(57)【要約】本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、または未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持する方法を提供する。この方法は、細胞におけるＥｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることを含む。
2011522520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持する方法であって、前記細胞におけるエストロゲン関連受容体（Ｅｒｒ）タンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｅｒｒタンパク質が、Ｅｓｒｒｂタンパク質、Ｅｓｒｒｄタンパク質およびＥｓｒｒｇタンパク質のうちの一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のうちの一つの量または活性を増大させることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも部分的に分化した細胞が、最終分化した体細胞、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、系統限定（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）幹細胞、体性幹細胞および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）のうちの一つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記未分化細胞が、幹細胞、生殖細胞、卵母細胞、割球、および内細胞塊細胞のうちの一つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞における前記Ｅｒｒタンパク質の量を増加させることが、前記Ｅｒｒタンパク質の発現を増大させることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅｒｒタンパク質の前記発現を、核酸分子によって増大させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が異種核酸分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸分子がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸分子が、Ｅｒｒタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞における前記Ｅｒｒタンパク質の活性を増大させることが、前記Ｅｒｒタンパク質の核酸標的配列との相互作用を調節することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸標的配列がエストロゲン応答エレメントまたは回帰性甲状腺ホルモン応答エレメントを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞における前記Ｅｒｒタンパク質の活性を増大させることが、（ｉ）前記Ｅｒｒタンパク質とタンパク質、（ｉｉ）前記Ｅｒｒタンパク質と化合物、および（ｉｉｉ）前記Ｅｒｒタンパク質とタンパク質と化合物のうちの一つとの間で複合体を形成することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、ペプチド、ペプトイド、無機分子および低分子量有機分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｅｒｒタンパク質がＥｓｒｒｂタンパク質であり、前記低分子量有機分子が、４−ヒドロキシ安息香酸アリールヒドラジド、フラボンフィトエストロゲンおよびイソフラボンフィトエストロゲンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、ＧＲＩＰ１、ＳＲＣ−１ａ、ＡＣＴＲおよびＰＰＡＲガンマコアクチベータのうちの一つである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＰＡＲガンマコアクチベータが、ＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１βのうちの一つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞における前記Ｅｒｒタンパク質の活性を増大させることが、前記Ｅｒｒタンパク質の翻訳後修飾の変更を起こさせることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、ＳＵＭＯ化およびこれらの組み合わせのうちの一つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）前記Ｅｒｒタンパク質、又はその機能的フラグメントの前記細胞における前記量または活性、および
（ｉｉ）前記細胞中の分化状態のマーカーの存在
のうちの一つを評価することをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞の前記分化状態の前記マーカーが、
（ｉ）Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｔｃ１１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍ１７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄ１、Ｎｍｙｃ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ、Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆ１、Ｔｃｆａｐ２ｃおよびＺｆｐ５５３のうちの一つの発現、または
（ｉｉ）Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｔｃ１１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍ１７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄ１、Ｎｍｙｃ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ，Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆ１、Ｔｃｆａｐ２ｃおよびＺｆｐ５５３のうちの一つのプロモータのメチル化状態
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｅｒｒタンパク質の前記量及び活性の少なくともいずれか一方を評価することが、前記量および活性の少なくともいずれか一方をある期間にわたって評価することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｅｒｒタンパク質の前記細胞における量の評価を、前記細胞における前記Ｅｒｒタンパク質の遺伝子発現を測定することによって行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
Ｅｒｒ遺伝子発現の測定結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対照測定が、Ｅｒｒ遺伝子発現を少なくとも本質的に調節しない条件の使用を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞における分化状態のマーカーの存在の評価が、前記マーカーの発現および活性の少なくともいずれか一方をある期間にわたって測定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、宿主生命体から得られるか、または宿主生命体中に含まれる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主生命体が、微生物、魚、両生類、鳥および哺乳動物のうちの一つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞からなる群から選択される哺乳動物体細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が培養される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｅｒｒタンパク質の発現および活性の少なくともいずれか一方を調節する化合物を投与することを含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法によって得られる脱分化した細胞。
【請求項３３】
請求項３２に記載の脱分化した細胞の集団。
【請求項３４】
少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持することができる候補化合物を同定する方法であって、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に前記化合物を導入する工程と、前記Ｅｒｒタンパク質の発現を測定する工程とを含み、前記Ｅｒｒタンパク質の増大した発現が、前記化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持できることを示す方法。
【請求項３５】
前記Ｅｒｒタンパク質が、Ｅｓｒｒｂタンパク質又はＥｓｒｒｇタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持できる化合物を同定するインビトロ法であって、前記化合物、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくともいずれか一方を接触させる工程を含み、前記Ｅｒｒタンパク質とＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくともいずれか一方との間の複合体形成の促進が、前記化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくとも一つを維持できることを示す方法。
【請求項３７】
（ａ）Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくともいずれか一方の複合体形成を調節可能であると予測される化合物を試験管に添加する工程と、
（ｂ）前記Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントを前記試験管に添加する工程と、
（ｃ）ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくともいずれか一方を前記試験管に添加する工程と、
（ｄ）前記複合体形成を検出する工程と
を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出する工程を、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学的方法によって行う、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｅｒｒタンパク質が、Ｅｓｒｒｂタンパク質、Ｅｓｒｒｄタンパク質およびＥｓｒｒｇタンパク質のうちの一つである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持する薬剤の製造における、Ｅｒｒタンパク質の細胞での絶対量を増大させる核酸分子および化合物の少なくともいずれか一方の使用。
【請求項４１】
前記Ｅｒｒタンパク質が、Ｅｓｒｒｂタンパク質、Ｅｓｒｒｄタンパク質およびＥｓｒｒｇタンパク質のうちの一つである、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許商標庁に２００８年５月６日付で出願され、シリアル番号第６１／０５０，７２６号が与えられた「細胞の分化状態を調節する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｏｆ  Ａ  Ｃｅｌｌ）」の出願を引用し、これの優先権の利益を主張するものである。ＰＣＴ規則４．１８条に従い、本明細書に含まれていないＰＣＴ規則２０．５（ａ）条に規定する明細書、請求の範囲または図面のいずれの要素または部分を組み入れることを含め、２００８年５月６日付で出願された前記出願の内容は、引用によりあらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細胞の脱分化を行って、あまり分化していない細胞にする方法、たとえば多能性細胞にする方法に関する。したがって、この方法はとりわけ分化した体細胞から誘導多能性幹細胞を形成することを可能にする。この方法は、未分化細胞の多分化能を維持することも可能にする。
【背景技術】
【０００３】
転写因子は、遺伝子発現プログラムの特定において主な影響を及ぼし、独自の細胞学的性質を付与することができる。多分化能の重要な調節因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇは転写因子である。これらの三つのタンパク質のうち、Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇとは多能性細胞に対して特異的な役割を有する。多分化能とは、細胞が生命体の所望の組織の細胞を生じさせる能力である。さらなる転写因子、たとえばＳｔａｔ３、Ｐ５３などは、多分化能を制御する調節ネットワークに関与すると考えられる。
【０００４】
細胞の集団、たとえばヒトもしくは動物の身体の細胞は、分化のプロセスによって生じる。以前は、幹細胞は分化するにつれて、細胞の運命を決定する能力を失い、それらの潜在力がより制限されるようになると推測されていた。しかし、分化した体細胞の発生上制限された状態は、いくつかの再プログラミング法によって多能性状態に逆転することもできる（入門書として、非特許文献１、図１も参照）。これらの方法には、除核未受精卵母細胞を用いた体細胞核移植、分化した細胞の多能性細胞との融合および多能性細胞由来の抽出物を用いた分化した細胞の処理が含まれる（非特許文献２）。体細胞核移植は、一方で、レシピエントとして受精した胚にも適用されている（特許文献１）。
【０００５】
体細胞の多能性細胞への再プログラミングは、所定の転写因子のレトロウイルスが関与する形質導入によっても達成できる。ネズミおよびヒト線維芽細胞の、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞として知られる多能性細胞への変換は、四つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を用いて行うことができる（たとえば、非特許文献３および４を参照）。得られたｉＰＳ細胞は、発生上および後成的に胚幹（ＥＳ）細胞（同文献）と区別ができず、野生型胚幹細胞と非常によく似た発現プロフィールを有する（非特許文献５）。これらの転写因子を過剰発現することによって、ヒトＥＳ細胞から分化した線維芽細胞、一次胎児組織、新生児皮膚線維芽細胞、成人線維芽細胞および成人間充織幹細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングすることができる（非特許文献６）。線維芽細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングを成功させるためには、これら四つの転写因子の少なくとも１４日間の異種発現が必要とされる（非特許文献７）。
【０００６】
成熟な完全に分化したＢリンパ球、膵臓β細胞、肝細胞、ケラチノサイトおよび胃上皮細胞も、誘導性レンチウイルスベクターまたはｐＭＸｓベースのレトロウイルスを用いて異種Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を発現することによって、ｉＰＳ細胞に再プログラミングすることができる（非特許文献８〜１１、概説については例えば非特許文献１２、または１３、１４を参照）。ヒトＥＳ細胞由来の間葉細胞および骨髄細胞、ならびに一次線維芽細胞および新生児包皮線維芽細胞も、レンチウイルスベクターを用いて異種Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を発現することによって、ｉＰＳ細胞に再プログラミングすることができる（非特許文献１５）。本発明の優先日後に、成人神経幹細胞でも異種Ｏｃｔ４とＫｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃのいずれかを用いて誘導多能性幹細胞に再プログラミングされた（非特許文献１６）。
【０００７】
胚幹細胞が容易に分化できることは、さらに実施上の大きな課題となる。胚幹細胞を多能性状態に維持するために、取り扱いおよび培地中での培養の間のこれらの分化は防止しなければならない。この理由で、伝統的にはこれらを支持細胞の層上にてウシ胎仔血清の存在下で（例えば、特許文献２および３を参照）または線維芽細胞条件培地（ＣＭ）中で培養する。それでも、慎重に制御された条件下でさえ、胚幹細胞はインビトロ増殖の間に自発的分化をする可能性がある。マウス胚幹細胞において自己再生を仲介する因子である白血病抑制因子は、マウス胚幹細胞の分化を阻害することも判明しているが、ヒト胚幹細胞の分化の防止における支持細胞の役割の代替にはならない。したがって、胚幹細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持する手段は、幹細胞治療の商業的可能性の実現に実質的な成果をあげるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／１０３４６２号
【特許文献２】米国特許第５８４３７８０号明細書
【特許文献３】米国特許第６０９０６２２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，＆Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ（２００８）１３２，５６７−５８２
【非特許文献２】Ｌｅｗｉｔｚｋｙ，Ｍ．＆Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）１８，４６７−４７３
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ（２００６）１２６，６６３−６７６
【非特許文献４】Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ（２００８）１０５，８，２８８３−２８８８
【非特許文献５】Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５４，４９−５５，Ｎａｔｕｒｅの誤植（２００８）４５４，７９４−７９４
【非特許文献６】Ｐａｒｋ，Ｉ−Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１，１４１−１４７
【非特許文献７】Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００８）２，１５１−１５９
【非特許文献８】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ（２００７）１３１，８６１−８７２
【非特許文献９】Ｈａｎｎａ，Ｊ．、ら、Ｃｅｌｌ（２００８）１３３，２５０−２６４
【非特許文献１０】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）１８，１２，８９０−８９４
【非特許文献１１】Ｍａｈｅｒａｌｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００８）３，３４０−３４５
【非特許文献１２】Ｗｅｌｓｔｅａｄ，Ｇ．Ｇ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００８）１８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｄｅ．２００８．０１．０１３
【非特許文献１３】Ｄｕｒｃｏｖａ−Ｈｉｌｌｓ，Ｇ．ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００８）７６，３２３−３２５
【非特許文献１４】Ａｏｉ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）３２１，６９９−７０２
【非特許文献１５】Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８，１９１−９２０
【非特許文献１６】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５４，６４６−６５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一つの目的は、体細胞を再プログラミングし、未分化細胞の多分化能を維持する代替法を提供することにある。
この目的は、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることによって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様において、本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、あるいは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持する方法を提供する。この方法は、細胞におけるＥｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることを含む。
【００１２】
第二の態様において、本発明は、第一の態様の方法によって得られる脱分化した細胞に関する。
第三の態様において、本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができる候補化合物を同定する方法あるいは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持する方法を提供する。この方法は、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に化合物を導入することを含む。この方法は、Ｅｒｒタンパク質の発現を測定することをさらに含む。Ｅｒｒタンパク質の増大した発現は、化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化の実施あるいは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性の維持が可能であることの現れである。
【００１３】
第四の態様において、本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことあるいは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性の維持が可能である化合物を同定するインビトロ法を提供する。この方法は、化合物、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくとも一つを接触させることを含む。Ｅｒｒタンパク質ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくとも一つとの間での複合体形成の促進は、化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化の実施あるいは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性の維持が可能であることを示す。
【００１４】
第五の態様において、本発明は、細胞中のＥｒｒタンパク質の絶対量を増大させる核酸分子および／または化合物の、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことまたは未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性の維持のための薬剤の製造における使用に関する。
【００１５】
本発明は、以下の非限定例および添付の図面と併せて考慮する場合に、詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞分化および細胞の再プログラミング、すなわち脱分化を誘導するプロセスの概略を示す図である。幹細胞は多能性であり、中胚葉、外胚葉および内胚葉系に分化する能力を保有する。細胞運命の決定を、多能性状態を包含するあまり分化していない状態に戻す再プログラミングは、本発明の方法によって誘導することができる。本発明の方法を用いて、多能性細胞をその状態で停止させることもできる（左）。
【図２】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃを用いたＭＥＦを再プログラミングするＥｓｒｒｂを示す図である。Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ感染ＭＥＦから回収されたｉＰＳ細胞は、フィーダ上でＥＳ様コロニー形態を維持した（図２ａ）。６代継代培養したｉＰＳ−ＯＳＣＥクローン番号１３を示す。単離されたｉＰＳクローンは、ＥＳマーカー、例えばアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（図２ｂ）、Ｎａｎｏｇ（図２ｃ）およびＳＳＥＡ−１（図２ｅ）を安定して発現する。対応する試料におけるＤＡＰＩを用いた対比染色を、図２ｄおよびｆに示す。Ｐｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰ  ＭＥＦにおいて、ＧＦＰ発現によって示される内因性Ｏｃｔ４の回復は、特異的にｉＰＳコロニーにおいてＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導されるが、周囲の線維芽細胞では誘導されなかった（図２ｇおよび図２ｈ）。１４ｄｐｉ試料からの初代継代後３日目で形成されたコロニーを示す。ｉＰＳ：誘導多能性幹細胞、ｄｐｉ：感染後の日数、線分：２００μｍ（図２ａ、図２ｂ、図２ｇ、図２ｈ）、１００μｍ（図２ｃ〜図２ｆ）。
【図２ｉ】再プログラミングの仲介におけるＥｓｒｒｂの効率を、Ｐｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰ  ＭＥＦを用いたＫｌｆ４と比較する。１４ｄｐｉでのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃと関連してＥｓｒｒｂまたはＫｌｆ４によって誘導されたＧＦＰ陽性コロニーの数を示す。
【図３ａ】Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の全体的な遺伝子発現分析を示す図である。相関分析（４６６４３転写産物）を実施して、Ｒ１  ＥＳ細胞、再プログラミングされた細胞（ＯＳＣＥ番号１３細胞系、ＯＳＣＥ番号８細胞系およびＯＳＣＫ細胞系）、アクチン−ＧＦＰ  ＭＥＦおよびＰｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰ  ＭＥＦに遺伝子発現を分類した。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４によってＯＳＣＫ再プログラミング細胞系を得た。
【図３ｂ】Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の全体的な遺伝子発現分析を示す図である。図３ｂにおけるヒートマップは、Ｒ１  ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞（ＯＳＣＥ番号１３再プログラミング細胞、ＯＳＣＥ番号８再プログラミング細胞およびＯＳＣＫ再プログラミング細胞）、アクチン−ＧＦＰ  ＭＥＦおよびＰｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰ  ＭＥＦにおける５００ＥＳ細胞関連遺伝子およびＭＥＦ関連遺伝子の発現プロフィールを示す。ＥＳ細胞関連遺伝子およびＭＥＦ関連遺伝子を、Ｒ１  ＥＳ細胞とアクチン−ＧＦＰ  ＭＥＦ細胞との間の発現レベルのフォールド差（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）に基づいて選択した。遺伝子を、平均発現比によって分類し、平均中心を求めた。
【図４ａ】Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の後成的状態の分析を示す図である。再プログラミングされた細胞のプロモータメチル化分析を示す。ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４プロモータのメチル化状態を、重亜硫酸塩シークエンシングを用いて分析した。白丸は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、黒丸はメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示す。ＥＳ細胞（Ｖ６．４）、ＭＥＦ（ＣＤ１）、Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞（ＯＳＣＥ番号８およびＯＳＣＥ番号１３クローン）から配列決定された１０の代表的なクローンを示す。
【図４】Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の後成的状態の分析を示す図である。トリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４およびＨ３Ｋ２７に対する抗体とＥＳ細胞（Ｖ６．４）、ＭＥＦｓ（ＣＤ１）、およびＥｓｒｒｂ再プログラミング細胞（ＯＳＣＥ番号８およびＯＳＣＥ番号１３クローン）から得られる抽出物を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）後のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＥＳ細胞におけるいくつかのすでに報告されている「二価」遺伝子座についてのｌｏｇ２濃縮を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表し、３回の独立した実験から得る（ｎ＝３）。
【図５Ａ】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと組み合わせたＥｓｒｒｇ再プログラミングＭＥＦを示す図である。ＥｓｒｒａおよびＥｓｒｒｇの再プログラミング可能性を示す。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃとの組み合わせで、Ｅｓｒｒｇは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ  ＭＥＦ中、１６ｄｐｉで多くのＧＦＰ陽性コロニーを誘導した。対照的に、Ｅｓｒｒａは同じ条件下でごくわずかしかＧＦＰ陽性コロニーを誘導しなかった。
【図５Ｂ】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと組み合わせたＥｓｒｒｇ再プログラミングＭＥＦを示す図である。感染したＭＥＦにおけるウイルスでコードされたＥｓｒｒａ、ＥｓｒｒｂおよびＥｓｒｒｇの転写産物発現の検証を示す。ウイルス特異的プライマおよび遺伝子特異的プライマを用いてｃＤＮＡ上でＰＣＲを実施した。
【図５】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと組み合わせたＥｓｒｒｇ再プログラミングＭＥＦを示す図である。図５ｃは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ  ＭＥＦからＥｓｒｒｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞を示す。明視野像を示す。図５ｃに対応する蛍光画像を図５ｄに示す。ＧＦＰ陽性シグナルは、内因性Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の発現が再プログラミングされた細胞において特異的に回復されたが、周囲の線維芽細胞では回復されなかったことを示す。図５ｅは、Ｅｓｒｒｇ再プログラミング細胞におけるアルカリ性ホスファターゼ発現を示す。図５ｆは、Ｅｓｒｒｇ再プログラミング細胞におけるＮａｎｏｇ発現を示す。図５ｆにおいて核をマーキングするために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔで染色した（図５ｇ）。図５ｈは、Ｅｓｒｒｇ再プログラミング細胞におけるＥＳ細胞特異的表面抗原ＳＳＥＡ−１の発現を示す。図５ｈにおいて核をマーキングするために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔで染色した（図５ｉ）。線分は、図５ｃ〜図５ｅでは１００μｍを表し、図５ｆ〜図５ｉでは５０μｍを表す。
【図５Ｊ】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと組み合わせたＥｓｒｒｇ再プログラミングＭＥＦを示す図である。Ｅｓｒｒｇ再プログラミング細胞は、ＥＢが関与する分化において三つの主要胚系統に分化し得る。分化した細胞は、ネスチン（神経外胚葉）、α−平滑筋アクチン（中胚葉）またはＧａｔａ−４（内胚葉）を発現した。全ての系統マーカーを赤色に染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。選択された細胞は、アクチン−ＧＦＰ  ＭＥＦから生成し、ＧＦＰ発現は緑色シグナルによって示された。線分は１００μｍを表す。
【図５Ｋ】Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと組み合わせたＥｓｒｒｇ再プログラミングＭＥＦを示す図である。Ｅｓｒｒｇ再プログラミング細胞によるテラトーマ形成を示す。分割された試料のＭａｌｌｏｒｙのテトラクローム染色は、再プログラミングされた細胞の、三つ全ての一次胚葉由来の様々な組織への分化を示した。示された組織は、神経外胚葉（外胚葉）、血液（中胚葉）および肝細胞、細胞（内胚葉）に対応する。線分は５０μｍを表す。
【図６】Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞が多能性であることを示す図である。Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞は、マウス胚中に組み込まれ、三つの主要な胚葉由来の広範囲の組織に貢献する（図６ａ）。二つの異なる再プログラミング細胞系を、８細胞期のマウス胚中に顕微注入して、キメラを生成させ、これをＥ９．５で集め、ＥＧＦＰ発現について立体顕微鏡下で直接観察することによって、多能性について分析した。図６ａ〜図６ｃは、３胚についての明視野像を示し、図６ｄ〜図６ｆは、キメラ胚におけるＥＧＦＰ陽性細胞の広範囲の組み込みを示す。図６ｇ〜図６ｈは、キメラ胚の傍矢状断面におけるＥＧＦＰ陽性細胞の分布を示す。ＥＧＦＰ陽性細胞は、全組織および器官中で広範囲に分布し、発生中の胚の三つの主要な胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の組織において表される。略語：Ｆ：前脳、Ｆｇ：前腸憩室、Ｈ：心臓、Ｈｂ：後脳、Ｍ：中脳、Ｎｅ：神経上皮、Ｏ：耳胞、Ｓ：中胚葉節。
【図７ａ】Ｅｓｒｒｂが、自己複製、多分化能、再プログラミングおよび後成的修飾に関与する因子をコードする遺伝子を調節することを示す図である。経時変化マイクロアレイ分析を実施して、Ｅｓｒｒｂノックダウン後、様々な日数での遺伝子発現変化を測定した。形態およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）染色を、対照およびＥｓｒｒｂ欠失細胞の両方について各時点で示す。コロニー形態およびアルカリ性ホスファターゼ発現は２日目で維持されることに留意すべきであり、このことは、ＥＳ細胞が未分化のままであることを示す。選択されたＥＳ細胞関連遺伝子および再プログラミング遺伝子の様々な日での発現変化を表すマイクロアレイヒートマップを示し、これは、これらの遺伝子に対するＥｓｒｒｂの調節を示唆する。赤色は、対照試料と比べて増加した発現を示し、一方、緑色は減少した発現を意味する。遺伝子発現レベルの平均中心を求めて、これらの相対的変化を示す。
【図７ｂ】Ｅｓｒｒｂが、自己複製、多分化能、再プログラミングおよび後成的修飾に関与する因子をコードする遺伝子を調節することを示す図である。ＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂの役割に関するモデルを表す。Ｅｓｒｒｂは、フィードバックループによってその発現を自己調節する。Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は、多分化能および自己再生の維持に関与する遺伝子を調節する。これらの三つの転写因子はまた、再プログラミングに関与する遺伝子を正に調節する。
【図８】Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を含むが、ｃ−Ｍｙｃを含まない、Ｅｓｒｒｂ再プログラミングＭＥＦを表す図である。Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２感染ＭＥＦから回収されたｉＰＳクローンは、フィーダ上でＥＳ様形態を維持し（図８ａ）、ＡＰ（図８ｂ）、Ｎａｎｏｇ（図８ｃ）およびＳＳＥＡ−１（図８ｅ）を安定して発現する。図８ｄおよび図８ｆは、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いた対比染色を示す。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ  ＭＥＦにおいて、Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は特異的にｉＰＳコロニーにおけるＧＦＰ発現の引き金となるが、周囲の線維芽細胞では発現させず、このことは、内因性Ｏｃｔ４の回復を示す（図８ｇおよび図８ｈ）。ｉＰＳ：誘導多能性幹細胞、ｄｐｉ：感染後の日数、線分：２００μｍ（図８ａ、図８ｂ、図８ｇ、図８ｈ）、１００μｍ（図８ｃ〜図８ｆ）。
【図８ｉ】Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を含むが、ｃ−Ｍｙｃを含まない、Ｅｓｒｒｂ再プログラミングＭＥＦを表す図である。再プログラミングの仲介におけるＥｓｒｒｂの有効性を、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ  ＭＥＦを用いてＫｌｆ４と比較する。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２と関連してＥｓｒｒｂまたはＫｌｆ４により２３ｄｐｉで誘導されるＧＦＰ陽性コロニーの数を示す。
【図９ａ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。ｉＰＳ細胞系ＯＳＣＥ番号８についての正常な核型を示す。
【図９ｂ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。ｉＰＳ細胞系ＯＳＣＥ番号１３についての正常な核型を示す。
【図９ｃ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。Ｅｓｒｒｂをコードするレトロウイルスのゲノム中への組み込みを、キメラ胚のｉＰＳ細胞および卵黄嚢から単離されるＤＮＡを用いたＰＣＲを使用して検出した。
【図９ｄ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。Ｏｃｔ４をコードするレトロウイルスのゲノム中への組み込みを、キメラ胚のｉＰＳ細胞および卵黄嚢から単離されるＤＮＡを用いたＰＣＲを使用して検出した。
【図９ｅ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。Ｓｏｘ２をコードするレトロウイルスのゲノム中への組み込みを、キメラ胚のｉＰＳ細胞および卵黄嚢から単離されるＤＮＡを用いたＰＣＲを使用して検出した。
【図９ｆ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。ｃ−Ｍｙｃをコードするレトロウイルスのゲノム中への組み込みを、キメラ胚のｉＰＳ細胞および卵黄嚢から単離されるＤＮＡを用いたＰＣＲを使用して検出した。
【図９ｇ】Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃによって誘導された再プログラミング細胞系の検証を示す図である。
【図１０ａ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｅｓｒｒｂ遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｂ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｋｌｆ４遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｃ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｋｌｆ５遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｄ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｎａｎｏｇ遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｅ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。ＳａＭ遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｆ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｓｏｘ２遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｇ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｔｂｘ３遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【図１０ｈ】ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いたＥＳ細胞におけるＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２結合プロフィールを表す図である。Ｔｃｌ１遺伝子座でのＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびモックＣｈＩＰ対照の結合を示すＴ２Ｇブラウザのスクリーンショットを示す。クラスター密度（緑色）は結合のプロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法は、体細胞、前駆細胞または幹細胞などの細胞におけるエストロゲン関連受容体（Ｅｒｒ）タンパク質の量を調節すること、たとえばその発現を調節することに基づく。好適なＥｒｒタンパク質の実例としては、限定されるものではないが、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｄおよびＥｓｒｒｇが挙げられる。Ｅｒｒタンパク質は、リガンド調節転写因子として作用する核受容体のファミリーであり、リガンドの非存在下で転写を活性化する。これらはＤＮＡ結合ドメインにおいてエストロゲン受容体と高い配列類似性を有し、エストロゲン受容体と同じ標的反応エレメントおよび共調節（ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）タンパク質を共有する。しかし、Ｅｒｒタンパク質は古典的なＥＲリガンドである１７β−エストラジオールに反応しない。合成エストロゲン化合物、たとえばジエチルスチルベストロールおよび４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）はＥｒｒ−コアクチベータ相互作用を妨害することによって、Ｅｒｒファミリーメンバーの逆作動薬として作用する。低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）による低酸素遺伝子の転写活性化は、Ｅｒｒタンパク質によって向上されることが判明し、ＨＩＦおよびＥｒｒタンパク質は複合体を形成することが示されている（Ａｏ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００８）１０５，２２，７８１２−７８２６）。
【００１８】
エストロゲン関連受容体アルファ（Ｅｓｒｒａ）タンパク質（ＥＳＲＬ１、Ｅｒｒ１、Ｎｒ３ｂ１、ＥｓｔｒｒａおよびＥＲＲαとも称する）は、ミトコンドリア発生の重要な調節因子とされている。これはまた、筋肉における酸化的代謝の重要な調節因子とされ、代謝性疾患の治療において活性化の潜在的な標的と呼ばれている（Ｈｙａｔｔ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００７）５０，２６，６７２２−６７２４）。
【００１９】
エストロゲン関連受容体β（Ｅｓｒｒｂ）タンパク質は、Ｅｓｔｒｒｂ、ＥＲＲＢ、ＥＲＲβ、ＥＲＲ２、ＥＲＲβ２、ＥＳＲＬ２およびＮＲ３Ｂ２とも称し、適切な聴力に必須であることが示唆されている（Ｃｏｌｌｉｎ，Ｒ．Ｗ．Ｊ．ら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００８）８２，１２５−１３８）。Ｅｓｒｒｂはさらに、胚幹細胞のマーカーとしても示唆されている（Ｚｈｏｕ，Ｑ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００７）１０４，４２，１６４３８−１６４４３）。スクリーニングによって、特にＥｓｓｒｂは胚幹細胞における重要な遺伝子調節物質として特定され、さらに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇとともに作用するコアクチベータであり、これらの直接的標的であることが示唆されている（Ｚｈｏｕ，Ｑ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００７）１０４，４２，１６４３８−１６４４３）。質量分光分析および親和性精製によって、ＥｓｒｒｂとＮａｎｏｇとの間の複合体形成が特定された（Ｌｉａｎｇ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）１０，７３１−７３９、Ｗａｎｇ，Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４４，３６４−３６８）。しかし、ヒト臍帯静脈間充織幹細胞において、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇの両方が発現されることが判明したが、Ｅｓｓｒｂは発現されなかった（Ｋｅｒｍａｎｉ，Ａ．Ｊ．ら、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ（２００８）１１，２，３７９−３８５）。この知見は、万能幹細胞マーカーとしてのＥｓｓｒｂの有用性と、Ｅｓｓｒｂの遺伝子調節物質としての一般的重要性との両方について疑念を抱かせる。未分化胚幹細胞中に異種細胞集団が存在するという仮説に基づいて、Ｃａｒｔｅｒら（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ（２００８）８，１８１−１９８）は、胚幹細胞の培養物において転写因子の発現パターンを調べた。彼らは、ｅｓｒｒｂが不均一に発現されることを見いだし（「モザイク・イン・コロニー」）、これによっても、幹細胞の遺伝子調節におけるｅｓｒｒｂの役割について疑問が投げかけられた。
【００２０】
そのＮ末端ドメインの長さが異なる、エストロゲン関連受容体γ（Ｅｓｒｒｇ）タンパク質の異なるイソ型（ＥＲＲ３、Ｅｒｒγ、ＮＲ３Ｂ３、ＦＬＪ１６０２３、ＫＩＡＡ０８３２およびＤＫＦＺｐ７８１Ｌ１６１７とも称する）は、たとえばマウスおよびヒトにおいても見いだされ、この場合、これらはイソ型１および２と呼ばれる。Ｅｓｒｒｇは、発癌性およびホルモン活性物質ビスフェノールＡならびに４−α−クミルフェノールの特異受容体であることが判明している（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００８）３７３，４０８−４１３）。ビスフェノールＡと同様に、４−クロロ−３−メチルフェノールは、逆作動薬４−ヒドロキシタモキシフェンと競合して、Ｅｓｒｒｇのリガンド結合ドメインと結合し、安定化させることが示されている（Ａｂａｄ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）１０８，４４−５４）。したがって、ビスフェノールＡは、４−ヒドロキシタモキシフェンによる不活性化を、用量依存的に逆転させて当初の高い基礎活性化状態にするので、Ｅｓｒｒｇの逆拮抗物質と見なすことができる（Ｌｉｕ，Ｘ．ら、ＦＥＢＳ（２００７）２７４，６３４０−６３５１）。
【００２１】
Ｅｓｒｒａは卵巣癌細胞系および癌において高度に発現されることが判明しているが、Ｅｓｒｒｂは、分析した一つの細胞系および一つの癌でしか検出できなかった（Ｓｕｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００５）８３，４５７−４６７）。したがって、Ｅｓｒｒｂが癌の発生に関与するかどうかは現在のところ明らかではない。Ｅｓｒｒｇはすでに遺伝的プロファイリングに考慮されているが、乳癌に関連して特に関連性を有するものであることは見いだされていない（Ｏｒｓｅｔｔｉ，Ｂ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６）９５，１４３９−１４４７）。
【００２２】
本発明は、Ｅｒｒファミリーのオーファン核受容体がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃとともに作用して、マウス胚線維芽細胞などの体細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングに関与するという予想外の発見に基づく。Ｅｒｒ再プログラミング細胞は胚幹細胞の類似した発現および後成的特性を共有する。１４個のさらなる因子（転写因子およびクロマチン修飾因子）との、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）においてこれらの因子をＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃと同時発現することによる比較例によって、Ｅｒｒタンパク質ＥｓｒｒｂのみがＥＳ細胞様細胞の形成を誘発できることが示された（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｒｒファミリーの代表的メンバーとして選択された。表１を参照）。本発明者らによってなされたこの発見によって、Ｅｓｒｒｂは、自己再生、多分化能および遺伝子発現の後成的調節に関与する多くの遺伝子を標的とし得るという以前の示唆が現実味を帯びるようになる。このことはさらに、Ｅｒｒタンパク質が、胚幹（ＥＳ）細胞特異的遺伝子の上方調節によって再プログラミングに関与し得ることを示唆する。本発明者らの発見はまた、Ｋｌｆ転写因子と独立した方法でマウス線維芽細胞などの体細胞を再プログラミングすることが可能であることを示し、これらの核受容体を体細胞再プログラミングと関連付ける。
【００２３】
本発明者らの発見は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの標的に関するノックダウン研究における従来のデータについてさらに説明する。Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．ら（Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４２，５３３−５３８）は、Ｅｓｒｒｂを、ｓｈＲＮＡによってその欠乏がマウスＥＳ細胞のインビトロでの自己再生に影響を及ぼす、１０の遺伝子産物のうちの一つとして同定した。さらに、Ｅｓｒｒｂは、その欠乏が、分化細胞に特有の形態変化およびアルカリホスファターゼ活性の喪失をもたらす１９遺伝子産物のうちの一つであることを確認した（同文献およびＬｏｈ，Ｙ．−Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００６）３８，４，４３１−４４０）。国際公開第２００８／０２１４８３号はまた、マウス胚幹細胞は、Ｅｓｒｒｂ  ｓｉＲＮＡでの処理の６日後に、「幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」を失い、分化した細胞のコロニーを形成することが見いだされたことを開示している。
【００２４】
本発明は、細胞の分化を防止、阻害、阻止及び／又は逆転する方法および使用を提供する。任意の細胞を本発明の方法で使用することができる。細胞は、たとえば体細胞または生殖系列細胞で有り得る。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞および体細胞のハイブリッド細胞である。細胞は、任意の起源および任意の分化状態であってよい。細胞は、たとえば完全に分化していてもよいし、任意の程度まで分化していてもよいし、または未分化であってもよい。細胞が未分化である実施形態において、本発明の方法は典型的には、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）ならびに全能性（生命体のあらゆる細胞型を形成することができる）（適用可能な場合）および／またはその自己複製特性をはじめとする多分化能を維持する方法である（図１左側）。通常、このような細胞は、未分化細胞、たとえば胚幹細胞、トロホブラスト幹細胞および任意の胚外幹細胞、たとえば成人幹細胞などの幹細胞である。未分化細胞のさらなる例としては、生殖細胞、卵母細胞、割球、および内細胞塊細胞が挙げられる。
【００２５】
部分的に分化した細胞の一例は、前駆細胞である（図１、中央）。単能性または多能性で有り得る前駆細胞は、特定の種類の細胞に分化する能力および限定された自己再生能力を有し、これを維持することはできない。部分的に分化した細胞のさらなる例としては、限定されるものではないが、前駆細胞、すなわち特定の種類の新規血液細胞の形成がゆだねられる段階まで発達した幹細胞、系統限定（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）幹細胞、および体性幹細胞が挙げられる。好適な体細胞の例としては、限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血細胞、筋細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞が挙げられる。体細胞は、たとえば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、心臓、眼または神経組織などの任意の組織の細胞であってよい。
【００２６】
細胞は、任意の宿主生命体から得られるか、または誘導され得る。細胞は、各宿主生命体から、生検または血液試料などの試料の形態で直接採取することができる。宿主生命体から誘導し、続いて培養するか、成長させるか、形質転換させるかまたは選択された処理に付すこともできる。いくつかの実施形態において、細胞は、宿主生命体中に含まれていてもよい。たとえば、宿主生命体の血液中または器官中に存在していてもよい。細胞を誘導するかまたは得ることができる宿主生命体は、任意の生命体、たとえば微生物、動物、たとえば魚、両生類、は虫類、鳥、齧歯類種を包含する哺乳動物、無脊椎動物種、例えばカエル、ヒキガエル、サンショウウオもしくはイモリを包含する平滑両生亜綱のもの、または植物であってよい。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタ、ゾウ、ニワトリ、マーカーク、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。
【００２７】
本発明の方法が、前駆細胞、すなわち成熟体細胞を生じさせる細胞について用いられることが意図される場合、任意の前駆細胞を本発明の方法で使用することができる。好適な前駆細胞の例としては、限定されるものではないが、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法で用いられる細胞は、典型的には、Ｅｒｒタンパク質をコードする核酸配列を、一般的に（内因性または異種に関わらず）Ｅｒｒタンパク質の機能的遺伝子の形態で含む点で、少なくとも一つのＥｒｒタンパク質を発現できる。いくつかの実施形態において、細胞はすべてのＥｒｒタンパク質を発現できる。いくつかの実施形態において、細胞は、一つ以上のＥｒｒタンパク質、たとえばＥｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｄおよび／またはＥｓｒｒｇを発現する。いくつかの実施形態において、細胞は全てのＥｒｒタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、Ｅｒｒタンパク質をコードする一つ以上のそれぞれの（たとえば内因性）遺伝子は、機能的に活性であり、（一つまたは複数の）Ｅｒｒタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、一つ以上のＥｒｒタンパク質をコードする一つ以上の内因性核酸配列は機能的に不活性である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいては、Ｅｒｒタンパク質は異種Ｅｒｒ遺伝子からでも発現される。Ｅｒｒタンパク質をコードする異種遺伝子は、組換え技術によって、たとえば核酸分子を、典型的にはＥｒｒタンパク質遺伝子を保有するベクターとして使用することによって導入することができる（下記も参照）。この点で、各宿主細胞（内因性または異種起源のいずれかに関わらない）における転写を開始するのに有効なプロモータを含むベクターをさらに使用することが有利であり得る。この点で、本発明はまた、このような核酸分子、たとえば各ベクターを、細胞中のＥｒｒタンパク質の絶対量を増大させるために使用することにも関する。本発明はまた、このような核酸分子、たとえば各ベクターを、細胞の分化状態を調節するため、特に、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うため、または未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持するための医薬などの薬剤の製造において使用することにも関する。
【００２９】
「ベクター」という用語は、細胞中にトランスフェクトでき、細胞ゲノム内で、またはそれとは独立して複製可能な一本鎖もしくは二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子を切断して、制限酵素での処理によって直線化することができる。核酸ベクター、制限酵素、および制限酵素によって切断されたヌクレオチド配列の情報の組み合わせは、当業者には容易に入手可能である。ベクターを制限酵素で切断し、二つの断片をライゲートすることによって、Ｅｒｒタンパク質をコードする核酸分子をベクター中に挿入することができる。
【００３０】
「プロモータ」という用語は、本明細書で用いられる場合、遺伝子配列発現に必要な核酸配列を意味する。プロモータ領域は生命体ごとに異なるが、様々な生命体については当業者には周知である。たとえば、原核生物においてプロモータ領域は、プロモータ（ＲＮＡ転写を開始させる）ならびにＤＮＡ配列（ＲＮＡ中に転写される場合、合成開始のシグナルを送る）の両方を含む。このような領域は、通常、転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディング配列、たとえばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００３１】
「核酸」という用語は、本明細書で用いられる場合、一本鎖、二本鎖またはこれらの組み合わせなどの任意の可能な構造の任意の核酸分子を意味する。核酸は、たとえば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体を用いるかまたは核酸化学を用いて生成されるＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体、ロックト核酸分子（ＬＮＡ）、ペプチド核酸分子（ＰＮＡ）およびｔｅｃｔｏ−ＲＮＡ分子を包含する（たとえば、Ｌｉｕ，Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６，４０７６−４０７７）。ＰＮＡ分子は、骨格が糖ではなく擬ペプチドである核酸分子である。したがって、ＰＮＡは一般的に、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡとは対照的に、電荷中性骨格を有する。それでも、ＰＮＡは、少なくとも相補的な核酸ストランドおよび実質的に相補的な核酸ストランドを、たとえば（ＰＮＡが構造を模倣すると考えられる）ＤＮＡまたはＲＮＡのようにハイブリダイズできる。ＬＮＡ分子は、Ｃ４’とＯ２’との間にメチレンブリッジを有する修飾ＲＮＡ骨格を有し、このブリッジは、Ｎ型構造におけるフラノース環をロックし、個々の分子により高い二本鎖安定性およびヌクレアーゼ耐性を提供する。ＰＮＡ分子と異なり、ＬＮＡ分子は荷電した骨格を有する。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノムまたは合成起源のものであってよく、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。このような核酸は、たとえばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのコポリマー、オリゴヌクレオチド等であり得る。各核酸は、非天然ヌクレオチド類似体をさらに含有し得、および／または親和性タグもしくは標識と結合することができる。
【００３２】
多くのヌクレオチド類似体は公知であり、本発明の方法において用いることができる。ヌクレオチド類似体は、たとえば塩基、糖、またはリン酸塩部分で修飾を含むヌクレオチドである。実例として、ｓｉＲＮＡの２’−ＯＨ残基の２’Ｆ、２’Ｏ−Ｍｅまたは２’Ｈ残基での置換は、各ＲＮＡのインビボ安定性を改善することが知られている。塩基部分での修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、異なるプリンもしくはピリミジン塩基、たとえばウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イル、ならびに非プリンもしくは非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然および合成修飾を包含する。他のヌクレオチド類似体はユニバーサル塩基としての働きをする。ユニバーサル塩基としては、３−ニトロ−ピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基修飾は、多くの場合、たとえば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖修飾と組み合わせて、たとえば二本鎖安定性の増大など、独自の特性を得ることができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法または使用は、細胞におけるＥｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントの活性を増大させることを含む。各Ｅｒｒタンパク質は、たとえば、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｄまたはＥｓｒｒｇであり得る。いくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増大させることは、Ｅｒｒタンパク質の核酸標的配列との相互作用を増大させるかまたは減少させるなどの調節をすることを含む。ＥｓｒｒａおよびＥｓｒｒｂは、エストロゲン応答エレメント、および構成的に活性な形態で、すなわちリガンドの非存在下での回帰性甲状腺ホルモン応答エレメントによって、転写を活性することが判明している（Ｘｉｅ，Ｗ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１３，２１５１−２１６２）。Ｅｓｒｒｇ１は、ｓｆｔ４、ＳＦ−１ＲＥ、およびＴＲＥｐａｌなどの応答エレメント（Ｓａｎｙａｌ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００４）１８，２，３１２−３２５）ならびにＤＡＸ−１（染色体Ｘ、遺伝子１上の用量感受性性転換副腎形成不全臨界領域）のプロモータにおけるＥＲＲ調節エレメント（ＮＲ０Ｂ１）（Ｐａｒｋ，Ｙ．−Ｙ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）３３，２１，６７５６−６７６８）、オーファン核受容体を活性化することが示されている。ＤＡＸ−１の核免疫反応性が乳癌組織で検出され、Ｅｓｒｒｇの過剰発現が９例のうち３例で観察された（同文献）。Ｅｓｒｒｇ２は、たとえば、ヒトβＰＤＧＦプロモータのＤＲ−０エレメントおよびラクトフェリンプロモータの拡張されたハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）と結合することが判明した（Ｈｅｎｔｓｃｈｋｅ，Ｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００２）２６９，１６，４０８９−４０９７）。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増大させることは、Ｅｒｒタンパク質とさらなるタンパク質との間に複合体を形成するか、またはかかる複合体の形成を向上させることを含む。典型的には、Ｅｒｒタンパク質が一緒になって複合体を形成するタンパク質もまた核タンパク質である。この点で、他の核受容体、ＧＲＩＰ１、および（わずかであるが）ＳＲＣ−１ａおよびＡＣＴＲは、ＥｓｒｒａおよびＥｓｒｒｂの転写コアクチベータとしての働きをすることがさらに判明した（同文献）。ＰＰＡＲγコアクチベータ（ＰＧＣ１ａ）はさらにＥｓｒｒｂおよびＥｓｒｒｇの活性化因子として機能することが示されている（たとえば、Ｚｕｅｒｃｈｅｒ、ＷＪ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）４８，３１０７−３１０９、およびここで記載される文献を参照）。ＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１β（Ｈｅｎｔｓｃｈｋｅら、２００２、上記）に加えて、Ｅｓｒｒｇの好適なアクチベータのさらなる実例は、Ｐｌ６０コアクチベータ、たとえば転写中間因子２／グルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１、ステロイド受容体コアクチベータ１（乳癌１で増幅）、およびＲＡＰ２５０／活性化シグナルコインテグレータ２（ＡＳＣ２）である（たとえば、Ｓａｎｙａｌら、２００４、上記を参照）。この点で、Ｅｓｒｒｇ活性はさらに、これが結合する応答エレメントに依存することが示されている（同文献）。Ｅｓｒｒｇ２の一つ以上のアクチベータはさらに血清および網状赤血球溶解物中に含まれる（Ｈｅｎｔｓｃｈｋｅら、２００２、上記）。
【００３５】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増大させることは、Ｅｒｒタンパク質と化合物との間の複合体を形成することを含む。Ｅｒｒタンパク質を活性化する化合物の好適な例としては、限定されるものではないが、ペプチド、ペプトイド、無機分子および低分子量有機分子が挙げられる。
【００３６】
Ｅｓｒｒｂの作動性リガンドとして好適な各低分子量有機分子は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸アリールヒドラジド、フラボンフィトエストロゲンまたはイソフラボンフィトエストロゲンであってよい。対応する４−ヒドロキシ安息香酸アリールヒドラジドのアリール部分は、典型的には６員環、すなわちベンゼン誘導体である。４−ヒドロキシ安息香酸アリールヒドラジドの一例は、４−ヒドロキシ安息香酸２−［［４−（ジエチルアミノ）フェニル］メチレン］ヒドラジド（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｎｏ９５１６７−４１−２）（ＤＹ１３１もしくはＧＳＫ９０８９としても知られる）である（Ｙｕ，Ｄ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）１５，１３１１−１３１３、Ｚｕｅｒｃｈｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）４８，３１０７−３１０９、米国特許出願第２００６／０１８９８２５号明細書）。さらなる実例は、４−ヒドロキシ安息香酸［［４−（１−メチルエチル）フェニル］メチレン］ヒドラジド（ＣＡＳ−番号１０１５７４−６５−６）（ＧＳＫ４７１６としても知られる）であり、これも同様にＥｓｒｒｂを活性化することが判明している。好適なフラボンおよびイソフラボンフィトエストロゲンの例としては、限定されるものではないが、ゲニステイン（５，７，４’−トリヒドロキシイソフラボン）、ダイゼイン（７，４’−ジヒドロキシイソフラボン）、ビオカニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）が挙げられ、これらも（程度は低いが６，３’，４’−トリヒドロキシフラボン（フラボン）も同様に）Ｅｓｒｒｂを活性化することが報告されている（Ｓｕｅｔｓｕｇｉ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）１，９８１−９９１）。
【００３７】
ＥｓｒｒａおよびＥｓｒｒｇについて、今までのところ、それ自体アクチベータとして、特に作動薬として作用する化合物は特定されていない。しかし、逆作動薬（全体的な阻害効果を有するこのような化合物は、たとえばＥｓｒｒａとＥｓｒｒｇとの両方について知られている）の置換を、各Ｅｒｒタンパク質の活性化と見なすことができる。実例として、ビスフェノールＡならびに４−α−クミルフェノールは、Ｅｓｒｒｇを不活性化する４−ヒドロキシタモキシフェンを置換することによって、Ｅｓｒｒｇを活性化する（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら、２００８、上記）。ビスフェノールＡは、Ｅｓｒｒｇ活性を増大させることができるので、Ｅｓｒｒｇの逆拮抗物質であることがさらに示される（上記、Ｌｉｕら２００７、上記）。さらに、最近の結晶データ（たとえば、Ｋａｌｌｅｎ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２，２３，２３２３１−２３２３９）を考慮して、アクチベータを将来同定できることが期待できる。かかる化合物を次いで本発明の方法において用いることができる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増加させることは、Ｅｒｒタンパク質、さらなるタンパク質および化合物間で複合体を形成することを含む。さらなるタンパク質および化合物は前記定義の通りであってよい。実例として、ＰＰＡＲγコアクチベータ（ＰＧＣ１ａ）の存在下で、化合物４−ヒドロキシ安息香酸ベンジリデンヒドラジド（ＤＹ１５９）、４−ヒドロキシ安息香酸（３−メチル−ベンジリデン）ヒドラジド（ＤＹ１６２）、４−ヒドロキシ安息香酸（４−メチル−ベンジリデン）ヒドラジド（ＤＹ１６３）および４−ヒドロキシ安息香酸（５−エチル−チオフェン−２−イルメチレン）ヒドラジド（ＤＹ１６４）はＥｓｒｒｂを活性化することが見いだされた（ＵＳ第２００６／０１８９８２５号）。この点で、本発明は、前記のような化合物、たとえば上記の例のうちの一つを、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増加させるために使用することにも関する。本発明は、概して、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性および／または絶対量を増大させるための化合物の使用にも関する。本発明は、細胞の分化状態を増大させるための薬剤、たとえば医薬の製造における、かかる化合物の使用にも関する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、Ｅｒｒタンパク質の活性および／または細胞量は、リン酸化などの翻訳後修飾の変更によって変更される（Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ａ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００８）２２，３，５７０−５８４）。いくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性および／または量は、ＳＵＭＯ化、つまり小ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質の結合によって調節される（同文献）。ＥｓｒｒａおよびＥｓｒｒｇは、ＳＵＭＯ化され、これによってその転写活性が負に調節されることが示されている（同文献）。このように、本発明の方法のいくつかの実施形態において、細胞におけるＥｒｒタンパク質の活性を増大させることは、リン酸化および／またはＳＵＭＯ化の変更などの翻訳後修飾の変更を起こさせることを含む。典型的な実施形態において、ＳＵＭＯ化は、対応するリン酸化されたＥｒｒタンパク質でのみ起こる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、細胞は一つ以上の興味のあるＥｒｒタンパク質を発現しないか、または任意のＥｒｒタンパク質を発現しない。このような実施形態において、本発明の方法は、一つ以上のＥｒｒタンパク質をコードする一つ以上の内因性遺伝子を活性化することを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞におけるＥｒｒタンパク質の発現を可能にできる、Ｅｒｒタンパク質をコードする核酸分子、典型的には異種核酸分子（前出）を細胞中に導入することを含む。かかる実施形態における方法は、異種Ｅｒｒタンパク質を発現することをさらに含む。
【００４１】
本発明の方法は、各遺伝子の発現を測定することをさらに含んでもよい。これは例えば、各プロモータの制御下にある遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の数を測定することによって行うことができる。当該技術分野で通常用いられる方法は、その後、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡにコピーし、ｃＤＮＡ分子を蛍光色素とカップリングさせることである。分析は、典型的にはＤＮＡマイクロアレイの形態で実施される。多くのサービスおよびキットはそれぞれ、例えばＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから商業的に入手可能である。Ｅｒｒタンパク質の遺伝子発現を測定する他の手段としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドアレイ、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、遺伝子発現データを較正するか、または評価することが有利であるかまたは望ましい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、得られた結果を一つ以上の対照測定結果と比較することをさらに含む。このような対照測定は、主な測定自体と異なる条件を含んでもよい。各遺伝子の発現が起こらないような方法の条件を含んでもよい。対照測定のさらなる手段は、例えばＥｒｒタンパク質をコードしない遺伝子、または非機能性Ｅｒｒタンパク質をコードする遺伝子のなどの各遺伝子の突然変異形態の使用である。
【００４３】
その量または活性が増大したＥｒｒタンパク質は、各Ｅｒｒタンパク質の任意の変異体、イソ型、対立遺伝子などであり得る。Ｅｓｒｒｂの実例は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＡＡＨ４４８５８（マウス）、ＡＡＩ１１２７８（ウシ）、ＡＡＩ３１５１８（ヒト）、Ｏ９５７１８（ヒト）、ＮＰ＿００１００８５１６（ラット）、ＸＰ＿００１１６２６９８（チンパンジー）、ＸＰ＿００１１００６０８（アカゲザル）、ＸＰ＿００１５１９４３５（カモノハシ）、ＸＰ＿００１４９１６２３（ウマ）、ＸＰ＿００１２３５１４７（ニワトリ）、ＸＰ＿００１３３３９８０（ゼブラフィッシュ）、ＡＢＦ６５９９２（ロシアハタネズミ）、ＸＰ＿００１９２８０８６（ブタ）、ならびにｈＥＲＲｂ２−Δ１０および短形ｈＥＲＲβ［どちらもＺｈｏｕら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．＆Ｍｅｔａｂ．（２００６）９１、２、５６９−５７９）によって記載されている］のタンパク質である。Ｅｓｒｒｇの実例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ６２５０８のヒトタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ５ＲＡＭ２のオランウータンタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ６２５０９のマウスタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ６２５１０のラットタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ａ４ＩＩＴ９のアフリカツメガエルタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ｑ６Ｑ６Ｆ４のゼブラフィッシュタンパク質およびＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＸＰ＿００１４８９６４０、ＸＰ＿００１４８９７２５、ＸＰ＿００１４８９７０２およびＸＰ＿００１４８９６１１のウマタンパク質である。
【００４４】
Ｅｓｒｒａの実例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１１４７４のヒトタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ６ＱＭＹ５のイヌタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｏ０８５８０のマウスタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｑ５ＱＪＶ７のラットタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ａ０ＪＭ８６のアフリカツメガエルタンパク質およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ｏ４２５３７のゼブラフィッシュタンパク質である。
【００４５】
本発明の方法および使用は、一つ以上のＥｒｒタンパク質、または（一つまたは複数の）Ｅｒｒタンパク質の（一つまたは複数の）対応する機能的フラグメントの細胞における量もしくは活性を評価することをさらに含み得る。興味のあるＥｒｒタンパク質の量もしくは活性を評価することができる。
【００４６】
細胞におけるＥｒｒタンパク質の量を、たとえば標識と結合し得る免疫グロブリンなどの抗体によって評価することができる。細胞が単離された細胞もしくは微生物である場合、細胞内免疫グロブリンを、たとえば細胞膜の透過化後に細胞中に導入することができる。次いで検出をインビボまたはエキソビボで行うことができる。いくつかの実施形態において、検出はインビトロで、たとえば細胞抽出物または細胞溶解物に関して実施することができる。このような技術としては、電気泳動、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリ、蛍光相関分光法またはこれらの技術の変形態様もしくは組み合わせが挙げられる。
【００４７】
「抗体」という用語は、一般的に、免疫グロブリン、そのフラグメントまたは免疫グロブリン様機能を有するタンパク様結合分子を意味する。（組換え）免疫グロブリンフラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体（Ｉｌｉａｄｅｓ，Ｐ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９７）４０９，４３７−４４１）、デカボディ（ｄｅｃａｂｏｄｙ）（Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）３１８，８８−９４）および他のドメイン抗体（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），２１，１１，４８４−４９０）である。免疫グロブリン様機能を有するタンパク様結合分子の一例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づく突然変異タンパク質である（国際公開第２００３／０２９４６２号、国際公開第２００５／０１９２５４号、国際公開第２００５／０１９２５５号、国際公開第２００５／０１９２５６号、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９９）９６，１８９８−１９０３）。リポカリン、たとえばビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ、ヒト涙液リポカリン、またはグリコデリンは、ハプテンとして知られる選択された小タンパク質領域と結合するように修飾することができる天然のリガンド結合部位を有する。さらなるタンパク様結合分子の他の非限定的な例は、いわゆるグルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）（国際公開第９６／２３８７９号を参照）、アンキリン・スカフォールドに基づくタンパク質（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３，６，１４３５−１４４８）または結晶性スカフォールド（国際公開第２００１／０４１４４号）、Ｓｋｅｒｒａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３，１６７−１８７）によって記載されるタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン、アビマーおよびペプトイドである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において複数のドメインのストリングとして存在する、いわゆるＡドメインを含む（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，１５５６−１５６１）。ヒトフィブロネクチンのドメイン由来のアドネクチンは、標的との免疫グロブリン様結合が得られるように操作できる三つのループを含む（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７，６５３−６５８）。各ヒトホモトリマータンパク質由来のテトラネクチンは、所望の結合を得るために操作できるループ領域をＣ型レクチンドメインにおいて同様に含む（同文献）。タンパク質リガンドとして作用できるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素と結合している点でペプチドと異なるオリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは、典型的にはプロテアーゼおよび他の修飾酵素に対して耐性であり、ペプチドよりもはるかに高い細胞透過性を有する（たとえば、Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．、およびＫｏｄａｄｅｋ，Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１５０８−１５０９を参照）。所望により、標的物の任意の形態、種類などに対する各部分の親和性をさらに増大させる修飾剤を用いることができる。
【００４８】
Ｅｒｒタンパク質の活性の評価は、タンパク質の核酸標的配列に対する結合の測定を含み得る。このような測定は、たとえば、分光、光化学的、測光、蛍光測定、放射線、酵素的または熱力学的手段（インビボとインビトロとの両方）に依存し得る。分光検出法の一例は、蛍光相関分光法である（たとえば、Ｈａｕｓｔｅｉｎ，Ｅ．，＆Ｓｃｈｗｉｌｌｅ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（２００７）１５１−１６９を参照）。光化学的方法は、光化学的架橋である。光活性、蛍光、放射性または酵素標識の使用は、それぞれ測光法、蛍光測定法、放射線法および酵素検出法の例である。実例として、量子ドットもフルオロフォアとして、たとえばインビボ測定で使用できる（たとえばＬｉｄｋｅ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）２５．１．１−２５．１．１８、ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２５０１ｓ３６を参照）。蛍光のインビボでの使用のさらなる実例は、二分子蛍光相補法において黄色蛍光タンパク質を用いることである。蛍光プローブの使用に関する総括は、Ｘｉｅらによって提示されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８）３７，４１７−４４）。熱力学的検出法の一例は、等温滴定熱量測定である。Ｅｒｒタンパク質の核酸配列に対する結合を測定する好適な方法のさらに別の例は、表面プラズモン共鳴技術、たとえば局在表面プラズモン共鳴である（たとえば、Ｅｎｄｏ，Ｔ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ（２００８）６１４，２，１８２−１８９）。これらの方法のいくつかには、さらなる分離技術、たとえば、電気泳動またはＨＰＬＣが含まれる。詳細には、標識の使用例は、プローブとしての化合物または酵素が結合した免疫グロブリンを含み、これによって触媒される反応は、検出可能なシグナルをもたらす。放射性標識および電気泳動による分離を用いる方法の一例は、電気泳動移動度シフト分析である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞の分化状態を評価することを含む。細胞の分化状態は、例えば細胞によって提示される表現型に基づいて顕微鏡下で評価することができる。当業者は、細胞の表現型をモニタリングすることによって、分化状態における微細な変化を評価することができる。細胞の表現型はまた、細胞の高分子含量によっても反映される。この含量の変化は、したがって、分化状態の変化を示す。ラマン顕微分光法またはＦＴ−ＩＲ分光法は、これに関して分化状態を評価するために好適な技術の実例である。Ａｍｉら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２００８）１７８３，９８−１０６）は最近、たとえば胚幹細胞分化をモニタリングするために全タンパク質発現および核酸赤外線域の検出を評価することを含むＦＴ−ＩＲ分光法技術を実証した。同じ技術によって、細胞の脱分化を同様に評価することができる。
【００５０】
細胞の分化状態を評価する技術のさらなる例は、細胞の分化状態のマーカーの存在の評価である。このようなマーカーは、典型的には細胞タンパク質である。分化マーカーと見なすために、タンパク質は、細胞のある分化状態の間に検出可能な量でのみ存在し得る。あるいは、マーカーは、ある細胞の分化状態を特徴付けるいくつかの選択された相において存在し得る。この場合、それぞれが発現される分化状態に関して異なるプロフィールを有する異なるマーカーの組み合わせを使用して、細胞の分化状態を評価することができる。たとえば、第１マーカーが幹細胞もしくは前駆細胞を示し、第２マーカーが前駆細胞もしくは線維芽細胞を示すならば、両マーカーの存在は、前駆細胞を示す。さらなる代替法において、タンパク質はある段階、すなわちある細胞分化状態の間、特に多量または少量でのみ存在し得る。この点で異なる特性を有する多くのマーカーの組み合わせをまた細胞の分化状態を評価するために使用できる。一般的に、細胞の分化状態を評価するために、いくつかのマーカーの組み合わせを選択することが有利である。マーカータンパク質の存在は、たとえば抗体によってタンパク質レベルで検出することができるか（上記）、またはマーカータンパク質の発現レベルに基づいて評価することができる。タンパク質の半減期に関係なく、あるマーカータンパク質の発現は、一般的に各細胞の分化状態の好適な指標である。その量および発現を細胞の分化状態のマーカーとして評価することができるタンパク質の例としては、限定されるものではないが、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌ１４、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍｌ７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄ１、Ｎｍｙｃ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ、Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆ１、Ｔｃｆａｐ２ｃおよびＺｆｐ５５３、またはＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌ１４、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍｌ７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄ１、Ｎｍｙｃ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ、Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆ１、Ｔｃｆａｐ２ｃおよびＺｆｐ５５３のうちの一つのプロモータのメチル化状態が挙げられる。複数のこのようなマーカーの発現は、マイクロアレイハイブリダイゼーションなどの標準的技術を用いて実施することができる。定量的な発現プロファイリングに使用できるマイクロアレイの一例は、欧州特許出願公開第１４７７５７１号明細書に見いだすことができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、細胞の分化状態の評価は、ある期間にわたって量および／または活性を評価することを含む。一例として、細胞は、たとえば光学的に連続して評価することができる。さらなる例として、選択された時間間隔の後、細胞の評価を実施することができる。細胞の分化状態の評価は、対照測定をさらに含んでもよい。対照測定は、たとえば同じ起源であり、細胞におけるＥｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性が増加しないか、または一般的に調節されない、同等の細胞を含んでもよい。このような対照測定に関して、Ｅｒｒタンパク質の量もしくは活性が影響を受けないことがわかっている条件を選択することができる。条件は、各対照測定に関して、Ｅｒｒタンパク質の量もしくは活性が増加しないように、または概して変化しないように選択することもできる。一つ以上のＥｒｒタンパク質の量および／または活性、または一つ以上のＥｒｒタンパク質の（一つまたは複数の）機能的フラグメントが増加する細胞の評価を実施するので、この対照測定は、たとえば、ほぼ同時に、たとえば同時に実施することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、所定の閾値をそれぞれ分化および脱分化に設定する。二つの評価、すなわち、Ｅｒｒタンパク質の量および／または活性が増大した「試料」と「対照」測定値とが異なって、細胞の分化状態を示す／特徴付ける測定値間の差が所定の閾値よりも大きいならば、脱分化が達成される。実例として、マーカータンパク質の発現を用いて、細胞の分化状態を評価することができる。マーカータンパク質の発現は、選択された細胞型の細胞の脱分化を示す。発現における変動が、選択された条件下で起こり得るならば確実に考慮されるように、対照測定を用いることができる。「試料」（上記）と「対照」測定との間のマーカータンパク質の発現の差が所定の閾値を超えるならば、「試料」中で脱分化が起こったと結論づけられる。
【００５３】
脱分化した細胞を評価するさらなる好適な方法は、未分化対照細胞の使用および、たとえば米国特許出願公開第２００８／００７６１７６号明細書に記載される細胞の表現型のモニタリングを含む。多分化能は、たとえば細胞が、後に細胞混合物から完全に組み込まれた生命体を形成する胚盤胞と各幹細胞または幹様細胞を組み合わせた後に、胚のキメラ、つまり２以上の生命体からの細胞のブレンドを形成する能力によって評価することができる。多分化能を評価するさらなる方法は、各幹細胞をマウスの皮膚の下に注射することであり、皮下でこれらの幹細胞は奇形種を形成し得る。さらなる評価方法は、４倍体相補性、さらに分化することができない４Ｎ胚中に注射することによって、対応する細胞の多分化能を測定するインビボ試験である。結果として得られる正常な２Ｎ胚は、輸入された多能性細胞から発生し続ける。
【００５４】
実際面での最適化、たとえば最も好適なベクターの同定をより詳細に行うと、本発明の方法により得られた細胞、たとえば誘導幹細胞もしくは前駆細胞を、現在利用可能な細胞の代替物として容易に使用できる。最近、ゲノム組み込みウイルスは誘導多能性幹細胞を得るためには必要でないことが実証された。一つの代替物として、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを一時的に発現する非組み込みアデノウイルスがＳｔａｄｔｆｅｌｄらにより使用され（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６２４９４）、別の代替物として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４のｃＤＮＡを含むプラスミドを一つだけ、ｃ−Ｍｙｃ発現プラスミドとあわせて繰り返しトランスフェクションすることが、Ｏｋｉｔａらによって用いられた（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６４２７０）。
【００５５】
細胞を十分に未分化細胞状態まで脱分化させるために本発明の方法を使用した場合、得られた細胞、典型的には幹様細胞は、たとえば所望の分化した細胞型を得るために用いることができる。したがって、本発明の方法は、多種多様の治療上用途に使用することができる。このような細胞は、たとえば同じ個体から得られる細胞を選択された細胞型の細胞を提供するために使用できるという利点を有する再生医療において使用することができる。実例として、ヒト造血幹細胞を、骨髄移植を必要とする医療で用いることができる。本発明にしたがって得られる細胞を、多くの生理学的状態および疾患、たとえば多発性硬化症などの神経変性疾患、卵巣癌および白血病などの末期癌、並びにＨＩＶ感染症（「ＡＩＤＳ」）などの免疫系を傷つける疾患の治療において用いることができる。治療することができる生理学的状態のさらなる例としては、限定されるものではないが、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィ、糖尿病、肝臓疾患、すなわち、高コレステロール血症、心臓疾患、軟骨置換、熱傷、足部潰瘍、胃腸疾患、血管疾患、腎臓疾患、尿路疾患、および老化に伴う疾患および状態が挙げられる。このような細胞も、一つ以上の細胞系の形成に用いることができる。
【００５６】
本発明の方法は、たとえば、細胞を可逆的に脱分化および分化させることによって、いくつかの実施形態においてはさらに興味のある化合物の存在下で、研究目的で用いることもできる。この点に関して、本発明の方法によって得られる細胞は、ある状態、たとえば疾患状態になるインビトロ、エキソビボもしくはインビボモデル細胞、またはある状態、たとえば疾患状態にある細胞に対して用いることもできる。このような細胞は、ヒトをはじめとする動物などの生命体の発生を研究するために用いることもできる。本発明の方法を用いて誘導多能性幹細胞を生じさせる場合、疾患特異性多能性細胞系を、Ｐａｒｋら（Ｃｅｌｌ（２００８）１３４，８７７−８８６）によって記載される技術と同様にして生成させることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持する方法である。胚幹細胞などの幹細胞を制御された方法で、たとえば神経成長因子およびレチノイン酸の存在下でニューロンに分化させることができ（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒら、Ｂｒ．Ｒｅｓ．（２００１）９１３，２０１−２０５）、これらが容易に分化できることは、実施上の大きな問題となる。胚幹細胞を多能性状態に維持するためには、取り扱いおよび培地中での成長の間のこれらの分化は防止されなければならない。この理由のために、これらは伝統的に支持細胞の層上でウシ胎仔血清の存在下（たとえば米国特許第５８４３７８０号明細書および第６０９０６２２号明細書を参照）または線維芽細胞条件培地（ＣＭ）中で培養される。それにもかかわらず、慎重に制御された条件下でも、胚幹細胞はインビトロ増殖の間に自発的分化を受け得る。マウス胚幹細胞における自己複製に関与する因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）はまた、マウス胚幹細胞の分化を阻害することが判明しているが、ヒト胚幹細胞の分化の防止において支持細胞の役割の代替とならない。したがって、当業者らは、著しい改善として幹細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持することを含む調節方法を理解するであろう。
【００５８】
成人幹細胞は、多能性様胚幹細胞でないが、自己複製可能であり、柔軟性を有するものであることが証明され、これによって、これらの発生可能性は、より未熟な多能性胚幹細胞と匹敵するようになる。一例として、成人幹細胞は、その起源の組織とは異なる細胞系に分化することができる。
【００５９】
本発明の多分化能および／または自己複製特性を維持する方法は、任意の幹細胞、前駆細胞、奇形種細胞またはこれらから誘導される任意の細胞に好適である。典型的には、各細胞はＥｒｒタンパク質を発現することができる。実例として、任意の多能性ヒト胚幹細胞もしくは各細胞系を各方法で用いることができる。かかる細胞の集団を誘導する手段は当該技術分野で十分確立されている（たとえば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ［１９９８］２８２，１１４５−１１４７またはＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．［２００４］３５０，１３５３−１３５６を参照）。さらに、たとえば、少なくとも７８の独立したヒト胚幹細胞系（たとえば、ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｅｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙＣｒｉｔｅｒｉａ．ａｓｐを参照）、たとえばＧＥ０１、ＧＥ０９、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＴＥ０６またはＷＡ０９が存在することが知られ、そのうちの少なくとも２１細胞系が研究目的で利用可能である。ヒト胚幹細胞をはじめとする胚は、たとえば桑実胚、後期胚盤胞期の胚、単一割球または単為生殖胚から誘導することができる。多能性胎児幹細胞並びに前駆細胞を胎児から単離することができる。多能性胎児幹細胞は、通常、誕生時に廃棄される胎児外組織からも単離することができる。成人幹細胞は、たとえば神経組織（Ｃｈｏｊｎａｃｋｉ，Ａ．，＆Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００８）３，９３５−９４０）もしくは脂肪組織（Ｂｕｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）４５，２，１１５−１２０）などの組織、精巣の精原細胞（たとえばＣｏｎｒａｄ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７４０４）、歯、誕生後に残る胎盤および臍帯からの血液、または筋繊維から単離することができ、この幹細胞および前駆細胞にいわゆる「衛星細胞」として関連する（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ［２００５］１２２，２８９−３０１、Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［２００５］１１，８，８２９−８３１も参照）。前駆細胞は、血液および様々な組織、たとえば神経組織、脳室下帯、膵臓、網膜、骨膜または内皮細胞からも単離することができる。
【００６０】
「幹細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の幹細胞を意味し、いわゆる癌幹細胞も包含する。多くの種類の癌は、このような癌幹細胞を含むことが判明しており、これらは自己複製能力および分化能力によって特徴付けられる。広範囲の研究によって、ほとんどの癌がクローン性であり、腫瘍成長を維持する能力が付与された一つの癌幹細胞であり得ることがわかる。Ｋｒｉｖｔｓｏｖら（Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４２、８１８−８２２）は、たとえば、前駆細胞由来の白血病幹細胞を非常に多く含む細胞集団を精製し、これらを遺伝子発現プロファイリングによって特徴付けた。彼らは、これらの細胞が、これらが生じた前駆細胞と類似しているが、造血幹細胞において通常発現される自己複製関連プログラムを発現すると報告している（同文献）。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞または細胞が含まれる宿主生命体に対して、Ｅｒｒタンパク質の発現および／または活性を調節する化合物を投与することを含む。「投与する」という用語は、生命体の細胞または組織中に化合物を組み入れる技術に関する。
【００６２】
本明細書で記載する化合物、並びに本発明の方法によって同定される化合物は、細胞、動物またはヒト患者にそれ自体で、あるいは他の活性成分もしくは安定剤をはじめとする好適な担体または（一つもしくは複数の）賦形剤と混合される医薬組成物で投与することができる。このような担体、賦形剤または安定剤は、通常、用いられる用量および濃度で、暴露される細胞もしくは哺乳動物に対して無毒である点で薬剤的に許容される。多くの場合、生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝液である。生理学的に許容される担体の例としては、緩衝液、たとえばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸、アスコルビン酸をはじめとする酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン、アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする他の炭水化物、キレート剤、たとえばＥＤＴＡ、糖アルコール、たとえばマンニトールもしくはソルビトール、塩形成カウンターイオン、たとえばナトリウム、および／または非イオン性界面活性剤、たとえばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）が挙げられる。
【００６３】
好適な投与経路としては、たとえば持続性薬剤、経口、直腸、経粘膜、または腸投与、筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、並びに髄膜、直接脳室内、腹腔内、鼻内、または眼球内注射をはじめとする非経口送達を挙げることができる。化合物は、全身的ではなく、たとえば化合物を組織にたとえば持続性薬剤または持続放出処方で直接注射することにより、局所投与することもできる。
【００６４】
さらに、標的の薬物送達システム中、たとえば腫瘍特異性抗体でコーティングされたリポソーム中に薬物を投与することができる。リポソームは興味のある（一つもしくは複数の）細胞を含む組織によって選択的に標的とされ、吸収される。
【００６５】
前記の化合物を含む組成物は、たとえば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥法によって、医薬組成物についてそれ自体公知の方法で製造することができる。本発明にしたがって使用される組成物は、したがって活性化合物の薬剤的に使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および助剤を包含する一つ以上の生理学的に許容される担体を用いた通常の方法で処方することができる。適切な処方は、選択された投与経路に依存する。
【００６６】
注射に関して、化合物は水溶液、たとえば生理学的に適合性の緩衝液、たとえばハンクス液、リンガ液、または生理食塩緩衝液中に配合することができる。経粘膜投与に関して、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤を処方中で使用する。このような浸透剤は当該技術分野で一般的に公知である。経口投与に関して、化合物は、活性化合物を当該技術分野で周知である薬剤的に許容される担体と組み合わせることによって容易に配合することができる。このような担体によって、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することが可能になる。
【００６７】
固体賦形剤を添加し、場合によって結果として得られた混合物を粉砕し、所望により好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤もしくは糖衣錠コアを得ることによって、経口使用される製剤を得ることができる。好適な賦形剤は、特に、充填剤、たとえばラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールをはじめとする糖、セルロース調製物、たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。
【００６８】
糖衣錠コアに好適なコーティングを提供する。このために、濃厚糖溶液を用いることができ、この溶液は、場合によって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含む。活性化合物量の様々な組み合わせを特定するかまたは特徴付けるために、染料または顔料を錠剤もしくは糖衣錠コーティングに添加することができる。
前記の化合物を含む製剤を経口的に使用することができ、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、並びにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールなどの可塑剤で作製されたソフト密封カプセルを包含する。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および場合によって安定剤との混合物で活性成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解もしくは懸濁させることができる。加えて、安定剤を添加することができる。経口投与用の全ての処方は、かかる投与に好適な用量である。口腔投与のために、組成物は、通常の方法で処方された錠剤もしくはロゼンジの形態を取ることができる。
【００６９】
吸入による投与に関して、本発明にしたがって使用する化合物は、好適なプロペラント、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用した、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達される。加圧エアゾルの場合、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または注入器において用いられるゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤、たとえばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含んで処方することができる。
【００７０】
化合物は、注射、たとえばボーラス注入法または持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用処方は、単位投与形態、たとえばアンプル中または複数回投与容器中で、保存料を添加して提示することができる。各組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中エマルジョンなどの形態を取ることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。
【００７１】
好適な非経口投与用処方の実例は、水溶性形態の活性化合物の水溶液である。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油状注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒もしくはビヒクルとしては、脂肪油、たとえばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含むことができる。場合によって、懸濁液は、好適な安定剤または化合物の溶解度を増大させて非常に濃厚な溶液の調製を可能にする薬剤も含んでもよい。
【００７２】
活性成分は、好適なビヒクル、たとえば滅菌ピロゲンを含まない水で使用前に構成される粉末形態であってもよい。化合物は、たとえばカカオ脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に処方することもできる。
【００７３】
すでに記載した処方に加えて、化合物は持続性製剤として処方することもできる。このような長時間作用型処方は、移植（たとえば皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば化合物を、好適なポリマーもしくは疎水性材料（たとえば許容できる油中エマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体、たとえば、難溶性塩として処方することができる。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、細胞の脱分化を行うことができる化合物を同定する方法を提供する。このような方法は、化合物とＥｒｒタンパク質との間に複合体を形成することを包含する相互作用を可能にすることを含んでもよい。一実施形態において、方法は、化合物がＥｒｒタンパク質とＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の一方または両方との間の複合体の形成を変えるかどうか、たとえば防止、減少または向上させるかを確認することを含んでもよい。さらなる実施形態において、方法は、Ｅｒｒタンパク質の転写因子活性を向上、軽減または防止することなど調節するかどうかを確認することを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、各方法は、一つ以上のＥｒｒタンパク質、または一つ以上のＥｒｒタンパク質の（一つもしくは複数の）機能的フラグメントを発現できる細胞中に化合物に導入し、（一つもしくは複数のＥｒｒタンパク質）の発現を測定することを含む（詳細については前記参照）。各Ｅｒｒタンパク質の増大した発現は、対応する化合物が、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持することができることを示す。
【００７６】
この複合体の形成は、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学的方法を用いて実施できる。実例は、表面プラズモン共鳴（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術）、核磁気共鳴または結晶化およびその後のＸ線分析による検出である。分光検出法の一例は蛍光相関分光法である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．［２００２］１２，５，６３４−６４１）。光化学的方法は、たとえば光化学的架橋である。光活性標識、蛍光標識、放射性標識または酵素標識の使用は、それぞれ測光法、蛍光測定法、放射線法および酵素的検出方法の例である（これも前記参照）。
【００７７】
いくつかの実施形態において、かかる方法はインビトロ法である。化合物、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメント、およびＮａｎｏｇもしくはＯｃｔ４または三つのタンパク質全てを接触させることを含み得る。かかる方法において、一般的に、化合物がＥｒｒタンパク質と、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくとも一つとの間の複合体形成を調節できるかどうかを確認する。化合物がかかる複合体形成を軽減もしくは防止する場合、この化合物は、分化の実施に好適であり得る候補分子である。化合物がかかる複合体形成を増大もしくは促進する場合、このことは、この化合物が、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および／または自己複製特性を維持することができることを示す。
【００７８】
インビトロ方法の前記実施形態は、Ｅｒｒタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の少なくとも一つの複合体形成を調節できると予測される化合物を試験管に添加することを含むことができる。方法は、Ｅｒｒタンパク質、又はその機能的フラグメントを試験管に添加することをさらに含むことができる。方法は、ＮａｎｏｇもしくはＯｃｔ４を試験管に添加することも含むことができる。いくつかの実施形態において、ＮａｎｏｇとＯｃｔ４との両方を試験管に添加する。これらは、あわせて、または連続して添加することができる。これらはＥｒｒタンパク質を試験管に添加する前、添加とともに、または添加後に添加することもできる。さらに、方法は、Ｅｒｒタンパク質とＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４との間の複合体形成を可能にすることを含むことができる。方法は、この複合体の形成を検出することも含む。上で説明したように、この複合体の形成を、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学的方法を用いて実施することができる。
【００７９】
本発明を、以下の非限定的例によってさらに説明する。当業者には本発明の開示から容易に明らかになるように、既存の、または本明細書で記載する対応する実施形態例と実質的に同じ機能を果たすか、同じ結果を実質的に達成するように後に開発される他の物質の組成物、手段、使用、方法、または工程も同様に本発明にしたがって利用できる。
（実施例）
細胞培養およびトランスフェクション
マウスＥＳ細胞を、ゼラチンでコーティングした皿上、１５％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）、０．０５５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、５，０００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１，０００単位／ｍｌのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を添加したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）中で培養し、２〜３日ごとに継代した。再プログラミングされた細胞、Ｖ６．４およびＲ１マウスＥＳ細胞を同じＥＳ細胞培地中マイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダ上で培養し、２〜３日ごとに継代した。ＭＥＦを１３．５ｄ．ｐ．ｃ胚から、０．０５％トリプシンで３７℃にて１０分間解離させることにより単離し、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む１５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養した。この研究において、本発明者らは、ＭＥＦを５継代以内で使用して、複製老化を回避した。ＣＤ１、Ｂ６、１２９／Ｂ６、アクチン−ＧＦＰ、アクチン−ＧＦＰ／ＣＤ１、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ／Ｂ６マウス由来のＭＥＦを、この研究においてｉＰＳ誘導のために使用した。ｓｈＲＮＡおよび過剰発現プラスミドのトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して実施した。簡単に言うと、１．５μｇのプラスミドをＲＮＡおよびタンパク質抽出のために６０ｍｍのプレート上ＥＳ細胞中にトランスフェクトした。ＥＳ細胞の非分化状態の指標であるアルカリ性ホスファターゼの検出を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから市販のＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて実施した。プロマイシン（Ｓｉｇｍａ）選択をトランスフェクションの１日後、０．８μｇ／ｍｌの濃度で導入し、収集前２〜６日間維持した。
【００８０】
ＲＮＡ抽出、逆転写および定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を実施した。ＤＮＡ汚染をＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）処理によって除去し、ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によってさらに精製した。定量的ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを記載されているようにして使用して、リアルタイムで実施した。使用した全てのプライマについて、それぞれが正しい大きさの一つの生成物を生成した。逆転写酵素がない四つの対照全てにおいて、シグナルは検出されなかった。それぞれのＲＮＡｉ実験を、ＥＳ細胞の異なるバッチを用いて少なくとも３回繰り返した。Ｅｓｒｒｂ  ｓｈＲＮＡによって標的とされる配列は、Ｌｏｈら（２００６、上記）によって記載されている通りである。
【００８１】
マウス
野生型ＣＤ１マウス、Ｂ６マウス、アクチン−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスおよびＰｏｕ５ｆ１−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ  Ｌａｂ，それぞれストック番号００３５１６および００４６５４）をＭＥＦ単離のために使用した。Ｂ６マウスを顕微注入のために使用した。
【００８２】
レトロウイルスパッケージングおよび感染
Ｅｓｒｒｂおよび他の因子のＣＤＳをＰＣＲによってマウスＥＳ細胞から増幅させ、ＭＭＬＶ系ｐＭＸｓレトロウイルスベクター中にクローンした。レトロウイルスは、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ（２００６、上記）によって記載されているようにして生成させた。ｉＰＳ細胞を誘導するために、異なる因子をコードする等しい量のウイルスを、ＭＥＦ上に、６ｎｇ／ｍｌのポリブレンを含む１５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中、５０〜７０％コンフルエンスで塗布した。２４時間後、培地を新鮮なものと替え、翌日（２ｄｐｉ）に、細胞をＭＥＦフィーダ上で１：６〜１：２０に分割した。培養物を次いでマウスＥＳ細胞培地中に１１〜２４日間維持した。
【００８３】
免疫蛍光および免疫化学
ガラス底皿中またはゼラチン化スライドカバー上ＭＥＦフィーダ上で培養したＥＳ細胞または再プログラミングされた細胞を、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで固定した。１％トリトン−Ｘ１００／ＰＢＳ中で３０分間透過化後に、Ｎａｎｏｇを１：２０抗Ｎａｎｏｇ（ＲＣＡＢ０００２ＰＦ，ＣｏｓｍｏＢｉｏ）で染色した後、１：３００Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５６８接合抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＳＳＥＡ１を、１：２００モノクローナル抗ＳＳＥＡ１（ＭＡＢ４３０１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で直接染色し、続いて１：２０００Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５４６接合抗マウスＩｇＭで染色した。ＤＡＰＩもしくはＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を対比染色に使用した。免疫化学分析のために、Ｅ９．５胚を４％ＰＦＡ中４℃で一夜固定し、パラフィン中に埋め込んだ。セクショニング後、ＧＦＰを、１：２００抗ＧＦＰ（ｓｃ−９９９６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、続いてＨＲＰ接合抗マウス（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて染色し、次いでＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を用いて発生させた。ヘマトキシリンを用いて核を対比染色した。
【００８４】
Ｇバンド染色体分析
細胞を有糸分裂停止のためにコルセミドで処理し、標準的低張処理およびメタノール：酢酸（３：１）固定によって集めた。標準的空気乾燥法によってスライドを調製し、Ｇバンド染色体分析を実施した。
【００８５】
顕微注入
ｉＰＳ細胞をＭ２培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能（カタログ番号５１７０Ｃ）であり、Ｍ１６胚培地の修飾物である）中に再懸濁させ、８細胞期Ｂ６マウス胚中に注入した。胚を次いで発生させて、ｉＰＳ細胞が動物中に組み込まれる能力について試験した。
【００８６】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析
ＣｈＩＰ分析はすでに記載されているようにして実施した。簡単に言うと、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間室温にて架橋させ、ホルムアルデヒドを次いで１２５ｍＭのグリシンの添加によって不活性化した。平均サイズが５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むクロマチン抽出物を、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｂｃａｍ）または抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体を用いて免疫沈降させた。全ＣｈＩＰ実験について、定量的ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００配列検出システムおよびＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いてすでに記載されているようにしてリアルタイムで実施した。見かけの免疫沈降効率（免疫沈降したＤＮＡの量の、投入試料の量に対する比）を測定することによって相対的占有率値を計算し、観察されたレベルに対して標準化した。
【００８７】
重亜硫酸塩シークエンシング
Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の指示にしたがって用いて、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理を実施した。ゲル濾過カラムを使用することによって増幅産物を精製し、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンし、Ｍ１３順方向および逆方向プライマを用いて配列決定した。Ｎａｎｏｇプロモータを増幅するために使用したプライマは、配列：５’−ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴ（配列番号８）および５’−ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡ（配列番号９）を有していた。Ｏｃｔ４プロモータを増幅するために使用したプライマは、配列：５’−ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ（配列番号１０）および５’−ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ（配列番号１１）を有していた。
【００８８】
遺伝子型決定
各反応について、ＭＥＦ、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または胚卵黄嚢から抽出したゲノムＲＮＡ５００ｎｇを用いてＰＣＲ増幅を実施した。増幅に使用したセンスプライマは以下の配列を有していた：５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣ（配列番号１）。
【００８９】
増幅に使用したアンチセンスプライマは、以下の配列を有していた。
Ｅｓｒｒｂ：５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＡ（配列番号２）
Ｅｓｒｒａ：５’−ＴＧＴＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号３）
Ｅｓｒｒｇ：５’−ＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＡＴＣＣ（配列番号４）
Ｏｃｔ４：５’−ＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴ（配列番号５）
Ｓｏｘ２：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ（配列番号６）
ｃＭｙｃ：５’−ＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧ（配列番号７）
マイクロアレイ分析
細胞由来のｍＲＮＡを逆転写し、標識し、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイプラットフォーム（Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ−６  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  ｖｌ．ｌ）を用いて分析した。アレイを製造業者の指示にしたがって処理した。マイクロアレイデータをＳＡＭによって分析した。
【００９０】
Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の生成
すでに記載されている遺伝的に未修飾の線維芽細胞の直接再プログラミングを使用して（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００７）１，２４５−２４７、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）２５，１１７７−８１）、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＥｓｒｒｂを、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）中で共発現させた。得られたＥＳ細胞様細胞を、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＳＥＡ１およびＮａｎｏｇについて陽性に染色した（図２ａ〜図２ｇ）。以下で、これらのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＥｓｒｒｂ再プログラミング細胞は、ＯＳＣＥ再プログラミング細胞とも称する。先のレポートと一致して、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃは、安定したクローンの形成を誘導できない（データ不掲載、Ｂｌｅｌｌｏｃｈ，２００７、上記、Ｎａｋａｇａｗａ，２００８、上記）。先のレポートは、再プログラミング細胞単離のためのストリンジェントな選択法としての内因性Ｐｏｕ５ｆｌレポータの活性化の使用を示している（Ｗｅｒｎｉｇら、２００７、上記）。したがって、本発明者らは、ＭＥＦをＰｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰレポータとともに使用して（Ｓｚａｂｏ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ（２００２）１１５，１５７−１６０）、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃを用いたＥＳ細胞様コロニーの誘導におけるＥｓｒｒｂの潜在性をさらに検証した。ＥＳ細胞様コロニーは、９〜１１ｄｐｉ付近で出現した。本発明者らは、１４ｄｐｉでＧＦＰ陽性コロニーの数を定量化した（図２ｈ、図２ｉ）。Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞の生成効率は、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃの導入によって得られるものの約５０％であった（図２ｊ）。この結果から、ＥｓｒｒｂはＭＥＦの再プログラミングにおいてＫｌｆ４と置き換わることができることがわかった。
【００９１】
Ｐｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰレポータをＥｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２とともに用いてＭＥＦを形質導入し、本発明者らは、ＧＦＰ、アルカリ性ホスファターゼ、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１陽性細胞を誘導することができた（図８を参照）。Ｐｏｕ５ｆｌ−ＧＦＰレポータをＥｓｒｒｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃとともに使用してＭＥＦを形質導入し、本発明者らはＧＦ、アルカリ性ホスファターゼ、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１陽性細胞を誘導することができた（図５を参照）。
【００９２】
再プログラミング細胞の特徴付け
Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは発現プロファイリングを実施して、二つのＥＳ細胞系、三つの再プログラミング細胞系（Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞系について二つ、およびＫｌｆ４再プログラミング細胞系について一つ）ならびに二つのマウス系統由来のＭＥＦのトランスクリプトームを捕捉した。クラスター分析によって、再プログラミング細胞系がＭＥＦよりもＥＳ細胞に類似していることがわかった（図３ａ）。本発明者らのマイクロアレイ分析によって、再プログラミングされた細胞におけるＥＳ細胞関連遺伝子の上方調節およびＭＥＦ関連遺伝子の下方調節も明らかになった（図３ｂ）。
【００９３】
再プログラミングされた細胞の後成的状態
ＥＳ細胞特異的遺伝子、たとえばＮａｎｏｇおよびＰｏｕ５ｆｌはＥＳ細胞において高度に発現され、これらのプロモータ領域はＤＮＡメチル化が不足している。ＭＥＦにおいて、これらの遺伝子を抑制し、これらのプロモータはＤＮＡメチル化を獲得する。従来の研究から、再プログラミングがメチル化の除去につながることがわかっている（Ｗｅｒｎｉｇら、２００７、上記、Ｍａｈｅｒａｌｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００７）１，５５−７１、Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８，３１３−７）。本発明者らは、ＥＳ細胞、ＭＥＦおよび二つの再プログラミング細胞系の重亜硫酸塩シークエンシングによって、ＮａｎｏｇおよびＰｏｕ５ｆｌプロモータでのＤＮＡメチル化の状態を分析した。結果から、ＤＮＡメチル化が本発明者らの再プログラミング細胞系では失われたことがわかった（図４ａ）。
【００９４】
ＥＳ細胞において、ＥＳ細胞は分化する場合に抑制されるが誘導を受けない、いくつかの遺伝子は、活性Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マークと不活性Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークとの両方を示す（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ（２００６）１２５，３１５−３２６）。これらの二価クロマチン構造が、Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞中に存在するかどうかをさらに試験した。抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３および抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を使用するＣｈＩＰ分析によって、七つの遺伝子（Ｚｆｐｍ２、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１およびＤｌｘ１）のクロマチンが両修飾を含むことが明らかになった（図４ｂ）。この結果は、二価ドメインがｉＰＳ細胞において再形成されることを証明する先の研究（Ｗｅｒｎｉｇら、２００７、上記）と一致する。要するに、前記データにより、多分化能遺伝子の後成的状態が抑制（メチル化）から活性（非メチル化）胚状態へと再プログラミングされ、二価クロマチン構造がＥｓｒｒｂ再プログラミング細胞で獲得されたことが示された。
【００９５】
Ｅｓｒｒｂ再プログラミング細胞は多能性である
得られた再プログラミングされた細胞が多能性であるかどうかを評価するために、これらの細胞を細胞期Ｃ５７／ＢＬ６胚中に顕微注入した。ＯＳＣＥ再プログラミング細胞はアクチン−ＧＦＰレポータを用いてＭＥＦから誘導されるので、これらはＧＦＰ陽性である。これらの細胞を胚盤胞中に導入する前に、本発明者らまず、ＯＳＣＥ番号８およびＯＳＣＥ番号１３細胞系が正常な核型を有することを立証した（図９ａ、図９ｂを参照）。胚盤胞中に注射した後、ＯＳＣＥ番号８およびＯＳＣＥ番号１３細胞系は、９．５ｄ．ｐ．ｃ．胚がＧＦＰ標識細胞のモザイク組み込みを示したので、マウス胚に貢献した（図６ａ〜図６ｆ）。キメラ胚の卵黄嚢組織中に四つのレトロウイルスが存在することが、ＰＣＲ検出分析によってさらに確認された（図９ｃを参照）。胚の免疫染色も、ＧＦＰ陽性細胞が全組織に貢献することを示した（図６ｇ〜図６ｉ）。したがって、ＯＳＣＥ再プログラミング細胞は多能性であり、インビボで三つの系統に分化することができる。
【００９６】
Ｅｓｒｒｂは、ＥＳ細胞の自己複製状態の維持に関与することが示された（Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４２，５３３−５３８、Ｌｏｈ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２００６）３８，４３１−４４０）。今までのところ、再プログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ｎ−Ｍｙｃおよびｃ−Ｍｙｃ）はＥＳ細胞特異的遺伝子の上方調節に関与する（Ｉｖａｎｏｖａら、２００６、上記、Ｌｏｈら、２００６、上記、Ｂｏｉａｎｉ，Ｍ．＆Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００５）６，８７２−８８４、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００５）１３２，８８５−８９６、Ｍａｔｏｂａ，Ｒ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２００６）１，ｅ２６、Ｍａｓｕｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）９，６２５−６３５、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００８）１０，３５３−３６０）。ＥｓｒｒｂがどのようにしてＯｃｔ４およびＳｏｘ２を用いた再プログラミングを仲介するかについての洞察を得るために、ＥＳ細胞における遺伝子発現の調節におけるＥｓｒｒｂの役割を調べた。本発明者らは、すでにＥｓｒｒｂおよび他の転写因子のＥＳ細胞における結合部位を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ技術を用いて位置づけしていた（Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ（２００８）１３３，１１０６−１１１７）。ＥｓｒｒｂがＥｓｒｒｂ遺伝子のイントロン部位と結合することがわかることは興味深い（図１０を参照）。このことは、Ｅｓｒｒｂが潜在的に自身の発現を調節できることを示唆する。どの遺伝子がＥｓｒｒｂによって結合されているかは既知であるが、Ｅｓｒｒｂがこれらの遺伝子に対して転写効果を及ぼすかどうかは明らかではない。したがって、ＤＮＡマイクロアレイ実験を実施して、その発現がＥｓｒｒｂ欠乏によって減少するＥｓｒｒｂ結合遺伝子を決定した。ＲＮＡ試料を、ｓｈＲＮＡ発現構築物のトランスフェクション後、様々な時点で集めた。第２日に、ＥｓｒｒｂのないＥＳ細胞の形態は、ルシフェラーゼに対してｓｈＲＮＡを発現する対照プラスミドでトランスフェクトされたＥＳ細胞と類似し（図６ａ）、これらの細胞もアルカリ性ホスファターゼについて陽性染色された。これらのＥＳ細胞特性を維持するにもかかわらず、ＥＳ細胞の重要な調節因子（Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５）をコードするＥｓｒｒｂ結合遺伝子の発現はすでに減少していた（図６ａ）。４日および６日後、Ｅｓｒｒｂ欠失ＥＳ細胞はすでに分化し、異なる形態を有し、アルカリ性ホスファターゼ染色が失われていた。データから、ＥｓｒｒｂがＥＳ細胞状態に関連して上方調節する遺伝子であることがわかった。ＥｓｒｒｂによるＭＥＦの再プログラミングは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を必要とするので、結合Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２である遺伝子が特定された（図１０）。興味深いことに、これらは、多分化能の調節因子（Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４）、自己複製調節因子（Ｔｃｌｌ、Ｔｂｘ３）および再プログラミング因子（Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５）をコードする遺伝子を含む（���７ｂ）。これは、なぜＥｓｒｒｂが再プログラミングにおいてＯｃｔ４およびＳｏｘ２とともに作用できるかについての説明を提供することができる。
【００９７】
親和性精製および質量分析法を用いて、ＥｓｒｒｂはＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４を含む複合体において見いだされた（Ｗａｎｇら、２００６、上記、Ｌｉａｎｇら、２００８、上記）。共通の標的遺伝子を調節することに加えて、これらの転写因子間のタンパク質−タンパク質相互作用は、体細胞におけるＥＳ細胞特異的遺伝子発現プログラムに重要である可能性があり得る。ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４複合体の他の成分が再プログラミング機能を有するかどうかを試験することも興味深い。ＭＥＦのｉＰＳ細胞への再プログラミングに関する以前の研究は、細胞運命の改変におけるＫｌｆ４の重要な役割を強調する。前記結果は、Ｋｌｆ４がＥｓｒｒｂによって置換され得ることを示す。理論によって拘束されないが、ＥＳ細胞を用いて得られたデータ（上記）は、三つの転写因子Ｅｓｒｒｂ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２が、ＥＳ細胞の維持に重要であるかまたはそれ自体が再プログラミング因子をコードする共通の遺伝子を標的とすることの証拠を提供する。
【００９８】
本明細書における先に公開された文献の記載または議論は、この文献が最先端技術の一部であるか、または一般常識であるということを承認するものとして解釈すべきではない。
【００９９】
本明細書で例示的に記載した本発明は、本明細書で具体的に開示されていない任意の（一つもしくは複数の）要素、（一つもしくは複数の）制限の非存在下で好適に実施することができる。したがって、たとえば、「含む」、「包含する」、「含有する」などの用語は、広く制限なく解釈されるべきである。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載された整数もしくは整数の群を含むが、他の整数もしくは整数の群を排除しないことを意味すると理解される。さらに、本明細書で用いられる用語および表現は、説明に関して用いられ、制限するものではなく、このような用語および表現の使用は図示され記載された特徴の同等物またはその部分を排除することを意図せず、様々な変更が請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。このように、本発明を具体例によって具体的に開示したが、本明細書で開示された中で具体化された本発明の任意の特徴、変更および変形は、当業者が再分類することができ、このような変更および変形は、本発明の範囲内に含まれると見なされる。
【０１００】
本発明を本明細書では広く一般的に記載した。一般的開示内にある、より狭い種および亜属分類のそれぞれも、本発明の一部を形成する。除去された物質が本明細書で具体的に限定されているかどうかに関係なく、属から任意の対象物を除去するという条件付き、または消極的限定付きで、これは本発明の一般的記載を包含する。
【０１０１】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載される場合、本はつめがマーカッシュグループの任意の個々の要素、又は要素のサブグループに関しても記載されるということを当業者は認識するであろう。
【０１０２】
【表１】
2011522520.tif 000003
【図１】
2011522520.tif 000004
【図２】
2011522520.tif 000005
【図２ｉ】
2011522520.tif 000006
【図３ａ】
2011522520.tif 000007
【図３ｂ】
2011522520.tif 000008
【図４ａ】
2011522520.tif 000009
【図４】
2011522520.tif 000010
【図５Ａ】
2011522520.tif 000011
【図５Ｂ】
2011522520.tif 000012
【図５】
2011522520.tif 000013
【図５Ｊ】
2011522520.tif 000014
【図５Ｋ】
2011522520.tif 000015
【図６ａ】
2011522520.tif 000016
【図６ｂ】
2011522520.tif 000017
【図６ｃ】
2011522520.tif 000018
【図６ｄ】
2011522520.tif 000019
【図６ｅ】
2011522520.tif 000020
【図６ｆ】
2011522520.tif 000021
【図６ｇ】
2011522520.tif 000022
【図６ｈ】
2011522520.tif 000023
【図６ｉ】
2011522520.tif 000024
【図７ａ】
2011522520.tif 000025
【図７ｂ】
2011522520.tif 000026
【図８】
2011522520.tif 000027
【図８ｉ】
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【図９ａ】
2011522520.tif 000029
【図９ｂ】
2011522520.tif 000030
【図９ｃ】
2011522520.tif 000031
【図９ｄ】
2011522520.tif 000032
【図９ｅ】
2011522520.tif 000033
【図９ｆ】
2011522520.tif 000034
【図９ｇ】
2011522520.tif 000035
【図１０ａ】
2011522520.tif 000036
【図１０ｂ】
2011522520.tif 000037
【図１０ｃ】
2011522520.tif 000038
【図１０ｄ】
2011522520.tif 000039
【図１０ｅ】
2011522520.tif 000040
【図１０ｆ】
2011522520.tif 000041
【図１０ｇ】
2011522520.tif 000042
【図１０ｈ】
2011522520.tif 000043
【配列表】
2011522520000001.app
【国際調査報告】
2011522520.tif 000044
2011522520.tif 000045
2011522520.tif 000046