(57)【要約】  本発明は、対象に、同種抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫寛容を誘導するのに十分な有効量の抗ＣＤ８抗体を提供するステップを含む、必要とする対象において寛容を誘導するための組成物及び方法を含む。
2011522835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象において寛容を誘導する方法であって、
単離Ｔ細胞を、抗原を用いるＴ細胞プライミングの間に寛容原性Ｔ細胞を誘導するのに有効な量の非枯渇性抗ＣＤ８抗体と接触させるステップと、
必要とするか又は寛容にある対象に、前記寛容原性Ｔ細胞を提供するステップと
を含む方法。
【請求項２】
抗ＣＤ８抗体がヒト化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＣＤ８抗体が非枯渇性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サプレッサーＴ細胞の生成が、１又は複数の以下の表現型：グランザイムＡの減少、グランザイムＢの減少、パーフォリンの減少、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ若しくはこれら両方の分泌量の減少、ＩＬ−１０の分泌又はそれらの組合せを決定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
サプレッサーＴ細胞の生成が、ＩＬ−１０を分泌するサプレッサーＴ細胞の増殖である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＤ８抗体が、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原が同種である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
移植患者における移植拒絶を、その他の免疫応答を維持しながら低減する方法であって、
単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原を用いるプライミングの間にサプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を引き起こすのに有効な量の抗ＣＤ８非枯渇性遮断抗体で処理するステップであって、Ｔ細胞の抑制が、１又は複数の以下の表現型：グランザイムＡの減少、グランザイムＢの減少、パーフォリンの減少、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ若しくはこれら両方の分泌量の減少、ＩＬ−１０の分泌又はそれらの組合せを特徴とするステップと、
前記サプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞を、移植患者に導入するステップと
を含む方法。
【請求項９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α−２ｂと培養した単球から得られる単離樹状細胞（ＩＦＮ−ＤＣ）とインキュベートされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
樹状細胞が、ＣＤ３４＋ヒト末梢細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと９〜１０日間培養することによりインビトロで生成されたランゲルハンス細胞（ＬＣ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
樹状細胞が、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ランゲルハンス細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
抗ＣＤ８抗体が、ウイルスに対する免疫応答に影響することなく、生着された器官に対する免疫応答を下方制御する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＣＤ８抗体で処理されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、高結合活性の抗原特異的ナイーブＴ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＣＤ８抗体が、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＣＤ８抗体が、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌで培養物中に提供される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣ前駆体を前記末梢血単核細胞から単離するステップと、前記ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、前記ＬＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞が生成される条件下で共培養するステップと、前記Ｔ細胞、前記ＬＣ又はその両方を、移植の前、移植と同時又は移植の後に患者に再導入するステップとをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
移植患者から末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣを単離し、前記ＬＣをＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養するステップと、Ｔ細胞を移植患者から単離し、前記ＬＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で共培養してサプレッサーＴ細胞を生成するステップと、前記Ｔ細胞、前記ＬＣＳ又はその両方を、移植の前、移植と同時又は移植の後に患者に再導入するステップとをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
サプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞が、２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）及びＩＬ−１０の増加した発現を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
サプレッサーＴ細胞を作製する方法であって、
末梢血単核細胞を単離するステップと、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）前駆体を前記末梢血単核細胞から単離するステップと、前記ＬＣ前駆体を、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、前記ＬＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞が生成される条件下で共培養するステップとを含む方法。
【請求項２０】
抗ＣＤ８抗体が、ウイルスに対する免疫応答に影響することなく、生着された器官に対する免疫応答を下方制御する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞が、高結合活性の抗原特異的ナイーブＴ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ランゲルハンス細胞が、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ランゲルハンス細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ランゲルハンス細胞が、細胞選別により得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ランゲルハンス細胞が、ＣＤ３４＋ＨＰＣをＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと９〜１０日間培養することによりインビトロで生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＣＤ８抗体が、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＣＤ８抗体が、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌで培養物中に提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
サプレッサーＴ細胞を作製する方法であって、
末梢血単核細胞を単離するステップと、単球を前記末梢血単核細胞から単離するステップと、前記単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α−２ｂと培養して（ＩＦＮ−ＤＣ）を作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、前記ＩＦＮ−ＤＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、グランザイムＡの減少、グランザイムＢの減少、パーフォリンの減少、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ若しくはこれら両方の分泌量の減少、ＩＬ−１０の分泌又はそれらの組合せにより測定されるサプレッサーＴ細胞が生成される条件下で共培養するステップとを含む方法。
【請求項２８】
免疫応答に影響を及ぼすための方法であって、末梢血単核細胞を単離し、ＬＣ前駆体を前記末梢血単核細胞から単離し、前記ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製し、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、前記ＬＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞が生成される条件下で共培養することにより作製されたサプレッサーＴ細胞を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
哺乳動物における移植された組織の拒絶を阻害する方法であって、末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣ前駆体を前記末梢血単核細胞から単離するステップと、前記ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、前記ＬＣと前記Ｔ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞が生成される条件下で共培養するステップとを含む方法により作製されたサプレッサーＴ細胞を導入するステップを含む方法。
【請求項３０】
移植拒絶を低減する組成物であって、その他の免疫応答を消失させることなく移植拒絶を低減するのに十分な有効量のサプレッサーＴ細胞を含み、前記サプレッサーＴ細胞が、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞が生成される条件下で成熟ＬＣと共培養された単離末梢血Ｔ細胞から生成される組成物。
【請求項３１】
抗ＣＤ８抗体が、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
抗ＣＤ８抗体が、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌで培養物中に提供される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
細胞が、凍結しており、使用前に注射用の媒体に再懸濁される、請求項３０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、制御性Ｔ細胞の分野、より具体的には、抗ＣＤ８抗体を作製し用いるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を免疫細胞寛容との関連において記載する。Reichert, et al.に対して発行された米国特許第５５９３６７７号明細書は、移植片対宿主疾患の予防のための方法について教示している。この方法は、抗ＣＤ８モノクローナル抗体とＣＤ４＋細胞失活剤との組合せ使用によるヒトにおける移植片対宿主疾患の治療及び予防を含む。骨髄移植を受ける患者におけるＧＶＨＤに対する予防又は防御のための方法は、同種提供者の骨髄がＨＬＡ適合性について患者と適合している場合に、提供者の骨髄を、Ｔ細胞傷害性／サプレッサー細胞を１％未満まで枯渇させるのに十分な量の１又は複数の抗ＣＤ８モノクローナル抗体及び補体で処理するステップと、処理された骨髄を患者に移植するステップと、患者に、ＣＤ４＋細胞を失活させるのに十分な有効量のシクロスポリンＡを投与するステップとを含む。
【０００３】
Tykocinski, et al.に対して発行された米国特許第５６０１８２８号明細書は、ＣＤ８誘導体と、細胞調節及び細胞生着の増進のための使用方法とに関する。特異的及び非特異的な免疫調節、細胞生着の増進並びに非免疫細胞の調節は、多様な膜結合性及び可溶性のＣＤ８組成物を用いることにより達成される。この特許において、Ｔ細胞増殖又は同種抗原若しくはＭＨＣ関連抗原に対する細胞傷害性を特異的に低減するための方法は、その表面内又はその表面上でＣＤ８の細胞外ドメイン部分と同種抗原若しくはＭＨＣ関連抗原を提示する天然に存在しない膜を提供するステップであって、少なくとも免疫グロブリンＶホモログドメインを含むＣＤ８の細胞外ドメイン部分が、細胞表面分子と共有若しくは非共有結合する分子と共有結合しているステップと、膜を、同種抗原又はＭＨＣ関連抗原に対して応答できるＴ細胞に、同種抗原又はＭＨＣ関連抗原に対するＴ細胞の特異的細胞免疫応答を低減するのに十分な時間及び条件下で曝露するステップとを含む。
【０００４】
Sachsに対して発行された米国特許第５８７６７０８号明細書は、同種及び異種移植と、受容者に、短い経過の補助低減処置を施すステップ又は短い経過を投与するステップを含む、寛容を誘導するための方法と、短い経過の免疫抑制剤を投与することによる移植片の許容を延長する方法とに関する。この方法は、第１の種の霊長類受容者に、第２の種の哺乳類から得た移植片に対する寛容を、受容者に、第２の種の造血幹細胞を導入し、移植片を受容者に移植することにより誘導するステップと、受容者のＴ細胞を失活させるステップと、受容者に、短い経過の免疫抑制剤を投与するステップとを含み、この作用剤は抗Ｔ細胞抗体ではなく、短い経過は１２０日以下である。
【０００５】
やはりSachsに対して発行された米国特許第６９１１２２０号明細書は、同種及び異種移植に関する。この発明は、提供者の胸腺組織を受容者に導入するステップを含む、免疫能を回復又は誘導するための方法を提供する。この発明も、提供者の胸腺組織を受容者に導入するステップを含む、受容者における寛容を誘導するための方法を提供する。この発明は、さらに、受容者に、短い経過の補助低減処置を施すステップ又は短い経過を投与するステップを含む寛容を誘導する方法と、短い経過の免疫抑制剤を投与することによる移植片の許容を延長する方法とを提供する。
【０００６】
Bushell, et al.により出願された米国特許出願第２００７０１６６３０７号明細書は、移植片拒絶の抑制を対象とする。簡潔に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＣＡＭ−１からなる群より選択される細胞表面抗原に対する抗体、好ましくは抗ＣＤ４抗体を、非細胞性タンパク質抗原とともに投与して、動物における制御性Ｔリンパ球の集団を生成し、制御性Ｔリンパ球の集団を、動物に非細胞性タンパク質抗原をさらに投与することにより再活性化させ、制御性Ｔリンパ球の集団が活性化されている間に器官又は組織を移植することにより抑制される動物における移植拒絶が教示されている。制御性Ｔ細胞は、Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＣＡＭ−１からなる群より選択される細胞表面抗原に対する抗体と、同種抗原又は非細胞性タンパク質抗原のいずれかを提示する細胞の存在下で培養することにより、エクスビボで生成できる。エクスビボで生成されたＴリンパ球は、移植拒絶を克服する代替法として、又はインビボ法と組み合わせて用いることができる。類似のアプローチを、自己免疫状態の治療のために採用できる。
【０００７】
アロ拒絶の特異的阻害のための米国特許出願第２００５００４２２１７号明細書は、Qi, et al.により出願された。この明細書は、同種抗原に対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答をともに特異的に阻害するための方法及び組成物を提供することにより、移植同種移植片の生存の延長及び移植受容者における移植片対宿主疾患の治療における使用を見出している。この方法は、標的細胞特異的抗原に対する宿主免疫応答を、抗原を発現する標的細胞をＣＤ８ポリペプチドとＣＤ８α鎖とともにコードする発現ベクターと接触させることにより阻害することを教示し、ここで、ＣＤ８ポリペプチドは、標的細胞により発現され、それにより標的細胞に対する宿主免疫応答が特異的に阻害される。つまり、標的細胞上でのＣＤ８の増加が、免疫応答を特異的に阻害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５５９３６７７号明細書
【特許文献２】米国特許第５６０１８２８号明細書
【特許文献３】米国特許第５８７６７０８号明細書
【特許文献４】米国特許第６９１１２２０号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００７０１６６３０７号明細書
【特許文献６】米国特許出願第２００５００４２２１７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、必要とする対象において免疫寛容を誘導するための組成物及び方法を含む。ある実施形態において、組成物及び方法は、対象に、抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫寛容を誘導するのに十分な有効量の抗ＣＤ８抗体を提供することにより、対象における免疫寛容を誘導するために用いてよい。ある態様において、抗ＣＤ８抗体はヒト化されている。別の態様において、抗ＣＤ８抗体は、非枯渇性である。この方法は、１又は複数の以下の表現型：グランザイムＡの減少、グランザイムＢの減少、パーフォリンの減少、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ若しくはこれら両方の分泌量の減少、ＩＬ−１０の分泌又はそれらの組合せを測定又は決定することにより決定されるサプレッサーＴ細胞の生成も含んでよい。ある態様において、サプレッサーＴ細胞の生成は、ＩＬ−１０を分泌するサプレッサーＴ細胞の増殖である。別の態様において、抗ＣＤ８抗体は、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される。ある例において、抗原は同種である。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１又は複数の以下の表現型：グランザイムＡの減少、グランザイムＢの減少、パーフォリンの減少、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ若しくはこれら両方の分泌量の減少、ＩＬ−１０の分泌又はそれらの組合せを特徴するサプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を引き起こすのに有効な量の抗ＣＤ８非枯渇性遮断抗体で処理してサプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞を移植患者に導入することにより、移植患者における移植拒絶を、その他の免疫応答を維持しながら低減する組成物及び方法を含む。ある態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α−２ｂと培養した単球から得られる単離樹状細胞（ＩＦＮ−ＤＣ）とインキュベートされる。別の態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４＋ヒト末梢細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと９〜１０日間培養することによりインビトロで生成されたランゲルハンス細胞（ＬＣ，Langerhans cell）である。樹状細胞の別の例は、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−  ＬＣである。別の態様において、抗ＣＤ８抗体は、ウイルスに対する免疫応答に影響することなく、生着された器官に対する免疫応答を下方制御する。別の態様において、抗ＣＤ８抗体で処理されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、高結合活性の抗原特異的ナイーブＴ細胞である。ある非限定的な例において、抗ＣＤ８抗体は、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８、ＯＫＴ８及び表１に列挙される抗ＣＤ８抗体から選択される。インビトロでのＴ細胞の処理のある態様において、抗ＣＤ８抗体は、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌでＣＤ８＋Ｔ細胞培養物中に提供される。インビボでの使用のために、本発明は、個体の重量に依存して血液中の等価な濃度について同様のレベルを達成するために提供され得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は、末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣ前駆体を末梢血単核細胞から単離するステップと、ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、ＬＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で共培養するステップと、Ｔ細胞、ＬＣ又はその両方を、移植の前、移植と同時又は移植の後に患者に再導入するステップも含んでよい。別の態様において、この方法は、移植患者から末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣを単離し、ＬＣ  ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαを培養するステップと、Ｔ細胞を移植患者から単離し、ＬＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で共培養してサプレッサーＴ細胞を生成するステップと、Ｔ細胞、ＬＣＳ又はその両方を、移植の前、移植と同時又は移植の後に患者に再導入するステップも含んでよい。ある態様において、サプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞は、２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）及びＩＬ−１０の増加した発現を有する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、サプレッサーＴ細胞を作製する方法及びそれにより作製される細胞を含み、該方法は、末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣ前駆体を末梢血単核細胞から単離するステップと、ＬＣ前駆体を、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、ＬＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で共培養するステップとを含む。ある態様において、抗ＣＤ８抗体は、ウイルスに対する免疫応答に影響することなく、生着された器官に対する免疫応答を下方制御する。ある態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、高結合活性の抗原特異的ナイーブＴ細胞である。ある態様において、ランゲルハンス細胞は、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−  ＬＣである。別の態様において、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ランゲルハンス細胞は、細胞選別により得られる。さらに別の態様において、ランゲルハンス細胞は、ＣＤ３４＋ＨＰＣをＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと９〜１０日間培養することによりインビトロで生成される。ある態様において、抗ＣＤ８抗体は、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される。抗ＣＤ８抗体は、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌで培養物中に提供されてもよい。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、末梢血単核細胞を単離し、単球を末梢血単核細胞から単離し、単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α−２ｂと培養して（ＩＦＮ−ＤＣ）を作製し、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、ＩＦＮ−ＤＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で共培養することにより、サプレッサーＴ細胞を作製する方法及びそれにより作製されるサプレッサーＴ細胞を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、末梢血単核細胞を単離し、ＬＣ前駆体を末梢血単核細胞から単離し、ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製し、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、ＬＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で共培養することにより作製されたサプレッサーＴ細胞を含む組成物を投与することにより、免疫応答に影響を及ぼすための方法である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態は、末梢血単核細胞を単離するステップと、ＬＣ前駆体を末梢血単核細胞から単離するステップと、ＬＣ前駆体をＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαと培養してＬＣを作製するステップと、Ｔ細胞を末梢血単核細胞から単離し、ＬＣとＴ細胞とを、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で共培養するステップとを含む方法により作製されたサプレッサーＴ細胞を導入することにより、哺乳類における移植された組織の拒絶を阻害する方法である。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、移植拒絶を低減する組成物であって、その他の免疫応答を消失させることなく移植拒絶を低減するのに十分な有効量のサプレッサーＴ細胞を含み、サプレッサーＴ細胞が、抗ＣＤ８抗体の存在下で、サプレッサーＴ細胞を生成する条件下で成熟ＬＣと共培養された単離末梢血Ｔ細胞から生成される組成物である。ある態様において、抗ＣＤ８抗体は、ｃＭ−Ｔ８０７、Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８、ＨＩＴ８ａ、Ｌｅｕ２、Ｔ８及びＯＫＴ８から選択される。別の態様において、抗ＣＤ８抗体は、０．５〜５，０００ｎｇ／ｍｌで培養物中に提供される。ある態様において、細胞は凍結しており、使用前に注射用の媒体に再懸濁される。
【００１７】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、ここで、添付の図面に従って本発明の詳細な説明について言及する。添付の図面においては次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ−１ｃ】ＣＤ８発現の増加が、ＬＣでプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞で誘導されるが、ＩｎｔＤＣでプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞では誘導されないことを示す図である。図１ａは、ＣＤ３４−ＤＣサブセットによりプライミングされたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ８発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。ＬＣでプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８（黒色の線）；ＩｎｔＤＣでプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８（灰色の線）。図１ｂは、ＬＣによりプライミングされたナイーブＭａｒｔ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、これらは、ＩｎｔＤＣでプライミングされたＭａｒｔ−１特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と比較してより高いレベルのＣＤ８を発現する。図１ｃは、両方のサブセット、すなわちＬＣ又はＩｎｔＤＣにより活性化されたメモリーインフルエンザ−ＭＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、等しいレベルの表面ＣＤ８を発現することを示す。
【図２ａ−２ｈ】ＤＣ媒介自己ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングにおけるＣＤ８の役割を示す図である。図２ａは、自己Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングが、ＣＤ８ライゲーションに依存することを示す。図２ｂは、第１〜９日に、ＬＣでのプライミング中に測定されたＭａｒｔ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図２ｃは、少なくとも３名の異なる提供者を用いた少なくとも３回の独立した実験における３つの異なるクローンが、ＬＣにより誘導されるナイーブ同種増殖の著しい遮断を示したことを示す。Ｔ８  Beckmanは上のパネル、ＲＰＡ−Ｔ８は真ん中のパネル、ＯＫＴ８は下のパネル。図２ｄは、抗ＣＤ８が、自己ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを、用量依存的な様式で遮断することを示す。５０ｎｇ／ｍｌで決定したＩＣ５０。図２ｅは、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８Ｔ細胞、抗ＣＤ８のパーセンテージが、共培養の開始から７０時間後ほど遅く加えた場合であっても、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞プライミングを効率的に遮断することを示す。図２ｆは、ペプチド負荷ＬＣにより、低用量の抗ＣＤ８Ｍａｂの存在下でプライミングされたＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、アイソタイプ対照の存在下でプライミングされた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、より低い強度で四量体を染色することを示す。図２ｇは、四量体強度と、用いた抗ＣＤ８Ｍａｂの用量との相関を示す。図２ｈ。特異的ＭＡＲＴ−１プライミングは、高濃度のペプチド１００ｕＭをＤＣに負荷した場合、又はペプチドが培養の間中存在していた場合でさえ、抗ＣＤ８により遮断された（左のパネル）；右のパネル：ＩＦＮ−ＤＣによりプライミングされ、記載されるペプチド濃度が負荷されたＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。図２ｉは、抗ＣＤ８が、ＭＡＲＴ−１（上のパネル）又はｇｐ１００（下のパネル）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−ＤＣによるプライミングを遮断することを示す。
【図３ａ−３ｇ】ＣＤ８ライゲーションが、同種ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングにとって重要であることを示す図である。図３ａは、抗ＣＤ８又はアイソタイプ対照の存在下での同種ＤＣに応答するナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が、細胞へのチミジンの取り込みにより決定されたことを示す。図３ｂは、抗ＣＤ８又はアイソタイプ対照の存在下での同種ＬＣに応答するナイーブＴ細胞増殖が、ＣＦＳＥ希釈により決定されたことを示す。上のパネルにＣＤ８＋Ｔ細胞及び下のパネルにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞増殖。図３ｃは、３０ｎｇ／ｍｌ〜３ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ８の用量力価決定が、ＣＤ８Ｔ細胞増殖の最大阻害を３０ｎｇ／ｍｌにて示したことを示す（上のパネル）。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の阻害は、用いたいずれの濃度の抗ＣＤ８Ｍａｂでも検出されなかった（下のパネル）。図３ｄ及び３ｅは、抗ＣＤ８Ｍａｂが、皮膚由来ＤＣである表皮ＬＣ（３ｄ）又は真皮ＤＣ（３ｅ）により刺激されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のアロ増殖を妨げ、５０％阻害が３０ｎｇ／ｍｌにて検出されたことを示す。図３ｆ及び３ｇは、ペプチド負荷ＬＣ及びナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が、共培養の第９日に明確なクラスタを創出するが（３ｇ）、抗ＣＤ８の存在下では、クラスタの形成が阻害されることを示す（３ｆ）。倍率２０×上のパネル、４０×下のパネル。
【図４ａ−４ｆ】抗ＣＤ８が、ウイルス又は同種抗原に対する２次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を遮断しないことを示す図である。図４ａは、３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８Ｍａｂ（左のパネル）又はアイソタイプ適合対照（右のパネル）の存在下でＨＬＡ−Ａ２０１提供者からのインフルエンザＭＰペプチド負荷ＬＣを用いる活性化の９日後に、インフルエンザＭＰ−ＨＬＡ−Ａ２０１四量体を用いて分析したインフルエンザＭＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。図４ｂは、抗ＣＤ８Ｍａｂが、ＬＣにより誘導された２次インフルエンザ−Ｍｐ特異的応答を、インフルエンザ−ＭＰ−ＨＬＡ−Ａ２０１四量体により分析されるように、用いたＭａｂのいずれの濃度でも遮断しないことを示す。図４ｃは、３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８Ｍａｂ（左のパネル）又はアイソタイプ適合対照（右のパネル）の存在下でＨＬＡ−Ａ２０１提供者からのインフルエンザＭＰペプチド負荷ＩｎｔＤＣを用いる活性化の９日後に、インフルエンザＭＰ−ＨＬＡ−Ａ２０１四量体を用いて分析したインフルエンザＭＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。図４ｄは、抗ＣＤ８Ｍａｂが、ＩｎｔＤＣにより誘導された２次インフルエンザ−Ｍｐ特異的応答を、インフルエンザ−ＭＰ−ＨＬＡ−Ａ２０１四量体により分析されるように、用いたＭａｂのいずれの濃度でも遮断しないことを示す。図４ｅは、抗ＣＤ８による阻害の欠如が、特定の抗ＣＤ８抗体クローンに限定されないことを示す。なぜなら、２つの異なるクローンであるＴ８  Beckman（左のパネル）及びＲＰＡ−Ｔ８（右のパネル）が、ペプチド負荷ＬＣにより誘導されるインフルエンザ−ＭＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を、３ｕｇ／ｍｌの記載される抗ＣＤ８クローン又はアイソタイプ適合対照の存在下での培養の９日後に阻害しないことを示したからである。図５ｆは、同種抗原に対するメモリー応答が、抗ＣＤ８により遮断されないことを示す。２次的同種共培養物のチミジン取り込みは、同種ＬＣ（左のパネル）又はＩｎｔＤＣ（右のパネル）が、培養物中に抗ＣＤ８Ｍａｂ又はアイソタイプ適合対照のいずれが存在していても、アロ特異的２次応答を誘導するのに効果的であったことを示す。
【図５ａ−５ｂ】抗ＣＤ８ｍＡｂの存在下でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞の機能分析を示す図である。図５ａにおいて、抗ＣＤ８ｍＡｂの存在下でプライミングされた同種ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、６日後に、フローサイトメトリーにより、活性化及びエフェクター分子の発現について分析した。図５ｂにおいて、抗ＣＤ８Ｍａｂの存在下でプライミングされた同種ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、２型及び制御性のサイトカインを分泌する。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＬＣ上で、抗ＣＤ８の存在下又は非存在下で培養した。６日後に、増殖した（ＣＦＳＥｌｏｗ）細胞を選別し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズを用いて２４時間再刺激し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を、luminexマルチプレックスビーズアッセイにおいて測定した。提示するデータは、３回の独立する研究からである。
【図６ａ−６ｂ】抗ＣＤ８の存在下でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞が、サプレッサーＴ細胞であることを示す図である。図６ａは、１次Ｔ細胞応答を抑制するプライミングされたＴ細胞の能力が、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、同種ＤＣを用いて、抗ＣＤ８又はアイソタイプ対照の存在下でＬＣによりインビトロにてプライミングされた減少する数の同系Ｔ細胞の存在下で刺激することにより、試験されたことを示す。３［Ｈ］チミジンの取り込みを、６日後に評価した。結果は、３回の独立する研究の代表である。図６ｂは、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞（提供者Ａ）が、提供者Ｂからの同種ＬＣを用いて、抗ＣＤ８又はアイソタイプ対照の存在下で提供者ＣからのＬＣに対してインビトロでプライミングされたＣＤ８Ｔｒ細胞の存在下で刺激されたことを示す。結果は、３回の独立する研究の代表である。
【図７ａ−７ｂ】抗ＣＤ８処置の効果が、インビボでヒト−マウスモデルにおける移植片対宿主を妨げることを示す図である。図７ａは、同種ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗ＣＤ８ＭＡｂ又はアイソタイプ対照とを注射されたヒト化マウスを用いた結果を示す。２つの研究のうちの１つにおいて、抗ＣＤ４０を注射して、活性化を誘導した。アイソタイプ対照で処置したマウスは、目の周囲の紅斑（示される）、体重減少及び脱力の慢性移植片対宿主疾患の臨床症状を発症したが、抗ＣＤ８で処置したマウスは発症しなかった。図７ｂは、マウスからの結果を採集し、ＢＭ及び血液からのＣＤ８＋Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５及びＣＤ１０３の発現について分析したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の種々の実施形態を作製して用いることについて以下に詳細に論じるが、本発明は、広い多様性の具体的な状況において具体化できる多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書において論じる具体的な実施形態は、本発明を作製し、用いるための具体的な様式の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものでない。
【００２０】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下において定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する領域における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」のような用語は、単数形の物体にのみ言及することを意図しないが、全般的なクラスを含むことを意図し、その具体例は、例示のために用いられ得る。本明細書における術語は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されることを除いて、本発明を限定しない。
【００２１】
樹状細胞（ＤＣ，Dendritic cell）は、Ａｇ特異的免疫の誘導を担う効力のあるＡＰＣである（Banchereau, J. & Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-52 (1998)）。異なる組織に存在するＤＣのいくつかの集団が存在し、異なる機能的属性を有する（Banchereau, J. & Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-52 (1998)）。健康な皮膚は、少なくとも２つのＤＣ集団、表皮においてランゲルハンス細胞（ＬＣ）及び真皮において間質ＤＣを有する。これらのＤＣは、不活性化されたときに末梢寛容のために、そして活性化されたときに免疫のために流入領域リンパ器官に遊走する。その他のＤＣは、２次リンパ器官に存在し、血液中を循環することが見出されている。ＤＣ生物学の理解における多くの進歩が、インビトロで生成したＤＣを用いて行われた研究に由来した。特に、ＴＮＦａ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下でのＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ，hematopoietic progenitor cell）の培養物は、間質ＤＣ及びランゲルハンス細胞をともに生じさせる（Caux, C. et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med 184, 695-706 (1996)）。本発明者らは、ＩｎｔＤＣではなくＬＣが、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングにおいて特に効果的であることを示した。また、これらのサブセットはともに、メモリー応答の誘導において等しく効果的であり、両方のサブセットにより活性化されるＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８分子の等しい発現を示す。
【００２２】
ＣＤ８は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成したペプチド抗原（ｐＭＨＣＩ）のＴＣＲ認識のための補助受容体として機能する表面糖タンパク質である。これは、ααホモ二量体又はαβヘテロ二量体のいずれかとして発現され（Zamoyska, R. The CD8 coreceptor revisited: one chain good, two chains better. Immunity 1, 243-6 (1994)）、両方の鎖は単一細胞外Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）Ｖドメイン、膜近位ヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端を発現する（Zamoyska, R. The CD8 coreceptor revisited: one chain good, two chains better. Immunity 1, 243-6 (1994)）。ＣＤ８は、ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ｍ並びにα２及びα３ドメインと、そのβ鎖及び細胞外ＩｇＳＦ  Ｖドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ，complementary determining region）を用いて相互作用する。この会合は、そのクラスＩ標的とのＴ細胞受容体の接着／結合活性を増加させる。さらに、ＣＤ８α鎖会合チロシンプロテインキナーゼｐ５６ｌｃｋにより媒介される内部シグナル伝達カスケードは（Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, E. M. & Bolen, J. B. The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck. Cell 55, 301-8 (1988)、Chalupny, N. J., Ledbetter, J. A. & Kavathas, P. Association of CD8 with p56lck is required for early T cell signalling events. Embo J 10, 1201-7 (1991)）、Ｔ細胞活性化を導く。Ｌｃｋは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増殖のために必要である。しかし、その発現は、インビボ又はインビトロでの２次抗原刺激に対するメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の応答のために必須ではない（Bachmann, M. F. et al. Developmental regulation of Lck targeting to the CD8 coreceptor controls signaling in naive and memory T cells. J Exp Med 189, 1521-30 (1999)、Tewari, K., Walent, J., Svaren, J., Zamoyska, R. & Suresh, M. Differential requirement for Lck during primary and memory CD8+ T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16388-93 (2006)）。ＣＤ８α又はＣＤ８β遺伝子標的マウスのいずれかにより示されるように、ＣＤ８は、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔリンパ球の成熟及び機能において重要な役割を有する（Fung-Leung, W. P. et al. The lack of CD8 alpha cytoplasmic domain resulted in a dramatic decrease in efficiency in thymic maturation but only a moderate reduction in cytotoxic function of CD8+ T lymphocytes. Eur J Immunol 23, 2834-40 (1993)、Nakayama, K. et al. Requirement for CD8 beta chain in positive selection of CD8-lineage T cells. Science 263, 1131-3 (1994)）。繰り返し細菌感染に罹患している１名の患者は、ＣＤ８α遺伝子における単一変異によるＣＤ８欠損を示すことが見出された。ＣＤ８の欠如は、ＣＤ８＋Ｔ細胞分化系列決定又は末梢細胞溶解機能のいずれにとっても必須でないようであった（de la Calle-Martin, O. et al. Familial CD8 deficiency due to a mutation in the CD8 alpha gene. J Clin Invest 108, 117-23 (2001)）。
【００２３】
２Ｄ２；４Ｄ１２．１；７Ｂ１２  １Ｇ１１；８Ｅ−１．７；８Ｇ５；１４；２１Ｔｈｙ；５１．１；６６．２；１０９−２Ｄ４；１３８−１７；１４３−４４；２７８Ｆ２４；３０２Ｆ２７；ＡＩＣＤ８．１；抗Ｔ８；Ｂ９．１．１；Ｂ９．２．４；Ｂ９．３．１；Ｂ９．４．１；Ｂ９．７．６；Ｂ９．８．６；Ｂ９．１１；Ｂ９．１１．１０；ＢＥ４８；ＢＬ１５；ＢＬ−ＴＳ８；ＢＭＡＣ８；ＢＵ８８；ＢＷ１３５／８０；Ｃ１−１１Ｇ３；Ｃ１０；Ｃ１２／Ｄ３；ＣＤ８−４Ｃ９；ＣＬＢ−Ｔ８／１；ＣＴＡＧ−ＣＤ８，３Ｂ５；Ｆ８０−１Ｄ４Ｄ１１；Ｆ１０１−８７（Ｓ−Ｔ８ａ）；Ｇ１０−１；Ｇ１０−１．１；ＨＩ２０８；ＨＩ２０９；ＨＩ２１２；ＨＩＴ８ａ；ＨＩＴ８ｂ；ＨＩＴ８ｄ；ＩＣＯ−３１；ＩＣＯ−１２２；ＩＰ４８；ＩＴＩ−５Ｃ２；ＩＴＭ８−１；ＪＭＬ−Ｈ７；ＪＭＬ−Ｈ８；Ｌ２；Ｌ５３３；Ｌｅｕ−２ａ；ＬＴ８；ＬＹ１７．２Ｅ７；ＬＹ１９．３Ｂ２；Ｍ２３６；Ｍ−Ｔ１２２；Ｍ−Ｔ４１５；Ｍ−Ｔ８０５；Ｍ−Ｔ８０６；Ｍ−Ｔ８０７；Ｍ−Ｔ８０８；Ｍ−Ｔ８０９；Ｍ−Ｔ１０１４；ＭＣＤ８；ＭＥＭ−３１；ＭＥＭ−１４６；ＮＵ−Ｔｓ／ｃ；ＯＫＴ８；ＯＫＴ８ｆ；Ｐ２１８；ＲＰＡ−Ｔ８；ＳＭ４；Ｔ８；Ｔ８／２Ｔ８−１９；Ｔ８／２Ｔ８−２Ａ１；Ｔ８／２Ｔ８−１Ｂ５；Ｔ８／２Ｔ８−１Ｃ１；Ｔ８／７Ｐｔ３Ｆ９；Ｔ８／２１ｔｈｙ２Ｄ３；Ｔ８／２１ｔｈｙ；Ｔ８／ＴＰＥ３ＦＰ；Ｔ８ｂ；Ｔ４１Ｄ８；Ｔ８１１；Ｔｕ６８；Ｔｕ１０２；ＵＣＨＴ４；ＶＩＴ８；ＶＩＴ８ｂ；ＷｕＴ８−１；Ｘ１０７；ＹＴＣ１４１．１；及び／又はＹＴＣ１８２．２０を含むヒト白血球分化抗原（Human Leucocyte Differentiation Antigens，ＨＬＤＡ）についての国際ワークショップの一部分のもののような、モノクローナル抗体を含むいくつかの公知の抗ＣＤ８抗体のいずれも、本発明に関連して用いてよい。
【００２４】
【表１】
2011522835.tif 000003
2011522835.tif 000004
2011522835.tif 000005
【００２５】
ヒト化抗ＣＤ８抗体の限定しない例は、ｃＭ−Ｔ８０７（Centocor社、ＭＡ）及びＴＲＸ２（Oxford Therapeutic Antibody Centre、Oxford University、Oxford、United Kingdom）を含む。
【００２６】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的免疫応答を開始して極性化する。ヒト骨髄細胞（ｍＤＣ，myeloid DC）は、ランゲルハンス細胞及びヒトの皮膚に存在する間質（真皮）ＤＣのような異なるサブセットを含む。我々は、間質ＤＣと比較した場合に、ランゲルハンス細胞が、同種及び自己の抗原に対してナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングすることについて特に強力であるが、これらのｍＤＣサブセットはともに、２次応答の誘導においては等しく有効であったことを報告した。本研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの誘導におけるＬＣの優れた機能を説明するであろうパラメータを分析するために行った。ＬＣによりプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩｎｔＤＣによりプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、より高いレベルのＣＤ８を発現するが、両方のサブセットにより誘導される抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、等しいレベルのＣＤ８を提示する。
【００２７】
本明細書において、抗ＣＤ８モノクローナル抗体が、自己及び同種抗原ＣＴＬのＤＣにより媒介されるインビトロプライミングを遮断することを示す。抗ＣＤ８の存在下でプライミングされるＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的を死滅させることができず、２型（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）及び制御性（ＩＬ−１０）のサイトカインを産生した。さらに、抗ＣＤ８ｍＡｂの存在下でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、アロ反応を阻害でき、よって、サプレッサーＣＤ８＋Ｔ細胞として作用した。しかし、インフルエンザ及びＣＭＶに対するもののような２次ＣＴＬ応答の誘導は、妨害されなかった。同様に、抗ＣＤ８ｍＡｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を変化させなかった。ヒト−マウスモデル細胞集団におけるアロ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビボでの活性化のための抗ＣＤ８ｍＡｂの投与は、同種ＣＤ８＋Ｔ細胞の注射により誘導される移植片対宿主疾患の発生を妨げた。つまり、抗ＣＤ８抗体療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される移植片拒絶を、抗ウイルス保護応答を混乱させることなく予防し、よって現在の免疫抑制治療を超える著しい進歩を示すかもしれない。本出願は、ＣＤ８ライゲーションが、Ｔ細胞プライミングの阻害及び制御性Ｔ細胞の生成をもたらすことを示した。
【００２８】
本発明者らは、ＬＣが、間質ＤＣと比較してナイーブＣＤ８Ｔ細胞のプライミングにおいて非常に効果があるが、これらのｍＤＣサブセットはともに、２次応答の誘導において等しく有効であることを示した。本研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの誘導におけるＬＣの優れた機能を説明するであろうパラメータを分析するために行った。本明細書において、ＣＤ８ライゲーションが、Ｔ細胞プライミングの阻害をもたらすだけでなく、制御性Ｔ細胞の生成も引き起こすことを示す。
【００２９】
ＤＣ精製及び培養。ＣＤ３４由来ＤＣは、Ｇ−ＣＳＦ動員性ＣＤ３４−ＨＰＣを０．５×１０６／ｍｌにて２５ｃｍ２フラスコ中で、５％自己血清、５０μＭ  ２−β−メルカプトエタノール、１％  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン並びにサイトカイン；ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Immunex Corp.社製）、ＦＬＴ３−Ｌ（１００  ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）を含有するYssel培地（Irvine Scientific社製、ＣＡ又はGemini BioProducts社製）中で培養することにより生成した。培養物は、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて湿潤環境中でインキュベートした。細胞を、サイトカインを補った新鮮な培地に培養第５日に移し、第９又は１０日に採集した。ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−−ＬＣ及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋−ｉｎｔＤＣを選別した。純度は、日常的に、９５〜９９％であった。
【００３０】
ＣＤ１４＋単球（純度９０％を超える）（１×１０６細胞／ｍｌ）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったCellgenix培地（Cellgenix社製）並びに１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Berlex社製）及び５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−α−２ｂ（Schering Corp社製）の中で３７℃及び５％ＣＯ２にて培養することにより、ＩＦＮ由来ＤＣ（ＩＦＮ−ＤＣ）を生成し、新鮮な培地及びサイトカインを第１日に加え、ＤＣを第３日に採集した。
【００３１】
ＬＣ及び真皮ＩｎｔＤＣを、正常ヒト皮膚検体から精製した。検体を、細菌プロテアーゼ２型ジスパーゼ（Roche社製）、抗生物質／抗真菌物質（Gibco社製）中で４℃にて１８時間、次いで３７℃にて２時間インキュベートした。表皮及び真皮のシートを次いで分離し、小片（およそ１〜１０ｍｍ）に切断し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったRPMI 1640（Gibco社製）中に入れた。２日後に、培地中に遊走した細胞を回収し、Ficoll-ジアトリゾエート勾配、１．０７７ｇ／ｄｌ（リンパ球分離用培地（ＬＳＭ，Lymphocyte Separation Medium）、MP Biomedicals社製）を用いてさらに濃縮した。ＤＣを、抗ＣＤ１ａ  ＦＩＴＣ（ＯＫＴ６；DAKO社製）ｍＡｂ及び抗ＣＤ１４−ＡＰＣ（ＬｅｕＭ３；Invitrogen社製）ｍＡｂで染色した後に細胞選別により精製した。
【００３２】
Ｔ細胞単離。細胞を、成人ボランティア提供者からの白血球除去により得られた凍結ＰＢＭＣから単離した。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞を、ＣＤ４−、ＣＤ５６−、ＣＤ１６−及びＣＤ１９−磁気細胞除去（Miltenyi社製）の後にＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ８＋細胞として選別した。ＣＤ８Ｔ細胞を除去し、得られる細胞をＣＤ４＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４−ＣＤ１６−ＣＤ１９−ＣＤ５６−として選別した以外は同様の方法で、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を得た。再生応答のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、濃縮集団からポジティブ選択した。
【００３３】
ＤＣ／ＣＤ８Ｔ細胞共培養。自己ＣＤ８＋Ｔ細胞−ＤＣ共培養。１次応答評価のために、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ウェル）を、ＨＬＡ−Ａ２０１拘束性ＭＡＲＴ−１（ＭＡＲＴ−１Ｍ２６〜３５、ELAGIGILTV）又はｇｐ１００（ｇｐ１００Ｍ２０９〜２１７、IMDQVPFSV）ペプチド（３μＭ）と３時間予めインキュベートした自己ｍＤＣ（５×１０４細胞／ウェル）で刺激した。細胞を９日間、２４ウェルプレートにおいて、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−７（R&D社製）及び１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（R&D社製）を補ったYssel完全培地中で培養した。ＩＬ−２（R&D社製）を１０Ｕ／ｍｌにて第３日に加えた。抗ＣＤ８又はアイソタイプ適合対照は、そうでないと記載しない限り第０日に加えた。
【００３４】
ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、培養期間の最後にてペプチド／ＨＬＡ−Ａ２０１四量体（Beckman Coulter社製）に結合する細胞の数を計数することにより決定した。再生応答の評価のために、全ＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、ＨＬＡ−Ａ２０１拘束性インフルエンザ−ＭＰペプチド（GILGFVFTL）を負荷した自己（５×１０５細胞／ｍｌ）ｍＤＣサブセットで刺激した。抗ＣＤ８又はアイソタイプ適合対照の存在下で。インフルエンザ−ＭＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、インフルエンザ−ＭＰ／ＨＬＡ−Ａ２０１四量体を用いることにより決定した。
【００３５】
同種ＣＤ８Ｔ細胞培養。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の同種増殖を、［Ｈ３］−チミジン取り込み又はＣＦＳＥ希釈により評価した。ナイーブＴ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、丸底９６ウェルプレートにおいて、２．５×１０４（そうでないと記載しない限り）の同種ｍＤＣサブセットを加えた１０％熱失活プールＡＢヒト血清を補ったYssel培地（Yssel完全培地）、ＩＬ−７及びＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍｌ、R&D社製）中で培養した。ＣＤ４０Ｌを用いて、ＤＣを活性化した。５日後に、細胞を１８時間、１μＣｉ［Ｈ３］−チミジンを用いてパルスし、トレーサーの取り込みを、継続中の増殖の指標として決定した。
【００３６】
ＣＦＳＥ希釈による増殖の評価のために、細胞を、０．５μＭのＣＦＳＥで、製造者の手順に従って標識した。７日後に、細胞を採集し、増殖のレベルをフローサイトメトリーにより分析した。さらに、プライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞の質を、以下に記載するようにして評価した。
【００３７】
記載する場合、ＣＤ８に対する遮断抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＯＫＴ６、ＢＤ又はＴ８  Beckman Coulter社製）又はアイソタイプ対照抗体を、共培養物に加えた。
【００３８】
２次同種ＣＤ８＋Ｔ細胞培養のために、５×１０４のナイーブＣＤ８Ｔ細胞を、２．５×１０３のＣＤ４０リガンド活性化ＤＣと、丸底９６ウェルプレートにおいて、ＩＬ−７及びＩＬ−２を加えて培養した。６日後に、細胞を、１次培養に用いたのと同じ提供者からのＤＣを用いて再刺激した。抗ＣＤ８抗体又はアイソタイプ適合対照を、培養物に３日間加え、その後、細胞増殖を、［３Ｈ］チミジンの取り込みにより評価した。
【００３９】
サイトカイン産生。ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生評価のために、増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞（ＦＳＣｈｉｇｈＣＤ１１ｃ−又はＣＦＳＥｌｏｗＣＤ１１ｃ−）を第７日に、１次同種培養物からの細胞選別により単離し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８被覆マイクロビーズを用いて１晩再刺激した。上清中のサイトカインを、マルチプレックスビーズベースのサイトカインアッセイにより評価した。
【００４０】
ＣＤ８＋Ｔサプレッサーアッセイ。ＣＤ８＋Ｔサプレッサー機能アッセイのために、増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞（ＦＳＣｈｉｇｈＣＤ１１ｃ−又はＣＦＳＥｌｏｗＣＤ１１ｃ−）を第７日に、１次同種培養物からの細胞選別により単離し、段階的な数で、５×１０４ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４０Ｌ活性化２．５×１０３同種ＤＣ（ＬＣ）との共培養物に加えた。培養５日後に、１μ／Ｃｉの［３Ｈ］チミジンをそれぞれのウェルに加え、細胞への取り込みを１８時間後に決定した。
【００４１】
Ｔ細胞タンパク質及び遺伝子分析。エフェクター分子の染色のために、プライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞を固定し、透過性にし、ＰＥ標識抗グランザイムＡ、グランザイムＢ及びパーフォリン（BD Biosciences社製）で染色した。
【００４２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞表現型分析のために、細胞を、全てBD biosciences社からのＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、ＣＣＲ７、ＣＤ１０３（Ｂｅｒ−ＡＣＴ８）の表面発現について染色した。
【００４３】
マイクロアレイ遺伝子分析のために、１次同種培養物から増殖ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＦＳＥ−）を選別し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８被覆マイクロビーズで再刺激した。
【００４４】
インビボでの移植片対宿主疾患に対する抗ＣＤ８治療の評価。動員性末梢血（mobilized peripheral blood，ＭＰＢ）ＣＤ３４＋細胞（動物あたり３〜６×１０６のＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞）を、致死量以下で照射した（１３７Ｃｓγ照射による３００センチグレイ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの別々の実験的コホートに、以前に記載されたようにして、移植の１０〜１２週間後に静脈内注入し、マウスに、同種提供者からの１０Ｍの選別したナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を皮下注射した。マウスを、ＩｇＧ１対照ｍＡｂ又は抗ＣＤ８ｍＡｂ（ＲＰＡ−Ｔ８、BD biosciences社製、第０日に０．７５ｍｇ及び第３日に０．２５ｍｇ）を用いて皮下処置した。２回の実験のうちの一方において、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ＭＡＢ８９、Schering-Plough社製）を、同種移植の日に腹腔内注射して、ＤＣを活性化した。
【００４５】
マウスを、生存、並びに下痢、体重減少及びひだ状の皮膚により発現されるＧＶＨＤの臨床徴候について毎日観察した。症状が現れた場合に、マウスを採集した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。
【００４６】
インビトロ生成ＬＣを用いるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロプライミング。ＨＬＡ−Ａ２０１＋ＬＣ及びＩｎｔＤＣを、ＣＤ３４＋ＨＰＣを、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＴＮＦαの存在下で９〜１０日間培養することによりインビトロで生成した。細胞を、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ＬＣ（ＬＣ）とＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣ（ＩｎｔＤＣ）とに選別した。１次応答のために、３μＭのＨＬＡ−Ａ２０１拘束性黒色腫ペプチドＭＡＲＴ−１（２６〜３５）を負荷したＤＣサブセットを、自己ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と９〜１０日間培養した。培養の最後での抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、特異的ペプチド−ＭＨＣ四量体を用いて測定した。
【００４７】
図１ａ及び図１ｂに示すように、ＬＣによりプライミングされたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩｎｔＤＣでプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、表面ＣＤ８発現を上方制御する。メモリー応答のために、ＤＣサブセットに、１μＭのＨＬＡ−Ａ２０１拘束性インフルエンザ基質ペプチドＭ１を負荷した。ＤＣを、選別した自己メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞と培養した。対照的に、両方のサブセットは、ウイルス抗原に対する２次応答の誘導について等しく効果的であり、いずれのサブセットにより活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞も、等しいレベルの表面ＣＤ８を発現する（図１ｃ）。
【００４８】
抗ＣＤ８抗体は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを妨げる。抗ＣＤ８ｍＡｂ  ＲＰＡ−Ｔ８を加えることにより、ＭＡＲＴ−１によりパルスされたＬＣによるＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が効果的に遮断された（図２ａ）。動態分析は、抗ＣＤ８ｍＡｂを培養物に加えた場合に、第１日〜第９日に、ほとんど抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が観察されないことを示す（図２ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの阻害は、０．１μｇ／ｍｌの抗体が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖のほぼ完全な阻害をもたらし、５０％阻害濃度（ＩＣ５０，50% Inhibitory Concentration）が５０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲であったので、非常に効果的であった（図２ｃ）。３つの試験した抗ＣＤ８抗体（Ｔ８、ＲＰＡ−Ｔ８及びＯＫＴ８）のうち３つが、Ｔ細胞プライミングを阻害した（図２ｄ）。
【００４９】
７０時間目まで培養物への抗ＣＤ８ｍＡｂの添加を遅らせてもまだ、黒色腫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの７５％が阻害された（図２ｅ）。ＭＡＲＴ−１ペプチド負荷ＬＣとナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を低濃度の抗ＣＤ８の存在下で培養すると、１次対照培養物と比較して、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が減少した（図２ｆ）。さらに、抗ＣＤ８ｍＡｂに曝露したＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照抗体に曝露したものと比較して、より低いＭＡＲＴ−１  ＭＨＣ−四量体強度染色を示した。培養物に加える抗ＣＤ８ｍＡｂが多いほど、抗原特異的Ｔ細胞上で観察される四量体強度結合がより小さかった（図２ｇ）。
【００５０】
抗ＣＤ８ｍＡｂは、単球をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮと培養することにより生成するＤＣ（ＩＦＮ−ＤＣ）により誘導されるＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを遮断できたが（図２ｈ）、このことは、阻害効果が、ＤＣの供給源にもプライミングのために選択された抗原にも依存しないことを示す。さらに、抗ＣＤ８ｍＡｂは、高濃度のペプチドをＤＣに負荷した場合又は抗原が培養の間中存在した場合でさえもプライミングを遮断できた（図２ｉ）。これらのデータをまとめると、遮断ＣＤ８が、高結合活性抗原特異的ナイーブＴ細胞のＤＣにより誘導されるプライミングを妨げることを示す。
【００５１】
抗ＣＤ８抗体は、ＤＣにより媒介されるＣＤ８Ｔ細胞のアロ増殖を阻害する。抗ＣＤ８ｍＡｂ又はアイソタイプ対照を、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の培養物に、段階的な数のインビトロ生成同種ＬＣとともに加えた。［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いる図３ａに示すように、ＬＣにより誘導される同種ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、抗ＣＤ８ｍＡｂにより阻害された。ＬＣと同種ナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養物に対して行ったＣＦＳＥ希釈アッセイにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の阻害を確認した（図３ｂ上のパネル）。これはさらに、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が、抗ＣＤ８抗体により影響されなかったことを明らかにした（図３ｂ下のパネル）。実際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が３０ｎｇ／ｍｌにて阻害されたが（図３ｃ上のパネル）、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、用いた抗ＣＤ８ｍＡｂのいずれの濃度についても（０〜３μｇ／ｍｌ）増殖の低下を示さなかった（図３ｃ下のパネル）。ヒト皮膚から単離された真皮ＤＣ又はＬＣにより誘導される同種Ｔ細胞の活発な増殖も、抗ＣＤ８ｍＡｂにより遮断された（図３ｄ及びｅ）。抗ＣＤ８ｍＡｂの存在下では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＤＣの間でわずかにまばらな小さいクラスタのみが形成された（図３ｆ）。しかし、抗ＣＤ８ｍＡｂを含まない培養物では、活発な増殖が、ＤＣ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の多くの大きいクラスタを伴った（図３ｇ）。つまり、抗ＣＤ８抗体は、同種ＣＤ８＋Ｔ細胞のＤＣにより媒介されるプライミングを阻害できる。
【００５２】
抗ＣＤ８は、自己又は同種抗原に対する２次応答を遮断しない。メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答が抗ＣＤ８ｍＡｂによっても阻害されるかを調べるために、免疫優性ＨＬＡ−Ａ２結合インフルエンザ基質タンパク質Ｍ１ペプチド（５７〜６８）を負荷したＨＬＡ−Ａ２＋ＬＣ又はＩｎｔＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞並びに抗ＣＤ８ｍＡｂ及びその適切な対照とともに培養した。両方のＤＣサブセットについて、四量体染色により測定される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、抗ＣＤ８ｍＡｂ又はアイソタイプ対照と同等であった（図４ａ及びｃ）。抗ＣＤ８ｍＡｂの濃度が２．５μｇ／ｍｌほど高くても、阻害は検出されなかった（図４ｂ及びｄ）。試験した２つの他の抗ＣＤ８ｍＡｂ（Ｔ８  Beckman、ＲＰＡ−Ｔ８  ＢＤ）は、メモリー細胞のインフルエンザペプチドにより誘導される活性化を阻害しなかった（図４ｅ）。
【００５３】
メモリー同種ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が抗ＣＤ８ｍＡｂにより影響されるかを証明するために、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、同種ＬＣ又はＩｎｔＤＣにより７日間プライミングし、Ｔ細胞を３日間再刺激した。図４ｆに示すように、抗ＣＤ８ｍＡｂは、ＬＣ又はＩｎｔＤＣのいずれを用いても、元来の同種抗原でのＣＤ８＋Ｔ細胞再刺激を阻害できなかった。つまり、これらのデータは、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＣＤ８に依存しないことを証明する。
【００５４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗ＣＤ８ｍＡｂでのプライミングは、低レベルの細胞溶解分子を有する２型Ｔ細胞を生じる。図５に示すように、同種ＤＣを用いるプライミングの間に抗ＣＤ８ｍＡｂに曝露したＣＤ８＋Ｔ細胞は、低レベルのＣＤ２５、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２８と、グランザイムＡ及びＢ並びにパーフォリンのより低い細胞内発現とを発現する（図５ａ）。ＬＣ及びアイソタイプ対照で７日間プライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８とを用いる２４時間の再刺激の後に、ＩＦＮ−γ（２，０００〜６，０００ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２（１，０００〜６０００ｐｇ／ｍｌ）、並びに低レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生した。ＬＣ及び抗ＣＤ８でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、同量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが、高い量のＩＬ−４（１００〜６００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ−５（５００〜２５００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（１０００〜７０００ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１０（７０〜１００ｐｇ／ｍｌ）を分泌した（図５ｂ）。
【００５５】
まとめると、データは、抗ＣＤ８ｍＡｂが、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を変更して、２型サイトカインを分泌し、低レベルの細胞傷害性分子を発現する細胞を生じることを示す。
【００５６】
抗ＣＤ８の存在下でプライミングされたアロ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強く抑制する。抗ＣＤ８ｍＡｂの存在下でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞がサプレッサー機能を示すかを決定するために、ＣＦＳＥ標識ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（提供者Ａ）を、同種ＬＣ（提供者Ｂ）と、抗ＣＤ８ｍＡｂ又はアイソタイプ適合対照とともに７日間培養した。活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥ−ＣＤ１１ｃ−）を選別し、段階的な数（３〜３００）にて、５０，０００の提供者Ａからの自己ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と２５００の提供者Ｂからの同種ＬＣとの共培養物に加えた。抗ＣＤ８ｍＡｂを用いてプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の同種ＬＣへの増殖を用量依存的な様式で強く阻害し、１００ほどの少ない細胞が８０％程度アロ反応を抑制し、１０の細胞が５０％遮断した。しかし、アイソタイプ対照でプライミングされたＣＤ８＋Ｔ細胞は、阻害を示さなかった（図６ａ）。阻害は、抗ＣＤ８ｍＡｂ処理ＣＤ８＋Ｔ細胞にそれらのアロ特異的ＤＣを加えたときに特に著しく、抑制の強さは、提供者ＣからのＤＣを用いると、より低かった（図６ｂ）。
【００５７】
抗ＣＤ８ｍＡｂは、同種ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化及び移植片対宿主疾患をインビボで阻害する。抗ＣＤ８抗体を用いてインビトロで観察されたＣＤ８ＩＴ細胞プライミングの強い阻害に導かれて、我々は、このことが、ｐＤＣ、ｍＤＣ及びＢ細胞に分化するがＴ細胞に分化しないヒトＣＤ３４＋ＨＰＣを移植された免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてインビボでも発生するかを調べた。これらのヒト化マウスに、同種提供者からの２０×１０６の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、０．７５ｍｇの抗ＣＤ８ｍＡｂ又はアイソタイプ適合対照抗体のいずれかとともに、皮下にて養子移入した。さらに０．２５ｍｇの抗体を第３日に注射した。２回の実験のうちの一方において、抗ＣＤ４０抗体（ＭＡＢ８９、Schering Plough社製、１００μｇ）を、ＤＣ活性化のために腹腔内注射した。マウスを、疾病の徴候について定期的に調べた。ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入の１０週間後に、アイソタイプ適合対照抗体を受容したマウスは、目の周囲の発疹、体重減少及び脱力の慢性移植片対宿主疾患の臨床症状を発生した（図７ａ）。しかし、抗ＣＤ８抗体での処置は、病原性Ｔ細胞の活性化及び増殖と臨床症状の発生とをともに完全に阻害した（図７）。アイソタイプ対照処置マウスの骨髄からのＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ１０３を上方制御したが、抗ＣＤ８ｍＡｂで処置したマウスは上方制御しなかった（図７ｂ）。
【００５８】
まとめると、これらのデータは、抗ＣＤ８ｍＡｂ療法が、ヒト免疫系を有する免疫不全マウスにおいて移植片対宿主疾患を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の同種１次活性化を妨げることにおいて効果的であることを示す。
【００５９】
本研究は、なぜＬＣが間質ＤＣよりも、これらのｍＤＣサブセットがともに２次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導において等しく効果的であるのに、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングにおいて、より効力があるのかを理解するために行った。抗ＣＤ８ｍＡｂをナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞とＤＣとの共培養物に加えた結果から、いくつかの結論が導かれた。第１に、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングは、非常に低い濃度の抗体で著しく阻害されることが見出されたが、メモリー細胞の活性化は、高濃度の抗体にさえ影響されなかった。第２に、残存増殖細胞は、エフェクター経路よりもむしろサプレッサー経路に沿って分化した。
【００６０】
これらのデータは、試験した抗ＣＤ８モノクローナル抗体の全体が、非常に低い濃度にて、自己又は同種ＭＨＣの状況においてインビトロで提示される抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞のＤＣにより媒介される増殖を遮断することを証明した。しかし、ウイルス又は同種抗原に対する再生応答は、抗ＣＤ８ｍＡｂにより阻害されなかった。これらのデータは、抗ＣＤ８抗体がナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を遮断できるが、エフェクター及びメモリー細胞のものは遮断できないことを示す、マウスリンパ球を用いたインビトロ研究についての以前の報告と一致する（Bachmann, M. F. et al. Developmental regulation of Lck targeting to the CD8 coreceptor controls signaling in naive and memory T cells. J Exp Med 189, 1521-30 (1999)）。アロ反応性ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化も遮断した抗ＣＤ８は、ヒト化マウスモデルにおいてインビボでも観察され、移植片対宿主応答の除去をもたらした。おそらく最も著しい観察は、抗ＣＤ８抗体を加えることが、応答の型をエフェクター応答からサプレッサー応答へ質的に改変したことである。生成されたサプレッサー細胞は、発現が低下したグランザイムＡ及びＢ並びにパーフォリンと、低いＣＤ２８との独特の表現型を発現する。さらに、これらの細胞は、発現が増加した２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）と、発現が増加したＩＬ−１０との変更された表現型パターンを発現する。さらに、これらの細胞は、１００のこれらの細胞が８０％のアロ反応を、特に同族ＡＰＣにより活性化されたときに遮断できるという効力のある抑制能力を発現する。興味深いことに、この表現型は、我々が他の所で報告するようなＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣ上で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型と同等である。
【００６１】
これらの観察は、臨床的に重要である。なぜなら、Ｔ細胞は、同種移植片拒絶の主なメディエーターであるからである（Hall, B. M. Cells mediating allograft rejection. Transplantation 51, 1141-51 (1991)、Rosenberg, A. S. & Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annu Rev Immunol 10, 333-58 (1992)）。同種移植片受容者におけるＴ細胞の最初の活性化を特異的に遮断する治療を設計することに対して、多くの努力が向けられてきた。ＣＤ４＋Ｔ細胞依存性経路及びＣＤ８＋Ｔ細胞依存性経路はともに、同種移植片拒絶を開始することが示されている。ラパマイシン（Slavik, J. M., Lim, D. G., Burakoff, S. J. & Hafler, D. A. Rapamycin-resistant proliferation of CD8+ T cells correlates with p27kip1 down-regulation and bcl-xL induction, and is prevented by an inhibitor of phosphoinositide 3-kinase activity. J Biol Chem 279, 910-9 (2004)）、シクロスポリン（Boleslawski, E. et al. Defective inhibition of peripheral CD8+ T cell IL-2 production by anti-calcineurin drugs during acute liver allograft rejection. Transplantation 77, 1815-20 (2004)）、抗ＣＤ４ｍＡｂ（Jones, N. D. et al. CD40-CD40 ligand-independent activation of CD8+ T cells can trigger allograft rejection. J Immunol 165, 1111-8 (2000)）、抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（Guo, Z. et al. CD8 T cell-mediated rejection of intestinal allografts is resistant to inhibition of the CD40/CD154 costimulatory pathway. Transplantation 71, 1351-4 (2001)）及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Newell, K. A. et al. Cutting edge: blockade of the CD28/B7 costimulatory pathway inhibits intestinal allograft rejection mediated by CD4+ but not CD8+ T cells. J Immunol 163, 2358-62 (1999)）のような免疫調節ストラテジーは、ＣＤ４依存性免疫活性化の抑制に非常に効果的であるが、拒絶のＣＤ８依存性経路は、研究において、耐性であることが示されている。カルシニューリン阻害剤による抑制に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の耐性は、臨床研究における急性同種移植片拒絶の発生率の増加とも関連している（Zhai, Y., Meng, L., Gao, F., Busuttil, R. W. & Kupiec-Weglinski, J. W. Allograft rejection by primed/memory CD8+ T cells is CD154 blockade resistant: therapeutic implications for sensitized transplant recipients. J Immunol 169, 4667-73 (2002)）。このことは、インビボで観察されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の異なる共刺激要件と一致する。ＣＤ８依存性の同種移植片拒絶は、ＣＤ４０／ＣＤ１５４共刺激に依存し、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路から独立している（Newell, K. A. et al. Cutting edge: blockade of the CD28/B7 costimulatory pathway inhibits intestinal allograft rejection mediated by CD4+ but not CD8+ T cells. J Immunol 163, 2358-62 (1999)）。
【００６２】
第１世代の抗ＣＤ３ｍＡｂは、その他のほとんどの免疫抑制治療と同様に、ＣＭＶのような重篤なウイルス感染を伴う免疫抑制をもたらす同種移植片受容者におけるＴ細胞の最初の活性化を遮断する。つまり、抗ＣＤ８抗体がウイルス特異的メモリー応答を損なわれないままにしながら、エフェクター細胞プライミングを遮断するとの観察は、抗ウイルス２次応答を損なわれないままにしながら、移植片を攻撃するアロ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を妨げるのだろう。
【００６３】
移植部位でのＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＤ１０３の上方制御は、同種移植片損傷を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力と密接につながっている（Hadley, G. A., Bartlett, S. T., Via, C. S., Rostapshova, E. A. & Moainie, S. The epithelial cell-specific integrin, CD103 (alpha E integrin), defines a novel subset of alloreactive CD8+ CTL. J Immunol 159, 3748-56 (1997)）。上皮細胞特異的インテグリンであるＣＤ１０３（αＥインテグリン）は、アロ反応性ＣＤ８＋ＣＴＬの新規なサブセットを規定する（Feng, Y. et al. CD103 expression is required for destruction of pancreatic islet allografts by CD8(+) T cells. J Exp Med 196, 877-86 (2002)）。同種移植片拒絶の（ＣＤ４非依存性）ＣＤ８依存性経路の活性化は、活発な免疫応答を惹起し、これは、免疫調節に対して非常に耐性が高い。腎臓拒絶中の主にＣＤ８＋ＣＴＬＡ４＋Ｔリンパ球の強い局所的な浸潤が、患者において記載されている。このことは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、免疫抑制を逃れて、拒絶プロセスに参加できることを示唆する。ＣＤ４及びＣＤ８応答の両方を制御することは、寛容及び長期の生存を促進するために必要であり得る（Cobbold, S. P., Martin, G. & Waldmann, H. The induction of skin graft tolerance in major histocompatibility complex-mismatched or primed recipients: primed T cells can be tolerized in the periphery with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies. Eur J Immunol 20, 2747-55 (1990)）。
【００６４】
ＣＤ８療法は、ループス又は糖尿病のような自己免疫疾患における自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングの予防においても有益であり得る。
【００６５】
本明細書で論じられるいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法、キット、試薬又は組成物に関しても実行でき、またその逆も同じであると考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００６６】
本明細書に記載される具体的な実施形態は、例示のために示され、本発明の限定として示されるのでないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の実施形態において用いることができる。当業者は、日常的なものを超える実験を行うことなく、本明細書に記載される特定の手順の多数の等価物を認識するか、又は確認できる。このような等価物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲によりカバーされる。
【００６７】
本明細書で言及する全ての出版物及び特許出願は、本発明が関する当該技術における当業者のレベルを示す。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個別の出版物又は特許出願が、参照により組み込まれると具体的にかつ個別に記載されているのと同程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」とともに用いる場合の語句「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１つ（one）」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１及び１より多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、それが選択肢のみ及び「及び／又は」に言及するという定義を開示が支持しても、選択肢のみに言及すると明記するか、又は選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するために用いられる。本出願をとおして、用語「約」は、値が、値を決定するために用いた装置、方法についての固有の誤差の変動、又は研究対象のうちに存在する変動を含むことを示すために用いられる。本明細書及び特許請求の範囲において用いる場合、語句「含んでいる（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」のような含んでいる（comprising）の任意の形）、「有している（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」のような有している（having）の任意の形）、「含んでいる（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」のような含んでいる（including）の任意の形）、又は「含有している（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）のような含有している（containing）の任意の形）は、包括的又は拡張可能であり、追加の明記されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「又はそれらの組合せ」とは、この用語に先行する列挙された項目の全ての順列及び組合せに言及する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、もし特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例の続きとして、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１若しくは複数の項目又は用語の反復を含む組合せも明確に含まれる。当業者は、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組合せの項目又は用語の数に制限がないことを理解する。
【００７０】
本明細書に開示され、請求される組成物及び／又は方法の全ては、本発明の開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製して実行できる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の点で記載されているが、組成物及び／又は方法並びに本明細書に記載される方法のステップ又はステップの順序を、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、変動し得ることが当業者に明らかである。当業者にとって明らかな全てのこのような類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の精神、範囲及び概念内であるとみなされる。
【００７１】
（参考文献）
1.  Banchereau, J. & Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-52 (1998)
2.  Caux, C. et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med 184, 695-706 (1996)
3.  Zamoyska, R. The CD8 coreceptor revisited: one chain good, two chains better. Immunity 1, 243-6 (1994)
4.  Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, E. M. & Bolen, J. B. The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck. Cell 55, 301-8 (1988)
5.  Chalupny, N. J., Ledbetter, J. A. & Kavathas, P. Association of CD8 with p56lck is required for early T cell signalling events. Embo J 10, 1201-7 (1991)
6.  Bachmann, M. F. et al. Developmental regulation of Lck targeting to the CD8 coreceptor controls signaling in naive and memory T cells. J Exp Med 189, 1521-30 (1999)
7.  Tewari, K., Walent, J., Svaren, J., Zamoyska, R. & Suresh, M. Differential requirement for Lck during primary and memory CD8+ T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16388-93 (2006)
8.  Fung-Leung, W. P. et al. The lack of CD8 alpha cytoplasmic domain resulted in a dramatic decrease in efficiency in thymic maturation but only a moderate reduction in cytotoxic function of CD8+ T lymphocytes. Eur J Immunol 23, 2834-40 (1993)
9.  Nakayama, K. et al. Requirement for CD8 beta chain in positive selection of CD8-lineage T cells. Science 263, 1131-3 (1994)
10.  de la Calle-Martin, O. et al. Familial CD8 deficiency due to a mutation in the CD8 alpha gene. J Clin Invest 108, 117-23 (2001)
11.  Hall, B. M. Cells mediating allograft rejection. Transplantation 51, 1141-51 (1991)
12.  Rosenberg, A. S. & Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annu Rev Immunol 10, 333-58 (1992)
13.  Slavik, J. M., Lim, D. G., Burakoff, S. J. & Hafler, D. A. Rapamycin-resistant proliferation of CD8+ T cells correlates with p27kip1 down-regulation and bcl-xL induction, and is prevented by an inhibitor of phosphoinositide 3-kinase activity. J Biol Chem 279, 910-9 (2004)
14.  Boleslawski, E. et al. Defective inhibition of peripheral CD8+ T cell IL-2 production by anti-calcineurin drugs during acute liver allograft rejection. Transplantation 77, 1815-20 (2004)
15.  Jones, N. D. et al. CD40-CD40 ligand-independent activation of CD8+ T cells can trigger allograft rejection. J Immunol 165, 1111-8 (2000)
16.  Guo, Z. et al. CD8 T cell-mediated rejection of intestinal allografts is resistant to inhibition of the CD40/CD154 costimulatory pathway. Transplantation 71, 1351-4 (2001)
17.  Newell, K. A. et al. Cutting edge: blockade of the CD28/B7 costimulatory pathway inhibits intestinal allograft rejection mediated by CD4+ but not CD8+ T cells. J Immunol 163, 2358-62 (1999)
18.  Zhai, Y., Meng, L., Gao, F., Busuttil, R. W. & Kupiec-Weglinski, J. W. Allograft rejection by primed/memory CD8+ T cells is CD154 blockade resistant: therapeutic implications for sensitized transplant recipients. J Immunol 169, 4667-73 (2002)
19.  Hadley, G. A., Bartlett, S. T., Via, C. S., Rostapshova, E. A. & Moainie, S. The epithelial cell-specific integrin, CD103 (alpha E integrin), defines a novel subset of alloreactive CD8+ CTL. J Immunol 159, 3748-56 (1997)
20.  Feng, Y. et al. CD103 expression is required for destruction of pancreatic islet allografts by CD8(+) T cells. J Exp Med 196, 877-86 (2002)
21.  Cobbold, S. P., Martin, G. & Waldmann, H. The induction of skin graft tolerance in major histocompatibility complex-mismatched or primed recipients: primed T cells can be tolerized in the periphery with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies. Eur J Immunol 20, 2747-55 (1990)
【図１ａ】
2011522835.tif 000006
【図１ｂ】
2011522835.tif 000007
【図１ｃ】
2011522835.tif 000008
【図２ａ】
2011522835.tif 000009
【図２ｂ】
2011522835.tif 000010
【図２ｃ】
2011522835.tif 000011
【図２ｄ】
2011522835.tif 000012
【図２ｅ】
2011522835.tif 000013
【図２ｆ】
2011522835.tif 000014
【図２ｇ】
2011522835.tif 000015
【図２ｈ】
2011522835.tif 000016
【図２ｉ】
2011522835.tif 000017
【図３】
2011522835.tif 000018
【図３ａ】
2011522835.tif 000019
【図３ｂ】
2011522835.tif 000020
【図３ｃ】
2011522835.tif 000021
【図３ｄ】
2011522835.tif 000022
【図３ｅ】
2011522835.tif 000023
【図４ａ】
2011522835.tif 000024
【図４ｂ】
2011522835.tif 000025
【図４ｃ】
2011522835.tif 000026
【図４ｄ】
2011522835.tif 000027
【図４ｅ】
2011522835.tif 000028
【図４ｆ】
2011522835.tif 000029
【図５ａ】
2011522835.tif 000030
【図５ｂ】
2011522835.tif 000031
【図６ａ】
2011522835.tif 000032
【図６ｂ】
2011522835.tif 000033
【図７ａ】
2011522835.tif 000034
【図７ｂ】
2011522835.tif 000035
【国際調査報告】
2011522835.tif 000036
2011522835.tif 000037
2011522835.tif 000038
2011522835.tif 000039