(57)【要約】  本発明は、一又は複数のＮ-グリカンを有する新規のヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)変異体に関する。本発明のｈＧＨ変異体は、野生型ｈＧＨに存在しない一又は複数の変異から生じる、少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。本発明のｈＧＨ変異体は長時間にわたる循環半減期を有し、よってｈＧＨのレベルを高めることが有益でありうる疾患状態のタンパク質治療剤として効果的に使用することができる。またｈＧＨ変異体を得る方法も、本発明に含まれる。
2011525800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン変異体であって、該変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン。
【請求項２】
分子量が野生型ヒト成長ホルモンと比較して増加している、請求項１に記載のヒト成長ホルモン。
【請求項３】
変異体の活性が、野生型ヒト成長ホルモンの活性と実質的に同じである、請求項１に記載のヒト成長ホルモン。
【請求項４】
ヒト成長ホルモン変異体のインビボ循環半減期が、野生型ヒト成長ホルモンと比較して延長されている、請求項１に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項５】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｓ５５Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ６５Ｓ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ／Ｔ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ／Ｔ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｓ／Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｓ／Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｓ／Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｓ／Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓ／Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じている、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項６】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｔ１４８Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、又はＲ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項７】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ及びＬ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項８】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項９】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じている、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項１０】
変異／変異対の次のセット：
ａ．Ｑ４９Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｂ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｃ．Ｑ４９Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｄ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｅ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｆ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｇ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｈ．Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｉ．Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｊ．Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、及び
ｋ．Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ
ｌ．Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ、
ｍ．Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ、及び
ｎ．Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ、
から選択される、一又は複数の変異を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項１１】
一又は複数の化学的変異又は付加的変異を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸、ＤＮＡコンストラクト又はベクター。
【請求項１３】
Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を調製する方法であって、該方法が、真核細胞中で請求項１２に記載の核酸、ＤＮＡコンストラクト又はベクターを組換え発現させることを含む方法。
【請求項１４】
Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体が、一又は複数のＮ-グリカンでグリコシル化されている、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のヒト成長ホルモン変異体であり、該Ｎ-グリカンが、該ヒト成長ホルモンが変異体において、一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)に結合しており、Ｎ-グリコシル化モチーフが野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【請求項１５】
少なくとも５０％の成長ホルモン変異体がＮ-グリコシル化されている、請求項１４に記載のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物。
【請求項１６】
少なくとも５０％のＮ-グリカンが、少なくとも一のシアル酸部分を有する、請求項１４に記載のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する製薬用組成物を調製する方法であって、該方法が、
ａ．Ｎ-グリコシル化を実施可能な宿主細胞において、請求項８に記載のベクターの核酸、ＤＮＡコンストラクトを組換え発現させ、
ｂ．Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を精製し、
ｃ．工程ｂで精製されたＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する製薬的に許容可能な製剤を調製する、
工程を含む方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体、又は請求項１５又は１６に記載の調製物と、製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体、請求項１５又は１６に記載の調製物、又は請求項１５に記載の製薬用組成物を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、ヒト成長ホルモンを必要とする哺乳動物を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、新規のヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)変異体で、Ｎ-グリコシル化モチーフが、野生型ｈＧＨに存在しないものに関する。本発明のｈＧＨ変異体は、ｈＧＨのレベルを高めることが有益であり得る疾患状態のタンパク質治療剤として使用される際に長時間にわたる循環半減期を有する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は、２つのジスルフィド架橋と２２ｋＤａの分子量を有する、１９１アミノ酸長のタンパク質である。ジスルフィド結合は、５３位と１６５位及び１８２位と１８９位を連結させる。ｈＧＨは、成長の促進、正常な体組成、同化作用及び脂質代謝の維持において、重要な役割を担っている(Barnels K, Keller U. Clin. Endocrinol. Metab.10, 337(1996))。また、中間代謝における直接的影響を有し、例えばグルコース取り込み度合いを低減させ、脂質分解を増加させ、アミノ酸取り込み度合いを増加、及びタンパク質合成を促進させる。さらにホルモンは、脂肪組織、肝臓、腸、腎臓、骨格、結合組織、及び筋肉を含む他の組織に影響を与える。組換えｈＧＨが生産されており、例えば：ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＴＭ(Pharmacia Upjohn)、ＮｕｔｒｏｐｉｎＴＭ及びＰｒｏｔｒｏｐｉｎＴＭ(Genentech)、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭ(Eli Lilly)、ＳｅｒｏｓｔｉｍＴＭ(Serono)及びＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＴＭ(Novo Nordisk)等、商業的に入手可能である。さらに、Ｎ末端に付加的なメチオニン残基を有するアナログ、例えば：ＳｏｍａｔｏｎｏｒｍＴＭ(Pharmacia Upjohn/Pfizer)も市販されている。
【０００３】
一般的に、ｈＧＨが正常値以下であると、成長関連欠陥に至る。例えば、窒素保持率の増加、骨格筋成長の刺激により、ｈＧＨは正常な体組成を維持している。子供において成長ホルモンが欠失すると小人症に至り、これはｈＧＨの外的投与により効果的に処置することができる。また、ｈＧＨのレベルの低減は、除脂肪体重の低下、脂肪組織量の増加、皮膚の収縮を含む、加齢の兆候の原因となりうると考えられている。
【０００４】
現在のｈＧＨ治療レジメンでは、毎日の皮下注射が必要である。週当たりの注射が少ない投与レジメンが有益である。タンパク質の半減期を増加させるためのいくつかの原則は発見されているが、部分的には種々のタンパク質は異なる経路及びメカニズムにより排出されるため、それらの利用性は種々のタンパク質間で異なる。
【０００５】
いくつかのタンパク質は、野生型タンパク質においてグリコシル化していないアミノ酸位置に、Ｎ-グリカンを付加することにより、半減期の増加を達成することができる(Sinclair及びEllliott, J Pharm Sci. 94, 1626(2005))。Ｎ-グリカンは、タンパク質を生成する真核細胞により、タンパク質に結合している。真核細胞の細胞Ｎ-グリコシル化メカニズムは、Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔモチーフを認識し、新生タンパク質がリボソームから小胞体へ転位置する場合に、このモチーフのＮ残基にグリカンを付与する(Kielyら J Biol Chem. 251 5490(1976); Glabeら J Biol Chem. 255, 9236(1980))。よって、糖鎖操作されたタンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列にＮ-グリコシル化部位を付加する変異を導入することにより、生成することができる。この原則は長時間作用する第２世代のエリスロタンパク質を得るのに使用される(Aranesp(登録商標), Amgen), Elliottら Nature Biotechnology 21, 414(2003)。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)変異体で、Ｎ-グリコシル化モチーフが、野生型ｈＧＨに存在しないものに関する。一実施態様において、前記変異体は、前記部位にＮ-グリコシル化が提供され、長時間にわたる循環半減期を有するｈＧＨ変異体の発現に至る、真核細胞において発現する。このようなｈＧＨ変異体は、ｈＧＨのレベルを増加させることが有益な疾患状態用のタンパク質治療剤として、特に一日の注射、例えば週当たりの注射を減らした処置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａは、実施例１に記載するような、哺乳動物細胞における発現のための、野生型ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。図１Ｂは、成熟したｈＧＨのタンパク質配列である(配列番号１)。
【図２】図２は、ｐＧＢ０３９で一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞の培地において、ＥＬＩＳＡにより測定された組換え野生型ヒト成長ホルモンの収率を示す(実施例２)。
【図３】図３は、利用されるＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトで一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの培地を用いたＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイの結果を示す。細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンが標準体として供給され、平行してテストした。テストされるヒト成長ホルモン変異体を、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、１００ρＭ、３００ρＭ、３０ρＭ、１０ρＭ、３ρＭ、１ρＭ、０．３ρＭ、及び０．１ρＭまで希釈した。種々の勾配を使用する、成長反応に対するｈＧＨ濃度の対数を記載したトレンドラインを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(Prism)(実施例５)を用いて算出した。
【図４】図４は、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトで一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの培地を用いたＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイの結果を示す。細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンが標準体として供給され、平行してテストした。テストされるヒト成長ホルモン変異体を、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ρＭ、１００ρＭ、５０ρＭ、１０ρＭ、５ρＭ、１ρＭ、０．５ρＭ及び０．１ρＭまで希釈した。種々の勾配を使用する、成長反応に対するｈＧＨ濃度の対数を記載したトレンドラインを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(Prism)(実施例７)を用いて算出した。
【図５】図５は、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ(ＴＶＬ２０)、又は野生型ヒト成長ホルモンが静脈注射されたオスのスプラーグドーリーラットの血漿における、時間に対するヒト成長ホルモン濃度の平均を示す(実施例１０)。
【図６】図６は、利用されるＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトで一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの培地を用いたＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイの結果を示す。細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンが標準体として供給され、平行してテストした。テストされるヒト成長ホルモン変異体を、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ρＭ、１００ρＭ、５０ρＭ、１０ρＭ、５ρＭ、１ρＭ、０．５ρＭ、及び０．１ρＭまで希釈した。種々の勾配を使用する、成長反応に対するｈＧＨ濃度の対数を記載したトレンドラインを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(Prism)(実施例１３)を用いて算出した。
【図７】図７は、利用されるＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトで一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの培地を用いたＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイの結果を示す。細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンが標準体として供給され、平行してテストした。テストされるヒト成長ホルモン変異体を、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ρＭ、１００ρＭ、５０ρＭ、１０ρＭ、５ρＭ、１ρＭ、０．５ρＭ、及び０．１ρＭまで希釈した。種々の勾配を使用する、成長反応に対するｈＧＨ濃度の対数を記載したトレンドラインを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(Prism)(実施例１３)を用いて算出した。
【図８】図８は、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトで一時的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの培地を用いたＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイの結果を示す。細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンが標準体として供給され、平行してテストした。テストされるヒト成長ホルモン変異体を、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ρＭ、１００ρＭ、５０ρＭ、１０ρＭ、５ρＭ、１ρＭ、０．５ρＭ、及び０．１ρＭまで希釈した。種々の勾配を使用する、成長反応に対するｈＧＨ濃度の対数を記載したトレンドラインを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(Prism)(実施例１５)を用いて算出した。
【図９】図９は、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６４)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６６)、又はＱ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６７)、又は野生型ヒト成長ホルモンが静脈注射されたオスのスプラーグドーリーラットの血漿における、時間に対するヒト成長ホルモン濃度の平均を示す(実施例１７)。
【図１０】図１０は、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６４)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６６)、又はＱ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６７)、又は野生型ヒト成長ホルモンが皮下注射されたオスのスプラーグドーリーラットの血漿における、時間に対するヒト成長ホルモン濃度の平均を示す(実施例１７)。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
(発明の記載)
本発明は、治療目的で使用可能な、長時間にわたる半減期を有するヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)変異体に関し、付加的なＮ-グリコシル化を担持し、組換え的に発現するヒト成長ホルモンが提供され、該変異体は、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ類(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。核酸ｈＧＨは、特定のアミノ酸位置で変異しており、真核細胞における核酸の組換え発現により、野生型ｈＧＨと比較して、長時間にわたる循環半減期を有する、これらのｈＧＨ変異体のＮ-グリコシル化誘導体が生じるであろう。その改善された薬物動態性の故に、本発明のｈＧＨ変異体は、変化していないｈＧＨと比較して投与頻度を低減した場合も、ｈＧＨのレベルを高めることが有益になるであろう疾患状態のタンパク質治療剤としてさらに有用なものとなる。
【０００９】
本文において、「変異体」なる用語は、付与されたポリペプチドの自然に生じた変異体、又は付与されたペプチド又はタンパク質、例えばヒト成長ホルモン(配列番号１に存在する配列)の組換え的に調製された又は他の方法で修飾された変異体を称することを意図しており、ここで、一又は複数のアミノ酸残基は、アミノ酸の置換、付加、欠失、挿入、又は反転(invertion)により修飾されている。精製について、ｈＧＨ変異体は、誘導体化又はそうでなければ修飾、すなわち親ペプチドに任意の種類の分子が共有結合することにより修飾されてもよい。典型的な修飾は、ヒト成長ホルモン変異体配列を含むポリペプチドへの、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等の結合であり得る。特に、ｈＧＨ変異体は、Ｎ-グリコシル化を担持可能である。ｈＧＨ変異体は、野生型ヒト成長ホルモンに存在しないＮ-グリコシル化部位の導入に関連しない、さらなる変異を付加的に含むことができる。このような付加的な変異は、多様な理由のため、例えば上述した任意の種類の分子の共有結合による修飾可能性を含む。
【００１０】
一実施態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるｈＧＨ変異体を提供する。
【００１１】
当該技術で公知の「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定されるような、２又はそれ以上のペプチド配列の間の関係を称する。当該技術において、「同一性」とは、２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリングの間の適合数により決定されるような、ペプチド間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により処理されるギャップアラインメント(もしあれば)を用いて、２又はそれ以上の配列の同一適合性のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法により容易に算出することができる。このような方法は、限定されるものではないが、 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,及びGriffin, H. G編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991;及びCarilloら, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものを含む。
【００１２】
同一性を決定するための好ましい方法は、テストされる配列間に最も大きな適合性を付与するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＡＰ(Devereuxら, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschulら, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschulら, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschulら, 上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)も、同一性を決定するために使用され得る。
【００１３】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)の使用では、パーセント配列同一性が測定される２つのペプチドは、それらそれぞれのアミノ酸が最適に適合するように整列させられる(アルゴリズムにより決定される「適合スパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスにより適合する、それぞれ完全アミノ酸に割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開裂ペナルティの{分率(１／１０)}倍である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２が、アルゴリズムと併用して使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992))も、アルゴリズムにより使用される。
【００１４】
ペプチド配列比較のために好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needlemanら, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoffら, PNAS. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性閾値：０。
上述したパラメータを有するＧＡＰプログラムが有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップに対するペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
【００１５】
一実施態様において、ｈＧＨ変異体は、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一実施態様において、ｈＧＨ変異体は、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
また本発明は、一又は複数の次の変異セット：
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ；
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、及びＧ１０４Ｎ；又は
Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、及びＧ１０４Ｎ；
から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体を含む。
【００１８】
一実施態様において、本発明は、ｈＧＨ変異体をコードする単離された核酸配列であって、該変異体が、野生型ｈＧＨには存在しない一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むものを提供する。
【００１９】
本発明は、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するｈＧＨをコードする単離された核酸配列を提供する。
【００２０】
本発明は、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するｈＧＨをコードする単離された核酸配列を提供する。
【００２１】
また本発明は、一又は複数の次の変異セット：
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ；
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、及びＧ１０４Ｎ；又は
Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、及びＧ１０４Ｎ；
から生じるＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体をコードする単離された核酸配列を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸を含有するベクターを含む真核宿主細胞を提供する。
【００２３】
またさらに本発明は、一又は複数の次の変異セット：
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ；
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、及びＧ１０４Ｎ；又は
Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、及びＧ１０４Ｎ；
から生じるＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸を含有するベクターを含む。
【００２４】
一実施態様において、本発明は、上述した一又は複数の変異から生じる一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフにおいてグリコシル化された、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を提供する。
さらに本発明は、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン変異体と、製薬的に許容可能な担体を含有する、製薬用組成物を提供する。前述の製薬用組成物は、本開示に記載された種々の任意のｈＧＨ変異体を含む。
【００２５】
一実施態様において、本発明は、ヒト成長ホルモンを必要とする哺乳動物を処置する方法であって、本開示に記載された任意のヒト成長ホルモン変異体を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
野生型ｈＧＨに存在しない一又は複数の変異から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を含有するＮ-グリコシル化ｈＧＨ変異体を得るための方法において、次の：(ａ)Ｎ-グリコシル化を実施可能で、変異したヒト成長ホルモンを発現可能な細胞を、該変異したヒト成長ホルモンをコードする核酸で形質移入し；(ｂ)該変異したヒト成長ホルモンを発現させる工程を含む該方法が、本発明にさらに含まれる。
【００２７】
本発明は、特定のアミノ酸位置に、少なくとも一のＮ-グリコシル化部位を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)変異体を提供し；該本発明のｈＧＨ変異体は、治療的に活性であり、グリコシル化されていない野生型ｈＧＨタンパク質に対して改善された薬物動態パラメーター及び特性を有する。
【００２８】
一実施態様において、本発明のｈＧＨ変異体は、真核宿主細胞に形質移入された外因的ＤＮＡ配列の発現の生成物である。例えば、本発明のｈＧＨは、組換え的に生成される。組換えｈＧＨの生成は当該技術でよく知られており、当業者にとって容易に認識可能である(例えば：US4670393)。
【００２９】
一実施態様において、本発明は、野生型ｈＧＨと比較して、改善された循環半減期を有する活性化Ｎ-グリコシル化タンパク質を得るために、ポリペプチドに適切な部位又は部位類を有する組換えｈＧＨを提供する。ここに記載の発明は、組換えＤＮＡ技術を使用することにより、簡便に実施される。
【００３０】
一般的に、ｈＧＨをコードするＤＮＡ配列はクローンされ、簡便な宿主で発現可能なようにマニピュレートされる。図１Ａに示されるヌクレオチド配列は、２１７のアミノ酸ｈＧＨタンパク質前駆体(配列番号６５及び６６)をコードする。Ｎ末端の２６のアミノ酸は、ｈＧＨが真核細胞で生成される際に、細胞内で切断される、シグナルペプチドを構成する。よって、図１Ａに示される配列によりコードされるヒト成長ホルモンを発現する哺乳動物細胞は、図１Ｂに提供される成熟した１９１のアミノ酸成長ホルモン(配列番号１)を分泌する。
【００３１】
ｈＧＨＤＮＡは、宿主細胞の形質転換又は形質移入に使用される、適切なプラスミド又はベクターに挿入される。原核生物、真核生物の生物体、例えば酵母培養体又は多細胞生物体から誘導される細胞が、ＤＮＡ配列のクローニング又は発現のために、当該技術で使用される。
本発明で使用される適切な宿主細胞は、Ｎ-グリコシル化が可能な細胞である。Ｎ-グリコシル化とは、Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔモチーフにおける、アスパラギン残基への糖部分の付加である。アスパラギンの側鎖におけるアミド窒素に、真核細胞のＮ-グリコシル化機構により結合したこのような糖部分は、Ｎ-グリカンと呼ばれる。
【００３２】
真核細胞、例えば哺乳動物細胞は、一般的にこのようなＮ-グリコシル化を実施することが可能である。本発明での使用に適した株化細胞の具体例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)(ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１)、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)及び２９３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Grahamら, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)株化細胞である。さらに、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ(ラット肝細胞腫；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００)、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ(ラット肝細胞腫；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８)、ＴＣＭＫ(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９)、ヒト肺(ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５)、ＮＣＴＣ １４６９(ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１)、ＣＯＳ-１(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０)、ＤＵＫＸ細胞(Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)及びＣＨＯ-ＤＧ４４細胞(Urlaubら Cell 33:405-412, 1983)を含む他の多くの株化細胞が、本発明で使用できる。一実施態様において、本発明のＮ-グリコシル化部位を有するｈＧＨ変異体の発現に使用される宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様において、本発明のＮ-グリコシル化部位を有するｈＧＨ変異体の発現に使用される宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３３】
また、哺乳動物細胞とは別に、操作された酵母細胞も、適切な系、例えばグリコＦｉ()の使用により、グリコシル化タンパク質を発現させるのに使用可能である。
ｈＧＨの発現に使用される宿主細胞は、細胞増殖及びｈＧＨ変異体の発現に適した条件下で培養される。特に、培養培地は、前記目的のために選択された宿主細胞の増殖に適した成長因子、及び適切な栄養素を含有する。例えば、哺乳動物宿主細胞に適した培養条件は、例えばMammalian Cell Culture(Mather, J. P編, Plenum Press 1984)、及びBarnes及びSato, Cell, 22:649(1980)に記載されている。さらに近年、動物性成分フリーの方法が、ますます生物製剤製造の標準になりつつある(Butlerら Appl Microbiol Biotechnol 68:283, 2005)。さらに、選択された培養条件では、細胞内コンパートメント間の転写、翻訳及びタンパク質移動が可能である。これらの方法に影響を与える要因のいくつかには、限定されるものではないが、例えばＤＮＡ／ＲＮＡのコピー数；ＲＮＡを安定化させる因子；培養培地に存在する栄養素、サプリメント、及び転写誘導因子又は抑制因子；温度、ｐＨ及び培養体の浸透圧；及び細胞密度が含まれる。特定のベクター-宿主細胞系における適切な発現を促進させるための上述した因子のマピュレーションは、当業者には容易に認識可能である。
【００３４】
宿主細胞と適合する種から誘導されたコントロール配列及び複製を含有するプラスミドベクターが、一般的に発現に使用される。ベクターは複製部位、並びに形質転換細胞に表現型選択を提供可能な関心あるタンパク質をコードする配列を担持する。
【００３５】
ｈＧＨ遺伝子のクローニング後、アミノ酸配列を修飾するために、コード化された変異ＤＮＡを生成する種々の技術を使用することができる。これらの技術には、部位特異性突然変異誘発(Carterら, Nucl Acids Res.13：4331, 1986；Zollerら Nucl Acids Res. 10：6487, 1987)、カセット突然変異誘発(Wellsら Gene, 34：315, 1985)、制限選択突然変異誘発(Wellsら Philos Trans R Soc. London SerA, 317：415, 1986)、又は当業者に認識されている他の公知の技術が含まれる。好ましい実施態様においては、部位特異性突然変異誘発を、グリコシル化部位を有するｈＧＨを生成するために、本発明で使用した。グリコシル化部位が適切な発現ベクターに作用可能に結合している場合に、ｈＧＨ変異体が得られる。また、ヒト成長因子(ｈＧＨ)変異体は、ｈＧＨの親又は変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に結合した適切なシグナル配列を使用することにより、発現宿主からこのような分子を発現させ、分泌させることで、得ることもできる。このような方法は当業者によく知られている。また本発明は、ｈＧＨポリペプチドを生成するために使用可能な他の方法、例えば所望のｈＧＨ変異体のインビトロ化学合成(Baranyら The Peptides編. E. Gross 及び J. Meienhofer, Academic Press: New York 1979, Vol. 2, pp. 3-254)を含む。
【００３６】
炭水化物は、アスパラギンへのＮ結合、及びセリン及びスレオニンへのＯ結合が、組換え糖タンパク質治療に最も関連しているいくつかの方法において、糖ペプチドに結合している。タンパク質のグリコシル化を開始させるための決定要因は、一次配列関係に存在しているが、タンパク質領域及び立体構造を含む他の要因も、それらの役割を有している。Ｎ結合グリコシル化はコンセンサス配列Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔで生じ、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸であってよい。好ましい実施態様において、システイン又はプロリン残基に係るアミノ酸置換により形成されたＮ-グリコシル化部位は無視される。
【００３７】
ここに記載のｈＧＨアナログは、グリコシル化されていない野生型ｈＧＨと比較して、グリコシル化のための少なくとも一の付加的部位を含むアミノ酸配列を含む。ポリペプチドにＮ-グリコシル化を導入するための部位は、配列のどこにでも位置させることができる。タンパク質構造又は折り畳みとの干渉を防止するために、一実施態様では、一又は複数のＮ-グリコシル化部位は、タンパク質の表面上に存在するとうに選択される。さらに、成長ホルモンレセプターへの結合に干渉することも所望されておらず、よって、ヒト成長ホルモンの結合間期にＮ-グリコシル化部位が導入されることも所望されない。一実施態様において、一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフは、成熟したヒト成長ホルモンタンパク質の一又は複数の領域に導入される。一実施態様において、少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)は、成熟したｈＧＨ(配列番号１)のアミノ酸残基４９-７５、９３-１０４及び１１１-１４０における一又は複数の変異から生じる。本発明のさらなる実施態様において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は全てのＮ-グリコシル化モチーフが、アミノ酸残基４９-７５、９３-１０４及び１１１-１４０に導入される。一実施態様において、全てのＮ-グリコシル化モチーフがアミノ酸残基４９-７７、９３-１０４及び１２７-１３３に導入される。
【００３８】
一実施態様において、本発明は、野生型ｈＧＨの一又は複数の変異から生じた少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)に関する。Ｎは、野生型に存在するＳ又はＴからの適切な距離において導入され、又はＳ又はＴ(以下Ｓ／Ｔと記す)は、野生型に存在するＮからの適切な距離に導入されうる。または、Ｎ-グリコシル化モチーフは、Ｎ、及びＳ又はＴの双方に導入されることによって生じせしめることもできる。
【００３９】
一実施態様において、本発明は：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｓ５５Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｓ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ／Ｔ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ／Ｔ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｓ／Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｓ／Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｓ／Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｓ／Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓ／Ｔからなる変異／変異対の群から選択される、一又は複数の単一変異又は二重変異から生じる一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体を提供する。
【００４０】
一実施態様において、本発明は：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｔ１４８Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓからなる変異／変異対の群から選択される、一又は複数の単一変異又は二重変異から生じる一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体を提供する。
【００４１】
一実施態様において、本発明は：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ及びＬ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔからなる変異／変異対の群から選択される、一又は複数の単一変異又は二重変異から生じる一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体を提供する。表３、９及び１０に示すように、これらの変異は、野生型のグリコシル化されていないｈＧＨと比較して低減した移動度を有するバンドの検出により示される、ＨＥＫ２９３細胞で発現した場合に、機能的Ｎ-グリコシル化モチーフを生じせしめる。
【００４２】
一実施態様において、本発明は、一又は複数の次の変異：
Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎから生じる一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むｈＧＨ変異体を提供する。
【００４３】
一実施態様において、ｈＧＨ変異体は、一又は複数の次の変異：
Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎから生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。
【００４４】
一実施態様において、本発明は：Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔからなる変異／変異対の群から選択される、一又は複数の変異を導入することにより生じる、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、ヒト成長ホルモン変異体を提供する。
【００４５】
一実施態様において、ｈＧＨ変異体は、一又は複数の次の変異：
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ；
Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ；又は
Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎ；
から生じる少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含む。
【００４６】
一実施態様において、ヒト成長ホルモン変異体は：ａ）Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｇ１０４Ｎの群から選択される一又は複数の変異、及び／又はｂ）Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔからなる群から選択される一又は複数の二重変異を導入することにより生じる、少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を含有する。このような個々の実施態様は、次の変異セット：
ａ) Ｑ４９Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｂ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｃ) Ｑ４９Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｄ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｅ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｆ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｇ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｈ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｉ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｊ) Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、及び
ｋ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ
を含む、ヒト成長ホルモン変異体を含有する。
【００４７】
さらなる実施態様において、ｈＧＨ変異体は、ここで上述した野生型ヒト成長ホルモンに存在しないＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を生じせしめる変異に加えて、修飾及び／又は二次的変異を含む。
【００４８】
本発明の一実施態様において、成長ホルモン化合物は、結合部分、例えば限定されるものではないが、ＰＥＧ、炭水化物、アルブミンバインダー、脂肪酸、アルキル鎖、脂質親和性基、ビタミン類、胆汁酸、又は成長ホルモン化合物の側鎖又は主鎖へのスペーサーを介して、化学的に修飾される。このような修飾は、野生型ヒト成長ホルモン配列のアミノ酸残基に又は野生型配列のアミノ酸の置換により挿入されるアミノ酸残基に結合されうる。
【００４９】
また、アミノ酸置換を引き起こすｈＧＨ配列の付加的な変異により、ｈＧＨ変異体の機能を直接変化させることができる。一実施態様において、ｈＧＨ変異体は、欧州特許第534568号及び国際公開第2006048777号に記載されているような、タンパク質分解に対して耐性のある変異をさらに含む。宿主での発現中に生じる変異又は修飾は、インビトロでの後続する修飾工程にとっての必要性を無効にし、よって生成プロセスが短縮されるであろう。
【００５０】
ｈＧＨ変異体は、宿主細胞又は培養培地の成分から変異体を分離可能な任意の方法により、培養培地から精製することができる。簡単には、ｈＧＨ変異体は、例えば治療用ｈＧＨのペグ化、又はその診断使用において、変異体のさらなる使用と干渉するであろう宿主細胞を含有する培養培地から分離される。
【００５１】
このような分離の一般的な手順では、細胞残屑を除去するための、培養培地又は細胞可溶化物の遠心分離又は濾過が可能である。ついで典型的には、上清は、所望の容量になるまで濃縮又は希釈されるか、又はさらなる精製用の調製物を状態に適したバッファーにダイアフィルトレーションされる。ｈＧＨ変異体のさらなる精製は、典型的には、無傷形態から、脱アミド化又は政断された形態のものを分離することを含む。
【００５２】
アフィニティクロマトグラフィー；アニオン-又はカチオン-交換クロマトグラフィー(例えば、ＤＥＡＥセファロースを使用)；シリカにおけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過(例えば、セファデックスＧ-７５を使用)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；金属-キレートクロマトグラフィー；限外濾過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマトフォーカシング；及び置換クロマトグラフィーは、ｈＧＨ変異体の精製に使用可能であり、当該技術で公知のいくつかの技術である。
【００５３】
一実施態様において、本発明は、ここで上述したような一又は複数の変異により生じた一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフにおいてグリコシル化した、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を提供する。
【００５４】
成長ホルモンの効力は、成長ホルモンレセプター(ＧＨＲ)との相互作用に依存する。よって、生成されたｈＧＨ変異体はＧＨＲと接触し、もしあるとすれば、レセプターと各変異体との間の相互作用は、さらなる分析により測定される。活性ドメインにおけるアミノ酸残基がレセプターとの相互作用に関与していることを測定するために、これらの活性を、同様のレセプターを有する野生型ｈＧＨの活性と比較する。
【００５５】
レセプター及び親及び変異体の相互作用を、当該技術でよく知られている、任意の簡便なインビトロ又はインビボアッセイにおいて測定する。インビトロアッセイは、ＧＨＲとｈＧＨの間の任意の検出可能な相互作用を測定するために使用可能である。このような検出は、比色変化、放射活性の変化、溶解度の変化、増殖誘発力、ゲル電気泳動により測定されるような分子量の変化の測定、及び／又はゲル排除法等を含むことができる。ｈＧＨの生理学的影響を検出するためのインビボアッセイは、例えば、電解質バランスの変化、又は重量増加である。一般的に、関心あるｈＧＨとレセプターとの相互作用における変化を検出するために、任意のインビトロ又はインビボアッセイは、可変パラメーターが存在する限り使用可能である。好ましい実施態様において、本発明のＮ-グリコシル化により生成されるｈＧＨ変異体は、例えば実施例５及び１３に記載されるように、ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞におけるそれらの増殖誘発力について試験した。ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞は、以前、参照としてここに導入される、国際公開第2006134148号に記載されている。ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞はＩＬ-３依存性マウスプロ-Ｂリンパ様ＢＡＦ３株化細胞から誘導される。ＩＬ-３は、成長ホルモンレセプター結合の結合により活性化される、ＪＡＫ-２及びＳＴＡＴを活性化させる。ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞は、ヒト成長ホルモンレセプターを発現させ、成長ホルモンでの刺激に対して、用量依存性増殖応答に応答する。
【００５６】
また、本発明では、(ａ)Ｎ-グリコシル化を実施可能で、変異したヒト成長ホルモンを発現可能な細胞を、該変異したヒト成長ホルモンをコードする核酸で形質移入し；(ｂ)該変異したｈＧＨを発現させることを含む工程を有する、Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体を発現させるための方法が提供される。
一実施態様において、細胞は真核細胞、例えばＣＨＯ細胞である。もちろん、本発明のベクターは原核細胞で複製することもできる。
【００５７】
野生型ヒト成長ホルモンに存在しないＮ-グリコシル化モチーフに、一又は複数のＮ-グリコシル化を含むｈＧＨ変異体は、いくつかの方法を使用することにより、野生型ヒト成長ホルモンから分化させることができる。Ｎ-グリコシル化は、野生型ヒト成長ホルモンと比較して、変異体の分子量が増加していると思われる。付加的又は代替的に、Ｎ-グリコシル化はタンパク質の等電点に影響を与える可能性がある。
【００５８】
ここで使用される場合「等電点」とは、タンパク質が正味荷電を担持しないｐＨを記載する。同様に、タンパク質における個々のアミノ酸の等電点は、アミノ酸が正味荷電を担持しないｐＨである。酸性アミノ酸は、その等電点以下のｐＨで中性の正味荷電、その等電点以上のｐＨで負の正味荷電を有する。塩性アミノ酸は、その等電点以上のｐＨで中性の正味荷電、その等電点以下のｐＨで正の正味荷電を有する。よって、付与された任意のｐＨで、グリカン等の他の部分の荷電と、タンパク質の個々のアミノ酸の組合せ荷電で、タンパク質の正味荷電が決定される。それらの等電点以下のｐＨでは、タンパク質は正の正味荷電を担持している。それらの等電点以上のｐＨでは、タンパク質は負の正味荷電を担持している。グリカン鎖のシアル酸は酸性の等電点を有する。よって、タンパク質にシアル化グリカン鎖を付加すると、さらに酸性の等電点へのシフトが誘発される。成熟した野生型ｈＧＨの等電点は５．２７である。
【００５９】
タンパク質の等電点は、典型的には、等電点電気泳動により決定される。等電点電気泳動は、ｐＨ勾配のある培地における、関心あるタンパク質の電気泳動により実施される。タンパク質が、タンパク質等電点のｐＨを有する培地の領域に達したとき、タンパク質はもはや正味荷電を有さないために、タンパク質の移動が停止する。よって、タンパク質はその等電点のｐＨで、シャープなバンドに集中するようになる。方法の具体例は、Eap及びBaumann(Eap CB, Baumann P, Electrophoresis 9, 650(1988))により記載されている。
【００６０】
一実施態様において、上述した方法を使用して調製されたヒト成長ホルモン変異体の等電点は、野生型ヒト成長ホルモンよりも酸性である。一実施態様において、ヒト成長ホルモン変異体の等電点は５．２７未満、例えば５．０未満、例えば４．５未満、又は４．０未満である。一実施態様において、前記ヒト成長ホルモン変異体の等電点は、０．２ｐＨ単位以上、又は０．４ｐＨ単位以上、例えば０．６ｐＨ単位以上、又は０．８ｐＨ単位以上、例えば１．０ｐＨ単位以上、成熟した野生型ｈＧＨの等電点未満である。
【００６１】
一実施態様において、上述した方法を使用して調製されたヒト成長ホルモン変異体は、野生型ヒト成長ホルモンと比較して、増加した分子量を有する。分子量における増加度は、当該技術でよく知られているいくつかの方法の一つ、例えばＳＤＳ-Ｐａｇｅ又は質量分析により測定することができる。
一実施態様において、このような重量増加は、Ｎ-グリコシル化部位の利用、例えばヒト成長ホルモン変異体に、Ｎ-グリカンが付加することによるものである。ＡＡ配列の変異により、野生型ヒト成長ホルモンと比較して、分子量の少しの変化が生じうる。
Ｎ-グリカンが、グリコシターゼ、例えばＰＮＧアーゼＦ-酵素又はノイラミニダーゼ-酵素を使用し、酵素的に除去又は修飾されるため、重量増加に対するＮ-グリカンの寄与は、インビトロ分析により確認することができる。
【００６２】
一実施態様において、上述した方法を使用して調製されたヒト成長ホルモン変異体は、グリコシダーゼで処理された場合、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおける移動度が変化する。移動度のシフトの検出は、一般的に当該技術で公知である。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは頻繁に使用され、移動度のシフトは、実施例５及び１３に記載されるようにして、容易に検出される。一つのＮ-グリカンの除去で表される移動度のシフトは、一般的に２-５ｋＤａのオーダーであり、一以上のＮ-グリカンが除去されるならば、それに応じて、移動度のシフトは増加するであろう。一実施態様において、前記グリコシダーゼはＰＮＧアーゼＦ-酵素又はノイラミニダーゼ-酵素である。一実施態様において、シフトは、少なくとも１ｋＤａ、例えば少なくとも２ｋＤａ、例えば少なくとも３ｋＤａ、例えば少なくとも５ｋＤａ、又は例えば少なくとも１０ｋＤａである。一実施態様において、シフトは１-１０ｋＤａ又は２-６ｋＤａである。
【００６３】
一実施態様において、本発明は、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物に関し、ここで、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体は、ここに記載したようなヒト成長ホルモン変異体であり、ヒト成長ホルモン変異体は一又は複数のＮ-グリカンでグリコシル化されており、該Ｎ-グリカンは、該ヒト成長ホルモン変異体において、一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)に結合しており、Ｎ-グリコシル化モチーフは野生型ヒト成長ホルモンに存在しない。本発明の一実施態様において、このような調製物は、ＳＤＳ-ｐａｇｅゲルにおいて推定される場合、少なくとも２０％のヒト成長ホルモン変異体がＮ-グリコシル化されているものを含有する。さらなる実施態様において、前記調製物の少なくとも２５、例えば４０、５０、６０、８０又は９０％のヒト成長ホルモン変異体がＮ-グリコシル化されている。一実施態様において、ここに記載したようなヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物では、該ヒト成長ホルモン変異体の６０-１００％、例えば７０-１００％、例えば８０-１００％、例えば９０-１００％、又は例えば９５-１００％がＮ-グリコシル化されている。Ｎ-グリコシル化の含有量の推定は、ここでは実施例５及び１３に例証されており、当該技術で公知の適切なスキャニング装置を使用して実施することができる。一以上のグリコシル化モチーフを含有する成長ホルモン変異体にとって、このような調製物は、異なる数のＮ-グリカンを有するヒト成長ホルモン変異体を含有可能である。一実施態様においては、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全てのグリコシル化モチーフが使用される。一実施態様において、少なくとも２０％のヒト成長ホルモン変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、全ての該グリコシル化モチーフに結合したＮ-グリカンを含む調製に含有される。一実施態様において、該調製物にて、少なくとも２５、例えば少なくとも４０、５０、６０、８０又は９０％のヒト成長ホルモン変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全てのグリコシル化モチーフにおいてＮ-グリコシル化している。本発明の一実施態様において、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物では、６０-１００％、例えば７０-１００％、例えば８０-１００％、例えば９０-１００％、又は例えば９５-１００％の該このようなヒト成長ホルモン変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全ての該グリコシル化モチーフにおいてＮ-グリコシル化している。
【００６４】
本発明の化合物は、成長ホルモンの活性化に働きかけ、循環している成長ホルモンの量を増加させることが有益となるであろう病気又は状態の処置に使用される。このような病気又は状態には、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、子供が受けたＨＡＡＲＴ処置によるＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；短い妊娠期間で出生した低身長小児(ＳＧＡ)；ＳＧＡではないがかなりの出生時低体重(ＶＬＢＷ)を有する小児出生における低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人おけるＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又はその内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨又はその内部の骨折；例えば手、膝又は肩等における、腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受ける又は受けた患者；腰又は円板置換、半月板修復、脊椎固定術、膝、臀部、肩、肘、手首又は顎のプロテーゼ固定術後の患者；骨接合術物質、例えば爪、ネジ及びプレートが固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィ症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；主として待機手術、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマを受けた後の患者；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷性の損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極小未熟児；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド処置による低身長症が含まれる。また、成長ホルモンは、筋組織、神経組織又は傷の治癒を促進させ、ダメージを受けた組織に対する血流を促進又は改善し；又はダメージを受けた組織における感染率を低下させるために使用され、該方法は、式Ｉの化合物を治療的有効量、それを必要としている患者に投与することを含む。よって、本発明は、これらの病気又は状態を処置する方法を提供するものであり、該方法は、本発明の成長ホルモン又は成長ホルモン化合物コンジュゲートを治療的有効量、それを必要とする患者に投与することを含む。
典型的には、投与される変異した成長ホルモンの量は、１０−７-１０−３ｇ／ｋｇ体重、例えば１０−６-１０−４ｇ／ｋｇ体重、例えば１０−５−１０−４ｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００６５】
一実施態様において、本発明は、上述した病気又は状態の処置に使用される、医薬の製造における、成長ホルモン又は成長ホルモン化合物コンジュゲートの使用を提供する。
ここに記載のｈＧＨ変異体は、治療用タンパク質として使用されることを意図している。また本発明は、ここに開示の任意の方法により修飾されたタンパク質を含有する製薬用組成物を指向している。一態様において、このような製薬用組成物は、１０−１５ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば１０−１０ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)等の修飾タンパク質を含有し、該組成物は２．０〜１０．０のｐＨを有する。組成物は、緩衝系、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、及び界面活性剤をさらに含有可能である。本発明の一実施態様において、製薬用組成物は水性組成物、すなわち水を含有する組成物である。このような組成物は、典型的には水溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様において、製薬用組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する組成物として定められる。同様に「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する溶液として定められ、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する懸濁液として定められる。
【００６６】
一実施態様において、製薬用組成物は凍結乾燥された組成物であり、医師又は患者は、使用前に溶媒及び／又は希釈液を添加する。
一実施態様において、製薬用組成物は、何ら事前に溶解することなく使用準備が整った乾燥した組成物(例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
【００６７】
一実施態様において、本発明は、修飾タンパク質、例えばｈＧＨ変異体とバッファーの水溶液を含有する製薬用組成物に関し、ここで該ｈＧＨ変異体は０．１-１００ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在しており、該組成物は約２．０〜１０．０のｐＨを有する。
一実施態様において、製薬用組成物のｐＨは、０．１の上方勾配を有する、例えば２．１、２．２、２．３等、２．０〜１０．０からなる列挙から選択される。
【００６８】
一実施態様において、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファー各自は、本発明の別の実施態様を構成する。
【００６９】
一実施態様において、組成物は、製薬的に許容可能な防腐剤をさらに含有する。一実施態様において、防腐剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサル(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択される。一実施態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる実施態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。一実施態様において、防腐剤は、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。一実施態様において、防腐剤は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の防腐剤各自は、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に防腐剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が挙げられる。
【００７０】
一実施態様において、組成物は、等張剤をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択される。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一実施態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定められ、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一実施態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。一実施態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様において、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様において、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤各自は、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が挙げられる。
【００７１】
本開示で使用される場合「成長ホルモン」又は「ＧＨ」は、トリ、ウマ、ブタ、ウシ又はヒツジのものを含む、任意の種、好ましくは哺乳動物由来、さらに好ましくはヒトからの成長ホルモンを称する。成長ホルモン様活性を示す任意の他のポリペプチド、そのフラグメント及び誘導体も、この発明で称されるＧＨの意味の範囲に含まれる。
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)のアミノ酸配列と野生型ＤＮＡが報告されている。アミノ酸配列は配列番号１と示すことができる。本発明は、部位特異性突然変異誘発により導入されたＮ-グリコシル化部位を有する新規のｈＧＨ変異体を記載する。本発明のｈＧＨ変異体は、グリコシル化可能な任意の組換え発現系において発現可能である。
【００７２】
本発明のｈＧＨ変異体配列におけるアミノ酸置換は、ｈＧＨ変異体を定める表記を有しており、例えばアミノ酸置換は１文字コードで野生型残基を表す文字により示され、数字は野生型配列におけるアミノ酸位置を示し、第２の文字は置換されたアミノ酸残基を示し、例えばＬ１０１Ｓは、１０１位のアミノ酸Ｌがアミノ酸Ｓで置換されている。多重変異は、「＋」により離間している連続した単一変異により示され、例えばＬ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎは、これら全ての変異を担持している変異体であることを示す。
【００７３】
「プラスミド」及び「ベクター」及び「プラスミドベクター」は、本明細書でのケースでは、最も一般的には交換可能に使用され得る。本用語は、宿主細胞に形質移入された後、宿主ゲノムとは独立して、又は宿主ゲノムに導入されることにより複製可能な、任意の核酸コンストラクトを含むことを意図している。
【００７４】
本開示で意味するところの「発現ベクター」はベクターの一実施態様であり、適切な宿主において、核酸の発現に影響を及ぼすことが可能な適切なコントロール配列に、作用可能に結合している核酸配列を含む核酸コンストラクトを称する。このようなコントロール配列には、転写をもたらすプロモーター、このような転写をコントロールする任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終了をコントロールする配列が含まれる。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、宿主細胞における組換え発現に適した真核発現ベクターであり、宿主細胞は、このようなモチーフを含有するポリペプチドにおいて、モチーフＮ-Ｘ-Ｓ／ＴでＮ-グリコシル化を導入可能である。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、ＣＨＯ細胞における発現に適した発現ベクターである。本開示で意味することろの「作用可能に結合」とは、ＤＮＡ又はポリペプチドの内部において、互いに機能的に関連していることである。例えば、プレ配列は、それがシグナル配列として機能する場合は、成熟形態のタンパク質の分泌に関与する、おそらくはシグナル配列の切断に関与するペプチドに、作用可能に結合する。プロモーターは、それが配列の転写をコントロールするならば、コード化配列に作用可能に結合し；リボソーム結合部位は、それが翻訳可能なように位置しているならば、コード化配列に作用可能に結合している。
【００７５】
ここで使用される場合「オリゴ糖鎖」とは、単一のアミノ酸残基に共有結合した全オリゴ糖構造を称する。「Ｎ-グリカン」とは、単一のアスパラギン残基に共有結合した全オリゴ糖構造を称する。「アンテナ」とは、オリゴ糖鎖の分枝状部を称する。Ｎ-グリカンは、１-、２-、３-、４、５、６又は７-アンテナであってよい。各アンテナはシアル酸部分を含みうる。
【００７６】
本発明は、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物に関し、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体は、ここに記載のヒト成長ホルモン変異体であり、ヒト成長ホルモン変異体は一又は複数のＮ-グリカンでグリコシルされており、該Ｎ-グリカンは、ヒト成長ホルモン変異体において、一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)に結合しており、Ｎ-グリコシル化モチーフは野生型ヒト成長ホルモンには存在せず、少なくとも５０％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する。一実施態様において、少なくとも６０％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有し、例えば少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する。分岐したオリゴ糖鎖のケースにおいて、各Ｎ-グリカンは多くのシアル酸部分、例えば５、８、１０、１２、１４又は１６のシアル酸部分を有する。
本発明の例証的実施例を以下に記載するが、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００７７】
実施態様
１．ヒト成長ホルモン変異体であって、該変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有するアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン。
２．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１のヒト成長ホルモン変異体。
【００７８】
３．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｓ５５Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ／Ｔ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ／Ｔ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｓ／Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｓ／Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｓ／Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｓ／Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓ／Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様１のヒト成長ホルモン変異体。
【００７９】
４．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｔ１４８Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様１ないし３のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
【００８０】
５．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ及びＬ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様１、３及び４のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
【００８１】
６．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１又は２のヒト成長ホルモン変異体。
【００８２】
７．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１、２及び３のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
８．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様７のヒト成長ホルモン変異体。
【００８３】
９．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様５のヒト成長ホルモン変異体。
【００８４】
１０．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１ないし９のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
１１．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１０のヒト成長ホルモン変異体。
【００８５】
１２．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１ないし１０のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
１３．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１２のヒト成長ホルモン変異体。
【００８６】
１４．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１ないし１０のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
１５．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様１４のヒト成長ホルモン変異体。
【００８７】
１６．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に一つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１ないし１５のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
１７．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、少なくとも２のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１ないし１５のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
１８．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に２つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１７のヒト成長ホルモン変異体。
【００８８】
１９．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、少なくとも３のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１７のヒト成長ホルモン変異体。
２０．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に３つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１９のヒト成長ホルモン変異体。
２１．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない３つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様２０のヒト成長ホルモン変異体。
２２．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない３つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様２０のヒト成長ホルモン変異体。
【００８９】
２３．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、少なくとも４のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様１９のヒト成長ホルモン変異体。
２４．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に４つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様２３のヒト成長ホルモン変異体。
２５．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない４つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様２４のヒト成長ホルモン変異体。
【００９０】
２６．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、少なくとも５のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様２３のヒト成長ホルモン変異体。
２７．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に５つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様２６のヒト成長ホルモン変異体。
【００９１】
２８．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、少なくとも６又は７のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様２６のヒト成長ホルモン変異体。
２９．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、厳密に６つ又は厳密に７つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)を有する、実施態様２８のヒト成長ホルモン変異体。
【００９２】
３０．野生型ヒト成長ホルモンに存在しないＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：
ａ) Ｑ４９Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｂ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｃ) Ｑ４９Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｄ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｅ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｆ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｇ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｈ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｉ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｊ) Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、及び
ｋ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ
からなる群から選択される変異セットを導入することによる、少なくとも２のＮ-グリコシル化モチーフを導入することにより生じる、実施態様１７のヒト成長ホルモン変異体。
【００９３】
３１．実施態様１ないし３０のいずれかのヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸。
３２．ＤＮＡコンストラクトである、実施態様３１の核酸。
【００９４】
３３．実施態様３１の核酸配列を含むベクター。
３４．変異体が発現ベクターである、実施態様３２のベクター。
３５．ベクターが、宿主細胞における組換え発現に適した発現ベクターであり、該宿主細胞が、このようなモチーフを含有するポリペプチドにおいて、モチーフＮ-Ｘ-Ｓ／ＴにＮ-グリコシル化を導入可能である、実施態様３３のベクター。
３６．ベクターが真核発現ベクターである、実施態様３５のベクター。
３７．ベクターが哺乳動物細胞における組換え発現に適した真核発現ベクターである、実施態様３６のベクター。
３８．ベクターがＣＨＯ細胞における組換え発現に適した発現ベクターである、実施態様３７のベクター。
３９．実施態様３１の前記核酸がＤＮＡコンストラクトである、実施態様３２ないし３８のいずれかのベクター。
【００９５】
４０．実施態様２２ないし３９のいずれかのベクターを含有する宿主細胞。
４１．細胞が、このようなモチーフを含有するポリペプチドにおいて、モチーフＮ-Ｘ-Ｓ／ＴでＮ-グリコシル化を実施可能である、実施態様４０の宿主細胞。
４２．細胞が真核細胞である、実施態様４１の宿主細胞。
４３．細胞が哺乳動物細胞である、実施態様４２の宿主細胞。
４４．細胞がＣＨＯ細胞である、実施態様４３の宿主細胞。
【００９６】
４５．Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を調製する方法であって、該方法が、真核細胞において、実施態様３１又は実施態様３２の核酸を組換え発現させることを含む方法。
４６．前記核酸が哺乳動物細胞で発現する、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を調製するための実施態様４５の方法。
４７．前記核酸がＣＨＯ細胞で発現する、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を調製するための実施態様４６の方法。
４８．前記核酸の組換え発現後に、Ｎ-グリカンのさらなるグリコシル化又は修飾を実施しない、実施態様４５ないし４７のいずれかの方法。
【００９７】
４９．実施態様４５ないし４８のいずれかの方法を使用して調製されるヒト成長ホルモン変異体。
５０．前記変異体の等電点が、野生型ヒト成長ホルモンよりも酸性である、実施態様４５ないし４８のいずれかの方法を使用して調製されるヒト成長ホルモン変異体。
５１．前記変異体が、グリコシダーゼで処理された場合、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおける移動度が変化する、実施態様４５ないし４８のいずれかの方法を使用して調製されるヒト成長ホルモン変異体。
５２．前記グリコシダーゼがＰＮＧアーゼＦ-酵素又はノイラミニダーゼ-酵素である、実施態様５１のヒト成長ホルモン変異体。
【００９８】
５３．分子量が野生型ヒト成長ホルモンと比較して増加している、実施態様４５ないし４８のいずれかの方法を使用して調製されるヒト成長ホルモン変異体。
５４．変異体の活性が、野生型ヒト成長ホルモンと比較して、せいぜい１００倍、例えば５０倍、例えば２０倍、例えば１０倍、例えば５倍、例えば２倍、例えば１倍未満低下している、実施態様４９ないし５３のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
５５．変異体の活性が、野生型ヒト成長ホルモンと実質的に同様の活性である、実施態様５４のヒト成長ホルモン変異体。
【００９９】
５６．ヒト成長ホルモン変異体のインビボ循環半減期が、野生型ヒト成長ホルモンと比較して長時間である、実施態様４９ないし５５のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
５７．少なくとも５０％のグリカンがシアル化されている、実施態様４９ないし５６のいずれかのヒト成長ホルモン変異体。
【０１００】
５８．変異体が少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)でＮ-グリコシル化され、該モチーフが野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
５９．Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体が、実施態様１ないし３０及び４９ないし５７のいずれかのヒト成長ホルモン変異体であり、ヒト成長ホルモン変異体が一又は複数のＮ-グリカンでグリコシル化され、該Ｎ-グリカンが、該ヒト成長ホルモン変異体において、一又は複数のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)に結合しており、Ｎ-グリコシル化モチーフが野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
６０．前記ヒト成長ホルモン変異体が一又は複数のＮ-グリカンでグリコシル化され、該Ｎ-グリカンが、該ヒト成長ホルモン変異体において、全てのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)に結合しており、Ｎ-グリコシル化モチーフが野生型ヒト成長ホルモンに存在しない、Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０１】
６１．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記ＮＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６０のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０２】
６２．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｓ５５Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様５５のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０３】
６３．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｔ１４８Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様５５のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０４】
６４．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、Ｅ１８６Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ及びＬ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様５５のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０５】
６５．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、Ｇ１６１Ｔ及びＥ１８６Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６１のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０６】
６６．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６４のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
６７．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６４のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０７】
６８．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６０ないし６７のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
６９．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６７のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０８】
７０．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６３ないし６９のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
７１．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎからなる群から独立して選択される変異を導入することにより生じる、実施態様７０のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１０９】
７２．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様６３のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
７３．全ての前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎからなる群から選択される変異を導入することにより生じる、実施態様７２のヒト成長ホルモン変異体。
【０１１０】
７４．少なくとも一の前記Ｎ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔからなる群から選択される一又は複数の変異／変異対を導入することにより生じる、実施態様６４のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１１】
７５．野生型ヒト成長ホルモンに存在しないＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が：
ａ) Ｑ４９Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｂ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｃ) Ｑ４９Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｄ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｌ９３Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｅ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｆ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｇ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｈ) Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｎ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、
ｉ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎ、
ｊ) Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、及び
ｋ) Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｌ９３Ｎ、Ｇ１０４Ｎ及びＲ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ
からなる群から選択される変異セットを導入することによる、少なくとも２のＮ-グリコシル化モチーフを導入することにより生じる、実施態様７４のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１２】
７６．厳密に一つのＮ-グリカンを含有する、実施態様４９ないし７５のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
７７．少なくとも２のＮ-グリカンを含有する、実施態様４９ないし７５のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
７８．厳密に２つのＮ-グリカンを含有する、実施態様７７のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１３】
７９．少なくとも３のＮ-グリカンを含有する、実施態様７７のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８０．厳密に３つのＮ-グリカンを含有する、実施態様７９のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８１．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない３つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様８０のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８２．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない３つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様８０のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１４】
８３．少なくとも４のＮ-グリカンを含有する、実施態様７９のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８４．厳密に４つのＮ-グリカンを含有する、実施態様８３のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８５．野生型ヒト成長ホルモンに存在しない４つのＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)が、変異Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ及びＧ１０４Ｎを導入することにより生じる、実施態様８４のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１５】
８６．少なくとも５のＮ-グリカンを含有する、実施態様８３のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８７．厳密に５つのＮ-グリカンを含有する、実施態様８６のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８８．少なくとも６のＮ-グリカンを含有する、実施態様８６のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
８９．厳密に６つのＮ-グリカンを含有する、実施態様８８のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体。
【０１１６】
９０．Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する調製物であって、変異体が少なくとも一のＮ-グリコシル化モチーフ(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)でＮ-グリコシル化されており、該モチーフが野生型ヒト成長ホルモンに存在しない調製物。
９１．実施態様１ないし３０のいずれかのヒト成長ホルモン変異体を含有する、実施態様９０の調製物。
９２．実施態様４９-８９のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有し、少なくとも５０％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する、実施態様９０の調製物。
【０１１７】
９３．少なくとも５０％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する、実施態様９０ないし９２のいずれかの調製物。
９４．少なくとも７５％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する、実施態様９３の調製物。
９５．少なくとも９０％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する、実施態様９４の調製物。
９６．少なくとも９５％のＮ-グリカンが少なくとも一のシアル酸部分を有する、実施態様９５の調製物。
【０１１８】
９７．少なくとも２０％の前記ヒト成長ホルモン変異体がＮ-グリコシル化されている、実施態様９０-９２のいずれかの調製物。
９８．少なくとも５０％の前記ヒト成長ホルモン変異体がＮ-グリコシル化されている、実施態様９０-９２のいずれかの調製物。
９９．少なくとも５０％の前記ヒト成長ホルモン変異体が、野生型ヒト成長ホルモンに存在しない全てのグリコシル化モチーフにおいてＮ-グリコシル化されている、実施態様９７の調製物。
【０１１９】
１００．実施態様４９ないし８９のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する製薬用組成物を調製する方法であって、該方法が次の：
ｉ）Ｎ-グリコシル化を実施可能な宿主細胞において、実施態様３１又は実施態様３２の核酸を組換え発現させ、
ｉｉ）Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を精製し、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で精製されたＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する製薬的に許容可能な製剤を調製する、
工程を含む方法。
１０１．前記宿主細胞が真核細胞である、実施態様１００のＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を含有する製薬用組成物を調製する方法。
１０２．細胞が哺乳動物細胞である、実施態様１０１の方法。
１０３．細胞がＣＨＯ細胞である、実施態様１０２の方法。
【０１２０】
１０４．実施態様４９ないし８９のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体と、製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
１０５．実施態様９０ないし９９のいずれかの調製物と、製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
【０１２１】
１０６．実施態様４９ないし８９のいずれかのＮ-グリコシル化ヒト成長ホルモン変異体を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、ヒト成長ホルモンを必要とする哺乳動物を処置する方法。
１０７．実施態様９０ないし９９のいずれかの調製物を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、ヒト成長ホルモンを必要とする哺乳動物を処置する方法。
本発明を以下の実施例においてさらに例証する。しかしながら、これらの実施例は例証目的のためだけであり、何らの方法においても、本発明の範囲を制限するために使用されるものではないと理解される。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
哺乳動物細胞における野生型ヒト成長ホルモンの発現のためのベクターの構築
図１Ａに示すヌクレオチド配列を、配列に隣接するＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏ ＲＩ部位により、プラスミドｐＥＥ１４．４に挿入し、プラスミドｐＧＢ０３９を作製した。ｐＧＢ０３９において、成長ホルモンコード化ヌクレオチド配列を、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの転写コントロール下に配した。
ｐＧＢ０３９において、成長ホルモンコード化ヌクレオチド配列を、ｐＴＴ５のＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉ部位の間に挿入することによりサブクローンし、プラスミドｐＴＶＬ０１を作製した。
【０１２３】
実施例２
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における野生型ヒト成長ホルモンの一時的発現
ヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)を、製造者の使用説明書につき、野生型ヒト成長ホルモンをコードするｐＧＢ０３９発現プラスミドで形質移入した。簡単には、３０μｇのプラスミドを、４０μｌの２９３フェクチン(fectin)(Invitrogen)と共に２０分インキュベートし、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに３ｘ１０７細胞を添加した。形質移入された細胞を振とうインキュベーター(３７℃、８％のＣＯ２、及び１２５ｒｐｍ)において、７日間インキュベートした。培地サンプルを毎日収集し、ＥＬＩＳＡキット(Roche)を用いて、ヒト成長ホルモンについて分析した。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡの結果を図２に示し、一時的に形質移入された哺乳動物細胞が、ヒト成長ホルモンの効果的方法であったことが示された。形質移入の７日後、培地を収集し、細菌において生成された精製組換えヒト成長ホルモンの希釈液を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙリーダーでスキャンした。形質移入していない細胞からの培地ではなく、形質移入した細胞からの培地に、細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンと共遊走した、約２２ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含有せしめた。これにより、一時的に形質移入された哺乳動物細胞が、成熟した組換えヒト成長ホルモンを分泌することが示された。
【０１２５】
実施例３
Ｎ-グリコシル化部位の導入に適したヒト成長ホルモンタンパク質における位置の同定
成長ホルモンレセプターとの結合間期に関与しない、ヒト成長ホルモンタンパク質の表面上のアミノ酸残基を、Ｎ-グリコシル化部位の導入に最も適した位置とみなした。これらの残基の中でも、単一のアミノ酸置換により潜在的Ｎ-グリコシル化部位(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)の形成を可能にする配列状況のアミノ酸を選択した。しかしながら、システイン又はプロリン残基に係るアミノ酸置換により形成されたＮ-グリコシル化部位は無視された。
【０１２６】
上述した要求に従ったアミノ酸位置は、Ｍｏｌｓｏｆｔ Ｂｒｏｗｓｅｒ ３．４-９ｄ(Molsoft)ソフトウェアを用いた、タンパク質データバンクからのファイル３ｈｈｒを分析することにより見出された。ファイル３ｈｈｒには、２つの成長ホルモンレセプター分子の細胞外ドメインに結合したヒト成長ホルモンの構造体が記載されており、Vosら(1992)の文献に基づくものである。この分析により、成熟したヒト成長ホルモンのアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換が同定された：
Ｓ５５Ｎ、Ｑ６９Ｎ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、
Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｓ、
Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｇ１６１Ｓ、
Ｇ１６１Ｔ、及びＥ１８６Ｎ
これらの配列変化はそれぞれ、成長ホルモンレセプターとの結合間期に関与しないタンパク質の表面にあると考えられている位置に、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を導入する。
【０１２７】
実施例４
一つの潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする発現コンストラクトの生成
潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトを、野生型ヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなるｐＴＶＬ０１の部位指向性突然変異誘発により生成させた。変異Ｑ６９Ｎ、Ｒ７７Ｎ、Ｉ８３Ｎ、Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｓ１０６Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、Ｉ１２１Ｎ、Ｋ１４０Ｎ、又はＧ１６１Ｔの一つを有する変異体をコードするコンストラクトを、表１(配列番号２-１３)に示されるプライマーを使用し、製造者に推奨されるようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット(Stratagene)を用いて生成させた。変異Ｄ１３０Ｎ又はＥ１８６Ｎの一つを有する変異体をコードするコンストラクトを、表２(配列番号１４-１５)に示される順方向プライマー及び相補的な逆方向プライマーを使用し、製造者に推奨されるようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット(Stratagene)を用いて生成させた。生成したコンストラクトにおける、全ヒト成長ホルモン変異体コード化ヌクレオチド配列の配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。１４変異体をコードするコンストラクトの名称を、表１及び２に示す。
【０１２８】
2011525800.tif 000003
【０１２９】
2011525800.tif 000004
【０１３０】
実施例５
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における、一つの潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの一時的発現
ヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)を、製造者の使用説明書につき、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ０２-ｐＴＦＶＬ１６コンストラクト、又は野生型ヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ０１発現プラスミドで形質移入した。簡単には、３０μｇの各プラスミドを、４０μｌの２９３フェクチン(Invitrogen)と共に２０分インキュベートし、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに３ｘ１０７細胞を添加した。形質移入された細胞を振とうインキュベーター(３７℃、８％のＣＯ２、及び１２５ｒｐｍ)においてインキュベートした。形質移入の７日後に収集された培地を、ペプチドＮ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧアーゼＦ)と共に、又はなしに、３７℃で１時間インキュベートし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙリーダーでスキャンした。ｐＴＶＬ０１で形質移入された細胞からの培地における野生型成長ホルモンは、約２２ｋＤａの分子量を有するバンドとして遊走し、細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンと共に共遊走した。潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有する変異成長ホルモンは、野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走する単一バンドとして、又は２つのバンドとして遊走し、一方のバンドは野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走し、他方のバンドは野生型ヒト成長ホルモンと比較して、移動度が低減していた(表３)。Ｎ-グリカンを除去するＰＮＧアーゼＦと共にインキュベートすると、全ての変異体は、野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走する単一バンドとして遊走した。よって、成熟したヒト成長ホルモンのアミノ酸９３、９８、９９、１０４、１０９、及び１４０でのＮ-グリコシル化部位のみが利用された。これら６つのＮ-グリコシル化部位は、それぞれ変異Ｌ９３Ｎ、Ａ９８Ｎ、Ｌ１０１Ｔ、Ｇ１０４Ｎ、Ｙ１１１Ｔ、及びＫ１４０Ｎにより生じた。
【０１３１】
2011525800.tif 000005
【０１３２】
少なくとも一のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体のインビトロ活性をテストするために、ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞におけるそれらの増殖誘発力を試験した。成長ホルモン活性アッセイについて、ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞を３７℃、５％のＣＯ２、成長ホルモンを含有しない培養培地(飢餓培地)において、２４時間インキュベートした。ついで、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに飢餓培地にて２．２２ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。各ウェルに、９０μｌの上述した細胞懸濁液、及び１０μｌの野生型又は変異成長ホルモンを、１０ｎＭ〜０．１ρＭの範囲の濃度で添加した。播種後、マイクロタイタープレートを３７℃、５％のＣＯ２において、６８時間インキュベートした。次に、飢餓培地で希釈された３０μｌのアラマーブルー(Biosource)を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを３７℃、５％のＣＯ２において、さらに４時間インキュベートした。最終的に、マイクロタイタープレートを、５４４ｎＭの励起フィルター及び５９０ｎＭの発光フィルターを使用し、蛍光プレートリーダーにおいて分析した。アラマーブルーは酸化還元指示薬であり、細胞代謝に固有の反応により還元され、よって生存細胞数の間接的測定が提供され、細胞の成長ホルモン依存性増殖を反映する。一つのＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体の活性テストの結果を、図３に示す。
【０１３３】
実施例６
一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする発現コンストラクトの生成
２又は３の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトを、表４に示すプライマーを使用し、製造者に推奨されるようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット(Stratagene)を用い、変異Ｌ９３Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなるｐＴＶＬ０５の部位指向性突然変異誘発により生成させた。この方法で、コンストラクトｐＴＶＬ０５ＣとｐＴＶＬ２２が生じた。これらの２つのコンストラクトは、変異Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ０５Ｃ)及びＬ９３Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ２２)を有するヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなる。Ａ９８Ｎ変異を、表５に示される順方向プライマー及び相補的な逆方向プライマーを使用し、製造者に推奨されるようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット(Stratagene)を用いて、これらのコンストラクトの双方に導入した。この方法で、コンストラクトｐＴＶＬ２０及びｐＴＶＬ２１が生じた。これらの２つのコンストラクトは、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ２０)及びＬ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ２１)を有するヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなる。よって、３つのコンストラクトｐＴＶＬ２０、ｐＴＶＬ２１、及びｐＴＶＬ２２は、アミノ酸９３、９８、９９、及び１０４(ｐＴＶＬ２０)、アミノ酸９３、９８、及び１０４(ｐＴＶＬ２１)、及びアミノ酸９３、９９及び１０４(ｐＴＶＬ２２)で、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする。生成されたコンストラクトにおける、全ヒト成長ホルモン変異体コード化ヌクレオチド配列の配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０１３４】
ｐＴＶＬ２０、ｐＴＶＬ２１、及びｐＴＶＬ２２における成長ホルモン変異体コード化挿入物を、ｐＥＥ１４．４のＨｉｎｄ ＩＩＩとＮｏｔ Ｉ部位の間に挿入することにより、ｐＥＥ１４．４にサブクローンした。これらのサブクローンにより、それぞれコンストラクトｐＴＶＬ２０-ＳＶ、ｐＴＶＬ２１-ＳＶ及びｐＴＶＬ２１-ＳＶが生じた。
【０１３５】
2011525800.tif 000006
【０１３６】
2011525800.tif 000007
【０１３７】
実施例７
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの一時的発現
ヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)を、製造者の使用説明書につき、変異Ｌ９３Ｎ  ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ２２、変異Ｌ９３Ｎ＋−Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ２１、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ２０、野生型ヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ０１発現プラスミドで形質移入した。簡単には、３０μｇの各プラスミドを、４０μｌの２９３フェクチン(Invitrogen)と共に２０分インキュベートし、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに３ｘ１０７細胞を添加した。形質移入された細胞を振とうインキュベーター(３７℃、８％のＣＯ２、及び１２５ｒｐｍ)においてインキュベートした。形質移入の７日後に収集された培地を、ペプチドＮ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧアーゼＦ)と共に、又はなしに、３７℃で１時間インキュベートし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙリーダーでスキャンした。３又は４の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有する変異成長ホルモンは全て、それぞれ０、２又は３のＮ-グリカンを有する成長ホルモンを表す３つの主要なバンドとして遊走した。Ｎ-グリカンを除去するＰＮＧアーゼＦと共にインキュベートすると、３つ全ての変異体は、グリコシル化していない成長ホルモンと共に共遊走する単一バンドとして遊走した。よって、３つのＮ-グリコシル化部位は、３つ全ての変異体において利用されていた。
一以上のＮ-グリコシル化部位を有する、３つのヒト成長ホルモン変異体のインビトロ活性を、実施例５に記載したＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイで試験した。活性テストの結果を図４に示す。
【０１３８】
実施例８
一以上の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンを生成する、安定したＣＨＯ株化細胞の生成
プラスミドｐＴＶＬ２０-ＳＶを、ＣＨＯ-Ｋ１-ＳＶ細胞に電気穿孔した。ｐＴＶＬ２０-ＳＶは実施例６に記載されており、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＥＥ１４．４からなる。簡単には、１ｘ１０７のＣＨＯ-Ｋ１-ＳＶ細胞を４０μｇのｐＴＶＬ２０-ＳＶ細胞と共に電気穿孔し、１０％のウシ胎児血清を含有する培地と共に、４０マイクロタイター組織培養プレートに播種した。形質移入の後日、最終濃度５０μＭまでのＭＳＸを全てのウェルに添加した。細胞増殖を、形質移入の３-６週間後に検出し、増殖した細胞を２４ウェル組織培養プレートに移した。２４ウェルプレートの細胞が半密集度に到達したら、７日間増殖させ、収集した細胞培養上清における標準的なＥＬＩＳＡ手順を実施し、最も好ましい収率の株化細胞を選択した。これらの株化細胞を、振とうフラスコにおいて適合させて無血清細胞培養培地で増殖させ、最も好ましい産生細胞を、１１日間補填なしで実施された無血清培養で、最も高い細胞密度を有するヒト成長ホルモンを高レベルで生成する能力に基づき同定した。最も好ましい産生株化細胞の選択は、細胞培養上清についてのＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、及びＳＤＳ-ＰＡＧＥに基づいた。
【０１３９】
実施例９
哺乳動物細胞培養上清からの、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの精製
ＣＨＯ-Ｋ１-ＳＶ株化細胞を実施例８に記載したようにして生成させ、変異９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンの生成に使用されるバイオリアクターに播種した。発酵槽から収集した培地は細胞欠失しており、その後、最終濃度２０ｍＭのトリエタノールアセタートを含有し、ｐＨ８．５のバッファーにおいて、室温にて１０倍に希釈した。希釈した物質を、ＡＫＴＡ ＭｉｎｉＰｉｌｏｔ装置(GE Healthcare)により駆動するプロセスにおいて、１７０ｍｌ(φ＝５．０ｃｍ、ｌ＝８．７ｃｍ)ＱセファロースＨＰ(２４-４４μｍ)アニオン交換カラム(GE Healthcare)に充填した。２０ｍＭのトリエタノールアセタートと４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を用い、室温にて、１４カラム容量(２３９０ｍＬ)にわたって０〜１００％の濃度で増加させ、カラムから物質を溶出させた。２５４ｎｍと２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用し、スループットを登録し、フラクションに収集した。成長ホルモンを含有するフラクションをプールに収集した。
【０１４０】
実施例１０
一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの薬物動態特性と、野生型ヒト成長ホルモンの薬物動態特性との比較
組換え野生型ヒト成長ホルモンと、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ(ＴＶＬ２０)を有するヒト成長ホルモンを、２０ｍｇ／ｍｌのグリシン、２ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２．４ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３を含有し、ｐＨが８．２に調節されたバッファーにおいて、最終濃度１５０ｎｍｏｌ／ｍｌまで希釈した。各バッチ及び各化合物の１５ｎｍｏｌに相当する０．１ｍｌを、９匹のオスのスプラーグドーリーラットの尾部静脈(ＩＶ)を介して静脈内投与した。スプラーグドーリーラットは、約２００-２５０ｇと計量された。
全てのラットについて、投与の５分、さらに１、２、４、８、１８、２４、４８及び７２時間後に、血液サンプルを取り出した。２３Ｇ針を使用し、尾部静脈穿刺として、０．２ｍｌの血液サンプルを取り出した。８ｍＭのＥＤＴＡを含有するテスト用チューブに、血液サンプルを収集した。遠心分離(１５００ｘｇ、４℃、１０分)前に、最大で２０分、血液サンプルを氷上で保持した。各血液サンプルから１２０μｌの血漿を収集し、テスト用チューブに移し、ドライアイス上に配した。化合物に特異的な標準曲線を使用し、ヒト成長ホルモン抗原の含有量を分析するまで、凍結血漿サンプルを−２０℃で保管した。
【０１４１】
ヒト成長ホルモンアナログ濃度を、均一なビーズベースアッセイである発光酸素チャンネリングイムノアッセイ(ＬＯＣＩ)により測定した。ＬＯＣＩ試薬には、２つのラテックスビーズ試薬と、サンドイッチの一部であるビオチニル-ｍＡｂ２０ＧＳ１０が含まれる。ビーズ試薬の一方はジェネリック試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンでコーティングされ、感光染料を含有する。第２のビーズ試薬(アクセプタービーズ)はサンドイッチを構成する抗体でコーティングされる。アッセイ中、３つの反応体は検体と組合せられ、ビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体の照明で、アクセプタービーズに通じたドナービーズから一重項酸素が放出され、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定される化学発光が誘発される。生じた光量はｈＧＨ誘導体の濃度に比例する。２μＬの４０ｘのＬＯＣＩバッファー希釈されたサンプル／キャリブレーター／対照体を、３８４-ウェルＬＯＣＩプレートに適用する。ビオチニル-ｍＡｂ ２０ＧＳ１０とｍＡｂ１０Ｇ０５／Ｍ９４１６９ 抗-(ｈＧＨ)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物１５μＬを、各ウェルに添加した(２１-２２℃)。プレートを２１-２２℃で１時間インキュベートする。３０μＬのストレプトアビジンでコーティングされたドナー-ビーズ(６７μｇ／ｍＬ)を各ウェルに添加し、全てを２１-２２℃で３０分インキュベートする。６８０ｎｍのレーザーで励起させた後、５２０-６４５ｎｍのバンド幅を有するフィルターを用い、２１-２２℃で、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて、プレートを読み取る。ウェル当たりの全測定時間は、７０ｍｓの励起時間を含め、２１０ｍｓである。Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモンアナログについての検出限界は、それぞれ１９９、８０及び３５０ｐＭであった。
【０１４２】
血漿濃度-時間のデータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ(Pharsight Corporation)を使用し、非コンパートメント薬物動態分析により分析した。各時点で、２匹の動物からの平均濃度-時間値を使用して算出した。
静脈投与後の、時間に対する平均成長ホルモン抗原濃度を、図５に示す。静脈投与後の推定薬物動態パラメータを、表６に列挙する。
スプラーグドーリーラットにおける野生型ヒト成長ホルモンと比較して、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｌ１０１Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ(ＴＶＬ２０)を有するヒト成長ホルモンの薬物動態データには、血漿濃度-時間曲線(ＡＵＣ)下の、用量修正領域に関しては増加した暴露、クリアランスの低減、及び血漿インビボ半減期の増加が示された。
【０１４３】
2011525800.tif 000008
【０１４４】
実施例１１
Ｎ-グリコシル化部位の導入に適した、ヒト成長ホルモンタンパク質における位置の同定
アミノ酸変異の第２段階において、成長ホルモンレセプターとの結合間期に関与しない、ヒト成長ホルモンタンパク質の表面上の残基を、Ｎ-グリコシル化部位の導入にとって最も適切な位置とみなした。これらの残基の中でも、単一アミノ酸置換による潜在的Ｎ-グリコシル化部位(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)の形成を可能にする配列状況でのアミノ酸が好ましい。しかしながら、二重アミノ酸置換による潜在的Ｎ-グリコシル化部位(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔ)の形成を可能にする配列状況でのアミノ酸も含まれる。
【０１４５】
上述した要求に従ったアミノ酸位置は、Ｍｏｌｓｏｆｔ Ｂｒｏｗｓｅｒ ３．４-９ｄ(Molsoft)ソフトウェアを用いた、タンパク質データバンクからのファイル３ｈｈｒ及び１ｈｗｇを分析することにより見出された。ファイル３ｈｈｒには、２つの成長ホルモンレセプター分子の細胞外ドメインに結合したヒト成長ホルモンの構造体が記載されており、Vosら(1992)の文献に基づくものであり、１ｈｗｇには、２つの成長ホルモンレセプター分子の細胞外ドメインに結合した、アンタゴニスト変異体、Ｇ１２０Ｒ、ヒト成長ホルモンの構造体が記載されており、Sundstromら(1996)の文献に基づくものである。この分析により、成熟したヒト成長ホルモンのアミノ酸配列における次の単一アミノ酸置換：
Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｓ／Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、
Ｔ１４２Ｎ、及びＴ１４８Ｎ
及び成熟したヒト成長ホルモンのアミノ酸配列における次の二重アミノ酸置換：
Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ／Ｔ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ／Ｔ、
Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｓ／Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｓ／Ｔ、
Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋  Ｅ１２９Ｓ／Ｔ、
Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｓ／Ｔ、及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓ／Ｔ
が同定された
これらの配列変化はそれぞれ、成長ホルモンレセプターとの結合間期に関与しないタンパク質の表面にあると考えられている位置に、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を導入する。
【０１４６】
実施例１２
一つの潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする発現コンストラクトの生成
潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトを、野生型ヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなるｐＴＶＬ０１の部位指向性突然変異誘発により生成させた。変異／変異対Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｔ１４２Ｎ、Ｔ１４８Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ａ３４Ｎ＋Ｉ３６Ｓ、Ｌ４５Ｎ＋Ｎ４７Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｋ１１５Ｎ＋Ｌ１１７Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、Ｌ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔ及びＴ１７５Ｎ＋Ｌ１７７Ｓの一つを有する変異体をコードするコンストラクトを、表７(配列番号２０-２７)及び８(配列番号２８-３７)に示される順方向プライマーと相補的な逆方向プライマーを使用し、、製造者に推奨されるようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット(Stratagene)を用いて生成させた。生成したコンストラクトにおける、全ヒト成長ホルモン変異体コード化ヌクレオチド配列の配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。単一導入変異を有する８つの新規の変異体をコードするコンストラクトの名称を表７に示し、二重変異が導入された１０の新規の変異体をコードするコンストラクトの名称を表８に示す。
【０１４７】
2011525800.tif 000009
【０１４８】
2011525800.tif 000010
【０１４９】
実施例１３
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における、一つの潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの一時的発現
ヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)を、製造者の使用説明書につき、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ４０-ｐＴＶＬ５９コンストラクト、又は野生型ヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ０１発現プラスミドで形質移入した。簡単には、３０μｇの各プラスミドを、４０μｌの２９３フェクチン(Invitrogen)と共に２０分インキュベートし、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに３ｘ１０７細胞を添加した。形質移入された細胞を振とうインキュベーター(３７℃、８％のＣＯ２、及び１２５ｒｐｍ)においてインキュベートした。形質移入の７日後に収集された培地を、ペプチドＮ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧアーゼＦ)と共に、又はなしに、３７℃で１時間インキュベートし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙリーダーでスキャンした。ｐＴＶＬ０１で形質移入された細胞からの培地における野生型成長ホルモンは、約２２ｋＤａの分子量を有するバンドとして遊走し、細菌において生成された組換えヒト成長ホルモンと共に共遊走した。潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有する変異成長ホルモンは、野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走する単一バンド、又は２つのバンドとしてとして遊走し、その一方は野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走し、他方のバンドは野生型ヒト成長ホルモンと比較して、移動度が低減していた(表９及び１０)。Ｎ-グリカンを除去するＰＮＧアーゼＦと共にインキュベートすると、全ての変異体は、野生型ヒト成長ホルモンと共に共遊走する単一バンドとして遊走した。低減した移動度を有するバンドはＮ-グリコシル化成長ホルモンを表す。よって、成熟したヒト成長ホルモンのアミノ酸４１、４９、６３、６５、７２、１３３、１９、５８、６２、７１、１２７、及び１２８でのＮ-グリコシル化部位のみが利用された。これら１２のＮ-グリコシル化部位は、それぞれ変異Ｋ４１Ｎ、Ｑ４９Ｎ、Ｅ６５Ｔ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ７４Ｔ、Ｐ１３３Ｎ、Ｒ１９Ｎ＋Ｈ２１Ｓ、Ｉ５８Ｎ＋Ｐ５９Ｆ、Ｓ６２Ｎ＋Ｒ６４Ｔ、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ、Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ、及びＬ１２８Ｎ＋Ｄ１３０Ｔにより生じた。
【０１５０】
2011525800.tif 000011
【０１５１】
2011525800.tif 000012
【０１５２】
一のＮ-グリコシル化部位を有する１２のヒト成長ホルモン変異体のインビトロ活性をテストするために、ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞におけるそれらの増殖誘発力を試験した。成長ホルモン活性アッセイについて、ＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞を３７℃、５％のＣＯ２、成長ホルモンを含有しない培養培地(飢餓培地)において、２４時間インキュベートした。ついで、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに飢餓培地にて２．２２ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。各ウェルに、９０μｌの上述した細胞懸濁液、及び１０μｌの野生型又は変異成長ホルモンを、１０ｎＭ〜０．１ρＭの範囲の濃度で添加した。播種後、マイクロタイタープレートを３７℃、５％のＣＯ２において、６８時間インキュベートした。次に、飢餓培地で希釈された３０μｌのアラマーブルー(Biosource)を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを３７℃、５％のＣＯ２において、さらに４時間インキュベートした。最終的に、マイクロタイタープレートを、５４４ｎＭの励起フィルター及び５９０ｎＭの発光フィルターを使用し、蛍光プレートリーダーにおいて分析した。アラマーブルーは酸化還元指示薬であり、細胞代謝に固有の反応により還元され、よって生存細胞数の間接的測定が提供され、細胞の成長ホルモン依存性増殖を反映する。一又は複数のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体の活性テストの結果を、図６及び図７に示す。
【０１５３】
実施例１４
一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする発現コンストラクトの生成
２、３、４、５、６、又は７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモン変異体をコードするコンストラクトを、全ヒト成長ホルモンコード化ｃＤＮＡをカバーする２０-ｍｅｒの順方向及び逆方向プライマー、及び４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により生成させた。酵素Ｐｍｅ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩの制限部位を、ヒト成長ホルモンコード化ｃＤＮＡの前に導入し、酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ及びＮａｅ Ｉの制限部位を、ヒト成長ホルモンコード化ｃＤＮＡの後に導入した。表１１には、野生型ヒト成長ホルモンｃＤＮＡの順方向ストランドの組み立てに使用される、２０-ｍｅｒのプライマー(配列番号３８)及び４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチド(配列番号３９-５６)を示す。
対応する順方向ストランドと、２０ｂｐの重複の形で(すなわち、順方向プライマーと、ｈＧＨオリゴヌクレオチド１の最初の２０塩基、又はｈＧＨオリゴヌクレオチド１の最後の２０塩基と、ｈＧＨオリゴヌクレオチドの最初の２０塩基の重複)、相補的ストランドを記述した２０-ｍｅｒのプライマーと１８の４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドもまたＰＣＲに含めた。
【０１５４】
野生型ヒト成長ホルモンｃＤＮＡに変異を導入するために、与えられたｈＧＨの４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、選択される変異を有する４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドに置き換えた。相補的オリゴヌクレオチドを同様の方法で交換した。表１２には、順方向ストランドに変異を導入するために使用される４０-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、関連変異を表すコンストラクトで命名される。
この方法で、変異したヒト成長ホルモンｃＤＮＡを有する１１の種々のＰＣＲ生成物が生成された。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏ ＲＩ及び標準的なライゲーション手順を用いた、ＰＣＲ生成物及びｐＴＴ５ベクターの消化により、ＰＣＲ生成物をｐＴＴ５に挿入した。この方法で、コンストラクトｐＴＶＬ６０、ｐＴＶＬ６１、ｐＴＶＬ６２、ｐＴＶＬ６３、ｐＴＶＬ６４、ｐＴＶＬ６６、ｐＴＶＬ６７、ｐＴＶＬ６８、ｐＴＶＬ７０、ｐＴＶＬ７１、及びｐＴＶＬ７２が生成された。これらの１１のコンストラクトは、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６０)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ６１)、Ｑ４９Ｎ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６２)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ６３)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６４)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６６)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６７)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ６８)、Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ(ｐＴＶＬ７０)、Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ７１)、及びＳ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ｐＴＶＬ７２)を有するヒト成長ホルモンをコードする挿入物を有するｐＴＴ５からなる。
【０１５５】
よって、１１のコンストラクトｐＴＶＬ６０、ｐＴＶＬ６１、ｐＴＶＬ６２、ｐＴＶＬ６３、ｐＴＶＬ６４、ｐＴＶＬ６６、ｐＴＶＬ６７、ｐＴＶＬ６８、ｐＴＶＬ７０、ｐＴＶＬ７１、及びｐＴＶＬ７２は、アミノ酸４９及び１２７(ｐＴＶＬ６０)、アミノ酸４９、６５、及び１０４(ｐＴＶＬ６１)、アミノ酸４９、９３、及び１２７(ｐＴＶＬ６２)、アミノ酸４９、６５、９３、及び１０４(ｐＴＶＬ６３)、アミノ酸４９、６５、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ６４)、アミノ酸４９、６５、７１、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ６６)、アミノ酸４９、６５、７１、９３、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ６７)、アミノ酸４９、６５、７１、９３、９８、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ６８)、アミノ酸７１、９３、９８、及び１０４(ｐＴＶＬ７０)、アミノ酸９３、９８、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ７１)、及びアミノ酸７１、９３、９８、１０４、及び１２７(ｐＴＶＬ７２)で、潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンをコードする。生成したコンストラクトにおける全ヒト成長ホルモン変異体コード化ｃＤＮＡの配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０１５６】
2011525800.tif 000013
【０１５７】
2011525800.tif 000014
【０１５８】
実施例１５
哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの一時的発現
ヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)を、製造者の使用説明書につき、野生型ヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ０１発現プラスミド、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６０、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６１、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６２、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６３、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６４、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６６、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６７、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６８、変異Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ７０、変異Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ７１、及び変異Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ａ９８Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ７２で形質移入した。簡単には、３０μｇの各プラスミドを、４０μｌの２９３フェクチン(Invitrogen)と共に２０分インキュベートし、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに３ｘ１０７細胞を添加した。形質移入された細胞を振とうインキュベーター(３７℃、８％のＣＯ２、及び１２５ｒｐｍ)においてインキュベートした。形質移入の７日後に収集された培地を、ペプチドＮ-グリコシダーゼＦ(ＰＮＧアーゼＦ)と共に、又はなしに、３７℃で１時間インキュベートし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動させた。ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙリーダーでスキャンした。主要なバンドが最大数のグリカンを有する成長ホルモンを表し、僅かに０〜６(可能ならば)のグリカンを表すので、２-７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を有する変異成長ホルモンは全て遊走した。Ｎ-グリカンを除去するＰＮＧアーゼＦと共にインキュベートすると、全ての変異体は、グリコシル化していない成長ホルモンと共に共遊走する単一バンドとして遊走した。よって、最大数のＮ-グリコシル化部位は、１１全ての変異体において利用されていた。
一以上のＮ-グリコシル化部位を有する、８つのヒト成長ホルモン変異体のインビトロ活性を、実施例６に記載したＢＡＦ３-ＧＨＲ細胞アッセイで試験した。活性テストの結果を図８に示す。
【０１５９】
実施例１６
哺乳動物細胞培養上清からの、一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの精製
変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６４発現プラスミド、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６６、又は変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔを有するヒト成長ホルモンをコードするｐＴＶＬ６７で形質移入したヒト胎児性腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞に適応した懸濁液(Freestyle, Invitrogen)からの培地を、４５μｍの酢酸セルロースフィルター、及び２２μｍのポリエーテルスルホンフィルター(Corning)に通し、その後、４℃、ｐＨ７．０で、最終濃度２５ｍＭのＨＥＰＥＳを有するバッファーにおいて、１０倍に希釈した。希釈した物質を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ装置(GE Healthcare)により駆動するプロセスにおいて、４５ｍＬ(φ＝１．８ｃｍ、ｌ＝１７．５ｃｍ)ソース３０Ｑアニオン交換カラム(GE Healthcare)に充填した。２５ｍＭのＨＥＰＥＳと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用い、４℃にて、１９のカラム容量(ＣＶ)(８４０ｍＬ)にわたって０〜２０％の濃度で、１０ＣＶ(２００ｍＬ)にわたって２０〜４０％で、５ＣＶ(９０ｍＬ)にわたって４０〜１００％の濃度で増加させ、カラムから物質を溶出させた。２５４ｎｍと２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用し、スループットを登録し、１０ｍＬのフラクションに収集した。
【０１６０】
実施例１７
一以上のＮ-グリコシル化部位を有するヒト成長ホルモンの薬物動態特性と、野生型ヒト成長ホルモンの薬物動態特性との比較
組換え野生型ヒト成長ホルモンと、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６４)、Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６６)、又はＱ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６７)を有するヒト成長ホルモンを、２０ｍｇ／ｍｌのグリシン、２ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２．４ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３からなり、ｐＨが８．２に調節されたバッファーにおいて、最終濃度１００ｎｍｏｌ／ｍｌまで希釈した。各化合物の１０ｎｍｏｌに相当する０．１ｍｌを、６匹のオスのスプラーグドーリーラットの尾部静脈(ＩＶ)介して静脈内又は頸部背面へ皮下的に投与した。各スプラーグドーリーラットは、約２００-２５０ｇと計量された。
投与の５分、３０分、さらに１、２、４、８、１８、２４、４８、７２及び９６時間後に、血液サンプルを取り出した。２３Ｇ針を使用し、尾部静脈穿刺として、０．３ｍｌの血液サンプルを取り出した。８ｍＭのＥＤＴＡを含有するテスト用チューブに、血液サンプルを収集した。遠心分離(１５００ｘｇ、４℃、１０分)前に、最大で２０分、血液サンプルを氷上で保持した。各血液サンプルから１５０μｌの血漿を収集し、テスト用チューブに移し、ドライアイス上に配した。化合物に特異的な標準曲線を使用し、ヒト成長ホルモン抗原の含有量を分析するまで、凍結血漿サンプルを−２０℃で保管した。
【０１６１】
ヒト成長ホルモンアナログ濃度を、均一なビーズベースアッセイである、発光酸素チャンネリングイムノアッセイ(ＬＯＣＩ)により測定した。ＬＯＣＩ試薬には、２つのラテックスビーズ試薬と、サンドイッチの一部であるビオチニル-ｍＡｂ２０ＧＳ１０が含まれる。ビーズ試薬の一方はジェネリック試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンでコーティングされ、感光染料を含有する。第２のビーズ試薬(アクセプタービーズ)はサンドイッチを構成する抗体でコーティングされる。アッセイ中、３つの反応体は検体と組合せられ、ビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体の照明で、アクセプタービーズに通じたドナービーズから一重項酸素が放出され、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定される化学発光が誘発される。生じた光量はｈＧＨ誘導体の濃度に比例する。ＬＯＣＩにおいて、２μＬ ４０ｘのバッファー希釈されたサンプル／キャリブレーター／対照体を、３８４-ウェルＬＯＣＩプレートに適用する。ビオチニル-ｍＡｂ ２０ＧＳ１０とｍＡｂ１０Ｇ０５／Ｍ９４１６９ 抗-(ｈＧＨ)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物１５μＬを、各ウェルに添加した(２１-２２℃)。プレートを２１-２２℃で１時間インキュベートする。３０μＬのストレプトアビジンでコーティングされたドナー-ビーズ(６７μｇ／ｍＬ)を各ウェルに添加し、全てを２１-２２℃で３０分インキュベートする。６８０ｎｍのレーザーで励起させた後、５２０-６４５ｎｍのバンド幅を有するフィルターを用い、２１-２２℃で、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて、プレートを読み取る。ウェル当たりの全測定時間は、７０ｍｓの励起時間を含め、２１０ｍｓである。Ｎ-グリコシル化ヒト成長ホルモンアナログについての検出限界は、それぞれ１９９、８０及び３５０ｐＭであった。
【０１６２】
静脈投与後の、時間に対する平均成長ホルモン抗原濃度を、図９に示す。皮下投与後の、時間に対する平均成長ホルモン抗原濃度を、図１０に示す。静脈投与後の推定薬物動態パラメータを、表１３に列挙する。皮下投与後の推定薬物動態パラメータを、表１４に列挙する。
スプラーグドーリーラットにおける野生型ヒト成長ホルモンと比較して、変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６４)又はＱ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６６)を有するヒト成長ホルモンの薬物動態データには、血漿濃度-時間曲線(ＡＵＣ)下の、用量修正領域に関しては増加した暴露、クリアランスの低減、及び血漿インビボ半減期の増加が示された。変異Ｑ４９Ｎ＋Ｅ６５Ｎ＋Ｓ７１Ｎ＋Ｌ７３Ｔ＋Ｌ９３Ｎ＋Ｇ１０４Ｎ＋Ｒ１２７Ｎ＋Ｅ１２９Ｔ(ＴＶＬ６７)の結果には、他の変異と同様の傾向が示され；しかしながら、特に皮下投与後の希薄なデータのため、確固たる薬物動態的結論は阻まれた。
【０１６３】
2011525800.tif 000015
【０１６４】
2011525800.tif 000016
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011525800.tif 000028
2011525800.tif 000029
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