(57)【要約】  本発明は、試料を、多くのゲノム位置のコピー数分析に基づき、ＢＲＣＡ１関連腫瘍由来又は散発性腫瘍由来として分類する方法に関する。本発明はさらに、腫瘍分類のための本発明の診断及び／又は予後予測の方法に使用される、核酸プローブのセット、アレイ、並びにこれらのセット及びアレイを含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料をＢＲＣＡ１関連腫瘍由来細胞又は散発性腫瘍由来細胞を含むとして分類する方法であって、前記試料中のゲノムＤＮＡの、１ｐ２１−３４、３ｐ２１、３ｑ２２−２７、５ｑ１３−１５、５ｑ２１−２３、６ｐ２２−２３、１０ｐ１４、１２ｑ２１−２３、１３ｑ３１−３３及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択される少なくとも３つのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出するステップを含み、非癌細胞における細胞当たりのコピー数と比較した、１ｐ２１−３４、３ｑ２２−２７、６ｐ２２−２３、１０ｐ１４及び１３ｑ３１−３３からなる群から選択されるゲノム位置におけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の増加、並びに／又は３ｐ２１、５ｑ１３−１５、５ｑ２１−２３、１２ｑ２１−２３及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択されるゲノム位置におけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の減少により、細胞試料がＢＲＣＡ１関連腫瘍由来として分類される方法。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡにおける細胞当たりのコピー数の検出が、定量的又は半定量的に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞試料中のゲノムＤＮＡの少なくとも６つのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出し、好ましくは、１０すべてのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ゲノム位置が、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７及び１３ｑ３１−３３を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞試料中のゲノムＤＮＡの、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７及び１３ｑ３１−３３から選択される少なくとも１つ又は２つのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出するステップをさらに含み、非癌細胞における細胞当たりのコピー数と比較した、これらのゲノムにおけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の減少により、細胞試料が散発性腫瘍由来として分類される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ゲノム位置の細胞当たりのコピー数を、ＲＰ１１−４０２Ｆ５−ＲＰ１１−２０Ｏ１３、ＲＰ１１−２２Ｅ１２−ＲＰ１１−６５Ｊ１４、ＲＰ１１−６３２Ｌ２−ＲＰ１１−２５５Ｐ５、ＲＰ１−９７Ｇ４−ＲＰ１１−４７８Ｈ３、ＲＰ４−５４２Ｇ１６−ＲＰ１−２５１Ｍ９、ＲＰ１１−３Ｂ７−ＲＰ１１−４４７Ａ２１、ＲＰ１１−５３３Ｌ７−ＲＰ１１−２０４Ｋ１６、ＲＰ３−３６５Ｅ２−ＲＰ１−１５３Ｇ１４、ＲＰ１１−１７Ｌ１４−ＣＴＢ−５４Ｇ２、ＲＰ１１−３４２Ｍ１−ＲＰ１１−１４Ｏ１９、ＲＰ１１−３４２Ｍ１、ＲＰ１１−１４８Ｋ１４、ＲＰ１１−２９１Ｎ１、ＲＰ１１−４２０Ｍ１２、ＲＰ１１−３５５Ｌ４、ＲＰ１１−２６４Ｆ２３、ＲＰ１１−２４３Ａ１８、ＲＰ１１−１９Ｃ２０、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−２０Ｆ２０、ＲＰ１１−４３８Ｐ８、ＲＰ１１−５４８Ｌ８、ＲＰ１１−５Ｐ４、ＲＰ１１−２０８Ｏ６、ＲＰ１１−３６６Ｌ２０、ＲＰ４−７００Ａ９、ＲＰ１１−５１０Ｄ４、ＲＰ１−９７Ｇ４、ＲＰ５−１０３３Ｋ１９、ＲＰ１１−１４８Ｌ２４、ＲＰ１１−２６Ｌ７、ＲＰ１１−２５０Ｄ８、ＲＰ１１−１９２Ｈ６、ＲＰ１１−３６２Ａ１、ＲＰ１１−４１３Ｅ１、ＣＴＤ−２２６７Ｈ１９、ＲＰ１１−８７Ｐ１３、ＲＰ１１−１４Ｏ１９、ＲＰ１１−３４Ｊ１５、ＲＰ１１−４３５Ｏ２２、ＲＰ４−７８７Ｈ６、ＲＰ１１−４０２Ｆ５、ＲＰ１１−２３９Ｆ２０、ＲＰ１１−９８Ｄ１８、ＲＰ１１−１１５Ｉ６、ＲＰ１１−２Ｋ１２、ＲＰ１−９７Ｐ２０、ＲＰ１１−９７Ｌ２、ＲＰ１１−４３５Ｅ３、ＲＰ５−１０２６Ｅ２、ＲＰ１１−２４１ｊ１２、ＲＰ１１−５１０Ｉ５、ＲＰ１１−４６９Ａ１５、ＲＰ１１−３５６Ｄ２３、ＲＰ１１−４０６Ｈ４、ＲＰ４−７９９Ｇ３、ＲＰ１１−３５６Ｄ２３、ＲＰ１１−４２６Ｈ２４、ＲＰ１１−１３２Ｈ１、ＲＰ１１−３Ｈ１５、ＲＰ１１−２１０Ｌ７、ＲＰ１１−２４７Ｈ１６、ＲＰ１１−１２Ｄ３、ＲＰ１１−４７８Ｈ３、ＲＰ１１−２９８Ｅ１８、ＣＴＤ−２０１１Ｌ２２、ＲＰ１１−１８Ｃ２４、ＲＰ１１−３２Ｃ２０、ＲＰ１１−１７Ｌ１４、ＲＰ１１−５２１Ｌ１５、ＲＰ１１−１７６Ｌ２０、ＲＰ１１−２４９Ｍ１２、ＲＰ１１−６３２Ｌ２、ＲＰ１１−３８Ｈ６、ＲＰ１１−１１Ｐ１１、ＲＰ１１−７４Ａ１２、ＲＰ１１−３７８Ａ１３、ＣＴＢ−５４Ｇ２、ＲＰ１１−２３５Ｏ２０、ＲＰ１１−８６Ｏ１７、ＣＴＢ−３Ｃ２０、ＲＰ１１−３８３Ｈ１７、ＲＰ１１−４５７Ｐ２３、ＲＰ１１−５１１Ｍ９、ＲＰ１１−４４２Ｉ９、ＲＰ１１−３Ｂ７、ＲＰ１１−１６３Ｉ２２、ＲＰ１１−２７９Ｄ１７、ＲＰ１１−８９ｆ１７、ＲＰ３−３６５Ｅ２、ＲＰ１１−１１８Ｆ１６、ＲＰ１１−４４７Ａ２１、ＲＰ１１−６８Ｊ１５、ＲＰ１１−５６４Ｎ１０、ＲＰ１１−４８４Ｉ１９、ＲＰ１１−４０８Ｃ８、ＲＰ１１−２５５Ｐ５、ＲＰ１１−１１５Ｂ２２、ＲＰ４−６２５Ｈ１８、ＲＰ１１−３１０Ｄ８、ＲＰ１１−３２４Ｈ４、ＲＰ３−４４４Ｃ７、ＲＰ１１−４６８Ｅ２、ＲＰ１１−２２Ｅ１２、ＲＰ１１−１７６Ｊ５、ＲＰ１１−３４Ｏ１８、ＲＰ１１−２６９Ａ１４、ＲＰ１１−２８９Ｇ１１、ＲＰ１１−３３２Ｏ９、ＲＰ１１−３４９Ｄ２４、ＲＰ１−１５３Ｇ１４、ＲＰ１１−４８４Ｆ１６、ＲＰ１１−３４９Ｄ２４、ＲＰ１１−４７２Ｍ１９、ＲＰ１１−６６Ｅ７、ＲＰ１１−８９Ｅ１６、ＲＰ１１−７６７Ｊ１４、ＲＰ１１−２０４Ｋ１６、ＲＰ１１−２３１Ｌ１１、ＲＰ３−４２９Ｇ５、ＲＰ１１−３６８Ｋ８、ＲＰ１１−２３５Ｉ１８、ＧＳ−５７−Ｈ２４、ＲＰ１１−４０６Ａ９、ＲＰ１１−１６０ａ１３、ＲＰ１１−５０５Ｄ１７、ＲＰ１１−１７９Ｏ１１、ＲＰ１１−１６０Ａ１３、ＲＰ１１−５１２Ｅ１６、ＲＰ１１−３６５Ｎ１９、ＲＰ１１−１６５Ｍ１１、ＲＰ１１−１２６Ｃ１９、ＲＰ１１−１３Ｏ２４、ＲＰ１１−２１Ｍ４、ＲＰ１１−２６９Ｎ１８、ＲＰ１１−３８０Ｄ１１、ＲＰ１１−２５１Ｃ９、ＲＰ４−７６４Ｏ１２、ＲＰ１１−１５１Ｎ１７、ＲＰ１１−３Ｆ１１、ＲＰ１１−５４０Ｅ４、ＲＰ１１−１５４Ｊ２２、ＲＰ１１−２４０Ｇ５、ＲＧ−４１−Ｌ１３、ＲＰ１１−２６６Ｏ８、ＲＰ１１−２２３Ｌ１８、ＲＰ１１−５０９Ｊ２１、ＲＰ１１−１５２Ｐ２３、ＲＰ１１−６Ｆ２、ＲＰ１１−５Ｐ１５、ＲＰ１１−３１Ｏ１１、ＲＰ１１−２０９ｈ２１、ＲＰ１１−２０Ｐ５、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−２０９Ｈ２１、ＲＰ１１−３３６Ｎ８、ＲＰ１１−４２４Ｋ７、ＲＰ１１−２０９Ｈ２１、ＲＰ１１−６６Ｄ１、ＲＰ１１−４８１Ｊ２、ＲＰ１１−２０３Ｌ１５、ＲＰ１１−４２３Ｏ１３、ＲＰ１１−１０５Ｃ２０、ＲＰ１１−３９５Ｆ２１、ＲＰ１１−３３３Ｉ７、ＲＰ１１−４１１Ｂ１０、ＲＰ１１−８１６Ｊ６、ＲＰ１１−２３Ｊ９、ＲＰ１１−４５Ａ１、ＲＰ１１−３６２Ｋ１４、ＲＰ１１−４００Ａ２４、ＲＰ１１−２６８Ｏ２１、ＲＰ１１−１６３Ｈ６、ＲＰ１１−７８Ｈ１８、ＲＰ４−７９６Ｉ１１、ＲＰ１１−４７７Ｐ１６、ＲＰ４−５４２Ｇ１６、ＲＰ１１−３０４Ｄ２、ＲＰ１１−９１Ｋ９、ＲＰ１１−５６６Ｋ１、ＲＰ１−２４５Ｐ１７、ＲＰ１１−６８２Ａ２１、ＲＰ１−２５１Ｍ９、ＲＰ１−２５５Ｐ７、ＲＰ１１−４２０Ｊ１１、ＲＰ１１−２Ｋ１７、ＲＰ１１−９８Ｏ１３、ＲＰ１１−５１０Ｋ１６、ＲＰ１１−３０７Ｂ２３、ＣＴＡ−３９７Ｃ４、ＲＰ１１−４１６Ｏ１８、ＲＰ１１−５０５Ｎ１０、ＲＰ１１−４４５Ｏ１６、ＲＰ１１−６５Ｊ１４、ＲＰ１１−３１３Ｂ１５、ＲＰ３−３９４Ｆ１２、ＲＰ１１−３２４Ｉ１０、ＲＰ１１−２１０Ｇ２２、ＲＰ３−４２８Ａ１３、ＲＰ１１−３９０Ｃ１９及びＲＰ１−３１６Ｄ７からなる群から選択されるＢＡＣクローン中に存在する配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含むプローブとのハイブリダイゼーションによって検出する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３種の核酸プローブのセットであって、各プローブが、請求項１に記載の群から選択されるさまざまなゲノム位置と特異的にハイブリダイズする、核酸プローブのセット。
【請求項８】
少なくとも６種のプローブを含み、各プローブが、請求項１に記載の群から選択されるさまざまなゲノム位置と特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の核酸プローブのセット。
【請求項９】
前記プローブが、請求項６に列挙したＢＡＣクローンの群から選択されるＢＡＣクローン中に存在する配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む、請求項７又は８に記載の核酸プローブのセット。
【請求項１０】
前記プローブが、ゲノムにおいて唯一の配列を含む、請求項９に記載の核酸プローブのセット。
【請求項１１】
前記プローブの少なくとも２種が、配列番号１から１０までのいずれか１つから選択される、請求項９又は請求項１０に記載の核酸プローブのセット。
【請求項１２】
請求項６に列挙したＢＡＣクローンの群から選択される、少なくとも３つのＢＡＣクローンのセット。
【請求項１３】
請求項７から１１までのいずれか一項に記載の核酸プローブの位置的にアドレス可能なセットを含むアレイ。
【請求項１４】
前記プローブが固体支持体上に固定された、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
請求項７から１１までのいずれか一項に記載の核酸プローブのセット又は請求項１３若しくは１４に記載のアレイを含み、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法を実施するための少なくとも１つの分析試薬又はバッファーをさらに含むキット。
【請求項１６】
請求項７から１１までのいずれか一項に記載の核酸プローブのセット又は請求項１３若しくは１４に記載のアレイを含み、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法を実施するための指示書をさらに含むキット。
【請求項１７】
対象において腫瘍の発生に対するＢＲＣＡ１の欠損の関与を示す、診断及び／又は予後予測の方法であって、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法、請求項７から１１までのいずれか一項に記載の核酸プローブのセット、請求項１３若しくは１４に記載のアレイ又は請求項１５若しくは１６に記載のキットの使用を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤及び腫瘍の分子生物学の分野に関する。特に本発明は、アレイＣＧＨなどの技法による、特定のゲノムのコピー数変化（ＣＮＡ）に基づく腫瘍分類を使用した、ＢＲＣＡ１様腫瘍の診断及び予後予測のための手段及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は先進国における最も一般的な癌であり、女性の死亡の主原因の１つであり、女性の９人のうち１人は乳癌にかかる（Ｗｅｉｒら、２００３年、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９５（１７）：１２７６〜９９；ＡＣＳ  ２００３〜２００４年）。乳癌症例のおよそ１０〜１５％が、乳癌に関する陽性の家族歴を示し（Ａｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒら、１９９６年、Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１３（２）：１９３〜２０５）、それらのおよそ２５〜５０％は乳癌素因遺伝子のＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変異によるものである（Ｎａｒｏｄ及びＦｏｕｌｋｅｓ、２００４年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．４（９）：６６５〜７６）。ＢＲＣＡ１／２が変異を起こしている女性は、最大８０％の乳癌の生涯リスクを有する（Ｆｏｒｄ  １９９８年、Ｅａｓｔｏｎ  １９９５年、Ａｎｔｏｎｉｏｕ  ２００３年、Ｋｉｎｇ  ２００３年）。患者におけるＢＲＣＡ１／２の変異の同定は、患者の治療（例えば、放射線療法、予防的両側乳房切除、（Ｔｅｒｃｙａｋ  ２００６年）又は卵管卵巣摘出）及び監視（腫瘍予防）に影響を与えるだけでなく、家族のメンバーの発症前の変異のスクリーニングもまた可能にする。
【０００３】
乳癌患者は、家族歴及び発症の年齢に基づいた、ＢＲＣＡ１／２における病因性変異に関するＤＮＡのスクリーニングに適している。診断は、現在変異スキャニング及び生殖細胞系ＤＮＡの遺伝子断片の配列決定を含む。これらの技術はすべて、それらの欠点を有し、変異の一部は未だ検出されないままである（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｕｔ  ２００６年）。ＢＲＣＡ１に関連付けられる家族の２０〜３０％において、変異が発見されていない（Ｎａｒｏｄ  １９９５年、Ｆｏｒｄ  １９９８年）。さらに、臨床的有意性が未知な変異体の検出が、カウンセリング及び臨床管理を複雑にする。したがって、乳癌に対するＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の関与を示すさらなるツールが、現在の臨床診断に役立つと思われる。
【０００４】
非常に多くの研究が、腫瘍をサブクラスに分類できる特定の遺伝的特性を示す。腫瘍の多様性のため、多くの症例において複数の特徴、すなわち特性が、これらのサブクラスを識別可能にするために必要とされる。腫瘍型を区別できる客観的方法は、カウンセリー及び臨床医の治療の決定に寄与することができるだろう（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ２００２年、Ｎａｔｕｒｅ．４１５（６８７１）：５３０〜６；Ｈａｎｎｅｍａｎｎ  ２００６年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８（５）：Ｒ６１）。遺伝性ＢＲＣＡ１癌に関して、本発明者ら及び他による先の刊行物は、これらの腫瘍は、認識可能な異なる遺伝的変化を生じ、非遺伝性、すなわち散発性腫瘍と識別されることを示す。発現プロファイル（Ｈｅｄｅｎｆａｌｋ  ２００１年）又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｗｅｓｓｅｌｓ  ２００２年、Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００５年、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ２００５年）を使用するさまざまな方法は、これらの腫瘍群に関する特定の遺伝的変化を示す。腫瘍のｍＲＮＡは多くの分子ポートレートをもたらすが、新鮮に凍結された組織は、特に家族のスクリーニングが罹患した血縁者を含む場合それほど頻繁には入手できない。一方、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）は、すべての病院における腫瘍組織の保存のための一般的な手法である。ＣＧＨ研究を実施するために、本発明者らは、パラフィン包埋腫瘍が適切な品質であることをすでに示した（Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００６年）。中期ＣＧＨと比較したマイクロアレイの解明の強化（Ｗｅｓｓｅｌｓ  ２００２年）により、ＣＧＨ技術を使用したＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２腫瘍の検出の感度及び特異性が改善できる。さらに、それは、遺伝子異常の染色体切断点の位置のより優れた推定も提供する。
【０００５】
ＤＮＡのスクリーニングに適格な家族及び個体は非常に多いため、現在の診断アッセイの、現在提供されている検査及び全家族メンバーのスクリーニングを超えて拡大することは実現不可能である。さらに、家族歴に基づく予測モデルを使用して計算された変異を担持するリスクは、特に小規模の家族に関係する場合、多くの場合より悪い予測材料である。腫瘍のみに基づく、家族においてＢＲＣＡ１の関与を示すであろう客観的予備スクリーニング試験は、より拡大した分析を必要とするそれらの患者のみを選択することに役立ち得る。比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用した腫瘍のゲノムプロファイルは、このような戦略であり得るが、この取り組みは、診断設定の早期において検証されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＢＲＣＡ１の関与に関する、腫瘍のゲノムプロファイリングの予後予測及び／又は診断のための方法及び手段を提供することである。
【０００７】
定義
「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基対合を介した２つの一本鎖核酸の結合を指す。本明細書において使用する場合、「と特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」及び「と選択的ハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に核酸分子が結合、二重化又はハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列と優先的にハイブリダイズし、混合集団（例えば、組織生検由来の細胞溶解物又はＤＮＡ調製物）中の他の配列とは少ない頻度でハイブリダイズする、又は全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイ、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの洗浄条件」は、配列依存性であり、さまざまな環境パラメーターのもとで異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲なガイドは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３年）「生化学及び分子生物学における実験技術−−核酸プローブとのハイブリダイゼーション  パート１（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ）、第２章、「ハイブリダイゼーションの原理の概説及び核酸プローブアッセイの戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される。一般的に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、確定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列に関する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする（確定されたイオン強度及びｐＨ下の）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに関するＴｍと等しく選択される。サザンブロット又はノーザンブロットにおいて、アレイ上又はフィルター上の１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、標準的ハイブリダイゼーション溶液（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）Ｖｏｌ．１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ及び下記の詳細な論議を参照されたい）を使用して、ハイブリダイゼーションを一晩実施して、４２℃である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌで７２℃において約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃において１５分間の���．２×ＳＳＣによる洗浄である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ上記、ＳＳＣバッファーに関する記述を参照されたい）。多くの場合、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するための低いストリンジェント洗浄が高度にストリンジェント洗浄に先行する。例えば、１００ヌクレオチドを超える二本鎖のための中程度のストリンジェント洗浄は、１×ＳＳＣ、４５℃において１５分間である。例えば、１００ヌクレオチドを超える二本鎖のための低度のストリンジェント洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃において１５分間である。
【０００８】
本明細書において使用する場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。この用語は、所望の目的のための、基準核酸と同様の結合特性又は改善された結合特性を有する天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。この用語はさらに、天然発生のヌクレオチドと同様の様式で、又は所望の目的のために改善された速度において代謝される核酸も含む。この用語はさらに、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。本発明により提供されるＤＮＡ骨格類似体は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホン酸、ホスホロアミダート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カーバメート、モルホリノカーバメート及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む；「オリゴヌクレオチド及び類似体、実践的取り組み（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；「アンチセンス戦略（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ６００、Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ  １９９２年）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３〜１９３７；「アンチセンス調査及び応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などの非イオン性骨格を含む。ホスホロチオエート結合は、ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７年）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９〜１９７に記載されている。この用語に包含される他の合成骨格は、メチルホスホネート結合又は改変メチルホスホネート及びホスホジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：８６９２〜８６９８）並びにベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６年）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３〜１５６）を含む。
【０００９】
「アレイ」、「マイクロアレイ」、「核酸アレイ」及び「バイオチップ」という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。これらの用語は、好ましくはその配列が公知である、所定の同一性を有する複数の核酸分子の基板表面上における構成を指す。各核酸分子は、基板表面上の「個別スポット」（すなわち、画定された位置又は割り当てられた場所）に固定される。「マイクロアレイ」という用語は、より具体的には、視覚的評価のための顕微鏡検査を必要とするように小型化したアレイを指す。本発明の方法に使用するアレイは、マイクロアレイが好ましい。本明細書において使用する核酸アレイは複数の標的要素であり、個々の標的要素は、試料核酸をハイブリダイズできる、１つ又は複数の固体表面上に固定された１種又は複数種の核酸分子（プローブ）を含む。プローブの核酸は、特定の遺伝子又はクローン由来の、例えば、表１に記載の特定のゲノム領域由来の（１種又は複数種の）配列を含むことができる。他のプローブは、例えば基準配列を含むことができる。アレイのプローブは、固体表面にさまざまな密度で構成できる。プローブの密度は、標識の性質、固体支持体などのいくつかの要素によって決まる。技術者は、各プローブがさまざまな長さ及び配列の核酸混合物を含み得ることを認識するであろう。したがって、例えば、プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡのクローン部分の複数のコピーを含むことができ、個々のコピーはさまざまな長さの断片に分割され得る。標的要素上に固定された核酸の長さ及び複雑度は、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要素を調整して、最適なハイブリダイゼーション及び所与のハイブリダイゼーション手法のためのシグナル発生を提供でき、さまざまな遺伝子又はゲノム位置において必要な解明を提供できる。
【００１０】
本明細書において使用する場合、「プローブ」又は「核酸プローブ」という用語は、試料に対する特異的ハイブリダイゼーションが検出できるような１種又は複数種の核酸断片であると定義される。プローブは、非標識であっても、又は下記のように、標的又は試料に対するその結合が検出できるように標識されてもよい。プローブは、染色体の１つ又は複数の特定の（あらかじめ選択された）部分、例えば１つ又は複数のクローンに由来する核酸供給源、単離された全染色体又は染色体断片、或いはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のコレクションから作製される。本発明のプローブは、本明細書に記載の領域に見出される核酸から作製される。
【００１１】
プローブはまた、アレイ中のように、固体表面上（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、融合シリカスライド）に固定された単離核酸であってもよい。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載された核酸アレイのメンバーであってもよい。高密度アレイ（例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７６７〜７７３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８年）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１〜Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１０８７〜１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１２０〜１２４；米国特許第５，１４３，８５４号を参照されたい）を作製できる技術もまた、この目的のために使用できる。当業者は、本明細書に記載の特定のプローブの正確な配列は、開示されたプローブと「実質的に同一」であるプローブを作製するためにある程度改変することができるが、それらが由来するプローブと同じ標的又は試料に特異的に結合する（すなわち、特異的にハイブリダイズする）能力は維持する（上の記述を参照されたい）ことを認識するであろう。このような改変は、本明細書に記載の個々のプローブへの言及によって具体的に取り扱われる。
【００１２】
本明細書に使用する場合「試験核酸試料」又は「試験核酸」は、その量又は表現程度（例えば、コピー数）又は配列同一性が分析された配列を含む核酸を指す。同様に、「試験ゲノム酸」又は「試験ゲノム試料」は、その量又は表現程度（例えば、コピー数）又は配列同一性が分析された配列を含むゲノム核酸を指す。
【００１３】
本明細書において使用する場合、「基準核酸試料」又は「基準核酸」は、その量又は表現程度（例えば、コピー数）又は配列同一性が、１種又は複数種の試験試料を比較する基準として機能し、より好ましくは基準試料の量又は表現程度（例えば、コピー数）又は配列同一性が公知である配列を含む核酸を指す。
【００１４】
本明細書において使用する場合、「試料」という用語は、対象となる１種又は複数種の要素を含む材料又は材料の混合物に関する。試料は、限定するものではないが、生物から得た試料を含み、供給源（例えば、生検又は腫瘍由来など）から直接得ても、又は例えば、培養後及び／又は１つ又は複数の処理ステップ後に間接的に得てもよい。
【００１５】
「ゲノム」という用語は、すべての核酸配列（コード配列及び非コード配列）及び対象の個々の細胞型、好ましくは個々の体細胞型に存在する要素を指す。ゲノムという用語はまた、腫瘍細胞を含む任意の細胞型の変異体又は疾患変異体に存在し得る、これらの配列の任意の天然発生変異体又は誘導された変異体にも適用される。「ゲノムＤＮＡ」及び「ゲノム核酸」という用語は、本明細書において同じ意味で使用する。それらは、１種又は複数種の細胞の核から単離された核酸を指し、ゲノムＤＮＡに由来する（すなわち、ゲノムＤＮＡから単離された、ゲノムＤＮＡから増幅された、ゲノムＤＮＡからクローン化された、及びゲノムＤＮＡの合成型）核酸を含む。例えば、ヒトゲノムは、異なる染色体に組織化されたおよそ３．０×１０９塩基対のＤＮＡからなる。正常な２倍体ヒト体細胞のゲノムは、２２対の常染色体（１番染色体〜２２番染色体）及びＸ及びＹ染色体（男性）又はＸ染色体の対（女性）のいずれかの、計４６本の染色体からなる。癌細胞のゲノムは、任意のサブ染色体領域又はＤＮＡ配列の欠失、再構成及び増幅に加えて、可変数の個々の染色体を含み得る。
【００１６】
本明細書において使用する場合、「ゲノム遺伝子座」又は「ゲノム領域」という用語は、ゲノムの定義された部分を指す。同様に、「染色体遺伝子座」及び「染色体領域」という用語は、染色体の定義された部分を指す。実用目的のために、「ゲノム遺伝子座」、「ゲノム領域」、「染色体領域」及び「染色体遺伝子座」という用語は、本明細書において同じ意味で使用する。本発明の方法において、アレイ上の個別スポットに固定された個々の核酸プローブは、特定のゲノム領域に特異的な（又は特定のゲノム領域の特性である）配列を有する。アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション実験において、アレイ上の所与のスポットの２つの差次的標識試験及び基準試料強度比は、特定のゲノム領域における２種の試料のゲノムコピー数比を反映する。
【００１７】
表面結合ポリヌクレオチド又はプローブが、ゲノム領域に「対応する」場合、ポリヌクレオチドは普通、そのゲノム領域に唯一である核酸配列を含む。したがって、特定のゲノム領域に対応する表面結合ポリヌクレオチドは、普通そのゲノム領域から作製された標識核酸と、他のゲノム領域から作製された標識核酸と比較して特異的にハイブリダイズする。
【００１８】
「ＣＧＨ」又は「比較ゲノムハイブリダイゼーション」は、染色体の変化（例えば、癌細胞において）の同定のための技術を一般的に指す。ＣＧＨを使用して、腫瘍又は試験試料と、正常又は基準試料との間の比により、染色体増幅及び領域の欠失の検出が可能になる。
【００１９】
動物（例えば、ヒト）における「腫瘍」又は「癌」という用語は、調節されない増殖、不死、転移能、急速な成長及び増殖速度及びある特性の形態的特徴を含む、非定型の成長又は形態などの特性を保有する細胞の存在を指す。多くの場合、癌細胞は腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物内で互いに分離して存在し得る。「腫瘍」は、良性及び悪性双方の新生物を含む。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「ＢＲＣＡ１関連腫瘍」は、ＢＲＣＡ１遺伝子座の変異を含む細胞を有する腫瘍を意味する。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「非ＢＲＣＡ１／２  ＨＢＯＣ腫瘍」は、ＢＲＣＡ１関連乳癌に関してハイリスクな患者群（遺伝性乳癌及び卵巣癌の家族由来の患者）であるが、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変異に関して陰性のスクリーニング結果を有する患者群における腫瘍を指す。このような患者は、家族由来であり、これらは少なくとも２例の乳癌症例及び１例の卵巣癌を含み、これらの家族は、ＨＢＯＣ（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ）家族と称される。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、腫瘍細胞における特定の染色体コピー数異常（ＣＮＡ）が、ＢＲＣＡ１関連腫瘍と散発性腫瘍の識別を可能にするという発見に一部基づく。これらの染色体コピー数の異常は、少なくとも１０の染色体領域、１ｐ２１−３４、３ｐ２１−３１（本明細書では３ｐ２１、より好ましくは３ｐ２１．１−２１．３１を意味すると理解される）、３ｑ２２−２７、５ｑ１３−１５、５ｑ２１−２３、６ｐ２２−２３、１０ｐ１４、１２ｑ２１−２３、１３ｑ３２−３３（本明細書では１３ｑ３１−３３を意味すると理解される）、１４ｑ２２−２４（表１）、及びＢＡＣクローンのリストにより示されたいくつかのより小さい領域（表２）のセットを含む。これらのゲノム領域の少なくともサブセットのコピー数を決定する方法は、乳癌、並びに卵巣癌及び他の種類の腫瘍の診断及び／又は予後予測に有用である。
【００２３】
ゲノムの不安定性は固形腫瘍の特質であり、ゲノムにいくらかの変化を示さない固形腫瘍は事実上存在しない。いくつかの症例において、これらの染色体の異常は、腫瘍の特定の型の特性であり、したがって腫瘍型を差別化するためのマーカーとして機能できる。
【００２４】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞試料をＢＲＣＡ１関連腫瘍由来細胞又は散発性腫瘍由来細胞を含むとして分類する方法に関する。この方法は、試料中のゲノムＤＮＡの、１ｐ２１−３４、３ｐ２１、３ｑ２２−２７、５ｑ１３−１５、５ｑ２１−２３、６ｐ２２−２３、１０ｐ１４、１２ｑ２１−２３、１３ｑ３１−３３及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択される少なくとも３つのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出するステップを含む。好ましくは本方法において、非癌細胞における細胞当たりのコピー数と比較した、１ｐ２１−３４、３ｑ２２−２７、６ｐ２２−２３、１０ｐ１４及び１３ｑ３１−３３からなる群から選択されるゲノム位置におけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の増加、並びに／又は３ｐ２１、５ｑ１３−１５、５ｑ２１−２３、１２ｑ２１−２３及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択されるゲノム位置におけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の減少により、細胞試料がＢＲＣＡ１関連腫瘍由来として分類される。
【００２５】
これらの位置は、個別に又は組み合わせて検出できる。したがって、例えば、いくつかの実施形態において、上記に列挙した染色体位置のうちの３、４、５、６、７、８、９又は１０を検出できる。最も好ましくは、上記に列挙した染色体位置（表１にも列挙）のうちの１０すべてを検出する。本発明の好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１、１４ｑ２２−２４、６ｐ２２−２３及び５ｑ２１−２３からなる群から選択される。本発明のより好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１、１４ｑ２２−２４及び６ｐ２２−２３からなる群から選択される。本発明のさらにより好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択される。本発明のその上さらに好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４及び３ｐ２１からなる群から選択される。本発明の、さらにまた好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３及び１０ｐ１４からなる群から選択される。本発明のさらにまた好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３及び１２ｑ２１−２３からなる群から選択される。本発明の最も好ましい方法において、検出されたゲノム位置は、少なくとも５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７及び１３ｑ３１−３３からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の方法は、細胞試料中のゲノムＤＮＡの、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７及び１３ｑ３１−３３から選択される少なくとも１つ又は２つのゲノム位置における細胞当たりのコピー数を検出するステップをさらに含むことができ、非癌細胞における細胞当たりのコピー数と比較した、これらのゲノムにおけるＤＮＡの細胞当たりのコピー数の減少により、細胞試料を散発性腫瘍由来として分類する。
【００２７】
本発明の対象となる上記に列挙したゲノム位置には、表１に列挙したＢＡＣプローブが結合する。
【００２８】
上記のゲノム位置内でＤＮＡを検出する単一又は少コピー数のプローブは、本発明における使用に特に有用である。さまざまなゲノム位置を検出するためのプローブを検出又は作製するために使用できる、例示的ＢＡＣクローンのリストを表２に示す。しかし、このリストは、本発明を限定する意図のものではなく、ゲノム位置内の他のプローブもまた使用できると理解されるべきである。さらに、「プローブ」という用語は、所与のゲノム位置の相補配列とハイブリダイズすることによって、この位置を検出できる任意の核酸分子を含むように、広い意味で理解されるべきである。細胞遺伝学的分染法又は染色体分染法は、技術者には周知の技術であり、例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：９５３〜９５８；Ｆｕｒｅｙ及びＨａｕｓｓｌｅｒ（２００３年）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：１０３７〜１０４４；並びにＳｐｅｉｃｈｅｒ及びＣａｒｔｅｒ（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６：７８２〜７９２は、どのように染色体分染法をゲノム上にマッピングするかを記載している。
【００２９】
したがって、本発明の方法における使用のためのプローブ分子は、下記に記載のコピー数の決定に使用する特定の技術次第で、合成オリゴヌクレオチドプローブ及び／又は（増幅）プライマーから１Ｍｂを超える人工染色体に及ぶ。本明細書に記載の方法に有用なプローブは、多くの供給源から利用可能である。例えば、Ｐ１クローンは、ＤｕＰｏｎｔ  Ｐ１ライブラリ（Ｓｈｅｐａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２；２６２９（１９９４年））から利用可能であり、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。全染色体にわたるさまざまなライブラリもまた市販されている（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）又はＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから利用可能である。本発明者らは、Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）から入手できる、１Ｍｂ間隔で全ヒトゲノムを包含するヒト３６００ＢＡＣ／ＰＡＣゲノムクローンセットを使用した。このクローンセットについての情報は、ＢＡＣ／ＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｗｅｂ  Ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：ｌ／ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ）において入手できる。本発明の方法における使用に好ましいプローブは、表１及び２に挙げたＢＡＣクローンに存在する（ヒトゲノム）配列の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２２、３０、５０又は１００の連続したヌクレオチドを含む。より好ましい核酸プローブは、ゲノム、好ましくはヒトゲノムにおいて唯一である配列を含む。
【００３０】
核酸プローブの調製及び操作に関する技術は、当分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「核酸プローブとのハイブリダイゼーション−生化学及び分子生物学における実験技術（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（パートＩ及びＩＩ）」、１９９３年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ＰＣＲ戦略（ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」、１９９５、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；並びに「分子生物学における短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、第５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい）。核酸プローブは、さまざまなビヒクルにクローニングすることによって得ることができ、操作できる。それらは、ゲノムＤＮＡの任意の供給源からスクリーニングされ、再クローン化又は増幅され得る。核酸プローブは、哺乳動物及びヒトの人工染色体（それぞれＭＡＣ及びＨＡＣ、これらは約５〜４００キロベース（ｋｂ）の挿入体を含むことができる。）、サテライト人工染色体又はサテライトＤＮＡ系人工染色体（ＳＡＴＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ；サイズ０．２〜１Ｍｂ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ；最大３００ｋｂ）、Ｐ１人工染色体（ＰＡＣ；約７０〜１００ｋｂ）などを含むゲノムクローンに由来してよい。ＭＡＣ及びＨＡＣは記載されている（例えば、Ｗ．Ｒｏｕｓｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、２７６：３８〜３９；Ｍ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７年、１５：３３３〜３３５；Ｆ．Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９９７年、１１８：１３５〜１４２；Ｙ  Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００年、１８：１０８６〜１０９０；Ｊ．Ｅ．Ｍｅｉｊａら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１年、６９：３１５〜３２６；及びＣ．Ａｕｒｉｃｈｅら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００１年、２：１０２〜１０７を参照されたい）。ＳＡＴＡＣは、さまざまな哺乳動物種の細胞において、新たに誘導された染色体形成によって作製できる（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ及びＤ．Ｋｉｐｌｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８６：５５３〜５５５；Ｅ．Ｃｓｏｎｋａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．２０００年、１１３：３２０７〜３２１６；並びにＧ．Ｈａｄｌａｃｚｋｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｔ．Ｔｈｅｒ．２００１年、３：１２５〜１３２を参照されたい）。又は、核酸プローブはＹＡＣに由来してもよく、これらは、サイズ最大１００万塩基対のゲノム断片の安定な繁殖のために長年��用されてきた（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｆｅｉｎｇｏｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０年、８７：８６３７〜８６４１；Ｇ．Ａｄａｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９７年、１１：１３４９〜１３５８；Ｒ．Ｍ．Ｔｕｃｋｅｒ及びＤ．Ｔ．Ｂｕｒｋｅ、Ｇｅｎｅ、１９９７年、１９９：２５〜３０；並びにＭ．Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９９年、２７：Ｅ３０を参照されたい）。ＢＡＣもまた、本発明の実践における使用のための核酸プローブを作製するために使用できる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＦ因子プラスミド系に基づくＢＡＣは、マイクログラム量の操作及び精製を容易にする有利性を提示する（例えば、Ｓ．Ａｓａｋａｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９７年、１９１：６９〜７９；及びＹ．Ｃａｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９９年、９：７６３〜７７４を参照されたい）。ＰＡＣは、バクテリオファージＰ１由来のベクターである（例えば、Ｐ．Ａ．Ｉｏａｎｎｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９４年、６：８４〜８９；Ｊ．Ｂｏｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６年、６：１１２３〜１１３０；Ｈ．Ｇ．Ｎｏｔｈｗａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９７年、４１：３７０〜３７８；Ｌ．Ｈ．Ｒｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９７年、４３：３６６〜３７５；及びＰ．Ｙ．Ｗｏｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９８年、５０：３０６〜３１６を参照されたい）。核酸プローブはまた、例えば、組換えウィルス、コスニッド又はプラスミドなどの他のクローニングビヒクルにクローン化することによって得、操作することができる。又はアレイ固定核酸プローブとして使用する核酸配列は、当分野において周知の化学技術によって、インビトロで合成できる。これらの方法は記載されている（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７年、２５：３４４０〜３４４４；Ｍ．Ｊ．Ｂｌｏｍｍｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、３３：７８８６〜７８９６；及びＫ．Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９５年、１９：３７３〜３８０を参照されたい）。核酸プローブのカスタムアレイのための選択肢は、市販のアレイ及びマイクロアレイを頼る。このようなアレイが、例えば、Ｖｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ．）、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．）及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）により開発されている。
【００３１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡにおける細胞当たりのコピー数の検出は、定量的又は半定量的に実施される。非癌細胞におけるコピー数からの異常、すなわち核酸材料の増減の検出で十分なので、ゲノム領域の正確なコピー数の決定は必要ではない。したがって、コピー数の検出は、コピー数の推定も含むと理解される。それゆえに、半定量的又は相対的な測定で通常十分である。さらに、定量技術を使用し、細胞当たりのコピー数を決定できる。技術者は、コピー数を決定するための定量的及び半定量的技術、例えば半定量的ＰＣＲ分析又は定量的リアルタイムＰＣＲの双方を知っている。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）それ自体は定量的技術ではないが、定量的又は半定量的であるＰＣＲに基づく方法が開発されており、それらは、特定範囲内でもともとのコピー数の妥当な推定値を与える。例としては、定量的ＰＣＲは、好ましくは定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＱ−ＰＣＲ、ＱＲＴ−ＰＣＲ又はＲＴＱ−ＰＣＲとして公知である）である。さらに、多くの技術、例えば多くのアレイ技術により、基準と比較して計算された相対的コピー数の推定値が得られる。絶対コピー数の推定値は、インサイツのハイブリダイゼーション技術（ＩＳＨ）、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）の技術によって得ることができる。これ以降、コピー数の分析に使用できる技術の、非限定の実施例を示す。
【００３３】
個々のゲノム位置のコピー数の分析を可能にする技術は当分野において周知である。例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、個々の遺伝子座又は染色体上の特定の領域のコピー数を研究するために使用できる（Ｐｉｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、８５、９１３８〜４２（１９８８年））。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８、８１８〜２１（１９９２年））もまた、染色体領域のコピー数変化を探るために使用できる（Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５、１２５３〜６０（１９９４年））。
【００３４】
ゲノム位置のコピー数はさらに、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５４０５〜９（２０００年）を参照されたい）などの定量的ＰＣＲを使用して決定できる。例えば、定量的マイクロサテライト分析（ＱＵＭＡ）は、ＤＮＡ配列の相対的コピー数の高速測定のために実施できる。ＱＵＭＡにおいて、プールされた基準と比較した試験遺伝子座のコピー数は、単純反復配列を担持する遺伝子座の定量的、リアルタイムＰＣＲ増幅を使用して評価される。単純反復配列の使用は、正確にマッピングされた数が多いので有利である。定量的ＰＣＲに関するさらなるプロトコルは、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０年）「ＰＣＲプロトコル、方法及び応用のガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に提供される。特定のＤＮＡコピー数を決定するための他の半定量的方法は、多重連鎖反応依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０（１２）：ｅ５７；Ｓｅｌｌｎｅｒ及びＴａｙｌｏｒ（２００４年）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２３（５）：４１３〜４１９）並びに多重増幅及びプローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）（Ｓｅｌｌｎｅｒ及びＴａｙｌｏｒ（２００４年）上記）である。
【００３５】
しかし、本発明の方法において、好ましくはゲノム位置のコピー数は、固体支持体上で実施されるハイブリダイゼーションにより決定される。例えば、特定の染色体領域と選択的にハイブリダイズするプローブは、表面上にスポットできる。好都合なことに、スポットは、順序づけられたパターン又はアレイで配置されており、アレイ上のプローブの配置は記録され、結果のその後の相関が容易である。その後、核酸試料を、アレイとハイブリダイズする。したがって、本発明の方法において、ゲノム位置のコピー数は、好ましくはアレイに基づく取り組み、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して分析される。任意のさまざまなアレイが本発明の実践に使用できる。研究者らは、市販のアレイ又は彼ら自身で作製したアレイのいずれかに頼ることができる。アレイの作製及び使用の方法は、当分野において周知である（例えば、Ｓ．Ｋｅｒｎ及びＧ．Ｍ．、Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７年、２３：１２０〜１２４；Ｍ．Ｓｃｈｕｍｍｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７年、２３：１０８７〜１０９２；Ｓ．Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏら、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ、１９９７年、２０：３９９〜４０７；Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９８年、８：Ｒ１７１〜Ｒ１７４；Ｄ．Ｄ．Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．１９９９、Ｓｕｐｐ．２１：２５〜３２；Ｓ．Ｊ．Ｗａｔｓｏｎ及びＨ．Ａｋｉｌ、Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９９９年、４５：５３３〜５４３；Ｗ．Ｍ．Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０００年、２９：１０４２〜１０４６及び１０４８〜１０５５；Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ及びＥ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、４０５：８２７〜８３６；Ｍ．Ｃｕｚｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．２００１年、８：２９１〜２９６；Ｐ．Ｐ．Ｚａｒｒｉｎｋａｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００１年、１１：１２５６〜１２６１；Ｍ．Ｇａｂｉｇ及びＧ．Ｗｅｇｒｚｙｎ、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．２００１年、４８：６１５〜６２２；並びにＶ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４０：９５３〜９５８を参照されたい；さらに、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；第５，４３４，０４９号；第５，５５６，７５２号；第５，６３２，９５７号；第５，７００，６３７号；第５，７４４，３０５号；第５，７７０，４５６号；第５，８００，９９２号；第５，８０７，５２２号；第５，８３０，６４５号；第５，８５６，１７４号；第５，９５９，０９８号；第５，９６５，４５２号；第６，０１３，４４０号；第６，０２２，９６３号；第６，０４５，９９６号；第６，０４８，６９５号；第６，０５４，２７０号；第６，２５８，６０６号；第６，２６１，７７６号；第６，２７７，４８９号；第６，２７７，６２８号；第６，３６５，３４９号；第６，３８７，６２６号；第６，４５８，５８４号；第６，５０３，７１１号；第６，５１６，２７６号；第６，５２１，４６５号；第６，５５８，９０７号；第６，５６２，５６５号；第６，５７６，４２４号；第６，５８７，５７９号；第６，５８���，７２６号；第６，５９４，４３２号；第６，５９９，６９３号；第６，６００，０３１号；及び第６，６１３，８９３号も参照されたい）。アレイは、基板表面上の個別スポット（すなわち、確定された位置又は割り当てられた場所）に固定された複数の核酸プローブを含む。本発明における使用のための基板表面は、核酸プローブが基板表面に直接又は間接的に接着（すなわち固定化）可能な、任意のさまざまな硬質、半硬質又は柔軟な材料で作製できる。適切な材料は、限定するものではないが、セルロース（例えば、米国特許第５，０６８，２６９号を参照されたい）、酢酸セルロース（例えば、米国特許第６，０４８，４５７号を参照されたい）、ニトロセルロース、ガラス（例えば、米国特許第５，８４３，７６７号を参照されたい）、石英又はガリウムヒ素、シリコーンなどの他の結晶基板（例えば、米国特許第６，０９６，８１７号を参照されたい）、さまざまなプラスチック及びプラスチックコポリマー（例えば、米国特許第４，３５５，１５３号；第４，６５２，６１３号；及び第６，０２４，８７２号を参照されたい）、さまざまなメンブレン及びゲル（例えば、米国特許第５，７９５，５５７号を参照されたい）並びに常磁性体粒子又は超磁性粒子（例えば、米国特許第５，９３９，２６１号を参照されたい）を含む。蛍光を検出する場合、シクロオレフィンポリマーを含むアレイを使用することが好ましいと思われる（例えば、米国特許第６，０６３，３３８号を参照されたい）。材料上の反応性化学官能基（例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノの各基など）の存在は、核酸プローブが基板表面に直接又は間接的に接着するために利用できる。核酸プローブを基板表面に固定し、アレイを形成する方法は、当分野において周知である。
【００３６】
個々の核酸プローブの複数のコピーをアレイ上にスポットできる（例えば、二重又は三重に）。例えば、この構成は、得られた結果の再現性の評価を可能にする（下記を参照されたい）。関連核酸プローブはまた、アレイ上のプローブ要素に分類され得る。例えば、プローブ要素は、さまざまな長さの、複数の関連核酸プローブを含むことができるが、実質的に同じ配列を含む。又は、プローブ要素は、ＤＮＡの複数のクローン化部分の消化により得られた、さまざまな長さの断片である複数の関連核酸プローブを含むことができる。アレイは、複数のプローブ要素を含むことができる。アレイ上のプローブ要素は、さまざまな密度で基板表面上に構成できる。アレイ固定化核酸プローブは、例えば、実質的に完全なゲノム又はゲノムのサブセットを集合的に包含する配列を含む、遺伝子由来（例えば、ゲノムライブラリ由来）の配列を含む核酸であってよい。核酸プローブの配列は、コピー数の比較情報が望ましい配列である。例えば、全ゲノムにわたるＤＮＡ配列のコピー数情報を得るために、全ゲノム又は実質的に完全なゲノムを包含する核酸プローブを含むアレイを使用する。しかし、本発明の方法の好ましい実施形態において、関係のあるゲノム位置はすでに確立されており、ゲノム全般での実験のために必要ではない。このような場合において、アレイは、遺伝子の個別のセット又は上に示したゲノム位置から発生する特定の核酸配列を含むことができ、腫瘍型に関係するそれらのコピー数を検査するべきである。さらに、アレイは、陽性対照又は陰性対照（すなわち、この核酸配列は、核型的に正常なゲノムに由来し得る）としての核酸配列を含むことができる。
【００３７】
又は、試料は、別々のウェル又はチャンバーに配置でき、それらの個別のウェル又はチャンバーにおいてハイブリダイズできる。本発明の文脈において、別々のウェル又はチャンバーのアレイもまた、本明細書において一般用語「アレイ」の中に含まれることを理解すべきである。当分野では、「チップ」及び微小流体技術を含む、別々の反応チャンバーに試薬の自動送達が可能なロボット設備が開発されており、これらにより、反応あたりに使用する試薬量を大幅に減少できる。チップ及び微小流体技術は、例えば、米国特許第５，８００，６９０号、Ｏｒｃｈｉｄ、「平行線における作動（Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｏｎ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｌｉｎｅｓ）」Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｏｃｔ．２５、１９９７年、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２６２６〜３０（１９９７年）及びＴｕｒｇｅｏｎ、「ＣＤ−ＲＯＭ上の将来の研究室（Ｔｈｅ  Ｌａｂ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ？）」Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９７年、１頁に教示されている。チップ及び微小流体環境においての自動ハイブリダイゼーションは、本発明の実践の企図された方法である。微小流体環境は本発明の一実施形態であるが、それらは流体環境においてハイブリダイゼーションを実施するのに適切した唯一の画定された空間ではない。他のこのような空間は標準的研究室設備を含み、マイクロタイタープレートのウェル、ペトリ皿、遠心管などが使用できる。
【００３８】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）による腫瘍細胞試料の分析を含む。より具体的には、本発明の特定の方法は、腫瘍ＤＮＡの試料を提供するステップ、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーションにより腫瘍ＤＮＡを分析し、腫瘍ゲノム情報を得るステップ、得られた腫瘍ゲノム情報に基づき、ＢＲＣＡ１関連腫瘍又は散発性腫瘍として腫瘍を分類するステップを含む。本発明の方法の分析ステップは、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーションの実施のために、任意のさまざまな方法、手段及びそれらの変形を使用して実施できる。アレイに基づくＣＧＨ方法は、当分野において公知であり、多くの科学出版物及び特許に記載されている（例えば、米国特許第５，６３５，３５１号；第５，６６５，５４９号；第５，７２１，０９８号；第５，８３０，６４５号；第５，８５６，０９７号；第５，９６５，３６２号；第５，９７６，７９０号；第６，１５９，６８５号；第６，１９７，５０１号；第６，３３５，１６７号；及び欧州特許第ＥＰ１  １３４  ２９３号及びＥＰ１  ０２６  ２６０号；ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６年；２０．Ｊｏｏｓｓｅら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７年、７：４３；Ｄ．Ｐｉｎｋｅｌら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８年、２０：２０７〜２１１；Ｊ．Ｒ．Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９年、２３：４１〜４６；Ｃ．Ｓ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１年、３：１５８〜１７５を参照されたい）。本発明の実践において、これらの方法及びアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーションの実施のための、当分野において公知の他の方法を、記載のように又はそれらが腫瘍ゲノム情報を得ることが可能なように修正して使用できる。腫瘍ゲノム情報は、例えば、複数のゲノム遺伝子座位における遺伝物質の増減、染色体異常及びゲノムコピー数変化を含む。
【００３９】
本発明の方法は、あらゆる種類の腫瘍を包含するが、本発明の方法の好ましい実施形態において、ＢＲＣＡ１関連腫瘍又は散発性腫瘍は乳腺腫瘍又は卵巣腫瘍である。最も好ましくは、ＢＲＣＡ１関連腫瘍又は散発性腫瘍は、乳腺腫瘍である。
【００４０】
本発明の方法における使用のための試験核酸試料及び基準核酸試料は、ＤＮＡの単離又は抽出の任意の適切な方法によって、腫瘍細胞又は基準細胞を含む生物学的試料から単離できる。ＤＮＡの抽出方法は、当分野において周知である。古典的なＤＮＡの単離プロトコルは、フェノール及びクロロホルムの混合物などの有機溶媒を使用して抽出、その後のエタノールによる沈殿に基づく（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記を参照されたい）。他の方法は、塩析ＤＮＡ抽出、トリメチルアンモニウムブロミド塩ＤＮＡ抽出法及びグアニジウムチオシアネートＤＮＡ抽出法を含む。体液からＤＮＡを抽出するために使用できるさらに多くのさまざまな、多目的なキットがあり、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈ．）、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）及びＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ）から市販されている。従うべき極めて詳細なプロトコルが記載された利用者用ガイドは、普通これらすべてのキットに含まれている。感度、処理時間及びコストは、キットによって異なる。普通の当業者は、特定の状況に関して最も適した（１種又は複数種の）キットを、容易に選択できる。
【００４１】
本発明の方法において、基準試料は、問題になっている方法における被験プールであるゲノム領域の相補体の正常な（すなわち、非乳腺腫瘍／非癌細胞）コピー数を代表する、好ましくは核酸試料である。基準は、例えば正常な及び／又は健康な個人に由来する、或いはこのような個人のプールに由来するゲノム試料から得ることができる。好ましくは、基準核酸試料は、女性の個人に由来する。基準核酸試料が腫瘍ＤＮＡを含まないこともまた好ましい。好ましい基準核酸試料は、いくつか（例えば、少なくとも４〜１０）の見かけ上健康な女性に由来する組織試料（例えば、リンパ球）から単離されたプールされたゲノムＤＮＡからなる。別の好ましい実施形態において、基準核酸試料は、腫瘍試料においてコピー数が決定される個々のゲノム領域又はそれらの断片に由来する核酸配列のレベルに近づくように設計された、人工的に作製された核酸集団を含むこともできる。さらに別の実施形態において、基準核酸は、正常な細胞系又は細胞系試料に由来してもよい。
【００４２】
本発明の方法において、抽出された試験核酸及び／又は基準核酸は、ハイブリダイゼーションによって分析する前に、検出可能物質又は部分を用いて標識してもよい。好ましくは、検出可能物質は測定可能なシグナルを発生し、その強度が、分析する試料中に存在する標識された核酸の量に関係（例えば比例する）ように選択される。本発明のアレイに基づくハイブリダイゼーション法において、検出可能物質は、局在シグナルを発生し、その結果、アレイ上の個々のスポットからシグナルの解明が可能になるように選択されることが好ましい。
【００４３】
核酸断片を標識するための方法は、当分野において周知である。標識プロトコル、標識検出技術及びこの分野における最近の開発の再検討のために、例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年、３９：１１４〜１２９；Ｒ．Ｐ．ｖａｎ  Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２００１年、１：８１〜９１；及びＳ．Ｊｏｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４年、３５：１３５〜１５３を参照されたい。標準的核酸標識方法は、放射性物質の組み込み、蛍光染料又は酵素の直接接着、核酸断片を免疫化学的に又は他の親和性反応によって検出可能にする核酸断片の化学修飾及びランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲ及びターミナルトランスフェラーゼを用いたテイリングなどの酵素媒介標識法を含む。さらに最近開発された好ましい核酸標識系はＵＬＳ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含み、これは、一反応性シスプラチン誘導体とＤＮＡ中のグアニン部分のＮ７位との反応に基づく（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｈｅｅｔｅｂｒｉｊら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９年、８７：４７〜５２参照されたい）。他の適切な標識系は、例えばソラレン−ビオチン、光反応性アジド誘導体及びＤＮＡアルキル化剤を含む。
【００４４】
任意のさまざまな検出可能物質が、本発明の実践に使用できる。適切な検出可能物質は、限定するものではないが、さまざまなリガンド、放射性核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、蛍光染料（特定の例示的蛍光染料に関しては下記を参照されたい）、化学発光物質（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）、微少粒子（例えば、量子ドット、ナノ結晶、リン光体など）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに使用する酵素、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば、染料、コロイド金など）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）など）；及びビオチン、ジオキシゲニン又は抗血清又はモノクロナール抗体が使用できる他のハプテン及びタンパク質含を含む。
【００４５】
特に好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションによって分析する試験核酸及び／又は基準核酸は、蛍光的に標識される。本発明における使用に適切な蛍光染料は、例えば、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、スペクトラムレッド（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ）、スペクトラムグリーン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン及びそれらの同等物、類似体又は誘導体を含む。本発明の実践において使用される蛍光標識剤の好ましい特性は、高モル吸収係数、高蛍光量子収率及び光安定性を含む。好ましい標識蛍光体は、スペクトルの紫外線範囲（すなわち、４００ｎｍ未満）より可視（すなわち、４００及び７５０ｎｍの間）の波長の吸収及び発光を示す。好ましい蛍光染料は、Ｃｙ−３及びＣｙ−５（すなわち、それぞれ３−及び５−Ｎ，Ｎ’−ジエチルテトラメチルインドジカルボシアニン）を含む。Ｃｙ−３及びＣｙ−５はまた、アレイに基づく器具に関する大部分の蛍光検出系と適合する、蛍光標識のマッチドペアを形成する有利性を提示する（下記を参照されたい）。蛍光染料の別の好ましいマッチドペアは、スペクトラムレッド及びスペクトラムグリーンを含む。「差次的に標識する」という用語は、例えば、第１の試料が試験試料であり、第２の試料は基準試料である、核酸セグメントの２種の試料を、識別可能なシグナルを発生する、第１の検出可能物質及び第２の検出可能物質を用いて標識することを指定するために使用する。識別可能なシグナルを発生する検出可能物質は、蛍光染料のマッチドペアを含む。蛍光染料のマッチドペアは当分野において公知であり、例えば、ローダミン及びフルオレセイン、Ｃｙ−３（商標）及びＣｙ−５（商標）並びにスペクトラムレッド（商標）及びスペクトラムグリーン（商標）を含む。
【００４６】
本発明の方法との使用に適切なハイブリダイゼーションプロトコル及び洗浄プロトコルは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「核酸プローブとのハイブリダイゼーション−生化学及び分子生物学における実験技術（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＰａｒｔＩＩ））」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年、及び「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）」、Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（編）、１９９９年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。ＣＧＨのための好ましいハイブリダイゼーションプロトコルは、Ｐｉｎｋｅｌら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：２０７〜２１１又はＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：５３２１〜５３２５（１９９２年）のプロトコルである。ハイブリダイゼーション条件を最適にする方法は、当業者には周知である（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、上記を参照されたい）。比較ハイブリダイゼーション条件を作り出すために、アレイを試験試料及び基準試料の（差次的に）標識した核酸断片と同時に接触させることができる。このことは、例えば、試験試料及び基準試料を混合し、ハイブリダイゼーション混合物を形成し、アレイと混合物とを接触させることによって実施できる。
【００４７】
ハイブリダイゼーションの特異性は、反復配列を阻害することによってさらに強化できる。特定の好ましい実施形態において、核酸断片に存在する反復配列（例えば、Ａｌｕ、Ｌ１及びサテライト配列、ＭＲＥ配列及び単純なホモヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド区間）は除去される、又はそれらのハイブリダイゼーション能力は無効にされる。混合物からの反復配列の除去又はそれらのハイブリダイゼーション能力の無効化は、当業者に周知の任意のさまざまな方法を使用して達成できる。これらの方法は、限定するものではないが、固体支持体に固定された特定の核酸配列とのハイブリダイゼーションによる反復配列の除去（例えば、Ｏ．Ｂｒｉｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２年、２：５７８〜５８７を参照されたい）；適切なＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ増幅による、反復配列の産生の抑制、自己再連結による、高度に反復された配列のハイブリダイゼーション能力の阻害（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｂｒｉｔｔｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９７４年、２９：３６３〜４１８を参照されたい）或いはヒドロキシアパタイト（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａから市販されている）を使用した反復配列の除去を含む。好ましくは、高度に反復された配列のハイブリダイゼーション能力は、ハイブリダイゼーション混合物中に非標識のブロッキング核酸を含むことによって、競合的に阻害される。接触ステップの前に試験試料及び基準試料と混合される非標識のブロッキング核酸は、競合相手として作用し、標識された反復配列が、核酸プローブの高度の反復配列と結合することを妨げ、したがってハイブリダイゼーションのバックグラウンドを減少させる。特定の好ましい実施形態において、非標識のブロッキング核酸は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡである。ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡは、例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）から市販されている。
【００４８】
別の態様において、したがって本発明は、本発明の上記の方法における使用のための、少なくとも３種の核酸プローブのセットに関する。好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１、１４ｑ２２−２４、６ｐ２２−２３及び５ｑ２１−２３からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。より好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１、１４ｑ２２−２４及び６ｐ２２−２３からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。さらに好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４、３ｐ２１及び１４ｑ２２−２４からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。その上さらに好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３、１０ｐ１４及び３ｐ２１からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。さらにまた好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３、１２ｑ２１−２３及び１０ｐ１４からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。まださらに好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７、１３ｑ３１−３３及び１２ｑ２１−２３からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。最も好ましくは、このセットにおいて、各プローブは、５ｑ１３−１５、３ｑ２２−２７及び１３ｑ３１−３３からなる群から選択される異なるゲノム位置と特異的にハイブリダイズする。これらのセットにおいて、ゲノム位置の検出のための核酸プローブは、上に定義された通りであり、及び／又は上記の方法において得ることができる。
【００４９】
別の態様において、本発明はＢＡＣクローンに関し、ＢＡＣクローンは、表１又は表２に列挙したＢＡＣクローンの群から選択される。好ましくは、本発明は、表１又は表２に列挙したＢＡＣクローンの群から選択される、少なくとも３つのＢＡＣクローンのセットに関する。より好ましくは、このセットは、表１及び表２に列挙したＢＡＣクローンの群から選択される、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、６０、８０又は１００のＢＡＣクローンを含む。さらにより好ましくは、このＢＡＣクローンのセットは、上記に列挙したゲノム位置のうちの少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、５、６、７、８、９又は１０を表す。最も好ましくは、このＢＡＣクローンのセットは、上記に列挙した染色体位置（表１にも列挙）のうちの１０すべてを表す。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、上に定義した、本発明の上記の方法に使用される、少なくとも３種の核酸プローブのセットを含むアレイに関する。より好ましくは、アレイは、上記に列挙したゲノム位置のうちの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０と特異的にハイブリダイズする、異なる核酸プローブ及び／又は異なるＢＡＣクローンを含む。より好ましくは、アレイは、上記に列挙したゲノム位置において唯一である配列を含む核酸プローブを含む。最も好ましくは、アレイは、上記に列挙した染色体位置（表１にも列挙）のうちの１０すべてに関する異なるプローブ及び／又は異なるＢＡＣクローンを含む。本明細書において、少なくとも３つのゲノム位置と特異的にハイブリダイズする、異なる核酸プローブ及び／又は異なるＢＡＣクローンを含むアレイは、少なくとも３つの（異なる）ゲノム位置を個別に分析できるアレイであると理解される。したがって、好ましくは、核酸プローブ及び／又はＢＡＣクローンのセットは、位置的にアドレス可能な様式でアレイ上に構成される。本明細書において、アレイは、プローブが固定された任意の固体支持体として理解され、好ましくはプローブ及び／又はＢＡＣクローンは、位置的にアドレス可能な様式で固体支持体上に固定される。好ましくは、アレイ上に含まれる異なるＢＡＣクローンは、表１及び表２に列挙したＢＡＣクローンの群から選択される。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、上記の診断適用における使用のためのキットに関する。本発明のキットは、本明細書に記載の方法を実施するための、任意の又はすべての試薬を含むことができる。診断適用において、このようなキットは、下記：分析試薬、バッファー、本明細書に記載の少なくとも１つのゲノム位置と特異的に結合する、ハイブリダイゼーションプローブ及び／又はプライマーのような核酸並びにこのような核酸を含むアレイのいずれか又はすべてを含むことができる。さらに、このキットは、本発明の方法の実践のための指示（すなわち、プロトコル）を含む取扱説明書を含むことができる。教材は、通常文書又は印刷物を含むが、このようなものに限定されない。このような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることが可能な任意の媒体は、本発明により企図される。このような媒体は、限定するものではないが、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学メディア（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などを含む。このような媒体は、このような取扱説明書を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【００５２】
その上さらなる態様において、本発明は、対象において腫瘍の発生におけるＢＲＣＡ１の欠損の関与を示す、診断及び／又は予後予測の方法に関する。好ましくは、この方法は、これ以前に定義された方法、これ以前に定義された核酸プローブのセット、これ以前に定義されたアレイ又はこれ以前に定義されたキットの使用を含む。診断及び／又は予後予測の方法は、ＢＲＣＡ１関係が未だ不明確である、ＢＲＣＡ１の変異を担持する家族を同定するためにさらに（それ自体で又は追加のツールとして）使用できる。診断及び／又は予後予測の方法は、変異を担持する可能性が最も高い、集中的ＤＮＡスクリーニングに関してハイリスクな家族内の個人を選択するためにも使用でき、並びに／或いは診断及び／又は予後予測の方法は、ＤＮＡ診断を導くために使用できる。さらに、診断及び／又は予後予測の方法は、非分類の変異体の有意性に関する指標をもたらすために使用できる。本発明の方法は、個々の腫瘍の発生におけるＢＲＣＡ１欠損の関与を示すための信頼できる検査を提供し、したがって、例えば乳腺腫瘍の治療の遺伝カウンセリング及び臨床管理において、決断の支えとなる。
【００５３】
本文献及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用は非限定的な意味で使用し、その言葉の後ろの項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目が排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が唯一の要素であることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は普通「少なくとも１つ」を意味する。
【００５４】
本明細書に引用されたすべての特許及び参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００５５】
下記の実施例は単に例示目的のために提示され、本発明の範囲を限定する意図では決してない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＢＲＣＡ１（Ａ）乳腺癌及び散発性（Ｂ）乳腺癌に関する増加（灰色、ｌｏｇ２比＞０．２）又は減少（黒、ｌｏｇ２比＜０．２）を示す試料の、染色体（Ｘ軸）対パーセント（Ｙ軸）の図である。
【図２】箱髭図（Ａ）にプロットされた訓練及び検証のセットに関するさまざまな腫瘍群の判別スコアの分布図である。ＢＲＣＡ１関連腫瘍は、正の値でプロットされ、散発性腫瘍は負の値でプロットされる。これらの値に基づいて、９５％の基準範囲を、ＢＲＣＡ１関連群について１．７及び散発性群について−１．０（点線）に設定した。分類規則を本発明者らのＨＢＯＣ群に適用し、２種の腫瘍をＢＲＣＡ１様（Ｂ、黒い点）として分類した。
【図３】クラス予測因子のロバスト性の図である。訓練セットの１５種の独立したランダムな選択により、例外なく１００％の分類精度がもたらされた。訓練セット（左）を、対応する検証セット（右）と共に、正の値にＢＲＣＡ１試料及び負の値に散発性腫瘍試料に関してプロットした。点線は、セットの対応する群の中央値を表す。
【図４】ＢＲＣＡ１関連腫瘍及び散発性腫瘍の、その病理学的特性ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ及びＴＰ５３の状態に付随する、アレイＣＧＨの結果に基づく、完全な階層的クラスタリングを示す図である。ＢＲＣＡ１関連及び散発性腫瘍の間にいくらかの分離があるが、病理学的特性は、明らかなクラスタには存在しない。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
【実施例】
【００５８】
１．１  方法及び材料
１．１．１  患者及び試料の選択
本研究は、３つの乳癌群において実施した：１）病原性ＢＲＣＡ１の生殖細胞系列変異が立証された患者由来の２８例の乳腺腫瘍、診断時の平均年齢３９歳（範囲：２７〜６１）；２）４８例の散発性乳腺腫瘍診断時の平均年齢４５歳（範囲：３２〜６０）、乳癌の家族歴はなく、研究所の保管からランダムに選択されたが、Ｐ５３が陰性の試料及び陽性の試料のパーセントは、ＢＲＣＡ１関連腫瘍群と同じである（表３）。ＢＲＣＡ１関連腫瘍群及び散発性腫瘍群の双方が、侵襲グレードＩＩ〜ＩＩＩの非浸潤性乳管癌からなる。３）定期診断検査に供され、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の双方における変異に関して陰性の検査結果を有する、ＨＢＯＣ家族由来の４８例の腫瘍（少なくとも２例の乳癌及び１例の原発性卵巣癌）（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｕｔ  ２００６年により記載）。診断時の平均年齢は４８歳（範囲：２０〜６１）であった。３群すべてに関する患者の特性は、患者情報の追加の表に記載されている。すべての試料材料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であり、抽出ＤＮＡは以前に記載されたような（Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００６年）、十分な品質でなければならなかった。ヒト組織に関連するすべての実験は、研究所の医療倫理諮問機関の承認により実行された。
【００５９】
１．１．２  ＤＮＡの単離
試料ＤＮＡを、下記のようにＦＦＰＥ腫瘍から単離した。少なくとも７０％の腫瘍細胞を含む１０の１０μｍの薄片をパラフィン除去し（キシレンで２×５分、１００％エタノールで２×３０秒、９０％エタノールで３０秒、７０％エタノールで３０秒及びＨ２Ｏですすいだ）、１Ｍの酢酸ナトリウムで３７℃において一晩処理し、対象となる部分（＞７０％腫瘍細胞）を、２００μｌのバッファーＡＴＬ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１３０４）にこそげ落とした。２７μｌのプロテアーゼＫ（１５μｇ／μｌ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号３１１５８７９００１）をすぐに加え、その日の終わり及び翌日の初めと終わりに同量を加え、試料を消化時間の間、３７℃において振とうし続けた。次の日、４０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（２０μｇ／μｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ５５００）を試料に加え、ボルテックスにかけ、室温で２分間インキュベートした。４００μｌのバッファーＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１３０４）を加え、７０℃において１０分間インキュベートした。４２０μｌの１００％エタノールを加え、ボルテックスにかけた。試料混合物を、スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１３０４）において８０００ｒｐｍにおいて１分間回転させた。カラムを下記の試薬で連続して洗浄し、８０００ｒｐｍにおいて１分間回転させた：５００μｌのＡＷ１、５００μｌのＡＷ２及び８０％のエタノールで２回。カラムを、１４，０００ｒｐｍにおいて３分間、遠心力で脱水した。試料を、５０μｌのＡＥバッファーを用いて８０００ｒｐｍにおいて１分間回転させることによって溶出した。
【００６０】
基準ＤＮＡを、６例の見かけ上健康な女性のリンパ球から単離し、プールした。リンパ球を、溶解バッファー（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、血液体積の４倍加えることによって精製し、その後４℃で３０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離機にかけた。上清を除去し、細胞ペレットをもとの血液体積の５倍の溶解バッファーに再懸濁した。これらのステップを、全赤血球が除去され、上清が透明な溶液になるまで繰り返した。はじめの血液体積の１／１０のＤＮＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０５０３−０２７）を細胞ペレットに加え、透明な溶液が残るまでピペッティングにより混合した。ＤＮＡｚｏｌ体積の１／２の１００％エタノールを加え、ＤＮＡを溶液から除去し、７０％エタノール中で洗浄し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに溶解した。ＤＮＡを、平均長が３００〜８００ｂｐになるまで超音波処理した。
【００６１】
１．１．３  品質検査
試料ＤＮＡのアレイＣＧＨに対する適性を検査するために、定性的ＰＣＲを上記のように実施した（Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００６年）。この多重ＰＣＲは、１００、２００、３００及び４００ｂｐのバンドを生み出すプライマーを含有する。ＤＮＡの品質に依存して、ＰＣＲは異なるバンドを生み出すであろう。少なくとも２００ｂｐの断片を増幅できるＤＮＡは、アレイＣＧＨのために十分な品質である。
【００６２】
１．１．４  ハイブリダイゼーション
先に記載のように（Ｊｏｏｓｓｅ  ２００７年）、ハイブリダイゼーションを、平均間隔が１Ｍｂの全ゲノムを包含するＤＮＡセグメントに由来する３．５ｋ  ＢＡＣ／ＰＡＣを含有するマイクロアレイ上で実施した。全ライブラリを各スライドに三重にスポットした。（Ｃｏｄｅ  Ｌｉｎｋ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号３０００１１  ００）。
【００６３】
１．１．５定量化測定
走査マイクロアレイスライドのデータ処理は、ＩｍａＧｅｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにおけるシグナル強度測定、その後の中央ピンチップ（例えば、サブアレイ）の正規化を含む。強度比（Ｃｙ５／Ｃｙ３）をｌｏｇ２変換し、三重のスポットの測定を平均した。染色体切断点及び異常を、ＣＧＨ−セグメンテーション（Ｐｉｃａｒｄ  ２００５）を使用して計算した。
【００６４】
１．１．６  クラス予測
本発明者らのＣＧＨ実験のｌｏｇ２（比）に基づくクラス予測因子を構築するために、収縮重心アルゴリズム（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、２００２年）を使用した。各クラスＫの試料ｘ＊に対する２乗距離δｋを計算するために、本発明者らは等事前確率を適用した（πｋ＝１／Ｋ）。収縮が増加するにつれて、腫瘍群を分割するＢＡＣクローン数のｄ’ｉｋが減少し、その結果、２乗距離もまた相対的に小さくなる。したがって、ガウスの線形判別分析に対する類似性は適合しなかった。異なるダイナミックレンジ及び試料間のＣＧＨプロファイルにおける差異は、判別スコアにおける広範な多様性をもたらす。この多様性は、双方のクラスのスコアに影響を与え、したがって、双方のスコアから最も小さい判別スコアを引くことによって０に向かって縮小できる。
δｋ’（ｘ＊）＝δｋ（ｘ＊）−ａｒｇｍｉｎｋδ（ｘ＊）
試料ｘ＊に関する分類規則は、δｋ’（ｘ＊）＝０の場合である。ａｒｇ  ｍａｘδ’ｋ（ｘ＊）は、試料ｘ＊に関する可能性の低いクラスへの距離である。本発明者らは、ａｒｇ  ｍａｘδ’ｋ（ｘ＊）を、本明細書において可能性の高いクラスに関する「尤度スコア」として使用する。
【００６５】
クラス予測因子は、１８例のランダムに選択されたＢＲＣＡ１変異乳腺腫瘍及び３２例の散発性乳腺腫瘍について構築され、１０例のＢＲＣＡ１変異腫瘍及び１６例の散発性腫瘍の独立したセットについて評価した。ＨＢＯＣ腫瘍群の検査を可能にするために、基準区間は、訓練スコア及び評価スコアの９５％に基づいた。視認性のために、散発性腫瘍群に関するスコアを負に、ＢＲＣＡ１のスコアを正に示す。
【００６６】
１．１．７メチル化の検出
ＢＲＣＡ１プロモーターの過剰メチル化を、メチル化ＭＬＰＡを使用して、製造業者のプロトコル（ＭＲＣ−Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＥ００１）に従って、３０周期のＰＣＲで決定した。２μｌのＭＬＰＡ−ＰＣＲ産物を、９．８μｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢ、４３１１３２０）及び０．２μｌのＲＯＸ−５００（ＡＢ、４０１７３４）に加え、３７３０ＤＮＡシークエンサー（ＡＢ）において分析した。
【００６７】
１．１．８  ヘテロ接合性の消失
ＢＲＣＡ１遺伝子座におけるＬＯＨを、５つのマーカー：Ｄ１７Ｓ５７９、Ｄ１７Ｓ５８８、Ｄ１７Ｓ１３２２、Ｄ１７Ｓ１３２３及びＴＨＲＡ１を使用して決定した。プライマー及びＰＣＲプログラムを、表４及び５に記載する。１μｌのＰＣＲ産物を、１４．９μｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミド及び０．１μｌのＲＯＸ−３５０（ＡＢ、４０１７３５）に加え、３７３０ＤＮＡアナライザーを使用して分析した。
【００６８】
１．１．９  ＧＥＯ
マイクロアレイのデータは、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託されており、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓアクセス番号ＧＳＥ９０２１（ＢＲＣＡ１関連腫瘍）及びＧＳＥ９１１４（散発性腫瘍）を介してアクセス可能である。
【００６９】
２．結果
全体で、本発明者らは、２８例のＢＲＣＡ１関連腫瘍、４８例の散発性腫瘍及び４８例ＨＢＯＣの乳腺腫瘍のアレイＣＧＨプロファイルを得た。本発明者らは、染色体異常及びそれらの位置、腫瘍群の間の差異及び本発明者らのＣＧＨの結果に基づくクラス予測因子の判別力を、本明細書に報告する。
【００７０】
２．１  染色体異常
染色体異常を分析するために、本発明者らは、切断点の位置及び推定コピー数レベルを、ＣＧＨセグメンテーションアルゴリズム（Ｐｉｃａｒｄ  ２００５年）を使用して決定した。推定コピー数レベルに基づいて、全ＢＡＣクローンの増減の頻度を、それぞれ０．２及び−０．２の固定ｌｏｇ２比の閾値を使用して計算した。図１は、ＢＲＣＡ１関連腫瘍（図１Ａ）及び散発性（図１Ｂ）乳腺腫瘍に関するＢＡＣクローンの増加（灰色）及び減少（黒）の頻度を表す。異常の位置及び平均頻度を、表６に詳細に記載する。ＢＲＣＡ１関連腫瘍において、１３の領域（＞１０Ｍｂ）増加及び１２の領域減少が、腫瘍の＞２０％において観察された。同じ基準を使用して、本発明者らは、散発性乳腺腫瘍において、４つの染色体領域において増加及び６つの領域減少を観察した。ｔ検定を用いて計算すると、ＢＲＣＡ１関連腫瘍において発見された２１のこれらの異常は、散発性症例におけるそれらの領域と有意に異なり（ｐ＜０．００１）、散発性腫瘍において発見された７つの異常は、同じ領域におけるＢＲＣＡ１関連腫瘍と有意に異なった（ｐ＜０．００１）。全体として、４つの異常が、２つの群の間で有意に異ならなかった（ｐ＞０．００１）。
【００７１】
２．２  ＢＲＣＡ１乳腺腫瘍及び散発性乳腺腫瘍のクラス予測因子
本発明者らは、２種の乳癌型：生殖細胞系列変異ＢＲＣＡ１（クラス１）腫瘍と散発性腫瘍（クラス２）を区別するための分類方法として、最短収縮重心法（ＳＣ）を使用した。個々のセットの試料の２／３、すなわち、１８例のＢＲＣＡ１腫瘍及び３２例の散発性腫瘍を、ＳＣ分析のためにランダムに選択した。リーブワンアウト交差検証（ＬＯＯＣＶ）（補足データＬＯＯＣＶ）に基づき、Δ＝１．３（Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００６年、式５）を使用して分析を実施し、１９１の特徴を判別的に選択した。試料の残りの１／３を、クラス予測因子に関する外部検証として使用した。ＢＲＣＡ１群（ｎ＝１０）の全試料を、ＢＲＣＡ１様として予測し、全散発性試料（ｎ＝１６）を散発性腫瘍として正確に分類した。ＢＲＣＡ１乳腺腫瘍に関する大部分の特性として選択された特徴は、染色体３ｑ２２−２７（増加）、５ｑ１２−１４（減少）、６ｐ２３−２２（増加）、１０ｐ１５−１４（増加）、１２ｐ１３（増加）、１２ｑ２１−２３（減少）及び１３ｑ３１−３４（増加）の領域において豊富であった。散発性腫瘍セットに特異的であった特徴は、染色体３ｑ２２−２６（減少）及び１３ｑ３１−３３（減少）の領域において豊富であった。ＳＣ法を使用して選択されたＢＡＣクローンを、表１及び２に記載する。図２Ａは、箱髭図における試料群の判別スコアの分布を表す。この図は、双方の腫瘍群を互いに非常によく区別できることを例示する。
【００７２】
２．３  性能検証
本発明者らの分類予測因子のロバスト性を、クラス予測因子の２／３の訓練用データセットの１５倍のランダムな選択及び試料の残りの１／３についての検証によりさらに検査した。全１５のさまざまな順列により、図３に見ることができるような１００％の性能がもたらされる。
【００７３】
２．４  受容体及びＰ５３の関与
本発明者らの腫瘍群において、ＢＲＣＡ１変異腫瘍は、一般的にＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２／Ｎｅｕ陰性（トリプルネガティブとしても知られる）であり、散発性症例のわずか１９％がトリプルネガティブである（表の試料の補足情報）。ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ又はＰ５３の状態と染色体異常の関係、したがって本発明者らのクラス予測因子についての影響を調査するために、階層的クラスタ分析（Ｅｉｓｅｎ  １９９８年）を、２８例のＢＲＣＡ１関連乳腺腫瘍及び４８例の散発性乳腺腫瘍のアレイＣＧＨの結果について実施した。同じ受容体又はＰ５３の状態を共有する腫瘍は、図４に見ることができるように、クラスタ内に存在しない。これらの結果は、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２１ｎｅｕ又はＰ５３の状態と本発明者らのＣＧＨ結果とは関連がないことを示す。
【００７４】
２．５  臨床における分類指標の適用
ＨＢＯＣ家族由来の４８例の患者（少なくとも２例の乳腺癌患者及び少なくとも１例の原発性卵巣癌）を、ＣＧＨを用いて選択し、分析した。クラス予測因子を適用し、本発明者らは、ＢＲＣＡ１様である２例の試料を発見し、４２例の試料を散発性癌として予測し、４例の試料は、９５％基準区間外であるとして確実にクラス指定できなかった。図２Ｂは、本発明者らのクラス予測因子を構築及び検証するために使用したＢＲＣＡ１関連腫瘍及び散発性腫瘍（図２Ａ）と比較した、臨床試料の分布を示す。ＢＲＣＡ１様と思われる試料は、ＨＲ０１５及びＨＲ０１９であった。全患者についての情報は、表７Ａ〜７Ｃに見出すことができる。
【００７５】
本発明者らがＢＲＣＡ１様として分類した乳癌症例における、ＢＲＣＡ１の関与のための証拠を発見するために、本発明者らは、もともとの診断設定（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｕｔ  ２００６年）に含まれていなかった追加の検査を実施した。ＢＲＣＡ１のプロモーターの過剰メチル化を、すべてのＢＲＣＡ１関連、散発性及びＨＢＯＣ試料に関して、ＭＬＰＡ−メチル化（ＭＲＣ−Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＥ００１）を使用して決定した。ＢＲＣＡ１様として分類された症例ＨＲ０１５のみが、ＢＲＣＡ１プロモーターにおいて過剰メチル化されていた。追加の分析もまた、同じ患者の卵巣腫瘍内のＢＲＣＡ１プロモーター部位における過剰メチル化を示すが、興味深いことに、彼女のリンパ球においては過剰メチル化が示されなかった。ＢＲＣＡ１のヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、試料ＨＲ０１５及びＨＲ０１９の双方において観察された。ＢＲＣＡ１のエクソン１１は、遺伝子の最も長いエクソンであり（タンパク質の６１％をコードする）、およそ３．４ｋＢ長であるので、配列決定は標準的診断手順ではないが、ＢＲＣＡ１のエクソン１１は、ＰＴＴ（Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ  １９９５年）により切断型変異に関してスクリーニングされる。本発明者らは、いずれの変異も見出されないエクソン１１を配列決定した。症例ＨＲ０１９に関して、ＢＲＣＡ１のメチル化又は分類されていない変異体は同定されなかったが、１つのＢＲＣＡ１の対立遺伝子の消失が腫瘍中に観察された。
【００７６】
３．考察
本発明者らは、ＢＲＣＡ１関連乳腺腫瘍が、散発性乳腺腫瘍と有意に異なる、特定ゲノムの異常を有するゲノムの再構成を発生することを示す。本発明者らのアレイＣＧＨデータに基づき、本発明者らは、これら２種の腫瘍群の間の最も有意な差異を同定でき、収縮重心法（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ２００２）を使用して、１００％の感度及び特異性のクラス予測因子を構築できた。ＢＲＣＡ１関連腫瘍と比較して、散発性乳腺腫瘍において異常はそれほど頻繁に見られない。ＢＲＣＡ１関連腫瘍に特異的な、同定された領域の多くは、公開されている（Ｔｉｒｋｋｏｎｅｎ  １９９７年、Ｗｅｓｓｅｌｓ  ２００２年、Ｖａｎ  Ｂｅｅｒｓ  ２００５年、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ２００５年、Ｊｏｈａｎｎｓｄｏｔｔｉｒ  ２００６年）が、組み合わされた受容体及びＰ５３の状態との相関はほとんどない。ＢＲＣＡ１腫瘍は、一般的にＥＲ、ＰＲ，及びＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性であることが報告されている（Ｌａｋｈａｎｉ  ２００２）。さらに、特定の遺伝子変化が受容体及びＰ５３の状態に関連することが示されている（Ｌｏｏ  ２００４年、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ  ２００６年）。ＥＲ陰性及び陽性の乳腺癌の間の染色体異常の差異は、４ｐ１６、５ｑ２３−３５、８ｐ２３−２１、１０ｐ１２、１０ｑ２５、１７ｑ１１、１９ｑ１３、及び２１ｑ２２に位置する（Ｌｏｏ  ２００４年）。Ｐ５３陽性及び陰性の乳腺腫瘍の間の染色体異常の差異は、３ｐ、４ｑ、５ｑ、８ｑ、１５ｑ及び１７ｑ（Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ  ２００６）である。本発明者らの腫瘍群の分離に対するＰ５３の状態の影響の可能性を防ぐために、Ｐ５３陰性及び陽性が均等分布の腫瘍を使用して、本発明者らのクラス予測因子を構築した。本発明者らは、双方の腫瘍クラス中に同数のＥＲ陰性腫瘍を有さなかったので（ＢＲＣＡ１関連腫瘍が優勢なので）、本発明者らは、受容体の状態が、本発明者らのクラス予測因子に影響を与えることがあり得るかどうかを、本明細書において考察するつもりである。ＥＲ及びＰ５３特異的染色体領域は、本発明者らのＣＧＨデータ（データ非掲載）において確認できるが、５ｑの小さな領域のみが本発明者らのクラス予測因子に存在し、ＥＲ及びＰ５３の状態が分類指標に強く影響しないことを示す。Ｗｅｓｓｅｌｓらは、古典的なＣＧＨを使用して、８４％の正確度で、ＢＲＣＡ１関連腫瘍及び散発性腫瘍をすでに分類しており、３ｐ及び５ｑにおける減少並びに３ｑにおける増加を判別異常として同定した。Ｆｒｉｄｌｙａｎｄらにより記載されたように、ＴＰ５３突然変異腫瘍は、染色体３ｐにおいて減少を示す。この染色体領域は、Ｗｅｓｓｅｌｓらの偽陽性の一因となり得る分類指標の一部である。染色体領域３ｑ及び５ｑは、本発明者らの現在のクラス予測因子に存在するが、３ｐは存在しない。このことは、双方の腫瘍群におけるＰ５３腫瘍の均等分布が、より良好な特異性の達成に寄与できたことを示唆する。
【００７７】
アレイＣＧＨの結果について、教師なしクラスタ分析を実施すると、同じ受容体又はＰ５３の状態を共有するＢＲＣＡ１関連腫瘍群及び散発性腫瘍群に由来する腫瘍は、クラスタの中に存在しない（図４）。分類性能１００％の教師なしクラスタリング及び双方の腫瘍クラス中のＰ５３陽性腫瘍が同じパーセントであることは、本発明者らの腫瘍予測において、Ｐ５３、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２ｎｅｕに特異的な染色体の不均衡が不在であることを強く示す。
【００７８】
臨床及び病理学的検討に基づくＢＲＣＡ１の状態の予測を報告する他の研究がある（Ｌａｋｈａｎｉ  ２００５年、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒｏｅｐ  ２００６年）。これらの研究は、タンパク質発現の調査は、機能不全のＢＲＣＡ１と明確に関連させることができず、現在利用可能なマーカーを用いた病理学的検討の難しさを示唆していることを示す。
【００７９】
本発明者らの分類技術を、非ＢＲＣＡ１／２家族由来の乳腺腫瘍に適用し、本発明者らは、４８例の腫瘍のうち２例をＢＲＣＡ１様であると同定した。すべての腫瘍はホルマリン固定パラフィン包埋であったので、本発明者らはＢＲＣＡ１のＲＮＡ発現を調査できなかった。しかし、ゲノムＤＮＡについてのさらなる分析により、これらの症例の１例において、ＢＲＣＡ１遺伝子の過剰メチル化及びＬＯＨが示され、ＢＲＣＡ１の機能不全が強く示された。ＢＲＣＡ１の変異による癌の形成は、一般的に、第２のＢＲＣＡ１様ＨＢＯＣ腫瘍においても発見された野生型の対立遺伝子の減少、すなわちＬＯＨを伴う。しかし、ＢＲＣＡ１遺伝子において新規及び記載された変異は、エクソン１１の配列決定後にこの腫瘍において同定できなかった。腫瘍形成におけるＢＲＣＡ１の関与に関して未だ証拠が発見されないことの１つの説明は、この腫瘍は散発的に生じるが、ＢＲＣＡ１の機能不全を患う（Ｔｕｒｎｅｒ  ２００７）ことであり得る。この特定の患者の家族歴は、平均的ＢＲＣＡ１関与家族（乳癌及び卵巣癌）と比較して異なり、脳腫瘍、結腸癌及び白血病もまた含み、さらにこの腫瘍は、ＢＲＣＡ１関連腫瘍には珍しいＥＲ及びＰＲ陽性であった（Ｌａｋｈａｎｉ  ２００２年）。この未解決のＢＲＣＡ１様の症例は、新しい技術及び知見が利用可能な場合、より集中的に分析されなければならない。
【００８０】
これら２例のＢＲＣＡ１様腫瘍を、Ｅｖａｎｓのスコアリング（Ｅｖａｎｓ  ２００４年）に従ってＢＲＣＡ１の変異を有する可能性を有することについて計算し、それぞれ２０％及び１１．８％であり、これはＥｖａｎｓスコア＞５０％の腫瘍と比較して驚くほど低く、ＢＲＣＡ１様であるとは分類されなかった。このことは、家族歴に基づくリスク予測が完璧でなく、また、機能不全のＢＲＣＡ１を有する散発性腫瘍（Ｔｕｒｎｅｒ  ２００７）が、明らかに家族に基づくモデルを使用して予測できなかったことを示唆する。
【００８１】
ＢＲＣＡ１関連腫瘍群及び散発性腫瘍群内の判別スコアの多様性に関する理由のいくつかは、ｌｏｇ２比の間の技術的誤差であり、さらに抑制された腫瘍プロファイルを起こし得る腫瘍パーセントの過大評価が、分類の誤りをもたらす可能性がある。したがって、本発明者らは、本発明者らのデータの９５％に基づく基準区間を用いた。本発明者らの被験ＨＢＯＣ乳腺癌の４例は、本発明者らの分類の９５％基準区間の外側に終わった。９５％基準区間の外側の判別スコアは小さすぎて信頼性がないので、本発明者らはこれらの症例の分類を差し控える。
【００８２】
大きな系でのさらなる検証が必要であるが、本発明者らは、現在の診断は、大部分の遺伝性のＢＲＣＡ１関連乳腺腫瘍を発見すると結論付ける。しかし、本発明者らは、ＢＲＣＡ１関連乳腺腫瘍を発見できるが、本発明者らの取り組みは、ＢＲＣＡ１関連が未だ不明確な、ＢＲＣＡ１変異を担持する家族を同定するための追加のツールとしてもまた使用できる。将来は、変異を担持する可能性が最も高い、集中的ＤＮＡスクリーニングに関してハイリスクな家族内の個人を選択するために、この検査を日常の診断に含めることが可能になるもしれず、ＤＮＡ診断を導くために使用できる。さらに、非分類の変異体（Ｔｉｓｃｈｋｏｗｉｔｚ提出）の重要性に関する指示をもたらし得る。本発明者らの方法は、ＢＲＣＡ１関連に関する臨床試料の予測において、腫瘍材料についての病理学的検討及び他のすべての方法より優れている。
【００８３】
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【００８４】
表１．ＢＲＣＡ１関連腫瘍と散発性腫瘍を識別する方法における使用のための、コピー数異常のある染色体領域の定義
【表１】
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【００８５】
表２．本発明のゲノム位置におけるコピー数異常を検出するためのプローブを、検出又は作製するために使用できる例示的ＢＡＣクローン
【表２−１】
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【表２−２】
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【００８６】
表３．分析されたＢＲＣＡ１変異保因者、散発性癌及びＨＢＯＣ乳腺癌の保因者の病理学的特性
【表３】
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【００８７】
表４．ＬＯＨ  ＰＣＲプライマー
【表４】
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【００８８】
表５．ＬＯＨ  ＰＣＲプログラム
【表５】
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【００８９】
表６．高頻度（＞２０％）の異常染色体領域（＞１０Ｍｂ）に関する、２８例のＢＲＣＡ１関連腫瘍及び４８例の散発性乳腺腫瘍の異常の平均頻度及び位置。腫瘍群の間の異常の差異の有意性に関するｐ値
【表６】
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【００９０】
表７Ａ．ＢＲＣＡ１関連患者の患者情報
【表７】
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【００９１】
表７Ｂ．散発性患者の患者情報
【表８−１】
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【表８−２】
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【００９２】
表７Ｃ．ＨＢＯＣ患者の患者情報
【表９−１】
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【表９−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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