(57)【要約】  【解決手段】  本発明は小さい干渉するＲＮＡに（ｓｉＲＮＡ）分子、それらを含んでいる組成物および回復している皮膚瘢痕のない損傷および他の皮膚状況（例えば乾癬およびループスを引き起こされた皮膚病変）の改良のためのそれらを使用する方法を提供する。本発明はｓｉＲＮＡ分子を含む、そして、それらを含んでいる組成物はそれらを使用する損傷治癒および方法の病理学的であるか望まれていないプロセスを促進する一つ以上の遺伝子の表示を非常に禁止する。  【選択図】      図Ａ
2011504170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
倍から成る小さい干渉するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は（二重）オリゴヌクレオチドを立ち往生させた。そこにおいて、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖（ｓｓ）目標ＲＮＡ分子の補完的なヌクレオチド配列を目標とする。そこにおいて、前記ｓｓ目標ＲＮＡ分子は少なくともペプチドの一部をコード化しているｍＲＮＡまたは活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する、または、前記ｓｓ目標ＲＮＡ分子が活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する調節性の分子として機能しているミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるタンパク質である。
【請求項２】
前記目標ｍＲＮＡ分子が炎症誘発性経路遺伝子、ｐｒｏ-脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路遺伝子のグループから選択される遺伝子を符号化する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記遺伝子がＨｏｘｂｌ３、ＴＧＦ-βｌ、ＴＧＦ-β２またはコックス-２である請求項２のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１、２または３のｓｉＲＮＡ分子から成る構成および薬学的に受け入れられるキャリア。
【請求項５】
少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子（各ｓｉＲＮＡ分子が炎症誘発性経路遺伝子、プロ脈管形成経路遺伝子およびｐｒｏ-細胞増殖経路遺伝子からなる群から選択される遺伝子をコード化するｍＲＮＡ分子を結合する）および薬学的に受け入れられるキャリアから成る構成。
【請求項６】
前記少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子の各々が前記グループから選択される異なる遺伝子をコード化する異なるｍＲＮＡ分子と結合する請求項５の構成。
【請求項７】
前記遺伝子の各々が前記経路遺伝子の異なるグループから選択される請求項６の構成。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡ分子が表アンペア時において、確認される混合物から選択される請求項５の構成。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡ分子が人間およびマウス細胞のＨｏｘｂｌ３、ＴＧＦ-βｌ、ＴＧＦ-β２またはコックス-２の表示を禁止する表２、３、４、または５にリストされるシーケンスの一つ以上を目標とする請求項５の構成。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡ分子がＰＤＧＦａの表示を禁止する表６、７、８、または９にリストされるそれらから選択される請求項５の構成、ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦ  Ａまたは人間およびマウス細胞のＬａｍｉｎ  Ｂ  １。
【請求項１１】
請求項４-１０（前記薬学的に受け入れられるキャリアが枝分れヒスチジン・ポリペプチドまたは枝分れリジン・ポリペプチドから成る）のいずれか一つの構成。
【請求項１２】
主題（前記損傷が炎症および新血管形成によって、部分的には、少なくとも特徴づけられる）の真皮であるか表皮性損傷を治療するために方法前記主題に請求項１-３のいずれか一つのｓｉＲＮＡの薬学的に有効な量を与えることから成る前記方法。
【請求項１３】
主題（前記損傷が炎症および新血管形成、前記主題に少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子から成る構成を与えることから成る前記方法および薬学的に受け入れられるキャリアによって、部分的には、少なくとも特徴づけられる）の真皮であるか表皮性損傷を治療するためにＡ方法、そこにおいて、前記少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子は、前記損傷の治癒の病理学的であるか望まれていないプロセスを促進する少なくとも一つの遺伝子の表示を禁止する。
【請求項１４】
請求項１３（前記少なくとも一つの遺伝子が遺伝子を炎症誘発性経路遺伝子、プロ脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路からなる群から選択した）の方法。
【請求項１５】
主題（前記損傷が炎症および新血管形成によって、部分的には、少なくとも特徴づけられる）の真皮であるか表皮性損傷を治療するために方法前記主題に請求項４-１１のいずれか一つの組成物の薬学的に有効な量を与えることから成る前記方法。
【請求項１６】
前記主題が哺乳類である請求項１２、１３、１４、または１５の方法。
【請求項１７】
前記主題が人間である請求項１２、１３、１４、または１５の方法。
【請求項１８】
倍から成るｓｉＲＮＡ分子を確認するための方法は（二重）オリゴヌクレオチドを立ち往生させた。そこにおいて、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖（ｓｓ）目標ＲＮＡ分子の補完的なヌクレオチド配列を目標とする。そこにおいて、前記ｓｓ目標ＲＮＡ分子は少なくともペプチドの一部をコード化しているｍＲＮＡまたは活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する、または、前記ｓｓ目標ＲＮＡ分子が活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する調節性の分子として機能しているミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるタンパク質である。そして、前記方法が次のステップを含んだ、
（ａ）  前記ｓｓ目標ＲＮＡ分子（前記ｓｉＲＮＡデュプレックスのターゲッティング索がヌクレオチドのさまざまなシーケンスから成る）の補完的なヌクレオチド配列を目標とするように設計された一まとまりのｓｉＲＮＡデュプレックスを作成すること、
（ｂ）  生体外で前記標的分子に対して最も高い所望の効果を示すｓｉＲＮＡデュプレックスを選択すること、
（ｃ）  動物の損傷モデルの評価前記選択されたｓｉＲＮＡデュプレックス、そして、前記モデルにおいて、最も大きな有効性を示すｓｉＲＮＡデュプレックスを選択する。（ｄ）
【請求項１９】
薬学的に受け入れられるキャリアを前記動物の損傷モデルの医薬品組成物および評価各々の前記医薬品組成物を形成するためにステップ（ｂ）により選択される前記ｓｉＲＮＡデュプレックスの各々に加えるステップをさらに有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物がモデルを回した請求項１８または１９の方法は、Ｈｏｘｂｌ３遺伝子を取り除いたマウスのリップ摘出損傷モデルまたはＨｏｘｂｌ３遺伝子を取り除いたマウスの後ろの摘出損傷モデルである。
【請求項２１】
請求項１８の方法または評価前記ｓｉＲＮＡの１９のそこにおいて、前記ステップが動物の損傷モデルにおいて、二重化するは、Ｈｏｘｂｌ３遺伝子を取り除いたマウスの両方のリップ摘出損傷モデルの評価前記ｓｉＲＮＡデュプレックスとＨｏｘｂ  １３遺伝子を取り除いたマウスの後ろの摘出損傷モデルとを具備している。
【請求項２２】
ＴＧＦ-βｌ、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３を目標とするｓｉＲＮＡデュプレックスから成る請求項５の構成。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡデュプレックスが以下のオリゴヌクレオチドから成る請求項２２の構成：（１）ｈｍＴＦ-２：感覚、アンチセンス５Ｉ-ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ-３Ｉ、５１ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ-３Ｉ、
（２）  ｈｍＣＸ-１：感覚、Ｓのもの-ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ-Ｓの  -  アンチセンスの  -  ５’-ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ-３Ｉ、そして、（３）ｈｍＨＸ-１：感覚、５’-ＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＵＧＵＧＵＵ-Ｓのものアンチセンス、５’-ＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣＣＡＣＣ-Ｓのもの。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物および皮膚瘢痕のない損傷治癒および他の皮膚状況（例えば複数の疾患を引き起こしている遺伝子を目標としている複数のオリゴヌクレオチド配列を有する小さい干渉するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の組成物を使用して乾癬およびループスを引き起こされた皮膚病変）の改良のための方法に関する。
この用途は米国の暫定特許２００７年１１月６日に出願の出願番号第６０／９８５，８２０号に優先権の利益を請求する。そして、それは完全に本願明細書に引用したものとする。
【背景技術】
【０００２】
皮膚、本体で最も大きな器官、は下にある間充織（真皮）層と、外側の上皮の（表皮性）層とを含む。皮膚の主要な機能は、環境に対して保護バリアとして役立つことである。損傷または疾患の結果としての皮膚の大きな部分の健全性の低下は、大きな障害または死にさえ至ることができる。米国の毎年、１，２５０，０００人以上は熱傷がある。そして、６，５００，０００は圧力、静脈鬱血または真性糖尿病によって、生じる慢性皮膚潰瘍がある。損傷の処置の主な目的は、迅速な損傷閉鎖および機能的なおよび美学的に満足な瘢痕（１）である。細胞および分子生物学の最近の進歩は、損傷修理および組織再生に関係する生物学的方法の我々の理解を非常に拡大して、損傷治療（２）の改良に至った。損傷Ｈｅａｌｉｎｇ：損傷へのＳｋｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｔｈｅ反応に対するＲｅｓｐｏｎｓｅは、組織完全性の回復のための系統学的に原始的、これまでに基本的生来のホスト免疫応答である。より高い脊椎動物（下等脊椎動物と異なった）の組織混乱は、組織再生でなくにおいて、線維症瘢痕につながっている迅速な修理プロセスで結果としてなる。外傷、微生物または外国の材料によって、始められるかどうか、損傷治癒は凝固を含むイベントの重なり合うパターン、炎症、上皮形成、肉芽組織の形成、マトリックスおよび組織リモデリングを介して進行する。修理の方法は相互に作用している分子信号（主にサイトカイン）によって、主に伝達される、炎症および治癒を強調する多種多様な細胞動作に非常に動機づけして、組織化する。損傷への反応は皮膚（１）において、しばしばモデル化される、しかし、規定能および細胞イベントの平行した調整および時間的に調整されたパターンは損傷に続く大部分の組織に起こる。第一の損傷は、間葉細胞補充、増殖およびマトリックス合成が続く凝固および鋭いローカル炎症性の反応を誘発する。炎症を分解することの不履行は慢性非治癒損傷に至ることができるが、非管理マトリックス蓄積は、しばしば異常なサイトカイン経路を含んで、過度に瘢痕化しているおよび線維症後遺症を導く。損傷治癒のサイトカインの役割を解読することにおける継続進歩は、病理学的治癒を制御するかまたは調整するために阻害して／適当なサイトカインを強化するために経路を調べる機会を提供する。胎児性損傷は、治癒がそうである瘢痕Ｗｏｕｎｄなしで、より急速に癒やされる可溶な規定能を含んでいる動的な、双方向の方法、血液細胞、細胞外マトリックス、そして、実質性細胞。損傷治癒は、３つの位相を有する−炎症、組織形成および組織リモデリング−時間内の（１，２）その重なり。胎児皮膚現像の間、ケラチノサイトは、単細胞増殖している基底層から生じて、発展停止を受けて、表皮の形態学的に異なった層を生じるために、分化の厳しく制御プログラムで、上方へ移動する。類似のプログラムを使用して、表皮は、有機体の期間中、絶えず更新される。成体哺乳類の皮膚も、損傷の後に修理の相当な能力を有する。しかしながら、反応は、皮膚の不完全な回復の感染症結果の終了および防止を巻回される急速のために、非常に最適化された表皮、そして、瘢痕化して真皮。
【０００３】
成体皮膚の修復とは対照的に、妊娠の初期に作られる哺乳類の胎児性皮膚損傷は再生の方法によって、平癒する。そこにおいて、表皮性および真皮層は瘢痕形成（１、２）なしで完全に再構成される。いくつかの顕著な対照がある胎児の対、成人は治癒を巻回した。一般に下部のレベル（４）で、胎児性損傷は、より急速にふさがって、ほとんど炎症性反応（３）を示さなくて、サイトカイン／成長因子表現の異なる側面を呈する。
【０００４】
ＴＧＦ-β抗体は、部分的に、Ｅｖｉｄｅｎｃｅに傷をつけることの量を減らした損傷治癒が一群のサイトカイン、成長因子およびそれらのレセプタ（５-７）により調整されることを証明する。それらは、複合の、組織化された方法の細胞遊走、成長および増殖に影響して、好中球およびマクロファージ浸入、脈管形成、線維増殖、基材堆積、瘢痕化することおよびｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎに関係している。血小板およびマクロファージの他に、線維芽細胞は、サイトカインの主な細胞出所または損傷治癒の間の成長因子である。初期の妊娠で胎児の皮膚において、平癒している瘢痕のない損傷は、ユニークなサイトカインまたは成長因子プロフィールの結果である。
【０００５】
これらのうちで、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）は、瘢痕形成を有する瘢痕のない治癒および修理との間に移行に関係して、そのまま最も広く調査された。歴史的な理由のための成長因子と呼ばれて、それらの主要な機能は、細胞増殖および微分を制御して、細胞外マトリックス（例えばコラーゲン）の合成を刺激することである。ＴＧＦ-βは非傷ついた胎児の皮膚の免疫組織化学によって、分かった、そして、ＴＧＦ-βの高次は瘢痕のない修理と関連した在胎月齢で表される。通常瘢痕のない胎児性損傷に対するＴＧＦ-βの外因性アプリケーションは瘢痕形成に結果としてなった、そして、大人のような炎症性の反応は観察された。部分的にＴＧＦ-β抗体を中和することが瘢痕化することの量を減らしたので、ＴＧＦ-βのプロ線維症性質は成熟したネズミの損傷において、確認された。ＴＧＦ-βは、コラーゲンＩを刺激する製造（成体皮膚の支配的なコラーゲン・タイプである）。一方では、ＴＧＦ-β中和抗体が成体皮膚において、瘢痕化するのを完全に妨げるというわけではない、そして、最近の研究は優位なＳｃａｒ-形成要因（８-１５）としてＴＧＦ-βの有効性を疑う。
【０００６】
調査でその減少したおよび急速に消去されたＴＧＦ-β１も明らかになった、そして-増加したおよび長期にわたるＴＧＦ-β３が付随するβ２表現は６匹の動物が組織化されたコラーゲン沈着に関連させた傷ついたＥｌにおいて、水平になる。対照が増加して、ＴＧＦ-β１を延長して中で、そして-９匹の動物が相関した傷ついたＥｌの減少したおよび後発性ＴＧＦβ３つの表現を伴うβ２表現は、コラーゲン・アーキテクチャを混乱させた。ＴＧＦ-β１を増加させたこの手段-β２、そして、３つの表現が原因となる減少したＴＧＦ-β遅い妊娠胎児性瘢痕形成。ＴＧＦ-βの過剰がホストの迅速なおよび最適保護のための反応の通常の構成要素でもよいという点で、これらの観察は内在性損傷を癒やしている反応のＴＧＦ-βの役割を理解することに対する広い意味を有する。感染がない場合、しかしながら、この過度に生き生きとした補充、炎症およびケラチノサイト抑制の減少は、より美容的に受け入れられる瘢痕に結果としてなることができる。
【０００７】
ＣＯＸ-２インヒビターは瘢痕組織形成を減らして、引張強さＷｈｉｌｅを強化するインターロイキンＩＬ-６、ＩＬ-８、そして、ＩＬ-ＩＯは胎児の損傷修理において、研究された、ＣＯＸ-２は最近そのまま異常調整された炎症性の状況（例えば慢性関節リウマチ患者および骨関節炎、心血管疾患および発癌プロセス（１６-２０）と関連した疾患に関係する多くの注意も受信した。ＣＯＸ-２は、炎症性刺激（２０、２１）（例えば損傷）に応答して、即初期上に向かう調節を受ける。それは結果として生じる炎症の多くの態様を制御するプロスタグランジンを生じることによって、機能する。そして、脈管透過性および浸入の誘導および炎症細胞（２２）の活性化を含む。これらの初期のイベントが修理の結果を調整することを示したように、ＣＯＸ＾２経路の役割および成体損傷修理プロセスの炎症の他の態様に対する関心は（３５）を増加させている。炎症のＣＯＸ-２およびそれが成体損傷修理（２３-２５）のいくつかの態様に貢献させる最近のデモンストレーションの関係に基づいて、胎児の損傷を癒やしている方法のＣＯＸ-２の役割は、検討された。これらの研究は、初期のおよび遅い妊娠胎児性損傷のＣＯＸ-２酵素の差動の発現を示す。
【０００８】
さらにまた、初期の胎児性損傷にもたらされるときに、ＰＧＥ２（皮膚の多くの方法の媒介となることを示すＣＯＸ-２製品）によって、治癒の遅れおよび瘢痕の製造が生じた。瘢痕形成のＣＯＸ-２経路の関係は、瘢痕のない損傷のＰＧＥ２レベルを上昇させることが瘢痕の生成を有する修理のうちの１つに瘢痕のない治癒方法のコンバートに結果としてなるという事実によって、更に強調される。ＰＧＥ２の導入は胎児性損傷（２６）の炎症を誘発した。但し、コラーゲン沈着または線維症に対するそれらの効果は検討されなかった。炎症誘発性分子がたぶんＰＧＥ２．のためのレセプタの表示または活動の違いから生じるにつれてＰＧＥ２が免疫抑制性であるか抗炎症性特性を示すかまたはその代わりに作用するかどうか、ＰＧＥ２が胎児性損傷の瘢痕形成を誘発していることができるいくつかのもっともらしい機構が、ある。ＰＧＥ２は、炎症細胞の漸増および活性化による瘢痕形成を促進して、間接的にこのことにより、急性炎症（すでに、瘢痕のない治癒を妨げることは公知の）を強化していることができる。ＰＧＥ２処理は、回復することを遅延させていることができて、プロ線維症ＴＧＦβｌ（２７）の増加による瘢痕組織堆積を促進していることができる。ｓｍａｄ３の経路の信号を送っているＴＧＦβの中で混乱-不十分なマウス治癒率および広範囲なデータの速度を上げることが制限されたＴＧＦβ３レベルが瘢痕のない治癒にとって重要なことを証明することを明らかにする。最後に、ＰＧＥ２に応答する増加した線維芽細胞増殖がＰＧＥ２が線維芽細胞を励まして直接増殖するようにしていることができることを示唆することを証明していて、コラーゲン産生を増幅していて、瘢痕化しているデータが、ある。この考えは、ＰＧＥ２への露出の後に線維芽細胞によって、コラーゲン沈着および増殖の増加を示している以前の研究でも支えられる。相当なデータはＣＯＸ-２表現の低次を暗示した、そして、ＰＧＥ２は胎児の皮膚の瘢痕のない修復のために必要でもよい。ＰＧＥ２が更にＣＯＸ-２経路のための役割を瘢痕形成に支持している胎児の皮膚の瘢痕形成を誘発するという事実。切開性損傷を治療するためにＣＯＸ-２インヒビター・セレコキシブを使用して、損傷を癒やしている方法のＣＯＸ-２の役割は、創傷部位（２８）の炎症のいくつかのパラメータの重要な抑制で検査された。損傷治癒の炎症性位相初期にこの減少は、ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎまたは減少性引張強さを崩壊させることのない損傷を癒やしている方法（すなわち、瘢痕組織形成の減少）の後のイベントに、重大な影響を及ぼした。マウスがＨｏｘ転写制御因子の進化的に節約された一系統が器官形成の間、分化を導いてそれらの重要な役割による胎児の皮膚再生の調節の魅力的な候補と考えられたより少ない瘢痕組織形成によって、より急速に癒やすＨｏｘＢ１３  ＫＯの損傷の外皮をはぐ。研究はＨｏｘタンパク質族（ＨｏｘＢ１３）の１つの特定の部材を確認したとして優勢である、妊娠中期から主要な線維芽細胞培養組織において、表されるＨｏｘ遺伝子は（２９）の外皮をはぐ。妊娠中期胎児の皮膚（それは、瘢痕なしで回復する）を使用している研究を癒やしている次の損傷および人間の成体皮膚は、ＨｏｘＢ１３が中で差別的に表されることを証明した胎児の対成人損傷。面白いことに、ＨｏｘＢ１３表現は、非傷ついた規制と比較して胎児性損傷において、著しく刺激に対する反応を抑制された。対照的に、成人損傷のＨｏｘＢ１３表現における重要な変更が、非傷ついた規制と比較してなかった。一緒に、これらの結果は、ＨｏｘＢ１３表現のダウンレギュレーションが平癒している胎児性瘢痕のない損傷のために必要でもよいことを示唆する。それも、ＨｏｘＢ１３を成体皮膚から減らすかまたは除去することが損傷治癒を改善できるという可能性を上げる。
【０００９】
成熟したＨｏｘＢ１３ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて、平癒している皮膚摘出および切開性損傷の研究はＨｏｘＢ１３  ＫＯ損傷が初期の妊娠胎児性損傷のいくつかの特徴を呈することを証明した。そして、より速い閉鎖、増加した引張強さおよびより真皮に瘢痕化しないことをそれらの原株（ＷＴ）相対物から損傷と比較してとき含んだ。生化学評価で、表皮および真皮ＨＡのレベルがＷＴ皮膚と比較して非傷ついた成体ＨｏｘＢ１３  ＫＯ皮膜分が著しくより高いことが分かった。組織学的比較を使用して、切開性損傷が呈するＨｏｘＢ１３  ＫＯは、ＷＴ損傷において、よりＨｏｘＢ１３  ＫＯ損傷のより良い回復する真皮健全性を有する治癒を強化した。ＨｏｘＢ１３は、ＷＴ摘出損傷より急速に、また、近い成人摘出損傷をノックアウトする。ＨｏｘＢ１３  ＫＯ損傷において、コラーゲン凝集はより不安定なおよびより網状である。そして、非傷ついた皮膚のそれに似ている。そして、ＨｏｘＢ１３  ＫＯ損傷のコラーゲン・リモデリングがより通常の真皮建築を再構成していることを示す。成人ＷＴおよびＨｏｘＢ１３  ＫＯ全体皮膚の遺伝子発現のマイクロアレイ分析で、いくつかの表皮性分化標識の表現レベルが非傷ついたＷＴ成人皮膚と比較して非傷ついたＨｏｘＢ１３  ＫＯ成人皮膚において、著しく低下することが分かった。Ｈｏｘｂ  １３の研究は、平癒している（２９-３１）瘢痕のない損傷の改良の潜在的目標として更に慢性Ｈｏｘｂ  １３を癒やしているマウス損傷をノックアウトする。
【００１０】
皮膚に関係する他の要因は、皮膚損傷への胎児の反応が顕著に異なる治癒方法を巻回した成人、最小の炎症だけを有する手続き、最小の線維芽細胞増殖および基本的コラーゲン沈着だけの中でそれ。ＰＤＧＦが調節を癒やしている成人損傷において、重要な役割を果たすことは公知であるので、胎児の創傷部位の細胞および細胞外マトリックス・イベント上の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の効果は調査された。ＳＩＬＡＳＴＩＣ損傷インプラントは、子宮内でいずれの１、３または５日後にも収集された。標本は、標準組織学的処理を受けて、評価された。ＰＤＧＦ治療をうけているインプラントは、急性炎症、線維芽細胞補充およびコラーゲンの著しい増加およびヒアルロン酸の酸性沈降を有した。これらの違いは主にｔｉｍｅ-および用量依存的ＰＤＧＦであるように見えた、そして、データは胎児の修理がＰＤＧＦがない場合進行することを示唆する。
【００１１】
瘢痕のない胎児性治癒の鍵となる特徴は、損傷しているイベントに応答する炎症の不足であるように見える。対照的に、胎児のおよび成体皮膚年後半の損傷治癒の初期の相は、強い炎症性の反応および結局損傷域の永続的な瘢痕によって、特徴づけられる。インターロイキンＩＬ-６およびＩＬ-８が胎児の損傷修理において、研究されると共に、瘢痕のない治癒の他の古典的な炎症性規定能の役割はわかっていない。Ｓｍａｄ３タンパク質は、トランスフォーミング成長因子β超科の部材によって、細胞内シグナリングを伝達することに関係していて、平癒している皮膚損傷に、回動マトリックスの細胞激増、分化、移動および仕上げにおいて、重要な役割を果たす。Ｓｍａｄ３およびホルモン・シグナリング間の漏話は、細胞動作を制御している重要な制御メカニズムとして、生体外で示唆された、しかしながら、生体内その関連は、知られていない。アッシュクロフトＧＳその他は、Ｓｍａｄ３が生体内エストロゲン変調への反応でなくにおいて、損傷治癒のアンドロゲンにより媒介される抑制において、役割を果たすと報告した。無効な雌のマウスが呈した原株およびＳｍａｄ３は以下の卵巣切除術を癒やすことを遅延させた。そして、それはエストロゲン置換によって、逆転できる。対照的に、去勢は、原株男性マウスの治癒を加速して、外因性アンドロゲン処理によって、可逆性であった。興味をそそるように、アンドロゲン・レベルの変調は、ＳｍａｄＳヌル・マウスの治癒反応の識別可能な混乱に結果としてならなかった。変異体単球は、一応は原株細胞と類似の（抑制マクロファージ単球が、因数に分解する）特定の炎症誘発性剤を生産するようにされるリポポリサッカライドでありえたが、エストロゲンにより誘発されたマクロファージ抑制要因抑制への通常の反応を維持すると共に、抑えた反応をアンドロゲンにより媒介される刺激に示した。これらのデータは、ＳｍａｄＳが通常の損傷を癒やしている反応の間、信号を送っているアンドロゲンを伝達することで役割を果たすことを示唆して、アンドロゲンによって、ＳｍａｄＳを炎症細胞活性の変調に関係させる。
【００１２】
フイブロネクチン（ＦＮ）は、マルチ汎関数である、粘着力タンパク質、そして、損傷を癒やしている方法のｍｕｌｔｉ-ステップに関与している。強い証拠は、ＦＮタンパク質多様性が選択的ＲＮＡスプライシングにより制御されることを示唆する、調整転写およびＲＮＡプロセシング（すなわち現像）-ａｇｅ-および組織／細胞は、ｔｙｐｅ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄした。このモデルのＦＮ遺伝子およびさまざまな継がれた形の表示、調節および生物学的機能は、知られていない。航空路および皮膚切開性損傷は、胎児の（妊娠日２１-２３）ｗｅａｎｌｉｎｇしている（４-６週）および、成熟した（>６ヵ月）ウサギにおいて、なされた。表現プロフィールはｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイを使用して得られた、そして、興味があるｃＤＮ  ＡｓはリアルタイムＰＣＲによって、クローンをつくられて、配列決定されて、確認された。ＦｎＩおよびＳｆｒｓ３反訳記録の増加したレベルは、航空路粘膜損傷をｗｅａｎｌｉｎｇする際の最高４８ｈ維持された。出産後の航空路粘膜損傷の２つの遺伝子の拡大は皮膚損傷のそれより顕著であった。そして、出産後の航空路粘膜損傷のＳｆｒｓ３およびＦｎＩ遺伝子の関係が組織特異的なことを示した。ＳＲｐ２０が実際ＦＮの選択的スプライシングに関係しているという、そして、胚ＦＮ異型が平癒している成人損傷の間、再び現れるという証拠が、ある。Ｓｆｒｓ３の強化された分子活性および出産後の航空路粘膜損傷修理の初期のイベントの間の選択的スプライシングによるＦＮ遺伝子発現の調節との結合は、提案された。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、比較的簡単なおよびダイレクト方法をノックダウンまたは沈黙（理論的にいかなる遺伝子（３３、３４）も）に提供する配列特異的ＲＮＡ分解プロセスである。自然に生じるＲＮＡ干渉において、二重鎖ＲＮＡは、小さい干渉するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子（３’末端の２ｎｔ突出を有する１９-２３のヌクレオチド（ｎｔ）のｄｓＲＮＡ）に、ＲＮアーゼＩｌｌ／ヘリカーゼ・タンパク質（Ｄｉｃｅｒ）により切断される。これらのｓｉＲＮＡｓは、ＲＮＡ-ｉｎｄｕｃｅｄ-ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ-ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれている多成分リボヌクレアーゼに組み込まれる。ｓｉＲＮＡの１つの索は、ＲＩＳＣと関係しているままで、ＲＩＳＣのガイド装置ｓｓｓｉＲＮＡと相補的なシーケンスを有する同族のＲＮＡの方へ、複合体を導く。このｓｉＲＮＡに誘導されたエンドヌクレアーゼはＲＮＡを消化する。それによって、それを不活性化する。研究で化学的に合成された２１-２５ｎｔ  ｓｉＲＮＡｓの使用が哺乳動物細胞のＲＮＡｉ効果を呈することが分かった、そして、ｓｉＲＮＡハイブリダイゼーション（端末で、または、中央において、）の熱力学的安定性は分子の機能（３３、３６、３７）を決定することで中心的役割を果たす。重要なことに、事実潜在的に疾患遺伝子のｍＲＮＡ配列を目標としている多くの可能な候補ｓｉＲＮＡシーケンスのうちどちらが有効なＲＮＡｉ活性を呈するかは、現在高度な信頼によって、予測するのが可能でない。その代わりに、個々に特定の候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配���は、目標とされた遺伝子の発現に対する意図された干渉が発生したかどうか決定するために発生しなければならなくて、哺乳類の細胞培養において、テストされなければならない。ｓｉＲＮＡのユニークな効果は同じ処理の複数の疾患を引き起こしている遺伝子を目標とするために複数のｓｉＲＮＡデュプレックスと結合されることを可能にする。これは、次のことの故である。すべてのｓｉＲＮＡデュプレックスは同じ起源および同じ製造プロセス（３３、３６-４０）源によって、化学的に同種である。
【００１３】
要約すると、成体皮膚の中で平癒している瘢痕のない損傷に関係する分子目標は、よく定められて、評価される。しかしながら、炎症誘発性要因ＴＧＦ-β、炎症プロモータＣＯＸ-２および更なるＨｏｘＢ１３  Ｔｈｅｒｅが必要である分化調節装置を目標としている強力なｓｉＲＮＡデュプレックスがマルチ目標とされたｓｉＲＮＡ組成物にこの種のｓｉＲＮＡデュプレックスを公式化すると定める緊急の必要が、ある。より遠くに、損傷および多くの疾患によって、生じる皮膚損傷を負っている患者の治癒結果を改善するために治療的な方法を提供する必要は、残る。このように、損傷治癒の処置のマルチ目標とされたＲＮＡｉ治療学の強い必要が、さまざまな皮膚状況を患っている患者用にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｅｒ  ＡＪ，  Ｃｌａｒｋ  ＲＡ：  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９９，  ３４１  ：７３８−７４６．
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎ  Ｐ：  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：  ａｉｍｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，  ２７６：７５−  ８１．
【非特許文献３】Ｒｏｗｌａｔｔ  Ｕ：  Ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ２０  ｗｅｅｋ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔｕｓ．  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  Ａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ａｎａｔ  Ｈｉｓｔｏｌ  １９７９，  ３８１  ：３５３−３６１．
【非特許文献４】．  Ｌｉｎ  ＲＹ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｃａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｓｋｉｎ  ｒｅｐａｉｒ．  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  １９９５，  ２２２：１４６−１５４．
【非特許文献５】Ｃｏｗｉｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｄｅｒｍａｌ  ｗｏｕｎｄｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１，  １１．４２４−４３１．
【非特許文献６】Ｋｒｕｍｍｅｌ  ＴＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  （ＴＧＦ−ｂｅｔａ）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  １９８８，  ２３：６４７−６５２．
【非特許文献７】Ｌａｎｎｉｎｇ  ＤＡ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＧＦ−ｂｅｔａｌ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆｅｔａｌ  ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄｓ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  １９９９，  ３４：６９５−７００．
【非特許文献８】Ｓｏｏ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００３，  １６３：２４５９−２４７６．
【非特許文献９】Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＫＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｃａｒｌｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  １９９５，  ３０：１９８−２０２２０２−１９３．
【非特許文献１０】．  Ｓｔｅｌｎｉｃｋｉ  ＥＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｅｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ  １９９７，  ３９：３７４−３８０．
【非特許文献１１】Ｗｈｉｔｂｙ  ＤＪ  ａｎｄ  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＭＷ：  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９１，  １４７：２０７−２１５．
【非特許文献１２】Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＡＢ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ：  ｒａｐｉｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  １９８６，  ８３：４１６７−４１７１．
【非特許文献１３】Ｓｈａｈ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  １，  ２  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒｏｄｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９４，  １０７：１１３７−１１５７．
【非特許文献１４】Ｓｈａｈ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｗｏｕｎｄｓ  ｂｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９２，  ３３９：２１３−２１４．
【非特許文献１５】Ｃｈｏｉ  ＢＭ，  ｅｔ  ａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｗｏｕｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９６，  ７４：１４４−１５０．
【非特許文献１６】Ｗｕ  ＫＫ：  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｏｌｅｓ．  Ｊ  Ｌａｂ  ＣＨｎ  Ｍｅｄ  １９９６，  １２８：２４２−２４５．
【非特許文献１７】Ｗｉｌｇｕｓ  ＴＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＵＶＢ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔ  ２０００，  ６２：３６７−３８４．
【非特許文献１８】Ｓｕｎ  ＷＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００，  １５：７５２−７６１．
【非特許文献１９】Ｇｕｏ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｕｌｃｅｒ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２，  １８３：４１−４５．
【非特許文献２０】Ｓｉｍｏｎ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，  １７：９６３−９７６．
【非特許文献２１】Ｂｌｏｍｍｅ  ＥＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ＳＫＨ−Ｉ  ｍｉｃｅ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００３，１４８：２１１−２２３．
【非特許文献２２】Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｅｃｋｅｒ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２，  １１９：１１８９−１１９５．
【非特許文献２３】Ｍｕｓｃａｒａ  ＭＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｕｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ＮＯ−ＮＳＡＩＤ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＣＯＸ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００，  １２９：６８１−６８６．
【非特許文献２４】Ｆｕｔａｇａｍｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｉｎ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００２，  ８２：１５０３−１５１３．
【非特許文献２５】Ｗｉｌｇｕｓ  ＴＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｗｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２００３，  １１：２５−３４．
【非特許文献２６】Ｍａｃｋ，  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＨｏｘＢ１３  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ａｄｕｌｔ  ｓｋｉｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００３  Ｊｕｌ；１７（１０）：１３５２−４．  Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｍａｙ  ２０．
【非特許文献２７】Ｍａｃｋ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＨｏｘＢ１３  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ａｕｇ  １９；２８０（３３）：２９９０４−ｌ  ｌ．  Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊｕｎ  １７．
【非特許文献２８】Ｓｔｅｌｎｉｃｋｉ，  Ｅ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ  ＰＲＸ−２  ａｎｄ  ＨＯＸＢ  １３  ｉｎ  ｓｃａｒｌｅｓｓ  ｆｅｔａｌ  ｗｏｕｎｄｓ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９９８  ＪｕＩ；  １１  ｌ（ｌ）：５７−６３．
【非特許文献２９】Ｗｉｌｇｕｓ，  Ｔ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｗｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  ２００３  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；ｌ  ｌ（ｌ）：２５−３４．
【非特許文献３０】Ｍａｎｕｓ，  Ｍ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｐ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ  （２００２）  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ３（１０）：７３７−７４７．
【非特許文献３１】Ｌｕ，  Ｐ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ５（３）：２２５−２３４．
【非特許文献３２】Ｋｉｍ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｉＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｐａｔｈｗａｙ  ｇｅｎｅｓ；  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｈｅｒｐｅｔｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６５  （６）：  ２１７７−８５．
【非特許文献３３】．  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｚａｍｏｒｅ，  Ｌｅｈｍａｒｍ，  Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９９９），  Ｇｅｎｅｓ  &  Ｄｅｖ．  １３：  ３１９１−３１９７．
【非特許文献３４】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ  （２００１）．  Ｇｅｎｅｓ  &  Ｄｅｖ．  １５：  １８８−２００．
【非特許文献３５】Ｋｉｍ，  ＤＨ，  Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｓＲＮＡ  Ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＲＮＡｉ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙｉ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｆｅｂ；２３（２）：２２２−６．
【非特許文献３６】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｓｉＲＮＡ  ｉｓ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−  ａｎｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ｌｅｎｇｔｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．  ＲＮＡ．  ２００６，１２（６）：９８８−９３．
【非特許文献３７】．  Ｆｅｄｏｒｏｖ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．  Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ｓｉＲＮＡ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｏｘｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  ＲＮＡ．  ２００６，  １２（７）：  １１８８−９６．
【非特許文献３８】Ｌｕ，  Ｐ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｗｏｏｄｌｅ  （２００５）  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｃａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｉｎ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｐ  ３０３−３１７．
【非特許文献３９】Ｌｕ，  Ｐ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １１（３），  １０４−１３．
【非特許文献４０】Ｌｕ  ＰＹ，  Ｘｉｅ  Ｆ，  Ｗｏｏｄｌｅ  ＭＣ．  （２００５）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ５４：１  １７−４２．
【非特許文献４１】Ｌｅｎｇ，  Ｑ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｘｓｏｎ  ＡＪ．  Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒａｆ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  （２００５），  １−９．  Ｓｅｅ  ａｌｓｏ  ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｆｃｇｉ？ａｒｔｉｄ＝２９７４７；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ｍａｒｃｈ  １５；  ２９（６）：  １３３４−１３４０．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  （Ｃ）  ２００１  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ，  Ｑｉｎｇ−Ｒｏｎｇ  Ｃｈｅｎ，  Ｌｅｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｓａｎｆｏｒｄ  Ａ．  Ｓｔａｓｓ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｊａｍｅｓ  Ｍｉｘｓｏｎ］
【非特許文献４２】Ｓｕｔｔｏｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｉＲＮＡ  ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００６：  １（２）  １５５−１６２
【非特許文献４３】Ｂｒａｕｎ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ／ＤＮＡ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ａｓ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．  ＳｃＬ，  ９４（２）  （２００５）．
【非特許文献４４】Ｗｏｏｄｌｅ，  ＭＣ  ａｎｄ  ＰＹ  Ｌｕ，  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｎｏｔｏｄａｙ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００５，  ３４−４１．
【非特許文献４５】Ｘｉｅ，  Ｙ．Ｆ．，  Ｍ．  Ｗｏｏｄｌｅ  ａｎｄ  ＰＹ  Ｌｕ．  Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  ２００６  Ｊａｎ；ｌ  ｌ（ｌ−２）：６７−７３．
【非特許文献４６】Ｌｉ  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｕｓｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ．２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １１，  ９４４−９５１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
出された特許および公表された出願を含んで、すべての刊行物および登録番号により確認されるデータベース・エントリは、それらの全部において、本願明細書に引用したものとする。本発明は皮膚損傷を治療する際の使用のためのｓｉＲＮＡ分子に関する。本発明は二重鎖（二重）オリゴヌクレオチドから成る小さい干渉するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を形成する。そこにおいて、オリゴヌクレオチドは一本鎖（ｓｓ）目標ＲＮＡ分子の補完的なヌクレオチド配列を目標とする。ｓｓ目標ＲＮＡ標的分子は少なくともペプチドの一部をコード化しているｍＲＮＡまたは活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進するタンパク質である、または、活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する調節性の分子として機能することはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【００１６】
分子は、組成物を主題に与えるために提供するために、薬学的に受け入れられるキャリアに加えられる。実施例において、構成は薬学的に受け入れられるキャリアおよび少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子から成る。そこにおいて、各ｓｉＲＮＡ分子は炎症誘発性経路遺伝子、プロ脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路遺伝子からなる群から選択される遺伝子をコード化するｍＲＮＡ分子を結合する。
【００１７】
本発明も方法を主題の真皮であるか表皮性損傷を治療するために提供する。そこにおいて、損傷は炎症および新血管形成によって、部分的には、少なくとも特徴づけられる。方法は主題に本発明および薬学的に受け入れられるキャリアの少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子から成る構成を与えることを含む。そこにおいて、分子は損傷を癒やす際の病理学的であるか望まれていないプロセスを促進する少なくとも一つの遺伝子の表示を禁止する。
【００１８】
本発明の方法および組成物は、皮膚損傷治癒および他の皮膚状況の改良に役立つ。  
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図Ａ】損傷治癒のための図ａ．ナノ粒子-ＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡ。４つのグループの中で、グループ２は、５番目に日上のｓａｍｌｌｅｒ損傷を示して、９番目に日上の完了された閉鎖を成し遂げた。ＨＫポリマー・ナノ粒子（グループ３）のない唯一の作動中のＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡはより弱い結果を示した、そして、制御ｓｉＲＮＡはＨＫポリマーによって、さえパックされる効果を示さなかった。
【図１】原株のヘマトキシリンおよびＥｏｓｉｎ油焼けは、唇を使って、皮膚を後退させる。
【図２】ＷＴのコラーゲン組織およびＨｏｘｂｌ３は、損傷生検をノックアウトする。
【図３】ＷＴから分離される始原真皮線維芽細胞を使用している損傷分析をひっかく、そして、Ｈｏｘｂｌ３はマウスをノックアウトする。
【図４】ネズミ上皮ケラチノサイト（ＲＥＫ）を表しているＨＯＸＢ  １３の減らされた増殖速度。
【図５】日５の異常な分化のＨＯＸＢ  １３結果の過剰発現は、培養組織を持ち上げた。
【図６】ＧＦＰ-ＨＯＸＢ  １３タンパク質は、ＲＥＫおよび２９３の細胞（ヒト上皮細胞）の核に局所化される。
【図７】マウスＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲｌおよびＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡ上の目標とされたシーケンスのＡ．Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ。ビトロのｓｉＲＮＡトランスフェクションの後のＢ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆｍＲＮＡノックダウン。
【図８】ｓｉＲＮＡｓを目標としているＶＥＧＦ経路遺伝子の地方への配送は、ＣｐＧ  ＯＤＮにより誘発された脈管形成を阻害する。
【図９】ＨＫポリマーが腫瘍内配達を伝達したあと、Ｒａｆ-１  ｓｉＲＮＡは生体内で腫瘍成長を阻害する。
【図１０】ＰＣ３細胞合計ＲＮＡサンプルの全３つのｍＲＮＡ種のシーケンスの検出。
【図１１】ＴＧＦ-β-１  ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞の目標とされた遺伝子発現を著しくノックダウンすることが可能である。
【図１２】共同ｘｌ  ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞の目標とされた遺伝子発現を著しくノックダウンすることが可能である。
【図１３】Ｈｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞の目標とされた遺伝子発現を著しくノックダウンすることが可能である。
【図１４】強力なｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓの選択のためのＲＴ-ＰＣＲ分析。対応する遺伝子を目標としている３つのｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓのサイレンシング動作は、ゲル電気泳動分析により示された。Ａ．Ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ  ＴＧＦｓｉ-βターゲッティングＴＧＦ-βは、人間およびマウス細胞のサイレンシング動作に基づいて確認された。Ｂ．Ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ  ＣＸｓｉ-Ａターゲッティング・コックス-２は、ヒト細胞のサイレンシング活性に基づいて確認された。Ｃ．Ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ  Ｈｘｓｉ-ＡターゲッティングＨｏｘｂｌ３は、ヒト細胞のサイレンシング活性に基づいて確認された。
【図１５】摘出マウス皮は、モデルを回した。対照群のＡ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎおよびＤａｙ  １、３および５の治療群。Ｄａｙ  ５ｏｆにＢ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ、全層摘出皮膚が損傷する対５ｍｍの直径は、両側ｆｏにつくったＣ５７マウスの中で背面の正中。マウス皮膚サンプルから分離される全ＲＮＡからの標的遺伝子表現のＣ．ＲＴ-ＰＣＲ検出。
【図１６】生体内のｓｉＲＮＡ送出のためのＨＫポリマー。ＨＫＰが水溶液のｓｉＲＮＡと混ざるときに、ナノ粒子は左パネルに示すように形成された。そして、Ｓｃａｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＳＥＭ）により観察された。ＨＫポリマーの２つの種が、皮膚損傷ｓｉＲＮＡ送出のために使われた。
【図１７】Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇのための動物のＳｋｉｎ  Ｍｏｄｅｌ。摘出使用マウス皮は、ＴＧＦβ-１-ｓｉＲＮＡのナノ粒子の強化された局在配達の治療的な利益を分析するために、モデルを回した。１０匹のマウスが、後ろの皮膚上の２つの損傷によって、用いられた。各損傷の直径は計量された、そして、各損傷のイメージは写真画像によっても記録された。
【図１８】ナノ粒子-ＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡの治療的な利点は、標的遺伝子ノックダウンの結果であった。ＲＴ-ＰＣＲ分析はいずれの特定のｓｉＲＮＡを有するＴＧＦβ-１特定のノックダウンも示した、または、カクテルｓｉＲＮＡはＴＧＦβ-１特定のｓｉＲＮＡを含む。より低い列は、遺伝子発現を保っている住宅を示す。
【図１９】Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇのためのナノ粒子-ＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡ。４つのグループの中で、グループ２は、５ｌ、日上のより小さい損傷を示して、９番目に日上の完了された閉鎖を成し遂げた。ＨＫポリマー・ナノ粒子（グループ３）のない唯一の作動中のＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡはより弱い結果を示した、そして、制御ｓｉＲＮＡはＨＫポリマーによって、さえパックされる効果を示さなかった。
【図２０】Ｗｏｕｎｄ  Ｃｌｏｓｕｒｅ上のＨｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡの類似のＥｆｆｅｃｔｓ。ナノ粒子パックされたＨｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡを使用して、我々は、日４および日７で損傷閉鎖に関して定量化された結果を観察できる。ＨＫポリマーによって、パックされるＨｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡは、より良好なおよびより速い損傷閉鎖を有した。
【図２１】ＴＧＦβ-１のためのナノ粒子、Ｈｏｘｂｌ３およびナノ粒子パックされたＴＧＦβ-１、Ｈｏｘｂｌ３およびコックス-２  ｓｉＲＮＡデュプレックスの皮膚配達がよりよく示したコックス-２  ｓｉＲＮＡ送出は、治癒を使用しているマウス皮損傷。
【図２２】を巻回した。ＷＴマウスのコラーゲン組織は、生検を巻回した。柱Ａ：低い拡大のＷＴマウス損傷生検の中で（１０ｘまたは２Ｏｘ）、柱Ｂ：ＷＴマウスの高い倍率（１０Ｏｘ）は、生検を巻回した、柱Ｃ：Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯマウスの低い拡大（１０Ｘまたは２０Ｘ）は、生検を巻回した、柱Ｄ：マウスの高い倍率（１０Ｏｘ）は、生検を巻回した。列１：非傷ついた皮膚、列２：日２０は、生検を巻回した、列３：日３０は、生検を巻回した、列４：日６０は、生検を巻回した。矢は、墨場所を確認する。
【図２３】Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ／Ｃｏｘ-２  ｓｉＲＮＡ処理は、類似の組織構造に結果としてなった。治療された損傷の新真皮は、より通常の真皮のように見える、コラーゲンは、ゆるい構造を混交した。対照的に、虚偽の制御損傷および制御ｓｉＲＮＡ-ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ治療された損傷の新真皮の膠原繊維は、異常な平行したパターンに置かれる。
【図２４】Ｈ２Ｋ４ｂは、強い抗真菌性活性を示した。Ｈ２Ｋ４ｂのいくつかの服用または最高１００ｍｇ／ｍｌ変動しているヒスタチン５は、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓを含んでいるＹＭ（イースト-マルトース）媒体に加えられた。菌類はそれから２４ｈのためのＲＴで回転した、そして、ポリマーによる成長抑制は図２に示すように決定された。実験は三つ組の一つにおいて、実行された、そして、データは手段±標準誤差として描写される。＊、ＰＯ．００１、＊＊、ＰＯ．０１、Ｈ２Ｋ４ｂ対Ｈｉｓｔａｔｉｎ  ５。
【図２５】ＨＫポリマーの細胞毒性Ｓｔｕｄｙ。ＢＨＫＰ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ３（Ｇ）Ｋ４ｂ（ＰＴ７３）およびＨ２Ｋ４ｂ）のＬＤＨ-細胞毒性分析は、通常の人間の真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）ウシ内皮細胞（ＢＡＥＣ）またはヒト臍の脈管構造内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の媒体に加えられた。細胞毒性は、ＬＤＨ-細胞毒性分析キットにより評価された。実験値は、３つの実験の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明はさまざまなｓｉＲＮＡ分子（分子を含んでいる組成物）およびそれらの使用方法に関する。そして、それは皮膚の損傷治癒を促進することの方向を目指す。
【００２１】
本発明は二重鎖（二重）オリゴヌクレオチドから成る小さい干渉するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を形成する。そこにおいて、オリゴヌクレオチドは一本鎖（ｓｓ）目標ＲＮＡ分子の補完的なヌクレオチド配列を目標とする。ｓｓ目標ＲＮＡ標的分子は少なくともペプチドの一部をコード化しているｍＲＮＡまたは活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進するタンパク質である、または、活性が皮膚組織の炎症、損傷治癒または瘢痕形成を促進する調節性の分子として機能することはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。実施例において、目標ｍＲＮＡ分子は、炎症誘発性経路遺伝子、プロ脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路遺伝子のグループから選択される遺伝子をコード化する。好ましくは、遺伝子は、Ｈｏｘｂｌ３、ＴＧＦ-βｌ、ＴＧＦ-β２またはコックス-２である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡシーケンスは、少なくとも、各デュプレックスが同じ遺伝子を人間およびマウスまたは人間以外の霊長類を目標とすることができて、妨げることができるこの種の方法で準備される。ある種の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも一つのタンパク質をコード化するｍＲＮＡ分子と結合する。更なる実施例において、分子がｍＲＮＡ分子に結合するｓｉＲＮＡは、少なくとも一つのヒト・タンパク質をコード化する。まだ付加的な実施例において、ｓｉＲＮＡ分子は、ヒトｍＲＮＡ分子に、そして、相同的マウスｍＲＮＡ分子（すなわち同じであるか類似のタンパク質をコード化するそれぞれの種のｍＲＮＡ）に結合する。各種実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、表２-９にリストされる目標ｍＲＮＡコード配列に関して造られる。
【００２２】
実施例において、ｓｉＲＮＡ分子は、１９-２７の塩基対の長さを有する。分子は、両端のブラントエンドまたは両端または各々の一つの粘着性の端を有することができる。ｓｉＲＮＡ分子は個々のヌクレオチドレベルで、または、オリゴヌクレオチド・バックボーン・レベルで化学修飾を含むことができる、または、それは変更態様を有することができない。
【００２３】
分子は、組成物を主題に与えるために提供するために、薬学的に受け入れられるキャリアに加えられる。好ましくは、主題は、人間である。
【００２４】
実施例において、構成は薬学的に受け入れられるキャリアおよび少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子から成る。そこにおいて、各ｓｉＲＮＡ分子は炎症誘発性経路遺伝子、プロ脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路遺伝子からなる群から選択される遺伝子をコード化するｍＲＮＡ分子を結合する。さらに他の実施例では、各ｓｉＲＮＡカクテルは、少なくとも３つの異なる遺伝子配列を目標とする少なくとも３つのｓｉＲＮＡデュプレックスを含む。好ましくは、各遺伝子は、異なる経路から選択される。ｓｉＲＮＡ分子の混成である構成は、「カクテルと称されることができる。」少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子を有するカクテルのいくつかの実施例において、カクテル混合は、表Ａ、Ｂ、Ｃにリストされる混合から選択される、または、Ｄ．Ｏｎｅ具体例は、表Ａ（そこにおいて、ｓｉＲＮＡ）において、開示される、（感覚：５’-ｃａａｇｇａｕａｕｃｇａａｇｇｃｕｕｇｃｕｇｇｇａ-３フィート（アンチセンス）：５’-ｕｃｃｃａｇｃａａｇｃｃｕｕｃｇａｕａｕｃｃｕｕｇ-３フィート）人間およびマウスＨｏｘＢ  １３タンパク質（ｓｉＲＮＡ分子）をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひも（感覚：５’-ｇｕｃｕｕｕｇｇｕｃｕｇｇｕｇｃｃｕｇｇｕｃｕｇａ-３フィート（アンチセンス）：５’-ｕｃａｇａｃｃａｇｇｃａｃｃａｇａｃｃａａａｇａｃ-３フィート）人間およびマウスＣＯＸ-２タンパク質をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひもおよびｓｉＲＮＡ分子（感覚：５’-ｃｃｃｃｇｇａｇｇｕｇａｕｕｕｃｃａｕｃｕａｃａａ−３フィート（アンチセンス）：５’-ｕｕｇｕａｇａｕｇｇａａａｕｃａｃｃｕｃｃｇｇｇｇ-３フィート）人間およびマウスＴＧＦ-β１をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひも。表Ａにおいて、開示される更なる具体例において、ｓｉＲＮＡ（感覚：５’-ＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＵＧＵＧＵＵ-Ｓ、『アンチセンスの：５’-ＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣＣＡＣＣ-３フィート）両方とも人間およびマウスをコード化するｍＲＮＡ分子を目標とするＨｏｘｂｌ３タンパク質（少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子）（感覚：５’-ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ-３フィート（アンチセンス）：５’-ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣ  ＡＧＧＣ  ＡＣＣＡＧＡＣＣ-３、『）人間およびマウス・コックス-２タンパク質および少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子をコード化するｍＲＮＡ分子を目標とする（感覚：５’-ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ-３フィート（アンチセンス）：５’-ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵ  ＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ-３フィート）人間およびマウスＴＧＦ-β１をコード化するｍＲＮＡ分子を目標とする。
【００２５】
表Ｃで開示される他の具体例において、ｓｉＲＮＡ（感覚：５１-ｃａａｇｇａｕａｕｃｇａａｇｇｃｕｕｇｃｕｇｇｇａ-３フィート（アンチセンス）：５’-ｕｃｃｃａｇｃａａｇｃｃｕｕｃｇａｕａｕｃｃｕｕｇ-３フィート）人間およびマウスＨｏｘＢ１３タンパク質（ｓｉＲＮＡ分子）をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひも（感覚：５’-ｇｇｕｃｕｇｇｕｇｃｃｕｇｇｕｃｕｇａｕｇａｕｇｕ-３１、アンチセンスの：５’-ａｃａｕｃａｕｃａｇａｃｃａｇｇｃａｃｃａｇａｃｃ-３フィート）人間およびマウスＣＯＸ-２タンパク質（ｓｉＲＮＡ分子）をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひも（５’-ｃａｃｇａｇｃｃｃａａｇｇｇｃｕａｃｃａｕｇｃｃａ-３フィート（アンチセンス）：５’-ｕｇｇｃａｕｇｇｕａｇｃｃｃｕｕｇｇｇｃｕｃｇｕｇ-３フィート）人間およびマウスＴＧＦ-βｌタンパク質をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひもおよびｓｉＲＮＡ分子（感覚：５’-ｃｃｇｇａｇｇｕｇａｕｕｕｃｃａｕｃｕａｃａａｃａ-３フィート、そして、アンチセンスの：５’-ｕｇｕｕｇｕａｇａｕｇｇａａａｕｃａｃｃｕｃｃｇｇ-３フィート）人間およびマウスＴＧＦ-β２タンパク質をコード化するｍＲＮＡ分子に対するひも。
【００２６】
更なる実施例において、ｍＲＮＡ分子は、一つ以上のＨｏｘＢ  １３経路遺伝子、ＣＯＸ-２経路遺伝子、ＴＧＦ-β経路遺伝子またはそれらの組み合わせをコード化する。まだ付加的な実施例において、ｍＲＮＡ分子は一つ以上のｐｒｏ-脈管形成遺伝子、炎症誘発性遺伝子またはそれらの組み合わせをコード化する。そして、さらに他の実施例で、ｍＲＮＡ分子は一つ以上のプロ炎症遺伝子またはそれらの組み合わせをコード化する。カクテルの更なる実施例において、その中の少なくとも３つのｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも２つ以上の異なるｍＲＮＡ分子と結合する。
【００２７】
まだ付加的な実施例において、ｓｉＲＮＡ分子の混成は、表ＥＨに示される混合物から選択される。
【００２８】
これまでに付加的な実施例において、ｓｉＲＮＡカクテルは、炎症誘発性経路遺伝子、ｐｒｏ-脈管形成経路遺伝子およびプロ細胞増殖経路遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の表示を禁止する。具体例において、ｓｉＲＮＡカクテルは、複数の遺伝子の表示を禁止する。付加的な実施例において、ｓｉＲＮＡカクテルが表２、３、４および５にリストされるそれらを目標とする。そして、ＨｏｘＢ  １３（ＴＧＦ-ｂｅｔａｌな）の表示を禁止するシーケンスを含むことＴＧＦ-ｂｅｔａ２および両方の人間およびマウス細胞のＣＯＸ-２。さらに他の実施例において、ｓｉＲＮＡカクテルは、ＰＤＧＦａ、ＶＥＧＦＡ  ＦＧＦ-２および人間およびマウス細胞のＬａｍｉｎ  Ｂｌタンパク質の表示を禁止する表６、７および９に示されるシーケンスを含む。なお更なる実施例において、ｓｉＲＮＡカクテルは、１時に少なくとも３つのｓｉＲＮＡデュプレックスを含む：１  ：１つの比率または１：１．５：０．５の比率または０．５：０．５：２つの比率、か何かは、二重各ｓｉＲＮＡの効力およびアプリケーションの治療的な要件に従って比率で表す。
【００２９】
更なる本発明は、薬学的に有効なキャリアを疾患組織および細胞にｓｉＲＮＡカクテル送出を強化するために提供する。
【００３０】
構成の各種実施形態において、キャリアは、食塩溶液、糖液、ポリマー、脂質、クリーム、ゲルおよびミセル者材料からなる群から選択される一つ以上の構成要素から成る。更なる構成要素またはキャリアはポリカチオン性の結合剤、カチオン脂質、カチオンのミセル、カチオンのポリペプチド、親水性ポリマー融合するポリマー、非自然のカチオンポリマー、カチオンのポリアセタール、親水性ポリマー移植されたポリアセタール、リガンドｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄされたカチオンポリマーを含む、そして、リガンドｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄされた親水性ポリマーはポリマー、生物分解可能なポリエステル類、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ（乳共同-グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（ＰＥＧ-ＰＥＩ（ポリエチレングリコールおよびポリエチレン＝イミン）Ｐｏｌｙ-Ｓｐｅｒｍｉｎｅ（スペルミジン）およびポリ・アミド・アミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマ）を移植した。構成の更なる実施例において、キャリアはｓｉＲＮＡ分子を含んでいるナノ粒子を形成すると考えられているヒスチジン-リジン・コポリマーである。そこにおいて、ナノ粒子は-４００が局所投与のためのＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅゲルによって、公式化されて直径走らせた約１００のサイズを有する。ｓｉＲＮＡ分子は、次の工程により確認されることができる：１）ｓｓ目標ＲＮＡ分子（前記ｓｉＲＮＡ分子のターゲッティング要素がヌクレオチドのさまざまなシーケンスから成る）の補完的なヌクレオチド配列を目標とするように設計された一まとまりのｓｉＲＮＡデュプレックスを作成すること、２）生体外で前記標的分子に対して最も高い所望の効果を示すｓｉＲＮＡ分子を選択すること、３）動物の選択されたｓｉＲＮＡ分子を評価することは、モデルを回した、そして、４）モデルにおいて、最も大きな有効性を示すｓｉＲＮＡ分子を選択すること。薬学的に受け入れられるキャリアはステップ（２）によって、医薬品組成物を形成するように選択されるｓｉＲＮＡ分子の各々に加えられることが可能である。そして、それぞれは動物の損傷モデルにおいて、評価される。好ましくは、動物の損傷モデルは、Ｈｏｘｂｌ３遺伝子を取り除いたマウスのリップ摘出損傷モデルまたはＨｏｘｂｌ３遺伝子を取り除いたマウスの後ろの摘出損傷モデルである。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、両方の動物モデルにおいて、評価される。目標とされた遺伝子が疾患組織の異なる細胞タイプを中で表すことができるので、特定のｓｉＲＮＡカクテルの有効性は試験されて、細胞培養だけでなくにおいて、動物病モデルにおいても確認される。好ましくは、カクテルの治療的な利益が単独で単一のｓｉＲＮＡ成分の治療的な利点より良好であるように、ｓｉＲＮＡカクテルの構成要素は選択される。
【００３１】
本発明も、ｓｉＲＮＡカクテルが最も強力な相乗効果を達成できるために各デュプレックスの適当な比率を準備するために、方法を提供する。実施例において、比率は、制御シーケンスのそれと比較して標的配列の表現レベルを決定することにより決定される。より高い表している標的配列は、対応するｓｉＲＮＡ分子のより高い比率を必要とする。
【００３２】
本発明も、方法を主題の真皮であるか表皮性損傷を治療するために提供する。損傷は、物理的な損傷、燃焼、アレルギー、糖尿病性疾患、炎症または腫瘍によって、生じることができる。損傷は、炎症および新血管形成によって、部分的には、少なくとも特徴づけられることが可能である。方法は、主題に本発明の少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子から成る構成を与えることと薬学的に受け入れられるキャリア（分子が損傷を癒やす際の病理学的であるか望まれていないプロセスを促進する少なくとも一つの遺伝子の表示を禁止する）とを具備している。構成は、当業者に知られている塗剤、スプレー、経皮パッチまたは他の方法で適用されることができる。
【００３３】
成功したｓｉＲＮＡにより媒介される治療だけでなく目標および、目標組織に対する。そして、細胞質（４１-４３）への効果的な生体内の配達にも以外、活性ｓｉＲＮＡ分子の配列の識別に依存する。平癒している皮膚損傷の処置のためのｓｉＲＮＡカクテル製剤の配送のルートは、適当な臨床的に確認されたキャリアでローカルでなければならないおよび、局所でなければならない。ｉｍｉｑｕｉｍｏｄを使用することに加えて、ｓｉＲＮＡカクテル局所用処方のためのキャリアとしての５％のクリーム、ヒスチジン-リジン・ポリマー（ＨＫＰ）（４４）を含む３つのポリマー系キャリア、ｐｅｇｙｌａｔｅｄされたＰＥＩ（４５）およびＰＡＭＡＭデンドリマ（４６）は、特に役立つキャリアである。
ｓｉＲＮＡカクテルは、プロ脈管形成遺伝子、炎症誘発性遺伝子、瘢痕形成を促進する遺伝子またはそれらの組み合わせの表示を禁止する。この方法のなお更なる実施例において、ｓｉＲＮＡは、表２-９に示される標的配列に対して使用される。この方法のこれまでに付加的な実施例において、方法で使用されるカクテルは、表Ａ-Ｈにおいて、開示されるｓｉＲＮＡ分子の混合物のうちの１つである。
【００３４】
実施例
実施例１。リップＳｕｒｇｅｒｙ  Ｍｏｄｅｌ  Ｆｏｒ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｈｅｒｅは、マウスが回復したＨｏｘＢ１３  ＫＯの背中の皮膚損傷が瘢痕化することを減らしたことを示している以前の調査からの結果である。リップ皮膚組織の筋肉および脂肪層が上の背面の後ろの皮膚のそれよりそれほど構成されなかった時からマウスが回復するＫＯのリップ損傷が瘢痕形成を減らしたかどうか、後部およびリップ皮膚の可能な違いは問題を起こした。我々は、最初に後部および舌区域の構造を比較した。後ろの皮膚構造とは異なり、舌区域の筋肉および脂肪層は、異なった層（図１）に組織されない。舌区域の変えられた構造が損傷を癒やしている方法に影響するかどうかは、不明であった。損傷を癒やしている方法を研究するためにマウス唇手術モデルを使用する可能性を明らかにするために、我々は、唇裂および口蓋手術を模倣するために、マウス唇手術モデルを決めた。全麻および無菌の状況の下で、ＨｏｘＢ１３  ＫＯおよびＷＴ成人マウス（８-１６週間目）はそれらの前歯と並列の切開性損傷が損傷を縫合する（６．０のＮｙｌｏｎ）ことによって、続いた単一の０．５ｃｍの完全な厚み皮膚を与えられた。そして、唇裂および口蓋手術を模倣した。損傷が追跡されることができるように、１０％の無菌の墨は管理された。各動物は、手術の後、個々に収容された。リップ損傷生検は、組織学的もののために集められて、免疫組織学的で、各所望の時点の遺伝子発現分析であった。ＨｏｘＢ１３の表示は、ＷＴマウスＨｐ皮膚組織から分離される完全ＲＮＡサンプルを有するＲＴ-ＰＣＲによって、マウス唇皮膚において、確認された。逆転写は、バイオラドｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して実施された。ＰＣＲは、前方のプライマ、５フィート  -  ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ-３フィートおよび復帰プライマ、５’-ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＧ-３フィートにより実行された。ＨｏｘＢＢ製品は、シークエンシング（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ  Ｉｎｃ）により検出されて、確認された。
【００３５】
実施例２。唇の設立が巻回したＨｏｘＢ１３  ＫＯ  Ｍｉｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｃａｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇはモデル化する、ＨｏｘＢ１３  ＫＯマウス（優しく、マリオ・レナト・カペッキ博士によって、設けられる）は同一の手術を受けた。ＫＯマウスは、ＷＴ（ＷＴおよびＫＯマウスが同じ遺伝子の背景を有することを確実にする少なくとも１０世代のためのＣ５７ＢＬ６マウス）によって、後ろに交差した。リップ切開損傷生検は日２０、３０および６０の損傷から集められた、そして、コラーゲン組織はマソンＴｒｉｃｈｒｏｍｅコラーゲン油焼け（図２）で測定された。日２０（Ｂ-Ｄａｙ２０）および３０の（Ｂ-Ｄａｙ３０）損傷はより密度の高いコラーゲン油焼けを示した、そして、ＨｏｘＢ１３において、よりＷＴのより大きな損傷収縮はマウスをノックアウトする。事実、野生型マウスのコラーゲン収縮は、我々が日２０および３０が損傷する日において、同時に収縮したコラーゲンおよび周囲のコラーゲンに集中することができなかったように強かった。日６０で、ＷＴコラーゲンは濃い、しかし、収縮は顕著なものではなく、日２０および３０が損傷する日としてある。対照的に、ＨｏｘＢ１３  ＫＯマウスは日２０、日３０および日６０損傷生検でゆるいコラーゲン組織を示した。そして、ノックアウト・マウス（上の背面の後部において、観察されたことと整合した）の舌区域の減らされた瘢痕形成を示唆した。
【００３６】
実施例３。Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅおよび次のＭｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＷｅがＷＴおよびＫＯマウス第一線維芽細胞活動を比較したＨｏｘＢ１３  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄビトロ。始原真皮線維芽細胞は、３日の古い生まれたばかりのマウスから準備された。マウスは、頚椎脱臼によって、安楽死して、７０％のエタノールによって、不妊化された。皮膚は、４５分間の２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンをもつＰＢＳにおいて、収集されて、浸漬された。皮膚は、それから４０Ｃで終夜２５単位／ｍｌ／ｍｌの逆パセ溶液（シグマ）において、浮いた。表皮層は、微細な先端鉗子を使用している皮層から切り離された。表皮層は、ケラチノサイトを分離するために、更に処理された。皮層は、１時間の３７  ０Ｃで、１００単位／ｍｌの粗コラゲナーゼ（シグマ）において、更に処理された。細胞濾過器（ファルコン、７ＯｕＭ）による濾過の後、細胞は、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ高グルコースの組織ペトリ皿において、塗布されて、分析のために使われる前に、二度を二次培養した。増殖分析のために、セルは、９６穴プレートの５０００／ｗｅｌｌで播種された。ＭＴＴ更なる分析は、毎日実行されて（分子Ｐｒｏｂｅ、ＣＡ）ＨｏｘＢ１３ノックアウト線維芽細胞の減らされた増殖活動を示した。この結果は、血球計数器（示されないデータ）を使用している手の細胞計数方法により確認された。ＨＯＸＢ  １３がアポトーシスの経路（Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓその他、２００３）のニューロン細胞増殖活性化因子のインヒビターであると報告された。従って、ＨｏｘＢ１３ノックアウト線維芽細胞の増殖速度は増加すると思われた。そして、それは我々が観察したものと対照的にある。ＨｏｘＢ１３の役割が特定の細胞種でもよいかもしれない。事実、ＨｏｘＢ１３の余分の表示は前立腺ガンと相関していた、そして、ＨｏｘＢ１３は前立腺ガン（エドワーズその他、２００５）のためのバイオマーカであることが提案された。加えて、我々は、切開性損傷を模倣するために、生体外かき傷損傷分析を実行した。この分析のために、主要な真皮線維芽細胞ペルがよくそうであった２ｘ１０５は、６枚のウェルプレート（コラーゲンＩ型、タイプＩＶまたはフィブロネクチンでプレコートされた）に実を結んだ。細胞は、それから２４時間の０．２％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ高グルコースにおいて、暖められた。それから、ＩｍＩ  ＰｉｐｅｔｍａｎＴＭについての情報は、すきまをつくるために細胞単層をひっかくために用いた。すきまのパーセンテージは４時間後に閉じた、そして、ＤＭＥＭ／０．２％のＦＢＳの２４時間の培養はオリンパスＭｉｃｒｏｓｕｉｔｅソフトウェアを使用して測定された。血小板由来成長因子Ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、ＷＴの移動に対するその効果をモニタして、線維芽細胞をノックアウトするために加えられた。図３において、示されるにつれて、被覆されているコラーゲンＩ型、タイプＩＶおよびフィブロネクチン上のＰＤＧＦがない場合ＷＴ線維芽細胞が４ｈのｐｏｓｔ-で損傷することに表面をつけるより、ＨｏｘＢ１３  ＫＯ線維芽細胞はより遅い遊走率を呈した。加えて、ＨｏｘＢ１３  ＫＯ線維芽細胞は、ＰＤＧＦ刺激に応答した。２４時間のポストを損傷することで、活性があった遊走の違いは、発音した。
【００３７】
実施例４。Ｑｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  ＨｏｘＢ１３  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｗｈｅｎ  Ｒａｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ（ＲＥＫ）細胞は、記載されて（小Ｔａｍｍｉ  ａｌ．２０００）液インタフェースを空気に、上がった（細胞が表皮のすべての層に区別するＲＥＫ）。生体外ケラチノサイト分化モデルとしてこれを使用して、我々は、ＲＥＫ層化上のＨＯＸＢ  １３の効果を調査した。ＨＯＸＢ  １３を表しているＲＥＫ細胞クローンは、レトロウイルスのトランスダクションおよびクローンのより抜きによって、得られた。ＨｏｘＢ１３  ｃＤＮＡは、ＣＭＶプロモータの管理下のＭＬＶベクトルに、下位クローンをつくられた。レトロウイルスの粒子は、３つのプラスミドｃｏ-トランスフェクション（Ｌｉその他、２００１）によって、生じた。ＲＥＫ細胞はＭＯＩ-ＩＯだけでＨｏｘＢ１３またはベクトルを有するレトロウイルスの粒子により変換されて、２つのμｇ／ｍｌピューロマイシンにおいて、選択された（注：ｌμｇ／ｍｌピューロマイシンは、すべての非変換された細胞を殺すのに十分である）。ピューロマイシン耐性セルは、ウェル密度につき１つの細胞で３つの９６-ｗｅｌｌ-ｄｉｓｈｅｓに播種された。２週の培養の後、各々の細胞はよく視覚化された、そして、個々のクローンはｌμｇ／ｍｌピューロマイシンにおいて、転送されて、拡大されて、維持された。ＨｏｘＢ１３またはベクトルの表示は、ベクトルにある１つのプライマを使用しているＲＴ-ＰＣＲおよびＨｏｘＢ１３  ｃＤＮＡに位置する他のプライマにより確認された。ＲＥＫと比較してＭＴＴ分析（図４）を使用しているだけのベクトルにより変換されるときに、示されるＨｏｘＢ１３を表すＲＥＫ細胞は増殖速度を減らした。これらのＲＥＫ細胞が空気液インタフェース（図５）に上がるときに、ＲＥＫのＨｏｘＢ１３の過剰発現は過剰な終端の分化に結果としてなった。この結果は、２台の追加ＲＥＫ-ＨｏｘＢ１３クローンで再生された。結論として、ＨＯＸＢ  １３の過剰発現は、ケラチノサイト細胞の増殖および層化に影響を及ぼす。
【００３８】
実施例５。ＨＯＸＢ  １３は、ＨｏｘＢ１３（緑色蛍光タンパク質）の亜細胞性の位置を決定するＧＦＰ-ＨｏｘＢ１３融合タンパク質がＧＦＰの終止コードンおよびＨｏｘＢ１３の開始コードンの除去によって、発生したという命令において、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎである。ＧＦＰ-ＨｏｘＢ１３表現は、ＣＭＶプロモータによって、ドライブされた。プラスミドを含んでいるＧＦＰ-ＨｏｘＢ１３  ｃＤＮＡはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロゲン、ＣＡ）を使用しているＲＥＫまたは２９３Ｔのヒト腎臓上皮細胞にトランスフェクションした、そして、ＧＦＰの表示は２４時間のポスト・トランスフェクションで蛍光顕微鏡の下でモニタされた。ＨｏｘＢ１３表現が胎児性皮膚発現（Ｋｏｍｕｖｅｓその他、２００３）の間、細胞質であるという以前の報告とは対照的に、我々はＧＦＰ-ＨｘｏＢ１３が核に局所化されるとわかった。そして、ＨＯＸＢ  １３が核タンパク質（図６）であることを示唆した。ＨｏｘＢ１３の核移行は、小型分子状阻害剤およびモノクローナル抗体インヒビターによって、アクセス可能であることを非常に困難にする。従って、細胞質のｍＲＮＡ分解によるその表現を沈黙させるｓｉＲＮＡインヒビターのアプリケーションは、論理的治療的な方法を提供する。
【００３９】
実施例６。Ｄｏｕｂｌｅ-要素をもつｓｉＲＮＡｓがＶＥＧＦ-経路要因を目標とするために用意されたＰｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  Ｔｏ  Ｃｏｍｐｏｓｅ  Ｍｕｌｔｉ-Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを確認する：ｍＶＥＧＦ-Ａ（ＸＭ＿１９２８２３）ｍＶＥＧＦＲｌ（Ｄ８８６８９）およびｍＶＥＧＦＲ-２（ＭＮ＿０１０６１２）。２つの標的配列は、各遺伝子から拾われた。これらのシーケンスは、ある（５フィートから３フィートまで）：ｍ  ＶＥＧＦ-Ａ（１．ＡＡＧＣＣＧＵＣＣＵＧＵＧＵＧＣＣＧＣＵＧ、２．ＡＡＣＧＡＵＧＡＡＧＣＣＣＵＧＧＡＧＵＧＣ）、ｍＶＥＧＦＲｌ（１．ＡＡＧＵＵ  ＡＡＡＡＧＵＧＣＣＵＧＡＡＣＵＧ、２．  ＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＵＣＵＣＵＵＵＣ）、ｍＶＥＧＦＲ２（１．ＡＡＧＣＵＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣ、２．ＡＡＵＧＣＧＧＣＧＧＵＧＧＵＧＡＣＡＧＵＡ）。無関係な規制に関しては、ホタル・ルシフェラーゼ（リュック、ＡＦ４３４９２４）から２つのｓｉＲＮＡシーケンスは、リュックとして選ばれた（１．ＡＡＧＣＵ  ＡＵＧ  ＡＡＡＣＧＡＵ  ＡＵＧＧＧＣ、２．ＡＡＣＣＧＣＵＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＵＧＣＡ）。捜している吹付けシーケンスはそれらの目標とされたシーケンスを有するこれらのｓｉＲＮＡｓの特異性を確認した、そして、ｍＶＥＧＦ-Ａ目標は異なるｍＶＥＧＦ-Ａ異性体により共有されるように設計されていた。すべてのｓｉＲＮＡｓは中央の１９ｎｔデュプレックスを有する２１ｎｔ二重鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとして習慣用意されていた、そして、ｄＴｄＴは３つの『-いずれのＲＮＡ索（Ｑｉａｇｅｎにより総合される）の端もで突き出る。より良好なＲＮＡｉ効果を得るために、我々は、日常的に２の混成を使用した二本鎖２１-単一のｍＲＮＡ分子上の２つの異なるシーケンスを目標としているヌクレオチドＲＮＡデュプレックス。ＲＴ-ＰＣＲは、生体外でｓｉＲＮＡｓによって、ｍＲＮＡノックダウンの検出のために実行された。細胞質のＲＮＡは、追加的なＤＮＡｓｅ治療を有する製造業者の指示に従ってＲＮＡ魔法使い（Ａｍｂｉｏｎ、＃９７３６）により分離されて、特製のプライマを有するＲＴ-ＰＣＲに従属した。ＲＴ反応のためのｍＲＮＡに特有の復帰プライマは５つを有するすべての４７-構造単位オリゴヌクレオチドであった。そして、『-非反復配列、呼ばれた「ＴＳｌ」シーケンス、下記の大文字に示すの端３０-構造単位は、ｍＲＮＡ分子（下記の小文字において、）ごとに、ユニークな１７-構造単位配列とつながった。それらは、あった（５フィートから３フィートまで）：１）ｍＶＥＧＦＡ  Ｄｎ：ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡｃａａｇｃｔｇｃｃｔｃｇｃｃｔｔｇ、２）：ｍＶＥＧＦＲｌ  Ｄｎ：ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡｔａｇａｔｔｇａａｇａｔｔｃｃｇｃ、３）ｍＶＥＧＦＲ２  Ｄｎ：ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴａｇｇｔｃａｃｔｇａｃａ  ｇａｇｇｃｇ。すべてのテストされた遺伝子（ＲＴ分析に続く）のＰＣＲ検査法は、同じ復帰プライマ（ＴＳｌ）を使用した：ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡ。しかし���がら、ＰＣＲのための前方のプライマは、すべて３０-構造単位オリゴヌクレオチド（各遺伝子のためにユニークな）であった：ＶＥＧＦＡ  Ｕｐ：ＧＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＧＴＣＣＧ、２）ｍＶＥＧＦＲｌ  Ｕｐ：ＧＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＴ、３）ｍＶＥＧＦＲ２  Ｕｐ：ＧＧＣＧＣＴＧＣＴＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴ  ＴＣＴＧ。家事遺伝子ＧＡＰＤＨのＲＴ-ＰＣＲが、ＲＳ-ＰＣＲにおいて、使用するＲＮＡ量のための制御として使われた。オリゴヌクレオチドｄＴプライマ（１９-構造単位）が、ＧＡＰＤＨのＲＴ分析のために用いられた。続かれたＰＣＲのために使用するプライマは、２０マー・オリゴヌクレオチドであった：１）ＧＡＰＤＨ  Ｕｐ：ＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴ、２）ＧＡＰＤＨ  Ｄｎ：ＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴ。ＲＴ-ＰＣＲが、以前に記載されているプロトコルに従っても使われた。ｍ  ＶＥＧＦ-Ａ表現の検出のために使用するプライマが５’-ＧＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＣＡＧＴＣ-Ｓであったこと、『（感覚）そして、５’-ＴＣ  ＡＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣ  ＡＣ-３』（アンチセンスの）。図７。全３つのｓｉＲＮＡ対が標的遺伝子表現を事実上ノックダウンしていることを示す。３対のｓｉＲＮＡデュプレックスを有するｓｉＲＮＡカクテルの効力を評価するために、我々は、活発な配達において、伝達されるヒスチジン-リジン・ポリマー・ナノ粒子を有する眼新血管形成マウスモデルを使用した。
【００４０】
実施例７。角膜マイクロ・ポケットに挿入されるときに、以前の研究がそのＣｐＧを含んでいるオリゴヌクレオチド・ヌクレオチドがペレットが誘発するｈｙｄｒｏｎに簡約することを証明したｓｉＲＮＡカクテルＡの地方への配送による脈管形成の抑制は脈管形成をｄＶＥＧＦ伝達した。このシステムは、そのレセプタ（ＶＥＧＦＲｌおよびＶＥＧＦＲ２）のうちの２つと同様にＶＥＧＦを目標とする準備ができているｓｉＲＮＡ準備の地方行政の禁止効果を測定するために用いた。ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ-リジン・ポリマー・ナノ粒子を有する中でｓｉＲＮＡの１０のμｇの一用量が、すべてのケースにおいて、使われた。これは、ＣｐＧ  ＯＤＮが入っているマイクロ・ポケットの設立の２４時間後に、下位結膜注入により管理された。ｓｉＲＮＡｓは、１と同様に、個々にテストされた：１  ：全３（ｓｉＶＥＧＦＡ、ｓｉＶＥＧＦＲｌおよびｓｉＶＥＧＦＲ２）の１つの混成。角膜縁の新しい血管形成は、ペレット移植の後、日４および７時に監視された。図８に示すように、角膜新血管形成の重要な抑制は、ペレット移植（Ｐ<０．０５）の後、日４でそれらの所与の制御ｓｉＬａｃＺと比較して全３つの試験ｓｉＲＮＡｓによって、結果としてなった。３つのテストされたｓｉＲＮＡｓの組合せは最も有効なインヒビターであった。そして、新血管形成（Ｐ<０．０１）の６０％の減少を提供した。下位結膜管理でも、ローカルｓｉＲＮＡ送出はヒスチジン-リジン・ポリマー・ナノ粒子により行われた。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルの相乗的利益は、この眼脈管形成モデルにおいて、示された。より少ない瘢痕組織形成およびより強い引張強さによって、平癒している成人皮膚損傷を改善するために本願明細書において、開示されるように、データは強いサポートをマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルの消費に提供する。
【００４１】
実施例８。２５の構造単位ｓｉＲＮＡシーケンスがそうである２５-構造単位ｓｉＲＮＡｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂｏｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｓは、その目標に両方の人間の相同的シーケンスおよびオルト・ログの多い遺伝子のマウスを用意した。例えば、ＨｏｘＢ１３を目標としているｓｉＲＮＡデュプレックス・シーケンスは、ヒトＨｏｘＢ１３およびマウスＨｏｘＢ１３遺伝子を目標とすることが可能である。表１は、ｓｉＲＮＡ治療学（３６-３７）のために確認されるシーケンスを提供する。各シーケンスは、人間およびマウス対応する遺伝子を目標とする。従って、マウス細胞から定められる強力なシーケンスは、ヒト細胞を使用して、再び確認されることができる。二重特定のｓｉＲＮＡが両方の試験において、強力である場合、マウス動物モデルにおいて、明らかにされるサイレンシング活性は人間において、作動中であるとみなされることができる。この方法を使用して、我々はこの種のインヒビターの種差に対する一般の懸念について述べることができる、モノクローナル抗体のような、遭遇した。加えて、ｓｉＲＮＡデュプレックスの治療的な候補のために、研究を使用しているマウスモデルから成し遂げられる有効性および毒性データは、人間の設定に容易に変換されることができる。
【００４２】
実施例９。ナノ粒子により媒介される地方への配送が有するＨＫ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｌｏｃａｌ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｈｅ  ＨＫポリマー-ｓｉＲＮＡは、強い抗血管新生活性を成し遂げた。腫瘍内で、ｓｉＲＮＡ送出を強化するために別々の研究を使用しているＨＫポリマーにおいて、腫瘍成長曲線は、標的遺伝子表現の明白なダウンレギュレーションを有する有意な抗腫瘍有効性を示した。ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞の乳房分厚いパッドへの注入の後の１０日に、可視腫瘍をもつマウスは、治療群に分けられた。各グループは８つの腫瘍をもつ４匹のマウスを有した、そして、腫瘍サイズは二次元において、評価されて、算出された。マウスは、５日毎に各腫瘍内注入を有するｓｉＲＮＡの４つのμｇ／腫瘍を受けた。より詳細に最適ポリマーを有するｓｉＲＮＡ  Ｒａｆ-１の抗腫瘍有効性を確認するために、腫瘍をもつマウスは、これらのグループに分けられた：無処置で、ｂ-ガラクトシダーゼｓｉＲＮＡおよびＲａｆ-１  ｓｉＲＮＡ。図９に示すように、ＨＫポリマーが腫瘍内配達を伝達したあと、Ｒａｆ-１  ｓｉＲＮＡは生体内で腫瘍成長を阻害する。明らかに、ＨＫポリマーは、有効なローカルｓｉＲＮＡ送出キャリアとして確認された。これは、我々にＨＫポリマーが適切な製剤を有する皮膚損傷へのローカルｓｉＲＮＡ送出を容易にすると結論させた。
【００４３】
ここ数数十年にわたって、生物分解可能なポリエステル類（例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ、乳共同-グリコール酸）、ＰＬＧＡは、多種多様な製薬および生医学的アプリケーションのために、広範囲に調査された。生物分解可能なポリエステル族は、制御可能な生分解性を有する数合成生分解性高分子のうちの１つ、優れた生互換性および高い安全と考えられていた。異なる薬および配達経路のための様々な薬製剤の必要は、生物分解可能なポリエステル類およびポリエチレングリコールからなる様々な形のブロックコポリマー（例えばジブロック、トリブロック、マルチ・ブロックおよび星型のブロック）の開発に結果としてなった）（ＰＥＧ）。
ＰＡＭＡＭデンドリマは、高分子建築の刺激的な新規な種類が「密集した星」ポリマーと呼ばれていることを表す。古典的ポリマーとは異なり、デンドリマは、高度な分子均一性、狭い分子量分布、特定のサイズおよび形状特徴および非常にｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄされた終端面を有する。製造プロセスは、中心イニシエータ核から始めている一連の反復ステップである。各次の成長階段は、より大きい分子直径（反応表層サイトの数の２倍の）を有するポリマーの新規な「生成」およびほぼ前の生成の倍の分子量を表す。ポリ・アミド・アミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマは、多くの材料科学および生物工学アプリケーションに適しているデンドリマで最も一般のクラスである。ＰＡＭＡＭデンドリマは、アルキル-ジアミン核および第三アミン分岐から成る。
【００４４】
実施例１０：生体外で人間およびマウスＨｏｘｂｌ３、ＴＧＦ-β２およびコックス-２  ｍＲＮＡを目標としているＣｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ．ｓｉＲＮＡデュプレックスにおいて、ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｑｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｓは、準備された。
【００４５】
１．ｓｉＲＮＡデュプレックスは、備えた：２５-構造単位ブラントエンドについては、３つのシーケンスは、３つのｍＲＮＡの各々を目標とする準備ができていた：
ｈｍＨＸ-２５-１：５’-ｒ（ＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＵＧＵＧＵＵ）-３フィート・アンチセンス５’-ＫＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣＣＡＣＣを検出する）-Ｓ『ｈｍＨＸ-２５-２：感覚５’-ｒ（ＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＵＧＵＧＵＵＧＣＣＡ）-３』アンチセンス５-ｒ（ＵＧＧＣＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣ）-３フィートｈｍＨＸ-２５-３：感覚５『-ｒ（ＣＧＣＣＡＧＡＵＵＡＣＣＡＵＣＵＧＧＵＵＵＣＡＧＡ）-３』アンチセンス５-ｒ（ＵＣＵＧＡＡＡＣＣＡＧＡＵＧＧＵＡＡＵＣＵＧＧＣＧ）-３フィートｈｍＴＦ-２５-ｌ：５つの『-ＫＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣ＾-Ｓ』アンチセンス５’-ＫＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧを検出する感覚５『-ｒ（ＧＧＡＵＣＣ  ＡＣＧ  ＡＧＣＣＣ  ＡＡＧＧＧＣＵ  ＡＣＣ  Ａ）-３』アンチセンス５  ｈｍＴＦ-２５-２『-ｒ（ＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣＧＵＧＧＡＵＣＣ）-３』：）＾』ｈｍＴＦ-２５-３：感覚Ｓのもの-ｒＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣ＾-Ｓのアンチセンスの５  ｈｍＣＸ-２５-１『-ｒ（ＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣ）-３』：５’-ｒ（ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ）-３フィート・アンチセンス５’-ｒ（ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ）-３フィートｈｍＣＸ-２５-２を検出する：感覚５’-ｒ（ＧＡＧＣＡＣＣＡＵＵＣＵＣＣＵＵＧＡＡＡＧＧＡＣＵ）-３フィート・アンチセンスの５、『-ｒ（ＡＧＵＣＣＵＵＵＣ  ＡＡＧＧ  ＡＧ  ＡＡＵＧＧＵＧＣＵＣ）-３』ｈｍＣＸ-２５-３：感覚５『-ｒ（ＣＣＵＣ  ＡＡＵＵＣ  ＡＧＵＣＵＣＵＣ  ＡＵＣＵＧＣ  ＡＡ）-３』アンチセンス５『-ｒ（ＵＵＧＣＡＧＡＵＧＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＵＵＧＡＧＧ）-３』’
２．２つの制御配列が、研究において、準備されもして、使われもした：
Ｌｕ２５-ａ：アンチセンス５つの『-ｒ（Ｇ  ＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵ）-Ｓ』を検出する５『-ｒ（Ａ  ＡＵＣＵＵＧＵ  ＡＡＵＣＣＵＧ  ＡＡＧＧＣＵＣＣＵＱ-３』ＧＦ２５-ａは、５-ｒ（ＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣ）を検出するｄＴｄＴアンチセンス５’-ｒ、（ＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣ  ＡＧＧＧＵＣ  ＡＧＱｄＴｄＴ
３．Ｈｏｘｂｌ  ３、コックス-２およびＴＧＦ-賭けのｃＤＮＡ配列検出のための６対のＰＣＲプライマは、人間およびマウス・シーケンスのために準備されもして、合成されもした：
ｈＨｘｕｐ：５’-ＧＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＴＴ-３『ｈＨｘｄｎ：５’-ＣＴＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＴＧＡＴ-ＳのｍＨｘｕｐ：５’-ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ-Ｓ『ｍＨｘｄｎ：５つの『-ＡＣＴＧＧＣＣ  ＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＧ-３』。
【００４６】
ｈＣｘｕｐ：５’-ＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡ-ＳのｈＣｘｄｎ：５つの『-ＣＣＴＡＴＣ  ＡＧＴＡＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＴ-３』ｍＣｘｕｐ：５’-ＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴ-ＳのｍＣｘｄｎ：５つの『-ＧＧＡＴ  ＡＣ  ＡＣＣＴＣＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ-３』。
ｈＴＧｂ２ｕｐ：５つの『-Ｇ  ＡＧＴ  ＡＣＴＡＣＧＣＣ  ＡＡＧＧ  ＡＧＧＴＴ-３』ｈＴＧｂ２ｄｎ：５つの『-ＣＣ  ＡＴＴＣ  ＡＴＧＡＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＴ-３』ｍＴＧｂ２ｕｐ：５つの『-ＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴ-３』ｍＴＧｂ２ｄｎ：５’-ＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴ-Ｓ’
４．ヒト前立腺癌ｃｅｌｌ-ＰＣ３が、遺伝子発現ノックダウンの検出のために使われた。一連の標準トランスフェクション実験は、したがって、ステップ２において、確認されるｓｉＲＮＡデュプレックスをもつベンダー（インビトロゲン）によって、設けられているプロトコルを使用して行われた。
【００４７】
５．  完全ＲＮＡサンプルは、分離されて、上記のステップ３において、確認されるそれぞれのＰＣＲプライマを使用しているＲＴ-ＰＣＲ分析を受けた。結果は、図１０、１１、１２、および１３に示される。対応するターゲッティングｓｉＲＮＡがトランスフェクションするときに、目標とされた遺伝子の（ＲＴ-ＰＣＲにより検出されるにつれて）発現が著しく減らされるということを知られるが、さまざまな制御（すなわち非ターゲッティング）ｓｉＲＮＡｓは表現に影響を及ぼさない。
【００４８】
実施例１１。強力なｓｉＲＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  Ｆｏｒ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＴＧＦ-Ｂｌ。ＣＯＸ-２  Ａｎｄ  ＨｏｘＢ１３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  
Ｔａｂｌｅ  １は、１０のｓｉＲＮＡシーケンスを目標とされた遺伝子、ＨｏｘＢ１３、ＣＯＸ-２およびＴＧＦ-βの各々に提供する。
【００４９】
ｓｉＲＮＡに制御ものは配列決定する各標的遺伝子のための４つのｓｉＲＮＡデュプレックスの選択は、選択された非関連したシーケンスを目標として、そして、人間およびマウスの同族体なしであった。それは、Ｌｕ２５-ａである：（感覚、５’-ＧＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣ  ＡＧＧ  ＡＵＵ  ＡＣ  ＡＡＧ  ＡＵＵ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵ  ＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣ-３フィート）。人間およびマウスＨｏｘＢ  １３を目標としている４つのｓｉＲＮＡシーケンスは、以下の通りである：ｈｍＨＸ-１：（感覚、５『-ＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＣ  ＡＧＣＣ  ＡＧＡＵＧＵＧＵＵ-３』そして、アンチセンス、５-ＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣＣＡＣＣ-Ｓのもの）、ｈｍＨＸ-２：（感覚（５’）-ＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣ  ＡＧＡＵＧＵＧＵＵＧＣＣ  Ａ-３、そして、アンチセンス、５-ＵＧＧＣＡＡＣＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＡＧＣ-３フィート）、ｈｍＨＸ-３：（感覚（５’）-ＣＧＣＣ  ＡＧＡＵＵ  ＡＣＣＡＵＣＵＧＧＵＵＵＣ  ＡＧＡ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＵＣＵＧＡＡＡＣＣＡＧＡＵＧＧＵ  ＡＡＵＣＵＧＧＣＧ-３フィート）、そして、ｈｍＨＸ-４：（感覚（５’）-ＣＡＡＧＧＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＧＧＡ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＵＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＵＣＧＡＵ  ＡＵＣＣＵＵＧ-３フィート）。人間およびマウスＣＯＸ-２を目標としている４つのｓｉＲＮＡシーケンスおよびそれらは、以下の通りである：ｈｍＣＸ-１：（感覚（５’）-ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ-Ｓのもの、そして、アンチセンス、５’-ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣ-３フィート）、ｈｍＣＸ-２：（感覚、５’-ＧＡＧＣＡＣＣ  ＡＵＵＣＵＣＣＵＵＧＡＡＡＧＧＡＣＵ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＡＧＵＣＣＵＵＵＣＡＡＧＧＡＧＡＡＵＧＧＵＧＣＵＣ-３フィート）、ｈｍＣＸ-３：（感覚、５’-ＣＣＵＣＡＡＵＵ  Ｃ  ＡＧＵＣＵＣＵＣ  ＡＵＣＵＧＣＡＡ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＵＵＧＣＡＧＡＵＧＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＵＵＧＡＧＧ-３フィート）、そして、ｈｍＣＸ-４：−人間およびマウスＴＧＦ-βｌを目標としている４つのｓｉＲＮＡシーケンスおよびそれらは、そうである（感覚、５’-ＧＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣ-３フィート）：ｈｍＴＦ-１：（感覚、５’-ＧＧＡＵＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵ  ＡＣＣＡ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣＧＵＧＧＡＵＣＣ-３フィート）、ｈｍＴＦ-２：（感覚、５’-ＣＣＣ  ＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣ  ＡＵＧＣＣ  ＡＡＣＵＵＣＵ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ-３フィート）、ｈｍＴＦ-３：（感覚（５’）-ＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣ  ＡＵＧＣＣ  ＡＡＣＵ-３フィート、そして、アンチセンス、５’-ＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣ-３フィート）、そして、ｈｍＴＦ-４：特定の細胞培養Ｆｏｒへの（感覚、５’-ＣＣＣＣＧＧＡＧＧＵＧＡＵＵＵＣＣ  ＡＵＣＵ  ＡＣ  ＡＡ-３、そして、アンチセンス、５  -  ＵＵＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＧＧＧ-３）ｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆｓｉＲＮＡデュプレックスが４つの選択されたｓｉＲＮＡデュプレックスを使用しているｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでＨｏｘＢ１３遺伝子発現ノックダウンを測定して、ＨＯＸＢ  １３を表しているＲＥＫ細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００を有する４つのｓｉＲＮＡデュプレックスによって、トランスフェクションした。同様に、４つの選択されたｓｉＲＮＡデュプレックスを使用しているｍＲＮＡおよびタンパク質レベルのＣＯＸ-２遺伝子発現ノックダウンの測定のために、米国菌培養収集所（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られる人間の包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）は、１０％の胎児のウシ血清（ＦＢＳ）１００のμｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００のＵ／ｍｌペニシリンで補充されるＤＭＥＭの１０ｃｍのプレートに培養されて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００を使用しているｓｉＲＮＡデュプレックスによって、トランスフェクションする。細胞は、ＰＢＳによって、二回洗われなければならなくて、２４ｈのＦＢＳのない媒体で暖められなければならない。ＦＢＳのない媒体は、細胞周期を始めるために１０％のＦＢＳを含んでいる媒体と交換された。４つの選択されたｓｉＲＮＡデュプレックスを使用しているｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでＴＧＦ-βｌ遺伝子発現ノックダウンを測定するために、マウス胚内皮細胞（ＭＥＥＣｓ）は、ＲＴ-ＰＣＲ分析が続くｓｉＲＮＡ-ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００によって、トランスフェクションしなければならない。潜在的陥穽：２０００が必ずしもそうすることができないＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを有するそれらの細胞のトランスフェクションは能率的に働く、代わりのトランスフェクション方法はエレクトロポレーションまたは他のトランスフェクション剤のような適用されなければならない。効率的なトランスフェクションおよび以下のＲＴ-ＰＣＲ分析法は、満足なデータを成し遂げるために協力して機能することを必要とするかもしれない。
【００５０】
ＲＥＫ細胞を表しているＨｏｘＢ１３（マウス）を含んでいるそれらのトランスフェクションする細胞系の各々からＲＴ-ＰＣＲ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用している測定ｏｆｍＲＮＡレベル、細胞を表しているＣＯＸ-２（人間的な）およびマウス胚内皮細胞は、ＲＴ-ＰＣＲ分析のために分離されて、浄化される。ＨｏｘＢ１３アンプリコン（マウス）の検出のために、ＲＴ反応は、前方のプライマ、５フィート  -  ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ-３フィートおよび復帰プライマ、５’-ＡＣＴ  ＧＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＧ-Ｓのものを使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる。ＣＯＸ-２アンプリコン（人間的な）の検出のために、ＲＴ反応は、前方のプライマ（５’）を使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる-ＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡ-３フィートおよび復帰プライマ（５’）-ＣＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＴ-３フィート。ＴＧＦ-βｌアンプリコン（マウス）の検出のために、ＲＴ反応は、前方のプライマ（５’）を使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる-ＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣ  ＡＣＣＴＴ-３フィートおよび復帰プライマ（５’-ＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴ-３フィート）。ＰＣＲ製品は、１％のアガロースゲルに積まれなければならなくて、臭化エチジウムで色付けされなければならない。ＰＣＲ製品は、特定のｓｉＲＮＡデュプレックスを使用している各特定のｍＲＮＡのノックダウンのレベルを呈しなければならない。二重特定のｓｉＲＮＡが最も有力なものである場合、この実験からの結果は二重各ｓｉＲＮＡの効力を決定することになっていて、第１の観察を提供することになっている。ＰＣＲ分析のための全ＲＮＡの充分な量を成し遂げるために、適当な状況が特定の細胞系のための効率的なトランスフェクションのために最適化されるように、ＲＴ-ＰＣＲ分析はトランスフェクション実験によって、密接に調整される。加えて、各遺伝子のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスのより抜きは、３つの反復実験に基づかなければならない。対応するｓｉＲＮＡデュプレックス、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析によって、トランスフェクションする細胞のＥＬＩＳＡ  Ｔｏ計測タンパク質レベルを使用しているタンパク質レベルの測定は、充分でなければならないおよび、満足でなければならない。細胞可溶化物または細胞培養基が、タンパク質検出のために用いられる。マウスＨｏｘＢ１３の検出のＥＬＩＳＡ検査法が利用可能なコマーシャルでないにもかかわらず、我々は、使用できるウエスタンブロット分析を有するＲＥＫ細胞を表しているＨｏｘＢ  １３のｓｉＲＮＡにより媒介されるノックダウンを検出するマウスＨｏｘＢ  １３（歓声Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）にネズミ・ポリクローナル抗体。ラビット反Ｈｏｘｂ  １３抗体は、Ｎに対して発生した-マウスＨｏｘＢ  １３の中で端末（アミノ酸１-７  ９）部分。この抗体は、ＷＴおよびノックアウトＨｏｘＢ  １３タンパク質を認識しなければならない。後者は、ホメオドメインのアミノ酸３３で止まる切り詰めたタンパク質である。使用の前に、抗血清は、明らかに、他のＨｏｘｌ３タンパク質を有する���能な交差反応性を除去するためにマウスＨｏｘｃｌ３およびチキンＨｏｘｄｌ３に対して負の親和性浄化が続いて浄化される親和性でなければならない。油焼けはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を使用して捕えられなければならない。人間のＣＯＸ-２は、細胞培養上澄みおよび細胞可溶化物の人間のＣＯＸ-２の定量的検出の酵素結合免疫溶解サンドイッチ検査法であるＣＯＸ-２  ＥＬＩＳＡキット（酵素の、聖フランシスコ、ＣＡ）を使用して分析される。Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ）が膜結合酵素（７１ｋＤａの分子量を有する）であるので、細胞可溶化物はＥＬＩＳＡ分析の準備ができていなければならない。マウスＴＧＦ-βｌは、Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ  ＴＧＦｂＩ（トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ-ｂｅｔａｌな）ＴＧＦ-ｂｌ）ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ-ＳＥＴ-Ｇｏキット（Ｐｒｅ-Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓによって、）を使用して分析される。各遺伝子のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスのより抜きは、３つの反復実験に基づかなければならない。潜在的陥穽は、いつか最も、ｍＲＮＡノックダウンから選択される強力なｓｉＲＮＡデュプレックスがタンパク質ノックダウンから選択されるものと相関していないということである。その状況が起こるときに、それが動きのＲＮＡｉ機構の鏡面反射であった時から、我々はｍＲＮＡレベルのノックダウンからデータに中継しなければならない。タンパク質レベル・ノックダウンの矛盾がいつか非特異性のもののためあることができるかまたは「的外れの」効果を非常に呼ぶことができる。そして、それは動きのＲＮＡｉ機構の結果でない。
【００５１】
実施例１２。以下の３つの遺伝子、ＨｏｘＢ１３、ＣＯＸ-２およびＴＧＦ-βｌの各々のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスのＭｏｓｔ  Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｆｔｅｒより抜きの選択が細胞培養研究に基づいて、組合せのいくつかの比率を有するｓｉＲＮＡカクテルが１のような使うことができるように、それらは一緒に結合される：１：１，  ２：１  ：１および３：１  ：１、その他、成人皮膚損傷のＨｏｘＢ１３の重要性のＢｅｃａｕｓｅが回復して、ＨｏｘＢ１３に特有のｓｉＲＮＡデュプレックスの適切な比率変更は、決定される。
【００５２】
適当なｓｉＲＮＡカクテルを評価するマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルおよび大部分の適切な製剤の評価のためにマウスモデル、我々は、ＨｏｘＢ１３ノックアウト（ＫＯ）成人マウスにアクセスする。我々はＨｏｘＢ１３  ＫＯ損傷が初期の妊娠胎児性損傷のいくつかの特徴を呈するとわかった。そして、より速い閉鎖、増加した引張強さおよびより真皮に瘢痕化しないことをそれらの原株（ＷＴ）相対物から損傷と比較してとき含んだ。生化学評価で、表皮および真皮ＨＡのレベルがＷＴ皮膚と比較して非傷ついた成体ＨｏｘＢ１３  ＫＯ皮膜分が著しくより高いことが分かった。これらの結果に基づいて、我々は成体皮膚のＨｏｘＢ  １３が分化を促進すると仮定したが、その不在はより多くのｆｅｔａｌ-ｌｉｋｅ環境をつくる。そして、このｆｅｔａｌ-ｌｉｋｅ状態のその唯一の結果は平癒している強化された損傷である。ＨｏｘＢ１３  ＫＯマウスの背中の皮膚損傷を使用しているよく認められたモデルに加えて、我々は唇裂および口蓋手術を模倣するためにマウス唇手術モデルも決めた。そして、全麻および無菌の状況の下で実行された。ＨｏｘＢ１３  ＫＯおよびＷＴ成人マウス（８-１６週間目）はそれらの前歯と並列の切開性損傷が損傷を縫合する（６．０のＮｙｌｏｎ）ことによって、続いた単一の０．５ｃｍの完全な厚み皮膚を与えられる。そして、唇裂および口蓋手術を模倣する。マルチ目標とされたｓｉＫＮ  ＡカクテルＴｏの配達のために使用する製剤はポリマー-ｓｉＲＮＡナノ粒子を決める。そして、我々が最初にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ-Ｌｙｓの枝分れポリマーをこの製剤用に試験すると決定される。メリーランド大学のバイオポリマー核機能は、Ｒａｎｉｎボイジャー・シンセサイザ（ＰＴＩ、トゥーソン、ＡＺ）上のポリマーを合成する。枝分れＨＫポリマー（生体内のｓｉＲＮＡ転送のために有効な）は、地方行政のためのｓｉＲＮＡデュプレックスによって、複雑になった。ポリマーは、ＨＰＬＣ（ベックマン、フラートン、ＣＡ）により精製される。この研究において、使用する第２の枝分れＨ（ヒスチジン）およびＫ（リジン）ポリマーは、Ｒ-ＫＲ-ＫＲ-ＫＲでなければならない、どこでＲ＝［ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ］２ＫＨ４ＮＨ４］。Ｒ分岐が異なること以外は、Ｈ３Ｋ４ｂは上記の同じ核および構造を有する枝分れポリマーである：Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ。ＨＫＰは水溶液に溶かされることができて、それから質量によって、４：１の比率でｓｉＲＮＡ水溶液を混ぜ合わせられることが可能である。そして、直径１５０-２００の実行の平均繊度のナノ粒子を形成する。ＨＫＰ-ｓｉＲＮＡ水溶液は、沈殿物の目立つ凝集なしで透明なｓｅｍｉ-であって、少なくとも３ヵ月間の４Ｃで格納されることができる。ＨＫポリマーに加えて、皮膚損傷の周囲の領域への効果的な配達のための我々のｓｉＲＮＡカクテルについては、我々は、ポリマー・キャリア、ｐｅｇｙｌａｔｅｄされたＰＥＩおよびＰＡＭＡＭデンドリマの２つの異なるタイプをテストすることもできる。すべてのこれらのｓｉＲＮＡポリマー製剤は、ＲＮＡｓｅのないＤ５Ｗ溶液において、分解される。Ｖａｒｉｏｕｓ製剤がそうである皮膚損傷のマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテ���の管理は２つの異なる皮膚損傷モデルを中で評価した。そして、３つの異なるｓｉＲＮＡデュプレックスの３つの異なる比率を有する固定された製剤を含んだ。３つの比率は、１時にＨｏｘＢ１３、ＣＯＸ-２およびＴＧＦ-βｌを目標としているｓｉＲＮＡデュプレックスである：１  ：１，  ２：１  ：１および３：１：Ｈ３Ｋ４ｂポリマーによって、公式化される１。研究会は、以下の通りである：Ｇｌ：各リップ手術のためのＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ２：各リップ手術のためのＨｏｘＢ１３  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ３：各リップ手術のためのＣＯＸ-２  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ４：各リップ手術のためのＴＧＦ-βｌ  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ５：各リップ手術のための比率１カクテルｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ６：各リップ手術のための比率２  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、そして、Ｇ７：各リップ手術のための比率３  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった。４匹の動物は、各グループにおいて、ある。同じ管理は、ＨｏｘＢ１３  ＫＯおよびＷＴマウスが利用できる。この研究の結果は、一回のｓｉＲＮＡ製剤に匹敵しているカクテルｓｉＲＮＡ製剤の相乗的利益を示すことである。
【００５３】
損傷を癒やしているＴｈｒｅｅ製剤上の異なる製剤の影響は、ｓｉＲＮＡの組合せ（例えば１）の単一の比率を使用しているＨｏｘＢ１３  ＷＴマウスのマウス唇手術モデルを使用して、ｓｉＲＮＡカクテルでテストされる：１  ：１．実験は、Ｇｌを含む：制御ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ２：制御ｓｉＲＮＡ-Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ＰＥＩポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ３：制御ｓｉＲＮＡ-ＰＡＭＡＭ樹枝状のポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ４：カクテルｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ５：カクテルｓｉＲＮＡをｐｅｇｙｌａｔｅｄされたＰＥＩポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇおよびＧ６：カクテルｓｉＲＮＡ-ＰＡＭＡＭ樹枝状のポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ。各グループは、４匹の動物を有する。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル分析は、他の生体内の研究として続かれる。結果は、マルチの最適製剤を提供する-臨床的に生き残れるプロトコルのための目標とされたｓｉＲＮＡカクテル。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルＳｋｉｎサンプルで生体内標的遺伝子ノックダウンはＨｏｘＢ１３  ＫＯおよびＷＴマウス（背中の皮膚損傷かリップ手術損傷）から削除されて、１０％のＦＢＳを含んでいる高グルコースＤＭＥＭおよび抗生物質／菌ゾーン（７０％のエタノールにおいて、殺菌される表面）に浸される解剖する-５-ｍｍ２は組織から４°Ｃ．Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルで終夜ＤＭＥＭ（５ｍｇ／ｍｌ）の逆パセを切断して、消化した、そして、細胞はＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔキットおよびプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して転写される後退である。抗体油焼けのために、パラホルムアルデヒドを固定した成人ＷＴおよびＨｏｘＢ１３  ＫＯ皮膚サンプルは、処理されなければならなくて、パラフィンに封埋されなければならなくて、切断されなければならなくて（６つのμｍ）５５°で終夜焼かれなければならない。ＲＮＡ隔離の類似の方法および免疫組織化学のための試料調整が、生体内でＣＯＸ-２およびＴＧＦ-βｌ検出のために使うことができる。最も強力なｓｉＲＮＡカクテル製剤の判断は、皮膚損傷モデル（ＨｏｘＢ１３の遺伝子型および二重各ｓｉＲＮＡの比率）を考慮してなされなければならない。ｍＲＮＡレベルのノックダウンがマルチターゲットｓｉＲＮＡカクテルの効力の鍵となる徴候である同じ原理は、考慮されなければならない。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルＴｏの潜在的治療的な利点はｓｉＲＮＡカクテルの潜在的治療的な利益の第一の評価を有する、我々は２つの分析を行うつもりである：組織学的およびＨＡ分析。パラホルムアルデヒドを固定した皮膚サンプルは、処理されて、パラフィンに封埋されて、切断される（６つのμｍ）。スライドは５５°Ｃで終夜焼かれなければならなくて、ヘマトキシリンによって、しみをつけられなければならない、そして、エオシンまたはマソンは標準プロトコルを使用してコラーゲンのためにトリクロームである。ＨＡ検出のために、皮膚部は２％のＦＢＳにおいて、ブロックされる。そして、ビオチン化されたＨＡ結合タンパク質によって、暖められる、（ｂＨＡＢＰ、ＰＢＳの１つのμｇ／ｍｌ、ケープコッド、会社、ファルマス、ＭＡの付随物）終夜４°Ｃで、ＰＢＳにおいて、すすがれて、Ｃｙ-３-ストレプトアビジンによって、暖められる（１：５００、ジャクソンＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）室温の３０分間、ＰＢＳにおいて、すすがれて、前述したように取り付けられる。ネガティブコントロールとして、組織は、単独でＰＢＳにおいて、暖められなければならない。ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ-７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌシステムを使用することを捕えた。組織学分析は、治療されたおよび無処置の皮膚損傷の形態学的違いおよびＨＡタンパク質の存在の強度に関するグラフィック情報を提供する。
【００５４】
実施例１３。カクテルを公式化する際のｓｉＲＮＡデュプレックスのＭｕｌｔｉ-Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＳｉＲＮＡｓ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ａ適切な比率のためのＣｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｖｉａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを開発する最適化されたポリマー製剤を有する定められて、そして、特定のマウスモデルを有する相関した。ｓｉＲＮＡｓおよびそのカクテルは、Ｈｐ手術モデルにおいて、テストされる。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテル製剤Ｔｏの服用に依存する曲線は定義済みの治療候補ｓｉＲＮＡカクテル製剤の適当な投与量を定める、６つの異なる投与量はマウス唇手術モデルにおいて、テストされる。テスト・グループは、Ｇｌでありそうである：損傷上へ２つのμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ２：損傷上へ１０のμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ３：損傷上へ２０のμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ４：損傷（Ｇ５）上へ、３０のμｇ／５０μＬを適用する：損傷およびＧ６上へ４０のμｇ／５０μＬを適用する：損傷上へ６０のμｇ／５０μＬを適用する。各グループは、４匹の動物を含む。分子生物学的および生化学読み出しは、組織学および形態学評価とともに測定されなければならない。組織学的およびＨＡ分析は、皮膚サンプルが処理されて、パラフィンに封埋されて、切断される（６つのμｍ）ことをＰａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ-ｆｉｘｅｄした。スライドは５５°Ｃで終夜焼かれて、ヘマトキシリンによって、しみをつけられる。そして、エオシンまたはマソンは標準プロトコルを使用してコラーゲンのためにトリクロームである。ＨＡ検出のために、皮膚部は２％のＦＢＳにおいて、ブロックされる。そして、ビオチン化されたＨＡ結合タンパク質によって、暖められる、（ｂＨＡＢＰ、ＰＢＳの１つのμｇ／ｍｌ、ケープコッド、会社、ファルマス、ＭＡの付随物）終夜４°Ｃで、ＰＢＳにおいて、すすがれて、Ｃｙ-３-ストレプトアビジンによって、暖められる（１：５００、ジャクソンＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）室温の３０分間、ＰＢＳにおいて、すすがれて、前述したように取り付けられる。ネガティブコントロールとして、組織は、単独でＰＢＳにおいて、暖められなければならない。ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ-７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌシステムを使用することを捕えた。組織学分析は、治療されたおよび無処置の皮膚損傷の形態学的違いおよびＨＡタンパク質の存在の強度に関するグラフィック情報を提供する。コラーゲン量Ｃｏｌｌａｇｅｎ内容の定量化は、サンプルのヒドロキシプロリン内容を測定することにより決定される。手短に言えば、８-から１６-週前の成熟したマウス（「各々ＷＴおよびＨｏｘＢ１３  ＫＯ間の＝６）まで収集される全層背面の皮膚サンプル（￣１６  ｍｇ）が終夜凍結乾燥されて、１１００Ｃ（組織をカバーするのに十分な使用）で、１８ｈのための６Ｎ  ＨＣｌにおいて、加水分解されること、そして、ｐＨが、それからＮａＯＨ．を有する６〜７に合うサンプルは、Ｈ２Ｏを有する５ｍｌまで希釈されて、ワットマン濾紙を使用して濾過される。以下の溶液は、連続して各サンプルの１．０ｍｌに加えら��る：クロラミンＴ溶液（１．０ｍｌ、０．０５Ｍ、２０分間の室温）過塩素酸（１．０ｍｌ、３．１５Ｍ、５分間の室温）および２０％のｐ-ジメチルアミノベンズアルデヒド（１．０ｍｌ）。サンプルは、２０分間の６０°Ｃで暖められなければならなくて、室温に冷やされなければならない。吸光度は５５７．５ナノメートルの波長で読み込まれそうである。そして、ヒドロキシプロリン濃度は標準曲線を使用して決定されそうである。以下の算出は、コラーゲン量を決定するために用いなければならない：ヒドロキシプロリンのμｇは、コラーゲンの７．４６＝μｇに×印を付ける。値は、μｇ／ｍｇ乾燥重量として報告される。張力学Ｆｏｒの中で測定、この研究、切開性損傷さらに周囲の皮膚は慎重に切除されて、そして、組織は、終夜４％のパラホルムアルデヒドに取り付けられる。同じ時間およびすべての時点の張力学のために固定するすべての組織必要は、損傷収集の後、日実行される。ｔｅｎｓｏｍｅｔｒｉｃな分析の前に、サンプルは同一の長さおよび幅に慎重に切られなければならない、そして、創傷部位の皮膚の厚みは決定される。張力学学科は、Ｉｎｓｔｒｏｎテスト・システムを使用して実施される。結果はＹ-モジュラスとして報告されなければならない、そして、Ｙ-モジュラスは応力／圧力を算出することによって、引き出されて、全体の損傷強さを代表する。応力は、損傷の損傷別々の／断面領域に怪我をすることを必要とする力の量である。圧力は、割れのサンプル／長の原長である。生の圧力値および断面積はＷＴとの間にｐｏｓｔｗｏｕｎｄｉｎｇしているいかなる時点にも著しく変化しない、そして、ＨｏｘＢ１３は損傷（示されないデータ）をノックアウトする。このように、Ｙ-モジュラス値の違いは、主に応力価格の力構成要素に起因する。
【００５５】
実施例１４。ｓｉＲＮＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓに本発明を用意することは、ｓｉＲＮＡを目標としているシーケンスを準備するために、新規な方法を提供する。他の方法と異なる３つの重要な態様が、ある：ｓｉＲＮＡデュプレックスによって、目標とされるシーケンスは、人間および同じ遺伝子のマウス配列にホモロジを有する（１）。それは、ｓｉＲＮＡデュプレックス・ノックダウンの各々にいずれの人間もまたはマウス細胞の同じ遺伝子目標を定める。例えば、ＨｏｘＢ１３遺伝子に特有の強力なｓｉＲＮＡは、ヒトＨｏｘＢ１３およびマウスＨｏｘＢ１３遺伝子発現をノックダウンする。シーケンスが３つの異なる長さにおいて、用意された（２）：２１-構造単位、２３-構造単位および２５-構造単位。
【００５６】
所与のｓｉＲＮＡを目標としているシーケンスの最適長さは、さまざまな模型系において、確認される。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、いずれのブラントエンドもまたは粘着性の端形で準備される（３）。ここで使用しているように、これに基づく「オリゴヌクレオチド」および類似の条件は、合成であるか改質ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドにと同様に自然に生じるヌクレオチドから成る短いオリゴヌクレオチドに関する。条件「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」が、同義的に本願明細書において、使われる。
ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１９および３０のヌクレオチドとの間に、いかなる数のヌクレオチドを有することができる。好ましい実施例において、ｓｉＲＮＡは、１９および２７のヌクレオチドとの間に、いかなる数のヌクレオチドを有することができる。ｓｉＲＮＡは２つのブラントエンドまたは２つの粘着性の端を有することができる、または、１は１つの粘着性の端を有する端を鈍くする。粘着性の端の突出ヌクレオチドは、１から４以上までの範囲である。
特に好ましい実施態様では、本発明は、２１、２３および、２５の塩基対のｓｉＲＮＡにブラントエンドを提供する。
【００５７】
【表１】
2011504170.tif 000003
【００５８】
表２にリストされるシーケンス−９は、「ｔ」を「ｕ」（例えば表１にリストされるシーケンス）に変えることによって、ｓｉＲＮＡシーケンスのために用いられることが可能である目標ｍＲＮＡコード配列である。
【００５９】
【表２−１】
2011504170.tif 000004
【００６０】
【表２−２】
2011504170.tif 000005
【００６１】
【表３−１】
2011504170.tif 000006
【００６２】
【表３−２】
2011504170.tif 000007
【００６３】
【表４−１】
2011504170.tif 000008
【００６４】
【表４−２】
2011504170.tif 000009
【００６５】
【表５−１】
2011504170.tif 000010
【００６６】
【表５−２】
2011504170.tif 000011
【００６７】
【表６−１】
2011504170.tif 000012
【００６８】
【表６−２】
2011504170.tif 000013
【００６９】
【表７−１】
2011504170.tif 000014
【００７０】
【表７−２】
2011504170.tif 000015
【００７１】
【表８−１】
2011504170.tif 000016
【００７２】
【表８−２】
2011504170.tif 000017
【００７３】
【表９−１】
2011504170.tif 000018
【００７４】
【表９−２】
2011504170.tif 000019
【００７５】
実施例１５。ｓｉＲＮＡカクテルＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｉｓ発明のための方法は、同じ処理の複数の疾患をおさえている遺伝子を目標としている治療的なｓｉＲＮＡカクテルを提供する。本発明はＲＮＡｉ剤のために定める、例えば、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは同じ供給および同じ製造プロセス源と非常に化学的に類似している。そして、それらは異なるシーケンスを有する４種類のヌクレオチドから成る。本発明は、ｓｉＲＮＡカクテル薬をＴＧＦ-β、ＣＯＸ-２、ＨｏｘＢ１３その他を含む損傷を癒やしている方法に関係するターゲッティング遺伝子によって、平癒している瘢痕のない損傷の改良に提供する。好ましい実施例において、ｓｉＲＮＡカクテルは、以下の特徴を有する：
（１）  ｓｉＲＮＡカクテルは、少なくとも３つの異なる遺伝子（同じ遺伝子の３つの配列でない）の治療のために必要とされる比率に目標を定めている少なくとも３つのｓｉＲＮＡデュプレックスを含む。
（２）  各組合せのためのｓｉＲＮＡカクテルはシステム生物学ネットワークの背景の各遺伝子の役割を目標とする。ここで、これらの遺伝子は同じ経路において、または、異なるものにおいて、機能している。
【００７６】
【表Ａ】
2011504170.tif 000020
【００７７】
【表Ｂ】
2011504170.tif 000021
【００７８】
【表Ｃ−１】
2011504170.tif 000022
【００７９】
【表Ｃ−２】
2011504170.tif 000023
【００８０】
【表Ｄ−１】
2011504170.tif 000024
【００８１】
【表Ｄ−２】
2011504170.tif 000025
【００８２】
【表Ｅ】
2011504170.tif 000026
【００８３】
【表Ｆ−１】
2011504170.tif 000027
【００８４】
【表Ｆ−２】
2011504170.tif 000028
【００８５】
【表Ｇ−１】
2011504170.tif 000029
【００８６】
【表Ｇ−２】
2011504170.tif 000030
【００８７】
【表Ｈ−１】
2011504170.tif 000031
【００８８】
【表Ｈ−２】
2011504170.tif 000032
【００８９】
実施例１６。付加的なｓｉＲＮＡ構造物。
両方の人間を対象としているｓｉＲＮＡおよび我々がｓｉＲＮＡ設計に入れたマウスｍＲＮＡ配列Ｏｎｅ効果を設計することは、全２５の構造単位ｓｉＲＮＡシーケンスが両方の人間の同族体シーケンスおよび同じ遺伝子のマウスを目標とすることが可能であるということである。例えば、Ｈｏｘｂｌ３を目標としているｓｉＲＮＡデュプレックス・シーケンスは、ヒトＨｏｘｂｌ３およびマウスＨｏｘｂｌ３遺伝子を目標とすることが可能である。シーケンスは、以下の特徴を確実にするためにｓｉＲＮＡ設計および登録商標のアルゴリズムに対する一般の規則を使用して、コンピュータで設計された：（１）最適熱力学は結合しているＲＩＳＣを強化する（２）免疫刺激のモティーフ、（４）人間のマウス・ホモロジ、「的外れの」可能性が噴射した（５）および（６）マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルを除去する。（３）各シーケンスは、人間およびマウス対応する遺伝子を目標とすることが可能である。従って、マウス細胞研究から定められる強力なシーケンスは、ヒト細胞を使用して、更に確認されることができる。強力なｓｉＲＮＡデュプレックス・ターゲッティングＴＧＦ-βｌ、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３  ｍＲＮＡは、コンピュータで設計された２５の構造単位ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｗｅが最初に試験して３を選択する確認されたＡｍｏｎｇ  １０であった。対応する細胞、例えばヒトＰＣ-３細胞、前立腺等級ＩＶの中で骨転移腺癌のそれらのｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓ（Ｑｉａｇｅｎにより総合される）をテストする前に、我々は、完全ＲＮＡサンプル（図１４）の標的遺伝子表現の存在を調査するために、最初にＲＴ-ＰＣＲを使用する。十分に面白いことに、我々は、ヒトＴＧＦ-βｌ、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３  ｍＲＮＡの相当な発現をＰＣ-３セルで見つけた。我々は、１６６のセル、更にマウスＣのこれらの３つの遺伝子の発現を調査した。ＲＴ-ＰＣＲ結果は、全３つの遺伝子が１６６のセル、Ｃで表されることを再び示した。従って、我々は対応する細胞に特定の遺伝子を目標としている３つの選択されたｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓをトランスフェクションさせることができて、そうすると、それらの遺伝子サイレンシング可能性を評価できる。そして、完全なＲＮＡ隔離およびＲＴ-ＰＣＲ分析が続く。３つの服用が、６穴プレート上のトランスフェクションごとに使われた：０．５ｕｇ、１ｕｇおよび２ｕｇ（ベンダーの方向後のＬｉｐｏ２０００を有する）。余分のものを回避する増幅、そして、ＲＴ-ＰＣＲの平坦効果、特定の遺伝子を目標としている各ｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏのサイレンシング動作を区別するために、我々は、増幅の２５-３０サイクルを走らせるだけである。ＲＴ-ＰＣＲ製品は、ゲル電気泳動および定量化を受けもした。図２３は、ＴＧＦ-β、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３遺伝子を目標としている強力なｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓのより抜きを示す。１６６セル、ヒトＰＣ-３細胞およびマウスＣから分離される完全ＲＮＡサンプルのＲＴ-ＰＣＲ分析に基づいて、ＴＧＦ-β１、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３  ｍＲＮＡ配列を目標としているこれらのｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓのトランスフェクションの後、我々は、平癒している瘢痕のない皮膚損��の改良のためのそれらの潜在的治療的な動作の更なる評価のための以下の強力な２５の構造単位ｓｉＲＮＡデュプレックスを選択した：（１）ｈｍＴＦ-２：感覚、５’-ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵ  ＡＣＣＡＵＧＣＣＡＡＣＵＵＣＵ-３フィート（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，５’-ＡＧＡＡＧＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧ-３フィート）、（２）ｈｍＣＸ-１：感覚、５’-ＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＵＧＵ-Ｓの  -  アンチセンスの  -  ５’-ＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧ  ＣＡＣＣＡＧＡＣＣ-３フィート、（３）ｈｍＨＸ-１：感覚、５’-ＧＧＵＧＧＣＵＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＵＧＵＧＵＵ-Ｓの  -  アンチセンスの  -  ５つの『−Ａ  ＡＣ  ＡＣ  ＡＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣ  ＡＧＣＣ  ＡＣＣ-３』。損傷を癒やしている分析Ａの皮膚切除損傷モデルは、全層摘出皮膚損傷がそうであった５ｍｍの直径を対にした背面の正中の両側に作成するマウス（Ｃ５７マウスかＢａｌｂ／ｃマウス（図１５）を使用する）の中でｄｅｐｉｌｉｔａｔｅｄされた背。制御および治療された損傷は、損傷を癒やしている表現型（例えば損傷閉鎖および標的遺伝子ノックダウンの変更および組織病理変化）のために観察されることができる。マウス皮組織のｓｉＲＮＡにより媒介される遺伝子発現ノックダウンを評価するために、我々は、マウス皮合計ＲＮＡサンプルのＴＧＦ-βｌ、Ｃｏｘ-２およびＨｏｘｂｌ３のｍＲＮＡ表示を検出するために、ＲＴ-ＰＣＲを使用する。完全ＲＮＡサンプルは、製造の指示（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓな４ＰＣＲ、Ａｍｂｉｏｎ）に従う引き抜かれた形皮膚サンプルであった。全ＲＮＡの０．２５のμｇは、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマを有する３分間の７Ｏ０Ｃで暖められて、それから、ＴＧＦ-βｌ、コックス-２およびＨｏｘＢ１３遺伝子のための特定のプライマを使用しているＰＣＲ（３５サイクル）が続く逆転写酵素を含んでいる２０μｌ反応混合物の３０分間の４２０Ｃで、後退転写された。（１）Ｍｏｕｓｅ  ＴＧＦ-β、前方へ：５’-ＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴ-３フィート（後退）：５’-ＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴ-３フィートおよび製品：４８８ｂｐ、（２）Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｘ-２、前方へ：５’-ＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴ-３フィート（後退）：５’-ＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴ−３フィート、製品：３７１ｂｐ、（３）Ｍｏｕｓｅ  ＨｏｘＢ１３、前方の５’-ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ-３フィート（後退）：５’−ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＧ-３フィート、製品：２０５ｂｐ。生体内のＯｐｔｉｍｉｚｅｄヒスチジン-リジン・ポリマー（ＨＫＰ）がそうであったｓｉＲＮＡ送出のためのヒスチジン-Ｌｙｓのポリマーは、生体外で、そして、生体内で、ｓｉＲＮＡ送出を申し込んだ。一対のＨＫポリマー種（Ｈ３Ｋ４ｂおよびＰＴ７３）は、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、ＬｙｓインまたはＡｓｐａｒａｇｉｎｅの複数の繰り返しを含んでいる４本の分岐を有するＬｙｓのバックボーンを有する。このＨＫＰ水溶液が質量によって、４：１のＮ／Ｐ比率で水溶液のｓｉＲＮＡを混ぜ合わせられるときに、ナノ粒子（直径１００-２００ナノメートルの平均繊度）は自己集合であ��た（図１６）。最適枝分れヒスチジン-リジン・ポリマー（ＨＫＰ）は、Ｒａｎｉｎボイジャー・シンセサイザ（ＰＴＩ、トゥーソン、ＡＺ）に合成された。研究において、使用するＨＫＰの２つの種は、Ｋ（Ｒ）-Ｋ（Ｒ）の（Ｒ）構造を有するＨ３Ｋ４ｂおよびＰＴ７３であった−（Ｒ）Ｋ（Ｘ）Ｈ３Ｋ４ｂが、どこでＲ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ、そして、Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮ、Ｘ＝Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｋ＝リジン、Ｈ＝ヒスチジン、そして、Ｎ＝Ａｓｐｅｒａｇｉｎｅ所で、ＰＴ７３間の。ＨＫＰは水溶液に溶かされて、それから質量によって、４：１の比率でｓｉＲＮＡ水溶液を混ぜ合わせられた。そして、直径２００ナノメートルの１５０-の平均繊度のナノ粒子を形成した。ＨＫＰ-ｓｉＲＮＡ水溶液は、沈殿物の目立つ凝集なしで半透明で、少なくとも３ヵ月間の４Ｃで格納されることができる。我々は、Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅを有する皮膚損傷ｓｉＲＮＡ送出のためのＨＫＰを適用した。損傷を癒やしている分析の皮膚摘出損傷モデルを使用して、我々が皮膚摘出損傷モデルでした第１の実験は、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ-Ｌｙｓのポリマーにより媒介される局所投与を有するＴＧＦβ-ｓｉＲＮＡの治療的な利点を分析することである。１０匹のマウスが、摘出皮膚が背面の正中の両側に損傷する対５ｍｍの直径ｆｕｌｌ-厚の実験において、用いられたＢａｌｂ／ｃマウスの中でｄｅｐｉｌｉｔａｔｅｄされた背）。従来のメチルセルロースが、ナノ粒子／ｓｉＲＮＡの有無にかかわらない局所投与キャリアとして使われた。各マウス上の２つの損傷は、毎日第一の５日間のナノ粒子／ｓｉＲＮＡに加えて、メチルセルロースだけまたはメチルセルロースだけで扱われもした。観察は、日０、５、９および第１５にされた。画像がまとめられる（図１７）ときに、我々は皮膚損傷の終了に対する明白な治療的な利益がナノ粒子の強化されたｓｉＲＮＡ送出で扱われるのを発見した。日の損傷閉鎖の速度は、５番目に処置群において、対照群のそれらより非常に急速だった。第９に日に、対照群がまだ多くの開かれた損傷があると共に、ほとんどすべての治療された損傷はほとんど閉じた。第１５に日に、表面的な観察は、２つのグループとの間に有意差を示さなかった。
【００９０】
我々がそうした第２の実験が各時点に損傷閉鎖を定量化するためにそうであった皮膚摘出損傷の終了の定量化。同じ時刻に、我々も、治療的な利点がＨＫポリマーの結果かｓｉＲＮＡ自体であるかどうか尋ねた。１０のサンプルを有する処理の４つのグループが、研究において、各々使われた：１）Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、２）だけ）Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅさらにナノ粒子／ＴＧＦβ-１-ｓｉＲＮＡ、３ＴＧＦβ-１-ｓｉＲＮＡを加えたＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、そして、４）Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅさらにｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ／ｃｏｎｔｒｏｌ-ｓｉＲＮＡ。５番目におよび９番目に日上の各グループの損傷サンプルの測定値を平均することによって、若干の効果がグループ３によって、見られた場合であっても、我々はグループ２および他の３つのグループとの間に有意差（Ｐ<０．０５）を見つけた。明らかに、より速い皮膚損傷閉鎖のための治療的な利点は、ナノ粒子の強化されたＴＧＦβ-１-ｓｉＲＮＡ送出の結果である。皮膚摘出損傷Ａｓのサンプルの標的遺伝子ノックダウンの中でナノ粒子の強化されたＴＧＦβ-１が治療的なものに対する責任があることは公知であったという証拠皮膚損傷閉鎖のために幸運をもたらす、損傷の囲い組織の標的遺伝子が調整されて下にある場合、鍵となる質問はそれのように見える。この種の質問に答えるために、全ＲＮＡは、ＲＴ-ＰＣＲ分析が続く各グループの代表試料から分離された。図２１に示すように、対照群と比較して、損傷組織のＴＧＦβ-１表現の特定のノックダウンは、ナノ粒子の強化されたＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡ送出によって、扱った。面白いことに、ＨＫポリマーによって、パックされるｓｉＲＮＡカクテル・ターゲッティングＴＧＦβ-１、Ｈｏｘｂｌ３およびコックス-２はＨＫポリマーを有するＴＧＦβ-１  ｓｉＲＮＡパッケージとして類似のノックダウン活性を示した。その一方で、Ｈｏｘｂｌ３かＨＫポリマーにより包装されるコックス-２に特有のｓｉＲＮＡデュプレックスはＴＧＦβ-１ダウンレギュレーションを示した。矢で示されるように、異なる倍率が使われた損傷を癒やしている方法Ｔｈｒｅｅの間の真皮組織構造の組織病理学イメージは傷ついた領域を囲んでいる真皮組織構造を示す。皮膚サンプルは、損傷した１４日後に収集されて、パラホルムアルデヒド固定して、膠原瘢痕組織を検出するために、マソンのｔｒｉｃｈｒｏｍ油焼けに従属した。通常の組織アーキテクチャの回復は、ＴＧＦβｌ  ｓｉＲＮＡ-（コックス-２  ｓｉＲＮＡ）で扱われる損傷に示すことができる−そして、Ｈｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡ-ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ。ＴＧＦβｌ  ｓｉＲＮＡ-コックス-２  ｓｉＲＮＡ-およびＨｏｘｂｌ３  ｓｉＲＮＡ-ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓで扱われる損傷の新真皮の構造は、斜子織りパターンにおいて、ゆるく配置される網状の膠原繊維を有する通常の真皮のそれに似ている。対照、虚偽の制御損傷の新真皮の膠原繊維および制御ｓｉＲＮＡ-によって、ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ治療をうけている損傷は、異常な平行したパターンに高密度に置かれる。これらのイベントによって、膠原繊維が一緒により間近の状態のままの（図２２）ことができる、コラーゲンを促進することは交差する-結鎖、そして、��終的に減少している瘢痕厚み。分子内および分子間コラーゲン架橋は、増加した損傷破裂強さに結果としてなる。ナノ粒子の強化されたコックス-２-ｓｉＲＮＡ送出はそのナノ粒子の強化されたＴＧＦβ-１が責任があることは公知だった構造Ａｓのような通常の組織に結果としてなった。そして、皮膚のための治療的な利点は閉鎖を巻回した。我々もそのｓｉＲＮＡデュプレックスがコックス-２を目標としているのを見る。そして、Ｈｏｘｂｌ３遺伝子は損傷閉鎖を強化することが可能だった。同時に、我々は、組織病理変化がナノ粒子／ｓｉＲＮＡ（図２３）の結果であることを確認したい。画像は、ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ／Ｃｏｘ-２  ｓｉＲＮＡが同様が通常の組織として構造の外皮をはぐ結果になっている有力な誘因であることを示している。損傷の引張強さは、装置域につきそのロード能力の測定値である。その寸法に関係なく、損傷の破裂強さは損傷を壊すことを必要とする力である。破裂強さは、皮膚厚によって、変化する。損傷のピークの引張強さは、損傷のほぼ６０日後に発生する。癒やされた損傷は、非傷ついた皮膚の引張強さのほぼ８０％に達するだけである。
【００９１】
我々の以前の研究において、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ-Ｌｙｓのペプチドの中で抗真菌性有効性、ＨＫペプチドが細胞にｓｉＲＮＡを分配してそれらの線形相対物より効果的であることが示された。枝分れＨＫペプチドがより有効な抗かび剤であるかどうか決定するために、分岐のそれらの数において、変化したＨＫペプチドは、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ成長（図２４）の抑制のために研究された。Ｈ２Ｋ３ｂは、３７．５のμｇ／ｍｌ（４．５のμＭ）の１１．３％、そして、５０のμｇ／ｍｌ（６．０のμＭ）の６１．７％Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓの成長を減らした。Ｈ２Ｋ４ｂは、５０のμｇ／ｍｌ（４．５のμＭ）で、３７．５のμｇ／ｍｌ（３．４のμＭ）および８５％でほとんど４０％までＣ．  ａｌｂｉｃａｎｓで最も強い抗真菌性効果を減らしている成長を有した。これらの結果は、より非常に枝分れＨＫペプチドがＣ．  ａｌｂｉｃａｎｓの成長を阻害することで、それらのより小さい枝分れ相対物より効果的であったことを示す。生体外毒性と関連して、これらのペプチドの中の生体内の毒性違いは、より打っている。予備データは、４ｂ、Ｈ３Ｋ（Ｇ）を管理されるマウスの鋭いか亜急性の毒性（肺、肝臓および腎臓）が静注で１０-第二期（図２５）が治った（５０ｍｇ／ｋｇ）最高１０００のμｇをしないことを示す。対照的に、予備研究は１０００のμｇで、Ｈ２Ｋ４ｂが注入の２４ｈ後に肝臓、肺および腎臓に有毒だったことを示すが、Ｈ３Ｋ４ｂは腎臓に最小限有毒だった。検討される３つの器官のうち、腎臓は、これらのペプチドに最も影響されるように見える。Ｈ２Ｋ４ｂと関連して、Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ（Ｇ）Ｋ４ｂのターミナルの分岐のカチオンの負担の減少は、一つには、生体外で、そして、生体内で、それらの減らされた毒性を占めることができる、充電の減少は、負に荷電する細胞膜を有するそれらの相互作用を減少させることができる。さらに８つのグリシンについては、Ｈ３Ｋ（Ｇ）４ｂポリマーは、Ｈ３Ｋ４ｂと関連してアミノ酸の総数につき、減らされた負担を有する。５つのリジンがＨ３Ｋ（Ｇ）４ｂおよびＨ３Ｋ４ｂの各終端の腕にあるので、しかしながら、我々は最小の充電違いがＨ３Ｋ４ｂと関連して４ｂ、直ちにＨ３Ｋ（Ｇ）の減らされた毒性を説明することを疑う。他の可能性はグリシンがターミナルの分岐のα螺旋を崩壊させることができるということである。それによって、ポリマーの柔軟性を強化して、酵素的分解を許容する。ペプチドのためのいくつかの二次組織プログラムは、ペプチド、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ４ｂを含んでいるグリシンを含んでいるペプチド、Ｈ３Ｋ（Ｇ）４ｂおよび非グリシンとの間にα螺旋含量の印のある違いを予測する。実際、円二色性分光学を有する予備データは、Ｈ３Ｋ（Ｇ）が４ｂ、そのＨ３Ｋ４ｂ相対物と関連してより少ないα螺旋構造を有することを証明する。
要約すると、いくつかのマウスモデルで平癒している皮膚瘢痕のない損傷を改善するためのｓｉＲＮＡ治療学の集中的な研究に基づいて、我々は、枝分れＨｉｓｔｉｄｉｎｅ-Ｌｙｓのペプチド類が生体内で（真皮）ｓｉＲＮＡのための非常に有力な配達剤であると非常に確信している。
【００９２】
実施例１７：将来の研究Ｔｏのための実験的なＤｅｓｉｇｎは、提案された研究の目的に達する：引張強さを減少させて、ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎを崩壊させることのないより少ない瘢痕組織形成によって、平癒している成人皮膚損傷の改良のための臨床的に生き残れるＲＮＡｉ治療的なプロトコルを開発して、我々は、３つの特定の目的をセットした：
サイレンシングＴＧＦ-β（ＣＯＸ-２および生体外Ａｓが表１に記載したＨｏｘｂｌ３表現）のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスを確認する、我々は、目標とされた遺伝子、Ｈｏｘｂ  １３、ＣＯＸ-２およびＴＧＦ-β１の各々のためのｓｉｌｉｃｏの１０のｓｉＲＮＡシーケンスを設計した。我々は、それからそれらの１０のｓｉＲＮＡシーケンスの各々から３つのｓｉＲＮＡデュプレックスをとって、それらの作用強度を尊重された細胞培養、ヒト細胞ＰＣ-３およびマウス細胞Ｃ  １６６の標的遺伝子ノックダウン用に試験する。Ｔｏが非常に最も二重強力なｓｉＲＮＡに保証する目標とされた遺伝子ごとに最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスの選択は将来の医療適用のために選択されることになっている。そして、我々が更にこれらの目標とされた遺伝子の各々のためのさらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスを評価するベンチマークとしてそれらの確認されたｓｉＲＮＡデュプレックスを使用すると決定される：ＴＧＦ-β１、コックス-２およびＨｏｘｂｌ３。ｓｉＲＮＡ制御シーケンスに関して、我々は、非関連したシーケンスを目標としているｓｉＲＮＡデュプレックスを選択した、そして、両方の人間およびマウス・ゲノムに対するいかなるホモロジなしでも：ＣＴ-Ｉ：（感覚、５’-ＧＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵ-Ｓのもの、そして、アンチセンス、５’-ＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣ-Ｓのもの）中で確認されたいくつかの我々の以前の刊行物（３５、４９）。人間およびマウスＨｏｘｂｌ３を目標としているさらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスは、以下の通りである：ｈｍＨＸ-１：（感覚、５’-ＣＡＡＧＧＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＧＧＡ-Ｓの  -  アンチセンスの  -  ５’-ＵＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＵＣＧＡＵ  ＡＵＣＣＵＵＧ-３フィート）、ｈｍＨＸ-２：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＧＣＡＡＧＡＵＣＵＣＧＧＣＡ-３フィート）５’-ＵＧＣＣＧＡＧＡＵＣＵＵＧＣＧ  ＣＣＵＣＵＵＧＵＣＣ-３フィート）、ｈｍＨＸ-３：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＣＡＡＧＡＵＣＵＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵ-３フィート）５’-ＡＧＧＣＵＧＧＵＧＧＣＵＧＣＣＧＡＧＡＵＣＵＵＧＣ-Ｓのもの）。人間およびマウス・コックス-２を目標としているさらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスは、以下の通りである：ｈｍＣＸ-１：（アンチセンスで、感覚（５’-ＣＡＵＣＡＧＵＵＵＵＵＣＡＡＧＡＣＡＧＡＵＣＡＵＡ-３フィート）５’-ＵＡＵＧＡＵＣＵＧＵＣＵＵＧＡＡＡＡＡＣＵＧＡＵＧ-Ｓ）『、ｈｍＣＸ-２：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵＧＡ-３フィート）５’-ＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣ-３フィート）、ｈｍＣＸ-３：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＵＧＣＣＵＧＧＵＣＵ  ＧＡＵＧＡＵＧＵＡＵＧＣＣＡ-３フィート）５’-ＵＧＧＣＡＵＡＣＡＵＣＡＵＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣ-Ｓのもの）。人間およびマウスＴＧＦ-βｌを目標としているさらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスは、以下の通りである：ｈｍＴＦ-１：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＡＵＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵ-３フィート）５’-ＡＵＧＧＵ  ＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣＧＵＧＧＡＵＣ-３フィート）、ｈｍＴＦ-２：（アンチセンスで、感覚（５’-ＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＵＧＣＣＡ-３フィート）５’-ＵＧＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＣＵＵＧＧＧＣＵＣＧＵＧ-Ｓのもの）、ｈｍＴＦ-３：（アンチセンスで、感覚（５’-ＧＧＣＧＣＣＧＣＣＵＣＣＣＣＣＡＵＧＣＣＧＣＣＣＵ-３フィート）５’-ＡＧＧＧＣＧＧＣ  ＡＵＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＣ-３フィート）。一連のトランスフェクション実験はＲＮＡ隔離およびＲＴ-ＰＣＲ分析が続いて行われそうである。そして、これらの付加的なｓｉＲＮＡが二重化するいずれかが確認されてすでにより良好ないずれか、それからそれらであるかどうか決定する。我々がヒトＰＣ-３細胞が全３つの遺伝子目標に対するｓｉＲＮＡ-により媒介される遺伝子サイレンシング検査に非常にかなり適しているとわかったので、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは特定の細胞に培養組織を二重化する、我々は確認されたｓｉＲＮＡデュプレックスと比較するさらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで遺伝子発現ノックダウンの生体外研究のためのＰＣ-３細胞によって、とどまる。同様に、マウスＣは、１６６のセル、全３つの遺伝子を静まらせるためのこれらのｓｉＲＮＡデュプレックス・テストに役立つこともありえる。これらの２つの細胞系は、１０％の胎児のウシ血清（ＦＢＳ）１００のμｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンで補充されるＤＭＥＭの１０ｃｍのプレートに培養されて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を使用しているｓｉＲＮＡデュプレックスによって、トランスフェクションする。細胞は、ＰＢＳによって、二回洗われなければならなくて、２４ｈのＦＢＳのない媒体で暖められなければならない。ＦＢＳのない媒体は、細胞周期を始めるために１０％のＦＢＳを含んでいる媒体と交換された。トランスフェクション実験は、試薬対照群、非特異的ｓｉＲＮＡ対照群、特定のｓｉＲＮＡデュプレックスをトランスフェクションさせるための３つの異なる投与量を有する：６穴プレート上の１ウェルにつき０．５、１．０および２．０ｕｇ。潜在的陥穽：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を有するそれらの細胞のトランスフェクションは、能率的に必ずしも働くことができない。エレクトロポレーションまたは他のｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ剤のような、代わりのトランスフェクション方法が、用いられることが可能である。効率的なトランスフェクションおよび以下のＲＴ-ＰＣＲ分析法は、満足なデータを成し遂げるために協力して機能することを必要とするかもしれない。それらの各々からＲＴ-ＰＣＲ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用している測定ｏｆｍＲＮＡレベルは、細胞系をトランスフェクションさせた：ＰＣ-３およびＣ１６６。Ｈｏｘｂｌ３アンプリコン（マウス）の検出のために、ＲＴ反応は、前方のプライマ（５フィート）を使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる-ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ-３フィートおよび復帰プライマ（５’-ＡＣＴ  ＧＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＧ-Ｓのもの）。コックス-２アンプリコン（人間的な）の検出のために、ＲＴ反応は、��方のプライマ（５’）を使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる-ＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣ  ＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡ-３『そして、復帰プライマ、５』-ＣＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＴ-３。ＴＧＦ-βｌアンプリコン（マウス）の検出のために、ＲＴ反応は、前方のプライマ（５’）を使用しているＰＣＲ反応を付け加えられる-ＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣ  ＡＣＣＴＴ-３フィートおよび復帰プライマ（５’-ＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧ  ＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴ-３フィート）。ＰＣＲ製品は、１％のアガロースゲルに積まれなければならなくて、臭化エチジウムで色付けされなければならない。ＰＣＲ製品は、特定のｓｉＲＮＡデュプレックスを使用している各特定のｍＲＮＡのノックダウンのレベルを呈しなければならない。二重特定のｓｉＲＮＡが最も有力なものである場合、この実験からの結果は二重各ｓｉＲＮＡの効力を決定して、第１の観察を提供する。ＰＣＲ分析のための全ＲＮＡの充分な量を成し遂げるために、適当な状態が特定の細胞系のための効率的なトランスフェクションのために最適化されることができるように、ＲＴ-ＰＣＲ分析法はトランスフェクション実験によって、密接に機能することを必要とするかもしれない。加えて、各遺伝子のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスのより抜きは、３つの反復実験に基づく。サイレンシング有効性は、さらに３つのｓｉＲＮＡデュプレックスおよび前に確認されたｓｉＲＮＡデュプレックスとの間に比較される。対応するｓｉＲＮＡデュプレックス、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析によって、トランスフェクションする細胞のＥＬＩＳＡ  Ｔｏ計測タンパク質レベルを使用しているタンパク質レベルの測定は、充分でなければならないおよび、満足でなければならない。細胞可溶化物または細胞培養基が、タンパク質検出のために用いられる。
【００９３】
マウスＨｏｘｂｌ３の検出のＥＬＩＳＡ検査法が市販でないにもかかわらず、我々は、使用できるウエスタンブロット分析を有するＲＥＫ細胞を表しているＨｏｘｂｌ３のｓｉＲＮＡにより媒介されるノックダウンを検出するマウスＨｏｘｂｌ３（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）にネズミ・ポリ・コロンの抗体。ラビット反Ｈｏｘｂ  １３抗体は、マウスＨｏｘｂｌ３のＮ末端基（アミノ酸１-７  ９）部分に対して発生した。この抗体は、ＷＴおよびノックアウトＨｏｘｂｌ３タンパク質を認識しなければならない。後者は、ホメオドメインのアミノ酸３３で止まる切り詰めたタンパク質である。使用の前に、抗血清は、明らかに、他のＨｏｘｌ３タンパク質を有する可能な交差反応性を除去するためにマウスＨｏｘｃｌ３およびチキンＨｏｘｄｌ３に対して負の親和性浄化が続いて浄化される親和性でなければならない。油焼けはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を使用して捕えられなければならない。人間のＣＯＸ-２は、細胞培養上澄みおよび細胞可溶化物のヒトＣＯＸ-２の定量的検出の酵素結合免疫溶解サンドイッチ検査法であるＣＯＸ-２  ＥＬＩＳＡキット（酵素の、聖フランシスコ、ＣＡ）を使用して分析される。Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ）が膜結合酵素（７１ｋＤａの分子量を有する）であるので、細胞可溶化物はＥＬＩＳＡ分析の準備ができていなければならない。マウスＴＧＦ-βｌは、Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ  ＴＧＦ-βｌ（トランスフォーミング成長因子β１、ＴＧＦ-βｌ／ＴＧＦ-βｌ）ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ-ＳＥＴ-Ｇｏキット（Ｐｒｅ-Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓによって、）を使用して分析される。各遺伝子のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスのより抜きは、３つの反復実験に基づかなければならない。潜在的陥穽は、いつか最も、ｍＲＮＡノックダウンから選択される強力なｓｉＲＮＡデュプレックスがタンパク質ノックダウンから選択されるものと相関していないということである。その状況が起こるときに、それが動きのＲＮＡｉ機構の鏡面反射であった時から、我々はｍＲＮＡレベルのノックダウンからデータに依存する。タンパク質レベル・ノックダウンの矛盾がいつか非特異的もののためあることができるかまたは「的外れの」効果を非常に呼ぶことができる。そして、それは動きのＲＮＡｉ機構の結果でない。以下の３つの遺伝子（Ｈｏｘｂｌ３、ＣＯＸ-２および細胞培養研究に基づくＴＧＦ-βｌ）の各々のために最も強力なｓｉＲＮＡデュプレックスの活発なＡｆｔｅｒ選択において、最も有効なｓｉＲＮＡカクテルを選択する、我々は、ｓｉＲＮＡカクテルとして一緒にそれらをいくつかの比率と結合する。組合せが、１として使うことができる：１：１，  ２：１  ：１および３：１：１、その他、成人皮膚損傷のＨｏｘｂ  １３の重要性のＢｅｃａｕｓｅが回復して、我々は、Ｈｏｘｂｌ３に特有のｓｉＲＮＡデュプレックスの比率変更に集中する。加えて、我々は適当なマウスモデルおよびｓｉＲＮＡナノ粒子製剤を評価する。その結果、我々は潜在的治療的なプロトコルのた���に最も適切なｓｉＲＮＡ-ナノ粒子製剤を定めることができる。
適当なｓｉＲＮＡカクテルを評価するマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルおよび大部分の適切な製剤の評価のためにマウスモデル、我々はリンＬｉ博士の研究室からＨｏｘｂｌ３ノックアウト（ＫＯ）成人マウスを得る。これは、次のことの故である。Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯ損傷は初期の妊娠胎児性損傷のいくつかの特徴を呈する。そして、損傷と比較されるときに、より速い閉鎖、増加した引張強さおよびより真皮に瘢痕化しないことをそれらの原株（ＷＴ）相対物から含む。生化学評価で、表皮性および真皮ヒアルロン酸（ＨＡ）の濃度がＷＴ皮膚と比較して非傷ついた成体Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯ皮膜分が著しくより高いことが分かった。これらの結果に基づいて、我々は成体皮膚のＨｏｘｂｌ３が分化を促進すると仮定するが、その不在はより多くのｆｅｔａｌ-ｌｉｋｅ環境をつくる。そして、このｆｅｔａｌ-ｌｉｋｅ状態のその唯一の結果は平癒している強化された損傷である。Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯマウスの背中の皮膚損傷を使用しているよく認められたモデルに加えて、我々は、唇裂および口蓋手術を模倣するために、マウス唇手術モデルも決めた。我々の研究において、全麻および無菌の状況の下で、Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯおよびＷＴ成人マウス（８-１６週間目）はそれらの前歯と並列の切開性損傷が損傷を縫合する（６．０のＮｙｌｏｎ）ことによって、続いた単一の０．５ｃｍの完全な厚み皮膚を与えられる。そして、裂けたＨｐおよび口蓋手術を模倣する。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルＴｏの配達のために使用する製剤はポリマー-ｓｉＲＮＡナノ粒子を決める。そして、我々が最初にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ-Ｌｙｓの枝分れポリマーをこの製剤用に試験すると決定される。メリーランド大学のバイオポリマー核機能は、Ｒａｎｉｎボイジャー・シンセサイザ（ＰＴＩ、トゥーソン、ＡＺ）上のポリマーを合成する。枝分れＨＫポリマー（生体内のｓｉＲＮＡ転送のために有効な）は、地方行政のためのｓｉＲＮＡデュプレックスによって、複雑になった。ポリマーは、ＨＰＬＣ（ベックマン、フラートン、ＣＡ）により精製される。この研究において、使用する第２の枝分れＨ（ヒスチジン）およびＫ（リジン）ポリマーは、Ｒ-ＫＲ-ＫＲ-ＫＲでなければならない、どこでＲ＝［ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ］２ＫＨ４ＮＨ４］。Ｒ分岐が異なること以外は、Ｈ３Ｋ４ｂは上記の同じ核および構造を有する枝分れポリマーである：Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ。ＨＫＰは、水溶液に溶かされることができて、それから４の比率で、ｓｉＲＮＡ水溶液を混ぜ合わせられることが可能である：１５０-２００の平均繊度の大量の、形をなしているナノ粒子による１は、直径動作する。ＨＫＰ-ｓｉＲＮＡ水溶液は、沈殿物の目立つ凝集なしで透明なｓｅｍｉ-であって、少なくとも３ヵ月（５０）間の４Ｃで格納されることができる。ＨＫポリマーに加えて、皮膚損傷の領域への効果的な配達のための我々のｓｉＲＮＡカクテルについては、我々は、ポリマー・キャリア、ｐｅｇｙｌａｔｅｄされたＰＥＩおよびＰＡＭＡＭデンドリマの２つの異なるタイプをテストすることもできる。すべてのこれらのｓｉＲＮＡポリマー製剤は、ＲＮＡｓｅのないＤ５Ｗ溶液において、分解されて、そうすると、��％のＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（１：１）または２％Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅに組み込まれる：ＰＢＳ（ｌ：ｌ）。製剤は、損傷台上へ塗布されて、透明なＴｅｇａｄｅｒｍドレッシングでもおおわれている。皮膚損傷Ｔｏのマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルの管理は２つの異なる皮膚損傷モデルのさまざまな製剤をテストする、我々は固定された製剤を３つの異なるｓｉＲＮＡデュプレックスの３つの異なる比率で最初にテストする。３つの比率は、１時にＨｏｘｂ  １３、コックス-２およびＴＧＦ-β１を目標としているｓｉＲＮＡデュプレックスである：１  ：１  ，  ２：１  ：１および３：１：Ｈ３Ｋ４ｂポリマーによって、公式化される１。グループがそうでありに行っている研究：Ｇｌ：各リップ手術のためのＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ２：各リップ手術のためのＨｏｘｂ  １３  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ３：各リップ手術のためのコックス-２  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ４：各リップ手術のためのＴＧＦ-βｌ  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ５：各リップ手術のための比率１カクテルｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、Ｇ６：各リップ手術のための比率２  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった、そして、Ｇ７：各リップ手術のための比率３  ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇは、曲がった。４匹の動物は、各グループにおいて、ある。同じ管理は、１３がノックアウトするＨｏｘｂおよびＷＴマウスが利用できる。この研究の結果は、一回のｓｉＲＮＡ製剤に匹敵しているカクテルｓｉＲＮＡ製剤の相乗的利益を示すことである。いずれのＫＯ動物もおよびＷＴ動物からの結果の間の比較は、異なるテストが新しい治療製剤への意志反応をモデル化する洞察を提供する。損傷上の異なる製剤の影響が処方物がｓｉＲＮＡカクテルでテストされてなる３から回復して、我々は、３つの製剤をＨｏｘｂ  １３  ＷＴマウスのマウス唇手術モデルでテストするだけの予定である。実験は、ｓｉＲＮＡの組合せ（例えば１：１：１）の１つの比率に集中する。実験は、Ｇｌを含む：制御ｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ２：制御ｓｉＲＮＡ-Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ＰＥＩポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ３：樹枝状の制御ｓｉＲＮＡ-ＰＡＭＡＭの中で２０μｇポリマー製剤（５０のμＬ）、Ｇ４：カクテルｓｉＲＮＡ-ＨＫポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ、Ｇ５：カクテルｓｉＲＮＡをｐｅｇｙｌａｔｅｄされたＰＥＩポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇおよびＧ６：カクテルｓｉＲＮＡ-ＰＡＭＡＭ樹枝状のポリマー製剤（５０のμＬ）の２０のμｇ。各グループは、４匹の動物を有する。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル分析は、他の生体内の研究として続かれる。この研究は、我々がマルチで最高の製剤を決めるのを助ける-臨床プロトコルのための目標とされたｓｉＲＮＡカクテル。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルＳｋｉｎサンプルで生体内標的遺伝子���ックダウンはＨｏｘｂｌ３  ＫＯおよびＷＴマウス（背中の皮膚損傷かリップ手術損傷）から削除されて、高グルコースＤＭＥＭ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌＯ％ＦＢＳおよび抗生物質／菌ゾーン（７０％のエタノールにおいて、殺菌される表面）に浸される解剖する-５-ｍｍ２は組織から４°Ｃ．Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルで終夜ＤＭＥＭ（５ｍｇ／ｍｌ）の逆パセを切断して、消化した、そして、細胞はＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔキットおよびプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して転写される後退である。抗体油焼けのために、ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙは成人ＷＴを非固定した、そして、Ｈｏｘｂｌ３  ＫＯ皮膚サンプルは処理されなければならなくて、パラフィンに封埋されなければならなくて、切断されなければならなくて（６つのμｍ）５５°で終夜焼かれなければならない。ＲＮＡ隔離の類似の方法および免疫組織化学のための試料調整が、生体内でコックス-２およびＴＧＦ-βｌ検出のために使うことができる。最も強力なｓｉＲＮＡカクテル製剤の判断は、皮膚損傷モデル（Ｈｏｘｂｌ３の遺伝子型および二重各ｓｉＲＮＡの比率）を考慮してなされなければならない。ｍＲＮＡレベルのノックダウンがマルチターゲットｓｉＲＮＡカクテルの効力の鍵となる徴候である同じ原理は、考慮されなければならない。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルＴｏの潜在的治療的な利点はｓｉＲＮＡカクテルの潜在的治療的な利益の第一の評価を有する、我々は２つの分析を行うつもりである：組織学的およびＨＡ分析。パラホルムアルデヒドを固定した皮膚サンプルは、処理されて、パラフィンに封埋されて、切断される（６つのμｍ）。スライドは５５°Ｃで終夜焼かれなければならなくて、ヘマトキシリンによって、しみをつけられなければならない、そして、エオシンまたはマソンは標準プロトコルを使用してコラーゲンのためにトリクロームである。ＨＡ検出のために、皮膚部は２％のＦＢＳにおいて、ブロックされる。そして、ビオチン化されたＨＡ結合タンパク質によって、暖められる、（ｂＨＡＢＰ、ＰＢＳの１つのμｇ／ｍｌ、ケープコッド、会社、ファルマス、ＭＡの付随物）終夜４°Ｃで、ＰＢＳにおいて、すすがれて、Ｃｙ-３-ストレプトアビジンによって、暖められる（１：５００、ジャクソンＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）室温の３０分間、ＰＢＳにおいて、すすがれて、前述したように取り付けられる。ネガティブコントロールとして、組織は、単独でＰＢＳにおいて、暖められなければならない。
【００９４】
ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ-７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌシステムを使用することを捕えた。組織学分析は、治療されたおよび無処置の皮膚損傷の形態学的違いおよびＨＡタンパク質の存在の強度に関するグラフィック情報を提供する。ｓｉＲＮＡカクテルの適当な比率がそうであるマルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルＡのための臨床プロトコルを開発する最適化されたポリマー製剤を有する定めて、そして、特定のマウスモデルを有する関連させた。我々は、薬理学的特徴およびいかなる可視毒性のためのもこの候補治療的なプロトコルまたは副作用を試験するために、実験を設計する。鮮明な画像を発表するために、我々は、ちょうどリップ手術モデルが我々がその時に選択する（我々が第一の２つの研究を完了するときに本当の結果が達されることができるだけであるにもかかわらず）ものになると仮定する。マルチ目標とされたｓｉＲＮ  Ａカクテル製剤Ｔｏの服用に依存する曲線は定義済みの治療候補ｓｉＲＮＡカクテル製剤の適当な投与量を定める、我々にはマウスＨｐ手術モデルにおいて、検証されている６つの異なる投薬がある。テスト・グループは、Ｇｌでありそうである：損傷上へ２つのμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ２：損傷上へ１０のμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ３：損傷上へ２０のμｇ／５０μＬを適用する、Ｇ４：損傷（Ｇ５）上へ、３０のμｇ／５０μＬを適用する：損傷およびＧ６上へ４０のμｇ／５０μＬを適用する：損傷上へ６０のμｇ／５０μＬを適用する。各グループは、４匹の動物を含む。分子生物学的および生化学読み出しは、組織学および形態学評価とともに測定されなければならない。Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを固定した皮膚がサンプルをとる組織学的およびＨＡ分析法は、処理されて、パラフィンに埋め込まれて、区分される（６つのμｍ）。スライドは５５°Ｃで終夜焼かれて、ヘマトキシリンによって、しみをつけられる。そして、エオシンまたはマソンは標準プロトコルを使用してコラーゲンのためにトリクロームである。ＨＡ検出のために、皮膚部は２％のＦＢＳにおいて、ブロックされる。そして、ビオチン化されたＨＡ結合タンパク質によって、暖められる、（ｂＨＡＢＰ、ＰＢＳの１つのμｇ／ｍｌ、ケープコッド、会社、ファルマス、ＭＡの付随物）終夜４°Ｃで、ＰＢＳにおいて、すすがれて、Ｃｙ-３-ストレプトアビジンによって、暖められる（１：５００、ジャクソンＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）室温の３０分間、ＰＢＳにおいて、すすがれて、前述したように取り付けられる。ネガティブコントロールとして、組織は、単独でＰＢＳにおいて、暖められなければならない。ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅはライカＤＭＬＢ顕微鏡を使用して見られなければならない、そして、画像はＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ-７５０Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌシステムを使用することを捕えた。組織学分析は、治療されたおよび無処置の皮膚損傷の形態学的違いおよびＨＡタンパク質の存在の強度に関するグラフィック情報を提供する。コラーゲン量Ｃｏｌｌａｇｅｎ内容の定量化は、サンプルのヒドロキシプロリン内容を測定することにより決定される。手短に言えば、８-から１６-週前の成人マウス（各々ＷＴおよびＨｏｘｂＢ  ＫＯ間のｎ＝６）まで収集される全層背面の皮膚サンプル（-１６ｍｇ）が終夜凍結乾燥されて、１１００Ｃ（組織をカバーするのに十分な使用）で、１８ｈのための６Ｎ  ＨＣｌにおいて、加水分解されること、そして、ｐＨが、それからＮａＯＨ．を有する６〜７に合うサンプルは、Ｈ２Ｏを有する５ｍｌまで希釈されて、ワットマン濾紙を使用して濾過される。以下の溶液は、連続して各サンプルの１．０ｍｌに加えられる：クロラミンＴ溶液（１．０ｍｌ、０．０５Ｍ、２０分間の室温）過塩素酸（１．０ｍｌ、３．１５Ｍ、５分間の室温）および２０％／？-ジメチルアミノベンズアルデヒド（１．０ｍｌ）。サンプルは、２０分間の６Ｏ０Ｃで暖められなければならなくて、室温に冷やされなければならない。吸光度は５５７．５ナノメートルの波長で読み込まれそうである。そして、ヒドロキシプロリン濃度は標準曲線を使用して決定されそうである。以下の算出は、コラーゲン量を決定するために用いなければならない：ヒドロキシプロリンのμｇは、コラーゲンの７．４６＝μｇに×印を付ける。値は、μｇ／ｍｇ乾燥重量として報告される。張力学Ｆｏｒの中で測定、この研究、切開性損傷さらに周囲の皮膚は慎重に切除されて、そして、組織は、終夜４％のパラホルムアルデヒドに取り付けられる。同じ時間および位置がその翌日実行されるすべての時の張力学のために固定するすべての組織必要は、収集を巻回した。ｔｅｎｓｏｍｅｔｒｉｃな分析の前に、サンプルは同一の長さおよび幅に慎重に切られなければならない、そして、創傷部位の皮膚の厚みは決定される。張力学学科は、Ｉｎｓｔｒｏｎテスト・システムを使用して実施される。結果はＹ-モジュラスとして報告されなければならない、そして、Ｙ-モジュラスは応力／圧力を算出することによって、引き出されて、全体の損傷強さを代表する。応力は、損傷の損傷別々の／断面領域に怪我をすることを必要とする力の量である。圧力は、割れのサンプル／長の原長である。生の圧力値および断面積はＷＴとの間にｐｏｓｔｗｏｕｎｄｉｎｇしているいかなる時点にも著しく変化しない、そして、Ｈｏｘｂｌ３は損傷（示されないデータ）をノックアウトする。このように、Ｙ-モジュラス値の違いは、主に応力価格の力構成要素に起因する。
【００９５】
結論として、我々は、提案された研究からの大量のデータセットが我々にｍｕｌｔｉ-目標とされたｓｉＲＮＡカクテル製剤の特徴を理解するための相当な情報を提供すると思っていて、従って、より少ない瘢痕組織形成、より強い引張強さおよびより速い閉鎖によって、平癒している成人皮膚損傷の改良のための臨床プロトコルを定める。マルチ目標とされたｓｉＲＮＡカクテルは、新規な治療的な方法がさまざまな皮膚損傷を治療すると述べて、製薬およびｃｏｓｍａｃｅｕｔｉｃａｌな市場のために、非常に貴重である。
【図Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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