(57)【要約】  本発明は、受容体結合性リガンドを、該リガンド、および該受容体に対する別のリガンド（第１のリガンドの第２のコピー、または第２の異なるリガンド）、受容体自身、またはその両者のいずれかと非共有的に結合する、小分子（すなわち、ペプチドでない有機分子）またはペプチドであり得る有機分子と接触させるステップ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を特徴とする。例示的なリガンド／受容体のペアとしては、ＦＧＦ−２／ＦＧＦ−Ｒ１およびＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒが挙げられる。本発明はさらに、種々の臨床状態を治療するための医薬組成物およびそのような組成物の使用方法も特徴とする。【選択図】図１８
2011513206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞性受容体への第１のリガンドの結合を増強する方法であって、該リガンドを、該第１のリガンドに非共有的に結合し、かつ（ｉ）該受容体に対する第２のリガンドまたは（ｉｉ）該受容体のいずれかと非共有的に結合する外因性の有機分子と接触させ、それにより該受容体への該第１のリガンドの結合を増強させるステップを含む、上記方法。
【請求項２】
前記接触ステップをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触ステップがｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有機分子がペプチドでない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有機分子が１５０〜５，０００の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１のリガンドが、ペプチド（３０アミノ酸以下）、ポリペプチド（３１〜１００アミノ酸）、またはタンパク質（１００アミノ酸超）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有機分子が前記受容体に対する前記第２のリガンドと非共有的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記有機分子が前記受容体と非共有的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記有機分子が前記第２のリガンドおよび前記受容体と非共有的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機分子が２分子の前記受容体と非共有的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のリガンドがＦＧＦ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のリガンドがＥＰＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、およびＡｌａ−１３６のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＧｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＰｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機分子が、２分子のＥＰＯのそれぞれの、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機分子が、ＥＰＯ−ＲのＴｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８のうちの１箇所；ならびにＥＰＯのＡｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）細胞性受容体に対する第１のリガンドならびに／または（ｂ）該リガンドおよび（ｉ）該受容体に対する第２のリガンドもしくは（ｉｉ）該受容体に非共有的に結合して該受容体への該第１のリガンドの結合を増強する有機分子、ならびに（ｃ）製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
第１のリガンドがＦＧＦ−２またはＥＰＯである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、およびＡｌａ−１３６のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＧｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＰｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記有機分子が、２分子のＥＰＯのそれぞれの、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記有機分子が、ＥＰＯ−ＲのＴｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８のうちの１箇所；ならびにＥＰＯのＡｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
４つの非共有的に結合したＥＰＯ分子を含む四量体であって、各ＥＰＯ分子が２つの他のＥＰＯ分子と非共有的に結合している、上記四量体。
【請求項２４】
２以上のＥＰＯ分子間の非共有結合の形成を安定化する２つの外因性有機分子をさらに含む、請求項２３に記載の四量体。
【請求項２５】
２分子のＥＰＯが、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７を介して非共有的に結合している、請求項２３に記載の四量体。
【請求項２６】
前記有機分子のそれぞれが、２分子のＥＰＯのそれぞれのＡｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７と非共有的に結合する、請求項２４に記載の四量体。
【請求項２７】
製薬上有効量の図３、４、１２または１３の化合物を、製薬上許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項２８】
ヒト患者の臨床状態を治療する方法であって、細胞性受容体に対する第１のリガンドに非共有的に結合し、かつ（ｉ）該受容体に対する第２のリガンドまたは（ｉｉ）該受容体と非共有的に結合することにより該受容体への該第１のリガンドの結合を増強する有機化合物を、該臨床状態を治療するのに十分な量で該患者に投与し、それにより該臨床状態を治療するステップを含む、上記方法。
【請求項２９】
前記第１のリガンドがＦＧＦ−２またはＥＰＯである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記臨床状態が貧血である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が脳血管疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記脳血管疾患が卒中である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患が心血管疾患または末梢血管疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記有機分子が前記受容体に対する前記第２のリガンドと非共有的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記有機分子が前記受容体と非共有的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記有機分子が前記第２のリガンドおよび前記受容体と非共有的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記有機分子が２分子の前記受容体と非共有的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、およびＡｌａ−１３６のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＧｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２のうちの１箇所；およびＦＧＦ−Ｒ１のＰｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記有機分子が、２分子のＥＰＯのそれぞれの、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記有機分子が、ＥＰＯ−ＲのＴｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８のうちの１箇所；ならびにＥＰＯのＡｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞性受容体への第１のリガンドの結合を増強する有機分子を特定する方法であって、該有機分子が、該第１のリガンド、および（ｉ）該受容体に対する第２のリガンドまたは（ｉｉ）該受容体と非共有的に結合することにより、該受容体への該第１のリガンドの結合の増強をもたらすか否かをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定するステップを含む、上記方法。
【請求項４３】
前記有機分子が化学的特性および物理的特性に基づいてライブラリから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化学的特性および物理的特性が、以下：水素結合ドナーの存在、水素結合アクセプターの存在、分子量、元素組成、溶解度、反応性、安定性、毒性、および親油性のうちの１以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のリガンドがＦＧＦ−２またはＥＰＯである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機分子が、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｂ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、およびＣａより選択される元素のみを含有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記有機分子が前記受容体に対する前記第２のリガンドと非共有的に結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記有機分子が前記受容体に非共有的に結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記有機分子が前記第２のリガンドおよび前記受容体に非共有的に結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記有機分子が２分子の前記受容体と非共有的に結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、およびＡｌａ−１３６のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＧｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記有機分子が、ＦＧＦ−２のＡｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２のうちの１箇所；ならびにＦＧＦ−Ｒ１のＰｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記有機分子が、２分子のＥＰＯのそれぞれの、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記有機分子が、ＥＰＯ−ＲのＴｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８のうちの１箇所；ならびにＥＰＯのＡｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４のうちの１箇所と非共有的に結合する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体結合性リガンドを、該リガンド、および該受容体に対する別のリガンド（第１のリガンドの第２のコピー、または第２の異なるリガンド）、受容体自身、またはその両者のいずれかと非共有的に結合する、小分子（すなわち、ペプチドでない有機分子）またはペプチドであり得る有機分子と接触させるステップ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を特徴とする。例示的なリガンド／受容体のペアとしては、ＦＧＦ−２／ＦＧＦ−Ｒ１およびＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒが挙げられる。本発明はさらに、種々の臨床状態を治療するための医薬組成物およびそのような組成物の使用方法も特徴とする。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年１月４日提出の米国仮出願第６１／０１０，００７号（参照により本明細書中に組み入れられる）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
多くのリガンドが二量体としてその受容体に結合する。その例には、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および成長ホルモン（ＧＨ）が含まれる。一部の例では、共有結合によって単量体を共に連結して二量体を形成させると、受容体に対するリガンド結合が増強され、その結果としてのシグナル伝達が増強されることが示されている。いくつかの特許出願は、そのような共有結合によって連結されたリガンド二量体を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の要旨
リガンド単量体同士が共有的に結合している、増強された結合性の二量体化リガンドを作製するのではなく、発明者らは、有機分子と１以上のリガンド単量体および、一部の例では、受容体自身を含む、受容体媒介性細胞プロセスに関与する別の分子との間の非共有結合の形成、例えばファンデルワールス力または静電相互作用によって、増強された受容体結合性を生じさせる。有機分子−リガンド相互作用の結果、リガンド／受容体「オンタイム（on time）」が増加し、シグナル伝達が増強され、生物学的／治療的活性が増加する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、概して、本発明は、受容体結合性リガンドを、該リガンド、および該受容体に対する別のリガンド（第１のリガンドの第２のコピー、または第２の異なるリガンド）、受容体自身、またはその両者のいずれかと非共有的に結合する、小分子（すなわちペプチドでない有機分子）またはペプチドであり得る有機分子と接触させるステップ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を特徴とする。
【０００６】
本発明の一態様では、それは、細胞性受容体への第１のリガンドの結合を増強する方法であって、該第１のリガンドを、第１のリガンドに非共有的に結合し、かつ（ｉ）該受容体に対する第２のリガンド（第１のリガンドと同じであってもなくてもよい）または（ｉｉ）受容体自身のいずれかと非共有的に結合する外因性の有機分子と接触させることによる方法を特徴とする。前記接触ステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで行うことができる。
【０００７】
関連する態様では、本発明は、ヒト患者の臨床状態を治療する方法であって、細胞性受容体に対する第１のリガンドに非共有的に結合し、かつ（ｉ）該受容体に対する第２のリガンド（第１のリガンドと同じであってもなくてもよい）または（ｉｉ）受容体自身のいずれかと非共有的に結合することにより該受容体への該第１のリガンドの結合を増強する有機化合物を、該臨床状態を治療するのに十分な量で該患者に投与することによる方法を特徴とする。典型的な臨床状態には、脳血管疾患、末梢血管疾患、および心血管疾患ならびに貧血が含まれる。
【０００８】
さらに、本発明は、細胞性受容体への第１のリガンドの結合を増強する有機分子を特定する方法であって、該有機分子が、該第１のリガンド、および（ｉ）該受容体に対する第２のリガンド（第１のリガンドと同じであってもなくてもよい）または（ｉｉ）受容体自身のいずれかと非共有的に結合することにより、該受容体への該第１のリガンドの結合の増強をもたらすか否かをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定することによる方法を特徴とする。この方法では、該有機分子を、水素結合ドナーの存在、水素結合アクセプターの存在、分子量、元素組成、溶解度、反応性、安定性、毒性、および親油性のうちの１以上などの化学的特性および物理的特性に基づいてライブラリーから選択してよい。該有機分子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｂ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、およびＣａより選択される元素のみを含有してもよい。
【０００９】
前記有機分子を使用して、患者に投与するためのリガンド含有複合体を製造することができ、または、より好ましくは、それらを患者に（好ましくは経口で）投与して、投与後に該患者の体内で例えばＦＧＦ−２またはＥＰＯの非共有的結合が生じるようにすることができる。したがって、本発明は、細胞性受容体に対する第１のリガンドならびに／または該第１のリガンドおよび（ｉ）該受容体に対する第２のリガンド（第１のリガンドと同じであってもなくてもよい）または（ｉｉ）受容体自身のいずれかと非共有的に結合して該受容体への該第１のリガンドの結合を増強する有機分子；および（ｃ）製薬上許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。さらに、本発明は、製薬上有効量の図３、４、１２、または１３の化合物を、製薬上許容される担体と共に含む医薬組成物を特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、各ＥＰＯ分子が２つの他のＥＰＯ分子と非共有的に結合している４つのＥＰＯ分子の四量体を特徴とする。該四量体は、２以上のＥＰＯ分子間の非共有結合の形成を安定化する２つの外因性有機分子をさらに含んでよい。２セットの２分子のＥＰＯは、好ましくは、Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、および／またはＡｒｇ−１６７を介して非共有的に結合している。該四量体中に存在する任意の外因性有機分子は、２分子のＥＰＯのそれぞれの１以上の前記残基と非共有的に結合して、２つのＥＰＯ分子の結合を増強することができる。
【００１１】
第１のリガンドは、例えば、ペプチド（３０アミノ酸未満）、ポリペプチド（３１〜１００アミノ酸の範囲）、またはタンパク質（１００アミノ酸を超える）である。好ましい実施形態では、第１のリガンドはＦＧＦ−２またはＥＰＯであり、かつ受容体はＦＧＦ−Ｒ１またはＥＰＯ−Ｒである。２以上のリガンド群および／またはリガンドおよびその受容体の間の典型的な相互作用部位には、（ｉ）ＦＧＦ−２のＡｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、およびＡｌａ−１３６；およびＦＧＦ−Ｒ１のＧｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９；（ｉｉ）ＦＧＦ−２のＡｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２；およびＦＧＦ−Ｒ１のＰｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１；（ｉｉｉ）２分子のＥＰＯのそれぞれのＡｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７；（ｉｖ）ＥＰＯ−ＲのＴｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８；およびＥＰＯのＡｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４が含まれる。本発明の有機分子は、好ましくは、リガンド群および／またはリガンドおよび受容体のそれぞれの少なくとも１つの前記残基と結合する。他の実施形態では、該有機分子は、２つのリガンド群またはリガンドおよび受容体の間の少なくとも２、３、４、５またはそれ以上の残基と結合する。有機分子は同様に受容体の複数の分子と結合してもよい。理解されるように、被験体間の生物学的多様性（biological variability）は、上記で特定される残基の１つの不存在または上記で特定される残基の１つへの変化を生じさせるかもしれない。本発明は、すべての生物学的形式のＦＧＦ−２およびＥＰＯの受容体結合を増強するための有機分子の使用を包含する。
【００１２】
特定の実施形態では、該有機分子は、該有機分子の不存在下でのオフレート（off-rate）と比較してリガンド／受容体結合のオフレートを２、５、１０、１００倍、またはそれ以上低下させる。あるいは、またはさらに、該有機分子はリガンドおよび／または受容体に５〜２００ｋＪ／ｍｏｌの強度で結合する。他の実施形態では、該有機分子はペプチドではなく、１５０〜５，０００の範囲の分子量を有する。
【００１３】
他の特徴および利点は以下の説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＦＧＦ−２／ＦＧＦ−Ｒ１部位Ｉの描写である；有機分子はこの部位で２つのＦＧＦ−２リガンドおよび２つのＦＧＦ−Ｒ１受容体分子に同時に結合することができる。
【図２】図２は、ＦＧＦ−２／ＦＧＦ−Ｒ１部位ＩＩの描写である；有機分子はこの部位で２つのＦＧＦ−２リガンドおよび２つのＦＧＦ−Ｒ１受容体分子に同時に結合することができる。
【図３−１】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図３−２】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図３−３】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図３−４】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図３−５】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図３−６】図３は、図１の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図４】図４は、図２の部位ＩＩに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図５】図５は、図１の部位Ｉに結合する有機分子の描写である。図に示されるように、該分子は一般的な構造上の特徴を共有する。
【図６】図６は、図２の部位ＩＩに結合する有機分子の描写である。図に示されるように、該分子は一般的な構造上の特徴を共有する。
【図７】図７は、図１の部位Ｉに結合している代表的な分子の描写である。
【図８】図８は、図２の部位ＩＩに結合している代表的な分子の描写である。
【図９】図９は、ＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒ部位Ｉの描写である；有機分子は２つのＥＰＯ分子に同時に結合することができる。
【図１０】図１０は、ＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒ部位ＩＩの描写である；有機分子は１つのＥＰＯ分子および２つのＥＰＯ−Ｒ受容体分子に同時に結合することができる。
【図１１】図１１は、ＥＰＯの非共有結合性四量体の描写である。
【図１２−１】図１２は、図９の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図１２−２】図１２は、図９の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図１２−３】図１２は、図９の部位Ｉに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図１３】図１３は、図１０の部位ＩＩに結合可能であるとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで特定された有機分子の表である。
【図１４】図１４は、図９の部位Ｉに結合する有機分子の描写である。図に示されるように、該分子は一般的な構造上の特徴を共有する。
【図１５】図１５は、図１０の部位ＩＩに結合する有機分子の描写である。図に示されるように、該分子は一般的な構造上の特徴を共有する。
【図１６】図１６は、図９の部位Ｉに結合している代表的な分子の描写である。
【図１７】図１７は、図１０の部位ＩＩに結合している代表的な分子の描写である。
【図１８】図１８は、漸増濃度のヘパリンの存在下でのＦＧＦ−２活性の増加を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
概して、本発明は、有機分子が、受容体へのリガンドの結合を増強する方法および組成物を提供する。例えば、複数のリガンド（同一または異なるリガンド）に非共有的に結合して二量体またはより大きいポリマー、例えば四量体を形成させる有機分子によって、またはリガンド（または複数のリガンド）および受容体（または複数の受容体）に非共有的に結合する有機分子によって、増強が生じる。これらのタイプの非共有結合性相互作用の組み合わせも本発明に含まれる。
【００１６】
特定のリガンドに結合する有機分子（本明細書中で化合物と称されることもある）の能力は、本明細書中に記載の手順およびアッセイを使用して決定することができる。本明細書中に記載の多数の個々の化合物および化合物クラスは広範に研究されており、化合物は、商業的に購入するか、または有機化学の技術分野において周知の手順を使用して合成することができる。本発明の有機分子はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計することもできる。化合物が２つのリガンド分子群および／またはリガンドおよびその受容体の界面の部位に結合するように該化合物を選択または設計する。本発明の化合物を選択または設計するためのいくつかの方法が存在することを当業者は認識する。例えば、ＵＳ２００６／０１９４８２１を参照されたい。この設計または選択は、界面の結合部位を占める種々の部分の選択で開始することができる。
【００１７】
個々の界面の結合部位を占める部分を選択するためのいくつかの方法が存在する。これらの方法には、活性部位の物理モデルまたはコンピュータモデルの目視検査および選択された部分のモデルの、種々の結合部位へのマニュアルドッキングが含まれる。当技術分野において周知でかつ利用可能なモデリングソフトウェアを使用してもよい。これらのソフトウェアには、ＱＵＡＮＴＡ（Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.）、およびＳＹＢＹＬ（Molecular Modeling Software, Tripos Associates, Inc., St. Louis, Mo.）が含まれる。このモデリングステップ後、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲ（ＡＭＢＥＲ：Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. 106:765 (1984)；ＣＨＡＲＭＭ：Brooks, et al., Comp. Chem. 4:187 (1983)）などの標準分子力学の力場でのエネルギー最小化を行うことができる。
【００１８】
さらに、完全分子または分子断片を結合部位に最適に配置するプロセスを補助するためのいくつかの、より特殊化されたコンピュータプログラムが存在する。これらのソフトウェアには、ＧＲＩＤ（Goodford, J. Med. Chem. 28:849-857 (1985), Oxford University, Oxford, UKから入手可能）；ＭＣＳＳ（Miranker, et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 11, 29-34 (1991), Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手可能）；およびＤＯＣＫ（Kuntz, et al., J. Mol. Biol. 161:269-288 (1982), ＤＯＣＫはthe University of California, San Francisco, Calif.から入手可能である）が含まれる。
【００１９】
好適な結合配向が選択されたら、生物学的評価のために完全分子を選択することができる。分子断片の場合、それらを化合物に組み立てることができる。この組み立ては、種々の部分を中心骨格に連結することによって達成することができる。組み立てプロセスは、例えば、目視検査およびその後の、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙ１などのソフトウェアをやはり使用するモデル構築によって行うことができる。いくつかの他のプログラムを使用して、種々の断片を連結する方法の選択を支援してもよい。これらのプログラムには、ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett, et al. In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc. 78: 182-196 (1989)）、３Ｄデータベース系、例えばＭＡＣＣＳ−３Ｄ（MDL Information Systems, San Leandro, Calif.、Ｍａｒｔｉｎ（J. Med. Chem. 35: 2145 (1992)）、およびＨＯＯＫ（Molecular Simulations, Burlington, Mass.）が含まれる。
【００２０】
上記のコンピュータ支援化合物モデリングに加えて、空の活性部位を使用して本発明の化合物を「新規」構築することができる。そのような方法は当技術分野において周知である。該方法には、例えば、ＬＵＤＩ（Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design. 6:61-78 (1992), ＬＵＤＩはBiosym Technologies, San Diego, Calif.から入手可能である）、ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata, Tetrahedron 47:8985 (1991), ＬＥＧＥＮＤはMolecular Simulations, Burlington, Mass.から入手可能である）、およびＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos Associates, St. Louis, Mo.から入手可能）が含まれる。薬物のモデリングに一般に使用されるいくつかの技術を使用することができる（例えば、Cohen, et al., J. Med. Chem. 33:883 (1990); Navia, et al., Current Opinions in Structural Biology 2:202 (1992); Baldwin, et al., (J. Med. Chem. 32:2510 (1989); Appelt, et al., J. Med. Chem. 34:1925 (1991); およびEalick, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 11540 (1991)）。
【００２１】
種々の慣用の技術を使用して、上記評価ならびにリガンド−受容体結合を増強する活性に関する候補化合物のスクリーニングに必要な評価のそれぞれを実行することができる。一般に、これらの技術は、所定の部分の位置および結合近接性（binding proximity）、結合化合物の占有スペース、化合物とリガンド／受容体との間の相補的（complementary）接触面の量、受容体への化合物の結合において生成する変形エネルギーの概算、および化合物／受容体結合によって生じる水素結合強度および／または静電相互作用エネルギーの概算を測定することを含む。上記評価に有用な公知の学問分野の例には、量子力学、分子力学、分子動力学、モンテカルロサンプリング（Monte Carlo sampling）、システマティックサーチ（systematic searches）、およびディスタンス・ジオメトリー法（distance geometry methods）（Marshall, Ann. Rev: Pharmacol. Toxicol. 27:193 (1987)）が含まれる。上記特性に関する化合物のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングで使用するためのコンピュータソフトウェアが開発されている。その例には、Ｇａｕｓｓｉａｎ（M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.,）；ＡＭＢＥＲ；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.）；Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif.）；およびＧＬＩＤＥを含むSchrodinger First Discovery Suite（Schrodinger, Inc., Portland, OR）が含まれる。
【００２２】
本発明では、異なるクラスの化合物を、リガンド−リガンドおよび／またはリガンド−受容体結合部位の種々の結合領域と同様に相互作用させることができる。本発明の異なるクラスの化合物は異なる骨格またはコア構造を使用してもよく、任意の該異なる骨格またはコア構造は、結合に必要な特異的相互作用が達成されるように必要な部分が結合部位中に配置されることを可能にする。
【００２３】
以下、２つの生物活性タンパク質、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）に関して、非共有結合性相互作用によってリガンド−受容体結合を増強する有機分子を特定して使用するプロセスを例証する。
【００２４】
ＦＧＦ−２
ＦＧＦ−２／ＦＧＦ−２受容体（ＦＧＦ−Ｒ１）複合体の分子モデルを、この複合体の公開されている結晶構造に基づいて構築した（図１および２）（pdb code 1FQ9; Schlessinger et al. Mol.Cell 6: 743-750 (2000)）。これらのモデルは、受容体に結合している場合のＦＧＦ−２単量体のごく近位を示し、有機分子が結合する２つの部位が特定された。部位Ｉ（図１）では、有機分子が結合する以下のアミノ酸：ＦＧＦ−２の：Ａｓｎ−２７、Ａｒｇ−１２０、Ｔｈｒ−１２１、Ｌｙｓ−１２５、Ｌｙｓ−１２９、Ｇｌｎ−１３４、Ｌｙｓ−１３５、Ａｌａ−１３６；ならびにＦＧＦ−Ｒ１の：Ｇｌｕ−１５９、Ｌｙｓ−１６０、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７２、Ｔｈｒ−１７３、Ｐｈｅ−１７６、Ｌｙｓ−１７７、Ｌｙｓ−２０７、Ｖａｌ−２０８、Ａｒｇ−２０９、Ｔｈｒ−２１２、Ｉｌｅ−２１６、Ｍｅｔ−２１７、Ａｓｐ−２１８、およびＳｅｒ−２１９を特定した。本発明の有機分子は、好ましくは、各ＦＧＦ−２分子およびＦＧＦ−Ｒ１分子の前記残基の少なくとも１つに非共有的に結合する。図１に示されるように、有機分子は２分子のＦＧＦ−２および２分子のＦＧＦ−Ｒ１に同時に結合することができる。
【００２５】
部位ＩＩ（図２）では、有機分子が結合する以下のアミノ酸：ＦＧＦ−２の：Ａｒｇ−９７、Ｌｅｕ−９８、Ｇｌｕ−９９、Ｓｅｒ−１００、Ａｓｎ−１０１、およびＡｓｎ−１０２；ならびにＦＧＦ−Ｒ１の：Ｐｒｏ−１６９、Ａｌａ−１７０、Ａｌａ−１７１、Ａｓｐ−２１７、Ｓｅｒ−２１８、Ｖａｌ−２１９、Ｖａｌ−２２０、Ｐｒｏ−２２１、Ｓｅｒ−２２２、Ａｓｐ−２２３、Ｖａｌ−２４８、Ｇｌｕ−２４９、Ａｒｇ−２５０、およびＳｅｒ−２５１を特定した。本発明の有機分子は、好ましくは、各ＦＧＦ−２分子およびＦＧＦ−Ｒ１分子の前記残基の少なくとも１つに非共有的に結合する。図２に示されるように、有機分子は２分子のＦＧＦ−２および２分子のＦＧＦ−Ｒ１に同時に結合することができる。
【００２６】
受容体へのＦＧＦ−２の結合を増強する有機分子を特定するための典型的な方法は以下の通りである。ＲｅｄＨａｔ Ｌｉｎｕｘ（Fedora Version 7）が起動している３．２ＧｈｚのＰＣですべての計算を行った。発明者らは、有機分子の初期特定に表１に列挙されるライブラリを用いた。発明者らは、「Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ」（Adv Drug Del Rev 23: 3-25 (1997)）を満たす分子に関して選択するための、特性に基づくフィルタリングを使用したが、元のＬｉｐｉｎｓｋｉ値と比較して緩やかな閾値（水素結合ドナー≧５；水素結合アクセプター≧１０；１００≧分子量≧８００；ＣｌｏｇＰ≧７）を用いて、浪費される化合物を最小にした。Ｌｉｐｉｎｓｋｉルールでのフィルタリング後、ライブラリーをさらにフィルタリングして、重金属を含有する化合物を除去し；Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｂ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、およびＣａより選択される元素を有する化合物のみをさらなるプロセシングのために保持した。フィルタリングされたサブセットをSchrodinger First Discovery Tool（Schrodinger Inc.）のｌｉｇｐｒｅｐモジュールで処理し、対イオンを除去し、電荷状態を調節し、適用可能な場合にはいつでも互変異性体を作製した。ｂｍｉｎモジュールを使用して、各データベース中のすべての化合物に関するエネルギー最小化構造を生成した。
【表１】
2011513206.tif 000003
【００２７】
最終データベースをｍａｅｓｔｒｏ（Schrodinger Inc.の独自形式）で保存した。ＦＧＦ−２と複合体形成したＦＧＦ−Ｒ１受容体構造（1evt.pdb）に水素原子を付加し、エネルギーを最小化した。ドッキング計算の格子の作製のための質量の中心として残基１７９を選択した。
【００２８】
プログラムＧｌｉｄｅ（Schrodinger First Discovery Suiteの一部分）をドッキングに使用した。デフォルトＧｌｉｄｅパラメータを使用して第１のメインドッキング作業を行った。最初のラウンドのドッキング計算のためにデータベースあたりｇｌｉｄｅｓｃｏｒｅによって分類された最大５０００分子を要求した。第１ラウンドのドッキングから得られたコレクションを組み合わせてトータルで３２，２１４分子を得た。これらの分子を「高精度（extra-precision）」モードのＧＬＩＤＥで再びドッキングした。該モードでは、荷電基および強い極性基が溶媒に適切に露出されることなどの確立された原理に違反する複合体に厳格なペナルティを要求する。このラウンドのドッキングで最大５００ポーズを要求した。計算を容易にするために、ｐａｒａｇｌｉｄｅユーティリティーを使用してメイン作業をサブ作業に分割して、デュアルコアプロセッサコンピュータでのパラレルプロセシングを可能にした。
【００２９】
この方法によって特定された化合物を部位Ｉに関して図３に示し、部位ＩＩに関して図４に示す。部位Ｉおよび部位ＩＩでの複数の化合物のドッキングされた構造を図５および図６に示す。図に示されるように、有機分子は、受容体および両側の２分子のＦＧＦ−２と広範囲にわたって接触する。図７は、代表的な化合物の、部位ＩでのＦＧＦ−２およびＦＧＦ−Ｒ１との水素結合形成を示し、図８は、代表的な化合物の、部位ＩＩでのＦＧＦ−２およびＦＧＦ−Ｒ１との水素結合形成を示す。
【００３０】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏまたは他の方法によって特定された有機分子を、例えば最大下濃度のＦＧＦ−２の存在下で、ＦＧＦ−２受容体シグナル伝達のアップレギュレーションを検査するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでさらにスクリーニングすることができる。典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを下に挙げる。このアッセイによって特定された候補を、特定の疾患のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、例えばげっ歯類の機能的卒中回復に進めることができる。
【００３１】
ＥＰＯ
同様のストラテジーを適用して、ＥＰＯとＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）との間の結合を増強する有機分子を特定した。ＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒ複合体の分子モデルを、この複合体の公開されている結晶構造および共有結合性二量体からの実験結果に基づいて構築した（図９および１０）（pdb code 1EER; Syed et al. Nature 395: 511-516 (1998)）。これらのモデルによって有機分子に関する２つの結合部位が特定された。さらに、発明者らは、ＥＰＯが非共有結合性二量体を形成できる２つの領域を特定した。これらの両領域で同時に二量体化すると、非共有結合性ＥＰＯ四量体が形成される（図１１）。部位Ｉに結合する有機分子は、２つのＥＰＯ分子にそのＮ−Ｃ末端で同時に結合することによって二量体／四量体形成を促す。部位Ｉ（図９）では、有機分子が結合する以下のアミノ酸：Ａｌａ−１、Ｐｒｏ−２、Ｐｒｏ−３、Ａｒｇ−４、Ｌｅｕ−５、Ｉｌｅ−６、Ｃｙｓ−７、Ａｓｐ−８、Ｃｙｓ−１６１、Ａｒｇ−１６２、Ｔｈｒ−１６３、Ｇｌｙ−１６４、Ａｓｐ−１６６、およびＡｒｇ−１６７を特定した。本発明の有機分子は、好ましくは、２つのＥＰＯ分子のそれぞれの前記残基の少なくとも１つに非共有的に結合する。図９に示されるように、四量体が形成される場合、２つの有機分子はそれぞれ、２分子のＥＰＯに同時に結合することができる。
【００３２】
部位ＩＩ（図１０）では、有機分子が結合する以下のアミノ酸：ＥＰＯの：Ａｓｐ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１０、Ｖａｌ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１３、Ａｒｇ−１４、Ｔｙｒ−１５、Ｌｅｕ−１６、Ｌｅｕ−１７、Ｇｌｕ−１８、Ａｌａ−１９、Ｌｙｓ−２０、Ｇｌｕ−２１、Ａｌａ−２２、Ｇｌｕ−２３、およびＬｙｓ−２４；ならびにＥＰＯ−Ｒの：Ｔｈｒ−１４８、Ｐｒｏ−１４９、Ｍｅｔ−１５０、Ｔｈｒ−１５１、Ｓｅｒ−１５２、Ｈｉｓ−１５３、Ａｒｇ−１５４、Ｌｅｕ−１７５、Ｇｌｕ−１７６、Ｇｌｙ−１７７、およびＡｒｇ−１７８を特定した。本発明の有機分子は、好ましくは、各ＥＰＯ分子およびＥＰＯ−Ｒの前記残基の少なくとも１つに非共有的に結合する。図１０に示されるように、有機分子は１分子のＥＰＯおよび２つのＥＰＯ−Ｒ分子に同時に結合することができる。
【００３３】
この方法によって特定された化合物を部位Ｉに関して図１２に示し、部位ＩＩに関して図１３に示す。部位Ｉおよび部位ＩＩでの複数の化合物のドッキングされた構造を図１４および図１５に示す。図に示されるように、有機分子は部位Ｉで２分子のＥＰＯと広範囲にわたって接触し、部位ＩＩでＥＰＯおよび２つのＥＰＯ−Ｒ分子と広範囲にわたって接触する。図１６は、代表的な化合物の、部位Ｉでの２つのＥＰＯ分子との水素結合形成を示し、図１７は、代表的な化合物の、部位ＩＩでのＥＰＯおよび２つのＥＰＯ−Ｒ分子との水素結合形成を示す。
【００３４】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏまたは他の方法によって特定された有機分子を、例えば最大下濃度のＥＰＯの存在下で、ＥＰＯ受容体シグナル伝達のアップレギュレーションを検査するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでさらにスクリーニングすることができる。このアッセイによって特定された候補を、特定の疾患、例えば貧血のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイに進めることができる。
【００３５】
治療方法
本発明の有機分子は、一般に、例えばＦＧＦ−２およびＥＰＯに関する、受容体オンタイムの増加（およびゆえにオフタイムの減少）が所望である任意の治療的使用に好適である。有機分子は、典型的に、タンパク質リガンド、例えばＦＧＦ−２またはＥＰＯより容易に患者に投与することができる。したがって、本発明の有機分子の投与は、受容体へのリガンドの結合を増強することによるリガンド−受容体複合体の活性のアップレギュレーションのための代替経路を提供する。
【００３６】
有機分子の供給源は当技術分野において周知であり、それには、新規合成、天然に存在する化合物の単離または改変、およびライブラリからの選択が含まれる。適切な有機分子の典型的な薬物様特性も周知である。本明細書中に記載のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用して具体的化合物を特定することができる。
【００３７】
原理的に、リガンドとその受容体との間の結合の増強によって影響を受ける任意の医学的障害を本発明の方法によって治療することができる。ＦＧＦ−２は心血管疾患、脳血管疾患、および末梢血管疾患において有益な効果を有し、卒中後の機能的回復の増強が含まれる。受容体結合の増強によるＦＧＦ−２の活性の増加は、ゆえに、卒中回復を含む心血管疾患、脳血管疾患、および末梢血管疾患の治療を提供する。ＥＰＯは、いくつかの原因のいずれかを有する貧血を治療するために投与され、該原因には、慢性腎不全（透析を伴うか伴わないかにかかわらない）；ＨＩＶ（例えばジドブジン治療患者）；および癌の化学療法による治療が含まれる。また、ＥＰＯは外科手術を受けている貧血患者に投与される。ＥＰＯおよび／またはその受容体に結合する本発明の有機分子を用いて、これらの適応のすべてに関して内因性または外因性ＥＰＯの活性を増加させることができる。
【００３８】
本発明の有機分子を、例えば同一部位を標的とする２以上の有機分子として、または異なる部位を標的とする２以上の有機分子として（例えばＦＧＦ−２およびＥＰＯに関する部位ＩおよびＩＩ）、互いに組み合わせて用いてもよい。特定の症状に関する他の治療法を伴うかまたは伴わずに有機分子を投与してもよい。特に、ＦＧＦ−２またはＥＰＯの部位ＩまたはＩＩに結合する有機分子を、それぞれ外因性ＦＧＦ−２またはＥＰＯと共に投与するか、またはＦＧＦ−２またはＥＰＯ投与の２時間以内に投与することができる。
【００３９】
特定の有機化合物に関する用量、タイミング、および投与経路は、標準的技術を使用して、治療法、具体的疾患、および患者の特性に基づいて当業者によって決定される。また、適切な製薬上許容される担体は当技術分野において周知である。
【００４０】
ＦＧＦ−２シグナル伝達のアップレギュレーションに関する典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
発明者らは、ＦＧＦ−２に応答する細胞に関する分裂促進アッセイを開発した。該アッセイは最大下濃度のＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で実施される。ヘパリンは、ＦＧＦ−２活性の公知の増強剤である。漸増濃度のヘパリンに伴ってＦＧＦ−２活性が増大するからである（図１８）。これらの結果を表９で定量化する。１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２の存在下での７２時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのヘパリンを加えると分裂促進活性が５８％増大した。
【００４１】
本発明の有機化合物を、このアッセイを使用してＦＧＦ−２の増殖刺激に対するその効果に関してアッセイすることができる。本発明の有機分子を投与した場合に増殖量が増大すれば、それが治療物質としての開発の候補化合物であることを示す。例えば、「ヒット」は、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２の存在下（ヘパリン無添加）での、５０％超の活性の増加として定義することができる。  
アッセイの詳細は以下の通りである。
【００４２】
ヘパリン対照試験
Ａ．  細胞プレーティング
１．  細胞をトリプシン処理する。細胞計数および生存度のために細胞懸濁液の少量のアリコートを取り出す。  
２．  セロメーター（Cellometer）を使用して細胞をカウントし、細胞生存度を測定する。  
２．１  細胞計数：７．５７×１０５細胞／ｍＬ
２．２  総細胞：７．５７×１０５細胞／ｍＬ×細胞懸濁液１１．５ｍＬ＝８．７１×１０６細胞
２．３  生存度：９８．６％
２．４  総細胞：８．７１×１０６×０．９８６＝８．５９×１０６生存細胞
３．  トリプシン／トリプシン中和剤／細胞懸濁液を２５０×ｇで６分間遠心分離して細胞をペレットにする。上清を吸引する。  
３．１  細胞ペレットを再懸濁するために使用するＤＭＥＭ／１０％ ＢＣＳ／１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（培地）の容量を決定する：８，５９０，０００細胞／６２，５００細胞／ｍＬ＝培地１３７ｍＬ。  
３．２  必要であれば、３．１の結果を１０で除算することによって１０×希釈を作製する：培地１３７ｍＬ／１０＝１３．７ｍＬ。そして、３ｍＬの１０×細胞懸濁液を２７ｍＬの培地に加える。  
４．  ８０μＬの細胞懸濁液を３つの９６ウェル組織培養処理プレートの適切なウェルに移す。  
５．  プレートを３７℃／５％ ＣＯ２で１８時間インキュベートする。
【００４３】
Ｂ．  血清欠乏
プレートから培地を吸引する。  
１００μＬ／ウェルの１×ＰＢＳで細胞を１回すすぐ。  
８０μＬ／ウェルのＤＭＥＭ／０．１％ ＢＣＳ／１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（０．１％ ＢＣＳ培地）を加え、細胞を３７℃／５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【００４４】
Ｃ．  ＦＧＦ−２およびヘパリン調製
２０ｍｇのヘパリン塊を２．０ｍＬの０．１％ ＢＣＳ培地に溶解して、終濃度１０ｍｇ／ｍＬにした。  
１０×ヘパリン溶液の調製：  ５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ溶液を４，９５０μＬの０．１％ ＢＣＳ培地に加えることによって１０ｍｇ／ｍＬのヘパリン溶液を１００μｇ／ｍＬに希釈した。  
１０μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２ストックを９０μＬの１×ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡに加えることによって１：１０中間希釈物を調製し、終濃度１０μｇ／ｍＬにした。  
１０×ＦＧＦ−２の調製：  ５０μＬを４，９５０μＬの０．１％ ＢＣＳ培地に加えることによって１：１０中間体をさらに希釈し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬにした。５００μＬを４，５００μＬの０．１％ ＢＣＳ培地に加えることによって１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２溶液を希釈し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬにした。  
１０×ヘパリン希釈物の調製：  表２に示されるように０．１％ ＢＣＳを含有する培地中で１０×ヘパリンの段階希釈物を調製する。
【表２】
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【００４５】
６．  ５×ヘパリン／ＦＧＦ−２希釈物：  等容量の１０×ＦＧＦ−２（ステップ３および４）および１０×ヘパリンストック（ステップ５）を混合して、表３および４に示される５×処理中間体を作製する。
【表３】
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【表４】
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【００４６】
Ｄ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ展開
２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液を各処理ウェルに加える。  
３７℃／５％ ＣＯ２で１時間インキュベートする。  
４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【００４７】
これらのアッセイの結果を以下の表に示す。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【００４８】
他の実施形態
現在好ましい例であるとみなされているものに関して本発明を説明してきたが、本発明は開示されている例に限定されないことが理解されるものとする。反対に、本発明は、特許請求の範囲の思想および範囲内に含まれる種々の改変および等価のアレンジを含むものとする。
【００４９】
すべての刊行物、特許および特許出願は、個別の各刊行物、特許または特許出願が参照によりその全体が組み入れられると具体的かつ個別に指定されているのと同程度に参照によりその全体がここに組み入れられる。本出願中の用語が、参照により本明細書中に組み入れられている文書において異なって定義されていることが見出された場合、本明細書中で提供される定義が該用語の定義としての役割を果たす。
【００５０】
他の実施形態は特許請求の範囲にある。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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