(57)【要約】  キシロースおよびヘキソース糖類の異性化および／または発酵のための方法およびシステムを開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つまたはそれを超える糖類を発酵させる方法であって、
（ｉ）一つまたはそれを超える共固定化（co-immobilized）酵素を含む粒子を、ボレート源およびキシロースを含む混合物中に分散させ；そして
（ii）該混合物を発酵させること
を含む方法。
【請求項２】
粒子が、第一酵素活性を有する内部コアと、第二酵素活性を有する外部領域を含む二層粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合物が、酸性ｐＨを有し、そして内部コアが、実質的に非酸性のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イオン性ボレートおよびキシロース双方が、混合物からペレットの内部コアへと拡散し、ここにおいて、キシロースは、キシルロースへと変換され且つボレート−キシルロース複合体を形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ボレート−キシルロース複合体が、引き続き混合物へと移動し、そこで、ボレート−キシルロース複合体が解離して、遊離キシルロースを放出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
内部コアのｐＨが、約７〜約８であり、そして混合物のｐＨが、約４〜約５．５である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ボレート源が、テトラホウ酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
共固定化酵素が、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびウレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
イオン性ボレートが、テトラヒドロキシボレートを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
一つまたはそれを超える糖類を発酵させる方法であって、
（ｉ）共固定化酵素ペレットを、尿素、ボレート源および基質を含有する混合物中に分散させ、ここにおいて、該共固定化酵素ペレットは、固定化ウレアーゼと、当該基質に作用するウレアーゼ以外の固定化酵素を含み、そして
（ii）該混合物を発酵させること
を含む方法。
【請求項１１】
共固定化酵素ペレットが、固定化ウレアーゼを含む多孔質外部領域と、前記基質に作用するウレアーゼ以外の固定化酵素を含む多孔質内部コアを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ペレットの内部コアが、ペレットの外部領域中に拡散する尿素に作用するウレアーゼによって生成されるアンモニアの存在ゆえに、混合物のｐＨより高いｐＨを維持する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固定化酵素および前記基質が反応して、ペレットコア中に生成物を生じ、該生成物が、イオン化ボレートと複合体を形成する、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ボレート−生成物複合体が、引き続き混合物へと移動し、そこで、ボレート−生成物複合体が解離する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
混合物が、酸性ｐＨを有し、そしてペレットの少なくとも一部分が、異なったｐＨを有する、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ペレットの少なくとも一部分のｐＨが、約７〜約８であり、そして混合物のｐＨが、約４〜５．５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ボレート源が、テトラホウ酸ナトリウムを含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
イオン化ボレートが、テトラヒドロキシボレートを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キシロースのエタノールへの同時異性化・発酵の方法であって、
（ｉ）キシロース、尿素、および高いエタノール生産性およびエタノール寛容性を有する酵母細胞を反応器中で混合して、液体混合物を形成し；
（ii）該混合物のｐＨを約４．０〜約５．５の範囲内で維持し；
（iii）少なくとも二つの酵素を有する共固定化酵素粒子を該混合物中に分散させ；
（iv）ボレート源を該混合物に加え；
（ｖ）キシロースを該粒子中に拡散させ；
（vi）拡散したキシロースを、固定化キシロースイソメラーゼの活性によってキシルロースへと異性化し；
（vii）該キシルロースを該混合物中に拡散させ；
（viii）異性化の際の該粒子中の液体のｐＨを、該粒子中に尿素を拡散させることによって約７．０〜約８．０の範囲内で維持し、それによって、該尿素は、固定化ウレアーゼによってアンモニアへと加水分解され、該アンモニアは、ペレット中に拡散する水素イオンを中和し；
（ix）該混合物を、キシルロースのエタノールへの発酵を可能にするように、実質的に嫌気性の条件下で撹拌し；そして
（ｘ）キシルロースをエタノールへと発酵させる
という工程を含む方法。
【請求項２０】
粒子が、ウレアーゼを含む外部領域と、キシロースイソメラーゼを含む内部コアを含む二層ペレットである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
外部領域が、ポリアクリルアミドのポリマーコーティングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
酵素を共固定化しているポリマー粒子が、ポリアクリルアミドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
発酵を、密閉反応器中で撹拌しながら行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ボレート源が、テトラホウ酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
次の一つまたはそれを超える工程：
（ｉ）ボレート源を反応させて、ホウ素を含有する酸を生成すること；
（ii）該ホウ素含有酸をペレット中に拡散させ、そしてキシルロースを該ホウ素含有酸と反応させて、キシルロース−ボレートイオン複合体を生成すること；および
（iii）該キシルロース−ボレートイオン複合体を混合物中に拡散させ、ここにおいて、複合体は解離すること
を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
ホウ素含有酸が、ホウ酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ボレートイオンが、テトラヒドロキシボレートを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
天然Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いて、キシルロースをエタノールへと変換する、請求項１、請求項１０、請求項１１または請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
エタノールの生産速度を増加させ、そしてＣ６およびＣ５双方の糖類の発酵に必要な全時間を減少させる、請求項１、請求項１０、請求項１１または請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
二ｐＨ環境を含む共固定化酵素ペレット中におけるキシロースの異性化のためのボレート増強システム。
【請求項３１】
ホウ砂を更に含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
ホウ砂から形成されるテトラヒドロキシボレートイオンへのキシルロースの選択的複合体形成に起因する平衡における正移動（positive shift）を引き起こすことを更に含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
単一容器中の二つの異なったｐＨ微環境を持続可能な実質的に同時の異性化・発酵（ＳＩＦ）工程を更に含み、ここにおいて、第一ｐＨは、キシロース異性化に実質的に最適であり、そして第二ｐＨは、キシルロースの発酵に実質的に最適である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３４】
同時異性化・発酵工程が、ウレアーゼとキシロースイソメラーゼとの共固定化を更に含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
キシロース、ボレート源および尿素を含む反応媒質。
【請求項３６】
多孔質中空ファイバーメンブラン発酵装置に直列に連通した共固定化酵素粒子を含む充填床システム。
【請求項３７】
エタノール回収用に濃縮することができる実質的に酵母不含である発酵ビールを更に含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
緩衝剤およびボレートを含有する再循環可能な水溶液を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３９】
酵母と直接的に接触することがないように、充填床に閉じ込められた異性化触媒粒子を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４０】
発酵装置中に高密度の酵母を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４１】
酵母を、各々の発酵バッチ後に廃棄しない、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
発酵ブロス中で回転する閉じ込めシステム中に充填された共固定化酵素粒子を含む異性化・発酵システム。
【請求項４３】
一つまたはそれを超えるプロセスを実質的に同時に行うように配置された異性化・発酵システム。
【請求項４４】
プロセスが、同時糖化・キシロース異性化（ＳＳＩ）プロセス；同時異性化・発酵（ＳＩＦ）；および同時糖化・発酵（ＳＳＩＦ）の一つまたはそれを超えるものを含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
共固定化酵素粒子を用いる、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４６】
粒子が、二層粒子である、請求項４５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：サシドハル・ヴァラナシ（Sasidhar Varanasi）、クリプラ・ラオ（Kripra Rao）、パトリシア・レルー（Patricia Relue）、ダウェイ・ユアン（Dawei Yuan）
関連出願のクロス・リファレンス
[0001]本出願は、その開示が本明細書中にそのまま援用される２００８年１月４日出願の米国仮特許出願第６１／００９，９７３号の恩典を主張する。
【０００２】
[0002]本発明は、概して、キシロースおよびヘキソース糖類から燃料を生成する発酵方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]エタノールは、将来の燃料として認められている。再生可能な源からの燃料エタノールの生産への関心は、有意に増加していた。燃料エタノール生産が実際に現実となるためには、より安価な基質およびより有効な生産プロセスが必要とされる［１，２］。全ての植物および植物由来物質を包含するバイオマスは、燃料エタノールおよびいろいろな他の燃料および化学薬品を生成するように発酵させることができる糖類について可能性のある再生可能な源を形成している。再生可能エネルギーに共通の多数の利点に加えて、バイオマスは、現在のところ、液体輸送燃料のための唯一の再生可能で持続可能なエネルギー源であるので、それは、特に魅力的である。
【０００４】
[0004]リグノセルロース系バイオマスは、液体輸送燃料へと変換することができる豊富な家庭用の再生可能な源であるので、それは、魅力的なエネルギー供給原料である（From Biomass to Biofuels: A Roadmap to the Energy Futture; Office of Science, US Dept. of Energy, December 2005）。
【０００５】
[0005]リグノセルロース系バイオマスは、三つの主成分、すなわち、セルロース（約４０〜５０％）、ヘミセルロース（約２５〜３５％）およびリグニン（約１５〜２０％）から成る［３］。これらの内、セルロースおよびヘミセルロースは、エタノールへと発酵させうると考えられる糖類へと加水分解することができる多糖類を構成している。バイオマスの場合、セルロースの大部分は、グルコースの結晶性ポリマーであり、それは、そのモノマー性糖残基へと加水分解するのが比較的難しい。ヘミセルロースは、セルロースフィブリルを取り囲むペントースおよびいくつかのヘキソース糖類の短分枝ポリマーであり、ほとんど組織化されていない［４］。ペントース糖類は、主に、キシロースおよびより少ないアラビノースから成るが、ヘキソース糖類は、通常は、ガラクトースおよびマンノースである。その比較的開いた構造ゆえに、ヘミセルロース部分は、いろいろな前処理技術によってその糖モノマーへと変換するのが、セルロース部分よりも容易である。
【０００６】
[0006]リグノセルロース系バイオマスのバイオエタノールへの変換が経済的に実行可能であるためには、ヘミセルロース由来のモノマー性糖類が、セルロース由来のグルコースと一緒に発酵可能であることが肝要である。残念ながら、既知の天然（または野生型）微生物で、グルコースおよびキシロース双方をエタノールへと効率よく発酵させることができるものはない。野生型サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）菌株は、グルコース、更には、マンノース、フルクトースおよびガラクトースのようなバイオマスの他の糖成分を容易に発酵させることができる［５］。ヘミセルロースの主要部分を形成しているキシロースは、酵母の同じ天然菌株によって発酵させることができない。ピキア・スチピティス（Pichia stipitis）およびカンジダ・シェハテ（Candida shehatae）などの酵母のいくつかの非サッカロミセス属（Saccharomyces）菌株は、ペントース糖類を他の酵母より効率よく発酵させることが知られている［６］。このような酵母の場合、キシロース代謝経路は、キシロース〜キシリトール〜キシルロースへと進行する［７，８］。他の酵母菌株並びに細菌および真菌の場合、キシロースは、単一の酵素キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）によってキシルロースへ変換されることもできる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）を含めた、キシロースを発酵させることができないいくつかの酵母は、キシロースのケトース異性体であるキシルロースをエタノールへと発酵させることができる［９〜１２］。微生物の遺伝的修飾にかなりの努力が集中したので、キシロースおよびグルコース双方は、同じ生物を用いて効率よく代謝させることができる［１３〜２５］。
【０００７】
[0007]遺伝的に修飾された生物（ＧＭＯ）は、ペントースおよびヘキソース糖類の発酵の可能性を有するが、それらの遺伝的安定性、全エタノール収率および工業用発酵条件下で生存する能力は、未証明である［２６，２７］。したがって、エタノールへのキシロースの発酵への別のアプローチは、キシロースの異性化のための外因性酵素の添加を伴って天然酵母菌株を用いることを必要とする。このアプローチの場合、キシルロースの生産は、固定化グルコース／キシロースイソメラーゼを用いて達成される［１１，２８〜３０］。このアプローチの魅力は、ＸＩが、アミラーゼおよびプロテアーゼと一緒に、最も広く且つ安価に入手可能な市販酵素の中にあるということである［３１］。リグノセルロース系バイオマスからの加水分解産物は、キシロースおよびグルコース双方を含有するであろう。キシロースへのＸＩの親和性は、典型的に、グルコースへのその親和性よりも１〜２桁大である；したがって、キシロースのキシルロースへの異性化は、グルコースのフルクトースへの異性化を上回って優勢であろう［３１］。しかしながら、形成されるフルクトースはいずれも、エタノールを生成する Saccharomyces によって容易に発酵可能であるので、フルクトース形成は、懸念の原因ではない。
【０００８】
[0008]ＸＩは、キシロースをキシルロースへ変換することができるが、ＸＩが有意の活性を有する条件下において、キシロース：キシルロースの平衡比率は、典型的に（５：１の程度で）高い［３２〜３４］。したがって、キシロース異性化は、好ましい前進平衡を有することがない。キシロース変換を増加させる一つの方法は、生成物キシルロースの除去によって異性化を推進することである。キシロースの異性化およびキシルロースのエタノールへの発酵が同じ容器中で同時に行われる同時異性化・発酵（ＳＩＦ）は、キシロース利用を増加させる一つの方法である。しかしながら、ＳＩＦは、ＸＩが活性であるｐＨ範囲ゆえに、固有の限界を有している。商業的に入手可能なＸＩは全て、ｐＨ７〜８で最適活性を有し、そしてＸＩ活性は、ｐＨが減少するにつれて急降下する。対照的に、発酵のための最適ｐＨは、４〜５の範囲内である。これら二つの工程に関連した大きいｐＨ差は、ＳＩＦを効率よく行うのに問題となる。ＳＩＦは、４〜７の折衷ｐＨで行うことができるが、それら結果は、双方の反応について最適未満である［１１］。ＳＩＦについて有意に一層低いｐＨで最適活性を有するＸＩを単離する努力は、参考文献においても注目された［３０］。しかしながら、この酵素が、商業的に入手可能な酵素によって示されるのと同レベルの活性を有するということは考えられない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zaldivar, J., Nielsen, J., and Olsson, L., Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Biotechnol., 56(1-2) 2001 17-34
【非特許文献２】Office of Science, U. S. D. O. E., Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol: A Research Roadmap Resulting from the Biomass to Biofuels Workshop. December 2005, U.S Department of Energy: Rockville, MD
【非特許文献３】From Biomass to Biofuels: A Roadmap to the Energy Futture; Office of Science, US Dept. of Energy, December 2005
【非特許文献４】Holtzapple, M.T., Chapters, cellulose, hemicelluloses, and lignin., in Encyclopedia of Food Science, Food Technology and Nutrition., M.J. Sadler, Editor. 1993, Academic Press: London. p.758-767,2324-2334,2731-2738
【非特許文献５】Somerville, C., Bauer, J., G., B., Facette, M., Hamann, T., Milne, J., Osborne, E., Paredez, A., Persson, S., Raab, T., Vorwerk, S., and Youngs, H., Toward a Systems Approach to Understanding Plant Cell Walls. Science, 306(5705) 2004 2206-2211
【非特許文献６】Van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., Bellissimi, E., Van Den Brink, J., Kuyper, M., Luttik, M. A. H., Wisselink, H., Scheffers, A. W., Van Dijken, J. P., and Pronk, J. T., Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek, 90(4) 2006 391-418
【非特許文献７】Prior, B. A., Kilian, S. G., and Dupreez, J. C., Fermentation of d-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stiptis, in Process Biochem. 1989. p.21-32
【非特許文献８】Tantirungkij, M., Nakashima, N., Seki, T., and Yoshida, T., Construction of xylose-assimilating Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentaion and Bioengineering, 75(2) 1993 83-8
【非特許文献９】Wang, P.Y., Shopsis, C., and Schneider, H., Fermentation of a pentose by a yeasts. Biochem. Biophysics. Res. Communications, 94 1980 248-254
【非特許文献１０】Chiang, L. C., Gong, C. S., Chen, L. F., and Tsao, G. T., D-xylulose Fermentation to Ethanol by Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 42(2) 1981 284-289
【非特許文献１１】Hsaio, H. Y., Chiang, L. C., Ueng, P. P., and Tsao, G. T., Sequential Utilization of Mixed Monosaccharides by Yeasts. Applied and Environmental Microbiology, 43(4) 1982 840-845
【非特許文献１２】Gong, C. S., Chen, L. F., Flickinger, M. C., Chiang, L. C., and Tsao, G. T., Production of Ethanol from D-xylose by using D-Xylose Isomerase and Yeasts. Applied and Environmental Microbiology, 41(2) 1981 430-436
【非特許文献１３】Yu, S., Jeppsson, H., and Hahn-Gaegerdal, B., Xylulose fermentaion by Saccharomyces cerevisiae and xylose fermenting yeast strains. Applied Microbiology and Biotechnology, 44 1995 314-320
【非特許文献１４】Sarthy, A. V., Mcconaughy, B. L., Lobo, Z., Sundstrom, J. A., Furlong, C. E., and Hall, B. D., Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology, 53(9) 1987 1996-2000
【非特許文献１５】Kotter, P., Amore, R., Hollenberg, C. P., and Ciriacy, M., Isolation and characterization of the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene, XYL2, and construction of a xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae transformant. Current genetics, 18(6) 1990 493-500
【非特許文献１６】Amore, R., Kotter, P., Kuster, C., Ciriacy, M., and Hollenberg, C. P., Cloning and Expression in Saccharomyces cerevisiae of the NAD(P)H-dependent xylose reductase-encoding gene (XYL1) from the xylose assimilating yeast Pichia stiptis. Gene, 109 1991 89-97
【非特許文献１７】Moes, C. J., Pretorius, I. S., and Van Zyl, W. H., Cloning and expression of the Clostridium thermosulfurogenes D-xylose isomerase gene (xylA) in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Letters, 18(3) 1996 369-74
【非特許文献１８】Walfridsson, M., Bao, X., Anderlund, M., Lilius, G., Buelow, L., and Hahn-Gaegerdal, B., Ethanolic fermentaion of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Thermus thermophilus xylA gene, which expresses and active xylose (glucose) isomerase. Applied and Environmental Microbiology, 62(12) 1996 4648-4651
【非特許文献１９】Hahn-Hagerdal, B., Wahlbom, C. F., Gardonyi, M., Van Zyl, W. H., Otero, R. R. C., and Jonsson, L. J., Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 73 (Metabolic Engineering) 2001 53-84
【非特許文献２０】Jeppsson, M., Johansson, B., Hahn-Gaegerdal, B., and Gorwa-Grauslund, M. F., Reduced Oxidative Pathway flux in recombinant xylose-utilizing strains improves the ethanol yield from xylose. Applied and Environmental Microbiology, 36 2002 5892-5897
【非特許文献２１】Johansson, B. and Hahn-Gaegerdal, B., The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylulose, but not of xylose in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research, 2 2002 277-282
【非特許文献２２】Verho, R., Londesborough, J., Penttilae, M., and Richard, P., Engineering redox cofactor regeneration for improved pentose fermentation in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 69(10) 2003 5892-5897
【非特許文献２３】Gardonyi, M. and Hahn-Hagerdal, B., The Streptomyces rubiginosus xylose isomerase is misfolded when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 32(2) 2003 252-259
【非特許文献２４】Kuyper, M., Harhangi, H. R., Stave, A. K., Winkler, A. A., Jetten, M. S. M., De Laat, W. T. A. M., Den Ridder, J. J. J., Op Den Camp, H. J. M., Van Dijken, J. P., and Pronk, J. T., High-level functional expression of a fungal xylose isomerase: the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces cerevisiae ? FEMS Yeast Research, 4(1) 2003 69-78
【非特許文献２５】Kuyper, M., Winkler, A. A., Van Dijken, J. P., and Pronk, J. T., Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle. FEMS Yeast Research, 4 2004 655-664
【非特許文献２６】Kuyper, M., Toirkens, M. J., Diderich, J. A., Winkler, A. A., Van Dijken, J. P., and Pronk, J. T., Evolutionary Engineering of mixed-sugar utilization by a xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae strain.  FEMS Yeast Research, 5 2005 925-934
【非特許文献２７】Dien, B.S., Cotta, M. A., and Jeffries, T. W., Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status. Applied Microbiology and Biotechnology, 63 2003 528-266
【非特許文献２８】Jeffries, T. W., Engineering yeasts for xylose metabolism. Current Opinion in Biotechnology, 17 2006 320-326
【非特許文献２９】Linden, T. and Hahn-Gaegerdal, B., Fermentation of lignocellulose hydrolysates with yeasts and xylose isomerase. Enzyme and Microbial Technology, 11 1989 583-589
【非特許文献３０】Byers, J. P., Fournier, R. L., and Varanasi, S., A Feasibility Analysis of a Novel Approach For the Conversion of Xylose to Ethanol. Chem. Eng. Comm, 112 1992 165-187
【非特許文献３１】Chandrakant, P. and Bisaria, V. S., Simultaneous bioconversion of glucose and xylose to ethanol by Saccharomyces cerevisiae in the presence of xylose isomerase. Applied Microbiology and Biotechnology, 53 2000 301-309
【非特許文献３２】Bhosale, S. H., Rao, M. B., and Deshpande, V. V., Molecular and industrial aspects of glucose isomerase. Microbiological Reviews, 60(2) 1996 280-300
【非特許文献３３】Mitsuhashi, S. and Lampen, J. O., Conversion of D-Xylulose to D-Xylose in Extracts of Lactobacillus Pentosus. Journal of Biological Chemistry, 204 1953 1011-1018
【非特許文献３４】Hochester, R. M. and Watson, R. W., Enzymatic Isomerization of D-Xylose to D-xylulose. Archives of Biochemistry and Biophysics, 48 1954 120-129
【非特許文献３５】Tewari, Y. B., Steckler, D. K., and Goldberg, R. N., Thermodynamics of the Conversion of Aqueous Xylose to Xylulose. Biophysical Chemistry, 22 1985 181-185
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[0009]本発明は、各々の開示が本明細書中にそのまま援用される、Fournier et al. 米国特許第５，２５４，４６８号および Fournier et al. 米国特許第５，３９７，７００号に開示された共同発明者の先行発明の一つにまさる追加の改良を提供する。
【００１１】
[0010]上述の懸念を考えると、当該技術分野において、キシロースおよびヘキソース糖類の有効な発酵を可能にするプロセスを開発する方法への要求が依然としてあるということは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0011]第一の広範な側面において、キシロースを含めた一つまたはそれを超える糖類を発酵させる方法であって、一つまたはそれを超える共固定化（co-immobilized）酵素を含む粒子を、ボレート源およびキシロースを含む混合物中に分散させ、そしてその混合物を発酵させることを含む方法を提供する。第一酵素活性を有する内部コアと、第二酵素活性を有する外部領域を含む二層粒子の使用が、更に考えられる。本発明の態様において、それら二層粒子は、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびウレアーゼを含むと考えられる。
【００１３】
[0012]本発明の一つの態様において、発酵プロセスを改良する方法であって、次の工程：（ｉ）一つまたはそれを超える共固定化酵素粒子を、ボレート添加剤およびキシロースを含有する混合物中に分散させ、それら共固定化粒子は、ウレアーゼを含む外部層と、共固定化されたキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）（または双方の酵素）を含む内部コアを有する；（ii）その混合物から内部コアへとキシロースを拡散させ、そこで、ＸＩは活性であり、そしてキシルロースを形成させる；（iii）イオン形の少なくとも一定量のホウ素を、ボレート添加剤から、少なくともいくつかの粒子の内部コア中へ拡散させる；（iv）イオン化ボレートとキシルロースとを反応させて、イオン化ボレート−キシルロース複合体を形成する；（ｖ）イオン化ボレート−キシルロース複合体を混合物へと移動させる；そして（vi）混合物中においてイオン化ボレート−キシルロース複合体を解離させて、遊離キシルロースを得る工程を含む、または或いは、から成るまたはから本質的になる方法を提供する。このプロセスのいくつかの工程は、受動的に行われてよく、積極的工程を必要としないということは理解されるはずである。
【００１４】
[0013]特定の態様において、混合物は、酸性ｐＨを有し、そしてペレットの少なくとも一部分は、異なったｐＨを有する。更に、特定の態様において、ペレットの少なくとも一部分のｐＨは、約７〜約８であり、そして混合物のｐＨは、約４〜５．５である。
【００１５】
[0014]特定の態様において、混合物は、酸性ｐＨを有し、そしてペレットの内部コアは、異なったｐＨを有する。特定の態様において、内部コアのｐＨは、約７〜約８であり、そして混合物のｐＨは、約４〜約５．５である。
【００１６】
[0015]特定の態様において、ボレート添加剤は、テトラホウ酸ナトリウムを含む、または或いは、から成る。
【００１７】
[0016]特定の態様において、イオン化ボレートは、テトラヒドロキシボレートイオンを含む、または或いは、から成る。
【００１８】
[0017]別の広範な側面において、キシロースを含めた一つまたはそれを超える糖類を発酵させる方法であって、二層ペレットを、尿素、ボレート源および基質を含有する混合物中に分散させ、ここにおいて、二層ペレットは、固定化ウレアーゼを含む多孔質外部領域と、基質に作用するウレアーゼ以外の固定化酵素を含む多孔質内部コアを含み、そしてその混合物を発酵させることを含む方法を提供する。
【００１９】
[0018]別の態様において、生成物を生成する方法であって、固定化ウレアーゼを含有する多孔質物質の外部層と、基質に作用するウレアーゼ以外の固定化酵素を含有する多孔質物質の内部コアを有する共固定化二層ペレットを用いて生成物を生成する、次の工程：（ｉ）二層ペレットを、尿素、ボレート添加剤および基質を含有する混合物であって、酸性ｐＨを有する混合物中に分散させる；（ii）ウレアーゼを、外層中に拡散する尿素と反応させて、アンモニアを生成し、それが、内部コアに向かって拡散する水素イオンを消費して、混合物の酸性ｐＨより高いｐＨを有する内部コアに与える；（iii）内部コア中の固定化酵素を、基質と、それが内部コア中に拡散するように反応させて、生成物を生成する；（iv）イオン化ボレートを生成物と反応させて、イオン化ボレート−生成物複合体を生成する；そして（ｖ）イオン化ボレート−生成物複合体を混合物へと移動させ、そこで、それが解離して、遊離キシルロースを放出する工程を含む、または或いは、から成るまたはから本質的になる方法を提供する。この方法のいくつかの工程は、受動的に行われてよく、積極的工程を必要としないということは理解されるはずである。
【００２０】
[0019]この方法の一つの態様において、内部コア中の固定化酵素は、キシロースイソメラーゼであり、そして生成物は、キシルロースである。
【００２１】
[0020]別の広範な側面において、キシロースのエタノールへの同時異性化・発酵（ＳＩＦ）の方法であって、次の工程：（ｉ）実質的に球状の粒子であって、より大きいペレットの内部コア領域を形成する粒子を形成するように、多孔質ポリマー物質中にキシロースイソメラーゼを固定化する；（ii）それら粒子を、少なくとも水、ウレアーゼ、モノマー、架橋剤および重合開始剤と混合して、水性媒質を形成するようにし、その水性媒質および粒子が水性懸濁液を構成する；（iii）水性懸濁液を約０℃〜約４℃の温度で維持する；（iv）少なくともトルエン、クロロホルムおよび界面活性剤を懸濁液に加えて、水性疎水性相を形成するようにする；（ｖ）その疎水性相を窒素条件下および約０℃〜約４℃の温度で撹拌して、モノマーの重合を可能にし、そして固定化されたウレアーゼを含有する薄いポリマーコーティングを粒子のまわりに形成させて、二層固定化酵素ペレットを形成する；（vi）バルク液であって、撹拌手段を有する密閉反応器中に入っているバルク液を形成するように、少なくともキシロース供給原料、尿素、および高いエタノール生産性およびエタノール寛容性を有する酵母細胞を混合する、（vii）バルク液のｐＨを設定し且つ調整して、約４．０〜約５．５の範囲内のｐＨを維持するようにする、（viii）二層固定化酵素ペレットをバルク液中に分散させる；（ix）ボレート添加剤をバルク溶液に加える；（ｘ）キシロースをペレットの内部コア領域中に拡散させる；（xi）拡散したキシロースを、内部コア中に固定化されたキシロースイソメラーゼとの接触によって、キシルロースへと異性化する；（xii）キシルロースをバルク液中に拡散させる；（xiii）ペレットの外部層中に尿素を拡散させることによって、約７．０〜約８．０の内部コア領域中のｐＨを与え、それによって、尿素は、固定化ウレアーゼによってアンモニアへと加水分解し、そのアンモニアは、バルク液からペレットの内部コア領域中へ拡散する水素または陽電荷のイオンを中和する；（xiv）二層ペレットおよびバルク液を、実質的嫌気性条件下および一定温度で、キシルロースのエタノールへの発酵を可能にする十分に長時間撹拌する；そして（xv）キシルロースをエタノールへと発酵させることを、キシロースのキシルロースへの異性化と実質的に同時発生的に行う工程を含む、または或いは、から成るまたはから本質的に成る方法を提供する。この方法のいくつかの工程は、受動的に行われてよく、積極的工程を必要としないということは理解されるはずである。
【００２２】
[0021]更に、本明細書中に記載の同時異性化・発酵法は、（ｉ）酵素キシロースイソメラーゼおよびウレアーゼが、一緒に共固定化されている多孔質単層粒子；および（ii）内部層および外部層を有する二層粒子であって、ここにおいて、内部層がキシロースイソメラーゼを含有し且つ外部層がウレアーゼを含有するもので作業するということは理解されるはずである。更に、本明細書中の「共固定化」という用語は、双方の態様に言及することができるということは理解されるはずである。更に、粒子およびペレットという用語は、同じ意味に用いることができるということは理解されるはずである。
【００２３】
[0022]別の態様において、キシロースのエタノールへの同時異性化・発酵の方法であって、キシロース、尿素、および高いエタノール生産性およびエタノール寛容性を有する酵母細胞を反応器中で混合して、液体混合物を形成し、その混合物のｐＨを約４．０〜約５．５の範囲内で維持し、少なくとも二つの酵素を有する共固定化酵素粒子を混合物中に分散させ、ボレート源を混合物に加え、キシロースを粒子中に拡散させ、拡散したキシロースを、固定化キシロースイソメラーゼの活性によってキシルロースへと異性化し、そのキシルロースを混合物中に拡散させ、異性化の際の粒子中の液体のｐＨを、粒子中に尿素を拡散させることによって約７．０〜約８．０の範囲内で維持し、それによって、尿素は、固定化ウレアーゼによってアンモニアへと加水分解し、そのアンモニアは、ペレット中に拡散する水素イオンを中和し、その混合物を、キシルロースのエタノールへの発酵を可能にするように、実質的嫌気性条件下で撹拌し、そしてキシルロースをエタノールへと発酵させるという工程を含む方法を提供する。
【００２４】
[0023]第一酵素活性を有する内部コアと、第二酵素活性を有する外部領域を含む二層粒子の使用が、更に考えられる。本発明の態様において、それら二層粒子は、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびウレアーゼを含むと考えられる。
【００２５】
[0024]別の態様において、発酵は、密閉反応器（または発酵装置）中で撹拌しながら行う。
【００２６】
[0025]特定の態様において、粒子は、ポリマーコーティングを有することがありうる。このようなコーティングの一つの非制限例は、ポリアクリルアミドである。
【００２７】
[0026]特定の態様において、ボレート添加剤は、テトラホウ酸ナトリウムを含む、または或いは、から成る。
【００２８】
[0027]特定の態様において、その方法は、次の一つまたはそれを超える工程（ixａ）ボレート添加剤を反応させて、ホウ素を含有する酸を生成する；工程（ｘａ）ホウ素含有酸をペレット中に拡散させ、そしてキシルロースをホウ素含有酸と反応させて、キシルロースおよびボレートイオンの複合体を生成する；および工程（xiiａ）キシルロースおよびボレートイオン化合物をバルク液中に拡散させることを包含する。
【００２９】
[0028]特定の態様において、ホウ素含有酸は、ホウ酸を含む、または或いは、から成る。特定の態様において、ボレートイオンは、テトラヒドロキシボレートイオンを含む、または或いは、から成る。
【００３０】
[0029]更に考えられるのは、キシロース、ボレート源および尿素を含む反応媒質である。
【００３１】
[0030]本発明の別の態様において、本明細書中に記載の方法は、キシロース異性化からの高収率のキシルロース、および天然Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いたエタノールへの高百分率のキシルロースおよびグルコース変換を提供する。
【００３２】
[0031]本発明は、キシロースのキシルロースへの変換を増強し、エタノールの生産速度を増加させ、そしてＣ６およびＣ５双方の糖の発酵に必要な全時間を減少させる発酵方法を提供する。
【００３３】
[0032]また別の態様において、二ｐＨ環境システムを含む共固定化酵素ペレットシステムにおけるキシロースのボレート増強異性化を提供する。特定の態様において、そのシステムは、ホウ砂（テトラホウ酸ナトリウム）を加えることを包含する。特定の態様において、二ｐＨ環境システムは、ホウ砂から形成されるテトラヒドロキシボレートイオンへのキシルロースの選択的複合体形成に起因するキシロース：キシルロース平衡の正移動の誘導を包含する。特定の態様において、そのシステムは、単一容器中の二つの異なったｐＨ微環境を持続可能な実質的同時異性化・発酵（ＳＩＦ）工程を包含し、ここにおいて、第一ｐＨは、キシロース異性化に実質的に最適であり、そして第二ｐＨは、キシルロースの発酵に実質的に最適である。特定の態様において、ＳＩＦ工程は、ウレアーゼとキシロースイソメラーゼとの共固定化を包含する。
【００３４】
[0033]別の広範な側面において、多孔質中空ファイバーメンブラン発酵装置（ＨＦＭＦ）に直列に連通している共固定化酵素ペレットの充填床を必要とする新規な配置を本明細書中で提供する。その充填床配置は、酵母不含であり且つエタノール回収用に容易に濃縮することができる発酵ビールを提供する。更に、エタノールをその発酵ビールから留去した後、緩衝剤およびボレートを含有する残りの水溶液を、上流のプロセス装置（すなわち、加水分解／異性化）へ再循環して、消耗品の有意の費用節約をもたらすことができる。その充填床配置は、更に、異性化触媒ペレットが、充填床に閉じ込められていて且つ酵母と直接的に接触することがないので、それらペレットの容易な回収および再使用の方法を提供する。充填床配置は、キシルロース発酵に必要とされるＨＦＭＦ中の高密度の酵母を考慮し、そして更に、発酵用の酵母の延長使用を可能にする。伝統的発酵装置とは異なり、酵母は、各々の発酵バッチ後に廃棄しない。その充填床配置のモジュール性は、有意の資本経費を伴わないＳＩＦプロセスの容易な拡大を考慮している。
【００３５】
[0034]本発明のいろいろな目的および利点は、添付の図面に照らして読んだ時に、一つまたは複数の好ましい態様および実施例についての次の詳細な説明から当業者に更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】[0035]図１：ウレアーゼをペレット中に共固定化し且つ尿素を発酵ブロスに加えた時に生じる定常状態ｐＨプロフィールを示している固定化ＸＩ、例えば、SweetzymeＴＭペレットの横断面図。発酵ブロス中のｐＨは、ｐＨ０であり、それは、典型的に、４〜５の範囲内である。ペレットの Zone１（外部層）は、固定化ウレアーゼを含有し、そして尿素の消費によってアンモニアが生成されるにつれてｐＨが半径方向位置で変化するペレットの領域である。Zone２（コア）は、ｐＨ２で高ｐＨであるペレットの領域である。ゾーン１と２との間の境界は、全ての尿素が消費される地点かまたは、ペレット中へのウレアーゼの浸透深さである。
【図２】[0036]図２：二ｐＨ微環境が、共固定化酵素システムにおいて尿素加水分解によって生じることを示しているグラフ。中実記号を、未改変 SweetzymeＴＭに用い；空白記号を、ＸＩ／ウレアーゼ共固定化酵素ペレットに用いる。示されている３回の実験は、（Ａ）ｐＨ７．５；（Ｂ）０．０１Ｍ尿素でｐＨ４．５；および（Ｃ）尿素不含でｐＨ４．５であり；各々、０．１３ｇのペレットを用いている。未改変 SweetzymeＴＭは、ｐＨ４．５でキシルロース無生産であった（データは示されていない）。Ｂについて示されたキシルロース生産は、ＸＩが、尿素を加えた時に活性を有するということを示している。初期キシロース濃度は、６０ｇ／ｌである。
【図３】[0037]図３：未改変および共固定化双方の酵素ペレットについて、ボレートが、キシロース／キシルロース平衡を好ましく移動させることを示しているグラフ。中実記号を、未改変 SweetzymeＴＭに用い；空白記号を、ＸＩ／ウレアーゼ共固定化酵素ペレットに用いる。示されている３回の実験は、（Ａ）ｐＨ７．５；（Ｂ）０．０１Ｍ尿素でｐＨ４．５；および（Ｃ）尿素不含でｐＨ７．５である。３回の実験は全て、キシルロース生産に対する平衡の有意の移動を示す。曲線Ｂで表される状態のみが、同時異性化・発酵に貢献している。初期キシロース濃度は、６０ｇ／ｌである。
【図４】[0038]図４：共固定化酵素システムにおけるキシルロース−ボレート複合体形成の役割を示している略図。テトラホウ酸ナトリウム（ホウ砂）を溶液に加えた時、それは解離して、テトラヒドロキシボレート（ボレート、Ｂ）イオンおよびホウ酸になる。ペレット内部において、より高いｐＨは、より緊密なキシルロース−ボレート結合（Ｘｕ−Ｂ複合体形成）に好都合であり、それが、内部のキシルロース濃度を有効に減少させ、そして異性化を前進させる。バルクの場合、より低いｐＨは、Ｘｕ−Ｂ複合体への脱共役作用を有して、解離したキシルロースを、酵母にとって容易に利用可能にする。発酵によるキシルロースの除去は、更に、キシルロース−ボレート複合体の解離を推進する。破線は、種の輸送を示し；実線は反応を示す。
【図５】[0039]図５：共固定化酵素ペレットについての異性化速度論およびキシロース／キシルロース生産へのＸＩ／ウレアーゼ活性の作用を示しているグラフ。ペレットは全て、同じ共固定化バッチからであったが、ｐＨ７．５において１ｇペレットにつき同じウレアーゼおよびＸＩ活性を有する。全ての実験に用いられる初期尿素濃度は、０．０１Ｍであった。増加した酵素装填量でのキシルロース収率の改良は、共固定化酵素ペレットシステムにおけるテトラヒドロキシボレートイオンの二重の役割に起因することがありうる。初期キシロース濃度は、６０ｇ／ｌである。
【図６】[0040]図６：共固定化酵素ペレットについての異性化速度論およびキシルロース生産への初期尿素濃度の作用を示しているグラフ。実験は双方とも、同じ共固定化バッチからの０．１３ｇのペレットを用い、そしてｐＨ７．５において１ｇペレットにつき同じウレアーゼおよびＸＩ活性を有する。曲線Ａで認められる異性化およびキシルロース生産の速度の減少は、尿素の消費のためである。曲線Ｂの場合、尿素濃度は、キシルロース異性化速度が、全４８時間にわたって尿素消費に影響されているとは考えられないほど十分に高い。初期キシロース濃度は、６０ｇ／ｌである。
【図７】[0041]図７：共固定化酵素ペレットについてのキシルロース生産への初期尿素濃度およびペレット質量の作用を示しているグラフ。バーはキシロースであるが；線影付きバーは、キシルロースである。ペレットは全て（Ａ〜Ｅ）、同じ共固定化バッチからであったが、１ｇペレットにつき同じウレアーゼおよびＸＩ活性を有する；初期ｐＨは４．５であった。未改変 SweetzymeＴＭの結果を、Ｆに与える。実験は全て、２５ｍｌのブロス中に０．０５Ｍボレートを含有した。全キシルロースの百分率を、各々の実験についてバーの上に与える。用いられるペレットの見かけ平衡の時間および質量を、ｘ軸上に示す。
【図８】[0042]図８：金属イオンの添加は、キシルロースに対する異性化に僅かな移動を引き起こすが、その作用は、テトラホウ酸ナトリウムの添加に関連した移動ほど有意ではないということを示しているグラフ。加えた場合、テトラホウ酸ナトリウムは０．０５Ｍであったし、金属イオンは、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣｏＣｌ２であった。示されているデータは全て、ｐＨ７．５における未改変 SweetzymeＴＭについてである。示されている４回の実験は、添加剤が異なり、（Ａ）添加剤なし；（Ｂ）金属イオン；（Ｃ）ボレート；および（Ｄ）ボレートおよび金属イオンである。
【図９】[0043]図９：同時異性化・発酵「ＳＩＦ」プロセスの充填床および発酵装置モジュール配置を示すフローチャート。中空ファイバーメンブラン発酵装置（ＨＦＭＦ）は、微孔質ファイバーおよび酵母細胞のブローアップ（blow-up）を示す。糖は、ファイバー内腔を介して流れ、そして酵母は、ファイバーの周囲空間で成長する。糖は、ファイバー壁の細孔を介して酵母へと拡散し、そこで、糖はエタノールへと発酵する。エタノールは、細孔を介してファイバー内腔中へ拡散し戻り、そして最後に装置から流出する。酵母細胞は、シェル空間に閉じ込められているので、示されているように、装置体積につき極めて高密度で装填することができる。
【図１０】[0044]図１０：充填床および振とうフラスコ中の共固定化酵素ペレットの異性化速度論。ペレットは全て、同じ共固定化バッチからであったが、ｐＨ７．５において１ｇペレットにつき同じウレアーゼおよびＸＩ活性を有する。全ての実験に用いられる初期尿素濃度は、０．０５Ｍであった。異性化速度論は、充填床実験について、撹拌されている振とうフラスコ中の対照実験と比較して有意に速い。
【図１１】[0045]図１１：ＨＦＭＦでのグルコース発酵の結果。初期グルコース濃度は、６０ｇ／ｌである。２５ｇの酵母細胞を、ＨＦＭＦの細管外空間に充填した。発酵は、異なった媒質流速を用いて２４時間行った。エタノール生産速度は、３０〜５０ｍｌ／分の流速でピークに達し、ほぼ１００％のエタノール収率であった。理論エタノール収率は、０．５１ｇエタノール／ｇグルコースである。
【図１２】[0046]図１２：発酵装置中に沈められる回転バスケット触媒ペレット閉じ込め。
【図１３】[0047]図１３：共固定化酵素技術を用いたプロセス配置の例。プロセスＡ−共固定化酵素ペレットを、セルラーゼと一緒に、ボレートおよび尿素の存在下においてｐＨ４．８および５０℃で用いることは、同時糖化・キシロース異性化（ＳＳＩ）を可能にすることができる。得られたグルコースおよびキシルロース糖配合物は、天然酵母によって発酵させることができる。プロセスＢ−共固定化酵素ペレットおよび天然酵母を、ボレートおよび尿素の存在下においてｐＨ４．５および３５℃でバイオマス加水分解産物に加えることは、全てのバイオマス糖類からほぼ理論エタノール収率での同時異性化・発酵（ＳＩＦ）を可能にする。プロセスＣ−天然酵母を用いたＣ６およびＣ５糖類の同時糖化・発酵（ＳＳＩＦ）は、ボレート、尿素、セルラーゼおよび天然酵母を含有するｐＨ４．８および３５℃で維持されている媒質中において共固定化酵素ペレットで行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
[0048]定義
[0049]本発明は、それ自体異なっていてよい記載されている特定の方法論、プロトコル、細胞系、属および試薬に制限されないということは理解されるはずである。更に、本明細書中で用いられる専門用語は、単に特定の態様を記載する目的のためであり、本発明の範囲を制限するためのものではないということは理解されるはずである。
【００３８】
[0050]本明細書中で用いられる「ある（a）」および「その（the）」という単数形は、その文脈が特に明記していない限り、複数の意味を包含する。本明細書中で用いられる専門用語および科学用語は全て、特に明記していない限り、本発明が属する技術分野の業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３９】
[0051]リグノセルロースから回収される糖類の内、Ｄ−グルコースは、パン酵母または醸造酵母（Saccharomyces cerevisiae）によってエタノールへと容易に変換することができる。しかしながら、ヘミセルロース性部分の加水分解によって得られるキシロースは、同種の酵母によって発酵可能ではない。天然酵母によるキシロース発酵は、キシロースのそのケトン異性体であるキシルロースへの異性化を経て達成することができる。外因性キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）での異性化は、最適には、７〜８のｐＨで起こるが、引き続きのキシルロースのエタノールへの発酵は、４〜５のｐＨで起こる。
【００４０】
[0052]異性化および発酵を達成するのに有用な方法は、前の「課題を解決するための手段」に挙げられている方法およびプロセスを含めて、本出願中に記載されている。
【００４１】
[0053]第一の広範な側面において、キシロースのキシルロースへの有効な異性化の方法であって、単一容器中において二つの異なったｐＨ微環境を持続可能な固定化酵素システムであって、発酵に適する条件も与えるシステムを用いることによる方法を提供する。
【００４２】
[0054]本明細書中に記載の方法の二酵素ペレット試験は、固定化酵素ペレットを、ＸＩ活性についてｐＨが最適下限であるバルク溶液中に懸濁させた時でさえも、キシロースのキシルロースへの変換を示す。共固定化酵素ペレットは、キシロースの「同時異性化・発酵」（ＳＩＦ）を有効に行う場合に有用でありうる。
【００４３】
[0055]具体的な態様において、キシルロース形成を支持して平衡を更に移動させるために、テトラホウ酸ナトリウム（ホウ砂）を、異性化溶液に加えた。テトラヒドロキシボレートイオンのキシルロースへの結合は、キシルロースの濃度を有効に減少させ、そして増加したキシロース異性化をもたらす。
【００４４】
[0056]別の具体的な態様において、このような共固定化酵素ペレットを含有する異性化溶液への０．０５Ｍホウ砂の添加は、ＸＩ活性について最適下限であるｐＨ条件下において８６％程度に高いキシロース〜キシルロース変換を生じた。それ自体で、本明細書中に記載の方法は、工業用条件に適応可能であり、そしてＳＩＦアプローチにおいてキシロースからのエタノール収率の有意の増加を与える。
【００４５】
[0057]異性化および発酵に最適なｐＨの不同を克服するために、ここで、キシロースイソメラーゼと共固定化されたウレアーゼを包含する新規な異性化方法を記載する。この方法は、異性化のための多孔質ペレット中に固定化されたＸＩと、ｐＨ制御のための固定化ウレアーゼ酵素を含む共固定化酵素ペレットを用いる（図１）。
【００４６】
[0058]共固定化酵素ペレットが、発酵に必要な他の成分に加えて尿素を含有する発酵ブロス中に分散した場合、水素イオンがペレット中に拡散するにつれて、それらは、ウレアーゼによる尿素の加水分解で生成するアンモニアによって中和されるので、バルク液とペレットのコア領域との間の有意のｐＨ勾配を持続することは可能である。ＸＩは、ペレットの内部コア中により高いｐＨで維持された後、キシロースのキシルロースへの異性化を触媒する；キシルロースは、ペレットから拡散後、バルク溶液中の発酵に利用可能である。
【００４７】
[0059]好ましくは、発酵ブロス中に用いられる尿素の濃度は、約０．０１Ｍ尿素〜約０．１Ｍ尿素である。本発明の特に好ましい態様において、尿素濃度は、約０．１Ｍ尿素である。
【００４８】
[0060]共固定化酵素方法は、ＳＩＦにおける異性化工程と発酵工程との間の必要なｐＨ差を持続することができるが、ＳＩＦにおけるエタノール全生産速度は、酵母に利用可能なキシルロースの全濃度によって制限されることがありうる。普通の平衡条件下において、キシルロース濃度は、通常は、キシロース濃度のせいぜい５分の１である。したがって、エタノール生産速度を更に増加させる一層高率のキシルロース形成に対して平衡を移動させる方法への要求が存在する。
【００４９】
[0061]その方法は、更に、発酵ブロス中のボレート添加剤の使用を包含し、それは、増加したキシルロース形成に対するキシロース：キシルロース平衡の移動を与える。本発明の一つの態様において、ボレート添加剤は、テトラホウ酸ナトリウムである。本発明の非制限仮説において、ボレートイオンは、ＸＩで触媒される異性化においてキシロースとキシルロースとの間の平衡を約２０：８０〜約７０：３０へ移動させることができると考えられる。ボレートイオンは、キシロースよりもキシルロースへ緊密に結合して、生成物濃度を有効に減少させ、したがって、増加したキシルロース形成に対して平衡を移動させると考えられる。キシルロースに結合するボレートの能力は、ｐＨ依存性であり、より高いｐＨ（６．５〜７）が、より緊密な結合を支持する。したがって、ｐＨが増加するにつれて、遊離キシルロースの濃度は減少する。したがって、ボレートの存在下におけるキシルロースの発酵速度も、ｐＨ依存性であり、より低いｐＨが、より高いキシルロース濃度をもたらし、したがって、より高いエタノール生産速度および収率をもたらす。
【００５０】
[0062]異性化および発酵のための異なった微環境を与える特定の共固定化酵素方法において、それら微環境は、発酵ブロスへのボレートの添加によって利益を得ることができる。共固定化酵素ペレット内部では、ｐＨは上昇し、ＸＩは活性であり、そして異性化平衡は、キシルロースへの強いボレート結合によって支持される。対照的に、低ｐＨ発酵ブロス中では、ボレートは、キシルロースへの減少した結合親和性を有し、したがって、エタノールへの発酵についてより高い遊離キシルロース濃度を生じる。
【００５１】
[0063]本明細書中に記載の共固定化酵素方法は、一般的なＳ．cerevisiae による発酵に最適な条件と共に、異性化に特に有効である。本発明で有用である、キシルロースおよびグルコースからのエタノールの追加の生産者には、ブレッタノミセス（Brettanomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、トルラスポラ（Torulaspora）、サッカロミセス（Saccharomyces）、パキソレン（Pachysolen）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）およびハンセヌラ（Hansenula）の種が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００５２】
[0064]慣用的な発酵技術は、当該技術分野において周知であり、バルク液中のキシルロースおよびグルコース糖類をエタノールへと発酵させるのに用いることができる。発酵プロセスにおいて典型的であるように、極めて嫌気性の条件および約３０℃〜約４０℃に維持される温度は、本明細書中に挙げられている方法およびプロセスを実施するのに有用であるが、微好気性条件も有用でありうるということは理解されるはずである。
【００５３】
[0065]グルコースおよびキシロース糖類は、リグノセルロースの加水分解について慣用的な技法によってリグノセルロースバイオマスから誘導することができる。セルロースは、グルコース供給原料を与えるが、その結晶性構造およびバイオマス中のリグニンとの接近した会合ゆえに、加水分解しにくい。対照的に、ヘミセルロースの非晶質構造は、弱酸によってそれを容易に加水分解させて、その成分である糖類、すなわち、キシロース、更には、アラビノースおよびグルコースにする。
【００５４】
[0066]具体的な態様において、媒質組成は、キシルロース生産を支持して平衡を移動させるし、しかもＸＩ活性を改良する。更に、特定の態様において、ボレートおよび／または他の金属イオンは、異性化反応の速度論および／または平衡をモジュレーションするのに有用である。したがって、特定の態様において、二価金属イオンは、ＸＩの長期活性を増加させるのに有用である。本発明の好ましい態様において、二価金属イオンは、マグネシウム（Ｍｇ２＋）およびコバルト（Ｃｏ２＋）より選択される。
【００５５】
[0067]これら利点を、ここで、次の非制限例によって詳しく説明する。本発明を、次の実施例で更に定義するが、ここにおいて、特に断らない限り、部および百分率は全て重量によるし、度は摂氏である。これら実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、単に例示として与えられているということは理解されるはずである。上の考察およびこれら実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができるし、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、本発明のいろいろな変更および修飾を行って、いろいろな使用法および条件にそれを適合させることができる。本明細書中に言及されている特許文献および非特許文献を含めた全ての公報は、特に援用される。次の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳しく説明するためのものであり、そのように明記されない限り、請求の範囲に定義の本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５６】
[0068]実施例
[0069]材料および方法：
[0070]化学薬品：Novo SweetzymeＴＭ（Sigma Aldrich Ｇ４１６６，グルコースのフルクトースへの異性化に基づく活性で≧３５０Ｕ／ｇ）であって、ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）より生産される固定化グルコースイソメラーゼであるもの、および Genencor GenSweetＴＭＩＧＩ（グルコースのフルクトースへの異性化に基づく活性で２２０Ｕ／ｇ）であって、ストレプトミセス・ルビギノーサス（Streptomyces rubiginosus）より生産される固定化グルコースイソメラーゼであるものを、キシロースの異性化に用いた。その固定化グルコースイソメラーゼは、ｐＨ７．５〜７．８および５４〜６０℃でグルコース／フルクトース異性化に最適活性を有する（製造者による）。SweetzymeＴＭまたは GenSweetＴＭペレットは、約１〜３ｍｍの直径を有する乾燥褐色円筒形顆粒である。タチナタマメ（jack bean）ウレアーゼ（Sigma Ｕ４００２，７０，４００Ｕ／ｇ）を、異性化研究に用いられる共固定化酵素ペレットを生じるのに用いた。ウレアーゼは、ｐＨ７．０および２５℃で最適活性を有する（製造者による）。双方の酵素を、４℃で貯蔵した。キシロース、尿素、ホウ砂、塩化マグネシウム、塩化コバルト、クエン酸ナトリウムおよび Tris を含めた追加の化学薬品は全て、Sigma Aldrich（St. Louis, MO）より購入した。
【００５７】
[0071]SweetzymeＴＭおよび GenSweetＴＭペレットへのウレアーゼの固定化：ペレットへのウレアーゼの固定化のために、５００ｍｌの１ｇ／ｌまたは２ｇ／ｌウレアーゼ溶液および２ｇの Sweetzyme ペレットを、１リットルビーカーに加えた。そのビーカーを、卓上に室温で２４〜４８時間放置して、共固定化酵素ペレットを形成させた。
【００５８】
[0072]それら共固定化酵素ペレットを、傾瀉および重力濾過によって溶液から分離し、そしてペーパータオル上において室温で２４時間または乾燥するまで乾燥させた。共固定化酵素ペレットは、使用するまで４℃で貯蔵した。固定化ウレアーゼの活性は、アンモニア遊離速度を測定する標準的な検定手順を用いてｐＨ７．５および２５℃で測定した。この固定化手順で得られたウレアーゼ活性は、５５０〜５７７Ｕ／ｇペレットの範囲内であったが、この場合、１ Unit は、検定条件下において１分につき１μｍｏｌのアンモニアを遊離する。
【００５９】
[0073]キシロース異性化速度論および平衡の測定：実験は全て、インキュベーションシェーカー中において１３０ｒｐｍで撹拌されている５０ｍｌ振とうフラスコ中の２５ｍｌ容量中において３４℃で行った。実験は全て、６０ｇ／ｌのキシロースを用い、そして特に断らない限り、５．２ｇ／ｌの酵素ペレット（０．１３ｇ）を、各々の実験に用いた。異性化媒質を作る場合に用いた緩衝溶液は、０．０１Ｍ Tris 緩衝液（０．０１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５）および０．０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（クエン酸を用いてｐＨ４．５）であった。共固定化酵素ペレットでの実験において、尿素濃度は、０．０．０１または０．１Ｍであった。
【００６０】
[0074]分析技術およびデータ分析：キシロースおよびキシルロース濃度について実験を分析するために、２００μｌの試料を、各々の時点に集めた。その試料を、脱イオン水で１：３に希釈後、０．２μｍフィルターを介して濾過した。ｐＨ４．５クエン酸緩衝液中に０．２５〜８０ｇ／ｌの濃度を有するキシロースおよびキシルロース検量基準を、同様に調製した。基準および試料は全て、ＨＰＬＣにより、１００μｌ注入ループで３０μｌ注入容量を用いて分析した。用いられたＨＰＬＣ装置は、ＳＩＬ−１０Ａｉオートサンプラーおよび屈折率検出器（ＲＩＤ  １０Ａ）を装備した Shimadzu Series １０Ａ  ＨＰＬＣ装置であった。Bio-Rad Aminex ＨＰＸ−８７Ｐ（３００ｘ７．８ｍｍ）イオン交換カラムを、糖分析用に用い、脱イオン水の移動相を０．６ｍｌ／分の流速および８０℃の温度で用いた。このカラムは、キシロースおよびキシルロースを分離することに成功した。キシルロース−ボレート複合体が解離し且つ別々に溶離したかどうか確かめるために、ボレートの溶液およびキシルロースを含むボレートの溶液を注入し、そしてボレートピークの面積を測定した。ボレートピークの高さは、キシルロース濃度とは無関係であったので、本発明者は、現在、キシルロース−ボレート複合体が解離してキシルロースおよびボレートになり、そしてキシルロースピークは、混合物中の全キシルロース示したと考えている。最後に、各々の時点でのキシロースおよびキシルロース濃度のデータを要約し、そして６０ｇ／ｌの全濃度に規格化して、変動をなくし且つ質量バランスを接近させた。実験は全て、二重反復で行ったし、そしてデータは、極めて再現性があった；示されているデータは、一つの実験を代表するものである。
【００６１】
[0075]結果および考察：
[0076]共固定化酵素ペレットシステムは、単一容器内で二つの異なったｐＨ微環境、すなわち、ＸＩ活性に最適なものと、発酵を行うのに適するもう一つを達成することができる。更に、テトラホウ酸ナトリウム十水和物（ホウ砂）は、速度論を変化させ且つキシロース／キシルロース平衡を移動させることができる。
【００６２】
[0077]単一容器中の二ｐＨ環境の持続可能性
[0078]未改変ペレット：初期対照実験として、キシロースのキシルロースへの異性化を、SweetzymeＴＭペレットを受け取った状態で（すなわち、ウレアーゼとの共固定化不含で）用いて研究した。キシロース消費およびキシルロース形成の時間経過を、６０ｇ／ｌの初期キシロース濃度について２５ｍｌ溶液中、３４℃において０．１３ｇのペレットで監視した。異性化混合物は、ＸＩ活性の最適ｐＨであるｐＨ７．５で緩衝化した。
【００６３】
[0079]図２の曲線Ａで認められるように、キシルロースの濃度は、一定に増加し、そして約９ｇ／ｌの平衡値に達して、これら条件下においてほぼ６：１の平衡キシロース：キシルロース比率が示唆された。同じ実験を４．５の低ｐＨで繰り返した場合、４０時間後でさえも、反応混合物中にキシルロースは検出されなかった（データは示されていない）。４．５のｐＨにおいて、ＸＩは、その最適未満の３ｐＨ単位であり、本質的に活性を示さない。
【００６４】
[0080]ＸＩ／ウレアーゼ共固定化酵素ペレット：共固定化酵素ペレットを、SweetzymeＴＭペレット上にウレアーゼを吸着させることによって成形した。
【００６５】
[0081]それら共固定化酵素ペレット（０．１３ｇ）を、６０ｇ／ｌキシロースを含有するｐＨ４．５に緩衝化された２５ｍｌの反応媒質に加えた。未改変ペレットの場合のように、これら条件下では、４８時間でさえも、キシルロース形成は認められなかった（図２の曲線Ｃを参照されたい）。次に、０．０１Ｍ尿素を、４．５のｐＨに緩衝化されたバルク溶液に加えた。キシルロースの形成は、尿素の存在下で認められ、そして反応媒質中のキシルロースの濃度は、徐々に増加して、４８時間までに約５ｇ／ｌの値に達した（図２の曲線Ｂを参照されたい）。
【００６６】
[0082]ペレット中の固定化ウレアーゼによって触媒される尿素加水分解によるアンモニアの生産は、図１に示されるように、ペレットのコア中の内部ｐＨを上昇させる。特定の態様において、内部ｐＨは、ペレット内のＸＩが触媒活性であるために、４．５のバルクｐＨより十分に高くあるべきである。したがって、バルク溶液中のキシロースが、ペレット中に拡散し、そしてＸＩが活性である一層高いｐＨ領域に達した時、キシロースは異性化してキシルロースを形成する。同時に、共固定化酵素ペレットの外部層（図１、Zone１）におけるアンモニアの連続生産も、バルク溶液からペレットのコア中に拡散するいずれの水素イオンも中和する傾向があり、それによって、ペレットの内部と外部溶液との間のｐＨ差を持続する。
【００６７】
[0083]図２に示される曲線Ｂの異性化速度は、未改変ペレットにおいてｐＨ７．５で得られる速度より低いので、それは、内部ｐＨが、７．５で維持されないが、７．５より高いかまたは低い最適下限ｐＨで維持されることを示している。内部ｐＨが最適下限である場合、ＸＩ活性は、ｐＨ７．５での未改変ペレットの場合よりも低いであろうし、そして平衡に達するのに必要な時間は、より長いであろう。ＸＩ活性が、共固定化酵素ペレットにおいて減少する場合、異性化に必要な時間は、最終的に、バルク溶液から尿素を消耗させるかもしれないが、その時点で、ＸＩ活性は失われるであろうし、そして異性化反応は止むであろう。
【００６８】
[0084]内部ペレットｐＨは、ペレット中のウレアーゼ装填量並びに尿素濃度プロフィールの関数である。尿素のウレアーゼ加水分解についてのミカエリス定数（Ｋｍ）は、２．９ｍＭであるので、０．０１Ｍ（１０ｍＭ）尿素で、尿素は、最初、ペレットの表面においてＶｍａｘの約７８％で消費されている。尿素のバルク濃度を増加させることは、増加したアンモニア生産および内部ペレットｐＨの増加を引き起こす。内部ｐＨが、最適ＸＩ活性のためのｐＨより高いかまたは低いかに依存して、内部ｐＨの増加は、キシロース異性化速度を減少させるまたは増加させるであろう。
【００６９】
[0085]共固定化酵素ペレットシステムで所望の異性化を達成するために、バルク溶液中の尿素濃度は、特定のウレアーゼ装填量に最適化することができるし、そして異性化の間中、最大で一定のＸＩ活性を可能にする一定濃度で維持することができる。
【００７０】
[0086]共固定化酵素ペレット中の有意のＸＩ活性は、４．５のバルクｐＨにおいて０．０１Ｍ尿素で示された。エタノールの全生産速度は、酵母に利用可能なキシルロースの全濃度によって制限されるので、特定の態様において、異性化およびキシロース：キシルロース比を好都合に増強するように条件を修飾することが望まれる。特定の態様において、反応媒質へのボレートの添加は、異性化速度論を増強するのに且つ平衡を好都合に移動させるのに用いられる。
【００７１】
[0087]キシロース異性化へのテトラホウ酸ナトリウム添加の作用
[0088]糖−ボレート複合体形成の機構：ボレートは、アルドースおよびケトース糖類へのテトラヒドロキシボレートイオンの結合ゆえに、平衡異性化の移動をもたらす。中性ｐＨ付近では、テトラヒドロキシボレートイオンを、ホウ砂（Ｎａ２Ｂ４Ｏ５（ＯＨ）４・８Ｈ２Ｏ）の加水分解によって形成させることができる。
【００７２】
[0089]Ｂ４Ｏ５（ＯＨ）４２−＋５Ｈ２Ｏ ⇔ ３Ｂ（ＯＨ）３＋Ｂ（ＯＨ）４−＋ＯＨ−  （１）
[0090]上の反応で生成するホウ酸は、弱酸（約９ｐＫａ）であり、それは、中性ｐＨでの水との反応によって僅かにイオン化して、追加のテトラヒドロキシボレートイオンを形成する。
【００７３】
[0091]Ｂ（ＯＨ）３＋Ｈ２Ｏ ⇔ Ｂ（ＯＨ）４−＋Ｈ＋  （２）
[0092]上の反応で生成するテトラヒドロキシボレートイオンは、糖分子上の隣接したヒドロキシルと複合体形成することができる。方程式３ａおよび３ｂで示されるように、各々のテトラヒドロキシボレートイオンは、糖の２個までの分子を二段法で結合することができる。
【００７４】
【化１】
2011508606.tif 000002
【００７５】
[0093]ボレートは、上の機構によって、キシロースの環状ヘミアセタール形と比較したところ、キシルロースの開鎖構造と一層容易に複合体形成することができる。この結合選択は、キシルロース形成を支持したキシロース：キシルロース異性化平衡の移動をもたらす。
【００７６】
[0094]未改変ペレット：最初に、ｐＨ７．５の緩衝液中の未改変ＸＩペレットについての異性化の速度論および平衡へのテトラホウ酸ナトリウムの作用を研究した。これらデータは、図３の曲線Ａに示されている。ボレートの不存在下で得られた該当するデータ（図２の曲線Ａ）と比較した場合、この低濃度（０．０５Ｍ）でさえも、ボレートは、より高いキシルロース生産を支持して有意に平衡を移動させることができる。キシルロースの平衡濃度は、約３０ｇ／ｌに達し、それは、ボレート不含で認められる場合（約９ｇ／ｌ）の３倍より大である。ボレート添加は、増加したキシロース変換および約６：１〜１：１の平衡キシロース：キシルロース比率の移動をもたらす。
【００７７】
[0095]ウレアーゼ共固定化酵素ペレット：ペレットへのウレアーゼ固定化の作用は、図３の曲線ＡおよびＣに示されるように、ｐＨ７．５で達成される全速度論および平衡には無視できる影響力しかない。（双方とも尿素不含で実験）。固定化ウレアーゼは、低分子物質移動抵抗を加えることができるが、それは、キシロース濃度が減少するにつれて認められる速度論の減速を説明しうると考えられる。次に、尿素（０．０１Ｍ）をクエン酸緩衝溶液に加えることで、共固定化酵素ペレットでの有意のキシルロース形成が存在し、キシルロースは４８時間までに約１７ｇ／ｌの濃度に達する。この値は、ボレート添加を伴うことなく達した約５ｇ／ｌであった該当するレベルよりもはるかに高い（図２の曲線Ｂおよび図３の曲線Ｂを参照されたい）。
【００７８】
[0096]等式１および２で与えられた反応に再度論及すると、テトラヒドロキシボレートイオンの形成は、媒質のｐＨに影響される。結果として、キシロース：キシルロース異性化平衡を移動させるホウ砂の能力も、ｐＨの関数である。低ｐＨ（４〜５）では、テトラヒドロキシボレートイオンは（第二反応が起こらないので）極めて僅かしか形成されず、したがって、ホウ砂が、異性化平衡に何らかの影響を有するとはあまり考えられない。もう一方で、より高いｐＨ範囲（６〜８）では、テトラヒドロキシボレートイオン濃度は、かなりのレベルに達し、そしてこれらイオンは、キシルロースに強く結合して（等式３）、異性化平衡を移動させる。
【００７９】
[0097]図４に示されるように、二ｐＨ環境共固定化酵素ペレットシステムにおいて、ペレットのコア領域（ｐＨは高く且つＸＩは活性である）は、テトラヒドロキシボレートイオンへのキシルロースの強い結合に貢献する条件、およびキシルロース−ボレート複合体（Ｘｕ−Ｂ）の形成を与える。しかしながら、ｐＨが低いバルク溶液中では、ボレート−糖複合体形成は極めて僅かしか起こらない。ＳＩＦの場合のこの二ｐＨ環境の可能性のある最終結果は、ホウ酸が、ペレット中に拡散し、テトラヒドロキシボレートイオンに変換し（等式２）、キシルロースに結合し、そしてキシルロースをペレット内部からバルク溶液外へ渡すということである。低ｐＨバルク溶液中において、Ｘｕ−Ｂは、キシルロースを放出し、そしてボレートイオンは、水素イオンと再結合して、ホウ酸を形成する。したがって、テトラヒドロキシボレートは、異性化平衡を移動させることに加えて、ペレットのコアからバルク中へのキシルロースの除去を容易にし、そこで、キシルロースは、酵母によってエタノールへと容易に代謝されることができる。０．０５Ｍボレートの存在下で異性化されるキシロース供給溶液は、酵母での発酵研究に用いられてきたが、ボレートによる酵母の阻害が認められたものはなかった［４５］。
【００８０】
[0098]異性化への共固定化酵素ペレット質量の作用
[0099]ウレアーゼと共固定化された SweetzymeＴＭペレットの能力は、多数の因子に依存する。これら因子には、バルク溶液中の尿素濃度およびｐＨ、およびペレットの外部層（Zone１）に固定化されたウレアーゼの活性が含まれる。これら因子は、アンモニアの生産および拡散している水素イオンの中和、そしてしたがって、活性ＸＩゾーン（Zone２）のサイズに影響する。
【００８１】
[00100]図５には、一時的なキシルロース生産を、全共固定化酵素ペレット質量の関数として示す。用いられたペレットは全て、同じ共固定化バッチからであったが、同じウレアーゼおよびＸＩ装填量を有する。実験は、３４℃およびｐＨ４．５において０．０１Ｍ尿素、０．０５Ｍテトラホウ酸ナトリウムおよび６０ｇ／ｌの初期キシロース濃度で行った。図５の曲線ＢおよびＣに示されている実験は、曲線Ａ（５．２ｇ／ｌ）と比較して、各々の酵素の３．３倍（１８ｇ／ｌ）および６．６倍（３６ｇ／ｌ）以上を有する。全ての実験の０時において、内部ｐＨは、アンモニアが生成するにつれて、ＸＩ活性の最適に一層近い値へと急速増加する。実験ＢおよびＣにおいて、ウレアーゼおよびＸＩの増加した質量は、Ａの場合よりも急速なバルク尿素およびキシロース濃度の減少を引き起こすであろう。バルク尿素濃度が減少するにつれて、ペレット当たりのアンモニア生産は減少し、そして内部ｐＨも低下し始める。このｐＨ降下は、全ウレアーゼ質量（活性）がより高い場合により早く起こり、付随するＸＩ比活性損失をもたらす。
【００８２】
[00101]図５に示されたデータにより、平均ＸＩ比活性を、異性化の最初の１時間計算した；これら結果を、表１に要約するが、これは、異性化速度論およびキシルロース生産への共固定化酵素ペレット質量の作用を示している。全ＸＩは、ペレット質量に比例するが、最初の１時間にわたって測定されたＸＩ活性は、ペレット中の内部ｐＨプロフィールに依存する。ペレット質量が増加するにつれて、バルク尿素濃度は一層急速減少し、そして変化している内部ｐＨプロフィールは、ＸＩ比活性の明らかな減少を引き起こす。尿素消費およびＸＩ活性損失は、最高ペレット質量について最も急速に起こるが、ＸＩが活性である間に生成した全キシルロースは、最大である。
【００８３】
【表１】
2011508606.tif 000003
【００８４】
[00102]平均ＸＩ比活性（ｐＨ４．５で１ｇのペレット当たりのキシルロース生産に基づく）は、ペレット質量増加で減少する。しかしながら、対応する全ＸＩ活性は一層高く、４８時間までにはるかに急速なキシルロース生産およびはるかに高いキシルロース収率をもたらす。
【００８５】
[0100]最高ペレット質量についての４８時間でのキシルロース濃度（約４４ｇ／ｌ）は、ｐＨ７．５において同じボレート濃度を有する未改変ペレットで達した値（約３０ｇ／ｌ）よりも実質的に高い（図３の曲線Ａ）。未改変 SweetzymeＴＭペレットについて、異性化の速度論は、ＸＩ活性に依存するが、平衡は、熱力学によって単独で支配され、しかもＸＩ活性およびペレット質量によって影響されていない。
【００８６】
[0101]共固定化酵素ペレットシステムには、ｐＨ７．５において未改変ペレットで可能なものよりも高いキシルロース変換が存在する。図３および図４に示されるように、共固定化酵素ペレットシステムでは、テトラヒドロキシボレートは、キシルロースに結合することによって平衡を移動させるように働き、そして更に、複合体形成したキシルロースをペレット内部からバルク溶液へと往復輸送する。理論によって拘束されたくはないが、本発明者は、ここにおいて、テトラヒドロキシボレートのこの二重の役割が、共固定化酵素ペレットシステムにおいてｐＨ勾配が確定した時に認められるキシロース変換の有意の改良に関与していると考える。
【００８７】
[0102]尿素の作用：
[0103]バルク媒質中の尿素濃度は、生成されるアンモニアの速度および量に影響するであろうし、したがって、共固定化酵素ペレット内のｐＨ勾配の維持に影響するであろう。尿素濃度は、更に、活性ＸＩコアの体積を決定するであろうし、そしてこれは、順次、異性化の速度論および異性化の程度に影響するであろう。図６に、一時的なキシルロース生産を、尿素濃度の関数として示す。用いられたペレットは全て、同じ共固定化バッチからであったが、同じウレアーゼおよびＸＩ装填量を有する。実験は、３４℃およびｐＨ４．５において０．０１Ｍ尿素（図６、曲線Ａ）かまたは０．１Ｍ尿素（図６、曲線Ｂ）、０．０５Ｍテトラホウ酸ナトリウムおよび６０ｇ／ｌの初期キシロース濃度で行った。
【００８８】
[0104]これら二つの実験で認められるように、キシロース異性化速度は、最初の４時間は極めて似ている。双方の場合について、尿素濃度は、ウレアーゼのＫｍより有意に高いので、ペレット中の内部ｐＨプロフィールは似ていると考えられる。それらペレットは、更に、同じＸＩ装填量を有するので、キシルロース生産は、双方で同等である。しかしながら、８時間までに、図６の曲線Ａにおける尿素消費は、尿素加水分解の反応速度の減少を引き起こす。減少したアンモニア生産で、活性ＸＩを有するペレットの内部体積は減少し、そして図６の曲線Ｂに相対するキシルロース生産の降下が認められる。図６の曲線Ａについて示された結果に基づき、尿素加水分解は、二ｐＨ微環境を２４時間まで維持することにおいて、もはや有効ではない。図６の曲線Ｂについて、はるかに高い初期尿素濃度で、キシロース異性化のための活性ゾーンは、はるかに長時間（＞４８時間）維持される。４８時間で測定された最終キシルロース濃度は、約１：６．５のキシロース：キシルロース比率に相当する約５２ｇ／ｌであった。
【００８９】
[0105]過剰尿素の存在下における異性化への共固定化酵素ペレット質量の作用：
[0106]異性化溶液の最終組成へのペレット質量および尿素濃度の作用を、図７に要約する。ペレット質量は、実験当たり０．１３ｇ〜０．９ｇであったし、初期尿素濃度は、０．０１Ｍかまたは０．１Ｍであった。０．０１Ｍ尿素について（図７、ＢおよびＣ）、ペレット質量の増加は、キシルロース生産速度の増加（図５も参照されたい）並びに生成される全キシルロースの増加を引き起こす。しかしながら、０．０１Ｍ尿素での実験で、０．１Ｍ尿素を加えた時の最低ペレット質量で達した場合と同程度に高いキシルロース収率に達するものはない。０．１Ｍ尿素について（図７、ＤおよびＥ）、ペレット質量の増加はまた、キシルロース生産速度の増加、および最終溶液組成に達するのに必要な時間の減少を引き起こすが、最終キシルロース収率は未変化のままである。ペレット質量を増加させること（より多いＸＩ）は、異性化速度論を増加させるが、尿素は、ＸＩ活性を維持し且つ高キシルロース収率を達成する場合に不可欠な役割を果たす。共固定化酵素システムは、独特の二ｐＨ微環境およびバルクへのキシルロースのボレート往復輸送によって、キシロースのキシルロースへの変換（約８６％）を引き起こし、それは、天然ＸＩでその最適ｐＨにおいて達成可能なものよりも有意に高い（図７、Ｆ）。
【００９０】
[0107]キシルロース異性化への金属イオン添加の作用
[0108]キシロース〜キシルロース平衡を好都合に移動させる場合のボレートの有効性を評価することに加えて、ＸＩの持続した最適活性を長時間維持することも考慮した。ＸＩ酵素は、活性のために金属イオンを必要とするが、これらイオンは、異性化の際に消耗することがありうる。本発明者は、ＸＩの活性の改良を、媒質へのＭｇ２＋およびＣｏ２＋イオンの添加によって実現できるか否かを調べた。
【００９１】
[0109]これら実験では、ｐＨ７．５で未改変 SweetzymeＴＭを用いた。ボレートの不存在下において、金属イオンの添加は、キシルロースに対する異性化に僅かな移動を引き起こす（図８の曲線ＡおよびＢ）。ボレートの存在下では、異性化に同様の移動が認められる（図８の曲線ＣおよびＤ）。したがって、金属イオンは、単独でかまたはボレートと一緒に、キシルロース生産の漸増改良を与えるが、その作用は、テトラホウ酸ナトリウムの添加に関連した移動ほど有意ではない。特定の態様において、金属イオンを補足することは、長期活性および粒子の再使用可能性に寄与するかもしれない。
【００９２】
[0110]発酵装置に加えられた異性化ペレットでのポプラ加水分解産物のＳＩＦ
[0111]未濾過加水分解産物を発酵に用いる場合、ＨＦＭＦは、中空ファイバーの塞栓ゆえに用いることができない。ＳＩＦは、３種類の異なった発酵であって、ブロスが、（１）純キシロース、（２）等比率のグルコースおよびキシロース、および（３）ポプラ加水分解産物を含有した発酵において行った。ボレートは、全ての実験に用いたが、酵母生存能力にも、エタノールを生産するそれらの能力にも悪影響を与えることはなかった。
【００９３】
[0112]同時異性化・発酵（ＳＩＦ）実験において、共固定化酵素ペレットを、標準的な発酵装置中のブロスに加え、最初の異性化を２４時間させた後、酵母を加えて、発酵を開始させた。
【００９４】
[0113]純キシロースについて表２に示されるように、本発明者は、エタノールの理論収率の９８％に２８時間で発酵させることができる。加水分解産物を模擬実験するために、本発明者は、更に、等量のグルコースおよびキシロースを含有する糖媒質を発酵させた。混合糖についてのこれら結果は、ＳＩＦ様式の場合、本発明者が、ほとんど全部の利用可能なグルコースおよびキシロースを発酵させ且つ僅か３６時間で８８％のエタノール収率を生じることができたということを示している。ポプラ加水分解産物について、キシロースの完全変換は、発酵の最後に認められて、ＳＩＦが行われることを示している。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
[0114]濾過されたバイオマス加水分解産物での同時異性化・発酵（ＳＩＦ）システム使用：
[0115]図９は、ＳＩＦプロセスのための共固定化酵素ペレットの充填床および発酵装置モジュール配置の略図である。中空ファイバーメンブラン発酵装置（ＨＦＭＦ）は、微孔質ファイバーおよび酵母細胞のブローアップを示す。糖は、ファイバー内腔を介して流れ、そして酵母は、ファイバーの周囲空間で成長する。糖は、ファイバー壁の細孔を介して酵母へと拡散し、そこで、糖はエタノールへと発酵する。エタノールは、細孔を介してファイバー内腔中へ拡散し戻り、そして最後に装置から流出する。酵母細胞は、シェル空間に閉じ込められているので、示されているように、装置体積につき極めて高密度で装填することができる。
【００９７】
[0116]この配置は、酵母不含であり且つエタノール回収用に容易に濃縮することができる発酵ビールを与える。その発酵ビールからエタノールを留去した後、緩衝剤およびボレートを含有する残りの水溶液を、上流のプロセス装置（すなわち、加水分解／異性化）へ再循環することができ、消耗品の有意の費用節約をもたらす。この配置は、異性化触媒ペレットが、充填床に閉じ込められていて且つ酵母と直接的に接触することがないので、それらペレットの容易な回収および再使用の方法を与える。この配置は、キシルロース発酵に必要とされるＨＦＭＦ中の高密度の酵母を考慮し、そして更に、発酵用の酵母の延長使用を可能にする。伝統的発酵装置とは異なり、各々の発酵バッチ後に酵母を廃棄しない。この配置のモジュール性は、有意の資本経費を伴わないＳＩＦプロセスの容易な拡大を考慮している。
【００９８】
[0117]ＳＩＦのためのモジュール配置の使用。
【００９９】
[0118]４．５ｇのウレアーゼ被覆 GenSweetＴＭペレットを含有する充填床反応器を、キシロースの異性化に用いた。その反応器は、長さ３０ｃｍ、内径１ｃｍの円筒形カラムである（Kontes Chemistry and Life Sciences Products）。Ｆ５０ＮＲｅ HemoflowＴＭ中空ファイバー発酵装置に、エタノールへの糖の発酵用に５０ｇの乾燥酵母を装填した。次に、６０ｇ／ｌのグルコースおよび３０ｇ／ｌのキシロースを含有する２５０ｍｌ容量の栄養緩衝液を、異性化および発酵のために３０ｍｌ／分の速度で循環させた。３種類の異なった場合を、３４℃およびｐＨ４．５で実験した。（１）充填床装置中においてペレット不含で発酵（異性化なし）；（２）糖溶液の１時間のプレ異性化後、同時異性化・発酵（ＳＩＦ）；および（３）同時異性化・発酵。
【０１００】
[0119]これら実験の結果を、表３に要約する。３種類の場合について、グルコースは全て、２時間以内にエタノールへ変換されている。
【０１０１】
【表３】
2011508606.tif 000005
【０１０２】
[0120]ケース１の場合、キシロースは消費されるが、エタノール濃度は２〜２４時間一定であるので、この糖からエタノールが生成することはない。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）の不存在下において、キシルロースが形成されることはない；キシロースは、酵母によって利用されていて、キシリトールおよびアラビトールなどの他の代謝生成物を形成する。
【０１０３】
[0121]ケース２について、キシロースの半分は、発酵開始前にキシルロースへ異性化されている。２４時間までに、全てのグルコース、全ての初期キシルロース、および一部分の初期キシロースはいずれも、エタノールへと変換された。ＸＩの存在は、キシロースのキシルロースへおよびエタノールへの急速変換を可能にし、それが、他の副生成物経路へのキシロースの流れを減少させる。これらデータは、追加のキシロースの異性化およびキシルロースの発酵が、ケース１の場合よりも相当して高いエタノール収率で２４時間行われることを示している。
【０１０４】
[0122]ケース３について、データは、キシルロースが急速発酵していることを示し、５時間を超えるような生産で、キシルロース濃度はゼロである。しかしながら、エタノール濃度は増加し続け、そして２４時間までに理論収率の９５％に達した。
【０１０５】
[0123]モジュール配置でのポプラ加水分解産物の異性化および発酵
[0124]この実施例は、バイオマス加水分解産物を含む本明細書中に記載のシステムの生存能力を示す。モデル糖溶液は、加水分解産物中に存在する主な糖類を含有するが、実際の加水分解産物は、発酵および異性化に阻害的でありうる追加の加水分解生成物を含有しうると考えられる。共固定化酵素ペレット並びに発酵装置（ＨＦＭＦ）が、実際の加水分解産物でどのように作業するかを示すために、本発明者は、有標イオン液前処理法で調製された５％ｗ／ｖポプラ加水分解産物を用いた。それとして、同時係属特許出願第１１／７１０，３５号および同第１２／０７５，７６２号は、本明細書中にそのまま援用される。
【０１０６】
[0125]２００ｍｌ容量の加水分解産物を、最初に、ＸＩペレットを含有する充填床中で異性化した後、ＨＦＭＦ中で発酵させた。異性化は、０．０５Ｍボレートで２４時間行った；９１％のキシロースをキシルロースへと異性化した。発酵の結果を表４に要約するが、それは、ＨＦＭＦ中のポプラ加水分解産物からのエタノール収率を示している。
【０１０７】
【表４】
2011508606.tif 000006
【０１０８】
[0126]ＳＩＦプロセスのための共固定化酵素ペレットの充填床および中空ファイバー発酵装置モジュール配置のこの組合せは、いくつかの独特且つ予想外の利点を有する。（ｉ）それは、酵母不含であり且つエタノール回収用に容易に濃縮することができる発酵ビールを与える。（ii）その発酵ビールからエタノールを留去した後、緩衝剤およびボレートを含有する残りの水溶液を、上流のプロセス装置（すなわち、加水分解／異性化）へ再循環することができ、消耗品の有意の費用節約をもたらす。（iii）この配置は、異性化触媒ペレットが、充填床に閉じ込められていて且つ酵母と直接的に接触することがないので、それらペレットの容易な回収および再使用の方法を与える。（iv）この配置は、キシルロース発酵に必要とされるＨＦＭＦ中の高密度の酵母を考慮し、そして更に、発酵用の酵母の延長使用を可能にする。（ｖ）伝統的発酵装置とは異なり、各々の発酵バッチ後に酵母を廃棄しない。（vi）この配置のモジュール性は、有意の資本経費を伴わないＳＩＦプロセスの容易な拡大を考慮している。
【０１０９】
[0127]濾過された加水分解産物で用いるためのモジュールＳＩＦ配置。
【０１１０】
[0128]セルロース系エタノールの生産は、リグニンを回収する能力によって強く影響される。特定の態様において、加水分解産物を発酵前に濾過することは必要でありうる。
【０１１１】
[0129]別の側面において、清澄な加水分解産物を用いることができるモジュールＳＩＦ配置をここで提供する。図９は、充填床システム１０の略図を示す。そのモジュールＳＩＦ配置は、共固定化酵素の容易且つ迅速な再使用、および柔軟且つ有効な発酵装置作業を考慮している。
【０１１２】
[0130]充填床システム１０には、バッチ容器１２；入口１５、出口１６を有し且つ所望の量の共固定化酵素ペレット１８を含有する充填床カラム１４；および入口２１および出口２２を有する発酵装置２０が含まれる。特定の態様において、発酵装置２０は、発酵装置２０中の流路２８から酵母２６を分離する微孔質中空ファイバーメンブラン２４を含む。
【０１１３】
[0131]キシロースの異性化は、固定化酵素ペレット１８を含有する充填床カラム１４において行われ、発酵は、発酵装置２０において行われる。バッチ容器１２、充填床カラム１４および発酵装置２０は、閉ループシステムで連通していて、グルコースおよびキシロースが充填床カラムの入口１５に流入するようにある。
【０１１４】
[0132]作業中に、バッチ容器１２からのグルコースおよびキシロースは、共固定化酵素ペレット１８と接触し、そこで、本明細書中に記載の異性化反応が起こる。次に、グルコースおよびキシルロースは、充填床出口１６から発酵装置入口２１に流入する。それらグルコースおよびキシルロース糖類は、メンブランを通過し、そして酵母２６と接触する。酵母がこれら糖類を利用すると、エタノールを生成する。次に、そのエタノールは、メンブランを介して流路２８中へ通過し、そして発酵装置出口２２を介して出る。
【０１１５】
[0133]充填床システム１０を一連の配置で連通することによって、そして再循環様式で作業することによって、「同時異性化＋発酵」ＳＩＦ作業を達成する。充填床システム１０は、ペレット１８の反復使用および大多数のバッチ発酵のための発酵装置２０を考慮している。その充填床システムは、中空ファイバーメンブラン発酵装置２０（ＨＦＭＦ）のシェル側に酵母２６を閉じ込めていて、酵母と固定化酵素ペレットとの間の直接的接触を免れ、それが、ペレットの回収および再使用を極めて容易にする。更に、特定の態様において、発酵装置２０は、シェル側を充填する十分に高い酵母密度を有して、酵母の更なる成長を妨げるようにあり、そして糖類は、エタノールへ急速発酵する。充填床システム１０は、キシルロース利用に特に好都合である。
【０１１６】
[0134]図１０および図１１は、二つのプロセスについて、すなわち、別々に作業する（１）充填床および（２）ＨＦＭＦのデータを示している。充填床異性化には、０．９ｇの固定化酵素ペレットを、５ｍｌガラスシリンジの底に充填した。蠕動ポンプを用いて、３０ｇ／ｌキシロース、０．０５Ｍボレートおよび０．０５Ｍ尿素を含有する５０ｍｌの媒質を、レザバー（reservoir）から床を介して１ｍｌ／分で、カラム中の酵素ペレットより上に１ｃｍの液体ヘッドを維持しながら再循環させた。充填床設定は、インキュベーター中で組み立てて、３４℃の一定温度を維持した。試料は、キシロースおよびキシルロースのＨＰＬＣ分析用にレザバーから集めた。同じ固定化バッチからのペレットでの対照実験は、撹拌されている振とうフラスコ中で行った。充填床実験および振とうフラスコ実験についての一時的キシルロース濃度および収率は、図１０に示されている通りである。キシルロースの形成速度および全収率は双方とも、充填床の場合に一層高く、異性化のための時間は、充填床設計における酵素への糖類の一層有効な物質移動ゆえに、約２４時間〜１０時間未満へ実用的に減少させることができるということが示される。
【０１１７】
[0135]発酵装置には、Ｆ５０ＮＲ HemoflowＴＭカートリッジ（Fresenius Medical Care North America）を用いた。微孔質ファイバーは、２５ｋＤａの分画分子量を有するポリスルホンから作られていて、全メンブラン表面積は１ｍ２である。そのカートリッジのシェル側の口を用いて、酵母を導入し、そして発酵中に生成したＣＯ２をガス抜きした。酵母（Sigma ＹＳＣ２−５００Ｇ，２５ｇ）を接種し、そしてファイバーのシェル側（１５０ｍｌ容量）において３４℃で培養した。６０ｇ／ｌグルコースを含有する２５０ｍｌの媒質を、ファイバー内腔（５０ｍｌ容量）を介して１〜７０ｍｌ／分の流速でポンプ輸送して、エタノール発酵速度への流速の作用を決定した。エタノールの濃度は、バッチ容器からの試料口を介して測定した。
【０１１８】
[0136]図１１に示されるように、グルコースは、全ての流速で６時間以内に消費されたが、それは、本発明者のバッチ発酵結果（データは示されていない）に匹敵する。３０〜５０ｍｌ／分の範囲について、グルコースは、本発明者のバッチ実験の場合より一層早く消費されて、ＨＦＭＦが、バッチ発酵にまさる時間利点を有することがありうるということが示された。エタノール収率は、全ての実験についてほぼ１００％であり、最小限の副生成物生産が示された。これら時間目盛は、充填カラムでの異性化の場合に匹敵するので、当該技術分野にわたる別の有意の利点を与える。
【０１１９】
[0137]他の糖溶液および加水分解産物は、ＳＩＦ時間を最小限にするモジュールサイジングを決定するのに用いることができるということは理解されるはずである。更に、それらモジュールは、一層大規模なＳＩＦを行うのに合わせることができる。更に、再使用可能性の標線およびモジュールの寿命を容易に決定することができるということが理解されるはずである。
【０１２０】
[0138]固形分含有加水分解産物で用いるための共固定化酵素の容易且つ迅速な再使用のシステム
[0139]ペレットを、固形分含有加水分解産物と一緒に発酵容器に直接的に加える場合、それらの回収は極めて難しい。更に、バイオマスの同時糖化・発酵（ＳＳＦ）は、いくつかのプロセス利点を有するが、固形分含有発酵媒質の取扱を必要とする。
【０１２１】
[0140]これら状況において（残留固形分の極めて僅かな部分である）ペレットの回収および再使用に取り組むために、ここで、固形分含有加水分解産物で用いるための共固定化酵素の容易且つ迅速な再使用を考慮しているシステムを更に提供する。
【０１２２】
[0141]一つの非制限例において、一層大規模なバッチ発酵のために、共固定化酵素ペレットは、閉じ込めシステム中に確保することができる。適する閉じ込めシステムの一例は、図１２に略図で示されている回転バスケットシステム３０である。
【０１２３】
[0142]この態様において、酵素ペレット３２は、発酵ブロス中で回転される羽根車３８の羽根３６を形成する平形バスケット３４中に充填する。バスケット用の材料の選択を変更することによって、および回転速度を最適にすることによって、発酵ブロスからバスケットへの固形分の付着を最小限にすることができる。更に、発酵中に生じるＣＯ２は、バスケットの表面に刻みをつけて、材料蓄積を更に妨げるであろう。回転バスケットシステム３０の一つの利点は、この閉じ込め法が、不均一化学反応を行う場合の規模拡大に特に有用であるということである。
【０１２４】
[0143]図１３：共固定化酵素技術を用いたプロセス配置の例。プロセスＡ−共固定化酵素ペレットをセルラーゼと一緒に、ボレートおよび尿素の存在下においてｐＨ４．８および５０℃で用いることは、同時糖化・キシロース異性化（ＳＳＩ）を可能にすることができる。得られたグルコースおよびキシルロース糖配合物は、天然酵母によって発酵させることができる。プロセスＢ−共固定化酵素ペレットおよび天然酵母を、ボレートおよび尿素の存在下においてｐＨ４．５および３５℃でバイオマス加水分解産物に加えることは、全てのバイオマス糖類からほぼ理論エタノール収率での同時異性化・発酵（ＳＩＦ）を可能にする。プロセスＣ−天然酵母を用いたＣ６およびＣ５糖類の同時糖化・発酵（ＳＳＩＦ）は、ボレート、尿素、セルラーゼおよび天然酵母を含有するｐＨ４．８および３５℃で維持されている媒質中において共固定化酵素ペレットで行うことができる。
【０１２５】
[0144]図１３に示されるように、セルロース系エタノールは、いろいろな作業配置で生成することができる。非制限例には、具体的には、次の性能を可能にする共固定化酵素ペレットが含まれる。
【０１２６】
プロセスＡ−同時糖化・異性化（ＳＳＩ）；
プロセスＢ−同時異性化・発酵（ＳＩＦ）および
プロセスＣ−同時糖化・異性化・発酵（ＳＳＩＦ）。
【０１２７】
[0145]特定の態様において、酵素ＸＩおよびウレアーゼは双方とも、３５〜７０℃の温度範囲で有意の活性を有する。実際に、それらの最適活性は、まさにセルラーゼと同様に、ほぼ５０℃である。しかしながら、ｐＨ４．８で最適活性を有するセルラーゼとは異なり、ＸＩの最適ｐＨは７．５である。本明細書中に記載の方法は、二ｐＨ微環境の生成によってこのｐＨ不一致を克服することができるので、プロセスＡ「ＳＳＩ」は、高温で行って、異性化速度論および反応平衡を有意に増強することができる。これは、糖化および発酵に必要な時間の有意の減少をもたらす。更に、プロセスＡが、前処理済みバイオマスの糖化環境（milieu）（mileau）へ加えられたボレートおよび尿素を包含する場合、セルラーゼ酵素活性は、これら添加剤によって悪影響を受けることはない。
【０１２８】
[0146]更に、プロセスＡ（「ＳＳＩ」）は、糖化後の酵素ペレットの容易な回収を可能にすることができる閉じ込めシステムで実行することができる。プロセスＡ（「ＳＳＩ」）後、グルコースおよびキシルロースのエタノールへの発酵は、同じ容器中において、単純に加水分解産物温度を低下させ且つ天然酵母を加えることによって行うことができる。
【０１２９】
[0147]特定の態様において、プロセスＢ（「ＳＩＦ」）は、二層ペレットの使用に特に適しているということに注目すべきである。
【０１３０】
[0148]更に、特定の態様において、天然酵母では、Ｃ６糖類のみが、同時糖化・発酵様式（「ＳＳＦ」）でエタノールへと発酵することができ、キシロース部分は未発酵のままである。天然酵母がキシロースを発酵させることができないことは、バイオマス加水分解産物からの利用可能な糖類のほぼ４０％の損失をもたらす。したがって、「ＳＳＦ」様式は、特定の態様において、バイオマスのＣ６およびＣ５双方の糖類を約４．８のｐＨで発酵させることができるＧＭＯのみを用いて生存可能でありうる。
【０１３１】
[0149]しかしながら、図１３で理解されるように、共固定化酵素技術の独特の特徴は、それが、酵素的糖化にも典型的なｐＨである４．５のｐＨで異性化および発酵が起こることを可能にするということである。これは、糖化、異性化および発酵を全て一緒にして一つの工程にする機会を与える。酵素ペレットの濃度は、バイオマスの他の固形分に相対して低いし、しかも粒子上の吸着による有意のセルラーゼ損失が予想されることはないと考えられる。更に、特定の態様において、反応媒質へのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加は、多糖類以外の固形分への非特異的吸着ゆえに、セルラーゼの損失を妨げる手段として行うことができる。
【０１３２】
[0150]本発明を、いろいろな且つ好ましい態様に関して記載してきたが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、いろいろな変更を行うことができるし且つ均等物をそれらの要素に置き換えることができるということは当業者に理解されるはずである。更に、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の内容に特定の状況および材料を適合させるように多数の修飾を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するのに考えられる本明細書中に開示の具体的な態様に制限されるものではなく、本発明は、請求の範囲の範囲内にある全ての態様を包含するであろうということである。
【０１３３】
参考文献
[0151]上に論及された参考文献および以下の参考文献は、それらが、本明細書中に挙げられたものを補足する代表的な手続き上のまたは他の詳細を与える程度に、本明細書中に具体的に援用される。本明細書中の参考文献の引用は、それが、本発明への先行技術であるという承認として解釈されるべきではない。
【０１３４】
【表５】
2011508606.tif 000007
【０１３５】
【表６】
2011508606.tif 000008
【０１３６】
【表７】
2011508606.tif 000009
【０１３７】
【表８】
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【図１】
2011508606.tif 000011
【図２】
2011508606.tif 000012
【図３】
2011508606.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011508606.tif 000017
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2011508606.tif 000021
【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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