(57)【要約】【課題】デンプンから工業生産物をつくるための改善された方法の必要性が当該分野に存在する。特に、糖化工程における改善された効率の必要性が存在する。【解決手段】バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のアルファアミラーゼ（ＡｍｙＥ）、その変異体、同をコードする核酸および該核酸を含む宿主細胞が提供される。ＡｍｙＥまたはその変異体を使用する方法、たとえばデンプンの液化および／または糖化が開示される。かかる方法は、エタノールの生産または高フルクトースコーンシロップの生産に有用な糖をもたらすことができる。ある場合には、該アミラーゼは低ｐＨでカルシウムの不存在下および／またはグルコアミラーゼの不存在下に用いられることができる。【選択図】図２
2011522546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン転化方法においてデンプンを液化しおよび糖化する方法であって、
デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させて反応混合物を形成し、該反応混合物中で該デンプン基質を液化しおよび糖化してグルコースを生産する工程を含み、
該液化および糖化がｐＨの調整なしに同じ反応混合物中で実施される、方法。
【請求項２】
糖化が、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドの不存在下に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液化が、グルコアミラーゼポリペプチドの活性に適したｐＨにおいて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｐＨが５．０以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが４．５以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨが４．０以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させる前に、反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させた後に、反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させるのと同時に、反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
液化および糖化によって生産されたグルコースを発酵させてアルコールを生産する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アルコールがエタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
糖化と発酵との少なくとも一部が、同じ反応混合物中で同時に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させてフルクトースを生産する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
外因性カルシウムが反応混合物に添加されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物中のカルシウム濃度が約８ｐｐｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させて、反応混合物中のカルシウムの量を低減することなく、フルクトースを生産する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＡｍｙＥポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＡｍｙＥポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＡｍｙＥポリペプチドが、Ｃ末端デンプン結合ドメインの欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＡｍｙＥポリペプチドが、α−アミラーゼ活性および酵素性能を改善する少なくとも１の変えられた特性を有する変異体ポリペプチドであって、該変異体ポリペプチドが、
ＡｍｙＥ（配列番号１）またはＡｍｙＥの切断変異体（配列番号２）から選択された親α−アミラーゼポリペプチドと少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 5 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択された１以上の位置における修飾を含み、
該修飾が酵素性能を改善する少なくとも１の特性について１．０超の性能指数（ＰＩ）を有する変異体ポリペプチドを生成する、変異体ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
修飾が、IA, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 1OA, 10I, 1OL, 1OM, ION, 1OP, 1OQ, 1OS, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 2OA, 2OC, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OL, 2OM, 2OP, 2OQ, 2OR, 2OS, 2OT, 20V, 2OW, 2OY, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 3OA, 3OC, 3OD, 3OE, 3OF, 3OG, 30I, 3OK, 3OL, 3OM, 3ON, 3OP, 3OQ, 3OR, 3OS, 3OT, 30V, 3OW, 3OY, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 4OA, 4OD, 4OM, 4ON, 4OP, 4OQ, 4OT, 40V, 4OW, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 5OA, 5OC, 5OE, 5OF, 5OG, 5OH, 50I, 5OK, 5OL, 5OM, 5ON, 5OP, 5OR, 5OS, 5OT, 50V, 5OW, 5OY, 5 IA, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 6OA, 6OC, 6OD, 6OE, 6OG, 60I, 6OK, 6OL, 6OM, 6ON, 6OQ, 6OR, 6OT, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 65I, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 66I, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 67I, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 68I, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69 A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 7OA, 7OE, 7OH, 7ON, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 73I, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 76I, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 77I, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 81I, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 83I, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 84I, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88I, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 9OC, 9OD, 9OE, 9OF, 9OG, 9OH, 90I, 9OK, 9OL, 9OM, 9ON, 9OQ, 9OR, 90S, 9OT, 90V, 9OW, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 93I, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 94I, 94M, 94T, 95 A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 96I, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 98I, 98L, 98M, 98T, 98V, 99 A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99I, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 10OA, lOOC, 10OF, 10OM, 10ON, 10OP, 10OT, 10OV, 10OY, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 103I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 106I, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111I, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 112I, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113I, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 115I, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 118I, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124I, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 125I, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129I, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 132I, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134I, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 147I, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 151I, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 153I, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 154I, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 155I, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 156I, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 157I, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 158I, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 162I, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163 Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 165I, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 166I, 166K, 166M, 166N, 166Q, 1
66R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 192I, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 194I, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 195I, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 198I, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 1991, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 202I, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204I, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 205I, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 217I, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 221I, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 222I, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 223I, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223W, 224I, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 225I, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 226I, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230I, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 239I, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242I, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 244I, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 246I, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 248I, 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251I, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 252I, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 253I, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255I, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 256I, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 258I, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259I, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 261I, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262I, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264I, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270I, 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 272I, 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 273I, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 275I, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 283I, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 285I, 285L, 285M, 285N, 285Q, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 286L, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 287S, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 288I, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, 291N, 291S, 291T, 291V, 292A, 292C, 292I, 292L, 292M, 292S, 292T, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 305I, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309I, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 310I, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 313I, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 315I, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 316I, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 317I, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 
320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 331I, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 33IY, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332I, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333I, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336I, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 338I, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339I, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341I, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348I, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349I, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352I, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 355I, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 356I, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357I, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359I, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362I, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365I, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367I, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368I, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 371I, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 37IW, 37IY, 372A, 372C, 372G, 372I, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 373I, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374I, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377I, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381I, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384I, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 386I, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 387I, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388I, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390I, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 391I, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395I, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 398I, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 399I, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 416I, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425 W, および 425Yからなる群から選択された１以上の位置における、親ポリペプチド中に存在する１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
修飾が位置１５３に存在するアミノ酸残基をＮ、ＫまたはＦに変える置換であり、変異体ポリペプチドが親ポリペプチドと比較してマルトースおよびマルトヘプタオース基質をグルコースに転化する能力の向上を示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
修飾が、Ｌ１４２Ｆ、Ｌ１４２Ｇ、Ｌ１４２Ｑ、Ｌ１４２Ｓ、Ｌ１４２Ｗ、Ｌ１４２Ｙ、Ａ２１４Ｉ、Ａ２１４Ｖ、Ｓ２４５Ｙ、Ｑ１２６Ｆ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｐ、Ｑ１２６Ｖ、Ｓ１３１ＬおよびＳ２４５Ｉからなる群から選択された置換である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
修飾が、Ｗ６０Ｌ、Ｗ６０Ｍ、Ｗ６０Ｎ、Ｉ１００Ｆ、Ｉ１００Ｍ、Ｓ１０５Ｍ、Ｓ１０５Ｗ、Ｇ２０７Ａ、Ｔ２７０Ａ、Ｔ２７０Ｅ、Ｔ２７０Ｌ、Ｔ２７０Ｎ、Ｔ２７０ＶおよびＴ２７９Ａからなる群から選択された置換である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＡｍｙＥポリペプチドを含んでいない同等のパン生地に観察される老化の量と比較して、老化を低減するのに十分な量のＡｍｙＥポリペプチドをパン生地に添加する工程を含む、パンの老化を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００８年６月６日に出願された米国特許仮出願番号第６１／０５９，５１３号および６１／０５９，６１８号の優先権を主張し、これらの内容はその全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【０００２】
バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のアルファアミラーゼ（ＡｍｙＥ）、その変異体、同をコードする核酸および該核酸を含む宿主細胞が提供される。ＡｍｙＥまたはその変異体を使用する方法、たとえばデンプンの液化および／または糖化が開示される。かかる方法は、エタノールの生産または高フルクトースコーンシロップの生産に有用な糖をもたらすことができる。ある場合には、該アミラーゼは低ｐＨにおいてカルシウムの不存在下および／またはグルコアミラーゼの不存在下に用いられることができる。
【背景技術】
【０００３】
穀粒、穀草および植物デンプン、たとえばコーンスターチは、シロップやバイオ燃料のような産物の工業的生産に広く用いられている。たとえば、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）は、高フルクトース含有量および砂糖に匹敵する甘味を有する加工された形のコーンシロップであり、このことによってＨＦＣＳはソフトドリンクや他の加工食品への砂糖代替物として有用である。ＨＦＣＳの生産は現在１０億ドル産業となっている。バイオ燃料としてのエタノールの生産も成長産業である。
【０００４】
コーンシロップおよびバイオ燃料は、デンプンからグルコースへの分解を触媒する酵素プロセスによってデンプンから生産されることができる。この酵素プロセスは、典型的には以下の一連の酵素で触媒された反応を含む。
【０００５】
（１）液化：アルファ（α）アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）は最初にデンプン懸濁物からマルトデキストリンへの分解を触媒し、このデンプン懸濁物は３０〜４０ｗ／ｗ％の乾燥固形分（ｄｓ）を含有することができる。α−アミラーゼは、内部α−１，４−Ｄ−グルコシド結合のランダム切断を触媒するエンドヒドロラーゼである。液化は典型的には高温度、たとえば９０〜１００℃で実施されるので、熱安定性のα−アミラーゼ、たとえばバチルス種由来のα−アミラーゼがこの工程では好まれる。この工程に現在用いられているα−アミラーゼ、たとえばバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびバチルスステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡｍｙＳ）由来のα−アミラーゼは有意の量のグルコースを生産しない。それよりむしろ、得られる液化物は低デキストロース当量（ＤＥ）を有し、マルトースおよび高重合度（ＤＰｎ）の糖を含有する。
【０００６】
（２）糖化：グルコアミラーゼおよび／またはマルトース生成型α−アミラーゼは、液化後に生成されたマルトデキストリンの非還元性末端の加水分解を触媒し、Ｄ−グルコース、マルトースおよびイソマルトースを放出する。糖化はグルコースに富んだまたは高マルトースのシロップを生産する。前者の場合、グルコアミラーゼは典型的には高められた温度、たとえば６０℃、ｐＨ４．３で酸性条件下に糖化を触媒する。このプロセスに用いられるグルコアミラーゼは、典型的には真菌、たとえばＯＰＴＩＤＥＸ（商標）Ｌ４００に用いられるアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼまたはフミコーラグリセア（Ｈｕｍｉｃｕｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼから得られる。脱分枝酵素、たとえばプルラナーゼは糖化を補助する。
【０００７】
マルトース生成型α−アミラーゼは、他方、糖化を触媒して高マルトースシロップを生成することができる。マルトース生成型α−アミラーゼは典型的にはグルコアミラーゼよりも高い最適ｐＨおよび低い最適温度を有し、マルトース生成型α−アミラーゼは典型的にはＣａ２＋を必要とする。この用途に現在用いられているマルトース生成型α−アミラーゼは、バチルスサブティリスα−アミラーゼ、植物性アミラーゼおよびアスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のα−アミラーゼ、すなわちＣＬＡＲＡＳＥ（商標）Ｌの活性成分を含む。様々な生成物を生産するために用いられる典型的な糖化反応が以下に示される。
【表１】
2011522546.tif 000003
【０００８】
（３）さらなる処理：グルコースに富んだシロップの生産後にプロセスの分岐点があり、上記の反応経路の左側に示されている。最終所望産物がバイオ燃料であれば、酵母がグルコースに富んだシロップをエタノールに発酵させることができる。他方、最終所望産物がフルクトースに富んだシロップであれば、グルコースイソメラーゼがグルコースに富んだシロップからフルクトースへの転化を触媒することができる。
【０００９】
糖化はグルコースに富んだシロップの生産における律速段階である。糖化は典型的には４８〜７２時間にわたって行われ、その時間までに多くの真菌グルコアミラーゼが有意の活性を失う。さらに、マルトース生成型α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼは双方とも糖化を触媒するけれども、これらの酵素は典型的には上記のように異なる最適ｐＨおよび温度で働く。両方の酵素が逐次的に用いられるならば、これら２の酵素間の反応条件の差はｐＨおよび温度を調整することを必要とし、これはそのプロセス全体の速度を落とし、不溶性アミロース凝集体の形成を生じることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、デンプンから工業生産物をつくるための改善された方法の必要性が当該分野に存在する。特に、糖化工程における改善された効率の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載されているのは、バチルスサブティリス（ＡｍｙＥ）由来のα−アミラーゼおよび関連したポリペプチドに関する組成物および方法である。
【発明の効果】
【００１２】
ＡｍｙＥα−アミラーゼは、ｐＨ５．０より下で、さらにはｐＨ４〜４．５で高い比活性を示すという点で特有である。さらにその上、Ｃａ２＋がＡｍｙＥの熱安定性に影響を与えないので、外因性のＣａ２＋をデンプンの液化または糖化反応に添加する必要が除かれる。ＡｍｙＥポリペプチドのこれらの特徴は、液化および糖化が同じ反応混合物中で（および任意的に同じ反応容器中で）実施されることを、液化および糖化の間の反応混合物のｐＨを調整する必要なく可能にする。特に、ＡｍｙＥおよびグルコアミラーゼを用いるときに反応条件が調整される必要がなく、液化および糖化の間の工程および時間遅延を、不溶性アミロース凝集物の潜在的形成ともども回避することができる。したがってＡｍｙＥはグルコアミラーゼと逐次的にまたはそれと同時に、およびグルコアミラーゼに最適であるｐＨおよびＣａ２＋濃度において用いられて、デンプンを液化および／または糖化することができる。ＡｍｙＥは、またグルコアミラーゼ活性も示し、糖化を遂行するためのグルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドの必要を低減しまたは排除する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号１のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ（本明細書では「ＡｍｙＥ完全長」と呼ばれる。）と配列番号３のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥ（本明細書では「Ａｍｙ３１Ａ」と呼ばれる。）との間の配列アラインメントを示す図である。アミノ酸配列の差異はボールド体で示される。残基は、成熟型のこれらの酵素中の最初のアミノ酸から数えられる。
【図２】ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（「ＳＡＭＹ４２５ａａ」と表示される。）を含むプラスミドｐＭＥ６３０−７を示す図である。このプラスミドは、ＳＡＭＹ遺伝子とインフレームで、バチルスリケニフォルミスα−アミラーゼ由来のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む（「プレＬＡＴ」と表示される）。
【図３】ＡｍｙＥ（配列番号１：「ＡｍｙＥ完全長」）、ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２：「ＡｍｙＥ切断体」）およびＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）の、Ｒａｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＲＢＢ）で標識された不溶性トウモロコシデンプン基質に対する相対比活性を示す図である。該基質の加水分解反応は、ｐＨ４．５、５．０または５．６において５０℃で３０分間触媒された。酵素活性は放出されたＲＢＢ標識の５９５ｎｍにおける吸光度によって測定された。
【図４Ａ】ｐＨ４．５または５．８における０．７ｍｇのＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）の存在下に時間（分）の関数として測定された１５ｇのｄｓデンプン基質の粘度（μＮｍ）を示すグラフである。
【図４Ｂ】ｐＨ４．５または５．８における２．２ｍｇのＡｍｙＥ（配列番号１）の存在下の時間の関数としての基質粘度を示すグラフである。
【図４Ｃ】ｐＨ４．５または５．８における１．４ｍｇのＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）の存在下の時間の関数としての基質粘度を示すグラフである。
【図４Ｄ】ｐＨ４．５または５．８における４．１ｍｇのＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）の存在下の時間の関数としての基質粘度を示すグラフである。
【図５Ａ】２ｍＭのＣａ２＋の存在または不存在下のＡｍｙＥ（配列番号１：「ＡｍｙＥ完全長」）およびＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２：「ＡｍｙＥ切断体」）の過剰熱容量関数の示差走査熱量計（ＤＳＣ）分析を示すグラフである。
【図５Ｂ】２ｍＭのＣａ２＋の存在または不存在下のＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）のＤＳＣ分析を示すグラフである。
【図５Ｃ】２ｍＭのＣａ２＋の存在または不存在下のゲオバチルスステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼ（ＡｍｙＳ）のＤＳＣ分析を示すグラフである。
【図６】ＡｍｙＥの位置Ｑ１５３変異体および切断ＡｍｙＳ（配列番号４）と比較したＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）によるマルトース基質からのグルコース生産の結果を示すグラフである。
【図７】ＡｍｙＥの位置Ｑ１５３変異体および切断ＡｍｙＳ（配列番号４）と比較したＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）によるマルトヘプタオース基質からのグルコース生産の結果を示すグラフである。
【図８】ＡｍｙＥ−ｔｒをマルトヘプタオース（ＤＰ７）とともに０時間（上図）および７２時間（下図）温置した後のＨＰＬＣによって検出された分解生成物を示すグラフである。
【図９】ＡｍｙＳをＤＰ７の基質とともに０時間、２時間、４時間および２４時間（上図から順に下図へ）温置した後のＨＰＬＣによって検出された分解生成物を示すグラフである。
【図１０】ＡｍｙＥ−ｔｒのＱ１５３Ｋ変異体をマルトヘプタオース（ＤＰ７）とともに温置することによって生成された生成物を示すグラフである。上図から順に下図に示されたＨＰＬＣ追跡曲線は、時間０時間、１時間、２時間、３時間および２４時間に対応する。
【図１１】ｐＨ４．３および５．８での慣用の発酵において切断ＡｍｙＥおよびＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａアミラーゼによるエタノール生成を示すグラフである。
【図１２】ｐＨ４．３および５．８においてＡｋＡＡ単独またはＳｔａｒｇｅｎ（商標）００２と比較した完全長（ＦＬ）および切断（ｔｒ）ＡｍｙＥによる不溶性顆粒（未調理）デンプンからエタノールへの加水分解を示すグラフである。
【図１３】ｐＨ４．５および５．６においてＡｍｙＳと比較したバチルスサブティリスＡｍｙＥ完全長、ＡｍｙＥ切断体およびＡｍｙ３１Ａによるグルコース生成を示すグラフである。
【図１４】完全長ＡｍｙＥを粗デンプン（トウモロコシ粉）とともに温置し、時間（０、３０、９０分間）とともに生産されたオリゴ糖のＨＰＬＣによる検出の結果を示すグラフである。
【図１５】ＡｍｙＥポリペプチドを用いたデンプン加水分解アッセイにおいて得られたピークおよび最終粘度を示すグラフである。
【図１６】ＡｍｙＥポリペプチドを用いたパン老化アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１の側面では、デンプン転化方法においてデンプンを液化しおよび糖化する方法であって、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させて反応混合物を形成し、該反応混合物中で該デンプン基質を液化しおよび糖化してグルコースを生産する工程を含み、該液化および糖化がｐＨの調整なしに同じ反応混合物中で実施される、方法が提供される。
【００１５】
ある実施態様では、糖化すること（すなわち、糖化）が、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドの不存在下に実施される。ある実施態様では、液化すること（すなわち、液化）が、グルコアミラーゼポリペプチドの活性に適したｐＨにおいて実施される。ある実施態様では、該ｐＨは５．０以下である。ある実施態様では、該ｐＨは４．５以下である。ある実施態様では、該ｐＨは４．０以下である。ある実施態様では、外因性カルシウムが反応混合物に添加されない。ある実施態様では、反応混合物中のカルシウム濃度は約８ｐｐｍ未満である。
【００１６】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドは、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させる前に、反応混合物に添加される。ある実施態様では、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドは、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させた後に、反応混合物に添加される。ある実施態様では、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドは、デンプン基質をＡｍｙＥポリペプチドに接触させるのと同時に、反応混合物に添加される。
【００１７】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、液化および糖化によって生産されたグルコースを発酵させてバイオ燃料、たとえばアルコールを生産する工程を含む。ある実施態様では、該アルコールはエタノールである。ある実施態様では、該アルコールはブタノールである。ある実施態様では、糖化と発酵との少なくとも一部が、ＳＳＦの場合のように、同じ反応混合物中で同時に行われる。
【００１８】
ある実施態様では、回分式発酵プロセスが閉鎖系で用いられ、この場合反応混合物の組成が（ｐＨを含めて）発酵の初めに選択され、発酵の間変えられない。他の実施態様では、「流加回分式発酵」系が用いられ、この場合発酵が進行するにつれてデンプン基質が徐々に添加される。さらに他の実施態様では、連続発酵系が用いられ、この場合所定の発酵媒体がバイオ反応器に連続的に加えられ、そして等量の調整済みの反応混合物が取り出されてさらに処理される。
【００１９】
ある実施態様では、糖化デンプン溶液はフルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）、たとえばＨＦＣＳに転化される。ＨＦＳＳへの転化は約６．０〜約８．０のｐＨ、たとえばｐＨ７．５で触媒されることができ、産物は４０〜４５％のフルクトースを含有することができる。ある実施態様では、本発明の方法はさらに、液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させて（たとえば、ＨＦＣＳの形で）フルクトースを生産する工程を含む。ある実施態様では、外因性カルシウムは反応混合物に添加されない。ある実施態様では、反応混合物中のカルシウム濃度は約８ｐｐｍ未満である。ある実施態様では、本発明の方法はさらに、液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させて、反応混合物中のカルシウムの量を低減することなくフルクトースを生産する工程を含む。
【００２０】
ある実施態様では、ＡｍｙＥポリペプチドは乾燥固形分（ｄｓ）メートルトン当たり約０．０３〜１ｋｇの量で反応混合物に添加される。ある実施態様では、反応混合物は約２０〜３５（ｗ／ｗ）％ｄｓを有するデンプンスラリーである。糖化反応は約６０℃〜約９０℃、たとえば７０℃〜８５℃、さらにデンプンゲル化温度の１０、１２、１４、１６、１８またはさらに２０℃下の（たとえば、約７５℃の）温度および約４．０〜約６．０、たとえば約４．２〜約４．８のｐＨで実施されることができる。ある実施態様では、糖化反応の生成物はグルコースに富んだシロップである。このグルコース濃度は少なくとも約９５ｗ／ｗ％ｄｓに達することがある。
【００２１】
ある実施態様では、ＡｍｙＥポリペプチドは任意の天然に存在するＡｍｙＥポリペプチドであり、たとえば配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸配列、または、たとえばＢＬＡＳＴ配列アラインメントアルゴリズムで測定されて配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＡｍｙＥポリペプチドである。特定の実施態様では、本発明の方法に用いられるＡｍｙＥポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施態様では、本発明の方法に用いられるＡｍｙＥポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２２】
ある実施態様では、本発明の方法に用いられるＡｍｙＥポリペプチドはＣ末端デンプン結合ドメインの欠失を含む。特定の実施態様では、Ｃ末端欠失を有するＡｍｙＥポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施態様では、このＡｍｙＥポリペプチドは（配列番号１に関して）残基Ｄ４２５を切除されている。
【００２３】
他の実施態様では、有利な特性を有するＡｍｙＥ変異体が提供される。ＡｍｙＥ変異体は、野生型ＡｍｙＥポリペプチドと比較して変えられた１または複数の特性、たとえばデンプン、マルトヘプタオースおよび／またはマルトトリオース基質に対する比活性、基質特異性、熱安定性、最適温度、最適ｐＨ、ｐＨおよび／または温度の範囲、酸化安定性、デンプン組成物の粘度を下げる能力等に関する変えられた特性を有する。ある実施態様では、ＡｍｙＥ変異体の変えられた特性は、特定のｐＨ（たとえば、４または５．８）における特定のトウモロコシ粉、マルトトリオース、マルトヘプタオース基質上での比活性、特定の温度（たとえば、６０℃）における熱安定性または特定のｐＨ（たとえば、８またはｐＨ１０）における洗浄性能に関する。この変えられた特性は性能指数（ＰＩ）によって特徴付けられることができ、ＰＩとは野生型ＡｍｙＥの性能と比較したＡｍｙＥ変異体の性能の割合である。ある実施態様ではＰＩは約０．５よりも大きく、他方、他の実施態様ではＰＩは約１でありまたは１よりも大きい。
【００２４】
１の側面では、この変異体ポリペプチドはα−アミラーゼ活性および酵素性能を改善する少なくとも１の変えられた特性を有し、該変異体ポリペプチドは、
ＡｍｙＥ（配列番号１）またはＡｍｙＥの切断変異体（配列番号２）から選択された親α−アミラーゼポリペプチドと少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 5 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択された１以上の位置における修飾を含み、
該修飾は、酵素性能を改善する少なくとも１の特性について１．０超の性能指数（ＰＩ）を有する変異体ポリペプチドを生成する。
【００２５】
ある実施態様では、変異体ポリペプチドは1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択された１以上の位置における修飾であって、該修飾がタンパク質の発現について０．５よりも大きい性能指数（ＰＩ）および酵素性能を改善する少なくとも１の特徴について１．１よりも大きいＰＩを有する変異体ポリペプチドを生成する、修飾を含む。
【００２６】
ある実施態様では、この１以上の位置は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択され、これらの位置は完全長親ポリペプチドか、あるいは切断された親ポリペプチドにおける性能について非完全制限位置である。
【００２７】
ある実施態様では、この修飾は、IA, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 1OA, 10I, 1OL, 1OM, ION, 1OP, 1OQ, 1OS, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 2OA, 2OC, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OL, 2OM, 2OP, 2OQ, 2OR, 2OS, 2OT, 20V, 2OW, 2OY, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 3OA, 3OC, 3OD, 3OE, 3OF, 3OG, 30I, 3OK, 3OL, 3OM, 3ON, 3OP, 3OQ, 3OR, 3OS, 3OT, 30V, 3OW, 3OY, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 4OA, 4OD, 4OM, 4ON, 4OP, 4OQ, 4OT, 40V, 4OW, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 5OA, 5OC, 5OE, 5OF, 5OG, 5OH, 50I, 5OK, 5OL, 5OM, 5ON, 5OP, 5OR, 5OS, 5OT, 50V, 5OW, 5OY, 5 IA, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 6OA, 6OC, 6OD, 6OE, 6OG, 60I, 6OK, 6OL, 6OM, 6ON, 6OQ, 6OR, 6OT, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 65I, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 66I, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 67I, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 68I, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69 A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 7OA, 7OE, 7OH, 7ON, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 73I, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 76I, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 77I, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 81I, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 83I, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 84I, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88I, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 9OC, 9OD, 9OE, 9OF, 9OG, 9OH, 90I, 9OK, 9OL, 9OM, 9ON, 9OQ, 9OR, 90S, 9OT, 90V, 9OW, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 93I, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 94I, 94M, 94T, 95 A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 96I, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 98I, 98L, 98M, 98T, 98V, 99 A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99I, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 10OA, lOOC, 10OF, 10OM, 10ON, 10OP, 10OT, 10OV, 10OY, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 103I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 106I, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111I, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 112I, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113I, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 115I, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 118I, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124I, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 125I, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129I, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 132I, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134I, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 147I, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 151I, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 153I, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 154I, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 155I, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 156I, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 157I, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 158I, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 162I, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163 Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 165I, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 166I, 166
K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 192I, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 194I, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 195I, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 198I, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 1991, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 202I, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204I, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 205I, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 2141, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 217I, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 221I, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 222I, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 223I, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223W, 224I, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 225I, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 226I, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230I, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 239I, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242I, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 244I, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 246I, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 248I, 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251I, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 252I, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 253I, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255I, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 256I, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 258I, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259I, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 261I, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262I, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264I, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270I, 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 272I, 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 273I, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 275I, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 283I, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 285I, 285L, 285M, 285N, 285Q, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 286L, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 287S, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 288I, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, 291N, 291S, 291T, 291V, 292A, 292C, 292I, 292L, 292M, 292S, 292T, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 305I, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309I, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 310I, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 313I, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 315I, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 316I, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 317I, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320K, 320L, 320M, 32
0N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 331I, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 33IY, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332I, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333I, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336I, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 338I, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339I, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341I, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348I, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349I, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352I, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 355I, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 356I, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357I, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359I, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362I, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365I, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367I, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368I, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 371I, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 37IW, 37IY, 372A, 372C, 372G, 372I, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 373I, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374I, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377I, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381I, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384I, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 386I, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 387I, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388I, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390I, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 391I, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395I, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 398I, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 399I, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 416I, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425 W, および 425Yからなる群から選択された１以上の位置における、親ポリペプチド中に存在する１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換である。
【００２８】
ある実施態様では、この修飾は、1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 4I, 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 10I, 1OL, 1OM, 1OP, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 12I, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 2OA, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OM, 2OR, 2OS, 20V, 2OW, 2OY, 21E, 21I, 21M, 21Q, 21S, 21V, 22I, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26I, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 36I, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45I, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 5OE, 50F, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 53I, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 6OL, 6ON, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 65I, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 67I, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 68I, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 9OD, 9OE, 9OF, 9OH, 90I, 9OK, 9OM, 9ON, 9OR, 90S, 9OT, 90V, 9OW, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N, 91Q, 91R, 91S, 92L, 92V, 93 A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 93S, 93Y, 94I, 95F, 95M, 96I, 98C, 99I, 1OOC, 10OF, 10OM, 10OV, 103A, 103C, 103V, 104A, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 109I, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 110V, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, 111T, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 112S, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 115I, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 125I, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132I, 132N, 132S, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 158I, 158M, 158T, 158V, 159H, 159I, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160Q, 160S, 160T, 160V, 162I, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165I, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 166I, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 171I, 171M, 171N, 171Q, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 179S, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 192S, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 198I, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 200I, 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203 A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204I, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205I, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 217I, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223W, 224I, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 226I, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 230I, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 236I, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 239I, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 242I, 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244I, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 246I, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 253I, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 255I, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 256I, 257E, 257I, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 262I, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 264I, 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 273I, 273L, 273T, 273 Y, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 288I, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 292I, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295 A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 2991, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 301I, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 30
8P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373I, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, および 425Yからなる群から選択された１以上の位置における、親ポリペプチド中に存在する１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換である。
【００２９】
ある実施態様では、この置換は位置１５３に存在するアミノ酸残基をＮ、ＫまたはＦに変え、この変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較してマルトースおよびマルトヘプタオース基質をグルコースに転化する能力の向上を示す。ある実施態様では、この置換は位置１５３に存在するアミノ酸残基をＫに変え、この変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較してＤＰ７の基質をグルコースに転化する能力の向上を示す。
【００３０】
ある実施態様では、この置換はＬ１４２Ｆ、Ｌ１４２Ｇ、Ｌ１４２Ｑ、Ｌ１４２Ｓ、Ｌ１４２Ｗ、Ｌ１４２Ｙ、Ａ２１４Ｉ、Ａ２１４Ｖ、Ｓ２４５Ｙ、Ｑ１２６Ｆ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｐ、Ｑ１２６Ｖ、Ｓ１３１ＬおよびＳ２４５Ｉからなる群から選択され、該置換は、配列番号１の親ポリペプチドに比較して変異体ポリペプチドのデンプン液化性能を改善する。ある実施態様では、この置換はＷ６０Ｌ、Ｗ６０Ｍ、Ｗ６０Ｎ、Ｉ１００Ｆ、Ｉ１００Ｍ、Ｓ１０５Ｍ、Ｓ１０５Ｗ、Ｇ２０７Ａ、Ｔ２７０Ａ、Ｔ２７０Ｅ、Ｔ２７０Ｌ、Ｔ２７０Ｎ、Ｔ２７０ＶおよびＴ２７９Ａからなる群から選択され、該置換は、配列番号２の親ポリペプチドに比較して変異体ポリペプチドのデンプン液化性能を改善する。
【００３１】
ある実施態様では、この置換は052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, および 416Vからなる群から選択され、この突然変異体はタンパク質および活性の双方についてＰＩ値＞０．５を有する。
【００３２】
ある実施態様では、変異体ポリペプチドは親ポリペプチドの７５、９７，１０１，１０２，１２０，１２３、１３３，１３７、１８２、２６６および３０６からなる群から選択された位置におけるアミノ酸残基の修飾を含まない。ある実施態様では、変異体ポリペプチドは７５および１２３からなる群から選択された位置におけるアミノ酸残基の修飾を含まず、これらの位置は切断型親ポリペプチドの性能について完全制限位置であることが見つけ出された。ある実施態様では、変異体ポリペプチドは７５、９７，１０１，１０２，１２０，１３３，１３７、１８２、２６６および３０６からなる群から選択された位置におけるアミノ酸残基の修飾を含まず、これらの位置は完全長親ポリペプチドの性能について完全制限位置であることが見つけ出された。
【００３３】
ある実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
ある実施態様では、酵素性能を改善する特徴は、熱安定性の向上、比活性の向上およびタンパク質発現の向上からなる群から選択される。
【００３４】
ある実施態様では、酵素性能を改善する特徴は、熱安定性の向上、比活性の向上およびタンパク質発現の向上からなる群から選択される。
【００３５】
同様に提供されるのは、ＡｍｙＥポリペプチド（変異体を含む。）および任意的にグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、真菌α−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼまたはこれらの組み合わせを含むデンプン処理組成物である。特定の実施態様では、この組成物はグルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドを含む。
【００３６】
同様に提供されるのは、ＡｍｙＥポリペプチド（変異体を含む。）を溶液中にまたはゲル中に含むベーキング組成物である。ベーキングの方法は、焼かれるべき物質にベーキング組成物を加えそしてその物質を焼くことを含む。関連した側面では、ＡｍｙＥポリペプチドを含んでいない同等のパン生地に観察される老化の量と比較して、老化を低減するのに十分な量のＡｍｙＥポリペプチドをパン生地に添加する工程を含む、パンの老化を低減する方法が提供される。
【００３７】
他の側面では、ＡｍｙＥポリペプチド（変異体を含む。）および任意的に他の酵素、洗剤および／または漂白剤を水性溶液中に含む洗浄組成物が提供される。洗浄溶液は、衣類の洗濯、食器洗いまたは他の表面の洗浄に用いられることができる。関連した方法では、食器、洗濯物またはその他の表面は、これらの物品は洗浄されるのに十分な時間洗浄組成物と接触される。
【００３８】
他の側面では、ＡｍｙＥポリペプチド（変異体を含む。）および任意的に他の酵素を水性溶液中に含む布地サイズ剤除去組成物が提供される。関連した方法では、布地は該布地をサイズ剤除去するのに十分な時間サイズ剤除去組成物と接触される。
【００３９】
他の側面では、ＡｍｙＥ変異体をコードする核酸、かかるポリペプチドを含む発現ベクターおよびＡｍｙＥ変異体を発現する宿主細胞が提供される。さらに他の側面では、本明細書に記載されたＡｍｙＥ変異体のいずれかをコードする核酸に相補的な核酸が提供される。さらに、本明細書に記載されたＡｍｙＥ変異体のいずれかをコードする核酸にハイブリダイズする能力のある核酸またはその相補体が提供される。他の側面では、本明細書に記載されたＡｍｙＥ変異体のいずれかをコードする合成的核酸を含む組成物および方法であって、コドンが特定の宿主生物中での発現のために任意的に最適化される組成物および方法が提供される。
【００４０】
本発明の組成物および方法のこれらのおよび他の側面ならびに実施態様は、以下の記載および添付図面から明らかにされる。
【００４１】
以下の配列が本願明細書において言及される。
【００４２】
配列番号１：完全長バチルスサブティリスＡｍｙＥアミノ酸配列。天然シグナル配列は示されていない。
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL
451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT
501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL
551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD
601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH
【００４３】
配列番号２：切断バチルスサブティリスＡｍｙＥ（ＡｍｙＥ−ｔｒ）アミノ酸配列。天然シグナル配列は示されていない。
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGE IL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD
【００４４】
配列番号３：バチルスサブティリスα−アミラーゼ変異体Ａｍｙ３１Ａアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ  受入番号Ｏ８２９５３）。天然シグナル配列はボールド体で示される。
1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG
51 TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SP INQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA
151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK
201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK
451 LTGTINARSA AVLYPDD IGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK
501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDP I GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ
551 EYTFVKKDPS QTNI IGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM
601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN
651 SGLNGYLPH
【００４５】
配列番号４：切断ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ（ＡｍｙＳ）タンパク質配列（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａアミラーゼ）。天然シグナル配列はボールド体で示される。
1 MLTFHRI IRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW
251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY
301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD
351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAF ILTRQ EGYPCVFYGD
401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSD I IGWTREGVTE
451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG
501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT
【００４６】
配列番号５：配列番号１のＡｍｙＥをコードするヌクレオチド配列
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGT TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA CCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCG ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG CCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAA AACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACAC AAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGA CGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAA TTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTG TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGT CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAG TACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGC CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGA ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATAT TGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGAT CAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATG GACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAA AACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGT TTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCC AGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCC TGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGAT ACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTG GCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT
【００４７】
配列番号６：ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGT TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA CCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCG ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG CCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAA AACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACAC AAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGA CGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAA TTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTG TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGT CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAG TACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGC CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGA ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT
【００４８】
配列番号７：バチルスサブティリスＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列
TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAACACGCTGACCCAGAACA TGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGA AGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAG ATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCGGCTGAGAAAT ATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAG CGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTGGAGCGAC CGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAAAACACCGAAG TACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTA CGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAAC ATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACA CCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCT GAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAA CTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACGACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGA GCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTT CTTTAGCCGTCCGGAAGGTGGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGAT CGTGGCTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATGG CAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGG CAGCAAAGGCGTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAA CTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGC TGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCC GCACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCGTC ACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGAAACTG CTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACTTATAACGT TAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGAAA GACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGGTAATGTGAACGCTT ACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCTTGGCCAGGTAAAGCCAT GACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCAATGCGGATACCGCAGATGCG AAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCAAAACCATCCGGGCTTTGACTACG TACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC
【００４９】
配列番号８：ゲオバチルスステアロサーモフィルスＡｍｙＳ（配列番号４）をコードするヌクレオチド配列
GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGT TATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCT GCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGAC CTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTC AAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAA AGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAA GAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACA CCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAA ATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGA AACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGA AAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAA GCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCG CTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAA CAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATC AGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTG GCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACC CATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTT TTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCG CTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACA TCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCAC CGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTAT GACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAG TCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC
【００５０】
配列番号９：配列番号１のＡｍｙＥの天然シグナル配列
ＭＦＡＫＲＦＫＴＳＬＬＰＬＦＡＧＦＬＬＬＦＨＬＶＬＡＧＰＡＡＡＳＡＥＴＡＮＫＳＮＥ
【００５１】
配列番号１０：プライマーＰＳＴＡＭＹＥ−Ｆ５'
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣ
【００５２】
配列番号１１：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｒ５'
ＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧ
【００５３】
配列番号１２：プライマーＡＭＹＥＮＯＰＳＴ−Ｆ５'
ＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧ
【００５４】
配列番号１３：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ−Ｒ５'
ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴＣ
【００５５】
配列番号１４：プライマーＨＰＡＩＡＭＹＥ４６６−Ｒ５'
ＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧ
【００５６】
配列番号１５：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ１  ５'
ＴＡＣＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧ
【００５７】
配列番号１６：プライマーＡＭＹＥ  ＳＥＱ−Ｆ２  ５'
ＣＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣ
【００５８】
配列番号１７：ブティアウクセラフィターゼ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｐｈｙｔａｓｅ）のＢＰ−１７変異体
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL
KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ
【００５９】
本発明の組成物および方法は、バチルスサブティリス由来のα−アミラーゼ（ＡｍｙＥ）およびその変異体（集合的にＡｍｙＥポリペプチドという。）に関するものであり、これらは他のアミラーゼに比較してある利点を提供する。たとえば、ＡｍｙＥポリペプチドは酸性ｐＨにおいてデンプン基質に対する高い比活性を示し、糖化についても適している条件下にＡｍｙＥポリペプチドがデンプン液化に用いられることを可能にする。これは液化と糖化との間のデンプンスラリーのｐＨを調整する必要を排除する。ＡｍｙＥポリペプチドはグルコアミラーゼ活性をも有し、別のグルコアミラーゼを用いて糖化を実施する必要を排除しまたは低減する。さらに、ＡｍｙＥポリペプチドは熱安定性のためのカルシウムをほとんどまたは全く必要とせず、異性化を実施する前に添加されたカルシウムをその後に除去する必要をなくし、それによって高フルクトースコーンシロップの生産に要求される少なくとも１工程を排除する。
【００６０】
本発明の組成物および方法のこれらのまたは他の特徴は、以下にもっと詳細に記載される。
定義および略号
【００６１】
特に指定されない限り、全ての技術および科学用語および略号は、当業者によって理解されるようにこれらの通常の意味に一致していなければならない。以下の用語および略号は明確化のために定義される。
１．１．定義
【００６２】
本明細書で用いられる「デンプン」の語は、植物の複合多糖炭水化物から構成される任意の物質をいい、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有するアミロースおよびアミロペクチンから構成され、ここでＸは任意の数字である。特に、この語は任意の植物に基づいた物質をいい、たとえば、以下のものに限定されることなく、穀粒、草、塊茎および根、より具体的には小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、ふすま、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモおよびタピオカである。
【００６３】
本明細書で用いられる「オリゴ糖」の語は、３〜２０の単糖から構成される糖質分子をいう。
【００６４】
本明細書で用いられる「アミラーゼ」とは、デンプンの分解を触媒する能力のある酵素をいう。一般に、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムな様式で切断するエンド作用性酵素である。対照的に、エキソ作用性デンプン分解酵素、たとえばβ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）およびマルトース生成型α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）のようないくつかの生成物特異性アミラーゼは、基質の非還元性末端からデンプン分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）および生成物特異性アミラーゼは、デンプンから特定の長さのマルトオリゴ糖を生産することができる。明細書で用いられるように、アミラーゼは任意の／全てのアミラーゼ、たとえばグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび野生型α−アミラーゼ、たとえばバチルス種のもの、たとえばバチルスリケニフォルミスおよびバチルスサブティリスを含み、他方、α−アミラーゼはこれらの酵素の上述の下位集団を含む。
【００６５】
本明細書で用いられる「α−アミラーゼ変異体」および類似の語句は、参照α−アミラーゼの変異体／突然変異体をいい、これは該参照α−アミラーゼの親（野生型；参照）アミノ酸配列についてのアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含む。「変異体」の語は、「突然変異体」の語と互換的に用いられる。変異体α−アミラーゼは、親シグナル配列に関して該シグナル配列中に突然変異を含むことができる。さらに、α−アミラーゼは、非相同のα−アミラーゼシグナル配列、たとえばバチルスリケニフォルミス（ＬＡＴ）由来のものを含む融合タンパク質の形態をしていることができる。
【００６６】
「親核酸／ポリヌクレオチド」、「野生型核酸／ポリヌクレオチド」または「参照核酸／ポリヌクレオチド」とは、親ポリペプチドをコードする核酸配列およびそれに相補的な核酸をいう。
【００６７】
「変異体核酸／ポリヌクレオチド」とは、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列もしくはそれに相補的な核酸、または親ポリヌクレオチド配列もしくはそれに相補的な核酸についての少なくとも１の塩基の置換、挿入もしくは欠失を有するポリヌクレオチド配列をいう。この場合、特定のかかる核酸は、参照配列と特定の相同性の程度を有するもの、または、たとえば厳密度条件［たとえば、５０℃および０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）］または高度厳密度条件［たとえば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）］下に参照配列にハイブリダイズする能力のあるものを含む。変異体核酸は、特定の宿主生物、たとえばメチロトローフ酵母（たとえば、ピチア、ハンゼヌラ等）または糸状菌（たとえば、トリコデルマ（たとえば、トリコデルマリーゼイ）等）または他の発現宿主（たとえば、バチルス、ストレプトマイセス等）のための好まれるコドンの使用頻度を反映するように最適化されることができる。
【００６８】
「シグナル配列」とは、タンパク質のＮ末端部分につながれたアミノ酸配列であり、これは細胞外へのタンパク質の分泌を促進する。「シグナル配列」は「リーダー配列」または「プロ配列」とも呼ばれることがある。
【００６９】
本明細書で用いられる「未成熟」または「完全長（ＦＬ）」型のアミラーゼは、シグナルペプチドを含む。未成熟型は他の翻訳後修飾を含むことができる。
【００７０】
本明細書で用いられる「成熟」型の細胞外タンパク質（たとえば、アミラーゼ）はシグナル配列を欠いている。シグナル配列は分泌過程の間に切り離されることができる。あるいは、ポリペプチドはその成熟型で、たとえば細胞内タンパク質として発現され、またはその成熟型で合成されることができる。
【００７１】
本明細書で用いられる「切断され」た形態のＡｍｙＥ（すなわち、ＡｍｙＥ−ｔｒ）は、Ｃ末端デンプン結合ドメインの全てまたは一部の欠失を有するＡｍｙＥポリペプチドをいう。配列番号２のＡｍｙＥ−ｔｒでは、たとえば配列番号１のＡｍｙＥが残基Ｄ４２５において切断される。このＡｍｙＥ−ｔｒの２．５オングストローム分解能の結晶構造は、タンパク質データバンク登録（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｎｏ．１ＢＡＧにおいて入手可能であり、これはFujimotoら, "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose," Ｊ. Moｌ. Biol. 277: 393-407 (1998)に開示されている。ＡｍｙＥ−ｔｒは、Ｃ末端デンプン結合ドメインの全てまたは一部が切除されることを条件として、他の位置、たとえば配列番号１のＡｍｙＥのＹ４２３、Ｐ４２４、Ｄ４２６またはＩ４２７で切断されてもよい。
【００７２】
「組換え体」の語は、対象の細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられるときは、非相同の核酸もしくはタンパク質の導入、もしくは天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって該対象が修飾されたことを、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。かくして、たとえば組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内には認められない遺伝子を発現し、または他様に異常に発現された、不十分に発現された、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００７３】
「回収され」、「単離され」および「分離され」の語は、少なくとも１の成分であって、そのものが該成分と天然に結びついており自然界に見出される少なくとも１の成分を除かれた化合物、タンパク質、細胞、核酸またはアミノ酸をいう。
【００７４】
本明細書で用いられる「精製され」の語は、相対的に純粋な状態、たとえば少なくとも約９０％純粋な、少なくとも約９５％純粋な、少なくとも約９８％純粋な、またはさらに少なくとも約９９％純粋な状態にある物質（たとえば、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をいう。
【００７５】
「熱安定な」および「熱安定性」の語は、高められた温度に曝露された後に活性を保持する酵素の能力をいう。酵素、たとえばα−アミラーゼ酵素の熱安定性は、分間、時間または日間単位で示されるその半減期（ｔ１／２）によって測定され、その間に酵素活性の半分は所定の条件下に失われる。高められた温度への曝露（すなわち、それによる攻撃）に引き続いて残留アミラーゼ活性を測定することによって、半減期は計算されることができる。
【００７６】
「ｐＨの範囲」とは、酵素がその下で触媒活性を示すｐＨ値の範囲をいう。
【００７７】
本明細書で用いられる「ｐＨ安定な」および「ｐＨ安定性」の語は、ｐＨ値の広い範囲にわたって所定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間等）酵素が活性を保持する能力に関する。
【００７８】
本明細書で用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」の語と同義であり互換的に用いられる。かかるアミノ酸配列が活性を示すときは、それは「酵素」と呼ばれる。アミノ酸残基を表す慣用の１文字または３文字のコードが本明細書では用いられる。
【００７９】
「核酸」の語は、ポリペプチドをコードする能力のあるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖および合成分子を包含する。核酸は１本鎖または２本鎖であることができ、化学修飾されたものであってもよい。「核酸」および「ポリヌクレオチド」の語は互換的に用いられる。遺伝子暗号は縮重性であるので、１より多いコドンが特定のアミノ酸をコードするために用いられることができ、本発明の組成物および方法は、特定のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を包含する。特に指定されない限り、核酸は左から右に５'から３'の方向に、アミノ酸配列は左から右にアミノ基からカルボキシル基の方向に、それぞれ書かれる。
【００８０】
「相同体」の語は、参照アミノ酸もしくはヌクレオチド配列とある同一性を有する、または他の特定の共通の構造上もしくは機能上の特徴を有するアミノ酸およびヌクレオチド配列をいう。相同配列は、慣用の配列アラインメント手法（たとえば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴ等）を用いて、対象配列と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらには９９％相同であるアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には特に指定されない限り、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含む。
【００８１】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、ブロットハイブリダイゼーション手法およびＰＣＲ手法の間に生じるように、１本鎖の配列塩基が相補的な１本鎖と対をつくる過程をいう。
【００８２】
本明細書で用いられる核酸中の「縮重配列」の語は、複数の核酸配列が同じコドン、すなわち遺伝子暗号の縮重性の故に同じコドンをコードするものを含む。縮重配列は、特定の宿主生物中でコードされたポリペプチドの最適な発現のために、たとえばコドン選択の結果として選択されることができる。
【００８３】
本明細書で用いられる「合成」分子は、有機体によってではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的または酵素的合成によって生産される。
【００８４】
本明細書で用いられ、細胞について用いられる「形質転換され」、「安定に形質転換され」および「トランスジェニックの」の語は、この細胞が、そのゲノム中に組み込まれた、または複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして保持される非天然の（たとえば、非相同の）核酸配列を有することを意味する。
【００８５】
核酸配列を中に挿入する文脈における「導入され」の語は、従来技術で知られた「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意味する。
【００８６】
「宿主株」または「宿主細胞」とは、その中に発現ベクター、ファージ、ウイルスまたは対象のポリペプチド（たとえば、変異体α−アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む他のＤＮＡ構成体が導入された有機体である。典型的な宿主株は細菌細胞である。「宿主細胞」の語は、細胞、たとえばバチルス種の細胞から生成されたプロトプラストを含む。
【００８７】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関連する「非相同」の語は、宿主細胞中に天然には生じないポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。
【００８８】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関連する「内因性」の語は、宿主細胞中に天然に生じるポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。
【００８９】
本明細書で用いられる「発現」の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生産される過程をいう。この過程は転写および翻訳の双方を含む。
【００９０】
「選択マーカー」または「選択可能マーカー」とは、宿主中で発現されて、遺伝子を有する宿主細胞の選択を促進する能力のあるその遺伝子をいう。選択可能マーカーの例は、以下のものに限定されることなく、抗菌物質（たとえば、ヒグロマイシン、ブレオマイシンまたはネオマイシン）および／または宿主細胞に代謝上の利益、たとえば栄養的利益を与える遺伝子を含む。
【００９１】
「培養」とは、液状または固形培地中で好適な条件下に微生物細胞の集団を育成することをいう。培養は、粒状デンプンを含むデンプン基質から最終産物への（典型的には容器中または反応器中の）発酵によるバイオ転化を含む。
【００９２】
「発酵」とは、微生物によって有機物質を酵素的に分解して、より簡単な化合物を産生することである。発酵は一般に嫌気性条件下に生じるけれども、発酵は酸素の存在下にも起きるので、この語は厳格な嫌気性条件のみに限定されることを意図していない。
【００９３】
「遺伝子」とはポリペプチドの産生に関わっているＤＮＡセグメントをいい、コーディング領域、コーディング領域に先行および追随する領域、ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００９４】
「ベクター」とは、核酸を１以上の細胞型中に導入するために設計されたポリヌクレオチド配列をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
【００９５】
「発現ベクター」とは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成体をいい、これは、適当な宿主中でＤＮＡの発現を達成する能力のある適当な制御配列に、機能しうるように連結されている。かかる制御配列は、転写を達成するプロモーター、転写を制御する任意的なオペレーター配列、ｍＲＡ上に適当なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、ならびに転写および翻訳の停止を制御する配列を含むことができる。
【００９６】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合して遺伝子の転写を開始することに関わる調節配列である。プロモーターは誘導プロモーターまたは構成プロモーターであることができる。典型的なプロモーターはバチルスリケニフォルミスα−アミラーゼ（ＡｍｙＬ）プロモーターである。
【００９７】
「機能しうるように連結され」の語は、複数の特定の成分が、意図された様式で機能することが可能である関係にあること（併置を含むがこれに限定されない。）を意味する。たとえば、調節配列は、コーディング配列の発現がこの調節配列の制御下にあるように、このコーディング配列と機能しうるように連結されている。
【００９８】
「転写の制御下に」の語は、ポリヌクレオチド配列の転写が、普通にはＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に貢献しまたは転写を促進する要素に機能しうるように連結されていることに依存していることを意味する。
【００９９】
「翻訳の制御下に」の語は、ポリヌクレオチド配列、普通にはＤＮＡ配列からポリペプチドへの翻訳が、翻訳の開始に貢献しまたは翻訳を促進する要素に機能しうるように連結されていることに依存していることを意味する。
【０１００】
本明細書で用いられる「生物学的に活性な」の語は、特定の生物学的活性、たとえば酵素活性を有する配列をいう。本発明のアミラーゼの場合、この活性はアミラーゼの活性である。
【０１０１】
「水の硬度」とは、水中に存在する鉱物（たとえば、カルシウムおよびマグネシウム）の尺度である。
【０１０２】
「ゲル化」とは、調理によってデンプン分子が溶解して粘性な懸濁物を形成することをいう。
【０１０３】
本明細書で用いられる「液化」または「液化する」の語は、デンプンがより低分子量の（すなわち、より短い）デキストリンに転化される過程を意味し、デキストリンは一般に出発デンプン物質よりも可溶性かつ低粘性である。この過程は、ＡｍｙＥもしくはその変異体の添加と同時の、またはそれに引き続くデンプンのゲル化を含む。
【０１０４】
本明細書で用いられる「一次液化」の語は、スラリーの温度がそのゲル化温度までまたはその近くまで上げられるときの液化の工程をいう。温度の上昇に続いて、スラリーは熱交換器またはジェットを通して約９０〜１５０℃、たとえば１００〜１１０℃（２００〜３００°Ｆ、たとえば２２０〜２３５°Ｆ）の温度にされる。熱交換器またはジェットの温度にされた後、スラリーはその温度に３〜１０分間保たれる。スラリーを９０〜１５０℃（２００〜３００°Ｆ）に保つこの工程が、一次液化と称される。
【０１０５】
本明細書で用いられる「二次液化」の語は、一次液化（９０〜１５０℃（２００〜３００°Ｆ）までの加熱）に続く液化工程をいい、ここでスラリーは室温まで放置冷却される。この冷却工程は３０分間〜１８０分間、たとえば９０分間〜１２０分間であることができる。
【０１０６】
本明細書で用いられる「二次液化の分間」の語は、二次液化の開始からＤＥが測定される時刻までに経過した時間をいう。
【０１０７】
「糖化」とは一般にグルコースの液化後に生成されたマルトデキストリンの酵素による転化をいう。
【０１０８】
「重合度（ＤＰ）」の語は、所与の糖中のアンヒドログルコピラノースの数（ｎ）をいう。ＤＰ１の例は単糖、たとえばグルコースおよびフルクトースである。ＤＰ２の例は２糖、たとえばマルトースおよびスクロースである。ＤＰ＞３は３超の重合度を有するポリマーを表す。
【０１０９】
デンプン転化に関する「最終産物」または「所望の最終産物」の語は、特定の炭素源由来分子をいい、これはデンプン基質から酵素によって転化されたものである。
【０１１０】
本明細書で用いられる「乾燥固形分含有量（ｄｓ）」の語は、乾燥重量％単位で表されたスラリー中の全固形分をいう。
【０１１１】
「スラリー」の語は、不溶性固形分を含有する水性混合物をいう。
【０１１２】
「残留デンプン」の語は、デンプン含有基質の発酵または酵素的加水分解後の組成物中に残留する（可溶性または不溶性の）デンプンをいう。
【０１１３】
明細書で用いられる「リサイクル工程」の語は、マッシュ成分をリサイクルすることをいい、マッシュ成分は残留デンプン、酵素および／または微生物を含んでおり、デンプンを含む基質を発酵させる。
【０１１４】
「マッシュ」の語は、発酵性炭素源（すなわち、炭水化物）を含む水性混合物をいい、これは発酵産物、たとえばアルコールを生産するために用いられることができる。「ビール」および「マッシュ」の語は互換的に用いられることができる。
【０１１５】
「スチレッジ」の語は、非発酵固形物および水の混合物をいい、これは発酵マッシュからアルコールを取り出した後の残渣を表す。
【０１１６】
「ディスティラーズ乾燥穀粒（ＤＤＧ）」および「可溶分を含むディスティラーズ乾燥穀粒（ＤＤＧＳ）」の語は、穀粒の発酵の有用な副産物をいう。
【０１１７】
本明細書で用いられる「エタノール生成型微生物」の語は、糖またはオリゴ糖をエタノールに転化する能力のある微生物をいう。エタノール生成型微生物は、糖をエタノールに個別にまたは一緒に転化する１以上の酵素を発現するその能力の故にエタノール生成型である。
【０１１８】
本明細書で用いられる「エタノール産生体」または「エタノール産生微生物」の語は、ヘキソースまたはペントースからエタノールを産生する能力のある任意の生物または細胞をいう。一般に、エタノール産生細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼおよびピルベートデカルボキシラーゼを有する。エタノール産生微生物は真菌微生物、たとえば酵母を含む。好まれる酵母はサッカロマイセス、特にサッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。
【０１１９】
アミラーゼ酵素およびその基質に関する「接触させる」の語は、該酵素を該基質に十分に近接して置いて、該酵素が該基質を最終産物に転化することを可能にすることをいう。接触させることは混合することを含むことができる。
【０１２０】
「から誘導され」の語は、「に由来し」、「に基づき」、「から得られ」、「から得られることができ」または「から単離され」を文脈に応じて意味する。
【０１２１】
「酵素的転化」の語は、一般に酵素（たとえば、アミラーゼ）の作用による基質（たとえば、デンプン）の修飾をいう。
【０１２２】
本明細書で用いられる「崩壊」の語は、生物膜中の個々の生物膜細胞を結び付け一緒に結合している生物膜マトリクス中の多糖を加水分解して、それによって微生物細胞が該生物膜から放出され取り出されることをいう。
【０１２３】
「スウォッチ」とは、素材、たとえば布地の片であって、組成物の洗浄効率を評価するためにそれに染色剤が施与されることができる片をいう。
【０１２４】
本明細書で用いられる「比活性」の語は、特定の条件下に単位時間当たり酵素調製物によって産物に転化された基質のモル数をいう。比活性は、単位（Ｕ）／タンパク質のｍｇとして表される。
【０１２５】
本明細書で用いられる「生物学的に活性な」の語は、予め選択された機能を示す分子をいう。
【０１２６】
「収量」の語は、プロセスによって、たとえば濃度、体積、量または出発物質のパーセントで表された、生産された最終産物の量をいう。
【０１２７】
「ＡＴＣＣ」とは、米国、２０１０８、バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓに置かれたアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）をいう。
【０１２８】
本明細書で用いられる、精製の目的のための「沈降剤」の語は、溶液からポリペプチド、たとえばＡｍｙＥまたはその変異体を沈降するのに有効な化合物をいう。沈降物の形態は、たとえば結晶性、非晶性またはこれらのブレンドであることができる。
【０１２９】
「ＮＲＲＬ」とは、米国、イリノイ州、Ｐｅｏｒｉａの米国立農業利用研究センター（米国農務省北部地域研究所（ＵＳＤＡ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）として従来知られていた。）、農事研究事業団カルチャーコレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をいう。
【０１３０】
本明細書で用いられる「スウォッチ」とは、素材、たとえば布地の片であって、それに染色剤が施与されることができ、または施与された染色剤を有する片である。この素材は、たとえば綿、ポリエステルまたは天然および合成繊維の混合物からつくられた布地であることができる。あるいは、この素材は、紙、たとえばろ紙もしくはニトロセルロースまたは硬質素材の片、たとえばセラミック、金属もしくはガラスであることができる。典型的な染色剤は、血液、ミルク、インク、ガラス、茶、ワイン、ホウレンソウ、グレイビー、チョコレート、卵、チーズ、粘土、顔料、油またはこれらの組み合わせを含む。
【０１３１】
本明細書で用いられる「比較的小さいスウォッチ」の語は、単穴パンチ具もしくは特注の９６穴パンチ具または同等具で切り出されたスウォッチの片をいい、９６穴パンチのパターンは標準９６ウェルマイクロタイタープレートに一致しており、または他様にスウォッチから切り出されたものである。スウォッチは、布地、紙、金属または他の適当な素材のものであることができる。比較的小さいスウォッチは、それが２４、４８または９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れられる前か、あるいはその後に染色剤を加えられることができる。
【０１３２】
本明細書で用いられる「食品」の語は、加工食品および食品成分の双方、たとえば粉を包含し、これは消費者調理者に利益をもたらすことができる。食品成分は、たとえば酸性にするまたは乳化する目的のために、食品または食材に添加されることができる配合物を含む。食品成分は、使用および／または適用の様式および／または投与の様式に応じて、溶液または固体の形態をしていることができる。
【０１３３】
本明細書で用いられる「粉」の語は、粉砕されたもしくは磨砕された穀粒、または磨砕されたもしくはマッシュにされたサゴもしくは塊茎産物をいう。ある実施態様では、粉は、磨砕されたもしくはマッシュにされた穀粒または植物に加えて成分、たとえば膨張剤を含有してもよい。穀粒は小麦、オート麦、ライ麦および大麦を含む。塊茎産物はタピオカ粉、カサバ粉および粉末カスタードを含む。粉はまた、磨砕トウモロコシ粉、メーズミール、米粉、全粒小麦粉、セルフライジングフラワー、タピオカ粉、カサバ粉、米粉、栄養強化粉および粉末カスタードも含む。
【０１３４】
本明細書で用いられる「ストック」の語は、穀粒および破砕されまたは破壊された植物成分をいう。たとえば、ビールの生産に用いられる大麦は、粗に磨砕されまたは破砕されて、発酵のためのマッシュを生産するのに適当な稠度を有する穀粒である。ストックは、破砕されまたは粗に磨砕された形態をした前述の種類の植物および穀粒のいずれかを含んでいてもよい。
【０１３５】
本明細書で用いられる「性能指数（ＰＩ）」の語は、特定の性能特性についての変異体ポリペプチドの性能と親ポリペプチドの性能との比をいう。本明細書の分脈内で、「アップ突然変異体」はＰＩ＞１を有する突然変異体をいい、「中性突然変異体」はＰＩ＞０．５を有する突然変異体をいい、「非有害突然変異体」はＰＩ＞０．０５を有する突然変異体をいい、また「有害突然変異体」はＰＩ≦０．０５を有する突然変異体をいう。
【０１３６】
本明細書で用いられる「付加された（もしくは、さらなる）グルコアミラーゼ（もしくはグルコアミラーゼポリペプチド）」または「グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチド」の語は、ＡｍｙＥと同じポリペプチドではないグルコアミラーゼ酵素をいう。
【０１３７】
単数形の「１の（ａ）」、「１の（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他様に指示しない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、たとえば「１の酵素」への言及は複数のかかる酵素を包含し、「その配合物」への言及は１以上の配合物および当業者に知られたその同等物を包含する、等々である。
【０１３８】
数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。見出しは説明するためのものであり、限定を意図するものではない。本明細書に引用された全ての参考文献は、参照によって取り込まれる。
１．２．略号
以下の略号が特に指定されない限り適用される。
ＡＥ          アルコールエトキシレート
ＡＥＯ        アルコールエトキシレート
ＡＥＯＳ      アルコールエトキシサルフェート
ＡＥＳ        アルコールエトキシサルフェート
ＡＧＵ        グルコミラーゼ活性単位
ＡｋＡＡ      アスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）α−アミラーゼ
ＡｍｙＥ      バチルスサブティリスα−アミラーゼ
ＡｍｙＳ      ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ
ＡＳ          アルコールサルフェート
ＢＡＡ        細菌α−アミラーゼ
ｃＤＮＡ      相補的ＤＮＡ
ＣＭＣ        カルボキシメチルセルロース
ＤＥ          デキストロース同等物
ＤＩ          蒸留された、脱イオンされた
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
ＤＰ３        ３の副単位を有する重合度
ＤＰｎ        ｎの副単位を有する重合度
ＤＳまたはｄｓ  乾燥固形分
ＤＴＭＰＡ    ジエチルトリアミン五酢酸
ＥＣ          酵素分類のための酵素番号
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ＥＤＴＭＰＡ  エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸
ＥＯ          エチレンオキシド
Ｆ＆ＨＣ      布地および家庭用品
ＧＡＵ        グルコアミラーゼ単位
ＨＦＣＳ      高フルクトーストウモロコシシロップ
ＨＦＳＳ      高フルクトースデンプンベースシロップ
ＩＰＴＧ      イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトース
ＬＡ          ルリア寒天
ＬＢ          ルリアブロス
ＬＵ          リパーゼ単位
Ｌ１Ｔ        位置１におけるロイシン（Ｌ）残基がトレオニン（Ｔ）残基で置き換えられること。ここでアミノ酸は当分野で普通に知られた単文字略号によって表示される。
ＭＷ          分子量
ＮＣＢＩ      米国立生物工学情報センター
ｎｍ          ナノメートル
ＮＯＢＳ      ノナノイルオキシベンゼンスルフォネート
ＮＴＡ        ニトリロ三酢酸
ＯＤ          光学密度
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ        ポリエチレングリコール
ｐＩ          等電点
ｐｐｍ        １００万分の１部
ＰＶＡ        ポリ（ビニルアルコール）
ＰＶＰ       ポリ（ビニルピロリドン）
ＲＡＵ       参照アミラーゼ単位
ＲＮＡ       リボ核酸
ＳＡＳ       ２級アルカンスルホネート
１×ＳＳＣ    ０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
ＳＳＦ       同時の糖化および発酵
ＳＳＵ       可溶性デンプン単位、１分間当たり１ｍｇのグルコースが放出される還元力と同等
ＴＡＥＤ      テトラアセチルエチレンジアミン
ＴＮＢＳ      トリニトロベンゼンスルホン酸
ＴｒＧＡ      トリコデルマリーゼイグルコアミラーゼ
ｗ／ｖ       重量／体積
ｗ／ｗ       重量／重量
ｗｔ         野生型
μＬ         マイクロリットル
μＮｍ       マイクロニュートン×メートル
２．ＡｍｙＥポリペプチド
２．１．親ＡｍｙＥポリペプチド
【０１３９】
ＡｍｙＥα−アミラーゼとは、バチルスサブティリス由来の天然に存在するα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１；１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ）をいい、配列番号１で例示される。関連するポリペプチドは、天然に存在するＡｍｙＥの配列とは異なるアミノ酸配列、たとえばデフォルトマッチングパラメータを有するＢＬＡＳＴ配列アラインメントアルゴリズムで測定されて、配列番号１と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはさらには少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４０】
他の典型的なＡｍｙＥポリペプチドは、配列番号３（Ａｍｙ３１Ａ）のアミノ酸配列を有するＡｍｙ３１Ａである。Ａｍｙ３１ＡはOhdanら, "Characteristics of two forms of alpha-amylases and structural implication," Appl. Environ. Microbiol. 65(10): 4652-58 (1999)およびUniProtKB/TrEMBL受入番号082953 (配列3)に記載されている。Ａｍｙ３１Ａは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて配列番号１のＡｍｙＥと約８６％の配列同一性を有する。さらなるＡｍｙＥポリペプチドは、以下のものに限定されることなく、NCBI受入番号：ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841およびBAA31528に記載されたアミノ酸配列を有するＡｍｙＥを含み、これらの内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
【０１４１】
配列番号１に記載された代表的なＡｍｙＥアミノ酸配列は、成熟型のものであり、これは天然のシグナル配列を欠いている。ＡｍｙＥの成熟型は他の個所で「ＡｍｙＥ完全長」と呼ばれる。一般に、ＡｍｙＥの成熟型は酵素としてもっとも関心の高いものである。もっとも、宿主細胞からの分泌に影響を及ぼす（シグナル配列を有する）未成熟型を発現することが望ましいこともある。このＡｍｙＥの天然シグナル配列は長さが４１個のアミノ酸残基であり、配列番号９として示される。配列番号３のＮ末端４５個アミノ酸残基は、Ａｍｙ３１Ａのシグナル配列である。ＡｍｙＥ（配列番号１）とＡｍｙ３１Ａ（シグナル配列なし）との間の配列アラインメントは図１に示される。
【０１４２】
ＡｍｙＥポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する切断されたＡｍｙＥポリペプチド（ＡｍｙＥ−ｔｒ）によって例示されるようにＣ末端デンプン結合ドメインの欠失を有していてもよい。このポリペプチドは、（配列番号１を参照して）残基Ｄ４２５から切断される。ＡｍｙＥ−ｔｒの２．５オングストローム分解能の結晶構造は、タンパク質データバンク登録（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｎｏ．１ＢＡＧにおいて入手可能であり、これはFujimotoら, "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose," Ｊ. Moｌ. Biol. 277: 393-407 (1998)に開示されている。ＡｍｙＥ−ｔｒは、Ｃ末端デンプン結合ドメインの全てまたは一部が切除されることを条件に、他の位置、たとえば配列番号１のＡｍｙＥのＹ４２３、Ｐ４２４、Ｄ４２６またはＩ４２７で切断されてもよい。同様な切断はＡｍｙ３１Ａおよび他のＡｍｙＥポリペプチドになされることができる。
２．２．ＡｍｙＥ変異体
【０１４３】
ＡｍｙＥ変異体は、配列番号１の天然に存在するＡｍｙＥと比較して、または配列番号２（切断ポリペプチド）と比較して少なくとも１のアミノ酸修飾を含む。したがって、配列番号１または配列番号２のＡｍｙＥポリペプチドは、それからＡｍｙＥ変異体が誘導される「親ポリペプチド」、「親酵素」または「親配列」と呼ばれることができる。修飾されていないアミノ酸残基（すなわち、残っている連続したアミノ酸配列）は、配列番号１もしくは２のものと同一、配列番号３のものと同一、またはNCBI受入番号：ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841およびBAA31528のものと同一であることができる。あるいは、残っているアミノ酸配列は、たとえばデフォルトアラインメントパラメータを有するタンパク質配列のＢＬＡＳＴアラインメントを用いて、これらの配列の１以上と所定の配列同一度を有することができる。たとえば、残っているアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のＡｍｙＥと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはさらには少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【０１４４】
ＡｍｙＥ変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と比較して単一のアミノ酸修飾を有することができ、または、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上のアミノ酸修飾を有することができる。修飾は、置換、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを含む。ある場合には、修飾は、生物学的機能のためには要求されないアミノ酸残基へのものである。修飾されるべきアミノ酸残基の選択は、複数のＡｍｙＥ配列間の配列相同性によって導びかれることができる。一般に、ＡｍｙＥ配列中に十分に保存されるアミノ酸が、生物学的活性のためにより要求される可能性が高い。逆に、複数のＡｍｙＥ配列間で変動するアミノ酸の位置は、生物学的活性のためにより低度に要求される可能性が高い。たとえば、図１にボールド体で示された、ＡｍｙＥとＡｍｙ３１Ａとの間のアラインメントにおいて異なっているアミノ酸残基は、生物学的活性の損失なしにＡｍｙＥ変異体中で修飾されることができる可能性が高い。
【０１４５】
好まれるＡｍｙＥ変異体は、天然に存在するＡｍｙＥと比較して少なくとも部分的な１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ活性、および天然に存在するＡｍｙＥと比較して少なくとも１の変えられた特性を有する。該変えられた特性は、デンプン、マルトヘプタオースおよび／またはマルトトリオース基質への比活性、基質特異性、熱安定性、最適温度、最適ｐＨ、ｐＨおよび／または温度範囲、酸化安定性、デンプン組成物の粘度を下げる能力等に関するものであることができる。ある場合には、ＡｍｙＥ変異体の変えられた特性は、特定のｐＨ（たとえば、４または５．８）における特定のトウモロコシ粉、マルトトリオース、マルトヘプタオース基質についての比活性、特定の温度（たとえば６０℃）における熱安定性、または特定のｐＨ（たとえば、８またはｐＨ１０）における洗浄性能に関する。この変えられた特性は性能指数（ＰＩ）によって特徴付けられることができ、ＰＩとは野生型ＡｍｙＥの性能と比較したＡｍｙＥ変異体の性能の割合である。ある実施態様ではＰＩは約０．５よりも大きく、他方、他の実施態様ではＰＩは約１でありまたは１よりも大きい。
【０１４６】
得られるＡｍｙＥ変異体に有益な特性を与えるために置換されることができる特定の残基は、以下のうちの１以上を含む。すなわち、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425。これらの位置のうちのいずれかにおける修飾は、タンパク質の発現について０．５超の性能指数（ＰＩ）および酵素性能を改善する少なくとも１の特性について１超のＰＩを有する変異体ポリペプチドを生産する。
【０１４７】
得られるＡｍｙＥ変異体に有益な特性を与えるために置換されることができる残基の下位群は、以下のうちの１以上を含む。すなわち、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425。これらの位置のうちのいずれかにおける修飾は、タンパク質の発現について０．５超の性能指数（ＰＩ）および酵素性能を改善する少なくとも１の特性について１．１超のＰＩを有する変異体ポリペプチドを生産する。
【０１４８】
ある場合には、１以上の位置は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択され、これらの位置は、完全長か、あるいは切断親ポリペプチドにおける性能について非完全制限位置である。
【０１４９】
いくつかの位置は、切断ＡｍｙＥ親ポリペプチドの文脈における性能について非完全制限位置であることが見つけ出され（すなわち、1, 2, 3, 4, 5, 8, 18, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 35, 44, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 54, 56, 59, 68, 73, 76, 78, 85, 88, 89, 90, 91, 106, 107, 108, 109, 112, 115, 116, 118, 119, 124, 125, 126, 127, 131, 132, 134, 142, 143, 152, 153, 156, 160, 163, 166, 167, 184, 185, 187, 188, 190, 192, 195, 199, 200, 201, 202, 203, 212, 213, 214, 218, 219, 221, 222, 223, 233, 234, 238, 240, 241, 243, 245, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 274, 275, 276, 277, 282, 283, 284, 287, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 331, 333, 344, 346, 347, 349, 357, 358, 359, 367, 368, 369, 378, 380, 382, 385, 386, 388, 390, 393, 395, 400, 401, 402, および 406）、また、いくつかの位置は、完全長ＡｍｙＥ親ポリペプチドの文脈における性能について非完全制限位置であることが見つけ出された（すなわち、6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 48, 52, 53, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 6
5, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425）。
【０１５０】
ある場合には、この修飾は、親ポリペプチド中に存在する１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換であり、たとえばIA, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, AC, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, AY, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 1OA, 10I, 1OL, 1OM, ION, 1OP, 1OQ, 10S, 10V, HA, HF, HG, HH, HM, US, 11V, HW, HY, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 2OA, 2OC, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OL, 2OM, 2OP, 2OQ, 2OR, 2OS, 2OT, 20V, 2OW, 2OY, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 221, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25 A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 4OA, 4OD, 4OM, 4ON, 4OP, 4OQ, 4OT, 40V, 4OW, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47 A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 6OA, 6OC, 6OD, 6OE, 6OG, 60I, 6OK, 6OL, 6OM, 6ON, 6OQ, 6OR, 6OT, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 65I, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 66I, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 67I, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 68I, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 7OA, 7OE, 7OH, 7ON, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 73I, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 76I, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 77I, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 81I, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 83I, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 84I, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88I, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 9OC, 9OD, 9OE, 9OF, 9OG, 9OH, 90I, 9OK, 9OL, 9OM, 9ON, 9OQ, 9OR, 90S, 9OT, 90V, 9OW, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 93I, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 94I, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 96I, 96L, 96M, 96P, 96T, 97 A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99I, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 10OA, lOOC, 10OF, 10OM, 10ON, 10OP, 10OT, 10OV, 10OY, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 103I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 106I, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107 A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 11OL, 11OM, 11OV, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111I, 111K, 111L, 111M, 111, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 112I, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113I, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 115I, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 118I, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124I, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 125I, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129I, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 132I, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134I, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 147I, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 151I, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 153I, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 154I, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 155I, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 156I, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 157I, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 158I, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 162I, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 165I, 165L, 165M, 165Q, 1
65S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 166I, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167 A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 192I, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 193I, 193L, 193M, 194I, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 195I, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 198I, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 199I, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 202I, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204I, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 205I, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 217I, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 221I, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 222I, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 223I, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223W, 224I, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 225I, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 226I, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230I, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 239I, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242I, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 244I, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 246I, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 248I, 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 2501, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251I, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 252I, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 253I, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255I, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 256I, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 258I, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259I, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 261I, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262I, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264I, 264L, 264N, 264Y, 265 A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270I, 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 272I, 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 273I, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 275I, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 283I, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 285I, 285L, 285M, 285N, 285Q, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 286L, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 287S, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 2881, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, 291N, 291S, 291T, 291V, 292A, 292C, 292I, 292L, 292M, 292S, 292T, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 305I, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309I, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 310I, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 313I, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 315I, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 316I, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 317I, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q
, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 331I, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332I, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333I, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336I, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339I, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341I, 341L, 341M, 341V, 34 IW, 34 IY, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348I, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349I, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 35 IY, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352I, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 355I 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 356I 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357I 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 358I 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359I, 59K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362I, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365I, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367I, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368I, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 371I, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 372I, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 373I, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374I, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377I, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381I, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384I, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 387I, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388I, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390I, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 391I, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395I, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 398I, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 399I, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403 A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 41 IN, 411Q, 41 IR, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 416I, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W, および 425Yである。
【０１５１】
ある場合には、修飾は、親ポリペプチド中に存在する１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換であり、1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 4I 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 10I, 1OL, 1OM, 1OP, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 12I, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 2OA, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OM, 2OR, 2OS, 20V, 2OW, 2OY, 21E, 21I, 21M, 21Q, 21S, 21V, 22I, 22T, 22V, 23 A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26I, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 3OA, 3OC, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 36I, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45I, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48 A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 53I, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 6OL, 6ON, 63H, 63N, 64A, 64S, 65 A, 65I, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67 A, 67F, 67G, 67I, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 68I, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 9OD, 9OE, 9OF, 9OH, 90I, 9OK, 9OM, 9ON, 9OR, 90S, 9OT, 90V, 9OW, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N, 91Q, 91R, 91S, 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 93S, 93Y, 94I, 95F, 95M, 961, 98C, 99I, lOOC, 10OF, 10OM, 10OV, 103A, 103C, 103V, 104A, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 109I, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 11OV, 11lC, 111E, 111F, 111G, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, 111T, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 112S, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 115I, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 125I, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132I, 132N, 132S, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 158I, 158M, 158T, 158V, 159H, 159I, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160Q, 160S, 160T, 160V, 162I, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165I, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 166I, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 171I, 171M, 171N, 171Q, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 179S, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 192S, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 198I, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 2001, 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203 A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 2041, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205I, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 217I, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223W, 224I, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 226I, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 230I, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 236I, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 2391, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 242I, 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243 W, 243 Y, 244I, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 246I, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247 Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 253I, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 255I, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 256I, 257E, 2571, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 262I, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 264I, 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 273I, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 288I, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 292I, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295 A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 299I, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 301I, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 3
05T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407 Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, および 425Yによって例示される。
【０１５２】
ある場合には、これらの置換は、052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, および 416Vから選択され、これらの突然変異体は、タンパク質および活性の双方についてＰＩ値＞０．５を有する。
【０１５３】
親ＡｍｙＥポリペプチドの位置１５３に存在するアミノ酸残基をＮ、ＫまたはＦに変える置換は、マルトースおよびマルトヘプタオース基質からグルコースへ転化する能力の向上を示した。親ＡｍｙＥポリペプチドの位置１５３に存在するアミノ酸残基をＫに変える置換は、ＤＰ７基質からグルコースへ転化する能力の向上を示した。
【０１５４】
Ｌ１４２Ｆ、Ｌ１４２Ｇ、Ｌ１４２Ｑ、Ｌ１４２Ｓ、Ｌ１４２Ｗ、Ｌ１４２Ｙ、Ａ２１４Ｉ、Ａ２１４Ｖ、Ｓ２４５Ｙ、Ｑ１２６Ｆ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｐ、Ｑ１２６Ｖ、Ｓ１３１ＬおよびＳ２４５Ｉの置換は、完全長ＡｍｙＥポリペプチドの文脈においてデンプン液化性能を改善した。Ｗ６０Ｌ、Ｗ６０Ｍ、Ｗ６０Ｎ、Ｉ１００Ｆ、Ｉ１００Ｍ、Ｓ１０５Ｍ、Ｓ１０５Ｗ、Ｇ２０７Ａ、Ｔ２７０Ａ、Ｔ２７０Ｅ、Ｔ２７０Ｌ、Ｔ２７０Ｎ、Ｔ２７０ＶおよびＴ２７９Ａの置換は、切断ＡｍｙＥポリペプチドの文脈においてデンプン液化性能を改善した。
【０１５５】
052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, および 416Vの位置のうちの１以上としての置換は、タンパク質および活性の双方についてＰＩ値＞０．５を有し、ＡｍｙＥポリペプチドの様々な特性に影響を与えるために組み合わせ可能であると期待される。
【０１５６】
ＡｍｙＥポリペプチドの多くの位置は変異させることできるけれども、ＡｍｙＥポリペプチドの位置７５、９７、１０１、１０２、１２３、１３３、１３７、１８２、２６６および３０６は、これらの位置における変異が一般的に性能を減少させるという意味で、制限位置である。特に、位置７５および１２３は、親ポリペプチドの切断版における性能について完全制限位置であることが見つけ出され、他方、位置７５、９７、１０１、１０２、１２０、１３３、１３７、１８２、２６６および３０６は、親ポリペプチドの完全長版における性能について完全制限位置であることが見つけ出された。
【０１５７】
大群および下位群の文脈において多くの突然変異体が列挙されているけれども、各突然変異体は別々の実体であり、特定された突然変異体のうちの任意の１以上が突然変異体のさらなる下位群に含められまたはそれから除外されることができることに注意されたい。したがって、本発明の組成物および方法は、本明細書に記載された任意の１以上の変異体またはこれらの組み合わせを有するＡｍｙＥ変異体を含む。
３．ＡｍｙＥポリペプチドの生産
【０１５８】
ＡｍｙＥポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当なプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意的なリプレッサー遺伝子または様々なアクチベーター遺伝子をコードする制御配列を典型的には含む発現ベクターを用いて、酵素の形に発現されることができる。
【０１５９】
ＡｍｙＥまたはその変異体もコードする核酸を含むベクターが提供される。該ベクターを含む宿主細胞が提供される。該宿主細胞は、該ＡｍｙＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現することができる。宿主はバチルス種、たとえばバチルスサブティリスであることができる。
３．１．ポリヌクレオチドおよびベクター
【０１６０】
本発明の組成物および方法の１の側面は、ＡｍｙＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチドに基づいてＡｍｙＥポリペプチドを発現するために有用なベクターおよび宿主細胞を含む。ＡｍｙＥポリペプチドをコードする核酸は、以下のものに限定されることなく、配列番号５および６のポリヌクレオチドを含み、これらはそれぞれ配列番号１のＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）、およびこれらの変異体をコードする。さらなる代表的なポリヌクレオチドは配列番号７のものを含み、これはＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）をコードする。NCBI受入番号：ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841およびBAA31528に開示されたＡｍｙＥは、公的にアクセス可能なデータベースに開示されたポリヌクレオチドによって同様にコードされ、これらの配列は参照によって本明細書に取り込まれる。核酸はＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であることができる。核酸はさらに、上述の核酸のいずれかに対応する縮重配列を含む。縮重配列は、特定の宿主生物によって好まれるコドンを用いることによって最適の発現のために設計されることができる。
【０１６１】
ＡｍｙＥポリペプチド（変異体を含む。）をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付されることができる任意のベクターであることができ、ベクターの選択は、しばしばそれが導入されるべき宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであることができ、その複製は染色体複製、たとえばプラスミド、バクテリオファージもしくは染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体とは独立である。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた１または複数の染色体と一緒に複製されるものであることができる。組み込まれた遺伝子はまた、抗生物質選択もしくは他の選択圧、たとえば必須調節遺伝子によって、または必須代謝経路遺伝子の相補性によって駆動される増幅可能な構成体の使用によって、増幅されて染色体中に該遺伝子の複数のコピーを生成することができる。
【０１６２】
発現ベクターは、典型的にはクローニングベクターの成分、たとえば選択された宿主生物中の該ベクターの自立的な複製を可能にする要素、および選択の目的のための１以上の表現型として検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは、普通、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意的にレプレッサー遺伝子または１以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。１の側面では、用いられた全てのシグナル配列は、より容易な酵素の収集および任意的な精製のために細胞培養培地への物質を標的とする。ＡｍｙＥまたはその変異体をコードするＤＮＡ構成体、プロモーター、ターミネーターおよび他の要素をそれぞれ結合するために、および複製に必要な情報を含む適当なベクター中にこれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である（たとえば、Sambrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 and 3rd ed., 2001参照）。
【０１６３】
ベクター中で、ＤＮＡ配列は、適当なプロモーター配列に機能しうるように結合されていなければならない。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、その宿主細胞と相同か、あるいは非相同のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されることができる。ＡｍｙＥまたはその変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を、とりわけ細菌宿主中で指令する適当なプロモーターは、各種のバチルス由来のプロモーター、たとえばバチルスサブティリス、バチルスリケニフォルミス、バチルスステアロサーモフィルスまたはバチルスアミロリケファシエンス由来のα−アミラーゼプロモーター、エシェリキアコリ（Escherichia coli）のラックオペロンのプロモーター、ストレプトマイセスセリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡまたはｃｅｌＡプロモーターおよびバチルスサブティリスｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子等を含む。真菌宿主中での転写の場合、有用なプロモーターはアスペルギルスオリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガーグルコアミラーゼ、リゾムコールミエヘイリパーゼ、アスペルギルスオリザエアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルスオリザエトリオースフォスフェートイソメラーゼまたはアスペルギルスニジュランスアセタミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。ＡｍｙＥまたはその変異体をコードする遺伝子が細菌種、たとえばエシェリキアコリ中で発現されると、適当なプロモーターが、たとえばＴ７プロモーターおよびファージラムダを包含するバクテリオファージプロモーターから選択されることができる。酵母種中での発現のために適当なプロモーターの例は、以下のものに限定されることなく、サッカロマイセスセレビジエのＧａｌ  １およびＧａｌ  １０プロモーターおよびピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーターを含む。
【０１６４】
発現ベクターはまた、適当な転写ターミネーター、および真核生物中では、α−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に機能しうるように結合されたポリアデニル化配列を含んでいてもよい。停止およびポリアデニル化配列は、そのプロモーターと同じ源に好適に由来するものであることができる。ベクターはさらに、該ベクターが対象の宿主細胞中で複製することを可能にするＤＮＡ配列を含む。かかる配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＣａｔＨおよびｐＩＪ７０２の複製基点である。
【０１６５】
ベクターはまた、選択可能マーカー、たとえばその産物が宿主細胞中の欠陥を補完する遺伝子、たとえばバチルスサブティリスもしくはバチルスリケニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を含んでいてもよい。さらにその上、ベクターは、アスペルギルス選択マーカー、たとえばａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤおよびｘｘｓＣ、ヒグロマイシン耐性を生じるマーカーを含んでいてもよく、または選択はっ従来技術で知られた共形質転換によって達成されることができる。たとえば、国際公開第９１／１７２４３号参照。
３．２  ＡｍｙＥポリペプチドの発現および宿主生物
【０１６６】
宿主細胞中で発現されたときに、ＡｍｙＥポリペプチドが培地中に分泌されるならば、一般に有利である。この目的を達成するために、ＡｍｙＥポリペプチドは、発現された酵素の培地中への分泌を可能にするシグナル配列を含むことができる。シグナル配列はＡｍｙＥと同じ遺伝子によってコードされることができる。たとえば、配列番号１に記載されたＡｍｙＥはシグナル配列および
配列ＭＦAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE（配列番号９）
を有する付加的なＮ末端アミノ酸とともに天然に発現される。シグナル配列は、あるいは、異なるＡｍｙＥ由来またはさらには異なるタンパク質由来のバチルスサブティリス種シグナル配列であってもよい。さらに、シグナル配列は異なる種、たとえばバチルスリケニフォルミス由来であってもよい。シグナル配列は、たとえば特定の宿主細胞中でＡｍｙＥまたはその変異体の最適な発現をもたらすように選択されることができる。成熟ＡｍｙＥは、シグナル配列ではないＮ末端から付加配列をタンパク質分解的に切断した結果として生成されることができる。たとえば、バチルスリケニフォルミス由来の３１アミノ酸残基シグナル配列（「ＬＡＴリーダー配列」）は、ＡｍｙＥ配列とフレーム内で融合されることができる。たとえば、ＡｍｙＥをコードする核酸は、図２に示された発現ベクター中のバチルスリケニフォルミスシグナル配列に機能しうるように連結されている。
【０１６７】
ＤＮＡ構成体か、あるいは発現ベクターを含む単離された細胞は、ＡｍｙＥまたはその変異体の組換え生産における宿主細胞として好都合に用いられる。この細胞は、ＡｍｙＥまたはその変異体をコードするＤＮＡ構成体によって、任意的に該ＤＮＡ構成体を（１以上のコピーで）宿主染色体中に組み込むことによって形質転換される。ＤＮＡ配列は該細胞中に安定に維持される可能性がより高いので、この組み込みは一般に利点であると考えられる。宿主染色体中へのＤＮＡ構成体の組み込みは慣用の方法に従って、たとえば相同的または非相同的組換えによって実施されることができる。あるいは、異なる種類の宿主細胞に関連して上記したように、該細胞は発現ベクターによって形質転換されてもよい。
【０１６８】
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性の細菌種、たとえばバチルス科のもの、たとえばバチルスサブティリス、バチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス、バチルスコアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスランタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｎｔｕｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；ストレプトマイセス種、たとえばストレプトマイセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）；乳酸細菌種、たとえばラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、たとえばラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、たとえばラクトバチルスリューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）；ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種；ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）種；ならびにストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種である。さらに他の有用な宿主は、たとえばバチルス種Ａ７−７を含む。あるいは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、たとえばエシェリキアコリに属する、またはシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属するグラム陽性細菌種の株が、宿主生物として選択されることができる。
【０１６９】
好適な酵母宿主生物は、生物工学的に関連のある酵母種、たとえば以下のものに限定されることなく、ピチア種、ハンセヌラ（Ｈａｎｅｎｕｌａ）種、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ヤロウィニア（Ｙａｌｌｏｗｉｎｉａ）種、サッカロマイセス種、たとえばからサッカロマイセスセレビジエまたはシゾサッカロマイセスに属する種、たとえばシゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）から選択されることができる。メチロール生成型酵母種ハンセヌラパストリス（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株は宿主生物として用いられることができる。あるいは、宿主生物はハンセヌラ種であることができる。糸状菌の中の適当な宿主生物はアスペルギルス種、たとえばアスペルギルスニガー、アスペルギルスオリザエ、アスペルギルスチュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルスアワモリまたはアスペルギルスニジュランスを含む。あるいは、フサリウム種の株、たとえばフサリウムオキシスポラムまたはリゾムコール種、たとえばリゾムコールミエヘイが宿主生物として用いられることができる。他の適当な酵母は、サーモマイセス種およびムコール種を含む。真菌細胞は、プロトプラスト生成およびプロトプラストの形質転換に引き続いて従来技術で知られた様式での細胞壁の再生を含むプロセスによって形質転換されることができる。アスペルギルス宿主細胞を形質転換する好適な手順は、たとえば欧州特許第２３８０２３号に記載されている。
【０１７０】
本発明の組成物および方法の１の側面は、ＡｍｙＥ変異体を生成する方法であり、この方法は、該変異体の生成に貢献する条件下に上記の宿主細胞を培養する工程ならびに該細胞および／または培地から該変異体を回収する工程を含む。細胞を培養するために用いられる培地は、対象の宿主細胞を育成しそしてＡｍｙＥ変異体の発現を達成するのに適した任意の慣用の培地でよい。好適な培地および培地成分は、供給業者から入手可能でありまたは公開された処方に従って、たとえばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のカタログに記載されたように調製されることができる。典型的な培地は以下のものに限定されることなく、３，０００リットル（３，０００Ｌ）攪拌槽型発酵槽中で実施される流下回分発酵用のものを含むことができる。その場合の育成培地は、ナトリウム、カリウム、ホスフェート、マグネシウムおよびサルフェートの源としての無機塩ならびに微量元素とともに有機化合物源としてのコーンスティープ固形分および大豆粉、からなることができる。典型的には、炭水化物源、たとえばグルコースも当初培地の一部である。培養系が設定完了し育成が開始すると、該炭水化物が槽中に計量供給され、従来技術で知られているように培養が維持される。サンプルが発酵槽から規則的な間隔で取り出されて、酵素の滴定濃度が、たとえば比色分析アッセイ法を用いて測定される。酵素の生産速度が測定結果に基づいて増加をやめたときに、発酵工程は停止される。
【０１７１】
宿主細胞から分泌されたＡｍｙＥポリペプチドは、周知の方法によって、たとえば遠心分離またはろ過によって細胞を培地から分け、硫酸アンモニウムのような塩によって培地のタンパク質成分を沈降させ、引き続いてクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等を用いて培地から都合よく回収されることができる。
【０１７２】
宿主細胞は、ＡｍｙＥポリペプチドの発現を可能にする適当な条件下に培養されることができる。タンパク質の発現は、タンパク質が持続的に生産されるような構成的なものであり、または発現を開始するための刺激を必要とする誘導的なものであることができる。誘導発現の場合、タンパク質の生産はたとえば、誘導剤物質、たとえばデキサメタゾン、ＩＰＴＧまたはセファロースを培地に添加することによって開始されることができる。ポリペプチドは、細胞のないｉｎ  ｖｉｔｒｏ系、たとえばＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系において組換えによって生産されることもできる。
【０１７３】
ＡｍｙＥポリペプチドを発現する宿主は、該宿主のための適切な培地中で嫌気性条件下に培養されることができる。振とうまたは攪拌と通気との組み合わせが施され、生産は、該宿主の要求および所望のα−アミラーゼ変異体の生産に応じて、該宿主に適した温度、たとえば約３０℃〜約７０℃で行われることができる。培養は約１２から約１００時間以上まで（およびその間の任意の時間値で）またはよりとりわけ２４〜７２時間行われることができる。典型的には、培養ブロスは、ここでもＡｍｙＥ変異体の生産と対比して宿主細胞に必要とされる培養条件に応じて約５．５〜約８．０のｐＨにある。
【０１７４】
発現された酵素のデンプン分解活性は、たとえばジャガイモデンプン基質を用いて測定されることができる。この方法は、修飾されたジャガイモデンプンの酵素による分解に基づいており、この反応に引き続いてデンプン／酵素溶液のサンプルはヨウ素溶液と混合される。最初に黒青色が形成されるが、デンプンの分解の間に黒青色は次第に薄くなり、そして徐々に赤茶色に変わり、これが標準色付きガラスと比較される。
【０１７５】
ＡｍｙＥポリペプチドは、成熟型ＡｍｙＥのＮおよび／またはＣ末端にある、発現、欠失および／もしくは精製を促進する配列、たとえばシグナル配列もしくはヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を含む融合タンパク質として発現されることができる。かかる配列はシグナル配列を含み、これは宿主生物中でのＡｍｙＥの分泌および発現を促進する。付加的アミノ酸残基は、Yangら, "Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis " Nucleic Acids Res. 11: 237-49 (1983). で検討されているようにシグナル配列の切断に引き続いてＡｍｙＥのＮ末端から切断されることができる。
４．ＡｍｙＥポリペプチドの精製
【０１７６】
ある場合には、精製されたＡｍｙＥポリペプチドを調製するために慣用の方法が用いられることができる。培養物中の宿主生物を育成した後に成長（または「発酵」）ブロスが得られ、微生物細胞および各種の懸濁固形分、たとえば残留粗発酵物質が慣用の分離手法によって除かれてアミラーゼ溶液が得られる。ろ過、遠心分離、精密ろ過、回転真空ドラムろ過、引き続いて限外ろ過、抽出またはクロマトグラフィー等が一般に用いられる。
【０１７７】
発現されたＡｍｙＥまたはその変異体を含有する溶液を濃縮して回収を最適化することが一般に望ましい。というのは、濃縮されない溶液の使用は、精製された酵素を含有する沈降物を収集するために温置時間の増加が必要になるからである。溶液は、所望の酵素レベルが得られるまで慣用の手法を用いて濃縮される。酵素含有溶液の濃縮は、上記の手法のいずれかによって達成されることができる。１の実施態様では、回転真空蒸発および／または限外ろ過が用いられる。あるいは、限外ろ過が用いられることができる。
【０１７８】
沈降は、たとえばハロゲン化金属沈降剤を用いて実施されることができる。ハロゲン化金属沈降剤は、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物およびこれらのハロゲン化金属の２以上のブレンドを含む。ハロゲン化金属は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウムおよびこれらのハロゲン化金属の２以上のブレンドからなる群から選択されることができる。好適なハロゲン化金属は塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、特に塩化ナトリウムを含み、これはさらに保存剤として用いられることができる。最大回収のための沈降の条件の選択は、温置時間、ｐＨ、ＡｍｙＥまたはその変異体の温度および濃度を含めて、ルーチンの試験後に当業者には容易に明らかだろう。
【０１７９】
一般に、少なくとも約５ｗ／ｖ（重量／体積）％〜約２５ｗ／ｖ％のハロゲン化金属が濃縮酵素変異体溶液に添加され、通常少なくとも約８ｗ／ｖ％である。一般に、約２５ｗ／ｖ％以下のハロゲン化金属が濃縮酵素変異体溶液に添加され、通常約２０ｗ／ｖ％以下である。ハロゲン化金属沈降剤の最適濃度は、何よりも特定のＡｍｙＥまたはその変異体の性質および溶液中のその濃度に依存する。
【０１８０】
酵素の沈降を実現する代替手段は有機化合物の使用であり、これは濃縮酵素変異体溶液に添加されることができる。有機化合物沈降剤は、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルおよびこれらの有機化合物の２以上のブレンドを含むことができる。当該有機化合物沈降剤の添加は、ハロゲン化金属沈降剤の添加の前、それと同時、またはその後に行われることができ、また有機化合物とハロゲン化金属との両方の沈降剤の添加が逐次的にまたは同時に実施されてもよい。さらなる説明のためには、たとえばＤａｎｉｓｃｏ社への米国特許第５，２８１，５２６号参照。
【０１８１】
一般に、有機化合物沈降剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、たとえばナトリウムまたはカリウム塩、および４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状または分枝状アルキルエステル、およびこれらの有機化合物の２以上のブレンドからなる群から選択され、該アルキル基は１〜１２の炭素原子を有する。有機化合物沈降剤は、たとえば４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状または分枝状アルキルエステルおよびこれらの有機化合物の２以上のブレンドであることができ、該アルキル基は１〜１０の炭素原子を有する。好適な有機化合物は４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状アルキルエステルおよびこれらの有機化合物の２以上のブレンドを含み、該アルキル基は１〜６の炭素原子を有する。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステルおよびこれらの有機化合物の２以上のブレンドが、用いられることもできる。さらなる有機化合物は、以下のものに限定されることなく４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルパラベン）および４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベン）も含み、これらはアミラーゼ保存剤でもある。かかる有機化合物沈降剤の添加は、ｐＨ、温度、酵素濃度、沈降剤濃度および温置時間に関わる沈降条件の柔軟性の利点をもたらす。一般に、少なくとも０．０１ｗ／ｖ％の有機化合物沈降剤が濃縮酵素変異体溶液に添加され、通常少なくとも０．０２ｗ／ｖ％である。一般に、０．３ｗ／ｖ％以下の有機化合物沈降剤が濃縮酵素変異体溶液に添加され、通常０．２ｗ／ｖ％以下である。
【０１８２】
ハロゲン化金属沈降剤および、１の側面では、有機化合物沈降剤を含有する濃縮酵素溶液は、精製されるべき酵素変異体に必然的に依存するｐＨに調整される。一般に、そのｐＨは該アミラーゼの等電点（ｐＩ）に近いレベルに調整される。たとえば、そのｐＨは、ｐＩの下約２．５ｐＨ単位〜ｐＩの上約２．５ｐＨ単位の範囲内に調整されることができる。変異体のｐＩが野生型のｐＩと異なるならば、そのｐＨはしかるべく調整されることができる。
【０１８３】
精製酵素沈降物を得るために必要な温置時間は、特定の酵素の性質、酵素の濃度ならびに特定の１または複数の沈降剤およびそれらの濃度に依存する。一般に、酵素変異体を沈降するのに有効な時間は約１〜約３０時間、通常この時間は約２５時間を超えない。有機化合物沈降剤の存在下では、温置の時間はさらに約１０時間未満まで低減されることができ、ほとんどの場合約６時間でさえある。
【０１８４】
一般に、温置の間の温度は約４℃〜約５０℃である。普通、本発明の方法は約１０℃〜約４５℃、特に約２０℃〜約４０℃の温度で実施される。沈降を生じさせるのに最適の温度は、用いられる溶液条件および酵素または１もしくは複数の沈降剤に従って変動する。
【０１８５】
精製酵素沈降物の全回収率およびこの工程が実施されるその効率は、酵素、添加されたハロゲン化金属および添加された有機化合物を含む溶液を撹拌することによって改善される。撹拌段階は、ハロゲン化金属および有機化合物の添加の間ならびにその後の温置時間の間の双方で実施される。適当な撹拌方法は、機械的撹拌もしくは振とう、激しい通気または任意の類似の手法を含む。
【０１８６】
精製された酵素は、慣用の分離技術、たとえばろ過、遠心分離、精密ろ過、回転真空ろ過、限外ろ過、加圧ろ過、膜通過精密ろ過等によってさらに精製されることができる。膜通過精密ろ過が、用いられる１の方法であることができる。精製された酵素沈降物のさらなる精製は、該沈降物を水で洗うことによって達成されることができる。たとえば、精製された酵素沈降物はハロゲン化金属沈降剤を含有する水で洗われることができ、たとえばハロゲン化金属沈降剤および有機化合物沈降剤を含有する水で洗われることができる。
【０１８７】
培養の間、発現された酵素は培養ブロス中に蓄積されることができる。発現酵素の単離および精製のために、培養ブロスは遠心分離またはろ過されて細胞を排除し、そして得られた細胞を含まない液体が酵素の精製のために用いられることができる。１の実施態様では、細胞を含まない液体は、約７０％飽和度における硫酸アンモニウムを用いる塩析に付され、この７０％飽和−沈降画分は次に緩衝液中に溶解され、カラム、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラムにかけられ、そして溶出されて酵素活性画分が回収される。さらなる精製のために、慣用の手法、たとえばイオン交換クロマトグラフィーが用いられてもよい。
【０１８８】
精製された酵素は、該酵素が一般に利用される全ての用途に有用である。たとえば、該酵素は、洗濯洗剤および染み取り剤に、食品産業に、デンプン処理およびベーキングにならびに消化剤のような医薬組成物に用いられることができる。該酵素は、液状（溶液、スラリー）か、あるいは固形（顆粒、粉末）である最終生成物にされることができる。
【０１８９】
あるいは、酵素のさらなる精製をすることなくろ過または遠心分離によって細胞および細胞残屑を除くために、酵素生成物が回収され、凝集剤が培地に添加されることができる。
【０１９０】
上記の方法によって生成され精製されたＡｍｙＥポリペプチドは様々な有用な産業用途に用いられることができる。この酵素は、布地および家庭用品（Ｆ＆ＨＣ）に関連した用途を手助けする有益な特性を有する。たとえば、ＡｍｙＥポリペプチドは、洗い、食器洗いおよび硬質表面洗浄用の洗剤組成物として用いられることができる。ＡｍｙＥポリペプチドは甘味料およびデンプンからのエタノールの生産に、ならびに／または布地サイズ剤除去剤のためにも有用である。ＡｍｙＥポリペプチドは、たとえば国際公開第２００５／１１１２０３号および米国特許出願公開第２００６／００１４２６５号（Ｄａｎｉｓｃｏ社）に記載されているように、特にデンプン転化プロセス、たとえばデンプンの液化および／または糖化プロセスに有用である。ＡｍｙＥポリペプチドのこれらの用途は以下に、より詳細に記載される。
５．ＡｍｙＥポリペプチドの組成物および使用方法
５．１．デンプン処理組成物および方法
５．１．１．概説
【０１９１】
ＡｍｙＥポリペプチドは、デンプン処理／転化に用いられることができ、これは甘味料の生産、燃料または飲料（たとえば、飲用アルコール）用のアルコールの生産、飲料の生産、サトウキビの処理または所望の有機化合物、たとえばクエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン、ホルモン等の生産の中核をなしている。デンプン転化は一般に、ゲル化されたまたは顆粒状のデンプンのスラリーを加水分解して可溶性デンプン加水分解物にすることを含む。慣用のデンプン転化は、３の連続した酵素による工程を含む。すなわち、液化工程、糖化工程およびグルコースから所望の生成物を生産するさらなる工程である。所望の生成物に応じて、さらなる処理は異性化、発酵等であることができる。デンプンをフルクトースシロップに転化するプロセスでは、該さらなる処理は異性化である。
５．１．２．  デンプン組成物
【０１９２】
処理されるべきデンプンは塊茎、根、幹、マメ類、穀物または全粒粉から得られることができる。より具体的には、粒状デンプンはトウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ、マメ、バナナまたはジャガイモから得られることができる。特別に検討されたのは、油性および非油性の両方の種類のトウモロコシおよび大麦である。該デンプンは高度に精製されたデンプン品質、たとえば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９．５％純度であることができる。あるいは、該デンプンは、粉砕全粒粉、たとえば非デンプン画分、たとえば胚残屑および繊維を含む素材を含有するより粗のデンプンであることができる。粗素材、たとえば全粒粉は粉砕されて構造を開きさらなる処理を可能にする。
【０１９３】
２の粉砕プロセスが適している。すなわち、湿式および乾式粉砕（乾燥磨砕）である。乾式粉砕では、全穀粒が粉砕され用いられる。乾式粉砕された穀粒は、デンプンに加えて有意の量の非デンプン炭水化物化合物を含む。かかる不均一な素材がジェットクッキングによって処理されると、しばしばデンプンの部分的ゲル化のみが達成される。湿式粉砕は胚および粗引き粉（デンプン顆粒およびタンパク質）の十分な分離をもたらし、通常、シロップの生産に用いられる。このプロセスは限外ろ過系で実施されてもよく、濃縮液は酵素、粗デンプンおよび水の存在下に再循環下に保持され、透過液は可溶性デンプン加水分解物である。このプロセスはまた限外ろ過膜を備えた連続膜反応器中で実施されてもよく、濃縮液は酵素、粗デンプンおよび水の存在下に再循環下に保持され、透過液は可溶性デンプン加水分解物である。このプロセスはさらに精密ろ過膜を備えた連続膜反応器中で実施されてもよく、濃縮液は酵素、粗デンプンおよび水の存在下に再循環下に保持され、透過液は可溶性デンプン加水分解物である。
【０１９４】
上記の側面のいずれかに用いられるべきデンプンスラリーは、約２０％〜約５５％の乾燥固形分粒状デンプン、約２５％〜約４０％の乾燥固形分粒状デンプンまたは約３０％〜約３５％の乾燥固形分粒状デンプンを有することができる。本発明の酵素変異体は可溶性デンプンを、少なくとも８５％の量、少なくとも８６％の量、少なくとも８７％の量、少なくとも８８％の量、少なくとも８９％の量、少なくとも９０％の量、少なくとも９１％の量、少なくとも９２％の量、少なくとも９３％の量、少なくとも９４％の量、少なくとも９５％の量、少なくとも９６％の量、少なくとも９７％の量、少なくとも９８％の量または少なくとも９９％の量の粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解物に転化する。
５．１．３．液化および糖化
【０１９５】
液化工程の間に、デンプンスラリー中に存在する長鎖デンプン分子はα−アミラーゼによって分解されてより短い分枝状および直鎖状分子（マルトデキストリン）になる。多数のα−アミラーゼ、たとえばＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸｔｒａおよびＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）が商業的に利用可能である。
【０１９６】
液化工程は一般に約１０５〜１１０℃で約５〜１０分間、引き続いて９５℃で１〜２時間実施される。液化のｐＨは典型的には約５．０〜約６．２、通常約５．５である。これらの条件下におけるα−アミラーゼの安定性を促進するために、１ｍＭのカルシウム（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）が典型的には添加される。この処理の後、液化されたデンプン組成物は大体はデキストリンを含有し、約１０〜１５の「デキストロース当量」（ＤＥ）を有する。
【０１９７】
液化工程に引き続いて、このデキストリンは典型的には別の糖化工程で、グルコアミラーゼ（たとえば、ＡＭＧ（商標））の添加によってデキストロースに転化される。脱分枝酵素、たとえばイソメラーゼまたはプルラナーゼ（たとえば、ＰＲＯＭＯＺＹＭＥ（商標））が添加さてれもよい。糖化工程に備えるために、液化するα−アミラーゼが変性されないように温度を９５℃以上に維持しながら、スラリーのｐＨは典型的には約４．５未満の値まで下げられる。温度は次に約６０℃まで下げられ、デキストリンからグルコースへの生産の作用を与えるためにグルコアミラーゼおよび脱分枝酵素が添加される。糖化工程は典型的には約２４〜約７２時間進行する。
５．１．４．糖化によって生産されたグルコースのさらなる処理
【０１９８】
糖化工程の後に、デキストロースシロップは、たとえば固定化グルコースイソメラーゼ（たとえば、ＳＷＥＥＴＺＹＭＥ（商標））を用いて高フルクトースシロップに転化されることができる。１の観点では、この工程の可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）、たとえば高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）への転化に付される。この転化は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを用いて実施されることができる。検討されたイソメラーゼは、市販製品ＳＷＥＥＴＺＹＭＥ（商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社）；Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）ＩＭＧＩおよびＧ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３、ＫＥＴＯＭＡＸ（商標）、Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３、Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３液状およびＧＥＮＳＷＥＥＴ（商標）ＩＧＩを含む。Ｃａ２＋は従来のα−アミラーゼの安定性を増加するけれども、これはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害する。したがって、Ｃａ２＋は典型的には異性化の前にＣａ２＋のレベルが３〜５ｐｐｍ未満となるように、たとえばイオン交換によって除かれる。この工程は時間がかかりかつコストがかかる。
【０１９９】
あるいは、糖化によって生産されたグルコースは発酵に用いられて、発酵産物、たとえばエタノール、ブタノールおよび本明細書に記載され従来技術で知られた他の化合物を生産する。発酵によってデンプン含有素材からエタノールを生産する典型的な完全なプロセスは、（ｉ）ＡｍｙＥまたはその変異体を用いてデンプン含有素材を液化する工程、（ii）得られた液化マッシュを糖化する工程、および（iii）発酵生物の存在下に工程（ii）で得られた物質を発酵する工程を含む。任意的に、このプロセスはさらにエタノールの回収工程を含む。発酵の間に、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、たとえば少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％または少なくとも約１６％に達する。
【０２００】
糖化および発酵プロセスは、同時糖化および発酵プロセス（ＳＳＦ）として実施されることができる。発酵が加水分解と同時に実施されるときは、温度は約３０℃〜３５℃、特に３１℃〜３４℃であることができる。このプロセスは限外ろ過系で実施されてもよく、濃縮液は酵素、粗デンプン、酵母、酵母栄養物および水の存在下に再循環下に保持され、透過液はエタノール含有液体である。同様に検討されるのは、限外ろ過膜を備えた連続膜反応器中で実施されるプロセスであり、この場合濃縮液は酵素、粗デンプン、酵母、酵母栄養物および水の存在下に再循環下に保持され、透過液はエタノール含有液体である。
【０２０１】
糖化によって生産されたグルコースは、発酵産物、たとえばエタノール、ブタノール、クエン酸、グルタミン酸モノナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトンまたはエリトルビン酸塩ナトリウムの生産に用いられてもよい。
５．１．５．ＡｍｙＥアミラーゼの利点
【０２０２】
ＡｍｙＥポリペプチドはデンプンの加水分解に用いられるといくつかの利点を提供し、これはＡｍｙＥポリペプチドを他のα−アミラーゼと差別化し、デンプン加水分解方法の合理化を可能にする。第一に、デキストリンは、グルコアミラーゼに適しているのと同じ反応条件下にＡｍｙＥポリペプチドによってデキストロースに転化されることができる。これは、α−アミラーゼの場合の反応混合物（たとえば、スラリー）のｐＨおよび温度を最適化し、そして次にグルコアミラーゼに適合するように、たとえばスラリーのｐＨおよび／または温度を下げることによって反応条件を調整する必要性を除去する。このようにして、デンプン加水分解におけるＡｍｙＥの使用は、液化および糖化が同じスラリー条件下に実施されることを可能にし、それによってデンプン加水分解における１工程を排除する。
【０２０３】
ある場合には、液化および糖化の双方は、約４〜７、たとえば約４〜５、約４〜６、約５〜６、約５〜７および約６〜７の単一のｐＨで実施されることができる。この単一ｐＨの判断基準は、液化または糖化の間に生じる反応混合物のｐＨへの何らかの微小な変化を無視するが、反応混合物のｐＨを意図的に変えるための酸または塩基の添加は含まないことに注意されたい。ある場合には、液化および糖化の双方は、従来の液化プロセスが実施されるｐＨよりも下のｐＨで、たとえば約５．０未満のｐＨ、約４．８未満のｐＨ、約４．６未満のｐＨ、約４．４未満のｐＨ、約４．２未満のｐＨまたは約４．０のｐＨでさえ実施されることができる。液化についてのＡｍｙＥの使用は、液化に用いられるデンプン組成物中に、より高いパーセントの薄いスチレッジ、たとえば反応混合物の＞５０％または＞６０％さえをも含めることを可能にする。ある場合には、液化および糖化の双方は、約２０〜１０５℃、たとえば６０〜８５℃の温度、またはデンプンゲル化温度（すなわち、約７５℃）よりも約１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０℃さえも下の温度で実施されることができる。重要なことは、ｐＨ調整を全く介入させることなく、液化および糖化が実施されることができることである。あるいは、液化および糖化の間にｐＨ調整が依然として望ましい場合でも、従来のプロセスで用いられる量と比較して低減された量の酸または塩基を用いてそれが実施されることができ、それによって反応混合物中により少ない塩が導入される。
【０２０４】
さらに、ＡｍｙＥポリペプチドは複合糖、たとえばマルトース、マルトトリオースおよびマルトヘプタオースからグルコースへの分解を触媒する。かかる酵素活性は、従来α−アミラーゼではなくグルコアミラーゼと関連付けられている。ＡｍｙＥポリペプチドのこの活性は、デンプンからグルコースへの加水分解を、別のグルコアミラーゼの不存在下か、あるいは従来のα−アミラーゼを用いて必要とされる量と比較して低減された量のグルコアミラーゼの存在下に実施することを可能にする。このようにして、デンプン加水分解へのＡｍｙＥポリペプチドの使用は、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの双方として機能する単一の酵素を用いて液化および糖化を同時に実施することを可能にし、それによって別の酵素の必要を排除しまたは低減する。
【０２０５】
ＡｍｙＥポリペプチドは安定化のためのＣａ２＋をほとんどまたは全く必要とせず、Ｃａ２＋を液化反応に添加する必要を排除しまたは低減する。Ｃａ２＋を添加する工程を回避できることに加えて、このことは、その後にＣａ２＋に敏感であるグルコースイソメラーゼのような酵素とスラリーとを接触させる前に、スラリーからＣａ２＋を（たとえば、イオン交換によって）除く必要を回避できる。Ｃａ２＋除去を未然に取り除くことは、時間およびコストを節減し、高フルクトースシロップを生産する効率を高める。
【０２０６】
最後に、ＡｍｙＥポリペプチドは、従来のα−アミラーゼの酵素活性では扱いにくいことがあるゲル化していないデンプンに対して高活性を有する。これは、転化効率を改善するために湿式粉砕デンプンが一般に好まれる液化および糖化に、ジェットクッキングされた乾式粉砕デンプンを用いることを可能にする。
【０２０７】
発酵、異性化または任意の他の後続プロセス、たとえばＳＳＦに結びついている液化／糖化プロセスに、ＡｍｙＥが用いられるのに適していることは正当に評価されるだろう。
５．１．６．ＡｍｙＥとグルコアミラーゼおよび他の酵素との組み合わせ
【０２０８】
ＡｍｙＥポリペプチドは単独で（たとえば、デンプン処理における唯一のデンプン分解酵素として）用いられることができ、または他のα−もしくはβ−アミラーゼもしくは他の酵素と組み合わされて広範囲の活性を有する「カクテル」をもたらすことができる。たとえば、デンプンは、真菌α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、細菌α−アミラーゼ、たとえばバチルスα−アミラーゼもしくは非バチルスα−アミラーゼ、またはβ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）からなる群から選択された１以上の酵素と接触されることができる。他のデンプン分解酵素または脱分枝酵素、たとえばイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）もしくはプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）はＡｍｙＥポリペプチドと組み合わされることができる。イソアミラーゼは、アミロペクチンおよびβ限界デキストリン中のα−１，６−Ｄ−グルコシド分枝結合を加水分解し、イソアミラーゼにプルランを攻撃する能力が欠けていることおよびα限界デキストリンへのイソアミラーゼの制限された作用によって、プルラナーゼと区別されることができる。
【０２０９】
β−アミラーゼはエキソ作用性マルトース生成型アミラーゼであり、これは１，４−α−グルコシド結合のアミロース、アミロペクチンおよび関連したグルコースポリマーへの加水分解を触媒し、それによってマルトースを放出する。β−アミラーゼは様々な植物および微生物から単離されている（Fogartyら, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979）。これらのβ−アミラーゼは４０℃〜６５℃の範囲に最適温度および約４．５〜約７．０の範囲に最適ｐＨを有することで特徴付けられる。検討されたβ−アミラーゼは以下のものに限定されることなく、大麦SPEZYME（商標）BBA 1500, SPEZYME（商標）DBA, OPTIMALT（商標）ME, OPTIMALT（商標）BBA (Danisco社);およびNOVOZYM（商標）WBA (Novozymes社)由来のβ−アミラーゼを含む。
【０２１０】
本明細書に記載されたように、ＡｍｙＥポリペプチドはグルコアミラーゼ活性を有し、別のグルコアミラーゼの不存在下に用いられることができる。あるいは、グルコアミラーゼは、従来のデンプン加水分解方法に要求される量と比較して低減された量で添加されることができる。好ましくは、グルコアミラーゼは０．５以下の（すなわち、未満の）グルコアミラーゼ活性単位（ＡＧＵ）／ｇＤＳ（すなわち、乾燥固形分１ｇ当たりのグルコアミラーゼ活性単位）、０．４ＡＧＵ／ｇＤＳ以下、０．３ＡＧＵ／ｇＤＳ以下、０．２ＡＧＵ／ｇＤＳ以下または０．１ＡＧＵ／ｇＤＳ以下の量で存在する。より一般的には、グルコアミラーゼは０．０２〜２．０ＡＧＵ／ｇＤＳまたは０．１〜１．０ＡＧＵ／ｇＤＳの量で添加されることができる。もっとも、これらの範囲はＡｍｙＥとの組み合わせで要求されるのよりも多いグルコアミラーゼの使用を考慮している。何故ならば、ＡｍｙＥポリペプチドはグルコアミラーゼと同じｐＨおよび温度で活性であり、ＡｍｙＥポリペプチドはグルコアミラーゼの添加の前もしくは後に、またはグルコアミラーゼと同時に、たとえばＡｍｙＥおよびグルコアミラーゼの双方を含むカクテルによって添加されることができるからである。したがって、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの添加の順番および様式はもはや決定的に重要ではなく、デンプン加水分解プロセスにおける柔軟性を可能にする。
【０２１１】
グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）は微生物又は植物由来であることができる。真菌および細菌由来の様々な公知のグルコアミラーゼがある。典型的な細菌グルコアミラーゼはアスペルギルスグルコアミラーゼ、特にアスペルギルスニガーＧ１またはＧ２グルコアミラーゼ（Boelら、(1984), EMBO J. 3: 1097-1102）またはこれらの変異体であり、たとえば国際公開第９２／００３８１号および国際公開第００／０４１３６号に開示されたもの；アスペルギルスアワモリグルコアミラーゼ（国際公開第８４／０２９２１号；アスペルギルスオリザエ（Agric. Biol. Chem. (1991) 55(4): 941-949）またはこの変異体または断片である。アスペルギルスグルコアミラーゼ変異体は、熱安定性を高めるもの；Ｇ１３７ＡおよびＧ１３９Ａ（Chenら、(1996) Prot. Eng. 9:499-505)； Ｄ２５７ＥおよびＤ２９３Ｅ／Ｑ  (Chenら、(1995) Prot. Eng. 8:575-582）；Ｎ１８２（Chenら、(1994) Biochem. J. 301:275-281）；ジスルフィド結合Ａ２４６Ｃ（Fierobeら、(1996) Biochemistry, 35:8698-8704）；および位置Ａ４３５およびＳ４３６におけるプロ残基の導入（Li ら、(1997) Protein Eng. 10: 1199-1204）を含む。他のグルコアミラーゼはトリコデルマリーゼイグルコアミラーゼ（国際公開第２００６／０６００６２号の配列番号３参照、ＴｒＧＡ）、タラロマイセスグルコアミラーゼ、特にトリコデルマエメルソニ由来のもの（国際公開第９９／２８４４８号）、トリコデルマレイセッタナス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ  ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）（米国特許第ＲＥ３２，１５３号）、トリコデルマデュポンティ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ  ｄｕｐｏｎｔｉ）またはトリコデルマサーモフィラス（米国特許第４，５８７，２１５号）を含む。細菌グルコアミラーゼは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属由来のグルコアミラーゼ、特にクロストリジウムサーモアミロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（欧州特許第１３５１３８号）およびクロストリジウムサーモヒドロスルフリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）（国際公開第８６／０１８３１号）を含む。他の好適なグルコアミラーゼは、アスペルギルスオリザエ由来のもの、たとえば国際公開第００／０４１３６号の配列番号２に示されたアミノ酸配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはさらに９０％の相同性を有するグルコアミラーゼを含む。同様に好適なのは、市販グルコアミラーゼ、たとえばＡＭＧ  ２００Ｌ；ＡＭＧ  ３００Ｌ；ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲおよびＡＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）；ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）３００（Ｄａｎｉｓｃｏ社、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門）；ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）およびＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ社から）；Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９００（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；およびＧ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９０ＺＲ（アスペルギルスニガーグルコアミラーゼおよび低プロテアーゼ含有量）である。
【０２１２】
フィターゼは、穀粒および菜種中に認められるフィチン酸（フィテート）を分解する酵素である。フィターゼならびにその分解中間体はα−アミラーゼを不安定化するまたは他様に悪影響を及ぼし、それによってその効率を下げると考えられる。変異体α−アミラーゼと組み合わされて用いられることができるフィターゼは、温置および液化工程の規定条件下にフィチン酸を加水分解する能力がある。ある実施態様では、フィターゼは、イノシトールヘキサホスフェート（フィチン酸）から少なくとも１の無機ホスフェートを遊離させる能力がある。その位置で加水分解が開始されるフィテート分子上のホスフェートエステル基の特定の位置への選好に従って、（たとえば、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）のようにまたは６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）のように）フィターゼは分類されることができる。フィターゼの典型的な例はミオイノシトール−ヘキサキホスフェート−３−ホスホヒドロラーゼである。
【０２１３】
フィターゼは微生物、たとえば真菌および細菌生物から得られることができる。これらの微生物のいくつかは、たとえば、アスペルギルス（たとえば、アスペルギルスニガー、アスペルギルステレウス、アスペルギルスフィカムおよびアスペルギルスフミガタス）、マイセリオフソーラ（マイセリオフソーラサーモフィラ）、タラロマイセス（タラロマイセスサーモフィラス）、トリコデルマ種（トリコデルマリーゼイ）およびサオモマイセス（国際公開第９９／４９７４０号）を含む。また、フィターゼはペニシリウム種、たとえばペニシリウムホルデイ（ＡＴＣＣ番号２２０５３）、ペニシリウムピセウム（ＡＴＣＣ番号１０５１９）またはペニシリウムブレビコンパクタム（ＡＴＣＣ番号４８９４４）が利用可能である。たとえば、米国特許第６，４７５，７６２号参照。さらに、フィターゼはバチルス（たとえば、バチルスサブティリス、シュードモナス、ペニオフォーラ、エシェリキアコリ、シトロバクター、エンテロバクターおよびブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ））が利用可能である（国際公開第２００６／０４３１７８号参照）。
【０２１４】
市販のフィターゼ、たとえばＮＡＴＵＰＨＯＳ（商標）（ＢＡＳＦ社）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ（商標）Ｐ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社）、ＰＨＺＹＭＥ（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ社、Ｄｉｖｅｒｓａ社）およびＦＩＮＡＳ（商標）（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ社）が入手可能である。微生物フィターゼ活性を測定する方法およびフィターゼ単位の定義は、Engelenら、(1994) /. AOAC Int. 77:760 - 764によって出版されている。フィターゼは野生型フィターゼ、その変異体または断片であることができる。
【０２１５】
典型的なフィターゼは細菌ブティアウクセラ種由来であることができる。ブティアウクセラ種は、ブティアウクセラアグレティス、ブティアウクセラブレナイ、ブティアウクセラフェラグティアーゼ、ブティアウクセラガビニイ、ブティアウクセライザルディ、ブティアウクセラノアキイおよびブティアウクセラワルムボリディを含む。ブティアウクセラ種の株は、ＤＭＳＺ、独国立生物学物質資源センター（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）（独国、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  ３８１２４、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ）から入手可能である。登録番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８の下に寄託されたブティアウクセラ種株Ｐ１−２９は、それからフィターゼが得られることができる特に有用な株のサンプルである。フィターゼは、国際公開第０６／０４３１７８号に記載されたＢＰ野生型、その変異体（たとえば、ＢＰ−１１）、または２００７年３月６日に出願された米国特許出願公開第２００８０２２０４９８号に記載された変異体であることができる（たとえば、表１および配列番号３参照）。
【０２１６】
フィターゼは、下に示された配列番号１７のアミノ酸配列を有するブティアウクセラフィターゼのＢＰ−１７変異体、または配列番号１７に記載されたアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％およびさらに少なくとも９９％の配列同一性を有するフィターゼであることもできる。
【０２１７】
温置および／または液化プロセスに用いられるフィターゼの量（配量）は約０．００１〜５０ＦＴＵ／ｇ−ｄｓの範囲（たとえば、約０．０１〜２５ＦＴＵ／ｇ−ｄｓの範囲）、約０．０１〜１５ＦＴＵ／ｇ−ｄｓ、約０．０１〜１０ＦＴＵ／ｇ−ｄｓ、約０．０５〜１５ＦＴＵ／ｇ−ｄｓおよび約０．０５〜５．０ＦＴＵ／ｇ−ｄｓの範囲であることができる。
【０２１８】
ＡｍｙＥポリペプチドと組み合わされて用いられることができる他の酵素は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ラッカーゼまたはこれらの組み合わせを含む。ある場合には、国際公開第９８／２２６１３号に開示されたタイプの炭水化物結合ドメインが用いられてもよい。
５．２．洗浄組成物および食器洗い組成物ならびに方法
【０２１９】
ＡｍｙＥポリペプチドは、食器および他の硬質表面を洗浄するために用いられる洗浄組成物中に配合されることができる。これらの組成物はゲル、粉体または液体であることができる。該組成物は、組成物中の単一のタンパク質分解酵素としてＡｍｙＥポリペプチドを含むことができる。あるいは、該組成物は、他の／追加のタンパク質分解酵素、他の洗浄酵素および他の成分を含むことができ、これらの多くは洗浄組成物に共通している。洗濯洗剤組成物は追加として１以上の他の酵素、たとえばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、パーオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン、リアーゼおよび／もしくはラッカーゼまたはこれらの組み合わせを含む。
【０２２０】
食器洗い洗剤組成物は、一般に１以上の界面活性剤を含み、これはアニオン性、非イオン性、カチオン性、両性またはこれらの種類の混合物を含む。洗剤は０％〜約９０重量％の非イオン性界面活性剤、たとえば低〜非発泡性エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールを含有することができる。
【０２２１】
液体洗剤組成物はプロピレングリコールを含むことができる。ＡｍｙＥポリペプチドは、たとえば１０％の塩化カルシウムを含有する２５体積／体積％のプロピレングリコール溶液中を循環することによってプロピレングリコール中に可溶化されることができる。
【０２２２】
食器洗剤組成物は、無機および／または有機型の洗剤ビルダー塩を含むことができる。洗剤ビルダーは、リン含有および非リン含有タイプに細分されることができる。洗剤組成物は通常、約１％〜約９９％の洗剤ビルダーを含有する。リン含有無機アルカリ性洗剤ビルダーの例は水溶性塩、とりわけアルカリ金属ピロホスフェート、オルトホスフェートおよびポリホスフェートである。リン含有有機アルカリ性洗剤ビルダーの例はホスホネートの水溶性塩である。非リン含有無機ビルダーの例は水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレートおよびシリケートならびに様々な種類の非水溶性結晶性または非晶性アルミノシリケートであり、その中のゼオライトは最もよく知られた代表例である。
【０２２３】
好適な有機ビルダーの例は、アルカリ金属；アンモニウムおよび置換アンモニウム；シトレート；サクシネート；マロネート；脂肪酸スルホネート；カルボキシメチルサクシネート；アンモニウムポリアセテート；カルボキシレート；ポリカルボキシレート；アミノポリカルボキシレート；ポリアセチルカルボキシレートおよびポリヒドロキシスルホネートである。他の好適な有機ビルダーは、ビルダー特性を有することが知られているより高分子量のポリマーおよびコポリマー、たとえば適当なポリアクリル酸、ポリマレイン酸およびポリアクリル酸／ポリマレイン酸コポリマーならびにこれらの塩を含む。
【０２２４】
洗浄組成物は漂白剤、たとえば塩素／臭素型または酸素型の漂白剤を含有することができる。無機塩素／臭素型漂白剤の例はリチウム、ナトリウムまたカルシウムハイポクロライトおよびハイポブロマイト、ならびに塩素化リン酸３ナトリウムである。有機塩素／臭素型漂白剤の例はヘテロ環式Ｎ−ブロモおよびＮ−クロロイミド、たとえばトリクロロイソシアヌル、トリブロモイソシアヌル、ジブロモイソシアヌルおよびジクロロイソシアヌル酸、ならびにこれらと水溶性カチオン、たとえばカリウムおよびナトリウムとの塩である。ヒダントイン化合物も適している。
【０２２５】
洗浄組成物は酸素漂白剤、たとえば無機過酸基塩の形をしたもの、任意的に漂白剤前駆体を有するものまたはパーオキシ酸化合物としてのものを含有することができる。パーオキシ漂白化合物の典型例はアルカリ金属パーボレート、テトラハイドレートおよびモノハイドレートの双方、アルカリ金属パーカーボネート、パーシリケートおよびパーホスフェートである。好適な活性剤物質はテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）およびグリセロールトリアセテートを含む。酵素漂白活性系、たとえばパーボレートまたはパーカーボネート、グリセロールトリアセテートおよびパーヒドロラーゼも、たとえば国際公開第２００５／０５６７８３号に開示されたように存在することができる。
【０２２６】
洗浄組成物は、１または複数の酵素についての慣用の安定剤、たとえばポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体（たとえば、芳香族ホウ酸エステル）を用いて安定化されることができる。洗浄組成物は他の慣用の洗剤成分、たとえば解膠剤物質、フィラー物質、泡抑制剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤および香料も含有することができる。
【０２２７】
最後に、ＡｍｙＥポリペプチドは、従来の食器洗い洗剤、たとえば以下の公表特許に記載された洗剤のいずれかに、ＡｍｙＥポリペプチドは以下の特許および公開特許出願に記載されたα−アミラーゼの代わりにまたはそれに追加して用いられることを理解して、用いられることができる。すなわち、CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197および米国特許第5,112,518; 5,141,664; and 5,240,632号である。
【０２２８】
ＡｍｙＥポリペプチド含有洗剤組成物は、手洗いまたは機械食器洗い作業用に処方されることができる。
５．３．洗濯洗剤組成物および方法
【０２２９】
ＡｍｙＥポリペプチドは洗濯洗剤組成物の成分、たとえばダスティング防止顆粒、安定化液体、保護された酵素等の形態をした成分であることができる。ダスティング防止粒子は、たとえば米国特許第４，１０６，９９１号および４、６６１，４５２号に記載されたように製造されることができ、任意的に従来技術で知られた方法で被覆されてもよい。油性被覆物質の例はポリ（エチレンオキシド）製品；１，０００〜２０，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；その中のアルコールが１２〜２０の炭素原子を有し、１５〜８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノおよびジおよびトリグリセリドである。流動床技術による施与に適した膜形成被覆物質の例は独国特許第１，４８３，５９１号に記載されている。
【０２３０】
液状酵素調製物は、確立された方法に従ってポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することによって安定化されることができる。他の酵素安定化剤は従来技術で知られている。保護された酵素は、たとえば米国特許第５，８７９，９２０号（Ｄａｎｉｓｃｏ社）または欧州特許第２３８２１６号に従って調製されることができる。ポリオールはタンパク質の安定化剤として、ならびにタンパク質の溶解度を改善するために長く認められている。たとえば、Kaushikら、 Ｊ. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003)およびそこに引用された参考文献、ならびにM. Contiら、Ｊ. Chromatography 757: 237-245 (1997)参照。
【０２３１】
洗濯洗剤組成物は任意の都合のよい形態、たとえばゲル、粉末、顆粒、ペーストまたは液体としていることができる。液体洗剤は、典型的には約７０％までの水および０％〜約３０％の有機溶媒を含有する水性であることができ、また約３０％の水のみを含有するコンパクトゲルタイプであることができる。
【０２３２】
洗濯洗剤組成物は典型的には１以上の界面活性剤を含み、これはアニオン性、非イオン性（半極性を含む。）、カチオン性もしくは両性イオンまたはこれらの組み合わせであることができる。界面活性剤は典型的には０．１％〜６０重量％のレベルで存在する。ある場合には、この洗剤は通常０％〜約４０％、または約５０％のアニオン界面活性剤、たとえば直鎖アルキルベンゼンスルホネート；α−オレフィンスルホネート；アルキルサルフェート（脂肪族アルコールサルフェート）（ＡＳ）；アルコールエトキシサルフェート（ＡＥＯＳまたはＡＥＳ）；２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）；α−スルホ脂肪酸メチルエステル；アルキルまたはアルケニルコハク酸：または石けんを含む。この組成物は０％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、たとえばアルコールエトキシレート（ＡＥＯまたはＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、（国際公開第９２／０６１５４号に記載された）ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）も含む。
【０２３３】
洗濯洗剤組成物はさらに１以上の他の酵素、たとえばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、パーオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ラッカーゼおよび／もしくは他のタンパク質分解酵素（たとえば、α−アミラーゼ）またはこれらの組み合わせを含むことができる。ある場合には、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼが洗濯洗剤組成物中に入れられ、家庭および／または工業用布地／洗濯物上に存在する生物膜を除去／洗浄するために用いられることができる。
【０２３４】
洗濯洗剤は約１％〜約６５％の洗剤ビルダーまたは錯化剤、たとえばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ３酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートもしくは層状シリケート（たとえば、Ｈｏｅｃｈｓｔ社からのＳＫＳ−６）を含有することができる。該洗剤はビルダー非処方、すなわち本質的に洗剤ビルダーを含まないこともできる。酵素は、その酵素の安定性と両立する任意の組成で用いられることができる。酵素は、一般的に有害な成分から公知のカプセス封入の形態によって、たとえばヒドロゲルへの顆粒化または金属イオン封鎖によって保護されることができる。酵素および特にデンプン結合ドメインを有するか、あるいは有しないα−アミラーゼは、洗濯および食器洗い用途に限定されないで、表面洗浄剤およびデンプンまたはバイオマスからのエタノール生産に用途を見出す。
【０２３５】
洗濯洗剤は１以上のポリマーを含むことができる。その例は、カルボキシメチルセスロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロール）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、たとえばポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーを含む。
【０２３６】
洗濯洗剤は漂白系を含有することができ、これはＨ２Ｏ２源、たとえば任意的に過酸形成性漂白活性剤と組み合わされたパーボレートまたはパーカーボネート、たとえばＴＡＥＤまたはノナノイルオキシベンゼンスルフォネート（ＮＯＢＳ）を含むことができる。あるいは、漂白系は、たとえばアミド、イミドのパーオキシ酸またはスルホンタイプを含むことができる。漂白系は、国際公開第２００５／０５６７８３号に記載されたようにパーヒドロラーゼがパーオキシドを活性化する酵素漂白系であることもできる。
【０２３７】
洗濯洗剤組成物の酵素は、ＡｍｙＥポリペプチドを含めて、慣用の安定化剤、たとえばポリオール、たとえばプロピレングリコールまたはグリセロール；糖または糖アルコール；乳酸；ホウ酸またはホウ酸誘導体たとえば、芳香族ホウ酸エステル用いて安定化されることができ、該組成物は、たとえば国際公開第９２／１９７０９号および国際公開第９２／１９７０８号に記載されたように処方されることができる。
【０２３８】
洗濯洗剤は他の慣用の洗剤成分、たとえば衣類仕上げ剤、たとえば粘土、起泡剤、泡抑制剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤または香料も含有することができる。（使用濃度における水性溶液中で測定された）ｐＨは普通、中性またはアルカリ性、たとえばｐＨ約７．０〜約１１．０である。もっとも、ＡｍｙＥポリペプチドは低ｐＨ条件でも、デンプン加水分解の場合と同じように働く。
【０２３９】
１以上のＡｍｙＥポリペプチドが洗濯洗浄組成物中に、かかる組成物中に慣用される濃度、たとえば洗い液の１リットル当たり（純酵素タンパク質として計算されて）０．００００１〜１．０ｍｇのＡｍｙＥポリペプチドで存在することができる。典型的な洗剤組成物は以下のものを含む。
【０２４０】
（１）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約７％〜約１２％；アルコールエトキシサルフェート（たとえば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））またはアルキルサルフェート（たとえば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約４％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約１４％〜約２０％；可溶性シリケート、約２〜約６％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約１５％〜約２２％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）０％〜約６％；クエン酸ナトリウム／クエン酸（たとえば、C６H5Na3O７／C６H8O７)約０％〜約１５％；ナトリウムパーボレート（たとえば、NaBO3・H2O)約１１％〜約１８％；TAED約２％〜約６％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）約０％〜約２％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ，ＰＥＧ）０〜３％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色剤）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４１】
（２）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約６％〜約１１％；アルコールエトキシサルフェート（たとえば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））またはアルキルサルフェート（たとえば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約３％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約１５％〜約２１％；可溶性シリケート、約１％〜約４％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約２４％〜約３４％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）約４％〜約１０％；クエン酸ナトリウム／クエン酸（たとえば、C６H5Na3O７／C６H8O７)０％〜約１５％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ，ＰＥＧ）１〜６％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；微小成分（たとえば、泡抑制剤、香料）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４２】
（３）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約５％〜約９％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約７％〜約１４％；脂肪酸としての石けん（たとえば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）約１〜約３％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約１０％〜約１７％；可溶性シリケート約３％〜約９％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約２３％〜約３３％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）０％〜約４％；ナトリウムパーボレート（たとえば、NaBO3・H2O)約８％〜約１６％；TAED約２％〜約８％；ホスホネート（たとえば、ＥＤＴＭＰＡ）０％〜約１％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ，ＰＥＧ）０〜３％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；微小成分（たとえば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４３】
（４）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約８％〜約１２％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約１０％〜約２５％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約１４％〜約２２％；可溶性シリケート、約１％〜約５％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約２５％〜約３５％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）０％〜約１０％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ，ＰＥＧ）１〜３％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、泡抑制剤、香料）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４４】
（５）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約１５％〜約２１％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、またはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約１２％〜約１８％；脂肪酸としての石けん（たとえば、オレイン酸）約３〜約１３％；アルケニルコハク酸（Ｃ１２〜１４）０％〜約１３％；アミノエタノール約８％〜約１８％；クエン酸約２％〜約８％；ホスホネート０％〜約３％；ポリマー（たとえば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０％〜約３％；ボレート（たとえば、B４O７）０％〜約２％；エタノール０％〜約３％；プロピレングリコール約８％〜約１４％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％を含む水性液体洗剤組成物。
【０２４５】
（６）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約１５％〜約２１％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、またはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）３〜９％；脂肪酸としての石けん（たとえば、オレイン酸）約３〜約１０％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約１４％〜約２２％；クエン酸カリウム約９％〜約１８％；ボレート（たとえば、B４O７）０％〜約２％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；ポリマー（たとえば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）０％〜約３％；固着ポリマー（たとえば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、モル比２５：１、ＭＷ３８００）０％〜約３％；グリセロール０％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％を含む水性構造性液体洗剤組成物。
【０２４６】
（７）脂肪族アルコールサルフェート約５％〜約１０％；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミン約３％〜約９％；脂肪酸としての石けん０〜３％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約５％〜約１０％；可溶性シリケート約１％〜約４％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約２０％〜約４０％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）約２％〜約８％；ナトリウムパーボレート（たとえば、NaBO3・H2O)約１２％〜約１８％；ＴＡＥＤ約２％〜約７％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、蛍光増白剤、泡抑制剤、香料）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４７】
（８）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約８％〜約１４％；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミン約５％〜約１１％；脂肪酸としての石けん０％〜約３％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約４％〜約１０％；可溶性シリケート約１％〜約４％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約３０％〜約５０％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）約３％〜約１１％；クエン酸ナトリウム（たとえば、Ｃ６Ｈ５Na３O７）約５％〜約１２％；ポリマー（たとえば、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、泡抑制剤、香料）０〜５％を含む顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４８】
（９）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約６％〜約１２％；非イオン界面活性剤約１％〜約４％；脂肪酸としての石けん約２％〜約６％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約１４％〜約２２％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約１８％〜約３２％；ナトリウムサルフェート（Na2SO4）約５％〜約２０％；クエン酸ナトリウム（たとえば、Ｃ６Ｈ５Na３O７）約３％〜約８％；ナトリウムパーボレート（たとえば、NaBO3・H2O)約４％〜約９％；漂白活性化剤（たとえば、ＮＯＢＳまたはＴＡＥＤ）約１％〜約５％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；ポリマー（たとえば、ポリカルボキシレートまたはＰＥＧ）約１％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、蛍光増白剤、香料）０〜５％を含む顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２４９】
（１０）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約１５％〜約２３％；アルコールエトキシサルフェート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、２〜３ＥＯ）約８％〜約１５％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約３％〜約９％；脂肪酸としての石けん（たとえば、ラウリン酸）０％〜約３％；アミノエタノール約１％〜約５％；クエン酸ナトリウム約５％〜約１０％；ヒドロトロープ（たとえば、トルエンスルホン酸ナトリウム）約２％〜約６％；ボレート（たとえば、B４O７）０％〜約２％；カルボキシメチルセルロース０％〜約１％；エタノール約１％〜約３％；プロピレングリコール約２％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％を含む水性液体洗剤組成物。
【０２５０】
（１１）直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（酸として計算）約２０％〜約３２％；アルコールエトキシレート（たとえば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）６〜１２％；アミノエタノール約２％〜約６％；クエン酸約８％〜約１４％；ボレート（たとえば、B４O７）約１％〜約３％；ポリマー（たとえば、マレイン／アクリル酸コポリマー、固着ポリマー、たとえばラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー）０％〜約３％；グリセロール約３％〜約８％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％を含む水性液体洗剤組成物。
【０２５１】
（１２）アニオン界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート、α−オレフィンスルフォネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホネート、石けん）約２５％〜約４０％；非イオン界面活性剤（たとえば、アルコールエトキシレート）約１％〜約１０％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約８％〜約２５％；可溶性シリケート約５％〜約１５％；ナトリウムサルフェート（たとえば、Na2SO4）０％〜約５％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約１５％〜約２８％；ナトリウムパーボレート（たとえば、NaBO3・H2O)０％〜約２０％；漂白活性化剤（TAEDまたはＮＯＢＳ）約０％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、香料、蛍光増白剤）０〜３％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２５２】
（１３）上記の組成物（１）〜（１２）に記載された洗剤組成物であって、全てまたは一部の直鎖アルキルベンゼンスルフォネートが（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキルサルフェートによって置き換えられている洗剤組成物。
【０２５３】
（１４）（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキルサルフェート約９％〜約１５％；アルコールエトキシレート約３％〜約６％；ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド約１％〜約５％；ゼオライト（たとえば、NaAlSiO4）約１０％〜約２０％；層状ジシリケート（たとえば、Ｈｏｅｃｈｓｔ社からのＳＫ５６）約１０％〜約２０％；ナトリウムカーボネート（たとえば、Na2CO３）約３％〜約１２％；可溶性シリケート０％〜約６％；クエン酸ナトリウム約４％〜約８％；ナトリウムパーカーボネート約１３％〜約２２％；TAED約３％〜約８％；ポリマー（たとえば、ポリカルボキシレートおよびＰＶＰ）０％〜約５％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、蛍光増白剤、光退色剤、香料、泡抑制剤）０〜５％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２５４】
（１５）（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキルサルフェート約４％〜約８％；アルコールエトキシレート約１１％〜約１５％；石けん約１％〜約４％；ゼオライトＭＡＰまたはゼオライトＡ約３５％〜約４５％；ナトリウムカーボネート（Na2CO３として）約２％〜約８％；可溶性シリケート０％〜約４％；ナトリウムパーカーボネート約１３％〜約２２％；TAED１〜８％；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約３％；ポリマー（たとえば、ポリカルボキシレートおよびＰＶＰ）０％〜約３％；酵素（純酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％；および微小成分（たとえば、蛍光増白剤、ホスホネート、香料）０〜３％を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として処方された洗剤組成物。
【０２５５】
（１６）上記の（１）〜（１５）に記載された洗剤組成物であって、安定化またはカプセル封入された過酸を、追加の成分としてか、あるいは上で特定された漂白系の代替物として含有する洗剤組成物。
【０２５６】
（１７）上記の（１）、（３）、（７）、（９）および（１２）に記載された洗剤組成物であって、パーボレートがパーカーボネートによって置き換えられた洗剤組成物。
【０２５７】
（１８）上記の（１）、（３）、（７）、（９）、（１２）、（１４）および（１５）に記載された洗剤組成物であって、さらにマンガン触媒を含有する洗剤組成物。
【０２５８】
（１９）液状非イオン界面活性剤、たとえば直鎖アルコキシル化１級アルコール、ビルダー系（たとえば、ホスフェート）、１または複数の酵素およびアルカリを含む非水性洗剤液体として処方された洗剤組成物。この洗剤はアニオン界面活性剤および／または漂白系を含んでいてもよい。
【０２５９】
ＡｍｙＥポリペプチド含有洗濯洗剤組成物は、汚れた布地の前処理に適した洗濯添加剤組成物およびリンス添加布地柔軟化組成物を含む、手洗いもしくは機械食器洗い作業用に処方されることができ、または一般家庭硬質表面洗浄作業用の洗剤組成物として処方されることができる。
【０２６０】
洗剤組成物は、２，６−β−Ｄ−フルカンヒドロラーゼ、１以上の追加のα−アミラーゼ酵素および１以上の他の洗浄酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼおよび／もしくはパーオキシダーゼならびに／またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。一般に、選択された１または複数の酵素の特性は、選択された洗剤と相容性（たとえば、ｐＨ最適値、他の酵素的および非酵素的成分との相容性等）でなければならず、また１または複数の酵素は有効な量で存在しなければならない。
【０２６１】
洗剤添加剤、すなわち分かれた添加剤または組み合わされた添加剤は、顆粒、液体、スラリー等として配合されることができる。好適な顆粒状洗剤添加剤配合物はダスティング防止顆粒を含む。
【０２６２】
洗剤組成物中に、ＡｍｙＥポリペプチドは洗い液１リットル当たり約０．０１〜約１００ｍｇの酵素タンパク質、特に洗い液１リットル当たり約０．０５〜約５．０ｍｇの酵素タンパク質、またはさらに洗い液１リットル当たり約０．１〜約１．０ｍｇの酵素タンパク質に相当する量で添加されることができると考えられる。
５．４．ＡｍｙＥポリペプチドと組み合わされて用いられる酵素
【０２６３】
上記のようにＡｍｙＥポリペプチド含有洗浄組成物は、１以上の追加の酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼおよび／もしくはパーオキシダーゼ、２，６−β−Ｄ−フルカンヒドロラーゼ、追加のα−アミラーゼ酵素、ならびにこれらの組み合わせを含むことができる。一般に、選択された１または複数の酵素の特性は、選択された洗剤と相容性（たとえば、ｐＨ最適値、他の酵素的および非酵素的成分との相容性等）でなければならず、また１または複数の酵素は有効な量で存在しなければならない。これらの酵素の多くは、洗浄組成物以外の組成物にＡｍｙＥポリペプチドと組み合わされて用いられることもできる。
【０２６４】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは動物、植物または微生物由来のものを含む。化学修飾されたまたはタンパク質操作された変異体も適している。このプロテアーゼはセリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、たとえばアルカリ性微生物プロテアーゼもしくはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、とりわけバチルス種、たとえばサブチリシンノボ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９（たとえば、米国特許第６，２８７，８４１号参照）、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（たとえば、国際公開第８９／０６２７９号参照）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（たとえば、豚のまたはウシ由来の）およびフサリウムプロテアーゼ（たとえば、国際公開第８９／０６２７０号および国際公開第９４／２５５８３号参照）である。有用なプロテアーゼの例は、以下のものに限定されることなく、国際公開第９２／１９７２９号および国際公開第９８／２０１１５号に記載された変異体を含む。好適な商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はALCALASE（商標）, SAVINASE（商標）, PRIMASE（商標）, DURALASE（商標）, ESPERASE（商標）,およびKANNASE（商標） (Novo Nordisk社); MAXATASE（商標）, MAXACAL（商標）, MAXAPEM（商標）, PROPERASE（商標）, PURAFECT（商標）, PURAFECT OXP（商標）, FN2（商標）,およびFN3（商標） (Danisco社)を含む。
【０２６５】
リパーゼ：好適なリパーゼは細菌または真菌由来のものを含む。化学修飾されたまたはタンパク質操作された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、以下のものに限定されることなく、フミコーラ（同義語サーモマイセス）由来のリパーゼ、たとえばフミコーララヌギノサ（サーモマイセスラヌギノサ）（たとえば、欧州特許第２５８０６８号および欧州特許第３０５２１６号参照）およびフミコーラインソレンス（たとえば、国際公開第９６／１３５８０号参照）；シュードモナスリパーゼ（たとえば、シュードモナスアルカリゲネスまたはシュードモナスシュードアルカリゲネス由来；たとえば、欧州特許第２１８２７２号参照）、シュードモナスセパシア（たとえば、欧州特許第３３１３７６号参照）、シュードモナステュツェリたとえば、英国特許第１，３７２，０３４号参照）、シュードモナスフルオレセンス、シュードモナス種株ＳＤ  ７０５（たとえば、国際公開第９５／０６２７０号および国際公開第９６／２７００２号参照）、シュードモナスウィスコンシネンシス（たとえば、国際公開第９６／１２０１２号参照）；バチルスリパーゼ（たとえば、バチルスサブティリス由来；たとえば、Dartoisら、Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)参照）、バチルスステアロサーモフィルス（たとえば、特開昭６４−７４４９９２号参照）またはバチルスプミルス（たとえば、国際公開第９１／１６４２２号参照）を含む。配合物に用いるために検討されたさらなるリパーゼ変異体は、たとえばWO 92/05249, WO94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, およびEP 260105に記載されたものを含む。いくつかの商業的に入手可能なリパーゼ酵素はＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）およびＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社）を含む。
【０２６６】
ポリエステラーゼ：好適なポリエステラーゼは以下のものに限定されることなく、国際公開第０１／３４８９９号（Ｄａｎｉｓｃｏ社）および国際公開第０１／１４６２９号（Ｄａｎｉｓｃｏ社）に記載されたものを含み、本明細書で検討された他の酵素とのいずれかの組み合わせ中に含められることができる。
【０２６７】
アミラーゼ：本発明の組成物は他のα−アミラーゼ、たとえば非変異体α−アミラーゼと組み合わされることができる。これらは、商業的に入手可能なアミラーゼ、たとえば以下のものに限定されることなく、DURAMYL（商標）, TERMAMYL（商標）, FUNGAMYL（商標）およびBAN（商標） (Novo Nordisk社), RAPIDASE（商標）および PURASTAR（商標） (Danisco社)を含む。
【０２６８】
セルラーゼ：セルラーゼは本発明の組成物に添加されることができる。好適なセルラーゼは細菌または真菌由来のものを含む。化学修飾されたまたはタンパク質操作された変異体が含まれる。好適なセルラーゼは、バチルス、シュードモナス、フミコーラ、フサリウム、シーラビア、アクレモニウムの属、たとえば米国特許4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; およびWO 89/09259に開示されたフミコーラインソレンス、マイセリオフソーラサーモフィラおよびフサリウムオキシポラムから産生された真菌セルラーゼ由来のセルラーゼを含む。使用を検討された典型的なセルラーゼは布地用の色の手入れの利点を有するものである。かかるセルラーゼの例は、たとえばEP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Danisco社), WO 96/34108 (Danisco社), WO 96/11262; WO 96/29397; およびWO 98/08940に記載されたセルラーゼである。他の例はセルラーゼ変異体、たとえばWO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531 315; 米国特許5,457,046; 5,686,593;および5,763,254.に記載されたものである。商業的に入手可能なセルラーゼはCELLUZYME（商標）およびCAREZYME（商標） (Novo Nordisk社); CLAZINASE（商標）およびPURADAX（商標） HA (Danisco社);およびKAC-500(B) （商標）(花王社)を含む。
【０２６９】
パーオキシダーゼ／オキシダーゼ：本発明の組成物への使用を検討された好適なパーオキシダーゼ／オキシダーゼは植物、細菌または真菌由来のものを含む。化学修飾されたまたはタンパク質操作された変異体が含まれる。有用なパーオキシダーゼの例は、WO 93/24618, WO 95/10602, およびWO 98/15257に記載されたコプリナス由来、たとえばコプリナスシネレウスおよびこれらの変異体由来のパーオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なパーオキシダーゼは、たとえばGUARDZYME（商標）(Novo Nordisk社) を含む。
５．５．ＡｍｙＥポリペプチドの洗浄性能を測定するアッセイ
【０２７０】
ＡｍｙＥポリペプチドの洗浄性能を測定する典型的なアッセイが以下におよび添付された実施例に記載される。ＡｍｙＥポリペプチドを含む洗浄組成物の効能を試験するために用いられることができる１の標準的なアッセイはスウォッチ試験を含む。様々な種類の素材上に既知の「強さ」の染みを有するスウォッチは商業的に入手可能であり（スイス国、St. Gallen, EMPA; 独国、Krefeld、 wfk- Testgewebe社;または蘭国、Vlaardingen,  Center for Test Materials）、および／または熟練家によってつくられることができる（MorrisおよびPrato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982)）。スウォッチは、たとえば血液／ミルク／インク（ＢＭＩ）、ホウレンソウ、草またはチョコレート／ミルク／すすによってつくられた染みを有する綿含有布地を含む。ＢＭＩ染みは、たとえば０．０００３％〜０．３％の過酸化水素とともに綿に固着されることができる。他の組み合わせは、０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドを固着された草またはホウレンソウ、０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドで固着されたゼラチンおよびクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染み、または０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドで固着されたチョコレート、ミルクおよびすすを含む。
【０２７１】
スウォッチは、ＡｍｙＥポリペプチドおよび／または洗剤配合物とともに温置される間撹拌されることができる。洗い性能データは、ウェル中の、特に９６ウェルプレート中のスウォッチの向き（水平対垂直）に依存する。このことは温置の期間の混合が不十分であることを示しているだろう。温置の間の十分な撹拌を確保する多数の方法があるけれども、アルミニウムの２枚のプレート間にマイクロタイタープレートが挟まれたものが入れられるプレートホルダーが作製されることができる。これは、ウェルの上全体に粘着プレートシーラーを被せ、次に２枚のアルミニウムプレートで９６ウェルプレートを任意のタイプの適当な市販のクランプを用いて締めることと同じように簡単であるといえる。これは次に市販の恒温器振とう機に取り付けられることができる。振とう機を約４００ｒｐｍに設定すると非常に有効な混合が得られ、その間、漏れや交差汚染がホルダーによって効果的に防止される。
【０２７２】
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）が、洗い液中のアミノ基の濃度を定量するために用いられることができる。これは、スウォッチから除かれたタンパク質の量の尺度の役割をすることができる（たとえば、CayotおよびTainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997)参照）。しかし、洗剤または酵素サンプルが（たとえば、サンプル中のペプチダーゼの存在により）異常に小さいペプチド断片の形成に至るならば、より大きいＴＮＢＳシグナル、すなわちより大きい「ノイズ」が得られるだろう。
【０２７３】
血液／ミルク／インクの洗い性能を測定する他の手段は、洗い液の吸光度を測定することによって定量されることができるインクの遊離に基いている。吸光度は３５０〜８００ｎｍの間の任意の波長、たとえば４１０ｎｍまたは６２０ｎｍで測定されることができる。洗い液は、草、ホウレンソウまたはクマシー染みを含む染みについての洗い性能を測定することによって試験されることもできる。これらの染みについての適当な吸光度は、ホウレンソウまたは草の場合６７０ｎｍ、ゼラチンまたはクマシーの場合６２０ｎｍである。たとえば、洗い液のアリコート（典型的には、たとえば９６ウェルプレートからの１００〜１５０μＬ）が取り出され、キュベットまたは多ウェルマイクロプレートに入れられる。これは次に分光光度計に入れられ、吸光度が適切な波長で読まれる。この系は、たとえば、適当な基質、たとえば布、プラスチックまたはセラミック上の血液／ミルク／インク染みを用いて食器洗いのための適当な酵素および／または洗剤組成物を決定するためにも用いられることができる。
【０２７４】
１の例では、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿スウォッチに２５℃で３０分間施与することによって、または０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿スウォッチに６０℃で３０分間施与することによってＢＭＩ染みが綿に固着される。約０．２５インチの比較的小さいスウォッチがＢＭＩ／綿スウォッチから切り取られ、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に入れられる。各ウェル中に洗剤組成物および酵素、たとえば変異体タンパク質の既知の混合物が入れられる。マイクロタイタープレートの上に粘着プレートシーラーを置いた後、マイクロタイタープレートはアルミニウムプレートでクランプ締めされ、公転振とう機上で約２５０ｒｐｍで約１０〜６０分間撹拌される。この時間の終了後に新しいマイクロタイタープレートのウェルに上清が移され、６２０ｎｍのインクの吸光度が測定される。これは、０．０１％のグルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿スウォッチまたは草／綿スウォッチに２５℃で３０分間施与することによって綿に固着されたホウレンソウ染みまたは草染みの試験についても同様であることができる。同じことがチョコレート、ミルクおよび／またはすす染みについて行われることができる。
５．６．布地サイズ剤除去組成物および方法
【０２７５】
同様に検討されたのは、１以上のＡｍｙＥポリペプチドを用いて織物を処理する（たとえば、布地をサイズ剤除去する）組成物および方法である。本発明のＡｍｙＥポリペプチドは、従来技術で知られた任意の織物処理方法に用いられることができる（たとえば、米国特許第６，０７７，３１６号参照）。たとえば、織物の感触および外観は、織物をＡｍｙＥポリペプチドと溶液中で、任意的に圧力下に接触させることを含む方法を用いて改善されることができる。
【０２７６】
ＡｍｙＥポリペプチドは布地を織る間もしくはその後に、またはサイズ剤除去工程もしくは１以上の付加的織物処理工程の間に施与されることができる。布地を織る間、より糸はかなりの機械的応力にさらされる。機械織機で織る前に、縦糸は、その引張強さを増加し破断を防ぐために、サイズ用デンプンまたはデンプン誘導体でしばしばコーティングされる。ＡｍｙＥポリペプチドは、これらのサイズ用デンプンまたはデンプン誘導体を除くために施与されることができる。布地が織られた後、織物はサイズ剤除去工程に進むことができる。１以上の付加的織物処理工程がこれに続くことができる。サイズ剤除去は布地からサイズ剤を除く作業である。織った後、均一かつ洗いに耐える結果物を確保するために、織物をさらに処理する前にサイズ剤コーティングは除かれなければならない。ＡｍｙＥポリペプチドはそこで、ＡｍｙＥポリペプチドの作用によるサイズ剤の酵素による加水分解を含む、織物をサイズ剤除去する方法に用いられることができる。
【０２７７】
ＡｍｙＥポリペプチドは、単独でまたは織物、たとえば綿含有織物をサイズ剤除去する他のサイズ剤除去化学剤および／またはサイズ剤除去酵素とともに用いられることができる。ＡｍｙＥポリペプチドはさらに、インジゴ染色されたデニムおよび衣類にストーンウォッシュ外観を形成する組成物および方法に用いられることができる。衣類の製造の場合、織物は切断され縫われて衣類または衣料にされ、その後仕上げられることができる。特に、デニムジーンズの製造については様々な酵素的仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは普通、酵素によるサイズ剤除去工程から始まり、その間に衣類はタンパク質分解酵素の作用に付されて織物に柔軟さが与えられかつ綿を後続の酵素的仕上げを受けやすいものにする。ＡｍｙＥポリペプチドは、デニム衣類の仕上げ（たとえば、「バイオストーンプロセス」）、酵素的サイズ剤除去および織物への柔軟さの付与の方法、ならびに／または仕上げプロセスに用いられることができる。
５．７．ベーキングおよび食品調製のための組成物および方法
【０２７８】
ＡｍｙＥポリペプチドは、ベーキングおよび食品調製のための組成物および方法に用いられることができる。ベーキングおよび食品調製のための粉（小麦粉）の商用および家庭使用では、小麦粉中のα−アミラーゼ活性の適切なレベルを維持することが重要である。高すぎる活性のレベルは、粘り気がありおよび／または生焼けで商品にならない生成物をもたらすことがある。逆に、不十分なα−アミラーゼ活性の小麦粉は、適当な酵母の働きに十分な糖を含有していないことがある。したがって、ＡｍｙＥポリペプチドは、単独でも他の１もしくは複数のα−アミラーゼと組み合わされても、小麦粉に添加されて小麦粉中の内因性α−アミラーゼ活性のレベルを増加することができる。本明細書に記載されたように、ＡｍｙＥポリペプチドは３０〜９０℃、５０〜８０℃、５５〜７５℃またはさらに６０〜７０℃の範囲の温度最適値を有し、これはＡｍｙＥポリペプチドをベーキングおよび食品調製用途に適切なものにする。様々なＡｍｙＥ変異体の温度最適値は、たとえばｐＨ５．５における可溶性デンプンの１％溶液で、または本明細書に記載されたもしくは従来技術で知られた他の方法を用いて測定されることができる。
【０２７９】
ベーキングへの穀粒および他の植物産品の使用に加えて、穀粒、たとえば大麦、オート麦および小麦、ならびに植物成分、たとえばトウモロコシ、ホップおよび米が商用および家庭用醸造の双方に用いられる。醸造に用いられる成分は麦芽になっていなくても、なっていても、すなわち部分的に発芽していてもよく、酵素、たとえばα−アミラーゼのレベルの増加をもたらす。醸造の成功のためには、α−アミラーゼ酵素活性の適当なレベルが、発酵のための糖の適切なレベルを確保するために必要である。ＡｍｙＥポリペプチドは、単独でも他の１もしくは複数のα−アミラーゼと組み合わされても、麦芽汁またはマッシュに添加されてデンプンの転化を改善することができる。本明細書の他所に記載されたように、ＡｍｙＥポリペプチドはグルコアミラーゼ活性を示し、追加のグルコアミラーゼの使用なしに、または他のα−アミラーゼを使用して要求される量に比較して低減された量のグルコアミラーゼを用いて、デンプン含有穀粒からグルコースが生成されることを可能にする。
【０２８０】
ＡｍｙＥポリペプチドはさらに、単独でまたは他のアミラーゼと組み合わされて、焼かれたパンの老化、すなわちボロボロ化を防ぎまたは遅らせるために添加されることができる。老化防止アミラーゼとして用いられるＡｍｙＥポリペプチドの量は、典型的には小麦粉１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの酵素タンパク質の範囲である。ＡｍｙＥポリペプチドと一緒に用いられることができる追加の老化防止アミラーゼは、エンドアミラーゼ、たとえばバチルス由来の細菌エンドアミラーゼを含む。追加のアミラーゼは、マルトース生成型α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、たとえばバチルス由来のものであることもできる。ＮＯＶＯＭＹＬ（商標）はバチルスステアロサーモフィラス株ＮＣＩＢ  １１８３７由来の好適なマルトース生成型α−アミラーゼであり、Christophersenら、(1997) Starch, 50:39-45に記載されている。老化防止エンドアミラーゼの他の例は、バチルスに由来する細菌α−アミラーゼ、たとえばバチルスリケニフォルミスまたはバチルスアミロリケファシエンスおよびエキソアミラーゼ、たとえばβ−アミラーゼ、たとえば植物由来のもの、たとえば大豆もしくは微生物源由来のもの、たとえばバチルスを含む。
【０２８１】
ＡｍｙＥポリペプチドを含むベーキング組成物は、さらにホスホリパーゼを含んでいてもよい。ホスホリパーゼは、リン脂質から脂肪酸を除くＡ１またはＡ２活性を有して、リゾリン脂質を生成することができる。ホスホリパーゼはリパーゼ活性、すなわちトリグリセリドへの活性を有していることも有していないこともある。これは典型的には３０〜９０℃、たとえば３０〜７０℃の範囲に温度最適値を有する。添加されるホスホリパーゼは動物由来のもの、たとえば膵臓由来、たとえばウシまたは豚の膵臓、ヘビ毒またはハチ毒由来のものであることができる。あるいは、ホスホリパーゼは微生物由来のもの、たとえば糸状菌、酵母または細菌、たとえば以下の属または種、すなわちアスペルギル、スアスペルギルスニガー；ディクチオステリウム、ディクチオスディスコイデウム；ムコール、ムコールジャバヌカス、ムコールムセド、ムコールサブティリシムス；ニューロスポーラ、ニューロスポーラクラッサ；リゾムコール、リゾムコールプシラス；リゾプス、リゾプスアーヒザス、リゾプスジャポニカス、リゾプスストロニファ；スクレロティニア、スクレロティニアリベルティアナ；トリコフィトン、トリコフィトンルブラム；ウェゼリニア、ウェゼリニアスクレロティオラム；バチルス、バチルスメガテリウム、バチルスサブティリス；シトロバクター、シトロバクターフレウンディ；エンテロバクター、エンテロバクターアエロギネス、エンテロバクタークロアキ；エドワードシエラ、エドワードシエラタルダ；エトウィニア、エトウィニアヘルビコーラ；エシェリキア、エシェリキアコリ；クレブシエラ、クレブシエラニューモニイ；プロテウス、プロテウスバルガリス；プロビデンシア、プロビデンシアスチュアーティ；サルモネラ、サルモネラティフィムリウム；セラティア、セラティアリケファシエンス、セラティアマルセセンス；シゲラ、シゲラフレクスネリ；ストレプトマイセス、ストレプトマイセスビオレセオルベル；イェルシニア、イェルシニアエンテロコリティカ；フサリウム、フサリウムオキシスポラム、たとえば株ＤＳＭ  ２６７２由来のものであることができる。
【０２８２】
ホスホリパーゼは焼いた後の初期の期間、特に最初の２４時間のパンの柔らかさを改善する量で添加されることができる。ホスホリパーゼの量は、典型的には小麦粉１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの酵素の範囲、たとえば０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。ホスホリパーゼ活性は一般に２０〜１，０００リパーゼ単位／小麦粉ｋｇの範囲であり、ここでリパーゼ単位は、アラビアゴムを乳化剤としトリブチリンを基質として３０℃、ｐＨ７．０において１分間当たり１μモルの酪酸を放出するのに要求される酵素の量と定義される。
【０２８３】
生地の組成は一般に、小麦全粒粉または小麦粉および／または他の種類の粗引き粉、粉またはデンプン、たとえばトウモロコシ粉、コーンスターチ、ライ粗引き粉、ライ粉、オート粉、オート粗引き粉、大豆粉、ソルガム粗引き粉、ソルガム粉、ジャガイモ粗引き粉またはジャガイモデンプンを含む。生地は作りたて、冷凍品または半焼き品であることができる。生地は、発酵された生地または発酵に付されるべき生地であることができる。生地は、様々な様式で、たとえば化学膨張剤、たとえば重炭酸ナトリウムを添加することによって、またはイースト、すなわち発酵生地を添加することによって発酵されることができる。生地は、適当な酵母培養液、たとえばサッカロマイセスセレビジエ（パン酵母）、たとえば商業的に入手可能な１のサッカロマイセスセレビジエ株を添加することによって発酵されることもできる。
【０２８４】
生地は、さらに他の慣用の生地成分、たとえばタンパク質、たとえばミルク粉、グルテンおよび大豆；卵（全卵、卵黄または卵白）；酸化剤、たとえばアスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカルボンアミド（ＡＤＡ）または過硫酸アンモニウム；アミノ酸、たとえばＬ−システイン；砂糖；または塩、たとえば塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸カルシウムを含むことができる。生地は、さらに脂肪、たとえばトリグリセリド、たとえば顆粒状脂肪またはショートニングおよび／または乳化剤、たとえばモノもしくはジグリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレートまたはレソレシチンを含むことができる。生地は乳化剤の添加なしにつくられることもできる。
【０２８５】
任意的に、追加の酵素は老化防止アミラーゼおよびホスホリパーゼと一緒に用いられることができる。追加の酵素は第二の（すなわち、付加的な）アミラーゼ、たとえばアミログルコシダーゼ、β−アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；ペプチダーゼ、特にエキソペプチダーゼ；トランスグルタミナーゼ；リパーゼ；セルラーゼ；ヘミセルラーゼ、特にペントサナーゼ、たとえばキシラナーゼ；プロテアーゼ；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、たとえば国際公開第９５／００６３６号に記載されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ；グルカノトランスフェラーゼ；分枝酵素（１，４−α−グルカン分枝酵素）；４−α−グルカノトランスフェラーゼ（デキストリングリコシルトランスフェラーゼ）；またはオキシドレダクターゼ、たとえばパーオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼまたは炭水化物オキシダーゼであることができる。追加の酵素は任意の由来のもの、たとえば哺乳類および植物由来のもの、また特に微生物（細菌、真菌の酵母）由来のものであることができ、従来技術で慣用の手法によって得られることができる。
【０２８６】
キシラナーゼは典型的には微生物由来のもの、たとえば細菌または真菌、たとえばアスペルギルスの株、特にアスペルギルスアクレアタス、アスペルギルスニガー（たとえば、国際公開第９１／１９７８２号）、アスペルギルスアワモリ（たとえば、国際公開第９１／１８９７７号）またはアスペルギルスチュビゲンシス（たとえば、国際公開第９１／０１７９３号）の株；トリコデルマの株、たとえばトリコデルマリーゼイ、またはフミコーラの株、たとえばフミコーラインシレンス（たとえば、国際公開第９２／１７５７３号）に由来する。ＰＥＮＴＯＰＡＮ（商標）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ３８４（商標）は、トリコデルマリーゼイから産生された商業的に入手可能なキシラナーゼ調製物である。アミログルコシダーゼはアスペルギルスニガーアミログルコシダーゼ（たとえば、ＡＭＧ（商標））であることができる。他の有用なアミラーゼ生成物はＧＲＩＮＤＡＭＹＬ（商標）Ａ１０００またはＡ５０００（デンマーク国、Ｇｒｉｎｓｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手可能）およびＡＭＹＬＡＳＥ（商標）ＨまたはＡＭＹＬＡＳＥ（商標）Ｐ（蘭国、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社から入手可能）を含む。グルコースオキシダーゼは真菌グルコースオキシダーゼ、特にアスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼ（たとえば、ＧＬＵＺＹＭＥ（商標））であることができる。典型的なプロテアーゼはＮｅｕｔｒａｓｅ（商標）である。典型的なリパーゼはサーモマイセス、リゾムコール、カンジダ、アスペルギルス、リゾプスまたはシュードモナスの株、特にサーモマイセスラヌギノサス（フミコーララヌギノサス）、リゾムコールミーヘイ、カンジダアンタークチカ、アスペルギルスニガー、リゾプスデレマールまたはリゾプスアルヒザスまたはシュードモナスセパシアに由来することができる。リパーゼは、たとえば国際公開第８８／０２７７５号に記載されたカンジダアンタークチカに由来するリパーゼＡまたはリパーゼＢであることができ、またはリパーゼは、たとえば欧州特許第２３８，０２３号に記載されたリゾムコールミーヘイもしくは欧州特許第３０５，２１６号に記載されたフミコーララヌギノサスもしくは、たとえば欧州特許第２１４，７６１号および国際公開第８９／０１０３２号に記載されたシュードモナスセパシアであることができる。
【０２８７】
ＡｍｙＥポリペプチド含有酵素調製物は、任意的に顆粒または凝集した粉体の形態をしていることができる。該調製物は、９５（重量）％超の粒子が２５〜５００μｍの範囲にある狭い粒子サイズ分布を有することができる。顆粒または凝集した粉体は、慣用の方法、たとえばＡｍｙＥポリペプチドを流動床造粒機中で担体にスプレーすることによって調製されることができる。担体は適当な粒子サイズを有する粒子状コアからなることができる。担体は可溶性または不溶性、たとえば塩（たとえば、ＮａＣｌまたは硫酸ナトリウム）、糖（たとえば、スクロースまたはラクトース）、糖アルコール（たとえば、ソルビトール）、デンプン、米、ひき割りトウモロコシまたは大豆であることができる。
【０２８８】
ＡｍｙＥポリペプチドを含む粒子は、食品級脂質を用いてカプセス封入されることもでき、この食品級脂質は水に不溶であるが非極性有機溶媒、たとえば炭化水素またはジエチルエーテルに可溶である任意の天然の有機化合物であることができる。適当な食品級脂質は以下のものに限定されることなく、飽和か、あるいは不飽和の、脂肪か、あるいは油の形態をしているトリグリセリドを含む。飽和トリグリセリドを構成する脂肪酸およびそれらの組み合わせの例は以下のものに限定されることなく、（乳脂肪由来の）酪酸、（動物および植物脂肪由来の）パルミチン酸および／または（動物および植物脂肪由来の）ステアリン酸を含む。不飽和トリグリセリドを構成する脂肪酸およびそれらの組み合わせの例は以下のものに限定されることなく、（動物および植物脂肪由来の）パルミトオレイン酸、（動物および植物脂肪由来の）オレイン酸、（植物油由来の）リノール酸および／または（アマニ油由来の）リノレン酸を含む。他の適当な食品級脂質は以下のものに限定されることなく、上記のトリグリセリドから誘導されたモノグリセリドおよびジグリセリド、リン脂質ならびに糖脂質を含む。
【０２８９】
食品級脂質、特に液体形態のものは、脂質物質がＡｍｙＥポリペプチド粒子の少なくとも大部分、たとえば１００％の表面の少なくとも一部を覆う（包み込む）ような様式で、粉末形態のＡｍｙＥポリペプチドと接触される。ＡｍｙＥポリペプチド粒子を包み込む利点は二重である。第一に、食品級脂質が、ベーキング工程の間に酵素が熱変性することから酵素を保護する。というのは、これらの酵素は熱に弱いからである。したがって、ＡｍｙＥポリペプチドはプルーフィングおよびパン焼き段階の間安定化され保護されながら、最終の焼かれた食品製品では保護コーティングから開放され、そこでＡｍｙＥポリペプチドはポリグルカン中のグルコシド結合を加水分解する。添加された送達媒体は、焼かれた食品中への活性酵素の持続的放出ももたらす。すなわち、パン焼き工程の後、活性ＡｍｙＥポリペプチドは、老化の速度に対抗する、したがって老化の速度を低減する速度で保護コーティングから連続的に放出される。
【０２９０】
一般に、ＡｍｙＥポリペプチド粒子に施与される脂質の量は、該脂質の性質、それが粒子に施与される様式、処理されるべき生地混合物の組成、およびかかわる生地混合作業の厳しさに応じて、α−アミラーゼの全重量の数パーセントからその重量の何倍までものさまざまであることができる。
【０２９１】
脂質に包み込まれた酵素は、焼かれる食品を調製するのに用いられる成分に、焼かれた食品の貯蔵寿命を伸ばすのに有効な量で添加される。製パン業者は、所望の老化防止効果を達成するのに要求される、上で検討されたように調製される包み込まれるα−アミラーゼの量を計算する。所要の包み込まれるα−アミラーゼの量は、包み込まれる酵素の濃度およびα−アミラーゼと指定された小麦粉との割合に基いて計算される。広い範囲の濃度が有効であると見出された。もっとも、既に検討されたように、観察できる老化防止の改善度はα−アミラーゼ濃度と直線的には対応しないで、ある最低レベルより上では、α−アミラーゼ濃度を大きく増加させてもほとんど追加の改善は生じない。特定のベーカリー生産における実際に用いられるα−アミラーゼ濃度は、製パン業者に自身による不注意な過少見積りの誤りに対するいくらかの保険を与えるために必要な最低値よりもはるかに高いことがあろう。酵素濃度の下限は、製パン業者が達成したい最低老化防止効果によって決定される。
【０２９２】
焼かれた食品を調製する方法は、（ａ）脂質で被覆されたＡｍｙＥポリペプチド粒子を調製する工程であって、該粒子の実質的に１００パーセントが被覆される工程、（ｂ）小麦粉を含有する生地を混合する工程、（ｃ）該混合が完了する前に、該脂質で被覆されたα−アミラーゼを該生地に添加し、そして該脂質コーティングが該α−アミラーゼから除かれる前に該混合を終了する工程、（ｄ）該生地を焼いて焼かれた食品をもたらす工程を含み、該α−アミラーゼは混合、プルーフィングおよびパン焼き工程の間不活性であり、そして焼かれた食品中で活性である。包み込まれたＡｍｙＥポリペプチドは、混合サイクルの間に、たとえば混合サイクルの終了近くに生地に添加されて生地全体に十分に分配されることを可能にすることができる。しかしながら、混合段階は、該粒子から保護コーティングが剥がされてしまう前に終了する。
【０２９３】
ある場合には、細菌α−アミラーゼ（ＢＡＡ）が脂質で被覆されたＡｍｙＥポリペプチドを含む粒子に添加されることができる。ＢＡＡはその過度の熱安定性および完全に焼かれたパン一塊中で保持される活性の故にパンを粘着性の塊に縮小する。しかしながら、ＢＡＡが脂質で被覆された粒子中に取り込まれると、非常に低いＢＡＡ施量レベルでさえも実質的な追加の老化防止保護が得られる。
【０２９４】
様々な修正および変更が本発明の組成物および方法に行われることができる。本明細書に引用された全ての参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって取り込まれる。
実施例
【０２９５】
以上の記載および以下の実施例では、以下の略号が適用される。ｗｔ％（重量パーセント）、℃（摂氏度）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過）、ｇまたはｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｌおよびμＬ（マイクロリットル）、ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、Ｕ（単位）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）（時）、ＤＯ（溶存酸素）、ｗ／ｖ（重量対体積）、ｗ／ｗ（重量対重量）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ＩＫＡ（米国、ノースカロライナ州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈａｓｅ  Ｐａｒｋｗａｙ  ＳＥ、２６３５、ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（米国、カリフォルニア州、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ社、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門）、Ｎｃｍ（ニュートンセンチメートル）およびＥＴＯＨ（エタノール）、ｅｑ（当量）、Ｎ（規定度）、ｄｓまたはＤＳ（乾燥固形分含有量）、ＳＡＰＵ（分光光度法酸プロテアーゼ単位、１ＳＡＰＵは、このアッセイの条件下にカゼイン基質から１分間当たり１マイクロモルのチロシンを放出するプロテアーゼ酵素活性の量である。）およびＧＡＵ（グルコアミラーゼ単位、これは、ｐＨ４．２および６０℃において可溶性デンプン基質から１時間当たりグルコースとして計算されて１ｇの還元糖を生成する酵素の量と定義される。）。
【実施例１】
【０２９６】
プラスミドの構築およびタンパク質の発現
以下の一般的方法がプラスミドの構築およびタンパク質の発現に用いられた。
１．１．プラスミドの構築
【０２９７】
配列番号１のＡｍｙＥまたはＣ末端切断ＡｍｙＥ変異体、すなわちＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）をコードする核酸が、米国特許第５，０２４，９４３号に記載されたバチルスサブティリスｐＨＰＬＴ発現ベクター中にクローン化された。図２はＡｍｙＥ−ｔｒをコードする核酸を含むベクターを示す。
【０２９８】
ｐＨＰＬＴベクターは、バチルスリケニフォルミス、ＬＡＴプロモーター（「Ｐｌａｔ」）、ＬＡＴシグナルペプチドをコードする配列（「ｐｒｅＬＡＴ」）、その後にクローニングのためのＰｓｔＩおよびＨｐａＩ制限部位を含んでいた。「ｏｒｉ−ｐＵＢ」はｐＵＢ１１０からの複製起点であり、「ｒｅｐｐＵＢ」はｐＵＢ１１０からの複製遺伝子であり、「ｎｅｏ」はｐＵＢ１１０からのネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子であり、「ｂｌｅｏ」はブレオマイシン耐性マーカーであり、「Ｔｌａｔ」はバチルスリケニフォルミスアミラーゼ由来の転写ターミネーターである。プラスミドｐＵＢ１１０のこれらおよび他の特徴はMcKenzieら、Plasmid 15(2): 93-103 (1986)に記載されている。
【０２９９】
ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ−ｔｒの発現のためのプラスミド構成体は、Yang ら、"Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis," Nucl. Acids Res. 11(2): 237-49 (1983)によって記載されたＡｍｙＥをコードする配列を用いて組み立てられた。プラスミドｐＭＥ６２９．５は配列番号１の完全長ＡｍｙＥをコードする核酸を有する。この遺伝子は、Yang らによって記載された配列と比較して、デンプン結合ドメインをコードする配列中に３の塩基の欠失を有する。
【０３００】
図２に示されたプラスミドｐＭＥ６３０．７は切断されたＡｍｙＥ配列（すなわち、ＡｍｙＥ−ｔｒ）を含んでいた。ＡｍｙＥ−ｔｒは配列番号１の位置Ｄ４２５で切断されている。ＡｍｙＥ−ｔｒは、Fujimotoら、 "Crystal structure of a catalytic- site mutant alpha-amylase from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose," J. Moｌ. Biol. 277: 393-407(1998)に記載されたようにデンプン結合ドメインを欠いているＡｍｙＥ変異体の結晶構造に基づいて設計された。The RCSB Protein Data Bank(C) Accession No. IBAG, "Alpha-Amylase From Bacillus Subtilis Complexed With Ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｅ”も参照せよ。
【０３０１】
プラスミドの構築のために、HERCULASE（商標） (米国、カリフォルニア州、La Jolla, Stratagene社)を用いてＡｍｙＥポリペプチドをコードする核酸はＰＣＲ増幅され、Qiagen QIAQUIK（商標） PCR精製キット(米国、カリフォルニア州、Valencia,  Qiagen社)中に提供されたカラムを用いて精製され、５０μＬのミリＱ（商標）精製水中に再懸濁された。５０μＬの精製ＤＮＡがＨｐａＩ（Ｒｏｃｈｅ社）およびＰｓｔＩ（Ｒｏｃｈｅ社）によって連続的に消化され、得られたＤＮＡ断片が３０μＬのミリＱ（商標）精製水中に再懸濁された。１０〜２０ｎｇ／μＬのＤＮＡがＨｐａＩおよびＰｓｔＩクローニング部位を用いてｐＨＰＬＴプラスミド中にクローン化された。リグニン混合物がコンピテントバチルスサブティリス細胞中に直接形質転換された（遺伝子型：ΔaprE, ΔnprE, degUHy32 oppA, ΔspoIIE3501, amyE：：xylRPxylAcomK-phleo）。これらのバチルスサブティリス細胞は、キシロース誘導プロモーターの制御下に置かれたコンピテンシー遺伝子（ｃｏｍK）を有していた。ＤＮＡの結合および吸収のためのコンピテンシーはキシロースの添加によって誘導される。親プラスミド中のＡｍｙＥ遺伝子は２のＰｓｔＩ部位を有するので、ＰＣＲ融合反応が実施されてクローニング前にこれらの部位は除かれた。２の別々のＰＣＲ反応の後にＰＣＲ融合が実施された。ＨｐａＩおよびＰｓｔＩ部位を用いるｐＨＰＬＴ構成体をつくるために以下のプライマーが用いられた。
配列番号１０：プライマーPSTAMYE-F’
5 '-CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC AGC ACTT-ACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC-3’
配列番号１1：プライマーAMYENOPST-R’
5'-CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG- GAACTCTGCTGATGTATTTGTG-3'
配列番号１2：プライマーAMYENOPST-F’
5'-CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA-TCCTTCAGGATAGTGCCTCC AG-3’
配列番号１3：プライマーHPAIAMYE-R’
5'-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGA-GAACCGCTTAAGCCCGAGTC-3’
配列番号１4：プライマーHPAIAMYE-R’
5'-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAA-AGC ACAGCTAC AG ACCTGG-3’
配列番号１5：プライマーAMYE SEQ-F’
5'-TACACAAGTACAGTCCTATCTG-3’
配列番号１6：プライマーAMYE SEQ-F’
5'-CATCCTCTGTCTCTATCAATAC-3’
【０３０２】
プラスミドｐＭＥ６２９．５およびｐＭＥ６３０．７は、３１残基シグナル配列を有するＡｍｙＥを発現し、この残基シグナル配列は翻訳後に切断される。後続の１０Ｎ末端アミノ酸は、Ｙａｎｇら（１９８３年）によって提案されたように別に処理される。ｐＭＥ６２９．５は「完全長」ＡｍｙＥをコードし、ｐＭＥ６３０．７は「切断された」ＡｍｙＥをコードする。
１．２．タンパク質の発現
【０３０３】
ＡｍｙＥ完全長ポリペプチドおよび切断されたＡｍｙＥポリペプチドをコードする構成体を抱く細菌形質転換体は、１０μｇ／ｍＬネオマイシン、１％可溶性デンプンを有するＬｕｒｉａ寒天（ＬＡ）上で選択され、そして３７℃で一晩温置された。コロニーのまわりに空所（またはハロー）を示す形質転換体がさらなる検討のために選択された。形質転換体のそれぞれの前培養物が１０μｇ／ｍＬネオマイシンを有するＬＢ中で８時間育成された。３０μＬの各前培養物が、１０μｇ／ｍＬネオマイシンおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を補強された３０ｍＬの培地（下記）を含む２５０ｍＬフラスコ中に加えられた。培地は、尿素を主要窒素源、グルコースを主要炭素源とし、頑健な細胞成長のための１％ソイトンを補強されたＭＯＰ緩衝液ベースの補強半合成培地であった。振とうフラスコは２５０ｒｐｍで混合されながら３７℃で６０〜６５時間温置された。円錐管中５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって培養物が収穫された。完全長ＡｍｙＥおよび切断されたＡｍｙＥタンパク質の両方が高レベルで発現したので、培養物上清がさらなる精製なしにその後のアッセイに用いられた。
【実施例２】
【０３０４】
共通アッセイ
以下のアッセイが以下に記載された実施例に用いられた。以下に示される手順からの偏差は個々の実施例に示される。これらの実験では、反応終了後の生成産物の吸光度を測定するために、分光光度計が用いられた。
２．１．アミラーゼ活性アッセイ
【０３０５】
アミラーゼ活性は分光光度分析によって測定された。標識Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒ（「ＲＢＢトウモロコシデンプン」、Ｓｉｇｍａ  Ｓ７７７６）を共有結合された不溶性トウモロコシデンプンが基質として用いられた。５０ｍＬ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５または５．６中の７５μＬの２％（ｗｔ  ｓｄ）ＲＢＢトウモロコシデンプンスラリーが１０μＬの１００μｇ／ｍＬ酵素に添加され、十分に混合された。この混合物は次に氷上に置かれ、卓上遠心分離機を用いて４，１００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって、基質が除かれた。生成物の量が、デンプンから分離された青色染料の量を測定することによって決定された。該染料の光学密度（ＯＤ）は５９５ｎｍで正副３通りに測定された。
２．２．粘度測定アッセイ
【０３０６】
粘度計が用いられてｐＨ４．５および５．８においてアミラーゼの存在下のトウモロコシデンプン基質の粘度が測定された。１バッチの３０ｄｓ％トウモロコシデンプンスラリーが新しくつくられ、硫酸を用いてｐＨが４．５か、あるいは５．８に下げられた。各反応について、５０ｇのスラリーが秤量され、１０分間７０℃まで温まれた。α−アミラーゼを添加すると、温度は７０℃から８５℃まで直ちに上がり、反応系は７５ｒｐｍで撹拌された。スラリーと酵素との混合物の温度が８５℃に達した後、粘度がさらに３０分間監視された。
２．３．熱安定性を測定するための示差走査熱量計法（ＤＳＣ）
【０３０７】
ＡｍｙＥまたはその変異体の過剰熱容量関数が、２ｍＭの塩化カルシウムの存在下また不存在下に超高感度走査高処理量マイクロ熱量計（ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ；ＭｉｃｒｏＣａｌ社、米国、マサチューセッツ州、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）を用いて測定された。約５００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのＡｍｙＥまたはその変異体が３０〜１２０℃の温度範囲にわたって走査された。切断されたゲオバチルスステアロサーモフィラスα−アミラーゼ（ＡｍｙＳ）が対照として用いられた。ＡｍｙＳのアミノ酸配列は、３４アミノ酸シグナル配列を含み、配列番号４に示される。同じサンプルが次にプロセスの可逆性を確認するために再走査された。用いられた緩衝液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５であった。２００℃／時の走査速度が、凝集から生じる何らかの人為的な影響を最小限にするために用いられた。ＤＳＣ曲線の熱的中点（Ｔｍ）が熱安定性の指標として用いられた。全てのＴｍ測定値の標準誤差は１％未満であった。
２．４．９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ
【０３０８】
サンプル上清中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄＱＵＩＣＫＳＴＡＲＴ（商標）染料試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて測定された。２８０ｒｐｍでの振とうおよび加湿通気をされながら３７℃で３日間マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で育成された培養物のブロスをろ過することによって、サンプルは得られた。１０μＬの培養物ろ液が、第２のＭＴＰのウェル中で２００μＬのＢｒａｄｆｏｒｄＱＵＩＣＫＳＴＡＲＴ（商標）染料試薬と一緒にされた。十分な混合後、このＭＴＰは室温で少なくとも１０分間温置された。気泡発生器が取り外され、ＯＤ（光学密度）が５９５ｎｍで測定された。タンパク質濃度を決定するために、（培養されなかったウェルからの）バックグラウンド読み取り値がサンプル読み取り値から差し引かれた。
２．５．ＨＰＬＣ測定によるグルコースの生成
マルトースおよびマルトヘプタオースの加水分解
【０３０９】
０．５％のマルトースまたはマルトヘプタオース溶液が５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５もしくは５．６中に、または５０ｍＭリンゴ酸ｐＨ５．６中に、各実験について指定されたように調製された。全ての酵素サンプルは当初１ｍｇ／ｍｌまで希釈された。適切な基質溶液を用いて酵素を希釈することによって反応混合物が調製されて、１ｐｐｍの最終酵素濃度が得られ、そして次に２００μＬのアリコートが無菌のねじぶた付き試験管に移され、３７℃の恒温器中に入れられた。指定された時間に１０ｍＭ水酸化ナトリウム中に１０倍に希釈することによって、反応は停止された。
不溶性デンプンの加水分解
【０３１０】
不溶性粒状デンプンの加水分解を測定するために、精製されたＡｍｙＥまたはその変異体（２４．５ｇ／Ｌ）がリンゴ酸緩衝液、ｐＨ５．６中２０．４ｐｐｍの最終濃度まで希釈された。このタンパク質は次にリンゴ酸緩衝液、ｐＨ５．６中に準備された５％トウモロコシ粉溶液に添加されて、１ｐｐｍの最終濃度とされ、この混合物が振とう機中３２℃で温置された。サンプルが定期的に取り出され、５０ｍＭのＮａＯＨ中に１０倍に希釈されて反応が停止された。
ＨＰＬＣ検出方法
【０３１１】
グルコースおよび他の基質分解生成物が、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰＡ−１カラムおよび電気化学検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ装置を用いてＨＰＬＣによって分析された。１０μＬのサンプルが注入され、ＮａＯＨおよび酢酸ナトリウムの傾斜物が２５℃で１．０ｍＬ／分で施与された。単糖類の分布が、既に測定された標準物から測定された。溶出曲線が４５分間にわたって得られた。糖についてのピーク面積を実際の糖濃度に換算するための認証されたグルコース参照標準（Ｓｉｇｍａ社、米国、ミズーリ州）を用いて、生成されたグルコースの（ｇ／Ｌとして報告される）定量が達成された。
２．６．マルトースおよびマルトヘプタオース基質を用いるグルコース生成
【０３１２】
マルトースまたはマルトヘプタオースからグルコースへの分解がＨＰＬＣによってアッセイされた。０．５％のマルトースおよびマルトヘプタオース溶液がｐＨ４．５およびｐＨ５．６の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中につくられた。全ての酵素サンプルが精製ストックから１ｍｇ／ｍＬまで希釈された。この１ｍｇ／ｍＬ酵素サンプルはマルトース溶液中にさらに希釈されて、１μＬ／ｍＬ酵素の最終濃度を与えた。２００μＬのアリコートが次に無菌のねじぶた付き試験管に移され、３７℃の恒温器中に入れられた。反応は２、５および８日後に水酸化ナトリウムの添加によって停止された。グルコースの生成およびマルトースの分解が、ＨＰＬＣによって実施例２．５に記載方法を用いて認証された標準物に対して分析された。
２．７．三重アッセイ
【０３１３】
標準全還元糖、グルコースおよびヨウ素アッセイが別々に実施されて、アミロペクチン消化の生成物が特性解析された。２．２（ｗ／ｗ）％トウモロコシアミロペクチン基質が５５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．８中に、この混合物を３０分間撹拌しながら沸騰することによって、調製され、次に室温まで冷却された。１００μＬの基質が９６ウェル中度結合性ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中に入れられ、ＡｍｙＥ変異体の希釈された培養物上清１０μｌがそれに添加された。プレートはシールされ（Ｎｕｎｃ社、カタログ番号２３６３６６）、ｉＭＥＳ振とう恒温器に直ちに入れられ、そして５０℃、１１５０ｒｐｍで１０分間温置された。アミラーゼ反応は、２０μｌの０．５ＮのＮａＯＨを混合しながら添加することによって停止された。
【０３１４】
存在する全還元糖が、８０μｌの０．５ＮのＮａＯＨとともに２０μｌの５ｗ／ｖ％４−ヒドロキシベンズヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社Ｈ９９８２、０．５ＮのＨＣｌ中に調製されたもの）と混合し、引き続いてフルスカートＰＣＲプレート中２０μｌのアミラーゼ反応（Ａｘｙｇｅｎ  ＰＣＲ−９６−ＦＳ−Ｃ）によって測定された。プレートはシールされ（ＭｉｃｒｏｓｅａｌＢ粘着シーラー、ＢｉｏＲａｄ  ＭＳＢ−１００１）、９５℃で２分間温置され、引き続いてＰＣＲ様式の熱サイクル加熱ブロック上で２５℃まで直ちに冷却された。８０μＬの反応サンプルがポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートに移され、光学密度がＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを用いて４４０ｎｍで測定された。
【０３１５】
アミラーゼ反応系に存在する全グルコースが、マイクロタイタープレート中で２０μｌ反応サンプルを、０．００５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８中の５０μｌの５．８ｍｇ／ｍｌの２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ社、Ａ１８８８）と混合し、引き続いてセイヨウワサビタイプVI由来の０．３３Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ８３７５）、３．３３Ｕ／ｍｌのＯｘｙＧｏ（グルコースオキシダーゼ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社）を含む同じ緩衝液中で調製された３０μｌの溶液を添加することによって測定された。マイクロタイタープレートはＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー中に直ちに入れられ５秒間振とうされ、そして光学密度が６０〜１８０秒の期間９０秒間隔で４０５ｎｍにおいて監視された。
【０３１６】
アミラーゼ反応のヨウ素分析が、アミラーゼ反応サンプルの１：４（水中）希釈物を１：２０で水中に希釈された８０μｌのＬｕｇｏｌｓ試薬（１００ｍｌ水中に溶解された５ｇヨウ素、１０ｇヨウ化カリウム）とポリスチレンマイクロタイタープレート中で混合することによって実施された。５８０ｎｍにおける光学密度がＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを用いて測定された。Ｍｉｃｒｏｓｉｆｔ  Ｅｘｃｅｌが用いられてＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（プレートリーダー）から得られたデータが集計された。
【０３１７】
ヨウ素の結果が全ＯＤ５８０として報告される。鎖長／残留アミロースは全ＯＤの関数であり、したがってアミロースは全ＯＤに反比例する。全還元糖が全ＯＤ４４０として報告され、これはＯＤに比例し、したがってアミロース活性はＯＤに直接比例する。全グルコースはグルコースアッセイにおける動的速度として報告され、これは直接比例する。グルコースから構築された標準曲線を用いて既知の数量に換算する代わりに、ＯＤおよび速度が報告される。これらの比は粗データを用いて報告され、したがって無単位である。ヨウ素の比を全還元糖とグルコースとの比で割ったものとして、これらの３の種類のデータがグラフ上で合体される。
２．８  粘度低下速度測定のための高処理量粘度測定アッセイ
【０３１８】
高処理量粘度測定アッセイが、商業的に入手可能な分子ローターＣＣＶＬ（９−（２−カルボキシ−２−シアノビニル）ジュロリジン）を用いて開発された。分子ローターは、その量子収率（放射された光子の数を吸収された光子の数で割ったもの）がミクロ環境の自由体積に依存する蛍光化学種であり、該量子収率は次なる順番として粘度に関係する。かかる分子の場合、分子内回転が励起状態からの緩和の好まれるモードである。分子内回転はミクロ環境の粘度に比例するような形で禁止され、エネルギーの残余は放射緩和（蛍光発光）によって消散される。
【０３１９】
酵素活動による粘度の低下速度を測定するために、分子ローターＣＣＶＬがトウモロコシアミロペクチンの緩衝化懸濁物中に以下のように取り込まれた。５ｍｇの凍結乾燥されたＣＣＶＬ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）を含有するバイアルに１８６μｌのジメチルスルフォキシドを添加することによってＣＣＶＬの１００ｍＭストック溶液が調製された。このＣＣＶＬストック溶液は室温で暗所に貯蔵され、使用前に沈降物の有無が確認された。トウモロコシ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国、オハイオ州、Ｓｏｌｏｎ）からの９０ｇのアミロペクチンが２，８５０ｍＬの蒸留水に添加された。これは持続的に撹拌されながら沸騰まで加熱され、この条件下にアミロペクチンは徐々にゼラチン化され溶解した。得られた、ゲル化アミロペクチンの一様に粘性の懸濁物は熱源から離され、室温に戻りながら連続的に撹拌され、その時点で１５０ｍＬの（１Ｍの酢酸ナトリウムを１Ｍ酢酸で滴定することによって予め調製された）１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．８が添加され、引き続いて１５０μｌのＴｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）が添加された。Ｔｗｅｅｎ−８０が完全に溶解されると、１５０μｌの１００ｍＭ  ＣＣＶＪストック溶液が添加され溶解され、その時点でアミロペクチン／ＣＣＶＪ試薬は完成し使える状態になる。粘度測定スクリーニングを完了するためにかかる３日間、この試薬は持続的に撹拌されながら室温で透明ガラスに貯蔵された。
【０３２０】
該アッセイのために、全ての液体取扱い作業は、９６ウェルマイクロタイタープレートの全ての９６ウェルからの同時ピペット採取を可能にする多重チャンネルヘッドを備えたＢｉｏｍｅｋＦＸＰロボットによって遂行された。６０μｌのアミロペクチン／ＣＣＶＪ試薬が、ブラック非処理ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、ニューヨーク州、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに添加された。３０μｌの酵素サンプルがこの上にピペットで添加され、このマイクロタイタープレートはＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２ｅ蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国、カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で直ちに読み取られた。この蛍光光度計は以下のように設定された。すなわち、トップリード（ｔｏｐ−ｒｅａｄ）蛍光モード；励起波長４３５ナノメートル（ｎｍ）；放射波長４９５ｎｍ；カットオフ波長４５５ｎｍ；２４秒間リード間隔の動的リードモード；最初のリード前１５秒間振とう、リード間の３秒間振とう；（集められた９データ点の最初のものを各動的速度計算から排除する）２０秒間ラグ期間を有する１９２秒間の全リード時間。
【０３２１】
このアッセイでは、蛍光シグナルの降下速度の観点から粘度低下速度が測定された。蛍光シグナル降下の動的速度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ計器とパッケージで来たソフトウェアであるＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏによって「Ｖｍａｘ（毎分ミリ単位）」として自動的に計算された。
２．９  液化後粘度測定のための高処理量粘度測定アッセイ
【０３２２】
酵素活動による液化後の粘度の低下を測定するために、分子ローターＣＣＶＬがトウモロコシ粉の緩衝化スラリー中に以下のように取り込まれた。５ｍｇの凍結乾燥されたＣＣＶＬ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）を含有するバイアルに１８６μｌのジメチルスルフォキシドを添加することによってＣＣＶＬの１００ｍＭストック溶液が調製された。このＣＣＶＬストック溶液は室温で暗所に貯蔵され、使用前に沈降物の有無が確認された。有機トウモロコシ粉（Ａｚｕｒｅ農園、米国、オレゴン州、Ｄｕｆｕｒ）が６００マイクロメートルシーブを通され、それから９５℃で１６時間焼かれ、室温に戻された。１５２０ｇの蒸留水、（１Ｍの酢酸ナトリウムを１Ｍ酢酸で滴定することによって予め調製された）８０ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６、８０μｌのＴｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、セントルイス）、８０μｌの１００ｍＭ  ＣＣＶＪストック溶液および４００ｇの篩分された有機トウモロコシ粉を一緒にすることによって、２０（重量／重量）％、ｐＨ５．８のトウモロコシ粉スラリーが２ｋｇバッチで調製された。このスラリーは磁気撹拌棒を用いて半時間激しく連続的に撹拌され、その時点でｐＨが調べられ５．８であることが確認された。このスラリーはトウモロコシ粉を均一に分散された状態に保つために激しく連続的に撹拌され、その間に９０μｌのスラリーがブラック非処理ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、ニューヨーク州、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルにノギス（ミツトヨ社、日本国、広島県、呉）によって測定された約２．３ミリメートルの内径まで削られた２００μｌの先端を有する多重チャンネルピペットを用いて添加された。各マイクロタイタープレートウェルについて、１０μｌの酵素サンプルがピペットでトウモロコシ粉スラリーの上部に添加され、その後プレートは粘着シーラー（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）でシールされ、８０℃に設定された高温オーブン中で前平衡化金属プレート間にきつく挟まれた。プレートは１時間温置され、その後取り出されて室温にされ、そして室温に一晩放置された。翌日プレートシーラーが剥がされ、プレートはＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２ｅ蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国、カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で読み取られた。この蛍光光度計は以下のように設定された。すなわち、トップリード蛍光モード；励起波長４３５ナノメートル（ｎｍ）；放射波長４９５ｎｍ；カットオフ波長４５５ｎｍ。このアッセイでは、蛍光スグナルの減少はゼラチン化トウモロコシ粉の密度の減少に対応し、これは次なる順番として酵素活動による液化の増加に対応する。
【実施例３】
【０３２３】
比活性およびｐＨ最適値
完全長ＡｍｙＥ（配列番号１）、ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）およびこれらの変異体の比活性およびｐＨ最適値が、実施例２．１に記載されたアッセイを用いて測定された。比活性は、５０℃ならびにｐＨ４．５、５．０および５．６で３０分間にわたってＲＢＢトウモロコシデンプン基質から放出された染料の量を分光光度法で測定することによって決定された。図３は、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙ３１ＡがｐＨ５および５．６と比較してｐＨ４．５においてもっとも高い比活性を有することを示す。ＡｍｙＥは、ｐＨ５においてｐＨ５．６におけるよりも高い比活性を示す。
【実施例４】
【０３２４】
トウモロコシデンプン基質の粘度の低下
トウモロコシデンプン基質の粘度を低減するＡｍｙＥ、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびこれらの変異体の能力は、実施例２．２に記載されたアッセイ方法を用いて測定された。粘度は、各酵素についてｐＨ４．５および５．８において時間の関数として測定された。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙＥがｐＨ４．５および５．８の双方において基質の粘度を低減することを示す。より低い最終粘度はｐＨ５．８で観察されたけれども、ピーク粘度は同じであった。図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ、Ａｍｙ３１ＡがｐＨ４．５およびｐＨ５．８で、よりよい性能を有することを示す。
【実施例５】
【０３２５】
熱安定性
ＡｍｙＥ、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびこれらの変異体の熱安定性が、実施例２．３に記載された示差走査熱量計法（ＤＳＣ）を用いてＣａ２＋の存在および不存在下に測定されて、Ｃａ２＋が酵素の安定性に寄与しているか否かが決定された。ＤＳＣは熱的高次構造破壊過程が不可逆であることを明らかにした。図５Ａは、２ｍＭのＣａ２＋ありおよびなしでのＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ−ｔｒについてのＤＳＣ高次構造破壊曲線を示す。図５Ｂは、完全長Ａｍｙ３１Ａ変異体についてのＤＳＣ高次構造破壊曲線を示す。カルシウムが熱融点に何らの効果も有しないことは、ＡｍｙＥ、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙ３１ＡのいずれもＣａ２＋を結合せず、ｍＭ濃度領域においてＣａ２＋によって安定化されないことを示唆する。図５Ｃに示されたように、ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ（ＡｍｙＳ）について対照的な結果が得られた。表１は試験された酵素の融点をまとめている。Ｃａ２＋の添加はＡｍｙＥ、ＡｍｙＥ−ｔｒまたはＡｍｙ３１Ａの熱安定性を有意に変化させないが、他方、Ｃａ２＋はＡｍｙＳの熱安定性を有意に増加した。
【表２】
2011522546.tif 000004
【実施例６】
【０３２６】
マルトースおよびマルトヘプタオースからグルコースへの転化
ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）およびＡｍｙＥ−ｔｒの位置Ｑ１５３（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、ＮおよびＶ）の６のＡｍｙＥ変異体がマルトースおよびマルトヘプタオース基質をｐＨ５．６においてグルコースに転化する能力が、実施例２．３に記載されたグルコース生成アッセイを用いて試験された。生成されたグルコースは１，２および３日後に測定された。ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙＥ変異体は１ｐｐｍで用いられた。切断されたＡｍｙＳ（配列番号４）が同様な施量で比較のために用いられた。
【０３２７】
図６はマルトース基質からのグルコース生成の結果を示す。ＡｍｙＳによるグルコース生成は最小であり、他方、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＱ１５３位置変異体は有意の量のグルコースを生成した。変異体Ｑ１５３Ｎはこれらの条件下でのグルコースの最良の生産者であった。これらの結果は、ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥの変異体がマルトースからグルコースを効率的に生成することを裏付ける。
【０３２８】
図７はマルトヘプタオース基質からグルコースの生成の結果を示す。マルトースを基質とした場合と同じように、ＡｍｙＳはマルトヘプタオースを不十分な効率でグルコースに転化した。対照的に、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＱ１５３位置変異体はマルトヘプタオースを非常に有効にグルコースに転化し、Ｑ１５３ＫおよびＦ変異体は３日後までに最大の転化率を示した。この実施例は、ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥの変異体が複合オリゴ糖からグルコースを効率的に生成することを実証している。
【実施例７】
【０３２９】
マルトヘプタオースからグルコースへの転化
ＡｍｙＥ−ｔｒ（配列番号２）、ＡｍｙＳおよびＡｍｙＥ変異体Ｑ１５３Ｋがマルトヘプタオース（ＤＰ７）をグルコース（ＤＰ１）に転化する能力が試験された。この反応の産物が実施例２．２に記載されたＨＰＬＣ方法を用いて分析された。代表的な溶出プロファイルが図８〜１０に示される。
【０３３０】
図８は、７２時間の温置後にＡｍｙＥ−ｔｒがＤＰ７を主にＤＰ１に転化することおよびマルトース（ＤＰ２）の残留量を示す。対照的に、図９は、ＡｍｙＳがＤＰ７をこれよりも小さいオリゴ糖に時間をかけて転化し、ＤＰ５、ＤＰ４、ＤＰ３、ＤＰ２およびＤＰ１のオリゴ糖の混合物を生成することを示す。図１０は、ＡｍｙＥ変異体Ｑ１５３Ｋの存在下におけるＤＰ７からこれよりも小さいオリゴ糖への転化の経時変化を示す。有意のレベルのＤＰ１、ＤＰ２およびＤＰ３が１時間という短さで検出された。３時間までにＱ１５３Ｋ変異体はＤＰ７を主にＤＰ１に転化する。これらの結果は、ＡｍｙＥおよびその変異体がＤＰ７基質からグルコース（ＤＰ１）を効率的に生成することを示す。
【実施例８】
【０３３１】
位置変異体の生成および発現
この実施例は位置変異体のライブラリーの構築および発現に関する。
８．１  位置ライブラリーの構築
【０３３２】
プラスミドｐＭＥ６３０．７（図２、実施例１）が、ＡｍｙＥ−ｔｒの１５０の異なるアミノ酸残基における位置ライブラリーを構築するために用いられた。表１は位置ライブラリーがつくられた各残基を列挙する。残基は配列番号２中のそれらの位置を基準に数えられる。各位置に挙げられたアミノ酸は配列番号２のＡｍｙＥ（すなわち、野生型残基）中に現れる残基である。
【表３】
2011522546.tif 000005
【０３３３】
表１に挙げられた１５０の残基のそれぞれについての位置ライブラリーは、約１６のアミノ酸置換変異体を含んでいた。このライブラリーは、上記の１５０の位置におけるＡｍｙＥ変異体配列をコードする発現プラスミドを含む形質転換されたバチルスサブティリス細胞からなっていた。各変異体は、タンパク質の活性評価の前にＤＮＡ配列分析によって確認された。個々のクローンが下記のように培養されて、機能的特性解析のための様々なＡｍｙＥ変異体が得られた。
８．２．タンパク質の発現
【０３３４】
ＡｍｙＥ置換変異体を含むバチルスサブティリス形質転換体が、１０μｇ／ｍｌネオマイシンを含むＬＢ（リリア培地）中８時間、９６ウェルプレート中で培養され、３０μｌのこの前培養物が、２５ｐｐｍクロラムフェニコールおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を補強された３０ｍＬの培養媒体（下記）を含む２５０ｍＬフラスコに加えられた。このフラスコは２５０ｒｐｍで継続的に回転混合されながら３７℃で６０〜６５時間温置された。培養物が、円錐管中２０分間５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって収穫された。培養物上清がアッセイに用いられた。上記の培養媒体は尿素を主要窒素源、グルコースを主要炭素源とし、頑健な細胞成長のための１％ソイトンを補強されたＭＯＰ緩衝液ベースの補強半合成培地であった。
【実施例９】
【０３３５】
比活性および熱安定性を測定するためのデンプン加水分解アッセイ
アミラーゼ位置変異体は、比活性および熱安定性を測定するためのデンプン加水分解アッセイを用いて評価された。ＡｍｙＥ変異体はまた、染み除去性能を測定するための洗浄スウォッチアッセイを用いても分析された。ＡｍｙＥ変異体のｐＨ安定性は、マルトヘプタオース基質へのアミラーゼ活性を測定することによって評価された。ＡｍｙＥ変異体のそれぞれの熱安定性は、熱応力の前後のマルトヘプタオース基質へのアミラーゼ活性を測定することによって決定された。
９．１．比活性および熱安定性の測定
【０３３６】
デンプン加水分解アッセイが、ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ変異体の比活性および安定性を測定するために用いられた。洗浄および穀粒処理における現実界の適用を厳密に真似る条件が用いられた。活性は、トウモロコシ粉の酵素的分解によって生成された還元末端と定義される。還元末端は、下記のＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイを用いて測定された。安定性は、８０℃における持続された活性と定義される。
【０３３７】
ハードウェア：ＰＣＲプレートアダプターを備えたＩｎｈｅｃｏ  Ｖａｒｉｏｍａｇ  Ｔｅｌｅｓｈａｋｅ  ９５加熱振とう機（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社、米国、ネバダ州、Ｒｅｎｏ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分注機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）：ｉＥＭＳ恒温器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）；Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ撹拌ディスク分注機（モデルＶＰ７２２Ｂ）；Ａｘｙｇｅｎ  ＰＣＲ−９６−ＦＳ−ＣフルスカートＰＣＲプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、カリフォルニア州、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ）；Ｔｅｔｒａｄ熱サイクル機（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）、Ｂｉｏｍｅｋ（商標）ＦＸ液体取扱い機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国、マサチューセッツ州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）。
【０３３８】
デンプン加水分解：Ａｚｕｒｅ  Ｆａｒｍｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｒｎ  Ｆｌｏｕｒ（米国、カリフォルニア州、Ｎｏｒｃｏ）が篩分されて＜６００ミクロン画分が得られ、８０℃で４時間焼かれ、それから室温で一晩放置平衡化された。調製された乾燥トウモロコシ粉が、粉体フリップ分注機としてＶＰ７２２Ｂ装置を用いてＡｘｙｇｅｎ  ＰＣＲプレート中に供給された。各ウェルに供給された粉の質量は約５ｍｇであると測定された。１００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．６（最終懸濁液ｐＨとして約５．８）が各ウェルに加えられ混合された。ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ変異体の培養物上清が希釈緩衝液（水＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０）中に約２０μｇ／ｍｌに希釈された。１０μＬの希釈上清が８分間および３０分間反応プレートに移されサンプルを一度ピペットで上げ下げすることによって混合された。５０μＬの軽質鉱油のアリコートが各ウェルに入れられた。プレートは８０℃に予熱されたＩｎｈｅｃｏ装置に移された。温置後のいくつかの時点でデンプン加水分解反応が、各ウェルに１０μＬの４ＮのＮａＯＨを添加することによって停止された。デンプン加水分解反応生成物はＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析された。
【０３３９】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：８０μＬの０．５ＮのＮａＯＨのアリコートが空のＰＣＲプレート（「ＰＡＨＢＡＨ反応プレート」）の全てのウェルに加えられ、引き続いて２０μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬（０．５ＮのＨＣｌ中に溶解された５ｗ／ｖ％ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ９８８２、米国、ミズーリ州、セントルイス））が加えられた。この溶液はピペットで上げ下げすることによって混合された。１０μＬのデンプン加水分解反応上清がＰＡＨＢＡＨ反応プレートの各ウェルに加えられた。このプレートはシールされ、９５℃で２分間にプログラムされた熱サイクル機に入れられ、それから２０℃に冷却された。進展したＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルが新しいプレートに移され、分光光度計にて４０５ｎｍで吸光度が測定された。
９．２．染み除去性能の測定
【０３４０】
ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ変異体の染み除去性能が、ＣＳ−２８米デンプン染みマイクロスウォッチを用いて測定された。円直径１／４インチ（６．４ｍｍ）のマイクロスウォッチが試験材料センター（ＣＦＴ）（蘭国、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ）から得られた。２のマイクロスウォッチが９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れられた。
【０３４１】
ろ過された培養ブロスサンプルが、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０の混合物で性能試験の所望最終濃度の２０倍まで希釈することによって、適切な濃度で試験された。酵素の最終濃度は約０．０２５〜０．１０ｐｐｍであった。アミラーゼ性能はｐＨ８およびｐＨ１０の両方で測定された。
【０３４２】
１９０μｌの、（Ａ）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ｈ７５２３）、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する緩衝液、ｐＨ８．０か、あるいは（Ｂ）２５ｍＭのＣＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ２６３２）、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する緩衝液、ｐＨ１０．０が、マイクロスウォッチを含む各ウェルに加えられた。１０μｌの希釈アミラーゼサンプルが各ウェルに加えられて、２００μｌ／ウェルの全量とされた。プレートはプレートシールで覆われ、１，１５０ｒｐｍで撹拌されながら４０℃で６０分間ｉＥＭＳ恒温器に入れられた。適当な条件下の温置後、各ウェルから１００μｌの溶液が取り出され新しいマイクロタイタープレートに入れられ、そして分光光度計にて４８８ｎｍで吸光度が測定された。１ウェルにつき２のマイクロスウォッチおよび洗剤を含有するがアミラーゼを含有しない「ブランク対照」も、試験に含められた。
【０３４３】
ＣＳ−２８米デンプン加水分解性能の計算：得られた吸光度値はブランク対照値で補正された。得られた吸光度「ΔＯＤ４８８」がアミラーゼ活性の尺度とされた。各ＡｍｙＥまたはＡｍｙＥ変異体について、変異体の活性を野生型酵素の活性で割ることによって、性能指数が計算された。性能指数は、かくして同じタンパク質濃度における変異体（実測値）と標準ＡｍｙＥ参照酵素（理論値）との性能の比較を表す。さらに、この理論値は標準ＡｍｙＥ酵素のラングミュアの式のパラメータを用いて計算された。
【０３４４】
野生型酵素に対して性能の差を有する変異体は性能指数（ＰＩ）によって特徴付けられる。１超のＰＩ（ＰＩ＞１）は標準、たとえば野生型に比較してより良好な変異体を特定し、他方、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は標準と同じ性能を示す変異体を特定する。１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は標準よりも悪い性能を示す変異体を特定する。
９．３．ｐＨ安定性の測定
【０３４５】
基質としてマルトヘプタオースを用いたアミラーゼ活性アッセイが、ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ変異体のｐＨ安定性を測定するために用いられた。酵素共役比色動的アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）を用いてｐＨ５．８およびｐＨ４におけるグルコースの生産を監視することによって、アルファアミラーゼ活性が測定された。酵素反応は、平底ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートにて室温で実施された。ｐＨ５．８で実施されたアッセイの場合、水中０．００５（ｗ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ−２０中に５倍に希釈された５μｌのＡｍｙＥまたはＡｍｙＥ変異体の培養物上清が、酢酸ナトリウムｐＨ５．８、ＣａＣｌ２、Ｔｗｅｅｎ−２０、セイヨウワサビパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号８３７５）およびグルコースオキシダーゼ（ＯＸＹＧＯ（商標）；Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ社、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門）を含有する４５μｌ緩衝液と混合された。最終５０μｌの量は、各成分の５０ｍＭ、２．６ｍＭ、０．００５（ｗ／ｖ）％、２０Ｕ／ｍｌおよび５０Ｕ／ｍｌをそれぞれ含有していた。５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．８、５．４ｍｇ／ｍｌの２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａ１８８８）および１０ｍＭマルトヘプタオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｍ７７５３）を含有する５０μｌの緩衝液の添加によって、反応は開始され、引き続いて５秒間混合された。反応系の発色は、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国、カリフォルニア州、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ）を用いて２４０秒の間９秒間隔で４０５ｎｍにおいて監視された。酵素活性は、監視期間の１２０〜２４０秒間の発色速度として報告された。ｐＨ４．０で実施されたアッセイの場合、ｐＨ４．０の緩衝液、および３０μｌのパーオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ含有緩衝液で希釈された２０μｌのＡｍｙＥまたはＡｍｙＥ変異体サンプルを用いた以外は上記の方法が、成分の濃度を適切に調整して正確に繰り返された。
９．４．熱安定性の測定
【０３４６】
ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ変異体の熱安定性は、酵素共役比色動的アッセイを用いてグルコースの生産を監視して、ｐＨ５．８におけるマルトヘプタオース基質へのアミラーゼ活性を測定することによって決定された。ここで用いられたアッセイ方法は、マルトヘプタオース基質を用いる上記のものと同じであった。ＡｍｙＥまたはＡｍｙＥ変異体の希釈培養物上清の２０μｌサンプルが用いられ、反応の６０〜１８０秒の間発色が監視された。さらに、希釈培養物の８０μｌサンプルが次に新しいプレートに移されプレートシーラーをかけられ、そしてｉＥＭＳ装置（（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ））上で６５０ｒｐｍで振とうされながら６０℃で３０分間温置された。プレートは氷上で４分間冷却され、それから２０μｌのサンプルが上記のようにマルトヘプタオース基質への活性についてアッセイをされた。前のアッセイと同じように各ＡｍｙＥまたはＡｍｙＥ変異体について、変異体の活性を野生型酵素の活性で割ることによって性能指数が計算された。性能指数は、同じタンパク質濃度における変異体（実測値）と標準ＡｍｙＥ参照酵素（理論値）との性能を比較する。
【実施例１０】
【０３４７】
ＡｍｙＥ位置変異体の相対性能
実施例９における手順を用いて、ＡｍｙＥ−ｔｒの相対性能または活性が、実施例６に記載されたように生成されたＡｍｙＥ変異体と比較された。６以上の構成員を有する全部で１４０の位置変異体が評価された。
【０３４８】
定義：以下の定義が適用される。
アップ突然変異体：ＰＩ＞１
中性突然変異体：ＰＩ＞０．５
非有害突然変異体：ＰＩ＞０．０５
有害突然変異体：ＰＩ≦０．０５
完全制限位置：タンパク質および活性について中性突然変異体なし
非完全制限位置：試験された特性のうちの１について少なくとも１の中性突然変異体
非制限位置：少なくとも１の特性について≧２０％の中性突然変異体
【０３４９】
表２は、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙＥ変異体の部位評価選抜の結果をまとめている。表２において、列１は調べられたアミノ酸の位置を示す。列２は野生型酵素においてその位置にあるアミノ酸を示す。列３は、この検討において調べられたその位置にある変異体の数を示す。これに続く列は、変異体の数、続いて、実施された各アッセイによって特定された中性突然変異体のパーセント（％）を与える。試験された特性は以下のとおりである。すなわち、列４および５（トウモロコシ粉ｄｄＧ）、トウモロコシ粉基質上での比活性；列６および７（ＤＰ３ｄｄＧ）、ｐＨ５．８におけるマルトトリオース加水分解；列８および９（ＤＰ７ｐＨ４  ｄｄＧ）、ｐＨ４におけるマルトヘプタオース加水分解；列１０および１１（ＤＰ７ｐＨ５．８  ｄｄＧ）、ｐＨ５．８におけるマルトヘプタオース加水分解；列１２および１３（ＤＰ３  ＨＳ  ｄｄＧ）、マルトトリオース加水分解アッセイを用いる熱安定性（６０℃で３０分間）；列１４および１５（洗剤  ｐＨ８  ｄｄＧ）、ｐＨ８における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ；列１６および１７（洗剤  ｐＨ１０  ｄｄＧ）、ｐＨ１０における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ。切断ＡｍｙＥ中の評価された１５０個の部位は２の完全制限位置、すなわち７５および１２３を含んでいた。完全長ＡｍｙＥ中の評価された２９５個の部位は１０の完全制限位置、すなわち７５、９７、１０１、１０２、１２０、１３３、１３７、１８２、２６６および３０６を含んでいた。
【表４】
2011522546.tif 000006
2011522546.tif 000007
2011522546.tif 000008
2011522546.tif 000009
2011522546.tif 000010
【実施例１１】
【０３５０】
ＡｍｙＥによるエタノール生成
この実施例では、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ（ＩＲＥ）液化物（３１％ＤＳ）に基づく慣用のエタノール発酵における切断ＡｍｙＥの性能を評価するための実験が、慣用のエタノール発酵アッセイを用いて実施された。手短にいうと、４００ｐｐｍの尿素を有する３１％ＤＳのＩｌｌｉｎｏｉｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ（ＩＲＥ）液化物のバッチが調製され、５ＮのＨ２ＳＯ４で１のバッチのｐＨが４．３に調整され、残りがｐＨ５．８に調整された。１００ｇの基質がフラスコ（１２５ｍｌ三角フラスコ）ごとに用いられた。酵素が指示通りに施量された。発酵物が０．２ｍｌの１０（ｗ／ｖ）％の（ＤＩ水中で約４５分間前水和された）Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ酵母を植菌された。フラスコは４８時間の発酵の間、撹拌棒にて３２０ｒｐｍで撹拌されながら３２℃において温置された。生産されたエタノールの量がＨＰＬＣ分析によって測定された。切断ＡｍｙＥ（配列番号２）の性能が、ｐＨ４．３およびｐＨ５．８においてＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａアミラーゼ（配列番号４）と比較された。切断ＡｍｙＥおよびＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａアミラーゼは０．２ｍｇ／ＤＳｇで施量された。
【０３５１】
図１１に示されたように、ｐＨ５．８において切断ＡｍｙＥによって生産された最終エタノール収率は１２．０（ｖ／ｖ）％であった。ｐＨ４．３における切断ＡｍｙＥは７．３（ｖ／ｖ）％の最終エタノール収率を与えた。ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａアミラーゼの存在下における最終エタノール収率はｐＨ４．３において２．７（ｖ／ｖ）％およびｐＨ５．８において３．９（ｖ／ｖ）％であった。
【実施例１２】
【０３５２】
ＡｍｙＥおよび他のα−アミラーゼのエタノール生成の比較
この実施例では、ｐＨ４．３およびｐＨ５．８において不溶性顆粒（未調理）デンプンをエタノールに加水分解する完全長ＡｍｙＥ（配列番号１）および切断ＡｍｙＥ（配列番号２）の能力を比較するための実験が、実施例１１に記載された全粉砕トウモロコシに基づくエタノール発酵アッセイを用いて実施された。
【０３５３】
このアッセイを用いて、完全長および切断ＡｍｙＥのエタノール生成性能が、１．５ＳＳＵ／ｇ（１単位の酵素活性−ＳＳＵ可溶性デンプン単位は、ｐＨ４．５および５０℃において可溶性ジャガイモデンプン基質（４％ｄｓ）の加水分解から１分間当たり放出されるグルコース１ｍｇの還元力に相当する。）で施量されたアスペルギルスカワチアルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ、ＧＣ２６）、および０．５ＧＡＵ／ｇで施量されたＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００２（トリコデルマリーゼイ中で発現されたアスペルギルスカワチアルファアミラーゼおよびトリコデルマリーゼイ由来のグルコアミラーゼ。これらは相乗的に作用して顆粒デンプン基質をグルコースに加水分解する。）と比較された。ここで、１グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）は、１μＭの還元糖を生産する酵素の量であり、ｐＨ４．２および６０℃において可溶性デンプン基質（４％ｄｓ）から１時間当たり生産されるグルコースとして計算される。ＳＳＵおよびＧＡＵの定義は、米国特許第７，０３７，７０４号にこれよりも詳しく記載されている。ＡｍｙＥ完全長および切断ＡｍｙＥは両方とも０．２ｍｇ／ＤＳｇで施量された。
【０３５４】
図１２は、ｐＨ４．３および５．８においてこれらの酵素の性能が比較されたときに観察され、生産された最終エタノール収率として報告された結果を示す。ｐＨ５．８で試験されると、完全長および切断ＡｍｙＥは両方ともＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００２とほとんど同等の性能を示し、ｐＨ４．３では完全長ＡｍｙＥはＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００２について観察されたエタノール収率を実際に超えていた。ｐＨ５．８で試験されたときの切断ＡｍｙＥは同じｐＨで試験されたＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００２とほとんど同等の性能を示した。相対的に、アスペルギルスカワチアルファアミラーゼはｐＨ４．２およびｐＨ５．８の両方において非常に不満足な性能を示した。
【実施例１３】
【０３５５】
バチルスサブティリスアルファアミラーゼによるグルコースの生成
この実験では、ｐＨ４．５およびｐＨ５．６においてマルトースをグルコースに転化するバチルスサブティリスアルファアミラーゼの能力を測定するための実験が、実施例２に記載されたグルコース生成アッセイを用いて実施された。反応は２、５および８日後に分析された。
【０３５６】
図１３に示されたように、バチルスサブティリスＡｍｙＥ完全長（配列番号１）、ＡｍｙＥ切断体（配列番号２）および変異体α−アミラーゼＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）はマルトースをグルコースに効果的に転化したが、他方、切断ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ、ＡｍｙＳ（配列番号４）はこれらの条件下に最小量のグルコース生成を示した。
【実施例１４】
【０３５７】
粗デンプンへのＡｍｙＥの作用
この実験では、不溶性顆粒（未調理）デンプンを加水分解する完全長ＡｍｙＥ（配列番号１）の能力を測定するための実験が実施された。不溶性デンプンから生産された糖の検出のために用いられるＨＰＬＣの方法は以下の通りである。
【０３５８】
精製ＡｍｙＥ（２４．５ｇ／Ｌ）が、リンゴ酸緩衝液、ｐＨ５．６中に２０．４ｐｐｍの最終濃度まで希釈された。このタンパク質は次にリンゴ酸緩衝液、ｐＨ５．６中の５％トウモロコシ粉溶液に添加され、１ｐｐｍの最終濃度とされた。この混合物は次に３２℃で振とう機中で温置された。サンプルが定期的に取り出され５０ｍＭのＮａＯＨ中に希釈されて反応が停止された。１０μＬのサンプルが次に電気化学的検出が使用可能なＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  １０００）中に注入された。２５℃で操作されるＮａＯＨと酢酸Ｎａとの傾斜液とともに、ＰＡ１カラムが用いられた。すでに試験された標準物から分布が決定された。
【０３５９】
結果：１ｐｐｍの完全長ＡｍｙＥ酵素を含む粗デンプンの温置は、多数のオリゴ糖（ＤＰ２、３、４、５、６、７）ならびにグルコース（ＤＰ１）の時間依存性放出をもたらす。これらの分解生産物の外観が、消化時点のＨＰＬＣ分析によって定量化される。０、３０および９０分間のサンプルのデータが図１４に示される。同様な結果が切断ＡｍｙＥ酵素についても観察された（データは示されていない）。
【実施例１５】
【０３６０】
完全長ＡｍｙＥの位置ライブラリー
位置ライブラリーが、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ社、独国、Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ、Ｄ−９３０５３、Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−ｓｔｒａｓｓｅ  １１）によって完全長ＡｍｙＥ（配列番号１）中の２９５部位において構築された。表３は、位置ライブラリーがつくられた各残基を示す。残基は配列番号１中のそれらの位置を基準に数えられる。
【表５】
2011522546.tif 000011
2011522546.tif 000012
2011522546.tif 000013
【０３６１】
２０個のライブラリーが、完全長ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ−ｔｒの両方の中の位置２７、３０、４５、７５、８８、８９、１２６、１３１、１６７，１８４、２２３、２３８、２４１、２６０、３０７、３１２、３４４、３８０および４０２において構築された。完全長ＡｍｙＥ置換変異体を含むバチルスサブティリス軽質転換体が実施例８に記載されたように培養された。培養物上清がアッセイに用いられた。
【実施例１６】
【０３６２】
ＡｍｙＥ変異体の性能
実施例８および９に記載された手順を用いて、完全長ＡｍｙＥおよび切断ＡｍｙＥの相対性能または活性が、完全長ＡｍｙＥおよび切断ＡｍｙＥ中に生成された変異体と比較された。表４はＡｍｙＥ完全長変異体の部位評価選抜の結果をまとめており、表５はＡｍｙＥ切断変異体の部位評価選抜の結果をまとめている。列１は野生型酵素中のアミノ酸を示す。列２はこの検討で調べられた位置における変異体を表している。それ以降の列は、試験された特性についての変異体の性能指数値を示す。試験された特性は以下の通りであった。すなわち、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（発現）によるタンパク質の測定、粘度低下速度（ピーク粘度）、液化後粘度の低下（最終粘度）、重合度（ヨウ素）、生成された還元末端（還元末端）、存在する全グルコース（グルコース）、ｐＨ５．８におけるマルトヘプタオースの加水分解（ＤＰ７ｐＨ５．８）、ｐＨ５．８におけるマルトヘプタオースの加水分解を用いた（６０℃において３０分間の）熱安定性（ＤＰ７ｐＨ５．８加熱）、ｐＨ４におけるマルトヘプタオースの加水分解（ＤＰ７ｐＨ４）、ｐＨ５．８におけるマルトトリオースの加水分解を用いた（６０℃において３０分間の）熱安定性（ＤＰ３ＨＳ）、トウモロコシ粉基質上３０分間の比活性（トウモロコシ粉３０分間）、ｐＨ８における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ（洗剤ｐＨ８）およびｐＨ１０における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ（洗剤ｐＨ１０）。性能指数（Ｐｉ）は変異体と親タンパク質との性能の比と定義される。
【表６】
2011522546.tif 000014
2011522546.tif 000015
2011522546.tif 000016
2011522546.tif 000017
2011522546.tif 000018
2011522546.tif 000019
2011522546.tif 000020
2011522546.tif 000021
2011522546.tif 000022
2011522546.tif 000023
2011522546.tif 000024
2011522546.tif 000025
2011522546.tif 000026
2011522546.tif 000027
2011522546.tif 000028
2011522546.tif 000029
2011522546.tif 000030
2011522546.tif 000031
2011522546.tif 000032
2011522546.tif 000033
2011522546.tif 000034
2011522546.tif 000035
2011522546.tif 000036
2011522546.tif 000037
2011522546.tif 000038
2011522546.tif 000039
2011522546.tif 000040
2011522546.tif 000041
2011522546.tif 000042
2011522546.tif 000043
2011522546.tif 000044
2011522546.tif 000045
2011522546.tif 000046
2011522546.tif 000047
2011522546.tif 000048
2011522546.tif 000049
2011522546.tif 000050
2011522546.tif 000051
2011522546.tif 000052
2011522546.tif 000053
2011522546.tif 000054
2011522546.tif 000055
2011522546.tif 000056
2011522546.tif 000057
2011522546.tif 000058
2011522546.tif 000059
2011522546.tif 000060
2011522546.tif 000061
2011522546.tif 000062
2011522546.tif 000063
2011522546.tif 000064
2011522546.tif 000065
2011522546.tif 000066
2011522546.tif 000067
2011522546.tif 000068
2011522546.tif 000069
2011522546.tif 000070
2011522546.tif 000071
2011522546.tif 000072
2011522546.tif 000073
2011522546.tif 000074
2011522546.tif 000075
2011522546.tif 000076
2011522546.tif 000077
2011522546.tif 000078
2011522546.tif 000079
2011522546.tif 000080
2011522546.tif 000081
2011522546.tif 000082
2011522546.tif 000083
2011522546.tif 000084
2011522546.tif 000085
2011522546.tif 000086
2011522546.tif 000087
2011522546.tif 000088
2011522546.tif 000089
2011522546.tif 000090
2011522546.tif 000091
2011522546.tif 000092
2011522546.tif 000093
2011522546.tif 000094
2011522546.tif 000095
2011522546.tif 000096
2011522546.tif 000097
2011522546.tif 000098
2011522546.tif 000099
2011522546.tif 000100
2011522546.tif 000101
2011522546.tif 000102
2011522546.tif 000103
2011522546.tif 000104
2011522546.tif 000105
2011522546.tif 000106
2011522546.tif 000107
2011522546.tif 000108
2011522546.tif 000109
2011522546.tif 000110
2011522546.tif 000111
2011522546.tif 000112
2011522546.tif 000113
2011522546.tif 000114
2011522546.tif 000115
2011522546.tif 000116
2011522546.tif 000117
2011522546.tif 000118
2011522546.tif 000119
2011522546.tif 000120
2011522546.tif 000121
2011522546.tif 000122
2011522546.tif 000123
2011522546.tif 000124
2011522546.tif 000125
2011522546.tif 000126
2011522546.tif 000127
2011522546.tif 000128
2011522546.tif 000129
2011522546.tif 000130
2011522546.tif 000131
2011522546.tif 000132
2011522546.tif 000133
2011522546.tif 000134
2011522546.tif 000135
2011522546.tif 000136
2011522546.tif 000137
2011522546.tif 000138
2011522546.tif 000139
2011522546.tif 000140
2011522546.tif 000141
2011522546.tif 000142
2011522546.tif 000143
2011522546.tif 000144
2011522546.tif 000145
2011522546.tif 000146
2011522546.tif 000147
2011522546.tif 000148
2011522546.tif 000149
2011522546.tif 000150
2011522546.tif 000151
2011522546.tif 000152
2011522546.tif 000153
2011522546.tif 000154
2011522546.tif 000155
2011522546.tif 000156
2011522546.tif 000157
2011522546.tif 000158
2011522546.tif 000159
2011522546.tif 000160
2011522546.tif 000161
【表７】
2011522546.tif 000162
2011522546.tif 000163
2011522546.tif 000164
2011522546.tif 000165
2011522546.tif 000166
2011522546.tif 000167
2011522546.tif 000168
2011522546.tif 000169
2011522546.tif 000170
2011522546.tif 000171
2011522546.tif 000172
2011522546.tif 000173
2011522546.tif 000174
2011522546.tif 000175
2011522546.tif 000176
2011522546.tif 000177
2011522546.tif 000178
2011522546.tif 000179
2011522546.tif 000180
2011522546.tif 000181
2011522546.tif 000182
2011522546.tif 000183
2011522546.tif 000184
2011522546.tif 000185
2011522546.tif 000186
2011522546.tif 000187
2011522546.tif 000188
2011522546.tif 000189
2011522546.tif 000190
2011522546.tif 000191
2011522546.tif 000192
2011522546.tif 000193
2011522546.tif 000194
2011522546.tif 000195
2011522546.tif 000196
2011522546.tif 000197
2011522546.tif 000198
2011522546.tif 000199
2011522546.tif 000200
2011522546.tif 000201
2011522546.tif 000202
2011522546.tif 000203
2011522546.tif 000204
2011522546.tif 000205
2011522546.tif 000206
2011522546.tif 000207
2011522546.tif 000208
2011522546.tif 000209
2011522546.tif 000210
2011522546.tif 000211
2011522546.tif 000212
2011522546.tif 000213
2011522546.tif 000214
2011522546.tif 000215
2011522546.tif 000216
2011522546.tif 000217
2011522546.tif 000218
2011522546.tif 000219
2011522546.tif 000220
2011522546.tif 000221
2011522546.tif 000222
2011522546.tif 000223
2011522546.tif 000224
2011522546.tif 000225
2011522546.tif 000226
2011522546.tif 000227
2011522546.tif 000228
2011522546.tif 000229
2011522546.tif 000230
2011522546.tif 000231
2011522546.tif 000232
2011522546.tif 000233
2011522546.tif 000234
2011522546.tif 000235
2011522546.tif 000236
2011522546.tif 000237
2011522546.tif 000238
2011522546.tif 000239
【０３６３】
表２、４および５に記載された特性についてのＡｍｙＥ変異体の相対性能データに基いて、ＡｍｙＥ完全長および切断ＡｍｙＥの位置は以下のように分類された。
完全制限位置：試験されたいずれの特性についても中性突然変異体なし
非完全制限位置：試験された特性のうちの１について少なくとも１の中性突然変異体
比制限位置：少なくとも１の特性について≧２０％の中性突然変異体
【０３６４】
表６は、非完全制限位置、および切断ＡｍｙＥ変異体中の各位置における野生型アミノ酸残基の特定、ならびに各特性についての中性突然変異体％を示す。表７は、非完全制限位置、および完全長ＡｍｙＥ変異体中の各位置における野生型アミノ酸残基の特定、ならびに各特性についての中性突然変異体％を示す。ここでも、列挙された全ての位置は、試験されたいずれの特性についても所望の様式で性能を変えるように突然変異されることができる。
【表８】
2011522546.tif 000240
2011522546.tif 000241
2011522546.tif 000242
2011522546.tif 000243
2011522546.tif 000244
2011522546.tif 000245
【表９】
2011522546.tif 000246
2011522546.tif 000247
2011522546.tif 000248
2011522546.tif 000249
2011522546.tif 000250
2011522546.tif 000251
2011522546.tif 000252
2011522546.tif 000253
2011522546.tif 000254
2011522546.tif 000255
【０３６５】
上記の記載から明らかなように、ＡｍｙＥポリペプチド中のある特定の位置は、いずれかの１の特性に実質的に有害な影響を及ぼすことなく、１以上の特性を変えるように突然変異されることができる。これらの突然変異体は、表面特性についての合体可能突然変異体と集合的に呼ばれる。かかる位置は単一の突然変異体および突然変異体の組み合わせをつくるための都合のよい候補である。というのは、これらの位置は一般に遺伝子操作に耐性があるからである。他方、これらの位置における突然変異は得られたＡｍｙＥ変異体に識別可能な特性を与え、このことはこれらの位置が酵素構造および／または機能に重要であることを示している。他の親アミラーゼ、たとえばＡｍｙＥ以外のα−アミラーゼ中の対応する位置は、同様に突然変異されることができる。ある場合であって、他の親アミラーゼ中の対応する位置が異なるアミノ酸残基を含む場合には、その位置は野生型ＡｍｙＥポリペプチド中に見出されるアミノ酸残基を含むように突然変異されることができる。これらの位置は次の通りである。052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, および 416V。全てのこれらの突然変異における突然変異体はタンパク質および活性の双方についてＰＩ値＞０．５を有し、これらの位置がタンパク質の発現または性能を破壊することなく突然変異されることができることを実証している。
【実施例１７】
【０３６６】
粘度形中での液化
α−アミラーゼの作用によるトウモロコシ粉の粘度低下が、ＨＡＡＫＥ  Ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒ５５０計器を用いて監視された。基質スラリーは、３０％トウモロコシ粉乾燥固形分を用いてバッチ様式で毎日足される。ｐＨは硫酸を用いて５．８に調整された。５０ｇのスラリー（１５ｇ乾燥固形分）が検量され、撹拌されながら１０分間前温置されて７０℃まで加熱された。α−アミラーゼを添加すると、７５ｒｐｍの回転速度で温度は７０℃から８５℃まで直ちに上昇した。スラリーと酵素との混合物の温度が８５℃に達した後、その温度が一定に保持され、粘度がさらに３０分間監視された。粘度は反応全体を通して監視され、μＮｍ単位で報告された。
【０３６７】
野生型ＡｍｙＥ（完全長または切断型）およびそのいくつかの変異体が約０．２５〜１．５ｍｇ／トウモロコシ粉５０ｇで施量され、粘度が記録された。
【０３６８】
ある時間にわたってのスラリーの粘度の典型的なグラフが図１５に示され、このグラフでは野生型完全長ＡｍｙＥおよびＡｍｙＥ完全長変異体Ｉ１００ＦおよびＷ６０Ｍが比較された。他の場合には、スラリーのピークおよび最終粘度のみが表に表されている。野生型完全長ＡｍｙＥおよび完全長ＡｍｙＥを基底としてつくられた他の変異体L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, およびS254Iについての結果が表８および９に示される。野生型切断ＡｍｙＥおよび切断ＡｍｙＥを基底としてつくられた他の変異体W60L, W60M, W60N, HOOF, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, およびT279Aについての結果が表１０に示される。
【表１０】
2011522546.tif 000256
【表１１】
2011522546.tif 000257
【表１２】
2011522546.tif 000258
【０３６９】
粘度計アッセイにおける改善された性能は、多数の判定基準、すなわちピーク粘度の減少、最終粘度の減少、または参照（対照）酵素に要求される施量との比較で同じようなピークもしくは最終粘度を生成するために要求される酵素施量の減少を用いて特定されることができる。表９および１０にボールド体で強調された文字列は、各変異体がそれぞれの野生型対照と比較して改善された性能を実証する判定基準を示す。
【実施例１８】
【０３７０】
示差走査型熱量計法を用いるＡｍｙＥ完全長、ＡｍｙＥ−ｔｒおよびＡｍｙＥ変異体の熱安定性
超高感度走査高処理量マイクロ熱量計ＶＰ−Ｃａｐ  ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ社、米国、マサチューセッツ州、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）を用いて、過剰熱容量曲線が測定された。ＤＳＣ測定の標準的な手順および該技術の理論はすでに公表されている（Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Moｌ. Biol. 41: 191-218）。約５００μＬの０．５ｍｇ／ｍｌのＡｍｙＥ−ｔｒまたは切断ＡｍｙＥ変異体が３０〜１２０℃の温度範囲にわたって走査された。この同じサンプルがそれからこの過程の可逆性を確認するために再走査された。用いられた緩衝液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０またはｐＨ５．８であった。凝集から生じるかもしれない何らかの人為的な影響を最小限にするために、２００℃／時の走査速度が用いられた。ＤＳＣ曲線の熱的中点（Ｔｍ）が熱安定性の指標として用いられた。表１１は、ｐＨ４．０およびｐＨ５．８で試験された野生型切断ＡｍｙＥおよび切断ＡｍｙＥ変異体のＴｍ値を示す。
【表１３】
2011522546.tif 000259
【実施例１９】
【０３７１】
パンの老化
以下の実施例はパンの老化を低減するためにＡｍｙＥポリペプチドを用いる方法に関する。
Ａ．ベーキング試行の処方
【０３７２】
アメリカトーストのための標準的精白パンスポンジおよび生地の処方を用いて、ベーキング試行が実施された。スポンジ生地は、米国、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ社の小麦粉「Ｇｏｌｄ  Ｍｅｄａ」１４００ｇ、水８００ｇ、菜種油４０ｇ、ＧＲＩＮＤＳＴＥＤ（商標）ＳＳＬＰ５５  Ｖｅｇ７．５ｇ、ＤＩＭＯＤＡＮ（商標）ＰＨ２００乳化剤１０ｇおよび圧搾酵母６０ｇから調製される。スポンジはＨｏｂａｒｔスパイラルミキサーで低速度で１分間、その後速度２で３分間混合される。スポンジはその後２５℃、相対湿度８５％で３時間発酵される。
【０３７３】
その後、「Ｇｏｌｄ  Ｍｅｄａ」小麦粉６００ｇ、圧搾酵母１８ｇ、プロピオン酸カルシウム５ｇ、スクロース１６０ｇ、プロピオン酸カルシウム５ｇ、水４３２ｇおよびアスコルビン酸（最終濃度６０ｐｐｍ）ならびにＡＤＡ（アゾジカルボンアミド、最終濃度６０ｐｐｍ）がこのスポンジに添加される。得られた生地はＤｉｏｓｎａミキサーで低速度で１分間、次に高速度で２分間混合される。次に食塩３０ｇがこの生地に添加される。
【０３７４】
生地は環境温度で５分間休まされ、次に５５０ｇの生地片が計量され、１：４、２：４、３：１５、４：１２および両側に幅８の設定をされたＧｒｉｍｅｋシーター上で型作りされ、ベーキング型台に移された。４３℃、相対湿度９５％で６５分間のプルーフィングの後、生地はＭＩＷＥオーブン中２００℃で２６分間焼かれる。
Ｂ．堅さ、弾力性および一体性を評価する手順
【０３７５】
堅さ、弾力性および一体性が、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ社の質感分析機を用いる質感プロファイル分析（Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）によってパンスライスを分析することによって測定される。堅さおよび弾力性の計算はＳｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ社によって提供されたプリセット標準に従って行われる。用いられた測定子はアルミニウム製５０ｍｍ丸物である。
【０３７６】
パンは１２．５ｍｍの幅にスライスされる。スライスは直径４５ｍｍの円形に打ち抜かれ、個別に測定される。
【０３７７】
以下の設定が用いられる。すなわち、前試験速度：２ｍｍ／秒、試験速度：２ｍｍ／秒、後試験速度：１０ｍｍ／秒、破断試験距離：１％、距離：４０％、力：０．０９８Ｎ、時間：５．００秒間、カウント：５、ロードセル：５ｋｇ、トリガータイプ：自動−０．０１Ｎ。
【０３７８】
圧縮様式は標準法ＡＡＣＣ  ７４−０９に用いられているものを変更したものである。サンプルはこの試験で２回圧縮される。
Ｃ．堅さの評価の手順
【０３７９】
堅さは最初の圧縮の間に圧縮率４０％で測定された。この数字はスライスを全厚さの４０％まで圧縮するのに必要な力である。この値が小さければ小さいほど、パンはそれだけ柔らかい。堅さは圧力、たとえばｈＰａ単位で表された。
Ｄ．ＡｍｙＥ変異体ポリペプチドで処理された食品の改善された取扱い特性
【０３８０】
０．４ｍｇ／ｋｇのＡｍｙＥ−ｔｒを有するパンが焼かれ、ベーキング後様々な時間で上記の手順に従ってパンの堅さが試験される。パンの堅さが試験された。対照として何らの酵素なしで焼かれたパンの堅さも測定される。
【０３８１】
図１６はベーキング試験の結果を示し、ＡｍｙＥ−ｔｒで処理されたパンの堅さが酵素なしのパンの堅さと比較された。ＡｍｙＥ−ｔｒとともに焼かれたパンの１日目から１４日目までの堅さの低い増加は、この酵素が老化防止効果を有しパンの新鮮さ保持を改善することができることを示している。
【図１】
2011522546.tif 000260
【図２】
2011522546.tif 000261
【図３】
2011522546.tif 000262
【図４Ａ】
2011522546.tif 000263
【図４Ｂ】
2011522546.tif 000264
【図４Ｃ】
2011522546.tif 000265
【図４Ｄ】
2011522546.tif 000266
【図５Ａ】
2011522546.tif 000267
【図５Ｂ】
2011522546.tif 000268
【図５Ｃ】
2011522546.tif 000269
【図６】
2011522546.tif 000270
【図７】
2011522546.tif 000271
【図８】
2011522546.tif 000272
【図９】
2011522546.tif 000273
【図１０】
2011522546.tif 000274
【図１１】
2011522546.tif 000275
【図１２】
2011522546.tif 000276
【図１３】
2011522546.tif 000277
【図１４】
2011522546.tif 000278
【図１５】
2011522546.tif 000279
【図１６】
2011522546.tif 000280
【国際調査報告】
2011522546.tif 000281
2011522546.tif 000282
2011522546.tif 000283
2011522546.tif 000284
2011522546.tif 000285