(57)【要約】  本発明は、腺疫菌エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種の一方または両方のタンパク質由来の少なくとも一つの抗原性エピトープまたは抗原決定基を含む、少なくとも一つの抗原を含む抗原性組成物、およびに腺疫菌エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種に対する非ヒト哺乳動物の免疫化のためのその使用に関する。本発明は、上記の抗原性組成物を免疫化成分として含む、ワクチン組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原を含む抗原組成物であって、
前記少なくとも１つの抗原は、腺疫菌エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種のタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部であり、かつ前記タンパク質またはポリペプチドの前記少なくとも一部は、腺疫菌の少なくとも１つの抗原性エピトープまたは抗原性決定基を含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１３に示すＥＡＧと命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号１０に示すＩｄｅＥと命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号１に示すＩｄｅＥ２と命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号３に示すＥｑ５と命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号５に示すＥｑ８と命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号７に示すＩｄｅＺ２と命名されたタンパク質またはポリペプチド、配列番号８に示すＥｑｚ５と命名されたタンパク質またはポリペプチド、及び配列番号９に示すＥｑｚ８と命名されたタンパク質またはポリペプチド、またはこれらの類似体もしくは断片からなる群より選択され、及び、
ＥＡＧを含む組成物が、ＩｄｅＥ，ＩｄｅＥ２，Ｅｑ５，Ｅｑ８，ＩｄｅＺ２，Ｅｑｚ５およびＥｑｚ５からなる群より選択されるタンパク質またはポリペプチドである、少なくとも１つのさらなる抗原を含む、抗原組成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドはＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２からなる群より選択され、かつＩｄｅＥ２を含む組成物がさらに少なくとも一つの抗原を含む、請求項１の抗原性組成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドがＥｑ５およびＥｑ８からなる群より選択される、請求項１または２の抗原性組成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドがＥＡＧ，Ｅｑ５およびＥｑ８からなる群より選択され、前記組成物が、配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するＣＮＥ（またはＳＥＣ）と命名されたタンパク質またはポリペプチド、および配列番号２９に示すアミノ酸配列を有するＳｃｌＣと命名されたタンパク質またはポリペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの抗原を含む、請求項１の抗原性組成物。
【請求項５】
前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドはＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２からなる群より選択される、請求項４の抗原性組成物。
【請求項６】
前記抗原ＥＡＧ，ＳｃＩＣ，ＣＮＥ（またはＳＥＣ），Ｅｑ５，Ｅｑ８，ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２を含み、または前記組成物が前記抗原ＥＡＧ，ＳｃＩＣ，ＣＮＥ（またはＳＥＣ），Ｅｑ５およびＥｑ８を含む、請求項１の抗原性組成物。
【請求項７】
前記少なくとも一つのタンパク質がＥＡＧ、Ｅｑ８，およびＩｄｅＥ２からなる群より選択され、前記組成物はＩｄｅＥ， Ｅｑ５，ＩｄｅＺ２，Ｅｑｚ５およびＥｑｚ８からなる群より選択されるさらに少なくとも一つの抗原を含む、請求項１の抗原性組成物。
【請求項８】
少なくとも一つの抗原が組換え的に生産された、請求項１〜７のいずれか一項の抗原性組成物。
【請求項９】
少なくとも一つの抗原が単離されたまたは精製された抗原である、請求項１〜８のいずれか一項の抗原性組成物。
【請求項１０】
少なくとも一つの組替えベクター、およびそれに挿入された、前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、かつ  前記ベクターは、腺疫菌感染に感受性の非ヒト哺乳動物の生体内で前記ポリペプチドを発現できる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原性組成物。
【請求項１１】
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルス性ベクターの発現ベクターであり、かつ前記ポリヌクレオチドが配列番号１２および１４〜２１に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の抗原性組成物。
【請求項１２】
免疫原性組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項の抗原性組成物。
【請求項１３】
免疫化成分として請求項１〜１２のいずれか一項の抗原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、非ヒト哺乳動物の腺疫菌感染を予防するワクチン組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１３のワクチン組成物。
【請求項１５】
感受性哺乳動物、好ましくはウマに対する腺疫菌エクイ亜種が引き起こす腺疫を予防するワクチンである、請求項１３〜１４のいずれか一項のワクチン組成物。
【請求項１６】
生理的に投与可能な形態で提供され、かつ好ましくは皮下または経鼻接種で投与可能な、請求項１３のワクチン組成物。
【請求項１７】
腺疫菌感染に感受性な哺乳動物、好ましくはウマにおいて、腺疫菌抗原に向かう血清、粘膜および／または気管支洗浄抗体応答を刺激する、請求項１５または１６のワクチン組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項の抗原性組成物の抗原または免疫原を生産する方法であって、
（ａ）前記抗原をコードするＤＮＡ断片を提供するステップと、そして前記断片を発現ベクターに導入するステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片を含む前記ベクターを適合する宿主細胞に導入するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で提供された前記宿主細胞を  前記DNA断片にコードされる前記生産物の発現に必要な条件下で培養するステップと、
（ｄ）前記培養した宿主細胞より発現した生産物を単離するステップ
とを含み、かつ、任意で、
（ｅ）ステップ（ｄ）で単離した生産物を、アフィニティークロマトグラフィーまたは当技術分野で既知の他のクロマトグラム法で精製するステップ
とを含む、方法。
【請求項１９】
前記ワクチン組成物が、請求項１〜１２のいずれか一項の抗原性または免疫原性組成物を免疫化成分として含み、前記方法が前記抗原性または免疫原性組成物と薬学的に許容される担体とを混合するステップを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項のワクチン組成物の調製方法。
【請求項２０】
ウマにおけるエクイ亜種が原因の腺疫を含む腺疫菌感染を予防するワクチンを調製するための、請求項１〜１２のいずれか一項の抗原性または免疫原性組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項の抗原性調製物を動物宿主に投与して、前記動物宿主において抗体を生産するステップと、
前記動物宿主において生産された前記抗体を含む抗血清を回収するステップ
とを含む、抗血清の生産方法。
【請求項２２】
非ヒト哺乳動物、好ましくはウマにおける腺疫菌感染の予防的治療または治療方法であって、前記哺乳動物に、免疫学的に効果のある量の、請求項１３〜１７のいずれか一項のワクチン組成物、または請求項２１に従って生産された抗血清を投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
ウマを腺疫菌感染から予防する方法であって、皮下または経鼻で、請求項１３〜１７のいずれか一項のワクチン組成物をウマに接種して、前記ウマにおいて腺疫菌に対する免疫応答を誘導するステップを含む、方法。
【請求項２４】
鼻咽頭粘膜におけるＩｇＧおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＭ抗体を形成する免疫応答が前記ウマにおいて誘導された、請求項２３の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの、好ましくは少なくとも２つの、請求項１〜１２のいずれか一項の組成物のタンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体を含む、抗体調製物であって、前記抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであって、または前記調整物は前記抗体の断片を含む、抗体調製物。
【請求項２６】
腺疫に対して予防的または治療的に使用され、かつ腺疫菌感染に感受性のある、または腺疫菌に感染した非ヒト哺乳動物に投与した場合、受動的免疫を提供する、請求項２５の抗体調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば馬などの非ヒト哺乳類に対する、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）に対する免疫処置のための、抗原組成物又は免疫原性組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウマにおける連鎖球菌感染症は、ランスフィールド（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）Ｃ群に分類され、エクイ（ｅｑｕｉ）およびズーエピデミカス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）とそれぞれ命名された２つの亜種を含む、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）種が主な原因である。
【０００３】
実質的にウマに限定される腺疫菌エクイ亜種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． ｅｑｕｉ）は、全世界に分布し、かつウマの上気道への伝染性の強い重度の病気である、腺疫の原因病原体である。腺疫は、全世界的に最も頻繁に報告されるウマの病気の一つであり、熱、鼻汁、咽頭後リンパ節および下顎リンパ節における膿瘍形成を特徴とする。 いくつかの場合において、この病気は、擬似腺疫（ｂａｓｔａｒｄ  ｓｔｒａｎｇｌｅｓ）と呼ばれる、体内における転移性経過を示す。この病気は全世界的に分布し、かつ多大な経済的損失を引き起こす。その上、腺疫は強い伝染性の病気でありながら、感染した動物だけでなく、例えば罹災した種馬飼育場の他のすべての動物も、少なくとも３ヶ月は隔離しなければならない。
【０００４】
腺疫菌亜種ズーエピデミカスは、健康なウマの上気道においてしばしば日和見共生をしていると考えられている。しかしながら、ストレス後またはウイルス感染後は、腺疫菌亜種ズーエピデミカスは、腺疫様症状をもたらす、二次感染を引き起こす。その上、ズーエピデミカス亜種はウマだけでなく、ブタ、イヌ、ネコ、およびウシなどの広範囲にわたる他の動物にも感染する。ヒトでも、ズーエピデミカス亜種の感染の症例が報告された。この亜種は、子宮内膜炎、子宮頸炎、流産、乳腺炎、肺炎、膿瘍および関節感染などの状態における一次病原体として関係している。
【０００５】
これらの連鎖球菌感染は、ペニシリン、テトラサイクリン、またはゲンダマイシンなどの抗生物質で手当てし治療することは可能であるが、このような感染の爆発を阻害し、かつ抗生物質治療に関連した耐性株の発生リスクを未然に防ぐかまたは減少させる、効果的な予防薬が望まれている。
【０００６】
しかしながら、Ｓ．エクイに対するワクチンなどの、予防薬の開発に多くの試みがなされてきたにもかかわらず、エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種に対する効果的なワクチン又は免疫製剤は、現在までに利用可能ではない。
【０００７】
存在する腺疫に対するワクチンは、例えば熱殺菌などの不活性化、または弱毒化した腺疫菌エクイ亜種、もしくは酸抽出／Ｍ−タンパク質中でのムタノリシン濃縮、すなわちＳ．エクイ株産生の免疫原生タンパク質に基づく。Ｍ様タンパク質に基づく腺疫菌ズーエピデミカス亜種に対するワクチンは、米国特許出願第５５８３０１４号に開示されている。国際特許出願第８７／００４３６号では、ウマに投与後、上咽頭粘膜における抗体応答を刺激する、腺疫菌に対するワクチンの使用のための、腺疫菌の非病原性株が開示されている。
【０００８】
近年、腺疫に対する市販ワクチンであるＥｑｕｉｌｉｓ ＳｔｒｅｐＥ（ＩｎｔｅｒｖｅｔＶＥＴ社、英国）が、英国において販売され（２００４年１１月）、ヨーロッパ、南アフリカおよび南米において使用されている。しかしながら、弱毒化（生きた、欠損変異した）した腺疫菌エクイ亜種に基づくこのワクチンの安全性及び有効性は、疑わしい。
【０００９】
既存の開発ワクチンはまたは免疫原生製剤は、副作用に阻害され、さらに、不十分な保護を提供するため、望ましくない副作用を引き起こすことなく、腺疫菌の感染を保護する及び／またはその蔓延を阻害する、ワクチンなどの有効かつ安全な予防薬が必要とされている。
【００１０】
真核細胞表面への接触が、感染の確立および細菌病原体によるコロニー形成に必須のステップであることは、周知である。よって、宿主細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）または細胞質タンパク質の異なる成分と相互作用及び／または結合する連鎖球菌の表面タンパク質は、免疫的な目的の活性成分として使用するための、潜在的な候補である。
【００１１】
これは、上記のＭ様タンパク質に基づくワクチン、または国際特許出願第９８／０１５６１号に開示されている記載に例示されている。フィブリノーゲンおよび補体因子Ｈの、Ｍタンパク質への結合は、腺疫菌の貪食作用への抵抗に重要であると考えられている。
【００１２】
宿主細胞への接触のために腺疫菌が使う他の機序は、ＥＣＭ成分のフィブロネクチン（Ｆｎ）が挙げられる（参考文献２１、２２）。Ｆｎ結合細菌性細胞表面タンパク質と固定Ｆｎとの結合は、腺疫菌の上皮細胞への内在化を促進する（参考文献２，２３，２４）。フィブロネクチンは、細胞質および細胞外マトリックスでは原繊維形態で見られる、二量体糖タンパク質である。Ｆｎの主な機能は、Ｆｎ分子の任意の領域を特異的な細胞表面受容体への結合に関与する、真核細胞の基質接着を仲介することである。さらにＦｎは、ＤＮＡ、ヘパリン、フィブリン、およびコラーゲンなどの、いくつかの他の巨大分子と相互作用する。
【００１３】
従って、異なる腺疫菌由来のＦｎ結合タンパク質が以前にクローン化され、配列決定された。例えば、腺疫菌からは、ズーエピデミカス亜種のＦｎ結合性細胞表面タンパク質である、一つのＦｎ結合タンパク質がクローン化および特徴付けられ、ＦＮＺと命名された（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６年，参考文献９）。他の腺疫菌エクイ亜種由来のＦｎ結合タンパク質が、Ｌｉｎｄｍａｒｋ およびＧｕｓｓによってクローン化され、かつ特徴付けられた（１９９９年、参考文献１２）。ＳＦＳと命名された後者のタンパク質、およびそのウマの腺疫予防ワクチン中での活性成分として使用使用できる可能性は、国際出願第００／３７４９６号で開示されている。
【００１４】
Ｊｏｎｓｓｏｎ 等 （１９９５年、参考文献８）において、血漿プロテアーゼインヒビターα２Ｍとの結合を仲介する、ＺＡＧと命名されたタンパク質が、腺疫菌ズーエピデミカス亜種よりクローン化及び特徴付けられた。この文献中では、このタンパク質は、連鎖球菌Ｍタンパク質機能が類似していると推測されている。このタンパク質ＺＡＧも、国際出願第９５／０７２９６号に開示され、そのα２Ｍ結合特性も含まれている。 しかしながら、その免疫原生特性、または例えばウマの腺疫予防ワクチン中の活性成分として使用できる可能性は、開示されていない。ＺＡＧをコードする遺伝子ｚａｇは、これらの参考文献中に開示されている。
【００１５】
腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来の、上記のｚａｇ遺伝子と類似の遺伝子であって、エクイ亜種に存在する遺伝子が、Ｌｉｎｄｍａｒｋ 等 （１９９９年、参考文献１１）および Ｌｉｎｄｍａｒｋ （１９９９年、参考文献１３）に記載されている。この遺伝子は以下で、ｅａｇと命名され、ＥＡＧと命名されたタンパク質をコードする。
【００１６】
国際出願第２００４／０３２９５７ Ａ１号では、腺疫菌に存在し、かつその組成物が、腺疫菌に存在し、ＦＮＺ，ＳＦＳ，ＳＥＣ，及びＳｃｌＣとそれぞれ命名されているタンパク質群より選択される、好ましくは少なくとも一つのさらなる抗原を含む、ＥＡＧと命名されたタンパク質由来の少なくとも一つの抗原を含む、抗原性組成物が開示されている。
【００１７】
国際出願第２００７／１１５０５９ Ａ２号では、本願に添付の配列表に示す特異的なアミノ酸配列もしくはその類似体、またはそのポリペプチドの一部であり、かつ少なくとも一つのエピトープを含む断片を有する、少なくとも一つの腺疫菌のポリペプチドを含む、サブユニット免疫原性またはワクチン組成物が開示されている。しかしながら、腺疫に対する免疫を与えたウマに関する結果は、この文献では提供されていない。
【００１８】
Ｌａｎｎｅｒｇａｒｄ，Ｊ．，Ｆｒｙｋｂｅｒｇ，Ｌ．およびＧｕｓｓ， Ｂ．（２００３年） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２２２： ６９−７４（参考文献２８）で報告されている研究では、ｃｎｅと命名された新しい遺伝子が単離され、かつ対応するタンパク質ＣＮＥが特徴付けられた。
【００１９】
Ｆｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｆｒｙｋｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｈｉｒｓｔ，Ｔ．， Ｒ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ａ．，Ｇｕｓｓ，Ｂ． および Ｆｌｏｃｋ，Ｊ．−Ｉ．（２００４年） Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：３２２８−３２３６（参考文献５）では、ウマ腺疫のマウスモデルにおいて、ＦＮＳ，ＳＦＳ，及びＥＡＧとそれぞれ命名されたタンパク質の一部が、マウスを免疫するのに用いられたことが報告されている。ＦＮＺおよびＥＡＧは、安全かつ効果的な、腺疫に対するワクチンの開発の有望な候補と考えられている。
【００２０】
Ｌａｎｎｅｒｇａｒｄ，Ｊ．およびＧｕｓｓ，Ｂ．（２００６年）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２６２： ２３０−２３５（参考文献２６）では、それぞれ腺疫菌エクイ亜種および腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来の２つの新規タンパク質ＩｄｅＥおよびＩｄｅＺが、酵素活性に関して特徴付けられた。
【００２１】
Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｔｉｍｏｎｅｙ 等、２００７年）では、ＣＮＥ（ＳＥＣとも命名）およびＳｅ４４．２（ＩｄｅＥ２とも命名）を含む、腺疫菌の非常に多くの組換え細胞外タンパク質が、ワクチン組成物として有用でないことが報告されている。先にマウスで得られたＳＣＥ／ＣＮＥの結果は、ウマに適用されないと推測される。したがって、必要な表面局在タンパク質の組換え形態が、ワクチン組成物の好ましい候補であるかどうかは明らかではない。
【００２２】
Ｗａｌｌｅｒ，Ａ．，Ｆｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｚ．，Ｋａｒｌｓｔｒ（ｏｅ）ｍ，Ａ．，Ｌａｎｎｅｒｇａｒｄ，Ｊ．，Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｒ．，Ｇｕｓｓ，Ｂ．および Ｆｌｏｃｋ，Ｊ．−Ｉ．（２００７年）Ｖａｃｃｉｎｅ ２５： ３６２９−３６３５（参考文献２７）では、腺疫菌エクイ亜種由来の組換え抗原ＥＡＧ，ＣＮＥおよびＳｃｌＣを用いたウマの腺疫に対するワクチン接種が報告されている。この研究では、ワクチン接種した動物は、腺疫菌エクイ亜種で曝露後、顕著に減少した細菌の回復、および顕著に低いレベルの鼻汁を示した。
【００２３】
効果的なワクチンを開発するために多大な努力がなされ、また国際出願第２００４／０３２９５７ Ａ１号のいくつかの免疫化成分は、腺疫菌感染を予防するワクチンとして使用する有力な候補であるが、高度の免疫原性を有し、かつ制限された副作用を示す、または副作用を示さない、安全なワクチンの開発が未だに望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、腺疫菌エクイ亜種およびズーエピデミカス亜種の一方または両方に存在するタンパク質由来の、少なくとも一つの抗原性エピトープまたは抗原性決定因子を含む、少なくとも一つの抗原、好ましくは免疫原を含む、抗原性、好ましくは免疫原性組成物、ならびにその非ヒト哺乳動物の腺疫菌エクイ亜種および／またはズーエピデミカス亜種に対する免疫化のための使用に基づく。
【００２５】
本発明は、上記の該抗原性組成物を免疫原生成分として含むワクチン組成物、該抗原性、好ましくは免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製する方法、非ヒト哺乳動物において腺疫菌に対する免疫応答を誘導する方法、および非ヒト哺乳動物における腺疫菌感染を予防または治療する方法を目指す。一般的に使用する場合、「腺疫菌」という表現は、腺疫菌エクイ亜種およびズーエピデミカス亜種の一方または両方を表す。
【００２６】
好ましい態様では、本発明はウマなどのウマ科の腺疫を予防するワクチンを目指す。
【００２７】
腺疫菌エクイ亜種が原因の感染に関連して、「非ヒト哺乳動物」という表現は、原則的にウマ、ロバ、およびシマウマ、ならびにラバおよびケッティなどのこれらの交雑種からなる、ウマ科に属する動物を表す。ラクダおよびヒトコブラクダもこれに包含される。
【００２８】
腺疫菌ズーエピデミカス亜種が原因の感染に関連して、「非ヒト哺乳動物」という表現は、ウシ、ブタ、イヌおよびネコなどの他の哺乳動物を、さらに表す。
【００２９】
以下に、本発明は、図面を参考にしてより詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ポリペプチドＥｑ５およびＥｑ８（白丸）でワクチン接種した、または未ワクチン接種（黒丸）した後に、腺疫菌エクイ亜種株１８６６で実験感染した、所定のマウスの体重減少を示す。平均値及び誤差を示している。
【図２】ポリペプチドＥｑ５およびＥｑ８（白丸）でワクチン接種した、または未ワクチン接種（黒丸）した後に、腺疫菌エクイ亜種株１８６６で実験感染した、所定のマウスの鼻腔成長を示す。平均値及び誤差を示している。
【図３】ポリペプチドＥＡＧ（白四角）、ポリペプチドＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２（白丸）でワクチン接種した後、または未ワクチン接種（黒丸）した後に、腺疫菌エクイ亜種株１８６６で実験感染した、所定のマウスの体重減少を示す。平均値及び誤差を示している。
【図４】ポリペプチドＥＡＧ（白四角）、ポリペプチドＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２（白丸）でワクチン接種した後、または未ワクチン接種（黒丸）した後に、腺疫菌エクイ亜種株１８６６で実験感染した、所定のマウスの鼻腔成長を示す。平均値及び誤差を示している。
【図５】図５ａおよび５ｂは、ＥＡＧ＋ＣＮＥ＋ＳｃｌＣ 経鼻投与（黒四角）、Ｅｑ５＋Ｅｑ８経鼻投与（黒丸）および対照（白丸）で免疫化したマウスの体重減少および鼻腔成長を示している。平均値及び誤差を示している。
【図６】抗原投与接種材料の生育を示している（腺疫菌エクイ亜種４０４７）
【図７】ワクチン接種段階でのポニーの平均体温を示している。
【図８】ワクチン接種段階での鼻のスコアの平均を示している。
【図９】ワクチン接種段階でのリンパ節のスコアの平均を示している。
【図１０】ワクチン接種段階での鼻洗浄液中の腺疫菌ズーエピデミカス種の平均カウントを示している。
【図１１】抗原投与後のポニーの平均体温を示している
【図１２】抗原投与段階での平均フィブリノーゲンレベルを示している。
【図１３】抗原投与段階での平均好中球レベルを示している。
【図１４】抗原投与段階での平均リンパ節スコアを示している。
【図１５】抗原投与段階での平均リンパ節スコアを示している。
【図１６】抗原投与段階での鼻洗浄液中の腺疫菌ズーエピデミカス種の平均カウントを示している。
【図１７】死後の実験における平均病理スコアを示している。
【図１８】平均組織病理スコアを示している。
【図１９】７頭の免疫したウマの鼻洗浄液中のＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。切捨ての吸光度値１．０を与えるのに必要とされた血清の対数希釈が、各個別の鼻洗浄液サンプルについて計算された。平均値（ｎ＝７）および標準誤差が示されている。免疫化前（免疫前１日目）および３回目の免疫化から１２日後（８６日目）に採取したサンプルが示されている。ウマは、ＥＡＧ，ＣＮＥおよびＳｃｌＣで免疫化されている。
【図２０】７頭の免疫したウマの血清中のＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。切捨ての吸光度値１．５を与えるのに必要とされた血清の対数希釈が、各個別の鼻洗浄液サンプルについて計算された。平均値（ｎ＝７）および標準誤差が示されている。免疫化前（免疫前１日目）、Ｖ２後（７１日目）、およびＶ３後（８６日目）に採取したサンプルが示されている。
【図２１】７頭の免疫したウマ（Ｐｅｎｔａｖａｃ）の血清中のＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。切捨ての吸光度値１．５を与えるのに必要とされた血清の対数希釈が、各個別の鼻洗浄液サンプルについて計算された。平均値（ｎ＝７）および標準誤差が示されている。免疫化前（免疫前１日目）、Ｖ２後（７１日目）、Ｖ３後（８６日目）、およびＶ３とＶ４の間（２７０日目）に採取したサンプルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［配列の簡単な説明］
配列番号１は、ＩｄｅＥ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、組換えＩｄｅＥ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｅｑ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、組換えＥｑ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｅｑ８タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、組換えＥｑ８タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ズーエピデミカス亜種由来のＩｄｅＺタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ズーエピデミカス亜種由来のＥｑｚ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ズーエピデミカス亜種由来のＥｑｚ８タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＩｄｅＥタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ズーエピデミカス亜種由来のＩｄｅＺタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２および１３は、本発明に関して通常ＥＡＧと命名されている、ｅａｇ遺伝子のヌクレオチド配列およびＥＡＧ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
配列番号１４は、ｉｄｅＥ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、ｅｑ５遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６は、ｅｑ８遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、ズーエピデミカス亜種由来のｉｄｅＺ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１８は、ズーエピデミカス亜種由来のｅｑｚ５遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、ズーエピデミカス亜種由来のｅｑｚ８遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２０は、ｉｄｅＥ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、ズーエピデミカス亜種由来のｉｄｅＺ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２〜２７は、オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８は、ＣＮＥ（またはＳＥＣ２．１６）タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＳｃｌＣタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、免疫化に使用する、組換えＩｄｅＥのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１〜３２は、プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
本発明は、非ヒト哺乳動物に投与した場合、抗原性応答、好ましくは免疫原性応答を導くことを可能にする、腺疫菌のポリペプチドまたはタンパク質の同定、およびこれらのポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の同定に関する。
【００３３】
本発明は、該ポリペプチドもしくはタンパク質、または該ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の断片または類似体にも関連する。
【００３４】
より特異的には、細胞外タンパク質をコードする腺疫菌の遺伝子が同定され、かつ続いて、対応する産物が発現されて、ワクチン研究において評価された。本発明は、少なくとも部分的に、このような研究に基づく。
【００３５】
したがって、本発明は少なくとも一つの抗原を含む抗原性組成物に関し、前記少なくとも一つの抗原は、少なくとも腺疫菌エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種のタンパク質の一部を含み、かつ前記少なくとも該タンパク質の少なくとも一部は、腺疫菌の少なくとも一つの抗原性エピトープまたは抗原性決定部分を含む。
【００３６】
一実施形態によれば、本発明は少なくとも一つの抗原を含む、抗原性組成物に関し、 
前記少なくとも一つの抗原は、少なくとも腺疫菌エクイ亜種またはズーエピデミカス亜種のタンパク質の一部を含み、かつ前記少なくとも該タンパク質の少なくとも一部は、腺疫菌の少なくとも一つの抗原性エピトープまたは抗原性決定部分を含み、かつ、該タンパク質またはポリペプチドは、
ＥＡＧと命名され、かつ配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
ＩｄｅＥと命名され、かつ配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
ＩｄｅＥ２と命名され、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
Ｅｑ５と命名され、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
Ｅｑ８と命名され、かつ配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
ＩｄｅＺ２と命名され、かつ配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、
Ｅｑｚ５と命名され、かつ配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド、および
Ｅｑｚ８と命名され、かつ配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド、またはその類似体もしくは断片、からなる群より選択され、かつ、ＥＡＧを含む組成物は、タンパク質またはポリペプチドであり、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５、Ｅｑ８，ＩｄｅＺ２、Ｅｑｚ５、およびＥｑｚ８からなる群より選択される、少なくともさらに一つの抗原を含む。
【００３７】
便宜上、配列の詳細な説明で示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、しばしば単にＥＡＧ，ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５，Ｅｑ８，ＩｄｅＺ２、Ｅｑｚ５，およびＥｑｚ８とそれぞれ命名される。ＥＡＧ，ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５，Ｅｑ８と命名されたタンパク質は腺疫菌エクイ亜種で見つけることができ、かつＩｄｅＺ２、Ｅｑｚ５，およびＥｑｚ８と命名されたタンパク質は腺疫菌ズーエピデミカス亜種で見つけることができる。
【００３８】
現存の抗原性組成物または免疫原性組成物の抗原または免疫原は、該タンパク質もしくはポリペプチドの全アミノ酸配列を含むことができ、またはそのＣ末端もしくはＮ末端などの断片、もしくはその類似体を含むことができる。例えば、ＥＡＧのＮ末端断片は、本発明の様々な態様に従って使用されている。
【００３９】
一実施例では、本発明は、ＥＡＧ，ＩｄｅＥ，ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５，Ｅｑ８、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＺ２、Ｅｑｚ５，およびＥｑｚ８からなる群より選択される、少なくとも２または３の、抗原または免疫原を含む、抗原性組成物または免疫原性組成物に関する。
【００４０】
特定の態様では、本発明は、ＥＡＧ，ＩｄｅＥ，ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５，およびＥｑ８からなる群より選択される、少なくとも２または３の、抗原または免疫原を含む、抗原性組成物または免疫原性組成物に関する。好ましくは、この組成物は、ＳｃｌＣ（配列番号２９）およびＣＮＥ（配列番号２８）（ＳＥＣ、例えばＳＥＣ２．１６とも命名）のいずれかまたは両方の上記の抗原も含む。さらなる態様は、ＥＡＧ，ＳｃｌＣ、ＣＮＥ、Ｅｑ５，Ｅｑ８を含む抗原性組成物に関する。
【００４１】
好ましい組成物は、Ｅｑ５およびＥｑ８をそれぞれ含む、２つの抗原または免疫原を含む。さらなる態様において、本発明は、好ましくはＥＡＧ，ＩｄｅＥ、およびＩｄｅＥ２を含む、３つの抗原または免疫原を含む組成物に関する。本発明は、にＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２のいずれかまたは両方を含む組成物にも関連する。
【００４２】
本発明は、抗原性組成物にも関連し、前記少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドがＥＡＧ，Ｅｑ５，およびＥｑ８からなる群より選択され、かつ組成物が、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する、ＣＮＥ（またはＳＥＣ）と命名されたタンパク質またはポリペプチド、および配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する、ＳｃｌＣと命名されたタンパク質またはポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも一つの抗原をさらに含む。好ましくは、該少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドは、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２からなる群より選択される。
【００４３】
有用なワクチン組成物として示される、本発明の抗原性組成物は、一つの態様では、抗原ＥＡＧ，ＳｃｌＣ、ＣＮＥ（またはＳＥＣ）、Ｅｑ５、Ｅｑ８、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２を、ならびに別の態様では、抗原ＥＡＧ１、ＳｃｌＣ、ＣＮＥ（またはＳＥＣ）、Ｅｑ５、およびＥｑ８を含む。
【００４４】
本発明は、抗原性組成物にも関連し、該少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドはＥＡＧ，Ｅｑ８、およびＩｄｅＥ２からなる群より選択され、かつ前記組成物は、ＩｄｅＥ、Ｅｑ５，ＩｄｅＺ２、Ｅｑｚ５およびＥｑｚ８および／またはＳｃｌＣならびにＣＮＥ（またはＳＥＣ）からなる群より選択される、少なくとも一つのさらなる抗原を含む。
【００４５】
本発明によれば、抗原性組成物は、好ましくは、組換え技術的に生産された少なくとも一つの抗原、および／または単離されたもしくは精製された抗原である、少なくとも一つの抗原を含む。
【００４６】
上記より、腺疫菌のタンパク質由来の本発明の抗原または免疫原は、抗原性または免疫原性である、全長タンパク質、該タンパク質の断片または該タンパク質の類似体を含み得ることは明白である。よって、本発明は本願明細書で特異的に開示するタンパク質の断片に限定されない。
【００４７】
本発明の抗原性組成物は、該少なくとも一つのタンパク質またはポリペプチドをコードする、少なくとも一つの組み換えベクターおよびこれに挿入された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み得、かつ前記ベクターは該ポリペプチドを、腺疫菌に感受性の非ヒト哺乳動物の生体内で発現することができる。
【００４８】
本発明の一実施形態よれば、前記ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである発現ベクターであり、かつ該ポリヌクレオチドは、本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、上記の抗原性組成物を免疫化成分として含む、腺疫菌の感染から非ヒト哺乳動物を予防するためのワクチン組成物、および薬学的に許容される担体に関する。
【００５０】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、免疫化成分として２、３またはそれ以上の本発明の抗原または免疫原を含む、抗原性組成物または免疫原性組成物を含む。さらに、１またはそれ以上のこれらの抗原または免疫原は、Ｎ末端断片またはＣ末端断片などの、該タンパク質またはその断片の類似体を含む。
【００５１】
ワクチン組成物は、アジュバントなどのさらなる成分を含み得る。好ましくは、該アジュバントは全身性免疫または粘膜系免疫を刺激する。このようなアジュバントは、当技術分野で周知である。
【００５２】
本発明による使用に好ましいアジュバントには、（１）アクリル酸またはメタクリル酸、無水マレイン酸ポリマーおよびアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、（３）水中油型エマルション、（４）４級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、（７）サポニン、または（８）ナノ粒子を含む。
【００５３】
本発明の使用に好ましいアジュバントは、Ａｂｉｓｃｏ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，スウェーデン）である。ＩＳＣＯＭＳの重要な成分は、チリアン・ソープバークツリー（シャボンノキ：Ｑｕｉｌｌａｉａ  Ｓａｐｏｒｉｎａｒｉａ  ｍｏｌｉｎａ）由来のキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ）サポニンである。キラヤサポニンには、免疫系を活性化する能力があることが周知である。特別な化学量論下でキラヤサポニンをコレステロールおよびリン脂質と混合すると、ＩＳＯＣＯＭＳとして知られる、球状オープンケージ様構造を形成する。
【００５４】
他の好ましいアジュバントはＧｉｎｓｅｎｇである。 Ｇｉｓｅｎｇは、植物オタネニンジン（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ， ＣＡ． Ｍｅｙｅｒ）の根から調製される、乾燥抽出物である。Ｇｉｎｓｅｎｇは、化学的にはダマラン類の三テルペノイド配糖体である、サポニンの一種であるジンセノサイドと呼ばれるいくつかの活性物質を含む。ジンセノサイドはアジュバンド特性を有し、最も活性なアジュバンドはＲｂ１を名づけられた画分である。Ｒｂ１アジュバント化ワクチンのワクチン接種後に分泌されたサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４，ＩＬ−１０を測定することにより、Ｒｂ１画分は、Ｔｈ１とＴｈ２の免疫応答の平衡を引き起こすことが証明されている。加えて、ＧｉｎｓｅｎｇおよびＲｂ１画分は、強力な抗原特異的抗体応答を刺激する。
【００５５】
好ましい態様においては、ワクチン組成物は、好ましくはウマである、腺疫菌エクイ亜種が原因の腺疫に感受性の哺乳動物を保護するワクチンである。
【００５６】
本発明のワクチン組成物は、生理的に投与可能な形態で提供される。好ましくは、ワクチン組成物は、皮下接種、筋肉内接種、または経鼻接種で投与可能である。
【００５７】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、腺疫菌抗原に向けた血清、粘膜および／または気管支洗浄抗体応答を、腺疫菌に感受性の哺乳動物、特にウマ内で刺激する。
【００５８】
本発明は、本発明の抗原性組成物または免疫原性組成物として使用される、抗原または免疫原の生産方法にも関連し、該方法は、
（ａ）該抗原をコードするＤＮＡ断片を提供し、そして該断片を発現ベクター内に挿入するステップと、
（ｂ）該ＤＮＡ断片を含む該ベクターを、適合する宿主細胞内に導入するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の該宿主細胞を、該ＤＮＡ断片のコードされる生産物が発現するのに必要な条件下で培養するステップと、 
（ｄ）発現した生産物を培養した宿主細胞から単離するステップ
とを含む。
【００５９】
好ましくは、該方法は、ステップ（ｄ）で単離された生産物を、アフィニティークロマトグラフィーまたはその他の当技術分野で周知のクロマトグラム法によって精製する、ステップ（ｅ）をさらに含む。
【００６０】
従って、本発明の抗原はは通常、組換え技術によって生産される。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、本発明のワクチンを調製する方法に関し、該ワクチンは免疫化成分として上記の抗原性または免疫原性組成物を含み、該方法は該抗原性組成物と薬学的に許容される担体とを混合するステップを含む。
【００６２】
本発明は、抗血清の生産方法にも関連し、該方法は、本発明の抗原性調製物を宿主動物に投与して、該動物中で抗体を生産するステップと、該動物中で生産された該抗体を含む抗血清を回収するステップとを含む。
【００６３】
さらに本発明は、非ヒト哺乳動物、好ましくはウマの腺疫菌感染を予防または治療する方法に関係し、該動物に免疫学的に有効量の本発明のワクチンまたは抗血清を投与するステップを含む。
【００６４】
従って、本発明は、腺疫菌感染からウマを予防する方法に関係し、該方法はウマに本発明のワクチン組成物を、筋肉内接種、皮下接種、もしくは経鼻接種、または例えば皮下および経鼻の組み合わせで接種して、該ウマ中で腺疫菌に対する免疫応答を誘導するステップを含む。好ましくは、鼻咽頭粘液内でのＩｇＧおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＭ抗体様の免疫応答は、該ウマ内で誘導される。
【００６５】
本発明は、本発明の抗原性組成物のタンパク質またはポリペプチドに特異的な、少なくとも一つの、好ましくは２つの抗体を含む、抗体調製物に関連し、該抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり、または該調製物は該抗体の断片を含む。
【００６６】
本発明の抗体調製物は、腺疫に対して予防的または治療的に使用でき、かつ腺疫菌に感受性の、または腺疫菌に感染した非ヒト哺乳動物に投与した場合、受動免疫法を提供する。
【００６７】
本発明は、大腸菌を宿主細胞として用いる本発明方法によって調製された、１または複数の抗原成分を含むワクチン組成物を記載する。これらの抗原の元は、該方法がその発現および精製用に開発されている場合、天然の細菌でもあり得る。あるいは、本発明の抗原は、融合戦略に基づく方法によっても生産され、それぞれの抗原の様々な部分は、異なる抗原由来の部分からなるタンパク質中の融合カン（ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｎ）として再結合する。この融合戦略は、Ｔ細胞エピトープまたは弱毒化毒素（またはその一部）などの免疫反応部の導入にも適しているため、抗原提示または抗原局在を最適化する他の特性の導入に適している。
【００６８】
さらに、大腸菌に加えて組換え抗原を発現するための他の宿主は、他の適した細菌種およびウイルス種でもある。今日、異種発現のための多くの異なる発現系が分子生物学の分野で周知である。
【００６９】
本発明の他の関連は、本発明は宿主内での生存に重要な遺伝子（すなわち、代謝経路における欠損を引き起こす変異）が欠損した、または不活性化した遺伝子を有するが、本発明の抗原を維持または過剰生産する、腺疫菌の特異的な弱毒化変異体の設計に使用できる。
【実施例】
【００７０】
腺疫菌エクイ亜種およびズーエピデミカス亜種のゲノムのＤＮＡ配列は同定されたが（ｗｗｗ．ｓａｎｑｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）、まだアノテートされていない。スクリーニングされた読み取り枠から、細胞外タンパク質をコードする多くの遺伝子が同定された。これらの遺伝子の間で、いくつかを選択して、組換えタンパク質は生産され、かつワクチン研究で評価された。これらの遺伝子のクローニングおよび発現は、以下に示す。さらに、これらのタンパク質の抗原としての使用も記載されている。
【００７１】
［実施例１］エクイ亜種由来のｉｄｅＥ、ｉｄｅＥ２、ｅｑ５およびｅｑ８遺伝子を内包するクローンの構築
腺疫菌エクイ亜種株１８６６（ＰＣＴ／ＳＥ０３／０１５８７， Ｌａｎｎｅｒｇａｒｄ ａｎｄ Ｇｕｓｓ ２００７）由来の染色体ＤＮＡを、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２、Ｅｑ５およびＥｑ８をコードする潜在的な遺伝子を増幅する鋳型として使用した（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は以下の配列表に示す）。予想されるシグナル配列を同定するために、コンピュータープログラムＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用した。ｉｄｅＥ、ｉｄｅＥ２、ｅｑ５およびｅｑ８遺伝子またはこれらの遺伝子の一部を増幅するのに使用したプライマーの配列は、プライマー表に列挙してある。プラスミドベクターｐＴＹＢ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）中のクローニング部位に合わせるため、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの切断部位が、プライマー配列に導入された。
【００７２】
ＰＣＲ増幅は、プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）およびＲｅａｄｙＴｏＧｏ（登録商標）ＰＣＲビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、以下のプログラムを用いて行った。
ステップ１：９５℃で１分間予熱、ＤＮＡ鎖分離
ステップ２：９５℃で３０秒
ステップ３：４６℃で１５秒間、アニーリング
ステップ４：７２℃で２分間、伸長
ステップ２〜４を２６サイクル。
【００７３】
ＰＣＲ生産物は１％アガロースゲル上で解析後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。制限酵素による切断を一晩行った後、断片を再度同じキットを用いて精製した。
【００７４】
プライマー表：ｉｄｅＥ、ｉｄｅＥ２、ｅｑ５およびｅｑ８遺伝子のＰＣＲ増幅に使用したプライマー配列。下線のヌクレオチド配列は、導入した制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ切断部位に対応する。
【００７５】
【表１】
2011506433.tif 000002
【００７６】
大腸菌内でクローン化及び組換えタンパク質を生産するために、ＩＭＰＡＣＴ（登録商標）タンパク質精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）が使用された。ｐＴＹＢ４ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を含む大腸菌株ＥＲ２５６６株は使用説明書に従って生育され、そしてベクターはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ （Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製された。精製されたベクターは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化された。消化後、ベクターは、以後のライゲーションステップにおけるバックグラウンドの再ライゲーションしたベクターを減らすため、酵素アルカリフォスファターゼで処理された。ベクターのライゲーションおよび個々のＰＣＲ産物用に、ＲｅａｄｙＴｏＧｏ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）が使用された。ライゲーション後、個々のサンプルをコンピテントセルである大腸菌株ＥＲ２５６６に電気穿孔法で形質転換して、そしてＬＡ−Ａｍｐプレート（最終濃度５０μｇ／ｍｌでアンピシリンが添加されたＬＢ培地寒天プレート）上に播種後、３７℃で一晩培養した。次の日、コロニーを数え、一構築物あたり４個のコロニーが培養され、以後の実施例に使用した。それぞれの構築物中の挿入物の存在の確認のため、プラスミドを精製し、それぞれのプライマーの組み合わせを用いて、さらにＰＣＲ解析を行った。それぞれの挿入物の配列は、ベクターにハイブリダイズするプライマー（インテインコード領域に位置するＴ７ ユニバーサル順方向および逆方向プライマー）を用いたＤＮＡ配列解析によっても同定された。
【００７７】
腺疫菌エクイ亜種株１８６６のｉｄｅＥ遺伝子のクローニングは、以前にＬａｎｎｅｒｇａｒｄおよびＧｕｓｓによって報告された（２００６年）。ｉｄｅＥのＧｅｎＢａｎｋ受入番号はＤＱ５０８７３３である。免疫化用の組換えＩｄｅＥタンパク質を得るために用いる遺伝子の一部分は、プライマー表に列挙されているプライマーＩｄＥＧ１およびＩｄＥＧ２を用いてクローン化した。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片は制限酵素ＢＡｍＨ１およびＸｈｏＩで消化後、先に同じ酵素で消化したベクターｐＧＥＸ６−Ｐ−１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にライゲートした。
【００７８】
［実施例２］抗原ＣＮＥ，ＳｃＩＣ，ＥＡＧ４Ｂ，ＩｄｅＥ，ＩｄｅＥ２，Ｅｑ５およびＥｑ８の調製
使用したベクターは、大腸菌発現およびＩＭＰＡＣＴ（登録商標）Ｔ７（ＮＥＢ Ｉｎｃ．）と呼ばれる精製系の一部である。簡単には、使用説明書に従って、それぞれ組換えＩｄｅＥ２、Ｅｑ５及びＥｑ８を発現するクローンは、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ培地中で、３７℃で生育した。光学密度（ＯＤ６００）が０．６付近の時点で、生育培地にＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）が添加され、生育温度を２０℃に変更した。一晩の生育後、細胞は回収されて、緩衝液［２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）， ５００ｍＭ ＮａＣＩ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，および ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］中に再懸濁して、凍結及び解凍によって溶解した。遠心後、上清を滅菌濾過して、キチンカラムに添加した。カラムは同じ緩衝液で広範囲に洗浄した後、切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），５０ｍＭ ＮａＣＩ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，および ３０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））で処理した。切断緩衝液中には、還元環境は、インテイン−キチン結合部分が結合している間、抗原部分をカラムから遊離させる、インテイン仲介自己切断を誘導する。抗原を含む溶出サンプルは、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．４））中で透析後、濃縮した。得られた抗原の量を定量後、その品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥも用いて確認した。組換えＩｄｅＥタンパク質は生産後、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）推奨の手順に従って、ＧＳＴ−アフィニティークロマトグラフィー系を用いて精製した。ＣＮＥ（ＳＥＣ）， ＳｃＩＣ， および ＥＡＧ４Ｂの記載及び生産は、以前に記載されている（国際出願第 ２００４／０３２９５７ 号（ＰＣＴ／ＳＥ０３／０１５８７），Ｗａｌｌｅｒ 等、２００７年）。以下の実施例において、ＥＡＧ４Ｂタンパク質は単にＥＡＧと呼ぶ。
【００７９】
［実施例３］組換えＩｄｅ２はＩｇＧを切断する
ＩｄＥは、様々な種由来のＩｇＧを特異的に切断するプロテアーゼとして、以前に示されている（ＬａｎｎｅｇａｒｄおよびＧｕｓｓ、２００６年）。組換えＩｄＥ２も抗体を切断するかどうかを検証するため、ヒト、ウマおよびマウス由来のＩｇＧをＰＢＳ内で、３７℃で１時間反応させた。精製した組換えＩｄｅＥを正の対照として、精製ＩｇＧを負の対照として使用した。切断後、サンプルは８〜２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。結果は、組換えＩｄｅＥ２は、ＩｄｅＥよりも効果的にウマＩｇＧを切断することを示した。
【００８０】
［実施例４］腺疫菌エクイ亜種におけるｉｄｅＥ、ｉｄｅＥ２、ｅｑ５、およびｅｑ８遺伝子の存在
以前に、エクイ亜種のｉｄｅＥ遺伝子のホモログがズーエピデミカス亜種に存在することが報告されている（ＬａｎｎｅｇａｒｄおよびＧｕｓｓ、２００６年）。ズーエピデミカス亜種のゲノムデータベース（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて、ｉｄｅＥ２、ｅｑ５およびｅｑ８に類似の遺伝子の存在を、ＢＬＡＳＴ検索を用いて解析した。 結果は、類似のタンパク質をコードする遺伝子が検出されたことを示した。ｉｄｅＺ２、 ｅｑｚ５、及びｅｑｚ８と呼ばれる遺伝子の配列と、これらに伴うＩｄｅＺ２， Ｅｑｚ５およびＥｑｚ８のアミノ酸配列は本明細書の実施例の配列表に示してある。
【００８１】
［実施例５］Ｅｑ５およびＥｑ８によるマウスの免疫化
約２３〜２５ｇのマウス（ＮＭＲＩ）をケージ内に各５匹ずつ入れた。マウスは、１２μｇの各抗原および１０μｇのＡｂｉｓｃｏ３００（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，スウェーデン）で、経鼻で免疫化した。１５匹を抗原（Ｅｑ５およびＥｑ８）で免疫化し、１５匹は陰性対照として用いるため、Ａｂｉｓｃｏ３００アジュバントを投与した。 全体積を最低２７μｌに保ち、かつＩｓｏｆｌｏｖｅｔ（Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，英国）で麻酔したマウスの鼻孔に、３０分おきに２回投与した。免疫化は、０、１３および３２日目に行った。
【００８２】
［実施例６］ＥＡＧ、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２によるマウスの免疫化
ＥＡＧ、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２によるマウスの免疫化は、Ｅｑ５とＥｑ８の場合と同様に行った。しかしながら、マウスは３つの群に分け、各グループ１０匹づつとした。 これらはＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２、またはＥＡＧのみ、投与され、かつ１つの群は陰性対照としてアジュバントＡｂｉｓｃｏ３００のみが投与された。免疫化は、０、２１、および５３日目に行った。実験感染は６０日目に行った。
【００８３】
［実施例７］腺疫菌エクイ亜種による実験感染
実験感染は、Ｅｑ５＋Ｅｑ８については４３日目（最後の免疫化から１０日後）、ＥＡＧ＋／−ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２については６０日目（最後の免疫化から１０日後）に行った。 腺疫の臨床例として、腺疫菌エクイ亜種株１８６６を用いた。株は最初、麻酔したマウスの鼻孔に約１０６ＣＦＵを接種して、動物を通過した。細菌は７日後のマウスの鼻から回収された後、５％ＣＯ２で３７℃の条件下、ＢＧプレート上で生育した。単一コロニーを、ＢＧプレート上で、３７℃で一晩生育した後、１％酵母抽出物（ＴＨＹ）を含むＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中に再懸濁した。培養物はバイアル中に−８０℃で保管され、各実施例において新しいバイアルを使用した。マウスに感染させるために、細菌はＢＧプレート上で５％ＣＯ２下、３７℃で一晩生育後、ＴＨＹに植菌し、振とうすること無く一晩生育した。培養液はその後ＴＨＹおよび１０％ウマ血清（Sigma社）１０倍に希釈後、５％ＣＯ２下で、３７℃で４時間生育した。培養液は遠心分離後、ＴＨＢに再懸濁した。 １０μｌ中に１×１０６ＣＦＵを含む投与量を、すべてのマウスの腺疫菌感染に使用した。マウスは日ごとに追跡調査した。細菌の鼻中での生育は、再現可能な状態で、マウスの鼻を血液寒天プレート上に優しく押し付けて、０〜＋＋＋の４段階の基準でスコア化した。鼻サンプルをその後プレート全体の表面に塗布した。１個の＋は、５〜１００個のコロニーを、２個の＋は１００以上のコロニーを、３個の＋はコンフルエントな生育を意味する。体重は毎日測定し、体重減少の百分率を計算した。
【００８４】
［実施例８］ワクチン投与の実験結果
マウスはＥｑ５およびＥｑ８の両方で免疫化され、経時体重減少を測定した。図１は、ワクチン投与したマウス（ｎ＝１５）は、対照マウス（ｎ＝１５）よりも体重減少が少なかったことを示す。すべての日においてＰ値は０．０００１であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定）。 腺疫菌の鼻内での生育も、日ごとに４段階スケールの測定を行った。図２は、ワクチン接種したマウスは、対照群よりも鼻内での生育がより少ないことを示す。５日目における鼻内で細菌が大幅に生着した（スコア２〜３）マウスの頻度は、２つの群の間で、顕著に違っていた。Ｐ＝０．００２（フィッシャー直接検定）。
【００８５】
次の実験において、マウスはＥＡＧ（ｎ＝１０）、ＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２（ｎ＝１０）でワクチン接種、または非ワクチン接種（ｎ＝１０）した。経時体重減少率を測定した。図３は、ＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２をワクチン接種した動物が、対照群よりも低い体重減少であったことを示す。Ｐ値は３日目、５日目、６日目でそれぞれ０．００１３、０．０００８および０．０００９であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定）。ＥＡＧのみをワクチン接種した動物も、対照群と同等の体重減少であった。腺疫菌の鼻内での生育も、日ごとに４段階スケールの測定を行った。図４は、ＥＡＧ＋ＩｄｅＥ＋ＩｄｅＥ２をワクチン接種した動物は、対照群よりも鼻内での生育がより少ないことを示す。また、ＥＡＧのみのワクチン接種では予防されなかった。
【００８６】
［実施例９］Ｅｑ５、Ｅｑ８およびＥＡＧ、ＣＮＥ、ＳｃＩＣでのマウスの免疫化
経鼻投与による  Ｅｑ５＋Ｅｑ８およびＥＡＧ＋ＣＮＥ＋ＳｃＩＣでの免疫化は、上記と同様に行い、１群あたり１０匹のマウスで、３群行った。１群はＥｑ５＋Ｅｑ８で、他群はＥＡＧ＋ＣＮＥ＋ＳｃＩＣである。第３群はＡｂｉｓｃｏ３００での対照群である。免疫化は０、１４、および２２日目に行った。抗原投与は２９日目に行った。実験結果を図５ａおよび図５ｂに示す。図５ａおよびｂは、ＥＡＧ＋ＣＮＥ＋ＳｃＩＣ（ｎ＝１０）の顕著な予防効果を示す。Ｐ値は２日目で０．０４、５日目で０．０９であった。Ｅｑ５＋Ｅｑ８の予防効果は、より顕著であり、Ｐ値は２日目で０．００５、５日目で０．００９であった。
【００８７】
配列リスト
（１）配列番号１と配列番号１４は、ｉｄｅＥ２のヌクレオチド配列（配列番号１４）の下にＩｄｅ２タンパク質（配列番号１）を示すために、組み合わせられている。
【００８８】
2011506433.tif 000003
【００８９】
（２）配列番号２は、組換えＩｄｅＥ２タンパク質の配列を示す。太字で表示されているアミノ酸は、ｐＴＹＢ４ベクターにコードされているアミノ酸である一方、残りはＩｄｅＥ２タンパク質由来である。
【００９０】
2011506433.tif 000004
【００９１】
（３）配列番号３と配列番号１５は、Ｅｑ５のヌクレオチド配列（配列番号１５）の下にＥｑ５タンパク質（配列番号３）を示すために、組み合わせられている。
【００９２】
2011506433.tif 000005
2011506433.tif 000006
【００９３】
（４）配列番号４は、組換えＥｑ５タンパク質の配列を示す。太字で表示されているアミノ酸は、ｐＴＹＢ４ベクターにコードされているアミノ酸である一方、残りはＥｑ５タンパク質由来である。
【００９４】
2011506433.tif 000007
【００９５】
（５）配列番号５と配列番号１６は、Ｅｑ８のヌクレオチド配列（配列番号１６）の下にＥｑ８タンパク質（配列番号５）を示すために、組み合わせられている。
【００９６】
2011506433.tif 000008
【００９７】
（６）配列番号６は、組換えＥｑ８タンパク質の配列を示す。太字で表示されているアミノ酸は、ｐＴＹＢ４ベクターにコードされているアミノ酸である一方、残りはＥｑ８タンパク質由来である。
【００９８】
2011506433.tif 000009
【００９９】
（７）配列番号７と配列番号１７は、腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来のｉｄｅＺ２のヌクレオチド配列（配列番号１７）の下にＩｄｅＺ２タンパク質（配列番号７）を示すために、組み合わせられている。
【０１００】
2011506433.tif 000010
【０１０１】
（８）配列番号８と配列番号１８は、腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来のｅｑｚ５のヌクレオチド配列（配列番号１８）の下にＥｑｚ５タンパク質（配列番号８）を示すために、組み合わせられている。
【０１０２】
2011506433.tif 000011
2011506433.tif 000012
【０１０３】
（９）配列番号９と配列番号１９は、腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来のｅｑｚ８のヌクレオチド配列（配列番号１９）の下にＥｑｚ８タンパク質（配列番号９）を示すために、組み合わせられている。
【０１０４】
2011506433.tif 000013
【０１０５】
（１０）配列番号１０と配列番号２０は、ｉｄｅＥのヌクレオチド配列（配列番号２０）の下にＩｄｅＥタンパク質（配列番号１０）を示すために、組み合わせられている。
【０１０６】
腺疫菌エクイ亜種由来のｉｄｅＥ遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ５０８７３３）およびＩｄｅＥのアミノ酸配列を示す。
【０１０７】
2011506433.tif 000014
【０１０８】
（１１）配列番号１１と配列番号２１は、ｉｄｅＺのヌクレオチド配列（配列番号２１）の下にＩｄｅＺタンパク質（配列番号１１）を示すために、組み合わせられている。
【０１０９】
腺疫菌ズーエピデミカス亜種由来のｉｄｅＺ遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ８２６０３７）およびＩｄｅＺのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
2011506433.tif 000015
【０１１１】
（１２）配列番号１２
ｅａｇ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１１２】
2011506433.tif 000016
【０１１３】
（１３）配列番号１３
ＥＡＧ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列
【０１１４】
2011506433.tif 000017
【０１１５】
（１４）配列番号２８
ＳＥＣ２．１６（ＣＮＥ）のタンパク質配列
【０１１６】
2011506433.tif 000018
2011506433.tif 000019
2011506433.tif 000020
【０１１７】
（１５）配列番号２９
ＳｃｌＣのタンパク質配列
【０１１８】
2011506433.tif 000021
2011506433.tif 000022
【０１１９】
（１６）配列番号３０  組換えタンパク質ＩｄｅＥ
【０１２０】
2011506433.tif 000023
太字のアミノ酸はベクター由来である。
【０１２１】
［実施例１０］ワクチン接種実験
本実験の目的は、ウェルシュ・マウンテンポニーにＩｎｔｅｒｖａｃｃ社の多成分サブユニットワクチンを接種後、野生型腺疫菌株４０４７を経鼻抗原投与した場合の、予防レベルを特定することである。本実験は、英国のＡｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｒｕｓｔ社によって行われた。本実験で使用した、Ｎｏｒｄｏｓｔｒｅｐ  ＳｅｐｔａｖａｃまたはＮｏｒｄｏｓｔｒｅｐ  Ｐｅｎｔａｖａｃ Ａ（または単にＳｅｐｔａｖａｃまたはＰｅｎｔａｖａｃ）と命名されたワクチンは、以下に記載されている。
【０１２２】
方法
ワクチン接種期間のため、ポニーは最初に３つの群に無作為抽出した。
【０１２３】
【表２】
2011506433.tif 000024
【０１２４】
最初の試験群１および３を、抗原投与に回した（第２の試験群２（Ｐｅｎｔａｖａｃ Ａ）は、第９節に記載してある）。いずれのワクチン群で抗原投与するかの決定は、抗原投与の１週間前にＩｎｔｅｒｖａｃｃで行った。
【０１２５】
Ｎｏｒｄｏｓｔｒｅｐ Ｐｅｎｔａｖａｃ Ａ処方
Ｐｅｎｔａｖａｃワクチンは、以下の５つの腺疫菌タンパク質：ＥＡＧ，ＳｃｌＣ、ＣＮＥ、Ｅｑ５およびＥｑ８からなる。皮下ワクチン接種のため、５種類のタンパク質をＰＢＳ中に溶解し（各タンパク質を５０μｇ／ｍｌ）、１ｍｌのバイアルに分取して、−２０℃で保存した。ワクチン接種の直前に、バイアルを解凍後、１ｍｌのアジュバント（Ａｂｉｓｃｏ ２００， ３７５ μｇ／投与量， Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，スウェーデン）と混合した。経鼻投与のため、５種類のタンパク質をＰＢＳ中に溶解し（各タンパク質を１５０μｇ／ｍｌ）、２ｍｌのバイアルに分取して、−２０℃で保存した。ワクチン接種の直前に、バイアルを解凍後、２ｍｌのアジュバント（Ａｂｉｓｃｏ ３００， ５００ μｇ／投与量， Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ， Ｓｗｅｄｅｎ）と混合した。プラセボ処方において、腺疫菌タンパク質は省略した。従って、皮下ワクチン接種のプラセボは、ＰＢＳ及びＡｂｉｓｃｏ ２００， ３７５ μｇ／投与量のみを、ならびに経鼻ワクチン接種では、プラセボはＰＢＳ及びＡｂｉｓｃｏ ３００， ５００ μｇ／投与量のみを含む。
【０１２６】
Ｎｏｒｄｏｓｔｒｅｐ Ｓｅｐｔａｖａｃ処方
Ｓｅｐｔａｖａｃワクチンは、以下の７つの腺疫菌タンパク質：ＥＡＧ，ＳＣｌＣ、ＣＮＥ、Ｅｑ５、Ｅｑ８、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２からなる。皮下ワクチン接種のため、７種類のタンパク質をＰＢＳ中に溶解し（各タンパク質を５０μｇ／ｍｌ）、１ｍｌのバイアルに分取して、−２０℃で保存した。ワクチン接種の直前に、バイアルを解凍後、１ｍｌのアジュバント（Ａｂｉｓｃｏ ２００， ３７５ μｇ／投与量， Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ， Ｓｗｅｄｅｎ）と混合した。経鼻投与のため、７種類のタンパク質をＰＢＳ中に溶解し（各タンパク質を１５０μｇ／ｍｌ）、２ｍｌのバイアルに分取して、−２０℃で保存した。ワクチン接種の直前に、バイアルを解凍後、２ｍｌのアジュバント（Ａｂｉｓｃｏ ３００， ５００ μｇ／投与量， Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ， スウェーデン）と混合した。プラセボ処方において、腺疫菌タンパク質は省略した。従って、皮下ワクチン接種のプラセボは、ＰＢＳ及びＡｂｉｓｃｏ ２００， ３７５ μｇ／投与量のみを、ならびに経鼻ワクチン接種のプラセボは、ＰＢＳ及びＡｂｉｓｃｏ ３００， ５００ μｇ／投与量のみを含む。
【０１２７】
これらの処方において、ＥＡＧはＥＡＧ４Ｂの断片を含み、かつＣＮＥは２．１６と命名された断片である。
【０１２８】
結果の要約
本実験は  新規多成分サブユニットワクチンの腺疫に対する予防の効率で評価した。Ｓｅｐｔａｖａｃワクチンは、１回目および２回目の投与後１日後に、ポニーにおいて発熱を誘導した。しかしながら、それ以外の副作用はなく、このワクチンは大変良好な耐用性を示した。
【０１２９】
すべてのポニーは、分割して同一の投与量（腺疫菌株４０４７、１×１０８ｃｆｕ）で抗原投与され、両方の鼻孔から投与された。７頭すべての対照ポニーが、発熱および多発性リンパ節膿瘍を発症した（１００％）。ワクチン接種した１頭のポニーのみが、発熱（進行中のズーエピデミカス亜種感染によるもの）し、および１頭がリンパ節膿瘍を発症した（１４％）。 統計的に、体温、検死スコア、ならびにフィブリノーゲン及び好中球レベルを測定した場合、ワクチン接種したポニーは顕著に腺疫菌を予防していた。  
【０１３０】
全体的に、Ｓｅｐｔａｖａｃワクチンは腺疫の予防に安全かつ効果的なワクチンであった。しかしながら、本発明は、本実施例で研究されたＳｅｐｔａｖａｃおよびＰｅｎｔａｖａｃワクチンに制限されないが、本発明の抗原／免疫原の多くの組み合わせは、腺疫の予防に用いるワクチン組成物に使用可能な候補である。
【０１３１】
１．処置
先の２つの研究（国際出願第２００４／０３２９５７Ａ１号および参考文献２７）は、Ｉｎｔｅｒｖａｃｃワクチンは腺疫菌抗原投与においていくつかの予防を与えたことを示した。 ２つの研究にまたがる４つすべてのワクチン群は、咽嚢蓄膿症を減じた。本実験は、一つは５種類（Ｐｅｎｔａｖａｃ）の、もう一つは７種類（Ｓｅｐｔａｖａｃ）の腺疫菌タンパク質を含む、２つのＮｏｒｄｖａｃｃワクチンの免疫原性を比較するために設計された。
【０１３２】
血液及び鼻洗浄液サンプルは、ワクチンサブユニットに対するウマの免疫応答を特定するプロトコールに従って採取された。免疫原性データに基づき、与えられた予防レベルを定量するため、ワクチン接種した一群を抗原投与した。それぞれのポニーは、全抗原投与量が１×１０８ｃｆｕの腺疫菌株４０４７を、両方の鼻孔にそれぞれ５×１０７の２ｍｌの培地を、噴霧することで抗原投与された。この用法は、不可抗力の宿主免疫応答を避けている間、感染度を最適化するものと信じられている。ポニーは抗原投与後三週間の期間にわたり、定期健診、毎日の健康診断、体温のモニタリング、セロコンバージョンを特定するための血清の採取、及び鼻洗浄液の採取による細菌学的分析によって、病気の臨床兆候を注意深くモニターした。すべてのポニーは、膿瘍発症後の解剖検査、または抗原投与後３週間の実験終点に達した場合、ＡＨＴが開発したスコア化システムによる疾患病状の重症度の特定に供した。 実験のポニーから回収された組織の組織病理学検査は、解剖（ＰＭ）検査では明瞭でない、腺疫菌感染の前兆を同定するために使用した。
【０１３３】
【表３】
2011506433.tif 000025
2011506433.tif 000026
【０１３４】
２．１ワクチン
ウマ用のＮｏｒｄｏｓｔｒｅｐワクチン
第１群：Ｎｏｒｄｏｓｔｒｅｐ Ｐｅｎｔａｖａｃ Ａをワクチン接種した７頭のポニー
２ｍｌ  皮下投与（各側頭部に１ｍｌずつ）
４ｍｌ  経鼻投与（各鼻孔に２ｍｌずつ）
４、６０、７４日目
第２群：Ｎｏｒｄｏｓｔｒｅｐ Ｓｅｐｔａｖａｃをワクチン接種した７頭のポニー
２ｍｌ  皮下投与（各側頭部に１ｍｌずつ）
４ｍｌ  経鼻投与（各鼻孔に２ｍｌずつ）
４、６０、７４日目
第３群：皮下投与でプラセボ２ｍｌをワクチン接種した７頭のポニー（各側頭部に１ｍｌずつ）
４ｍｌ  経鼻投与（各鼻孔に２ｍｌずつ）
４、６０、７４日目
【０１３５】
ワクチンバイアルは１回目のワクチン接種前にＡＨＴから受領し、ＥＱ番号２３０５の冷凍庫に、使用するまで−２０℃で保存した。プラセボ（抗原を含まない）およびアジュバントバイアルは、ＥＱ番号４４の冷蔵庫に、使用するまで４℃で保存した。
【０１３６】
ワクチン接種時に、ＡＨＴのＡ．Ｗａｌｌｅｒ、 Ｌ．ＰｒｏｗｓｅまたはＣ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎが規定したプロトコールどおりに、ワクチン及びアジュバントを混合した。
【０１３７】
２．２  細菌抗原投与
ＳＯＰ／ＢＡＣＴ／２５の記載に従って、腺疫菌４０４０７を新鮮なプレートから調製した。
【０１３８】
細菌は予想通り生育し、そして１：４０希釈培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．３に到達したときに回収した。抗原投与接種材料の生育を、図６に示す。以下の結果が得られた。
【０１３９】
播種結果：１／１０５希釈  ３７コロニー
３５コロニー
３３コロニー
３２コロニー
平均＝１００μｌあたり３４．２５
従って、ポニー１頭あたりの実質投与量は、４×３４．２５×１０５×１０ ＝ １．３７×１０８ｃｆｕ／投与量。
【０１４０】
３．動物管理
３．１供給
英国のＢｅｅｄｉｅｓ、 Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅより供給された２１頭のウェルシュ・マウンテンポニーを使用した。ポニーは初回ワクチン接種時において約８ヶ月齢であった。
【０１４１】
３．２  同定／分配
ポニーは、首のマイクロチップによって識別した。２１頭のポニーは、ワクチン接種の群に無作為に割り振った（表３）。
【０１４２】
【表４】
2011506433.tif 000027
【０１４３】
３．３飼育
抗原投与に先立ち、ポニーは，英国 Ｋｅｎｔｆｏｒｄ州のＬａｎｗａｄｅｓ Ｐａｒｋ、およびＮｅｗｍａｒｋｅｔ州のＫｉｒｔｌｉｎｇの草地で放牧した。これらの場所はこの種の仕事のホームオフィスとして承認されている。飲料水は適宜利用した。
【０１４４】
第１群および第３群のポニーは、順化を可能にするために、抗原投与の３日前にＡＣＶＳ（Ａｌｌｅｎ Ｃｅｎｔｒｅ）に移送された。ポニーはワクチン接種群に従って２つの動物室に分離されたため、それぞれのワクチン接種群は一緒にいた。
【０１４５】
４．方法
４．１ワクチン接種
ワクチン接種はＡＨＴ  ＳＯＰ／ＥＱＵ／０３に従って咽頭後リンパ節の近傍への皮下投与で、またはＡＨＴ ＳＯＰ／ＥＱＵ／０７に従い、経鼻スプレーで行った。
【０１４６】
４．１．２臨床的予備試験
初回ワクチン接種前、Ｖ２（ズーエピデミカス接種）前、およびＶ３前に、獣医師がすべてのポニーを臨床試験した。臨床的に良好な状態の健康なポニーのみが、本試験に用いられた（ＳＯＰ／ＥＱＵ／０８）。
【０１４７】
４．１．３  ワクチン接種
ポニーは、表４に従いワクチン接種した。ポニー９２２９は進行性のズーエピデミカス亜種の感染により、２００８年２月１４日に発熱したため、除外した。このポニーは週末に回復し、２００８年４月１８日にワクチン接種した。
【０１４８】
【表５】
2011506433.tif 000028
＊ズーエピデミカス亜種の感染により、７日遅れ
【０１４９】
４．１．４  ワクチン接種前後の臨床観察
臨床観察はワクチン接種後日毎に行った。 副作用が発生した場合、必要に応じて追加の検査を行った。
【０１５０】
４．２  腺疫菌４０４７株の実験的抗原投与
４．２．１  予備臨床検査
ＡＣＶＳ投与の前に、獣医師が抗原投与するポニーの臨床検査をした。臨床状態が良好な健康なポニーのみが、抗原投与に供された。
【０１５１】
４．２．２  抗原投与
３回目のワクチン接種から２週間後（２００８年５月８日）、各ポニーは、新しい腺疫菌４０４７培養液２ｍｌを、ＡＨＴ  ＳＯＰ／ＢＡＣＴ３２に従い、軟性チューブおよびスプレーノズルを用いて、両方の鼻孔に経鼻で投与された。このような抗原投与量は、全量で１×１０８ｃｆｕの腺疫菌４０４７と予想された。
【０１５２】
抗原投与量の投与の間、問題には直面しなかった。予備の接種材料を、実際の抗原投与量（投与量あたり１．３７×１０８ｃｆｕ）を定量するのに用いた。
【０１５３】
４．３  抗原投与後のモニタリング
４．３．１  臨床検査
ＡＨＴ ＳＯＰ／ＥＱＵ／０２に従い、ポニーを検査した。各ポニーを抗原投与の日、および２１日後毎に、腺疫菌感染に関連する兆候（様子、鼻汁、リンパ節腫長および膿瘍、咳の兆候、つかえ感および摂食障害、ならびに眼球の兆候）の発生について臨床的に検査した。
【０１５４】
４．３．２  直腸温度
個体の直腸温度を、抗原投与日から投与から２１日後までの間、午前９時付近に測定した。
【０１５５】
４．４  血液採取
血液サンプルは、ＡＨＴ ＳＯＰ／ＥＱＵ／０１および実験プロトコール予定に従って、頸静脈より採取した。血清は、ＡＨＴ ＳＯＰ／ＥＱＵ／０１に従って調製後、使用時まで−２０℃以下で凍結保存した。
【０１５６】
４．５  血液サンプルの調製
血液サンプルの調製は、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ＴｒｕｓｔのＡｎｄｒｅｗ  Ｗａｌｌｅｒ氏の責任下で、Ｌｅａｈ  Ｐｒｏｗｓｅ氏によって行われた。
【０１５７】
４．６  鼻洗浄液サンプルの調製
個々の鼻洗浄液サンプルは、実験プロトコール予定に述べたように、ＡＨＴ  ＳＯＰ／ＥＱＵ／０２に従って行われた。５００μｌの鼻洗浄液サンプルに、ＡＨＴ ＳＯＰ/ＢＡＣＴ/０２に従って、１ｍｌあたりのβ‐溶血連鎖球菌数の定量を可能にする研究室に送るサンプリングの時点で５００μｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスを、その場で加えた。残りの鼻洗浄液サンプルは遠心分離後、上清をデカントで清潔な５ｍｌのポリプロピレンチューブに入れ、粘膜抗体の定量に使用するまで、−７０℃で保存した。
【０１５８】
４．７  解剖検査
膿瘍、または抗原投与後２１日目の終点に達した結果、すべてのポニーを安楽死させた後、Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｒｕｓｔによって行われる完全な解剖検査に供された。
【０１５９】
組織サンプルはリン酸緩衝液ホルマリン中に保存された後、通常の方法に従って微視的検査、および完全かつ正式な報告の提供に供された。 組織標本を取り出した後、結果は記録され、かつ腺疫菌感染レベルの評価に用いた。プロトコールに従ってチャコール標本を各エリアから採取した後、腺疫菌の存在を特定するため、ＣＯＢＡ連鎖球菌選択プレートで処理した。
【０１６０】
腺疫の病状は表５に示す系を用いてスコア化した。
【０１６１】
【表６】
2011506433.tif 000029
【０１６２】
４．８  病理組織検査
解剖検査時にポニーより採取した組織サンプルはホルマリンで固定後、薄片に切断され、解析のためＲｏｙａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ＣｏｌｌｅｇｅのＫｅｎ Ｓｍｉｔｈ教授に送った。Ｓｍｉｔｈ教授は各ポニー由来のサンプルに対する報告を準備してくれ、かつ彼の所見は表６に従ってスコア化した。
【０１６３】
【表７】
2011506433.tif 000030
【０１６４】
偏差
実験は、許可された実験プロトコールによる以下の偏差と共に、第０８.Ｃ００１ Ｐ号のプロトコール、およびそれに続く補正に従って行われた。
【０１６５】
ポニー９２２９は２００８年２月１４日から、ズーエピデミカス感染により、発熱した。 このポニーは週末には回復し、２００８年４月１８日にはワクチン接種した。
【０１６６】
４５％のポニーがズーエピデミカス感染のため、Ｖ２の日付は、７日遅れた。これはＶ３に影響し、抗原投与も７日遅れた。
【０１６７】
スタッフの不足により、ポニーのサンプリングが１日遅れた。
８５日目にサンプル採取しなければならなかったポニーは、実質的に８６日目にサンプル採取した。
【０１６８】
２０ｍｌのＥＤＴＡ血液を８６日目に採取し、そのうち１０ｍｌを、アーカイビング用のポニーのＤＮＡ精製ができるようにした。
【０１６９】
Ｎｏｒｄｖａｃｃは、抗原接種していないＰｅｎｔａｖａｃ群（２）を、抗原応答の持続をモニターするため、６カ月の期間維持することを決定した。
【０１７０】
６．実験終了時におけるポニーの最終結果
第１群および第３群のすべてのポニーは、安楽死させた後、解剖検査に供した。第２群のポニーは６ヶ月間の間、抗体応答の持続をモニターするために維持した。
【０１７１】
７．アーカイビング
生データはＬａｎｗａｄｅｓ Ｐａｒｋ， Ｋｅｎｔｆｏｒｄ， Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ， Ｓｕｆｆｏｌｋ， ＣＢ８ ７ＵＵのＡｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｒｕｓｔに保管された。
【０１７２】
８．結果の要約
８．１  第１回目および第２回目のワクチン接種後の応答
８．１．１臨床応答
すべてのポニーは、第１回目のワクチン接種において良好に応答した。 注入部位反応は、どの群でも観測されなかった。しかしながら、ワクチン接種群では、直腸温度の上昇が観測された（図７）。これは、７頭中４頭がＶ１の１日後に、７頭中５頭がＶ２の１日後に、発熱（体温＞３８．９℃）したことが、Ｓｅｐｔａｖａｃの群において顕著であった。対して、Ｐｅｎｔａｖａｃ群の７頭中２頭、および対照では０頭がＶ１後の発熱し、Ｐｅｎｔａｖａｃ群の７頭中３頭、および対照では０頭がＶ２後の発熱した。興味深いことに、Ｓｅｐｔａｖａｃを投与した1頭、Ｐｅｎｔａｖａｃを投与した２頭、および対照の１頭が、Ｖ３後に発熱した。これは、ワクチン中の抗原をより効果的に中和する、Ｖ２後に誘導された高いレベルの抗体によるものであると考えられる。
【０１７３】
ワクチン投与相における実験群間の経鼻スコア（図８）、リンパ節スコア（図９）、またはズーエピデミカスカウント（図１０）には、いくつかのポニーがこの年齢のポニーに典型的なズーエピデミカス感染をしたことを除いては、明確な違いはなかった。これは、図７で示すようなＶ２の初回投与日（２００８年４月３日）付近での平均直腸温度の上昇をもたらす。ポニーはズーエピデミカス感染から回復することができ、すべてのポニーは２００８年４月１０日にワクチン接種した。
【０１７４】
８．２  抗原投与後の応答
両方の抗原投与の準備および処理は極めて順調に行われ、すべてのポニーが必要量の腺疫菌を、２００８年５月８日に問題なく受けた。
【０１７５】
最も早い発熱の発症は、抗原投与後４日後における対照ポニー２０７８であった。さらに２頭のポニーが、５日目に発熱し、さらに６，７日目、および最後の対照ポニーが１０日目に発熱した（図１１）。対照ポニーの発熱平均日は４．２日であり、対照的にワクチン接種したポニーは０．７日であった。しかしながら、対照ポニーは抗原投与後８日目に健康上の問題で安楽死させた後、すべてのポニーは抗原投与後１３日目に安楽死させたことに注目されたい。これは、腺疫菌感染に負けたポニーを安楽死させるため、平均体温、観測スコア、フィブリノーゲンオおよび好中球レベル、ならびに対照ポニーの観測スコアに波及効果をもたらした。全体的に、抗原投与後５日目から１１日目にかけて、２つの群の平均体温に顕著な違いがあった（表１１）。Ｓｅｐｔａｖａｃを投与したポニーについては、ポニー０９７６のみが８日目に発熱した（表７）。しかしながら、これは、このポニーにおける明らかなズーエピデミカス亜種感染の進行によるものであった。
【０１７６】
フィブリノーゲンレベルは、抗原投与後６、８日目および１１日目に、２つの群の平均体温に顕著な違いがあった（図１２）。すべての対照はフィブリノーゲンレベルの上昇を呈したが、ワクチン接種した２頭（ポニー０９７６および９７９４）のみがより高いレベルを示した。
【０１７７】
好中球レベルも、抗原投与後６、８日目および１１日目に、２つの群の平均体温に顕著な違いがあった（図１３）。すべての対照はフィブリノーゲンレベルの上昇を呈したが、ワクチン接種した１頭（ポニー９７９４）のみがより高いレベルを示した。
【０１７８】
顎下腺リンパ節腫長のレベルが対照ポニーで増大したが、統計的に顕著には見えなかかった（図１４）。実験群間において、鼻洗浄液（図１５）およびズーエピデミカスカウント（図１６）の違いはなかった。
【０１７９】
解剖検査において、すべての対照は複数のリンパ節膿瘍が見られた一方で、ワクチン接種した１頭のポニー（９７９４）のみに、リンパ節膿瘍が見られた（表８および９）。全体的に、対照の平均病理スコアは１１．７であり、それぞれ顕著なレベルの予防がＳｅｐｔａｖａｃワクチンによって誘導されたことを意味する（図１７）。腺疫菌はすべての対照ポニーのリンパ節から単離されたが、ワクチン接種群は２頭のみであった（０９７６および９７９４）（表１０）。これらの知見は、Ｓｅｐｔａｖａｃ群のポニーは１頭のみが、リンパ節の２か所において膿瘍を発症しという、組織病理検査によって強調される。
【０１８０】
さらに、Ｓｅｐｔａｖａｃ群の鼻洗浄液中および血清サンプルのＩｇＧレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した結果、抗原は粘膜抗体および血清抗体を産生していた（図１９および図２０）。
【０１８１】
【表８】
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【０１８２】
【表９】
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【０１８３】
【表１０】
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【０１８４】
【表１１】
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【０１８５】
【表１２】
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【０１８６】
９．Ｐｅｎｔａｖａｃ  Ａ  ワクチン接種実験
２回目の試験において、実験群２の７頭のウマ（３．２節、表３）はＶ３ワクチン接種後（表４）、放牧したのち、ＥＬＩＳＡにおけるＰｅｎｔａｖａｃ  Ａ製剤中の５つの抗原に対するＩｇＧ抗体力価を、血液サンプルを定期的に採取した。２７０日目（２００８年１１月６日）、Ｐｅｎｔａｖａｃ  Ａの追加抗原投与を４．１節に記載の手順に従って行った。 抗原投与に先立って、群はＡＣＶSに移送された後、１４日間にわたり追加投与され、その後群は、４．２章に記載のように実験的に腺疫菌４０４７を抗原投与された後、４．３に記載のように基本的にモニターした。
【０１８７】
９．１  Ｐｅｎｔａｖａｃ  Ａ  ワクチン接種実験の簡単な要約
Ｐｅｎｔａｖａｃ  Ａ実験は、ワクチン接種後、個々の抗原に対する顕著な抗体応答が最低６ヶ月間持続することを明らかにした（図２１）。 Ｐｅｎｔａｖａｃ  Ａワクチンは、腺疫菌の抗原投与による感染の発生のため遅延し、そのため群中の１頭のポニーが腺疫を発症しなかった。
【０１８８】
さらなる応用
本発明から予想される結果は、免疫グロブリンを分解する酵素は、標的動物を感染から予防するワクチン中の抗原として使用できる。したがって、本発明の一態様においては、ヒト病原体群Ａ連鎖球菌（ＧＡＳ）に関して、細菌によるヒトの感染を予防するワクチン組成物を構築することは可能である。ＧＡＳ株において、ＩｄｅＥおよびＩｄｅＥ２と配列相同性を共有する、細胞外免疫グロブリン分解タンパク質（Ｓｉｂ３５、ＩｄｅＳまたはＭａｃ−タンパク質と呼ばれる）についてのいくつかの報告があるため、したがって本発明を考慮することは、抗原を精製することが可能で、かつ別々にまたはＡ群株由来の他の精製した細胞外タンパク質（Ｍタンパク質もしくはＭ様タンパク質またはこれらの断片）と組み合わせて、ワクチン中の抗原として使用できる。本発明についての他の推測される結果は、本発明は、診断目的またはヒトを含む標的動物の受動免疫の目的において、特異的な抗血清、ポリクローナル、またはモノクローナル抗体の開発に使用できる。
【０１８９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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