(57)【要約】本発明は、ＧＡＬＮＴの発現または活性を阻害することによる総血漿リポタンパク質およびＨＤＬ−Ｃのレベルのモジュレーションに基づいた冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症の検出および処置方法に関するものである。また、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤（複数も可）の同定方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＬＮＴ遺伝子によりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントであって、細胞上の表面受容体に結合し、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止するかまたは改善する抗体またはその機能性フラグメントの使用。
【請求項２】
ＧＡＬＮＴ遺伝子がＧＡＬＮＴ２遺伝子である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
請求項１〜２記載の抗体またはその機能性フラグメントの有効量を対象に投与することを含む、ＨＤＬ関連疾患の処置方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメントおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
処置を必要とする対象に請求項４記載の医薬組成物の有効量を投与することを含むＨＤＬ関連疾患の処置方法。
【請求項６】
ＨＤＬ関連疾患処置用医薬を製造するための単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、上記抗体またはその機能性フラグメントがＧＡＬＮＴ遺伝子によりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含むものである、使用。
【請求項７】
ＧＡＬＮＴ遺伝子がＧＡＬＮＴ２遺伝子である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１記載の抗体またはその機能性フラグメントをコード化する遺伝子を担持するトランスジェニック動物。
【請求項９】
ＧＡＬＮＴの発現および／または活性の阻害を含む、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法。
【請求項１０】
ＧＡＬＮＴがヒトＧＡＬＮＴ２である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カルボキシルエステラーゼの発現および／または活性の阻害段階が、さらに、カルボキシルエステラーゼ遺伝子によりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントを用いて活性を阻害することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントが、細胞上の表面受容体に結合し、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する、請求項１２記載の方法。
【請求項１３】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の指標であるヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子の対立遺伝子を検出することを含む、冠動脈疾患または冠動脈疾患に対する易罹患性の検出方法。
【請求項１４】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力の測定方法であって、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症を処置し、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力が測定されるようにＧＡＬＮＴのレベルを対照標準と比較することを含む方法。
【請求項１５】
ＧＡＬＮＴがヒトＧＡＬＮＴ２である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、ＧＡＬＮＴの阻害により血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの増加が誘導されることに基づき、生物試料を候補薬剤と接触させ、候補薬剤との接触の前後に試料中のＨＤＬ−Ｃレベルを測定することを含み、ＨＤＬ−Ｃの増加が、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤を示すものとする方法。
【請求項１７】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、既知ＧＡＬＮＴ基質の存在下でＧＡＬＮＴを候補薬剤と接触させることを含み、ＧＡＬＮＴのＧＡＬＮＴ活性の減少により、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤として候補薬剤を同定する方法。
【請求項１８】
ＧＡＬＮＴがマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
接触段階を培養細胞で実施する、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
接触段階を生体内で実施する、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ＧＡＬＮＴが内因性または外因性である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
対象においてＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させるＨＤＬモジュレーション剤の投与を含む、ＨＤＬ関連疾患をモジュレーションする方法。
【請求項２３】
ＨＤＬ関連疾患が、アテローム性動脈硬化症、脂質障害、アルツハイマー病、過度の酸化ストレス、内皮機能不全、肥満、慢性腎疾患、２型糖尿病およびインスリン抵抗から成る群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
脂質障害が、高コレステロール、脂質異常症候群、高トリグリセリド、脂質異常症、異常リポタンパク血症、高脂血症、家族性高コレステロール血症および家族性高トリグリセリド血症から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が、ヒトＧＡＬＮＴ２の活性を阻害するかまたはその発現を減少させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
ＨＤＬモジュレーション剤が、低分子量分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび抗体から成る群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＨＤＬ関連疾患が、対象におけるＨＤＬ−Ｃレベルが許容された正常ＨＤＬ−Ｃレベルより低い疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
ＨＤＬ関連疾患が、対象におけるＨＤＬ−Ｃレベルが関連集団の正常ＨＤＬ−Ｃレベルより低い疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
ＨＤＬモジュレーション剤が、医薬上許容される担体と共に投与される、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法に関するものである。特に、本方法では、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＡＬＮＴ）の発現および／または活性を阻害することにより、高比重リポタンパク質レベルを増加させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症は、脂質蓄積、炎症応答、細胞死および動脈壁での線維化を特徴とする。アテローム性動脈硬化症は、特に米国および西欧諸国における罹病率および死亡率の主要原因である。例えば家族歴など遺伝的に支配されている因子、高血漿低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルおよび低血漿高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル、高血圧、糖尿病、老齢、男性であること、および喫煙、高脂肪で過度の加工食品の食べ過ぎおよび運動不足などの生活様式因子を含め、多くの危険因子がアテローム性動脈硬化症の発症に関与している。
【０００３】
ＬＤＬ−Ｃはアテローム発生促進性であるため、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させ、有害な心臓血管事象の危険性を縮小させるためにスタチン薬剤が開発された。最近の研究は、現行の指針目標を下回るレベルまでＬＤＬ−Ｃレベルを低下させると、さらにアテローム発生が阻止され、有害な冠動脈事象が低減化されることを示唆している。スタチン薬剤は新たな有害な心臓血管事象を３分の１ほど減少させた。これは意義深いことであるが、追加治療が必要とされるのは明らかである。血漿ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルの増加によりアテローム性動脈硬化が阻止されるという証拠はあるが、有効なＨＤＬ上昇剤が多数存在するとは思われない。したがって、ＨＤＬレベルを高める薬剤の同定が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（本明細書では「ＧＡＬＮＴ」）が血漿中の高比重リポタンパク質レベルを調節するという新たな発見に関するものである。血漿リポタンパク質レベルに影響を及ぼす際のこのタンパク質の役割は、未だ判明していない。本発明は、ＧＡＬＮＴがＨＤＬコレステロールの血漿レベルに影響を及ぼすこと、具体的には、ＧＡＬＮＴ活性阻害を利用することにより、血漿ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、アテローム性動脈硬化症を処置し得ることを立証している。
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、ＧＡＬＮＴ遺伝子（例、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子）によりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む、単離抗体またはその機能性フラグメントの使用に関するものであり、この場合抗体または機能性フラグメントは、細胞上の表面受容体に結合することにより、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する。
【０００６】
一実施態様において、本発明は、抗体またはその機能性フラグメントの有効量を対象に投与することを含む、ＨＤＬ関連疾患の処置方法に関するものである。
【０００７】
抗体は、抗体またはその機能性フラグメントおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。医薬組成物は、処置を必要とする対象に抗体または機能性フラグメントを含む医薬組成物の有効量を投与することによるＨＤＬ関連疾患の処置方法として使用され得る。
【０００８】
本発明はまた、ＨＤＬ関連疾患処置用医薬の製造を目的とする単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、上記抗体または機能性フラグメントは、ＧＡＬＮＴ遺伝子（例、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子）によりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む、使用に関する。また、抗体または機能性フラグメントをコード化する遺伝子を担持するトランスジェニック動物も本発明の範囲内に含まれる。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、ＧＡＬＮＴの発現を阻止することを含む冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法に関するものである。一実施態様では、ＧＡＬＮＴは、ヒトＧＡＬＮＴ２である。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患または冠動脈疾患に対する易罹患性の検出方法であって、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症発症の危険性に関連するヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子の対立遺伝子の検出を含む方法に関するものである。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力を測定し、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力が決定されるように生物試料中のＧＡＬＮＴのレベルを対照標準と比較する方法に関するものである。一実施態様において、ＧＡＬＮＴはヒトＧＡＬＮＴ２である。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、ＧＡＬＮＴの阻害により血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの増加が誘導されることに基づくもので、候補薬剤と生物試料を接触させ、候補薬剤との接触の前後に試料中のＨＤＬ−Ｃのレベルを測定することを含み、ＨＤＬレベルの増加が、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の指標となる方法に関するものである。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、既知ＧＡＬＮＴ基質の存在下でＧＡＬＮＴを候補薬剤と接触させることを含み、ＧＡＬＮＴの活性の減少により冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な候補薬剤が同定されることを特徴とする方法に関するものである。一実施態様において、ＧＡＬＮＴはヒトＧＡＬＮＴ２である。一実施態様では、接触段階を培養細胞で実施する。別の実施態様では、接触段階を生体内で実施する。別の実施態様において、ＧＡＬＮＴは、内因性または外因性である。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、対象においてＨＤＬレベルを上昇させるＨＤＬモジュレーション剤の投与を含む、ＨＤＬ関連疾患のモジュレーション方法に関するものである。一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、アテローム性動脈硬化性心臓血管疾患（冠動脈疾患、卒中、心不全、末梢毒脈疾患）、脂質障害、アルツハイマー病、過度の酸化ストレス、内皮機能不全、肥満、慢性腎疾患、糖尿病およびインスリン抵抗から成る群から選択される。脂質障害は、例えば、高い血漿コレステロールレベル、脂質異常症候群、高トリグリセリド、脂質異常症、異常リポタンパク血症、高脂血症、家族性高コレステロール血症および家族性高トリグリセリド血症であり得る。別の実施態様において、モジュレーション薬剤は、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび抗体から成る群から選択される。一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが一般に容認された正常ＨＤＬ−Ｃレベルを下回る疾患を包含する。一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが関連集団の一般に容認された正常ＨＤＬ−Ｃレベルを下回る疾患を包含する。別の実施態様では、医薬上許容される担体を用いて薬剤を投与する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】内部対照（マウス組織についてはβ−アクチンＲＮＡおよびヒト組織については１８ｓ ＲＮＡ）に対する様々なヒト（図１Ａ）およびマウス（図１Ｂ）組織におけるＧＡＬＮＴ２のｍＲＮＡ発現レベルを示すチャートを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な記載
本発明は、ＧＡＬＮＴ２発現が、ＨＤＬコレステロールの血漿レベルと相関関係をなすという予想外の発見に関するものである。上記阻害により、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは上昇する。これらの酵素は、オリゴ糖、多糖および複合糖質の合成に関与する、グリコシルトランスフェラーゼのファミリー、具体的にはヘキソシルトランスフェラーゼに属する（Breton et al., 2006, Glycobiology 16:29R-37R）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２.４.１.４１、ＣＡＺｙにおけるファミリー２７）は、Ｏ−結合オリゴ糖生合成の第１段階においてＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基に転移させることによりムチン型糖タンパク質の合成を開始させる。このファミリーは、ヒトでは進化的に保存された２０の構成員を有する。個々のアイソフォームについての基質優先性は決定されておらず、リポタンパク質代謝におけるＧＡＬＮＴ２の正確な機能も解明されていない。
【００１７】
定義
本明細書で使用されている「ＨＤＬ」の語は、高比重リポタンパク質を意味する。ＨＤＬは、血中でのコレステロール輸送体として機能する、ほぼ等量の脂質とタンパク質から成る複合体を含む。ＨＤＬは、主として肝臓および小腸の内皮細胞で合成および分泌される。分泌直後、ＨＤＬは、その主要構成成分としてアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉとも呼ばれる）およびリン脂質を含む円盤状粒子の形態を呈し、新生ＨＤＬとも呼ばれる。この新生ＨＤＬは、血中で、末梢細胞の細胞膜からの遊離コレステロールまたは他のリポタンパク質の加水分解過程で生成されたコレステロールを受け取る。成熟球状ＨＤＬは、その疎水性中心でＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）の作用により上記コレステロールから変換されたコレステロールエステルを保持している。ＨＤＬは、血中で末梢組織からのコレステロールを取り込み、それを肝臓に輸送する「コレステロール逆転送」と呼ばれる脂質代謝過程において非常に重要な役割を演じる。コレステロール逆転送は、アテローム性動脈硬化症に対するＨＤＬの予防的作用に関わる主要機構の一つであると考えられるため、ＨＤＬのレベルが高いと、アテローム性動脈硬化症および冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の危険性は低下する。
【００１８】
本明細書で使用されている「ＨＤＬモジュレーション剤」の語は、ＨＤＬレベルの改変により、ＨＤＬ関連疾患または状態が改変されるようにＨＤＬの発現または機能性レベルを改変させ得る分子をいう。ＨＤＬモジュレーション剤は、ＨＤＬレベルに影響を及ぼす核酸またはポリペプチドと直接的または間接的に作用し得る。ＨＤＬモジュレーション剤の例としては、限定されるわけではないが、抗体、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子および低分子量化合物がある。一実施態様において、ＨＤＬモジュレーション剤は、ＣＥＳ遺伝子（例、ｈＣＥＳ１遺伝子）によりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントである。抗体または機能性フラグメントは、細胞上の表面受容体に結合することにより、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善し得る。
【００１９】
本明細書で使用されている「生物試料」の語は、生物全体またはその組織のサブセット、細胞または構成部分（例、限定されるわけではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液を含む体液）をいう。さらに「生物試料」は、生物全体またはその組織のサブセット、細胞または構成部分、または限定されるわけではないが、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の表面薄片、呼吸器、腸および尿生殖器官、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含むフラクションまたはその一部分から調製されるホモジネート、ライゼートまたは抽出物をいう。たいていの場合、試料を動物から取り出すが、「生物試料」の語は、例えば動物から採取せずに、生体内で分析される細胞または組織を指す場合もあり得る。典型的には、「生物試料」は動物からの細胞を含むが、この語はまた、血液、唾液または尿の非細胞性フラクションなどの非細胞性生物材料を指す場合もあり得て、これらは疾患関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの測定に使用され得る。さらに「生物試料」は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含む、生物を増殖させていた栄養ブイヨンまたはゲルなどの培地も包含する。
【００２０】
本明細書で使用されている「核酸」の語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその重合体の１本または２本鎖形態を包含する。この語は、合成的、天然的および非天然的に存在し、対照標準核酸と類似した結合特性を有し、対照標準ヌクレオチドと同様に代謝される既知ヌクレオチド類似体または修飾バックボーン残基または結合を含む核酸を包含する。上記類似体の例としては、制限は無いが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド−核酸（ＰＮＡ）がある。核酸配列はまた、上記核酸の天然に存する対立遺伝子変異型を含む。
【００２１】
本明細書で使用されている「オリゴヌクレオチド」の語は、ホスホジエステル結合により連結された２またはそれより多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成り、好ましくは約６ないし約３００のヌクレオチド長を含む核酸分子をいう。オリゴヌクレオチドのサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的機能または使用を含む多くの因子により異なる。好ましくは、例えば伸長プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドは、触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分なほど長いものである。さらに、本明細書で使用されている「オリゴヌクレオチド」の語は、構造的に修飾されてはいるが（「修飾オリゴヌクレオチド」）、非修飾オリゴヌクレオチドと同様に機能するオリゴヌクレオチドも包含する。修飾オリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオエートのように、改変糖部分または糖間結合などの非天然部分を含み得る。
【００２２】
本明細書で使用されている「ポリペプチド」の語は、単量体がアミノ酸であり、ペプチドまたはジスルフィド結合により連結されている重合体をいう。またこの語は、約８ないし約５００アミノ酸長の完全長天然アミノ酸配列またはそのフラグメントを包含する。さらに、非天然アミノ酸、例えば、ベータ−アラニン、フェニル、グリシンおよびホモアルギニンも含まれ得る。本発明で使用されるアミノ酸は全て、Ｄ−またはＬ−光学異性体であり得る。また、ポリペプチド配列は、上記ポリペプチドの天然対立遺伝子変異型も包含する。
【００２３】
本明細書で使用されている「対象」の語は、ヒトまたはヒト以外の動物を含む。好ましくは、動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類である。対象には、例えば、霊長類（例、サル、類人猿およびヒト）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類などがある。好ましい実施態様では、対象はヒトである。
【００２４】
本明細書で使用されている「効力」の語は、所望の効果が得られる程度をいう。具体的には、この語は、血漿リポタンパク質およびＨＤＬレベルがモジュレーション（例、上昇、増加、阻害、低減化または遅延）される程度をいう。本願明細書で使用されている「効力」の語はまた、冠動脈疾患（ＣＡＤ）の１つまたは複数の症状または臨床事象の軽減または縮小を指す。症状の軽減または縮小には、限定されるわけではないが、ホスファチジルコリン分解、酸化リン脂質の縮小または排除、アテローム斑（プラーク）形成および破綻の縮小、心臓発作、アンギナまたは卒中などの臨床事象の縮小、高血圧の減少、炎症伝達物質生合成の減少、血漿コレステロールの減少などがある。また、症状の軽減または縮小は、アテローム性動脈硬化により影響される血管床への血流の改善を含み得る。
【００２５】
本明細書で使用されている「冠動脈疾患」（ＣＡＤ）または同意語の「冠動脈性心疾患」（ＣＨＤ）の語は、冠動脈の遮断を特徴とする心臓血管疾患をいう。遮断は、プラーク破綻または塞栓形成などの機構により突然起こり得る。遮断は、筋内膜過形成およびプラーク形成による動脈の狭窄を伴いながら漸進的に起こり得る。プラークが肥厚すると、動脈は狭まり、血流が減少することにより、心筋層への酸素供給が減少する。血流におけるこの減少により、心筋層に関する一連の重大な結果がもたらされる。例えば、心筋層への血流の中断により、一般に心臓発作として知られている「梗塞」（心筋梗塞）が誘発される。心臓に酸素を送達する動脈の遮断から起こるそれらの臨床徴候および症状が、ＣＡＤの症状発現である。ＣＡＤの症状発現には、アンギナ、虚血、心筋梗塞、心筋症、うっ血性心不全、不整脈および動脈瘤形成がある。冠動脈循環系における脆弱性プラーク疾患は、動脈血栓症またはそれ自体心筋梗塞として症状を発現する遠位塞栓形成と因果関係を示すことがわかる。ＣＡＤは、一連の病期を包含し得る。ＣＡＤの初期段階は、血流を遮断してはいない冠動脈の壁内におけるアテローム線条を特徴とする。何年もの期間にわたって、これらの線条は肥厚する。すなわち、ＣＡＤの次なる段階は、動脈壁および脈管内腔中へ拡大し、動脈を通る血流に影響を及ぼすプラークの形成を特徴とする。プラークが厚さを増し、脈管の直径の大部分を遮断したときに、対象は、閉塞性ＣＡＤまたは虚血性心疾患の症状を呈し得る。症状は、労作性狭心症または運動耐容能の減少を含むことが多い。ＣＡＤの度合いが進行すると、冠動脈の管腔がほぼ完全に遮断され、心筋層へ酸素を送達する血液の流れが厳しく制限され得る。ＣＡＤのこの段階は心筋梗塞（心臓発作）と呼ばれ、安静時狭心症および急性肺浮腫の症状を含む、慢性冠動脈虚血の徴候および症状を特徴とする。
【００２６】
本明細書で使用されている「アテローム性動脈硬化症」の語は、１本またはそれより多い動脈、小動脈および身体および身体諸器官の移植静脈、例えば、限定されるわけではないが、冠動脈、大動脈、腎動脈、頸動脈、四肢および中枢神経系へ血液を供給する動脈、およびバイパス手術における移植静脈の狭窄および／または閉塞をまねく、マクロファージ、平滑筋細胞および細胞外空間におけるコレステロールおよびコレステロールエステルおよび関連脂質の異常な蓄積に至る過程をいう。アテローム性動脈硬化症は、血流からの物理的な力によりアテローム性動脈硬化病変部分が崩壊し、動脈壁成分が流れている血液に露出されるまで何十年も続く全く潜行性のものであり、血栓症を誘発し、心臓または脳などの標的臓器への酸素供給に支障をきたすことになり得る。
【００２７】
本明細書で使用されている「ＨＤＬ関連疾患」は、低ＨＤＬレベルに伴う疾患または特性またはＨＤＬレベルの上昇が有利にはたらき得る疾患または特性、例えばアテローム性動脈硬化症をいう。これらの関連疾患としては、例えば、アテローム性動脈硬化性心臓血管疾患（冠動脈疾患、卒中、心不全、末梢動脈疾患）、脂質障害、アルツハイマー病、過度の酸化ストレス、慢性腎疾患、肥満、２型糖尿病およびインスリン抵抗、および高血圧、脂質異常症、中心性肥満および空腹時血漿グルコースの増加を含むいわゆる「メタボリック症候群」が挙げられる。脂質障害としては、例えば、異常に高いコレステロール（１デシリットル当たり１３０ミリグラムまたはｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬレベル）、脂質異常症候群、異常に高いトリグリセリド（１５００ｍｇ／ｄＬ程度の高トリグリセリドレベル）、脂質異常症またはリポタンパク質異常血症（ＨＤＬが３５ｍｇ／ｄＬ未満である）、高脂血症または高コレステロール、家族性高コレステロール血症（総およびＬＤＬコレステロールを高める遺伝疾患）および家族性高トリグリセリド血症（遺伝的高トリグリセリド）が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用されている「発現レベルの有意な変化」という表現は、発現の評価に使用された本検定法の標準誤差より大きい量での対照レベルからの発現レベルの増加または減少を指す。この表現はまた、好ましくは少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える変化を包含する。
【００２９】
本明細書で使用されている「遺伝子」の語は、ポリペプチドをコード化し、その発現を調節する核酸配列をいう。したがって、遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーター、スプライス部位、エンハンサー、リプレッサー結合部位などを含む。遺伝子は、ポリペプチド配列または発現レベルに影響を及ぼし得るか、またはポリペプチドに対して何ら影響を及ぼさない配列変異型である多くの異なる「対立遺伝子」を有し得る。遺伝子は、連続したポリペプチドをコード化する核酸配列である、１つまたはそれより多い「読み枠」を含み得る。遺伝子は、内因的または外因的に存在し得る。
【００３０】
本明細書で使用されている「ＧＡＬＮＴ（またはＧＡＬＮＴ２）の発現レベル」なる語は、生物試料中に存在する対応遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を指す。発現レベルは、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測レベルとの比較を伴うかまたは伴わずに検出され得る。
【００３１】
本明細書で使用されている「対照レベル」の語は、変化を測定するためのバイオマーカーの標準レベルをいう。一実施態様では、「対照レベル」は、正常または健康な細胞、組織または対象から、または正常または健康な細胞、組織または対象の集団から発現されたバイオマーカー核酸またはポリペプチド、またはバイオマーカー生物活性の正常レベルであり得る。非限定的な例として、対照レベルは、正常細胞、組織または対象におけるマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドまたは生物活性のレベル、または血漿総リポタンパク質またはＨＤＬレベルであり得る。
【００３２】
本明細書で使用されている「ＧＡＬＮＴ（またはＧＡＬＮＴ２）の対照発現レベル」なる語は、健康な対象の典型を示す生物試料中に存在する対応遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を指す。また、「対照発現レベル」なる語は、健康な対象からの測定値に基づいて先に確立された健康な集団の典型を示すｍＲＮＡの確立されたレベルを意味し得る。
【００３３】
本明細書で使用されている「検出する」とは、試料中における分子の存在または非存在の識別を指す。検出すべき分子がポリペプチドである場合、検出段階は、例えば、検出可能な形で標識された抗体にポリペプチドを結合させることにより実施され得る。検出可能な標識は、刺激因子とは独立して、またはそれに応答して観察可能なシグナルを発し得る分子である。検出可能な標識としては、限定されるわけではないが、蛍光性標識、色素原標識、発光標識または放射性標識が挙げられる。標識を「検出する」方法には、例えば、標準または共焦顕微鏡、ＦＡＣＳ分析に適合させた定量的および定性的方法、およびマルチウェルプレート、アレイまたはマイクロアレイを伴うハイスループット方法に適合させた同方法がある。当業者であれば、所与の蛍光性ポリペプチドまたは染料からの蛍光放射線検出に適切なフィルターセットおよび励起エネルギー供給源を選択し得るはずである。本明細書で使用されている「検出する」はまた、検出すべきポリペプチドに対する多抗体の使用を含み得て、その場合、多抗体は、検出すべきポリペプチド上の異なるエピトープに結合する。この方法で使用される抗体は、２つまたはそれより多い検出可能な標識を利用し得て、例えばＦＲＥＴ対を含み得る。検出可能なシグナルのレベルが検出可能な標識のバックグラウンドレベルより実際に大きいとき、または測定されたポリペプチドのレベルが対照試料で測定されたレベルよりも実際に大きい場合、ポリペプチド分子は本発明に従って「検出」される。
【００３４】
本明細書で使用されている「検出する」はまた、例えば、直接的または間接的に標識された（血清試料中で標的とハイブリダイゼーションし得る）プローブ核酸分子により発せられるシグナルを測定または観察する方法による、標的核酸分子の存在の識別を指す。プローブ核酸の検出は、標的核酸、例えばマーカー遺伝子をコード化する配列の存在を直接的に示すもの、すなわちその検出である。蛍光性、放射性および他の化学的標識を「検出する」ための方法および技術は、Ausubel et al.（1995, Short Protocols in Molecular Biology, 第３版、John Wiley and Sons, Inc.）により記載されている。
【００３５】
別法として、ある部分を標的とハイブリダイゼーションするプローブ核酸に結合させ、その部分が、例えば、適切な基質の存在下において標的の検出を可能にする酵素活性、または抗体または他の特異的指標の付加による検出を可能にする特異的抗原または他のマーカーを含んでいる場合、核酸は「間接的に検出され」得る。別法として、標的核酸分子は、標的核酸配列の一部分とハイブリダイゼーションするように特異設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、患者臨床試料から調製された核酸試料を増幅することにより検出され得る。また、定量的増幅方法、例えばTaqMan（登録商標）を用いて、本発明による標的核酸を「検出する」ことも可能である。（例えば定量的ＰＣＲにより）測定された核酸のレベル、または検出可能な標識により提供された検出可能なシグナルのレベルがバックグラウンドレベルより実際に上である場合、核酸分子は本明細書で使用されているとおり「検出される」。
【００３６】
さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、対象におけるアテローム性動脈硬化症などのＣＡＤの少なくとも早期発見を指し、その場合、「早期」発見とは、好ましくは症状が目に見える時点より前の初期段階でのＣＡＤの検出を指す。さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、上記で示したのと同一の検出基準を用いることによる対象におけるＣＡＤ再発の検出を指す。さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、ＨＤＬモジュレーション剤での処置の前後におけるＣＡＤの程度の変化の測定を指す。この場合、ＨＤＬモジュレーション剤に応答したＣＡＤの程度の変化は、ＨＤＬモジュレーション剤が存在しない場合に対する、ＨＤＬモジュレーション剤の存在に応答した、超音波、Ｘ線、内視鏡または組織分析により検出される１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子（例、ＧＡＬＮＴ２）またはタンパク質の増加または減少を指す。
【００３７】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、無傷の抗体またはその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖（すなわち、軽または重鎖）を指す。無傷の抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では略してＶＨ）および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３により構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では略してＶＬ）および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬにより構成される。さらにＶＨおよびＶＬ領域は、間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分けられ得る。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより構成される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。
【００３８】
本明細書で使用されている抗体の「抗原結合部分」の語は、所与の抗原への特異的結合能を保持している無傷抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントにより遂行され得る。抗体の「抗原結合部分」なる語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る１価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖から１つおよび軽鎖から１つ）を含む２価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインから成る単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；および単離相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。
【００３９】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して１価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている；例、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 参照）を形成している単タンパク質鎖としてそれらを構成させ得る人工ペプチドリンカーによる組換え技法を用いて連結され得る。上記の単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合部分」を含む。当業者に周知の慣用的技術を用いてこれらの抗体フラグメントを得て、無傷抗体の場合と同様にして上記フラグメントを有用性についてスクリーニングにかける。
【００４０】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内発現抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例、Hollinger および Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 参照）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンIII型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づいたスカホールドに移植され得る（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載している米国特許第６７０３１９９号参照）。
【００４１】
抗原結合部分は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子に組み込まれ得る（Zapata et al., 1995  Protein Eng. 8(10):1057-1062;および米国特許第５６４１８７０号参照）。
【００４２】
「サイレンス」および「の発現を阻害する」という表現は、それらが標的遺伝子、例えばヒトＧＡＬＮＴ２について用いられている限り、本明細書では、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子が転写され、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子の発現が阻害されるように処理が為された第１細胞または細胞群から単離され得るヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を、第１細胞または細胞群と実質的に同一であるが、上記の処理は為されていない第２細胞または細胞群（対照細胞）の場合と比較したときの量の縮小により証明される、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子発現の少なくとも部分的な抑制をいうものとする。阻害の程度は通常下式で表される。
【数１】
2011508730.tif 000002
【００４３】
別法として、阻害の程度は、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子転写に機能的に結びついたパラメーター、例えば細胞により分泌されるヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子によりコード化されるタンパク質の量、またはある種の表現型を呈する細胞数の縮小によって与えられ得る。原則として、ヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子サイレンシングは、構成的またはゲノム遺伝子操作により標的を発現する細胞において、適切な検定法により測定され得る。
【００４４】
本発明の英文明細書（特に請求の範囲の部分で）で使用されている冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および本明細書で使用されている同様の語は、本明細書で特に断らなければ、または明らかに文脈と矛盾していなければ、単数および複数の両方の場合を包含するものと見なす。本明細書では値の範囲を列挙しているが、これは単にその範囲内に含まれる各独立値を個々に示す手短な方法としての役割を果たしているのに過ぎないものとする。本明細書において特に断らなければ、個々の各値は、それが明細書において個々に列挙されているがごとく、明細書に組み入れられているものとする。本明細書記載の方法は全て、特に断らなければ、または文脈と明らかに矛盾するものでなければ、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に記載された全ての実例または例示的な表現（例、「例えば、などの」）の使用は、単に本発明をよりわかり易くすることを意図しているのに過ぎず、別の形で請求された発明の範囲に制限を設けるものではない。本明細書中で、本発明の実践に不可欠な請求外の要素を示すものとしてみなされるべき表現は一切無いものとする。
【００４５】
本発明は、マウスおよびヒトＧＡＬＮＴ２が、ＣＡＤの発生および進行に影響を及ぼすレベルである、血漿ＨＤＬ−Ｃのレベルを調節するという驚くべき新発見に基づいている。特に、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２発現および／または活性を阻害すると、ＨＤＬ−Ｃレベルは高くなる。したがって、本発明の一態様は、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の発現または活性を阻害するか、低下または遅延させる化合物、またはＣＡＤを処置する化合物の同定方法を提供する。本発明の別の態様は、ＣＡＤの発症、進行または退縮をモニターするか、またはＣＡＤの処置における化合物の効力を評価するためのバイオマーカーとしてのマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の使用に関するものである。
【００４６】
スクリーニング検定法
一態様において、本発明は、ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の活性を阻害するかまたはその発現を低下させることにより、ＨＤＬ−Ｃの血漿レベルを増加させる化合物のスクリーニング（同定）方法を提供する。スクリーニングは、例えば、ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２を含む生物試料と化合物を接触させ、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２のＧＡＬＮＴ活性に対する化合物の効果をモニターするか、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の発現をモニターするか、または試料中のＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃレベルに対する化合物の効果をモニターすることにより実施され得る。ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２は、内因性または外因性核酸分子（例、適切な読み枠を含む内因性遺伝子または外因性ベクター）またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの形態であり得る。
【００４７】
総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃレベルのモジュレーションに対する化合物の効果は、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の活性のモジュレーションによるものである。マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の活性のモジュレーションは、限定されるわけではないが、１）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントによるＨＤＬ分解の阻害または阻止、２）マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドまたはその機能性フラグメントの分解または分解の誘導、３）マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドまたはその機能性フラグメントの生物活性の不活化、４）マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸分子の発現の縮小または阻害、および５）マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸分子の分解または脱安定化を含み得る。
【００４８】
ＨＤＬに対する化合物の効果の測定を目的とする場合、化合物を投与していない並行試料についても対照としてモニターする。次いで、処理および未処理試料を、限定されるわけではないが、顕微鏡分析、生存能試験、複製能力、組織検査、特定ＲＮＡまたはポリペプチドまたはその複合体のレベル、酵素活性のレベル、および他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力などを含む適切な表現型基準により比較する。処理および未処理細胞間の差異は、化合物に起因すると考えられる効果を示す。一実施態様において、化合物は、少なくとも約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれを超える率でのＧＡＬＮＴ活性の阻害またはＨＤＬ−Ｃレベルのモジュレーションについて同定され得る。スクリーニング方法は、１）ＨＤＬおよび適切なＧＡＬＮＴ、例、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２を含む生物試料と化合物を接触させ、２）第１生物試料中におけるＨＤＬのレベルを測定し、３）第２生物試料中におけるＨＤＬのレベルを測定し、ただし、第２生物試料は化合物に暴露されていないものとし、４）２）からのＨＤＬレベルが、３）からのＨＤＬレベルと比べて増加、例えば１.５倍増加している化合物を選択する段階を含む。
【００４９】
一実施態様において、スクリーニング検定法は、ＨＤＬおよび適切なＧＡＬＮＴ、例えば、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２を含む無細胞生物試料を、化合物と接触させ、血漿総−およびＨＤＬ−Ｃレベルをモジュレーションする化合物の能力を測定する無細胞検定法である。ＨＤＬレベルの測定方法は、当業界では周知である（Sugiuchi, et al. Clin. Chem., 41:717-723, 1995; Izawa et al., J. Med. Pharm. Sci., 37:1385-1388, 1997）。
【００５０】
本明細書記載の無細胞スクリーニング検定法の場合、適切なＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドまたはその機能性フラグメントは、生物試料そのものに含有されるか、または他の供給源から生物試料中に添加され得る。例えば、ポリペプチドまたはその機能性フラグメントは、市販されているか、または適切な生物学的供給源、例えば培養細胞からかなりの量で精製され得る。別法として、タンパク質は、同じく当業界では周知のとおり、適切な原核生物または真核生物発現系での発現により単離遺伝子またはｃＤＮＡから遺伝子組換えにより製造され、その後に精製され得る。同様に、ＨＤＬは、生物試料それ自体に含有され得るか、または他の供給源から生物試料中に添加され得る。ＨＤＬは、完全に単離または部分的に単離され得る。ＨＤＬの部分的または完全単離方法は、当業界では周知である（Havel et al., J. Clin. Invest., 43:1345-1353, 1955; Navab et al., J. Clin. Invest., 99:2005-2019, 1997; Carroll および Rudel, J. Lipid Res., 24:200-207, 1983, McNamara et al., Clin. Chem., 40:233-239, 1994, Grauholt et al., Scandinavian J. Clin. Lab. Invest., 46:715-721, 1986; Warnick et al., Clin. Chem., 28:1379-1388, 1982; Talameh et al., Clin. Chimica Acta, 158:33-41, 1986）。
【００５１】
別の実施態様では、スクリーニング検定法は、インビボスクリーニング検定法である。インビボスクリーニング検定法をヒト以外の動物で実施することにより、動物においてＨＤＬの分解を効果的に阻害、縮小または遅延させるかまたはＨＤＬ構成成分（複数も可）の生成に影響を及ぼす化合物を発見することができる。非限定的な例では、化合物を、適量の時間適切な用量で、所望により高脂肪食餌摂取後でもよいヒト以外の動物に投与する。次いで、動物を採血し、血漿リポタンパク質を単離し、当業界で公知の方法によりＨＤＬレベルを測定する。化合物で処置した動物におけるＨＤＬレベルの増加および総コレステロールの減少を、化合物で処置しなかった動物におけるＨＤＬレベルと比較したところ、この化合物は、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の活性を阻害することにより、動物において総血漿リポタンパク質および／またはＨＤＬ−Ｃのレベルをモジュレーションすることが示された。好ましくは、変化は少なくとも約１.５倍である。また好ましくは、化合物は、動物における総リポタンパク質および／またはＨＤＬ−Ｃのレベルを少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれを超える率でモジュレーションする。
【００５２】
所望により、動物に投与する前に、化合物を本明細書記載の無細胞スクリーニング検定法または細胞に基づくスクリーニング検定法によるプレ-スクリーニングにかけることも可能である。
【００５３】
細胞に基づくスクリーニング検定法では、適切なＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２またはその機能性フラグメント（複数も可）を発現する細胞を、化合物と接触させ、化合物がＧＡＬＮＴ活性をモジュレーションする能力を測定する。ＧＡＬＮＴ活性をモジュレーションする細胞の能力の測定は、適切な基質についてのＧＡＬＮＴの生物活性、例えば触媒／酵素活性を評価することにより、化合物が呈するＧＡＬＮＴへの結合能力またはそれとの相互作用能力を評価することにより、検出可能なマーカーをコード化する核酸に機能し得るように結合されたＧＡＬＮＴ応答性エレメントを含むリポーター遺伝子の誘導を評価することにより、または適切なＧＡＬＮＴ調節細胞性応答、例えばシグナル伝達またはタンパク質／タンパク質相互作用を評価することにより実施され得る。細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌細胞または酵母細胞などであり得る。
【００５４】
本発明の別の態様は、上記スクリーニング検定法から得られる化合物に関するものである。化合物は、化学的化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、非免疫グロブリン結合スカホールドまたは抗体であり得る。
【００５５】
抗体
一実施態様では、本発明は、抗体を用いることによるＨＤＬ核酸およびポリペプチドレベルのモジュレーションに関するものである。抗体としては、限定されるわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント、抗イディオタイプ抗体または他のエピトープ結合ポリペプチドを挙げることができる。本発明抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性であり得る。好ましくは、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチド検出に関して本発明で有用な抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｄ、単鎖抗体またはＦｖを含む、ヒト抗体またはそのフラグメントである。本発明で有用な抗体は、完全重または軽鎖定常領域またはその一部分を含むか、またはそれが欠如している場合もあり得る。一実施態様において、本発明で有用な抗体は、ヒト抗体と緊密に類似するようにアミノ酸が非抗原結合領域で置換されているが、元の結合能は依然として保持しているヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体の製造方法は、当業界では公知である（Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16, 1982; 国際公開第９２／０６１９３号; および欧州特許第０２３９４００号）。
【００５６】
実施態様によっては、ＧＡＬＮＴ２ポリペプチドに結合する抗体の抗原結合部分、（例、ＶＨおよびＶＬ鎖）が、「混合および対合」され、他の抗ＧＡＬＮＴ２結合分子を作製し得ることもある。上記の「混合および対合」抗体の結合は、結合検定法（例、ＥＬＩＳＡ）を用いて試験され得る。ＶＨを選択して特定ＶＬ配列と混合および対合させるとき、典型的にはＶＨと構造上類似したＶＨを選択し、それをそのＶＬとの対合で置き換える。同様に、特定完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列は、一般的に構造上類似した完全長重鎖配列と置換される。同様に、特定ＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列は、当然構造上類似したＶＬ配列と置換される。同様に、特定完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列は、構造上類似した完全長軽鎖配列により置換されるべきである。上記における構造類似性の同定は、当業界では公知のプロセスである。
【００５７】
抗体の可変領域または完全長鎖が配列供給源としてヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、ヒト抗体は、特定生殖系列配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」重または軽鎖可変領域または完全長重または軽鎖を含む。かかる一系では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスで産生される。トランスジェニック（マウス）を、興味の対象である抗原（例、ＧＡＬＮＴ２ポリペプチドのエピトープ）で免疫化する。
【００５８】
ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近似した（すなわち、最大同一性％の）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定され得る。特定ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」ヒト抗体は、例えば、天然に存する体細胞突然変異または人工的位置指定突然変異導入の結果として、生殖系列コード化配列との比較におけるアミノ酸差異を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的にはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、他種（例、ネズミ生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列との比較に際しヒト由来であるものとしてヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含む。場合によって、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示し得る。
【００５９】
ラクダ科抗体
例えばラマ種（ラマ・パコス（Lama paccos）、ラマ・グラマ（Lama glama）およびラマ・ビクグナ（Lama vicugna））などの新世界要員を含む、（フタコブ）ラクダおよびヒトコブラクダ（カメルス・バクトリアヌス（Camelus bactrianus）およびカレルス・ドロマデリウス（Calelus dromaderius））ファミリーの要員から得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造複雑度およびヒト対象に対する抗原性に関して特性確認されてきた。この哺乳類ファミリーで天然に見出されるある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠くため、他の動物からの抗体に典型的な２重鎖および２軽鎖を有する４鎖４次構造とは構造的に区別される。国際公開第９４／０４６７８号参照。
【００６０】
ＶＨＨとして同定された小さな単一可変ドメインであるラクダ科抗体の一領域を遺伝子工学技術により入手して、標的に対し高い親和力を有する小タンパク質を生成することにより、「ラクダ科ナノ抗体」として知られる低分子量抗体由来タンパク質が得られる。米国特許第５７５９８０８号参照；また、Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; および Lauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520 も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの遺伝子工学的ライブラリーは、例えばAblynx（ゲント、ベルギー国）から市販されている。ヒト以外に由来する他の抗体の場合と同様、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組換え技法で改変することにより、ヒト配列とより密接に類似した配列を得ることも可能である、すなわち、ナノ抗体の「ヒト化」も可能である。したがって、ヒトに対するラクダ科抗体の天然の低抗原性はさらに低減化され得る。
【００６１】
ラクダ科ナノ抗体は、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、このタンパク質は僅か数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことによる一つの結果は、ラクダ科ナノ抗体が、大きな抗体タンパク質では機能的に見えないほど小さい抗原部位へ結合できることである、すなわち、ラクダ科ナノ抗体は、古典的免疫学的技術を用いても普通なら曖昧なものである抗原を検出する試薬として、また可能性のある治療剤として有用である。すなわち、サイズが小さいことによるさらに別の結果は、ラクダ科ナノ抗体が、標的タンパク質の溝または狭い裂け目にある特異的部位へ結合することによりそれを阻害し得て、このため、古典的抗体の場合よりも古典的低分子量薬剤の機能とさらに密接に類似した受容力で役割を果たし得ることである。
【００６２】
さらに、低分子量および小型サイズであることから、ラクダ科ナノ抗体は、非常に熱安定性が高く、極端なｐＨおよびタンパク質分解的消化にも安定性を示し、抗原性も乏しい。別の結果は、ラクダ科ナノ抗体が、循環系から組織中へ容易に移動し、そして血液脳関門さえも通過するため、神経組織に影響を及ぼす疾患を処置し得ることである。さらにナノ抗体により、血液脳関門を超える薬剤輸送が容易に行える。２００４年８月１９日付公開の米国特許公開第２００４０１６１７３８号参照。これらの特徴をヒトでの低抗原性と組み合わせると、多大な治療的可能性が示される。さらに、これらの分子は、エシェリキア・コリ（E.coli）などの原核生物細胞で十分に発現され得る。ラクダ科抗体も、本発明の範囲内に含まれるものとする。したがって、本発明の一つの特徴は、ＧＡＬＮＴ２ポリペプチドについての高い親和力を有するラクダ科抗体またはラクダ科ナノ抗体である。
【００６３】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖で発現される２価の二重特異性分子であり、これらは同一鎖において２ドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーにより結合されている。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対をなすことにより、２つの抗原結合部位を設ける（例、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123 参照）。二重特異性抗体は、同一細胞内で構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を有する２本のポリペプチド鎖を発現させることにより製造され得る。それらのほとんどは、細菌において可溶性形態で発現され得る。
【００６４】
単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）は、２本の二重特異性抗体形成ポリペプチド鎖を約１５アミノ酸残基のリンカーと連結することにより製造される（Holliger および Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36 参照）。ｓｃＤｂは、細菌において可溶性活性モノマー形態で発現され得る（Holliger およびWinter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun およびPack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21 参照）。二重特異性抗体をＦｃと融合させることにより、「二重−二重特異性抗体（di-diabody）」が生成され得る（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65参照）。
【００６５】
遺伝子操作および修飾抗体
出発材料として１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて本発明抗体を製造することにより、遺伝子工学的に修飾抗体が作製され得て、その修飾抗体は、出発抗体からの改変された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つまたはそれより多いＣＤＲ領域内および／または１つまたはそれより多いフレームワーク領域内における１つまたはそれより多い残基を修飾することにより遺伝子工学的に作製され得る。さらに、または別法として、抗体は、定常領域（複数も可）内の残基に修飾を加えることにより、例えば抗体のエフェクター機能（複数も可）を改変するように遺伝子工学的に作製され得る。
【００６６】
実施され得る可変領域遺伝子操作の一タイプは、ＣＤＲグラフト技術である。抗体は、主に６つの重および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由により、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で高い多様性を示す。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性をもつ異なる抗体からフレームワーク配列へグラフトされた特異的天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例、Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第５２２５５３９号および米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６２および６１８０３７０号参照）。
【００６７】
フレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは発表された参考文献から入手され得る。例えば、ヒト重および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベースおよび Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、 U.S. Department of Health and Human Services, NIH 公開第91-3242号; Tomlinson et al., 1992  J. Mol. Biol. 227:776-798; および Cox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836 から入手され得て、これらの内容については、出典明示で援用する。
【００６８】
ＶＨＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が誘導される生殖系列免疫グロブリン遺伝子で見いだされるのと同一の配列を有するフレームワーク領域へグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比べて１つまたは複数の突然変異を含むフレームワーク領域へ移植され得る。例えば、ある一定の場合には、フレームワーク領域内における残基に突然変異を導入して、抗体の抗原結合能力を維持または高めるのが有益であることが見出された（例、米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６２および６１８０３７０号参照）。
【００６９】
ＣＤＲはまた、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域へグラフトされ得る。適切なスカホールドは、グラフト残基が局在化した表面を形成し、興味の対象である標的と結合するようにそれらを提示する立体配座的に安定したフレームワークを形成する。例えば、ＣＤＲは、フレームワーク領域が、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタイン、シトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、超らせん、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミサット(tendramisat)に基づいているスカホールドへグラフトされ得る（例、Nygren および Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469参照）。
【００７０】
可変領域修飾の別のタイプは、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内におけるアミノ酸残基への突然変異導入であり、それにより「親和性成熟」として知られる、興味の対象である抗体の１つまたは複数の結合特性（例、親和性）が改善される。位置指定突然変異導入またはＰＣＲを通した突然変異誘発を実施することにより、突然変異（複数も可）が導入され得て、抗体結合または興味の対象である他の機能的特性に対する効果を、本明細書記載のインビトロまたはインビボ検定法で評価することができる。保守的修飾が導入され得る。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内における多くて１、２、３、４または５の残基が改変される。
【００７１】
遺伝子操作された本発明抗体には、例えば抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が加えられたものがある。典型的には、上記フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすように行われる。例えば、一方法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異させる」ことである。さらに具体的には、体細胞突然変異を被った抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。上記残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列立体配置に戻すために、体細胞突然変異を、例えば位置指定突然変異導入またはＰＣＲを通した突然変異誘発により生殖系列配列に「復帰突然変異」させることが可能である。上記「復帰突然変異」抗体もまた、本発明に包含されるものとする。
【００７２】
フレームワーク修飾の別のタイプでは、フレームワーク領域内、または１つまたは複数のＣＤＲ領域内における１つまたは複数の残基に突然変異を誘発することにより、Ｔ細胞エピトープを除去し、抗体の潜在的免疫原性を縮小させる。この方法は、「脱免疫化」とも称され、Carr et al.による米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳述されている。
【００７３】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に加える修飾に加えて、またはそれに代わるものとして、本発明抗体の場合、遺伝子工学技術によりＦｃ領域内に修飾を加え、典型的には抗体の１つまたは複数の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存的細胞傷害性を改変させることも可能である。さらに、本発明抗体を化学的に修飾するか（例、１つまたは複数の化学的部分を抗体に結合させ得る）、またはそのグリコシル化を改変して、再び抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することも可能である。
【００７４】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を改変する、すなわち増加または減少させるように、ヒンジ領域を修飾する。この方法は、Bodmer et al.による米国特許第５６７７４２５号に詳述されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を改変することにより、例えば軽および重鎖の会合を促進するか、または抗体の安定性を増加または減少させる。
【００７５】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域に突然変異を導入して、抗体の生物学的半減期を減少させる。さらに具体的には、抗体が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインブドウ球菌（スタフィロコッカス(Staphylococcyl)）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて低下したＳｐＡ結合性を示すように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異をＦｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この方法は、Ward et al.による米国特許第６１６５７４５号で詳細に記載されている。
【００７６】
別の実施態様では、抗体にその生物学的半減期を増すように修飾を加える。様々な方法が可能である。例えば、米国特許第６２７７３７５号は、そのインビボ半減期を増加させるＩｇＧにおける次の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆについて報告している。別法として、Presta et al.による米国特許第５８６９０４６および６１２１０２２号に記載されているとおり、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取り出したサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【００７７】
さらに他の実施態様では、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換してＦｃ領域を改変することにより、抗体のエフェクター機能を改変させる。例えば、抗体が、エフェクターリガンドについては親和性が改変されているが、親抗体の抗原結合能については保持しているように、１個または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置換することができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体系のＣ１成分であり得る。この方法は、両方ともWinter et al.による米国特許第５６２４８２１および５６４８２６０号で詳細に報告されている。
【００７８】
別の実施態様では、抗体においてＣ１ｑ結合性が改変されるか、そして／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）が低減化または排除されるように、アミノ酸残基から選択された１個または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置換することも可能である。この方法は、Idusogie et al. による米国特許第６１９４５５１号で詳細に記載されている。
【００７９】
別の実施態様では、１個または複数のアミノ酸残基を改変することにより、抗体の補体固定能力を改変させる。この方法は、Bodmer et al. による国際公開第９４／２９３５１号に詳述されている。
【００８０】
さらに別の実施態様では、抗体の抗体依存的細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の伝達能を高めるか、そして／または１個または複数のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に関する抗体の親和性を増加させるようにＦｃ領域を修飾する。この方法は、Presta による国際公開第００／４２０７２号に詳述されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１での結合部位はマッピングされており、結合性が改善された変異型も報告されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604 参照）。
【００８１】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、アグリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めるように改変され得る。上記炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内における１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成され得る。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことにより、その部位でのグリコシル化が排除され得る。上記アグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が高められ得る。上記方法は、Co et al. による米国特許第５７１４３５０および６３５０８６１号でさらに詳細に報告されている。
【００８２】
さらに、または別法として、改変されたグリコシル化タイプを有する抗体、例えばフコシル残基の量が縮小された低フコシル化抗体または高バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。上記の改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが立証された。上記炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞で抗体を発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、文献で報告されており、本発明の組換え抗体を発現させることによりグリコシル化が改変された抗体を産生させる宿主細胞として使用され得る。例えば、Hang et al. による欧州特許第１１７６１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコード化する、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を担持するセルラインに関するもので、結果的に上記セルラインで発現された抗体はフコシル化の低下を呈することを報告している。Presta によるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）−結合炭水化物へのフコース結合能が低下した変異型ＣＨＯセルライン、Ｌｅｃ１３細胞に関するもので、この場合も、結果として、その宿主細胞で発現された抗体が低フコシル化を呈することを報告している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 も参照）。Umana et al. による国際公開第９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例、ベータ（１,４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII））を発現するように遺伝子操作されたセルラインに関するものであり、結果的に、遺伝子操作されたセルラインで発現された抗体はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈するため、抗体のＡＤＣＣ活性が高くなることを報告している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180 参照）。
【００８３】
本発明により想到される本発明抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化すると、例えば、抗体の生物学的（例、血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、典型的には、抗体またはそのフラグメントを、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が抗体または抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧ、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施され得る。本明細書で使用されている「ポリエチレングリコール」の語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に使用されてきたＰＥＧのあらゆる形態を包含するものとする。ある種の実施態様では、ペグ化される抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は当業界では公知であり、本発明抗体にも適用され得る。例えば、Nishimura et al.による欧州特許第０１５４３１６号およびIshikawa et al.による欧州特許第０４０１３８４号参照。
【００８４】
さらに、ペグ化は、非天然アミノ酸の導入により抗体のいずれかの部分で達成され得る。ある種の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang および Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 または米国特許第７０８３９７０号に記載された技術により導入され得る。簡単に述べると、これらの発現系の中には、位置指定突然変異導入により、本発明ポリペプチドをコード化する読み枠へアンバーＴＡＧ等のナンセンスコドンを導入するものがある。次いで、上記発現ベクターを、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用し得る宿主に導入し、選択された非天然アミノ酸を負荷する。本発明ポリペプチドに該当部分をコンジュゲートする目的に有益な特定非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を伴うものである。次いで、これらの新規アミノ酸を含むポリペプチドは、タンパク質におけるこれらの選択された部位でペグ化され得る。
【００８５】
抗体の遺伝子操作方法
抗体に修飾を加えて、すなわち完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはそこに結合した定常領域（複数も可）を修飾することにより新たな抗体が作製され得る。例えば、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域を、遺伝子組換え操作で既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせることにより、新たな遺伝子組換え抗体を作製することができる。遺伝子操作方法についての出発材料は、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列、または１つまたは複数のそのＣＤＲ領域である。遺伝子組換え抗体を作製するために、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはその１つまたは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に製造する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列（複数も可）に含まれる情報を出発材料として使用することにより、元の配列（複数も可）から誘導される「第２世代」配列（複数も可）を作製し、次いで「第２世代」配列（複数も可）を調製し、タンパク質として発現させる。
【００８６】
標準分子生物学技術を用いることにより、改変された抗体配列を調製および発現させることができる。改変された抗体配列（複数も可）によりコード化される抗体は、それが誘導される所望の機能的特性の一つ、幾つかまたは全部を保持しているものである。改変された抗体の機能的特性は、当業界で利用可能および／または本明細書記載の標準検定法（例、ＥＬＩＳＡ）により評価され得る。
【００８７】
本発明抗体の遺伝子操作方法のある種の実施態様では、突然変異が抗体コーディング配列の全部または一部に沿って無作為または選択的に導入され得る。例えば、Short によるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリまたはその組み合わせを用いた抗体突然変異の誘発およびスクリーニング方法について記載している。別法として、Lazar et al. による国際公開第０３／０７４６７９号は、コンピュータースクリーニング方法の使用により抗体の物理化学特性を最適化する方法について報告している。
【００８８】
非抗体結合分子
さらに本発明は、抗体の機能的特性を呈するが、それらのフレームワークおよび抗原結合部分が他のポリペプチド（例、抗体遺伝子によりコード化されるかまたは抗体遺伝子のインビボ組換えにより作製されたもの以外のポリペプチド）から誘導されている結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメインは、定向進化過程を通して生成される。米国特許第７１１５３９６号参照。抗体の可変ドメインの場合と類似した全体的折りたたみ（「免疫グロブリン様」折りたたみ）を有する分子は、適切なスカホールドタンパク質である。抗原結合分子の誘導に適切なスカホールドタンパク質には、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テナシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、チチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＩクラスＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＣＤ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−セットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポイエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびソーマチンがある。
【００８９】
非抗体結合分子の抗原結合ドメイン（例、免疫グロブリン様折りたたみ）は、１０ｋＤ未満または７.５ｋＤを超える分子量（例、７.５〜１０ｋＤの分子量）を有し得る。抗原結合ドメインの誘導に使用されるタンパク質は、天然に存する哺乳類タンパク質（例、ヒトタンパク質）であり、抗原結合ドメインは、それが由来するタンパク質の免疫グロブリン様折りたたみと比較した場合５０％以下（例、３４％以下、２５％、２０％または１５％）の割合で突然変異アミノ酸を含む。免疫グロブリン様折りたたみを有するドメインは、一般的に５０〜１５０アミノ酸（例、４０〜６０アミノ酸）から成る。
【００９０】
非抗体結合分子を生成するため、抗原結合表面を形成するスカホールドタンパク質の領域（例、抗体可変ドメイン免疫グロブリン折りたたみのＣＤＲと位置および構造が類似した領域）における配列がランダム化されているクローンのライブラリーを作製する。ライブラリークローンを、興味の対象である抗原への特異的結合性および他の機能について試験する。選択されたクローンをさらなるランダム化および選択についての基礎として用いることにより、抗原に対する親和性がさらに高い誘導体を製造することができる。
【００９１】
例えば、スカホールドとしてフィブロネクチンIIIの第１０モジュール（１０Ｆｎ３）を用いることにより、高親和性結合分子が生成される。残基２３〜２９、５２〜５５および７８〜８７にある１０ＦＮ３の３つのＣＤＲ様ループのそれぞれについてライブラリーを構築する。各ライブラリーを構築するため、各ＣＤＲ様領域と部分的に重複する配列をコード化するＤＮＡセグメントをオリゴヌクレオチド合成によりランダム化する。選択可能な１０Ｆｎ３ライブラリーの作製技術は、米国特許第６８１８４１８および７１１５３９６号;  Roberts および Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; 米国特許第６２６１８０４号; 米国特許第６２５８５５８号; および Szostak et al. 国際公開第９８／３１７００号に記載されている。
【００９２】
非抗体結合分子を二量体または多量体として製造することにより、標的抗原についての結合活性を高めることができる。例えば、抗原結合ドメインは、Ｆｃ−Ｆｃ二量体を形成する抗体の定常領域（Ｆｃ）との融合体として発現される。例えば、米国特許第７１１５３９６号参照。
【００９３】
ＲＮＡ干渉
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的一次転写物（プロセッシングされていない転写物）またはｍＲＮＡの全部または一部と相補的なポリヌクレオチドであり、標的遺伝子の発現を遮断する（米国特許第５１０７０６５号、国際公開第９９２８５０８号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性は、特異的遺伝子転写物のいずれかの部分、例えば５´非コーディング配列、３´非コーディング配列、またはコーディング配列によるものであり得る。
【００９４】
ｓｉＲＮＡは、短い干渉性ＲＮＡを指し、二重らせんにおけるＲＮＡ鎖のどちらかと相同的なｍＲＮＡ配列を分解するように作用し、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳類の身体（人体を含む）において特異的遺伝子の転写後サイレンシングを誘発し得る。ｓｉＲＮＡ分子は、細胞または哺乳類における標的遺伝子（例、ｈＧＡＬＮＴ２）発現の阻害に使用され得て、その場合ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現で形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である領域を含むものとする。ＲＮＡ干渉現象は当業界では周知である（Bass, Nature, 411:428-29, 2001; Elbahir et al., Nature, 411:494- 98, 2001; Fire et al., Nature, 391:806-11, 1998; および国際公開第０１／７５１６４号）。本明細書で開示された遺伝子産物をコード化する配列および核酸に基づいたｓｉＲＮＡは、典型的には１００未満の塩基対を有し、例えば約３０ｐｂまたはそれより短いものであり得て、相補性ＤＮＡ鎖の使用または合成的方法を含む、当業界で周知の方法により作製され得る。ｓｉＲＮＡは、干渉を誘発し得て、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳類の身体（人体を含む）における特異的遺伝子の転写後サイレンシングを誘発し得る。本発明による典型的ｓｉＲＮＡは、２９ｂｐ以下、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその前後またはその間の整数値の塩基対を有し得る。最適な阻害性ｓｉＲＮＡを設計するための道具としては、DNAengine Inc.（シアトル、ワシントン）およびAmbion, Inc.（オースチン、テキサス）から入手できるものが挙げられる。
【００９５】
また、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子も細胞または哺乳類における標的遺伝子（例、ｈＧＡＬＮＴ２）の発現阻害に使用され得て、その場合ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部分と相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性領域は３０未満のヌクレオチド長、一般的には１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞と接触したとき、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％または４０％阻害するものとする。
【００９６】
ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーションして二重らせん構造を形成するのに十分な程度相補的である２本のＲＮＡ鎖から成る。これら２鎖が、適切な条件下で組合わされたとき、ハイブリダイゼーションし、二重らせん構造を形成するように、ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列から誘導された、標的配列と実質的に相補的、さらに一般的には完全に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）はアンチセンス鎖と相補的である領域を含むものとする。一般的に、二重らせん構造は、長さが１５ないし３０、さらに一般的には１８ないし２５、さらに一般的には１９ないし２４、そして最も一般的には１９ないし２１塩基対である。同様に、標的配列との相補性領域は、１５ないし３０、さらに一般的には１８ないし２５、さらに一般的には１９ないし２４、そして最も一般的には１９ないし２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに１つまたはそれより多い１本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数も可）を含み得る。ｄｓＲＮＡは、自動式ＤＮＡ合成装置、例えばBiosearch, Applied Biosystems, Inc.から市販されている装置の使用による当業界で周知の標準方法により合成され得る。
【００９７】
当業者であれば、２０ないし２３、特に２１塩基対の二重らせん構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導する上で特に有効であると認められていることを熟知しているはずである（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。
【００９８】
さらに別の実施態様では、安定性を高めるためにｄｓＲＮＡを化学的に修飾する。本発明の核酸は、当業界で十分に確立された方法、例えばCurrent Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S.L. et al. (編), John Wiley & Sons, Inc.（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）に記載された方法により合成および／または修飾され得て、これについては、出典明示で援用する。化学的修飾としては、限定されるわけではないが、２´修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学的部分への共有結合、およびチオリン酸基などの代替的結合によるヌクレオチド間リン酸結合の置換が挙げられる。複数の上記修飾が使用され得る。
【００９９】
２本の別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学的結合は、様々な公知技術のいずれかにより、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入、疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用、金属イオン配位手段またはプリン類似体の使用により達成され得る。一般的に、ｄｓＲＮＡの修飾に使用され得る化学基には、制限は無いが、メチレンブルー、二官能基、一般的にビス−（２−クロロエチル）アミン、Ｎ−アセチル−Ｎ´−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン、４−チオウラシルおよびソラレンがある。一例では、リンカーは、ヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡを固相合成により製造し、ヘキサ−エチレングリコールリンカーを標準的方法に従って組み込む（例、Williams, D.J.,および K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）。一実施態様では、アンチセンス鎖の５´−末端およびセンス鎖の３´−末端をヘキサエチレングリコールリンカーにより化学的に結合する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端における化学結合は、一般的に三重らせん結合により形成される。
【０１００】
さらに別の実施態様において、２本の単鎖のうちの一方または両方にあるヌクレオチドを修飾することにより、細胞性酵素、例えば、制限はないが、ある種のヌクレアーゼ類の分解活性が阻止または阻害され得る。核酸に対する細胞性酵素の分解活性の阻害技術は、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、２´−アミノ修飾、２´−アミノ糖修飾、２´−Ｆ糖修飾、２´−Ｆ修飾、２´−アルキル糖修飾、非荷電バックボーン修飾、モルホリノ修飾、２´−Ｏ−メチル修飾およびホスホルアミデートがある（例、Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8参照）。すなわち、ｄｓＲＮＡにおけるヌクレオチドの少なくとも１個の２´−ヒドロキシル基を、化学基、一般的には２´−アミノまたは２´−メチル基により置換する。また、少なくとも１個のヌクレオチドを修飾することにより、ロックトヌクレオチドを形成させ得る。上記のロックトヌクレオチドは、リボースの２´−酸素をリボースの４´−炭素と結合するメチレン架橋を含む。ロックトヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron Lett 1998), 54: 3607-3630) および Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404で報告されている。オリゴヌクレオチドへのロックトヌクレオチドの導入により、相補的配列についての親和性が改善され、融解温度が数度高くなる（Braasch, D.A. およびD.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7）。
【０１０１】
バイオマーカーとしてのＧＡＬＮＴ２の使用
一態様において、発現差があるマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子の発現レベルを、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織で測定する。一実施態様において、遺伝子（複数も可）の発現レベルの測定方法は、任意の効果的な順序で以下の段階の１つまたはそれ以上、例えばポリヌクレオチドプローブと生物試料を、上記プローブが上記試料中のマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸分子と特異的にハイブリダイゼーションするのに有効な条件下で接触させ、上記試料中におけるマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２マーカー遺伝子核酸の存在または非存在を検出する段階を含み得る。また、明確で関連性のある多形を含む特異的対立遺伝子も検出される。
【０１０２】
一実施態様では、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織の両方から得られた試料にプローブを適用し、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸分子の存在を当業界で周知の方法により検出する。例えば、マーカー遺伝子の存在の検出方法は、有効な方法、例えばノーザン・ブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションなどにより実施され得る。
【０１０３】
別の実施態様では、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織の両方から得られた試料にプローブを適用し、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸の量を当業界で周知の方法により検出する。上記方法は、例えばプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションしたプローブを検出する段階を含むが、さらに定量的な方法および／または標準との比較を使用し得る。プローブと標的間のハイブリダイゼーションの量は、適切な方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、ノーザン・ブロット、ポリヌクレオチドマイクロアレイ、高速スキャン（Rapid-Scan）などにより測定され得て、定量的および定性的測定結果の両方を含む。
【０１０４】
別の実施態様では、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２特異的抗体を用いて、当業界で公知の方法により生物試料中におけるマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２またはそのフラグメント（複数も可）の存在を検出し得る。この方法には、少し例を挙げると、免疫検定法、例えばウエスタン・ブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈殿反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体固定化検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテインＡ免疫検定法等の技術を用いる競合的および非競合的検定法系が含まれ得る。上記検定法は当業界では公知である（Ausubel et al.編、1994, Current Protocols in Molecular Biology, 第１巻 1, John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク、これについては出典明示で援用する）。さらにまた、本発明で有用な免疫検定法としては、ホモジニアスおよびヘテロジニアスの両方法、例えば蛍光偏光免疫検定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）およびネフロメトリー阻害免疫検定法（ＮＩＡ）などの方法が挙げられる。
【０１０５】
別の実施態様では、生物試料中におけるマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドのレベルが、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の発現レベルのモニター手段として測定され得る。かかる方法は、例えば、生物試料を入手し、マウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドまたはその適切なエピトープに特異的な抗体と試料を接触させ、抗体との免疫複合体形成の量を測定する段階を含み、免疫複合体形成の量がマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２ポリペプチドのレベルの指標となる。ＣＡＤに罹患した対象から入手した生物試料中におけるＧＡＬＮＴポリペプチドレベルを、正常対象から採取した生物試料中、または同一対象から予め、または後続的に入手した１つまたは複数の試料中のＧＡＬＮＴレベルと比較するとき、この測定法は有益である。
【０１０６】
また、ＧＡＬＮＴポリペプチドの量の測定結果は、ＣＡＤの進行と相関関係を示し得る。ＧＡＬＮＴポリペプチドレベルは、これらのペプチドを含む生物試料がＣＡＤ罹患の傾向を示すか否かを評価するために予測的に使用され得るか、または特定治療計画を立てるのに使用され得る。
【０１０７】
診断的検定法
正常対象と比べた場合のＣＡＤ罹患対象における適切な、例えばリポタンパク質モジュレーション性ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２の発現レベルの検出可能な増加または減少の測定は、病気の状態および／または治療にとって有益となる応答の診断またはモニター手段を提供する。したがって、本発明は、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の検出方法、または別法として、対象においてＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症を発症する危険が増しているか否かの測定方法を提供する。
【０１０８】
臨床適用では、適切なＧＡＬＮＴコード化核酸および／またはＧＡＬＮＴポリペプチドの存在および／または非存在についてヒト組織試料をスクリーニングにかけ得る。上記試料は、例えば穿刺生検コア、外科的切除標本、リンパ節組織、血漿または血清を含む、組織試料、全細胞、細胞ライゼート、または単離核酸を含み得る。ある種の実施態様では、これらの試料から抽出された核酸は、当業界で公知の技術を用いて増幅され得る。検出されたＧＡＬＮＴおよび／または血漿総および／またはＨＤＬ−Ｃのレベルを、正常組織試料の場合と比較する。
【０１０９】
一実施態様における診断方法では、適切な、例えばリポタンパク質モジュレーション性ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはポリペプチドレベルを検出することにより、対象におけるＣＡＤ罹患についての危険性が増しているか否かを測定する。健康な正常対象の場合と比較した対象におけるＧＡＬＮＴの発現レベルの有意な変化が、ＣＡＤまたはＣＡＤに対する易罹患性の指標である。好ましくは、変化は、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える％である。
【０１１０】
別法として、診断方法は、抗体を用いてＧＡＬＮＴポリペプチドまたはその機能性フラグメントを検出することにより実施され得る。一実施態様において、本方法は、対象からの生物試料中における適切なＧＡＬＮＴポリペプチド分子のレベルと、ポリペプチド分子の対照レベルとの比較を含み、その場合、ＧＡＬＮＴポリペプチドレベルの有意な変化が対象におけるＣＡＤの指標となる。「有意な変化」の語は、健康な正常対象由来の生物試料の場合との比較におけるポリペプチドまたはその機能性フラグメントの量の少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える変化をいう。
【０１１１】
冠動脈疾患の予後、病期分類およびモニター
一態様において、本発明は、適切な、例えばリポタンパク質モジュレーション性ＧＡＬＮＴ、例えばマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２核酸、ポリペプチドおよび／またはその機能性フラグメントの発現レベルの検査に基づいたＣＡＤの開始、予後および病期の決定方法を提供する。本明細書で使用されている予後とは、疾患の考えられる経過および結果の予測をいう。
【０１１２】
一般に、ＣＡＤの予後または病期分類に使用される方法では、興味の対象である試料中における適切なＧＡＬＮＴの量を対照試料のそれと比較することにより、ＧＡＬＮＴ発現レベルの相対的差異を検出する。この差異は、定性的および／または定量的に測定され得る。対照試料は、無ＣＡＤまたは正常試料、または進行していないことが判明している試料、または進行していることが判明している試料であり得る。
【０１１３】
本明細書で使用されているＣＡＤ病期分類とは、ＣＡＤが発生し、症状を誘発している事象の進行度をいう。さらに、病期分類は、ＣＡＤの病状が患者においていかなる形で進行しているかを述べるのに使用されるプロセスである。本発明方法は、ＣＡＤの病期分類を検定するのに有用である。病期分類は、対照標準レベルに対して適切なＧＡＬＮＴの発現レベルを測定することにより達成され得る。対照標準レベルは、無ＣＡＤの健康な状態の試料、または病気の展開における異なる病期のＣＡＤ試料からのものであり得る。
【０１１４】
さらに本発明は、適切なＧＡＬＮＴ核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルを経時的に測定することによる、対象におけるＣＡＤの進行または再発のモニター方法を提供する。
【０１１５】
一実施態様において、本方法は、ａ）最初の時点で対象における適切なＧＡＬＮＴ核酸分子の発現レベルを測定し、ｂ）後の時点で対象におけるＧＡＬＮＴ核酸の発現を測定し、ｃ）最初の時点での発現レベルを後の時点でのそれと比較することを含み、その場合の発現レベルの有意な変化を、ＣＡＤの開始、進行または退縮の指標とする。
【０１１６】
別の実施態様では、本方法は、ａ）最初の時点で対象におけるＧＡＬＮＴポリペプチド分子の発現レベルを測定し、ｂ）後の時点で対象におけるＧＡＬＮＴポリペプチドの発現を測定し、ｃ）最初の時点での発現レベルを後の時点でのそれと比較することを含み、その場合の発現レベルの有意な変化を、ＣＡＤの開始、進行または退縮の指標とする。
【０１１７】
初期の時点に対する後の時点でのＧＡＬＮＴ核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルの増加は、病気がより深刻な段階に進行していることを示す。対照的に、後の時点での発現レベルの低下は、病気が深刻度の低い段階に移行していることを示す。
【０１１８】
治療および治療化合物の効力
別の態様において、本発明はまた、ＣＡＤに関する伝統的および非伝統的処置および治療の両方が奏功していると思われる患者の評価および／またはモニターを可能にする方法を提供する。本発明の利点は、利用可能な治療の一つまたは幾つかが奏功し得る患者を経時的にモニター、スクリーニングすることにより、患者が処置（複数も可）によりいかなる経過をたどっているか、処置の変更、改変または中止が正当化されるか否か、または患者の病状または病期が進行したか否かを決定できることである。
【０１１９】
本発明による特定治療について正しい患者を同定することにより、処置の効力を高めることができ、治療の不必要で生命を脅かす副作用に患者をさらすことを回避できる。本発明方法を用いて１クールの治療を受けている患者をモニターできれば、患者が経時的に治療に対し適正に応答しているか否かを測定でき、投薬または用量または送達方法を改変または調節するべきか否かを決定し、患者が治療中に快方に向かっているか、回帰しているか、またはより深刻または進行した病期に突入しているか否かを確認できる。
【０１２０】
本発明によるモニター方法は、患者の体液試料をある一定期間、例えば処置または治療過程中、または患者の病気の経過中に試験または分析することにより、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に罹患した患者の系列的または連続的な試験または分析結果を反映させる。例えば、系列試験では、同一患者が体液試料、例えば血清または血漿を提供するか、または本発明方法に従って、処置過程中、および／または病気の経過中にＧＡＬＮＴレベルを測定することにより、患者における適切なＧＡＬＮＴ核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルを観察、チェックまたは検査する目的で同一患者から試料を採取する。
【０１２１】
同様に、彼または彼女の病気の状態および／または彼または彼女が受けている処置または治療に対する効力、反応および応答を測定する目的で生物試料におけるＧＡＬＮＴレベルを評価するために患者を経時的スクリーニングにかけ得る。１つまたは複数の生物試料を、処置または治療過程以前に、または処置または治療の開始時点で患者から最適な形で採取することにより、患者が処置を受け、臨床および医学的評価を受けている期間中における１または複数の後の時点での患者の進行および／または応答の分析および評価を補足するのが望ましい。
【０１２２】
レベルは、何日か、何週間か、何か月か、何年かのある一定期間にわって、またはその様々な間隔でモニターされ得る。患者の体液試料、例えば血清または血漿試料を、医師または臨床研究者などの専門家が定めた間隔で集めて、処置または病気の経過に即して患者におけるＧＡＬＮＴ、ＨＤＬを含む血漿リポタンパク質レベルを測定し、正常個体でのレベルと比較する。例えば、本発明に従って、患者試料を毎月、２か月ごとまたは１、２または３か月間隔の組み合わせで採取およびモニターし得る。年４回またはそれより頻繁な患者試料のモニターが賢明である。患者で見いだされるレベルを、正常個体でのレベル、以前の検査期間から得られた患者自身のレベルと比較することにより、処置または病期の進行または結果を測定する。
【０１２３】
適切なＧＡＬＮＴレベルの経時的な低下は、血漿ＨＤＬ−Ｃの増加を示すもので、処置の進行または効力、および／または病気の改善、寛解などの指標となる。
【０１２４】
キット
本発明はまた、生物試料中の適切なＧＡＬＮＴの発現レベル（核酸またはポリペプチドレベル）の検出に必要な試薬を含むキットを提供する。試薬は、上記の特異的プローブ／プライマーおよび抗体を含み得る。またキットは、正常な状態および病気の様々な臨床的進行段階を示す対照／標準値または一連の対照／標準値を含み得る。好ましい実施態様では、対照／標準値または一連の対照／標準値は、正常な状態およびＣＡＤの様々な臨床的進行段階を示す。さらに、キットは、試験試料と比較するための陽性対照および／または陰性対照を含み得る。陰性対照は、ＧＡＬＮＴ核酸またはポリペプチドを持たない試料を含み得る。陽性対照は、様々な既知レベルの適切なＧＡＬＮＴ核酸またはポリペプチドを有する試料を含み得る。またキットは、検定を実施し、結果を解釈するための使用説明書を含み得る。抗体に基づくキットの場合、キットは、例えば（１）ＧＡＬＮＴポリペプチドまたはその機能性フラグメントに結合する第１抗体（例、固体支持体に結合されている）および所望により（２）ＧＡＬＮＴポリペプチド、そのエピトープまたは第１抗体に結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされた第２の異なる抗体を含み得る。オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは、例えば、（１）適切なＧＡＬＮＴ核酸配列とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能な形で標識されたオリゴヌクレオチドまたは（２）ＧＡＬＮＴ核酸分子の増幅に有用な一対のプライマーを含み得る。またキットは、例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤を含み得る。さらにキットは、検出可能な標識（例、酵素または基質）の検出に必要な成分を含み得る。キットはまた、検定にかけられ、試験試料と比較され得る対照試料または一連の対照試料を含み得る。キットの各成分は、個別容器内に封入され得て、様々な容器は全て、キットを用いて実施した検定の結果を解釈するための使用説明書と一緒に単一パッケージ内に収められ得る。
【０１２５】
上記キットは、対照がＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に罹患しているかまたはその発症の危険が増しているか否かを決定するのに使用され得る。さらに、上記キットは、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の予後を測定し、病期分類し、またはその進行をモニターするのに使用され得る。さらに、上記キットは、薬剤スクリーニングまたはＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症についての処置の選択に使用され得る。
【０１２６】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、医薬上許容される担体と一緒に処方された、本発明のＨＤＬモジュレーション剤（例、モノクローナル抗体または抗原結合部分（複数も可）、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子）の１つまたはその組み合わせを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。上記組成物は、結合分子の一つまたはその（例、２種またはそれより多い異なる結合分子の）組み合わせを含み得る。例えば、本発明医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体または薬剤の組み合わせを含み得る。
【０１２７】
本発明医薬組成物はまた、併用療法、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、併用療法は、ＨＤＬモジュレーション剤を少なくとも１種の他のコレステロール低下剤と組み合わせた形で含み得る。併用療法で使用され得る治療剤の例は、下記の本発明薬剤の使用に関する項でさらに詳しく記載されている。
【０１２８】
本明細書で使用されている「医薬上許容される担体」は、生理学的に適合し得る溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを全て包含する。担体は、当然、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例、注射または注入による）に適したものである。投与経路により、活性化合物は、化合物を酸の作用および不活化し得る他の自然条件から化合物を保護する物質でコーティングされ得る。
【０１２９】
本発明医薬組成物は、１種またはそれより多い医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持しており、望ましくない毒物学的作用をもたらすことのない塩をいう（例、Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。上記塩類の例には、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩には、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、並びに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから誘導されるものがある。塩基酸付加塩には、アルカリ土類金属等、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、並びに非毒性有機アミン類、例えばＮ,Ｎ´−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導されるものがある。
【０１３０】
本発明医薬組成物はまた、医薬上許容される酸化防止剤を含み得る。医薬上許容される酸化防止剤の例としては、水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、および金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などがある。
【０１３１】
本発明医薬組成物で使用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール類（例えばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル類、例えばエチルオレエートがある。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。
【０１３２】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の存在の阻止は、滅菌処理、および様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方により確実に達成され得る。また、組成物中へ等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを含有させることが望ましい場合もあり得る。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含ませることにより、注射可能医薬形態の吸収を延長することも可能である。
【０１３３】
医薬上許容される担体は、無菌水溶液または分散液および無菌注射可能溶液または分散液をその場で調製するための無菌粉末を含む。医薬活性物質についての上記媒質および薬剤の使用は当業界では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と適合し得ない場合を除き、本発明医薬組成物でのその使用も考慮に入れられる。補足的活性化合物もまた組成物中に混合され得る。
【０１３４】
治療組成物は、典型的には製造および貯蔵条件下で無菌かつ安定していなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬剤濃度に適した他の整った構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール類（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒質であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含ませ得る。例えばモノステアリン酸塩類およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませることにより、注射可能組成物の吸収を延長することも可能である。
【０１３５】
無菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を上記で列挙した成分の一つまたはその組み合わせと混合し、次いで、必要に応じて滅菌精密ろ過することにより調製され得る。一般的に、塩基性分散媒質および上記で列挙したものから選択される他の必要成分を含む無菌賦形剤中へ活性化合物を混ぜ込むことにより、分散液を調製する。滅菌注射可能溶液調製用の無菌粉末の場合、製造方法は真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）であり、有効成分と所望の追加成分を、その予め滅菌ろ過しておいた溶液から上記手段により粉末として得る。
【０１３６】
担体材料と組み合わされて単一用量形態を形成し得る有効成分の量は、処置されている対象および特定の投与方法により変動する。担体材料と組み合わされて単一用量形態を形成し得る有効成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、医薬上許容される担体との組み合わせにおいて約０.０１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、約０.１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの割合の有効成分となる。
【０１３７】
最適条件の所望の応答（例、治療応答）を引き出せるように投薬レジメンを調節する。例えば、単一ボーラスを投与することもあれば、時間をかけて幾つかの分割用量で投与することもあれば、治療状況の緊急性に応じて用量を適宜増減することもあり得る。投与を容易にし、投薬量を均一にするためには単位用量形態で非経口組成物を処方するのが、特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態は、処置される対象にとって単位用量として適切な物理的個別単位をいう。各単位は、必要とされる医薬用担体と配合して所望の治療効果を収めるように計算された予め定められた量の活性化合物を含む。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体における感受性に応じた処置に関する上記活性化合物の調合技術に内在する制限により必然的に決められ、直接左右される。
【０１３８】
ＨＤＬモジュレーション剤、例えば抗体の投与について、投薬量は、対象の体重に基づくと約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常は０.０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、体重に基づくと０.３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。具体例としての処置レジメンは、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回または３〜６か月に１回の投与を必要とする。抗体に関する投薬レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ（体重）または３ｍｇ／ｋｇ（体重）を含み、以下の投薬スケジュールの一つを用いて抗体を投与する：６回投薬について４週間ごと、次いで３か月ごと；３週間ごと；３ｍｇ／ｋｇ（体重）１回、次いで３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ（体重）。
【０１３９】
方法によっては、結合特異性が異なる２種またはそれより多い結合分子（例、モノクローナル抗体）を同時に投与することがあり、その場合、投与される各抗体の用量は指示範囲内に含まれるものとする。ＨＤＬモジュレーション剤は、通常多頻度で投与される。投薬間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月ごとまたは１年ごとであり得る。患者におけるＨＤＬモジュレーション剤（例、抗体）の血液レベルの測定結果によっては、不定期的な間隔が指示されることもあり得る。若干の方法では、約１〜１０００μｇ／ｍｌおよび方法によっては約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように投薬量を調節する。
【０１４０】
別法として、ＨＤＬモジュレーション剤は持効型製剤として投与され得て、その場合投与頻度は少なくて済む。投薬量および頻度は、患者におけるＨＤＬモジュレーション剤の半減期により変動する。例えば抗体の場合、ヒト抗体が最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体と続く。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかにより異なり得る。予防的適用の場合、長期間にわたって比較的低用量を比較的低頻度間隔で投与する。患者によっては残りの生涯処置を受け続ける場合もある。治療的適用の場合、病気の進行が低下するかまたは終結するまで、または患者が病気の症状の部分的または完全な改善を示すまで比較的短い間隔で比較的高用量が要求されることもある。その後、患者は予防的投薬プログラムで投与され得る。
【０１４１】
本発明医薬組成物中における有効成分の実際の投薬レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定患者、組成物および投与方式について所望の治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分が得られるように変更され得る。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定化合物の排泄速度、処置の持続期間、特定の使用組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、病状、全般的健康状態および既往歴および医学界で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態的因子により変化する。
【０１４２】
本発明ＨＤＬモジュレーション剤の「治療有効量」は、病状の重症度の減少（例、血漿コレステロールの減少またはコレステロール関連疾患の症状の減少）、疾患の無症状期間の頻度および持続時間の増加、または病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止をもたらすものである。
【０１４３】
組成物は、当業界で公知の様々な方法の一つまたはそれ以上を用いる一つまたは複数の投与経路により投与され得る。当業者であれば、投与経路および／または方法が所望の結果により異なることは容易に理解できるはずである。ＨＤＬモジュレーション剤の投与経路としては、限定されるわけではないが、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路がある。本明細書で使用されている「非経口投与」という表現は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与方式を意味し、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および幹内(intrastemal)注射および注入を包含する。
【０１４４】
別法として、ＨＤＬモジュレーション剤は、非経口経路、例えば局所、表皮または粘膜投与経路により、例えば鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与され得る。
【０１４５】
活性化合物は、急速な放出から化合物を保護する担体を用いて、例えば移植体、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御型製剤として調製され得る。生物分解性の生体適合性ポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ酪酸が使用され得る。上記製剤の多くの製造方法は、特許を取得しているかまたは当業者には公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson 編、Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク（1978）参照。
【０１４６】
治療組成物は、当業界で周知の医療器具により投与され得る。例えば、一具体例において、本発明の治療組成物は、針の無い皮下注射器具、例えば米国特許第５３９９１６３、５３８３８５１、５３１２３３５、５０６４４１３、４９４１８８０、４７９０８２４または４５９６５５６号で示された器具により投与され得る。本発明で有用な公知の移植体およびモジュールの例としては、制御された速度で薬剤を分配する移植可能な微量注入ポンプを示す米国特許第４４８７６０３号、皮膚を通して薬剤を投与する治療器具を示す米国特許第４４８６１９４号、正確な注入速度で薬剤を送達する薬剤注入ポンプを示す米国特許第４４４７２３３号、連続的薬剤送達用の可変流動性で移植可能な注入装置を示す米国特許第４４４７２２４号、マルチチャンバー区画を有する浸透性薬剤送達システムを示す米国特許第４４３９１９６号、および浸透性薬剤送達システムを示す米国特許第４４７５１９６号が挙げられる。これらの特許については出典明示で援用する。多くの他の上記移植体、送達システムおよびモジュールは、当業者には周知である。
【０１４７】
ある種の実施態様において、本発明のＨＤＬモジュレーション剤は、生体内での適正な分布を確保するように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明治療化合物がＢＢＢを（所望ならば）確実に越えるようにするため、それらを例えばリポソームで製剤化し得る。リポソームの製造方法については、例えば米国特許第４５２２８１１、５３７４５４８および５３９９３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または臓器へ選択的に輸送される１または複数の部分を含むため、ターゲッティングされた薬剤送達を促進させ得る（例、V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685参照）。ターゲッティング部分の例としては、葉酸塩またはビオチン（例、Low et al.、米国特許第５４１６０１６号参照）、マンノシド類（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）、界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）、ｐ１２０（chreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）がある。また、K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照。
【０１４８】
実施例
機能的ＨＤＬの血漿レベルが上昇すると、冠動脈疾患の危険性が減るということの強力な証拠がある（Gotto, A. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43:717-724, 2004）。以前には知られていなかった、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの調節におけるヒトＧＡＬＮＴ２の役割について本明細書では開示している。マウス遺伝学、ヒト遺伝学、マウス比較ゲノミクスおよびバイオインフォマティクス方法の組み合わせを用いることにより、ＧＬＡＮＴ２は、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルを調節する遺伝子として見出された。血漿リポタンパク質およびＨＤＬ−ＣのモジュレーションにおけるこのＧＡＬＮＴの役割は、これらのＧＡＬＮＴを阻害することで、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の処置に有用なものとされている薬剤についてのスクリーニングにおけるその有用性、並びに例えば、ＣＡＤ、アテローム性動脈硬化症、またはＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に対する易罹患性についての生物マーカーとしてのそれらの有用性を示している。
【０１４９】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）解析は、複雑な形質を調節する新規遺伝子を発見する手段である（Abiola O et al., 2003, Nature Rev Genet 4:911-916）。マウス罹患モデルで検出されたＱＴＬにより、ヒト罹患ＱＴＬの遺伝子座を予測できることが多いことから、マウスモデルを用いた遺伝子解析はヒト疾患にとって重要な遺伝子を潜在的に同定できると考えられるため、ＱＴＬ解析は生化学研究にとって特に重要である（Abiola O et al., 2003, Nature Rev Genet 4:911-916; Rollins J et al., 2006, Trends Cardiovasc Med 16:220-234; Chen et al., 2007, Cell Metab 6: 164-179）。
【０１５０】
血漿ＨＤＬ−ＣレベルについてのＱＴＬは、交雑Ｂ６ｘＣＡＳＴおよびＢ６ｘＣＡＳＡからのマウス遠位染色体（Ｃｈｒ）８で見出された（Rollins J et al., 2006, Trends Cardiovasc Med 16:220-234）。我々は、Pletcher et al., PLoS Biol. 2:e393 (2004)記載の方法に従って、マウス全ゲノム関連研究からＧａｌｎｔ２の多形がマウス集団（Ｐ＝３.５×１０−５）におけるＨＤＬ−Ｃレベルと関連していることを見出した。
【０１５１】
ハプロタイプ分析は、Ｇａｌｎｔ２が、上記２交雑種に基づいた候補遺伝子であることを示していた（表１）。染色体８におけるＧａｌｎｔ２遺伝子内のＳＰＮの位置を、表１（表中、「ｂｐ」は塩基対である）で強調して示している。（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｂ６およびＣＡＳＴは、異なるハプロタイプを有し、ＣＡＳＡについてのＧａｌｎｔ２内におけるＳＮＰデータは入手できない。しかしながら、マウス Phenome データベースによると、ＣＡＳＴおよびＣＡＳＡは、この遺伝子の周囲領域に同じハプロタイプを有する。この証拠およびＣＡＳＴおよびＣＡＳＡの関連性（両系統とも、Jackson Laboratoryで捕獲された野生カスタネウス（Castaneus）マウスの同一群から同系交配された）に基づくと、ＣＡＳＡおよびＢ６ハプロタイプがＧａｌｎｔ２遺伝子内では異なることが想定され得る。したがって、Ｇａｌｎｔ２における対立遺伝子変異および改変されたＨＤＬレベルとの関連性から、ＨＤＬ代謝におけるこの遺伝子についてのある一定の役割が示唆される。この遺伝子の発現それ自体が、ＨＤＬレベルの低下により誘発されるＣＡＤに関するバイオマーカーとして有用である。
表１．異なるマウス系統間におけるハプロタイプ比較
【表１】
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【０１５２】
Ｂ６およびＣＡＳＴマウスに平常食餌または高脂肪食餌を与えた。１０〜１１週齢のマウスを血液試料の採取前に４時間絶食させた。血漿を新たな管に入れ、分析時まで−２０℃で冷凍した。血漿試料を解凍し、収集される１週間以内に分析した。各血液試料からの血漿リポタンパク質濃度を、Synchron CX Delta System (Beckman Coulter)で製造業者の推奨に従って酵素試薬キット（６５０２０７番、Beckman Coulter）を用いて直接測定した。
【０１５３】
ＨＤＬレベルが異なる２系統のマウスにおいてＧＡＬＮＴ２の発現を調べた。Ｂ６およびＣＡＳＴ間のＧＡＬＮＴ２に関する倍率変化およびｑ値を表２に示す。示された倍率変化は、ＣＡＳＴと比較したＢ６におけるものである。データは、ＧＡＬＮＴ２が、高対立遺伝子系統であるＢ６ではダウンレギュレーションされていることを示す。すなわち、ＧＡＬＮＴ２発現は、ＨＤＬと相関関係をなし、０.３８０１のピアソン係数（ｐ＝０.０１９）を示す。この相関関係は、ＣＡＳＴと比較されたＢ６で見られる負の倍率変化を実証している。この関係に基づくと、ＧＡＬＮＴ２の阻害によりＨＤＬは上昇すると予測される。すなわち、ＧＡＬＮＴ２の阻害を含む方法は、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の処置に使用され得る。
表２．肝臓におけるＧａｌｎｔ２遺伝子発現変化（Ｂ６対ＣＡＳＴ）
【表２】
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【０１５４】
さらに、ヒトでのＨＤＬモジュレーションにおけるＧＡＬＮＴ２の役割は、ＧＡＬＮＴ２における４つのＳＮＰの多形（rs2144300, rs 17315646, rs4846914, およびrs10127775）がヒトでの血漿ＨＤＬレベルと関連していること（Ｐ＝１.４ｘ１０-4 〜３.４ｘ１０-4）を示した Novartis-Broad 共同研究により立証されている。
【０１５５】
リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて、マウスおよびヒト組織の両方においてＧＡＬＮＴ２の遺伝子発現を調べた。図１に示すとおり、ＧＡＬＮＴ２は、ヒトでは肝臓、膵臓および筋肉で高度に発現され（図１Ａ）、マウスでは膵臓および筋肉で高度に発現される（図１Ｂ）。発現レベルを、マウス組織におけるβ−アクチンｍＲＮＡおよびヒト組織における１８ｓ ＲＮＡに対して正規化した。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月3日(2010.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＬＮＴ遺伝子によりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントであって、細胞上の表面受容体に結合し、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止するかまたは改善する抗体またはその機能性フラグメント。
【請求項２】
ＧＡＬＮＴ遺伝子がＧＡＬＮＴ２遺伝子である、請求項１記載の単離抗体またはその機能性フラグメント。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメントおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含む、ＨＤＬ関連疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項４】
ＨＤＬ関連疾患処置用医薬を製造するための単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、上記抗体またはその機能性フラグメントがＧＡＬＮＴ遺伝子によりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含むものである、使用。
【請求項５】
ＧＡＬＮＴ遺伝子がＧＡＬＮＴ２遺伝子である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
請求項１または２記載の抗体またはその機能性フラグメントをコード化する遺伝子を担持するトランスジェニック動物。
【請求項７】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の指標であるヒトＧＡＬＮＴ２遺伝子の対立遺伝子を検出することを含む、冠動脈疾患または冠動脈疾患に対する易罹患性の検出方法。
【請求項８】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力の測定方法であって、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力が測定されるようにＧＡＬＮＴのレベルを対照標準と比較することを含む方法。
【請求項９】
ＧＡＬＮＴがヒトＧＡＬＮＴ２である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、ＧＡＬＮＴの阻害により血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの増加が誘導されることに基づき、生物試料を候補薬剤と接触させ、候補薬剤との接触の前後に試料中のＨＤＬ−Ｃレベルを測定することを含み、ＨＤＬ−Ｃの増加が、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤を示すものとする方法。
【請求項１１】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、既知ＧＡＬＮＴ基質の存在下でＧＡＬＮＴを候補薬剤と接触させることを含み、ＧＡＬＮＴのＧＡＬＮＴ活性の減少により、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤として候補薬剤を同定する方法。
【請求項１２】
ＧＡＬＮＴがマウスまたはヒトＧＡＬＮＴ２である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
接触段階を培養細胞で実施する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
接触段階を生体内で実施する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
ＧＡＬＮＴが内因性または外因性である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＨＤＬ関連疾患をモジュレーションするための医薬組成物であって、対象においてＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させるＨＤＬモジュレーション剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＤＬ関連疾患が、アテローム性動脈硬化症、脂質障害、アルツハイマー病、過度の酸化ストレス、内皮機能不全、肥満、慢性腎疾患、２型糖尿病およびインスリン抵抗から成る群から選択される、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
脂質障害が、高コレステロール、脂質異常症候群、高トリグリセリド、脂質異常症、異常リポタンパク血症、高脂血症、家族性高コレステロール血症および家族性高トリグリセリド血症から成る群から選択される、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
薬剤が、ヒトＧＡＬＮＴ２の活性を阻害するかまたはその発現を減少させる、請求項１６〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＨＤＬモジュレーション剤が、低分子量分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡおよび抗体から成る群から選択される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＤＬ関連疾患が、対象におけるＨＤＬ−Ｃレベルが許容された正常ＨＤＬ−Ｃレベルより低い疾患である、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＨＤＬ関連疾患が、対象におけるＨＤＬ−Ｃレベルが関連集団の正常ＨＤＬ−Ｃレベルより低い疾患である、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項２３】
さらに医薬上許容される担体を含む、請求項１６〜２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
ハプロタイプ分析は、Ｇａｌｎｔ２が、上記２交雑種に基づいた候補遺伝子であることを示していた（表１）。染色体８におけるＧａｌｎｔ２遺伝子内のＳＰＮの位置を、表１（表中、「ｂｐ」は塩基対である）で強調して示している。（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｂ６およびＣＡＳＴは、異なるハプロタイプを有し、ＣＡＳＡについてのＧａｌｎｔ２内におけるＳＮＰデータは入手できない。しかしながら、マウス Phenome データベースによると、ＣＡＳＴおよびＣＡＳＡは、この遺伝子の周囲領域に同じハプロタイプを有する。この証拠およびＣＡＳＴおよびＣＡＳＡの関連性（両系統とも、Jackson Laboratoryで捕獲された野生カスタネウス（Castaneus）マウスの同一群から同系交配された）に基づくと、ＣＡＳＡおよびＢ６ハプロタイプがＧａｌｎｔ２遺伝子内では異なることが想定され得る。したがって、Ｇａｌｎｔ２における対立遺伝子変異および改変されたＨＤＬレベルとの関連性から、ＨＤＬ代謝におけるこの遺伝子についてのある一定の役割が示唆される。この遺伝子の発現それ自体が、ＨＤＬレベルの低下により誘発されるＣＡＤに関するバイオマーカーとして有用である。
表１．異なるマウス系統間におけるハプロタイプ比較
【表１】
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【国際調査報告】
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