段落Ｂで確認されたｉｓ−ＨＩＴ残基のうち、遮蔽されていない残基には、下記のようなｉｓ−ＨＩＴ残基があるが、これに限定されない：Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｃ７、Ｄ８、Ｒ１０、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｙ１５、Ｃ２９、Ｋ４５、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｌ１０５、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｋ１５２、Ｌ１５３、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５９、Ｒ１６２、Ｄ１６５、及びＲ１６６。上記遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基でのタンパク質分解酵素抵抗性修飾の例には、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｑ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑなどがあるが、これに限定されない。特に、１つ以上の遮蔽された修飾と結合できる代表的な遮断され
ていない修飾には、Ｒ４Ｈ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｒ１５０Ｈ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；及びＬ１５３Ｖ、特に、Ｒ４Ｈ、Ｋ５２Ｎ、Ｌ１５３Ｖ、及びＥ１５９Ｎがある。このような変異体の例は、下記の表６に記載されている。後述するように、上記の修飾は、位置Ｎ２４、Ｎ３８、またはＮ８３でポリペプチドを脱糖化する１つ以上の修飾を含むバックボーンに提供されることもできる。例えば、完全に、または部分的に脱糖化されたポリペプチドは、これら部位のうちの１つ以上（例えば、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、またはＮ３８Ｈのうちの１つ以上）で修飾を有することができる。また、完全に、または部分的に脱糖化された（ＮＨ３）変異体に対する配列番号が下記の表６に記載されている。
【０２９８】
【表６Ａ】
2011520472.tif 000010
【表６Ｂ】
2011520472.tif 000011
【０２９９】
上記修飾のうちのずれかは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を有するＥＰＯのような未修飾型ポリペプチドに存在するか、または配列番号２または２３７に記載された成熟ヒトＥＰＯポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその以上の配列同一性を有する成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体に位置できる。上記ＥＰＯポリペプチドには、配列番号３１４、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６９、３７５、３７７、３７９、３８１、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４２４、４２６、４２８、４３０、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２に記載されたように、１６６個アミノ酸長を有するものが含まれ、また修飾を含む活性断片である配列番号３１４、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６９、３７５、３７７、３７９、３８１、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４２４、４２６、４２８、４３０、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、及び４９０に記載されたものが含まれる。例えば、ＥＰＯポリペプチドには１６５個のアミノ酸長を有し、配列番号３１４、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６９、３７５、３７７、３７９、３８１、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４２４、４２６、４２８、４３０、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６
６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、及び４９０のうちのいずれかでＣ−末端アルギニンが欠失されたものが含まれる。
【０３００】
本発明で記載したように、ポリペプチドの糖化により正常に遮蔽される残基でＥＰＯのような治療用ポリペプチドを修飾する長所の１つは、タンパク質が脱糖化または部分的脱糖化される時、このような残基がタンパク質分解酵素攻撃に重要であるということである。したがって、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基の修飾は、ポリペプチドがグルコシダーゼにより脱糖化されるか、脱糖化された形態で提供される時、タンパク質分解酵素抵抗性を増加させる。これで、このような治療用ポリペプチドは、ポリペプチドに対するより値段が安く、より効率的な製造系であるバクテリアのような非哺乳動物細胞で製造できる。しかしながら、バクテリアでＥＰＯの製造における問題の１つは、特に残基Ｎ２４、Ｎ３８、及びＮ８３と関連して凝集する可能性があることである。したがって、大腸菌由来ＥＰＯの凝集を減少させるための試みとして、Ｎ−糖化部位残基Ｎ２４、Ｎ３８、及びＮ８３をリシンまたはヒスチジンのような基本残基に変異させて、ポリペプチドの安定性を改善することができる（Narhi et al. (2001) Protein Eng., 14:135-140）。したがって、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上の修飾を含む本発明で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのうちのいずれかは、Ｎ２４、Ｎ３８、またはＮ８３のうち、いずれの部位で１つ以上の追加の修飾（例えば、修飾Ｎ２４Ｋ、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｋ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｋ、またはＮ８３Ｈ）を含むことができる。このような代表的なＥＰＯポリペプチド、またはＣ末端アルギニンが欠乏された１６５個アミノ酸のようなこの断片は、上記の表５、表６、及び配列番号３４４−３４６、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８４、４８５、４８７、４８９、及び４９１に記載されている。
【０３０１】
３．遮蔽された部位でタンパク質分解酵素抵抗性修飾を含む他の治療用ポリペプチド
糖化部位を含み、インビボで正常に糖化される任意の治療用ポリペプチドは、グリコシル化部位で遮蔽される残基の変異により修飾できる。修飾される遮蔽された残基はｉｓ−Ｈｉｔとして同定され、タンパク質分解酵素分解を受けることができるものである。アミノ酸残基の付加、置換、または取替によるこのようなタンパク質分解酵素に対して感受性を有するｉｓ−Ｈｉｔ位置の修飾は、インビトロまたはインビボ（例えば、血清、血液、消化管）でタンパク質分解酵素に抵抗性があるポリペプチドをもたらすことができる。前述したように、遮蔽された残基はタンパク質が脱糖化形態で提供されるか、または糖化形態で投与されて、特に経口投与時、消化管で酵素の作用により脱糖化または部分的脱糖化される場合、タンパク質分解酵素の攻撃を受けることができる部位であることと判断される。
【０３０２】
当業者は、糖化により遮蔽される残基を同定するための任意の方法、例えば、本発明で記載された方法のうち、いずれかの方法を利用することができる。例えば、タンパク質分解酵素分解を受けやすいことが確認され、糖化部位から０−２５Å以内に位置するｉｓ−Ｈｉｔ位置は、本発明の修飾のための遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基として同定できる。前述したように、１つ以上、一般的には２つの修飾が糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基でなされる限り、治療用ポリペプチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の修飾を含むことができる。また、露出または遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基（即ち、糖化部位から０−２５Å以内に位置しない残基）もタンパク質分解酵素分解に対する保護を増加させるために含まれることもできる。また、本発明で提供される修飾型治療用ポリペプチドは、当業界に知られた任意の他の変異を含むこともできる。
【０３０３】
代表的な糖化された治療用ポリペプチドには、ホルモン（例えば、インシュリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、牛の成長ホルモン、レプチン）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば、上皮成長因子、神経成長因子、またはインシュリン様成長ホルモン）、成長因子受容体、サイトカイン、及び免疫系タンパク質（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、またはインターフェロン−ガンマのようなインターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミングレセプター（homing receptor）、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、溶解性主組織複合体（major histocompatibility）抗原、細菌、寄生、またはウイルス抗原またはアレルゲンまたは自己抗原のような免疫的活性抗原、酵素（例えば、組織プラスミノーゲン活性剤、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成、または分解酵素、ステロイド合成酵素、キナーゼ、ホスホダイエステラーゼ、メチラーゼ、脱−メチラーゼ、脱水素酵素、セルラーゼ、タンパク質分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、サイトクロム、アデニレート、またはグアニレートサイクラーゼ及びニューラミダーゼ）、受容体（例えば、ステロイドホルモン受容体またはペプチド受容体）、結合タンパク質（例えば、ステロイド結合タンパク質、成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質）、転写または翻訳因子、腫瘍タンパク質または原始腫瘍タンパク質（例えば、細胞周期タンパク質）、筋肉タンパク質（例えば、ミオシンまたはトロポミオシン）、ミエロタンパク質、神経活性タンパク質、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）、抗腐敗タンパク質(anti-sepsis protein)（例えば、殺菌透過性増強タンパク質）、構造タンパク質（例えば、コラゲン、フィブロイン、フィブリノゲン、エラスチン、チュブリン、アクチン、またはミオシン）、血液タンパク質（例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＦａｃｔｏｒVII、ＦａｃｔｏｒVIII、インシュリン、ＦａｃｔｏｒIX、ＦａｃｔｏｒX、組織プラスミノゲン活性剤、タンパク質Ｃ、フォンヴィレブランド因子、抗トロンビン、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、または修飾型ＦａｃｔｏｒVIII、フリジンなどの抗凝固剤）を含むが、これらに限定されない。
代表的な修飾型治療用ポリペプチドはサイトカインである。糖化サイトカインを含む代表的なサイトカインファミリーは、インターフェロン、インターロイキン、ヘマトポエイチン、及びケモカインを含む。糖化サイトカインの代表例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエイチン（ＴＰＯ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ−コロリ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＯＳＭ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含むが、これらに限定されない。
【０３０４】
ａ．ＧＭ−ＣＳＦ
顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、リンパ細胞、内皮細胞、肥満細胞、繊維芽細胞、単核細胞、及び一部の悪性細胞を含むが、これらに限定されない様々な細胞により産生された糖タンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、１７個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む１４４個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質をコードする（配列番号２７３）。翻訳後プロセッシングは、１２７個のアミノ酸長の糖化成熟ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を生成する（配列番号２７４）。成熟ＧＭ−ＣＳＦは、配列番号２７４に示される成熟ＧＭ−ＣＳＦ配列のＮ２７及びＮ３７、及び配列番号２７３に示される前駆体ポリペプチドのＮ４４及びＮ５４に対応する２つの位置においてＮ糖化が生成される。また、成熟タンパク質のＮ末端に位置する、配列番号２７４に示される配列のアミノ酸位置Ｓ５、Ｓ７、Ｓ９及びＴ１０（配列番号２７３に示される前駆体ポリペプチドのＳ２２、Ｓ２４、Ｓ２６及びＴ２７に対応する）に４個のＯ糖化部位がある。ＧＭ−ＣＳＦは、好中性白血球、好酸性白血球及び単核球起源の造血前駆細胞の増殖及び分化を刺激可能な複数系統のコロニー刺激因子である。例えば、このように、ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄移植または骨髄移植失敗または遅延後、自家組織抹消血液前駆細胞の移植後、及び急性骨髄性白血病を有する高齢者における誘導化学療法後の骨髄再建に治療的に使用可能である。
【０３０５】
本発明は、糖化部位であるＮ２７、Ｎ３７、Ｓ５、Ｓ７、Ｓ９、またはＴ１０で糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上の修飾によって、未修飾型ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されないか、露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−Ｈｉｔ位置及び置換アミノ酸は下記の表７に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基及び遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基が含まれる。当業者は、本発明で記載した方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を同定することができる。本発明で提供される修飾型ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔで１つ以上の修飾、一般的に２つの修飾を含み、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＧＭ−ＣＳＦでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３０６】
本発明で提供される修飾型ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。例えば、脱糖化されたポリペプチドは大腸菌を宿主に利用する発現系のような原核細胞発現系を用いて製造できる。他の例で、タンパク質分解酵素抵抗性ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、１つ以上の糖化部位を修飾することによって、非糖化タンパク質形態で製造できる。例えば、成熟ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド（配列番号２７４）のアミノ酸位置Ｎ２７及びＮ３７のうちの１つまたは２つ位置での修飾は非糖化タンパク質をもたらすことができる。本発明に従って提供される修飾ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性のない完全に糖化されたＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの活性を維持することができる。したがって、上記タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを用いて、化学療法または骨髄移植後、好中球及び単核球の再構成を含んでＧＭ−ＣＳＦにより正常的に治療される状態または疾病を治療される症状及び疾病を治療することができる。
【０３０７】
【表７】
2011520472.tif 000012
【０３０８】
ｂ．Ｍ−ＣＳＦ
Ｍ−ＣＳＦは、リンパ球、単核球、繊維芽細胞、内皮細胞、筋芽細胞及び骨芽細胞を含む様々な細胞により産生された糖化サイトカインである。ディファレンシャルなスプライシングの結果として、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子は、３種類の異なるアイソフォームを産生する。アイソフォーム１は、３２個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む５５４個のアミノ酸前駆体（配列番号２７５）として発現される。成熟したアイソフォーム１Ｍ−ＣＳＦタンパク質は５２２個のアミノ酸からなり、配列番号２７６に示されている。アイソフォーム２は、３２個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む４３８個のアミノ酸前駆体（配列番号２７７）として発現される。成熟したアイソフォーム２Ｍ−ＣＳＦタンパク質は４０６個のアミノ酸からなり、配列番号２７８に示されている。アイソフォーム３は、３２個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む２５６個のアミノ酸前駆体（配列番号２７９）として発現される。成熟したアイソフォーム３Ｍ−ＣＳＦタンパク質は２２４個のアミノ酸からなり、配列番号２８０に示されている。Ｍ−ＣＳＦは、２つのＮ糖化部位（配列番号２７５、２７７及び２７９のそれぞれに示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸残基１５４及び１７２、及び配列番号２７６、２７８及び２８０のそれぞれに示される成熟ポリペプチドのアミノ酸１２２及び１４０に対応する）を有している。Ｍ−ＣＳＦは、細胞の増殖、分化、及び血液単核球、組織マクロファージ、及びそれらの前駆細胞の生存の核心調節子である。Ｍ−ＣＳＦはまた、真皮の厚さ、及び雌雄受精を調節するのに重要な役割を果たすことが判明された。
【０３０９】
本発明は、糖化部位であるＮ１２２及びＮ１４０での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型Ｍ−ＣＳＦポリペプチドを 提供する。本発明で提供される修飾型Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されないか、露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供されるＭ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾、一般的に２つの修飾を含み、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの活性を保有する場合、当業界に知られたＭ−ＣＳＦでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３１０】
本発明で提供される修飾型Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化されたポリペプチド形態で製造できる。一例で、大腸菌のような原核宿主を含んだ糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造することによって糖化されていないタンパク質分解酵素抵抗性Ｍ−ＣＳＦサイトカインを製造することができる。更に他の例で、ポリペプチドで糖化部位の１つ以上または全部を変異させることによって糖化されていないタンパク質分解酵素抵抗性Ｍ−ＣＳＦサイトカインを製造することができる。例えば、タンパク質分解に対する抵抗性を増加させる１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置Ｎ１２２及び／またはＮ１４０の修飾を追加で含むことができる。本発明で提供される修飾型Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性を有するように未修飾型完全に糖化されたＭ−ＣＳＦポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｍ−ＣＳＦが治療のために一般的に使われる疾病または障害の治療に使用できる。このような疾病または障害の例には、骨髄移植後の造血回復、アテローム性動脈硬化症、及び真菌感染を含んだ悪性疾病があるが、これに限定されない。
【０３１１】
ｃ．Ｇ−ＣＳＦ
糖化サイトカインの代表例は、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦは、３０個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む２０７個のアミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号２８１）であり、単核細胞、マクロファージ、好中性白血球、繊維芽細胞及び内皮細胞により産生される。配列番号２８２に示される１７７個のアミノ酸からなる成熟タンパク質は、シグナル配列の切断後に産生される。Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡのディファレンシャルなスプライシングは、他の前駆体変異体、２０４個のアミノ酸からなるアイソフォームｂ（配列番号２８３）をもたらす。シグナル配列の切断は、１７４個のアミノ酸からなる成熟したアイソフォームｂＧ−ＣＳＦポリペプチドをもたらす（配列番号２８４）。Ｇ−ＣＳＦは、配列番号２８２に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸位置Ｔ１３６（配列番号２８１の前駆体ポリペプチドのＴ１６６、配列番号２８４の成熟したアイソフォームｂポリペプチドのＴ１３３、配列番号２８３の前駆体アイソフォームｂポリペプチドのＴ１６３に対応する）においてＯ結合型糖化されている。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は顆粒球生成の主な細胞外調節子であり、特定の骨髄前駆細胞の増殖と生存及びこれらの顆粒球への分化を刺激することにより好中性白血球の生成を調節する。
【０３１２】
本発明は、糖化部位であるＴ１３６での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認できる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−Ｈｉｔ位置及び置換アミノ酸は、下記の表８に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基及び遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾を含み、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＧ−ＣＳＦでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３１３】
本発明で提供される修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化ポリペプチド形態で製造できる。一例で、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造することによって、本発明で提供されるＧ−ＣＳＦポリペプチドを製造することができる。更に他の例で、修飾型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ポリペプチド内のＯ−糖化部位を変異させて製造することができる。例えば、配列番号２８２のアミノ酸置換に該当する表８に記載された修飾のうち、１つ以上の遮蔽ｉｓ−Ｈｉｔ残基で１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、アミノ酸位置Ｔ１３６の修飾を追加で含むことができる。本発明で提供される修飾型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＧ−ＣＳＦポリペプチドの活性を維持する。このようなタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｇ−ＣＳＦが治療のために一般的に使われる疾病または障害の治療に使用できる。このような疾病または障害の例には、クローン病、心臓病、化学療法により誘導されるような、後天的な好中球減少症、先天的な好中球減少症、及び喘息を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
【表８】
2011520472.tif 000013
【０３１５】
ｄ．ＬＩＦ
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、糖タンパク質である。ＬＩＦ遺伝子は、２２個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２０２個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質（配列番号２８５）をコードする。翻訳後プロセッシングは、１８０個のアミノ酸からなる糖化型成熟ＬＩＦタンパク質をもたらす（配列番号２８６）。成熟ＬＩＦは、配列番号２８６に示される成熟ＬＩＦ配列のＮ７、Ｎ３４、Ｎ６３、Ｎ７３、Ｎ９６及びＮ１１６（配列番号２８５の前駆体ポリペプチドのＮ３１、Ｎ５６、Ｎ８５、Ｎ９５、Ｎ１１８及びＮ１３８）に対応する複数のＮ糖化部位を含む。ＬＩＦは、血小板形成、一部造血細胞の増殖、骨形成、脂肪細胞脂質輸送、副腎皮質刺激ホルモン生成、ニューロンの生存及び形成、筋肉衛星細胞増殖、及び肝細胞による急性期産生のための刺激として作用するものを含む広い範囲の作用をする。ＬＩＦは、胚盤胞の着床及び海馬及び嗅覚器受容体ニューロンの正常的な発達に欠かせないものである。
【０３１６】
本発明は、糖化位置であるＮ７、Ｎ３４、Ｎ６３、Ｎ７３、Ｎ９６、及びＮ１１６の糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＬＩＦポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された耐性を表す修飾型ＬＩＦポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＬＩＦポリペプチドは、遮蔽されないか、露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−Ｈｉｔ位置及び置換アミノ酸は、下記の表９に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基及び遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基が含まれる。当業者は本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＬＩＦポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾を含み、ＬＩＦポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＬＩＦでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３１７】
本発明で提供される修飾型ＬＩＦポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化ポリペプチド形態で製造できる。例えば、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造することによって、本発明で提供される非糖化された修飾ＬＩＦポリペプチドを製造することができる。他の例で、修飾型ＬＩＦポリペプチドは１つ以上の糖化部位を修飾して非糖化タンパク質形態で製造できる。例えば、成熟ＬＩＦポリペプチド（配列番号２８６）のアミノ酸位置Ｎ７、Ｎ３４、Ｎ６３、Ｎ７３、Ｎ９６、及びＮ１１６のうちの１つ以上を修飾させれば、非糖化タンパク質が得られることができる。本発明で提供される修飾型ＬＩＦポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＬＩＦポリペプチドの活性を維持する。したがって、上記修飾型ＬＩＦポリペプチドを用いて、化学療法または骨髄移植後、好中球及び単核球を再構成することを含んで、ＬＩＦにより正常に治療される症状及び疾病を治療することができる。
【０３１８】
【表９】
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【０３１９】
ｅ．インターロイキン−１β
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、１１６個のアミノ酸からなるプロペプチドを含む２６８個のアミノ酸前駆体（配列番号２８７）として合成される。成熟ＩＬ−１βの配列は配列番号２８８に示されており、１５２個のアミノ酸からなる。ＩＬ−１βは配列番号２８７に示される前駆体ポリペプチドの１２３番アミノ酸及び配列番号２８８に示される成熟ポリペプチドの７番アミノ酸に対応する一つのＮ結合型糖化部位を有している。ＩＬ−１βは、単核細胞、組織マクロファージ、角質形成細胞、及び他の内皮細胞を含む様々な細胞において産生された炎症誘発サイトカインである。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは両方とも同じ受容体に結合し、同一ではなければ、類似する生物学的特性を有している。このようなサイトカインは。ＩＬ−２放出誘導による胸腺細胞増殖、Ｂ細胞成熟と増殖、ミトゲンＦＧＦ類似活性及び滑液細胞からのプロスタグランジンと膠原質分解酵素の放出を刺激する能力の刺激を含む広い範囲の活性を有している。
【０３２０】
本発明は、糖化部位であるＮ７での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−１βポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−１βポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−１βポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−１βポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾、一般的には２つの修飾を含み、ＩＬ−１βポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＬ−１βでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３２１】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−１βポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化ポリペプチド形態で製造できる。一例で、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造することによって、上記修飾型ＩＬ−１βポリペプチドを製造することができる。更に他の例で、非糖化されたＩＬ−１βポリペプチドを、ポリペプチド内の部位のうちの１つ以上乃至全部を変異させて製造できる。例えば、１つ以上の修飾が遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置に存在する修飾であり、配列番号２８８のアミノ酸置換に該当するタンパク質分解酵素抵抗性を増加させる１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、アミノ酸位置Ｎ７の修飾を追加で含むことができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−１βポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−１βポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＬ−１βポリペプチドは、ＩＬ−１βが治療のために一般的に使われる疾病または障害の治療に使用できる。このような疾病または障害の例には、化学療法後、免疫系を回復するためにＩＬ−１βを使用することを含む癌、局所貧血／ 再かん流損傷、及び後天性及び先天性好中性白血球減少症を含むが、これらに限定されない。
【０３２２】
ｆ．インターロイキン−２
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、抗原性またはミトゲン性刺激に対する反応においてＴ細胞により産生された糖タンパク質である。ＩＬ−２遺伝子は、２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む１５３個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質（配列番号２８９）をコードする。翻訳後プロセッシングは、１３３個の糖化アミノ酸からなる糖化型成熟ＩＬ−２タンパク質（配列番号２９０）をもたらす。成熟ＩＬ−２は、配列番号２９０に示される成熟ＩＬ−２のＴ３及び配列番号２８９に示される前駆体ポリペプチドのＴ２３に対応する位置においてＯ糖化されている。ＩＬ−２は、Ｔ−細胞増殖及び免疫反応の調節に重要な他の活性を必要とする。これは、Ｂ細胞、単核球、リンホカイン活性化されたキラー細胞、自然殺害細胞及び神経膠腫細胞を刺激することができる。
【０３２３】
本発明は、糖化部位であるＴ３での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−２ポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−２ポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−Ｈｉｔ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１０に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基及び遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＬ−１βポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＬ−２でどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３２４】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化ポリペプチド形態で製造できる。例えば、本発明で提供される修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、大腸菌を用いる発現系のような原核発現系を宿主細胞に用いて製造できる。他の例として、修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、１つ以上の糖化部位を修飾させることによって、非糖化されたタンパク質形態で製造できる。例えば、成熟したＩＬ−２ポリペプチド（配列番号２９０）のＴ３で、修飾は非糖化されたタンパク質をもたらす。本願で提供された修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−２ポリペプチドの活性を維持する。したがって、上記修飾型ＩＬ−２ポリペプチドは、ＨＩＶ及び巨大細胞ウイルス感染のような感染、リンパ球減少症、及び転移黒色腫と転移腎臓癌を含む癌を含む一般的にＩＬ−２により治療される疾病と状態を治療するのに使用可能である。
【０３２５】
【表１０】
2011520472.tif 000015
【０３２６】
ｇ．インターロイキン−３
糖化サイトカインの代表例として、インターロイキン−３（ＩＬ−３）がある。ＩＬ−３は、１９個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む１５２個のアミノ酸からなる前駆体ポリペプチド（配列番号２９１）として活性化されたＴ細胞、単核細胞／マクロファージ及びストロマ細胞により産生される。配列番号２９２に示される１３３個のアミノ酸からなる成熟タンパク質は、シグナル配列の分離後に産生される。ＩＬ−３ポリペプチドは、配列番号２９２に示される成熟ポリペプチドのＮ１５及びＮ７０位（配列番号２９１の前駆体ポリペプチドのＮ３４及びＮ８９に対応する）にＮ結合型糖化部位を含む。ＩＬ３は、骨髄、赤血球及び去核細胞系統の産生前駆細胞の成長と分化を調節し、成熟した好中性白血球及びマクロファージを機能的に活性化させる多能性造血成長因子である。このようなＩＬ−３は、造血細胞個体群を拡張するのに使用可能である。
【０３２７】
本発明は、糖化部位Ｎ１５及びＮ７０での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−３ポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−３ポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−３ポリペプチドは、遮蔽されないか、露出されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−Ｈｉｔ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１１に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基及び遮蔽されていないｉｓ−Ｈｉｔ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−Ｈｉｔ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−３ポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＬ−３ポリペプチドの活性を保有する場合、当業界に知られたＩＬ−３でどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３２８】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−３ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＬ−３ポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＬ−３サイトカインは、ポリペプチドの１つ乃至全部のＮ−糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号２９２のアミノ酸置換に相応する表１１に提示された１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ１５及び／またはＮ７０位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＬ−３ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−３ポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＬ−３ポリペプチドは、一般的にＩＬ−３が治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。代表的なこのような疾病や障害は、先天性または後天性好中性白血球減少症及び低血小板症、例えば、化学療法により誘導されるものを含むが、これに限定されない。
【０３２９】
【表１１】
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【０３３０】
ｈ．インターロイキン−４
糖化サイトカインの代表例には、インターロイキン−４（ＩＬ−４）がある。ＩＬ−４は、２４個のアミノ酸シグナルペプチドを含む１５３個のアミノ酸の前駆体（配列番号２９３）として合成される。成熟ＩＬ−４の配列は配列番号２９４であり（ユニプロット番号Ｐ０５１１２）、１２９個のアミノ酸からなる。ＩＬ−４は、２つのＮ結合型糖化部位（配列番号２９３に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸６２及び１２９、及び配列番号２９４に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸３８及び１０５に対応する）を有している。ＩＬ−４はまた、ジスルフィド結合の形成に関与する６個のシステイン残基を含む。ＩＬ−４は、純粋なヘルパーＴ細胞のＴｈ２細胞への分化を誘導する。ＩＬ−４はまた、活性化されたＢ細胞の刺激及びＴ細胞の増殖を行う役割を果たす。このため、ＩＬ−４は、体液性及び適応性免疫の調節因子である。
【０３３１】
本発明は、糖化部位であるＮ３８及びＮ１０５での糖化により遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−４ポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−４ポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−４ポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は下記の表１２に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法を用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−４ポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＬ−４ポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＬ−４でどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３３２】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−４ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＬ−４ポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＬ−４サイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号２９４のアミノ酸置換に相応する表１２に提示された１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ３８及び／またはＮ１０５位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＬ−４ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−４ポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＬ−４ポリペプチドは、一般的にＩＬ−４が治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。代表的なこのような疾病や障害は、炎症性及び自家免疫疾患、例えば、コラゲン誘導関節炎、自家免疫糖尿病、多発性硬化症及び炎症性腸疾患などの自家免疫疾患、そして結腸癌と乳房癌等の癌を含むが、これに限定されない。
【０３３３】
【表１２】
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【０３３４】
ｉ．インターロイキン−５
糖化サイトカインの代表例には、ＩＬ−５がある。ＩＬ−５は、好酸球白血球の増殖、分化、及び活性化を促進するホモ二量体型糖タンパク質である。ＩＬ−５は、また、Ｂ細胞成長を刺激する機能をし、免疫グロブリン分泌を増強させる。ＩＬ−５は１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む１３４個のアミノ酸前駆体（配列番号１３４）として合成される。成熟ＩＬ−５の配列は配列番号２９６に示されており、１１５個のアミノ酸からなる。ＩＬ−５は、２つのシステイン（配列番号２９６に示されるアミノ酸配列のＣ４４とＣ８６に対応する）により結合された逆平行二量体である。ＩＬ−５はまた、配列番号２９６に示されるアミノ酸配列に対応するＴ３及びＮ２８位置においてそれぞれＯ結合型及びＮ結合型糖化により糖化されている（Minamitake et. al., (1990) J. Biochem., 107:2:292-297）。
【０３３５】
本発明は、糖化部位であるＴ３及びＮ２８での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−５ポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−５ポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−５ポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−Ｈｉｔ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１３に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−５ポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＬ−５ポリペプチドの活性を保有する場合、当業界に知られたＩＬ−５でどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３３６】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−５ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＬ−５ポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＬ−５サイトカインは、ポリペプチドの１つ乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号２９６のアミノ酸置換に相応する表１３に提示された１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｔ３及び／またはＮ２８位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＬ−５ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−５ポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＬ−５ポリペプチドは、一般的にＩＬ−５が治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。代表的なこのような疾病や障害は、 大腸癌、胃癌、そして、肺、膀胱、子宮頸部及び頭部と頸部の癌腫、及び移植拒否を含むが、これらに限定されない。
【０３３７】
【表１３】
2011520472.tif 000018
【０３３８】
ｊ．インターロイキン−６
糖化サイトカインの代表例には、インターロイキン−６（ＩＬ−６）がある。ＩＬ−６は多面発現性サイトカインであり、多くの造血細胞発達、増殖、及び成熟を刺激することができる。ＩＬ−６はまた、免疫グロブリン分泌細胞であり、Ｂ細胞成熟に必要とされる。さらに、ＩＬ−６は、神経細胞の分化、骨の代謝作用及び肝細胞における急性期タンパク質の誘導作用をする。ＩＬ−６は、２９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２１２個のアミノ酸前駆体（配列番号２９７）として合成される。成熟ＩＬ−６の配列は配列番号２９８に示されており、１８３個のアミノ酸からなる。ＩＬ−６は、Ｔ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞及び角質形成細胞により発現される。発現の根源に従属して、分泌された成熟したヒトＩＬ−６は、１８３から１８６個の残基を含む。例えば、繊維芽細胞由来のＩＬ−６のアミノ末端は、配列番号２９７のアミノ酸配列のＡｌａ２８である。ＩＬ−６は、Ｎ結合型およびＯ結合型糖化により翻訳後修飾される。例えば、Ｔｈｒ１６６はＯ結合型糖化部位であり、Ａｓｎ７３及びＡｓｎ１７２は配列番号２９７に示される前駆体配列の残基に対応するＮ結合型糖化部位である（それぞれ配列番号２９８の１３７、４４及び１４３残基に対応する）。
【０３３９】
本発明は、糖化部位であるＴ１３７、Ｎ４４、及びＮ１４３での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＬ−６ポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＬ−６ポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＬ−６ポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１４に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＬ−６ポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＬ−６ポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＬ−５でどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３４０】
本発明で提供される修飾型ＩＬ−６ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＬ−６ポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＬ−６サイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号２９８のアミノ酸置換に相応する表１４に提示された１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｔ１３７、Ｎ４４及び／またはＮ１４３位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＬ−６ポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＬ−６ポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＬ−６ポリペプチドは、一般的にＩＬ−６が治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。このような疾病の代表例としては、癌、及び化学療法により誘導される、低血小板症及び好中性白血球減少症、炎症性疾病（糸球体腎炎を除く）、例えば、多発性硬化症、敗血性ショック、関節炎状態、特に、病源体により誘導される関節炎状態、例えば、ライム病関節炎、細菌誘導関節炎、及びポリオ関節炎多発性硬化症及びその他の脱髄性疾病（すなわち、神経、脳及び／または脊髄において脱髄性により特性化された疾病、例えば、多発性硬化症、急性破腫性脳脊髄炎、または脳炎、視神経脊髄炎、耳鳴、びまん性脳硬化症、シルダー病、副腎白色質形成障害症、３次ライム疾患、熱帯痙攣性パラポエシス、及び特に、自家免疫媒介の脱髄性が主な症状であるその他の疾病）、バムス、感染ショック、髓膜炎、及び肺炎などの急性重症炎症及び多発軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋肉炎、慢性活動肝炎、重症筋肉無力症、乾癬、乾癬性関節炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、自家免疫炎症性腸疾患（例えば、潰瘍大腸炎、クローン病）、内分泌腺眼病、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、小児糖尿病（糖尿病第Ｉ型）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、 乾性角結膜炎及び春季カタル、及び間質性肺繊維症を含むが、これらに限定されない。
【０３４１】
【表１４】
2011520472.tif 000019
【０３４２】
ｋ．オンコスタチンＭ
代表的な糖化サイトカインは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）である。刺激されたＯＳＭは、Ｔ細胞と単核球により合成された多面発現性サイトカインであり、肝発達、造血、炎症及び中枢神経発達に関与する。ＯＳＭは、２５個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２５２個のアミノ酸前駆体（配列番号２９９）として合成される。成熟したＯＳＭ配列は配列番号３００に示され、２２７個のアミノ酸長を有する。チロシン類似切断位置における３１カルボキシ末端アミノ酸部位は、ＯＳＭの完全に活性化された１９６残基を提供する。ＯＳＭ配列内の５個のシステイン残基のうち４個は、ジスルフィド結合に関与する（すなわち、配列番号２９９に示される残基に対応するＣ３１及びＣ１５２、Ｃ７４及びＣ１９２位におけるシステイン間）、螺旋Ａ及びＢ（Ｃ７４及びＣ１９２）間のジスルフィド結合はＯＳＭ活性に欠かせないものである。システインがない残基（Ｃ１０５）はＯＳＭの二量体化を調節することができない。ＯＳＭはＮ結合型糖化により翻訳後さらに修飾される。例えば、Ａｓｎ１００及びＡｓｎ２１７は配列番号２９９に示される前駆体配列内残基に対応するＮ結合型糖化部位である（及び、配列番号３００に示される残基７５及び１９２にそれぞれ対応する）。
【０３４３】
本発明は、糖化部位Ｎ７５及びＮ１９２での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＯＳＭポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＯＳＭポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＯＳＭポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１５に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＯＳＭポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＯＳＭポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＯＳＭでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３４４】
本発明で提供される修飾型ＯＳＭポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＯＳＭポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＯＳＭサイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号３００のアミノ酸置換に相応する表１５に提示された１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ７５及び／またはＮ１９２位置のアミノ酸修飾を追加で含むことができる。本願で提供された修飾型ＯＳＭポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＯＳＭポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＯＳＭポリペプチドは、一般的にＯＳＭが治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。このような疾病や治療の例は、慢性炎症疾患、急性及び慢性胃腸管炎症、リウマチ関節炎及び多発性硬化症及び組織損傷抑制を含むが、これらに限定されない。
【０３４５】
【表１５】
2011520472.tif 000020
【０３４６】
ｌ．幹細胞因子
代表的な糖化サイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）である。ＳＣＦ（「スチール因子」または「ｃキットリガンド」と知られている）は、ＣＤ１１７（ｃキット）と結合したサイトカインであり、造血幹細胞及び他の造血前駆細胞の生存、増殖、及び分化に重要である。これらの機能の一つは、例えば、赤血球系列の初期赤血球前駆体であるＢＦＵ−Ｅ（破裂形成単位赤血球）をＣＦＵ−Ｅ（コロニー形成の単位赤血球）細胞に変化させることである。ＳＣＦは、２５個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２７３個のアミノ酸前駆体（配列番号３０１）として合成される。成熟ＳＣＦの配列は配列番号３０２に示され、その長さはアミノ酸２４８個である。ＳＣＦは、細胞表面に結合したＳＣＦ及び溶解性（または、自由）ＳＣＦの２種類の形態として存在する。受容性ＳＣＦは、メタロタンパク質分解酵素により表面に結合したＳＣＦを切断することにより製造されて、配列番号３０１の２６から２１４のアミノ酸に対応する１８９アミノ酸ポリペプチドを産生する。ＳＣＦは、配列番号３０１に示される前駆体配列内残基に対応するＣ２９及びＣ１１４、及びＣ６８及びＣ１６３位のシステイン間に２つのジスルフィド結合を有している。ＳＣＦは、Ｎ結合型糖化により翻訳後にさらに修飾される。例えば、Ａｓｎ９０、Ａｓｎ９７、Ａｓｎ１１８、Ａｓｎ１４５、及びＡｓｎ１９５は配列番号３０１に示される前駆体配列内残基に対応するＮ結合型糖化部位である（配列番号３０２の６５、７２、９３、１２０と１７０残基にそれぞれ対応する）。
【０３４７】
本発明は、糖化部位であるＮ６５、Ｎ７２、Ｎ９３、Ｎ１２０、及びＮ１７０での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＳＣＦポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＳＣＦポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＳＣＦポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１６に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＳＣＦポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＳＣＦポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＳＣＦでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３４８】
本発明で提供される修飾型ＳＣＦポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＳＣＦポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＳＣＦサイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号３０２のアミノ酸置換に相応する表１６に提示された修飾のうちの１つ以上の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ６５、Ｎ７２、Ｎ９３、Ｎ１２０及び／またはＮ１７０位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＳＣＦポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＳＣＦポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＳＣＦポリペプチドは、一般的にＳＣＦが治療のために使われる疾病や障害の治療に使用できる。このような疾病や治療の例は、肝損傷、喘息、造血移植を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３４９】
【表１６】
2011520472.tif 000021
【０３５０】
ｍ．インターフェロン−β
代表的な糖化サイトカインは、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）である。インターフェロンのI型クラスの構成要素であるＩＦＮ−βは、５個のアルファ螺旋を含む球状タンパク質である。一般的に、ＩＦＮ−βは抗炎症分子であり、この様々な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、マクロファージ及び樹脂状細胞）に対する観察効果は、例えば、次を含む：Ｔ細胞の細胞毒性強化、抗体生成調節Ｔ細胞の増殖及び移動阻害接着分子の抑制、腫瘍結合表面抗原の発現増加、ＭＨＣクラスＩ抗原などの表面分子の刺激、親細胞自滅遺伝子及びタンパク質（例えば、腫瘍壊死因子関係の細胞死滅誘導リガンド、キャスパーゼ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、及びｐ５３）の誘導及び活性化、抗細胞自滅遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−２、細胞死滅タンパク質の阻害剤）の抑制、及び血管新生の阻害（Pestka et. al., Immunological Reviews 202: 8-32 (2004); Holten et. al., (2002), Arthritis Research, 4: 346-352)。
【０３５１】
ＩＦＮ−βは、２１個のアミノ酸シグナルペプチドを含む１８７個のアミノ酸の前駆体（配列番号３０３）として合成される。成熟ＩＦＮ−βポリペプチドは可変長を有し、典型的に１６６個のアミノ酸（配列番号３０４）、１６４及び１６５個のアミノ酸長のポリペプチドを含む。ＩＦＮ−βは、配列番号３０３に示される前駆体配列残基に対応するＣ５２とＣ１６２位のシステイン間に一つのジスルフィド結合を有する。ＩＦＮ−βは、Ｎ結合型された糖化により翻訳後さらに修飾される。例えば、Ａｓｎ１０１は、Ｎ結合型糖化部位（配列番号３０３に示される前駆体配列のうち１０１番残基に対応し、配列番号３０４の８０番残基に対応する）。ＩＦＮ−βの商業的な形態は、商標ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）及びRebif（登録商標）で販売されているものを含む。ＩＦＮ−β−１ａ（Avonex（登録商標） Biogen Inc, CA, USA,及びRebif（登録商標） Serono Inc., Geneva, Switzerland）は、ＩＦＮ−βをコードするｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞において産生される。ＩＦＮ−β−１ａは長さが１６６個のアミノ酸であり、８０位のアスパラギン残基において糖化を含む（Nelissen et. al., Brain 126: 1371-1381 (2003)）繊維芽細胞由来のヒトＩＦＮ−βと同様である。Rebif（登録商標）ＩＦＮ−β−１ａは筋肉内投与の方よりも皮膚（すなわち、皮下）投与のために製剤化された点において、Avonex（登録商標）ＩＦＮ−β−１ａとは異なる。ＩＦＮ−β−１ｂ（Betaseron（登録商標） Berlex研究所、Richmo- nd, CA, USA）は、ヒトＩＦＮ−βをコードする遺伝的に操作されたプラスミドを有する大腸菌において産生される。前記生成された発現ＩＦＮ−β−１ｂ製品は非糖化型のものであり、アミノ末端メチオニンが欠失されており、（配列番号３０４の）１７位のシステイン残基がセリンに修飾型。ＩＦＮ−β−１ｂは１６５個アミノ酸長であり、天然ヒトＩＦＮ−β（Nelissen et. al., Brain 126: 1371-1381 (2003)）において発見された炭水化物側鎖が含まれていない。
【０３５２】
本発明は、糖化部位Ｎ８０での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１７に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＦＮ−βポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＦＮ−βでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３５３】
本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＦＮ−βサイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号３０４のアミノ酸置換に相応する表１７に提示された修飾のうちの１つ以上の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ８０位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドは、上記修飾を含まない完全に糖化されたＩＦＮ−βポリペプチドの活性を維持する。このような修飾型ＩＦＮ−βポリペプチドは、一般的にＩＦＮ−βが治療のために使われ、及び／またはＩＦＮ−βの投与に反応する疾病や障害の治療に使用できる。このような疾病の例は、ウイルス感染、増殖障害、自家免疫疾患、及び炎症性障害を含むが、これに限定されない。 治療される疾病が自家免疫疾患である一例において、前記疾病や状態は、多発性硬化症、リウマチ関節炎、慢性ウィルス肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及び心筋ウィルス感染のいずれか１種でありうるが、これらに限定されない。治療される疾病が増殖障害である他の例において、この疾病または疾患は癌または骨障害でありうるが、これらに限定されない。本願で提供される医薬組成物により治療される癌の例は、ブドウ膜、黒色腫、結腸癌、肝癌または転移癌が含まれる。骨障害の例は、骨多孔症と骨減少症である。治療される疾病が炎症障害であるさらに他の例において、この疾病または状態は、喘息、ギラン・バレー症候群、及び潰瘍大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患でありうるが、これらに限定されない。前記疾病がウィルス性感染であるさらに他の例において、感染は慢性ウィルス性肝炎や心筋感染でありうるが、これらに限定されない。
【０３５４】
【表１７Ａ】
2011520472.tif 000022
【表１７Ｂ】
2011520472.tif 000023
【表１７Ｃ】
2011520472.tif 000024
【０３５５】
ｎ．インターフェロン−γ
代表的な糖化サイトカインがインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）である。一般的に、ＩＦＮ−γは、活性化されたＴ細胞及びＮＫ細胞を含む免疫細胞において産生される多面発現性サイトカインである。ＩＦＮ−γ及びこれを産生した細胞は、様々な細胞形態に抗ウィルス、抗増殖及び免疫調節効果を及ぼすことにより宿主防御において中樞的な役割を果たす。例えば、ＩＦＮ−γは、マクロファージの機能的な活性を向上させ、Ｔ及びＢ細胞分化を促進し、様々な細胞においてクラスI及びIIＭＨＣ基抗原発現を調節し、天然キラー細胞及び中性球を活性化させ、中性球生存を延ばす能力を有する。ＩＦＮ−γポリペプチドは様々なアミノ酸配列長から構成された非均質性ポリペプチドであり、組換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド及び細胞及び組織、例えば、Ｔリンパ球及び天然キラー（ＮＫ）細胞から抽出されたＩＦＮ−γでありうる。一般的に、ＩＦＮ−γは、シグナル配列の切断によりさらに小さなポリペプチドとして成熟するさらに大きなポリペプチドとして産生される。成熟ＩＦＮ−γポリペプチドは、シグナル配列の切断後に、通常、１２４から１４６個のアミノ酸長からなる。ヒトＩＦＮ−γの前駆体形態は１６６個のアミノ酸ポリペプチドであり（例えば、配列番号３０５）、切断されるシグナル配列（すなわち、アミノ酸１−２０）を含み、配列番号３０６に示される１４６個のアミノ酸の成熟ポリペプチドなどの成熟ポリペプチドをもたらす。ＩＦＮ−γは、Ｎ結合型糖化によりさらに翻訳後修飾される。例えば、Ａｓｎ４８とＡｓｎ１２０は、配列番号３０５に示される前駆体配列の残基に対応（及び、配列番号３０６内の２８番及び１００番の残基に対応）するＮ結合型糖化部位である。
【０３５６】
さらに、成熟ＩＦＮ−γは、１４６個のアミノ酸長よりもさらに小さな、例えば、１２４、１２５、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、及び１４５個のアミノ酸長の形態で存在しうる。ＩＦＮ−γポリペプチドの異種型は、Ｃ末端において起こるＩＦＮ−γの自然的な切断に起因し、例えば、分泌前後におけるタンパク質分解酵素分解に起因する。例えば、切断は、宿主細胞により産生された内因性または外因性タンパク質分解酵素活性に起因する。一部の場合において、分泌後におけるタンパク質分解酵素的分解は、培養培地内のタンパク質分解酵素の存在に起因する。ＩＦＮ−γのＮ末端アミノ酸残基の欠失も報告されている。一部の場合において、Ｎ末端残基の欠失は翻訳後修飾に起因する。ＩＦＮ−γの出処に従属して、ＩＦＮ−γの翻訳後修飾は、配列番号３０６に示される成熟ポリペプチドから最初３個のアミノ酸Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓの除去を含む（The Cytokine FactsBook, (1994) Callard R., and Gearing A., (eds) pp.157-158）。
【０３５７】
本願の目的のために、ＩＦＮ−γポリペプチドの修飾は、アミノ酸１４６個の長さを有するＩＦＮ−γポリペプチド（配列番号３０６）を基準とする。しかしながら、本願で提供される修飾ＩＦＮ−γポリペプチドは、当業者に周知な方法により製造可能であり、様々な長さに製造可能であることが理解される。このため、本願で提供される修飾ＩＦＮ−γポリペプチドは１４６個のアミノ酸長を有するもの（例えば、配列番号３０６に示される成熟ＩＦＮ−γポリペプチド内のアミノ酸修飾を含む）、Ｎ末端またはＣ末端において種々に切断されたこれらの断片、またはこれらの組み合わせを含む。必要に応じて、ＩＦＮ−γポリペプチドを均一に精製し、所望の長さへとすることができる。
【０３５８】
本発明は、糖化部位Ｎ２８及びＮ１００での糖化により遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基での１つ以上の修飾により、未修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドと比較してタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドは、遮蔽されないか露出されたｉｓ−ＨＩＴ位置で追加の修飾を含むことができる。タンパク質分解酵素分解を受けることができるｉｓ−ＨＩＴ位置は、米国出願公開２００５０２０２４３８号に記載された方法を用いて確認することができる。タンパク質分解酵素抵抗性を与える代表的なｉｓ−ＨＩＴ位置及び置換アミノ酸は、下記の表１８に記載されている。これには遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基及び遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基が含まれる。当業者は、本発明に記載された方法などを用いて、糖化により遮蔽されるｉｓ−ＨＩＴ残基を確認することができる。本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドは、遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ位置で１つ以上の修飾を含み、ＩＦＮ−γポリペプチドの活性を維持する場合、当業界に知られたＩＦＮ−γでどの他の修飾を追加で含むことができる。
【０３５９】
本発明で提供される修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化された形態で製造できる。一例として、大腸菌のような原核宿主を含んで、糖化できない宿主細胞でタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを製造して、修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドを製造することができる。更に他の例として、非−糖化されたタンパク質分解酵素抵抗性ＩＦＮ−γサイトカインは、ポリペプチドの１つ以上乃至全部の糖化部位を変異させることによって生成できる。例えば、配列番号３０６のアミノ酸置換に相応する表１８に提示された修飾のうちの１つ以上の遮蔽されたｉｓ−ＨＩＴ残基で１つ以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、Ｎ２８及びＮ１００位置のアミノ酸修飾を追加的に含むことができる。本願で提供された修飾型ＩＦＮ−γポリペプチドは、プロテアーゼ抵抗性のない完全に糖化されたＩＦＮ−γポリペプチドの活性を維持する。前記非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性を有するポリペプチドは、ＩＦＮ−βが一般的に治療のために用いられる疾病や障害を治療するのに用いられる。前記疾病や治療の例は、ウィルス性感染（例えば、Ｃ型肝炎、後天性免疫欠乏症）、細菌性感染、真菌感染（例えば、アスペルギルス症、カンジダ性敗血症、癌性状態（例えば、好中球減少症、造血細胞移植）、癌、肝疾患、肺疾患または状態、悪性骨多孔症または慢性肉芽腫を含むが、これらに限定されない。
【０３６０】
【表１８】
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【０３６１】
４．治療用ポリペプチドのその他の修飾
本願で提供されるタンパク質分解酵素抵抗性増強のための任意の１以上のアミノ酸修飾に加えて、修飾型治療用ポリペプチドはまた、１以上のさらなる修飾を含むことができる。一般的に、修飾は、治療用ポリペプチドの少なくとも一つの活性の損失も無しに安定性の増強をもたらす。例えば、治療用ポリペプチド内の他のさらなる修飾は、１以上の付加的なアミノ酸修飾及び／または１以上の化学的修飾を含む。このような修飾は、免疫原性、糖化、活性または治療用ポリペプチドの任意の他の既知の性質を変更することを含むが、これらに限定されない。一部のケースにおいて、アミノ酸修飾は治療用ポリペプチドの性質を変更し、これは、その活性のために必要とされる。例えば、アミノ酸修飾は受容体などの他のポリペプチドと治療用ポリペプチドとの相互作用を増減させる。一部のケースにおいて、アミノ酸修飾はある性質の喪失を伴う。例えば、一つのアミノ酸修飾が受容体結合などの性質を減少させたならば、他の位置における付加的なアミノ酸修飾が前記結合を回復することができる。
【０３６２】
治療用ポリペプチド中の他のさらなる修飾は、１以上の付加的なアミノ酸修飾及び／または１以上の化学的修飾または付加的な化学的修飾を許容する１以上の付加的なアミノ酸修飾（例えば、化学的修飾のための部位の発生）を含む。そのような修飾は、ＰＥＧ化、非免疫化、アシル化（例えば、アセチル化またはサクシニル化）、メチル化、リン酸化、ハシル化、硫酸化、プレニル化、酸化、グアニジル化、アミジン化、カルバミル化（例えば、カルバモイル化）、トリニトロフェニル化、窒酸化、当業者に周知な他のもの（例えば、米国特許第５、８５６、２９８号、米国公開番号第２００３−０１２００４５号、第２００４−００６３９１７号、第２００５−０２２０８００号、第２００５−０１０７５９１号、第２００６−００３５３２２号、及び第２００６−００７３５６３号、及び国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／８１４０５号）またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ＥＰＯの修飾のための代表的な方法が本発明で提供され、本発明で提供される他の修飾型治療用ポリペプチドに類似な修飾が適用できる。
【０３６３】
加えて、タンパク質修飾は、ポリペプチドの検出、精製、及びアッセイ開発を容易化させるための修飾、例えば、タンパク質の一級アミンへの共有結合のためのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンでのポリペプチドの修飾、または、蛍光、非同位元素、または放射能標識付着のための他の変更を含む。修飾型治療用タンパク質はまた、治療的用途、検出、精製、及びアッセイ開発のためのポリペプチドの標的化を容易化させるための１以上のポリペプチドに、または治療のための他の治療用ポリペプチドに融合可能である。
【０３６４】
ａ．溶解性を向上させるための修飾
前記提供された修飾型治療用ポリペプチドはまた、タンパク質の溶解性を増強させるためにさらに修飾可能である。例えば、タンパク質の活性のために要求されない表面の極性残基は、細菌内において産生される場合、ポリペプチドの凝集を防止するために修飾可能である（Narhi et. al., (2001) Prot. Eng. 14(2) 135-140）。一般的に、残基は、前記タンパク質が修飾されない治療用タンパク質の１以上の活性を維持するように修飾される。修飾のための残基は、タンパク質糖化部位であるアスパラギン残基を含むが、これに限定されない。典型的に、中性のアスパラギン残基は、リシンまたはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸残基に代替可能である。一例において、修飾型治療用タンパク質は修飾型ＥＰＯタンパク質であり、アミノ酸Ｎ２４、Ｎ３８及びＮ８３からなる群より選択される１以上のアスパラギン残基が修飾されている。特別な例において、ＥＰＯポリペプチド内のＮ２４、Ｎ３８、及びＮ８３残基は、リシンに代替することができる（例えば、配列番号３０９または３１０）。
【０３６５】
Ｅ．ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドを生成及び修飾するための代表的な方法
本発明は、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与えるアミノ酸修飾を有するＥＰＯポリペプチドを提供する。このような修飾型ポリペプチドは、未修飾型ポリペプチドと比較して増加された安定性及び半減期を表す。また、本発明は、ポリペプチドにタンパク質分解酵素抵抗性を与えるアミノ酸修飾を含む糖化された治療用ポリペプチド（ＥＰＯを含む）であって、少なくとも1つの修飾が遮蔽されたｉｓ−Ｈｉｔ残基に位置するポリペプチドを提供する。本発明で提供される修飾型ポリペプチドは、ポリペプチドの一次配列のみを修飾することによって、タンパク質分解酵素に対して抵抗性を有する。したがって、本発明で提供されるポリペプチドは、糖化のような他の翻訳後修飾またはＰＥＧ化のような他の修飾に依存せず、非修飾ポリペプチドと比較して増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を表す。本発明で提供されるアミノ酸修飾の中には、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させるためにポリペプチドの一次配列でアミノ酸の置換を含む修飾がある。得られるポリペプチドは、タンパク質分解酵素（血液、血清、胃腸管等）による分解に対して増加された抵抗性を表すことによって、インビトロ及び／またはインビボで増加された半減期を表す。
【０３６６】
変異誘発に基づいたタンパク質進化に対して説明された種々の一般的な方法のうち、いずれかの方法が利用できる。これら方法及び他の適当な方法は、単独または組合により使われて、タンパク質分解に対して増加された安定性及び／または抵抗性が達成されるように修飾型ＥＰＯポリペプチド、または他の治療用ポリペプチドが製造できる。このような方法には、出発タンパク質配列のアミノ酸が相異するアミノ酸位置で単一または多重置換により２０個アミノ酸の全部（または、グループ）により置換されるランダムな変異誘発がある。更に他の方法である制限無作為変異誘発は、２０個アミノ酸の全部またはＤＮＡバイアス（DNA-biased）残基を導入するものである。上記バイアスは、「進化させる」活性に関与することが前もって知られたタンパク質の制限された領域または予め決められた領域内で確率論的または反確率論的方法によりＤＮＡ配列に基づき、タンパク質配列には基づかない。また、１Ｄ−スキャニング、２Ｄ−スキャニング、及び３Ｄ−スキャニングを含んだ合理的変異誘発方法を単独または組合により用いて、修飾型ＥＰＯ変異体を製作することができる。したがって、当業界に知られた任意の方法を用いて、修飾型ＥＰＯポリペプチドを生成することができる。得られる修飾型ポリペプチドは、本発明に記載したように、タンパク質分解酵素に対する抵抗性及び／または活性に対して試験することができる。
【０３６７】
米国特許出願公開ＵＳ−２００４−０１３２９７７−Ａ１号及びＵＳ−２００５−０２０２４３８−Ａ１号の記載のような方向付けられた進化方法を含んだ任意の修飾方法を利用することができる。例えば、本発明に記載された方法においては、増加されたタンパク質分解酵素抵抗性のための修飾がＰＣＴ出願公開ＷＯ ２００４／０２２７４７号及びＷＯ２００４／０２２５９３号で記載した方法を用いて選択される。個々のＬＥＡＤＳが確認されれば、結合させて修飾型ＳｕｐｅｒＬＥＡＤポリペプチドを生成することができる。
【０３６８】
ＥＰＯポリペプチド及びその種変異体、及び対立遺伝子変異体を含んだ変異体は、本発明で記載した方法を用いて修飾できる。例えば、上記方法を用いて、本願で記載したような任意のＥＰＯポリペプチド、例えば配列番号２または２３７で記載した野生型ＥＰＯポリペプチド、またはその対立遺伝子変異体、種変異体または他の変異体にタンパク質分解酵素抵抗性を与える修飾を確認することができる。また、本発明の方法を用いて修飾（即ち、ＬＥＡＤｓ）が確認されれば、通常的な分子生物学的方法を用いて、選択されたどのＥＰＯポリペプチドバックボーンの相応するアミノ酸残基、または位置内に修飾を導入できると理解される。ＬＥＡＤ修飾を結合させて、各々タンパク質分解酵素抵抗性を与える２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはその以上の変異を有するＳｕｐｅｒ−Ｌｅａｄ ＥＰＯポリペプチドを生成することができる。また、任意の修飾を当業界に知られた任意の他のＥＰＯ変異体と組合せることができ、またはＥＰＯポリペプチドへの任意の他の修飾（例えば、糖化、ＰＥＧ化、カルバミル化）と組合せることができる。タンパク質分解酵素抵抗性、半減期、安定性及び／または活性を評価するための通常の分析を遂行して、本願に記載するように、得られた修飾ポリペプチドがタンパク質分解酵素抵抗性及び／または活性を確実に保有するようにすることができる。
【０３６９】
１．非制限合理的変異誘発１次元（１Ｄ）スキャニング
合理的変異誘発（１Ｄスキャニングとも称する。）は２段階過程であり、同時継続中の米国出願第１０／０２２、２４９号（米国公開番号第２００３／０１３４３５１−Ａ１号）に記述されている。１Ｄ−スキャニングを用いて、ＥＰＯポリペプチドを修飾する以外にも、２Ｄ−及び３Ｄ−スキャニングのような他の方法を用いて修飾位置を同定することができる。簡略に述べると、第１段階において、全長アミノ酸スキャニングが行われるが、ここで、開始治療用ポリペプチド配列（例えば、配列番号２のＥＰＯポリペプチド）の全体またはそれぞれのアミノ酸は指定された標準アミノ酸（例えば、アラニン）により置換される。単一のアミノ酸が同時にそれぞれのタンパク質分子に置換される。一つのアミノ酸置換を有するタンパク質分子の集合が生成され、各分子は置換が起きたアミノ酸位置により異なる。変異ＤＮＡ分子はそれぞれ変異誘導とクローニングにより個別的に考案されて生成されるが、例えば、アドレス可能なアレイにおいて、それぞれ物理的に互いに分離され、個々のものは独立した変異誘導反応産物である。また、変異核酸分子集合から由来した変異タンパク質分子は、例えば、アドレス可能なアレイ形式化により物理的に互いに分離されている。それぞれのタンパク質分子に対する活性評価は、置換されたときに活性が低下するアミノ酸位置の同定を可能にする。これにより、この特定のアミノ酸の位置が、タンパク質の生物学的な活性及び／または進化する特定の特徴への適応を導く構造に関与していることが示される。このようなアミノ酸位置をＨＩＴと称する。
【０３７０】
第２段階において、各分子の新たな集合が生成されるため、個々の分子が第１段階において同定された個々のＨＩＴ位置に存在するアミノ酸が互いに異なる。全ての２０個のアミノ酸（残りの１９個）を第１段階において同定されたそれぞれのＨＩＴ位置に導入させ、このとき、個々の分子は原則的に単一のアミノ酸置換しか含有しない。変異ＤＮＡ分子はそれぞれ変異誘導とクローニングにより個別的に考案されて生成されるが、例えば、アドレス可能なアレイにおいてそれぞれ物理的に互いに分離され、個々のものは独立した変異誘導反応産物である。さらに、変異核酸分子集合から由来した変異タンパク質分子は、例えば、アドレス可能なアレイ形式化により物理的に互いに分離されている。その後、それぞれの変異分子において個別的な活性を評価する。タンパク質活性の目的とする変更（例えば、向上）を誘導する新たに生成された変異体をＬＥＡＤと称する。当該方法によれば、タンパク質のいくつかの予想していなかった領域の新たな予想していなかったアミノ酸の配列の探索において、同時に１つのアミノ酸部位での１つの合理的なアミノ酸置換及び配列変更に基づいて、特性や活性変更（例えば、向上されたタンパク質分解酵素に対する抵抗性などの向上された安定性）に関する間接的なサーチが可能となり、開始タンパク質よりも高い好適な活性または変化した活性を示すタンパク質を産生することができる。
【０３７１】
当該アプローチにおいて、アミノ酸の位置だけではなく、アミノ酸のタイプも限定されない。ＨＩＴ位置を同定するための第１段階において全長タンパク質スキャニングが行われ、ＬＥＡＤ配列を同定するためにＨＩＴ位置のそれぞれにおいて２０個のアミノ酸が全て試験されるが、ここで、開始点として、それぞれの分子上に１回につき１つずつのアミノ酸を置換する。第２段階のための標的領域（ＨＩＴと周辺アミノ酸）の選別は、第１段階において得られた活性に関する実験的データに基づく。このため、タンパク質構造及び／または機能に関する事前知識が不要になる。このアプローチにより、変更された特定の生物学的活性に関与することが従来知られていなかったタンパク質の領域に位置するＬＥＡＤ配列が、タンパク質上において発見されるため、適合性改善のための標的として予測不可能な領域（ＨＩＴ）を発見するこのアプローチの能力が強調される。
【０３７２】
２．二次元（２Ｄ）合理的スキャニング（制限された合理的変異誘発）
タンパク質合理的進化のための２Ｄスキャニング（または、制限された合理的変異誘発）方法（同時係属中の米国出願公開第ＵＳ２００５−０２０２４３８Ａ１及びＵＳ−２００４−０１３２９７７−Ａ１、及び国際出願公開ＷＯ２００４／０２２５９３及びＷＯ２００４／０２２７４７参照）は、２次元上におけるスキャニングに基づく。第１次元は、ｉｓ−ＨＩＴ標的位置を同定するためのタンパク質配列中のアミノ酸位置である。第２次元は、特定のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置を置換するために選別されたアミノ酸のタイプをスキャニングすることである。本願で提供される２Ｄスキャニング方法のメリットは、少なくとも１以上の、通常的にアミノ酸位置及び／または置換アミノ酸が制限されて、タンパク質骨格上の全てのアミノ酸よりも少数のアミノ酸がアミノ酸置換のために選別され、及び／または、元（例えば、天然）のアミノ酸を置換するのに利用可能な残りの１９個アミノ酸の全部よりも少数のアミノ酸が置換のために選別可能である。
【０３７３】
特別な態様において、ｉ）進化させる特定のタンパク質特性（例えば、タンパク質分解に対する抵抗性）、ii）タンパク質のアミノ酸配列、及びiii）個々のアミノ酸の公知の特性に基づいて、タンパク質配列中の多くの標的位置を、インシリコにて、「ｉｓ−ＨＩＴ標的位置」として選別する。このようなｉｓ−ＨＩＴ標的位置の数は、進化させる特定の特徴に対して全ての合理的に可能な標的位置が含まれるように、合理的に可能な限り多くする。特に、限られた数のｉｓ−ＨＩＴ標的位置が置換のために選別される態様において、最適化される特定のタンパク質上のｉｓ−ＨＩＴ標的位置を置換するために選別されるアミノ酸は、全ての残りの１９個のアミノ酸、または、さらに頻繁には、タンパク質活性に好適な効果を及ぼすと考慮される選別されたアミノ酸を含むより限られたグループでありうる。他の態様において、限られた数の置換アミノ酸が用いられる限り、タンパク質骨格における全てのアミノ酸位置は、アミノ酸置換のためのｉｓ−ＨＩＴ標的位置として選別可能である。次いで、タンパク質骨格上の特定のｉｓ−ＨＩＴ標的位置において単一アミノ酸残基を置換することにより（例えば、アドレス可能なアレイにおいて「１回につき１つずつ」）変異誘発を行うことで、生成された個々の変異体がそれぞれの単一変異誘発反応の単一生成物となる。変異ＤＮＡ分子は、それぞれ変異誘導とクローニングにより個別的に考案されて生成されるが、例えば、アドレス可能なアレイにおいて、それぞれ物理的に互いに分離され、個々のものは独立した変異誘導反応産物である。変異核酸分子集合から由来した変異タンパク質分子は、また、例えば、アドレス可能なアレイ形式化により物理的に互いに分離されている。このため、多数の変異タンパク質分子が産生される。それぞれの変異タンパク質は、単一のｉｓ−ＨＩＴ標的位置において単一アミノ酸置換を含有する。次いで、タンパク質発現及び適切な活性を測定後、個々のタンパク質変異分子に対する活性評価を個別的に行う。このような方法の例示は、変異型ＥＰＯ分子を産生する下記の実施例に開示されている。
【０３７４】
変化させて、通常は増強された、標的タンパク質活性を誘導する新たに生成されたタンパク質をＬＥＡＤと称する。当該方法は、特定の活性（タンパク質分解に対する増強された抵抗性）に対するタンパク質向上に関する間接的サーチに依存し、これは、単一または、他の態様においては、限られた数のアミノ酸位置における同時のアミノ酸置換及び配列変化に基づく。その結果、（特定の標的活性または他の特性において）開始アミノ酸よりも良好であるかまたは異なるタンパク質中の一部領域に修飾型アミノ酸配列を有する最適化されたタンパク質が同定されて分離される。
【０３７５】
タンパク質分解に対する増強された抵抗性を含むタンパク質安定性が増強された変異体を生成するのにＥＰＯに対する２Ｄスキャニングを利用した。このような修飾を施すために、ＥＰＯのインシリコ分析を用いてアミノ酸位置を選別した。
【０３７６】
ａ．インシリコＨＩＴの同定
タンパク質の方向付けされた進化のための２Ｄスキャニング方法には、タンパク質配列において、進化させる特徴に直接的または間接的に関連すると考えられる特定のアミノ酸及びアミノ酸位置（本願において、ｉｓ−ＨＩＴと称する。）を（インシリコ分析を用いて）同定して選別することが含まれる。上述したように、提供された２Ｄスキャニング方法には、下記の２段階が含まれる。第１段階は、進化させる活性の標的になりうる可能性のある全てのアミノ酸位置を同定するためにタンパク質の標的アミノ酸配列をインシリコにてサーチ調査することである。この段階は、例えば、タンパク質上の変更させる特性に対するアミノ酸残基の効果を任意の公知の標準ソフトウェアを用いて評価することにより行う。インシリコ分析の詳細事項は、修飾させる特性と関係がある。
【０３７７】
一旦同定されると、これらアミノ酸位置または標的配列を「ｉｓ−ＨＩＴ」（インシリコＨＩＴ）と称する。インシリコＨＩＴは、タンパク質分解に対する増強された抵抗性などの「進化」に関連する可能性のあるアミノ酸位置（または、標的位置）として定義される。タンパク質配列内の全てのアミノ酸位置の中でｉｓ−ＨＩＴを区別することは、タンパク質２次または３次構造に関する情報に加えて、各位置のアミノ酸のタイプに基づいて行うことができる。インシリコＨＩＴは変異分子の集合を構成して、特徴の進化に関連する可能性のある全ての可能なアミノ酸、アミノ酸位置、または標的配列が提示される。この段階においては、アミノ酸またはアミノ酸位置の中で強力な理論的区別がなされない。インシリコＨＩＴの位置は、タンパク質配列の全長に亘って散在している。単一または限られた数のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸を標的ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチド上で一度に置換する。
【０３７８】
様々なパラメータを分析して、タンパク質上の特定のアミノ酸が進化特徴と関連するかどうかを決定することができ、通常、限られた数の初期前提（通常、２以下）を用いてインシリコＨＩＴを決定する。例えば、本願明細書に記述されたように、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの安定性を増強させるために、最初の条件は、タンパク分解酵素的切断に関与するなど分子の安定性と関連するアミノ酸の性質である。例えば、第２番目の前提は、タンパク質構造によるアミノ酸の特定の位置に関するものである。
【０３７９】
本願で提供される方法によりｉｓ−ＨＩＴを同定する第１段階中に、タンパク質配列による個々のアミノ酸を個別的に考慮してｉｓ−ＨＩＴの候補であるかどうかを評価する。このような調査は１つずつ行い、アミノ酸がｉｓ−ＨＩＴの候補として考慮されるかに関する決定は、（１）アミノ酸のタイプ、（２）公知である場合は、タンパク質及びタンパク質構造内の位置、及び（３）配列及び空間において前記アミノ酸及びこの周辺間の予測された相互作用、に基づく。
【０３８０】
タンパク質分解酵素に対して意感受性を有する部位の除去／変更などのタンパク質安定性に寄与するＥＰＯの多くの特性についてｉｓ−ＨＩＴを同定した。このような変更はタンパク質安定性に寄与し、インビトロ、インビボ、エクスビボに供されたＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドの半減期を増大させる。
【０３８１】
ｂ．置換するアミノ酸の同定
一旦ｉｓ−ＨＩＴ標的位置が選別されると、次の段階は、進化させる特定の特徴に対する活性レベルを変更する各ｉｓ−ＨＩＴ位置で、天然などの元のアミノ酸を置換するアミノ酸を同定することである。各ｉｓ−ＨＩＴ位置に存在する天然などの元のアミノ酸を置換するのに用いられる置換アミノ酸のセットは、特定のｉｓ−ＨＩＴ位置ごとに異なり、特異的でありうる。置換アミノ酸の選択は、必須の（例えば、触媒する、結合するなど）残基の疎水性、電荷及び極性などの物理化学的特性を保存させ、タンパク質の一部の他の特性（例えば、タンパク質安定性）を変更する必要性を考慮する。特定のｉｓ−ＨＩＴ標的位置を置換するのに使用可能な残りの１９個の非天然（または非本来）アミノ酸のうち置換アミノ酸の数は、特定の修飾のための特性により、１個〜約１９個及びこの間の範囲である。
【０３８２】
置換アミノ酸（本願において「置換体アミノ酸」とも称する。）の多くの選別方法は当業界に既に公知されている。タンパク質化学者は、特定のアミノ酸置換が異なる種からの関連タンパク質において一般的に起こると決定した。このような置換を有するタンパク質が依然として機能をするため、置換されたアミノ酸はタンパク質構造及び機能に適している。しばしば、このような置換は化学的に類似するアミノ酸への置換であり、相対的に稀ではあるが、他のタイプの変化が起こることもある。
【０３８３】
多数のタンパク質において最大限及び最小限に共通す変化のタイプを知ることは、タンパク質配列の任意のセットに対するアライメント及びアミノ酸置換を予測する上で役立つ。このような目的のために、アミノ酸置換マトリックスを使用する。多くのマトリックスが利用可能である。このようなマトリックスの詳細な説明は、同時係属中の米国出願公開第ＵＳ２００５−０２０２４３８Ａ１号及びＵＳ−２００４−０１３２９７７−Ａ１号及び国際出願公開ＷＯ２００４／０２２５９３号及びＷＯ２００４／０２２７４７号（それぞれその全文が本願において引用される）から見出すことができる。このようなマトリックスはまた、当業界に、例えば、下記に列記した参照文献に公知されており、利用可能である。
【０３８４】
アミノ酸置換マトリックスにおいて、アミノ酸は水平及び垂直に列挙されており、それぞれのマトリックス位置は、一つのアミノ酸が関連タンパク質配列のアライメントにおいていかに頻繁に他のアミノ酸と対をなすかを反映するスコアで満たされている。アミノ酸「Ａ」がアミノ酸「Ｂ」に変化する確率は、アミノ酸「Ｂ」がアミノ酸「Ａ」に変化する確率の逆数と同じであると想定する。任意の２つの配列において、系統樹において祖先のアミノ酸が一般的に公知されていないため、このような仮定を立てる。また、置換可能性は２つのアミノ酸の発生頻度の積及びこれらの化学的及び物理的類似性に依存的であると考えられる。このようなモデルの予測は、アミノ酸頻度が進化時間に亘って変化しない筈であるということである（Dayhoff et. al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3): 345-352, 1978参照)。数個の代表的なアミノ酸置換マトリックスには、ブロック置換マトリックス (BLOSUM)（Henikoff et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992); Jones et al., Comput. Appl. Biosci., 8: 275-282 (1992); Gonnet et al.,  Science, 256: 1433-1445 (1992); Fitch, J. Mol. Evol., 16(1): 9-16 (1966); Feng et al.,  J. Mol. Evol., 21: 112-125, (1985); McLachlan, J. Mol. Biol., 61: 409-424 (1971); Grantham, Science, 185: 862-864 (1974); Miyata, J. Mol. Evol., 12: 219-236 (1979); Rao, J. Pept. Protein Res., 29: 276-281 (1987); Risler, J. Mol. Biol., 204: 1019-1029 (1988); Johnson et al.,  J. Mol. Biol., 233: 716-738 (1993)］及びPoint
Accepted Mutation（ＰＡＭ； Point Accepted Mutation)(Dayhoff et al., Atlas Protein Seq. Struct.5: 345-352 (1978)）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３８５】
Dayhoff及びその同僚は、percent accepted mutation matrices（ＰＡＭ）と呼ばれ、且つ、汎用される置換マトリックス１セットをもたらすタンパク質進化モデルを開発した（Dayhoff et. al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352 (1978)）。これらのマトリックス由来において、特別の位置にある現在のアミノ酸の個々の変化は、その位置の以前の変異とは独立的であると推定される。このため、一種のアミノ酸ＡからＢへの変更可能性は、その位置における以前の変更に関わらず、そしてタンパク質配列におけるアミノ酸Ａの位置に関わらず同様である。
【０３８６】
Dayhoffのアプローチにおいて、置換率は少なくとも８５％以上同じタンパク質配列のアライメントに由来する。この制限は、特定の変異が連続した変異セットの結果となる可能性が低いということを保証する。というのは、このような変更が密接に連関したタンパク質において観察されるため、これらは、タンパク質の機能を重要に変更しないアミノ酸を示す。ここで、これらは「許容された変異(accepted mutations)」と呼ばれ、自然選択により受け入れられるアミノ酸の変更として定義される。
【０３８７】
インシリコにて行われた上記の２段階の結果は、（１）変異誘発のための標的アミノ酸の位置（ｉｓ−ＨＩＴと称する。）が同定され、（２）ｉｓ−ＨＩＴに位置する天然などの元のアミノ酸に対する置換アミノ酸が同定されて、天然分子とは異なる作用をすると予想される候補ＬＥＡＤ変異分子の集合を提供する。目的とする最適化された（または、向上または変化した）活性に対してアッセイするする。
【０３８８】
ｃ．修飾型タンパク質の製作及び生物学的アッセイ
上述したようにして一旦ｉｓ−ＨＩＴが選別されると、置換アミノ酸が導入される。このような方法を用いたＥＰＯの代表的な置換アミノ酸が段落Ｄで記載されている。 変異タンパク質は、通常、組換えＤＮＡ方法を用いて製造し、最適化された特定の活性（特徴）に対する適切な生物学的アッセイにおいて評価する。変異タンパク質を製造する代表的な方法は、当業界に既に公知の方法を用いて、天然などの元の遺伝子の変異を誘発することである。また、天然ポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、または他の変異体のようなどの他のＥＰＯポリペプチドを利用し、確認された変異をポリペプチドの相応する位置に導入することによって、変異タンパク質を生成することもできる。変異分子は、例えばアドレス可能なアレイ（addressable array）で１つずつ生成されて、生成される各々の個々変異体が各々の単一の独立的な変異反応の単一生成物になるようにする。個々の変異誘発反応は、これらが互いに物理的に分離されているアドレス可能なアレイでのように個別的に行う。一旦それぞれの変異タンパク質をコードする核酸分子のセットの集団が製造されると、それぞれ適切な細胞内に１つずつ個別的に導入して対応する変異タンパク質を産生する。これはまた、例えば、それぞれの変異タンパク質をコードする核酸分子の各セットを多重ウェルマイクロタイタープレートのウェル内などの分離された位置に限定された細胞内に導入するアドレス可能なアレイにおいて行うことができる。個々の変異タンパク質を個別的に表現型的に特性化させ、最適化される特徴（すなわち、進化する特徴）に適したアッセイを用いて性能を定量的に評価する。また、前記段階は、アドレス可能なアレイにおいて行うことができる。天然などの元の分子と比べて目的とする増減された性能を示す変異体を同定し、ＬＥＡＤと命名する。変異ＤＮＡ分子を生成する過程の開始から性能結果の判読及び分析まで、それぞれの候補ＬＥＡＤ変異体を、アドレス可能なアレイでのこの個別的なアドレスのように個別的に生成し、産生し、且つ、分析する。当該過程は自動化可能である。
【０３８９】
３．３次元的（３Ｄ）スキャニング
同時係属中の米国公開出願第２００５−０２０２４３８Ａ１及び第２００４−０１３２９７７−Ａ１号、ＰＣＴ公開出願ＷＯ２００４／０２２７４７号及びＷＯ２００４／０２２５９３号に記述された３Ｄスキャニングは、変異誘発のための潜在的標的部位（ｉｓ−ＨＩＴ）の同定に基づくタンパク質のさらなる合理的進化方法である。当該方法は、比較されるタンパク質の基本的な配列とは無関係に、構造的に関連するタンパク質間のタンパク質骨格折り畳みパターンの比較を使用する。一旦関心対象のタンパク質上に構造的に関連するアミノ酸位置が同定されると、ＰＡＭ分析などの適当なアミノ酸置換基準を用いて作製及びスクリーニングのための候補ＬＥＡＤを同定することができる。
【０３９０】
例えば、数多くの関連するサイトカインの中で、「構造的同質性」の分析は、種々のサイトカインファミリーにおいて構造的に類似するかまたは構造的に関連するアミノ酸位置と残基を同定することができる。例えば、３Ｄスキャニングは、向上された安定性のために修飾されてきたサイトカイン変異において発見されるものに構造的に類似するかまたは構造的に関連するＥＰＯにおけるアミノ酸位置を同定するために使用可能である。例えば、サイトカインは、顆粒性マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、Ｆｌｔ３リガンドと幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３９１】
本願明細書に記述された３Ｄスキャニング方法を用いて、タンパク質群において一つのタンパク質（例えば、サイトカイン群におけるＥＰＯ）がＬＥＡＤ変異を製作するために本願で提供される方法により同定されると、ｉｓ−ＨＩＴｓは、本願明細書に後述するように、構造的類似性の分析（置換のために対応する残基を同定するための元のタンパク質とファミリー構成要素の３Ｄ構造との比較による。）を用いて対応するアミノ酸位置を同定することにより、特定の群において他のまたは全てのタンパク質を見出すことができる。このような方法により見出されたファミリー構成要素のためのｉｓ−ＨＩＴｓは、置換するアミノ酸を見出し、次の段階に提示され、本願明細書に記述されたように、ＬＥＡＤまたはスーパーＬＥＡＤを得るための分析をさらに行うことができる。同様に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、Ｆｌｔ３リガンド、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）などの他のサイトカイン上において行われた２Ｄスキャニングから得た情報がＥＰＯポリペプチドを最適化させるために用いられる。
【０３９２】
この方法は、例えば、米国公開出願第２００３−０１３４３５１Ａ１または本願明細書に記述された２次元的スキャニング方法の合理的な方向付けされた進化方法などの進化方法に適用する出発物質としてサイトカインなどの任意のタンパク質を用いて、好適な表現型に適用可能である。類似する表現型変更を有する付加的なサイトカインを産生するために、群の構成要素において構造的に対応する残基を変更する。
【０３９３】
ａ．相同性
一般的に、タンパク質間の相同性は、配列を基準（一般的に開始コドンによりコードされた残基）から開始して整列させたときのアミノ酸対アミノ酸、それぞれのアミノ酸の一致のパーセントまたはレベルに基づいて、アミノ酸のレベルで比較される。例えば、２種類のタンパク質は、それらの個別的アミノ酸配列が整列比較した際のマッチングの程度を示して、「相同的」があるというか、または、ある程度の類似性を有していると言う。比較分子生物学は主にこのようなアプローチに基づく。アミノ酸配列間の類似性の度合いまたは一致から２以上のタンパク質配列と生物学的体系との間の進化的な間隔の結論を導き出すことができる。
【０３９４】
「収束進化」の概念は、系統発生学的に無関係な有機体または生物学的体系が周辺環境と生物体からの一般的な力、制約と進化的な要求に対する反応としてそれらの解剖学、生理学及び構造に関連する特徴を共有するために進化する現象を説明するのに利用される。代案的に、「分岐進化」は、系統発生学的に深く関連する有機体または生物学的体系が分岐力、制約と周辺環境と生物体からの進化的な要求に対する反応として同一性または類似性から分岐するように進化する現象を説明するのに利用される。
【０３９５】
代表的且つ伝統的な相同タンパク質の分析において、ｉ）「収束進化」と、i）「分岐進化」に対応する２種類の概念的バイアスがある。列記された２種類のタンパク質のアミノ酸配列は相互間の一致性が良好ではないとき、これらのタンパク質は互いに「関係ない」または「関連性が低い」と言え、異なる系統発生の起源を有する。これらのタンパク質間には相同性がなく（または、低く）、これらの個別的遺伝子が一致しない（または、低い相同性を示す）。もし、研究に当たって、２つの「非相同性」タンパク質が幾つかの共通機能的特徴（例えば、他の特定分子との相互作用または活性）を共有しているとすれば、それらは「収束進化」（すなわち、それらの非相同性アミノ酸配列の進化により、機能的に「関連する」構造を生成するように）により生成されたことが決定される。
【０３９６】
一方、２種類のタンパク質のアライメントしたアミノ酸配列が互いにある程度一致する場合は、これらのタンパク質は「関連する」と認識され、共通系統発生の起源を有する。与えられた相同性の度合いはこれらの両タンパク質間において定められ、それらの各遺伝子もまた対応する相同性の度合いを有する。これらの初期の高い相同アミノ酸配列が進化する間に、「関連性が低い」配列及び関連性が低い機能を生成するような方法により十分な変化が蓄えられる。研究中での、これらの両「相同性の」タンパク質間の完璧な一致からの分岐は「分岐進化」に起因すると言われる。
【０３９７】
ｂ．３Ｄスキャニング（構造的相同性）方法
構造的相同性とは、２つのタンパク質のトポロジーと３次元構造との間の相同性のことを言う。構造的相同性は「収束進化」または「分岐進化」に必須的に関連するものではなく、根源的なアミノ酸配列と関連しない。むしろ、構造的な相同性は、タンパク質がその環境により課せられた特定の構造要求にフィットする必要があったことによって（自然的進化により）なされたと言われる。固有の根源的な配列が分岐されるときでさえ、特に構造的に一致する「個所」または「位置」は構造的に元の構造から分岐しない。このような構造的な相同性は、本願において、変異のための位置を確認するために開発された。
【０３９８】
タンパク質のアミノ酸配列には、非依存的な方法またはシャペロンを用いた方法により特定の立体的折り畳みを達成する適切な生化学的及び構造的シグナルが存在する。実際に、このような特定の立体的折り畳みは、究極的にはタンパク質特性と活性を決定する。タンパク質は、通常、それらの特定のトポロジーと空間構造を通じて他のタンパク質及び分子と相互作用する。原則的に、このような相互作用は関与するトポロジーまたは構造に基づく正確なアミノ酸配列のみには依存しない。タンパク質特性、活性（行動及び表現型）及び相互作用がタンパク質のトポロジーと構造に依存しているならば、タンパク質に作用する進化の力と制約はトポロジーと構造に作用していると予想することができる。類似する機能を共有するタンパク質は、トポロジーと構造をもたらす基礎となるアミノ酸配列にも関わらず、トポロジーおよび構造において同程度の特性を共有する。   
【０３９９】
４．スーパーＬＥＡＤと付加的な方向付けられた変異誘発（ＡＤＭ）
ＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドの修飾はまた、２以上の変異を組合せることを含む。例えば、付加的な方向付けられた変異誘発（ＡＤＭ）は、スーパーＬＥＡＤ変異タンパク質を生成するために、個別的なＬＥＡＤ分子にある多重の変異を１個の変異タンパク質に集めることができる（同時係属中の米国公開出願第２００５−０２０２４３８Ａ１号及び第２００４−０１３２９７７−Ａ１号及び公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０２２７４７号及びＷＯ２００４／０２２５９３号参照）。ＡＤＭはスーパーＬＥＡＤ変異タンパク質を生成し続けるために以前のＬＥＡＤ変異タンパク質に最初のＬＥＡＤ変異タンパク質生成後、各段階において新たなＬＥＡＤ変異を付加する反復的な多段階過程である。ＡＤＭは、遺伝子組換え機序またはシャッフリング方法に基づくものではない。この代わりに、同じ分子内に所望の変異の総数になるまで１回につき１つの変異を所要数だけ繰り返し導入する単純な過程である。本願は、与えられた数の単一変異を同じ分子に構成することにより可能な組み合わせの数が指数的に増加することを避ける方法を提供し、たとえ全ての組み合わせ可能な空間を含んでいないとしても、依然として組み合わせ潜在力の大きな部分を占める。「組み合わせ」は、本願において数学的意味（すなわち、ある可能な順序において要素の一部を含む要素グループの部分集合）で用いられ、分子生物学または方向付けれれた進化（すなわち、それらの構成成分のランダム混合による分子の集合、混合物、または集合物）を意味するものではない。
【０４００】
新たなスーパーＬＥＡＤ変異分子の集合をコードする核酸分子セットの集合は、アドレス可能なアレイにおいて一つずつ生成され、試験され、表現型の特徴づけを行う。スーパーＬＥＡＤ変異分子は、それぞれの分子がＬＥＡＤ変異の様々な数と形式を含むものである。進化させる特定の特徴についてさらに改善された適合性を有するこのような分子は、スーパーＬＥＡＤと称する。スーパーＬＥＡＤは当業者に周知であり、且つ、本願におけるハイスループット方法により試験された他の方法により生成可能である。本願の目的から、スーパーＬＥＡＤは、典型的に関心対象の機能または生物学的活性と関連してＬＥＡＤの増強された活性と所要量に見合う分だけ、例えば、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上に見合う分だけ、それが由来したＬＥＡＤ変異とは異なる活性を有する。他の例において、活性の変化は、それが由来する１以上のＬＥＡＤ分子よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上である。ＬＥＡＤでのように、スーパーＬＥＡＤに対する活性の変化は、「進化させる」特性により左右される。特性または特徴の増減としうる目的とする変更は、関心対象の機能または特性により左右される。
【０４０１】
１態様において、ＡＤＭ方法は多くの反復的な段階を採択し、従って、各段階において新たな変異が与えられた分子に付加される。多数の他の方法により、各ＬＥＡＤ変異をスーパーＬＥＡＤタンパク質に組み込むことが可能はあるが、新たな変異（例えば、変異１（ｍ１）、変異２（ｍ２）、変異３（ｍ３）、変異４（ｍ４）、変異５（ｍ５）、変異ｎ（ｍｎ））を付加する代表的な方法は、下記の図解に対応する：
ｍ１
ｍ１＋ｍ２
ｍ１＋ｍ２＋ｍ３
ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４
ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４＋ｍ５
ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
ｍ１＋ｍ２＋ｍ４
ｍ１＋ｍ２＋ｍ４＋ｍ５
ｍ１＋ｍ２＋ｍ４＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
ｍ１＋ｍ２＋ｍ５
ｍ１＋ｍ２＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
ｍ２
ｍ２＋ｍ３
ｍ２＋ｍ３＋ｍ４
ｍ２＋ｍ３＋ｍ４＋ｍ５
ｍ２＋ｍ３＋ｍ４＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
ｍ２＋ｍ４
ｍ２＋ｍ４＋ｍ５
ｍ２＋ｍ４＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
ｍ２＋ｍ５
ｍ２＋ｍ５＋．．．＋ｍｎ
．．．、 et al., ．．
【０４０２】
５．多重重複したプライマー伸張
２以上の変異の組み合わせを生成するために使用可能な他の方法は、「多重重複したプライマー伸張(multi-overlapped primer extensions)」と呼ばれるオリゴヌクレオチド媒介の変異誘発である。この方法は、スーパーＬＥＡＤを形成する目的で変異ＬＥＡＤを合理的に組み合わせるために使用可能である。この方法は、小さなタンパク質または公知の配列のタンパク質領域の全体に亘って多数の変異を同時に挿入するような方法である。典型的に約２０個の塩基領域において重ね合わせるように、一般的に約７０個の塩基長の（より長いオリゴヌクレオチドは誤りを増加させる）オリゴヌクレオチドを重ね合わせを、変異ＬＥＡＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）からデザインする。重複オリゴヌクレオチドを生成するために典型的に約７０個の塩基が使用されるが、使用するための付加的重複オリゴヌクレオチドの長さは約３０個の塩基から約１００個の塩基までの範囲でありうる。同様に、重複オリゴヌクレオチドの重複領域が典型的に約２０個の塩基であるが、本願明細書で使用される他の重複領域の長さは約５個の塩基から約４０個の塩基までの範囲でありうる。これら重複オリゴヌクレオチド（点変異を包含または排除する。）をＰＣＲ（予期しない変異を避けるための校正ポリメラーゼ、例えば、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用する。）の第１段階において鋳型及びプライマーとして用いて少量の全長遺伝子を生成する。次いで、第１のＰＣＲから生成された全長遺伝子を、それぞれが事後的なクローニングを促進するために制限酵素部位に結合したフランキングプライマーを用いて、ＰＣＲの第２段階において選択的に増幅させる。１回の多重重複された伸張過程によりＬＥＡＤ変異タンパク質から由来した、内部に多数の変異を有する候補スーパーＬＥＡＤタンパク質をコードする全長（多重変異された）核酸分子が導き出される。
【０４０３】
Ｆ．タンパク質分解抵抗性が増強されたＥＰＯ変異体の評価
ＥＰＯ変異体のタンパク質分解に対する抵抗性の増強は、タンパク質安定性、耐熱性、タンパク質分解酵素に対する感受性及び抵抗性及び／またはＥＰＯ活性を評価する当業界に周知な任意の方法により評価することができる。例えば、タンパク質分解酵素抵抗性は、１以上のタンパク質分解酵素と修飾型ＥＰＯポリペプチドを一緒に反応した後に、未処理対照群と残存活性を測定する。特定の変異体の方が未修飾型ＥＰＯよりも活性がより維持されるかどうかを確認するために、類似する条件下において、修飾型ＥＰＯは未修飾型及び／または野生型天然型ＥＰＯと比較可能である。活性は、例えば、赤血球産生または組織保護活性を測定することにより当業界に周知な方法により評価可能である。
【０４０４】
また、タンパク質分解酵素抵抗性の速度論的評価が修飾型ＥＰＯポリペプチドの評価のために利用可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドを１以上のタンパク質分解酵素と培養し、一連の時間別に試料を取る。それぞれの時点において、タンパク質分解酵素は不活性化させてから、試料のＥＰＯ活性を測定する。一例において、修飾型ポリペプチドは。少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のタンパク質分解への抵抗性を有する。
【０４０５】
代表的な一例において、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ＮＳ３、エラスターゼ、血液凝固因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰａ及びＰＳＡを含むタンパク質分解酵素の混合物及びタンパク質分解条件を用いて、ＥＰＯ変異体をタンパク質分解酵素抵抗性に対して評価する。例えば、細胞増殖分析は、未修飾型ＥＰＯポリペプチドと比べて、修飾型ＥＰＯポリペプチドの赤血球産生活性の測定に利用可能である。特に、ＥＰＯの赤血球細胞増殖活性は、ＴＦ−１増殖分析などの赤血球細胞増殖分析において細胞増殖を誘導する修飾型ＥＰＯポリペプチドの能力を検証することができる。野生型ＥＰＯと比べて酵素的切断に対する修飾型ＥＰＯポリペプチドの抵抗性は、ＥＰＯポリペプチドをタンパク質分解酵素と混合することにより分析可能である。タンパク質分解酵素への露出後に、赤血球産生または組織保護活性が評価可能である。
【０４０６】
一例において、修飾型ＥＰＯの赤血球産生活性は、試料に入れたときに細胞増殖を調節する修飾型ＥＰＯの能力を測定することにより評価される。活性測定に先立って、ＥＰＯポリペプチドは、血清、血液、唾液または消化アッセイ（インビトロアッセイ）などの投与に類似した条件を含む条件下でタンパク質分解酵素（血液、腸など）と接触させることができ、及び／または、異なるインキュベーションまたは注入後の時の間にマウスまたはヒト（インビボアッセイ）などの対象体に投与することができる。測定された活性は、タンパク質分解酵素混合物への露出後に残存する活性に対応する。活性は、タンパク質分解酵素安定性と活性における修飾効果を測定することにより未修飾型ＥＰＯと比較可能である。一例において、未修飾型ＥＰＯは、野生型の天然ＥＰＯである。他の例において、未修飾型ＥＰＯは、さらなる修飾を導入するための出発物質として用いられたＥＰＯ変異体である。また、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質分解酵素感受性、耐熱性及び／または任意の他の活性を比較するために周知の任意の試験を通じて任意の既知のＥＰＯと比較可能である。
【０４０７】
Ｇ．ＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドの産生
１．発現システム
（修飾及び未修飾）ＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドは、タンパク質産生のために当業界に周知な任意の方法により製造可能であり、これは、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞、宿主動物への導入、及びＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドをコードする核酸分子のインビトロ発現を含む。発現宿主は、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株や遺伝子挿入動物を含む哺乳動物細胞を含む。発現宿主は、それらのタンパク質産生レベルだけではなく、発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾型において異なる場合がある。発現宿主は、前記及び他の要素、例えば、規定及び安定性の考慮、産生コスト及び精製の必要及び方法に基づいて選択することができる。
【０４０８】
真核宿主内発現は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、メタノール資化酵母（Pichia pastrori）などの酵母、ショウジョウバエ細胞及び蛾（lepidopteran）細胞などの昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、米、藻類、ウキクサなどの植物細胞における発現を含むことができる。発現のための真核細胞には、チャイニーズハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの哺乳動物細胞株が含まれる。真核発現宿主は、遺伝子挿入動物内産生、例えば、血清、尿、牛乳及び卵における産生を含む。野生型ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチド若しくはＥＰＯ融合タンパク質及び他の治療用融合ポリペプチドの製造のための遺伝子挿入動物は当業界に公知されており、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの製造のために適応可能である（例えば、Mikus et. al., (2004) Transgenic Res. 13(5): 487-98; Korhonen et. al., (1997) Eur. J. Biochem. 245: 482-489; Kwon et. al., (2006) Transgenic Res. 15(1): 37-55参照）。
【０４０９】
多くの発現ベクターがＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの発現に利用可能である。発現ベクターの選択は、宿主発現システムの影響を受ける。これは、当業者のレベルにおいて選択された方がいい。通常、発現ベクターは、転写プロモータ及び選択的にはエンハンサ、翻訳シグナル信号、及び転写及び翻訳終結シグナルを含むことができる。発現ベクターは安定した形質転換のために用いられ、典型的に形質転換された細胞の選択と維持のために選択マーカーを有する。一部の場合において、複製の起源は細胞内ベクターの複製数を増幅するために使用可能である。
【０４１０】
ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの製造方法は、ＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドの生成に役立つ１以上の付加的な異種ポリペプチドの同時発現を含むことができる。例えば、前記ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断またはＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの分泌または翻訳後プロセッシング（例えば、糖化）の補助に寄与する。前記１以上の付加的なポリペプチドは、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドと同じベクターまたは異なるベクターから発現可能である。
【０４１１】
ａ．原核細胞発現
原核細胞、特に、大腸菌は、ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの大量産生のためのシステムを提供する（例えば、Plastis et. al., (2003) Protein Exp. Purif. 31(2):222-30, and Khalizzadeh et. al., (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69参照）。大腸菌形質転換は当業者に広く公知された単純で且つ迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞に対する若干の毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用な誘導性プロモータを含有することができる。誘導性プロモータの例には、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ハイブリダイズｔａｃプロモータ、Ｔ７及びＳＰ６ＲＮＡプロモータ及び温度調節性Ｌプロモータが含まれる。
【０４１２】
ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドは、大腸菌の細胞質環境において発現可能である。細胞質は還元性環境であり、これは、一部の分子に対して不溶性封入体の形成をもたらす可能性がある。ジチオールトレイトール及びβ−メルカプトエタノールなどの還元剤及び変性化剤（例えば、グアニジン−ＨＣＬ及びウレア）は、タンパク質を再可溶化させるために使用可能である。代案的なアプローチは、溶解性タンパク質の産生を誘導する酸化性環境及びシャヘロニン様及びジスルフィドイソメラーゼを提供する細菌のペリプラズム空間においてＥＰＯポリペプチドまたは他の治療的ポリペプチドを発現することである。典型的に、タンパク質をペリプラズムに送達するリーダー配列が発現されるタンパク質に融合される。前記リーダーは、ペリプラズム内においてシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズム標的化リーダー配列の例には、ペクタテリアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダー及びアルカリンホスファターゼ遺伝子から由来のリーダーが含まれる。一部の場合において、ペリプラズム発現は、発現されたタンパク質の培養培地への漏出を誘導する。タンパク質の分泌は、培養物上澄み液からの迅速で且つ簡単な精製を可能にする。未分泌タンパク質は、浸透性溶解によりペリプラズムから得られる。細胞質発現と同様に、一部の場合において、タンパク質は不溶性にもなり、変性化剤及び還元剤を用いて可溶化及びリフォールディングを促進することができる。誘導及び成長の温度はまた、発現レベル及び溶解度に影響を与えることができる。通常、２５℃〜３７℃の温度を使用する。さらに、変異が発現されたタンパク質の溶解度を増加させるために使用可能である。通常、細菌は、非糖化型タンパク質を産生する。このため、タンパク質の機能のために糖化を必要とする場合、宿主細胞から精製後にインビトロにおいて糖化を付加することができる。
【０４１３】
ｂ．酵母
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウィ ア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、キラー酵母（Kluyveromyces lactis）及びメタノール資化酵母（Pichia paseris）などの酵母は、ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドのため の有用な発現宿主である（Skoko et. al., (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65参照）。酵母は、エピソーム複製ベクターを有するか、または相同組換えによる安定した染色体統合により形質転換可能である。通常、誘導性プロモータを用いて遺伝子発現を調節する。このようなプロモータの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ５及びメタロチオネインプロモータ（例えば、ＣＵＰ１）が含まれる。発現ベクターにはしばしば、形質転換されたＤＮＡの選別及び維持のためのＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３及びＵＲＡ３などの選択マーカーが含まれる。酵母において発現されるタンパク質はしばしば溶解性であり、シャヘロニン、例えば、Ｂｉｐ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共同発現は、発現レベル及び溶解度を向上させることができる。また、酵母において発現されたタンパク質は、出芽酵母からの酵母交配型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合及び酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ａｇａ２ｐ交配付着受容体またはアルシュラ・アデニニヴィランス（Arxula adeninivirans）グルコアミラーゼとの融合を用いて分泌されるように指示可能である。タンパク質分解酵素切断位置（例えば、Ｋｅｘ−２タンパク質分解酵素）を操作して、これらが分泌経路を抜け出るときに融合された配列がポリペプチドから除去されるようにもできる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいて糖化可能である。
【０４１４】
ｃ．昆虫及び昆虫細胞
昆虫及び昆虫細胞、特に、バキュロウイルス発現システムの使用は、ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドなどのポリペプチドを発現させる上で有用である（Quelle et. al., (1992) Protein Expr. Purif. 3(6): 461-9参照）。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞及び昆虫幼虫は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核細胞により用いられるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは制限的宿主範囲を有していて安定性を向上させ、真核性発現の規制的恐れを減少させる。通常、発現ベクターは、高レベル発現のためのバキュロウイルスのポリヘドリンプロモータなどのプロモータを使用する。一般的に用いられるバキュロウイルスシステムには、バキュロウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォニア（Autographa californica）核ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びボムビックス・モリ（bombyx mori）核ポリヘドロシスバイサス（ＢｍＮＰＶ）、及び昆虫細胞株、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から由来のＳｆ９、シュダラチア・ウニパンクタ（Psuedlaetia unipuncta）（Ａ７Ｓ）及びダナウス・フレキシプス（ＤｐＮ１）を含む。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列は、ウィルスのポリヘドリン開始コドンの下流に直ちに融合される。哺乳動物分泌シグナルは昆虫細胞において正確にプロセッシングされ、発現されたタンパク質を培養培地に分泌させるために使用可能である。また、細胞株シュダラチア・ウニパンクタ（Psuedlaetia unipuncta）（Ａ７Ｓ）及びダナウス・フレキシプス（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞システムと類似する糖化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０４１５】
昆虫細胞における代案的発現システムは、安定的に形質転換された細胞を使用することである。細胞株シュナイダー２（Ｓ２）及びＫｃ細胞（ドロソフィラ・メラノガスター）及びＣ７細胞（アエデス・アルボピクタス）などの細胞株を発現用に使用することができる。ドロソフィラ・メタロチオネインプロモータを用いて、カドミウムまたは銅を用いた重金属誘導の存在下において高レベルの発現を誘導することができる。通常、ネオマイシン及びハイグロマイシンなどの選択マーカーを用いて発現ベクターを維持する。
【０４１６】
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現システムを用いてＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを発現させることができる。発現製作物は、アデノウィルスまたはワクシニアウイルスなどのウィルス性感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的ＤＮＡ伝達により、及び電気穿孔及び微細注入などの物理的手段により哺乳動物細胞に伝達可能である。哺乳動物細胞用発現ベクターには、通常、ｍＲＮＡキャップ位置、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザク共通配列）及びポリアデニル化要素が含まれる。このようなベクターには、しばしば、高レベル発現のための転写プロモータ−エンハンサ、例えば、ＳＶ４０プロモータ−エンハンサ、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長末端反復部が含まれる。これらのプロモータ−エンハンサは、多くのタイプの細胞において活性がある。組織及び細胞タイプのプロモータ及びエンハンサ領域もまた発現のために使用することができる。代表的なプロモータ／エンハンサ領域には、エルサスターゼＩ、インシュリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウィルス、アルブミン、α−胎児タンパク質、アルファ１−抗トリプシン、ベータ−グロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖−２及び性線刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子からのものが含まれるが、これらに限定されるものではない。選別可能マーカーを用いて発現構築物を有する細胞を選別及び維持することができる。選別可能なマーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素及びチミジンキナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞表面シグナル伝達分子、例えば、ＴＣＲ−ζ及びＦｃεＲＩ−γとの融合は、細胞表面において活性状態であるタンパク質の発現を指示することができる。
【０４１７】
マウス、ラット、ヒト、猿、鶏及びハムスター細胞を含む、多くの細胞株が哺乳動物発現のために利用可能である。細胞株の代表例には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分性）及び他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ及びヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、ＲＰＭＩ１７８９８、繊維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、ＥＢＮＡ−１及びＨＫＢ細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、米国特許番号第５、６１８、６９８号、第６、７７７、２０５号参照）。細胞培養培地から分泌されたタンパク質の精製を促進する無血清培地に順応された細胞株を用いることができる（例えば、 EBNA-1, Pham et. al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42) 。その一例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株(Pham et. al.,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42参照）である。尿由来のＥＰＯと類似する翻訳後炭水化物変更及び構造を示す組換え野生型ＥＰＯポリペプチドが当業界に公知されており、この一部はシアル部位結合において違いがある（例えば、Takeuchi et. al., (1988) J. Biol. Chem. 263(8): 3657-3663; Inoue et. al., (1995) Biotechnol. Annu. Rev.1: 297-313）。最適なＥＰＯ発現のための方法も当業界に知られて いる（例えば、Tsao et. al., (1992) Ann N Y Acad Sci. 665: 127-36; Wang et. al., (2002) Biotech nol Bioeng. 77: 194-203; Sethuraman and Stadheim (2006) Curr. Opin. Biotech. 17:341-346; Yoon et. al., (2001) Biomed. Life Sci. 37(2) 119-132）
【０４１８】
ｅ．植物
ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの発現のために遺伝子挿入された植物細胞及び植物を使用することができる。通常、微細粒子投射法及びＰＥＧ媒介の原形質体内への伝達などの直接的ＤＮＡ伝達及びアグロバクテリウム媒介の形質転換を用いて発現構築物を植物に伝達する。発現ベクターには、プロモータ及びエンハンサ配列、転写終結要素及び翻訳制御要素（例えば、Ｔｉプラスミド）が含まれうる。発現ベクター及び形質転換技術は、一般的に、シロイヌナズナ及びタバコなどの双子葉宿主とトウモロコシ及び稲などの単子葉宿主との間において区分される。発現のために用いられる植物プロモータの例には、カリフラワーモザイクウィルスプロモータ、ノパリン合成酵素プロモータ、リボースビフォスフェイトカルボキシラーゼプロモータ及びユビキチン及びＵＢＱ３プロモータが含まれる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選別マーカーをよく用いて形質転換された細胞の選別及び維持を容易化させる。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養物中に維持されるが、全体植物に再生可能である。遺伝子挿入された植物細胞にはまた、タンパク質を産生するように設計された藻類が含まれうる（例えば、 Mayfield et. al., (2003) PNAS100:438-442参照）。さらに、植物細胞発現システムは、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）などのウィルス発現ベクターに感染された植物を含む。植物は、哺乳動物細胞と異なる糖化パターンを有するため、これは前記宿主においてＥＰＯを産生するための選択に影響を与えることができる。
【０４１９】
２．精製
宿主細胞からＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを精製する方法は、選択された宿主細胞及び発現システムにより異なってくる。分泌される分子の場合、一般的に細胞を除去した後、培養培地からタンパク質を精製する。細胞内発現の場合、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。発現のために遺伝子挿入植物及び動物などの遺伝子挿入有機体を使用する場合、組織または器官を開始物質として用いて融解された細胞抽出物を得ることができる。また、遺伝子挿入された動物の製造には、回収可能な乳汁または卵におけるポリペプチドの産生が含まれ、必要に応じて、当業界における標準方法を用いてさらにタンパク質を抽出して精製することができる。
【０４２０】
ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドは、次を含む当業界に公知の標準タンパク質精製技術を用いて精製可能であるが、これに限定されない：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分別沈降、血液透析ろ過、限外ろ過、カラム電気フォーカシング、平盤電気フォーカシング、ゲルろ過、等速電気泳動、サイズ分別、硫酸アンモニウム沈殿、高性能液体クロマトグラフィ、キレートクロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、及び分子排除クロマトグラフィ。また、アフィニティ精製技術を用いて製造効率及び純度を向上させることができる。例えば、アフィニティ精製に際し、ＥＰＯまたは他の治療用ポリペプチドに結合する抗体、受容体及び他の分子を使用することができる。また、発現構築物を操作してｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合またはＨｉｓ６などのアフィニティタグ、及びｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、及びニッケル樹脂を用いて精製された親和度をそれぞれタンパク質に追加することができる。純度は、ゲル電気泳動、染色及び分光光度測定技術を含む当業界に公知の任意の方法により評価することができる。ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチド精製の例示的な技術は、例えば、米国特許第４、３７７、５１３号、第４、６６７、０１６号、第４、６７７、１９５号、第５、７３３、７６１号、第６、６８２、９１０号、第７、０１２、１３０号、Miyake et. al., (1977) J. Biol. Chem. 252(15) 5558-5564; Spivak et. al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(10): 4633-4635に開示されている。
【０４２１】
３．融合タンパク質
一部の実施態様において、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドは、融合タンパク質を形成するための外来のポリペプチド（例えば、融合パトナー）をさらに混合するか、あるいは、リンカー、例えば、化学的手段によりポリペプチドと結合される。融合パトナーの好適な例としては、インビボにおける増強された安定性を与えるペプチド及びポリペプチド（例えば、血清半減期増加）、精製し易さを提供するペプチド及びポリペプチド、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）ｎ（例えば、６ｘＨｉｓ及び類似物）、細胞から融解タンパク質の分泌を提供するペプチド及びポリペプチドエピトープタグを提供するペプチド及びポリペプチド（例えば、ＧＳＴ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び類似物）検出可能なシグナル（検出可能な産物を産生する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ））、または自家検出可能なタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）を提供するペプチド及びポリペプチド重合体を提供するペプチド及びポリペプチド（例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分などの重合体部分）などを含む。
【０４２２】
さらに、本願は、標的試薬及び修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。本願は、例えば、特に、経口投与のように適切な経路による投与を考慮して製剤化された前記融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。融合タンパク質は、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用タンパク質と製剤、例えば、抗体またはこの断片、成長因子、受容体、リガンド、及び標的細胞または組織に変異タンパク質を送るためのその他の製剤を任意の順序に従い結合して生成される。結合は、リンカーを介して直接的に若しくは間接的に行われる。融合タンパク質は組換え的に、または化学的結合、例えば、異種二作用性製剤またはチオール結合またはその他の結合により化学的に製造可能である。前記融合タンパク質は、しばしば、タンパク質コンジュゲートと呼ばれる。化学的に結合されたコンジュゲートに適したリンカー及び結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、妨害されたジスルフィド結合、アミンとチオール基などの自由反応基との間の共有結合を含むが、これらに限定されない。このような結合は、ポリペプチドの一つまたは全部の間に反応的なチオール基を産生する異種二作用性製剤の利用下で、次いで、一つのポリペプチドのチオール基を反応性マレイミド基やチオール基が他のポリペプチドに結合可能な反応性チオール基またはアミン基と反応させて製造される。異種二作用性交差結合製剤に使用可能な例示的な基は、典型的に、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル、ヒドラジド、ＰＦＰ−エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラーレン、イミドエステル、ピリジル２硫化物、イソシアネート及びビニールスルホンを含むが、これらに限定されない。
【０４２３】
融合タンパク質は、溶解性、折り畳み、精製及び細胞のタンパク質流入を補助する大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの付加成分を含むことができる。他の実施態様において、修飾ＥＰＯは、アルブミンのように安定性を増強させるポリペプチドと融合される（米国特許公開番号第６、９８７、００６号、第６、５４８、６５３号、第７、１０１、９７１号、米国特許公開番号第２００４−００６３６３５号、第２００６−００５８２３６号参照、Albupoietin（商標） CoGenesys）。
【０４２４】
選択的に修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ融合タンパク質として発現させるか、あるいは、重合体ドメイン融合させて重合体の形態に製造可能である。ＥＰＯ融合ポリペプチド及び他の治療用融合ポリペプチドはまた、融合、２以上の治療用ポリペプチドの融合または二量体化／重合体化を含むことができる（例えば、米国特許番号第５５８０８５３号、Sytkowski (1999) J. Biol. Chem. 274(35): 24773-24778）。二量体化または重合体化は直接的に達成されるか、（例えば、２以上のＥＰＯ分子が直列に配列された一つのポリペプチド）、またはリンカー（例えば、ヘテロまたはホモ二作用性交差結合剤）を介して間接的に達成されるか、または二量体化能力を有するか化学的手段により二量体化可能な１対のポリペプチドへのＥＰＯポリペプチドまたは他の治療的ポリペプチドの融合でありうる。後者の例において、ＥＰＯまたは他の治療用ポリペプチドと融合されたポリペプチドは、同じポリペプチドまたは異なるポリペプチドでありうる（例えば、互いに結合可能な二つのタンパク質）。代表的な重合体化ドメインが当業界に公知されており、Ｆｃドメイン、または類似する抗体類似断片、ロイシンジッパーモチーフ、コイルドコイルドメイン、親水性領域、疎水性領域、２以上の重合体化ドメイン間に分子内ジスルフィド結合を形成する自由チオールを含むポリペプチド、または「突起−内−穴」ドメインを含むが、これらに限定されない（国際特許ＷＯ９４／１０３０８号、米国特許第５、７３１、１６８号、 Lovejoy et. al., (1993), Science 259: 1288-1293; Harbury et. al., (1993), Science 262: 1401-05; Harbury et. al., (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et. al., (1999), Structure 7: 255-64参照参照）。
【０４２５】
さらなる典型的なＥＰＯ融合タンパク質及び他の治療融合ポリペプチド、並びに製造方法は当業界に提供されており、例えば、Ｆｃ融合及びβ−ラクトグロブリン融合を含む（米国特許第６、９９２、１７４号、第６、１６５、４７６号、米国特許公開番号第２００３−００６４４８０号、第２００５−０２０２５３８号、第２００５−０１９２２１１号、Korhonen et. al., (1997) Eur. J. Bioch. 245: 482-489）。治療タンパク質と一緒に構築時に、Ｆｃドメインはさらに長い半減期を提供するか、あるいは、Ｆｃ受容体結合、二量体化、タンパク質Ａ結合、補体固定及び胎盤移送などの機能を提供することができる。前記融合タンパク質において、ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの特性は、１以上のさらなる修飾によりさらに改善可能である。非制限的な例において、Ｆｃ−ＥＰＯ融合タンパク質の文脈において、Ｃｙｓ−２９−Ｃｙｓ３３からＣｙｓ−２９−Ｃｙｓ８８までのジスルフィド結合パターンの再配列をもたらす、ＥＰＯポリペプチドのＨ３２Ｇ、Ｃ３３、Ｗ８８Ｃ及びＰ９０Ａなどの修飾は、顕著に改善された性質をもたらす（Way et. al., (2005) Protein Eng. Des. Sel. 18(3): 111-8参照）。また、本願で提供される修飾ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの融合タンパク質は当業界に公知されたか本願に記載されたＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドのさらなる修飾（例えば、変異、糖化、ＰＥＧ化、ハシル化など）と結合可能である。
【０４２６】
４．ポリペプチド修飾
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用タンパク質は、ネイキッドポリペプチド鎖として、または複合体として製造可能である。一部の適用例において、翻訳後または他の化学的修飾がない「ネイキッド」である修飾型ＥＰＯまたは他の治療ポリペプチドを製造することが好ましい。ネイキッドポリペプチド鎖は、治療用ポリペプチドを翻訳後修飾させない適当な宿主において製造可能である。また、このようなポリペプチドは、インビトロシステム及び化学的ポリペプチド合成を用いて製造可能である。他の適用例において、ＰＥＧ化、アルブミン化、糖化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化または他の公知の修飾を含む特定の修飾が好ましい。修飾は、インビトロにおいて、または、例えば、このような修飾を生み出す適切な宿主において修飾型ＥＰＯ及び他の治療的ポリペプチドを産生することにより製造可能である。
【０４２７】
５．ヌクレオチド配列
本願は、原核性または哺乳動物細胞などの真核性細胞における発現のために誘導性プロモータなどのプロモータに操作的に結合された修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドまたはこれらの融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。前記プロモータは、原核性、真核性、またはウィルス性プロモータを含むが、これらに限定されない。細胞内発現のためのプロモータの選択は、発現に用いられる細胞タイプに依存的である。哺乳動物細胞内発現のための例示的なプロモータには、ＣＭＶ及びＳＶ４０プロモータ、アデノウィルスプロモータ、例えば、ＨＰＶＥ７腫瘍タンパク質に反応性を示すＥ２遺伝子プロモータＰＶプロモータ、例えば、ＰＶＥ２タンパク質に反応するＰＢＶｐ３８プロモータ及びＨＩＶまたはＰＶまたは腫瘍遺伝子により活性化される他のプロモータが含まれるが、これらに限定されない。
【０４２８】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドは、また、遺伝子伝達ベクター内において細胞に伝達可能である。伝達ベクターは、血友病、先天性疾患及びＥＰＯが投与される他の疾病または障害に対する治療のための付加的な治療剤をコードすることができる。修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする伝達ベクターは、核酸を対象体に投与することにより全身的に使用可能である。例えば、伝達ベクターは、アデノウィルスベクターなどのウィルス性ベクターでありうる。ＥＰＯまたは他の治療用ポリペプチドをコードするベクターを幹細胞内に混入することができ、前記幹細胞は、例えば、治療法のための位置に幹細胞を移植または生着させることにより対象体に投与可能である。例えば、中間葉幹細胞（mesenchymal stem cells （ＭＳＣｓ））は修飾型ＥＰＯ及び他の治療用ポリペプチドを発現させるように操作されており、前記ＭＣＳは治療のための腫瘍位置に生着可能である。
【０４２９】
Ｈ．修飾型ＥＰＯポリペプチドの特性及び活性評価
ＥＰＯ活性及び特性は、インビトロ及び／またはインビボにおいて評価することができる。このような評価のための分析は当業者に公知されており、検査された活性及び結果と治療学的及びインビボ活性を関連付けることが公知されている。一例として、ＥＰＯ変異体は未修飾型及び／または野生型ＥＰＯと比較して評価することができる。他の例として、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質安定性−変更条件（例えば、タンパク質分解酵素、または温度やｐＨなどの変性化剤への露出）に対するインビトロやインビボ露出による生物学的活性により評価可能である。インビトロ分析は、例えば、細胞基礎分析、例えば、赤血球生成分析、細胞生存力分析、細胞生存分析、タンパク質分析及び分子生物学的分析などの当業界に周知な任意の実験実績分析法を含む。インビボ分析は、動物モデル分析だけではなく、ヒトに投与したＥＰＯ分析をも含む。一部の場合、インビボＥＰＯ活性は、血液、血清または分析決定子のためのその他の体液を評価して決定可能である。ＥＰＯ変異体はまた、インビボにおいて安定性（例えば、半減期）などの特性または活性及び治療効果を評価するために試験可能である。このような分析結果は、治療的有効性、投与量レベル、投薬ガイドライン及びＥＰＯ媒介疾病または状態に対する有用性などのパラメータを評価するために利用可能である。
【０４３０】
本願で提供され、且つ、当業界に周知なＥＰＯ特性及び活性分析は、翻訳後または化学的修飾または未修飾型ＥＰＯポリペプチドの１次アミノ酸配列のアミノ酸置換、欠失または付加を含む変化を１以上のさらなる修飾と組み合わせて、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの特性及び活性評価に利用することができる。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのさらなる修飾は、ＥＰＯポリペプチド内に体系的に混入可能であり、１以上の活性は実験的に決定することができる。
【０４３１】
１．インビトロ分析
代表的なインビトロ分析は、ポリペプチドの安定性及び活性を評価するための分析を含む。安定性分析は、インビトロやインビボにおいてタンパク質分解酵素に対する抵抗性やポリペプチドの安定性を指示する物理的性質を評価する分析を含む。安定性はまた、当業界に周知なタンパク質の構造及び構造解析により評価可能である。活性分析は赤血球細胞増殖分析法を含むが、これに限定されない。
【０４３２】
修飾型ＥＰＯポリペプチドの濃度は、次の当業界に周知な方法により評価可能である：酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Bradford／Lowry／ＢＣＡ法、紫外線吸光及び免疫学的、放射性、蛍光及び関連方法を含むが、これらに限定されないその他の定量化可能なタンパク質標識法を含むが、これらに限定されない。
【０４３３】
ＥＰＯポリペプチドの切断を含むタンパク質分解反応の分解産物評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫組織化学法、ＮＨ２末端シーケンシング、発色性基質切断法、ＨＰＬＣ法、及びタンパク質標識法を含むが、これらに限定されない当業界に周知な標準方法を用いて行うことができる。タンパク質分解酵素に露出させたＥＰＯポリペプチドをＮＨ２末端シーケンシングして修飾型ＥＰＯポリペプチドの切断部位の位置または変化を決定することができる。
【０４３４】
ＥＰＯポリペプチドはＥＰＯ受容体との結合により試験可能である。例えば、ＥＰＯとＥＰＯ受容体若しくはＥＰＯ受容体断片との結合は、免疫沈降法、カラム精製法、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、表面プラスモン共鳴法（ＳＲＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光法（ＦＲ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、循環２色性法（ＣＤ）、タンパク質断片補体分析法（ＰＣＡ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、光散乱法、沈降平衡法、小区域ゲルろ過クロマトグラフィ法、ゲル減速法、ファーウェスターンブロット、蛍光偏光法、ヒドロキシル−ラジカルタンパク質フットプリント法、相分析法及び様々な２−ハイブリッドシステムを含む当業界に公知されているものの、これらに限定されない結合分析法を用いて評価可能である。
【０４３５】
ＥＰＯポリペプチドの赤血球生成活性は、当業界に周知な分析法を用いて試験可能である。例えば、前記分析法の一部は、ＴＦ−１増殖力分析などの細胞基盤の分析法を含むが、これに限定されない。ＴＦ−１細胞は、ＥＰＯ受容体を発現させるヒト赤白血病細胞株である。三重水素（３Ｈ）−チミジンの混入により決定されるＴＦ−１細胞の増殖は、赤血球生成活性の機能である（Ham- merlling et. al., (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 1455; Kitamura et. al., (1989) J. Cellular Physiol. 140: 323）。ＦＤＣＰ−１細胞株を用いた類似分析法を行うことができる（例え ば、 Dexter et. al., (1980) J. Exp. Med.152: 1036-1047参照）。ＦＤＣＰ−１は、ＷＥＨＩ−３条件下の培養培地（ＩＬ−３含有培養培地（ATCC No.ＴＩＢ−６８））による補充時に増殖可能であるが、未分化マウス由来の多重分化能成長因子従属原始造血前駆細胞株である。前記試験のために、ＦＤＣＰ−１細胞株はヒトまたはマウスのＥＰＯ−Ｒで形質感染されてＦＤＣＰ−１−ｈＥＰＯ−ＲまたはＥＰＯにより増殖する未分化ＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ細胞株をそれぞれ産生することができる。このような実験に当たって、細胞は必須成長因子の存在下で半分の飽和密度まで培養される（例えば、米国特許第５、７７３、５６９号と米国特許公開第２００５−０１３７３２９号に記述）。ＰＢＳにおいて細胞を洗浄した後、成長因子が排除された全体培地において２４時間切食させる。細胞の生存能を（例えば、トリパンブルー染色により）決定した後、培養溶液（成長因子だけ排除された全体培地）を５０μＬ当たりに１０５個の細胞を提供するように製造する。試験されるＥＰＯポリペプチドを９６ウェル平板プレートにおいて、１ウェル当たりに５０μＬずつの最終体積にて連続して希釈した。細胞（５０μＬ）を各ウェルに付加し、前記細胞を２４から４８時間かけて培養し、この時点で、陰性対照群は死滅または停止されなければならない。次いで、細胞増殖は、当業界に周知な技術、例えば、３Ｈ−チミジン注入を細胞増殖の指標として測定するＭＴＴ分析法により測定する（例えば、Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63参照）。ＥＰＯ修飾型ポリペプチドは、ＥＰＯ−Ｒ発現細胞株及び非発現母細胞株の両方において評価される。最大細胞増殖の半分を産生するのに必要とされる試験ポリペプチドの濃度をＥＣ５０と記録した。
【０４３６】
他の例示的な分析において、細胞をＥＰＯ−補充培地内で静止期へと成長させ、集めた後、ここにＥＰＯ無し培地においてさらに１８時間かけて培養する。細胞を同じ細胞密度の３グループに分ける：付加ポリペプチドがないグループ（陰性対照群）、ＥＰＯを含むグループ（陽性対照群）、及び修飾型試験ＥＰＯポリペプチドを含む実験群。次いで、種々の時点において培養された細胞を集め、固定した後、ＤＮＡ結合蛍光染料（例えば、プロピジウムヨード化物またはヘキスト染料、いずれもSigmaにて市販）により染色する。次いで、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリーを用いて蛍光を測定する。次いで、細胞周期の各フェーズの細胞のパーセントを、例えば、CellFITソフトウェア（Becton Dickinson）のＳＯＢＲモデルを用いて決定する。ＥＰＯまたは修飾型活性ＥＰＯペプチドを処理した細胞は、陰性対照群よりもより高い割合のＳ期の細胞を示すであろう（増加されたＤＮＡ含量の指標として蛍光増加により決定される）。
【０４３７】
他の例示的分析に際し、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現し、ｆｏｓプロモータ誘導ルシフェラーゼレポータ遺伝子構築物によりさらに形質感染されたマウス由来Ｂ前駆細胞株を使用することができる。ＥＰＯまたはＥＰＯ−Ｒ作用剤に露出時に、前記細胞はルシフェラーゼを合成して反応する。ルシフェラーゼは基質であるルシペリン添加時に光を発する。このため、前記細胞におけるＥＰＯ−Ｒの活性レベルは、ルシフェラーゼ活性の測定により定量可能である。試験ポリペプチドの活性は、細胞に前記試験ポリペプチドの連続的希釈物を添加し、次いで、４時間かけて培養して測定される。培養後、ルシペリン基質を細胞に添加した後、発光を測定する。最大発光の半分をもたらした試験ポリペプチドの濃度をＥＣ５０と記録する。
【０４３８】
他の分析法において、Krystal (1983) Exp. Hematol 11: 649-660に開示された脾臓細胞内３Ｈ−チミジンの混入に基づく微細分析法を用いて、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの細胞増殖促進能を測定することができる。要するに、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスに２日間毎日フェニルヒドラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注射する。３日目に脾臓細胞を摘出し、この増殖能を２４時間かけてＭＴＴ分析法を用いて測定する。
【０４３９】
エリスロポエチン応答性細胞株内におけるＥＰＯとＥＰＯ−Ｒとの結合は、受容体及びＳｈｃ、ｖａｖ、及びＪＡＫ２キナーゼを含む数多くの細胞内タンパク質全部のチロシンリン酸化を引き起こす。このため、他のインビトロアッセイは、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドのＥＰＯ−Ｒ、及び下流に位置する細胞内シグナル伝達子タンパク質のチロシンリン酸化能を測定する。上記の結合及び増殖分析法により確認されたように、活性ペプチドは、エリスロポエチン応答性細胞内においてＥＰＯのリン酸化パターンとほとんど同じリン酸化パターンを示す。このアッセイにおいて、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞（Dexter et. al., (198 0) J Exp Med 152: 1036-47）はＥＰＯ補充培地において維持され、静止期まで培養される。次いで、前記細胞をＥＰＯが排除された培地において２４時間かけて培養する。次いで、限られた数の前記細胞を修飾型ＥＰＯプリペプチドと一緒に３７℃の温度下において約１０分間培養する。ＥＰＯを含む対照群試料に対してもそれぞれの分析を行う。次いで、処理された細胞を遠心分離して収集し、ＳＤＳ溶解バッファに再懸濁した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動する。ゲル上において電気泳動されたタンパク質をニトロセルローズに移動させ、ブロット上にホスホチロシン含有タンパク質を標準免疫学的技術により視覚化させる。例えば、前記ブロットは、抗ホスホチロシン抗体（例えば、マウス抗ホスホチロシンＩｇＧ、Upstate Biotechnology, Inc社製）により標識し、洗浄した後、２次抗体（例えば、ペルオキシダーゼが標識された山羊抗マウス免疫グロブリン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.(Washington, D.C.)社製）により標識する。その後、ホスホチロシン含有タンパク質は、発色、化学発光または蛍光分析法を含む標準技術により視覚化させることができる。例えば、化学発光分析法は、アマシャム社のＥＣＬウェスターンブロットシステムを用いて行うことができる。
【０４４０】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの活性を測定するために使用可能な他の細胞に基づくインビトロアッセイは、マウス由来骨髄またはヒトの抹消血液単核細胞を用いるコロニー分析法である。マウス由来骨髄はマウスの大腿骨から得られ、ヒト抹消血液単核細胞の試料は健康な寄贈者から得られる。抹消血液単核細胞の場合、単核細胞は、例えば、フィコール・ハイパック勾配（Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)）を用いた遠心分離により血液から最初に分離される。この分析において、有核細胞の計数は、そもそも、試料内有核細胞の数及び濃度を確立するために行う。限られた数の細胞を製造者の指示によりメチルセルローズ上にプレイティングする（Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)）。実験群を修飾型ＥＰＯポリペプチドで処理し、陽性対照群をＥＰＯで処理し、陰性対照群は任意の処理もしない。次いで、各グループのコロニー数を所定の培養期間、一般的に、１０日から１８日間培養後に評価する。活性ペプチドは、コロニー形成を促進する。
【０４４１】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの活性測定に用いられる他のインビトロ生物学的分析法は、下記に開示されている： Greenberger et. al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935（ＥＰＯ従属造血前駆細胞株）； Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614（B6SUt.EP細胞内タンパク質チロシンリン酸化）； Dusanter-Fourt et. al., (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678（ヒトＥＰＯ反応性細胞内ＥＰＯ受容体のチロシンリン酸化）； Quelle et. al., (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060（ＦＤＣ−ＥＲ細胞内細胞質タンパク質のチロシ ンリン酸化、pp100）； Worthington et. al., (1987) Exp. Hematol. 15:85-92（ヘモグロビンに 対する発色分析）； Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120（２、７−ジアミノフルオレンによるヘモグロビン検出）； Patel et. al., (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302（ｃ −ｍｙｂの発現）； Witthuhn et. al., (1993) Cell 74:227-236（ＪＡＫ２の連合及びチロシンリ ン酸化）； Leonard et. al., (1993) Blood 82:1071-1079（ＧＡＴＡ転写因子の発現）； and Ando et. al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575（Ｄ２及びＤ３の環化によるＧＩ転移調節）。
【０４４２】
マイクロフィジオメータとして知られた、モレキュラーデバイス社により設計された機器を様々な受容体の作用剤及び拮抗剤の効果測定のために利用することができる。前記装置の原理は、受容体活性化に反応性を示す細胞外媒質の酸性化速度の変化を測定することである。
【０４４３】
また、本願で提供されるＥＰＯポリペプチドの翻訳後修飾の存在を測定することができる。このような分析は当業界に公知されており、糖化、水酸化、酸化、硫酸化、カルボキシル化及びリン酸化を測定する分析を含む。糖化に対する例示的分析において、炭水化物分析は、例えば、ヒドラジン分解またはエンドグリコシダーゼ処理に露出されたＥＰＯポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法により行うことができる。ヒドラジン分解は、無水ヒドラジンと培養した糖タンパク質からＮ及びＯ結合型グリカンを放出するのに対し、エンドグリコシダーゼ分泌は、糖タンパク質からＮ−グリカンを放出するＰＮＧａｅＦを含む。ＥＰＯポリペプチドのヒドラジン分解またはエンドグリコシダーゼ処理は、蛍光団または発色団を標識によりタグ可能な還元末端を生成することができる。標識されたＥＰＯポリペプチドは、ＦＡＣＥ（蛍光団補助炭水化物電気泳動）を用いて分析することができる。グリカンに対する蛍光タグはまた、ＨＰＬＣを用いた単糖類分析、複雑な糖化パターンのプロファイルまたはフィンガープリントのために利用することができる。例示的なＨＰＬＣ方法は、親水結合クロマトグラフィ、電子結合、イオン交換、疎水性結合クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィを含む。例示的なグリカン探針は、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン（ＡＡ−Ａｃ）及び２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）である。炭水化物部位はまた、糖化型ＥＰＯポリペプチドを認識する特定の抗体を用いて検出可能である（Cheetham et. al., (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 861-866; Watson et. al., (1994) Glycobiology 4(2): 227-237参照）。
【０４４４】
修飾型ＥＰＯポリペプチドの構造的特徴もまた評価可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドのＸ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び低温電子顕微鏡（cryo−ＥＭ）は、ＥＰＯポリペプチドの３次構造及び／または性質、例えば、他の受容体結合及び炭水化物修飾を分析するために行うことが可能である（Cheetham et. al., (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 861-866; Watson et. al., (1994) Glycobiology 4(2): 227-237参照）。
【０４４５】
２．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルは、修飾型ＥＰＯポリペプチドの活性及び安定性を評価するのに利用可能である。例えば、非ヒト動物モデルは、疾病または状態に対するモデルとして使用可能である。疾病及び／または疾病の進行に対する効果をモニターリングするために、ＥＰＯ投与前に非ヒト動物モデルに表現型誘発物質を注射することができる。遺伝学的なモデルも有用である。マウスなどの動物は１以上の遺伝子の過発現、発現低下または除去により疾病または状態と同様に誘導することができる。このような動物は当業界に周知な遺伝子挿入動物製造技術または自然発生的または誘導された変異種により産生することができる。ＥＰＯと関連する疾病の有用な非ヒト動物モデルの例は、マウス、ラット、兔、犬及び霊長類などの動物における、鎌状赤血球貧血、後天性骨髄不全症、β−地中海性貧血、急性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血及び腎不全または癌から誘発された貧血のモデルを含む貧血モデルである（例えば、Nagel (1998) N. Engl J Med. 339(3): 194-5;  Chen (2005) Clin. Med. Res. 3:102-108;  Chen et. al., (2004) Blood 104: 1671-1678; McMullin et. al., (1989) Biochem Med Metab Biol. 41(1): 30-5; Alderuccio et. al., (2002) Clin. Immun. 102(1): 48-58; Kawamura et. al., (1990) Biotherapy 2(1): 77-85; Bohl et. al., (2000) Blood 95: 2793-2798 参照）。前記非ヒト動物モデルは、野生型ＥＰＯポリペプチドと比べてＥＰＯ修飾活性をモニターリングするのに利用可能である。
【０４４６】
動物モデルはまた、修飾型ＥＰＯポリペプチドの安定性、半減期及び排出をモニターリングするのに使用可能である。このような分析法は、修飾型ＥＰＯポリペプチド間の比較及び付加的な非ヒト動物及びヒト臨床のための投与量及び投与量計画を計算する上で有用である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドをマウス尾静脈に注射することができる。次いで、血液試料は、注射後時間別（投与後、分、時間、日付）に得られ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定法を用いて、血漿または血清を含むが、これらに限定されない体内試料の修飾型ＥＰＯポリペプチドのレベルを特定の時間帯にモニターリングすることができる。血液試料は、造血活性を、例えば、赤血球増殖分析により試験することができる。
【０４４７】
インビボ試験法の例としては、ヘマトクリット（ＨＣＴ）分析法、鉄吸収及び網状赤血球分析法を含むが、これらに限定されない（例えば、Cotes et. al., (1961) Nature 191: 1065、米国特許第６、０９９、８３０号参照）。ＨＣＴ分析法は、エリスロポエチン処理動物血液試料から赤血球の体積を測定するものであり、毛細管において血液を遠心分離し、沈殿された赤血球により占められた全体体積の分画を測定して行われる。網状赤血球分析法は、最近に前駆細胞から分化され、前駆細胞の核酸特徴が残っている新生赤血球または網状赤血球を測定することである。この分析法において、非処理正常マウスに本願で提供されるＥＰＯまたは修飾型ＥＰＯポリペプチドのどちらか一方を３日間連続して皮下注射する。３日目にデキストラン鉄を腹腔投与する。５日目から採血する。血液における網状赤血球のパーセント（％）は、アクリジンオレンジまたはチアゾールオレンジなどの核酸染料により染色した後、ＦＡＣＳ分析により決定する。網状赤血球は、陽性的に染色された網状赤血球分画を計数して測定する。加えて、ヘマトクリットは手動的に決定される。
【０４４８】
修飾型ＥＰＯポリペプチドの効能を評価するために用いられる他の例示的なインビボ機能性分析法としては、赤血球増強性前低酸素性マウス生物学的定量法がある。この分析法のために、マウスに数日間交差条件化周期を加える。この周期において、マウスは、低気圧条件と大気圧条件との間の変化を有する。その後、マウスは、試験試料の投与に先立って２、３日間大気圧条件下において維持される。陽性対照群マウスの場合において、修飾型ＥＰＯポリペプチド試料またはＥＰＯ標準物が前記条件化されたマウスに皮下投与される。放射能標識された鉄（５９Ｆｅ）を２日後投与し、放射能標識された鉄投与２日後に採血する。次いで、標準的な方法により各血液試料のヘマトクリットと放射能数値を測定する。活性試験ペプチドを投与したマウスの血液試料は、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは天然ＥＰＯの非投与マウスよりもさらに高い放射能数値（赤血球ヘモグロビンによる５９Ｆｅ結合に起因する）を示すであろう。
【０４４９】
また、修飾型ＥＰＯポリペプチドが動物モデルを用いて免疫抵抗性のために試験可能である。霊長類及びげっ歯類モデルを含む免疫抵抗性動物モデルは、ＥＰＯポリペプチド投与または遺伝子運搬ベクターの投入を通じてＥＰＯの長期間発現を試験するために使用可能である。投与後に各時間別に採取された血液試料は、抗ＥＰＯ抗体の産生のために評価可能である。
【０４５０】
３．臨床分析
臨床用ＥＰＯの活性を評価するために多くの分析法を利用することができる。このような分析法には、赤血球細胞生成活性、組織保護活性、タンパク質安定性及びインビボ半減期の評価及び表現型分析が含まれる。表現型分析及びＥＰＯ処理の治療効果を測定する分析は、血中ＥＰＯレベル（例えば、ボディマス指数（ＢＭＩ）を考慮した投与前及び初回投与、最後の投与後に直ちに、及び投与間時点を含む投与後時点の血清ＥＰＯの測定）、未修飾型及び／または野生型ＥＰＯまたはプラセボにより処理された対象体と比べて経時による症状の緩和を含むＥＰＯ処理に対する表現型反応を含む。ＥＰＯ活性を評価する臨床実験の例は、例えば、Marsden(2006) Ann Clin Biochem 43: 97-104; Gascon (2005) Eur J Cancer 41(17): 2601-12; ANNA J. (1989) Aug;16(5):344-8に開示されている。患者は、日常的または反復的投与の所定の期間中に薬物投与による急性症状、例えば、出血、外傷または外科的経過が定期的にモニターリングされた。
【０４５１】
Ｉ．製剤／包装／投与
本願明細書に記述された方法により製造された最適化ＥＰＯ変異体または他の治療用ポリペプチドを含む医薬組成物は、ＥＰＯ変異体（修飾型）ポリペプチド、修飾型ＥＰＯ融合タンパク質またはコードする核酸分子を含み、１以上の生理学的に許容される担体または賦形剤とポリペプチドの選択される量を混合して通常の方法により製剤化可能である。担体または賦形剤の選択は、専門的投与技術により、多数のパラメータに依存する。例えば、これは、治療の対象となる疾病及び投与モード（例えば、全身（例えば、静脈内または腹腔内）、経口、鼻腔、経肺、経皮、非経口、直腸、局所、外用またはその他のモード）を含む。ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの組成物は、治療の対象となる疾病または状態に有用な１以上の治療剤などの付加成分を添加して製剤化することができる。前記提供された組成物に用いられる治療剤の組み合わせは、本願に他の個所に記載されている。本願で提供される医薬組成物は、単回量（直接）投与または希釈または他の修飾のために製剤化可能である。その製剤内化合物の濃度は、投与時に意図した治療に効果的な量の伝達のために効果的である。典型的に、前記組成物は、単回量投与のために製剤化される。組成物を製剤化するために、治療された状態を軽減または改善するための効果的な濃度にて選択されるベヒクル内の一つの化合物またはそれらの混合物の重量分画を溶解、懸濁、分散、または混合する。本願で提供される化合物の投与に適した医薬担体またはベヒクルは、特定の投与方法に適した当業者に公知の任意の担体を含む。
【０４５２】
１．修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの投与
前記ポリペプチドは、組成物内の唯一の医薬的に活性を示す成分として製剤化可能であり、または、他の活性成分と組合せることも可能である。前記ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的化試薬に接合することにより伝達のために標的化可能である。また、組織標的化されたリポソームを含むリポソーム懸濁液は、医薬的に許容される担体として用いて好適である。これは、当業者に周知な方法により製造可能である。例えば、リポソーム製剤は、例えば、米国特許番号第６、６４５、５２２号または第６、７２６、９２４号に開示の方法により製造可能である。リポソーム運搬はまた、コラゲンゲルとフィブロネクチンにより修飾型リポソーム（例えば、Weiner et. al., (1985) J Pharm Sci. 74(9):922-5）などの医薬的基材を含む徐放型製剤を含むことができる。
【０４５３】
活性化合物は、治療対象に不所望の副作用なしに治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量にて医薬的に許容された担体内に含まれる。前記治療的に有効な濃度は、前記化合物を本願で提供される分析法などの周知のインビトロ及びインビボシステムにおいて実験することにより実験的に決定可能である。活性化合物は任意の適切な経路、例えば、経口、鼻腔、経肺、非経口、静脈、真皮内、皮下または外用に、液状、半液状、固形にて投与可能であり、各投与経路に適した方式により製剤化することができる。特別な一実施態様において、ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドは経口投与される。
【０４５４】
修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチド及び生理学的に許容される塩及び溶媒化物は、吸入（口腔または鼻腔内）、経口、経皮、経肺、非経口または直腸投与のために製剤化することができる。吸入投与のための修飾型ＥＰＯ及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、圧縮パックまたは適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を含む噴霧器からエアロゾルスプレーの形態伝達可能である。圧縮エアロゾルの場合に、投与量単位は、計量された量を運搬するためのバルブを提供することにより決定可能である。吸入器または吹込器に用いられるカプセル及びゼラチンなどの薬包は、乳糖または澱粉などの好適な粉基剤と治療用化合物の粉ミックスを含んで製剤化可能である。
【０４５５】
肺への経肺投与のために、修飾型ＥＰＯ及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、適当な推進剤を使用する噴霧器、ターボ噴霧器またはマイクロプロセッサー調節測定投与量の経口吸入器からのエアロゾルスプレイ提示の形態で体内に運搬可能である。一般的に、粒子径は０．５から５ミクロンと小さい。経肺投与のために製剤化された医薬組成物の場合、界面活性成分は典型的には使用されない。経肺薬物伝達は、全身投与の有望な非侵襲性方法である。肺は、薬物伝達のための魅力的な経路を提示し、これは、吸収のための表面積が広く、肺胞上皮は薄く、血管が広範に分布し、肝臓の初回通過代謝がなく、相対的に代謝活性が低いことに起因する。
【０４５６】
経口投与のために、医薬組成物は、結合剤（例えば、前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニールピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、添加剤（例えば、乳糖、微細結晶セルロースまたはカルシウムハイドロジェンホスフェイト）、滑剤（例えば、マグネシウムステアリン酸塩、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはナトリウム澱粉グリコレート）、浸潤剤（例えば、ナトリウムラウリル硫酸塩）などの医薬的に許容される賦形剤を用いて通常の方法により製造された錠剤、丸薬、懸濁液またはカプセル剤の形態を有することができる。錠剤は、当業界に周知な方法によりコーティング可能である。経口投与のための液状製剤は、例えば、水薬、シロップ、または混濁液の形態を取るか、あるいは、使用前に水または他の適当なベヒクルとの構成のために乾燥された製品として提供可能である。前記液体製剤は、医薬的に許容される食塩水または懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化された食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水溶性賦形剤（例えば、アモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは蒸留された植物性油）、保存剤（メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤をもって通常の方法により製造可能である。前記製剤はまた、適切な緩衝塩、香料、色素、甘味料を含むことができる。
【０４５７】
経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出を提供するために適切に製剤化可能である。口腔投与のために、組成物は、通常の方法により製剤化されたトローチ剤や錠剤の形態を有することができる。
【０４５８】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型ポリペプチドは、胃腸管内においてタンパク質分解に対する抵抗性及び半減期増加を示す。このため、経口投与のための製剤は、ボウマン・バーク抑制剤、接合されたボウマン・バーク抑制剤、アプロチニン及びカモスタットなどのタンパク質分解酵素抑制剤の使用なしに適切に製剤化可能である。しかしながら、前記化合物は、前記提供された組成物内使用から排除されない。
【０４５９】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、持効性製剤として製剤化可能である。このような持効性製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内投与）または筋肉内注射により投与可能である。このため、例えば、治療用化合物は、適切な重合体または疎水性物質（例えば、使用可能なオイル内における乳化液として）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体、難溶性塩を用いて製剤化可能である。
【０４６０】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、注射（例えば、ボーラス注射、または連続的注入）による非経口投与のために製剤化可能である。注射のための製剤は、添加された防腐剤と共に単位剤形(unit dosage form)（例えば、アンプル内または複数回投与容器内）内に提供可能である。前記組成物は、懸濁液、水薬、油性または水性のベヒクル内乳化剤の形態を有することができ、安定剤、分散剤及び／または懸濁剤などの製剤を含むことができる。代案的に、活性成分は、使用前適切なベヒクル（例えば、発熱源無し蒸留水）との構成をための凍結乾燥粉末の形態でありうる。
【０４６１】
前記活性製剤は、皮膚（経皮）及び目などの粘膜への外用適用などの局所または外用適用のためのゲル、クリーム及びローションの形態にて、目適用、あるいは、嚢内または髄腔内適用のために製剤化可能である。このような水薬は、特に点眼使用のために０．０１％〜１０％の等張液及び適当な塩により約ｐＨ５〜７を有するように製剤化可能である。この化合物は、外用適用のために製剤化可能である（米国特許第４、０４４、１２６号、第４、４１４、２０９号及び第４、３６４、９２３号、炎症疾患、特に、喘息治療に有用なステロイドの伝達のためのエアロゾールを記述し、それぞれは全文が参考として取り込まれる）。
【０４６２】
前記薬物組成物に含まれる活性化合物の濃度は、前記活性化合物の吸収、不活性化、排泄率、しかも、投薬日程及び投与量だけではなく、当業者に周知な他の要因によって異なってくる。本願にさらに記載されているように、投与量は、未修飾型ＥＰＯまたは他の未修飾型治療用ポリペプチドの投与のために当業界に周知な投与量、及び未修飾型及び／または天然ＥＰＯまたは他の未修飾型及び／または天然治療用ポリペプチドと比較した前記修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの特性及び活性（例えば、安定性及び活性）の比較を用いて実験的に決定可能である。
【０４６３】
必要に応じて、前記組成物は、活性成分を含む１以上の単位剤形を含みうる包装、キット、または分配装置内に提供可能である。例えば、包装には、金属またはブリスター包装などのプラスチックホイルが含まれる。パックや分配装置は、投与のためのガイドラインを含むことができる。活性成分を含む組成物は、包装材料、本願で提供される製剤及び製剤が提供される疾病を指示するラベルを含む物品として包装可能である。
【０４６４】
本願で提供される修飾ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療ポリペプチドの一部は、経口伝達のために修正可能な状態に対する安定性を増強させるために修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドである。経口伝達は、口及び／または胃腸管への投与を含む。このような修飾は、唾液への露出、胃腸管内タンパク質分解酵素への露出、胃の低いｐＨ及び／または腸内ｐＨなどの特定のｐＨ条件への露出などの１以上の条件下でのタンパク質半減期増加を含むことができる。修飾には、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、アルファキモトリプシン、カルボキシルペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びトリプシン、 内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、加水分解酵素、ＮＳ３、エラスターゼ、血液凝固因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ及びＰＳＡなどの１以上のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を含むことができる。また、修飾は、耐熱性、混合及び通気（例えば、そしゃく）による抵抗性と潜在的変性または構造変更条件に対する総合的安定性を高めることを含む。
【０４６５】
経口伝達適合性のための修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドは、本願明細書に記述された任意の方法を用いて製造可能である。例えば、タンパク質の合理的な進化のための２Ｄ及び３Ｄスキャニング変異誘発法（同時継続中の米国特許公開第２００５−０２０２４３８Ａ１号、及び米国公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号及び国際公開特許ＷＯ２００４／０２２５９３及びＷＯ２００４／０２２７４７参照）が修飾型ＥＰＯ及び他の修飾型治療用ポリペプチドを製造するために使用可能である。経口伝達適合性のためのＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの修飾は、タンパク質構造の全体的な安定性増強及び／またはタンパク質分解消化位置の除去を含むことができる。このようなＥＰＯ変異体及び他の修飾型治療用変異体は、１以上の経口伝達条件下における未修飾型及び／または野生型天然型ＥＰＯまたは他の未修飾型及び／または野生型天然型治療用ポリペプチドと比べてタンパク質の半減期の増加を示す。例えば、修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチドは、口腔、咽喉（例えば、粘膜通過）、胃腸管または全身循環において増加されたタンパク質の半減期及び生体利用率を有する。
【０４６６】
一実施態様において、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの半減期は、１以上の経口伝達条件に露出された天然ＥＰＯの半減期と比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上に増加される。他の実施態様において、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの半減期は、１以上の経口伝達条件に露出された天然ＥＰＯの半減期と比べて、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上に増加される。
【０４６７】
他の例において、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型ポリペプチドの半減期は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、アルファキモトリプシン、カルボキシルペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、加水分解酵素、ＮＳ３、エラスターゼ、血液凝固因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ及びＰＳＡなどの１以上のタンパク質分解酵素の存在下で増加された半減期により評価される。修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチドは、１以上のタンパク質分解酵素と混合し、次いで、適当な反応時間後にタンパク質構造及び／または活性を測定することができる。また、半減期の評価は、対象の体温などの温度の増加への露出、胃液及び／または類似胃液への露出、特定のｐＨ条件への露出、及び／または２種類以上の条件の組み合わせを含んで評価される。１以上の条件への露出に続き、タンパク質構造の評価及び／または活性は、適合な対照群（すなわち、未修飾型及び／または野生型のＥＰＯポリペプチド）と比べて修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの半減期を評価するために使用可能である。
【０４６８】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、錠剤、カプセル、液剤または経口投与に適した他のベヒクルなどの経口投与のために製剤化可能である。経口伝達のための修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを含む医薬組成物の製造は、本願明細書に記述された周知の経口製剤をもって修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを製剤化することを含むことができる。前記製剤化された組成物は、タンパク質分解酵素抑制剤及び／またはタンパク質分解酵素、ｐＨ、及び経口伝達の他の条件への露出時に未修飾型及び野生型治療用ポリペプチドの安定化に要される他の成分の添加を必要としない。例えば、前記組成物は、アクチノニンまたはエピアクチノニン及びその誘導体ボウマン・バーク抑制剤及びそのコンジュゲートアプロチニン及びカモスタットなどの化合物の不在時に安定性を示す。しかしながら、前記提供された組成物において、このような化合物の使用を排除しない。
【０４６９】
さらに、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、増強されたタンパク質の安定性を示すため、これらの未修飾対応物よりも医薬組成物の投与に当たってさらに融通が利く。典型的に、経口摂取されたポリペプチドは、朝食前（すなわち、消化酵素が活性化される前）に服用される。本願で提供される修飾型ポリペプチドは消化酵素に対してタンパク質分解抵抗性を有し、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを含有する医薬組成物は、日課中の他の時期、及び消化酵素が存在して活動する条件下においても投与可能である。
【０４７０】
経口投与のために、医薬組成物は、結合剤（例えば、前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニールピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、乳糖、微細結晶セルロースまたはカルシウムハイドロジェンホスフェイト）、滑剤（例えば、マグネシウムステアリン酸塩、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはナトリウム澱粉グリコレート）、浸潤剤（ナトリウムラウリル硫酸塩）などの医薬的に許容される賦形剤をもって通常の方法により製造された錠剤やカプセルの形態を有することができる。錠剤は、当業界に周知な方法によりコーティング可能である。経口投与のための液状製剤は、水薬、シロップ、懸濁液の形態を取ることができ、または、使用前に水または他の適当なベヒクルと一緒に構成されるための乾燥製品として提供可能である。
【０４７１】
前記液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化された食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水溶性賦形剤（例えば、アモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは蒸留された植物性油）及び保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬的に許容される添加剤をもって通常の方法により製造可能である。前記製剤は、適切な緩衝塩、香料、色素、及び／または甘味料を含むことができる。経口投与のための製剤は、制御放出、持続放出、または活性化合物の胃腸通過後または小腸管内放出のために製剤化可能である。経口投与のために、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、液剤、トローチ剤、及び経口投与に適した他の剤形を有することができる。経口投与に適した製剤は、トローチ剤及び口腔、咽喉、及び／または胃腸管の粘膜に医薬組成物を伝達する製剤を含む。トローチ剤は、無水麦芽糖及びマグネシウムステアリン酸塩などの賦形剤を含む適切な成分により製剤化可能である。言及したように、本願明細書に記述された修飾型ポリペプチドは、血液や小腸内のタンパク質分解酵素に対して抵抗性を示し、他の保護化合物または付加的なタンパク質分解酵素抑制剤なしに製剤化可能である。経口投与のための製剤は、タンパク質分解に対して抵抗性を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを含んでタンパク質分解酵素抵抗性を与えるか、あるいは、特定のｐＨ条件などの他の条件下において安定性を付与する１以上の付加成分をもって製剤化可能である。
【０４７２】
２．修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドをコードするヌクレオチドの投与（遺伝子治療）
本願は、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドをコードした核酸分子及び遺伝子治療のために適したこれらがコードされた発現ベクターの組成物を提供する。タンパク質を輸送するよりは、むしろ、核酸は、全身で、または他の経路によりインビボにおいて、または、リンパ球を含んで、細胞の摘出、その中への核酸の導入、そして宿主や適切な供与体への再導入によるなどのエクスビボにおいて投与可能である。
【０４７３】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、核酸分子の発現により細胞及び組織内に伝達可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、エクスビボ技術及び直接的なインビボ発現を含んで、修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドがコードされている核酸として投与可能である。発現のために骨格筋組織などの組織内にネイキッドＤＮＡを直接的に注入（Rizzuto et. al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 6417-6422）するなど当業者に周知な任意の方法により核酸を細胞及び組織内に伝達することができる。分離された核酸配列はさらなる操作のためにベクター内に統合可能である。本願で用いられるように、ベクター（または、プラスミド）とは、発現または複製のための細胞内に外来のＤＮＡを導入するのに用いられる別個の成分を言う。前記ベヒクルの選択及び使用は当業者にとって容易である。
【０４７４】
コードされた核酸分子の発現による修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの投与方法は、組換えベクターの投与法を含む。ベクターは、例えば、複製の起源を含むことにより、エピソームに残るように設計されるか、あるいは、細胞内染色体中に統合されるように設計される。また、修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドは、非ウィルス性ベクターを用いたエクスビボ遺伝子発現治療法に使用可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドをコードしている核酸を、制御配列に操作的に結合されるかまたは遺伝子の位置内において制御配列と操作的に結合されて位置するように遺伝子の位置内に統合させて、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを発現させるように細胞を操作することができる。次いで、前記細胞は、対象、例えば、治療を必要とする患者に全身でまたは局所的に投与可能である。
【０４７５】
例えば、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス（ＡＡＶ）、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、そして他の遺伝子治療のためのものを含むウィルス性ベクターが使用可能である。ベクターは、エピソームに残留してもよく、治療対象の染色体内に統合されてもよい。修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドは、治療を要する患者に投与されたウィルスにより発現可能である。遺伝子治療に適したウィルスベクターは、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウイルス及び上述した他のウィルスを含む。例えば、アデノウィルス発現技術は当業界に広く知られており、アデノウィルス製造及び投与法もよく知られている。例えば、アデノウィルス抗原型はAmerican Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から入手可能である。アデノウィルスはエクスビボで使用可能であり、例えば、細胞は治療を要する患者から分離されて、修飾型ＥＰＯポリペプチド発現アデノウィルスベクターに形質導入される。適切な培養期間後、前記形質導入された細胞は対象に局所的、及び／または全身投与される。代案的に、修飾型治療用ポリペプチド発現アデノウィルス小粒子を分離して、対象の状態または疾病の治療、予防、または改善のために治療的に有効な量の伝達のために医薬的に許容される担体内に製剤化可能である。典型的に、アデノウィルス小粒子は、患者の重量キログラム当たりに１個の粒子から１０１４個の粒子、一般的に、患者の重量キログラム当たりに１０６または１０８個から１０１２個の粒子範囲の服用量にて伝達される。一部の状況において、核酸原料に細胞を標的とする試薬（例えば、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、または標的細胞上受容体に対するリガンド）を提供することが好ましい。ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドはまた、特定の細胞種類に伝達されるために標的化可能である。例えば、ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドがコードされているアデノウィルスベクターは、未分化細胞、例えば、肝または筋肉細胞内での安定した発現のために使用可能である（Tipathy et. al., (1994) Proc Natl Acad Sci U S A. 91(24): 11557-11561; Svensson et. al., (1997) Hum Gene Ther 8: 1797; Setoguchi et. al., (1994) Blood 84(9): 2946-2953、米国特許第６、６１３、３１９号）。他の例において、コードされたＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドをコードするウィルス性または非ウィルス性ベクターは、順次的伝達のための分離された細胞内に形質導入可能である。ＥＰＯ及び他の修飾型治療用ポリペプチドの発現及び伝達のための付加的な細胞種類は当業界に知られており、膵臓細胞、肺の上皮細胞及び中皮細胞を含むが、これらに限定されない（Fenjves et. al., (2004) Transplantation 77(1): 13-8; Davis et. al., (2004) Mol Ther. 10(3): 500-6）。
【０４７６】
核酸分子は、人工的な染色体及び他の非ウィルス性ベクター内に導入可能である。ＡＣＥＳ（Lindenbaum et. al., Nucleic Acids Res. 2004 Dec 7;32(21):e172参照）などの人工染色体はアイソフォームをコードして発現するように操作可能である。簡略に説明すれば、哺乳動物の人工染色体（ＭＡＣｓ）は自己複製し、非統合形態で細胞内に多量の遺伝情報を導入させる手段を提供する。独特なＭＡＣｓの中で、哺乳動物サテライトＤＮＡに基づく人工的染色体発現（Artificial Chromosome Expression: ＡＣＥ）は、他の種の細胞株において新たに再産生可能に生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製可能である。精製された哺乳動物ＡＣＥは、次いで、様々な供与者細胞株内に再導入され、ここで、これらはＡＣＥ系を使用して選択的圧力不在下で長い期間、安定的に維持される。このアプローチを用いて、一つまたは２つの遺伝子標的の特定のローティングがＬＭＴＫ（−）とＣＨＯ細胞内において達成される。
【０４７７】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドをコードする核酸を導入させる他の方法は、酵母内２段階遺伝子置換技術であり、これは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）内のクローニングされた完全なアデノウィルスゲノム（Ad2; Ketner et. al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6186-6190）、及びＹＡＣクローン内特定の地域を標的化するためのアデノウィルス配列、関心ある遺伝子のための発現カセット、及び陽性及び陰性の選択マーカーを含むプラスミドをもって開始される。ＹＡＣはさらに大きな遺伝子との結合を許容するため、特に関心がある。このアプローチは、哺乳動物細胞または全体動物への遺伝子伝達のために上記の修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運搬するアデノウィルス基盤ベクターの構築のために使用可能である。
【０４７８】
核酸は、リポソームなどのベヒクル内にカプセル化されるか、細菌細胞、特に、弱くなった細菌などの細胞内に導入されるか、あるいは、ウィルス性ベクターに導入される。例えば、リポソームを使用時、食細胞作用が連携された細胞表面膜タンパク質と結合したタンパク質は、例えば、特定の細胞種類に向性を示すカプシドタンパク質またはその断片、循環において内部化を経るタンパク質に対する抗体、及び細胞内位置化を標的化し、細胞内半減期を向上させるタンパク質を標的化するか、及び／または、吸収を容易化させるために使用可能である。
【０４７９】
エクスビボ及びインビボ方法のために、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドをコードする核酸分子は、適当な供与者または治療される患者から得られる細胞に導入される。核酸が治療目的で導入された細胞は、例えば、治療される疾病や状態に適した任意の所望の利用可能な細胞種類を含み、これは、上皮細胞、内皮細胞、角質形成細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単核球、マクロファージ、好中球、好酸球、去核細胞、顆粒球などの血液細胞、様々な幹細胞、または前駆細胞、特に、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、抹消血液、胎児の肝及びこれらの他の根源から得られる幹細胞を含むが、これらに限定されない。
【０４８０】
エクスビボ治療のために、治療される対象、または細胞治療される対象に適した寄付者から得られた細胞を摘出し、核酸を分離された細胞内に導入し、修飾細胞を前記対象に投与する。治療は、例えば、患者に移植される多孔性膜内カプセル化などの直接的な投与を含む（米国特許第４、８９２、５３８号及び第５、２８３、１８７号参照、それぞれ全体が参照として本願に取り込まれる）。インビトロにおいて核酸を哺乳動物細胞に移転するために適切な技術は、リポソーム及び陽イオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔法微細注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン及びリン酸カルシウム沈殿法を含む。ＤＮＡ伝達方法は、インビボにおける修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの発現のために使用することができる。この方法は、電気穿孔法、超音波法、及びリン酸カルシウム輸送の利用などの局所的及び全身的伝達を含む、核酸のリポソーム輸送及びネイキッドＤＮＡ伝達を含む。他の技術は、微細注射、細胞融合、染色体媒介の遺伝子運搬、微細細胞媒介の遺伝子運搬及びスフェロプラスト融合法を含む。
【０４８１】
修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドのインビボ発現は、付加的な分子の発現に連携可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの発現は、操作されたウィルス内または細胞毒性ウィルスにおいて発現されるような細胞毒性産物の発現に連携可能である。このようなウィルスは、治療的効果のための標的である特定の細胞タイプに標的化可能である。前記発現された修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドは、ウィルスの細胞毒性を強化させることができる。
【０４８２】
修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドのインビボ発現は、細胞特異的または組織特異的プロモータなどの特定の調節配列と修飾型治療用ポリペプチドをコードする核酸を操作的に結合することを含むことができる。修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドはまた、標的細胞の種類及び／または組織に特異的に感染し、及び／または、複製するベクターから発現可能である。誘導性プロモータは、修飾型ポリペプチドの発現を選択的に調節するために使用可能である。例示的な調節発現系は、骨格筋内において組換えＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチド発現を調節するために用いられるミフェプリストン、ドキシサイクリン及びテトラサイクリン遺伝子発現系を含むが、これらに限定されたものではない（Serguera et. al., (199 9) Human Gene Therapy 10(3): 375-383; Bohl et. al., (1998) Blood 2(5): 1512-1517 Rizutto et. al., (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(11): 6417-6422;  Rendahl et. al., (2002) Human Gene Therapy 13(2): 335-342）。
【０４８３】
ネイキッド核酸としてまたはベクター内にある核酸分子、人工染色体、リポソーム及び他のベヒクルは、対象に、全身投与、外用、局所及び他の投与経路にて投与可能である。インビボ及び全身の場合、核酸分子または核酸分子を含むベヒクルが細胞に標的化可能である。
【０４８４】
投与はまた、組織または細胞を典型的に標的化するベクターまたは細胞を投与するなど直接的でありうる。例えば、癌細胞及び分化中の細胞は、修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドのインビボ発現のための細胞に標的化可能である。さらに、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドのインビボ発現のために用いられる細胞は、患者自家細胞を含む。この細胞を患者から摘出して、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの発現のための核酸を導入し、例えば、注射または生着させることにより患者に投与される。
【０４８５】
本願で提供されるポリヌクレオチド及び発現ベクターは、任意の適切な方法により生成可能である。配列番号３−２０１のいずれかに示されるＥＰＯポリペプチドをコードする核酸の配列またはこの断片を含む、上記の核酸分子を含有する核酸とベクターがさらに提供される。上述した核酸分子を含む核酸ベクターとこのベクターを含む細胞が提供される。
【０４８６】
Ｊ．治療学的用途
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチド、及び核酸分子は、未修飾型ＥＰＯまたは未修飾型治療用ポリペプチドが用いられる任意の条件の治療にも使用可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、単独または他の薬剤と組み合わせられて治療効果を有する。本願で提供される修飾型ポリペプチドは治療効果を維持するために考案されたが、修飾型特性、特に、安定性が増強されることを示す。例えば、このような修飾型特性はポリペプチド治療効果を向上させたり、経口投与などの追加経路を介する投与を可能にする。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型ポリペプチド、及びコードされた核酸分子は、未修飾型ＥＰＯまたは未修飾型治療用タンパク質が用いられる任意の条件の治療にも使用可能である。このセクションでは、投与方法と典型的な使用法を提供する。ここで説明された治療法は例示であり、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの適用に限定されない。
【０４８７】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、ＥＰＯまたは治療用ポリペプチドが用いられる診断法だけではなく、様々な治療法に使用可能である。この方法は、下記表に示す生理学的で且つ医学的状態の治療に用いられる治療法を含み、これらに限定されるものではない。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、類似する天然型の治療用ポリペプチドと比べて、低い投与量において、同じ効能、薬効の追加延長、投与と治療面におけるその他の改善などインビボ活性及び治療効果が改善されることを示す。
【０４８８】
本願明細書に記述された修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、タンパク質安定性の増強及び半減期の改善を示す。このため、修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の治療用ポリペプチドはさらに長く持続され、安定的な治療のために使用可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドの使用による治療効果改善の例は、低量投与可能、投与頻度数減少、副作用減少、治療効果増加などであり、これは上記の例に限定されるものではない。
【０４８９】
特に、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、治療のために用いられるＥＰＯの治療法に利用するためのものである。この方法は、腎不全、後天性免疫欠乏症、悪性腫瘍、慢性炎症に伴われる貧血症など貧血症などの疾病、疾患の治療方法を含み、これらに限定されるものではない。修飾型ＥＰＯポリペプチドにより治療するさらなる貧血の例は、地中海性貧血、鎌状赤血球性貧血、未熟児貧血、白金化学療法に伴われる貧血、及び集中的な放射線治療、及び／または化学治療と骨髄移植に起因する貧血を含む。
【０４９０】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、細胞生存、増殖、分化を調節する上で有用である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドと修飾型ＥＰＯポリペプチドを含む組成物は、赤血球を生成する前駆体の増殖を促進する上で有用であり、インビボ、エクスビボ、インサイチュまたはインビトロにおいて使用可能である。例えば、配列番号３−２０１から選択される１以上の修飾型ヒトＥＰＯポリペプチドを含む組成物は、個人から赤血球を生成する前駆細胞を得た後、体外において細胞増殖をさせ、再び患者に投与することができる。本願で提供される赤血球生成活性を示さない修飾型ＥＰＯポリペプチドは、組織保護活性などのＥＰＯ関連疾患の治療に有用なＥＰＯ活性を依然として有しうるか、あるいは、元のエリスロポエチンの拮抗剤（例えば、多血球血症またはエリスロポエチンの過生成を含む状態の治療）、または診断法において使用可能である。
【０４９１】
修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを用いた疾病、及び状態の治療は、本願明細書に記述された適当な製剤を用いて、注射、経肺、経口、及び経皮投与を含む任意の適切な投与経路でも効果的であり、前記例に限定されるものではない。必要に応じて、特定の投与量、投与期間や治療手続きが経験的に決定まはた推定可能である。例えば、組換えまたは元のＥＰＯポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドの典型的な投与量は適正量を決定する上で開始点として使用可能である。体内においてさらに安定的であり、且つ、インビボにおいて増加された半減期を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、軽減された投与量と投与頻度の面で効果的でありうる。例えば、血漿安定性のように改善された特性のため、未修飾型ＥＰＯや未修飾型治療用ポリペプチドと比べて投与量が減少可能である。未修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の未修飾型治療用ポリペプチドの投与量は、類似する修飾型ポリペプチドの投与量の決定のための模範ケースとして使用可能である。未修飾型ポリペプチドと比較された修飾型ポリペプチドの半減期及び活性の数値などの要素は、このような決定を下るのに使用可能である。特定の投与量と方法は、経験的に決定可能である。
【０４９２】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドのいかなるものでも、治療効能を有する特定の投与量は当業界に周知な様々な技術を用いて初期に評価可能である。例えば、細胞培養法において、細胞培養において決定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を得て実験モデルにおいて投与量が計算可能である。ヒトに投与するための適正投与量範囲は、細胞培養実験と動物実験を通じて得られた試料を用いて決定可能である。
【０４９３】
投与量レベルと投与計画は、周知の投与量と投与計画に基づき、必要に応じて、修飾型ポリペプチドの性質の変化に基づく推論及び／または様々な要素に基づく経験により決定可能である。このような要素は、個人の体重、一般的健康状態、年齢、服用された特定薬物の活性、性別、食事、投与時間、排泄率、薬物の複合、疾病の度合いと進行の度合い、そして疾病と治療の医者の判断に対する患者の性向などを含む。投与量を決定する他の要因として、赤血球数値などの生物学的活性または結果の望むレベルを含むことができ、これらに限定されるものではない。活性成分であるポリペプチドは、典型的に、医薬担体と結合することができる。単回投与剤形または複数回投与剤形を産生するために担体と結合可能な活性成分の量は、治療される対象と特定の投与方法により様々である。
【０４９４】
患者の状態の改善時、必要に応じて、維持量の化合物と組成物が投与可能であり、投与量、投与形態、投与頻度、またはその組合せは修正可能である。場合によっては、対象体に疾病症状の任意の再発または予定される投与量に基づいて長期間の断続的な治療が要求される。さらには、出血、外傷、外科手術などの急性状況に対する対応時に追加投与が必要となる場合もある。
【０４９５】
投与法のための効果的で且つ毒性がない投与量の選択は、当業界における通常の技術として知られた要因に基づいて、当業者により決定可能である。このような要因の例は、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの特定形態の生体利用率、代謝、半減期（当業者に提供された）などの修飾型ＥＰＯポリペプチドの薬物動態学的パラメータ、治療される疾病または状態、正常個体において達成されるメリット、患者の体重投与方法、投与頻度（例えば、常習的、緊急的、断続的）、併用薬物、そして投与された薬物の効果に影響を及ぼすと知られている要素を含む。このため、正確な投与量は医者の判断と特定の患者の状況により決定さるべきである。
【０４９６】
ＥＰＯポリペプチドの投与のための典型的な投与量は当業界によく知られており、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの投与量の決定に際して基礎資料として使用可能である。例えば、組換えヒトＥＰＯポリペプチドは、貧血治療のための赤血球生成活性を有し、患者に推奨される赤血球範囲を回復させるために、組換えヒトＥＰＯは、典型的に、５０−１５０単位／ｋｇ体重の初期投与量にて１週間に３回、６−８週間静脈または皮下投与される。患者が要求される赤血球数値（例えば、３０〜３６％範囲の量）に達した後、鉄の欠乏や他の随伴疾患がない場合、ＥＰＯの初期投与により得られた正常赤血球数値を維持するのに適した頻度と十分な量を投与して、この赤血球数値は維持量のＥＰＯのにより持続可能である。投与要求量は患者の個人的な必要に応じて多様化され、一般的に、維持量は１週当たりに約３回投与される（もし、濃度がさらに高ければ、より少ない頻度で用いられる）。有効量は、薬物投与後に、血清において約１０、０００、１５、０００、または２０、０００ｍＵ／ｍｌよりも高い薬物の血清レベルを達成するのに十分でなければならない。このような血清のレベルは、投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０時間後に達成可能である。このような投与量は、必要分だけ反復可能である。例えば、投与は、臨床学的な必要分だけ毎日反復可能であり、または、適当な間隔にて毎１週から１２週まで、好ましくは、毎１週から３週まで反復的でありうる。
【０４９７】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を増強させて血清の半減期を増加させることができる。このため、体内における有効性も増強される。その結果、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、組換えＥＰＯ組成物の頻度及び量と比べてより少ない頻度やより少ない量にて投与可能である。
【０４９８】
以下は、ＥＰＯを単独または他の物質と併用して治療剤として利用するいくつかの例である。
【０４９９】
１．貧血症
ＥＰＯと関連する貧血症などの疾病の治療に使用可能な精製されたＥＰＯ治療剤中には、Epogen（登録商標）、Procrit（登録商標）、Eprex（登録商標）、Erypo（登録商標）、Epopen（登録商標）、Epoxitin（登録商標）、Globuren（登録商標）、Epoade（登録商標）及びEspo（登録商標）などの製品を含むEpoietinαアイソフォーム、Recormon（登録商標）、Neorecormon（登録商標）、Epogin（登録商標）、Epoch（登録商標）、Eritrogen（登録商標）、Erantin（登録商標）及びMarogen（登録商標）などの製品を含むEpoietinβアイソフォーム、Epomax（登録商標）及びHemax（登録商標）などのEpoietinωアイソフォーム、Dynepo（登録商標）などの製品を含むEpoietinδアイソフォーム、Aranesp（登録商標）などの製品を含むDarbepoietinαアイソフォーム、Ｒ−７４４連続的なエリストポエイチン受容体活性成分（ＣＥＲＡ）及び合成赤血球生成タンパク質（ＳＥＰ）がある。これらの製品は、いずれも、本願において説明されたように修飾可能であり、及び／または、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドに代替可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、赤血球細胞の欠乏と関連する状態の治療を含む貧血症の治療に使用可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは赤血球生成を促進し、赤血球再生などの例にも使用可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドにより治療可能な典型的な貧血症は、腎不全、後天性免疫欠乏症、悪性腫瘍、及び慢性的な炎症により引き起こされる貧血症を含む。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドを用いた付加的な貧血症の例は、地中海貧血と鎌状赤血球障害などの異常血色素症、早熟性貧血、鉄貯蔵障害、シス型白金または放射能などの化学治療剤の処理により惹起される貧血症、再生不良性貧血、リバビリンなどのＣ型感染の治療のための治療用薬物による貧血症、悪性の疾病（例えば、固形癌、転移された乳房癌、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫を含む血液癌のあらゆるタイプ）と連携された貧血症、過度な血液細胞破壊（溶血、溶血性貧血、赤血球死滅、過度な血液損失（赤血球破壊などの急性損失または低体積損失などの慢性的損失）、老化、慢性腎臓疾患（ＣＤＫ）、肝炎、腎臓の衰弱、後天性免疫欠乏症患者におけるジドブジン治療療法（例えば、アジドチミジン（ＡＺＴ）処置）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、包嚢の繊維腫、糖尿病性腎臓疾患、敗血症、脳の低酸素症／虚血、リウマチ性疾患、骨髄異形成症候群、鬱血性心臓機能喪失（ＣＨＦ）、ゴーシェ病、キャッスルマン病、及び骨髄移植と集中的な放射線療法及び／または化学療法による貧血症が含まれる（例えば、Little et. al., (2006) Haematologica 91(8): 1076-83; Eisenstaedt et. al., (2006) Blood Rev. 20(4): 213-26; Rodgers and Lessin (1989) Blood 73(8): 2228-9; Boogaerts et. al., (2005) Oncology. 69 Suppl 2: 22-30; Regnier et. al., (1989) ANNA J. (7): 512-3, Olsson et. al., (2002) Acta Oncol. 41(6): 517-24; Ritz and Haxsen (2005) Eur J Clin Invest. 35 Suppl 3: 66-74, Nurko (2006) Cleveland Clin. J. Med. 73(3): 289-297;  Koltwasser et. al., (2001) J Rheumatol. 28(11): 2430-6; Kuehl and No ormoha- med (1995) Ann Pharmacother. 29(7-8): 778-9; Singer et. al., (2005) Ann N Y Acad Sci. 1054: 250-6参照）。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、狹心症、肺疾患、低血��、鬱血性心臓機能喪失または一過性脳虚血発作と関連する貧血症治療にも使用可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドはまた、過度な血液損失の危険性がある非心臓または非血管手術などの手術前、手術中、または手術後に同じ手術を受けた患者の治療にも使用可能である。また、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、鉄またはビタミン補助療法と共に、鉄欠乏貧血症と葉酸欠乏貧血症などの栄養分欠乏貧血症の治療にも使用可能である。
【０５００】
貧血症治療に加えて、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、鉄過多障害の処置のための治療法に使用可能である。鉄過多障害を有する患者は。赤血球産生増加のための修飾型ＥＰＯポリペプチドが投与され、その後、余分の産生された赤血球を除去するために瀉血される（例えば、米国特許第５、０１３、７１８号参照）。
【０５０１】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、非正常的止血の治療法に使用可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、凝固、血小板、または血管に先天的または後天的障害を有する患者、抗凝固剤や抗血小板剤を治療上過量服用しなければならない患者からの出血を治療、調節または予防するときに使用可能である（米国特許第６、２７４、１５８号）。
【０５０２】
配列番号３−２０１から選択されるアミノ酸配列を含む修飾型ＥＰＯポリペプチド及び薬学的に許容される媒質を含む有効量の組成物を対象全体に投与して対象体の赤血球を増加させる方法がある。例えば、個人における赤血球数はヘマトクリットを用いて測定される。また、配列番号３−２０１から選択されるアミノ酸配列を含む修飾型ＥＰＯポリペプチド及び薬学的に許容される媒質を含む有効量の組成物を対象全体に投与して対象体の赤血球を増加させる方法において、前記対象体は貧血である方法を提供する。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは修飾型ＥＰＯポリペプチドの組成物は、貧血患者の赤血球数値を増加させる上で有効な量が投与可能である。貧血は、健康異常だけではなく、食餌、遺伝的な要素を含むいくつかの要因により惹起可能である。例えば、貧血症は、慢性腎不全によっても惹起され、癌にかかった個人の化学処置法の副作用によっても誘発可能である。
【０５０３】
本願の修飾型ＥＰＯポリペプチドは、増強されたタンパク質安定性と増加されたタンパク質半減期を提供する。興味深いのは、タンパク質分解酵素に対して抵抗性を有するＥＰＯポリペプチドである。このため、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、貧血症の治療時にさらに長く持続され、さらに安定的に使用可能である。例えば、このようなポリペプチドは、配列番号３−２０１から選択されるものである。修飾型ＥＰＯポリペプチドを用いた治療改善の例は、投与量減少、より少数及び／またはより低頻度の投与、副作用減少、治療効果の増加を含むが、これらに限定されるものではない。修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えば、動物モデルを用いて治療効果を試験することが可能である。例えば、貧血症マウス、または貧血症の動物モデルとしてよく知られた他のいずれであっても修飾型ＥＰＯポリペプチドにより処理することができる。疾患症候の進行と表現型は、修飾型ＥＰＯポリペプチドの効果を評価するために測定可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドはまた、プラシーボ対照群及び／または未修飾型ＥＰＯを用いた対照群と比べて、インビボにおける有効性を評価するために臨床試験における対象体だけではなく、動物モデルにも投与可能である。
【０５０４】
修飾型ＥＰＯポリペプチドは、長い持続力とさらに安定した貧血治療のために使用可能である。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型または天然型ＥＰＯポリペプチドまたは上述したエポエチンα、β、ω、δ、及びダルベポイエチンαアイソフォームなどの他のＥＰＯ組換え型よりも低い濃度及び／または低い頻度で投与可能であり、１以上の治療用活性及び／または１以上の少ない／減少された副作用を有する。
【０５０５】
２．組織保護的な治療
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、損傷に対する予防または反応性哺乳類細胞、組織、または器官に対する損傷による機能回復のための治療法に使用可能である。典型的な反応性哺乳類細胞は、ニューロン、脳、脊髄、網膜、筋肉、心臓、肺、肝、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髓質、毛細血管、内皮、精素、卵巣、子宮内膜または幹細胞を含む。付加的な反応性哺乳類細胞の例は、光受容器、神経節、双極細胞、水平細胞、アマクリン、ミュラー、心筋、ペースメーカー、洞房結節、洞結節、房室結節、ヒス筋続、肝細胞、星細胞、クッパー、メサンギウム細胞、杯細胞、腸線、消化管、内分泌、 球状帯細胞、 束生細胞、網状帯細胞、親クロム、血管周囲細胞、ライディッヒ、セストリ、精子、グラーフ濾胞、原始濾胞、子宮内膜基質、及び子宮内膜細胞がある。
【０５０６】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、主として神経学上のまたは精神医学上の症候群、眼科疾病、心血管疾患、心肺疾患、呼吸器疾患、腎臓、泌尿器疾患、生殖器疾患、骨疾患、皮膚疾患、胃腸疾患、及び内分泌系及び代謝不均衡を有する中枢神経系または抹消神経系の疾患と関連する状態を治療するための医薬組成物の製造に使用可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、このような状態による機能障害の回復または再生、または対象体の細胞、組織、及び器官の局地的または組織的保護を提供するために使用可能である。
【０５０７】
特に、このような状態と疾患は、例えば、脳、心臓、または網膜／目などの中枢神経系組織、抹消神経系組織または心臓組織または網膜細胞内の興奮性反応性組織などの興奮性、反応性組織に有害な影響を与える低酸素症状態を含む。神経組織への酸素の利用性を減少させてストレス、損傷、及び結局として神経細胞死滅を引き起こすいかなる状態も、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸の投与により治療可能である。一般的に、低酸素症及び／または局所貧血と呼ばれるこのような状態は、これらに限定されるものではないが、脳卒中、血管閉塞、出生前または出生後酸素欠乏、窒息、息詰まり、喘息、溺水事故、一酸化炭素中毒、煙吸入、手術と放射性治療を含む外傷、気絶、癲癇、低血糖、慢性肺鎖肺病、気腫、成人性呼吸困難症候群、低血圧ショック、敗血性ショック、過敏性ショック、インシュリンショック、鎌状赤血球貧血、心臓停止、律動不整、窒素中毒、及び心肺バイパス手続きにより引き起こされた神経性欠損に起因するか、あるいは、含む。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、主として神経学上のまたは精神医学上の症状、眼科疾病、心臓血管疾患、心肺疾患、呼吸疾患、腎臓、泌尿器疾患、生殖器疾患、骨疾患、皮膚疾患、胃腸疾患、及び内分泌系と代謝不均衡を有する中枢神経系または抹消神経系ヒト疾患の治療用または予防用処置のために一般的に有用である。中でも、そのような状態と疾患は、脳、心臓、または網膜／目などの中枢神経系組織、抹消神経系組織または心臓組織または網膜細胞内の興奮性反応性組織などの興奮性反応性組織に有害な影響を与える低酸素症状態を含む。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、様々な条件と環境において低酸素症状態が原因となる興奮性組織の損傷を治療または予防するために使用可能である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸の投与は、発作疾患、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心臓麻痺、局所貧血、心筋梗塞、炎症、老化による認識能力の退化、精神分裂症を有する対象体における認識拒否、放射性損傷、脳性麻痺、
神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー脳症、ＡＩＤＳ痴呆、記憶力減退、筋萎縮性側上硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、注意欠失障害、精神分裂症、自閉性、狂牛病、脳または脊髄外傷または局所貧血、心肺バイパス、慢性的な頭損傷、黄班変性、毒素により誘導された神経障害、糖尿病性抹消神経病症、糖尿網膜病症、緑内障、網膜局所貧血または網膜外傷などの傷害に対する保護のために使用可能である（例えば、Grasso et. al., (2006) J Neurosurg Spine 4(4):310-80; Boogaert et. al., (2005) Oncology. 69 Suppl 2:22-30; Krebs et. al., (2006) Expert Opin Pharmacother. 7(7): 837-48参照）。
【０５０８】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドと本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３−２０１から選択されるアミノ酸配列を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドと医薬的に許容可能な媒質を含む組成物を有効量だけ対象体に投与することにより、患者における神経学的な状況の処置のための治療法に使用可能である。例えば、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドを含む医薬組成物は、神経学的状況の危険がある個人に予防次元で処置可能であり、また、脳卒中や他の神経学的な損傷などの状況後に使用可能である。上述したように、神経学的な状況は、神経系の神経または阿膠細胞に影響を与える病理学的な状況になりうる。神経または阿膠細胞に影響を与える病理学的な状況は、局所貧血、細胞死滅、細胞壊死、酸化損傷または自由ラジカル損傷と興奮細胞毒性を含む。例えば、これらに限定されないが、神経学的な状態は、大脳及び脊髄虚血、急性脳損傷、脊髄の損傷、網膜疾患、及びアルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、及びルゲリック病などの神経変性疾患を含む。
【０５０９】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、増強されたタンパク質安定性と増加されたタンパク質半減期を提供する。興味深いのは、タンパク質分解酵素に対して抵抗性を有するＥＰＯポリペプチドである。このため、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、貧血症においてさらに長く持続され、損傷に対する保護または反応性哺乳類細胞、組織または器官損傷による機能回復にさらに安定的に使用可能である。例えば、このようなポリペプチドは、配列番号３−２０１から選択される修飾型ＥＰＯポリペプチドである。修飾型ＥＰＯポリペプチドを用いた治療改善の例は、これらに限定されるものではないが、少ない投与量、少数及び／または低頻度の投与、副作用減少、治療効果の増加を含む。修飾型ＥＰＯポリペプチドは、例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドにより治療可能な動物モデルを用いて治療有効性を試験することができる。例えば、疾患症候の進行と表現型は、修飾型ＥＰＯポリペプチドの効果を評価するために測定可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドはまた、プラシーボ対照群及び／または未修飾型ＥＰＯを用いた対照群と比較してインビボにおける有効性を評価するために臨床試験での対象体だけではなく、動物モデルにも投与可能である。
【０５１０】
修飾型ＥＰＯポリペプチドは、反応性哺乳類細胞、組織、または器官の傷害による機能の回復または損傷に対する予防のための長い持続力とさらに安定した治療法のために使用可能である。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、未修飾型または天然型ＥＰＯポリペプチドまたは上述したエポエチンα、β、ω、δ、及びダルベポエチンαアイソフォームなどの他のＥＰＯ組換え型よりも低い濃度及び／または低い頻度にて投与可能であり、１以上の治療用活性及び／または１以上の少ない／減少された副作用を有する。
【０５１１】
Ｋ．診断的用途
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、診断上の目的でも使用可能である。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、必要に応じて、エリストポエチン受容体の存在を測定し、その量を測定するためにまたは赤血球生成を誘導する成分の活性を比較するために分析過程に使用可能である。例えば、向上された活性を有する修飾型ＥＰＯポリペプチドは、受容体への結合と関連する分析の感度を増加させ、分析時間を減少させる上で有用である。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドはまた、エリスロポエチンタンパク質がその受容体への結合に対する新たな薬物の影響を決定するためのインビトロ結合分析に使用可能である。
【０５１２】
さらに、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、エリスロポエチンとエリスロポエチン受容体との構造的／機能的な連関性だけではなく、赤血球生成におけるエリスロポエチンの役割をさらに明らかにするために有用な研究薬物を提供することができる。例えば、修飾型ＥＰＯポリペプチドは、赤血球前駆細胞の成長と分化を調節する能力を有する物質を評価するために使用可能である。赤血球前駆細胞の成長と分化を調節する能力を有する物質を評価するための分析法の一例は、エリスロポエチン受容体と物質との結合、及び修飾型ＥＰＯポリペプチドとエリスロポエチン受容体との結合を比較することである。もし、試験物質（評価される物質）のエリスロポエチン受容体との結合が修飾型ＥＰＯポリペプチドのエリスロポエチン受容体との結合と対等であれば、試験物質の結合は、赤血球前駆細胞の成長と分化を調節する試料の能力は概略的に修飾型分泌されたエリスロポエチン変異体と同等な能力であることを示唆する。エリスロポエチン受容体との結合は、当業界における公知の方法と類似する数多くの方法から任意の方法を用いて決定可能である。例えば、本願に取り込まれた参考文献のYonekura et. al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1-5; Chern et. al., (1990)Blood 76(11): 2204-2209; and Krystal (1983) Exp. Hematol. 11: 649-660に開示された方法が使用可能である。
【０５１３】
Ｌ．併用治療法
本願において言及された任意の修飾型ＥＰＯポリペプチドと修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸は、これらに限定されるものではないが、他の生物製剤、小分子型化合物及び手術を含む治療用薬物や施術前に、これと一緒に断続的に、またはこれよりも後に複合的に投与可能である。前記例示された全ての疾患または状態、ＥＰＯが指示または使用されており、他の薬剤及び治療が利用可能な任意の疾患または状態の場合、ＥＰＯをこれと一緒に使用することができる。このため、本願で提供される修飾型ポリペプチドは同様に使用することができる。しかも、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは同様に使用可能である。治療する疾患または状態により、典型的な併用投与は、これらに限定されるものではないが、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、化学治療用薬物（例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、感光剤、放射性核種、毒素、代謝拮抗物質、シグナル調節因子、抗癌性抗生物質、抗癌性抗体、抗癌性オリゴペプチド、新生血管生成阻害剤、放射能治療、化学的治療用化合物、またはその組み合わせ物）または鉄（例えば、タブロン、フェロゾル、色源体、ニフェレックス、硫酸鉄（II）またはフマル酸鉄（II）の組成物、デキストラン鉄）と併用可能である。
【０５１４】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、鎌状赤血球貧血症またはヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）−β０−地中海貧血などの異常血色素症患者に、これらに限定されるものではないが、クリトリアゾールのように赤血球細胞の脱水を防ぐ薬物やヒドロキシウレア、ソジウムフェニルブチレートなどの胎児のヘモグロビンの内因性産生を向上させる薬物、または組換え型ヘモグロビンと一緒に投与をすることができる。
【０５１５】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（例えば、sargramostim、ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）、ＰＲＯＫＩＮＥ（登録商標）、顆粒球コロニー刺激因子（例えば、filgrastim、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）、ｃ−ｍｐｌリガンド（トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはＭＧＤＦとしてよく知られている）、マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ−１としてよく知られている）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子、好酸性白血球分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ、c-キットリガンド、鉄因子）、ＰＩＸＹ３２１（ａＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、またはインターフェロン−γなどのインターフェロンを含むサイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、血液成長因子の１以上の付加的なコロニー成長因子を併用投与または順次投与することができる。しかしながら、これらに限定されない。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、他のエリスロポエチン型（epoetinalfa、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））と併用可能である。これらの要素と本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドの併用は、ペプチドそれぞれの一般的な活性を有するか、あるいは、各成分と修飾型ＥＰＯポリペプチドの単独に対する付加的な活性よりも高い生物学的なまたは生理学的な活性を有する。併用投与はまた、活性の効果を増加させたり、ＥＰＯや付加的な要素の存在により期待されることとは異なる活性を提供することもできる。さらに、併用療法は、天然型ヒトＥＰＯと関連する不所望の生物学的活性の減少を含む活性側面を向上させることもできる。上記のリストだけではなく、各成分の修飾形態もこのように併用可能である（例えば、ＷＯ９４／１２６３９号、ＷＯ９４／１２６３８号、ＷＯ９５／２１１９７号、及びＷＯ９５／２１２５４号におけるＩＬ−３変異体、ＷＯ９７／１２９７７号におけるＧ−ＣＳＦ受容体作用剤、ＷＯ９７／１２９７８号におけるｃ−ｍｐｌ受容体作用剤、ＷＯ９７／１２９７９ＩＬ−３号受容体作用剤、ＷＯ９７／１２９８５号における多機能性受容体作用
剤）。本願明細書に記述されたように、「ＩＬ−３変異体」とは、ＷＯ９４／１２６３９号及びＷＯ９４／１２６３８号において教示するＩＬ−３変異体を言う。
【０５１６】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、また、貧血症を誘発させる治療用化合物や薬剤投与による疾患と障害にも併用療法により使用可能である。例えば、Ｃ型感染（ＨＣＶ）の感染における治療においては、リバビリン（ＲＢＶ）とインターフェロン-α（ＩＦＮ−α）をしばしば併用投与する。このような治療法は、投与量の減少または治療の中断をする程度に深刻な貧血症が発生可能であり、（処方された者の１０％）分の３ｇ／dl以上のヘモグロビンを減少させる（リバビリンとインターフェロン-αを一緒に処理した者の５４％において発生）。リバビリン（ＲＢＶ）とインターフェロン-α（ＩＦＮ−α）の併用投与は、治療法により誘発される貧血症の問題点を軽減することができる（米国特許第６、８３３、３５１号）。このため、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドは、リバビリン（ＲＢＶ）とインターフェロン-α（ＩＦＮ−α）の投与により誘発される貧血症を治療するための併用治療法により使用可能である。
【０５１７】
Ｍ．製品及びキット
修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチド、または修飾型ポリペプチドをコードする核酸またはその誘導体、または生物学的な活性部分の医薬化合物は、包装材料、ＥＰＯ媒介の疾患または障害または治療用ポリペプチド関連疾病または障害を治療する医薬組成物、修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは核酸分子がＥＰＯ関連疾病または障害治療のために用いられるか、または、治療用ポリペプチド関連疾病または障害を治療するために用いられるということを指示するラベルを含む製品として包装可能である。
【０５１８】
本願で提供される製造品は、包装材料を含む。医薬製品を包装するのに使用する包装材料は当業者によく公知されている。例えば、その全文が本願に取り込まれた米国特許第５、３２３、９０７号、第５、０５２、５５８号及び第５、０３３、３５２号を参照することができる。医薬包装材料の例には、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、パンプ、バッグ、バイアル、容器、注射器、瓶、及び選択された製剤及び意図された投与及び治療方式に適した任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されるものではない。本願で提供される化合物及び組成物の広範な製剤は、任意のＥＰＯ関連疾患または障害若しくは治療用ポリペプチド関連疾患または障害に対する様々な治療として考慮される。
【０５１９】
また、修飾型ＥＰＯポリペプチド、他の修飾型治療用ポリペプチド、修飾型ポリペプチドをコードする核酸分子はキットとして提供可能である。キットには、本願の医薬組成物及び投与用アイテムが含まれうる。例えば、修飾型ＥＰＯまたは他の修飾型治療用ポリペプチドは、注射器、吸入器、投与量カップ、点滴器またはアプリケータなどの投与用装置に供給可能である。キットには、任意に、投与量、投与方法及び投与方式に関する指示を含む投与ガイドラインが含まれうる。また、キットには、本願明細書に記述された医薬組成物及び診断用アイテムが含まれうる。例えば、このようなキットには、ＥＰＯまたは他の治療用ポリペプチドの濃度、量または活性またはＥＰＯ調節されたシステムを測定するためのアイテムが含まれうる。
【０５２０】
Ｎ．修飾型ＥＰＯポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドに対する抗体
本願で提供される修飾型治療用ポリペプチドと他の修飾型ＥＰＯポリペプチドを認知する抗原が産生可能である。例えば、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二重機能のまたは二重特異性を有する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）または抗原結合配列を含む化合物を含む相補性決定領域（complementary determining regi on（ＣＤＲ））−移植抗体（ＣＤＲ−grafted antibodies）を含む。前記抗体は、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチドと特異的に結合する。また、本願は、Fab、Fab、Fab'、F(ab').sub.2、及びＦｖを含む抗体断片を提供する。本願で提供される抗体の結合特異性または独占性を決定する選別分析法は当業者に既に公知されている（Harlow et. al., (Eds), Antibodies A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)参照）。
【０５２１】
抗体は、提供された修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドまたはその断片を用いて当業者に既に公知の方法により産生可能である。免疫性のポリペプチドは、天然の供給源、組換え型宿主細胞から分離することもでき、化学的に合成されることもできる。修飾型ＥＰＯポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドはまた、免疫原性を増強させるために、keyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）などのハプテンと結合させることもできる。そのようなペプチドの合成方法は、例えば、 Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154; Krstenansky, et. al., (198 7) FEBS Lett. 211:10に開示されて、当業界に既に公知されている。本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドや他の修飾型治療用ポリペプチドに対する抗体は、また、修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を用いた免疫により製造可能である（例えば、Fan et. al., (1999) Nat. Biote ch. 17:870-872参照）。修飾型ＥＰＯポリペプチドや他の修飾型治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ネイキッドプラスミドＤＮＡの局所投与によるか、あるいは、例えば、ＤＮＡの筋肉内注射などの注射によりコードされたポリペプチドに対する抗体を生成するのに使用可能である。
【０５２２】
非ヒト抗体は当業界に周知な方法によりヒト化可能である。ある方法においては、非ヒト相補性決定領域（ＣＲＤ）は、ヒト抗体または共通の抗体のフレームワーク配列に挿入可能である。親和度や免疫原性を調節するためにさらなる変換が抗体のフレームワークに導入可能である。ひいては、抗体は、プラスチック抗体やモレキュラーインプリンティングポリマー（molecularly imprinted polymers (ＭＩＰｓ)）を含む（Haupt and Mosb- auch (1998) TIBTech 16:468-475）。このような形態の抗体は、例えば、イムノアフィニティによる分離に、クロマトグラフィーに、固体相抽出法に、免疫測定法に、イムノセンサーとして、及び化学的または生物学的ライブラリーをスクリーニングするために利用することができる。この種の抗体のメリットは、動物免疫化が不要であるということと、相対的に産生コストが安く、有機溶媒に抵抗性があり、しかも、長期間に亘って再使用可能であるということである。
【０５２３】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドや他の修飾型治療用ポリペプチドが結合する抗体は、診断方法や治療方法に使用可能である。例えば、抗体は、特定の細胞、組織や、血清における発現測定時にインビボ、インビトロまたはインサイチュにおいて修飾型治療用ポリペプチドの有無または量を測定する診断分析法に使用可能である。当業者に周知な様々な診断分析技術としては、ヘテロジーニアスまたはホモジーニアスな系で行われる競合結合測定法、直接的または間接的なサンドイッチ測定法、免疫沈降測定法などの当業界に周知な種々の診断分析技術を使用することができる（Zola (1987) Monoclonal Ant ibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. 147-158）。
【０５２４】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドを認知する抗体は、修飾型ＥＰＯポリペプチドに特異的でありうる。本願明細書に記述されたように、修飾型ＥＰＯポリペプチドに特異的な抗体は、野生型ＥＰＯポリペプチド、他の種からのＥＰＯポリペプチド（すなわち、種間変異体）、または他の修飾型ＥＰＯポリペプチドと比べて高い親和力をもって修飾型ＥＰＯポリペプチドと結合可能である。修飾型ＥＰＯポリペプチドを特異的に認知する抗体は、天然型ＥＰＯポリペプチド、他の種からのＥＰＯポリペプチド（すなわち、種間変異体）または他の修飾型ＥＰＯポリペプチドと特別に修飾型ＥＰＯポリペプチドを区別する診断分析法に使用可能である。しかも、抗体は、化学療法の薬物などの治療部分によりラベル可能であり、例えば、このようなポリペプチドを内在化可能な細胞の数を減らすために使用可能である。ひいては、本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドを認知する抗体は、エリスロポエチン活性を妨害または低減するために競合的またはドミナントネガティブ的により作用することができる。
【０５２５】
診断分析法に用いられる抗体は、測定を迅速化させるための測定可能な部分により標識することができる。測定可能な部分は、直接的にまたは間接的に測定可能なシグナルを産生することができる。例えば、測定可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ロダミンまたはルシペリンなどの蛍光性または化学発光型化合物、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはワサビペルオキシダーゼなどの酵素がある。抗体を測定可能な部分に結合するために当業界に周知な方法を適用することができる。前記方法は、Hunter et. al., (1962) Nature, 144: 945; David et. al., (1974) Biochemistry, 13:1014; Pain  et. al., (1981) J. Immunol. Meth., 40: 219; and Nygren (1982)  Histochem. and Cytoch em. 30: 407に開示された方法を含む。蛍光性分子などの部分は、ポリペプチド内のいかなる位置においても修飾型ＥＰＯポリペプチドを認知する抗体を含む修飾型治療用ポリペプチドと結合可能である。ポリペプチドと様々な部分との結合に用いられる化学は当業界に知られている。測定部分としての部分は、例えば、カルボジイミド結合を用いて抗体を含む修飾型治療用ポリペプチドと結合可能である（Bauminger and Wilchek (1980) Meth. Enzymol. 70:151-159）。カルボジイミドは、ＲとＲ’が脂肪族または芳香族化合物でありうるＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’の一般式を有する化合物の群を含み、ポリペプチド結合の合成に利用される。予備的な準備手続きは簡単であり、相対的に速くて穏やかな状態下においても行うことができる。カルボジイミド化合物は、カルボキシル基が自由アミノ基の反応部位に変化されるように攻撃する。カルボジイミド結合は、様々な化合物を抗体産生のための担体に結合させるために用いられてきた。水溶性のカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、本願で提供される抗体を含むポリペプチドに部分を結合させるのに有用である。
【０５２６】
本願で提供される修飾型ＥＰＯポリペプチドや他の治療用ポリペプチドに結合する抗体は、また、組換え細胞培養や天然の供給源から修飾型治療用ポリペプチドのアフィニティ精製に利用可能である。このような過程において、修飾型治療用ポリペプチドに対する抗体は、当業界に既に公知の方法を用いてセファデックスレジンまたはろ過紙などの好適な支持体に固定される。固定された抗体は、その後に精製の対象となる修飾型治療用ポリペプチドを含む試料と接触され、その後、支持体は固定された抗体に結合した修飾型治療用ポリペプチドを除く全ての物質を試料から十分に除去可能な好適な溶媒により洗い落とす。最後に、支持体は、抗体から修飾型治療用ポリペプチドを放出可能な他の好適な溶媒により洗い落とす。
【０５２７】
本願の修飾型ＥＰＯポリペプチドや修飾型治療用ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、医薬組成物の形態で様々な障害の処置のために投与可能である。本願の製剤は、また、好ましくは互いに否定的な影響を与えない相補的な活性を有する友好的な物質と一緒に処置される、特別な処方のために必要とされる１以上の活性成分を含むことができる。代替的にまたは付加的に、組成物は、例えば、細胞毒性物質、サイトカイン、化学的治療用薬物、または成長阻害薬物などその機能を強化する物質を含むことができる。このような分子は、意図した目的に有効性ある量にて複合物中に適切に存在する。
【実施例】
【０５２８】
Ｏ．実施例
下記の実施例は単に例示的な目的で含まれ、本願で提供される態様の範囲を制限するためのものではない。
【０５２９】
実施例１．
ＥＰＯ変異体のクローニング及び産生
１．ＥＰＯをコードするｃＤＮＡクローニング及び哺乳動物発現ベクターへの挿入
ヒトエリスロポエチンをコードする配列を含む塩基配列を（配列番号２２９）当業者に標準技術として広く知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてResGen OR F Expression Positive Gollectionから得たGenestorm（登録商標） Human Clone ID RG001720（販売元； Invitrogen, Catalog #H-K1000）において増幅した。塩基配列は、哺乳動物発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ（販売元；Invitrogen、配列番号２３０）に挿入した。このときに用いたプライマーは、下記の通りである。
ＥＰＯＢａｍＨＩ順方向プライマー：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号２３１）。
ＥＰＯＮｄｅＩ逆方向プライマー：５’ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２３２）。
【０５３０】
増幅されたエリスロポエチンｃＤＮＡ配列は、ｐＴＯＰＯ−ＴＡベクター（販売元：Invitro- gen）にクローニングしてｐＴＯＰＯ−ＴＡ−ｈＥＰＯプラスミドを製作した。ＥＰＯｃＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡ配列分析方法を用いて確認した。その後、ｐＴＯＰＯ−ＴＡ−ｈＥＰＯプラスミドをＮｏｔＩとＳｐｅＩ制限酵素を用いて切断し、ｈＥＰＯ断片をＮｏｔＩとＸｂａＩを用いて切断したｐＮＡＵＴにサブクローニングしてｐＮＡＵＴ−ｈＥＰＯ（配列番号２３３）を生成した。このＥＰＯ−ｃＤＮＡ塩基配列は、下記のプライマーを用いて塩基配列分析方法により確認した。
ｐＮＡＵＴ順方向プライマー：５’ＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号２３４）
ｐＮＡＵＴ逆方向プライマー：５’ＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号２３５）
コードされた成熟ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２と同じアミノ酸配列を有する。
【０５３１】
２．ＥＰＯ変異体の産生
予めデザインされた標的の変異体の集団を生成させて、アドレス可能なアレイにおいて個々の変異体が生成され、個別的にプロセッシングされ、互いに物理的に分離されるようにした。本願明細書に記述され、且つ、米国出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号及び米国出願公開第２００５−０２０２４３８Ａ１号に記述された２Ｄスキャニング技術を用いて、タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有するＥＰＯ変異体を企図して得た。（１）進化させるタンパク質特性（例えば、タンパク質分解に対する抵抗性または安定性）、（２）アミノ酸配列、及び（３）個々のアミノ酸の特性によりｉｓ−ＨＩＴが同定された。
【０５３２】
タンパク質分解に対する抵抗性を増強させるために産生されたＥＰＯ ＬＥＡＤ
２Ｄスキャニングを用いてタンパク質分解に対する抵抗性を付与する位置を同定するために変異体をデザインした。ｈＥＰＯ（配列番号２）上において選択された位置（ｉｓ−ＨＩＴ）は、次の通りである（番号付けは、シグナル配列を除く配列番号２の成熟ｈＥＰＯポリペプチドのアミノ酸位置に対応する）：Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｄ８、Ｒ１０、Ｌ１２、Ｅ１３、Ｒ１４、Ｙ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｋ２０、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ３１、Ｌ３５、Ｅ３７、Ｐ４２、Ｄ４３、Ｋ４５、Ｆ４８、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、Ｅ６２、Ｗ６４、Ｌ６７、Ｌ６９、Ｌ７０、Ｅ７２、Ｌ７５、Ｒ７６、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｐ８７、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｐ９０、Ｌ９１、Ｌ９３、Ｄ９６、Ｋ９７、Ｌ１０２、Ｒ１０３、Ｌ１０５、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｒ１１０、Ｌ１１２、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ｐ１２９、Ｌ１３０、Ｒ１３１、Ｄ１３６、Ｆ１３８、Ｒ１３９、Ｋ１４０、Ｌ１４１、Ｆ１４２、Ｒ１４３、Ｙ１４５、Ｆ１４８、Ｌ１４９、Ｒ１５０、Ｋ１５２、Ｌ１５３、Ｋ１５４、Ｌ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５９、Ｒ１６２、Ｄ１６５、Ｒ１６６。
【０５３３】
上述したｉｓ−ＨＩＴ位置における天然アミノ酸は、表１９に示すアミノ酸残基にそれぞれ置換した。
【０５３４】
【表１９】
2011520472.tif 000026
【０５３５】
タンパク質分解に対する増強された抵抗性を試験するために生成されたＥＰＯ変異体は、表２０（配列番号３−２０１）に示す。生成された変異体は、次の通りである。Ｐ２Ｓ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｎ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｅ７２Ｎ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｑ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ
、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑ。
【０５３６】
【表２０】
2011520472.tif 000027
【０５３７】
実施例２
哺乳動物細胞における天然型及び修飾型ヒトＥＰＯポリペプチド（タンパク質）の産生及び収率決定
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有 Dulbecco（登録商標） Modified Eagle（登録商標） 培地（ＤＭＥＭ、販売元： Invitrogen）において成長させた。形質感染の一日前に、ＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳ含有（抗生物質を除く）ＤＭＥＭ培地においてウェル当たりに５ｘ１０５の細胞濃度にて６−ウェルプレートに接種した後、翌日の形質感染時には５０〜９０％飽和度の細胞濃度となるように、３７℃、７％ＣＯ２組成を含む湿潤な大気下において培養した。
【０５３８】
ＣＨＯ細胞は、製造社による提示方法によりペルフェクチン試薬（製造社：Ozyme）を用いてＥＰＯ変異ＤＮＡ２ｕｇにより形質感染させた。形質感染後、細胞プレートは、３７℃、７％ＣＯ２組成を含む湿潤な大気下においてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）還元血清培地（製造社：Invitrogen）において４時間培養した。培養後、形質感染された培地を１％ＦＣＳ含有新たなＤＭＥＭ培地１ｍＬに交換した。９６時間後に細胞上澄み液を回収し、９６ウェルプレートに分注して−８０℃に保管した。
【０５３９】
回収した細胞上澄み液のｈＥＰＯ変異体ポリペプチドの濃度はヒトエリスロポエチン特異的なＥＬＩＳＡキット（製造社：ＩＢＬ, Hamburg, Germany）を用いて製造社による提示方法により測定した。ｈＥＰＯ変異体の濃度をタンパク質分解酵素抵抗性分析のために標準化した。
【０５４０】
実施例３
ＴＦ−１増殖検出法によるヒトＥＰＯの比活性の測定
それぞれの各カイネティクスポイント試料における残存する増殖活性（ＥＣ５０）を決定するために、ヒト赤白血病ＴＦ−１細胞株生分析において、異なる時間帯に得られたそれぞれの分注試料のタンパク質分解酵素の分解カイネティクスについて増殖分析を行った。ＴＦ−１細胞株をＴ１７５（１７５ｃｍ２）ポリスチレン組織培養フラスコにおいて、３７℃、７％ＣＯ２／９５％空気組成を含む湿潤な大気下において、１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、及び２ｎｇ／ｍｌヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（製造社：Invitrogen）に維持し、１週間に２回ずつ継代培養した。増殖アッセイ２４時間前に、細胞は冷たいＰＢＳにより２回洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦなし２ｍＭグルタミンと１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地において１６時間再懸濁した。
【０５４１】
ＴＦ１細胞をＧＭ−ＣＳＦなし２ｍＭグルタミンと１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地７０μｌにウェル当たりに４ｘ１０４の細胞数で９６ウェルプレートに分注した。各分画された試料を９６ウェルディーププレートにおいて２倍ずつ連続希釈し、ＥＰＯ希釈液（３０μｌ）を最終濃度７００００ｐｇ／ｍＬから３４．２ｐｇ／ｍＬまで７０μｌのＴＦ−１細胞含有各ウェルに添加した。各ＥＰＯ試料希釈液は３回反復評価した。非増殖細胞の基本吸光度を測定するために、平底９６ウェルプレートの最後の列（「Ｇ」列）にはＧＭ−ＣＳＦを添加しなかった。ＥＰＯについての第２の国際的な標準（ＮＩＢＳＣ、８８／５７４）とＧＭＣＳＦについての第１の国際的な標準（ＮＩＢＳＣ、８８／６４６）の両方を含む内部対照群を２倍ずつ連続希釈（７００００における３４．２ｐｇ／ｍＬ）させ、増殖結果を標準化するために分析プレートに３回反復添加した。
【０５４２】
プレートを７％ＣＯ２組成を含む湿潤な大気を維持しながら、３７℃において４８時間培養した。成長４８時間後に、Cell titer 96 Aqueous one solution reagent（製造社：Promega）２０μｌを各ウェルに添加し、７％ＣＯ２組成を含む大気下、３７℃において３時間培養した。ＭＴＳ細胞的還元により現れる色を帯びる可溶性のホルマザンの量を測定するために、染料の吸光度を４９０ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡプレート測定器（Spectramax（登録商標））を用いて測定した。
【０５４３】
４９０ｎｍにおいて測定された校正吸光度（「Ｇ」列の基本値を差し引く）をサイトカイン濃度によりグラフにて示した。ＥＣ５０値は、最大吸光度と最小吸光度との差の１／２に対応するＸ軸の値を求めることにより計算した（ＥＣ５０＝最大反応の半分を付与するために要求されるサイトカインの濃度）。
【０５４４】
実施例４
タンパク質分解抵抗性
ＥＰＯ変異体のタンパク質分解酵素抵抗性を評価した。天然型ＥＰＯと比較したＥＰＯ変異体の保護効果を評価するために、３７℃において、異なる時間帯に酵素分解を行った。天然型ＥＰＯとそれぞれのＥＰＯ変異体に対して、α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼ−ＧｌｕＣ及びトリプシン（製造社：Sigma）をそれぞれ含む１．５％タンパク質分解酵素混合液（ｗｔ／ｗｔ）を無血清ＲＰＭＩ培地４００μｌに混合することにより、タンパク質分解酵素混合溶液を準備した。カイネティクス分析のために１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（ＣＨＯＫ１培養培地）３００μｌに入っているそれぞれのＥＰＯ変異体または天然型タンパク質５５７．２ｎｇにタンパク質分解酵素混合溶液を添加することにより、タンパク質分解酵素による分解を開始した。培養時間は、次の通りである：０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、及び７ｈ。異なるカイネティクス時点においてそれぞれの試料に対して７０μｌの分画を取り、タンパク質分解酵素反応を中断させるために抗タンパク質分解酵素混合液（mini ＥＤＴＡ free、製造社：Roche−１つの錠剤を１０％ＦＣＳ含有１０ｍＬのＲＰＭＩ培地において溶解した）１０μｌずつ添加した。試料は、残存する増殖活性の測定前まで−８０℃に保管した。
【０５４５】
処理された試料の細胞増殖誘導活性は、各時点に残存する増殖活性を決定するために、実施例３に示す方法と同様にして分析した。代表的な非制限的修飾型ＥＰＯポリペプチドのタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、同じタンパク質分解酵素の処理条件下において天然型ＥＰＯの残存する増殖活性と比べて「変化なし」または「タンパク質分解酵素に対する増強された抵抗性」として表２１に示す。
【０５４６】
この資料は、全てのタンパク質分解酵素を代表することを意味するものではなく、これは例示的な資料であり、上記したタンパク質分解酵素を含む代表的なタンパク質分解酵素カクテルに対するタンパク質分解に対する抵抗性を示す。このため、この資料は包括的ではなく、他のＥＰＯポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性を有さないということを意味することはない。
【０５４７】
【表２１Ａ】
2011520472.tif 000028
【表２１Ｂ】
2011520472.tif 000029
【表２１Ｃ】
2011520472.tif 000030
【０５４８】
２回目の実験においては、さらに高いタンパク質分解酵素濃度におけるタンパク質分解抵抗性を測定した。この分析の実験過程は、タンパク質分解のためにα−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼ−ＧｌｕＣ及びトリプシン（製造社：Sigma）のそれぞれを含む３％タンパク質分解酵素混合液（ｗｔ／ｗｔ）を用いた以外は、上記の方法と同様にして行った。この実験の結果を表２２に示す。同表は、各試料間のタンパク質分解酵素に対する相対的な抵抗性として表現された：（＋）、（＋＋）、または（＋＋＋）、（＋＋＋）は最もタンパク質分解酵素抵抗性が高いものを言う。
【０５４９】
【表２２Ａ】
2011520472.tif 000031
【表２２Ｂ】
2011520472.tif 000032
【表２２Ｃ】
2011520472.tif 000033
【０５５０】
ＥＰＯ ＬＥＡＤの選別のために、残存する増殖活性とタンパク質分解酵素処理後の未分解ＥＰＯタンパク質の濃度を比較した。上記の実験のためのＥＰＯタンパク質濃度（表２２に示す）は、製造社による提示方法によりヒト特異的なＥＬＩＳＡキット（製造社：Ｒ＆Ｄ Systems）を用いて測定した。Ｌｅａｄは、試料におけるＥＰＯタンパク質量に対する残存する増殖活性レベルについての２つの分析の相関によって選択し、タンパク質分解酵素抵抗性が増強されたＥＰＯポリペプチドを決定した。。選択されたＥＰＯ ＬＥＡＤの結果は表２３に示す。この結果は、選択されたＥＰＯ ＬＥＡＤ間の相対的なタンパク質分解酵素抵抗性として表示した：（＋）、（＋＋）、または（＋＋＋）、ここで、（＋＋＋）は、最も高いタンパク質分解酵素抵抗性を有していることを意味する。
【０５５１】
【表２３】
2011520472.tif 000034
【０５５２】
表に示す資料は例示的な資料であり、上記したように、タンパク質分解酵素を含む代表的なタンパク質分解酵素カクテルを使用する特別な実験においてタンパク質分解に対する抵抗性を示す。このため、この資料は包括的ではなく、他のＥＰＯポリペプチドがタンパク質分解酵素抵抗性を有さないということを意味しない。
【０５５３】
実施例５
残存タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡを用いたタンパク質分解に対する抵抗性
増殖活性によりタンパク質の残存量を測定する代わりに、タンパク質の残存量をＥＬＩＳＡで測定したことを除いて、実施例４で記載したように候補ＥＰＯ Ｌｅａｄポリペプチドのタンパク質分解抵抗性を試験した。ＥＬＩＳＡは、増殖分析と比較して残存タンパク質の検出に一層精密な結果を提供する。また、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮをタンパク質分解酵素混合物に添加した。簡略に説明すると、４００μｌのＦＣＳ無添加ＲＰＭＩ培地を、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、及びトリプシン（Sigma）を含む１．５％タンパク質分解酵素混合物（ｗｔ／ｗｔ）と混合してタンパク質分解酵素の混合物を製造した。１％ＦＣＳ（ＣＨＯＫ１培地）が添加されたＤＭＥＭ培地で各々のＥＰＯポリペプチドに上記タンパク質分解酵素混合物溶液を添加してタンパク質分解反応を開始した。上記ＥＰＯポリペプチドは、３７℃でタンパク分解酵素と共に培養した。相異する反応時点で各試料を取り、タンパク質分解抑制剤（mini EDTA free, Roche −１つの錠剤が１０％ＦＣＳ含有１０ｍｌ ＲＰＭＩに溶解される）と混合してタンパク質分解を停止した。上記試料を−８０℃で凍結した後、各試料のＥＰＯの残存濃度をQuantikine IVD human EPO ELISA kit (R&D Systems, UK）を用いて測定した。次に、タンパク質分解前の元の濃度の割合を測定した。各々のＥＰＯ Ｌｅａｄポリペプチドの比活性（specific activity）を実施例３で記載したように測定した。その結果は、下記の表２４に表す。このような分析法は、残存タンパク質の検出に関してはより精密であったが、その結果は実施例４の結果と一致し、修飾Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ；Ｆ４８Ｉ；Ｋ５２Ｑ；Ｌ８０Ｉ；Ｐ９０Ｓ；Ｌ９３Ｖ；Ｌ９３Ｉ；Ｄ９６Ｑ；Ｋ１１６Ｔ；Ｌ１３０Ｉ；Ｒ１３１Ｈ；Ｒ１３１Ｑ；Ｒ１４３Ｈ；Ｒ１４３Ｑ；Ｒ１５０Ｈ；Ｄ１２３Ｎ；Ｄ１３６Ｎ；Ｅ１５９Ｎ；Ｋ１１６Ｎ；Ｋ４５Ｎ；Ｋ５２Ｎ；Ｄ１６５Ｑ；Ｄ１６５Ｈ；Ｄ１６５Ｎ；Ｒ１６６Ｈ；Ｌ１６Ｉ；Ｌ１６Ｖ；Ｒ１３９Ｈ；Ｒ１３９Ｑ；及びＬ１５３Ｖを含むＥＰＯ ＬＥＡＤがこのような分析条件で増加されたタンパク質分解酵素抵抗性を見せることを表す。提示されたデータは代表的なものであり、特定の実験条件下のタンパク質分解酵素抵抗性を反映するものであるので、包括的なものではなく、他のＥＰＯポリペプチドがタンパク質分解酵素抵抗性を表さないということを意味するのでない。
【０５５４】
【表２４Ａ】
2011520472.tif 000035
【表２４Ｂ】
2011520472.tif 000036
【表２４Ｃ】
2011520472.tif 000037
【表２４Ｄ】
2011520472.tif 000038
【表２４Ｅ】
2011520472.tif 000039
【０５５５】
実施例６
ＳｕｐｅｒＬＥＡＤのタンパク質分解に対する抵抗性
実施例４及び５に記載した実験においてタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す個々のＬＥＡＤを合わせてＳｕｐｅｒＬＥＡＤポリペプチドを生成した。修飾Ｒ４Ｈ及び実施例４及び５で記載したタンパク質分解に対して増加された抵抗性を表す１つ以上の追加の候補ＬＥＡＤ修飾を各々含む代表的なＳｕｐｅｒ−Ｌｅａｄポリペプチドをデザインした。生成される代表的なＳｕｐｅｒＬＥＡＤは、タンパク質分解に対する抵抗性は実施例５で記載した通り試験し、比活性は実施例３で記載した通り試験した。その結果を、下記の表２５に表す。
【０５５６】
【表２５】
2011520472.tif 000040
【０５５７】
実施例７
糖化により隠されたタンパク質分解可能な位置の同定
天然型ＥＰＯにおいて糖化により隠蔽可能なタンパク質分解に対して感受性を有する位置を決定するために、Ｎ２４Ｈ（配列番号２４４）、Ｎ３８Ｈ（配列番号２４５）またはＮ８３Ｈ（配列番号２４６）アミノ酸置換を含むＥＰＯ変異体をそれぞれ産生してタンパク質分解に対する抵抗性を実験した。各々の脱糖化型変異体は、ＣＨＯ細胞において発現された。簡略に説明すれば、形質感染の一日前にＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（INtrogen,ＣＡ）において５ｘ１０５細胞／ウェル濃度にて６−ウェルプレートにおいて接種した後、３７℃の湿潤な大気下において培養した。
【０５５８】
ＣＨＯ細胞は、製造社による提示方法によりペルフェクチン試薬（製造社：Ozyme）を用いてＥＰＯ変異ＤＮＡ２ｕｇにより形質感染させた。形質感染された細胞は、３７ｏＣの湿潤な大気下においてOptimem培地（製造社：Invitrogen）において４時間培養した。その後、形質感染された培地を１％ＦＣＳ含有新たなＤＭＥＭ培地１ｍＬに交換した。９６時間後に、ＥＰＯポリペプチドを含有する細胞上澄み液を回収して分注し、−８０℃に保管した。各ＥＰＯ変異体濃度は、Quantikine IVD human EPO ELISAキット（製造社：Ｒ＆Ｄ Systems,ＵＫ）を用いて製造社による提示方法により標準化された。
【０５５９】
各変異体のタンパク質分解酵素に対する感受性を完全糖化型天然型ＥＰＯポリペプチドと比べて評価するために、タンパク質分解酵素の集合を用いた培養により酵素的切断反応を行った。α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼ−ＧｌｕＣ及びトリプシン（製造社：Sigma）含有１．５％タンパク質分解酵素混合液を（ｗｔ／ｗｔ）４００μｌの無血清ＲＰＭＩ培地に混合してタンパク質分解酵素混合溶液を準備した。タンパク質分解カイネティクスは、１％ＦＣＳ（ＣＨＯＫ１培養培地）含有ＤＭＥＭ培地にある各ＥＰＯポリペプチドにタンパク質分解酵素混合溶液を添加して開始した。ＥＰＯポリペプチドは、３７℃においてタンパク質分解酵素と培養した。異なるカイネティクス時点（０ｈｒ、０．５ｈｒ、１ｈｒ、２ｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、及び８ｈｒ）において各試料の分画を得、タンパク質分解を中断させるために抗タンパク質分解酵素混合液（mini EDTA free 、製造社：Roche−１つの錠剤を１０％ＦＣＳ含有１０ｍＬのＲＰＭＩに溶かした。）を添加した。各試料は−８０℃に冷凍させ、各試料のＥＰＯ濃度はＥＬＩＳＡにより上記の方法と同様にして測定した。
【０５６０】
ＥＰＯ変異体において、Ｎ３８糖化部位の変異がタンパク質分解の影響を非常に受けやすいことが観察された。ＥＰＯ変異体において、Ｎ８３とＮ２４糖化部位の変異はそれぞれ中間または低いレベルでタンパク質分解の影響を受けやすいことが判明された。このため、Ｎ３８が最も感受性に影響を及ぼす位置であることが確認され、Ｎ８３は中間レベルであり、Ｎ２４はあまり影響を及ぼさない位置であると考慮される。
【０５６１】
どのｉｓ−ＨＩＴｓが糖化型ＥＰＯポリペプチドにおいて「隠蔽」可能であるが、脱糖化時にタンパク質分解酵素に露出可能であるかを決定するために、Ｎ糖化部位から、タンパク質分解酵素に感受性を有する位置として実施例１、２で同定したｉｓ−ＨＩＴｓまでの距離分析が行われた。表２６は、糖化部位から１０Åまたは１５Åの半径以内に位置するｉｓ−ＨＩＴ位を示す（シグナル配列無し配列番号２の成熟ｈＥＰＯポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応して番号を付ける）。
【０５６２】
【表２６】
2011520472.tif 000041
【０５６３】
実施例８
タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する脱糖化型ＥＰＯ変異体の産生
タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する脱糖化型ＥＰＯ変異体を産生するために選択される一つまたはそれ以上のｉｓ−ＨＩＴ位置において、糖化が減少されたＥＰＯポリペプチドを修飾した。下記のセクション１−３において説明するように、３つの初期過程は部分脱糖化型ＥＰＯ変異体に対する保護効果を有する変異を究明するために用いられた。ＥＰＯポリペプチドは、Ｎ３８及びＮ８３のどちらか一方の一連の変異により徐々に脱糖化された。各脱糖化段階において、タンパク質分解に対して感受性を有する位置を除去するために選択されるｉｓ−ＨＩＴ位置において変異をポリペプチドに導入し、任意の変異がＮ３８及びＮ８３位置において脱糖化型変異体を保護することができるかを決定した。このような変異体は、実施例１〜４においてタンパク質分解に対する保護的効果を有すると同定されたＬＥＡＤにより保有されるＲ１３９Ｈ、Ｋ２０Ｑ、Ｅ１５９Ｎ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ５２Ｎ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、及びＲ４Ｈアミノ酸置換を含む。ＥＰＯ変異体はタンパク質分解酵素抵抗性を評価し、タンパク質分解酵素抵抗性が増強された変異体は新たな変異を導入するための鋳型として用いられた。下記のセクション４において説明するように、この過程の最後の段階は、最後のＮ糖化部位、Ｎ−２４の変異を含み、このような変異の導入がタンパク質分解に対する保護作用を有するＮ糖化なしＥＰＯ変異体を保護するということを示す。
【０５６４】
前記実施例１及び２に示す方法によりＥＰＯ変異体を生成して発現させ、上述したようなＥＬＩＳＡ方法により濃度を測定した。完全糖化型天然型ＥＰＯポリペプチドも産生した。完全非糖化型ＥＰＯポリペプチドは、糖化型ＥＰＯタンパク質（European pharmacopeia (EP) reference standard; E1515000, Batch 3.0）を脱糖化させることにより産生した。脱糖化は、製造社による提示方法によりGlyco Pro Enzymatic De-glycosylated Kit（製造社：Prozyme、ＧＫ８０１１０）を用いて効果的に行った。簡略に説明すれば、１＞１０７ｐｇ／ｍｌのＥＰＯをＮ−グリカナーゼＰＮＧａｓｅＦ、シアリダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ、ガラクトシダーゼｂ（１−４）およびｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む１×培養緩衝液と一緒に３７℃において一晩中培養した。
【０５６５】
ＥＰＯ変異体と対照ポリペプチド（完全糖化型天然型ＥＰＯ、及び完全脱糖化型ＥＰＯ）のタンパク質分解抵抗性を評価するために、３７℃において所定の期間中に酵素的切断反応を行った。α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ及びトリプシン（製造社：Sigma）を含む１．５％タンパク質分解酵素混合液を（ｗｔ／ｗｔ）４００μｌのＦＣＳなしＲＰＭＩ培地に混合してタンパク質分解酵素混合溶液を準備した。タンパク質分解カイネティクスは、１％のＦＣＳ（ＣＨＯＫ１培養培地）含有ＤＭＥＭ培地にある各ＥＰＯポリペプチドにタンパク質分解酵素混合溶液を添加して開始した。ＥＰＯポリペプチドは、３７℃においてタンパク質分解酵素と培養した。異なるカイネティクス時点において各試料の分画を得、タンパク質分解を中断させるために抗タンパク質分解酵素混合液（mini EDTA free、製造社：Roche−１つの錠剤を１０％のＦＣＳ含有１０ｍＬのＲＰＭＩに溶かした。）を添加した。各試料は−８０℃において冷凍させ、各試料の残存ＥＰＯ濃度はQuantikine IVD human EPO ELISA kit（製造社：Ｒ＆Ｄ Systems, ＵＫ）を用いて測定した。その後、タンパク質分解前初期濃度によるパーセントを決定した。
【０５６６】
１．タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する部分脱糖化型Ｎ３８ＨＥＰＯ変異体の産生
最初の実験過程により、Ｎ３８Ｈ変異体に起因する部分脱糖化型タンパク質分解酵素に対して抵抗性を有するＥＰＯポリペプチドを究明した。Ｎ３８Ｈ変異体を含む部分脱糖化型ＥＰＯポリペプチドから確認されたタンパク質分解感受性を回復させるために、実施例２〜４において同定された選択されたＬＥＡＤ変異をＮ３８Ｈ変異体ポリペプチドに順次に挿入し、タンパク質分解に対する抵抗性を実験した。完全糖化型または非糖化型（例えば、完全脱糖化型）ＥＰＯポリペプチドに対しても実験を行った。
【０５６７】
Ｒ１３９Ｈ変異体がＮ３８Ｈ／Ｒ１３９ＨＥＰＯ変異体（配列番号２４７）を産生するためにＮ３８Ｈ変異体に最初に挿入された。上記したように、Ｎ３８Ｈ変異体、完全糖化型ポリペプチド、脱糖化型ポリペプチドもタンパク質分解に対する抵抗性が分析された。Ｎ３８ＨとＲ１３９Ｈ変異の両方を含むＥＰＯ変異体は完全糖化型天然型ＥＰＯと類似する程度のタンパク質分解敏感度を示している。タンパク質分解１時間後に存在する完全糖化型ＥＰＯと部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９ＨＥＰＯ変異体の濃度は、それぞれ初期濃度の４８％、４４％であった。比較すると、非保護Ｎ３８Ｈ変異体の１７％だけがタンパク質分解１時間後に残っていた。基本的に完全脱糖化型ＥＰＯポリペプチドはいずれも反応１時間の間にタンパク質分解酵素により切断された。タンパク質分解２時間後には非保護Ｎ３８Ｈ変異体は僅か２％だけが残っており、これに対し、完全糖化型ＥＰＯと部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９ＨＥＰＯ変異体はそれぞれ１５％と１４％が残っていた。この結果は、Ｒ１３９Ｈ変異が、アミノ酸Ｎ３８位における糖化がＥＰＯポリペプチドに付与する保護的効果を代替することができるということを示す。
【０５６８】
実施例２から実施例４において究明されてＬＥＡＤに含まれた追加変異をＮ３８ＨとＲ１３９Ｈ変異を含むＥＰＯ変異体に挿入して３重変異型ＥＰＯポリペプチドを生成した。Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ２重変異とＲ４Ｈ（配列番号２４８）、Ｌ９３Ｉ（配列番号２４９）、Ｋ２０Ｑ（配列番号２５０）、Ｅ１５９Ｎ（配列番号２５１）、Ｋ５２Ｎ（配列番号２５２）及びＬ１５３Ｖ（配列番号２５３）それぞれを含むＥＰＯポリペプチドを生成し、様々なタンパク質分解に対する感受性を評価した。場合によっては、付加的なタンパク質分解酵素に対して感受性を有する位置を除去するために行ったＮ３８Ｈ／Ｒ１３９ＨＥＰＯ変異体へのＬＥＡＤ変異の挿入は、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ２重変異体、及び完全糖化型天然型ＥＰＯと比べてタンパク質分解抵抗性が増強される結果を示す。タンパク質分解１時間後に、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と完全糖化型ＥＰＯポリペプチドは約４６％が残っていた。Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２ＮまたはＮ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ変異を含む変異体においては、ほとんど同様またはやや良好な結果が得られた。タンパク質分解１時間後の部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ及びＮ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ変異体の濃度は、初期濃度の約６０％であった。３重のＮ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ２０Ｑ変異体は、タンパク質分解１時間後に６４％のタンパク質が残っていて、タンパク質分解に対して最も抵抗性が高い変異体であることが確認された。タンパク質分解酵素との２時間反応後、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と完全糖化型天然型ＥＰＯがそれぞれ約１４％、１８％残っているのに対し、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ２０Ｑ変異体は４３％が残っていた。
【０５６９】
２．タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３ＨＥＰＯ変異体の産生
第２の実験段階は、Ｎ３８とＮ８３の両方の変異に起因する部分脱糖化型タンパク質分解酵素抵抗性ＥＰＯポリペプチドを究明した。Ｒ１３９Ｈ変異をＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ２重変異ＥＰＯ変異体内に挿入した。これにより得られたＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体（配列番号２５４）が４重変異Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ（配列番号２５５）を生成するためにＫ２０Ｑなどの付加的な変異が導入される鋳型として用いられた。ＥＰＯ変異体はＣＨＯ細胞において発現されて、上記したようにタンパク質分解抵抗性を分析した。単一Ｎ３８Ｈ変異または２重Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異、完全糖化型ＥＰＯポリペプチド、及び部分脱糖化型ＥＰＯポリペプチドを含むＥＰＯ変異体に対するタンパク質分解酵素抵抗性を分析した。Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と完全糖化型ＥＰＯタンパク質がタンパク質分解１時間後にそれぞれ４５％と４９％残っていたのに対し、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体は僅か１７％が前者と比較したときにタンパク質分解抵抗性が減少したことを示す。これは、Ｎ８３位における糖化がＥＰＯポリペプチドにタンパク質分解に対する保護効果をいかに大きく付与するかを示す。しかしながら、この保護効果は、Ｋ２０Ｑ変異挿入により回復された。Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ４重変異体は、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と完全糖化型ＥＰＯタンパク質から観察される程度のタンパク質分解抵抗性を示す。タンパク質分解１時間後に、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体の４８％が残っていた。タンパク質分解２時間後には２１％が残り、これは、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体（１６％）よりも僅かに高く、かつ、完全糖化型ＥＰＯタンパク質（２５％）よりは僅かに低かった。
【０５７０】
３．タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３ＨＥＰＯ変異体の産生
第３の実験過程は、タンパク質分解抵抗性を増強させるためのこれらの変異体の能力を評価するために、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体を鋳型として用いて付加的な変異を挿入した。Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９ＨとＬ９３Ｖ（配列番号２５６）、Ｌ８０Ｉ（配列番号２５７）またはＬ９３Ｉ（配列番号２５８）をそれぞれ含むＥＰＯ変異体を製作し、ＣＨＯ細胞において発現させた。変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を分析し、このとき、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体、完全糖化型ＥＰＯポリペプチド及び部分脱糖化型ＥＰＯポリペプチドも分析した。Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９ＨにＬ９３Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ９３Ｉ変異のいかなるものを挿入しても、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と比べてタンパク質分解酵素に対する抵抗性が増強された。タンパク質分解１時間後にＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈの２６％が残っており、完全糖化型天然型ＥＰＯは４６％残っていた。これと比較すれば、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ及びＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ変異体はそれぞれ３０％、３７％、４５％がタンパク質分解酵素との１時間反応後にも残っていた。タンパク質分解２時間後の完全糖化型タンパク質は１４％が残り、且つ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体は４％残っていたのに対し、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ及びＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖは８％、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ変異体は３％残っていた。
【０５７１】
４重変異体（Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２５７）、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｉ（配列番号２５８）及びＮ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｖ（配列番号２５６））のそれぞれは「Umbrella 83」変異体と命名し、Ｋ２０Ｑ置換を挿入する付加的な変異のための鋳型として用いられた。これを通じて次の変異体を製造した：
Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｌ８０Ｉ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ（配列番号２５９）、
Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ（配列番号２６０）、
及びＫ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ（配列番号２６１）。
【０５７２】
これらの変異体も、上述したような分析を通じてタンパク質分解酵素抵抗性が評価された。Umbrella83変異体にＫ２０Ｑ変異を挿入したとき、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と比べてＥＰＯポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性が増強された。タンパク質分解１時間後に、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体は初期濃度の３７％が残っていた。これと比較すれば、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｌ８０Ｉ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９ＨとＫ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ変異体は５８％、Ｋ２０Ｑ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ変異体は７１％が残っていた。タンパク質分解酵素抵抗性に対するこのレベルは、完全糖化型ＥＰＯポリペプチド（７１％残存）と同等なレベルであった。
【０５７３】
４．タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する完全脱糖化型Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３ＨＥＰＯ変異体の生成
上記の１−３に示す３過程を通じて部分脱糖化型ＥＰＯポリペプチドに顕著なタンパク質分解酵素抵抗性を付与する変異体を確認した。特に、Ｋ２０ｉｓ−ＨＩＴ位置はタンパク質分解に重要な位置であることが示され、この位置の適切な変異はＮ３８及び／またはＮ８３位の変異を含む部分脱糖化型ＥＰＯポリペプチドに増強されたタンパク質分解酵素抵抗性を付与することができるということを示唆する。他のＮ糖化部位、すなわち、Ｎ２４に近い接近性のために、Ｋ２０Ｈ変異は２４位置における脱糖化に対する保護効果を示すかもしれない。脱糖化型ＥＰＯポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性の付与に関与するＫ２０Ｈ変異と他のＬＥＡＤ変異の能力を評価するために、各Ｎ糖化部位を変異させた一連の変異体を製造した。
【０５７４】
最初の一連の変異体は、Umbrella 83変異体（前記実施例６．３）にＮ２４Ｈ変異を挿入した。その結果として生成された完全脱糖化型ＥＰＯ変異体は、次の変異体を含む：
Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２６２）、
Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ（配列番号２６３）、
または、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ（配列番号２６４）。
【０５７５】
Ｎ３８Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、及びＮ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体、完全糖化型天然型ポリペプチド、脱糖化型ポリペプチドと一緒にこれらの変異体に対してタンパク質分解酵素抵抗性を評価した。変異誘発によるＮ−２４糖化部位の除去は、完全糖化型ＥＰＯポリペプチドと部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体と比べてＥＰＯ変異体の抵抗性を減少させた。しかしながら、特徴的に、完全脱糖化型対照ＥＰＯポリペプチドと比較すれば、抵抗性が高いことが分かる。完全糖化型ＥＰＯと部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ及びＮ３８ＨＥＰＯ変異体のタンパク質分解１時間後における残存濃度は、初期濃度に対してそれぞれ７０％、６２％、２７％であった。完全脱糖化型天然型ＥＰＯポリペプチドの僅か４％だけが反応１時間後にタンパク質分解酵素により切断されずに残っていた。これと比較すれば、脱糖化型Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ及びＮ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ変異体は、反応１時間後に２１％、２２％、％が残っていた。
【０５７６】
上記したように、完全脱糖化型変異体に対するＫ２０Ｑ変異の保護的効果を評価するために、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、またはＮ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ変異体を鋳型としてＫ２０Ｑ変異を製造した。これを通じて得られた脱糖化型ＥＰＯ変異体は、次の変異体を含む：
Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２６５）、
Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ（配列番号２６６）、または
Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ（配列番号２６７）。
【０５７７】
Ｎ３８Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体、完全糖化型天然型ポリペプチド、脱糖化型ポリペプチドと一緒にこれらの変異体に対してタンパク質分解に対する抵抗性を評価した。脱糖化Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ、及びＫ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｖ変異体は、タンパク質分解酵素により切断されずに残っているポリペプチドの量が３５から４２％であり、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体から観察されたのと同様なタンパク質分解酵素抵抗性を示す。このような抵抗性レベルは、保護的変異を全く含んでいない完全脱糖化型ＥＰＯポリペプチド（４％残存）から観察されるよりも遥かに高いものである。しかしながら、完全糖化型天然型ＥＰＯポリペプチド（７１％残存）と部分脱糖化型Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体（６２％残存）のそれよりは低かった。
【０５７８】
糖化が完全に除去されたＥＰＯポリペプチドがタンパク質分解から保護可能であるかどうかを確認するために、付加的なＬＥＡＤ変異を脱糖化型変異体に導入した。これを通じて得られた脱糖化型ＥＰＯ変異体は、次を含む：
Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２６８）、
Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ（配列番号２６９）、
Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ（配列番号２７０）、
Ｌ１５３Ｖ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２７１）及び、
Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉ（配列番号２７２）。
【０５７９】
Ｎ３８Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｒ１３９Ｈ、Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ変異体、天然型完全糖化型ポリペプチド、脱糖化型ポリペプチドと一緒にこれら変異体に対してタンパク質分解抵抗性を評価した。新たな変異体のそれぞれは、完全糖化型天然型ＥＰＯポリペプチドと比較したときに同等またはやや高いタンパク質分解抵抗性を示した。タンパク質分解１時間後におけるポリペプチドの初期濃度に対する残存量のパーセントは、Ｅ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉは７５％、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖは７６％、Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０ＩとＬ１５３Ｖ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉは７９％、そしてＥ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉは８１％であった。
【０５８０】
比較すれば、完全糖化型ＥＰＯポリペプチドはタンパク質分解１時間後に僅か７１％が残っており、完全脱糖化型ＥＰＯはわずか４％だけが残っていた。タンパク質分解２．５時間後におけるＥＰＯの初期濃度に対する残存量のパーセントは、Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖは２４％、Ｌ１５３Ｖ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０ＩとＥ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０ＩとＥ１５９Ｎ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉは２５％、そしてＲ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｎ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ８０Ｉは２７％であった。
比較すれば、完全糖化型ＥＰＯポリペプチドの２時間反応後における残存量は２３％であり、完全脱糖化型ＥＰＯは全く残っていなかった。
【０５８１】
実施例９
遮蔽された位置で修飾を含む脱糖化されたＥＰＯポリペプチドのタンパク質分解に対する増加された抵抗性
三個の糖化位置の全てをヒスチジン（Ｈ）、即ちＮ２４Ｈ／Ｎ３８Ｈ／Ｎ８３Ｈ（本願ではＮＨ３と表す）に修飾して脱糖化したＬＥＡＤ即ちＳｕｐｅｒ−ＬＥＡＤ ＥＰＯポリペプチドを生成した。また、実施例２で記載したように、ＣＨＯ細胞で天然ＥＰＯを生成して完全に糖化された天然ＥＰＯポリペプチドを製造した。糖化されたＥＰＯタンパク質（European pharmacopeia (EP) reference standard; E1515000, Batch 3.0）を脱糖化して完全に非糖化したＥＰＯポリペプチドを生成した。脱糖化はGlycoPro Enzymatic Deglycosylation Kit (Prozyme, GK80110)を用いて製造社の指示に従って実施した。簡略に説明すると、１ｘ１０７ｐｇ／ｍｌのＥＰＯを、Ｎ−グリカナーゼＰＮＧａｓｅ Ｆ、シアリダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ、ガラクトシダーゼｂ（１−４）、及びｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含有する１×培養緩衝液と共に３７℃で一晩中培養した。
【０５８２】
ＥＰＯ変異及び対照群ポリペプチド（完全に糖化された天然ＥＰＯ、及び完全脱糖化されたＥＰＯ）のタンパク質分解に対する抵抗性を評価するために、実施例５で記載したように、３７℃で所定時間の間酵素分解を遂行した。４００μｌのＦＣＳ無添加ＲＰＭＩ培地をα−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、及びトリプシン（Sigma）を含有する１．５％タンパク質分解酵素混合物と混合してタンパク質分解酵素の混合物を製造した。１％ＦＣＳ（ＣＨＯＫ１培地）が添加されたＤＭＥＭ培地で各々のＥＰＯポリペプチドに上記タンパク質分解酵素混合物溶液を添加してタンパク質分解反応を開始した。上記ＥＰＯポリペプチドは、３７℃でタンパク分解酵素と一緒に培養した。相異する反応時点で各試料を取り、タンパク質分解抑制剤（mini EDTA free, Roche−１つの錠剤が１０％ＦＣＳ含有１０ｍｌ ＲＰＭＩに溶解される）と混合してタンパク質分解を停止した。上記試料を−８０℃で凍結した後、各試料のＥＰＯの残存濃度をQuantikine IVD human EPO ELISA kit (R&D Systems, UK）を用いて測定した。次に、タンパク質分解の以前の本来濃度の割合を測定した。
【０５８３】
三重脱糖化されたＥＰＯ ＬＥＡＤ即ちＳｕｐｅｒ−ＬＥＡＤポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を完全糖化された天然ＥＰＯポリペプチド及び非糖化されたＥＰＯポリペプチドと比較した。その結果は、下記の表２７及び表２８に表す。
【０５８４】
【表２７Ａ】
2011520472.tif 000042
【表２７Ｂ】
2011520472.tif 000043
【０５８５】
【表２８Ａ】
2011520472.tif 000044
【表２８Ｂ】
2011520472.tif 000045
【０５８６】
修飾は当業者にとって自明であるため、本発明は請求の範囲によってのみ限定さるべきである。
【図１Ａ】
2011520472.tif 000046
【図１Ｂ】
2011520472.tif 000047
【図２】
2011520472.tif 000048
【配列表】
2011520472000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月28日(2011.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号２３７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸修飾Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｅ７２Ｑ、Ｅ７２Ｈ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７５Ｉ、Ｒ７６Ｈ、Ｒ７６Ｑ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｐ１２１Ｓ、Ｐ１２１Ａ、Ｐ１２２Ｓ、Ｐ１２２Ａ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｌ１３０Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、及びＹ１４５Ｉのうちから選択される、相異する糖化部位により遮蔽された遮蔽ｉｓ−ＨＩＴ残基における１つ以上のアミノ酸修飾、及び
配列番号２または配列番号２３７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸修飾Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｈ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ｋ４５Ｔ、Ｋ４５Ｎ、Ｆ４８Ｉ、Ｆ４８Ｖ、Ｙ４９Ｈ、Ｙ４９Ｉ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｑ、Ｋ５２Ｔ、Ｋ５２Ｎ、Ｒ５３Ｈ、Ｒ５３Ｑ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ５５Ｑ、Ｅ５５Ｈ、Ｅ５５Ｎ、Ｅ６２Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｑ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｒ１６２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｈ、Ｄ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｈ、及びＲ１６６Ｑのうちから選択される、遮蔽されていないｉｓ−ＨＩＴ残基における１つ以上の追加のアミノ酸修飾を含む、
修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記修飾は、Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｒ４Ｈ；Ｒ１３９Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ１３９Ｈ／Ｌ１５３Ｖ及びＲ１３９Ｈ／Ｅ１５９Ｎのうちから選択される、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項３】
Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ／Ｒ１３９Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ１５３Ｖ；Ｋ２０Ｑ／Ｅ１５９Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｒ４Ｈ；Ｋ２０Ｑ／Ｋ５２Ｎ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ８０Ｉ；Ｋ２０Ｑ／Ｌ９３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｅ１５９Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３９Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｄ９６Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１３０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１５３Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｋ２０Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｆ４８Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１３１Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｋ４５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ５２Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ８０Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｔ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１２３Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１３６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｐ９０Ｓ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｄ１６５Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｋ１１６Ｎ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１６６Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｉ；Ｒ４Ｈ／Ｌ１６Ｖ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１４３Ｑ；Ｒ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｒ１５０Ｈ；Ｒ４Ｈ／Ｒ１４３Ｑ／Ｒ１５０Ｈ；及びＲ４Ｈ／Ｌ９３Ｉ／Ｅ１５９Ｎのうちから選択された１つ以上のアミノ酸修飾を、未修飾型ＥＰＯポリペプチドにおいて含む、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、糖化、部分的糖化、または脱糖化されたものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは部分的に糖化されるか、糖化部位Ｎ２４、Ｎ３８、Ｎ８３またはＳ１２６のうちの１つ以上で、１つ以上の追加のアミノ酸修飾により脱糖化されたものであり、前記追加のアミノ酸修飾は前記糖化部位で糖化を除去するものである、請求項４に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項６】
前記修飾は、Ｎ２４Ｈ、Ｎ３８Ｈ、Ｎ８３Ｈ、Ｎ２４Ｋ、Ｎ３８Ｋ、及びＮ８３Ｋのうちから選択されたアミノ酸置換である、請求項５に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項７】
ＥＰＯポリペプチドにおいて２つ以上の修飾を含み、かつ前記修飾のうちの１つ以上は配列番号２または配列番号２３７に記載されたアミノ酸残基に対応するＲ４Ｈである、修飾型エリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項８】
前記１つ以上の追加のアミノ酸修飾は、Ｐ２Ｓ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ｓ、Ｐ３Ａ、Ｒ４Ｑ、Ｌ５Ｉ、Ｌ５Ｖ、Ｃ７Ｓ、Ｃ７Ｖ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｉ、Ｃ７Ｔ、Ｄ８Ｑ、Ｄ８Ｈ、Ｄ８Ｎ、Ｒ１０Ｈ、Ｒ１０Ｑ、Ｌ１２Ｖ、Ｌ１２Ｉ、Ｅ１３Ｑ、Ｅ１３Ｈ、Ｅ１３Ｎ、Ｒ１４Ｈ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｈ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１６Ｉ、Ｌ１６Ｖ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｅ１８Ｑ、Ｅ１８Ｈ、Ｅ１８Ｎ、Ｋ２０Ｑ、Ｋ２０Ｔ、Ｋ２０Ｎ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｈ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｎ、Ｃ２９Ｓ、Ｃ２９Ｖ、Ｃ２９Ａ、Ｃ２９Ｉ、Ｃ２９Ｔ、Ｅ３１Ｑ、Ｅ３１Ｈ、Ｅ３１Ｎ、Ｌ３５Ｖ、Ｌ３５Ｉ、Ｅ３７Ｑ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｎ、Ｐ４２Ｓ、Ｐ４２Ａ、Ｄ４３Ｈ、Ｋ４５Ｔ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｈ、Ｋ５２Ｔ、Ｍ５４Ｖ、Ｍ５４Ｉ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｈ、Ｅ６２Ｎ、Ｗ６４Ｓ、Ｗ６４Ｈ、Ｌ６７Ｉ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｌ６９Ｉ、Ｌ７０Ｉ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｐ８７Ｓ、Ｐ８７Ａ、Ｗ８８Ｓ、Ｗ８８Ｈ、Ｅ８９Ｑ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｎ、Ｐ９０Ｓ、Ｐ９０Ａ、Ｌ９１Ｉ、Ｌ９１Ｖ、Ｌ９３Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｄ９６Ｑ、Ｄ９６Ｈ、Ｄ９６Ｎ、Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｔ、Ｋ９７Ｎ、Ｌ１０２Ｖ、Ｌ１０２Ｉ、Ｒ１０３Ｈ、Ｒ１０３Ｑ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｖ、Ｌ１０８Ｉ、Ｌ１０８Ｖ、Ｌ１０９Ｉ、Ｌ１０９Ｖ、Ｒ１１０Ｈ、Ｒ１１０Ｑ、Ｌ１１２Ｖ、Ｌ１１２Ｉ、Ｋ１１６Ｑ、Ｋ１１６Ｔ、Ｋ１１６Ｎ、Ｅ１１７Ｑ、Ｅ１１７Ｈ、Ｅ１１７Ｎ、Ｄ１２３Ｈ、Ｄ１３６Ｑ、Ｄ１３６Ｈ、Ｄ１３６Ｎ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｖ、Ｒ１３９Ｈ、Ｒ１３９Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｌ１４１Ｉ、Ｌ１４１Ｖ、Ｆ１４２Ｉ、Ｆ１４２Ｖ、Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｑ、Ｙ１４５Ｈ、Ｙ１４５Ｉ、Ｆ１４８Ｉ、Ｆ１４８Ｖ、Ｌ１４９Ｉ、Ｌ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｑ、Ｋ１５２Ｑ、Ｋ１５２Ｔ、Ｋ１５２Ｎ、Ｌ１５３Ｉ、Ｌ１５３Ｖ、Ｋ１５４Ｑ、Ｋ１５４Ｔ、Ｋ１５４Ｎ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｉ、Ｙ１５６Ｈ、Ｙ１５６Ｉ、Ｅ１５９Ｑ、Ｅ１５９Ｈ、Ｅ１５９Ｎ、Ｄ１６５Ｈ、Ｒ１６６Ｈ、Ｒ１６６Ｑ、Ｆ４８Ｉ、Ｋ５２Ｑ、Ｄ９６Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｒ１３１Ｈ、Ｒ１３１Ｑ、Ｄ１２３Ｎ、Ｅ１５９Ｎ、Ｋ４５Ｎ、Ｋ５２Ｎ、Ｄ１６５Ｑ、Ｄ１６５Ｎ及びＲ１６６Ｈのうちから選択される、請求項７に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項９】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６個のアミノ酸長を有する、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列、または配列番号２または２３７で記載された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含む、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１１】
前記未修飾型ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または２３７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは更に修飾され、前記修飾は、免疫原性の変化に寄与する修飾、カルボキシ化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、燐酸化、酸化、ＰＥＧ化、アルブミン化またはポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性に寄与する修飾の１つ以上である、請求項１に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の修飾型ＥＰＯポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、液体、溶液、懸濁液、エアゾール、錠剤、トローチ錠、またはカプセルの形態である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、口腔、吸入、筋肉内、直腸、または局所投与用に剤形化されている、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、経口投与用に剤形化されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）で治療できる疾病または障害の治療のために、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療方法。
【請求項２１】
前記医薬組成物は経口投与される、請求項２０に記載の治療方法。
【請求項２２】
前記疾病または障害は、腎不全、ＡＩＤＳ、悪性及び慢性炎症、手術前後処置、鉄過剰症、止血異常、組織保護療法、神経学的疾患、及び自家輸血のための献血に伴われる貧血症のうちから選択される、請求項２１に記載の治療方法。
【請求項２３】
前記貧血症は、地中海性貧血、鎌状赤血球性貧血、未熟児貧血、及びcis-platinumを用いた化学療法（cis-platinum chemotherapy）に伴われる貧血、及び集中的な放射線療法及び／または化学療法及び骨髄移植後の貧血のうちから選択される、請求項２２に記載の治療方法。
【国際調査報告】
2011520472.tif 000049
2011520472.tif 000050
2011520472.tif 000051
2011520472.tif 000052
2011520472.tif 000053
2011520472.tif 000054
2011520472.tif 000055