(57)【要約】本発明は、対象化合物の免疫原性を評価するためのin vitro方法であって、ａ）全血サンプルを準備し、該血液は該対象化合物に曝露されており、ｂ）該サンプル中のペントラキシン３のレベルを測定し、そしてｃ）ペントラキシン３の測定されたレベルをコントロールと比較する、工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象化合物の免疫原性を評価するためのin vitro方法であって、
ａ）全血サンプルを準備し、該血液は該化合物に曝露されており、
ｂ）該サンプル中のペントラキシン３のレベルを測定し、そして
ｃ）ペントラキシン３の測定されたレベルをコントロールと比較する、
工程を含む方法。
【請求項２】
ＰＴＸ３レベルを全血サンプルから得られた血漿又は血清において測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全血が凝固防止剤を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
血漿が凝固防止剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
凝固防止剤がヘパリンである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
対象化合物と全血サンプルとのインキュベーションを血液サンプルの採集後４時間以内に開始する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
全血サンプルを３０分〜２４時間対象化合物とインキュベーションする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ペントラキシン３のレベルを増感化学発光ＥＬＩＳＡで測定する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象化合物のヒトにおけるサイトカイン放出症候群を誘導するリスクを決定するためのＰＴＸ３の使用。
【請求項１０】
本明細書において、特に実施例に実質的に記載されている方法及び使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これまで、治療抗体の投与は、臨床試験期間中該抗体の初回注入により重い副作用を引き起こした。体内循環における過剰量の特定の前炎症性サイトカインの急激な放出が記載されておりそしてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と呼ばれる合併症を引き起こすのに重要であると考えられる。通常、ＣＲＳは、注入の２０〜９０分後に始まりそして抗体によりターゲティングされた細胞から及びＦｃレセプターへの抗体の結合を介してもたらされた免疫エフェクター細胞からのサイトカインの放出の結果である。サイトカインが体内循環に放出されると、熱、悪心、悪寒、低血圧、頻脈、無力症、頭痛、発疹、擦過性咽喉(scratchy throat)及び呼吸困難などの全身性症状が起こりうる。大抵の患者において、この症状は重症度においては軽度〜中程度でありそして容易に処置されうる。しかしながら、ある患者は、多量のサイトカインの放出から生じうる重い生命にかかわる反応を経験することがある。
【０００２】
ＣＲＳは薬物試験の通常の動物モデルで観察されえない種特異的事象であるので、ヒト血液由来の細胞に基づくin vitroモデルが、新規な医薬製品のサイトカイン放出の危険を評価するために必要とされる。血清又は血漿におけるサイトカインレベルを測定するアッセイが知られている。しかしながら、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はインターロイキンなどの標準的なサイトカインの増加は、必ずしもＣＲＳが起こるのを予想しない。更に、利用可能なアッセイでは、血液サンプル中のサイトカイン放出は、潜在的な有害事象の後相当な長さの時間の後にのみ検出可能である。したがって、化合物がＣＲＳを誘発するリスクの信頼性の高いより迅速な測定方法を提供する必要がある。この問題は、本発明により、特に急性サイトカイン放出関連注入反応の誘導に関して化合物の免疫原性を測定するためのペントラキシン３の使用により解決される。
【０００３】
ゆえに、本発明は、対象化合物がヒトにおけるサイトカイン放出症候群を誘導するリスクを測定するためのＰＴＸ３の使用を提供する。
【０００４】
更に、本発明は、対象化合物の免疫原性の新規な測定方法を提供する。特にこの方法は、対象化合物が個体におけるＣＲＳを誘導するリスクを評価することを可能とする。
【０００５】
前記方法は、
ａ）全血サンプルを準備し、該血液サンプルは前記化合物に曝露されており、
ｂ）該サンプル中のペントラキシン３（ＰＴＸ３）のレベルを測定し、
ｃ）ペントラキシン３の測定されたレベルをコントロールと比較する、
工程を含む。
【０００６】
好ましくは、ＰＴＸ３レベルは、全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られる血漿において測定される。あるいは、ＰＴＸ３レベルは、全血サンプルから得られた血清において測定することもできる。
【０００７】
用語「免疫原性」は、物質が免疫応答を引き起こす能力を指す。免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び先天性免疫系の細胞、例えは単球、マクロファージ又は好中球により媒介される物質に対する免疫系の反応である。Ｂ細胞反応は、抗原特異的抗体の産生及び放出に関与している。Ｔ細胞、単球又は顆粒球の応答は、前炎症性及び／又は抗炎症性サイトカインの放出に関与し得る。身体の体内循環における過剰量の特定の前炎症性サイトカインの急激な放出は、「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）と呼ばれる。
【０００８】
サイトカインは、免疫系の種々の細胞の活性を刺激又は抑制する細胞間のメッセンジャーとして作用する可溶性タンパク質である。サイトカインは、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン及びインターフェロンを含む。
【０００９】
本明細書で使用される用語「対象化合物」は、生物学的又は化学的分子を指す。生物学的分子は、特にポリペプチド又はポリヌクレオチドであることができる。該ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、例えばメチル化、ペグ化、リン酸化及びグリコシル化などの修飾を有することができる。
【００１０】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を指す。用語「ポリペプチド」は、タンパク質及びペプチドも含む。好ましくは、ポリペプチドは、抗体、より好ましくは治療抗体である。治療抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることができる。
【００１１】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ（又はＵ）を含むヌクレオチドのポリマーに関する。ポリヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡである。
【００１２】
好ましくは、対象化合物は、治療化合物である。治療化合物は、ヒト又は動物身体の症状を軽減、除去又は少なくすること又は、ヒト又は動物身体の任意の障害又は機能不全に罹る可能性を予防又は減少させることを含む、治療方法に使用するための化合物である。治療化合物は、生物学的分子又は化学的分子であることができる。生物学的治療化合物は、好ましくは抗体又はｓｉＲＮＡである。
【００１３】
ペンタキシン３としても知られているペントラキシン３（ＰＴＸ３）は、カルボキシ末端ペントラキシンドメイン(Basile et al, J Biol Chem. 1997,272(13):8172-8)により特徴付けられる「長ペントラキシン」として知られているタンパク質のファミリーに属する。３８１アミノ酸のこのタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）は、Breviario等(J Biol Chem, 1992, 267(31): 22190-22197)によりクローニングされそして発現がＩＬ−１βによりヒト臍帯静脈内皮細胞において誘導される遺伝子として同定された。
【００１４】
ペントラキシン３は、種々の細胞タイプにより産生及び分泌される。ヒト末梢血単核細胞は、バクテリアリポ多糖、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに応答してタンパク質を産生するが、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮ−γには応答しない(Alles et al, Blood. 1994, 84(10): 3483-93)。ペントラキシンは、刺激された単球、内皮細胞及び繊維芽細胞(Alles et al, 1994)、樹状細胞(Doni et al, Eur J Immunol. 2003,33(10): 2886-93)、未分化筋芽細胞及び分化筋芽細胞(Introna et al, Blood. 1996, 87(5): 1862-72)、関節リウマチ滑膜細胞(Luchetti et al, Clin Exp Immunol. 2000, 119(1):196-202)、グリア細胞(Polentarutti et al,J Neuroimmunol. 2000 Jul 1: 106(1-2): 87-94)、カポジ肉腫細胞（ウイルスＩＬ−６により誘導可能）(Klouche et al, AIDS. 2002 May 24; 16(8):F19-18)、マクロファージ及び内皮細胞において及びたまに進行したアテローム性動脈硬化症プラークにおける平滑筋細胞により(Rolph et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002; 22(5):e10-4)、糸球体間質細胞及び内皮細胞(Bussolati et al, J Immunol. 2003 Feb 1; 170(3):1466-72)、前駆脂肪細胞(Abderrahim-Ferkoune et al, J Lipid Res. 2003; 44(5): 994-1000)、ヒト及びマウス卵丘細胞(Salustri et al,Development. 2004; 131(7): 1577-86)、及び好中球(Jaillon et al, JEM. 2007,204(4):793-804; Imamura et al, Cell Immunol 2007, 248(2): 86-94)において発現される。
【００１５】
本明細で使用される用語「全血」は、血漿と呼ばれる流体中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含む流体を指す。全血サンプルは、任意の動物から採集されうる。好ましくは、全血サンプルは、ヒト患者から採集される（ヒト全血サンプル）。
【００１６】
対象化合物に全血を曝露するためのいくつかの方法がある：
方法１）１つの可能性は、全血サンプルに化合物を加えることである。化合物は、サンプルが採集された後できるかぎり早く、好ましくは採集後４時間以内に、より好ましくは採集後０．５〜３時間に加えられる。最も好ましくは、化合物は、採集後３０〜６０分に加えられる。
【００１７】
全血サンプルに化合物を加えることとサンプルを処理することとの間にインキュベーション期間がある。インキュベーションは、好ましくは血液サンプルの採集後４時間以内に開始する。全血サンプルを好ましくは少なくとも３０分間対象化合物とインキュベーションする。より好ましくは、インキュベーション期間は、少なくとも１時間であり、さらにより好ましくは、全血サンプルと対象化合物とのインキュベーションは少なくとも２時間である。好ましくは、全血サンプルを対象化合物と４８時間以下、より好ましくは２４時間以下インキュベーションする。好ましいインキュベーション期間は３０分〜２４時間である。更なる好ましいインキュベーション期間は２〜２４時間である。より好ましくは、インキュベーション期間は３０分〜４時間である。
【００１８】
インキュベーションは、室温（２０℃）以上の温度で行う。好ましくは、サンプルを生理学的条件下で（温度：３５〜３９℃、好ましくは約３７℃、ＣＯ２濃度３〜７％、好ましくは約５％）インキュベーションする。
【００１９】
方法２）第２の可能性は、対象化合物をドナーに投与し（例えば、注入により）、その後全血サンプルを採集することである。
【００２０】
対象化合物を投与することと全血サンプルを採集することとの間に待機時間がある。該待機時間は３０分〜２４時間である。
【００２１】
さらに２つの方法の組み合わせが可能であり、即ち、ドナーに対象化合物を投与し、ドナーの全血サンプルを採集し、そして全血サンプルに対象化合物を加えることである。
【００２２】
曝露の後、サンプルを更に処理する。更なる処理は、全血サンプルから血液細胞を除去することを含むが、それに限定されない。場合により、フィブリノーゲン及び凝固因子をサンプルから更に除去する。好ましくは、全血サンプルを、ドナーからの採集後４時間以内に、より好ましくはドナーからの血液サンプルの採集後３時間以内に更に処理される。最も好ましくは、全血サンプルの処理は、ドナーからの血液サンプルの採集後３０〜６０分以内になされる。対象化合物と全血サンプルのインキュベーションの場合（方法１に従う曝露又は方法１及び２の組み合わせ）、血液サンプルの更なる処理は、インキュベーションの期間の後、好ましくはインキュベーション時間の終わりの後５〜６０分以内になされる。
【００２３】
ＰＴＸ３は、前記全血サンプルに由来する血清又は血漿において測定されうる。ＰＴＸ３レベルの測定は、対象化合物とのインキュベーションの後全血サンプルから得られた新鮮な血漿又は血清において行われうる。あるいは、血漿又は血清は、凍結させることができ、そして後日、解凍してＰＴＸ３レベルを測定することができる。
【００２４】
用語「血漿」は、血液の液体部分を指す。血漿は、遠心により血液細胞（赤血球、白血球、血小板）を除去することにより得られる。上清（＝血漿）は、血清、フィブリノーゲン及び他の凝固因子を含む。したがつて、血清は凝固因子なしの血漿である。
【００２５】
用語「血液細胞」は、血液中に普通に見出される任意のタイプの任意の細胞を指す。血液細胞は、赤血球、白血球及び血小板を含むが、それらに限定されない。
【００２６】
全血サンプル又は血漿の凝固を防止又は遅延させるために、凝固防止剤をサンプルに加える。好ましくは、凝固防止剤は、ヘパリン（例えはヘパリンＮａ、例えば３０ＵＳＰ〜１４３ＵＳＰ単位のヘパリンナトリウム（凍結乾燥された）又は６０〜９０ＵＳＰ単位のヘパリンナトリウム（噴霧コーティングされた））、クエン酸塩（例えば約０．４％の最終濃度）又はシュウ酸塩である。通常、凝固防止剤は、サンプルを入れる容器（例えばチューブ）の内表面にコーティングされる。このようなコーティングされたチューブは当業者に周知である（例えば、BD Diagnostic SystemsのVacutainer又はGreiner-Bio-oneのvacuette）。他の可能性は、血液の採集後５〜１５分以内に（好ましくは採集後５分未満に、より好ましくは採集後１分未満に）、サンプルに凝固防止剤を加えることもできる。ヘパリン処理した血漿は、凝固を防止するためのヘパリンを含む血漿である。
【００２７】
ＰＴＸ３の測定方法は、当業者に周知である。それは、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用することにより測定されうる。ＥＬＩＳＡ試験は、当業者に周知である。ＰＴＸ３を測定するために、典型的にはサンドイッチＥＬＩＳＡが使用される。キットは市販されている（例えば、ALEXIS BiochemicalsのＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ−８５０−２９９）。好ましくは、ＰＴＸ−３レベルは、増感化学発光（ＥＣＬ）ＥＬＩＳＡにより測定される。
【００２８】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、例えば、（１）固体支持体（例えばプレート）を捕捉抗体でコーティングする、（２）サンプル（血漿）を加えそして存在する任意の抗原を捕捉抗体に結合させ；（３）抗原に結合する検出抗体を加え（４）検出抗体に結合する酵素結合二次抗体を加え；（５）酵素により検出可能な形態に変換される基質を加えることにより行われる。
【００２９】
ＥＣＬ  ＥＬＩＳＡにおいて、二次抗体に結合された酵素は、直接又は間接的に、ＥＣＬ基質を、化学発光を放出する形態に変換する。適当な酵素は、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）である。適当なＥＣＬ基質は、例えばルミナールである。酵素は、対象分子のすぐ近くでＥＣＬ基質の増感された試薬への変換を触媒し、これは、過酸化水素により更に酸化されると三重項（励起された）カルボニルを産生し、これは一重項カルボニルに崩壊するとき光を放出する。増感化学発光は、微量のバイオ分子の検出を可能とする。タンパク質は、フェムトモル量まで検出されうる。
【００３０】
別のＰＴＸ３測定方法は、比色ＥＬＩＳＡアッセイである。比色ＥＬＩＳＡにおいて、二次抗体に結合した酵素は、基質を分光光度法により検出可能な形態に直接又は間接に変換する。適当な酵素は、例えば、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）又はＣＮ（４−クロロ−１−ナフトール）と組み合わせたセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素である。他の適当な酵素は、例えばナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート又はニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロム−４−クロロ−３−インドキシルホスフェートｐ−トルイジン（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）と組み合わせたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。
【００３１】
対象化合物は、該化合物への曝露後測定されたＰＴＸ３レベルがコントロールのＰＴＸ３レベルに比較して有意に増加している場合、in vivoでＣＲＳを誘発するリスクを有する。
【００３２】
コントロールは、非曝露全血サンプルのＰＴＸ３レベルである。非曝露とは、該血液が対象化合物にも生理学的条件下でサイトカイン放出を引き起こすことが知られている他の化合物にも曝露されていないことを意味する。好ましくは、血液は処理の前に物質に全く曝露されなかった。
【００３３】
有意に増加したとは、ＰＴＸ３レベルが対照に比較してより高く、そして対照レベルに対する差が統計的に有意である(relevant)（ｐ≦０．０５、好ましくはｐ≦０．０１）ことを意味する。
【００３４】
今、本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、下記の図面と関連して、説明の目的でのみ本明細書に含まれそして特記しない限り限定的であることを意図しない特定の実施例により更に良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１は、MabCampath（登録商標）、Synagis（登録商標）、Orthoclone OKT（登録商標）３又はＬＰＳに曝露した後の全血中のＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）及び測定されたＰＴＸ３の放出（ＩＩ及びＩＩＩ）のグラフ表示を示す。全血サンプルを２つの異なる個体ドナー１（図１Ａ）及びドナー２（図１Ｂ)から採集しそして各々（０．００１〜１００ng／ml）ＬＰＳ（△）により又は治療タンパク質のヒトにおいて初めての(first-in-man)注入期間中in vivoで典型的に達成された薬物曝露レベルに対応する０．０１〜２００μg／mlの濃度範囲の陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（◆）、陰性対照Ab Synagis（登録商標）（□）及び比較物mAb Orthoclone OKT3（登録商標）（▲）により２時間処理した。ＣＤ１１ｂ発現を、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）においてＦＡＣＳ（Ｉ）により測定しそしてＰＴＸ３放出を、比色（ＩＩ）又は電気化学発光（ＩＩＩ）カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１Ｂ】図１は、MabCampath（登録商標）、Synagis（登録商標）、Orthoclone OKT（登録商標）３又はＬＰＳに曝露した後の全血中のＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）及び測定されたＰＴＸ３の放出（ＩＩ及びＩＩＩ）のグラフ表示を示す。全血サンプルを２つの異なる個体ドナー１（図１Ａ）及びドナー２（図１Ｂ)から採集しそして各々（０．００１〜１００ng／ml）ＬＰＳ（△）により又は治療タンパク質のヒトにおいて初めての(first-in-man)注入期間中in vivoで典型的に達成された薬物曝露レベルに対応する０．０１〜２００μg／mlの濃度範囲の陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（◆）、陰性対照Ab Synagis（登録商標）（□）及び比較物mAb Orthoclone OKT3（登録商標）（▲）により２時間処理した。ＣＤ１１ｂ発現を、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）においてＦＡＣＳ（Ｉ）により測定しそしてＰＴＸ３放出を、比色（ＩＩ）又は電気化学発光（ＩＩＩ）カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【図２Ａ】図２は、MabCampath（登録商標）、Synagis（登録商標）、Orthoclone OKT（登録商標）３又はＬＰＳに曝露した後の全血中のＴＮＦ−α放出のグラフ表示を示す。全血サンプルを２つの異なる個体ドナー１（図２Ａ）及びドナー２（図２Ｂ)から採集しそして各々陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（◆）、陰性対照Ab Synagis（登録商標）（□）及び比較物mAb Orthoclone OKT（登録商標）3（▲）により又は（０．００１〜１００ng／ml）ＬＰＳ（△）により２時間処理した。ＣＤ１１ｂ及びＰＴＸ３濃度を血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。典型的には、mAb MabCampath（登録商標）は、両ドナーにおいて、強いＴＮＦ−α放出を引き起こし、１μg／mlのピークレベルに達したが、これに対して、mAb Synagis（登録商標）は、両ドナーにおいていかなる濃度でも陰性であった。MAb Orthoclone OKT（登録商標）3は、一方のドナーの血液においてのみＴＮＦ−αの用量依存的に増加したが（図２Ａ）、他方のドナーにおいては示さなかった（図２Ｂ）。
【図２Ｂ】図２は、MabCampath（登録商標）、Synagis（登録商標）、Orthoclone OKT（登録商標）３又はＬＰＳに曝露した後の全血中のＴＮＦ−α放出のグラフ表示を示す。全血サンプルを２つの異なる個体ドナー１（図２Ａ）及びドナー２（図２Ｂ)から採集しそして各々陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（◆）、陰性対照Ab Synagis（登録商標）（□）及び比較物mAb Orthoclone OKT（登録商標）3（▲）により又は（０．００１〜１００ng／ml）ＬＰＳ（△）により２時間処理した。ＣＤ１１ｂ及びＰＴＸ３濃度を血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。典型的には、mAb MabCampath（登録商標）は、両ドナーにおいて、強いＴＮＦ−α放出を引き起こし、１μg／mlのピークレベルに達したが、これに対して、mAb Synagis（登録商標）は、両ドナーにおいていかなる濃度でも陰性であった。MAb Orthoclone OKT（登録商標）3は、一方のドナーの血液においてのみＴＮＦ−αの用量依存的に増加したが（図２Ａ）、他方のドナーにおいては示さなかった（図２Ｂ）。
【図３Ａ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｂ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｃ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｄ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｅ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｆ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｇ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｈ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｉ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図３Ｋ】図３は、異なる濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）のmAb MabCampath（登録商標）(◆)、Orthoclone OKT（登録商標）３(▲)、Synagis（登録商標）(□)、又はＬＰＳ(△)の存在下で２時間後分析された５〜１０人の健康な個体からの全血サンプルにおいて測定したＣＤ１１ｂ＋好中球の活性化（Ｉ）ならびにＰＴＸ３（ＩＩ）及びＴＮＦ−α（ＩＩＩ）の放出のグラフ表示である。ＰＴＸ３及びＴＮＦ−αを、血漿（全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた）において測定した。Ａ)：ドナー１、Ｂ）：ドナー２、Ｃ）：ドナー３、Ｄ）：ドナー４、Ｅ）：ドナー５、Ｆ）：ドナー６、Ｇ）：ドナー７、Ｈ）：ドナー８、Ｉ）：ドナー９、Ｋ）：ドナー１０
【図４Ａ】図４は、MabCampath（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたMabCampath（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをMabCampath（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ）：ドナー６、Ｂ）：ドナー７、Ｃ）：ドナー８、Ｄ）：ドナー９、Ｅ）：ドナー１０
【図４Ｂ】図４は、MabCampath（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたMabCampath（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをMabCampath（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ）：ドナー６、Ｂ）：ドナー７、Ｃ）：ドナー８、Ｄ）：ドナー９、Ｅ）：ドナー１０
【図４Ｃ】図４は、MabCampath（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたMabCampath（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをMabCampath（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ）：ドナー６、Ｂ）：ドナー７、Ｃ）：ドナー８、Ｄ）：ドナー９、Ｅ）：ドナー１０
【図４Ｄ】図４は、MabCampath（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたMabCampath（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをMabCampath（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ）：ドナー６、Ｂ）：ドナー７、Ｃ）：ドナー８、Ｄ）：ドナー９、Ｅ）：ドナー１０
【図４Ｅ】図４は、MabCampath（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたMabCampath（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをMabCampath（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ）：ドナー６、Ｂ）：ドナー７、Ｃ）：ドナー８、Ｄ）：ドナー９、Ｅ）：ドナー１０
【図５Ａ】図５は、Synagis（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたSynagis（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをSynagis（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ)：ドナー６、Ｂ）ドナー７、Ｃ)ドナー８、Ｄ）ドナー９、Ｅ）ドナー１０
【図５Ｂ】図５は、Synagis（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたSynagis（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをSynagis（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ)：ドナー６、Ｂ）ドナー７、Ｃ)ドナー８、Ｄ）ドナー９、Ｅ）ドナー１０
【図５Ｃ】図５は、Synagis（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたSynagis（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをSynagis（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ)：ドナー６、Ｂ）ドナー７、Ｃ)ドナー８、Ｄ）ドナー９、Ｅ）ドナー１０
【図５Ｄ】図５は、Synagis（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたSynagis（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをSynagis（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ)：ドナー６、Ｂ）ドナー７、Ｃ)ドナー８、Ｄ）ドナー９、Ｅ）ドナー１０
【図５Ｅ】図５は、Synagis（登録商標）への曝露後のＰＴＸ３（Ｉ）、ＴＮＦ−α（ＩＩ）及びＩＦＮ−γ（ＩＩＩ）の放出動態のグラフ表示を示す。Ｙ軸：血漿におけるＰＴＸ３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの測定濃度；Ｘ軸：全血サンプルに加えられたSynagis（登録商標）の濃度（２００μg／ml、１００μg／ml、１０μg／ml、１μg／ml、０．１μg／ml、０．０１μg／ml）。ヒト全血サンプルをSynagis（登録商標）と３０分（◆）、１時間（▲）、２時間（□）及び４時間（○）インキュベーションした。５人の健康なドナーについての結果を示す：Ａ)：ドナー６、Ｂ）ドナー７、Ｃ)ドナー８、Ｄ）ドナー９、Ｅ）ドナー１０
【図６Ａ】図６は、ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）及びＰＴＸ３放出（図６Ｃ）のダイナミックレンジのグラフ表示を示す。ダイナミックレンジの測定のために、１０人の健康なドナーからの血液サンプルを指示された濃度のMabCampath（登録商標）の存在下で２時間インキュベーションした。各曲線は、ドナー１〜１０人の１人から収集されたデータを表す。
【図６Ｂ】図６は、ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）及びＰＴＸ３放出（図６Ｃ）のダイナミックレンジのグラフ表示を示す。ダイナミックレンジの測定のために、１０人の健康なドナーからの血液サンプルを指示された濃度のMabCampath（登録商標）の存在下で２時間インキュベーションした。各曲線は、ドナー１〜１０人の１人から収集されたデータを表す。
【図６Ｃ】図６は、ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）及びＰＴＸ３放出（図６Ｃ）のダイナミックレンジのグラフ表示を示す。ダイナミックレンジの測定のために、１０人の健康なドナーからの血液サンプルを指示された濃度のMabCampath（登録商標）の存在下で２時間インキュベーションした。各曲線は、ドナー１〜１０人の１人から収集されたデータを表す。
【図７】図７は、ＥＣＬ ＥＬＩＳＡによるＰＴＸグラフの検出範囲の表示を示す。測定をドナー１〜１０人から採集された全血サンプルから血液細胞を除去することにより得られた血漿において行った。標準プロットは、濃度フレーム及び検出範囲に対する測定された標準の線形性を示す。Ａは、検出範囲より上のシグナルを示し、Ｂは検出範囲内のシグナルを示し、Ｃは検出範囲より低いシグナルを示す。Ｘ軸は濃度（pg/mgl）を、Ｙ軸はシグナル強度を示す。
【図８Ａ】図８は、ＴＧＮ１１４１２様抗体、MabCampath（登録商標）（陽性対照）及びEribitux（陰性対照）への曝露後のＰＴＸ３の放出のグラフ表示を示す。２つの異なる個体からの血液を、濃度０．１、１．０、１０及び１００μg／mlにおいて陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（○）又は陰性対照Ab Eribitus（登録商標）（◇）及び比較物ＴＧＮ１４１２様mAb（■）で２４時間処理した。ＰＴＸ３（Ｉ）及びＴＮＦ−α放出（ＩＩ）を、電気化学発光カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。図８Ａ：ドナーＡ；図８Ｂ：ドナーＢ
【図８Ｂ】図８は、ＴＧＮ１１４１２様抗体、MabCampath（登録商標）（陽性対照）及びEribitux（陰性対照）への曝露後のＰＴＸ３の放出のグラフ表示を示す。２つの異なる個体からの血液を、濃度０．１、１．０、１０及び１００μg／mlにおいて陽性対照mAb MabCampath（登録商標）（○）又は陰性対照Ab Eribitus（登録商標）（◇）及び比較物ＴＧＮ１４１２様mAb（■）で２４時間処理した。ＰＴＸ３（Ｉ）及びＴＮＦ−α放出（ＩＩ）を、電気化学発光カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。図８Ａ：ドナーＡ；図８Ｂ：ドナーＢ
【００３６】
実施例：
実施例で言及された市販の試薬は、特記しない限り製造者の使用説明書にしたがって使用された。
【００３７】
実施例１：
Ａ）物質及び方法
試験物質
最も重症なＣＲＳを生じる抗CD28 mAb TGN1412（Suntharalingam G, et al., Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006): 1018-28）は公に入手可能ではないので、本発明者等は、再製した(remanufactured)抗ＣＤ２８ヒトＩｇＧ、ＴＧＮ１４１２様抗体、抗ＣＤ３mAb Muromonab-CD3(Orthoclone OKT（登録商標）３）を利用した（Chatenoud L, Ferran C, Legendre C. In vivo cell activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and modulation by steroids. Transplantation. 49(1990): 697-702) and , in particular, the anti-CD52 mAb Alemtuzumab(MabCampath（登録商標））as reference standards(Wing MG, et al. Mechanism of first-dose cytokine-release syndrome by CAMPATH（登録商標）1−H: involvement of CD16(FcgammaRIII) and CD11a/CD18(LEA-1)on NK cells. J Clin. Invest. 98(1996): 2819-26), in accordance to the Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials(ESG Final Report: EXPERT SCIENTIFIC GROUP ON PHASE ONE CLINICAL TRIALS, Final Report, Department of Health(UK), 30. November 2006)。
【００３８】
比較物：Muromonab-CD3(Orthoclone OKT（登録商標)3）、抗CD３マウスIgG2a、Jansen Cilag AG, Switzerland, Lot. No.BN 6GSTV00, 有効期限(Expiry date): ２００７年４月, ストック１０mg／ml（Centicon Ultracel YM-100. Cat. No. 4211, Miconにより１mg／ml注入溶液から濃縮した）、濃度及び純度を、Bradford分析及びSDS-PAGEによりチェックした。４℃で一定分量保存し、そして更にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した（「全血アッセイ」参照）。
【００３９】
腎移植患者においてＣＲＳを発症するマウスIgG2a抗CD3 mAb Orthoclone OKT（登録商標）3を追加の参照薬物として使用する。それは、試験された事例の４０％においてＴＮＦ−α放出について陽性であった（図２、３及び６）。
【００４０】
再製した抗CD28ヒトIgG、TGN1412様抗体（US2006/0286104A1にTeGenero TGN1412公表された配列に基づいて）ストック１１．２mg／ml、濃度及び純度をBradford分析及びSDS-PAGEによりチェックした。−８０℃に貯蔵し、ＰＢＳで更に希釈した。
【００４１】
陽性対照：アレムツズマブ（（MabCampath（登録商標））、抗CD52ヒト化IgG1、Schering, Switzerland, Lot.no. 42018R, 有効期限２００７年５月及び42019T、有効期限：２００７年１２月、ストック１０mg／ml、無菌液、４℃で一定分量保存；ＰＢＳで更に希釈した（「全血液細胞アッセイ」参照）。
【００４２】
白血病、リンパ腫及び多発性硬化症患者において初回投与でＣＲＳを引き起こすことが知られているヒト化IgG1抗CD52 mAb MabCampath（登録商標）（Wing MG, et al., Mechanism of first-dose cytokine-released syndrome by CAMPATH（登録商標）1-H: involvement of CD16(FcgammaRIII) and CD11a/CD18(LFA-1) on NK cells. J Clin. Invest. 98(1996):2819-26）をサイトカイン放出及び付随する好中球の活性化のための陽性対照として使用する。MabCampath（登録商標）は、試験された１つを除くすべてのサンプルにおいて６０±１０pg/mlの閾値（「閾値」参照）を超えてＴＮＦ−α放出を誘導した（図２、３及び６、表５）。動態学研究の最初のドナーは、MabCampath（登録商標）とのインキュベーションの４時間後にのみＴＮＦ−α分泌のこの閾値に達した。
【００４３】
陰性対照抗体：パリビズマブ（Synagis（登録商標）)、抗RSVヒト化IgG1、Abbott Laboratories, Lot.no.20282 TF,有効期限２００８年６月、ストック１００mg／ml、医薬製品をエンドトキシンフリー水で再構成、−８０℃で一定分量保存し、ＰＢＳで更に希釈した（「全血液細胞アッセイ」参照）。
【００４４】
いずれのタイプのＣＲＳとも関連していない子供の先天性心疾患のため適用されるヒト化IgG1抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）mAb Synagis（登録商標）を陰性対照として使用する。MAb Synagis（登録商標）は、試験されたすべての事例においてサイトカイン放出について陰性であった（図２、３及び６）。
【００４５】
患者の約３％において重い注入反応が起こったヒト上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに特異的に結合するErubitux(Cetuximab（登録商標））、組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体、ストック２mg／ml、４℃で一定分量保存し、そしてＰＢＳで更に希釈した。
【００４６】
薬物濃度範囲
分析されるべき医薬製品を、０．０１〜２００μg／ml（０．０１μg／ml、０．１μg／ml、１μg／ml、１０μg／ml、１００μg／ml及び２００μg／ml又は０．１μg／ml、１μg／ml、１０μg／ml及び１００μg／ml）の濃度範囲で試験した。この範囲は、最も多くの例において、それぞれ薬物動態学（ＰＫ）プロフィルから誘導された、ヒトにおいて始めての（first-in-man）投与について予測されたそれぞれの製品のピーク曝露レベルを包含する。すべての参照薬物を同じ濃度で平行して分析し、それにより処置された患者におけるそれぞれの薬物の典型的な血漿曝露も包含する。ＰＢＳコントロールはベースラインレベルを決定するために含まれた。
【００４７】
薬物濃度＞２００μg／mlは、血液由来の細胞の死をもたらす、参照薬物、mAb MabCampath（登録商標）の細胞毒性により及び許容できない希釈を回避することにより全血に加えられうる容量制限によりＷＢＡに殆どなじまない。
【００４８】
全血液細胞アッセイ（ＷＢＡ）
特記しない限り、健康な血液ドナーからの全血は凝固防止剤としてのヘパリンリチウ
ムを含有するバキュテイナーチューブ内に採集された(Blood Donation Center, Swiss Red Cross, Basel, Switzerland, or Roche Pool)。血液を、採集後に１〜３時間内に処理し、そして関連医薬製品の濃度の増加とともに３０分〜４時間及び２４時間３７℃でコインキュベーションした。予備評価実験は、４時間以内に開始された血液処理で最適の性能条件を示した。もし４時間以内でなければ赤血球の溶解がアッセイを妨害するであろう。参照抗体 MabCampath（登録商標）、Orthoclone OKT（登録商標）3及びSynagis（登録商標）を含む医薬製品を下記の濃度で分析した：０．０１μg／ml、０．１μg／ml、１μg／ml、１０μg／ml、１００μg／ml及び２００μg／ml。ＴＧＮ１４１２様抗体を下記の濃度で分析した：０．１μg／ml、１μg／ml、１０μg／ml及び１００μg／ml。試験されるべき品目５μlを含有する９６ウエルプレートのＵ底ウエルに血液１９５μlをトリプリケートで加えた。これらの条件は、少なくとも７０μlの血漿を得るため及びそれぞれ血漿におけるＰＴＸ３、多重サイトカイン測定及び最後にＣＤ１１ｂフローサイトメトリー細胞分析を行うのに十分な細胞を得るための実行可能性及び効率が最適となる。血液細胞の内因性活性化はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を含有するコントロールを含むことにより評価された。
【００４９】
５％ＣＯ２でのインキュベータにおける３７℃で３０分〜４時間／２４時間のインキュベーション後に、プレートを１８００gで５分間遠心した。上清（約７０μlの血漿を含有する）を注意深く除去しそして−７０℃で一定分量で凍結させた。７０μlのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を細胞ペレットに加えそして穏やかに混合した。
【００５０】
ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ多重アッセイ（ＭＳＤ）
血漿におけるサイトカインの測定のために、血漿を解凍した。予備試験は、サイトカインのレベルが新しい血漿サンプルと解凍した血漿サンプルとの間で差がないことを示した。サイトカイン濃度は、製造者のプロトコール(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)(Human Cytokine Assay, MS2400 custom plate human TNF-α and IFN-γ２erPlex from MSD)に従う超高感度ヒトサイトカインアッセイにより決定された。プレートを、MSD Discovery workbench software2.0(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA,USA)を使用してSector Imager 2400で分析した。
【００５１】
データは、トリプリケートウエル(triplicate wells)からの血漿上清に関する測定値の平均として示される。結果を、pg／mlで表示する。
【００５２】
蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ分析のために、全血液細胞５０μl（全血液細胞アッセイ参照）を、抗体ＣＤ４５ＰｅｒＣＰ，（Cat. No.345809,BD Pharmingen）、ＣＤ１１ｂＰＥ（Cat No. 555388, BD Pharmingen）及びＣＤ１６ＦＩＴＣ（Cat. No.554406, BD Pharmingen）と室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション時間後に、ＦＡＣＳLysis Solution(Cat,No. 349202, BD Pharmingen)４５０μlを細胞懸濁液に加えた。染色されそして固定された細胞を室温で暗所に貯蔵しそしてＣＤ１６＋／ＣＤ４５＋好中球上のＣＤ１１ｂのアップレギュレーション（Nicholson et al. A novel flow cytometric assay of human whole blood neutrophil and monocyte CD11b levels: upregulation by chemokines is related to receptor expression, comparison with neutrophil shape change, and effects of a chemokine receptor(CXCR2) antagonist. Pulm Pharmacol Ther. 20(2007):52-9.）のために次の日フローサイトメトリー(BD FACS Calibur; CellQuestPro4.0.2.Software, manufacturer ? BD Bioscience San Jose CA, USA)により分析した。
【００５３】
ヒト血漿におけるＰＴＸ３の比色ＥＬＩＳＡ
ＰＴＸ３ヒト検出セット(Cat.No.ALX-850-299,Alexis Biochemicals(ALEXIS Corporation, Lausen, Scweiz)を使用してサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。捕捉抗体（７００ng/ml）を４℃で一晩コーティングした後、９６ウエルプレート（Cat. No. 446612, Nunc Maxisorpy（商標）, Nunc A/S）をＰＢＳ-0.05％ｔｗｅｅｎで洗浄しそして３７℃で１〜２時間ＰＢＳ−０．２％ゼラチン緩衝液でブロッキングした。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ−２％ＢＳＡ（ｔｗｅｅｎ０．０５％、ＰＢＳｐＨ７．４）で組換えヒトＰＴＸ３タンパク質を希釈することにより較正液(calibrators)を調製した。サンプルと較正液を３７℃で２時間インキュベーションし、続いて３７℃で１時間ビオチン化検出抗体（５０ng/ml）とインキュベーションした。サンプルをストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Cat. No. 7100-05, Southern Biotech Birmingham,USA）と４５分間インキュベーションして比色反応を開始し、次いでＴＭＢ（テトラメチルベンジジン,Cat, No. T4444, Sigma Saint Louis,USA）と１５分間インキュベーションし、次いで濃硫酸で停止させた。プレートをSoftMax Pro sotware(Molecular Devices, USA)を使用してＥＬＩＳＡリーダーで４５０nmで読み取った。
【００５４】
ヒト血漿におけるＰＴＸ３のＥＣＬ ＥＬＩＳＡ
MSD QuickPlexカスタムプレート(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)及びイムノアッセイを、ＰＴＸ３ヒト検出セット(Cat. No. ALX-850-299, Alexis)を使用する電気化学発光によるＰＴＸ３測定用にデザインした。捕捉抗体（１μg／ml）をQuickPlexリンカー(Cat. No. K15A06-2, MesoScaleDiscovery)に結合させそしてＭＳＤの使用説明書(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)にしたがってイムノアッセイを行った。プレートをSector Imager 2400 Reader(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)で分析した。
【００５５】
データは、トリプリケートウエルから血漿上清に関する測定値の平均として示される。結果をng／mlで表示する。
【００５６】
閾値の定義（陽性対照）
サンプルは、以下の２つの基準：
（ｉ）６０±１０pg／mlのカットポイントより高かったＴＮＦ−αレベルを測定した。この閾値は、MabCampath（登録商標）の初回注入後にＣＲＳを発症した多発性硬化症患者の血漿から採集されたin vivoデータに由来する(Moreau T, et al. Transient increase in symtoms associated with cytokine release in patients with multiple screlosis. Brain. 119(1996):225-37)。６０±１０pg／mlは、それぞれの患者群において重症なＣＲＳに関連していることが報告された最も低いＴＮＦ−αレベルであった。同様な範囲にあるＴＮＦ−α値が、リツキシマブの初回注入後のＣＲＳを示す癌患者に関して見出された(Winkler U, et al., Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8), Blood. 94(1999): 2217-24)。
【００５７】
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ＋好中球の百分率は３０％を超えた。
【００５８】
この閾値は、サイトカイン放出がない場合ですら、好中球の活性化は、ある程度観察され、時にはドナーに依存して２５〜３０％までの値に達することにより説明される。
【００５９】
統計的評価
平均値及び標準偏差をトリプリケートから計算した。動力学的範囲の評価及び分散係数の計算を、Graphpad prism 4により行った(GraphPad Software Inc, La Jolla. USA)。LLOD及びLLOQを、LOD Fit １．０で計算した(Roche Pharma Informatics)。
【００６０】
in vivoサイトカイン放出とin vitro評価の関係
ＷＢＡプロトコールは、関連医薬製品の濃度を増加させながら、採集後１〜３時間以内に、健康な個体又は患者からのヘパリン処理血液の４時間までの３７℃でのＯＫＴ（登録商標）コインキュベーションについて予測する。その後これらのサンプルに由来する血漿を、ＰＴＸ３ならびに前炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの放出について分析する。
【００６１】
このプロトコールは、in vivoでの状況をできる限り模倣する：ＣＲＳを引き起こすことが報告された抗体は初回注入の開始後０．５〜４時間以内に、ＴＮＦ−α及び／又はＩＦＮ−γ及び潜在的に他のサイトカイン及びケモカイン、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８の全身系放出を誘導する(Moreau T, et al., Transient increase in symptom associated with cytokine release in Patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996): 225-37; Suntharalingam G, et al., Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006): 1018-28)。更に全身性炎症性応答症候群を有する又は敗血症性ショックを起こす患者において、ＰＴＸ３血漿レベルは、最初の２４時間の間に劇的に増加しそして臨床的スコア及び疾患の重症さと相関する(Muller B, et al., Circulating levels of the long pentraxinＰＴＸ３ correlate with severity of infection in critically ill patients, Crit Care Med. (2001)29:1404-1407)。総じてこれらの可溶性因子は、放出され、そして血流を介して体内循環されるサイトカインの量、位置、タイミング及びタイプに明らかに依存して変化する重症度の相当な数の症状を引き起こし、そして影響すると考えられる。
【００６２】
終点
重要な前炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの薬物誘導サイトカイン放出、分泌のリスク及び好中球上の接着分子ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションのリスクに取り組むために、２つのタイプの終点が確立された。
【００６３】
ａ．前炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ
サイトカインの中でも、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γは、初回注入に関連するＣＲＳに関して繰り返し述べられている。主としてＴＮＦ−αは、それぞれの薬物により放出されるべき動態学的に最初のかつペースメーキングサイトカインであると思われ、ＴＮＦ−α放出の振幅はＣＲＳの重症度とある程度相関している(Suntharalingam G, et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355(2006): 1018-28; Winkler U, et al., Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8). Blood. 94(1999): 2217-24)。
【００６４】
表示されたサイトカインは、小容量のサンプルにおける多重アナライトの検出を可能とするMSD 超高感度サイトカインアッセイ（MesoScale Discovery, Gaithersburg Maryland,USA) の使用により測定される。慣用のＥＬＩＳＡに比較して、ＭＳＤシステムは、（ｉ）広いダイナミックレンジ及び高感度スルホ−ＴＡＧ電気発光検出（ｉｉ）多重スポットプレート上のパターン化されたアレイに固定された特異的抗体を介するアナライトの効率的な捕捉及び（ｉｉｉ）独特なバーコードシステムによるプレート製造レコード及び抗体スポットパターンへの完全なトレーサビリティーという利点を有する。
【００６５】
ｂ．好中球上の接着分子ＣＤ１１ｂ
サイトカイン放出は、血圧低下及びときには多重器不全をもたらす血液細胞の末梢組織への毛細管漏洩及び血管外遊出としばしば連動している(Suntharalingam G, et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006): 1018-28)。高レベルで接着分子ＣＤ１１ｂを発現する活性化された好中球(Nicoholson GC, et al., A novel flow cytometric assay of human whole blood neutrophil and monocyte CD11b levels: upregulation by chemokines is related to receptor expression, comparison with neutrophil shape change, and effects of a chemokine receptor(CXCR2) antagonist. Pulm Pharmacol Ther. 20(2007):52-9)は、毛細管漏洩及びその結果に関与している免疫細胞のサブセットに属すると思われる。したがって、ＣＤ１１ｂ＋好中球の画分の測定は、潜在的な下流事象、例えば好中球の活性化、毛細管壁への好中球の接着及び毛細管漏洩症候群をもたらす上皮内膜の付随する開始に前炎症性サイトカインの放出に関連している。
【００６６】
活性化された好中球の画分は、ＣＤ４５＋／ＣＤ１６＋血液細胞のサブセットに関してゲーティングするマルチカラーフローサイトメトリーにより測定されうる。それぞれの薬物の添加によるＣＤ１１ｂ＋細胞の百分率のベースラインに対する変化は、再評価されなかった。
【００６７】
閾値
サイトカイン
血漿中の分泌されたＴＮＦ−αの量は、初回投与時のＣＲＳに関連した症状の数及び重症度と明らかに相関する。結果として、ＭＳＤ試験で決定されたＴＮＦ−αの量は、リスク評価に最も関連していると考えられる。MabCampath（登録商標）で処置された多発性硬化症患者(Moreau T, et al., Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1966): 225-37)ならびにリツキシマブで処置されたリンパ腫又は白血病患者(Winkler U, et al., Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8).Blood. 94(1999):2217-24)からex vivoで得られたデータにしたがえば、６０±１０pg／mlのＴＮＦ−αレベルは、陽性を陰性サンプルから識別するのに合理的なカットポイントと考えられた。この閾値は、ＣＲＳの軽度な型の誘導のために十分なＴＮＦ−αの最小レベルに相当する。
【００６８】
ＣＤ１１ｂ
ＴＮＦ−α又は他のサイトカインの１つの不存在下に、ＣＤ１１ｂ＋好中球のサブセットは、本明細書に述べたＷＢＡの条件下で約３０％までのベースライレベルに達することを示した。結果として、３０％の百分率がカットポイントとして使用された。したがって、ＣＤ１１ｂ＋好中球の＞３０％の値のみを陽性シグナルと考えた。
【００６９】
要約すると、ＴＮＦ−αレベル＞６０pg／ml及び＞３０％ＣＤ１１ｂ＋好中球を達成するサンプルは、臨床的に有意義なサイトカイン放出のリスクについて「陽性」と考えられた。
【００７０】
サイトカイン放出及び好中球活性化の長期的安定性
健康な個体からの全血における薬物で誘導されるサイトカイン放出及び付随する好中球活性化は、大きく変動するというよりはむしろ長期的に安定であると思われる。ゆえにサイトカイン放出の長期的安定性の研究はここでは繰り返さなかった。
【００７１】
技術的適格性
ＴＮＦ−αは、多くの場合にＣＲＳに罹っている患者において放出される動態学的に最初のサイトカインであることが分かったので、ＴＮＦ−αはＣＲＳのリスク評価のための重要なサイトカインであると思われる。結果として下記に詳述した技術的適格性プログラムは、主としてＴＮＦ−αで得られたデータを指す。
【００７２】
しかしながら追加のサイトカインＩＦＮ−γは、主に確認の理由で研究された。
【００７３】
接着分子ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションにより決定される、好中球活性化によりＴＮＦ−α放出がどの程度に達成されるかを評価するために、ＣＤ１１ｂ＋好中球のサブセットを平行して分析した。画期的なアプローチとしてＰＴＸ３をヒト血漿において測定して、好中球活性化を翻訳するための準備を評価し、そしてＰＴＸ３がＣＲＳのリスクの評価のための適切なパラメーターとして役立ちうるかどうかを決定した。
【００７４】
MabCampath（登録商標）は、ＷＢＡの技術的定性のための主要な参照薬物として選ばれた。何故ならば、大多数の血液ドナーは、MabCampath（登録商標）の存在下で適度〜強いサイトカイン放出を示したからである。
【００７５】
ＰＴＸ３測定及び好中球活性化（結果）
ＯＫＴ３（登録商標）
２つの異なる個体からの血液サンプルを、（０．００１〜１００ng／ml）リポ多糖（ＬＰＳ）又は、治療タンパク質のヒトにおいて最初の注入期間中in vivoで典型的に達成される薬物曝露レベルに相当する０．０１〜２００μg／mlの濃度範囲の陽性対照mAb MabCampath（登録商標）、陰性対照Ab Synagis（登録商標）及び比較物mAb Orthoclone OKT3（登録商標）で２時間処理した。ＣＤ１１ｂ発現をＦＡＣＳにより測定した。ＰＴＸ３放出を、比色又は電気化学発光カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７６】
血液との２時間のコインキュベーションの後、Synagis（登録商標）以外のすべての試験した薬物は、両ドナーにおいて好中球の活性化のための３０％閾値より大きいＣＤ１１ｂのアップレギュレーションを誘導した。更に、ＬＰＳ、MabCampath（登録商標）及びOrthoclone OKT3（登録商標）は、両ＥＬＩＳＡアッセイプラットホームにおける用量依存性ＰＴＸ３放出を引き起こした。比色及びＥＣＬ ＥＬＩＳＡ ＰＴＸ３用量応答曲線は、同様な形状を示したが、測定した濃度の並べての比較はそれぞれ０．１〜０．６ng／ml対１０〜６０ng／mlの範囲の値で２つの方法間で１００倍の差を示した（図１）。
【００７７】
臨床試験及びex-vivoでの研究において報告されたＰＴＸ３の血液レベルは、典型的には、８時間後の敗血症性患者の８００ng／mlに対して、コントロールでは２ng／mlより低い範囲にある（Bottazzi B, Garlanda C, Salvatori G, Jeannin P, Manfredi A, Mantovani A. Pentraxins as a key component of innate immunity. Curr Opin Immunol(2006)18: 10-15）。これらの値は、ＥＣＬアッセイで得られたＰＴＸ３濃度のスケールに相当し、かくして本研究におけるＰＴＸ３測定のために選ばれる方法としてこのアッセイが好まれる。
【００７８】
ＴＧＮ１４１２様抗体
２人の異なる個体からの血液を、治療タンパク質のヒトにおいて初めての注入期間中in vivoで典型的に達成される薬物曝露レベルに相当する０．１〜１００μg／mlの濃度範囲の陽性対照mAb MabCampath（登録商標）又は陰性対照Ab Erbitux（登録商標）及び比較物ＴＧＮ１４１２様mAbで２４時間処理した。ＰＴＸ３放出を電気化学発光カスタムサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図８に示す。
【００７９】
正確さ
最も正確なＰＴＸ３ ＥＬＩＳＡ法を決定するために、２人のヒト全血ドナーに由来する血漿を、０〜２５００pg／mlの範囲で組換えヒトＰＴＸ３濃度を増加させながらスパイキングした。次いでＰＴＸについてのシグナルをＥＣＬ ＥＬＩＳＡ対比色ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００８０】
ＥＣＬ法により測定されると、１０〜２５００pg／mlのスパイキング濃度におけるＰＴＸ３回収範囲は、第１のドナーで１２〜１３６５pg／mlでありそして第２のドナーでは１６〜２１０４pg／mlであった（表１）。
【００８１】
全く同じサンプルをＰＴＸ３比色アッセイで測定すると（表１）、値は３５５〜６４６４pg／mlの範囲にあった。
【００８２】
結論として、ヘパリン処理ヒト血漿におけるＰＴＸ３の測定における回収は、ＥＣＬ ＥＬＩＳＡ技術を使用するとより正確であることが見出された。したがってこの方法は、本研究においてＰＴＸ３の更なる測定のために選択された。
【００８３】
マトリックス効果
マトリックスがＰＴＸ３検出をどの程度妨害するかを決定するために、ヘパリン又はＥＤＴＡ凝固防止剤で処理された２人のドナーの血液から得られた血漿でＰＴＸ３標準を希釈した。回収されたＰＴＸ３濃度を較正液希釈剤で得られた標準曲線濃度と比較した。
【００８４】
ＥＣＬ
ＥＣＬアッセイにより、１０〜２５００ng／mlにおいて、回収されたＰＴＸ３の全体の百分率は、ヘパリン処理血漿において８５±１３％でありそしてＥＤＴＡ血漿においては４０００％以上であった（表２）。
【００８５】
提供者により特定されたとおりヘパリン処理血液における測定のために比色法によるアッセイは適当ではない。
【００８６】
感度
２５人の健康な血液ドナーからのサンプルを、ＰＴＸ３終点について、検出の下限（ＬＬＯＤ）及び定量の下限（ＬＬＯＱ）を決定するために分析した（（IUPAC Technical Report）Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis, Pure and Applied Chemistry(2002)74:835-855)。
【００８７】
ＰＴＸ３測定のＬＬＯＤは、０．０６５ng／mlであり、ＬＬＯＱは０．４６６ng／mlであることが見出された（表３）。これは、ヒトＰＴＸ３検出セット抗体の供給者により与えられた値と一致しており、ＥＬＩＳＡ適用では７５pg／mlのＬＬＯＤである。
【００８８】
２〜１０００ng／mlＰＴＸ３の範囲にある値のみがex vivoでのＰＴＸ３分析により関連していると考えられるので、このアッセイは、ヒト血液におけるＰＴＸ３レベルの有意義な変化を測定するのに感度に関して非常によく適する。
【００８９】
ＣＤ１１ｂのフローサイトメトリー分析は、全血中の細胞の全セットに対する細胞のサブセットの測定に依存しており、それについて＜１．０％の感度がフローサイトメトリー分析の標準セッティングで容易に得られる。３０％ＣＤ１１ｂ＋好中球のカットポイントより上の値のみがリスク評価に関連していると考えられるので、フローサイトメトリー分析の検出感度が適当であると考えられている。
【００９０】
ＰＴＸ３応答の動力学的範囲及び動態学
ＰＴＸ３の分析に関して、ＥＣＬ ＰＴＸ３ ＥＬＩＳＡ試験の較正曲線の線形範囲は、典型的には０．６〜２５００ng／mlの範囲にある。この範囲は、敗血症及び内毒素ショック期間の２００〜８００ng／mlの範囲にある６〜８時間に報告された患者血液におけるＰＴＸ３値のピークと共に、臨床試験において又はいくつかの症状においてex vivoで患者からの血液において観察されたＰＴＸ３値の全スペクトルを包含する(Bottazzi B, Garlanda C, Salvatori G, Jeannin P, Manfredi A, Mantovani A. Pentraxins as a key component of innate immunity. Curr Opin Immunol(2006) 18: 10-15; Latini R., Maggioni A. P., Peri G., Gonzini L, Lucci D, Mocarelli P, Vago L, Pasqualini F, Signorini S, Soldateschi D, Tarli L, Schweiger C, Fresco C, Cecere R, Tognoni G, Mantovani A; Lipid Assessment Trial Italian Network(LATIN)Investigators. Prognosic significance of the long pentraxin PTX3 in acute myocardial infarction. Circulation(2004)110: 2349-2354; Muller B, Peri G, Doni A, Torri V, Landmann R, Bottazzi B, Mantovani A. Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlate with severity of infection in critically ill patients, Crit Care Med. (2001)29:1404-1407)。
【００９１】
本発明者等のアッセイにおいてPTX３放出は、プラトーに達することなく薬物濃度及びインキュベーション時間と共に増加した。適用された薬物濃度においてピークに達するサイトカイン及びＣＤ１１ｂ値と異なって、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ分泌は薬物インキュベーションの期間と共に増大するが、２時間後サイトカインの分泌程度は、試験されたドナーの９０％において６０pg／ml閾値に達するのに十分である。
【００９２】
全血に０．０１〜２００μg／ml  MabCampath（登録商標）負荷の２時間後、ＰＴＸ３の最大値２２〜８８ng／mlが１０人の健康なドナーから得られた（図６Ｃ）。
【００９３】
ＬＰＳ０．００１〜１００ng／mlに応答するＰＴＸ３放出のダイナミックレンジは、試験された５人の健康な個体について２２〜９１pg／mlの範囲にあって、僅かに広い範囲であった。
【００９４】
活性化された好中球の指標となる、ＣＤ１１ｂ＋好中球のサブセットを測定するためのフローサイトメリトーアッセイにおいて、ダイナミックレンジは１〜１００％の間隔内にある。好中球活性化評価において実際に得られた値は、典型的には３〜９７％ＣＤ１１ｂ＋好中球の範囲にあった（図３、表５）。
【００９５】
ＴＮＦ−αの分析のために、ＭＳＤ試験の較正曲線の線形部分は、典型的には１０〜１００００pg／mlの範囲にあり、これは、ＣＲＳを引き起こす薬物の注入時の臨床試験又は市販後においてex vivoで患者血液で報告されたＴＮＦ−α値の全セットを包含する(Moreau T, et al., Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996): 225-37; Moreau T, et al., Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996): 225-37; Winkler U, et al., Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8). Blood. 94(1999): 2217-24)。
【００９６】
それにしたがえば、４時間のMab Campath（登録商標）負荷において、６４〜６９０pg／mlＴＮＦ−α放出のピーク値が９人の健康なドナーからの全血において得られた。一人のドナーでは、２時間目のサイトカインレベルは低くそしてＴＮＦ−α放出は６０pg／ml閾値に達しなかった（図３、４及び５）。より高い範囲は、１２〜１９０４pg／mlの濃度でＩＦＮ−γピーク値で観察された（図４）。
【００９７】
特異性
全血アッセイの特異性は、２つのレベル：（ｉ）ドナー特異的応答及び（ｉｉ）薬物特異的応答で確立された。
【００９８】
ドナー特異性は、mAb MabCampath（登録商標）及びOrthoclone OKT3（登録商標）の存在下でサイトカイン及びＣＤ１１ｂ分析により検討され：ドナー２は、MabCampath（登録商標）に応答してＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの分泌に関して陽性であった。対照的に、ドナー１は、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの誘導に関してMabCampath（登録商標）に応答しなかった（図３、表５）。ドナー差はＰＴＸ３測定においても観察され、動態学研究のドナー１で３５ng／mlのベースライン値に対してドナー３、４及び５では３〜５ng／mlであった（図４及び５）。
【００９９】
アッセイは顕著な薬物特異性も確証する：mAb MabCampath（登録商標）はドナー３においてＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ放出を誘導したが、これに対してmAb Orthoclone OKT3（登録商標）は誘導しなかった（表５）。逆の傾向が、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの誘導によりmAb Orthoclone OKT3（登録商標）に強く応答したがmAb MabCampath（登録商標）添加後非常に少量のサイトカインを分泌したドナー１で見られた（表５）。
【０１００】
分散係数：濃度及びドナーにおける精度
分散係数（ＣＶ）がそれぞれの抗体の濃度又はドナーの選択にどの程度依存しているかを評価するために、１０人の個体からの血液サンプルを５つの異なる濃度のmAb MabCampath（登録商標）で試験し、そしてmAb MabCampath（登録商標）のそれぞれの濃度で１人のドナーからのサンプルで得られたＣＶ値を他の９人のドナーのＣＶ値と比較した。更に濃度におけるすべてのＣＶ値の平均及びＳＤを計算しそしてグループあたりの最小値（ＣＶｍｉｎ）及び最大値ＣＶ（ＣＶｍａｘ）値を算出した（表４）。
【０１０１】
ＰＴＸ３についてのＣＶ値の分析は、１．６〜２．５％のＣＶｍｉｎ値及び１３．４〜２３．５％のＣＶｍａｘ値を示し（表４）、平均ＣＶ値は、濃度間で非常に低い分散を示した（５．１〜９．８％）。
【０１０２】
ＣＶ値のより広い分布が、濃度曲線の下端を除いてＣＤ１１ｂアップレギュレーションアッセイで見出された（ＣＶｍｉｎ：１．０〜８．６％、ＣＶｍａｘ：４．７〜４２．０％、平均ＣＶ：２．５〜１９．９％）（表４）。
【０１０３】
結論として、ＰＴＸ３ＣＶ値は、ドナー及び濃度において適度に変化しそして薬物濃度と何ら相関も示さなかった。異なるドナーからのサンプル間でＣＶ値の有意な変化も観察されなかった。
【０１０４】
閾値評価
ＰＴＸ３放出がＷＢＡにおいて有意に陽性であると考えられる閾値を評価するために、本発明者等は、陰性対照mAb Synagis（登録商標）の存在下で２時間後に測定されたＰＴＸ３応答について平均＋２ＳＤの値を決定した。この研究のすべての濃度及び１０人すべてのドナーにおいて、このカットポイント値は２５ng／mlに相当する（表６）。
【０１０５】
したがって、この結果に基づいて、本発明者等は、２時間目の２５±５ng／mlＰＴＸ３濃度をＷＢＡにおいて陽性応答と陰性応答を区別するための閾値として使用することを提唱する。
【０１０６】
このような条件において、すべてのドナー１〜５は、mAb MabCampath（登録商標）及びmAb Orthoclone OKT3（登録商標）との２時間のインキュベーション後の応答について陽性であると考えられる。mAb MabCampath（登録商標）で興味深いことに、ドナー１は、ＴＮＦ−α（６４±１５pg／ml）及びＰＴＸ３（２２．７±３．５ng／ml）の両方の放出についてちょうど閾値に達する。更にＰＴＸ３応答は、mAb MabCampath（登録商標）で陽性としてドナー4を定性するのにサイトカイン分泌と整合するが、ＣＤ１１ｂアップレギュレーションは、３０％閾値より低くかった（表5）。更に、予想されたとおりサイトカイン分泌の点でSynagis（登録商標）に応答しなかったドナー３は、ＰＴＸ３放出に関しても陰性と思われる（１３．９９±０．６ng／ml）。対照的に、動態学研究のドナー１は、その結果単にSynagis（登録商標）（０．５時間）でのその高いＰＴＸ３ベースラインレベル（３６．４５±２．０１ng／ml）により、薬物曝露とは独立にＰＴＸ３について陽性と考えられる。
【０１０７】
要約すると、２時間後に血漿においてＰＴＸ３レベル＞２５ng／mlＰＴＸ３に達するサンプルは、臨床的に問題とされるサイトカイン放出のリスクについて「陽性」と考えられる。
【０１０８】
好中球活性化の程度を評価するための末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサブセットを含むＣＤ１１ｂアッセイと比較して、ＥＣＬ ＥＬＩＳＡカスタム技術に基づくＰＴＸ３測定は、下記の利点を有すると思われる：
●ヘパリン処理血漿はin vivoで適切な区分である
●希釈工程及びＦｉｃｏｌｌの添加（ＰＢＭＣ調製のために必要な）は回避される
●全血における好中球及び好酸球を含む、細胞フルセットの存在
●二重（ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ）アッセイフォーマットの代わりに単一（ＥＣＬ）
●サイトカイン放出症候群の典型的な症状がin vivoで観察されるときは、評価は、２時間の適切な時間枠内で行われる。
【０１０９】
表
表１：正確さ。増感化学発光（ＥＣＬ）ＥＬＩＳＡ（表１ａ）及び比色アッセイ（表１ｂ）を、ＰＴＸ３の検出方法として比較した。測定は、ヘパリン又はＥＤＴＡ凝固防止剤を含む２人のドナーからの血漿で行った。２人のヒト全血ドナーに由来する血漿を、０〜２５００pg／mlの範囲で、組換えヒトＰＴＸ３の濃度の増加とともにスパイキングした。＃トリプリケートからの平均、ｎ．ｅ．：評価できなかった。
【表１】
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【０１１０】
表２：マトリックス効果。増感化学発光（ＥＣＬ）ＥＬＩＳＡ（表２ａ）及び比色アッセイ（表２ｂ）を、ＰＴＸ３の検出方法として比較した。測定は、ヘパリン又はＥＤＴＡ凝固防止剤で処理した２人のドナーの血液から得られた血漿で行った。
【表２】
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【０１１１】
表３：サイトカイン測定の感度；検出の下限及び定量の下限
【表３】
2011524531.tif 000004
【０１１２】
表４：ＰＴＸ３（表４ａ）及びＣＤ１１ｂ（表４ｂ）の分析の分散係数（ＣＶ）：ドナー及び濃度（０．１〜２００μg／ml）における精度。（ＳＤ＝標準偏差）
【表４】
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【０１１３】
表５：ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＰＴＸ３の2時間−放出及び好中球活性化
【表５】
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【０１１４】
【表６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2011524531.tif 000024
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2011524531.tif 000029
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｋ】
2011524531.tif 000032
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2011524531.tif 000034
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2011524531.tif 000037
【図５Ａ】
2011524531.tif 000038
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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