(57)【要約】修飾ヌクレオチド三リン酸が配列に導入されたアプタマー治療薬を生成するための、材料および方法が提供される。一実施形態において、本発明は、核酸を転写する方法を提供し、この方法は、ａ）（ｉ）修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートおよび（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸を含む、転写反応混合物を調製するステップと；ｂ）一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップとを含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を転写する方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ  ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップであり、前記生じる一本鎖核酸の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、またはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ  ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ  ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アプタマーを同定する方法であり、前記アプタマーが２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ  ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、一本鎖核酸の候補混合物の前記核酸分子に、少なくとも一つの修飾２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ）が導入される条件下で、前記転写反応混合物を転写することにより、前記一本鎖核酸の候補混合物を調製するステップであり、前記候補混合物の前記一本鎖核酸分子の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと；
ｃ）前記候補混合物を前記標的分子と接触させるステップと、
ｄ）前記候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対する親和性が増加した前記核酸を、前記候補混合物から分離するステップと、
ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を生じるために、前記親和性が増加した核酸を増幅するステップを含み、それによって、アプタマーの前記グアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて、全て２’―ＯＭｅ修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む、前記標的分子に対する前記アプタマーが、同定される、
方法。
【請求項２９】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオンまたはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ  ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ  ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
この本特許出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、以下の仮出願への利益を主張する：２００６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８７６，７８０号および２００７年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／８７９，８３０号。これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸を転写するための材料および方法、特に、テンプレート指向性重合において修飾酵素を用いて核酸、特にアプタマーへの修飾ヌクレオチドの導入を増加させるための、修飾酵素および材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アプタマーは、定義上、ワトソン―クリック塩基対合以外の相互作用を通じて、タンパク質等の標的に対して高特異性および親和性で結合する、単離された核酸分子である。アプタマーは核酸ベースの分子であるが、アプタマーと、遺伝子およびｍＲＮＡ等の他の核酸分子との間には基本的に違いがある。後者においては、核酸構造が、その直鎖状塩基配列により情報をコードし、したがってこの配列は、情報保存の機能に重要な配列である。全く対照的に、標的分子の高特異性結合に基づくアプタマー機能は、保存直鎖状塩基配列ではなく、特定の二次構造／三次構造に依存する。すなわち、アプタマーは非コード配列である。アプタマーが有しうる一切のコード能力は、全く偶発的であり、アプタマーの関連標的に対する結合において一切何の役割も果たさない。したがって、同じ標的、さらには標的上の同じ部位に結合するアプタマーであっても、類似する直鎖状塩基配列を有することはあるが、ほとんどがそうではない。
【０００４】
アプタマーは、一定のタンパク質に結合する天然核酸配列とも区別されなければならない。これらの後者の配列は、天然の核酸の転写、翻訳、および輸送に関係するタンパク質の特定のサブグループ、すなわち核酸結合タンパク質に結合する、生物のゲノム中に埋め込まれた天然の配列である。一方で、アプタマーは、短い、単離された、天然には存在しない核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーを同定することができるが、ほとんどの場合には、そのようなアプタマーは、天然において核酸結合タンパク質により認識される配列に対する配列同一性をほとんどまたは全く持たない。さらに重要なことに、アプタマーは、（核酸結合タンパク質だけでなく）事実上任意のタンパク質、ならびに、小分子、炭水化物、ペプチド等を含むほぼすべての目的の標的に結合できる。ほとんどの標的では、タンパク質であっても、それが結合する天然の核酸配列が存在しない。そのような配列を有する標的、すなわち核酸結合タンパク質では、そのような配列は、天然で用いられる結合親和性が強力に結合するアプタマーと比較して相対的に低いために、アプタマーと異なる。
【０００５】
アプタマーは、ファージディスプレイまたは抗体により生成されるペプチドと同様、選択された標的に高特異性で結合し、標的の活性または結合相互作用を調節できる。例えば、アプタマーの結合により、それらの標的の機能する能力をブロックできる。抗体と同様に、標的に対する高特異性結合のこの機能特性は固有の性質である。また、抗体と同様に、標的に対するアプタマーが有する正確な構造特性を当業者は知り得ないが、正確な構造定義の非存在下でかかる分子を同定、作製、および使用する方法を知っている。
【０００６】
アプタマーは、単一の構造変化が、一見いかに軽微なものであっても、アプタマーの結合および／または他の活性（単数または複数）に劇的に（数桁の規模で）影響しうるという点で、小分子薬にも類似する。一方で、いくつかの構造変化は、ほとんどまたは全く影響がない。これは、アプタマーの二次構造／三次構造の重要性から生じる。換言すれば、アプタマーは、その所与の標的を高特異性で結合する化学的接触を提供する、固定されたコンホメーションに維持された三次元構造である。その結果、（１）いくつかの領域または特定の配列が、（ａ）標的との具体的接触点として、および／または（ｂ）分子を標的と接触させる配列として、必須であり；（２）いくつかの領域または特定の配列が、例えばヌクレオチドＸがピリミジンでなければならず、またはヌクレオチドＹがプリンでなければならず、またはヌクレオチドＸおよびＹは相補的でなければならないといった、様々の可変性を有し；（３）いくつかの領域または特定の配列は、任意のものでありうる、すなわちそれらは基本的にスペーシング要素であり、例えば任意の長さの任意ヌクレオチド列、またはＰＥＧ分子等の非ヌクレオチドスペーサーでもありうる。
【０００７】
アプタマーは、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択プロセスにより発見され、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含めて、１３０を超えるタンパク質につき生成されている。典型的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモルからナノモル未満の親和性で標的を結合し、そして密接に関連する標的を区別する（例えばアプタマーは、同じ遺伝子ファミリーの他のタンパク質を通常結合しない）。一連の構造実験により、アプタマーが、抗体―抗原複合体における親和性および特異性を促進する同じタイプの結合相互作用（例えば水素結合、静電相補性、疎水的接触、立体排除）を利用できることが示されている。
【０００８】
アプタマーは、意図する用途に応じて、高特異性および親和性、生物学的効力、ならびに優れた薬物動態特性を含めて、治療薬として使用するため、および親和性精製、検出および診断において使用するための多数の望ましい特徴を有する。さらに、それらは、抗体および他のタンパク質生物製剤に対して、例えば以下のような特定の競争的利点を提供する。
【０００９】
１）速度および制御。アプタマーは、完全なｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスにより生産され、治療リード化合物を含む初期リード化合物の迅速な生成が可能になる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択により、アプタマーの特異性および親和性を厳しく制御でき、毒素標的および非免疫原性標的の両方に対するリード化合物を含むリード化合物の生成が可能となる。
【００１０】
２）毒性および免疫原性。アプタマーはクラスとして、治療上許容可能な毒性、または免疫原性の欠如を示している。多くのモノクローナル抗体の効力は、抗体自体に対する免疫応答により非常に制限され得るが、アプタマーに対する抗体を誘導することは、極めて困難である。それは、アプタマーがＭＨＣを介してＴ細胞により提示され得ないこと、および、免疫応答が一般に核酸フラグメントを認識しないようになっていることによる可能性がもっとも高い。
【００１１】
３）投与。現在承認されている抗体薬の大半は、静脈内注入（典型的に２〜４時間）により投与されるが、アプタマーは皮下注射により投与できる（皮下投与によるアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究において＞８０％である（非特許文献１））。この差は主に、比較的低い溶解性と、そのために大半の治療用ｍＡｂが大量に必要となることが原因である。良好な可溶性（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）と比較的低い分子量（アプタマー：１０〜１５ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）を有するアプタマーでは０．５ｍＬ未満の体積で、注射により１週間の用量を投与できる。さらに、アプタマーはサイズが小さいために、抗体または抗体フラグメントが浸透できないコンホメーションの狭窄領域に浸透でき、これもアプタマーベースの治療薬または予防薬のさらなる利点となる。
【００１２】
４）拡大縮小可能性およびコスト。治療用アプタマーは化学合成され、したがって、生産需要を満たすために、必要に応じて容易に拡大縮小できる。現在では、生産の拡大縮小困難が、一部の生物製剤の入手可能性を制限しており、大規模なタンパク質生産プラントの資本コストは膨大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成装置は、少なくとも１００ｋｇ／年を生産でき、必要な初期投資も比較的少ない。キログラムスケールでのアプタマー合成のための品物の現在のコストは、＄５００／ｇと概算され、高度に最適化された抗体のコストに匹敵する。プロセス開発の改善の継続により、品物のコストが五年間で＜＄１００／ｇに下がると期待される。
【００１３】
５）安定性。治療用アプタマーは化学的に強力である。それらは本質的に、熱および変性剤等のファクターへの曝露後に活性を回復するように構成され、凍結乾燥粉末として室温で長時間（＞１年）保存できる。これに対して抗体は、冷蔵保存されなければならない。
【００１４】
アプタマーの固有の安定性に加えて、アプタマーへの修飾ヌクレオチド（例えば２’―修飾ヌクレオチド）の導入により、酵素的、化学的、熱的、および物理的分解に対する抵抗を高めることができる。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの間の修飾ヌクレオチドの導入は、アプタマーの同定後の修飾ヌクレオチドの導入より好ましいことが多いが、転写収率が低いために歴史的に困難となっている。さらに、アプタマーが選択されるプールまたはライブラリの、化学的および構造的多様性を増加させることが有益である。本発明は、これおよび他のニーズを満たす、改良された材料および方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．（１９９９）７３２：２０３―２１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
現在は、精製、単離、および／または組み換えであり得る、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに関する。本明細書で使用されるところの、「単離」という用語は、細胞または組織において組み換え発現された場合の、本発明のポリメラーゼを含む。本明細書で使用されるところの、「単離」という用語は、細胞または組織中へと導入された本発明の核酸配列を含む。一実施形態においては、６３９位と７８４位で改変アミノ酸を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンではないものが、提供される。別の実施形態においては、３７８位に改変アミノ酸をさらに含む、上述のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが提供される。別の実施形態においては、２６６位に改変アミノ酸をさらに含む、上述のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが提供される。特定の実施形態においては、６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。本明細書で用いられるところの、「改変アミノ酸」という用語は、指定の位置において対応する野生型アミノ酸に対して改変されている。
【００１７】
好ましい実施形態においては、改変アミノ酸が、グアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅグアニジン三リン酸であり、好ましくは全てのヌクレオチド三リン酸が２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸である、ヌクレオチド三リン酸を含む転写反応物における、ポリメラーゼによる２’―ＯＭｅ修飾を含む核酸の転写収率を増加させる。特定の実施形態においては、転写収率の増加は、同一の転写条件下で改変アミノ酸Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび改変アミノ酸を欠くＴ７ＲＮＡポリメラーゼの両方につき転写が行われる場合において、改変アミノ酸を欠くＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対してである。別の実施形態においては、改変アミノ酸が、２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸、特に２’―ＯＭｅグアニジン三リン酸に対する識別を減少させる。特定の実施形態では、２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸に対する識別の低下は、両ポリメラーゼが同一の転写条件下で使用される場合において、改変アミノ酸を欠くＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対して、特に野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対してである。この態様の特定の実施形態においては、改変アミノ酸を欠くＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位のアミノ酸がフェニルアラニンに変更され、７８４位のアミノ酸がアラニンに変更されていることを除き、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、または、６３９位でフェニルアラニンがチロシンと置換され、７８４位でアラニンがヒスチジンと置換され、アルギニン残基が３７８位でリジン残基と置換されている（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）ことを除き、野生型アミノ酸配列を有する変異ポリメラーゼである。
【００１８】
特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチド。特定の実施形態では、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含むキットが、提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、転写をもたらすために十分な反応条件下で、本発明の変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをテンプレート核酸とともにインキュベートするステップを含む、一本鎖核酸を転写する方法が、提供される。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全に二本鎖である。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。特定の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸が、提供される。特定の実施形態においては、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群より選択される核酸配列が、提供される。いくつかの実施形態においては、本発明の単離された核酸配列を含むベクターが、提供される。特定の実施形態では、プロモータに操作可能に連結された本発明の核酸を含む発現ベクターが、提供される。本発明の別の実施形態においては、本発明の発現ベクターを含む細胞が、提供される。特定の実施形態では、本発明の変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが発現される細胞が、提供される。いくつかの実施形態においては、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む容器を含むキットが、提供される。いくつかの実施形態においては、本発明の変異Ｔ７ポリメラーゼ、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含むポリメラーゼを製造する方法が、提供される。いくつかの実施形態においては、製造方法には、細胞において本発明の変異Ｔ７ポリメラーゼをコードする発現ベクターを発現するステップが含まれる。いくつかの実施形態においては、製造方法には、発現本発明の変異Ｔ７ポリメラーゼを精製するステップが、さらに含まれる。
【００２１】
別の実施形態においては、ａ）変異ＲＮＡポリメラーゼと、核酸転写テンプレートと、ヌクレオシド三リン酸とを含む条件下で反応混合物においてテンプレート核酸をインキュベートするステップであり、ヌクレオシド三リン酸が２’―ＯＭｅであるステップと、ｂ）一本鎖核酸を生じるために転写反応混合物を転写するステップであり、転写産物の最初のヌクレオチド（すなわち５’末端ヌクレオチド）が２’修飾されていなくてもよいことを除いて、一本鎖核酸の全てのヌクレオチドが２’―ＯＭｅ修飾される、ステップとを含む、完全２’―ＯＭｅ核酸を転写する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、転写産物の最初のヌクレオシドは、２’―ＯＨグアニジンでありうる。方法のいくつかの実施形態においては、変異ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含む変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでないＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に、３７８位の改変アミノ酸および／または２６６位の改変アミノ酸をさらに含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが、提供される。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全に二本鎖である。
【００２２】
本発明の方法のいくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マンガンイオンがさらに含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオンより３．０〜３．５倍高い濃度で転写反応物中に存在する。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度８ｍＭ、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度９．５ｍＭ、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００２３】
別の実施形態においては、転写反応物には、非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基、特にグアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、２’フルオログアノシン一リン酸、２’フルオログアノシン二リン酸、２’―アミノグアノシン一リン酸、２’―アミノグアノシン二リン酸、２’―デオキシグアノシン一リン酸、および２’―デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基が、さらに含まれる。別の実施形態においては、転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータが含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、ポリエチレングリコールがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、無機ピロホスファターゼが含まれる。
【００２４】
本発明の別の態様においては、アプタマーを同定する方法が提供される。一実施形態においては、ａ）本発明の変異ポリメラーゼと、一つ以上の核酸転写テンプレートとを含む転写反応混合物を準備するステップと、）一本鎖核酸の候補混合物を生じるために、転写反応混合物を転写するステップであり、一本鎖核酸のヌクレオチドの選択的に一つ以外の全てが２’修飾されている、ステップと、ｃ）候補混合物を標的分子と接触させるステップと、ｄ）候補混合物の親和性に対して標的分子に対する親和性が増加した核酸を、候補混合物から分離するステップと、ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を得るために、親和性の増加した核酸を増幅するステップであり、標的分子に対するアプタマーが、アプタマーの最初のヌクレオチドが２’―非修飾でありうることを除いては、全て２’―修飾されたヌクレオチドを含むが同定されるステップを含む、アプタマーを同定する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、増幅ステップｆ）には、（ｉ）親和性が増加した核酸を標的から選択的に解離させるステップと、ｉｉ）核酸―標的複合体から解離された親和性が増加した核酸を、逆転写するステップと、ｉｉｉ）逆転写された親和性が増加した核酸を増幅するステップと；（ｉｉ）増幅された、逆転写された親和性が増加した核酸を転写テンプレートとして含む転写反応物混合物を調製し、転写混合物を転写するステップが含まれる。
【００２５】
本発明のアプタマー同定方法のいくつかの実施形態においては、変異ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含む変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでないＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に、３７８位の改変アミノ酸および／または２６６位の改変アミノ酸をさらに含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが、本発明のアプタマー同定方法において使用される。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全二本鎖である。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、転写反応物中の全てのヌクレオチド三リン酸は、２’―ＯＭｅ修飾されている。一実施形態においては、一つ以上の核酸転写テンプレートは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータに対してすぐ３’側のリーダー配列を含む。この態様のいくつかの実施形態においては、方法には、ステップａ）〜ｅ）を反復的に繰り返すステップが含まれる。
【００２７】
いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マンガンイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンが、マンガンイオンより３．０〜３．５倍高い濃度で転写反応物中に存在する。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度８ｍＭ、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度９．５ｍＭ、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００２８】
この態様の別の実施形態においては、本発明のアプタマー同定方法において使用するための転写反応物には、非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基、特にグアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、２’フルオログアノシン一リン酸、２’フルオログアノシン二リン酸、２’―アミノグアノシン一リン酸、２’―アミノグアノシン二リン酸、２’―デオキシグアノシン一リン酸、および２’―デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基がさらに含まれる。別の実施形態においては、転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータが含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、ポリエチレングリコールがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、無機ピロホスファターゼが含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。
【００２９】
別の実施形態では、ａ）変異ポリメラーゼと、核酸転写テンプレートと、ヌクレオシド三リン酸とを含む反応混合物において、テンプレート核酸をインキュベートするステップであり、グアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅであるステップと、ｂ）一本鎖核酸を生じる条件下で転写反応混合物を転写するステップであり、転写産物の最初のヌクレオチドを除いて、得られる一本鎖核酸の全てのグアニジンヌクレオチドが２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップとを含む、核酸を転写する方法が提供される。
【００３０】
方法のいくつかの実施形態においては、変異ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含む変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでないＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に、３７８位の改変アミノ酸および／または２６６位の改変アミノ酸をさらに含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。特定の実施形態では、本発明の転写方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを使用する。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全二本鎖である。
【００３１】
反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、転写方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のシチジン三リン酸は２’デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のチミジン三リン酸は２’デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のウリジン三リン酸は２’―ＯＨである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のウリジン三リン酸は２’―デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、シチジン三リン酸は２’―デオキシであり、チミジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、シチジン三リン酸は２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、チミジン三リン酸２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、ウリジン三リン酸は２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、ウリジン三リン酸は２’―ＯＨであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。
【００３２】
本発明の転写方法のいくつかの実施形態においては、転写反応混合物には、マグネシウムイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マンガンイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンが、マンガンイオンより３．０〜３．５倍高い濃度で、転写反応物中に存在する。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が、１．５ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度８ｍＭ、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度９．５ｍＭ、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００３３】
別の実施形態においては、転写反応混合物には、非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基、特にグアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、２’フルオログアノシン一リン酸、２’フルオログアノシン二リン酸、２’―アミノグアノシン一リン酸、２’―アミノグアノシン二リン酸、２’―デオキシグアノシン一リン酸、および２’―デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基が含まれる。別の実施形態においては、転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータが含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、ポリエチレングリコールがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、無機ピロホスファターゼが含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。
【００３４】
別の実施形態においては、ａ）変異ポリメラーゼと、一つ以上の核酸転写テンプレートと、ヌクレオシド三リン酸とを含む転写反応混合物を調製するステップであり、グアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅであるステップと、ｂ）一本鎖核酸の候補混合物を生じる条件下で、転写反応混合物を転写するステップであり、一本鎖核酸のグアノシンヌクレオチドの選択的に一つ以外の全てが２’修飾されている、ステップと、ｃ）候補混合物を標的分子と接触させるステップと、ｄ）候補混合物の親和性に対して標的分子に対する親和性が増加した核酸を、候補混合物から分離するステップと、ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を得るために、親和性の増加した核酸を増幅するステップであり、アプタマーの最初のヌクレオチドを除いて全て２’―修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む標的分子に対するアプタマーが同定されるステップを含む、アプタマーを同定する方法が提供される。一実施形態においては、増幅ステップには、（ｉ）親和性が増加した核酸を標的から選択的に解離させるステップと、ｉｉ）核酸―標的複合体から解離された親和性が増加した核酸を、逆転写するステップと、ｉｉｉ）逆転写された親和性が増加した核酸を増幅するステップと；（ｉｉ）増幅された逆転写された親和性が増加した核酸を転写テンプレートとして含む転写反応物混合物を調製し、転写混合物を転写するステップが含まれる。
【００３５】
本発明のアプタマー同定方法のいくつかの実施形態においては、変異ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含む変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでないＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に、３７８位の改変アミノ酸および／または２６６位の改変アミノ酸をさらに含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法に用いられるポリメラーゼの６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。特定の実施形態では、本発明のアプタマー同定方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含むポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全二本鎖である。
【００３６】
反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、アプタマー同定方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のシチジン三リン酸は２’デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のチミジン三リン酸は２’デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のウリジン三リン酸は２’―ＯＨである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、反応混合物中のウリジン三リン酸は２’―デオキシである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、シチジン三リン酸は２’―デオキシであり、チミジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、シチジン三リン酸は２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、チミジン三リン酸２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、ウリジン三リン酸は２’―デオキシであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。反応混合物中の全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅである、方法のいくつかの実施形態においては、ウリジン三リン酸は２’―ＯＨであり、ウリジンおよびアデノシン三リン酸は２’―ＯＭｅである。
【００３７】
本発明のアプタマー同定方法のいくつかの実施形態においては、転写反応混合物には、マグネシウムイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マンガンイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオンより３．０〜３．５倍高い濃度で転写反応物中に存在する。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が、１．５ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度８ｍＭ、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。転写反応混合物中に各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度９．５ｍＭ、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００３８】
別の実施形態においては、転写反応混合物には、非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基、特に、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、２’フルオログアノシン一リン酸、２’フルオログアノシン二リン酸、２’―アミノグアノシン一リン酸、２’―アミノグアノシン二リン酸、Ｔ―デオキシグアノシン一リン酸、および２’―デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基が、さらに含まれる。別の実施形態においては、転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータが含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、ポリエチレングリコールがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、無機ピロホスファターゼが含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。
【００３９】
別の実施形態においては、ａ）変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、ヌクレオシド三リン酸とを含む転写反応混合物を調製するステップであり、ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと；ｂ）一本鎖核酸を生じる条件下で、転写反応混合物を転写するステップであり、得られる一本鎖核酸の全てのグアニジンヌクレオチドが、選択的に一つを除いて、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップを含む、核酸を転写する方法が提供される。別の実施形態においては、ａ）変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、ヌクレオチド三リン酸とを含む転写反応混合物を準備するステップであり、ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、全てのグアニジン三リン酸が２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと；ｂ）一本鎖核酸の候補混合物を生じる条件下で、転写反応混合物を転写するステップであり、一本鎖核酸のグアニジンヌクレオチドの選択的に一つ以外の全てが２’修飾されている、ステップと、ｃ）候補混合物を標的分子と接触させるステップと、ｄ）候補混合物の親和性に対して標的分子に対する親和性が増加した核酸を、候補混合物から分離するステップと、；ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を得るために、親和性の増加した核酸を増幅するステップであり、アプタマーのグアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて全て２’―ＯＭｅ―修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む標的分子に対するアプタマーが、同定されるステップを含む、アプタマーを同定する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、増幅ステップには、（ｉ）親和性が増加した核酸を標的から選択的に解離させるステップと、ｉｉ）核酸―標的複合体から解離された、親和性が増加した核酸を逆転写するステップと、ｉｉｉ）逆転写された親和性が増加した核酸を、増幅するステップと；（ｉｉ）増幅された逆転写された親和性が増加した核酸を転写テンプレートとして含む転写反応物混合物を調製し、転写混合物を転写するステップがさらに含まれる。いくつかの実施形態においては、方法には、ステップａ）〜ｅ）を反復的に繰り返すステップがさらに含まれる。
【００４０】
本発明の方法のこの態様のいくつかの実施形態においては、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して、６３９位および７８４位に改変アミノ酸を含み、７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでなく、特に変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位にロイシンおよび７８４位にアラニンを含む。いくつかの実施形態においては、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型に対して、３７８位および／または２６６位に改変アミノ酸をさらに含む。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが、本発明の方法において使用される。いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとも称されるテンプレート核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。例えば、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％二本鎖である。いくつかの実施形態においては、テンプレート核酸は、テンプレートの全長にわたり完全二本鎖である。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、転写反応混合物は、シチジン三リン酸、ウリジン三リン酸、チミジン三リン酸およびアデノシン三リン酸からなる群より選択される少なくとも二つの追加的な異なる種類のヌクレオチド三リン酸をさらに含み、特に、少なくとも二つの追加的な異なる種類のヌクレオチド三リン酸が２’―ＯＭｅ修飾され、特に、転写反応混合物に含まれる異なる種類のヌクレオチド三リン酸の全てが、２’―ＯＭｅ修飾されている。
【００４２】
本発明の方法のこの態様のいくつかの実施形態においては、少なくとも一種類のヌクレオチド三リン酸が、側鎖で修飾された核酸塩基を含む。本明細書で用いられるところの、側鎖には、少なくとも一つの原子が炭素であり、少なくとも一つの他の原子が一価でない、少なくとも二つの原子を含む有機側鎖が含まれる。一実施形態においては、核酸塩基は、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾され、特に核酸塩基、例えばピリミジンが、５位で修飾され、特に修飾核酸塩基がウラシルまたはシトシンである。いくつかの実施形態においては、側鎖は、疎水性および／または芳香族側鎖、特にベンジルまたはインドリル側鎖である。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、核酸塩基が側鎖で直接修飾されるが、いくつかの実施形態においては、核酸塩基は、側鎖に共有結合するリンカーにより修飾され、リンカーは、―Ｏ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―（カルボキシ）および―ＣＨ２―、―ＣＯ―Ｏ―および―ＣＯ―ＮＨ―および―ＣＨ２―ＣＯ―ＮＨ―（ＣＨ２）ｎ―ＮＨ―からなる群より選択され、ｎが１〜６であり、特にリンカーが、―ＣＯ―（カルボキシ）および―ＣＨ２―および―ＣＯ―ＮＨ―からなる群より選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、修飾核酸塩基を含むヌクレオチドは、２’―ＯＭｅである。特定の実施形態においては、転写反応混合物に含まれる全ての異なる種類のヌクレオチド三リン酸が、修飾核酸塩基を含む種類のヌクレオチドを含めて、２’―ＯＭｅ修飾される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオチドは、２’―Ｏ―メチル―５―インドリルメチレンＵまたは２’―Ｏ―メチレ（ｍｅｔｈｙｌｅ）―５―ベンジルＵである。他の実施形態においては、修飾核酸塩基を含むヌクレオチドは、２’―デオキシまたは２’―ＯＨである。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、マンガンイオンがさらに含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオンより３．０〜３．５倍高い濃度で転写反応物中に存在する。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度８ｍＭ、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。転写反応物中に各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で存在する、別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度９．５ｍＭ、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、転写反応混合物には、非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基、特に、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、２’フルオログアノシン一リン酸、２’フルオログアノシン二リン酸、２’―アミノグアノシン一リン酸、２’―アミノグアノシン二リン酸、２’―デオキシグアノシン一リン酸、および２’―デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される非２’―ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基が含まれる。別の実施形態においては、転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータが含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応混合物に含まれる核酸転写テンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータに対してすぐ３’側のリーダー配列が含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、ポリエチレングリコールがさらに含まれる。別の実施形態においては、転写反応物には、無機ピロホスファターゼがさらに含まれる。いくつかの実施形態においては、転写反応物には、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方がさらに含まれる。
【００４７】
本発明の方法のこの態様のいくつかの実施形態においては、転写のステップにより、一本鎖核酸の転写収率がもたらされ、転写収率は、同一の転写反応物が野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含むことを除いては同一の転写反応物の収率より高い。転写収率は、電気泳動および可視化により定量し、転写産物コピー数および／または濃度、例えばμＭまたはμｇ／ｍｌで表せる。本発明の方法のこの態様においては、野生型Ｔ７ポリメラーゼは、配列番号３３によるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ（商標））プロセスの概略図である。
【図２】標準的モノ―ＰＥＧ化、多重ＰＥＧ化、およびＰＥＧ化による二量体化を表す、様々なＰＥＧ化戦略を示した図である。
【図３Ａ】核酸（配列番号３２）である。
【図３Ｂ】野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号３３）である。
【図４Ａ】変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａの核酸配列（配列番号３４）である。
【図４Ｂ】Ｔ７変異ポリメラーゼＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒの核酸配列（配列番号３５）である。
【図４Ｃ】変異Ｔ７ポリメラーゼＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａの核酸配列（配列番号３６）である。
【図４Ｄ】変異Ｔ７ポリメラーゼＰ２６６Ｌ／６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒの核酸配列（配列番号３７）である。
【図５】転写混合物中にＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７ＳＲ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、ｒＧＴＰ（２’―ＯＨ  ＧＴＰ）の滴定を用いた、ＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９の、ＰＡＧＥ―ゲル分析のＵＶ―シャドウイングから定量された相対的転写産物収率を示す。＊は、与えられた収率が、ＵＶ―シャドウにより最も高い収率が定量された、２０ｕＭ  ｒＧＴＰで転写されたＡＲＣ２１１８に対するものである。
【図６】転写混合物中にＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７ＳＲ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、様々な濃度の２’―ＯＭｅ  ＮＴＰｓ（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を伴い、ｒＧＴＰ（２’―ＯＨ  ＧＴＰ）を伴わない、ＡＲＣ２１１９の、ＰＡＧＥ―ゲル分析のＵＶ―シャドウイングから定量された相対的転写産物収率を示す。与えられた収率は、各１ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ、６．５ｍＭのＭｇＣｌ２、および２ｍＭのＭｎＣｌ２の転写条件に対するものである。
【図７】Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた全ＲＮＡまたは２’―ＯＭｅ転写の忠実度と比較した、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる完全２’―ＯＭｅ転写（１００％  ２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）のヌクレオチド挿入、欠失および置換の分析を示す表である。表において、（１）は、ＦＡＲ  Ｔ７変異ポリメラーゼで転写が行われた、“Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２’―Ｏ―Ｍｅｔｈｙｌ  Ａｐｔａｍｅｒ  ｔｏ  ＶＥＧＦ”Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ等、（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：２５―３３からのデータを示し、（２）は、ＬＡＲ  Ｔ７変異体ポリメラーゼで転写が行われたことを示す。
【図８】Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた一ラウンドの完全２’―ＯＭｅ転写、その後のＤＮアーゼ処置、逆転写、スプリンテッドライゲーション、およびＰＣＲ増幅を行った前後の、完全２’―ＯＭｅ転写物（１００％  ２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）の％ヌクレオチド組成の分析を示す表である。
【図９】３’―末端にキャップを有する（暗色のボール）、５’から３’方向に示される、最小化ＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマーの略図である。
【図１０】最小化ＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマー、二つのデオキシ置換を有する最小化ＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマー、および一つのデオキシ置換とホスホロチオエート置換とを有する最小化ＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマーの略図であり、各々が５’〜３’方向に示され、各々が３’―末端にキャップを有する（黒色のボール）。
【図１１】修飾および野生型Ｔ７ポリメラーゼを用いて２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰまたは２’―ＯＨ  ＮＴＰｓを導入する転写のレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細が、以下の付随の記述に記載される。本発明の実行または試験においては、本明細書に記載のものに類似するか同等の任意の方法または材料を使用できるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、記載から明らかになる。明細書においては、文脈が逆を明示しない限り、単数形には複数も含まれる。本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、特に断りがない限り、本発明が属する技術の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、本明細書が優先する。
【００５０】
ＳＥＬＥＸ（商標）方法
アプタマーを生成する好ましい方法は、概して図１に示され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択と呼もばれる、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（試験管内人工進化法）”（「ＳＥＬＥＸ（商標）」）と称されるプロセスによる。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、標的分子に対する高特異性結合をもつ核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法であり、例えば、１９９０年６月１１日出願の、現在は放棄されている米国特許出願第０７／５３６４２８号、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”という題の米国特許第５，４７５，０９６号、および“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”という題の米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照）に記載されている。ＳＥＬＥＸ（商標）は、選択および増幅の反復的サイクルを実行することにより、任意の所望のレベルの標的結合親和性をもつ、本明細書において「核酸リガンド」とも称されるアプタマーを得るために使用できる。
【００５１】
ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、核酸が様々な二次元および三次元構造を形成するための十分な能力と、モノマーかポリマーかを問わず事実上任意の化学化合物とのリガンドとして働く（すなわち特異的結合対を形成する）ために利用可能な十分な化学的可転性をそれらのモノマーの中に有するという、固有の洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的となりうる。
【００５２】
ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、標的を結合する能力に基づく。したがって、ＳＥＬＥＸ（商標）手順から得られたアプタマーは、標的に結合する特性を有する。しかし、単なる標的結合からは、アプタマー結合作用により標的に及ぼされうる機能効果に関する情報が、仮にあるとしても提供されない。
【００５３】
標的分子の特性の変更には、アプタマーが標的の特性の変化をもたらすために標的上の一定の位置で結合することが必要である。理論的には、ＳＥＬＥＸ（商標）法により、各アプタマーが標的の異なる部位に結合する、多数のアプタマーの同定がもたらされうる。実行においては、アプタマー―標的結合相互作用は、相互作用のための安定的で利用可能な構造的インターフェイスを提供する、標的上の一つまたは比較的少数の好ましい結合部位で生じることが多い。さらに、ＳＥＬＥＸ（商標）法が生理的標的分子に実行される場合には、技術者は通常、標的に対するアプタマーの位置を制御できない。したがって、標的上のアプタマー結合部位の位置が、所望の効果につながりうる、あるいは標的分子に影響し得ない、複数の潜在的結合部位の一つまたはその付近である可能性も、そうでない可能性もある。
【００５４】
アプタマーが、その標的結合能力によって、効果をもつことが認められる場合でも、その効果の存在を予測し、または効果がどのようなものになるかを予知する方法はない。ＳＥＬＥＸ（商標）実験の実施においては、技術者は、アプタマーが、標的に対するアプタマーを得ることができる範囲で、標的を結合する特性を有するということしか確実には分からない。同定されるアプタマーの一部が標的に結合する以上の効果も有することを期待してＳＥＬＥＸ（商標）を行うことはできるが、それは不確実である。
【００５５】
ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、開始点としてランダム化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリまたはプールに依存する。オリゴヌクレオチドは、修飾または非修飾ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでありうる。いくつかの例においては、プールは、１００％縮重または部分的縮重オリゴヌクレオチドを含む。他の例においては、プールは、ランダム化された配列に導入された少なくとも一つの固定配列および／または保存配列を含む、縮重または部分的縮重オリゴヌクレオチドを含む。他の例においては、プールは、オリゴヌクレオチドプールの全ての分子により共有される配列を含みうる少なくとも一つの固定配列および／または保存配列を、５’および／または３’末端に含む、縮重または部分的縮重オリゴヌクレオチドを含む。固定配列は、後述のＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３、Ｔ４、Ｔ７、およびＳＰ６）のプロモータ配列、制限部位、またはポリＡ領域またはポリＴ領域等のホモポリマー配列、触媒核、アフィニティーカラムへの選択的結合の部位、転写を促進するリーダー配列、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列等、予め選択された目的のために導入された、プールのオリゴヌクレオチドに共通の配列である。
【００５６】
プールのオリゴヌクレオチドは、効率的な増幅に必要な固定配列ならびに縮重配列部分を含むのが好ましい。典型的には、開始プールのオリゴヌクレオチドは、３０〜４０のランダムなヌクレオチドの内部領域に隣接する固定５’および３’末端配列を含む。縮重ヌクレオチドは、ランダムに切断された細胞核酸から、化学合成およびサイズ選択を含む多数の方法により作成できる。選択／増幅の反復の前または間に、突然変異誘発によりテスト核酸において配列変異を導入または増加することもできる。
【００５７】
オリゴヌクレオチドの縮重配列部分は、任意の長さであり得、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、修飾または非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含みうる。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；第５，６６０，９８５号；第５，９５８，６９１号；第５，６９８，６８７号；第５，８１７，６３５号；第５，６７２，６９５号、および国際公開第９２／０７０６５号を参照。縮重オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知のオリゴヌクレオチド固相合成技術を使用してホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成されうる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９―５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５―５５７８（１９８６）を参照。トリエステル合成法等の液相法を用いて、ランダムオリゴヌクレオチドを合成することもできる。例えば、Ｓｏｏｄ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅ等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照。自動ＤＮＡ合成装置で行われる典型的な合成は、ほとんどのＳＥＬＥＸ（商標）実験に十分な数である、１０１６〜１０１７の個々の分子を生じる。配列設計における十分に大きな縮重配列の領域により、各合成分子が固有の配列を表わす可能性が増加する。
【００５８】
オリゴヌクレオチドの開始ライブラリは、ＤＮＡ合成装置での自動化された化学合成により生成されうる。縮重配列を合成するために、四つ全てのヌクレオチドの混合物を、合成プロセスの間に各ヌクレオチド添加ステップにおいて加え、ヌクレオチドの確率的導入を可能にする。前述の通り、一実施形態においては、ランダムオリゴヌクレオチドは完全縮重配列を含むが、他の実施形態では、縮重オリゴヌクレオチドは非ランダムまたは部分的にランダムな配列の連なりを含みうる。各添加ステップで四つのヌクレオチドを異なるモル比で加えることにより、部分的にランダムな配列が生成されうる。
【００５９】
ＲＮＡライブラリが開始ライブラリとして用いられる場合には、典型的に、ＤＮＡライブラリを合成し、選択的ＰＣＲ増幅してから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡライブラリをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、転写されたライブラリを精製することにより、それが生成される。そして、ＲＮＡまたはＤＮＡライブラリが、結合に好ましい条件下で標的と混合され、同じ一般的選択スキームを用いて結合、分離および増幅の段階的な反復が行われ、結合能および選択性の事実上任意の所望の基準が達成される。より詳しくは、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、核酸の開始プールを含む混合物から開始し、（ａ）結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させるステップと；（ｂ）標的分子に特異的に結合した核酸から、未結合核酸を分離するステップと；（ｃ）核酸―標的複合体を選択的に解離させるステップと；（ｄ）リガンドが濃縮された核酸の混合物を得るために、核酸―標的複合体から解離された核酸を増幅するステップと；（ｅ）標的分子に対する高特異性、高親和性核酸リガンドを得るために、結合、分離、解離、および増幅のステップを、必要な回数のサイクルで繰り返すステップを含む。ＲＮＡアプタマーが選択される場合においては、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、（ｉ）ステップ（ｄ）の増幅の前に、核酸―標的複合体から解離された核酸を逆転写するステップと；（ｉｉ）プロセスを再開する前に、ステップ（ｄ）からの増幅された核酸を転写するステップをさらに含む。
【００６０】
多数の可能性のある配列および構造を含む核酸混合物の中においては、所与の標的に対する様々な結合親和性がある。標的に対する親和性が高い（解離定数が低い）ものは、最も標的と結合しやすい。分離、解離および増幅の後、第二核酸混合物が生成され、結合親和性がより高い候補が濃縮される。得られた核酸混合物が一つまたは数個の配列のみから主に構成されるまで、追加的な選択のラウンドにより次第に最適なリガンドが選ばれる。そして、これらがクローニングされ、配列決定され、リガンドまたはアプタマーとして１）標的結合親和性；および／または２）標的機能に影響する能力につき個々に試験されうる。
【００６１】
所望の目標が達成されるまで、選択および増幅のサイクルが繰り返される。最も一般的な場合においては、サイクルの反復により結合強度に有意な改善が達成されなくなるまで、選択／増幅が継続される。方法は、典型的には、約１０１４の異なる核酸種のサンプリングに使用されるが、約１０１８もの数の異なる核酸種のサンプリングにも使用されうる。一般に、５〜２０サイクルの手順において、核酸アプタマー分子が選択される。一実施形態においては、最初の選択ステージにおいてのみ不均質性が導入され、複製プロセスの全体にわたって生じることはない。
【００６２】
ＳＥＬＥＸ（商標）法の一実施形態においては、選択プロセスが、選択された標的に最も強く結合する核酸リガンドを単離することにおいて非常に効率的であるために、選択および増幅のサイクルが一度で足りる。そのような効率的な選択は、例えば、カラムに結合した標的と結びつく核酸の能力が、カラムが最も親和性の高い核酸リガンドの分離および単離を十分に許容できるような態様で働く、クロマトグラフィタイプのプロセスにおいて生じうる。
【００６３】
多くの場合には、単一の核酸リガンドが同定されるまでＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの反復的ステップを行うことが、必ずしも望ましいとは限らない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に大きく影響せずに置換または加えられうる多数の配列を有する、核酸構造またはモチーフのファミリーを含みうる。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを完了前に終了することにより、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。
【００６４】
種々の核酸の一次構造、二次構造および三次構造が存在することが知られている。非ワトソン―クリック型の相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称のバルジ、シュードノットおよびこれらの無数の組み合わせと呼ばれる。このようなモチーフの公知の場合のほぼ全てが、それらがわずか３０ヌクレオチド以内の核酸配列において形成されうることを示唆する。この理由から、連続したランダム化セグメントを用いたＳＥＬＥＸ（商標）手順が、約２０〜５０、いくつかの実施形態においては約３０〜４０の間のヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列で開始されることが好ましいことが多い。一実施例においては、５’―固定：ランダム：３’―固定配列は、約３０〜約４０ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【００６５】
多くの特定の目的を達成するために、基本的なＳＥＬＥＸ（商標）法が改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、曲がったＤＮＡ等の特定の構造特性を有する核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と合わせたＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの利用を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子に結合および／または光架橋および／またはこれを光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸ（商標）ベースの方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および第５，８６１，２５４号は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を持つオリゴヌクレオチドの非常に効率的な分離を達成する、ＳＥＬＥＸ（商標）ベースの方法を記載する。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスが実施された後に、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドを標的に共有結合するための方法を記載する。
【００６６】
ＳＥＬＥＸ（商標）法を用いて、標的分子上の一つ以上の部位に結合する核酸リガンドを得ること、および、標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得ることもできる。ＳＥＬＥＸ（商標）法は、核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質、ならびに補因子および他の小分子等の、巨大分子および小分子を含む任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号は、カフェインとその密接に関連するアナログ、テオフィリンに対して高い親和性で結合し得る、ＳＥＬＥＸ（商標）法により同定される核酸配列を開示する。
【００６７】
Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、一つ以上の非標的分子への交差反応性をもつ核酸リガンド配列を排除することにより、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスには、（ａ）核酸の候補混合物を調製するステップと；（ｂ）候補混合物を標的に接触させるステップであり、候補混合物と比較して標的に対する親和性が増加している核酸が、候補混合物の残部から分離され得る、ステップと；（ｃ）候補混合物の残部から親和性が増加した核酸を分離するステップと；（ｄ）標的から親和性が増加した核酸を選択的に解離するステップと；（ｅ）非標的核酸分子（単数または複数）に対する特異的親和性をもつ核酸リガンドが除去されるように、親和性の増加した核酸を一つ以上の非標的分子と接触させる、ステップと；（ｆ）標的分子への結合につき比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得るために、標的分子だけに対して特異的親和性をもつ核酸を増幅する、ステップが含まれる。ＳＥＬＥＸ（商標）法について上述したように、所望の目標が達成されるまで、選択および増幅のサイクルが必要に応じて繰り返される。
【００６８】
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において直面する一つの潜在的な問題は、そのホスホジエステル形態におけるオリゴヌクレオチドが、所望の効果が現れる前に、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ等の細胞内酵素および細胞外酵素により体液中で急速に分解されうることである。したがって、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、リガンドに、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の改善または送達特性の改善等の特性の改善を与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例には、糖位および／またはリン酸位および／または塩基位での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ（商標）―同定核酸が、例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６６０，９８５号、様々な２’修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，７５６，７０３号、および、２’―アミノ（２’―ＮＨ２）、２’―フルオロ（２’―Ｆ）、および／または２’―Ｏ―メチル（２’―ＯＭｅ）置換基で修飾された一つ以上のヌクレオチドを含む、高特異的核酸リガンドを記載する米国特許第５，５８０，７３７号に記載されている。
【００６９】
本発明において意図される核酸リガンドの修飾には、核酸リガンド塩基または全体としての核酸リガンドに追加的電荷、極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、および流動性を導入する他の化学基を提供するものが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼに対して抵抗性のオリゴヌクレオチド集団を生成するための修飾には、一つ以上の置換ヌクレオチド間結合、改変された糖、改変された塩基、またはそれらの組み合わせも含まれうる。このような修飾には、２’―位糖修飾、５―位ピリミジン修飾、８―位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４―チオウリジンの置換、５―ブロモもしくは５―ヨードウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、および、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアノシン等の異常な塩基対の組み合わせが含まれるが、これに限られない。修飾には、キャッピング等の３’修飾および５’修飾も含まれうる。修飾には、キャッピング、例えばエキソヌクレアーゼ抵抗性を増加させるための３’―３’―ｄＴキャップの付加等の、３’修飾および５’修飾も含まれうる（例えば、各々参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６７４，６８５号；第５，６６８，２６４号；第６，２０７，８１６号；および第６，２２９，００２号を参照。）
一実施形態においては、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）、または３’―アミン（―ＮＨ―ＣＨ２―ＣＨ２―）により置換されたオリゴヌクレオチドが提供され、各ＲまたはＲ’は、独立してＨであるか置換もしくは非置換アルキルである。―Ｏ―、―Ｎ―、または―Ｓ―結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合基が結合され得る。オリゴヌクレオチドにおける全ての結合が同一である必要はない。
【００７０】
さらなる実施形態においては、オリゴヌクレオチドは修飾糖基を含み、例えば一つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、エーテルまたはアミンとして官能化される。一実施形態においては、フラノース残基の２’位が、Ｏ―メチル、Ｏ―アルキル、Ｏ―アリル、Ｓ―アルキル、Ｓ―アリル、またはハロ基のいずれかにより置換される。２’―修飾糖の合成方法が、例えばＳｐｒｏａｔ等、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１９：７３３―７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｏｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９―２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２：５１３８―５１４５（１９７３）に記載される。他の修飾は、当技術分野の技術者に公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾（先に同定された未修飾リガンドの修飾）であるか、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへの組み込みによりなされうる。
【００７１】
ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへの組み込みによりなされるものは、そのＳＥＬＥＸ（商標）標的に対する特異性と、安定性の改善、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じる。核酸リガンドに対するＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾（（例えばＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾によりヌクレオチドが導入された、先に同定されたリガンドの切断、欠失、置換または追加的なヌクレオチド修飾）は、核酸リガンドの結合能に悪影響を与えることなく、安定性、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の改善をもたらしうる。選択的に、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾により導入されたアプタマーが、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾（すなわちＳＥＬＥＸの後のＳＥＬＥＸ（商標）後修飾プロセス）により、さらに修飾されうる。
【００７２】
ＳＥＬＥＸ（商標）法は、米国特許第５，６３７，４５９号および第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能単位と組み合わせるステップを含む。ＳＥＬＥＸ（商標）法は、例えば米国特許第６，０１１，０２０号、第６，０５１，６９８号、および国際公開第９８／１８４８０号に記載されるように、選択された核酸リガンドを、診断用または治療用複合体において親油性または非免疫原性の高分子量化合物と組み合わせるステップをさらに含む。これらの特許および特許出願は、広範囲の形および他の特性の組み合わせを、オリゴヌクレオチドの効率的増幅および複製特性、および他の分子の所望の特性とともに教示する。
【００７３】
ＳＥＬＥＸ（商標）法による、小さなフレキシブルペプチドに対する核酸リガンドの同定も調査されている。小ペプチドは、フレキシブルな構造を有し、通常は複数のコンホーマの平衡状態で溶液中に存在し、そのため、フレキシブルペプチドを結合する際のコンホメーションのエントロピーの損失により結合親和性が制限されうると当初は考えられた。しかし、溶液中における小ペプチドに対する核酸リガンドの同定の実現可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号において示された。この特許においては、１１アミノ酸ペプチドのサブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【００７４】
ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの一部として、標的と結合するように選択された配列は、その後、所望の結合親和性を有する最小の配列を決定するために、選択的に最小化される。選択された配列および／または最小化された配列は、例えば結合親和性を増加し、あるいは配列中のどの位置が結合活性に必須であるか決定するために、配列のランダムまたは定方向突然変異誘発を行うことにより選択的に修飾される。
【００７５】
修飾ヌクレオチドＳＥＬＥＸ（商標）法
アプタマーが、治療薬および／または特定の種類の診断薬としての使用に適するためには、合成が安価であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで安全および安定していることが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは通常、ヌクレアーゼにより分解されやすいため、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定してない。２’―位における修飾基の導入により、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗が大きく高められうる。
【００７６】
さらに、アプタマーが選択されるオリゴヌクレオチドライブラリへの化学修飾の導入により、オリゴヌクレオチドライブラリの構造的および化学的多様性が増加し、特に望ましい特性を有する高親和性および高特異的アプタマーが得られる標的数が、潜在的に増加する。例えば、多くの用途においては、完全２’―ＯＭｅアプタマーを得ることが望ましいが、そのようなアプタマーを、標的の機能を所与の用途において十分な程度に調節、例えば阻害するアプタマーをもたらす単一のプールの組成物、例えば最初のヌクレオチド以外の全てが２’―ＯＭｅであるオリゴヌクレオチドから得ることは必ずしも可能でないだろう。この場合には、ｄＣｍＤ転写組成物から得られるライブラリなど、一つ以外の全てのヌクレオチドが２’―ＯＭｅであるオリゴヌクレオチドを含むプール等の他のプール組成物からアプタマーを選択することが望ましいだろう。それはまた望ましい、および、別の実施形態においては、本発明は、２’―ＯＭｅ修飾ならびに核酸塩基の位置に側鎖修飾を有するオリゴヌクレオチドを含むプール組成物からアプタマーを選択する方法を提供する。
【００７７】
２’―フルオロおよび２’―アミノ基がオリゴヌクレオチドプールに良好に導入され、そこからその後アプタマーが選択されている。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成費用を大きく増加させ、また、修飾オリゴヌクレオチドの分解およびその後のＤＮＡ合成の基質としてのヌクレオチドの使用により、修飾ヌクレオチドがホストＤＮＡに再利用される可能性があるために、一部の場合には安全性の問題をもたらしうる。
【００７８】
本明細書に提供される、２’―Ｏ―メチル（「２’―ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含むアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’―ＯＭｅヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり、合成が安価である。２’―ＯＭｅヌクレオチドは、生物系に遍在するが、天然のポリメラーゼは２’―ＯＭｅ  ＮＴＰｓを生理学的条件下で基質として受け入れず、したがって、２’―ＯＭｅヌクレオチドのホストＤＮＡへの再利用に関する安全性の問題がない。２’―修飾アプタマーを生成するために使用されるＳＥＬＥＸ（商標）法が、例えば、２００２年１２月３日に出願の米国特許仮出願第６０／４３０，７６１号、２００３年７月１５日に出願の米国特許仮出願第６０／４８７，４７４号、２００３年１１月４日に出願の米国特許仮出願第６０／５１７，０３９号、２００３年１２月３日に出願の米国特許出願第１０／７２９，５８１号、２００４年６月２１日に出願の、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”と題した米国特許出願第１０／８７３，８５６号、２００５年６月３０日に出願の、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｙ  ２’―Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓと題した米国特許仮出願第６０／６９６，２９２号、および２００６年６月３０日に出願の、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｙ  ２’―Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓと題した米国特許出願第１１／４８０，１８８号に記載されており、これらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００７９】
本発明は、アプタマー標的に結合してその機能を調節するアプタマーであり、オリゴヌクレオチドを非修飾オリゴヌクレオチドよりも酵素的および化学的分解、ならびに熱的および物理的分解に対してより安定させるために修飾されたヌクレオチド（例えば２’―位に修飾を有するヌクレオチド）を含む、アプタマーを含む。本発明には、アプタマー標的に結合してその機能を調節するアプタマーであり、２’位、例えば２’―ＯＭｅ修飾、および核酸塩基の位置、例えばピリミジンの５位の側鎖修飾で修飾されたヌクレオチドを含む、アプタマーも含まれる。２’―ＯＭｅを含むアプタマーのいくつかの例が文献にあるが（例えばＲｕｃｋｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９８  ２７３，２０５５６―２０５６７―６９５）、これらは、ＣおよびＵ残基が２’―フルオロ（２’―Ｆ）置換され、ＡおよびＧ残基が２’―ＯＨである修飾された転写産物のライブラリのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択により生成された。機能的配列が同定されると、各ＡおよびＧ残基の２’―ＯＭｅ置換に対する寛容性が試験され、２’―ＯＭｅ残基としての２’―ＯＭｅ置換に寛容な全てのＡおよびＧ残基を有するアプタマーが再合成された。この二段階様式で生成されるアプタマーのほとんどのＡおよびＧ残基は、２’―ＯＭｅ残基による置換に寛容であるが、平均的に約２０％は許容しない。したがって、この方法を用いて生成されるアプタマーは、２〜４の２’―ＯＨ残基を含む傾向があり、安定性および合成費用が結果的に損なわれる。本発明の方法は、ＳＥＬＥＸ（商標）法（および／または本明細書に説明されるものを含むその任意の変化形および改善形態）によりアプタマーが選択および濃縮されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される、安定化されたオリゴヌクレオチドを生成する、転写反応物への修飾ヌクレオチドの導入により、アプタマーオリゴヌクレオチドを２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチドにより再合成することにより、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要性をなくす。
【００８０】
一実施形態においては、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’―ＯＨ、２’―Ｆ、２’―デオキシ、および２’―ＯＭｅ修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態においては、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’―ＯＨ、２’―Ｆ、２’―デオキシ、２’―ＯＭｅ、２’―ＮＨ２、およびＴ―メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。好ましい実施形態においては、本発明は、全てまたは実質的に全て２’―ＯＭｅ修飾されたＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、および／またはＵＴＰヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。別の好ましい実施形態においては、本発明は、全てのヌクレオチド三リン酸基、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよび／またはＵＴＰが、一つを除いて２’―ＯＭｅ修飾されたアプタマーを提供する。例えば、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰを含むが、ＣＴＰがデオキシであるアプタマーである。本発明は、任意の先行する２’修飾の組み合わせとの組み合わせにおける、側鎖による核酸塩基修飾を含むアプタマーをさらに提供する。
【００８１】
別の好ましい実施形態においては、本発明は、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、三つの２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸基および一つのデオキシまたは２’―ＯＨヌクレオチド三リン酸基を含むアプタマーを提供する。特定の実施形態では、アプタマーはデオキシシチジンヌクレオチド三リン酸を含み、残りのヌクレオチド三リン酸は、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、２’―ＯＭｅ修飾される。別の実施形態では、アプタマーはデオキシチミジンヌクレオチド三リン酸を含み、残りのヌクレオチド三リン酸は、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、２’―ＯＭｅ修飾されている。別の実施形態では、アプタマーは２’―ＯＨウリジンヌクレオチド三リン酸を含み、残りのヌクレオチド三リン酸は、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、２’―ＯＭｅ修飾されている。別の実施形態では、アプタマーはデオキシグアノシンヌクレオチド三リン酸を含み、残りのヌクレオチドは、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、２’―ＯＭｅが修飾される。別の実施形態では、アプタマーはデオキシアデノシンヌクレオチド三リン酸を含み、残りのヌクレオチドは、開始ヌクレオチドが２’修飾である必要がないことを除いて、２’―ＯＭｅ修飾されている。
【００８２】
修飾ポリメラーゼ
本発明の２’修飾アプタマーは、野生型ポリメラーゼ、例えば野生型Ｔ７ポリメラーゼより高い、フラノース２’位に大きな置換基を有する修飾ヌクレオチドの導入率を有する修飾ポリメラーゼ、例えば変異Ｔ７ポリメラーゼを用いてつくられる。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変えられている（Ｙ６３９Ｆ）変異Ｔ７ポリメラーゼは、２’デオキシ、２’アミノ―、および２’フルオロ―ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰｓ）を容易に基質として利用し、様々な用途のために修飾ＲＮＡｓを合成するために広く使われている。しかし、この変異Ｔ７ポリメラーゼは、２’―ＯＭｅまたは２’―アジド（２’―Ｎ３）置換基等の大きな２’―置換基を伴うＮＴＰｓを容易に利用（すなわち導入）できないことが報告されている。大きな２’置換基の導入のために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変えられた変異Ｔ７ポリメラーゼが、記載されており（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）、修飾ピリミジンＮＴＰｓを導入するために、限られた状況において使われている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．およびＳｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８を参照。６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変えられ、７８４位のヒスチジン残基がアラニンに変えられ、３７８位のリジン残基がアルギニンに変えられている変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）が、修飾プリンおよびピリミジンＮＴＰｓ、例えば２’―ＯＭｅ  ＮＴＰｓを導入するために、限られた状況において使用されているが、転写のための２’―ＯＨ  ＧＴＰのスパイクを含む。Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ等、（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：２５―３３を参照。転写のための２’―ＯＨ  ＧＴＰスパイクの包含により、完全に２’―ＯＭｅではなく２’―ＯＨ  ＧＴＰの存在に依存しうるアプタマーが生じうる。
【００８３】
７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変えられた（Ｈ７８４Ａ）変異Ｔ７ポリメラーゼも、説明されている。Ｐａｄｉｌｌａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異およびＨ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼの両方において、アラニン等のより小さなアミノ酸残基への変更により、より大きなヌクレオチド基質、例えば２’―ＯＭｅ置換ヌクレオチドの導入が可能になる。Ｃｈｅｌｌｉｓｅｒｒｙ，Ｋ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，９：１１５５―６０を参照。大きな２’修飾基質をより容易に導入する、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性部位に変異を伴う追加的なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、例えば６３９位のチロシン残基がロイシンに変えられた（Ｙ６３９Ｌ）変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、記載されている。しかし、そのような変異により与えられる基質特異性の増加のために活性が犠牲になり、転写収率が低下することが多い。Ｐａｄｉｌｌａ  ＲおよびＳｏｕｓａ，Ｒ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（６）：１５６１を参照。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異Ｐ２６６Ｌが、プロモータクリアランスを促進することが記載されている（Ｇｕｉｌｌｅｒｅｚ等（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（１７）５９５８）。ポリメラーゼは、プロモータに結合された開始コンホメーションから、結合されていない伸長コンホメーションへと変化する。以上の変異ポリメラーゼのいずれも、完全２’―ＯＭｅ転写産物をもたらすことが報告されていない。
【００８４】
本発明は、オリゴヌクレオチドの転写収率を増加させる材料および方法を提供する。一実施形態においては、本発明は、オリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオチドを酵素的に導入するために、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの修飾は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、配列番号３３に対するもの）を使用するための、方法および条件を提供する。好ましい実施形態においては、本発明の転写方法で使用される変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、２’―ＯＨ  ＧＴＰの存在を要しない。好ましい実施形態においては、修飾ポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変えられ、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変えられた（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。別の好ましい実施形態においては、修飾ポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変えられ、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変えられ、３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変えられた（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。別の実施形態においては、本発明の方法に用いられる修飾ポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変えられ（Ｙ６３９Ｌ）、さらに別の実施形態においては、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変えられ、３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変えられ（Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ）ている。いかなる理論にも拘束されるものではないが、Ｋ３７８Ｒ変異は、ポリメラーゼの活性部位の近くでなく、したがってサイレント変異であると考えられる。別の実施形態においては、本発明の方法に用いられる修飾ポリメラーゼは、２６６位のプロリン残基がロイシンに変えられ、６３９位のチロシン残基がロイシンに変えられ、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変えられた（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、さらに別の実施形態においては、変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、２６６位のプロリン残基がロイシンに変えられ、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変えられ、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変えられ、３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変えられている（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）。
【００８５】
変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、以下に示される。
【００８６】
【化１】
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【００８７】
【化２】
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【００８８】
【化３−１】
2011504357.tif 000004
２’修飾（例えば２’―ＯＭｅまたは２’―ＯＭｅおよび核酸塩基側鎖修飾）ＲＮＡ転写物のプールを生成するために、変異ポリメラーゼが２’―修飾ＮＴＰｓを許容する条件下における、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが使用されうる。好ましいポリメラーゼは、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。別の好ましいポリメラーゼは、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。本発明における別の好ましいポリメラーゼは、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。他のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、特に大きな２’―置換基に対する高い寛容性をもつものも、本発明の方法で使用できる。本明細書に開示される条件を用いたテンプレート指向性重合において使用される場合には、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、またはＹ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて達成されるより高い転写収率で、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰを含み、核酸塩基の位置で側鎖修飾もされた２’―ＯＭｅ  ＮＴＰＳも含む、全て２’―ＯＭｅのＮＴＰｓの導入のために使用されうる。Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、２’―修飾、例えば２’―ＯＭｅを含むオリゴヌクレオチドの高収率を達成するために、２’―ＯＨ  ＧＴＰを伴って使用されうるがその必要はない。
【００８９】
好ましい実施形態においては、本発明のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、より高い完全２’―ＯＭｅ転写収率を促進するために、ＭＮＡ転写混合物とともに使用される。いくつかの実施形態においては、ＭＮＡ転写混合物の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の位置における側鎖変更も含む。別の好ましい実施形態においては、本発明のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、転写産物の最初のヌクレオチド以外の全てのグアノシン三リン酸が２’―ＯＭｅである、より高い転写収率を促進するために、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶ転写混合物とともに使用される。いくつかの実施形態においては、本発明のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶ転写混合物とともに使用され、転写産物の最初のヌクレオチド以外の全てのグアノシン三リン酸が２’―ＯＭｅである、より高い転写収率を促進するために、混合物中の少なくとも一つヌクレオチドタイプがその核酸塩基の位置の側鎖修飾も含み、一つのヌクレオチドタイプが核酸塩基の側鎖修飾も含む。いくつかの実施形態においては、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、ｒＲｍＹ、ｄＲｍＹ、ｒＧｍＨ、ｆＧｍＨ、ｄＧｍＨ、ｄＡｍＢ、ｒＲｄＹ、ｄＲｄＹまたはｒＮ転写混合物とともに使用されうる。いくつかの実施形態においては、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれか一つが、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶ、ｄＵｍＶ、ｄＧｍＨ、ｒＧｍＨ、交互混合物、ｆＧｍＨ、ｒＡｍＢまたはｄＡｍＢ転写反応混合物において使用されうる。特定の実施形態においては、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれか一つが、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶ転写反応混合物において使用されうる。
【００９０】
本明細書で使用されるところでは、２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ三リン酸（２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ）だけを含む転写混合物が、ＭＮＡ混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーはＭＮＡアプタマーと呼ばれ、２’―Ｏ―メチルヌクレオチドだけを含む。２’―ＯＭｅ  ＣおよびＵ、ならびに２’―ＯＨ  ＡおよびＧを含む転写混合物は「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＲｍＹ」と呼ばれる。デオキシＡおよびＧ、ならびに２’―ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む転写混合物は「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵ、ならびに２’―ＯＨ  Ｇを含む転写混合物は「ｒＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、ならびに２’―ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’―Ｆ  Ｇを交互に含む転写混合物は「交互混合物」と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「交互混合物」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、およびＣ、ならびに２’―Ｆ  Ｇを含む転写混合物は「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、およびＣ、ならびにデオキシＧを含む転写混合物は「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡ、ならびに２’―ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む転写混合物は「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＨ  Ａならびに２’―ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む転写混合物は「ｒＡｍＢ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＡｍＢ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＨアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸およびデオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸を含む転写混合物はｒＲｄＹ混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＲｄＹ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、ＵまたはＴ、およびＧ、ならびにデオキシＣを含む転写混合物は「ｄＣｍＤ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＣｍＤ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｇ、およびＣ、ならびにデオキシＴを含む転写混合物は「ｄＴｍＶ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＴｍＶ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、およびＧ、ならびに２’―ＯＨ  Ｕを含む転写混合物は「ｒＵｍＶ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＵｍＶ」アプタマーと呼ばれる。２’―ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、およびＧ、ならびに２’―デオキシＵを含む転写混合物は「ｄＵｍＶ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＵｍＶ」アプタマーと呼ばれる。全２’―ＯＨのヌクレオチドを含む転写混合物は「ｒＮ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｒＮ」、「ｒＲｒＹ」またはＲＮＡアプタマーと呼ばれ、全デオキシヌクレオチドを含む転写混合物は「ｄＮ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは「ｄＮ」または「ｄＲｄＹ」またはＤＮＡアプタマーと呼ばれる。
【００９１】
２’―修飾オリゴヌクレオチドは、完全に修飾ヌクレオチドから、または修飾ヌクレオチドのサブセットから合成できる。全てのヌクレオチドが修飾され、全てが同じ修飾を含みうる。全てのヌクレオチドが修飾されるが、異なる修飾を含みうる。例えば、同じ塩基を含む全てのヌクレオチドが、一つのタイプの修飾を有し、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なるタイプの修飾を有しうる。全てのプリンヌクレオチドは、一つのタイプの修飾を有し（または修飾されず）、全てのピリミジンヌクレオチドは別の、異なるタイプの修飾を有しうる（または修飾されない）。この様式で、例えばリボヌクレオチド（２’―ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’―デオキシ）、２’―Ｆ、および２’―ＯＭｅヌクレオチドを含め、任意の修飾の組み合わせを用いて、転写産物または転写産物のプールが生成される。さらに、修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合（例えばホスホロチオエート）および糖（例えば２’―ＯＭｅ）および塩基（例えばイノシン）での修飾等、同時に二つ以上の修飾をもつヌクレオチドを含みうる。別の実施形態においては、同時に二つ以上の修飾をもつヌクレオチドは、例えば２’―ＯＭｅ修飾および側鎖修飾を核酸塩基の位置で含む。
【００９２】
転写条件
２’―修飾ＳＥＬＥＸ（商標）法の転写条件に、多数の因子が重要であると決定されている。２’修飾、特に２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む転写混合物による転写条件のために記載される因子は、２’修飾および側鎖核酸塩基修飾ヌクレオチド三リン酸を含む転写混合物による本発明の転写方法と関連しても用いられる。本発明に用いられる側鎖修飾ヌクレオチド三リン酸が、説明されている。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｖａｕｇｈｔ  ＪＤ，Ｄｅｗｅｙ  Ｔ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００４；１２６：１１２３１―１１２３７；Ｎｉｅｕｗｌａｎｄｔ  Ｄ，Ｗｅｓｔ  Ｍ，Ｃｈｅｎｇ  Ｘ，Ｋｉｒｓｈｅｎｈｅｕtｅｒ  Ｇ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，４，６５１―６５４；Ｉｔｏ  Ｔ，Ｕｅｎｏ  Ｙ，Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３；３１，２５１４―２５２３；Ｄｅｗｅｙ，ＴＭ，Ｍｕｎｄｔ，ＡＡ，Ｃｒｏｕｃｈ，ＧＪ，Ｚｙｚｎｉｅｗｙｓｋｉ，ＭＣ，Ｅａｔｏｎ，ＢＥ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９５，１１７，８４７４―８４７５；Ｊａｇｅｒ  Ｓ，Ｒａｓｃｈｅｄ  Ｇ，Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈ―Ｌｅｓｈｅｍ  Ｈ，Ｅｎｇｅｓｅｒ  Ｍ，Ｔｈｕｍ  Ｏ，Ｆａｍｕｌｏｋ  Ｍ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５，１２７，１５０７１―１５０８２；Ｔａｒａｓｏｗ  ＴＭ，Ｔａｒａｓｏｗ  ＳＬ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７，３８９，５４―５７；Ｌｉｕ  Ｄ，Ｇｕｇｌｉｏｔｔｉ  ＬＡ，Ｗｕ  Ｔ，Ｄｏｌｓｋａ  Ｍ，Ｔｋａｃｈｅｎｋｏ  ＡＧ，Ｓｈｉｐｔｏｎ  ＭＫ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ，Ｆｅｌｄｈｅｉｍ  ＤＬ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００６，２２，５８６２―５８６６；Ｇｕｇｌｉｏｔｔｉ  ＬＡ，Ｆｅｌｄｈｅｉｍ  ＤＬ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５，１２７，１７８１４―１７８１８；Ｇｕｇｌｉｏｔｔｉ  ＬＡ，Ｆｅｌｄｈｅｉｍ  ＤＬ，Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４，３０４，８５０―８５２；Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｈａｎａｗａ  Ｋ，Ｏｈｓａｗａ  Ｋ，Ｋｉｔａｇａｔａ  Ｒ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６，１４，２５１８―２５２６；Ｓａｉｔｏｈ  Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．２００２，２，２１５―２１６；Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｏｈｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｈａｎａｗａ  Ｋ，Ｓｈｏｊｉ  Ａ，Ｏｚａｋｉ  ＡＮ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．２００２，２，８３―８４．Ｍｅｈｅｄｉ  Ｍａｓｕｄ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ―Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，４，５８４―５４８；Ｍａｓｕｄ  ＭＭ，Ｏｚａｋｉ―Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｓａｔｏｕ  Ｆ，Ｏｈｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．２００１；（ｌ）：２１―２；Ｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｍａｓｕｄ  ＭＭ，Ｏｚａｋｉ  ＡＮ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｋｕｗａｈａ��ａ  Ｍ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００２，１２，１１６７―７０；Ｓａｗａｉ  Ｈ，Ｏｚａｋｉ―Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｍｉｎｅ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ．．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００２，２，３０９―３１６；Ｏｈｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｋａｓａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｓａｗａｉ  Ｈ  Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５，３，２４６３―２４６８；Ｓｈｏｊｉ  Ａ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｔ，Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｏｃｔ  ２８；［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｊ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｋｉｔａｇａｔａ  Ｒ，Ｈａｎａｗａ  Ｋ，Ｈｏｓｏｓｈｉｍａ  Ｓ，Ｋａｓａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６，３４，５３８３―５３９４；Ｉｔｏ  Ｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．９９７，３７，２５９―２６０；Ｓｃｈｏｅｔｚａｕ  Ｔ，Ｌａｎｇｎｅｒ  Ｊ，Ｍｏｙｒｏｕｄ  Ｅ，Ｒｏｅｈｌ  Ｉ，Ｖｏｎｈｏｆｆ  Ｓ，Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００３，５，９１９―９２６；Ｍｅｈｅｄｉ  Ｍａｓｕｄ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ―Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ，Ｏｚａｋｉ  Ｈ，Ｓａｗａｉ  Ｈ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，４，５８４―５８８；およびＥｂａｒａ  Ｙ，Ｋａｉｈａｔｓｕ  Ｋ，Ｕｅｊｉ  Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．１９９９，４２，１７５―１７６を参照。
【００９３】
例えば、特定のリーダー配列／変異ポリメラーゼの組み合わせが使用されるいくつかの条件下で、修飾転写産物の収率の増加が観察できる。リーダー配列は、ＤＮＡ転写テンプレートの５’末端の固定配列の３’末端に導入されうる配列である。リーダー配列は典型的に、６〜１５ヌクレオチド長であり、所定のヌクレオチド組成により構成され、例えば全てプリンであるか、プリンおよびピリミジンヌクレオチドの特定の混合物でありうる。
【００９４】
特にＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒと組み合わせて、本発明の変異ポリメラーゼおよび転写条件とともに使用されうるテンプレートの例は、ＡＲＣ２１１８（配列番号７）、ＡＲＣ２１１９（配列番号３１）、および以下の実施例に示されるとおりである。これらの変異ポリメラーゼとともに使用されるテンプレートのリーダー配列は、選択的である。
【００９５】
さらに、２’―ＯＨ  ＧＴＰの存在は、修飾ヌクレオチドを導入した転写産物を得る上で歴史的に重要な因子となっている。転写は、二相に分割されうる：第一相は開始であり、その間に、ＮＴＰがＧＴＰ（または別の置換グアノシン）の３’―末端に加えられて、ジヌクレオチドが得られ、これが約１０〜１２ヌクレオチド延長される；第二相は伸長であり、その間に、転写が最初の約１０〜１２ヌクレオチドの添加を越えて進む。Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ変異またはＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む転写混合物に加えられた少量の２’―ＯＨ  ＧＴＰおよび過量の２’ＯＭｅ  ＧＴＰが、ポリメラーゼによる２’―ＯＨ  ＧＴＰを用いた転写の開始を可能にするために十分であることが以前に分かった（また、２’―ＯＨ  ＧＴＰを伴わない場合よりも高い、２’―ＯＭｅを含む転写産物の転写収率をもたらした）が、転写が伸長相に入ると、２’―ＯＭｅおよび２’―ＯＨ  ＧＴＰの間の選別の減少、および２’―ＯＨ  ＧＴＰに対する過量の２’ＯＭｅ  ＧＴＰにより、主に２’―ＯＭｅ  ＧＴＰの導入が許容される。
【００９６】
本発明は、ＧＴＰが開始ヌクレオチドを除いて２’―ＯＭｅである転写産物をもたらす、高収率の２’―ＯＭｅ転写のために転写混合物において２’―ＯＨ  ＧＴＰを必要としない変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７Ｓ４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒを提供する。一実施形態において、高収率は、平均して投入転写テンプレートにつき少なくとも一つの転写産物である。
【００９７】
転写産物への２’―ＯＭｅ置換ヌクレオチドの導入における別の因子は、転写混合物における二価マグネシウムおよびマンガン（Ｍｎ２＋）の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の異なる組み合わせが、２―’Ｏ―メチル化転写産物の収率に影響することがわかっており、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最良の濃度は、二価金属イオンと複合体を形成する転写反応混合物中のＮＴＰｓの濃度に依存する。全て２―’Ｏ―メチル化された転写産物（すなわち全２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチド）の最も高い収率を得るためには、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在するときには、約５ｍＭの濃度の塩化マグネシウムおよび約１．５ｍＭの濃度の塩化マンガンが好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭであるときには、約６．５ｍＭの濃度の塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭの濃度の塩化マンガンが好ましい。各ＮＴＰが１．５ｍＭの濃度で存在するときには、約８ｍＭの濃度の塩化マグネシウムおよび３．０ｍＭの濃度の塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭであるときには、約９．５ｍＭの濃度の塩化マグネシウムおよび３．０ｍＭの濃度の塩化マンガンが好ましい。いずれのケースにおいても、これらの濃度からの最大二倍の逸脱は、なお有意な量の修飾転写産物を与える。
【００９８】
２’―ＯＨ  ＧＭＰ、グアノシン、または２’―ＯＨ糖位以外の位置で置換された他の２’―ＯＨグアノシンを転写に入れることも、２’―ＯＨ  ＧＴＰを含まない転写混合物に重要である。この効果は、開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性から生じる。その結果、この様式で生成される任意の転写産物の５’―末端ヌクレオチドは、２’―ＯＨグアノシン（２’―ＯＨ  Ｇ）である可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、より好ましくは１ｍＭである。ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ―８０００を転写反応物に含むことが、修飾ヌクレオチドの導入を最大化するのに有用であることも分かっている。
【００９９】
転写産物への２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ（１００％）および２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）（「ＭＮＡ」）の最大限の導入のために、以下の条件が使用されうる：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ―８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ３．０ｍＭ、２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）１．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ０．０２５単位／ｍｌ、およびＤＮＡテンプレート。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、好ましくは約５〜５００ｎＭの濃度で存在しうる。
【０１００】
転写産物への２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ（１００％）または２’―ＯＭｅ  ＴＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）および２’―デオキシＣＴＰ（１００％）（「ｄＣｍＤ」）の最大限の導入のために、以下の条件が使用されうる：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ―８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ３．０ｍＭ、２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰまたはＴＴＰ、ＧＴＰ）１．５ｍＭ、２―デオキシＣＴＰ  １．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ０．０２５単位／ｍｌ、およびＤＮＡテンプレート。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、好ましくは約５〜５００ｎＭの濃度で存在しうる。
【０１０１】
転写産物への２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）および２’―デオキシＴＴＰ（１００％）（「ｄＴｍＶ」）の最大限の導入のために、以下の条件が使用されうる：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ―８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）１．５ｍＭ、２―デオキシＴＴＰ  １．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、およびＤＮＡテンプレート。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、好ましくは約５〜５００ｎＭの濃度で存在しうる。
【０１０２】
転写産物への２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）および２’―デオキシＵＴＰ（１００％）（「ｄＵｍＶ」）の最大限の導入のために、以下の条件が使用されうる：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ―８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ３．０ｍＭ、２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）１．５ｍＭ、２―デオキシＵＴＰ  １．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ０．０２５単位／ｍｌ、およびＤＮＡテンプレート。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、好ましくは約５〜５００ｎＭの濃度で存在しうる。
【０１０３】
転写産物への２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ（１００％）、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）および２’―ＯＨ  ＵＴＰ（１００％）（「ｒＵｍＶ」）の最大限の導入のために、以下の条件が使用されうる：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ―８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ３．０ｍＭ、２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）１．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＵＴＰ  １．５ｍＭ、２’―ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡテンプレート２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ０．０２５単位／ｍｌ、およびＤＮＡテンプレート。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、好ましくは約５〜５００ｎＭの濃度で存在しうる。
【０１０４】
選択的に、上述の転写条件で使用されるＤＮＡテンプレートは、両方のテンプレートが同一の条件下で転写されたときに、そのようなリーダー配列を含まないテンプレートに対して転写収率を増加させる、全てプリンのリーダー配列を含む。別の実施形態においては、リーダー配列は、両方が同一の条件下で転写されたときに、そのようなリーダー配列を含まないテンプレートに対して転写収率を増加させる、プリンおよびピリミジンの混合物である。本明細書で使用されるところの、一単位の無機ピロホスファターゼは、ｐＨ７．２および２５℃で一分あたり１．０モルの無機オルトリン酸塩を遊離させる酵素の量として定義される。反応は、約１〜２４時間行われうる。
【０１０５】
各場合においてその後、転写産物が、アプタマーを同定および／または所与の標的に対する結合特異性を有する保存配列を決定するために、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへのインプットに使用されうる。得られる配列はすでに安定化され、ＳＥＬＥＸ（商標）後修飾プロセスからこのステップが除去され、結果的により安定化されたアプタマーが得られる。
【０１０６】
後述するように、２’置換ヌクレオチドを導入した有用な収率の転写産物は、上述の条件以外の条件下で得ることもできる。例えば、上述の転写条件に対する変更には、以下が含まれる。
【０１０７】
ＨＥＰＥＳバッファーの濃度は、０〜１Ｍの範囲でありうる。本発明は、例えばトリス―ヒドロキシメチル―アミノメタンを含む、５〜１０の間のｐＫａを有する他のバッファーの使用も予定する。
【０１０８】
ＤＴＴの濃度は、０〜４００ｍＭの範囲でありうる。本発明の方法は、例えばメルカプトエタノールを含む他の還元剤の使用も提供する。
【０１０９】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は、０〜２０ｍＭの範囲でありうる。
【０１１０】
ＰＥＧ―８０００の濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。本発明の方法は、例えば他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールを含む他の親水性ポリマーの使用も提供する。
【０１１１】
ＴｒｉｔｏｎＸ―１００の濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。本発明の方法は、例えば他のＴｒｉｔｏｎ―Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤を含む他の非イオン性界面活性剤の使用も提供する。
【０１１２】
ＭｇＣｌ２の濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲でありうる。ＭｎＣｌ２の濃度は、０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲でありうる。ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の両方が記載の範囲内になければならず、好ましい実施形態では、ＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２が約１０対約３の比率で存在し、好ましくは、比率は約３〜５：１、より好ましくは比率は約３〜４：１である。
【０１１３】
２’―ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲でありうる。
【０１１４】
デオキシＮＴＰの濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲でありうる。
【０１１５】
２’―ＯＨ  ＮＴＰの濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲でありうる。
【０１１６】
２’―ＯＨ  ＧＴＰの濃度（２’―ＯＭｅ  ＧＴＰが反応混合物中５μＭ〜５ｍＭの範囲である場合）は、０μＭ〜３００μＭの範囲でありうる。好ましい実施形態においては、２’―ＯＨ  ＧＴＰの非存在下（０μＭ）で転写が生じる。
【０１１７】
２’―糖の位置以外の位置で置換された２’―ＯＨ  ＧＭＰ、グアノシンまたは他の２’―ＯＨ  Ｇの濃度は、０〜５ｍＭの範囲でありうる。２’―ＯＨ  ＧＴＰが反応物に含まれない場合は、２’―ＯＨ  ＧＭＰが必要であり、５μＭ〜５ｍＭの範囲でありうる。
【０１１８】
ＤＮＡテンプレートの濃度は、５ｎＭ〜５μＭの範囲でありうる。
【０１１９】
変異ポリメラーゼの濃度は、２ｎＭ〜２０μＭの範囲でありうる。
【０１２０】
無機ピロホスファターゼは、０〜１００単位／ｍｌの範囲でありうる。
【０１２１】
ｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲でありうる。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを導入した大半のポリメラーゼの活性のｐＨの範囲内で実施されうる。
【０１２２】
転写反応は、約一時間〜数週間、好ましくは約１〜約１００時間行われうる。
【０１２３】
さらに、本発明の方法は、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴを含めて、転写反応条件におけるキレート剤の選択的使用を提供する。
【０１２４】
Ａｐｔａｍｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アプタマー医薬品化学）
所望の標的に結合するアプタマーが同定されたら、同定されたアプタマー配列の結合および／または機能的特性をさらに増加させるために、いくつかの技術が選択的に実行されうる。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス（例えば２’―修飾ＳＥＬＥＸ（商標））により同定される所望の標的に結合するアプタマー、例えばＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶ、ｄＵｍＶアプタマーが、所望の結合および／または機能的特性を有する最小のアプタマー配列（本明細書において「最小化コンストラクト」とも称される）を得るために、選択的に切断されうる。これを達成する一つの方法は、最小化コンストラクトのデザインを知るための、フォールディングプログラムおよび配列分析（例えば保存モチーフおよび／または共変動を探すための、選択から得られるクローン配列のアライニング）の使用による。最小化コンストラクトのデザインを知るために、アプタマー配列の５’および３’境界を決定するために、生化学的プロービング実験も行われうる。その後、最小化コンストラクトが化学合成され、それらが得られた非最小化配列と比較して、結合および機能的特性につき試験されうる。一連の５’、３’および／または内部欠損を含むアプタマー配列の変異体も、直接化学合成され、それらが得られた非最小化アプタマー配列と比較して、結合および／または機能的特性につき試験されうる。
【０１２５】
さらに、ドープ再選択を用いて、ＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶアプタマー等の単一の活性アプタマー配列（すなわち、（２’―修飾ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを含むＳＥＬＥＸ（商標）プロセスにより同定される、所望の標的に結合するアプタマー）または単一の最小化アプタマー配列の範囲内の配列要件を調査できる。目的の単一の配列に基づいて設計されている合成の縮重プールを用いて、ドープ再選択が行われる。縮重のレベルは通常、野生型ヌクレオチド、すなわち目的の単一の配列から７０％〜８５％変動する。一般に、中立変異を伴う配列がドープ再選択プロセスにより同定されるが、場合によっては、配列変化が親和性の改善をもたらしうる。そして、ドープ再選択を用いて同定されるクローンからの合成配列情報を用いて、最小結合モチーフを同定し、医薬品化学研究をたすけうる。
【０１２６】
ＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶアプタマー等、（２’―修飾ＳＥＬＥＸプロセスおよびドープ再選択含む）ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを用いて同定されるアプタマー配列および／または最小化アプタマー配列は、配列のランダムまたは定方向突然変異を行って結合親和性および／または機能的特性を高めるため、あるいは配列のどの位置が結合活性および／または機能的特性に必須であるかを決定するために、アプタマー医薬品化学を用いてＳＥＬＥＸ（商標）後選択により選択的に修飾されてもよい。
【０１２７】
アプタマー医薬品化学は、一連の変異アプタマーが化学合成されるアプタマー改善技術である。これらの一連の変異体は典型的に、単一の置換基の導入により親アプタマーと異なり、この置換基の位置により互いに異なる。そして、これらの変異体が互いと親に対して比較される。特性の改善は十分に大きくなりうるため、特定の治療基準を達成するのに、単一の置換基の包含だけで足りうる。
【０１２８】
あるいは、単一の変異体組から収集された情報を用いて、二つ以上の置換基が同時に導入されたさらなる変異体組を設計できる。一つの設計戦略においては、全ての単一置換基の変異体がランク付けされ、トップ４が選択され、これら４つの単一置換基変異体の全ての可能な二重（６）、三重（４）および四重（１）の組み合わせが合成および検定される。第二の設計戦略においては、最良の単一置換基変異体が新しい親と考えられ、この最高ランクの単一置換基変異体を含む全ての可能な二重置換基変異体が合成および検定される。他の戦略が用いられてもよく、さらに改良された変異体の同定を続けながら置換基の数が段階的に増加するように、これらの戦略が繰り返し行われうる。
【０１２９】
アプタマー医薬品化学は特に、全体的でなく局所的な置換基の導入を調査する方法として用いることができる。アプタマーが転写により生成されるライブラリの中に発見されるため、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの間に導入される任意の置換基は、全体的に導入されなければならない。例えば、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を導入することが望ましい場合には、全てのＡ（または全てのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕ等）に導入することしかできない（全体的に置換される）。ホスホロチオエートがいくつかのＡ（またはいくつかのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕ等）（局地的に置換）に必要であるが他のＡでは寛容性がないアプタマーは、このプロセスにより容易に発見できない。
【０１３０】
アプタマー医薬品化学プロセスにより利用されうる置換基の種類は、それらを固相合成試薬として生成し、オリゴマー合成スキームに導入する能力によってのみ制限される。プロセスは、もちろんヌクレオチドだけに限られない。アプタマー医薬品化学スキームには、立体的大きさ、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正電荷、負電荷、中性電荷、双性イオン、分極率、ヌクレアーゼ抵抗性、構造的剛性、構造的柔軟性、タンパク質結合特性、質量等を導入する置換基が含まれうる。アプタマー医薬品化学スキームには、塩基―修飾、糖―修飾またはホスホジエステル結合―修飾が含まれうる。
【０１３１】
治療用アプタマーの文脈で有益となりうる置換基の種類を考える際には、以下の一つ以上のカテゴリに入る置換を導入することが望ましい：
（１）すでに体内に存在する置換基、例えば２’―デオキシ、２’―リボ、２’―Ｏ―メチルプリンまたはピリミジンまたは５―メチルシトシン。
【０１３２】
（２）既に承認された治療薬の一部である置換基、例えばホスホロチオエート―結合オリゴヌクレオチド。
【０１３３】
（３）上の二つのカテゴリのうち一つに加水分解または分解する置換基、例えばメチルホスホネート―結合オリゴヌクレオチド。
【０１３４】
本発明のアプタマーは、本明細書に記載されるアプタマー医薬品化学により開発されるアプタマーを含む。
【０１３５】
本発明のアプタマーの標的結合親和性は、アプタマーと標的（例えばタンパク質）の間の一連の結合反応により評価でき、トレース３２Ｐ―標識アプタマーが緩衝培地において標的の希釈系とともにインキュベートされ、その後真空濾過マニホルドを用いてニトロセルロース濾過により分析される。本明細書においてドットブロット結合アッセイと称されるこの方法は、（上から下に）ニトロセルロース、ナイロンフィルタ、およびゲルブロット紙からなる三層濾過媒体を使用する。標的に結合したＲＮＡがニトロセルロースフィルタに捕らえられ、標的に結合していないＲＮＡがナイロンフィルタに捕らえられる。ゲルブロット紙は、他のフィルタの支持媒体として含まれる。濾過の後に、濾過層が分離され、乾燥させられて蛍光スクリーンに曝露され、リン光画像化システムを使用して定量される。定量結果を用いてアプタマー結合曲線を生成でき、そこから解離定数（ＫＤ）を計算できる。好ましい実施形態においては、結合反応を実行するために用いられる緩衝培地は、１Ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋）と０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡである。
【０１３６】
一般に、標的の機能的活性を調節するアプタマーの能力、すなわちアプタマーの機能的活性は、標的の生物学的機能に応じたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して評価できる。いくつかの実施形態においては、本発明のアプタマーは、標的の公知の生物学的機能を阻害でき、他の実施形態では、本発明のアプタマーは、標的の公知の生物学的機能を刺激しうる。アプタマー標的の公知の機能を測定するために設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して、本発明のアプタマーの機能的活性を評価できる。
【０１３７】
本発明のアプタマーは、当業者により用いられる任意の数の技術により、診断目的にルーチン的に採用されうる。診断への利用には、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の診断用途が含まれうる。診断薬は、利用者が特定の場所または濃度での所与の標的の存在を同定することを可能にするだけで足りる。単に標的と結合対を形成する能力が、診断目的でプラスのシグナルを誘発するために十分でありうる。当業者は、そのようなリガンドの存在を追跡するために標識タグを導入するために、公知技術の方法により任意のアプタマーを適応させることもできる。そのようなタグは、多数の診断法において用いられうる。
【０１３８】
免疫賦活性モチーフを有するアプタマー
脊椎動物の免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、特定の配列コンテキストにおける非メチル化ＣＧジヌクレオチドの認識に基づく（「ＣｐＧモチーフ」）。このようなモチーフを認識する一つのレセプターは、異なる微生物成分を認識することにより先天性の免疫反応に関与するＴｏｌｌ―ｌｉｋｅレセプター（〜１０メンバー）のファミリーのメンバー、Ｔｏｌｌ―ｌｉｋｅレセプター９（「ＴＬＲ９」）である。ＴＬＲ９は、非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列を配列特異的様式で結合する。ＣｐＧのモチーフの認識が防御機構を誘発し、先天性および最終的に後天性の免疫反応につながる。例えばマウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、および重要な共刺激分子およびＩＬ―１２およびＩＬ―２３を含むサイトカインの発現を誘導する。この活性化は、ＴＨ１サイトカインＩＦＮ―ガンマの強いアップレギュレーションを含めて、直接および間接的にＢおよびＴ細胞反応を増強する。ＣｐＧ配列に対する反応は、集合的に、感染症からの保護、ワクチンに対する免疫反応の改善、喘息に対する有効な反応、および抗体依存―細胞媒介細胞傷害の改善につながる。したがって、ＣｐＧ  ＯＤＮｓは、感染症からの保護を提供し、免疫アジュバントまたは癌治療薬（単独療法またはｍＡｂや他の療法と組み合わせて）として機能し、喘息およびアレルギー反応を減少させうる。
【０１３９】
本発明のアプタマー、例えばＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶアプタマーは、一つ以上のＣｐＧまたは他の免疫賦活性配列を含みうる。このようなアプタマーは、例えば本明細書に説明されるＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを用いて、様々な戦略により同定または生成されうる。一般に、戦略は二つの群に分けられうる。群一においては、戦略は、標的のための結合部位ならびにＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列の両方を含むアプタマーを同定または生成することを目指し、標的（以下「非ＣｐＧ標的」）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列を認識することが知られており、ＣｐＧモチーフに結合するときに免疫反応を刺激することが知られているもの以外の標的である。この群の第一戦略は、ＣｐＧモチーフが固定領域またはその一部としてプールの各メンバーに導入されているオリゴヌクレオチドプールを用いて（例えば、いくつかの実施形態においては、プールメンバーのランダム化領域が、ＣｐＧモチーフが導入された固定領域を含む）、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って特異的非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得るステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第二戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは標的に対するアプタマーを得、選択の後ＣｐＧモチーフを５’および／または３’末端に加えるかＣｐＧモチーフをアプタマーの領域、好ましくは非必須領域に組み込むステップを含む。この群の第三の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って特異的非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得るステップであり、プールの合成の間に、プールの各メンバーのランダム化領域のＣｐＧモチーフが濃縮されるように、一つ以上のヌクレオチド添加ステップにおいて様々なヌクレオチドのモル比が偏らせられる、ステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第四の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って特異的非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得るステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第五の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って特異的非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得るステップと、結合時に免疫反応を刺激するがＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定するステップを含む。
【０１４０】
群二においては、戦略は、ＣｐＧモチーフのレセプター（例えばＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ―ｌｉｋｅレセプター）により結合され、結合時に免疫反応を刺激する、ＣｐＧモチーフおよび／または他の配列を含むアプタマーの同定または生成を目指す。この群の第一戦略は、ＣｐＧモチーフがプールの各メンバーに、固定領域またはその一部として導入されているオリゴヌクレオチドプールを用いて（例えばいくつかの実施形態においては、プールメンバーのランダム化領域は、ＣｐＧモチーフが導入された固定領域を含む）、ＳＥＬＥＸ（商標）を行ってＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、結合時に免疫反応を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第二戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、結合時に免疫反応を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得てから、ＣｐＧモチーフを５’および／または３’末端に加えるかＣｐＧモチーフをアプタマーの領域、好ましくは非必須領域に組み込むステップを含む。この群の第三の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、結合時に免疫反応を刺激することが分かっている標的に対するアプタマーを得るステップであり、プールの合成の間に、プールの各メンバーのランダム化された領域がＣｐＧモチーフにおいて濃縮されるように、一つ以上のヌクレオチド添加ステップにおいて様々なヌクレオチドのモル比が偏らせられるステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第四の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合し、結合時に免疫反応を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得るステップと、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定するステップを含む。この群の第五の戦略は、ＳＥＬＥＸ（商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫賦活性配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーを得るステップと、結合時に免疫反応を刺激するがＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定するステップを含む。
【０１４１】
各々が異なるイベントのカスケードにおける認識、サイトカインおよび他の分子の放出、一定の細胞型の活性化により生じる、多様なＣｐＧモチーフのクラスが同定されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９―７６０を参照。追加的な免疫賦活性モチーフは、参照により各々が本明細書に組み込まれる以下の米国特許において開示される：米国特許第６，２０７，６４６号；第６，２３９，１１６号；第６，４２９，１９９号；第６，２１４，８０６号；第６，６５３，２９２；第６，４２６，４３４号；第６，５１４，９４８号および第６，４９８，１４８号。これらのＣｐＧまたは他の免疫賦活性モチーフが、アプタマーに導入されうる。アプタマーの選択は、治療される病気または疾患に依存する。好ましい免疫賦活性モチーフは以下の通りであり（左から右に５’から３’で示される）、「ｒ」がプリンを表わし、「ｙ」はピリミジンを表わし、「Ｘ」は任意のヌクレオチドを表わす：
【０１４２】
【化３−２】
2011504357.tif 000005
，ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ，ＸＣＧＸ，ＸＸＣＧＸＸ，およびＸ１がＧまたはＡであり、Ｘ２がＣでなく、Ｙ１がＧでなく、Ｙ２が好ましくはＴであるＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２。
【０１４３】
ＣｐＧモチーフに結合し、結合時に免疫反応を刺激することが知られている標的以外の特異的標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合するアプタマーにＣｐＧモチーフが導入される場合においては、ＣｐＧは、アプタマーの非必須領域に位置するのが好ましい。アプタマーの非必須領域は、部位特異的変異誘発、欠失分析および／または置換分析により同定されうる。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力を大きく妨げない任意の位置が使用されうる。ＣｐＧモチーフは、アプタマー配列に埋め込まれるのに加えて、５’および３’末端のいずれかまたは両方に加えられるなど、アプタマーに付着されうる。非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力が大きく妨げられない限り、任意の付着の位置または手段が使用されうる。
【０１４４】
本明細書で使用されるところの、「免疫反応の刺激」は、（１）特異的反応（例えばＴｈ１反応の誘発）または一定の分子の産生の誘発、または（２）特異的反応（例えばＴｈ２反応の阻害または抑制）または一定の分子の阻害または抑制を意味しうる。
【０１４５】
アプタマー治療薬の薬物動態および体内分布の調節
アプタマーを含む全てのオリゴヌクレオチドベースの治療薬の薬物動態学的特性が、所望の薬学的用途に適合するように調整されることが重要である。細胞外標的に対するアプタマーには（アンチセンスおよびＲＮＡｉベースの治療薬の場合のように）細胞内送達と関連した問題がないが、このようなアプタマーはなお、標的器官および組織に分布され、所望の薬剤投与計画と整合した一定期間体内にとどまることが可能でなければならない。
【０１４６】
したがって、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態、および、特にアプタマー薬物動態を調整する能力に影響を及ぼすための、材料および方法を提供する。アプタマー薬物動態の調整可能性（すなわち調節の可能性）は、アプタマーに対する修飾部分（例えばＰＥＧポリマー）の結合および／または修飾ヌクレオチド（例えば２’―フルオロまたは２’―Ｏ―メチル）の導入により核酸の化学組成を変更することにより達成される。アプタマー薬物動態の調整可能性は、既存の治療的応用の改善、あるいは新しい治療用途の開発において用いられる。例えば、迅速な薬物クリアランスまたはターンオフが求められうる抗腫瘍または救急処置の場合等、いくつかの治療用途においては、循環中のアプタマーの滞留時間を減少させることが望ましい。あるいは、他の治療用途、例えば治療薬の全身循環が求められる維持療法においては、循環中のアプタマーの滞留時間を増加させることが望まれうる。
【０１４７】
さらに、アプタマー薬物動態の調整可能性は、対象におけるアプタマー治療薬の生体分布を改変するために用いられる。例えば、いくつかの治療用途においては、特定のタイプの組織または特定の臓器（または一連の臓器）を標的とする努力においてアプタマー治療薬の生体分布を変更することが望まれうる。これらの用途においては、アプタマー治療薬は、優先的に特定の組織または臓器（単数または複数）に蓄積する。他の治療用途においては、アプタマー治療薬が患部組織に優先的に蓄積するように、所与の病気、細胞傷害または他の異常な症状と関連した細胞マーカまたは症状を示す組織を標的とすることが望まれうる。例えば、２００４年３月５日に出願の、“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”と題した米国特許仮出願第６０／５５０７９０号、および２００５年３月７日に出願の、“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”と題した米国特許出願第１０／―――，―――号に記載されるように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば２０ｋＤａのＰＥＧポリマーによるＰＥＧ化）が、ＰＥＧ化されたアプタマー治療薬が炎症組織に優先的に蓄積するように、炎症組織の標的化に使用される。
【０１４８】
アプタマー治療薬（例えばアプタマー結合体または修飾ヌクレオチド等、化学的に変更されたアプタマー）の薬物動態学的および生体分布プロフィールを決定するために、様々なパラメータがモニタされる。このようなパラメータには、例えば半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布体積（Ｖｓｓ）、濃度―時間曲線下面積（ＡＵＣ）、血清または血しょう中濃度の最大値（Ｃｍａｘ）の観察、およびアプタマー組成物の平均滞留時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書において使用されるところの「ＡＵＣ」という用語は、アプタマー投与後の時間に対するアプタマー治療薬の血しょう中濃度のプロット下の面積を指す。ＡＵＣ値を用いて、所与のアプタマー治療薬の生物学的利用能（すなわちアプタマー投与後の循環中の投与アプタマー治療薬の割合）および／または総クリアランス（Ｃｌ）（すなわちアプタマー治療薬が循環から除去される速度）が推定される。分布体積は、アプタマー治療薬の血しょう中濃度を体内に存在するアプタマーの量に関連させる。Ｖｓｓが大きいほど、アプタマーが血漿外でより多く見られる（すなわち血管外遊出が多い）。
【０１４９】
本発明は、アプタマー、例えばＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶアプタマーを小分子、ペプチドまたはポリマー末端基等の調節部分に結合することにより、または修飾ヌクレオチドをアプタマーに導入することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで、安定化されたアプタマー組成物、例えばＭＮＡ、ｄＣｍＤ、ｄＴｍＶ、ｒＵｍＶまたはｄＵｍＶアプタマーの薬物動態および生体分布を、制御された様式で調節する材料および方法を提供する。本明細書に記載されるように、修飾部分の結合および／またはヌクレオチド（単数または複数）化学組成の変更は、循環におけるアプタマー滞留時間および組織への分布の基本的側面を変更する。
【０１５０】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療薬は、腎臓の濾過により除去される。そのようなものとして、静脈内投与されるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、濾過を遮断できない限り、典型的に＜１０分のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期をもつ。これは、血流から組織への迅速分布を促進すること、またはオリゴヌクレオチドの見掛けの分子量を糸球体の有効なカットオフサイズより上に増加させることにより達成できる。後述されるＰＥＧポリマーに対する小さな治療薬の結合（ＰＥＧ化）は、循環中のアプタマーの滞留時間を劇的に延長し、これにより投与頻度を減少させ、血管標的に対する有効性を高めうる。
【０１５１】
アプタマーは、高分子量ポリマー、例えばＰＥＧ；ペプチド、例えばＴａｔ（ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質の１３―アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓ等（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０―７））、Ａｎｔ（ショウジョウバエアンテナペディアホメオチックタンパク質の第三のらせんに由来する１６―アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ等（２００１），Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１―１２）：１３９７―４０５））およびＡｒｇ７（ポリアルギニン（Ａｒｇ７）で構成される短い正に帯電する細胞浸透ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ等（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３―７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ等（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２―８））；および小分子、例えばコレステロール等の脂肪親和性化合物等、様々な修飾部分に結合されうる。本明細書に説明される様々な結合体の中で、アプタマーのｉｎ  ｖｉｖｏ特性は、ＰＥＧ基との錯体形成により最も大きく変更される。例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの、混合２’Ｆおよび２’―ＯＭｅ修飾アプタマー治療薬の錯体化は、腎臓濾過を妨げ、健常および炎症組織へのアプタマー分布を促進する。さらに、２０ｋＤａのＰＥＧポリマー―アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を防止する上で、４０ｋＤａのＰＥＧポリマーとほぼ同じくらい有効である。ＰＥＧ化の一つの効果はアプタマークリアランスにあるが、２０ｋＤａ部分の存在により生じる全身的曝露の延長により、組織、特に高灌流臓器および炎症部位の組織へのアプタマーの分布も促進される。アプタマー―２０ｋＤａＰＥＧポリマー結合体は、ＰＥＧ化されたアプタマーが炎症組織に優先的に蓄積するように、アプタマー分布を炎症部位に導く。いくつかの場合には、２０ｋＤａのＰＥＧ化アプタマー結合体は、例えば腎臓細胞等の細胞の内部にアクセスできる。
【０１５２】
修飾ヌクレオチドを用いて、アプタマーの血漿クリアランスを調節することもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いヌクレアーゼ安定性をもつために現世代のアプタマーに典型的である、２’―Ｆおよび２’―ＯＭｅ安定化化学を導入する非結合アプタマーは、非修飾アプタマーと比較して、血漿からの迅速な減少（すなわち迅速な血漿クリアランス）、および組織、主に腎臓への迅速な分布を示す。
【０１５３】
ＰＥＧ誘導体化核酸
上述の通り、高分子量の非免疫原性ポリマーによる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的および薬力学的特性を変更し、それらをより有効な治療剤とする可能性を有する。活性の好ましい変化には、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗の増加、腎臓による濾過の減少、免疫系に対する曝露の減少、および治療薬の体内分布の変更を含みうる。
【０１５４】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分により誘導体化されうる。ＰＡＧ―誘導体化核酸の例は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２００３年１１月２１日に出願の米国特許出願第１０／７１８，８３３号に見られる。本発明で使用される典型的なポリマーには、ポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）としても知られるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が含まれる。さらに、異なるアルキレンオキシド（例えばエチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のランダムまたはブロックコポリマーが、多くの用途において使用されうる。その最も一般的な形において、ＰＥＧ等のポリアルキレングリコールは、各末端でヒドロキシル基で終了する直鎖状ポリマーである：ＨＯ―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ―ＣＨ２ＣＨ２―ＯＨ。このポリマー、アルファ―、オメガ―ジヒドロキシルポリエチレングリコールは、ＨＯ―ＰＥＧ―ＯＨとしても表わすことができ、―ＰＥＧ―記号は以下の構造単位を表すと理解され：―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ―ＣＨ２ＣＨ２―、ｎが典型的に約４〜約１０，０００の範囲である。
【０１５５】
示されるように、ＰＥＧ分子は二機能であり、「ＰＥＧジオール」と呼ばれることもある。ＰＥＧ分子の終末部は、化合物の反応部位における他の化合物に対するＰＥＧの付着のために、活性化または機能的部分に転換されうる、比較的非反応性のヒドロキシ部分、―ＯＨ基である。このような活性化されたＰＥＧジオールは、本明細書において二活性化されたＰＥＧｓと称される。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、アミノ部分との選択反応のために、比較的非反応性のヒドロキシ部分、―ＯＨを、Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドからのスクシンイミジル活性エステル部分と置換することにより、活性カルボネートエステルとして官能化されている。
【０１５６】
多くの用途においては、ＰＥＧ分子が単官能性（または単活性化）であるように、一端のＰＥＧ分子を本質的に非反応性の部分でキャップすることが望ましい。一般に活性化ＰＥＧｓのための複数の反応位置をもつタンパク質治療薬の場合には、二官能性の活性化ＰＥＧｓは広範な架橋に至り、機能性が低い凝集物を生成する。単活性化ＰＥＧｓを生成するために、ＰＥＧジオール分子の末端上の一つのヒドロキシ部分が、典型的に非反応性メトキシ末端部分、―ＯＣＨ３と置換される。ＰＥＧ分子の他方のキャップされていない末端は、典型的に、表面またはタンパク質等の分子上の反応部位における付着のために活性化されうる反応性末端部分に転換される。
【０１５７】
ＰＡＧｓは、水および多くの有機溶媒中における溶解性、無毒性、および非免疫原性の性質を典型的に有するポリマーである。ＰＡＧｓの一つの使用は、ポリマーを不溶性分子に共有結合させて、得られるＰＡＧ―分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧに連結されると水溶性になることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１―３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体は、溶解性および安定性を高めるためだけでなく、分子の血液循環半減期を延長するためにも用いられることが多い。
【０１５８】
本発明のポリアルキル化化合物は、典型的には５〜８０ｋＤａのサイズであるが、任意のサイズを使用でき、その選択はアプタマーおよび用途に依存する。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０〜８０ｋＤａのサイズである。本発明のさらに他のＰＡＧ化合物は、１０〜６０ｋＤａのサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズでありうる。このようなポリマーは直鎖状または分枝ポリマーでありうる。いくつかの実施形態においては、ポリマーは、ＰＥＧである。
【０１５９】
生物学的に発現されたタンパク質治療薬に対して、核酸治療薬は典型的に、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。同じ反復的モノマー合成を用いてＰＥＧを導入することにより、ＰＥＧ―核酸結合体が調製されうる。例えば、ホスホラミダイト形態への変換により活性化されたＰＥＧｓが、固相オリゴヌクレオチド合成に導入されうる。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ付着部位の部位特異的導入により完了されうる。最も一般的には、これは、５’―末端における遊離一級アミンの添加により達成されている（固相合成の最後のカップリングステップにおいて修飾因子ホスホラミダイトを用いて導入される）。このアプローチを用いて、反応性ＰＥＧ（例えば、反応してアミンと結合を形成するように活性化されたもの）が精製オリゴヌクレオチドと組み合わせられ、溶液中で共役反応が行われる。
【０１６０】
治療薬の生体分布を変更するＰＥＧ結合の能力は、結合体の見掛け上のサイズ（例えば流体力学的半径に関して測定される）を含む、多数のファクターに関連する。より大きな結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介した濾過をより効果的に遮断し、その結果小さな高分子（例えばペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血中半減期を増加させることが知られている。濾過を遮断するＰＥＧ結合体の能力は、約５０ｋＤａまでのＰＥＧのサイズとともに増加することが分かっている（半減期が腎臓による除去よりマクロファージ媒介性代謝により定められるため、さらなる増加による有益な効果は最小限である）。
【０１６１】
高分子量のＰＥＧｓ（＞１０ｋＤａ）の産生は困難で、非効率的で高価でありうる。高分子量ＰＥＧ―核酸結合体の合成へのルートとして、過去の研究は、より高分子量の活性化ＰＥＧｓの生成に集中している。このような分子を生成する一方法は、活性化された基を担持する中心コアに二つ以上のＰＥＧｓが付着する、分枝した活性化ＰＥＧの形成を伴う。これらの高分子量のＰＥＧ分子の末端部、すなわち比較的非反応性のヒドロキシル（―ＯＨ）部分は、他の化合物に対する化合物上の反応部位における一つ以上のＰＥＧｓの付着のために、活性化または機能的部分に転換されうる。分枝活性化ＰＥＧｓは、二つ以上の末端を有し、二つ以上の末端が活性化されている場合においては、このような活性化された高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書において多活性化ＰＥＧｓと呼ばれる。いくつかの場合には、分岐ＰＥＧ分子の全ての末端が活性化されるわけではない。分岐ＰＥＧ分子の任意の二つの末端が活性化される場合においては、このようなＰＥＧ分子は、二活性化ＰＥＧｓと呼ばれる。分岐ＰＥＧ分子の一つの末端だけが活性化されるいくつかの場合においては、このようなＰＥＧ分子は単活性化と呼ばれる。このアプローチの例として、反応のためにその後活性化される、リシンコアに対する二つのモノメトキシＰＥＧｓの付着により調製される、活性化ＰＥＧが説明されている（Ｈａｒｒｉｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４―２２１，２００３）。
【０１６２】
本発明は、多重ＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ―核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の合成に、別の費用効果的ルートを提供する。本発明は、ＰＥＧ―連結多量体オリゴヌクレオチド、例えば二量体化アプタマーも含む。本発明は、ＰＥＧ安定化部分が、例えばアプタマーの異なる部分を隔てるリンカーである、例えば高分子量アプタマー組成物の線形配置が、例えば、ｎが１以上である核酸―ＰＥＧ―核酸（―ＰＥＧ―核酸）ｎであるように、ＰＥＧが単一のアプタマー配列中に結合されている、高分子量組成物にも関する。
【０１６３】
本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものを含む。組成物は典型的に、１０〜８０ｋＤａのサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズである。
【０１６４】
安定化部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的および薬力学的特性を改善する分子または分子の部分である。いくつかの場合においては、安定化部分は、二つ以上のアプタマーまたはアプタマードメインを近づけるか、本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度の減少を提供する、分子または分子の部分である。安定化部分は、ポリアルキレングリコール、線形または分枝、ホモポリマーまたはヘテロポリマーでありうるようなポリエチレングリコールでありうる。他の安定化部分には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のポリマーが含まれる。オリゴヌクレオチドも安定化部分になりうる；このようなオリゴヌクレオチドには、修飾ヌクレオチド、および／またはホスホロチオエート等の修飾結合を含みうる。安定化部分は、アプタマー組成物の一体的部分、すなわちアプタマーに共有結合された部分でありうる。
【０１６５】
本発明の組成物には、二つ以上の核酸部分が少なくとも一つのポリアルキレングリコール部分に共有結合される、高分子量アプタマー組成物を含む。ポリアルキレングリコール部分は、安定化部分として働く。ポリアルキレングリコールが核酸部分を一つの分子において結合するように、ポリアルキレングリコールがアプタマーのいずれかの末端で共有結合された組成物においては、ポリアルキレングリコール部分は連結部分であると言われる。このような組成物においては、共有結合分子の一次構造には、線形配置の核酸―ＰＡＧ―核酸が含まれる。一つの例は、核酸―ＰＥＧ―核酸の一次構造を有する組成物である。別の例は、線形配置：核酸―ＰＥＧ―核酸―ＰＥＧ―核酸である。
【０１６６】
核酸―ＰＥＧ―核酸結合体を生成するために、核酸が、単一の反応部位を持つように（例えば単活性化）最初に合成される。好ましい実施形態においては、この反応部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成の最終ステップにおける修飾因子ホスホラミダイトの添加により５’―末端に導入されるアミノ基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、それは、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小化する溶液において高濃度で再構築される。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構築された溶液はｐＨ８．３の２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３―バッファー、を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした段階的添加により開始される。好ましい実施形態においては、ＰＥＧジオールが、スクシンイミジルプロピオン酸による誘導体化により、両末端で活性化（二活性化）される。反応の後、完全―、部分―、および非―結合種を分離するために、ＰＥＧ―核酸結合体が、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィにより精製される。（例えばランダムまたはブロックコポリマーとして）連結された複数のＰＡＧ分子または小さなＰＡＧ鎖が連結されて、様々な長さ（または分子量）が達成されうる。様々な長さのＰＡＧ鎖の間に、非ＰＡＧリンカーが使用されうる。
【０１６７】
２’―Ｏ―メチル、２’―フルオロおよび他の修飾ヌクレオチド修飾は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化し、そのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させる。３’―３’―ｄＴキャップも、エキソヌクレアーゼ抵抗を増加させる。例えば、参照により各々が全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６７４，６８５号；第５，６６８，２６４号；第６，２０７，８１６号；および第６，２２９，００２号を参照。
【０１６８】
反応性核酸のＰＡＧ―誘導体化
高分子量ＰＡＧ―核酸―ＰＡＧ結合体は、二つ以上の反応部位を含む核酸と単官能性活性化ＰＥＧの反応により調製されうる。一実施形態においては、核酸は二反応性または二活性化され、二つの反応部位：従来のホスホラミダイト合成によりオリゴヌクレオチドに導入された５’―アミノ基および３’―アミノ基、例えば図２に示されるような３’―５’―ジ―ＰＥＧ化を含む。代替的実施形態では、例えばピリミジンの５―位、プリンの８―位またはリボースの２’―位を一級アミンの付着のための部位として用いて、内部の位置に反応部位が導入されうる。このような実施形態においては、核酸がいくつかの活性化または反応性部位を有することができ、多重活性化されていると言われる。合成および精製の後、修飾オリゴヌクレオチドは、自発的加水分解を最小化しながら、オリゴヌクレオチド反応部位との選択反応を促進する条件下で、単活性化ＰＥＧと組み合わせられる。好ましい実施形態においては、モノメトキシ―ＰＥＧがスクシンイミジルプロピオン酸で活性化され、ｐＨ８．３で共役反応が行われる。二置換ＰＥＧの合成を誘発するために、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的過剰のＰＥＧが提供される。反応の後、完全、部分的、および非結合種を分離するために、ＰＥＧ―核酸結合体がゲル電気泳動または液体クロマトグラフィにより精製される。
【０１６９】
連結ドメインは、それに付着した一つ以上のポリアルキレングリコール部分も有しうる。このようなＰＡＧｓは、様々な長さであり得、組成物の所望の分子量を達成するために、適切な組み合わせにおいて用いられうる。
【０１７０】
特定のリンカーの効果は、その化学組成および長さの両方により影響されうる。長すぎる、短すぎる、または標的と好適でない立体化学的および／またはイオン相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと標的の間の複合体形成を妨げる。核酸の間の距離をつなぐのに必要であるより長いリンカーは、リガンドの有効濃度を減ずることにより、結合安定性を減じうる。したがって、標的に対するアプタマーの親和性を最大化するために、リンカー組成物および長さを最適化することが必要である場合が多い。
【０１７１】
本明細書にあげられる全ての刊行物および特許文献は、そのような刊行物および文献の各々が特に個々に参照により本明細書に組み込まれるものと示されるのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、いずれかが関連する従来技術であるとの承認を意図するものでなく、内容または同の日付に関するいかなる承認も構成しない。以上本発明を記述してきたが、当業者には当然のことながら、本発明は様々な実施形態において実施でき、以上の記載および以下の実施例は説明を目的としたものであり、後続の請求の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１７２】
（実施例１）ポリメラーゼ発現および精製
本発明の方法に用いられる変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、以下のように調製されうる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示され、Ｂｕｌｌ，Ｊ．Ｊ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，５７（３），２４１―２４８（２００３）に記載される核酸およびアミノ酸配列を変異させて、ＬＡ変異体（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）、ＬＡＲ変異体（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ＬＬＡ変異体（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）またはＬＬＡＲ変異体Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を生じうる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、発現ベクター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターの例が、参照により全体として本明細書組み込まれるに米国特許出願第５，８６９，３２０号に記載される）に含まれ、または変異誘発後に発現ベクターに挿入されうる。変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、タンパク質精製の間の容易性のためにＨｉｓ―ｔａｇを選択的に含むために、操作されうる。
【０１７３】
６３９位のロイシンの変異を含む相補的オリゴヌクレオチド配列
【０１７４】
【化３−３】
2011504357.tif 000006
が、合成されうる。Ｐ２６６Ｌ変異のための相補的オリゴヌクレオチド配列
【０１７５】
【化３−４】
2011504357.tif 000007
が、合成されうる。Ｈ７８４Ａ変異のための相補的オリゴヌクレオチド配列
【０１７６】
【化３−５】
2011504357.tif 000008
が、合成されうる。Ｋ３７８Ｒ変異のための相補的オリゴヌクレオチド配列
【０１７７】
【化３−６】
2011504357.tif 000009
が、合成されうる。部位特異的変異誘発が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ―Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて、製造者の指示に従って実行されて、上述の変異の組み合わせをもつ変異ポリメラーゼをコードする核酸配列（図４）を生じうる。本発明の変異ポリメラーゼをコードする得られた核酸配列が、発現および精製のための標準的な技術を用いて、所望の発現ベクターに挿入されうる。
【０１７８】
発現および精製
変異Ｔ７ポリメラーゼ核酸配列を含む発現ベクターは、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）に形質転換され、２０分間氷上でインキュベートされる。チューブを２分間４２℃に入れることにより、熱ショックが行われる。チューブを１分間氷に置いた後、１ｍｌのＬブロス（「ＬＢ」）が加えられ、３７℃のシェーカで４５分間インキュベートされる。１００ｕｌの培養液が、ＬＢ＋Ａｍｐ寒天プレートにプレートされ、一晩３７℃でインキュベートされる。
【０１７９】
一晩培養されたプレートからの単一のコロニーが、１００ｍｌのＬＢ―Ａｍｐ＋（１５０ｕｇ／ｍｌ）に３７℃で一晩植えつけられる。２日目に、２リットルの予熱されたＬＢ＋Ａｍｐを含む二つの４リットルフラスコに、５０ｍｌの一晩培養物が植えつけられ、ＯＤ６００が０．６〜０．８の間に達するまで３７℃で成長させられる。２００ｕｌの１Ｍ  ＩＰＴＧが各２Ｌの細胞培養に１００ｕＭの最終濃度で加えられ、３７℃でさらに３時間成長させられる。１０分間の５０００ｒｐｍでのスピニングにより、細胞がペレット化される。細胞は、２００ｍｌの溶解バッファーの中に再懸濁され（溶解バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭイミダゾール、ベータメルカプトエタノール（「ＢＭＥ」）５ｍＭ）、６つの５０ｍｌ円錐チューブに分割される。各チューブにつき、細胞がパワーレベル８、３×３０’’で超音波破壊され、６０分間１１，０００ｒｐｍで細菌細片が沈降され、上清が０．２２ｕＭフィルタで濾過される。イミダゾールが、１０ｍＭの最終濃度でフィルタに加えられる。
【０１８０】
濾過液は、サンプルポンプで５ｍｌのＮｉ―ＮＴＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ―Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）にロードされる。カラムが、２０ｍＭのイミダゾールを含む１０カラム体積（ＣＶ）のバッファーＡで洗浄される（バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、ＢＭＥ１０ｍＭ）。その後、カラムは、バッファーＡ中４０ｍＭ〜７０ｍＭのイミダゾールの直線濃度勾配を伴う１０ＣＶのバッファーで洗浄される。タンパク質が、６ＣＶのバッファーＢにより溶出される（バッファーＢ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２５０ｍＭイミダゾール、ＢＭＥ１０ｍＭ）。収集画分を４―１２％のＳＤＳ―ＰＡＧＥ上で５μｌの試料と照合した後、全ての目的の画分が合わせられ、１Ｌの透析バッファー中（透析バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―Ｃｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、ＢＭＥ２０ｍＭ）で一晩透析される（透析管：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ多孔膜（ＶＷＲ）ＭＷＣＯ：１２―１４０００）。透析バッファーは１２時間後に交換され、透析はさらに４時間行われる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８に記載されるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて測定される。
【０１８１】
（実施例２）１００％２’―Ｏ―メチルヌクレオチドを導入する転写
実施例２Ａ：２’―ＯＨ  ＧＴＰを伴わない２’―Ｏ―メチル転写
２’―ＯＨ  ＧＴＰの滴定を用いて、２’―ＯＨ  ＧＴＰの濃度に対するＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異ポリメラーゼの感受性をテストするために、実験が行われた。
【０１８２】
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともに使用されたときに高い転写収率を示した二つのライブラリ、ＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９を用いて、２’―ＯＨ  ＧＴＰの濃度に対するＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写の感受性がテストされた。ＡＲＣ２１１８の配列が以下の実施例２Ｃに与えられ、ＡＲＣ２１１９の配列がすぐ下に、５’から３’方向に与えられる。
【０１８３】
【化４】
2011504357.tif 000010
１Ｘ転写バッファー（ＨＥＰＥＳ２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％ｗ／ｖ）、〜２００ｎＭテンプレート、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ各１ｍＭ、ＭｇＣｌ２６．５ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．０ｍＭ、ＰＥＧ―８０００ｗ／ｖ  １０％、ＧＭＰ１ｍＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭと、２’―ＯＨ  ＧＴＰ（０〜１６０ｕＭ）の滴定を用いて、一晩３７℃で転写が行われた。
【０１８４】
各条件下の転写産物が、２００ｕＬの反応混合物を用いてＰＡＧＥ―ゲル分析によりアッセイされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．２版ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、ＰＡＧＥ―ゲル分析のＵＶ―シャドウイングから、各条件の転写産物が定量された。図５は、ＰＡＧＥ―ゲル分析の定量結果をまとめ、バックグラウンドに対する各条件による転写収率の増加倍率を示す。図５にみられるように、２’―ＯＨ  ＧＴＰを含まない全ての条件下でＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒにより転写されるＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９、および２’―ＯＨ  ＧＴＰの非存在下での収率は、反応混合物に２’―ＯＨ  ＧＴＰが含まれる場合の転写収率と同等だった。これらの結果は、転写のために２’―ＯＨ  ＧＴＰを必要とするＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（データは示されない）と対照的に、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、転写収率増加のために２’―ＯＨ  ＧＴＰの存在を必要としないことを示す。
【０１８５】
その後、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで使用される最適な転写条件を決定するために実験が行われた。２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ、マグネシウムおよびマンガン濃度の変更の転写収率への影響をテストするために、ＡＲＣ２１１９が、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともに用いられた。
【０１８６】
１Ｘ転写バッファー（ＨＥＰＥＳ２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％）、〜２００ｎＭテンプレート、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ（それぞれ０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、および２ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ、６．５ｍＭ、８ｍＭ、および９．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ）、ＰＥＧ―８０００ｗ／ｖ  １０％、ＧＭＰ１ｍＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭを用いて、一晩３７℃で転写が行われた。
【０１８７】
各条件下の転写産物が、２００ｕＬの反応混合物を用いてＰＡＧＥ―ゲル分析によりアッセイされ、各条件の転写産物がＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．２版ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、ＰＡＧＥ―ゲル分析のＵＶ―シャドウイングから定量された。図６は、ＰＡＧＥ―ゲル分析の定量結果をまとめ、バックグラウンドに対する各条件による転写収率の増加倍率を示す。２’―ＯＭｅ  ＮＴＰｓのコストおよびこの実験の結果に基づき、各１．５ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ（および８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２）が、ＡＲＣ２１１９および本発明のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのための好ましい条件として採用された。
【０１８８】
実施例２Ｂ：Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＭＮＡ転写の忠実度およびバイアス：
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用い、２’―ＯＨ  ＧＴＰを用いないＭＮＡ転写の忠実度およびバイアスを評価するために、追加的な実験が行われた。忠実度をテストするために、単一のクローン配列がＰＣＲにより増幅され、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒポリメラーゼを用いた２’―ＯＨ  ＧＴＰを伴わないＭＮＡ転写をプログラムするために使用され、ＰＡＧＥにより精製され、ＲＱｌ  ＤＮアーゼを用いて残りのＤＮＡテンプレートが消化され（そしてＤＮＡテンプレートの非存在がＰＣＲによりアッセイされ）、転写物が逆転写され（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、ＰＣＲにより増幅された。このＰＣＲ産物が配列決定された後、欠失、挿入および置換の数が計算された。この実験で配列決定された１３００の塩基のうちに、欠失および挿入は観察されず、三つの置換が観察された（図７を参照）。これらの数は、３０―ヌクレオチド縮重領域内にコードされる配列情報がＳＥＬＥＸ（商標）の次のラウンドに忠実に伝達されるチャンスが、９３％であることを示唆し、この数は非常に高いため、野生型ＲＮＡにつき測定される数を上回る。
【０１８９】
ヌクレオチドのバイアスをテストするために、ライブラリＡＲＣ２１１８が、以下の条件下：ＨＥＰＥＳ２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００  ０．０１％ｗ／ｖ、〜２００ｎＭテンプレート、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ各１ｍＭ（２’―ＯＨ  ＧＴＰなし）、ＭｇＣｌ２（６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（２ｍＭ）、ＰＥＧ―８０００ｗ／ｖ  １０％、ＧＭＰ１ｍＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭで、３７℃で一晩転写され、ＰＡＧＥにより精製され、残りのＤＮＡテンプレートがＲＱ１  ＤＮアーゼを用いて消化され（その後ＤＮＡテンプレートの非存在がＰＣＲによりアッセイされ）、転写物が逆転写され、クローニングおよび配列決定の前にＰＣＲを用いて増幅された。増幅ライブラリからの４８のクローンおよび開始ライブラリからの４８のクローンが、配列決定された。バイアスが生じたかを見るために、縮重領域におけるヌクレオチド頻度の値が検査された。図８により示されるように、転写後のヌクレオチド組成の割合は、各ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）の割合がほぼ等しい開始ライブラリのヌクレオチド組成の割合と非常に類似しており、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを転写に用いてヌクレオチドバイアスが生じないことが示された。
【０１９０】
実施例２Ｃ：Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＭＮＡ転写
二本鎖転写テンプレートを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応をプログラムするために以下のＤＮＡテンプレートおよびプライマが用いられた。Ｎは、ＡＴＧＣの各々である確率がほぼ等しい縮重位置を示し、全ての配列が３’から５’方向にリストされる：ＰＣＲテンプレート（ＡＲＣ２１１８）
【０１９１】
【化５】
2011504357.tif 000011
【０１９２】
【化６】
2011504357.tif 000012
【０１９３】
【化７】
2011504357.tif 000013
その後、得られた二本鎖転写テンプレートを用いて、以下のように各サンプルの２００ｕＬ転写混合物がプログラムされた：ＨＥＰＥＳ（２００ｍＭ）、ＤＴＴ（４０ｍＭ）、スペルミジン（２ｍＭ）、ＴｒｉｔｏｎＸ―１００（０．０１％ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２（８ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＰＥＧ―８０００（１０％ｗ／ｖ）、各１．５ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＮＴＰ、ＧＭＰ  １ｍＭ、１００―２００ｎＭ転写テンプレート、無機ピロホスファターゼ（１単位）、ｐＨ７．５、Ｔ７変異ポリメラーゼＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒが下記のように希釈された。転写混合物は、３７℃で一晩インキュベートされた（１６ｈ）。
【０１９４】
インキュベーション後、混合物は、イソプロパノールにより沈殿され、得られたペレットが溶解され、変性ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）を用いて６０分間２５Ｗで定量された。サンプルがＵＶシャドウにより２６０ｎｍで視覚化および定量された。転写収率が下表１に与えられる。
【０１９５】
【表１】
2011504357.tif 000014
（実施例３）２’―Ｏ―メチルＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチド、および２’―デオキシＣＴＰヌクレオチドを導入する転写
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて２’―Ｏ―メチルヌクレオチドおよび２’―デオキシヌクレオチドの両者を導入するＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異ポリメラーゼの能力をテストするために実験が行われた。
【０１９６】
ＤＮＡテンプレートＡＲＣ４２０６およびＡＲＣ４２１２、およびその各々のプライマ（下記に５’から３’方向に配列が与えられる）を用いて、一つの２’―デオキシＣＴＰヌクレオチドと、２’―Ｏ―メチルＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰである他の三つのヌクレオチドを導入するＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写能力がテストされた。２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２．０ｍＭ  スペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼおよび〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて、３７℃で一晩転写が行われて、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドおよび２’―デオキシＣＴＰヌクレオチドからなるＡＲＣ４２０６およびＡＲＣ４２１２プールが生成された（以下に「ｄＣｍＤ」）。同時に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  スペルミジン、０．００２５％  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｍＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼおよび〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて３７℃で一晩転写が行われて、２’―ＯＭｅプリンおよびピリミジンヌクレオチドからなるＡＲＣ４２０６およびＡＲＣ４２１２プールが生成された（以下に「ＭＮＡ」）。各条件組下の転写産物が、４００ｕＬの反応混合物を用いてＰＡＧＥ―ゲル分析によりアッセイされ、各条件の転写産物がＰＡＧＥ―ゲルのＵＶ―シャドウイングから視覚化された。表２は、３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中３７℃での一晩のＰＡＧＥ―ゲルからの溶出、エタノール沈殿、その後のＵＶ分光法による定量化後に単離されたプールに基づいて、転写収率の定量結果をまとめる。
【０１９７】
【表２】
2011504357.tif 000015
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＭＮＡおよびｄＣｍＤ転写の忠実度を評価するために、追加的な実験が行われた。忠実度をテストするために、上で生成されたＡＲＣ４２０６およびＡＲＣ４２１２ＭＮＡおよびｄＣｍＤプールが、逆転写され（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、ＰＣＲにより増幅され、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒポリメラーゼを用いた追加的なＭＮＡおよびｄＣｍＤ転写をプログラムするために使用された。プールはＰＡＧＥにより精製され、転写物がＰＡＧＥ―ゲルのＵＶ―シャドウイングから視覚化された。表３は、３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中での６５℃での４．５時間のＰＡＧＥ―ゲルからの溶出、エタノール沈殿、その後のＵＶ分光法による定量後に単離されたプールに基づく、転写収率の定量結果をまとめる。
【０１９８】
【表３】
2011504357.tif 000016
【０１９９】
【化８】
2011504357.tif 000017
テンプレートは、その各々のＤＮＡプライマにより増幅された：
【０２００】
【化９】
2011504357.tif 000018
（実施例４）Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたアプタマー選択
２’―ＯＭｅプリンおよびピリミジンヌクレオチド（以下に「ＭＮＡ」）からなるプールを用いて、ヒトＡｎｇ２（以下に「ｈ―Ａｎｇ２」）に対するアプタマーを同定するために、選択が実行された。選択戦略は、ｈ―Ａｎｇ２に特異的な高親和性アプタマーをもたらした。
【０２０１】
ヒトＡｎｇ２は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）から購入された。上の実施例１に記載したように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）が発現され、精製された。２’―ＯＭｅプリンおよびピリミジンヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。
【０２０２】
Ａｎｇ２アプタマーの選択
プール調製
配列
【０２０３】
【化１０】
2011504357.tif 000019
のＤＮＡテンプレートが、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）ＤＮＡ合成装置を用いて合成され、標準法により脱保護された。テンプレートは、プライマ
【０２０４】
【化１１】
2011504357.tif 000020
により増幅されてから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのテンプレートとして使用された。２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ、ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｍＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼ、および〜９μｇ／ｍＬ  Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．５μＭテンプレートＤＮＡを用いて転写が行われて、ＡＲＣ２１１８ｍＲｍＹプールが生成された。
【０２０５】
選択
１００μＬの最終的体積の選択バッファー（１Ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ））において１００ｐｍｏｌのタンパク質と３３０ｐｍｏｌ（２×１０１４分子）のＭＮＡ  ＡＲＣ２１１８プールを１時間室温でインキュベートすることにより、選択が開始された。ＲＮＡ―タンパク質複合体および未結合ＲＮＡ分子が、０．４５ミクロンニトロセルローススピンカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）を用いて分離された。カラムはＫＯＨで前処置され（１ｍＬ  ０．５Ｍ  ＫＯＨ中にカラムフィルタ浸漬、１５分ＲＴ；スピン。１ｍＬ  ｄＨ２Ｏ中にフィルタ浸漬  ５分ＲＴ；スピン）、１ｍＬ  １Ｘ  ＰＢＳで二回洗浄されてから、プール：Ａｎｇ２複合体を含む溶液がカラムに加えられ、２分間１５００ｘｇで遠心分離された。フィルタは、非特異的結合物を除去するために、５００μＬ  ＤＰＢＳにより二回洗浄された。２×１００μＬ溶離バッファー（７Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭＥＤＴＡ、９５℃に予熱）の添加によりＲＮＡが溶出されてから、エタノールにより沈殿させられた。プライマ配列番号２７を用いて、製造者の指示に従って、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ―ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）により、ＲＮＡが逆転写された。配列番号２６および配列番号２７を用いて、製造者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）によるＰＣＲにより、ｃＤＮＡが増幅された。プール調製のために上述のようにテンプレートが転写され、変性ポリアクリルアミドゲルで精製された。
【０２０６】
ラウンド２は、ラウンド１と同じ方法により実行された。ラウンド３―１２は、疎水性プレートに固定されたｈ―Ａｎｇ２により行われた。各選択ラウンドは、１００μＬの１Ｘ  ＤＰＢＳ中で室温で１時間Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ―Ａｎｇ２を固定することにより開始された。プレートは、１２０μＬ  ＤＰＢＳで５×洗浄された後、ブロッキングバッファー（１Ｘ  ＤＰＢＳ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で１時間インキュベートされた。そして、上清が除去され、ウェルが１２０μＬ  １Ｘ  ＤＰＢＳで５回洗浄された。プールＲＮＡは、１時間室温で空のウェルでインキュベートされてから、１００μＬのブロッキングバッファーで先にブロックされたウェルで１時間インキュベートされた。ラウンド３から先は、標的が固定されたウェルが、ポジティブ選択ステップの前に１００μＬブロッキングバッファー（１Ｘ  ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で、１時間室温でブロックされた。全ての場合において、固定ｈ―Ａｎｇ２に結合したプールＲＮＡは、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマ、配列番号２７、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の添加により、選択プレートにおいて直接逆転写された後、１時間６５℃でインキュベートされた。ラウンド１につき記載されるように、得られたｃＤＮＡがＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）および転写のテンプレートとして使用された。各ラウンドの条件が、表４にある。
【０２０７】
【表４】
2011504357.tif 000021
ＭＮＡアプタマー結合分析
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース３２Ｐ―エンド標識したプールＲＮＡが、ｈ―Ａｎｇ２と組み合わされ、ＤＰＢＳバッファー中で３０μＬの最終的体積で、３０分間室温でインキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ―１Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ、Ａｃｒｙｌｉｃ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）、（上から下へ）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたＲＮＡはニトロセルロースフィルタに捕らえられ；非タンパク結合ＲＮＡはナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド９でｈ―Ａｎｇ２結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド９、１０および１２のプールテンプレートが、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して製造者の指示に従ってクローニングされ、化学合成のために２６のユニーククローンが選択され、解離定数（ＫＤ）が決定された。簡単にいうと、合成ＲＮＡｓがγ―３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび１Ｘ  ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のバッファー条件を用いてＫＤ値が決定された。式：ＲＮＡ結合画分＝振幅＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―Ａｎｇ２］＋ＫＤ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―Ａｎｇ２］＋ＫＤ）２−４（ＡｐｔＣｏｎｃ＊［ｈ―Ａｎｇ２］）））／（２＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンドにデータをあてはめてＫＤｓが推定された。結果は、下表５にレポートされる。
【０２０８】
２６のユニーク配列の中で、８つが類似のモチーフを共有し、類似の結合および阻害活性を有した。これらの配列は、ファミリーＩとして同定される。ファミリーＩＩは、類似の結合および阻害活性を有した、モチーフを共有する二つの配列を含む。
【０２０９】
ＭＮＡアプタマー機能の分析
Ｅｌｉｓａアッセイ
いくつかアプタマーが、Ｔｉｅ２レセプターに対するＡｎｇ２結合を妨げる能力を測定するために準備されたＥＬＩＳＡアッセイにおいてテストされた。Ｔｉｅ２レセプターを捕捉するために、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１５０ｎｇのＴｉｅ２―Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３―ＴＩ―１００―ＣＦ、ミネソタ州ミネアポリス）が、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ＮＵＮＣ＃４４６６１２、ニューヨーク州ロチェスター）に置かれ、４℃で一晩インキュベートされた。捕捉の間、様々な濃度の合成ＲＮＡ５０μＬが、５０μＬの３．６ｎＭ  Ａｎｇ２（２００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、６２３―ＡＮ―０２５／ＣＦ、ミネソタ州ミネアポリス）（０．２％  ＢＳＡを伴うＰＢＳ中）と、０．１％  ＢＳＡを伴うＰＢＳ中１．８ｎＭ（１００ｎｇ／ｍＬ）の最終Ａｎｇ２濃度で混合され、１時間室温でインキュベートされた。一晩のインキュベーション後に捕捉溶液が除去され、２００μＬのＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）によりプレートが三回洗浄された。そして、プレートが、５％脱脂粉ミルクを含む２００μＬ  ＴＢＳＴにより室温で３０分間ブロックされた。ブロッキングの後、プレートが２００μＬのＴＢＳＴで再び室温で三回洗浄され、合成ＲＮＡ：Ａｎｇ２混合物がプレートに加えられ、１時間室温でインキュベートされた。そして、プレートが２００μＬのＴＢＳＴで三回洗浄され、１００μＬのビオチン化ヤギ抗Ａｎｇ２抗体（１：１０００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＡＦ６２３、ミネソタ州ミネアポリス）が加えられ、室温で１時間インキュベートされた。２００μＬのＴＢＳＴにより三回洗浄したあと、１００μＬのＨＲＰ連結ストレプトアビジン（１：２００；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＤＹ９９８、ミネソタ州ミネアポリス）が加えられ、０．５時間室温でインキュベートされた。そして、プレートが再び２００μＬのＴＢＳＴにより三回洗浄され、１００μＬのＴＭＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２８）が加えられ、暗所で、室温で５分間インキュベートされた。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む１００μＬの溶液が加えられて反応が停止され、プレートがＳｐｅｃｔｒｏＭａｘで、４５０ｎｍで読み取られた。結果は、下表５の最終的欄に与えられる。
【０２１０】
ＦＡＣＳアッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）（ＡＴＣＣ）およびＫ２９３細胞、ヒトＴｉｅ２レセプターを過剰発現する細胞系統を用いて、細胞膜上のＴｉｅ２レセプターに対するＡｎｇ２の結合を阻害する特異的ＭＮＡ  Ａｎｇ２アプタマーのＩＣ５０が決定された。簡単にいうと、組換え哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１―Ｔｉｅ２が２９３細胞（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナサス）にトランスフェクションされ、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）による選択の後、安定したクローンが得られた。フローサイトメトリは、ＨＵＶＥＣおよびＫ２９３細胞の両方のＴｉｅ２タンパク質の発現を示した。Ａｎｇ２滴定アッセイにより、ＨＵＶＥＣおよびＫ２９３細胞に対する細胞アプタマー阻害アッセイのＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）の量がさらに決定され、それぞれ１および０．１μｇ／ｍＬであった。
【０２１１】
フローサイトメトリ結合アッセイにおいては、ＨＵＶＥＣおよびＫ２９３細胞（２×１０５細胞／ウェル）が、Ｖ底９６ウェルプレートにペレット化され、その後ＭＮＡアプタマー／Ａｎｇ２溶液中に再懸濁され、２時間インキュベートされた。アプタマー／Ａｎｇ２溶液は、ＦＡＣバッファー（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．２％アジ化ナトリウム）中のＡｎｇ２と異なる用量のアプタマー（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４１１ｎＭ、０．１３７ｎＭ、および０．０４５６ｎＭ）を氷上で３０分間プレインキュベーションすることにより調製された。ＦＡＣｓバッファーによる三度の洗浄のあと、細胞はビオチン化抗ヒトＡｎｇ２抗体（５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で３０分間インキュベートされた後、ストレプトアビジンＰＥ（１：１０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）によるもう３０分間のインキュベーションが行われた。ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて、ＦＡＣＳ分析が完了された。結果は、下表５にレポートされる。
【０２１２】
【表５−１】
2011504357.tif 000022
【０２１３】
【表５−２】
2011504357.tif 000023
（実施例５）Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたアプタマー選択
２’―ＯＭｅプリンおよびピリミジンヌクレオチドからなるプール（以下に「ｍＲｍＹ」）を用いて、ヒトＩｇＥ（以下に「ｈ―ＩｇＥ」）に対するアプタマーを同定するために、選択が行われた。選択戦略は、ｈ―ＩｇＥに特異的な高親和性アプタマーをもたらした。
【０２１４】
ヒトＩｇＥは、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｔ．＃１６―１６―０９０７０５  ジョージア州アセンズ）から購入された。実施例１に上述したように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）が発現され、精製された。２’―ＯＭｅプリンおよびピリミジンヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。
【０２１５】
ＩｇＥアプタマーの選択
プール調製
配列
【０２１６】
【化１２】
2011504357.tif 000024
【０２１７】
【化１３】
2011504357.tif 000025
のＤＮＡテンプレートが、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）ＤＮＡ合成装置用いて合成され、標準法により脱保護された。テンプレートは、プライマ
【０２１８】
【化１４】
2011504357.tif 000026
により増幅され、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のテンプレートとして使用された。２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２．０ｍＭ  スペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％  ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｍＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼ、および〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて転写が行われ、ＡＲＣ２１１８  ＭＮＡプールが生成された。
【０２１９】
選択
３３０ｐｍｏｌ（２×１０１４分子）のＭＮＡ  ＡＲＣ２１１８プールを、ＢＳＡブロックされた疎水性プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に結合した２４ｐｍｏｌのタンパク質とともに１００μＬの最終体積の選択バッファー（１Ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ））中で、室温で１時間インキュベートすることにより選択が開始されれた。ウェルは、非特異的結合物を除去するために、１２０μＬ  ＤＰＢＳにより四回洗浄された。ＲＮＡが溶出され、プライマ配列番号２７を用いて、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ―ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）により、製造者の指示に従って逆転写された。配列番号２６および配列番号２７を用いて、製造者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）を使用したＰＣＲによりｃＤＮＡが増幅された。プール調製で上述したようにテンプレートが転写され、変性ポリアクリルアミドゲルで精製された。
【０２２０】
全てのラウンドは、疎水性プレートに固定されたｈ―ＩｇＥにより行われた。各選択ラウンドが、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２４ｐｍｏｌのｈ―ＩｇＥを１００μＬの１Ｘ  ＤＰＢＳ中で、室温で１時間固定することにより開始された。プレートが１２０μＬ  ＤＰＢＳにより四回洗浄されてから、ブロッキングバッファー（１Ｘ  ＤＰＢＳ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で１時間インキュベートされた。そして、上清が除去され、１２０μＬ  １Ｘ  ＤＰＢＳによりウェルが四回洗浄された。ラウンド２から開始して、プールＲＮＡは空のウェルで、室温で１時間インキュベートされてから、１００μＬのブロッキングバッファーで先にブロックされたウェルで１時間インキュベートされた。ラウンド２から先は、非―特異的競合物が、正の選択ステップに加えられた（０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡ）。全ての場合において、固定されたｈ―ＩｇＥに結合したプールＲＮＡは、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマ、配列番号２７、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の添加後６５℃で１時間インキュベートすることにより、直接選択プレートにおいて逆転写された。得られたｃＤＮＡは、ラウンド１につき記載されるように、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）および転写のテンプレートとして使用された。各ラウンドの条件が、表６にある。
【０２２１】
【表６】
2011504357.tif 000027
ＭＮＡアプタマー結合分析
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース３２Ｐ―エンド標識したプールＲＮＡが、ｈ―ＩｇＥと組み合わされ、ＤＰＢＳバッファー中で３０μＬの最終体積で、３０分間室温でインキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ―１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ、Ａｃｒｙｌｉｃ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）、（上から下へ）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたＲＮＡは、ニトロセルロースフィルタに捕らえられ；非タンパク結合ＲＮＡは、ナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド８でｈ―ＩｇＥ結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド５、８および１２のプールテンプレートが、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して製造者の指示に従ってクローニングされた。配列決定データから、ラウンド８のプールが全配列の５９％を含む単一の主要クローンに収束したことが明らかになった。この主要クローンと三つの可能性のあるミニマーが化学合成のために選択され、解離定数（ＫＤ）が決定された。簡単にいうと、合成ＲＮＡｓがγ―３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび１Ｘ  ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のバッファー条件を用いてＫＤ値が決定された。式：ＲＮＡ結合画分＝振幅＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ＩｇＥ］＋ＫＤ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ＩｇＥ］＋ＫＤ）２−４（ＡｐｔＣｏｎｃ＊［ｈ―ＩｇＥ］）））／（２＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンドにデータをあてはめてＫＤｓが推定された。主要クローンは、約８００ｐＭのＫＤを有した。最善の結合のミニマーの、サルＩｇＥ（ｍ―ＩｇＥ）に対する結合もテストされたが、サルＩｇＥタンパク質に対する交差反応結合は示されなかった。この交差反応性の欠如は、ＥＬＩＳＡによっても確認された。３’末端に逆方向ｄＴを伴うミニマーが、医薬品化学プロセスの親分子として用いられた。
【０２２２】
医薬品化学
ＩｇＥ特異的ＭＮＡミニマーの一つの化学組成（図９）が、化合物の血漿安定性を維持しながら親和性および能力を改善するために変更された。プロセスは、最小化ＩｇＥアプタマーの一連の誘導体の設計、合成および評価を含み、一連の各誘導体は、いずれの残基が置換に耐えるかを決定するため、各所定のヌクレオチドで単一の修飾を含んだ。第一修飾組は、各ユニーク２’―ＯＭｅヌクレオチドへのデオキシヌクレオチドの置換であった。別個の修飾ラウンドにおいては、各誘導体が異なるヌクレオチド間結合位置で単一のホスホロチオエート修飾を含む一連の誘導体が合成された。これらの修飾の最初の段階において生成されたデータを用いて、最小化アプタマーの構造活性相関（ＳＡＲ）が確立された。後の修飾段階においては、最初のＳＡＲデータに基づいて設計された複合置換組でアプタマーが合成され、テストされた。複合置換パネルから、２’―ＯＭｅから２’―デオキシへの置換がその組成に導入された、３９ヌクレオチドの長さのアプタマーが同定された。さらに、２’―ＯＭｅから２’―デオキシへの一つの置換およびリン酸塩からホスホロチオエートへの四つの置換がその組成に導入された、３９ヌクレオチドの長さの、得られた最小化修飾アプタマーが同定された。図１０に示すように、このデオキシ／ホスホロチオエート修飾アプタマーは、最小化非修飾親アプタマーならびに二つの２’―ＯＭｅからデオキシへの置換を有する最小化親アプタマーの両方と比較して、結合親和性の増加を示す。
【０２２３】
血清安定性
最小化非修飾親アプタマーおよびデオキシ／ホスホロチオエート修飾アプタマーが、ヒト、ラットおよびサル血清における安定性を決定するためにアッセイされた。各アプタマーが、９０％血清中５μＭの最終濃度になるように、１ｍｌのプール血清に加えられた。アプタマーは振盪を伴って３７℃でインキュベートされ、０、０．５、１、４、２４、４８、７２、および９８時間でタイムポイントがとられた。各タイムポイントで、インキュベート試料からの９０μｌのストックが、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡに加えられ、ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００システムを用いた後の安定性分析のために−２０℃で冷凍された。
【０２２４】
全てのバイオセンサ結合測定が、研究等級のＣＭ５バイオセンサチップを備えたＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、２５℃で行われた。精製された組換えヒトＩｇＥ（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ジョージア州アセンズ）が、アミノ―カップリング化学を用いてバイオセンサ表面に固定された。これを達成するために、二つのフローセルの表面が、まず０．１Ｍ  ＮＨＳ（Ｎヒドロキシスクシンイミド）および０．４Ｍ  ＥＤＣ（３―（Ｎ，Ｎジメチルアミン）プロピル―Ｎ―エチルカルボジイミド）の１：１混合物で、５μｌ／分の流速で７分間活性化された。表面活性化の後、活性化された表面に対する共有結合の確立を許容するために、一つのフローセルに５０μｇ／ｍｌのＩｇＥが１０μｌ／分で２０分間注入された。次に、１ＭのエタノールアミンヒドロクロリドｐＨ８．５が、残余エステルを不活性化するために、５μｌ／分で７分間注入された。ブランクとして使用されるフローセルには、タンパク質注入を伴わずに残余エステルを不活性化するために、１ＭのエタノールアミンヒドロクロリドｐＨ８．５が７分間注入された。
【０２２５】
全てのタイムポイントが分析される前に、調製されたチップに一連のアプタマースタンダードが通されて、標準曲線が生成された。標準曲線を確立するために、アプタマーが、４％ヒト血清および５０ｍＭ  ＥＤＴＡが添加されたＨＢＳ―Ｐバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ２０）に、連続的に希釈された（２００ｎＭから１２．５ｎＭへ）。全ての希釈サンプルがＢｉａｃｏｒｅ  ２０００に注入されて２０μｌ／分で５分間結合され、３分間置かれた。チップを再生させるために、１Ｎ  ＮａＣｌが３０μｌ／分で６０秒間注入された。結合段階の最後のＲＵピーク反応がアプタマー濃度に対してプロットされ、Ｆｏｕｒ―Ｐａｒａｍｅｔｅｒロジスティック関数を用いて標準曲線が生成された。ヒト、ラット、およびサル血清における活性アプタマー濃度を測定するために、タイムポイントサンプルが、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００への注入の直前に最終血清濃度が４％となるように、ＨＢＳ―Ｐ中２２．５倍に希釈された。上で生成された標準曲線を用いてＲＵ反応単位から濃度に変換することにより、各血清インキュベーションピリオドの機能的アプタマー濃度が計算された。追加的な品質制御措置として、二つのアプタマースタンダードが実験の最後に独立してテストされて、ＢＩＡＣＯＲＥで測定された濃度のスタンダードからの逸脱が２０％未満であることが確認された。最小化非修飾親アプタマーおよびデオキシ／ホスホロチオエート修飾アプタマーは、ヒト、ラット、およびサル血清中でいずれも９８時間で９０％以上活性であることが決定された。
【０２２６】
（実施例６）Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたアプタマー選択
２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチド、および２’―デオキシＣＴＰヌクレオチド（以下に「ｄＣｍＤ」）からなるプールを用いて、ヒトフォンビルブラント因子（以下に「ｈ―ｖＷＦ」）に対するアプタマーを同定するために、選択が行われた。選択戦略から、ｈ―ｖＷＦに特異的な高親和性アプタマーが生じた。
【０２２７】
ヒトｖＷＦは、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｔ．＃６８１３００、カリフォルニア州ラホーヤ）から購入された。ヒトｖＷＦ  Ａｌドメインが発現および精製された。変異ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）が、上述の実施例１に記載したように発現および精製された。２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチド、および２’―デオキシＣＴＰヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。
【０２２８】
ｖＷＦアプタマーの選択
プール調製
配列
【０２２９】
【化１５】
2011504357.tif 000028
を伴うテンプレートが、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）ＤＮＡ合成装置を使用して合成され、標準法により脱保護された。テンプレートは、プライマ
【０２３０】
【化１６】
2011504357.tif 000029
により増幅されてから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのテンプレートとして使用された。２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼ、および〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて転写が行われて、ＡＲＣ４２１８ｄＣｍＤプールが生成された。
【０２３１】
選択
１００μＬの最終体積の選択バッファー（１Ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）において、ＨＳＡブロックされた疎水性プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に結合された２０ｐｍｏｌのタンパク質とともに３３０ｐｍｏｌ（２×１０１４分子）のｄＣｍＤ  ＡＲＣ４２１８プールを１時間室温でインキュベートすることにより、選択が開始された。非特異的結合物を除去するために、２００μＬ  ＤＰＢＳによりウェルが五回洗浄された。ＲＮＡが溶出され、プライマＡＲＣ４２０８（配列番号３０）を用いて、製造者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ―ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）により逆転写された。プライマＡＲＣ４２１９（配列番号２９）およびＡＲＣ４２０８（配列番号３０）を用いて、製造者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）によるＰＣＲによりｃＤＮＡが増幅された。プール調製につき上述したようにテンプレートが転写された。エタノール沈殿によりテンプレートが精製され、その後Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ―ｓｐｉｎカラム（Ｃａｔ．＃７３２―６２５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いた脱塩ステップが行われた。
【０２３２】
全てのラウンドが、疎水性プレートに固定されたｈ―ｖＷＦにより行われた。１０ｐｍｏｌのｈ―ｖＷＦおよび１０ｐｍｏｌのヒトｖＷＦ  Ａｌドメインを、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に１００μＬの１Ｘ  ＤＰＢＳ中で、室温で３０分間固定することにより、最初の三つの選択ラウンドが開始された。ラウンド４で開始して、２０ｐｍｏｌのｈ―ｖＷＦが疎水性プレートに２ラウンド固定された後、２０ｐｍｏｌのヒトｖＷＦ  Ａｌドメインが疎水性プレートに一ラウンド固定された。プレートは、２００μＬ  ＤＰＢＳにより三回洗浄されてから、ブロッキングバッファー（１Ｘ  ＤＰＢＳおよび５％ＨＳＡ）で３０分間インキュベートされた。それから上清が除去され、２００μＬ  ＤＰＢＳによりウェルが三回洗浄された。ラウンド２から始まり、プールＲＮＡが室温で３０分間空のウェルでインキュベートされてから、１００μＬブロッキングバッファーにより先にブロックされたウェルで３０分間インキュベートされた。ラウンド２から先は、正の選択ステップに非特異的競争物が加えられた（０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ）。いずれの場合も、固定標的に結合されたプールＲＮＡが、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマ、配列番号３０、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の添加およびその後の６５℃での１時間のインキュベートにより、直接選択プレートにおいて逆転写された。ラウンド１につき記載されるように、得られたｃＤＮＡが、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）および転写のテンプレートとして用いられた。各ラウンドの条件が、表７にある。
【０２３３】
【表７】
2011504357.tif 000030
ｄＣｍＤアプタマー結合分析
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース３２Ｐ―エンド標識したプールＲＮＡが、ｈ―ｖＷＦと組み合わされ、ＤＰＢＳバッファー中で３０μＬの最終体積で、室温で３０分間インキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ―１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ、Ａｃｒｙｌｉｃ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）、（上から下へ）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたＲＮＡは、ニトロセルロースフィルタに捕らえられ；非タンパク結合ＲＮＡは、ナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド５でｈ―ｖＷＦ結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド５およびラウンド６プールの解離定数（ＫＤ）が決定された。簡単にいうと、プールＲＮＡｓがγ―３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび１Ｘ  ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のバッファー条件を用いてＫＤ値が決定された。式：ＲＮＡ結合画分＝振幅＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ｖＷＦ］＋ＫＤ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ｖＷＦ］＋ＫＤ）２−４（ＡｐｔＣｏｎｃ＊［ｈ―ｖＷＦ］）））／（２＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンドにデータをあてはめてＫＤｓが推定された。ラウンド６プールは、約２ｎＭのＫＤを有した。プールは、Ａｌドメインに対する結合についてもテストされ、約４ｎＭのＫＤを有した。
【０２３４】
（実施例７）Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたアプタマー選択
２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチド、および２’―デオキシＣＴＰヌクレオチド（以下に「ｄＣｍＤ」）からなるプールを用いて、ヒトＩｇＥ（以下に「ｈ―ＩｇＥ」）に対するアプタマーを同定するために選択が行われた。選択戦略から、ｈ―ＩｇＥに特異的な高親和性アプタマーが生じた。
【０２３５】
ヒトＩｇＥは、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｔ．＃１６―１６―０９０７０５  ジョージア州アセンズ）から購入された。実施例１に上述したように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）が発現され、精製された。２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチド、および２’―デオキシＣＴＰヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。
【０２３６】
ＩｇＥアプタマーの選択
プール調製
配列
【０２３７】
【化１７】
2011504357.tif 000031
のＤＮＡテンプレートが、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）ＤＮＡ合成装置用いて合成され、標準法により脱保護された。テンプレートは、プライマ
【０２３８】
【化１８】
2011504357.tif 000032
により増幅されてから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のテンプレートとして使用された。２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２．０ｍＭスペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼ、および〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて転写が行われ、ＡＲＣ４２１８ｄＣｍＤプールが生成された。
【０２３９】
選択
３３０ｐｍｏｌ（２×１０１４分子）のｄＣｍＤ  ＡＲＣ４２１８プールを、ＨＳＡブロックされた疎水性プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に結合した２０ｐｍｏｌのタンパク質とともに１００μＬの最終体積の選択バッファー（１Ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ））中で、室温で１時間インキュベートすることにより選択が開始されれた。ウェルは、非特異的結合物を除去するために、２００μＬ  ＤＰＢＳにより五回洗浄された。ＲＮＡが溶出され、プライマＡＲＣ４２０８（配列番号３０）を用いて、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ―ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）により、製造者の指示に従って逆転写された。プライマＡＲＣ４２１９（配列番号２９）およびＡＲＣ４２０８（配列番号３０）を用いて、製造者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）を用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡが増幅された。プール調製につき上述したように、テンプレートが転写された。エタノール沈殿によりテンプレートが精製された後、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ―ｓｐｉｎカラム（Ｃａｔ．＃７３２―６２５０、Ｂｉｏ―Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて脱塩ステップが行われた。
【０２４０】
全てのラウンドが、疎水性プレートに固定されたｈ―ＩｇＥにより行われた。各選択ラウンドが、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に２０ｐｍｏｌのｈ―ＩｇＥを１００μＬの１Ｘ  ＤＰＢＳ中で、室温で３０分間固定することにより開始された。プレートは、２００μＬ  ＤＰＢＳにより三回洗浄されてから、ブロッキングバッファー（１Ｘ  ＤＰＢＳ、および５％  ＨＳＡ）で３０分間インキュベートされた。そして上清が除去され、２００μＬ  ＤＰＢＳによりウェルが三回洗浄された。ラウンド２から開始して、プールＲＮＡが空のウェルにおいて室温で３０分間インキュベートされてから、１００μＬのブロッキングバッファーで先にブロックされたウェルで３０分間インキュベートされた。ラウンド２から先は、非―特異的競合物が正の選択ステップに加えられた（０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ）。全ての場合において、固定されたｈ―ＩｇＥに結合したプールＲＮＡは、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマ、配列番号３０、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の添加と、その後の６５℃での１時間のインキュベーションにより、直接選択プレートにおいて逆転写された。得られたｃＤＮＡが、ラウンド１につき記載されるように、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）および転写のテンプレートとして使用された。各ラウンドの条件が、表８にある。
【０２４１】
【表８】
2011504357.tif 000033
ｄＣｍＤアプタマー結合分析
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース３２Ｐ―エンド標識したプールＲＮＡが、ｈ―ＩｇＥと組み合わされ、ＤＰＢＳバッファー中で３０μＬの最終体積で、室温で３０分間インキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ―１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ、Ａｃｒｙｌｉｃ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）、（上から下へ）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたＲＮＡはニトロセルロースフィルタに捕らえられ；非タンパク結合ＲＮＡはナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド５でｈ―ＩｇＥ結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド５および６プールの解離定数（ＫＤ）が決定された。簡単にいうと、プールＲＮＡｓがγ―３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび１Ｘ  ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のバッファー条件を用いてＫＤ値が決定された。式：ＲＮＡ結合画分＝振幅＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ＩｇＥ］＋ＫＤ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ―ＩｇＥ］＋ＫＤ）２―４（ＡｐｔＣｏｎｃ＊［ｈ―ＩｇＥ］）））／（２＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンドにデータをあてはめてＫＤｓが推定された。ラウンド６プールは、約８０ｎＭのＫＤを有した。
【０２４２】
（実施例８）２’―Ｏ―メチルＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよび２’―Ｏ―メチル―５―インドリルメチレンＵＴＰヌクレオチドを導入する転写
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異ポリメラーゼが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて２’―Ｏ―メチルＡ、Ｃ、Ｇおよび２’―Ｏ―メチル―５インドリルメチレンＵを転写産物に導入するために用いられる。修飾ウリジンが、以下にヌクレオシドとして示される：
【０２４３】
【化１９】
2011504357.tif 000034
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１０％  ＰＥＧ―８０００、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．５ｍＭ  ｍＣＴＰ、１．５ｍＭ  ５―インドリル―ｍＵＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＧＴＰ、１．５ｍＭ  ｍＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ無機ピロホスファターゼ、および〜９μｇ／ｍＬ変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）および０．３μＭテンプレートＤＮＡを用いて、３７℃で一晩転写が行われて、５’―末端に単一の２’―ヒドロキシＧＭＰを伴う２’―ＯＭｅ  Ａ、２’―ＯＭｅ  Ｇ、２’―ＯＭｅ  Ｃおよび２’―ＯＭｅ―５―インドリルメチレンＵからなる転写産物が生成される（以下に「ＭＮＡ―Ｉ」）。各条件下の転写産物が、４００ｕＬの反応混合物を用いてＰＡＧＥ―ゲル分析によりアッセイされ、各条件での転写産物が、ＰＡＧＥ―ゲルのＵＶ―シャドウイングから視覚化される。
【０２４４】
（実施例９）Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび２’―Ｏ―メチル―５―インドリルメチレンウリジンを用いたＳＥＬＥＸ
治療目的のタンパク質標的に対するＳＥＬＥＸが、複数の縮重位置および上の実施例７に記載のＭＮＡ―Ｉ転写条件を含む転写テンプレートを用いて実行される。
【０２４５】
最終体積１００μＬの選択バッファー（１ＸＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ））において、ＨＳＡブロックされた疎水性プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に結合した２０ｐｍｏｌのタンパク質とともに３３０ｐｍｏｌ（２×１０１４分子）のＭＮＡ―Ｉ転写ライブラリを１時間室温でインキュベートすることにより、選択ステップが開始される。非特異的結合物を除去するために、２００μＬ  ＤＰＢＳによりウェルが五回洗浄される。製造者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ―ＰＣＲ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、選択ウェル中でＲＮＡが逆転写される。得られたｃＤＮＡが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータをコードする５’プライマを用いて、製造者の指示に従って、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）によるＰＣＲにより増幅される。得られた転写テンプレートが、ＭＮＡ―Ｉ条件下で上述のように転写される。エタノール沈殿により、得られた転写産物が精製され、その後Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ―ｓｐｉｎカラム（Ｃａｔ．＃７３２―６２５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いた脱塩ステップが行われる。
【０２４６】
１０ラウンドのＳＥＬＥＸの後、得られた転写産物ライブラリが逆転写され、ＰＣＲにより増幅され、クローニングおよび配列決定される。個々のクローンがＭＮＡ―Ｉ条件下で転写され、標的タンパク質を結合および阻害する能力につきアッセイされる。
【０２４７】
（実施例１０）２’―ＯＭｅ  ＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｍＴｍＶ組成物）
２００ｎＭの４０ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ  ８０００、２．５単位／ｍｌ無機ピロホスファターゼ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―ＯＭｅ  ＴＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２４８】
（実施例１１）デオキシＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｄＴｍＶ組成物）
２００ｎＭの二本鎖転写テンプレートＡＲＣ３２０５、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―デオキシＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、２．５単位／ｍｌ無機ピロホスファターゼ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―デオキシＴＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２４９】
（実施例１２）２’―ＯＨ  ＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｒＴｍＶ組成物）
２００ｎＭの４０ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―ＯＨ  ＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―ＯＨ  ＴＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２５０】
（実施例１３）デオキシＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｄＵｍＶ組成物）
２００ｎＭの二本鎖転写テンプレートＡＲＣ３２０５、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―デオキシＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―デオキシＵＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２５１】
（実施例１４）２’―ＯＨ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｒＵｍＶ組成物）
２００ｎＭの二本鎖転写テンプレートＡＲＣ３２０５、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―ＯＨ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―ＯＨ  ＵＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２５２】
（実施例１５）２’―ＯＨ  ＧＴＰ、デオキシＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｒＧｄＴｍＭ組成物）
２００ｎＭの二本鎖転写テンプレートＡＲＣ３２０５、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―デオキシＴＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＨ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動したバンドが観察された。２’―デオキシＴＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２５３】
（実施例１６）２’―ＯＭｅ  ＱＴＰ、２’―ＯＨ  ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰヌクレオチドを導入する転写（ｍＱｒＧｍＭ組成物）
２００ｎＭの４０ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＱＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰ、２’―ＯＨ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５およびＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異Ｔ７ポリメラーゼにより、４００ｕｌ転写が準備された。２’―ＯＭｅ  ＱＴＰ（ｍＱ）が下に示される：
【０２５４】
【化２０】
2011504357.tif 000035
溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するＭＮＡ転写産物と共移動した明らかなバンドが観察された。２’―ＯＭｅ  ＱＴＰを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
【０２５５】
（実施例１７）修飾および野生型Ｔ７ポリメラーゼを用いて２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰまたは２’―ＯＨ  ＮＴＰｓを導入する転写（ｒＧｄＴｍＭ組成物）
５０ｎＭの３０ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、各１．５ｍＭの２’―ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ  ＣＴＰおよび２’―ＯＭｅ  ＧＴＰ、または各１．５ｍＭの２’―ＯＨ  ＵＴＰ、２’―ＯＨ  ＡＴＰ、２’―ＯＨ  ＣＴＰおよび２’―ＯＨ  ＧＴＰ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％ＰＥＧ８０００、無機ピロホスファターゼ２．５単位／ｍｌ、ｐＨ７．５および以下に示される変異または野生型Ｔ７ポリメラーゼ（ＷＴがＫ３７８Ｒ、ＦがＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ、ＬがＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｌ、ＦＡがＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、ＬＡがＫ３７８Ｒ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）により、４００ｕｌの転写が準備された。溶液が３７℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性ＰＡＧＥを用いて分析された後、ＵＶシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。図１１に示されるように、異なる転写の収率が観察された。
【０２５６】
説明および実施例により本発明を記載してきたが、当業者には当然のことながら、本発明は様々な実施形態において実施することができ、以上の説明および実施例は説明を目的としたものであり、以下の請求の範囲を制限するためのものではない。
【図１】
2011504357.tif 000036
【図２】
2011504357.tif 000037
【図３Ａ】
2011504357.tif 000038
【図３Ｂ】
2011504357.tif 000039
【図４Ａ】
2011504357.tif 000040
【図４Ｂ】
2011504357.tif 000041
【図４Ｃ】
2011504357.tif 000042
【図４Ｄ】
2011504357.tif 000043
【図５】
2011504357.tif 000044
【図６】
2011504357.tif 000045
【図７】
2011504357.tif 000046
【図８】
2011504357.tif 000047
【図９】
2011504357.tif 000048
【図１０】
2011504357.tif 000049
【図１１】
2011504357.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月14日(2009.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011504357000001.app
【国際調査報告】
2011504357.tif 000051
2011504357.tif 000052