(57)【要約】  本発明は、抗体を工業的に生産する方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体化合物を該抗体化合物を含有する懸濁液から精製する方法であって、
ｉ）該懸濁液を所定の条件下でプロテインＡ誘導体／アナログと接触させ、ここで、プロテインＡ誘導体／アナログが抗体化合物と結合し、
ｉｉ）前記プロテインＡ誘導体／アナログ結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ）前記抗体化合物を、適切なバッファーを用いてプロテインＡ誘導体／アナログから溶出させ、生じた溶出液に収集する方法。
【請求項２】
前記プロテインＡ誘導体／アナログ樹脂が、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｉ）からｉｉｉ）の一又は複数が、室温以下の温度で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体化合物を該抗体化合物を含有する懸濁液から精製する方法において、
ｉ）前記懸濁液を、所定の条件下で該抗体に対して親和性を有するリガンドと接触させ、ここで、該リガンドが抗体化合物と結合し、
ｉｉ）前記リガンド結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ）前記抗体化合物を適切なバッファーを用いてリガンドから溶出させ、溶出液に収集し、
工程ｉｉｉ）からの溶出液にカチオンクロマトグラフィーを施す方法。
【請求項５】
前記リガンドがプロテインＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｉｉｉ）からの溶出液にカチオンクロマトグラフィーを施す、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｉｉｉ）からの溶出液に、カチオンクロマトグラフィーが施される前にウイルス不活化が施される、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カチオンクロマトグラフィーが、室温以下の温度で実施される、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｉｉｉ）からの溶出液にアニオンクロマトグラフィーが施される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｉｉｉ）からの溶出液に、アニオンクロマトグラフィーが施される前にウイルス不活化が施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カチオンクロマトグラフィーからの溶出液にアニオンクロマトグラフィーが施され、ここでカチオンクロマトグラフィーからの溶出液に、場合によっては、アニオンクロマトグラフィーが施される前に、ウイルス濾過が施される、請求項４ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
カチオンクロマトグラフィーからの溶出液に、アニオンクロマトグラフィーが施される前に、ウイルス濾過が施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アニオンクロマトグラフィーが、室温以下の温度で実施される、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アニオンクロマトグラフィーが、膜又は固形樹脂を使用するフロースルーとして実施される、請求項９から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
アニオンクロマトグラフィーからの溶出液にウイルス濾過が施される、請求項９から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
最終溶出液にダイアフィルトレーション及び／又は限外濾過が施される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
最終溶出液が製薬用調製物に処方される、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体精製プラットフォームであって、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法を含むプラットフォーム。
【請求項１９】
ＩｇＧ抗体を精製するのに適した抗体精製プラットフォームであって、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法を含むプラットフォーム。
【請求項２０】
治療用ＩｇＧ抗体の生成に使用される、請求項１８に記載の抗体精製プラットフォーム。
【請求項２１】
抗体を工業的に精製するプロセスであって、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法を含むプロセス。
【請求項２２】
プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出後の工程が、貯蔵タンクを使用することなく、連続したプロセス方式で実施される、請求項２１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換え的に発現された抗体の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体を精製する方法は、典型的には、プロテインＡを捕捉するためのアフィニティークロマトグラフィーと、続いてのイオン交換及び／又は疎水性相互作用及び／又は混合方式クロマトグラフィー工程に一般的に基づく。このような方法は、少なくとも２つのウイルス低減工程、典型的には親和工程で溶出されるｐＨを低下させる、また方法の適切な位置でウイルス濾過を実施することによる低減を含む。ｍＡｂ精製方法により除去される不純物には半抗体(half antibody)、抗体断片、ダイマー、及び凝集体、ＤＮＡ、ウイルス、ＨＣＰ、プロテインＡ漏出、内毒素、及び他の関連する不純物が含まれる。
【０００３】
プロテインＡは、元来は、細菌である黄色ブドウ球菌の細胞壁に見出される４０-６０ｋＤａの表面タンパク質である。それは、免疫グロブリン、ほとんどの場合、特にＩｇＧに結合する能力があるために、生化学研究に使用されることが見出されている。それは、重鎖と相互作用し、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する。
WO9856808及びWO2005016968には、プロテインＡ精製の例が記載されている。
またプロテインＡ精製は、WO2004076485、US20070060741、及びKelley BD Biotechnol Bioeng. 101(3). 553-66 (2008)にも記載されている。
組換え抗体を工業的に生成するための効果的な方法が、必要とされ続けている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、抗体化合物を含有する懸濁液から、該抗体化合物を精製する方法に関し、ここで、
ｉ)所定の条件下、該懸濁液をプロテインＡ誘導体／アナログと接触させ、プロテインＡ誘導体／アナログと抗体化合物とを結合させ、
ｉｉ)該プロテインＡ誘導体／アナログ結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ)適切なバッファーを用い、該抗体化合物をプロテインＡ誘導体／アナログから溶出させ、得られた溶出液を収集する。
【０００５】
本発明は、抗体化合物を含有する懸濁液から、該抗体化合物を精製する方法に関し、ここで、
ｉ)所定の条件下、このような抗体への親和性を有するリガンドと該懸濁液とを接触させ、該リガンドと抗体化合物とを結合させ、
ｉｉ)該リガンド結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ)適切なバッファーを用い、該抗体化合物をリガンドから溶出させ、溶出液を収集し、工程ｉｉｉ)の溶出液をカチオンクロマトグラフィーにかける。
【０００６】
本発明は、抗体精製プラットフォームに関し、該プラットフォームは本発明の方法を含む。
また本発明は、抗体を工業的に生成するプロセスに関し、該プロセスは本発明の方法を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
抗体を精製するための一般的な方法は当該分野でよく知られており、例えば、Pete Gagnon: Purification Tools for monoclonal Antibodies (1996) ISBN-9653515-9-9に記載されている。この発明は、抗体化合物を精製するための新規の方法の開発に関連している。この出願において、抗体化合物は免疫グロブリンである。「免疫グロブリン」なる用語は、２対のポリペプチド鎖からなり、一方が軽(Ｌ)鎖対であり、他方が重(Ｈ)鎖対であり、４つ全てがジスルフィド結合により相互結合している、構造的に関連した糖タンパク質のクラスに属する分子である。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W編, 第2版. Raven Press, N.Y. (1989))を参照。簡単には、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(ＶＨ)と重鎖定常領域(典型的には３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む)からなる。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域(ＶＬ)と軽鎖定常領域(典型的には１つのドメインＣＬを含む)からなる。
【０００８】
本発明において「抗体化合物」なる用語は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、又はそのいずれかの誘導体で、例えば少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間又はそれ以上、約４８時間又はそれ以上、約３、４、５、６、７日又はそれ以上のかなりの時間、又は任意の他の関連する機能的に定められた期間(例えば、抗体が抗原に結合するのに関連した生理学的反応を誘発、促進、向上、及び／又は調節するのに十分な時間)、典型的な生理学的条件下で、抗原に特異的に結合する能力を有するものを称する。
【０００９】
免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体(Ａｂｓ)の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えばエフェクター細胞)及び古典的な補体系の第１成分(Ｃｌｑ)を含む、宿主組織又は因子に対する、免疫グロブリンの結合性を媒介し得る。
【００１０】
上述したように、特に示さず、又は本文中において明確に矛盾しない限りは、ここで抗体なる用語は、任意の適切な全長抗体の断片を含み、該断片は、抗原に対して特異的に結合する能力を保持し、プロテインＡに結合可能であり、それをプロテインＡ誘導体／アナログに結合させることができる。
抗体は、上述したような「典型的な」免疫グロブリン構造以外の他の構造を有していてもよい。それは、単鎖抗体、ダイアボディ、及び全ての種類の断片、及び軽鎖と重鎖の組合せとすることができる。このような抗体の記述は、文献に沢山ある。本発明の目的にとって、抗体化合物がプロテインＡ及び抗原に結合することは十分である。
【００１１】
一実施態様において、抗体化合物は治療用抗体である。
一実施態様において、抗体化合物はＩｇＧ抗体である。
【００１２】
一実施態様において、本発明は、抗体化合物を精製する方法を提供するものであって、該方法は、従来のプロテインＡカラムとは対照的に、プロテインＡ誘導体／アナログをベースにしたアフィニティクロマトグラフィーを使用することを含む。このようなプロテインＡ誘導体／アナログカラムでは、リガンド漏出が低減し、生成のランニングコストが改善され、生成物の品質が改善される。さらに、伝統的なプロテインＡ工程と比較して、少ない塩分量で使用される溶出条件により、アフィニティ及びイオン交換工程の間の、任意の濃縮工程、例えばＵＦ／ＤＦが回避される。
【００１３】
一実施態様において、本発明は、抗体化合物を含有する懸濁液から、抗体化合物を精製する方法を提供するものであって、ここで、
ｉ)所定の条件下、プロテインＡ誘導体／アナログと該懸濁液とを接触させ、プロテインＡ誘導体／アナログ該と抗体化合物とを結合させ、
ｉｉ)該プロテインＡ誘導体／アナログ結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ)適切なバッファーを用い、該抗体化合物をプロテインＡ誘導体／アナログから溶出させ、得られた溶出液を収集する。
【００１４】
本発明において、プロテインＡ誘導体／アナログは、プロテインＡ誘導体／アナログリガンドであり、ここで、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインにおけるアルカリに不安定なアミノ酸は、よりアルカリ安定したアミノ酸で置換されている。一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログはプロテインＡ分子であり、ここで一又は複数のアスパラギン(Ａｓｎ)残基は、アルカリ条件下でもタンパク質安定性が増加するように修飾されている。一実施態様において、２又はそれ以上のＡｓｎ残基が修飾されている。一実施態様において、全てのＡｓｎ残基が修飾されている。一実施態様において、前記Ａｓｎ残基はリジン、アスパラギン酸及びロイシンから選択されるアミノ酸で置換されている。一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログが、先に記載された様にして修飾されたドメインＺである。一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログは、EP1123389A1及び／又はUS6831161に記載されているような、プロテインＡ誘導体／アナログである。親プロテインＡ分子は、例えば性能を増加させ得る、他の方法で修飾することもできる。
【００１５】
一実施態様において、前記プロテインＡ誘導体／アナログは不活性樹脂に共有的に結合している。一実施態様において、前記プロテインＡ誘導体／アナログ樹脂は、マブセレクト(MabSelect)ＳｕＲｅＴＭである。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭはGE Healthcare lIfe Sciences (http://www.gelifesciences.com)から入手可能である。
【００１６】
一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログを使用するアフィニティクロマトグラフィーは、室温以下の温度で実施される。一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログを使用するアフィニティクロマトグラフィーは、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度、又は２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度、又は２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度、又は２〜５℃の温度で実施される。一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログを使用するアフィニティクロマトグラフィーは、２、５、１０、１５、２０又は２５℃の温度で実施される。
一実施態様において、工程ｉ)、ｉｉ)及びｉｉｉ)は、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルーとして実施されてよい。
【００１７】
一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出液はウイルス不活化にかけられる。一実施態様において、前記ウイルス活性化は、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出液のｐＨを低下させることによって実施される。一実施態様において、溶出液のｐＨは、５分〜１日の期間で、３〜４のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３．１〜４、例えば３．２〜４、例えば３．３〜４、例えば３．４〜４、例えば３．５〜４、例えば３．６〜４、例えば３．７〜４、例えば３．８〜４のｐＨ、例えば４のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．９、例えば３．１〜３．９、例えば３．２〜３．９、例えば３．３〜３．９、例えば３．４〜３．９、例えば３．５〜３．９、例えば３．６〜３．９、例えば３．７〜３．９のｐＨ、例えば３．９のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．８、例えば３．１〜３．８、例えば３．２〜３．８、例えば３．３〜３．８、例えば３．４〜３．８、例えば３．５〜３．８、例えば３．６〜３．８のｐＨ、例えば３．８のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．７、例えば３．１〜３．７、例えば３．２〜３．７、例えば３．３〜３．７、例えば３．４〜３．７、例えば３．５〜３．７のｐＨ、例えば３．７のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．６、例えば３．１〜３．６、例えば３．２〜３．６、例えば３．３〜３．６、例えば３．４〜３．６のｐＨ、例えば３．６のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．５、例えば３．１〜３．５、例えば３．２〜３．５、例えば３．３〜３．５のｐＨ、例えば３．５のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．４、例えば３．１〜３．４、例えば３．２〜３．４のｐＨ、例えば３．４のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは、３〜３．３、例えば３．１〜３．３のｐＨ、例えば３．３のｐＨまで低下させる。一実施態様において、ｐＨは３〜３．２のｐＨ、例えば３．２のｐＨまで、又は３．１のｐＨまで、又は３のｐＨまで低下させる。
【００１８】
上述したように、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出液は、５分〜１時間の期間に、これらのｐＨ値を保持していてもよい。一実施態様において、この期間は１０分〜２４０分、例えば２０〜９０分である。
以後、溶出液のｐＨは４．５〜５．５のｐＨ、又は任意の以下の抗体に適するように調節される。
【００１９】
一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出液は、ｐＨ値を低下させる前及び／又はｐＨを再調節した後に濾過される。
本発明の一実施態様において、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーから得られた溶出液は、上述したｐＨ低下にかけてもかけなくても、カチオン交換工程にかけられる。アフィニティー工程の下流にカチオン交換を配することは、得られた溶出液のｐＨが７以下であり、ｍＡｂの等電点とクロスしうるさらなる調節やｐＨ調節の潜在的な付加調節をすることなく、溶出液を処理できるという利点がある。さらなるｐＨ調節の回避は、沈殿及び凝集体形成の回避の助力となる
【００２０】
カチオンクロマトグラフィーは、酢酸ナトリウムバッファーでｐＨ４．５〜６．０に前平衡されたカラムに、プロテインＡ(可能であれば、ウイルス不活化後)プールからの溶出液を充填することにより実施され得る。未結合の物質はカラムから洗い流されて、酢酸ナトリウムバッファーに、０-０．０３Ｍの塩化ナトリウムが入ったものからの線形勾配を使用し、ｍＡｂを溶出させる。凝集体は、生成物の後のピークとして溶出する。不純物、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、及びプロテインＡの漏洩も、かなり低減する。  
【００２１】
一実施態様において、カチオンクロマトグラフィーは室温以下の温度で実施される。一実施態様において、カチオンクロマトグラフィーは、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度、又は２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度、又は２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度、又は２-５℃の温度で実施される。一実施態様において、カチオンクロマトグラフィーは、２、５、１０、１５、２０又は２５℃の温度で実施される。
【００２２】
一実施態様において、カチオンクロマトグラフィーは、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルーとして実施される。
ランスルーモードでは、カラム又は膜は、酢酸ナトリウムバッファーにて、ｐＨ４．５〜６．０に平衡にされる。カラムは、収集されたプール(試料／生成物の画分)中に存在する、ＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)、凝集体又は他の不純物のいずれかに許容できない増加が生じるまで充填される。
【００２３】
一実施態様において、ウイルス濾過は室温以下の温度で実施される。一実施態様において、ウイルス濾過は、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度、又は２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度、又は２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度、又は２-５℃の温度で実施される。一実施態様において、ウイルス濾過は、２、５、１０、１５、２０又は２５℃の温度で実施される。
ウイルス濾過は、例えばPete Gagnon：Purification Tools for monoclonal Antibodies (1996) ISBN-9653515-9-9に記載されているようなウイルス用フィルターを使用し、当該分野で知られているようにして実施可能である。
【００２４】
一実施態様においては、第２のウイルス濾過用に、同様のウイルス濾過フィルター又は異なるウイルス濾過フィルターを使用して、ウイルス濾過工程が繰り返される。一実施態様において、第１のフィルターは第２のフィルターよりも多孔質である。これにより、第１工程で、より効果的に凝集体を除去し、第２工程で、より効果的にウイルスを除去することができる。
【００２５】
一実施態様において、カチオンクロマトグラフィーからの溶出液は、可能であれば、上述したようなウイルス濾過工程の後に、アニオンクロマトグラフィーにかけてもよい。
アニオンクロマトグラフィーは、リン酸バッファーで、予めｐＨ６-８に平衡にされた膜又はカラムにおいて、カチオン交換クロマトグラフィー工程からのプールを充填することにより実施されてよい。充填前、物質は、２-１２ｍＳ／ｃｍの伝導率まで、水を用いて希釈され、標的ｐＨにｐＨが調節される。生成物はフロースルー画分に収集される。
【００２６】
一実施態様において、ウイルス濾過は、アニオンクロマトグラフィーの後に実施される。ウイルス濾過は上述したように実施されてよい。一実施態様において、ウイルス濾過は、カチオンクロマトグラフィーの後、及びアニオンクロマトグラフィーの後の双方で実施される。
一実施態様において、アニオンクロマトグラフィーは、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルーとして実施される。
【００２７】
バッファー交換及び抗体濃縮は、所望するならば、最後のクロマトグラフィー工程後に実施されてよく、例えば、Pete Gagnon: Purification Tools for monoclonal Antibodies (1996) ISBN-9653515-9-9、及びWO2009010269が参照される。
また、抗体試料は、当該分野で公知であるように、製薬用途に適した調製物等の、製薬用調製物に処方されてもよい。
【００２８】
さらに本発明は、豊富な選択の幅の種々の抗体を、フリーサイズで生成するのに有用な、標準化された方法である抗体精製プラットフォームであって、本発明の方法を含むプラットフォームを提供するものである。
このような標準化されたプラットフォームは、生産において、以下のような利点を有する：
−各プロジェクトに対して、同じ方法が利用されるので、開発／試験コスト及び時間が節約される
−同様の装置及び原料、バッファー等が適用され、よって余分な試験や承認されるさらなる仕入れ先を得る必要がない
−ウイルスの有効性を検証する研究は、このプロジェクトから次に再利用されうる
−労働力が節約され、生成物の品質が保証される。
【００２９】
一実施態様において、このような抗体はＩｇＧ抗体である。
本発明の方法を含む抗体生成プラットフォームは、例えば、同様の条件下で、種々のＩｇＧサブタイプが溶出する可能性、及びアフィニティーリガンドの漏洩の低減といった、さらなる利点を有する。
従って、本発明は、抗体を工業的に生成するプロセスを提供するものであり、該プロセスは、抗体化合物を精製するための、本発明の方法を含む。一実施態様において、このような抗体化合物は治療用抗体である。一実施態様において、このような抗体化合物はＩｇＧ抗体である。
一実施態様において、本発明は、抗体を工業的に生成するプロセスを提供するものであり、該プロセスは、抗体化合物を精製するための、本発明の方法を含み、プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出後の工程が、貯蔵タンクを使用することなく、連続したプロセス方式で実施される。
【００３０】
以下は、本発明の実施態様の非限定的列挙である。
実施態様１：抗体化合物を含有する懸濁液から、該抗体化合物を精製する方法であって、ここで、
ｉ)所定の条件下、該懸濁液とプロテインＡ誘導体／アナログとを接触させ、プロテインＡ誘導体／アナログと抗体化合物とを結合させ、
ｉｉ)該プロテインＡ誘導体／アナログ結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ)適切なバッファーを用い、該抗体化合物をプロテインＡ誘導体／アナログから溶出させ、得られた溶出液を収集する方法。
実施態様２：プロテインＡ誘導体／アナログが、ＩｇＧ結合ドメインにおけるアルカリに不安定なアミノ酸が、よりアルカリ安定したアミノ酸で置換されているプロテインＡ誘導体／アナログである、実施態様１の方法。
実施態様３：プロテインＡ誘導体／アナログが不活性樹脂に結合している、実施態様１又は２の方法。
実施態様４：前記プロテインＡ誘導体／アナログ樹脂が、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭである、実施態様３の方法。
【００３１】
実施態様５：工程ｉ)ないしｉｉｉ)の一又は複数が、室温以下の温度で実施される、実施態様１ないし４のいずれかの方法。
実施態様６：工程ｉ)、ｉｉ)及びｉｉｉ)の全てが、室温以下の温度で実施される、実施態様５の方法。
実施態様７：室温以下の温度が、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度である、実施態様５又は実施態様６の方法。
実施態様８：室温以下の温度が、２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度から選択される温度である、実施態様５又は実施態様６の方法。
実施態様９：室温以下の温度が、２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度から選択される温度である、実施態様５又は実施態様６の方法。
実施態様１０：室温以下の温度が２〜５℃の温度である、実施態様５又は実施態様６の方法。
実施態様１１：クロマトグラフィーが、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルー方式で実施される、実施態様１ないし７のいずれかの方法。
【００３２】
実施態様１２：抗体化合物を含有する懸濁液から、該抗体化合物を精製する方法であって、ここで、
ｉ)所定の条件下、このような抗体への親和性を有するリガンドと該懸濁液とを接触させ、該リガンドと抗体化合物とを結合させ、
ｉｉ)該リガンド結合抗体を適切なバッファーで洗浄し、
ｉｉｉ)適切なバッファーを用い、該抗体化合物をリガンドから溶出させ、溶出液を収集し、工程ｉｉｉ)の溶出液をカチオンクロマトグラフィーにかける方法。
実施態様１３：前記リガンドがプロテインＡである、実施態様１２の方法。
実施態様１４：工程ｉｉｉ)からの溶出液がカチオンクロマトグラフィーにかけられる、実施態様１ないし１１のいずれかの方法。
実施態様１５：工程ｉｉｉ)からの溶出液が、カチオンクロマトグラフィーにかけられる前にウイルス不活化にかけられる、実施態様１２ないし１４のいずれかの方法。
【００３３】
実施態様１６：工程ｉｉｉ)からの溶出液のｐＨが、５分〜１日の期間で、３〜４のｐＨまで低下され、ついで、カチオンクロマトグラフィーの前に再調節される、実施態様１５の方法。
実施態様１７：ｐＨが、２０〜９０分の期間で、３．４-３．９のｐＨまで低下される、実施態様１６の方法。
【００３４】
実施態様１８：カチオンクロマトグラフィーが、室温以下の温度で実施される、実施態様１２ないし１７のいずれかの方法。
実施態様１９：室温以下の温度が、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度である、実施態様１８の方法。
実施態様２０：室温以下の温度が、２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度から選択される温度である、実施態様１８又は実施態様１９の方法。
実施態様２１：室温以下の温度が、２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度から選択される温度である、実施態様１８又は実施態様１９の方法。
実施態様２２：室温以下の温度が２〜５℃の温度である、実施態様１８又は実施態様１９の方法。
実施態様２３：前記カチオンクロマトグラフィーが、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルー方式で実施される、実施態様１２ないし２２のいずれかの方法。
【００３５】
実施態様２４：工程ｉｉｉ)からの溶出液がアニオンクロマトグラフィーにかけられる、実施態様１ないし７のいずれかの方法。
実施態様２５：工程ｉｉｉ)からの溶出液の伝導率が、充填前に２〜１２ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節される、実施態様２４の方法。
実施態様２６：工程ｉｉｉ)からの溶出液が、アニオンクロマトグラフィーにかけられる前にウイルス不活化にかけられる、実施態様２４又は実施態様２５の方法。
【００３６】
実施態様２７：工程ｉｉｉ)からの溶出液のｐＨが、５分〜１日の期間で、３〜４のｐＨまで低下され、ついで、アニオンクロマトグラフィーの前に再調節される、実施態様２６の方法。
実施態様２８：ｐＨが、２０〜９０分の期間で、３．４-３．９のｐＨまで低下される、実施態様２７の方法。
【００３７】
実施態様２９：カチオンクロマトグラフィーからの溶出液がアニオンクロマトグラフィーにかけられ、ここでカチオンクロマトグラフィーからの溶出液が、場合によっては、アニオンクロマトグラフィーにかけられる前に、ウイルス濾過にかけられる、実施態様１２ないし２３のいずれかの方法。
実施態様３０：カチオンクロマトグラフィーからの溶出液が、アニオンクロマトグラフィーにかけられる前に、ウイルス濾過にかけられる、実施態様２９の方法。
実施態様３１：ウイルス濾過が、第１、ついで第２のフィルターにおける、カチオンクロマトグラフィーからの溶出液の濾過を含む、実施態様３０の方法。
実施態様３２：第１のフィルターが第２のフィルターよりも多孔質である、実施態様４２の方法。
実施態様３３：カチオンクロマトグラフィーからの溶出液の伝導率が、充填前に２〜１２ｍＳ／ｃｍに調節される、実施態様２９の方法。
【００３８】
実施態様３４：アニオンクロマトグラフィーが、室温以下の温度で実施される、実施態様２４ないし３３のいずれかの方法。
実施態様３５：室温以下の温度が、２〜２５℃、例えば５〜２５℃、例えば１０〜２５℃、例えば１５〜２５℃の温度である、実施態様３４の方法。
実施態様３６：室温以下の温度が、２〜２０℃、例えば５〜２０℃、例えば１０〜２０℃、例えば１５〜２０℃の温度、又は２〜１５℃、例えば５〜１５℃、例えば１０〜１５℃の温度から選択される温度である、実施態様３４又は実施態様３５の方法。
実施態様３７：室温以下の温度が、２〜１０℃、例えば５〜１０℃の温度から選択される温度である、実施態様３４又は実施態様３５の方法。
実施態様３８：室温以下の温度が２〜５℃の温度である、実施態様３４又は実施態様３５の方法。
実施態様３９：前記アニオンクロマトグラフィーが、膜又は固形樹脂を使用する、フロースルーとして実施される、実施態様２４ないし３８のいずれかの方法。
【００３９】
実施態様４０：アニオンクロマトグラフィーからの溶出液がウイルス濾過にかけられる、実施態様２４ないし３９のいずれかの方法。
実施態様４１：ウイルス濾過が、第１、ついで第２のフィルターにおける、アニオンクロマトグラフィーからの溶出液の濾過を含む、実施態様４０の方法。
実施態様４２：第１のフィルターが第２のフィルターよりも多孔質である、実施態様４２の方法。
実施態様４３：最終溶出液がダイアフィルトレーション及び／又は限外濾過にかけられる、実施態様１ないし４２のいずれかの方法。
実施態様４４：最終溶出液が製薬用調製物に処方される、実施態様１ないし４３のいずれかの方法。
実施態様４５：抗体化合物がＩｇＧ抗体である、実施態様１ないし４４のいずれかの方法。
実施態様４６：抗体化合物が治療用抗体である、実施態様１ないし４５のいずれかの方法。
【００４０】
実施態様４７：抗体精製プラットフォームであって、実施態様１ないし４６のいずれかの方法を含むプラットフォーム。
実施態様４８：ＩｇＧ抗体を精製するのに適した抗体精製プラットフォームであって、実施態様１ないし４６のいずれかの方法を含むプラットフォーム。
実施態様４９：ＩｇＧ抗体の生成に使用される、実施態様４７又は実施態様４８の抗体精製プラットフォーム。
実施態様５０：治療用抗体の生成に使用される、実施態様４７ないし４９のいずれかの抗体精製プラットフォーム。
【００４１】
実施態様５１：抗体を工業的に生成するプロセスであって、実施態様１ないし４６のいずれかの方法を含むプロセス。
実施態様５２：プロテインＡ誘導体／アナログクロマトグラフィーからの溶出後の工程が、貯蔵タンクを使用することなく、連続したプロセス方式で実施される、実施態様５１のプロセス。
【００４２】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全体が説明されているならば、同程度で出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解釈されない。
その全ての可能性のある変形例における、上述した要素の任意の組合せは、ここで特に示され、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、本発明に含まれる。
【００４３】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
ここで他に示されない限りは、ここでの値の範囲の記述は、単に、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に称する省略方法として提供することを意図しているものであって、ここで個々に列挙されているかのように、それぞれの別個の値が明細書に導入される。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
ここに記載されている全ての方法は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順番で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての実施例、又は例示的言語（「例えば」、「等」)の使用は、単に本発明をより例証することを意図しており、他に示されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明確に記載していない限りは、明細書中の如何なる語句も、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
【００４４】
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものとして理解される)。
この発明は、適用される法律に容認される最大範囲まで、ここに提供される請求項又は側面に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
【実施例】
【００４５】
実施例１
抗体精製方法
ＣＨＯ細胞培養からのｍＡｂｓ(例えばWO2006070286及びWO2008009545に記載の抗-ＮＫＧ２Ａ、例えばWO2005097160に記載の抗-ＮＫＧ２Ｄ、例えばWO2003062278 and WO2008022390に記載の抗-Ｃ５ａＲ)の精製方法は、いくつかの工程を含む。細胞培養上清を濾過し、１０６ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーカラム(長さ１１ｃｍ)(溶媒及び条件に応じて、以下参照)に充填した。溶出した生成物のプールを、０．２Ｍのクエン酸を用い、ｐＨをｐＨ３．７に調節することにより、ウイルス不活化にかけ、１時間、室温で保持した。また、低ｐＫａの他のバッファー、例えば５-１００ｍＭ濃度のクエン酸又は酢酸を使用し、さらなる溶出を実施してもよい。続いて、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いてプールをｐＨ５．０に調節し、ついで、９４ｍｌのポロス(POROS)５０ＨＳカチオン交換カラム(長さ４．８ｃｍ)に充填した。ｐＨ調節後、溶液中に不純物が沈殿する場合もあり、これを、カチオン性カラムに充填する前に、濾過又は遠心分離によって除去しなければならない。溶出は、２５ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ５．０、０-０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ勾配、１０ＣＶ超により実施した。実際のｍＡｂのｐＩに応じて、この工程のｐＨを調節してもよい。０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液を用い、ｍＡｂプールをｐＨ７．０に調節し、０．１μｍフィルター(４．５２ｃｍ２)、続いてプラノバ(Planova)２０Ｎウイルスフィルター(０．００１ｍ２)からなるフィルタートレーンを通して濾過した(ミレックス(Millex)-ＶＶフィルターの代替は、０．１μｍのミリポア・オプティキャップ(Millipore Opticap)ＸＬＴ２０フィルターである)。ウイルス濾液を、室温にて水で≦７．０ｍＳ／ｃｍまで希釈し、サルトバインド(Sartobind)Ｑシングルセプ(SingleSep)カプセル(７５ｃｍ２)アニオン交換膜に充填した。また、伝導率の低下はＵＦ／ＤＦにより達成されてもよい。アニオン交換膜工程を、非結合条件下で、フロースルー方式で実施し、最後に、１０ｍＭのヒスチジンバッファー、ｐＨ６．２にて、続いて０．０１％までトゥイーン８０を添加することにより、アクタクロスフロー(Akta cross-flow)装置において、５０ｃｍ２のバイオマックス(Biomax)３０ｋ膜を用い、濾液を限外濾過又はダイアフィルトレーションした。製剤原料処方物の最終組成は、４０ｍｇのｍＡｂ／ｍＬ、２５ｇ／Ｌのスクロース、０．０１％ｗ／ｗのトゥイーン８０、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．２であった。抗-ＮＫＧ２Ａ、抗-ＮＫＧ２Ｄ及び抗-Ｃ５ａＲについての工程収率及び他の条件／結果を、それぞれ表１、２及び３に付与する。最も高い可能性のある収率を有する、不純物の最大低下が達成されるように、伝導率、及びＱ膜工程のｐＨ、及び膜を通過する充填溶液は、各ｍＡｂに対して調節される。よって、伝導率及びｐＨは、それぞれ２-１２ｍＳ／ｃｍ(ＮａＣｌ含有量によりコントロール)及びｐＨ５．８-８．０の範囲で変えてよい。
【００４６】
溶媒及び条件：
プロテインＡ誘導体／アナログの捕捉−ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ
・室温
・流量：１時間あたり２０カラム容量(ＣＶ／ｈ）
・充填：３０ｇのｍＡｂ／Ｌ樹脂、しかしながら、１-５０ｇ／Ｌ樹脂の範囲で変えてよい。
・装置及び洗浄バッファー：１１．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４、３８．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４、３００ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ
・洗浄バッファー：６．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４、４３．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４、１０００ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ
・溶出バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｋｇのギ酸、ｐＨ３．５
・段階勾配を使用して溶出
・ｐＨ３．７(０．２Ｍのクエン酸)で１時間のウイルス不活化、続いて０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ５．０にｐＨ調節
【００４７】
ＣＩＥＸ-ポロス５０ＨＳ、ｐＨ５
・室温
・流量：２５ＣＶ／ｈ
・充填：４５ｇのｍＡｂ／Ｌ樹脂、しかしながら、４０-１２０ｇ／Ｌ樹脂の範囲で変えてよい。
・装置及び洗浄バッファー：２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣＨ３ＣＯＯＮａ及び１２．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣＨ３ＣＯＯＨ
・溶出バッファー：２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣＨ３ＣＯＯＮａ及び１０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＣＨ３ＣＯＯＨ、３００ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ
・平衡／溶出バッファーに３００ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ段階勾配を使用して溶出。バッファー、ｐＨ５。
【００４８】
ウイルス濾過−プラノバ２０Ｎ
・室温
・濾過中の圧力、０．８バール
・充填：≦１１０ｋｇ／ｍ２、しかしながら、５００ｋｇ／ｍ２までであってよい。
・０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液を用い、７．０にｐＨ調節。
・装置及び洗浄バッファー：７．７ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４、１２．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ
・０．１μｍフィルターを用いた予備濾過
・プラノバ２０Ｎを用いた濾過
【００４９】
Ｑ膜フロースルー、ｐＨ７
・室温
・流量：３００ＣＶ／ｈ
・充填：４８３ｇ／ｍ２、しかしながら、充填は２００-３０００ｇ／ｍ２の範囲で変えてよい。
・水を用い、７ｍＳ／ｃｍまでプールを希釈
・装置及び洗浄バッファー：７．７ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４、１２．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ
・フロースルーの適用及び収集
【００５０】
ＵＦ／ＤＦ−３０ｋＤａのバイオマックス
・１０ｍｍｏｌ／ｋｇのヒスチジン、ｐＨ６．２-６．５にバッファー交換
・２５ｇ／Ｌのグルコース及び０．０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．２-６．５において３０-６０ｍｇ／ｍＬに濃縮及び処方
【００５１】
2011523408.tif 000002
【００５２】
2011523408.tif 000003
【００５３】
2011523408.tif 000004
【００５４】
実施例２
マブセレクトＳＵＲＥにおける抗-インターフェロン-アルファ(抗-ＩＦＮα)の捕捉
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清を、予備フィルターとして１．２μｍのフィルターを使用し、０．４５μｍのフィルターにおいて濾過した。細胞により生成された抗-ＩＦＮαの力価(例えば、WO2006086586に記載)は２ｍｇ／ｍｌであった。
モノクローナル抗体のｐＩは７．６であった。マブセレクトＳＵＲＥカラム(５６ｍｌ容量、高さ１０．５ｃｍ、直径２．６ｃｍ)を、１０カラム容量(ＣＶ)の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて、予め平衡にしておいた：流量は２０ＣＶ／ｈであった。カラムに、流量２０ＣＶ／ｈで操作される、８４０ｍｌの濾過された細胞培養上清を充填した；充填容量は約３０ｍｇ／ｍｌのマトリックス物質であった。
【００５５】
溶出前、カラムを、１０ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム＋３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄し、続いて６ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄し、５ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム＋３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。
１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５からなる溶出バッファーを使用し、溶出を実施した。溶出の直後、抗体プールを含有する溶出液の画分を、０．２Ｍのクエン酸溶液を使用してｐＨ３．７に調節し、ｐＨ３．７で１時間保持した。次に、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を使用し、溶液をｐＨ５．０に調節した。
抗体の濃度を、上述したようにして測定した。充填前の細胞培養上清溶液の力価に基づいた回収率は７８％であった：溶出液中の抗体濃度は７ｍｇ／ｍｌであった。
【００５６】
実施例３
マブセレクトＳＵＲＥにおける抗-第ＩＸ因子(抗-ＦＩＸ)の捕捉
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清を、サルトブラン(Sartobran)Ｐ１０、０．６５μｍ＋０．４５μｍのフィルターにおいて濾過した。細胞により生成された抗-ＦＩＸの力価は２ｍｇ／ｍｌであった。
モノクローナル抗体のｐＩは７．５であった。マブセレクトＳＵＲＥカラム(２．４ｌ容量)を、１０カラム容量(ＣＶ)の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて、予め平衡にしておいた：流量は１２．５ＣＶ／ｈであった。カラムに、流量３０ＣＶ／ｈで操作される、９ｌの濾過された細胞培養上清を充填した；充填容量は約７．５ｇ／ｍｌのマトリックス物質であった。
【００５７】
溶出前、カラムを、２ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄し、続いて６ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄し、５ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。
１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５からなる溶出バッファーを使用し、溶出を実施した。溶出の直後、抗体ピークを含有する溶出液の画分を、０．２Ｍのクエン酸溶液を使用してｐＨ３．７に調節し、ｐＨ３．７で１時間保持した。次に、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を使用し、溶液をｐＨ５．０に調節した。
溶出プールにおける抗体の濃度を、１．７１ｃｍ−１の伸び率を使用し、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。培養上清の抗体濃度を、モノマーＩｇＧ含有量を測定するために使用されるＳＥ-ＨＰＬＣ法により、％ＨＭＷＰを公知の濃度の参照試料を用いた抗-ＦＩＸモノマーピークの面積と比較することにより決定した。
充填前の細胞培養上清溶液の力価に基づく抗-ＦＩＸの回収率は、約１００％であった；溶出液における抗体の濃度は５ｇ／ｌであった。
【００５８】
実施例４
ポロス５０ＨＳにおける抗インターフェロンアルファ(抗-ＩＦＮα)のＣＩＥＸ
２．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、実施例２に記載したように調製されたｐＨ、及びマブセレクトＳＵＲＥカラムにおいて予め精製された１５１９ｍｌの抗-ＩＦＮαを、SartoriusからのＨＶＬＰ型０．４５μｍフィルターにおいて濾過した。濾過された抗体溶液を、１０カラム容量(ＣＶ)の２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で予め平衡にされたポロス５０ＨＳカラム(９４ｍｌの容量、高さ４．８ｃｍ、直径５．０ｃｍ)に充填した；流量は２５ＣＶ／ｈであった；充填容量は約４３ｍｇ／ｍｌのマトリックス物質であった。
溶出前、カラムを、１０ＣＶの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸で洗浄した。
【００５９】
２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０．１ｍＭの酢酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０からなる１０ＣＶ超の溶出バッファーの線形勾配を使用し、溶出を実施した。抗ＩＦＮα含有溶液を、先端のＯＤ０．２５０から後端のＯＤ１．１２５までを集めることによって達成した。
溶出プール及び充填溶液における抗体の濃度を、１．６３ｃｍ−１・(ｇ／Ｌ)−１の伸び率を使用し、試料における２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。抗-ＩＦＮαの回収率は７２％であった；溶出液における抗-ＩＦＮαの濃度は５．４ｍｇ／ｍｌであった。
ＣＩＥＸ精製工程上では、プロセス流体における高分子量のタンパク質の量(上述したＳＥ-ＨＰＬＣ法を使用)は、１４．５％から２％に低下した。
【００６０】
実施例５
ポロス５０ＨＳにおける抗第ＩＸ因子(抗-ＦＩＸ)のＣＩＥＸ
２．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ５．５にて、リン酸ナトリウム緩衝液中に４９０ｍｌの抗-ＦＩＸ(実施例３に記載したように調整されたｐＨ及びマブセレクトＳＵＲＥカラムにおいて予め精製されたもの)を、５カラム容量(ＣＶ)の２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で予め平衡にされたポロス５０ＨＳカラム(４５ｍｌの容量、高さ８．５ｃｍ、直径２．６ｃｍ)に充填した；流量は２５ＣＶ／ｈであった；充填容量は約４３ｍｇ／ｍｌのマトリックス物質であった。
溶出前、カラムを、１０ＣＶの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸で洗浄した。
【００６１】
２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０．１ｍＭの酢酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０からなる１０ＣＶ超の溶出バッファーの線形勾配を使用し、溶出を実施した。抗ＦＩＸ含有溶液を、先端のＯＤ０．２０から後端のＯＤ０．４までを集めることによって達成した。
溶出プール及び充填溶液における抗体の濃度を、１．７１ｃｍ−１・(ｇ／Ｌ)−１の伸び率を使用し、試料における２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。抗-ＦＩＸの回収率は９１％であった；溶出液における抗体の濃度は３．６ｍｇ／ｍｌであった。
【００６２】
実施例６
サルトバインドＱシングルセプナノカプセルＱ膜における抗第ＩＸ因子(抗-ＦＩＸ)のフロースルーＡＩＥＸ
伝導率１５．７ｍＳ／ｃｍで、ｐＨ５．１にて、酢酸ナトリウム溶液に含有される、実施例５に記載されたようにして予め精製された１８０ｍｌの抗-ＦＩＸを、０．５Ｍのリン酸二ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調節した(温度１５．７℃)。水を用い、伝導率を７．００ｍＳ／ｃｍに調節した。伝導率の調節後、ｐＨを７．０３にした(温度２０．１℃)。ｐＨ及び伝導率が調節された試料の容量は５４０ｍｌであり、抗体の濃度は１．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【００６３】
５００ｍｌの溶液を、１５の膜容量(ＭＶ)の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で予め平衡にされたシングルセプナノカプセルＱ膜に通した；流量は１０ＭＶ／ｈであった。続いて、１０ＭＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で膜を洗浄した。
収集されたフロースループール及び充填溶液における抗体の濃度を、１．７１ｃｍ−１・(ｇ／Ｌ)−１の伸び率を使用し、試料における２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。抗-ＦＩＸの回収率は９５％であり、溶出液における抗体の濃度は１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００６４】
実施例７
バイオマックス３０Ｋ限外濾過フィルターにおける抗インターフェロンアルファ(抗-ＩＦＮα)の限外濾過／ダイアフィルトレーション
約０．２ＭのＮａＣｌ、及びｐＨ５．０の酢酸ナトリウムに５．７ｍｇ／ｍｌの濃度で含有された５２０ｍｌの抗-ＩＦＮαを、３４ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５で予め平衡にされたバイオマックス３０ＫペリコンＸＬフィルターにおいて、４５ｍｌ、及び５１ｍｇ／ｍｌの抗体濃度まで濃縮した。５０ｍｌの３４ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５を用いて６回、バイオマックス３０ＫペリコンＸＬにおいて、濃縮試料をバッファー交換した。限外濾過及びダイアフィルトレーション後に、７７％の抗体が回収された。
【００６５】
１４ｍｌのバッファー交換された抗-ＩＦＮα濃縮物を、最終濃度８６ｍｇ／ｍｌまでスクロース、最終濃度０．０３％までトゥイーン８０に添加した。最終的に、溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
抗-ＩＦＮαの濃度を、１．６３ｃｍ−１(ｇ／Ｌ)−１の伸び率を使用し、試料における２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。抗-ＦＩＸの回収率は９５％であり、溶出液における抗体の濃度は１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００６６】
実施例８
冷たい部屋でのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅにおけるｍＡｂの精製
抗体、抗-ＩＬ２０を、捕捉用にＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂を使用して精製した。冷室温で実験を実施した。冷室温実験を、室温で実施した同様の実験と比較した。条件は以下の通りである：
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清(２．６ｇのｍＡｂ／ｌ)を濾過し、カラムを１０ＣＶの１１．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４＋３８．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４＋３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にした後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに充填した。５ｍｌのカラムを流量２０ＣＶ／ｈで操作し、カラムを１０ＣＶの平衡バッファー、続いて１０ＣＶの６．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４＋４３．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４＋１０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、続いて１０ＣＶの平衡バッファーを用いて、溶出前に洗浄した。１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５の溶出バッファーを使用し、溶出を実施し、溶出後、ｍＡｂを含有するプールを、０．２Ｍのクエン酸を用いてｐＨ３．７に調節し、続いて０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ５．０に調節した。プロテインＡ誘導体／アナログの漏出及び凝集のレベルを表４に示す。
【００６７】
2011523408.tif 000005
結論：表２から、冷室温にて、プロテインＡ誘導体／アナログをベースにしたアフィニティーカラムにおいて抗体を精製することで、室温で同様の抗体を精製した場合と比較して、プロテインＡ誘導体／アナログの漏出(〜１０倍)及びプールにおけるＨＭＷＰ(凝集)レベル(〜２倍)がかなり低減することがわかった。
【００６８】
実施例９
分析方法
プロテインＡ ＨＰＬＣによる抗体含有量の測定
抗体含有量をプロテインＡ ＨＰＬＣ法を使用して測定した。免疫検出カートリッジプロテインＡカラム(直径２．１ｍｍ、長さ３ｍｍ)を使用し、試料を分析した。流量１ｍｌ／分にて、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて３分、カラムを平衡にした。約３０μｇの抗体がカラムに充填された。平衡バッファーでカラムを洗浄し、最終的に、１０ｍＭのＨＣＯＯＮａ、ｐＨ３．５を含有するバッファーを用い、１ｍｌ／分で２分溶出させた。
抗体含有量を、公知の抗体濃度を有する参照試料を用い、溶出した主要ピーク下の面積を比較することにより測定した。
【００６９】
モノマーＩｇＧ含有量及び％高分子量タンパク質(ＨＭＷＰ)の測定
ＨＰＬＣによる純度を、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥ-ＨＰＬＣ法)を使用して測定する。ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム(直径７．８ｃｍ、長さ３０ｍｍ)、定組成溶離(溶出バッファー、２００ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％の２-プロパノール、及びｐＨ６．９)及び後述する２８０ｎｍでのＵＶ検出を使用し、試料を分析する。この方法は、モノマーＩｇＧ含有量(保持時間、約９．５分)、及びゲル樹脂によりサイズに応じて分離されるダイマー種又はより大きいものからなる、％ＨＭＷＰ(保持時間、７-８．５分)を測定するために使用される。モノマー含有量及び％ＨＭＷＰを、本方法により検出される全タンパク質含有量に対して測定する。
【００７０】
ＣＨＯ宿主細胞タンパク質の測定
ＣＨＯ宿主細胞タンパク質を２工程のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定する。測定は、マイクロタイタープレートに固定化されたポリクローナルウサギＨＣＰ抗体を用い、試料に存在する任意の宿主細胞タンパク質を捕捉することを含む。結合したＨＣＰを、ビオチンとコンジュゲートしたポリクローナルウサギＨＣＰ抗体を続けて添加することで検出し、順に、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたアビジンにより検出する。発色基質３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)と共にインキュベートすることに基づき、定量を行う。マイクロタイタープレートを４５０ｎｍで読み取る(参照波長は６２０ｎｍ)。
【００７１】
プロテインＡ誘導体漏出の測定
プロテインＡ誘導体漏出を、商業的に入手可能なキットを使用し、２工程のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定する。生成物におけるプロテインＡ誘導体の測定は、マイクロタイタープレートに固定化されたポリクローナルチキン抗-プロテインＡ抗体を用い、試料に存在するプロテインＡ誘導体を捕捉することを含む。プロテインＡ誘導体を、ビオチンとコンジュゲートしたポリクローナルウサギ抗-プロテイン抗体を続けて添加することで検出し、順に、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたアビジンにより検出する。発色基質ＴＭＢと共にインキュベートすることに基づき、定量を行う。マイクロタイタープレートを４５０ｎｍで読み取る(参照波長は６２０ｎｍ)。
【００７２】
実施例１０
４℃でのポロス５０ＨＳにおける抗体(抗-ＫＩＲ)のＣＩＥＸ
クロマトグラフィーシステム(アクタ・イクスプローラー(Akta Explorer)１００)及び溶媒を、４℃に設定された冷蔵庫に配した。
６．２ｍｇ／ｍＬの濃度で、２０．３ｍＬの抗体(例えば、WO2005003168、WO2005003172又はWO2006003179に記載されたような抗-ＫＩＲ)を、１０カラム容量(ＣＶ)の２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で予め平衡にされたポロス５０ＨＳカラム(３．１ｍＬの容量、直径１ｃｍ、長さ４ｃｍ)に充填した；流量は２５ＣＶ／ｈであった。
溶出前、カラムを、１０ＣＶの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸で洗浄した。
【００７３】
２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０．１ｍＭの酢酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０からなる１０ＣＶ超の溶出バッファーの線形勾配を使用し、溶出を実施した。抗体(抗ＫＩＲ)含有溶液を、先端のＯＤ１．０から後端のＯＤ１．０までを集めることによって達成した。カラムを、５ＣＶの１Ｍ ＮａＯＨ、続いて５ＣＶの２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭの酢酸、及び１０ＣＶの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で再生させた。
溶出プールにおける抗体の濃度をクロマトグラムから測定した(２８０ｎｍでの吸光度、伸び率＝１．４９(ｇ／Ｌ)−１・ｃｍ−１)。充填溶液における濃度に基づいた抗体の回収率は９７％であった；溶出液における抗体の濃度は３．７ｍｇ／ｍｌであった。
ＣＩＥＸ精製工程上では、プロセス流体におけるＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)の量は、因子３に低下した。室温(２０℃)での参照実験(厳密には同様の方法及び出発物質)の収率は９２％であった。低温でのＣＩＥＸでは、好ましくは室温で不安定な抗体に使用することができた。
【００７４】
実施例１１
非常に高充填でのポロス５０ＨＳにおける抗-ＩＬ２０のＣＩＥＸ(フロースルー方式)
クロマトグラフィーシステム(アクタ・イクスプローラー１００)及び溶媒を、２０℃に配した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、２１５ｍＬの抗体(例えば、WO9927103に記載されたような抗-ＩＬ２０)を、１０カラム容量(ＣＶ)の２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で予め平衡にされたポロス５０ＨＳカラム(３．１ｍＬの容量)に充填した；流量は２５ＣＶ／ｈであった。充填後、カラムを５ＣＶの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸で洗浄した。
【００７５】
収集したフロースループールにおける抗体の濃度をクロマトグラムから測定した(２８０ｎｍでの吸光度、伸び率＝１．５２(ｇ／Ｌ)−１・ｃｍ−１)。充填溶液における濃度に基づいた抗体の回収率は９１％であった；収集されたプールにおける抗体の濃度は９ｍｇ／ｍＬであった。ＣＩＥＸ精製工程上では、プロセス流体におけるＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)の量は、因子７に低下した。不純物の最大低下を得るために、クロマトグラフィープロセスのためのｐＨ調節は、ｐＨ４．５-６．０の範囲であることが必要である。
収集されたプールは、実施例６に記載したように、フロースルーＡＩＥＸを通した流れにおいて、さらに処理することができる。
【００７６】
実施例１２
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅにおける抗-ＩＦＮａの捕捉
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清を、濾過により粗く精製した(クラリガード(Clarigard)３．０μｍ、ポリセプ(Polysep)１／０．５μｍ、デュラポア(Durapore)０．２２μｍ）。細胞により生成された抗体の力価は３．４ｍｇ／ｍｌであった。
モノクローナル抗体のｐＩは７．７であった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム(１０００ｍｌ容量、高さ１３ｃｍ、直径１０ｃｍ)を、５カラム容量(ＣＶ)の２０ｍＭのホスファート(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて、予め平衡にしておいた：流量は２４ＣＶ／ｈであった。カラムに、流量１８ＣＶ／ｈで操作される、１０７５０ｍｌの濾過された細胞培養上清を充填した；充填容量は約３６ｍｇ／ｍｌのマトリックス物質であった。
【００７７】
溶出前、カラムを、４ＣＶの２０ｍＭのホスファート(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄した。６ＣＶ／ｈの流量で、１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５からなる１０ＣＶの溶出バッファーを使用し、溶出を実施した。溶出の直後、抗体プールを含有する溶出液の画分を、０．２Ｍのクエン酸溶液を使用してｐＨ４．０(伝導率０．１２ｍＳ／ｃｍ)〜ｐＨ３．７に調節し、ｐＨ３．７で１時間、室温で保持した。次に、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を使用し、溶液をｐＨ６．１に調節した。ついで、保管する前に、物質を濾過した(０．８＋０．４５μｍ、サルトポア２３００、０．０３ｍ２)。
この工程からの抗体収率は６２％であり、溶出液中の抗体濃度は９．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００７８】
実施例１３
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅにおける抗体抗-ＩＬ２０の捕捉
一時的に形質移入された培養からの細胞培養上清を、濾過により粗く精製した。モノクローナル抗体のｐＩは７．１であった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム(１ｍｌ容量、高さ２．５ｃｍ、直径０．７ｃｍ)を、１０カラム容量(ＣＶ)の２０ｍＭのホスファート(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて、予め平衡にしておいた：流量は６０ＣＶ／ｈであった。カラムに、流量３０-６０ＣＶ／ｈで操作される、５００ｍｌの濾過された細胞培養上清を充填した。
【００７９】
溶出前、カラムを、２５ＣＶの２０ｍＭのホスファート(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄した。２０ＣＶの溶出バッファーを使用し、０〜１００％の線形勾配において、溶出を実施した。試験した溶出バッファーは、(１)１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０、(２)０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０、又は(３)１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５からなる。溶出を６０ＣＶ／ｈの流量で実施した。カラムを付加的な１０ＣＶの溶出バッファー((１)１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０、(２)０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０、又は(３)１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５)、ついで５ＣＶの０．１ＭのＮａＯＨで再生させた。カラムを、１０ＣＶの２０ｍＭのホスファート(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて、再度平衡にした。収率は８５-９０％の範囲であった。
【００８０】
実施例１４
Ｆａｂ２精製プロセス
ＣＨＯ細胞培養からの抗-ＫＩＲのＦａｂ２断片の精製プロセスは、以下の工程からなる：親和性捕捉、ウイルス不活化／切断(ペプシン処理)、及びカチオン交換クロマトグラフィー。精製は以下に記載するようにして実施した。
【００８１】
全体的なプロセス：
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清を濾過し、５００ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーカラム(溶媒及び条件に応じて、以下参照)に充填した。６０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０の溶出バッファーを用いて、溶出を実施し、溶出後、ｍＡｂプールを、０．５ＭのＨＣｌを用いてｐＨ３．７５に調節した。１０ｍｇのペプシン／ｇ ｍＡｂを添加し、３７℃で３〜６時間インキュベートした。続いて、０．５Ｍの冷ＮａＯＨを添加することにより、プールをｐＨ７．０に調節し、４℃で少なくとも８時間インキュベートした。インキュベート後、プールのｐＨを５．０に調節した。さらに、Ｈ２Ｏを用いて、伝導率が２ｍＳ／ｃｍ以下になるまでプールを希釈し、ファインライン(FineLINE)１００カラムにおいて、５００ｍｌのソース(SOURCE)３０Ｓに充填した。２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０バッファーにおいて、２０ＣＶ超の０-０．２ＭのＮａＣｌの線形勾配を用い、溶出を実施した。
【００８２】
溶媒及び条件：
アフィニティークロマトグラフィー：
充填：細胞上清を０．４５μｍフィルターを通して濾過する
ｐＨ及び伝導率の測定
カラム物質：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、５００ｍｌのカラムＸＫ５０
バッファーＡ：２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２＋１５０ｍＭのＮａＣｌ
バッファーＢ：６０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０
バッファーＤ：０．１ＭのＮａＯＨ
サイクル：３ＣＶのバッファーＢを用いて再生
１０ＣＶのバッファーＡを用いて平衡化
１０ＣＶのバッファーＡを用いて洗浄(広範囲の洗浄により、ある程度の内毒          素が除去されるであろう)
１５ＣＶのバッファーＢを用いて段階溶出
５ＣＶのバッファーＤを用いてＣＩＰ
バッファーＡを用いて再平衡化
流量：３０-１８０ＣＶ／ｈ
クロマトグラフィーの温度：室温
【００８３】
切断(ペプシン処理)
Sigma-Aldrichからの、３２００-４５００単位／ｍｇタンパク質量で、ブタの胃粘膜を凍結乾燥させたパウダーのペプシンを、切断に使用した。
ペプシン保存溶液の調製：１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｈ２Ｏにペプシンを溶解。
ペプシン溶液の保管を−２０℃で実施。
ｍＡｂ試料：０．５Ｍの冷ＨＣｌを用いて、アフィニティー工程からのプールを、ｐＨ３．７５に調節。
ペプシン処理：試料に１０ｍｇペプシン／ｇ ｍＡｂを添加し、混合し、３７℃で３〜６時間インキュベート。ＳＥＣ-ＨＰＬＣにより反応をコントロール。０．５Ｍの冷ＮａＯＨをｐＨ７．０まで添加して反応を停止させ、続いて４℃で少なくとも８時間(一晩)インキュベート。
【００８４】
カチオン交換クロマトグラフィー
充填溶液の調製：ペプシン処理工程から得られた溶液を、伝導率が２ｍＳ／ｃｍ以下になるまで、Ｈ２Ｏで希釈する。ついで、ｐＨを５に調節する。
カラム物質：ソース３０Ｓ、カラムサイズ５００ｍｌ
限界容量：少なくとも１０ｍｇ／ｍｌカラム物質
バッファーＡ：２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０
バッファーＢ：２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０＋１．０ＭのＮａＣｌ
保存溶液１：１００ｍＭのＥＤＴＡ＋１００ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ
サイクル：１０ＣＶのバッファーＡを用いて平衡化
試料の充填
１０ＣＶのバッファーＡを用いて洗浄
塩勾配を用いた第１溶出；０-２０％のバッファーＢ、２０ＣＶ超
５ＣＶの１００％バッファーＢを用いて最終溶出
１ＭのＮａＯＨを用いて再生
流量：画分の収集中、１００ｍｌ／分
クロマトグラフィーの温度：室温
【００８５】
実施例１５
マウス抗-Ｃ５ａＲ及びヒト化抗-Ｃ５ａＲのアフィニティークロマトグラフィー精製
ＣＨＯ細胞培養からのｍＡｂのアフィニティー精製を次のようにして実施した。ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清を濾過し、１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーカラム(溶媒及び条件に応じて、以下参照)に充填した。１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．０又は１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０の溶出バッファーを用いて、溶出を実施し；溶出後、ｍＡｂプールを、０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．６に調節した。
【００８６】
溶媒及び条件：
カラム物質：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ(GE HealthCare cat no 17-5438-01)、１ｍｌのカラム、高さ５ｃｍ ｘ 直径０．５ｃｍ
バッファーＡ：２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２＋１５０ｍＭのＮａＣｌ
バッファーＢ１：５ｍＭのクエン酸水素二ナトリウム、ｐＨ３
バッファーＢ２：１０ｍＭのギ酸ナトリウム、ｐＨ３
バッファーＤ：０．１ＭのＮａＯＨ
バッファーＥ：０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．６
サイクル：３ＣＶのバッファーＢ１又はＢ２を用いて再生
１０ＣＶのバッファーＡを用いて平衡化
試料の充填
１０ＣＶのバッファーＡを用いて洗浄
１５ＣＶのバッファーＢ１又はＢ２を用いて段階溶出
５ＣＶのバッファーＤを用いてＣＩＰ
バッファーＡを用いて再平衡化
画分の収集：生成物の画分をプールし、バッファーＥを用いてｐＨを７．２に調節。
流量：３０-１８０ＣＶ／ｈ
クロマトグラフィーの温度：室温
分析方法の記載は実施例９に付与する。
【００８７】
実施例１６
製剤
実施例１に記載したＵＦ／ＤＦ工程を、バッファーを以下の溶液に交換することにより、抗-ＫＩＲについて適用した。
・５０ｍＭのホスファート、２５０ｍＭのスクロース、０．００１％のトゥイーン８０、ｐＨ７
・２０ｍＭのホスファート、２２０ｍＭのスクロース、０．００１％のトゥイーン８０、ｐＨ７
抗体の最終濃度は、双方の溶液において１０ｍｇ／ｍｌであった。
【００８８】
実施例１７
非常に高充填(フロースルー方式)でのＣＩＥＸ、続くフロースルーＡＩＥＸ
クロマトグラフィーシステム(アクタ・イクスプローラー１００)及び溶媒を、２０℃に配した。
５．２ｍｇ／ｍＬの濃度で、４７８ｍＬの抗体(抗-ＮＫＧ２Ａ)溶液(アフィニティークロマトグラフィー捕捉)を、１０カラム容量(ＣＶ)の２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１２．４ｍＭの酢酸、ｐＨ５．０で予め平衡にされたポロス５０ＨＳカラム(３．１ｍＬの容量)に、２５ＣＶ／ｈの流量を使用して充填した。
充填手順中に、フロースルー画分に抗体を収集した。収集したフロースループールにおける抗体の濃度を吸光度により測定した(２８０ｎｍ、伸び率＝１．５８(ｇ／Ｌ)−１・ｃｍ−１)。フロースルー画分における抗体の回収率は９２％であった。この画分におけるＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)及びＨＭＷＰ(凝集体)は、それぞれ因子１０及び３まで低下した。同様に、捕捉工程からのプロテインＡ誘導体の漏出もかなり低下した。抗体は樹脂に対して非常に高充填されているため、結合したモノマーは、充填中にＨＭＷＰ及びＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)に置き換えられた。不純物の最大低下を得るために、クロマトグラフィープロセスのためのｐＨ調節は、ｐＨ４．５-６．０の範囲であることが必要である。同様に、伝導率は０-１００ｍＭのＮａＣｌの範囲で最適化され得る。試料溶液及びフロースルー画分におけるＨＣＰ及びＨＭＷＰのレベルを表５に示す。
2011523408.tif 000006
【００８９】
収集したＣＩＥＸフロースループールを、０．５Ｍのリン酸水素二ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調節した。伝導率を、水を用いて７．０ｍＳ／ｃｍに調節した。充填溶液の容量は８２５ｍＬであり、抗体の濃度は２．７ｍｇ／ｍＬであった。溶液を、３５の膜容量(ＭＶ)の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、流量３００ＭＶ／ｈで予め平衡にされたサルトバインドＱ-ＭＡ７５(膜容量２．１ｍＬ)に通した。続いて、２０ＭＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で膜を洗浄した。
【００９０】
抗体をフロースループールに収集した。プールにおける抗体の濃度は２４．８ｍｇ／ｍＬに測定された。工程収率は９９％超であり、ＨＣＰＣＨＯＰの低下因子は３であった。試料溶液及びフロースルー画分におけるＨＣＰ及びＨＭＷＰのレベルを表６に示す。
2011523408.tif 000007
【００９１】
実施例１８
２工程アプローチを使用する抗-ＮＫＧ２Ｄの精製
ＣＨＯ細胞培養からの細胞培養上清(３．５ｇ／ｌ)を濾過し、１０６ｍｌのプロテインＡ誘導体(ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ)アフィニティーカラム(長さ１１ｃｍ)(溶媒及び条件に応じて、実施例１を参照)に充填した。全ての工程を室温で実施した。１０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５の溶出バッファーを使用し、溶出を実施した。溶出した生成物のプールを、０．２Ｍのクエン酸を用い、ｐＨをｐＨ３．６に調節することにより、ウイルス不活化にかけ、１時間、室温で保持した。続いて、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いて溶出液をｐＨ７．０に調節し、沈殿物を除去した。サルトバインドＱシングルセプカプセル(７５ｍ２)アニオン交換膜に充填する前に、室温で、溶液を７．０ｍＳ／ｃｍ(水又はＮａＣｌ)に調節した。さらにアニオン交換樹脂を使用してもよい。アニオン交換膜工程を、非結合条件下で、フロースルー方式で実施し、最後に、１０ｍＭのヒスチジンバッファー、ｐＨ６．２にて、続いて０．０１％までトゥイーン８０を添加することにより、アクタクロスフロー装置において、５０ｃｍ２のバイオマックス３０ｋ膜を用い、濾液を限外濾過又はダイアフィルトレーションした。ウイルス濾過をアニオン交換工程の後に追加することができる。製剤原料処方物の最終組成は、５０ｍｇのｍＡｂ／ｍＬ、８０ｇ／Ｌのスクロース、０．０３％ｗ／ｗのトゥイーン８０、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．２であった。精製の結果を表７に付与する。最も高い可能性のある収率を有する、不純物の最大低下が達成されるように、伝導率、及びＱ膜工程のｐＨ、及び膜を通過する充填溶液は、各ｍＡｂに対して調節される。よって、伝導率及びｐＨは、それぞれ２-１２ｍＳ／ｃｍ(ＮａＣｌ含有量によりコントロール)及びｐＨ５．８-８．０の範囲で変えてよい。
2011523408.tif 000008
【国際調査報告】
2011523408.tif 000009
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