(57)【要約】  本発明は、微生物および／またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む担体粒子に関する。本発明はまた、前記粒子を含む医薬組成物、医薬組成物の調製方法および動物の治療におけるこの組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物および／またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む担体粒子。
【請求項２】
一次転移が、疎水相中に含まれる結晶化合物の融解方法に対応することを特徴とする、請求項１に記載の担体粒子。
【請求項３】
化合物が、代謝化合物、特に脂肪酸エステルであることを特徴とする、請求項２に記載の担体粒子。
【請求項４】
親水相が、水および追加の化合物を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の担体粒子。
【請求項５】
追加の化合物が、ポリアルコール、好ましくはグリセロールであることを特徴とする、請求項４に記載の担体粒子。
【請求項６】
疎水相が、第２の微生物および／またはこのサブユニットを含有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の担体粒子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の担体粒子を含む、動物治療用の医薬組成物。
【請求項８】
担体粒子が分散している連続親水相を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
疎水相が、一次転移が動物の体温に関する所定温度において生じるように構成されていることを特徴とする、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
一次転移が、動物の体温未満の温度において生じることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
一次転移が、動物の体温において生じることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
一次転移が、動物の体温を超える温度において生じることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
微生物および／またはこのサブユニットを第１の親水相中に混合すること、
得られた混合物を、室温を超える温度において固液変換を受けることができる疎水相中で、固液変換が生じる温度を超える温度において乳化し、連続疎水相中の親水相滴の単一エマルションをもたらすこと、
得られたエマルションを固液変換が生じる温度を超える温度において第２の親水相と混合し、第２の親水相が医薬組成物の連続相になる二重エマルションをもたらすこと、
二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度に冷却すること
を含む、医薬組成物を調製する方法。
【請求項１４】
第２の親水相が、非水性化合物、好ましくはポリアルコール、より好ましくはグリセロールを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
冷却を、二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度を有する流体を含有する水と混合することにより行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
動物を微生物関連疾患について治療するための、請求項７から１２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物および／またはこのサブユニット用の担体、この担体を含む医薬組成物、医薬組成物の調製方法、ならびに動物を微生物関連疾患について治療するためのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患、特に伝染性感染性疾患から（ヒトを含む）動物を保護するにあたり、例えば野生型微生物による感染に直面した場合、動物に能力を発揮させ、防御応答を効果的に発現させるため、疾患に関連する１種以上の微生物（即ち、細菌およびウイルスを含むミクロンまたはサブミクロンサイズの生活形）および／またはこのサブユニット（一般に「抗原」と呼ばれる。）を含む医薬組成物、例えばワクチンを投与することは慣習的である。この目的のため、微生物が組成物中で使用される場合、微生物は生存形であるが非毒性形（「弱毒生」と称されることが多い。）または不活化形（「死滅」形）で投与されることが慣例である。微生物のサブユニット、即ち、動物内で微生物自体に対して免疫応答を誘導することができる抗原決定基を構成する微生物の一部を使用することも一般的である。例えば、一般に使用される細菌のサブユニットは、外膜タンパク質の一部である。死滅微生物および／またはサブユニットが使用される場合、標的動物内で免疫応答を刺激する成分が添加されることが多い。このような免疫応答刺激成分は、通常、「アジュバント」という用語により称される。様々な種類のアジュバントが公知である。これらのアジュバントの多くは、免疫刺激剤として鉱油をベースとする。これらの油は、水と配合されてエマルションを形成することが多い。相が不連続相であるか連続相であるかに応じて、エマルションの幾つかの種類を区別することでき、例えば、Ｗ／Ｏ（水滴が油中に分散している。）、Ｏ／Ｗ（油滴が水中に分散している。）またはＷ／Ｏ／Ｗエマルション（水滴が油滴中に分散しており、さらに油滴が水中に分散している。）などである。アジュバント配合物は、医薬組成物中の微生物および／またはこのサブユニットを運搬する担体手段として使用することができる。担体は、微生物またはサブユニット自体の安定性に関してだけでなく、医薬組成物の物理的構成に関しても、貯蔵中に安定性を提供することが重要である。さらに、担体により容易な投与が可能になるべきであり、例えば、注射が好ましい経路である場合は低粘度が可能になるべきである。また、例えばエネルギーの最小量が製造時に費やされるほど、担体により医薬組成物の容易な配合が可能になることが重要である。この容易な配合は、エネルギーの取込みが通常、（少なくとも局所的な）温度増加を導き、この温度増加が微生物およびサブユニットの不可逆的変化を導くことが多く、さらに、治療される動物内での適切な免疫応答の誘導能の損失を導き得るので重要であり得る。
【０００３】
ＥＰ  １  １７９  ３４９から、貯蔵中に安定性を提供し、（低粘度に起因して）注射による容易な投与が可能になり、配合が容易である微生物および／またはこのサブユニット用の担体手段が公知である。この公知の担体手段は、液体脂またはワックスをベースとする連続油相中に分散水相を含む。油相は、チキソトロピー効果を提供する二酸化ケイ素粒子をこの相中に含む。このように、油相は、機械的に離隔された場合、油滴の凝固傾向が高度に低減するので、エマルションの極めて良好な機械的安定性を提供する高度に粘性である相と同様に挙動する。振とうされた場合、エマルションにより注射を介する投与が可能になるほど粘度が降下する。また、二酸化ケイ素粒子を含む油相が撹拌された場合、粘度は極めて低くなる。従って、チキソトロピー油相により、過剰なエネルギーの取込みなしで容易な配合が可能になる。しかしながら、この公知の担体は、幾つかの重要な欠点を有する。第一に、二酸化ケイ素は毒性、病変および膿瘍を伴うことが多い。従って、医薬組成物用の担体に適用することは好ましくない。さらに、レシピエントの体内の固体粒子の貯留物があまり認識されない。ヒト適用については、一般にリスクが高すぎるとみなされており、種畜における適用については、貯留物がヒト消費に好適ではない部位を導き得る。第二に、油相のチキソトロピー特性は、油相がもはや機械的に乱されていない場合、高粘度のほぼ即時的な再生を提供する。この高粘度のほぼ即時的な再生は、注射による投与にとって実用的ではなく：充填された注射器を実際の注射直前に十分に振とうしなければならない。それというのも、十分に振とうしなければ円滑な注射方法にとっては粘度が高すぎるからである。この「注射器を注射前に十分に振とうすること」は、医師または獣医師にとって慣用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第１  １７９  ３４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、従来技術の担体手段の欠点を克服または少なくとも緩和し、同時にこの担体手段の利点を可能な限り多く提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的のため、微生物および／またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む粒子である、担体粒子を発明した。本発明による粒子において、微生物および／またはサブユニットは、親水相（この意味における親水は、水との混合後に均質な一相混合物を形成することができるような水との親和性を有することを意味する。）中に含有され、親水相が、連続疎水相（疎水は、親水の反対である。）中に分散しており、疎水相が、室温、即ち２５℃において固体である。疎水相が室温において固体であるという事実は、少なくとも室温まで極めて良好な物理的安定性を提供する。本発明の極めて重要な態様は、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含むことである。一般に知られている通り、一次転移は不連続転移、即ち転移点におけるエントロピーの不連続変化を伴う転移である（Ｐ．Ｅｈｒｅｎｆｅｓｔ，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３６，１５３，１９３３を参照のこと）。一次転移は、転移を受ける化合物についての特性の急変に対応する。転移のこの種類の例は、氷から水への融解である。氷が融解するにつれて、Ｈ２Ｏ分子内の「次数」が変化し、転移点を超える温度および転移点未満の温度において完全に異なる特性が物質に提供される。本発明において、固液変換は一次転移を含むので、転移点を超える温度において粘度の極めて急激な降下を提供することができる。温度が、転移が生じる温度を超える温度に保持されている限り、粘度は低いままとすることができる。粘度を低いままとすることにより、一次転移が生じる温度をちょうど超える温度においてエマルションの容易な配合が可能になる。室温を超える温度における二次以上の転移（より正確には：連続転移）の場合、相の粘度は徐々に降下するにすぎず、このことは、比較的高いエネルギーの取込みが通常の結果であることを意味する（相が比較的高温に加温され、または粘度が比較的高いからである。）。本発明の意味における用語「固体」は、「自己担持（ｓｅｌｆ−ｂｅａｒｉｎｇ）」、即ち、「固体」組成物がこのようにみなされている場合、この物理的環境（例えば、「固体」が配置されている容器の形状）とは独立してこの形状を肉眼上保持するのに十分な内部強度を有することを意味することが留意される。本特許の意味における「液体」は、「液体」組成物がこのようにみなされている場合、この形状を保持するのに不十分な内部強度を有し、形状がこの物理的環境（例えば、「液体」が配置されている容器の形状）によりほぼ即時的に決まることを意味する。例えば、ゴム製バウンスボール（変形可能であるが）、ガラス片（非晶質ゆえ粘性であるが）および一部のゲル化流体（例えば、コンクリート、流体を含有するが）は、本特許出願の意味における固体であるとみなすことができる一方、糖蜜、サンタンクリームおよびパンケーキ生地（これらは、いくぶんのせん断力に耐えることができるが）のような組成物は、本特許出願の意味における液体であるとみなすことができる。「固体」は、固体組成物中の各化合物が固体構成でなくてはならないことを必ずしも意味するものでないことが特に留意される。例えば、固体ゲルの場合、組成物に自己担持特性を付与する分子の網目が組成物における実際の質量の１０％にすぎない一方、網目の間隙は液体により充填されている（従って、液体が組成物の９０％を形成している。）ということがあってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５のＤＳＣイメージである。
【図２】本発明による担体粒子の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
一実施形態において、一次転移は、疎水相中に含まれる結晶化合物、即ち、各次元における均質な構造を有する構成（しかし、各次元については必ずしも同一ではない。）を凝結後に形成することができる化合物の融解方法に対応する。このような化合物は、結晶化温度未満の温度においてこの固有の安定性およびこの融解温度を超える温度においてより低次の構成へのこの極めて迅速な変化が付与されるので、本発明による担体粒子における適用に極めて好適であることが考えられる。
【０００９】
さらなる実施形態において、化合物は、代謝化合物、特に脂肪酸エステルである。代謝化合物、例えば天然ワックス、例えばヤシ油（融点±２６℃）、パーム油（融点±３５℃）および羊脂（融点±４２℃）は、代謝により、特に標的動物の代謝により変化することができる特性を有する。この代謝による変化は、例えば鉱油が担体手段に使用される場合に慣例である貯留物の問題を緩和または完全に解決しさえする。この意味におけるワックスは、室温において固体であり、凝結後に通常結晶を形成し、手でこすると広がり、７５℃未満の融点を有する物質と定義される。
【００１０】
別の実施形態において、親水相は、水および追加の化合物を含む。水は、最も一般に使用される抗原用担体であり、実際、水は医薬組成物中の構成成分として極めて許容されるものである。この実施形態において、第２の化合物は、水に隣接して存在する。第２の化合物が水に隣接して存在することは、微生物またはサブユニット自体の安定性の改善を導くことができると考えられる。さらなる実施形態において、追加の化合物は、ポリアルコール、好ましくはグリセロールである。
【００１１】
別の実施形態において、疎水相は第２の微生物および／またはこのサブユニットを含有し、第２の微生物および／またはこのサブユニットは、第１の微生物および／またはこのサブユニットと同一であっても異なっていてもよい。この実施形態により、粒子のより大きい部分を微生物および／またはこのサブユニットの実際の運搬に使用することができるので、抗原による粒子のより高い負荷が可能になる。さらに、接触した場合に反応し、例えば動物に投与した場合に不十分な免疫応答を導く微生物またはサブユニットは、これらを２つの別個の相中に配置することにより離して保持することができ、含有物交換の耐久性が優れており、本発明の担体粒子についても同様である。また、抗原を２つの別個の相中に配置することにより、抗原放出のタイミングの差異を提供することができる。この抗原放出のタイミングの差異の提供により、例えば、適用後にプライマー／ブースター投与の効果を模倣するワンショット医薬製剤の配合が可能になる。
【００１２】
本発明はまた、本発明による担体粒子を含む動物治療用の医薬組成物に関する。この場合における動物治療は、胎内の動物、例えばニワトリ胚の治療をも含む。粒子はこれ自体使用することができ、例えば融解滴の形で動物に投与することができるが、一実施形態において、医薬組成物は、上記定義の担体粒子が分散している連続親水相を含む。この組成物の粘度は、相当部分が第２の親水相の粘度により決まり、第２の親水相は、例えば、１種以上の他の流体と場合により組み合わせられており、医薬的に許容される、特に治療すべき動物内で肉眼上確認可能な組織損傷を惹起しないオスモル濃度を親水相に付与する溶解および／または分散材料を場合により含む水であってよい。この組成物の粘度は、相当部分が第２の親水相の粘度により決まるという事実は、粘度が主として系の機械的乱れにより決まる従来技術の医薬組成物と比べて重要な改善である。本発明の意味における「治療」は、疾患またはこの疾患に関連する徴候の予防、診断、治癒および軽減を提供することを目的としてなされる行為を含むことが留意される。本明細書において上記の成分とは別に、（２つまたは３つの別個の相の１つ以上において）医薬組成物は、助剤の全ての種類、例えば、乳化剤、安定剤、酸化防止剤、アジュバント（例えば、アルミニウム塩、免疫刺激複合体、サポニン、リポ多糖の誘導体、マイコバクテリアなど）、診断目的用の追跡化合物、緩衝用または他の目的のための塩などを含むことができる。
【００１３】
ＥＰ  １  ０９７  ７２１から、担体としてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを含み、疎水相（「Ｏ」）は室温未満の温度において固体である、良好な貯蔵安定性を有する医薬組成物が公知であることが留意される。しかしながら、室温において、この公知の組成物の疎水相は液体である（実際、全ての例示組成物において、疎水相は０℃ほどの低温においても液体である。）。室温において液体であることに次いで、室温を超える温度において疎水相は一次転移を受けず、（過剰な機械的労力なしでＷ／Ｏエマルションの配合を可能にするため）疎水相を疎水相の主要構成成分の融解温度を超える５３℃から１２５℃の範囲の比較的高温に加熱することを要する。従って、この組成物は、ＥＰ  １  １７９  ３４９から公知である組成物よりも本発明からさらに遠くに除外される。
【００１４】
一実施形態において、疎水相は、動物の体温に関する所定温度において一次転移が生じるように構成されている。この実施形態は、微生物および／またはサブユニットの放出を高度に制御することができるという極めて重要な利点を有する。即ち、本出願人は、放出が標的動物内で一次転移が生じるモーメントもしくは速度に依存し、または標的動物内で一次転移が生じるか全く生じないかにさえ依存することを認識した。さらに、放出は、担体粒子が投与後に存在する部位（例えば、医薬組成物が筋肉内投与される場合は筋肉内の部位、経口投与される場合は胃腸管内の部位、血管内投与される場合は血中の部位）における体の温度に実質的に依存する。これらの見識が本出願人により組み合わせられ、一次転移が生じる温度が、標的動物の体温に関する結果でなく、この動物の体温（即ち、担体粒子が医薬組成物の投与後に局在化する部位において生じる温度）から数度離れていることまたはこの動物の体温と同一であることの所望により実際決まるこの実施形態を発明する基礎として機能した。
【００１５】
一実施形態において、一次転移は、動物の体温未満の温度において生じる。この実施形態において、抗原の放出は、動物に投与後、組成物が容易に加温されて体温に到達することができる事実が付与され、疎水相がほぼ即時的に、または少なくとも極めて速やかに液体になるので比較的迅速であり得る。固液転移後、得られたＷ／Ｏタイプのエマルションが不安定である場合、抗原の放出はほぼ即時的である。エマルションが安定であればあるほど、抗原材料が全て動物体に放出されるまで長くかかる。幾つかの場合において、エマルションの安定性が優れている場合、放出は、例えば合計３ヵ月ほど長くかかり得る。
【００１６】
別の実施形態において、一次転移は、動物の体温において生じる。この意味における「体温において」は、担体粒子が医薬組成物の投与後に局在化する部位における動物体の温度と１度以下で異なることを意味する。こうして、緩慢な長期持続放出を（とりわけ、一次転移が生じた後に得られるエマルションの安定性に依存する期間）提供することができ、例えば、いわゆるプライム−ブーストワクチン接種により得られる応答と同等である動物内での免疫応答を創出する。
【００１７】
さらに別の実施形態において、一次転移は、動物の体温を超える温度において生じる。こうして、極めて緩慢な放出または放出の延長さえも提供することができる。例えば、動物が発熱している場合に動物体内において到達するにすぎない一次転移が生じる温度を選択することが可能である。実際の転移が生じる前、例えば、固体疎水相への抗原の拡散を介する放出が考えられる。とりわけ、このような拡散は、抗原の種類および疎水相の種類に依存し、中間速度により、または比較的早く完全に妨害し、または極めて遅延させることができる。この実施形態における放出のための代替経路は、疎水相が動物により代謝される場合に提供することができる。こうして、放出のための経路を担体粒子において創出することができる。これらの実施形態は、例えば、放出を合計３ヵ月を超えて行うべき場合、または、例えば、動物が発熱を発症するまで、もしくは（局所的な）温度上昇を誘導する別の方法を受けるまで延長すべき場合に使用することができる。
【００１８】
本発明はまた、微生物および／またはこのサブユニットを第１の親水相中に混合すること、得られた混合物を、室温を超える温度において固液変換を受けることができる疎水相中で、固液変換が生じる温度を超える温度において乳化し、連続疎水相中の親水相滴の単一エマルション（即ち、１つの相が別の相中に分散しているエマルション）をもたらすこと、得られた単一エマルションを固液変換が生じる温度を超える温度において第２の親水相と混合し、第２の親水相が医薬組成物の連続相になる二重エマルション（即ち、１つの相が別の相中に分散しており、この別の相はさらに別の相中に順次分散しているエマルション）をもたらすこと、および二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度に冷却することを含む、医薬組成物を調製する方法に関する。
【００１９】
この調製方法の一実施形態において、第２の親水相は、非水性化合物、好ましくはポリアルコール、より好ましくはグリセロールを含む。こうして、本出願人は、分散疎水滴が小サイズ（典型的には５０μｍ未満）および極めて狭い粒子分布、例えば２０μｍ±１０μｍ（ｄ９５、体積平均）を有する二重エマルションを得ることができることを見出した。
【００２０】
一実施形態において、冷却は、二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度を有する流体を含有する水と混合することにより行う。この冷却は、医薬組成物を得る極めて便利な手段である。
【００２１】
本発明はまた、動物を微生物関連疾患について治療するための、本明細書において上記の医薬組成物の使用に関する。
【００２２】
本発明は、微生物またはこのサブユニットの特定の種類に限定されないことが留意される。原則として、本発明は、任意の微生物および／またはこのサブユニットと組み合わせて使用することができる。本発明を、目下のところ、本明細書において下記の実施例および図面を使用することによりさらに説明する。
【００２３】
実施例１  本発明による担体粒子および医薬組成物を調製する方法。
【００２４】
実施例２  アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＰＰ）抗原を含有する担体粒子の使用。
【００２５】
実施例３  ブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏ  ｖｉｒｕｓ）抗原を含有する担体粒子の使用。
【００２６】
実施例４  トリウイルスおよび細菌抗原を含有する担体粒子の使用。
【００２７】
実施例５  担体粒子の疎水相の特性決定。
【００２８】
図１  Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５のＤＳＣイメージ
図２  本発明による担体粒子の写真。
【実施例１】
【００２９】
本実施例においては、本発明による担体粒子および医薬組成物を得る方法を記載する。最初に、Ｉｎｕｔｅｃ  ＳＰ１界面活性剤（Ｏｒａｆｔｉ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）０．４４ｇを緩衝溶液１０．５６ｇに添加することにより緩衝溶液を作出する。得られた混合物（「混合物１」）を、磁気撹拌子を使用して１時間撹拌する。次いで、混合物１を撹拌することなく１２１℃において１時間高圧滅菌する（Ｖａｒｉｏｋｌａｖ，Ｈ＋Ｐ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この後、高圧滅菌を止め、ドアを開放し、混合物１を撹拌しながら４８℃に冷却させておく。この冷却を約１から２時間行う。
【００３０】
混合物１の冷却工程の間、７．８３ｇのＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５（Ｓａｓｏｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．１６ｇのＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５（Ｕｎｉｑｅｍａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に添加することにより次の混合物（「混合物２」）を作出し、混合物を５０℃に加熱し、次いで混合物を、油性溶液に好適なフィルター（このようなフィルターは、例えば、Ｐａｌｌ、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能である。）による０．２２μｍ濾過により滅菌する。得られた混合物２を使用まで４８℃において貯蔵する。
【００３１】
抗原の滅菌混合物は、抗原を滅菌緩衝液中に入れることにより調製する。緩衝液中の抗原の量は、最終ワクチン中の抗原単位の所望量に依存する。この抗原混合物（「混合物３」）は、使用まで室温において貯蔵する。
【００３２】
混合物３は、約６０℃の温度を有する水のバッチを使用することにより４８℃に迅速に加熱する。加熱工程は、好ましくは、５分未満で行うべきである。その間、混合物２  ７．２６ｇをウルトラタラックス（ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ）（Ｔ２５Ｂ，ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２４．０００ｒｐｍで使用して４８℃において均質化する。混合物３  ４．８４ｇを混合物２  ７．２６ｇにゆっくり添加することにより次の混合物を調製し、この調製は約２分間で行うべきである。得られた混合物を、混合物（「混合物４」）の質が許容されるものになるまで２４．０００ｒｐｍで均質化する。質は、４８℃をわずかに超える温度に予熱した対物ガラス（試料プレートとも称される。）を使用する標準的な光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０）を使用することにより確認される保温生成物の質である。混合物の質は、抗原相滴の９５％が５μｍより小さい場合に許容される。混合物４は、４８℃において１０分間貯蔵する。
【００３３】
次いで、混合物１を、ウルトラタラックス（Ｔ２５Ｂ）を２４．０００ｒｐｍで使用して４８℃において均質化する。この混合物１に、混合物４  １１．００ｇを３分間ゆっくり添加する。均質化は、規格が合致したらすぐに停止する。規格は：粒子の９９％が８０μｍより小さい（上記光学顕微鏡により確認）。得られた生成物（「混合物５」）は、４８℃において短時間（典型的には５分未満）貯蔵する。この生成物は、油（疎水性Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）が液体であるＷ／Ｏ／Ｗエマルションである。混合物５中の油滴の密度は、比較的高い。混合物５の冷却後の油滴の凝集を防止するため、固体球状物にするための滴の冷却に滴の希釈が伴うように、混合物を緩衝化し連続撹拌した溶液中で冷却する。この緩衝化溶液は、混合物１を調製するために使用した緩衝液と同一の緩衝液中のホルムアルデヒド１０％溶液０．５４ｇ、アジュバントＭｉｃｒｏｓｏｌ  Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（「ＭＤＦ」アジュバント、製品Ｍｙｃｏ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ＯｎｃｅおよびＥｎｄ−ＦＬＵｅｎｃｅ２に使用されるもの、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  ＵＳＡ）１１．４４ｇおよび混合物１を構成するために使用した緩衝液と同一の緩衝液６６．６５ｇを混合することにより作出し、この混合物を５℃に冷却する。この混合物（「混合物６」）を１００ｒｐｍで撹拌する（Ｅｕｒｏ−ＳＴＰ  ＣＶ撹拌機、ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この混合物６に、（４８℃において貯蔵していた）混合物５  ２０．００ｇを添加する。得られた医薬組成物を８℃未満において保持し、バイアル中に充填し、ワクチン接種まで２から８℃において貯蔵する。ＭＤＦアジュバントに代えて、アジュバントを取り除き、アジュバントを例えば緩衝化滅菌水により置き換えること、または任意の他のアジュバント、例えば、ＥＰ  ３８２２７１またはＥＰ  １６１３３４６に記載のアジュバントの１種以上を使用することを決定することができることに留意されたい。
【実施例２】
【００３４】
本実験のため、市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＡＰＰ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）から公知である抗原、即ちＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ、ＡｐｘＩＩＩおよびＯＭＰを使用した。これらの抗原を滅菌Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＣｌによりｐＨ７．５にした）中に入れ、実施例１に概説した混合物３を得た（注：同一の緩衝液を使用して混合物１を得る。）。この混合物３は、１ｍｌ当たり各抗原２５０Ｕｎｉｔを含有した。この混合物３は、最終的に、市販製品の１ｍｌ当たり２５Ｕｎｉｔと比べて１ｍｌ当たりＡＰＰ抗原１０Ｕｎｉｔを含有する配合物をもたらした。
【００３５】
試験に使用した動物は６週齢の仔ブタであった。６匹の仔ブタは、本明細書において上記の通り得られた配合物１ｍｌを頸部筋肉内注射により受けた。ブースターワクチン接種を４週間後に行った。６匹の仔ブタに、６および１０週齢において、市販のＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＡＰＰワクチンをワクチン２ｍｌの頸部筋肉内注射により与えた。６匹の仔ブタの対照群には、６および１０週齢において、リン酸緩衝生理食塩水２ｍｌを頸部筋肉内注射により与えた。動物を、局所反応、直腸温、臨床徴候およびアクチノバチルス・プルロニューモニアに対する抗体価について試験した。
【００３６】
ＡＰＰワクチンを与えた仔ブタ数匹は、第１および第２のワクチン接種後、穏やかな臨床徴候、例えば、震え、嘔吐および／または呼吸の増加、ならびに時折局所反応を示した。本発明による担体粒子を含む配合物を与えた動物は、対照動物の場合と同様、臨床徴候または局所反応を全く示さなかった。直腸温は、対照動物と比較した場合、担体粒子を含む配合物についてわずかに上昇した。最大の差異は、第１のワクチン接種後が０．７℃であり、第２のワクチン接種後が１．１℃であった。この差異は、許容レベル内であり、Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＡＰＰが投与されている場合の直腸温増加と等しく、またはこの直腸温増加より小さくさえある。得られた抗体価を表１に示す。これらの力価は、市販製品Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＡＰＰにより得られた力価に関して正規化する。
【００３７】
【表１】
2011504906.tif 000002
表に示されている通り、Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＡＰＰワクチン２ｍｌと比較して、新規配合物１ｍｌの投与により抗原の約２０％のみを注射したという事実に関わらず、力価は同等であり、またはわずかに改善さえしている。
【実施例３】
【００３８】
本実験のため、ブタサーコウイルス２型抗原を使用した。これらの抗原は、当分野において公知である、例えばＷＯ２００７／０２８８２３に記載のバキュロウイルス発現系内で発現される、ＯＲＦ２によりコードされるＰＣＶ２のタンパク質である。ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡから入手可能）中で緩衝化したホールセル溶解物を使用して実施例１に概説した混合物３を得た。この混合物は、抗原１００．０００（Ｅｌｉｓａ）Ｕｎｉｔ／ｍｌを含有する（これらのＵｎｉｔの２．５Ｅ０３はＯＲＦ２によりコードされるタンパク質２０μｇに等しい。）。最終配合物を得るため、実施例１による方法を以下の通り変更して続けた：混合物１を得るため、Ｉｎｕｔｅｃ０．２０ｇをＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（緩衝液として）９．８０ｇに添加し；混合物２を得るため、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ１８５  ９．８０ｇおよびＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５  ０．２０ｇを使用し；混合物４を得るため、混合物３  ５．００グラムおよび混合物２  ５．００グラムを使用し；混合物５を得るため、混合物４  １０．００グラムを混合物１に添加し；混合物６を得るための緩衝溶液を、ＰＣＶ抗原濃縮物（２２１５２８Ｕ／ｇ含有）０．６８グラムを１６．７２ｇのＭＤＦおよび３５．３２ｇのＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭと混合することにより作出し；この緩衝溶液に混合物５  ６．００グラムを添加して混合物６を得た。この混合物６は、最終的に、１ｍｌの生成物当たり、ＰＣＶ抗原２５００ＵｎｉｔをＷ／Ｏ／Ｗ二重エマルションの疎水相中に含有し、ＰＣＶ抗原２５００ＵｎｉｔをＷ／Ｏ／Ｗ二重エマルションの連続親水相中に含有する配合物をもたらした。
【００３９】
試験に使用した動物は２週齢の仔ブタであった。１０匹の仔ブタは、実施例１により得られた配合物２ｍｌを頸部筋肉内注射により受けた。１０匹の仔ブタに、１用量当たり５０００Ｕｎｉｔを含有する、ＷＯ２００７／０２８８２３により作出したＰＣＶワクチンをワクチン２ｍｌの頸部筋肉内注射により与えた。これらの仔ブタは、第１のワクチン接種から２週間後にブースターワクチン接種と同一のワクチン接種を受けた。１０匹の仔ブタの対照群には、ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ２ｍｌを頸部筋肉内注射により与えた。動物を、公知ワクチンによるブースターワクチン接種８週間後まで局所反応およびブタサーコウイルスに対する抗体価について試験した。
【００４０】
新規配合物を受けた仔ブタの数匹（３匹）について、この配合物の残存物が実験終盤においていくらか可視的であった。新規ワクチン接種により得られた抗体価の発現は、ブースターワクチン接種を与えていないという事実に関わらず、得られた力価レベルが公知ワクチンにより得られるレベルの約８０％の最大値（対数スケール上）に限定されてはいるが、公知ワクチンとほぼ同一であった。依然として、これらの力価は仔ブタ保護を顕著なレベルで提供するのに十分である。
【実施例４】
【００４１】
本実験のため、ウイルスおよび細菌トリ抗原の組合せを使用する。これらの抗原は、ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ  ＩＢ  ｍｕｌｔｉ＋ＮＤ＋ＥＤＳ（第１のウイルスワクチン）、Ｎｏｂｉｌｉｓ  ＲＴ  Ｉｎａｃ（第２のウイルスワクチン）およびＮｏｂｉｌｉｓ  Ｓａｌｅｎｖａｃ  Ｔ（細菌ワクチン）（全て、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）中に存在する抗原と同一の抗原である。最終配合物は、生成物１ｍｌ当たり、市販ワクチンの場合と同一の抗原量を含有する。この配合物を得るため、最初の２種の（ウイルス）ワクチンの抗原を８．５６グラムの滅菌水中に懸濁させて混合物３を得た。混合物１は、０．９６グラムのＩｎｕｔｅｃ  ＳＰ１および滅菌水（緩衝化せず）４７．０４グラムを使用することにより作出した。混合物２は、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５  ２４．５０グラムおよびＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５  ０．５０グラムを使用することにより得た。混合物４は、混合物３  １６．５グラムおよび混合物２  １６．５０グラムを使用することにより得た。混合物５は、混合物１および３それぞれ３３．０グラムを使用することにより得た。混合物６を得るための緩衝溶液は、Ｔｒｏｍｅｔａｍｏｌ（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）０．２６グラム、マレイン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）０．２５グラム、塩化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋから入手可能）０．９０グラム、滅菌水７９ｍｌ、水酸化アルミニウムゲル（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）２７．５０グラムおよびＮｏｂｉｌｉｓ  Ｓａｌｅｎｖａｃ  Ｔ中に存在する死滅サルモネラ菌を混合することにより作出した。混合物６は、最終的に、この溶液の他、混合物５  ２２．００グラムを使用することにより得た。
【００４２】
この配合物を使用して４週齢のニワトリにワクチン接種した。１０羽のニワトリの第１群に、新規配合物０．５ｍｌにより左胸筋中にワクチン接種した。１０羽のニワトリの第２群は、市販ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ  ＩＢ  ｍｕｌｔｉ＋ＮＤ＋ＥＤＳおよびＮｏｂｉｌｉｓ  ＲＴ  Ｉｎａｃを受けた。１０羽のニワトリの第３群は、市販製品Ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｓａｌｅｎｖａｃ  Ｔを受けた。トリをワクチン接種４および６週間後に採血し、回収した血清を抗原に対する抗体について試験した。新規組合せ配合物を既存製品と比較した場合、ＩＢ、ＲＴおよびサルモネラ抗原に対して良好な抗体価を得ることができたことは明らかである。しかしながら、ＥＤＳおよびＮＤ抗原に対する抗体価は、既存製品により得られる力価と比較した場合、低かった。
【実施例５】
【００４３】
本発明による担体粒子の疎水相における使用に好適な材料は、室温を超える温度において固液変換を受けなければならず、変換は一次転移を含む。このような材料は、例えば、実際に一次転移を含む転移か否かを判断するため、示差走査熱量測定計（ＤＳＣ）、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＳＣ７において室温を超える融点または融解範囲を有すると考えられる材料を選別することにより見出すことができる。このような転移を検出するのに好適な方法は、例えば、試料を５℃／分の速度においてこの融解温度を１０℃を上回って超える温度に加熱し、次いで試料を同一速度において１０℃に冷却することによりあらゆる熱履歴作用を除外する第１の加熱サイクルに試料を供することである。次いで、第２の加熱サイクルを使用して、材料が室温を超える温度において一次転移を受けるか否かを確かめる。この加熱サイクルは、試料を５℃の速度においてこの融解温度を１０°超える温度に加熱し、次いで試料を同一速度において１０℃に冷却することを含むことができる。この方法を、本発明による担体粒子の構成に好適な材料を選択するために使用した。図１に、同一方法を使用することにより得たＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５のＤＳＣダイアグラムを示す。
【００４４】
図１
図１は、実施例５により計測したＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５のＤＳＣダイアグラムを示す（Ｘ軸は温度（℃）を示し；Ｙ軸は熱流Ｈ（任意単位）を示す）。Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５は、この材料が１０℃から約６０℃に加温された場合に種々の転移を生じる化合物の混合物である。融解ピークＡの非対称形状が付与されるので、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ化合物を融解させた場合に２つの一次転移が生じる。融点は、それぞれ約４０および４７℃である。さらに、約３５℃において、この温度においてわずかな「ふくらみ」およびピークＡ）の左から右に移行した場合にベースラインの上昇が付与されるので、より高次の転移が生じることが考えられる。全体として、これらの転移は、３０℃付近において始まり、５０℃付近において終わる１つの幅広ピークとして現れる。融解材料を冷却した場合、融解材料は３５℃をちょうど超える温度において結晶化し始める。２つの区別される結晶化ピークＢが、一方は３３℃付近において、他方は２４℃付近において測定されるという事実は、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５を融解させた場合に見られる２つの一次転移の出現に対応する。
【００４５】
本実施例においてＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｅ８５およびＨ１８５を本発明による担体粒子を構成するために使用したが、疎水性であり、室温を超える温度において固液変換（変換は一次転移を含む。）を受ける限り、他の材料を使用することができることが明白であり得る。このような材料は、例えばＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ５（融解範囲約３４から３６℃）または分枝鎖アルコール、例えばＩＳＯＦＯＬ２８（融解範囲３２から３９℃）およびＩＳＯＦＯＬ３２（融解範囲４４から４８℃）である。ＩＳＯＦＯＬ２８およびＩＳＯＦＯＬ３２の２つの材料は、Ｓａｓｏｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手することもできる。他の好適な材料は、例えば水素化油、例えば、水素化ヒマシ油、パルミチン酸セチル、高融点オレイルアルコール（最大３５℃）、多数のトリグリセリドおよびＣｏｇｎｉｓ（Ｍｏｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）からＮｏｖａｔａの商標（同社のＰｈａｒｍａｌｉｎｅの一部）で入手可能な硬化脂またはＣｏｇｎｉｓからさらに入手可能な植物系ステアリン酸／パルミチン酸のＥｄｅｎｏｒ  Ｌ２  ＳＭ  ＧＳである。他の材料は、例えば、室温において液体であるが、室温を超える温度において（一次転移を受けて）融解する結晶ゲル化剤を含む油である。こうして、疎水材料の主要成分は液体であるが、ゲル化剤のゲル化分子の網目の間隙に収容される。このようなゲル化油は、実際、ゲル化剤の融解後に流体になる（半）固体担体粒子である。好ましくは、疎水相の構成に使用される材料は医薬的に許容されるものであり、即ち、これらの材料は医薬組成物中で投与された場合に顕著な物理的問題を誘発しない。より好ましくは、材料は医薬賦形剤と認識される。実務上、特に哺乳動物における使用について、一次転移のための典型的な温度は６０℃未満である。
【００４６】
図２
図２は、本発明による担体粒子の顕微鏡写真である。実施例２において得られた粒子のエマルションを１０００ｒｐｍで３９℃の温度において１５分間撹拌する。次いで、試料を取り出し、光学顕微鏡に好適な透明試料プレート上に配置する。浸漬油を添加し、試料を第２の透明試料プレートにより被覆する。次いで、標準的な光学顕微鏡の透過モードにおいて標準的な光源を使用して図１に表す像を得ることができる。図２の最小粒子は、直径約５μｍである。中央の大きい粒子は、約５０μｍの直径を有する。これらの粒子は、疎水連続相からなり、疎水連続相中に分散している水性滴を有し、水性滴は典型的には０．５から５μｍのサイズであり、ＡＰＰ抗原を含む。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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