(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、乳腺腫の良性又は悪性の状態を診断するために少なくとも12個の遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を決定するための使用であって、前記ポリヌクレオチドプローブセットが核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体のポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせに含まれるポリヌクレオチドプローブが、それぞれのポリヌクレオチドプローブが１つの遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形と特異的にハイブリッド形成するようなものである使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、前記ライブラリーが配列番号1〜配列番号2938からなるそれぞれの核酸の少なくとも１つのコピーを含むか又は該コピーからなり、前記ポリヌクレオチドプローブが、それぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が１つの遺伝子及び／又は存在するならばその少なくとも１つの変異形の１つの標的領域の核酸配列と特異的にハイブリッド形成するようなものである、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための使用であって、
前記12個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654及び5683
で表され、
a)それぞれの与えられた遺伝子が、
a.変異形を有さない場合、該遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
b.１つの変異形を有する場合、該遺伝子及び変異形を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、該変異形は、その核酸配列が該遺伝子の核酸配列よりも短いことを特徴とし、
c.少なくとも２つの変異形を有する場合：
i.前記標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、該遺伝子の与えられた変異形に存在し、かつ
ii.該標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、
・与えられた変異形に存在しないか、又は
・前記遺伝子の配置とは異なる配置で、与えられた変異形に存在し、
前記変異形は、その核酸配列が該遺伝子の核酸よりも短いことを特徴とする
ような、該遺伝子を特徴づける少なくとも２つの標的領域を含み、
b)与えられた遺伝子のそれぞれの変異形が少なくとも１つの標的領域を有し、
・前記変異形が遺伝子のユニーク変異形である場合、前記変異形は該遺伝子と同じ標的領域を有し、
・前記変異形が少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形の１つである場合、該遺伝子のそれぞれの変異形は：
a.前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
b. 前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に天然には存在しない配置を示す標的領域が存在することとの組み合わせ
のいずれかを特徴とし、
c)それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの与えられたポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列により特異的に認識され、
d)ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、与えられた遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、
e)ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、
a.与えられた遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の核酸配列とハイブリッド形成し、
b.
i. 前記与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子のヌクレオチド配列とも、
ii.前記与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形のヌクレオチド配列とも
ハイブリッド形成できない
ようなものである、使用。
【請求項２】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群の少なくとも20個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、前記20個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683で表される使用。
【請求項３】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群の少なくとも35個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、前記35個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683で表される使用。
【請求項４】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群の少なくとも43個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、
前記43個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5455；5457；5462；5470；5475；5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686で表される使用。
【請求項５】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群の少なくとも206個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、
前記206個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692で表される使用。
【請求項６】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される275個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用。
【請求項７】
前記変異形が配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694のヌクレオチド配列で表され、それぞれの変異形とその対応する遺伝子との間の対応関係が表1A〜E及び表６に表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子及び存在するならば前記遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用。
【請求項８】
前記標的領域が、配列番号2939〜4578のポリヌクレオチド配列を特徴とし、それぞれの遺伝子及び存在するならばそれぞれの変異形のそれぞれの標的領域が表６に表される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用。
【請求項９】
ポリヌクレオチドプローブセットに含まれるそれぞれのポリヌクレオチドプローブが、配列番号1〜配列番号2938からなるライブラリーの核酸配列で表され、
それぞれのポリヌクレオチドプローブと、遺伝子及び存在するならばその変異形に対応する標的領域との対応関係が表６に表される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用。
【請求項１０】
50個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：配列番号136；137；138；157；158；159；167；168；169；171；172；173；177；312；313；313；314；315；316；；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374；375；790；791；792；793；794；795；969；972；981；1081；1082；1083；1129；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200；1203；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；2026；2027；2028；2179；2180及び2181であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む、1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための使用であって、
前記12個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654及び5683
で表される使用。
【請求項１１】
100個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：配列番号120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；312；313；314；315；316；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；378；379；380；381；555；556；557；558；560；561；562；566；567；788；789；790；791；792；793；794；795；800；801；802；821；822；823；969；971；972；981；1056；1057；1058；1075；1076；1077；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1509；1510；1511；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1561；1562；1682；1683；1684；1776；1777；1778；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2762；2763；2764；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む、少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも20個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも20個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための請求項10に記載の使用であって、
前記20個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683で表される使用。
【請求項１２】
150個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：配列番号4；5；6；120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；197；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；812；813；814；818；821；822；823；968；969；970；971；972；981；1056；1057；1058；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1284；1285；1315；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1580；1581；1582；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1690；1691；1692；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1952；1953；1954；1963；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2065；2067；2088；2089；2090；2091；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む、少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも35個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも35個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための請求項10又は11に記載の使用であって、
前記35個の遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683で表される使用。
【請求項１３】
200個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：配列番号4；5；6；120；121；122；123；130；131；132；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；195；196；197；198；199；200；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；809；810；811；812；813；814；815；816；817；818；821；822；823；824；825；826；840；841；845；846；847；868；968；969；970；971；972；973；974；975；976；977；981；1056；1057；1058；1059；1060；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1084；1085；1086；1087；1088；1089；1094；1095；1096；1103；1104；1105；1110；1111；1112；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1126；1127；1128；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1229；1230；1242；1243；1244；1245；1250；1251；1252；1262；1263；1264；1265；1266；1267；1268；1269；1270；1271；1272；1284；1285；1315；1335；1407；1408；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1512；1513；1514；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1563；1564；1580；1581；1582；1586；1587；1588；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1687；1688；1689；1690；1691；1692；1743；1744；1745；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1896；1897；1898；1952；1953；1954；1963；1974；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2061；2062；2063；2065；2067；2068；2072；2083；2084；2085；2088；2089；2090；2091；2092；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2381；2382；2383；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2601；2602；2603；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2778；2779；2783；2794；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む、少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも43個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも43個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための請求項10〜12のいずれか１項に記載の使用であって、
前記43個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5455；5457；5462；5470；5475；5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686で表される使用。
【請求項１４】
1228個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が表７の最初の1228行に示される、3985個のポリヌクレオチドプローブを含む、少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも206個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも206個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための請求項10〜13のいずれか１項に記載の使用であって、
前記206個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692で表される使用。
【請求項１５】
1640個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が表７に示される、1640個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、
乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される275個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば275個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための請求項10〜14のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体であって、前記50個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：
配列番号136；137；138；157；158；159；167；168；169；171；172；173；177；312；313；313；314；315；316；；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374；375；790；791；792；793；794；795；969；972；981；1081；1082；1083；1129；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200；1203；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；2026；2027；2028；2179；2180及び2181であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む集合体。
【請求項１７】
少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセットの請求項16に記載の集合体であって、前記100個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：
配列番号120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；312；313；314；315；316；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；378；379；380；381；555；556；557；558；560；561；562；566；567；788；789；790；791；792；793；794；795；800；801；802；821；822；823；969；971；972；981；1056；1057；1058；1075；1076；1077；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1509；1510；1511；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1561；1562；1682；1683；1684；1776；1777；1778；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2762；2763；2764；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む集合体。
【請求項１８】
少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセットの請求項16又は17に記載の集合体であって、前記150個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：
配列番号4；5；6；120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；197；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；812；813；814；818；821；822；823；968；969；970；971；972；981；1056；1057；1058；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1284；1285；1315；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1580；1581；1582；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1690；1691；1692；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1952；1953；1954；1963；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2065；2067；2088；2089；2090；2091；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む集合体。
【請求項１９】
少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットの請求項16〜18のいずれか１項に記載の集合体であって、前記200個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列：
配列番号4；5；6；120；121；122；123；130；131；132；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；195；196；197；198；199；200；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；809；810；811；812；813；814；815；816；817；818；821；822；823；824；825；826；840；841；845；846；847；868；968；969；970；971；972；973；974；975；976；977；981；1056；1057；1058；1059；1060；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1084；1085；1086；1087；1088；1089；1094；1095；1096；1103；1104；1105；1110；1111；1112；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1126；1127；1128；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1229；1230；1242；1243；1244；1245；1250；1251；1252；1262；1263；1264；1265；1266；1267；1268；1269；1270；1271；1272；1284；1285；1315；1335；1407；1408；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1512；1513；1514；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1563；1564；1580；1581；1582；1586；1587；1588；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1687；1688；1689；1690；1691；1692；1743；1744；1745；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1896；1897；1898；1952；1953；1954；1963；1974；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2061；2062；2063；2065；2067；2068；2072；2083；2084；2085；2088；2089；2090；2091；2092；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2381；2382；2383；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2601；2602；2603；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2778；2779；2783；2794；2860；2861；2862；2883；2884及び2885であり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、１〜４個の前記ポリヌクレオチドプローブを含む集合体。
【請求項２０】
3985個のポリヌクレオチドプローブを含む、少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセットの請求項16〜19のいずれか１項にに記載の集合体であって、前記1228個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、表７の最初の1228行に示される集合体。
【請求項２１】
1640個のポリヌクレオチドプローブセットの請求項16〜20のいずれか１項に記載の集合体であって、前記1640個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が表７に示される集合体。
【請求項２２】
請求項16〜21のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体を含むか又は該集合体からなるマイクロアレイ。
【請求項２３】
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定することにより、対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態を、好ましくはインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法であって、
前記12個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654及び5683で表され、
(1)前記生体試料からの核酸分子を、ポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなるポリヌクレオチドプローブセットの集合体と接触させて、核酸複合体の形成を可能にするステップであって、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、該ライブラリーは、配列番号1〜配列番号2938からなるそれぞれの核酸の少なくとも１つのコピーをを含むか又はそれからなり、
前記ポリヌクレオチドプローブは、それぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、１つの遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の１つの標的領域のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し、
a)それぞれの与えられた遺伝子が、
a.変異形を有さない場合、該遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
b.１つの変異形を有する場合、該遺伝子及び変異形を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、該変異形は、その核酸配列が該遺伝子の核酸配列よりも短いことを特徴とし、
c.少なくとも２つの変異形を有する場合：
iii.前記標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、該遺伝子の与えられた変異形に存在し、かつ
iv.該標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、
・与えられた変異形に存在しないか、又は
・前記遺伝子の配置とは異なる配置で、与えられた変異形に存在し、
前記変異形は、その核酸配列が該遺伝子の核酸よりも短いことを特徴とする
ような、該遺伝子を特徴づける少なくとも２つの標的領域を含み、
b)与えられた遺伝子のそれぞれの変異形が少なくとも１つの標的領域を有し、
・前記変異形が遺伝子のユニーク変異形である場合、前記変異形は該遺伝子と同じ標的を有し、
・前記変異形が少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形の１つである場合、該遺伝子のそれぞれの変異形は：
a.前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
b. 前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に天然には存在しない配置を示す標的領域が存在することとの組み合わせ
のいずれかを特徴とし、
c)それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの与えられたポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列により特異的に認識され、
d)ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、与えられた遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、
e)ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、
a.与えられた遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形のヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、
b.
i. 前記与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子のヌクレオチド配列とも、
ii.前記与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形のヌクレオチド配列とも
ハイブリッド形成できない
ようなものであるステップと、
(2)前のステップで形成された核酸複合体の検出から、前記遺伝子及び該遺伝子の変異形の発現のプロファイルを決定するステップと、
(3)前記プロファイルを、対照良性乳腺腫の参照発現プロファイル及び/又は対照悪性乳腺腫の参照発現プロファイルと比較するステップと、
(4)前記比較から：
-前記発現プロファイルが対照良性乳腺腫の参照発現プロファイルと同様である場合に、前記乳癌は良性であり、
-前記発現プロファイルが対照悪性乳腺腫の参照発現プロファイルと同様である場合に、前記乳癌は悪性である
と結論付けるステップと
を含む方法。
【請求項２４】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも20個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することによる、請求項23に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法であって、前記20個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683で表される方法。
【請求項２５】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の35個の決定された遺伝子による、請求項23又は24に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法であって、前記35個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683で表される方法。
【請求項２６】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも43個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することによる、請求項23〜25のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法であって、前記43個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686で表される方法。
【請求項２７】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも206個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することによる、請求項23〜26のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法であって、前記206個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692で表される方法。
【請求項２８】
配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される275個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することによる、請求項23〜27のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法。
【請求項２９】
前記変異形が、配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694の核酸配列で表され、それぞれの変異形とその対応する遺伝子との間の対応関係が、表1A〜E及び表６に表される請求項23〜28のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法。
【請求項３０】
前記標的領域が、配列番号2939〜4578のポリヌクレオチド配列を特徴とし、それぞれの遺伝子及び存在するならばそれぞれの変異形のそれぞれの標的領域が表６に示される請求項23〜29のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドプローブセットに含まれるそれぞれのポリヌクレオチドプローブが、配列番号1〜配列番号2938からなるライブラリーの核酸配列で表され、
それぞれのポリヌクレオチドプローブと、遺伝子及び存在するならばその変異形に対応する標的領域との間の対応関係が表６に示される、請求項23〜30のいずれか１項に記載の対象者の生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するための方法。
【請求項３２】
遺伝子及び/又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の発現の変動が
- 上回る表示(上方制御)、又は
- 下回る表示(下方制御)である
請求項23〜31のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
生体試料の核酸分子がmRNA又はcDNAであり、前記mRNAが配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される遺伝子及び/又は配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694のヌクレオチド配列で表される存在するならば少なくとも１つのそれらの変異形の発現による、請求項23〜32のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
-請求項22に記載のマイクロアレイ又は請求項16〜21のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドプローブセットの集合体と、
-可能であれば、生体試料の核酸分子を標識するための標識された分子と、
-可能であれば、生体試料の核酸分子の調製、特にmRNAの調製のための物質と
を含む、乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び/又はエクスビボで決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌のインビトロ分子診断について記載する。より具体的には、本発明は、乳腺腫の診断的評価のための分子プローブの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、西洋諸国における女性の最も頻度が高い癌である(フランスで年間に40000件の新しい症例)。最近10年間でいくつかの進歩が達成されているが、死亡率は高いままである(フランスで年間に11000件の死亡)。よって、この疾患における進歩の新しい段階が必要とされている。乳癌の生存率の改善を可能にする2つの軸がある：i.より早期でより正確な診断、ii.アジュバント療法の開発。
【０００３】
乳癌の診断は、現在のところ、その症例の大部分が、手術前針生検により行われている。この検査は、現在のところ、フランスにおいてレベル１で推奨されると考えられている(www.has-sante.fr)。この分野において専門の選択されたセンターにおいて、細針穿刺を用いて乳癌診断を行う。全体として、乳癌の手術前診断は、現在のところ、細針穿刺(FNA)又は針生検(CNB)のいずれかで得られた試料を顕微鏡で評価することにより可能である。このアプローチのそれぞれは、乳房障害を示す患者の治療の質を阻むいくつかの制限を有する。FNAは、許容できない割合の誤診を伴う。不確定の診断の割合は、実際に約30%である(Oyama T, Koibuchi Y, McKee G. Core needle biopsy (CNB) as a diagnostic method for breast lesions: comparison with fine needle aspiration cytology (FNA). Breast Cancer. 2004；11(4):339〜42；Orell SR, Farshid G. False-positive reports in fine needle biopsy of breast lesions. Pathology. 2001 Nov；33(4):428〜36；Meunier M, Clough K. Fine needle aspiration cytology versus percutaneous biopsy of nonpalpable breast lesions. Eur J Radiol. 2002 Apr；42(1):10〜6)。CNBは、よりよい診断性能を示すが、いくつかの大きい制限を伴う。まず、CNBは複雑な処置であるので、通常は乳房障害の検出後、数週間で予約がとられる。このことは、診断の遅れと、すなわち治療の遅れを導く。大量スクリーニングの増加につれて、この遅れはおそらく時間とともに増加するだろう。次に、CNBは、臨床上の副作用を伴う。この処置に関連する血腫は、実際に、0.6〜4%の範囲である(Barreau B, Tastet S, Lakdja F, Henriques C, Valentin F, Labat MJ, Dilhuydy MH.[Patients' information in percutaneous core breast biopsy] Bull Cancer. 2005 Mar；92(3):257〜65)。さらに、CNBは、FNAと比較して、より痛みを伴う処置である。最後に、CNBは頻度が高い疾患にとって高価な処置である(処置あたり200ユーロ)。全体として、これらのことを考慮すると、正確、迅速かつ費用を節約できるFNA試料に対して行われる診断試験に対する必要性が上昇する。この試験は、FNA試料の細胞診を置換するか、又はこれに補足的に行われるものであり得る。この試験は、より早期の安全で費用を節約できる診断手順を可能にするだろう。
【０００４】
大量スクリーニングに関して、マンモグラムが、現在のところ、大量スクリーニングの究極の基準とみなされている。にもかかわらず、このアプローチは、特に若い女性及び進行性の腫瘍において偽陰性の結果の割合が高いことにより制限される。さらに、マンモグラムは、かなりの割合の女性が検査を受けないという事実により制限される。これらのことは、マンモグラムよりよいか又はそれを補足し、かつより容易な処置に基づくスクリーニング検査に対する必要性を指摘する。
【０００５】
よって、患者に対して診断を行い、検出された乳腺腫の状態について診断する検査を提供する必要性がある。
乳腺腫の進展の分子学的機構の知見に基づく多くの方法が詳細に記載されている。これらの方法は、特に、乳腺腫の進展の特徴を規定できる遺伝子の発現又はタンパク質の変動を決定する大規模な手順を記載している。
【０００６】
WO 2007/048978は、癌を診断するための分子マーカーの検出のための方法及び組成物を記載している。特に、この文献は、患者における乳腺腫の存在又は進展を検出するために用いることができる方法及び組成物について記載している。
しかし、この文献は、特に、遺伝子の変異形の発現について興味を示すことなく、誤って制御されて発現された遺伝子の評価のためのマイクロアレイを開示している。
【０００７】
WO 2004/065545は、乳癌腫瘍状態の診断及び予後判定の方法を開示し、この方法は、70遺伝子の決められたリストのうちの少なくとも５つの遺伝子の発現プロファイルを、対照腫瘍の70遺伝子の決められたリストのうちの少なくとも５つの遺伝子の発現プロファイルと比較することからなる。
しかし、この文献は、開示される方法が、70遺伝子のリストから選択される上記の少なくとも５つの遺伝子のスプライシング変異形を検出して腫瘍の乳癌の状態を決定できることについて教示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エキソンの大規模発現を分析するための新しいアレイの設計により、２つの状態の間の異なる分子事象を非常に正確に同定することが可能になる。このアプローチは、異なって発現される遺伝子を分析する(従来のDNAアレイの場合と同様に)だけでなく、異なっているスプライシング事象も分析する。乳癌のために用いると、この大規模分析は、癌と良性障害との間の遺伝子配列の異なっている発現を同定できるだろう。これらのデータに基づいて、FNA試料に基づいて乳癌の分子診断を可能にし、迅速、正確かつ費用を節約できる診断を可能にする分子アッセイを設計することができるだろう。さらに、このアプローチは、血液試料、胸管洗浄(ductal lavage)又はFNAによる乳房サンプリング(breast sampling)に基づく乳癌スクリーニングのための分子学的検査を設計することを可能にするだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のある目的は、乳腺腫の状態を決定するための分子診断を提供することである。
本発明の別の目的は、乳腺腫の良性又は悪性の状態を決定するためのマイクロアレイを提供することである。
本発明の別の目的は、乳腺腫の良性又は悪性の状態を決定するために上記のマイクロアレイを用いる方法を提供することである。
本発明は、乳癌診断のためのキットも提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、乳腺腫の良性又は悪性の状態を診断するために、配列番号5419〜配列番号5693からなる遺伝子の群のうちの12個の遺伝子を含むサブグループの遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体(a multiplicity)の使用であって、前記ポリヌクレオチドプローブセットの集合体が、ポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなり、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含有し、それぞれの核酸配列が遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形と特異的にハイブリッド形成し、前記遺伝子が配列番号5419〜配列番号5693からなる遺伝子の群より選択され、
- それぞれの与えられた(given)遺伝子が、変異形を有さない場合、配列番号2939〜配列番号4578から選択される核酸配列を有し、かつ前記遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
- それぞれの与えられた遺伝子が、少なくとも１つの変異形を有する場合：
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される前記標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、前記遺伝子の与えられた変異形に存在し、
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される前記標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、与えられた変異形に存在しないか、又は前記遺伝子のものとは異なる配置で存在する
ような、前記遺伝子を特徴づける少なくとも２つの標的領域を含み、
【００１１】
- 与えられた遺伝子のそれぞれの変異形が、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択されるような少なくとも１つの標的領域を有し、
- それぞれの変異形が：
-それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、前記遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
-前記遺伝子に天然には存在しない配置を示す、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域が存在すること
のいずれかを特徴とし、
【００１２】
- ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブが、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域を含む特定の核酸配列とハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子、及び存在するならばその変異形は、少なくとも与えられたポリヌクレオチドプローブセットのポリヌクレオチドプローブにより特異的に認識され、
- ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成するが、該与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子ともハイブリッド形成できず、かつ該与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形ともハイブリッド形成できず、
前記ポリヌクレオチドプローブセットの集合体のポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせに含まれるポリヌクレオチドプローブは、それぞれのポリヌクレオチドプローブが、配列番号5419〜配列番号5693からなる遺伝子の群のうちの12個の遺伝子を含むサブグループの１つの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形と特異的にハイブリッド形成するようなものである使用を開示する。
【００１３】
本発明は、乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
- 配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子と、
- 存在するならば、前記少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形との発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、該ライブラリーは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸のそれぞれの少なくとも１つのコピーを含むか又は該コピーからなり、
前記ポリヌクレオチドプローブは、それぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、１つの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の１つの標的領域の核酸配列と特異的にハイブリッド形成するようなものであり、
前記12個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654及び5683で表され、
a) それぞれの与えられた遺伝子は、
a.変異形を有さない場合、該遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
b.１つの変異形を有する場合、前記遺伝子及びその変異形を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、好ましくは、該変異形は、その核酸配列が前記遺伝子の核酸配列よりも短いことを特徴とし、
c. 少なくとも２つの変異形を有する場合：
i.前記標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、前記遺伝子の与えられた変異形に存在し、
ii.前記標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、
・与えられた変異形に存在しないか、又は
・前記遺伝子のものとは異なる配置で、与えられた変異形に存在し、
好ましくは、前記変異形は、その核酸配列が前記遺伝子の核酸配列よりも短いことを特徴とする
ような、前記遺伝子を特徴づける少なくとも２つの標的領域を含み、
【００１４】
b) ある与えられた遺伝子のそれぞれの変異形は、少なくとも１つの標的領域を有し、
・前記変異形が遺伝子のユニーク変異形である場合、前記変異形は前記遺伝子と同じ標的を有し、
・前記変異形が少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形のうちの１つである場合、前記遺伝子のそれぞれの変異形は：
a.前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
b.前記遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、前記遺伝子に天然には存在しない配置を示す標的領域が存在することとの組み合わせ、
のいずれかを特徴とし、
【００１５】
c) それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの与えられたポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列により特異的に認識され、
d) ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、
【００１６】
e) ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、
a.与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形のヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、かつ
b.
i.前記与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子のヌクレオチド配列とも、
ii.前記与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形のヌクレオチド配列とも
ハイブリッド形成できない
ようなものであるが、
但し、前記遺伝子及び存在するならばその変異形は、それぞれ配列番号5431；5689；5651及び5682で表されるKRT17、LOC440421、KRT6C及びKRT6Aではない使用を開示する。
【００１７】
KRT17、LOC440421、KRT6C及びKRT6A遺伝子の場合、これらの遺伝子はそれぞれ配列番号5431；5689；5651及び5682で表され、ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列の上記の規定が、以下の場合を除いて用いられる：
1- KRT17を認識するポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのポリヌクレオチドプローブは、LOC440421及び存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成でき、
2- LOC440421を認識するポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのポリヌクレオチドプローブは、KRT17及び存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成でき、
3- KRT6Cを認識するポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのポリヌクレオチドプローブは、KRT6A及び存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成でき、
4- KRT6Aを認識するポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのポリヌクレオチドプローブは、KRT6C及び存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成できる。
【００１８】
本発明は、いくつかの遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動が、診断される乳腺腫の進展を特徴づけることを本発明者らが予期せぬことに観察したことに基づく。より具体的には、本発明の変異形は、異なるスプライシング、又は選択的スプライシングの産物である。
【００１９】
本発明者らは、275個の決定された遺伝子の群の少なくとも12個の決定された遺伝子、及び存在するならば該少なくとも12個の決定された遺伝子の変異形の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性の状態を特徴づけることを示した。
よって、本発明は、乳腺腫の良性の特徴  対  悪性の特徴を特徴づけるポリヌクレオチドプローブの使用について記載し、それぞれのポリヌクレオチドプローブは、１つの遺伝子及び存在するならば少なくとも１つのそのスプライシング変異形と特異的にハイブリッド形成し、前記遺伝子スプライシング変異形は、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより認識され得る。
【００２０】
遺伝学において、スプライシングは、転写後の遺伝子情報の改変であり、ここでは、前駆体メッセンジャーRNA (プレ-mRNA)のイントロンが除去され、前駆体メッセンジャーRNAのエキソンが連結される。スプライシングは、プレ-mRNAを調製して成熟メッセンジャーRNA (mRNA)を生成し、これが、タンパク質合成の一部として翻訳され、タンパク質を生成する。
本発明の意味において選択的スプライシングは、RNAスプライシングの変形機構であり、ここで、プレ-mRNAのエキソンが分離され、別のリボヌクレオチド配置を生み出すように再連結される。このようにして、選択的スプライシングは、遺伝子発現を用いて、より多様な転写産物の合成を促進する。
【００２１】
プレ-mRNAがDNAから転写されると、これは、いくつかのイントロン及びエキソンを含む。mRNAにおいて保持されるエキソンは、スプライシングプロセスの間に決定される。選択的スプライシング因子の使用が、「遺伝子」の定義の改変を導き、変異形の概念を課す。
例えば、３つのエキソンを含むプレ-mRNAは、変異形が遺伝子の少なくとも１つのエキソンと該遺伝子の失われた少なくとも１つのエキソンとを含まなければならないと考えられるならば、選択的スプライシングの結果として６つの異なる変異形を生成できると仮定される。
【００２２】
本発明において、遺伝子は、スプライシングプロセスの後に、DNA配列の転写の結果としてのmRNAに対応するデオキシリボ核酸配列を含むことにより規定される。よって、遺伝子は、該遺伝子のゲノム配列に存在する全てのエキソンを含むことを特徴とする。
本発明において考慮される275全ての遺伝子は、配列番号5419〜配列番号5693からなる群より選択される核酸配列を示す。
本発明において、遺伝子について２つの選択肢がある：
- 該遺伝子は、選択的スプライシングに付されず、変異形を有さないか、又は
- 該遺伝子は、少なくとも１つの変異形を有する。
【００２３】
変異形を有さない遺伝子の場合、この遺伝子は、本発明において、標的領域の存在を特徴とする。この標的領域は、該遺伝子の全体の核酸配列に含まれる核酸配列に相当する。
１つの変異形を有する遺伝子の場合、この遺伝子は、標的領域により規定され、その変異形は、同じ標的領域により規定される。該遺伝子とその変異形との間の違いは、該遺伝子の核酸配列が、その変異形の核酸配列よりも長いという事実により決定されることが好ましい。
この１つの標的領域による認識は、上記の遺伝子の代表性の重複を可能にする。実際に、１つの変異形を有する遺伝子に含まれる標的領域は、このようにして少なくとも２回、すなわち、遺伝子が存在する場合と、この遺伝子の変異形が存在する場合とに認識される。この重複は、遺伝子発現の変動の検出の特異性を増大させる。
少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の場合、この遺伝子は、この遺伝子を特徴づける少なくとも２つの領域により規定される。これらの領域は、よって、遺伝子の中に存在する。標的領域とも呼ばれるこれらの領域は、上記の遺伝子の全体の核酸配列に含まれる核酸配列に相当する。さらに、上記の遺伝子のこれらの標的領域は、上記の遺伝子の配列中の異なる位置にある。
本発明に関与する標的領域は、配列番号2939〜配列番号4578からなる群より選択される核酸配列を示す。
【００２４】
本発明によると、「変異形」とは、参照ポリヌクレオチド分子（遺伝子）とは異なるが、必須の特徴を保持するポリヌクレオチド分子として規定される。遺伝子及びその変異形は、例えば70%の核酸同一性、好ましくは80%の核酸同一性、好ましくは90%の核酸同一性、より好ましくは95%の核酸同一性を有する、類似のポリヌクレオチド配列を共有する。本発明の変異形は、アイソフォームともみなすこともできる。
【００２５】
与えられた遺伝子の変異形とみなされるためには、ポリヌクレオチド配列は、上記で規定される標的配列に相当する、該遺伝子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含まなければならない。
変異形が遺伝子のユニーク変異形である場合、この変異形は、その遺伝子と同じ標的領域を有し、好ましくは、上記の遺伝子の核酸配列のサイズよりも短いサイズの核酸配列を有する。上記の変異形は遺伝子のスプライシング生成物に相当するので、これは、通常、上記の遺伝子中に存在する１つ又は複数のエキソンが欠失している。にもかかわらず、いくつかの希な例において、遺伝子の変異形が、該遺伝子の核酸配列のサイズよりも大きいサイズの核酸配列を有することが可能である。
【００２６】
変異形が少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形である場合、上記の変異形は、与えられた遺伝子の核酸配列に関して核酸配列の存在下で少なくとも１つの違いを有する。少なくとも１つの標的配列が存在することと、少なくとも１つの標的配列が存在しないこととの特定の組み合わせは、与えられた変異形の特定の特徴を規定する。よって、それぞれの変異形は、遺伝子中に存在する全ての標的配列の存在及び不在の多様性に相当する「バーコード」により規定される。
例えば、遺伝子が３つのエキソンを含む場合、該遺伝子の最も小さい１つのエキソンからなり、該与えられた遺伝子のその他の２つのエキソンのうちの少なくとも１つを欠く全ての核酸配列は、該与えられた遺伝子の変異形であるとみなされる。
図1Aがこの例を示す。
【００２７】
本発明において、遺伝子の変異形は、少なくとも１つの標的領域を含むことを特徴とする。これらの標的領域は、配列番号2939〜配列番号4578からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００２８】
よって、遺伝子の与えられた変異形は、標的配列に関して、該変異形に相当する遺伝子中に存在する標的領域を少なくとも含み、該変異形に対応する遺伝子中に存在する少なくとも１つの標的領域がない（少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の場合のみ）ということを特徴とすることができる。
上記のように、少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形は、よって、変異形に対応する遺伝子の少なくとも１つの標的領域の存在と、変異形に対応する遺伝子の少なくとも１つの標的領域の不在との組み合わせに相当するバーコードにより特徴づけられる。
【００２９】
変異形は、別の様に規定することもできる。この別の規定は、本発明の特徴である選択的スプライシングにより支持される。
少なくとも３つのエキソンで構成される遺伝子が、異なってスプライシングされると、対応する変異形において、いくつかのエキソンが、遺伝子の配列中では天然に融合されていないエキソンに融合される。例えば、３つのエキソンE1、E2及びE3で構成される遺伝子において、１つの変異形は、E1とE3との融合により構成され得る。この遺伝子において、天然の配置は、配列E1-E2-E3に相当する。よって、変異形で観察される配置E1-E3は、非天然の配置であるとみなされる。
この場合、変異形は、遺伝子の天然配置に存在しない配列を示す。これは、通常、少なくとも１つの別のエキソンにより分けられた、離れたエキソン同士の結合部に相当する。変異形を特徴づける標的領域が、遺伝子の通常の配置では天然に離れている２つのエキソン間の結合部に相当する場合、上記の標的領域は、この変異形を特異的に特徴づける。この例を、図1Bに示す。
【００３０】
少なくとも１つの変異形を有するか又は有さない遺伝子の例を、図３に示す。
本発明によると、ポリヌクレオチドプローブを用いて遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動を検出して、乳腺腫の状態を決定するために用いられる。
人為的に、ポリヌクレオチドプローブをグループ分けしてポリヌクレオチドプローブセットを形成する。本発明で用いられる用語「ポリヌクレオチドプローブセット」は、上記のポリヌクレオチドプローブの群を規定する。与えられたポリヌクレオチドプローブセットは、１つのポリヌクレオチドプローブからいくつかのポリヌクレオチドプローブまでを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドプローブセットは、１つのポリヌクレオチドプローブから３つ又は４つのポリヌクレオチドプローブまでを含む。このことにより、本発明のポリヌクレオチドプローブセットに再グループ分けされるポリヌクレオチドプローブは、同じ標的領域とハイブリッド形成できる。
【００３１】
ポリヌクレオチドプローブを一緒にして、「ポリヌクレオチドプローブセットのプール」を形成する。プールのポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、遺伝子及び／又は存在するならば該遺伝子の変異形の核酸配列と特異的にハイブリッド形成できる。
或いは、プールのポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、別の遺伝子の核酸配列とも、存在するならば該異なる遺伝子の変異形の核酸配列とも特異的にハイブリッド形成できない。
しかし、上記の規定を変更すべきわずかな場合がある。遺伝子KRT17 (配列番号5431)及びLOC440421 (配列番号5689)の場合、これらの遺伝子は２つの異なる遺伝子であるが、その核酸配列中に高い類似性／同一性を共有する。よって、これらの２つの遺伝子は、同一であり得るいくつかの遺伝子領域をそれらの核酸配列中に有する。標的領域が上記の遺伝子領域中に存在すると、よって、該遺伝子領域に含まれる標的領域を認識するポリヌクレオチドプローブは、２つの遺伝子を認識できる。
【００３２】
同様の例が、遺伝子KRT6A (配列番号5682)及びKRT6C (配列番号5651)にも用いられる。
よって、ポリヌクレオチドプローブセットのプールのポリヌクレオチドプローブは、遺伝子及びその変異形を特徴づけることができる。さらに、与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形は、ポリヌクレオチドプローブセットの同じプールのポリヌクレオチドプローブのみによって検出できる。
【００３３】
本発明によると、それぞれの遺伝子及び存在するならばその変異形は、プローブセットの全てのポリヌクレオチドプローブにより検出できる。さらに、それぞれの遺伝子は、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブセットの全てのポリヌクレオチドプローブにより認識されることができ、すなわち、それぞれの遺伝子及びその変異形は、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブセットにより規定され得る。
変異形は、２つの異なるポリヌクレオチドプローブセットに属する２つのポリヌクレオチドプローブにより検出できるが、但し、これらはポリヌクレオチドプローブセットの同じプールに属する。
【００３４】
集合体、プール、ポリヌクレオチドプローブセット及びポリヌクレオチドプローブの相互関係を、図２に示す。
用語「配列番号1〜配列番号2938からなる核酸のそれぞれの少なくとも１つのコピーを含むか又は該コピーからなるライブラリー」とは、該ライブラリーが、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸で表されるそれぞれのポリヌクレオチドプローブの１又は２又は３又は４又は５又は６又は７又は８又は９又は10コピーを含み得ることを意味する。よって、最小のライブラリーは、2938個のポリヌクレオチドプローブを含み、最大のライブラリーは、29380個のポリヌクレオチドプローブを含む。好ましくは、本発明の好ましいライブラリーは、4582個のポリヌクレオチドプローブを含む。
【００３５】
本発明において、「良性の乳腺腫」は、いずれかの非癌性乳房異常である。いくつか（全てではない）の良性状態は、乳癌の危険性の増大のシグナルになり得る。最も一般的な良性乳房状態は、線維嚢胞性乳房状態、良性乳腺腫及び乳房炎症を含む。良性乳房状態の型及び患者の医療状態に応じて、治療は必要であるか又は必要でない。
本発明において、「悪性の乳腺腫」は、乳房内の細胞から発生した悪性腫瘍のことをいう。悪性腫瘍は、健康な体細胞に浸潤して破壊する。腫瘍内の細胞の群も離脱して、体の他の部分に広がり得る。体のある領域から他の領域に広がった細胞は、転移と呼ばれる。
【００３６】
用語「塩基」とは、DNA又はRNAの成分、すなわちそれぞれデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを規定するために用いられる。
用語「核酸」「核酸分子」「核酸配列」「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は、DNA又はRNA分子を特徴づける塩基の鎖を規定するために均等に用いられる。
本発明において、「ポリヌクレオチドプローブ」とは、種々の長さのDNA又はRNAに相当する核酸分子のフラグメントを表す。ポリヌクレオチドプローブの長さは、通常、15塩基〜1000塩基、好ましくは20塩基〜500塩基に含まれる。有利には、本発明で規定されるポリヌクレオチドプローブは、20塩基〜30塩基を含む。これらのポリヌクレオチドプローブは、それらの核酸配列により規定される。
本発明において、用語「集合体」及び「組み合わせ」は、それぞれポリヌクレオチドプローブセットの群及びポリヌクレオチドプローブの群を規定するために用いられる。これらの群は、類似の情報を含むことを特徴とするプローブの集合又はプローブのセットに相当する。
【００３７】
本発明によると、核酸プローブに相当するそれぞれの核酸配列は、上記の遺伝子の標的領域と「特異的にハイブリッド形成する」。これらの用語は、それぞれのポリヌクレオチドプローブが、遺伝子及び／又は存在するならば、上記で規定されるその変異形とハイブリッド形成できることを意味する。それによりポリヌクレオチドプローブは、１本鎖核酸分子（DNAもしくはRNAである遺伝子及び／又はその変異形）とハイブリッド形成し、その核酸配列は、プローブの核酸配列と、遺伝子及び／又は該遺伝子の変異形の核酸配列との間の相補性による塩基対形成を可能にする。塩基対形成(A-T；G-C)は、当業者に公知の概念である。
それぞれのポリヌクレオチドプローブは、１つの遺伝子及び／又は該遺伝子の少なくとも１つの変異形と、標的領域と呼ばれる該変異形の特定の領域においてハイブリッド形成できる。
よって、上記の標的領域は、ポリヌクレオチドプローブと、遺伝子及び／又は存在するならばその変異形との間の対形成を可能にする領域として規定される。
これにより、それぞれのポリヌクレオチドプローブは、遺伝子及び／又は存在するならば該遺伝子の少なくとも１つの変異形を規定できる。
【００３８】
本発明によると、それぞれのポリヌクレオチドプローブは、標的領域に含まれる特定の核酸配列と特異的にハイブリッド形成する。さらに、それぞれのポリヌクレオチドプローブは、同じポリヌクレオチドプローブセットの別のプローブにより認識される配列と部分的に重複する配列を認識できる。
まとめると、本発明において、それぞれの遺伝子又は関連する転写産物は、変異形の形態で異なって発現され得る。これらの変異形は、特定の領域、すなわち標的領域の配列の存在又は不在又は変動により互いに異なる。この領域は、１〜３個のポリヌクレオチドプローブにより認識されやすく、同じ標的領域とハイブリッド形成する該ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドプローブセットに一緒にまとめられる。
【００３９】
よって、本発明のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用は、配列番号5419〜配列番号5693で構成される群の遺伝子により構成される決定された遺伝子の群のうち、配列番号5421、配列番号5423、配列番号5432、配列番号5434、配列番号5486、配列番号5491、配列番号5525、配列番号5552、配列番号5599、配列番号5652、配列番号5654及び配列番号5683からなる少なくとも12個の決定された遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を検出することを可能にし、当業者は、乳腺腫が悪性又は良性であるかを決定できる。
【００４０】
このことにより、12個の決定された遺伝子の群に属する与えられた遺伝子及び／又は少なくとも１つのその変異形の発現が、良性腫瘍のものに類似の「プロファイル」に相当する場合、この患者の腫瘍は、良性の状態に進展しているとみなされる。対照的に、12個の遺伝子の群に属する遺伝子及び／又は少なくとも１つのその変異形の発現が、悪性腫瘍に類似の「プロファイル」のものに相当する場合、腫瘍は悪性腫瘍であるとみなされる。
【００４１】
ある実施形態において、本発明は、乳腺腫の良性又は悪性状態を診断するために、配列番号5419〜配列番号5693からなる群の遺伝子のうちの12個の遺伝子を含むサブグループの遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、該ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、ポリヌクレオチドの1640個のプローブセットから選択されるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなり、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、それぞれの核酸配列は、配列番号5419〜配列番号5693からなる遺伝子の群から選択される遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の少なくとも１つとハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子は、変異形を有さない場合、配列番号2939〜配列番号4578から選択される核酸配列を有し、かつ該遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
- それぞれの与えられた遺伝子は、少なくとも１つの変異形を有する場合：
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される上記の標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、上記の遺伝子の与えられた変異形に存在し、
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される上記の標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、与えられた変異形に存在しないか、又は上記遺伝子のものとは異なる配置で存在する
ような、上記の遺伝子を特徴づける少なくとも２つの標的領域を含み、
【００４２】
- 与えられた遺伝子のそれぞれの変異形が、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択されるようなものである少なくとも１つの標的領域を有し、
- それぞれの変異形は：
-それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、上記の遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、上記の遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
-それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、上記遺伝子に天然には存在しない配置を示す標的領域が存在すること
を特徴とし、
【００４３】
- ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定の核酸配列とハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形は、少なくとも与えられたポリヌクレオチドプローブセットにより特異的に認識され、
- ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成するが、該与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子ともハイブリッド形成できず、かつ該与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形ともハイブリッド形成できないようなものであり、
【００４４】
前記ポリヌクレオチドプローブセットの集合体のポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせに含まれるポリヌクレオチドプローブは、それぞれのポリヌクレオチドプローブが、配列番号5419〜配列番号5693からなる群の遺伝子のうちの12個の遺伝子を含むサブグループの１つの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形と特異的にハイブリッド形成する使用を開示する。
【００４５】
ある好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される遺伝子の群の少なくとも20個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための、上記で規定されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、該20個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列で表される：
配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683。
【００４６】
本発明は、275個の決定された遺伝子から選択される少なくとも20個の決定された遺伝子の群の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性状態を決定するのに充分であるという予期せぬ観察に基づく。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも35個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための、上記で規定されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、該35個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列で表される：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683。
【００４８】
本発明は、また、275個の決定された遺伝子から選択される少なくとも35個の決定された遺伝子の群の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性状態を決定するのに充分であるという予期せぬ観察に基づく。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも43個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための、上記で規定されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、該43個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列で表される：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5455；5457；5462；5470；5475；5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686。
【００５０】
本発明は、また、275個の決定された遺伝子から選択される少なくとも43個の決定された遺伝子の群の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性状態を決定するのに充分であるという予期せぬ観察に基づく。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群の少なくとも206個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための、上記で規定されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、該206個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列で表される：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692。
【００５２】
本発明は、また、275個の決定された遺伝子から選択される少なくとも206個の決定された遺伝子の群の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性状態を決定するのに充分であり、最良の結果を提供するという予期せぬ観察に基づく。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体の、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される275個の決定された遺伝子の発現の変動を決定するための使用を開示する。
本発明は、また、275個の決定された遺伝子の発現の変動が、乳腺腫の良性又は悪性状態を決定するのに充分であるという予期せぬ観察に基づく。
【００５４】
よって、ある有利な実施形態において、本発明は、12個の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形の発現の変動の検出を可能にするポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用について記載し、該変動が乳腺腫の良性又は悪性の特徴を規定する。
より具体的には、12個の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形は、配列番号5421、配列番号5423、配列番号5432、配列番号5434、配列番号5486、配列番号5491、配列番号5525、配列番号5552、配列番号5599、配列番号5652、配列番号5654及び配列番号5683からなる核酸配列で表され、それらの標的配列により特異的に認識される。
【００５５】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される遺伝子及び存在するならば該遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用に関し、前記変異形は、配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694の核酸配列で表され、各変異形とその対応する遺伝子との対応関係は、表1A〜E及び表６に示す。
【００５６】
よって、本発明により、本発明者らは、275個の遺伝子群から選択される少なくとも12個の遺伝子、及び少なくとも12個の遺伝子のそれぞれの少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定することが、重大な偽陽性なしで、乳腺腫の良性又は悪性の状態に関する良好な情報を与えることを示している。
【００５７】
また、本発明の別の態様は、275個の決定された遺伝子の群の
少なくとも20個の決定された遺伝子、又は
少なくとも35個の決定された遺伝子、又は
少なくとも43個の決定された遺伝子、又は
少なくとも206個の決定された遺伝子
の発現、及び
少なくとも20個の決定された遺伝子、又は
少なくとも35個の決定された遺伝子、又は
少なくとも43個の決定された遺伝子、又は
少なくとも206個の決定された遺伝子
の少なくとも１つの変異形の発現
の変動の研究が、病理医に、乳腺腫が良性若しくは悪性であるか、又は良性若しくは悪性になり得るかを明確に決定させることを可能にすることを示す。
ある特定の実施形態において、275個全ての決定された遺伝子及び少なくとも１つのそれらの変異形の発現の変動が、診断を可能にする。
【００５８】
別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の決定された遺伝子の群のうちの少なくとも12個の決定された遺伝子、及び少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表1Aに示す。
表1Aは、12個の決定された遺伝子の群とそれらの対応する変異形との間の対応関係を示す。
【００５９】
【表１Ａ−１】
2011508598.tif 000002
【００６０】
【表１Ａ−２】
2011508598.tif 000003
【００６１】
別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の遺伝子の群のうちの少なくとも20個の決定された遺伝子、及び少なくとも20個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表1Bに示す。
表1Bは、20個の決定された遺伝子の群とそれらの対応する変異形との間の対応関係を示す。
【００６２】
【表１Ｂ−１】
2011508598.tif 000004
【００６３】
【表１Ｂ−２】
2011508598.tif 000005
【００６４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の決定された遺伝子の群のうちの少なくとも35個の決定された遺伝子、及び少なくとも35個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表1Cに示す。
表1Cは、35個の決定された遺伝子の群とそれらの対応する変異形との間の対応関係を示す。
【００６５】
【表１Ｃ−１】
2011508598.tif 000006
【００６６】
【表１Ｃ−２】
2011508598.tif 000007
【００６７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の決定された遺伝子の群のうちの少なくとも43個の決定された遺伝子、及び少なくとも43個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表1Dに示す。
表1Dは、43個の決定された遺伝子の群とそれらの対応する変異形との間の対応関係を示す。
【００６８】
【表１Ｄ−１】
2011508598.tif 000008
【００６９】
【表１Ｄ−２】
2011508598.tif 000009
【００７０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の決定された遺伝子の群のうちの少なくとも206個の決定された遺伝子、及び少なくとも206個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表1Eに示す。
表1Eは、206個の決定された遺伝子の群とそれらの対応する変異形との間の対応関係を示す。
【００７１】
【表１Ｅ−１】
2011508598.tif 000010
【００７２】
【表１Ｅ−２】
2011508598.tif 000011
【００７３】
【表１Ｅ−３】
2011508598.tif 000012
【００７４】
【表１Ｅ−４】
2011508598.tif 000013
【００７５】
【表１Ｅ−５】
2011508598.tif 000014
【００７６】
【表１Ｅ−６】
2011508598.tif 000015
【００７７】
【表１Ｅ−７】
2011508598.tif 000016
【００７８】
【表１Ｅ−８】
2011508598.tif 000017
【００７９】
【表１Ｅ−９】
2011508598.tif 000018
【００８０】
【表１Ｅ−１０】
2011508598.tif 000019
【００８１】
別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693で表される275個の決定された遺伝子、及び存在するならば少なくとも１つのそれらの変異形の発現の変動を決定するための上記で規定される使用に関し、遺伝子とそれらの変異形との対応関係は、以下の表６に示す。
【００８２】
表６は、本発明で開示される全ての配列間の対応関係をまとめる。この表において：
- 配列番号1〜2938は、ポリヌクレオチドプローブ、並びにそれらが認識できる標的、変異形及び遺伝子を表し、
- 配列番号2939〜4578は、標的領域、並びにそれらを含有する変異形及び遺伝子、並びにそれらを認識するポリヌクレオチドプローブを表し、
- 配列番号4579〜5418及び配列番号5694は、変異形及びそれらの対応する遺伝子、並びにそれらが含む標的、及びそれらを認識するポリヌクレオチドプローブも表し、
- 配列番号5419〜5493は、遺伝子を表す。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用に関し、ここで、標的領域は、配列番号2939〜4578のポリヌクレオチド配列を特徴とし、それぞれの遺伝子及び存在するならばそれぞれの変異形のそれぞれの標的領域は、表６に示す。
例えば、本発明において、275遺伝子の群の少なくとも12個の決定された遺伝子の群の発現の変動を検出するために、12個の遺伝子のそれぞれは以下の標的領域を有する：
AK5 (配列番号5654)は、以下の標的領域を含む：配列番号2979及び2988、
COL17A1 (配列番号5683)は、以下の標的領域を含む：配列番号2944；2955；2971；2973及び2974、
DMD (配列番号5421)は、以下の標的領域を含む：配列番号2939；2940；2941；2942；2943；2945；2947；2949；2950；2952；2953；2957；2961；2962；2963；2964；2970及び2980、
KIT (配列番号5423)は、以下の標的領域を含む：配列番号2984；2946；2951；2954；2958；2960；2965；2969；2975及び2978
KRT16 (配列番号5525)は、以下の標的領域を含む：配列番号2966及び2972、
KRT14 (配列番号5434)は、以下の標的領域を含む：配列番号2946；2951；2954；2958；2960；2965；2969；2975及び2978、
KRT5 (配列番号5432)は、以下の標的領域を含む：配列番号2985、
MYH11 (配列番号5599)は、以下の標的領域を含む：配列番号2948；2956；2959；2967；2976；2981；2982及び2986、
NRG1 (配列番号5552)は、以下の標的領域を含む：配列番号2977、
PTN (配列番号5486)は、以下の標的領域を含む：配列番号2983、
SFRP1 (配列番号5491)は、以下の標的領域を含む：配列番号2968、
TSHZ2 (配列番号5652)は、以下の標的領域を含む：配列番号2987。
【００８４】
表６を用いて、遺伝子及び変異形がわかっていれば、対応する標的領域の配列が容易に同定される。
【００８５】
別の特定の実施形態において、本発明は、上記で定義される遺伝子及び／又は存在するならばそれらの変異形の発現の変動を決定するためのポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットに含まれるそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、配列番号1〜配列番号2938からなるライブラリーの核酸配列で表され、それぞれのポリヌクレオチドプローブと遺伝子及び存在するならばその変異形に対応する標的領域との間の対応関係は、表６に示される。
【００８６】
例えば、本発明において、275遺伝子の群の少なくとも12個の決定された遺伝子の群の発現の変動を検出するために、12個の遺伝子のそれぞれは以下のポリヌクレオチドプローブにより認識される：
AK5 (配列番号5654)は、配列番号790；791；792；793；794及び795のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
COL17A1 (配列番号5683)は、配列番号157；158；159；167；168；169；171；172；173及び177のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
DMD (配列番号5421)は、配列番号312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374及び375のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KIT (配列番号 5423)は、配列番号1081；1082及び1083のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT14 (配列番号5434)は、配列番号1165；1158；1159；1160；1161；1162；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200及び1203のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT16 (配列番号5525)は、配列番号1262；1263；1264；1267；1268及び1269のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT5 (配列番号 5432)は、配列番号1129；1140及び1141のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
MYH11 (配列番号5599)は、配列番号 1522；1519；1520；1521；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556及び1557のポリヌクレオチドプローブにより認識され
NRG1 (配列番号5552)は、配列番号969；972及び981のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
PTN (配列番号5486)は、配列番号2026；2027及び2028のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
SFRP1 (配列番号 5491)は、配列番号2179；2180及び2181のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
TSHZ2 (配列番号 5652)は、配列番号136；137及び138のポリヌクレオチドプローブにより認識される。
【００８７】
まとめると、275遺伝子の群の少なくとも12個の決定された遺伝子の同じ例について、以下の対応関係がある：
NRG1 (配列番号5552)及びその変異形の１つ(配列番号5084)はともに配列番号2977の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号969、972及び981のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
PTN (配列番号5486)及びその変異形の１つ(配列番号4666)はともに配列番号2983の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号2026、2027及び2028のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
SFRP1 (配列番号5491)及びその変異形の１つ(配列番号5161)はともに配列番号2968の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号2179、2180及び2181のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
TSHZ2 (配列番号5652)及びその変異形の１つ(配列番号4962)はともに配列番号2987の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号136、137及び138のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
KIT (配列番号5423)及びその変異形の１つ(配列番号5107)はともに配列番号2984の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1081、1082及び1083のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
KRT16 (配列番号5525)及びその変異形の２つ(配列番号4826及び4881)は：
KRT5及び配列番号4826がともに配列番号2972の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1267、1268及び1269のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT5及び配列番号4881がともに配列番号2966の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1262、1263及び1264のポリヌクレオチドプローブにより認識される
ようなものである、
【００８８】
KRT5 (配列番号5432)及びその変異形の１つ(配列番号5279)はともに配列番号2985の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1129、1140及び1141のポリヌクレオチドプローブにより認識される、
KRT14 (配列番号5434)及びその変異形の６つ(配列番号4819、4825、4845、4877、4891及び4969)は：
KRT14及び配列番号4819がともに配列番号2954、2960及び2969の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号116及び1166、配列番号1158、並びに配列番号1159、1160及び1161のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
KRT14及び配列番号4825がともに配列番号2975及び2978の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1167、1168及び1169、並びに配列番号1162、1170及び1171のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
KRT14及び配列番号4845がともに配列番号2965の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1203のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT14及び配列番号4877がともに配列番号2946の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1198、1199及び1200のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT14及び配列番号4891がともに配列番号2958の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1185、1186及び1194のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
KRT14及び配列番号4969がともに配列番号2951の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1185、1186及び1194のポリヌクレオチドプローブにより認識される
ようなものである、
【００８９】
MYH11 (配列番号5599)及びその変異形の４つ(配列番号4697、4870、5361及び5365)は：
MYH11及び配列番号4697がともに配列番号2948及び2986の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1522；1523及び1524、並びに配列番号1519；1520及び1521のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
MYH11及び配列番号4870がともに配列番号2956、2959、2981及び2982の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1551、1552及び1553、配列番号1523、1524及び1557、配列番号1551、1552及び1553、並びに配列番号 1554、1555及び1556のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
MYH11及び配列番号5361がともに配列番号2967の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1534、1535及び1536のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
MYH11及び配列番号5365がともに配列番号2976の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号1544、1545及び1546のポリヌクレオチドプローブにより認識される
ようなものである、
【００９０】
AK5 (配列番号5654)及びその変異形の１つ(配列番号4654)はともに配列番号2979及び配列番号2988の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号790、791及び792、並びに配列番号793、794及び795のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識される、
COL17A1 (配列番号5599)及びその変異形の４つ(配列番号4739、4784、5242及び5384)は：
COL17A1及び配列番号4739がともに配列番号2944及び2955の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号171；172及び173、並びに配列番号177のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
COL17A1及び配列番号4784がともに配列番号2973の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号167、168及び169のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
COL17A1及び配列番号5242がともに配列番号2974の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号167、168及び177のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
COL17A1及び配列番号5384がともに配列番号2971の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号157、158及び159のポリヌクレオチドプローブにより認識される
ようなものである、
【００９１】
DMD (配列番号5421)及びその変異形の７つ(配列番号4664、4860、5058、5095、5150、5381及び5410)は：
DMD及び配列番号4664がともに配列番号294及び2947の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号312、313及び314、並びに配列番号315、316及び317のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
DMD及び配列番号4860がともに配列番号2940の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号364、365及び366のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
DMD及び配列番号5058がともに配列番号2950の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号353、360及び361のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
DMD及び配列番号5095がともに配列番号2939、2942、2945、2949、2953、2961、2963、2964及び2970の標的領域を含み、該標的領域は、
・    配列番号333、334及び335、
・    配列番号312、313及び348、
・    配列番号315、331及び336、
・    配列番号339、340及び341、
・    配列番号324、325及び326、
・    配列番号345、346及び347、
・    配列番号315、330及び331、
・    配列番号327、328及び329、並びに
・    配列番号327、328及び329
のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
DMD及び配列番号5150がともに配列番号2980の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号368、374及び375のポリヌクレオチドプローブにより認識され、
DMD及び配列番号5381がともに配列番号2941、2952及び2962の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号364、365及び366、配列番号315、316及び370、並びに配列番号367、368及び369のポリヌクレオチドプローブによりそれぞれ認識され、
DMD及び配列番号5410がともに配列番号2957の標的領域を含み、該標的領域は、配列番号315、316及び370のポリヌクレオチドプローブにより認識される
ようなものである。
【００９２】
表６を用い、遺伝子及び変異形がわかっているならば、対応する標的領域及びプローブの配列が容易に同定される。
【００９３】
本発明は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも12個の決定された遺伝子のうちの遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、1640ポリヌクレオチドプローブセットから選択される少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、該50個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列であり：
配列番号136；137；138；157；158；159；167；168；169；171；172；173；177；312；313；313；314；315；316；；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374；375；790；791；792；793；794；795；969；972；981；1081；1082；1083；1129；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200；1203；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；2026；2027；2028；2179；2180及び2181、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが１〜４個の上記のポリヌクレオチドプローブを含み、
上記の12個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654 及び5683で表され、対応する変異形が表1Aに示される使用にも関する。
【００９４】
ある好ましい実施形態において、本発明は上記で規定される使用に関し、ここで、少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、上記のとおりであり、配列番号167；168；177；312；313；327；328；329；331；364；365；366；368；370；1185；1186；1194；1523；1524；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316は３コピー存在し、配列番号315は５コピー存在する。
よって、上記の50個の全てのポリヌクレオチドプローブセットにおいて、143個のポリヌクレオチドプローブが存在し、上記のポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１回存在し、特に配列番号167；168；177；312；313；327；328；329；331；364；365；366；368；370；1185；1186；1194；1523；1524；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316は３コピー存在し、配列番号315は５コピー存在する。
【００９５】
50個のヌクレオチドプローブセットに含まれる上記のポリヌクレオチドプローブは、上記の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形を標的領域により特異的に認識し、対応関係は表６から導かれる。
【００９６】
ある好ましい実施形態において、本発明は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも20個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも20個の決定された遺伝子のうちの遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、上記で定義される少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、該100個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列であり：
配列番号120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；312；313；314；315；316；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；378；379；380；381；555；556；557；558；560；561；562；566；567；788；789；790；791；792；793；794；795；800；801；802；821；822；823；969；971；972；981；1056；1057；1058；1075；1076；1077；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1509；1510；1511；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1561；1562；1682；1683；1684；1776；1777；1778；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2762；2763；2764；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが１〜４個の上記のポリヌクレオチドプローブを含み、
上記の20個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683で表され、対応する変異形が表1Bに示される使用も関する。
【００９７】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される使用に関し、ここで、少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、上記のとおりであり、配列番号167；168；177；312；313；316；317；327；329；330；353；361；364；365；366；367；368；369；370；821；822；823；1129；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1203；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号328；331；1162；1194；1519；1520；1521及び1524は３コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
よって、上記の100個の全てのポリヌクレオチドプローブセットにおいて、282個のポリヌクレオチドプローブが存在し、上記のポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１回存在し、特に配列番号167；168；177；312；313；316；317；327；329；330；353；361；364；365；366；367；368；369；370；821；822；823；1129；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1203；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号328；331；1162；1194；1519；1520；1521及び1524は３コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
【００９８】
100個のヌクレオチドプローブセットに含まれる上記のポリヌクレオチドプローブは、上記の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形を標的領域により特異的に認識し、対応関係は表６から導かれる。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも35個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも35個の決定された遺伝子のうちの遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、上記で定義される少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、該150個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列であり：
配列番号4；5；6；120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；197；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；812；813；814；818；821；822；823；968；969；970；971；972；981；1056；1057；1058；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1284；1285；1315；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1580；1581；1582；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1690；1691；1692；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1952；1953；1954；1963；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2065；2067；2088；2089；2090；2091；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
それぞれのポリヌクレオチドプローブセットが１〜４個の上記のポリヌクレオチドプローブを含み、
上記の35個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683で表され、対応する変異形が表1Cに示される使用に関する。
【０１００】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される使用に関し、ここで、少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、上記のとおりであり、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；969；1056；1057；1058；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1469；1470；1471；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1194；1519；1520；1521；1524は３コピー存在し、配列番号1162は４コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
よって、上記の150個の全てのポリヌクレオチドプローブセットにおいて、422個のポリヌクレオチドプローブが存在し、上記のポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１回存在し、特に配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；969；1056；1057；1058；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1469；1470；1471；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1194；1519；1520；1521；1524は３コピー存在し、配列番号1162は４コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
【０１０１】
150個のヌクレオチドプローブセットに含まれる上記のポリヌクレオチドプローブは、上記の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形を標的領域により特異的に認識し、対応関係は表６から導かれる。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも43個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも43個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、上記で定義される少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、該200個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、以下の核酸配列であり：
配列番号4；5；6；120；121；122；123；130；131；132；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；195；196；197；198；199；200；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；809；810；811；812；813；814；815；816；817；818；821；822；823；824；825；826；840；841；845；846；847；868；968；969；970；971；972；973；974；975；976；977；981；1056；1057；1058；1059；1060；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1084；1085；1086；1087；1088；1089；1094；1095；1096；1103；1104；1105；1110；1111；1112；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1126；1127；1128；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1229；1230；1242；1243；1244；1245；1250；1251；1252；1262；1263；1264；1265；1266；1267；1268；1269；1270；1271；1272；1284；1285；1315；1335；1407；1408；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1512；1513；1514；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1563；1564；1580；1581；1582；1586；1587；1588；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1687；1688；1689；1690；1691；1692；1743；1744；1745；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1896；1897；1898；1952；1953；1954；1963；1974；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2061；2062；2063；2065；2067；2068；2072；2083；2084；2085；2088；2089；2090；2091；2092；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2381；2382；2383；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2601；2602；2603；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2778；2779；2783；2794；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
上記の43個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5455；5457；5462；5470；5475；5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686で表され、対応する変異形が表1Dに示される使用に関する。
【０１０３】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される使用に関し、ここで、少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブは、上記のとおりであり、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；367；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；845；968；970；972；1056；1057；1058；1085；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1523；1551；1552；1553；1557；1586；1587；1588；1952；1953；1954；2088；2090；2091；2762；2763及び2764は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1284；1285；1469；1470；1471；1519；1520；1521；1524；2065；2067及び2089は３コピー存在し、配列番号1194は４コピー存在し、配列番号315及び1162は６コピー存在する。
よって、上記の200個の全てのポリヌクレオチドプローブセットにおいて、565個のポリヌクレオチドプローブが存在し、上記のポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１回存在し、特に配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；367；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；845；968；970；972；1056；1057；1058；1085；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1523；1551；1552；1553；1557；1586；1587；1588；1952；1953；1954；2088；2090；2091；2762；2763及び2764は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1284；1285；1469；1470；1471；1519；1520；1521；1524；2065；2067及び2089は３コピー存在し、配列番号1194は４コピー存在し、配列番号315及び1162は６コピー存在する。
【０１０４】
200個のヌクレオチドプローブセットに含まれる上記のポリヌクレオチドプローブは、上記の遺伝子及び存在するならばそれらの変異形を標的領域により特異的に認識し、対応関係は表６から導かれる。
上記の集合体は、「上位のポリヌクレオチドプローブセット(Top Polynucleotide Probe Sets)」と見なされる。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、本発明は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも206個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも206個の遺伝子のうちの遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、3985個のポリヌクレオチドプローブを含む上記で規定される少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用であって、上記の1228個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列が表７の最初の1228行に表され、
上記の206個の遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692で表され、対応する変異形が表1Eに示される使用に関する。
【０１０６】
よって、上記の1228個の全てのポリヌクレオチドプローブセットにおいて、3427個のポリヌクレオチドプローブが存在する。
【０１０７】
また、本発明の好ましい実施形態は、乳腺腫の良性又は悪性状態をインビトロ又はエクスビボで診断するために、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列により表される275個の決定された遺伝子、及び
-対応関係が表６に示される、存在するならば275個の決定された遺伝子のうちの遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定するための、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、該1640個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は表７に示される。
【０１０８】
よって、上記の1640個の全てのポリヌクレオチドプローブにおいて、4586個のポリヌクレオチドプローブが存在する。
別の実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、ここで、遺伝子のサブグループは、配列番号5419〜配列番号5677からなる遺伝子の群から選択される12〜259個の遺伝子により構成される。
遺伝子のサブグループは、上記のように少なくとも12個の遺伝子を含む。遺伝子のサブグループは、有利には19個の遺伝子、有利には32個の遺伝子、有利には40個の遺伝子、有利には214個の遺伝子、より有利には259個の遺伝子を含み得る。
本発明によると、遺伝子のサブグループのそれぞれの遺伝子及び／又は存在するならばそれらの変異形は、ポリヌクレオチドプローブセットのプールのポリヌクレオチドプローブセットに属する少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより特異的に認識される。
【０１０９】
より具体的な実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用に関し、ここで、遺伝子のサブグループは、配列番号5419〜配列番号5693からなる259個の遺伝子の群により構成される。
本発明者らは、259個の遺伝子及び／又は存在するならばそれらの変異形の群が、乳腺腫の良性又は悪性の状態を正確に決定するためのいくらか強力な情報を提供することを、予期せぬことに証明した。
259個の遺伝子の群において、それぞれの遺伝子及び存在するならばその変異形は、ポリヌクレオチドプローブセットのプールのポリヌクレオチドプローブセットに属する少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより特異的に認識される。
【０１１０】
別の有利な実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーの少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセット、特に少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される。
ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセット、特に少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセット、より有利には少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットである。
これらの集合体は、「上位のポリヌクレオチドプローブセット」と見なされる。
【０１１１】
上位50個のポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号138、配列番号140、配列番号157、配列番号159、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号353、配列番号360、配列番号361、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号969、配列番号972、配列番号981、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1129、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1194、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1203、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1520、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2179及び配列番号2181を特徴とするポリヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。
【０１１２】
上位100個のポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号120、配列番号138、配列番号140、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号159、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号328、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号337、配列番号338、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号349、配列番号350、配列番号351、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号360、配列番号361、配列番号363、配列番号364、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号369、配列番号371、配列番号376、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号555、配列番号556、配列番号557、配列番号558、配列番号560、配列番号561、配列番号562、配列番号566、配列番号567、配列番号788、配列番号789、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号800、配列番号801、配列番号802、配列番号821、配列番号822、配列番号823、配列番号969、配列番号971、配列番号972、配列番号981、配列番号1056、配列番号1057、配列番号1058、配列番号1075、配列番号1076、配列番号1077、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1087、配列番号1088、配列番号1089、配列番号1103、配列番号1104、配列番号1105、配列番号1114、配列番号1115、配列番号1116、配列番号1123、配列番号1124、配列番号1125、配列番号1129、配列番号1130、配列番号1131、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1142、配列番号1143、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1163、配列番号1163、配列番号1164、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1172、配列番号1172、配列番号1180、配列番号1181、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1187、配列番号1188、配列番号1189、配列番号1189、配列番号1190、配列番号1191、配列番号1192、配列番号1193、配列番号1194、配列番号1195、配列番号1196、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1201、配列番号1202、配列番号1203、配列番号1207、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1509、配列番号1510、配列番号1511、配列番号1519、配列番号1520、配列番号1520、配列番号1521、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1524、配列番号1528、配列番号1529、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号1561、配列番号1562、配列番号1682、配列番号1683、配列番号1684、配列番号1776、配列番号1777、配列番号1778、配列番号2023、配列番号2024、配列番号2025、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2173、配列番号2174、配列番号2175、配列番号2176、配列番号2177、配列番号2178、配列番号2179、配列番号2181、配列番号2762、配列番号2763、配列番号2764、配列番号2860、配列番号2861、配列番号2862、配列番号2883、配列番号2884及び配列番号2885を特徴とするポリヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。
【０１１３】
上位150個のポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938から選択されるポリヌクレオチドプローブを特徴とするポリヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。
上位200個のポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938から選択されるポリヌクレオチドプローブを特徴とするポリヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。
【０１１４】
本発明によると、用いられる集合体は、少なくとも300個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも400個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも500個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも600個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも700個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも800個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも900個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1000個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1400個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には1640個のポリヌクレオチドプローブセットの数で表すこともできる。
上記の全てのポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーから選択されるポリヌクレオチドプローブを含む。
本発明によると、1228個のポリヌクレオチドプローブセットは、乳腺腫の良性対悪性の状態を診断するために規定される有利なプローブセットの集合体である。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用に関し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーの少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセット、特に少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択され、遺伝子のサブグループは、配列番号5419〜配列番号5677からなる群の259個の遺伝子で構成される。
【０１１６】
本発明によると、乳腺腫の良性対悪性の状態が2938個のポリヌクレオチドプローブの使用により決定できる。
有利な実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用について記載し、ここで、与えられた遺伝子の変異形は、配列番号4579〜配列番号5418からなる変異形の群から選択される。
本発明によると、それぞれの遺伝子は：
-変異形を有さないか、
-上記で規定されるように少なくとも１つの変異形を有することができる。
有利な実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用を開示し、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプローブは少なくとも１つの遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成して、乳腺腫の良性対悪性の状態を決定できる。
より具体的には、本発明は、ポリヌクレオチドプローブセットに組み立てられた2938個のポリヌクレオチドプローブの使用を開示し、該ポリヌクレオチドプローブは259個の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動を検出できる。本発明によると、少なくとも839個の変異形の発現の変動と259個の遺伝子の発現の変動とが、上記のポリヌクレオチドプローブセットの集合体の使用により検出できる。
【０１１７】
本発明は、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーも開示する。
このライブラリーは、本発明の1640個の代表プローブセットに再グループ化できる全てのポリヌクレオチドプローブからなる。よって、ライブラリーは、2938個のポリヌクレオチドプローブを含む群からなる。
【０１１８】
本発明は、上記のライブラリーの核酸配列から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号5419〜配列番号5677から選択される214個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせを表す。
ポリヌクレオチドプローブの群は、1228個のポリヌクレオチドプローブセットの組み合わせを表す。この群は、214個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動の検出を可能にする。
【０１１９】
本発明は、有利には、請求項８によるライブラリーの核酸配列から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号5419〜配列番号5677から選択される40個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせを表す。
ポリヌクレオチドプローブの群は、200個のポリヌクレオチドプローブセットの組み合わせを表す。この群は、40個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動の検出を可能にする。
【０１２０】
本発明は、より有利には、請求項８によるライブラリーの核酸配列から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号5419〜配列番号5677から選択される32個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせを表す。
ポリヌクレオチドプローブの群は、150個のポリヌクレオチドプローブセットの組み合わせを表す。この群は、32個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動の検出を可能にする。
【０１２１】
本発明は、請求項８によるライブラリーの核酸配列から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号5419〜配列番号5677から選択される19個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせを表す。
【０１２２】
本発明によると、19個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブのセットは、以下からなるポリヌクレオチドプローブを含む：
配列番号120、配列番号138、配列番号140、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号159、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号328、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号337、配列番号338、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号349、配列番号350、配列番号351、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号360、配列番号361、配列番号363、配列番号364、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号369、配列番号371、配列番号376、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号555、配列番号556、配列番号557、配列番号558、配列番号560、配列番号561、配列番号562、配列番号566、配列番号567、配列番号788、配列番号789、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号800、配列番号801、配列番号802、配列番号821、配列番号822、配列番号823、配列番号969、配列番号971、配列番号972、配列番号981、配列番号1056、配列番号1057、配列番号1058、配列番号1075、配列番号1076、配列番号1077、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1087、配列番号1088、配列番号1089、配列番号1103、配列番号1104、
【０１２３】
配列番号1105、配列番号1114、配列番号1115、配列番号1116、配列番号1123、配列番号1124、配列番号1125、配列番号1129、配列番号1130、配列番号1131、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1142、配列番号1143、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1163、配列番号1163、配列番号1164、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1172、配列番号1172、配列番号1180、配列番号1181、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1187、配列番号1188、配列番号1189、配列番号1189、配列番号1190、配列番号1191、配列番号1192、配列番号1193、配列番号1194、配列番号1195、配列番号1196、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1201、配列番号1202、配列番号1203、配列番号1207、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1509、配列番号1510、配列番号1511、配列番号1519、配列番号1520、配列番号1520、配列番号1521、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1524、配列番号1528、配列番号1529、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号1561、配列番号1562、配列番号1682、配列番号1683、配列番号1684、配列番号1776、配列番号1777、配列番号1778、配列番号2023、配列番号2024、配列番号2025、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2173、配列番号2174、配列番号2175、配列番号2176、配列番号2177、配列番号2178、配列番号2179、配列番号2181、配列番号2762、配列番号2763、配列番号2764、配列番号2860、配列番号2861、配列番号2862、配列番号2883、配列番号2884及び配列番号2885。
【０１２４】
ポリヌクレオチドプローブの群は、100個のポリヌクレオチドプローブセットの組み合わせを表す。この群は、19個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動の検出を可能にする。
【０１２５】
本発明は、請求項８によるライブラリーの核酸配列から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、配列番号5419〜配列番号5677から選択される12個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせを表す。
本発明によると、12個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形と特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブのセットは、以下からなるポリヌクレオチドプローブを含む：
配列番号138、配列番号140、配列番号157、配列番号159、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号353、配列番号360、配列番号361、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号969、配列番号972、配列番号981、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1129、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1194、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1203、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1520、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2179及び配列番号218l。
【０１２６】
ポリヌクレオチドプローブの群は、50個のポリヌクレオチドプローブセットの組み合わせを表す。この群は、12個の遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の発現の変動の検出を可能にする。
【０１２７】
本発明は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される50個のポリヌクレオチドプローブセットの複数も開示する。
また、本発明は、1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体にも関し、上記の50個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、以下の核酸配列であり：配列番号136；137；138；157；158；159；167；168；169；171；172；173；177；312；313；313；314；315；316；；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374；375；790；791；792；793；794；795；969；972；981；1081；1082；1083；1129；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200；1203；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；2026；2027；2028；2179；2180及び2181、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、上記のポリヌクレオチドプローブの１〜４個を含み、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；327；328；329；331；364；365；366；368；370；1185；1186；1194；1523；1524；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316は３コピー存在し、配列番号315は５コピー存在する。
【０１２８】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体も開示する。
また、本発明は、上記で定義される少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体にも関し、上記の100個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、以下の核酸配列であり：配列番号120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；312；313；314；315；316；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；378；379；380；381；555；556；557；558；560；561；562；566；567；788；789；790；791；792；793；794；795；800；801；802；821；822；823；969；971；972；981；1056；1057；1058；1075；1076；1077；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1509；1510；1511；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1561；1562；1682；1683；1684；1776；1777；1778；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2762；2763；2764；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、上記のポリヌクレオチドプローブの１〜４個を含み、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；316；317；327；329；330；353；361；364；365；366；367；368；369；370；821；822；823；1129；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1203；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号328；331；1162；1194；1519；1520；1521及び1524は３コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体も開示する。
言い換えると、本発明は、上記で定義される少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体にも関し、上記の150個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、以下の核酸配列であり：配列番号4；5；6；120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；197；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；812；813；814；818；821；822；823；968；969；970；971；972；981；1056；1057；1058；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1284；1285；1315；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1580；1581；1582；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1690；1691；1692；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1952；1953；1954；1963；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2065；2067；2088；2089；2090；2091；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、上記のポリヌクレオチドプローブの１〜４個を含み、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；969；1056；1057；1058；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1469；1470；1471；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1194；1519；1520；1521；1524は３コピー存在し、配列番号1162は４コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する。
【０１３０】
本発明の別の好ましい実施形態は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に関する。
実際に、本発明の好ましい実施形態は、上記で定義される少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示し、上記の200個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、以下の核酸配列であり：配列番号4；5；6；120；121；122；123；130；131；132；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；195；196；197；198；199；200；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；809；810；811；812；813；814；815；816；817；818；821；822；823；824；825；826；840；841；845；846；847；868；968；969；970；971；972；973；974；975；976；977；981；1056；1057；1058；1059；1060；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1084；1085；1086；1087；1088；1089；1094；1095；1096；1103；1104；1105；1110；1111；1112；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1126；1127；1128；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1229；1230；1242；1243；1244；1245；1250；1251；1252；1262；1263；1264；1265；1266；1267；1268；1269；1270；1271；1272；1284；1285；1315；1335；1407；1408；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1512；1513；1514；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1563；1564；1580；1581；1582；1586；1587；1588；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1687；1688；1689；1690；1691；1692；1743；1744；1745；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1896；1897；1898；1952；1953；1954；1963；1974；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2061；2062；2063；2065；2067；2068；2072；2083；2084；2085；2088；2089；2090；2091；2092；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2381；2382；2383；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2601；2602；2603；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2778；2779；2783；2794；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、上記のポリヌクレオチドプローブの１〜４個を含み、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；367；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；845；968；970；972；1056；1057；1058；1085；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1523；1551；1552；1553；1557；1586；1587；1588；1952；1953；1954；2088；2090；2091；2762；2763及び2764は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1284；1285；1469；1470；1471；1519；1520；1521；1524；2065；2067及び2089は３コピー存在し、配列番号1194は４コピー存在し、配列番号315及び1162は６コピー存在する。
【０１３１】
本発明の別の特定の実施形態は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットから選択される1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に関する。
ある特定の実施形態において、本発明は、3985個のポリヌクレオチドプローブを含む上記で規定される少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に関し、上記の1228個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、表７の最初の1228行に示される。
【０１３２】
本発明は、別の好ましい実施形態において、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体を開示する。
本発明は、上記で規定される1640個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に関し、上記の1640個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列は、表７に示される。
【０１３３】
本発明は、上記で規定されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体を含むか又はそれらからなるマイクロアレイも開示する。
よって、本発明は、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリー、又は以下のポリヌクレオチドプローブセットの集合体を含むマイクロアレイを開示する：
- 配列番号1〜配列番号2938からなる群から選択される核酸配列を含む1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に相当するポリヌクレオチドプローブセットの集合体
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に相当するポリヌクレオチドプローブセットの集合体、
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に相当するポリヌクレオチドプローブセットの集合体、
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む、特に配列番号120、配列番号138、配列番号140、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号159、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号328、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号337、配列番号338、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号349、配列番号350、配列番号351、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号360、配列番号361、配列番号363、配列番号364、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号369、配列番号371、配列番号376、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号555、配列番号556、配列番号557、配列番号558、配列番号560、配列番号561、配列番号562、配列番号566、配列番号567、配列番号788、配列番号789、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号800、配列番号801、配列番号802、配列番号821、配列番号822、配列番号823、配列番号969、配列番号971、配列番号972、配列番号981、配列番号1056、配列番号1057、配列番号1058、配列番号1075、配列番号1076、配列番号1077、
【０１３４】
配列番号1081、配列番号1083、配列番号1087、配列番号1088、配列番号1089、配列番号1103、配列番号1104、配列番号1105、配列番号1114、配列番号1115、配列番号1116、配列番号1123、配列番号1124、配列番号1125、配列番号1129、配列番号1130、配列番号1131、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1142、配列番号1143、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1163、配列番号1163、配列番号1164、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1172、配列番号1172、配列番号1180、配列番号1181、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1187、配列番号1188、配列番号1189、配列番号1189、配列番号1190、配列番号1191、配列番号1192、配列番号1193、配列番号1194、配列番号1195、配列番号1196、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1201、配列番号1202、配列番号1203、配列番号1207、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1509、配列番号1510、配列番号1511、配列番号1519、配列番号1520、配列番号1520、配列番号1521、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1524、配列番号1528、配列番号1529、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号1561、配列番号1562、配列番号1682、配列番号1683、配列番号1684、配列番号1776、配列番号1777、配列番号1778、配列番号2023、配列番号2024、配列番号2025、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2173、配列番号2174、配列番号2175、配列番号2176、配列番号2177、配列番号2178、配列番号2179、配列番号2181、配列番号2762、配列番号2763、配列番号2764、配列番号2860、配列番号2861、配列番号2862、配列番号2883、配列番号2884及び配列番号2885からなる100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に相当するポリヌクレオチドプローブセットの集合体、若しくは
【０１３５】
- 配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む、特に配列番号138、配列番号140、配列番号157、配列番号159、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号353、配列番号360、配列番号361、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号969、配列番号972、配列番号981、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1129、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1194、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1203、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1520、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2179及び配列番号2181からなる50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体に相当するポリヌクレオチドプローブセットの集合体。
マイクロアレイとは、被覆されたガラススライド又は遺伝子チップのような不活性化学表面に共有結合した核酸分子であって、可動性DNA標的がハイブリッド形成する核酸分子のことをいう。全ての一般的に用いられる表面を支持体として用いることができる。
【０１３６】
本発明は、配列番号5419〜配列番号5677からなる群の遺伝子のうちの少なくとも12個の遺伝子を含むサブグループの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の発現の変動を決定することにより、対象からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法を開示し、該方法は：
a)上記の生体試料からの核酸分子を、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体と接触させるステップと：
ここで、該ポリヌクレオチドプローブセットの集合体は、ポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなり、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、それぞれの核酸配列は、配列番号5419〜配列番号5677からなる遺伝子の群から選択される遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形と特異的にハイブリッド形成し；
- それぞれの与えられた遺伝子は、変異形を有さない場合、その核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択され、上記の遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
- それぞれの与えられた遺伝子は、少なくとも１つの変異形を有する場合、上記の遺伝子を特徴づける、：
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、上記の遺伝子の与えられた変異形に存在し、
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、与えられた変異形に存在しないか、又は上記の遺伝子のものとは異なる配置で存在する
ような少なくとも２つの標的領域を含み、
【０１３７】
-与えられた遺伝子のそれぞれの変異形は、そのそれぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される少なくとも１つの標的領域を示し、
- それぞれの変異形は、以下の特徴：
-そのそれぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される、上記の遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、上記の遺伝子に存在する、そのそれぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
-上記の遺伝子に天然には存在しない配置を示す、そのそれぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域が存在すること
を特徴とし、
【０１３８】
- ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブが、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定の核酸配列とハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形は、少なくとも与えられたポリヌクレオチドプローブセットにより特異的に認識され、
- ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブが、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成するが、該与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子ともハイブリッド形成できず、上記の与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形ともハイブリッド形成できないようなものであり、
b) 前の工程で形成された核酸複合体の検出から、上記の遺伝子の発現変異形のプロファイルを決定するステップと、
c) 上記のプロファイルを、対照の対象者の参照遺伝子発現変異形プロファイルと比較するステップと、
d) 上記の比較から、対象者における乳癌の良性又は悪性の状態を結論付けるステップと
を含む。
【０１３９】
本発明は、
-配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群に属する少なくとも12個の決定された遺伝子、及び
-存在するならば少なくとも12個の決定された遺伝子の少なくとも１つの変異形
の発現の変動を決定することにより、対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態を、好ましくはインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、
上記の12個の決定された遺伝子は、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5421；5423；5432；5434；5486；5491；5525；5552；5599；5652；5654及び5683で表され、上記の方法は：
(1) 上記の生体試料からの核酸分子を、ポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなるポリヌクレオチドプローブセットの集合体と接触させて、核酸複合体の形成を可能にするステップと：
ここで、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、該ライブラリーは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸のそれぞれの少なくとも１つのコピーを含むか又はそれからなり、
上記のポリヌクレオチドプローブは、それぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、１つの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の１つの標的領域のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成するようなものであり、
a) それぞれの与えられた遺伝子は：
a.    変異形を有さない場合、上記の遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
b.    １つの変異形を有する場合、上記の遺伝子及び該遺伝子の核酸配列よりも短い核酸配列を有することを特徴とするその変異形を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
c.    少なくとも２つの変異形を有する場合、上記の遺伝子を特徴づける、以下：
iii. 標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、上記の遺伝子の与えられた変異形に存在し、
iv. 標的領域のそれぞれのポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが
・  与えられた変異形に存在しないか、又は
・  上記の遺伝子のものとは異なる配置で与えられた変異形に存在し、
上記の変異形は、その核酸配列が上記の遺伝子の核酸配列よりも短いことを特徴とする
ような少なくとも２つの標的領域を含み、
【０１４０】
b) 与えられた遺伝子のそれぞれの変異形は、少なくとも１つの標的領域を有し、
・    上記の変異形が、遺伝子のユニーク変異形である場合、該変異形は上記の遺伝子と同じ標的を有し、
・    上記の変異形が、少なくとも２つの変異形を有する遺伝子の変異形のうちの１つである場合、該遺伝子のそれぞれの変異形は、以下：
a.    遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、遺伝子に存在する少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
b.    遺伝子にも存在する少なくとも１つの標的領域が存在することと、遺伝子に天然には存在しない配置で標的領域が存在することの組み合わせ
を特徴とし、
【０１４１】
c)    それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの与えられたポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列により特異的に認識され、
d)    ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、
e)    ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブの核酸配列が：
a.    与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するが、
b.
i. 上記の与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子のヌクレオチド配列とも、
ii. 上記の与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形のヌクレオチド配列ともハイブリッド形成できない
ようなものであり、
(2) 前の工程で形成された核酸複合体の検出から、上記の遺伝子及び該遺伝子の変異形の発現のプロファイルを決定するステップと、
(3) 上記のプロファイルを、対照の良性乳腺腫の参照発現プロファイル及び／又は対照の悪性乳腺腫の参照発現プロファイルと比較するステップと、
(4) 上記の比較から：
- 上記の発現プロファイルが、対照の良性乳腺腫の参照発現プロファイルと類似する場合、乳癌が良性であり、
- 上記の発現プロファイルが、対照の悪性乳腺腫の参照発現プロファイルと類似する場合、乳癌が悪性である
と結論付けるステップと
を含むが、
但し、上記の遺伝子及び存在するならばその変異形は、それぞれ配列番号5431；5689；5651及び5682で表されるKRT17でもLOC440421でもKRT6CでもKRT6Aでもない。
【０１４２】
本発明は、乳腺腫の良性又は悪性の状態を決定することを可能にする方法についても記載する。
本発明の方法において、乳腺腫に対応する生体試料は、核酸分子の供給源として用いられる。上記の生体試料とは、生物又は生物の成分(例えば細胞)から得られる試料のことである。試料は、いずれの生体組織のものであってもよい。しばしば、試料は、患者から得られる試料である「臨床試料」であり得る。このような試料は、限定されないが、FNA試料、CNB試料、胸管洗浄及び血液試料を含む。生体試料は、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片も含み得る。
生体試料を提供する対象者は、一般的に、乳腺腫に罹患しているか又は罹患していると疑われる女性である。対象者は、乳癌であるか又は乳癌であると疑われる男性でもあり得る。拡張により、乳腺腫を生じ得ることを条件として全ての哺乳動物を本発明により提供される方法により診断できる。
【０１４３】
試料からの核酸分子の抽出は、当該技術において用いられる日常的なプロトコルにより行われる。有利には、生体試料から抽出される核酸分子はRNAである。
よって、本発明の方法は、対象者の生体試料から抽出された核酸分子を、ポリヌクレオチドプローブセットの集合体と接触させることである。それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含む。
【０１４４】
ポリヌクレオチドプローブセット、より具体的にはそれぞれのポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブとの接触は、遺伝子及び／又は存在するならばその変異形に対応する核酸分子と、ポリヌクレオチドプローブとの間の核酸複合体の形成を可能にする。
【０１４５】
好ましくは、ポリヌクレオチドプローブを核酸分子と接触させる前に、核酸分子を、任意の既知の標識剤(放射性同位体、酵素、蛍光分子など)で標識する。ハイブリッド形成は、標準的な手法に従って、塩濃度及び温度を必要に応じて改変することにより行われる。ハイブリッド形成のために用いられるプロトコルは当業者に公知である。
形成された核酸複合体の存在及び量は、標識剤で標識されたハイブリッド形成した核酸分子を、用いられた標識剤に適合する特定の検出方法を用いて検出することにより検出できる。
本発明によると、標識された核酸分子とハイブリッド形成したそれぞれのプローブセットは、ハイブリッド形成の値に起因し得る。与えられた値は、標識剤に依存する。
ハイブリッド形成の全ての値を収集することにより、アッセイした腫瘍の特定の特徴に相当するプロファイルを確立することができる。この結果は、アッセイされる腫瘍の特徴であるとみなされる。
【０１４６】
腫瘍のプロファイルを、参照プロファイル、特に乳癌に罹患していない対象者の生体試料から得られるか、又は良性若しくは悪性の乳腺腫に罹患した対象者の生体試料から得られる腫瘍のプロファイルと比較する。或いは、アッセイされる腫瘍のプロファイルを、良性の乳腺腫又は悪性の乳腺腫に罹患した患者の腫瘍のプロファイルと比較できる。典型的には、比較は、この種の比較に通常用いられ、当該技術において公知で記載されているソフトウェアを用いて行われる。
【０１４７】
腫瘍プロファイルと参照プロファイルとの比較から、患者の生体試料から得られる乳腺腫が、良性腫瘍又は悪性腫瘍であるかを決定できる。
【０１４８】
ある有利な実施形態において、本発明は、対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法を開示し、ここで、配列番号5419〜配列番号5677からなる群の遺伝子からの少なくとも12個の遺伝子を含むサブグループの遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の発現の変動の決定は：
a) 上記の生体試料からの核酸分子を、ポリヌクレオチドの1640個のプローブセットから選択されるポリヌクレオチドプローブセットのプールの組み合わせからなるポリヌクレオチドプローブセットの集合体と接触させるステップと：
ここで、それぞれのポリヌクレオチドプローブセットは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーから選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含み、それぞれの核酸配列は、配列番号5419〜配列番号5677からなる遺伝子の群から選択される遺伝子及び／又は存在するならばその変異形の少なくとも１つとハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子は、変異形を有さない場合、その核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択され、かつ上記の遺伝子を特徴づける少なくとも１つの標的領域を含み、
- それぞれの与えられた遺伝子は、少なくとも１つの変異形を有する場合、上記の遺伝子を特徴づける、以下：
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、上記の遺伝子の与えられた変異形に存在し、
-配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域のそれぞれの核酸配列の少なくとも１つが、与えられた変異形に存在しないか、又は上記遺伝子のものとは異なる配置で存在する
ような少なくとも２つの標的領域を含み、
【０１４９】
- 与えられた遺伝子のそれぞれの変異形は、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択されるような少なくとも１つの標的領域を有し、
- それぞれの変異形が、以下：
-遺伝子にも存在する、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される少なくとも１つの標的領域が存在することと、遺伝子に存在する、それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される少なくとも１つの標的領域が存在しないこととの組み合わせ、又は
-それぞれの核酸配列が配列番号2939〜配列番号4578から選択される標的領域が、上記の遺伝子に天然に存在しない配置で存在すること
を特徴とし、
- ポリヌクレオチドプローブセットのそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形を特徴づける標的領域のうちの与えられた標的領域に含まれる特定の核酸配列とハイブリッド形成し、
- それぞれの与えられた遺伝子及び存在するならばその変異形は、少なくとも与えられたポリヌクレオチドプローブセットにより特異的に認識され、
-ポリヌクレオチドプローブセットの与えられたプールのそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、与えられた遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形とハイブリッド形成するが、該与えられた遺伝子とは異なるいずれのその他の遺伝子ともハイブリッド形成できず、該与えられた遺伝子とは異なる遺伝子のいずれのその他の変異形ともハイブリッド形成できず、
【０１５０】
b) 前の工程で形成された核酸複合体の検出から、上記の遺伝子の発現変異形のプロファイルを決定するステップと、
c) 上記のプロファイルを、対照の対象者の参照遺伝子発現変異形プロファイルと比較するステップと、
d) 上記の比較から、対象者における乳癌の良性又は悪性の状態を結論付けるステップと
を含む。
【０１５１】
ある好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群のうちの少なくとも20個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することにより、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、
上記の20個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5432；5434；5457；5486；5491；5513；5516；5525；5532；5552；5599；5616；5624；5643；5652；5654；5673及び5683で表される。
【０１５２】
ある別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群のうちの35個の決定された遺伝子により、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、
上記の35個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：配列番号5421；5423；5431；5432；5434；5440；5457；5462；5470；5486；5491；5505；5513；5516；5525；5532；5546；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5624；5627；5630；5643；5645；5652；5654；5660；5669；5673及び5683で表される。
【０１５３】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群のうちの少なくとも43個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することにより、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、
上記の43個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：5486；5491；5499；5505；5513；5516；5520；5525；5532；5546；5549；5552；5594；5599；5601；5603；5616；5618；5623；5624；5627；5630；5643；5645；5651；5652；5654；5660；5669；5673；5683及び5686で表される。
【０１５４】
本発明の別の具体的な実施形態は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される決定された遺伝子の群のうちの少なくとも206個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することにより、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、
上記の206個の決定された遺伝子が、以下のヌクレオチド配列：
配列番号5420；5421；5422；5423；5425；5426；5427；5428；5429；5430；5431；5432；5434；5435；5436；5437；5438；5439；5440；5441；5442；5443；5444；5445；5446；5447；5449；5450；5451；5452；5453；5454；5455；5456；5457；5459；5460；5461；5462；5463；5465；5467；5468；5470；5473；5475；5476；5479；5480；5482；5484；5485；5486；5487；5488；5489；5490；5491；5492；5493；5495；5496；5497；5498；5499；5502；5503；5505；5506；5507；5508；5509；5511；5512；5513；5515；5516；5517；5518；5519；5520；5523；5524；5525；5526；5528；5529；5530；5531；5532；5533；5534；5536；5538；5539；5540；5543；5544；5545；5546；5547；5549；5550；5552；5553；5554；5556；5558；5559；5560；5562；5563；5564；5565；5566；5567；5568；5569；5570；5571；5573；5574；5575；5576；5577；5578；5581；5582；5585；5587；5588；5590；5591；5593；5594；5595；5597；5598；5599；5600；5601；5602；5603；5604；5605；5606；5608；5609；5610；5611；5612；5613；5615；5616；5617；5618；5622；5623；5624；5625；5627；5629；5630；5631；5632；5633；5634；5635；5637；5638；5639；5640；5641；5642；5643；5644；5645；5647；5648；5649；5651；5652；5653；5654；5656；5657；5658；5660；5661；5665；5667；5669；5672；5673；5675；5676；5677；5678；5680；5681；5683；5684；5686；5687；5689及び5692で表される。
【０１５５】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号5419〜配列番号5693のヌクレオチド配列で表される275個の決定された遺伝子の発現の変動を決定することにより、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法を開示する。
【０１５６】
本発明の別の特定の実施形態は、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、ここで、上記の変異形が配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694の核酸配列で表され、それぞれの変異形とその対応する遺伝子の間の対応関係が、表1A〜E及び表６に示される。
【０１５７】
さらに別の実施形態において、本発明は、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、ここで、標的領域が配列番号2939〜4578のポリヌクレオチド配列を特徴とし、それぞれの遺伝子及び存在するならばそれぞれの変異形のそれぞれの標的領域が、表６に示される。
【０１５８】
ある好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、ここで、ポリヌクレオチドプローブセットに含まれるそれぞれのポリヌクレオチドプローブは、配列番号1〜配列番号2938からなるライブラリーの核酸配列で表され、
それぞれのポリヌクレオチドプローブと、遺伝子及び存在するならばその変異形に対応する標的領域との間の対応関係が、表６に示される。
【０１５９】
別の有利な実施形態において、本発明は、対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、ここで、遺伝子のサブグループは、配列番号5419〜配列番号5677からなる群より選択される12〜259個の遺伝子で構成される。
別の実施形態において、本発明は、上記の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法を開示し、ここで、遺伝子のサブグループは、配列番号5419〜配列番号5677からなる群の259個の遺伝子で構成される。
【０１６０】
より具体的な実施形態において、本発明は、対象者からの生体試料中の乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法に関し、上記のポリヌクレオチドプローブのセットは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーの少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブセット、特に少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも150個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも200個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には1640個のポリヌクレオチドプローブセットからなる群から選択される。
【０１６１】
50、100、150、200個のポリヌクレオチドプローブセットのサブグループは、腫瘍の良性又は悪性の状態を決定することを可能にする上位のサブグループとして規定される。
本発明において、プローブセットの集合体が、少なくとも300個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも400個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも500個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも600個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも700個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも800個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも900個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1000個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1100個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1228個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には少なくとも1400個のポリヌクレオチドプローブセット、より具体的には1640個のポリヌクレオチドプローブセットで構成され得ることも開示される。
本発明の方法において用いられるポリヌクレオチドプローブセットに含まれる全てのポリヌクレオチドプローブは、配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーから選択される。
【０１６２】
ある実施形態において、本発明は、与えられた遺伝子の変異形が、配列番号4579〜配列番号5418からなる変異形の群から選択される上記の方法を開示する。
本発明の方法は、遺伝子及び存在するならばその変異形の発現の変動を検出することを可能にし、該遺伝子は、配列番号5419〜配列番号5677からなる群より選択される核酸配列からなることを特徴とし、該変異形は、配列番号4579〜配列番号5418からなる群より選択される核酸配列からなることを特徴とする。
【０１６３】
本発明において、乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定する方法も開示され、ここで、配列番号5419〜配列番号5693からなる群より選択される遺伝子及び／又は存在するならば少なくとも１つのその変異形の発現の変動は、
- 上回る(Over represented) (上方制御されている)か、又は
- 下回る(Under represented) (下方制御されている)。
【０１６４】
本発明の方法により明らかにされるそれぞれの遺伝子の発現、及び存在するならばその変異形の発現は、配列番号5419〜配列番号5693からなる群の遺伝子の発現生成物に対応する。
これらの変異形は、乳癌に罹患していない対象者において通常発現される。これらの変異形は、良性の乳癌又は悪性の乳癌に罹患した対象者の生体試料においても発現される。それぞれの変異形は、乳癌の状態に対応する特定の発現レベルを有する。それぞれの変異形は、よって、正常な対象者で発現される同じ変異形と比較して過剰発現されるか、又は正常な対象者で発現される同じ変異形と比較して少なく発現されることができる。
遺伝子及び／又はそれらの変異形は、好ましくはそれらの発現レベルが、乳腺腫に罹患していない患者における該遺伝子の発現レベルより1.7倍を超えて高い場合(好ましくは0.05未満の有意係数の値で)に、上方制御されている。遺伝子及び／又はそれらの変異形は、好ましくはそれらの発現レベルが、乳腺腫に罹患していない患者における該遺伝子の発現レベルより1.7倍未満で低く、かつ有意に異なる場合(好ましくは0.05未満の有意係数の値で)に、下方制御されている。
【０１６５】
ある特定の実施形態において、本発明は、対象者の生体試料からの核酸分子がmRNA及び／又はcDNAであり、該mRNAが配列番号5419〜配列番号5693からなる遺伝子、及び／又は配列番号4579〜配列番号5418及び配列番号5694のヌクレオチド配列で表される、存在するならば少なくとも１つのそれらの変異形の発現に起因する、上記の方法を開示する。
【０１６６】
本発明において、核酸分子は、支持体に固定化されたポリヌクレオチドプローブのセットと接触させる前に、対象者の生体試料から抽出される。
対象者の生体試料からの核酸分子の抽出及び調製は、当業者が通常用いる日常的なプロトコルを用いて行われる。
より具体的には、RNAが生体試料から抽出され、結局は、mRNAがトータルRNAから単離される。cDNAを用いる場合、mRNAは標準的な手順を用いて逆転写される。
【０１６７】
本発明は、
-上記で規定される集合体、又は
-上記で規定されるマイクロアレイ
を含む、乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定するためのキットに関する。
【０１６８】
本発明は、以下の群のポリヌクレオチドプローブを含む、乳腺腫の良性又は悪性の状態をインビトロ及び／又はエクスビボで決定するためのキットに関する：
- 配列番号136；137；138；157；158；159；167；168；169；171；172；173；177；312；313；313；314；315；316；；317；324；325；326；327；328；329；330；331；333；334；335；336；339；340；341；345；346；347；348；353；360；361；364；365；366；367；368；369；370；374；375；790；791；792；793；794；795；969；972；981；1081；1082；1083；1129；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1185；1186；1194；1198；1199；1200；1203；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；2026；2027；2028；2179；2180及び2181、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；327；328；329；331；364；365；366；368；370；1185；1186；1194；1523；1524；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316は３コピー存在し、配列番号315は５コピー存在する、又は
【０１６９】
- 配列番号120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；312；313；314；315；316；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；378；379；380；381；555；556；557；558；560；561；562；566；567；788；789；790；791；792；793；794；795；800；801；802；821；822；823；969；971；972；981；1056；1057；1058；1075；1076；1077；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1509；1510；1511；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1544；1545；1546；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1561；1562；1682；1683；1684；1776；1777；1778；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2762；2763；2764；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；316；317；327；329；330；353；361；364；365；366；367；368；369；370；821；822；823；1129；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1203；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号328；331；1162；1194；1519；1520；1521及び1524は３コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する、又は
【０１７０】
- 配列番号4；5；6；120；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；197；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；812；813；814；818；821；822；823；968；969；970；971；972；981；1056；1057；1058；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1087；1088；1089；1103；1104；1105；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1262；1263；1264；1267；1268；1269；1284；1285；1315；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1580；1581；1582；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1690；1691；1692；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1952；1953；1954；1963；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2065；2067；2088；2089；2090；2091；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；969；1056；1057；1058；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1469；1470；1471；1523；1551；1552及び1553は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1194；1519；1520；1521；1524は３コピー存在し、配列番号1162は４コピー存在し、配列番号315は６コピー存在する、又は
【０１７１】
- 配列番号4；5；6；120；121；122；123；130；131；132；136；137；138；154；155；156；157；158；159；167；168；169；171；172；173；174；175；176；177；195；196；197；198；199；200；248；254；255；305；306；307；312；313；314；315；316；317；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；345；346；347；348；349；350；351；352；353；354；355；356；360；361；362；363；364；365；366；367；368；369；370；371；374；375；376；377；378；379；380；381；513；514；515；552；553；554；555；556；557；558；559；560；561；562；563；564；565；566；567；783；784；785；788；789；790；791；792；793；794；795；796；797；798；799；800；801；802；803；804；805；806；807；808；809；810；811；812；813；814；815；816；817；818；821；822；823；824；825；826；840；841；845；846；847；868；968；969；970；971；972；973；974；975；976；977；981；1056；1057；1058；1059；1060；1061；1062；1063；1064；1065；1066；1067；1068；1069；1070；1071；1075；1076；1077；1080；1081；1082；1083；1084；1085；1086；1087；1088；1089；1094；1095；1096；1103；1104；1105；1110；1111；1112；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1126；1127；1128；1129；1130；1131；1139；1140；1141；1158；1159；1160；1161；1162；1163；1164；1165；1166；1167；1168；1169；1170；1171；1172；1174；1175；1176；1180；1181；1185；1186；1187；1188；1189；1190；1191；1192；1193；1194；1195；1196；1197；1198；1199；1200；1201；1202；1203；1204；1205；1206；1207；1229；1230；1242；1243；1244；1245；1250；1251；1252；1262；1263；1264；1265；1266；1267；1268；1269；1270；1271；1272；1284；1285；1315；1335；1407；1408；1469；1470；1471；1509；1510；1511；1512；1513；1514；1515；1516；1517；1519；1520；1521；1522；1523；1524；1528；1529；1534；1535；1536；1537；1538；1539；1544；1545；1546；1550；1551；1552；1553；1554；1555；1556；1557；1558；1559；1560；1561；1562；1563；1564；1580；1581；1582；1586；1587；1588；1671；1682；1683；1684；1685；1686；1687；1688；1689；1690；1691；1692；1743；1744；1745；1776；1777；1778；1788；1789；1790；1890；1891；1892；1896；1897；1898；1952；1953；1954；1963；1974；2023；2024；2025；2026；2027；2028；2061；2062；2063；2065；2067；2068；2072；2083；2084；2085；2088；2089；2090；2091；2092；2173；2174；2175；2176；2177；2178；2179；2180；2181；2196；2201；2229；2230；2231；2381；2382；2383；2536；2537；2538；2576；2577；2578；2599；2600；2601；2602；2603；2762；2763；2764；2774；2775；2776；2778；2779；2783；2794；2860；2861；2862；2883；2884及び2885、
好ましくは、配列番号167；168；177；312；313；317；327；329；330；353；361；363；364；365；366；367；369；370；371；558；567；796；797；801；806；807；808；813；814；821；822；823；845；968；970；972；1056；1057；1058；1085；1114；1115；1116；1123；1124；1125；1129；1141；1163；1164；1185；1186；1187；1188；1189；1199；1203；1523；1551；1552；1553；1557；1586；1587；1588；1952；1953；1954；2088；2090；2091；2762；2763及び2764は２回存在し、配列番号316；328；331；368；788；1284；1285；1469；1470；1471；1519；1520；1521；1524；2065；2067及び2089は３コピー存在し、配列番号1194は４コピー存在し、配列番号315及び1162は６コピー存在する、又は
【０１７２】
- 表７の最初の1228行に示される1228個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブ、又は
-表７に示される1640個のポリヌクレオチドプローブセットに含まれるポリヌクレオチドプローブの核酸配列。
【０１７３】
本発明は、
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列のライブラリーを含むマイクロアレイ、又は
- 以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドプローブセットの集合体：
-配列番号1〜配列番号2938からなる群から選択される核酸配列を含む1228個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体、若しくは
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む200個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体、若しくは
-配列番号1〜配列番号2938からなる核酸配列を含む150個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体、若しくは
【０１７４】
-配列番号1〜配列番号2938からなる、特に配列番号120、配列番号138、配列番号140、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号159、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号328、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号337、配列番号338、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号349、配列番号350、配列番号351、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号360、配列番号361、配列番号363、配列番号364、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号369、配列番号371、配列番号376、配列番号378、配列番号379、配列番号380、配列番号381、配列番号555、配列番号556、配列番号557、配列番号558、配列番号560、配列番号561、配列番号562、配列番号566、配列番号567、配列番号788、配列番号789、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号800、配列番号801、配列番号802、配列番号821、配列番号822、配列番号823、配列番号969、配列番号971、配列番号972、配列番号981、配列番号1056、配列番号1057、配列番号1058、配列番号1075、配列番号1076、配列番号1077、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1087、配列番号1088、配列番号1089、配列番号1103、配列番号1104、配列番号1105、配列番号1114、配列番号1115、配列番号1116、配列番号1123、配列番号1124、配列番号1125、配列番号1129、配列番号1130、配列番号1131、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1142、配列番号1143、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1163、配列番号1163、配列番号1164、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1172、配列番号1172、配列番号1180、配列番号1181、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1187、配列番号1188、配列番号1189、配列番号1189、配列番号1190、配列番号1191、配列番号1192、配列番号1193、配列番号1194、配列番号1195、配列番号1196、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1201、配列番号1202、配列番号1203、配列番号1207、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1509、配列番号1510、配列番号1511、配列番号1519、配列番号1520、配列番号1520、配列番号1521、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1524、配列番号1528、配列番号1529、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号1561、配列番号1562、配列番号1682、配列番号1683、配列番号1684、配列番号1776、配列番号1777、配列番号1778、配列番号2023、配列番号2024、配列番号2025、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2173、配列番号2174、配列番号2175、配列番号2176、配列番号2177、配列番号2178、配列番号2179、配列番号2181、配列番号2762、配列番号2763、配列番号2764、配列番号2860、配列番号2861、配列番号2862、配列番号2883、配列番号2884及び配列番号2885からなる核酸配列を含む100個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体、若しくは
【０１７５】
-配列番号1〜配列番号2938からなる、特に配列番号138、配列番号140、配列番号157、配列番号159、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号177、配列番号312、配列番号314、配列番号315、配列番号317、配列番号324、配列番号326、配列番号327、配列番号329、配列番号330、配列番号331、配列番号333、配列番号335、配列番号336、配列番号339、配列番号341、配列番号345、配列番号347、配列番号353、配列番号360、配列番号361、配列番号364、配列番号366、配列番号367、配列番号369、配列番号790、配列番号792、配列番号793、配列番号795、配列番号969、配列番号972、配列番号981、配列番号1081、配列番号1083、配列番号1129、配列番号1140、配列番号1141、配列番号1151、配列番号1158、配列番号1159、配列番号1162、配列番号1165、配列番号1166、配列番号1167、配列番号1169、配列番号1170、配列番号1171、配列番号1185、配列番号1186、配列番号1194、配列番号1198、配列番号1200、配列番号1203、配列番号1262、配列番号1264、配列番号1267、配列番号1269、配列番号1520、配列番号1522、配列番号1523、配列番号1524、配列番号1534、配列番号1536、配列番号1544、配列番号1546、配列番号1551、配列番号1553、配列番号1554、配列番号1556、配列番号1557、配列番号2026、配列番号2028、配列番号2179及び配列番号2181からなる核酸配列を含む50個のポリヌクレオチドプローブセットの集合体
にも関する。
【０１７６】
好ましくは、本発明のキットにおいて、マイクロアレイは、対象者の乳腺腫の良性又は悪性の状態を効率的に特徴づけるための最良のポリヌクレオチドプローブセットの集合体である1228個のポリヌクレオチドプローブセットを含む。
【０１７７】
所望により、本発明のキットは、マイクロアレイと接触させるために用いる核酸分子を標識するためのプロトコル及び分子を含み得る。また、本発明のキットは、対象者の生体試料からの核酸分子の抽出及び精製のためのプロトコル及び分子を含み得る。
キットの内容物は、記載された物質及び記載されたプロトコルに限定されず、本発明のキットを用いるために当業者を補助できる任意のその他の物質及び手順を含み得る。
【０１７８】
図１〜６は本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図1Aは、３つのエキソンを含む遺伝子、及び少なくとも１つのエキソンを欠くその変異形を示す。Ｔは標的領域を表す。標的領域の有無に関する「バーコード」を示す。１=存在；０=不在。  図1Bは、３つのエキソンを含む遺伝子、及び１つのエキソンを欠くその変異形を示す。Ｔは標的領域を表す。標的領域の有無に関する「バーコード」を示す。１=存在；０=不在。
【図２】図２は、本発明の集合体、プール、プローブセット及びプローブの概念を示す。
【図３】図3A〜3Gは、遺伝子及び存在するならばその変異形並びに対応する標的領域を示す。  図3Aは、変異形を有さず、１つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Bは、変異形を有さず、２つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Cは、１つの変異形を有し、１つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Dは、１つの変異形を有し、２つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Eは、２つの変異形を有し、２つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Fは、２つの変異形を有し、３つの標的領域を有する遺伝子を示す。  図3Gは、２つの変異形を有し、３つの標的領域を有する遺伝子を示し、その標的領域のうちの１つは変異形及び遺伝子において異なる配置である。
【図４】図４は、1656個のエキソンプローブのヒートマップを示し、悪性状態では２倍を超える高い強度を示す。図４は、悪性腫瘍において２倍を超えてより高い強度を示すエキソンプローブの強度について報告する。それぞれの列は試料を表し、それぞれの行はエキソンプローブを表す。
【図５】図５は、平均の良性及び悪性のプロファイルを有するそれぞれの検体の相関関係を示す。それぞれの腫瘍は、１つのリーブ-ワン-アウト(leave-one-out)ステップの間の良性及び悪性のそれぞれの群におけるプローブの平均発現との相関関係に従って分類される。二分する線(緑色)は、良性予測(右下の三角)及び悪性予測(左上の三角)の領域を規定する。良性群からの腫瘍は黒で示し、悪性群からの腫瘍は赤で示す。いずれの誤った分類も、悪性予測領域にある良性試料、及びその逆に相当する。学習セットは94個の試料を含んでいた(良性腫瘍、ｎ=24、悪性腫瘍、ｎ=70)。
【図６】図６は、検証(validation)セットにおけるそれぞれの検体と、学習セットの患者について得られた好ましい1,228個の特徴(signature)ポリヌクレオチドプローブセットの平均良性及び悪性プロファイルとの相関関係を示す。検証セットは、71個の試料(良性腫瘍、ｎ=21、悪性腫瘍、ｎ=50)を含んでいた。それぞれの腫瘍を、良性及び悪性プロファイルにおけるプローブの平均発現との相関関係に従って分類する。二分する線(緑色)は、良性予測(右下の三角)及び悪性予測(左上の三角)の領域を規定する。良性群からの腫瘍は黒で示し、悪性群からの腫瘍は赤で示す。いずれの誤った分類も、悪性予測領域にある良性試料、及びその逆に相当する。
【実施例】
【０１８０】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例I：悪性と良性の乳房疾患で異なって発現される遺伝子及びエキソン
56652個のプローブ(8%)が、悪性と良性の状態で異なる強度を示した(調整済みp値＜0.05)。これらのうち、37858個がエキソンプローブ(B、T及びF)であり、18794個が結合部プローブ(C、D、E)であった。37858個のエキソンプローブ(B、T、F)のうち、17441個が良性疾患に対抗して悪性においてより高かった。悪性状態でより高いことがわかった17441個のエキソンプローブ(B、T、F)は、12091個のエキソンと3391個の遺伝子に当てはまった。悪性腫瘍において増加している17441個のエキソンプローブのうち、1656個が、良性腫瘍と比較して悪性状態において２倍を超えて強度が増加していた。これらの1656個のプローブについての強度のヒートマップを図４に示す。これらの1656個のプローブセットは、1178個のエキソン及び363個の遺伝子に当てはまる。
【０１８１】
遺伝子発現のレベルを、次いで、患者及び方法の部分に報告されるようにして決定した。11921個のフィルタにかけた遺伝子のうち、3733個が、癌と良性状態との間で異なって発現された(調整済みp値＜0.05)。これは、アレイに含まれる全ての遺伝子の7%、及びフィルタにかけた遺伝子の31%を占める。これらのうち、1984個が悪性状態で過剰発現されていた。TOP2A、VEGFA、AURKA、PARP1、RASを含むこれらの遺伝子のうちいくつかは、現在、治療において標的となっている。72個の遺伝子の平均値が、乳癌において２倍を超えて増加していた。予期されたように、これらの72個の高度に過剰発現される遺伝子のうちの高い割合が、細胞周期活性化及び有糸分裂に関連し、サイクリン(CCNA2、CCNE2、CCNB2)、細胞分裂周期ファミリー(CDC2、CKS1B、CKS2、NUF2)、キネシンファミリーメンバー(KIF23、NDC80、KIF4A、KIF18A、MKLP2、KIF14)及び動原体タンパク質(CENPF、CENPE)を含んでいた。図３は、上位10個の過剰発現遺伝子の遺伝子発現についてのドットプロットを示す。10個の最も過剰発現された遺伝子のうちの２つ(PTTG1、NET1)は、それらの腫瘍形成性の特性に鑑みて、可能性のある新しい治療上の標的と考えられた。BioCartaデータベースを用いる経路解析は、７つの経路を同定し、これらは１つ又はその他の状態で異なって発現される遺伝子を増加させることが示された。興味深いことに、スプライソソームの組み立てに関与する遺伝子は、悪性状態において著しく増えており(LS並べ替え、p=0.001、KS並べ替え、p=0.002)、このことは、この現象が乳癌において活性化されていることを示唆した。
【０１８２】
最後に、本発明者らは、1984個のフィルタにかけた遺伝子には含まれず、癌と良性障害との間でその幾何平均値が異なる、悪性状態で過剰発現される2675個のエキソンを同定した(調整済みp値＜0.05)。これらの2675個のエキソンプローブは、1559個の遺伝子に存在した。2675個のエキソンについてのスプライスインデックスを、補足の表４に示す。変化していない遺伝子に存在するこれらの過剰発現エキソンの数は、潜在的な腫瘍形成性を有する。説明として、エキソン9カゼインキナーゼ1デルタ(CSNK1D)、エキソン5-6網膜芽腫結合タンパク質9 (RBBP9)及びエキソン21-22 Erbb2相互作用タンパク質(ERBB2IP/LAP2)についてのプローブセットの強度は、良性腫瘍と比較して悪性において、1.67倍(調整済みp値=0.005)、1.45倍(調整済みp値=0.006)及び1.6倍(調整済みp値=0.0005)増加した。反対に、遺伝子発現レベルについての癌と良性腫瘍との間の幾何平均の比は、CSNK1D、RBBP9、ERBB2IP/LAP2についてそれぞれ1.09 (p=0.95)、1.04 (p=0.61)及び1.00 (p=0.96)であった。これらの知見は、変化なしと同定された遺伝子のかなりの割合が、実際は異なって発現されるエキソンを含み得ることを示唆する。これらの考察は、エキソンレベルでの解析が、遺伝子レベルでの解析にさらなる情報を提供し、乳房悪性疾患の転写プログラムを解読することを示唆する。
乳癌及び良性腫瘍が大きく異なるエキソンプロファイルを示すという知見に基づいて、本発明者らは、FNA試料に対する乳癌診断についての分子分類手段を開発した。
【０１８３】
実施例II：乳癌診断についての分子分類手段の開発
患者及び方法
患者
この研究には94名の患者を含めた。これらの患者は、2006年に、臨床的又は放射線検査による乳房障害についてInstitut Gustave Roussyを訪れた。FNAを、これら全ての患者に対して行って、乳房障害の診断を評価した。70名の患者で乳腺癌が診断され、24名の患者で良性障害が診断された。乳癌診断は、CNB又は手術検体に対する癌細胞の同定に基づいた。良性障害の診断は、CNBでの非悪性上皮細胞の同定及びFNA試料での非悪性上皮細胞の同定、並びに３又は６か月後のフォローアップで放射線検査における変化がないことに基づいた。患者の特徴を表２に報告する。
【０１８４】
【表２】
2011508598.tif 000020
【０１８５】
試料プロセシング及びハイブリッド形成
RNAを、RNEasyキット(Qiagen)を用いてFNA検体から抽出した。トータルRNAの質及び量を、RNA 6000 Nano LabChipキットをAgilent 2100バイオアナライザーとともに用いて評価した。
試料の増幅及び標識を、WT-Ovation Pico RNA増幅システム及びFL-Ovation cDNA Biotin Module v2 (NuGen, Inc.、パート番号3300-60及び4200-60)を製造業者の使用説明に従って用いて行った。
製造業者の推奨に従う標準的な方法を用いて試料をハイブリッド形成させた。パンゲノムアレイを設計して、138,636のスプライシング事象を検出した。20,649個の遺伝子が、このアレイを用いて解析される。このアレイに含まれるプローブの全体数は6,079,562であった。今回の研究は、703,680個の立証されたプローブ(Evidenced probes)に焦点を当てた。一旦ハイブリッド形成させると、アレイを洗浄し、FS450-0001 Fluidicsプロトコルを用いて染色した後に、Affymetrix GeneChip (登録商標)スキャナ3000 7Gを用いてスキャンした。.DAT及び.CEL画像を、異常及び正確なグリッド配置について目視で検査した。.CELファイルをPartek (登録商標) Genomics Suiteにインポートし、データを、Robust Multichip Average (RMA)バックグラウンド補正法、次いでGC含量バックグラウンド補正を用いて処理した。分位正規化(Quantile normalization)を全てのアレイに対して行って、データをLog2変換し、平均プローブ統括(mean probe summarization)を行った。
【０１８６】
正規化
データを、RMAバックグラウンド補正法、次いでグアニン-シトシン含量バックグラウンド補正を用いて処理した。分位正規化を全てのアレイに対して行い、次いでデータをlog2変換し、平均プローブ統括を行った。
【０１８７】
プレフィルタリング
703,680の立証されたプローブから出発して、本発明者らは、以下のようにして、94患者学習セットにわたって発現がほとんど変動しないプローブをフィルタにかけて除外した。まず、本発明者らは、発現の値の最低値を10に設定し(すなわち、10未満の全ての発現の値を10に置き換えた)、次いで、94患者セットにわたって最低強度による最大の比が５以上であり、最大強度と最低強度との差が100以上である場合に、データセットからプローブを削除した。合計で176,832個のプローブが、予備フィルタリングステップの後に解析のために維持された。
【０１８８】
統計解析
点双列相関係数を、それぞれのプローブについて、プローブ発現と、患者の状態により規定される値である二進法の指標(この指標は、良性組織を有する患者では０の値であり、腫瘍を有する患者からの組織では１の値であった)との間で計算した(Kraemer HC: Biserial correlation, Encyclopedia of Statistical Science, Vol 1. Kotz S, Read CB編 New York, Wiley, 1982,. pp 276〜280)。最大の絶対相関係数を有するプローブは、腫瘍の発生と最も関連しやすいものである。本発明者らは、t検定を用いて、点双列相関係数の値が０から有意に異なるかについて試験した(Kraemer HC: Biserial correlation, Encyclopedia of Statistical Science, Vol 1. Kotz S, Read CB編 New York, Wiley, 1982, pp 276〜280)。複数の試験の問題点を考慮に入れるために、統計的有意性について非常に厳密なカットオフを用いた：10e-8 (1億(100million)のうちの１)。
【０１８９】
状態が未知の新しい患者からの組織を分類するための予測法則を開発するために(良性  対  悪性)、本発明者らは、最短重心予測法則を選択したが、これは、いくつかのマイクロアレイ研究からのデータに対してよく研究されている(S. Michiels, S. Koscielny, C. Hill. Prediction of cancer outcome with microarrays: a multiple random validation strategy. Lancet 2005；365:488〜92)。この予測法則は、新しい患者を、それらの特徴プローブの発現と２つのカテゴリー(平均の良性及び悪性プロファイルは、94患者学習セットの良性及び悪性組織を有する患者における特徴プローブの平均発現値のベクトルとして規定される)での平均プロファイルとの間のピアソン相関に従って分類し、予測されるカテゴリーは最高のピアソン相関を有するものである。特徴プローブは、良性  対  悪性状態での点双列相関係数の有意性の検定のp値がある特定の閾値より低いプローブであると規定した。
【０１９０】
リーブ-ワン-アウトクロスバリデーションを用いて、予測法則の予測の正確性を評価した。１つの試料を除外して、残りの試料を用いて予測法則を構築し、次いで、これを用いて残された試料を分類する。全体的なモデル構築プロセスを、それぞれのリーブ-ワン-アウト学習セットについて繰り返して、予測の正確性の不偏推定を行う(Ntzani EE, Ioannidis JP. Predictive ability of DNA microarrays for cancer outcomes and correlates: an empirical assessment. Lancet 2003；362: 1439〜44；Simon R, Radmacher MD, Dobbin K, McShane LM. Pitfalls in the use of DNA micro array data for diagnostic and prognostic classification. J Natl Cancer Inst 2003 ；95 : 14〜8)。相関係数を再計算し、それらの絶対値に従って並べ、規定された特徴プローブ及び最短重心予測法則を構築した。次いで、本発明者らは、93のその他の試料からの平均の良性及び悪性のプロファイルとのそれが有していた最大の相関係数に基づいて最初に残した１つの試料の結果を予測した。リーブ-ワン-アウトクロスバリデーション手順の最後に、本発明者らは、いくつのケースにおいて予測が正しく、いくつのケースにおいて予測が誤っていたかを計数した。
本発明者らは、誤って分類される患者の数が最も少なくなる最適予測法則を見出すために、特徴遺伝子についての異なるp値閾値についてのリーブ-ワン-アウトクロスバリデーションに基づく上記の性能評価手順を繰り返した。本発明者らは、以下の４つのp値閾値を試して、特徴遺伝子を規定した：10e-11、10e-10、10e-09及び10e-8。
本発明者らは、その発現が新しい患者の組織の良性及び悪性の状態を分類するために用いることができる50、100、150及び200個のポリヌクレオチドプローブセットのサブセットも提供する。
【０１９１】
結果：
本発明者らは、厳しいp値カットオフであるp＜10e-8にて悪性と有意に関連していた1,640個の立証されたポリヌクレオチドプローブセットを見出した(表３を参照)。正の相関係数を有するポリヌクレオチドプローブセットは、悪性組織において発現が増加したものであり、負の相関係数を有するものは、良性組織において発現が増加したものである。
本発明者らは、上記の方法論に基づいて、最適予測法則を開発した。特徴遺伝子を規定するために好ましいp値閾値は、p<10e-9であった。このp値閾値は、表３の最初の1228個のポリヌクレオチドプローブセットに相当する(識別名1番〜1228番)。リーブ-ワン-アウトクロスバリデーションを用いてこの特定の閾値を用いる予測法則の予測の正確性を評価する場合、良性状態の24名の患者のうち誤って分類されたものは０名であり(0%)、悪性状態の70名の患者のうち誤って分類されたものは０名であった(0%)。これは、100%の感度及び100%の特異性に相当する。
【０１９２】
【表３−１】
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【０１９３】
【表３−２】
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【０１９４】
【表３−３】
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【０１９５】
【表３−４】
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【０１９６】
【表３−５】
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【０１９７】
【表３−６】
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【０１９８】
【表３−７】
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【０１９９】
【表３−８】
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【０２００】
【表３−９】
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【０２０１】
【表３−１０】
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【０２０２】
【表３−１１】
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【０２０３】
【表３−１２】
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【０２０４】
【表３−１３】
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【０２０５】
【表３−１４】
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【０２０６】
【表３−１５】
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【０２０７】
【表３−１６】
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【０２０８】
【表３−１７】
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【０２０９】
【表３−１８】
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【０２１０】
【表３−１９】
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【０２１１】
【表３−２０】
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【０２１２】
【表３−２１】
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【０２１３】
【表３−２２】
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【０２１４】
【表３−２３】
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【０２１５】
【表３−２４】
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【０２１６】
【表３−２５】
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【０２１７】
【表３−２６】
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【０２１８】
【表３−２７】
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【０２１９】
【表３−２８】
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【０２２０】
【表３−２９】
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【０２２１】
【表３−３０】
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【０２２２】
【表３−３１】
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【０２２３】
【表３−３２】
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【０２２４】
【表３−３３】
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【０２２５】
【表３−３４】
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【０２２６】
【表３−３５】
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【０２２７】
【表３−３６】
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【０２２８】
【表３−３７】
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【０２２９】
【表３−３８】
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【０２３０】
【表３−３９】
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【０２３１】
【表３−４０】
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【０２３２】
【表３−４１】
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【０２３３】
【表３−４２】
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【０２３４】
【表３−４３】
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【０２３５】
【表３−４４】
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【０２３６】
【表３−４５】
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【０２３７】
【表３−４６】
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【０２３８】
【表３−４７】
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【０２３９】
【表３−４８】
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【０２４０】
【表３−４９】
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【０２４１】
【表３−５０】
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【０２４２】
組織の良性又は悪性の状態を分類するために用いられるポリヌクレオチドプローブセットのより少ない量のサブセットを見出すために、表４の上位50、上位100、上位150及び上位200のポリヌクレオチドプローブセットを用いて予測法則を構築した(識別名1番〜50番、1番〜100番、1番〜150番及び1番〜200番)。リーブ-ワン-アウトクロスバリデーションによる評価された予測の正確性は、以下の通りであった：
-上位50のポリヌクレオチドプローブセットを用いて：良性状態の24名の患者のうち１名と、悪性状態の70名の患者のうち７名が誤って分類された。
-上位100のポリヌクレオチドプローブセットを用いて：良性状態の24名の患者のうち１名と、悪性状態の70名の患者のうち５名が誤って分類された。
-上位150のポリヌクレオチドプローブセットを用いて：良性状態の24名の患者のうち０名と、悪性状態の70名の患者のうち６名が誤って分類された。
-上位200のポリヌクレオチドプローブセットを用いて：良性状態の24名の患者のうち０名と、悪性状態の70名の患者のうち４名が誤って分類された。
【０２４３】
表５は、学習セットの24の良性組織及び70の悪性組織について測定された、p<10e-9を有する好ましい1228の特徴ポリヌクレオチドプローブセットの平均プロファイルを含む。よって、今後の患者の組織の悪性状態を予測するために用いられるプローブの好ましいセットが、ここに報告される。
【０２４４】
2006年〜2007年に、臨床的又は放射線検査による乳房障害についてInstitut Gustave Roussyを訪れ、FNAを行って乳房障害の診断を評価したさらに100名の患者を、エキソンプロファイリングにより分析した。好ましい1228の特徴ポリヌクレオチドプローブセットを用いる予測法則を、この独立した検証セットに用いた。
【０２４５】
本発明者らは、上記の方法論に基づいて最適予測法則を開発した。特徴遺伝子を規定するために好ましいp値閾値は、p<10e-9であった。リーブ-ワン-アウトクロスバリデーションを用いてこの特定の閾値を用いる予測法則の予測の正確性を評価する場合、本発明者らは、図４に示されるように全ての試料を正確に分類した。このことは、100%の感度及び100%の特異性に相当する。表５は、学習セットの20の良性組織及び74の悪性組織とで測定された、p<10e-9を有する好ましい1228の特徴プローブセットの平均プロファイルを含む。正の相関係数を有するプローブは、悪性組織において発現が増加したものであり、負の相関係数を有するものは、良性組織において発現が増加したものである。
【０２４６】
【表４−１】
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【０２４７】
【表４−２】
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【０２４８】
【表４−３】
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【０２４９】
【表４−４】
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【０２５０】
【表４−５】
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【０２５１】
【表４−６】
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【０２５２】
【表４−７】
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【０２５３】
【表４−８】
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【０２５４】
【表４−９】
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【０２５５】
【表４−１０】
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【０２５６】
【表４−１１】
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【０２５７】
【表４−１２】
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【０２５８】
【表４−１３】
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【０２５９】
【表４−１４】
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【０２６０】
【表４−１５】
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【０２６１】
【表４−１６】
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【０２６２】
【表４−１７】
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【０２６３】
【表４−１８】
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【０２６４】
【表４−１９】
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【０２６５】
【表４−２０】
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【０２６６】
【表４−２１】
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【０２６７】
【表４−２２】
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【０２６８】
【表４−２３】
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【０２６９】
【表４−２４】
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【０２７０】
【表４−２５】
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【０２７１】
【表４−２６】
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【０２７２】
【表４−２７】
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【０２７３】
【表５−１】
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【０２７４】
【表５−２】
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【０２７５】
【表５−３】
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【０２７６】
【表５−４】
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【０２７７】
【表５−５】
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【０２７８】
【表５−６】
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【０２７９】
【表５−７】
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【０２８０】
【表５−８】
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【０２８１】
【表５−９】
2011508598.tif 000106
【０２８２】
【表５−１０】
2011508598.tif 000107
【０２８３】
【表５−１１】
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【０２８４】
【表５−１２】
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【０２８５】
【表５−１３】
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【０２８６】
【表５−１４】
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【０２８７】
【表５−１５】
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【０２８８】
【表５−１６】
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【０２８９】
【表５−１７】
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【０２９０】
【表５−１８】
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【０２９１】
【表５−１９】
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【０２９２】
【表５−２０】
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【０２９３】
【表５−２１】
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【０２９４】
【表５−２２】
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【０２９５】
【表５−２３】
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【０２９６】
実施例III：乳癌診断のための分子予測：検証セット。
全体で71個の試料を含む検証セットを行った。これらのうち、21及び50がそれぞれ良性障害及び乳癌であった。このデータセットを用いて、本発明者らは、1228個の特徴プローブの性能を評価して、良性障害に対抗する乳癌を予測した。71個の試料のうち全体で68個が正確に分類された(96%)。検査の感度及び特異性は、96% (95%CI：90.5〜100)及び95% (95%CI：86.1〜100)であった。悪性及び良性のプロファイルを有するそれぞれの検体の相関関係を、図６に報告する。分子予測手段により誤って分類された３つの検体のうち、１つは悪性腫瘍に分類された良性腫瘍(炎症性肉芽腫症)であり、２つは良性に分類された悪性腫瘍であった。
本発明者らは、次いで、細胞診、及びAmerican College of Radiology (ACR)の分類及び年齢を含むモデルに分子予測手段を加える価値(add-value)について評価した。細胞診は、71名の患者のうち５名において明確な診断を提供できなかった。これらの５名の患者のうち４名は、分子予測手段により正確に分類された。臨床モデル(年齢及びACR)による説明された変動の割合(proportion of explained variation；PEV)は、75%+-8%であり、分子予測手段によるPEVは81% (+/- 10%)であった。臨床モデル及び分子予測手段を組み合わせると、PEVは87% (+/-7%)であり、分子予測手段が臨床モデルに12% (+/-7%)の価値を加えることを示唆した。
【０２９７】
上位50のポリヌクレオチドプローブセットを用いた場合：良性状態の患者からの21個の試料のうち１個と、悪性状態の患者からの50個の試料のうち８個が誤って分類された。
上位100のポリヌクレオチドプローブセットを用いた場合：良性状態の患者からの21個の試料のうち１個と、悪性状態の患者からの50個の試料のうち７個が誤って分類された。
上位150のポリヌクレオチドプローブセットを用いた場合：良性状態の患者からの21個の試料のうち１個と、悪性状態の患者からの50個の試料のうち10個が誤って分類された。
上位200のポリヌクレオチドプローブセットを用いた場合：良性状態の患者からの21個の試料のうち１個と、悪性状態の患者からの50個の試料のうち７個が誤って分類された。
【０２９８】
これらのデータは、いくらかの誤った分類が生じるものの、上位のプローブセットは、乳腺腫についての良好な予測を提供することを示す。
さらに、1228個又は1640個の本発明によるポリヌクレオチドプローブセットを用いることは、明確にかつ誤って分類することなく、乳腺腫が良性又は悪性であるかを決定することを可能にする。
【０２９９】
考察
本研究では、本発明者らは、乳房悪性腫瘍のエキソンの描写を報告した。悪性障害と良性障害の間の異なるエキソン事象の解析は、乳房悪性腫瘍に関連するゲノムの異常を完全に描く。本研究は、悪性と良性の乳房障害の間の高いレベルのゲノム調節不全を明らかにする。本発明者らは、703680個の立証されたプローブのうち56652個(8%)が、これらの２つの状態において異なることを見出した。遺伝子発現レベルに注目した解析の場合(プローブセットの幾何平均)、20649個の遺伝子のうち3733個(7%)が、悪性と良性の障害の間で異なって発現されていた。遺伝子発現レベルの解析は、さらなる調査のための候補遺伝子の過剰発現を明らかにした。下垂体腫瘍トランスフォーミング1 (PTTG1)は、下垂体腫瘍、甲状腺癌、結腸癌及び神経膠腫において過剰発現され、悪性形質転換を媒介すると以前に報告された(Vlotides G, Eigler T, Melmed S. Pituitary tumor-transforming gene: physiology and implications for tumorigenesis. Endocr Rev. 2007 Apr;28(2):165〜86)。神経上皮細胞トランスフォーミング遺伝子1 (NET1)は、RhoAの活性化により腫瘍形成性形質転換を媒介すると報告されているグアニン交換因子である(Chan AM, Takai S, Yamada K, Miki T. Isolation of a novel oncogene, NET1, from neuroepithelioma cells by expression cDNA cloning. Oncogene. 1996 Mar 21;12(6):1259〜66)、経路解析により、スプライソソームの組み立てに関与する遺伝子が悪性状態において増加することが明らかになった。スプライソソームは、腫瘍形成に含まれる現象である選択的スプライシングを媒介する(Lonning PE, Knappskog S, Staalesen V, Chrisanthar R, Lillehaug JR. Breast cancer prognostication and prediction in the postgenomic era. Ann Oncol. 2007 Aug;18(8):1293〜306; Pajares MJ, Ezponda T, Catena R, Calvo A, Pio R, Montuenga LM. Alternative splicing: an emerging topic in molecular and clinical oncology. Lancet Oncol. 2007 Apr;8(4):349〜57)。今回の研究は、選択的スプライシングが乳癌の分子プロファイルに大きく貢献できることを示唆する。この考察に基づいて、本発明者らは、エキソンレベルでの解析がどの程度まで、遺伝子発現レベルでの解析により提供される情報にさらなる情報を提供できるかをさらに評価した。
【０３００】
本発明者らは、異なって発現されると同定された遺伝子に属さない2675個のエキソンプローブが、実際は、乳癌において著しくより高い強度を示すことを同定した。これらの2675個のエキソンプローブの高い割合は、良性腫瘍と比較して乳癌でのスプライスインデックスが著しく増加していることを示した。これらのエキソンプローブは、それらの関連遺伝子の１つと比較して、癌と良性障害との間の強度のより大きい違いを示すと考えられた。これらのエキソンのいくつかは、癌の生物学と関連する遺伝子に存在する(カゼインキナーゼ1, デルタ(Gao ZH, Seeling JM, Hill V, Yochum A, Virshup DM. Casein kinase I phosphorylates and destabilizes the beta-catenin degradation complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Feb 5;99(3):1182〜)、網膜芽腫結合タンパク質9 (Woitach JT, Zhang M, Niu CH, Thorgeirsson SS. A retinoblastoma-binding protein that affects cell-cycle control and confers transforming ability. Nat Genet. 1998 Aug;19(4):371〜4)、及びERB2相互作用タンパク質(Jaulin-Bastard F, Arsanto JP, Le Bivic A, Navarro C, Vely F, Saito H, Marchetto S, Hatzfeld M, Santoni MJ, Birnbaum D, Borg JP. Interaction between Erbin and a Catenin related protein in epithelial cells. J Biol Chem. 2002 Jan 25;277(4):2869〜75))。これらのデータは、疾患の転写プロファイルを明確にするために遺伝子発現レベルでの解析の限界を指摘し、エキソンレベルでの解析が、遺伝子発現レベルでの解析が逃してしまう生物学的情報をつかむことができるであろうことを示唆する。
【０３０１】
乳癌が、良性腫瘍と比較して大きく異なるエキソンプロファイルを示すという発見に基づいて、本発明者らは、この技術を乳癌診断に用い得るかどうかを評価した。腫瘍生検の病理検査は、癌診断の究極の基準である。にもかかわらず、このようなアプローチは、侵襲性の処置の必要性、及びいくつかの型の腫瘍においては誤診を含むいくつか限界を示す。本研究においては、本発明者らは、細針穿刺に基づく大規模分子解析が、乳癌診断を可能にすることを示した。この発見は、癌診断の分野において新たな道を開く。乳癌に適用して、細針穿刺の測定性能を増大させることにより、より効率的なスクリーニング後の治療パターンを可能にできる。生検は、乳癌診断のための現在のところの究極の基準であるが、これは、死亡及び治療の遅延の両方に関連する(Meunier M, Clough K. Fine needle aspiration cytology versus percutaneous biopsy of nonpalpable breast lesions. Eur J Radiol. 2002 Apr;42(1):10〜6)。細針穿刺はより安全でより容易なアプローチであるが、高い割合の偽陰性の結果を伴う。本研究では、FNA試料を用いる1228プローブ特徴による分子診断が、学習セットにおいて100%の正確性と、検証セットにおいて96%の正確性を伴った。興味深いことに、分子分類手段は、細胞診が確実ではなかった５つの試料のうち４つにおいて正確な診断を提供した。まとめると、これらのデータは、1228プローブ特徴が、乳癌診断について細胞診の補完的なツールになり得ることを示唆した。このツールは、生検、及び乳房の良性障害の患者における不必要な手術を回避することを可能にする。反対に、悪性障害について、このアプローチは、診断をスピードアップすることができ、手術までの時間を減らすことを可能にする。癌診断についての分子アッセイの開発は、他の型の腫瘍においても特に興味深いだろう。例として、甲状腺結節の良性の性質は、手術前に決定するのがしばしば困難であり、不必要な手術を導く(Poller DN, Stelow EB, Yiangou C. Thyroid FNAC cytology: can we do it better? Cytopathology. 2008 Feb;19(1):4〜10)。分子アッセイは、この状況において手術の必要性を劇的に低減できるだろう。
【０３０２】
全体として、本研究は、乳房の悪性及び良性の腫瘍の間で異なって発現されるエキソンを完全に記載する。これらのデータは、乳癌におけるさらに機能的な検証のための候補遺伝子(PTTG1、NET1)の同定を可能にした。さらに、これは、選択的スプライシングが、乳癌の分子プロファイルに大きく貢献し、癌において著しくより高いスプライスインデックを有するが、変化しない遺伝子内に存在するエキソンの同定を導く。
最後に、スプライスアレイ技術は、乳癌診断のためのエキソン特徴の開発を可能にした。
【０３０３】
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【表７−３】
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【０４９９】
【表７−１９】
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【０５００】
【表７−２０】
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【０５０１】
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【０５０２】
【表７−２２】
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【０５０３】
【表７−２３】
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【０５０４】
【表７−２４】
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【０５０５】
【表７−２５】
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【０５０６】
【表７−２６】
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【０５０７】
【表７−２７】
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【０５０８】
【表７−２８】
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【０５０９】
【表７−２９】
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【０５１０】
【表７−３０】
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【０５１１】
【表７−３１】
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【０５１２】
【表７−３２】
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【０５１３】
【表７−３３】
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【０５１４】
【表７−３４】
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【０５１５】
【表７−３５】
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【０５１６】
【表７−３６】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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