(57)【要約】  本発明は、哺乳動物ベータ・デフェンシンを用いたＴＮＦ‐アルファ活性の抑制に関し、そしてそれは、腫瘍壊死因子アルファに関連する病的状態の処置において有用性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ、骨関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、強皮症（全身性硬化症）、ループス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、（急性）糸球体腎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、血管炎、ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脱毛症、（アレルギー性）鼻炎、アレルギー性結膜炎、重症筋無力症、硬化性皮膚炎、サルコイドーシス、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、及びベーチェット病から成る群から選択される炎症性疾患又は障害の処置のための医薬の製造のための、哺乳動物ベータ・デフェンシンの使用。
【請求項２】
前記医薬が非経口投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬が、皮下、又は静脈内に投与される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量にて投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、ヒト・ベータ・デフェンシンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ヒト・ベータ・デフェンシンが、ヒト・ベータ・デフェンシン１、ヒト・ベータ・デフェンシン２、ヒト・ベータ・デフェンシン３、又はヒト・ベータ・デフェンシン４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、ヒト・ベータ・デフェンシン２である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ＴＮＦ‐アルファ活性が、処置した組織において低下する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
有効量の哺乳動物ベータ・デフェンシンを、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物組織の炎症性疾患又は障害の処置方法であって、ここで、前記炎症性疾患又は障害が、関節リウマチ、骨関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、強皮症（全身性硬化症）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、（急性）糸球体腎炎、喘息、例えば気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、炎症性腸疾患（例えばクローン病）、結腸炎（例えば潰瘍性結腸炎）、血管炎、ブドウ膜炎、皮膚炎（例えば炎症性皮膚炎）、アトピー性皮膚炎、脱毛症、（アレルギー性）鼻炎、アレルギー性結膜炎、重症筋無力症、硬化性皮膚炎、サルコイドーシス、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、及びベーチェット病から成る群から選択される、前記方法。
【請求項１２】
前記有効量が、処置した組織においてＴＮＦ‐アルファ活性を低減するために有効である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト・ベータ・デフェンシンが、非経口で、例えば皮下、又は静脈内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量にて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、ヒト・ベータ・デフェンシンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物ベータ・デフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト・ベータ・デフェンシンが、ヒト・ベータ・デフェンシン１、ヒト・ベータ・デフェンシン２、ヒト・ベータ・デフェンシン３、又はヒト・ベータ・デフェンシン４である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願には、コンピューターが読み取り可能な形式で配列表が含まれている。そのコンピューターが読み取り可能な形式を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、哺乳動物ベータ・デフェンシンの投与による腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐アルファ又はＴＮＦ‐α）活性の抑制に関し、そしてそれは、炎症に関連した病的状態の処置を含めた様々な障害の処置において有用性がある。
【背景技術】
【０００３】
ヒト・デフェンシン
他の多くの要素の中でも、先天性免疫の重要な成分は、十分な選択性を個々に示す抗微生物性ペプチド（ＡＭＰｓ）であるが、まとめると、それらは共同で、広範囲の細菌、ウイルス、及び真菌を素早く殺滅することができる。ＡＭＰｓの生物学的意味は、自然界の中でのそれらの遍在的分布によって強調され、そしてそれらはおそらくすべての多細胞生物によって産生されている。ヒトでは、主たるＡＭＰｓはデフェンシンである。ヒト・デフェンシンは、それらの３つの分子内システイン・ジスルフィド結合形成の位相に基づいてα‐及びβ‐デフェンシンに分類できるカチオン性小ペプチドである。α‐デフェンシンはさらに、好中性顆粒から最初に単離されたもの（ＨＮＰ１〜４）と小腸の腺窩内のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５とＨＤ６）に細分できる。β‐デフェンシンは主に、皮膚、気管、胃腸管、泌尿生殖器系、腎臓、膵臓、及び乳腺を含めた種々の組織並びに臓器の上皮細胞によって産生される。β‐デフェンシンファミリーの中で最もよく特徴づけされているメンバーは、ｈＢＤ１〜３である。しかしながら、様々な生命情報工学ツールを使用すると、ヒトゲノムにおいて、推定上のβ‐デフェンシン相同体をコードする４０近いオープン・リーディング・フレームには注釈が付されている。一部のヒト・デフェンシンは構成的に産生されているが、その他のものは炎症誘発性サイトカイン又は外因性微生物産物によって誘導される。
【０００４】
それらの直接的な抗微生物活性に加え、ヒト・デフェンシンには様々な免疫調節性／代替特性があることもまた、次第に明らかになった。これらの中には、様々なケモカイン及びサイトカインの誘導、走化作用及びアポトーシス活性、プロスタグランジン、ヒスタミン及びロイコトリエン放出の誘導、補体の阻害、トール様受容体シグナル伝達を通じた樹状細胞成熟の刺激、並びに好中球による病原菌クリアランスの刺激が含まれる。さらに、ヒト・デフェンシンはまた、創傷治癒、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管新生、並びに脈管形成においても役割を果たしている。
【０００５】
ヒト・デフェンシンが多くの感染性及び炎症性疾患において重要な役割を果たしていることが次第に明らかになっている。ヒト・デフェンシンの過剰発現は、おそらく微生物成分又は内因性炎症誘発性サイトカインによる局所的な誘導のため、炎症を起こした、及び／又は感染した皮膚において観察されることが多い。乾癬では、ｈＢＤ２とｈＢＤ３が過剰であり、そして尋常性座瘡又は表在性毛嚢炎を患っている患者の病変上皮においては、ｈＢＤ２の有意な上方制御が観察された。その一方、ｈＢＤ２とｈＢＤ３の下方制御がアトピー性皮膚炎に関連した。回腸クローン病はＨＤ５及びＨＤ６の発現欠如に関連し、そしてクローン病において、結腸でのｈＢＤ２〜４の発現は下方制御された。
【０００６】
サイトカイン
サイトカインは、細胞間のシグナル伝達に関与し、そして他の細胞の成長、分裂、及び機能に影響する高等真核生物から分泌される小さなポリペプチドである。それらは、例えば対応する受容体を介して局所的又は全身的な細胞間の調節因子として作用し、そのため多くの生物学的過程、例えば免疫、炎症、及び造血などにおいて極めて重要な役割を担っている強力な多機能ポリペプチドである。サイトカインは、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、マクロファージ／単球、及びリンパ球を含めた様々な細胞型によって産生される。
【０００７】
ＴＮＦ‐αは、様々な病態生理学的過程に関与し、そして宿主防御などの場合には保護的になり得、又は自己免疫などの場合には有害になり得る。ＴＮＦ‐αは炎症反応を引き起こし、維持する主要なサイトカインの１つであり、そしてＴＮＦ‐α不活性化が、自己免疫疾患に関連している炎症反応を下方制御する際に重要であることが立証された。感染時に、ＴＮＦ‐αはマクロファージによって多量に分泌され、そしてそれは接着分子を産生するように内皮細胞を刺激することによって、及び（走化性サイトカインである）ケモカインを産生することによって感染部位への好中球及びマクロファージの動員を媒介する。ＴＮＦ‐αは、白血球及びその他の炎症細胞を活性化し、そして傷害組織内での血管透過を増強するのを助ける。ＴＮＦ‐αは主に、マクロファージ、単球、及び樹状細胞によって産生されるが、リンパ球系細胞、マスト細胞、内皮細胞、心筋細胞、脂肪組織、繊維芽細胞、及び神経組織を含めたその他の様々な細胞型によっても産生される。
【０００８】
現在の抗炎症薬は、それがＴＮＦ‐αに結合し、それによりＴＮＦ‐αが細胞表面上のＴＮＦ‐αの受容体にシグナル伝達するのを防ぐことによってＴＮＦ‐αの作用を遮断する。このタイプの遮断には、一部の人々が結核、敗血症、及び真菌感染などに感染する、並びに癌発生率の上昇の可能性があるなどのいくつかの重大な副作用がある。
【０００９】
ヒト・サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られるＩＬ‐１０はまた、抗炎症性サイトカインとして免疫調節において重要な役割を担っている。このサイトカインは、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマスト細胞を含めたいくつかの細胞型によって産生される。このサイトカインには、免疫調節と炎症において多面的な効果がある。それは、炎症誘発性サイトカイン、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞によって分泌されるサイトカイン、ＭＨＣのクラスＩＩ Ａｇｓ、及び抗原提示細胞上の共刺激分子の発現を下方制御する。ＩＬ‐１０はまた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）と呼ばれるＴ細胞の集団によっても分泌される。これらの細胞は初期のＴ細胞活性化を妨げず；むしろ、それらは、持続的な応答を阻害するので、慢性的、且つ、潜在的な損害を与える応答を抑制する。末梢では、一部のＴ細胞が、Ｔｒｅｇｓになるように抗原及びＩＬ‐１０若しくはＴＧＦ‐βのいずれかによって誘導される。ＩＬ‐１０によって誘導されるＴｒｅｇｓは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３−であり、Ｔｒ１細胞とも呼ばれる。これらの細胞は、ＩＬ‐１０の分泌によって免疫応答を抑制する。最近の研究では、Ｔｈ１７細胞の識別を用いてＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｒｅｇに比べてＴ細胞エフェクター・レパートリーのより高い多様性が明らかになった。これまで原因がＴｈ１系統にあるとされていたいくつかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、乾癬、及び多発性硬化症などにおいて、この亜集団が病因であることが示された。Ｔｈ１７によって分泌されるサイトカインもまたＩＬ‐１０によって下方制御されるので、ＴＮＦの遮断がＴｈ１７細胞の不活性化によって乾癬を予防する。ＩＬ‐１０の総合的な活性は抗炎症性であり、そしていくつかの動物研究において炎症及び傷害を予防することが示されたが、しかしながら、ＩＬ‐１０投与の経路の難しさやその生物学的半減期のせいで、臨床的ＩＬ‐１０処置は不十分なままである。
【００１０】
炎症を治療するためのヒト・デフェンシンの使用
興味深いことに、小腸におけるクローン病がパネート細胞α‐デフェンシンＨＤ５及びＨＤ６のレベル低下に関連したのに対して、結腸におけるクローン病はβ‐デフェンシンｈＢＤ２及びｈＢＤ３の産生減少に関連した（Ｇｅｒｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｗｅｈｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。さらに、クローン病の発症機序における、腸内微生物叢の関与が納得できるように実証された（Ｓｗｉｄｓｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用することで、これらの研究者らは、活性なクローン病において、粘液関連及び侵入性の細菌の劇的な増加が観察されたのに対して、これらの細菌が通常の大小腸管上皮に不在であることを示した。健康な人では、腸の上皮バリアーに従って適切なレベルのデフェンシンが、管腔の細菌の組成及び数を制御して、それらが炎症を引き起こすように粘液に接着し、そして浸潤するのを避けるように作用していることを示唆しているこれらの観察を一緒に仮説に統合した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。その一方、保護的なレベルの分泌型デフェンシンを産生するには不十分な能力しかない人々では、抗微生物防御と管腔細菌の間のバランスが変化している。結果として、これが炎症状態を引き起こす根本的な腸組織内への細菌侵入を許し、それが今度は、クローン病に進展することもある。
【００１１】
この仮説に基づいて、ＷＯ２００７／０８１４８６は、炎症性腸疾患の処置におけるいくつかのヒト・デフェンシンの使用を開示している。当該発明者らは、経口的にそれが腸管腔内の適切な位置でのデフェンシンの放出を可能にする製剤によりクローン病の患者に対して投与されたデフェンシンが、浸潤している細菌の数を減らし、正常な上皮バリアー機能を再構築するので、よって炎症性疾患の重症度を低減するであろうことを示唆している。
【発明の概要】
【００１２】
ＷＯ２００７／０８１４８６によると、デフェンシンの機能は、管腔内の細菌を直接標的とし、そして殺滅して、それらが表皮組織に浸潤するのを予防することである。すなわち、デフェンシンの機能は、純粋に抗感染症化合物としてのものである。ＷＯ／２００７／０８１４８６と関連して、非経口的に投与されたｈＢＤ２が、この投与経路を使用することでペプチドが管腔細菌に遭遇することがないため、マウスにおいてＤＳＳ誘発結腸炎の重症度を低減することが可能であるというのは、驚くべきことである。さらに、我々は、ｈＢＤ２の効果がＰＢＭＣｓによって分泌される炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐２３のレベルの低減であることを本明細書において示す。これらのサイトカインは、炎症性腸疾患を含めた多くの炎症性疾患において中心的存在であることが知られている。デフェンシンはそれらの抗微生物機能と並んで、幅広い免疫調節機能も有することが１０余年にわたり知られている。しかしながら、ヒト・デフェンシンの免疫調節特性に対する研究の大多数は、それらには主として炎症誘発性又は免疫促進機能があると記載している（例えば、Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｂｏｗｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｌｅｈｒｅｒ， ２００４を参照のこと）。
【００１３】
従って、非経口的に投与されたｈＢＤ２が炎症性腸疾患における疾病重症度を軽減することが可能であることは、全く予期されていない。まず、非経口的に投与した場合、ｈＢＤ２は、疾患の誘発に関与する有害細菌に遭遇するように腸管腔に達することはないであろう。そのうえ、本明細書中に提示した研究において見られたように、刊行された文献の大多数に基づいて、当業者は血流に入ったデフェンシンが抗炎症応答よりむしろ炎症誘発応答を引き起こすと予想するだろう。
【００１４】
発明の詳細な説明
好ましい実施形態を理解する手助けとして、特定の定義を本明細書中に提供する。
本明細書中で使用する場合、「ＴＮＦ‐アルファ活性」という用語は、広義語であり、当業者にとって普通、且つ、通例の意味が与えられ（そして特別な又は特化した意味に制限されず）、そして、腫瘍壊死因子アルファによって少なくとも一部が媒介される活性又は作用を指すが、これだけに限定されるものではない。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、「抑制剤（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」という用語は、広義語であり、当業者にとって普通、且つ、通例の意味が与えられ（そして特別な又は特化した意味に制限されず）、そして、ＴＮＦ‐アルファの活性の少なくとも１つを低減できる分子（例えば天然又は合成の化合物）を指すが、これだけに限定されるものではない。言い換えれば、抑制剤を用いないで実施したアッセイと比較して、抑制剤を用いて実施したアッセイにおいて計測されるＴＮＦ‐アルファの量、ＴＮＦ‐アルファ活性、又は細胞外及び／又は細胞内で検出されるＴＮＦ‐アルファに統計的に有意な変化があれば、「抑制剤」が活性を変更している。
【００１６】
一般に、ＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、例えばＴＮＦ‐アルファの分泌を低減することによって、ＴＮＦ‐アルファの生理機能を低減するので、ＴＮＦ‐アルファが直接的又は間接的な病因となり得る疾患の処置において有用である。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「ＩＬ‐１０活性」という用語は、広義語であり、当業者にとって普通、且つ、通例の意味が与えられ（そして特別な又は特化した意味に制限されず）、そして、インターロイキン‐１０によって少なくとも一部が媒介される活性又は作用を指すが、これだけに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「誘導因子」という用語は、広義語であり、当業者にとって普通、且つ、通例の意味が与えられ（そして特別な又は特化した意味に制限されず）、そして、ＩＬ‐１０の活性の少なくとも１つを増強できる分子（例えば天然又は合成の化合物）を指すが、これだけに限定されるものではない。言い換えれば、誘導因子を用いないで実施したアッセイと比較して、誘導因子を用いて実施したアッセイにおいて計測されるＩＬ‐１０の量、ＩＬ‐１０活性、細胞外及び／又は細胞内で検出されるＩＬ‐１０に統計的に有意な変化があれば、「誘導因子」が活性を変更している。
【００１９】
一般に、ＩＬ‐１０誘導因子は、ＩＬ‐１０の生理機能を増強するので、ＩＬ‐１０によって影響を受ける疾患の処置において有用である。
【００２０】
「修飾」という用語は、本明細書中では、ヒト・ベータ・デフェンシン２のあらゆる化学修飾を意味する。（単数若しくは複数の）修飾は、（単数若しくは複数の）アミノ酸の（単数若しくは複数の）置換、（単数若しくは複数の）欠失、及び／又は（単数若しくは複数の）挿入、並びに（単数若しくは複数の）アミノ酸側鎖の（単数若しくは複数の）置換であるか；又はアミノ酸配列中で類似した特徴を有する非天然アミノ酸の使用であり得る。特に（単数若しくは複数の）修飾は、アミド化、例えばＣ末端のアミド化であり得る。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「デフェンシン」という用語は、デフェンシン・クラスの抗微生物ペプチドに属すると当業者に認識されたポリペプチドを指す。あるポリペプチドが本発明によるデフェンシンであるかどうか確認するために、自由に入手可能なＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを使用することによってＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデル特性とそのアミノ酸配列を比較してもよい。ＰＦＡＭデフェンシンファミリーとしては、例えばデフェンシン＿１又は「哺乳動物デフェンシン」（受入番号ＰＦ００３２３）、及びデフェンシン＿２又はデフェンシン＿ベータ又は「ベータ・デフェンシン」（受入番号ＰＦ００７１１）が挙げられる。
【００２２】
本発明のデフェンシンは、ベータ・デフェンシンクラスに属する。ベータ・デフェンシンクラスのデフェンシンは、システインパターンなどの共通の構造特徴を共有する。
【００２３】
本発明によるデフェンシンに関する例としては、ヒト・ベータ・デフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１を参照のこと）、ヒト・ベータ・デフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２を参照のこと）、ヒト・ベータ・デフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３を参照のこと）、ヒト・ベータ・デフェンシン４（ｈＢＤ４；配列番号４を参照のこと）、及びマウス・ベータ・デフェンシン３（ｍＢＤ３；配列番号６を参照のこと）が挙げられる。
【００２４】
２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、「同一性」というパラメーターによって説明される。
【００２５】
本発明の目的に対して、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６‐２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のニードルプログラムで実装されるニードルマン‐ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用することで決定される（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３‐４５３）。使用される任意パラメーターは、ギャップ開始ペナルティーが１０、ギャップ伸長ペナルティーが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリクスである。ニードル標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られた）の出力は、パーセント同一性として使用され、そして以下のとおり計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント内のギャップの総数）
【００２６】
本発明の目的に対して、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のニードルプログラムで実装されるニードルマン‐ウンシュ・アルゴリズムを使用することで決定している（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前掲）。使用される任意パラメーターは、ギャップ開始ペナルティーが１０、ギャップ伸長ペナルティーが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリクスである。ニードル標識された「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られた）の出力は、パーセント同一性として使用され、そして以下のとおり計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ‐アラインメントのギャップの総数）
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、供給源から単離されたバリアント又はポリペプチドを指す。１つの側面において、バリアント又はポリペプチドは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって測定した場合、少なくとも１％純粋であり、好ましくは少なくとも５％純粋であり、より好ましくは少なくとも１０％純粋であり、より好ましくは少なくとも２０％純粋であり、より好ましくは少なくとも４０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００２８】
「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、本明細書中では、天然に又は遺伝子組み換えにより付随するその他のポリペプチド物質を最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、よりいっそう好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてさらに最も好ましくは最大０．５重量％含有するポリペプチド調製物を意味する。そのため、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド物質のうちの少なくとも９２重量％純粋であり、好ましくは少なくとも９４重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも９９重量％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋であり、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態である。これは、例えばよく知られる遺伝子組み換え方法又は古典的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成できる。
【００２９】
哺乳動物ベータ・デフェンシン
本発明は、増強された（病因）レベルのＴＮＦ‐アルファに関連している疾患、例えば炎症性疾患などの処置における哺乳動物ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン及び／又はマウス・ベータ・デフェンシンなどの医薬使用に関する。上記処置は、処置された組織において低減されたＴＮＦ‐アルファ活性に関連することが好ましい。よって、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンはまた、ＴＮＦ‐アルファ抑制剤とも呼ばれる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ある実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び／又は配列番号６のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・デフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・デフェンシン３（配列番号３）、ヒト・ベータ・デフェンシン４（配列番号４）、ヒト・ベータ・デフェンシン４のバリアント（配列番号５）、及び／又はマウス・ベータ・デフェンシン３（配列番号６）から成る。よりいっそう好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・デフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・デフェンシン３（配列番号３）、及び／又はヒト・ベータ・デフェンシン４（配列番号４）から成る。
【００３１】
他の実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン２（配列番号２）から成る。
【００３２】
さらに他の実施形態において、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン及び／又はマウス・ベータ・デフェンシン、並びに機能的に同等なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン１、ヒト・ベータ・デフェンシン２、ヒト・ベータ・デフェンシン３、ヒト・ベータ・デフェンシン４、及びマウス・ベータ・デフェンシン３、並びに機能的に同等なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンは、ヒト・ベータ・デフェンシン２、及び機能的に同等なそのバリアントから成る。
【００３３】
本発明の哺乳動物ベータ・デフェンシンはまた、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。
【００３４】
本発明との関連において、哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシンの「機能的に同等なバリアント」は、ＴＮＦ‐アルファ活性に対して哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２などと大体同じ効果を示す修飾哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシンである。より好ましくは、それはまた、ＩＬ‐１０活性に対しても哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２などと大体同じ効果を示す。
【００３５】
本発明によると、哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２などの機能的に同等なバリアントは、哺乳動物（例えばヒト）ベータ・デフェンシン・アミノ酸配列、例えば配列番号２などと比較して、１〜５個のアミノ酸修飾、好ましくは１〜４個のアミノ酸修飾、より好ましくは１〜３個のアミノ酸修飾、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸修飾、そして特に１個のアミノ酸修飾を含有していてもよい。
【００３６】
好ましくは、アミノ酸修飾は、軽微な性質のものであり、それは、ポリペプチドの折りたたみ及び／又は活性に顕著に影響しない保存的なアミノ酸置換又は挿入；一つの欠失；小さなアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長；最長約２０〜２５残基の小さなリンカーペプチド；あるいは、正味電荷又は別の機能を変えることによって精製を容易にする小さい伸長、例えばポリ‐ヒスチジンタグ、抗原エピトープ若しくは結合ドメインなどである。
【００３７】
保存的置換に関する例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、及びメチオニン）の群の中にある。全体として比活性を変更しないアミノ酸置換が、当該技術分野で知られており、例えばＨ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって記載されている。最も一般的に生じる変更は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００３８】
２０種類の標準的なアミノ酸に加えて、非標準的なアミノ酸（４‐ヒドロキシプロリン、６‐Ｎ‐メチルリシン、２‐アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ・メチルセリンなど）を、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換してもよい。限られた数の非保存性アミノ酸、遺伝コードによってコード化されていないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、アミノ酸残基と置換してもよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾された、及び／又は標準的なアミノ酸のものと異なるそれらの側鎖の化学構造を持っている。非天然アミノ酸は、化学的に合成されることができ、好ましくは市販のものであり、そしてピペコリン酸、チアゾリジン・カルボン酸、デヒドロプロリン、３‐及び４‐メチルプロリン、並びに３，３‐ジメチルプロリンが挙げられる。
【００３９】
哺乳動物ベータ・デフェンシンの必須アミノ酸は、当該技術分野で知られている手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン‐スキャニング突然変異誘発などにより特定される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１‐１０８５）。後者の技術では、１つのアラニン突然変異が分子内のあらゆる残基に導入され、そして得られた突然変異体分子が生物学的活性（すなわち、ＴＮＦ‐アルファ活性の抑制）について試験されて、分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９‐４７０８もまた参照のこと。必須アミノ酸の同一性もまた、哺乳動物ベータ・デフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析から推測できる。
【００４０】
単一又は複数のアミノ酸置換を、おこなうことができ、そして既知の突然変異誘発、遺伝子組み換え、及び／又はシャッフリングの方法を使用し、続いて関連スクリーニング手順、例えばＲｅｉｄｈａａｒ‐Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３‐５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２‐２１５６；ＷＯ９５／１７４１３；又はＷＯ９５／２２６２５に開示されたものなどを使用して試験する。使用できるその他の方法としては、エラー‐プローンＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（例えばＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，３０：１０８３２‐１０８３７；米国特許番号第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／０６２０４）、及び領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドのＮ末端伸長は、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、特に３〜１５個のアミノ酸から適切に構成されることもできる。１つの実施形態において、Ｎ末端ペプチド伸長は、Ａｒｇ（Ｒ）を含んでいない。他の実施形態において、Ｎ末端伸長は、以下でさらに規定されるように、ｋｅｘ２又はｋｅｘ２様開裂部位を含んでなる。好ましい実施形態において、Ｎ末端伸長は、少なくとも２つのＧｌｕ（Ｅ）及び／又はＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基を含んでなるペプチド、例えば以下の配列：ＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ、及びＤＤのうちの１つを含んでなるＮ末端伸長などである。
【００４２】
方法と使用
ＴＮＦ‐アルファ抑制剤には、先に述べられたように、様々な適切な用途がある。当業者は、ＴＮＦ‐アルファのコントロールレベルからの統計的に有意な変動（低減）が観察されたとき、抑制が起こったと認識するだろう。
【００４３】
ヒト・ベータ・デフェンシン１、ヒト・ベータ・デフェンシン２、ヒト・ベータ・デフェンシン３、及びヒト・ベータ・デフェンシン４のバリアントが、ＬＰＳ及びＬＴＡ抗原投与細胞においてＴＮＦ‐アルファ活性を低減し、且つ、ＩＬ‐１０活性を誘導することがわかった。さらに、ヒト・ベータ・デフェンシン２が、ＬＰＳ及びＬＴＡ抗原投与細胞においてＩＬ‐２３分泌を低減することがわかり；並びにマウス・ベータ・デフェンシン３が、マウス並びにヒトのＬＰＳ及びＬＴＡ抗原投与細胞の両方においてＴＮＦ活性を低減することがわかった。これらの知見は、試験した哺乳動物ベータ・デフェンシンが素晴らしい抗炎症活性、特に自己免疫疾患又は障害において抗炎症活性を示すことを裏付けている。
【００４４】
好ましい実施形態の医薬組成物は、ＴＮＦ‐アルファ活性によって媒介された障害の処置のために使用され得る。ＴＮＦ‐アルファ活性によって媒介された障害を処置する方法もまた提供され、当該処置は、かかる処置を必要としている対象に、例えば医薬組成物の形態で、有効量の哺乳動物ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２を投与することを含んでなる。医薬の製造のための哺乳動物ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２、及びＴＮＦ‐アルファ活性によって媒介された障害の処置用の医薬、例えば医薬組成物の製造のための哺乳動物ベータ・デフェンシン、例えばヒト・ベータ・デフェンシン２の使用もまた提供される。処置は、既存の疾患又は障害の処置、並びに疾患又は障害の予防（防止）を含む。
【００４５】
ある実施形態において、処置は、処置組織における低減されたＴＮＦ‐アルファ活性、好ましくは低減されたＴＮＦ‐アルファ活性と増強されたＩＬ‐１０活性を結果的にもたらす。
【００４６】
（例えばＴＮＦ‐アルファ活性の阻害若しくは抑制によって、好ましい実施形態の化合物を用いて治療できる）疾患又は障害としては、ＴＮＦ‐アルファ活性によって媒介されるものが挙げられる。好ましくは、これらの障害の処置は、低減されたＴＮＦ‐アルファ活性及び／又は増強されたＩＬ‐１０活性の恩恵を受けることができる。そのような疾患又は障害としては、炎症性疾患若しくは障害、アレルギー疾患、及び自己免疫疾患が挙げられる。より詳しく述べると、上記障害又は疾患としては、関節リウマチ、骨関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、強皮症（全身性硬化症）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、（急性）糸球体腎炎、喘息、例えば気管支喘息など、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、炎症性腸疾患（例えばクローン病）、結腸炎（例えば潰瘍性結腸炎）、血管炎、ブドウ膜炎、皮膚炎（例えば炎症性皮膚炎）、アトピー性皮膚炎、脱毛症、（アレルギー性）鼻炎、アレルギー性結膜炎、重症筋無力症、硬化性皮膚炎（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、及びベーチェット病が挙げられる。
【００４７】
ＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、経腸的なもの（例えば、頬側、経口、経鼻、直腸）、非経口的なもの（例えば、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内）、又は局所的なもの（例えば、経皮、鼻腔内、若しくは気管内）を含めたいずれかの従来の経路による投与のために処方された組成物で治療において利用され得る。他の実施形態の中で、本明細書中に記載した組成物は、徐放性インプラントの一部として投与されることもできる。
【００４８】
さらに他の実施形態の中で、組成物、つまり好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物として、そして再給水の後に安定性を提供する適当な賦形剤を利用して凍結乾燥物として処方されることもできる。
【００４９】
好ましい実施形態のＴＮＦ‐アルファ抑制剤を含む医薬組成物は、従来の方法に従って、例えば、混合、顆粒化、コーティング、溶解、又は凍結乾燥の工程によって製造できる。
【００５０】
他の実施形態において、１種類以上のＴＮＦ‐アルファ抑制剤を含む医薬組成物を提供する。投与目的に対して、好ましい実施形態の化合物を医薬組成物として処方することもできる。好ましい実施形態の医薬組成物は、１又は２以上の好ましい実施形態のＴＮＦ‐アルファ抑制剤、並びに医薬的に許容し得る担体及び／又は希釈剤を含んでなる。
【００５１】
ＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、特定の障害を処置するのに有効である量、すなわち低減されたＴＮＦ‐アルファのレベル又は活性、及び症状を達成するのに十分な量で、及び／又は好ましくは患者に許容され得る毒性を有する医薬組成物の状態で利用されるのが好ましい。そのような処置に対して、適当な投薬量は、もちろん、例えば使用される本発明の化合物の化学的性質や薬物動力学データ、個々の受容者、投与の様式、及び処置される病態の性質や重症度に依存して変化する。しかしながら、一般に、より大きな哺乳動物、例えばヒトにおける満足できる結果のために、例えば１日あたり最大４回までの分割投与で投与される、指示される１日投与量は、好ましくは約０．００１ｇ〜約１．５ｇ、より好ましくは約０．０１ｇ〜１．０ｇ；又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましい実施形態の化合物は、例えばＴＮＦ‐アルファ活性のその他の伝達物質、例えば低分子量の阻害剤と従来法で併用されるよりも類似した投薬量にて類似した投与様式によってより大型哺乳動物、例えばヒトに投与できる。
【００５２】
特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、投与経路によって単位剤形あたり約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇ、そしてより好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇの量で（単数若しくは複数の）ＴＮＦ‐アルファ抑制剤を含有できる。しかしながら、特定の実施形態において、先に言及したものより低い又は高い投薬量が好まれることもある。適当な濃度及び投薬量は、当業者によって容易に決定できる。
【００５３】
医薬的に許容し得る担体及び／又は希釈剤は、当業者によく知られている。液体溶液として処方される組成物に対して、許容される担体及び／又は希釈剤としては、生理的食塩水や滅菌水が挙げられ、そして任意に抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及びその他の一般的な添加物を挙げることもできる。組成物はまた、丸薬、カプセル剤、顆粒剤、錠剤（コート若しくは無コート）、（注射用）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、例えば、アンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入散剤、フォーム、チンキ、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態で）固体分散系としても処方できる。製剤は、（１種類以上のＴＮＦ‐アルファ抑制剤とその他の任意の有効成分に加えて）担体、充填剤、崩壊剤、流動調整剤、糖や甘味料、香料、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤や界面活性剤、結合剤、滑沢剤、及び／又は当該技術分野で知られているその他の医薬賦形剤を含有できる。当業者はさらに、適当な手法、及び許容される実施方法で、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に記載のものに従ってＴＮＦ‐アルファ抑制剤を製剤化し得る。
【００５４】
ＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、単独で、又は１、２、若しくは３以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質との併用療法で、及び／又は１又は２以上の医薬的に許容し得る賦形剤と共に使用できる。
【００５５】
好ましい実施形態において、ＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、ＴＮＦ‐アルファが病因であるか、若しくはＴＮＦ‐アルファが疾患経過において中心的な若しくはその他の役割を果たしている疾患又は病態を処置するために使用される従来の薬物との組み合わせられた状態で存在する。特に好ましい実施形態において、これだけに限定されるものではないが、好ましい実施形態の化合物を含む１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ抑制剤を含む医薬組成物が、これだけに限定されるものではないが、ＴＮＦ‐アルファが病因である喘息若しくはその他の呼吸器疾患、糖尿病、関節炎若しくはその他の炎症性疾患、免疫障害、又はその他の疾患若しくは障害の処置のための薬物を含めた１又は２以上の追加の医薬化合物との併用で提供される。
【００５６】
好ましい実施形態のＴＮＦ‐アルファ抑制剤は、単独で、又は１若しくは２以上のその他の医薬的に活性な薬剤、例えば炎症若しくは関連疾患を処置するために有用な薬剤と組み合わせて医薬処置のために使用できる。かかるその他の医薬的に活性な薬剤は、例えば、ステロイド、グルココルチコイド、その他の炎症性サイトカインの阻害剤（例えば、抗ＴＮＦ‐アルファ抗体、抗ＩＬ‐１抗体、抗ＩＦＮ‐ガンマ抗体）、及びその他のサイトカイン、例えばＩＬ‐１ＲＡ若しくはＩＬ‐１０、並びにその他のＴＮＦ‐アルファ阻害剤を含む。
【００５７】
併用療法としては、２又は３以上の医薬的に活性な薬剤が同じ製剤中に存在する固定された組み合わせ；別々の製剤である２又は３以上の医薬的に活性な薬剤が、例えば同時投与のための取扱説明書と共に同じパッケージで販売されているキット；医薬的に活性な薬剤が別々にパッケージされているが、同時又は連続投与のための取扱説明書が提供される自由な組み合わせを挙げることができる。その他のキット構成要素としては、診断器具、アッセイ器具、連続若しくは同時投与のための複数の剤形、凍結乾燥若しくは濃縮形態の医薬組成物を再構成するための取扱説明書及び材料、医薬的に活性な薬剤を投与するための装置等を挙げることができる。例えば、併用投与のための取扱説明書と一緒に、好ましい実施形態の化合物である第１の医薬品物質と少なくとも１種類の第２の医薬品物質を含んでなる医薬パッケージが提供される。少なくとも１種類の第２の医薬品物質との併用投与のための取扱説明書と一緒に、好ましい実施形態の化合物を含んでなる医薬パッケージもまた提供される。本発明の化合物との併用投与のための取扱説明書と一緒に、少なくとも１種類の第２の医薬品物質を含んでなる医薬パッケージもまた提供される。
【００５８】
好ましい実施形態による組み合わせを用いた処置は、当該組み合わせのいずれかの成分単独による処置と比較して改善された又は優れた転帰を提供することもできる。例えば、ある量の好ましい実施形態の化合物と、ある量の第２の医薬品物質を含んでなる医薬の組み合わせを利用できるが、ここで、上記の量は相乗的な治療効果を生じるのに適当である。治療的有効量の好ましい実施形態の化合物と第２の医薬品物質を、例えば同時に又は連続して共投与することを含んでなる、好ましい実施形態の化合物の治療的有用性を改善するための方法もまた提供される。治療的有効量の好ましい実施形態の化合物と第２の医薬品物質を、例えば同時に又は連続して共投与することを含んでなる、第２の医薬品物質の治療的有用性を改善するための方法もまた提供される。本発明の組み合わせと、組み合わせパートナーとしての第２の医薬品物質は、例えば好ましい実施形態の化合物に関して上記に示したいずれかの従来の経路によって投与できる。第２の薬物は、適宜、例えば、単独処置に使用されるものと同様であるか、又は例えば相乗効果の場合には、従来の投薬量より低い用量域の投薬量で投与できる。
【００５９】
好適な第２の医薬品物質としては、化学療法薬、特に好ましい実施形態のＴＮＦ‐アルファ抑制剤以外のいずれかの化学療法薬が挙げられる。かかる第２の医薬品物質としては、例えば、抗炎症薬、及び／又は免疫調節薬等が挙げられる。
【００６０】
好ましい実施形態の化合物と組み合わせて使用することもできる抗炎症薬、及び／又は免疫調節薬としては、例えばｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。そして、上記ｍＴＯＲ阻害剤としては、ラパマイシン、例えば４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシン、３２‐デオキソラパマイシン、１６‐Ｏ‐置換ラパマイシン、例えば１６‐ペンタ‐２‐イニルオキシ‐３２‐デオキソラパマイシン、１６‐ペンタ‐２‐イニルオキシ‐３２（Ｓ若しくはＲ）‐ジヒドロ‐ラパマイシン、１６‐ペンタ‐２‐イニルオキシ‐３２（Ｓ若しくはＲ）‐ジヒドロ‐４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシンなど、４０‐［３‐ヒドロキシ‐２‐（ヒドロキシ‐メチル）‐２‐プロピオン酸メチル‐ラパマイシン（別名ＣＣＩ７７９）、４０‐エピ‐（テトラゾリル）‐ラパマイシン（別名ＡＢＴ５７８）、例えばＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９８／０２４４１、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ０１／１４３８７、及びＰＣＴ国際出願番号ＷＯ０３／６４３８３に開示されている、いわゆるラパログ、例えばＡＰ２３５７３など、並びにＴＡＦＡ‐９３やバイオリムス（バイオリムスＡ９）という名称で開示されている化合物；
【００６１】
カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ又はＦＫ５０６；免疫抑制性特性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ‐２８１、ＡＳＭ９８１；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸又は塩；ミコフェノール酸モフェチル；１５‐デオキシスペルガリン又は免疫抑制性のその相同体、類似体若しくは誘導体；ｂｃｒ‐ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤；ｃ‐ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼ阻害剤；ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばグリベック（イマチニブ）；ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、例えばＰＣＴ国際出願番号ＷＯ０２／３８５６１又はＰＣＴ国際出願番号ＷＯ０３／８２８５９に開示される、例えば実施例５６又は７０の化合物；
【００６２】
遊離形態若しくは医薬的に許容し得る塩の形態のＪＡＫ３キナーゼ阻害剤、例えばＮ‐ベンジル‐３，４‐ジヒドロキシ‐ベンジリデン‐シアノアセトアミド、アルファ‐シアノ‐（３，４‐ジヒドロキシ）‐Ｎ‐ベンジルシンナムアミド（チロホスチンＡＧ４９０）、プロジギオシン２５‐Ｃ（ＰＮＵＩ５６８０４）、［４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）‐アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ‐ＰＩ３１）、［４‐（３’‐ブロモ‐４’‐ヒドロキシフェニル）‐アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ‐ＰＩ５４）、［４‐（３’，５‐ジブロモ‐４’‐ヒドロキシフェニル）‐アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン］ＷＨＩ‐Ｐ９７、ＫＲＸ‐２１１、３‐｛（３Ｒ，４Ｒ）‐４‐メチル‐３‐［メチル‐（７Ｈ‐ピロロ［２，３‐ｄ］ピリミジン‐４‐イル）‐アミノ‐ピペリジン‐１‐イル｝‐３‐オキソ‐プロピオニトリル、例えばモノクエン酸（別名ＣＰ‐６９０，５５０）、又はＰＣＴ国際出願番号ＷＯ２００４／０５２３５９若しくはＰＣＴ国際出願番号ＷＯ２００５／０６６１５６で開示されている化合物；
【００６３】
ＳＩＰ受容体作動薬又はモジュレーター、例えば任意にリン酸化されたＦＴＹ７２０又はその類似体、例えば任意にリン酸化された２‐アミノ‐２‐［４‐（３‐ベンジルオキシフェニルチオ）‐２‐クロロフェニル］‐エチル‐１，３‐プロパンジオール若しくは１‐｛４‐［１‐（４‐シクロヘキシル‐３‐トリフルオロメチル‐ベンジルオキシイミノ）‐エチル］‐２‐エチル‐ベンジル｝‐アゼチジン‐３‐カルボン酸、又は医薬的に許容し得るその塩；免疫抑制モノクローナル抗体、例えば白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＢｌｙｓ／ＢＡＦＦ受容体、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ‐１２受容体、ＩＬ‐１７受容体、ＩＬ‐２３受容体、又はそれらのリガンド；
【００６４】
その他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４又はその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を持つ遺伝子組み換え結合分子、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列とつながっているＣＴＬＡ４又はその突然変異体の少なくとも細胞外領域部分、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば指定されたＡＴＣＣ６８６２９）又はその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ‐Ｉ拮抗薬、ＩＣＡＭ‐１又は‐３拮抗薬、ＶＣＡＭ‐４拮抗薬又はＶＬＡ‐４拮抗薬、ＣＣＲ９拮抗薬、ＭＩＦ阻害剤、５‐アミノサリチル酸（５‐ＡＳＡ）薬、例えばスルファサラジン、Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（登録商標）、Ａｓａｃｏｌ（登録商標）、Ｄｉｐｅｎｔｕｍ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｓａ（登録商標）、Ｒｏｗａｓａ（登録商標）、Ｃａｎａｓａ（登録商標）、Ｃｏｌａｚａｌ（登録商標）など、例えばメサラミンを含む薬物；例えばヘパリンと組み合わせたメサラジン；
【００６５】
ＴＮＦ‐アルファ阻害剤又は抑制剤、例えばＴＮＦ‐アルファと結合した抗体などの本発明のもの以外のもの、例えばインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、一酸化窒素放出非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、例えばＣＯＸ阻害性ＮＯ供与性薬物（ＣＩＮＯＤ）を含む；ホスホジエステラーゼ、例えばＰＤＥ４Ｂ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、「多機能性抗炎症」薬（ＭＦＡＩＤｓ）、例えばグリコサミノグリカンに連結された膜に固定されたホスホリパーゼＡ２阻害薬のような細胞質型ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）阻害剤が挙げられる。
【００６６】
他の好ましい実施形態において、好ましい実施形態の１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、関節炎又は他の炎症性疾患の処置のための１又は２以上の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）又は他の医薬化合物と組み合わされて存在する。好ましい化合物としては、セレコキシブ；ロフェコキシブ；ＮＳＡＩＤＳ、例えば、アスピリン、セレコキシブ、トリサリチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナックナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メレナミック酸、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサラート、スリンダク、及びトルメチン；並びにコルチコステロイド、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、ベタメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール、及びデキサメタゾンが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。
【００６７】
特に好ましい実施形態において、１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、喘息、急性呼吸窮迫疾患、又はその他の呼吸器疾患の処置のための１種類以上のベータ作動薬、吸入コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、ホルモン剤、又は他の医薬化合物と組み合わされて存在する。好ましい化合物としては、ベータ作動薬、例えば一般的に処方される気管支拡張剤；吸入コルチコステロイド、例えば、ベクロメタゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、モメタゾン、並びにプレドニゾン形態、例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、及びメチルプレドニゾロンなど；抗ヒスタミン剤、例えば、アザタジン、カルビノキサミン、プソイドエフェドリン、セチリジン、シプロヘプタジン、デキスクロルフェニルアミン、フェキソフェナジン、ロラタジン、プロメタジン、トリペレナミン、ブロムフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマスチン、ジフェンヒドラミン；そしてホルモン剤、例えばエピネフリンが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。
【００６８】
特に好ましい実施形態において、１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、１又は２以上の麻酔薬、例えば、エタノール、ブピバカイン、クロロプロカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、ロピバカイン、テトラカイン、デスフルラン、イソフルラン、ケタミン、プロポフォール、セボフルラン、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルフォン、マーカイン、メペリジン、メタドン、モルヒネ、オキシコドン、レミフェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ナルブフィン、トラマドール、ベンゾカイン、ジブカイン、塩化エチル、キシロカイン、及びフェナゾピリジンと組み合わされて存在する。
【００６９】
特に好ましい実施形態において、１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、医薬組成物中に、過敏性腸管疾患の処置のための医薬化合物、例えばアザチオプリン又はコルチコステロイドなどと組み合わされて存在する。
【００７０】
特に好ましい実施形態において、１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、医薬組成物中に、免疫抑制化合物と組み合わされて存在する。特に好ましい実施形態において、１種類以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、自己免疫疾患を処置するための１種類以上の薬物、例えば生物学的反応修飾物質、例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、及び腫瘍壊死因子を阻害又は干渉する他の化合物と組み合わされて存在する。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、１又は２以上のＴＮＦ‐アルファ阻害化合物は、ステロイドと組み合わされて存在するが、上記ステロイドとしては、コルチコステロイド、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカソン、トリアムシノロンアセトニド、ベタメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール、及びデキサメタゾンが挙げられる。
【００７２】
特定の疾患の処置において、ＴＮＦ‐アルファ抑制剤を麻酔薬、例えば、エタノール、ブピバカイン、クロロプロカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、ロピバカイン、テトラカイン、デスフルラン、イソフルラン、ケタミン、プロポフォール、セボフルラン、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルフォン、マーカイン、メペリジン、メタドン、モルヒネ、オキシコドン、レミフェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ナルブフィン、トラマドール、ベンゾカイン、ジブカイン、塩化エチル、キシロカイン、及びフェナゾピリジン、と組み合わせて用いて患者を処置することが有益であり得る。
【００７３】
インビトロ合成
ヒト・ベータ・デフェンシン２などの哺乳動物ベータ・デフェンシンを、当該技術分野で知られている従来の方法を使用してインビトロ合成によって調製することもできる。様々な市販の合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動合成装置が、利用可能である。合成装置を使用することによって、天然アミノ酸を、非天然アミノ酸、特にＤ‐異性体（又はＤ型）、例えばＤ‐アラニンやＤ‐イソロイシン、ジアステレオ異性体、異なる長さ又は機能性を持つ側鎖等で置換することもできる。調製の特定の順序や様式は、利便性、経済性、必要な純度等によって決定される。
【００７４】
アミド又は置換アミン形成、例えば還元アミノ化のためのアミノ基、例えばチオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基等の結合に都合のよい官能基を含めた化学的な結合が、様々なペプチド又はタンパク質に提供されてもよい。
【００７５】
所望であれば、合成中又は発現中に様々な基をペプチド内に導入することもでき、それが他の分子又は表面に連結することを可能にする。よって、システインはチオエーテルを作るのに使用でき、ヒスチジンは金属イオン錯体に連結するために使用でき、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用でき、アミノ基はアミドを形成するために使用できる等である。
【００７６】
哺乳動物ベータ・デフェンシンはまた、組み換え合成の従来の方法に従って単離され、そして精製されることもできる。発現宿主の溶解物を調製し、そしてその溶解物をＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、又は他の精製技術を使用して精製してもよい。
【００７７】
本発明の更なる態様と実施形態を以下に概説する：
請求項１０．関節リウマチ、骨関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、強皮症（全身性硬化症）、ループス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、（急性）糸球体腎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、血管炎、ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脱毛症、（アレルギー性）鼻炎、アレルギー性結膜炎、重症筋無力症、硬化性皮膚炎、サルコイドーシス、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、及びベーチェット病から成る群から選択される炎症性疾患又は障害の処置のための哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００７８】
請求項１１．非経口投与される、請求項１０に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００７９】
請求項１２．静脈内又は皮下に投与される、請求項１１に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８０】
請求項１３．ヒト・ベータ・デフェンシンである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８１】
請求項１４．配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８２】
請求項１５．ヒト・ベータ・デフェンシン１、ヒト・ベータ・デフェンシン２、ヒト・ベータ・デフェンシン３、又はヒト・ベータ・デフェンシン４である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８３】
請求項１６．配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８４】
請求項１７．ヒト・ベータ・デフェンシン２である、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８５】
請求項１８．ＴＮＦ‐アルファ活性が処置された組織において低減される、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の哺乳動物ベータ・デフェンシン。
【００８６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、その実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１
ヒト・ベータ・デフェンシン２（ｈＢＤ２）の抗炎症活性
免疫調節効果についてｈＢＤ２を試験している中で、ｈＢＤ２に非常に高い抗炎症能力があることが思いがけず観察された。ヒトＰＢＭＣ培養物において、ｈＢＤ２による処理がＬＰＳ、ＬＴＡ又はペプチドグリカンで刺激した培養物のサイトカイン特性に大きな影響をもたらすことが観察された。ｈＢＤ２が炎症誘発性サイトカイン及びケモカイン、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ‐１０及びＩＬ‐８を誘導することができることはこれまでに観察されていた（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｂｏｎｉｏｔｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００８８】
ここで、我々は、ｈＢＤ２にはＴＮＦ及びＩＬ‐１βの２種類の炎症誘発性サイトカインに対して下方制御能力があり；且つ、ｈＢＤ２はまた、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）又はペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた炎症刺激の誘導時にＩＬ‐１０を誘導することも示している。ＩＬ‐１０は、潜在的抗炎症性サイトカインであるため、したがって、得られるｈＢＤ２の効果は抗炎症効果である。これはヒトＰＢＭＣ、単球細胞系、及び樹枝状（ｄｅｎｄｒｉｔｏｉｄ）細胞株に関して観察された。
【００８９】
材料と方法
ｈＢＤ２の製造
ｈＢＤ２を組み換えによって製造した。ｈＢＤ２をコード化した合成ＤＮＡフラグメント（ＤＮＡ２．０）を、ｐＥＴ‐３２（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローン化した。得られたプラスミドは、Ｎ末端チオレドキシン部分とそれに続くｈｉｓ‐タグ、エンテロキナーゼ開裂部位、及び最後にｈＢＤ２ペプチドを含んでいる翻訳融合ペプチドをコード化していた。発現プラスミドをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１内に形質転換した。
【００９０】
この菌株の一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有したＴＢ‐グリセロール中で１００倍まで希釈し、３７℃にて約８のＯＤ６００まで培養し、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導した後、細胞を遠心分離によって集菌した。ｈｉｓ‐タグが付与されたｔｒｘ‐ｈＢＤ２融合ペプチドを、標準的なプロトコールを使用したＮｉ‐ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。ｈｉｓ‐タグ精製した融合ペプチドを、続いてエンテロキナーゼ・バッファー（５０ｍＭのｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＣａＣｌ2）中で一晩透析し、そしてエンテロキナーゼによって開裂して、成熟ｈＢＤ２を切り離した。ｈＢＤ２ペプチドを、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓマトリックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したカチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｈＢＤ２の正確な分子量を、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法を使用して確認した。
【００９１】
ｍＢＤ３（実施例４を参照のこと）の製造を、同一のプロトコールを使用して実施した。
【００９２】
続いて、ｈＢＤ２分子の適切な折りたたみ及びジスルフィド架橋形態を、ＬＣ‐ＭＳ及びＮＭＲ分光法に併せてトリプシン分解を使用して確認した。
【００９３】
エンドトキシンをｈＢＤ２及びｍＢＤ３調製物から低ｐＨの調製用ＲＰ‐ＨＰＬＣによって取り除き、そしてエンドトキシンの含有量をＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＫＴＡ２）によって測定すると、そのレベルがアッセイの検出限界（０．０５ＥＵ／ｍｇ）より低いことがわかった。エンドトキシン・アッセイの検出限界より低いレベルがＰＢＭＣを刺激できないことを確かめるために、非常に強力なリポ多糖（Ｅ．コリ、Ｏ１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低いレベルのこのＬＰＳ（０．０６ｎｇ／ｍｌ）は、検出可能なサイトカイン産生までＰＢＭＣを刺激できた。
【００９４】
ＰＢＭＣの分離と刺激
末梢血を、（デンマークの関連倫理委員会からの承認を受けた）健常ボランティアから採血した。ヘパリン添加血液を、ＲＰＭＩで１／１ ｖ／ｖに希釈し、そして採血後２時間以内に、それをＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。個々のドナーからの血漿を上端部から回収し、そして培地（自家培地）中に２％で使用するまで、それを氷上に保持した。分離したＰＢＭＣを、自家培地中に再懸濁し、合計２００μｌ中、１ウェルあたり２５５，０００細胞で９６ウェル培養プレート内に播種した。同じドナーからのＰＢＭＣを、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２で、単独で、あるいは０．６ｎｇ／ｍｌ又は２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．コリ、Ｏ１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）、１．２５μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来、Ｓｉｇｍａ Ｌ３２６５）又は４０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来、Ｓｉｇｍａ ７７１４０）と一緒に刺激した。刺激に使用する濃度は、最初の実験で３人の異なるドナーに対して最適化し、ＬＰＳに関しては、調節可能なサイトカイン・レベルにあることを確実にするために、２つの異なった濃度を使用した。いくつかの実験において、炎症誘発性サイトカインの下方制御におけるコントロールとしてデキサメタゾンとインドメタシン単独で、及びＬＰＳ又はＬＴＡと一緒に、ＰＢＭＣを処理した。上清を、３７℃にて２４時間のインキュベーション後に回収し、そして８０℃にてサイトカイン測定まで保存した。生存率を、すべての実験でＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＤＡＬＬ １１００）によって製造業者の取扱説明書に従って計測し、場合によってはＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によっても計測し、そしていくつかの実験においては、生存率をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによる細胞のカウントによっても判断した。
【００９５】
ＭＵＴＺ‐３の培養と刺激
ヒト骨髄性白血病由来細胞株ＭＵＴＺ‐３（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２０％［容積／容積（ｖ／ｖ）］のウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ６１７８）及び４０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ‐ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２１５‐ＧＭ‐０５０）を補ったａ‐ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｍ４５２６）中で維持した。これらの始原細胞は、以下に示された単球細胞株の状態にあるので、これらの単球を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２で、単独で又はＬＰＳ若しくはＬＴＡと一緒に刺激した。
【００９６】
樹状細胞の分化
樹枝状細胞株を作出するために、ヒト骨髄性白血病細胞株ＭＵＴＺ‐３（１×１０5細胞／ｍｌ）を、ｒｈＧＭ‐ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈＩＬ‐４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７日間未成熟なＤＣｓに分化させた。培地を２〜３日おきに交換した。分化細胞株を、ｈＢＤ２を伴う及び伴わないＬＰＳ又はＬＴＡのいずれかでさらに刺激して、樹状細胞に対するｈＢＤ２の効果について調査した。
【００９７】
サイトカインの測定
上清におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターによる製造業者の取扱説明書に従ってヒト炎症Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）（ＢＤ）を用いたフローサイトメトリーによって計測した。以下のサイトカイン：ＩＬ‐８、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐１０、ＴＮＦ、ＩＬ‐１２ｐ７０、ＩＬ‐６について計測した。いくつかの実験において、サイトカインを、製造業者の取扱説明書に従ってＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製のＥＬＩＳＡキット（ＩＬ‐１０、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β）によって計測した。
【００９８】
データ分析
すべての実験を、代表的な結果が示されている少なくとも２回実施した。提示されたデータは、平均プラス／マイナス標準偏差（ＳＤ）として表されている。統計的有意性を、表の説明文で説明されているとおり、処理（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）の変数を用いた２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定よって判定した。差は、ｐ＜０．０５の時に有意であるとみなした。
【００９９】
結果
ｈＢＤ２の効果を、ＬＰＳ及びＬＴＡを用いて、及び用いずに処理したヒトＰＢＭＣに対して試験した（表１、２、及び３）。ｈＢＤ２での処理は、試験した３つの濃度すべてに関して刺激培養物におけるＴＮＦの有意な下方制御をもたらし（表１）、その下方制御は０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及びＬＴＡに関して用量依存的である。ＩＬ‐１βに関して、下方制御は、大部分が最も高い用量で観察された（表２）。興味深いことに、ＩＬ‐１０は、有意に、そして用量依存的に上方制御された（表３）。炎症誘発性サイトカインの下方制御と抗炎症性サイトカインの誘導は、ｈＢＤ２の非常に高い抗炎症能力を示している。生存率は、ｈＢＤ２の抗炎症作用が細胞傷害効果に起因することを排除するために、２つの異なるアッセイによって計測された。表４及び５では、ｈＢＤ２が細胞に対して細胞傷害効果を全く持っておらず、観察された効果が、細胞の増殖につながるＬＰＳ又はＬＴＡでの刺激による刺激効果であることがわかった。従って、ｈＢＤ２は、これらの細胞に対して細胞傷害効果を全く持っていない。
【０１００】
表６、７、及び８では、別のドナーからの上清を、フローサイトメトリーによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙの代わりにＥＬＩＳＡによってサイトカインについて分析し、そしてここで同じ結果を観察したが、アッセイの感度が低いうえに検出限界がとても高いので、そのため効果は有意でなかった。
【０１０１】
さらに別のＴｏｌｌ様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカン刺激ＰＢＭＣに対するｈＢＤ２の効果を調査した（表９及び１０）。同じ結果を観察した：ＴＮＦは用量依存的に下方制御され、そしてＩＬ‐１０は用量依存的に誘導される。
【０１０２】
ＴＮＦの下方制御に関するポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンをアッセイで試験した。化合物が有毒にならず、且つ、培地中の溶解性によって達成可能な濃度であるように、濃度が選択されている。インドメタシンだけではＬＴＡでの刺激後にＴＮＦを阻害した（表１１）のに対して、デキサメタゾンはＴＮＦ産生を効果的に下方制御し、同じ結果がＩＬ‐１βに関しても観察された（表１３）。インドメタシンは、ＣＯＸ‐１及びＣＯＸ‐２阻害剤であり、軽度〜中等度の疼痛を処置するため、及び関節炎の症状を取り除くのを助けるために使用される非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、そしてデキサメタゾンは、主として炎症性疾患の処置に使用される合成グルココルチコイドであり、且つ、非常に少量でも炎症誘発性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有していて（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、そのことは、我々もまたＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１βに関して観察している。ｈＢＤ２は、これらの２つの抗炎症性化合物くらい、又はそれらよりも有効である。
【０１０３】
表１４及び１５では、単球細胞株及び樹状細胞におけるＴＮＦの下方制御に対するｈＢＤ２の効果が示されており、ＰＢＭＣで観察されたのと同じ結果が観察されている。ＩＬ‐１０はまた、ｈＢＤ２及びＬＰＳ又はｈＢＤ２及びＬＴＡで刺激した樹状細胞に関しても誘導された（結果未掲載）。
【０１０４】
ｈＢＤ２のＬＰＳ又はＬＴＡへの結合がＴＮＦ及びＩＬ‐１βの下方制御を引き起こすのを排除するために、合成リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２‐ＴＬＲ１リガンド）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｔｌｒｔ‐ｐｍｓ）でのＰＢＭＣの刺激に対するｈＢＤ２の効果を試験した。ｈＢＤ２は、同じくこのリガンドでの刺激後でもＴＮＦを下方制御することができ、ＬＰＳ又はＬＴＡの中和が観察された効果に関与していないことを示している（結果未掲載）。そのうえ、ｈＢＤ２と一緒にＴＮＦ‐α及びＩＬ‐αを含有しているサイトカイン・カクテルでの樹状細胞の刺激が、サイトカイン・カクテル単独での刺激と比較してＩＬ‐１β、ＩＬ‐８、及びＩＬ‐６に対する下方制御効果を有していた。明らかに、ＴＮＦに対して効果がないことを、ＴＮＦ‐αでの刺激により分析できた（結果未掲載）。
【０１０５】
表１．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生、すべてのサンプルを同じドナー、つまり５人のドナーのうちの代表的な実験で試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによりＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：それぞれのコントロール（太字）と比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１０６】
【表１】
2011528332.tif 000002
【０１０７】
表２．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１β産生、すべてのサンプルを同じドナー、つまり５人のドナーのうちの代表的な実験で試験した。ＩＬ‐１β：ＦＡＣＳアレイによりＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１０８】
【表２】
2011528332.tif 000003
【０１０９】
表３．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１０産生、すべてのサンプルを同じドナー、つまり５人のドナーのうちの代表的な実験で試験した。ＩＬ‐１０：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．５：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１１０】
【表３】
2011528332.tif 000004
【０１１１】
表４．２４時間の刺激後のＰＢＭＣ生存率をＭＴＳアッセイによって計測した。異なる上付き文字を持つ行中の値には、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって検定された有意差がある。
【０１１２】
【表４】
2011528332.tif 000005
【０１１３】
表５．Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅによって計測したＰＢＭＣ生存率、５人の異なるドナーからの５つ実験のうちの１つの代表的な実験。異なる上付き文字を持つ行中の値及び異なる上付き文字を持つ列中の値には、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって検定された有意差がある。
【０１１４】
【表５】
2011528332.tif 000006
【０１１５】
表６．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はこの混合物での刺激後のＰＢＭＣからのＴＮＦ‐アルファ分泌。ＴＮＦ‐アルファ：ＥＬＩＳＡによって計測した、ｎｄ：不検出、アッセイにおける検出限界：０．０１ｎｇ／ｍｌ、*ｐ＜０．０５：それぞれのコントロールと比較した、**ｐ＜０．０１：それぞれのコントロールと比較した。
【０１１６】
【表６】
2011528332.tif 000007
【０１１７】
表７．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はこの混合物での刺激後のＰＢＭＣからのＩＬ‐１０分泌。ＴＮＦ‐アルファ：ＥＬＩＳＡによって計測した、ｎｄ：不検出、アッセイにおける検出限界：０．０３ｎｇ／ｍｌ。
【０１１８】
【表７】
2011528332.tif 000008
【０１１９】
表８．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はこの混合物での刺激後のＰＢＭＣからのＩＬ‐１β分泌、ＴＮＦ‐アルファ：ＥＬＩＳＡによって計測した、ｎｄ：不検出、アッセイにおける検出限界：０．０１６ｎｇ／ｍｌ、**ｐ＜０．０１：それぞれのコントロールと比較した。
【０１２０】
【表８】
2011528332.tif 000009
【０１２１】
表９．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＰＧＮによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１２２】
【表９】
2011528332.tif 000010
【０１２３】
表１０．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＰＧＮによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１０産生；すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１２４】
【表１０】
2011528332.tif 000011
【０１２５】
表１１．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡ、あるいはＴＮＦの阻害に関する２つの異なるコントロール（デキサメタゾンとインドメタシン）による処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、下線を引いた値は、それぞれのコントロール（太字）と比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析すると有意に減少している。
【０１２６】
【表１１】
2011528332.tif 000012
【０１２７】
表１２．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡ、又は抗炎症作用に関する２つの異なるコントロール（デキサメタゾンとインドメタシン）による処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１０産生；すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＩＬ‐１０：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、下線を引いた値は、それぞれのコントロール（太字）と比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析すると有意に増加している。
【０１２８】
【表１２】
2011528332.tif 000013
【０１２９】
表１３．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡ、又は抗炎症作用に関する２つの異なるコントロール（デキサメタゾンとインドメタシン）による処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１β産生；すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＩＬ‐１β：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、下線を引いた値は、それぞれのコントロール（太字）と比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析すると有意に減少している。
【０１３０】
【表１３】
2011528332.tif 000014
【０１３１】
表１４．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わないＬＰＳ又はＬＴＡによる処理後のヒト単球細胞株（ＭＵＴＺ‐３）からの上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによりＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、*ｐ＜０．０５：それぞれのコントロールと比較し、**ｐ＜０．０１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１３２】
【表１４】
2011528332.tif 000015
【０１３３】
表１５．ｈＢＤ２を伴う若しくは伴わない（成熟ＤＣを作出するための）ＬＰＳ又はＬＴＡで刺激した未成熟樹状細胞からの上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、*有意に減少したｐ＜０．０５：それぞれのコントロールと比較し、***有意に減少したｐ＜０．０１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝各データセットあたり約２００）によって分析した。
【０１３４】
【表１５】
2011528332.tif 000016
【０１３５】
実施例２
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの抗炎症活性
実施例２を、実質的に実施例１に記載のとおり実施した。以下の表中に示されている化合物ｒｈＢＤ２は組み換えｈＢＤ２であるが、これは実施例１で使用されているｈＢＤ２と同一である。
【０１３６】
以下の表中に示されている化合物ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントは、化学合成を使用して調製されたもので、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．から入手された。
組み換えｈＢＤ２（ｒｈＢＤ２）のアミノ酸配列は、化学合成によって調製したｈＢＤ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１３７】
以下の表中に示されているｈＢＤ４バリアントは、ｈＢＤ４の第３〜３９アミノ酸から成っており、そしてそのアミノ酸配列は配列番号５として示されている。
【０１３８】
各表において、すべてのサンプルを同じドナーで試験した。ＳＤは標準偏差を意味する。
【０１３９】
結果
表１６．ヒト・ベータ・デフェンシン、デキサメタゾン、若しくはインフリキシマブを伴う又は伴わないＬＰＳによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって分析し、そしてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって無処理細胞と比較した。
【０１４０】
【表１６】
2011528332.tif 000017
【０１４１】
表１７．ヒト・ベータ・デフェンシン、デキサメタゾン、若しくはインフリキシマブを伴う又は伴わないＬＰＳによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１０産生。ＩＬ‐１０：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって分析し、そしてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって無処理細胞と比較した。
【０１４２】
【表１７】
2011528332.tif 000018
【０１４３】
表１８．ヒト・ベータ・デフェンシン、デキサメタゾン、若しくはインフリキシマブを伴う又は伴わないＬＰＳによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ‐１β産生。ＩＬ‐１β：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって分析し、そしてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって無処理細胞と比較した。
【０１４４】
【表１８】
2011528332.tif 000019
【０１４５】
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの効果を、ＬＰＳで処理したヒトＰＢＭＣ、及びＬＰＳなしで処理したヒトＰＢＭＣで試験した（表１６、１７、及び１８）。比較のために、ｒｈＢＤ２を各構成に加えた。
【０１４６】
ＴＮＦは、すべてのデフェンシンに関して下方制御された。ＩＬ‐１β分泌の減少をＴＮＦと比較したが、ＴＮＦほど顕著ではなかった。ＩＬ‐１０の分泌は有意であり、そしてｈＢＤ２及びｈＢＤ４バリアントに関しては用量依存的に増強された。
【０１４７】
ｈＢＤ３を１０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌにおいても試験し、そしてｈＢＤ４バリアントを４０μｇ／ｍｌにおいても試験した；しかしながら、両分子はこれらの濃度において細胞に対して有毒であったので、毒性と抗炎症作用を区別することは不可能であった。
ＴＮＦの下方制御に関するポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブを構成に加えた。
【０１４８】
結論
試験したヒト・ベータ・デフェンシンの全てが抗炎症能力を示した。
【０１４９】
実施例３
ヒト単球由来樹状細胞及びヒトＰＢＭＣからのＩＬ‐２３の減少
実施例３を、実質的にヒトＰＢＭＣに関して実施例１に記載されたとおり実施した；しかしながら、読み取りはＴＮＦ、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐１０ではなくＩＬ‐２３であった。そのうえ、ヒト単球由来樹状細胞に対するｒｈＢＤ２の効果もまた調査した。
【０１５０】
単球由来樹状細胞（ＤＣｓ）の作出
ＤＣｓを、最初にＲｏｍａｎｉらによって記載された改良プロトコールに従って調製した。簡単に言えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、Ｆｉｃｏｌｌ‐ｐａｇｕｅ（ＧＥ‐ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配上での遠心分離によって健常ドナーの軟膜から精製した。単球を、製造業者の取扱説明書に従って磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＣＤ１４+細胞の正の選択によってＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４+単球を、６ウェルプレート内のＲＰＭＩ／２％ヒトＡＢ血清組み換えヒト組み換え顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ‐４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中、２及び５日後に培地／サイトカインを補給して６日間培養した。６日間にわたる培養後に、未成熟ＤＣｓを、９６ウェルプレート内で１×１０6細胞／ｍｌの濃度にて再培養し、そして無処理のままにしておくか、又はカクテル及び／又はｈＢＤ２でさらに２４時間処理する。ｈＢＤ２を、四重反復試験において４種類の濃度で試験した。ｈＢＤ２を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ‐γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含んだ炎症誘発カクテルを使用して炎症誘発性表現型へのｈＤＣの成熟化を抑制する能力について分析した。デキサメタゾンを、臨床的抗炎症活性が証明された化合物のポジティブ・コントロールとしてカクテルに２０時間前に加えた。ｈＢＤ２とのインキュベーションを、カクテルの添加より４時間前におこなった。
【０１５１】
サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培養上清を、回収し、そして−８０℃にて保存した。ＩＬ‐２３の量を、製造業者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って市販の抗体と標準物質を使用した標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって計測した。
【０１５２】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴベースの細胞増殖測定キットを、細胞のいずれかがビヒクル、カクテル又はｈＢＤ２での処理によって重大な影響を受けているか評価するために４８時間後の細胞生存の評価基準として使用し、そして製造業者のプロトコール（Ｓｉｇｍａ）に従ってそれをおこなった。
【０１５３】
統計的分析
すべての実験を、示されている代表的な結果を含めて少なくとも２回実施した。提示されたデータは、平均プラス／マイナス標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。統計的有意性は、表の説明文で説明されているとおり、処理（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）の変数を用いた２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって判定した。差は、ｐ＜０．０５の時に有意であるとみなした。
【０１５４】
結果
表１９．培地（未刺激）又はＬＰＳ及びＩＦＮ‐γのいずれかで刺激し、そして培地（無処理）、ｈＢＤ２、又はデキサメタゾンのいずれかで処理したヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞の上清中のＩＬ‐２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）、Ｎ＝４、３人のドナーのうちの１人の代表的なドナー。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１：２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって分析し、そしてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって無処理細胞と比較した。ｎｄ：不検出（検出限界以下）。
【０１５５】
【表１９】
2011528332.tif 000020
【０１５６】
表２０．培地（コントロール）、０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、又は５μｇ／ｍｌのＬＴＡのいずれかで刺激し、そしてｈＢＤ２、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処理したヒトＰＢＭＣの上清中のＩＬ‐２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１：１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって分析し、そしてＤｕｎｎｅｔｔ多重比較事後検定によって無処理細胞と比較した。
【０１５７】
【表２０】
2011528332.tif 000021
【０１５８】
表１９中に示したとおり、ｈＢＤ２は、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞からのＩＬ‐２３分泌を有意に、且つ、用量依存的に抑制する。
【０１５９】
ヒトＰＢＭＣに関して、ＩＬ‐２３分泌もまた有意に抑制された（表２０）。これらの細胞に対して逆用量依存性があり、それが低用量のｈＢＤ２を試験したときの釣鐘型用量‐応答阻害曲線であることがわかった（データ未掲載）。
【０１６０】
ＩＬ‐２３が炎症反応の重要な部分であるので、これは、ｈＢＤ２にはＩＬ‐２３分泌の抑制による慢性自己免疫性病態の抑制作用があるかもしれないことを示している。Ｔｈ１７細胞はそれらの生存と増殖に関してＩＬ‐２３に依存しているので、Ｔｈ１７細胞がクローン病、潰瘍性結腸炎、乾癬、及び多発性硬化症などのいくつかの自己免疫疾患における病因であることが示された。
【０１６１】
実施例４
マウス・ベータ・デフェンシン３（ｍＢＤ３）を用いたＰＢＭＣｓからのＴＮＦ分泌の減少
実施例４を、実質的にヒトＰＢＭＣに関して実施例１に記載されたとおり実施した。マウス・ベータ・デフェンシン３（ｍＢＤ３）を、実施例１でｈＢＤ２の製造のために使用したものと同じプロトコールを使用して調製した。ｍＢＤ３のアミノ酸配列を、配列番号６に示している。マウスＰＢＭＣｓを以下に記載したとおり調製した。
【０１６２】
マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離と刺激
マウス末梢血単核細胞を１０匹のＮＭＲＩマウスの血液から単離した。要するに、ヘパリン添加血液を、ＲＰＭＩで１／１ ｖ／ｖに希釈し、そして採血後２時間以内にＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。血漿を上端部から回収し、そして処分した。単離したＰＢＭＣを、培地（１％のペニシリンとストレプトマイシン、及び１％のＬ‐グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、４２４０１））中に再懸濁し、そして合計２００μｌ中、１ウェルあたり１１５，５００細胞で９６ウェル培養プレート内に播種した。同じドナーからのＰＢＭＣを、１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２又はｍＢＤ３（マウス・ベータ・デフェンシン３）で；単独で又は２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．コリ、Ｏ１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）と一緒に刺激した。デキサメタゾンを、ＬＰＳ刺激を伴う又は伴っていない培養物に３．５ｎｇ／ｍｌにて追加した。上清を、３７℃にて２４時間のインキュベーション後に回収し、そしてサイトカイン測定まで−８０℃にて保存した。
【０１６３】
上清におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターによる製造業者の取扱説明書（ＢＤ）に従ったマウス炎症Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって計測した。
【０１６４】
上清を回収した後に、生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＤＡＬＬ １１００）によって計測した。
【０１６５】
結果
表２１．ｈＢＤ２を伴う又は伴わないＬＰＳによる処理後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生、すべてのサンプルを同じドナー、つまり２人のドナーのうちの代表的な実験で試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝２）によって分析した。
【０１６６】
【表２１】
2011528332.tif 000022
【０１６７】
表２２．ｍＢＤ３を伴う又は伴わないＬＰＳによる処理後のマウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生、すべてのサンプルを同じドナー、つまり２匹のドナーのうちの代表的な実験で試験した。ＴＮＦ：ＦＡＣＳアレイによるＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）によって計測した、***ｐ＜０．００１：それぞれのコントロールと比較し、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｎ＝２）によって分析した。
【０１６８】
【表２２】
2011528332.tif 000023
【０１６９】
表２１に示したとおり、マウス・ベータ・デフェンシン３（ｍＢＤ３）は、ｈＢＤ２及びデキサメタゾンと同程度までヒトＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌を下方制御している。ｍＢＤ３もまた、マウスＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌を下方制御する（表２２）。
【０１７０】
従って、この構成において、ｍＢＤ３は優れた抗炎症活性を示す。
【０１７１】
実施例５
マウスにおける１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発結腸炎モデル
下記の研究の目的は、マウスにおける経口デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）投与によって誘発した炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおけるヒト・ベータ・デフェンシン２の抗炎症活性を測定することであった。
【０１７２】
ＤＳＳ結腸炎マウスモデルは、Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３（４２），ｐｐ．５５８１−５５９３（２００７）；及びＷｉｒｔｚ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ“Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５９（１１），１０７３−１０８３（２００７）に記載されているとおり、炎症性腸疾患を研究するための十分に認識されたモデルである。
【０１７３】
材料
試験品目
ヒト・ベータ・デフェンシン２（ｈＢＤ２）：上記実施例１を参照のこと
メチルプレドニゾロン２１‐ヘミコハク酸塩（「プレドニゾロン」）
ＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ）
【０１７４】
実験動物
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を研究で使用した、これが１０日間にわたり飲料水の状態で２％のＤＳＳ溶液を投与したときに顕著な結腸の炎症を発症することが実証された種及び性別であったためである。
【０１７５】
識別
動物を、それらの尾の数字及び文字表記によって識別した。さらに、各ケージを、動物の数と性別、試験品目、コード又は名称、投薬レベル、投与経路、処置期間、グループ番号、研究コード、及び試験責任者名を示す色分けしたカードによって識別した。
【０１７６】
体重
研究開始日の動物の平均体重は、２２．４±０．１６ｇであった。
【０１７７】
順化（隔離）
最低でも研究開始より７日前に、主要な研究の条件と同じ条件下においた。
【０１７８】
動物舎
到着次第、動物を、ステンレス製の蓋の付いたポリカーボネートのケージ（Ｅ‐Ｔｙｐｅ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、２５５×４０５×１９７ｍｍ）内に無作為に分け、そして収容した。
【０１７９】
動物を、温度（２２±２℃）、照明（１２／１２時間の明／暗）、空気圧、空気入れ替えの回数、及び相対湿度（３０〜７０％）の管理された動物部屋内に、それらの性別により１ケージあたり５匹の動物群で収容した。
【０１８０】
ケージにはすべて、リターとして床の上におがくず（Ｌｉｇｎｏｃｅｌ ３‐４；Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ、Ｓｐａｉｎ）を備えていた。
【０１８１】
食餌及び給水
すべてのマウスが、乾燥した標準的な齧歯動物ペレット飼料（Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ ２０１４；Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ、Ｓｐａｉｎ）を任意に摂取した。
【０１８２】
水は、適宜ボトル内に用意した。動物部屋への水道水供給を定期的に分析して、組成物をチェックし、そして想定される（化学的と細菌学的）混入物を検出した。
【０１８３】
機材
機器：
・動物はかりＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＰ２１００
・外科用解剖機器
・Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｃ遠心分離機
・Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ顕微鏡
・Ｈｏｏｋ ＆ Ｔｕｃｋｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｒｏｔａｍｉｘｅｒ
・ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ
・Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｏｄ．ＢＰ２２１Ｓ分析用天秤
・ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ
【０１８４】
材料と試薬：
・滅菌済みディスポーザブルシリンジ（１ｍｌ）
・滅菌済みＢｕｔｔｅｒｆｌｙ２５Ｇ輸液セット
・麻酔剤（ケタミン／キシラジン）
・局所麻酔剤クリーム（ＥＭＬＡ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）
・デキストラン硫酸ナトリウム３０．０００〜５０．０００Ｄａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）
・中性緩衝ホルマリン（ＶＷＲ）
・ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）
・プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）
・マウスＴＮＦ‐α ＥＬＩＳＡキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１８５】
実験プロトコール
研究設計
動物を５つの実験群に分けた。各群は１０匹の雄から成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）ｉ．ｖ．で処置した
グループＢ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した
グループＣ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した
グループＤ：ｈＢＤ２（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した
グループＥ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処置した。
すべての実験群への動物割り振りを、無作為様式でおこなった。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って）最大５匹のマウスを各ケージに収容した。すべての動物を、研究室に到着した時点、及び試験品目の投与前に計量した。
【０１８６】
試験物質の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、スロー・ボーラスで、５ｍｌ／ｋｇ体重の投薬容積で滅菌済み針（２５Ｇ）を使用して尾静脈を通じて静脈内に投与した。動物には、連続した１０日間、１日（２４時間毎）の用量の対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）を与えた。
【０１８７】
プレドニゾロンを、ｈＢＤ２と同じ投薬計画により、５ｍｌ／ｋｇ体重の投薬容積で１ｍｇ／ｋｇの用量で経口的に与えた。
【０１８８】
実験手順
結腸炎の誘発
７日間、ＤＳＳ２％をそれらの飲料水に足すことによって、結腸炎をマウスにおいて誘発した。
１日目に、すべてのマウスを計量し、そしてそれらの実験群に従ってマークを付けた。それぞれのケージの飲用ボトルをＤＳＳ溶液で満たし、すべてのボトルの蓋が適切にはめ込まれたこと、及び何も詰まっていないことを確認した。
【０１８９】
３日目に、ボトル内の残っている溶液をすべて取り除き、そして新しいＤＳＳ溶液で詰め替えた。この手順を、５日目に再び繰り返した。
【０１９０】
８日目に、残っている溶液をすべて捨て、そしてオートクレーブ処理した水で置き換えた。
【０１９１】
動物を１０日目の２日間後に屠殺した。
【０１９２】
臨床的評価（疾患活動性インデックス）
ＤＳＳ処置動物の毎日の臨床的評価を、以下のパラメーター：便の硬さ、直腸出血の有無、及び体重減少、に従って０〜４の範囲を持つ有効な臨床疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）の計算を用いて実施した。
【０１９３】
【表２３】
2011528332.tif 000024
【０１９４】
体重減少を、最初の体重（１日目）とそれぞれの実験日（２〜１０日目）の実際の体重との差の割合（パーセント）として計算した。
【０１９５】
下痢の様子を、肛門の被毛への粘液／排泄物の付着と規定する。直腸出血を、目に見える血液／粘液を含んでいる下痢、又は肉眼的直腸出血と規定する。１日の最高ＤＡＩスコアは１２である。
【０１９６】
血液のサンプリング
２つの血液サンプルを、研究経過中の２回の別々の時期：１日目と５日目に各動物から得た。血液サンプルを、試験品目の投与の２時間後に伏在静脈の穿刺によってＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ‐３００マイクロチューブ内に得た。この血液採取法は、麻酔剤又は鎮痛剤を必要としないので、動物に最小限のストレスしか生じさせない（Ｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、末梢血サンプルを、研究最後日にすべての動物から、試験品目投与の２時間後にも腹筋大静脈から得た。
【０１９７】
血液サンプルを、凝固させ、次に３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、そして得られた血清を保管のために−８０℃にて冷凍した。
【０１９８】
安楽死と結腸サンプルの収集
１０日目、コントロール・ビヒクル、ｈＢＤ２、又はプレドニゾロンの最後の投与の２時間後に、動物を過剰量の麻酔剤によって死に至らしめた。それらの結腸を、取り出し、そして盲腸の除去後にそれらの長さと重さを計測した。
【０１９９】
結腸の２つの切片（近位及び遠位）を、各動物から採取し、そして以下の採点法によるその後の組織学的分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）のために中性緩衝ホルマリン中で保存した：
【０２００】
【表２４】
2011528332.tif 000025
【０２０１】
結腸組織サンプル中のＴＮＦ‐アルファ濃度の測定
結腸の追加サンプルを、各動物から得、そして１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）を含有するＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。次に、ホモジネートを１４００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、そしてその後の特異的酵素免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＴＮＦ‐α濃度の測定のために、その上清を−２０℃にて保存した。
【０２０２】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表２３．１日目〜１０日目の疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの進行。所定の期日のコントロール（ビヒクル）群の値からの有意差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（ノンパラメトリック・データに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定）として示す。
【０２０３】
【表２５】
2011528332.tif 000026
【０２０４】
組織学的評価
結腸の２つの切片（近位及び遠位）を、各動物から採取し、組織学的分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）のために処理し、そして先に記載した組織学採点法に従って盲検観察者によってスコア化した。
【０２０５】
結腸組織サンプル中のＴＮＦ‐α濃度の決定
結腸の追加サンプルを、各動物から得、そして１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）を含有するＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。次に、ホモジネートを１４００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、そしてその後の特異的酵素免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＴＮＦ‐α濃度の測定のために、その上清を−２０℃にて保存した。
【０２０６】
表２４．組織学的スコア、結腸の重さと長さ、及び結腸ＴＮＦ‐α濃度。コントロール（ビヒクル）群の値との組織学的スコアの差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（ノンパラメトリック・データに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定）として示す。
【０２０７】
【表２６】
2011528332.tif 000027
【０２０８】
統計解析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を使用して評価した。疾患活動性インデックスと組織学的スコアに関する群間の差を、対応のないデータに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定と事後検定Ｄｕｎｎによって評価して、多重比較を可能にした。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
【０２０９】
結論
結果は、試験した中で最も低い用量（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）にてｈＢＤ２が、７日目（１．４４±０．３８試験品目対４．１±０．６９ビヒクル；ｐ＜０．０１）、８日目（２．１１±０．２試験品目対５．９±１．２６ビヒクル；ｐ＜０．０５）、９日目（３．８９±０．３５試験品目対８．９±１．０２ビヒクル；ｐ＜０．０１）、及び１０日目（６．４４±０．８５試験品目対１０．９±０．６２ビヒクル；ｐ＜０．０５）にＤＳＳ投与によって誘発された疾患活動性インデックスの上昇を有意に低下させることを実証している。
【０２１０】
中間用量のｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）を用いた１０日間の連続した処置は、疾患活動性インデックス・スコアの見かけ上の低下をもたらしたが、これは１０日目においてのみ有意であった（６．４４±１．０８試験品目対１０．９±０．６２ビヒクル；ｐ＜０．０５）。
【０２１１】
１０日目の疾患活動性インデックスで得られた結果と同様に、それぞれの動物の近位結腸の組織学的分析は、低用量のｈＢＤ２を用いた処置による組織学的損傷スコアの非常に有意な低下を明らかにした（２．２２±０．４３試験品目対４．２±０．２５ビヒクル；ｐ＜０．０１）。そのうえ、組織学傷害の有意な低下はまた、中間用量及び高用量のｈＢＤ２、並びにプレドニゾロンでも観察された（２．８９±０．３５；２．８９±０．３９及び２．８±０．５、それぞれｐ＜０．０５）。対照的に、遠位結腸では、‐組織学傷害の見かけ上の減少が、低用量及び中間用量のｈＢＤ２、並びにプレドニゾロンによって処置した動物に関して観察できたが‐これは統計的に有意でなかった。高用量のｈＢＤ２で処置した動物において低下は観察できなかった。同様に、低用量及び中間用量のｈＢＤ２での処置は、結腸のＴＮＦ‐アルファ・レベルの見かけ上の低下をもたらしたが、この見かけ上の低下は統計的に有意でなかった。
【０２１２】
本研究において得られた結果は、１０日間の処置期間後にマウスで誘発したＤＳＳ結腸炎のモデルにおけるｈＢＤ２の抗炎症活性を実証している。しかしながら、この抗炎症活性は、使用した中でもより低い用量のｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ／日 ｉ．ｖ．）にてより顕著であるように思われ、そして研究で使用した中で最も高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日 ｉ．ｖ．）まで用量が増加するにつれて徐々に失われる。そのうえ、最も低い用量のｈＢＤ２の抗炎症作用は、１ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．の用量のプレドニゾロンの作用に匹敵するか、それよりさらに大きいことさえある（例えば組織学的スコア）。
【０２１３】
実施例６
マウスにおける１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発結腸炎モデル
実施例６を、実質的に実施例５に記載されたとおり実施した。相違点を以下に示す。
【０２１４】
体重
研究開始日の動物の平均体重は、１９．７４±０．０９ｇ（平均±ＳＥＭ）であった。
【０２１５】
研究設計
動物を９つの実験群に分けた。各群は１０匹の雄から成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）ｉ．ｖ．で処置した
グループＢ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した‐１日１回
グループＣ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した‐１日１回
グループＤ：ｈＢＤ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した‐１日１回
グループＥ：ｈＢＤ２（０．００１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した‐１日１回
グループＦ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．＋ｓ．ｃ．）で処置した‐１日２回
グループＧ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した‐２日に１回
グループＨ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処置した
グループＪ：メチルプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処置した。
【０２１６】
すべての実験群への動物割り振りを、無作為様式でおこなった。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って）最大５匹のマウスを各ケージに収容した。すべての動物を、研究室に到着した時点、及び試験化合物と基準化合物の投与前に計量した。
【０２１７】
試験品目の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、（１５秒間かけて）スロー・ボーラスとして５ｍｌ／ｋｇ体重の投薬容積で滅菌済み針（２５Ｇ）を使用して尾静脈を通じて静脈内に投与した。
【０２１８】
グループＡ〜グループＥの動物には、連続した１０日間、１日（２４時間毎）用量の対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）を与えた。
【０２１９】
グループＦの動物には、連続した１０日間、ある用量でｉ．ｖ．及び別の用量でｓ．ｃ（ｉ．ｖ．用量の１２時間後）の対応する試験品目を与えた。
【０２２０】
グループＧの動物には、連続した１０日間、２日に１回１用量の対応する試験品目を与えた。
【０２２１】
メチルプレドニゾロンを、連続した１０日間１日１回、５ｍｌ／ｋｇ体重の投薬容積で１ｍｇ／ｋｇ（グループＨ）及び１０ｍｇ／ｋｇ（グループＪ）の用量にて経口的に与えた。
【０２２２】
血液サンプリング
末梢血サンプルを、研究最後日にすべての動物から、試験品目投与の２時間後に腹筋大静脈から得た。
【０２２３】
血液サンプルを、凝固させ、次に３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、そして得られた血清をその後の分析のために−８０℃にて冷凍した。
【０２２４】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表２５．１日目〜１０日目の疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの進行。所定の期日のコントロール（ビヒクル）群の値からの有意差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（ノンパラメトリック・データに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定）として示す。６日目〜１０日目を次のページに示す。
【０２２５】
【表２７】
2011528332.tif 000028
【０２２６】
【表２８】
2011528332.tif 000029
【０２２７】
組織学的評価
結腸の２つの切片（近位及び遠位）を、各動物から採取し、組織学的分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）のために処置し、そして先に記載した採点法に従って盲検観察者によってスコア化した。
【０２２８】
表２６．組織学的スコア、結腸の重さと長さ、及び結腸ＴＮＦ‐α濃度。コントロール（ビヒクル）群の値との組織学的スコアの差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（ノンパラメトリック・データに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定）として示す。
【０２２９】
【表２９】
2011528332.tif 000030
【０２３０】
統計解析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を使用して評価した。疾患活動性インデックスと組織学的スコアに関する群間の差を、対応のないデータに関するＫｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓ検定と事後検定Ｄｕｎｎによって評価して、多重比較を可能にした。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。上記の表中では、対応するコントロール（ビヒクル）群に対する有意差を：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１で示す。
【０２３１】
結論
本研究の目的は、マウスで経口デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、２％）投与によって誘発した炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおけるｈＢＤ２の抗炎症活性を測定することであった。
【０２３２】
本研究において得られた結果は、１０日間の処置期間後にマウスで誘発したＤＳＳ結腸炎のモデルにおけるｈＢＤ２の抗炎症活性をさらに実証している。
【０２３３】
この抗炎症活性は、０．１ｍｇ／ｋｇの用量にて静脈内と皮下の両方での１日２回（１２時間毎）のｈＢＤ２投与後により顕著であるように思われた。そのうえ、この用量のｈＢＤ２で観察された抗炎症作用は、経口的に与えられた１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のプレドニゾロンの作用に匹敵するか、（疾患活動性インデックスと組織学的スコアの両方では）それよりさらに大きいことさえある。
【０２３４】
実施例７
コラーゲン誘発関節リウマチモデルにおけるヒト・ベータ・デフェンシン２の評価
下記の研究の目的は、マウスでのコラーゲン誘発関節リウマチモデルにおけるヒト・ベータ・デフェンシン２の抗炎症活性を測定することであった。
【０２３５】
試験システム
種／系統：マウス／ＤＢＡ／１
供給業者：Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ
性別：雄
動物数：ｎ＝５０
年齢：若年成体、研究開始時点で６〜８週齢
体重：コラーゲン誘発時点での研究動物の体重のばらつきは平均体重の±２０％を超えていなかった。
動物健康：この研究で使用した動物の健康状態は到着時点で検査した。良好な健康である動物だけを、研究室条件に順化し、そして研究に使用した。
順化：少なくとも７日間。
【０２３６】
動物舎：気候順化と次の投薬の間、動物を、立ち入りが制限された齧歯動物の施設内に収容し、そして丈夫な底を取り付け、そして床材としてかんな屑を詰め込んだポリプロピレン製ケージ（４５ｃｍ×２５ｃｍ×１３ｃｍ）内に、最大１０匹のマウスから成る群を入れておいた。ケージを１週間に１回変えた。
【０２３７】
食餌と給水：動物は、市販の齧歯動物飼料を任意に摂取し、そしてステンレス製の吸水管（ｓｉｐｐｅｒ ｔｕｂｅｓ）を備えたポリエチレン製ボトルによって各ケージに供給された飲料水を自由摂取した。給水ボトルを少なくとも３週間に１回交換した。水を１週間に３回交換した。
【０２３８】
環境：自動的制御環境条件を、３０〜７０％の相対湿度（ＲＨ）を持つ２０〜２４℃の温度、１２／１２時間の明／暗サイクル、及び研究室における１０〜３０回の換気／時間を維持するように設定した。温度とＲＨを、手作業の測定と制御コンピューターの両方で毎日観察した。明るさのサイクルを、制御コンピューターによって観察した。
【０２３９】
識別：動物には、固有な動物識別耳番号を付与した。この数はまた、それぞれのケージの前面に見えるケージ・カードにも載せた。ケージ・カードには研究番号も含まれた。
無作為化：動物を無作為に実験群に割り付けた。
終了：研究の終了時に、生き残った動物をＯ2／ＣＯ2吸入とそれに続く放血によって安楽死させた。
根拠：この実験的動物モデルにとって最適な種であってので、マウスを選択した。ＤＢＡ／１系統のマウスは、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）に高い感受性を持っている。
【０２４０】
材料
ヒト・ベータ・デフェンシン２（ｈＢＤ２）；実施例１を参照のこと
デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ１７５６）
ウシＩＩ型コラーゲン（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号８０４００１３１４）
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５０１００９７０３）
ＰＢＳ（ＰＡＡ、カタログ番号Ｈ１５‐００２）
試験群の構成
表２７．試験グループと処置。
【０２４１】
【表３０】
2011528332.tif 000031
【０２４２】
試験手順
関節炎誘発
すべての動物に、研究０日目（研究の開始）に、軽いイソフルラン麻酔下、プラスチック製シリンジを使用して０．１ｍｌのＩＩ型コラーゲン／ＣＦＡ乳濁液（マウス１匹あたり２００μｇのコラーゲン）の尾部への皮内注射を与えた。注射位置は、体の後端に近接した、尾の付け根から約１ｃｍの距離であった。コラーゲン抗原投与（２００μｇ／マウス）を、２１日目にコラーゲン尾ＰＢＳのＩＰ注射によって動物に与えた。
【０２４３】
処置
処置を、研究の１４日目に開始し、そして１日１回でずっと続けた。すべての生き残ったマウスは、研究４２日目に終了させた。
【０２４４】
投与経路：
（ｉ）ｈＢＤ２：静脈内
（ｉｉ）デキサメタゾン：腹腔内
（ｉｉｉ）ビヒクルコントロール：静脈内
【０２４５】
用量と投薬の容積（表２７もまた参照のこと）：
（ｉ）ｈＢＤ２：１０、１、又は０．１ｍｇ／ｋｇ、５ｍＬ／ｋｇにて
（ｉｉ）デキサメタゾン：１ｍｇ／ｋｇ、５ｍＬ／ｋｇにて
（ｉｉｉ）ビヒクルコントロール：０ｍｇ／ｋｇ、５ｍＬ／ｋｇにて
【０２４６】
鎮痛：研究中は、鎮痛剤を使用しなかった。
【０２４７】
観察と検査法
関節炎反応
マウスを、研究０、１４、２１日目とその後研究終了まで１週間に５回、末梢関節の関節炎誘発応答の兆候について検査した。関節炎反応を、下記に示したとおり重症度の低い順に０〜４の等級に従って各肢に関して記録した：
【０２４８】
【表３１】
2011528332.tif 000032
【０２４９】
臨床徴候
０、１４、２１日目に、そしてその後１週間に５回、慎重な臨床検査をおこない、そして記録した。観察には、皮膚、毛皮、目、粘膜、膜の変化、分泌物及び排泄物（例えば下痢）の存在、並びに自律神経活動（例えば、流涙、唾液分泌、立毛、瞳孔サイズ、異常な呼吸パターン）が含まれた。歩き方、姿勢、及び世話に対する応答の変化、並びに異常行動、震え、けいれん、睡眠、及び昏睡の存在にも言及した。
【０２５０】
１４日目より前には、あらゆる異常行動について毎日マウスを観察した。
【０２５１】
体重
動物の個々の体重の測定を、０、１４、２１日目に、そしてその後研究終了まで１週間に５回、関節炎誘発の直前におこなった。
【０２５２】
実験的関節炎の計測
それぞれの動物の両後脚の厚さ（左右の、肉球のすぐ下、且つ、踵骨の上）の相対変化を、ダイヤル・キャリパー（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ、Ｍｕｎｉｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して研究０、１４、２１日目に、及びその後１週間に５回、ｍｍ単位で計測した。
【０２５３】
研究の終了
すべてのマウスを研究４２日目に終了させた。
【０２５４】
サンプル収集
研究終了時に、Ｏ2／ＣＯ2吸入後に、末梢血サンプルを残ったすべての研究動物から得た。血清を各サンプルから調製し、そして−２０℃にて保存した。加えて、左前肢と後肢を採取し、そしてホルマリン中に保存した、及び右前肢と後肢を採取し、そして可能な関節ＲＮＡ分析のために急速冷凍した。
【０２５５】
人道的なエンドポイント
瀕死状態に見える動物、及び激痛と重度の苦痛の持続的兆候を示す動物を、人道的に安楽死させた。加えて、最初の体重測定から２０％を超える体重減少を示す動物を、人道的に安楽死させた。１２以上の総関節炎スコアを有するマウスもまた、人道的な理由で除外した。すべての動物を、Ｏ2／ＣＯ2吸入とそれに続く放血によって安楽死させた。すべての研究動物から肢サンプルと末梢血サンプルを得た。
【０２５６】
統計解析
評価は、主として関節炎スコアと肢の厚みの測定値の平均に基づいた。必要に応じて、適当な統計的方法によるデータの分析を適用して、処置効果の有意性を判定した。分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙ事後解析（Ｅｘｃｅｌ用Ｗｉｎｓｔａｔ ２００５．１）を使用して、処置群の統計的な差を評価した。
【０２５７】
内務省の規則に従って、１２以上の総臨床スコアを有するマウスを、関節炎重症度を理由に除外した。高い採点のマウスの排除によってデータが人工的に歪曲されないように、終了時のこれらのマウスの臨床スコアを研究の残りの部分に関する分析に繰り越した。
【０２５８】
動物愛護と使用の記述
この研究を、科学的手順での動物の使用に関する英国内務省規則に従って実施した。
【０２５９】
結果
表２８．コラーゲン誘発雄ＤＢＡ／１関節炎マウスにおいて４２日間の観察期間中に測定された平均臨床関節炎スコア。*ｐ＜０．０５：ビヒクル群との有意差。
【０２６０】
【表３２】
2011528332.tif 000033
【０２６１】
【表３３】
2011528332.tif 000034
【０２６２】
結論
関節炎反応を、研究１４日目からすべての群において認めた。ビヒクルで処置したマウスの平均総関節炎スコアは、研究４１日目の８．５±０．７２にて最高になった（表２８）。１０ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置したマウス（グループＣ）の平均総関節炎スコアは、研究４０日目の５．０±１．０４にて最高になった。この群の平均関節炎スコアは、２３日目から研究終了までビヒクルで処置したマウスと比較して低かったが、研究４１日目においてのみ有意であった。
【０２６３】
１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置したマウス（グループＤ）における平均総関節炎スコアは、研究４１日目の５．２±１．１１にて最高になり、そして２１日目から研究終了までビヒクル処置群と比較して一貫して低かったが、４０日目においてのみ有意であった。０．１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置したマウス（グループＥ）は、ビヒクル処置群と比較して平均総関節炎スコアを有意に下げなかった。この群の平均スコアは、研究４０日目の９．０±０．７７にて最高になった。デキサメタゾン処置群（グループＢ）のマウスは、研究２６日目から研究終了までビヒクル処置群と比較して有意に低い関節炎スコアを示した。
【０２６４】
関節炎の重症度が原因で、研究において早期に除外したマウスの排除がデータを人工的に歪曲しないことを確実にするために、分析において、そのようなマウスからの関節炎スコアを研究終了まで持ち越した。
【０２６５】
【表３４】
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【配列表】
2011528332000001.app
【国際調査報告】
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