(57)【要約】  本発明は、転写後、ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に切断されて、関心対象のタンパク質を多コピー形成する、マルチマー性前駆体をコードしている核酸分子に関する。本発明はさらに、この核酸分子を含む細胞、およびこの細胞を用いて関心対象のタンパク質を産生するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象のタンパク質を含むマルチマー性前駆体をコードする核酸分子であって、該核酸分子がモチーフを含み、前記モチーフが少なくとも２回反復され、前記モチーフが少なくとも２つの要素を含み、前記の少なくとも２つの要素が：
ａ）関心対象のタンパク質をコードする要素
および
ｂ）切断部位をコードする要素
である、前記核酸分子。
【請求項２】
切断部位がＫｅｘ２切断部位である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
モチーフがさらに、介在配列である第三の要素を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
関心対象のタンパク質が、以下のリスト：サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ケモカイン、ホルモン、血液凝固剤、抗凝血剤、酸化防止剤、抗体、遺伝子操作（engineered）免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、ヒト化抗体、免疫同時刺激分子、免疫調節分子、ターゲットタンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、ウイルス、細菌、または寄生虫感染を阻害可能なタンパク質、構造タンパク質、融合タンパク質、酵素、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍または癌の開始または進行を阻害可能なタンパク質、増殖因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質、ペプチドおよびゼラチン様タンパク質、より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５】
関心対象のタンパク質がゼラチン様タンパク質である、請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】
関心対象のタンパク質が、ナノボディＴＭ、アビマー（avimer）ＴＭ、アンチカリン（anticalin）（登録商標）またはデュオカリン（duocalin）（登録商標）である、請求項４記載の核酸分子。
【請求項７】
要素ａ）が関心対象のタンパク質をコードし、少なくとも２つの別個のａ）要素が存在し、各々が関心対象の別個のタンパク質をコードし、そして
要素ｂ）が切断部位をコードし、切断部位が関心対象の各タンパク質の間に存在するように、少なくとも２つのｂ）要素が存在し、各々が切断部位をコードする
請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸分子を含む、核酸構築物または発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の核酸構築物または発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１０】
細胞が真核細胞である、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
真核細胞が酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞である、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
メチロトローフ酵母細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）株である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
Ｋｅｘ２様酵素、またはＫｅｘ２様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ２様プロセシング活性を有する酵素を含み、発現しそして／または過剰発現し、そして場合によって
Ｋｅｘ１様酵素、またはＫｅｘ１様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ１様プロセシング活性を有するＫｅｘ１様をさらに発現するかまたは含み、そして／または過剰発現し、ならびに／あるいは
ＳＴＥ１３遺伝子産物と同じ活性または増進した活性を有するＳＴＥ１３遺伝子様産物またはＳＴＥ１３遺伝子産物をさらに発現するかまたは含み、そして／または過剰発現する
請求項９〜１２のいずれか一項記載の細胞。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一項に定義される細胞を用いた、関心対象のタンパク質の産生法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写後、ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に切断されて、関心対象のタンパク質を多コピー形成する、マルチマー性前駆体をコードしている核酸分子に関する。本発明はさらに、この核酸分子を含む細胞、およびこの細胞を用いて関心対象のタンパク質を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分泌系は広範囲に研究されてきている。しかし、関心対象のタンパク質の分泌収量は、これまで研究されてきた多くの分泌系において、制限要因のままであり続けているようである。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現プラットフォームを用いると、１０ｇ／Ｌを超えて分泌されるタンパク質の例は比較的少なく（Ｗｅｒｔｅｎら（１９９９）．Ｙｅａｓｔ，１５：１０８７−１０９６）、一方、多くの他のタンパク質は（はるかに）より低いレベルで分泌される（多コピーピキア発現キット、マニュアルバージョンＦ、０１０３０２、Invitrogen社、および該文献中の参考文献）。関心対象のタンパク質の分泌収量はまた、発現系の特性にも応じる。関心対象のタンパク質は、多様な宿主において、異なるレベルで分泌されうる（Ｓｔｅｉｎｂｏｒｎ，Ｇ．ら．，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．，２００６，Ｎｏｖ  １４；５：３３）。関心対象のタンパク質の分泌収量を改善するよう試みる、いくつかの戦略が発展してきた。例えば、分泌しようとする関心対象のタンパク質をコードする核酸分子を含む発現構築物において、用いる宿主から生じる制御領域を用いてもよい。酵母において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子由来の強いプロモーターが頻繁に用いられ、そしてメチロトローフ酵母において、ペルオキシソーム・アルコールオキシダーゼの遺伝子由来の強いプロモーターが頻繁に用いられる（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０３巻，Ｄａｖｉｄ  Ｒ．  ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪａｍｅｓ  Ｍ．  Ｃｒｅｇｇ監修）。関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を改変して、宿主生物において高発現される遺伝子のコドン使用頻度に類似の使用頻度を採用してもよい（Ｇｒｏｓｊｅａｎ，Ｈら（１９８２），Ｇｅｎｅ，１８：１９９−２０９）。遺伝子の改変はまた、転写の未成熟な終結を防止し、そしてメッセンジャーＲＮＡの安定性を増進しうる（Ｓｃｏｒｅｒ，ＣＡら，（１９９３），Ｇｅｎｅ，１３６：１１１−１１９）。しばしば、分泌収量は、遺伝子コピー数を増加させることによって増加させうる（Ｓｃｏｒｅｒ，ＣＡら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）．，１９９４，Ｆｅｂ；１２（２）：１８１−４．；Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＤＲら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９９８；１０３：４１−５３）。
【０００３】
いくつかの関心対象のタンパク質に関しては、分泌収量は、シャペロン、または分泌経路の他の構成要素、例えばＣＮＥ１（Ｃｏｎｅｓａ，Ａ．ら（２００２），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：８４６−８５１；Ｋｌａｂｕｎｄｅら，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，（２００５）Ｏｃｔ  ７）、ＰＤＩ１（Ｓｍｉｔｈ，ＪＤ．ら（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８５：３４０−３５０；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｊ．ら（２００５）；Ｉｎａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２００６），９３：７７１−７７８；Ｌｉｕ，ＳＨ．ら（２００５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２６：８１８２４およびＬｏｄｉ，Ｔ．ら（２００５），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１：４３５９−４３６３）、ＫＡＲ２（Ｓｍｉｔｈ，ＪＤ．ら（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８５：３４０−３５０；Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｊ．ら（２００５））、ＳＥＣ４（Ｌｉｕ，ＳＨら（２００５））、ＳＳＯ１およびＳＳＯ２（Ｔｏｉｋｋａｎｅｎ，ＪＨ．ら（２００４），Ｙｅａｓｔ，２１：１０４５−１０５５；Ｒｕｏｈｏｎｅｎ，Ｌ．ら（１９９７），Ｙｅａｓｔ，１３：３３７−３５１、およびＫｌａｂｕｎｄｅ，Ｊ．ら（２００５））、ＥＲＯ１（Ｌｏｄｉ，Ｔ．ら（２００５））、ＳＢＨ１（Ｔｏｉｋｋａｎｅｎ，ＪＨ．ら（２００４），Ｋｌａｂｕｎｄｅ，Ｊ．ら（２００５））、ＰＳＡ１（Ｕｃｃｅｌｌｅｔｔｉ，Ｄ．ら（２００５），ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５：７３５−７４６）、ＵＢＩ４（Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら，（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｎ．Ｙ．），１２：８１９−８２３）、ＰＳＥ１（Ｃｈｏｗ，ＴＹ．ら，（１９９２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，（Ｐｔ３）：７０９−７１９）、ならびにＤＰＭ１（Ｋｒｕｓｚｅｗｓｋａ，ＪＳ．ら，（１９９９），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２３８２−２３８７）をコードする遺伝子の同時過剰発現によって増加されうると報告された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｅｒｔｅｎら（１９９９）．，Ｙｅａｓｔ，１５：１０８７−１０９６
【非特許文献２】多コピーピキア発現キット、マニュアルバージョンＦ、０１０３０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
【非特許文献３】Ｓｔｅｉｎｂｏｒｎ  Ｇ．ら．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．，２００６，Ｎｏｖ  １４；５：３３
【非特許文献４】Ｐｉｃｈｉａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０３巻，Ｄａｖｉｄ  Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇ監修
【非特許文献５】Ｇｒｏｓｊｅａｎ，Ｈら（１９８２），Ｇｅｎｅ，１８：１９９−２０９
【非特許文献６】Ｓｃｏｒｅｒ，ＣＡら，（１９９３），Ｇｅｎｅ，１３６：１１１−１１９
【非特許文献７】Ｓｃｏｒｅｒ，ＣＡら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）．１９９４，Ｆｅｂ；１２（２）：１８１−４．
【非特許文献８】Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＤＲら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８；１０３：４１−５３
【非特許文献９】Ｃｏｎｅｓａ，Ａ．ら（２００２），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：８４６−８５１
【非特許文献１０】Ｋｌａｂｕｎｄｅら，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（２００５）  Ｏｃｔ  ７
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ  ＪＤ．ら（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８５：３４０−３５０
【非特許文献１２】Ｉｎａｎら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｂｉｏｅｎｇ．（２００６），９３：７７１−７７８
【非特許文献１３】Ｌｉｕ  ＳＨ．ら（２００５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２６：８１８２４
【非特許文献１４】Ｌｏｄｉ  Ｔ．ら（２００５），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１：４３５９−４３６３
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ  ＪＤ．ら（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８５：３４０−３５０
【非特許文献１６】Ｔｏｉｋｋａｎｅｎ  ＪＨ．ら（２００４），Ｙｅａｓｔ，２１：１０４５−１０５５
【非特許文献１７】Ｒｕｏｈｏｎｅｎ  Ｌ．ら（１９９７），Ｙｅａｓｔ，１３：３３７−３５１
【非特許文献１８】Ｕｃｃｅｌｌｅｔｔｉ  Ｄ．ら（２００５），ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５：７３５−７４６
【非特許文献１９】Ｃｈｅｎ  Ｙ．ら，（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．），１２：８１９−８２３
【非特許文献２０】Ｃｈｏｗ  ＴＹ．ら，（１９９２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，（Ｐｔ３）：７０９−７１９
【非特許文献２１】Ｋｒｕｓｚｅｗｓｋａ  ＪＳ．ら，（１９９９），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２３８２−２３８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、多くの分泌系における関心対象のタンパク質の分泌収量は、産業規模でのこれらの系の使用を可能にするのに十分に高くはない。したがって、現存する系の欠点すべてを持たない、代替の、そして場合によって改善された分泌系の必要がなおある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
タンパク質分泌を改善する方法に関する本発明者らの研究において、本発明者らは、ここで、驚くべきことに、モチーフを含む核酸分子であって、前記モチーフが少なくとも２回反復され、前記モチーフが少なくとも２つの要素を含み、前記の２つの要素が：
ａ）関心対象のタンパク質をコードする要素
および
ｂ）切断部位をコードする要素
である、前記核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって、タンパク質分泌量が有意に改善されうることを見出した。
【０００７】
切断部位がＫｅｘ２切断部位である場合が、さらに好適であるようであった。Ｋｅｘ１切断部位が利用可能であれば、さらなる改善が提供される。宿主細胞は、真核細胞、例えば酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞等のリストより選択可能である。この方法を用いると、関心対象の多様なタンパク質が分泌可能であり、そして以前は不可能であった量で、関心対象の各タンパク質に関して可能である。分泌プロセスを設計することすら可能であり、ここで、関心対象の２つ、３つまたはそれより多くの別個のタンパク質が１つの単一の生物より分泌される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マルチマー性前駆体の構築ブロックの設計。所望のタンパク質、この場合はゼラチン配列は、太字および下線で示すアミノ酸モチーフ（ＫＲＥＡ）に隣接している。マルチマー構築は、ＤｒａＩＩＩおよびＰｆｌｍＩ制限部位（斜字で示す）によって容易になる。プライマーＢ１−ＦおよびＢ１−Ｒの結合部位を下線で示す。
【図２】関連する制限部位を含むｐＰＩＣＺ−Ｂ１のプラスミドマップ。
【図３】マルチマー性前駆体Ｂ４（四量体前駆体）の遺伝子。所望の（成熟）ゼラチン配列は、太字および下線で示すアミノ酸モチーフ（ＫＲＥＡ）に隣接している。斜字で示す残基（ｇｐａｐｅｐｇ）は介在配列を形成し、これは部位ＤｒａＩＩＩおよびＰｆｌＭＩを用いたマルチマー構築を容易にするために導入されている。
【図４】Ａ．  ｐＢ１（レーン１および２）、ｐＢ２（レーン３および４）、ｐＢ４（レーン５および６）およびｐＢ８（レーン７および８）の単一組込みコピーを含むピキア・パストリス株由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｍ：低分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。Ｂ．  ｐＢ８（レーン１）の単一組込みコピーを含むピキア・パストリス株およびＫＥＸ２遺伝子を過剰発現するｐＢ８の単一組込みコピーを含む株由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義：
マルチマー（すなわちポリマー）は、関心対象のタンパク質が、モチーフまたはモノマーであって、直鎖方式で少なくとも２回反復されて、より長いポリマーまたはマルチマーを生じる、前記モチーフまたはモノマーを含むことを意味する。こうしたマルチマー（またはポリマー）は、したがって、モノマー配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０反復を含むかまたはこうした反復からなる。モノマーまたはモノマー単位は、好ましくは、介在アミノ酸を伴わずに反復されるが、場合によって、いくつかまたはすべてのモノマー単位の間に、１、２、３、４、５、またはそれより多い連結アミノ酸が存在してもよい。
【００１０】
ホモマルチマーＭａは、関心対象のタンパク質が「ａ」回反復される単一モチーフＭを含むことを意味する。整数「ａ」は、１および２０以上の間であり、例えば２〜５０の間、または２〜１００の間またはさらにそれ以上であってもよい。
【００１１】
ヘテロマルチマーは、関心対象のタンパク質が、数回反復されるいくつかの別個のモチーフまたはモノマーを含むことを意味する：例えばＭ１ａＭ２ｂＭ３ｃＭ４ｄ。この例において、モチーフＭ１は「ａ」回、Ｍ２は「ｂ」回、Ｍ３は「ｃ」回、Ｍ４は「ｄ」回反復される。整数ａ、ｂ、ｃおよびｄは、必ずしも同じ値を持たない。これらは、上記で「ａ」として定義される。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４は、少なくとも２つのモノマーが互いに異なっている限り、同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００１２】
用語「タンパク質」、「関心対象のタンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」または「遺伝子産物」は、交換可能に用いられ、そして特定の作用様式、サイズ、三次元構造または起源に関わらず、アミノ酸鎖からなる分子を指す。単離タンパク質は、培地から精製されたタンパク質などの、天然環境で見られないタンパク質である。
【００１３】
用語「酵素」は、基質に対する特定の触媒活性、例えば、限定されるわけではないが、特定のペプチド配列を切断し、特定のペプチド配列を除去し、特定のヌクレオチド配列を切断し、特定のヌクレオチド配列を除去すること等の活性を有するタンパク質を指す。この特定の触媒活性は、酵素濃度、基質濃度および環境因子、例えば温度、酸性度、特定のイオンおよび他の補因子の存在に応じる。
【００１４】
用語「コラーゲン」、「コラーゲン関連」、「コラーゲン由来」および「ゼラチン」または「ゼラチン様」は、交換可能に使用可能である。
「天然」または「自然」または「内因性」のタンパク質または関心対象のタンパク質は、これらが由来する生物によって産生されるようなタンパク質または関心対象のタンパク質を意味する。
【００１５】
「天然」または「自然」コラーゲンまたはコラーゲン性ドメインは、天然に、例えばヒトまたは他の哺乳動物で見られる、５，０００から４００，０００ダルトンを超えるまでの範囲のＭＷを有する核酸またはアミノ酸配列を指す。
【００１６】
ゼラチン様タンパク質は、ゼラチン様タンパク質モノマーまたはゼラチン様タンパク質マルチマーのいずれも意味する。
ゼラチン様タンパク質モノマー（あるいはモノマーを含むかまたはモノマーからなるポリマー）は、好ましくは、かなりの数のＧＸＹ三つ組を含むか、または該三つ組からなり、ここで、Ｇはグリシンであり、そしてＸおよびＹは任意のアミノ酸である。かなりの数のＧＸＹ三つ組は、ゼラチン様タンパク質モノマー全体のアミノ酸トリプレットの少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または最も好ましくは１００％が、ＧＸＹ、特に連続したＧＸＹトリプレットであることを指す。モノマーおよび／またはポリマーのＮ末端および／またはＣ末端は、ＧＸＹトリプレットでなくてもよい他のアミノ酸を含んでもよい。また、モノマーの分子量は、好ましくは、少なくとも約１ｋＤａ（計算分子量）、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く、例えば１５、２０、２５、３０およびさらに４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００およびさらにそれより多い。
【００１７】
「断片」は、より長い核酸またはポリペプチド分子の一部であり、例えば、より長い分子の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００またはそれより多い連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含むかまたはこれらからなる。好ましくは、断片は、より長い分子の１０００、８００、６００、５００、３００、２００、１００、５０、３０またはそれより少ない連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含むかまたはこれらからなる。
【００１８】
「変異体」は、１またはそれより多くのアミノ酸挿入、欠失または置換によって、自然または天然配列とは異なり、そして以下に定義するような天然配列に「実質的に同一」である配列を指す。
【００１９】
用語「同一性」、「実質的に同一」、「実質的同一性」または「本質的に類似」または「本質的類似性」は、２つのポリペプチドがデフォルトパラメータを伴うＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて対で並列された際に、少なくとも６０％、７０％、８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、または９７％、より好ましくは少なくとも９８％、９９％またはそれより多いアミノ酸配列同一性を含むことを意味する。好ましくは、並列は、本明細書記載の配列番号によって同定される全コード配列を用いて行われる。配列並列および配列同一性パーセントに関するスコアは、コンピュータプログラム、例えば、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USAより入手可能である、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３を用いるか、またはＥｍｂｏｓｓＷＩＮ（例えば、バージョン２．１０．０）において用いて、決定してもよい。２つの配列間の配列同一性を比較するため、局所並列アルゴリズム、例えばＥｍｂｏｓｓＷＩＮプログラム「ｗａｔｅｒ」において用いられるような、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７（１）；１９５−７）などを用いることが好ましい。デフォルトパラメータは、タンパク質用のＢｌｏｓｕｍ６２置換マトリックスを用いると、ギャップオープニングペナルティ１０．０およびギャップ伸長ペナルティ０．５である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ，８９，９１５−９１９）。
【００２０】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結されている」は、機能的関連にある要素（核酸またはタンパク質またはペプチド）の連結を指す。要素は、別の要素と機能的関連にあるように配置された際、「機能可能であるように連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。機能可能であるように連結されている、とは、連結されている要素が、典型的には隣接しており、そして２つのタンパク質コード領域を連結することが必要である場合、隣接しており、そしてリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００２１】
発現は、限定されるわけではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌等を含む、タンパク質産生に関与する任意の工程を含むよう理解される。
過剰発現は、当該技術分野に知られる任意の方法による、宿主細胞への単数または多数の修飾による内因性タンパク質の発現レベル増加と理解される。発現レベル増加は、非修飾宿主細胞に比較した際、内因性タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡレベルの少なくとも１０％の増加と定義される。メッセンジャーＲＮＡレベルはノーザンブロッティングまたはアレイによって評価可能である。宿主細胞において内因性に発現されるのではないタンパク質の場合、こうしたタンパク質が、当業者に知られる任意の方法によって、好ましくは組換え分子生物学技術によって、前記宿主細胞において発現されるのであれば、好ましくは、前記宿主細胞における前記タンパク質の発現について述べるであろう。この場合、発現は、前記宿主細胞における、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡの任意の検出可能な量を意味する。
【００２２】
核酸構築物は、天然存在遺伝子から単離されるか、あるいは単離されるか、合成されるか、組み合わされるかまたはそうでなければ天然には存在しない方式で並置される核酸セグメントを含むように修飾されている、核酸分子と定義される。
【００２３】
さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、文脈が明らかに要素の１つであってそして１つのみを必要とするのではない限り、要素の１より多くが存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つの」を意味する。用語「含む」は、言及する部分、工程または構成要素の存在を特定するものとして解釈されるものとするが、１以上のさらなる部分、工程または構成要素の存在を排除しない。さらに、動詞「からなる」は、本明細書に定義するような核酸分子、核酸構築物、細胞が、特に同定されたもの以上にさらなる構成要素（単数または複数）を含んでもよく、前記のさらなる構成要素（単数または複数）が本発明に特有の特性を改変しないことを意味する、「から本質的になる」によって置換可能である。
【００２４】
単語「およそ」または「約」は、数値と関連して用いた場合（およそ１０、約１０）、好ましくは、所定の値の１０より、５％多いまたは少ない値であってもよいことを意味する。
【００２５】
本明細書に引用されるすべての特許および参考文献は、その全体が本明細書に援用される。
特定の微生物による、関心対象のタンパク質の分泌収量を改善する方法を調査していて、本発明者らは、タンパク質の分泌収量（リットルあたりのグラムで表す）がサイズに応じることを見出した。特に、ゼラチン様タンパク質の場合、より高い分子量のゼラチン様タンパク質は、より低い分子量のゼラチン様タンパク質よりもより高いレベルで分泌されることが見出した。さらなる調査において、本発明者らは、関心対象のタンパク質の分泌収量を増加させる新規アプローチを探索した。
【００２６】
核酸分子
第一の側面において、本発明は、モチーフを含む核酸分子であって、前記モチーフが少なくとも２回反復され、前記モチーフが少なくとも２つの要素を含み、前記の少なくとも２つの要素が：
ａ）関心対象のタンパク質をコードする要素
および
ｂ）切断部位をコードする要素
である、前記核酸分子を提供する。
【００２７】
関心対象のタンパク質をコードする要素（要素ａ））
関心対象のタンパク質は、化粧品産業、食品または餌産業、洗剤産業などの産業適用で使用可能な任意のタンパク質であってもよい。タンパク質は、任意のタイプの疾患または状態を防止し、治療し、遅延する薬剤として使用可能な、活性成分であってもよい。薬剤は、疼痛、癌、心臓血管疾患、心筋修復、血管新生、骨修復および再生、創傷治療、神経刺激／療法または糖尿病の治療のためであってもよい。関心対象のタンパク質の例には：サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ−２、４、５、６、１２等）、アルファ−、ベータ−およびガンマ−インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、ケモカイン、ホルモン（成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン等）、血液凝固剤および抗凝血剤（ヒルジン等）または酸化防止分子が含まれる。さらなる例は、抗体、遺伝子操作（engineered）免疫グロブリン様分子（ナノボディＴＭなどのラクダ科（camelid）由来単一ドメイン抗体、アビマー（avimer）ＴＭなどのアビディティー・マルチマー等、またはアンチカリン（anticalin）（登録商標）およびデュオカリン（duocalin）（登録商標）などのリポカリン誘導体等）、一本鎖抗体またはヒト化抗体、免疫同時刺激分子、免疫調節分子、ターゲットタンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、ウイルス、細菌、または寄生虫の感染および／または発達を阻害可能な別のタンパク質、構造タンパク質（アルブミン、コラーゲン等）、ゼラチンまたはゼラチン様タンパク質、融合タンパク質、酵素（トリプシン、リボヌクレアーゼ、Ｐ４５０チトクロム、リパーゼ、アミラーゼ等）、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍または癌の開始または進行を阻害可能なタンパク質（細胞分裂または伝達シグナルのレベルで作用する阻害剤、腫瘍抑制剤遺伝子の発現産物、例えばｐ５３またはＲｂ等）、増殖因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質およびその誘導体（会合したレポーター基を含むものなど）である。関心対象のタンパク質はまた、プロドラッグ活性化酵素も含みうる。
【００２８】
別の態様において、関心対象のタンパク質はそれ自体、マルチマー：本明細書の一般的な定義のセクションにおいて定義するような、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーである。
【００２９】
さらに別の態様において、それ自体がマルチマーである関心対象のタンパク質は、本明細書の一般的な定義と題するセクション中に定義するような、ゼラチン様タンパク質である。
【００３０】
切断部位をコードする要素（要素ｂ））
本発明の核酸分子の核酸配列中に存在するモチーフの要素（ｂ）は、切断部位をコードする。こうした切断部位は、当該技術分野に知られる任意の切断部位であってもよい。本発明において、Ｋｅｘ２切断部位を用いることによって、優れた結果が得られた。好ましくは、切断部位はＫｅｘ２切断部位である。
【００３１】
好ましい態様において、本発明の核酸分子中に存在するモチーフは、さらに、介在配列である第三の要素を含む。
別の好ましい態様において、本発明の核酸分子はモチーフを含み、前記モチーフが少なくとも２回反復され、前記モチーフが少なくとも２つの要素を含み、ここで：
要素ａ）が関心対象のタンパク質をコードし、少なくとも２つの別個の要素ａ）が存在し、各々が関心対象の別個のタンパク質をコードし、そして
要素ｂ）が切断部位をコードし、切断部位が関心対象の各タンパク質の間に存在するように、少なくとも２つのｂ）要素が存在し、各々が切断部位をコードする。
【００３２】
この核酸分子は、混合物が関心対象の別個のタンパク質を含むことができる、関心対象のタンパク質の混合物の産生を可能にするため、好ましい。この態様の有益な使用の例は、肝炎ワクチンの製造である。このワクチンは、いくつかの別個のタンパク質を含む。
【００３３】
本発明の核酸分子において、本明細書に定義するようなモチーフは、少なくとも２回反復されるが、多数回、例えば２〜１００回、またはそれより多く反復されてもよい。例えば、モチーフは、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５、２０、２５、３０、または４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５回あるいはそれより多く反復されてもよい。
【００３４】
場合によっては、関心対象のタンパク質自体が、例えばＫｅｘ２様またはＫｅｘ２切断部位のような切断部位を含有し、前記関心対象のタンパク質もまたこうしたものとして切断され、これが望ましくない可能性もある。こうした場合、関心対象のタンパク質をコードする天然配列から、切断部位を除去することを考慮してもよい。その結果、関心対象の天然タンパク質の変異体を含むマルチマー性前駆体が産生され、そして続いて、関心対象の天然タンパク質の変異体が、本発明の方法によって分泌される。好ましい態様において、関心対象の天然タンパク質は、内部切断部位、より好ましくはＫｅｘ２切断部位を持たない。
【００３５】
本発明の核酸分子の核酸配列中の反復モチーフの発現は、関心対象のタンパク質を含むマルチマー性前駆体の発現を生じる。このマルチマー性前駆体内の関心対象の各タンパク質は、切断部位によって分離されている。特異的な切断酵素の作用によって、関心対象の個々のタンパク質は、関心対象のタンパク質の発酵プロセスにおいて分泌されて、非常に高収量を生じうる。
【００３６】
先のパラグラフに示すように、関心対象の天然タンパク質は、すでに、少なくとも１つの切断部位を含んでもよい。上に定義するような要素ａ）およびｂ）を含む本発明の核酸分子において、要素ｂ）は、好ましくは、関心対象のタンパク質（要素ａ））内に存在せず、関心対象のタンパク質の上流および下流に存在する。関心対象のタンパク質が少なくとも１つの切断部位を含有する場合、この少なくとも１つの部位は、好ましくは除去される。当業者は、対応するコード配列を操作することによって、所定のタンパク質配列中のこうした部位を特異的に除去する方法を知っている。
【００３７】
Ｋｅｘ２切断部位は、Ｋｅｘ２またはＫｅｘ２様酵素によって切断可能な部位である。Ｋｅｘ２は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵素の名称である（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ，３０：９３３−９４３；Ｂｒａｋｅ  ＡＪら（１９８３），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１４４０−１４５０；ならびにＣａｐｌａｎら，（１９９１），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：６２７−６３５）。しかし、Ｋｅｘ２様酵素またはＫｅｘ２相同体は、すでに、植物を含むいくつかの真核生物において同定されてきている（Ｊｉａｎｇ  Ｌら，（１９９９），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８：２３−３２；Ｆｕｌｌｅｒ  ＲＳら，（１９８９），Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：４８２−４８６およびＢｒｅｓｎａｔａ  ＰＡら，（１９９０），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１１：２８５１−２８５９）。本発明者らは、Ｋｅｘ２様酵素に関して以下の定義を提唱する：該酵素は、ゴルジに局在するプロテアーゼであり、ＫまたはＲなどの２つの連続する塩基性アミノ酸残基の後でタンパク質を特異的に切断する。したがって、Ｋｅｘ２切断部位は、好ましくは：ＫＫ、ＫＲ、ＲＲまたはＲＫである。ＫＲがより好ましい切断部位である。しかし、単一のＲ残基を含有するいくつかの配列もまた、Ｋｅｘ２によって切断される。例えば、Ｋｅｘ２は、特定のコラーゲン性配列に存在する配列ＭＧＰＲ中のＲ残基の後で、切断する（Ｗｅｒｔｅｎ  ＭＷ，ｄｅ  Ｗｏｌｆ  ＦＡ．Reduced proteolysis of secreted gelatin and Yps1-mediated alpha-factor leader processing in a Pichia pastoris kex2 disruptant.  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５  Ｍａｙ；７１（５）：２３１０−７）。
【００３８】
したがって、要素ｂとして、ＫＫ、ＫＲ、ＲＲ、またはＲＫのいずれかをコードする核酸分子を含む核酸分子が本発明に含まれ、ＭＧＰＲ配列をコードする核酸分子もまた含まれる。Ｋｅｘ２様酵素による切断の効率は、二塩基性モチーフに続く残基に依存する。例えば、原型Ｋｅｘ２切断部位ＫＲＸにおいて、芳香族アミノ酸、小さいアミノ酸およびヒスチジンなどのいくつかのアミノ酸Ｘが許容される（多コピーピキア発現キット、マニュアルバージョンＦ、０１０３０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。酵母では、二塩基性Ｋｅｘ２切断部位に、ＥＡまたはその反復が続く場合に、非常に効率的な切断が起こる。これらのＥＡ反復は、典型的には、ＳＴＥ１３（ＳＴＥｒｉｌｅ１３）遺伝子産物によって除去される（Ｊｕｌｉｕｓ  Ｄ，Ｂｌａｉｒ  Ｌ，Ｂｒａｋｅ  Ａ，Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｇ，Ｔｈｏｒｎｅｒ  Ｊ．，Yeast alpha factor is processed from a larger precursor polypeptide: the essential role of a membrane-bound dipeptidyl aminopeptidase.  Ｃｅｌｌ，１９８３  Ｍａｒ；３２（３）：８３９−５２）。１つの態様において、こうしたＥＡモチーフは、Ｋｅｘ２切断部位に関連して位置する場合、例えばＫＲＥＡの場合、ＳＴＥ１３切断部位と称される。
【００３９】
したがって、好ましい態様において、Ｋｅｘ２切断部位は、ＥＡまたはその反復が続く、本明細書において定義される二塩基性モチーフによって定義される。
より好ましい態様において、関心対象のタンパク質を数コピー含むマルチマー性前駆体をコードし、関心対象のタンパク質の各コピーがＫＲＥＡ、ＫＲＥＡＥＡおよびＫＲＥＡＥＡＥＡより選択される配列によって分離されている核酸分子を用いる。この核酸分子を、Ｋｅｘ２様タンパク質、Ｋｅｘ１様タンパク質およびＳＴＥ１３遺伝子産物と同じ活性を持つタンパク質を含む、宿主細胞、好ましくは酵母細胞に導入する。
【００４０】
本発明の核酸分子は、式：
（ＣＰ）ｎまたは（ＣＰ）ｎＣ、式中、Ｐは本明細書に定義するような関心対象のタンパク質であり、Ｃは、本明細書に定義するような切断部位、好ましくはＫｅｘ２切断部位を含むジペプチドであり、そしてｎは少なくとも２である整数である
で示されうるポリペプチドをコードしてもよい。好ましい態様において、ｎは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または５０、１００、１５０、２００またはそれより多い。あるいは、または先の好ましい態様と組み合わせて、本発明は、リーダー配列（Ｌ）が第一のＣＰモチーフの上流に存在する好ましい態様：Ｌ（ＣＰ）ｎまたはＬ（ＣＰ）ｎＣに関する。好ましいリーダー配列は、アルファ因子プレプロ配列である（Ｂｒａｋｅ  ＡＪら，（１９８３），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１４４０−１４５０；ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２），Ｃｅｌｌ，３０：９３３−９４３）。
【００４１】
本発明記載の核酸分子は、宿主において対応するタンパク質に翻訳された際、宿主細胞中に存在するＫｅｘ２様プロテアーゼによって各Ｋｅｘ２切断部位が認識され、そして切断され、Ｋｅｘ２が認識部位のＣ末端で切断することから、典型的にはＣ末端伸長（Ｋｅｘ２部位から残るもの）を含む、関心対象のタンパク質の産生を生じるため、特に好適である。場合によって、Ｋｅｘ１様酵素がＣ末端塩基性残基（Ｋｅｘ２部位から残るもの）を除去する（Ｗａｇｎｅｒ  ＪＣおよびＷｏｌｆ  ＤＨ．，（１９８７），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４：４２３−４２６、ならびにＣｏｏｐｅｒ  Ａ．およびＢｕｓｓｅｙ  Ｈ．，（１９８９），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：２７０６−２７１４）。例えば、Ｋｅｘ２による配列ＬＣＰＣＰＣＰＣＰの切断は、ＬＣ、ＰＣ、ＰＣ、ＰＣおよびＰの産生を生じる。Ｋｅｘ１によるさらなる切断は、関心対象のタンパク質Ｐ（ならびにＬおよびＣ）の４コピーの産生を生じる。
【００４２】
したがって、本発明の１つの単一の核酸分子は、関心対象のタンパク質ｎコピーの産生を導く。発酵プロセスにおいて産生されるはずの関心対象のタンパク質の収量は、したがって、同じ宿主細胞中であるが、古典的な核酸分子（または核酸構築物または発現構築物）であって、関心対象のタンパク質をコードする核酸分子の１つの単一コピーを含む前記古典的核酸分子を用いた、関心対象の同じタンパク質の収量に比較して増加すると期待されうる。本発明者らは、驚くべきことに、この理論を実行可能であることを実際に見出した。当業者は、予期される増加が、とりわけ、選択する宿主細胞および選択する関心対象のタンパク質に応じて多様であることを理解するであろう。いくつかの宿主細胞−関心対象のタンパク質の組み合わせに関しては、２％、３％、４％、５％、７％、または１０％のわずかな増加しか達成できない。他の組み合わせに関しては、増加はより有意であることも可能であり、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％あるいはそれより多く、そしてまた他の組み合わせに関しては、収量は、２、３、４、５、６、７、８、９そしてさらに１０倍またはそれより多い倍率で増加しうる。収量は、好ましくは定量的方法で評価される。例えば、培養上清中の関心対象のタンパク質の量は、同じタンパク質の既知の量との比較によって、ＨＰＬＣまたはＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）などのクロマトグラフィー法によって決定可能である。収量はまた、関心対象のタンパク質の活性に関する特異的アッセイが使用可能である場合、こうしたアッセイを用いることによっても比較可能である。収量が少なくとも５０％増加する場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロッティングなどの半定量的方法もまた使用可能である。
【００４３】
１つの態様において、関心対象のタンパク質をコードする各要素ａ）を、切断部位、好ましくはＫｅｘ２切断部位をコードする各要素ｂ）に、機能可能であるように連結してもよい。あるいは、または他の態様と組み合わせて、本発明は、本発明の核酸分子が、・・・ＣＰＣＱＣＲＣＳ、式中、Ｃは、例えばＫｅｘ２切断部位を含むジペプチドのような切断部位であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓは関心対象の４つの別個のポリペプチドである、によって示されるマルチマー性前駆体をコードする、別の好ましい態様に関する。もちろん、これは例であり、本発明の他の態様は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い別個の関心対象のタンパク質の産生を可能にする核酸分子を含む。本発明のこの態様は、いくつかの関心対象のペプチドまたはタンパク質を含むワクチンの産生のために特に好適である。こうしたワクチンの例は肝炎ワクチンである。
【００４４】
あるいは、または先の好ましい態様と組み合わせて、本発明は、本発明の核酸分子が、以下のように示されうるマルチマー性前駆体をコードする、別の好ましい態様に関する：（ＣＰＣＩ）ｎ、式中、Ｃは、例えばＫｅｘ２切断部位を含むジペプチドのような切断部位を示し、Ｐは関心対象のタンパク質を示し、Ｉは介在配列を示し、そしてｎは少なくとも２である整数である。好ましい態様において、ｎは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００またはそれより多い。より好ましくは、リーダー配列が、第一のモチーフＣＰＣＩの上流に存在する：Ｌ（ＣＰＣＩ）ｎ。好ましいリーダーは、本明細書にすでに定義されている。
【００４５】
介在配列は、通常、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸を含む。１つの態様において、介在配列は、例えば７アミノ酸を含む。介在配列はまた、例えばＫｅｘ２切断部位のようなさらなる切断部位も含んでもよい。介在配列は、実用的な結果に相当してもよいし、あるいは本発明の核酸分子の設計または構築の副次的な結果に相当してもよい。好ましい介在配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いた、本発明のヌクレオチドの構築によって形成される。
【００４６】
本発明の核酸分子の調製は、当業者に知られる分子生物学技術を用いて実行される（Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２００１，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００４７】
核酸構築物または発現ベクター
さらなる側面において、先のセクションに定義されるような核酸分子を含む核酸構築物または発現ベクターを提供する。場合によって、核酸構築物中に存在する核酸分子は、１以上の調節配列に機能可能であるように連結され、こうした配列は、適切な発現宿主において、コードされるタンパク質の産生を導く。
【００４８】
調節配列は、本明細書において、関心対象のタンパク質の発現に必要であるかまたは好適であるすべての構成要素を含むよう定義される。最小限、調節配列には、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルが含まれる。
【００４９】
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含む発現ベクターにも関する。好ましくは、発現ベクターは、適切な発現宿主において、コードされる関心対象のタンパク質の産生を導く１以上の調節配列に機能可能であるように連結されている、本発明の核酸分子を含む。最小限、調節配列には、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルが含まれる。発現ベクターは、組換え発現ベクターとして見出されてもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に供されることも可能であり、そして関心対象の組換えタンパク質をコードする核酸配列の発現を達成することも可能な、任意のベクター（例えばプラスミド、ウイルス）であってもよい。この発現ベクターが導入される宿主の同一性、および本発明の核酸配列の起源に応じて、当業者は、最も適した発現ベクターおよび調節配列を選択する方法を知っている。
【００５０】
宿主細胞
さらにさらなる側面において、先のセクションに定義するような核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞または宿主または細胞を提供する。
【００５１】
好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞等の真核細胞である。少なくとも、機能するＫｅｘ２様および好ましくはＫｅｘ１様酵素をも発現する任意の細胞において、本発明を適用可能であることが注目される。好ましい哺乳動物細胞はヒト細胞である。酵母細胞は、ハンセヌラ属（Hansenula）、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）、ニューロスポラ属（Neurospora）、アルクスラ属（Arxula）またはピキア属（Pichia）より選択可能である。真菌および酵母細胞は、反復配列の不適切な発現に対して感受性でないため、細菌より好ましい。酵母細胞がさらにより好ましい。メチロトローフ酵母宿主が最も好ましい。メチロトローフ酵母の例には、ハンセヌラ属またはピキア属種に属する株が含まれる。好ましい種には、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）およびピキア・パストリスが含まれる。より好ましくは、宿主は、発現された際に関心対象のタンパク質を攻撃するかまたは分解しうる、高レベルのプロテアーゼおよび／またはタンパク質分解酵素を持たない。さらにより好ましくは、宿主は、１以上のプロテアーゼおよび／またはタンパク質分解酵素および／または他の望ましくない酵素が不全であるように修飾されている。これに関連して、プロテアーゼは、好ましくは、Ｋｅｘ２様またはＫｅｘ１様酵素ではない。望ましくない酵素の例は、プロテイナーゼＡまたはＢである。この点において、ピキア属またはハンセヌラ属は、非常に適切な発現系の例を提供する。ゼラチン発現系としてのピキア・パストリスの使用が、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３およびＥＰ−Ａ−１０１４１７６に開示されている。当業者は、宿主細胞および発現しようとする配列に関する知識と組み合わせて、宿主細胞を、本発明にしたがって用いるのに適した関心対象のタンパク質の発現に適したものにする、本明細書に記載する必要なパラメータに基づいて、既知の産業的酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞から、適切な宿主細胞を選択することが可能であろう。
【００５２】
好ましい態様において、宿主細胞は、Ｋｅｘ２様酵素、またはＫｅｘ２様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ２様プロセシング活性を有する酵素を含むか、または発現しそして／または過剰発現する。より好ましくは、宿主細胞は、機能する内因性（すなわち天然）Ｋｅｘ２様酵素を発現する。
【００５３】
あるいはまたは先の好ましい態様と組み合わせて、宿主細胞は、Ｋｅｘ２様酵素を（過剰）発現するように遺伝子操作され、そして／または増進したＫｅｘ２様プロセシング活性を示すように遺伝子操作される。この態様において、宿主細胞は、すでに、機能する内因性Ｋｅｘ２様酵素を発現してもよい。内因性Ｋｅｘ２様酵素および／または非天然Ｋｅｘ２様酵素は、宿主細胞において過剰発現されてもよい。細胞が、本明細書において先に定義するようなＫｅｘ２切断部位をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％、特異的に切断可能である場合、用いる宿主細胞は、機能するＫｅｘ２様酵素を発現するか、あるいはＫｅｘ２様プロセシング活性を所持するかまたは含むといわれる。所定のＫｅｘ２様酵素がｉｎ  ｖｉｖｏでＫｅｘ２切断部位を切断する能力は、好ましくは、Ｋｅｘ２またはＫｅｘ２様部位を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物で、前記Ｋｅｘ２様酵素を発現する細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養し、そして細胞のＫｅｘ２様酵素の機能性のパーセントとして評価することによって、評価される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価は、好ましくは、試験しようとする前記Ｋｅｘ２様酵素に対して行われ、該酵素を、本明細書において先に定義するようなＫｅｘ２切断部位を含むポリペプチドとインキュベーションする。
【００５４】
あるいは、Ｋｅｘ−２様酵素の機能性は、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス由来のＫｅｘ２酵素のＫｅｘ−２活性との比較によって評価する。この態様において、所定のＫｅｘ２切断部位を切断する能力が、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリスのＫｅｘ２が前記の同じ切断部位を切断する能力の少なくとも５０％である場合、Ｋｅｘ２様酵素は、好ましくは、機能性であるといわれるか、あるいはＫｅｘ２様プロセシング活性を所持するかまたは含むといわれる。好ましくは、切断能は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％あるいはそれより高い。この態様において、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価を行ってもよい。
【００５５】
Ｋｅｘ２様プロセシング活性は、好ましくは、上に提供するアッセイいずれかを用いて測定した際、遺伝子操作された所定の細胞において、由来する細胞における同じ活性との比較によって、少なくとも５％増進している場合、増進したといわれる。あるいは、活性は、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価される。より好ましくは、増進した、とは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれより多くの増進を意味する。
【００５６】
Ｋｅｘ２様活性の存在の結果としての切断産物の存在を、質量分析によって評価してもよい。
さらにより好ましくは、宿主細胞は、Ｋｅｘ１様酵素、またはＫｅｘ１様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ１様プロセシング活性を有するＫｅｘ１様をさらに発現するか、または含みそして／または過剰発現する。さらにより好ましくは、宿主細胞は、本明細書にすでに定義するような、いかなるさらなるＣ末端残基（Ｋｅｘ２部位から残るもの）も伴わずに関心対象のタンパク質を生じるように、機能性の内因性Ｋｅｘ１様酵素を発現する。Ｋｅｘ１は、サッカロミセス・セレビシエにおいて同定されるような酵素の名称である（Ｗａｇｎｅｒ  ＪＣら（１９８７），Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．，２２１：４２３−４３６）。Ｋｅｘ２と同様、Ｋｅｘ１のいくつかの真核生物相同体がすでに同定されてきている。別のさらにより好ましい態様において、Ｋｅｘ１様酵素を過剰発現するために宿主細胞を遺伝子操作し、そして／または増進したＫｅｘ１様プロセシング活性、好ましくはＫｅｘ１切断部位を示すために遺伝子操作する。この態様において、宿主細胞は、すでに、機能する内因性Ｋｅｘ１様酵素を発現してもよい。内因性Ｋｅｘ１様酵素および／または非天然Ｋｅｘ１様酵素は、宿主細胞において過剰発現されてもよい。細胞が、本明細書において先に定義するようなＫｅｘ１切断部位をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％、特異的に切断可能である場合、用いる宿主細胞は、機能するＫｅｘ１様酵素を発現するか、またはＫｅｘ１様プロセシング活性を所持するといわれる。所定のＫｅｘ１様酵素がｉｎ  ｖｉｖｏでＫｅｘ１切断部位を切断する能力は、好ましくは、Ｋｅｘ１またはＫｅｘ１様部位を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物で、前記Ｋｅｘ１様酵素を発現する細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養し、そして細胞のＫｅｘ１様酵素の機能性のパーセントとして評価することによって、評価される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価は、好ましくは、試験しようとする前記Ｋｅｘ１様酵素に対して行われ、該酵素を、本明細書において先に定義するようなＫｅｘ１切断部位を含むポリペプチドとインキュベーションする。
【００５７】
あるいは、Ｋｅｘ１様酵素の機能性は、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス由来のＫｅｘ１酵素のＫｅｘ１活性との比較によって評価する。この態様において、所定のＫｅｘ１切断部位を切断する能力が、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリスのＫｅｘ１が前記の同じ切断部位を切断する能力の少なくとも５０％である場合、Ｋｅｘ１様酵素は、好ましくは、機能性であるといわれるか、あるいはＫｅｘ１様プロセシング活性を所持するかまたは含むといわれる。好ましくは、切断能は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％あるいはそれより高い。この態様において、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価を行ってもよい。
【００５８】
Ｋｅｘ１様プロセシング活性は、好ましくは、上に提供するアッセイいずれかを用いて測定した際、遺伝子操作された所定の細胞において、由来する細胞における同じ活性との比較によって、少なくとも５％増進している場合、増進したといわれる。あるいは、活性は、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価される。より好ましくは、「増進した」は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれより多くの増進を意味する。
【００５９】
Ｋｅｘ１様活性の存在の結果としての切断産物の存在を、質量分析によって評価してもよい。
さらにより好ましくは、宿主細胞は、ＳＴＥ１３遺伝子産物と同じ活性または増進した活性を有するＳＴＥ１３遺伝子様産物またはＳＴＥ１３遺伝子産物をさらに発現するか、または含みそして／または過剰発現する。さらにより好ましくは、宿主細胞は、本明細書にすでに定義するような、いかなるさらなるＥＡモチーフ（Ｋｅｘ２部位から残るもの）も伴わずに関心対象のタンパク質を生じるように機能する、内因性ＳＴＥ１３遺伝子様産物を発現する。Ｓｔｅ１３は、Ｊｕｌｉｕｓらに同定されるようなサッカロミセス・セレビシエの酵素の名称である（Ｊｕｌｉｕｓ  Ｄ．ら，  （１９８３），Ｃｅｌｌ，３２：８３９−８５２）。Ｋｅｘ２と同様、Ｓｔｅ１３のいくつかの真核生物相同体がすでに同定されてきている。別のさらにより好ましい態様において、ＳＴＥ１３遺伝子様産物を過剰発現するために宿主細胞を遺伝子操作し、そして／または増進したＳＴＥ１３遺伝子産物プロセシング活性を示すために遺伝子操作する。この態様において、宿主細胞は、すでに、機能性の内因性ＳＴＥ１３遺伝子産物を発現してもよい。内因性ＳＴＥ１３遺伝子産物および／または非天然ＳＴＥ１３遺伝子産物は、宿主細胞において過剰発現されてもよい。細胞が、本明細書において先に定義するようなＳＴＥ１３切断部位をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％、特異的に切断可能である場合、用いる宿主細胞は、機能するＳＴＥ１３遺伝子産物を発現するか、またはＳＴＥ１３遺伝子産物のプロセシング活性を所持するといわれる。所定のＳＴＥ１３様酵素がｉｎ  ｖｉｖｏでＳＴＥ１３切断部位を切断する能力は、好ましくは、ＳＴＥ１３またはＳＴＥ１３様部位を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物で、前記ＳＴＥ１３様酵素を発現する細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養し、そして細胞のＳＴＥ１３様酵素の機能性のパーセントとして評価することによって、評価される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価は、好ましくは、試験しようとする前記ＳＴＥ１３様酵素に対して行われ、該酵素を、本明細書において先に定義するようなＳＴＥ１３切断部位を含むポリペプチドとインキュベーションする。
【００６０】
あるいは、ＳＴＥ１３様酵素の機能性は、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス由来のＳＴＥ１３酵素のＳＴＥ１３活性との比較によって評価する。この態様において、所定のＳＴＥ１３切断部位を切断する能力が、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリスのＳＴＥ１３が前記の同じ切断部位を切断する能力の少なくとも５０％である場合、ＳＴＥ１３様酵素は、好ましくは、機能性であるといわれるか、あるいはＳＴＥ１３様プロセシング活性を所持するかまたは含むといわれる。好ましくは、切断能は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％あるいはそれより高い。この態様において、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価を行ってもよい。
【００６１】
ＳＴＥ１３様プロセシング活性は、好ましくは、上に提供するアッセイいずれかを用いて測定した際、遺伝子操作された所定の細胞において、由来する細胞における同じ活性との比較によって、少なくとも５％増進している場合、増進したといわれる。あるいは、活性は、本明細書において先に定義するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価される。より好ましくは、「増進した」は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれより多くの増進を意味する。
【００６２】
ＳＴＥ１３様活性の存在の結果としての切断産物の存在を、質量分析によって評価してもよい。
好ましい態様において、細胞は、Ｋｅｘ２様酵素、またはＫｅｘ２様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ２様プロセシング活性を有する酵素を含み、発現しそして／または過剰発現し、そして場合によって
−Ｋｅｘ１様酵素、またはＫｅｘ１様プロセシング活性もしくは増進したＫｅｘ１様プロセシング活性を有するＫｅｘ１様をさらに発現するかまたは含み、そして／または過剰発現し、ならびに／あるいは
−ＳＴＥ１３遺伝子産物と同じ活性または増進した活性を有するＳＴＥ１３遺伝子様産物またはＳＴＥ１３遺伝子産物をさらに発現するかまたは含み、そして／または過剰発現する。
【００６３】
あるいは、または先に言及する態様と組み合わせて、宿主細胞を、Ｋｅｘ２様および場合によってＫｅｘ１様酵素および／またはＳＴＥ１３遺伝子様産物をコードする核酸分子を含む核酸構築物で形質転換する。Ｋｅｘ１酵素をコードする核酸配列を配列番号１として提供する。Ｋｅｘ２酵素をコードする核酸配列を配列番号２として提供する。対応する、コードされるＫｅｘ２を配列番号３として提供する。対応する、コードされるＫｅｘ１を配列番号４として提供する。ＳＴＥ１３遺伝子産物をコードする核酸配列を配列番号５として提供する。対応するＳＴＥ１３遺伝子産物を配列番号６として提供する。本発明で好ましく用いられるＫｅｘ２様酵素をコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより高い。
【００６４】
本発明で好ましく用いられるＫｅｘ１様酵素をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより高い。
【００６５】
本発明で好ましく用いられるＳＴＥ１３遺伝子産物をコードする核酸配列は、配列番号５と少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより高い。
【００６６】
当業者は、選択する宿主細胞の同一性に応じて、Ｋｅｘ２をコードする最も適切な配列、場合によってＫｅｘ２の発現を確実にするＫｅｘ１酵素および／またはＳＴＥ１３遺伝子産物、場合によってＫｅｘ１酵素および／またはＳＴＥ１３遺伝子産物を選択することを知っているであろう。
【００６７】
産生法
さらにさらなる側面において、先のセクションで定義されるような細胞を用いた、関心対象のタンパク質の産生法を提供する。この方法において、好ましくは先のセクションで定義されるような宿主細胞を、関心対象のタンパク質の発現を導くのに適した条件下で培養する。好ましくはないが、場合によって、関心対象のタンパク質はまた、宿主細胞から回収可能である。
【００６８】
本発明にしたがった関心対象のタンパク質の好ましい産生法は：
−セクション「核酸分子」に定義するような核酸分子を含む発現ベクターを調製し
−宿主、好ましくは酵母、より好ましくはメチロトローフ酵母において、前記核酸分子を発現し、
−前記核酸分子の発現および好ましくは前記の関心対象のタンパク質の分泌を可能にするのに適した発酵条件下で、前記酵母を培養し；
−培養から、前記の関心対象のタンパク質を精製する
工程を含む。
【００６９】
例えばゼラチン様タンパク質のような関心対象のタンパク質は、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６またはＷＯ０１／３４６４６に開示されるような組換え法によって産生可能である。また、例えばゼラチン様タンパク質のような関心対象のタンパク質の産生および精製を可能にするため、ピキア・パストリスを宿主細胞として用いる、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３およびＥＰ−Ａ−１０１４１７６を参照されたい。
【００７０】
本発明の関心対象のタンパク質の産生法を用いることによって、関心対象のこうした組換え的に作製されるタンパク質は、現在、経済的な方式で、産業規模で作製可能である。これらのタンパク質の同一性に応じて、これらを多様な適用で使用可能である。
【００７１】
以下の実施例は例示目的のみのために提供され、そしていかなる点でも、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００７２】
本実施例において、ゼラチン様タンパク質を関心対象のタンパク質の例として採用する。
本発明者らは、ゼラチン様タンパク質をコードする所望の遺伝子を数コピー含む巨大分子を生成した。この巨大分子を発現した際、コードされるポリペプチドが産生され、そして続いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロテアーゼによってプロセシングされて、多コピーの所望のゼラチン様タンパク質が放出された。
【００７３】
二塩基性切断部位（特に、ＥＡが続くＫＲ）によって、所望のゼラチン様タンパク質断片を分離した。酵母プロテアーゼＫｅｘ２は、二塩基性アミノ酸モチーフのすぐＣ末端側でタンパク質を切断する。ピキア・パストリスにおいて、Ｙｐｓ１もまた、この二塩基性アミノ酸モチーフをＣ末端側で切断する。このＹｐｓ１部位は、他の微生物において同様に振る舞う。
【００７４】
別の酵母プロテアーゼ、Ｋｅｘ１は、Ｋｅｘ２による切断後にＣ末端側に残る塩基性アミノ酸残基を除去する。Ｋｅｘ１およびＫｅｘ２は、酵母ゴルジ体のプロテアーゼである。Ｙｐｓ１は、形質膜に位置する。ＳＴＥ１３遺伝子産物は、Ｋｅｘ２による切断後の断片のＮ末端側に残ったＥＡジペプチドを除去する。すべての４つのタンパク質分解性酵素は、分泌経路を通過するタンパク質に作用する。したがって、上述の巨大なゼラチン様タンパク質前駆体は、分泌中に細胞内でプロセシングされ、そして所望の小さいゼラチン様タンパク質断片が、培地内に分泌される。
【００７５】
前駆体の設計
この試験の基礎として、Ｐモノマーまたは極性ゼラチン（Ｗｅｒｔｅｎ  ＭＷ，Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ＷＨ，Ｊａｎｓｅｎ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ＴＪ，ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ＥＣ，ｄｅ  Ｗｏｌｆ  ＦＡ． Secreted production of a custom-designed, highly hydrophilic gelatin in Pichia pastoris.  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２００１  Ｊｕｎ；１４（６）：４４７−５４）は、化学的および／またはタンパク質分解的分解に対して非常に安定であるため、これを選択した。「安定な」ゼラチン様タンパク質の使用は、結果の解釈を容易にするはずである。
【００７６】
前駆体は、α接合因子分泌シグナル、その後、二塩基性切断部位を含み、そして数コピーのゼラチン様タンパク質および介在配列が、同じ二塩基性切断部位および介在配列によって分離されて存在している（特に、ＥＡが続くＫＲ）。酵母プロテアーゼＫｅｘ２は、二塩基性アミノ酸モチーフのすぐＣ末端側でタンパク質を切断する。ピキア・パストリスにおいて、Ｙｐｓ１もまた、この二塩基性アミノ酸モチーフをＣ末端側で切断する。Ｙｐｓ１は、他の微生物において同様に振る舞いうる。
【００７７】
別の酵母プロテアーゼ、Ｋｅｘ１は、Ｋｅｘ２による切断後にＣ末端側に残る塩基性アミノ酸残基を除去する。Ｋｅｘ１およびＫｅｘ２は、酵母ゴルジ体のプロテアーゼである。Ｙｐｓ１は、形質膜に位置する。ＳＴＥ１３遺伝子産物は、Ｋｅｘ２による切断後の断片のＮ末端側に残ったＥＡジペプチドを除去する。すべての４つのタンパク質分解性酵素は、分泌経路を通過するタンパク質に作用する。したがって、上述の巨大なゼラチン様タンパク質前駆体は、分泌中に細胞内でプロセシングされ、そして所望の小さいゼラチン様タンパク質断片が、培地内に分泌される。
【００７８】
方法
本発明の核酸構築のための構築ブロックが、プライマーＢ１−ＦおよびＢ１−Ｒを用いた、ｐＰＩＣ−Ｐ由来のＰモノマー遺伝子の増幅によって生成された（Ｗｅｒｔｅｎ  ＭＷ，Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ＷＨ，Ｊａｎｓｅｎ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ＴＪ，ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ＥＣ，ｄｅ  Ｗｏｌｆ  ＦＡ．，Secreted production of a custom-designed, highly hydrophilic gelatin in Pichia pastoris.  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２００１  Ｊｕｎ；１４（６）：４４７−５４）。この構築ブロックの構造および配列を図１に示す。制限部位ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、生じたＰＣＲ産物をｐＰＩＣＫαＡ内にクローニングして、ｐＢ１を生じた（図２）。ｐＰＩＣＫαＡは、ｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のカナマイシン遺伝子のコード配列で、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）のゼオシン遺伝子のコード配列を置換することによる、ｐＰＩＣＺαＡの修飾である。ｐＰＩＣＫαＡ中のカナマイシン耐性遺伝子は、大腸菌ではカナマイシンに対する耐性を与え、そして酵母ではＧ４１８またはジェネティシンに対する耐性を与える。Ｗｅｒｔｅｎら、２００１に本質的に記載されるように、マルチマー（Ｂ２、Ｂ４、Ｂ８）を生成した（いくつかのＤｒａＩＩＩ部位およびＰｆｌＭＩ部位が、消化後、適合末端を有し、そして連結した際、元来の部位はどちらも再び形成されることがないという事実を用いる）。クローニング工程を表１に要約する。多数コピーの関心対象のゼラチンおよび介在配列を含むポリペプチドをコードする巨大分子の構造を、４コピーの所望のゼラチンを含むポリペプチドをコードする遺伝子に関して、図３に例示する。
【００７９】
プラスミドｐＢ１、ｐＢ２、ｐＢ４およびｐＢ８をＰｍｅＩで直線化し、そしてピキア・パストリスＸ−３３に導入した。０．５ｍｇ／ｍｌジェネティシンを含有するＹＰＤプレート上での選択によって、単一コピー形質転換体を得た。以下のように、サザンブロット分析によって、コピー数を確認した。野生型ピキア・パストリスのＡＯＸ１プロモーターは、約２．２ｋｂのＡｃｃ６５Ｉ断片上に位置する。ＡＯＸ１プロモーター中のａの組込みに際して、プラスミドはすべてＡｃｃ６５Ｉ部位を欠くため、この断片はプラスミドのサイズとともに増加する。
【００８０】
いくつかの形質転換体からゲノムＤＮＡを単離し、Ａｃｃ６５Ｉで消化し、電気泳動し、そして膜上にブロッティングした。ＡＯＸ１プロモーターを含有する断片（約１．２ｋｂ）で膜を探査した（probed）。ＡＯＸ１プロモーター中の単一コピーとしてのｐＢ１、ｐＢ２、ｐＢ４およびｐＢ８それぞれの組込みと予期される、約６．５ｋｂ、６．８ｋｂ、７．５ｋｂおよび８．８ｋｂの断片が観察された。
【００８１】
表１．マルチマーを生成するためのクローニング戦略
【００８２】
【表１】
2011507507.tif 000002
【００８３】
多コピーピキア発現キット、マニュアルバージョンＦ、０１０３０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のマニュアル中の示唆にしたがって、各プラスミドの２つの単一コピー形質転換体の小規模発現研究を行った。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３およびＥＰ−Ａ１０１４１７６に記載されるような修飾ピキア株を用いて、発酵を実行した。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４Ａ）。マルチマーに関しては、部分的におよび完全にプロセシングされた型の両方が観察され、ＫＥＸ２酵素によるプロセシングが不完全であることが示された。分泌されるゼラチン様タンパク質の総量は、前駆体のサイズとともに増加した。
【００８４】
ＫＥＸ２によるプロセシングを改善するため、ＫＥＸ２コード配列をｐＧＡＰＺ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。生じたプラスミドをＨｐａＩで直線化してＧＡＰプロモーターにおける組込みを促進し、そしてｐＢ８の単一の組込みコピーを含有するピキア・パストリス内に形質転換した。図４Ｂからわかるように、ＫＥＸ２遺伝子の過剰発現は、Ｂ８前駆体の完全なプロセシングを生じた。Ｋｅｘ２過剰発現を伴って、ｐＢ８プラスミドで形成されるＢの量（図４Ｂ、レーン２）は、ｐＢ１プラスミドから産生されるＢの量（図４Ａ、レーン１および２）よりはるかに高い。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、プラスミドｐＢ２、ｐＢ４またはｐＢ８の単一の組込みコピーを含むピキア・パストリス株由来の培養上清が、プラスミドｐＢ１の単一の組込みコピーを含む対照株よりも、はるかに多くの関心対象のゼラチン、Ｂを産生することを見出した。特定の株および発酵条件に応じて、収量は、最大８倍改善された。
【図１】
2011507507.tif 000003
【図２】
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【図３】
2011507507.tif 000005
【図４ａ】
2011507507.tif 000006
【図４ｂ】
2011507507.tif 000007
【国際調査報告】
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2011507507.tif 000009
2011507507.tif 000010
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