(57)【要約】内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素とが欠失したバシラス宿主細胞を準備する工程と、プロモーターと動作可能に組み合わされた非相同中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素をコードする核酸で、バシラス宿主細胞を形質転換して形質転換された宿主細胞を調製する工程と、形質転換された宿主細胞を、非相同ＮｐｒＥ酵素を産出させるために適した条件下で培養して非相同ＮｐｒＥ酵素を産出する工程とを含む、セリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ない中性メタロプロテアーゼを製造する方法、及びこの方法で用いる形質転換されたバシラス宿主細胞、及びこの方法で得られた中性メタロプロテアーゼを含む組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性メタロプロテアーゼを製造する方法であって、
ｉ）内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）とが欠失したバシラス宿主細胞を準備する工程と、
ｉｉ）プロモーターと作動可能に組み合わされ、非相同ＮｐｒＥ酵素をコードする核酸で、前記バシラス宿主細胞を形質転換して形質転換された宿主細胞を調製する工程と、
ｉｉｉ）前記形質転換された宿主細胞を、非相同ＮｐｒＥ酵素を産出させるために適した条件下で培養して非相同ＮｐｒＥ酵素を産出する工程とを含む方法。
【請求項２】
さらに、産出された前記非相同ＮｐｒＥ酵素を回収する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに前記バシラス宿主細胞の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに前記バシラス宿主細胞の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、および／または、内因性バシロペプチターゼ（ｂａｃｉｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｆ酵素（Ｂｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バシラス宿主細胞の内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）、および／または内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非相同ＮｐｒＥ酵素がバシラス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮｐｒＥ酵素、またはその変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示したアミノ酸配列の１, ３, ４, ５, ６, １１, １２, １３, １４, １６, ２１, ２３, ２４, ２５, ３１, ３２, ３３, ３５, ３６, ３８, ４４, ４５, ４６, ４７, ４８, ４９, ５, ５１, ５４, ５５, ５８, ５９, ６, ６１, ６２, ６３, ６５, ６６, ６９, ７, ７６, ８５, ８６, ８７, ８８, ９, ９１, ９２, ９６, ９７, ９８, ９９, １, １２, １９, １１, １１１, １１２, １１３, １１５, １１７, １１９, １２７, １２８, １２９, １３, １３２, １３５, １３６, １３７, １３８, １３９, １４, １４６, １４８, １５１, １５２, １５３, １５４, １５５, １５７, １５８, １５９, １６１, １６２, １６９, １７３, １７８, １７９, １８, １８１, １８３, １８４, １８６, １９, １９１, １９２, １９６, １９８, １９９, ２, ２２, ２３, ２４, ２５, ２１, ２１１, ２１４, ２１５, ２１６, ２１７, ２１８, ２１９, ２２, ２２１, ２２２, ２２３, ２２４, ２２８, ２２９, ２３７, ２３９, ２４, ２４３, ２４４, ２４５, ２４８, ２５２, ２５３, ２６, ２６１, ２６３, ２６４, ２６５, ２６７, ２６９, ２７, ２７３, ２７７, ２８, ２８２, ２８３, ２８４, ２８５, ２８６, ２８８, ２８９, ２９, ２９２, ２９３, ２９６, ２９７,及び２９９から成る群から選択される位置に相当する少なくとも１の位置に置換が含まれるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示したアミノ酸配列中に下記から選択される少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【表１−１】
2011504097.tif 000018
【表１−２】
2011504097.tif 000019
【請求項１０】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体に、Ｓ１２９Ｉ／Ｆ１３０Ｌ／Ｄ２２０Ｐ, Ｍ１３８Ｌ／Ｖ１９０Ｉ／Ｄ２２０Ｐ, 及びＳ１２０Ｉ／Ｆ１３０Ｌ／Ｍ１３８Ｌ／Ｖ１９０Ｉ／Ｄ２２０Ｐから成る群から選択される多重変異体が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記中性メタロプロテアーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示すアミノ酸配列を有する中性メタロプロテアーゼに対し少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で産出された非相同ＮｐｒＥ酵素。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示すアミノ酸配列を有する中性メタロプロテアーゼまたはその変異体に対し少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を有する、単離されたＮｐｒＥ酵素。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＮｐｒＥ酵素またはその変異体を含む組成物であって、バシラス・セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）が実質的に混入していない組成物。
【請求項１５】
前記混入ＡｐｒＥの量がＮｐｒＥまたはその変異体に対し約１重量%未満である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．５０Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．０５Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．００５Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が洗浄剤組成物である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記洗浄剤組成物が洗剤である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
さらに、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、及びセルラーゼから選択される少なくとも１の追加の酵素、または酵素誘導体が含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＮｐｒＥ酵素またはその変異体が少なくとも約０．０００１重量％含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＮｐｒＥ酵素またはその変異体が約０．００１から約０．５重量％含まれる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
さらに少なくとも１の補助剤が含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
さらに組成物の原液ｐＨを約３から約５にするために必要な量のｐＨ調整剤が含まれ、ｐＨ約３から約５において加水分解する物質が含まれていない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
ｐＨ約３から約５において加水分解する前記物質が、少なくとも１の界面活性剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記界面活性剤がエチレンオキサイド部位を有するスルホン酸ナトリウム塩である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が液状である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２９】
織物から成る物品および／または表面と、請求項１９に記載の洗浄組成物とを接触させる工程を含む洗浄方法。
【請求項３０】
さらに、織物から成る前記物品または前記表面と前記洗浄組成物とを接触させた後、前記表面および／または前記物品をすすぎ洗いする工程が含まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む動物用飼料である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む織物および／または皮革加工剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項３３】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）とが欠失したバシラス宿主細胞であって、プロモーターと作動可能に組み合わされた非相同ＮｐｒＥ酵素をコードする核酸で形質転換されたバシラス宿主細胞。
【請求項３４】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３５】
さらに内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）が欠失した、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３６】
さらに、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、および／または、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）が欠失した、請求項３５に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３７】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３６に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３８】
さらに、内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素 （ＷｐｒＡ）、および／または内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）が欠失した、請求項３６に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３９】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３８に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４０】
前記非相同ＮｐｒＥ酵素が、バシラス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮｐｒＥ酵素、またはその変異体である、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４１】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）と、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）と、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）と、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）とが欠失した、単離されたバシラス宿主細胞。
【請求項４２】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項４１に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４３】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）と、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）と、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）と、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）と、内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素 （ＷｐｒＡ）と、内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）とが欠失した、単離されたバシラス宿主細胞。
【請求項４４】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項４３に記載のバシラス宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願  −  本願は、2007年10月31日出願の「セリンプロテアーゼの無い環境下での中性メタロプロテアーゼの使用と産出」と題する米国仮出願60/984,040に基づく優先権を主張する。
【０００２】
この発明は、セリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ない、少なくとも1の中性メタロプロテアーゼを含む組成物と、この組成物の製造方法に関する。いくつかの実施形態では、中性メタロプロテアーゼは、洗浄等の用途に用いられる。
いくつかの好ましい実施形態では、この発明は、種々のセリンプロテアーゼが欠失するように設計されたバシラス（Bacillus）株を含む組成物及びその方法と、このバシラス株を用いた遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼの産出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バシラス属に属する細菌は、工業的に有用な様々な酵素を分泌するグラム陽性であり、発酵させることにより酵素を安価で大量に製造することができる。バシラス・スブチリス（B.subtilis）や他のバシラス属の細菌は、その機能及び切断箇所により分類されている種々のプロテアーゼを産出する。このようなプロテアーゼの例として、酸性pH下でペプチド結合を切断する酸性プロテアーゼと、ペプチド結合をセリンにおいて切断するセリンプロテアーゼの2つが挙げられる。
【０００４】
バクテリアの細胞内には大量のプロテアーゼが存在し、これらのプロテアーゼの機能が多様であることから、1種類のプロテアーゼのみを産出する野生型、または天然変異菌株を単離することは困難である。
また、公知のプロテアーゼの精製方法は、多数のプロテアーゼに共通する生物化学的性質に依存しているため、適用範囲に限界がある。
このため、プロテアーゼ産出バシラス株から混入するプロテアーゼにより、目的とするプロテアーゼが分解されるという問題が生じることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、目的とする非相同プロテアーゼを、内因性の有害なプロテアーゼ活性の無い宿主株中で産出させる方法と、この方法で産出されたプロテアーゼを含む組成物が求められている。特に、セリンプロテアーゼの無い環境下で遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼを産出する方法、及びこの方法で産出された中性メタロプロテアーゼを含む組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明により、セリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ない、少なくとも1の中性メタロプロテアーゼを含む組成物と、この組成物の製造方法が提供される。
いくつかの実施形態では、中性メタロプロテアーゼは、洗浄等の用途に用いられる。
いくつかの好ましい実施形態では、この発明により、複数のセリンプロテアーゼが欠失するように設計されたバシラス（Bacillus）株を含む組成物及びその方法と、このバシラス株を用いた遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼの産出方法が提供される。
【０００７】
この発明により：内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ(NprE)酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)とが欠失したバシラス宿主細胞を準備する工程と；プロモーターと作動可能に組み合わされ、非相同NprE酵素をコードする核酸で、バシラス宿主細胞を形質転換する工程と；形質転換された宿主細胞を、非相同NprE酵素を産出させるために適した条件下で培養する工程とを含む、非相同中性メタロプロテアーゼの産出方法が提供される。
いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、産出された非相同NprE酵素を回収する工程が含まれる。好ましい実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、特に好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6100株(ΔaprE, ΔnprE, Δvpr, oppA, ΔspoIIE,  degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
【０００８】
別の実施形態では、バシラス宿主細胞は微量内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)が欠失している。
好ましい実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、特に好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6101株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
別の実施形態では、バシラス宿主細胞はさらに、主要な内因性細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)と、内因性バシロペプチターゼ(bacillopeptidase)F酵素(Bpr)との、いずれか一方または両方が欠失している。
好ましい実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、特に好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6000株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
【０００９】
また別の実施形態では、バシラス宿主細胞は、内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素 (WprA)と、内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素(Mpr)との、いずれか一方または両方が欠失している。
好ましい実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、特に好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6003株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxy IA- comK))である。
【００１０】
この発明により、非相同NprE酵素がバシラス・アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens) NprE酵素、またはその変異体である方法が提供される。
いくつかの実施形態では、バシラス・アミロリケファシエンスNprE変異体は、SEQ ID NO:3に示したアミノ酸配列の1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 210, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 228, 229, 237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263, 264, 265, 267, 269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293, 296, 297, 及び299から成る群から選択される位置に相当する少なくとも1の位置(1, 2, 3, 4または5箇所）に、置換が含まれるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
好ましい実施形態では、バシラス・アミロリケファシエンスNprE変異体は、SEQ ID NO:3に示したアミノ酸配列中に下記から選択される少なくとも1の置換(1, 2, 3, 4または5置換）を含むアミノ酸配列を有する。
【表１】
2011504097.tif 000003
2011504097.tif 000004
【００１２】
好ましい実施形態では、置換にはS129I/F130L/D220P, M138L/V190I/D220P, 及びS120I/F130L/M138L/V190I/D220Pから成る群から選択される多重変異体が含まれる。
好ましい実施形態では、中性メタロプロテアーゼはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有する中性メタロプロテアーゼに対し、少なくとも約45%のアミノ酸同一性を有する。
またこの発明により、この発明の方法で産出された非相同NprE酵素を含む組成物が提供される。 
【００１３】
さらに、この発明により単離されたバシラス中性メタロプロテアーゼまたはその変異体を含む組成物が提供され、この組成物にはバシラス・セリンプロテアーゼ(AprE)が実質的に混入していない。
いくつかの好ましい実施形態では、混入AprEの量はNprEまたはその変異体に対し約1 重量%未満である。
いくつかの好ましい実施形態では、混入AprEのセリンプロテアーゼ活性は0.50U/ml未満であり、好ましくはセリンプロテアーゼ活性は0.05 U/ml未満であり、より好ましくはセリンプロテアーゼ活性は0.005 U/ml未満である。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態では、組成物は洗浄剤組成物である。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄剤組成物は洗剤である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物にはさらに、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、及びセルラーゼから選択される少なくとも1の追加の酵素、または酵素誘導体が含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物には中性メタロプロテアーゼ変異体が少なくとも約0.0001重量％含まれ、好ましくは中性メタロプロテアーゼ変異体が約0.001から約0.5重量％含まれる。いくつかの実施形態では、組成物にはさらに少なくとも1の洗浄補助剤が含まれる。
【００１５】
この発明により、さらに組成物の原液pHを約3から約5にするために必要な量のpH調整剤が含まれ、pH約3から約5において加水分解する物質が含まれていない組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、pH約3から約5において加水分解する物質は,少なくとも1の界面活性剤である。ある実施形態では、界面活性剤はエチレンオキサイド部位を有するスルホン酸ナトリウム塩である。いくつかの実施形態では、組成物は液状である。
この発明によりさらに、表面および／または織物から成る物品と、この発明の洗浄組成物とを接触させる工程を含む洗浄方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、表面および／または物品と、洗浄組成物とを接触させた後、表面および／または物品をすすぎ洗いする工程が含まれる。
別の実施形態では、組成物は単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む動物用飼料である。また別の実施形態では、組成物は単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む織物加工剤である。また別の実施形態では、組成物は単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む皮革加工剤である。
【００１６】
またこの発明により、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ(NprE)酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)とが欠失したバシラス宿主細胞であって、単離されたバシラス宿主細胞が提供され、このバシラス宿主細胞は、プロモーターと作動可能に組み合わされた非相同NprE酵素をコードする核酸で形質転換されている。
【００１７】
いくつかの実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6100株(ΔaprE, ΔnprE, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
別の実施形態では、バシラス宿主細胞は微量内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)が欠失している。 
いくつかの実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6101株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, Δvpr,oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
別の実施形態では、バシラス宿主細胞はさらに、主要な内因性細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)、及び内因性バシロペプチターゼ(bacillopeptidase)F酵素(Bpr)の、いずれか一方または両方が欠失している。
いくつかの実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6000株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
また別の実施形態では、バシラス宿主細胞は、プロテアーゼ酵素に付随する内因性細胞壁(WprA)と、内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素(Mpr)との、いずれか一方または両方が欠失している。
好ましい実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6003株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxy IA- comK))である。
また別の好ましい実施形態では、非相同NprE酵素がバシラス・アミロリケファシエンス(amyloliquefacien)NprE酵素、またはその変異体である。
【００１８】
この発明により、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ(NprE)酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)と、微量内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)と、主要な内因性細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)と、内因性バシロペプチターゼ(bacillopeptidase)F酵素(Bpr)とが欠失したバシラス宿主細胞であって、単離されたバシラス宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6000株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))である。
【００１９】
別の実施形態では、この発明により、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素(AprE)と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ(NprE)酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)と、微量内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Epr)と、主要な内因性細胞内セリンプロテアーゼ酵素(IspA)と、内因性バシロペプチターゼ(bacillopeptidase)F酵素(Bpr)と、プロテアーゼ酵素に付随する内因性細胞壁(WprA)と、内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素(Mpr)とが欠失したバシラス宿主細胞であって、単離されたバシラス宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、バシラスはバシラス・スブチリスであり、好ましい実施形態ではバシラス・スブチリスはBG6003株(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxy IA- comK))である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】内因性プロテアーゼ遺伝子が欠失したバシラス宿主細胞を生成させる方法を表す模式図である。この図は、スペクチノマイシン耐性(spec)遺伝子及びカナマイシン耐性(kan)遺伝子を有するプラスミドと、抗生物質のスペクチノマイシン及びカナマイシンとを用いることにより、バシラス・スブチリス壁プロテアーゼ(wprA)遺伝子を欠失させる方法を例示する図である。
【図２】PCRテンプレートとして用いられるプラスミドのマップを表す。図２ＡはプラスミドpJHTのマップである。図２ＢはプラスミドpUBnprEのマップである。
【図３】aprEプロモーター配列に作動可能に組み合わされたB.アミロリケファシエンスのnprEコード配列を含む核酸を調製するために用いたスプライス重複伸長(SOE)反応の一例を表す模式図である。
【図４】図３に示したSOE反応で調製した核酸のDNA配列(SEQ ID NO: 12)を表す図である。図の下部はaprEプロモーターを表し、図の下部において下線を付した部分はB.アミロリケファシエンスのnprEシグナル配列を表し、図の下部において二重下線を付した部分はB.アミロリケファシエンスのnprEプロ配列を表し、図の上部は成熟B.アミロリケファシエンスのnprE配列を表す。
【図５】バシラスプロテアーゼのノックアウト株の発酵培養液についてセリンプロテアーゼの混入を評価して得られた結果を表す図である。セリンプロテアーゼの発現及び活性は、それぞれSDS-PAGE分析及びAAPFアッセイにより評価した。20〜30kDaと100kDaのタンパク質バンドはN-末端シークエンシングにより同定した結果、100kDaプロテアーゼが微量細胞外プロテアーゼVpr (Sloma et al., J Bacteriol, 173:21, 6889, 1991)に相当することが明らかになった。
【図６】図５におけるゲルの各レーンのデンシトメトリーのグラフを表す図である。図の左側に2つの欠失を有するプロテアーゼ発酵培養液に対応するグラフを示し、図の右側に8つの欠失を有するプロテアーゼ発酵培養液に対応するグラフを示す。
【図７】プライマー末端に公知の制限酵素認識部位が導入された上流側及び下流側の相同染色体DNAのPCR増幅によるプロテアーゼ遺伝子欠失プラスミドの構築を表す模式図である（例えば図７参照）。
【図８】pLoxSpecプラスミドのマップを表す。
【図９】上流側染色体DNA−Spec-loxP−下流側染色体DNAカセットを有するプラスミドを直線化して表す模式図である。
【図１０】pCRM-Ts Phleoプラスミドのマップを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
この発明により、セリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ない、少なくとも1の中性メタロプロテアーゼを含む組成物と、この組成物の製造方法が提供される。いくつかの実施形態では、中性メタロプロテアーゼは、洗浄等の用途に用いられる。
いくつかの好ましい実施形態では、この発明により、種々のセリンプロテアーゼが欠失するように設計されたバシラス（Bacillus）株を含む組成物及びその方法と、このバシラス株を用いた遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼの産出方法が提供される。
【００２２】
特に断りのない限り、本発明の実施においては分子生物学、微生物学、及びDNA組み換え分野で通常使用される従来の技術を用いる。その様な技術は当業者に知られており、数多くの論文及び参考文献に記載されている（例えばSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989; 及び Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," 1987を参照）。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び出版物は、既に挙げたもの及び以下に挙げるものの何れも参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
特に断りのない限り、全ての科学及び技術用語は、この発明が属する技術分野において当業者が理解している通常の意味で用いられる。例えば、Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N. Y. (1991) に本願で用いられる用語の一般的意義が記載されている。
本願発明を実施する際、以下に開示する方法または材料と類似または均等な方法または材料を用いることができる。本願には好ましい方法と材料を開示した。以下に定義を示す用語の意味は、明細書全体を参酌することにより、より完全に理解される。
【００２４】
本願で用いる「１つの」及び「この」等の単数形には、特に断りのない限り複数形も含まれる。数値範囲には、その範囲の上限値と下限値も含まれる。特に断りのない限り、核酸は左から右に向かって5'から3'方向に記載し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ基からカルボキシル基方向に記載に記載する。本願は特定の方法、手段、試薬の使用に限定されず、当業者がその目的に応じて種々変更して実施することが可能である。
【００２５】
また、文中の見出しは本願の実施形態を限定するものではなく、本願の範囲は明細書を参照して定められる。以下に定義を示す用語の意味は、明細書全体を参酌することにより、より完全に理解される。しかし、本願発明の理解を容易にするために、以下に用語を定義する。
【００２６】
＜定義＞
特に断りのない限り、全ての科学及び技術用語は、この発明が属する技術分野において当業者が理解している通常の意味で用いられる。本願発明を実施する際、以下に開示する方法または材料と類似または均等な方法または材料を用いることができる。本願には好ましい方法と材料を開示した。以下に定義を示す用語の意味は、明細書全体を参照することにより、より完全に理解される。本願で用いる「１つの」及び「この」等の単数形には、特に断りのない限り複数形も含まれる。特に断りのない限り核酸は左から右に向かって5'から3'方向に記載し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ基からカルボキシル基方向に記載に記載する。本願は特定の方法、手段、試薬の使用に限定されず、当業者がその目的に応じて種々変更して実施することができることを理解できよう。
【００２７】
本明細書全体に記載されている数値限定の上限値は、あたかも明示的に下限値が本明細書に記載されているように、下限値を含むことが意図されている。本明細書全体に記載されている数値限定の下限値は、あたかも明示的に上限値が本明細書に記載されているように、上限値を含むことが意図されている。本明細書全体に記載されている全ての数値範囲には、より狭い数値範囲が本明細書で全て明示的に記載されているかのように、広い数的範囲内に含まれる全てのより狭い数的範囲を含む。
【００２８】
引用した全ての文献は、関連のある部分を参照として本明細書に組み込む。いずれかの文献の引用は、本願発明に関してその文献が先行技術であることを認めたものとして解釈されてはならない。
【００２９】
本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」とは、ペプチドまたはペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
タンパク質分解活性を測定するための公知の方法は多数ある（例えばKalisz， "Microbial Proteinases，"In: Fiechter（ed.），Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988]）。
例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を解析して比較することにより、確認することができる。プロテアーゼまたはタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質には、ジメチルカゼイン（Sigma C-9801）、ウシコラーゲン（Sigma C-9879）、ウシエラスチン（Sigma E- 1625）、及びウシケラチン（ICN Biomedical 902111）が含まれる。しかしこれらに限定されない。
これらの基質を用いた比色分析は当業者に良く知られている（WO 99/34011 及び U.S. Pat. No. 6，376，450，参照。これらの文献を参照として本願に組み込む）。
ｐＮＡアッセイ（例えば、Del Mar et ah，Anal Biochem.，99:316-320 [1979]参照）も、グラジエント溶離をする間に収集される分画の活性酵素濃度の測定に有用である。このアッセイでは、可溶性合成基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン-p-ニトロアラニン（sAAPF-pNA）を加水分解したときのp-ニトロアラニンの放出速度を測定する。加水分解反応による黄色物質の生成速度を、４１０ｎｍの比色計で測定し、活性酵素の濃度を計算する。更に、280nmの吸光度を、タンパク質の総濃度の測定に用いることができる。活性酵素／総タンパク質の比が酵素の純度を表わす。
【００３０】
「NprEプロテアーゼ」と「NprE」とは、この発明に開示する中性メタロプロテアーゼを意味する。
ある好ましい実施形態では、NprEプロテアーゼは本願で精製されたMULTIFECT（登録商標）Neutralと指定するプロテアーゼ、またはバシラス・アミロリケファシエンス由来のPMNである。すなわち、いくつかの実施形態では、「PMNプロテアーゼ」とは、SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するバシラス・アミロリケファシエンスに由来する天然の成熟プロテアーゼを意味する。
別の実施形態では、この発明によりNprプロテアーゼの複数の部分が提供される。
【００３１】
「バシラスプロテアーゼ相同体」とは、バシラス・アミロリケファシエンス由来の成熟プロテアーゼと実質的に同じアミノ酸配列を有する天然プロテアーゼを意味し、あるいは天然プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列によりエンコードされ、中性メタロプロテアーゼの機能的特性を保持するプロテアーゼを意味する。
【００３２】
「NprE変異体」及び「NprEプロテアーゼ変異体」というときは、機能において野生型NprEと類似するプロテアーゼであるが、そのアミノ酸配列に変異を有しており、野生型プロテアーゼとはアミノ酸配列が異なるプロテアーゼを意味する。
【００３３】
「バシラス種」というときは、バシラス科、バシラス目、バシラス綱に分類されるグラム陽性バクテリアである「バシラス」属の全種を意味する。
「バシラス属」には、バシラス・スブチリス（B.subtilis）、バシラス・リケニフォルミスス（B.licheniformis）、バシラス・レンタス（B.lentus）、バチスル・ブレビス（B.brevis）、バシラス・ステアロセレモフィリス（B.stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィリス（B.alkalophilu）、バシラス・アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バシラス・クラウシ（B.clausii）、バシラス・ハロデュランス（B.halodurans）、バシラス・メガテリウム（B.megaterium）、バシラス・コアギュランス（B.coagulans）、バシラス・サーキュランス（B.circulans）、バシラス・ラウタス（B.lautus）、及びバシラス・ツリンギエンシス（B.thuringiensis）等が含まれるが、これらに限定されず、当業者にバシラスであると認識されている全てのバシラスが含まれる。バシラス属は分類学上の再編成を受け続けている。従って、再分類された種もバシラス属に含まれるものとし、例えば今は「ゲオバシラスステアロセレモフィリス」（Geobacillus stearothermophilus）と命名されているバシラス・ステアロセレモフィリス（B.stearothermophilus）も含まれる。
酸素の存在下で耐性芽胞を生成することがバシラス属を定義するときの特徴と考えられる。しかし、この特徴は最近アリシクロバシラス（Alicyclobacillus）、アンフィバシラス（Amphibacillus）、アニューリーニバシラス（Aneurinibacillu）、アノキシバシラス（Anoxy bacillus）、ブレビバシラス（Brevibacillus）、フィロバシラス（Filobacillus）、グラシリバシラス（Gracilibacillus）、ハロバシラス（Halobacillus）、ペニバシラス（Paenibacillus）、サリバシラス（Salibacillu）、サーモバシラス（Thermobacillus）、ウレーバシラス（Ureibacillus）及びヴァージバシラス（Virgibacillus）と命名されたものにも当てはまる。
【００３４】
関連する（及び誘導体）タンパク質は「変異タンパク質」を含む。
幾つかの好ましい態様では、変異タンパク質は親タンパク質とは少数のアミノ酸残基において異なる。異なるアミノ酸残基の数は１つ以上であり、好ましくは1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50,またはこれより多くのアミノ酸残基が異なる。
幾つかの好ましい態様では、変異体同士で異なるアミノ酸の数は1から10の範囲である。
いくつかの実施形態では、関連タンパク質、特に変異タンパク質はアミノ酸配列同一性を少なくとも約35%,約40%,約45%,約50%,約55%,約60%,約65%,約70%,約75%,約80%,約85%,約90%,約95%,約97%,約98%,または約99%有する。
また、関連タンパク質または変異タンパク質というときは、プロミネント領域の数が他の関連タンパク質、または親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。例えば、幾つかの態様において、変異体タンパク質は親タンパク質と異なる1, 2, 3, 4, 5, または10の対応するプロミネント領域を有する。
【００３５】
本発明の酵素の変異体の生成に適した方法はいくつか知られており、非限定的例示として部位飽和変異誘発、スキャニング変異誘発、挿入変異誘発、ランダム変異誘発、部位指定変異誘発、及び指定進化、その他の遺伝子組み換え技術が挙げられる。
【００３６】
野生型及び変異タンパク質の特性分析は適切な種々の手段または「試験」によって行うことができ、好ましくは評価対象の特性の分析により行うことができる。例えばいくつかの実施形態では、pHおよび／または温度、あるいは洗剤および／または酸化安定性を評価する。これらの特性(pH、温度、タンパク質分解安定性、洗剤安定性、および／または酸化安定性)の1以上において、様々なレベルの安定性を示す酵素が実用に供される。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」と「核酸」は本願において同義で用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。これらの用語には、一本鎖、または二本鎖、または三本鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の核酸塩基、化学的または生物学的に修飾された非天然または誘導された核酸塩基を含むが、これらに限定されない。
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＡＮ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え体ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離ＤＮＡ配列、単離ＲＮＡ配列、核酸プローブ及びプライマー。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変性ヌクレオチドを含んでもよく、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、ウラシル、その他の糖、及びフルオロリボース及びチオアートのような結合基、及びヌクレオチド分枝などを含む。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分により阻害される。
【００３８】
本願では「DNA構築体」及び「形質転換DNA」は同義で用いられ、宿主細胞または有機体に配列を導入するために用いられるDNAを意味する。このDNAはin vitroにおいて、PCRで生成されるか、または当分野で公知の任意の技術を用いて生成させることができる。
好ましい実施形態では、DNA構築体には目的の配列（例えば入来配列）が含まれる。
別の好ましい実施形態では、この配列は、制御エレメント（例えばプロモーター等）等の追加のエレメントに作動可能に結合している。DNA構築体にはさらに選択マーカーが含まれる。DNA構築体にはさらにホモロジーボックスに隣接した入来配列が含まれる。
また別の実施形態では、形質転換DNAには末端部（例えば、スタファー（stuffer）配列または隣接配列）に付加された他の非相同配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、形質転換DNAが閉じた環状となるように、入来配列の末端部が閉じられている。形質転換配列は、野生型、変異体、あるいは修飾されている。
いくつかの実施形態では、DNA構築体には、宿主細胞染色体と相同な配列が含まれる。別の実施形態では、DNA構築体には非相同な配列が含まれる。
in vitroで調製されたDNA構築体は、1) 宿主細胞の所望の目的配列に非相同配列を挿入する、および／または2) 宿主細胞染色体のある領域に突然変異誘発する（すなわち、内因性配列を非相同配列で置き換える）、3) 標的遺伝子を欠失させる、および／または、宿主に複製プラスミドを導入するために用いられる。
【００３９】
「発現カセット」および「発現ベクター」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントを用いた組換え、または合成によって生成された核酸構築体を意味する。
組換え発現カセットは、プラスミド、クロモソーム、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウイルス、または核酸フラグメントに組み込まれる。
通常、発現ベクター、DNA構築体、または形質転換DNAの組換え発現カセット部位は、他の配列の中に、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは宿主細胞中に非相同DNAフラグメントを導入し、発現する能力を有している。
多くの原核性及び真核性発現ベクターが市販されている。当業者であれば、適切な発現ベクターを選択することができる。
本願では「発現カセット」と「DNA構築体」という用語は同義で用いられ、これらの用語の文法上の同義語も含まれる。当業者であれば、適切な発現ベクターを選択することができる。
【００４０】
本願では、「ベクター」とは１つ以上の細胞タイプへ核酸を導入するためにデザインされたポリヌクレオチド構築体を意味する。ベクターにはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等が含まれる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築体にはプロテアーゼ(例えば前駆体または成熟プロテアーゼ)をコードするDNA配列が含まれている。このDNA配列は、適切な宿主中でDNAを発現可能な適切なプロ配列（例えば分泌腺等）に作動可能に結合している。
【００４１】
本明細書において、「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ds）DNA構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、または他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。
【００４２】
本願で細胞内への核酸配列の導入に関し「導入された」というときは、細胞へ核酸配列を導入するのに適した任意の方法を意味する。核酸配列の導入の方法としてプロトプラスト融合、トランスフェクション、トランスフォーメーション、コンジュゲンチオビオース-ション、及びトランスダクション等がある。(例えば Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al, (eds.), Bacillus. Plenum Publishing Corp., pages 57-72, 1989参照)
【００４３】
本願で「形質転換された」及び「安定な形質転換された」というときは、そのゲノムまたは少なくとも2世代にわたり維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれた非天然（非相同）ポリヌクレオチド配列を有する細胞を意味する。
【００４４】
「ヌクレオチド配列をエンコードする選択マーカー」とは、宿主細胞中で発現可能なヌクレオチド配列であって、発現された遺伝子を含む細胞に対応する選択試薬の存在下で成長する能力、または必須栄養素の非存在下で成長する能力を、選択マーカーの発現により付与することができるヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」とは、宿主細胞中で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）であって、ベクターを含む宿主細胞の選択を容易にすることができる核酸を意味する。
選択可能マーカーの一例は抗生物質耐性であるが、これに限定されない。従って、「選択マーカー」とは、宿主細胞が目的の入来DNAを取り込んだ、またはその他の反応が起こったことを表示する遺伝子をいう。
一般に、選択マーカーは、形質転換時に入来配列を受け取らなかった細胞と入来ＤＮＡを含む細胞との区別を可能にするために宿主細胞に抗菌耐性または栄養要求性を与える遺伝子をいう。
「存在（residing）選択マーカー」とは、形質転換される微生物の染色体上に位置するマーカーである。存在選択マーカーは形質転換DNA構築体上の選択マーカーとは異なる遺伝子をコードする。
選択マーカーは当業者に公知である。上述の通り、このマーカーは好ましくは抗微生物耐性マーカーである（例えば、ampR; phleoR; specR ; kanR; eryR; tetR; cmpR; and neoR ：例えばGuerot-Fleury, Gene, 167:335-337, 1995; Palmeros et al., Gene 247:255-264, 2000; and Trieu-Cuot et al, Gene, 23:331-341, 1983を参照）。本願で有用な他のマーカーにはトリプロファン等の栄養要求性のマーカーや、β-ガラクトシダーゼ等の標識検出マーカーが含まれるが、これに限定されない。
【００４６】
ここで用いる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接機能する核酸配列をいう。好ましい実施態様において、プロモーターは標的遺伝子が発現するように宿主細胞に適合したものである。プロモーターはその他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）とともに、所定の遺伝子を発現するために必要なものである。転写及び翻訳調節配列の非限定的例示として、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサーまたは活性化配列が挙げられる。
【００４７】
核酸が他の核酸配列と機能的に関連するように位置する場合、「作動可能に連結している」という。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルぺプチド）をコードするDNAがポリぺプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、そのポリぺプチドに関しDNAに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーが配列転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結し；またはリボソーム結合部位は翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結している。
一般に「作動可能に結合する」とは、結合するDNA配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合、連続かつ読取りフェーズにある。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。適切な制限酵素認識部位で結合することにより、結合が達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを公知の方法に従って用いる。
【００４８】
本願で「遺伝子」というときは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAフラグメント）を意味し、コード領域の前後の領域だけでなく、個々のコード配列（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００４９】
本願で「相同遺伝子」というときは、相違点は有るが、関連性を有する種に由来する一組の遺伝子を意味する。これらは互いに対応し、互いに同一であるか非常に似ている。この用語には、スペーシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の開発）（例えば、オーソロガス遺伝子）だけでなく、遺伝子複製により分離された遺伝子（パラロガス遺伝子）も含む。
【００５０】
本願で「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」というときは、スペーシエーションにより共通の先祖遺伝子から進化した遺伝子を意味する（即ち、相同遺伝子）。通常、オーソログは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムの遺伝子の機能を予測する上で有用である。
【００５１】
本願で「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」というときは、ゲノム内での複製により関係している遺伝子を意味する。オーソログは進化の過程で同じ機能を保持しているのに対し、パラログの場合は、いくつかの機能はオリジナルの遺伝子に関連しているが、更に新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコードしている遺伝子等があるが、これらに限定されない。これらは全てセリンプロテアーゼであり、同じ種を起源とする。
【００５２】
本願で「相同性」というときは、類似または同一な配列を意味し、好ましくは同一である。この相同性は当業者において標準的な方法で測定することができる（例えば、Smith And Waterman,Adv. Appl. Math.,2:482 [1981]; Needleman And Wunsch，J. MoI. Biol．,48:443 [1970]; Pearson And Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988];ウィスコンシンジェネチックソフトウェアパッケージのGAP,BESTFIT,FASTA,及びTFASTA等のプログラム(Genetics Computer Group、Madison,WI)；及びDevereux et al,Nucl. Acid Res.，12:387-395 [1984]参照）。
【００５３】
ここで用いる「類似配列」とは、遺伝子の機能が本質的にバシラス・アミロリケファシエンスNprEプロテアーゼに基づく遺伝子と同じである遺伝子をいう。さらに、類似遺伝子はバシラス・アミロリケファシエンスNprEプロテアーゼの配列に対し配列同一性を少なくとも約45%,約50%,約55%,約60%,約65%,約70%,約75%,約80%,約85%,約90%,約95%,約97%,約98%,約99%,または約100%有する。別の実施形態では、上記の性質の1以上が、この配列に当てはまる。
類似配列は、公知の配列アライメント法により決定できる。一般的に用いられる配列アライメント法はBLASTであるが、他の方法を配列のアライメントに用いることもできる。
【００５４】
有用なアルゴリズムの１の例はPILEUP法である。PILEUP法によりプログレッシブ、あるいはペアワイズ・アライメントを用いて、関連配列グループから複数の配列アライメントを行うことができる。また、配列アライメントに用いる集積性関係を示す系図をプロットすることもできる。PILEUP法では、Feng及びDoolittleのプログレッシブ・アライメント法を単純化して用いる(Feng and Doolittle, J MoI Evol, 35:351-360, 1987)。この方法は、HigginsとSharpの方法に似ている(Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989)。有用なPILEUPパラメーターは、初期設定ギャップウエイト3.00、初期設定ギャップ長さウエイト0.10であり、加重エンドギャップを用いる。
【００５５】
他の有用なアルゴリズムの例はAltschulらのBLASTアルゴリズムである(Altschul et al., J MoI Biol, 215:403-410, 1990; and Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993)。
特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2プログラムである(Altschul et al., Meth Enzymol, 266:460-480, 1996参照)。WU-BLAST-2ではいくつかのサーチパラメーターが用いられ、ほとんどは初期値に設定されている。調節可能なパラメーターを以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、言語閾値（T）＝11。HSP S及びHSP S2パラメーターは動的値であり、特定配列の構成及び目的配列がサーチされる特定データベースの構成に応じてプログラム自体により設定される。しかし、これらの値を調節して感度を増加させることもできる。
アミノ酸配列同一性%は、マッチする同一の残基の数を、アライメントさせた領域における「より長い」配列中の残基の合計数で割ることにより求められる。「より長い」配列は、アライメントさせた領域において実際に存在している残基を有する配列である（配列スコアを最大化するためにWU-BLAST-2により導入されたギャップは無視する）。
【００５６】
「核酸配列同一性パーセント(%)」とは、開始配列（すなわち、対象とする配列）中の核酸残基と同一な、候補配列中の核酸残基のパーセンテージを意味する。
好ましい方法では、WU-BLAST-2の初期設定値のオーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションをそれぞれ1及び0.125としたBLASTNモジュールを用いる。
【００５７】
「ハイブリダイゼーション」とは、公知のように塩基のペアリングを通じて核酸のストランドが相補的なストランドと結合するプロセスを意味する。
【００５８】
２つの配列が中程度から高度にストリンジェントな条件下、及び洗浄条件下で特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列が参照配列に対し「選択的にハイブリダイズすることができる」と言う。
ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体、または核酸結合プローブの融点(Tm)に依存する。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Tm−5℃（プローブのTmより5℃低い温度）で生じ、「高ストリンジェンシー」はTmより約5℃から10℃低い温度で生じる。 「中ストリンジェンシー」はプローブのTmより約10℃から20℃低い温度で生じ、「低ストリンジェンシー」はプローブのTmより約20℃から25℃低い温度で生じる。
機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダーゼーションプローブに対し厳密に一致または準厳密に一致する配列を同定するために用いられる。中または低ストロンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、相同なポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いられる。
【００５９】
中及び高ストリンジェンシー条件はよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例は、約42℃、50%ホルムアミド、5X SSC、5Xデンハード溶液、0.5%SDS、100μg/mlで変性されたキャリアーDNA中でハイブリダイズを行い、その後、室温で2X SSC及び0.5%SDSを用いて2回洗浄し、さらに42℃で、0.1X SSC及び0.5%SDSを用いて2回洗浄することである。
中ストリンジェンシー条件の例は20％ホルムアミド、5 x SSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mM リン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハード溶液、10% 硫酸デキストラン、及び20mg/mlの変性されたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩ハイブリダイズを行い、その後37℃から50℃で1x SSCを用いてフィルターを洗浄することである。当業者であれば、温度、イオン強度等を適宜調整して、プローブ長さ等の因子を最適化することができる。
【００６０】
「組換え」とは、非相同の核酸の導入により修飾された細胞またはベクター、あるいはそのように修飾された細胞に由来する細胞を意味する。従って組換え細胞は、その細胞の天然形態（非組換体）の遺伝子とは異なる遺伝子を発現するか、あるいは人工的な技術により過剰に発現するか、十分発現しないか、または全く発現しない遺伝子を発現する。「組換え」、「組換え操作」、及び「組み換えられた」核酸は、2以上の核酸フラグメントの組合せであり、組合せによりキメラ遺伝子が生成する。
【００６１】
好ましい実施形態では、変異ＤＮＡ配列は、少なくとも1のコドンにおける部位飽和変異誘発を用いて生成される。別の好ましい実施形態では、部位変異誘発は2以上のコドンについて行われる。
また別の実施形態では、変異体DNA配列は野生型配列に対して、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、8０％以上、85％以上、90％以上、95％以上、または98％以上相同である。また別の実施形態では、変異体DNAは、例えば、放射線照射、ニトロソグアニジン等の既知の変異方法を用いてin vivoで生成される。その後所望のDNA配列を単離し、本明細書に開示する方法に用いる。
【００６２】
「標的配列」とは、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をエンコードする宿主細胞中のDNA配列を意味する。いくつかの実施態様において、標的配列は機能性の野生型遺伝子またはオペロンをエンコードし、一方、他の実施態様では、標的配列は機能性変異遺伝子またはオペロンまたは非機能性遺伝子またはオペロンをエンコードする。
【００６３】
「隣接配列」とは、対象とする配列の上流または下流にある配列をいう（例えば、遺伝子A-B-Cにおいて、遺伝子BはA及びC遺伝子配列に隣接している）。
好ましい実施態様では、入来配列は相同ボックスの両側に隣接する。他の実施態様において、入来配列及び相同ボックスが一つの単位となり、この単位の両側にスタファー配列が隣接する。
いくつかの実施態様において、隣接配列は一方の側（3’または5’）にのみ存在するが、好ましい実施態様において、配列の両側に隣接する。各相同ボックスの配列はバシラス染色体中の配列に相同である。これらの配列はバシラス染色体に新しい構築体が統合されること、及びバシラス染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。
好ましい実施態様において、選択マーカーの５’及び３’末端は不活性化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列の側面に位置する。いくつかの実施態様において、隣接配列は一方の側（3’または5’）にのみ存在するが、好ましい実施態様において、配列の両側の側面に位置する。いくつかの実施態様において、隣接配列は一方の側（3’または5’）にのみ存在するが、好ましい実施態様において、配列の両側の側面に位置する。
【００６４】
「スタファー配列」とは、相同ボックスに隣接する任意の追加のDNAをいう（通常ベクター配列）。しかし、この用語には非相同DNA配列も含まれる。理論により限定するものではないが、スタファー配列はDNA取込みを開始するために細胞に重要でない標的を提供する。
【００６５】
「増幅」及び「遺伝子増幅」とは、特定のDNAにより、増幅遺伝子が初期ゲノムに存在した数より多いコピー数で存在するように均衡を破って複製されるプロセスをいう。
いくつかの実施態様では、薬物存在下（例えば、阻害性酵素のインヒビター）での増殖による細胞の選択は、薬物存在下で増殖するために必要な遺伝子をエンコードする内因性遺伝子の増幅、またはこの遺伝子をエンコードする外因性（すなわち、入来）配列の増幅または両方をもたらす。
【００６６】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定のテンプレートに依存しない複製）と対比される。
テンプレート特異性は、複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ、またはデオキシリボ）特異性とは区別される。テンプレート特異性は「標的」特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００６７】
「共増幅」とは、その他の遺伝子配列がともに導入される増幅マーカーの１の細胞内への導入（すなわち、発現ベクター内に含まれる遺伝子のような1以上の非選択遺伝子を含む）及び細胞が増幅マーカーとその他の非選択遺伝子配列の両方を増幅するような適当な選択圧の増幅をいう。増幅マーカーは、その他の遺伝子配列に物理的に結合していてもよく、またはDNAが2つの別個の断片、すなわち一方が増幅マーカーを含み、及びもう一方が非選択マーカーを含む2つの断片として同じ細胞内に導入されてもよい。
【００６８】
「増幅マーカー」、「増幅遺伝子」及び「増幅ベクター」とは、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターを意味する。
【００６９】
「テンプレート特異性」は、ほとんどの増幅において酵素の選択により達成される。増幅酵素は、使用される条件下において、非相同核酸の混合物中の特定の核酸の配列のみを処理する酵素である。
例えばQβレプリカーゼの場合、MDV-1 RNAはレプリカーゼの特異テンプレートである（例えばKacian et al, Proc Natl Acad Sci USA 69:3038, 1972参照）。その他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。
同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターにストリンジェントな特異性を有する（Chamberlin et al, Nature 228:227, 1970参照）。
T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを結合せず、接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在する（Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989参照）。
最後に、Taq及びPfuポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため配列結合の高い特異性を示し、これによりプライマーにより確定される。高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには不利な熱力学的条件を生じる。
【００７０】
「増幅核酸」とは、任意の増幅方法により増幅され得る核酸をいう。「増幅核酸」には通常「サンプルテンプレート」が含まれる。
【００７１】
「サンプルテンプレート」とは、「標的」（下記に定義）の存在に関して分析されるサンプルから得られるる核酸を意味する。一方、「背景テンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。背景テンプレートはほとんどの場合、故意のものではない。それは前回のサンプルが残留した結果であり、あるいはサンプルから精製すべき核酸汚染物質が混入したものである。例えば、検出すべき微生物以外の生物由来の核酸が、試験サンプル内で背景として存在し得る。
【００７２】
「プライマー」とは、精製された制限消化などにおいて自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成されたオリゴヌクレオチドをいい、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が開始される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、適した温度及びpHにおかれた場合）、合成開始点として作用することができる。
プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする1本鎖であるが、2本鎖であってもよい。2本鎖の場合、そのプライマーを伸長生成物を生成させるために用いる前に、ストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
プライマーは誘発剤の存在下、伸長生成物の合成開始のため十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に左右される。
【００７３】
「プローブ」とは、精製された制限酵素消化などで自然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を意味し、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。プローブは1本鎖または2本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。
本発明で用るプローブは、例えば酵素（例えば、ELISA及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システム等の検出システムで検出できるように、「リポーター分子」で標識される。この発明は、特定の検出システムや標識に限定されるものではない。
【００７４】
「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合した核酸領域をいう。従って、「標的」はその他の核酸配列から探索されるものである。「セグメント」とは、標的配列内の核酸領域として定義される。
【００７５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）とは、本願に引用として組み込まれる米国特許4,683,195 4,683,202, 及び4,965,188に開示された方法を意味し、クローン化または精製することなくゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させる方法が含まれる。
標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含むDNA混合物に大過剰の2種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、DNAポリメラーゼの存在下、ヒートサイクルを正確な順序で行うことからなる。2種のプライマーは、2本鎖標的配列の各鎖に相補的である。
増幅を行うために混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内の相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させ、新しい相補鎖ペアを形成すさせる。
変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長工程は何回も繰り返すことができ（すなわち変性、アニーリング、及び伸長が1「サイクル」であり、多数の「サイクル」を繰り返し行うことができる）、所望の標的配列の増幅されたセグメントを高濃度で得ることができる。
所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いのプライマーの相対位置により決定さため、この長さは制御可能である。このプロセスは繰返し可能であることから、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「PCR」）と呼ばれる。所望の標的配列の増幅されたセグメントは、DNA混合物中で主要な配列（濃度に関して）となるので、「PCR増幅された」と呼ばれる。
【００７６】
「増幅試薬」とは、プライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチド3リン酸、バッファー等）。通常、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に仕込まれる。
【００７７】
PCRにより、ゲノムDNA中の特異標的配列の1のコピーを、いくつかの異なる方法で検出可能なレベルまで増幅することができる（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの導入とこれに続くアビジン−酵素結合検出；dCTPまたはdATPなどの32P-標識されたデオキシヌクレオチドトリホスフェートの増幅セグメントへの導入）。
ゲノムDNAに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を適当なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、PCRプロセスにより作成された増幅セグメントそれ自身が、その後継続するPCR増幅の効率的なテンプレートとなる。
【００７８】
「PCR生成物」、「PCR断片」及び「増幅生成物」とは、変性、アニーリング及び伸長サイクルを2回以上行ったPCR工程後の化合物の最終混合物をいう。これらの語には、1以上の標的配列の1以上の断片の増幅が行われた場合が含まれる。
【００７９】
「RT-PCR」とは、RNA配列の複製及び増幅をいう。この方法では逆転写とPCRとが組み合わされ、ほとんどの場合、本願に参照として組み込まれる米国特許5,322,770に開示されているように、熱安定性ポリメラーゼを用いる１の酵素手順が用いられる。RT-PCRでは、RNAテンプレートはポリメラーゼの逆転写酵素活性によりcDNAに転換され、次にポリメラーゼの重合活性を用いて増幅される（すなわち、他のPCR法と同様）。
【００８０】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」とは、細菌性酵素をいい、いずれも2本鎖DNAを特定ヌクレオチド配列において切断し、または特定ヌクレオチド配列の近傍で切断する。
【００８１】
「制限酵素認識部位」とは、所定の制限エンドヌクレアーゼにより認識及び切断されるヌクレオチド配列を意味し、DNAフラグメントの挿入部位であることが多い。本発明の特定の実施形態において、制限酵素認識部位は選択マーカー内及びDNA構築体の5’及び3’末端内に設計される。
【００８２】
「染色体への組み込み」とは、入来配列が宿主細胞の染色体に導入されるプロセスを意味する。形質転換DNAの相同領域が、染色体の相同領域に対しアライメントする。次に、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバー（すなわち相同組み換え）において入来配列によって置換される。いくつかの実施形態では、DNA構築体の不活性化染色体セグメントの相同セクションが、バシラス染色体の固有染色体領域の隣接相同領域に対しアライメントする。次に、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバー中のDNA構築体により切り取られる（すなわち相同組み換え）。
【００８３】
「相同組み換え」とは、2つのDNA分子または一対の染色体の間のDNAフラグメントを、同一の部位または略同一の核酸配列の部位において交換することを意味する。好ましい実施形態では、染色体取込は相同組み換えである。
「相同配列」とは、比較するために適切にアライメントさせたとき他の核酸またはポリペプチド配列に対し配列同一性を約100%,約99%,約98%,約97%,約96%,約95%,約94%,約93%,約92%,約91%,約90%,約88%,約85%,約80%,約75%,または約70%有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。
別の実施形態では、相同配列は約85%から約100%の配列同一性を有し、別の実施形態では約90%から約100%の配列同一性を有し、別の好ましい実施形態では約95%ら約100%の配列同一性を有する。
【００８４】
ここで用いる「アミノ酸」とは、ぺプチドまたはタンパク質配列またはそれらの一部をいう。「タンパク質」、「ぺプチド」及び「ポリぺプチド」の語は同義で用いられる。
【００８５】
タンパクまたはポリペプチドについて「非相同」というときは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、宿主細胞において天然では生じない得ない配列を有することを意味する。
非相同タンパク質の例として、プロテアーゼを含むヒドロラーゼ等の酵素が挙げられる。いくつかの実施形態ではタンパク質をコードする遺伝子は天然由来の遺伝子であり、別の実施形態では変異誘導または合成された遺伝子が用いられる。
【００８６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて「相同」というときは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、宿主細胞において天然に生じる配列を有することを意味する。
好ましい実施形態では細胞はグラム陽性細胞であり、より好ましい実施形態では細胞はバシラス宿主細胞である。別の実施形態では、相同タンパク質は、E. coli, ストレプトマイセス（Streptomyces）, トリコデルマ（Trichoderma）, 及びアスペルギルス（Aspergillus）等の他の有機体から産出された天然タンパク質である。この発明はには、組み換えDNA技術により相同タンパク質を産出する宿主細胞が含まれる。
【００８７】
「オペロン領域」には、共有プロモーターから単一の転写単位として転写され、それにより共調節される隣接遺伝子のグループが含まれる。いくつかの実施形態では、オペロンには調節遺伝子が含まれる。最も好ましい実施形態では、RNAレベルで測定して高度に発現するが、未知または不必要な機能を有するオペロンが用いられる。
【００８８】
「抗菌領域」とは、抗菌タンパク質をエンコードする少なくとも１の遺伝子を含む領域である。
【００８９】
ポリヌクレオチドは、天然の状態において又は当業者により既知の方法で操作されたとき、転写および／または翻訳されてRNA、ポリペプチド、又はそれらのフラグメントを生成する場合、RNA又はポリペプチドを「コードする」と言う。このような核酸のアンチセンスストランドも、この配列をコードすると言う。 
【００９０】
当業者に知られているように、DNAはRNAポリメラーゼにより転写され、RNAを生成する。しかし、RNAは逆転写酵素により逆転写されて、DNAを生成することもできる。従って、DNAはRNAをコードし、その逆も成立する。
【００９１】
「制御セグメント」または「制御配列」または「発現制御配列」とは、コードされたアミノ酸配列を発現させるポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードするDNAのポリヌクレオチド配列に対し、作動可能に結合したDNAのポリヌクレオチド配列を意味する。制御配列は、アミノ酸をコードし、作動可能に結合したポリヌクレオチドの発現を、禁止、抑制、または促進することができる。
【００９２】
「宿主株」または「宿主細胞」は、本発明のDNAを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。
【００９３】
酵素が細胞中において、対応する野生型細胞中よりも高いレベルで発現されるとき、酵素が宿主細胞中で「過剰発現された」と言う。
【００９４】
本願では「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義で用いる。本願では生化学の命名に関するIUPAC-IUB 共同委員会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))に従い定義されたアミノ酸を表す3文字のコードを用いる。遺伝子コードの縮重により、ポリペプチドは1以上のヌクレオチド配列でコードされ得る。
【００９５】
「プロ配列」はシグナル配列と、タンパクの分泌に必要とされる成熟タンパク質との間のアミノ酸配列である。このプロ配列が切断すると成熟活性タンパク質となる。
【００９６】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、タンパク質の成熟または前駆型の分泌に関与する核酸配列及び／またはアミノ酸配列の任意の配列である。このシグナル配列の定義は機能的なものであり、タンパク質の分泌に関与するタンパク質遺伝子のN末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。
一般的ではないが、これらはタンパク質のN末タンパク質または前駆体タンパク質のN末部分に結合することがある。シグナル配列は内因性でも、外因性でもよい。シグナル配列はタンパク質（例えば、プロテアーゼ）に関係するものでもよいし、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来のものでもよい。
シグナル配列の例として、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）（ATCC21536）由来スブチリシンのシグナル配列の残りに融合したバシラス・スブチリス（BACILLUS subtilis）のスブチリシン由来のシグナル配列の最初の7つのアミノ酸残基が挙げられる。
【００９７】
「ハイブリッドシグナル配列」とは、シグナル配列であって、その配列の一部が発現される遺伝子のシグナル配列に融合した発現宿主から得られたシグナル配列を意味する。いくつかの実施形態では、合成された配列が用いられる。
【００９８】
「成熟」の語は、タンパク質またはペプチドの最終的に機能を発揮する形態を意味する。例えば、本発明のNprEプロテアーゼの成熟形態には、少なくともSEQ IDNO:3のアミノ酸配列が含まれる。
【００９９】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」とは、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に結合したプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有する。この前駆体は翻訳後活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質またはポリペプチドの成熟形態から切り離されたポリペプチド）も有する。
【０１００】
「天然酵素」は自然に見られるのと同一の修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素を意味する。天然酵素には、自然発生酵素、特定の微生物中で自然発生的に発現される酵素、または見出される酵素が含まれる。
【０１０１】
「〜由来の」または「〜より得られた」とは、問題の有機体の株から生成されたプロテアーゼ、または生成可能なプロテアーゼだけでなく、そのような株から単離されたDNA配列、及びそのようなDNA配列を含む宿主有機体により生成されたプロテアーゼも含む意味で用いる。更にこの用語は、合成DNA及び／またはcDNAによりコードされるプロテアーゼも含まれ、このプロテアーゼは問題のプロテアーゼを同定するための性質を有する。
例えば、「バシラス種由来のプロテアーゼ」には、バシラス種から自然発生的に生成されたタンパク質分解活性を有する酵素が含まれる。また、バシラス種から同様してに生成された中性メタロプロテアーゼも含まれが、遺伝子工学技術を用いて中性メタロプロテアーゼをコードする核酸配列を有する形質転換された非バシラス・アミロリケファシエンス有機体から生成された中性メタロプロテアーゼは含まれない。
【０１０２】
「誘導体」は、誘導体が野生型、天然、また親同様の用途に使用可能であるという意味において、野生型、天然、または親において見られるタンパク質分解活性の性質を保持している。
中性メタロプロテアーゼの機能的な誘導体には、本発明の中性メタロプロテアーゼの一般的な性質を有する自然発生、合成、または組み換えにより生成されたポリペプチド、またはペプチドフラグメントが含まれる。
【０１０３】
「機能的な誘導体」とは、中性メタロプロテアーゼをコードする核酸の機能的な性質を有する核酸の誘導体を意味する。本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする核酸配列の機能的な誘導体は、天然発生、合成、または組み換え的に生成された核酸またはフラグメントを含み、本発明のセリンプロテアーゼ性質をコードする。本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする野生型核酸には、自然発生対立遺伝子及びこの分野で知られている遺伝子コードの退縮に基づく相同体が含まれる。
【０１０４】
2つの核酸配列またはポリヌクレオチド配列について「同一」というときは、以下説明する1つの配列比較または配列解析アルゴリズムを用いて測定した場合、最大対応となるようにアライメントしたときに2つの配列中の残基が同じであることを意味する。
【０１０５】
「最適アラインメント」とは、最も高い同一性のパーセンテージスコアを与えるアラインメントを意味する。
【０１０６】
2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び／または遺伝子配列に対して用いる「配列同一性」、「アミノ酸配列同一性パーセント」、「遺伝子配列同一性のパーセント」及び／または「核酸／ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセント」とは、配列を最適にアラインメントしたときの、2つの配列における同一な残基のパーセンテージを意味する。従って80%のアミノ酸配列同一性とは、最適にアラインメントされたポリヌクレオチド配列において80%のアミノ酸が同一であることを意味する。
【０１０７】
2つの核酸またはポリヌクレオチドについて「実質的に同一」であるというときは、標準的なパラメーターを用いたプログラムまたはアルゴリズム（例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTAL）で対象の配列と比較したときに、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも75%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、及び好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
2つのポリヌクレオチドが実質的に同一であることの確認は、第一ポリヌクレオチドが免疫学的に第二ポリペプチドに交差反応性があることで行うことができる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドが免疫学的に交差反応性がある。従って、2つのポリペプチドが保存置換によってのみ違う場合は、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一であると言う。2つの核酸配列が実質的に同一であることを確認する他の同定法は、2つの分子をストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることである（例えば、中程度から高度にストリンジェントな条件）。
【０１０８】
「単離された」または「精製された」とは、本来の環境（例えば、それが自然派生的なものであるならば自然環境）から切り離されている物質を意味する。
例えば、この物質が自然発生または野生型有機体と比較したときに低いまたは高い濃度で存在するか、または自然発生または野生型有機体から発現する上では通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製」されていると言う。例えば、生きている動物中にある自然派生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない。しかし自然システムにおいて共存している物質の幾つかまたは全てを分離した、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言う。幾つかの態様において、このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／または、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物一部であり、更にそのようなベクターまたは組成物において、単離されたものは自然環境の一部ではない。
好ましい実施形態では、核酸またはタンパク質は、電気泳動ゲルまたはブロットにおいて１つのバンドか検出された場合には、精製されていると言う。
【０１０９】
DNA配列について「単離された」というときは、本来の遺伝的環境から単離されているDNA配列を意味する。従って、単離されたDNA配列は他の入来または不要なコード配列を有しておらず、遺伝子工学によるタンパク質にの生成において有用である。
このような単離された分子は、それらの本来の環境から分離されており、cDNA及び／またはゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は通常関連している他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーターとしての自然発生5’末端及び3’を含む。
関係のある領域の同定法は、当業者に良く知られている（例えば、Dynan and Tijan， Nature 316:774-78 1985参照）。「単離されたDNA配列」を、「クローンされたＤＮＡ配列」と言うこともある。
【０１１０】
タンパク質について「単離された」というときは、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好適な態様において、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、DSD-PAGEにより、10%より、好ましくは20%より、更に好ましくは30%より高く精製されている。別の実施形態では、SDS-PAGEによってより高度に（すなわち、40%より高く、60%より高く、80%より高く、90%より高く、95%より高く、97%より高く、及び99%より高く）精製されたタンパク質が得られる。
【０１１１】
この発明の酵素変異体の構築には、以下のカセット突然変異誘発法を用いることができる。これ以外の方法を用いることも可能である。
第一に、タンパク質をコードしている自然発生遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。次に、コードされているタンパク質中に1以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作成するために適した場所をスキャンする。この場所に隣接している配列は、発現したときに各種変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて、遺伝子の短いセグメントを置換するための制限部位があるかどうかを評価する。このような制限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク遺伝子内の特徴的な部位である。
しかし、アミラーゼ遺伝子中にあまり多く存在しない任意の制限酵素認識部位を用いることもできる。制限酵素消化によって、生成する遺伝子セグメントを所望の配列中で再構築することもできる。もし、制限酵素認識部位が選択されたポイントから適切な距離（10から15ヌクレオチド）に存在しないときは、最終的な構築物中のリーディングフレーム、またはアミノ酸のいずれも変化させずに、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドを置換することによってそのような部位を生成することができる。
対象とする配列を確認するために、その配列を変化させるための遺伝子の変異は、既知の方法であるM13プライマーを伸長させることによって生じさせることができる。適切な隣接領域の位置決め、及び2の簡便な制限酵素認識部位配列で必要な変異を発現させるための評価の作業は、遺伝子コードの冗長性、遺伝子の制限酵素マップ、及び多くの異なる制限酵素を用いたルーチン作業で行うことができる。もし、簡便な制限隣接部位が使用可能であるならば、上記方法は、部位を含まない隣接領域の結合にのみ用いる。
【０１１２】
自然発生DNAまたは、合成DNAをクローン化した後、変異位置に隣接している制限酵素認識部位を同じ起源の制限酵素を用いて消化させ、エンド末端に相補的なオリゴヌクレオチドの複数のカセットを、遺伝子の中に結合させる。この方法によって変異誘発を簡素化することができる。これは、全てのオリゴヌクレオチドを同じ制限部位を有するように合成することができ、該制限部位をつくるための合成リンカーが必要ないためである。
【０１１３】
「対応する」とは、タンパク質またはペプチド配列中の数値で表された位置にある残基、またはこの残基と類似、相同、または均等な残基を意味する。
【０１１４】
「対応する領域」とは、関連するタンパク質または親タンパク質の配列上において類似する位置の範囲を意味する。
【０１１５】
「組合せ変異誘発」とは、初期配列の変異体のライブラリーを生成する方法を意味する。これらのライブラリーにおいて、変異体は変異体のあらかじめ決められたセットから選択される1つまたは幾つかの変異を含む。更にこの方法は、変異体の予め決められたメンバーではないランダム変異体を導入する手段を提供する。
いくつかの実施形態では、この方法には2000年10月26日に出願された米国特許出願番号09/699,250に記載された方法が含まれる。この文献を参照として本明細書に組み込む。別の実施形態では、組合せ変異誘発法には市販のキットが用いられる（例えば、QuikChange（商標）Multisite，Stratagene，San Diego，CA）。
【０１１６】
「変異体のライブラリー」とは、そのゲノムの大部分が同一であるが、1以上の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団を意味する。変異体のライブラリーは、例えば改善された性質を有する遺伝子またはオペロンの同定に用いることができる。
【０１１７】
「開始遺伝子」とは、本発明に用いる改善、または変更された所望のタンパク質をコードする所望の遺伝子を意味する。
【０１１８】
本明細書において、「複数配列アラインメント（MSA）」はアルゴリズム（例えば、Clustal W）を用いてアライメントさせた開始遺伝子の複数の相同体の配列を意味する。
【０１１９】
「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」とは、比較される特定のタンパク質または所望の配列の全ての変異体に対し元型となるアミノ酸配列を意味する。また、「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」はDNA配列中に最も多く存在するヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の各位置において、コンセンサス配列はMSA中のその位置において最も高頻度で出現するアミノ酸である。
【０１２０】
「コンセンサス変異体」とは、開始遺伝子の配列とコンセンサス配列との違いを意味する。コンセンサス変異体は、開始遺伝子の配列とMSAにより得られたコンセンサス配列を比較することにより特定される。
いくつかの実施形態では、コンセンサス変異体はコンセンサス配列により類似するように開始遺伝子に導入される。コンセンサス変異体には、開始遺伝子中のある位置に在るアミノ酸を、開始剤遺伝子におけるアミノ酸の頻度に対し、MSAでより高頻度に見出されるアミノ酸に変更するアミノ酸変異が含まれる。従って、コンセンサス変異体には、MSAにおけるアミノ酸よりも豊富に存在する1のアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、単一のアミノ酸変異が含まれる。
【０１２１】
本願では「修飾された配列」と「修飾された遺伝子」とは同義で用いられ、天然の核酸配列における欠失、挿入または中断を有する配列を意味する。
好ましい実施形態では、修飾された配列の発現生成物は切断タンパク質である（例えば修飾が配列の欠失または中断である場合）。いくつかの好ましい実施形態では、切断タンパク質が生化学的活性を保持している。
別の実施形態では、修飾された配列の発現生成物は伸長タンパク質である（例えば修飾が核酸配列への挿入である場合）。いくつかの実施形態では、挿入により切断タンパク質が生成する（例えば挿入により停止コドンが形成される場合）。すなわち、挿入により発現生成物として切断タンパク質または伸長タンパク質が得られる。
【０１２２】
本願では「変異体配列」及び「変異体遺伝子」は同義で用いられ、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも1つのコドンの変更を有する配列を意味する。変異配列の発現性生物は野生型に対して変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現性生物は変更された機能的な能力を有する（例えば、高められた酵素活性）。
【０１２３】
「変異プライマー」または「変異オリゴヌクレオチド」（本願では同義で用いる）とは、テンプレート配列の一部分に対応し、それらにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド組成物を意味する。変異体プライマーに関して、このプライマーは正確にテンプレート核酸に一致しない。プライマー中の1以上のミスマッチを、核酸ライブラリーに所望の変異を導入するために利用する。
「非変異プライマー」または「非変異オリゴヌクレオチド」とは、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物を意味する。本発明の幾つかの態様では、変異プライマーのみを用いる。
別の好ましい態様において、プライマーの少なくとも１つの領域に変異プライマーが含まれ、オリグヌクレオチド混合物中に非変異プライマーが含まれるように設計される。変異プライマーと、少なくとも1つの変異プライマーに対応する非変異プライマーとの混合物を添加することにより、様々な組合せ変異パターンが存在する核酸ライブラリーを構築することができる。
例えば、変異体核酸ライブラリーのいくつかの構成成分が、特定の部位において変異体の親配列を有し、他のメンバーがこの特定の部位に対応する部位で変異していることが望ましい場合、非変異プライマーは所与の残基について核酸ライブラリー内に特定のレベルの非変異の構成成分を生じさせることができる。
本発明の方法では、10から50塩基の間の長さ、好ましくは約15から4 5塩基の間の長さの変異体及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかし、所望の変異誘発を行うためには10塩基より短いか、あるいは50塩基より長いプライマーを用いることが必要な場合もある。
対応する変異及び非変異プライマーについては、対応するオリゴヌクレオチド同士の長さが同一である必要はないが、導入される変異に対応する領域において重なり合っていることが必要である。
【０１２４】
プライマーは、本発明により予め決められた比で添加される。例えば、得られたライブラリーが有意なレベルの特定の変異を有し、同じまたは別の部位においてより少ない量の別の変異を有することが望ましい場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望の偏ったライブラリーを生成することができる。あるいは、より少ないまたはより多い量の非変異プライマーの添加により。変異核酸ライブラリーにおいて対応する変異体が生成される頻度を調節することができる。
【０１２５】
本願では「野生型配列」または「野生型遺伝子」とは同義で用いられ、宿主細胞内に天然で存在する配列、または本来存在する配列を意味する。幾つかの実施形態において、この野生型配列はタンパク質工学プロジェクトの開始点である所望の配列である。この野生型配列は相同のまたは非相同のタンパク質のいずれかをコードする。相同タンパク質は、本発明を用いることなく宿主細胞が生成するものである。非相同タンパク質は、本発明によらなければ宿主細胞が生成することができないものである。
【０１２６】
本明細書で用いる「洗浄用組成物」には、特に断りのない限り、顆粒状または粉末状の汎用または強力洗濯剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル、またはペースト状の汎用洗濯用剤、特にいわゆる強力洗剤；液状のきめ細かい織物用洗剤；手洗い用皿洗い用洗剤または自動皿洗い機用洗剤、特に高泡立ちタイプの皿洗い用洗剤；家庭用及び業務用の種々の錠剤、顆粒、液体及びすすぎ補助タイプを含む自動皿洗い機用洗剤；抗菌性手洗いタイプ、洗浄用石鹸、うがい薬、入れ歯洗浄剤、車またはカーペット用シャンプー、フロ洗浄剤を含む液体洗浄剤及び殺菌剤；ヘアシャンプー、及びヘアリンス；シャワーゲル及び泡バス及び金属洗浄を含み、並びに漂白用添加剤及びステイン・スティック（stain stick）または前処理タイプ等の洗浄補助剤が含まれる。
【０１２７】
特に断りのない限り、本明細書に記載の成分または組成物のレベルはすべて、その成分または組成物の活性レベルに関して言うものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒または副生物を除いたものである。酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。全てのパーセント及び比率は、特に断りのない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成物に基づき計算される。
【０１２８】
「洗浄活性」とは、本発明のタンパク質分解、洗浄、または他のプロセスの条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄性能を意味する。幾つかの態様において、洗浄性能は、例えば、ガラス、血液、ミルク、またはタマゴのタンパク質等の酵素感受性のある汚れを評価する各種洗浄アッセイを用い、これらの汚れを標準的な洗浄条件に曝した後に、各種クロマトグラフ、分光光度計、または他の同様の方法を用いて評価される。例示的なアッセイは実施例に示す方法のほかに、WO99/34011、及び米国特許No.6,605,458（これらの文献を参照として本明細書に組み込む）に記載されているが、これらに限定されない。
【０１２９】
プロテアーゼの「洗浄に有効な量」とは、特定の洗浄組成物において望ましい酵素活性のレベルを達成するプロテアーゼの量を意味する。そのような有効量は当業者に容易に理解され、用いるプロテアーゼ、洗浄製品、洗浄組成物の特定の組成、及び液体または乾燥組成物（例えば、粉末、固形棒状）が必要とされているかどうかなどの多くの要因に依存する。
【０１３０】
「洗浄補助剤」とは、組成物に用いられるプロテアーゼ酵素と相性のよい物質であって、任意の液体、固形または気体物質を意味し、所望の洗浄組成物の特定のタイプ及び製品の形状（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、スプレー、タブレット、ゲル、または発泡組成物）に応じて選択される。幾つかの態様において、顆粒組成物は、「コンパクト」形態であり、他の態様において、液体組成物は「濃縮」形態である。
【０１３１】
低洗剤濃度系には、約800ppm以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する。日本の洗剤は通常、約667ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、低洗剤濃度系と考えられる。
【０１３２】
中洗剤濃度には、約800ppm〜約2000ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する。北米の洗剤は通常、約975ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、中洗剤濃度系と考えられる。ブラジルは約1500ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する。
【０１３３】
高洗剤濃度系には、約2000ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する。ヨーロッパの洗剤は通常、約3000〜8000ppmの洗剤成分を洗浄水中に含むので、高洗剤濃度系と考えられる。
【０１３４】
「布製品洗浄用組成物」とは、洗濯用添加剤組成物、及び汚れた布製品（例えば、衣類、繊維、及び他の布製品）を浸す及び／または前処理するのに用いるのに好適な組成物を含む、手洗いまたは機械洗いのための洗濯用組成物を意味する
【０１３５】
「非布製品洗浄用組成物」とは、布製品以外の表面を洗浄する組成物を意味し、食器洗浄用組成物、口腔洗浄用組成物、歯磨き用組成物、及びパーソナルケア組成物を含むがこれらに限定されない。
【０１３６】
本願における洗浄組成物の「コンパクト」形態は、密度がコンパクトであることを意味し、組成物の観点からは、無機充填塩の量に最も良く反映されている。無機充填塩は、粉末形態の洗浄用組成物用の公知の成分である。従来の洗浄組成物において、充填塩は組成物全体に対して、通常17から35%の量含まれている。対照的に、コンパクト組成物では、充填塩は15%を超えない量で存在する。幾つかの実施形態において、この充填塩は10%を超えない量で存在し、またはより好ましくは組成物の重量に対し5%である。いくつかの実施形態では、無機充填塩は硫酸または塩素のアルカリ及びアルカリ土類金属塩である。好適な無機充填塩は硫酸ナトリウムである。
【０１３７】
タンパク質（例えば酵素）について「内因性」というときは、そのタンパク質が宿主細胞の天然遺伝子から発現されたか、あるいは対象とする有機体から発現されたことを意味する。タンパク質（例えば酵素）について「非相同」というときは、そのタンパク質が宿主細胞または対象とする有機体に導入された外来遺伝子から発現されたことを意味する。
【０１３８】
本願で「セリンプロテアーゼが無い」、「セリンプロテアーゼが極めて少ない」、及び「実質的にセリンプロテアーゼが欠乏している」というときは、セリンプロテアーゼの量が微量または測定不能（例えば検出限界以下のタンパク質または活性）である組成物を意味する。
いくつかの実施形態では、組成物中のセリンプロテアーゼの量が0.050 U/ml未満、好ましくは0.025 U/ml未満、より好ましくは0.005 U/ml、最も好ましくは0.0025 U/ml未満（例えばAAPFアッセイで測定したとき）である。いくつかの実施形態では、組成物には中性メタロプロテアーゼが含まれる。
【０１３９】
「セリンプロテアーゼの無い環境下」というときは、微量または測定不能（例えば検出限界以下のタンパク質または活性）な量のセリンプロテアーゼを発現する有機体（例えばセリンプロテアーゼ産出欠失株）を用いて、対象とするタンパク質を産出させることを意味する。
いくつかの好ましい実施形態では、有機体を修飾して少なくとも1のセリンプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させるか、または有機体を変異させて、有機体がセリンプロテアーゼを産出できないようにする。
いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼ産出欠失株は、対応する野生型株（またはセリンプロテアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されていない親株）と比較して約1%未満、好ましくは約0.5%未満、より好ましくは0.1 %未満、最も好ましくは約0.05%未満のセリンプロテアーゼ活性を示す。
【０１４０】
＜発明の詳細な説明＞
中性メタロエンドペプチダーゼ（すなわち中性メタロプロテアーゼ）(EC 3.4.24.4)は、触媒活性に亜鉛イオンを必須とするプロテアーゼに分類される。この酵素はpHが中性のとき最大の活性を示し、サイズは30から40 kDaである。
中性メタロプロテアーゼには、タンパク質の構造の安定化に寄与する2から4個のカルシウムイオンが結合する。メタロプロテアーゼの活性部位に結合した金属イオンは、水分子を活性化させるために必須である。活性化された水分子は求核剤として機能し、ペプチド結合のカルボニル基を開裂させる。
【０１４１】
この発明により、セリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ない、少なくとも1の中性メタロプロテアーゼを含む組成物と、この組成物の製造方法が提供される。
いくつかの実施形態では、中性メタロプロテアーゼは、洗浄等の用途に用いられる。
いくつかの好ましい実施形態では、この発明により、種々のセリンプロテアーゼが欠失するように設計されたバシラス（Bacillus）株を含む組成物及びその方法と、このバシラス株を用いた遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼの産出方法が提供される。
【０１４２】
この発明では、NprEを発現させるための組み込みプラスミドを調製し、1以上の酵素遺伝子が欠失または不活性化されたバシラス宿主株中に形質転換した。次に、組み込みプラスミドを2-欠失宿主株中に形質転換して、EL534及びEL535（例えば実施例7）とした。
EL534の染色体DNAを5-欠失宿主株中（例えば実施例10）、及び8-欠失宿主株中（例えば実施例12）に形質転換した。
2-欠失、5-欠失、及び8-欠失宿主株をそれぞれ培養タンクで発酵させ、セリンプロテアーゼ混入物の残留を評価した。
この3種の宿主株の発酵から得られたサンプルを用い、宿主細胞上清の、サイズが20-30kDa及び100kDaのタンパク質バンドについて、SDS-PAGEゲル、AAPFアッセイ、及びN-末端シークエンシングによる分析を行った。これにより、内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素(Vpr)が認められ、セリンプロテアーゼが混入していると推定された。
EL534株の染色体DNAを、3-欠失、4-欠失、及び6-欠失宿主株中に形質転換した。3-欠失株(EL552)、4-欠失株(EL553)、及び6-欠失株(EL547)のサンプルの分析結果から、EL547はセリンプロテアーゼ酵素の混入が極めて少ないことが示された。
以上から、この発明の好ましい実施形態では、遺伝子組み換え中性メタロプロテアーゼの産出に6-欠失株及び8-欠失株が用いられる。
【０１４３】
＜本発明の洗浄及び洗剤製剤の詳細な説明＞
特に断りのない限り、本明細書に記載の成分または組成物のレベルはすべて、その成分または組成物の活性レベルに関して言うものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒または副生物を除いたものである。
酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。
全てのパーセント及び比率は、特に断りのない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成物に基づき計算される。
【０１４４】
例示した洗剤組成物においては、酵素レベルは全組成物の重量に基づく純粋な酵素により表わし、特に断りのない限り、洗剤成分の量は全組成物の重量により表わす。
【０１４５】
＜中性メタロプロテアーゼを含む洗剤組成物＞
本発明の中性メタロプロテアーゼは種々の洗剤組成物の配合処方において有用である。本発明の洗浄組成物は、例えば、義歯、歯、髪及び皮膚のような美容用途のみならず、洗濯用、硬質表面の洗浄、自動皿洗い機用に有利に用いることができる。しかし、低温溶液中において効果が増大するという特徴を備え、また優れた退色防止性を有するので、本発明の酵素は織物の漂白のような洗濯用途に適している。さらに本発明の酵素は、顆粒及び液状組成物の両者に使用することができる。
【０１４６】
本発明の酵素はまた、洗浄添加剤製品として使用することができる。本発明の少なくとも一つの酵素を含む洗浄添加剤製品は、漂白効果を得たい場合に、洗浄プロセスに添加することができる。この様な場合の例は低温での洗浄であるが、これに限定されるものではない。
添加剤製品は、本発明により提供される一以上の中性メタロプロテアーゼ酵素であっても良い。いくつかの実施形態では、過酸化物の漂白剤が用いられ、さらに大きな漂白効果を得たい場合、本発明の添加剤を洗浄プロセスに添加することができる。
いくつかの実施形態では、添加は、丸薬、錠剤、ゲルキャップまたは予め計量された粉末および／または液体等の形態で行うことができる。いくつかの実施形態では、洗剤組成物の容量を増すために充填剤および／またはキャリア材料を添加する。好適な充填剤またはキャリア材料には、タルク、クレイ等のみならず種々の硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、液状洗剤組成物用の充填剤及び/またはキャリア材料には、水、および／またはポリオール及びジオールを含む低分子量第一級および／または第二級アルコールが含まれる。このようなアルコールの例には、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組成物にはこの様な材料が約5%から約90%含まれる。別の実施形態では、組成物のpHを低下させるために酸性充填剤が使用される。また別の実施形態では、洗浄用添加剤には、以下に述べる少なくとも一つの活性過酸化物および／または詳細を以下に述べる補助成分が含まれる。
【０１４７】
本発明の洗浄組成物及び洗浄添加剤は、効果的な量の本発明で提供される中性メタロプロテアーゼ酵素を必要とする。いくつかの実施形態では、酵素の必要レベルは、本発明により提供される一以上の中性メタロプロテアーゼの添加により達成される。典型的には、本発明の洗浄組成物には、本発明の中性メタロプロテアーゼの少なくとも1種が、少なくとも0.0001 重量%, 約0.0001 から約1, 約0.001 から約0.5, または約0.01から約0.1重量%含まれる。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明の洗浄組成物は水を使用する洗浄において、洗浄水のpHが約5.0から約11.5になるように、別の実施形態ではpHが約6.0 から約0.5となるように処方される。
別の好ましい実施形態では、液状洗剤製品処方では、原液のpHが約 3.0から約9.0であり、別の実施形態では原液のpHが約3から約5である。ある好ましい実施の態様においては、顆粒状の洗剤用製品は、pHが約8から約11と成るように処方される。pHを推奨される使用レベルに制御する方法には、緩衝液、アルカリ、酸等を用いることが含まれ、これらの方法は当業者に周知である。
【０１４９】
特に好ましい実施形態では、少なくとも1の中性メタロプロテアーゼが顆粒状組成物または液状で使用される場合、保存中に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するために、中性メタロプロテアーゼをカプセルに収めた粒子の形態とする。さらに、カプセルに収めることは、洗浄するときにのみ中性メタロプロテアーゼが機能するように制御する手段となり、中性メタロプロテアーゼの効果を高めることになる。本発明のカプセルに収められた中性メタロプロテアーゼは種々の場面で用いることができる。また、中性メタロプロテアーゼは既知の任意の好適なカプセル化材料及びカプセル化方法を用いてカプセル化することができる。
【０１５０】
好ましい実施形態では、カプセル化材料を用いて、中性メタロプロテアーゼ触媒の少なくとも一部をカプセル化する。ある実施形態では、カプセル化材料は水溶性および／または水中に分散性である。また別の実施形態では、カプセル化材料は0℃以上のガラス転移温度（Tg）を有する（ガラス転移温度についての詳細な情報はWO 97/11151, 特に6ページ, 25 行から7ページ、2行までを参照）。
【０１５１】
ある実施形態では、カプセル化材料は炭水化物、天然または合成ゴム糊、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。カプセル化材料が炭水化物である実施形態では、炭水化物は単糖類、オリゴ糖、多糖類及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。ある好ましい実施形態では、カプセル化材料は澱粉である（好ましい澱粉については、例えばEP 0 922 499; 米国特許第4,977,252号、米国特許第5,354,559号, 及び米国特許第5,935,826号を参照）。
【０１５２】
別の実施形態では、カプセル化材料はプラスチックからなるミクロスフェアから成る（例えば、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物；市販の利用可能なミクロスフェアには、EXPANCEL（登録商標）[Casco Products, Stockholm, Sweden], PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES（登録商標）, 及びQ-CEL（登録商標） [PQ Corp., Valley Forge, PA], LUXSIL （登録商標）及び SPHERICELl（登録商標） [Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ 及びValley Forge, PA]）が含まれるが、これらに限定されない）。
【０１５３】
＜この発明の洗浄用組成物を生成及び使用するプロセス＞
好ましい実施形態では、本発明の洗浄用組成物は、製造者によって選択される任意のプロセスによって任意の適切な形態に処方される（例えば、米国特許第 5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第 5,574,005号、米国特許第 5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第. 5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第 5,486,303号が参照されるが、これらに限定されない）。低pＨ洗浄用組成物が望まれる実施形態では、洗浄用組成物のpHはHClのような酸性物質を添加することにより調整される。
【０１５４】
＜補助材料＞
本発明にとって必須ではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に非限定的に例示する補助材料を本発明の洗浄用組成物に用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明の洗浄用組成物に補助材料が添加される。
いくつかの実施形態では、補助材料は洗浄を助け、および／またはその機能を向上させ、洗浄される物体を処理し、および／または洗浄用組成物の美観を整える（例えば、香水、顔料、染料等）。
補助剤は本発明の中性メタロプロテアーゼに追加して添加される。これらの添加成分の性質及び添加量は、組成物の物理的形態、および／または添加成分が用いられる洗浄作業の性質による。
好ましい補助材料の非限定的例示として、界面活性剤、ビルダー、キレート材、染料移動抑制剤、堆積助剤、分散剤、追加酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白推進剤、過酸化水素、過酸化水素のソース、事前生成過酸、ポリマー系分散剤、粘土質土壌/再堆積防止剤、光沢剤、泡抑制剤、染料、香水、構造弾力付与剤、織物柔軟剤、キャリアー、可水溶剤（hydrotrope）、プロセス補助剤及び/または色素が挙げられる。
本明細書に明記した補助材料の他、さらなる補助材料が当業者に知られている（例えば、米国特許第5,576,282号, 米国特許第6,306,812号Bl 及び米国特許第6,326,348号Blを参照）。
いくつかの実施形態では、補助材料は本発明の洗浄組成物の一部を構成する。
【０１５５】
＜界面活性剤＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗浄組成物には少なくとも一つの界面活性剤または界面活性剤システムが含まれ、界面活性剤はノンイオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性ノンイオン性活性剤、及びこれらの混合物から選択される。
低pＨ洗浄組成物（例えば、pHが約3から約5の組成物）の実施形態では、洗浄組成物にはアルキルエトキシ硫酸塩が含まれていない。これは、アルキルエトキシ硫酸塩等の界面活性剤は、組成物中の酸性物質により加水分解されると考えられているためである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄組成物の重量に基づき約0.1％から約60％存在し、別の実施形態では約1％から約50％存在し、さらに別の実施形態では約5％から約40％存在する。
【０１５７】
＜ビルダー＞
いくつかの実施形態では、、本発明の洗剤組成物は一以上の洗浄ビルダーまたはビルダー系を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1種のビルダーが使用され、洗剤組成物には、洗剤組成物の全重量に対し、少なくとも約1％、約3% から約60%または約5%から約40%のビルダーが含まれる。
【０１５８】
ビルダーには、アルカリ金属、アンモニウム及びポリリン酸のアルカノールアンモニア塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸ビルダー、ポリカルボン酸化合物、ヒドロオキシポリカルボン酸塩エーテル、エチレンまたはビニルメチルエーテルを持つ無水マレイン酸のコポリマー、1, 3, 5-トリヒドロキシベンゼン-2, 4, 6-トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、及び種々のアルカリ金属、アンモニアエチレンジアミン テトラ酢酸及びニトリロトリ酢酸の様なポリ酢酸、アンモニア置換塩、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン1,3,5-トリカルボン酸及びカルボキシメチルオキシコハク酸及びそれらの可溶性塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
＜キレート剤＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物には少なくとも一つのキレート剤が含まれる。好適なキレート剤には銅、鉄及び/またはマンガンキレート剤及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1のキレート剤が使用される場合、洗剤組成物にはその洗剤組成物の重量に対し約0.1から約15％または約3.0から約10％のキレート剤が含まれる。
【０１６０】
＜沈殿助剤＞
いくつかの実施形態では、、本発明の洗剤組成物には沈殿助剤が含まれる。好適な沈殿助剤には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸、ポリテレフタル酸の様な防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリナイト、アタプルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物等のクレイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
＜染料移行防止剤＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物には1以上の染料移行防止剤が含まれる。好適な高分子性の染料移行防止剤には、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリ−ビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
洗剤組成物に少なくとも1の染料移行防止剤が含まれる実施形態の場合、染料移行防止剤は洗剤組成物の重量に対し約0.0001から約10％、約0.01から約5％、または約0.1から約3％含まれる。
【０１６３】
＜分散剤＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物には少なくとも1の分散剤が含まれる。好適な水溶性有機材料には、単独重合体酸または共重合体酸またはその塩が含まれる、この場合、ポリカルボン酸には、炭素原子同士が2以上離れていない少なくとも2つのカルボキシル基が含まれる。
【０１６４】
＜酵素＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物にはさらに、洗浄能力及び/または衣類の柔軟剤の効果を有する他の酵素が含まれる。好ましい酵素の例には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、マンナナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、マラナーゼ、β―グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、エンドグリコシダーゼ及びアミラーゼまたはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、従来から使用されている酵素の組み合わせ、例えば、プロテーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び/またはセルラーゼと、アミラーゼとの組合せ等のように、組合わされた酵素（すなわち「カクテル」）が使用される。
【０１６５】
＜酵素安定剤＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物に用いる酵素を安定化させる。酵素を安定化させるための種々の技術を用いることができる。例えば、ある実施形態では、洗剤組成物中に水溶性の亜鉛(II)，カルシウム(II)及び/またはマグネシウム(II)イオン、及び/他の金属イオン（例えば、バリウム(II)，スカンジウム(II)，鉄(II)，マグネシウム(II)，アルミニウム(III)，スズ(II)，コバルト(II)，銅(II)、ニッケル(II)，及びオキソバナジウム(IV)）を供給する物質を添加することにより、本発明で用いる酵素を安定化させる。
【０１６６】
＜触媒金属複合体＞
いくつかの実施形態では、本発明の洗浄組成物には一以上の触媒金属複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が用いられる。
好ましい実施形態では、金属含有漂白触媒には所定の漂白触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンカチオン）、漂白触媒活性をほとんどまたは全く持たない補助的金属カチオン（例えば、亜鉛、アルミニウムカチオン）、及び触媒及び補助的金属カチオンの所定の安定係数を持つセクエストレート（sequestrate）を含む触媒システムを含む。特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びそれらの可水溶塩が用いられる（例えば、米国特許第4,430,243号を参照）。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明の洗浄組成物はマンガン化合物により触媒される。このマンガン化合物及び使用量は公知である（例えば、米国特許第5,576,282号を参照）。
【０１６８】
別の実施形態では、コバルト漂白触媒を本発明の洗浄組成物に用いることができる。種々のコバルト漂白触媒が知られている（例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照)。このようなコバルト触媒は、既知の方法で容易に製造することができる（例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照）。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明の洗浄組成物には、マクロ多還式剛直リガンド（MRL）の遷移金属複合体が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び洗浄プロセスに、水性洗濯媒体中において活性MRLが少なくとも1ppmオーダーで含有されるように調整され、ある好ましい実施の態様においては、洗濯液中で約0.005 ppmから約25ppm、より好ましくは約0.05 ppmから約10ppm、最も好ましくは約0.1ppmから約5ppmのMRLが含有されるが、これらに限定されない。
【０１７０】
遷移金属漂白触媒中の好ましい遷移金属はマンガン、鉄、及びクロム等であるが、これらに限定されない。また好ましいMRLには、架橋を有する特別な剛直リガンド(例えば、5,12-ジエチル-l,5,8,12-テトラアザビシクロ [6.6.2]ヘキサデカン)が含まれるが、これに限定されない。好ましい遷移金属MRLは公知の方法で容易に製造することができる（例えば、WO 00/32601, 及び米国特許第6,225,464号を参照)。
【０１７１】
＜洗浄組成物の製造及び使用プロセス＞
本発明の洗浄組成物は製剤者により選択される任意のプロセスにより、任意の好ましい形態に処方され、製造される（例えば、米国特許第5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第5,574,005号、米国特許第5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第5,486,303号、米国特許第4,515,705号、米国特許第4,537,706号、米国特許第4,515,707号、米国特許第4,550,862号、米国特許第4,561,998号、米国特許第4,597,898号、米国特許第4,968,451号、米国特許第5,565,145号、米国特許第5,929,022号、米国特許第6,294,514号、及び米国特許第6,376,445,を参照。これらの引用文献は参照として本願に組み入れられる）。
【０１７２】
＜使用方法＞
好ましい実施形態において、本発明の洗浄組成物は表面および／または織物の洗浄に使用できる。いくつかの実施形態では、表面および／または織物の少なくとも一部に、本発明の少なくとも1の実施形態に示す洗浄組成物を原液または水で希釈して接触させ、そして表面および／または織物が任意に洗濯されおよび／またはすすぎ洗いされる。本発明では、「洗濯」には、手洗いと機械的攪拌が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、織物には、通常の消費者の使用条件で洗濯することのできる織物が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の洗浄組成物は溶液中で約500ppmから約1500ppmの濃度で使用される。洗濯液が水の実施形態では、水の温度は通常約5℃から約90℃である。好ましい実施形態では、水と織物の質量比は通常約1：1から約30：1である。
【実施例】
【０１７３】
本発明の好ましい実施形態と本発明の側面について、以下の実施例に基づき説明する。本発明は以下の実施例に限定されない。
【０１７４】
以下の実施例において使用する略語を列挙する；℃（摂氏）； rpm（１分間当たりの回転数）；H2O（水）；HCl（塩酸）；aa及びAA（アミノ酸）；bp（ベースペア）；kb（キロ・ベースペア）；kD（キロダルトン）；gm（グラム）；μg及びug（マイクログラム）；mg（ミリグラム）；ng（ナノグラム）；μl及びul（マイクロリットル）；ml（ミリリットル）；mm（ミリメートル）；nm（ナノメートル）； μm及びum（マイクロメートル）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM及びｕM（マイクロモル）；U（単位）； V（ボルト）；MW（分子量）；sec（秒）；min（分）；hr（時間）；MgCl2（塩化マグネシウム）；NaCl（塩化ナトリウム）；OD280（280nmにおける光学密度）；OD（光学密度）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；EtOH（エタノール）；PBS（リン酸緩衝生理食塩水［150mM NaCl, 10mMリン酸ナトリウム緩衝液, pH7.2］）；LAS（ラウリルスルホン酸ナトリウム）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；TAED（N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン）；BES（ポリエステルスルホン）；MES（2-モルフォリノエタンスルホン酸、一水和物; f.w. 195.24; Sigma # M-3671）；CaCl2（塩化カルシウム、無水物; f.w. 110.99; Sigma # C-4901）；DMF （N,N-ジメチルホルムアミド, f.w. 73.09, d = 0.95）；Abz‐AGLA‐Nba（2‐アミノベンジル-L-アラニル-グリシル-L-ロイシル-L-アラニノ‐4‐ニトロベンジルアミド, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR カタログ# 100040-598）；SBG 1%（"Super Broth with Glucose"; 6 g Soytone [Difco], 3g イースト抽出物, 6 g NaCl, 6gグルコース）；無菌化する前に公知の方法でNaOHを用いてpHを7.1に調整した。；w/v（重量対容量）；v/v（容量対容量）； Npr及びnpr（中性メタロプロテアーゼ）；
SEQUESTTM（SEQUESTデータベースサーチプログラム, University of Washington）；Npr及びnpr（中性メタロプロテアーゼ）；NprＥ及びnprE（バシラス・アミロリケファシエンス中性メタロプロテアーゼ）；PMN (精製MULTIFECTTM メタロプロテアーゼ）；MS（マススペクトトロコピー）；及びSRI（汚染除去指数）。
【０１７５】
実施例において言及した商品またはサービスの提供元の会社の略号を以下に示す。
TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists); Amersham (Amersham Life Science, Inc. 社Arlington Heights, IL); Corning (Corning International社, Corning, NY); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc. 社, Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology社, Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc. 社, Flintshire, UK); EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc. 社Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware社, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer社, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument社, LLC, Woburn, MA); Eppendorf (Eppendorf AG社, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc. 社, Milford, MA); Geneart (Geneart GmbH社, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems社, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes社, Eugene, OR); BioRad (BioRad社, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories社, Palo Alto, CA); Cargill (Cargill, Inc. 社, Minneapolis, MN); Difco (Difco Laboratories社, Detroit, MI); GIBCO BRL or Gibco BRL (Life Technologies, Inc. 社, Gaithersburg, MD); New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc. 社, Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp. 社, Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH社, Offenburg, Germany) ;Greiner (Greiner Bio-One社, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc. 社, Madison, WI); Novex (Novex社, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY社, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co. 社, St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation社; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research社, Waltham, MA); Infors (Infors AG社, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems社, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc. 社, Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies社, Palo Alto, CA); S-Matrix (S-Matrix Corp. 社, Eureka, CA); US Testing (United States Testing Co. 社, Hoboken, NY); West Coast Analytical Services (West Coast Analytical Services, Inc. 社, Santa Fe Springs, CA); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory社, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG社, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc. 社, Sunnyvale, CA); Corning (Corning International社, Corning, NY); MicroCal (Microcal, Inc. 社, Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp. 社, Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Argo Bioanalytica (Argo Bioanalytica. Inc社, New Jersey); Vydac (Grace Vydac, Hesperia, CA); Minolta (Konica Minolta社, Ramsey, NJ); and Zeiss (Carl Zeiss, Inc. 社, Thornwood, NY).
【実施例１】
【０１７６】
＜アッセイ及び洗剤＞
以下の実施例、または遺伝子組み換えプロテアーゼのその他の分析では、以下の評価方法を用いた。
以下の実施例では、反応が完了した後に反応生成物の吸光度をスペクトロメーターを用いて測定した。材料見本の反射率は、反射率計で測定した。
【０１７７】
＜A．タンパク質含有量の測定＞
＜1. 96ウエルマイクロタイタープレート(MTP)でのBCA（ビシンコニン酸）アッセイによるタンパク質含有量の測定＞
このアッセイでは、BCA (Pierce)アッセイを用いて、MTPスケールのプロテアーゼサンプルについてタンパク質含有量を測定した。このアッセイで使用した試薬類は；BCAプロテインアッセイ用試薬、及び Pierce 希釈緩衝液(50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl2, 0.005% TWEENTM-80)であった。使用した測定装置は、SpectraMAX (タイプ 340) MTP計測器であった。MTPはCostar (type 9017)を用いた。
【０１７８】
試験では、200μlのBCA試薬を各ウエルにピペットで注入し、次に希釈されたタンパク質20 μlを各ウエルに注入した。十分に撹拌した後、MTPを37℃で30分間培養した。気泡を除去した後、各ウエル内の溶液の562 nmにおける光学密度(OD)を測定した。タンパク質濃度の測定に当り、各サンプルの測定値からバックグラウンドの測定値を差し引いた。OD562を標準タンパク質（精製プロテアーゼ）に対しプロットして検量線を作成した。各サンプルの濃度は、この検量線から求めた。
【０１７９】
＜2．96ウエルマイクロタイタープレート(MTP)でのBradfordアッセイによるタンパク質含有決定＞
これらのアッセイでは、MTPスケール上でBradford染色試薬（Quick Start）アッセイにより、プロテアーゼサンプル中のタンパク質濃度を決定した。
このアッセイシステムで使用した化学試薬及び溶液は：
Quick Start Bradford 染料試薬 (BIO-RAD カタログNo. 500-0205) 
希釈緩衝液 (10mM NaCl, 0.1mM CaC12, 0.005% TWEETM-80)
であった。
使用した機器はBiomek FX Robot (Beckman) 及びSpectraMAX (type 340) MTP 計測器であり、MTPはCostar製(type 9017)であった。
【０１８０】
テストでは、200μlのBradford 染色試薬を各ウエルにピペットで入れ、続いて15μlの希釈緩衝液を加えた。最後に、ろ過した培養ブロス10μlをウエルに加えた。十分攪拌した後、MTPを室温で少なくとも10分培養した。発生する空気の泡を吹き払い、各ウエルのODを595nｍで測定した。
タンパク質濃度を決定するため、このサンプルの計測値からバックグラウンドの計測値（すなわち、予防接種されていないウエルの計測値）を差し引いた。得られたOD595値は、サンプル中のタンパク質含有量の相対的測定値を示す。
【０１８１】
＜プロテアーゼ・アッセイ＞
1）アゾ−カゼイン・アッセイ
アゾ−カゼイン・エンドポイント・アッセイ用いて、特定の条件下で生じるタンパク質分解量を評価した。このアッセイでは、75μLの酵素を、過剰のカルシウムまたは亜鉛またはその両方のイオンが加えられた250 μl の1 % (w/v) アゾーカゼイン(Sigma)により培養した。反応は30℃で15分行い、その後反応を停止させるために10 % (w/v)トリクロロ酢酸を加えた。沈殿したタンパク質及び未反応アゾ−カゼインを、14000 rpmで10分間遠心分離することにより除去した。アゾ基の色は、750μLの1M水酸化ナトリウムを加えることで発色させた。5分間かけて発色させ、その後反応を停止させ440 nmで吸光度を測定した。
【０１８２】
2)コハク酸化−カゼイン及びTNBSAアッセイ
中性金属プロテアーゼ(NprE)の活性を、QuantiCleave Protease Assay KitTM(Pierce社)を用いて評価した。このアッセイは、酵素によるコハク酸化−カゼインの消化に基づく。次に、生成した第１級アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBSA）と反応させ、450nmで最大吸光度をもつ着色複合体を生成させた。このアッセイは96ウエルマイクロタイター形式で実施される。このアッセイでは、コハク酸化−カゼインで15分培養し、そしてTNBSAと15分間反応させることが必要である。いずれの培養中でも、サンプルを振とう器に取り付けた。TPCK-トリプシン (Pierce社)を、プロテアーゼの全体の活性を決定するための通常の標準として使用した。
しかし、特異的プロテアーゼの活性の最適条件化には、対象とするプロテアーゼを使用する必要がある。これらの実験で実施したアッセイでは、アッセイを較正するために、トリプシンと対象とするプロテアーゼの両方を用いた。アッセイを精確に行うためには、0.5 mg/mLトリプシンから調製される標準希釈液の吸光度（450 nmにおける）が、常に0.5未満であることが必要である。
【０１８３】
各サンプルを、カゼインを含まないコントロールと対比して測定した。測定された吸光度 (ΔAbs(450nm))の変化は、カゼインのアミノ基の影響によるものである。
さらに、緩衝液中の第１級アミノ基、および／または、洗剤の他の成分中の第１級アミノ基による生じうる全ての影響も、この方法によって較正した。すべてのサンプルの活性を、中性金属プロテアーゼを加えていない洗剤との比較において測定し、またキットに含まれるBupHTMホウ酸塩緩衝液中で培養した酵素についても、同じ時間及び同じ温度において活性を測定した。
【０１８４】
この試験はエンドポイント アッセイであり、pH 8.5のホウ酸塩緩衝液50 mMを32℃の温度で使用した。プロテアーゼ・アッセイは２回行った。安定性評価のほとんどの実験では、タンパク質及び洗剤を上記の緩衝液で1:1000に希釈した。しかしいくつかの実験では、ブランクの吸光度が0.5未満の場合には、測定値を得るために1:500 または1: 200の希釈度を用いた。これらの実験で用いたマイクロリッター分光光度計はSpectraMax250TM(Molecular Devices社)であり、すべてのアッセイは中程度タンパク質結合性96ウエルプレート(Corning)で実施した。
【０１８５】
これらのアッセイで得られた標準タンパク質サンプル（例えば、トリプシン及び精製メタロプロテアーゼ）の結果は、非線形応答（線形目盛は狭いアッセイの範囲でのみ有効であろう）であることを示していた。そこで、近似曲線に二次関数f = yo+ax2 +bxを用い、ｆをｙに適合させた(SigmaPlot TM v. 9; SPSS, Inc.)。すなわち、仮に一次関数をタンパク質の定量に用いた場合は、不正確なデータが得られると考えられ、正確な結果を得るためには二次関数が必要となることが判明した。なお、製造者(Pierce社)の取扱説明書には、評価結果はlogスケールで「x」についてフィッティングすることが記載されている。
【０１８６】
＜３；ジメチルカゼイン(DMC)加水分解評価＞
このアッセイでは、下記の薬品及び試薬を使用した。
【表２】
2011504097.tif 000005
【０１８７】
＜方法＞
4gのDMCを400mlのPIPES緩衝液に溶解させて、基質を調製した。濾過した培養液上清をPIPES緩衝液で希釈した。次に、各上清の希釈液10μlを、MTPの各ウエル中にある200μlの基質に添加した。MTPをテープで覆い、数秒間振とうし、次にオーブンに入れて25℃で30分間、撹拌せずに加熱した。
オーブンから最初のプレートを取り出す約15分前に、1mlのTNBS溶液と50mlの試薬Aとを混合してTNBS試薬を調製した。MTPの各ウエルを60μlのTNBS試薬Aで満たした。
インキュベートしたプレートを数秒間振とうし、その後10μlをTNBS試薬Aが入れられた MTPに移した。
プレートをテープで覆い、ベンチシェーカー(BMG Thermostar)を用いて、室温において500rpmで20分間振とうした。最後に、各ウエルに200μlの試薬Bを添加し、シェーカーで1分間混合し、MTP計測器を用いて405nmの吸光度を測定した。
【０１８８】
得られた吸光度の測定値を、ブランクの値（すなわち、酵素を入れていない基質）で補正した。得られた吸光度は、加水分解活性の測定値となる。サンプルの（酵素）比活性度は、吸光度をタンパク質濃度測定値で割り算して求めた。
【０１８９】
＜４：2-アミノベンゾイル-L-アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4ニトロベンジルアミド  アッセイ(Abz-AGLA-Nba)＞  
下記の方法は、時と場所によらず再現性のあるプロテアーゼアッセイが行えるように、技術的詳細を開示するものである。このアッセイを所与の実験室の条件に適合させることはできるが、修正された方法で得られたデータは、オリジナルの方法で得られる結果との比較調整を行う必要がある。
天然メタロプロテアーゼは、2-アミノベンゾイル-L-アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド(Abz-AGLA-Nba)のグリシンとロイシンの間のペプチド結合を開裂させる。
溶液中の遊離2-アミノベンゾイル-L-アラニルグリシン(Abz- AG)は、最大蛍光発光波長が415nmにあり、最大励起光波長が340nm にある。Abz-AGの蛍光は、無傷のAbz-AGLA-Nba分子中のニトロベンジルアミドにより消光される。
【０１９０】
以下の実験では、Abz-AGLA-Nbaからプロテアーゼによる開裂で放出されたAbz-AGを蛍光スペクトル(励起 340 / 発光415)で測定した。Abz-AGの生成速度から、タンパク質分解活性を評価した。アッセイは、非基質制限初期速度（non-substrate limited initial rate）条件下で行った。
【０１９１】
再現性のある評価結果を得るためには、温度制御可能なマイクロプレートミキサー(例えばEppendorf Thermo mixer)が必要であった。酵素を添加する前に、マイクロプレートミキサー中でアッセイ用溶液を所望の温度（例えば25℃）でインキュベートした。酵素溶液をミキサー中のマイクロプレートに添加し、激しく撹拌し、直ちにプレート計測器へ移した。
【０１９２】
連続データ読み込み、直線回帰分析、及び温度制御が可能な蛍光分光光度計が必要であった(例えばSpectraMax M5, Gemini EM, Molecular Devices)。プレート計測器を常に所望の温度（例えば25℃）に保った。プレート計測器をトップ−リード（top-read）蛍光検出にセットし、励起光を350nm、発光測定波長を415nmにセットし、カットオフフィルターは使用しなかった。
PMTを中程度の感度にセットし、1ウエルにつき5回データを読み込んだ。自動キャリブレーションを作動させたが、初回のデータ読み込みのときだけキャリブレーションを行った。アッセイでは、モニターするために選択したウエルの数に応じて、最小のデータ読み込み間隔で3分間測定した。プレート計測器を、milli-RFU/分（1分当たり相対蛍光単位(relative fluorescence unit)の千分の一）の速度を計算するようにセットした。この速度(Vmaxポイント)の計算に用いた読み込みデータの数は、2分間に読み込まれるデータの数と同じ数とし、読み込み間隔に応じて決めた（例えば10秒ごとにデータを読み込む場合は12点のデータを速度の計算に用いた）。最大RFUは50,000とした。
【０１９３】
全ての酵素と基質ストック溶液のピペッティングは、容積式ピペット(Rainin Microman社)を用いて行った。緩衝液、アッセイ、及び酵素試料溶液は、シングルまたはマルチチャンネル吸引ピペット(Rainin LTS)でチューブ、試薬容器、またはストックマイクロプレートから採取した。連続分注ピペット(Eppendorf社)は、少数のウエルを用いる場合、試薬のロスを最小にしてアッセイ溶液をマイクロプレートのウエルに移すとき有用であった。Beckman FXまたはCybio Cybi-well等の自動ピペッティング装置は、マイクロプレート全体について一斉に試験するために酵素溶液を評価試料ストックマイクロプレートからアッセイマイクロプレートへ移すとき有用であった。
【０１９４】
＜試薬と溶液＞
[52.6 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl2, pH 6.5 - MES緩衝液]
MES酸(10.28g)と292mgの無水CaCl2を約900mLの純水に溶解させた。この溶液をNaOHで滴定し、pH 6.5とした（25℃、温度較正pHプローブ使用）。pHを調整した緩衝液の全容量を1Lにした。0.22μmの無菌フィルターで濾過した最終溶液を、室温下で保存した。
【０１９５】
[DMF-Abz-AGLA-Nba中の48mM Abz-AGLA-Nbaスットク溶液]
約28mgのAbz-AGLA-Nbaを小さなチューブに入れた。このAbz-AGLA-NbaをDMFに溶解させ（容積はAbz-AGLA-Nbaの凝集度により変わりうる）、数分間撹拌した。この溶液を、室温下で暗所に保存した。 
【０１９６】
[50 mM MES, 2.5 mM CaCl2, 5% DMF, 2.4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6.5 - アッセイ溶液]
1mL Abz-AGLA-NbaのAbz-AGLA-Nbaスットク溶液を、19mLのMES緩衝液に添加し、撹拌した。。この溶液を、室温下で暗所に保存した。 
【０１９７】
[50mM MES, 2.5mM CaCl2, pH6.5 - 酵素希釈緩衝液]
この緩衝液は、95mLのMES緩衝液に純水5mLを添加して調製した。
【０１９８】
[50mM MES, 2.5mM CaCl2, 5%DMF, pH6.5 - 基質希釈緩衝液]
5mLの純DMFを、95mLのMES緩衝液に添加した。この緩衝液は熱力学パラメータの評価に用いた。
【０１９９】
[酵素溶液]
酵素ストック溶液を、酵素希釈緩衝液で約1ppm(1ug/mL)の濃度まで希釈した。MULTIFECTTM中性メタロプロテアーゼ（野生型NprE）を6ppm (6ug/mL)以下の濃度まで希釈した。連続希釈法が好ましい。各溶液は室温では1時間は安定であるが、長期間保存する場合は氷冷した。
【０２００】
＜方法＞
まず、緩衝液、ストック溶液、及び試料溶液を調製した。各酵素希釈溶液のアッセイは、特に断りの無い限り3つのサンプルについて測定した。マイクロプレートを完全に満たすことができないときは、酵素試料溶液ストックマイクロプレートの左側の縦の列から順次酵素試料溶液を満たした（プレート計測器に適合させるため）。対応するアッセイプレートも同様にして準備した。マイクロプレート蛍光分光光度計は上記のようにして準備した。
【０２０１】
まず、200□Lのアッセイ用試料溶液を96ウエルマイクロプレートの各ウエルに入れた。このプレートを、光から遮断され温度が制御されたマイクロプレートミキサーを用いて、25℃で10分間インキュベートした。マイクロプレートミキサー中で、10 uLの酵素試料溶液をストックマイクロプレートからアッセイマイクロプレートへ移して、評価を開始した。96ウエルピペッティングヘッドを用いることが好ましい。または、左側の列から試料溶液をマイクロプレートへ移す場合は、8ウエル・マルチチャンネル・ピペットを用いた。各試料溶液を約15秒間、激しく撹拌した（Eppendorf Thermomixer中、900rpm）。
その後直ちにアッセイマイクロプレートをマイクロプレート蛍光分光光度計に移し、350nmの励起光で415nmに生じる蛍光により蛍光測定を開始した。蛍光分光光度計のソフトウエアにより、各ウエルの蛍光強度の増加における反応速度を、ミリ-RFU/分の回帰直線で計算した。いくつかの実験では、最初のプレートを測定しているときに、2番目のプレートをマイクロプレートミキサー中に入れておき、平衡な温度とした。
反応の初期速度は、生成物の濃度（すなわち2-アミノベンゾイルが放つ蛍光）が0.3mMに達するまでは、生成物の濃度に対し直線的であった。生成物の濃度0.3mMは、バックグラウンド蛍光が約22,000RFU（relative fluorescence units per minute）の2.3mM Abz-AGLA-Nbaから反応を開始した溶液の場合、約50,000RFUに相当する。
Abz-AGLA-NbaはDMFに溶解させて調製し、その日の内に使用した。
【０２０２】
＜５：suc-AAPF-pNAアッセイ＞  
セリンプロテアーゼの活性を、N-スクシニル-L-Ala-L-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-ニトロアニリド(suc-AAPF-pNA)基質の開裂を測定することにより評価した。このアッセイは、プロテアーゼによるN-スクシニル試薬のフェニルアラニンとp-ニトロアニリンとの間のアミド結合の開裂を利用している。p-ニトロアニリンの410nmのスペクトルをモニターし、p-ニトロアニリンの生成速度に基づきタンパク質分解活性を評価した。
プロテアーゼの単位は、光路長1cmのキュベットに入れた、0.1M Tris緩衝液と1.6mM suc-AAPF-pNAから成る25℃の標準溶液の410nmにおける吸光度を、1吸光度単位(AU)/分増加させるプロテアーゼ酵素の量と定義される。
【０２０３】
＜洗剤組成物＞
例示した洗剤組成物では、特に断りの無い限り、酵素のレベルを組成物全体の重量に対する純粋な酵素の重量で表す。洗剤の各原料は組成物全体の重量で表す。成分の略号は下記を意味する。
【０２０４】
＜原料の略号＞
LAS : C11からC13の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 
NaC16-17HSAS：高水溶性C16-17アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム  
TAS： タロウ（tallow）アルキル硫酸ナトリウム
CxyAS： C1x - C1y アルキル硫酸ナトリウム
CxyEz： 平均Ｚモルのエチレンオキシドで濃縮したC1x - C1yの大部分が直鎖状の１級アルコール
CxyAEzS：  Ｚモルのエチレンオキシドで濃縮したC1x - C1yの硫酸アルキルナトリウム（追加の物質名は実施例に記載）
ノニオニック（Nonionic）：  エトキシレート／プロポキシレート脂肪酸アルコール混合物（例えばPlurafac LF404）、特に平均エトキシル化が3.8で平均プロポシキル化が4.5のアルコール  
QAS：  R2がC12-C14であるR2．N+(CH3)2(C2H4OH)
シリケート：  アモルファスケイ酸ナトリウム (SiO2:Na2O比=1.6-3.2:1) 
メタシリケート：  メタケイ酸ナトリウム (SiO2:Na2O比=1.0)
ゼオライトA：  Na12(AlO2SiO2)12-27H2Oの式の水和アルミノケイ酸塩
SKS-6：  σ-Na2Si2O5の結晶性多層構造のシリケート
硫酸塩：  無水硫酸ナトリウム 
STPP：  トリポリリン酸ナトリウム
MA/AA：  平均分子量約70,000から約80,000のアクリレート／マレエートが４：１のランダムコポリマー
AA：  平均分子量4,500のポリアクリル酸ナトリウム
ポリカルボキシレート：  2,000から80,000のMWを有するアクリレート、マレエート、及びメタクリレート等のカルボキレートモノマーの混合物を含むコポリマー（例えばMW4,500のアクリル酸のコポリマー；Sokolan（商標）、BASF社）
BBl:  3-(3，4-ジヒドロイソキノリニウム)プロパンスルホネート 
BB2：  l-(3，4-ジヒドロイソキノリニウム)-デカン-2-スルホネート
PBl：  過ホウ酸ナトリウム一水和物
PB4：  一般式NaBO3-4H2Oの過ホウ酸ナトリウム四水和物 
過ホウ酸：  一般式、2Na2CO3-3H2O2の過ホウ酸ナトリウム
TAED：  テトラアセチルエチレンジアミン
NOBS：  ナトリウム塩のノナノイルオキシベンザンスルホネート
DTPA：  ジエチレントリアミンペンタ酢酸 
HEDP：  1，1-ヒドロキシエタンジフォスフォン酸
DETPMP：  ジエチルトリアミンペンタ(メチレン)フォスフォネート(例えば、 Dequest 2060（商標）； Monsanto社)
EDDS：  エチレンジアミン-N，N’-ジコハク酸, ナトリウム塩の形態の(S, S) 異性体
ジアミン：  ジメチルアミノプロピルアミン；1，6-hezane（ヘキサン）ジアミン；1，3-プロパンジアミン；  2-メチル-1，5-ペンタンジアミン； 1，3- ペンタンジアミン；1-メチル-ジアミノプロパン
DETBCHD：  5，12-ジエチル-l，5，8，12-テトラアザビシクロ 6，6，2ヘキサデカン、ジクロライド、Mn(II) 塩
PAAC：  ペンタアミンアセテートコバルト（III）塩
パラフィン：  パラフィンオイル (例えば、 Winog 70（商標）Wintershall社)
パラフィンスルホネート：  スルホン酸基で水素原子を置換したパラフィンオイルまたはワックス
アルドースオキシダーゼ：  オキシダーゼ酵素 （例えば、アルドースオキシダーゼ、ノボザイムA/S社）
ガラクトースオキシダーゼ：  ガラクトースオキシダーゼ （例えば、シグマ社）
nprE： バシラス・スブチリスにより発現された中性メタロプロテアーゼの遺伝子組み換え体
PMN： 精製されたバシラス・アミロリケファシエンス由来中性メタロプロテアーゼ
アミラーゼ：  アミラーゼ酵素 (例えば WO94/18314及びWO96/05295に記載されたジェネンコー社のPURAFECT（商標）Ox、及びノボザイムA/Sの NATALASE（商標）、TERMAMYL（商標）、FUNGAMYL（商標）、及びDURAMYL（商標）)
リパーゼ：  脂肪分解酵素 (例えば、ノボザイムA/SのLIPOLASE（商標）、LBPOLASE（商標）ウルトラ 及びGist-Brocadesの Lipomax（商標）) 
セルラーゼ：  セルラーゼ酵素 (例えば、ノボザイムA/SのCAREZYME（商標）、ＣELLUZYME（商標）、ENDOLASE（商標）)
ペクチンリアーゼ：  ノボザイムA/SのPECTAWAY（商標）及び PECTAWASH（商標）
PVP：  平均分子量が60,000のポリビニルピロリドン
PVNO：  平均分子量が50,000のポリビニルピロリドンN-オキシド
PVPVI：  平均分子量が20,000のビニルイミダゾールとビニルピロリドンのコポリマー
光沢剤１： 4，4’-ビス(2-スルホスチリル)ビフェニルジナトリウム
シリコン消泡剤：  シロキサン−オキシアルキレンコポリマーを分散剤として含むポリジエチルシロキサン発泡制御剤であって、前記制御剤対分散剤の比率は10:1から100:1である
泡抑制剤：  12％のシリコン／シリカ、18％のステアリルアルコール、70％の顆粒状スターチ
SRP1：  アニオンでエンドキャップしたポリエステル
PEG X：  分子量Xのポリエチレングリコール
PVP K60 （商標）：ビニルピロリドンホモポリマー（平均MW160,000）
Jefifamine（商標）ED-2001：  キャップされたポリエチレングリコール（例えばHuntsman社） 
Isachem（商標）AS：分岐アルコールアルキルスルフェート (例えばEnichem社） 
MME PEG (2000)：  モノメチルエーテルポリエチレングリコール（MW2000）（例えばFluka Chemie AG） 
DC3225C：  シリコン消泡剤であって、シリコンオイルとシリカ（例えば、Dow Corning社）の混合物
TEPAE：  テトラエチレンペンタアミンエトキシレート
BTA：  ベンゾトリアゾール
ベタイン：  (CH3)SN+CH2COO-
糖：  工業用のＤ−グルコースまたは食品用の糖
CFAA：C12−C14アルキルN-メチルグルカミド
TPKFA：  高分子量除去C12-C14脂肪酸
クレイ：  一般式Al2O3SiＯ2・xH2Oを有する水和アルミニウムシリケート（例えば、カオリン、モントモリロナイト、アタプルガイト、リライト、ベントナイト、ハロサイト）
pH：  20℃の蒸留水中で1％水溶液として測定されるpH 
【実施例２】
【０２０５】
＜B.スブチリスによるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、B.スブチリスによりNprEプロテアーゼを産出した例について説明する。特に、pUBnprEプラスミドをB.スブチリス中に形質転換する方法を説明する。
形質転換は公知の方法で行った。（例えば本願に参照として組み込むWO 2002/014490, WO 2007/044993参照）
以下に示すDNA配列（B.アミロリケファシエンス由来のnprEリーダー、nprEプロ配列、及びnprE成熟DNA配列）が、NprE前駆体タンパク質をコードする。 
【化１】
2011504097.tif 000006
【０２０６】
上記の配列表では、太字は成熟NprEプロテアーゼをコードするDNAを表わし、標準フォントはリーダー配列(nprEリーダー)を表わし、下線部はプロ配列(nprEプロ)を表わしている。
下記に示すアミノ酸配列(NprEリーダー配列、NprEプロ配列、及びNprE成熟DNA配列) (SEQ ID NO:2)は、NprE前駆体タンパク質の全長に相当する。この配列表では、下線部はプロ配列を表わし、太字は成熟NprEプロテアーゼを表わしている。
【化２】
2011504097.tif 000007
【０２０７】
成熟NprE配列をSEQ ID NO:3に示す。本願の変異体ライブラリーは、この配列を基礎にして構築した。
【化３】
2011504097.tif 000008
【０２０８】
pUBnprE発現ベクターは、2種の特異的プライマーを用いたPCRでB.アミロリケファシエンスの染色体DNA由来のnprE遺伝子を増幅することにより構築した。
【化４】
2011504097.tif 000009
【化５】
2011504097.tif 000010
【０２０９】
PCRはPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ(Finnzyme社)とヒートサイクラーを用いて実施した。PCR混合物には、10μl 5x緩衝液(Finnzymes Phusion)、lμlの10mM dNTP、1.5μlのDMSO、各プライマーlμl、lμlのFinnzymes Phusion DNA ポリメラーゼ、lμlの 50ng/μl染色体DNA 溶液、34.5μlのMilliQ 水が含まれていた。使用した手順は以下の通りである。
PCR手順： 
1) 30 秒98°C；
2) 10秒98°C；
3) 20秒55°C；
4) 1分72°C; 
5) 2から4のステップを25サイクル;
6) 5分72°C.；
【０２１０】
この結果1.9 kb DNAが生成し、このDNAをBglII及びBclI DNA制限酵素を用いて消化した。マルチコピーバシラスベクターpUB110 (例えば、Gryczan, J. Bacterid., 134:318-329 [1978]を参照)をBamHIにより消化した。次にPCR断片ｘBglIIｘBclI をpUB110 x BamΗIベクター中で結紮してpUBnprE発現ベクターを形成した。
【０２１１】
pUBnprE をバシラス・スブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換した。バシラス・スブチリスへの形質転換は、WO 02/14490に記載された方法に従って行った。本文献は参照として本明細書に組み入れられる。
pUBnprEベクターを宿すバシラス・スブチリス形質転換体の選択的培養は、20 mg/L ネオマイシンを含有する25 ml MBD培地（MOPSベースの合成培地）を入れた振とうフラスコで行った。MBD媒体培地は、基本となる培地からNH4Cl2, FeSO4 及びCaCl2を除いたこと、3 mM K2HPO4 を用いたこと、及び基本となる培地に60 mM 尿素、75 g/Lグルコース、及び1 % ソイトン（soytone）を追加添加したことを除いては、本質的に公知の方法( Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747, 1974参照)に従って調製した。
また、１リットルの100Ｘ原液に対し400 mg FeSO4 .7H2O, 100 mg MnSO4 .H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50mg CuCl2.2H2O, 100 mg CoCl2.6H2O, 100 mg NaMoO4.2H2O, 100 mg Na2B4O7.10H2O, 10 mlの1M CaCl2,及び10 ml の0.5 Mクエン酸ナトリウムから成る微量栄養素を含有させた。
培養器/振とう器(Infors社)を用いて、培養液を37℃で3日間培養した。この培養により、分泌NprEプロテアーゼが生成され、この分泌NprEプロテアーゼはタンパク質分解活性を有することがプロテアーゼ・アッセイにより示された。
ゲル分析を、NuPage Novex 10% Bis-Tris ゲル (Invitrogen, Catalog No. NP0007)を用いて行った。分析用サンプルを調製するため、2容量の上清と、１容量の１M HClと、１容量の4xLDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Cat.No. NP0007)と、1% PMSF (20 mg/ml)とを混合した。その後、サンプルを70℃で10分加熱した。
その後、各サンプル25μLを、10μLのSeeBlue plus2の事前に染色された標準タンパク質(Invitrogen, Cat.No.LC5925)と共にゲルに導入した。この結果から、この実施例に記載のnprEクローン化方法により、バシラス・スブチリス中に活性prEが生成されることが明確に示された。
【実施例３】
【０２１２】
＜部位評価用ライブラリ(SEL)の構築＞
この実施例では、nprE SELの構築方法について述べる。
【０２１３】
＜nprE SELの生成  −  方法1＞
上に述べたnprE発現カセットを含むpUBnprEベクターを、テンプレートDNAとして使用した。このベクターは独特のBg/II制限部位を含み、このBg/II制限部位を部位評価用ライブラリーの構築に使用した。
簡潔にいうと、nprE部位評価用ライブラリーを構築するために、3種のPCR反応を行った。その内の2種は、対象とするコドンの変異体を成熟nprE DNA配列に導入する突然変異生成PCRであり、3番目のPCRでは、成熟nprE配列中に所望のコドン変異体を含むUBnprE発現ベクターを構築するために、2つの突然変異PCRを融合させた。
【０２１４】
この突然変異の方法はコドン−特異性突然変異アプローチに基づき、DNAトリプレット中で全ての可能性のある突然変異を同時に生成するものであり、特異的に設計されたトリプレットDNA配列NNS (N = A, C, TまたはG； S = CまたはG)を含む25から45ヌクレオチド長のフォワード（forward）及びリバース(reverse)オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した。NNSは突然変異されるコドンの配列に対応し、特異的nprE成熟コドンにヌクレオチドをランダムに組み入れることを保証するものであった。
プライマーの名称に記載した数字は、特異的nprE成熟コドンの位置に対応する。複数の部位を評価に含めた。プライマー配列の例は、本願に参照として組み込むWO 2007/044993に開示されている。
【０２１５】
部位評価ライブラリーの構築に用いた2つの追加のプライマーには、BglII制限酵素認識部位と、BglII制限酵素認識部位に隣接するpUBnprE DNA配列の一部が含まれていた。次のプライマーがInvitrogen （50 ナノモルスケール, 脱塩）により作られた：
【化６】
2011504097.tif 000011
【化７】
2011504097.tif 000012
【０２１６】
各部位評価ライブラリーの構築は、pUB-Bglll-FWプライマー及び特異的nprEリバース突然変異プライマーを用いた2種のPCR増幅により開始した。第2のPCRでは、pUB-BglII-Rvプライマー及び特異的nprEフォワード突然変異プライマー（フォワード及びリバース突然変異プライマーのnprE 成熟コドンの位置は同等)を使用した。
【０２１７】
成熟nprE配列中への突然変異の導入は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes; Cat. no. F-530L)を用いて行った。全てのPCRは、ポリメラーゼに添付されたFinnzymesの取扱い説明書に従って行った。PCRの条件は下記の通りである。
【０２１８】
PCR1の条件：
pUB-BglII-FW プライマー及び特異NPRE リバース突然変異プライマー  −  いずれも1 μL (10 μM) ;
【０２１９】
PCR2の条件：
pUB-BglII-FW プライマー及び特異NPREフォワード突然変異プライマー  −  いずれも1 μL (10 μM) ; 
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL；
10 mM dNTP混合物 1 μL；
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)；
DMSO, 100% l μL；
pUBnprE テンプレートDNA l μL (0.1〜l ng/ μL)；
精製加熱滅菌水 最大50 μL。
【０２２０】
PCRプログラムは以下の通りであった：
30秒98℃、30×（98℃で10秒、55℃で20 秒、72℃で1.5分）、及び72℃で5分、PTC-200 Peltier ヒートサイクラー（MJ Research社）で実施。
PCRにより、約2から3 kBの2つのフラグメントが生成され、この2つのフラグメントは対象とするNprE成熟コドンの周囲で、約30ヌクレオチド塩基が重なり合う。前記の2つのフラグメントと、フォワード及びリバースBglIIプライマーとを用いて、第3のPCR反応で各フラグメントを融合した。
この融合PCRは、以下の溶液を用いて行った：
pUB-BlII-FW プライマー及びpUB-BglII-RV プライマー  各1μL (10μM)：
5 x Phusion HF 緩衝液  10 μL：
10 mM dNTP混合物  1μL：
Phusion DNAポリメラーゼ  0.75μL (2単位/ μL)：
DMSO, 100%  1μL：
主PCR 1 反応ミックス 1μL：
主PCR ２ 反応ミックス 1μL：
精製加熱滅菌水 最大50μL。
【０２２１】
PCR融合プログラムは以下の通り：
30秒98℃、30×(98℃で10秒、55℃で20秒、72℃で2.40分)及び72℃で5分、PTC-200 Peltierヒートサイクラー（MJ Research社）で実施
【０２２２】
増幅された直鎖状6.5 Kbフラグメントを、QiaquickPCR精製キット(Qiagen社, Catalog No. 28106)を用いて精製し、融合フラグメントの両端に付着端を形成するためにBglII制限酵素で消化した。
- 35 μL 精製直鎖状DNA フラグメント
- 4 μL REACTTM3緩衝液 (Invitrogen社)
- 1 μLBglII, 10単位/ml (Invitrogen社)
反応条件：1時間、30℃
【０２２３】
BglIIによる消化、及びQiaquickPCR精製キット(Qiagen社, Catalog No. 28106)を用いて精製したフラグメントを結紮することにより、所望の突然変異体を含む環状及び多重結合DNAを生成させた。
- 30μL  BglIIで消化させた精製DNAフラグメント
- 8μL   T4 DNAリガーゼ緩衝液 (InvitrogenTM Catalog No. 46300-018)
- 1μL   T4 DNAリガーゼ, 1単位/μL (InvitrogenTM Catalog No. 15224-017)
反応条件：16〜20時間、16℃
【０２２４】
次いで、結紮後の混合物をバシラス・スブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株中に形質転換した。バシラス・スブチリスへの形質転換は、本願に参照として組み込むWO02/14490に記載された方法で行った。各ライブラリーについて、単一コロニーを96採取し、後の配列分析(BaseClear)及びスクリーニング用に、ネオマイシン及び1.25 g/Lイーストエキスを含むMOPS培地で成長させた。各ライブラリーは最大19の nprE部位特異的変異体を含んでいた。
【０２２５】
変異体は、バシラス・スブチリスSEL形質転換体を、96ウエルMTPにおいて20 mg/Lのネオマイシン及び1.25 g/Lのイーストエキスを含むMBD培地を用いて、温度37℃で68時間培養することにより生成させた。
【０２２６】
＜nprE SELの生成  −  方法2＞
nprE SELを生成する別の方法を説明する。これらの方法は、他の対象とする酵素のSELの構築に適している。上記と同様に、nprE SEL発現カセットを含むpUBnprEベクターは、nprE SELとNprE変異体を生成させるためのテンプレートDNAとなる。2つの方法の主な違いは、この方法では、相補的部位特異的な突然変異プライマーを用いた全ベクターの増幅が必要であることである。
【０２２７】
＜材料＞
pUBnprEベクターを含むバシラス株
Qiagen プラスミド Midi Kit (Qiagen社 Catalog No. 12143)
Ready-Lyseリゾチーム (Epicentre社 Catalog No. Rl802M) 
dam メチラーゼKit (New England Biolabs社 Catalog No. M0222L) 
Zymoclean Gel DNA回収Kit (Zymo Research社 Catalog No. D4001) 
nprE部位特異的突然変異プライマー、100ナノモルスケール、5'リン酸化され、PAGEにより精製されたもの(Integrated DNA Technologies, Inc社)
QUIKCHANGETM複数部位特異的突然変異キット(Stratagene社 Catalog No. 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier サーマルサイクラー (Bio-Rad Laboratories社)
1.2% アガロースE-ゲル(Invitrogen社 Catalog No. G5018-01)
TempliPhi増幅キット(GE Healthcare社 Catalog No. 25-6400-10)
コンピテント・バシラス・スブチリス細胞 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- comK)
【０２２８】
＜方法＞
1の変異（上記の実施例3、および本願に参照として組み込むWO 2007/044993に開示したnprE SELスクリーニングで同定される）を含むpUBnprEプラスミドを得るために、対象とする各バシラス株の単一コロニーを、5ml LB + l0ppm ネオマイシンチューブ（例えばスタータ培地）に植菌した。
この培地を37℃において、225rpmで6時間振とうしながら培養した。次に、100mlの新しいLB + l0ppmネオマイシンを1mlのスタータ培地に植菌した。
この培地を225rpmで振とうしながら、37℃で一晩培養した。この培養の後、十分な遠心分離により細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを、10 ml 緩衝液Pl (Qiagen Plasmid Midi Kit)中に再懸濁させた。次に、l0ulのReady-Lyseリゾチームを再懸濁させた細胞ペレットに添加し、37℃で30分間培養した。その後、細胞培養液の体積増加を補償するための10ml の緩衝液P2及びP3を使用して、QiagenプラスミドMidi Kitの手順を継続した。
【０２２９】
nprE変異を含む各pUBnprEプラスミドをバシラスから単離した後、各プラスミドの濃度を測定した。dam Methylase Kit (New England Biolabs社)を製造者の取扱説明書に従って使用して、チューブ1本当たり約2 μgの各pUBnprEプラスミドをdamメチレート化した。
Zymoclean Gel DNA回収キットを用いてdam メチル化されたpUBnprEプラスミドを精製・濃縮した。
dam メチル化された各pUBnprEプラスミドを定量し、次にそれぞれを評価用の濃度である50ng/ulまで希釈した。
各反応において、混合部位特異的突然変異プライマーを別々に調製した。例えば、pUBnprE T14Rプラスミドをテンプレートに用いた場合、混合部位特異的突然変異プライマーのチューブには10μlのnprE-S23Rと、10μlのnprE-G24Rと、10 μlのnprE-N46Kと、10 μlのnprE-T54Rとが含まれる (全プライマーはそれぞれ10 μMである)。
【０２３０】
QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用いてPCR反応を行った。（例えば、1μl の1の変異体を含むdamメチル化pUBnprEプラスミド(50 ng/μl)、2 μlのnprE部位特異的突然変異プライマー(10 μM)、2.5μlの10x QuikChange Multi Reaction緩衝液、1μlのdNTP Mix、1μlのQuikChange Multi酵素ブレンド(2.5U/μl)、及び17.5μlの精製加熱滅菌水 、トータル25μlの反応混合物）
【０２３１】
nprE変異体ライブラリーを、以下の条件を用いて増幅した：95℃で1分 (最初のサイクルのみ), 続いて95℃で1分、55℃で1分、65℃で13.5分のサイクルを、29回繰り返した。
反応生成物を4℃で一晩保存した。その後、反応混合物をDpnl 消化（QUIKCHANGETM Multi Site-Directed Mutagenesis Kitに付属）処理することにより、親 pUBnprE ベクターを消化した。（この操作は製造者の取扱い説身書に従って行った。すなわち、1.5ul Dpnl 制限酵素を各チューブに加え、37℃で3時間培養し；2ul のDprcl-消化PCR 反応を1.2% E-ゲル上で分析することにより、PCR反応が正常に機能しており、親テンプレートが分解されていることを確認した。）
【０２３２】
nprE SELのマルチ変異体のライブラリーサイズを増大させるために、TempliPhiローリングサークル増幅法を製造者の取扱い説身書に従って使用して多量のDNAを生成させた。（すなわち、1ul のDpnl で処理されたQuikChange PCR Multi Site-Directed Mutagenesis PCR、5ulのTempliPhiサンプル緩衝液、5ulのTempliPhi 反応緩衝液、及び0.2ulのTempliPhi 酵素ミックス、全反応量は最大11μl；30℃で3 時間培養；TempliPhi 反応物に200ul の精製加熱滅菌水を加えて希釈し、短時間攪拌した)。
次に、希釈したTempliPhi溶液の1.5ulを用いてコンピテント・バシラス・スブチリス細胞を形質転換し、nprEマルチ変異体をLA + l0ppm ネオマイシン + 1.6% スキムミルクプレートを用いて選択した。コロニーを採取し、配列分析により異なるnprE変異体ライブラリーの組合せであることを確認した。
【０２３３】
DNA技術を組み合わせることにより、突然変異生成に用いた全てのプライマー（100ナノモルスケール、5'-リン酸化、及びPAGE精製）を合成した。評価した部位には4, 12, 13, 23, 45, 49, 50, 54, 59, 60, 65, 82, 90, 110, 119, 128, 129, 130, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 151, 152, 155, 179, 190, 197, 198, 199, 204, 205, 214, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 243, 244, 260, 261, 263, 265, 269, 273, 282, 285, 286, 289, 293, 296, 297 及び299が含まれていた。突然変異生成プライマーは、本願に参照として組み込まれるWO 2007/044993に開示されている。
【実施例４】
【０２３４】
＜プロテアーゼ変異体の発現、発酵、及び精製＞
この実施例では、形質転換されたB. ・スブチリスのプロテアーゼの発現、発酵、及び精製方法について説明する。
【０２３５】
遺伝子組み換えバシラス・スブチリスを、公知の培養液と発酵方法を用いて培養した。
B．スブチリスの培地（B.アミロリケファシエンスの中性メタロプロテアーゼ、またはその変異体が含まれる）のグリセロール・バイアルを用いて、200 mg/Lのクロラムフェニコールを含むSBG 1 %培養液600 mlに植菌した。これらの培養液を37℃で36〜48時間培養した。別の方法では、遺伝子組み換えB.スブチリスを前記の培地を用いて35℃で60時間培養した。公知の方法により培養液を12,000 rpmで遠心分離した(SOR V ALLTM遠心分離 model RC5B)。分泌された中性メタロプロテアーゼを培養液から分離し、BES (ポリエチレンスルホン) 10 kDaカットオフのAmiconフィルター8400を用いて約10倍濃度になるまで濃縮した。
【０２３６】
濃縮された上清を、1mMの CaCl2を含みpH 5.4の25mM MES緩衝液に対し、温度4℃で一晩透析した。次に、透析物をカチオン交換カラムPorous HS20 (Applied Biosystems社、カラム全容量 〜 83 mL; 結合能力〜 4.5g タンパク質/mL カラム; Waters)に注入した。カラムは1mMの CaCl2を含みpH 5.4の25mM MES緩衝液で予め平衡化されていた。吸着されたタンパク質は、1mM CaCl2を含みpH 5.4の25mM MES緩衝液から、2mM CaCl2及び100mM NaCl含みpH 6.2の50 mM MESへのpH及び塩傾斜緩衝液を用いて溶出させた。溶出したタンパク質のpH は5.8から6.0であった。
純粋なタンパク質を濃縮し、2mM CaCl2及びプロレングリコールを含み、pH 5.8の25mM MES緩衝液に緩衝液交換した。調合液の純度を、タンパク質分解活性の測定と、10%(w/v) NU-PAGETM Novex SDS-PAGE (Invitrogen Corp社)により評価した結果、95%以上であることが分かった。
【実施例５】
【０２３７】
＜バシラス宿主細胞の遺伝子工学＞
この実施例では、組み換え酵素の生産の改善に用いられる多様なB.スブチリス宿主株の構築について説明する。この生産方法の典型例では、以下のステップが用いられる。
【０２３８】
＜ステップ1：アルカリプロテアーゼの欠失とscoCの導入＞
DNA組み換え技術により生成された研究株(Stahl and Ferrari, J Bacteriol, 158:411-418, 1984; and Yang et al., J Bacteriol, 160:15-21, 1984)B.スブチリス168から、アルカリプロテアーゼ遺伝子(aprE)を欠失させた。欠失は、PBSl形質導入により生じさせた。欠失は当初、組み換えDNAにより生成したが、プラスミド切除後は非相同DNAの残留は無かった。
aprE欠失と並行して、もう一つの別の突然変異であるscoCを導入した。この突然変異生成は、細胞外プロテアーゼ産出を増加させる突然変異として既に開示されている(Dod et al., Molec Gene Genet, 163:45-56, 1978)。
【０２３９】
＜ステップ2：中性プロテアーゼの欠失＞
また、第2の細胞外プロテアーゼである中性プロテアーゼ(npr)の欠失を、DNA組み換え技術により生成させた。ステップ1のprEΔscoC株に変異遺伝子を導入する前に、まず研究株(Yang et al., J Bacteriol, 160:15-21, 1984)中のnpr遺伝子に欠失を生じさせた。
【０２４０】
＜ステップ3：スレオニン要求性の除去＞
ステップ2の株は、ヒスチジン要求性、スレオニン要求性、及びトリプトファン要求性（すなわち、成長にはこの3種の栄養素が必要）であるため、コンピテント細胞形質転換を用いて、スレオニンに対し原栄養性（prototrophy）に形質転換した。この結果、ステップ3で生成させた株の成長においてスレオニンは不要となったが、トリプトファンとヒスチジンに対する要求性は残っていた。
【０２４１】
＜ステップ4：胞子形成突然変異の導入とトリプトファン要求性の除去＞
このステップには、酵素産出には影響しない胞子形成欠失(spo‐)突然変異の導入が含まれる。プロテアーゼを産出する研究株を、公知のN-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)化学変異誘発により突然変異させた(Gerhardt (ed.) Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC, p. 226, 1981)。
spo‐突然変異体を単離し、高レベルのプロテアーゼ産出性保持について評価したところ、非突然変異株と同等であった。ステップ3の株にspo‐突然変異体を導入するため、突然変異させた株から染色体DNAを調製し、コンピテント細胞形質転換を用いて、トリプトファンマーカー及びspo‐突然変異を、ステップ3の株に導入した。この方法により得られた株はspo‐突然変異を有し、成長にトリプトファンは不要となったが、ヒスチジンに対する要求性は残っていた。
【０２４２】
＜ステップ5：sacU(h)遺伝子の導入とヒスチジン要求性の除去＞
PBS-1を介した形質導入により、sacU(h)遺伝子をステップ4の株に導入した。sacU(h)遺伝子の対立遺伝子は、scoC変異株とは明らかに異なり、B.スブチリスのいくつかの細胞外酵素の産出を増加させた(Kunst et al., Biochemie, 56:1481-1489, 1974)。ヒスチジンに対する要求性は、sacU(h)遺伝子の導入と同時に消失した。得られた株は原栄養性の株で、胞子形成欠失であった。
【０２４３】
＜ステップ6：胞子形成制御の欠失＞
sacU(h)遺伝子を導入した後、spo-3501欠失と呼ばれる、別の胞子形成変異体を導入した。この変異体は、トランスポゾン変異生成によって同定された。遺伝子をクローンし、欠失を生じさせ、宿主株中に導入した。spo‐とspo-3501欠失胞子形成変異との組み合わせにより、胞子形成頻度が大幅に低下した。  
【０２４４】
＜ステップ7：プロテアーゼの導入＞
ステップ6のB.スブチリス宿主株を、いくつかの酵素の高レベルでの産出に用いた。これは、適切なプロモーターと作動可能に組み合わされた、対象とする酵素のコード領域を有するプラスミド発現ベクターを用いて宿主株を形質転換することにより実施した。
【０２４５】
＜ステップ8：NTG突然変異生成＞
ステップ7の組み換え酵素の発現を増大させるため、形質転換された宿主をNTGで処理した。多数の独立分離株について、親株より産出能力の高い株のスクリーニングを行った。これにより、非常に効率の高い産出株が単離された。
【０２４６】
＜ステップ9：遺伝子産物のループアウト（loopout）＞
ステップ7または8で生成した宿主株を一般的な産出宿主として用いるために、対象とする酵素の遺伝子を標準的な方法で除去した。この方法には、バシラス宿主中での相同組み換えによる遺伝子のループアウトが含まれていた。
【０２４７】
＜ステップ10：細胞外プロテアーゼの除去＞
aprEの欠失に用いた方法と同様の組み換えDNA技術を用いて、微量細胞外プロテアーゼ(Epr)を宿主株(Sloma et al., J Bacteriol, 170:5557-5563, 1988)から欠失させた。epr遺伝子中の欠失は、サザンハイブリッド化により確認した。
【０２４８】
＜ステップ11：細胞内セリンプロテアーゼの除去＞
aprEの欠失に用いた方法と同様の組み換えDNA技術を用いて、細胞内セリンプロテアーゼ(ISP)遺伝子(Koide et al., J Bacteriol, 167:110-116, 1986)の除去を行った。isp欠失の効率をISP活性の測定と、サザンブロットにより評価した。 
【０２４９】
＜ステップ12：バシロペプチダーゼ（Bacillopeptidase）Fプロテアーゼの除去＞
aprEの欠失に用いた方法と同様の組み換えDNA技術を用いて、バシロペプチダーゼF(BPF)遺伝子(Sloma et al., J Bacteriol, 172: 1470- 1477, 1990)を欠失させた。bpf遺伝子の欠失は、サザンハイブリッド化により確認した。
【０２５０】
＜ステップ13：アミラーゼの除去＞
in vitroで欠失を生じさせた野生型アミラーゼ(amyE)遺伝子を、ステップ12のB.スブチリス株に導入した。切断されたアミラーゼ遺伝子を有するamy/pUCTskanプラスミドを、天然コンピテンスによりBG3934中に形質転換した。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子(kanr) を備え、温度感受性複製起点(TsOri)であった。本願で用いたkanr遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）プラスミドpJHl(Trieu-Coet and Courvalin, Gene, 23: 331-341, 1983)から単離したものである。 
【０２５１】
TsOriが存在するため、このプラスミドは非許容温度（例えば48℃）において、染色体のアミラーゼ遺伝子と相同の位置に組み込まれた。組み込み操作の後、このプラスミドを有する株を、許容温度においてカナマイシンの非存在下で増殖させた。これにより、プラスミドの切除と損失が生じ、親株またはアミラーゼ遺伝子が欠失した変異体が増加する。
【０２５２】
＜ステップ14：細胞壁プロテアーゼの除去＞
細胞壁プロテアーゼ遺伝子(wprA)の欠失は、ステップ13の株からアミノ末端WprA残基をコードするヌクレオチドを除去するこよにより行った。wprAの上流側領域(5')の隣接領域、及びWprA残基のカルボキシ末端をコードする下流側領域(3')にスペクチノマイシン遺伝子を備える第1プラスミドを調製した。
カナマイシン、及び37℃以上の温度で組み込みを可能にする温度感受性複製起点(TsOri) を備える第2プラスミドを調製した。第2プラスミドは、第1プラスミドと同じ5'及び3' wprA DNAフラグメントも備えていたが、5'及び3' wprA DNAフラグメントを分断するスペクチノマイシン遺伝子は備えていなかった。
【０２５３】
スペクチノマイシン遺伝子含有プラスミドを、宿主株中にダブルクロスオーバーにより組み込み、無傷wprA遺伝子と置換した。次に、Campbell組み換え法（Campbell integration）により、TsOriを含むプラスミドを、スペクチノマイシンが含まれる株中に形質転換した。2番目の形質転換では、図1に示すように、wprA欠失を有する宿主染色体カセットを導入した。二重形質転換体の染色体DNAを用いて、このカセットを宿主中に形質転換し、抗生物質の非存在下で許容温度（30℃）において培養した。次に、培養したコロニーについて、カナマイシン耐性及びスペクチノマイシン耐性を喪失したクローンのスクリーニングを行い、非相同DNAの無いwprA欠失変異体を得た。
【実施例６】
【０２５４】
＜様々なプロテアーゼ遺伝子の欠失を有するバシラス宿主株の構築＞
この実施例では、Cre/loxP部位特異的組み換え(Palmeros etal., Gene, 247: 255-264, 2000)を用いて、B. スブチリスの内因性プロトプラストの産出能力を消去する遺伝子工学的方法を説明する。この方法の典型例では、以下のステップが用いられる。
【０２５５】
ステップ1： B. スブチリスのプロテアーゼ遺伝子欠失プラスミドを、プライマーの末端に組み込まれた適切な制限酵素認識部位を備える相同染色体DNAであって、対象とするプロテアーゼ遺伝子欠失部位の上流側および下流側フラグメントを含む約1000bpの相同染色体DNAを、PCRで増幅することにより構築する。（例えば図7参照）
【０２５６】
ステップ 2：BamHIを用いて、pLoxSpecプラスミドからSpec-loxPフラグメントを消化する。（例えば図8参照）
【０２５７】
ステップ3：BamHIを用いてB. スブチリスプロテアーゼ遺伝子欠失プラスミドを消化し、Spec-loxPフラグメントをB. スブチリスプロテアーゼ遺伝子欠失プラスミド中にサブクローンする。
【０２５８】
ステップ4：上流側染色体DNA-Spec-loxP-下流側染色体DNAカセットの範囲内を切断しない制限エンドヌクレアーゼでB. スブチリスプロテアーゼ遺伝子欠失プラスミドを消化し、このプラスミドを直線状にする。（例えば図9参照）
【０２５９】
ステップ5：直線状にしたプラスミドでB. スブチリス宿主株を形質転換する。選択培地で得られた形質転換体は、ダブルクロスオーバー組込みにより、標的遺伝子欠失部位に染色体に組み込まれたSpec-loxPカセットを有する。
【０２６０】
ステップ6：新しい宿主株の、B. スブチリス・コンピテント細胞を調製する。
【０２６１】
ステップ7：pCRM-Ts Phleoプラスミドで新しい宿主株を形質転換し（例えば図10参照）、フレオマイシンプレートを用いて30℃で選択する。
【０２６２】
ステップ8：LB振とうフラスコに、単一のフレオマイシン耐性コロニーを抗生物質の非存在下（すなわち、非選択圧力下）で植菌し、42℃で6時間培養する。
【０２６３】
ステップ9：培養物を抗生物質の非存在下でLBアガー・プレートに塗布し、37℃でインキュベートする。
【０２６４】
ステップ10：培養物を採取し、複数の新しいプレート（抗生物質を含むプレートと含まないプレート）に植菌して、目的の遺伝子欠失を有し、かつ非相同組込みベクターDNAを備えない（例えば、スペクチノマイシンやフレオマイシンの存在下では成長しない）コロニーを同定する。このようなコロニーでは、染色体DNA 中の標的プロテアーゼ遺伝子が欠失しており、pCRM-Ts Phleoプラスミドを備えていない。
この方法は、以下に示す種々のBG6000及びBG6100株の調製に用いた。
【０２６５】
対象とするプロテアーゼ遺伝子欠失を有する株の配列を解読し、プロテアーゼ遺伝子配列が切除されていることを確認した。次に、欠失変異体をB. スブチリス株EL534由来の染色体DNAで形質転換して、種々のNprEプロテアーゼ産出株を作った。これらの産出株を、実施例4に開示した大スケールの発酵槽を用いて培養した。培養液のプロテアーゼ組成物について、プロテアーゼ活性測定とSDS-PAGE分析により評価した。
【０２６６】
対象の菌株にはノックアウトしたプロテアーゼ遺伝子の数を表示した。例えば2-欠失株というときは、相同aprE(セリンプロテアーゼ/アルカリプロテアーゼ) 遺伝子とnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ)遺伝子が欠失したB. スブチリスを意味する。
【０２６７】
2-欠失(aka SC6.l) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
【０２６８】
3-欠失(aka BG6100) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
Δvpr (微量細胞外セリンプロテアーゼ)
【０２６９】
4-欠失(aka BG6101) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
Δepr (微量細胞外セリンプロテアーゼ)
Δvpr (微量細胞外セリンプロテアーゼ)
【０２７０】
5-欠失(aka BG3934) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
Δepr (微量細胞外セリンプロテアーゼ) 
ΔispA (主要細胞内セリンプロテアーゼ) 
Δbpr (セリンプロテアーゼ) 
【０２７１】
6-欠失(aka BG6000) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
Δepr (微量細胞外セリンプロテアーゼ) 
ΔispA (主要細胞内セリンプロテアーゼ) 
Δbpr (セリンプロテアーゼ) 
Δvpr (微量細胞外セリンプロテアーゼ) 
【０２７２】
8-欠失(aka BG6003) 
ΔaprE (セリンアルカリプロテアーゼ) 
ΔnprE (細胞外中性メタロプロテアーゼ) 
Δepr (微量細胞外セリンプロテアーゼ) 
ΔispA (主要細胞内セリンプロテアーゼ) 
Δbpr (セリンプロテアーゼ) 
Δvpr (微量細胞外セリンプロテアーゼ) 
ΔwprA (細胞壁関連プロテアーゼ) 
Δmpr-ybfJ (細胞外メタロプロテアーゼ)
【実施例７】
【０２７３】
＜2欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、2欠失(ΔaprE, ΔnprE)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL534及びEL535 におけるNprE産出を説明する。プラスミドpJHT及びpUBnprEのマップを図2に示す。
【０２７４】
＜使用原料＞
pJHTプラスミド
pUB-nprEプラスミド
プライマーEL-755, EL-818, EL-819, 及びEL-820 (Operon Biotechnologies, Inc社)
SC6.1 バシラスコンピテント細胞
KOD Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen社)
QIAquick PCR精製キット(Qiagen社) 
pJM102プラスミド
TempliPhi Amplification Kit (GE Healthcare社)
BG3594コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- cornK))
【０２７５】
プライマー配列：
【化８】
2011504097.tif 000013
【化９】
2011504097.tif 000014
【化１０】
2011504097.tif 000015
【化１１】
2011504097.tif 000016
【０２７６】
＜方法＞
aprEプロモーター(バシラス・スブチリス由来)と、prE遺伝子(B.アミロリケファシエンス由来)とを含む組込みベクターを構築するために、2種のPCR反応を別々に行った。
【０２７７】
図3に示す最初のPCR反応では、プラスミドpJHTからaprEプロモーターを増幅した。この反応では次の試薬を用いた。1μlのpJHTプラスミド(50ng/μl)、lμlのプライマーEL-755 (25uM)、lμlのプライマーEL-818 (25μM)、10μlの10x KOD緩衝液、10μlのdNTP (2mM)、4μlのMgSO4 (25mM)、1μl のKOD Hot Start DNAポリメラーゼ、及び72μlの加熱滅菌Milli-Q水を用い、全反応容積を100μlとした。
PCRサイクルは：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、次に95℃で30秒間、54℃で30秒間、及び72℃で16秒間のサイクルを、28回繰り返した。
【０２７８】
2番目のPCR反応では、プラスミドpUB-nprEからnprE遺伝子を増幅した。この反応では次の試薬を用いた。LμlのpUB-nprEプラスミド(50ng/ul)、lμlのプライマーEL-819 (25uM)、lμlのプライマーEL-820 (25uM)、10μlの10x KOD緩衝液、10μlのdNTP (2mM)、4μlのMgSO4 (25mM)、lμlのKOD Hot Start DNAポリメラーゼ、及び72μlの加熱滅菌Milli-Q水を用い、全反応容積を100μlとした。 
PCRサイクルは：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、次に95℃で30秒間、56℃で30秒間、及び72℃で40秒間のサイクルを、28回繰り返した。
【０２７９】
各フラグメントを増幅した後、PCR生成物をQIAquick PCRを用いて精製した。スプライシングオーバーラップ伸長（Splice Overlap Extension (SOE)）PCR反応を用いて、別々の2つのDNAフラグメントを結合させた。SOE反応では、次の試薬を用いた。1μlのaprEプロモーターDNAフラグメント、1μlの B.アミロリケファシエンスnprE遺伝子フラグメント、 lμlのプライマーEL-755 (25□M)、lμlのプライマーEL-820 (25μM)、10μlの10X KOD緩衝液、10μlのdNTP (2mM)、4μlのMgSO4 (25mM)、lμlの KOD Hot Start DNAポリメラーゼ、及び69μlのMilli-Q水(加熱滅菌) を用い、全反応容積を100μlとした。
PCRサイクルは：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、次に95℃で30秒間、58℃で30秒間、及び72℃で55秒間のサイクルを、28回繰り返した。
【０２８０】
PCRにより生成したaprE-プロモーター-B.アミロリケファシエンス-nprE遺伝子融合フラグメントをEcoRI及びBamHl制限エンドヌクレアーゼで消化した。pJM102ベクターは、EcoRI及びBamHl制限エンドヌクレアーゼで消化した。次に、制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprEプロモーターB.アミロリケファシエンスnprEフラグメントと、制限エンドヌクレアーゼで消化されたpJM102ベクターとを結紮した。
次に、取扱説明書に従って、TempliPhiローリングサークル増幅法を用いて、増大したバシラス形質転換効率で大量の結紮されたDNA産物を生成させた。詳しくは、lμlのDNA結紮混合物、5μlのTempliPhi サンプル緩衝液、5μlのTempliPhi反応緩衝液、及び0.2μlのTempliPhi酵素混合物を用い、トータル11μlの反応液を30℃で3時間インキュベートした。TempliPhi酵素混合物を100μlの加熱滅菌したMilli-Q水を添加して希釈し、軽く撹拌して用いた。
【０２８１】
2μlの希釈されたTempliPhi混合液をBG3594-comKコンピテント細胞中に形質転換し、染色体のaprEローカスに組み込まれたプラスミドを、LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクを有するプレートを用いて選択した。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL534株が得られた。
EL534株の染色体DNAを抽出し、次にaprE-プロモーター-B.アミロリケファシエンス-nprE遺伝子融合フラグメントPCRで増幅し、配列を分析して確認した。図4(SEQ ID NO: 12)に、nprEオープン・リーディング・フレームに融合したaprEプロモーターを含む核酸フラグメントの配列を示す。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL534株を増幅することにより、NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL535株が得らえた。
【実施例８】
【０２８２】
＜3欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、3欠失(ΔaprE, ΔnprE, Δvpr)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL549 及び EL552におけるNprE産出を説明する。
【０２８３】
＜使用原料＞
EL534の染色体DNA
BG6100コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK))
【０２８４】
＜方法＞
100μlのBG6100コンピテント細胞を、lμlのEL534染色体DNA (100ng/μl)を添加することにより形質転換した。次に、形質転換した細胞をLA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で選択した。5ppmクロラムフェニコール上で成長可能で、スキムミルクプレート上でハローを形成可能な形質転換体を採取し、この形質転換体の染色体DNA抽出物を5ml LB+5ppmクロラムフェニコールの入ったチューブに植菌した後、37℃で一晩培養した。 
バシラス染色体に確実に3つのプロテアーゼ欠失を含ませるために、DNA抽出物を用いて、2回目のBG6100コンピテント細胞の形質転換を行った。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL549株が得られた。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL549株を増幅することにより、非相同NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL552株が得らえた。
【実施例９】
【０２８５】
＜4欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、4欠失(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, Δvpr)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL550 及び EL553におけるNprE産出を説明する。
【０２８６】
＜使用原料＞
EL534の染色体DNA
BG6101コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK))
【０２８７】
＜方法＞
100μlのBG6101コンピテント細胞を、lμlのEL534染色体DNA (100ng/μl)を添加することにより形質転換した。次に、形質転換した細胞をLA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で選択した。5ppmクロラムフェニコール上で成長可能で、スキムミルクプレート上でハローを形成可能な形質転換体を採取し、この形質転換体の染色体DNA抽出物を5ml LB+5ppmクロラムフェニコールの入ったチューブに植菌した後、37℃で一晩培養した。 
バシラス染色体に確実に4つのプロテアーゼ欠失を含ませるために、DNA抽出物を用いて、2回目のBG6101コンピテント細胞の形質転換を行った。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL550株が得られた。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL550株を増幅することにより、非相同NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL553株が得らえた。
【実施例１０】
【０２８８】
＜5欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、5欠失(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL543及び EL546におけるNprE産出を説明する。
【０２８９】
＜使用原料＞
EL534の染色体DNA
BG3934コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, oppA,ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK)) 
【０２９０】
＜方法＞
100μlのBG3934-comKコンピテント細胞を、lμlのEL534染色体DNA (100ng/μl)を添加することにより形質転換した。次に、形質転換した細胞をLA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で選択した。5ppmクロラムフェニコール上で成長可能で、スキムミルクプレート上でハローを形成可能な形質転換体を採取し、この形質転換体の染色体DNA抽出物を5ml LB+5ppmクロラムフェニコールの入ったチューブに植菌した後、37℃で一晩培養した。 
バシラス染色体に確実に5つのプロテアーゼ欠失を含ませるために、DNA抽出物を用いて、2回目のBG3934コンピテント細胞の形質転換を行った。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL543株が得られた。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL543株を増幅することにより、非相同NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL546株が得らえた。
【実施例１１】
【０２９１】
＜6欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、6欠失(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL544及び EL547におけるNprE産出を説明する。
【０２９２】
＜使用原料＞
EL534の染色体DNA
BG6000コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK))
【０２９３】
＜方法＞
100μlのBG6000コンピテント細胞を、lμlのEL534染色体DNA (100ng/μl)を添加することにより形質転換した。次に、形質転換した細胞をLA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で選択した。5ppmクロラムフェニコール上で成長可能で、スキムミルクプレート上でハローを形成可能な形質転換体を採取し、この形質転換体の染色体DNA抽出物を5ml LB+5ppmクロラムフェニコールの入ったチューブに植菌した後、37℃で一晩培養した。 
バシラス染色体に確実に6つのプロテアーゼ欠失を含ませるために、DNA抽出物を用いて、2回目のBG6000コンピテント細胞の形質転換を行った。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL544株が得られた。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL544株を増幅することにより、非相同NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL547株が得らえた。
【実施例１２】
【０２９４】
＜8欠失プロテアーゼ遺伝子を有するB. スブチリス宿主株におけるNprEプロテアーゼ産出＞
この実施例では、8欠失(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfj)プロテアーゼ遺伝子を変異生成させたB. スブチリス宿主株EL545及び EL548におけるNprE産出を説明する。
【０２９５】
＜使用原料＞
EL534の染色体DNA
BG6003コンピテント細胞(ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpf, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, oppA,
ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK))
【０２９６】
＜方法＞
100μlのBG6003コンピテント細胞を、lμlのEL534染色体DNA (100ng/μl)を添加することにより形質転換した。次に、形質転換した細胞をLA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で選択した。5ppmクロラムフェニコール上で成長可能で、スキムミルクプレート上でハローを形成可能な形質転換体を採取し、この形質転換体の染色体DNA抽出物を5ml LB+5ppmクロラムフェニコールの入ったチューブに植菌した後、37℃で一晩培養した。 
バシラス染色体に確実に6つのプロテアーゼ欠失を含ませるために、DNA抽出物を用いて、2回目のBG6003コンピテント細胞の形質転換を行った。
LA+5ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上で成長し、ハローを形成することができる形質転換体には組込プラスミドが含まれていると考えられ、この結果EL545株が得られた。その後、LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレートを用いてEL545株を増幅することにより、非相同NprEタンパク質を高レベルで発現可能なEL548株が得らえた。
【実施例１３】
【０２９７】
＜振とうフラスコによる評価＞
この実施例では、種々のB.スブチリス宿主株における非相同NprEの発現を評価に用いられる方法を説明する。
【０２９８】
＜使用原料＞
バシラス株 EL535, EL546, EL547, EL552, EL553 及び EL548 
LA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート 
LB + 25ppmクロラムフェニコール
振とうフラスコ評価用媒体 + 25ppmクロラムフェニコール
1N 塩酸 
NuPage 10% Bis-Trisゲル (Invitrogen社) 
Novex 2x Tris-グリシン SDS サンプル緩衝液 (Invitrogen社) 
NuPage 20x MES SDS ランニング緩衝液 (Invitrogen社) 
Novex XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen社) 
SimplyBlue SafeStain (Invitrogen社)
＜振とうフラスコ評価用媒体：パート1 (1リットルボトル使用)＞
0.03g MgSO4 (無水)
0.22g K2HPO4
21.32g Na2HPO4*7H2O
6.1g NaH2PO4*H20 
3.6g 尿素
Milli-Q水を添加して、全容積を500mlにする。
＜振とうフラスコ評価用媒体：パート2 (1リットルボトル使用)＞
7g Cargill社  大豆かす 
Milli-Q水を添加して、全容積を400mlにする。
＜振とうフラスコ評価用媒体：ストック溶液＞
350g MaltrinTM M150 
210g グルコース 
Milli-Q水を添加して、全容積を1リットルにする。
放冷し、パート1とパート2を混合し、100mlのストック溶液を添加。
【０２９９】
＜方法＞
NprEを発現する種々のB.スブチリス株のグリセロールストック溶液を、それぞれLA+25ppmクロラムフェニコール+1.6%スキムミルクプレート上に線状に塗布した。このプレートを、37℃で一晩インキュベートした。翌日、分析する各菌株の単一コロニーを、2ml LB+25ppmクロラムフェニコールチューブにそれぞれ植菌し、37℃において225rpmで振とうしながら6時間培養した。予備培養した培養液を、上記の振とうフラスコ評価用媒体+25ppmクロラムフェニコール溶液25mlで1：1000に希釈した。培養液を37℃において225rpmで振とうしながら40時間培養した。40時間後、遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞の上清を分離容器に移した。
【０３００】
100μlの細胞上清に25μlの氷及び冷1N塩酸を添加し、氷上で10分間インキュベートすることによりSDSタンパク質ゲル分析用の細胞上清サンプルを調製した。次に、62.5μlのNovex 2X Tris-グリシンSDS サンプル緩衝液を添加し、室温で10分間インキュベートした。NuPage MES SDSランニング緩衝液を用いて、NuPage 10% Bis-TrisゲルをNovex Xcell SureLock Mini-Cell中に準備した（取扱説明書に従った）。各細胞上清サンプルを、取扱説明書に従ってNuPage 10% Bis-Trisゲルの各ウエルに仕込んだ。SDSタンパク質ゲルを水洗し、SimplyBlue SafeStainで染色した（取扱説明書に従った）。
図5と図6に示すように、2-欠失株の上清にVprプロテアーゼの混入が認められたが、8-欠失株にはVprプロテアーゼの混入は認められなかった。
【０３０１】
さらに、実施例1の方法でAAPFに対するセリンプロテアーゼの活性を評価したところ、セリンプロテアーゼの活性は酵素における欠失数が増えるに従い減少することが分かった(Table 13-1)。
【表３】
2011504097.tif 000017
【０３０２】
すなわち、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させることにより、セリンプロテアーゼのメタロプロテアーゼに対する混入割合が1%未満の中性メタロプロテアーゼ産出株が得られることが分かる。
【０３０３】
本明細書で言及した全ての特許及び文献は、本発明の属する技術分野の当業者の技術常識の水準を示すために用いる。本明細書の説明に用いられる範囲で、参照された特許及び文献は本明細書に援用される。しかし、本明細書に引用した文献は、本発明に対する先行技術では無い。
【０３０４】
本明細書において説明されている好適な態様を参照して、本発明の構成に各種変更を加えることは当業者が容易になし得ることである。そのように変更を加えられた発明も本発明の範囲内に属するものである。
【０３０５】
当業者は本発明が、本明細書で言及され、並びに内在する本発明の目的及び利益を達成するのに好適であることを理解している。本明細書で説明する組成物及び方法は好適な態様の一例、及び例示であり、本発明の範囲をこれらに限定されない。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱しない範囲で各種変更及び変法を提供することが可能である。
【０３０６】
本明細書で説明される発明は、本明細書で特定されていない任意の要件、限定がなくても実施することができる。本明細書で用いられている用語及び表現は説明のために用いるのであり、限定のために用いるのではない。このような用語及び表現の使用について、これらの等価物を排除することは意図しておらず、このような等価物は本発明の範囲内である。従って、本発明を好適な態様及び目にみえる特徴により特定してはいるが、開示されている本発明の技術的思想の変更及び変法も当業者には容易になし得ることができ、そのような変更及び変法は添付の特許請求の範囲により定義されている本発明の範囲内である。
【０３０７】
本発明は幅広く一般化して説明されている。より狭い範囲のもの及び下位グループに属するものも本発明の一部分である。またこのことは、削除された構成が本明細書で開示されているか否かに関わらない。総括的な請求の範囲から任意の事項を削除するような条件、または負の限定を伴う一般的発明の記載についても当てはまる。
【図１】
2011504097.tif 000020
【図２Ａ】
2011504097.tif 000021
【図２Ｂ】
2011504097.tif 000022
【図３】
2011504097.tif 000023
【図４】
2011504097.tif 000024
【図５】
2011504097.tif 000025
【図６】
2011504097.tif 000026
【図７】
2011504097.tif 000027
【図８】
2011504097.tif 000028
【図９】
2011504097.tif 000029
【図１０】
2011504097.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月20日(2010.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性メタロプロテアーゼを製造する方法であって、
ｉ）内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）とが欠失したバシラス宿主細胞を準備する工程と、
ｉｉ）プロモーターと作動可能に組み合わされ、非相同ＮｐｒＥ酵素をコードする核酸で、前記バシラス宿主細胞を形質転換して形質転換された宿主細胞を調製する工程と、
ｉｉｉ）前記形質転換された宿主細胞を、非相同ＮｐｒＥ酵素を産出させるために適した条件下で培養して非相同ＮｐｒＥ酵素を産出する工程とを含む方法。
【請求項２】
さらに、産出された前記非相同ＮｐｒＥ酵素を回収する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに前記バシラス宿主細胞の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに前記バシラス宿主細胞の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、および／または、内因性バシロペプチターゼ（ｂａｃｉｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｆ酵素（Ｂｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バシラス宿主細胞の内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）、および／または内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）が欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非相同ＮｐｒＥ酵素がバシラス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮｐｒＥ酵素、またはその変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示したアミノ酸配列の１, ３, ４, ５, ６, １１, １２, １３, １４, １６, ２１, ２３, ２４, ２５, ３１, ３２, ３３, ３５, ３６, ３８, ４４, ４５, ４６, ４７, ４８, ４９, ５０, ５１, ５４, ５５, ５８, ５９, ６０, ６１, ６２, ６３, ６５, ６６, ６９, ７０, ７６, ８５, ８６, ８７, ８８, ９０, ９１, ９２, ９６, ９７, ９８, ９９, １００, １０２, １０９, １１０, １１１, １１２, １１３, １１５, １１７, １１９, １２７, １２８, １２９, １３０, １３２, １３５, １３６, １３７, １３８, １３９, １４０, １４６, １４８, １５１, １５２, １５３, １５４, １５５, １５７, １５８, １５９, １６１, １６２, １６９, １７３, １７８, １７９, １８０, １８１, １８３, １８４, １８６, １９０, １９１, １９２, １９６, １９８, １９９, ２００, ２０２, ２０３, ２０４, ２０５, ２１０, ２１１, ２１４, ２１５, ２１６, ２１７, ２１８, ２１９, ２２０, ２２１, ２２２, ２２３, ２２４, ２２８, ２２９, ２３７, ２３９, ２４０, ２４３, ２４４, ２４５, ２４８, ２５２, ２５３, ２６０, ２６１, ２６３, ２６４, ２６５, ２６７, ２６９, ２７０, ２７３, ２７７, ２８０, ２８２, ２８３, ２８４, ２８５, ２８６, ２８８, ２８９, ２９０, ２９２, ２９３, ２９６, ２９７,及び２９９から成る群から選択される位置に相当する少なくとも１の位置に置換が含まれるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示したアミノ酸配列中に下記から選択される少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【表１−１】
2011504097.tif 000031
【表１−２】
2011504097.tif 000032
【請求項１０】
前記バシラス・アミロリケファシエンスＮｐｒＥ変異体に、Ｓ１２９Ｉ／Ｆ１３０Ｌ／Ｄ２２０Ｐ, Ｍ１３８Ｌ／Ｖ１９０Ｉ／Ｄ２２０Ｐ, 及びＳ１２０Ｉ／Ｆ１３０Ｌ／Ｍ１３８Ｌ／Ｖ１９０Ｉ／Ｄ２２０Ｐから成る群から選択される多重変異体が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記中性メタロプロテアーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示すアミノ酸配列を有する中性メタロプロテアーゼに対し少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で産出された非相同ＮｐｒＥ酵素。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示すアミノ酸配列を有する中性メタロプロテアーゼまたはその変異体に対し少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を有する、単離されたＮｐｒＥ酵素。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＮｐｒＥ酵素またはその変異体を含む組成物であって、バシラス・セリンプロテアーゼ（ＡｐｒＥ）が実質的に混入していない組成物。
【請求項１５】
前記混入ＡｐｒＥの量がＮｐｒＥまたはその変異体に対し約１重量%未満である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．５０Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．０５Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記混入ＡｐｒＥのセリンプロテアーゼ活性が０．００５Ｕ／ｍｌ未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が洗浄剤組成物である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記洗浄剤組成物が洗剤である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
さらに、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、及びセルラーゼから選択される少なくとも１の追加の酵素、または酵素誘導体が含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＮｐｒＥ酵素またはその変異体が少なくとも約０．０００１重量％含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＮｐｒＥ酵素またはその変異体が約０．００１から約０．５重量％含まれる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
さらに少なくとも１の補助剤が含まれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
さらに組成物の原液ｐＨを約３から約５にするために必要な量のｐＨ調整剤が含まれ、ｐＨ約３から約５において加水分解する物質が含まれていない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
ｐＨ約３から約５において加水分解する前記物質が、少なくとも１の界面活性剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記界面活性剤がエチレンオキサイド部位を有するスルホン酸ナトリウム塩である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が液状である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２９】
織物から成る物品および／または表面と、請求項１９に記載の洗浄組成物とを接触させる工程を含む洗浄方法。
【請求項３０】
さらに、織物から成る前記物品または前記表面と前記洗浄組成物とを接触させた後、前記表面および／または前記物品をすすぎ洗いする工程が含まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む動物用飼料である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、単離された中性メタロプロテアーゼ変異体を含む織物および／または皮革加工剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項３３】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）とが欠失したバシラス宿主細胞であって、プロモーターと作動可能に組み合わされた非相同ＮｐｒＥ酵素をコードする核酸で形質転換されたバシラス宿主細胞。
【請求項３４】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３５】
さらに内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）が欠失した、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３６】
さらに、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、および／または、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）が欠失した、請求項３５に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３７】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３６に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３８】
さらに、内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素 （ＷｐｒＡ）、および／または内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）が欠失した、請求項３６に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項３９】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項３８に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４０】
前記非相同ＮｐｒＥ酵素が、バシラス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮｐｒＥ酵素、またはその変異体である、請求項３３に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４１】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）と、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）と、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）と、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）とが欠失した、単離されたバシラス宿主細胞。
【請求項４２】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項４１に記載のバシラス宿主細胞。
【請求項４３】
内因性セリンアルカリ・プロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）と、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ（ＮｐｒＥ）酵素と、微量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）と、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）と、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）と、内因性バシロペプチターゼＦ酵素（Ｂｐｒ）と、内因性細胞壁に関連するプロテアーゼ酵素 （ＷｐｒＡ）と、内因性細胞外メタロプロテアーゼ酵素（Ｍｐｒ）とが欠失した、単離されたバシラス宿主細胞。
【請求項４４】
前記バシラス宿主細胞がバシラス・スブチリスである、請求項４３に記載のバシラス宿主細胞。
【国際調査報告】
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