(57)【要約】【化１】2011500624.tif 000017  本発明は、２−［３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−５−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミドおよびそのアナログもしくは製薬学的に許容しうる塩、それらを製造する方法、それらを含有する製薬学的組成物ならびに治療におけるそれらの使用に関する。本発明は特に、ニコチン性受容体アゴニストの効能を増加する能力を有するニコチン性アセチルコリン受容体の強力なポジティブアロステリックモジュレーターに関する。【選択図】  なし
2011500624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2011500624.tif 000015
の化合物あるいはその製薬学的に許容しうる塩または水和物もしくは溶媒和物。
【請求項２】
化合物が請求項１に記載の化合物である、α７ニコチン性受容体の調節が有益である精神障害、知的機能障害もしくは疾患、炎症性疾患もしくは症状の防止または処置もしくは予防用の薬剤の製造のための化合物の使用。
【請求項３】
製薬学的に許容しうる担体および有効成分として請求項１に記載の化合物の治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４】
製薬学的に許容しうる担体を請求項１に記載の化合物の治療的に有効な量と密接に混合することを特徴とする、請求項３に記載の組成物を製造する方法。
【請求項５】
α７ニコチン性受容体の調節が有益である疾患を予防するかもしくは処置することにおける同時、別個もしくは逐次使用のための組み合わされた製剤として、（ａ）請求項１に記載の化合物および
（ｂ）α７ニコチン性受容体アゴニスト
を含んでなる製品。
【請求項６】
０℃〜５０℃の温度範囲において７５容量％〜８５容量％のＴＨＦおよび１５容量％〜２５容量％のＮＭＰからなる溶媒系において触媒量の鉄（ＩＩＩ）アセチルアセトネートの存在下で式（ＶＩ）の中間体を過剰のグリニャール試薬ＭｅＭｇＢｒと反応させる段階を含んでなる請求項１に記載の化合物を製造する方法。
【化２】
2011500624.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−［３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−５−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミドおよびその製薬学的に許容しうる塩、それらを製造する方法、それらを含有する製薬学的組成物ならびに治療におけるそれらの使用に関する。本発明は、ニコチン性受容体アゴニストの効能を増加する能力を有するα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的な強力なポジティブアロステリックモジュレーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、神経ペプチドＹ受容体リガンドとして３−アルキルアミノ−１，２，４−トリアゾールを記述する。
【０００３】
Ｍａｋａｒａ  Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．による論文（非特許文献１）は、３−アルキルアミノ−１，２，４−トリアゾールの固相合成を記述し、そしてＮ−（４−メトキシフェニル）−１−メチル−５（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−アミン［ＣＡＳ  Ｎｏ：４３３７１０−５５−５］のうまくいかなかった合成を例示し、そしてこの化合物の潜在的治療応用について、特にα７ニコチン性アセチルコリン受容体のポジティブアロステリックモジュレーターとしてのその使用について語らない。
【０００４】
Ｃｈｅｎ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、非特許文献２において、１−アルキル−３−アミノ−５−アリール−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール、特にＮ−（２−メトキシフェニル）−１−メチル−５−（２，４−ジクロロフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−アミンの合成、およびコルチコトロピン放出因子−１（ＣＲＦ１）アンタゴニストとしてのそれらの使用を記述する。
【０００５】
コリン作動性受容体は、通常は、内因性神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）に結合し、それによりイオンチャンネルの開口を引き起こす。哺乳類中枢神経系におけるＡＣｈ受容体は、それぞれ、ムスカリンおよびニコチンのアゴニスト活性に基づいてムスカリン性（ｍＡＣｈＲ）およびニコチン性（ｎＡＣｈＲ）サブタイプに分類することができる。ニコチン性アセチルコリン受容体は、５個のサブユニットを含有するリガンド依存性イオンチャンネルである。ｎＡＣｈＲサブユニット遺伝子ファミリーのメンバーは、それらのアミノ酸配列に基づいて２群；いわゆるβサブユニットを含有する一群およびαサブユニットを含有する第二群に分類されている。３種類のαサブユニット、α７、α８およびα９は、単独で発現した場合に機能的受容体を形成することが示されており、従って、ホモオリゴマーペンタマー受容体を形成すると推定される。
【０００６】
ｎＡＣｈＲのアロステリック転移状態モデルが構築されており、これは少なくとも静止状態、活性化状態および「脱感作」閉チャンネル状態（受容体がアゴニストに対して非感受性になる過程）を含む。異なるｎＡＣｈＲリガンドは、それらが優先的に結合する受容体の立体配座状態を安定させることができる。例えば、アゴニストＡＣｈおよび（−）−ニコチンは、それぞれ活性および脱感作状態を安定させる。
【０００７】
ニコチン性受容体の活性の変化は、多数の疾患に関与している。これらのいくつか、例えば重症筋無力症および常染色体優性夜間前頭葉癲癇（ＡＤＮＦＬＥ）は、受容体数の減少もしくは増大した脱感作のいずれかによるニコチン性伝達の活性の減少と関連する。
【０００８】
ニコチン性受容体の減少はまた、アルツハイマー病および統合失調症のような疾患において見られる認知障害を媒介すると仮定されている。
【０００９】
タバコからのニコチンの作用もまたニコチン性受容体により媒介され、そしてニコチンの作用は脱感作状態の受容体を安定させることであるので、ニコチン性受容体の増加した活性は喫煙に対する欲求を減らし得る。
【００１０】
ｎＡＣｈＲに結合する化合物は、学習障害、認知障害、注意欠陥もしくは記憶喪失のような減少したコリン作動性機能を伴う様々な障害の処置に示唆されている。α７ニコチン性受容体活性の調節は、アルツハイマー病、レビー小体認知症、注意欠陥多動性障害、不安、統合失調症、躁病、躁鬱病、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、脳損傷、または時差ぼけ、ニコチン中毒、疼痛を包含する、コリン作動性シナプスの喪失がある他の神経、変性もしくは精神障害を包含する多数の疾患において有益であると考えられる。
【００１１】
しかしながら、ＡＣｈは受容体活性を活性化するだけでなく、脱感作および非競合的遮断を含む過程を通して阻害もするので、ＡＣｈと同じ部位で作用するニコチン性受容体アゴニストでの処置は問題がある。さらに、長期的活性化は長期にわたる不活性化を誘導するように思われる。従って、ＡＣｈのアゴニストは活性を高めると同様にそれを減少させると考えることができる。
【００１２】
一般に、ニコチン性受容体で、そして特にα７ニコチン性受容体で、脱感作は適用したアゴニストの作用の持続時間を限定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＥＰ  １０４４９７０明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）Ｖｏｌ．４（１０）；１７５１−１７５４
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１（２００１）３１６５−３１６８
【発明の概要】
【００１５】
［発明の記述］
驚くべきことに、２−［３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−５−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミドはニコチン性アセチルコリン受容体でのアゴニストの効能を増加できることが見出された。このタイプの作用を有する化合物は「ポジティブアロステリックモジュレーター」と呼ばれ、そしてニコチン性伝達の減少と関連する症状の処置に有用であると思われる。治療環境において、そのような化合物は活性化の時間的プロフィールに影響を及ぼさずに正常なニューロン間伝達を回復し得る。さらに、ポジティブアロステリックモジュレーターは、アゴニストの反復もしくは長期適用後に起こり得るような受容体の長期間の不活性化を引き起こすと考えられない。
【００１６】
本発明のポジティブｎＡＣｈＲモジュレーターは、α７ニコチン性受容体の調節が有益である精神障害、知的機能障害もしくは疾患、炎症性疾患もしくは症状の処置もしくは予防に有用である。
【００１７】
本発明は、α７ニコチン性受容体でのアゴニストの効能を増加する、ポジティブアロステリックモジュレーター特性を有する２−［３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−５−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミドに関する。本発明はさらに製造方法およびそれらを含んでなる製薬学的組成物に関する。本発明はまた、α７ニコチン性受容体の調節が有益である精神障害、知的機能障害もしくは疾患もしくは症状の処置もしくは予防用の薬剤の製造のためのこの誘導体の使用にも関する。
【００１８】
本発明の化合物およびその塩は、先行技術化合物と構造的にそしてα７ニコチン性アセチルコリン受容体のポジティブアロステリックモジュレーターとしてのその高められた活性により、その高められた水溶性により、そしてその改善されたインビトロ心血管安全性パラメーター、特にｈＥＲＧカリウムチャンネルに対する減少した親和性により薬理学的に異なる。
【００１９】
本発明は化合物（Ｉ）
【００２０】
【化１】
2011500624.tif 000003
【００２１】
あるいはその製薬学的に許容しうる塩または水和物もしくは溶媒和物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
治療用途には、式（Ｉ）の化合物の塩は、対イオンが製薬学的に許容しうるものである。しかしながら、製薬学的に許容できない塩もまた、例えば製薬学的に許容しうる化合物の製造もしくは精製において、用途を見出すことができる。全ての塩は、製薬学的に許容しうるかもしくはそうでないにしても、本発明の範囲内に包含される。
【００２３】
上記もしくは下記のような製薬学的に許容しうる付加塩は、化合物（Ｉ）が形成することのできる治療的に有効な無毒の酸付加塩形態を含んでなるものとする。製薬学的に許容しうる酸付加塩は、塩基形態をそのような適切な酸で処理することにより都合良く得ることができる。適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸；または例えば酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモン酸などのような有機酸を含んでなる。逆に、該塩形態は適切な塩基での処理により遊離塩基形態に転化することができる。
【００２４】
水和物および溶媒和物という用語は、式（Ｉ）の化合物ならびにその塩が形成することのできる水和物およびアルコラートをさす。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物はまた、互変異性体において存在することもできる。そのような形態は、上記の式において明白に示されないが、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００２６】
化合物の製造
本発明の化合物は一連の段階により一般に製造することができ、その各々は当業者に既知である。特に、本特許出願における化合物は以下の製造方法（スキーム１〜５）に従って製造することができる。
【００２７】
【化２】
2011500624.tif 000004
【００２８】
アシルチオ尿素（ＩＩ）は、２段階で得られる。第一の段階において、塩化アシル（Ｉ）を例えばチオシアン酸アンモニウムのようなチオシアン酸１価陽イオンと反応させて対応するイソチオシアン酸アシルを生成せしめる。この反応は、溶媒としてアセトンを用いてそして０℃〜７０℃の間の温度で、好ましくは室温で行うことができる。
【００２９】
中間体イソチオシアン酸アシルを単離せずに、同じ反応媒質において都合良く行うことができる第二の段階において、アニリン（ＩＩＩ）を加えて式（ＩＩ）のＮ−アシルチオ尿素を生成せしめる。この反応は通常は０℃〜７０℃の間の温度で、好ましくは室温で行われる（スキーム１）。
【００３０】
【化３】
2011500624.tif 000005
【００３１】
次の段階において、Ｎ−アシルチオ尿素（ＩＩ）のＳ−メチル化により式（ＩＶ）のＮ−アシルカルバムイミドチオ酸（ｃａｒｂｏｍｉｍｉｄｏｔｈｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、メチルエステル誘導体を生成せしめる。この転化は塩基、好ましくは強い無機塩基、例えばＮａＨもしくは炭酸カリウムの存在を必要とし、そして例えばＤＭＦ、ＴＨＦなどのような非プロトン性溶媒において、−７０℃〜室温の間の温度、好ましくは０℃で行われる（スキーム２）。
【００３２】
【化４】
2011500624.tif 000006
【００３３】
式（ＩＶ）のＮ−アシルカルバムイミドチオ酸、メチルエステル誘導体は、２−ヒドラジニル酢酸エチルエステル、塩酸塩を用いて式（Ｖ）の１，２，４−トリアゾールに転化することができる。この転化はメタノールもしくは高級アルコールのようなプロトン性溶媒において典型的に行われ、そして室温〜１５０℃の間の温度を必要とする。特定の態様において、高級アルコールは第三級ブチルアルコールであり、そして反応温度は７０℃〜１２０℃の間、最も好ましくは１００℃である。化学量論量の塩基の添加が好ましい。該塩基は酢酸カリウムもしくは炭酸カリウムのような無機塩基であることができ、より好ましくはしかしながら、該塩基はジイソプロピルエチルアミンなどのような第三級アミンである（スキーム３）。
【００３４】
【化５】
2011500624.tif 000007
【００３５】
式（Ｖ）の［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−酢酸エチルエステルは、０℃〜８０℃の間の温度、好ましくは室温でプロトン性溶媒における過剰量のエチルアミンでの処理により、対応する［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミド（ＶＩ）に転化される（スキーム４）。
【００３６】
【化６】
2011500624.tif 000008
【００３７】
式（Ｉ）の最終的なジメチル置換されたピリドトリアゾールは、７５容量％〜８５容量％のＴＨＦおよび１５容量％〜２５容量％のＮＭＰからなる溶媒系において触媒量の鉄（ＩＩＩ）アセチルアセトネートの存在下で過剰（３〜１５当量）のグリニャール試薬ＭｅＭｇＢｒでの２−クロロピリジル前駆体（ＶＩ）の処理により製造することができる。該転化は０℃〜５０℃の間、最も好ましくは０℃〜２５℃の間の温度範囲において行うことができる（スキーム５）。
【００３８】
薬理学
本発明の化合物は、α７ニコチン性受容体のポジティブアロステリックモジュレーターであることが見出された。α７ニコチン性受容体（α７ｎＡＣｈＲ）は、５−ＨＴ３、ＧＡＢＡＡおよびグリシン受容体ファミリーを包含するｃｙｓ−ループイオンチャンネル型リガンド依存性イオンチャンネルのスーパーファミリーに属する。それはアセチルコリンおよびその分解産物コリンにより活性化され、そしてα７ｎＡＣｈＲの主な特徴はアゴニストの持続的存在下でのその迅速な脱感作である。それは脳における２番目に豊富なニコチン性受容体サブタイプであり、そして多数の神経伝達物質の放出の重要な調節因子である。それは、海馬および前頭前皮質のような、注意および認知過程に関連性を有するいくつかの脳構造における離散分布を有し、そしてヒトにおける様々な精神および神経障害に関与している。それはまた、コリン作動性炎症経路にも関与している。
【００３９】
統合失調症とのその関連の遺伝学的証拠は、統合失調症マーカー（感覚ゲーティング障害）と１５ｑ１３−１４上のα７遺伝子座およびα７遺伝子のコアプロモーター領域における多型との間の強い連鎖の形態において見られる。
【００４０】
病理学的証拠は、統合失調症脳の海馬、前頭および帯状皮質における、パーキンソン病およびアルツハイマー病そして自閉症における室傍核および結合核におけるα７免疫反応性およびα−Ｂｔｘ結合の喪失を提示する。
【００４１】
健常者と比較して統合失調症患者の顕著な喫煙習慣のような薬理学的証拠は、α７ニコチン作動性伝達の障害を補うために自分で治療しようとする患者による試みとして解釈されている。ニコチン投与の際の動物モデルおよびヒトの両方における感覚ゲーティングの障害の一時的な正常化（プレパルス抑制ＰＰＩ）および前脳コリン作動性活性が低い場合（例えば段階２睡眠）の統合失調症患者における正常な感覚ゲーティングの一時的な回復は、両方ともα７ニコチン性受容体の一時的な活性化およびその後に続く脱感作の結果であると解釈されている。
【００４２】
従って、α７ｎＡＣｈＲを活性化することは多数のＣＮＳ（精神および神経）障害に治療的に有益な効果を有すると考える十分な理由がある。
【００４３】
すでに述べたように、α７ｎＡＣｈＲは天然の伝達物質アセチルコリンならびにニコチンのような外来リガンドの持続的存在下で迅速に脱感作する。脱感作状態において、受容体はリガンドと結合したままであるが、機能的に不活性である。アセチルコリンおよびコリンのような天然の伝達物質は、非常に強力な分解（アセチルコリンエステラーゼ）およびクリアランス（コリン輸送体）機序の基質であるので、これはこれらにとってそれほど問題ではない。これらの伝達物質分解／クリアランス機序は、生理学的に有用な範囲において活性化可能な（ａｃｔｉｖａｔｉｂｌｅ）および脱感作したα７ｎＡＣｈＲ間の平衡を維持すると思われる。しかしながら、天然の分解およびクリアランス機序の基質ではない合成アゴニストは、過剰刺激ならびに持続的脱感作状態にα７ｎＡＣｈＲ個体群平衡を推し進めることの両方の潜在的不利益を有すると考えられ、それはα７ｎＡＣｈＲ発現もしくは機能の欠損が一因となる障害において望ましくない。アゴニストは、本質的に、異なるニコチン性受容体サブタイプにわたって高度に保存されるＡＣｈ結合ポケットを標的
としなければならず、他のニコチン性受容体サブタイプの非特異的活性化による有害反応の可能性につながる。従って、これらの潜在的不利益を防ぐために、α７アゴニスム（ａｇｏｎｉｓｍ）の代替治療戦略は、ポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）で天然のアゴニストに対する受容体反応性を高めることである。ＰＡＭは、アゴニスト結合部位と異なる部位に結合しそしてそれ故にアゴニストもしくは脱感作特性を有すると考えられないが、天然の伝達物質に対するα７ｎＡＣｈＲの反応性を高める薬剤として定義される。この戦略の価値は、所定量の伝達物質に対してα７ｎＡＣｈＲ反応の大きさがＰＡＭの不在下において可能な伝達のレベルに対してその存在下で増加されることである。従って、α７ｎＡＣｈＲタンパク質の欠損がある障害について、α７ニコチン作動性伝達のＰＡＭにより誘導される増加は有益であることができる。ＰＡＭは天然の伝達物質の存在に依存するので、過剰刺激の可能性は天然の伝達物質の分解／クリアランス機序により限定される。
【００４４】
本発明の化合物は、全細胞電圧固定記録により決定した場合に、定性的速度論的性質に基づいて、１〜４型として分類される。この分類は、アゴニスト適用により誘発されるシグナルへの、上記のような、α７ＰＡＭ化合物の効果に基づく。特に、該アゴニストは１ｍＭの濃度のコリンである。好ましい実験設定において、該α７ＰＡＭ化合物およびコリンは、下記の通り、細胞に同時に適用される。脱感作は、下記の通り、アゴニストによる初期活性化後に外向き電流の減少として見られる全細胞電圧固定電気生理学測定におけるアゴニストの適用中の活性化の際の受容体の閉鎖である。
【００４５】
ＰＡＭ１〜４型の定義を以下に記述する：
１型化合物は、１ｍＭのコリンにより誘発される電流のエフェクトサイズを高めるが、受容体の反応速度論を最低限にしか改変しない。特に、アゴニストにより誘発される、脱感作の速度および程度は影響されない。従って、１ｍＭのコリンに対する化合物により調節される反応は、α７  ＰＡＭ化合物の不在下での１ｍＭコリン反応の線形に近いスケーリング（ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｉｎｇ）である。
２型化合物は、脱感作の速度および／もしくは程度を減少させながら１ｍＭのコリンにより誘発される電流のエフェクトサイズを高める。
３型化合物は、１ｍＭのコリンにより誘発される電流のエフェクトサイズを高める。１０μＭまでのより高い濃度で試験した場合に、それらは脱感作を完全に抑制する、特に２５０ミリ秒の１ｍＭのコリン適用。
４型化合物は受容体の初期脱感作、続いてアゴニスト適用中の受容体の再開口を可能にする。α７  ＰＡＭ化合物の低効能濃度で、脱感作が後に続く、アゴニストにより誘導される活性化は、初期内向き電流最大値として化合物により誘導される再開口からなお分離することができる。α７  ＰＡＭ化合物のより高い効能濃度で、再開口は脱感作による閉鎖より速く起こり、その結果として初期電流最大値は消失する。
【００４６】
従って、唯一の活性物質としてポジティブアロステリックモジュレーターを投与し、そのようにしてアセチルコリンもしくはコリンのような内因性ニコチン性受容体アゴニストの活性を調節すること、またはニコチン性受容体アゴニストと一緒にポジティブアロステリックモジュレーターを投与することのいずれかを含む処置の方法を提供することは本発明の目的である。本発明のこの態様の特定の形態において、処置の方法は本明細書に記述されるようなα７ニコチン性受容体のポジティブアロステリックモジュレーターおよびα７ニコチン性受容体アゴニストもしくは部分アゴニストでの処置を含んでなる。α７ニコチン性受容体アゴニスト活性を有する適当な化合物の例には：
−１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−カルボン酸，４−ブロモフェニルエステル，１塩酸塩（ＳＳＲ１８０７１１Ａ）；
−（−）−スピロ［１−アザビシクロ［２．２．２．］オクタン−３，５’−オキサゾリジン］−２’−オン；
−３−［（２，４−ジメトキシ）ベンジリデン］−アナバセイン２塩酸塩（ＧＴＳ−２１）；
−［Ｎ−［（３Ｒ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イル］−４−クロロベンズアミド塩酸塩］ＰＮＵ−２８２９８７）
が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の化合物は、α７ニコチン性受容体活性の調節が有益である精神障害、知的機能障害もしくは疾患もしくは症状の処置もしくは予防に有用である。本発明の方法の特定の態様は、学習障害、認知障害、注意欠陥もしくは記憶喪失の処置の方法であり、α７ニコチン性受容体活性の調節は、アルツハイマー病、レビー小体認知症、注意欠陥多動性障害、不安、統合失調症、躁病、躁鬱病、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、脳損傷、または時差ボケ、ニコチン中毒、疼痛を包含する、コリン作動性シナプスの損失がある他の神経、変性もしくは精神障害を包含する多数の疾患において有益であると考えられる。
【００４８】
ニコチン性アセチルコリン受容体α７サブユニットはコリン作動性炎症経路によるサイトカイン合成を抑制するために必須であるので、本発明の化合物（１つもしくは複数）はまた抗炎症薬（１つもしくは複数）としても治療用途を見出し得る。本発明の化合物（１つもしくは複数）により処置することができる適応症の例は、内毒素血症、内毒素性ショック、敗血症、関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、炎症性腸疾患、炎症性胆汁疾患、クローン病、膵炎、心不全および同種移植片拒絶である。
【００４９】
上記の薬理学的性質を考慮して、本発明の化合物およびその製薬学的に許容しうる付加塩は薬剤として使用することができる。特に、本発明の化合物は、α７ニコチン性受容体の調節が有益である精神障害、知的機能障害もしくは疾患もしくは症状の処置もしくは予防のための薬剤の製造に用いることができる。
【００５０】
本発明の化合物の有用性を考慮して、統合失調症、躁病および躁鬱病、不安、アルツハイマー病、学習障害、認知障害、注意欠陥、記憶喪失、レビー小体認知症、注意欠陥多動性障害、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、脳損傷、時差ぼけ、ニコチン中毒および疼痛のような、α７ニコチン性受容体の調節が有益である疾患を患っているヒトを包含する温血動物を処置する方法、もしくはヒトを包含する温血動物が患うのを予防する方法が提供される。該方法は、ヒトを包含する温血動物への、その全ての立体化学的異性体、その製薬学的に許容しうる付加塩、溶媒和物もしくは水和物を包含する式（Ｉ）の化合物の有効量の投与、すなわち、全身もしくは局所投与、好ましくは経口投与を含んでなる。
【００５１】
本発明のＰＡＭの治療的に有効な量はα７ニコチン性受容体の活性を調節するために十分な量であること、およびこの量はとりわけ疾患のタイプ、治療製剤における化合物の濃度および患者の症状により異なることを当業者は認識する。一般に、統合失調症、躁病および躁鬱病、不安、アルツハイマー病、学習障害、認知障害、注意欠陥、記憶喪失、レビー小体認知症、注意欠陥多動性障害、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、脳損傷、時差ぼけ、ニコチン中毒および疼痛のような、α７ニコチン性受容体の調節が有益である疾患を処置するための治療薬として投与されるＰＡＭの量は、主治医によりケースバイケースで決定される。
【００５２】
一般に、適当な用量は０．５ｎＭ〜２００μＭ、そしてより通常には５ｎＭ〜５０μＭの範囲の処置部位でのＰＡＭの濃度をもたらすものである。これらの処置濃度を得るために、おそらく処置を必要とする患者は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間、特に０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。治療的効果を得るために
必要とされる、有効成分とも本明細書において呼ばれる本発明の化合物の量は、もちろんケースバイケースで異なり、特定の化合物、投与の経路、レシピエントの年齢および症状、ならびに処置する特定の障害もしくは疾患によって異なる。処置の方法にはまた、１日当たり１〜４回の間の服用の処方計画で有効成分を投与することを含むこともできる。これらの処置方法において、本発明の化合物は好ましくはアドミッション（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）の前に調合される。以下に本明細書において記述されるように、適当な製薬学的製剤は周知のそして容易に利用可能な成分を用いて既知の方法により製造される。
【００５３】
本発明はまた、統合失調症、躁病および躁鬱病、不安、アルツハイマー病、学習障害、認知障害、注意欠陥、記憶喪失、レビー小体認知症、注意欠陥多動性障害、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥーレット症候群、脳損傷、時差ぼけ、ニコチン中毒および疼痛のような、α７ニコチン性受容体の調節が有益である疾患を予防するかもしくは処置するための組成物も提供する。該組成物は、式（Ｉ）の化合物の治療的に有効な量および製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる。
【００５４】
有効成分を単独で投与することは可能であるが、製薬学的組成物としてそれを与えることが好ましい。従って、本発明はさらに、製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤と一緒に、本発明の化合物を含んでなる製薬学的組成物を提供する。担体もしくは希釈剤は、組成物の他の成分と適合しそしてそのレシピエントに有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。
【００５５】
本発明の製薬学的組成物は、薬学の当該技術分野において周知である任意の方法により、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，特にＰａｒｔ  ８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照）に記載のもののような方法を用いて製造することができる。有効成分として、塩基形態もしくは付加塩形態の特定の化合物の治療的に有効な量を、投与に所望される製剤の形態により多種多様な形態をとり得る、製薬学的に許容しうる担体とよく混合して合わせる。望ましくは、これらの製薬学的組成物は、好ましくは、経口、経皮もしくは非経口投与のような全身投与；または吸入、鼻腔用スプレー、点眼薬によるかもしくはクリーム、ゲル、シャンプーなどによるような局所投与に適当な単位投与形態物においてである。例えば、経口用投与形態物における組成物を製造することにおいて、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および液剤のような経口用液状製剤の場合には例えば水、グリコール、油、アルコールなどのような通常の製薬学的媒質のいずれかを：または散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤の場合には澱粉、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような固形担体を用いることができる。錠剤およびカプセル剤は、それらの投与の容易さのために、最も都合のよい経口用投与単位形態物に相当し、この場合、固形の製薬学的担体が明らかに用いられる。非経口組成物では、例えば溶解性を促進するために、他の成分を含むことができるが、担体は通常は少なくとも大部分において滅菌水を含んでなる。例えば、注入可能な液剤を製造することができ、ここで、担体は食塩水溶液、グルコース溶液もしくは食塩水とグルコース溶液の混合物を含んでなる。注入可能な懸濁剤もまた製造することができ、この場合、適切な液状担体、沈殿防止剤などを用いることができる。経皮投与に適当な組成物において、担体は、場合によりわずかな割合の任意の性質の適当な添加剤と組み合わせて、場合により浸透促進剤および／もしくは適当な湿潤剤を含んでなってもよく、これらの添加剤は皮膚へのいかなる重大な有害効果も引き起こさない。該添加剤は皮膚への投与を容易にすることができ、そして／もしくは所望の組成物を製造するために役立ち得る。これらの組成物は様々な方法において、例えば経皮パッチとして、スポットオンとしてもしくは軟膏として投与することができる。
【００５６】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投与単位形態物における上記の製薬学的組成物を調合することは特に好都合である。投与単位形態物は、本明細書および本明細書の請求項において用いる場合、単位投薬量として適当な物理的に分離した単位をさし、各単位は、必要とされる製薬学的担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された有効成分の所定量を含有する。そのような投与単位形態物の例は錠剤（分割錠もしくはコート錠を包含する）、カプセル剤、丸剤、散剤パケット、カシェ剤、注入可能な液剤もしくは懸濁剤、茶さじ一杯分、大さじ一杯分など、およびその分離した倍量である。
【００５７】
本発明の化合物は、経口、経皮もしくは非経口投与のような全身投与；または吸入、鼻腔用スプレー、点眼薬によるかもしくはクリーム、ゲル、シャンプーなどによるような局所投与に用いることができる。化合物は、好ましくは経口投与される。正確な投薬量および投与の頻度は、当業者に周知であるように、使用する式（Ｉ）の特定の化合物、処置する特定の症状、処置する症状の重症度、特定の患者の年齢、体重、性別、障害の程度および一般的な身体状態ならびに個体が服用している可能性がある他の薬剤により決まる。さらに、該有効毎日量は、処置した患者の反応によりそして／もしくは本発明の化合物を処方する医師の評価により減らすかもしくは増やし得ることは明らかである。
【００５８】
式（Ｉ）の化合物はまた、例えば１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−カルボン酸，４−ブロモフェニルエステル，１塩酸塩（ＳＳＲ１８０７１１Ａ）；（−）−スピロ［１−アザビシクロ［２．２．２．］オクタン−３，５’−オキサゾリジン］−２’−オン；３−［（２，４−ジメトキシ）ベンジリデン］−アナバセイン２塩酸塩（ＧＴＳ−２１）；もしくは［Ｎ−［（３Ｒ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イル］−４−クロロベンズアミド塩酸塩］ＰＮＵ−２８２９８７）のような他の通常のα７ニコチン性受容体アゴニストと組み合わせて用いることもできる。従って、本発明はまた式（Ｉ）の化合物およびα７ニコチン性受容体アゴニストの組み合わせにも関する。該組み合わせは、薬剤として使用することができる。本発明はまた、α７ニコチン性受容体の調節が有益である疾患の処置における同時、別個もしくは逐次使用のための組み合わされた製剤として、（ａ）式（Ｉ）の化合物および（ｂ）α７ニコチン性受容体アゴニストを含んでなる製品にも関する。異なる薬剤は、製薬学的に許容しうる担体と一緒に単一の製剤において組み合わせることができる。
【実施例】
【００５９】
実験部分
本発明の化合物を製造するためのいくつかの方法を以下の実施例において例示する。他に記載されない限り、全ての出発材料は商業的供給業者から入手し、そしてさらに精製せずに使用した。
【００６０】
以下でそして上記で、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味し；「ＮＭＰ」は１−メチル−２−ピロリジノンを意味し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、そして「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルを意味する。
【００６１】
本発明の中間体および化合物のＬＣＭＳ特性化には、以下の方法を使用した。
【００６２】
一般的方法
ＨＰＬＣ測定は、脱気装置を有するクォータナリポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン（ＬＣＭＳ方法１には６０℃でそしてＬＣＭＳ方法２には４０℃で設定する）、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および以下のそれぞれの方法において特定されるようなカラムを含んでなるＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ  ２７９０（Ｗａｔｅｒｓ）システムを用いて行った。カラムからのフローは、ＭＳ分光器に分けられた。ＭＳ検出器は、エレクトロスプレーイオン化源を用いて設定された。質量スペクトルは、０．１秒の滞留時間を用い
て１秒で１００〜１０００をスキャンすることにより得られた。キャピラリーニードル電圧は３ｋＶであり、そして供給源温度を１４０℃で保った。窒素をネブライザーガスとして用いた。データ収集は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘ−Ｏｐｅｎｌｙｎｘデータシステムで行った。
【００６３】
ＬＣＭＳ方法１
一般的方法に加えて：逆相ＨＰＬＣを１．６ｍｌ／分の流速でＸｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６ｘ１００ｍｍ）上で実施した。３つの移動相（移動相Ａ：９５％の２５ｍＭ酢酸アンモニウム＋５％のアセトニトリル；移動相Ｂ：アセトニトリル；移動相Ｃ：メタノール）を用いて６．５分で１００％Ａから５０％Ｂおよび５０％Ｃまで、０．５分で１００％Ｂまでの勾配条件を行い、そしてこれらの条件を１分間保持し、そして１００％Ａで１．５分間再平衡化した。１０μｌの注入容量を用いた。コーン電圧はポジティブイオン化モードでは１０Ｖ、そしてネガティブイオン化モードでは２０Ｖであった。
【００６４】
ＬＣＭＳ方法２（中間体にのみ使用した）
一般的方法に加えて：逆相ＨＰＬＣを３ｍｌ／分の流速でＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（４．６ｘ２５ｍｍ）上で実施した。３つの移動相（移動相Ａ：９５％の２５ｍＭ酢酸アンモニウム＋５％のアセトニトリル；移動相Ｂ：アセトニトリル；移動相Ｃ：メタノール）を用いて０．９分で９６％Ａ、２％Ｂおよび２％Ｃから４９％Ｂおよび４９％Ｃまで、０．３分で１００％Ｂまでの勾配条件を行い、そして０．２分間保持した。２μｌの注入容量を用いた。コーン電圧はポジティブイオン化モードでは１０Ｖ、そしてネガティブイオン化モードでは２０Ｖであった。
【００６５】
融点
融点（ｍ．ｐ．）は、ＤＳＣ８２３ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）で決定した。融点は３０℃／分の温度勾配で測定した。最高温度は４００℃であった。値は、この分析方法と一般に関連する実験不確実性で得られる。
【００６６】
Ａ．中間体の製造
説明１
１−（２−クロロ−６−メチル−ピリジン−４−カルボニル）−３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル）−チオ尿素（Ｄ１）
【００６７】
【化７】
2011500624.tif 000009
【００６８】
チオシアン酸、アンモニウム塩（１：１）（９．３５ｇ；０．１２３０ｍｏｌ）を室温で２−プロパノン（３００ｍｌ）において撹拌した。次に、２−クロロ−６−メチル−４−ピリジンカルボニルクロリド（２２．２ｇ；０．１１７０ｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を室温で２時間撹拌した。いくらかの２−プロパン中の２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−アミン（１９．２ｇ；０．１１１０ｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に、反応混合物を氷上に注ぎ、そして残留物を
濾過して分離し、そして乾燥させた。収量：３８．１ｇの中間体Ｄ１。
ＬＣＭＳ  保持時間：１．０３；［Ｍ−Ｈ］−ピーク：３８４；ＬＣＭＳ方法２
【００６９】
説明２
２−クロロ−Ｎ−［（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−メチルスルファニル−メチル］−６−メチル−イソニコチンアミド（Ｄ２）
【００７０】
【化８】
2011500624.tif 000010
【００７１】
ＮａＨ、６０％（２．２ｇ；０．０５５０ｍｏｌ）をＮ２下で氷浴上でＴＨＦ（１７０ｍｌ）において撹拌した。次に、中間体Ｄ１（１９．３ｇ；０．５００ｍｏｌ）を加え、そして０℃で１時間撹拌した。次に、ＣＨ３Ｉ（７．８ｇ；０．０５５０ｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を一晩室温まで温めておいた。水を加え、そしてＴＨＦを真空中で蒸発させた。沈殿物を濾過して分離し、水で洗浄し、そして乾燥させた。収量：２２．８６ｇの中間体Ｄ２。
ＬＣＭＳ  保持時間：１．１５；［Ｍ−Ｈ］−ピーク：３９８；ＬＣＭＳ方法２
【００７２】
説明３
［５−（２−クロロ−６−メチル−ピリジン−４−イル）−３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−酢酸エチルエステル（Ｄ３）
【００７３】
【化９】
2011500624.tif 000011
【００７４】
中間体Ｄ２（１３．６ｇ；０．０３４０ｍｏｌ）、２−ヒドラジニル酢酸エチルエステル，塩酸塩（１：１）（１０．５ｇ；０．０６８０ｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（１−メチルエチル）−２−プロパンアミン（１３．２ｇ；０．１０２０ｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＯＨ（４００ｍｌ）を２時間還流させた。次に、反応混合物を蒸発させた。水を加え、そして生成物をＣＨ２Ｃl２で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で蒸発させた。次に、残留物をエタノール／ＨＣｌにおいて６０℃に１時間加熱した。反応混合物を部分的に蒸発させ、そして沈殿物を濾過して分離し、そして乾燥させ
た。収量：４．５７ｇの中間体Ｄ３。
ＬＣＭＳ  保持時間：１．０３；［Ｍ−Ｈ］−ピーク：４５０；ＬＣＭＳ方法２
【００７５】
説明４
２−［５−（２−クロロ−６−メチル−ピリジン−４−イル）−３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミド（Ｄ４）
【００７６】
【化１０】
2011500624.tif 000012
【００７７】
中間体Ｄ３（１ｇ；０．００２２ｍｏｌ）およびＣＨ３ＯＨ中のエチルアミン（４０ｍｌ；２Ｍ）を室温で一晩撹拌した。生成物が反応混合物から結晶化した。結晶を濾過して分離し、そして乾燥させた。収量：７００ｍｇの中間体Ｄ４。
ＬＣＭＳ  保持時間：０．９５；［Ｍ−Ｈ］−ピーク：４４９；ＬＣＭＳ方法２
【００７８】
Ｂ．最終化合物の製造
２−［３−（２，２−ジフルオロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミノ）−５−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−エチル−アセトアミド（Ｅ１）
【００７９】
【化１１】
2011500624.tif 000013
【００８０】
中間体Ｄ４（０．７０ｇ；０．００１６ｍｏｌ）、鉄（ＩＩＩ）アセチルアセトネート（０．０６７ｇ；０．０００２ｍｏｌ）、ＴＨＦ（２０ｍｌ）および１−メチル−２−ピロリジノン（５ｍｌ）をＮ２下で０℃で撹拌した。ジエチルエーテル中の過剰のＣＨ３ＭｇＢｒ（２Ｍ）を加え、そして混合物を室温にした。次に、反応混合物をＣＨ３ＯＨで分解し、そして真空中で蒸発させた。水およびＣＨ２Ｃｌ２を加え、そして混合物をジカライト上で濾過した。濾液を蒸発させ、そして水およびＤＩＰＥを加えた。沈殿物を濾過して分離し、ＣＨ２Ｃl２に溶解し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で蒸発させた。残留物を水において撹拌し、沈殿物を濾過して分離し、そして乾燥させた。収
量：４００ｍｇの化合物Ｅ１
融点：２４２．２８℃
ＬＣＭＳ  保持時間：５．１２；［Ｍ＋Ｈ］＋ピーク：４３１；ＬＣＭＳ方法１
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ  ３６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ９．６２（ｓ），８．３７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．６７（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．３８（ｓ），７．２９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．２Ｈｚ），４．８４（ｓ），３．１３（ｑｄ，Ｊ＝７．２，５．５Ｈｚ），２．５０（ｓ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）
【００８１】
Ｃ．薬理学的実施例
実施例Ｃ．１ｂ：Ｃａ２＋フラックスイメージング（ＦＤＳＳ）
材料
ａ）アッセイバッファー
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、５ｍＭの最終濃度までのＣａＣｌ２、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を補足した、ハンクス緩衝食塩水溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
ｂ）カルシウム感受性色素−Ｆｌｕｏ−４ＡＭ
Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を１０％プルロン酸（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＳＯに溶解してストック溶液を生成せしめ、それを５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ  ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を補足したアッセイバッファーにおいて希釈して２μＭの最終濃度を与えた。
ｃ）３８４ウェルプレート
ＰＤＬでプレコートした、ブラック３８４ウェルプレートブラック／クリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）
ｄ）カルシウムフラックス測定
機能的薬剤スクリーニングシステム（ＦＤＳＳ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を細胞内遊離カルシウムフラックスシグナルを測定するために使用した。
【００８２】
方法
ｈα７−ｗｔ  ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃ１細胞の単層をマルチウェルプレート、特にポリ−Ｄ−リシンを被覆したブラック表面の（ｂｌａｃｋ−ｓｉｄｅｄ）透明な底の３８４ウェルプレートにおいて２４時間培養し、その後で蛍光カルシウム指示薬を負荷し、特定の態様においてｆｌｕｏ−４ＡＭを１２０分までにわたって負荷した。
【００８３】
ＰＡＭ活性は、ＦＤＳＳにおける蛍光による細胞カルシウム動員の常時モニタリング中にα７ニコチン性受容体アゴニストと一緒に負荷細胞に試験する化合物を適用することによりリアルタイムで検出した。アゴニスト単独による応答より大きいピーク蛍光応答を与える化合物は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＰＡＭであると考えられた。特定の態様において、α７ニコチン性受容体アゴニストはコリンであり、より特定の態様において１００μＭの最大下濃度で適用するコリンであった。本発明のさらなる設定において、試験する化合物はα７ニコチン性受容体アゴニストの前に、特定の態様においてアゴニストの前に１０分まで適用した。
【００８４】
コリンに対するコントロール応答は、コリンもしくはアッセイバッファーのいずれかを単独で与えるウェルにおける蛍光のピークの差から各プレート上で計算した。本発明の化合物は、０．０１μＭ〜３０μＭの濃度範囲で試験した。化合物は、３０μＭの濃度で試験した時にそれらが少なくとも２５０％でコリンシグナルを強化した場合に興味深い活性を有すると考えられた（１００μＭのコリンの効能をＰＡＭの不在下で１００％と定義し
た）。
【００８５】
ＥＣ５０値（効能）、最大効果（％効能）およびヒルスロープは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてデータにＳ字方程式（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を適合させることにより概算された。ＥＣ５０（もしくはｐＥＣ５０）は、トップがプラトーな明白なＳ字形曲線が得られた場合に、最大効果の半分に関連する濃度として決定された。
【００８６】
本発明の化合物はまた、下記の通り、ヒト野生型α７受容体を安定に過剰発現するＧＨ４Ｃｌ細胞において全細胞電圧固定電気生理学により測定した場合にコリンに対する応答への増強効果も有する。
【００８７】
実施例Ｃ．２：全細胞電圧固定記録
哺乳類細胞からの全細胞電圧固定記録は、リガンド依存性イオンチャンネルのサブユニットであると考えられる膜タンパク質の機能を評価する強力な手段を提供している。内因性もしくは外来リガンドによるそのようなタンパク質の活性化は、受容体と関連する細孔の開口を引き起こし、それを通してイオンはそれらの電気化学的勾配を流れ降りる。ｈα７−ｗｔ  ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃｌ組換え細胞系の場合においてこの受容体のカルシウムに対する優先的透過性は、ＡＣｈ、コリンおよびカルシウム電流を生じさせる他のニコチン性リガンドによる活性化の際にカルシウムが細胞に流入することを意味する。この受容体はアゴニストの存在下で迅速に脱感作するので、アゴニスト適用の時間と一致する受容体応答の部分的もしくは完全な脱感作を防ぐために溶液の非常に迅速な交換（＜１００ｍｓ）ができる適用システムを用いることが重要である。結果として、ニコチン性効能の増大を評価するための第二の都合のよい技術は、迅速な適用システムと連結したｈα７−ｗｔ  ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃｌ細胞からの全細胞電圧固定記録である。
【００８８】
材料
ａ）アッセイバッファー
外部記録溶液は、１５２ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭカルシウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．３からなった。内部記録溶液は、１４０ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３からなった。
ｂ）パッチクランプ記録は、パッチクランプ増幅器（Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ａ，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。ｈα７−ｗｔ
ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃｌ細胞の膜電位は、内部記録溶液で満たした場合に１．５〜３ＭΩの先端抵抗のホウケイ酸ガラス電極で全細胞形態において電位固定した（Ｈａｍｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８１）。記録は、膜抵抗＞５００ＭΩそしてより好ましくは１ＧΩおよび少なくとも６０％の直列抵抗補償で直列抵抗＜１５ＭΩで細胞上で行った。膜電位は、−７０ｍＶで固定された。
ｃ）アゴニスト
ＡＣｈ、コリンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍから購入した。
ｄ）化合物適用
ｈα７−ｗｔ  ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃｌ細胞にコントロール、アゴニストおよびＰＡＭ化合物を適用するために溶液の迅速な交換（交換分解時間（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ
ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）＜１００ｍｓ）用の１６チャンネルＤｙｎｆｌｏｗ
ＤＦ−１６マイクロ流体システム（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。
【００８９】
方法
ｈα７−ｗｔ  ｎＡＣｈＲを発現するＧＨ４Ｃｌ細胞をＤｙｎａｆｌｏｗ灌流チャンバーにおいて外部記録溶液中で平板培養し、そして２０分までにわたって定着させた（ｓｅｔｔｌｅ）。個々の細胞を全細胞パッチし、そしてパッチピペットでチャンバーの底から外部記録溶液の連続的に流れる灌流の流れ（０．７５μｌ／分）に穏やかに持ち上げた。ＰＡＭ活性は、試験する化合物を負荷細胞にあらかじめ適用し、続いて細胞膜電流の常時モニタリング中にα７ニコチン性受容体アゴニストを適用することによりリアルタイムで検出した。アゴニスト単独による応答より大きい電流応答を与える化合物は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＰＡＭであると考えられた。特定の態様において、α７ニコチン性受容体アゴニストは非選択的ニコチン性アゴニストにより活性化され、さらに特定の態様においてアゴニストはコリン、そしてさらにより特定の態様において１ｍＭの最大下濃度で適用するコリンであった。本発明のさらなる設定において、試験する化合物はα７ニコチン性受容体アゴニストの前に、さらに特定の態様においてアゴニストの前に３０秒まで適用された。コントロール応答は、２５０ｍｓ間の最大下コリンの適用に対して各細胞において誘発される電流の曲線下面積から計算された。曲線下面積は経時的な正味電流の積分であり、そしてチャンネルを通った全イオンフラックスの一般的表現である。ポジティブアロステリックモジュレーターにより引き起こされるアゴニスト効能の増加は、アゴニスト応答の「曲線下面積」（ＡＵＣ）の増強パーセントとして計算された。本発明の化合物により引き起こされるコントロールＡＵＣより大きい増強は、それらが有用な治療活性を有すると考えられることを示す。
【００９０】
【表１】
2011500624.tif 000014
【００９１】
２型化合物は、脱感作の速度および程度を減少させる。
【国際調査報告】
2011500624.tif 000018
2011500624.tif 000019