(57)【要約】細菌に対して効果的及び選択的に用いることができる抗菌ペプトイド化合物及び関連組成物を提供することを目的とする。  下記式のポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物。 2011511077.tif 000022  式中、Ａは、Ｈ及び末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基から選択され、前記アルキル置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択され、ｎは、１〜３から選択される整数であり、Ｂは、ＮＨ２、１及び２つのＮ−置換グリシン残基から選択され，前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され、Ｘ、ＹおよびＺは、独立してＮ−置換グリシン残基から選択され、前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され，及びプロリン残基，前記Ｘ−Ｙ−Ｚ周期性は前記化合物に両親媒性を供給する。
2011511077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式のポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物。                                
2011511077.tif 000016
式中、Ａは、Ｈ及び末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基から選択され、前記アルキル置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択され、
ｎは、１〜３から選択される整数であり、
Ｂは、ＮＨ２、１及び２つのＮ−置換グリシン残基から選択され、前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され、
Ｘ、ＹおよびＺは、独立してＮ−置換グリシン残基から選択され、前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され、及びプロリン残基，前記Ｘ−Ｙ−Ｚ周期性は前記化合物に両親媒性を供給する。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、
Ａは、Ｈであり、
Ｂは、前記１及び２つのＮ−置換グリシン残基から選択され、前記選択は前記化合物の疎水性を低下させる化合物。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であって、
ＸがＮＬｙｓ残基であり、
ｎが３であり及び
Ｂは２個のＮ−置換グリシン残基である化合物。
【請求項４】
請求項２に記載の化合物であって、下記式の化合物。
2011511077.tif 000017
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、少なくともＹ及びＺのうち一つがプロリン残基である化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって、Ｙ及びＺがプロリン残基である化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、
Ａは末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基であり、前記アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖アルキル部分から選択され、
ＢはＮＨ２であり、並びに
ｎは１及び２から選択される化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、
Ａは末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基であり、前記アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖アルキル部分から選択され、
ＢはＮｌｙｓ残基であり、並びに
ｎは１である化合物。
【請求項９】
下記式のポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物。
2011511077.tif 000018
式中、ｎは２及び３から選択され、並びに
Ｙ、Ｚ、Ｙ’及びＺ’は独立してＮ−置換グリシン残基から選択され、前記置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体及びプロリン残基から選択され、前記Ｙ’及びＺ’残基は、前記化合物に三倍周期性の化合物と比較して低下した疎水性を供給するよう選択される。
【請求項１０】
請求項９に記載の化合物であって、Ｘ及びＹのうち少なくとも１つがプロリン残基である化合物。
【請求項１１】
請求項９に記載の化合物であって、ｎは２及び３から選択され、Ｙ’はＮｌｙｓ残基である化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物であって、Ｘ及びＹのうち少なくとも１つがプロリン残基である化合物。
【請求項１３】
請求項９に記載の化合物であって、下記式の化合物。
2011511077.tif 000019
【請求項１４】
下記式のポリ−Ｎ−アルキル置換グリシン抗生物質化合物。
2011511077.tif 000020
式中、ＢはＮＨ２及びＸ’から選択され、
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＸ’は独立してＮ−置換グリシン残基から選択され、前記置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体及びプロリン残基から選択され、
ｎは１及び２から選択される整数であり、並びに
Ｒは前記グリシン残基のＮ−アルキル置換基であり、前記置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル部分から選択される。
【請求項１５】
請求項１４に記載の化合物であって、ｎは２であり、ＢはＮＨ２である化合物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の化合物であって、ｎは１であり、ＢはＸ’である化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、Ｘ及びＸ’のうち少なくとも一つがＮｌｙｓ残基である化合物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の化合物であって、前記アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル部分から選択される化合物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の化合物であって、Ｘ及びＸ’はＮｌｙｓ残基である化合物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の化合物であって、下記式の化合物。
2011511077.tif 000021
【請求項２１】
ポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物であって、Ｈ及びＮ−アルキル置換グリシン残基から選択されるＮ末端基を含み、前記アルキル置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル部分から選択され、Ｃ末端はＮＨ２、一個及び二個のＮ−置換グリシン残基から選択され、前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され、並びに前記Ｎ−及びＣ末端間の２個〜約１５個のモノマー残基、各前記残基は独立してプロリン残基及びＮ−置換グリシン残基から選択され、前記Ｎ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの炭素同族体から選択され、前記モノマーは前記化合物にモノマーの非周期的配列を供給するよう選択される化合物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の化合物であって、前記Ｎ末端基はＨであり、並びに前記Ｃ末端は前記１個及び２個のＮ−置換グリシン残基から選択される化合物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の化合物であって、前記モノマー残基は２−５（Ｘ−Ｙ−Ｚ−）非周期的三量体を含む化合物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の化合物であって、前記三量体の各々におけるＸ、Ｙ及びＺのうち少なくとも一つが三倍周期性を中断するよう選択される化合物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の化合物であって、少なくとも１つの前記三量体中の少なくとも１つのＸはＮｌｙｓ残基である化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の化合物であって、少なくとも１つの前記三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つがプロリン残基である化合物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の化合物であって、前記モノマー残基は少なくとも２個の非連続反復三量体を含み、その間に少なくとも１個の前記残基を含む化合物。
【請求項２８】
請求項２３に記載の化合物であって、少なくとも１つの前記三量体中の少なくとも１つのＸはＮｌｙｓ残基であり、並びに少なくとも１つの前記三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つはプロリン残基である化合物。
【請求項２９】
請求項２１に記載の化合物であって、前記Ｎ末端基はＮ−アルキル置換グリシン残基であって、前記アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖アルキル部分から選択される化合物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の化合物であって、前記モノマー残基は２−５（Ｘ−Ｙ−Ｚ）非周期的三量体を含む化合物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の化合物であって、前記三量体の各々のＸ、Ｙ及びＺのうち少なくとも一つは三倍周期性を中断するよう選択される化合物。
【請求項３２】
請求項２９に記載の化合物であって、前記モノマー残基は少なくとも２個の非連続反復三量体を含み、その間に少なくとも１個の残基を含む化合物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の化合物であって、少なくとも１つの前記三量体中の少なくとも１つのＸはＮｌｙｓ残基であり、並びに少なくとも１つの前記三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つはプロリン残基である化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年２月８日に出願された米国特許出願第６１／０６５，１８９号の優先権を主張するものであり、その全内容を、参照により援用する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ０１ＨＬ６７９８４及びＡＩ００７２６６の下及び米国エネルギー省によって授与された契約番号第ＤＥ−ＡＣ０２−０５ＣＨ１１２３１の下に、政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
天然の抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は感染菌から幅広く生体を防御し、これらへの耐性を獲得した細菌は少ないため、従来の抗生物質への補充又は代替物としての可能性を示す。多くのＡＭＰは、細胞膜の透過化によって細菌を殺し、脱分極、漏出及び死を引き起こすが、一方で付加的な陰イオン性の細菌成分を標的とするＡＭＰもある（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は細胞壁成分）。細菌がＡＭＰに対する耐性を有することはまれであるが、これは細菌がＡＭＰを回避するよう設計された耐性メカニズムとともに進化したためであろう。さらには、多くのＡＭＰの標的（例えば、細菌の原形質膜、陰イオン性の細胞内高分子）は十分に一般的であるため、耐性を失うが、全体的な官能性には無視できる程度の影響しかないようにそれらの配列を変化させることができる。
【０００３】
ＡＭＰは何十年にもわたり大いに研究されてきたが、今後も広範な臨床用途を見出すものとされている。これは、ペプチドによる治療は、急激なインビボでの分解に弱いことが一因であり、そのような分解によってそれらの生物学的利用能は劇的に低下する。ＡＭＰの非天然模倣物は、ＡＭＰの有益な特徴を保ちつつ、ペプチドのタンパク分解性感受性を回避することができる。よく知られたマガイニンなどの、陽イオン性、直鎖、αヘリックス類に属する短くて（＜アミノ酸４０個）単純な構造のＡＭＰは、特に模倣薬に適している。これらのＡＭＰのβ−ペプチド模倣薬で、抗菌性及び非溶血性インビトロ活性を有する模倣薬の開発が成功している。ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）は、これらとは別の部類のペプチド模倣であり、ペプトイド側鎖がα炭素ではなく主鎖アミド窒素に結合しているという点でペプチドの異性体である。β−ペプチド、β−ペプトイド、オリゴ尿素及びオリゴ（フェニレンエチニレン）などを含め、他のどの研究中のペプチド模倣システムよりも、ペプトイドはＡＭＰ模倣に特に好適である。それはペプトイドが、比較的低コストで多様な配列にアクセスでき、（従来のペプチド合成装置を用いて）固体相において容易に合成されるためである。簡易なサブモノマー合成方法で、タンパク新生アミノ酸の類似体又は完全な非天然部分にかかわらず、一級アミンとして利用可能なあらゆる化学官能性を導入することができる。よって、ペプトイドは高度かつ精密に調整可能である。さらに、ペプトイドはプロテアーゼ耐性であり、熱変性及びカオトロピック変性に抵抗性のある両親媒性ヘリックスを形成するよう設計することができる。
【０００４】
ペプトイドのポリ−Ｎ−置換グリシン構造は、主鎖のキラリティー及び鎖内の水素結合の双方を妨げるが、にもかかわらず、ペプトイドは、かさ高いα−キラル側鎖の周期的な導入によって安定したヘリックス二次構造を形成するよう変化させることができる。ペプトイドオリゴマーのＸ線、ＮＭＲ及びＣＤによる研究によると、ホモキラル側鎖の導入により、１回転あたり〜３モノマー、６．０〜６．７Åのヘリカルピッチの周期性でポリプロリンＩ型様ヘリックスを増大させることができることが分かった。ペプトイドヘリックスの三倍周期（three-fold periodicity）は、多くのＡＭＰが形成するのと同様の面状両親媒性構造の設計を容易にする。例えば、三量体の反復単位（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎは、各々Ｘ、Ｙ及びＺ残基からなる三面を有するペプトイドヘリックスを形成する。
【０００５】
残基が疎水性の領域と陽イオン性の領域に分かれている両親媒性の二次構造は、ほとんどのＡＭＰの特徴である。ＡＭＰは、殺そうとしている最終的な標的が何であるかにかかわらず、細菌細胞膜と相互作用しなければならず、両親媒性は、そのような相互作用に不可欠である。哺乳動物細胞膜は双性イオン性が高いため、陽イオン性領域は、陰イオン性の細菌膜への静電気的吸着を容易にし、選択性のいくつかの手段をもたらしている。疎水性領域は、ＡＭＰの脂質二分子膜内への導入のための追加的な駆動力を提供する。ＡＭＰと膜との相互作用の正確な性質はいまだ議論の余地があり、活発に論議されている；カーペットモデル、樽側板孔（barrel-stave pore）モデル、ドーナツ型孔モデル及び集合体モデルを含めて、多くのメカニズムが提案されている。
【０００６】
発明の要約
上記に鑑み、本発明の課題は、新しいポリ−Ｎ−置換グリシン化合物及びそれらの抗生物質としての使用に関する方法及び／又は療法を提供し、それによって、従来技術を改良し様々な不足や欠点を克服することである。当業者は、本発明の１つまたは複数の態様が、一定の目的に適合しうるものであり、一方、１つ以上の他の態様が一定の他の目的に適合する事を理解するであろう。各目的は、その全ての点において、本発明の全ての態様に等しく当てはまらなくてもよい。従って、以下の目的は、本発明のいずれか１つの態様に関する別の方法において考察することができる。
【０００７】
本発明の課題の一つは、グラム陽性菌とグラム陰性菌との双方に対する低マイクロモル範囲において最小発育阻止濃度を有し、従来技術の化合物と比較して、そのような濃度において哺乳動物細胞毒性がより低く、溶血が無視できる程度の化合物を提供することある。
本発明の別の課題は、疎水性及び／又は両親媒性に影響を与え及び／又は選択性を高めるために、残基配列及び／又はＮ−置換基によって変化させることができる化合物を提供することである。
本発明の別の課題は、単独で又は一つ以上の前述の課題と組み合わせて、既存のものより少ないモノマー数及び短いペプトイド長においてそのような可能性及び選択性をもたらす、新しい種類のＮ−アルキル化ペプトイドを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的、特徴、有益性及び利点は、この概要及び特定の実施形態のその記載から明らかとなり、種々のペプチド模倣化合物及びそれらの合成の知識を有する当業者には容易に明らかとなるであろう。そのような目的、特徴、有益性及び利点は、添付の実施形態、データ、図及びそれらから単独でもしくは本明細書に援用した参照を考慮して導き出される全ての合理的な推論と併せれば、上記から明らかとなるであろう。
【０００９】
一つには、本発明は、式
2011511077.tif 000003
のポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物に指向することができる。
そのような化合物において、Ａは、Ｈ及び末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基から選択することができ、ここでそのようなアルキル置換基は、約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択することができ、ｎは１〜３から選択した整数とすることができ、ＢはＮＨ２ならびに１及び２つのＮ−置換グリシン残基から選択することができ、そのようなＮ−置換基は、独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの構造的／機能的類似体から選択することができ、Ｘ、Ｙ及びＺは、Ｎ−置換グリシン残基から独立して選択することができ、そのようなＮ−置換基は、α−アミノ酸側鎖部分及びそれらの構造的／機能的類似体及びプロリン残基から独立して選択することができる。本明細書中の他所に記載するとおり、そのようなＸ−Ｙ−Ｚ周期性は、そのような化合物に特定の両親媒性をもたらすことができる。本発明を認識する当業者が理解するように、そのような構造的及び／又は機能的な類似性は、あらゆるα−アミノ酸側鎖、Ｎ−置換基及び／又はＮ−置換グリシン残基の配列との関連で考慮することができ、そのような構造及び／又は機能は、電荷、キラリティー、疎水性、両親媒性、ヘリックス構造並びに面状組織を含むが、これらに限定されない。そのような類似体は、そのような側鎖の炭素同族体（当該技術において理解されるような同族体）を含むが、それらに限定されず、±１または±２つのメチレン基及び／又はメチル基を含むが、それらに限定されない。
【００１０】
一方、ある実施形態では、ＡはＨとすることができ、またＢは１または２つのＮ−置換グリシン残基から選択することができ、そのような選択によって、その化合物の疎水性を、三倍周期化合物と比較して低下させることができる。そのような特定の実施形態では、ＸはＮＬｙｓ残基とすることができ、ｎは２〜３とすることができ、Ｂは２つのＮ−置換グリシン残基とすることができる。そのような化合物は、限定はされないが、式    
2011511077.tif 000004
とすることができる。
【００１１】
その他多くの実施形態においては、Ａ、Ｘ及びＢの同一性にかかわらず、ＹとＺのうち少なくとも１つをプロリン残基とすることができる。そのような特定の実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺは、プロリン残基とすることができる。
【００１２】
他の特定の実施形態では、Ａは、末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基とすることができ、そのようなアルキル置換基は、約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖アルキル基から選択してもよい。にもかかわらず、ＢはＮＨ２とすることができ、ｎは１及び２から選択してもよい。そのような特定の実施形態では、Ａは末端Ｎ−アルキル置換グリシン残基とすることができ、アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖アルキル部分から選択される。あるいは、ＢはＮＬｙｓ残基とすることができ、ｎは１とすることができる。
【００１３】
一つには、本発明は、式
2011511077.tif 000005
のポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物にも指向することができる。
式中、ｎは２及び３から選択することができ、Ｙ、Ｚ、Ｙ’及びＺ’は独立してＮ−置換グリシン残基から選択することができ、ここでそのような置換基は、独立してα−アミノ酸側鎖部分及びその炭素同族体から選択することができる。そのようなＹ’及びＺ’残基は、三倍周期化合物と比較して、疎水性を低下させるような化合物を提供するよう選択することができる。そのような特定の実施形態では、Ｘ及びＹのうちの少なくとも１つをプロリン残基とすることができる。また、ｎは２及び３から選択することができ、Ｙ’はＮＬｙｓ残基とすることができる。そのような特定の実施形態では、Ｘ及びＹのうちの一方もしくは両方をプロリン残基とすることができる。限定されないが、疎水性の低下したそのような化合物は、式
2011511077.tif 000006
とすることができる。
【００１４】
一つには、本発明は、式
2011511077.tif 000007
のポリ−Ｎ−アルキル置換グリシン抗生物質化合物にも指向することができる。
式中、ＢはＮＨ２及びＸ’から選択することができ、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＸ’は独立してＮ−置換グリシン残基から選択することができ、ここでそのような置換基は、独立してα−アミノ酸側鎖部分及びその炭素同族体から選択することができ、ｎは１及び２から選択した整数とすることができ、Ｒはそのようなグリシン残基のＮ−アルキル置換基とすることができ、そのようなアルキル置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択することができる。特定の実施形態では、ｎは２とすることができ、ＢはＮＨ２とすることができる。他の特定の実施形態では、ｎは１とすることができ、ＢはＸ’とすることができる。従って、Ｘ及びＸ’のうち一方もしくは両方をＮＬｙｓ残基とすることができる。それにかかわらず、アルキル置換基は約Ｃ６〜約Ｃ１８の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択することができ、Ｘ及びＸ’はＮＬｙｓ残基とすることができる。限定されないが、そのような化合物は、式
2011511077.tif 000008
とすることができる。
【００１５】
一つには、本発明は、Ｈ及びＮ−アルキル置換グリシン残基から選択されるＮ末端基を含む、ポリ−Ｎ−置換グリシン抗生物質化合物に指向することができ、そのようなアルキル置換基は約Ｃ４〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖及び環式のアルキル基から選択することができ、Ｃ末端はＮＨ２、一つ及び二つのＮ−置換グリシン残基から選択され、そのようなＮ−置換基は、独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの構造的／機能的類似体及びＮ−末端とＣ末端間の２〜約１５のモノマー残基から選択することができ、そのような残基は各々独立してプロリン残基及びＮ−置換グリシン残基から選択することができ、このＮ−置換基は独立してα−アミノ酸側鎖部分及びそれらの構造的／機能的類似体から選択される。本明細書中にて説明し、従来技術と区別するように、そのようなモノマーは、その化合物にモノマーの非周期的配列を提供するよう選択することができる。本発明を認識する当業者に理解されるように、そのような構造的及び／又は機能的類似性は、あらゆるα−アミノ酸側鎖、Ｎ−置換基及び／又はそのようなＮ−置換グリシン残基の配列との関係で考慮することができ、そのような構造及び／又は機能は電荷、キラリティー、疎水性、両親媒性、ヘリックス構造並びに面状組織を含むが、それらに限定されない。そのような類似体は、当業者に理解されるような側鎖の炭素同族体を含むが、それらに限定されず、±１または±２つのメチレン基及び／又はメチル基を含むが、それらに限定されない。
【００１６】
特定の実施形態では、そのような化合物のＮ末端基はＨとすることができ、Ｃ末端は前記１及び２つのＮ−置換グリシン残基から選択することができる。にもかかわらず、そのような化合物は、２〜約５つの（Ｘ−Ｙ−Ｚ）非周期的三量体を含むことができる。そのような特定の実施形態では、その三量体の各々におけるＸ、Ｙ及びＺのうち少なくとも１つは、三倍周期性を中断するよう選択することができる。限定されないが、少なくとも１つの前記三量体中の少なくとも１つのＸを、ＮＬｙｓ残基とすることができる。そのような特定の実施形態では、少なくとも１つのそのような三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つを、プロリン残基とすることができる。他の実施形態では、そのモノマー残基は、それもしくは反復三量体の非連続体を少なくとも２つ含むことができ、その間の少なくとも１つのそのような残基は、周期性を中断するようにすることができる。そのような特定の実施形態では、少なくとも１つのそのような三量体中の少なくとも１つのＸはＮＬｙｓ残基とすることができ、少なくとも１つの三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つは、プロリン残基とすることができる。
【００１７】
その他多くの限定されない実施形態では、そのような化合物のＮ末端基はＮ−アルキル置換グリシン残基とすることができ、アルキル置換基はＣ６約〜約Ｃ１８の直鎖アルキル基から選択される。にもかかわらず、そのような化合物は、２〜約５つの（Ｘ−Ｙ−Ｚ）非周期的三量体を含むことができる。そのような特定の実施形態では、該三量体の各々におけるＸ、Ｙ及びＺのうち少なくとも１つは、三倍周期性を中断するよう選択することができる。他の特定の実施形態では、該モノマー残基は、それもしくは反復三量体の非連続体を少なくとも２つ含むことができ、その間の少なくとも１つの残基を周期を中断するようなものとすることができる。そのような特定の実施形態では、少なくとも１つの三量体中の少なくとも１つのＸは、ＮＬｙｓ残基とすることができ、少なくとも１つの前記三量体中のＹとＺのうち少なくとも１つをプロリン残基とすることができる。
【００１８】
一つには、本発明は、本発明のポリ−Ｎ−置換グリシン化合物を一つ以上含む抗菌のペプトイド組成に指向することができる。そのような化合物は、当該技術において現在知られているか、もしくは今後知られるようになる一つ以上の抗菌性ペプチド及び／又はペプチド模倣化合物を任意に含むことができる。従って、本発明は、従来技術の抗菌成分及び薬学的に許容される担体を任意に有する、１つ以上の当該ポリペプトイド／アンペトイド化合物を含む医薬品組成物の一範囲に指向することができる。そのような組成物は、本発明を認識する当業者に理解されるように調製及び／又は配合することができる。にもかかわらず、以下に説明するように、そのポリペプトイド／アンペトイド化合物及び／又は関連組成物のいずれも、単独もしくは組み合わせて、共に投与するか、順次投与するかして、一以上の細菌又は微生物治療法と併せて使用できる。限定されないが、そのような方法は、一以上のそのようなポリ−Ｎ−置換グリシン化合物及び／又は関連組成物の提供並びにそのような化合物／組成物及び／又はそれらに接触する細菌の投与を含むことができる。当業者に理解されるように、そのような投与は、本明細書中で記載する種類の技術又はそれらを明確に改変した技術を用い、インビトロ又はインビボで行うことができ、そのような改変は、当業者及び本発明を認識するものには既知であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ペプトイドモノマー側鎖構造、それらの正式名称及び略称。
【図２】Ａ５４９肺上皮細胞に対する選択ペプトイド及びコンパレータペプチドの細胞毒性データ。
【図３】図３Ａ−Ｂ  （Ａ）１の変種及び（Ｂ）２の変種の１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）でのＣＤスペクトル。
【図４】図４Ａ−Ｂ  ５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（１：１）ＳＵＶに懸濁した（Ａ）１の変種及び（Ｂ）２の変種の１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）でのＣＤスペクトル。
【図５】図５Ａ−Ｂ  ５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（７：３）ＳＵＶ中に懸濁した（Ａ）１の変種及び（Ｂ）２の変種の１０ｍＭ水性トリス緩衝液（ｐＨ７．４）でのＣＤスペクトル。
【図６】ペプトイド１を単層の下方の副相に注入する前（円；イラスト上）及び後（正方形；イラスト下）のＸ線反射率データ及びＤＰＰＧ単分子膜の対応する適合度。
【図７】マウス腹膜注入モデルにおけるアンペトイドのインビボ有効性。５匹又は６匹のマウスを、各実験の各研究群に含めた。マウス１匹あたり２枚のプレートを用い、各プレートからの細菌コロニー数を点グラフで示す。各群中の横線は、個体群の幾何平均を表わす。
【図８】ポリペプトイドのサブモノマー合成プロトコルの概略図。単にステップ２及び３を繰り返して各モノマー単位を加えた。完全なポリペプトイドが合成されたら、該樹脂をトリフルオロ酢酸で切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。
【図９】アンペトイド（ameptoid）変種及び側鎖構造の模式図。従来、Ｎ末端基は左側にあり、Ｃ末端は右側にある。ここに示す該模式図は視覚化のためだけのものであり、各分子の実際のフォールディング挙動を意味するものではないことに注意されたい。マーカーのない三角形のヘリックス上の点はＮｓｐｅモノマーである。
【図１０】図１０Ａ−Ｃ：アンペトイドレジスター（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）及び配列変種のＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭであった。（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）でのＣＤ。（Ｂ）５ｍＭ赤血球模倣ＰＯＰＣ：コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む１０ｍＭトリス緩衝液でのＣＤスペクトル：（Ｃ）５ｍＭ細菌模倣ＰＯＰＥ：ＰＥＰＧ（３：７）ＳＵＶを含む１０ｍＭトリス緩衝液でのＣＤ。
【図１１】図１１Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液での実効電荷変種のＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭである。
【図１２】図１２Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液、（Ｃ）５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（３：７）ＳＵＶを加えた同緩衝液での長さ変種のＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭである。
【図１３】図１３Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液及び（Ｃ）５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（３：７）ＳＵＶを含む同緩衝液でのプロリン変種のＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭである。
【図１４】図１４Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液及び（Ｃ）５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（３：７）ＳＵＶを含む同緩衝液でのアキラルモノマー含有アンペトイドのＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭであった。
【図１５】図１５Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液及び（Ｃ）５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（３：７）ＳＵＶを含む同緩衝液での逆キラリティモノマー含有するアンペトイドのＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭであった。
【図１６】図１６Ａ−Ｃ：（Ａ）１０ｍＭトリス緩衝液、（Ｂ）５ｍＭ  ＰＯＰＣ／コレステロール（２：１）ＳＵＶを含む同緩衝液及び（Ｃ）５ｍＭ  ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（３：７）ＳＵＶを含む同緩衝液での脂肪族モノマー含有アンペトイドのＣＤスペクトル。アンペトイド濃度は６０μＭであった。
【図１７Ａ】選択されたアンペトイドの抗菌／溶血活性プロフィールの比較。最も有利なプロフィールを有するものは、各プロットの右下部分に現れる。
【図１７Ｂ】選択されたアンペトイドの抗菌／溶血活性プロフィールの比較。最も有利なプロフィールを有するものは、各プロットの右下部分に現れる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
説明の通り、本発明は、有効かつ非常に選択的な抗菌活性を有する、ヘリックス状、陽イオン性、両親媒性の、配列特異的及び／又は長さ特異的なポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）を提供する。これらの分子は、様々な病原体に対して広域スペクトラムの抗菌力を示し、インビボでの細菌感染を効果的に治療することができる。これらのペプトイドは、天然分子である抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）に構造的にも機能的にも相似していることが実証されている。また、配列及び側鎖の官能性を調整することによって、抗菌ペプトイドの活性及び選択性を調整することができる。いくつかの化合物は、低マイクロモル範囲においてグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を有し、それらのＭＩＣにおいて哺乳動物細胞毒性が低く、溶血は無視できる程度（＜１％）である。これらの活性は、既に報告されている従来の抗菌性のペプトイドに対して実質的に向上したものであるが、それらのうち活性が最も高い部類のものは、ヒト赤血球に対して溶血性がはるかに高かった。また本発明は、長さが５モノマーと短い類似体における抗菌能力及び選択性を保持する新しい種類のアルキル化抗菌性のペプトイドを提供する。
【００２１】
下記の実施例１〜９及び図１〜８を参照すると、当該技術において広く知られているように、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎらによって説明されたサブモノマー合成方法を用いてペプトイドを合成し、逆位相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）及び円二色性（ＣＤ）分光法で特徴を調べた（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，＆Ｍｏｏｓ，Ｗ．Ｈ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１０６４６−１０６４７を参照、参照することによりその全体をここに取り込む）。抗菌ペプトイドのＣＤスペクトルにより、それらは水性緩衝液及び脂質小胞の双方においてヘリックス構造をとり、そのため陽イオン性残基と疎水性残基との面状両親媒性の構成を有することが確認される。ブロス微量希釈の臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＣＬＳＩ）プロトコルに従って抗菌活性を求め、同様の微量希釈方法を用いて溶血活性を求めた。ペプトイドの細胞代謝活性に対する効果を、比色分析テトラゾリウム塩系ＭＴＳ［３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］アッセイを用いて求め、これには段階微量希釈も用いた。これらのデータは、臨床的に関連する病原体の変種に対する広域スペクトラム活性を示すが、最も選択性の高い抗菌ペプトイドは、それらの抗菌性の濃度の何倍もの濃度ではヒト赤血球又は哺乳動物の線維芽細胞に害を与えない。最後に、マウス腹膜注入モデルを用いて、２種類のペプトイドのインビボ感染治療能力を評価した。これらの結果は、２４時間の曝露期間で、マウスが死に至ることなく、マウス腹膜腔中の細菌数を著しく減少させることができることを示す。
【００２２】
抗菌ペプトイドの構造活性研究では、抗菌ペプトイドとＡＭＰの細菌殺傷メカニズムとの間に密接な類似性が示唆されている。多数のＡＭＰ研究において、一般に、疎水性及び両親媒性が増大し、実効電荷が低下すると、ペプチドをより選択性の低い機構へ偏らせる（bias）可能性があることが判明している。陽イオン性電荷が増え、疎水性又は両親媒性が低下すると、ペプチドの選択性が高まる可能性があるという点において、逆も成り立つ。行われた構造活性研究によると、ペプトイドは物理化学的性質の変化に同様に反応することが分かる。即ち、選択的ペプトイドは、配列が変化して疎水性、両親媒性が高くなるかまたは陽イオン性が低くなると、選択性が低くなり、逆もまた然りである。よって、抗菌ペプトイドはＡＭＰの機能的類似体である。
【００２３】
鏡面Ｘ線反射率を用いて、抗菌ペプトイドと脂質との細胞レベルでの相互作用を調べた。選択的ＡＭＰが大部分の時間、膜の表面の平面と平行な方向を向いているのと同様に、抗菌ペプトイドは、陰イオン性ＤＰＰＧ単層内で表面法線とペプチドの長軸との間で５６°に向いており、明らかに膜に対して垂直ではない。これは膜貫通型ポア形成ペプチドに予想されることであり、明らかにペプトイドと脂質頭部との間に相互作用が見られる。同様のＡＭＰと抗菌ペプトイドとの脂質結合配向は、これら２種類の分子間の機構的な類似性をさらに示唆している。
【００２４】
従って、本発明は、いくつかの望ましい性質の組合せをもたらす新規な種類の抗生物質を提供する。望ましい性質とは、以下を含むが、それらに限定されない。
１．腹腔内注射マウス・モデルを用いた２４時間の曝露によって哺乳類系中の細菌数を減少させる有効性。
２．臨床的に関連する病原体の広域抗菌スペクトルに対する低マイクロモル抗菌活性。
３．分子配列特性によって調整可能な選択性、それにより化合物のＭＩＣにおいて哺乳動物細胞が害を受けることがない。
４．天然抗菌性ペプチドとの機能的類似性、これは、ＡＭＰのように、抗菌ペプトイドが容易に菌耐性の発生の影響を受けないことを意味する。
【００２５】
疎水性の役割は、ポリミキシンＢ及びトリコギン等の抗菌リポペプチドの研究によって明らかにされている。これらのＡＭＰは、Ｎ末端基に脂肪酸の尾部を有するペプチド鎖からなる。例えば、ポリミキシンＢの脱アシル化されたものは、殺菌性が天然リポペプチドよりもずっと低い。また、異なる長さの脂質を有するトリコギン類似化合物は、尾部が長いものがより高い活性を示し、炭素原子４個より短い尾部を有する類似体は不活性であることが分かった。通常アシル化されないＡＭＰへ脂肪の尾部を付着させる試みがなされ、いくつかの場合では、不活性な陽イオン性ペプチドのアルキル化は、得られたリポペプチドに抗菌活性又は抗真菌活性を賦与するのに十分であった。さらには、Ｓｈａｉらによる研究では、アルキル尾部の長さを変えると、ペプチドが選択的でなくなる疎水性の閾値に達することが判明した。即ち、先端部において、尾部の長さを延ばしても溶血活性を増大させるのみであり、抗菌活性は増大しない。
【００２６】
本明細書中にて説明の通り、ＡＭＰの単純なペプトイド模倣物のインビトロ活性は、ＡＭＰ自体のインビトロ活性に非常に類似している（例えば、表１を参照）。特定の抗菌ペプトイド（「アンペトイド」）は、広域スペクトラムの抗菌力、低溶血性、哺乳動物細胞代謝に対する影響が最小限であること及びインビボ感染の治療における有効性を示す。さらに、脂肪尾部がペプトイドへ結合すると、長さが５モノマーと短く、細菌と真菌の両方に対して効力を有するＡＭＰの選択的、非天然類似体となる可能性がある。合理的に設計されたアンペトイドのライブラリに見られる構造と活性の関係は、多くのＡＭＰを説明する関係と全面的に相似している。シンクロトロン放射光を用いて、アンペトイドと脂質層との相互作用をプローブにて探究し、ＡＭＰとアンペトイドの類似性を見出し、細胞レベルでの相互作用に拡張した。
【００２７】
【表１】
2011511077.tif 000009
アンペトイド及びＡＭＰの抗菌活性及び溶血活性
ペプトイドモノマーの略称を図２において説明する。「＞ｘ」と報告される最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び溶血用量（hemolytic dose：ＨＤ）については、ｘ＝２００μｇ／ｍＬである。これは試験を行った最高濃度である（最高５００μｇ／ｍＬで試験したペキシガナンを除く）。
【００２８】
*水中のアセトニトリルのパーセント、ＨＰＬＣ溶出における０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。
†１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含有、ＴＦＡなし、ｐＨ７．０。
‡選択比、ＳＲ＝（ＨＤ１０）／（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＩＣ）。
§「＞ｘ」と報告される濃度に関して、ｘ＝２００μｇ／ｍＬであり、これは試験を行った最高濃度である（最高５００μｇ／ｍＬで試験したペキシガナンを除く）。
【００２９】
初期抗菌活性及び選択性検査
１５種類のアンペトイド類似体の初期セットを合成し、ＡＭＰ活性と一致した方法で、ペプトイドが構造の改変及び配列の改変によって影響を受けるかどうかを調べた。このライブラリにおけるアンペトイドの設計は、２つの抗菌選択性両親媒性十二量体、１及び２より得た。ペプトイド１［Ｈ−（Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅ−Ｎｓｐｅ）４−ＮＨ２］は、フェニルアラニンのペプトイド類似体、２／３Ｎｓｐｅ及びリジンのペプトイド類似体、１／３Ｎｌｙｓからなる（代表的なペプトイドモノマー及び対応するＮ−置換基の構造については図１を参照）。ペプトイド２［Ｈ−（Ｎｌｙｓ−Ｎｓｓｂ−Ｎｓｐｅ）４−ＮＨ２］は、Ｎｓｐｅの代わりに１／３イソロイシン様Ｎｓｓｂモノマーを含有する。変種配列は、キラリティー、長さ、疎水性、電荷及び両親媒性の変化に影響を与えるよう設計された。これらの化合物で、全て、代表的なＢＳＬ１グラム陰性菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９及びグラム陽性（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＲ１５１）菌種に対する抗菌活性について試験した。選択性の初期の大きさとして、ヒト赤血球に対するペプトイドの溶菌活性を求めた。表１は、合成された配列、分子疎水性の相対的大きさとしてのＲＰ−ＨＰＬＣ溶出における溶媒の組成及び抗菌活性及び溶血活性の概要を示す。１５種類のペプトイドのうち１０種類が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方に対して低マイクロモルＭＩＣを示し、非天然ペプトイドオリゴマーがＡＭＰと同等の活性を有する可能性があることを表している（マガイニン−２の選択的ＡＭＰ類似体であるペキシガナンのＭＩＣ及びハチ毒ＡＭＰであるメリチンのＭＩＣを表１に示す）。
【００３０】
各化合物に対する選択比（ＳＲ）を、１０％溶血用量（ＨＤ１０）をＥ．ｃｏｌｉのＭＩＣで割った値と定義し、同じく表１に示した。よって、ＳＲは、アンペトイドが哺乳動物細胞ではなく細菌を殺傷する傾向の評価である。アンペトイド１はＳＲが６．０であり、ペキシガナン（ＳＲ＝５．８）と同等である。予想通り、メリチン（細胞毒性がよく知られている）のＳＲは０．１６と低い。ほとんどのＡＭＰは低マイクロモル範囲の抗菌活性を有し、ペプトイド１のＭＩＣはその範囲にあるため、アンペトイドのライブラリは、選択性の増大した変種を産生すると当初予測された。実際に、１３種類の変種のうち６種類が、１及びペキシガナン（ＳＲ＞６）より選択性が高い。
【００３１】
選択されたオリゴマーのＡ５４９肺上皮細胞との生体適合性を、ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］アッセイを用いて評価した。図２は、これらの選択されたペプトイドの１０％代謝阻害用量（ＩＤ１０）及び５０％阻害量（ＩＤ５０）が、ペキシガナン及びメリチンと非常に近いことを示す。アンペトイド１−Ｐｒｏ６及び１−Ｎｈｉｓ６，１２はＭＩＣが＜７μＭであるが、ＩＤ１０がペキシガナンの１０倍及び２０倍である。興味深いことに、比較的非選択的であるペプトイド１１５ｍｅｒは、ペキシガナンと同等の細胞毒性を示す。
【００３２】
以下に、変化させた主要な物理化学パラメータに従ってアンペトイドのライブラリより導き出された構造活性相関について述べる。過去の研究にあるように、円二色性（ＣＤ）分光法を用いてスペクトルの極値の強度を特に１９０及び２２０ｎｍにおいてモニターすることによってアンペトイドのヘリシティを比較した。１０ｍＭ水性のトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で、単独及びモデル二成分脂質混合物からなる、下記の２種類の小さな一枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＳＵＶ）の存在下でＣＤを行った。
（１）陰イオン性Ｅ．ｃｏｌｉ膜模倣ＳＵＶ［ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（７：３モル比）］、並びに
（２）双性イオン性赤血球膜模倣ＳＵＶ［ＰＯＰＣ／コレステロール（ＣＨ）（１：１モル比）］。
【００３３】
キラリティーに関しては、対掌体の側鎖（Ｎｓｐｅの代わりにＮｒｐｅ；図１）を用いて、１と比較したその鏡像ＣＤスペクトルによって証明されるように（図３Ａ）、１ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒと言われる、ペプトイド１の左巻きヘリックス類似体を作成した。１及び１ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒの活性及び選択性は一致する（表１）。
長さに関しては、６〜１５モノマーに及ぶ、全て同じ三倍周期配列反復を有し、電荷と長さの比率が１：３の１の変種を作成した。１の短縮した変種、１６ｍｅｒ及び１９ｍｅｒ（それぞれ、長さ約１２Å及び１８Å）は、双方とも活性の高い抗菌物質であり、１より選択的である（表１）。一方、１の長さを伸ばした変種、１-１５ｍｅｒ（長さ約３０Å）は、実質的に１より溶血性が高く（ＳＲ＝０．５５）、細胞毒性が高く（図２）、抗菌性がわずかに低かった。緩衝液中でのこれらの化合物のヘリシティは一致する（データ表示せず）。
【００３４】
１及び２の疎水性Ｉｌｅ様のＮｂ及びＰｈｅ様のＮｓｐｅモノマーを、各々、よりかさ高く疎水性の高いＮｓｍｂ及びＮｓｎａで置換することによって、長さとは独立して疎水性を調節した（図１）。２−Ｎｓｍｂ２，５，８，１１及び２−Ｎｓｎａ６，１２の分子疎水性を高くしたことで、抗菌活性及び溶血活性の双方が増大した（表１）。しかし１−Ｎｓｎａ６，１２は、１に対しての抗菌活性が増大せず、溶血性が高い（ＳＲ＝１．２）。
【００３５】
また、疎水性を低下させた１の変種２種を作成した。１中の均等に離間した疎水性Ｎｓｐｅ残基２個を、生理的ｐＨでは極性があるが大部分において無電荷の、ヒスチジン（図１）のアキラル性ペプトイドモノマー類似体である、Ｎｈｉｓによって置換し、１−Ｎｈｉｓ６，１２を得た。このオリゴマーは、１と比較して、実質的に溶血が低下し（ＳＲ＞３１；表１）、細胞毒性（図２）が低下したが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する抗菌活性はわずかに低下しただけである。疎水性を低下させた第２の変種、１−Ｐｒｏ６を、６位にあるＮｓｐｅをｌ−プロリンで置換することによって作成した。プロリンはペプチドのα−ヘリックスを不安定にすることがよく知られているが、ｌ−プロリンは左巻きＩ型ポリプロリン様のペプトイドヘリックス内にうまく収容されているため、１−Ｐｒｏ６及び１のヘリックスは緩衝液中で同様であった（図３Ａ）。１−Ｐｒｏ６（ＳＲ＝８．９）は１より低い溶血及び細胞毒性を示し、抗菌活性は１と同等である（Ｔｂｌｅ１、図２）。
【００３６】
電荷については、ＡＭＰの大部分は陽イオン性であり、それらの塩基性残基を無電荷部分又は陰イオン性部分と置換すると、一般的に抗菌活性が失われる。アンペトイドにおけるこの現象を調べるため、１中のＮｌｙｓモノマーを、グルタミン酸塩様のＮｇｌｕ（図１）と置換し、１−Ｎｇｌｕ４，１０及び１−Ｎｇｌｕ１，４，７，１０を作成した。双性イオン性１−Ｎｇｌｕ４，１０は、１と比較して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して活性が著しく低下し、同様に陰イオン性細菌膜との有利な静電相互作用がないため、Ｅ．ｃｏｌｉに対して不活性である（表１）。しかし、溶血性がかなり高い（ＳＲ＜０．１７）。完全に陰イオン性である変種、１−Ｎｇｌｕ１，４，７，１０は、抗菌活性及び溶血活性の双方を欠いている。
【００３７】
両親媒性を調査するため、全体的な（global）両親媒性（２ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）を排除するよう設計された２の組み換え配列と同様（表１）、ブロック状構造（１ｂｌｏｃｋ）であり、面状両親媒性ではなく末端が両親媒性の、１の異性体を作成した。該１ｂｌｏｃｋ配列中の陽イオン性残基及び疎水性残基の末端を分離すると、ヘリックスに沿った残基の面状構成とは独立した強力な両親媒性の構造が確実に得られる。１ｂｌｏｃｋは、１と同じモノマー組成であるが、１よりわずかに抗菌性が低く、溶血性が高い（ＳＲ＝２．６）。緩衝液中及び脂質環境（図３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ）での２ｓｃｒａｍｂｌｅｄのＣＤスペクトルは、２にほぼ一致し、２ｓｃｒａｍｂｌｅｄが、その組み換え配列によって、２に対して全体的な両親媒性が低い構造化ヘリックスを形成すること示唆している。ペプトイド２ｓｃｒａｍｂｌｅｄは抗菌活性を示すが、最高１２０μＭまで溶血は示さない。
【００３８】
【表２】
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ペプトイド１のアルキル化変種の抗菌活性、抗真菌活性及び溶血活性
モノマー構造については図１を参照。
【００３９】
＊アスタリスクを付したものを除いて、アッセイは全て陽イオンを調整したブロス中で行われた。
†ＨＰＬＣ溶出は疎水性の大きさとして挙げ、Ｈ２Ｏ中のアセトニトリルのパーセントと定義する（Ｃ１８カラム、０．１％ＴＦＡ、ｐＨ１の存在下で実施）。
【００４０】
抗菌ペプトイドに対するアルキル化の効果を試験するため、１の一連のアルキル化変種を、アルキル尾部の長さとペプトイド鎖の長さの両方を系統的に変化させて合成した。一般に、ペプトイド鎖の長さは、元の１の配列から３モノマー（ヘリックス１回転）ずつ減らした。しかし、２価の正電荷を含む活性のある極めて短いＡＭＰの報告に基づき、最短の長さにおいて付加的なＮｌｙｓモノマーを保持した。Ｎ末端基ペプトイド残基の側鎖として、サブモノマーペプトイド合成プロトコル（置換ステップに適したアルキルアミンを用いて）によって、アルキル尾部を組み入れた。ペプトイドは全て、Ｃ末端においてアミノ化した。表２は、調査したアルキル化ペプトイドの短縮名及び配列とともに、これらのアルキル化変種の活性を列挙している。興味深いことに、分子量が１のおよそ半分である化合物、Ｃ１３−１４ｍｅｒは、１に匹敵する抗菌活性を示し、実際に赤血球に対してより選択性が高いことが分かったことは、注意に値する。
【００４１】
また、可能性のある抗真菌活性の特徴を調べるため、アルキル化化合物のライブラリを、代表的な真菌株であるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ・アルビカンス）に対して試験した。いくつかのケースでは、Ｃ１０−１６ｍｅｒ及びＣ１３−１４ｍｅｒ等の化合物は、有効かつ選択的な抗真菌活性を有すると分かった。
前出の分子世代は、特定の分子パラメーター（キラリティ、長さ、疎水性等）の構造機能相関を解明するよう設計した一方、別の世代の化合物は、選択性に関する結果を探究するよう明示的に設計した。これらの化合物の抗菌力を、陽イオンを調整したＭＨＢ中で上述の微量希釈プロトコルを用いて、菌種Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＴＣ３５２１８）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＡＴＴＣ６６３３）に対して試験した。ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対する配列、抗菌活性、溶血活性及び代謝阻害濃度の概要を表３に示し、それらの設計の理論的根拠を以下に記述する。
【００４２】
【表３】
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選択性の探究用に設計された第二世代ペプトイドの配列及び活性
【００４３】
限定されないが、異例の選択性を有することが判明した表１中の２つの分子（１−Ｐｒｏ６及び１−Ｎｈｉｓ６，１２）を用いて、いくつかの新しい配列を誘導そた。１−Ｐｒｏ６は１よりも抗菌性が高いが溶血性は低いことが判明したため、２種類の異性体的に関連性のある化合物（１−Ｐｒｏ３，１−Ｐｒｏ９）を作成し、プロリン残基の位置が活性及び選択性に与える効果を探究した。また、３位および９位の双方にプロリンを有するある変種（１−Ｐｒｏ３，９）を、プロリン残基の数を増やすことが活性プロフィールに与える効果を評価するよう設計した。第２の分子対（１−Ｎｈｉｓ６及び１−Ｎｈｉｓ３，６，９，１２）を作成し、配列内でＮｈｉｓ残基の数を調整することで起こる効果を調べた。
【００４４】
疎水性が活性及び選択性に与える効果を、表３に記述するさらなる分子セットを用いて調べた。いくつかの配列は、選択されたＮｓｐｅ残基をアキラル性Ｎｐｍ残基によって置換して設計した（図１を参照）。２種類の配列では、含まれる４つのＮｐｍ残基が一面に整列しているか（１−Ｎｐｍ２，５，８，１１）又はペプトイドの二つの面に分布している（１−Ｎｐｍ２，３，８，９）。また、１２位を除いて全てのＮｓｐｅがＮｐｍで置換されている分子（１ａｃｈｉｒａｌ−Ｎｓｐｅ１２）を、疎水性が低くなるが、まだ多少ヘリカルとなるよう設計した。キラル残基をＣ末端に含有させることは、ヘリシティを促進することが示された。最後に、１の全アキラル性のものである１ａｃｈｉｒａｌは、Ｎｐｍで置換されたＮｓｐｅ残基を全て含有する。
【００４５】
Ｎｓｍｂと異性体的に関連性がある（図１）疎水性側鎖Ｎｓｄｐを、さらに脂肪族側鎖の使用を調査するためのあと二つの配列に組み入れた。１−Ｎｓｄｐａｌｌは、Ｎｓｄｐで置換されたＮｓｐｅモノマーを全て有し、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１は、一つの面に４個のＮｓｄｐモノマーを示す。
最後の配列の系統は、配列レジスター、電荷配分及び長さが活性及び選択性に与える効果を評価するよう設計した。化合物１Ｂ及び１Ｃは、１の異性体であり、各々末端の電荷の存在を取り除くため（Ｎｓｐｅ−Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅ）、もしくはＣ末端の電荷（Ｎｓｐｅ−Ｎｓｐｅ−Ｎｌｙｓ）を示すため、配列レジスターを変さらした。また、分子の多数の面に分布した電荷の価数を増やした（すなわち、疎水性を低下させた）数種類の化合物を作成した。化合物１−Ｎｌｙｓ５，１１は、５位及び１１位の２個のＮｓｐｅモノマーをＮｌｙｓで置換し、結果的に電荷が２つ増えた１の配列を示す。その他の変種は、１Ｂレジスター配列において、同様に４位及び１０位の両方をＮｌｙｓで置換した、１２ｍｅｒ（１Ｂ１２ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，１０）及び１５ｍｅｒ（１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，１０）のものを含む。また同様に、３面上に分布するＮｌｙｓモノマーを付加した分子（１Ｂ１２ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，６，１０および１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，６，１０）を作成した。
【００４６】
脂質層中のアンペトイド配向のＸ線反射率研究
細胞膜の外葉を模したモデル脂質層（図６）におけるアンペトイド１の膜配向及び浸透深さを調べるため、シンクロトロン放射を用いて液体（水性緩衝液）表面鏡面Ｘ線反射率（ＸＲ）研究を行った。単分子膜から反射されたＸ線からは、界面に垂直の電子密度プロファイルが得られ、層の厚さ及び追加された分子の存在及び配向を決定することができる。実験データを、厚さ、電子密度及び界面粗さが均一なスラブの重なりとして表わす。
純粋なＤＰＰＧ（陰イオン性）フィルムのＸＲデータ（図６、円）は、二重スラブモデルと良好に適合し、炭化水素尾部密度（ρｔ／ρｓ）０．９９、炭化水素尾部のスラブ厚み（Ｌ１）１７．９Å、また頭部の電子密度（ρｈ／ρｓ）１．５４及び頭部のスラブ厚み（Ｌ２）５．７Åが得られた。これらのデータは、先出のＤＰＰＧ単分子膜Ｘ線研究と良く一致している。ＸＲプロフィールは、ペプトイド１を導入した後に劇的に変化し（図６、正方形）、四重スラブモデルに近似する。この近似によると、第一のスラブ（ρｔ／ρｓ＝０．９６、Ｌ１＝１２．１Å）は１のない脂質尾部と対応し、第二のスラブ（ρｔ＋ｐ／ρｓ＝１．０５、Ｌ２＝２．８Å）は１を部分的に挿入した尾部部位と対応し、第三のスラブ（ρｈ＋ｐ／ρｓ＝１．３３、Ｌ２＝７．０Å）は、１が完全に挿入された脂質頭部部位と対応し、第四のスラブ（ρｐ／ρｓ＝１．１６、Ｌ２＝３．６Å）は、ＤＰＰＧ頭部を超えて突出している１のみに対応する。この電子密度プロファイルは、脂質頭部を貫通する１の挿入及び部分的に脂質尾部を通っている１の挿入と一致する。さらに、１がそのヘリックス構造をモデル脂質単分子層内で保持すると仮定すると、データは、１がペプトイドの界面法線とへリックス長軸との間で約５６°の角度で挿入していることを示唆している。
【００４７】
【表４】
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ペキシガナン及び選択されたアンペトイドのＢＳＬ２及びＢＳＬ３病原性菌に対する広域スペクトラムの抗菌活性。
【００４８】
種々の病原性菌に対する広域スペクトラムの活性は、ＡＭＰの特徴である。従って、選択されたペプトイド及び対照ペプチドペキシガナンを、１６種類の臨床的に関連する生物学的安全性レベル−２（ＢＳＬ２）病原性微生物、７種類のグラム陰性株及び９種類のグラム陽性株に対して試験した。表４に示すこれらの微生物のＭＩＣの概要は、製薬用途に最適化されたペキシガナンに匹敵する有望な活性を示す。
【００４９】
ペプトイドがマウス腹膜注入モデル内で感染を治療する生体内有効性。
マウス腹膜注入マウス・モデル（murineperitoneal injection mouse model）を用いて、ペプトイドの感染治療能力をインビボで評価した。食塩水で処理した対照に対するペプトイド１の別個の研究３件及びペプトイド１−Ｎｈｉｓ６，１２の研究２件で得られた結果を、図７に示す。横線は、各個体群の幾何平均を表わす。
【００５０】
先の研究では、ＡＭＰと同様の抗菌力を有する化合物を作成するためにペプトイドを使用できることが判明している。この研究では、アンペトイドとＡＭＰとの機能的及び機構的類似性を示唆し、アンペトイドの臨床的に有益な抗生物質への発展の可能性を示すアンペトイド変種のライブラリ作成及び研究するため、ペプトイドのヘリックス形成の容易な合成及び高い性向を利用した。
１及び１ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒの同等な活性は、アンペトイド機構が、全体的な掌性（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）や、レセプタ又は酵素との立体特異的な相互作用、多くのＡＭＰに観察されてきた属性に依存しないということを示す。アンペトイドが膜と相互作用し、膜内に挿入するという証拠は、Ｘ線反射率研究（図６）によって提供される。さらには、頭部を通り部分的に脂質尾部内部に至る、ペプトイド１の挿入の深さは、１が疎水性及び親水性の脂質部分と同時に相互作用することを示す。よって、ＡＭＰと同じく、１の両親媒性構造は、膜との相互作用に不可欠である。界面法線に対して〜５６°の角度で１が配向していることで、１が樽側板メカニズム（ｂａｒｒｅｌ−ｓｔａｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって機能していないことが示唆される。これは、該メカニズムには、膜貫通配置が必要であるためである。１が天然のα−ヘリックス抗菌性ペプチドと同じ機構的挙動を示すと結論を下すことはできないが、これらのＸ線結果により、ペキシガナン及びＬＬ−３７等のＡＭＰに見られるものと一致するアンペトイドと脂質の相互作用が示される。
【００５１】
最終的に、アンペトイド活性は構造及び機能に関する傾向にも従っているかどうかをＡＭＰと類似の方法で調べ、選択的なアンペトイドの物理化学的性質は選択的ＡＭＰと一致していることが分かり、非選択的ペプトイドは、細胞毒性のペプチドと密接な類似性を示す。多種多様なＡＭＰに関する多数の構造活性研究によって、選択的な抗菌活性又は非選択的細胞毒性を誘発する物理化学的特性が明らかにされてきた。構造の種類（すなわち、α−ヘリックス、β−シート、ループ、又は伸長）にかかわらず、非選択的ＡＭＰは典型的には、
（１）非常に疎水性であり、そのためそれらと膜との相互作用は主に疎水性効果に支配され、
（２）はっきりした（well-defined）両親媒性の構造を有する。
一方、選択的ＡＭＰの抗菌活性は、以下のものに依存している。
（１）高い実効陽イオン性電荷（但し、過剰な陽イオン性電荷は溶血活性につながる可能性もある）及び
(２)ちょうど中程度の疎水性。おそらく反直感的には、はっきりした両親媒性構造は、選択的な抗菌力に必要ではない。ＡＭＰ二次構造の不安定化は選択性を向上させることが多い。
【００５２】
アンペトイド１−Ｎｇｌｕ４，１０，１１５ｍｅｒ，１−Ｎｓｎａ６，１２及び１ｂｌｏｃｋは全て、ペプトイド１（ＳＲ＜６．０）より選択性が低い（表１）。非選択的ＡＭＰの性質と一致して、これらの化合物は全て、１より疎水性が高く（ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出時間によると）及び／又は電荷が少ない（１−Ｎｇｌｕ４，１０）。さらには、それらは全て、赤血球模倣ＰＯＰＣ／ＣＨ  ＳＵＶ（図４）中で１と同等にヘリカル（もしくは１以上にヘリカル）であり、その脂質環境におけるそれらのはっきりした膜結合型両親媒性構造を表す。
【００５３】
一方、１９ｍｅｒ、１−Ｎｈｉｓ６，１２及び１−Ｐｒｏ６は全て、１と同等の抗菌活性を有するが、選択性が増強する（ＳＲ＞６．０）。これらのペプトイドは全て１より親水性が高く、全て実効電荷が少なくとも＋３である。よって、実効正電荷を有し、十分であるが過剰でない程度に疎水性であるならば、アンペトイドは選択的に活性であり、これは選択的ＡＭＰの観察と全面的に一致する現象である。また、短縮１９ｍｅｒにおける抗菌活性の保持及び選択性の増強は、切断型ＡＭＰの研究において観察される挙動と類似している。
【００５４】
一般に、長さがアンペトイドの効力及び選択性に与える効果は、長さに比例して増大する疎水性の差にかなり起因する可能性がある（ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間、表１）。１２ｍｅｒ  １は、それより長い類似体や短い類似体より抗菌性が高いため、これらの結果は、抗菌活性が最大となる至適な疎水性の存在を示唆する。疎水性が高まると、溶血活性のみが増大する。この結論は、疎水性が中程度の２−Ｎｓａｐ２，５，８，１１及び２−Ｎｓｎａ６，１２は両方とも２より抗菌性が高く、溶血性が高いため、疎水性変種によっても裏付けられ、一方で強疎水性の１−Ｎｓｎａ６，１２（表１）は、１に対して溶血性の増強を示すが、抗菌活性は増強しない。これらの結果は、ＡＭＰ及びそれらの変種の観察と一致する。
【００５５】
それらは２より溶血性が高いが、ペプトイド２−Ｎｓｎａ６，１２及び２−Ｎｓａｐ２，５，８，１１はそれでも１より選択的性が高く（ＳＲはそれぞれ７．６、１６）、それらの物理化学的性質は、この発見と一致する。それらは電荷が大きく（＋４）、疎水性が中程度であり、低ヘリシティと一致したＣＤスペクトルを示す（図３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ）。２−Ｎｓｎａ６，１２のＣＤスペクトルは赤方偏移した極値を示し、不安定化した二次構造を示唆している。よって、これらの２の変種は全て、はっきりしない両親媒性構造を有する。
【００５６】
実際に、ＡＭＰと一致して、結果は総じて、溶血活性には両親媒性の高い構造が必要であるが、抗菌活性には必要ではないことを示唆している。ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ  ＳＵＶでのアンペトイドのＣＤスペクトル（図５）は、この細菌模倣系でのヘリシティの程度は、抗菌力と相関性が低いことを示す。例えば１−Ｎｓｎａ６，１２は１よりヘリシティが低い（図５Ａ）が、該２種類の化合物は同様の抗菌能を有する（表１）。一方、２−Ｎｓａｐ２，５，８，１１は２と同様にヘリカルである（図５Ｂ）が、２−Ｎｓｍｂ２，５，８，１１は抗菌性がはるかに高い（表１）。
【００５７】
しかし、赤血球模倣ＰＯＰＣ／ＣＨ  ＳＵＶ（図４）でのＣＤスペクトルは、溶血活性とヘリシティとの相関を明らかにしている。１−Ｎｓｎａ６，１２及び１−Ｎｇｌｕ４，１０は、最も溶血性の高いアンペトイドであり（表１）、ＰＯＰＣ／ＣＨ  ＳＵＶ（図４Ａ）中で最もヘリカルである。１１５ｍｅｒもまた非常に溶血性が高く、ＰＯＰＣ／ＣＨ中で１と同等にヘリカルである。逆に、１−Ｎｈｉｓ６，１２、２，２−Ｎｓｍｂ６，１２及び２ｓｃｒａｍｂｌｅｄは、１より溶血性が低く（表１）、ヘリシティが低い（図４）。よって、これらの陽イオン性、面状両親媒性化合物に関しては、陽イオン基及び疎水基間のきれいな分離をもたらすはっきりしたヘリックス構造は、溶血活性に重要であると思われる。さらに、そのヘリシティとは独立したはっきりした末端両親媒性構造を有する１ｂｌｏｃｋによって、洞察がもたらされる。１ｂｌｏｃｋは溶血性である（ＳＲ＝２．６）。共に、これらの結果は、ヘリシティが、オリゴマー化及び非選択的機構への偏りを容易にする両親媒性構造を組織化するための手段としてのみ重要であることを示唆する。この結論に基づくと、２ｓｃｒａｍｂｌｅｄ等のヘリカルであるが両親媒性に乏しい化合物は、抗菌性であるが選択性があるはずである。実際に、２ｓｃｒａｍｂｌｅｄは細菌を殺傷するが、最高１２０μＭまで溶血を示さない。
【００５８】
結果はまた、疎水性が溶血活性にも関連していることを示し、１−Ｐｒｏ６と１との比較により、この関係がより具体的に確証される。これらのアンペトイドは、同じ実効電荷の同様の配列を有し、ほぼ一致するＣＤスペクトルを示す（図３Ａ）。これは、それらのらせん含有、ひいてはそれらの結果として得られる両親媒性が同様であることを示唆する。しかし、Ｎｓｐｅ→Ｐｒｏの置換はＲＰ−ＨＰＬＣ溶出時間（表１）に従って疎水性の低下を起こす。この唯一の相違点は、１と比較して１−Ｐｒｏ６の溶血性及び細胞毒性活性の低下に反映され、他の全てのパラメータが一定である場合、選択性が疎水性に依存することを明らかにする。
【００５９】
表３の結果は、分子構造の特徴がペプトイドの活性と選択性をいかに調整するかについてさらなる洞察を提供する。抗菌活性がプロリンの位置によって変化しない一方で、プロリンがＣ末端に近づくと、細胞毒性は低下する。プロリンは、その哺乳動物細胞への有害性を低下させるＣ末端における構造安定性を提供する一方、その殺細菌力に影響を及ぼさない可能性がある。Ｎｈｉｓ残基の数を増やすことは、抗菌活性と細胞毒性の両方を低下させた。興味深いことに、１−Ｎｈｉｓ６，１２（この系統の基礎配列）がＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ３５２１８に対して当初試験された株（ＪＭ１０９）よりはるかに活性が低いと分かった。
【００６０】
様々な量のアキラル残基を含んでいる化合物の系統は、アキラル残基の位置は抗菌活性に多大な影響を及ぼさず、選択性（表３、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１１対１−Ｎｐｍ２，３，８，９）には影響を及ぼす可能性があることを示す。面白いことに、これらの化合物は両方とも化合物１と等しい抗菌活性を示すが、優れた選択性を示す。アキラル残基が増えると、抗菌活性が低下するようにも見えるが、これは疎水性の低下とヘリックスの組織的構成が減少したことを原因とする可能性がある効果である。全てのＮｓｄｐ残基を含有する配列は比較的活性が低いが、４個のＮｓｄｐ残基を１面に沿って含有する配列（１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１）は抗菌力を示す。
【００６１】
荷電数を増やし、それらを多数の面に分布させると活性にいかに影響を与えるかを調べるため、いくつかの化合物を作成した。電荷の増大の効果を打ち消すため、２個の分子の長さを伸ばし疎水性を高めた。興味深いことに、この系統のどの分子も、同じく疎水性の低下のため、Ｅ．ｃｏｌｉに対して活性がないが、全ての分子がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して非常に活性が高いことが示された。同時に、赤血球と哺乳動物細胞に対しては完全に無毒である。この系統は、荷電がこれほど大きくない分子の作用とは異なる作用メカニズムによって作用している可能性がある。
【００６２】
広域スペクトル抗菌物質テストと生体内の有効性研究の結果は、抗菌物質ペプトイドの治療可能性を示す。試験したほとんど全てとも言える７種のペプトイドは、９種のグラム陽性株（バンコマイシン耐性４を含む）に対して、ペキシガナンより強力だった。グラム陰性株に対して、化合物１と１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１は、ペキシガナンに相当する活性を示した。
【００６３】
図２に示されるインビボの結果より、ペプトイド１（ｐ＜０．０５）で処理すると、腹膜洗浄液からの細菌数がかなり減少したことが分かる。さらに、ペプトイド１で処理されたマウスで、早期死亡したものはなかった。他方、ペプトイド１−Ｎｈｉｓ６，１２で処理した１１匹のマウスのうち、８匹は暴露期間の間に早期死亡した。全３件の実験を通して、食塩水で処理した１５匹の対照のうち、４匹のみが早期死亡した。また平均細菌数は、食塩水で処理した対照と比較して減少しなかった。
【００６４】
要約すると、結果はＡＭＰや同じくアンペトイドのうちでの抗菌活性は、中程度の疎水性及び実効陽イオン性電荷に依存しており、一方、溶血活性は、らせん含有に関わらず、主に高疎水性及び強両親媒性構造と関連性があることを示唆する。ＭＴＳ分析評価は、Ａ５４９真核生物哺乳動物細胞に対する溶血活性と細胞毒性の間の類似した傾向を示す。アンペトイドの構造と機能の関係は、ＡＭＰにおけるそれらの関係と経験的に類似している。Ｘ線反射率研究は、アンペトイド１が膜活性型であり、安定した膜結合型配向を採用することを示し、ＡＭＰとアンペトイドとの細胞レベルでの類似性を実証する。
【００６５】
アルキル化変種の結果によると、アルキル鎖を付着させることが、アルキル化ヘリックスが長いものと同等抗菌活性及び無毒性を有する、非常に短いペプトイドの作成に使用できるかもしれないことが分かる。特に、Ｎｄｅｃ−１６ｍｅｒ及びＮｔｒｉｄｅｃ−１４ｍｅｒの双方は、活性及び選択性が１に匹敵すると分かった。ほとんどのＡＭＰの長さがアミノ酸〜１２−１００個の範囲であるとすると、そのような低分子量（＜１ｋＤａ）ペプトイドが細菌と真菌に対してそのような効力と選択性を示すことは注目に値する。アルキル尾部のＮ末端基への付着は、効力の向上及びアンペトイドの分子量の低下に役に立つモチーフである可能性がある。さらに、アルキル化はペプトイド機能に対するはっきりした効果を示す、効果的で調整できる修飾である。
【００６６】
ペプトイドには、向上した安定性、生物学的利用能及びその調整可能性の高い側鎖化学のため、医薬として、また生体適合物質中での使用に、ペプチドより大きな可能性がある。ペプチドが有し得る毒性は、それらの臨床用途を制限する大きな障害であるため、ここでＡＭＰペキシガナンとの比較で観察されるアンペトイドの低細胞毒性は、それらの治療可能性をさらに強調するものである。ここに報告される結果は、アンペトイドと他の非天然オリゴマーの抗菌物質としての合理的な設計と最適化を促すであろう。
【００６７】
上述の研究の継続として、特定の構造特性が選択性に影響を及ぼす方法及び範囲をより完全に探究することを目的として、他の多様なアンペトイドを作成した。（表５〜７、図９〜１７及び実施例１０〜１５を参照。）さらなるアンペトイドを、以前に報告した十二量体、ペプトイド１より得た。ペプトイド１は、反復配列Ｈ−（Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅ−Ｎｓｐｅ）４−ＮＨ中に配置した１／３リジン様の荷電モノマー（Ｎｌｙｓ）及び２／３フェニルアラニン様の疎水性モノマー（Ｎｓｐｅ）から成る（図９、表５）。上に述べた特定の化合物を参照すると、付加的な分子を、抗菌力及び細胞選択性に対する、（１）一次配列、（２）配列レジスター、（３）実効電荷及び（４）電荷／長さ比率（ＣＴＬＲ）の重要性を探究するよう設計した。異なる疎水性部分の影響は、一つ以上のＮｓｐｅモノマーを他の疎水性部分と組織的に置換することによって評価された。（１）Ｌプロリンモノマー（２）アキラル性疎水性モノマー、（３）逆のキラリティーの疎水性モノマー（Ｎｒｐｅ）及び（４）脂肪族疎水性モノマー。また、上記のように、幅広く研究され、臨床的に重要なマガイニン−２のＡＭＰ類似物であるペキシガナンを、ＡＭＰへの比較の基準として、この研究に含めた。
【００６８】
ペプトイド１（基本配列）と、アンペトイド変種（上述のものを含む）の三倍周期構造を示している概略的な構造を図９に示し、ここで述べる設計戦略およびアンペトイド変種間の関係を明らかにする。この研究全体にわたり言及する３種類の分子アンペトイド面を、図示の通り、左側、後側及び右側に整列したモノマーとして表す。各分子の完全な配列を、分子量、実効電荷、ＣＴＬＲ及び分子疎水性の大きさとして、溶出時の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）溶媒組成を含むその他の分子物性とともに表５に示す。一般に、上に示したように、アンペトイドの命名規則は、基本化合物（１、ほとんどの場合）を含み、基本化合物と比較して配列がどのように修飾されているかの説明が続く。例えば、化合物１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，１０は、Ｎｌｙｓモノマーが４位と１０位で置換された１Ｂの配列をベースとする変種を表している。
【００６９】
細菌株と哺乳動物細胞に対する全化合物の活性を、表６にまとめる。代表的なグラム陰性（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ３５２１８）及びグラム陽性（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ６６３３）生物学的安全性レベル１（ＢＳＬ１）生体に対する全ての化合物の効力を調べた。哺乳動物細胞への毒性の従来基準である溶血活性に加えて、各アンペトイドがＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞に与える効果を、ＭＴＳテトラゾリウム塩比色測定法を用いて求めた。溶血は赤血球の溶解の程度を示し、ＭＴＳ測定法は、細胞代謝活性が抑制される範囲を間接的に定量化する。
【００７０】
これらの分子によって示される溶血活性の範囲が阻害活性の範囲よりかなり大きいので、溶血アッセイは、哺乳動物細胞に対する活性をより高感度に計測する。従って、赤血球と比較した様々な細菌株に対する各アンペトイドの選択性を、選択比（ＳＲ）として報告する。選択比は、１０％溶血用量を細菌株ごとの最小阻止濃度（ＭＩＣ）で割った値と定義される。
【００７１】
このライブラリにおけるアンペトイドは、３．１μＭ〜＞１００μＭに及ぶグラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗菌能を示した。同様に、溶血活性はＨＤ１０＝１６μＭ〜ＨＤ１０＞２００μＭの範囲であり、代謝阻害活性はＩＤ５０＝４．９μＭ〜ＩＤ５０＞１００μＭの範囲であった。これらの化合物によって証明される活性及び選択性の幅は、このライブラリは、構造と活性の関係を解明するため、一連の反応に影響を与えるよう上手く設計されていることを示唆する。１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ，＝３．３）と比較して、２６種類のアンペトイド変種のうち１７種類は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．８〜２６）に対する選択性の向上を示す。４種類のアンペトイド（１−Ｎｐｍ２，５，８，１１，１１１ｍｅｒ，１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２，１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２）が、ペキシガナン（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１１）と比較して、同等（６．３μＭ）及びより高い選択性（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１４〜２６）を示した。Ｅ．ｃｏｌｉに対するそれらの活性と比較して、全てのオリゴマーが、ＭＩＣが０．７８〜１．６μＭの範囲であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対してより効力が高かった。対応する選択比は＞２５６と高かった。
【００７２】
【表５】
2011511077.tif 000013
アンペトイド及び対照ペプチドペキシガナンの配列及び分子物性。各配列に示すペプトイドモノマーの構造については図２．１を参照。ＨＰＬＣ溶出は、注入３回に対する化合物溶出時の溶剤混合物中のアセトニトリルの平均比率として報告する。アセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸）を、４５分間のアセトニトリル５％から９５％までの直線勾配で、Ｃ１８カラムに流した。§ＣＴＬＲは、ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ｌｅｎｇｔｈ  ｒａｔｉｏ（電荷対長さの比）の略であり、荷電モノマー合計数の、各配列中のモノマー合計数に対する比率と定義される。
【００７３】
【表６】
2011511077.tif 000014
アンペトイド及びペキシガナンの細菌及び哺乳動物細胞に対する活性。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ３５２１８）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ６６３３）に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対する１０％及び５０％溶血用量（ＨＤ）及び５０％抑制量（ＩＤ）を示す。＊選択比（ＳＲ）は、１０％溶血用量の、対象菌株のＭＩＣに対する比率と定義する。
【００７４】
アンペトイドの二次構造を、ＰＯＰＣ／コレステロール（モル比２：１）かＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（モル比７：３）から成る１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）及び小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を含有する同緩衝液で、円二色性（ＣＤ）分光法を用いて評価した。ＰＯＰＣ／コレステロール混合物は、赤血球膜を模した双性イオン性二成分モデルの脂質製剤であり、負に荷電したＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜の組成を模したものである。芳香族右巻きポリ−プロリン−Ｉ型様のヘリックスから成るペプトイドは、極大値が１９２ｎｍ、２つの極小値が各々〜２０２ｎｍ及び〜２２０ｎｍにあるスペクトルの特徴を示す。
【００７５】
Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅ−Ｎｓｐｅの周期的な三量体反復配列を有するペプトイド１は、図９に示すように、左側の分子面に沿って面状に整列した四つのＮｌｙｓモノマー（１、４、７及び１０位）からなり、荷電したＮ末端モノマーを有する。配列レジスターを修飾した２種類の異性体変種を作成した。この変化は、末端位置に対するモノマーの相対位置に最も明白に影響を与えるものである。ペプトイド１ＢはＮｓｐｅ−Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅの三量体の反復を有し、背面に沿って荷電モノマーを示し（２、５、８及び１１位）、両末端に疎水性部分を有する。アンペトイド１Ｃは、Ｎｓｐｅ−Ｎｓｐｅ−Ｎｌｙｓの配列レジスターを示し、右側面に沿って（３、６、９及び１２位）荷電モノマーを有し及びＣ末端位置に荷電モノマーを有する（図９を参照）。この系統の最後の変種は「組み換え」異性体、１ｓｃｒであり、４個の荷電モノマーが３つの分子面全てにわたって分布する非周期的配列で作成した（図９）。
【００７６】
全ての３種類の変種のＥ．ｃｏｌｉ（ＭＩＣ＝６．３μＭ）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＭＩＣ＝１．６μＭ）に対する抗菌効力は、１と同じであり、それらのＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対する毒性もまた、ＩＤ５０値４．９〜５．６μＭと同様であった。しかし、１ｓｃｒ（ＨＤ１０＝６４μＭ）及び１Ｂ（ＨＤ１０＝５５μＭ）に対する溶血活性は、１（ＨＤ１０＝２１μＭ）及び１Ｃ（ＨＤ１０＝２５μＭ）と比較して低下した。結果として、１ｓｃｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１０）及び１Ｂ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝８．７）に対する選択性は、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）及び１Ｃ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝４．０）と比較してより有利であった。
【００７７】
ＣＤ分光法により、これらの変種は全て、１と同様の１０ｍＭトリス緩衝液中でヘリシティを示し、１ｓｃｒがわずかにヘリカルが高く、１Ｃがわずかにヘリシティが低い（図１０Ａ）ことが分かった。しかし、１Ｂは、ＰＯＰＣ／コレステロール及びＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ脂質の双方において、その他の変種と比較して２２０ｎｍでのヘリカル強度が著しく増大した（図１０Ｂ、Ｃ）。その組み換え配列の設計の性質により、１ｓｃｒに対するヘリシティの範囲は、その両親媒性の度合いから切り離されている。３つの分子面全てに電荷を分布させると、三倍周期ヘリックス構造に関わらずその両親媒性が低下する。１ｓｃｒのある分子面に沿った側鎖部分の分子内静電反発力が低下すると、その両親媒性が全体的に低下するにもかかわらず、よりヘリカルな二次構造を容易に収容するという可能性がある。以上の研究に基づくと、両親媒性の低下は抗菌力を損なうことなく選択性を向上させる可能性がある。実際に、１ｓｃｒは、抗菌力が低下せず（両分子ともＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝６．３μＭ、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）と比較して、選択性（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１０）が向上する。
【００７８】
アンペトイドの第２の系統を、電荷密度の増大が効力及び選択性に与える影響を評価するよう設計した（図９）。実効電荷の低下したアンペトイド変種より導き出された構造活性相関は、同じく負に荷電した細菌膜との静電相互作用が不利であるため、それらの細菌に対する選択性を著しく低下させると分かった。アンペトイドのこの系統の変種を、実効電荷及び電荷／長さ比（ＣＴＬＲ）の増大が細胞選択性に与える影響を探究するよう設計した。アンペトイド１及びこのライブラリの他の変種のほとんどは、実効電荷が＋４、ＣＴＬＲが０．３３である。これらの化合物は、＋６〜＋８の範囲の実効電荷及び０．４７〜０．５８の範囲のＣＴＬＲを示す。また、これらの化合物の疎水性（ＨＰＬＣ溶出時のアセトニトリルが４５．４％〜５５．５％範囲）は、１（６５．１％）と比較して全て著しく低下した（表９）。１−Ｎｌｙｓ５，１１は、ヘリックスの背面に沿って整列した５位及び１１位で置換されたＮｌｙｓモノマーを（１と比較して）２個多く有し、合計６価の正電荷を有する（図９）。１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，１０は、１Ｂの配列レジスターを持つ１−Ｎｌｙｓ５，１１の異性体変種であり、１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，６，１０は同様に、陽イオン性電荷が３分子面全てに存在し、実効電荷が＋７である。これより長い１５ｍｅｒ変種である、１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，１０及び１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，６，１０も、（Ｎｓｐｅ−Ｎｌｙｓ−Ｎｓｐｅ）ターンをＣ末端に追加して作成し、実効電荷は各々＋７及び＋８となった（図９）。
【００７９】
この系統の変種は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＩＣ＝５０−＞１００μＭ）に対する活性が著しく低く、非溶血性（ＨＤ１０＞１００μＭ）であり、１と比較して、これらの変種の疎水性の低下に大きく影響を受けた結果であった。変種のこの系統は広範囲の選択性を示さないため（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＞２〜＞４）、物理化学的性質と選択性との有意義な関係を解明することは困難である。しかし、観察された全般的な傾向は、ＣＴＬＲが〜０．５０未満、疎水性がアセトニトリル〜５０％超であり、１つの完全に疎水性である面（１−Ｎｌｙｓ５，１１，１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，１０及び１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，１０）を有する変種は、弱い活性を示したということである（ＭＩＣＥｃｏｌｉ＝５０μＭ）。ＣＴＬＲが〜０．５０超、疎水性がアセトニトリル〜５０％未満であり、３分子面全てに電荷が分布する変種（１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，６，１０及び１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４，６，１０）は、完全に不活性であった（ＭＩＣＥｃｏｌｉ＞１００μＭ）。これらの結果は、ＡＭＰとアンペトイドの双方について過去に確立された構造と活性の関係と釣り合うものである。（１）抗菌オリゴマーは、グラム陰性菌に対して有効であるためには疎水性が十分でなければならない及び（２）荷電が大きく両親媒性に乏しい構造は、一般的に選択性である。
【００８０】
この分子系統が示したＥ．ｃｏｌｉに対する活性の低下がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する活性に持ち越されなかったことは、大いに注目に値する。１（ＮＣ＝＋４、疎水性＝６５．１％及びＣＴＬＲ＝０．３３）と比較して、この分子系統が示した物理化学的性質の顕著な変化にも関わらず（＋８の高ＮＣ、アセトニトリル４５．４％の低疎水性、０．５８の高ＣＴＬＲ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対するこれらの変種のＭＩＣは、０．７８〜１．６μＭの範囲であり、１と非常に近いものであった。このライブラリにおける分子のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する得られた選択比は、試験した全化合物中、最高の部類に属するものであった（ＳＲＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ＞２５６）。
【００８１】
図１１のＣＤスペクトルは、１Ｂ−Ｎｌｙｓ４，６，１０の例外を除き、１０ｍＭトリス緩衝液中で全ての化合物が１と同様のヘリシティを示したことを示す。しかし、ＰＯＰＣ／コレステロール脂質中では、ヘリシティとＣＴＬＲとは逆の関係にあり、同時に、ヘリシティとアキラル性モノマー含有量も逆の関係であった。アキラル性モノマーの含有量の増大がペプトイドのＣＤスペクトルに与える影響は、脂質小胞の疎水性環境ではっきりと示されている。図１１Ｂに示すように、アキラル性モノマーの含有量の増大は、特に２２０ｎｍでの全体的なＣＤ信号強度を低下させた。
【００８２】
図９及び表５に示すように、長さが１０〜１３モノマーの範囲の十二量体ペプトイド１の変種を探究した。ＣＴＬＲが一定（１６ｍｅｒ，１９ｍｅｒ，及び１１５ｍｅｒ）で長さを変えたアンペトイドの変種を探究した上述の研究から、長さを１２モノマー以上（アンペトイド１）に伸ばすと、抗菌効力は向上せず、溶血活性のみが増大することが分かった。この研究における変種、１１０ｍｅｒ、１１１ｍｅｒ、１及び１１３ｍｅｒは、配列長さの差が小さいが、ＣＴＬＲの範囲に著しく影響する（０．３３〜０．４０）。このＣＴＬＲ範囲は、電荷密度変種が示す範囲と比較して著しく低い（０．４７〜０．５８）。図１２に示すＣＤスペクトルは、水性緩衝液及び脂質環境の双方において、全ての変種が同様にヘリカルであり、従って同様の両親媒性を示すことを示唆している。
【００８３】
先ず実効電荷が＋４（１１０ｍｅｒ，１１１ｍｅｒ，１）の変種のみを考えると、疎水性とＣＴＬＲの両方とも、長さと単調に対応する。アンペトイド１（１２ｍｅｒ）は最も疎水性が高く（アセトニトリル６５．１％）、最も低いＣＴＬＲを示し（０．３３）、１１０ｍｅｒは疎水性が最も低く（アセトニトリル６０．９％）、ＣＴＬＲが最も高いことが特徴である（０．４０）。表５のデータは、細胞選択性がＣＴＬＲと直接関係し、疎水性とは逆の関係であることを示す。Ｅ．ｃｏｌｉに対する１１０ｍｅｒの活性（１２．５μＭ）のわずかな低下（その疎水性の低下の結果）は、その溶血活性のはるかに大きな向上を伴った（ＨＤ１０＞２００μＭ）；従って１１０ｍｅｒは、この群中で最も選択性が高い（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＞１６）。１１１ｍｅｒは、１と等価な抗菌力（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ  ６．３μＭ）を保持したが、選択性は１１０ｍｅｒより低かった（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１６）。アンペトイド１は最も選択性が低いことが判明した（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）。同じ傾向が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する選択性について観察された（表６）。
【００８４】
上記の関係に基づき、１１３ｍｅｒ（ＣＴＬＲ＝０．３８）は１１１ｍｅｒ（ＣＴＬＲ＝０．３６）と比較して選択性が向上していると予想されたが、これに当てはまらなかったことは注目に値する。逆に、アンペトイド１１１ｍｅｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１６）は１１３ｍｅｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．８）より選択性が高い。このことは、１１０ｍｅｒ、１１１ｍｅｒ及び１の全てが実効電荷が＋４であるのに対し、１１３ｍｅｒの実効電荷は＋５に増大したという事実に起因しうる。上述のように、実効電荷は細胞選択性、特にグラム陰性菌に対する細胞選択性に影響を与える可能性がある。ＣＴＬＲが０．３６で実効電荷が＋４の１１１ｍｅｒが、この分子群のうち有効な抗菌力及び細胞選択性の最適なバランスを表わす。しかし、１１０ｍｅｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＞１６）、１１１ｍｅｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１６）及び１１３ｍｅｒ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．８）の選択比は全て、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）よりも優れている。
【００８５】
自然発生のＡＭＰ中のプロリンモノマーは、α−ヘリックス二次構造を不安定化させ、ヘリックス−ベンド−ヘリックスモチーフの形成を誘発することが知られているが、ここでは、プロリンはポリプロリンＩ型様のペプトイドヘリックス構造内に上手く収容されている。プロリンのＮｓｐｅと比較して低下した疎水性のため、アンペトイド１の配列において、Ｌ−プロリンを、中心に位置する疎水性残基で置換すること（この変種を１−Ｐｒｏ６と呼ぶ）によって、分子疎水性が低下し、選択性が向上することが判明した。いかに相対位置並びにプロリンモノマーの数が効力及び選択性に影響を与えるかを評価するため、ＣＴＬＲ及びヘリシティを一定に保ちつつ、分子系統を設計した。１−Ｐｒｏ６と同様、１−Ｐｒｏ３及び１−Ｐｒｏ９は、アンペトイド１配列の各々３位並びに９位内に置換した単一のプロリンモノマーを有する。第四の変種、１−Ｐｒｏ３，９は、２個の置換プロリンモノマーを組み入れたものである（図９及び表５）。１−Ｐｒｏ３、１−Ｐｒｏ６及び１−Ｐｒｏ９の相対的な疎水性は、全て１と比較して同様である（６２．４％−６３％）か、低下した（６５．１％）；１−Ｐｒｏ３，９は、疎水性がはるかに低い（５８．１％）ことが判明した。トリス緩衝液中でのＣＤ分光法及び双性イオン性及び陰イオン性脂質の両方は、プロリン含有アンペトイドが１と同等のヘリシティを示すことを示す（図１３）。
【００８６】
Ｅ．ｃｏｌｉに対するこれらの変種の活性は疎水性に対応する。１−Ｐｒｏ３、１−Ｐｒｏ６及び１−Ｐｒｏ９は、ペプトイド１（６．３μＭ）と比較してＥ．ｃｏｌｉに対する効力が均一に低下した（１２．５μＭ）。１−Ｐｒｏ３，９，９の効力は、Ｅ．ｃｏｌｉに対してはさらに弱まった（５０μＭ）。またこれらの変種は哺乳動物細胞に対しても活性の低下を示すため、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）と比較して全てのモノ−置換変種（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝５．９〜１３）に対して選択性が向上した。
【００８７】
モノ−置換プロリン含有変種に関する興味深い観察は、プロリンモノマーの配列内での相対位置が、細胞選択性に影響したことである。１−Ｐｒｏ３、１−Ｐｒｏ６、１−Ｐｒｏ９は、ＣＴＬＲ、実効電荷及び疎水性が一定に保たれる分子系統を含む。また、これらの変種のうち両親媒性の程度は、水性緩衝液及び脂質環境の双方におけるそれらのＣＤスペクトルの類似性に基づき、同等である（図１３）。しかし、特にプロリンをＮ末端からＣ末端部位に移動することによって、赤血球及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の双方に対する選択性がさらに増大した（表６）；１−Ｐｒｏ３はＨＤ１０＝７４μＭかつＩＤ５０＝１２μＭであり、１−Ｐｒｏ９はそれぞれ１６５μＭ及び２４μＭであった。得られた選択性は、１−Ｐｒｏ３（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝５．９）から、１−Ｐｒｏ６（ＳＲＥ。ｃｏｌｉ＝６．６）、１−Ｐｒｏ９（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１３）の順に単調に増大した。同様の傾向が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する選択比について観察された。このことは、アンペトイドが哺乳動物細胞と相互作用する際に好ましい配向がある可能性があることを示唆する。例えば、アンペトイドがＣ末端部位において哺乳動物細胞と優先的に相互作用する場合、分子のその部分に特異的に疎水性を低下させることは、哺乳動物細胞に対するその活性を損ない、選択性を増大させる可能性がある。
【００８８】
選択性を向上させる別の戦略は、疎水性が低く、アンペトイド１において選択されたＮｓｐｅモノマーの代わりにアキラル性Ｎｐｍ側鎖を有するアンペトイドの系統に関する（図９及び表５）。ペプトイドの分子キラリティーは、主鎖のキラリティーよりも側鎖のキラリティーから導き出されるため、キラルモノマーの数の変化が二次構造の安定性に影響を与えると予想される。従って、この分子系統を、１と比較して、ＣＴＬＲ及び実効電荷の定数のあらゆる変化とは独立して、低下した疎水性及びヘリシティ範囲に影響するようよう設計した。１ａｃｈｉｒａｌは、Ｎｐｍで置換された８個のＮｓｐｅモノマー全てを有する。２種類の変種、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２および１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２は、それぞれ２位と１２位に１個のキラルＮｓｐｅモノマーのみを有する。他の２種類のアンペトイドは、分子の背面に沿って整列している（１−Ｎｐｍ２，５，８，１１）か、もしくは疎水性の分子面の両方にかけて分布している（１−Ｎｐｍ２，３，８，９）、各４個のアキラル性Ｎｐｍを含有する（図９）。
【００８９】
これらの化合物の疎水性は、１ａｃｈｉｒａｌの５９．８％からペプトイド１の６５．１％にわたり、一般的に、Ｎｓｐｅの含有量とともに増大する。また、図１４に示すように、両親媒性と相関するヘリックス信号の強度は、Ｎｓｐｅの含有量とともに低下した。１ａｃｈｉｒａｌのＣＤスペクトルは平坦であり、このことは、安定した二次構造の欠如及び分子両親媒性の低下を示唆するが、１のＣＤスペクトルは、最も強いスペクトルの極値を示し、よって最も両親媒性の高い構造を示す。興味深いことに、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２は、異性体的に関連する１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２よりわずかに強いＣＤスペクトルを示し、Ｃ末端位置がペプトイドヘリックス構造の安定化に特に重要な役割を果たすという過去の発見５７をさらに裏付ける観察である。
【００９０】
アキラル性側鎖を有する変種は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＩＣ＝６．３〜１２．５μＭ）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＭＩＣ＝０．７８〜１．６μＭ）に対するペプトイド１と同様の活性を示すが、哺乳動物細胞（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２〜２６；ＳＲ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ＝２４〜２３５）に対してよりも、細菌に対して選択性が高い（表６）。一般に、選択性はＮｐｍ含有量とともに増大し、モノマーをＮｓｐｅに置換することは両親媒性及び疎水性を同時に低下させる。
【００９１】
変種のこの系統は、疎水性及びヘリシティがいかに効力及び選択性に影響を及ぼすかさらなる洞察を提供する。前出の研究により、疎水性が低くなるよう設計された変種は、（より極性の高いヒスチジン様の側鎖（例：１−Ｎｈｉｓ６，１２）もしくは疎水性がより低いＬ−プロリンモノマー（例：１−Ｐｒｏ６）を導入することにより、選択性が向上するが、抗菌力の低下なしには成し得ないことが分かった。実際に、この観察は、ここで報告するプロリン含有変種にも成り立つ。しかし、この系統の４種類の分子の活性及び選択性プロフィールは、疎水性を低下させて、抗菌力を損なわずに選択性を向上させることができることを明らかに示す。変種１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１及び１−Ｎｐｍ２，３，８，９）は、抗菌力は１（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝６．３μＭ）と同等だが、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）と比較して著しく向上した選択性（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２〜２６）を示す。疎水性を低下させるために、Ｎｈｉｓ又はＬ−Ｐｒｏモノマーを用いることと、アキラル性Ｎｐｍを用いることの最も明白な相違点は、そのヘリシティに与える影響である。１−Ｎｈｉｓ６，１２及び１−Ｐｒｏ６の両方が１と同等のヘリシティを示した一方、Ｎｐｍモノマーの置換は、図１４に示すように、ヘリックスの安定性のさらなる低下をもたらした。このことは、疎水性と同時に、両親媒性を低下させること（ヘリシティと相関する）は、抗菌力を損なわずに選択性の向上の手段を提供することを示唆する。
【００９２】
このグループ内での異性体の対の比較は、アキラル性モノマーの相対位置は選択性に重要な影響を与えないことを示唆する。例えば、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝２５、ＩＤ５０＝１１μＭ）と１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝２６、ＩＤ５０＝１５μＭ）とを比較すると、赤血球及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の双方に対する選択性は、１個のキラルＮｓｐｅモノマーの配列中での位置によって影響されなかったことが示唆される。同じ数のＮｐｍとＮｓｐｅモノマーを異なる位置（１−Ｎｐｍ２，５，８，１１及び１−Ｎｐｍ２，３，８，９）に含有する異性体の変種を比較すると、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝１４）は赤血球に対する選択性が、１−Ｎｐｍ２，３，８，９（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２）より高かったが、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対する選択性（それぞれＩＤ５０＝６．８μＭ及び１５μＭ）において逆の傾向が明らかであった。総合すると、これらの結果は、選択性の程度とアンペトイド配列内でのアキラル性モノマーの相対位置との間には明白な相関がないことを示唆する。
【００９３】
全てのＮｓｐｅ側鎖を対掌体のＮｒｐｅモノマーで置換したペプトイド１の変種である１ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒは、左巻きヘリシティを有することを先に示したが、抗菌活性及び細胞選択性はペプトイド１と一致する。ペプトイド二次構造はその側鎖のキラリティーに従うため、得られた二次構造（並びに関連活性／選択性プロフィール）が、両方の対掌体の側鎖を含むペプトイド中で何になるかは不明である。また、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の双方を含有するジアステレオ異性のペプチドは、有効な、広域スペクトラムの抗菌力及び向上した選択性を示すと判明した。ここで、１の変種は、図９及び表５に示すように、同じ数のＮｓｐｅ及びＮｒｐｅ側鎖を異なる配置で含有することができる。１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１は、対掌体のＮｒｐｅモノマーで置換された４個の面状に整列したＮｓｐｅモノマーを有する鏡像体である。１−Ｎｒｐｅ２，３，５，６は、分子のＮ末端基部分において２、３、５及び６位がＮｒｐｅで置換された、末端で分離された対掌体のモノマーを有する（図９）。
【００９４】
これらの変種の抗菌能及び細胞選択性プロフィールは、二次構造が異なるにもかかわらず、ペプトイド１と非常に類似している。図１５は、水性緩衝液中では、両方の脂質環境と同様、対掌体の分子、１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１は、鏡像関係のＣＤスペクトルを生じることを示す。図１５Ａは、緩衝液中では、１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１は、全体的な掌性がＣ末端モノマーと釣り合って、ヘリックス二次構造を採るように見えることを示す。１−Ｎｒｐｅ２，３，５，６もまた全体的な右巻きスペクトルを採るように見えるが、ヘリシティが強いようには見えない。しかし、双性イオン性及び陰イオン性脂質の双方において、面状に整列した１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１のＣＤは顕著に変化し、脂質との強い相互作用及び二次構造の著しい変化を示唆している（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。
【００９５】
全Ｎｒｐｅ含有ペプトイドのＣＤスペクトルの強度は、１と比較して著しく低下し、これは以前は両親媒性の低下と相関していた観察である。しかし、細胞膜模倣脂質環境における変種に対応するＣＤスペクトルは、ペプトイドヘリックス二次構造の典型ではないため、いかに両親媒性がこれらの分子内で影響を受けるのかは不明である。
【００９６】
側鎖化学が細胞選択性に与える影響を、アンペトイド１中の芳香族Ｎｓｐｅモノマーの一部、もしくは全部の代わりに、かさ高く、疎水性の脂肪族のＮｓｄｐ側鎖の系統を用いて評価した（図９及び表５）。脂肪族のイソロイシン様のＮｓｓｂ側鎖を含有する先に報告したアンペトイドは選択性であるが、特にグラム陰性の菌種に対して活性の低下を示した。より大きくかさ高い脂肪族側鎖、１−メチルブチルグリシン（Ｎｓｍｂ）を組み入れることは、抗菌能の増大につながるが、選択性を低下させる。この分子系統に用いられるジプロピルグリシン（Ｎｓｄｐ）（図９）モノマーは、Ｎｓｍｂの異性体であり、分岐鎖を有する脂肪族のモノマーの形状によって、有利な選択性を保ちながら効力を向上させることができる場合に評価を行うために選択された。このグループの全ての変種は、ＣＴＬＲ（０．３３）及び実効電荷（＋４）が１と同等であった。
【００９７】
１−Ｎｓｄｐａｌｌは、Ｎｓｄｐが、ペプトイドの１配列中の８個の疎水性モノマー全てにおいて置換されている。１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１及び１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９は、ペプトイド１のＮｓｐｅモノマーのうち半分が脂肪族Ｎｓｄｐで置換されている異性体である。図２．１に示すように、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１は、分子背面に沿って整列している４個のＮｓｄｐモノマーを示し、１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９に含まれる４個のＮｓｄｐは、両方の疎水面にわたって分布している。１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１が分離された芳香族及び脂肪族面を含有する一方、１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９は、両疎水面において芳香族及び脂肪族のモノマーの混合物を有する。
【００９８】
キラル脂肪族側鎖を有する右巻きヘリックスペプトイドのＣＤスペクトルは、極大が２１０ｎｍにあることが最も顕著な特徴である芳香族側鎖のスペクトルとは明確に異なることが示されている。実際に、１−Ｎｓｄｐａｌｌのスペクトルは、水性環境と脂質環境の双方においてこの特徴を示す（図１６）。１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１及び１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９は双方とも、脂肪族及び芳香族ペプトイドヘリックス信号の組合せと思われるスペクトル特性を有する。得られた「組み合わせ」ＣＤスペクトルは、１と比較してヘリシティの強度が弱いように見えるが、脂肪族モノマー及び芳香族モノマーを含有させることでいかに分子両親媒性が影響を受けたのかは不明である。１−Ｎｓｄｐａｌｌ及び１は両方とも、不同性ではあるがヘリカルなＣＤスペクトルを示す。
【００９９】
１−Ｎｓｄｐａｌｌ（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＞８）の選択性の増大は、１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３；ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝６．３μＭ）と比較して、（２５μＭ）というＥ．ｃｏｌｉに対する活性の著しい低下を代償として実現した。１−Ｎｓｄｐａｌｌは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する効力が高く（０．７８μＭ）、２５６という選択比であった（表６）。
【０１００】
等しい数の芳香族及び脂肪族モノマーを含有する配列、１−Ｎｓｐｄ２，５，８，１１及び１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９、は、１と比較して（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝６．２５μＭ、ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝３．３）、抗菌力のわずかな低下（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝１２．５μＭ）及び選択性の向上（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝９．７及び６．２、各自）を見せた。疎水性のわずかな低下は、選択性の向上の一因である可能性があるが、他の変種との比較によると、脂肪族側鎖化学もその活性プロフィールに重要な役割を果たしていることが示唆される。全ての芳香族疎水性モノマーを含有するいくつかの配列において観察されたこととは異なり、脂肪族側鎖の導入は選択性を向上させるように見えるが、その代償として抗菌力が損なわれる。例えば、変種１−Ｎｐｍ２，３，８，９（６３．３％アセトニトリル）、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１（６３．６％アセトニトリル）及び１１１ｍｅｒ（６３．５％アセトニトリル）は全て、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１（６３．８％アセトニトリル）に匹敵する疎水性を示す。しかし、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１の抗菌力と選択性プロフィールのバランスは、これらの芳香族側鎖のみを含有する配列と比べて最適ではない。これらの３種類の分子（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝６．３μＭ、ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２〜１６）と比較して、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１の抗菌力は低下し（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝１２．５μＭ）、選択性（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝９．７）は同等である。これらの３種類の分子全体的な疎水性（６３．２％〜６４．７％）は、１（６５．１％）と比較してわずかに低下した。１−Ｎｓｄｐａｌｌ（６３．２％）の疎水性の低下は、その活性の低下の一因である可能性があるが、芳香族側鎖の欠如も役割を果たしている可能性がある。脂肪族側鎖と芳香族側鎖の両方を含有する変種は、１と比較して（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２〜１２）、低抗菌力（ＭＩＣＥ．ｃｏｌｉ＝１２．５μＭ）と選択性の向上とのバランスをもたらすように思われる：１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＝６．２〜１２）及び１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１（ＳＲＥ．ｃｏｌｉ＞９．７）。
【０１０１】
選択されたアンペトイド及び対照ペプチドペキシガナンの抗菌力を、１６種類の臨床的に関連するＢＳＬ２菌種に対して試験した。菌種のパネルには、７種類のグラム陰性種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（尋常変形菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ミラビリス変形菌）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（クレブシェラ肺炎杆菌）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（エロゲネス菌）、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（霊菌））及び３種類のグラム陽性種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（エンテロコッカス−フェカーリス）及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（エンテロコッカス−フェシウム））からの９株を含めた。アンペトイド１、１−Ｐｒｏ６、１−Ｐｒｏ９、１ａｃｈｉｒａｌ、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１及び１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１を、これらの生体に対して試験した。ＭＩＣ（μｇ／ｍＬで表示）を表７Ａに示し、対応する選択比（１０％溶血用量をＭＩＣで割った値）を表７Ｂに示す。
【０１０２】
試験した６種類のペプトイドの活性は全て、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＭＩＣ＝３２〜６４μｇ／ｍＬ）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＭＩＣ＝８〜１６μｇ／ｍＬ）及びＥ．ｃｏｌｉ（４−１６μｇ／ｍＬ）に対するペキシガナンの活性と同様であった。Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに対し、ペキシガナン及び全ての試験したペプトイドは不活性であった（ＭＩＣ≧１２８）。しかし、ＢＳＬ２グラム陽性菌に対する試験したアンペトイドの活性は、ペキシガナンの活性と比較して非常に良好であった。試験したＳ．ａｕｒｅｕｓ６株に対するペキシガナンのＭＩＣは、８〜６４μｇ／ｍＬの範囲であり、試験した全てのペプトイドのＭＩＣは、４〜１６μｇ／ｍＬの範囲であった。興味深いことに、他のアンペトイド（ＭＩＣ＝８〜６４μｇ／ｍＬ）及びペキシガナン（ＭＩＣ＝３２〜１２８μｇ／ｍＬ）と比較して、１は唯一Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＭＩＣ＝４〜８μｇ／ｍＬ）株の双方に対して活性を示した。全ての化合物は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（ＭＩＣ＝４μｇ／ｍＬ）に対して等しく有効であった。
【０１０３】
表７Ａ−Ｂ：選択したアンペトイド及びペキシガナンの広範囲のスペクトル活性及び選択性。（Ａ）選択したアンペトイドのＢＳＬ２細菌種に対するＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）。（Ｂ）選択比は、１０％溶血用量を対象の生体のＭＩＣで割った値と定義した。選択比を計算するため、各化合物（表２−２）の溶血用量（μｇ／ｍＬ）にその分子量（表２−１）を掛けた。注記：＊は、ＮＣＣＬＳ推奨標準株を示す；§は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株を示す；†は、バンコマイシン耐性株を示す；‡は、リネゾイド耐性株を示す。
【表７】
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【０１０４】
表７Ｂに示した選択比は、最もグラム陰性の細菌種に対し、少なくとも１種のアンペトイドが、ペキシガナンと比較して高い選択性を有していたことを示す。各グラム陰性種に対して最も有利な選択比を、表７Ｂに太字体で示す。１ａｃｈｉｒａｌ、１−Ｐｒｏ９及び１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１は、選択されたＭＤＲ菌種に対して最も選択性が高かった。グラム陽性菌に対して、アンペトイドは、ペキシガナン又はアンペトイド１と比較して選択性の向上をより一貫して示した。全てのＳ．  ａｕｒｅｕｓ株に対して、例えば、ペキシガナンの選択比は、２．８〜２３の範囲であり、アンペトイド１は４．８〜９．５の範囲であり、より選択的なアンペトイドのパネルは９．１〜３９であった。
【０１０５】
以上に示したように、アンペトイドは、有効性及び広域スペクトラムの抗菌力を示し、それらの天然の対応物と同様のメカニズムを用いると見られている新しい種類のＡＭＰ模倣薬である。細胞選択性に影響する因子の理解を、対応する医薬品の文脈において用いることができる。従って、アンペトイドのライブラリを、種々の物理化学的性質及び構造モチーフがいかにそれらの細胞選択性に影響するか、またその影響の範囲を探究するよう設計した。
【０１０６】
いかにアンペトイドが種類の異なる哺乳動物細胞に影響しているかという理解を広げるため、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対する溶血用量や代謝阻害量を求めた。溶血活性及び阻害活性は、多くのアンペトイドで同様の傾向を示した一方、溶血用量は一貫して同じ化合物の抑制用量より高かった。これは、ペキシガナンや他のＡＭＰ模倣薬について報告されてきた傾向である。溶血用量と抑制用量との間の不同性は、２種類の細胞間の膜構成の差異を一因とする可能性がある。赤血球膜のコレステロール含有量は、例えば約２３０μｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎである一方、ＮＩＨ  ３Ｔ３コレステロール含有量は、たった３０．５μｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであると報告されてきた。赤血球のコレステロール含有量の増大は、膜の硬直に影響し、またＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較して、膜活性抗菌物質に対する抵抗性を増大させる可能性がある。
【０１０７】
溶血とＭＴＳ分析との他の不一致は、それらが細胞毒性を定量化するために用いられた大きさの点で異なるということである。溶血は赤血球を溶解するのに必要なアンペトイドの用量を測定するのに対し、ＭＴＳアッセイは、細胞代謝を阻害するのに必要な用量を定量化するものであり、細胞集団によって生成されるＮＡＤＨの量によって間接的に測定される。従って、細胞膜を溶解するのに必要な用量は、必ずしも細胞代謝を阻害するために必要な用量と同じではないと予測することは合理的である。溶解は膜破壊活性を意味するが、細胞代謝への干渉は細胞内標的を意味する。これらの分子に対する真の治療指数を決定するためには動物試験が必要であるが、溶血及びＭＴＳアッセイ結果はともに、双方の細胞のタイプに対する多くのアンペトイドの相対的な結果が同様である可能性があるということを示唆している。
【０１０８】
アンペトイドのこのライブラリを、様々な構造モチーフを示し、値が広範囲にわたるような物理化学的性質を有するものを含むよう設計した。異なるアンペトイドが、種々のグラム陰性菌に対して有望な活性を示したが、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎桿菌、ＡＴＣＣ  ３３４９５）及びＥ．ｃｏｌｉ  （ＡＴＣＣ  ２５９２２）に対して最も有効であった。全２６種類のアンペトイド変種が、グラム陽性検査生体、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して一貫して非常に有効であったことは、特に注目に値する。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．  ｆａｅｃｉｕｍのＭＤＲ株に対する選択されたアンペトイドの広域スペクトラム試験結果は、アンペトイドがバンコマイシン耐性生体及びリネゾリド耐性生体（それぞれ４〜８μＭ及び４〜１６μＭ）と同様、ＭＲＳＡ（４〜８μＭ）に対しても有効であることを示す。ＭＤＲ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株に対する１ａｃｈｉｒａｌ（１９〜３９）及び１−Ｐｒｏ９（１８〜３６）の対応する選択比は、ペキシガナン（２．８〜２３）又はアンペトイド１（４．８〜９．５）と比較して特に有利である。医療システムのＭＤＲグラム陽性の感染の負担は甚大であり、増加する一方である。これらの結果は、アンペトイドが、この未対処の臨床的必要性に取り組むための従来の療法の代替として実行可能であり得ることを示唆する。
【０１０９】
構造活性研究によって、アンペトイドの抗菌活性及び選択性プロフィールは、物理化学的性質に支配されることが示されており、物理化学的性質は、同様にＡＭＰの活性及び選択性を支配する。これらの研究から収集された構造活性相関は、アンペトイドにおけるこれらの発見を再確認するさらなる証拠を提供するのみならず、特定の構造的部分の数、配列位置、配置及び化学構造に関するより微妙な変化がいかに活性及び選択性に影響するかに影響を及ぼす原理へのさらなる洞察をも提供する。
【０１１０】
有効であるが非選択的なＡＭＰ及びアンペトイドは疎水性である傾向があり、はっきりした両親媒性構造を採用するが、一方では、より選択的なＡＭＰ及びアンペトイドは典型的には陽イオン性が高く、疎水性は中程度にとどまり、両親媒性は低いことが多い。上述のように、この研究の活性及び選択性の結果は、いくつかの新しいアンペトイド配列を含むが、以下のいくつかの方法でこれらの全般的な関係を再確認するものである：（１）１と、それよりも両親媒性が低く、選択性が高い１ｓｃｒの比較；（２）１と、それよりも荷電が大きく、両親媒性が低い変種（１−Ｎｌｙｓ５、１１、１Ｂ−Ｎｌｙｓ４、１０及び１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４、１０、１Ｂ−Ｎｌｙｓ４、６、１０及び１Ｂ１５ｍｅｒ−Ｎｌｙｓ４、６、１０）との比較、（３）１と、それよりも疎水性が低いプロリンを含む変種（１−Ｐｒｏ３、１−Ｐｒｏ６、１−Ｐｒｏ９、１−Ｐｒｏ３，９）との比較（４）アキラル性変種（１ａｃｈｉｒａｌ、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２、１−Ｎｐｍ  ２，３，８，９、１−Ｎｐｍ２，５，８，１１）間での比較、これは、選択性と対応する疎水性及び両親媒性の範囲を示す。この研究に含まれるアンペトイドのより詳細な構造特性をさらに子細に見ると、わずかな分子変化が活性及び選択性に与える影響を解明することができる。
【０１１１】
モノ−置換プロリンモノマー間での比較は、分子の長さに沿ったモノマーの位置が選択性に影響する可能性があることを示唆する。モノ−置換プロリンモノマーは、それよりも疎水性が低いプロリンモノマーがＮ末端からＣ末端部位に移動すると、選択性のさらなる増大を示した。
【０１１２】
配列レジスターの異なる変種（１、１Ｂ及び１Ｃ）や長さの異なる変種１１３ｍｅｒの選択性プロフィールに観察される傾向は、末端に対するモノマー位置も選択性に影響することを示唆する。全ての変種が、Ｅ．ｃｏｌｉに対して同様に有効である：１、１Ｂ及び１ＣのＭＩＣＥ．ｃｏｌｉは６．３μＭであり、１１３ｍｅｒのＭＩＣＥ．ｃｏｌｉは１希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ、３．１μＭ）向上した。１及び１Ｃはそれぞれ１個の荷電ＮｌｙｓモノマーをＮ末端及びＣ末端に有し、１Ｂは疎水性のＮｓｐｅモノマーを両末端に有する。逆に、１１３ｍｅｒは荷電Ｎｌｙｓモノマーを両端末位置に有する。これらの分子を２つのグループで考える：（１）両末端が荷電しているか、疎水性のもの（１Ｂ及び１１３ｍｅｒ）及び（２）１つの末端が荷電していて、１つの末端が疎水性であるもの（１及び１Ｃ）。興味深いことに、末端が異なる１（６５．１％アセトニトリル）及び１Ｃ（６４．８％アセトニトリル）の疎水性は、類似のモノマーを端末位置に有する変種１Ｂ（６３．４％アセトニトリル）及び１１３ｍｅｒ（６２．８％アセトニトリル）の疎水性よりも大きい。同様に、疎水性がより低い変種１Ｂ及び１１３ｍｅｒ（ＳＲＥ．  ｃｏｌｉ＝６．８〜８．７、ＳＲＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ＝２７〜３４）の選択性は、１及び１Ｃ（ＳＲＥ．  ｃｏｌｉ＝３．３〜４．０、ＳＲＲＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ＝１３〜１６）と比較して向上する。このことは、同様に荷電した末端（両方とも疎水性であるか、両方とも正に荷電）を有すると、分子疎水性が低下し、その結果選択性が向上することを示唆する。これは、疎水性モノマーの配列中の相対位置が、得られる疎水性及び細胞選択性に影響する可能性があることを発見した、マガイニンの抗菌性ペプチド類似体に関して報告された同様の現象と関係している可能性がある。これらの結果は、抗菌力を保持しながら選択性を向上させる戦略が、同様に荷電した又は同様に疎水性の末端モノマーを用いて配列を設計することであることを示す。
【０１１３】
上述のように、変種のアキラル性の系統は、アキラル性のＮｐｍ疎水性モノマーをキラルＮｓｐｅモノマーの代わりに導入することが、抗菌力を損なわずに選択性を向上させる別の手段であることを示唆する証拠を提供する。アンペトイド１において８個のＮｓｐｅのうち７個もの変種の構造が、等価な活性及び著しく向上した選択性を示した。Ｎｐｍ含有量の増加と同時に起こる両親媒性の低下は、有利な選択性プロフィールにつながると思われる。アキラル性モノマーの含有量が増大したアンペトイドの剛性の弱い構造は、哺乳動物細胞の強固な細胞膜を透過する能力が弱い。
【０１１４】
化合物のこのライブラリを選択性に影響を与えるよう設計する第３の方法は、ＣＴＬＲを増大させることである。ＣＴＬＲが（アンペトイド１の０．３３と比較して）０．４７〜０．５８の範囲の、電荷密度を高くした変種は、Ｅ．ｃｏｌｉ  に対して最高でも中程度の活性しかなかった  （ＭＩＣ＝５０〜＞１００μＭ）。しかし、低い範囲（０．３３〜０．４０）でＣＴＬＲの変化に影響を与えるよう設計された、これらの長さ変種の長さが異なる変種、１１１ｍｅｒは、ＣＴＬＲ（０．３６）の最適なバランスを示し、低最小発育阻止濃度（ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝６．３μＭ）において細菌膜を透過性にするために十分な疎水性があることが分かった（６３．５％）。
【０１１５】
疎水性を低下させるその他の手段として、Ｌ−プロリン含有量又は脂肪族Ｎｓｄｐモノマーを置換するという二つの手段があるが、これらはグラム陰性菌に対する抗菌力を犠牲にして選択性を向上させるため、あまり有利ではない。１個のプロリンモノマー（１−Ｐｒｏ３、１−Ｐｒｏ６及び１−Ｐｒｏ９、ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝１２．５μＭ）及び２個のプロリンモノマー（１−Ｐｒｏ３，９、ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝５０μＭ）を追加することで、アンペトイド１（ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝６．３μＭ）と比較して活性がさらに低下した。４個の（１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９及び１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１、ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝１２．５μＭ）脂肪族モノマー及び８個の（１−Ｎｓｄｐｌｌ、ＭＩＣＥ．  ｃｏｌｉ＝２５μＭ）脂肪族モノマーを有する分子は、抗菌力の低下の同様の傾向を示した。
【０１１６】
１ａｃｈｉｒａｌ、１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１の特徴化から、アンペトイドは、必ずしも安定したヘリックス二次構造を採らずに有効な抗菌力を示す可能性があることを示唆する、別の観察が明らかである。名前が示すとおり、１ａｃｈｉｒａｌはキラルモノマーが全くなく、従って光学的に活性である。水性緩衝液及び脂質環境での得られたＣＤスペクトルは平坦である（図１３）。１ａｃｈｉｒａｌが過渡的にいずれかの掌性をヘリックス構造に採用することは考え得るが、その構造を安定化させる外的又は内因性の力は存在しないようである。一方１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１は、等しい数のＮｓｐｅ及びＮｒｐｅ疎水性芳香族側鎖を含有する対掌体の分子である。興味深いことに、これらのモノマーの全体的なキラリティーは、１２位のモノマーのキラリティーに支配されると思われ、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ１２は、１ａｃｈ−Ｎｓｐｅ２より右巻きキラリティーの程度が高いという観察と釣り合った発見である。このことは、Ｃ末端モノマーは組織安定性に大きな影響を与えるというさらなる証拠を提供する。緩衝液中では、これらの変種の両方が、極値が通常２０２ｎｍで、約１９５ｎｍに青方偏移したペプトイドポリプロリンＩ型様の構造に類似したＣＤスペクトルを生成する（図１５）。しかし中性のＰＯＰＣ／コレステロール脂質中では、２２０ｎｍの極値は大幅に減少し、ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ  ＳＵＶ中では、この特徴は完全に消失した。このＣＤスペクトルの顕著な変化は、１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１がこれらの脂質混合物の双方と協力に相互作用するため、それらの全体的な構造が著しく変化することを示唆する。総合すると、安定した二次構造を欠くと思われる１ａｃｈｉｒａｌは、脂質中では、基準のペプトイドポリプロリンＩ型様のＣＤスペクトルとは異なるＣＤスペクトルを見せる１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２及び１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１と同様、全てアンペトイド１としてＥ．ｃｏｌｉ  に対して等しく有効である  （ＭＩＣ＝６．３μＭ）。Ａ安定したヘリックス二次構造は、アンペトイド抗菌力に必要ではないと思われる。安定したヘリックス二次構造がアンペトイド抗菌力に必要ではないと思われるというこの発見は、過去の発見を超えるものであり、ヘリシティが両親媒性構造を組織化する手段としてのみ重要であることを示唆した。
【０１１７】
一対の分子を、面状分離脂肪族及び芳香族疎水性モノマーが選択性に影響を及ぼすかどうか評価するよう設計した。１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１は、分子面に沿って整列した４個の置換脂肪族モノマーを有するが、１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９は両面に脂肪族及び芳香族疎水性モノマーの混合物を有する（図９）。面状に整列した異性体１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１（ＳＲＥ．  ｃｏｌｉ＝９．７；ＳＲＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ＝１４２）は、その面状分布対応物（１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９−ＳＲＥ．  ｃｏｌｉ＝６．２、ＳＲＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ＝９９）よりも選択性が高かった。これらの異性体は同様の実効電荷（双方＋４）、ＣＴＬＲ（双方０．３３）及び疎水性（アセトニトリル６３．８％−６４．７％）を示すが、これらの間の注目すべき相違点は、１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１上の疎水性モノマーの配置が、一つの全面的に芳香族である面を維持した一方、１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９は完全に芳香族である面を全く示さない。少なくとも一つの芳香族面を含めると、ヘリックス安定性が高まることを先に示した５７。双性イオン性混合物及び陰イオン性脂質の双方において、１−Ｎｓｄｐ２，３，８，９より１−Ｎｓｄｐ２，５，８，１１のヘリシティが高強度であることは、この観察を裏付ける（図１６）。このことは、少なくとも一つのアンペトイド芳香族面の保存が、他の物理化学的パラメータの変化とは独立してその選択性を増大させる可能性があることを示唆する。
【０１１８】
最も有望な治療薬は、細菌に対して効力が高く、哺乳動物細胞には無毒であるものである。この関係を図１７に図示し、選択されたペプトイドのＥ．ｃｏｌｉ（図１７Ａ）及びＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（図１７Ｂ）最小発育阻止濃度と比較して溶血用量をプロットする。ペプトイド１及びペキシガナンを参照のため赤マーカーによって表す。右下の座標空間に示すペプトイドは、最も有望な治療可能性を有する。ここで報告する多くの化合物は、ペプトイド１及びペキシガナンより有利な活性プロフィールを示す。電荷密度を高くした変種は、完全に非溶血性であったが、グラム陽性Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して活性プロフィールの顕著な向上を示した。
【０１１９】
示したように、アンペトイドは、特に多くの多剤耐性グラム陽性菌に対して有効であり、広域スペクトラムの活性を示す有望な種類のＡＭＰ模倣薬である。ここに示す２６種類の配列のうち、１７種類は基本配列１と比較してＥ．ｃｏｌｉ  に対する選択性向上を示す。化合物のこのライブラリより導き出された構造活性相関はＡＭＰとアンペトイドのメカニズム類似性を再確認し、拡張する。選択的なアンペトイドは、疎水性及び両親媒性が中程度にしかならない傾向があったが、非選択的アンペトイドは疎水性が高く、より両親媒性の高い構造を示す。このライブラリにおけるアンペトイド変種間の関係もまた、配列、側鎖化学及びモノマー位置のより軽微な変化がいかに選択性に影響するかの効果を示唆する。選択性を損なわずにアンペトイドの選択性を向上させる３種類の戦略は、以下を含む。（１）同じ陽イオン性又は疎水性のモノマーを配列の端末位置に配置すること、（２）Ｎｓｐｅモノマーの代わりに疎水性アキラル性Ｎｐｍモノマー含有させること、（３）細菌細胞膜を透過性にするのに十分な疎水性を保ちつつＣＴＬＲを最適化すること。特に疎水性を低下させるために設計された２つのアプローチは、選択性を向上させるという所望の結果に効果を与えたが、抗菌力の低下と引き替えであった。最適には至らないこの活性プロフィールは、
（１）疎水性がより低いＬ−プロリンモノマーの置換、
（２）脂肪族Ｎｓｄｐモノマーの置換の結果であった。興味深いことに、いくつかのモノマーのヘリックスに沿った相対位置は、選択性にある役割を果たした（例：モノ−プロリン置換変種）が、常にそうである訳ではなかった（例：アキラル性の変種）。少なくとも一つの芳香族面の保存も、選択性の向上に役割を果たしている可能性がある。最後に、このような研究は、安定した二次構造のない（１ａｃｈｉｒａｌ）、又は基準のペプトイドヘリックスとは異なる二次構造を採ると思われる（１−Ｎｒｐｅ２，５，８，１１及び１−Ｎｒｐｅ３，６，９，１２）アンペトイドにおいて抗菌力を保つことができるという証拠を提供する。ペプトイドは、多様な一級アミンからなることができる配列特異的生体高分子であるため、アンペトイドの効力及び選択性を特定の臨床的に関連する生体と戦うよう精密に調整することは可能であると考えられる。ここで証明する設計ヒューリスティックスは、有効でありかつ選択的である、アンペトイドの将来世代の設計を支援するかもしれない。
【実施例】
【０１２０】
以下の非限定的実施例及びデータは、種々のヘリックスペプトイド化合物の調製を含む、本発明の化合物及び／又は方法に関する種々の側面及び特徴を説明するものであり、ここで記載する合成方法によって利用可能である。従来技術に比べて、本件のペプトイド化合物は、驚くべき、予想外かつ従来技術に反した結果及びデータを提供する。数種類の化合物を用いて本発明の有用性を説明するが、本発明の範囲と見合うような他の多様な化合物、ペプトイドの長さ、残基配列及び／又はＮペンダント側鎖を用いても、匹敵する結果を得ることができることは当業者に理解されるであろう。
【０１２１】
実施例１
合成及び精製
ＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザを用いるか、リンクアミド樹脂（ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ）に並行合成ロボットを用いて、サブモノマー方法に従ってペプトイドを合成した。（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｎ．，  Ｋｅｒｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｋｅｎｔ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｈ．，  ＆  Ｍｏｏｓ，  Ｗ．  Ｈ．  （１９９２）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１４，  １０６４６−１０６４７を参照。）簡潔に説明すると、新生鎖上のアミドをブロモアセチル化し、続いて臭化物を一級アミンでＳＮ２置換して側鎖を形成する。標準Ｆｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成した。合成した後、ペプトイド及びペプチドを切断し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：水（体積比９５：２．５：２．５）中で１０分間脱保護した。Ｃ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによってアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）の直線勾配で、化合物を＞９７％同質になるまで精製した。質量分析法を用いて、精製された生成物の分子量を確認した。
【０１２２】
サブモノマー方法を図８に図示する。成長するペプトイドポリマーの各モノマーを、２種類の容易に利用可能なサブモノマー単位を用いて２つの工程で組み合わせる。ジイソプロピルカルボジイミド活性化ブロモ酢酸を用いて、リンクアミド樹脂をブロモアセチル化する。次に、ブロモアセチル化樹脂において、臭化物を一級アミンでＳＮ２置換し、それにより所望の側鎖が導入される。数百種類の可能性のあるアミンサブモノマー及び対応する側鎖が、商業的もしくは合成によって利用可能である。結果として、（１）サブモノマー方法によってペプトイドを合成することにより、モノマーアプローチによって容易に得られるものより化学的多様性に富んだ配列へ容易なアクセスでき及び（２）本発明にもっと直接適用可能なのは、生物模倣型のペプトイドを、所望の抗菌活性をもたらすのに十分な配列オーダー、長さ及び／又はＮペンダント側鎖構造によってのみ制限する。
【０１２３】
より具体的には、リンクアミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノメチル）−フェノキシ樹脂、０．２５ｍｍｏｌ；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）を始めに３０分間ＣＨ２Ｃｌ２中で膨潤させることできる。樹脂を膨潤させた後、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の２０％ピペリジン溶液で処理することによって取り除く。その後、樹脂に結合した脱保護アミンを、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．２Ｍブロモ酢酸（５０ｍｍｏｌ）４．２ｍｌ及び純粋な（ｎｅａｔ）Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）１．０ｍｌ（１１ｍｍｏｌ）と６０分間室温で常に混合しながら反応させることによってブロモアセチル化する。次に、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）ですすぎ、続いてＮＭＰですすぐ（３×１０ｍｌ）。ＮＭＰもしくはＣＨ２Ｃｌ２中の一級アミン「サブモノマー」（以下を参照）の１Ｍ溶液（６ｍｍｏｌ）６ｍｌを、樹脂に結合したブロモアセチル部分と反応させ、臭化物を置換した。保護サブモノマー（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１、４−ブタンジアミン）を合成し、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン残基（Ｎｌｙｓ）を作成する。次に樹脂を再びＮＭＰ（３×１０ｍｌ）ですすぎ、続いてＤＭＦ（３×１０ｍｌ）ですすぐ。これら２種類の反応の生成物はペプトイド「残基」を作成するが、その識別は用いられたサブモノマーアミンによって行った。このサブモノマー方法によって、所望の鎖長が得られるまでペプトイドを伸長する。
【０１２４】
合成に続いて、ペプトイドオリゴマーは、２、２、２−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ（体積比９５：２．５：２．５）１０ｍｌで３０分間処理することによって樹脂から切断し、同時にｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基をＮｌｙｓ残基から取り除くことができる。次に切断混合物を、５０％水性アセトニトリル２５ｍｌで希釈し、凍結し、凍結乾燥する。過剰ＴＦＡを取り除くため、希釈及び凍結乾燥をあと２回繰り返す。切断に引き続き、Ｗａｔｅｒｓ社  Ｐｒｅｐ  ＬＣ  ４０００システム、Ｗａｔｅｒｓ社２４８７二波長ＵＶ検出器及びＶｙｄａｃ社（米国カリフォルニア州ヘスペリア）２１４ＴＰ１０１５５０  Ｃ４ペプチド／蛋白質カラム（１０〜１５μＭ、３００Ａ、５×２５ｃｍ）を用いて、分取スケール逆相ＨＰＬＣによって、ペプトイドを各々＞９７％同質になるまで精製する。分取ＨＰＬＣに続き、ペプトイドの純度及び粗産生量（ｃｒｕｄｅ  ｙｉｅｌｄｓ）を分析スケールＨＰＬＣから求め、Ｗａｔｅｒｓ２４８７二波長ＵＶ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ２６９５分離モジュール及び勾配溶離（溶媒Ａ、水中０．１体積％ＴＦＡ；溶媒Ｂ、アセトニトリル中０．１体積％ＴＦＡ）Ｖｙｄａｃ  Ｃ４２１４ＴＰ５３ペプチド／蛋白質カラム（５μＭ、３００Å、３．２×２５０ｍｍ）で行った。ＨＰＬＣに用いた正確な勾配は、対象のオリゴマーの同一性及び疎水性によるものとした。勾配溶離におけるＨＰＬＣ溶媒の組成は、この疎水性の表示であり、表１に示す。分析ＨＰＬＣは全て、流量０．５ｍｌ／分及び５８℃で行った。分取ＨＰＬＣは、流量５０ｍｌ／分及び室温で行った。
【０１２５】
そのような合成及び特徴の測定は、米国特許第６、８８７、８４５号にも記載されており、ここに参照することによりその全体を取り込む。該文献に説明されているように、また本発明を認識する当業者が理解するように、本Ｎ−置換グリシン残基及び得られるペプトイド化合物は、対応するアミン試薬の合成による入手可能性、もしくは商業的な入手可能性によってのみ限定される。
【０１２６】
実施例２
ＳＵＶの調製
ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ（７：３）又はＰＯＰＣ／ＣＨ（１：１）のどちらかの脂質混合物をクロロホルムに溶解し、Ｎ２下に乾燥し、一晩凍結乾燥した。得られた脂質膜を、４０℃の１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１時間水和した。得られた多層小胞の懸濁液をボーテックスし、その後４０℃で、溶液が透明になりＳＵＶが生じるまで超音波処理し、そのＳＵＶを６時間以内に使用した。
【０１２７】
実施例３
ＣＤ分光法
Ｊａｓｃｏ  ７１５分光偏光計で、円筒形石英セル（路長＝０．０２ｃｍ）を用いて、ＳＵＶを使用した場合はトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ中のペプトイド５０μＭ及び脂質５ｍＭで、ＣＤ測定を行った。１００ｎｍ／分、１８５−２８０ｎｍ間、データピッチ０．２ｎｍ、バンド幅１ｎｍ、レスポンス２秒、感度１００ｍｄｅｇ及び蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）４０で、スキャンを行った。
【０１２８】
実施例４
抗菌性の分析
ＣＬＳＩ  Ｍ７−Ａ６プロトコルに従って９６穴微量定量プレート内でＭＩＣを求めた。試験ウェルに、ミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ）中の細菌接種材料（５×１０５  ＣＦＵ／ｍｌ）５０μＬを、ＭＨＢ（１：２連続希釈法によって調製）中のペプトイド溶液５０μＬに加えた。正の対照は、接種材料５０mＬ及びＭＨＢ５０mＬを含み、ペプトイドを含まなかった。ＭＩＣは、３５℃で１６時間培養した後、細胞の成長を完全に阻害するペプトイドの最低濃度と定義した。報告したＭＩＣ値は３回の独立した反復実験の間に再現可能であり、各反復実験は２つの並行試験で構成した。Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．社（テキサス州コンロー）製造のＢＳＬ２病原体に対する広域スペクトラムの抗菌薬感受性試験を行った。
【０１２９】
実施例５
抗真菌性の分析
ＣＬＳＩ  Ｍ２７−Ａ２プロトコルが示すブロス微量希釈分析を用いてＭＩＣを求めた。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（鵞口瘡カンジダ、ＳＣ５３１４）を、サブローデキストロース寒天培地で２４時間、３０℃で培養した。細胞を０．１４５Ｍ食塩水に懸濁させ、細胞濃度を３ｘ１０６個／ｍＬに調節した。細胞濃度を調節した後、０．１４５Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）で緩衝したＲＲＰＭＩ  １６４０（Ｌグルタミン含有、炭酸水素ナトリウムを含有しない、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁液を１：１０００に希釈した。ペプトイド、ペプチド及びアンホテリシンＢＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）の二倍連続希釈液をＲＰＭＩ  １６４０で調製し、９６穴プレート内で等容積の細胞懸濁液と混合した。ペプトイド及びペプチドの最終試験濃度は０．２０〜１００μＭであり、アンホテリシンＢの濃度は０．０３１〜１６μＭであった。増殖対照及び無菌対照も含めた。プレートを４８時間３５℃で培養し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を目視で調べてＭＩＣを求めた。各化合物に対するＭＩＣを、可視の真菌増殖がない最低濃度と定義した。実験は別々の日に２回行った。
【０１３０】
実施例６
溶血分析
抽出したてのヘパリン処置したヒト血液から赤血球を分離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２０体積％に再懸濁した。９６穴微量定量プレート内で、赤血球懸濁液１００μＬをペプトイドのＰＢＳ溶液（１：２連続希釈法によって調製）１００μＬに加えるか、もしくは負の対照の場合はＬ  ＰＢＳ１００μに加えた。１００％溶血ウェルには、２体積％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１００μＬ加えた血球浮遊液１００μＬを含有させた。プレートを１時間３７℃で培養し、次に各ウェルをＰＢＳ１５０μＬで希釈した。その後プレートを１２００ｇで１５分間遠心分離し、各ウェルからの上澄み１００μＬを新しい微量定量プレートに転送し、Ａ３５０を測定した。溶血のパーセントを、（Ａ−Ａ０）／（Ａｔｏｔａｌ−Ａ０）×１００として求めたが、ここで、Ａは試験ウェルの吸光度であり、Ａ０は負の対照の吸光度であり、Ａｔｏｔａｌは、全ての３５０ｎｍでの１００％溶血ウェルの吸光度である。
【０１３１】
実施例７
ＭＴＳ分析
Ａ５４９癌腫由来肺上皮細胞（ＡＴＴＣ  ＣＣＬ−１８５）を、Ｈａｍ社のＦ１２Ｋ培養液（ＡＴＴＣ、バージニア州マナッサス）中で培養した。ペプトイド溶液の入ったプレート（１００μＬ／ウェル）を培養液中の水性ペプトイドストックの連続希釈法によって調製した。ペプトイド溶液を、培養液（細胞〜５０００個／ウェルを含有）を１００μＬ／ウェルを含有する、１日齢の細胞単層の入った９６穴プレートに移した。ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ウィスコンシン州マディソン）（４０μＬ／ウェル）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で３時間培養し、その後４９０ｎｍでの吸光度を求めた。抑制のパーセントを、［１−（Ａ−Ａｔｅｓｔ  ｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］  ｘ  １００として求めたが、ここでＡは試験ウェルの吸光度であり、Ａｃｏｎｔｒｏｌは培養液及びＭＴＳ（ペプトイドなし）に曝露した細胞の入ったウェルの平均吸光度である。Ａｔｅｓｔ  ｂｌａｎｋ（培養液、ＭＴＳ及びペプトイド）及びＡｂｌａｎｋ（培養液及びＭＴＳ）は、細胞の不在化に測定されたバックグラウンド吸光度であった。反復試験６回の平均を報告し、エラーバーは、ある標準偏差を示す。
【０１３２】
実施例８
鏡面Ｘ線反射率
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，  Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（イリノイ州アルゴンヌ）において、ＸＲ実験を９−ＩＤビームラインで行った。注文制作のラングミュアートロフを、ヘリウムを充填した密封キャニスターに搭載し、可動の単一の障壁を備えた。ウィルヘルミープレートを用いて表面圧を測定した。室温でＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）副相において定圧挿入実験を行った。ＤＰＰＧ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、アラバマ州アラバスター）を、６５／３５（ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール中に既知の濃度に溶解し、その後ガラス注射器を用いて空気と緩衝液の界面に広げた。有機溶媒を１０分間蒸発させた。単層を、細胞膜内で発生すると思われる表面圧３０ｍＮ／ｎｍに圧縮し、純粋な脂質層でＸＲを行った。次いで、Ｄ−ＰＢＳ中に溶解したペプトイド１を、副相内へ総濃度６．２６μＭ（ＭＩＣより十分高い）まで注射し、約４５分間挿入させ、その後ＸＲ測定を再び収集した。Ｘ線反射率（ＸＲ）プロフィールを、界面に垂直な電子密度の勾配のフーリエ変換によって求めた。ｑｚ値：〜０−０．６Å−１に対応する角度の範囲にわたってＸＲ測定を行った。ここで、ｑｚ＝（４π／λ）ｓｉｎ（α）であり、λは波長であり、αは角度である。
【０１３３】
実施例９
マウスの腹腔内感染モデル
画線したばかりのプレートから得た単一コロニーのＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  （ＡＴＣＣ  ＃２５９２３）を含有するＭＨＢを５ｍＬ播種することによって、細菌を調製し、一晩３７度で増殖させた。翌朝、細菌をＭＨＢで１／３に希釈することによって継代培養し、約１．５時間増殖させた。その後細菌を、ムチンのＰＢＳ５％溶液で１０倍に希釈し、完全に混合した。マウスが受け取った細菌の量を後に決定するため、試料を保管した。
【０１３４】
マウスの体重を計測し、標識をつけ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ接種材料を２００ｕＬ含むＩ．Ｐ．を注射した。感染から４時間後、マウスをペプトイド４ｍｇ／ｋｇ含むＩ．Ｐ．で処理した（〜１００ｕｇ／匹）。一晩放置して感染させた。２４時間後にＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、腹膜腔を露出し、ＰＢＳ５ｍＬで洗浄した。洗浄液を混合し、プレーティングまで氷の上で保存した。洗浄液をＰＢＳで１０−５（１／１０ずつ）に希釈し、全ての希釈液を複数のＭＨ寒天培地上に蒔いた。洗浄液５０ｕＬを点滴板上に蒔き、放置して乾燥させ、一晩３７℃で培養した。翌日コロニーを数え、各試料のＣＦＵ／ｍｌを計算した。あまりに多くのコロニーがあり数えられないプレートには、任意数×１０００コロニーを割り当てた。
【０１３５】
実施例１０
化合物合成及び精製
ＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）をリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ．）に用いて、サブモノマーアプローチ３によってペプトイドを合成した。簡単に説明すると、ジイソプロピルカルボジイミドによって活性化したブロモ酢酸を用いて、末端アミド基にブロモアセチル化中間体を形成した。その後臭化物をＳＮ２置換によって所望の一級アミンで置換し、ペプトイド鎖を構築した。ペプトイド合成に用いたアミンは、ベンジルアミン、オクタデシルアミン、（ｓ）−（＋）−２−アミノ−３−メチルブタン、（ｓ）−α−メチルベンジルアミン、（ｒ）−（α−メチルベンジルアミン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）及び発表された手順８３を用いて作成したＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１、４ジアミノブタン（Ｎｌｙｓ）を含む。その後樹脂に結合したペプトイドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物、トリイソプロピルシラン：水（９５：２．５：２．５、ｖ：ｖ：ｖ）に１０分間曝露して、ペプトイドを固体相から切断した。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってＣ１８カラム及びアセトニトリル／水の直線勾配で、ペプトイドを精製した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって測定された９７％を超える最終純度が達成され、各分子の同一性をエレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて確認した。試薬は全てシグマＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１３６】
実施例１１
円偏光二色性分光法
Ｊａｓｃｏ  ７１５分光偏光計を用いて、路長が０．０２ｃｍの円筒形石英セルにおいて全てのＣＤ測定を行った。測定は、１９０ｎｍ〜２８０  ｎｍの範囲にわたり、走査速度１００ｎｍ／分で行った。そのほかのパラメータは、データピッチ０．２ｎｍ、バンド幅１ｎｍ、応答時間２秒及び感度１００ｍｄｅｇを含む。化合物濃度は、１０ｍＭトリス緩衝液中で６０μＭであった（ｐＨ７．４）。ＳＵＶ存在下での試料については、脂質濃度は５ｍＭであった。各試料につき４０蓄積を収集した。
【０１３７】
実施例１２
抗菌アッセイのスクリーニング
ＣＬＳＩ  Ｍ７−Ａ６プロトコルに従って、９６穴微量定量プレート内でＭＩＣを求めた。全体積で５０μＬのペプトイド溶液を、２：１連続希釈法を用いて調製した。陽イオンを調整したミュラー−ヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）中で調製した細菌接種材料（１  ｘ  １０６  ＣＦＵ／ｍＬ）５０μＬを、試験ウェルに加えた。対照ウェルは、ＭＨＢ（増殖なし）１００μＬ、又はＭＨＢ５０μＬを含むペプトイドなしの接種材５０μＬを含んだ。ＭＩＣを、完全に細胞増殖を阻害したペプトイドの最低濃度として、培養の１６時間後に３５℃で測定した。報告された値は、実験３回にわたって再現可能であり、各回では２つの並行試行を行った。
【０１３８】
実施例１３
広域スペクトラムの抗菌性の分析
ＣＬＳＩ  Ｍ７−Ａ６プロトコルに従い、微量希釈方法によって、スクリーン抗菌性の分析について記載の方法と同様の方法で、ミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ）中で化合物のＭＩＣを求めた。播種した微量定量プレートを、結果を記録するまでに３５℃で２４時間培養した。基準として用いた４種類のＡＴＣＣ株は、ＣＬＳＩの推奨する以下のものである：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９２１２。そのほかのＡＴＣＣコレクションからの株は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９１３２，  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５６５９，  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ３３４９５，  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ３５０２９  及び  Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １３８８０を含む。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＮＲＳ１００  （ＣＯＬ）は、かなり特徴的なメチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株である。ミシガン及びペンシルバニアで分離された、バンコマイシン耐性のＭＲＳＡ株、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＶＡＮ１及びＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＶＡＮ２は、臨床的に単離された最初のバンコマイシン耐性株であった。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＮＲＳ  １１９及びＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＮＲＳ  １２０は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＮＡＲＳＡ）コレクション中の抗菌耐性ネットワークからのリネゾリド耐性の単離物である。Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ  ９９  及びＥ．  ｆａｅｃｉｕｍ  １０６は、バンコマイシン耐性の腸球菌株である。
【０１３９】
実施例１４
溶血分析
抽出したてのヘパリン処置したヒト血液から赤血球を分離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁して２０体積％の懸濁液を作成した。９６穴微量定量プレート内で、連続希釈法（２：１）によってペプトイド溶液を調製した。試験ウェルにおいて、赤血球懸濁液１００μＬをペプトイドのＰＢＳ溶液１００μＬに加えた。ペプトイドを含まないＰＢＳを負の対照として用い、０．２体積％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１００％溶血を示す正の対照として用いた。３７℃での培養の１時間後、各ウェルをＰＢＳ１５０μＬで希釈した。次にプレートを１、２００ｘｇで１５分間遠心分離し、細胞をペレットにした。各ウェルの上澄み３０μＬを、ＰＢＳ７０μＬを含有する第２の９６穴プレートの対応するウェルに移した。プレートリーダを用いて、３５０ｎｍでの吸光度を測定し、溶血のパーセントを（Ａ−Ａ０）／（Ａｔｏｔａｌ−Ａ０）として定義した。ここでＡは試験ウェルの吸光度であり、Ａ０は負の対照の平均吸光度であり、Ａｔｏｔａｌは１００％溶血ウェルの平均吸光度である。
【０１４０】
実施例１５
ＭＴＳ分析
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、３７℃、５％ＣＯ２において、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３及び１０％胎児ウシ血清を添加した完全なダルベッコ変法イーグル培地（ＣＤＭＥＭ）中で培養した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞について５、０００個／ウェルの密度で、９６穴プレート中に細胞を播種した（合計体積１００μｌ）。ペプトイド溶液プレート（１ウェル当たり合計体積１００μＬ）を、水性ペプトイド保存溶液の連続希釈法によってハンクス液（ＨＢＳＳ）培養液中で調製した。１日齢の細胞単層をＨＢＳＳで洗浄し、培養液をＨＢＳＳ１００μＬで置換した。ペプトイド溶液プレートの内容を、細胞単層プレートの対応するウェルに移し、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）４０μＬを各ウェルに加えた。３時間３７℃で培養した後、４９０ｎｍでの吸光度を求めた。抑制パーセンテージを［１−（Ａ−Ａｔｅｓｔｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］×１００として求めた。ここでＡは試験ウェル吸光度であり、Ａｃｏｎｔｒｏｌは培養液及びＭＴＳ（ペプトイドなし）に曝露した細胞の入ったウェルの平均吸光度である。Ａｔｅｓｔｂｌａｎｋ（培養液、ＭＴＳ及びペプトイド）及びＡｂｌａｎｋ（培養液及びＭＴＳ）を、細胞なしのバックグラウンド吸光度として測定した。６件の反復実験の平均を報告する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2011511077.tif 000050
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
2011511077000001.app
【国際調査報告】
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