(57)【要約】  本発明は、レオウイルス科に属するウイルス（すなわちレオウイルス）のためのリバースジェネティクスシステム、その様々な使用、遺伝的に修飾したレオウイルス、レオウイルス選択／産生および増殖システム、薬剤およびワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
（ｄ）レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ｅ）前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｆ）修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程（ｂ）で使用されるレオウイルスと比較して、前記レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む、前記方法。
【請求項２】
前記レオウイルス科に属するウイルスが、オルトレオウイルス種、オルビウイルス種、ロタウイルス種またはコルティウイルス種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レオウイルスゲノムを含む１種以上の二本鎖ＲＮＡゲノムセグメントを修飾する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
１種以上の前記二本鎖ＲＮＡゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ゲノムによってコードされた１種以上のウイルス成分を修飾する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上のウイルス成分が、構造成分および／または非構造成分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記レオウイルスゲノムを、１種以上の異種核酸配列を含むように修飾する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記異種核酸配列が、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または１種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞に導入される前記核酸が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写カセット内に含まれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写カセットが、レンチウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
（ｄ）レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ｅ）前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｆ）修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程（ｂ）で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの前記修飾成分を含む、前記方法。
【請求項１２】
レオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）のσ−１（Ｓ１）カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
（ａ）修飾Ｔ３ＤのＳ１タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
（ｄ）前記細胞にＴ３Ｄウイルスを感染させる工程、及び
（ｅ）修飾Ｓ１タンパク質を有する修飾Ｔ３Ｄウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾Ｓ１カプシドタンパク質を有する前記修飾Ｔ３Ｄウイルスが、工程（ｂ）で使用されるＴ３Ｄウイルスと比較して、前記修飾Ｓ１カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルス。
【請求項１４】
修飾レオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）であって、カルボキシ末端において少なくとも１つのヒスチジン残基を含む修飾Ｓ１カプシドタンパク質を含む、前記ウイルス。
【請求項１５】
修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
（ａ）請求項１３もしくは１４に記載のレオウイルスまたは請求項１〜１２の方法のいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、前記修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
（ｂ）修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記修飾レオウイルスが、カルボキシ末端において少なくとも１つのヒスチジン残基を含むように修飾されたＳ１カプシドタンパク質を含むＴ３Ｄレオウイルスであり、さらに細胞の前記部分が、前記修飾Ｓ１カプシドタンパク質の前記少なくとも１つのヒスチジン残基を結合することができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾レオウイルスが、カプシドタンパク質に対する１種以上の付加の修飾をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記付加の修飾が、レオウイルスＴ３ＤのＳ１タンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３６９〜Ｇｌｕ３８４に対する修飾を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌などの疾患の治療における請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法によって増殖されたウイルスの使用。
【請求項２０】
修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、Ｓ１タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも１つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを、ヒスチジン結合部分と、前記少なくとも１つのヒスチジン残基と前記ヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
レオウイルス科のメンバーによって引き起こされるかまたはレオウイルス科のメンバーが寄与する疾患の予防のためのワクチンの調製における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【請求項２２】
細胞増殖及び分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レオウイルス科に属するウイルス（すなわちレオウイルス）のためのリバースジェネティクスシステム、その様々な使用、遺伝的に修飾したレオウイルス、レオウイルス選択／産生および増殖システム、薬剤およびワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｃ  Ｏｒｐｈａｎ  ｖｉｒｕｓｅｓ））は、分節された二本鎖ＲＮＡゲノムを備えた非エンベロープウイルスのファミリーを構成する。レオウイルス科は、胃腸系に影響するウイルス（ロタウイルスなど）を含み、それは呼吸器感染を引き起こす。用語「オーファンウイルス」は、特定のウイルスが任意の公知の疾患に関連しないことを示しており、レオウイルス科は多数の疾患に関連するが、オリジナル名がなお使用されている（Ｔｙｌｅｒ、２００１）。ロタウイルスは、ヒトからヒトへ直接伝達されることが可能であり、世界の全体で２歳未満の小児においておよそ１年で５００，０００人死亡を生じる深刻な下痢性疾病の主要な原因微生物である（Ｋａｐｉｋｉａｎら、２００１）。
【０００３】
哺乳類オルトレオウイルスのプロトタイプはヒト呼吸管および腸管から単離されていたが、重篤なヒト疾患と関連しない。これらのうちの１つ、ヒトレオウイルスタイプ３ディアリング（Ｄｅａｒｉｎｇ）（Ｔ３Ｄ）がしばしば研究され、通常この科のモデルとされる（Ｎｉｂｅｒｔら、２００１）。さらに、最近十年間の間に、哺乳類オルトレオウイルス（特にＴ３Ｄ）は前臨床および臨床の癌治療実験において癌溶解剤として使用されてきた（Ｎｏｒｍａｎら、２０００；Ｓｈｍｕｌｅｖｉｔｚら、２００５）。本発明は、レオウイルスが、健康な非形質転換細胞ではなく腫瘍細胞の細胞死およびアポトーシスを誘導するという観察に部分的に基づく（Ｈａｓｈｉｒｏら、１９７７；Ｄｕｎｃａｎら、１９７８）。現在までに、癌治療に対するかかるアプローチの実施可能性を研究するために、複数の臨床試験がカナダ、米国およびイギリスで開始された。
【０００４】
野生型レオウイルスは、標的細胞への結合のための受容体として複数の別個のタンパク質を使用することができる。最初に、接合部接着分子（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−Ａ（Ｊａｍ−Ａ、接合部接着分子１、またはＪａｍ−１としても公知）は、オルトレオウイルス属（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）のタイプ１およびタイプ３のための受容体として働き、ウイルスの付着および感染を仲介できることが実証されている（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００２ｄ）。Ｊａｍ−Ａは組込まれた密着結合タンパク質であり、レオウイルスＴ３Ｄのσ−１タンパク質の球状頭部中の領域はＪａｍ−Ａと相互作用する（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００２ｃ）。さらに、スパイクタンパク質σ−１のシャフトドメインの配列は、産生性感染のための細胞表面シアル酸分子と相互作用することができる（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、１９９７）。σ−１タンパク質はＲＮＡ分節Ｓ１（σ１としても公知である）によってコードされる。
【０００５】
レオウイルス受容体が高い頻度で出現するにもかかわらず、いくつかの腫瘍細胞は細胞表面上に限られた数の受容体を有する。例えば、Ｓｍａｋｍａｎ（２００５）は、結腸直腸転移をともなう患者からの１３の腫瘍の断片のどれもレオウイルスＴ３Ｄ感染に感受性がないことを記載した（Ｓｍａｋｍａｎ、２００５）。腫瘍細胞上のレオウイルス受容体の欠乏は、癌溶解剤としてのレオウイルスの効率を妨げる。
【０００６】
レオウイルス科の遺伝子修飾は、それらの二本鎖ＲＮＡゲノムの分節構造のために困難なことが有名である。それゆえ、本発明はレオウイルス科のメンバーのためのリバースジェネティクス法に関する。Ｒｏｎｅｒら、２００１、およびＲｏｎｅｒら、１９９０は、ＲＮＡ分節のうちの１つのインビトロ合成、このＲＮＡのインビトロキャッピング、および他の９つの分節の一本鎖（プラス鎖）ＲＮＡおよび／または二本鎖ＲＮＡとのこのＲＮＡのコトランスフェクションを含む、複雑なレオウイルスリバースジェネティクスシステムを開発した。複製を開始するために、トランスフェクションした細胞を、ヘルパーウイルスとしてゆっくり溶菌するレオウイルスバリアントのレオウイルスＴ２またはＴ１により感染させた（Ｒｏｎｅｒら、２００１）。クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を保持する単一の組換えレオウイルスＴ３Ｄは生成されたが、方法は非能率的で煩わしいものである。
【０００７】
代わりのアプローチはＫｏｍｏｔｏおよびＳａｓａｋｉ（Ｋｏｍｏｔｏら、２００６）によって記述され、ロタウイルスのためのリバースジェネティクスシステムの確立について記述する。彼らは再集合されたロタウイルスのレスキューに成功したが、方法は非常に非能率的であり、改善する必要がある。Ｋｏｂａｙａｓｈｉおよび共同研究者は、完全にプラスミドに基づいたシステムを使用する組換えレオウイルスＴ３Ｄの生成について最近記述した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．、Ａ．Ａ．Ｒ．Ａｎｔａｒ、Ｋ．Ｗ．Ｂｏｅｈｍｅ、Ｐ．Ｄａｎｔｈｉ、Ｅ．Ａ．Ｅｂｙ、Ｋ．Ｍ．Ｇｕｇｌｉｅｌｍｉ、Ｇ．Ｈ．Ｈｏｌｍ、Ｅ．Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍ．Ｓ．Ｍａｇｉｎｎｉｓ、Ｓ．Ｎａｉｋ、Ｗ．Ｂ．Ｓｋｅｌｔｏｎ、Ｊ．Ｄ．Ｗｅｔｚｅｌ、Ｇ．Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．Ｃｈａｐｐｅｌｌ，およびＴ．Ｓ．Ｄｅｒｍｏｄｙ．２００７．Ａ  Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １：１４７−１５７）。
【０００８】
これらの両方の方法は、真の分節末端を備えた一本鎖プラス鎖ＲＮＡの産生に依存する。一般にポリアデニル化されていない一本鎖ＲＮＡが哺乳類細胞中で非常に短命であることが周知であるので、このことは組換体の形成を妨げる（Ｚｅｅｖｉら、１９８２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、先行技術に関する上述の問題を回避または軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、例えば、遺伝的に修飾されたレオウイルスおよび／またはレオウイルスの宿主域バリアントの開発に特定の適用を有することができるレオウイルス科のための効率的なリバースジェネティクスシステムの開発に基づく。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
（ａ）レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ｂ）細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｃ）修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程（ｂ）で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、細胞中で発現された場合、レオウイルスゲノムの修飾部分が新しく形成されたレオウイルス粒子へと組み入れられうるという意外な観察に基づく。理論に束縛されるものではないが、細胞へといったん導入された修飾レオウイルスゲノム部分は転写されて、真の５'キャップで開始し、３'末端で短縮せず、ポリＡトラクトを含むようにさらに伸長されるｍＲＮＡの分子をもたらすと考えられている。
【００１３】
レオウイルス科は、分節二本鎖ＲＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルス（他の場合にはレオウイルスとして既知である）の科であり、例えば、オルトレオウイルス（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、オルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）およびコルティウイルス（Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）種を含む。そのようなものとして、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、例えばレオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）などのオルトレオウイルス種のゲノムを遺伝的に修飾する方法を提供する。
【００１４】
典型的には、細胞にレオウイルスを感染させる工程（上記の工程（ｂ））は、「野生型レオウイルス」の使用を必要としうる。野生型レオウイルスは、レオウイルス科に属する任意のウイルスの生来の形態または自然発生の形態でありえる。好ましくは、野生型レオウイルスは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスの野生型形態である。一例として、方法がオルトレオウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルトレオウイルス種の野生型形態でありえる。
【００１５】
あるいは、細胞にレオウイルスを感染させる工程は、レオウイルス突然変異体(mutant)またはバリアントにより実行することができる。例えば、特定の実施形態において、例えば、高温感受性変異体および／または宿主域変異体を使用することは望ましいだろう。さらに、またはあるいは、工程（ｂ）において上で言及されたレオウイルスは、参照または同じ種の野生型株に比べて、修飾されたゲノムを含むレオウイルスでありえる。かかる事例において、本明細書において記述した方法の工程（ｂ）において使用するレオウイルスのゲノムは、本明細書において記述した方法または既に当業者に公知方法のうちのいずれかに従って修飾することができる。上述のように、工程（ｂ）において使用したバリアント、突然変異体または修飾レオウイルスは、好ましくは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスのバリアント、変異体または修飾バージョンである。一例として、方法がオルビウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルビウイルス種のバリアント、突然変異体および／または修飾形態でありえる。
【００１６】
本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスは、細胞の感染に使用するレオウイルスと比較して、「修飾された」こと、および工程（ｂ）において使用されるレオウイルスは、同じウイルスの野生型、バリアント、突然変異体または修飾形態でありえることが理解されるべきである。したがって、語句「修飾ゲノム」は、工程（ｂ）で使用されるウイルスに由来したゲノムに比べた場合に、改変されているか、または何らかの形で異なるゲノムを意味するように意図される。例えば、ゲノムは、付加ヌクレオチドおよび／または置換ヌクレオチドおよび／または反転ヌクレオチドを含むように修飾することができる。さらに、またはあるいは、ゲノムは、細胞の感染に使用されるウイルスのゲノムと比較して、特定のヌクレオチドが欠失されるように修飾することができる。
【００１７】
さらに、用語「細胞」は、野生型レオウイルスによる感染が可能な任意のタイプの細胞を包含する。周知の例は、細胞株「９１１」、ＰＥＲ．Ｃ６、「２９３」、ＨｅＬａ、Ａ５４９、およびＬ９２９を含む。
【００１８】
１つの実施形態において、本明細書において記述した方法を使用して、レオウイルスゲノムを含む１種以上の二本鎖ＲＮＡゲノムセグメントを修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して１種以上の二本鎖ＲＮＡゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾することができる。
【００１９】
本明細書において記述した方法により導入されたゲノム修飾は、第１の態様に従う方法の工程（ｂ）において感染した細胞によって産生されたウイルスの成分（例えば、１種以上の構造的および／または非構造的タンパク質）における１種以上の修飾として現われうることが理解されるべきである。言いかえれば、本明細書において記述した方法によって産生された修飾ゲノムは、１種以上の修飾ウイルス成分をコードし得る。したがって、本発明は、修飾ゲノムを有するレオウイルスの産生が可能な方法の提供に加えて、ゲノムによってコードされた１種以上のウイルス成分を修飾する方法もまた提供する。この手段で、上記の工程（ｂ）において感染した細胞によって産生されたウイルスは、１種以上の修飾成分（例えば、構造的タンパク質および／または非構造的タンパク質）および／または修飾ゲノムを含むことができる。
【００２０】
さらなる実施形態において、本方法を使用して、例えば、コアまたはカプシドの構造を含むものなどの１種以上の構造成分を修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して、１種以上の非構造成分、例えば、感染、複製、集合および／または放出に関与するタンパク質などを修飾し得る。特に、本方法を使用して、ウイルスカプシドを含むタンパク質の１つまたは複数を修飾し得る。
【００２１】
さらに、またはあるいは、本明細書において記述した方法を使用して、１種以上の異種核酸配列を含むように、レオウイルスゲノムを修飾することができる。１つの実施形態において、異種核酸配列は異種成分および／またはタンパク質をコードし得る。例えば、ゲノムを修飾して、１種以上の生来または天然のレオウイルス成分を対応する異種成分と置換し得る。さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムによってコードされた生来または天然の成分に加えて、１種以上の異種成分および／またはタンパク質をコードするように、レオウイルスゲノムを修飾し得る。
【００２２】
またさらなる実施形態において、異種核酸配列は、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または１種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードし得る。
【００２３】
用語「異種の」は、本明細書において記述した方法が行なわれている特定のレオウイルス以外のソースに由来する核酸配列および／またはその産物（例えばそれによってコードされたタンパク質）を指すことが理解されるべきである。
【００２４】
オルトレオウイルス属（レオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ））の事例において、本明細書において記述した方法のうちのいずれかを使用して、ゲノムを含む１種以上の二本鎖ＲＮＡセグメント（またはその一部分もしくは複数部分）を修飾することに加えて、Ｔ３Ｄの１種以上の成分、例えば、構造的成分および／または非構造成分を修飾し得る。特に、本方法を使用して、Ｔ３Ｄの内殻および／または外殻のカプシドを含む１種以上のタンパク質を修飾し得る。タンパク質σ１、σ３、λ２およびμ１ｃは、外殻カプシドの成分であり、タンパク質λ１、λ３、σ２およびμ２は、内殻カプシドの一部である。
【００２５】
当業者は、多数のウイルス成分を修飾するために、細胞へと多数の核酸（ウイルスの修飾成分をそれぞれコードしている）を導入できることを認識するだろう。
【００２６】
好ましくは、成分は、構造成分および／または非構造成分である。例えば、構造成分はウイルスカプシドを含むタンパク質でありえる。
【００２７】
好ましくは、および１つの実施形態において、細胞に導入される核酸は、ウイルスのゲノムの選択された部分の相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを生成する工程を含む方法によって提供し得る。有利には、ウイルスゲノムの選択された部分は、ウイルスの１種以上の成分をコードし得る。
【００２８】
１つの実施形態において、細胞（宿主細胞）を使用して、本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスを増殖し得る。宿主細胞としての使用のために適切な細胞は、例えば、９１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、２９３の細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、およびＬ９２９細胞を含むことができる。
【００２９】
典型的には、その中でウイルスを増殖させた細胞はＲＮＡ抽出プロトコールにさらされ得る。１つの実施形態において、ＲＮＡ抽出プロトコールは、溶解を誘導する条件に宿主細胞をさらす工程を含み得る。かかる条件は、ウイルスを含む細胞懸濁液の凍結融解の使用を含み得る。このように、宿主細胞内の任意のウイルス粒子は、例えば遠心分離、好ましくは超遠心分離によって放出および採取し得る。
【００３０】
有利には、採取されたウイルス粒子は、溶解を誘導する条件にさらし得る。かかる条件は、例えばウイルス粒子の変性および酵素の不活性化を可能にし、他の場合には核酸を変性および／または破壊し得るカオトロピック化合物の使用を含み得る。かかる化合物は、例えば、塩化グアニジンまたはグアニジウムチオシアネートなどの、尿素および／またはグアニジン化合物を含み得る。典型的には、残存ウイルスおよび／または細胞残屑をさらなる遠心分離ラウンドによって除去して、ウイルスＲＮＡを含む上清を残し得る。
【００３１】
好ましくは、ＲＮＡ抽出は、フェノール−クロロホルム、シリカビーズ、粒子または珪藻などの化合物、および／または溶液からＲＮＡを抽出するようにデザインされたミクロスピンのカラム（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社）の使用を含む核酸沈殿技術によって達成し得る。これらの技術に関するさらに詳しい情報は例えばＢｏｏｍら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．（３）２８，ｐ４９５−５０３；Ｓｈａｆｅｒら、Ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｌｉｇａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．エイズ臨床試験研究班ウイルス学委員会薬物耐性ワーキンググループ（Ｔｈｅ  ＡＩＤＳ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｇｒｏｕｐ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６  ３４：１８４９−１８５３およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；ＣＳＨＬプレス社から得ることができる。
【００３２】
好ましくは、抽出されたＲＮＡは、特定のウイルスＲＮＡ配列（以下に標的ウイルス配列と呼ばれる）は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが使用される増幅プロトコールを行なって、選択された配列を増幅し得る。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、特定のヌクレオチド配列により特異的にハイブリダイズするようにデザインされる。
【００３３】
１つの実施形態において、標的ウイルス配列は特定のウイルスの構造成分および／または非構造成分をコードする。例えば、標的ウイルス配列は、１種以上のカプシドタンパク質をコードし得る。
【００３４】
有利には、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ウイルス配列のｃＤＮＡコピーの生成を許容する条件下で、ウイルスＲＮＡと接触させられる。かかる条件は、ＲＮＡをｃＤＮＡへの逆転写が可能な酵素の使用を含み得る。１つの実施形態において、標的配列は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅される。ＲＴ−ＰＣＲに関するさらに詳しい情報は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；ＣＳＨＬプレス中で見出すことができる。
【００３５】
好ましくは、１つの実施形態において、標的ウイルス配列は、対応する野生型ウイルス配列に比べた場合、改変されているか、または何らかの形で異なる配列を提供するように修飾され得る。例えば、標的ウイルス配列は、ウイルスの野生型形態における対応するアミノ酸配列に比べた場合、１種以上の付加、欠失、置換、または反転したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含むように修飾され得る。
【００３６】
有利には、標的ウイルス配列は増幅プロトコールの間に修飾され得る。好ましくは、上述されたＲＴ−ＰＣＲ増幅プロトコールで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに加えて、生じたｃＤＮＡに導入される修飾をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。さらにまたはあるいは、オリゴヌクレオチドは、ウイルス標的配列によってコードされた１種以上のアミノ酸の欠失、置換または反転をもたらすヌクレオチド配列を含み得る。
【００３７】
したがって、本明細書において記述された方法は、レオウイルスゲノムの修飾部分および／またはレオウイルスの修飾成分をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を細胞に導入する工程を含み得る。
【００３８】
細胞への核酸の導入に関与する工程は、当業者に周知であり、例えば、トランスフェクションプロトコール、または転写カセット、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター（例えば真核生物遺伝子発現ベクター）の使用を含み得る。望ましくは、ベクターはワクシニアウイルスではなく、Ｔ７  ＲＮＤポリメラーゼ駆動ベクターは、有利には、本方法ではヘルパーウイルスの使用に依存しない。
【００３９】
典型的には、トランスフェクションプロトコールは、細胞膜を核酸などの化合物に対して透過性があるようにする条件を利用する。一例として、エレクトロポレーション、熱ショックおよび／またはリン酸カルシウムなどの化合物を使用して、核酸を細胞にトランスフェクションすることが可能であり得る。
【００４０】
さらに、またはあるいは、核酸は遺伝子銃によって細胞に導入することができる。かかる事例において、導入される核酸は、細胞に直接送達することができる粒子を結合させるかまたは他の場合にはコンジュゲートさせ得る。
【００４１】
好ましくは、細胞に導入される核酸は、例えばウイルスベクターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写カセット内に含まれる。このような方法で、核酸は安定的に発現することができる。１つの実施形態において、導入された核酸の産物が安定的に発現されるように、転写カセットを細胞のゲノムへと安定的に組込むことが可能である。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写カセットはレンチウイルスベクターである。
【００４２】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、例えばベクターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写カセット内に核酸（例えばｃＤＮＡ）が含まれる、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムおよび／または成分を修飾する方法を提供する。
【００４３】
有利には、ベクターはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである。
【００４４】
レオウイルス科に属するウイルスは、特定の細胞の表面上に存在する特定のタイプの受容体分子に結合し得る。例えば、接合部接着分子Ａ（ＪＡＭ−Ａ：他の場合には接合部接着分子１、またはＪａｍ−１として公知）は、オルトレオウイルス属のタイプ１およびタイプ３のための受容体として作用する（結合および感染を仲介する）ことが公知である。より具体的には、Ｔ３Ｄのカプシドタンパク質σ−１（Ｓ１）の部分（球状頭部の領域）は、Ｊａｍ−Ａと相互作用するが、Ｓ１のシャフトドメイン内の特定の他の配列は細胞表面上に存在するシアル酸分子と相互作用することができる。特定の細胞分子（以下、「細胞受容体」と呼ばれる）を結合すると同時に、ウイルスは内部移行され、従って細胞に「感染する」。
【００４５】
ウイルス構造成分と細胞受容体との間の特異的な相互作用は、レオウイルス科に属するウイルスによって示される特定の細胞指向性（すなわち結合および伝染力の特異性）に寄与する。
【００４６】
したがって、およびさらなる態様において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
（ａ）レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ｂ）細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｃ）修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程（ｂ）で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの修飾成分を含む方法が提供される。
【００４７】
好ましくは、レオウイルスの修飾成分はウイルスカプシドタンパク質などの修飾構造成分でありえる。有利には、修飾は、ウイルス成分を、工程(b)において使用されるレオウイルスが結合できない細胞受容体に結合可能なようにする。
【００４８】
さらなる実施形態において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法は、特定の細胞への結合が可能なタンパク質をコードするようにウイルスのゲノムを修飾する工程を含み得る。このような方法で、樹状細胞、マクロファージ、および／または他のタイプの免疫学的細胞または白血球、および／またはヒトまたは動物の身体の組織および器官に由来する細胞などの細胞に対してレオウイルス粒子を標的化することが可能であり得る。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は、Ｔ３Ｄの細胞指向性を修飾する方法であって、
（ａ）修飾Ｓ１カプシドタンパク質をコードする核酸を提供する工程、
（ｂ）核酸を細胞に導入する工程、
（ｃ）細胞にＴ３Ｄウイルスを感染させる工程、及び
（ｄ）修飾された細胞指向性の新規のＴ３Ｄウイルスの産生に適切な条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記新規のＴ３Ｄが、工程（ｃ）で使用されるＴ３Ｄウイルスと比較して、前記修飾されたＳ１カプシドタンパク質を含む方法を提供する。
【００５０】
典型的には、工程（ｃ）において使用されるＴ３Ｄウイルスは、上述された方法が行なわれるＴ３Ｄの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【００５１】
好ましくは、修飾Ｓ１タンパク質は、Ｓ１タンパク質を、工程（ｃ）において使用されるＴ３ＤレオウイルスのＳ１タンパク質が結合できない細胞受容体に結合が可能なようにする修飾一次構造を含む。１つの実施形態において、Ｓ１タンパク質に対する修飾は、工程（ｃ）で使用されるレオウイルスのＳ１タンパク質と比較して、Ｓ１アミノ酸一次配列に対する、またはそれからの１種以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または反転を含み得る。有利には、その修飾は、Ｓ１タンパク質のカルボキシ末端に対する修飾を含み得る。より好ましくは、修飾はＳ１一次配列に対するアミノ酸の付加を含み、１つの実施形態において、修飾は、Ｓ１カプシドタンパク質のカルボキシ末端に対する１種以上のヒスチジン残基の付加を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、上述された細胞指向性を修飾する方法が行なわれるレオウイルスは、特定の疾患および／または条件の研究および／または治療において使用し得る。疾患および／または条件の中で研究および／または治療が可能であるものは、癌などの細胞増殖および／または分化障害である。レオウイルスが癌細胞においてアポトーシスを誘導することが公知であるので、特定の細胞型についての指向性を示すように修飾されるレオウイルスを使用して、癌を治療し得る。
【００５３】
有利には、またさらなる実施形態において、レオウイルスは、細胞死もしくはアポトーシスを誘導し得るかまたは１種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る一化合物又は複数の化合物をコードする、１種以上の核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。例えば、化合物は、タンパク質産生および／または細胞（分裂）サイクルに関与するプロセスに影響し得る。例えば、レオウイルスゲノムは、化合物、例えば、正常な細胞過程を干渉または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ｓｉＲＮＡ配列および／またはｉＲＮＡ配列などをコードする核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。さらなる実施形態において、修飾ゲノムは、細胞に対する細胞毒性効果、アポトーシス効果および／または阻害効果を有する化合物をコードする核酸配列を含み得る。このような方法で、本発明に従う修飾レオウイルス粒子を使用して、特定の疾患または状態を治療し得る。
【００５４】
さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムは、細胞内での検出を許容する１種以上の化合物をコードする核酸配列を含むように修飾し得る。例えば、修飾ゲノムは、ＧＦＰまたは同種のものなどの蛍光化合物をコードする核酸を含み得る。
【００５５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、レオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）のσ−１（Ｓ１）カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
（ａ）修飾Ｔ３ＤのＳ１タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
（ｂ）細胞にＴ３Ｄレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｃ）修飾Ｓ１タンパク質を有する修飾Ｔ３Ｄウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾Ｓ１カプシドタンパク質を有する前記修飾Ｔ３Ｄウイルスが、工程（ｂ）で使用されるＴ３Ｄレオウイルスと比較して、修飾されたＳ１カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む方法を提供する。
【００５６】
典型的には、工程（ｂ）において使用されるＴ３Ｄレオウイルスは、上述された方法が行なわれるＴ３Ｄの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【００５７】
第４の態様において、本明細書において記述された方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルスが提供される。
【００５８】
第５の態様において、修飾レオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）であって、そのカルボキシ末端において少なくとも１つのヒスチジン残基を含む修飾Ｓ１カプシドタンパク質を含む前記ウイルスが提供される。
【００５９】
第６の態様において、修飾Ｓ１カプシドタンパク質を含むレオウイルスタイプ３、ディアリング株（Ｔ３Ｄ）を作製する方法であって、
（ａ）修飾Ｔ３ＤのＳ１カプシドタンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞に導入する工程、
（ｂ）細胞にＴ３Ｄレオウイルスを感染させる工程、及び
（ｃ）修飾Ｔ３Ｄウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾Ｔ３Ｄウイルスが、野生型ウイルスと比較して、修飾されたＳ１カプシドタンパク質を含む方法が提供される。
【００６０】
典型的には、工程（ｂ）において使用されるＴ３Ｄレオウイルスは、上述された方法が行なわれるＴ３Ｄの野生型または突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【００６１】
第７の態様において、本発明は、レオウイルスを増殖する方法を提供する。これらの方法は、本明細書において記述された方法のいずれかに従うレオウイルスの１種以上の成分の修飾、および続いて修飾レオウイルスの修飾成分との結合または相互作用が可能な部分(moiety)（タンパク性化合物など、例えば、抗体または同種のもの）を発現する細胞（例えば修飾細胞）と修飾レオウイルスを接触させることを必要とし得る。有利には、レオウイルスは、細胞によって発現されるかまたは細胞上に存在する化合物または部分との相互作用または結合が可能な修飾カプシド成分を含むように修飾され得る。このような方法で、細胞の部分とレオウイルスの修飾成分との相互作用（またはその間の結合）によって、細胞は修飾レオウイルスにより感染され得る。当業者は、新規のウイルスの産生／生成を許容する条件下での修飾細胞の維持によって、レオウイルスを増殖させることが可能なことを認識するだろう。
【００６２】
それゆえ、本発明は、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
（ａ）本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、、修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
（ｂ）修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法を提供する。
【００６３】
上記を考慮して、および１つの実施形態において、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
（ａ）そのカルボキシ末端において少なくとも１つのヒスチジン残基を含むように、本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従うＳ１カプシドタンパク質を修飾する工程、
（ｂ）修飾レオウイルスを、少なくとも１つのヒスチジン残基の結合が可能な部分を発現するように修飾された細胞と接触させる工程、及び
（ｃ）修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法が提供される。
【００６４】
好ましくは、修飾レオウイルスは修飾レオウイルスＴ３Ｄであり、「細胞」は神経膠芽腫細胞株に由来する。１つの実施形態において、細胞はＵ１１８ＭＧ細胞である。
【００６５】
有利には、少なくとも１つのヒスチジン残基を結合することができる部分は、例えば抗体などのペプチドである。用語「結合部分」は、任意のかかるペプチドまたは抗体のヒスチジン結合断片／部分をもまた包含するようにとることができる。例えば、および抗体の事例において、断片は１種以上の重鎖および／または軽鎖および／またはＦ（ａｂ）および／またはＦ（ａｂ）2断片を含み得る。例えば、結合部分は一本鎖抗体であり得る。
【００６６】
当業者は、生来のレオウイルス受容体（例えばＪＡＭ−Ａ受容体）の欠落にもかかわらず、ＨＩＳ修飾Ｓ１カプシドタンパク質を保有する修飾レオウイルスは、修飾Ｓ１カプシドタンパク質の少なくとも１つのヒスチジン残基と相互作用する一本鎖抗体を発現するように修飾された細胞（Ｕ１１８ＭＧ細胞などの）において感染および増殖することができることを認識するだろう。
【００６７】
１つの特定の実施形態において、第７の態様に従う方法は、カプシドタンパク質の修飾に加えて、１種以上の他のカプシドタンパク質に対する修飾をさらに含むレオウイルスの増殖を許容し得る。例えば、増殖されるレオウイルスは、同じまたは代替のカプシドタンパク質に対する１種以上の付加の修飾とともに、Ｓ１カプシドタンパク質のカルボキシ末端に少なくとも１つのヒスチジン残基を付加する修飾も含み得る。かかる付加の修飾は、例えば、生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するカプシド（例えばＳ１）タンパク質を構成する１種以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を含み得る。「生来の」レオウイルス受容体は、細胞に感染するためにレオウイルスによって通常は結合される受容体と見なされることが理解されるべきである。かかる受容体は正常な健全細胞上に存在し得る。レオウイルスＴ３Ｄの事例において、生来の受容体はＪＡＭ−Ａと見なし得る。生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するアミノ酸配列の修飾によって、修飾レオウイルスと生来のレオウイルス受容体との間の結合、相互作用および／または会合を妨害または阻害することが可能であり得る。
【００６８】
したがって、さらなる実施形態において、第７の態様に従う方法は、そのカルボキシ末端に少なくとも１つのヒスチジン残基を付加する修飾、および生来のレオウイルス受容体と相互作用するアミノ酸を改変するカプシドタンパク質に対するさらなる修飾を含む修飾レオウイルスを増殖する方法に関する。有利には、さらなる修飾は、レオウイルスＴ３ＤのＳ１タンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３６９〜Ｇｌｕ３８４に対する修飾を含むことができる。当業者は、これらの特定の残基がＪＡＭ−Ａと相互作用すると示唆されることを認識するだろう（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（２００５）Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａ  Ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ−Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｒｅｏｖｉｒｕｓ．ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，７９：７９６７−７９７８）。
【００６９】
上述の方法を使用して、Ｓ１タンパク質のカルボキシ末端に対するヒスチジン修飾の保有に加えて、ウイルスが生来の受容体と相互作用、結合または他の場合には会合することを妨害する修飾をカプシドタンパク質へと導入する修飾もまた含むウイルスを増殖し得る。かかるウイルスは、正常細胞とは対照的に腫瘍細胞を特異的に標的化できるので癌などの疾患の治療において有用であり得る。
【００７０】
第８の態様において、修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、少なくとも１つの修飾カプシド成分と少なくとも１つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分との間の結合を許容する条件下で、少なくとも１つの修飾カプシド成分を有する修飾レオウイルスを、少なくとも１つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分と接触させる工程を含む方法が提供される。例えば、本方法は、少なくとも１つのヒスチジン残基とヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で、ヒスチジン結合部分とＳ１タンパク質のカルボキシ末端で１つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを接触させる工程を含み得る。
【００７１】
当業者は、ヒスチジン結合部分が上述された部分のうちの任意の１つであり得ることを理解するだろう。さらにまたはあるいは、ヒスチジン結合部分は、ニッケルイオンなどの金属イオンを含み得る。好ましくは、金属イオンは、例えば、セファロース、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、アガロースまたは同種のものなどの支持基質のいくつかの形態に結合または他の場合には固定し得る。
【００７２】
ヒスチジン結合部分は、カラムの形態で提供され得る。一例として、カラムは、ニッケルイオンにカップリングまたはコンジュゲートしたセファロースを含み得る。
【００７３】
本方法は、ヒスチジン結合部分に結合されない任意の修飾レオウイルスを除去する洗浄工程を含み得る。
【００７４】
このような方法で、修飾レオウイルスは、水性溶液、細胞溶解物または同種のものから単離および／または濃縮し得る。
【００７５】
第９の態様において、本発明は、レオウイルス科のメンバーによって引き起されるかまたはそれらが寄与する疾患に対するワクチンの調製における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用を提供する。
【００７６】
第１０の態様において、例えば癌などの細胞増殖および分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用が提供される。
本発明はここで以下の図に対する参照によって記述されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】異なる細胞株におけるレオウイルス収率。
【図２】Ｓ１  ｃＤＮＡ配列およびそれによってコードされたσ１タンパク質のアミノ酸配列。
【図３】Ｓ１ＨＩＳ  ｃＤＮＡ配列およびそれによってコードされたσ１−ＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列。
【図４】ＨＡＪａｍ−Ａ、ｓｃＦｖＨＩＳおよびＳ１ＨＩＳをコードするレンチウイルスコンストラクトの図式的な表示。
【図５】Ｕ１１８ＭＧ細胞におけるＪａｍ−Ａ  ｍＲＮＡの不在を実証する逆転写酵素ＰＣＲ解析。下部は、Ｊａｍ−Ａ  ｍＲＮＡに対するプライムの位置を示す。
【図６】ＷＳＴ細胞生存率分析により決定されるようなレオウイルスのＴ３Ｄに感染した９１１細胞およびＵ１１８ＭＧ細胞の生存。
【図７】ＨＡ抗血清によるウエスタン解析によって検出されるＵ１１８ＭＧ細胞におけるＨＡＪａｍの異種発現。
【図８】レオウイルスＴ３Ｄ感染２日後のＵ１１８ＭＧ−ＨＡＪａｍ細胞およびＵ１１８ＭＧ細胞における細胞変性効果。
【図９】レオウイルスＴ３Ｄ感染細胞の［35Ｓ］−メチオニン標識化は、示されるようなレオウイルスタンパク質のλクラス、σクラスおよびμクラスを検出する。
【図１０】ＬＶ−Ｓ１ＨＩＳ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏにより形質導入された９１１細胞におけるσ１−ＨＩＳタンパク質。抗ＨＩＳの抗血清によるウエスタン解析によって検出された。
【図１１】９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞または対照としての９１１細胞で２回（Ｐ２）または３回（Ｐ３）継代したレオウイルスＴ３Ｄからの抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析をペンタ−ＨＩＳ血清により実行して、ＨＩＳタグを含むσ１タンパク質の存在を検出した。
【図１２】ＬＶ−ｓｃＦｖＨＩＳ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ細胞に感染したＵ１１８ＭＧ細胞の抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析を抗ＨＡ血清により実行して、形質導入細胞におけるＨＡタグｓｃＦｖＨＩＳの存在を検出した。
【図１３】ＷＳＴ細胞生存分析により検出された、野生型レオウイルスＴ３Ｄおよびσ１−ＨＩＳをロードしたレオウイルスによる感染後の細胞生存。
【図１４】Ｓ１−ＨＩＳゲノムセグメントを獲得したレオウイルスＴ３Ｄを濃縮する選択システムの図式的なアウトライン。
【図１５】ＨＩＳタグσ１タンパク質を検出するペンタＨＩＳ血清を使用する、それぞれ９１１−Ｓ１Ｈｉｓ細胞およびＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞についての連続継代（Ｐ）および選択（Ｓ）の間のレオウイルスＴ３Ｄのウエスタン解析。Ｍ＝分子量マーカー、ｗｔは９１１細胞から単離した野生型レオウイルスＴ３Ｄのサンプル。
【図１６】野生型レオウイルスＴ３ＤおよびＵ１１８ＭＧ−ＳｃＦｖＨＩＳ細胞で選択されたＳ１−ＨＩＳレオウイルスの修飾Ｓ１ゲノムセグメントを検出する逆転写酵素ＰＣＲ。
【図１７】Ｕ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞でＨＩＳタグの存在について選択されたレオウイルスからのＳ１−ＨＩＳ分節によってコードされたσ１＿ＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列。４つの単離物のＲＴ５、ＲＴ６、ＲＴ８およびＲＴ１０からの配列は、９１１細胞において発現されたσ１−ＨＩＳ（上部列）と比較される。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
この開示は、σ−１タンパク質またはレオウイルスＴ３Ｄにおけるアミノ酸の異種ストレッチの操作のための本発明の使用について記述する。これらのアミノ酸は、修飾σ−１タンパク質を保有するウイルスが腫瘍細胞の外側の新しいタンパク質受容体を結合し利用することを可能にする。親野生型レオウイルスＴ３Ｄではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−１タンパク質を保有するレオウイルスＴ３Ｄは、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞に感染できるという観察から明白なように、相互作用は機能的である。親野生型レオウイルスＴ３Ｄではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−１タンパク質を保有するレオウイルスＴ３Ｄを、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞株で、増殖させることができる。
【００７９】
本発明の方法は、従来の真核生物遺伝子発現ベクターを使用する修飾レオウイルスＴ３Ｄゲノムセグメントの発現に依存する。この開示において、出願人は、６つのヒスチジンのトラクトからなるカルボキシ末端の伸長を保有するσ１タンパク質をコードするようにσ１ゲノムセグメントを修飾した。ｍＲＮＡがプラス鎖σ−１ＲＮＡの真のＣＡＰ部位で開始するように、発現カセットを構築した。野生型Ｓ１ゲノムセグメントとは対照的に、修飾バージョンはプラス鎖ＲＮＡの正常な３'末端で短縮せず、伸長し、ポリＡトラクトを含む。任意の従来のＲＮＡポリメラーゼＨ依存性転写カセットはこれを達成することができる。本形態において、スタンダードレンチウイルスベクターを使用した。スタンダードレンチウイルスベクター法の補助により（Ｃａｒｌｏｔｔｉら、２００４）、発現カセットをいわゆる９１１細胞へと導入した。結果として生じる細胞において、野生型レオウイルスＴ３Ｄは３回の継代で増殖させた。結果として生じるウイルスストックを使用して、ＨＩＳタグを結合する一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体を表面上に発現するＵ１１８ＭＧ細胞を感染させる。Ｕ１１８ＭＧ細胞は正常なレオウイルスＴ３Ｄ受容体Ｊａｍ−Ａを欠く。Ｕ１１８ＭＧ細胞もそのｓｃＦｖＨＩＳ受容体発現誘導体も野生型レオウイルスによって感染できない。しかしながら、修飾レオウイルスＴ３Ｄ（ＨＩＳタグＳ１タンパク質を含む）は、サロゲート受容体としてｓｃＦｖＨＩＳ受容体を使用することができ、これらの細胞において増殖することができる。ウエスタンブロッティング、およびＳ１分節のヌクレオチド配列分析によって子孫ウイルスにおいてＨＩＳタグの存在を確認した。総合すれば、本データは、（ｉ）ポリアデニル化ｍＲＮＡによるレオウイルス科のリバースジェネティクスが実行可能であること、（ｉｉ）レオウイルス科の遺伝子再標的化が実行可能であること、および（ｉｉｉ）Ｓ１タンパク質のＣ末端は、宿主域修飾変異の挿入のための有用な場所であることを実証する。これはより効果的な癌溶解レオウイルスの生成に直接的に役立つようになり、病原性レオウイルス科のための新しいワクチンの開発を促進するだろう。
プライマー
表１：この研究において使用されるプライマー
【表１】
2011500049.tif 000002
制限部位（ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）およびＨＩＳタグの配列に下線を引く。
【実施例】
【００８０】
実施例１：Ｒｅｏウイルス受容体およびレオウイルスσ１の異種発現のためのベクターの構築
第１の実験において、レオウイルスＴ３ＤはマウスＬ細胞で増殖される。感染５日後、子孫ウイルスを培地の凍結融解によって感染細胞から放出し、その中で細胞を再懸濁した。この溶解物のアリコートを使用して、９１１細胞（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９６）、９１１細胞のＳＶ４０ラージＴ発現クローン（ＰＥＲ．Ｃ６細胞）（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８）およびもとは２９３／ｔｓＡ１６０９ｎｅｏと呼ばれた２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅら、１９８７）を感染させた。初回感染（３７℃、５％ＣＯ2で２時間）の後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む通常のダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）により培地を置換し、インキュベーションを継続した。細胞変性効果は、すべてのレオウイルスＴ３Ｄに感染した細胞株の感染４８時間後において明らかだった。様々なタイムポイントで、培養培地を採取し、細胞は１０9／ｍＬの密度で２％ＦＣＳ含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ウイルスは３サイクルの凍結融解によって細胞から放出された。溶解物はテーブルトップ遠心分離機中で１２００×ｇ１０分間の遠心分離によって清澄化した。ウイルスの濃度は、９１１細胞でアデノウイルスベクターについて今までに記述されたように、スタンダードのプラーク分析を実行することによって決定された（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９６）。図１において表わされたデータは、検査したすべての細胞株が妥当な量のレオウイルスＴ３Ｄを産生したことを示す。最も高い収率が９１１細胞の感染４８時間後で得られた。便宜上、細胞株９１１はスタンダードの細胞株としてウイルス産生およびプラーク分析による量子化のために使用した。
【００８１】
σ１ゲノムセグメントの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを得るために、ＤＭＥＭ／２％ＦＣＳ中で５プラーク形成単位／細胞（ｐｆｕ）のレオウイルスＴ３Ｄにより９１１細胞を感染させた。初回感染（３７℃、５％ＣＯ2で２時間）の後に、１０％ＦＣＳを含む通常のＤＭＥＭにより培地を置換した。ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、ストラタジーン社アブソルートリーＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲミニプレップキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を使用して、感染２４時間後の感染細胞から抽出した。プライマーペアのＲｅｏＳ１／Ｈ３およびＲｅｏＳ１／Ｎ１（表１）により、およびインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社からのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素を使用して、Ｓ１ゲノムセグメントを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にコピーし、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社から得たＴａｑポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。アガロースゲル電気泳動の後に、ジェットソーブ（ＪＥＴｓｏｒｂ）ゲル抽出キット（ゲノメッド（Ｇｅｎｏｍｅｄ）社）によりＳ１ＤＮＡ断片を精製し、制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩにより消化した。結果として生じる断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋中にクローン化した。結果として生じるライゲーション混合物を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換し、予想される構造を備えたプラスミドを含むクローン（ｐＣＤＮＡＲＴ３Ｓ１と呼ばれる）を単離し増やした。クローンｐＣＤＮＡＲＴ３Ｓ１からのプラスミドＤＮＡを、ライデンゲノムテクノロジーセンターでのプライマーペアのＲｅｏＳ１／Ｈ３およびＲｅｏＳ１／Ｎ１による配列解析のために使用した。Ｓ１分節のｃＤＮＡを表わす配列は、図２において表わされる。概念的な翻訳開始配列に下線を引く。σ−１タンパク質の予測されたアミノ酸配列が示される。
【００８２】
代わりの受容体に対して再標的化したレオウイルスに関して、新しいペプチドリガンドをウイルスカプシド中に含むことができる。１つの選択肢は、カプシド成分をコードする遺伝子断片のうちの１つの中にかかるリガンドをコードするコドンを組み入れることである。カプシド成分および位置の選択においては、ウイルス粒子においてリガンドが標的とされた受容体に接近することができ、修飾カプシド成分の基本的な構造または機能が妨害されないような方法でリガンドについてのコドンの挿入のための部位を選ぶことが必要である。したがって、我々は、σ−１タンパク質へとリガンドを挿入することを選んだ。レオウイルスＴ３Ｄのσ−１タンパク質の一部の結晶構造が公知であり（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００２ｂ）、ＩＫＫＥ（ＤＯＩ／ｐｄｂｌｋｋｅ／ｐｄｂ  １０．２２１０）としてブルックヘヴン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンクに寄託されている。
【００８３】
人工リガンドをσ−１タンパク質のカルボキシル末端に挿入した。これは、この領域が、レオウイルスＴ３Ｄのための天然の受容体として働くＪａｍ−Ａタンパク質と相互作用することが提唱される領域に近い頭部ドメイン中に位置するためである（Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００２ｂ）。さらに、末端アミノ酸が外側へ伸びるように、σ１のカルボキシル末端は位置する。したがって、カルボキシル末端での付加アミノ酸の融合が頭部ドメインの空間構成に影響を及ぼさないはずであることが推測された。付加アミノ酸が頭部ドメインの表面で露出され、これはそれらを評価可能にし、それらが標的とした受容体と相互作用することを可能にするだろうとさらに提唱された。
【００８４】
σ−１タンパク質をコードする領域のカルボキシル末端終了に６つのヒスチジン残基（「ＨＩＳタグ」）のためのヌクレオチド配列コーディングを付加するために、ポリメラーゼ連鎖反応クローニング戦略を使用した。異なる２つのコンストラクトが作製され、両方は、σ１のコドンと融合したＨＩＳタグのコドンを含む。第１のコンストラクトはＨＩＳタグを含むが、ＨＩＳタグσ１の下流のレオウイルス配列をすべて欠く。従って、このプラスミドはＨＩＳにタグσ１タンパク質コード領域の下流の非コードの配列を欠く。第２のコンストラクトは、ＨＩＳにタグσ−１の分節コーディングの完全なｃＤＮＡを含む。このコンストラクトは３'非翻訳領域全体を含む。
【００８５】
第１のプラスミドは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、プライマーペアＨｉｓＲｅｏＳ１Ｍ２およびＲｅｏＳ１Ｈ３により作製した（それらの配列については表１を参照）。平滑末端を含む産物を生成するために、Ｐｆｕポリメラーゼ（プロメガ社）を使用した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶにより消化したｐＣＤＮＡ３．１＋のプラスミドＤＮＡへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはｐＲＴ３Ｓ１ＨＩＳｓｔｏｐと命名され、さらなる研究のために使用した。ｐＣＤＮＡ３．１＋中に挿入した断片の配列はＤＮＡ配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。
【００８６】
プラスミドｐＲＴ３Ｓ１ＨＩＳＣｏｍｐｌｅｔｅを、鋳型としてｐＲＴ３Ｓ１ＨＩＳｓｔｏｐ、およびＳｉｇｍａＥｎｄＲｅｖおよびＲｅｏＳ１Ｈ３のプライマーの組合せを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって生成した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶにより消化したｐＣＤＮＡ３．１＋のプラスミドＤＮＡへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはｐＲＴ３Ｓ１ＨＩＳＣｏｍｐｌｅｔｅと命名され、さらなる研究のために使用した。ｐＣＤＮＡ３．１＋中に挿入した断片の配列はＤＮＡ配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。修飾レオウイルスＳ１ゲノムセグメントのｃＤＮＡ配列は図３中に表わされ、この配列の下にσ−１−ＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列を表わす。
【００８７】
安定的に異種の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを発現する細胞株の生成のために、レンチウイルスベクターを比較的容易に用いることができる。後続する実験のために、４つの異なるレンチウイルスベクターがスタンダードのクローン技術によって生成された。この研究において使用されるレンチウイルスコンストラクトはすべて、ｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯベクターにおいて作製したベクターに基づいた（Ｖｅｌｌｉｎｇａら、２００６）。図４は、作製されたコンストラクトの図式的な説明を示す。
【００８８】
プラスミドｐＬＶ−ＣＭＶ−Ｓ１ＨＩＳ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯおよびｐＬＶ−ＣＭＶ−Ｓ１ＨＩＳｓｔｏｐ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯを生成するために、コンストラクトｐＲＴ３ＳｌＨＩＳＣｏｍｐｌｅｔｅおよびｐＲＴ３Ｓ１ＨＩＳｓｔｏｐをＥｃｏ１０５ＩおよびＸｂａＩにより消化し、プラスミドｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯ中のＥｃｏ１０５Ｉ部位とＸｂａＩの部位の間にクローン化した。
【００８９】
プラスミドｐＬＶ−ＣＭＶ−ＨＡＪａｍ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯプラスミドを生成するために、ｐＣＤＮＡ−ＨＡＪａｍ（Ｎａｉｋら、２００１）（Ｕ．Ｐ  Ｎａｉｋ博士によって快く提供された）を制限酵素のＥｃｏｌ０５ＩおよびＸｂａＩを使用して消化し、プラスミドｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯ中のＥｃｏｌ０５Ｉ部位とＸｂａＩの部位の間に挿入した。
【００９０】
一本鎖ＨＩＳタグ受容体をコードするコンストラクトを生成するために、ｐＨＩＳｓＦｖ．ｒｅｃ（Ｄｏｕｇｌａｓら、１９９９）（Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ博士からの親切な寄贈）を、Ｅｃｏｌ０５ＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯ中のＥｃｏｌ０５ＩおよびＸｈｏＩの部位の間に挿入した。図４は、作製されたコンストラクトの全体図を示す。
【００９１】
以前に記述されたように（Ｃａｒｌｏｔｔｉら、２００４；Ｖｅｌｌｉｎｇａら、２００６）、リン酸カルシウム共沈殿方法を使用して、２９３Ｔ細胞で、レンチウイルスベクターストックの産生を正確に実行した。すべてのレンチウイルスベクターはトランスフェクションの４８時間後に採取した。
【００９２】
安定的に導入遺伝子を発現する細胞株を生成するために、異なるレンチウイルスベクターストックの適切な希釈物を、８μｇ／ｍｌポリブレン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）社、ツビンドレヒト、オランダ）の存在下において、細胞株に添加し（２５００細胞あたり１〜１０ｎｇの間のｐ２４の濃度で）、一晩インキュベートした。翌日、細胞に新鮮な培地を与えた。４８時間後、細胞をトリプシン処理によって剥がし、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロゲン社、ブレダ、オランダ）を含む培地中に再プレーティングして、Ｇ４１８耐性細胞集団を選択した。選択開始の３〜５日後に、培地は１ｍｌあたり２００μｇのＧ４１８含有培地により置換された。
【００９３】
実施例２：Ｕ１１８ＭＧ細胞は受容体Ｊａｍ−Ａの非存在に起因してレオウイルス感染症に耐性がある。
いくつかのグループは、Ｕ１１８ＭＧはレオウイルス感染症に完全に耐性があることを実証した（Ｗｉｌｃｏｘ  ら、２００１；Ｙａｎｇら、２００３）。Ｕ１１８ＭＧ細胞についてのこの観察を確認するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）によってＪａｍ−Ａ  ｍＲＮＡの存在を解析した。この解析中に陽性対照として９１１細胞を含む。
【００９４】
逆転写酵素反応のために使用したプライマーを表１中にリストする。Ｕ１１８ＭＧ細胞および９１１細胞を５ｃｍのディッシュに播種した。培養の密集と同時に、ストラタジーン社からのアブソルートリーＲＮＡミニプレップキットを使用して、細胞からＲＮＡを単離した。１細胞株あたり６００ｎｇのＲＮＡを、ＲｅｖＲＴｈＪａｍプライマー（マニュアルに従って１反応あたり２ｐｍｏｌｅ）を使用して、スーパースクリプトＩＩ（インビトロゲン社）によるファーストストランド合成で使用した。２μｌのｃＤＮＡをＲｅｖＲＴｈＪａｍおよびｈＪａｍ  ｎｅｗ  Ｆのプライマーの組合せによる増幅のために使用して、ｈＪａｍ−Ａの完全なコード領域（９２８ｂｐ）を増幅した。さらに、プライマーペア組合せｈＪａｍｎｅｓｔ  Ｒおよびｈｊａｍ  ｎｅｗ  Ｆをより短い産物（３５９ｂｐ）の増幅のために使用した。Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ社）を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった：３分９５℃、（３０秒９５℃−４０秒５８℃−１分７２℃）×３０−１０分７２℃−１０分４０℃−終了。結果を図５中に図示する。９１１細胞においてＪａｍ−Ａ  ＲＮＡは容易に検出されたが、Ｕ１１８ＭＧ由来サンプルにおいてシグナルは明らかではなく、ＭＧ１１８細胞のＪａｍ−Ａ  ｍＲＮＡが検出可能なレベルに足りないことを示す。
【００９５】
Ｕ１１８ＭＧ細胞がレオウイルスＴ３Ｄ感染に耐性があることを確認するために、Ｕ１１８ＭＧ細胞の培養を様々な感染多重度でレオウイルスＴ３Ｄウイルスに暴露した。この実験において、対照として９１１細胞の培養を同じ多重度で暴露した。９１１細胞の培養において細胞変性効果は容易に観察されたが、ＭＧ１１８培養においてウイルス感染に際してはインキュベーション時間を延長しても変化は明らかではなかった。これらの培養における細胞の生存能力をＷＳＴ細胞生存率分析により分析した（図６）。これらのデータは、再び、レオウイルスＴ３Ｄは容易に９１１細胞を殺傷するが、Ｕ１１８ＭＧ細胞はレオウイルスＴ３Ｄ感染に完全に耐性があることに確証を与えた。これがＪａｍ−Ａ受容体の非存在のためであることを実証するために、レオウイルスＴ３Ｄのための一次受容体として働くＨＡタグＪａｍ−Ａタンパク質を合成をさせるようにレンチウイルスベクターｐＬＶ−ＣＭＶ−ＨＡＪａｍ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯに、Ｕ１１８ＭＧ細胞を暴露した。Ｇ４１８耐性ＬＶ−ＣＭＶ−ＨＡＪａｍ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯ形質導入細胞集団のＨＡに特異的抗血清を使用するタンパク質溶解物のウエスタン解析は、これらの細胞中のＨＡにタグＪａｍ−Ａの着実な発現を実証した（図７）。これは、ＨＡ−Ｊａｍ−Ａシグナリングが形質導入および選択された細胞集団中の細胞の大部分で検出可能であることを明らかにする免疫蛍光顕微鏡によって、さらなる確証が与えられた。レオウイルスＴ３Ｄに対するこれらの細胞の暴露は、親Ｕ１１８ＭＧ細胞ではなく、ＨＡ−Ｊａｍ発現Ｕ１１８ＭＧ細胞において細胞変性効果の徴候の急速な発生を導いた（図８）。これは、ウイルスタンパク質の代謝的標識によってさらなる確証が与えられた。感染細胞またはモック感染細胞を、様々な感染後のタイムポイントでレディビュー（Ｒｅｄｉｖｕｅ）［35Ｓ］メチオニンプロミックス（２００μＣｉ／ｍｌ；アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社、ローセンダール、オランダ）により４時間標識した。細胞をＰＢＳにより一回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニタブレット、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、アルメレ、オランダ）のカクテルを含むジョルダーノ溶解緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解した。すべての標識分析は１ウェルあたり５μｌのプロミックスにより２４−ウェルプレート中で行われ、溶解緩衝液の体積は１ウェルあたり１００μｌであった。サンプル緩衝液の添加後に、これの５０μｌを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに添加した。ゲルを乾燥して放射線用フィルムに暴露し、スタンダードな手順に従って処理した（図９）。この結果は、未修飾のＵ１１８ＭＧ細胞ではなく、９１１細胞およびＨＡ−Ｊａｍ−Ａ発現Ｕ１１８ＭＧ細胞におけるウイルスタンパク質の存在を実証した。これらのデータから、Ｕ１１８ＭＧ細胞はレオウイルスＴ３Ｄ感染に耐性があり、これはもっぱらレオウイルスＴ３Ｄ感染のための一次受容体として働くことができるＪａｍ−Ａタンパク質の不在のためであると結論する。
【００９６】
実施例３：σ１産生９１１細胞株の生成。
次の工程として、レオウイルスＴ３Ｄタンパク質を産生する細胞株を生成した。この目的のために、９１１細胞は、２５００細胞あたり１〜１０ｎｇのｐ２４の濃度でＬＶ−ＣＭＶ−Ｓ１ＨＩＳ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯベクターウイルスに暴露された。Ｇ４１８耐性細胞集団（ここで９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞と命名した）についての選択の後に、タンパク質溶解物をこれらの細胞から生成し、１：１５００に希釈したα−ペンタ−Ｈｉｓ血清（キアゲン・ベネルクス社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  ｂｖ）オランダ）を使用するウエスタン解析によって解析して、ＨＩＳタグを含むσ１タンパク質を検出した。結果を図１０中に図示する。これらのデータは、親９１１細胞ではなく、Ｇ４１８選択を生き延びたＬＶ−ＣＭＶ−Ｓ１ＨＩＳ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯ形質導入細胞における４９ｋＤａバンドの存在を実証する。これらのデータから、９１１細胞株が有意な量のＨＩＳタグＳ１タンパク質を含むと結論する。これは、Ｓ１過剰発現が細胞に対して毒性がないことを示唆する。
【００９７】
実施例４：ウイルスカプシド中の修飾σ１タンパク質の機能的取り込み
次に、およそ１０の感染多重度でレオウイルスＴ３Ｄにより９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞を感染させた。細胞変性効果の出現１日後に、ウイルスを採取し、凍結融解によって細胞に結合したウイルスを放出させ、収量の１００分の１を使用して９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞の第２の培養を感染させた。ウイルスは９１１−Ｓ１ＨＩＳで連続して３回継代した。単離したウイルスのアリコートは、α−ペンタ−Ｈｉｓ血清を使用するウエスタン解析によって解析した。結果を図１１中に図示する。抗ＨＩＳ血清は予想されるサイズに移動したタンパク質を検出し、レオウイルスがカプシド中にＨＩＳタグσ１タンパク質を組み入れできたことを示唆した。
【００９８】
この位置に挿入されたアミノ酸が機能的にＨＩＳタグと相互作用できるかどうかを検査するために、Ｕ１１８ＭＧ細胞は細胞表面上でＨＩＳタグと相互作用することができる一本鎖抗体を発現するように修飾された。この目的のために、Ｕ１１８ＭＧ細胞をレンチウイルスベクターＬＶ−ＣＭＶ−ｓｃＦｖＨＩＳ−ＩＲＥＳ−ＮＥＯに暴露した。プローブとしてＨＡ抗血清を使用する細胞のタンパク質溶解物のウエスタン解析から明白であるように、Ｇ４１８耐性細胞集団は一本鎖ＨＩＳ受容体を発現した（図１２）。親Ｕ１１８ＭＧ細胞においてシグナルは存在しない。また、免疫蛍光顕微鏡は、培養におけるすべての細胞の均質の染色を示し、すべての細胞において類似した量のタンパク質が実証された。これらのデータから、ここでＵ１１８ＭＧ細胞が表面上に一本鎖ＨＩＳ受容体を発現すると結論する。
【００９９】
ＨＩＳタグσ−１タンパク質を保有するレオウイルスＴ３Ｄのためのサロゲート受容体として一本鎖ＨＩＳ受容体を使用できるかどうか検査するために、細胞株を、増加した量のウイルスストック、および対照として親野生型レオウイルスＴ３Ｄの同等量に暴露した。ＨＡタグＪＡＭ−Ａを発現するＵ１１８ＭＧ細胞は、９１１由来Ｔ３Ｄレオウイルスおよび９１１−Ｓ１ＨＩＳ由来レオウイルスの両方に感受性があるが、Ｕ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞は、９１１由来Ｔ３Ｄレオウイルスではなく９１１−Ｓ１ＨＩＳ由来レオウイルスにのみ感受性がある。細胞変性効果の徴候は、９１１−Ｓ１ＨＩＳ株で増殖させたＴ３Ｄウイルスによる感染３日後のＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖ−ＨＩＳ細胞の顕微鏡検査に際して明らかであった。これらのデータはＷＳＴ細胞生存率分析により定量された（図１３）。総合すれば、これらのデータは、Ｕ１１８ＭＧ細胞においてｓｃＦｖ−ＨＩＳを人工受容体として使用できるかもしれないことを実証する。これは、Ｕ１１８ＭＧ細胞の感染が通常のレオウイルスＴ３Ｄ受容体Ｊａｍ−Ａに非依存的に進行することを可能にする。さらに、これは、ウイルスカプシド中にＨＩＳタグσ−Ｉタンパク質の存在を確認し、ＨＩＳタグがウイルスカプシドで暴露され、Ｕ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖ−ＨＩＳ細胞の感染を可能にすることを実証する。
【０１００】
実施例５：レオウイルスにおける修飾Ｓ１ゲノムセグメントの取り込み
レオウイルスＴ３Ｄが、９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞での増殖の間に組み入れられたＨＩＳタグＳ１ゲノムセグメントを獲得したかどうかを検査するために、９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞から採取したウイルスを使用してＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞を感染させた。細胞変性効果の明らかな徴候に際して、細胞を穏やかにフラッシングすることによってディッシュの表面から細胞を剥がし、馴化培地中での細胞の粉砕によって懸濁した。ウイルスは凍結融解によって細胞から放出された。次に、レオウイルスバッチはテーブルトップ遠心分離機中で２０００ｒｐｍ１０分間の遠心分離によって清澄化された。このバッチを再び使用してＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞を感染させ、感染４日後に細胞を採取した。この手順を６回繰り返した。選択スキームを図１４中に略述する。連続的増殖に際して、細胞変性効果の徴候は、９１１細胞から単離したレオウイルスＴ３Ｄにより感染した細胞よりも、９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞から採取されたレオウイルスＴ３Ｄにより最初に感染したＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳにおいてより明らかであった。これは、Ｕ１１９ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞でウイルスを増殖できるかもしれないことを示唆した。９１１−Ｓ１ＨＩＳ細胞で増殖されたレオウイルスに感染させたＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞およびその連続継代のタンパク質溶解物のウエスタン分析は、溶解物におけるＨＩＳタグＳ１タンパク質の存在を実証した（図１５）。
【０１０１】
ＨＩＳタグＳ１ゲノムセグメントの存在を実証するために、継代７で連続的に継代したレオウイルスＴ３Ｄから単離したＲＮＡについて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）解析を実行した。ウイルスに連続的に感染させたＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞における細胞変性効果の徴候に際して、ストラタジーン社からのアブソルートリーＲＮＡミニプレップキットを使用して細胞からＲＮＡを単離した。１細胞株あたり６００ｎｇのＲＮＡを、ＨｉｓＲｅｖプライマー（マニュアルに従って１反応あたり２ｐｍｏｌｅ）を使用して、スーパースクリプトＩＩ（インビトロゲン社）によるファーストストランド合成で使用した。２μｌのｃＤＮＡをＨｉｓＲｅｖおよびＲｅｏＳ１Ｎ１のプライマーの組合せによる増幅のために使用して、Ｓ１ゲノムセグメントの完全なコード領域を増幅した。Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ社）を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった：３分９５℃、（３０秒９５℃−４０秒５８℃−８０秒７２℃）×３０−１０分７２℃−１０分４℃−終了。結果を図１６中に図示する。ＨＩＳタグＳ１産物はＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳにおいて容易に検出されたが、未修飾９１１細胞由来レオウイルスＴ３Ｄにより感染されたＵ１１８ＭＧ−ｓｃＦｖＨＩＳ細胞においてはシグナルは明らかではない。ＰＣＲ産物は、製造者の使用説明書に従ってプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロゲン社）中にクローン化した。挿入された断片を有するクローンを個別に増やし、これらのクローンから単離したプラスミドＤＮＡをそれぞれＭ１３リバースプライマーおよびＭ１２３フォワードプライマーによるＤＮＡ配列解析のために使用した。クローン化されたＰＣＲ産物の配列解析から、σ１のコーディングのＣ末端の予想される位置でＨＩＳタグについてのコドンの存在が確認された。４つの異なるＳ１ＨＩＳ  ｃＤＮＡクローンによってコードされたσ−１タンパク質のアミノ酸配列は、図１７中に表わされる。親配列（図３からの）は上部列において表わされ、σ１−Ｈｉｓ（クローン化された）と表記される。クローンのＲＴ５およびＲＴ６のアミノ酸配列は親クローンと同一であるが、ＲＴ８およびＲＴ１０はそれぞれ１つおよび２つのアミノ酸の違いを有する。それにもかかわらず、ＨＩＳタグは、すべての事例においてσ１のカルボキシル末端に予想通りに結合される。
【０１０２】
これらのデータから、９１１  Ｓ１ＨＩＳ細胞での増殖に際して、レオウイルスＴ３ＤがＨＩＳタグについてのコドンを獲得したと結論する。これは、親野生型親Ｓ１ゲノムセグメントと異種Ｓ１  ＲＮＡとの間の再集合プロセスの結果である可能性が最も高い。しかしながら、組換えなどの他の機構、または複製の間の鋳型スイッチングは、これまで得られたデータに基づいて除外することができない。
【０１０３】
連続的に増殖させたウイルスは未修飾Ｕ１１８ＭＧ細胞に感染することができず、形質導入は、サロゲート受容体として働く細胞上のｓｃＦｖ−ＨＩＳタンパク質に厳密に依存することが実証される。
【０１０４】
総合すれば、本データは、再標的化されたレオウイルスの生成は、レオウイルスＳ１ゲノムセグメントに組み込まれているポリアデニル化されたｍＲＮＡを含むレオウイルスを細胞で増殖させることによって比較的容易に行なえることを示す。細胞において発現されたｍＲＮＡは一本鎖であり、Ｓ１ゲノムセグメントのプラス鎖ＲＮＡ全体を含む。しかしながら、異種Ｓ１  ｍＲＮＡは、５'末端の真のＳ１ゲノムセグメントの位置またはその付近で開始するが、３'末端は有意に伸長され、ＩＲＥＳ配列、ＮＥＯ遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、およびヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−Ｉ）長末端反復の一部を含む。Ｓ１ゲノムセグメントのプラス鎖上の３'伸長の存在が、再標的化変異の獲得を妨害しないことは明らかである。
【０１０５】
参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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