(57)【要約】  本発明は、老化プロセスによって引き起こされた、好ましくはヒトの疾患または病状の治療における医薬または医薬組成物を製造するためのＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物の使用に関する。上記医薬組成物は、例えば上皮組織または造血細胞などの組織を再生するための治療に使用されることができ、また、バイオテクノロジーの研究またはプロセスにおいて真核細胞を使用するための、当該真核細胞の不死化に使用されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化異常のプロセスによって起こる、好ましくはヒトの疾患または病状の治療に対する医薬または医薬組成物を製造するための、ＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物の使用。
【請求項２】
上記疾患が、自然老化の結果としての自然な老化のプロセスに起因するものであることを特徴とする請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
上記疾患が、加速された老化における病理学的なプロセスに起因するものであることを特徴とする請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項４】
上記自然な老化のプロセスは、上皮組織または高い増殖レベルを有する組織に影響を与えるものであることを特徴とする請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項５】
上記上皮組織は、皮膚、好ましくは、表皮、内臓、角膜、肝臓、肺および毛球の群に属するものであることを特徴とする請求項４に記載の化合物の使用。
【請求項６】
上記高い増殖レベルを有する組織は、造血系細胞、好ましくはリンパ球、マクロファージおよび赤血球、ならびに胚芽細胞の群に属するものであることを特徴とする請求項４に記載の化合物の使用。
【請求項７】
上記細胞は、体細胞、体幹細胞または胚細胞であることを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８】
ＧＳＥ２４．２誘導化剤は、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞内において老化からの回復を誘導するタンパク質またはペプチドを発現させる塩基配列であって、以下の群に属するＧＳＥ２４．２の塩基配列の１個または数個により構成されているものであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物の使用：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２塩基配列により構成されている塩基配列（配列番号１）、
ｂ）ａ）の塩基配列の変異体であって、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかの配列を含む塩基配列である、遺伝的構成物。
【請求項９】
上記塩基配列がＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの配列であることを特徴とする請求項８に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
ａ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号１により構成されていることを特徴とする請求項８に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
ｃ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号３または配列番号５により構成されており、これらはそれぞれＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩのペプチドドメインをコードするものであることを特徴とする請求項８に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
上記塩基配列は、ＧＳＥ２４．２の配列を含むＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物であることを特徴とする請求項８に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
上記塩基配列は、ＧＳＥ２４．２の塩基配列またはＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物を含んでおり、かつ老化のプロセスを減少または逆転させることが可能なタンパク質またはペプチドを発現させる、ＧＳＥ２４．２の発現ベクターであることを特徴とする請求項８に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
上記発現ベクターは、プラスミドｐＬＮＣＸ２４．２であることを特徴とする請求項１３に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
ＧＳＥ２４．２誘導化剤は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内において老化を逆転させる活性を表すタンパク質またはペプチドであって、以下の群に属するアミノ酸配列の１個または数個により構成されている、請求項１に記載の化合物の使用：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２のアミノ酸配列により構成されているアミノ酸配列（配列番号２）、
ｂ）ａ）の配列に基づくアミノ酸配列の変異体であって、配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列。
【請求項１６】
ＧＳＥ２４．２誘導化剤はタンパク質であり、
上記タンパク質におけるａ）のアミノ酸配列が配列番号２により構成されていることを特徴とする請求項１５に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
ＧＳＥ２４．２誘導化剤はタンパク質であり、
上記タンパク質におけるｃ）のアミノ酸配列が配列番号４または配列番号６により構成されていることを特徴とする請求項１５に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
ＧＳＥ２４．２誘導化剤は、ヒト組織の再生細胞として用いられ得る、ＧＳＥ２４．２の上記塩基配列を用いて形質転換された、種々の細胞系統における真核細胞、好ましくはヒト細胞であることを特徴とする請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
老化異常に関連する疾患または病状を治療するための医薬組成物または医薬であって、
必要に応じて１つ以上のアジュバントおよび／または医薬的に認容され得る賦形剤とともに、治療的に有効な量にてＧＳＥ２４．２化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物を含んでおり、
老化のプロセスを減少または逆転させることが可能であり、かつ、本発明に係る使用により獲得され、ならびに請求項１から１８のいずれかに記載の化合物の使用により獲得される、医薬組成物または医薬。
【請求項２０】
ヒトに影響を及ぼす異常な老化のプロセスによって引き起こされる疾患または病状の治療の処置における、請求項１９に記載の医薬組成物の、使用。
【請求項２１】
生物医学研究に用いられる真核細胞、好ましくはヒトまたは動物の細胞を不死化させる処置における、請求項１９に記載の医薬組成物の、使用。
【請求項２２】
老化のプロセスが逆転または減少されているとともに、ＧＳＥ２４．２分子を含むことを特徴とする真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
ヒトの健康に適用させるためのバイオテクノロジー分野、およびより具体的には、加齢および細胞老化に関する疾患を患っている人に対して治療的に適用させるための、生物学的な化合物−塩基配列、ペプチド、およびヒトの形質転換細胞。
【０００２】
〔従来技術〕
ＴＴＡＧＧＧ配列（参照文献１）の多数の繰り返しにより構成されているテロメアは、ＤＮＡポリメラーゼがクロモソームの末端まで複製できないため、細胞周期のたびに短くなる。クロモソームの末端におけるテロメアの維持は、テロメラーゼ複合体によって行なわれる。この複合体のタンパク質成分であるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）は、触媒作用を有する逆転写酵素モチーフを含んでおり、一方、テロメアＲＮＡ成分は、内部にあるテロメアの繰り返し配列ＴＴＡＧＧＧと相補的な鋳型を用いて、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の作用を導く（参照文献２〜３）。近年、ヒトテロメラーゼ酵素複合体が、２つのタンパク質成分、ｈＴＥＲＴおよびジスケリン（dyskerin）、ならびにＲＮＡ成分であるｈＴＲのみからどのように構成されているかについて、報告されている（参照文献７）。ジスケリンが、「Ｈ／ＡＣＡ  ｂｏｘ」リボ核タンパク質に属するシュードウリジン合成酵素と推定される一方、Ｈ／ＡＣＡモチーフがｈＴＲ内に存在する。この複合体は、最終的に、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲおよびジスケリンのそれぞれ２つの分子により構成される。
【０００３】
テロメラーゼの発現は、成人の組織における多くの体細胞内では抑制されているが、多くの癌では高いままであり、このテロメラーゼは、クロモソームの整合性を保証するため、これらの癌の細胞内において不死の表現型に寄与している（参照文献６）。テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）のレベルは、最初の転写レベルで制御され（参照文献８）、またヒトでは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の５’領域における制御領域によって制御されている。この制御領域は、最大活性化のために必要であり、またｍｙｃ結合部位（Ｅ−ｂｏｘ）を含む（参照文献８〜９）。ｃ−ＭＹＣ転写因子は、ｈＴＥＲＴの発現を促進させるが、ｍａｄ１の発現が強化されると、ｈＴＥＲＴを抑制する（参照文献１０〜１１）。ｃ−ｍｙｃの転写制御には、多数のプロモーターが含まれ、なかでもＰ１およびＰ２が最も重要である（参照文献１２）。ｃ−ＭＹＣプロモーターのヌクレアーゼ過感受性エレメントＩＩＩ（ＮＨＥＩＩＩ）は、ｃ−ＭＹＣ転写の８５〜９０％を制御し、当初はＤＮＡｓｅＩに対して最も過感受性の部位として同定された（参照文献１３）。ＮＨＥＩＩＩは、ＤＮＡ鎖上にプリン−リッチ部位を含み、この部位は、ＤＮＡにおける二重螺旋構造とｎｏｎ−Ｂ形態との間のバランスを確立する能力がある（参照文献１４）。プリン−リッチなＤＮＡ鎖は、異なるＧ−カルテット（G quartets）による２つの分子内構造を形成でき（参照文献１５）、これらは転写抑制因子として機能するため、抗腫瘍性治療のターゲットとして用いられている。
【０００４】
テロメアの短縮、またはその二次構造の欠失は、細胞を老化および／またはアポトーシスに向かわせる原因となる。これらの２つのプロセスは、制御不能な細胞分裂および遺伝的不安定性を防止する生物学的なコントロールポイントとして機能する（参照文献４〜５）。テロメアの長さの制御についての欠損は、早期老化症候群および癌などの様々な疾患の病状に関わる（参照文献６）。
【０００５】
老化細胞は、ＤＮＡ合成を停止した生細胞であり、平板化されるとともに液胞が豊富な細胞質が存在し、独特の遺伝子発現プロファイルを有する。そして、老化細胞は、酸性ｐＨにおける、老化に付随する  −ガラクトシダーゼ（  −ｇａｌ）活性の増加を可視化する生化学的アッセイによって、および、時間内に細胞集団が倍加できないために、同定可能である。
【０００６】
ヒト細胞の老化は、テロメア侵食に関連付けられる。形質転換されていない正常な細胞は、細胞分裂プロセスごとにテロメアが短縮することによって死ぬ運命にある。一方、テロメラーゼを発現する癌細胞は、テロメアの長さを安定化させるので、不死となる。これらの知見により、テロメアが細胞の加齢を制御する生物時計として働くという仮説が提唱される。
【０００７】
テロメア侵食に関連する早期老化症候群の１つは、先天性角化異常症（ＤＣ）である。これは、非常にまれな遺伝的疾患であり、骨髄機能不全および高い癌性向によって特徴付けられ、これらは先天性角化異常症の患者の死につながる最も重大な原因である（参照文献１６〜１８）。主にＤＫＣ遺伝子の突発性変異によって、クロモソームと結びついた形（Ｘ−ＤＣ）で引き起こされる（参照文献１９〜２０）。この遺伝子は、テロメラーゼ複合体の成分となる、シュードウリジン合成酵素ドメインを含む５８ｋＤのタンパク質であるジスケリンをコードする。ジスケリンは、脊椎動物において、ＳｎｏＲＮＡｓ（小さい核小体のＲＮＡｓ）およびｈＴＲに存在する複数のＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘに結合する（参照文献２１）。ＳｎｏＲＮＡｓは、ジスケリンを介したＲＮＡシュードウリジル化の鋳型として機能する。Ｈ／ＡＣＡ  ＲＮＡは、Ｈ  ｂｏｘと、これに続くトリヌクレオチドＡＣＡを含む短い配列とを含む単連鎖領域によって分けられた、２つの可変長の範囲を含む（参照文献２２）。ＳｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡにおけるＤＫＣに結合する、３つの異なるタンパク質がある：Ｎａｐ２、Ｇａｒ１およびＮＯＰ１０（参照文献３、２２〜２４）。ＤＫＣ、Ｎａｐ２およびＮＯＰ１０は、密接に結合して、リボ核タンパク質複合体の安定性に関連する一方、Ｇａｒ１による相互作用は、より緩やかでありかつ一時的である（参照文献２５、２６〜２８）。したがって、ジスケリンは、ｈＴＲ（参照文献７、２４〜２９）の蓄積およびリボソーマルＲＮＡのシュードウリジル化（参照文献３０）に必須であるため、テロメラーゼ活性に必要である。ＤＣを有する患者においては、テロメラーゼ活性が減少しており、テロメア構造を維持できないため、年齢とともにクロモソームの不安定性が増加する。Ｘ−ＤＣ患者のリンパ芽球細胞および繊維芽細胞では、テロメラーゼ活性およびｈＴＲレベルが減少し（参照文献２１）、影響を受けていない細胞よりもテロメアが短い。テロメラーゼ活性の欠如は、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現によって救済され得る（参照文献２１、３１）。ｈＴＲの変異または欠失によって、先天性角化異常症の他の形態が引き起こされ、テロメアの短縮化の加速および早死を引き起こす。この欠損は、ｈＴＲの再発現によってのみ救済され得る（参照文献３１）。
【０００８】
近年、ジスケリンタンパク質のシュードウリジン合成酵素ドメインをコードする、２４−２として知られる遺伝的抑制因子（ＧＳＥ）が報告されている。ＧＳＥ２４．２は、ＤＣ−Ｘを有する患者の細胞内においてテロメラーゼ活性を回復させるため、テロメラーゼ複合体異常によって起こるこの病気および他の病気のための新しい治療的アプローチが発展しつつある（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書、SEQUENCE OF NUCLEOTIDES AND PEPTIDES GSE 24.2 OF DYSKERIN, WHICH CAN INDUCE TELOMERASE ACTIVITY, METHOD FOR OBTAINING SAME, THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF）。しかし、このＧＳＥ２４．２分子の新しい活性に関する知見によって、新しい治療的ツールおよび研究ツールを発展させることができる。
【０００９】
〔本発明の説明〕
＜簡単な説明＞
本発明の一実施形態は、老化のプロセスによって起こる、好ましくはヒトの疾患または病理学的な状態の治療に対する医薬または医薬組成物を製造するための、ＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物の使用（以下本明細書において、本発明に係る使用）により構成される。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤が、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞内において老化からの回復を誘導するタンパク質またはペプチドを発現させる塩基配列（以下本明細書において、本発明に係るＧＳＥ２４．２の遺伝子配列）であり、以下の群に属するＧＳＥ２４．２の塩基配列の１個または数個により構成されている：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２塩基配列により構成されている塩基配列（配列番号１）、
ｂ）ａ）の塩基配列の変異体であって、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかの配列を含む遺伝的構成物である、塩基配列。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ａ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号１により構成されている。
【００１２】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ｃ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号３または配列番号５により構成されており、これらはそれぞれＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩのペプチドドメインをコードするものである。
【００１３】
また、本発明の他の好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤が、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞内において老化を逆転させる活性を表すタンパク質またはペプチド（以下本明細書において、本発明に係るＧＳＥ２４．２タンパク質）であり、以下の群に属するアミノ酸配列の１個または数個により構成されている：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２のアミノ酸配列により構成されているアミノ酸配列（配列番号２）、
ｂ）ａ）の配列に基づくアミノ酸配列の変異体であって、配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列。
【００１４】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤はタンパク質であり、このタンパク質におけるａ）のアミノ酸配列が配列番号２により構成されている。
【００１５】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤はタンパク質であり、このタンパク質におけるｃ）のアミノ酸配列が、配列番号４または配列番号６により構成されている。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、老化異常に関連する疾患または病状を治療するための医薬組成物または医薬（以下本明細書において、本発明に係る医薬組成物）からなり、必要に応じて１つ以上のアジュバントおよび／または医薬的に認容され得る賦形剤とともに、治療的に有効な量にてＧＳＥ２４．２化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物を含んでいる。また、この医薬組成物または医薬は、老化のプロセスを減少または逆転させることが可能であり、かつ、本発明に係る使用により獲得される。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、老化の異常なプロセスによって引き起こされる、好ましくはヒトの疾患または病状を治療するための処置における、本発明に係る医薬的化合物の使用からなる。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施形態は、真核細胞、好ましくはヒト細胞からなり、その老化のプロセスが逆転または減少されており、かつ本発明に用いられるＧＳＥ２４．２分子を含むものである。
【００１９】
＜本発明の詳細な説明＞
本発明は、ジスケリンのフラグメントとして同定された（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書を参照）ＧＳＥ２４−２タンパク質（配列番号１）の発現が、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲのＲＮＡレベルを制御し、テロメラーゼ活性の回復を誘導できるという、本発明者らの観察結果に基づいている。この結果は、種々の細胞種；ジスケリンの変異体が発現されているＤＣ患者（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書）の細胞、および野生型のＤＫＣ対立遺伝子を有し、かつ低いテロメラーゼ活性を有する者（ＶＡ１３）の細胞の両方の細胞において観察されている（実施例４）。また、本発明における意味において、初めてＧＳＥ２４．２ペプチドを直接に（その遺伝子発現を利用せずに）使用し、その結果これがテロメラーゼ活性を再活性化できることを明らかにした（実施例１）。
【００２０】
同時に、ＧＳＥ２４−２タンパク質が、ｃ−ｍｙｃ発現を調節することによってｈＴＥＲＴタンパク質の転写を活性化することを示した。これは、ｍｙｃ／ｍａｄの融合分子が、ｈＴＥＲＴの転写活性化を完全に消滅させるからである。欠失および変異解析によって、ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーターにある、ＧＳＥ２４−２タンパク質の活性化因子としての標的領域は、Ｐ１領域を超えて位置するＮＨＥＩＩＩドメインであることが示された。さらに、異常なＤＮＡ構造によく結合するＣＣＲ５およびＰＤＧＦＡ（参照文献６１）などの他の遺伝子プロモーターにも見られるポリプリン配列（Ｐｕ２７）は、ｃ−ｍｙｃ転写を刺激するためにインタクトのままでなければならない（実施例３）。そのため、ＮＨＥＩＩＩ部位におけるＧカルテットの二次構造の異常は、ＧＳＥ２４−２タンパク質におけるこの配列を介した活性を変化させる。ＮＨＥ部位と相互作用して活性化するタンパク質がほとんど知られていないことは、ＧＳＥ２４．２タンパク質が、ＮＨＥドメインを有するプロモーターを持つ遺伝子を制御するために選択されて発現され得ることを意味しており、これは、強調されるべき１つの点である。これらのタンパク質の１つはＮＨ２３−Ｈ２またはＮＤＰキナーゼＢであり、これは、特異的なＤＮＡ配列に結合し、ｃ−ｍｙｃプロモーターのＮＨＥ部位に対する親和性を有するタンパク質である。それはまた、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＤ１１ｂ、ＣＣＲ５などの他の遺伝子の発現を活性化し、ＰＤＧＦＡなどの他の遺伝子の発現を抑制する（参照文献６１〜６２）。このタンパク質はまた、ヒトにおいてｃ−ｍｙｃプロモーターのＮＨＥおよびテロメアに見られるようなグアニン−リッチ配列にインビトロにて結合し得る（参照文献６１〜６２）。そのため、ＧＳＥ２４−２がＮＨＥを介して転写を活性化し得るための１つの可能性あるメカニズムは、ＧＳＥ２４−２がＮＭ２３Ｈ２などのタンパク質と結合することによりＤＮＡと相互作用しやすくなり、その結果、転写を増加させるという手段によるものである。
【００２１】
Ｘ−ＤＣおよびＶＡ１３細胞において得られた結果は、ＧＳＥ２４−２ペプチドが、２つの異なるメカニズムの組み合わせによってテロメラーゼ活性を増加させることを示す：１）ｈＴＥＲＴ転写を活性化し、そして、２）プロモーターの活性には影響を与えることなく、ＲＮＡの安定化によってｈＴＲレベルを増加させる。さらに、ＧＳＥ２４．２は、ジスケリンが欠損している場合であっても、Ｈ／ＡＣＡ  ｂｏｘにおけるｈＮａｆ１またはＮｏｐ１０などの他のタンパク質の会合を促進できる（参照文献２８）。
【００２２】
最後に、そして驚くことに、ＧＳ２４．２タンパク質によるこのテロメラーゼ活性の増加は、繊維芽細胞の繁殖能を回復させるなどの方法によって、Ｘ−ＤＣ患者におけるこれらの細胞の早期の老化を回復させ、この活性を１４０日以上維持することが、本発明において観察されている（実施例４、図５を参照）。これは、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの両方のレベルの増加によって媒介され得る。この意味において、ＧＳＥ２４．２のタンパク質または遺伝子は、細胞老化に関連する疾患および病状のプロセスのための治療的アプローチを構成し得る、または、真核細胞を不死化させるため、もしくはその増殖能を増加させるためのツールを構成し得る。一方、ＧＳＥ２４．２の発現が腫瘍形成能を誘導せず、かつ細胞増殖の異常性を増加させないであろうことが、本発明の結果によって示されている（実施例３）。
【００２３】
上述した全ての点に照らせば、ＧＳＥ２４．２は、正常なジスケリンを発現するＶＡ１３細胞などの細胞、または常染色体優性の先天性角化異常症（ＤＣ）もしくは再生不良性貧血などの変異体を発現する細胞を含む、細胞老化を異常化または加速するプロセスに関連する疾患または病状のプロセスを治療するための、医薬または実験用試薬を調製するために使用され得る。
【００２４】
したがって、本発明の一実施形態は、老化異常のプロセスによって起こる、好ましくはヒトの疾患または病状の治療に対する医薬または医薬組成物を製造するための、ＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物の使用（以下、本発明に係る使用）からなる。本発明において、用語「医薬組成物」は、本発明において記載され、または使用されているＧＳＥ２４．２の薬剤により構成されている組成物であって、研究分野において（実験用試薬など）、または産業的なバイオテクノロジー関連の活動において使用されるものもまた含む。
【００２５】
本発明において使用される場合、ＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物の用語は、ジスケリンにおけるＧＳＥ２４．２フラグメントの塩基配列、または当該塩基配列によってコードされるタンパク質もしくはペプチドの配列であって、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内における老化プロセスを減少または逆転させることが可能なものをさす。この定義はまた、ＧＳＥ２４．２タンパク質をコードする塩基配列を発現させる化合物または分子をも含む。活性化化合物は、ペプチド、タンパク質または塩基配列、抗体および多糖により構成されていてもよい。
【００２６】
本発明において使用される場合、用語「正常な、または加速された老化プロセスによって起こる疾患または病状」は、細胞および組織が増殖能の減少（加齢による自然なものを含む）、または加速を示す疾患をさす（本発明の従来技術に記載されている老化の概念を参照）。このように、本発明において使用されるこの用語はまた、ヒト細胞、好ましくは上皮の、または高レベルの増殖を伴うヒト細胞であり、説明するためであって本発明の範囲を限定するものではないが、以下の群に属する細胞の、自然な加齢によって異常化した生理的な状態をもさす：皮膚細胞、好ましくは表皮の皮膚細胞、腸上皮組織、角膜、肝臓、肺、毛球等、または造血系細胞、好ましくはリンパ球、マクロファージおよび赤血球；精巣および卵巣における胚芽細胞等であって、それぞれ、体細胞か、幹細胞か、または胚細胞。老化のプロセスおよび／またはテロメラーゼ活性の制御による、ヒトの疾患または病状のプロセスの例は、特に限定されないが、Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡの改訂版に見られる（Blasco MA, Telomere length, stem cells and aging. Nature Chemical Biology 3 (10): 640-649, 2007; Crabbe L, Jauch A, Naeger CM, Holtgreve-Grez H., and Karlseder J. Telomere dysfunction as a cause of genomic instability in Werner syndrome. PNAS 104 (7): 2205-2210, 2007）。
【００２７】
細胞老化のプロセスの逆転または減少は、分裂して器官の恒常性を維持する能力を有する細胞において治療的に使用され得る。これによって、加齢か、毒素による組織の損傷か、外科的処置に続く組織の損傷か、そして先天的または遺伝的な原因、例えば肺の形成不全など、の再生不良性の組織であるか、の原因に無関係に、組織の再生能力を増加させる。さらに、この細胞老化のプロセスにおける逆転または減少は、移植治療または細胞治療において、幹細胞、体細胞または胚細胞の集団の生存能力を増加させるために使用され得る。これらの治療において、幹細胞はテロメラーゼを発現するが、それらはテロメアの長さを長期間維持できないため、ＧＳＥ２４．２ペプチドを用いた細胞の形質転換または処理によって、これらの細胞の生存機能を高め、そしてそれゆえこれらの細胞処理の効率性を高めることができる。このように、例えば、この医薬組成物は、高齢者の表皮を再生するために使用され得る。または、この医薬組成物は、皮膚の創傷もしくは火傷の皮膚再生を促進するため、または化学療法による治療をされた患者に移植された自家造血細胞を刺激するために使用され得る。
【００２８】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、本発明に係る使用を含み、ＧＳＥ２４．２誘導化剤は、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞内において老化からの回復を誘導するタンパク質またはペプチドを発現させる塩基配列（以下本明細書において、本発明に係るＧＳＥ２４．２の遺伝子配列）であって、以下の群に属するＧＳＥ２４．２の塩基配列の１個または数個により構成されているものである：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２塩基配列により構成されている塩基配列（配列番号１）、
ｂ）ａ）の塩基配列の変異体であって、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかの配列を含む塩基配列である、遺伝的構成物。
【００２９】
この記載に使用される意味において、用語「変異体」は、配列番号１の配列に基づいて、単離され得る塩基配列、または、例えば１つ以上の塩基の挿入を含む、塩基の保存的置換または非保存的な置換の導入、分子のいずれかの末端に対する１つ以上の塩基の付加、もしくはいずれかの末端か配列内部かからの１つ以上の塩基の欠失、によって構築され得る塩基配列のいずれかを含み、かつ、ＧＳＥ２４．２（配列番号２）またはそのフラグメント（配列番号４および配列番号６）の配列の活性を模倣することができるペプチドまたはタンパク質をコードし得ることを意図する。
【００３０】
酵素ジスケリンは、様々な生物に存在するシュードウリジン合成酵素ファミリーに属する（図３Ｂを参照、Mitchel et al, 1999）。当業者は、本発明に含まれる情報、−およびスペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書−に基づき、自然界に存在する種々の生物から、本明細書に記載した塩基配列のアナロガスを同定または構築することができる。
【００３１】
本発明において使用される場合、用語「塩基配列」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの配列をさす。
【００３２】
本発明のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ａ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号１により構成されている。
【００３３】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ｃ）におけるＧＳＥ２４．２の配列の塩基配列が、配列番号３または配列番号５により構成されており、これらはそれぞれＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩのペプチドドメインをコードするものである。
【００３４】
ＧＳＥ２４．２の塩基配列は、ＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物に相当するｄ）として同定される。この本発明に係るＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物はまた、もし必要であれば、発現したペプチドの細胞質からの単離、検出または分泌をよりよく行なうために、単離、検出または分泌の目的で使用され得るペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよい。したがって、本発明の他の好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、その塩基配列は、ＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物であって、ＧＳＥ２４．２の塩基配列に加えて、発現したペプチドを細胞質から単離、検出または分泌させるペプチドまたはペプチド配列を含む。このペプチドまたはペプチド配列は、例えば、本発明の範囲を限定するものではないが、ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）配列、モノクローナル抗体により認識可能なペプチド配列（例えば、その同定のための抗体、または免疫親和性クロマトグラフィーを用いて、その結果の融合タンパク質を精製するために利用する他の抗体：ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ、Ｅ−ｔａｇなどのタグペプチド）（抗体の使用：実験用マニュアル、Ed. Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Chapter: Tagging proteins. Pp. 347-377）などである。
【００３５】
上述したＧＳＥ２４．２の塩基配列およびＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物は、従来技術における公知の方法により、専門家によって取得できる（Sambrook et al. “Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3）。この塩基配列は、細胞内にて適した条件下でその発現を制御することができる遺伝子発現ベクター内に組み込まれてもよい。
【００３６】
したがって、本発明の他の好ましい目的は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤またはＧＳＥ２４．２活性化剤は、ＧＳＥ２４．２の発現ベクターであって、これは、本発明において記載されるＧＳＥ２４．２の塩基配列またはＧＳＥ２４．２の遺伝的構成物を含み、そして、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内において老化のプロセスを減少または逆転させることが可能なタンパク質またはペプチドを発現させるものである。より好ましい実施形態は、発明ｐＬＮＣＸ２４．２の発現ベクターによって表される（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書をも参照）。
【００３７】
一般的に、発現ベクターは、本発明に記載のＧＳＥ２４．２の塩基配列または２４．２の遺伝的構成物に加えて、その転写を導くプロモーター（例えば、ｐＴ７、ｐｌａｃ、ｐｔｒｃ、ｐｔａｃ、ｐＢＡＤ、ｒｅｔなど）であって機能的に結びついているもの、ならびにこの転写、および適切な場所における所定の産物の翻訳を調節および制御する他の必要な、または適切な配列、例えば、転写開始シグナルおよびストップシグナル（ｔｌｔ２など）、ポリアデニル化シグナル、複製点、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、転写制御因子をコードする配列、（エンハンサー）、転写サイレンサー、リプレッサーなど、を含む。好適な発現ベクターの例は、発現プラスミド、ウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、コスミド、人工クロモソームなどの中からそれぞれの特定の場合における条件および必要に応じて選択されることができ、また、所定の１つまたは複数の遺伝子を用いて形質移入された細胞または形質転換された細胞を選択するために使用され得るマーカーをも含み得る。ベクターの選択は、宿主細胞、および要求される使用形態に依存され得る。したがって、本発明の好適な実施形態によれば、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。微生物および真核細胞の形質転換に、異なった複数の周知の方法（化学形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）が使用され得る（様々なマニュアルに記載されている（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.））ように同様に、ベクターは、当業者によって知られている慣用的な方法を用いて取得され得る。
【００３８】
さらに、本発明の他の好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内において老化を逆転させる活性を表すタンパク質またはペプチド（以下本明細書において、本発明に係るＧＳＥ２４．２タンパク質）であって、以下の群に属するアミノ酸配列の１個または数個により構成されている：
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２のアミノ酸配列により構成されているアミノ酸配列（配列番号２）、
ｂ）ａ）の配列に基づくアミノ酸配列の変異体であって、配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列を有するフラグメント、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列。
【００３９】
本発明の原理から理解されるように、配列番号２の配列に示されるポリペプチドの変異体は、当該配列から、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって取得されうるいずれかのペプチドである。置換による変異体の場合には、置換は好ましくは保存的置換であり、すなわち、アミノ酸は、その側鎖の性質が似た特徴を有する他のアミノ酸に置換される。したがって、保存的置換は、表１に示すアミノ酸の群の中での置換を含む。
【００４０】
【表１】
2011504483.tif 000002
【００４１】
さらに、本発明の変異体における１つ以上のアミノ酸は、特別な天然または合成アミノ酸によって置換されてもよい。このアミノ酸は、例えばベータ−アミノ酸、２−アミノアジピン酸、アルファ−アスパラギン、２−アミノブタン酸、２−アミノカプロン酸、アルファ−グルタミン、アルファ−メチルアラニン、２−アミノピメリン酸、ガンマ−アミノ−ベータ−ヒドロキシベンゼンペンタン酸、２−アミノスベリン酸、２−カルボキシアゼチジン、ベータ−アラニン、ベータ−アスパラギン酸、３，６ジアミノヘキサン酸、酪酸、４−アミノ  ４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸、ガンマ−アミノ−ベータ−ヒドロキシシクロヘキサンペンタン酸、Ｎ５−アミノカルボニルオルニチン、３−スルホアラニン、２，４  ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、２，３ジアミノプロパン酸、２，７ジアミノスベリン酸、Ｓ−エチルチオシステイン、ガンマ−グルタミン酸、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ピログルタミン酸、ホモアルギニン、ホモシステイン、ホモヒスチジン、ホモセリン、２−ヒドロキシイソ吉草酸（2-hydroxyisovaleric acid）、２−ヒドロキシペンタン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、２−カルボキシオクタヒドロインドール、３−カルボキシイソキノリン、イソバリン、２−ヒドロキシプロパン酸、メルカプト酢酸、メルカプト酪酸、４−メチル−３−ヒドロキシプロリン、メルカプトプロパン酸、ノルロイシン、ノルチロシン、ノルバリン、オルニチン、ペニシラミン、２−フェニルグリシン、２−カルボキシピペリジン、サルコシン、１−アミノ−１−カルボキシシクロペンタン、スタチン（statin）、３−チエニルアラニン（3-thyenylalanine）、イプシロン−Ｎ−トリメチルリジン、３−チアゾールアラニン、アルファ−アミノ−２，４−ジオキソピリミジンプロピオン酸などである。
【００４２】
さらに、本発明は、本発明に係るペプチドの変異体として、１つ以上のアミノ酸の側鎖を変化させた変異体の使用について検討する。本発明における側鎖の改変の例は、アルキル化、アミジン化、アシル化、カルボモイル化（carbomoylation）、トリニトロベンジル化、ピリドキシル化などのアミノ基の改変、複素環縮合の形成からなるアルギニン残基のグアニジン基の改変；アミド化によるカルボキシル基の改変、メトキシル化によるチロシンの改変、アルキル化またはＮ−カルボキシエチル化によるヒスチジンのイミダゾール環の改変、４位のヒドロキシル化によるプロリンの改変などを含む。あるいは、本発明は、本発明に係るペプチドの変異体として、グリコシル化、すなわち、セリンおよび／もしくはスレオニン（Ｏ−グリコシル化）の側鎖、またはアスパラギンおよび／またはグルタミン（Ｎ−グリコシル化）の側鎖のどちらかへのグリカン基の付加による変異体について検討する。本発明におけるポリペプチドに組み込まれ得るグリカンが含む糖ユニットの数は、変えることができる（単糖、二糖、三糖、四糖など）。グリカンを形成する単糖は、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｄ−フコース、またはＤ−アラビノースを含む。
【００４３】
あるいは、本発明は、本発明に記載されたポリペプチドの変異体として、逆反転（retro-inverse）アイソマーを生じさせるために、ペプチド鎖を構成するアミノ酸の少なくとも１つとしてＤ立体異性体が含まれる変異体の使用を検討する。
【００４４】
他の実施形態において、本発明は、本発明に記載されたポリペプチドにおける擬態ペプチド（peptidomimetics）、すなわち１つ以上のペプチド結合が共有結合に代わるものにより置き換わっている変異体の使用を検討する。この擬態ペプチドは、プロテアーゼに対してより耐性であるため、より高い安定性を示すことによって特徴付けられる。ペプチド骨格の改変は、ペプチド結合の構成要素（−ＮＨ−、−ＣＨ−、−ＣＯ−）に対する基の置換または挿入を含み、この基とは、例えば、−ＮＨ−の代わりに−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２など、−ＣＨＲの代わりに−Ｎ−、−Ｃ−アルキル  ｐ  −ＢＨ−など、および、−ＣＯ−の代わりに−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−ＳＯｎ−、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）−または−Ｂ（ＯＨ）−などである。さらに、Ｎ末端をブロックする基を用いれば、本発明に係るペプチドの安定性を高めることができる。この基とは、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、スベリル基（suberyl）、アジピル基（adipyl）、ダンシル基（dansyl）、ベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、メトキシアジピル基、メトキシアジピル基、メトキシスベリル２，３−ジニトロフェニル基などである。この代わりに、または同時に、アミド化によって本発明に係るペプチドのＣ末端を改変することが可能である。
【００４５】
変異体と、配列番号２の配列によって示されるポリペプチドとの間の同一性は、コンピュータアルゴリズムおよび当業者に周知の方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の相同性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（BLASTManual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. MoI. Biol. 21 5: 403-410 (1990)）を用いて決定されることが好ましい。本発明において使用されるポリペプチドは、配列番号１〜１９の配列によって示されるポリペプチドに対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列の同一性を示すことが好ましい。
【００４６】
酵素ジスケリンは、種々の生物に存在するシュードウリジン合成酵素ファミリーに属する（図３Ｂ、Mitchel et al, 1999を参照）。当業者は、本明細書に記載の情報および自然界に存在する種々の生物から、本明細書に記載のアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を同定または構築することができる。
【００４７】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤がタンパク質であって、そのａ）のアミノ酸配列が配列番号２により構成されているものである。
【００４８】
本発明の他のより好ましい実施形態は、本発明に係る使用からなり、ＧＳＥ２４．２誘導化剤がタンパク質であって、そのｃ）のアミノ酸配列が配列番号４または配列番号６により構成されているものである。
【００４９】
一方、本発明の他のさらなる実施形態は細胞（以下本明細書において、本発明に係るＧＳＥ２４．２細胞）からなり、この細胞は、真核細胞−好ましくはヒト細胞、より好ましくは単離された細胞−または原核細胞であり、遺伝的に改変されており、かつ本発明に係るＧＳＥ２４．２の塩基配列、構成物および発現ベクターを含んでおり、本発明において使用されるＧＳＥ２４．２のペプチドまたはタンパク質が安定的に発現され得る。これらの細胞は、当業者に公知の遺伝子工学技術を用いて、上述した塩基配列により形質転換、感染または形質移入され得る（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning：実験用マニュアル、2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratoryおよび本発明に含まれる）。これらの細胞は、例えば老化プロセスを逆転させ、または減少させることができるペプチドを生産するために有用であり得る。また、これらの細胞は、例えば上述した塩基配列の組み換え体を増幅するために、医薬組成物のための基材として貢献し得る。あるいは、これらの細胞は、例えば遺伝子治療において細胞自体として有用であり得る。好ましい実施形態は、上述したＧＳＥ２４．２の塩基配列により形質転換された、種々の細胞系統由来のヒト細胞の使用であってもよく、この細胞は、ヒト組織の再生細胞として使用できる。
【００５０】
他の実施形態において、本発明は、本発明に係る遺伝的構成物または本発明において規定されたベクターを含む細胞または宿主生物に関する。本発明には、当業者に公知の宿主生物のいかなる類型をも使用でき、例えば細菌系統（大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）など）、酵母系統（酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）など）、遺伝子導入植物（双子葉植物または単子葉植物）、昆虫細胞、例えば、バキュロ・ウイルス、哺乳動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨｅＬａ細胞など）、および非ヒトトランスジェニック（例えば、マウス、ウシ、ヤギ、ウサギ、ブタなど）などを使用できる。
【００５１】
宿主細胞のゲノム中に新しい遺伝的物質が組み込まれるか組み込まれないかは、遺伝子発現系によって決まる。このように、ＧＳＥ２４．２の塩基配列、遺伝的構成物または発現ベクターはいずれも、異常な老化プロセスに関連する疾患に影響を受けるヒトに対する遺伝子治療の治療法および予防法において、異常化している（増加している）か否かにかかわらず老化プロセスに影響を受ける宿主細胞、好ましくはヒト細胞を保護するための医薬として使用され得る。同様に、本発明に係るＧＳＥ２４．２細胞は、ヒトの組織または細胞の再生または移植のための医薬として使用され得る。これらの生物製剤ツールおよび遺伝子治療法は、本発明に記載の情報を過度の努力なしに発展させられる技術を有する当業者に充分に知られている。さらに、このタンパク質またはペプチドおよび細胞それら自身は、バイオドラッグとなり得る。
【００５２】
本発明の他の実施形態は、老化の異常に関連する疾患または病状を治療するための医薬組成物または医薬（以下本明細書において、本発明に係る医薬組成物）からなる。この医薬組成物は、必要に応じて１つ以上のアジュバントおよび／または薬剤的に認容され得る溶媒とともに、ＧＳＥ２４．２誘導化化合物またはＧＳＥ２４．２活性化化合物を治療的に有効な量において含む。また、この医薬組成物は、老化プロセスを減少させまたは逆転させることができ、かつ本発明に係る使用を用いて取得される。
【００５３】
医薬に使用するために、本発明に係る化合物を有する化合物および組合せは、医薬品の観点から認容され得る賦形剤とともに処方され得る。本発明における使用のための好ましい賦形剤は、糖、デンプン、セルロース、粘剤およびタンパク質を含む。
【００５４】
この記載中に使用される意味において、用語「治療的に有効な量」とは、老化からの回復が可能な薬剤または化合物の量をさし、所望の効果を生み出すために算出されるとともに、一般に、その化合物の固有の特性に基づいて、年齢、患者の状態、異常性または障害の重症度、および投与の経路および頻度を含む他の原因から決定されてもよい。
【００５５】
好ましい実施形態において、本発明に係る医薬的組成物は、固形（例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、座薬など）または液体（剤剤、懸濁剤、乳剤など）にて投与する医薬的な形態として処方されてもよい。他の好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下または直腸を含むいかなる経路を解して投与されてもよい。有効成分の種々の投与形態、使用される賦形剤およびその製造方法についての総説を、Galenic Pharmacy Treatise (Tratado de Farmacia Galenica), C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993.にて見出すことができる。
【００５６】
本発明の他の実施形態は、好ましくはヒトにおいて、異常な老化のプロセスによって引き起こされる疾患または病状を治療するための方法における、本発明に係る医薬組成物の使用からなる。
【００５７】
他の好ましい実施形態が、生物医学研究に使用する真核細胞、好ましくはヒト細胞または動物細胞を不死化するための方法における本発明に係る医薬組成物の使用からなることは、非常に重要である。真核細胞の不死化は、組み換えタンパク質生産工程に関して、好ましくは生物医学的適用における組み換えタンパク質生産工程に関して、その有効寿命を増加させるため、バイオテクノロジーのＲ＋Ｄの分野において大いに必要な操作である。また、治療化合物として可能性のある化合物の効果の解析に用いられる正常細胞の有効寿命を増加させ、また、そのより長い寿命のおかげで二次的な効果を長期にわたって解析するのに好都合であるため、バイオテクノロジーのＲ＋Ｄの分野において大いに必要な操作である。
【００５８】
本発明の他の好ましい実施形態は、老化プロセスが逆転され、または減少しており、かつ本発明に用いられるＧＳＥ２４．２の構成要素を含む、真核細胞、好ましくはヒト細胞からなる。
【００５９】
〔図面の説明〕
＜図１−シスプラチンへの応答におけるテロメラーゼ活性に対するＧＳＥ２４−２ペプチドの発現の効果＞
（Ｃ）シスプラチンおよびＧＳＥ２４−２ペプチドを用いた、２９３Ｔ細胞抽出物のインビトロでの処理に続く、テロメラーゼ活性。シスプラチン、および精製したペプチドＧＳＥ２４−２の量を増加させたもの（３−５列目）、熱により失活させたＧＳＥ２４−２ペプチド（７列目）またはコントロールペプチド（８列目）を用いて、２９３Ｔ細胞抽出物をインビトロにて処理した後、後者をＴＰＡＰアッセイに用いた。テロメラーゼアッセイを行なうために、テロメアの配列を有する特異的な鋳型を用いた。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。（Ｄ）ＧＳＥ２４−２を発現する細胞抽出物を用いたゲルシフト試験。プラスミドｐｃＤＮＡ３−９Ｅ１０２４−２またはｐｃＤＮＡ３−９Ｅ１０を発現する細胞の核抽出物をゲルシフト試験に供した。特異的なテロメアの配列を含むＴＥＬ１プローブを使用した。特異的な抗体９Ｅ１０（３列目）、およびＴＥＬ１とハイブリダイズして競合分子として機能するオリゴヌクレオチドＣＸｅｘｔ（４−５列目）を用いることにより、特異的な結合が確立された。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【００６０】
＜図２−ＧＳＥ２４−２はｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加させる＞
（Ａ）ｐＬＮＣＸ、ＤＸＣ、ＧＳＥ２４−２、Ｃｂｆ５、モチーフＩまたはモチーフＩＩ（細胞百万個あたり１０μｇのＤＮＡ）およびレポータープラスミドｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のテロメラーゼ活性を測定した。＊は統計値がｐ＜０．０５であることを示す。（Ｂ）レポーターベクターｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞（黒）および２９３Ｔ２４−２細胞（白）を同時形質移入した。２４時間後、これらの細胞をシスプラチン（３  ｇ／ｍｌ）により８時間処理した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｃ）提示された構築物（細胞百万個あたり１０μｇのＤＮＡ）およびレポーターベクターｈＴＲ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｄ）レポーターベクターｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ、および様々な量のＭａｄ／ｍｙｃの発現ベクターを用いて、これらの細胞系統を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｅ）レポーターベクターＨＩＶ−ｌｕｃと、発現ベクターｍａｄ／ｍｙｃの量を増加させたものとを用いて、これらの細胞系統を同時形質移入した。形質移入して２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ  を用いてこれらの細胞を６時間刺激した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率を制御するために、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。
【００６１】
＜図３−ＧＳＥ２４．２はｃ−ＭＹＣ遺伝子のプロモーターを介してその活性を誘導する＞
（Ａ）実験に使用したそれぞれの構築物を示す、ｃ−ＭＹＣプロモーターの概略図。（Ｂ）レポーターベクターｃ−ＭＹＣ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）のそれぞれの構築物を用いて、２９３Ｔ  ｐＬＮＣＸおよび２９３Ｔ  ＧＳＥ２４−２の細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率のコントロールとして、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（細胞百万個あたり０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。（Ｃ）ＮＨＥＩＩＩにおいて作製した変異体の概略図。（Ｄ）プラスミドｐｘ３．２由来の変異体のレポーターベクター（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、提示された細胞系統を形質移入した。形質移入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率のコントロールとして、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（細胞百万個あたり０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。（Ｅ）発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２を用いて、ＭＥＦ細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって、マウスのｃ−ｍｙｃ遺伝子および  −アクチン遺伝子の発現を測定した。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。（Ｆ）発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２を用いて、ＭＥＦ細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後、全タンパク質の抽出物を単離し、特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって、マウスのｃ−ｍｙｃタンパク質および  −チューブリンタンパク質の発現を決定した。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【００６２】
＜図４−ＧＳＥ２４−２は、Ｘ染色体に関連する先天性角化異常症の患者の細胞、およびＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性を再活性化させる＞
（Ａ）キャリアの母親（ＤＣ−Ｃ）、および影響を受けた子供（ＤＣ−１、ＤＣ−２およびＤＣ−３）から取得した、Ｘ染色体に関連する先天性角化異常症を患う患者のリンパ芽球において、テロメラーゼ活性を測定した。これらの細胞に対し、空のベクター（−）またはＧＳＥ２４−２（＋）を細胞百万個あたり３μｇ用いて一過的に形質移入した。その２４時間後にテロメラーゼ活性を測定した。（Ｂ）細胞百万個あたり３μｇの発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＧＳＥ２４−２またはＤＫＣを用いて、一過的にＤＣ２細胞を形質移入した。その２４時間後にテロメラーゼ活性を測定した。（Ｃ）細胞百万個あたり３μｇの空のベクターまたはＧＳＥ２４．２により形質移入された患者（ＤＣ−３）の１人の細胞における、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベル。ＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ＧＡＰＤＨ発現をコントロールとして用いた。（Ｄ）Ｘ−ＤＣ  ＧＭＯ１７８７の患者の繊維芽細胞を、ベクターｐＬＮＣＸまたはＧＳＥ２４−２由来のウイルスによって感染させ、安定な細胞系統をテロメラーゼ活性測定のために用いた（タンパク質の全量を三角形にて示す）。（Ｅ）プラスミドｐＬＮＣＸおよびｐＧＳＥ２４−２によって形質移入したＧＭＯ１７８７細胞におけるｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨ発現をコントロールとして用いた。（Ｆ）パネルＤに記載したように形質移入されたＧＭＯ１７８７細胞の増殖速度を、一定時間における個体数の重複の累積を用いて評価した。全ての実験について３回繰り返し、同様の結果を得た。（Ｇ）ＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性。この細胞に対し、細胞百万個あたり１６μｇのコントロールベクターｐＬＮＣＸまたはＧＳＥ２４．２を用いて一過的に形質移入した。その２４時間後に、タンパク質抽出液の連続した希釈液を用いて、テロメラーゼ活性を測定した（タンパク質の全量を三角形にて表す）。（Ｈ）細胞百万個あたり１６μｇのプラスミドｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２により形質移入されたＶＡ１３細胞における、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベル。ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを測定した。ＧＡＰＤＨレベルをコントロールとして用いた。
【００６３】
＜図５−ペプチドＧＳＥ２４．２は細胞老化から回復させる＞
図４Ｄに記載されたように形質移入されたＧＭＯ１７８７細胞の増殖速度を、一定時間における個体数の重複の累積を用いて評価した。全ての実験について３回繰り返し、同様の結果を得た。
【００６４】
〔本発明の実施例〕
（実施例１−ＧＳＥ２４．２ペプチドはインビトロにてテロメラーゼ活性を救済させる）
テロメア配列ＴＴＡＧＧＧは、シスプラチンの標的である（参照文献４５）。シスプラチンがこの領域に結合することによって、テロメラーゼの阻害とテロメアの短縮化とがもたらされる（参照文献４３）。したがって、ジスケリンはテロメラーゼ複合体の構成要素の１つであるため（参照文献７）、本発明者らはＴＲＡＰ（参照文献３７）アッセイを用いてテロメラーゼ活性におけるシスプラチンおよびＧＳＥ２４−２の発現の効果についての研究を続け、ＧＳＥ２４−２を発現させるベクターにより形質移入された細胞が高いテロメラーゼ活性を示すことを見出した（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書）。
【００６５】
本説明では、はじめに、２９３Ｔ細胞からの細胞抽出物、シスプラチン、およびシスプラチンに処理されたテロメアプローブを用いたインビトロのテロメラーゼ活性阻害試験における、前述したＧＳＥ２４．２ペプチドの使用について記載する。この試験では、ＧＳＥ２４−２ペプチドを用量依存的な様式にて加えた結果、抽出物におけるテロメラーゼ活性をシスプラチンによる阻害から保護した（図１Ｃ、３−５列）。一方、熱により失活されたＧＳＥ２４−２ペプチドまたは無関係のペプチドは、シスプラチンにより誘導されたテロメラーゼ阻害を救済することができなかった（図１Ｃ、７−８列）。これらによって、ＧＳＥ２４−２ペプチドが、インビトロでテロメアにおいてシスプラチンにより誘導される架橋を阻害できることが示された。さらに、小さい３’の吊り下がった配列によってテロメアの二重鎖配列を再構築する、ループを形成するオリゴヌクレオチド（ＴＥＬ１）（参照文献４１）を用いて、ＧＳＥ２４−２ペプチドにおけるテロメア配列に対する結合の可能性について、ゲルシフト試験によって解析した。特異的な複合体ＧＳＥ２４−２／ＴＥＬ１（図１Ｄ）が検出された。一本鎖の延長部分の３’にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＣｘｅｘｔは、複合体ＧＳＥ２４−２／ＴＥＬ１の形成を完全に阻害した。併せて、これらの結果は、ＧＳＥ２４−２がテロメアの配列に結合し得ること、およびＧＳＥ２４−２のテロメアプローブに対する保護効果によってシスプラチンによるテロメラーゼ活性の阻害が部分的に欠如することを示す。
【００６６】
（実施例２−ｈＴＥＲＴのプロモーターはＧＳＥ２４−２タンパク質によって活性化されるが、ｈＴＲのプロモーターは活性化されない）
従来、ＧＳＥ２４．２におけるシスプラチンに対して保護できる能力によって、ｈＴＥＲＴの高いＲＮＡレベルが維持され得ることが観察された（スペイン国特許出願公開第２００５０２５１１号明細書）。この仮説により、ｈＴＥＲＴを過剰発現する２９３Ｔ細胞は、コントロール細胞よりもシスプラチンに対してより耐性であった。
【００６７】
シスプラチンがｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの減少を誘導し、かつＧＳＥ２４−２の発現がこの効果を補償しているのではないかと考え、本発明者らは、ＧＳＥ２４−２がｈＴＥＲＴの転写を変化させ得るかどうかを詳細に調べた（参照文献５３）。本発明者らは、ｈＴＥＲＴプロモーターの３４０２ｂｐを含むレポーターベクターを用いて、ＧＳＥ２４−２細胞におけるこのプロモーター活性を調査した（参照文献３３）。ＧＳＥ２４−２の発現は、一過的な形質移入試験においてｈＴＥＲＴプロモーターの転写を刺激できたが、ＤＫＣはできなかった（図２Ａ）。また、シスプラチンは、コントロール細胞よりもＧＳＥ２４−２細胞において、このプロモーター活性を刺激する（図２Ｂ）。これらの結果は、ＧＳＥ２４−２の発現が、シスプラチン存在下であっても転写を刺激でき、その結果ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡレベルが増加したことを示す。本発明者らはまた、プラスミドＧＳＥ２４−２により形質移入されたＭＥＦ細胞（一次マウスの繊維芽細胞）におけるｈＴＥＲＴプロモーターの刺激について検出できた（データは示さない）。ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２を発現する細胞を用いたところ、ｈＴＲプロモーター（参照文献９）に対するＧＳＥ２４−２の発現の効果は観察されなかった（図２Ｃ）。しかし、以前に報告されたように、阻害剤ＪＮＫ  ＳＰ６０１２５（参照文献９）の処理は、このプロモーター活性を活性化することができた（データは示さない）（参照文献１１）。これらの結果は、ＧＳＥ２４−２活性がｈＴＥＲＴ発現に対して特異的であることを示す。
【００６８】
ジスケリンは、当初は、酵母（S. cerevisiae）のＣｂｆ５遺伝子と、タンパク質レベルで８５％の同一性を示す、ヒトの相同遺伝子ｃｂｆ５（参照文献５５）として同定された（参照文献５６）。そのため、本発明者らは、酵母遺伝子S. cerevisiae  ｃｂｆ５から、ＧＳＥ２４−２に相当する配列（配列番号２）をベクターｐＬＮＣＸにクローニングした。この構築物の発現もまた、ｈＴＥＲＴプロモーターの発現を増加させる（図２Ａ）が、ｈＴＲプロモーターの発現は増加させない（図２Ｃ）。これは、このＤＫＣ領域の機能が高度に保存されていることを示す。
【００６９】
（実施例３−ｃ−ＭＹＣプロモーターのＮＨＥＩＩＩドメインはＧＳＥ２４−２の標的配列である）
ｈＴＥＲＴプロモーターは、ｍｙｃ／ｍａｘヘテロダイマーに結合可能な２つのＥ−ｂｏｘを含む（参照文献３２、５７）。ｍａｄをトランス活性化するｃ−ｍｙｃのＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッド分子は、Ｅ  ｂｏｘに結合可能であり、そのためｃ−ｍｙｃ依存的な転写を阻害する。ｍａｄ／ｍｙｃの発現は、ＤＫＣ細胞だけでなくコントロール細胞においても、投与量に依存する様式にて、ｈＴＥＲＴプロモーター活性を阻害することができる（図３Ｄ）。また、ｍｙｃ／ｍａｄの発現は、ＧＳＥ２４−２細胞におけるＧＳＥ２４．２タンパク質によって介される転写活性化を消失させることができる。これにより、ＧＳＥ２４−２によって誘導されるｈＴＥＲＴの転写の活性化が、ｃ−ｍｙｃ依存的であることが示された（図３Ｄ）。ｍｙｃ／ｍａｄ構築物をＮＦκＢプロモーターのためのレポーターベクター（ＨＩＶＬｕｃ）とともに形質移入しても、ＴＮＦαによって誘導される転写に影響を及ぼさないことから、この阻害は特異的である（図４Ｅ）。
【００７０】
３．２Ｋｂのｃ−ｍｙｃ遺伝子（ｐｘ３．２ｍｙｃ）を含み、かつルシフェラーゼ遺伝子に結合されたプロモーターＰ０、Ｐ１およびＰ３を包含するレポーターベクター（図３Ａ）を用いて、コントロール細胞およびＧＳＥ２４−２細胞を形質移入した。ＧＳＥ２４−２細胞におけるプロモーター活性が、コントロール細胞と比べて３倍に増加したことが観察された（図３Ｂ）。レポーターベクターｐｘ３．２ｍｙｃとともにベクターｐＬＮＣＸまたはＧＳＥ２４−２を発現するプラスミドにより２９３Ｔ細胞を形質移入した場合にも、同様の結果が得られた（データは示さない）。ＧＳＥ２４−２が介する活性化に必要な領域を調べるために、ｃ−ｍｙｃプロモーターの３つの欠失変異体を用いた（図３Ａ）。ＮＨＥＩＩＩが含まれる、末端のプロモーターＰ１およびＰ０が包含される構築物のみが、ＧＳＥ２４−２細胞において活性化されることができたが、コントロール細胞においては活性化されなかった（図３Ｂ）。これにより、最も近いプロモーターＰ２は、ＧＳＥを介した活性化に関わっていないことが示された。
【００７１】
Ｇ−カルテットの二次構造の維持に関わっているプリンリッチ領域（Ｐｕ２７）におけるグアニン残基を置換することによって、ＮＨＥＩＩＩの種々の変異体を取得した。４つ組のＧ群の２番目におけるＧ１２Ａ変異体、２番目の３つ組のＧからＧ１７Ａの変異体、そして最後にプリンリッチ領域の末端における２つの連続したグアニン（Ｇ２６Ａ／Ｇ２７Ａ）の変異体を取得した（図３Ｃ）。この結果から、オリジナルの配列のみがＧＳＥ２４−２によって活性化されることが示された（図３Ｄ）。概して、これらの結果により、ＧＳＥ２４−２が、Ｐｕ２７領域の二次構造の変形を誘導してｃ−ｍｙｃ転写させる活性のある配置にさせることが可能であることが示唆される。
【００７２】
本発明者らはまた、ｃ−ｍｙｃプロモーター活性にて観察される変化が、その発現に反映されるのかを調べた。この効果のために、空のベクター、ＤＫＣの発現ベクターまたはＧＳＥ２４−２発現ベクターを用いてＭＥＦ細胞を一過的に形質移入し、次にｍＲＮＡおよびｃ−ｍｙｃタンパク質のレベルを測定した（図３Ｅ  ｙ  ３Ｆ）。予想どおり、ＧＳＥ２４−２の発現のみが、ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡとタンパク質との両方について、その発現の活性化を誘導できた。ｃ−ＭＹＣ発現の増加が細胞の形質転換を誘導し得ることは、ＧＳＥ２４−２発現による不要な効果の１つとなり得る。この可能性を評価するために、極小マウス（atimic mice）に、空のベクター、ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子、またはＧＳＥ２４−２を発現しているＰａｍ２１２細胞を接種した。ｃ−ｍｙｃを発現している細胞を接種された動物のみが、最初の１０日以内に腫瘍を発症し、ＧＳＥ２４−２を発現している細胞は接種後３ヶ月間でさえも腫瘍を発症させなかった。
【００７３】
（実施例４−ＧＳＥ２４−２を用いて刺激されたＶＡ１３細胞およびＸ−ＤＣ患者におけるテロメラーゼ活性は、老化プロセスからそれらを回復させる）
本発明者らは、Ｘ−ＤＣを患っている患者の細胞におけるＧＳＥ２４−２発現の効果を調べた。キャリアの母親（ＤＣ、正常なｄｋｃ対立遺伝子）および臨床的に影響を受けた彼女の３人の子供（ＤＣ１、ＤＣ２およびＤＣ３、変異体ｄｋｃ対立遺伝子）から取得された市販のリンパ芽球を用いた。これらの細胞は不死化されておらず、培養中に正常に老化し始める。さらに以前観察されたように、すなわちＧＳＥ２４−２の発現はこれらの細胞系統におけるテロメラーゼ活性を増加させ（図４Ａ）、前述したように（参照文献２１）、全長のジスケリン発現によるテロメラーゼ活性の増加は観察されなかった（図４Ｂ）。ＧＳＥ２４−２により形質移入された細胞において、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲのＲＮＡレベルが増加した（図５Ｃ）ことは、ＧＳＥ２４−２の形質移入によるテロメラーゼ活性の回復が、両方の分子の増加に起因することを示唆する。
【００７４】
一方、Ｘ−ＤＣ患者における本来の真皮の繊維芽細胞は、連続培養において３〜４週間以内に完全に老化するが、正常な細胞は、２ヶ月増殖した後に老化期に到達する（参照文献２１）。ｈＴＥＲＴを発現するＸ−ＤＣ細胞は、より長く分裂し、数ヶ月間連続して生育する能力を獲得する（参照文献２１）。Ｘ−ＤＣにおけるＧＭＯ１７８７細胞内でのＧＳＥ２４−２の発現は、前述したように、Ｘ−ＤＣにおける繊維芽細胞内のｈＴＲおよびｈＴＥＲＴのＲＮＡレベルの発現を増加させることによって、テロメラーゼ活性の増加を誘導することができた（図４Ｄ）。そして、驚いたことに、これらの細胞は、連続して１６０日以上成育することができた（図５）。ウェルナー症候群の患者における細胞（老化した真皮の繊維芽細胞）もまた、連続して１５０日以上生育することができた（図６）。
【００７５】
さらに興味深いことに、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの欠如を示し（参照文献５９）、かつＡＬＴメカニズムを用いてテロメアを維持するＶＡ１３のテロメラーゼ欠失細胞系統（野生型のジスケリン）において、ＧＳＥ２４−２の発現が、テロメラーゼ活性（図４Ｇ）、およびｈＴＥＲＴおよびｈＴＲのＲＮＡレベル（図４Ｈ）を回復させることができた。
【００７６】
〔材料および方法〕
（構築物および細胞系統）
ＧＳＥ２４−２、ＤＫＣ、ＤＫＣ５’、モチーフＩ、モチーフＩＩおよびＧＳＥ２４−２と相同なＣＢＦ５遺伝子の領域の配列を、ｐＬＮＣＸベクター（BD Biosciences, Madrid）にクローニングした。ｈＴＥＲＴプロモーターを有する構築物は、Dr. T.Kim（参照文献３２）から取得し、ｈＴＲプロモーターを有する構築物は、Dr. N.Keith（参照文献９）から取得し、ｃ−ＭＹＣプロモーター（ｐｘ３．２）を有する構築物は、Dra. A. Arandaから取得し、そしてハイブリッド構築物Ｍｙｃ／ｍａｄ、ｐＥＣＬおよびｐＥＣＬｃ−ｍｙｃは、Dr. J. Leonから取得した。プラスミドＢＡＳＥ−ＴＥＲＴはDra. K. Collinsから取得した（参照文献３１）。プラスミドＰＧＡＴＥＶ（参照文献３３）は、Dr. G. Montoyaから取得した。プラスミドＰＧＡＴＥＶ−２４−２は、ｐＧＡＴＥＶプラスミドのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位の２４−２断片をサブクローニングすることにより取得した。プラスミドｐＣＤＮＡ３−９Ｅ１０−２４−２は、エピトープ９Ｅ１０−ｍｙｃを含むｐＣＤＮＡ３ベクターのＥｃｏＲ１／ＸｂａＩ部位の間の２４−４断片をサブクローニングすることによって取得した。２９３Ｔ細胞（American Type Culture Collection）Ｐｈｏｅｎｉｘを、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地にて培養した。細胞系統ＶＡ１３は、Dr. M. Serranoから取得した。ファミリー（ＤＣ、ＤＣ１、ＤＣ２およびＤＣ３）のＸ−ＤＣリンパ芽球については、臨床的に報告されており（参照文献３４〜３５）、そのジスケリン遺伝子は１塩基置換を示す：Ｔ６６Ａ。Ｘ−ＤＣの皮膚の繊維芽細胞ＧＭＯ１７８７は、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭにて培養し、そしてこの細胞には、ロイシン３７を欠失したジスケリンタンパク質がコードされていた（参照文献３１）。マウスの胚の繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、１０％ＦＢＳと非必須アミノ酸（Gibco, Carlsbad, USA）とを添加したＤＭＥＭにて培養した。安定な形質移入のために、２９３Ｔ細胞を、細胞百万個あたり１０μｇのＧＳＥ２４−２またはｐＬＮＣＸと１μｇのプラスミドｐ−ＢａｂｅＰＵＲ（Clontech）とを用いて同時形質移入し、形質転換２４時間後にピューロマイシン耐性のものを選択した。Ｐａｍ２１２細胞は、ベクターｐＥＣＬ、ｐＥＣＬｃ−ｍｙｃまたはＧＳＥ２４−２を用いて形質移入し、Ｇ４１８耐性のものを選択した。Ｘ−ＤＣ繊維芽細胞の感染のために、リン酸カルシウム法によりｐＬＮＣＸ由来のベクターを用いてＰｈｏｅｎｉｘ細胞を形質移入した。形質移入４８時間後、ウイルスを回収し、Ｘ−ＤＣ繊維芽細胞を感染させるために４８時間使用した。安定な細胞系統は、Ｇ−４１８（Gibco）より選択した。
【００７７】
（ＧＳＥｓのライブラリーおよびシスプラチンによる選択）
基本的に、以前にRoninson et al（参照文献３６）によって記載されたように、ＧＳＥｓのライブラリーを構築した。
【００７８】
（試薬）
シスプラチン、テロメラーゼＩの阻害剤およびＳＰ６０１２５は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（San Diego, USA）から購入した。ＴＮＦαは、Ｕｐｓｔａｔｅ（Charlottesville, USA）から購入した。
【００７９】
（ペプチドＧＳＥ２４−２の生産および精製）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ５α細胞を、ベクターｐＧＡＴＥＶ  ＧＳＥ２４−２を用いて形質転換し、その溶菌液を前述されたように調製した（参照文献３３）。融合タンパク質をグルタチオン−セファロース法によって精製し、その純度をゲル電気泳動によって解析した。製造者の指示にしたがってプロテアーゼＴＥＶにより消化して、ＧＳＥ２４−２を取得した。通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて取得されるものによれば、消化されたタンパク質の９０％が取得される。このタンパク質は、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに２回通され、ポリヒスチジンテール、未消化のタンパク質、ＴＥＶプロテアーゼおよび不純物を廃棄した。
【００８０】
（定方向突然変異誘発）
Quickchange X-L site-directed mutagenesis kit（Stratagene, Santa Clara, USA）を用いて、製造者の指示にしたがってｃ−ＭＹＣプロモーター（ｐｘ３．２）のＮＨＥＩＩＩ領域におけるグアニン残基の変異導入を行なった。
【００８１】
（テロメアリピート増幅プロトコール（ＴＲＡＰ））
TRAPeze（参照文献３７） telomerase detection kit（Intergen, Purchase, USA）を用いて製造者の指示にしたがってテロメラーゼ活性を測定した。ＴＲＡＰアッセイは、存在する全タンパク質の濃度によりそれぞれのタンパク質抽出物を標識して行なった。所望の実験において、テロメアのプローブをＴＲＡＰアッセイに使用した（参照文献３８）。ＴＲＡＰ反応において直接にシスプラチンとともにインキュベートすることによってインビトロでのプラチナ化（platination）を行なった。
【００８２】
（イムノブロットおよび抗体）
前述されたように細胞を溶解させ（参照文献３９）、その後２０μｇのタンパク質を１０％にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。使用した抗体：抗ｐＪＮＫ（Ｖ７３９１、Promega, Madison, USA）、抗ＪＮＫ１（Ｃ−１７、Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, USA）、抗ｐ−Ｐ３８（Cell Signaling, Charlottesville, USA）、９−Ｅ１０（Ａ１４−Santa Cruz Biotechnologies）および抗Ｆｌａｇ（Invitrogen, Carlsbad, USA）。
【００８３】
（ｃＤＮＡの調製およびＲＴ−ＰＣＲ）
Ｔｒｉｚｏｌ（Life Technologies, Carlsbad, USA）を用いて製造者の指示にしたがって細胞の全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素Ｍ−Ｍｌｖ（Promega）を用いて、各反応において２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写させた。
【００８４】
（形質移入および遺伝子発現解析）
２９３Ｔ細胞は、前述されたようにリン酸カルシウム法を用いて一過的に形質移入した（参照文献３９）。ＤＮＡの全量は、常に細胞百万個あたり１０μｇを維持した。Ｘ−ＤＣ細胞は、細胞百万個あたり３μｇのｐＬＮＣＸ−ＧＳＥ２４−２を用いたエレクトロポレーション法により一過的に形質移入した。ＶＡ１３のＭＥＦｓ細胞は、１００万個の細胞あたり１６μｇのＤＮＡを用いてリポフェクタミン  プラス（lipofectamine plus）（Invitrogen）により製造者の指示にしたがって形質移入した。タンパク質抽出液を調製し、市販のキット（Promega）を用いてルシフェラーゼを測定した。各試験は３通りにて行ない、実験は３回繰り返した。形質移入効率は、プラスミドｐ−ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａを同時形質移入することによって修正した。
【００８５】
（ゲル易動度シフトアッセイ）
プラスミドｐＣＤＮＡ３−Ｅ１０２４−２または空のベクターによって２９３Ｔ細胞を形質移入し、Ｇ−４１８により選択することによって安定な細胞系統を作製した。これらの細胞は、エピトープＥ１０−ｍｙｃ  ＧＳＥ２４−２の融合タンパク質を発現する。核タンパク質（参照文献４０）の抽出液における結合反応を、前述されたように行なった（参照文献４１）。テロメア配列を含むオリゴヌクレオチドＴＥＬ１の５’末端、及びＴＥＬ１のハンギング領域（hanging zone）にハイブリダイズするＣＸｅｘｔ（ネガティブコントロールとして）（参照文献４１）の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）および  ３２Ｐ  ＡＴＰ（Amersham Bioscences, Orsay, France）によって標識した。エピトープ９Ｅ１０に対する抗体を用いて、ＧＳＥ２４−２結合と競合させた。ＤＮＡに結合した複合体は、トリス・ホウ酸塩・ＥＤＴＡバッファーを用いた０．５％アクリルアミドの非変性ゲルにおいて分離させた。
【００８６】
（生存度アッセイおよび累積重複数（ＰＬＤ））
前述されたように、クリスタル・バイオレット染色法を用いて、細胞増殖および生存度を調べた（参照文献３９）。感染後にＤＫＣ繊維芽細胞を混合し、Ｇ−４１８耐性細胞を選択した。細胞を選択する最初のステップにおいて、培養中のＰＬＤｓを定量化して増殖を測定した。
【００８７】
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１ａ】シスプラチンへの応答におけるテロメラーゼ活性に対するＧＳＥ２４−２ペプチドの発現の効果。
【図１ｂ】シスプラチンへの応答におけるテロメラーゼ活性に対するＧＳＥ２４−２ペプチドの発現の効果。
【図１ｃ】（Ｃ）シスプラチンおよびＧＳＥ２４−２ペプチドを用いた、２９３Ｔ細胞抽出物のインビトロでの処理に続く、テロメラーゼ活性。シスプラチン、および精製したペプチドＧＳＥ２４−２の量を増加させたもの（３−５列目）、熱により失活させたＧＳＥ２４−２ペプチド（７列目）またはコントロールペプチド（８列目）を用いて、２９３Ｔ細胞抽出物をインビトロにて処理した後、後者をＴＰＡＰアッセイに用いた。テロメラーゼアッセイを行なうために、テロメアの配列を有する特異的な鋳型を用いた。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【図１ｄ】（Ｄ）ＧＳＥ２４−２を発現する細胞抽出物を用いたゲルシフト試験。プラスミドｐｃＤＮＡ３−９Ｅ１０２４−２またはｐｃＤＮＡ３−９Ｅ１０を発現する細胞の核抽出物をゲルシフト試験に供した。特異的なテロメアの配列を含むＴＥＬ１プローブを使用した。特異的な抗体９Ｅ１０（３列目）、およびＴＥＬ１とハイブリダイズして競合分子として機能するオリゴヌクレオチドＣＸｅｘｔ（４−５列目）を用いることにより、特異的な結合が確立された。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【図２ａ】ＧＳＥ２４−２はｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加させる。（Ａ）ｐＬＮＣＸ、ＤＸＣ、ＧＳＥ２４−２、Ｃｂｆ５、モチーフＩまたはモチーフＩＩ（細胞百万個あたり１０μｇのＤＮＡ）およびレポータープラスミドｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のテロメラーゼ活性を測定した。＊は統計値がｐ＜０．０５であることを示す。
【図２ｂ】（Ｂ）レポーターベクターｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞（黒）および２９３Ｔ２４−２細胞（白）を同時形質移入した。２４時間後、これらの細胞をシスプラチン（３  ｇ／ｍｌ）により８時間処理した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【図２ｃ】（Ｃ）提示された構築物（細胞百万個あたり１０μｇのＤＮＡ）およびレポーターベクターｈＴＲ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、２９３Ｔ細胞を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。
【図２ｄ】（Ｄ）レポーターベクターｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ、および様々な量のＭａｄ／ｍｙｃの発現ベクターを用いて、これらの細胞系統を同時形質移入した。形質移入して２４時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。
【図２ｅ】（Ｅ）レポーターベクターＨＩＶ−ｌｕｃと、発現ベクターｍａｄ／ｍｙｃの量を増加させたものとを用いて、これらの細胞系統を同時形質移入した。形質移入して２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ  を用いてこれらの細胞を６時間刺激した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率を制御するために、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。
【図３ａ】ＧＳＥ２４．２はｃ−ＭＹＣ遺伝子のプロモーターを介してその活性を誘導する。（Ａ）実験に使用したそれぞれの構築物を示す、ｃ−ＭＹＣプロモーターの概略図。
【図３ｂ】（Ｂ）レポーターベクターｃ−ＭＹＣ−ｌｕｃ（細胞百万個あたり１μｇ）のそれぞれの構築物を用いて、２９３Ｔ  ｐＬＮＣＸおよび２９３Ｔ  ＧＳＥ２４−２の細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率のコントロールとして、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（細胞百万個あたり０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。
【図３ｃ】（Ｃ）ＮＨＥＩＩＩにおいて作製した変異体の概略図。
【図３ｄ】（Ｄ）プラスミドｐｘ３．２由来の変異体のレポーターベクター（細胞百万個あたり１μｇ）を用いて、提示された細胞系統を形質移入した。形質移入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。形質移入効率のコントロールとして、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａベクターを用いた（細胞百万個あたり０．１μｇ／ｍｌ）。それぞれのグラフは、４通りにて行なった２つの実験の平均値および標準偏差を表す。
【図３ｅ】（Ｅ）発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２を用いて、ＭＥＦ細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって、マウスのｃ−ｍｙｃ遺伝子および  −アクチン遺伝子の発現を測定した。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【図３ｆ】（Ｆ）発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２を用いて、ＭＥＦ細胞を形質移入した。形質移入して２４時間後、全タンパク質の抽出物を単離し、特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって、マウスのｃ−ｍｙｃタンパク質および  −チューブリンタンパク質の発現を決定した。この実験を３回繰り返して同様の結果を得た。
【図４ａ】ＧＳＥ２４−２は、Ｘ染色体に関連する先天性角化異常症の患者の細胞、およびＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性を再活性化させる。（Ａ）キャリアの母親（ＤＣ−Ｃ）、および影響を受けた子供（ＤＣ−１、ＤＣ−２およびＤＣ−３）から取得した、Ｘ染色体に関連する先天性角化異常症を患う患者のリンパ芽球において、テロメラーゼ活性を測定した。これらの細胞に対し、空のベクター（−）またはＧＳＥ２４−２（＋）を細胞百万個あたり３μｇ用いて一過的に形質移入した。その２４時間後にテロメラーゼ活性を測定した。
【図４ｂ】（Ｂ）細胞百万個あたり３μｇの発現ベクターｐＬＮＣＸ、ＧＳＥ２４−２またはＤＫＣを用いて、一過的にＤＣ２細胞を形質移入した。その２４時間後にテロメラーゼ活性を測定した。
【図４ｃ】（Ｃ）細胞百万個あたり３μｇの空のベクターまたはＧＳＥ２４．２により形質移入された患者（ＤＣ−３）の１人の細胞における、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベル。ＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ＧＡＰＤＨ発現をコントロールとして用いた。
【図４ｄ】（Ｄ）Ｘ−ＤＣ  ＧＭＯ１７８７の患者の繊維芽細胞を、ベクターｐＬＮＣＸまたはＧＳＥ２４−２由来のウイルスによって感染させ、安定な細胞系統をテロメラーゼ活性測定のために用いた（タンパク質の全量を三角形にて示す）。
【図４ｅ】（Ｅ）プラスミドｐＬＮＣＸおよびｐＧＳＥ２４−２によって形質移入したＧＭＯ１７８７細胞におけるｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨ発現をコントロールとして用いた。
【図４ｆ】（Ｆ）パネルＤに記載したように形質移入されたＧＭＯ１７８７細胞の増殖速度を、一定時間における個体数の重複の累積を用いて評価した。全ての実験について３回繰り返し、同様の結果を得た。
【図４ｇ】（Ｇ）ＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性。この細胞に対し、細胞百万個あたり１６μｇのコントロールベクターｐＬＮＣＸまたはＧＳＥ２４．２を用いて一過的に形質移入した。その２４時間後に、タンパク質抽出液の連続した希釈液を用いて、テロメラーゼ活性を測定した（タンパク質の全量を三角形にて表す）。
【図４ｈ】（Ｈ）細胞百万個あたり１６μｇのプラスミドｐＬＮＣＸ、ＤＫＣまたはＧＳＥ２４−２により形質移入されたＶＡ１３細胞における、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベル。ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを測定した。ＧＡＰＤＨレベルをコントロールとして用いた。
【図５】ペプチドＧＳＥ２４．２は細胞老化から回復させる。図４Ｄに記載されたように形質移入されたＧＭＯ１７８７細胞の増殖速度を、一定時間における個体数の重複の累積を用いて評価した。全ての実験について３回繰り返し、同様の結果を得た。
【図６】ウェルナー症候群の患者における細胞（老化した真皮の繊維芽細胞）もまた、連続して１５０日以上生育することができたことを示す図である。
【図１ａ】
2011504483.tif 000003
【図１ｂ】
2011504483.tif 000004
【図１ｃ】
2011504483.tif 000005
【図１ｄ】
2011504483.tif 000006
【図２ａ】
2011504483.tif 000007
【図２ｂ】
2011504483.tif 000008
【図２ｃ】
2011504483.tif 000009
【図２ｄ】
2011504483.tif 000010
【図２ｅ】
2011504483.tif 000011
【図３ａ】
2011504483.tif 000012
【図３ｂ】
2011504483.tif 000013
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
2011504483.tif 000015
【図３ｅ】
2011504483.tif 000016
【図３ｆ】
2011504483.tif 000017
【図４ａ】
2011504483.tif 000018
【図４ｂ】
2011504483.tif 000019
【図４ｃ】
2011504483.tif 000020
【図４ｄ】
2011504483.tif 000021
【図４ｅ】
2011504483.tif 000022
【図４ｆ】
2011504483.tif 000023
【図４ｇ】
2011504483.tif 000024
【図４ｈ】
2011504483.tif 000025
【図５】
2011504483.tif 000026
【図６】
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【配列表】
2011504483000001.app
【国際調査報告】
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2011504483.tif 000029
2011504483.tif 000030
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