(57)【要約】  TRPCイオンチャネルは、ヒト組織において広く発現される非選択的チャネルである。これらのチャネルは多数の生理学的機能に関与しており、そして新規な薬剤開発のための推定標的である。細胞及びそれ以外におけるTRPCイオンチャネルのより良好な理解を得るニーズが存在する。  本発明は、TRPCサブファミリーの識別性の阻害のために、TRPCイオンチャネルの研究を可能にする薬理学的ツール化合物を提供する。本発明において、ノルゲスチメートは、TRPC3、TRPC6及びTRPC7を選択的に阻害することが示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰＣイオンチャネルの阻害のための、ノルゲスチメートの使用。
【請求項２】
ＴＲＰＣイオンチャネルが、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７からなるリストより選択される、請求項１に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項３】
ノルゲスチメートが、ＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーよりもＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバーに対して少なくとも４倍強い効力を有する、請求項１または２に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項４】
ノルゲスチメートが、種々のＴＲＰＣサブファミリーに属するチャネルの特徴づけを可能にする薬理学的ツールとして使用される、請求項１または２に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項５】
インビトロで行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項６】
非ヒト動物においてインビボで行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項７】
生理学的条件下及び病態生理学的条件下でのそれぞれＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバー及びＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーのチャネル機能のディファレンシャル解析を行うためにノルゲスチメートが使用される、請求項２に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項８】
解析が細胞において行われる、請求項７に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項９】
解析が組織において行われる、請求項７に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項１０】
解析が非ヒト動物において行われる、請求項７に記載のノルゲスチメートの使用。
【請求項１１】
ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している細胞をノルゲスチメートと接触させることを含む、ＴＲＰＣイオンチャネルを選択的に阻害するための方法。
【請求項１２】
ＴＲＰＣイオンチャネルが、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７からなるリストより選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロで行われる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト動物においてインビボで行われる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＲＰＣイオンチャネル活性に対するノルゲスチメートの効果を決定するための方法であって：
ａ）ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している細胞を接触させること、
ｂ）細胞をノルゲスチメートと接触させる前、同時、又は後に、チャネル活性化剤によりＣａ2+流入を刺激すること、及び
ｃ）ＴＲＰＣイオンチャネル活性の変化を測定又は検出すること、
を含む、方法。
【請求項１６】
ＴＲＰＣイオンチャネルモジュレーターを同定するための方法であって：
ａ）ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している細胞を接触させること、
ｂ）細胞を試験化合物と接触させる前、同時又は後に、チャネル活性化因子によりＣａ2+流入を刺激すること、及び
ｃ）ＴＲＰＣイオンチャネル活性の変化を測定又は検出すること、
を含む、方法。
【請求項１７】
細胞が蛍光細胞である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３又はＣＨＯ細胞より選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＲＰＣイオンチャネル活性が、Ｃａ2+流入の変化を測定若しくは検出することにより、パッチクランプ技術、全細胞電流、放射標識されたイオンフラックス、又は電位感受性色素若しくはイオン感受性色素を使用する蛍光により、測定又は検出される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動物がマウス又はラットである、請求項６または１０に記載の使用、並びに請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＲＰＣイオンチャネル活性を阻害するノルゲスチメートの能力を評価すること、そしてノルゲスチメートの阻害効力を種々のＴＲＰＣサブファミリー間及びＴＲＰＣサブファミリー内で比較することを含む、ＴＲＰＣイオンチャネルについてのノルゲスチメートの選択性をプロファイリングするための方法。
【請求項２２】
心臓血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末期腎不全、神経系疾患、慢性疼痛、急性疼痛、又は炎症性疾患の処置のための薬剤の製造における、ノルゲスチメートの使用。
【請求項２３】
対象に治療有効量の、ノルゲスチメートを含む組成物を投与することを含む、心臓血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末期腎不全、神経系疾患、慢性疼痛、急性疼痛、又は炎症性疾患の処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＣ３／６／７イオンチャネルサブファミリーのメンバーの選択的阻害剤としてのノルゲスチメートの使用に関し、これは、上記サブファミリーメンバーと他のＴＲＰＣサブファミリーとを薬理学的に区別することを可能にする。また、細胞モデル、組織又は動物モデルにおいてＴＲＰＣイオンチャネルを同定、特徴づけ及び調節するためのノルゲスチメートの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＣチャネルは、ヒト組織において広く発現される非特異的カチオンチャネルである（Ｍｏｎｔｅｌｌ２００５）。これらはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＴＲＰの最初に発見された哺乳動物相同体であった（Ｗｅｓら、１９９５、Ｚｈｕら、１９９５）。ＴＲＰＣ１−７と呼ばれる７つのタンパク質は、原型的なショウジョウバエＴＲＰに関連する最も近い（３０−４０％同一性、Ｏｋｕｈａｒａら、２００７）標準的な（又は伝統的な）ＴＲＰサブファミリーを構成する。
【０００３】
アミノ酸配列相同性、組織分布及び機能類似性に基づいて、ＴＲＰＣは４つのグループに下位分類することができる（Ｃｌａｐｈａｍら、２００１；Ｍｏｎｔｅｌｌ、２００１）。ＴＲＰＣファミリー内でかなり独特であり、ＴＲＰＣ１及びＴＲＰＣ２はそれぞれそれら自体でサブファミリーを構成するが、ＴＲＰＣ４及び−５は、ＴＲＰＣ３、−６、及び−７のように統合される。密接に関連するＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７チャネルは、共通の活性化機構を共有しており、そしてジアシルグリセロール（ＤＡＧ）はそれらの内因性リガンドとして同定されている（Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９；Ｏｋａｄａら、１９９９）。
【０００４】
ＷＨＯによれば、２００５年における世界中の全ての死亡の３０％が種々の心臓血管疾患により引き起こされた。従って、心臓血管疾患を予防及び処置する新しい医薬に対する非常に大きな医療的必要性が存在する。ＴＲＰＣチャネルは、心筋ミオパチー、血管リモデリング、高血圧及び高い内皮浸透性を含むいくつかの心臓血管病理のための新規な薬剤の開発のための重要な薬理学的標的と考えられる（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００７）。
【０００５】
しかしこれまで、それらの天然の組成及び活性化機構、生理的機能、並びに病態生理学及び疾患における役割に関して多くの未解決の疑問が存在する。天然のＴＲＰＣチャネルのインサイチュ同定は、それらの広くて部分的な分布の重なり、潜在的なヘテロマルチマー化、類似した電気生理学的特性及びこれらのチャネルを明白に追跡するためのツール化合物の不足により複雑になる（Ｍｏｒａｎら、２００４）。
【０００６】
公知のＴＲＰＣ有機阻害剤、例えば２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）（Ｘｕら、２００５）、ＳＫＦ９６３６５（Ｂｏｕｌａｙら、１９９７；Ｚｈｕら、１９９８）及びＢＴＰ２（Ｈｅら、２００５）、並びに無機遮断薬、例えばＧｄ3+及びＬａ3+は強力ではなく、十分に特異的でない （Ｌｉら、２００４）。
【０００７】
トランスジェニックマウスにおける研究は、特定のＴＲＰＣの可能な生理学的機能を解明する際に有益であることが既に分かっている（Ｆｒｅｉｃｈｅｌら、２００１）。しかしこれらのモデル系は７つの哺乳動物ＴＲＰＣチャネルのそれぞれについてはこれまで存在しておらず、それらの生成及び解析は、時間及び費用がかかり、そしてそれらは密接な関連があるチャネルによる補整効果に対して不安定であるという制限を有する（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００５ｃ）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ＴＲＰＣサブファミリー間及びＴＲＰＣサブファミリー内を区別することを可能にし、それにより生理学的条件下、さらには病態生理学的条件下での異なるチャネルの役割を解明することを可能にする、新しい薬理学的ツールを開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、これはＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７を選択的に阻害するためにノルゲスチメートを使用することで達成される。従って、ノルゲスチメートは、異なるＴＲＰＣサブファミリーに属するチャネルを薬理学的に区別することを可能にする。さらに、ノルゲスチメートは、一般的なＧタンパク質共役受容体、Ｇｑ、多くの細胞においてＴＲＰＣチャネル活性化を仲介するホスホリパーゼＣβ経路と干渉しない。これらの特性が、ノルゲスチメートを、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７の同定及び調節のための好ましいツールにしている。
【００１０】
発明の要旨
本発明の１つの主題は、ＴＲＰＣイオンチャネルの選択的阻害剤としてのノルゲスチメートの使用に関する。ノルゲスチメートにより選択的に阻害されるＴＲＰＣイオンチャネルは好ましくはＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６又はＴＲＰＣ７である。ノルゲスチメートは、インビトロ及びインビボでＴＲＰＣイオンチャネルを選択的に阻害するために使用され得る。
【００１１】
特に、ノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーよりもＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバーに対して少なくとも４倍強い効力を有する（図１及び２）。ＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーよりもＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバーに対して４倍強い効力を有するノルゲスチメートは、蛍光分析測定を用いて、そして１０μＭノルゲスチメートによる算出された阻害に基づいて評価された。
【００１２】
これらの蛍光分析測定は、全細胞構成におけるパッチクランプ記録を用いて典型的に確認した（図３）。
【００１３】
ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７の選択的阻害剤として、ノルゲスチメートは、異なるＴＲＰＣサブファミリーに属するチャネルを特徴付けすることを可能にする薬理学的ツールとして使用され得、これはＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバーと他のＴＲＰＣイオンチャネルサブファミリーのメンバーを区別する（図１、２及び３）。
【００１４】
このような阻害剤として、ノルゲスチメートはさらに、それぞれのイオンチャネルの活性を測定するアッセイを開発及び検証するためのツール化合物として使用され得る。このようなアッセイの例を図１に示す。
【００１５】
本発明の別の主題は、生理学的条件下及び病態生理学的条件下で、それぞれＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバー及びＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーのチャネル機能のディファレンシャル解析を行うための、ノルゲスチメートの使用に関する。これは、例えば例示（Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において記載されるように行うことができる。分析は、細胞、組織又は動物において行うことができる。動物は、げっ歯動物、好ましくはマウス又はラットであり得る。
【００１６】
好ましい実施態様によれば、ノルゲスチメートによる天然ＴＲＰＣの調節は、Ａ７ｒ５細胞株を使用して調べることができ、これは内因的に発現されたＴＲＰＣイオンチャネルの研究に有効なモデル系である。このような好ましいアッセイ系のさらなる詳細は、例示及び図４に示される。
【００１７】
本発明の別の主題は、ＴＲＰＣチャネル活性に対するノルゲスチメートの効果を決定する方法に関する。好ましいＴＲＰＣイオンチャネルは、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７である。
【００１８】
一般に、ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している細胞をノルゲスチメートと接触させ、そしてＴＲＰＣイオンチャネル活性に対するノルゲスチメートの影響を測定又は検出する。
【００１９】
本発明の別の主題は、ＴＲＰＣイオンチャネルモジュレーターを同定する方法に関する。好ましいＴＲＰＣイオンチャネルは、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７である。
【００２０】
一般に、ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している細胞を試験化合物と接触させて、ＴＲＰＣイオンチャネル活性に対する試験化合物の影響を測定又は検出する。
【００２１】
好ましい実施態様において、上記方法において使用される細胞は、蛍光性細胞である。
【００２２】
本発明に従う好ましい細胞は、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３又はＣＨＯ細胞であり、特にＨＥＫ２９３細胞である。
【００２３】
ＴＲＰＣチャネル活性は、イオンフラックス、特にＣａ2+フラックスの変化を、例えばパッチクランプ技術、全細胞電流、放射標識イオンフラックス、又は特に蛍光、例えば電位感受性色素もしくはイオン感受性色素を使用して測定又は検出することにより測定又は検出することができる（Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら（１９８８）、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．、８８：６７−７５；Ｄａｎｉｅｌら（１９９１）  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３；Ｈｏｅｖｉｎｓｋｙら（１９９４）  Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．、１３７：５９−７０；Ａｃｋｅｒｍａｎら（１９９７）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：１５７５−１５９５；Ｈａｍｉｌら（１９８１）、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．、３９１：１８５）。
【００２４】
ＴＲＰＣイオンチャネル活性の測定の例は、以下の工程：
（ａ）  ＴＲＰＣイオンチャネルを発現している蛍光性細胞を接触させる工程、
（ｂ）  蛍光性細胞をモジュレーター又は試験化合物と接触させる前、同時又は後に、チャネル活性化剤によりＣａ2+流入を刺激する工程、及び
（ｃ）  蛍光の変化を測定又は検出する工程、
を含むアッセイである。
【００２５】
本発明の別の主題は、ＴＲＰＣチャネル活性を阻害するノルゲスチメートの能力を評価すること、そしてノルゲスチメートの阻害効力を異なるＴＲＰＣサブファミリー間及びＴＲＰＣサブファミリー内で比較することを含む、ＴＲＰＣチャネルについてのノルゲスチメートの選択性をプロファイリングするための方法  に関する。
【００２６】
本発明の別の主題は、心臓血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末期腎不全、神経系疾患、慢性疼痛、急性疼痛、又は炎症性疾患の処置のための薬剤の製造における、ノルゲスチメートの使用に関する。
【００２７】
ノルゲスチメートは、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる担体又は補助物質とともに製剤化され得る。薬学的に許容しうる担体又は補助物質は、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定化剤、例えばプロテアーゼ若しくはヌクレアーゼ阻害剤、又は金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡである。
【００２８】
本発明の別の主題は、対象（subject）に治療有効量の、ノルゲスチメートを含む組成物を投与することを含む、心臓血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末期腎不全、神経系疾患、慢性疼痛、急性疼痛、又は炎症性疾患の処置の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（Ａ、Ｃ）はｆｌｕｏ−４をロードして誘導されたＴＲＰＣ３  ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）及びＴＲＰＣ６  ＨＥＫ２９３細胞（Ｃ）の細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の時間依存性変化を表すグラフである。３０μＭ  ＯＡＧの適用後のＴＲＰＣ仲介Ｃａ2+流入は、３０μＭノルゲスチメート（ＮＧ）とともにプレインキュベートした細胞において著しく減少した。測定を９６ｅｒウェルプレートでＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。  （Ｂ、Ｄ）はＴＲＰＣ３（Ｂ）及びＴＲＰＣ６（Ｄ）に対するノルゲスチメートＩＣ50値の決定を表すグラフである。データを、１ウェルあたり４５，０００細胞を含む２ウェル（Ｂ）及び４ウェル（Ｄ）の平均として表す。
【図２】（Ａ、Ｃ）はｆｌｕｏ−４をロードして誘導されたＴＲＰＣ４  ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）及びＴＲＰＣ５  ＨＥＫ２９３細胞（Ｃ）の細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の時間依存性変化を表すグラフである。２００ｎＭトリプシン適用後のＴＲＰＣ仲介Ｃａ2+流入は、３０μＭノルゲスチメート（ＮＧ）とともにプレインキュベートした細胞においてわずかに減少した。測定を９６ｅｒウェルプレートでＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。  （Ｂ、Ｄ）はＴＲＰＣ４（Ｂ）及びＴＲＰＣ５（Ｄ）に対するノルゲスチメートＩＣ50値の決定を表すグラフである。データを、１ウェルあたり４７，０００細胞を含む２ウェル（Ｂ）及び４ウェル（Ｄ）の平均として表す。
【図３】誘導されたＴＲＰＣ６−（Ａ）及びＴＲＰＣ５  ＨＥＫ  ２９３（Ｂ）細胞へのＡｌＦ4-注入により惹起された全細胞電流に対する１０μＭノルゲスチメート（ＮＧ）の効果を示す図である。全細胞電流は−７０ｍＶで記録され（左パネル）、そして対応する電流−電位（Ｉ−Ｖ）関係を示す（右パネル）。バックグラウンド補正のために、チャネルを１０μＭ  Ｌａ3+（Ａ）又は１０μＭ  ２−ＡＰＢ（Ｂ）で完全に遮断した。−１００〜＋８０ｍＶの電位ランプの間に曲線を得た。  （Ｃ）  ＴＲＰＣ５仲介電流及びＴＲＰＣ６仲介電流に対するノルゲスチメートの効果の統計的解析を示す。１０μＭノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ５仲介電流の２５．９±５．７％（ｎ＝２０）、及びＴＲＰＣ６仲介電流の８９．９±３．１％（ｎ＝１５）を阻害する（Ｐ＜０．００１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、両側）。
【図４】ｆｕｒａ−２をロードしたＡ７ｒ５細胞の［Ｃａ2+］iの時間依存性変化を示す図である。細胞を、１０μＭノルゲスチメート（ＮＧ）とともに、又は１０μＭノルゲスチメートなしで（コントロール）、カルシウム非含有標準細胞外溶液（１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中にて、１００ｎＭ  ＡＶＰの適用によるＶ１受容体を刺激する前の５分間プレインキュベートした。データを３３細胞（コントロール）及び３６細胞（１０μＭノルゲスチメート）の平均として示す。  標準的イメージング設定（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定を行った。
【図５】標準細胞外溶液（２００μＭ  ［Ｃａ2+］o）中のＡ７ｒ５細胞における１００ｎＭ  ＡＶＰにより惹起された全細胞電流に対する１０μＭノルゲスチメート（ＮＧ）の効果を示す図である。全細胞電流は−６０ｍＶで記録し（左パネル）、そして対応するＩ−Ｖ関係を示す（右パネル）。−１００〜＋８０ｍＶの電位ランプの間に曲線を得た。Ｌ−型電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）Ｃａ2+チャネルは、５μＭニモジピン（ＮＤ）により全実験の間遮断された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の文脈における用語「ＴＲＰＣイオンチャネル」又は「ＴＲＰＣ」は、Ｃａ2+透過性非選択的カチオンチャネルを指す。これは以下の一過性受容体電位標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）イオンチャネルのリストのうちいずれか１つを意味するべきである：ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７。ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及び／又はＴＲＰＣ７が特に好ましい。
【００３１】
このようなＴＲＰＣイオンチャネルは、あらゆる脊椎動物由来、特に哺乳動物種（例えば、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ科動物、ウサギ、ニワトリ、類人猿、ヒト又はその他）由来であり得る。ＴＲＰＣは、このような脊椎動物生物の組織プローブから単離され得るか、又はＴＲＰＣタンパク質を発現することができる組み換え生物学的材料を用いて製造され得る。
【００３２】
この用語は、天然のポリペプチド、多型変異体、突然変異体、及び種間相同体を指していてもよい。
【００３３】
「ノルゲスチメート」は、その化学名Ｄ−１７．ベータ．−アセトキシ−Ｂ−エチル−１７．アルファ．エチニル−ゴナ−４−エン−３−オンオキシムでも知られる。これは天然に存在する女性ホルモンプロゲステロンの合成形態であるゲスタゲンである。ノルゲスチメートは、先行技術においてホルモン避妊薬の組成物において使用される分子である。
【００３４】
本発明において、ノルゲスチメートはＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７の選択的阻害剤として使用される。
【００３５】
本発明の文脈における用語「選択的阻害」は、ＴＲＰＣファミリーの１つ又はそれ以上のメンバーを、１つ又はそれ以上の他のメンバーよりも高い有効性で阻害する、阻害剤、例えばノルゲスチメートの効力を指す。好ましい実施態様において、ノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ４／５サブファミリーに対してよりもＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーに対してより有効である。より好ましい実施態様において、ノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ４／５サブファミリーよりもＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーに対して少なくとも４倍有効である。
【００３６】
用語「薬理学的ツール」は、その機能的特性により、薬物がどのように生存生物と相互作用して目的の機能の変化を生じるのかを調べることが可能になり、それにより新しい薬物組成及び特性、相互作用、毒性、治療法、医療的応用及び抗病原体能力を調べることが可能になる、化合物を指す。さらに、この用語は、新規な薬剤の開発のための可能性のある標的を特徴付けするため、例えばそれらの天然の組成、活性化機構、生理的機能、並びに病態生理及び疾患における役割を特徴付けするために使用され得る化合物を指す。
【００３７】
用語「ディファレンシャル解析」は、同じ条件下でＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーメンバーとＴＲＰＣ４／５サブファミリーメンバーとの間のチャネル機能の差異を特徴づけることを可能にする分析を指す。
【００３８】
好ましい実施態様によれば、それぞれＴＲＰＣ６イオンチャネル及びＴＲＰＣ５イオンチャネルを発現している細胞を、２つの並行実験でノルゲスチメートと接触させ、そしてノルゲスチメートのそれぞれのＴＲＰＣイオンチャネルの活性に対する影響を測定又は検出し、同じ条件下でそれぞれのチャネルの機能を比較することが可能となる。
【００３９】
用語「ＴＲＰＣイオンチャネルモジュレーター」は、ＴＲＰＣチャネルを調節する分子、特に阻害又は活性化する分子（「阻害剤」又は「活性化剤」）、特に本発明の方法にしたがって同定可能なＴＲＰＣチャネルの阻害剤を意味する。
【００４０】
阻害剤は、一般的に、好ましくは上で詳細に記載されたＴＲＰＣチャネルの少なくとも１つの、例えば結合して活性を部分的若しくは完全に遮断するか、活性を低減、防止、遅延させるか、活性若しくは発現を不活化するか、感受性を減じるか、又は下方調節する化合物である。
【００４１】
活性化剤は、一般的に、好ましくは上で詳細に記載されたＴＲＰＣチャネルの少なくとも１つの活性又は発現を、増加させるか、開口させるか、活性化するか、促進するか、活性化を増強するか、感受性にするか、アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅｓ）か、又は上方調節する化合物である。
【００４２】
このようなモジュレーターには、ＴＲＰＣチャネルの遺伝的改変された変形、好ましくはＴＲＰＣチャネルの不活化変異体、さらには天然に存在すか又は合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、有機低分子などが含まれる。
【００４３】
ＴＲＰＣ活性化剤の例は、ジアシルグリセロール、特に１−オレイル−２アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、Ｇｑ−共役受容体アゴニスト、例えばフェニレフリン及び特にトリプシン、受容体チロシンキナーゼを刺激するアゴニスト、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）又はジアシルグリセロール生成酵素、例えばホスホリパーゼ又はその活性化剤である。
【００４４】
試験化合物の存在下でのＴＲＰＣイオンチャネル活性調節の測定の例は、以下のとおりである：
一般に、ＴＲＰＣチャネルを発現する細胞が供給される。このような細胞は、当業者に公知の遺伝的方法を使用して製造することができる。ＴＲＰＣチャネルの発現を誘導した後、通常は細胞を、例えばマイクロタイタープレートにプレーティングし、成長させる。通常、細胞はマルチウェルプレートの底部で成長し、固定される。その後、一般的には、細胞を洗浄し、適切なローディングバッファー中の色素、好ましくはｆｌｕｏ４ａｍのような蛍光色素をロードする。ローディングバッファーを除去した後、細胞を試験化合物又はモジュレーターとともに、例えば化学的化合物ライブラリーの形態の、特に上記のような生化学的又は化学的試験化合物とともに、インキュベートする。Ｃａ2+測定は、例えば蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を使用して行うことができる。ＴＲＰＣチャネルを介するＣａ2+流入を刺激するために、チャネル活性化剤、例えばＯＡＧを一般には適用するべきである。
【００４５】
阻害剤の期待される効果は、例えば蛍光増加の減少だろう。活性化剤は、例えば活性化剤誘発蛍光のさらなる増加をもたらすか、又は例えば活性化剤依存性蛍光増加を誘導するだろう。
【００４６】
その後、適切なモジュレーター、特に阻害剤を、分析及び／又は単離することができる。化学的化合物ライブラリーのスクリーニングには、ハイスループットアッセイの使用が好ましくは、これは当業者に公知であるか、市販されている。
【００４７】
用語「ＴＲＰＣを発現している細胞」は、目的のイオンチャネルを内因性発現している細胞又は組み換え細胞を指す。
【００４８】
この細胞は、通常は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター細胞などである。都合の良いことが知られている細胞としては、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３及びＣＨＯ細胞が挙げられ、好ましくはＨＥＫ２９３細胞である。
【００４９】
本明細書で使用される用語「組織」は、好ましくは脊椎動物由来である場合、より好ましくは哺乳動物、例えばヒト由来である場合、あらゆる種類の組織調製物又は組織若しくは器官（例えば、脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、血管、筋肉、皮膚など）の採取された部分のことを指すことができ、そしてあらゆる種類の体液（例えば、血液、唾液、リンパ液、滑液など）も指すことができる。組織サンプルは、周知の技術、例えば採血、組織穿刺（ｐｕｎｃｔｉｏｎ）又は外科技術により得ることができる。
【００５０】
このような測定において使用される色素の例は、ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ（ピリジニウム４−（２（６−（ジブチルアミノ）−２−ナフタレニル）エテニル）−１−（３−スルホプロピル）ヒドロキシド）、ＣＣ−２−ＤＭＰＥ（１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン  トリエチルアンモニウム）、ＤｉＳＢＡＣ２（ビス−（１，２−ジバルビツール酸）−トリメチンオキサノール）、ＤｉｓＢＡＣ３（（ビス−（１，３−ジバルビツール酸）−トリメチンオキサノール）、ＳＢＦＩ−ＡＭ（１，３−ベンゼンジカルボン酸，４，４’−［１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン−７，１３−ジイルビス（５−メトキシ−６，１２−ベンゾフランジイル）］ビス−（テトラキス−［（アセチルオキシ）メチル］エステル））、ｆｌｕｏ３ａｍ（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５＜１＞−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ））、ｆｌｕｏ４ａｍ（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−４−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ））又はｆｕｒａ２ａｍ（１−ｔ２−（５’−カルボキシオキサゾール−２’−イル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキシ］−２−（２’−アミノ−５＜ｌ＞−メチル−フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ））である。
【００５１】
用語「プロファイリング」は、化合物、例えばノルゲスチメートを、機能及び構造の分類、効力、特異性、選択性並びに作用機序により特徴付けすることを指す。本発明において、これは特に、ＴＲＰＣイオンチャネルに対するノルゲスチメートの阻害効果の選択性研究を指す。
【００５２】
用語「薬剤」は、治療有効量のノルゲスチメート及び１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる担体又は補助物質を含む組成物を指す。
【００５３】
薬剤は、従来の方法のいずれかで全身投与又は局所投与され得る。これは、例えば経口投薬形態、例えば、錠剤又はカプセル剤を用いて、粘膜、例えば鼻腔又は口腔により、皮下に移植された配置剤（ｄｉｓｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）の形態で、本発明に従う薬剤を含む注射、注入又はゲルによるものであり得る。上記のような特定の疾患を処置するために、薬剤を局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ及びｌｏｃａｌｌｙ）、適切な場合はリポソーム複合体の形態で投与することもさらに可能である。
【００５４】
薬剤はまた、注射液又は注入の形態で投与することもできる。注射液は、一般に、比較的少量の溶液又は懸濁液、例えば約１〜２０ｍｌのみが身体に投与される場合に使用される。輸液剤（ifusion solution）は一般に、より大量の溶液又は懸濁液、例えば１リットル又はそれ以上が投与される場合に使用される。しかし、比較的大量の投与の場合、本発明に従う製剤は、投与の直前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度まで希釈されるべきである。等張溶液の例は、０．９％力価（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の塩化ナトリウム溶液である。注入の場合、希釈は例えば滅菌水を使用して行うことができ、投与は例えばいわゆるバイパスを介して行うことができる。
【００５５】
以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明する。
【実施例】
【００５６】
例証
１．ＦＬＩＰＲ測定
ＴＲＰＣ３／６
ＴＲＰＣ３及びＴＲＰＣ６を、オレイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）（膜透過性ジアシルグリセロール類縁体）を適用することにより直接活性化した。３０μＭ  ＯＡＧ適用後にＴＲＰＣ３仲介Ｃａ2+流入及びＴＲＰＣ６仲介Ｃａ2+流入は、３０μＭノルゲスチメートとともにプレインキュベートした細胞において著しく減少した（図１Ａ、Ｃ）。ＴＲＰＣ３に対するノルゲスチメートのＩＣ50は、２．８±０．４μＭであった（ｎ＝２、図１Ｂ）。ノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ６に対して５．２±０．４μＭのＩＣ50で同様に活性であった（ｎ＝４、図１Ｄ）。
【００５７】
ＴＲＰＣ４／５
これらの実験を行ったとき、ＴＲＰＣ４及びＴＲＰＣ５の直接的な生理的刺激薬は知られていなかった。従って、両方のチャネルを間接的に、例えばトリプシン、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）刺激プロテアーゼの適用により刺激しなければならなかった。トリプシンは、４つの公知のＰＡＲサブタイプ全てを活性化することができ、そしてそのうち３つ（ＰＡＲ1、ＰＡＲ2及びＰＡＲ3）のｍＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞に内因的に存在することが示されている（Ｋａｗａｂａｔａら、１９９９）。ＰＡＲはＧタンパク質に共役しており、そしてそれらの活性化は、小胞体（ＥＲ）からのカルシウムストア枯渇をもたらす。このいわゆるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）応答は、チャネルの存在とは無関係であるが、結果としてＴＲＰＣ４及びＴＲＰＣ５のようなストア感受性チャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）の活性化をもたらす。
【００５８】
これらの条件下での両方のチャネルに対するノルゲスチメートの効果を測定するための基本的な要件は、この強力なチャネル阻害剤のＰＡＲ拮抗作用を排除することである。それ故、ＥＲからのカルシウム放出を、３０μＭノルゲスチメート又は緩衝液のみとともにプレインキュベートした（１０分）誘導されていないＴＲＰＣ５  ＨＥＫ２９３  ＦＩＴＲ細胞において比較した。３０μＭノルゲスチメートで処理された細胞におけるカルシウムストア放出の動力学及び量は、未処理の細胞と比較して変化がなかった。従って、ノルゲスチメートはＰＡＲアンタゴニストではなく、ＰＡＲ刺激を介するＴＲＰＣ４及びＴＲＰＣ５活性化は、ノルゲスチメートによりチャネル阻害を測定するために適している。
【００５９】
３０μＭノルゲスチメートは、ＴＲＰＣ４及びＴＲＰＣ５に対して小さい阻害効果しか有していない（図２Ａ、Ｃ）。ＴＲＰＣ４（ｎ＝２、図２Ｂ）及びＴＲＰＣ５（ｎ＝４、図２Ｄ）の両方に対してＩＣ50＞３０μＭであると決定された。
【００６０】
要約すれば、これらのＦＬＩＰＲ測定は、ノルゲスチメートがマイクロモル濃度で適用された場合にＴＲＰＣ４／５サブファミリーのチャネルに加えてＴＲＰＣ３／６／７サブファミリーのチャネルを阻害することを示した。ノルゲスチメートはＴＲＰＣ４／５サブファミリーよりもＴＲＰＣ３／６／７に対してより効果的であった。従って、ノルゲスチメートを、その識別性の能力を試験するためにさらなる実験に選択した。
【００６１】
２．パッチクランプ記録
２．１．組み換えホモマーＴＲＰＣ５及びＴＲＰＣ６チャネルに対するノルゲスチメートの差異効果（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）
細胞集団を用いた蛍光分析実験においてモニタリングリングしてノルゲスチメートによるＴＲＰＣ６仲介及びＴＲＰＣ５仲介Ｃａ2+流入の阻害を検証し、そして単一細胞の全細胞パッチクランプ記録と比較した。ノルゲスチメート効果のより良好な比較可能性のために同じ刺激薬で間接的にチャネルを刺激した。パッチピペットにより細胞内で適用された四フッ化アルミニウム（ＡｌＦ4-）は、ＧＴＰを模倣することによりＧタンパク質を活性化する（Ｓｔｅｒｎｗｅｉｓ＆Ｇｉｌｍａｎ、１９８２；ＢＩｇａｙｒａ、１９８５）。続いて、ＴＲＰＣチャネルが刺激され、そして非特異的カチオン電流を仲介する（図３Ａ、Ｂ）。
【００６２】
１０μＭノルゲスチメートを適用してＴＲＰＣ６チャネルを活性化した場合、静止膜電位で測定された電流の８９．９±３．１％（ｎ＝１５）が遮断された。この阻害は、ノルゲスチメート洗浄後に電流振幅が増加したので、可逆的であった（図３Ａ）。１０μＭランタン（Ｌａ3+）による隣接ブロックは完全で可逆的であり、それ故バックグラウンド（リーク（ｌｅａｋ））計算に使用した。
【００６３】
それに反して、刺激されたＴＲＰＣ５チャネルに対する１０μＭノルゲスチメートの適用は、電流に対して軽微な効果しか有しておらず、２５．９±５．７％（ｎ＝２０）が遮断された。これらのチャネルはマイクロモル濃度のＬａ3+濃度で増強されるので（Ｊｕｎｇら、２００３）、２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）（特徴付けされたＴＲＰＣ５遮断薬（Ｘｕら、２００５））を代わりに使用した。完全かつ可逆的にチャネルを遮断した１０μＭ  ２−ＡＰＢを適用することによりバックグラウンドを計算した。
【００６４】
これまでのところ、全てのノルゲスチメート効果を、ＨＥＫ２９３細胞において異種発現したホモマーチャネルにおいて調べた。ＴＲＰＣチャネルが生理条件下でヘテロマルチマー化することはよく知られている（Ｓｃａｅｆｅｒによる総説、２００５）。これらのヘテロマルチマーの多数の可能な化学量論的組成を考慮に入れると、人工モデル系でＴＲＰＣチャネルの薬理試験を開始することは一般的用法（ｃｏｍｍｏｎ  ｕｓｅ）である。しかし、ノルゲスチメートが天然のＴＲＰＣチャネルをも阻害するか否かを試験することは、なおさらに関心事である。
【００６５】
２．２  天然ヘテロマーＴＲＰＣ６／７チャネルに対するノルゲスチメートの効果
Ａ７ｒ５細胞株（ラット胸大動脈平滑筋細胞由来）は、内因性ＴＲＰＣチャネルを調べるためのモデル系である（Ｊｕｎｇら、２００２；Ｓｏｂｏｌｏｆｆら、２００５）。チャネルをＡｒｇ8−バソプレシン（ＡＶＰ）（これらの細胞において内因性バソプレシンＶ1A受容体を活性化する血管収縮ペプチド）（Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒら、１９９１）により間接的に刺激した。全細胞パッチクランプ記録を行う前に、ノルゲスチメートが一般的にＶ１受容体を抑制しないことがカルシウムイメージング実験において示された（図４）。
【００６６】
１００ｎＭ  ＡＶＰを用いたＡ７ｒ５細胞の潅流は、ＴＲＰＣチャネルの生物物理学的な特質を有する非選択的カチオン電流を刺激した（図５）。二重に整流する（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）Ｉ−Ｖの関係は、異種発現したＴＲＰＣ６ホモマーに示されたものと同様であった（図３Ａ）。１０μＭノルゲスチメートをＡＶＰ刺激Ａ７ｒ５細胞に適用した場合、静止膜電位で測定された電流の８６．５±６．０％（ｎ＝８）が遮断され、そしてこの効果は可逆的であった（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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