(57)【要約】本発明は、被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する方法を開示する。特に、本発明は、胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルから胎児ＲｈＤ遺伝子型を判定する非侵襲的方法を提供する。本発明はまた、記載した方法に有用な新規プローブおよびプライマーも提供する。さらに、新規プローブおよびプライマーを含むキットおよび混合物も開示する。被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する方法は、被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプル中の細胞を溶解して溶解混合物を形成すること、前記溶解混合物から核酸を抽出すること、および前記抽出された核酸においてＲｈＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出することを含み、前記エクソンの有無から被験体のＲｈＤ遺伝子型が示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離されたポリヌクレオチドが５０未満の塩基を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンにハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１および配列番号２４からなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離されたポリヌクレオチドが５０未満の塩基を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
レポーター分子が前記ポリヌクレオチドの５’末端に結合し、クエンチャー分子が前記ポリヌクレオチドの３’末端に結合する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンを検出する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３に記載された配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離されたポリヌクレオチドが５０未満の塩基を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがヒトＹ染色体を検出する、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１種のプライマーセット、
少なくとも１種の標識プローブ、および
生物学的サンプルにおいてＲＨＤ遺伝子を検出するための、前記少なくとも１種のプライマーセットおよび前記少なくとも１種のプローブの使用説明書
を含み、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンにハイブリダイズする、ＲｈＤジェノタイピングキット。
【請求項９】
前記エクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７またはエクソン１０である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記エクソンがエクソン４である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記フォワードプライマーが配列番号１または配列番号４であり、前記リバースプライマーが配列番号２または配列番号５である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の標識プローブが配列番号３または配列番号６である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記エクソンがエクソン５である、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
前記フォワードプライマーが配列番号７または配列番号１０であり、前記リバースプライマーが配列番号８または配列番号１１である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の標識プローブが配列番号９または配列番号１２である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記エクソンがエクソン７である、請求項９に記載のキット。
【請求項１７】
前記フォワードプライマーが配列番号１３または配列番号１６であり、前記リバースプライマーが配列番号１４または配列番号１７である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記少なくとも１種の標識プローブが配列番号１５または配列番号１８である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記エクソンがエクソン１０である、請求項９に記載のキット。
【請求項２０】
前記フォワードプライマーが配列番号１９または配列番号２２であり、前記リバースプライマーが配列番号２０または配列番号２３である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の標識プローブが配列番号２１または配列番号２４である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記キットが２種以上のプライマーセットおよび２種以上の標識プローブを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項２３】
前記２種以上のプライマーセットがヒトＲＨＤ遺伝子の１個のエクソンにハイブリダイズする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記２種以上のプライマーセットがヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンにハイブリダイズする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
溶解試薬をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項２６】
前記溶解試薬がＳ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記溶解試薬がＳ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素、ビタミンＥ、サポニン、ＤＭＳＯ、トリトンＸ−１００およびｐＨ７．２〜７．４の緩衝液を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する方法であって、前記方法は、
前記被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプル中の細胞を溶解させて溶解混合物を形成する工程、
前記溶解混合物から核酸を抽出する工程、および
前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出する工程
を含み、ここで、前記エクソンの有無から前記被験体のＲｈＤ遺伝子型が示される、方法。
【請求項２９】
前記被験体が胎児である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的サンプルが胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記母親の生物学的サンプルが全血サンプルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記胎児細胞が母親の細胞よりも優先的に溶解させられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を溶解させる前記工程が、前記母親の生物学的サンプルを溶解試薬と一定の時間接触させる工程を含み、前記溶解試薬がＳ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶解試薬がＳ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素、ビタミンＥ、サポニン、トリトンＸ−１００、ＤＭＳＯおよびｐＨ７．２〜７．４の緩衝液を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記時間が約１０分から約３０分である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンの前記検出が、前記少なくとも１個のエクソンを１種または複数種のプライマーセットで増幅する工程、および前記少なくとも１個のエクソンを１種または複数種の標識プローブで同定する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記１種または複数種のプライマーセットがフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１個のエクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７またはエクソン１０である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１個のエクソンがエクソン４である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記フォワードプライマーが配列番号１または配列番号４であり、前記リバースプライマーが配列番号２または配列番号５である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数種の標識プローブが配列番号３または配列番号６である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１個のエクソンがエクソン５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記フォワードプライマーが配列番号７または配列番号１０であり、前記リバースプライマーが配列番号８または配列番号１１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記１種または複数種の標識プローブが配列番号９または配列番号１２である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１個のエクソンがエクソン７である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記フォワードプライマーが配列番号１３または配列番号１６であり、前記リバースプライマーが配列番号１４または配列番号１７である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１種または複数種の標識プローブが配列番号１５または配列番号１８である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１個のエクソンがエクソン１０である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記フォワードプライマーが配列番号１９または配列番号２２であり、前記リバースプライマーが配列番号２０または配列番号２３である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１種または複数種の標識プローブが配列番号２１または配列番号２４である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
２種以上のプライマーセットが前記少なくとも１個のエクソンを増幅するために使用され、２種以上の標識プローブが前記少なくとも１個のエクソンを同定するために使用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記２種以上のプライマーセットがヒトＲＨＤ遺伝子の１個のエクソンを増幅する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記２種以上のプライマーセットがヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンを増幅する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記抽出された核酸において胎児ＤＮＡの存在を確認する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５５】
胎児ＤＮＡの存在を確認する前記工程がＹ染色体を検出する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｙ染色体が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む１種または複数種のプライマーセットで前記Ｙ染色体上にある遺伝子を増幅する工程、および、前記遺伝子を１種または複数種の標識プローブで同定する工程により検出される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｙ染色体上にある前記遺伝子がＳＲＹ、ＦＣＹおよびＤＡＺからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子がＤＡＺである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記フォワードプライマーが配列番号３１であり、前記リバースプライマーが配列番号３２である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１種または複数種の標識プローブが配列番号３３である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
胎児ＤＮＡの存在を確認する前記工程が父系遺伝の対立遺伝子を検出する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する方法であって、前記方法は、
前記被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプルから核酸を抽出する工程、および
前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも３個のエクソンを検出する工程
を含み、ここで、前記エクソンの有無から前記被験体のＲｈＤ遺伝子型が示される、方法。
【請求項６３】
ＲＨＤ遺伝子の少なくとも３個のエクソンの前記検出が、前記少なくとも３個のエクソンを３種以上のプライマーセットで増幅する工程、および前記少なくとも３個のエクソンを３種以上の標識プローブで同定する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも３個のエクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンが、前記抽出された核酸において検出される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記４個のエクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記被験体が胎児である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物学的サンプルが胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抽出された核酸において胎児ＤＮＡの存在を確認する工程をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
胎児ＤＮＡの存在を確認する前記工程がＹ染色体を検出する工程を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｙ染色体が、前記Ｙ染色体上にある遺伝子を１種または複数種のプライマーセットで増幅する工程、および、前記遺伝子を１種または複数種の標識プローブで同定する工程により検出される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｙ染色体上にある前記遺伝子がＳＲＹ、ＦＣＹおよびＤＡＺからなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
胎児ＤＮＡの存在を確認する前記工程が父系遺伝の対立遺伝子を検出する工程を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
単離された核酸、各々がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンを増幅するための３種以上のプライマーセット、ならびに３種以上の標識プローブを含む、試薬混合物。
【請求項７５】
前記３個以上のエクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０からなる群より選択される、請求項７４に記載の試薬混合物。
【請求項７６】
前記３種以上のプライマーセットの前記フォワードプライマーが配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９および配列番号２２からなる群より選択される、請求項７５に記載の試薬混合物。
【請求項７７】
前記３種以上のプライマーセットの前記リバースプライマーが配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０および配列番号２３からなる群より選択される、請求項７５に記載の試薬混合物。
【請求項７８】
前記３種以上の標識プローブが配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１および配列番号２４からなる群より選択される、請求項７５に記載の試薬混合物。
【請求項７９】
前記混合物が、単離された核酸、ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを増幅するための４種のプライマーセット、および４種の標識プローブを含む、請求項７４に記載の試薬混合物。
【請求項８０】
前記４個のエクソンがヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０である、請求項７９に記載の試薬混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、２００８年７月１８日に出願された米国仮出願６１／０８２，１６９への優先権を主張し、上記米国仮出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
一般に、胎児の性別、遺伝性障害または疾患のマーカー、および染色体異常など１つまたは複数の遺伝的特性を判定するには出生前診断が行われる。こうした出生前検査の１つに、胎児アカゲザルＤ抗原（ＲｈＤ：Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）状態の判定がある。この検査は、ＲｈＤ陰性の妊婦にとって特に重要である。ＲｈＤ陽性胎児を妊娠したＲｈ−Ｄ陰性の母親は、胎児赤血球の表面に発現するＲｈＤ抗原への抗体を産生する可能性がある。この抗体は、胎盤を通して胎児循環に入ることができるため、ＲｈＤ陽性胎児は、母親の抗Ｄ抗体がＤ陽性の胎児赤血球を攻撃してこれを溶解させる胎児新生児溶血性疾患（ＨＤＦＮ：ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｔｕｓ  ａｎｄ  ｎｅｗｂｏｒｎ）のリスクがある。ＨＤＦＮのリスクは、胎児がＲｈＤ陽性である第２子以降の妊娠で著しく高まる。ＨＤＦＮは、比較的軽度の場合、網状赤血球増加を伴う胎児貧血を、最も重度の場合、胎児の死亡を特徴とする。
【０００３】
Ｄ表面抗原を発現する可能性がある胎児の循環中の赤血球に対して母親のＲｈＤ抗体が産生されるのを防ぐには、予防的な抗ＲｈＤ免疫グロブリン処置剤を妊娠約２８週のＲｈＤ陰性妊婦全員に投与し、さらに任意に妊娠３４週にブースターを投与するのが出産前の一般的な医療行為である。しかしながら、こうした女性の最大約３８％がＲｈＤ陰性胎児を妊娠し、予防的処置を受ける必要がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在利用できる胎児ＲｈＤ状態の判定方法では、検査用の胎児細胞を採取する侵襲的な手順が必要となるのが一般的である。たとえば、ＲｈＤ状態または遺伝的異常のスクリーニングには絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ：ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｕｓ  ｓａｍｐｌｉｎｇ）または羊水穿刺（ａｍｉｎｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）を行う場合がある。しかしながら、自然流産、感染症および同種免疫にはこうした侵襲的な手順が関連している。したがって、侵襲的な診断検査に伴う合併症、および高価な予防的処置剤の不必要な投与を回避するには、胎児ＲｈＤ状態を判定する非侵襲的な手順を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は１つには、母体血液サンプルから胎児ＤＮＡを単離する非侵襲的方法の開発、およびＲｈＤ遺伝子の特定のエクソンの特定領域の検出からＲｈＤ遺伝子型が予測されるという発見に基づく。したがって、本発明は、生物学的サンプルから被験体、特に胎児被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する非侵襲的方法、および本発明の方法に使用できる新規なプローブおよびプライマーを提供する。
【０００６】
一実施形態では、本発明は、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０を増幅するためのプライマーとして有用な単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７またはエクソン１０を検出するためのプローブとして有用な単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、二重標識プローブであってもよい。
【０００７】
本発明は、被験体のＲＨＤ遺伝子型を判定する方法を包含する。一実施形態では、この方法は、被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプル中の細胞を溶解して溶解混合物を形成すること；前記溶解混合物から核酸を抽出すること；および前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出することを含み、前記エクソンの有無から被験体のＲＨＤ遺伝子型が示される。別の実施形態では、被験体は胎児であってもよい。生物学的サンプルは、全血サンプルなど胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルであってもよい。いくつかの実施形態では、母親の細胞よりも胎児細胞を優先的に溶解することができる。
【０００８】
別の実施形態では、本方法は、少なくとも１個のエクソンを１種または複数種のプライマーセットで増幅し、少なくとも１個のエクソンを１種または複数種の標識プローブで同定することによりＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出することを含む。エクソンは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４でも、エクソン５でも、エクソン７でも、あるいはエクソン１０でもよい。別の実施形態では、２種以上のプライマーセットを使用して少なくとも１個のエクソンを増幅し、２種以上の標識プローブを使用して少なくとも１個のエクソンを同定する。別の実施形態では、２種以上のプライマーセットによりヒトＲＨＤ遺伝子の１個のエクソンを増幅する。さらに別の実施形態では、２種以上のプライマーセットによりヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンを増幅する。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、本方法は、被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプルから核酸を抽出すること；および抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも３個のエクソンを検出することを含み、エクソンの有無から被験体のＲＨＤ遺伝子型が示される。一実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを検出する。検出され得るエクソンには、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０が含まれる。ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンは、３種以上のプライマーセットで３個以上のエクソンを増幅し、３種以上の標識プローブで３個以上のエクソンを同定することにより検出できる。いくつかの実施形態では、その被験体は胎児である。他の実施形態では、生物学的サンプルは胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、前記抽出された核酸において胎児ＤＮＡの存在を確認することを含む。一実施形態では、胎児ＤＮＡの存在は、Ｙ染色体を検出することにより確認される。別の実施形態では、Ｙ染色体は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む１種または複数種のプライマーセットでＹ染色体上にある遺伝子を増幅し；１種または複数種の標識プローブで遺伝子を同定することにより検出される。別の実施形態では、Ｙ染色体上にある遺伝子は、ＳＲＹ、ＦＣＹおよびＤＡＺからなる群より選択される。なお別の実施形態では、胎児ＤＮＡの存在は、父系遺伝の対立遺伝子を検出することにより確認される。
【００１１】
本発明はさらに、本明細書に開示された新規なプライマーおよびプローブを含むＲｈＤジェノタイピングキットを提供する。一実施形態では、キットは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１種のプライマーセット；少なくとも１種の標識プローブ；および生物学的サンプルにおいてＲＨＤ遺伝子を検出するための、前記少なくとも１種のプライマーセットおよび前記少なくとも１種のプローブの使用説明書を含み、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンにハイブリダイズする。エクソンは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４でも、エクソン５でも、エクソン７でも、あるいはエクソン１０でもよい。別の実施形態では、キットは、２種以上のプライマーセットおよび２種以上の標識プローブを含む。２種以上のプライマーセットは、ヒトＲＨＤ遺伝子の１個のエクソンにハイブリダイズしてもよいし、あるいは２種以上のプライマーセットは、ヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンにハイブリダイズしてもよい。別の実施形態では、キットはさらに、溶解試薬を含む。溶解試薬は、Ｓ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素および任意にビタミンＥ、トリトンＸ−１００、トウィーン−２０、ＮＰ−４０およびサポニンなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
【００１２】
本発明はさらに、単離された核酸と、本明細書に開示された新規なプローブおよびプライマーセットの様々な組み合わせとを含む試薬混合物を企図している。一実施形態では、試薬混合物は、単離された核酸；各々がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンを増幅するための３種以上のプライマーセット；および３種以上の標識プローブを含む。別の実施形態では、試薬混合物は、単離された核酸；ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを増幅するための４種のプライマーセット；および４種の標識プローブを含む。プライマーセットおよび標識プローブは好ましくは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０から選択される３個以上のエクソンにハイブリダイズする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＲｈＤ陽性および陰性遺伝子型のＲｈ抗原遺伝子およびそのコードされたＲｈタンパク質の模式図である。反対の方向を向いているＲｈＤ遺伝子（赤色）およびＲｈＣＥ遺伝子（青色）の１０個のエクソン、ＲｈボックスおよびＳＭＰ１遺伝子を示す。
【図２】ＲｈＤ陽性胎児を妊娠したＲｈＤ陰性の母親の血液サンプルから単離されたＤＮＡにおける、プライマーセットを用いたＲｈＤ遺伝子のエクソン４のＰＣＲ増幅を示す。Ａは、ＲｈＤプライマーセット４．２で増幅されたサンプル１４２０２である。一番上のバンドは予想された７０ｂｐの単位複製配列（アスタリスク）に対応する。Ｂは、ＲｈＤプライマーセット４．３で増幅されたサンプル１４２０２である。単一のバンドは予想された６２ｂｐの単位複製配列（アスタリスク）に対応する。
【図３】ＲｈＤ陽性胎児を妊娠したＲｈＤ陰性の母親から得られた血液サンプルから単離したＤＮＡにおける、プライマーセットを用いたＲｈＤ遺伝子のエクソン５のＰＣＲ増幅を示す。Ａは、ＲｈＤプライマーセット５で増幅されたサンプル１４１８０（最後の２レーン）である。一番上のバンドは予想された８３ｂｐの単位複製配列（アスタリスク）に相当する。Ｂは、ＲｈＤプライマーセット５．２で増幅されたサンプル１４１８０（最後の２レーン）である。一番上のバンドは予想された７２ｂｐの単位複製配列（アスタリスク）に相当する。
【図４】ＲｈＤ陽性胎児を妊娠したＲｈＤ陰性の母親から得られた血液サンプルから単離したＤＮＡにおける、プライマーセットを用いたＲｈＤ遺伝子のエクソン７のＰＣＲ増幅を示す。Ａは、ＲｈＤプライマーセット７で増幅されたサンプル１４２０２である（最後の３レーン）。４．５％ＭＳ８アガロースゲル上に約５３および５８ｂｐというサイズが近い２個のバンドが目視可能である。シーケンシングデータから５８ｂｐのバンドは間違いなく単位複製配列（アスタリスク）であることが確認された。Ｂは、ＲｈＤプライマーセット７．３で増幅されたサンプル１４２０２である（最後の２レーン）。単一のバンドは予想された６１ｂｐの単位複製配列（アスタリスク）に相当する。
【図５】ＲｈＤ陽性胎児を妊娠したＲｈＤ陰性の母親から得られた血液サンプルから単離したＤＮＡにおける、プライマーセットを用いたＲｈＤ遺伝子のエクソン１０のＰＣＲ増幅を示す。サンプル１４１８０は、エクソン１０（最後の２レーン）および１０．１（最初の２レーン；１０Ｈ）のＲｈＤプライマーセットで増幅した。一番上のバンドは間違いなく、プライマーセット１０（５９ｂｐ、最後の２レーン）およびプライマーセット１０．１（７４ｂｐ、最初の２レーン）の単位複製配列に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
アカゲザル（Ｒｈ：Ｒｈｅｓｕｓ）血液型抗原は、免疫原性が高いため臨床的に最も重要と考えられている。Ｒｈ抗原への抗体は、新生児の溶血性疾患だけでなく、輸血反応および自己免疫性溶血性貧血にも関わっている。ヒトＲｈ表現型は、１番染色体（１ｐ３４．１−１ｐ３６）上にある近接した２つのＲｈ遺伝子、ＲｈＤおよびＲｈＣＥにより制御されている。ＲｈＤはＤ抗原をコードし、ＲｈＣＥはＣｃおよびＥｅ抗原をコードする（Ｙ．Ｃｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７８：２７４７）。２つの遺伝子は１０個のエクソンを含み、配列相同性が各々約９４％であるが、テイル−テイル（ｔａｉｌ−  ｔｏ−  ｔａｉｌ）構造をとり染色体上で反対の方向を向いているため、ＲｈＤ遺伝子のコード鎖はＲｈＣＥの非コード鎖であり、その逆も同様である（図１；Ｎ．Ｄ．Ａｖｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．８：１）。膜小タンパク質（ＳＭＰ１：ｓｍａｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）遺伝子は、この２つのＲｈ遺伝子の間にある。また、ＲｈＤは、相同性が９８．６％でアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）ボックスとして公知の２つの９ｋｂの領域に挟まれている。
【００１５】
ＲｈＤおよびＲｈＣＥは、４１７個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＲｈＤおよびＲｈＣＥタンパク質は、アミノ酸が３１〜３５個異なっている。ＲｈＤはＤ抗原をコードし、ＲｈＣＥは、２組の対立遺伝子のＣ／ｃおよびＥ／ｅ抗原の発現に関わる４つの共通の対立遺伝子をコードする。ＲｈＤ陰性の個体の場合、ＲＨＤ遺伝子が完全に欠失しているか、あるいは遺伝子が変異していたり、一部が欠失していたりして遺伝子が非機能的になっているためＲｈＤ抗原が赤血球上に発現しない。
【００１６】
コーカサス人種は約１５パーセントがＲｈＤ陰性であり、通常ＲＨＤの欠失のホモ接合体である。ＲｈＤ陰性の黒人系アフリカ人の６６パーセントはインタクトなＲｈＤを持っているが、この遺伝子は、２６９番目のチロシンのコドンを翻訳終結コドンに変化させるエクソン６のナンセンス変異のため不活性である。このインタクトなＲｈＤ遺伝子はＲｈＤ偽遺伝子（ＲＨＤΨ）として公知であり、イントロン３とエクソン４の境界における３７ｂｐの重複、エクソン５のミスセンス変異、およびエクソン６のナンセンス変異など複数の変異を持っている（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８９：２５６８）。この不活性な偽遺伝子はＤタンパク質もＤ抗原も産生しない。アフリカ人に比較的に多く見られるもう１つの非機能的な遺伝子としてはＲｈＤ−ＣＥ−Ｄがある。ＲｈＤエクソンが存在していても、ＲｈＤ抗原は産生されない。
【００１７】
上記で論じたように、ＲｈＤ陰性の母親がＲｈＤ陰性胎児を妊娠していることが分かれば、出産前の不要な抗Ｒｈ免疫グロブリン予防法および往診がなくなる。胎児ＲｈＤ遺伝子型の判定に利用できる標準的な臨床試験は典型的には、妊娠を危うくするリスクを伴う侵襲的な手順を使用する必要がある。したがって、胎児ＲｈＤ状態を判定する非侵襲的な臨床試験の開発が求められている。
【００１８】
本発明は１つには、母親の生物学的サンプルから胎児ＤＮＡを単離する新規な方法の開発による。参照によってその全体を本明細書に援用する、２００７年１１月１日に出願された同時係属中の米国特許仮出願第６０／９８４，６９８号に詳しく記載されているように、この方法は、生物学的サンプルを所定の時間特定の溶解試薬（ｌｙｓｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）に曝露することにより母親の細胞よりも胎児細胞を選択的に溶解することを含む。この方法により、選択的ライセートからの胎児ＤＮＡ、たとえば、質の高い胎児ＤＮＡの抽出が可能になる。抽出された胎児ＤＮＡは、ＲｈＤ遺伝子型など様々な遺伝的マーカーのスクリーニングに使用することができる。
【００１９】
本発明はまた、ＲＨＤ遺伝子の１個または複数の特定のエクソンの検出からＲｈＤ遺伝子型が正確に予測されるという知見に基づく。したがって、本発明は、被験体のＲＨＤ遺伝子型を判定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプル中の細胞を溶解して溶解混合物を形成すること；前記溶解混合物から核酸を抽出すること；および前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出することを含み、前記エクソンの有無から被験体のＲＨＤ遺伝子型が示される。別の実施形態では、その被験体は胎児である。別の実施形態では、前記生物学的サンプルは胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルである。例示的な母親の生物学的サンプルとして、全血、血漿、血清、尿、頸管粘液、羊水または絨毛膜絨毛サンプルがあるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、前記母親の生物学的サンプルは全血サンプルである。
【００２０】
生物学的サンプル中の細胞を溶解するには、任意の好適な溶解試薬（ｌｙｓｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いればよい。溶解試薬の例としては、ビタミンＥ、サポニン、Ｓ−［（２−グアニジノ−４−チアゾイル）メチル］−イソチオ尿素（ＧＴＭＩ）またはその塩、グアニジニウムヒドロクロリド、グアニジニウムイソチオシアネート；尿素、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウムおよびチオシアン酸ナトリウム、フェリシアン化カリウムおよびチオシアン酸カリウム、アンモニウムクロリド、ジエチレングリコール、Ｚａｐ−Ｏｇｌｏｂｉｎ、およびトリトン、トウィーンおよびＮＰ−４０、ＤＭＳＯなどの一般に用いられる界面活性剤、ならびに参照によってその全体を本明細書に援用する、２００７年１１月１日に出願された米国特許仮出願第６０／９８４，６９８号に記載された組成物のいずれか一つがあるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の一実施形態では、胎児細胞は、母親の生物学的サンプルにおける母親の細胞よりも優先的に溶解される。胎児細胞は、母親の生物学的サンプルを、本明細書に記載するような溶解試薬と一定の時間接触させることにより母親の細胞よりも優先的に溶解することができる。技術的な限界にとらわれるわけではないが、母親の循環血中の胎児細胞は元来、傷ついており（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）、アポトーシスを起こしやすい（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）と考えられ、たとえば、胎児細胞は、母親の細胞がほとんど溶解しない濃度の溶解試薬で、あるいは（同じ濃度の溶解剤を使用する場合）母親の細胞の溶解に要する時間より短い時間で優先的に溶解できる。胎児細胞を優先的に溶解する溶解条件に関連する様々な因子は変化させてもよい。以下に限定されるものではないが、溶解反応の時間、溶解剤の濃度、溶解剤の性質、溶解液のｐＨおよび溶解反応が起こる温度などの例示的な因子は、胎児細胞の優先的な溶解を実現するが、母親の細胞の溶解は実現しないように変化させてもよい。別の実施形態では、前記時間は、約１０分から約３０分である。別の実施形態では、前記溶解試薬は、Ｓ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素（ＧＴＭＩ）またはその塩を含む。ＧＴＭＩの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ、一層好ましくは約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭであってもよい。別の実施形態では、溶解試薬は、ＧＴＭＩ、ビタミンＥ、界面活性剤および任意にサポニンを含む。別の実施形態では、溶解試薬は、ＧＴＭＩ、ビタミンＥ、サポニン、トリトンＸ−１００、ＤＭＳＯおよびｐＨ７．２〜７．４の緩衝液を含む。
【００２２】
上記のように、母親の生物学的サンプルにおいて母親の細胞よりも胎児細胞の優先的な溶解を実現するには、様々な因子を変化させてもよい。一実施形態では、母親の生物学的サンプルを約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭのＧＴＭＩ溶液と濃度範囲の上限で約１〜１０秒間、さらに濃度範囲の下限で約１時間接触させる。別の実施形態では、母親の生物学的サンプルを約１ｍＭ〜約２５ｍＭのＧＴＭＩ溶液と濃度範囲の上限値で約５分間、さらに濃度範囲の下限値で約３０分間接触させる。なお別の実施形態では、生物学的サンプルを約１ｍＭ〜約５ｍＭのＧＴＭＩ溶液と約１０〜３０分間接触させる。こうした変更および操作は、当業者の知識の範囲内である。
【００２３】
核酸については、当該技術分野において公知の任意の手段により溶解混合物から抽出することができる。一実施形態では、溶解混合物の遠心分離により得られた上清から任意の好適な手段により核酸を単離する。上清は任意に、核酸を単離する前にさらに処理してもよい。たとえば、上清は、試薬、たとえば、タンパク質を消化して溶解混合物中の核酸を取り出したり、あるいは精製したりしやすくするプロテイナーゼＫで処理してもよい。こうした試薬を使用する場合、たとえば、サンプルを約９５℃に加熱して試薬を不活性化する。次いで核酸を、たとえばフェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させてさらに精製してよい。次いで核酸ペレットをヌクレアーゼフリー水に懸濁し、その後の遺伝学的分析に使用してよい。あるいは、市販されているキット、たとえば、ＲｏｃｈｅのＡｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒキット、またはＱＩＡＭＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット、またはＲｏｃｈｅのＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＤＮＡキット１を使用して上清から核酸を取り出してもよい。
【００２４】
本発明の一実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出して被験体のＲｈＤ遺伝子型を確認する。１０個のエクソンのいずれかを検出してＲｈＤ遺伝子型を判定できる。好ましくは、エクソン４、エクソン５、エクソン７またはエクソン１０の少なくとも１個を検出する。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の少なくとも２個のエクソンを検出する。他の実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の少なくとも３個のエクソンを検出する。本発明の方法は、好ましいエクソン各々の起こり得るすべての組み合わせの検出を企図している。たとえば、エクソン４および５；エクソン４および７；エクソン４および１０；エクソン５および７；エクソン５および１０；またはエクソン７および１０の検出を使用すれば、被験体のＲｈＤ遺伝子型を予測することができる。同様に、エクソン４、５および７；エクソン４、５および１０；エクソン５、７および１０またはエクソン４、７および１０の検出を使用すれば、被験体のＲｈＤ遺伝子型を診断することができる。別の実施形態では、エクソン４、５、７および１０を検出して被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する。
【００２５】
ＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンを検出するとアッセイの感度および特異性が高まる。前述したように、ＲＨＤ遺伝子のエクソンの一部または全部を含む個体群にはＲＨＤ遺伝子の改変体が存在するが、遺伝子の変異により機能的なＤ抗原は産生しない。したがって、こうした対立遺伝子を保有する個体はＲｈＤ陰性である。２個以上のエクソンまたはエクソンの特定の領域（特定のｐｓｉ領域など）を検出することで、こうした非機能的なＲＨＤΨ改変体による偽陽性を排除できる。たとえば、エクソン７を検出すれば、ＲＨＤ遺伝子および非機能的なＲＨＤΨ改変体が共に同定される。しかしながら、エクソン５の特定のｐｓｉ領域の検出はＲＨＤΨ−遺伝子のみ同定する。いくつかの実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンを検出して被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する。他の実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを検出して被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する。
【００２６】
ＲＨＤ遺伝子のエクソンは、特定の核酸配列の存在を同定する、当該技術分野において公知の任意の方法により検出することができる。好適な方法として、サザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、サンドイッチハイブリダイゼーションおよびリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）があるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、ＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンの検出は、前記少なくとも１個のエクソンを１種または複数種のプライマーセットで増幅し、その少なくとも１個のエクソンを１種または複数種の標識プローブで同定することを含む。本明細書で使用する場合「プライマーセット」とは、一対のプライマー、すなわち特定のヌクレオチド配列またはゲノム領域に隣接し、かつポリメラーゼが特定の配列またはゲノム領域を増幅することを可能にする遊離の３’ヒドロキシル末端を持つフォワードプライマーおよびリバースプライマーをいう。「標識プローブ」とは、検出可能なシグナルを発生する化合物にコンジュゲートされ、かつ標的ＤＮＡ配列と相補的である一本鎖核酸をいう。本発明の別の実施形態では、１種または複数種のプライマーセットにより、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４を増幅する。別の実施形態では、１種または複数種のプライマーセットにより、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン５を増幅する。別の実施形態では、１種または複数種のプライマーセットにより、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン７を増幅する。さらに別の実施形態では、１種または複数種のプライマーセットにより、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン１０を増幅する。２種以上のプライマーセットを使用して１個のエクソンの特定の領域を増幅してもよい。たとえば、第１のプライマーセットにより第１のエクソンの第１の領域を増幅してもよく、第２のプライマーセットにより第１のエクソンの第２の領域を増幅してもよい。エクソンの第１の領域および第２の領域は重複しても構わない。その代わりに、またはそれに加えて、２種以上のプライマーセットを使用して２個の異なるエクソンを増幅してもよい。いくつかの実施形態では、２種以上のプライマーセットによりヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンを増幅する。
【００２７】
上記で論じたように、プライマーセットは、ヒトＲＨＤ遺伝子の特定のエクソンまたはそのエクソンの特定の領域を増幅するように設計してもよい。したがって、本発明はさらに、ヒトＲＨＤ遺伝子の１つまたは複数のエクソンの特定の領域を増幅するためのプライマーとして使用できる単離された新規なポリヌクレオチド（たとえばオリゴヌクレオチド）を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択される配列を含んでいてもよく、単離されたポリヌクレオチドは５０未満の塩基を含む。一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択される配列を含み、単離されたポリヌクレオチドは５０未満の塩基を含む。プライマーポリヌクレオチドは、以下に限定されるものではないが、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチジル核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、２’−Ｏ−アルキル（たとえば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）などの糖修飾、２’−フルオロおよび４’チオ修飾、骨格修飾、１つまたは複数のホスホロチオアート結合、メチルホスホナート結合、モルホリノ結合またはホスホノカルボキシレート結合などを含む１つまたは複数の化学修飾を含んでいてもよい。一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１０〜約３０塩基を含む。別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１５〜約２５塩基を含む。ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４を増幅するための好ましいプライマーセットとして、配列番号１、配列番号２、配列番号４または配列番号５に記載された配列を含む単離されたポリヌクレオチドがある。ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン５を増幅するための好ましいプライマーセットとして、配列番号７、配列番号８、配列番号１０または配列番号１１に記載された配列を含む単離されたポリヌクレオチドがある。ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン７を増幅するための好ましいプライマーセットとして、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１７に記載された配列を含む単離されたポリヌクレオチドがある。ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン１０を増幅するための好ましいプライマーセットとして、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２３に記載された配列を含む単離されたポリヌクレオチドがある。本発明の別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンにハイブリダイズする。なお別の実施形態では、本発明のプライマーは、非常に密接に関連するＲＨＣＥ遺伝子、またはゲノム内の他の任意の遺伝子の任意の部分を増幅せずにＲＨＤ遺伝子の特定のエクソンまたはエクソンの領域を特異的に増幅し、たとえば、プライマーは高感度であり、汚染染色体ＤＮＡのバ���クグラウンドが大きくても、ＲＨＤ遺伝子の配列を含む非常に少量のＤＮＡを増幅することができる。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、プライマーポリヌクレオチドは、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１および配列番号１２２からなる群より選択される配列を含んでいてもよく、プライマーポリヌクレオチドは５０未満の塩基を含む。
【００２９】
本発明はさらに、ＲＨＤ遺伝子の１つまたは複数のエクソンを検出するプローブとして使用できる単離されたポリヌクレオチド（たとえばオリゴヌクレオチド）を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１および配列番号２４からなる群より選択される配列を含んでいてもよく、単離されたポリヌクレオチドは、５０未満の塩基を含む。一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１０〜約４０塩基を含む。別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１５〜約３０塩基を含む。ＲＨＤ遺伝子のエクソン４を検出する例示的なプローブポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号６に記載された配列を含む。ＲＨＤ遺伝子のエクソン５を検出する例示的なプローブポリヌクレオチドは、配列番号９または配列番号１２に記載された配列を含む。ＲＨＤ遺伝子のエクソン７を検出する例示的なプローブポリヌクレオチドは、配列番号１５または配列番号１８に記載された配列を含む。ＲＨＤ遺伝子のエクソン１０を検出する例示的なプローブポリヌクレオチドは、配列番号２１または配列番号２４に記載された配列を含む。
【００３０】
別の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、配列番号７８、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１２０および配列番号１２３からなる群より選択される配列を含んでいてもよく、プローブポリヌクレオチドは５０未満の塩基を含む。
【００３１】
好ましくは、単離されたプローブポリヌクレオチドは、１つまたは複数の方法により検出が可能なシグナルを発生する少なくとも１つの標識を含む。好適な標識としては、３５Ｓ、３３Ｐおよび３２Ｐなどの放射能標識、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素およびアルカリホスファターゼなどの酵素があるが、これに限定されるものではない。別の標識および標識の適切な検出方法については、当業者であれば確認することができる。一実施形態では、標識は、単離されたポリヌクレオチドの５’末端に結合される。別の実施形態では、標識は、単離されたポリヌクレオチドの３’末端に結合される。別の実施形態では、第１の標識を単離されたポリヌクレオチドの５’末端に結合し、第２の標識を単離されたポリヌクレオチドの３’末端に結合する。第１の標識および第２の標識は、相互作用して特有のシグナルを発生してもよいし、またはどちらかの標識が発生したシグナルを減弱させてもよい。たとえば、蛍光共鳴エネルギー転移、すなわちＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）として公知の現象では、第１の蛍光標識が励起されると、エネルギーが転移するため第１の蛍光標識の近傍にある第２の蛍光標識の発光波長でシグナルが発生する。この現象の変形では、第１の蛍光標識の近傍にある第２の標識により第１の蛍光標識のシグナルを消光（ｑｕｅｎｃｈ）することができる。こうした様式で相互作用する第１の標識および第２の標識を使用すれば、標識を結合した分子の特定のコンホメーションを検出することができる。本発明の好ましい実施形態では、単離されたプローブポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの５’末端に結合したレポーター分子、およびポリヌクレオチドの３’末端に結合したクエンチャー分子を含む。レポーター／クエンチャーの任意の組み合わせを単離されたポリヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。好適なレポーター分子として、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ：ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＲＯＸ、ＨＥＸおよびＪＯＥがあるが、これに限定されるものではない。好適なクエンチャー分子としては、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド副溝結合物質（ＭＧＢ：ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ：ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）および副溝結合型非蛍光クエンチャー（ＭＧＢＮＦＱ：ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）があるが、これに限定されるものではない。こうした二重標識ポリヌクレオチドは、リアルタイムＰＣＲ技術を使用してＲＨＤ遺伝子の１つまたは複数のエクソンを検出する際に本発明のプライマーポリヌクレオチドと併用するとプローブとして特に有用である。
【００３２】
本発明は、胎児のＲＨＤ遺伝子型を判定する方法であって、胎児細胞を含む母親の生物学的サンプル中の細胞を溶解して溶解混合物を形成すること；前記溶解混合物から核酸を抽出すること；および前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも１個のエクソンを検出することを含み、前記エクソンの有無から胎児のＲｈＤ遺伝子型が示される、方法を包含する。一実施形態では、この方法はさらに、前記抽出された核酸において胎児ＤＮＡの存在を確認することを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、抽出された核酸中の胎児ＤＮＡの存在は、Ｙ染色体を検出することにより確認される。生物学的サンプルから抽出されたＤＮＡのＹ染色体を検出するには、いくつかの方法が当業者に知られている。一実施形態では、Ｙ染色体は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む１種または複数種のプライマーセットでＹ染色体上にある遺伝子を増幅し；１種または複数種の標識プローブで遺伝子を同定することにより検出する。ヒトＹ染色体上にある遺伝子、ＡＭＥＬＹ（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ，Ｙ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ：アメロゲニン、Ｙ染色体）、ＡＮＴ３Ｙ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ−３  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｙ：Ｙ上のアデニンヌクレオチド輸送体−３）、ＡＳＭＴＹ（アセチルセロトニンメチルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を表す）、ＡＺＦ１（ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ  １：無精子症因子１）、ＡＺＦ２（ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ  ２：無精子症因子２）、ＢＰＹ２（ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：Ｙ染色体上の塩基性タンパク質）、ＣＳＦ２ＲＹ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：Ｙ染色体上の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、αサブユニット）、ＤＡＺ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ：無精子症で欠失）、ＩＬ３ＲＡＹ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：インターロイキン−３受容体）、ＰＲＫＹ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，  Ｙ−ｌｉｎｋｅｄ：プロテインキナーゼ、Ｙ連鎖）、ＲＢＭ１（ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，  ｆａｍｉｌｙ  １，  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ１：ＲＮＡ結合モチーフタンパク質、Ｙ染色体、ファミリー１、メンバーＡ１）、ＲＢＭ２（ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：ＲＮＡ結合モチーフタンパク質２）、ＲＰＳ４Ｙ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４，  Ｙ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｐｙ  １：リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖コピー１）、ＲＰＳ４Ｙ２（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４，  Ｙ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｐｙ  ２：リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖コピー２）、ＳＲＹ（ｓｅｘ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：性決定領域）、ＴＳＰＹ（ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：精巣特異的タンパク質）、ＵＴＹ（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ＴＰＲ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：Ｙ染色体上で遍在的に転写されるＴＰＲ遺伝子）、ＺＦＹ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：亜鉛フィンガータンパク質）およびＦＣＹなどのいずれか一つを検出すればよい。好ましい実施形態では、遺伝子はＳＲＹ、ＦＣＹまたはＤＡＺである。ＳＲＹ遺伝子を増幅するための例示的なプライマーとして、配列番号２５または配列番号２６に記載された配列を含むポリヌクレオチドがある。ＦＣＹ遺伝子を増幅するための例示的なプライマーとして、配列番号２８または配列番号２９に記載された配列を含むポリヌクレオチドがある。ＤＡＺ遺伝子を増幅するための例示的なプライマーとして、配列番号３１または配列番号３２に記載された配列を含むポリヌクレオチドがある。ＳＲＹ遺伝子を検出するための例示的なプローブとして、配列番号２７を含むポリヌクレオチドがある。ＦＣＹ遺伝子を検出するための例示的なプローブとして、配列番号３０を含むポリヌクレオチドがある。ＤＡＺ遺伝子を検出するための例示的なプローブとして、配列番号３３を含むポリヌクレオチドがある。
【００３４】
本発明はさらに、Ｙ染色体上のＤＡＺ遺伝子の検出に例示的なプライマーおよびプローブとして使用できる新規なポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）（たとえばオリゴヌクレオチド）を提供する。一実施形態では、この単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３に記載された配列を含み、単離されたポリヌクレオチドは、５０未満の塩基を含む。別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１０〜約３０塩基を含む。別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、約１５〜約２５塩基を含む。
【００３５】
他の実施形態では、抽出された核酸中の胎児ＤＮＡの存在は、父系遺伝の対立遺伝子を検出することにより確認される。父系遺伝の対立遺伝子の検出は、１つまたは複数の多型マーカーの存在を判定することにより行えばよい。一実施形態では、母親の細胞から得られたＤＮＡの１つまたは複数の多型マーカーをスクリーニングする。その後、母体血液サンプルの選択的溶解物から得られる抽出されたＤＮＡについて、母親のＤＮＡ抽出物に認められない１つまたは複数の多型マーカーをスクリーニングする。選択溶解物からの抽出物に１つまたは複数の多型マーカーが存在すれば父系遺伝の対立遺伝子が示され、抽出物中に胎児ＤＮＡが存在することが確認される。父系遺伝の対立遺伝子の判定には様々な多型マーカーを使用してもよい。プライマーおよびプローブについては、抽出されたＤＮＡにおいて適切な多型マーカーを検出するように設計すればよい。多型マーカーならびに多型マーカーを検出するためのプライマーおよびプローブの例示的なセットは実施例３に記載する。
【００３６】
本発明はさらに、被験体から得られる生物学的サンプルから抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の複数のエクソンを検出することにより被験体のＲＨＤ遺伝子型を判定する方法を包含する。一実施形態では、この方法は、被験体由来の１つまたは複数の細胞を含む生物学的サンプルから核酸を抽出すること；および前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の少なくとも３個のエクソンを検出することを含み、前記エクソンの有無から被験体のＲｈＤ遺伝子型が示される。別の実施形態では、前記抽出された核酸においてＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを検出する。いくつかの実施形態では、被験体は胎児である。他の実施形態では、生物学的サンプルは胎児細胞を含む母親の生物学的サンプルである。
【００３７】
ＲＨＤ遺伝子の１０個のエクソンの任意の組み合わせの検出を使用して被験体のＲｈＤ遺伝子型を確認することができる。好ましくは、エクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０の組み合わせを検出する。いくつかの実施形態では、エクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０の４個をすべて検出して被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する。ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンの検出では、３種以上のプライマーセットでの３個以上のエクソンの増幅、および３種以上の標識プローブまたは上述の他の任意の方法での３個以上のエクソンの同定を含んでもよい。３種以上のプライマーセットおよび３種以上の標識プローブは、本明細書に記載の本発明のプライマーおよびプローブのいずれであってもよい。
【００３８】
本発明はさらに、本明細書に記載の新規なプライマーセットおよび新規なプローブを含むＲｈＤジェノタイピングキットを提供する。一実施形態では、このキットは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１種のプライマーセット；少なくとも１種の標識プローブ；および生物学的サンプルにおいてＲＨＤ遺伝子を検出するための、前記少なくとも１種のプライマーセットおよび前記少なくとも１種のプローブの使用説明書を含み、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンにハイブリダイズする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、キットは、２種以上のプライマーセットおよび２種以上の標識プローブを含む。他の実施形態では、２種以上のプライマーセットは、ヒトＲＨＤ遺伝子の１個のエクソンにハイブリダイズする。なお他の実施形態では、２種以上のプライマーセットは、ヒトＲＨＤ遺伝子の２個以上のエクソンにハイブリダイズする。好ましくは、各プライマーセットは、ＲＨＤ遺伝子のエクソンを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。一実施形態では、エクソンは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７またはエクソン１０である。別の実施形態では、フォワードプライマーは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９または配列番号２２に記載された配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、リバースプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に記載された配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。なお別の実施形態では、標識プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１または配列番号２４に記載された配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４０】
別の実施形態では、キットはさらに、溶解試薬を含む。溶解試薬は、本明細書に記載のものを含む生体細胞を溶解するための溶解試薬（ｌｙｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）のいずれでもよい。好ましい実施形態では、溶解試薬は、Ｓ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素を含む。別の実施形態では、溶解試薬は、Ｓ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素、ビタミンＥ、トリトンＸ−１００およびサポニンを含む。なお別の実施形態では、溶解試薬は、Ｓ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素、ビタミンＥ、サポニン、ＤＭＳＯ、トリトンＸ−１００およびｐＨ７．２〜７．４の緩衝液を含む。キットは、生物学的サンプル中の細胞を溶解し、その後そのライセートからＤＮＡ抽出物を調製するための溶解試薬の使用説明書をさらに含んでもよい。別の実施形態では、説明書には、母親の生物学的サンプル中の胎児細胞を選択的に溶解するための、溶解試薬の使用について記載されていてもよい。
【００４１】
本発明はさらに、単離された核酸および本明細書に記載の新規なプライマーおよびプローブの様々な組み合わせを含む試薬混合物を企図している。一実施形態では、この試薬混合物は、単離された核酸；各々がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、ＲＨＤ遺伝子の３個以上のエクソンを増幅するための３種以上のプライマーセット；および３種以上の標識プローブを含む。「単離された核酸」とは、被験体の生物学的サンプルから抽出された核酸をいう。単離された核酸は、試薬混合物に含まれる本発明のプライマーによりＲＨＤ遺伝子の特定のエクソンを増幅するための鋳型としてもよい。好ましい実施形態では、３個以上のエクソンは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０からなる群より選択される。別の実施形態では、試薬混合物は、単離された核酸；ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソンを増幅するための４種のプライマーセット；および４種の標識プローブを含む。４個のエクソンは、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン７およびエクソン１０であってもよい。
【００４２】
上記に詳細に記載されているように、本発明の新規なプライマーおよびプローブは、ＲＨＤ遺伝子の特定のエクソンまたは特定のエクソンの領域を特異的に増幅する。試薬混合物には、前述のプライマーポリヌクレオチドおよびプローブポリヌクレオチドのいずれが含まれていてもよい。いくつかの実施形態では、３種以上のプライマーセットのフォワードプライマーは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９および配列番号２２からなる群より選択される。他の実施形態では、３種以上のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０および配列番号２３からなる群より選択される。なお他の実施形態では、３種以上の標識プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１および配列番号２４からなる群より選択される。
【００４３】
以下、別の例により本発明をさらに説明するが、こうした例を限定するものと解釈してはならない。この出願において引用した参考文献、特許および公開された特許出願ならびに図の内容はすべて、参照によってその全体を本明細書に援用する。
【実施例】
【００４４】
（実施例）
（実施例１．母体血液ライセートから得られた胎児細胞のＲｈＤジェノタイピング）
蓋をした５０ｍｌチューブにおいて妊婦（妊娠８〜１２週）由来の血液サンプル（２０ｍｌ）を溶解試薬（２ｍｌ）で穏やかに混合しながら室温で１０〜２０分間処理した。溶解試薬は、１０ｍＭのＳ−（２−グアニジノ−４−チアゾイル）−メチル−イソチオ尿素（ＧＴＭＩ）、５ｍＭのビタミンＥ、１％トリトンＸ−１００、０．５％サポニン、２．５％ＤＭＳＯ、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を含んでいた。次いでチューブを２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を別の５０ｍｌチューブに移した。この手順を行うことで、母体血液サンプル中に存在する母親の細胞よりも、アポトーシスを起こしやすい胎児細胞の方を優先的に溶解する。参照によってその全体を本明細書に援用する、２００７年１１月１日に出願された同時係属中の米国特許仮出願第６０／９８４，６９８号を参照されたい。
【００４５】
ＤＮＡから任意のタンパク質を分離するため、まず上清をプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）で５５℃、１０分間処理し、続いて溶解緩衝液（５ｍＭのグアニジニウムイソチオシアネート１２ｍｌ、２０％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、あるいは１２ｍｌ、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅキット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのどちらか）および磁性ガラス粒子（ＭＧＰ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｇｌａｓｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）（３ｍｌ、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅキット）で処理した。よく混合してからチューブを回転ホイールで室温にて２０〜３０分間回転させた。チューブの上清を磁性ラックに２分間置いてＭＧＰに結合したＤＮＡを集めた。ＭＧＰで集めた後、上清を捨て、ＭＧＰを洗浄用緩衝液Ｉで２回、さらに洗浄用緩衝液ＩＩで２回、あるいは洗浄液が透明になるまで洗浄した。ＭＧＰを数時間にわたって完全に風乾した。このビーズから溶出緩衝液でＤＮＡを溶出し（２×４００μｌ）、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ−１０００で判定した。溶出したＤＮＡは、下記のような胎児起源および胎児ＲｈＤ状態を判定するＰＣＲ増幅に使用した。
【００４６】
特異性を高めるため、ＲＨＤ遺伝子の４個のエクソン（４、５、７および１０）各々に対しプライマーとプローブとのセットを２組作製した。母体血液から抽出したＤＮＡからの胎児ＲｈＤ状態の確認は、一致する胎児組織でのＤＮＡのリアルタイム−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行った。既知のＲｈＤ陽性およびＲｈＤ陰性の個体由来のＤＮＡを対照として使用した。胎児遺伝子型を評価する定量ＰＣＲ法に使用できる、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソンごとに作製したプライマーおよびプローブの配列を以下に示す。
【００４７】
【化１】
2011528554.tif 000003
ＲＴ−ＰＣＲ反応はすべて３連で行った。３反応のうち少なくとも２反応を、胎児ＲｈＤ遺伝子型判定の前にＰＣＲ増幅産物を生じさせるために必要とした。ＰＣＲ反応混合物の組成およびサイクルプロトコルを以下に示す。ＲＴ−ＰＣＲ反応の実施および分析はすべてＡＢＩ社の７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにより行った。
【００４８】
【化２】
2011528554.tif 000004
ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＰＣＲ反応ごとにサイクル閾値（Ｃｔ：ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に基づいて表にした。初期ＤＮＡ鋳型の量が多いほど、Ｃｔ値は低くなる。低いＣｔ値（＜３０）は母親のＲｈＤ陽性状態を示す（ＲＨＤ遺伝子の非機能的な遺伝的改変体の存在によりサンプルの１〜３％で母親のＤＮＡから陽性シグナルを得た）。高いＣｔ値（３４〜４３）から、陽性胎児ＲｈＤ状態が診断されるだけでなく、ライセートに胎児ＤＮＡが存在することも確認した。鋳型（抽出された）ＤＮＡの増幅がないとき、機能的なＤ抗原がない胎児（すなわち胎児のＲｈＤ陰性）と解釈し、これは、対応する胎児組織から抽出されたＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより確認した。表１は、１６例のＲｈＤ陰性母体血液サンプルから抽出されたＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲのＣｔ値を示す。その結果を表２にまとめてある。
【００４９】
【表１】
2011528554.tif 000005
【００５０】
【表２】
2011528554.tif 000006
（実施例２．ＲｈＤエクソンプライマーセットのバリデーション）
ＲｈＤ陰性の母親由来の選択溶解血液でのＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った際に、３７を超える高いＣｔ値が認められることもあった。ＲｈＤプライマーにより作製された単位複製配列のこうした高いＣｔ値が実際に少量のＲｈＤ陽性胎児ＤＮＡの存在に対応するＰＣＲ産物を反映するものであることを確認するため、ＰＣＲ産物のサイズをゲル電気泳動により調査し、その後ＲｈＤ遺伝子座が間違いなく増幅されていたかを確認するため配列決定を行った。
【００５１】
実施例１に記載した方法に従って、ＲｈＤ陽性胎児（サンプル１４１８０または１４２０２）を妊娠しているＲｈＤ陰性の母親の血液サンプルを溶解させた。溶解後、Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅキットを使用してＤＮＡを単離した。Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と実施例１に記載したＲｈＤプライマーセット４．２、４．３、５、５．２、７、７．３、１０および１０．１とを使用してＡＢＩ社の７９００ＨＴ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍでリアルタイムＰＣＲを行った。すべてのプライマーセットでＤＮＡ鋳型なしの対照（ＮＴＣ：ｎｏ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を実行したところ、増幅を示すものではない、特定されないＣｔ値を常に得た。次いで１．５％アガロースゲルあるいは４．５％アガロースＭＳ−８ゲルで高いＣｔ（＞３７）ＰＣＲ反応物およびＮＴＣを流し、マーカーとして既知のＤＮＡラダーを基準に単位複製配列のサイズを評価した。すべてのＲｈＤプライマーから得られた全ＰＣＲ産物で、予想された単位複製配列サイズ、５８〜８３ｂｐ長を観察した。
【００５２】
予想された単位複製配列のバンドをゲルから抽出後、フォワードあるいはリバースＰＣＲプライマーのどちらかを使用して単位複製配列の配列決定を直接行った。シーケンシングは、Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＲｅｔｒｏｇｅｎが行った。得られたシーケンシングデータが不確定である場合、単位複製配列をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｔ３プライマーを使用して配列決定を行った。８個の単位複製配列のうち６個は直接配列決定ができたのに対し、残りの２個はｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターから配列決定を行う必要があった。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、単位複製配列ごとに得られた配列をＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（ＮＣＢＩ）で公表されている配列と比較した。各プライマーセットについては以下で検討する。黒文字のＤＮＡ配列は、実験で得られた単位複製配列の配列を表す。赤文字のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋで公表されている配列（以下Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋと表示）である。すべての場合において、ＰＣＲの単位複製配列の配列はＲｈＤ遺伝子座に１００％一致した。
【００５３】
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット４．２（エクソン４））
図２Ａは、プライマーセット４．２で増幅されたサンプル１４２０２を示す（Ｃｔ４０．２）。観察された３つのＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯに別々にクローニングし、配列決定を行った。一番上のバンドは７０ｂｐの単位複製配列に正確に対応しており、ＢＬＡＳＴによりＲｈＤ遺伝子座と同定した。
【００５４】
【化３】
2011528554.tif 000007
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット４．３（エクソン４））
図２Ｂは、ＲｈＤプライマーセット４．３で増幅されたサンプル１４２０２の電気泳動ゲルを示す（Ｃｔ４０．４）。
【００５５】
【化４】
2011528554.tif 000008
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット５（エクソン５））
図３Ａは、ＲｈＤプライマーセット５で増幅されたサンプル１４１８０の電気泳動ゲルを示す（最後の２レーン）（Ｃｔ３９．３）。
【００５６】
【化５】
2011528554.tif 000009
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット５．２（エクソン５））
図３Ｂは、ＲｈＤプライマーセット５．２によるサンプル１４１８０の増幅を示す（最後の２レーン）（Ｃｔ３５）。
【００５７】
【化６】
2011528554.tif 000010
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット７（エクソン７））
図４Ａは、ＲｈＤプライマーセット７で増幅されたサンプル１４２０２の電気泳動ゲルを示す（最後の３レーン）（Ｃｔ３７．３）。４．５％ＭＳ８アガロースゲル上に約５３および５８ｂｐというサイズが近い２個の単位複製配列が目視可能である。この２つの産物をどちらも別々にＴＡクローニングベクターにクローニングし、複数のクローンの配列決定を行った。配列決定したクローンはすべて、間違いなく同一の５８ｂｐの単位複製配列であることを明らかにし、これを、ＢＬＡＳＴによりＲｈＤ遺伝子座と同定した。
【００５８】
【化７】
2011528554.tif 000011
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット７．３（エクソン７））
図４Ｂは、ＲｈＤプライマーセット７．３で増幅されたサンプル１４２０２の電気泳動による分析を示す（最後の２レーン）（Ｃｔ３８．２）。ＢＬＡＳＴによりＲｈＤ遺伝子座と同定された約６１ｂｐの単位複製配列が１個存在した。
【００５９】
【化８】
2011528554.tif 000012
（Ｒｈ（Ｄ）プライマーセット１０および１０．１）
図５は、ＲｈＤプライマーセット１０（Ｃｔ４２．１、最後の２レーン、５９ｂｐ）および１０．１（１０Ｈ；Ｃｔ３７．７、最初の２レーン、７４ｂｐ）で増幅されたサンプル１４１８０を示す。プライマーセット１０．１および１０の約７４ｂｐおよび５９ｂｐの単位複製配列をそれぞれ、ＢＬＡＳＴによりＲｈＤ遺伝子座と同定した。
【００６０】
【化９】
2011528554.tif 000013
表３にまとめたこれらの実験結果から、ＲｈＤプライマーで行ったリアルタイムＰＣＲから得られたＣｔ値４２．１までのＣｔが高いＰＣＲ産物はすべて、本物の増幅産物であることを確認する。
【００６１】
【表３】
2011528554.tif 000014
（実施例３−母体血液サンプル中の胎児ＤＮＡの存在の判定）
（胎児ＲｈＤ陰性男性サンプル）
この実施例に記載した実験の目的は、母体血液サンプルから調製したライセートに胎児ＤＮＡが存在することを確認することであった。ＲｈＤ陰性の母親の血液由来の胎児ＲｈＤが陽性であれば、母親のサンプルに胎児ＤＮＡが存在する診断指標となると考えた。胎児ＲｈＤ状態が陰性である場合、ＤＮＡの胎児起源を、まず、Ｙ染色体上のＳＲＹ（性決定領域）およびＦＣＹ遺伝子座を増幅するように設計されたプライマーおよびプローブを使用してＲＴ−ＰＣＲで胎児の性別を判定することにより確認した。使用したＦＣＹプライマーおよびプローブについては、以前文献（Ｄ．Ｂｉａｎｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４７：１８６７）に報告された。さらに胎児の性別は、Ｙ染色体上のＤＡＺ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ：無精子症で欠失）遺伝子を増幅するために作製された新規なプライマーおよびプローブによっても判定した。βグロビン遺伝子をハウスキーピング遺伝子として、さらに既知の男性ＤＮＡを陽性対照として、女性ＤＮＡを陰性対照として使用した。ＳＲＹ陽性サンプルのＣｔ値は３２〜３７．５の範囲であったのに対し、ＦＣＹ陽性サンプルのＣｔ値は３２〜３８であった。ＤＡＺ陽性サンプルのＣｔ値は３０〜３５の範囲であり、このことは、ＤＡＺプライマーおよびプローブの方が、ＳＲＹおよびＦＣＹプライマー／プローブより感度が高いことを示した。βグロビンの値は２４〜３２の範囲であった。ＳＲＹ、ＦＣＹ、ＤＡＺおよびβグロビン遺伝子のプライマーおよびプローブの配列を以下に示す。
【００６２】
【化１０】
2011528554.tif 000015
（胎児ＲｈＤ陰性女性サンプル）
父親から胎児に遺伝した対立遺伝子を増幅するように設計された１６組の多型マーカーを使用して、ＲｈＤ陰性、かつＹ染色体遺伝子陰性でもあったサンプルをＲＴ−ＰＣＲにより分析した（Ｍ．Ａｌｉｚａｄｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９９：４６１８）。最初にこれらの２対立遺伝子（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）マーカーについて母親のＤＮＡを検査した。次いで母親のＤＮＡで陰性であったこれらのマーカーについて胎児のＤＮＡを検査した。胎児のＤＮＡに対立遺伝子が存在し、母親のゲノムに同じ対立遺伝子が存在しないことは、対立遺伝子が父親から胎児に遺伝したことを示した。これらのマーカーの検出用のプライマーおよびプローブの配列を以下に示す。
【００６３】
【化１１】
2011528554.tif 000016
【００６４】
【化１２】
2011528554.tif 000017
【００６５】
【化１３】
2011528554.tif 000018
Ｃｔ値が４３と高い単位複製配列のシーケンシングは、こうしたＣｔの高い単位複製配列が実際に本物のＰＣＲ産物であることを疑いの余地なく示している（データ示さず）。これらの実験結果から、実施例１に記載されているように母体血液サンプルの選択的溶解により胎児ＤＮＡを抽出できること、さらにこの単離されたＤＮＡを使用して胎児のＲｈＤ遺伝子型を正確に予測できることを明らかにする。
【００６６】
（実施例４−ＲｈＤ遺伝子の特定のエクソンを増幅するための新規なプライマーおよびプローブ）
本実施例は、ヒトＲｈＤ遺伝子の特定のエクソンを増幅および検出するための別の新規なプライマーおよびプローブ配列について記載する。こうしたプローブおよびプライマーの配列を、被験体のＲｈＤ遺伝子型を判定する方法、特にＲＴ−ＰＣＲをベースとした方法において使用する。
【００６７】
【化１４】
2011528554.tif 000019
【００６８】
【化１５】
2011528554.tif 000020
【００６９】
【化１６】
2011528554.tif 000021
【００７０】
【化１７】
2011528554.tif 000022
開示された発明は、記載した特定の方法論、プロトコルおよび材料が変化しても構わないため、それらに限定されるものではないことが理解される。また、本明細書に使用した用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００７１】
当業者であれば、本明細書に記載した本発明の具体的な実施例に対する等価物を数多く認識するか、あるいはごく通常の実験を用いるのみで確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲の包含するところとして意図されている。
【図３Ａ】
2011528554.tif 000023
【図３Ｂ】
2011528554.tif 000024
【図５】
2011528554.tif 000025
【図１】
2011528554.tif 000026
【図２】
2011528554.tif 000027
【図４】
2011528554.tif 000028
【配列表】
2011528554000001.app
【国際調査報告】
2011528554.tif 000029
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