(57)【要約】本発明は、細胞組成物、その細胞組成物から得られた単離された組成物、関連する単離された細胞組成物を調製するための方法、それらのキットおよび使用に関する。より具体的には、本発明は、サンプル中の癌を引き起こす未成熟細胞または幹細胞を同定、精製および濃縮するための方法を提供する。本発明による細胞組成物、関連する方法および使用は、癌の処置および／または濃縮した癌を引き起こす未成熟細胞もしくは幹細胞、特に中枢および末梢神経系の癌、脳転移癌の検出に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）（ａ）で提供された前記細胞を培地中で必要に応じて培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された前記細胞から、蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍの波長でのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す前記細胞をサブサンプル中で単離する工程と、
（ｄ）蛍光活性化細胞分類によって、工程（ｃ）の下で蛍光を発光せず、ＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す前記細胞を別のサブサンプル中で単離する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）の下で得られた前記単離された細胞のサブサンプルの各々から死細胞を取り除く工程と、
（ｆ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｃ）の下で得られた前記細胞のサブサンプルをプールする工程と、
（ｇ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｄ）の下で得られた前記細胞のサブサンプルをプールする工程と、
を含む、細胞組成物の調製方法。
【請求項２】
工程（ｃ）の下で単離された前記細胞は、蛍光活性化細胞分類の下で高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ形態をさらに示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）の下で単離された前記細胞は、蛍光活性化細胞分類の下で低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ形態をさらに示すものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）の下で検出された前記自己蛍光発光は、約５２０ｎｍの波長にて前記ＦＬ１チャネルで検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の下で検出された前記自己蛍光発光は、ダイクロックミラーを用いて５３０ｎｍ＋／−１５ｎｍにてＦＬ１チャネルで検出される、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の下で検出された前記自己蛍光発光は、ダイクロックミラーを用いて５１５ｎｍ＋／−５ｎｍにてＦＬ１チャネルで検出される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）の下で検出された前記蛍光発光での前記わずかな正シフトは、６３０ｎｍより大きい波長にて検出される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
死細胞は、工程（ｃ）および（ｄ）の下で得られた前記サブサンプルへのトリパンブルーの添加によって工程（ｅ）の下で取り除かれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の下で提供された前記腫瘍細胞サンプルは、腫瘍サンプルからの解離後に前記細胞が培養されているサンプルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）の下で提供された前記腫瘍細胞サンプルは、腫瘍サンプルから新たに解離される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）の下での前記培地は、幹細胞培地、富血清培地および分化培地から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）の下で提供される前記腫瘍細胞サンプルは、細胞が、神経膠腫、シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ）、肺転移癌、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫から選択される腫瘍サンプルから解離されているサンプルである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍでのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す生細胞を含む単離された細胞組成物。
【請求項１４】
前記細胞は、蛍光活性化細胞分類によって、高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ形態をさらに示す、請求項１３に記載の単離された細胞組成物。
【請求項１５】
約４８８ｎｍでのレーザービーム励起時に前記ＦＬ１チャネルで検出される自己蛍光発光を示さず、蛍光活性化細胞分類によって、前記ＦＬ３および／または前記ＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す生細胞を含む、単離された細胞組成物。
【請求項１６】
前記細胞は、蛍光活性化細胞分類によって、高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ形態をさらに示す、請求項１５に記載の単離された細胞組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られる細胞サブサンプルを含む単離された細胞組成物。
【請求項１８】
前記細胞のサブサンプルは、工程（ｆ）の下で得られる、請求項１７に記載の単離された細胞組成物。
【請求項１９】
前記細胞のサブサンプルは、工程（ｇ）の下で得られる、請求項１７に記載の単離された細胞組成物。
【請求項２０】
前記細胞は、神経膠腫細胞である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の単離された細胞組成物。
【請求項２１】
請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞組成物を含む、キット。
【請求項２２】
以下の工程：
（ｉ）スクリーニングされる薬剤の存在／非存在下で、請求項１３〜１４または１７のいずれか１項に記載の単離された細胞組成物（ＦＬ１＋細胞）を混合する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つのＦＬ１＋細胞機能を阻害する前記薬剤の能力を測定する工程と、
を含む、抗腫瘍剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法。
【請求項２３】
以下の工程：
（ａ）細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）（ａ）で提供された前記細胞を培地中で必要に応じて培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された細胞から、蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍの波長でのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を検出する工程と、
（ｄ）蛍光活性化細胞分類によって、工程（ｃ）の下でＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示さず、工程（ａ）または（ｂ）の下で提供される細胞のレーザービーム励起時にＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで前記細胞の蛍光発光でわずかな正シフトを示す細胞を検出する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）および工程（ｃ）の下で得られた蛍光シグナルの比を測定する工程と、を含む、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の下で単離された前記細胞は、蛍光活性化細胞分類下で高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ形態をさらに示すものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｄ）の下で検出された前記細胞は、蛍光活性化細胞分類下で低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ形態をさらに示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程：
（ａ）癌幹細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の下で提供された前記癌幹細胞サンプルを薬剤で処置する工程と、
（ｃ）インキュベーション期間、処置せずに、前記処置された幹細胞サンプルを幹細胞培地中でインキュベートする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の下でインキュベートされた前記幹細胞サンプルから生存細胞集団を選択する工程と、
（ｅ）蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍの波長でのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を検出することにより工程（ｄ）の下で単離された前記生存細胞集団での自己蛍光の平均値を測定する工程と、
（ｆ）蛍光活性化細胞分類によって、高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ形態を有し、工程（ｄ）の下で単離された前記生存細胞集団の約４８８ｎｍの波長でのレーザービーム励起時に前記ＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を単離する工程と、
（ｇ）蛍光活性化細胞分類によって、低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ形態を有し、工程（ｄ）の下で前記ＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示さず、工程（ｄ）の下で単離された前記生存細胞集団のレーザービーム励起時に前記ＦＬ３および／または前記ＦＬ４チャネルで前記細胞蛍光発光中でわずかな正シフトを示す細胞を単離する工程と、
（ｈ）工程（ａ）の下で提供された前記癌幹細胞サンプル中の自己蛍光の平均値と、工程（ｅ）の下で測定された自己蛍光の平均値を比較することにより、自己蛍光生存細胞の割合を計算する工程と、
（ｉ）工程（ａ）の下で提供された前記癌幹細胞サンプルに存在する初期細胞の数と、工程（ｄ）の下で単離された得られた生存細胞集団とを比較することにより、細胞死の割合を計算する工程と、
（ｊ）工程（ａ）の下で提供された前記癌幹細胞サンプルに存在する初期ＦＬ１＋細胞の数と、工程（ｆ）の下で単離された得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することにより、生存ＦＬ１＋細胞の割合を計算する工程と、
（ｋ）工程（ａ）の下で提供された前記癌幹細胞サンプルに存在する初期ＦＬ１０細胞の数と、工程（ｇ）の下で単離された得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することにより、生存ＦＬ１０細胞の割合を計算する工程と、
（ｌ）工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された前記細胞集団のスフェア原性を検出する工程と、
（ｍ）癌幹細胞の再発を阻害する能力により、前記薬剤の活性を測定する工程と、
を含む、癌幹細胞サンプルにおける癌幹細胞の再発を検出する方法。
【請求項２７】
前記方法は、工程（ｌ）の後、工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された前記細胞集団での少なくとも１つの分化の発現を測定する工程（ｌ１）をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は、工程（ｌ）の後、工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された前記細胞集団での少なくとも１つの幹細胞性マーカーの発現を測定する工程（ｌ２）をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は、工程（ｌ）の後、工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された前記細胞集団で分裂細胞の割合を測定する工程（ｌ３）をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法は、工程（ｌ）の後、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の代謝活性を測定する工程（ｌ４）をさらに含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞組成物、その細胞組成物から得られた単離された組成物、関連する単離された細胞組成物を調製するための方法、それらのキットおよび使用に関する。より具体的には、本発明は、サンプル中の癌を引き起こす未成熟細胞または幹細胞を同定、精製および濃縮するための方法を提供する。本発明による細胞組成物、関連する方法および使用は、癌の処置および／または濃縮した癌を引き起こす未成熟細胞もしくは幹細胞、特に中枢および末梢神経系の癌ならびに脳転移癌の検出に有用である。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍−神経膠腫は成人において最も頻繁に起こる脳腫瘍であり、それらの悪性型（グレードＩＶまたは多形性膠芽腫）においては、依然として５年生存率が５％未満である最も侵攻性の疾患のうちの１つである（非特許文献１）。神経膠腫は、膠細胞、主に星状膠細胞（星状細胞腫（ａｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ））および乏突起膠細胞（欠突起膠腫）とのそれらの表現型類似性に従ってサブカテゴリーに分類される。病理組織学的特徴に基づいて、神経膠腫はまた、低い悪性度（グレードＩおよびＩＩ）ならびに高い悪性度（グレードＩＩＩおよびＩＶ）の腫瘍に細かく分けられ、異なる臨床予後を有する（非特許文献１）。手術技術、ならびに放射線および化学療法戦略における現在の進歩にもかかわらず、高い悪性度の神経膠腫は、依然として恐るべき予後の疾患のままである。環境的リスク要因は同定されておらず、それらの脳腫瘍の初期および進行段階に関与する生物学的機構についてもほとんど知られていない。従って、神経膠腫治療または予防におけるいくらかの意味のある改善は、神経膠腫の発達の細胞機構および分子機構のより深い理解を必要とする。
【０００３】
多くのヒト癌様急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳房、卵巣および脳の腫瘍における幹様細胞（ＳＣ）の最近の同定により、癌が、成人の幹／前駆細胞の体細胞変異から起こり得るという仮説に新しく興味が示されてきた（非特許文献２）。小集団の癌幹様細胞は、腫瘍細胞増殖、再発、および転移の起源を表す場合があり、それによって、増殖、進行、および治療に対するその後の反応を含む、腫瘍の生物学的挙動を決定する（非特許文献２；非特許文献３）。正常な細胞および癌幹細胞は、自己複製、多系統への分化を含む、挙動の類似点を共有するが、それらは、ヌードマウスへ移植されると、それらの腫瘍形成能に関して異なる（非特許文献４）。さらに、腫瘍表現型を支配するのに特異的であるヒト神経膠腫において癌幹マーカーを同定することは非常に複雑である。特定の癌幹細胞マーカーを発見し、特徴付けるための多くの試みがなされており、それは、癌細胞（巨大腫瘍由来の細胞のマーカー）または正常な幹細胞から特定の癌幹細胞マーカーを識別する。今まで、ＣＤ１３３の発現は、自己複製および腫瘍発生特性を示す神経膠腫幹細胞の亜集団を精製および濃縮することのみで可能であった（非特許文献５）。ＣＤ１３３は他の腫瘍発生系に現れていたが、正常な幹細胞においても発現され、治療のための癌細胞の特異的標的を困難なものにする（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。さらに、１つのマーカーのみが、腫瘍細胞集団の不均一性、および造血細胞系での現状を認識する「神経膠腫幹細胞集団」を定義するのに十分であると考えることは非常に難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｅａｒｄｏｎら，２００６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２４，１２５３
【非特許文献２】Ｒｅｙａら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，１０５
【非特許文献３】Ｇａｌｍｏｚｚｉら，２００６，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，６０３
【非特許文献４】ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋ，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，７３０
【非特許文献５】Ｓｉｎｇｈら，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２，３９６
【非特許文献６】Ｙｉｎら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，９０，５００２
【非特許文献７】Ｕｃｈｉｄａら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４７２０
【非特許文献８】Ｍｉｒａｇｌｉａら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１，４３９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、神経膠腫および他の固形癌における細胞分類体系のさらなる理解についてのより良い選択戦略を可能にする新規の方法、特に、幹細胞特性を示す、腫瘍を引き起こし、増殖させる細胞を単離し、完全に特徴付ける新規の方法についての必要性が存在し、それは、このような癌の処置に有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細胞組成物、その細胞組成物から得られる単離された組成物、関連する単離された細胞組成物を調製するための方法、およびその使用、ならびにサンプル中の癌を引き起こす未成熟細胞または幹細胞を同定、精製および濃縮する方法に関する。
【０００７】
本発明の第１の態様は、本発明による細胞組成物およびその細胞組成物から得られる単離された組成物を調製するための方法を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、レーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示し、蛍光活性化細胞分類によって単離される生細胞を含む単離された細胞組成物に関する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、蛍光活性化細胞分類によって、ＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す生細胞を含む単離された細胞組成物に関する。
【００１０】
本発明による第４の態様は、本発明による少なくとも１つの細胞組成物を含むキットである。
【００１１】
本発明による第５の態様は、本発明によるスクリーニング方法における本発明による単離された細胞組成物の使用およびそれに関連する方法に関する。
【００１２】
本発明による第６の態様は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法に関する。
【００１３】
本発明による第７の態様は、細胞を腫瘍発生状態から非腫瘍発生状態に移すことができる薬剤のための抗腫瘍剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法に関する。
【００１４】
本発明による第８の態様は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法に関する。
【００１５】
本発明による第９の態様は、本発明による細胞組成物を含むか、または用いるスクリーニングアッセイに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は本発明による方法についてのスキームを表す。（ａ）解離後の腫瘍細胞サンプルから新たに提供される。（ｂ）（ａ）で提供された細胞を培地中で必要に応じて培養する。（ｃ）蛍光活性化細胞分類によって約４８８ｎｍの波長におけるレーザービーム励起時に、ＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す細胞を、工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された細胞からサブサンプル中で単離する。（ｄ）蛍光活性化細胞分類によって、工程（ｃ）の下で蛍光を発せず、ＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す細胞を、別のサブサンプル中で単離する。（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）の下で得られた単離された細胞サブサンプルの各々から死細胞を排除する。（ｆ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｃ）の下で得られた細胞サブサンプルをプールする。（ｇ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｄ）の下で得られた細胞サブサンプルをプールする。
【図２】図２は、ＦＬ１＋細胞が、ＦＬ１０細胞より高いスフェア原性の特性、および排他的に長期間の自己複製能力を有することを示す。（Ａ）ＦＬ１＋およびＦＬ１０分類後に形成された二次スフェアユニットの割合、および１細胞／ウェルにおけるクローニング。スフェアの計数はクローン後１０日で評価した。（Ｂ）単一のＦＬ１＋由来または単一のＦＬ１０細胞由来の個々のクローンの連続継代（５回まで）。ＦＬ１陽性クローンは５継代より多く残り得るが、ほとんどのＦＬ１０クローンは、４継代後、それ以上スフェアを形成しない。（Ｃ）連続継代の間の２つの個々のクローンの位相差画像。左のパネル：ＦＬ１＋およびＦＬ１０クローンの形態。ＦＬ１＋クローンはスフェアであり、一方、ＦＬ１０クローンは付着細胞からなるが、両方のクローンは幹細胞条件で培養された。右のパネル：４継代までのＦＬ１＋およびＦＬ１０の両方の個々のクローンの発生および増殖のより低い倍率での写真。腫瘍サンプルの種類の凡例は図９Ａにある。
【図３】図３は、実施例１に記載されるような新鮮な試料で実施された細胞分析を示す。（Ａ）：全集団、（Ｂ）：ＦＬ１＋、（Ｃ）ＦＬ１０。自己蛍光はＦＬ１チャネル（５１５＋／−５ｎｍまたは５３０＋／−１５ｎｍ）で特に発光する。薄い灰色のドットは、低ＳＳＣ、および高ＦＣＳ特性（Ｐ１）を有する生存ＦＬ１＋細胞をゲートする。濃い灰色は、異なる形態（低／中ＳＳＣおよびＦＳＣ特性；Ｐ２）を有する生存ＦＬ１０細胞をゲートする。Ｐ４およびＰ５は、それぞれ、低レベルの蛍光（１０２より小さい）を有するＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞をゲートする。Ｐ６は低ＳＳＣおよびＦＳＣを有する小集団を表し、新鮮な一次ヒトサンプルまたは担癌マウス由来の組織においてのみ検出される。黒いドットは、いかなる他の基準も持たず、死細胞を含む、広範なゲートされていない集団を表す。
【図４】図４は、実施例２に記載されるような幹細胞条件で培養された細胞で実施された細胞分析を示す。（Ａ）全細胞集団。ゲートなし。（Ｂ１〜Ｂ３）Ｒ１潜在性生存細胞。（Ｃ１〜Ｃ３）ＦＬ１−Ｈ、ＦＬ２−Ｈ、ＦＬ３−Ｈチャネルのそれぞれにおける自己蛍光のレベル。Ｒ２生存ＦＬ１０。Ｃ１：ＦＬ１０形態、Ｃ２：トリパンブルーを用いないＦＬ１０蛍光レベル、Ｃ３：トリパンブルー添加後のＦＬ１０蛍光レベル。（Ｄ１〜Ｄ３）Ｒ３生存ＦＬ１＋。Ｄ１：ＦＬ１＋形態、Ｄ２：トリパンブルーを用いないＦＬ１＋蛍光レベル、Ｄ３：トリパンブルー添加後のＦＬ１＋蛍光レベル。Ｒ６：死細胞（Ｒ１ゲートされた集団における）。Ｒ７：生存細胞ＦＬ１０（Ｒ１ゲートされた集団における）。Ｒ８：生存ＦＬ１＋（Ｒ１ゲートされた集団における）。以下の結果を観測する：９３．３％のＲ１ゲートされた細胞が生存しており、そのうち約２１％がＦＬ１＋生存細胞であり、約２３％がＦＬ１０生存細胞である。
【図５】図５は、実施例２に記載される単離されたＦＬ１−Ｈ細胞、実施例３に記載されるように測定された幹細胞遺伝子発現についての濃縮およびタンパク質レベルを示す。（Ａ）非ＦＬ１−Ｈ細胞の１つに対するＦＬ１−Ｈ細胞で検出された遺伝子発現レベルの比。定量的リアルタイムＰＣＲによって分析され、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＧ１、およびＥＥＦ１Ａ発現レベルの幾何平均で正規化されたサンプル。ｎｄ（未決定）：両方の場合において、遺伝子発現レベルは非ＦＬ１−Ｈ細胞集団において検出されなかった。ＦＬ１−Ｈ細胞集団における一定の濃縮を示す第５のサンプルについての遺伝子発現レベルのリプレゼンティブ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｖｅ）ＰＣＲゲルの写真（パネルＡ、左）。（Ｂ）ＦＡＣＳ分類およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色後のＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の細胞周期分析（それぞれ左および右のパネル）。ほとんどのＦＬ１−Ｈ細胞はＳ細胞周期に存在するが、ほとんどのＦＬ１０細胞はＧ１期に存在する。これは、パネルＤにおけるＦＬ１０細胞で検出された代謝活性の欠如と部分的に相関する。（Ｃ）自己蛍光レベルについての分類および比色分析（ＭＴＳ）後のＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の代謝活性。４９０ｎｍで検出された光学密度（ＯＤ）を表す値。２９３Ｔ細胞を陽性コントロールとして使用し、一方、培地を陰性コントロールとしてのみ使用した。
【図６】図６は、ＦＬ１＋細胞がインビボにおいて腫瘍増殖を開始し、維持することを示す。（Ａ）実施例３に記載されるように、ＦＬ１＋またはＦＬ１０分類細胞を注入した（１０５の細胞を注入した）マウスのインビボでの画像化および組織学的分析。磁気共鳴映像法（ＲＭＩ）での、対比前（Ｔ２）、および対比後（Ｔ１＋ガドリニウム）後の脳に注入したマウスの代表的な一連の画像。注入した脳切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（２．５倍）、およびより高い倍率（２０倍）。ＦＬ１−Ｈ自己蛍光（薄い灰色）およびＭＨＣＩとの共局在化により、ヒト起源由来の腫瘍細胞の同定が可能になる（１０倍）。（Ｂ）ＦＬ１注入マウスにおけるＧＦＡＰ−、ＮＥＳＴＩＮ−、ＴＵＪ１−、Ｋｉ６７−発現細胞の発現分析。Ｄａｐｉ染色核（青）。スケールバー：μｍ。（Ｃ）ＦＬ１＋およびＦＬ１０注入マウス由来の神経膠腫スフェアの写真。注入した担癌マウス脳の対側を解離し、インビトロでの培養前に自己蛍光ＦＬ１−ＨレベルについてＦＡＣＳにより分析した。ＦＬ１＋注入マウスの対側由来の細胞培養物は、神経膠腫スフェアの形成を示し、ＦＬ１＋は、ＦＬ１＋の遊走能を示す。スケールバー：μｍ。（Ｄ）種々の神経膠腫スフェア培養物由来のＦＬ１＋およびＦＬ１０−分類細胞を注入したヌードマウスの数についての表の要約（それぞれ、Ｎ＝２４およびＮ＝２３）。（Ｅ）表は、単離したＦＬ１＋およびＦＬ１０分類細胞を予め注入したヌードマウスの数を示す（４０３細胞／マウス）。
【図７】図７は新鮮な神経膠腫腫瘍を示し、神経膠腫幹細胞培養物は、ＦＬ１−Ｈ自己蛍光集団を含む。（Ａ）腫瘍解離後、異なる培地条件で培養された一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞のＦＡＣＳ分析。上のパネル：幹細胞条件で培養された一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞、ＦＬ１＋細胞集団の存在を有する。対照的に、同じ一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞が、富血清条件で最初に培養される場合（真ん中のパネル）、ＦＬ１＋自己蛍光細胞は観測されず、代わりに、低い自己蛍光を有する均一の細胞集団をＦＡＣＳによりモニターした。一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞を、富血清培地から幹細胞培地に移し、４継代の間、培養した。しかしながら、細胞は、いずれもＦＬ１−Ｈ自己蛍光を回収しない。低ＦＬ１−Ｈ自己蛍光レベルを有する単一の細胞集団は残っており、一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞が、血清中のそれらのＦＬ１＋集団を不可逆的に損失することを示唆している。（Ｂ）幹細胞条件で最初に培養された一次ＧＢＭ  ＩＶ−２細胞のＦＡＣＳ分析（上のパネル）および次いで、７日間、マイトジェンのないポリ−オルニチン−ラミニン基質での分化についてのプレート（下のパネル）。Ｒ２は、ＦＬ１−Ｈ陽性細胞の割合をゲートする。マイトジェンのみまたは富血清条件（データは示さず）でのプレーティングの離脱は、分化アッセイと異なり、ＦＬ１＋自己蛍光細胞集団を無効にするほど重要ではない。腫瘍サンプルの種類の凡例は図９Ａにある。
【図８】図８は、トリパンブルー添加後の形態ならびにＦＬ１およびＦＬ３での蛍光レベル、２つの神経膠腫スフェア培養物の細胞周期および写真を示す。（Ａ）Ａ．Ｏ．ＩＩＩ−１および（Ｂ）一次ＧＢＭ−２。
【図９】図９は、ヒトの組織およびそれら由来の神経膠腫培養物のリストを示す。（Ａ）この研究において使用されたヒト神経膠腫のリストは、それらの種類およびグレードに従って分類された。部位、性別および年齢を、各試料（Ｎ＝２５）について示す。（Ｂ）フローサイトメトリーによって決定された自己蛍光細胞の割合および神経膠腫スフェア培養物におけるＦＬ１強度の平均（Ｎ＝７）。Ａ：星状細胞腫；Ｏ．Ｇ：乏突起膠腫；Ｏ．Ａ：乏突起星状細胞腫；ＧＢＭ：多形性膠芽腫；ＧＳＭ：神経膠肉腫。
【図１０】図１０は、ＦＬ１＋集団の割合が、種々の神経膠腫スフェア培養物において１０より多い継代にわたって安定なままであることを示す。ＦＬ１＋細胞の割合は、継代ごとにわずかに変化するが、それは、一次ＧＢＭ−２、−３、二次ＧＢＭ−１において長期間にわたって安定なままであり、Ｏ．Ａ  ＩＩＩ−１およびＧＳＭ  ＩＶ−１培養物において次第に濃縮される。
【図１１】図１１は、共焦点３Ｄ再構成後の神経膠腫スフェア内のタンパク質マーカーの定量化を示す。（Ａ）この図は、神経膠腫スフェア内のＦＬ１自己蛍光を用いて個々のマーカーの発現および局在を定量化し、平面化する手順を示す。具体的には、左のスキームは共焦点顕微鏡後のＺ堆積部分を示し、これにより、表面あたりのタンパク質の発現および局在の作表が可能になる（左のグラフのパネルＢ〜ＫのＸ軸）。右のスキームは、所定の表面についての６°区域内のタンパク質発現および局在の定量化を表す。表面あたりの６０区域の分析は、右のグラフ（平面内の区域）のパネルＢ〜ＫのＸ軸に対応する。（Ｂ〜Ｄ）３つの異なる神経膠腫スフェア培養物におけるＦＬ１自己蛍光レベルの定量化。スフェア（左のグラフ）内のＦＬ１自己蛍光のより強い強度、ならびに異なる表面（右のグラフ）間の区域あたりの異種発現および局在に留意すべきである。（Ｅ〜Ｍ）一次ＧＢＭ−３神経膠腫スフェア内の個々のマーカーの発現レベルおよび局在の定量化（左および中央のグラフ）。分類されていない一次ＧＢＭ−３細胞（上の右）、ＦＬ１＋分類細胞（中央の右）、ＦＬ１０−分類細胞（下の右）内のマーカー発現細胞の割合。研究したマーカーは、ＮＡＮＯＧ（Ｅ）、ＯＣＴ４（Ｆ）、ＳＯＸ２（Ｇ）、ＫＩ６７（Ｈ）、ＮＯＴＣＨ１（Ｉ）、ＮＥＳＴＩＮ（Ｊ）、ＧＦＡＰ（Ｋ）、ＰＤＧＦＲα（Ｌ）、インテグリンβ１（Ｍ）であった。
【図１２】図１２は、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞が、異なる神経系列に分化し得ることを示す。一次ＧＢＭ−２神経膠腫スフェアから精製されたＦＬ１＋−およびＦＬ１０−細胞を、１０日間、分化のためにプレートした。細胞を固定し、ＧＦＡＰ、ＮＥＳＴＩＮ、ＴＵＪ１、およびＭＡＰ２について染色した。ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞は、それらの多分化能を示す同様の拡張まで分化することに留意すべきである。少しの島細胞は、ＧＦＡＰについて陽性であった（細胞の２〜３％）。ＴＵＪ１陽性細胞の１％は、分化の誘導時に検出された。ＭＡＰ２発現細胞またはＮＥＳＴＩＮ発現細胞の基礎レベルおよび割合は、ＧＦＡＰ発現細胞およびＴＵＪ１発現細胞のものと比較してより高かったが、細胞の１０〜１５％のみが、ＭＡＰ２またはＮＥＳＴＩＮについて高い陽性であった。矢印は陽性細胞を指す。スケールバー：８０μｍ。
【図１３】図１３は、神経膠腫細胞集団が、それらの形態および（４８８ｎｍの励起波長における）内在する蛍光のレベルに基づいて本発明の方法によってどのように同定され、単離され得るかを示す。（Ａ）ＦＬ１＋細胞は、新鮮な培養神経膠腫試料内の任意の他の神経膠腫細胞と比較して、迅速、無毒性および強力な同定、精製および特徴付けを可能にする特定の形態および内因性の蛍光特性を有する。（Ｂ）本発明によるＦＬ１＋およびＦＬ１０単離細胞の特性の要約。
【図１４】図１４は、本発明による癌幹細胞サンプルにおける癌幹細胞の再発を検出するための方法についてのスキームを示す。本発明の方法の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ１）〜（ｌ４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「サンプル」は、例えば、ヒト神経膠腫、シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ）、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫などの癌を患っているか、または癌を患う疑いのある患者（哺乳動物の患者、より具体的にはヒト患者など）からの組織または流体サンプルなどの任意の起源由来の組織または流体サンプルを含む。別の実施形態において、サンプルは、例えば、黒色腫から脳への転移癌などの転移性癌、乳癌、結腸癌、肺癌などを患っているか、または癌を患う疑いのある患者（哺乳動物の患者、より具体的にはヒト患者など）からの組織または流体サンプルなどの任意の起源由来の組織または流体サンプルを含む。
【００１８】
用語「腫瘍細胞サンプル」は、例えば、幹細胞培地などで培養されるような神経膠腫スフェア培養物、富血清培地などで培養されるような付着細胞培養物および分化培地などで培養されるような分化細胞培養物などの腫瘍サンプルからの解離後に、細胞が培養されている腫瘍サンプルまたは細胞サンプルから新たに解離された細胞サンプルを含む。
【００１９】
用語「幹細胞培地など」は、新たに解離された組織サンプル由来の癌幹細胞（神経膠腫スフェアとも呼ばれる）が増殖する培地を含む。例えば、神経幹細胞培地としては、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（１／５０  Ｇｉｂｃｏ）またはＢＩＴ９５００（２０％  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒト組み換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびベーシックＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足されたＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【００２０】
用語「富血清培地など」は、新たに解離された組織サンプル由来の付着培養物が増殖する培地（例えば、ＦＢＳ  １０％、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補足されたＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（Ｇｉｂｃｏ））を含む。
【００２１】
用語「分化培地など」は、癌幹細胞が、それらの多分化能を分析するためにプレートされる培地（例えば、３７℃でＯ／ＮについてＨ２Ｏ中１：１００で希釈されたポリ−Ｌオルニチンおよびラミニン（シグマ）の混合物でコーティングされたプレート）を含む。細胞は解離されて、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（１／５０  Ｇｉｂｃｏ）またはＢＩＴ９５００（２０％  Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足されたＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０細胞／μｌの密度でプレートされる。
【００２２】
用語「増殖培地」は、細胞がインビトロで増殖する、すなわち、細胞が増殖し、分裂し、非対称性分裂または対称性分裂により娘細胞を生じる培地を定義する。
【００２３】
用語「ＦＬ１チャネル」は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｓｈａｐｉｒｏら，第４編，２００３，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるような蛍光の長手方向の検出チャネルである。典型的に、４８８ｎｍの励起波長に関して、自己蛍光検出は約５２０ｎｍの波長においてＦＬ１チャネルで生じる。
【００２４】
用語「ＦＬ３チャネル」は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｓｈａｐｉｒｏら，第４編，２００３，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるような蛍光の側面検知（４５°）チャネルである。典型的に、４８８ｎｍの励起波長に関して、蛍光検出は６３０ｎｍより大きい波長においてＦＬ３チャネルで生じる。
【００２５】
用語「ＦＬ４チャネル」は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｓｈａｐｉｒｏら，第４編，２００３，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるような蛍光の側面検知チャネルである。典型的に、約６３２ｎｍまたは約５４６ｎｍの励起波長に関して、蛍光検出は６３０ｎｍより大きい波長においてＦＬ４チャネルで生じる。
【００２６】
用語「癌」は、中枢および末梢神経系の癌、脳転移癌および肺転移癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌および卵巣癌などの癌を含む。さらに、用語、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌などの癌を含む。
【００２７】
用語「ＦＬ１＋細胞」または「ＦＬ１−Ｈ細胞」は、本発明の方法による蛍光活性化細胞分類によって分類される細胞、特に、特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）および細胞サブサンプルへのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出される自己蛍光発光を示す細胞を選択的に検出し、分類することによって分類される細胞を意味する。ＦＬ１チャネルで検出されるこのような自己蛍光発光を示す細胞亜集団からなるこのサブサンプルは、４８８ｎｍの波長（例えば青色レーザービーム、例えばアルゴン）の励起時に５２０ｎｍ付近の波長において検出される。より具体的には、ＦＬ１自己蛍光は、ダイクロックミラーを用いて５３０ｎｍ＋／−１５において、より厳密にはダイクロックミラーを用いて５１５ｎｍ＋／−５においてＦＬ１チャネルで検出され得、ＦＬ１自己蛍光発光スペクトルの特異性を確認する。
【００２８】
用語「ＦＬ１０細胞」または「非ＦＬ１−Ｈ細胞」または「非自己蛍光細胞」とは、本発明の方法による蛍光活性化細胞分類によって分類される細胞、特に、特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）を示し、ＦＬ１チャネルで蛍光を発せず、ＦＬ３またはＦＬ４チャネルで検出される蛍光でわずかな正シフトを示す細胞を選択的に検出し、分類することによって分類される細胞を意味する。
【００２９】
用語「高ＦＳＣ」または「高ＦＳＣ−Ｈ」または「高ＦＳＣ−Ａ」とは、前方散乱を意味し、粒子（細胞）サイズおよび速度測定（５〜７μｍの間の細胞直径）に対応する。
【００３０】
用語「低／中ＦＳＣ」または「低／中ＦＳＣ−Ｈ」または「低／中ＦＳＣ−Ａ」とは、前方サイズ散乱を意味し、細胞のサイズ（細胞直径＜５〜７μｍ）に対応する。
【００３１】
用語「中／高ＳＳＣ」または「中／高ＳＳＣ−Ｈ」または「中／高ＳＳＣ−Ａ」とは、側方または直交散乱を意味し、細胞複雑性または粒度（大きな細胞質および顆粒を有する細胞）に対応する。
【００３２】
用語「低／中ＳＳＣ」または「低／中ＳＳＣ−Ｈ」または「低／中ＳＳＣ−Ａ」とは、側方または直交散乱を意味し、細胞複雑性または粒度（無顆粒の細胞および核の周囲の限定された細胞質を有する細胞）に対応する。
【００３３】
典型的に、ＦＬ１＋またはＦＬ１−Ｈ細胞は、「高ＦＳＣ」または「高ＦＳＣ−Ｈ」または「高ＦＳＣ−Ａ」と、「低／中ＳＳＣ」または「低／中ＳＳＣ−Ｈ」または「低／中ＳＳＣ−Ａ」とを組み合わされ、従って、１より大きい核／細胞質の直径の比を有する。
【００３４】
典型的に、ＦＬ１０または非ＦＬ１−Ｈ細胞は、「低／中ＦＳＣ」または「低／中ＦＳＣ−Ｈ」または「低／中ＦＳＣ−Ａ」と、「中／高ＳＳＣ」または「中／高ＳＳＣ−Ｈ」または「中／高ＳＳＣ−Ａ」とを組み合わされ、従って、１より小さい核／細胞質の比を有する。
【００３５】
用語「癌幹細胞サンプル」とは、本発明による単離された細胞組成物または本発明による細胞組成物を調製する方法によって得られた細胞組成物を意味する。
【００３６】
用語「幹細胞培地」は、幹細胞の培養に適切な培地である。典型的に、幹細胞培地としては、例えば、マイトジェン（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ）および補足物を含まない培地（Ｂ２７またはＢＩＴ９５００）が挙げられる。
【００３７】
用語「スフェア原性（ｓｐｈｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」は、単一の幹細胞が、クローンを形成するために対称的または非対称的に分裂する能力を含む。このクローンはスフェアと呼ばれ、より正確には、スフェアが神経膠腫の腫瘍由来である場合、神経膠腫スフェアと呼ばれる。この能力は、実施例３および図２に記載されるような自己複製アッセイとも呼ばれるクローンアッセイによって測定され得る。自己複製アッセイは単一の細胞がクローンを形成する能力を測定するが、全てのクローンがスフェアを形成するわけではない。正常な発達または特定の癌の種類における幹細胞または初期前駆細胞のみが、スフェア原性の可能性を示し、この特異性は神経および神経膠腫幹細胞に存在する。
【００３８】
用語「多分化能」は、細胞がいくつかの細胞の種類に分化する能力を含み、例えば、中枢神経系由来の細胞の多分化能とは、ＧＦＡＰ（星状膠細胞）、ＮＥＳＴＩＮ（神経前駆細胞）、ＴＵＪ１（ニューロン）などの細胞に分化する能力を意味する。
【００３９】
用語「回収する」は、処置後のＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞を幹細胞培地へ戻す移動を含む。用語「抗癌剤」は、癌における治療活性、例えば、腫瘍増殖を減少または無効にすること、癌の再発を予防、減少または無効にすることなどの癌の処置における効果を有する可能性のある分子を含む。それは、癌における治療活性として公知である薬剤または癌における治療活性を有する能力について調べられる薬剤を含む。
【００４０】
用語「再発」とは、薬剤による処置後、癌幹細胞の固有特性（例えば、ＦＬ１チャネルでの自己蛍光、スフェア原性）、癌幹細胞の分裂能力を維持するため、および必要に応じて、さらなる特性（例えば、分化マーカーの発現によって測定される分化能、幹細胞性マーカーの発現によって測定される幹細胞性、ならびに酸化還元比色分析アッセイ（ＭＴＳ）を用いる活性およびＮＡＤ／ＮＡＤＰＨ＋酵素比によって測定される代謝特性）を維持するために癌幹細胞が生存する能力を意味する。再発の測定は、本発明によるスクリーニングアッセイによって実施され、図１４に要約されるような処置後、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の存在および割合の分析を含む。再発レベルは、回収期間の間、処置後に生存している癌幹細胞の割合、および癌幹細胞の再発が観測されない回収期間の長さに基づいて評価される。
【００４１】
用語「癌幹細胞の再発を阻害する能力」とは、処置後、およびこの処置後の回収期間の観測後、癌幹細胞サンプルにおける癌幹細胞の数を減少させ得る薬剤の特性を意味する。好ましくは、癌幹細胞の再発を阻害する能力は、回収期間の観測後、癌幹細胞サンプルから癌幹細胞を排除する薬剤、およびそれらの細胞の再発を回避する薬剤の能力である。
【００４２】
用語「薬剤」は、任意の分子（例えば、化学的、生物学的）または任意の外部／環境要因（例えば、機械的、放射線）を含む。
【００４３】
用語「癌幹細胞サンプル」とは、本発明によるＦＬ１＋とＦＬ１０細胞との混合物を含む（実施例に記載されるように培養される）神経膠腫スフェア培養物から選択されるサンプル、あるいは細胞が本発明による方法によって単離される２つの単離されたＦＬ１＋またはＦＬ１０細胞集団を含むサンプルを意味する。
【００４４】
本明細書に使用する場合、「処置」および「処置する」などは、概して、所望の薬理学的効果および生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患、その疾患の症状または状態を予防または部分的に予防するという観点から予防的であってもよく、および／または疾患、状態、症状またはその疾患による有害な影響の部分的もしくは完全な治療という観点から治療的であってもよい。本明細書に使用する場合、用語「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、（ａ）疾患に罹患しているとまだ診断されていないが、疾患を生じる可能性のある被験体において疾患を生じることを防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること；または疾患を軽減すること、すなわち、疾患および／またはその症状もしくは状態の退行を生じることを含む。
【００４５】
本発明の文脈において使用される用語「阻害剤」は、生体分子の完全または部分的に活性な分子と定義される。
【００４６】
用語「単離された」は、細胞が、他の細胞、タンパク質またはポリペプチド、例えば、精製産物または精製抽出物などと会合しないことを示すように使用される。
【００４７】
本明細書に使用する用語「被験体」は、哺乳動物を意味する。例えば、本発明によって意図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）が挙げられる。
【００４８】
本発明による一実施形態において、細胞組成物を調製するための方法が提供され、以下の工程：
（ａ）腫瘍細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）（ａ）で提供された細胞を培地中で必要に応じて培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された細胞から、蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍの波長におけるレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す細胞をサブサンプルで単離する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の下で蛍光を発せず、ＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出される蛍光でわずかな正シフトを示す細胞を、蛍光活性化細胞分類によって別のサブサンプルで単離する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）の下で得られた単離された細胞サブサンプルの各々から死細胞を排除する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｃ）の下で得られた細胞サブサンプルをプールする工程と、
（ｇ）工程（ｅ）の下での処置後、工程（ｄ）の下で得られた細胞サブサンプルをプールする工程と、
を含む。
【００４９】
さらなる実施形態において、本発明は、工程（ｃ）の下で単離された細胞が、蛍光活性化細胞分類の下で、特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）をさらに示すものである、本発明による方法を提供する。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明は、工程（ｄ）の下で単離された細胞が、蛍光活性化細胞分類の下で、特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）をさらに示すものである、本発明による方法を提供する。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明は、工程（ｃ）の下で検出された自己蛍光発光が、約５２０ｎｍの波長にてＦＬ１チャネルで検出される、本発明による方法を提供する。
【００５２】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ｃ）の下で検出された自己蛍光発光が、５３０ｎｍ＋／−１５ｎｍにおいてダイクロックミラーを用いてＦＬ１チャネルで検出される、本発明による方法を提供する。
【００５３】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ｃ）の下で検出された自己蛍光発光が、５１５ｎｍ＋／−５ｎｍにおいてダイクロックミラーを用いてＦＬ１チャネルで検出される、本発明による方法を提供する。
【００５４】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ｄ）の下で検出された蛍光発光でのわずかな正シフトが、６３０ｎｍより大きい波長で検出される、本発明による方法を提供する。
【００５５】
別のさらなる実施形態において、本発明は、死細胞が、工程（ｃ）および（ｄ）の下で得られたサブサンプルへのトリパンブルーの添加によって工程（ｅ）の下で排除される、本発明による方法を提供する。
【００５６】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ａ）の下で提供された腫瘍細胞サンプルが、細胞が腫瘍サンプルから解離された後に培養されているサンプルである、本発明による方法を提供する。
【００５７】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ａ）の下で提供された腫瘍細胞サンプルが、腫瘍サンプルから新たに解離されたものである、本発明による方法を提供する。
【００５８】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ｂ）の下の培地が、幹細胞培地、富血清培地および分化培地から選択される、本発明による方法を提供する。
【００５９】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ａ）の下で提供された腫瘍細胞サンプルが、細胞が神経膠腫、シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ）、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫から選択される腫瘍サンプルから解離されているサンプルである、本発明による方法を提供する。
【００６０】
別のさらなる実施形態において、本発明は、工程（ａ）の下で提供された腫瘍細胞サンプルが、細胞が脳転移癌、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌から選択される腫瘍サンプルから解離されているサンプルである、本発明による方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、蛍光活性化細胞分類によって、約４８８ｎｍのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す生細胞を含む単離された細胞組成物を提供する。
【００６２】
別のさらなる実施形態において、本発明は、特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）および蛍光活性化細胞分類によって約４８８ｎｍのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光を示す生細胞を含む単離された細胞組成物を提供する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、約４８８ｎｍのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出される自己蛍光発光を示さず、蛍光活性化細胞分類によってＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す生細胞を含む単離された細胞組成物を提供する。
【００６４】
別のさらなる実施形態において、本発明は、特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）を示さず、約４８８ｎｍのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出された自己蛍光発光をしないが、特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）を示し、蛍光活性化細胞分類によってＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルで検出された蛍光でわずかな正シフトを示す生細胞を含む単離された細胞組成物を提供する。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、本発明による方法によって得られた細胞サブサンプルを含む単離された細胞組成物を提供する。
【００６６】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞サブサンプルが工程（ｆ）の下で得られる、本発明による単離された細胞組成物を提供する。
【００６７】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サブサンプルが工程（ｇ）の下で得られる、本発明による単離された細胞組成物を提供する。
【００６８】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞が神経膠腫細胞である、本発明による単離された細胞組成物を提供する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つの細胞組成物を含むキットを提供する。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、抗癌剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供し、以下の工程：
（ｉ）スクリーニングされる薬剤の存在／非存在下で、本発明による単離された細胞組成物（ＦＬ１＋細胞）を混合する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つのＦＬ１＋細胞機能を阻害する薬剤の能力を測定する工程と、
を含む。
【００７１】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明による抗癌剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供し、工程（ｉｉ）が、自己複製、腫瘍原性、および幹細胞遺伝子特性の濃縮、細胞周期および代謝機能を測定することによって、ＦＬ１＋細胞機能を阻害する薬剤の能力を測定する工程を含む。
【００７２】
別の実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、以下の工程：
（ａ）細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）（ａ）で提供された細胞を培地中で必要に応じて培養する工程と、
（ｃ）蛍光活性化細胞分類によって、工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された細胞から、約４８８ｎｍの波長でレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を検出する工程と、
（ｄ）蛍光活性化細胞分類によって、工程（ｃ）の下でＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示さず、工程（ａ）または（ｂ）の下で提供された細胞のレーザービーム励起時にＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルにおいて細胞蛍光発光でわずかな正シフトを示す細胞を検出する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の下で得られる蛍光シグナルと、工程（ｃ）の下で得られる蛍光シグナルの比を測定する工程と、
を含む。
【００７３】
別の実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、工程（ｃ）の下で検出される細胞は、蛍光活性化細胞分類の下で特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）をさらに示すものである。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、工程（ｄ）の下で検出された細胞は、蛍光活性化細胞分類の下で特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）をさらに示す。
【００７５】
別の実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｃ）の後に、サンプル内の工程（ｃ）の下で検出された細胞の割合を計算する工程（ｆ）をさらに含む。
【００７６】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｆ）の後に、基準の割合（例えば、約０．１％〜約６％）と、工程（ｆ）の下で計算された割合とを比較する工程（ｇ）をさらに含む。
【００７７】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｄ）の後に、工程（ｄ）および／または工程（ｃ）の下で検出された細胞を、別のサンプル（ＦＬ１＋およびＦＬ１０）中で単離する工程（ｈ）をさらに含む。
【００７８】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｈ）の後に、工程（ｈ）の下で単離された細胞サンプルから生存細胞集団を選択する工程（ｊ）をさらに含む。
【００７９】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｊ）の後に、工程（ｊ）の下で提供された細胞の少なくとも１つの特性を特徴付ける工程（ｋ）をさらに含み、その特性は、幹特性、腫瘍原性、組込み、自己複製および多分化能から選択される。
【００８０】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｊ）の後に、（免疫化学あるいはＴＵＪ１、ＭＡＰ２またはＧＦＡＰを染色するＦＡＣＳによって）工程（ｊ）の下で提供された細胞サンプル上の少なくとも１つの分化マーカーの発現を測定する工程（ｋ）をさらに含む。
【００８１】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｊ）の後に、（例えば、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＯＴＣＨ１遺伝子を用いるｑＲＴ−ＰＣＴによって）工程（ｊ）の下で提供された細胞サンプル上で少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現を測定する工程（ｋ’）をさらに含む。
【００８２】
別のさらなる実施形態において、本発明は、細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｊ）の後に、（例えば、ヨウ化プロピジウムを用いるＦＡＣＳ細胞周期分析、抗Ｋｉ６７抗体を用いる免疫化学またはＦＡＣＳ染色によって）工程（ｊ）の下で提供された細胞サンプル上の分裂細胞の割合を測定する工程（ｋ’）をさらに含む。
【００８３】
別の実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、以下の工程：
（ａ）癌幹細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）（ａ）の下で提供された癌幹細胞サンプルを薬剤で処置する工程と、
（ｃ）処置された幹細胞サンプルを、インキュベーションの時間、処置せずに幹細胞培地中でインキュベートする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の下でインキュベートされた幹細胞サンプルから生存細胞集団を選択する工程と、
（ｅ）約４８８ｎｍの波長におけるレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を、蛍光活性化細胞分類により検出することによって、工程（ｄ）の下で単離された生存細胞集団上で自己蛍光の平均値を測定する工程と、
（ｆ）蛍光活性化細胞分類によって、特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）の下で単離された生存細胞集団の約４８８ｎｍの波長におけるレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示す細胞を単離する工程と、
（ｇ）蛍光活性化細胞分類によって、特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）の下でＦＬ１チャネルで自己蛍光発光を示さず、工程（ｄ）の下で単離された生存細胞集団のレーザービーム励起時にＦＬ３および／またはＦＬ４チャネルにおいて細胞蛍光発光でわずかな正シフトを示す細胞を単離する工程と、
（ｈ）工程（ａ）の下で提供された癌幹細胞サンプル中の自己蛍光の平均値と、工程（ｅ）の下で測定された自己蛍光の平均値とを比較することにより、自己蛍光生存細胞の割合を計算する工程と、
（ｉ）工程（ａ）の下で提供された癌幹細胞サンプル中に存在する初期細胞の数と、工程（ｄ）の下で単離された得られた生存細胞集団とを比較することによって、死細胞の割合を計算する工程と、
（ｊ）工程（ａ）の下で提供された癌幹細胞サンプル中に存在する初期ＦＬ１＋細胞の数と、工程（ｆ）の下で単離された得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することによって、生存ＦＬ１＋細胞の割合を計算する工程と、
（ｋ）工程（ａ）の下で提供された癌幹細胞サンプル中に存在する初期ＦＬ１０細胞の数と、工程（ｇ）の下で単離された得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することによって、生存ＦＬ１０細胞の割合を計算する工程と、
（ｌ）工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された細胞集団のスフェア原性を検出する工程と、
（ｍ）癌幹細胞の再発を阻害する能力によって、薬剤の活性を測定する工程と、
を含む。
【００８４】
別のさらなる実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｌ）の後に、（例えば、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２またはＧＦＡＰを染色する免疫化学またはＦＡＣＳによって）工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された細胞集団上で少なくとも１つの分化マーカーの発現を測定する工程（ｌ１）をさらに含む。
【００８５】
別のさらなる実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｌ）の後に、（例えば、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＯＴＣＨ１遺伝子を用いるｑＲＴ−ＰＣＴによって）工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された細胞集団上で少なくとも１つの幹細胞マーカーの発現を測定する工程（ｌ２）をさらに含む。
【００８６】
別のさらなる実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｌ）の後に、（例えば、ヨウ化プロピジウムを用いるＦＡＣＳ細胞周期分析、抗Ｋｉ６７抗体を用いる免疫化学またはＦＡＣＳ染色によって）工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された細胞集団上で分裂細胞の割合を測定する工程（ｌ３）をさらに含む。
【００８７】
別のさらなる実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｌ）の後に、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の代謝活性を測定する工程（ｌ４）をさらに含む。
【００８８】
別のさらなる実施形態において、本発明は、癌幹細胞サンプル中の癌幹細胞の再発を検出する方法を提供し、その方法は、工程（ｌ）の後に、（例えば、比色分析によって）ＮＡＤＨおよびＬＤＨ含有物ならびに工程（ｆ）および（ｇ）の下で検出された細胞集団上の活性を測定する工程（ｌ４）をさらに含む。
【００８９】
本発明による特定の態様において、腫瘍細胞サンプルは、哺乳動物の腫瘍細胞サンプルである。
【００９０】
さらなる実施形態において、腫瘍細胞サンプルは、ヒトの腫瘍細胞サンプルである。
【００９１】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明による単離された細胞組成物を含むか、または用いるスクリーニングアッセイに関する。
【００９２】
一般的手順および条件
本発明による方法は無毒性であり、細胞サンプル（例えば、図１に概略的に例示され得る神経膠腫などの腫瘍、末梢神経系由来の腫瘍（シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ））、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫から解離される細胞）から、癌を引き起こす未成熟細胞または幹細胞を同定、精製および濃縮するための直接的方法である。
【００９３】
工程（ａ）の下で本発明による方法に使用するための腫瘍細胞サンプル（例えばヒト起源由来）および本発明による組成物を調製するために、細胞は、以下のような一般的手順に従って調製される。
【００９４】
（Ａ）生検
対応する腫瘍組織の生検は、回収される特定の細胞に適合する標準的な方法を用いて滅菌条件の下で得られる。使用される腫瘍サンプルの例は、図９Ａに記載される。
【００９５】
（Ｂ）細胞解離
次いで、酵素法（例えば、パパイン溶液）などの標準的な方法および／または標準的な方法に記載されるような適切なインキュベーション、洗浄、抗生物質補充および遠心分離工程と組み合わせた機械的に標準的な方法（例えば、ブレードおよび激しいピペット上下）を用いて、細胞を生検（Ａ）から得られた腫瘍組織から解離する。得られた新しく解離された細胞は、次いで、即座に（図１（ａ））、または生体外での培養および以下のような細胞増殖後（図１（ｂ））のいずれかに腫瘍細胞サンプルとして使用される。
【００９６】
生体外での培養および細胞増殖（本発明の工程（ｂ）による方法）
本発明の文脈において腫瘍細胞サンプルとして使用される細胞は、幹細胞培地など、富血清培地など、または分化培地などの異なる培地中で培養されてもよい。培地は、培養される腫瘍細胞の種類に依存して当業者によって適合されてもよい。細胞培養工程は、標準的な方法に記載される適切なインキュベーション、洗浄、抗生物質および増殖因子または有糸分裂薬補充および遠心分離工程の組み合わせを含む。これらの工程は、スフェア（スフェアが神経膠腫由来である場合の神経膠腫スフェア）が現れるまで繰り返される。スフェアの出現は、以下の実施例３および図２に記載されるクローンアッセイ（自己複製アッセイとも呼ばれる）によってアッセイされ得る。一旦、細胞がスフェアを形成し始めると、その細胞は細胞培地から（例えば、機械的に）解離される。
【００９７】
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞分類（本発明の工程（ｃ）および（ｄ）による方法）
細胞サブサンプルへのレーザービーム励起時にＦＬ１チャネルで検出される自己蛍光発光を示す細胞を、選択的に検出および分類することによる蛍光活性化細胞分類によって、分類する。このサブサンプルは、４８８ｎｍの波長（例えば、青色レーザービーム、例えば、アルゴン）の励起時に、約５２０ｎｍにおいて検出されるＦＬ１チャネル（ＦＬ１＋とも呼ばれる）で検出されるこのような自己蛍光発光を示す細胞サブ集団からなる。より具体的には、ＦＬ１自己蛍光は、５３０ｎｍ＋／−１５においてダイクロックミラーを用いて、より厳密には、５１５ｎｍ＋／−５においてダイクロックミラーを用いてＦＬ１チャネルで検出され得、ＦＬ１自己蛍光発光スペクトルの特異性を確認する。特定の形態（高ＦＳＣおよび低／中ＳＳＣ）を有する細胞をさらに選択する。
【００９８】
非自己蛍光細胞（ＦＬ１０とも呼ばれる）を、ＦＬ１チャネルで蛍光を発せず、別の細胞サブサンプル内のＦＬ３またはＦＬ４チャネル（工程（ｅ））で検出される蛍光でわずかな正シフトを示す細胞を選択的に検出および分類することによる蛍光活性化細胞分類によって分類する。特定の形態（低／中ＦＳＣおよび中／高ＳＳＣ）を有する細胞をさらに選択する。
【００９９】
細胞調製物からの死細胞の排除（本発明の工程（ｅ）による方法）
死細胞を、同定し、単離されたＦＬ１＋およびＦＬ１０サブ集団から、例えば、トリパンブルーの添加によって排除することにより、ＦＬ１０サブ集団の検出を増幅させることに役立ち、３つの細胞集団（死細胞、ＦＬ１０およびＦＬ１＋）の間の区別を達成する。単離されたＦＬ１＋細胞は、対称性分裂および非対称性分裂、スフェア原性の可能性、選択的腫瘍原性によって、多分化能および自己複製などのインビトロでの幹細胞特性を示し、以下の実施例に示されるようにインビボでの腫瘍増殖を広めることができる。さらに、優先的に幹細胞関連遺伝子を発現するＦＬ１＋自己蛍光細胞集団は、代謝活性を高める。
【０１００】
区別した得られた細胞集団の使用
本発明による方法によって得られた単離されたサブ集団（ＦＬ１０およびＦＬ１＋）は、異なる目的のために使用され得る。例えば、本発明による単離された細胞組成物は、抗癌剤（例えば、化学物質、薬剤または任意の生物学的化合物など）をスクリーニングするためのスクリーニング方法に使用され得、以下の工程：
（ｉ）スクリーニングされる薬剤の存在／非存在下で本発明による細胞組成物（ＦＬ１＋細胞）を混合する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つのＦＬ１＋細胞特性および機能（例えば、自己複製、生存能力、腫瘍原性）を阻害する薬剤の能力を測定する工程と、を含む。例えば、ＦＬ１＋細胞の割合、ＦＬ１＋細胞の代謝活性、細胞周期および生存能力を測定すること、二次スフェアを形成するためのそれらの能力を試験すること（図２および１３）。
【０１０１】
例えば、本発明による単離された細胞組成物は、腫瘍原性遺伝子を同定するために使用され得、抗腫瘍遺伝子は、（タンパク質およびｍＲＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の異なる発現レベルを）プロファイリングすることにより、または免疫療法戦略のための抗体、ワクチン（パルスした樹状細胞）を発生させるための特定のペプチドを同定するための標的となる。
【０１０２】
例えば、本発明による単離された細胞組成物は、低グレード神経膠腫（グレードＩＩ、ＩＩＩ）由来の細胞培養物を増殖させるための培養条件を改良するための新規の培地補足物を同定および開発するために使用されてもよい。
【０１０３】
例えば、本発明による単離された細胞組成物は、通常の文脈において自己蛍光ＦＬ１＋の生存または存在を同定するために使用され得る。このことは、単離するために上記の技術を使用することを意味し、組織修復、幹細胞再生、追跡、インビボでの幹細胞の生存能力のための薬物を開発するために正常な幹細胞を特徴付ける。
【０１０４】
細胞サンプル（例えば、神経膠腫などの腫瘍から解離される細胞、末梢神経系（シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ））由来の腫瘍、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫）から、癌を引き起こす未成熟細胞または幹細胞を同定、精製および濃縮するための本発明による方法は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて未成熟／幹癌細胞の比を同定および定義するために使用されてもよい。この方法は、高レベルの自己蛍光ＦＬ１＋（１０１より多い平均）または低レベルの自己蛍光ＦＬ１０（１０１より小さい平均）を有する細胞を分析することを可能にする。
【０１０５】
この方法は、例えば、診断するために細胞サンプル中の幹癌細胞または未成熟癌細胞の存在を検出するために使用されてもよい。
【０１０６】
典型的に、本発明の態様において、工程（ａ）の下で提供された細胞サンプルが、例えば、ヒト神経膠腫、シュヴァン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａｓ）、脳転移癌、髄膜腫および上衣腫などの癌を罹患しているか、または癌を罹患する疑いのある患者由来のサンプルである、本発明による方法が提供される。さらに、本発明の別の態様において、工程（ａ）の下で提供される細胞サンプルが、転移癌を罹患しているか、または例えば、黒色腫由来の脳転移癌、乳癌、結腸癌、肺癌などの癌を罹患する疑いのある患者由来のサンプルである、本発明による方法が提供される。
【０１０７】
一態様によれば、本発明の方法は、レーザー励起時にＦＬ１チャネルでのＦＡＣＳによる自己蛍光によって検出された細胞の計算された割合と、基準の割合とを比較する工程をさらに含んでもよい。典型的に、この基準の割合は、健康的な患者由来の細胞サンプルまたは初期（例えば、手術前、処置前、手術後すぐ、処置後すぐなど）に測定された同じ患者の細胞サンプル上での同じ方法によって計算された細胞の割合である。一旦、それらのＦＬ１＋細胞が検出されると、インビボにおける腫瘍の特定の局所的切除または処置が指示されてもよい。
【０１０８】
特定の、かつ信頼できる幹マーカーの非存在下において、および全てのパターンまたは「特徴」による分類の複雑性のために、増加した幹細胞状態を反映するか、またはそれらに適切に関連する形態学的特徴または性質などの間接的な手段を使用することがより適切であり得る。従って、神経膠腫を発生させる細胞検出についての基準を再検討し、所定の分子マーカーに基づかないが、図１３（自己蛍光、特に形態または代謝状態）に示すような一般的な強力かつ容易な検出可能細胞特性に基づいた本発明による選択戦略を用いることは有用である。異なる分子マーカーを用いる容易な非分子の第１の分類工程のさらなる組み合わせは、将来的に神経膠腫幹細胞単離を洗練し得る。
【０１０９】
本発明を例示する実施例は、より詳細な様式で、かつ図に示す実施形態を参照して以下に記載される。本明細書に引用される参考文献は、本明細書にその全体を参照として援用される。本発明は本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されず、本発明の個々の態様の単一の例示のみとして意図され、機能的に均等な方法および組成物は本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の変更は、前述および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内であると意図される。
【実施例】
【０１１０】
以下の略語は、それぞれ以下の定義を意味する：
ｍｇ（ミリグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、ｍＭ（ミリモル）、ｍｉｎ（分）、ｎｇ（ナノグラム）、ｎｍ（ナノメートル）、ｒｐｍ（回転毎分）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＣＭ（馴化培地）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＳＣ（前方散乱）、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＭＨＣＩ（主要組織適合性遺伝子複合体Ｉ）、ＭＲＩ（磁気共鳴映像法）、ＭＴＳ（［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰＥＳ（フェナジンエトサルフェート）、ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）、ＳＣ（幹細胞）、ＳＳＣ（側方散乱）。
【０１１１】
実施例１：新たに解離された癌を引き起こす細胞を分析および精製するための方法（図３）
本発明による方法は、新たに解離された腫瘍細胞サンプルで実施される（工程（ｂ）省略）。
１−新鮮なヒト腫瘍サンプル（異なるグレードのヒト神経膠腫）を手術室から得て、ＰＢＳ１倍を含む受容体に入れる。
２−腫瘍サンプルを、活性化溶液（１．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５．５ｍＭ  Ｌ−システイン／ＨＣｌ  Ｓｉｇｍａ）に溶解したパパイン（３ｍｇ／ｍｌの活性化溶液  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて解離し、機械的に切断する。
３−インキュベーションを４５分続ける。
４−次いで、腫瘍断片を、１／１’０００でペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補足した培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ  Ｇｉｂｃｏ）で洗浄する。
５−細胞解離混合物を、４℃で１５分間、１’２００ｒｐｍで遠心分離する。
６−１：１のオボムコイド阻害剤（０．７ｍｇ／ｍｌ  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）とＤＮａｓｅ  １０ｍｇ／ｍｌの混合物を、プロテアーゼを阻害するために細胞ペレットに加える。その調製物は混合物がチップ内に正確に通過するまで、穏やかにピペット操作する。培地を、最終的に一定の比（（１：１）：８）まで加える。腫瘍断片が完全に消化しない場合、その調製物を７０μＭのセルスクレイパーに通す。
７−次いで、その調製物を４℃で５分間、１’２００ｒｐｍで遠心分離する。上清を捨てる。細胞ペレットを、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補足した１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ  Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、４℃で５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離する。この工程を２回繰り返す。
８−１／２の細胞ペレットを、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、無血清補足物Ｂ２７（１／５０  Ｇｉｂｃｏ）または無血清補足物ＢＩＴ９５００（２０％  Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒト組み換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびベーシックＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ  Ｇｉｂｃｏ）に取る。
９−１／２の細胞ペレットを、細胞分別機ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ  ＳＥで新たに分析するために４ｍｌのＰＢＳ１倍に取る。
１０−その分別機を４８８ｎｍの波長励起に調整し、細胞自己蛍光発光を、５９９ｎｍまで（しかし４５０ｎｍで十分である）の検出器レベルで５１５ｎｍまたは５３０ｎｍのミラーのいずれかを用いてＦＬ１チャネルで測定する。
１１−新しく解離された腫瘍細胞を含むＰＢＳ１倍へのトリパンブルー（１／１’０００  Ｓｉｇｍａ）の添加により、自己蛍光集団内の生存細胞（いわゆるＦＬ１＋）および非自己蛍光ＦＬ１集団（いわゆるＦＬ１０）の同定が可能となる。測定は、４８８ｎｍ励起レーザーを用いてＦＬ３チャネルで行われるが、５４６ｎｍまたは６３２ｎｍの励起レーザーのいずれかを用いてＦＬ４チャネルで行われてもよい。
１２−細胞を分析するためのプロトコルは生存細胞でゲートされ、従って、細胞は低ＦＳＣおよび低ＳＳＣを示し、ＦＳＣ−ＳＣＣ  Ｒ１ゲートから排除される。これは赤い小球も含む。
１３−新たに解離されたＦＬ１＋細胞の割合は、赤い小球を含む全集団内で計算される。
１４−ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞選択は、生存能力のある腫瘍細胞（Ｒ１＊ＦＬ１＋）および（Ｒ１＊ＦＬ１０）で特に行われるため、ゲートは、２つのサブ集団の精製前に特にＦＬ１＋およびＦＬ１０生存細胞に配置される（図３）。
【０１１２】
実施例２：幹細胞条件中で培養される癌を引き起こす細胞を分析および精製するための方法（図４）
本発明による方法は、幹細胞条件（工程（ｂ）の下）で培養される腫瘍細胞サンプルで行われる。
１−細胞を以前に記載されたプロトコルから得て、上記のポイント８（８−１／２の細胞ペレット）由来の培養物を、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（１／５０  Ｇｉｂｃｏ）またはＢＩＴ９５００（２０％  Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒト組み換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびベーシックＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ  Ｇｉｂｃｏ）に取る。
２−培養物を、４８時間、５％  ＣＯ２インキュベーター中に３７℃で入れる。
３−細胞懸濁液を、４℃で５分間、１’２００ｒｐｍで遠心分離する。細胞ペレットをＰＢＳ１倍で洗浄し、再び遠心分離し、その細胞ペレットを、１．１の比の馴化培地と、１／１’０００のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（１／５０  Ｇｉｂｃｏ）またはＢＩＴ９５００（２０％  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒト組み換えＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびベーシックＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した幹細胞培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ  Ｇｉｂｃｏ）中にとる。
４−馴化培地（ＣＭ）を、細胞が残っている場合（週に１度）、細胞の遠心分離後、癌を引き起こす細胞の以前の培養物から得る。このＣＭを−２０℃で保存し、新しい培地への添加前に、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターで濾過する。
５−洗浄、遠心分離、および培地交換の同じ手順を、スフェアが現れるまで、継代に沿って全て繰り返す。
６−一旦、細胞が顕微鏡検査によって観測されるようなスフェア（いわゆる神経膠腫スフェア）を形成し始めると、培地を新しくし、５００００ｃ／ｍｌの希釈物に細胞を通す場合、細胞は最大５倍の機械的再フラッシングによって機械的に解離される。
７−ＦＬ１＋およびＦＬ１０生存細胞の割合を分析するために、細胞を解離し（６を参照）、４℃で５分間、１’２００ｒｐｍで遠心分離し、ＰＢＳ１倍で洗浄し、４ｍｌのＰＢＳ１倍中に取る。
８−分別機を４８８ｎｍの波長励起に調整し、細胞自己蛍光発光を、５９９ｎｍまでの検出器レベルを用いて５１５または５３０ｎｍにおいてＦＬ１チャネルで測定する。
９−細胞を分析するためのプロトコルは生存細胞でゲートされる。解離された腫瘍細胞を含むＰＢＳ１倍へのトリパンブルー（１／１’０００  Ｓｉｇｍａ）の添加により、自己蛍光集団（いわゆる「ＦＬ１＋」）および非自己蛍光ＦＬ１集団（いわゆる「ＦＬ１０」）中の生存細胞の同定が可能となる。測定は４８８ｎｍの励起レーザーを用いてＦＬ３チャネルで行われるが、５４６ｎｍまたは６３２ｎｍの励起レーザーのいずれかを用いてＦＬ４チャネルで行われてもよい。
１０−解離されたＦＬ１＋細胞の割合を、全体の生存集団中で計算する（Ｒ１）。
１１−ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞選択は、生存腫瘍細胞（Ｒ１＊ＦＬ１＋）および（Ｒ１＊ＦＬ１０）で特に行われるため、ゲートは特に、２つのサブ集団の精製前に、ＦＬ１＋およびＦＬ１０生存細胞上に置かれる（図４）。
【０１１３】
実施例３：本発明による方法によって得られた同定かつ精製された癌を引き起こす未成熟細胞および幹細胞のサブ集団の性質のさらなる特徴付け（図６）
本発明による方法によって得られた単離された細胞サブ集団（ＦＬ１０およびＦＬ１＋）を、標準的なプロトコルによってインビトロで特徴付けする。インビトロでの特徴（スフェア原性の可能性および多分化能などの幹細胞特性など）の例を、以下、ならびに図２、５および１２に示す。さらに、これらの細胞サブ集団のインビボでの特性（腫瘍原性の可能性など）を、標準的なプロトコルに従って試験する。インビボでの特性の例を以下、および図６に示す。現在の研究において、別の形態および４８８ｎｍレーザー励起時のＦＬ１チャネルでの特定の自己蛍光発光を示すヒト神経膠腫細胞のサブ集団を単離する。ＦＬ１＋と呼ばれるこの細胞分画を、蛍光顕微鏡法（図１１）または蛍光活性化細胞分類ＦＡＣＳ（図３、４）によって検出する。ＦＬ１＋細胞を、腫瘍グレードおよび種類に関わりなく、神経膠腫組織（０．１５〜２１％、Ｎ＝１１）由来のヒトの新たに解離された細胞中の小さなサブ集団として検出する。幹細胞濃縮条件での培養後、神経膠腫スフェアと呼ばれるコロニーが浮遊している神経膠腫細胞形態は、ＦＬ１＋細胞（４〜６０％、Ｎ＝７）の高い分画を示す。異なる腫瘍グレード由来の培養物を比較する場合、ＦＬ１＋分画は、１０継代にわたって可変的に安定である（図１０、図９Ｂ）。
【０１１４】
しかしながら、新たに単離された神経膠腫細胞が、血清を含む非幹細胞条件にプレートされる場合、ＦＬ１＋分画は検出することができず、その後、ＦＬ１＋集団を回収するかまたはスフェア形成を開始する幹細胞培養条件に移すこともできない（図７Ａ）。対照的に、血清培地中で培養する前に、幹細胞培地中の神経膠腫スフェアとしての神経膠腫細胞のプライミングは、血清培地でさえ二次スフェアを開始し得るＦＬ１＋分画を維持するのに十分であった（データは示さず）。さらに、幹細胞条件で初期培養される神経膠腫スフェアは、分化の誘導時に、それらのＦＬ１＋分画およびそれらのコロニー形成能力を不可逆的に遊離する（図７Ｂ、図１２）。これらの実験は、ＦＬ１＋細胞が、神経膠腫スフェア中の幹細胞特性と関連し得ることを示唆する。
【０１１５】
自己複製は正常な組織および癌における幹細胞の標識であるため、クローンアッセイにおいて新しいスフェアを形成することによるＦＬ１＋および非ＦＬ１細胞（ＦＬ１０）の自己複製する能力は、種々の腫瘍サンプルについて試験されている（図９Ａ）。ＦＡＣＳによる精製後、ＦＬ１＋およびＦＬ０細胞を、幹細胞条件において単一の細胞としてプレートし、二次スフェアのカウンティングは、ＦＬ１＋細胞において著しく高いスフェア原性の可能性を示した（図２Ａ）。長時間の自己複製能力を比較するために、個々のＦＬ１＋およびＦＬ１０クローンのスフェア原性を、連続する継代に沿って測定した。ＦＬ１＋クローンは、５代の継代までにわたって顕著および安定なスフェア原性の可能性を保持するが、ＦＬ１０クローンは継代３と４との間に見られず、クローンはもはや、継代５において新しいスフェア形成を維持できなかった（図２Ｂ）。ＦＬ１＋およびＦＬ１０スフェアの形態は著しく異なり、ＦＬ１＋スフェアは大きく、浮遊し、健全のように見え、部分的に結合され、ＦＬ１０クローンは小さい（図２Ｃ）。これらのクローンアッセイは、自己複製に対する長期間の適性が、ヒト神経膠腫におけるＦＬ１＋区画に選択的に制限されることをもっともらしく説明している。それにもかかわらず、ＦＬ１０細胞もまた、それらが、新たに解離された神経膠腫組織だけでなく、クローン神経膠腫スフェアに見られるため、初期の生存腫瘍細胞であり、それらはＦＬ１＋細胞と共生し、分類され、数回（スフェアとして）継代され得る。分類されないが、クローン神経膠腫スフェアはＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の混合集団を含むため、およびＦＬ１＋細胞は高いスフェア原性の可能性を有するため、ＦＬ１０細胞は、必然的に、非対称性分裂またはＦＬ１＋特性の損失によるＦＬ１＋細胞由来の娘細胞であるはずである。分類されていない神経膠腫スフェアにおけるＦＬ１＋分画ならびにそれら由来の分類されたＦＬ１＋およびＦＬ１０クローンの分析は、４代の継代後に、スフェア由来のＦＬ１＋は、再び、混合ＦＬ１＋およびＦＬ１０集団を含むことを示す。対照的に、培養物由来のＦＬ１０は十分なＦＬ１＋細胞を回収しない。これは、ＦＬ１＋集団由来のＦＬ１０細胞がいくつかの継代について生存しているままであるが、それらはＦＬ１＋からＦＬ１０状態へ移ると、自己蛍光特性を同様に再び獲得できないという証拠を与える（データは示さず）。従って、ＦＬ１０細胞は、それらの自己複製および腫瘍原性特性を損失している関連する前駆細胞または分化細胞という疑いがある。
【０１１６】
いくつかの幹細胞または前駆細胞の特性は、神経膠腫またはそれらの推定癌幹細胞において確認されている（Ｃｌｅｍｅｎｔら，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１７，１６５ページ）。さらに、いくつかの発生経路は、ソニックヘッジホッグ−ｇｌｉ（Ｃｌｅｍｅｎｔら，２００７，上記）、Ｎｏｔｃｈ１（Ｆａｎら，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６，７４４５）などの神経膠腫およびそれらの幹細胞において重要な役割を果たすことが示されている。ＦＬ１＋神経膠腫細胞の選択的幹細胞表現型に内在する分子機構を理解するために、４つの異なる神経膠腫由来のＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞における１１の幹細胞関連遺伝子の選択の発現が試験されている。ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ−４、ＳＯＸ−２、ＮＯＴＣＨ−１、およびＮＥＳＴＩＮは、試験される４つの異なる神経膠腫以外の少なくとも３つのＦＬ１＋細胞において著しく過剰発現（２ｘより大きい）しているが、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＴＥＮ、ＩＮＴβ−１、ＯＬＩＧ−２、ＡＢＣＧ−２、ＢＭＩ−１の発現は、大きく変化していなかった（図５Ａ）。これらの変化は、ＰＣＮＡがＦＬ１＋とＦＬ１０細胞との間の有意な変化を示していないため、細胞増殖の差異と関連していないように見える。幹細胞遺伝子の発現、およびそれらのＦＬ１＋自己蛍光細胞との共領域化を、次いで、免疫組織化学および神経膠腫スフェアにおける共焦点画像を用いて試験した。個々の幹細胞遺伝子の分布はＦＬ１＋細胞と部分的にのみ重なっているが、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ−４、ＳＯＸ−２、ＮＯＴＣＨ−１およびＮＥＳＴＩＮは、ＦＬ１＋細胞との優先的な共領域化および共局在化を示した（図１１）。ＦＬ１＋集団におけるほとんどの濃縮幹細胞遺伝子もまた、ＦＬ１０細胞において検出されるという事実および神経膠腫スフェアにおけるいくつかのＦＬ１＋細胞は、大部分のＦＬ１＋において発現される他の個々の幹細胞タンパク質を発現しないという事実は、推定分子幹細胞マーカーとしてのこれらの幹細胞遺伝子のいずれかの使用と関する。さらに、全てのＦＬ１＋細胞はＫｉ６７＋であるが、全てのＫｉ６７＋がＦＬ１＋でなくてもよいことを示す、Ｋｉ６７を増殖指数のマーカーとして用いた（図１１）。Ｋｉ６７抗原は原型の細胞周期関連核タンパク質であるため、活性細胞周期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期）の全ての段階における増殖細胞によって発現され、これらの結果は、ＦＬ１０細胞が生存し、増殖しないことを示す。しかしながら、細胞周期のより正確な分析により、大部分のＦＬ１＋細胞が、Ｓ−Ｇ２／Ｍ期に存在するが、大部分のＦＬ１０細胞が、Ｇ１代謝期に存在することが示された（図５Ｂ）。いくつかの研究は、自己蛍光と、ＮＡＤ／ＮＡＤＰＨ＋状態などの細胞代謝活性、またはミトコンドリアのフラビン含有量、間充織幹細胞とを関連付けているため（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎら，２００１，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．，７，２６７ページ；Ｒｅｙｅｓら，２００６，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２４，１２１３ページ；Ｋａｎｎら，２００３，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１９，８７ページ）、従って、酸化還元比色分析（ＭＴＳおよび電子捕獲剤（ＰＥＳ）を含むＰｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を用いるＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の代謝活性を、活性およびＮＡＤ／ＮＡＤＰＨ＋酵素比に基づいて試験した。著しく高い代謝活性（濃い灰色）を、４つの試験された神経膠腫の中の４つにおいてＦＬ１０分類細胞と比較してＦＬ１＋分類細胞に見出した（図５Ｃ）。その結果として、明らかな相関を、代謝活性、Ｓ／Ｇ２−Ｍ期の細胞の割合、および自己蛍光のレベルの間で観測するが、自己蛍光が、神経膠腫細胞のサブ集団の幹細胞の可能性にどのように反映するかは不明確なままである。
【０１１７】
ＦＬ１＋神経膠腫細胞のみが、インビトロでの自己複製および多分化能などの幹細胞特性を示す場合、神経膠腫を引き起こす細胞は、ＦＬ１＋集団内にもっともらしく見出されるはずである。この可能性を試験するために、ヌードマウス（Ｎ＝４７）に、種々の神経膠腫スフェア培養物から分類された１０３、１０４および１０５のＦＬ１＋またはＦＬ１０細胞の負荷を頭蓋内に注入した（図６）。注入後４週で、１０５ＦＬ１＋細胞を注入したマウスの１００％は、著しい体重の減少ならびにＭＲＩおよび組織切片での頭蓋内腫瘍と関連した神経学的症状を引き起こし、その組織切片の全ては、神経膠腫スフェア由来の１０５の分類されていない細胞を注入したマウスにおいて観測されたものより著しく大きくなった（図６）。症状がない生存期間は長くなったが、１０４ＦＬ１＋注入マウスの全ても、注入後６週までに症状を引き起こした。対照的に、腫瘍は、３ヶ月以上の観測後、１０５の細胞の頭蓋内負荷でさえもＦＬ１０注入マウスのいずれにおいても見られなかった。注目すべきことに、共焦点顕微鏡で観測した場合、正常な非腫瘍性隣接マウス組織とは対照的に、全ての腫瘍は明るい自己蛍光を示した。免疫組織化学的分析により、ＦＬ１＋誘導腫瘍が、ＧＦＡＰ、ＮＥＳＴＩＮ、およびいくつかのＴＵＪ１を発現し、Ｋｉ６７染色によって視覚化される高い増殖指数を有することが示された。ヒト由来の腫瘍細胞を、特異的ＭＨＣＩ染色によって確認し（図６Ａ）、ＭＨＣＩ＋、ＦＬ１−Ｈ細胞の二重選択を可能にした。幹細胞条件におけるインビボでの解離細胞のプレーティングにより、ＦＬ１０を注入した脳由来の培養物と対照的に、ＦＬ１＋を注入した脳由来の多数かつ大きなスフェアの形成が示され、ＦＬ１０がインビボにおいてＦＬ１＋細胞に戻ることができないことが確認され、示され、ＦＬ１＋がインビボにおいて継代され得ることが確認される（図６Ｃ）。従って、これらのデータは、排他的なＦＬ１＋細胞のインビボにおける腫瘍原性の可能性を明確に示す。
【０１１８】
固有の幹細胞マーカーであるＣＤ１３３の発現を試験し、ＣＤ１３３発現細胞が、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞区画の両方内に分布されていることが示された。ＣＤ１３３マーカーはＦＬ１＋／０分画における自己複製細胞を濃縮するのに有用であり得、その大きな利点は、２／２の新鮮な神経膠腫および２／５のＧＩＣ培養物（効率：５７％）において見出された。従って、ＣＤ１３３細胞は腫瘍を引き起こす細胞供給源のサブ集団のみを示し、幹細胞マーカーとしてのＣＤ１３３の固有かつ排他的使用は、不適切であり、本質的ではないことを確認する。対照的に、本発明によるＦＬ１表現型の基準は、８／８の新鮮な神経膠腫および７／７のＧＩＣ培養物（効率：１００％）における自己複製細胞を単離するための非常に信頼できる方法であることがわかる。
【０１１９】
要約すれば、ＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の特性は、図１３の下にまとめられ、分子調査および特徴付けにより、ＦＬ１＋細胞は以下のように表される：
−腫瘍原性である
−ＦＬ１０細胞を生成でき、ＧＩＣ培養物を長時間、維持するのに関与する
−多分化能である
−ＲＮＡレベルにおいて幹細胞関連遺伝子のために濃縮されるが、幹細胞関連タンパク質の分布は、ＦＬ１＋およびＦＬ１０娘細胞内に均等に分布される
−４０％より多くの活発に分裂する細胞（Ｇ２／Ｍ期において）を含む
−大量の代謝活性（ＮＡＤＨ、ＬＤＨ含有量、典型的には、ＦＬ１０と比べてＦＬ１＋について少なくとも２倍のＮＡＤＨレベルおよびＦＬ１０と比べてＦＬ１＋について少なくとも３倍のＬＤＨレベル）を有する。
【０１２０】
総合すれば、これらのインビトロおよびインビボでの発見は、自己複製し、腫瘍を引き起こす神経膠腫細胞は、それらを同定および単離するために効果的に利用され得る固有の自己蛍光表現型を有するということを示唆する。さらに、これらのデータは、この表現型が、より高い代謝状態を反映し、神経膠腫を引き起こす細胞における幹細胞遺伝子およびタンパク質特性の選択発現と関連することを示唆する。
【０１２１】
特定の自己蛍光に基づく本発明による方法により、単一の分子マーカーの使用と比べてそれらの特徴付けをかなり容易にできる神経膠腫を引き起こす細胞の迅速、正確かつ強力な選択が可能となる。
【０１２２】
幹細胞または初期の前駆細胞集団は、分子マーカーの１つというよりむしろ組み合わせによって規定されているのみであることが示唆されている。従って、単一のマーカーは、神経膠腫中の幹細胞区画を具体的に限定できない可能性がある。興味深いことに、癌幹細胞の機能的マーカーとして潜在的に使用され得る幹細胞遺伝子のどれも、ＦＬ１＋集団を排他的に限定できず、従って、単一の幹細胞マーカーとして使用されない（図６）。
【０１２３】
従って、オン／オフ状態よりむしろ起こりそうな可能性として、所定のサブ集団または単一の細胞における幹細胞の可能性を考慮することがより適切であり得る。
【０１２４】
実施例４：本発明の方法によって得られる癌細胞の細胞サブ集団でのインビトロでの再発スクリーニングアッセイ（図１３および図１４）
本発明による方法は、図１４に記載されるような癌幹細胞のインビトロでの再発を検出するために実施される。
【０１２５】
（工程（ａ））で提供される本発明の方法によって調製される癌幹細胞（ＦＬ１＋、分類されていないＦＬ１＋およびＦＬ１０、ＦＬ１０細胞）は、減少した増殖因子（ＥＧＦおよびｂＦＧＦ）濃度（例えば、１ｎｇ／ｍｌ）の存在下（工程（ｂ））において２．５日ごと（１０細胞／μｌ）に抗癌治療に供される。この抗癌治療は、例えば、放射線治療（例えば、ガンマ線）および化学療法（例えば、抗癌剤候補物添加）などの商業的に使用される抗癌治療から選択される。処置された細胞は、インキュベーション時間の間、処置せずに、幹細胞培地中でインキュベートされる（工程（ｃ））。処置が停止すると、回収が開始し、一旦、細胞は幹細胞培地に戻される。インキュベーション時間（例えば、最後の処置の５日後、１０日後および２０日後）の間、以下のパラメータを測定する：
−実施例１〜３に記載されるように測定された細胞死の割合（工程（ｈ））；
−実施例１〜３に記載されるように測定された自己蛍光の平均レベル（工程（ｉ））；
−実施例１〜３に記載される蛍光および形態学的基準で選択された生存ＦＬ１０およびＦＬ１＋細胞の割合（工程（ｆ）、（ｇ）、（ｊ）および（ｋ））；
−実施例１〜３に記載されるように測定されるＦＬ１０およびＦＬ１＋細胞のスフェア原性の検出（工程ｌ）；
−実施例１〜３に記載されるように測定される分化マーカー（例えば、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ）の発現（工程ｌ１）；
−実施例１〜３に記載されるように測定される幹細胞遺伝子（例えば、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＯＴＣＨ１）の発現（工程ｌ２）；
−実施例３に記載されるように測定される分裂ＦＬ１０およびＦＬ１＋細胞（例えば、抗Ｋｉ６７抗体で染色する、ヨウ化プロピジウムを用いる細胞周期分析）の割合（工程ｌ３）；
−ＮＡＤＨおよびＬＤＨ含有量ならびに実施例１〜３に記載されるように測定される活性の測定によるＦＬ１＋およびＦＬ１０細胞の代謝活性の測定（工程ｌ４）。
【０１２６】
再発レベルは測定パラメータに基づいて評価する。従って、癌幹細胞サンプルからＦＬ１＋細胞を除去する際の抗癌治療の能力は、測定された再発レベルと反比例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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