(57)【要約】  試料中の金属ラベルされた検体（１２）を検出または定量する方法を開示する。方法は、検体から金属ラベル（１８）を解放するためにリリース剤（２０）を添加して、リリース剤（２０）に金属ラベル（１８）と安定した荷電種（２２）を形成させ、安定した荷電種（２２）を電極（２４）に移動させるために電位をかけるステップと、陽電位下で安定した荷電種（２２）を溶解して金属イオン（２６）を形成するステップと、金属ラベルされた検体（１２）を検出または定量するために、定量検出手段を実行するステップとを包含する。【選択図】なし
2011504593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の金属ラベルされた検体（１２）を検出または定量する方法であって、
検体から金属ラベル（１８）を解放するためにリリース剤（２０）を添加して、リリース剤と金属ラベルに共に荷電種（２２）を形成させ、荷電種を電極（２４）に移動させるために電位をかけるステップと、
荷電種が金属イオン（２６）を形成するように陽電位をかけるステップと、
金属ラベルされた検体を検出または定量するために、定量検出手段を実行するステップとを含む方法。
【請求項２】
荷電種（２２）が不溶性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
荷電種（２２）が陽電位により電極（２４）に移動し、陽電位が金属イオン（２６）の形成をもたらす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
荷電種（２２）は、陰性に荷電している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
リリース剤（２０）は荷電ユニットを有するチオールを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
リリース剤（２０）はチオシアン酸アンモニウムまたはチオシアン酸カリウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
リリース剤（２０）はチオスルホン酸または荷電チオール鎖である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
荷電種を形成するために、リリース剤（２０）がイオンを供給する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
荷電種を形成するために、リリース剤（２０）が塩化物イオンを供給する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
リリース剤（２０）がNaClまたはHClである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検体（１２）に結合可能で、かつ金属でラベルされた結合成分（１６）と検体とをインキュベートすることにより、検体を金属ラベル（１８）でラベルするステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
検体（１２）に結合可能で、かつ支持固体（１４）に固定された、さらなる結合成分（１０）と検体とをインキュベートするステップをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
支持固体（１４）が可動性、または固定されている、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
可動性の支持固体（１４）が磁性を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
金属ラベル（１８）を金属ナノ粒子とし、支持固体（１４）を前記金属ナノ粒子より大きい、または小さい粒子とする、結合した金属ナノ粒子から未結合分を除去しやすい構成とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
電気的分離を可能とするために、支持固体（１４）が荷電粒子である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
固定された支持固体（１４）が立体面または三次元構造である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
固定された支持固体（１４）が三次元多孔性構造である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
固定された支持固体（１４）が二次元平面または二次元構造である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
金属ラベル（１８）は微粒子ラベルまたはナノ粒子である請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
金属ラベル（１８）は銀ナノ粒子または金ナノ粒子である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
金属ラベル（１８）は銀ナノ粒子である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
定量検出方法がボルタンメトリー法である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ボルタンメトリー法が、アノーディックストリッピングボルタンメトリー法である、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的アッセイ、特に金属ナノ粒子を電気化学的ラベルとして利用する電気化学的アッセイに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
WO2005/121792に開示されるような金属ラベルを含む先行技術は、金属ナノ粒子を溶解するために化学的酸化剤を要する。このような技術の問題は、酸化剤がスキャンのベースラインを乱し、スキャンの電気化学的プロファイルを阻害するおそれがあることである。WO2005/121792に開示されるアッセイは、金属イオンの構造により、金属が電気分析的に電極表面に移動する構成となっている。このアッセイも、生物学的試料を分析する際には問題がある。特に、生物学的試料溶液中のタンパク質や他の分子は、通常、金属イオンと結合し、金属イオンを電気化学的に不活性な状態とする。金属イオンは、化学的酸化剤とのキレート結合によっても電気化学的に不活性な状態となり得る。このように、シグナルの感度が損なわれてしまう。
【０００３】
WO2004/016160は、ナノ粒子でラベルされた検体からナノ粒子を解放するための、化学的酸化還元分解剤の使用を開示している。電気化学的フローサイトメトリーを使用して、酸化還元分解剤によりポリマーナノ粒子から離脱する金属イオン等の酸化還元物を検出する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の問題の一つ以上を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、試料中の金属でラベルされた検体の存在量を測定する方法であって、金属でラベルされた検体にリリース剤を添加して、検体から金属ラベルを離脱させるステップ、リリース剤と金属ラベルに共に荷電種を形成させるステップ、前記荷電種を電極に移動させるため電位をかけるステップ、金属ラベルされた検体の検出またはその量の定量を行う定量検出手段を実行するステップを含む方法を提供する。
【０００６】
金属イオンは電極表面に形成される。そのため、測定される前に活性が失われ、金属イオン測定できる機会はほとんどない。そのため、金属イオンとキレート剤との複合体を形成する必要がない。さらに、金属ラベルを溶解するために電気化学的電位が使用されるため、化学的酸化剤を使用する必要がなく、化学的酸化剤に付随する問題は解消される。
【０００７】
荷電種は、通常不溶性である。
【０００８】
通常、リリース剤は荷電成分を含み、前記リリース剤の前記荷電成分と金属ナノ粒子が共に荷電種を形成する。
【０００９】
荷電種は陽電位がかけられることにより、電極に移動し得る。それにより、金属イオンの形成が生じる。
【００１０】
荷電種は陽電荷となる形態であってもよいが、陰電荷であることがより好ましい。
【００１１】
リリース剤としては、金属ラベル表面に荷電層を形成し、電位下でそれを移動させることができる、あらゆる塩または化合物を使用できる。
【００１２】
リリース剤は、荷電ユニットを有するチオールを含んでいてもよい。チオールは金属ラベルと検体との間の結合を変性または破壊するように働く。荷電ユニットは金属ラベルに電荷を与える。
【００１３】
好適なリリース剤の例としては、チオシアン酸アンモニウムとチオシアン酸カリウムを含むものが挙げられる。チオシアン酸の代わりに、チオスルホン酸または荷電チオール鎖を含むリリース剤としてもよい。リリース剤は荷電種を形成するためにイオンを提供してもよい。例えば、好適なリリース剤として、荷電種を形成するために塩化物イオンを供給する、NaClまたはHClを含むものが挙げられる。NaClとHClは酸化後に金属イオンと複合体を形成しないため、リリース剤として特に有利である。
【００１４】
リリース剤は、1M以上の濃度であることが好ましい。1Mよりモル濃度が低いと、銀の感度がよくないため、前記の範囲とすることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る方法は、さらに、検体を金属ラベルでラベルするステップを含みうる。このステップにおいて、検体は、検体結合成分と共にインキュベートされ、金属ラベルによってラベルされる。検体は、さらに検体結合成分分と共にインキュベートされ、支持固体に固定される。固定支持は可動性でも固定されていてもよく、磁性を有していてもよく、結合から解放された金属ナノ粒子をフィルターするように金属ナノ粒子より大きい、または小さい粒子であってもよく、電気的分離を可能とするように電荷を有する粒子であってもよく、多孔性構造であってもよく、二次元または三次元の、平面または構造であってもよい。
【００１６】
好適な形態において、金属ラベルは銀か金であり、例えば銀ナノ粒子または金ナノ粒子である。好適には、金属ラベルは、銀ナノ粒子のような、微粒子またはナノ粒子のラベルである。
【００１７】
検体は間接的にラベルされてもよく、この場合、ラベルは、検体に順次結合する種または検体結合成分に付着する。
【００１８】
定量検出手段は、アノーディックストリッピングボルタンメトリー法（ASV）のような、ボルタンメトリー法であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
ここに、好適な形態を下記の図を参照することによって説明する。
【００２０】
【図１】図１は、この発明の形態を概略的に図示したものである。
【図２】図２は、AgNO3標準液と1M NH4SCN（1-50ppm Ag+ ）のアノーディックストリッピングボルタンメトリー法（ASV）のスキャン結果を示す。
【図３】図３は、AgNO3標準液と1M NH4SCN（1-50ppm Ag+ ）のアノーディックストリッピングボルタンメトリー法（ASV）のスキャン結果を示す。
【図４】図４は、AgNO3標準液と1M NH4SCN（0.01-0.8ppm Ag+）のアノーディックストリッピングボルタンメトリー法（ASV）のスキャン結果を示す。
【図５】図５は、AgNO3標準液と1M NH4SCN（0.01-0.8ppm Ag+）のアノーディックストリッピングボルタンメトリー法（ASV）のスキャン結果を示す。
【図６】図６は、酸化剤であるヘキサシアノ鉄酸塩存在下のAg+の濃度を示す。
【図７】図７は、酸化剤であるヘキサシアノ鉄酸塩存在下のAg+の濃度を示す。
【図８】図８は、ヘキサシアノ鉄酸塩存在下または不存在下のAg+濃度を示す。
【図９】図９は、ヘキサシアノ鉄酸塩存在下または不存在下のAg+濃度を示す。
【図１０】図１０は、ヘキサシアノ鉄酸塩存在下または不存在下のAg+濃度を示す。
【図１１】図１１は、ヘキサシアノ鉄酸塩存在下または不存在下のAg+濃度を示す。
【図１２】図１２は、NH4SCN存在下または不存在下での銀ナノ粒子の吸収を示す。
【図１３】図１３は、NH4SCN存在下または不存在下での銀ナノ粒子の吸収を示す。
【図１４ａ−１４ｆ】図１４ａ〜図１４ｆは、銀ナノ粒子のサイズ分離における80％及び100％の効果を示す。
【図１５】図１５は、KSCNとNH4SCNとの比較結果を示す。
【図１６】図１６は、KSCNとNH4SCNとの比較結果を示す。
【図１７】図１７は、本発明の方法に係る形態に前処理時間が与える影響の比較を示す。
【図１８】図１８は、本発明の方法に係る形態に前処理時間が与える影響の比較を示す。
【図１９】本アッセイの最大感度において必要とされる対ミオグロビン抗体の量を示す。
【図２０】図２０は、本方法のさらなる形態の結果を示す。
【図２１】図２１は、本方法のさらなる形態の結果を示す。
【図２２】図２２は、本方法のさらなる形態の結果を示す。
【図２３】図２３は、本方法のさらなる形態の結果を示す。
【図２４】図２４は、測定された種が電荷を有さない場合の陰性の結果を示す。
【図２５】図２５は、測定された種が電荷を有さない場合の陰性の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本アッセイは、抗体、ミモトープ、または核酸ストランド等の所望の検体の検出または定量を行うものであり、図１に一形態が概略的に示されている。より好適な形態において、第１の結合成分１０は所望の検体１２への結合能を有し、固相１４（磁性粒子の表面）に固着される。第２の結合成分１６は検体１２の他の領域への結合能を有し、金属ラベル１８でラベルされる。金属ラベル１８は、通常は微粒子ラベルである。
【００２２】
検体１２を含む試料溶液は、固相支持１４に供給される。検体１２は第１の結合成分１０に結合する。次いで、支持１４は、ラベルされた第２の結合成分１６を含む溶液と共にインキュベートされ、第２の結合成分１６は検体１２に結合する。基質と銀粒子１８との間に起こる「サンドイッチ」効果により、粒子１８は捕捉される。未結合の粒子は取り除かれる（洗浄等の方法による）。本過程において、上記の粒子は酸化されない。
【００２３】
好適な形態において、銀ナノ粒子１８は電気化学的ラベルとして使用される。４０ｎｍの各銀ナノ粒子は約１０6個の銀イオンを有するため、銀ナノ粒子１８は電気化学的信号を分子的に増幅し、このアッセイの感度を促進する。また、銀は、バイオナノラベル１８として使用できるように安定的なナノ粒子であることが好ましい。さらに、銀ナノ粒子１８は電気的に容易に酸化され、銀イオンを形成する。他の金属ナノ粒子の中には、金属イオンを形成するために強い化学的酸化剤を要するものもある。
【００２４】
好適な形態においては、チオシアン酸アンモニウム２０が導入され（１００）、生物学的複合体から銀ナノ粒子１８を取り除き、電荷を有するナノ粒子２２の層（一層であってもよい）を形成する。前記層は、銀ナノ粒子の周囲に化学的に結合し、陰性に荷電したナノ粒子２２を形成する。荷電ナノ粒子２２は、電位下で、陽極の表面に向かって移動する（２００）。電極の銀ナノ粒子は、陽電位下で溶解し（３００）、銀イオン２６を形成する。銀イオン２６は、集積ストリッピングボルタンメトリーによって計測される。リリース剤が銀イオンをキレート化し得るものであっても、キレート剤と複合体を形成する銀イオンの割合は小さいであろう。
【００２５】
他のリリース剤２０、例えばチオスルホン酸のような、電荷ユニットを有するチオール等を使用してもよい。NaClやHClのようなチオール化されていない分子も使用することができる。
【００２６】
＜比較例１＞
この比較例は、WO2005/121792に開示された方法で測定された、電気的活性を有する複合体の形成の背景となる化学について説明する。
【００２７】
〔複合体を形成する銀イオン（Ag+）の測定〕
NH4SCN存在下で、銀イオンは強い電気活性を有する複合体を形成する：
【化１】
2011504593.tif 000003
【００２８】
これらの複合体はASVを使用して電気化学的に測定することができる。この過程において、陰性電位下の銀複合体は、まずカーボンを塗布した電極の表面に付与される。
【化２】
2011504593.tif 000004
【００２９】
次いで、電位を陽電位に変更し、電流にピークを与えることで銀複合体を電極から引き剥がす。
【化３】
2011504593.tif 000005
【００３０】
チオシアン酸アンモニウムは他の金属イオンとも複合体を形成し、これらの金属イオンの電気化学特性を銀イオンの電気化学特性から異なるものとすることで、スペクトルへの阻害要因を取り除く。
【００３１】
AgNO3の標準液（1.25, 6.25, 12.5, 25, 37.5, 50, 62.5ppm）を準備した。各標準液160μLに、5M NH4SCNを40μLを添加した。AgNO3，NH4SCNの溶液各50μLを順番に電極に添加し、ASVを実行した。ASVのパラメーターは下記の通りである。
ａ）  ＋0.4V  10秒間  （前処理）
ｂ）  直線スイープ  ＋0.4V  →  −1.6V
スキャンレート＝1V／秒、ステップ電位＝0.005V
ｃ）  −1.6V  5秒間
ｄ）  −1.2V  55秒間
ｅ）  直線スイープ  −1.2V  →  ＋0.1V
キャンレート＝1V／秒、ステップ電位＝0.01V
各測定の間に、電極を5M NH4SCN存在下でASVを運転し、次いでティシュで拭きとることによって洗浄する。
【００３２】
【表１】
2011504593.tif 000006
【００３３】
結果を表２及び３に示す。ピーク下の面積は、1〜50ppmの範囲では、Ag+濃度に比例する。
【００３４】
＜比較例２＞
同様の実験をより低濃度のAg+を用いて実施した。
【００３５】
【表２】
2011504593.tif 000007
【００３６】
結果を図４及び５に示す。
【００３７】
＜比較例３＞
WO2005/121792に開示されるような先行技術のアッセイでは、比較例１及び２で述べたような手順で使用される銀イオンを形成するために、酸化剤（ヘキサシアノ鉄酸）を使用する。下記の測定は、0.05M K3Fe(CN)6と0.01M K4Fe(CN)6の存在下で実施した。
【００３８】
【表３】
2011504593.tif 000008
【００３９】
図６〜９に結果を示す。ヘキサシアノ鉄酸の有無によって、銀イオンの検量線はほとんど変化しないにも関わらず、スキャン結果は異なるものとなった。
【００４０】
下記の実施例は、本発明の好適な形態の課題を示す。
【００４１】
＜実施例４＞
〔ヘキサシアノ鉄酸の有無による銀ナノ粒子の電気化学的挙動〕
5M NH4SCN、0.25M K3Fe(CN)6、及び0.05M K4Fe(CN)6の「混合」溶液を準備した。２つの銀ナノ粒子溶液各160μLを準備した。5M NH4SCN 40μLを第１の銀溶液に添加した。前記混合溶液40μLを第２の溶液に添加した。準備した各溶液50μLを順番に電極上に添加し、ASVを実行した。
【００４２】
【表４】
2011504593.tif 000009
【００４３】
図１０に結果を示す。チオシアン酸存在下の銀ナノ粒子は、ヘキサシアノ鉄酸存在下の銀ナノ粒子と挙動が似ているが、より強いピークを示す。しかし、ヘキサシアノ酸鉄酸化剤のない状態での銀ナノ粒子の方が、ベースラインが良好である。（ヘキサシアノ鉄酸の場合の）引き離しピークの後、ベースラインはより平らであり、電流の上昇は見られない。したがって、ピークの検出とピーク面積または高さの測定はより容易である。
【００４４】
さらに、（次の実験が示すように）ピーク下の面積は銀ナノ粒子の濃度に比例する。
【００４５】
【表５】
2011504593.tif 000010
【００４６】
図１１にデータを示す。
【００４７】
＜実施例５＞
NH4SCNが銀ナノ粒子を溶解したか否かを確認するために、分光的な方法を用いることができる。NH4SCN存在下、不存在下の銀ナノ粒子の吸収は、500〜300nmの条件で測定可能である。
【００４８】
銀ナノ粒子（40nm）は、400nm付近に吸収ピークを有するが、NH4SCNの添加後にこのピークは消失する。これは、銀ナノ粒子が溶解したともとれるが、文献によると、当該ピークの消失は他の機序による：ＳＣＮ−が銀粒子の表面に単層として結合することにより、銀ナノ粒子が凝集体を形成する。これが、銀ナノ粒子の400nmの吸収が減少して、550nm周辺に新たなピークが現れる理由である。そこで、より広い波長範囲で再度実験を実施した。
【００４９】
図１２及び１３にデータを示す。
【００５０】
ＵＶスペクトルは、400nmのシグナルが減少して、650nm付近に幅広いピークが上昇していることを示し、ナノ粒子のサイズの増大を示している。
【００５１】
＜実施例６＞
この実験において、100%銀ナノ粒子溶液、1M NH4SCN（濾過済み）を含む80%銀ナノ粒子溶液の銀粒子のサイズをMalvernゼータサイザー機器を用いて測定した。図１４ａは100%銀ナノ粒子溶液の結果を示す。測定はt=0、t=3時間でそれぞれ三重測定で行われた。
【００５２】
銀ナノ粒子の測定結果は、銀ナノ粒子が溶液中で安定していることを示す。図１４ｂに結果を示す。NH4SCN添加後、銀ナノ粒子のサイズは図１４ｃに示すように変化する。チオシアン酸アンモニウムの添加後、粒子が凝集し、全く溶解しないという結果が明らかに見られた（図１４ｄ参照のこと）。
【００５３】
１時間後、凝集体は大きくなっているように見られた（図１４ｅ及びｆ参照のこと）。
【００５４】
＜実施例７＞
データにより、チオシアン酸アンモニウムが銀ナノ粒子の周囲にチオシアン酸の単層を形成していることが示されている。類似の結果が、チオシアン酸ユニットを有する他の分子に変更しても得られる。この実験において、銀ナノ粒子と銀イオンの測定はNH4SCNだけでなくKSCNを使用することによって行われた。
【００５５】
【表６】
2011504593.tif 000011
【００５６】
図１５及び１６に結果を示す。
【００５７】
KSCNもAg+と電気活性を有する複合体を形成し、銀ナノ粒子とともに電流ピークを生ずることが分かる。
【００５８】
＜実施例８＞
上記において示したように、チオシアン酸は銀ナノ粒子の表面に単層を形成し、荷電ナノ粒子を形成する。これはナノ粒子の凝集を生じさせる。荷電粒子は陽電位下で電極向かって移動する。次の２つの実験は、銀ナノ粒子がASVによってどのように計測されるかを示す。第１に、銀イオン及び銀ナノ粒子の測定結果に与える前処理時間（U=+0.4V）の影響を確認する（表７参照のこと）。
【００５９】
【表７】
2011504593.tif 000012
【００６０】
銀イオンの測定結果は時間によって影響を受けないが、銀ナノ粒子の測定結果は時間の影響を受ける。これは陽電位が測定シグナルに影響を与えることを示す（図１７参照のこと）。
【００６１】
図１８に示すように、第２の方法は、前処理時間を一定（10秒間）とし、前処理の電位を変化させるものである。
【００６２】
Ag+からの電流シグナルは、電位によって変化しないが、ナノ粒子からのシグナルは電位によって異なる。
【００６３】
電位は銀イオンには全く影響を及ぼさないが、銀ナノ粒子には強い影響を与える。これらのデータは、銀ナノ粒子のASVの最終段階で測定される電気的に活性な種が、前処理時間に形成されることを示す。銀ナノ粒子とその荷電被覆物は電位勾配を介して電極へと移動する。電極の陽電位は、銀ナノ粒子を銀イオンへと溶解する。次いで、銀イオンは電極上に蓄積し、計測のために引き剥がされる。当業者であれば、この方法は知っているであろう。
【００６４】
＜実施例９＞
電気化学的イムノアッセイは、次のように実施された。
【００６５】
〔銀ナノ粒子と抗体のコンジュゲーション〕
１．10mLの銀ナノ粒子（British Biocell）を5本の2mLチューブに入れて、スピンダウンする（13,200rpm、5分、4℃）。
２．上澄みを捨て、5つのペレットを1つのチューブに集め、銀ナノ粒子の最終容量を1ｍLとする。
３．抗体溶液（Hytest）を加え、所望の濃度（〜0.05mg/mL）とする。
４．ローラーミキサー上で40分間インキュベートする。
５．13,200rpm、5分間、4℃で遠心分離する（必要に応じて上澄みからナノ粒子を取り出す）。
６．ペレットを1mLのブロッキング緩衝液（3％BSA）に再懸濁する。
７．ローラーミキサー上で40分間インキュベートする。
８．13,200rpm、5分間、4℃で遠心分離する（必要に応じて上澄みからナノ粒子を取り出す）。
９．ペレットを1mLの0.1M ホウ酸緩衝液（pH7.5）への再懸濁、スピンダウン（13,200rpm、5分間、4℃）（必要に応じて上澄みからナノ粒子を取り出す）により洗浄し、再度1mLの0.1M ホウ酸緩衝液（pH7.5）に懸濁する。
10．使用まで4℃で保管する。
【００６６】
〔電気的イムノアッセイ〕
１．第１の抗体溶液（10μg/mL in PBS）50μLでプレートをコートする。
２．4℃で一晩インキュベートする（プレートはシールする）。
３．200μLの洗浄緩衝液で3回洗浄する。
４．150μLのブロッキング緩衝液（Pierce #37536）を加え、振盪機上で30分間インキュベートする。
５．200μLの洗浄緩衝液で3回洗浄する。
６．検体を洗浄緩衝液に溶解した第１の濃度の（最も高い濃度の）検体を用意し、順次洗浄緩衝液で希釈する。
７．50μLの検体溶液を加え、振盪機上で30分間インキュベートする。
８．200μLの洗浄緩衝液で3回洗浄する。
９．銀ナノ粒子−抗体コンジュゲートを洗浄緩衝液で5倍に希釈し、ウェルに50μLずつ加える。振盪機上で1時間インキュベートする。
１０．200μLの洗浄緩衝液で3回洗浄する。
１１．4℃で一晩静置する（洗浄緩衝液なしでシールする）。
１２．50μLの1M NH4SCNを加え、ミキサー上で1時間振盪する。
１３．各ウェルからの溶液をカーボン塗布電極の表面に供給し、ASVを実行する。
【００６７】
ASVのステップは次の通りである。
ａ）ステップ：＋0.4V 10秒間（前処理）
ｂ）直線スイープ：0.0V→−1.6V
スキャンレート＝1V／秒  ステップ電位＝0.005V
ｃ）ステップ：−1.6V 5秒間（核生成）
ｄ）ステップ：−1.2Ｖ 55秒間（電気活性種の蓄積（還元））
ｅ）直線スイープ：−1.2V→＋0.1V（電気活性種の引き剥がし（酸化））
スキャンレート＝1V／秒 ステップ電位＝0.005V
（電気活性種の引き剥がし（酸化））
このスイープの間、ピーク電流が生じ、ピーク下面積（つまりクーロン        の数）は電気活性種の濃度に比例する。
【００６８】
電位は、基準電極を参照して計算される。基準電極は、通常はD2カーボンチオシアン酸アンモニウム基準電極である。
【００６９】
＜実施例１０＞
〔最大感度のアッセイのために供される、抗ミオグロビンHytest 4E2抗体量による、ミオグロビンのアッセイ〕
固相化抗体の濃度は、アッセイに大きな影響を与えない。感度は4E2抗体量を変化させても非常に良好であり、図１９に示すように、固相化抗体濃度を5, 10 及び 15 μg／mlのいずれにしても検量線は非常に近似する。しかし、固相化抗体濃度を高くし過ぎると、アッセイに負の影響を与える。これは、使用される抗体とそれが付着した表面の状態に大きく影響を受ける。約50ng／ｍLのミオグロビンでプラトーに達する感度が良好である。この感度は、伝統的なELISAをベースとした検体の酵素的検出と比較して、同等、もしくは良好な感度である。
【００７０】
荷電ユニットを有するチオールのようなリリース剤が固相検体−銀ナノ粒子複合体に添加される。リリース剤の至適な例としては、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウムが挙げられる。選択的に、チオスルホン酸も使用できる。他の薬剤と比してより効果的に銀と結合することから、チオールが好ましい。
【００７１】
チオールは抗体の結合力を弱めるため、銀ナノ粒子は複合体から解放される。また、荷電チオールは、銀ナノ粒子表面に層を形成し、粒子に電荷を与え、測定が行われる電極への粒子の移動を可能とする。測定はASVを用いて実行される。ASVは、電極表面上で金属相を予め濃縮し（前濃縮）、陽極の電位スイープの間に金属相種を選択的に酸化する分析的技術である。銀−チオール荷電ナノ粒子は、電気活性を有し、安定的である。電気活性を有する荷電ナノ粒子は、前濃縮ステップとして、電気化学的に電極上に固相化される。電極上に固相化された後、銀ナノ粒子は陽電位下で酸化されることにより、電気化学的に溶解される。イオンは、陰電位へ電位が反転されることにより、電極上に固相化される。銀相は電気化学的に電極から引き剥がされ（再び陽電位が与えられることによる）、強い銀のピークシグナルを発する。電極からはがされた銀イオンの量は、シグナルを提供するのに使用された銀ナノ粒子の数に相関し、銀ナノ粒子の数は、アッセイにおいて固相に捕捉された検体の数に相関する。
【００７２】
上記のような「サンドイッチ」または非競合的イムノアッセイの代わりに、競合的イムノアッセイやハプテンをベースとしたアッセイなど、他の形式を同様に使用して銀粒子を捕捉してもよい。このようなアッセイは広く知られている。
【００７３】
金属ナノ粒子は市販されており、公知の方法で結合成分にコンジュゲートすることができる。
【００７４】
結合成分は  検出する検体に結合するものであれば何でも使用できる。例えば、タンパク質、ペプチド、抗体またはその断片、核酸などである。
【００７５】
第１の結合成分は支持固体上に固定される必要はない。
【００７６】
＜実施例１１＞
実施例４に示す方法で（ヘキサシアノ鉄酸不存在下で）荷電銀ナノ粒子を準備した。ただし、リリース剤としては1M チオスルホン酸を使用した。銀ナノ粒子−チオスルホン酸種をASVによって測定した。
【００７７】
図２０に結果を示す。チオスルホン酸は本方法でリリース剤として適していることが示されている。
【００７８】
＜実施例１２＞
実施例１１と同様に、ただし、リリース剤として1M NaClを使用して実験を行った。図２１に示すように、NaClはリリース剤として適することを示す結果が得られた。
【００７９】
＜実施例１３＞
実施例１１と同様に、ただし、銀ナノ粒子の代わりに金ナノ粒子を使用して実験を行った。1M NaClをリリース剤として使用した。図２２に結果を示す。
【００８０】
＜実施例１４＞
実施例１３と同様に、ただし、リリース剤として1M チオシアン酸を使用して実験を行った。図２３に結果を示す。
【００８１】
＜比較例１５＞
荷電したリリース剤の不存在下で、金及び銀ナノ粒子に対してASVを実行した。図２４（金）及び２５（銀）は、ナノ粒子が荷電していないとピークが見られないことを示す。
【００８２】
他の例において、金ナノ粒子、銀ナノ粒子の両方を使用して、同一試料中の２つの異なる検体を検出ことができる。この場合、金ナノ粒子は第１の検体を認識する第１の結合成分に付着する。ASVによって、同一電極上で測定されるとき、金イオンと銀イオンは異なる判別可能なピークを示す。
【００８３】
キットが供給されてもよい。キットは、検体結合用の金属ラベル、検体に結合した金属を解放し、金属ラベルと荷電ナノ粒子を形成する少なくとも一つのリリース剤、金属ラベルを検体に結合するための少なくとも一つの領域を有する手段、及び少なくとも２つの電極を有する。選択的に、所望の検体に結合可能な、金属でラベルされた結合成分を有していてもよい。前記手段はマルチウェルプレートであってもよい。
【００８４】
本願が主張する優先権の基となるGB 0723137.6とGB 0812845.6、及び本願に添付する要約における開示内容は、引用として本願に包含される。
【図１】
2011504593.tif 000013
【図２】
2011504593.tif 000014
【図３】
2011504593.tif 000015
【図４】
2011504593.tif 000016
【図５】
2011504593.tif 000017
【図６】
2011504593.tif 000018
【図７】
2011504593.tif 000019
【図８】
2011504593.tif 000020
【図９】
2011504593.tif 000021
【図１０】
2011504593.tif 000022
【図１１】
2011504593.tif 000023
【図１２】
2011504593.tif 000024
【図１３】
2011504593.tif 000025
【図１４ａ】
2011504593.tif 000026
【図１４ｂ】
2011504593.tif 000027
【図１４ｃ】
2011504593.tif 000028
【図１４ｄ】
2011504593.tif 000029
【図１４ｅ】
2011504593.tif 000030
【図１４ｆ】
2011504593.tif 000031
【図１５】
2011504593.tif 000032
【図１６】
2011504593.tif 000033
【図１７】
2011504593.tif 000034
【図１８】
2011504593.tif 000035
【図１９】
2011504593.tif 000036
【図２０】
2011504593.tif 000037
【図２１】
2011504593.tif 000038
【図２２】
2011504593.tif 000039
【図２３】
2011504593.tif 000040
【図２４】
2011504593.tif 000041
【図２５】
2011504593.tif 000042
【国際調査報告】
2011504593.tif 000043
2011504593.tif 000044
2011504593.tif 000045