(57)【要約】本発明は、（−）ｓｓＲＮＡウイルス鋳型配列の３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基と相補的な少なくとも３塩基を含むウイルスキャップ−リーダー配列を含む。好ましくは前記コンセンサス配列は一般式７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣ、一層好ましくは７ｍＧ（Ｎ）７−８−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣで表される。さらに、ウイルスのポリメラーゼによる伸長またはウイルスエンドヌクラーゼによる切断を阻止することができる修飾キャップ−リーダー配列を含む。こうした修飾キャップ−リーダー配列は、３’−末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）リン酸基、１個または複数個のホスホロチオアートもしくはホスホロジアミデート結合、または１個または複数個のモルホリノ環を含む。また、こうした修飾キャップ−リーダー配列を含む医薬品も開示する。さらに、本発明は、こうした修飾キャップ−リーダー配列または医薬品によりウイルス転写、特にインフルエンザウイルスの転写を阻害する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）ｓｓＲＮＡウイルス鋳型配列の３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基と相補的な少なくとも３塩基を含み、かつ前記ウイルスのポリメラーゼによる伸長を防止するか、または前記ウイルスのエンドヌクレアーゼによる切断を防止するための保護基を含む、修飾キャップ−リーダー配列。
【請求項２】
コンセンサス配列；
７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣ、好ましくは７ｍＧ（Ｎ）７−８−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣ
を含む、請求項１に記載のキャップリーダー配列。
【請求項３】
前記保護基は前記ウイルスのポリメラーゼによる伸長を防止するための３’−リン酸（保護）基、ホスホロチオアート結合、ホスホロジアミデートおよび／または１個もしくは複数個のモルホリノ環を含む、請求項１または２に記載の修飾キャップ−リーダー配列。
【請求項４】
前記保護基はホスホロチオアート結合またはホスホロジアミデート結合を含む、請求項３に記載の修飾キャップ−リーダー。
【請求項５】
前記保護基は１個または複数個のモルホリノ環を含む、請求項３に記載の修飾キャップ−リーダー。
【請求項６】
請求項１または２に記載のキャップリーダー配列の修飾方法であって、前記３’−リン酸保護基の付加を含む、方法。
【請求項７】
請求項３または４に記載の修飾キャップ−リーダー配列を調製する方法であって、少なくとも１個のホスホジエステル結合を少なくとも１個のホスホロチオアート結合またはホスホロジアミデート結合で置換することを含む、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の修飾キャップ−リーダー配列を調製する方法であって、少なくとも１個のリボース環を少なくとも１個のモルホリノ環で置換することを含む、方法。
【請求項９】
細胞内の（−）ｓｓＲＮＡウイルスの転写を阻害する方法であって、請求項１〜５に記載の修飾キャップ−リーダーを前記細胞に与える、方法。
【請求項１０】
前記ウイルスはインフルエンザ（Ａ、ＢまたはＣ）であり、前記３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基は配列ＵＣＧを持つ、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５に記載の修飾キャップ−リーダー配列を含むビヒクルであって、前記ビヒクルは前記キャップ−リーダーを前記細胞に導入することができ、好ましくは前記ビヒクルはビロソーム、ウイルス粒子（ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）またはリポソームである、ビヒクル。
【請求項１２】
請求項１〜５に記載の、活性量の修飾キャップ−リーダーまたは請求項１１に記載のビヒクルおよび医薬品賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
（−）ｓｓＲＮＡウイルス感染の処置に使用する、請求項１〜５に記載の修飾キャップ−リーダー配列
【請求項１４】
ウイルス複製を阻害するか、またはウイルス感染を処置するための、請求項１〜５に記載のキャップ−リーダー配列の使用。
【請求項１５】
ウイルス複製を阻害するか、またはウイルス感染を処置するための、請求項９〜１０に記載の方法の使用。
【請求項１６】
ウイルス複製を阻害するか、またはウイルス感染を処置するための、請求項１１または１２に記載のビヒクルまたは医薬組成物の使用。
【請求項１７】
前記ウイルス感染はインフルエンザ感染である、請求項１４〜１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスゲノムの転写の分野に関し、より詳細にはインフルエンザゲノムの転写の開始に関与するキャップ−リーダー配列の分野に関し、さらに具体的には強いコンセンサスインフルエンザキャップ−リーダー配列に関する。また、本発明は、ウイルス感染を阻害する新規な治療物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
「キャップスナッチング」は、分節（−）ｓｓＲＮＡウイルス間で見られるウイルス転写開始の特殊な機構であり、最初にインフルエンザＡにより発見された（ボウロイ（Ｂｏｕｌｏｙ）ら、１９７８；プロッチ（Ｐｌｏｔｃｈ）ら、１９７９；クリュグ（Ｋｒｕｇ）ら、１９７９；ケイトン（Ｃａｔｏｎ）およびロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）、１９８０；ダール（Ｄｈａｒ）ら、１９８０；ビートン（Ｂｅａｔｏｎ）およびクリュグ、１９８１；プロッチら、１９８１）。この機構では、ウイルスゲノムの転写を始めるため、ウイルス転写酵素が宿主ｍＲＮＡのｍ７Ｇ−キャップ化ＲＮＡリーダー配列を切断する。これにより新生のウイルス転写物に５’キャップ構造および非ウイルスのリーダー配列が形成される。非ウイルスのリーダー配列によりウイルス転写物とウイルスの（アンチ）ゲノムＲＮＡ分子との区別が可能になる。キャップスナッチングについては後に、オフィオウイルス（Ｏｐｈｉｏｖｉｒｕｓｅｓ）を除き、その宿主（動物、ヒトまたは植物）と無関係にすべての分節（−）ｓｓＲＮＡウイルスで報告された（コルメリンク（Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ）ら、１９９２；ヒューイト（Ｈｕｉｅｔ）ら、１９９３；ジン（Ｊｉｎ）およびエリオット（Ｅｌｌｉｏｔｔ）、１９９３ａおよびｂ；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）ら、１９９５；ドゥイシングス（Ｄｕｉｊｓｉｎｇｓ）ら、２００１）。
【０００３】
こうしたウイルスの大部分は細胞質で複製し、既に存在する宿主ｍＲＮＡのプールを基質として使用するのに対し、インフルエンザＡウイルスは感染細胞の核で複製し、その際、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体から新たに合成された転写物を使用する（フォーダー（Ｆｏｄｏｒ）ら、２０００；エンゲルハート（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ）ら、２００５；チャン（Ｃｈａｎ）ら、２００６）。過去２０年にわたり、様々なインビトロ系の使用（ボウロイら、１９７８；プロッチら、１９７９；ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら、１９９４）および逆遺伝学系の確立（プレシュカ（Ｐｌｅｓｃｈｋａ）ら、１９９６；フォーダーら、１９９９；ニューマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）ら、１９９９）により、キャップスナッチングに関与するシスおよびトランス作用因子に対する知見が進んできた。しかしながら、この過程における多くの段階は依然として謎であるか、または議論が残っている。
【０００４】
インフルエンザＡポリメラーゼ複合体は、３種のウイルスタンパク質ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡからなり、ウイルスｍＲＮＡの合成にはどのタンパク質も必要とされる。ＰＡの役割についてはまだ不明だが、ＰＢ２は細胞ｍＲＮＡの５’キャップ構造に結合し（Ｌｉｃｈｅｎｇら、１９９５）、そのエンドヌクレアーゼドメインを活性化して５’キャップ構造の下流１０〜１４ヌクレオチドの部位で切断する。ＰＢ１についてはｍＲＮＡ鎖伸長の過程で、ヌクレオチド付加を触媒する（ブラーム（Ｂｒａａｍ）ら、１９８３）。キャップ依存性エンドヌクレアーゼ活性の活性化にはウイルスＲＮＡ鋳型（ｖＲＮＡ）の５’末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）が存在すれば必要にして十分であることを示唆する報告もあれば（ハーゲンら、１９９４；チアンチ（Ｃｉａｎｃｉ）ら、１９９５）、エンドヌクレアーゼ活性化にはｖＲＮＡ鋳型の５’および３’末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）の複数の残基間に特定の塩基対合が必要とされることを示唆する報告もある（リ（Ｌｉ）ら、２００１）。
【０００５】
エンドヌクレアーゼによる切断は一般に５’キャップ構造から１５ｎｔ付近で起こるが、１０〜２０ヌクレオチドの間でリーダーの長さが変化することが観察される。例外が報告されており、ジュグベ（Ｄｕｇｂｅ）ナイロウイルス（ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ））およびタカリベ（Ｔａｃａｒｉｂｅ）アレナウイルス（アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ））は比較的短いキャップ化ＲＮＡリーダー（それぞれ１〜４、５〜１６ｎｔ）を使用する。いくつかのウイルスでは、ウイルスｍＲＮＡの配列解析から、非ウイルスのリーダーの３’末端（ｅｎｄ）のヌクレオチド選好性が示されおり、これは、エンドヌクレアーゼによる切断の配列選好性を反映していると考えられる。インフルエンザＡウイルスの場合、プリン残基の選好性が提唱されており（プロッチら、１９８１；ビートンおよびクリュグ、１９８１）、プライマーとして効率的に使用されるのは３’−末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）ＣＡジヌクレオチドを保有するキャップ化ＲＮＡリーダーのみである（ビートンおよびクリュグ、１９８１；ラオ（Ｒａｏ）ら、２００３）。ブニヤムウェラ（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ）およびジュグベ（Ｄｕｇｂｅ）ウイルスはどちらも、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、それぞれＵまたはＣ残基後の切断に対する強い選好性が推察される（ジンおよびエリオット、１９９３ａおよびｂ）。しかしながら、こうした場合はどれも大部分の配列が、インビボで作製された限られた量のｍＲＮＡから得られたものであり、キャップ化リーダー配列が由来する宿主ｍＲＮＡについては不明のままであった。
【０００６】
このため、すべての分節（−）ｓｓＲＮＡウイルスにおいて、キャップ化リーダーが想定３’末端（ｅｎｄ）のさらに下流、たとえば１〜２ヌクレオチドを切断され、塩基対合によりウイルスの鋳型に沿ったキャップ化ＲＮＡリーダー分子のアライメントを補助するいくつかの残基が与えられることを否定することはできない。この考えは注目されているだけでなく、文献に発表された複数の証拠により裏付けられている。
【０００７】
インフルエンザＡウイルスのインビトロ研究からは、塩基対相互作用がウイルスＲＮＡ鋳型に対するキャップ化ＲＮＡリーダー分子のアライメントに寄与していることが示唆されているが（プロッチら、１９８１；ハーゲンら、１９９４；チュン（Ｃｈｕｎｇ）ら、１９９４）、いくつかの相反するデータも存在する（クリュグら、１９８０；ラオら、２００３）。
【０００８】
ハンタン（Ｈａｎｔａａｎ）ウイルスゲノム転写では、ウイルス転写物のリーダー配列内の反復配列の存在を説明するために「刺激およびリアライン」機構が提唱された。この過程においては、ウイルスＲＮＡ鋳型に対するキャップ化リーダー配列のリアライメントは塩基対合相互作用に依存する。その最初の記載以来（ガルシンら、１９９５）、一部のレトロスペクティブな研究を含め、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスリーダー配列内に反復配列が存在するのは、「刺激およびリアライン」の発生が原因と考えられてきた（ビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ）ら  １９８３；ボウロイら、１９９０；シモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）およびピーターソン（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ）、１９９１；ジンおよびエリオット、１９９３ｂ；ドゥイシングスら、２００１；バンクニッペンバーグ（ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ）ら、２００２）。
【０００９】
ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ：Ａｌｆａｌｆａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）との混合感染におけるＴＳＷＶ、および（ミュータント）ＡＭＶ−ＲＮＡ３（ＡＭＶ３）コンストラクトを共接種したＡＭＶレプリカーゼｐ１およびｐ２タンパク質を遺伝子導入により発現させたＴＳＷＶ感染ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物のインビボでの転写研究から、ＴＳＷＶ  ＲＮＡ鋳型の末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）または末端から２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）３’残基に対するＡＭＶ由来キャップ化ＲＮＡリーダーの塩基相補性の条件が明らかになった（ドゥイシングスら、１９９９および２００１）。ウサギ網状赤血球ライセート（ＲＲＬ：Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）を補充した精製されたＴＳＷＶ粒子を用いたインビトロ転写系によっても、同様の結果が得られている（バンクニッペンバーグら、２００２）。さらに、いくつかの（ミュータント）キャップドナーの対競合から、ＴＳＷＶは塩基相補性が低い他のものより比較的少量で加えたときでも、ウイルスの鋳型ＲＮＡに対する複数塩基相補性を選好することが示された（バンクニッペンバーグら、２００５）。
【００１０】
ＴＳＷＶの研究、キャップスナッチングの高度な保存性、およびインフルエンザＡウイルスの転写において様々なキャップドナーを使用した明らかな定量的（競合）データの不足を踏まえると、プリン残基でのエンドヌクレアーゼによる切断に対する、および３’−末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）ＣＡジヌクレオチドを保有するキャップ化ＲＮＡリーダーに対するインフルエンザの明らかな選好性については疑問が残り得る。
【００１１】
インフルエンザＡウイルスの感染は人類にとって重大な脅威であると一般に認められている。また、深刻な懸念の理由は、インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１ウイルス（家禽およびヒト）で観察されるように（突然変異を介して）様々な宿主種間に伝播する能力を獲得できるという知見にある。そのため、Ｈ５Ｎ１が効率的にヒトからヒトへ伝染できる株に変異することができると恐れられるのも当然であろう。現在のところ、インフルエンザウイルス感染の臨床的影響を抑制する選択肢として、ワクチン接種および抗ウイルス剤の使用がある。現在のワクチンの生産力は、大流行時の需要に対応するには不十分であるため、抗ウイルス剤を利用できるようになれば、汎流行ウイルスの出現をその発生時に封じ込めることができる。
【００１２】
現在利用できる２クラスの抗ウイルス剤、ノイラミニダーゼ阻害剤（たとえばタミフル）およびイオンチャンネル遮断薬の有効性は限られており、処置開始の早さによって大きく左右される。さらに、いくつかの耐性例が既に報告されている。
【００１３】
以上のように、インフルエンザウイルス感染に対処する新たな代替薬に対する必要性が増大している。インフルエンザウイルスの転写におけるキャップスナッチングの条件に関する理解が深まれば、転写を阻害できる方法についての知見が得られ、その後の薬剤開発に使用できる新たな抗ウイルス戦略につながるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは今回、（−）ｓｓＲＮＡウイルスのウイルスゲノム転写を最適に開始するのに必要なキャップ−リーダー配列の条件を詳細に同定した。本発明は、ウイルスＲＮＡの３’残基に対して少なくとも１から最大３塩基相補性を含むキャップ−リーダー配列を提供する。このキャップリーダーは、好ましくはコンセンサス配列７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣを持つ。また、本発明の一部は、ウイルスのポリメラーゼによる伸長および／またはエンドヌクレアーゼによる切断を防止するためのキャップ−リーダー配列の修飾である。
【００１５】
前記修飾は、好ましくは３’−ＯＨ末端（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）キャップ−リーダーを３’−リン酸に修飾する。あるいは、前記修飾は、キャップ−リーダー配列の伸長を可能にするウイルスのエンドヌクレアーゼ（および他の宿主ヌクレアーゼ）による切断を防止するための、キャップ−リーダー内のホスホジエステル結合の修飾である。前記修飾は、好ましくはキャップ−リーダー内のホスホジエステル結合をホスホロチオアート結合またはホスホロジアミデート結合に置換する。好ましくは、少なくとも３’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）のＡ、ＧまたはＣ間のホスホジエステル結合を置換する。最も好ましくは、分子全体がホスホロチアート結合またはホスホロジアミデート結合を持つ。あるいは、前記修飾は、キャップ−リーダー内の１個または複数個のリボース環（単数または複数）（またはＤＮＡコンセンサス配列を使用する場合はジデオキシリボース）を１個または複数個のモルホリノ環（単数または複数）で置換する。
【００１６】
本発明はさらに、細胞内の（−）ｓｓＲＮＡウイルスのゲノム転写を阻害する方法であって、ウイルスの鋳型の３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基と相補的な少なくとも３塩基を持つ修飾キャップ−リーダーを前記細胞に与え、その修飾が上記の修飾から選択される、方法も提供する。好ましくは、前記ウイルスはインフルエンザ（Ａ、ＢまたはＣ）であり、３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基は配列ＵＣＧを持つ。
【００１７】
本発明はさらに、ウイルス感染が好ましくはインフルエンザ感染であるウイルス感染を阻害または処置するための上記の配列および方法の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】インビトロ合成したインフルエンザｍＲＮＡの解析。（Ａ）ＲＲＬの存在下／非存在下で放射能標識ヌクレオチドを用いたインビトロ転写反応である。ライン１〜４：活性ウイルスを使用した。ライン５〜６：熱失活したウイルスを対照として使用した。ＲＲＬの非存在下では、ＡＭＶ３キャップ化リーダー分子を加えても転写は回復されなかった。（Ｂ）ＲＲＬの存在下でインビトロ合成したインフルエンザｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析である。活性ウイルスをレーン１に、熱失活したウイルスをレーン２に使用した。インフルエンザＮＳ１遺伝子に特異的な内部プライマーを用いて逆転写を行い、続いて同じ遺伝子の内部プライマーとα−グロビンｍＲＮＡの５’の最初の１１ヌクレオチドに特異的なプライマーを組み合わせて用いてＰＣＲを行った。
【図２】２ステップリアルタイムＰＣＲ解析による、ＡＭＶ／α−グロビンリーダーにより開始されたＮＳ１転写の定量。ＲＲＬの存在下でｍＲＮＡをインビトロ合成し、（ミュータント）ＡＭＶ３キャップ化リーダーを加え、インフルエンザＮＳ１遺伝子の内部プライマーを用いて逆転写した。ＮＳ１遺伝子のネステッドプライマーおよびＡＭＶ３またはα−グロビンｍＲＮＡのプライマーを用いてリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅（５００倍希釈したｃＤＮＡを使用）を行った。３つの独立した測定値の標準誤差を算出した。（Ａ）活性ウイルス、および濃度を上げながらＣ１０Ｃ１１Ａ１２（Ｗｔ）またはＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を使用した（濃度はＸ軸に表示する）。（Ｂ）活性ウイルスおよび０．５μｇのＣ１０Ｃ１１Ａ１２、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４またはＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書では「キャップ（化）−リーダー配列（単数または複数）」または「キャップ（化）−リーダー（単数または複数）」または「リーダー配列（単数または複数）」またはキャップ（化）ＲＮＡプライマーは、ウイルスゲノムの転写を始めるために使用し得るｍ７Ｇ−キャップ化ＲＮＡ配列と定義される。５’キャップはｍＲＮＡ分子の５’末端（ｅｎｄ）に認められ、特異な５’−５’三リン酸結合を介してＲＮＡに連結された７−メチルグアノシン残基（７ＭｅＧｐｐｐＮ）からなる。これを７−メチルグアノシンキャップといい、ｍ７Ｇ−キャップと略称される。転写終了後、ウイルスＲＮＡには非ウイルスの（ウイルス自体に由来しない）５’キャップ構造および非ウイルスのリーダー配列が形成される。キャップ−リーダーは、ウイルス、動物、ヒトまたは植物など、どのようなものに由来してもよいが、主に宿主由来である。キャップ−リーダー配列によるウイルス転写の開始過程プロセスは「キャップスナッチング」とも呼ばれる。
【００２０】
このキャップスナッチングは、ウイルスゲノム転写における重要な現象の１つである。キャップ−リーダー配列を扱った報告は複数あるが、インフルエンザのゲノム転写に関するキャップ−リーダー配列の具体的な条件についてはまだ解明されていない。本発明者らは今回、転写を始める過程で優先的に使用されるキャップ−リーダー配列の条件を見出した。このキャップ−リーダーは、ウイルスＲＮＡの３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基に対する少なくとも３塩基相補性を含む。
【００２１】
「塩基相補性」という用語は、５’−キャップ−リーダー配列と３’ウイルスＲＮＡとの間の相補性をいう。本明細書ではウイルスＲＮＡはウイルスの鋳型またはウイルス鋳型配列とも呼ばれる。相補的塩基はウイルスＲＮＡの３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｅｎｄ）に結合し、その後キャップ−リーダーのＡ、ＧおよびＣ残基が３’末端の（ｕｌｔｉｍａｔｅ）Ｕ、末端から２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）Ｃ、それに続くＧ（ウイルス３’末端（ｅｎｄ）１、２および３残基とも呼ばれる）に結合する。本明細書では「末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）」はウイルスの３’末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）ＲＮＡ塩基残基と定義される。本明細書では「末端から２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）」は、末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）塩基対に続くＲＮＡ塩基、すなわち末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）から２番目のウイルスＲＮＡ３’塩基残基と定義される。キャップ−リーダーとウイルスとの間の相補的塩基の１または２対合については記述されてきたが、驚くべきことに本発明の３塩基対合は非常に強い（優先的に使用される）キャップ−リーダーである。
【００２２】
本発明はさらに、転写を効率的に開始および刺激するうえで３個の相補的塩基に近接した残基が重要であることも確認している。こうした残基の位置については、キャップ−リーダー配列におけるＡＧＣの５’のすぐ上流側の塩基を−１、ＡＧＣの５’の上流から２番目の位置を−２という。本例は、キャップ−リーダーの−１の位置にＡまたはＴ、−２の位置にＡ、ＴまたはＧがあると刺激および伸長の際に非常によく使用されることを示す。
【００２３】
キャップリーダーは、好ましくは配列７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣを持ち、本明細書ではこの配列を「コンセンサス配列」という。コンセンス内の最後のＡＧＣは最も多く見られ、３塩基相補性または３相補性とも呼ばれる。
【００２４】
また、コンセンサス配列については最適なリーダーの長さも特定する。本発明で行った実験からは、リーダー配列の最適な長さが１０〜２０ヌクレオチドであることを確認することができ、最も多く見られるＡＧＣは好ましくはキャップ７ｍＧから１０〜１２ヌクレオチドまたは１１〜１３ヌクレオチドの位置にある（７ｍＧ（Ｎ）７−８−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣ）。本発明の別の実施形態では、リーダーは任意に拡張されてもよく、その場合、以下のコンセンサス配列７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣ−（Ｎ）６−１７になる。ウイルスＲＮＡとの結合後、リーダーは切断され（相補的な３個の塩基Ａ、ＧまたはＣの後で最も起こりやすい）、その後、相補的な３塩基ＡＣＧ末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）から伸長が開始される。この伸長は相補的な３塩基ＡＧＣ末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を修飾することで阻止することができる。前記修飾は、好ましくはキャップリーダーの３’−末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）への３’−リン酸基の付加である。考えられるもう１つの修飾は、キャップ−リーダー内の１つまたは複数のリボース環（単数または複数）（またはＤＮＡコンセンサス配列を使用する場合はジデオキシリボース）と１つまたは複数のモルホリノ環（単数または複数）との置換である。こうした修飾はバイアルエンドヌクレアーゼに対する耐性を付与する。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態では、ウイルス３’ＲＮＡと相補的な４もしくは５またはそれ以上の塩基まで塩基相補性を拡張してもよい。３塩基ＡＧＣの後の対応する相補配列はインフルエンザＡ、ＢおよびＣによりそれぞれ異なる。したがって、これら３属のうちの１つを特異的に阻害することを意図する場合、前記ウイルスに特異的な配列で拡張されたキャップ−リーダーを使用することが好ましい。こうした特異的な配列を以下の表に示し、キャップ−リーダー配列をそれぞれ、この配列により３塩基ＡＧＣの後に相補的な４、５またはそれ以上の塩基まで拡張する。
【００２６】
────────────────────────────────────────
オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈ  Ｉｎｆｌ．Ａ  ＵＵＣＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’
ｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）              
Ｉｎｆｌ．Ｂ  ＣＣＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵ−３’
Ｉｎｆｌ．Ｃ  ＣＣＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵ−３’
────────────────────────────────────────
【００２７】
塩基対合に基づくウイルスＲＮＡ鋳型に対するキャップ−リーダーのアライメントは、転写の開始／刺激における最初の段階である。これにより、ｍ７Ｇ−キャップ５’末端（ｅｎｄ）からキャップ化リーダーの１０〜２０ヌクレオチドがウイルスのエンドヌクレアーゼにより切断される。ウイルスは、その結果形成されたキャップ−リーダーを用いて転写を刺激する、すなわちキャップ−リーダーを伸長する。本明細書では、鎖の伸長を転写、伸長または取り込みともいう。
【００２８】
したがって「ウイルスゲノム転写」は、開始（キャップ−リーダーのアライメント／結合は転写の刺激とも呼ばれる）、エンドヌクレアーゼによる切断および伸長という３段階に分けることができる。比較的短い長さのキャップ−リーダーを使用する場合、開始の第１のステップにおけるエンドヌクレアーゼによる切断が不必要になり、ウイルスＲＮＡに対するキャップ−リーダーの結合により直接刺激を行うことができ、その後伸長が可能になることが当業者には、明らかであろう。ただし、９ｎｔよりも短いキャップ−リーダーについては転写を刺激するには短かすぎる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、保護基を含む本発明の修飾キャップ−リーダーに関する。この修飾により、キャップ−リーダーはウイルスＲＮＡに結合し、転写を刺激できるものの、その瞬間からウイルスのエンドヌクレアーゼにより切断されたり、または伸長させられたりすることを阻止される。本明細書では保護基は、キャップ−リーダーをウイルスＲＮＡに結合させるが、転写開始過程におけるその後の段階を阻害する任意の基と定義される。キャップ−リーダーを機能しないものに変換するには２個の保護基、すなわちホスホロチオアート結合および３’−リン酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）が好ましい。キャップ−リーダー内のホスホジエステル結合をホスホロチオアート結合に修飾すると、ヌクレアーゼ耐性が導入され、それによりキャップ−リーダー配列の切断が阻止される一方、３’−ＯＨ末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）基の代わりに３’−リン酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）基が存在すると（ＲＮＡポリメラーゼは伸長のため３’−ＯＨ末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を必要とする）、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる伸長が阻止される。この実施形態では、３’−リン酸による阻止は、好ましくは３’末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）Ｃで起こる。これにより、以下のコンセンサス７ｍＧ（Ｎ）６−１０−（Ａ／Ｕ／Ｇ）−Ａ／Ｕ−ＡＧＣｐが得られるが、ｐは、類似の機能を持つ他の任意の保護基と交換してもよい３’−リン酸基である。当業者であれば、（当該技術分野において公知の）他の保護基を使用しても同じ機能が得られる、すなわち転写開始過程におけるその後の段階を阻害することを理解するであろう。
【００３０】
インフルエンザの転写開始の阻害剤として、機能しないキャップ−ＲＮＡリーダーの安定性（ヌクレアーゼ耐性の向上）、親和性およびバイオアベイラビリティーを高めるのに使用してもよい他の化学修飾には、ホスホロチオアート結合またはホスホジエステル結合に代わるホスホロジアミデート結合、およびリボース環に代わるモルホリノ環がある。
【００３１】
ホスホジエステルをホスホロチオアートで置換すると、各リン酸の酸素がイオウ原子に置換される。この置換は、ホスホロチオアート結合によりＲＮＡまたはＤＮＡの分解を阻害する。
【００３２】
また、ホスホロジアミデート結合もＤＮＡおよびＲＮＡにエンドヌクレアーゼ耐性を付与する。
【００３３】
モルホリノまたはホスポホロジアミデートモルホリノとは、６員のモルホリノ環を含む化学物質をいう。モルホリノ環（単数または複数）を含むキャップ−リーダーはウイルスＲＮＡに結合すると、ウイルスのエンドヌクレアーゼによる切断に対する耐性が高まるため、伸長が阻害される。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、キャップ−リーダーを修飾する方法または修飾キャップ−リーダーを調製する方法を提供する。これは、好ましくは化学反応によって行われ、保護基をキャップ−リーダーに付加するか、あるいはホスホジエステル結合（単数または複数）の代わりに１つまたは複数のホスホロチオアート結合（単数または複数）を含むＤＮＡまたはＲＮＡを作製する。これは、当該技術分野において既知の任意の方法であってもよい。保護基は、好ましくは３’−リン酸基または１つまたは複数のホスホロチオアート結合である。当業者であれば、保護基を含むこうした化合物を作製することができる。たとえば３’リン酸は、キャップ−リーダーをリン酸でエステル化することで付加してもよい。当該技術分野の当業者には、ホスホロチオアート結合を含むＲＮＡの作製方法が分かるであろう。さらなる実施形態では、本発明は、キャップ−リーダーを修飾する方法または修飾キャップ−リーダーを調製する方法であって、保護基が、ホスホロチオアート結合またはホスホジエステル結合の代わりにホスホロジアミデート結合であり、および／またはリボース環の代わりにモルホリノ環である方法に関する。当該技術分野の当業者には、ホスホロジアミデート結合および／またはモルホリノ環を含むＲＮＡの作製方法が分かるであろう。
【００３５】
ＲＮＡの化学合成については、「遺伝子フラグメントの化学的および酵素的合成−−ラボラトリーマニュアル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（Ｈ．Ｇ．ガッセン（Ｇａｓｓｅｎ）およびＡ．ラング（Ｌａｎｇ）編）、フェアラークヘミー（Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）（１９８２）に記載されているような固相法を用いるなど従来のホスホトリエステル、ホスフィットまたはホスホラミダイト化学により行うことができる、たとえばＤＮＡ／ＲＮＡ合成機およびｂ−シアノエチル化学を用いて化学的に合成すればよい。
【００３６】
別の態様では、本発明は、細胞内の（−）ｓｓＲＮＡウイルスのウイルスゲノム転写を阻害する方法であって、ウイルスＲＮＡの３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基と相補的な少なくとも３塩基を持つ修飾キャップＲＮＡリーダーを前記細胞に与え、その修飾が３個の残基のいずれかの修飾からなる、方法を提供する。前記ウイルスは、好ましくはインフルエンザであり、ウイルスの３’末端（ｕｌｔｉｍａｔｅ）残基は配列ＵＣＧである。本明細書では「細胞」は、ウイルスに感染している、または感染する可能性がある任意の宿主細胞と定義される。本発明によりウイルスＲＮＡ転写が阻害されると、ウイルスは複製できないため、ウイルス感染が阻害される（および全般的なウイルス力価が低下する）。「ウイルス複製の阻害」、「ウイルス感染の処置」および「ウイルス複製の阻害」という用語はすべて、ウイルス転写の最初の阻害をいう。
【００３７】
キャップ−リーダーについては、従来技術の状態で使用される既知の任意の方法で細胞に導入することができる。修飾した（機能しない）キャップ−リーダーの送達は、好ましくはリポソーム、ポリマー、ウイルス粒子（ＶＰ：ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ビロソーム、ウイルスベクター、脂質粒子または（分解性）ナノ粒子など送達ビヒクルにより行う。最も好ましくは、インフルエンザＨおよびＮタンパク質がインフルエンザウイルスに感染しやすい宿主細胞（特に気道）を特異的に標的とするため、インフルエンザＨおよびＮタンパク質を含むビロソーム、ウイルス粒子（ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）またはリポソームを使用する。
【００３８】
本明細書ではリポソームとは二分子膜で構成された小胞をいい、前記二重層は典型的にはリン脂質およびコレステロール二重層であり得る。リポソームは複数の異なる種類の脂質、たとえば天然由来のリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン）またはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）のような界面活性剤成分で構成されていてもよい。リポソームの特性は、脂質の組成（カチオン性、アニオン性、中性脂質種）によって異なる場合がある。リポソーム．は、タンパク質、小分子、薬剤、化合物またはＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸など複数の異なる内容物の送達ビヒクルの機能を果たす能力がある。本発明では、前記リポソームを用いてＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を送達する。リポソームの内容物は、脂質二重層と細胞膜との融合を介して（ただし、特異的標的化または受容体を介した取り込みも用いられ得る）細胞に送達することができる。リポソームは、リン脂質を水中で超音波処理することで作製することができる。大きさおよび組成の異なるリポソームを作製してもよい。細胞型のエンドサイトーシスを活性化するためオプソニンおよびリガンドで構成されたリポソーム、またはモノクローナル抗体（イムノリポソームの作製）、ビタミンまたは特異的抗原など標的リガンドを含むリポソームを作製しても構わない。標的化したリポソームは、体内のほとんどどのような細胞型も標的とすることができる。感染症の好ましい実施形態では、インフルエンザＨおよびＮタンパク質は、インフルエンザウイルスが感染しやすい宿主細胞（特に気道の細胞）を特異的に標的とするため、リポソームはインフルエンザＨおよびＮタンパク質を含む。
【００３９】
ビロソームは、エンベロープウイルス由来のウイルス糖タンパク質を含む脂質二重層小胞である。ビロソームは一般に、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）でエンベロープウイルスから膜タンパク質および脂質を抽出し、続いてこの界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を、抽出した脂質およびウイルス膜タンパク質から除去して作製される。このため、ビロソームは、ヌクレオカプシドおよび遺伝子材料を欠く再構成した中空ウイルスエンベロープである。このため、ビロソームは複製できない。ビロソームは、リポソームと対照的にリン脂質二分子膜内に機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。ビロソームを用いれば、たとえばタンパク質、小分子、薬剤、化合物またはＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を送達することができる。本発明では、前記ビロソームを用いてＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を送達する。感染症の好ましい実施形態では、インフルエンザＨおよびＮタンパク質が、インフルエンザウイルスに感染しやすい宿主細胞（特に気道の細胞）を特異的に標的とするため、ビロソームはインフルエンザＨおよびＮタンパク質を含む。
【００４０】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）またはウイルス粒子（ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＶＰ）は、ウイルスのウイルスタンパク質（単数または複数）で構成される。好ましくは前記タンパク質は、脂質二重層に包埋される。このため、ウイルス粒子（ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、それが由来するウイルスに似ているが、他のウイルス成分をすべて欠いており、したがって感染性ではない。ＶＰを用いれば、たとえばタンパク質、小分子、薬剤、化合物またはＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を送達することができる。本発明では、前記ＶＰを用いてＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を送達する。感染症の好ましい実施形態では、インフルエンザＨおよびＮタンパク質は、インフルエンザウイルスが感染しやすい宿主細胞（特に気道の細胞）を特異的に標的とするため、ＶＰはインフルエンザＨおよびＮタンパク質を含む。
【００４１】
本発明のさらなる態様では、本発明の修飾キャップ−リーダー配列を用いてウイルス感染を処置する。ウイルス感染は、どのような（−）ｓｓＲＮＡウイルス感染であってもよいが、好ましくはインフルエンザ感染である。本発明のこの態様は、活性量の修飾キャップ−リーダーを含む薬学的ビヒクルまたは医薬組成物の投与を含む。任意に医薬組成物は送達ビヒクルおよび医薬品賦形剤中の修飾キャップ−リーダーからなるか、または送達ビヒクルおよび医薬品賦形剤上の修飾キャップ−リーダーからなる。
【００４２】
投与については、技術の現状で知られている任意の好適な形で行えばよく、ピル、錠剤、カプセル剤、散剤、ローション、軟膏、ソフトゲル、ゲル、クリーム、経皮パッチ、溶液剤、懸濁剤または吸入薬（散剤および噴霧される溶液剤または懸濁剤）のような医薬製剤に限定されるものではない。上述の医薬製剤は、経口（ピル、錠剤およびカプセル剤）、経鼻または経肺（吸入による）、局所、筋肉内または静脈内または皮下（注射による）に使用してもよい。注射および吸入が好ましい。医薬組成物の調製および投与は、当該技術分野の既知の任意の方法により行えばよい（マーチンデール  ザコンプリートドラッグリファレンス（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、Ｓ  スウィートマン（Ｓｗｅｅｔｍａｎ）、第３５版  ２００７も参照されたい）。
【００４３】
本発明について以下の非限定的な例によりさらに詳細に説明する。
【００４４】
実験部
材料および方法
ウイルス
インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１／Ｎ１）を増殖し、孵化鶏卵から精製した。手短に言えば、尿膜腔液を採取し、１０００ｇで１０分低速遠心分離により除きポアサイズ０，４５μｍのフィルターで濾過した。濾液を０，５ｍｌの６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース（ＰＢＳ溶液）〜２，０ｍｌの２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース（ＰＢＳ溶液）ステップ密度勾配に重層し、ＳＷ４１ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ））を用いて１５０，０００ｇ、４℃で２時間遠心した。界面からウイルス粒子を回収し、２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース（ＰＢＳ溶液）に調整し、１２ｍｌの２０〜６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース連続密度勾配（ＰＢＳ溶液）の上にのせた。ＳＷ４１ローター（ベックマン）内で１５０，０００ｇ、４℃で１６時間遠心分離した後、ウイル画分を採取した。転写アッセイに使用する前に、精製したウイルス（１０〜１５μｇ／μｌ）を小さいアリコートとして−８０℃で保存した。
【００４５】
プラスミドの構築
ＡＭＶ  ＲＮＡ３（ＡＭＶ３）コンストラクトおよび野生型（ｗｔ−ＡＭＶ３）コンストラクトを、ＡＭＶ３の全長ｃＤＮＡクローンを含むプラスミドｐＸＯ３２ＮｃｏＰ３から作製した（ニールマン（Ｎｅｅｌｅｍａｎ）ら、１９９３）。Ｗｔ−ＡＭＶ３、Ｍｕｔ−２およびＭｕｔ−３を、プライマーＡＭＶ３−Ｒｖ（ＡＭＶ３配列のｎｔ３３９〜３１３と相補的）およびそれぞれプライマーｗｔ−ＡＭＶ３、ｍｕｔ２ＡＭＶ３またはｍｕｔ３−ＡＭＶ３を用いてＰＣＲ増幅した。ウイルスＮＳ１鋳型の３’末端（ｅｎｄ）と１４ｎｔにわたり塩基対合できるＡＭＶ３−インフルエンザＮＰミュータント、Ｍｕｔ−Ｎ１４を、プライマーＭｕｔＮ１４−ＡＭＶ３およびＮＰＵＰ２を用いて増幅した。ＡＭＶ３配列の１１番目に点突然変異を含むＡＭＶ３コンストラクトを、最初にｐＸＯ３２ＮｃｏＰ３を増幅してプライマーＡＭＶ３−ＲｖおよびＢ１１Ａ１２（Ｂ＝Ｇ、ＡまたはＴ）を用いて作製した。第２の増幅については、Ｔ７プロモーター配列を含むＡＭＶ３リーダー配列を拡張するためプライマーＴ７ｐｒｏｍ１−ＡＭＶ３を用いて行った。ＡＭＶ３のヌクレオチド１１の点変異体は、Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２、Ｃ１０Ａ１１Ａ１２およびＣ１０Ｕ１１Ａ１２という（ｎｔ１１は野生型Ｃ残基からそれぞれＧ、ＡまたはＴに変化した）。同様に、ＡＭＶ３配列の１０あるいは１１番目に突然変異を含むＡＭＶ３ミュータント、さらに、同じプラスミドをそれぞれプライマーＡＭＶ３−ＲｖとＤ１０Ｃ１１Ａ１２ＧＣ（Ｄ＝Ｃ、Ｇ、ＡまたはＴ）またはＥ１１Ａ１２ＧＣ（Ｅ＝Ｃ、Ｇ、ＡまたはＴ）とを用いて最初に増幅して、３（ＡＧＣ）塩基対合残基を作製した。１０または１１番目に突然変異を含むＡＭＶ３コンストラクトのため、それぞれプライマーＴ７ｐｒｏｍ２−ＡＭＶ３またはＴ７ｐｒｏｍ１−ＡＭＶ３を用いて第２の増幅を行った。ｎｔ１０または１１のＡＭＶ３の点変異体に３塩基対合残基を加えたものは、Ｇ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４（ｎｔ１０は野生型Ｃ残基からＧに、１３および１４番目のｎｔはそれぞれＧおよびＣに変化した）、Ａ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＵ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、またはＣ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、Ｃ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＣ１０Ｕ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４という。１３および１４番目のヌクレオチドのみを野生型ＴＴ
残基からそれぞれＧおよびＣに変えたミュータントＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を作製した。ＧＦＸ  ＰＣＲ精製キット（ロシェ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて増幅したＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてｐＵＣ１９にライゲートした。個々のクローンについては配列解析により確認した。リーダーの長さ条件を判定するためのコンストラクトを、プライマーＡＭＶ３−ＲｖおよびプライマーＣ７Ａ８、Ｃ８Ａ９、Ｃ９Ａ１０、Ｃ１０Ａ１１、Ｃ１１Ａ１２、Ｃ１２Ａ１３、Ｃ１３Ａ１４、Ｃ１４Ａ１５、Ｃ１５Ａ１６、Ｃ１６Ａ１７またはＣ１７Ａ１８を用いて最初にｐＸＯ３２ＮｃｏＰ３を増幅して作製した。第２のＰＣＲ増幅ではプライマーＴ７ｐｒｏｍ３−ＡＭＶ３を用いた。こうしたコンストラクトの場合、さらにクローニングを行うことなく、精製されたＰＣＲフラグメントから直接キャップ化転写物を作製した。
【００４６】
プライマー配列を表６に示す（補足データ）。
【００４７】
キャップ化リーダーの合成
キャップ化ＲＮＡリーダーのインビトロ合成を、Ａｍｂｉｏｎ  Ｔ７  ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥキットを用いて製造者の指示に従って行った。転写は、キャップ−アナログｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下で行った。
【００４８】
転写の前に各ＤＮＡ鋳型をＥｃｏＲＩで直線化した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を、ＡＭＶ３リーダー配列の上流に上記のようなＰＣＲ増幅により導入した。
【００４９】
インビトロでのインフルエンザウイルスの転写およびＡＭＶキャップ化リーダー競合アッセイ
ＴＳＷＶについて以前記載されたのと同様に、インビトロでのインフルエンザ転写アッセイを、約１０μｇの精製されたインフルエンザを用いて最終容量２５μｌとして行った（バンクニッペンバーグら、２００２）。このアッセイは、４ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭの各ＮＴＰ、０．１％ＮＰ−４０、０．８Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｉｎ、２．５μｌの翻訳混合体（１：１：１―ｃｙｓ；−ｌｙｓ；−ｍｅｔのアミノ酸混合物）を含み、ＡＰ−バイオテク（ＡＰ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）ウサギ網状赤血球ライセート系を製造者の手順に従って補充した。この反応物に加えたＡＭＶ３キャップ化リーダーの量を表に示す。２時間、３７℃でインキュベーション後、反応混合物をフェノール−クロロホルムで抽出し、ＲＮＡをエタノール沈殿させた。
【００５０】
ＡＭＶ３−インフルエンザｍＲＮＡ配列の解析
ＡＭＶ３由来のキャップ化５’リーダー配列を含む新規合成したインフルエンザＮＰまたはＮＳ１  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）およびミューラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）、１９９９；シュラム（Ｓｃｈｒａｍｍ）ら、２０００）。一本鎖ｃＤＮＡを、インフルエンザＮＰまたはＮＳ１遺伝子の内部プライマー（それぞれＮＰＵＰ１またはＮＳ１ＵＰ１）を用いて、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳ−ｏｌｉｇｏ）の存在下で合成した。いくつかのＭｇ２＋濃度条件下で、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩにより少数のＣ残基をｃＤＮＡの３’末端（ｅｎｄ）に加え、これによりその３’末端（ｅｎｄ）に少数のＧ−残基を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、その後一本鎖ｃＤＮＡと塩基対合できる。スーパースクリプトＩＩはこのオリゴヌクレオチドを新しい鋳型と認識し、鋳型としてウイルスＲＮＡ転写物からオリゴヌクレオチドに乗り換える。このため、一本鎖ｃＤＮＡは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと相補的な残基により拡張された。
【００５１】
最後に、ＮＰまたはＮＳ１  ｍＲＮＡの完全な５’末端（ｅｎｄ）からなる一本鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、少数のＣ残基およびテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含むその５’末端（ｅｎｄ）を拡張させ、次いでネステッドＮＰまたはＮＳ１プライマー（それぞれプライマーＮＰＵＰ２またはＮＳ１ＵＰ２）およびＴＳオリゴヌクレオチドに適合するプライマーおよびα−グロビンｍＲＮＡリーダー配列の最初の１１ヌクレオチド（プライマーα−グロビン）またはＡＭＶ３リーダー配列（プライマーＡＭＶ３−リーダー１）を加えた。リーダーの長さ条件の実験の場合、ＰＣＲ増幅においてプライマーＡＭＶ３リーダー１の代わりにプライマーＡＭＶ３−リーダー２を使用した。ＧＦＸ  ＰＣＲ精製キット（ロシェ）を用いて、予想された大きさのＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の手順に従ってｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングし、配列を解析した。
【００５２】
２ステップリアルタイム定量的ＰＣＲ解析
前述ように、ＮＳ１遺伝子（ＮＳ１ＵＰ１）の内部プライマーおよびＴＳ−ｏｌｉｇｏプライマーを用いて新規合成したＮＳ１転写物を一本鎖（ｓｓ）ｃＤＮＡに逆転写した。その後、５０℃のアニーリング温度を使用し、標準曲線法（ロータージーン（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ）６．０ソフトウェア、コーベットリサーチ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて鋳型濃度を判定するなど、わずかに変更しただけでズワルト（Ｚｗａｒｔ）ら（２００７）に従って一本鎖ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）１を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲに使用した。鋳型ｃＤＮＡは５００倍希釈した。ＡＭＶ３−リーダー１およびＮＳ１ＵＰ２プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、サンプル中のＡＭＶ３−ＮＳ１ｃＤＮＡ濃度を判定した。α−グロビンおよびＮＳ１ＵＰ２プライマーを用いて別のＰＣＲ反応を行い、α−グロビン−ＮＳ１  ｃＤＮＡ濃度を判定した。次いでＡＭＶ３ＮＳ１とα−グロビン−ＮＳ１との比およびその標準誤差を、ズワルトら（２００７）が記載したように計算した。
【００５３】
結果
【実施例１】
【００５４】
インフルエンザＡウイルス粒子はＲＲＬの存在下でゲノム転写を促進する
インフルエンザＡウイルスのキャップドナー条件の解析、および特に塩基対合条件の判定の前に、成熟ウイルス粒子が転写を促進するＴＳＷＶと同様に（バンクニッペンバーグら、２００２）、インビトロ転写アッセイを確立した（材料および方法）。放射性ヌクレオチドの存在下で行ったアッセイのインビトロ反応産物をＲＮＡ電気泳動により分離したところ、ＴＳＷＶで以前観察されたように、孵化卵から精製されたインフルエンザウイルスはＲＲＬの存在下でＲＮＡ分子の合成を促進するが、この反応にＲＲＬが存在しない場合、ＲＮＡ分子の合成をほとんど促進しないか、あるいは促進しないことが明確に示された（図１Ａ）。ＡＭＶ  ＲＮＡをインビトロでのウイルス転写のプライマーとして加えても（プロッチら、１９７９；ボウロイら、１９８０；ロバートソンら、１９８０；プロッチら、１９８１；リら、１９９８および２００１；バンクニッペンバーグら、２００２）、この反応にＲＲＬが存在しない場合、転写活性は回復せず（図１Ａ）、ｒＮＴＰ濃度も上昇しなかった（データ示さず）。
【００５５】
新規合成したＲＮＡ分子（の一部）が複製活性でなく転写活性の産物であることを確認するため、インビトロ反応由来のＮＳ１  ｍＲＮＡ分子を逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによりクローニングし、ＲＲＬから存在するα−グロビンｍＲＮＡのリーダー配列に相当する５’非ウイルスのリーダー配列、あるいは外部から加えたＡＭＶ３キャップドナー由来の５’非ウイルスのリーダー配列の有無について配列を解析した。インフルエンザ転写物の５’非ウイルスのリーダー配列は９〜１３ｎｔのみであるため、こうした配列に対するプライマーは長さが短いため十分に特異的でないと考えられる。したがって、新規合成したＴＳＷＶ転写物の増幅に以前使用した選択ＲＴ−ＰＣＲ戦略は使用できなかった（ドゥイシングスら、１９９９および２００１；バンクニッペンバーグら、２００２）。そこで、ＲＴ−ＰＣＲによる新規合成インフルエンザ転写物に代替戦略を適用し、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩのテンプレートスイッチ能力を利用した（材料および方法；シュミットおよびミューラー、１９９９；シュラムら、２０００を参照されたい）。このアプローチを用いて、非ウイルスのリーダー配列を保有するＮＳ１転写物に適合する予想された大きさの産物を観察した（図１Ｂ、レーン１）。こうした産物のクローニングおよび配列解析から、インフルエンザＮＳ１転写物の５’末端（ｅｎｄ）にα−グロビンＲＮＡリーダー配列の存在が確認され（データ示さず）、インビトロで合成されたＲＮＡ分子が実際に転写によるものであることが明らかになった。同様にして、ＡＭＶ３リーダー配列を保有する新規合成したＮＳ１転写物をＲＴ−ＰＣＲ増幅して、クローニングおよび配列解析により確認した（表２）。熱失活したウイルスを用いた対照反応では常にＰＣＲ産物が認められなかった（図１Ｂ、レーン２）。
【００５６】
ＮＳ１転写物の５’末端（ｅｎｄ）のＡＭＶ３およびα−グロビンのＲＮＡリーダー配列は長さがインフルエンザ転写物について以前報告されたものと類似していたため、さらにインビトロ転写アッセイを利用して、キャップドナーとして外部から加えた（ミュータント）ＡＭＶ３分子のインフルエンザＡウイルス転写について試験した。
【実施例２】
【００５７】
インフルエンザＡウイルスは、ウイルスＲＮＡ鋳型に対する塩基相補性が高いキャップ化ＲＮＡリーダーを選好する
ＴＳＷＶに関して以前明らかになった内容と同様に（バンクニッペンバーグら、２００５）、転写開始において、インフルエンザＡが、ウイルスＲＮＡ鋳型に対する塩基相補性が高いキャップ化ＲＮＡリーダー分子を選好するかどうかを解析するため、ウイルスＲＮＡ鋳型の３’末端（ｅｎｄ）に対してその塩基相補性のみが異なる４つのＡＭＶ３リーダーコンストラクト（表１）を作製し、対競合におけるキャップドナーとしてインビトロでのインフルエンザＡウイルス転写アッセイに加えて試験した。最初の、１塩基対合コンストラクトは野生型（ｗｔ）ＡＭＶ３であり、ウイルスＲＮＡ鋳型に対して１塩基相補性を示し、５’キャップ化末端（ｅｎｄ）の下流１２番目のヌクレオチドがＡ残基である。２番目の、２塩基対合コンストラクト（Ｍｕｔ−２と表示）はｗｔ−ＡＭＶ３に由来し、５’キャップ化末端（ｅｎｄ）の下流１２および１３番目に２塩基対合（ＡＧ）残基を保有していた。３番目の、３塩基対合コンストラクト（Ｍｕｔ−３と表示）はｗｔ−ＡＭＶ３に由来し、５’キャップ化末端（ｅｎｄ）の下流１２〜１４番目に３塩基対合（ＡＧＣ）残基を保有していた。Ｍｕｔ−Ｎ１４と表示する４番目のコンストラクトは本物のインフルエンザＡウイルス転写物を示し、インフルエンザＡウイルスＮＰ遺伝子のＡＭＶ３リーダー配列５’からなり、ＮＳ１ゲノムＲＮＡ鋳型の最初の１４ｎｔと相補的な１４ｎｔを保有していた（表１）。ｗｔ−ＡＭＶ３と３種のミュータントを区別するため、リーダー配列内のＣ１０残基をそれぞれＡ、ＧまたはＴに変更して、こうしたコンストラクトそれぞれにマーカーヌクレオチドをさらに導入した（表１）。
【００５８】
最初のインビトロ競合はｗｔ−ＡＭＶ３およびＭｕｔ−２を用いて行った。インビトロでのインフルエンザ転写後、反応からＲＮＡを抽出し、テンプレートスイッチアプローチを用いてＲＴ−ＰＣＲにより解析した。予想された大きさのＰＣＲフラグメントをクローニングし、配列決定して新規合成したＮＳ１転写物についてｗｔ−ＡＭＶ３またはＭｕｔ−２由来のキャップ化ＲＮＡリーダー配列の有無を解析した。その結果から、すべてのクローンがＮＳ１転写物のリーダー配列内にマーカーヌクレオチドＡを含むことが示され（表２）、Ｍｕｔ−２ＲＮＡリーダー配列の存在が示唆された。Ｍｕｔ−２の比率をｗｔ−ＡＭＶ３の１０分の１にして供給したときも（表２）、リーダーの開始点が同定され得えなかった１個を除き、全ＮＳ１転写物クローンから、Ｍｕｔ−２ＲＮＡリーダー配列の存在が明らかになっており（表２）、インフルエンザＡウイルスはインビトロでＡＭＶ３  Ｍｕｔ−２に対する選好性、すなわちウイルスＲＮＡ鋳型に対して塩基相補性がより高いＡＭＶ３リーダー配列に対する選好性を示すことが示唆された。第２の実験では、Ｍｕｔ−１４との対競合におけるキャップドナーとしてのｗｔ−ＡＭＶ３を試験した。どちらのＲＮＡ分子も１：１の比（各５０ｎｇおよび各５００ｎｇ）でインビトロ転写アッセイに加え、全体で３９個のクローン化ＮＳ１配列のうち３５個はＭｕｔ−Ｎ１４のマーカーヌクレオチドを含み、ｗｔ−ＡＭＶ３由来のものは４個にすぎなかった。ｗｔ−ＡＭＶ３およびＭｕｔ−Ｎ１４を１０：１の比で加えた場合、２５個のうち２１個がＭｕｔ−Ｎ１４のリーダー配列を含んでいた。マーカーヌクレオチドが欠如していたため他の４個のクローンのリーダー配列の開始点は同定できなかった。以上のように、これらの結果から、インビトロでのインフルエンザＡウイルスはウイルスＲＮＡ鋳型の３’末端（ｅｎｄ）に対して塩基相補性が高いキャップ化ＲＮＡリーダー配列を選好することが強く示唆された。こうした結果をさらに実証するため、２つの追加のインビトロ転写アッセイを行い、それぞれ対競合におけるＭｕｔ−２とＭｕｔ−３、およびＭｕｔ３とＭｕｔ−Ｎ１４を試験した。Ｍｕｔ−２およびＭｕｔ−３を等モル量で加えた場合、Ｍｕｔ−３のＲＮＡ−リーダー配列はＭｕｔ−２のＲＮＡ−リーダー配列よりも２倍多く使用された（表２）。驚いたことに、Ｍｕｔ−３およびＭｕｔ−Ｎ１４を１：１競合でインビトロ転写アッセイに加えた場合、リーダーのどれにも明確な選好性が確認されなかった（表２）。Ｍｕｔ−３およびＭｕｔ−Ｎ１４の１０：１競合では、クローン化ＮＳ１転写物の５’−リーダー配列もほぼ１０：１の比に近くなっており、Ｍｕｔ−３とＭｕｔ−Ｎ１４との間には明確な選好性が存在しないという考えが裏付けられた。この場合に選好性が認められないのは、キャップ化ＲＮＡリーダーの塩基対合残基の上流５’配列が及ぼすと予想される作用に起因したものかもしれない。
【００５９】
さらに全ＮＳ１クローン内のＲＮＡリーダー配列の解析を行ったところ、９個のクローンで反復配列の存在が示され、キャップ化リーダー配列の刺激およびリアライメントの結果である可能性が高く、転写の刺激において塩基対合が、ウイルスＲＮＡ鋳型に沿ったキャップ化ＲＮＡリーダー配列のアライメントに関与しているという考えが裏付けられた。
【００６０】
データは全体として、インビトロでのインフルエンザＡウイルスが、インフルエンザＲＮＡ鋳型に対する塩基相補性が高いＡＭＶ３のキャップ化ＲＮＡリーダーに対して強い選好性を示すことを強く示唆する。
【実施例３】
【００６１】
キャップスナッチングにおけるキャップ化リーダーの３’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）のヌクレオチドの作用
ウイルスＲＮＡ鋳型との塩基対合（ｗｔ−ＡＭＶ３、Ｍｕｔ−２およびＭｕｔ−３の場合、それぞれＡ、ＡＧまたはＡＧＣ）に含まれる３’末端（ｅｎｄ）残基のすぐ上流に位置するキャップ化ＲＮＡリーダー配列内のヌクレオチドが、キャップドナーの使用効率に作用するかどうかを解析するため、想定（１）塩基対合残基Ａ１２の−１番目にＣ（コンストラクトｗｔ−ＡＭＶ３、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２ともいう）、Ａ（Ｃ１０Ａ１１Ａ１２）、Ｇ（Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２）またはＵ（Ｃ１０Ｕ１１Ａ１２）を保有する（ミュータント）ＡＭＶ３コンストラクトのセットを作製した（表１）。
【００６２】
同時に１１番目のヌクレオチドを変更したものをマーカーヌクレオチドとして使用して、ｗｔ−ＡＭＶ３由来のリーダーとこの３由来のミュータントとを区別した。全４種のＡＭＶ３コンストラクトの合成キャップ化転写物を等モル量でインビトロアッセイに加え、新規合成したＮＳ１遺伝子転写物をＲＴ−ＰＣＲ増幅し、クローニングし、配列決定した。驚いたことに、解析対象の３２個のクローンのうち１８個は１１番目にＧヌクレオチドを含み（表３）、Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２配列に対する選好性が示唆された。詳しく検討したところ、こうした１８個のクローンのほとんど全部（１７個）でウイルスの最初のＡ残基が欠落していたが、これはＧ残基直後のエンドヌクレアーゼによる切断、それに続くウイルスの鋳型の３’−末端から２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）Ｃ残基に対する内部刺激が原因である可能性が高い。さらに、これらの８個は、刺激およびリアライメントに起因した可能性がある反復配列を示した。（３２個のうち）残りの１４個クローンでは、８個のクローンがＣ１０Ａ１１Ａ１２リーダーを、４個がＣ１０Ｕ１１Ａ１２リーダーを、２個のみがＣ１０Ｃ１１Ａ１２（ｗｔ−ＡＭＶ３）配列を含んでいた。ミュータントＣ１０Ａ１１Ａ１２からスナッチングされたリーダーをよく検討したところ、こうした８個のクローンのうち７個はエンドヌクレアーゼによりＡ１２の後が切断されず、Ｃ１０Ａ１１の下流が切断されて得られたものであり、３’ＣＡ−末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）が生じた。これによりこれらのクローンは、リーダー配列がＣ１１Ａ１２の下流の切断後にミュータントＣ１０Ｃ１１Ａ１２から得られた２個のクローンと類似性があった。すべての（ミュータント）１塩基対合ＡＭＶ３分子をキャップドナーとして使用したわけではないが、インビトロでのインフルエンザＡウイルスは、３’ＣＧＡを保有するリーダー配列に対する選好性を明確に示し、主として内部刺激＿につながる。キャップ化ＲＮＡリーダー配列の塩基対合残基のすぐ上流−１および−２番目のヌクレオチド残基であって、内部刺激したり、またはエンドヌクレアーゼによる切断位置により５’キャップ−構造の距離を変化させたりせずに、キャップ化リーダーとしてのその利用を促進すると考えられる残基を同定するため、どれもがＡＭＶ３のキャップ化ＲＮＡリーダー配列の３’末端（ｅｎｄ）に
３塩基対合残基（ＡＧＣ）を、さらに−１または−２番目にＡ、Ｇ、ＣまたはＵ残基を保有するＡＭＶ３ミュータントの第２のセットを作製した（表１）。得られたコンストラクトはそれぞれＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、Ｃ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＣ１０Ｕ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、Ａ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、Ｇ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＵ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４という。この場合も、１１番目（最初の塩基対合残基に対して−１）または１０番目（最初の塩基対合残基に対して−２）を変更したヌクレオチドを同時にマーカーヌクレオチドとして使用した。
【００６３】
−１番目を変更したヌクレオチドを保有する全キャップドナー分子を多重競合に加えたところ、４０個のＮＳ１  ｍＲＮＡクローンのうち１９個は、ミュータントＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４由来のリーダーを、１５個はＣ１０Ｕ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４由来のものを含んでいた（表３）。残りの６個のクローンのうち５個はＣ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４由来のリーダーを、１個のみがＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４由来のものを含んでいた。さらに、リーダー配列が−１にＧを含むキャップドナーに由来する場合、ここで内部刺激が観察されたのは５個のクローンのうち１個のみであった。Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を個々にインビトロアッセイに加えた場合、回収された２２個のＮＳ１クローンのうち５個はウイルスの最初のＡ残基の欠如を示し、内部刺激を示唆した。Ｃ１０Ｇ１１Ａ１２による内部刺激の頻度が非常に高いのと比較してＣ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４による内部刺激の頻度が低いのは、ウイルスＲＮＡ鋳型の３’の最初の３残基に沿って適切にアライメントさせられたと思われるＣ１０Ｇ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４に存在する余分な塩基対合残基に起因する可能性が高かった。この観察はやはり、ウイルスの鋳型に対するキャップ化リーダーの塩基相補性がキャップスナッチングにおいて重要な役割を果たすという考えを裏付けるものである。
【００６４】
−２番目、すなわち最初の塩基対合Ａの上流２残基を改変したヌクレオチドを保有するキャップドナー分子全部（表１）を多重競合に加えたところ、Ｇ、ＡまたはＵを含むキャップ化リーダー間では、その位置に明確な選好性が認められなかったが、Ｃ残基については３１個のクローンのうち１個にしか出現しなかったため、非効率的であると思われた（表３）。
【実施例４】
【００６５】
相互に入れ替えた５’上流配列を含む１および３塩基対合キャップ化ＲＮＡリーダーの対競合
上述のデータによれば、他のＡＭＶ３の１塩基対合キャップ化リーダー分子を含む競合においてＡＭＶ３由来の３’ＣＡＡを保有する１塩基対合キャップ化リーダー分子は、比較的よく使用されたが、３’ＣＣＡを保有するものは使用されなかった。この作用がこうした分子と３塩基対合キャップドナー分子との対競合でも認められるかどうかを解析することで、推定塩基対合残基のすぐ上流のヌクレオチド配列の重要性を強調するため、さらに２つの対競合アッセイを行った。第１のアッセイでは、ウイルスＲＮＡ鋳型に対するその塩基相補性、およびＲＮＡリーダー配列の推定塩基対合残基のすぐ上流−１番目の１残基が異なるＣ１０Ａ１１Ａ１２およびＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４という２種のミュータントＡＭＶ３リーダー分子（表１）を試験し、第２のアッセイでは、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２（ｗｔ−ＡＭＶ３と同一）およびＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４という相互に入れ替えたリーダー変異体（表１）を試験した。第１の場合、解析対象の１８個のクローンのうち１４個は、ミュータントＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４由来のリーダーを、４個はＣ１０Ａ１１Ａ１２由来のリーダーを含んでいた。第２の場合、１９個のクローンのうちのほぼすべて（１８個）がＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４のリーダー配列を含み、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２由来のリーダー配列を含んでいたのは１個のみであった。こうした結果から、キャップ−ドナーとして利用するにはキャップ化リーダー内のヌクレオチド配列が重要である一方で、その配列は、ウイルスの鋳型と相補的な塩基を拡張する配列の付加により支配されるという考えが強く裏付けられる。
【実施例５】
【００６６】
インフルエンザの転写を刺激するためのリーダーの長さ条件
インフルエンザＡウイルス転写酵素によるキャップ化真核生物ＲＮＡの切断については複数の刊行物に記載されており、一般に５’−末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）キャップ構造の下流９〜１５ヌクレオチドで切断される（ボウロイら、１９７８；プロッチら、１９７９；ロバートソンら、１９８０）。最適なリーダーの長さをさらに正確に決定するため、本明細書に記載するインビトロ転写アッセイをこの目的のため利用した。そこで、塩基対合残基がＡＭＶ３分子の５’キャップ化末端（ｅｎｄ）の様々な位置にあるＡＭＶ３コンストラクトを作製し、同時にキャップドナー競合アッセイに加えた。加えたキャップドナー分子はすべて、オリゴＵストレッチに組み込まれたＣＡＧＣ配列を含んでおり、トリヌクレオチドＡＧＣの塩基対合によるウイルスＲＮＡ鋳型に沿ったキャップ化ＲＮＡリーダーの適切なアライメントが確保された。最も短いリーダーは５’キャップ化末端（ｅｎｄ）から８番目に最初の塩基対合Ａ残基を保有していたのに対し、最も長いリーダーは１８番目に最初のＡ塩基対合を保有していた（表１）。全リーダーミュータントの転写物を等モル量で同時にインビトロインフルエンザ転写アッセイに加えた。新規合成したウイルス転写物のＲＴ−ＰＣＲクローニングおよび配列解析から、１９個の転写物のうち９個はＡＭＶ３ミュータントＣ９Ａ１０Ｇ１１Ｃ１２に由来するキャップ化リーダーを含み、１９個のうち５個はミュータントＣ１０Ａ１１Ｇ１２Ｃ１３に由来したことが明らかになり（表４）、最適なリーダーの長さが１０〜１１ヌクレオチドであることが示唆された。複数のクローンからは反復配列の存在が明らかになり、やはり「刺激およびリアライン」が起きることが示された。
【実施例６】
【００６７】
α−グロビンリーダーの減少に伴い、１および３塩基対合キャップドナー分子によるインフルエンザＡウイルス転写が開始される
α−グロビンリーダーに対して１および３塩基対合キャップ化リーダー分子（競合による）が及ぼす競合物質作用によりインフルエンザＡウイルス転写が開始されることを解析するため、ウイルスＲＮＡ鋳型に対するその塩基相補性、および／またはＲＮＡリーダー配列の推定塩基対合残基（単数または複数）のすぐ上流−１番目の１残基が異なる３種の特定のキャップ化リーダーコンストラクトＣ１０Ｃ１１Ａ１２、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４（表１）を作製し、様々な濃度で個別にインビトロインフルエンザ転写アッセイに加えた。α−グロビンリーダーにより開始されたＮＳ１転写の相対量をＲＴ−ＰＣＲにより解析したところ、Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２量が増えると、程度は低いもののＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４およびＣ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４の場合よりも、グロビンリーダーにより開始されたＮＳ１転写が競合により減少することが明らかになった（データ示さず）。
【００６８】
この作用を定量するため、ＡＭＶ３−ＮＳ１とα−グロビン−ＮＳ１との比を２ステップリアルタイム定量ＰＣＲで判定した。最初に、新規合成したＮＳ１転写物を一本鎖ｃＤＮＡに逆転写し、次いでＰＣＲ解析した（材料および方法を参照されたい）。Ｃ１０Ｃ１１Ａ１２（ｗｔ−ＡＭＶ３）と比較してキャップ化リーダーＲＮＡ分子Ｃ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を使用した場合、α−グロビン−ＮＳ１に対するＡＭＶ３−ＮＳ１の比率はほぼ３倍であることが観察された（図２Ａ）。３種のＡＭＶ３キャップ化リーダーミュータントをすべて比較した場合、Ｃ１０Ａ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４を含むサンプルが、α−グロビン−ＮＳ１に対するＡＭＶ３−ＮＳ１の比率が最も高く、次にＣ１０Ｃ１１Ａ１２Ｇ１３Ｃ１４、続いてＣ１０Ｃ１１Ａ１２であった（図２Ｂ）。
【００６９】
このことは全体として、キャップドナー分子の選択基準としての塩基対合の重要性を明らかにするだけでなく、そのように好適に使用されるキャップ化リーダー分子は、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス剤設計において改めて使用する際に有用である場合があるという考えをも裏付ける。
【実施例７】
【００７０】
さらにインビボでのインフルエンザ転写を刺激するＲＮＡリーダーの選択を塩基−対合が促進することを確認するため、キャップ化−ＲＮＡリーダーｗｔ  ＡＭＶ、Ｍｕｔ−２、Ｍｕｔ−３およびＭｕｔ−Ｎ１４（表７）をインフルエンザウイルス−感染細胞にトランスフェクトし、対競合においてキャップ−ドナーとして試験した。インビトロ解析と同様に、新規合成したウイルス転写物にマーカーヌクレオチドが存在すれば、ＲＮＡリーダー配列の同定が可能であった。
【００７１】
比較的高濃度（各３ｕｇ）でのＷＴ（１塩基−対合）とＭｕｔ−２の対競合においては、新規合成したＮＳ１転写物から全（１５個）クローンが、Ｍｕｔ−２ＲＮＡリーダーのマーカーヌクレオチドを含んでいた。１：１の比で１０分の１の量を使用しても、なお全クローン（１２個）にＭｕｔ−２リーダー配列が存在することが明らかになり、インビトロでの状況と同様に、インフルエンザウイルスが、ウイルスＲＮＡ鋳型に対する塩基相補性が高いキャップ化ＲＮＡ−リーダー配列を選好することが示唆された（表８）。
【００７２】
このことは、すべてのリーダーがＭｕｔ−Ｎ１４からスナッチングされた、比較的高濃度および１０分の１の濃度でのＷＴとＭｕｔ−Ｎ１４との対競合によって裏付けられた（表８）。
【００７３】
インビトロ解析の場合と同様に、Ｍｕｔ−２とＭｕｔ−３との間の競合ではＭｕｔ−３に対する強い選好性は示されなかった（表８）。これは、トリヌクレオチド反復（ＡＧＣ）が、ウイルスＲＮＡ鋳型に対する塩基−対合に様々な可能性を与えることで、おそらくＭｕｔ−２により競合物質強度が弱められ得るＭｕｔ−３リーダーの配列構成により説明されると考えられる。
【００７４】
インビトロ解析と同様に、塩基対合残基の−１および−２番目のヌクレオチドの重要性を、３塩基−対合残基および−１または−２番目に変化を持つミュータントＲＮＡリーダーの多重競合において解析した（表３および４）。こうした競合により、−１および−２番目にＣＣを保有するリーダーは選好性が低いことが明らかになった（表９および１０）。
【００７５】
上流ヌクレオチド残基と塩基−対合との相対的な重要性を解析するため、１塩基−対合残基および弱い上流配列構成を含むキャップ化ＲＮＡ分子と、３塩基−対合残基および強い上流配列構成を含むキャップ化ＲＮＡ分子、さらにその相互に入れ替えた変異体について対競合アッセイを行った（表１１）。どちらの場合も、３塩基−対合残基を含むＲＮＡリーダーは大部分が選好されたことから、転写開始においては塩基対合がＲＮＡリーダー選択の主要な決定要因であることが示唆された。
【００７６】
全体としてこうした結果から、インビトロの場合と同様に、インビボ／細胞培養物の感染におけるインフルエンザウイルスは、ウイルスＲＮＡ鋳型の３’末端（ｅｎｄ）に対する塩基−相補性（キャップ−構造から約１０〜１２番目）が高いキャップ化ＲＮＡリーダーを選好する。
【００７７】
（表1）
表１．競合アッセイに使用したＡＭＶ３キャップ化リーダー
2011520464.tif 000002
【００７８】
ウイルスの鋳型（３’−ＵＣＧ…）と強力に塩基対合するヌクレオチド残基を下線で示す；様々なＡＭＶ３リーダーを区別するのに使用したマーカーヌクレオチドは網掛けで示す。
【００７９】
（表２）
表２．表示したキャップ化リーダーのキャップスナッチングから得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000003
【００８０】
インフルエンザウイルス配列を下線で示す；各ミュータントのマーカーヌクレオチドは網掛けで示す。
【００８１】
（表３）
表３．表示したキャップ化リーダーのキャップスナッチングから得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000004
【００８２】
インフルエンザウイルス配列を下線で示す；各ミュータントのマーカーヌクレオチドは網掛けで示す。
【００８３】
（表４）
表４．表示したキャップ化リーダーのキャップスナッチングから得られたＮＰ  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000005
【００８４】
ウイルスの鋳型（３’−ＵＣＧ…）と強力に塩基対合するヌクレオチド残基を下線で示す；様々なＡＭＶ３キャップ化リーダーを区別するのに使用したマーカーヌクレオチドは網掛けで示す。
【００８５】
（表５）
表５．クローン化ｃＤＮＡのシーケンシングに関する刊行物で以前報告されたインフルエンザウイルスｍＲＮＡの５’末端（ｅｎｄ）の宿主由来の配列
2011520464.tif 000006
【００８６】
インフルエンザウイルス配列を下線で示す；キャップスナッチング過程におけるリーダーの使用に強い作用を及ぼし得るキャップ化リーダーの３’−末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）ヌクレオチドを網掛けで示す。クローン化分節がコードするタンパク質を右に表示する。
【００８７】
補足データ
【００８８】
（表６）
表６．プライマー配列
2011520464.tif 000007
【００８９】
ウイルスの鋳型と強力に塩基対合し得る残基を下線で示す；太字の残基はＴ７プロモーター配列である。
【００９０】
（表７）
表７：塩基−対合実験用のコンストラクト
2011520464.tif 000008
マーカー残基を太字で表示する。
【００９１】
（表８）
表８：．表示したキャップ化リーダーの細胞内キャップスナッチングから得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000009
マーカー残基を太字で表示する
【００９２】
（表９）
表９：塩基対合残基の残基−１が変異した表示したキャップ化リーダーの細胞内キャップスナッチングから得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000010
マーカー残基を太字で表示する
【００９３】
（表１０）
表１０：塩基対合残基の残基−２が変異した表示したキャップ化リーダーの細胞内キャップスナッチングから得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000011
マーカー残基を太字で表示する
【００９４】
（表１１）
表１１：相互に入れ替えたリーダー分子間の細胞内競合から得られたＮＳ１  ｍＲＮＡ５’末端（ｅｎｄ）配列
2011520464.tif 000012
マーカー残基を太字で表示する
【００９５】
参考文献
ビートン、Ａ．Ｒ．およびクリュグ、Ｒ．Ｍ．、１９８１、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９：４４２３−４４３６。
ビショップ、Ｄ．Ｈ．Ｌ．ら、１９８３、ヌクレイックアシッズリサーチ  １１：６４０９−６４１８。
ボウロイ、Ｍ．ら、１９９０、ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７５：５０−５８。
ボウロイ、Ｍ．ら、１９７８、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７５：４８８６−４８９０。
ボウロイ、Ｍ．ら、１９８０、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ  ７７：３９５２−３９５６。
ブラーム、Ｊ．ら、１９８３、セル（Ｃｅｌｌ）３４：６０９−６１８。
ケイトン、Ａ．Ｊ．およびロバートソン  Ｊ．Ｓ．、１９８０、ヌクレイックアシッズリサーチ８：２５９１−２６０３。
チャン、Ａ．Ｙ．ら、２００６、ヴァイロロジー  ３５１：２１０−２１７。
チュン、Ｔ．Ｄ．ら、１９９４、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ  ９１：２３７２−２３７６。
チアンチ、Ｃ．ら  １９９５、ジャーナルオブヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６９：３９９５−３９９９。
ドン（Ｄｅｎｇ）、Ｔ．ら、２００６、ジャーナルオブヴァイロロジー  ８０：２３３７−２３４８。
ダール、Ｒ．ら  １９８０、セル  ２１：４９５−５００。
ドゥイシングス、Ｄ．ら、１９９９、ジャーナルオブヴァイロロジー  ７３：５１７２−５１７５。
エンゲルハート、Ｏ．Ｇ．ら、２００５、ジャーナルオブヴァイロロジー  ７９：５８１２−５８１８。
フォーダー、Ｅ．ら、１９９９、ジャーナルオブヴァイロロジー  ７３：９６７９−９６８２。
フォーダー、Ｅ．ら、２０００、ＥＭＢＯリポーツ（ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ）１：５１３−５１８。
ガルシン、Ｄ．ら、１９９５、ジャーナルオブヴァイロロジー  ６９：５７５４−５７６２。
ハーゲン、Ｍ．ら、１９９４、ジャーナルオブヴァイロロジー  ６８：１５０９−１５１５。
ホンダ（Ｈｏｎｄａ）、Ａ．ら、１９８６、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６１：５９８７−５９９１。
ヒューイト、Ｌ．ら、１９９３、ヴァイロロジー  １９７：８０８−８１２。
ジン、Ｈ．およびエリオット（Ｅｌｌｉｏｔ）、Ｒ．Ｍ．、１９９３ａ、ジャーナルオブヴァイロロジー６７：１３９６−１４０４。
ジン、Ｈ．およびエリオット（Ｅｌｌｉｏｔ）、Ｒ．Ｍ．、１９９３ｂ、ジャーナルオブジェネラルヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）７４：２２９３−２２９７。
コルメリンク、Ｒ．ら、１９９２、ジャーナルオブジェネラルヴァイロロジー  ７３：２１２５−２１２８。
クリュグ、Ｒ．Ｍ．ら、１９７９、セル  １８：３２９−３３４。
クリュグ、Ｒ．Ｍ．ら、１９８０、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ  ７７：５８７４−５８７８。
ライ、Ｃ．Ｊ．ら、１９８１、Ｉｎ：インフルエンザウイルス間の遺伝的変異（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ａｍｏｎｇ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）（Ｄ．Ｐ．ナヤック（Ｎａｙａｋ）編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．、ｐ．１６９−１８０。
ラム、Ｒ．Ａ．およびライ、Ｃ．Ｊ．、１９８０、セル  ２１：４７５−４８５。
ラム、Ｒ．Ａ．およびライ、Ｃ．Ｊ．、１９８１、ヴァイロロジー  １１２：７４６−７５１。
リ、Ｍ．Ｌ．ら、１９９８、ザＥＭＢＯジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）１７：５８４４−５８５２。
リ、Ｍ．Ｌ．ら、２００１、ザＥＭＢＯジャーナル  ２０：２０７８−２０８６。
ルオ（Ｌｕｏ）、Ｇ．ら、１９９７、ジャーナルオブジェネラルヴァイロロジー  ７８：２３２９−２３３３。
マーコフ、Ｌ．およびライ、Ｃ．Ｊ．、１９８２、ヴァイロロジー  １１９：２８８−２９７。
ニールマン、Ｌ．ら、１９９３、ヴァイロロジー  １９６：８８３−８８７。
ニューマン、Ｇ．ら、１９９９、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ  ９６：９３４５−９３５０。
パン（Ｐｅｎｇ）、Ｑ．ら、１９９６、ウイルスリサーチ（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）４２：１４９−１５８。
プレシュカ、Ｓ．，ら、１９９６、ジャーナルオブヴァイロロジー  ７０：４１８８−４１９２。
プロッチ、Ｓ．Ｊ．ら、１９７９、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズＵＳＡ  ７６：１６１８−１６２２。
プロッチ、Ｓ．Ｊ．ら、１９８１、セル  ２３：８４７−８５８。
ラオ、Ｐ．ら、２００３、ザＥＭＢＯジャーナル２２：１１８８−１１９８。
ロバートソン、Ｈ．Ｄ．ら、１９８０、ヌクレイックアシッズリサーチ８：９２５−９４２。
シュミット、Ｗ．Ｍ．およびミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ）、Ｍ．Ｗ．、１９９９、ヌクレイックアシッズリサーチ２７：ｅ３１。
シュラム、Ｇ．ら、２０００、ヌクレイックアシッズリサーチ２８：ｅ９６。
シー（Ｓｈｉ）、Ｌ．ら、１９９５、ヴァイロロジー  ２０８：３８−４７。
シー（Ｓｈｉｈ）、Ｓ．Ｒ．およびクリュグ、Ｒ．Ｍ．、１９９６、ヴァイロロジー  ２２６：４３０−４３５。
シモンズ、Ｊ．Ｆ．およびピーターソン（Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｒ．Ｆ．、１９９１、ジャーナルオブヴァイロロジー６５：４７４１−４７４８。
バンクニッペンバーグ、Ｉ．ら、２００２、ヴァイロロジー  ３０３：２７８−２８６。
バンクニッペンバーグ、Ｉ．ら、２００５、ヴァイロロジー  ３３５：１２２−１３０。
ズワルト、Ｍ．Ｐ．ら、２００７、ジャーナルオブヴァイロロジカルメソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、近刊。
【図１】
2011520464.tif 000013
【図２】
2011520464.tif 000014
【国際調査報告】
2011520464.tif 000015
2011520464.tif 000016
2011520464.tif 000017