(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体に比してより高い抗炎症活性を有する、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、未精製の抗体調製物とは性質の異なる単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドのシアル化能(sialylation)が該未精製の抗体調製物より高い、単離ポリペプチド。
【請求項２】
該少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体調製物に比してより高い抗炎症活性を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
該少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが、未精製の抗体調製物に比して、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ及びＦｃγＲＩＩＩＡからなる群より選択されるＦｃ活性化レセプターへの結合能が低い、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
ヒヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有し、未精製抗体に比してα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分の含量がより高い、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
天然に存在する抗体源または組換え抗体源由来である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
該未修飾抗体がＩＶＩＧを有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
組み換え源から生産され、Ｆａｂ領域を欠損し、該少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域が２つのガラクトース部分でグリコシル化される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：１を有する核酸配列によってコードされる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
タンパク質の多糖鎖における少なくとも一つのガラクトース部分と各末端シアル酸とのα２，６結合を生成する活性が向上した細胞系由来である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
α２−６シアリルトランスフェラーゼによる処理によって修飾される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｆｃ領域の多糖鎖のシアル化能を変更することを有する、Ｆｃ領域を有するポリペプチドの特性の調節方法。
【請求項１２】
該特性が、未精製の抗体より高い抗炎症活性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該シアル化能を変更する段階が、
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチド、および末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドを含む、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を用意し；さらに
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる、
ことを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源は、発現システムに核酸配列を有するベクターを発現することから提供され、該核酸配列は、ＩｇＧ抗体に翻訳される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
該末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加する段階は、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドを除去することによって達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
該除去は、ＨＰＬＣ、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群より選択される方法によって達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、ガラクトース部分と末端シアル酸との間のα２，３結合に対するよりα２，６結合に対する方が親和性の低いレクチンを用いて実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる段階が、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を増やすこと(enrichment)によって達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該増やすこと(enrichment)は、ＨＰＬＣ、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群より選択される方法によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、ガラクトース部分と末端シアル酸との間のα２，３結合に対するよりα２，６結合に対する方が親和性の高いレクチンを用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該増やすこと(enrichment)は、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドに結合する炭水化物と末端シアル酸との間のα２，６結合を作製する酵素による化学反応によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
治療上有効な量の、請求項１に記載のポリペプチドを、患者に投与することを有する、関節炎、血小板減少症、および腎炎からなる群より選択される炎症性疾患の治療方法。
【請求項２３】
それぞれが少なくとも一のＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する、複数の単離ポリペプチドを含む治療組成物を炎症性疾患の治療の必要のある患者に投与することを有する炎症性疾患の治療方法であって、
各Ｆｃ領域の第１の部分は、ガラクトース部分が２，６結合によって各末端シアル酸部分に連結してなる各炭水化物鎖を有し；
該治療組成物の投与量は、それぞれが少なくとも一のＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、ガラクトース部分が２，６結合によって各末端シアル酸部分に連結してなる各炭水化物鎖を有する各Ｆｃ領域の第２の部分を有する、複数の単離ポリペプチドを有する第２の組成物の投与量より少なく；さらに
該第１の部分は、該第２の部分より大きく、これにより該治療組成物の投与量および該第２の組成物の投与量が実質的に同じ程度にまで炎症を抑制する、または
該第１の部分は、該第２の部分より大きく、これにより該治療組成物が同じ投与量の該第２の組成物より実質的により高い程度にまで炎症を抑制する、治療方法。
【請求項２４】
哺乳動物の免疫抑制活性を得るのに十分な量のシアル化糖タンパク質を含むように配合される、Ｆｃ領域を有する糖タンパク質を含む組成物。
【請求項２５】
該組成物は、約５％以上の量のシアル化糖タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
該組成物は、約１０％以上の量のシアル化糖タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
該組成物は、約３０％以上の量のシアル化糖タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
該組成物は、約５％〜約３０％の量のシアル化糖タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
該シアル化糖タンパク質は、１つ以上の末端シアル酸残基またはその類似体を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
該末端のシアル酸残基は、α２，６結合によって糖タンパク質に結合する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
約５％〜約３０％の量のシアル化Ｆｃ含有糖タンパク質を含むように配合されるＩＶＩＧ由来組成物であって、該シアル化糖タンパク質は、１以上の末端シアル酸残基がα２，６結合によって該糖タンパク質に結合してなる、組成物。
【請求項３２】
少なくとも１つの末端シアル酸残基、もしくはその類似体が、α２，６結合によって糖タンパク質に結合してなる、組み換えＦｃ糖タンパク質、またはそのフラグメント。
【請求項３３】
２９７番目のＡｓｎにＮ−結合型炭水化物を有する組み換えＦｃ糖タンパク質であって、該炭水化物は、１つ以上の末端シアル酸残基がα２，６結合によって結合してなる二分岐型の(biantennary)ＧｌｎＮａｃ２、Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２構造を有する、組み換えＦｃ糖タンパク質。
【請求項３４】
該Ｆｃ領域がＩｇＧまたはそのサブクラスである、前記請求項のいずれか１項に記載のＦｃ含有糖タンパク質。
【請求項３５】
請求項２４に記載の糖タンパク質を含む薬剤調製物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の薬剤調製物を用いて患者の炎症性疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年４月５日付で提出の、米国仮特許出願第６０／７８９，３８４号の利益を主張する、２００７年４月３日付で提出の、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８３９６号の一部継続出願である、２００７年１２月１４日付で提出の、米国特許出願第１１／９５７，０１５号の利益を主張し、これらはすべて、参考で本明細書中に引用される。本出願はまた、２００５年１１月７日付で提出の、米国仮特許出願第６０／７３４，１９６号の利益を主張する、２００６年１０月２７日付で提出の、ＰＣＴ／ＵＳ０６／４１７９１号の利益を主張する、２００７年７月３日付で提出の、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７２７７１号の一部継続出願であり、これらはすべて、参考で本明細書中に引用される。
【０００２】
連邦政府の資金による研究に関する説明
本発明に至る研究は、米国の国立衛生研究所  認可番号ＡＩ  ０３４６６２によって、一部支援された。したがって、米国政府は、本発明において特定の権利を有しうる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、免疫疾患の治療のための治療用ポリペプチドの新規な設計方法に関する。
【０００４】
発明の背景
免疫グロブリンに対する細胞のレセプターは４０年近く前に初めて同定されたが、免疫応答における中心的な役割はここ１０年で発見されたにとどまる。免疫反応の末梢から中枢に向かう時期（ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｈａｓｅ）および中枢から末梢に向かう時期（ｅｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｈａｓｅ）の双方においてそれらは中心的存在であり、Ｂ細胞活性化および抗体産生の閾値を設定し、樹状細胞の成熟を調節し、抗体反応の高い特異性を、食作用、抗体依存性細胞障害ならびに炎症性細胞の動員および活性化などのエフェクター経路に関連つける。体液性免疫システムを固有のエフェクター細胞に導く際のそれらの中心的役割により、それらは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体活性を増強させるまたは制限するための魅力的な免疫治療用ターゲットとなる。
【０００５】
抗体および抗体−抗原複合体と、免疫システムの細胞との相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、食作用、炎症性メディエータの放出、抗原クリアランス、ならびに抗体半減期などの、種々の反応を引き起こす（Ｄａｒｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−２３４（１９９７）；Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２，７７−９４（１９９５）；Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，４５７−４９２（１９９１）中で概説され、各々は、本明細書で参照として引用される）。
【０００６】
抗体定常領域は、直接的には抗原への抗体の結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体または免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３がＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりもより効果的にＡＤＣＣを媒介する。
【０００７】
抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントが生成するが、このフラグメントは、各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメント、および、容易に結晶化できることを示す名前である、残りの「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる。Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能の中心となる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の結晶構造が決定されてきた（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２３６１−２３７０（１９８１）、これは本明細書に参照として引用される）。ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域は、パパインでＮ末端からＣｙｓ２２６までを切断することによって得られる。
【０００８】
ＩｇＧは、Ｆｃフラグメントによって媒介される相互作用を通じて、炎症性、および抗炎症性双方の活性を媒介すると長い間考えられてきた。したがって、Ｆｃ−ＦｃｙＲ相互作用は、免疫複合体および細胞障害抗体の炎症性特性に関与する一方、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）およびそのＦｃフラグメントは、抗炎症性であり、炎症性疾患を抑制するために広く用いられる。そのような逆説的な特性の正確なメカニズムは不明であるが、ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞毒性および炎症性の調節に重要であることが提案された。
【０００９】
ＩｇＧは、その２つの重鎖の各々のＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７に単一の、Ｎ−結合型グリカンを含む。共有結合した複合糖質は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）およびマンノース（ｍａｎ）を含む、コアの二分岐ペンタ−ポリサッカライドから構成される。コア糖質構造のさらなる修飾が、可変的に見出されるフコース、分岐ＧＩｃＮＡｃ、ガラクトース（ｇａｌ）および末端シアル酸（ｓａ）部分の存在によって血清抗体中に見られる。それ故、４０を超える異なる糖型が、この一つのグリコシル化部位に共有結合していることが見出されている。Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２６５，６００９（１９９０）。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖のオープン構造（ｏｐｅｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持することによって、全てのＦｃｙＲへの結合に不可欠であることが示されている。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，Ｉｍｍｕｎｅ．ｌ  Ｌｅｔｔ．  ８２，５７（２００２），Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９，７３７（２００１）。このようにＦｃｙＲ結合にＩｇＧグリコシル化が絶対不可欠であることは、脱グリコシル化ＩｇＧ抗体がＡＤＣＣ、食作用および炎症性メディエーターの放出などの、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘発される炎症反応を媒介することができないことの説明となる。Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４，１９（２００６）。さらに、フコースを含むまたは欠くＩｇＧ抗体に対して報告された各々のＦｃｙＲに対して親和性が変化し、その結果として細胞毒性に影響を与えることにより、個々のＩｇＧの糖型が炎症反応の調節に寄与しうるという知見が示唆された。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，２６７３３（２００２），Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定のグリコシル化パターンとの関連が、関節リウマチおよびＩｇＧ抗体のガラクトシル化およびシアル化の減少が報告されている幾つかの自己免疫血管炎の患者において見出されている。Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，４５２（１９８５），Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，６１２３（１９９４），Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１２８，６２１  （２０００），Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  Ｄｅｃ  ２７；［印刷に先立つ電子出版］２００５。ＩｇＧ糖型の変化のｉｎ  ｖｉｖｏにおける重要性は究明されていないものの、ＩｇＧ糖型の変化もまた老化とおよび免疫処置時に関連することが報告されている。Ｓｈｉｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．  １５，６８３  （１９９８），Ｌａｓｔｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，２５（１９９８）。
【００１０】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＶＩＧ特性の種々の知見を説明しうるポリペプチドの作製方法の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約
本発明は、そのような方法および分子を提供することによって前述の要求を満たすものである。一態様において、本発明は、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、未精製の抗体調製物とは性質の異なる単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドのシアル化能(sialylation)が未精製の抗体調製物より高い、単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、該少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する単離ポリペプチドは、α２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製抗体に比してより高い抗炎症活性を有する。一実施形態では、該少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する単離ポリペプチドは、α２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体調製物に比してＦｃ活性化レセプターに対する結合能が低い。さらなる実施形態では、Ｆｃ活性化レセプターがＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡからなる群より選択される。
【００１２】
一態様において、該単離ポリペプチドは、組換え源由来である。
【００１３】
他の態様において、本発明は、抗炎症活性のより高い少なくとも一のＦｃ領域を有するポリペプチドおよび適当な担体または希釈剤を含む薬剤を提供する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、Ｆｃ領域の多糖鎖のシアル化能(sialylation)を変更することを有する、Ｆｃ領域を有するポリペプチドの性質の調節方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本方法は、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチド、および末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドを含む、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を用意し；さらに末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる、ことを有する。
【００１６】
さらなる他の実施形態では、本発明は、それぞれが少なくとも一のＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する、複数の単離されたポリペプチドを含む治療組成物を炎症性疾患の治療の必要のある患者に投与することを有する炎症性疾患の治療方法であって、各Ｆｃ領域の第１の部分は、ガラクトース部分が２，６結合によって各末端のシアル酸部分に連結してなる各炭水化物鎖を有し；該治療組成物の投与量は、それぞれが少なくとも一のＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、ガラクトース部分が２，６結合によって各末端のシアル酸部分に連結してなる各炭水化物鎖を有する各Ｆｃ領域の第２の部分を有する、複数の単離されたポリペプチドを有する第２の組成物の投与量より少なく；さらに該第１の部分は、該第２の部分より大きく、これにより該治療組成物の投与量および該第２の組成物の投与量が実質的に同じ程度にまで炎症を抑制する、または該第１の部分は、前記第２の部分より大きく、これにより該治療組成物が同じ投与量の該第２の組成物より実質的により高い程度にまで炎症を抑制する、治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】図１Ａは、ＳＮＡ＋  ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＳＮＡ＋  ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＳＮＡ＋  ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。
【図２】図２は、シアル酸とガラクトースとのα２，６結合を増加させることにより、ＩＶＩＧ  Ｆｃフラグメントの抗炎症性が向上することを示す実験を要約したものである。
【図３】図３は、シアル酸とガラクトースとのα２，６結合の除去により、ＩＶＩＧ  Ｆｃフラグメントの抗炎症性が低減することを示す実験を要約したものである。
【図４】図４は、細胞毒性の減少がガラクトースとシアル酸との結合に依存しないことを示すものである。
【図５】図５は、２，６シアル化ＩｇＧ  Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症活性が単にＩｇＧ  Ｆｃグリカンの特性であることを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＩｇＧ  Ｆｃドメインの細胞毒性および抗炎症反応が、Ｆｃに結合したコア多糖のシアル化が異なることに起因することを見出した。ＩｇＧ抗体の細胞毒性は、シアル化時に低減する；逆に、ＩＶＩＧの抗炎症活性は増強される。ＩｇＧ  シアル化は、抗原特異的免疫反応の誘導時に調節されることが示され、したがって、抗原投与時に、定常状態の固有の抗炎症分子から、適応的、炎症性種に、ＩｇＧを転換する新規な手段を提供する。Ｆｃ−シアル化ＩｇＧはマクロファージ上の固有のレセプターに結合し、次に阻害性Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）をアップレギュレートし、これにより自己抗体が仲介する病変に対する保護が生じる。概して、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｊ．  Ｅｘｐｅｒｉｍ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２４（１）：１１−１５（２００７）を参照。本発明者らはさらに、驚くべきことに、抗炎症反応がガラクトース部分とシアル酸部分との結合の性質に依存することを見出した。ＩＶＩＧの抗炎症活性がＦｃの正確なグリカン構造に依存するという知見は、本発明者らが標準的なＦｃレセプターではなく、特定のレクチンレセプターがこの経路に関連することを既に提案した（Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ，  Ｆ．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，６７０（２００６）；Ｆ．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，  Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４，１１（２００７））モデルをさらに支持するものである。本発明の基礎となるデータは、２，６シアル化Ｆｃの、調節骨髄細胞の集団で発現する同族レクチンレセプターへの結合が、炎症関節等の、炎症を起こした部位に位置する、エフェクターマクロファージの抑制性Ｉｇ  Ｆｃのトランスアップレギュレーション（ｔｒａｎｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらし、これにより細胞毒性ＩｇＧが活性化ＦｃＲを連結し（ｅｎｇａｇｅ）、炎症反応を誘発するのに必要な閾値を上昇するモデルを支持する（Ｆ．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５））。
【００１９】
したがって、本発明の開示により、所望の細胞毒性および抗炎症性ポテンシャルを有するＩｇＧの作製および選択の有利な戦略が提供される。
【００２０】
定義
本明細書および請求項を通じて、免疫グロブリン重鎖における残基のナンバリングは、本明細書に参照として明示的に引用される、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるようなＥＵ  ｉｎｄｅｘのものである。「Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵ  ｉｎｄｅｘ」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
【００２１】
「ネイティブ」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」という用語は、Ｆｃアミノ酸配列を含む未修飾のポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、ネイティブ配列Ｆｃ領域または（付加、欠失および／または置換などの）予め存在するアミノ酸配列修飾を有するＦｃ領域を含みうる。
【００２２】
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むタンパク質のいずれかのフラグメントおよびこのフラグメントを指し、以下に限定されるものではないが、例えば、抗体、例えばＩｇＧ抗体等の、十分に機能するタンパク質が挙げられる。本発明のポリペプチドを未精製の抗体調節物と比べる場合、このような調製物としては、具体的には、哺乳動物、例えば、ヒトドナー由来の、血液サンプル、血清サンプル、および／またはＩＶＩＧサンプルがある。この調節物は、分画されていなくともあるいは部分的に分画されていてもよいが、通常、約２〜４％のシアル化Ｆｃ含有タンパク質を含む。免疫抑制活性を有するように濃縮されたまたは配合された本発明の組成物は、通常、少なくとも約５％のシアル化Ｆｃ含有タンパク質またはそれ以上（例えば、５〜１０％、１０〜３０％、３０〜５０％、５０〜１００％またはこれらの範囲もしくは合間）を含む。
【００２３】
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を規定するために用いられる。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列のＦｃ領域であってもまたは変異Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びると規定される。
【００２４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも称される）は、通常、約２３１番目のアミノ酸から約３４０番目のアミノ酸まで拡がる。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対をなさない点で特有である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が、正常ネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に入っている。炭水化物は、ドメイン−ドメイン対の代わりとなり、ＣＨ２ドメインの安定化を助けると考えられている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２，１６１−２０６（１９８５）、これは参考で本明細書中に引用される）。
【００２５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ−末端からＣＨ２ドメインまでの残基の拡がり（すなわち、ＩｇＧの約３４１番目のアミノ酸残基から約４４７番目のアミノ酸残基まで）を含む。
【００２６】
「ヒンジ領域」という用語は、一般的には、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの拡がりとして定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５））。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域を、最初および最後にシステイン残基を配置して、同じ位置に重鎖Ｓ−−Ｓ結合間（ｉｎｔｅｒ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｓ−−Ｓ  ｂｏｎｄ）を形成することによって、ＩｇＧ１配列と並べてもよい。
【００２７】
「結合ドメイン」は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域との結合に関与するポリペプチド鎖（例えば、そのα鎖）の一部を含みうる。結合ドメインの一例としては、ＦｃＲ鎖の細胞外ドメインがある。
【００２８】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の部分的「エファクター機能」を少なくとも有する。「エフェクター機能」の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変領域）に結合することを必要とし、例えば、本明細書で開示されているような種々のアッセイを用いて分析することができる。また、この用語は、フラグメントが本明細書に記載されるようなグリコシル化されるまたはグリコシル化に適当な少なくとも一つのアミノ酸を含む場合には、Ｆｃフラグメントを包含する。
【００２９】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に一致したアミノ酸配列を有する。「変異Ｆｃ領域」は、当業者によって認識されているように、少なくとも一つの「アミノ酸修飾」によりネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて少なくとも一つのアミノ酸置換、例えば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１から約１０アミノ酸置換、好ましくは約１から約５アミノ酸置換を有する。本明細書における変異Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、より好ましくはこれらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはこれらと少なくとも約９５％の相同性、より好ましくは少なくとも約９９％の相同性を有するであろう。
【００３０】
「変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）グリコシル化」という用語は、上記で定義したような、特定の糖成分を増加させるかまたは減少させるように重鎖定常領域への炭水化物付加が操作される、ネイティブでのあるいは修飾されたポリペプチドを指す。例えば、Ｌｅｃ２またはＬｅｃ３などの、特定の細胞系中で準備された抗体などの、ポリペプチドは、フコースやシアル酸などの糖部分の付着ができない可能性がある。
【００３１】
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表すために用いられる。本発明の一実施形態において、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。他の実施形態においては、ヒトＦｃＲを含むＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（γレセプター）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これにはこれらのレセプターの対立遺伝子多型および選択的スプライス型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性レセプター」）を含むが、これらのレセプターは主としてこれらの細胞質ドメインにおいて異なる、同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ））を含む。阻害性レセプターであるＦｃγＲＩｌＢは、細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ））を含む（Ｄａｒｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−２３４（１９９７）のレビュー；ＦｃＲｓ  ａｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４，２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１２６，３３０−４１（１９９５），Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ  ２００６，Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｄｅｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｐａｕｌ  ５ｔｈ  Ｅｄ．を参照、各々は本明細書に参照として引用される）。
【００３２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やマクロファージ等の単球細胞）が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞媒介反応を指す。原則として、活性化ＦｃγＲを有するエフェクター細胞はＡＤＣＣを媒介する誘因となりうる。そのような細胞の一つである、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は活性化、局在化、または分化によって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃＲ発現は、本明細書に参照として引用される、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｎｄ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，（２００１）に要約される。
【００３３】
「ヒトエフェクター細胞」は、一以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、上記細胞は、例えば、ＦｃγＲｌＩＩ等の活性化Ｆｃレセプターの少なくとも一つの型を発現し、ＡＤＣＣエファクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書で開示されているように、例えば血液またはＰＢＭＣなどのこれらの天然源から単離されうる。
【００３４】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、特にモノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクロール抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片にまでわたる。
【００３５】
抗体の「シアル酸含有量」という語は、この語が文脈上他の意味を意図していることを明確に示唆していない限り、抗体の重鎖のＦｃ領域上のシアル酸残基の総数および未精製抗体調製物中の非シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）抗体に対するシアル化抗体の比率の双方を指す。
【００３６】
本発明の目的のために定義される際、「抗体断片（抗体フラグメント）」は、通常、完全な（ｉｎｔａｃｔ）抗体の抗原結合もしくは可変領域またはＦｃＲ結合能力を保持している抗体のＦｃ領域を含む、完全な抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、線状（ｌｉｎｅａｒ）抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体断片は、好ましくはＩｇＧ重鎖のヒンジおよび必要であればＣＨｌ領域の少なくとも一部を保持する。より好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の全定常領域を保持し、ＩｇＧ軽鎖を含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同質の抗体集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から得られる抗体を意味し、すなわち、当該集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる、自然に起こりうる変異を除いて一致している。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原部位に対して指向している。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向している異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向している。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の実質的に同質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法によって抗体を製造する必要があると解されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、本明細書に参照として引用される、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）によって最初に開示されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照、これは、本明細書に参照として引用される）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，２２２，５８１−５９７（１９９１）に開示されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい、なお、上記は本明細書に参照として引用される。
【００３８】
本発明の他の実施形態において、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、以下に限定されるものではないが、全タンパク質などの、他のタンパク質断片に融合されてもよい。当業者は、多くのタンパク質が、以下に限定されるものではないが、他の免疫グロブリン、特に、それぞれのＦｃ領域を欠く免疫グロブリンなどの、本発明のポリペプチドに融合されうることを、確かに理解するであろう。あるいは、例えば、本明細書に参照として引用される、米国特許第６，６６０，８４３号に記載されているように、他の生物学的に活性なタンパク質またはその断片を、本発明のポリペプチドに融合してもよい。この実施形態は、そのような生物学的に活性なタンパク質またはその断片をＦｃレセプターを発現する細胞へデリバリーするのにとりわけ有利である。さらに、例えば、ＧＳＴタグもしくは緑色蛍光タンパク質、またはＧＦＰなどの異なるマーカーを用いてもよい。
【００３９】
本明細書中に詳細に記載されるモノクローナル抗体は、所望の生物学的活性を発揮する限り、抗体断片のみならず、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来のまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に一致するまたは相同するが、鎖の残りの部分は他の種由来のまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に一致するまたは相同する、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４（１９８５）;；国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２を参照、各々が本明細書に参照として引用される）。
【００４０】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたはヒト以外の霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに向上させるためになされる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも一つの、具体的には２つの可変ドメインを実質的に全てを含むが、可変ドメイン中、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体はまた、必要であれば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、具体的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むであろう。さらに詳細には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，２，５９３−５９６（１９９２）；米国特許第５，２２５，５３９号を参照、各々が本明細書に参照として引用される。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号：１等の、ｃＤＮＡから組換えにより製造されてもよい。異なる実施形態のポリペプチドは、Ｆｃ領域またはその機能性フラグメントを含む。
【００４２】
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドとしては、特定のアミノ酸置換、付加または欠失が、重鎖定常領域をコードする遺伝子を修飾するために組み換えＤＮＡ技術を用いることによって親の配列に導入されるポリペプチドがある。これらの修飾の導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１））などのマニュアルに記載されるのと同様にして、分子生物学のよく確立された技術に従う。加えて、少なくとも一つのＦｃ領域を有するポリペプチドは、グリコシル化特異性について知られている細胞系での発現（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，６９５−９（１９９６）；Ｗｅｉｋｅｒｔ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１１６−１１２１（１９９９）；Ａｎｄｒｅｓｅｎ  ＤＣ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，１１７−１２３（２００２））によってまたは特定のレクチンの増加（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）もしくは枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によってまたは酵素処理（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，７７１，６７−８７（２００２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，６，１−１５（１９９６））によってのいずれかによって得られる、特定の炭水化物修飾を含むよう選択された上記ポリペプチドを含むであろう。抗体グリコシル化の質および程度は、用いられる細胞のタイプや培養条件によって異なることが本分野において知られている。（例えば、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２８５，８３９−８４５（１９９２））は、抗体が結合した糖側鎖中のシアル酸含有量が、抗体が腹水としてまたは血清を含まないもしくは血清を含む培地中で生産される際には、有意に異なることを報告している。さらに、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１６，４６２−４７０（２０００）は、細胞成長に異なるバイオリアクターを使用することおよび培地中の溶存酸素の量が抗体が結合した糖部分中のガラクトースおよびシアル酸の量に影響を与えることを示した。しかしながら、これらの研究は、様々なシアル酸残基量がどのようにｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体活性に影響を与えるかについては取り上げていなかった。
【００４３】
ホスト発現系
本発明のポリペプチドは、Ｎ−結合型グリコシル化が可能なホスト発現系、すなわち、ホスト細胞中で発現させることができる。通常、このようなホスト発現系としては、細菌の、真菌の、植物の、脊椎動物または無脊椎動物の発現系が挙げられる。一実施形態において、ホスト細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ細胞系（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ  ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えばＮＳ／０）、Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２もしくはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、もしくはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）もしくは２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８））、または例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．等の公的な寄託機関から入手可能な他の適当な細胞系等の哺乳類細胞である。さらに、鱗翅目細胞系（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｏｒａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、例えばＳｆ９、等の昆虫細胞系、植物細胞系、真菌細胞系、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ等の酵母、またはＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｉａｅ  ｃｏｌｉを用いた細菌の発現系が使用できる。場合によっては、ヒトＩｇＧのＦｃドメイン上で通常見られるように二分岐の複合糖となるためには、ホスト細胞への修飾がＮ−結合型グリコシル化およびグリカン成熟が確実に起こるために必要とされる場合もあることが理解されるであろう。
【００４４】
治療製剤
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を有するポリペプチドを含む治療製剤は、所望の精製度を有する本発明のポリペプチドを、必要であれば生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保管用に製造されうる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照）。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度で患者に無毒であり、これらとしては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸およびメチオニン等の抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェニル、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等の）防腐剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン等の単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００４５】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有する化合物を含んでいてもよい。このような分子は、所望の目的に効果的な量で、適切に組み合わせて存在する。
【００４６】
活性成分はまた、それぞれ、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中にまたはマクロエマルション中に、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、取り込まれていてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００４７】
好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用に用いられる製剤は滅菌されている。本発明の製剤は、例えば、殺菌した濾過膜による濾過によって、容易に滅菌することができる。
【００４８】
徐放性製剤もまた準備されうる。徐放性製剤の適切な例としては、修飾抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、例えばフィルム、またはマイクロカプセルなどの、成形物の形態である。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号参照）、Ｌ−グルタミン酸およびｙ  エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日以上分子の放出が可能であるが、ヒドロゲルの中にはより短い期間タンパク質を放出するものもある。カプセル化された抗体は長時間体内に残存すると、３７℃で湿潤化される結果、変性または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。安定化に対する合理的戦略が、関連するメカニズムによって考え出されうる。例えば、凝集メカニズムがチオール−ジスルフィド交換により分子間でＳ−−Ｓ結合形成であることが見出される際には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿度量を制御し、添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリクスを開発することによって達成されうる。
【００４９】
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むシアル化されたポリペプチドの作製
本発明のポリペプチドは、未修飾および／または未精製の抗体と比較してシアル酸の量が増加するように、さらに精製または修飾してもよい。この目的に到達するために多数の方法が存在する。一つの方法では、例えば、ＩＶＩＧ等の、未精製のポリペプチド源を、シアル酸に結合することが知られているレクチンを有するカラムに通過させる。当業者は、レクチンが異なれば、ガラクトースとシアル酸との間でのα２，６結合およびα２，３結合に対する親和性が異なることを理解するであろう。ゆえに、特定のレクチンを選択することにより、シアル酸とガラクトースとの間の所望の結合型を有する抗体を増加することができるであろう。一実施形態においては、レクチンをセウヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）から単離される。当業者であれば、セウヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）のアグルチニン（ＳＮＡ）がα（２−６）結合によりガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンに結合するシアル酸に特異的であることを理解するであろう。Ｓｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６２：１５９６−１６０１（１９８７）。これに対して、イヌエンジュ（Ｍａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）（「ＭＡＡ」）レクチンは、α（２−３）結合によりガラクトースに結合するシアル酸に結合する。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６３：４５７６−４５８５（１９８８）。
【００５０】
したがって、ガラクトースとシアル酸との間の所望の結合を有する少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドのフラクションはカラム中に保持されるが、一方、このような結合をもたないフラクションは通過するであろう。少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドのシアル化フラクションは、異なるストリンジェンシー条件で別の洗浄液によって溶出されうる。このようにして、シアル酸含有量が通常の含有量と比較して増加する本発明のポリペプチドの調製物を得ることができる。さらに、シアリルトランスフェラーゼおよび、例えば、米国特許出願公開第２００６／００３０５２１号に記載されるようなシアル酸のドナーを用いた酵素反応を使用してもよい。
【００５１】
請求の範囲に記載される方法に使用できるシアリルトランスフェラーゼの適切な例としては、以下に限定されるものではないが、α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＥＣ  ２．４．９９．６）、およびα−（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１）とも称される、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩがある。
【００５２】
α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ−β−１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌ−β−１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５６：３１５９（１９９１）を参照）、糖ペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖のシアル化に応答する。シアル酸は、２つの単糖間のα−結合（α−ｌｉｎｋａｇｅ）を形成してＧａｌに連結する。単糖間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位およびＧａｌの３位間でおこる。この特有の酵素は、ラットの肝臓から単離することができ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３８４５（１９８２））；ヒトのｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２２７８２−２２７８７；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１３９４−１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：９３１−９３８）ＤＮＡ配列が知られており、これにより組み換え発現によってこの酵素を容易に製造できる。
【００５３】
α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼの活性は、６−シアル化ガラクトースなどの、６−シアル化オリゴ糖でみられる。「α−（２、６）シアリルトランスフェラーゼ」の名は、アクセプター多糖の６番目の原子にシアル酸を結合するシアリルトランスフェラーゼのファミリーを指す。様々なタイプのａ−（２、６）シアリルトランスフェラーゼは様々な組織から単離されうる。例えば、この酵素の一つの特定の型である、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは、脳および胎生組織から単離することができる。Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ−Ｒｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０，９５０（２００３）。
【００５４】
さらに、平均的な当業者であれば、シアル化率を変化させるために細胞培養条件を操作することができることを理解するであろう。例えば、シアル酸含有量を増加させるためには、生成率を減少させ、培養される特定のホスト細胞に適切なより低い範囲内で浸透圧を通常維持する。シアル酸含有量を増加させるためには、約２５０ｍＯｓｍから約４５０ｍＯｓｍの範囲内の浸透圧が適切である。このおよび他の適切な細胞培養条件は、例えば、米国特許第６，６５６，４６６号に開示されている。Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２８５，８３９−８４５（１９９２）では、抗体を腹水からまたは血清を含まない若しくは血清含有培養培地中で生産する場合では、抗体が結合した糖側鎖中のシアル酸の含有量は顕著に異なることが報告されている。さらに、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．，１６，４６２−４７０（２０００）では、細胞成長を目的とした異なるバイオリアクターの使用および培地中の溶解酸素量が抗体が結合した糖部分中のガラクトースおよびシアル酸の量に影響を与えることが示されている。
【００５５】
別の実施形態において、例えば、不死化ヒト胎生期網膜細胞等の、ホスト細胞を、例えば、ＣＭＶプロモーター等の、プロモーターに操作して結合される、例えば、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ等の、シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入することによって修飾してもよい。このα−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、ＳＩＡＴ４ＣまたはＳＴＺ（ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号：Ｌ２３７６７）として知られ、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１８１３５９号に開示される、ヒトのα−２，３−シアリルトランスフェラーゼであってもよい。
【００５６】
シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によってホスト細胞中に導入されうる。外来の核酸配列を導入する適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，２０００中にも開示されている。これらの方法としては、以下に限定されるものではないが、例えば、マイクロインジェクションまたはエレクトロポーション等の物理的導入技術；例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション等のトランスフェクション；例えば、リポソームを用いた膜融合転写（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）；および例えば、ＤＮＡまたはレトロウィルスベクターを用いた導入等のウィルスによる導入が挙げられる。
【００５７】
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、細胞上清から回収してもよく、また、このポリペプチドに、所望であれば、例えば、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィー等の一以上の精製段階を行なってもよい。適切な精製方法は、当業者にとって明白であろう。
【００５８】
当業者であれば、上述したシアル化方法の様々な組合わせによって、非常に高いシアル化レベルを有する少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドを製造することができることを理解するであろう。例えば、上述したように、シアリルトランスフェラーゼを過剰発現したホスト細胞中で、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドを発現させた後、例えば、酵素反応中でこれらのポリペプチドをシアル化し、続いてレクチンを含むカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、これらのポリペプチドのシアル化フラクションをさらに濃縮してもよい。同様にして、酵素反応およびその後のアフィニティークロマトグラフィーを、少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むＩＶＩＧ源に用いてもよい。
【００５９】
少なくとも一つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドのグリコシル化の程度を調べるために、これらのポリペプチドを精製し、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析することができる。グリコシル化は、特定のレクチンと単離されたポリペプチドを反応させることによって決定することができる、または、当業者によって認識されているように、糖型を同定するためにＨＰＬＣ次いで質量分析を用いることができる。（Ｗｏｒｍａｌｄ，ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３６：１３７０（１９９７））。
【実施例】
【００６０】
本発明をより詳細に説明するために、幾つかの実施例を下記に記載するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００６１】
実施例
実施例１．  シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧは、細胞毒性の減少を示す
ＩｇＧの特定の糖型が抗体のエフェクター機能を調節することに関与するかどうかを究明するために、特定のＩｇＧモノクローナル抗体の細胞毒性を仲介する際の特定のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物の役割を調べた。前記（６）で記載されるのと同様にして２９３個の細胞中でＩｇＧ１、２ａまたは２ｂスイッチ変異体のいずれかとして発現している、６Ａ６ハイブリドーマ由来の、抗血小板抗体を質量分析によって分析し、これらの具体的な炭水化物組成および構造を決定した。これらの抗体は、最小限のシアル酸残基を含む。セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）レクチンアフィニティークロマトグラフィーによるシアル酸含有種の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって、シアル酸含有量が６０〜８０倍高い抗体を産生した。シアル化および非シアル化６Ａ６−ＩｇＧ１および２ｂ抗体の血小板クリアランスを媒介する能力を比較すると、シアル化とｉｎ  ｖｉｖｏ活性との間で逆相関を示した。６Ａ６  ＩｇＧ抗体のシアル化により、生物学的活性が４０〜８０％低下した。
【００６２】
このような活性の減少のメカニズムを究明するため、マウスＦｃＹＲの各々に対するおよび同族の抗原に対するこれらの抗体について、表面プラズモン共鳴結合を行った。
【００６３】
表面プラズモン共鳴分析は、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）に記載されているのと同様にして行なった。簡潔に述べると、糖側鎖中のシアル酸残基レベルが高いまたは低い６Ａ６抗体変異体を、ＣＭ５センサーチップの表面上に固定化した。可溶性Ｆｃｙ−レセプターを、３０μＩ／分の流量でＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で室温にてフローセルを通じて異なる濃度で注入した。可溶性Ｆｃ−レセプターを３分間注入し、７分間結合分子の解離を観察した。コントロールフローセルに対するバックグラウンド結合性を自動的に引いた。物質移動の制限を排除するためにコントロール実験を行なった。会合相および解離相に対する同時フィッティングならびに一連の全てのカーブに対するグローバルフィッティングを用いて、親和定数をセンサーグラムデータから誘導した。１：１ラングミュア結合モデルが観察されたセンサーグラムデータに緊密に適合したため、全ての実験においてこれを用いた。
【００６４】
各々の活性化ＦｃｙＲに対するこれらのシアル化型の抗体で、非シアル化型のカウンターパートと比較して、結合親和性が５〜１０倍減少することが観察された一方で、抗原に対する結合親和性では何ら相違が観察されなかった。ＩｇＧ２ｂは、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対するＩｇＧ１の結性に比べて、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＶに対してより高い親和性で結合するため、シアル化の効果として、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対する非シアル化ＩｇＧ１結合親和性に匹敵する活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＶに対するＩｇＧ２ｂの結合親和性を生じることがある。活性化レセプター結合性のこのような定量的な相違のこの効果は、非シアル化ＩｇＧ１の活性に匹敵するｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すシアル化ＩｇＧ２ｂで認められる。同様にして、ＩｇＧ１のシアル化により、７倍（ｆａｃｔｏｒ）ほど、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対するすでに低い結合親和性が低減し、これにより生理学的に不活性な抗体が生産される。ゆえに、ＩｇＧのＡｓｎ２９７結合グリカン構造のシアル化は、サブクラス−限定的活性化ＦｃｙＲに対する結合親和性の減少をもたらし、したがってｉｎ  ｖｉｖｏ細胞毒性の減少をもたらした。
【００６５】
ＩｇＧのＮ−結合型グリカンのシアル化がｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症活性を調節することに関与しているという考察の一般性を究明するために、我々は、次に、ＩＶＩＧの抗炎症活性におけるＮ−結合型グリカンの役割を調べた。５〜１０、０００ドナーのプールされた血清から得られるこの精製ＩｇＧフラクションは、高投与量（１〜２ｇ／ｋｇ）で静脈内投与されると、広く炎症性疾患の処置を目的とした治療に用いられる。Ｄｗｙｅｒ，Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２６，１０７（１９９２）。この抗炎症活性は、Ｆｃフラグメントの特性であり、ＩＴＰ、ＲＡおよび腎毒性腎炎のネズミモデルで保護特性を示す。Ｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １，１２２８（１９８１），Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，４８４（２００１），Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，５７３（２００３），Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０３（３）：７８９−９７（２００６）。
【００６６】
この抗炎症活性の共通のメカニズムは、エフェクターマクロファージの阻害性ＦｃｙＲＩＩＢ分子の表面発現を誘導し、それにより細胞毒性ＩｇＧ抗体または免疫複合体が活性化ＦｃｙＲ誘発によってエフェクター細胞反応を誘導するのに必要とされる閾値が上昇することが報告された。Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４，１９（２００６）。
【００６７】
実施例２．  ＩＶＩＧの脱シアル化がマウス関節炎モデルでＩＶＩＧの抗炎症効果を減少させる
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＯＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入した。ＦｃｙＲＩＩＢ−／−マウスは、本発明者の研究室で作製され、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対して１２世代戻し交配された。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Ｋ／Ｂ）のＫＲＮ  ＴＣＲトランスジェニックマウスは、Ｄ．ＭａｔｈｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔ（ハーバードメディカルスクール、ボストン、マサチューセッツ州）から贈与され、ＮＯＤマウスと交配させて、Ｋ／ＢｘＮマウスを作製した。８〜１０週齢のメスマウスを全ての実験に用い、ロックフェラーユニバーシティ動物施設で飼育した。
【００６８】
血清を前記と同様にして調製した（Ｂｒｕｈｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，５７３（２００３））。簡潔にいうと、血清を、Ｋ／ＢｘＮマウス（６〜１２週齢）から集めた血液から分離する。数週間分の血清収集物を一緒に貯めて、アリコートに分けて凍結すて、ここで記載される全ての実験に使用した。１．５倍希釈したＫ／ＢｘＮ血清（１ｇのマウスあたり、４μｌの貯溜したＫ／ＢｘＮ血清）を１回静脈内注射して、関節炎を誘導した。関節炎を臨床検査によって採点した。４本足全ての指標を付加する：０［非罹患］、１［１関節の腫れ］、２［１超の関節の腫れ］、および３［全ての足で重篤な腫れ］。ＩＶＩＧをＫ／ＢｘＮ血清を注射する１時間前に注射する。数匹のマウスに６Ａ６−ＩｇＧ２ｂ抗体が枯渇した血小板５μｇを投与し、Ａｄｖｉａ１２０ヘマトロジーシステム（Ｂａｙｅｒ）を用いて処置してから２、４、および２４時間後に、血小板数を測定した。全ての実験は連邦法および機関ガイドラインにしたがって行われ、ロックフェラーユニバーシティ（ニューヨーク、ニューヨーク州）によって認証された。
【００６９】
抗体および可溶性Ｆｃレセプター
２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを行ない、次いで上記と同様にしてプロテインＧにより精製することによって、６Ａ６抗体スイッチ変異体を作製した。Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）。シアル酸リッチな抗体変異体を、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いたレクチンアフィニティークロマトグラフィーによってこれらの抗体調製物から単離した。シアル酸含有量が高いことは、レクチンブロットによって確認した（下記参照）。静脈注射用ヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、１０％マルトース中５％、クロマトグラフィー精製）は、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ（Ｈｅｍｄｏｎ、バージニア州）から購入した。ヒトＩＶＩＧの消化を行なった。Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０３（３）：７８９−９７（２００６）。簡単に述べると、ＩＶＩＧを３７℃で１時間０．５ｍｇ／ｍｌパパインによって消化し、２．５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを添加することによって止めた。得られたＦａｂおよびＦｃフラグメントを、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓ−２００ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）で、未消化ＩＶＩＧから分離した後、プロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびプロテインＬカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を用いてＦｃおよびＦａｂフラグメントを精製した。フラグメントの純度は、抗−ヒトＩｇＧ  ＦａｂまたはＦｃに特異的な抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア州）を用いて免疫ブロット法によって確認した。純度は、９９％より高いと判断された。Ｆ４／８０抗体はＳｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、イギリス）社製である。Ｌｙ  １７．２抗体は、Ｃａｌｔａｇ（バーリンゲーム、カリフォルニア州）社製である。ヒツジ抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗血清（腎毒性血清（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ  ｓｅｒｕｍ）、ＮＴＳ）は、Ｍ．Ｐ．Ｍａｄａｉｏ（ペンシルバニア大学、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から贈与された。Ｃ−末端のヘキサ−ヒスチジンタグを含む可溶性Ｆｃレセプターを、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製し、製造元（Ｑｉａｇｅｎ社）によって示されるのと同様にして、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて細胞培養上清から精製した。
【００７０】
ＩＶＩＧをノイラミニダーゼで処理し、得られた調製物の組成および構造を質量分析によって分析した。ノイラミニダーゼ処理後には、グリカンを含むシアル酸は何ら検出されなかった。次いで、これらのＩｇＧ調製物について、ＩｇＧ１免疫複合体が仲介する炎症性疾患モデルである、ＫｘＮ血清の受動伝達によって誘発される関節炎からマウスを保護する能力を試験した。ノイラミニダーゼによる脱シアル化は、ＫｘＮ血清誘発性関節炎モデルにおいてＩＶＩＧ調製物の保護効果を消滅させた。この活性の消失は、非シアル化ＩｇＧ調製物の血清半減期の減少の結果またはＩｇＧの単量体組成もしくは構造的完全性への変化の結果ではなかった。ＰＮＧａｓｅを用いた全てのグリカンの除去は同様の効果を有し、ｉｎ  ｖｉｖｉｏでのＩＶＩＧの保護効果を消滅させた。
【００７１】
実施例３．  シアル酸含有量が高いＩＶＩＧフラクションはマウス関節炎モデルにおいて炎症を抑制する
シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの調製
シアル酸はＩＶＩＧの抗炎症活性に必要であると思われるので、この抗炎症活性には高投与量（１ｇ／ｋｇ）が必要であるという根拠は、全ＩｇＧ調製物中のシアル化ＩｇＧの限定濃度でありうる。ＩＶＩＧをＳＮＡ−レクチンアフィニティカラムで分画して、シアル酸修飾グリカン構造が濃縮されたＩｇＧ分子を得た。
【００７２】
これらのシアル酸濃縮フラクションについて、未分画のＩＶＩＧと比較した、ＫｘＮ血清転移関節炎モデルにおける保護的効果を試験した。未分画のＩＶＩＧが１ｇ／ｋｇであったのに対して、ＳＮＡ濃縮ＩＶＩＧでは０．１ｇ／ｋｇで同等の保護が得られたため、１０倍の保護増強がＳＮＡ−結合フラクションで観察された。ＳＮＡ濃縮フラクションの血清半減期およびＩｇＧサブクラス分布は、未分画のＩＶＩＧのものと同等であった。シアル化の効果は、ＩｇＧに特異的であった；同じような２分岐の（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）、複合炭水化物構造を有するフェチュインまたはトランスフェリン等のシアル化Ｎ−結合型グリコプロテインは、等モル濃度のＩｇＧで統計学的に有意な抗炎症活性を示さなかった。最後に、シアル化ＩＶＩＧ調製物の保護機構は、ＦｃｙＲＩＩＢ発現に依存し、エフェクターマクロファージでのこの阻害性レセプターの発現の増大をもたらすという点で、未分画のＩＶＩＧと同様であった。
【００７３】
実施例４．  シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの抗炎症反応の向上はＦｃドメインのＮ−結合型グリカンのシアル化によって仲介される
ＩＶＩＧのポリクローナルＩｇＧもまたシアル化されうる軽鎖または重鎖可変領域のＯおよびＮ結合型グリカンを含むので、我々は、ＳＮＡ−リッチなＩｇＧ調製物の抗炎症活性の増加がＦｃ上のＮ−結合型グリコシル化部位のシアル化が増加した結果であることを、確認した。Ｆｃフラグメントは、未分画化のおよびＳＮＡ分画されたＩＶＩＧから作製し、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を試験した。インタクトＩｇＧで観察されたように、未分画化のＩＶＩＧから作製したＦｃ−フラグメントと比較した場合に、ＳＮＡ−精製Ｆｃフラグメントはｉｎ  ｖｉｖｏにおける保護効果を向上した。これに対して、Ｆａｂフラグメントはこのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて何ら抗炎症活性を示さなかった。したがって、ＩＶＩＧの抗炎症活性には高投与量が必要であることは、全調製物中に存在するシアル化ＩｇＧの寄与が小さいことに起因している可能性がある。シアル酸結合レクチンクロマトグラフィーによってこれらのフラクションを濃縮することは、その結果として抗炎症活性を増加した。
【００７４】
ＩｇＧ抗体の受動免疫を用いたこれらの結果から、炎症性種から抗炎症種へと切り替えるＩｇＧの能力がＦｃドメインのＮ−結合型グリカンのシアル化の程度の影響を受けることが示された。
【００７５】
実施例５．  ＩｇＧのシアル化によって媒介される、抗炎症活性の増加は、活性免疫反応中に起こる
グッドパスチャー症候群のマウスモデル
このモデルでは、マウスを最初にアジュバントを併用したヒツジＩｇＧで感作し、４日後にヒツジ抗マウス糸球体基底膜調製物（腎毒性血清、ＮＴＳ）を注射した。簡単に述べると、ＣＦＡにおけるヒツジＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）２００μｇをマウスに腹腔内に予め免疫した後、４日後に体重グラムあたりＮＴＳ血清２．５μｌを静脈内注射した。血液を、抗ＧＢＭ抗血清を注射してから４日後に未処理コントロールマウスから集め、血清ＩｇＧをプロテインＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュージャージー州）およびＮＨＳ−活性化セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュージャージー州）にヒツジＩｇＧを共有結合することによって作製される、セファロース結合ヒツジＩｇＧカラム、アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００７６】
予備感作、続いてのＮＴＳ処理により、マウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジＩｇＧ抗体を誘発する（ＮＴＮ免疫付与）。Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  ２０３：７８９（２００６）。マウスＩｇＧ２ｂ抗体は、ＮＴＳ抗体とともに糸球体中に蓄積され、浸潤性マクロファージのＦｃｙＲＩＶのＩｇＧ２ｂ媒介活性化による急性劇症炎症反応をもたらす。予備感作がない場合には、炎症は観察されないことから、マウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジＩｇＧ抗体は炎症性反応のメディエーターであることが示される。
【００７７】
炎症促進性ＩｇＧ（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＩｇＧ）をもたらす能動的な免疫処置（ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）がシアル化の変化と関連するかどうかを究明するために、免疫処置前のおよびＮＴＳで免疫処置されたマウスの血清ＩｇＧおよびＩｇＭについて、ＳＮＡレクチン結合によってシアル酸含有量を特性化した。全ＩｇＧシアル化は、免疫処置されていないコントロールと比較して、免疫処置されたマウスで平均で４０％減少した。この効果はＩｇＧに特異的であった；ＩｇＭのシアル化は免疫処置前および免疫処置後で同等であった。マウス血清のヒツジ特異的ＩｇＧフラクションを分析すると、このシアル化の相違はより顕著であり、免疫処置前のＩｇＧと比較してシアル化が５０〜６０％減少したことが示された。
【００７８】
これらの結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって確認された。単糖組成分析は、ＵＣＳＤ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって行なった。糖タンパク質サンプルを、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールで変性し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで消化した。放出されたＮ−グリカン混合物は逆相ＨＰＬＣおよび固相抽出によって精製した後、Ｎ−グリカンの露出した水酸基をメチル化した。得られた誘導体化単糖類を逆相ＨＰＬＣで再度精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけた。
【００７９】
免疫処置前および免疫処置後のＩｇＧの分析によって、Ｎ−グリカン構造の変化が末端シアル酸部分に特異的であることが確認された。ＦｃｙＲＩＶ産生のエンゲージメント（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に応答することが以前に示された、糸球体、浸潤性マクロファージ中に蓄積されるマウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジ抗体は、免疫処置前のコントロールと比較してシアル酸含有量が減少した。
【００８０】
実施例６．  ＩＶＩＧにおけるシアル酸とガラクトースとの結合の分析
ＳＮＡ＋（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ＩＶＩＧ  Ｆｃ結合のＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ分析を行ない、上記したＩＴＰ、ＲＡおよび腎毒性腎炎モデルで保護特性を示したシアル化ＩｇＧ  Ｆｃフラクションの構造を決定した。Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆで生じたグリカンピークを単離し、さらに分画して、ガラクトース−シアル酸構造が得られるまで再分析した。ｉｎ  ｖｉｖｏで抗炎症活性を有する高濃度のガラクトース−シアル酸構造物のフットプリントヒストグラム（図１Ａ）を、シアル酸結合の標準物である、α２−３シアリルラクトース（図１Ｂ）およびα２−６シアリルラクトース（図１Ｃ）のヒストグラムと比較した。標準物質の付号のついたピーク（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅａｋ）は矢印で示され、それぞれ、α２−３（図１Ｂ）またはα２−６（図１Ａおよび図１Ｃ）では矢印で示され、サンプルから得られたピークと比較する。
【００８１】
実施例７．  ＩＶＩＧ  Ｆｃフラグメントのｉｎ  ｖｉｒｔｏでのグリコシル化によるα２，６結合の濃縮により、ＩＶＩＧの抗炎症特性が向上する
図２Ａで示されるように、ＩＶＩＧ  ＦｃフラグメントのグリカンＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ  ＭＳ分析から、末端にガラクトースが存在しない（ピークＧ０）、１個のガラクトースが存在する（ピークＧ１）、２個のガラクトースが存在する（ピークＧ２）、またはシアル酸が存在する（「末端シアル酸」と記載される括弧で示される）構造物が示される。２，３または２，６シアル化ＩｇＧ  Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定するために、サンプルをシアリダーゼで処理した後、ガラクトーストランスフェラーゼで処理して、Ｇ０（ガラクトースなし）およびＧ１（１個のガラクトース）をＧ２（完全にガラクトシル化）に変換して、シアル化の可能性のある部位を増やした。図２Ｂに示されるように、ＥＣＬおよびクマシーをのせたコントロールによって測定される末端ガラクトースの相対的なバンド強度比を比較することによって、過剰ガラクトシル化（ｈｙｐｅｒｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）が確認された。ｉｎ  ｖｉｒｔｏのシアル化を、α２−６シアリルトランスフェラーゼ（「ＳＴ６Ｇａｌ」）またはα２−３シアリルトランスフェラーゼ（「ＳＴ３Ｇａｌ」）のいずれかを用いて行ない、ＳＮＡ（上段）ではα２−６結合またはＥＣＬ（中段）およびクマシー（下段）ではα２−３結合をレクチンブロットによって確認した。シアル化Ｆｃがｉｎ  ｖｉｔｒｏで炎症を阻害する能力を評価する（図２Ｄ）ために、マウスに、０．６６ｍｇのα２−６シアル化Ｆｃ（黒三角）または０．６６ｍｇのα２−３シアル化Ｆｃ（赤三角）のいずれかを投与した。１時間後、０．２ｍｌのＫ／ＢｘＮ血清を投与し、足底の腫れ（臨床スコア）を次の７日間モニターした。抗炎症活性は、２，６シアル化ＩｇＧ  Ｆｃフラグメントでは観察されたが、２，３シアル化分子では観察されなかった。これらの結果は上記データと一致し、これから２，６シアル酸−ガラクトースの優先的結合がシアル化ＩｇＧの抗炎症活性に関与していることが示される。
【００８２】
実施例８．  ２，３シアル酸結合ではなくα２−６シアル酸結合を除去すると、ＩＶＩＧの免疫抑制特性が無効にされる
ＩＶＩＧを結合に特異的なシアリダーゼ（ＳＡ）で処理し、消化物をレクチンブロットで確認した（図３Ａ）。上段は、ＩＶＩＧのα２−６結合（左レーン）、およびα２−３ＳＡ  ｔｘ  ＩＶＩＧ（中央レーン）では染色が確認され、陽性Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ）を示すが、α２−３，６ＳＡ  ｔｘ  ＩＶＩＧ（右レーン）では染色が確認されなかった。中段は、α２−３シアル酸結合に関するドットブロットであり（ＭＡＬ  Ｉ）、フェチュイン陽性コントロールでのみ陽性の染色が示される；１００μｇのタンパク質を１ドット当たりのせる。下段は、クマシーをのせたコントロールを示す。１０μｇ／レーンがブロットおよびゲルで示される。シアル酸部分の特異的な除去効果を調べるために、マウスに、１ｇ／ｋｇのＩＶＩＧ調製物を投与した後、２００μｌのＫ／ＢｘＮ血清を投与した。図３Ｂに示されるように、Ｋ／ＢｘＮ血清が投与されたマウス（白丸）では、１週間の間中、臨床スコアによって測定される際の、足底の腫れが観察された。ＩＶＩＧで処置されたマウス（黒三角）では、α２−３ＳＡ  ｔｘ  ＩＶＩＧで処置されたマウス（白三角）と同様、わずかなむくみが観察されたが、α２−３，６ＳＡ  ｔｘ  ＩＶＩＧが投与されたマウス（四角）は足底の腫れが保護されなかった。
【００８３】
実施例９．  細胞毒性の減少は、シアル酸とガラクトースとの結合の性質に依存しない
本発明者らは、ＩｇＧのＦｃドメインと関連するＮ−結合型グリカンのシアル化によりＦｃＲ結合が低減し、これによりＡ／Ｉ比（Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，６７０（２００６））、すなわち、個々の活性化（Ａ）または阻害（Ｉ）ＩｇＧ  Ｆｃレセプターに対するＩｇＧ  Ｆｃ結合に関する親和定数由来の値が減少することを既に示している。この比は、特定のＩｇＧ  Ｆｃに対するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞毒性を予測することが示される（Ｆ．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５））。したがって、Ｆｃシアル化は、ＡＤＣＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに加えて、誘導型血小板減少症モデルでのＩｇＧ抗体の細胞毒性を低減した（Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，６７０（２００６），Ｓｃａｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，１５２４（２００７））。したがって、本発明者らは、このＦｃＲ結合および細胞毒性の減少がシアル酸−ガラクトース結合の影響を受けるかどうかを究明することを開始した。血小板消費をもたらすことが既に示されている抗血小板ＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を上記と同様にしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでシアル化し、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を試験した。末端２，３および２，６双方をｉｎ  ｖｉｔｒｏでシアル化したＩｇＧ  Ｆｃは、血小板減少症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで、この抗血小板抗体、６Ａ６−ＩｇＧ２ｂの細胞毒性を減少し（図４）、これは以前の研究結果と一致する（Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，６７０（２００６），Ｓｃａｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，１５２４（２００７））。ゆえに、ＩｇＧ抗体の細胞毒性へのＦｃシアル化の効果は、最後から２番目のガラクトースへの結合の特異性に依存しない。
【００８４】
これに対して、シアル化ＩｇＧ  Ｆｃフラグメントの抗炎症活性（本発明者らが標準的なＩｇＧ  Ｆｃレセプターに依存しないことを示した特性（Ｆ．  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，  Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）；Ｆ．  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，  Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４，１１（２００７））は、図３Ｂに示されるように、２，６シアル酸−ガラクトース結合に対して明らかな優先を示した。
【００８５】
これらの結果はさらに、ＩＶＩＧの抗炎症特性が標準的なＦｃγＲへの結合に関与しない異なる経路を介して仲介される（このことは、従来認められているモデル（Ｆ．  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，  Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）；Ｆ．  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，  Ｊ．Ｖ．  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４，１１（２００７）とは際立って対照的である）という本発明者らの従来の考察を支持する。
【００８６】
実施例１０．  ２，６シアル化ＩｇＧ  Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏ抗炎症活性は、単にＩｇＧ  Ｆｃグリカンの特性である
２，６シアル化ＩｇＧ  Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏ抗炎症活性が単にＩｇＧ  Ｆｃグリカンの特性であり、異種のＩＶＩＧ  Ｆｃ調製物で見出される他の成分の結果ではないことを十分示すために、シアル化ＩＶＩＧ  Ｆｃの抗炎症活性を、２９３Ｔ細胞で発現するｃＤＮＡ（配列番号：１）由来の、同質の組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ基質（ｒＦｃ）を用いて概括した。精製した組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを、β１，４ガラクトシル化によって、次に、２，６シリル化によって、上記と同様、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリカン操作した（図５Ａ）。調製物を精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏ分析前に、レクチンブロットおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（図５Ａ）によって特性を明らかにした。ＥＣＬで末端ガラクトース（上段）、ＳＮＡでα２，６シアル酸（中段）についてレクチンブロットでグリコシル化を確認し、およびクマシーをのせたコントロールを下段に示す。
【００８７】
マウスに、ＩＶＩＧ、ＳＮＡ＋ＩＶＩＧ  Ｆｃ、またはシアル化ｒＦｃ（２，６ＳＴ  ｒＦｃ）を１時間投与した後、Ｋ／ＢｘＮ血清を投与し、次の数日間にわたって足底の腫れをモニターした。図５Ｂに示されるように、２，６シアル化組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントは、ＩＶＩＧ誘導性シアル酸増加Ｆｃフラグメント(IVIG-derived sialic- enriched Fc fragment)（ＳＮＡ＋ＩＶＩＧ  Ｆｃ）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ２，６シアル化ＩＶＩＧ誘導性Ｆｃフラグメント(in vitro 2,6 sialylated IVIG-derived Fc fragment)（２，６ＳＴ  ＩＶＩＧ  Ｆｃ）のいずれかで得られたものに匹敵する抗炎症活性を示した。１群あたり４〜５匹のマウスの臨床スコアの平均および標準偏差をプロットする；＊は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ａｎｏｖａ、さらにはＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃによって測定される際にｐ＜０．０５であることを示す。
【００８８】
これらの調製物はそれぞれ、３０ｍｇ／ｋｇで活性があり、これに比して、天然のＩＶＩＧでは１，０００〜２，０００ｍｇ／ｋｇが必要であった（表１）。
【００８９】
【表１】
2011506476.tif 000002
【００９０】
本明細書で引用される全ての特許および非特許文献は、これらの特許および非特許文献の各々が全体で参照によって本明細書に組み込まれる範囲で本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書の発明がたとえ特定の例や実施形態を参照して説明されているとしても、これらの実施例や実施形態は、本発明の原理および用途を単に詳細に説明するにすぎないと理解されるべきである。したがって、詳細な実施形態には多数の修飾が可能であり、下記特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から外れない限り、他の改変が考え出されうることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
2011506476.tif 000003
【図１Ｂ】
2011506476.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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