(57)【要約】線状ジペプチドの合成におけるCDSの使用、並びに対応するポリヌクレオチドを用いる線状ジペプチド、特にPhe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Tyr-Met、Met-Tyr、Met-Met、Tyr-Tyr、Ile-Met、Met-Ile、Leu-Ile、Ile-Leuのインビボ及びインビトロ合成のためのその応用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有し、且つ一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒する能力を有するタンパク質又はそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする単離された天然若しくは合成のタンパク質又はその少なくとも７アミノ酸残基を含む活性フラグメントの使用。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも20％で35％以下の同一性を有する請求項１に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項３】
配列番号９の一般配列：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S    (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸。[LVI] =ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン、及びS = セリン)
の第１の保存アミノ酸配列を含む請求項１又は２に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項４】
配列番号10の一般配列：
Y - [LVI] - X - X - E - X - P    (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X = 任意のアミノ酸、E = グルタミン酸、及びP = プロリン)
の第２の保存アミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項５】
前記第１の保存アミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが、少なくとも120アミノ酸残基で160以下のアミノ酸残基により隔てられている請求項４に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項６】
前記第１の保存アミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが、少なくとも140アミノ酸残基で150以下のアミノ酸残基により隔てられている請求項５に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項７】
前記第１の保存アミノ酸配列が配列番号１の残基31〜37に相当する請求項３〜６のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項８】
前記第２の保存アミノ酸配列が配列番号１の残基178〜184に相当する請求項４〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項９】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、バチルス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属、フォトラブダス属又はスタフィロコッカス属に属する微生物から単離された請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１０】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サチリス亜種サチリス、バチルス・チューリンゲンシス血清型イスラエレンシス、フォトラブダス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、結核菌、マイコバクテリウム・ボビス又はマイコバクテリウム・ボビスBCGから選択される微生物から単離された請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１１】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、AlbC(配列番号１)、Rv2275(配列番号２)、MT2335(配列番号２)、MRA2294(配列番号２)、TBFG12300(配列番号２)、Mb2298(配列番号２)、BCG2292(配列番号34)、YvmC-Bsub(配列番号３)、YvmClic(配列番号４)、YvmC-Bthu(配列番号５)、pSHaeC06(配列番号６)、Plu0297(配列番号７)、JK0923(配列番号８)、AlbC-his(配列番号35)、Rv2275-his(配列番号36)、YvmC-Bsub-his(配列番号37)からなる群より選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１２】
前記線状ジペプチドが、Phe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Tyr-Met、Met-Tyr、Met-Met、Tyr-Tyr、Ile-Met、Met-Ile、Leu-Ile、Ile-Leuからなる群より選択される請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項で特定されるか、又は配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号20、配列番号21、配列番号17の114位〜861位、配列番号18の114位〜1008位及び配列番号19の114位〜885位からなる群より選択されるタンパク質又はその活性フラグメントをコードする単離された天然又は合成の核酸配列の使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、該核酸コード配列を少なくとも１つの宿主細胞に導入するように構成され、そのことにより前記コード配列が前記宿主細胞の内因性発現機構によって発現される、組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、配列番号17、配列番号18及び配列番号19を含む群から選択される組換えベクター。
【請求項１６】
少なくとも２つのタンパク質又はその活性フラグメントのコード配列を含む請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
前記少なくとも２つのコード配列が異なる遺伝子に由来する請求項１６に記載の組換えベクター。
【請求項１８】
前記少なくとも２つのコード配列が単一遺伝子に由来する請求項１７に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
前記宿主細胞が原核生物である請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項２０】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、該核酸コード配列を無細胞発現系において、該無細胞発現系の内因性転写機構により発現するように構成されている組換えベクター。
【請求項２２】
ａ)１種以上のアミノ酸から線状ジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成する能力を有する宿主細胞を培地で培養する工程と、
ｂ)前記線状ジペプチドを形成させ、前記宿主細胞中及び任意に前記培地中に蓄積させる工程と、
ｃ)前記宿主細胞の抽出物及び任意に前記培地から前記線状ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする、線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２３】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、前記宿主細胞の内因性遺伝子によりコードされる請求項２２に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２４】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、前記宿主細胞の内因性遺伝子によりコードされない請求項２３に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、少なくとも２つのタンパク質又はその活性フラグメントのコード配列を含む請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２６】
前記少なくとも２つのコード配列が異なる遺伝子に由来する請求項２５に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つのコード配列が単一遺伝子に由来する請求項２５に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２８】
ａ)無細胞発現系を、１種以上のアミノ酸からジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成するように誘発する工程と、
ｂ)少なくとも１つのアミノ酸基質を、前記タンパク質又はその活性フラグメントに導入する工程と、
ｃ)前記ジペプチドを形成及び蓄積させる工程と、
ｄ)前記ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする、線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２９】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)以下のモチーフ：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S    (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及びS = セリンであって、
H、LVI、G又はSの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちHはリジン又はアルギニンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Gはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Sはシステイン、スレオニン又はメチオニンで置き換えられることができる)
Y - [LVI] - X - X - E - X - P     (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X = 任意のアミノ酸、E = グルタミン酸及びP = プロリンであって、
Y、LVI、E、X又はPの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちYはフェニルアラニン又はトリプトファンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Eはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミンのいずれか１つで置き換えられることができ、Pはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができる)
の少なくとも一方を有する候補ポリペプチド配列を同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチドのコード配列を、前記候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することにより、ポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の取り込みを誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対的生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)以下のモチーフ：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S    (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及びS = セリンであって、
H、LVI、G又はSの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちHはリジン又はアルギニンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Gはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Sはシステイン、スレオニン又はメチオニンで置き換えられることができる)
Y - [LVI] - X - X - E - X - P    (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X = 任意のアミノ酸、E = グルタミン酸及びP = プロリンであって、
Y、LVI、E、X又はPの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちYはフェニルアラニン又はトリプトファンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Eはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミンのいずれか１つで置き換えられることができ、Pはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができる)
の両方を有する候補ポリペプチド配列を同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチドのコード配列を、前記候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することにより、ポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の取り込みを誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記第１の保存モチーフ(配列番号９)と前記第２の保存モチーフ(配列番号１0)とが、少なくとも75で250以下のアミノ酸により隔てられている請求項３０に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項３２】
前記第１の保存モチーフ(配列番号９)及び／又は前記第２の保存モチーフ(配列番号10)が、１より多い残基の変更を含む請求項３０又は３１に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項３３】
工程ａ)が、ポリメラーゼ連鎖反応において配列番号22及び配列番号23の縮重プライマーを用いる候補ペプチドコード核酸配列の増幅を含む請求項２９、３０、３１又は３２のいずれか１項に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項３４】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するか、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号35、配列番号36、配列番号37のいずれか１つと少なくとも20％の同一性を有する候補ポリペプチドを同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチド配列を、該候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することによりポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の取り込みを誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線状ジペプチド(本明細書では、直鎖ジペプチドともいう)の合成におけるCDSの使用、及び対応するポリヌクレオチドを用いる線状ジペプチド、特にPhe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Tyr-Met、Met-Tyr、Met-Met、Tyr-Tyr、Ile-Met、Met-Ile、Leu-Ile、Ile-Leuのインビボ及びインビトロでの合成のためのその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
製薬、ヘルスケア製品、食品サプリメント、化粧品などの種々の分野におけるいくつかの線状ジペプチド及びそれらの誘導体の有用な特性が、既に示されている。
例えば、Val-Tyr及びIle-Tyrジペプチドは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)活性を阻害することが示されており(Maruyamaら，J．Jpn．Soc．Food Sci．Technol．2003，50，310〜315)、また、これらは、インビボ抗高血圧効果も有する(Tokunagaら，J．Jpn．Soc．Food Sci．Technol．2003，50，457〜462；Matsuiら，Clin．Exp．Pharmacol．Physiol.，2003，4，262〜265)。多くのその他のジペプチド(例えばVal-Trp、Val-Phe、Ile-Trp、Ala-Tyr)も、ACE阻害製品として知られている(Das及びSoffer，J．Biol．Chem.，1975，250，6762〜6768；Cheungら，J．Biol．Chem.，1980，255，401〜407)。
【０００３】
ウシの脳で最初に単離され、その後、ヒトを含む多くの他の種の脳で見出された(Takagiら，Nature，1979，282，410〜412；Shiomiら，Neuropharmacology，1981，20，633〜638)神経ジペプチドであるキョウトルフィン(Tyr-Arg)も、生物活性分子であることが示されている。これは、鎮痛効果を含む種々のオピオイド活性を有する(Bean及びVaught，Eur．J．Pharmacol.，1984，105，333〜337)。D-キョウトルフィン(すなわちTyr-D-Arg)又はN-メチル化キョウトルフィン(すなわちTyrΨ[CON(Me)]-Arg)アナログは、天然のキョウトルフィンよりも強いインビボ鎮痛効果を示し、これはおそらく、ペプチド分解に対するそれらのより良好な耐性に起因する(Takagiら，CMLS，1982，38，1344〜1345；Uedaら，Peptides，2000，21，717〜722)。
【０００４】
有用なジペプチドの他の例は、いくつかのヒト組織で見出されるカルノシン(β-Ala-His)及びホモカルノシン(γ-アミノブチリル-His)である。糖尿病性続発性合併症(例えば白内障)、アテローム性動脈硬化症、癌又は炎症性疾患における種々の可能性のある予防的又は治療的用途が報告されているが、それらの生理的機能は分かっていない(Hipkiss，Int．J．Biochem．Cell Biol.，1998，30，863〜868を参照)。カルノシンは、老化を遅延させ、細胞の若返りを引き起こすと考えられているので、ヒトの健康における補助栄養剤として現在、用いられている。
【０００５】
線状ジペプチドは、特に運動及びフィットネス製品として販売されているいくらかの補助栄養剤だけでなく、完全非経口栄養(TPN)及び経静脈栄養(IVN)製品においても見出される。これらは、グルタミン又はチロシンのように水中で不安定で不溶性のアミノ酸の送達形態として用いられる。
【０００６】
Gly-Gln及びAla-GlnはTPNにおいて用いられて(Jiangら，J．Parenter．Enteral Nut.，1993，17，134〜141)、外傷、感染又は癌のような代謝ストレスの特徴であるグルタミン欠乏を補償する(Zhouら，J．Parenter．Enteral Nut.，2003，27，241〜245)。
同様に、Ala-Tyr、Gly-Tyr及びTyr-Argは、IVN中で、容易に投与され得る形態のチロシンアミノ酸を提供するために用いられる(Kee及びSmith，Nutrition，1996，12，577〜577；Himmelseherら，J．Parenter．Enteral Nut.，1996，20，281〜286)。
最後に、線状ジペプチドは、アスパルテーム分子(Asp-Phe-OMe)により例示されるように、矯味矯臭剤として食品分野でも用いられ、これは、全世界で販売されている糖代替物として用いられる。これは、食卓調味料としてしばしば提供され、ダイエット食品又は飲料中に一般的に用いられる。
【０００７】
線状ジペプチドを製造する既知の方法は、化学合成、天然の産生体生物からの抽出及び酵素学的方法を含む。
化学的方法を用いてジペプチド誘導体を合成できるが、これらは線状ジペプチド合成において保護及び脱保護の工程を用いることがしばしば必要であるので、費用に関して不利であると考えられる。更に、これらは大量の有機溶媒などを用いるので、環境にやさしい方法ではない。
【０００８】
天然の原核生物又は真核生物の産生体からの線状ジペプチドの抽出を用いることができるが、天然産生物中の所望のジペプチド誘導体の全含有量はしばしば低く、産生体生物を操作するのは困難であり得るので、生産性及び収率は、一般的に低い。別の大きい短所は、一般には、単一の天然(例えば遺伝的に変更されていない)産物又は生物中に、全ての可能性のある線状ジペプチドが存在しているわけではないことである。
【０００９】
酵素学的方法、すなわちインビボ(例えば内因性若しくは異種のジペプチド合成酵素を発現する微生物の培養物中又は培養培地から単離された微生物細胞中)又はインビトロ(例えば精製ジペプチド合成酵素)のいずれかで酵素を用いる方法を用いることができる。
【００１０】
以下の方法が既に知られている。
プロテアーゼの逆反応を用いる方法(Bergmann及びFraenkel-Conrat，J．Biol．Chem.，1937，119，707〜720)；しかし、プロテアーゼの逆反応を利用する方法は、基質として用いるアミノ酸の官能基のための保護基の導入及び除去を必要とし、このことは、ペプチド形成反応の効率の上昇、及びペプチド分解反応の防止を困難にする。
【００１１】
熱安定性アミノアシルt-RNA合成酵素を用いる方法(日本国特許出願第146539/83号、日本国特許出願第209991/83号、日本国特許出願第209992/83号及び日本国特許出願第106298/84号)；熱安定性アミノアシルt-RNA合成酵素を用いる方法は、この酵素の発現及び所望の産物の他に望ましくない副産物が形成される副反応の防止を防ぐのが困難であるという問題を有する。
【００１２】
プロリンイミノペプチダーゼの逆反応を用いる方法(WO03/010307)；プロリンイミノペプチダーゼを用いる方法は、基質として用いられるアミノ酸の１つのアミド化を必要とし、このこともまた、この方法を行うことを困難にする。
【００１３】
非リボソームペプチド合成酵素(本明細書において以下、NRPSという)を用いる方法(Doekel及びMarahiel，Chem．Biol.，2000，7，373〜384；Dieckmannら，FEBS Lett.，2001，498，42〜45；米国特許第5,795,738号及び米国特許第5,652,116号)。NRPSを用いる方法は、補酵素４'-ホスホパンテテインの供給が必須であるという点で非効率的である。
【００１４】
NRPSの酵素分子量よりも低い酵素分子量を有し、補酵素４'-ホスホパンテテインを必要としないペプチド合成酵素群も存在する。例えば、ガンマ-グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、D-アラニル-D-アラニン(D-Ala-D-Ala)リガーゼ及びポリ-ガンマ-グルタメート合成酵素である。これら酵素のほとんどは、基質としてD-アミノ酸を利用するか、ガンマ-カルボキシル基でのペプチド結合形成を触媒する。この結果として、これらは、L-アミノ酸のアルファ-カルボキシル基でのペプチド結合形成によるジペプチドの合成のために用いることができない。
【００１５】
L-アミノ酸のアルファ-カルボキシル基でのペプチド結合形成によりジペプチドを合成できる酵素の例は、バシリシン(bacilysin)合成酵素である(バシリシンは、バチルス属(Bacillus)に属する微生物に由来するジペプチド抗生物質である)。バシリシン合成酵素は、バシリシン[L-アラニル-L-アンチカプシン(L-Ala-L-アンチカプシン)]及びL-アラニル-L-アラニン(L-Ala-L-Ala)を合成する活性を有することが知られているが、他のジペプチドを合成するその能力については情報がない(Sakajohら，J．Ind．Microbiol．Biotechnol.，1987，2，201〜208；Yazganら，Enzyme Microbial Technol.，2001，29，400〜406)。
そのゲノム全体が配列決定された(Kunstら，Nature，1997，390，249〜256)バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)168におけるバシリシン生合成遺伝子について、バシリシンの生産性は、ORFであるywfA-Fを含むバシリシンオペロンの増幅により増大することが知られている(WO00/03009)。
【００１６】
ywfE ORFが、L-アミノ酸基質からのアルファ-ジペプチドの合成を担うL-アミノ酸リガーゼをコードすることが最近示された。酵素は、広範囲のアルファ-ジペプチドの形成を導く広い基質特異性を有することが示された(Tabataら，J．Bacteriol.，2005，187，5195〜5202；米国特許出願第20050287626号)。
【００１７】
本発明者らは、NRPSと類似性がないAlbC(albC遺伝子産物)が、ストレプトミセス・ノウルセイ(Streptomyces noursei)ATCC 11455における、抗菌物質であるアルボノウルシン(シクロ(デルタPhe-デルタLeu))の生合成の間のシクロ(L-Phe-L-Leu)及びシクロ(L-Phe-L-Phe)の形成を担うことを以前に報告した。異種株であるエス・リビダンス(S．lividans)TK21又は大腸菌(Escherichia coli)におけるエス・ノウルセイからのAlbCの発現は、シクロ(L-Phe-L-Leu)及びシクロ(L-Phe-L-Phe)の生成を導き、これらは、培養培地に分泌された(Lautruら，Chem．Biol.，2002，9，1355〜1364；仏国特許第2841260号及びWO2004/000879)。
【００１８】
より最近では、エス・ノウルセイのAlbC(配列番号１)及びエス・アルブルス(S．albulus)のそのホモログ(99％の配列同一性(239アミノ酸のうち238のアミノ酸が同一)及び239残基にわたる100％の配列類似性)は、１種以上のアミノ酸からの直鎖ジペプチドを形成できることが示された。協和発酵工業(Kyowa Hakko Kogyo Co.)により特許出願(米国特許出願第20050287626号)がされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
AlbCが生成できる線状ジペプチドの型は、フェニルアラニン、ロイシン及びアラニンの組合せであると報告されている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、本発明者らにより特徴決定され、特定の配列サインの存在により規定される新たな酵素ファミリーであるシクロジペプチド合成酵素(CDS)を用いて、多様な線状鎖ジペプチド群を創出する方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、エス・ノウルセイ及びエス・アルブルスのAlbCが、CDSファミリーのまさに１つのメンバーであること、及び本出願において本発明者らにより同定されたファミリーの他のメンバーは、遥かに低い、エス・ノウルセイのAlbCとは僅か23〜33％の配列同一性、及びエス・ノウルセイのAlbCと212〜226残基にわたって41〜53％の配列類似性を示すことを見出した。
【００２１】
本発明者らは、驚くべきことに、CDSファミリーの多様なメンバーが、線状ジペプチドの合成を触媒するために必要な機能性を保持することを見出し、また驚くべきことに、該ファミリーのこれら異なるメンバーが、形成できる線状ジペプチドの種類について非常に有用な多様性を示し、AlbCにより形成されない線状ジペプチドの形成を触媒できること、及びAlbCが、以前に報告されていたよりも遥かに広い範囲の線状ジペプチドを生成することを見出した。
【００２２】
本発明者らは、このような方法を行うための材料を提供し、特に、同定した種々のCDSメンバーをコードする必要な核酸及びペプチド配列、並びにこれら酵素を発現するように適切な微生物を遺伝的に改変するためのベクターを提供する。
【００２３】
本発明者らは、更なるメンバーの単離及び特徴決定を可能にし、本発明により生成できる線状ジペプチドの種類を増加させる、種々の探索ストラテジーを用いてこのファミリーの更なるメンバーを同定するための手段も提供する。
【００２４】
本発明は、エス・ノウルセイのAlbCタンパク質に相当する配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質又はそのフラグメントからなる群より選択される、単離された天然若しくは合成のタンパク質又はそのようなタンパク質の活性フラグメントの使用に関する。このタンパク質又はその活性フラグメントは、一般式(ｉ)：
R1 − R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表す)
の線状ジペプチドの形成を触媒する能力を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本タンパク質の活性フラグメントは、線状ジペプチドについてのベースの生成レベルから統計学的に有意に上昇したレベルで線状ジペプチドの形成を触媒する能力を示すものである。特に、活性フラグメントは、機能性を有するために、少なくとも７アミノ酸残基の長さである必要があると考えられる。
【００２６】
本明細書で規定される配列同一性及び配列類似性のパーセンテージは、BLASTプログラムを用いて得られた(blast2seq、デフォルトパラメータ)(Tatutsova及びMadden，FEMS Microbiol Lett.，1999，174，247〜250)。
このようなパーセンテージ配列同一性及び類似性は、本明細書の図１に示すように、配列番号１との全長比較から導かれる。好ましくは、これらパーセンテージは、図１に示すように、上記の配列の長さの一部を示すオーバーラップに対して計算することにより導かれる。
【００２７】
好ましくは、本タンパク質又はその活性フラグメントは、配列番号１と少なくとも20％で50％以下の同一性を有する。
最も好ましくは、本タンパク質又はその活性フラグメントは、配列番号１と少なくとも20％で35％以下の同一性を有する。
【００２８】
記載された最初のCDSであるAlbC(Lautruら，Chem．Biol.，2002，9，1355〜1364)の239アミノ酸の配列と、データベースとの比較により、中程度の同一性及び類似性を有する、機能が未知の７つの仮想タンパク質(hypothetical protein)が同定された(図１)。AlbCと212残基にわたって33％の同一性と53％の類似性を示す、289アミノ酸の仮想タンパク質は、結核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex)に属するいくつかの生物のゲノムによりコードされていた。このタンパク質を、結核菌H37RvにおいてRv2275(配列番号２)(アクセッション番号NP 216791)、結核菌CDC 1551においてMT2335(アクセッション番号NP 336805)、結核菌H37RaにおいてMRA2294(アクセッション番号YP001283620)、結核菌F11においてTBFG12300(アクセッション番号YP001288233)、及びマイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)AF2122/97においてMb2298(アクセッション番号NP 855947)と命名した。よって、いくつかのマイコバクテリア株によりコードされるタンパク質は、以下、Rv2275(配列番号２)とよぶ。Rv2275は、AlbCよりも長く、AlbCとは整列しない49アミノ酸のN-末端部分を含む。他の仮想タンパク質が、エム・ボビスBCGパスツール1173P2株で見出された。BCG2292と命名されたこのタンパク質(アクセッション番号YP978381、配列番号34)は、Rv2275(配列番号２)タンパク質と、配列番号２において残基261のEがAに置き換えられている以外は同一である。
【００２９】
データベース検索によって、バチルス種に由来する３つの更なる別の相同タンパク質も明らかになった：AlbCと221残基にわたって29％の同一性と47％の類似性を示す、YvmCと命名された(以下、YvmC-Blicとよぶ、配列番号４)、同一の２つの249アミノ酸仮想タンパク質が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)ATCC 14580(アクセッション番号AAU25020)及びバチルス・リケニフォルミスDSM 13(アクセッション番号AAU42391)で見出された。AlbCと226残基にわたって29％の同一性と46％の類似性を有する１つの248アミノ酸YvmCタンパク質(以下、YvmC-Bsubとよぶ、配列番号３)は、バチルス・サチリス亜種サチリス(Bacillus subtilis subsp．subtilis)168株(アクセッション番号CAB15512)によりコードされた。214残基にわたって26％の同一性と45％の類似性を示す、RBTH_07362と命名された１つの238アミノ酸仮想タンパク質(以下、YvmC-Bthuとよぶ、配列番号５)は、バチルス・チューリンゲンシス血清型イスラエレンシス(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)ATCC 35646(アクセッション番号EAO57133)に由来する。２つ一組での比較では、バチルス種のこれら３つの異なるタンパク質は、より高い配列同一性及び類似性を有する(236〜247残基にわたって、61〜70％の同一性及び76〜81％の類似性)。
【００３０】
AlbCと相同なタンパク質の中に、AlbCと224残基にわたって28％の同一性と49％の類似性を示し、フォトラブダス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ(Photorhabdus luminescens subsp．laumondii)TTO1(NP 927658)で見出された234アミノ酸の仮想タンパク質Plu0297(配列番号７)も明らかになった。
【００３１】
別のAlbC相同タンパク質は、スタフィロコッカス・ヘモリティカス(Staphylococcus haemolyticus)JCSC1435株が有する約８ kbのpSHaeCプラスミドによりコードされた。pSHaeC06と命名されたタンパク質(配列番号６)は、234アミノ酸長であり、AlbCと220アミノ酸にわたって20％の同一性と44％の類似性を示す(アクセッション番号YP 254604)。
【００３２】
別の仮想タンパク質が、コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)K411のゲノム中でAlbCに相同であることが見出された。Jk0923と命名された216アミノ酸のタンパク質(アクセッション番号YP 250705、配列番号８)は、AlbCと212残基にわたって23％の同一性と41％の類似性を示す。
【００３３】
全ての場合において、これら対応関係は、タンパク質又はその活性フラグメントを配列番号１と整列させ、配列番号１のどこに保存配列が出現するかの決定を可能にするように、BLASTのような２つ一組での比較プログラムでこれらタンパク質又はそのフラグメントを配列番号１と比較するときに生じる。
【００３４】
７つの関連する仮想タンパク質とAlbCとのアミノ酸配列アラインメントにより、全てのタンパク質のうち13個の位置だけが保存されていることが示されたが、２つの特によく保存された領域が強調された。一方は残基31〜37(AlbCの番号付け)を含み、他方は残基178〜184(AlbCの番号付け)を含む(図１)。
これら２つの領域をそれぞれ用いて、２つの配列パターンH-X-[LVI]-[LVI]-G-[LVI]-S(配列番号９)及びY-[LVI]-X-X-E-X-P(配列番号10)を規定し、これらが、120〜160アミノ酸により隔てられてタンパク質中に同時に存在するかどうかを、Uniprot(Nucleic Acids Res．2007 Jan;35(データベース版):D193-7)において、PATTINPROT(Combetら，TIBS，2000，25，147〜150)を用いて走査した。
【００３５】
この検索により、AlbC及び上記のそのホモログ(Rv2275及びBCG2292、YvmC-Bsub、Yvmc-Blic、YvmC-Bthu、Plu0297、pSHaeC06及びJk0923)だけが明らかになった。よって、この第１の配列サインを用いて検索して、AlbCに関連する新たなタンパク質ファミリーを規定できることが示された。本発明者らは、これら酵素全てをシクロジペプチド合成酵素(CDS)と命名した。このファミリーに属する８つのタンパク質が、多様な線状ジペプチドを合成できることは下記に示されている。
【００３６】
上記の使用の好ましい実施形態において、本タンパク質又はその活性フラグメントは、配列番号９の一般配列の第１の保存アミノ酸配列を有する：
H-X-[LVI]-[LVI]-G-[LVI]-S    (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及び S = セリン)。
【００３７】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、本タンパク質又はその活性フラグメントは、配列番号10の一般配列の第２の保存アミノ酸配列を有する：
Y - [LVI] - X - X - E - X - P    (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X = 任意のアミノ酸、E = グルタミン酸、P = プロリン)。
最も好ましくは、本タンパク質又はその活性フラグメントは、第１及び第２の保存アミノ酸配列を両方有する。
【００３８】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、第１の保存アミノ酸配列と第２のアミノ酸配列は、少なくとも120アミノ酸残基で160以下のアミノ酸残基により隔てられている。
最も好ましくは、第１の保存アミノ酸配列と第２のアミノ酸配列は、少なくとも140アミノ酸残基で150以下のアミノ酸残基により隔てられている。
【００３９】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、第１の保存アミノ酸配列は、本タンパク質又はその活性フラグメントにおいて、配列番号１の残基31〜37に相当する。
上記の使用の別の好ましい実施形態において、第２の保存アミノ酸配列は、本タンパク質又はその活性フラグメントにおいて、配列番号１の残基178〜184に相当する。
【００４０】
本発明者らは、特定の配列サインの存在及びサイズの類似性に基づいて、AlbCに関連する新たなタンパク質ファミリーを同定し、今回、予期せぬことに、新しく同定されたCDSファミリーの全てのメンバーも線状ジペプチドを合成できることを見出した。
【００４１】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、本タンパク質又はその活性フラグメントは、バチルス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、ストレプトミセス、フォトラブダス又はスタフィロコッカスの属に属する微生物から単離された。
【００４２】
上記の使用のより好ましい実施形態によると、本タンパク質又はその活性フラグメントは、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サチリス亜種サチリス、バチルス・チューリンゲンシス血清型イスラエレンシス、フォトラブダス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、結核菌、マイコバクテリウム・ボビス又はマイコバクテリウム・ボビスBCGから選択される微生物から単離された。
【００４３】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、本タンパク質又はその活性フラグメントは、AlbC(配列番号１)、Rv2275(配列番号２)、MT2335(配列番号２)、MRA2294(配列番号２)、TBFG12300(配列番号２)、Mb2298(配列番号２)、BCG2292(配列番号34)、YvmC-Bsub(配列番号３)、YvmC-Blic(配列番号４)、YvmC-Bthu(配列番号５)、pSHaeC06(配列番号６)、Plu0297(配列番号７)、JK0923(配列番号８)、AlbC-his(配列番号35)、Rv2275-his(配列番号36)、YvmC-Bsub-his(配列番号37)からなる群より選択される。
【００４４】
好ましくは、ジペプチドは、特に、Phe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Tyr-Met、Met-Tyr、Met-Met、Tyr-Tyr、Ile-Met、Met-Ile、Leu-Ile、Ile-Leuであり得る。
【００４５】
本発明は、本明細書に記載されるタンパク質又はその活性フラグメントをコードする単離された天然又は合成の核酸配列の使用も提供する。
【００４６】
本発明は、更に、線状ジペプチドの合成のための、
ａ)上記で規定されるシクロジペプチド合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
ｂ)ポリヌクレオチドａ)の相補ポリヌクレオチド、
ｃ)ポリヌクレオチドａ)又はｂ)に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチドの使用に関する。
【００４７】
有利には、上記のポリヌクレオチドは、配列番号11、配列番号12、配列番号13〜16、20又は21の配列のポリヌクレオチドからなる群より選択される。配列番号11、配列番号12、配列番号13〜16の配列のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜５及び配列番号７の配列のポリペプチドをコードし、配列番号20及び21のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６及び８のポリペプチドをコードする。更に、配列番号17の114位〜861位に相当するポリヌクレオチドは、配列番号35のポリペプチドAlbC-hisをコードし、配列番号18の114位〜1008位に相当するポリヌクレオチドは、配列番号36のポリペプチドRv2275-hisをコードし、配列番号19の114位〜885位に相当するポリヌクレオチドは、配列番号37のポリペプチドYvmC-Bsub-hisをコードする。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「ハイブリダイズする」は、ポリヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドが、記載される核酸配列又はその部分とハイブリダイズするプロセスをいう。よって、上記の核酸配列は、それぞれのサイズに応じて、RNA若しくはDNA調製物のそれぞれノーザンブロット若しくはサザンブロット分析においてプローブとして有用であるか、又はPCR分析においてオリゴヌクレオチドプライマーとして用いることができる。上記のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも15ヌクレオチドを含む。一方、プローブとして用いられる本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチドを含む。
【００４９】
核酸分子を用いてハイブリダイゼーション実験を実施する方法は当該技術において公知である。すなわち、当業者は、本発明に従ってどのハイブリダイゼーション条件を使用すべきかが分かる。このようなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第２版、1989及び第３版、2001；Gerhardtら；Methods for General and Molecular Bacteriology；ASM Press，1994；Lefkovits；Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press，1997；Golemis；Protein-Protein Interactions：A Molecular Cloning Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002のような標準的な教科書中、及び当業者に知られているか又は上記で引用したような他の標準的な実験手引書中に言及されている。本発明に従えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。
【００５０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、42℃での、50％ホルムアミド、５×SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハルト溶液、10％デキストラン硫酸及び20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中での一晩のインキュベーション、続いて例えば0.2×SSC中で約65℃でのフィルタの洗浄をいう。
【００５１】
低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする核酸分子も企図される。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出のストリンジェンシーの変更は、主に、ホルムアミド濃度、塩濃度又は温度の操作により達成される。例えば、低ストリンジェンシー条件は、37℃での、６×SSPE(20×SSPE = ３mol/l NaCl；0.2mol/l NaH2PO4；0.02mol/l EDTA、pH7.4)、0.5％ SDS、30％ホルムアミド、100μg/mlサケ精子ブロッキングDNAを含む溶液中での一晩のインキュベーション、続く50℃での１×SSPE、0.1％ SDSでの洗浄を含む。
【００５２】
また、更に低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に行われる洗浄を、より高い塩濃度(例えば５×SSC)で行うことができる。上記の条件の変動は、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために用いられる代替ブロッキング試薬の包含及び／又は置換により達成できることに注目されたい。典型的なブロッキング試薬は、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNA及び商業的に入手可能な独自の処方物を含む。
【００５３】
本発明は、上記で規定される核酸コード配列を含む組換えベクターも提供する。このベクターは、核酸コード配列を宿主細胞に導入するように構成され、そのことにより、このコード配列は、該宿主細胞の内因性の転写及び翻訳機構によって転写及び翻訳される。
組換えベクターは、上記で規定される少なくとも２つのタンパク質又はその活性フラグメントをコードする配列を含み得る。複数のコード配列を提供することにより、本発明者らは、適切なコード配列を含ませることによって、いくつかのCDS酵素からいくつかの酵素特異的線状ジペプチドを生成する手段を提供する。
【００５４】
よって、少なくとも２つのコード配列は、異なる遺伝子からである。
或いは、少なくとも２つのコード配列は、単一遺伝子からである。この場合、同じ遺伝子産物についての複数のコード配列を提供することにより、外因性遺伝子産物のレベルの増幅が可能になり、線状ジペプチド形成の速度が増大する。
【００５５】
好ましくは、宿主細胞は原核生物である。原核細胞は、一般的に培養が単純であり、発酵の合間の貯蔵が容易であるので、単純な培地及び増殖条件から大規模で著しいレベルの線状ジペプチドを製造するための理想的な系とされる。
最も好ましくは、宿主細胞は、異なる複数の発現系及び培養技術が存在する最もよく特徴決定された原核生物である大腸菌である。
【００５６】
本発明は更に、上記で規定される核酸コード配列を含む組換えベクターに関する。このベクターは、無細胞発現系の内因性機構により、無細胞発現系において核酸コード配列を発現するように構成される。
【００５７】
本発明はまた、以下の工程：
ａ)１種以上のアミノ酸から線状ジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成する能力を有する宿主細胞を培地で培養する工程と、
ｂ)前記線状ジペプチドを形成させ、前記宿主細胞中に、場合によっては前記培地中にも蓄積させる工程と、
ｃ)前記細胞抽出物及び培地から前記線状ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択される、線状ジペプチドの製造方法を提供する。
【００５８】
好ましくは、前記タンパク質又はその活性フラグメントはまた、宿主細胞の内因性遺伝子によってコードされる。
或いは、前記タンパク質又はその活性フラグメントは、宿主細胞の内因性遺伝子によりコードされない。
【００５９】
本発明はまた、以下の工程：
ａ)無細胞発現系を、１種以上のアミノ酸から線状ジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成するように誘発する工程と、
ｂ)少なくとも１つのアミノ酸基質を、前記タンパク質又はその活性フラグメントに導入する工程と、
ｃ)前記線状ジペプチドを形成及び蓄積させる工程と、
ｄ)前記線状ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択される、線状ジペプチドの製造方法に関する。
【００６０】
本発明は更に、一般式(ｉ)：
R1 - R2     (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)以下のモチーフ：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S    (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及びS = セリンであって、
H、LVI、G又はSの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちHはリジン又はアルギニンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Gはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Sはシステイン、スレオニン又はメチオニンで置き換えられることができる)
Y - [LVI] - X - X - E - X - P    (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X = 任意のアミノ酸、E = グルタミン酸及びP = プロリンであって、
Y、LVI、E、X又はPの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちYはフェニルアラニン又はトリプトファンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Eはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミンのいずれか１つで置き換えられることができ、Pはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができる)
の少なくとも一方を有する候補ポリペプチド配列を同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチドのコード配列を、前記候補ペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することにより、ポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の取り込みを誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対的生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００６１】
よって、本発明者らは、線状ジペプチドを合成できる更なる酵素の同定のための系統的アプローチを提供する。このアプローチは、本発明者らが初めて同定した２つの保存モチーフを用い、これらドメイン又はその誘導体の一方又は両方を有する適切な候補ポリペプチドの同定をコンピュータ上で(in silico)可能にする。
【００６２】
これら候補ポリペプチドは、次いで、該候補ポリペプチドの発現をその活性が認識できるようになるレベルで可能にする特性を有する適切なプロモーターに連結される。認識できるようになるのに必要とされる正確なレベルは、用いられる正確な発現系に依存して変化する。そのため、具体的な詳細は提供しないが、一般的な実験慣行である。
【００６３】
上記の方法の好ましい実施形態によると、前記第１の保存モチーフ(配列番号９)と前記第２の保存モチーフ(配列番号10)とは、少なくとも75で250以下のアミノ酸によって隔てられている。
【００６４】
したがって、候補ポリペプチドの同定システムは、第１及び第２の保存モチーフ(それぞれ配列番号９及び10)がともに存在する場合にこれらが75〜250のアミノ酸によって隔てられている候補分子を包含し得る。
好ましくは、第１の保存モチーフ(配列番号９)及び／又は第２の保存モチーフ(配列番号10)は、１より多い残基の変更を含む。
【００６５】
本発明はまた、一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じてあっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するか、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号35、配列番号36、配列番号37のいずれか１つと少なくとも20％の同一性を有する候補ポリペプチドを同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチド配列を、該候補ペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することによりポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系に導入して、該少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の発現を誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の細胞抽出物及び増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド融合構築物による線状ジペプチドの相対生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００６６】
本発明のより良好な理解のため、及び本発明を実施する方法を示すために、例示のためだけに、添付の図面を参照して、本発明による具体的な実施形態、方法及びプロセスを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ストレプトミセス・ノウルセイからのAlbC(配列番号１)と、他のCDSタンパク質とのアミノ酸配列アラインメントを示す。関連するタンパク質は、結核菌からのRv2275(配列番号２)、バチルス・サチリスからのYvmC(本明細書ではYvmC-Bsubという、配列番号３)、バチルス・リケニフォルミスからのYvmC(本明細書ではYvmC-Blicという、配列番号４)、バチルス・チューリンゲンシスからのYvmC(本明細書ではYvmC-Bthuという、配列番号５)、スタフィロコッカス・ヘモリティカスからのpSHaeC06(配列番号６)、フォトラブダス・ルミネセンスからのPlu0297(配列番号７)及びコリネバクテリウム・ジェイケイウムからのJk0923(配列番号８)である。高度に保存された13個の位置(全ての配列において同一の残基)を、黒色の背景で示す。中程度の保存の位置を箱で囲む。
【図２】図２は、AlbC-hisを発現する大腸菌細胞の可溶性画分のLC-MS分析から検出された、AlbC-his(配列番号35)に特異的なジペプチドm/z値のEIC(上の黒色の線)を、対照サンプルのLCMS分析からの同じEIC(下の灰色の線)と比較して示す。それぞれの特異的EICピークを、図３〜17に示すMS及びMS/MSによる同定について表IIに特定したようにラベルを付した。
【図３】図３は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、20.6分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図４】図４は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.0分に検出されたEICピーク２のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５】図５は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.5分に検出されたEICピーク３のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図６】図６は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.9分に検出されたEICピーク４のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図７】図７は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、23.8分に検出されたEICピーク５のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図８】図８は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.0分に検出されたEICピーク６のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図９】図９は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.9分に検出されたEICピーク７のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１０】図10は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、26.6分に検出されたEICピーク８のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１１】図11は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.0分に検出されたEICピーク９のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１２】図12は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.3分に検出されたEICピーク10のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１３】図13は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.0分に検出されたEICピーク11のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１４】図14は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.3分に検出されたEICピーク12のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１５】図15は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、30.8分に検出されたEICピーク13のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１６】図16は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、31.5分に検出されたEICピーク14のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１７】図17は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、33.4分に検出されたEICピーク15のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図１８】図18は、化学合成したMet-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは19.4分に検出される(図18a)。
【図１９】図19は、化学合成したMet-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは21.6分に検出される(図19a)。
【図２０】図20は、化学合成したIle-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは21.8分に検出される(図20a)。
【図２１】図21は、化学合成したTyr-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは22.8分に検出される(図21a)。
【図２２】図22は、化学合成したLeu-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは22.9分に検出される(図22a)。
【図２３】図23は、化学合成したIle-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.3分に検出される(図23a)。
【図２４】図24は、化学合成したTyr-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.5分に検出される(図24a)。
【図２５】図25は、化学合成したLeu-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.7分に検出される(図25a)。
【図２６】図26は、化学合成したMet-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.0分に検出される(図26a)。
【図２７】図27は、化学合成したIle-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.1分に検出される(図27a)。
【図２８】図28は、化学合成したTyr-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.4分に検出される(図28a)。
【図２９】図29は、化学合成したMet-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.3分に検出される(図29a)。
【図３０】図30は、化学合成したLeu-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.4分に検出される(図30a)。
【図３１】図31は、化学合成したTyr-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.8分に検出される(図31a)。
【図３２】図32は、化学合成したIle-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは26.1分に検出される(図32a)。
【図３３】図33は、化学合成したPhe-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは26.7分に検出される(図33a)。
【図３４】図34は、化学合成したPhe-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは27.1分に検出される(図34a)。
【図３５】図35は、化学合成したLeu-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは27.4分に検出される(図35a)。
【図３６】図36は、化学合成したPhe-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは28.7分に検出される(図36a)。
【図３７】図37は、化学合成したTyr-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは29.0分に検出される(図37a)。
【図３８】図38は、化学合成したMet-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは29.5分に検出される(図38a)。
【図３９】図39は、化学合成したIle-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは30.2分に検出される(図39a)。
【図４０】図40は、化学合成したPhe-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは30.8分に検出される(図40a)。
【図４１】図41は、化学合成したLeu-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは31.5分に検出される(図41a)。
【図４２】図42は、化学合成したPhe-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは33.4分に検出される(図42a)。
【図４３】図43は、Rv2275-hisを発現する大腸菌細胞の可溶性画分のLCMS分析から検出された、Rv2275-his(配列番号36)に特異的なジペプチドm/z値のEIC(上の黒色の線)を、対照サンプルのLCMS分析からの同じEIC(下の灰色の線)と比較して示す。
【図４４】図44は、Rv2275-his(配列番号36)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、23.3分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図４５】図45は、YvmC-Bsub-his(配列番号37)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分のLCMS分析から検出された、YvmC-Bsub-his(配列番号37)に特異的なジペプチドm/z値のEIC(上の黒色の線)を、対照サンプルのLCMS分析からの同じEIC(下の灰色の線)と比較して示す。
【図４６】図46は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、20.6分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図４７】図47は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、21.8分に検出されたEICピーク２のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図４８】図48は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.8分に検出されたEICピーク３のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図４９】図49は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、24.9分に検出されたEICピーク４のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５０】図50は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.4分に検出されたEICピーク5のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５１】図51は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.9分に検出されたEICピーク６のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５２】図52は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、26.8分に検出されたEICピーク７のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５３】図53は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.3分に検出されたEICピーク８のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５４】図54は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.2分に検出されたEICピーク９のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５５】図55は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、30.8分に検出されたEICピーク10のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５６】図56は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、31.4分に検出されたEICピーク11のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５７】図57は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、33.3分に検出されたEICピーク12のMS及びMS/MSスペクトルを示す。
【図５８】図58は、線状ジペプチドの網羅的なスクリーニングプロトコルをまとめる。
【図５９】図59は、全てのCDS配列のアラインメントの一部分を示す。第１プライマーの設計に用いた領域をアラインメントの下に線で示す。番号付けは、エス・ノウルセイのAlbCのものである。縮重アミノ酸配列を対応するヌクレオチド配列と共に示す。ヌクレオチドについて、B = C又はG又はT、N = A又はC又はG又はT、R = A又はG、S = C又はG、W = A又はT、Y = C又はT。
【図６０】図60は、全てのCDS配列のアラインメントの一部分を示す。第２プライマーの設計に用いた領域をアラインメントの下に線で示す。番号付けは、エス・ノウルセイのAlbCのものである。縮重アミノ酸配列を対応するヌクレオチド配列及びプライマーとして用いた相補鎖(最下行)と共に示す。ヌクレオチドについて、D = A又はG又はT、K = G又はT、M = A又はC、N = A又はC又はG又はT、R = A又はG、S = C又はG、W = A又はT、Y = C又はT。
【実施例】
【００６８】
ここで、本発明者らにより企図される具体的形態を例示として記載する。以下の記載において、多くの具体的な詳細が、充分な理解のために記載される。しかし、本発明がこれら具体的な詳細に限定されることなく実施できることは当業者に明白である。また、説明を不必要に不明瞭にしないために、周知の方法及び構造については記載しない。
【００６９】
実施例１：実験方法
１)バイオインフォマティックツール
プログラムのデフォルトパラメータを用いてタンパク質ホモログを検索するBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(National Center for Biotechnology Informationウェブサイト；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。Multalin(Corpet，Nucleic Acids Res.，1988，16，10881〜10890)(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)又はClustal W(Thompson JD，Higgins DG，Gibson TJ．Nucleic Acids Res．1994，22：4673〜4680 European Bioinformatics Instituteウェブサイト；http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)をデフォルトパラメータで用いて、配列アラインメントを行った。
【００７０】
２)CDSをC-末端(His)6-タグ融合体としてコードする大腸菌発現ベクターの構築
AlbC、Rv2275及びYvmC-Bsubをコードする配列を、大腸菌発現ベクターpQE60(Qiagen)にクローニングした。このために、開始コドンと重複するNcoI部位を加え、他端で最後のセンスコドンの直後にBglII部位を加えるように設計されたプライマーを用いるPCR(標準的な条件を用いる25サイクル)によりコード配列を増幅した。先ずPCR産物をpGEMT-Easyベクター(Promega)にクローニングし、次いでコード配列を含むNcoI-BglIIフラグメントを、NcoI及びBglIIにより消化したpQE60にクローニングした。得られたpQE-60由来プラスミドから、タンパク質は６×His C-末端伸長を有して発現される。
【００７１】
AlbCについて、用いたプライマーは、5'-AGAGCCATGGGACTTGCAGGCTTAGTTCCCGC-3' 配列番号28(NcoI部位に下線を付す)及び5'-AGAGAGATCTGGCCGCGTCGGCCAGCTCC-3' 配列番号29(BglII部位に下線を付す)であり、鋳型はpSL122(仏国特許FR0207728、PCT/FR03/01851)であった。AlbC発現のためのpQE60誘導体をpQE60-AlbCと呼称した(配列番号17)；発現されたタンパク質AlbC-hisは配列番号35のペプチド配列を有した。
【００７２】
Rv2275について、用いたプライマーは、5'-CGGCCATGGCATACGTGGCTGCCGAACCAGGC-3' 配列番号30(NcoI部位に下線を付す)及び5'-GGCAGATCTTTCGGCGGGGCTCCCATCAGG-3' 配列番号31(BglII部位に下線を付す)であり、鋳型はpEXP-Rv2275(PCT/IB2006/001852)であった。Rv2275発現のためのpQE60誘導体をpQE60-Rv2275と呼称した(配列番号18)；発現されたタンパク質Rv2275-hisは配列番号36のペプチド配列を有した。
【００７３】
バチルス・サチリスのYvmC-Bsubについて、用いたプライマーは、5'-GGCCCATGGCCGGAATGGTAACGGAAAGAAGGTCTG-3' 配列番号32(NcoI部位に下線を付す)及び5'-GGCAGATCTTCCTTCAGATGTGATCCGTTTCTCAGAAAGC-3' 配列番号33(BglII部位に下線を付す)であり、鋳型はpEXP-YvmC-Bsub(PCT/IB2006/001849)であった。YvmC-Bsub発現のためのpQE60誘導体をpQE60-YvmC-Bsubと呼称した(配列番号19)；発現されたタンパク質YvmC-Bsub-hisは配列番号37のペプチド配列を有した。
【００７４】
上記のすべての場合において、天然型のAlbC(配列番号１)、Rv2275(配列番号２)及びYvmC-Bsub(配列番号３)酵素は、ここに記載される実験の過程で発現されたこれらタンパク質の６×HisタグバージョンAlbC-his(配列番号35)、Rv2275-his(配列番号36)及びYvmC-Bsub-his(配列番号37)と機能的に区別できない。これは、改変された２番目の残基も６×Hisタグも、これら酵素の保存されたいずれの部分の機能性に影響を及ぼさないという事実に起因する。また、これら改変は、これら２つの保存されたドメインの近傍にも、該ドメイン内にも存在しない。
【００７５】
３)AlbC、Rv2275及びYvmCによる線状ジペプチドのインビボ形成についてのアッセイ
それぞれ配列番号35、配列番号36及び配列番号37としてのエス・ノウルセイからのAlbC(配列番号１)、結核菌からのRv2275(配列番号２)及びビー・サチリスからのYvmC-Bsub(配列番号３)の組換え発現を、それぞれプラスミドpQE60-AlbC(配列番号17)、pQE60-Rv2275(配列番号18)及びpQE60-YvmC-Bsub(配列番号19)を有する大腸菌M15pREP4細胞(Invitrogen)において達成した。100μlの化学的にコンピテントな細胞を、40ngのプラスミドを用いて、標準的な熱ショック手順を用いて形質転換した(Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory manual，2001，New York)。SOC培地中で37℃にて１時間増殖させた後に、300μlの反応混合物を、100μg/mlのアンピシリンを含有する５mlのLB培地に直接加えた。振とうしながら37℃にて一晩のインキュベーション後に、このスターター培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含有する200mlのLB培地に植菌した。細菌をOD600が約0.7になるまで37℃にて増殖させ、１mM IPTGを加えた。培養を20℃にて18時間継続した。細菌細胞を遠心分離により回収し(30分間、5,000ｇ、４℃)、５mlの氷冷９‰NaCl溶液に懸濁した。細胞を再び遠心分離により回収し(30分間、5,000ｇ、４℃)、溶解バッファーＡに懸濁した(100mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、５％グリセロール)。加える溶解バッファーの容量は、約100のOD600を有する細菌懸濁物が得られるように調整した。懸濁した細胞を、イートンプレス(Rassant)を用いて溶解した。５％ジメチルスルホキシド(DMSO)を溶解物に加え、直後に遠心分離した(30分間、20,000ｇ、４℃)。可溶性画分を取り置き、２％ TFAを用いて酸性にし、遠心分離した(30分間、20,000ｇ、４℃)。得られた可溶性画分を、LC-MS/MSによる更なる分析のために取り置いた(以下を参照)。
【００７６】
対照実験として、全ての手順(細胞形質転換から線状ジペプチド含量の解析まで)を、CDSを発現しないアンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターであるpQE60(Qiagen)で形質転換した細菌に用いた。
【００７７】
４．質量分析とオンラインで連結したクロマトグラフィーによるサンプルの分析
カラムの平衡化及びサンプルの脱塩のための初期条件での５分間の工程の後、液体クロマトグラフィー(LC)分離を、C18分析用カラム(4.6×150mm、３μm、100Å、Atlantis，Waters)で、600μl/分の流速にて、0.1％ギ酸を含有する０〜45％のアセトニトリル/MilliQ水の50分間の線形勾配で行った。LCカラムからの溶出を２つのフローに分けた：一方は、550μl/分でダイオードアレイ検出器に導き、残りのフローは、MS及びMS/MS分析のためにエレクトロスプレー質量分析計に導いた。質量分析計は、直交型大気圧インターフェース-エレクトロスプレーイオン化(AP-ESI)源を備えたイオントラップ型質量分析計Esquire HCT(Bruker Daltonik GmbH，Germany)であった。
【００７８】
このオンライン連結システムにおいて、LC溶出サンプルを、50μl/分の流速でESIプローブに連続的に注入した。窒素を乾燥及び霧化ガスとして供給し、ESIにより生じるイオンの効率的なトラップ及び冷却のため並びにフラグメンテーションプロセスのためのイオントラップ中にヘリウムガスを導入した。イオン化は、ポジティブモードで、最適な噴霧及び脱溶媒(desolvatation)のための35psiに設定した霧化ガス、８μl/分に設定した乾燥ガス及び340℃に設定した乾燥温度を用いて行った。イオン化及び質量分析の条件(キャピラリー高電圧、スキマー及びキャピラリー出口電圧並びにイオン移動パラメータ)を、100〜400のm/z範囲の化合物の最適検出に合わせた。質量フラグメンテーションによる構造特徴決定のために、親イオン分離に１マスユニットの分離幅を用いた。MS/MSフラグメンテーションプロセスを最適化するために、フラグメンテーション振幅を自動的に変動させるためのフラグメンテーションエネルギーランプを用いた。フルスキャンMS及びMS/MSスペクトルを、EsquireControlソフトウェアを用いて取得し、全てのデータをDataAnalysisソフトウェアを用いて処理した。
【００７９】
５)線状ジペプチドの化学合成
Ile-Leu、Ile-Ile、Ile-Phe、Ile-Met、Phe-Ile、Leu-Met、Leu-Ile、Met-Ile及びTyr-Metを、通常のFmoc/tBuストラテジーによりApplied Biosystemsの装置で装置とともに供給されるユーザーマニュアル(Applied Biosystems 433A使用説明書第１巻、第３章)に従って合成した。均質になるまでの精製及び線状ペプチドの物理化学的特徴決定は、それぞれRP-HPLC及び質量分析により行った。全てのその他の線状ジペプチドは、Sigma及びBachemから購入した。
【００８０】
６)線状ジペプチドの検出及び同定のために用いたストラテジー
線状ジペプチドの探索は、図58にまとめる網羅的なスクリーニングプロトコルに従って行った。全てのサンプルをLC-MS/MSにより分析した。LC-MS/MSデータファイルから、210の可能性のある線状ジペプチド(表Ｉを参照)に関連する108の異なるm/z値に相当するイオンクロマトグラムを抽出した。次いで、各CDS含有サンプル及び対照サンプルについて１組の抽出イオンクロマトグラム(EIC)を得た。各m/z値について、CDS含有サンプル及び対照サンプルから得られたEICの比較により、CDS活性に特異的なEICピークの検出が可能になった。構造的推論のために、これら特異的ピークをMS/MSフラグメンテーションにより更に特徴決定した。娘イオンスペクトルの分析により、第一に、線状ジペプチドに対応するピークの同定が可能になった。実際、線状ジペプチドは、17、18、28及び/又は46のニュートラルロスの組合せによって特徴付けられる特定のフラグメンテーションサインを有する(以前に提案された、ペプチドの官能基のフラグメンテーションと、アミド結合のフラグメンテーションに相当する(Roepstorffら，Biomed．Mass Spectrom.，1984，11，601；Johnsonら，Anal．Chem.，1987，59，2621〜2625))。第二に、この分析により、アミノ酸側鎖に特徴的なインモニウムイオンの検出又は線状ジペプチドを構成するアミノ酸残基の離脱(departure)に相当するニュートラルロスのいずれかによる線状ジペプチドに含まれる２つのアミノ酸の同定が可能になった。サンプル中の線状ジペプチドの最終的な同定は、参照のジペプチド(市販又は自家製の合成ジペプチド)とのLC中の保持時間及び特にMS/MSにおけるフラグメンテーションパターンの両方の類似性を確証することにより得られた。
【００８１】
【表１】
2011500098.tif 000002
【００８２】
実施例２：CDSによる線状ジペプチドのインビボ合成
CDSによる線状ジペプチドの合成を、AlbC、Rv2275及びYvmC-Bsubをそれぞれ発現する細菌から得られた可溶性抽出物において線状ジペプチドについて探索することにより評価した。各々において、これら酵素はC-末端６-hisタグを有して発現され、２番目の残基は、前記(「実験方法」を参照)のように、pQE60ベクター中へのクローニングが可能なように配列中にNcoI制限酵素の標的配列を導入して改変されていた。発現された各酵素の実際のペプチド配列は、AlbC-hisが配列番号35、Rv2275-hisが配列番号36及びYvmC-Bsub-hisが配列番号37であった。これらの抽出を前記(「実験方法」を参照)のように行った。各々において、分子量及びN-末端配列が予測されたものに対応するタンパク質の生成が観察された。同時に、CDSを発現しない細菌(pQE60)から得られた可溶性抽出物も調製した。最後に、図58に示すように、これら全てのサンプルをLC-MS/MSにより分析し、線状ジペプチドについてスクリーニングした。方法の対照として、AlbC-his(配列番号35)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分をまず分析した。
【００８３】
１)AlbCの存在下で生成された更なる線状ジペプチド
AlbC-his(配列番号35)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分をLC-MS/MSにより分析して、第１組のEICを導いた。同じ分析を、AlbC-his(配列番号35)を発現しない大腸菌細胞の可溶性画分を用いて行って、第２組のEICを導いた。これら２組のEICを各m/z値について比較することにより、AlbC活性に特異的なEICピークの検出が可能になった。各EICピークをMS/MSフラグメンテーションにより特徴決定し、娘イオンスペクトルの分析により、15のピーク(図２に示す)が線状ジペプチドと一致することが示された(表IIに示す概要を参照)。
【００８４】
15のEICピークの各々の質量的特徴、特にインモニウムイオンの検出により、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク８、ピーク９、ピーク11、ピーク12及びピーク15(表II)に相当する８つの異なるジペプチドを構成するアミノ酸の一義的な同定が導かれた。ピーク４、ピーク５、ピーク６、ピーク７、ピーク10、ピーク13及びピーク14に相当する他のジペプチドを構成するアミノ酸の性質は、確証されていない。なぜなら、これらは全て86.5の同じインモニウムイオンm/zを有するロイシル又はイソロイシル残基(表IIを参照)を有するからである。全ての検出線状ジペプチドの性質及び配列の同定は、LC中での保持時間及びMS/MSにおけるフラグメンテーションパターン、すなわちフラグメントイオンの数、m/z値及び生成されたフラグメントイオンの強度(表II及びここで言及する図を参照)を、参照の化学合成ジペプチド(表III及びここに番号を付す図を参照)と比較することにより確実に達成された。LCカラムのエージングが原因で、３つの検出線状ジペプチドの保持時間は、対応する参照ジペプチド、すなわちMet-Met、Tyr-Met及びMet-Tyrと比較してシフトしていたが、溶出順序は、検出ジペプチドと参照ジペプチドとで同じであった。まとめると、これら全てのデータは、大腸菌細胞におけるAlbC発現が、以前に報告されたように(米国特許第20050287626号)、Leu-Phe及びPhe-Leuのインビボ形成を担い、またPhe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Met-Met、Tyr-Met及びMet-Tyrの形成も担うことを明確に証明した(表II及びIIIを参照)。
【００８５】
【表２】
2011500098.tif 000003
【００８６】
図３は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、20.6分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは281.0±0.1にメインm/zピークを示す(図3a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図3b)。丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【００８７】
図４は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.0分に検出されたEICピーク２のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは313.1±0.1にm/zピークを示す(図4a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図4b)。丸で囲んだ136.0±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【００８８】
図５は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.5分に検出されたEICピーク３のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは313.1±0.1にm/zピークを示す(図5a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図5b)。丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【００８９】
図６は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.9分に検出されたEICピーク４のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは263.0±0.1にメインm/zピークを示す(図6a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図6b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【００９０】
図７は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、23.8分に検出されたEICピーク５のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったマイナーm/zピークを295.1±0.1に示す(図7a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図7b)。丸で囲んだ136.0±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.6±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【００９１】
図８は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.0分に検出されたEICピーク６のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは263.0±0.1にメインのm/zピークを示す(図8a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図8b)。丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【００９２】
図９は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.9分に検出されたEICピーク７のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは295.1±0.1にm/zピークを示す(図9a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図9b)。丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【００９３】
図10は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、26.6分に検出されたEICピーク８のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったマイナーm/zピークを329.1±0.1に示す(図10a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図10b)。丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.2±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【００９４】
図11は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.0分に検出されたEICピーク９のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは297.1±0.1にm/zピークを示す(図11a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図11b)。丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【００９５】
図12は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.3分に検出されたEICピーク10のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは245.1±0.1にメインm/zピークを示す(図12a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図12b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【００９６】
図13は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.0分に検出されたEICピーク11のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったm/zピークを329.1±0.1に示す(図13a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図13b)。丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【００９７】
図14は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.3分に検出されたEICピーク12のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったm/zピークを297.1±0.1に示す(図14a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図14b)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【００９８】
図15は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、30.8分に検出されたEICピーク13のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは279.1±0.1にメインm/zピークを示す(図15a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図15b)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【００９９】
図16は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、31.5分に検出されたEICピーク14のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは279.1±0.1にメインm/zピークを示す(図16a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図16b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１００】
図17は、AlbCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、33.4分に検出されたEICピーク15のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったマイナーm/zピークを313.1±0.1に示す(図17a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図17b)。丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１０１】
【表３】
2011500098.tif 000004
【０１０２】
図18は、化学合成したMet-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは19.4分に検出される(図18a)。MSスペクトルは281.0±0.1にm/zピークを示す(図18b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図18c)。丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１０３】
図19は、化学合成したMet-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは21.6分に検出される(図19a)。MSスペクトルは313.1±0.1にm/zピークを示す(図19b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図19c)。丸で囲んだ136.0±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１０４】
図20は、化学合成したIle-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは21.8分に検出される(図20a)。MSスペクトルは263.0±0.1にm/zピークを示す(図20b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図20c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１０５】
図21は、化学合成したTyr-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは22.8分に検出される(図21a)。MSスペクトルは313.1±0.1にm/zピークを示す(図21b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図21c)。丸で囲んだ136.0±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１０６】
図22は、化学合成したLeu-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは22.9分に検出される(図22a)。MSスペクトルは263.0±0.1にm/zピークを示す(図22b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図22c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１０７】
図23は、化学合成したIle-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.3分に検出される(図23a)。MSスペクトルは295.1±0.1にm/zピークを示す(図23b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図23c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１０８】
図24は、化学合成したTyr-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.5分に検出される(図24a)。MSスペクトルは345.1±0.1にm/zピークを示す(図24b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図24c)。丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１０９】
図25は、化学合成したLeu-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは23.7分に検出される(図25a)。MSスペクトルは295.1±0.1にm/zピークを示す(図25b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図25c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１１０】
図26は、化学合成したMet-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.0分に検出される(図26a)。MSスペクトルは263.0±0.1にm/zピークを示す(図26b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図26c)。丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１１１】
図27は、化学合成したIle-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.1分に検出される(図27a)。MSスペクトルは245.1±0.1にm/zピークを示す(図27b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図27c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１１２】
図28は、化学合成したTyr-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは24.4分に検出される(図28a)。MSスペクトルは295.1±0.1にm/zピークを示す(図28b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図28c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１１３】
図29は、化学合成したMet-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.3分に検出される(図29a)。MSスペクトルは263.1±0.1にm/zピークを示す(図29b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図29c)。丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致する。
【０１１４】
図30は、化学合成したLeu-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.4分に検出される(図30a)。MSスペクトルは245.1±0.1にm/zピークを示す(図30b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図30c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu及びiIleと呼ぶLeu及びIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１１５】
図31は、化学合成したTyr-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは25.8分に検出される(図31a)。MSスペクトルは295.1±0.1にm/zピークを示す(図31b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図31c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１１６】
図32は、化学合成したIle-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは26.1分に検出される(図32a)。MSスペクトルは245.1±0.1にm/zピークを示す(図32b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図32c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiIle及びiLeuと呼ぶIle及びLeuのインモニウムイオンと一致する。
【０１１７】
図33は、化学合成したPhe-TyrのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは26.7分に検出される(図33a)。MSスペクトルは329.1±0.1にm/zピークを示す(図33b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図33c)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１１８】
図34は、化学合成したPhe-MetのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは27.1分に検出される(図34a)。MSスペクトルは297.1±0.1にm/zピークを示す(図34b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図34c)。丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１１９】
図35は、化学合成したLeu-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは27.4分に検出される(図35a)。MSスペクトルは245.1±0.1にm/zピークを示す(図35b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図35c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致する。
【０１２０】
図36は、化学合成したPhe-IleのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは28.7分に検出される(図36a)。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図36b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図36c)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１２１】
図37は、化学合成したTyr-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは29.0分に検出される(図37a)。MSスペクトルは329.1±0.1にm/zピークを示す(図37b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図37c)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
【０１２２】
図38は、化学合成したMet-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは29.5分に検出される(図38a)。MSスペクトルは297.0±0.1にm/zピークを示す(図38b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図38c)。丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１２３】
図39は、化学合成したIle-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは30.2分に検出される(図39a)。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図39b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図39c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iIleと呼ぶIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１２４】
図40は、化学合成したPhe-LeuのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは30.8分に検出される(図40a)。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図40b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図40c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１２５】
図41は、化学合成したLeu-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは31.5分に検出される(図41a)。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図41b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図41c)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、iLeuと呼ぶLeuのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１２６】
図42は、化学合成したPhe-PheのEIC並びにMS及びMS/MSスペクトルを示す。EICピークは33.4分に検出される(図42a)。MSスペクトルは313.1±0.1にm/zピークを示す(図42b)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図42c)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１２７】
２)Rv2275の存在下で生成された線状ジペプチド
Rv2275-his(配列番号36)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分を前記のようにLC-MSにより分析した。この分析により導いた１組のEICを、CDSをコードしないベクターで形質転換された細胞を用いる対照実験のEICと比較した。この比較により、線状ジペプチドと一致しRv2275活性に特異的な１つの顕著なEICピークが示された(図43及び表IV中で特定する図44)。
【０１２８】
【表４】
2011500098.tif 000005
【０１２９】
図43は、Rv2275を発現する大腸菌細胞の可溶性画分のLCMS分析から検出された、Rv2275に特異的なジペプチドm/z値のEIC(上の黒色の線)を、対照サンプルのLCMS分析からの同じEIC(下の灰色の線)と比較して示す。唯一の顕著な特異的EICピークに、図44に示すMS及びMS/MSによる同定のために、表IV中で特定するようにラベルを付した。
【０１３０】
図44は、Rv2275を発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析に間に、23.3分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったm/zピークを345.1±0.1に示す(図44a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図44b)。丸で囲んだ136.1±0.1のm/zピークは、iTyrと呼ぶTyrのインモニウムイオンと一致する。
このEICピークを、MS/MSフラグメンテーション及び娘イオンスペクトルの分析により更に特徴決定した。このことにより、１つの可能性のある一致する線状ジペプチド、すなわちTyr-Tyrの同定が可能になった(表IV)。この保持時間及びフラグメンテーションパターンを、参照の化学合成Tyr-Tyrと比較することにより(表III及び図24を参照)、本発明者らは、大腸菌細胞におけるRv2275の発現がTyr-Tyrのインビボ形成を担っていると結論付けることができた(表IVを参照)。
【０１３１】
３)YvmC-Bsubの存在下で生成された線状ジペプチド
YvmC-Bsub-his(配列番号37)を発現する大腸菌細胞の可溶性画分を前記のようにLC-MSにより分析した。この分析により導いた１組のEICを、CDSを発現しないベクターで形質転換された細胞を用いる対照実験のEICと比較した。この比較により、本発明者らは、線状ジペプチドと一致し、YvmC-Bsub活性に特異的な12のEICピークを検出することができた(図45及び表Ｖ中で特定する図)。
【０１３２】
【表５】
2011500098.tif 000006
【０１３３】
図45は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分のLCMS分析から検出された、YvmCに特異的なジペプチドm/z値のEIC(上の黒色の線)を、対照サンプルのLCMS分析からの同じEIC(下の灰色の線)と比較して示す。拡大図は、サンプル中で検出されたマイナー生成物を識別するためのものである。特異的EICピークを、図46〜57に示すMS及びMS/MSによる同定のために、表Ｖ中で特定するようにラベルを付した。
【０１３４】
図46は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、20.6分に検出されたEICピーク１のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったメインm/zピークを281.0±0.1に示す(図46a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図46b)。丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１３５】
図47は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、21.8分に検出されたEICピーク２のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったm/zピークを263.1±0.1に示す(図47a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図47b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１３６】
図48は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、22.8分に検出されたEICピーク３のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは263.0±0.1にメインm/zピークを示す(図48a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図48b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１３７】
図49は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、24.9分に検出されたEICピーク４のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは263.0±0.1にメインm/zピークを示す(図49a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図49b)。丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１３８】
図50は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.4分に検出されたEICピーク５のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったm/zピークを245.1±0.1に示す(図50a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図50b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１３９】
図51は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、25.9分に検出されたEICピーク６のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは245.1±0.1にメインm/zピークを示す(図51a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図51b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１４０】
図52は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、26.8分に検出されたEICピーク７のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは297.0±0.1にメインm/zピークを示す(図52a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図52b)。丸で囲んだ120.2±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.3±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１４１】
図53は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、27.3分に検出されたEICピーク８のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは245.1±0.1にメインm/zピークを示す(図53a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図53b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１４２】
図54は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、29.2分に検出されたEICピーク９のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは297.0±0.1にm/zピークを示す(図54a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図54b)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ104.2±0.1のm/zピークは、iMetと呼ぶMetのインモニウムイオンと一致する。
【０１４３】
図55は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、30.8分に検出されたEICピーク10のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図55a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図55b)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致する。
【０１４４】
図56は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、31.4分に検出されたEICピーク11のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは279.1±0.1にm/zピークを示す(図56a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図56b)。丸で囲んだ86.5±0.1のm/zピークは、それぞれiLeu又はiIleと呼ぶLeu又はIleのインモニウムイオンと一致し、丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
【０１４５】
図57は、YvmCを発現する大腸菌細胞の可溶性画分の分析の間に、33.3分に検出されたEICピーク12のMS及びMS/MSスペクトルを示す。MSスペクトルは、対照サンプルでは検出されなかったマイナーm/zピークを313.1±0.1に示す(図57a)。このピークを親イオンとして単離し、MS/MSフラグメンテーションに供して娘イオンスペクトルを生じさせた(図57b)。丸で囲んだ120.1±0.1のm/zピークは、iPheと呼ぶPheのインモニウムイオンと一致する。
これら全てのEICピークは、ピーク１、ピーク７、ピーク９及びピーク12を除いて、同一質量のロイシル残基又はイソロイシル残基を含有する線状ジペプチドに相当する(表Ｖ及びここで言及する図を参照)。
【０１４６】
最後に、12の線状ジペプチドの保持時間及びフラグメンテーションパターンを、参照の化学合成ジペプチド(表III及びここで言及する図を参照)と比較することにより、本発明者らは、大腸菌細胞におけるYvmC-Bsubの発現が、以下のジペプチドのインビボ形成を担っていると結論付けることができた：Ile-Met、Leu-Met、Met-Leu、Leu-Ile、Ile-Leu、Leu-Leu、Phe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Met-Met、Phe-Met及びMet-Phe(表Ｖを参照)。各検出線状ジペプチドの２つの可能な配列が、Ile-Metを除いて常に観察された。なぜなら、その対応物であるMet-Ileは検出されなかったからである。Met-IleもYvmC-Bsubにより生成されたが、その量が少なすぎて検出できなかったと合理的に推論される。
【０１４７】
結論として、３つの試験されたCDS(すなわちAlbC、Rv2275及びYvmC-Bsub)は、大腸菌のような細菌細胞に導入して線状ジペプチドを生成するために用いることができる。しかし、上記の基準を満たす全てのCDSが、線状ジペプチドのインビボ合成を導くことができる。
【０１４８】
実施例３：PCRに基づくアプローチによる、新たなCDSコード配列の単離
以前に示されたように、ストレプトミセス・ノウルセイ及びストレプトミセス・アルブルスは、アルボノウルシンを合成する。ストレプトミセスIMI 351155種は、１-N-メチルアルボノウルシンを合成することが報告されている(Biosynthesis of 1-N-methylalbonoursin by an endophytic Streptomyces sp．Isolated from perennial ryegrass，Gurney及びMantle，J．Nat．Prod．1993，56:1194-1198)。本発明者らはまた、この株が、１-N-メチルアルボノウルシンに加えてアルボノウルシンも生成することを見出した。
【０１４９】
本発明者らは、この株において１つ以上のCDS相同遺伝子の存在を同定しようとした。
本発明者らは、先ず、ストリンジェント又は非ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション実験を行った。しかし、これら実験により、遺伝子albCに対応するプローブ又はストレプトミセス・ノウルセイの他のalb遺伝子(例えばalbA及びalbB)に対応するプローブとハイブリダイズするストレプトミセスIMI 351155種のゲノムDNA中のフラグメントを検出することはできなかった。
【０１５０】
ストレプトミセス・アルブルスの全ゲノムDNAを用いて行った同じタイプのハイブリダイゼーション実験により、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAフラグメントが明らかになったことに注目すべきである。ストレプトミセス・アルブルスのゲノムDNAからのこれらフラグメントの更なる単離及び特徴決定により、これらフラグメントが、アルボノウルシン及び線状ジペプチドの生合成を導く遺伝子を含有することが確証された。
【０１５１】
よって、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアプローチを開発して、ストレプトミセスIMI 351155種から、albCホモログ、すなわち線状ジペプチドの生合成を担う遺伝子を見出し、単離した。
【０１５２】
このPCRに基づく反応のためのプライマーを設計するために、本発明者らは、配列番号９及び配列番号10に相当する、既知の全てのCDS中で保存されているアミノ酸モチーフを含む２つの領域を用いた。しかし、プライマーの縮重を制限するために、本発明者らは、いくつかの位置での部分的な保存性を考慮した(これは、サインH-X-[LVI]-[LVI]-G-[LVI]-S(配列番号９)及びY-[LVI]-X-X-E-X-P(配列番号10)の定義では考慮しなかったが)。
プライマーは、配列H-[LVA]-[LVI]-[LVI]-G-[VI]-S(配列番号24)及びY-[VI]-[LICF]-[AD]-E-[ALI]-P-[LFA]-[FY](配列番号25、図59及び60を参照)から設計した。
【０１５３】
全てのCDS配列の第１のモチーフ中でのアラインメントの一部分を図59に示す。プライマー設計に用いた領域をアラインメントの下に線で示す。番号付けは、エス・ノウルセイからのAlbCのものである。縮重アミノ酸配列を対応するヌクレオチド配列と共に示す。第１のプライマーは次のとおり最終決定した：
5' CAC BYS NTS NTS GGS RTS WSS SC(配列番号22)
(式中、ヌクレオチドについて：B = C又はG又はT、N = A又はC又はG又はT、R = A又はG、S = C又はG、W = A又はT、Y = C又はT)。
【０１５４】
全てのCDS配列の第２のモチーフ中でのアラインメントの一部分を図60に示す。プライマー設計に用いた領域をアラインメントの下に線で示す。番号付けは、エス・ノウルセイからのAlbCのものである。縮重アミノ酸配列を対応するヌクレオチド配列及びプライマーとして用いた相補鎖(最下行)と共に示す。第２のプライマーは、次のとおり最終決定した：
5' ATG YAS DMS CKS CTC NRS GGS MRS AWG(配列番号23)
(式中、ヌクレオチドについて：D = A又はG又はT、K = G又はT、M = A又はC、N = A又はC又はG又はT、R = A又はG、S = C又はG、W = A又はT、Y = C又はT)。
【０１５５】
プライマーの縮重を減らすため、ストレプトミセスのコドン使用頻度を考慮した。ストレプトミセスのゲノムDNAはGCリッチであるので、全てのコドンの３番目の位置は、優先的にC又はGである。よって、プライマー中、コドンの３番目の位置に相当する全てのヌクレオチドをC又はGのいずれかに改変した。例えば、プライマー中の残基YはCとし、残基NはSとした。用いた２つの縮重プライマーは、プライマー１ 5'-CACBYSNTSNTSGGSRTSWSSSC-3'(配列番号26)及びプライマー２ 5'-GWASRMSGGSRNCTCSKCSMDSAYGTA-3'(配列番号27)であった。
【０１５６】
これらプライマーを用いるPCRを、HT培地での培養３日後のストレプトミセスIMI 351155種から抽出したトータルRNAの逆転写により得られたcDNAに対して行った。この培養時間は、ジペプチド生合成の開始(ジペプチド生合成遺伝子が転写される時間である)に相当する。トータルRNAは十分に確立されたプロトコルを用いて抽出し、cDNAはInvitrogenのキットSuperScript(登録商標)ファーストストランドシステム(RT-PCR用)(First-Strand Synthesis System for RT-PCR)を用いて得た。
【０１５７】
PCR反応の特異性を増大させるために、以下のようなランピングPCR条件を用いた：95℃にて２分間の最初の変性工程後、アニーリング温度を最初は37℃として、72℃まで15秒ごとに１℃ずつ増加させた。この後に、95℃にて30秒間の変性を行った。このサイクルを２回行った。その後、PCRプログラムは、95℃で30秒間、55℃で１分30秒間及び72℃で１分間の35サイクルからなった。Taqポリメラーゼを用いた。
【０１５８】
得られたPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分離した。約470bpの微かなバンドが見えた。450〜500bpの範囲のDNAをゲルから抽出し、一部を、プライマー１及び２を用いるPCR増幅の鋳型として用いた。PCRプログラムは、95℃にて２分間の最初の変性工程、続いて、95℃で30秒間、55℃で１分30秒間及び72℃で１分間の35サイクルからなった。Taqポリメラーゼを用いた。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離した。約470bpのバンドが明確に見えた。このバンドをゲルから抽出し、ベクターpGEMT-Easy(Promega)に連結した。ライゲーションミックスを用いて、コンピテントな大腸菌細胞を形質転換した。プラスミドを９つのクローンから抽出し、挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。全ての挿入断片は非常によく似ており、これらの間の差異は、２つの縮重プライマーに相当する領域に存在した。推定産物は、ストレプトミセス・ノウルセイのAlbCと似ていた(アミノ酸で42％の同一性)。
【０１５９】
ストレプトミセスIMI351155種の完全albCホモログ(以下、albC-IMIという)を得るために、ストレプトミセスIMI351155種のゲノムDNAの遺伝子ライブラリーを、コスミドpWED2中に構築した(Karrayら，2007，Organization of the biosynthetic gene cluster for the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomyces ambofaciens，Microbiology，近刊)。albC-IMI遺伝子の部分に相当するクローニングされたPCRフラグメントを、コロニーハイブリダイゼーション実験のプローブとして用いた。このことにより、プローブと強くハイブリダイズする４つのクローンが単離された。これらが含有するコスミドを抽出し、挿入断片中にalbC-IMIプローブとハイブリダイズするフラグメントを有することを示した。
【０１６０】
これらフラグメントをサブクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。このことにより、ストレプトミセス・ノウルセイのAlbA、AlbB及びAlbCとそれぞれ51％、50％及び40％のアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする３つの遺伝子albA-IMI、albB-IMI及びalbC-IMIの特徴が決定された。
【図１】
2011500098.tif 000007
【図２】
2011500098.tif 000008
【図３】
2011500098.tif 000009
【図４】
2011500098.tif 000010
【図５】
2011500098.tif 000011
【図６】
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【図７】
2011500098.tif 000013
【図８】
2011500098.tif 000014
【図９】
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【図１０】
2011500098.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2011500098.tif 000019
【図１４】
2011500098.tif 000020
【図１５】
2011500098.tif 000021
【図１６】
2011500098.tif 000022
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2011500098.tif 000026
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2011500098.tif 000036
【図３１】
2011500098.tif 000037
【図３２】
2011500098.tif 000038
【図３３】
2011500098.tif 000039
【図３４】
2011500098.tif 000040
【図３５】
2011500098.tif 000041
【図３６】
2011500098.tif 000042
【図３７】
2011500098.tif 000043
【図３８】
2011500098.tif 000044
【図３９】
2011500098.tif 000045
【図４０】
2011500098.tif 000046
【図４１】
2011500098.tif 000047
【図４２】
2011500098.tif 000048
【図４３】
2011500098.tif 000049
【図４４】
2011500098.tif 000050
【図４５】
2011500098.tif 000051
【図４６】
2011500098.tif 000052
【図４７】
2011500098.tif 000053
【図４８】
2011500098.tif 000054
【図４９】
2011500098.tif 000055
【図５０】
2011500098.tif 000056
【図５１】
2011500098.tif 000057
【図５２】
2011500098.tif 000058
【図５３】
2011500098.tif 000059
【図５４】
2011500098.tif 000060
【図５５】
2011500098.tif 000061
【図５６】
2011500098.tif 000062
【図５７】
2011500098.tif 000063
【図５８】
2011500098.tif 000064
【図５９】
2011500098.tif 000065
【図６０】
2011500098.tif 000066
【配列表】
2011500098000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月1日(2010.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有し、且つ一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒する能力を有するタンパク質又はそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする単離された天然若しくは合成のタンパク質又はその少なくとも７アミノ酸残基を含む活性フラグメントの、線状ジペプチドの製造のための使用。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも20％で35％以下の同一性を有する請求項１に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項３】
配列番号９の一般配列：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸。[LVI] =ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン、及びS = セリン)
の第１の保存アミノ酸配列を含む請求項１又は２に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項４】
配列番号10の一般配列：
Y - [LVI] - X - X - E - X - P (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X =任意のアミノ酸、E = グルタミン酸、及びP = プロリン)
の第２の保存アミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項５】
前記第１の保存アミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが、少なくとも120アミノ酸残基で160以下のアミノ酸残基により隔てられている請求項４に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項６】
前記第１の保存アミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが、少なくとも140アミノ酸残基で150以下のアミノ酸残基により隔てられている請求項５に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項７】
前記第１の保存アミノ酸配列が配列番号１の残基31〜37に相当する請求項３〜６のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項８】
前記第２の保存アミノ酸配列が配列番号１の残基178〜184に相当する請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項９】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、バチルス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属、フォトラブダス属又はスタフィロコッカス属に属する微生物から単離された請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１０】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サチリス亜種サチリス、バチルス・チューリンゲンシス血清型イスラエレンシス、フォトラブダス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、結核菌、マイコバクテリウム・ボビス又はマイコバクテリウム・ボビスBCGから選択される微生物から単離された請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１１】
前記タンパク質又はその活性フラグメントが、AlbC(配列番号１)、Rv2275(配列番号２)、MT2335(配列番号２)、MRA2294(配列番号２)、TBFG12300(配列番号２)、Mb2298(配列番号２)、BCG2292(配列番号34)、YvmC-Bsub(配列番号３)、YvmClic(配列番号４)、YvmC-Bthu(配列番号５)、pSHaeC06(配列番号６)、Plu0297(配列番号７)、JK0923(配列番号８)、AlbC-his(配列番号35)、Rv2275-his(配列番号36)、YvmC-Bsub-his(配列番号37)からなる群より選択される請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１２】
前記線状ジペプチドが、Phe-Leu、Leu-Phe、Phe-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Phe、Leu-Leu、Leu-Tyr、Tyr-Leu、Phe-Met、Met-Phe、Leu-Met、Met-Leu、Tyr-Met、Met-Tyr、Met-Met、Tyr-Tyr、Ile-Met、Met-Ile、Leu-Ile、Ile-Leuからなる群より選択される請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質又はその活性フラグメントの使用。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項で特定されるか、又は配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号20、配列番号21、配列番号17の114位〜861位、配列番号18の114位〜1008位及び配列番号19の114位〜885位からなる群より選択されるタンパク質又はその活性フラグメントをコードする単離された天然又は合成の核酸配列の、線状ジペプチドの製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、該核酸コード配列を少なくとも１つの宿主細胞に導入するように構成され、そのことにより前記コード配列が前記宿主細胞の内因性発現機構によって発現される、組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、配列番号17、配列番号18及び配列番号19を含む群から選択される組換えベクター。
【請求項１６】
少なくとも２つのタンパク質又はその活性フラグメントのコード配列を含む請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
前記宿主細胞が原核生物である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１８】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１３に記載の核酸コード配列を含み、該核酸コード配列を無細胞発現系において、該無細胞発現系の内因性転写機構により発現するように構成されている組換えベクター。
【請求項２０】
ａ)１種以上のアミノ酸から線状ジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成する能力を有する宿主細胞を培地で培養する工程と、
ｂ)前記宿主細胞中及び任意に前記培地中、前記線状ジペプチドを形成させて蓄積させる工程と、
ｃ)前記宿主細胞の抽出物及び任意に前記培地から前記線状ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする、線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、少なくとも２つのタンパク質又はその活性フラグメントのコード配列を含む請求項２０に記載の線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２２】
ａ)無細胞発現系を、１種以上のアミノ酸からジペプチドを形成する活性を有するタンパク質又はその活性フラグメントを生成するように誘発する工程と、
ｂ)少なくとも１つのアミノ酸基質を、前記タンパク質又はその活性フラグメントに導入する工程と、
ｃ)前記ジペプチドを形成及び蓄積させる工程と、
ｄ)前記ジペプチドを回収する工程と
を含み、前記タンパク質又はその活性フラグメントが、配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するタンパク質及びそのフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする、線状ジペプチドの製造方法。
【請求項２３】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)以下のモチーフ：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及びS = セリンであって、H、LVI、G又はSの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちHはリジン又はアルギニンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン又はアラニンのいずれか１つで置き換えられることができ、Gはアラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Sはシステイン、スレオニン又はメチオニンで置き換えられることができる)
Y - [LVI] - X - X - E - X - P     (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X =任意のアミノ酸、E = グルタミン酸及びP = プロリンであって、Y、LVI、E、X又はPの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちYはフェニルアラニン又はトリプトファンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン又はアラニンのいずれか１つで置き換えられることができ、Eはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミンのいずれか１つで置き換えられることができ、Pはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができる)
の少なくとも一方を有する候補ポリペプチド配列を同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチドのコード配列を、前記候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することにより、ポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の発現を誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対的生成レベルを決定する工程と、
ｆ)線状ジペプチドの相対的生成を、前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)以下のモチーフ：
H - X - [LVI] - [LVI] - G - [LVI] - S (配列番号９)
(式中、H = ヒスチジン、X = 任意のアミノ酸、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、G = グリシン及びS = セリンであって、H、LVI、G又はSの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちHはリジン又はアルギニンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン又はアラニンのいずれか１つで置き換えられることができ、Gはアラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができ、Sはシステイン、スレオニン又はメチオニンで置き換えられることができる)
Y - [LVI] - X - X - E - X - P (配列番号10)
(式中、Y = チロシン、[LVI] = ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つ、X =任意のアミノ酸、E = グルタミン酸及びP = プロリンであって、Y、LVI、E、X又はPの少なくとも１つは別のアミノ酸であり得る、すなわちYはフェニルアラニン又はトリプトファンのいずれか１つで置き換えられることができ、LVIはグリシン又はアラニンのいずれか１つで置き換えられることができ、Eはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミンのいずれか１つで置き換えられることができ、Pはグリシン、アラニン、ロイシン、バリン又はイソロイシンのいずれか１つで置き換えられることができる)
の両方を有する候補ポリペプチド配列を同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチドのコード配列を、前記候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することにより、ポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の発現を誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対生成レベルを決定する工程と、
ｆ)前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における、線状ジペプチドの相対的生成を前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記第１の保存モチーフ(配列番号９)と前記第２の保存モチーフ(配列番号１0)とが、少なくとも75で250以下のアミノ酸により隔てられている請求項２４に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項２６】
前記第１の保存モチーフ(配列番号９)及び／又は前記第２の保存モチーフ(配列番号10)が、１より多い残基の変更を含む請求項２４又は２５に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項２７】
工程ａ)が、ポリメラーゼ連鎖反応において配列番号22及び配列番号23の縮重プライマーを用いる候補ペプチドコード核酸配列の増幅を含む請求項２３、２４、２５又は２６のいずれか１項に記載のポリペプチドを同定する方法。
【請求項２８】
一般式(ｉ)：
R1 - R2    (ｉ)
(式中、R1及びR2は同じであっても異なってもよく、各々が任意のアミノ酸を表し得る)
の線状ジペプチドの形成を触媒するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ)配列番号１と少なくとも20％の同一性で90％以下の同一性を有するか、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号35、配列番号36、配列番号37のいずれか１つと少なくとも20％の同一性を有する候補ポリペプチドを同定する工程と、
ｂ)前記候補ポリペプチド配列を、該候補ポリペプチドを適切なレベルで発現するように構成されたプロモーター配列に連結することによりポリペプチド発現構築物を創出する工程と、
ｃ)前記ポリペプチド発現構築物を少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系に導入し、前記少なくとも１つの細胞又は無細胞発現系による前記ポリペプチド発現構築物の発現を誘発する工程と、
ｄ)前記少なくとも１つの細胞の増殖培地中又は前記無細胞発現系中の線状ジペプチドのレベル及び種類をモニターする工程と、
ｅ)前記ポリペプチド発現構築物の存在下での線状ジペプチドのレベルを、前記ポリペプチド発現構築物の非存在下での線状ジペプチドのレベルと比較して、前記ポリペプチド発現構築物による線状ジペプチドの相対生成レベルを決定する工程と、
ｆ)前記少なくとも１つの細胞又は前記無細胞発現系における、線状ジペプチドの相対的生成を前記候補ポリペプチドの発現と相関させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2011500098.tif 000067
2011500098.tif 000068
2011500098.tif 000069
2011500098.tif 000070
2011500098.tif 000071