(57)【要約】  酵素活性分析を用いて病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーの有無を検出するための方法が提供される。ある実施態様においては、提供される方法は、対象中の病原体、疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーを検出するための酵素の競合阻害を利用する。この方法には、内在性基質を含むか又は含まない対象から生体試料を用意することが具備されている。この試験反応は、病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表す酵素及びシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによって提供される。酵素は、内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変する。酵素によるシグナル部分を有する基質の改変は、シグナル部分からシグナルを生じさせる。酵素とシグナル部分を有する基質からなるコントロール反応からのデータがさらに提供される。試験反応でシグナル部分によって生じるシグナルが検出される。病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの存在は、試験反応で生じたシグナルとコントロール反応からのデータの間での、生体試料中の内在性基質の存在により生じた違いにより示される。その他の実施形態では、対象中の病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーを表す生体試料中の酵素活性の有無を検出する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の内在性基質の有無を検出することによって、対象中の病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの有無を検出する方法であって、
ａ）前記内在性基質を含むか又は含まない対象からの前記生体試料を用意し、
ｂ）病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表わす酵素及びシグナル部分を有する基質と前記生体試料とを接触させることによって試験反応をもたらし、該酵素は前記内在性基質及び該シグナル部分を有する基質を改変し、該酵素による該シグナル部分を有する基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｃ）前記酵素と前記シグナル部分を有する基質とからなるコントロール反応からのデータを提供し、
ｄ）試験反応で前記シグナル部分によって生じた前記シグナルを検出し、
ｅ）病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの存在又は量は、試験反応で生じた前記シグナルとコントロール反応からの前記データの間での、前記生体試料中の前記内在性基質の存在により生じた違いにより示されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酵素は、前記シグナル部分を有する基質を切断することによって、該シグナル部分を有する基質を改変することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル部分を有する基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、改変されたシグナル部分を有する基質を、改変されていないシグナル部分を有する基質から分離することを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記病原体、疾患又は医学的状態は細菌感染であり、前記内在性基質はプロカルシトニンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記病原体、疾患又は医学的状態はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌であり、前記内在性基質はフェノール可溶性モジュリンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記生体試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、前記生体試料を病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表わす前記酵素の１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル部分を有する基質は、病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表す前記酵素による前記シグナル部分を有する基質の開裂を活性化する第２の酵素と融合し、活性化された該第２の酵素は、第２のシグナル部分を有する第２の基質を改変して、前記シグナル部分からシグナルを生じさせることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生体試料中の生物学的カスケードに関与する内在性基質の有無を検出することによって、対象の生物学的カスケードの機能障害の有無を検出するための方法であって、
ａ）前記内在性基質を含むか又は含まない対象からの前記生体試料を用意し、
ｂ）各試験反応において、酵素及びシグナル部分を有する基質と前記生体試料とを接触させることによって試験反応のアレイを提供し、各酵素は指定された内在性基質及びそれに対応するシグナル部分を有する基質を改変し、該酵素による該シグナル部分を有する基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｃ）コントロール反応のアレイから参照プロファイルデータを提供し、
各コントロール反応は、前記酵素と前記シグナル部分を有する基質とを含み、
ｄ）前記試験反応で前記シグナル部分によって生じた前記シグナルを検出し、
ｅ）前記試験反応のアレイから生じる前記シグナルの試料プロファイルを作成し、
ｆ）前記試料プロファイルと前記参照プロファイルとを比較し、生物学的カスケードの機能障害の存在又は量は、前記試料プロファイルと前記参照プロファイル間の違いにより示されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記生物学的カスケードの機能障害が、対象中の病原体、疾患又は医学的状態を表すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記病原体、疾患又は医学的状態が、自己免疫疾患、遺伝性疾患、凝固障害、癌、炎症、神経変性疾患、高血圧、血管拡張、糖尿病及びアレルギーから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的カスケードが、凝固カスケード、線維素溶解カスケード、キニン・カスケード、シグナル伝達カスケード、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケード及び炎症カスケードから選択される生物学的カスケードであることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素は、前記シグナル部分を有する基質を切断することによって、前記シグナル部分を有する基質を改変することを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナル部分を有する基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、改変されたシグナル部分を有する基質を、改変されていないシグナル部分を有する基質から分離することを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記生体試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、前記生体試料を内在性基質を改変する前記酵素の１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記シグナル部分を有する基質は、内在性基質を改変する前記酵素による前記シグナル部分を有する基質の開裂を活性化する第２の酵素と融合し、活性化された該第２の酵素は、第２のシグナル部分を有する第２の基質を改変して、前記シグナル部分からシグナルを生じさせることを特徴とする請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）生体試料中の内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変する酵素と、
ｂ）前記シグナル部分を有する基質と、
ｃ）生体試料中の内在性基質の有無を検出することによって、対象中の病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの有無を検出する方法を実施するための説明書とを備え、前記方法は、
ｄ）前記内在性基質を含むか又は含まない対象からの生体試料を用意し、
ｅ）病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表わす酵素及びシグナル部分を有する基質と前記生体試料とを接触させることによって試験反応をもたらし、該酵素は前記内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変し、該酵素による該シグナル部分を有する基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｆ）前記酵素と前記シグナル部分を有する基質とからなるコントロール反応からのデータを提供し、
ｇ）試験反応で前記シグナル部分によって生じた前記シグナルを検出し、
ｈ）病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの存在又は量は、試験反応で生じた前記シグナルとコントロール反応からの前記データの間での、前記生体試料中の前記内在性基質の存在により生じた違いにより示されることを特徴とするキット。
【請求項２７】
さらに、非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤を備えることを特徴とする請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
さらに、前記酵素の１つ以上の活性剤を備えることを特徴とする請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
病原体、疾患又は医学的状態を表す生体試料中の酵素の有無を検出することによって、対象の治療処置の有効性を測定するための方法であって、
ａ）治療処置の異なる時点で対象から得られた２つ以上の生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、前記酵素は該基質を改変し、前記酵素による該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記シグナル部分から生じたシグナルを検出し、前記２つ以上の生体試料から生じる前記シグナルの違いは治療処置の有効性を示すことを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記２つ以上の生体試料のうちの１つは治療前に得られ、もう１つは治療後に得られることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記２つ以上の生体試料は、治療の間に異なる時点で得られることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記２つ以上の生体試料のうちの１つは治療の間に得られ、もう１つは治療後に得られることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記２つ以上の生体試料のうちの１つは治療前に得られ、もう１つは治療の間に得られ、そして３つめは治療後に得られることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記２つ以上の生体試料は、白血球（ＷＢＣ）であることを特徴とする請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、前記２つ以上の生体試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
酵素の有無を検出することによって、白血球（ＷＢＣ）試料中の酵素活性の有無を検出する方法であって、
ａ）対象から得られた前記酵素を含むか又は含まないＷＢＣ試料と、シグナル部分を有する基質とを接触させ、前記酵素は該基質を改変し、該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記シグナル部分から生じたシグナルを検出し、生じた前記シグナルが前記試料中の酵素活性を表わすことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記酵素活性は、対象中の病原体、疾患又は医学的状態を表すことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
さらに、前記ＷＢＣ試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、前記ＷＢＣ試料を前記酵素の１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロテアーゼであることを特徴とする請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記基質が、アミノ酸配列ＶＸＡＡ／Ｓ（配列番号２３）を有することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記基質が、Ｇ-Ｖ-Ｖ-Ｎ-Ａ-／Ｓ-Ｃ-Ｒ（配列番号１９）、Ｓ-Ｙ-Ｖ-Ｌ-Ａ-／Ｓ-Ｖ-Ｓ（配列番号２０）、Ｎ-Ｎ-Ｖ-Ｅ-Ａ-／Ａ-Ｔ-Ｓ（配列番号２１）、Ｔ-Ａ-Ｖ-Ｎ-Ａ-／Ｓ-Ｇ-Ｎ（配列番号２２）、Ｒ-Ｇ-Ｖ-Ｖ-Ｎ-Ａ-／-Ｓ-Ｓ-Ｒ-Ｌ-Ａ（配列番号２６）及びＲ-Ｇ-Ｖ-Ｖ-Ｎ-Ａ／-Ｓ-Ｓ-Ｒ-Ｌ-Ａ-Ｃ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を有する基質であることを特徴とする請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記酵素が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼであることを特徴とする請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記基質は、アミノ酸配列（Ｓ／Ｇ）（Ｑ／Ｇ／Ｒ／Ｋ）（Ｎ／Ｃ／Ｄ）（Ｙ／疎水性／芳香族）-／-Ｐ（Ｉ／Ｖ／疎水性）（Ｖ／Ｑ）（配列番号２８）を有することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記酵素は、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）ウイルス・プロテアーゼであることを特徴とする請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記基質は、（Ｖ／Ｌ／Ｔ／Ｐ）Ｘ（疎水性）（Ｆ／Ｌ）-／-Ｖ（疎水性）Ｑ（配列番号２９）、ＫＶＫＶ（Ｆ／Ｌ）-／-ＶＶＱＰＫ（配列番号３０）及びＰＰＸ（疎水性）Ｌ-／-ＰＩ（配列番号３１）から選択されるアミノ酸配列を有する基質であることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
真菌によって産生される酵素の有無を検出することによって、対象の真菌感染の有無を検出する方法であって、
ａ）対象から得られた前記酵素を含むか又は含まない生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、前記酵素は該基質を改変し、前記酵素による該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記シグナル部分から生じた前記シグナルを検出し、生じた前記シグナルは、対象の真菌感染の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５８】
前記真菌はカンジダ菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガーツス、コウマクノウキン門、ツボカビ門、ディカリア、グロムス門、微胞子虫類及びネオカリマスティクスから選択される真菌であることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記真菌はカンジダ菌であることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記酵素は、分泌アスパルチル・プロテアーゼ（Ｓａｐ）、ホスホリパーゼＢ又はリパーゼから選択される酵素であることを特徴とする請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記酵素はＳａｐ２であることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記基質は、
Ｒ-Ｌ-Ｉ-Ｑ-Ｋ-Ｒ-Ｓ-Ｄ（配列番号３）、
Ｌ-Ｉ-Ｑ-Ｋ-Ｒ-Ｓ-Ｄ-Ｖ（配列番号４）、
Ｆ-Ｖ-Ｎ-Ｑ-Ｈ-Ｌ（配列番号５）、
Ｌ-Ｖ-Ｅ-Ａ-Ｌ-Ｙ-Ｌ-Ｖ（配列番号６）、
Ｅ-Ａ-Ｌ-Ｙ-Ｌ-Ｖ-Ｃ-Ｇ（配列番号７）、
Ｅ-Ｒ-Ｇ-Ｆ-Ｆ-Ｙ-Ｔ-Ｐ（配列番号８）、
Ｐ-Ａ-Ｌ-Ｆ-Ｆ-Ｒ-Ｌ（配列番号９）、
Ｌ-Ｖ-Ｉ-Ｈ-Ｔ（配列番号１０）、
Ｈ-Ｑ-Ｖ-Ｙ-Ｆ-Ｖ-Ｒ-Ｋ（配列番号１１）、
Ｐ-Ａ-Ｒ-Ｆ-Ｆ-Ｒ-Ｌ（配列番号１２）、
Ｐ-Ａ-Ｅ-Ｆ-Ｆ-Ａ-Ｌ（配列番号１３）及び、
Ｐ-Ｌ-Ｅ-Ｍ-Ｆ-Ａ-Ｌ（配列番号１４）、から選択されるアミノ酸配列を有する基質であることを特徴とする請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
さらに、前記生体試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項５７〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
さらに、前記生体試料を真菌により産生される前記酵素の１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項５７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
髄膜炎病原体によって産生される酵素の有無を検出することによって、対象の髄膜炎感染の有無を検出するための方法であって、
ａ）対象から得られた前記酵素を含むか又は含まない生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、前記酵素は該基質を改変し、前記酵素による該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記生体試料を非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させ、
ｃ）前記シグナル部分から生じた前記シグナルを検出し、生じた前記シグナルは、対象の髄膜炎感染の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項７１】
前記生体試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血清であり、前記酵素は細菌ノイラミニダーゼであることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記シグナル部分を有する基質は、α２−３、α２−６、α２−８、α２−９及び環状のノイラミン酸結合から選択されるリンカーによって連結したシアル酸及び炭水化物を含むことを特徴とする請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤は、グランザイムＨ、プロテイナーゼ３、ジペプチジル・ペプチダーゼ、ＰｒＳＳ１１、ＨｔｒＡ２、カルパイン７、カリクレイン１２、カテプシンＡ、カテプシンＨ及びカルパイン−１１の阻害剤から選択される１つ以上の阻害剤であることを特徴とする請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記非特異的酵素活性の１つ以上の阻害剤は、α１−プロテイナーゼ阻害剤、ディプロチンＡ、Ｌ−２，４−ジアミノブチリル−ピペリジンアミド、ＨｔｒＡ１阻害剤、Ｕｃｆ−１０１、３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸、ＨＡＩ−２Ａ、エコチン、エベラクトンＢ、キモスタチン、ヒトステフィンＡ、ヒトステフィンＢ及びカルパスタチンから選択される１つ以上の阻害剤であることを特徴とする請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ以上の阻害剤は、白血球からのプロテアーゼを阻害することを特徴とする請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記生体試料は、脳脊髄液の試料であることを特徴とする請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記生体試料は、血清であることを特徴とする請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項７０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項８０又は８１に記載の方法。
【請求項８３】
髄膜炎病原体によって産生される酵素の有無を検出することによって、対象の髄膜炎感染の有無を検出するための方法であって、
ａ）対象から得られた前記酵素を含むか又は含まない生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、前記酵素は該基質を改変し、前記酵素による該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記生体試料を髄膜炎感染に関連する酵素活性の１つ以上の阻害剤と接触させ、
ｃ）前記シグナル部分から生じた前記シグナルを検出し、生じた前記シグナルは、対象の髄膜炎感染の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項８４】
前記生体試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血清であり、前記酵素は細菌ノイラミニダーゼであることを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記シグナル部分を有する基質は、α２−３、α２−６、α２−８、α２−９及び環状のノイラミン酸結合から選択されるリンカーによって連結したシアル酸及び炭水化物を含むことを特徴とする請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記１つ以上の阻害剤は、細菌性髄膜炎感染に関連する酵素活性は阻害するが、ウイルス性髄膜炎の酵素活性は阻害しないことを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記酵素活性は、髄膜炎による炎症に起因することを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つ以上の阻害剤は、髄膜炎菌のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌及び髄膜炎菌のプロテアーゼ活性の両方を阻害することを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つ以上の阻害剤は、
ａ）カクテルＩｌ９ａ：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン及びホスホラミドン、
ｂ）カクテルＩ１９ｂ：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン及び２，６−ピリジンジカルボン酸、及び、
ｃ）カクテルＩ１０：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン、ホスホラミドン及び２，６−ピリジンジカルボン酸、
から選択される阻害剤の混合物であることを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記髄膜炎は、細菌性髄膜炎感染に関連する酵素活性は阻害するが、ウイルス性髄膜炎の酵素活性は阻害しない１つ以上の阻害剤の存在下で、シグナルが生じた場合には、ウイルス性髄膜炎であることを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記酵素活性は、髄膜炎による炎症に起因することを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記対象は、髄膜炎の酵素活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下で、これらの阻害剤がない場合に生じるシグナルと比較して、シグナルが減少するか又は生じない場合には、髄膜炎に感染していることを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記髄膜炎病原体は、髄膜炎菌のプロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下で、これらの阻害剤がない場合に生じるシグナルと比較して、シグナルが減少するか又は生じない場合には、髄膜炎菌であることを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記髄膜炎病原体は、肺炎球菌のプロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下で、これらの阻害剤がない場合に生じるシグナルと比較して、シグナルが減少するか又は生じない場合には、肺炎球菌であることを特徴とする請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記生体試料は、脳脊髄液の試料であることを特徴とする請求項８３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記生体試料は、血清であることを特徴とする請求項８３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項８３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項８３〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項１０１又は１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
髄膜炎感染を検出するためのキットであって、
ａ）生体試料中の髄膜炎病原体の酵素は該基質を改変し、該酵素による該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせるシグナル部分を有する基質と、
ｂ）髄膜炎の酵素活性の１つ以上の阻害剤と
を備えることを特徴とするキット。
【請求項１０５】
前記１つ以上の阻害剤は、細菌性髄膜炎感染に関連する酵素活性は阻害するが、ウイルス性髄膜炎の酵素活性は阻害しないことを特徴とする請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記１つ以上の阻害剤は、髄膜炎による炎症を阻害することを特徴とする請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０７】
前記１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とする請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０８】
前記１つ以上の阻害剤は、髄膜炎菌のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とする請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０９】
前記１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌及び髄膜炎菌のプロテアーゼ活性の両方を阻害することを特徴とする請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１０】
前記１つ以上の阻害剤は、
ａ）カクテルＩｌ９ａ：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン及びホスホラミドン、
ｂ）カクテルＩ１９ｂ：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン及び２，６−ピリジンジカルボン酸、及び
ｃ）カクテルＩ１０：
４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、ベスタチン、トランス−エポキシサクシニル−Ｌ−ロイシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）、エグリンＣ、（３Ｓ，３ａＳ，６ａＲ）−３−イソプロピル−１−（メタンスルホニル）−４−［４−（１−ピペリジニル）−２（Ｅ）−ブテノイル］パーヒドロピロロ［３，２ｂ］ピロール−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（ＧＷ３１１６１６Ａ）、ペプスタチンＡ、ヘパリン、ホスホラミドン及び２，６−ピリジンジカルボン酸、
から選択される阻害剤の混合物であることを特徴とする請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１１】
生体試料中のアロマターゼの有無を検出することによって、対象の内分泌系機能障害の有無を検出する方法であって、
ａ）対象から得られたアロマターゼを含むか又は含まない前記生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、アロマターゼは該基質を改変し、アロマターゼによる該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記シグナル部分から生じた前記シグナルを検出し、生じた前記シグナルは、対象の内分泌系機能障害の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１１２】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項１１４又は１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記基質は、メトキシ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＭＦＣ）であることを特徴とする請求項１１１、又は１１４〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
さらに、前記生体試料を非特異性プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項１１１〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
さらに、前記生体試料をアロマターゼの１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項１１１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記活性剤は、Ｎａ２ＳＯ４であることを特徴とする請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
生体試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の有無を検出することによって、対象の前立腺癌の有無を検出する方法であって、
ａ）対象から得られたＰＳＡを含むか又は含まない前記生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させ、ＰＳＡは該基質を改変し、ＰＳＡによる該基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｂ）前記シグナル部分から生じた前記シグナルを検出し、生じた前記シグナルは、対象の前立腺癌の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１２２】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項１２１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項１２４又は１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記基質は、
ＨＳＳＫＬＱ（配列番号１５）、
ＱＦＹＳＳＮ（配列番号１６）、
ＧＡＧＬＲＬＳＳＹＹ-ＳＧＡＧ（配列番号１７）又は、
ＳＳＩＹＳＱＴＥＥＱ（配列番号１８）、
から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１２１〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
さらに、前記生体試料を非特異性プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項１２１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
さらに、前記生体試料をＰＳＡの１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項１２１〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記活性剤は、Ｎａ２ＳＯ４であることを特徴とする請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
生物学的カスケードに関与する酵素の有無を検出することによって、対象の生物学的カスケードの機能障害の有無を検出する方法であって、
ａ）前記酵素を含むか又は含まない対象からの前記生体試料を用意し、
ｂ）各試験反応において、シグナル部分を有する基質と前記生体試料とを接触させることによって試験反応のアレイを提供し、前記酵素は該シグナル部分を有する基質を改変し、前記酵素による該シグナル部分を有する基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせ、
ｃ）前記試験反応で前記シグナル部分によって生じた前記シグナルを検出し、
ｄ）前記試験反応で生じた前記シグナルは、対象の生物学的カスケードの機能障害の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１３２】
前記シグナル部分が、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素、レクチン、アプタマー及び放射性同位体から選択されるシグナル部分であることを特徴とする請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記シグナル部分がＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記基質は、さらに分離部分を有することを特徴とする請求項１３１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記分離部分が、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分、レクチン、アプタマー及び核酸部分から選択される分離部分であることを特徴とする請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
さらに、改変された基質を改変されていない基質から分離することを特徴とする請求項１３４又は１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
さらに、前記生体試料を非特異性プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤と接触させることを特徴とする請求項１３１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
さらに、前記生体試料を生物学的カスケードに関与する酵素の１つ以上の活性剤と接触させることを特徴とする請求項１３１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記酵素は、前記シグナル部分を有する前記基質を切断することによって、前記シグナル部分を有する前記基質を改変することを特徴とする請求項１３１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年７月２８日に出願した米国仮出願第６１／１２９，８８７号、２００８年８月１２日に出願した米国仮出願第６１／１３６，１０５号、２００８年８月１４日に出願した米国仮出願第６１／１３６，１４３号、及び２００９年３月１２日に出願した米国仮出願第６１／１５９，４８５号の利益を主張する。
【０００２】
酵素活性分析を用いて、病原体、又は疾患、又は医学的状態を検出するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
対象中の病原体、疾患若しくは医学的状態又は病原体、疾患若しくは医学的状態の存在を示すバイオマーカー（以下、「そのバイオマーカー」という）のレベルの直接検出は、イムノ分析又は核酸増幅方法（例えばＰＣＲ）を用いることで達成することができる。しかしながら、対象中の病原体、疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーを検出するための迅速で精度の高い方法が引き続き必要とされている。
【０００４】
多くの微生物は、成長、分化又は代謝の異なる段階と関連した特有の酵素活性を有する。同様に、病理過程はそれらの診断に採用できる特有の酵素活性、例えば癌マーカーや心筋酵素といったバイオマーカーを有することが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
対象中の病原体、疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーを検出するための酵素の競合阻害の方法が提供される。方法には、内在性基質を含むか又は含まない対象からの生体試料を用意することが備えられている。試験反応は、病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表わす酵素及びシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによって提供される。この酵素は内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変する。この酵素によるシグナル部分を有する基質の改変は、シグナル部分からシグナルを生じさせる。酵素とシグナル部分を有する基質とからなるコントロール反応からのデータがさらに提供される。試験反応でシグナル部分によって生じたシグナルが検出される。病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの存在は、試験反応で生じたシグナルとコントロール反応からのデータの間での、生体試料中の内在性基質の存在により生じた違いにより示される。改変には、基質の開裂又は例えばリン酸基のような成分を基質に付加することが含まれる。この方法は、生体試料中の生物学的カスケードに関与する酵素によって改変された内在性基質を検出することによって、対象の生物学的カスケードの機能障害を検出するためにも用いられ得る。
【０００６】
さらに、競合阻害分析のアレイを用いて対象の生物学的カスケードの機能障害を検出する方法が提供される。方法には、内在性基質を含むか又は含まない対象からの生体試料を用意することが備えられている。試験反応のアレイは、各試験反応において、生物学的カスケードに関与する酵素及びシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによって、さらに提供される。この酵素は内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変し、この酵素によるシグナル部分を有する基質の改変は、シグナル部分からシグナルを生じさせる。さらに、酵素とシグナル部分を有する基質を含むコントロール反応のアレイからのデータによる参照プロファイルがさらに提供される。試験反応でシグナル部分によって生じたシグナルは検出され、試験反応のアレイから生じるシグナルの試料プロファイルが作成される。試料プロファイルは参照プロファイルと比較され、生物学的カスケードの機能障害の存在は試料プロファイルと参照プロファイルとの間の違いにより示される。
【０００７】
別の態様においては、生体試料中で生物学的カスケードに関与する酵素を検出する試験反応のアレイを使用して、生物学的カスケードの機能障害の有無を検出する方法が提供される。方法には、対象から、その酵素を含むか又は含まない生体試料を用意し、各試験反応においてシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによる試験反応のアレイを提供することが含まれる。その酵素が存在する場合には、その酵素はシグナル部分を有する基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。シグナル部分によって、生じたシグナルは、それから各試験反応において検出される。生じたシグナルは、対象の生物学的カスケードの機能障害の存在を示す。
【０００８】
生物学的カスケードとは、例えば、凝固カスケード、線維素溶解カスケード、キニン・カスケード、シグナル伝達カスケード、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケード及び炎症カスケードから選択されることができる。また、病原体、疾患又は医学的状態は、凝固障害、癌、炎症、神経変性障害、高血圧、血管拡張、糖尿病及びアレルギーから選択されることができる。
【０００９】
また、対象の治療処置の有効性を測定するための方法が提供される。この方法には、治療処置の異なる時点で対象から得られた２つ以上の生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させることが備えられている。生体試料中に酵素が存在する場合、酵素は基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。シグナル部分から生じたシグナルは検出され、２つ以上の生体試料から生じるシグナルの違いが治療処置の有効性を示す。生体試料は、治療の前、治療の間、及び／又は治療の後に得ることができる。
【００１０】
また、末梢白血球（ＷＢＣ）の試料の酵素活性を検出するための方法が、提供される。この方法には、対象から得られる酵素を含むか又は含まないＷＢＣ試料とシグナル部分を有する基質とを接触させることが備えられている。この酵素は基質を改変し、基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。生じたシグナルはシグナル部分から検出され、生じたシグナルは試料中の酵素活性を表す。この方法は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）を検出するために用いることができる。
【００１１】
また、対象の真菌感染の有無を検出するための方法が提供される。この方法には、対象から得られる真菌によって産生された酵素を含むか又は含まないＷＢＣ試料とシグナル部分を有する基質とを接触させることが備えられている。この酵素は基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。シグナル部分から生じるシグナルは検出され、生じたシグナルは対象の真菌感染の存在を示す。真菌は、例えば、カンジダ菌（クリプトコッカス・ネオフォルマンス）カンジダ菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガーツス、コウマクノウキン門、ツボカビ門、ディカリア、グロムス門、微胞子虫類及びネオカリマスティクスから選択されることができる。
【００１２】
また、対象の髄膜炎感染の有無を検出するための方法が提供される。この方法には、対象から得られる髄膜炎病原体によって産生された酵素を含むか又は含まないＷＢＣ試料とシグナル部分を有する基質とを接触させることが備えられている。この酵素は基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。生体試料は、非特異的プロテアーゼ活性又は髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤にも接触する。シグナル部分から生じるシグナルは検出され、生じたシグナルは対象の髄膜炎感染の存在を示す。髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤は、例えば、細菌性髄膜炎は阻害するが、ウイルス性髄膜炎は阻害しない。別の例として、髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌プロテアーゼ活性を阻害するが、ウイルス性髄膜炎を阻害しない。更なる例として、髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤は、髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害するが、ウイルス性髄膜炎を阻害しない。さらに別の例では、髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌及び髄膜炎菌プロテアーゼ活性の両方を阻害するが、ウイルス性髄膜炎を阻害しない。このように、細菌性髄膜炎は阻害するが、ウイルス性髄膜炎は阻害しない髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じる場合には、その髄膜炎はウイルス性髄膜炎である。他方、肺炎球菌プロテアーゼ活性を阻害する髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じる場合や、髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害する髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じない場合には、その髄膜炎は髄膜炎菌である。同様に、髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害する髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じる場合や、肺炎球菌プロテアーゼ活性を阻害する髄膜炎プロテアーゼ活性の１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じない場合には、その髄膜炎は肺炎球菌である。
【００１３】
また、対象中の疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーの有無を検出するための方法が提供される。疾患又は医学的状態は、例えば、内分泌系機能障害又は前立腺癌が含まれ得る。この方法には、対象から得られる疾患又は医学的状態を表す酵素を含むか又は含まない生体試料とシグナル部分を有する基質とを接触させることが備えられている。この酵素は基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。シグナル部分から生じるシグナルは検出され、生じたシグナルは疾患又は医学的状態の存在を示す。この疾患又は医学的状態は、例えば内分泌系機能障害でもよく、その酵素は例えばアロマターゼでもよい。さらに、この疾患又は医学的状態は、例えば前立腺癌でもよく、その酵素は例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）でもよい。
【００１４】
提供される方法には、例えば分離工程をさらに備えことができる。それらの態様において、この基質は、分離部分と、（１）反応において加工される基質と加工されない基質との間で分離され、（２）加工された基質の検出ができるシグナル部分を備える。分離は、例えば抗体と抗原との間及び核酸間のような２つの部分の特異的な結合であるか、例えば膜、チップ及びビーズのような固定された表面との結合を通じて得られる。
【００１５】
更なる態様において、提供される方法には、例えば、増幅工程を備えることができる。この方法には、病原体、疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーを表す酵素によって、第１の基質の開裂に活性化される第１の酵素（チモーゲンと呼ばれる）と融合する第１の基質と、生体試料とを接触させることが備えられている。活性化された第１の酵素は、シグナル部分から成る２枚目の基質を改変して、シグナル部分からシグナルを生じさせる。チモーゲンの開裂は第２の活性酵素を生じさせ、それは第３の活性酵素等を生じさせるための別のチモーゲンを活性化できる。各々の活性化された酵素は、特異的な基質を改変する。各々の改変の結果としてシグナルが生じ、それゆえシグナルが増幅される。生体試料が第１のチモーゲンを形成するために用いる開裂配列と競合する基質を含む場合には、生じるシグナルは低減する。
【００１６】
ある態様においては、シグナル部分は、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素及び放射性同位体酵素でもよい。
【００１７】
提供される方法の一部には、１つ以上の非特異的酵素活性の阻害剤が、生体試料に加えられることが可能である。別の態様においては、酵素の１つ以上の活性剤が、生体試料に加えられることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】生物学的カスケードの分析例である。
【図２】生物学的カスケードの分析から検出されたシグナルに基づく参照（コントロール）プロファイル及び試料（患者）プロファイルの例である。
【図３】不活性酵素前駆体（チモーゲン）を利用した生物学的カスケードのための分析例である。
【図４】凝固カスケードの説明図である。
【図５】線維素溶解カスケードの説明図である。
【図６】キニン・カスケードの説明図である。
【図７】シグナル伝達カスケードの説明図である。
【図８】分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの説明図である。
【図９】炎症カスケードの説明図である。
【図１０】基質の構造の説明図である。
【図１１】分離工程を有する本発明の方法の実施態様を説明する図である。
【図１２】複数の基質の開裂を検出するための本発明の方法の実施態様を説明する図である。
【図１３】動的な分離システムの説明図である。
【図１４】オリゴ糖ビーズ及び蛍光標識リガンド（レクチン）に基づいてノイラミニダーゼを検出する方法の説明図である。図１４Ａは、ノイラミニダーゼによるシアル酸及びレクチンの開裂を示す。図１４Ｂは、ヒト、鳥類及びイノシシ属のノイラミニダーゼを区別するためのオリゴ糖／シアル酸／レクチン組合せのさまざまな組合せを示す。ＳＮＡ：セイヨウニワトコレクチン、ＭＡＬ：イヌエンジュレクチン、ＷＧＡ：小麦胚芽アグルチニン。
【図１５】オリゴ糖ビーズ及び蛍光標識リガンド（レクチン）に基づくノイラミニダーゼ検出のための多重分析法の説明図である。
【図１６】基質がＣａｍｂ２であるエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼの３Ｄ構造により作成された系統樹である。
【図１７】プロカルシトニン（ＰＣＴ）の構造の説明図である。
【図１８】凝固カスケードの分析例を示す図である。
【図１９】４μＭの基質Ｂａｃｈ１での２００ｎＭの組換えＣＭＶプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図２０】非特異的プロテアーゼ活性の阻害剤がある場合とない場合のＷＢＣ試料及びＣＭＶプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、標本プール中（図２１Ａ）及びＷＢＣ溶解液中（図２１Ｂ）の組換えヒト・ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（３Ｃ）に対する阻害剤カクテルの効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ウイルス性及び細菌性髄膜炎に対する阻害剤の作用を示すグラフである。図２２Ａは、エコウイルス３Ｃプロテアーゼには作用しないホスホラミドンの肺炎球菌６Ｂ及び２３Ｆに対する作用を示す。図２２Ｂは、エコウイルス３Ｃプロテアーゼには作用しない２，６−ピリジンジカルボン酸の髄膜炎菌に対する作用を示す。
【図２３】エンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ、肺炎球菌プロテアーゼ及び髄膜炎菌プロテアーゼ活性に対するＩ１０、Ｉ９ａ及びＩ９ｂの阻害剤カクテルの作用を示すグラフである。
【図２４】ブランクの曲線形状での非付着性（ＮＢ）プレートの効果を示すグラフである。図２４Ａは、通常のプレートに特有な波形のブランク曲線を示し、図２４Ｂは、ＮＢプレートではわずかに傾きがプラスの直線形状を示すことを示す。
【図２５】エンテロウイルス分析において基質の調製のためのさまざまなタイプのチューブの効果を示すグラフである。図２５Ａは、アンバー及び低付着性（ＬＢ）チューブで調整された基質Ｃａｍｂ２．３及びＣａｍｂ２．４を用いたエンテロウイルス活性を示す。図２５Ｂは、異なるチューブ及び異なる基質バッチを用いたエンテロウイルス分析のブランクのパラメーターを示す。
【図２６】エンテロウイルス分析におけるアセトニトリルの効果を示すグラフである。図２６Ａは、１％のアセトニトリルの存在下、及びアセトニトリルのない条件下でのブランクの比較を示す。図２６Ｂは、エンテロウイルス分析における０−５％のアセトニトリルの効果を示す。
【図２７】異なる基質濃度（Ｃａｍｂ２）及び時間間隔でのエンテロウイルス分析における反応率を示すグラフである。図２７Ａ：１．５−５分、図２７Ｂ：５−１２分、図２７Ｃ：５−２２分。データは３回の実験の平均値±標準誤差を示す（各実験は３つ組試験で行われた）。
【図２８】図２８Ａは、エンテロウイルス分析における異なる基質濃度（Ｃａｍｂ２）及び時間間隔での陽性対照とブランクとの割合を示すグラフである。データは３回の実験の平均値±標準誤差を示す（各実験は３つ組試験で行われた）。図２８Ｂ及び２８Ｃは、エンテロウイルス分析における異なる基質濃度（Ｃａｍｂ２）及び時間間隔でのブランク及び陽性対照のＣＶ値を示すグラフである。データは３回の実験の平均値±標準誤差を示す（各実験は３つ組試験で行われた）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ここで用いられる「生体試料」とは、対象から得られるいかなる試料のことをいい、特に限定されないが、羊水粘液、唾液、咽頭洗浄液、血液、白血球（ＷＢＣ）、血清、プラズマ、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、組織生検、細気管支肺胞液、膣液及び涙液が含まれる。ある態様においては、分析の前に生体試料中の赤血球は、例えば遠心分離処理により除去される。別の態様においては、試料を凍結させる前に、赤血球は遠心分離処理によって除去される。
【００２０】
ここで用いられる「バイオマーカー」とは、通常の生物学的プロセス、発病過程又は治療介入に対する薬理反応の指標として使用される物質のことをいう。バイオマーカーには、例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、外因性物質又は化学物質が含まれる。
【００２１】
ここで用いられる「内在性」基質とは、生物、組織又は細胞から生じる基質であり、試験される生体試料に外から加えられていないもののことをいう。
【００２２】
ここで用いられる「医学的状態」とは、例えば妊娠のように、医療援助から利益を得ることができるか又は医療的治療について重要な意味を持つ通常の生物学的状態のことをいう。
【００２３】
ここで用いられる「コントロール反応からのデータ」とは、シグナル又はコントロール反応から生じるシグナル分析のことをいう。コントロール反応とは、生体試料からなる試験反応のための陽性又は陰性対照としての役目を果たす反応をいう。したがって、例えば、コントロール反応は酵素と、酵素によって改変されるシグナル部分を有する基質とからなり得るが、生体試料は含まれない。あるいは、コントロール反応は、酵素と、酵素によって改変されるシグナル部分を有する基質に加えて、試験されるバイオマーカーを欠くことが既知の生体試料とからなり得る。その他のコントロール反応は、当業者によって、容易に特定可能である。コントロール反応からのデータは、試験反応と同時に得られることが可能であるか、又は試験反応を実行する前か後に得られることが可能である。
【００２４】
ここで用いられる「疾患」とは、身体機能を害する対象の異常な医学的状態のことをいう。疾患としては、特に限定はされないが、例えば、菌類、酵母又は細菌によって生じた感染症、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、アレルギー、心臓血管障害及び凝固障害が挙げられる。
【００２５】
ここで用いられる「酵素」とは、化学反応を触媒するいかなる生体分子のことをいう。酵素には、特に限定はされないが、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、ノイラミニラーゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ポリメラーゼ及びヘリカーゼが含まれる。酵素の特別な例としては、ウイルス・プロテアーゼ、ノイラミニダーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びＳａｐ２が挙げられる。
【００２６】
ここで用いられる「阻害剤」とは、酵素の活性を失くすか又は低減させるいかなる薬剤のことをいう。
【００２７】
ここで用いられる「改変」とは、基質におけるいかなる化学変化のことをいう。改変には、基質の開裂及びリン酸基の付加等の部分の追加が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
ここで用いられる「病原体」とは、疾患又は宿主の疾患を引き起こす感染性因子のことをいう。病原体には、特に限定はされないが、細菌、ウイルス、酵母及び菌類が含まれる。
【００２９】
ここで用いられる「プロカルシトニン」とは、全長１１６アミノ酸のプロカルシトニン（配列番号４７）又は配列番号４７の３−１１６アミノ酸から成るプロカルシトニンのような天然に生じる切断産物、アミノプロカルシトニン、未成熟のカルシトニン及びカルシトニン・カルボキシ・ペプチド−Ｉ（ＣＣＰ−Ｉ又はカタカルシン）のことをいう。
【００３０】
ここで用いられる「分離部分」とは、別の分析要素から分析の要素の分離を許容する部分のことをいう。ある実施態様においては、分離部分は、免疫学的結合物質、磁気結合部分、ペプチド結合部分、親和結合部分及び核酸部分から選択される。
【００３１】
ここで用いられる「シグナル部分」とは、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生じるいかなる部分のことをいう。例えば、シグナル部分は、蛍光、化学発光又は熱量測定のシグナルを生じさせる検出可能な標識であり得る。シグナル部分は、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素及び放射性同位体から選択されることができる。シグナル部分は、親和性対を備えることができる。
【００３２】
ここで用いられる「親和性対」とは、互いの方への親和性を有するいかなる２つの部分を指す。親和性対の具体例としては、特に限定されないが、ビオチン−アビジン、抗体−基質／抗原、受容体−基質、シアロオリゴ糖／ガングリオシド類−レクチン、核酸ハイブリダイゼーションに基づくセンス−アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ鎖、核酸アプタマー／標的基質及びｐＨ依存性色素分子が含まれる。
【００３３】
ここで用いられる「対象」とは、いかなる人又は人間以外の動物のことをいう。対象は、健康でも、疾患、障害若しくは感染症の治療を必要としてもよく、又は治療が有益ないかなる対象のことをいう。人間以外の動物には、すべての家畜及び野生の脊椎動物が含まれる。
【００３４】
ここで用いられる「基質」とは、酵素により改変されることができる分子のことをいう。基質は生体試料中にあってもよい。又は、基質は、試験分析に添加されてもよい。ある態様において、基質は一般式Ａ−Ｂを備えることができ、Ｂには酵素によって改変され得る物質を備え、Ａにはシグナル部分を備える。別の態様においては、基質は一般式Ａ−Ｂ−Ｃを備えることができ、Ｂには酵素によって改変され得る物質を備え、ＡとＣには各々シグナル部分を備える。シグナル部分は、酵素、フルオロフォア、発色団、タンパク質、ペプチド、化学発光物質、消光剤、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、プレ酵素及び放射性同位体から選択されることができる。さらに別の態様としては、Ａはシグナル部分を備え、Ｃは分離部分を備える。基質は公知技術であり、国際公開２００５／０１７９１号公報、国際公開２００７／０２９２６２号公報及び国際公開２００７／０４９２７６号公報に記載されている方法、又はその他の公知技術に従って準備され得る。加えて、基質は、例えばその基質又は阻害剤と結合する酵素をモデル化することによる、酵素の３次元モデリングを用いて設計され得る。
【００３５】
ある態様において、基質は、ＦＲＥＴベースの基質である。フルオロフォア及び消光剤（ＦＲＥＴ対）は、基質の開裂配列の両側に取り付けられる。開裂にあたっては、ＦＲＥＴは蛍光を放出するようなフルオロフォアから分離される。
【００３６】
基質は１つの酵素に対して特異的なものでもよい。基質は複数の酵素を認識するものでもよい。例えば、単一の基質はウイルスに関する血清型中では複数の酵素を認識することができるが、その他の血清型では認識することができず、それによって、血清型が区別される。
【００３７】
ここで用いられる「白血球（ＷＢＣ）」の試料とは、少なくとも７０％ｖ／ｖのＷＢＣ、さらに少なくとも８０％ｖ／ｖのＷＢＣ、さらに少なくとも９０％ｖ／ｖのＷＢＣ、又は９５％ｖ／ｖのＷＢＣのＷＢＣを含む血液由来試料のことをいう。したがって、ＷＢＣの試料は、例えば、細菌及び細菌性の成分といった他の成分を含むことができる。
【００３８】
提供される方法は、周知の酵素及び／又は基質の濃度の限られた範囲を含むコントロール試料を用いることにより半定量的であってもよい。この方法は、周知の酵素及び／又は基質の濃度の全範囲を含むコントロール試料を用いることにより定量されてもよい。またこの方法は、定量的かつ試験試料とコンロトール試料との違いを検出することにより観察されるものであってもよい。
【００３９】
（生体試料中の基質の有無を検出するための競合阻害に基づく酵素分析）
ある実施態様においては、提供される方法は、対象中の病原体、疾患、医学的状態又はそのバイオマーカーの有無を検出するための酵素の競合阻害を利用する。方法には、内在性基質を含むか又は含まない対象からの生体試料を用意することが備えられている。試験反応は、病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーを表わす酵素及びシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによって提供される。の酵素は内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変する。この酵素によるシグナル部分を有する基質の改変は、シグナル部分からシグナルを生じさせる。酵素とシグナル部分を有する基質とからなるコントロール反応からのデータがさらに提供される。病原体、疾患又は医学的状態のバイオマーカーの存在は、試験反応で生じたシグナルとコントロール反応からのデータの間での、生体試料中の内在性基質の存在により生じた違いにより示される。
【００４０】
（生物学的カスケードの機能障害の有無を検出するための酵素分析）
生物学的カスケードは、１つの反応の産物が次の反応で用いられる一連の化学反応である。生物学的カスケードの例としては、特に限定されないが、凝固カスケード、補体系、シグナル伝達カスケード、線維素溶解カスケード、アポトーシス・カスケード、ＭＡＰＫカスケード、炎症カスケード、キニン・カスケード及びアレルギー・カスケードが含まれる。
【００４１】
生物学的カスケードに関与している１つ以上の酵素の機能障害は、病的な医学的状態を導き得る。機能障害性カスケードと関連する病的な医学的状態のいくつかは、カスケードに関与している酵素の異常な酵素活性から生じる。異常な生物学的カスケードは、病的な医学的状態の発生を導き得る。このような病的な医学的状態には、特に限定されないが、凝固障害、癌、炎症、神経変性障害、医学的に高血圧の状態、医学的に血管拡張の状態、糖尿病及びアレルギーが含まれる。
【００４２】
ある実施態様において、生体試料中の生物学的カスケードに関与する複数の酵素の酵素活性を、定量的に及び定性的に測定する方法が提供される。すべての試験された酵素の活性プロファイルは形成され、病的な医学的状態と相関し得る。そのプロファイルは、生体試料中の健康であるか、病的な医学的状態であるかの定性的な測定だけでなく、病的な医学的状態及びその機能障害の性質（例えば、活性の欠如、増加した活性、低い活性など）と関連する１つ以上の酵素の特定を可能とする。この方法は上述したような競合阻害に基づく。
【００４３】
生物学的カスケードに関与している酵素の活性は、競合阻害分析を使用して決定されることができる。内在性基質を含むか又は含まない生体試料が用意され、カスケードに関与する酵素及びシグナル部分を有する基質と接触する。酵素は内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変し、シグナル部分を有する基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。生体試料が酵素に対する内在性基質を含まない場合には、シグナル部分を有する基質との競合は生じておらず、シグナルはシグナル部分を有する基質の改変の結果として、このシグナル部分から生じている。生体試料が酵素に対する内在性基質を含む場合には、シグナル部分を有する基質との競合が生じており、シグナル部分から生じるシグナルが低減される。
【００４４】
生物学的カスケードの機能障害は、競合阻害分析のアレイを用いて検出されることもできる。方法には、内在性基質を含むか又は含まない対象からの生体試料が用意されることが備えられる。試験反応のアレイは、各試験反応において、生物学的カスケードに関与する酵素及びシグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることによって、さらに提供される。この酵素は内在性基質及びシグナル部分を有する基質を改変し、この酵素によるシグナル部分を有する基質の改変は、シグナル部分からシグナルを生じさせる。生じたシグナルを検出するにあたり、各分析からのシグナルレベルからなる「試料プロファイル」が形成されて、参照プロファイルと比較され得る。ここで用いられる「参照プロファイル」とは、カスケードに関与する各酵素の活性プロファイルのことをいう。さまざまな酵素の酵素活性は、棒グラフや円グラフとして、又は酵素活性を表わすためのその他の方法によって、示すことができる。試料プロファイルと参照プロファイルの違いは、カスケード中の機能障害を示す。この違いは、対象の病的な医学的状態を示すこともできる。
【００４５】
他の実施形態においては、生物学的カスケードの機能障害の有無は、生体試料中の生物学的カスケードに関与する酵素を検出する試験反応のアレイを用いて検出される。方法には、酵素を含むか又は含まない対象からの生体試料が用意され、各試験反応において、シグナル部分を有する基質と生体試料とを接触させることにより試験反応のアレイを提供することが備えられている。酵素がもし存在する場合には、シグナル部分を有する基質を改変し、酵素による基質の改変はシグナル部分からシグナルを生じさせる。シグナル部分により生じたシグナルは、それから試験反応中に検出される。生じたシグナルは、対象中の生物学的カスケードの機能障害の存在を示す。
【００４６】
さらに別の実施形態においては、対象中の病的な医学的状態の治療処置の有効性を測定する方法が提供される。この場合には、少なくとも２つのアレイが用いられる。このアレイは、治療前、治療の間又治療後の異なる時点で得られる生体試料について、生物学的カスケード中の酵素活性の試験を行う。したがって、例えば、一方のアレイについては、試験される生体試料は治療を開始する前に得られ、もう一方のアレイについては、生体試料は治療の終了時点で得られることが可能である。他の例としては、生体試料は、異なる時点でなく、治療の間に得られることが可能である。さらに別の例として、生体試料は、治療前、治療の間及び治療後に得られることが可能である。
【００４７】
各々のアレイのための試料プロファイルは、参照プロファイルと比較される。治療を行ったプロファイルの間の違いの減少が、治療の有効性を示す。
【００４８】
その他の実施態様においては、生物学的カスケードは、図１にて図示したように試験され得る。各々のアレイのウェルにおいて、内在性基質を含むか又は含まない生体試料と、カスケードに関与する酵素とシグナル部分を有する基質とを接触させる。各々のウェル中の蛍光が測定され、活性プロファイルが図２に示すように作成される。
【００４９】
他の実施態様においては、生物学的カスケードに関与する酵素の不活性前駆体が利用され得る。本実施態様の例が図３に示される。酵素を活性化するために、第１の不活性酵素を活性化する第２の酵素が添加される。活性化された酵素は、その後１つ以上の基質に作用し得る。
【００５０】
（生物学的カスケードの例）
（凝固カスケード）
凝固は、血液が凝血塊を形成する複雑なプロセスである。それは、ホメオスタシス（傷ついた血管からの失血の停止）に関与している。凝固は血管内皮での血管の損傷後、ほぼすぐに開始される。血小板は、損傷部位に直ちに止血血栓を形成する。その後、凝固因子と呼ばれている血漿中のタンパク質は、血小板血栓を強化するフィブリン鎖を形成するために、複雑なカスケードで反応する。
【００５１】
凝固カスケードは、接触活性経路（内因性経路と呼ばれる）及び組織因子経路（外因性経路と呼ばれる）のフィブリン形成に至る２つの経路を有する。図４を参照すると、経路はセリンプロテアーゼのチモーゲン（不活性酵素前駆体）と、カスケードで次反応を触媒する活性要素になるために活性化される糖タンパク質の補助因子との一連の反応であり、最終的には架橋フィブリンをもたらす。セリンプロテアーゼは、特異的部位で他のタンパク質を切断することによって作用する。凝固因子は不活性チモーゲンとして循環する。表１は、多くの凝固因子を一覧表にしたものである。
【００５２】
【表１】
2011528916.tif 000002
【００５３】
（凝固プロテアーゼ・チモーゲンの構造）
凝固に関係するプロテアーゼのチモーゲンは、肝細胞により血流中に分泌され、小胞体に輸送される間に除去されるシグナルペプチドを含む。各チモーゲンのＣ末端端部の約２００のアミノ酸は、トリプシンと類似しており、プロテアーゼの活性部位のＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ残基を有する。それらのドメインは、プロテアーゼとそれらの基質、補助因子及び／又は阻害剤の間の特異的な相互作用に関係しているように思われる。
【００５４】
（非酵素的なタンパク質の補助因子）
非酵素的なタンパク質補助因子には、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子、組織因子及び高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）が含まれる。下記の表２を参照。第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子は、銅―結合性タンパク質であるセルロプラスミンと相同性を有する反復配列を含む大きな血漿タンパク質である。トロンビンは、活性化された因子（Ｖａ及びＶＩＩＩａ）を得るために、第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子を切断する。第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子は酵素活性を有しない。その代わりに、それらは、それぞれ、第Ｘａ因子及び第ＩＸａ因子のタンパク質分解の効率を増加させる補助因子として作用する。
【００５５】
組織因子は、通常では血漿と接触していない細胞表面に構造的に発現する非酵素的なリポタンパク質である。それは、「活性化された」単球及び、腫瘍壊死因子のようなさまざまなサイトカインにさらされる内皮細胞の表面に発現する。組織因子は第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解効率をおおいに増加させる。
【００５６】
【表２】
2011528916.tif 000003
【００５７】
（線維素溶解カスケード）
線維素溶解カスケード（図５を参照）は凝固系に反して作用し、フィブリン血栓がもはや必要でない時にフィブリン血栓の分解を引き起こす。さらに、損傷部位を越えて凝血塊が拡張を防止する役目も果たす。線維素溶解はｔＰＡ（組織型プラスミノゲン活性化因子）又はｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）により開始され、フィブリンの存在下で、プラスミノゲンのＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２のペプチド結合を切断することにより、プラスミノゲンをプラスミンに変換する。プラスミンはフィブリン血栓及び無傷のフィブリンを分解し、可溶性フィブリン／フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）にする。プラスミンも第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子を不活性化する（プロテインＣ及びプロテインＳと同様に）。ｔＰＡは内皮細胞によって産生される。プラスミノゲンの活性化は、フィブリン血栓の溶解の主要機構である。組換えｔＰＡは心筋梗塞、脳卒中及び、場合によっては、急性血栓症を治療するために用いられる。ｕＰＡは尿及び血漿によって産生され、腎臓管を凝血塊がないように保つ。ｕＰＡはプラスミンの非線維素溶解活性を開始する役割も果たす。過剰な線維素溶解は、プラスミン阻害因子（抗プラスミン、かつてはアルファ２−抗プラスミンと呼ばれた）及びプラスミノゲン活性化抑制因子１（ＰＡＩ−１）により調節される。ＰＡＩ−１は、肝細胞及び内皮細胞により合成されて血小板及び血漿に存在し、そして、フィブリンと結合可能であり、プラスミノゲン活性化因子のｔＰＡ及びｕＰＡを阻害することができる。ＰＡＩ−１は急性期反応物質タンパク質であり、基準値の３０−５０倍に増えることができ、全身的に管理されたｔＰＡをできる限り直ちに不活性化する。プラスミノゲンのホモ接合性欠損は木質結膜炎（珍しい型の慢性偽膜性結膜炎）に関連し、プラスミノゲンによる補充療法は治療的である。プラスミノゲンのヘテロ接合性欠損（血栓症患者の０．５〜２．０％）もｔＰＡ欠損も、増加した血栓症のリスクと関係しない。
【００５８】
（キニン・カスケード）
キニン−カリクレイン・カスケード（又はキニン・カスケード）は、炎症、血圧コントロール、凝固及び痛みに関与する。図６を参照。それらの伝達物質ブラジキニン及びカリジンは血管拡張薬であり、多くの細胞種類で作用する。キニンは小さいペプチドであって、組織損傷はこれらのペプチドの活性化を誘導し、血管拡張及び増加した通過性をもたらす。カリクレインの機能は、凝固及び線維素溶解カスケードの活性化を増幅することである。さらに、カリクレインは、白血球動員の間、血管拡張をもたらす強力な炎症伝達物質であるブラジキニンを産生するために、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）も切断する。
【００５９】
（シグナル伝達カスケード）
アポトーシスは、多細胞生物のプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）のある型である。それは、一種のＰＣＤで、特徴的な細胞形態及び死をもたらす一連の生化学的事象を含む。形態的な変化は、ブレブ形成、細胞膜の非対称性及び付着の損失のような細胞膜の変化、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝集及び染色体ＤＮＡ断片化を含む。生物に損傷を与えない細胞残屑の除去のプロセスは、アポトーシスをネクローシスと区別する。
【００６０】
Ｃ．エレガンスのｃｅｄ−３と相同性を有するシステインプロテアーゼであるカスパーゼは、アポトーシスの細胞死のほとんどの場合に活性化されるアポトーシスのシグナル伝達カスケードに関連している。カスパーゼの触媒活性は、高度に保存されたペンタペプチドＱＡＣＲＧ中のシステイン残基に依存する。カスパーゼは、それらの基質のＡｓｐ残基の後を特異的に切断する。
【００６１】
図７において、カスパーゼを含むシグナル伝達カスケードが示される。外因性及び内因性の経路の両方がアポトーシスをもたらす。多くの病理学的過程において、アポトーシス・カスケードの機能障害は、抑制されない増殖及び癌をもたらす。
【００６２】
（ＭＡＰＫカスケード）
分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、細胞外刺激（分裂促進因子）に反応して、遺伝子発現、有糸分裂、発生、分化、発癌性シグナルの伝達及び細胞の生存／アポトーシスのような、さまざまな細胞活動を調節するセリン／トレオニン−特異的プロテインキナーゼである。
【００６３】
ＭＡＰＫは、大部分の非核癌遺伝子の作用に関係している。それは、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）又は神経成長因子のような、成長因子への細胞応答に関与する。細胞外刺激は、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ（ＭＫＫ、ＭＥＫＫ又はＭＡＰ２Ｋ）及びＭＡＰキナーゼ・キナーゼ・キナーゼ（ＭＫＫＫ又はＭＡＰ３Ｋ）から成るシグナル伝達カスケードを介して、ＭＡＰキナーゼの活性化を導く。図８を参照。
【００６４】
細胞外刺激により活性化するＭＡＰ３Ｋは、そのセリン及びトレオニン残基上のＭＡＰ２Ｋをリン酸化し、そして、ＭＡＰ２Ｋは、そのセリン及びチロシン残基でのリン酸化によりＭＡＰキナーゼを活性化する。
【００６５】
すべてのＭＡＰＫ経路は、転写因子をリン酸化し、遺伝子発現を制御するための逐次的なリン酸化事象によって機能する。それらは、細胞内事象を制御するために、細胞質の標的をリン酸化することもできる。
【００６６】
（炎症カスケード）
炎症カスケードは、病原体、損傷した細胞又は刺激物などの血管組織の有害な刺激に対する複雑な生物学的反応である。組織に対する治癒過程を開始するのと同様に、有害な刺激を取り除くことは、生物による保護の試みである。内皮細胞中の炎症カスケードのモデルの例が、図９に示される。
【００６７】
（生体試料中の酵素の有無を検出するための酵素分析）
生体試料中の酵素活性を検出する方法は、よく知られており、国際公開第２００５／０１７９１号公報、国際公開第２００７／０２９２６２号公報及び国際公開第２００７／０４９２７６号公報に記載されている。得られた生体試料からの酵素活性の検出は、対象中の病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーの存在を示す。方法には、酵素を含むか又は含まない対象からの生体試料と、検出される酵素の基質とを接触させることが備えられている。酵素が生体試料中に存在する場合には、基質はシグナル分子を有しており、酵素は基質を改変してシグナル部分はシグナルを発し、対象中の病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーの存在を示す。ある実施態様としては、生体試料中の複数の酵素が、アレイを用いて検出され得る。
【００６８】
提供される方法により検出される若干の非限定的な病原体、疾患及び医学的状態には、菌類、酵母、細菌、癌、自己免疫疾患、神経変性障害及びアレルギーにより生じるものが含まれる。加えて、提供される方法には、癌の医学的状態、遺伝病、心臓の医学的状態（例えば心臓血管障害）及び凝固障害の診断のためにも利用され得る。
【００６９】
（治療の有効性の測定）
対象中の病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーの存在を検出することに加えて、提供される方法は、病原体、疾患又は医学的状態に対する治療の有効性を測定するのに役立つことができる。生体試料は、治療前、治療の間又は治療後の異なる時点で得ることができ、本発明の方法の酵素分析を受けることができる。ある実施態様においては、ある生体試料は治療の前に得られ、もう一方は治療の間に得られる。別の実施態様においては、ある生体試料は治療前に得られ、もう一方は、治療の終了後に得られる。さらに別の実施態様においては、２つ以上の生体試料が治療中に得られる。２つ以上の生体試料から生じたシグナルの違い（例えば、減少のような）が、治療処置の有効性を表す。
【００７０】
（分離工程）
提供される方法のいずれかは分離工程を含むことができる。本実施態様においては、この方法は、１）反応において、処理される基質と処理されない基質の間での分離、及び２）処理された基質のみの検出とからなる。分離は、抗体と抗原の間及び核酸の間、又は膜、チップ及びビーズといった固定された表面との結合を通じた２つの部分のいずれかの特異結合によって得られる。検出工程は、親和性及び、シグナル部分を介したものに基づくことの両方可能である。
【００７１】
分離ステップを含む本発明の方法で使用される基質は、Ａ、Ｂ及びＣの３つのパーツから成る（図１０）。特異性断部位を有する中心部の分子（セグメントＢ）は、切断された基質を検出する役目を有するシグナル部分（Ａ）の片端と結合している。他端で、部分Ｂは、処理された基質と未処理の基質との間を分ける分離部分（Ｃ）に接続している。分子Ｂの切断にあたり、基質は２つの断片：（１）Ａ部分及びＢの一部分を含むシグナル部分（ＴＳ）と、（２）Ｃ部分及びＢの一部を含む分離部分（ＳＳ）を生じさせる。
【００７２】
図１１は、提供される方法の実施態様を示す。基質はその酵素と反応して開裂し、セグメントＣが処理されたものと未処理の基質とを分けるために用いられる。この場合、セグメントＡは、親和性対の一部である。処理される際には、処理される基質のセグメントＴＳだけが（タギング分子を含む）その親和性対と結合する。したがって、親和性結合処理は、切断された基質のみが検出される。このようにして、処理された分子だけを検出することが可能である。
【００７３】
別の実施態様が図１２に示される。本実施態様において、基質がこれらの分離部分（Ｃ）は類似しているが、これらの特異的切断分子（Ｂ）は異なる場合、上述の方法を用いて、複数の基質の開裂が検出されることができる。この場合、各基質は切断部位（Ｂ）を有する中心部の分子に結合できる特有かつ異なるシグナル部分（Ａ）を有する。処理された及び未処理の基質間の開裂及び分離の後には、異なる（かつ処理された）基質のＴＳのみが、親和力により（上述した方法に応じて）、結合する。Ｃ（未処理の基質又は処理された基質のＳＳ）を含むいかなる分子も、分離部分によって、外へ分離される。種々の基質の異なったＴＳは、膜、ウェル、又はチップのような固体表面上の予め定められた位置に、各位置は１種類のＴＳだけと結合できるように、その結合パートナーを固定することにより識別することができる。どのＴＳが予め定められた位置に結合するのか分かっていることにより、加工された基質を特定することができる。各基質が基質開裂を開始した酵素に特異的であるので、酵素が特定でき、そして、対象中に存在するという病原体、疾患若しくは医学的状態又はそのバイオマーカーの推論が許容される。
【００７４】
さらなる別の実施態様としては、リバースｐＨシステム（ＲＰＨＳ）を利用する。本実施態様においては、セグメントＣは、すべての基質に共通する分子である。さまざまな基質と関連するセグメントＡは、異なるｐＨに感受性のある種々の色素を有する色素分子化合物である。開裂の後、反応混合物はセグメントＣに親和性を有するカラムにろ過される。図１０のセグメントＣを含む分子（未処理の基質又は処理された基質のセグメントＳＳ）は、カラムに保持される。処理された基質のセグメントＴＳのみ（セグメントＣを含まない）は、各々が異なるｐＨを有する多数のセルを有するチャンバーへ移される。いったんセグメントＴＳ（セグメントＡを含む）が異なるｐＨを有するセルと接触すると、セルはセグメントＡの特性に従って色を変化させる。このことは、どの基質が加工されたかについて示す。
【００７５】
分離システムのその他の例は、以下の内容を含む。
【００７６】
１．固定化分離システム（ＩＳＳ）−本実施態様において、図１０のセグメントＣは、ビーズ、ニトロセルロース膜、ビオチン−アビジン又は他の親和性対を介して固定された表面に結合されたスペーサである。開裂の後、未処理の基質又は処理された基質のＳＳは、固定化表面を反応混合物から分離することによって除去されて（抽出、遠心分離、濾過等によって）、処理された基質のＴＳのみが残る。この方法も、各基質の動態をモニターすることを可能にする。
【００７７】
２．動的分離システム（ＤＳＳ）−本実施態様は図１３に示される。このシステムにおいて、図１０のセグメントＣは、すべての基質に対して共通又は固有の特別な分子である。開裂の後、反応混合物は、膜やチップのような固体表面と接触する。膜は垂直であり、一番下にセグメントＣに親和性を有する部分を備える。膜の他の部分は、異なる基質のセグメントＡに親和性を有する部分を備えた異なる部分を含む。反応混合物は、毛管現象か電子力によって、膜又はチップの長さ方向に沿って進む。Ｃを含む分子（未処理の基質又は処理された基質のＳＳ）も、膜の一番下に保持される。処理された基質のＴＳのみ（Ｃを含まない）が、膜を上昇することができ、それらの予め定められた部位に親和性により結合することができる。
【００７８】
３．親和性ろ過システム（ＡＦＳ）−本実施態様において、反応混合物は、Ｃに親和性を有するカラムにろ過され、それゆえ、Ｃを含む分子（未処理の基質又は処理された基質のＳＳ）はカラムに保持される。カラムの流出物には、処理された基質のＴＳのみを含む。
【００７９】
（検出システム）
基質の改変は、多くの方法により検出され得る。検出方法の例としては、以下のものが含まれる。
抗体／受容体−基質−免疫化学は、基質と抗体又は受容体との間の結合を検出及び測定するために用いられ得る。
リガンド／受容体−基質−免疫化学は、基質とリガンド又は受容体との間の結合を検出及び測定するために用いられ得る。
マーカー−図１０のシグナル部分（Ａ）は、色、蛍光、ＦＲＥＴ又は他の測定可能な、可視若しくは容易に検出可能な分子を生じさせる分子であることができる。
ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリダイゼーション−ハイブリダイゼーションは、例えば、蛍光又はカラープローブの使用により、検出及び測定され得る。
酵素反応−シグナル部分（Ａ）は、色、蛍光又は他の測定可能な、可視若しくはその他の容易に検出可能な反応を触媒する酵素であることができる。
【００８０】
（反応条件）
反応条件は、本発明の方法の特異性及び／又検出感度を上げるために最適化され得る。最適化され得る反応条件の例には、反応温度、反応時間、溶媒、バッファー、プレート及びチューブが挙げられる。したがって、例えば、反応は室温及び体温を含めた環境温度で実行されることができる。ＣＳＦ試料中のエンテロウイルス分析のための最適化の実施例が、後述の実施例１６−２１で提供される。さらに、本発明の方法は、研究室環境において、又は現場条件において、実施され得る。
【００８１】
（阻害剤）
本実施形態においては、酵素活性の検出を妨げるような、基質の非特異的な改変が高いこともあり得る。この活性源は、基質を改変することが可能な非特異的酵素の存在によるものである。ヒトゲノムは、何百もの酵素をコードしており、そのうちには明らかな特異性を有しないものもある。これらの多数は総合的なバイオマティクスに基づいて生体試料中で特定されており、各組織／器官源は多くのこれらの非特異的酵素と関連している。典型的な組織／器官源には、筋肉、泌尿器、呼吸器、消化器、神経系、生殖器、皮膚、循環器、骨格及び内分泌系が含まれる。各非特異的酵素は、それらの標的配列を分析されることができ、そして、関心のある基質の配列と比較され得る。関心のある酵素の活性に最小の影響を及ぼす範囲において、阻害剤又は阻害剤のカクテルは選択されることができ、非特異的酵素の活性を阻害するために試料に加えられることが可能である。この種の阻害剤の例は、特に限定されないが、白血球試料中のＣＭＶプロテアーゼ基質に対する非異的活性を阻害するためのペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、Ｅ−６４、ヘパリン、ベスタチン、ＧＷ３１１６１６Ａ及びエグリンＣが含まれる。阻害剤の他の例としては、特に限定されないが、鼻洗浄試料中のヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）基質に対する非異的活性を阻害するためのＥ−６４、ペプスタチンＡ、アプロチニン、アセチル−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、ＥＤＴＡ＋ＥＧＴＡ、ＡＥＢＳＦ、エグリンＣ及びベスタチンが含まれる。
【００８２】
加えて、バックグラウンド・ノイズが、間接的に病原体によって生じる場合がある。例えば、多くの病原体は炎症を誘導するが、酵素又は病原体によって直接生じた基質の検出を妨げる可能性のあるさまざまな酵素反応を体内で誘導することができる。よって、本実施態様においては、１つ以上の阻害剤が感染症に伴う酵素活性を阻害するのに有用であってもよい。特定の実施態様においては、１つ以上の阻害剤は、髄膜炎により誘発された炎症による酵素活性を阻害する。
【００８３】
特定の実施態様において、１つ以上の阻害剤は、ウイルス性感染と細菌性感染とを識別するのに（例えば、ウイルス性髄膜炎と細菌性髄膜炎といったように）有用であってもよい。１つ以上の阻害剤は、ウイルス性髄膜炎のプロテアーゼ活性は阻害しないが、細菌性髄膜炎のプロテアーゼ活性を阻害するように選択され得る。このように、対象から得られる生体試料が、細菌性髄膜炎のプロテアーゼに対して選択的な１つ以上の阻害剤の存在下で、髄膜炎のプロテアーゼにより改変され得る基質と接触するときには、生じるシグナルは対象のウイルス性髄膜炎の感染を表す。１つ以上の阻害剤は、同様の疾患又は医学的状態を引き起こしている細菌性感染症を区別するために用いることもできる。例えば、１つ以上の阻害剤は、細菌性髄膜炎の感染によってひきおこされる、肺炎球菌の感染と髄膜炎菌の感染とを区別するために用いることができる。本実施態様において、１つ以上の阻害剤は、ウイルス性髄膜炎でなく肺炎球菌のプロテアーゼ活性を阻害するように選択されることができる。他の１つ以上の阻害剤は、ウイルス性髄膜炎でない髄膜炎菌のプロテアーゼ活性を阻害するために選択されることができる。さらに別の実施態様では、１つ以上の阻害剤は、肺炎球菌及びウイルス性髄膜炎でない髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害するために選択されることができる。このように、肺炎球菌プロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じる場合、及び髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じない場合には、その髄膜炎は髄膜炎菌である。同様に、髄膜炎菌プロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じる場合及び、肺炎球菌プロテアーゼ活性を阻害する１つ以上の阻害剤の存在下でシグナルが生じない場合には、その髄膜炎は肺炎球菌である。
【００８４】
（活性剤）
いくつかの実施形態では、活性剤は、反応混合物に加えることが可能である。ここで使用する「活性剤」とは、酵素の活性を誘導するか又は増加させる薬品であればいかなるものでも指す。本実施形態のひとつでは、活性剤はＮａ２ＳＯ４である。
【００８５】
（シグナルの増幅）
酵素又は生体試料の基質の濃度は、幾つかの例において値が低く、検出レベルを下回ることがある。例えば、細菌感染の際のプロカルシトニン濃度は、０．５ｎｇ／ｍｌ（４０ｐＭ）の低さのことがある。この種の低レベルを検出するために、シグナルの増幅が役立つことがある。シグナルの増幅は、チモーゲン活性化カスケードを利用することによって、成し遂げられることが可能である。チモーゲン又はプロ酵素は、不活性酵素前駆体である。チモーゲンは、活性酵素になるために、そのための生化学な変換（例えば、活性部位を現している加水分解反応又は活性部位を現すために構成を変えること）を必要とする。通常、前駆体酵素の特定の一部は、それを活性化させるために切断される。
【００８６】
例えば、開裂配列はチモーゲンの生成のために酵素に結合することがある。開裂配列は、生体試料に存在する可能性のある基質のそれと同一か似たものでもよい。酵素による配列の切断は、活性化タンパク質分解酵素を与えるチモーゲンの抑制をリリースする。この酵素はそれから定量化された１組のチモーゲンによって、反応する。そして、それは遊離酵素の定量化された量をリリースする。そして、それは特定の基質の定量化された量によって、反応する。反応ごとに、シグナルを検出できる。それによって、シグナルの増幅を生じる。生体試料が第１のチモーゲンをつくるために用いる開裂配列と競合する基質を含む場合、発生するシグナルは減少する。
【００８７】
（ノイラミニダーゼの検出）
ある実施態様においては、この方法は、生体試料の細菌の特定タイプと関連するノイラミニダーゼ活性を検出するために用いることができ、また、菌感染症を検出するために用いることもできる。ノイラミニダーゼ（別名シアリダーゼ、アシルノイラミニルヒドラーゼ又はＥＣ３．２．１．１８）は、動物及び多くの微生物の中で一般的な酵素である。それは、終端のα−ケトシジカル基に結合するシアル酸を糖タンパク質、糖脂質及びオリゴ糖から切断するグリコヒドロラーゼである。微生物の多数は、それらのノイラミニダーゼを表面に有し、人に対して病原性を有する。これらの病原性微生物は、コレラ菌、アースロバクター・ウレアファシエンスのような細菌を含む、そして、肺炎球菌性髄膜炎に関係する髄膜炎菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌を含む。髄膜炎菌及びインフルエンザ菌の若干の分離株では、ガラクトースと結合したシアル酸α−２，３を切断するノイラミニダーゼ酵素が発現する。髄膜炎菌種はシチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）及び５−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を認識する。その一方で、ヘモフィルス属インフルエンザはＮｅｕ５Ａｃの形だけを認識する（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ）。肺炎球菌種は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌ、ＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌ、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌ）に対するα−２，６結合を有するそれらと同様にガラクトースに対するα２−６結合を有するシアル酸含有基質を切断することを示した。ノイラミニダーゼ活性を検出することに役立つ他の結合は、α２−８、α２−９及び周期的なノイラミン酸の結合（例えば髄膜炎菌Ｂ及びＣ並びにアースロバクター・ウレアファシエンス）及び環状ノイラミン酸の結合（例えば緑膿菌）を含む。
【００８８】
このように、基質は、異なる細菌株から生じているノイラミニダーゼを区別するために構築されることが可能である。特定の糖タンパク質に付加する可能性のあるシアル酸の例は、下で示される。
【００８９】
2011528916.tif 000004
【００９０】
（ノイラミニダーゼ活性を検出することによる細菌性髄膜炎の発見）
生体試料の上記の細菌の検出は、特定のノイラミニダーゼ活性の検出により行うことができる。分析は、ＣＳＦ中の細菌性髄膜炎を発見するために行うこともできる。ＣＳＦ自体が内在性ノイラミニダーゼ活性を有しない場合、細菌性ノイラミニダーゼ活性の存在はＣＳＦ中の細菌の存在を示す。次に、生体試料のノイラミニダーゼ活性を検出するためのこの種の分析の非限定的な例について説明する。
【００９１】
（オリゴ糖類ビーズ及び蛍光標識リガンド（レクチン）に基づくノイラミニダーゼ検出）
ノイラミニダーゼ活性は、シアル酸及びそのリガンド（レクチン）を使用して検出されることができる。基質は、オリゴ糖類（磁気ビーズに結合させている）の一端上のシアル酸とシアル酸と関する蛍光標識されたレクチンとを備える。
ＳＮＡ−セイヨウニワトコレクチン、Ｎｅｕ５ＡＣ（２―６）Ｇａｌ＾＾に特異的なもの。
ＭＡＬ−イヌエンジュレクチン、Ｎｅｕ５ＡＣ（２―３）Ｇａｌ＾＾。
ＷＧＡ−小麦胚芽アグルチニンレクチン、大部分のＳｉ−グリカン構造。
【００９２】
図１４Ａ〜１４Ｂを参照のこと。ノイラミニダーゼによるこの基質の開裂は、蛍光標識されたレクチンの分離に基づくものである。磁気ビーズを沈降させた後、蛍光を上清において検出することができる。
【００９３】
ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌの使用は、全３つの髄膜炎に伴う細菌株の検出を可能とする。ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌの使用は、肺炎球菌種の検出を可能とする。そして、ＣＭＰ−ＮＡＮＡを使用することは髄膜炎菌種の検出を可能とする。
【００９４】
他の実施形態においては、多重分析として分析を行うことができる。この場合、シアル酸関連のオリゴ糖類は、上記の通りに磁気ビーズに結合している。ビーズ−オリゴ糖混合物は生体試料と最初に接触し、蛍光標識されたレクチンが添加される。試料に存在するノイラミニダーゼがない場合、レクチンはシアル酸と結合して、磁気ビーズによってプルダウンされる。図１５（左パネル）を参照。しかしながら、ノイラミニダーゼが試料に存在する場合、シアル酸はオリゴ糖類から隔離される。そして、レクチンはシアル酸と結合するが、磁気ビーズによってはプルダウンされない。図１５（右パネル）を参照。
【００９５】
（血清型の検出）
ある実施態様においては、提供される方法は、特定の病原体の血清型を検出するために用いることができる。この例では、病原体の酵素は、血清型の構成型の範囲内で、共通の開裂配列を認識する。あるいは、単一の基質の改変がそのクラスの病原体を表すように、病原菌の種は開裂配列の類似点に従って分類することができる。例えば、エンテロウイルス（ＥＶ）は、１２０の報告されたヒト病原体から成る。３Ｃプロテアーゼは、ウイルスのライフサイクルにおける酵素で、株間で比較的保存されている。プロテアーゼ及びそれらの基質が酵素とＣａｍｂ２基質［ＱＳＹ９−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−（Ａｌｅｘａ５３２）−ＮＨ２］（配列番号５９）の間に進化樹と３Ｄ構造モデリングを用いて分析される。それらは、８つのグループ（図１６を参照）に分類できる。
【００９６】
（グループ１及び６）
エンテロウイルスのグループ１は、クローン（合計７３中４０）で最も大きい数を有する。グループ１の大部分のクローンは、同一の結合部位を共有する。にもかかわらず、エンテロウイルス８１、エンテロウイルス８３及びエコウイルス２は、Ｐ４位置で切断部位のＶａｌ及びＩｓｏに置換がある活性部位の組成に若干の不規則性を有する。しかしながら、グループの残りのクローンのこの類似の開裂配列の存在は、これらの変化がリガンド−受容体相互作用に影響を及ぼさないことを示した。従って、これらのクローンは、エコウイルス３０及びコクサッキーウイルスＢ５として類似の挙動を示すことが予想される。グループ１をグループ６と比較すると、基質の端に置換があることが示される。Ｔｙｒに対するＰｈｅのこれらの置換及びＩｓｏに対するＬｅｕは物理化学的に保存されている。したがって、グループ１及び６は１つのグループに入れることが可能である。
【００９７】
（グループ２及び７）
エンテロウイルスのグループ２は、同一の活性部位を有する４つのクローン全部から成る。しかしながら、開裂配列には、位置Ｐ４及びＰ５に変換がある。位置Ｐ４にはまた、Ａｓｎ又はＴｈｒの変換がある。これは、活性部位における共同発展する位置は、配列においては存在しないこと、あるいは、そのＰ４には特異的な関係がない可能性があることを示す。グループ２及び７の開裂配列の違いは、それぞれＬ及びＭを有する位置Ｐ６の基質の端にある。そして、これらの置換は保存されている。しかしながら、予備的な結合の結果によれば、そして、ライノウイルス１４の３Ｃプロテアーゼの解析された構造の分析によれば、基質の位置Ｐ６は３Ｃプロテアーゼの表面の限られた部分の範囲内で見つかる、したがって、それは特異性を決定する要素としての役割を果たす可能性がある。
【００９８】
（グループ３）
エンテロウイルスのグループ３は、全てのメンバーは同一の結合サイトと開裂配列を有する。さらにまた、それぞれの位置Ｐ３、Ｐ４及びＰ５が、基質（Ｃａｍｂ２）（配列番号：５９）から、ＩＥＦに置換される。
【００９９】
（グループ４）
このエンテロウイルスのグループのほとんどすべてのメンバーは、同じ切断部位配列及び同じ活性部位を共有する。唯一の変異した株はコクサッキーウイルスＡ１３である。そして、それは、Ａｓｎ及びＰｈｅの代わりに、それぞれ位置Ｐ４及びＰ５にＧｌｕ及びＰｈｅを有する。従って、コクサッキーウイルスＡ１３はグループ３に割り当てられることも可能である。そして、それはまた、位置Ｐ４及びＰ５で、又は、このグループにＧｌｕ及びＰｈｅを有する。いずれの場合においても、アミノ酸の置換は物理化学的に保存されている。
【０１００】
（グループ５及び８）
これらのエンテロウイルスのグループは、荷電アミノ酸の固有の特徴を位置Ｐ４（Ａｒｇ又はＬｙｓ）に示す。
【０１０１】
このように、それが酵素により改変されるときに、血清型又は病原体のサブグループを表すような基質を設計することができる。
【０１０２】
（キット）
酵素や基質を含み、本願明細書で記載されている方法に用いられるキットが提供される。本実施態様においては、キットの構成要素は、個別に包装されて使用の直前に混ぜられることが可能である。その他の実施態様としては、２つ又はより多くの構成要素が、一緒に包装されることができる。典型的なキットには、以下の試薬の１つ以上を含むことができる：酵素又は基質を含まない陰性対照試料、酵素又は基質から成る陽性対照試料、シグナル部分からの検出可能なシグナルの発生のためのシグナル生成試薬、試料収集手段（例えばシリンジ、綿棒又は他の試料回収装置）及び分離を実行するための試薬を含む。キットには、阻害剤及び／又は酵素の活性剤を含むこともできる。
【０１０３】
キットに含まれる試薬の包装は、例えば、ガラス、有機ポリマー、セラミック又は金属から作られるアンプルを含むことができ、瓶、エンベロープ、試験管、バイアル、フラスコ、シリンジ、などを含む。
【０１０４】
キットは、説明書と共に供給されることもできる。説明は紙に印刷されていてもよいし、又は、フロッピー（登録商標）ディスクのような、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭその他の電子フォーマットにおいて、供給されることができる。詳細な説明は、キットに物理的に付属してはいなくてもよく、その代わりとして、電子メールとして供給されるものの中で、ユーザは、キットの製造業者又は販売業者により示されるインターネット・ウェブサイトに誘導されるようにすることができる。
【０１０５】
以下の実施例は、この開示を説明するためのものであって、その範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１０６】
（２基質によるキモトリプシンの競合阻害の実証）
試薬および器具：
【０１０７】
2011528916.tif 000005
【０１０８】
希釈及び反応緩衝液：１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）
基質−１：Ｃａｍｂ−２．４（Ｃａｍｂ２基質のバッチ）：Ａｌｅｘａ  ５３２フルオロフォアに基づくＦＲＥＴ基質
基質−２：市販の比色ベース（４２０ｎｍ）のａ−キモトリプシン基質。１：１のＨＥＰＥＳ／ＤＭＳＯに２０ｎＭとなるよう溶解し、さらにＨＥＰＥＳバッファーで１：１０に希釈した。
酵素−ａ−キモトリプシン：市販のａ−キモトリプシン−タイプＩＶは、ＨＥＰＥＳバッファーで希釈し２０μｇ／ｍｌのストックとした。
蛍光計：ＤＭＶ、ポールスターギャラクシー。パラメーター：Ｅｘ．  ５３１ｍｍ、Ｅｍ．５６０ｍｍ、温度：室温、総読み込み時間：１０分、ゲイン９０。
すべての試験は３つ組試験で行われた。
【０１０９】
（反応手順）
溶液−１：ＨＥＰＥＳバッファー。
溶液−２：基質−１のストックは、１０００μｌのＨＥＰＥＳで１：１０に希釈し、１００ｎＭの２×溶液とした。
溶液−３、ａ−ｄ：基質−２のストックはそれぞれＨＥＰＥＳで１：１０に希釈し、その希釈液の１０μｌをそれぞれ４０μｌのＨＥＰＥＳに希釈した。ａ−４００μＭ、ｂ−４０μＭ，ｃ−４μＭ，ｄ−４００ｎＭ（１０×溶液）
溶液−４：酵素のストックは、３００μｌのＨＥＰＥＳで１：２０に希釈し、１０×溶液とした。
【０１１０】
マルチチャンネルピペットを用いて、上記の各溶液を、非付着性黒底９６ウェルプレートの列Ａ−Ｃ、カラム１−６に加えた。溶液−１を３０μｌ及び溶液−２を５０μｌ、各ウェルに加えた。列Ａ−Ｃに、溶液−１の１０μｌをカラム１及び２に加え、溶液−３ａの１０μｌをカラム３に、溶液−３ｂの１０μｌをカラム４に、溶液−３ｃの１０μｌをカラム５に、そして溶液−３ｄの１０μｌをカラム６に添加した。列Ａ−Ｃに、溶液−１の１０μｌをカラム１に添加し、溶液−４の１０μｌをカラム２−６に添加した。次いで蛍光計の読取を開始した。
【０１１１】
（結果）
【表３】
2011528916.tif 000006
【０１１２】
上記の条件で、２種の基質のおよそ１：１のモル比において、１０％の競合阻害が見られた。競合状態は対数関数的なスケールで確認できた。酵素濃度を変えること、基質１の濃度を低下させること、蛍光計のゲインを強めることでさらに高い測定感度を得ることができる。
【実施例２】
【０１１３】
（細菌感染検出のためのプロカルシトニン（ＰＣＴ）検出）
細菌感染に対する宿主反応は、複雑な免疫機構の活性化及び炎症伝達物質の豊富な放出が含まれる。プロカルトシニン（ＰＣＴ）は、最近、非常に重篤な患者の細菌感染の標識として提唱されている。ＰＣＴは、カルシトニンのプロホルモンと同一の配列を有する１１６のアミノ酸ペプチドである（Ｍｕｌｌｅｒなど、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ（２０００）２８：９７７−８３．図１７）。通常の代謝条件では、ＰＣＴは、甲状腺のＣ細胞に存在するだけである。しかしながら、細菌感染および敗血症では、完全な、又は切断された（３−１１６アミノ酸）ＰＣＴが血液で見出され、さらに重要なことに、そのレベルは敗血症の重篤性と相関している。さらにまた、微生物感染症において、そして、炎症の様々な形態により、いくつかのカルシトニン前駆体で、成熟したカルシトニンでなくＰＣＴを含むものの計算上の濃度が、数千倍の規模まで増加する。この増加および特にその経路は、病状の重篤さ及び死亡率と相関する。まず最初に、１１６のアミノ酸からなるプロカルシトニンが分泌される。ジペプチダーゼによる急速な開裂による１１４アミノ酸の長いプロカルシトニンが、この経路で見出される。さらなる開裂により、アミノプロカルシトニン、未発達のカルシトニン及びカタカルシンとして従来より知られるカルシトニン・カルボキシ・ペプチド−Ｉ（ＣＣＰ−Ｉ）に至る。敗血症において、これらのペプチドは様々に増大し、それらはしばしばな遍在的な発現及び分泌量において膨大なレベルとなる。しかしながら、成熟したカルシトニンの血清濃度は、甲状腺ｃ−細胞においてのみ、正常か又はわずかに増加するのみにとどまる。
【０１１４】
従って、敗血症または炎症の間、プロカルシトニンの血中濃度は上昇する。細菌性髄膜炎の場合、脳脊髄液のＰＣＴのレベルと細菌性髄膜炎の間には１００％の近くの高い相関が報告された。それ故、血液又はＣＳＦのプロカルシトニンの濃度を定量することは、細菌性感染症（例えば細菌性髄膜炎）を発見することに役立つ。
【０１１５】
この例では、競合阻害は、プロカルシトニンを検出するために利用される。この方法では、以下の組成物からなる。
１）プロホルモン・コンバターゼ１（ＰＣ１）のような、ＰＣＴを切断できる１種以上の酵素。
２）対応する１種以上の誘導体を合成するために、ＰＣＴを切断できる１種以上の酵素により改変され得る１種以上の基質化合物。同じか異なるシグナル部分を有する基質化合物の各々が、この基質化合物に結合する。酵素が存在する場合には、１つ以上の基質化合物は、ＰＣＴで生じる改変と同一かそれに類する改変を受ける。例えば、１つ以上の酵素について低い親和性を有するものについては、１つ以上の基質は、切断部位がＰＣＴの切断部位と同一か類似する切断部位を有する。
【０１１６】
分析は、２つの別々の試料により実行され得る：ＰＣＴを含まない対照試料及び生体試料（例えば血液又は脳脊髄液）を含む試験試料。１種以上の酵素および１種以上の基質化合物は、各試料に加えられる。
【０１１７】
ＰＣＴが試験試料に含まれていない場合は、基質化合物は両方の試料に同じ割合になるよう調整される（例えば分割される）。しかしながら、試験試料がＰＣＴを含む場合、例えば、細菌を含む試料の場合、ＰＣＴは試料に存在する酵素に対する競合的な基質として働き、その結果、試験試料との割合で加えられた対照試料の基質化合物から呈されるより低い総合的な活性が示される。
【０１１８】
分析から得られる値は、臨床参考テーブルと比較されることもできる。テーブルは、ＰＣＴ濃度の範囲を含み、確立した臨床データに由来するものがあり、細菌性敗血症の重篤性との関連づけに用いることができる。
【０１１９】
高いＰＣＴ濃度の試験結果は、敗血症の結果を示し、適切な薬物治療を可能にする。低いＰＣＴ濃度の試験結果は、通常の対象のレベルを示して、適切な処理および更なるテストにつながる。
【０１２０】
感染の間のＰＣＴレベルは、０．５ｎｇ／ｍｌ（４０ｐＭ）と同じくらいの低くてもよい。増幅システムは、低レベルの感染を検出するために有益である。したがって分析法は、酵素の反応から検出したシグナルを増幅するための増幅のシステムを含んでいるものでもよい。例えば、ＰＣＴの開裂配列を、プロ酵素のチモーゲン分子（例えばプロトロンビン）に融合できる。例えばＰＣ１やその他のＰＣＴ配列の認識酵素によるＰＣＴ配列の開裂は、プロ酵素を活性タンパク質分解酵素（例えば、トロンビン）にすることの抑制を引き起こす。この酵素は定量化されたプロ酵素のセットによって、反応する。そして、それは遊離酵素の定量化された量を示す。そして、それはこの酵素（例えば、トロンビン基質と反応しているトロンビン）のための特定の基質の定量化された量によって、反応する。
【０１２１】
分析のシグナル強度は、ＰＣＴを含まないコントロール試料に対する、プロ酵素−酵素の異なる濃度によって、定量化される。定量化された反応をＰＣＴの異なる濃度にさらすことは、最初のシグナルの強度を低下させる。プロカルシトニン量は、最終的な信号の強度から算出される。増幅のための方法は、０．５ｎｇ／ｍｌ程度に低い血清のＰＣＴ濃度の検出を可能にする。
【０１２２】
したがって、ＰＣ１または他のＰＣＴを改変している酵素に関連して用いられることが可能である基質の例は、以下を含むが、これに限定されるものではない：
１．ＰＣ−１の切断部位を含むＰＣＴのアミノ酸配列８−２０から成るＦＲＥＴ基質。
２．ＰＣ１の開裂の後に生じるｐＮＡ比色標識から成るＰＣＴのアミノ酸配列３−６０。この分析は、標識基質からの開裂の後の発色団ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の発色団の分光測光法の検出に基づく。ｐＮＡの発光は、４００−又は４０５−ｎｍで分光光度計またはマイクロタイタープレートリーダーを使用して定量化されることができる。
３．プロ酵素：生体試料のＰＣＴは、ＰＣ１の特異的切断配列から成るプロ酵素と比較される。ＰＣ１による開裂の後、プロ酵素は、シグナル部位を有する基質を改変させるために活性化され、シグナルを生じさせる。
４．全長プロカルシトニン（１１６アミノ酸）
５．ＧＫＫＲ配列を含む、プロカスパーゼ３チモーゲンは、４−２０アミノ酸の活性剤キャップで、酵素活性部位をカバーし、ＧＫＫＲ（配列番号１）またはＲＲＫＫ（配列番号２）配列及び、その中の２つの隣接する塩基性アミノ酸（Ｒ＆Ｋ）のいくつかの他の組合せを含む。
【実施例３】
【０１２３】
（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌毒素の検出）
ここで提供される方法は、例えば、ＭＲＳＡの特定のペプチドのタンパク質濃度を定量化することによって、市井獲得メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＣＡ−ＭＲＳＡ）又は均一にメチシリンに対して耐性を示す黄色ブドウ球菌（ＨｏＭＲＳＡ）を検出するために用いることもできる。この種のペプチドの例は、２１アミノ酸のペプチドのフェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）（ＭＲＳＡの多くの疾患の特徴の原因となる）である。他の実施例は、ＨｏＭＲＳＡのより高いレベルにおいて発現するパントンバレンタインロイコシジン（ＰＶＡ）毒素の検出である。
【０１２４】
グルタミル・エンドペプチターゼは、１６位置のアミノ酸ＧｌｕにおいてＰＳＭを切断する。ＰＳＭを検出するために、ＭＲＳＡの生体試料は、グルタミル・エンドペプチターゼ並びにシグナル部分及びＰＳＭと競合するグルタミル・エンドペプチターゼ切断部位を備える基質と接触される。このシグナル部分からのシグナルが測定される。ＰＳＭを含まない対照試料と比較してシグナルの違いがあるかどうかが決定される。シグナルの違い（例えば減少）が対照試料と比較してある場合、その違いは生体試料のＰＳＭの存在を示す。
【０１２５】
ここに提示する方法に従って検出できる他の典型的な黄色ブドウ球菌の抗原には、以下が含まれる：リビトール、ポリサッカライドＡ、ポリサッカライドＢ、テイコ酸、プロテインＡ、ＰＶＡ毒素、ＰＳＭ毒素、凝固促進酵素、ブドウ球菌キナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、ヘモリシン：α、β、γ、δ、バレンタインロイコシジン、ＬＵＫ、表皮剥脱内毒素、毒素性ショック症候群毒素、エンテロトキシンＣ、Ｄヘモリシンγ、ロイコシジンパントン−バレンタイン、ＴＳＳＴ−１、ペニシリン結合タンパク質２及びブドウ球菌内毒素。
【実施例４】
【０１２６】
（真菌感染の検出のための基質）
全身性真菌感染（真菌血症）は、病的状態の原因および免疫不全の患者（例えば、エイズ、癌化学療法、器官又は骨髄の移植）の死亡原因となっている。加えて、これまで危険にさらされているとみなされない患者（例えば集中治療室の患者）の院内感染は、主要な健康懸念の原因になっている。それ故、真菌感染は、診断および治療の目標として挙げられる。
【０１２７】
この方法はさまざまな菌類、例えば、カンジダ菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガーツス、コウマクノウキン門、ツボカビ門、ディカリア、グロムス門、微胞子虫類及びネオカリマスティクスの検出のために利用される。
【０１２８】
カンジダ菌（人間においては、消化管、口および陰部で見出される）は、真菌感染に関係する最も一般の微生物のうちの１つである。カンジダ属（例えば、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）によって生じる３つの主要な細胞外加水分解酵素群は、分泌アスパルチル・プロテイナーゼ（Ｓａｐ）、ホスホリパーゼＢ酵素及びリパーゼである。
【０１２９】
特異的酵素のひとつはＳａｐ２である。Ｓａｐ２は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの培養菌において豊富に発現し、従って、カンジダ感染症の発見の有力なターゲットである。Ｓａｐ２切断部位は、開裂部位（「Ｐ１」部位）のＮ末端アミノ酸のフェニルアラニンの選択性を示す。分泌イムノグロブリンＡ、インシュリンＢ、アルブミン及びコラーゲンを含むＳａｐ２の基質の複数の配列アラインメントは、公知の方法で利用できる配列を提供する。加えて、そのアラインメントは、真菌感染の疑いのある生体試料に存在する可能性のある天然の基質と競合する人工の基質の構築を許容する。このアラインメントは、下記の表４に示される。
【０１３０】
【表４】
2011528916.tif 000007
【実施例５】
【０１３１】
（癌の検出）
癌化のプロセスは、遺伝子の発現パターン及びより具体的にはプロテアーゼの発現パターンを変化させる。これらのプロテアーゼは、細胞内制御の、更には細胞外活性の一部である。細胞外活性は、活性の低下及び細胞外マトリックスの組織の再構築を含み、それらは悪性腫瘍と関係している。そして、プロセスは主にメタロプロテイナーゼによって行われる。
【０１３２】
数種類の癌バイオマーカー（例えばα−フェトプロテイン（ＡＰＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びＣＹＦＲＡ２１）が特定されている。ＰＳＡは、精漿において最も豊富なカリクレイン様セリンプロテアーゼで、成熟期の開始の後は血清において検出が可能である。血流へのＰＳＡの逆行的な放出は、若い健常な男性に稀に発生し、分泌されたＰＳＡ分子のうち１００万分の１より少ない頻度で発生する。前立腺の疾患において、この血液への漏出は非常に増加する。そして、それ故、血清ＰＳＡは前立腺癌のマーカーとして役立つ。しかしながら、医療の場でのＰＳＡ試験はしばしば、高い偽陽性率が欠点である。いくつかの研究は、他のカリクレインのようなプロテアーゼ（例えばＫＬＫ２、ＫＬＫ４及びＫＬＫ１）を検出することによるＰＳＡの診断値を改善しようとした。さらに、血液中でＰＳＡがほとんど触媒活性を示さないことを見出した。これは主にプロテアーゼ阻害剤（例えばα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α２−マクログロブリン及びプロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）が１０５倍以上過剰であることに起因する。そして、それは血清中で安定な共有結合複合体を形成することによって、いかなる触媒ＰＳＡも不活性化する。したがって、血液中のＰＳＡは複数の形態、遊離状態又は、さまざまなプロテアーゼ阻害剤との複合体で存在する。ＰＳＡ（それは全血液ＰＳＡの約５−３５％を構成する）の遊離状態の形態は、触媒的に不活性である。しかしながら、ＰＳＡの光分解の活性は、１．３ＭのＮａ２ＳＯ４の存在下では、１０３倍以上に増加する。従って、カリクレインファミリーのメンバーの活性を決定するために、プロテアーゼの検出を増加させるように活性剤を生体試料に加えてもよい。あるいは、複合体の形成は、親和性クロマトグラフィーによって逆転することができ、活性ＰＳＡを放出できる。遊離活性ＰＳＡの酵素活性は、ＰＳＡにより改変されるＰＳＡ基質を使用して検出することができる。ＰＳＡの検出に役立つ可能性のある基質の例としては、以下が挙げられる。
ＨＳＳＫＬＱ（配列番号１５）
ＱＦＹＳＳＮ（配列番号１６）
ＧＡＧＬＲＬＳＳＹＹ−ＳＧＡＧ（配列番号１７）
ＳＳＩＹＳＱＴＥＥＱ（配列番号１８）
基質は、さらに、ＰＳＡにより改変される基質の検出を許容し、改変に基づくシグナルを生じさせるシグナル部分を有する。生じる信号は、例えば、蛍光でもよい。
【実施例６】
【０１３３】
（アレイを用いた脳卒中及び凝固カスケードの検出）
凝固カスケードのための分析は、図１８に示すように行われ得る。各試験管には、凝固カスケードの動力学的に調製された既知濃度のセリンプロテアーゼ酵素と、その基質が入っている。基質には、特異的切断部位とシグナル部分とが備えられ、天然基質の力学的特性が保持されている。
【０１３４】
生体試料は、各試験管に加えられる。試験管中のプロテアーゼの基質が生体試料中に存在する場合、それはシグナル部分を有する基質と競合し、反応は、ＦＲＥＴ基質ベース分析又は蛍光分極化によって分析することができる。
【０１３５】
生体試料は異なる個体群から得ることが可能である。そして、脳卒中及び血液疾患の危険がある人々のプロファイルは、凝固カスケードのシグナルのマーカーの活性に基づいて作成されることができる。例えば、試料は、健常なドナー、脳卒中の危険があるドナー及び脳卒中のドナーから得ることが可能である。
【実施例７】
【０１３６】
（アロマターゼの検出）
アロマターゼは、シトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーであり、アンドロゲンを芳香族化し、エストロゲンを生産する。ステロイドは、４つの融合されたリングから成る。アロマターゼは、酸化に続くメチル基の除去によって、ステロイドの左側のリング（Ａ−リング）を芳香基（その名の由来である）に変換する。
【０１３７】
【化１】
2011528916.tif 000008
【０１３８】
アロマターゼ酵素は、性腺、脳、脂肪組織、胎盤、血管、皮膚、骨、子宮内膜において、また同様に子宮内膜症、子宮フィブロイド、乳癌及び子宮体癌を含む多くの組織に見られ得る。閉経後の女性が循環する血漿エストロゲンを低レベルで有する一方、乳癌組織自体において起こるエストロゲンの局在的な合成または腫瘍内の生産は腫瘍のより高いエストロゲン発現レベルにつながることがある。このように、アロマターゼ阻害剤は、病変がエストロゲン受容体陽性であるとわかった乳癌患者の管理に役立つようになった。
【０１３９】
アロマターゼは、性腺内分泌機能で最終的に発現する。腫瘍内のアロマターゼは、閉経後エストロゲン受容体の乳癌患者の臨床治療の標的であると考えられた。しかしながら、臨床患者でのアロマターゼ発現の検出のための所定の評価方法は、確立されなかった。
【０１４０】
ヒト組織のアロマターゼの局在分布の検査は、おそらく、悪性腫瘍レベルに関連した情報を伝えることによって、より良好な処置を閉経後の乳癌患者に提供することと、同様に内分泌系の機能のための診断ツールとして用いられる。
【０１４１】
提供される方法は、異なる組織を分析し、アロマターゼレベルを悪性腫瘍の測定及び閉経後の女性の内分泌系の機能として検出するために用いることができる。アロマターゼの検出に役立つ基質の例は、メトキシ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＭＦＣ）で、アロマターゼによって急速に高い蛍光物質に変換される蛍光基質、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル−クマリン（７−ＨＦＣ）を含むものである。このように、患者から得られた生体試料はＭＦＣと接触させられ、それの蛍光は生体試料中のアロマターゼの存在を検出するために測定され得る。
【実施例８】
【０１４２】
（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の検出のための基質の設計）
（組換えＣＭＶプロテアーゼの生産）
ＣＭＶはセリンプロテアーゼをコードし、その触媒ドメインは７４  ｋＤａの前駆体（ｐＰＲ、ｐＵＬ８０ａ）からの自己開裂によって生じたアセンブリン（２８ｋＤａ）であるものである。アセンブリンは、セリンプロテアーゼで、その構造研究によってＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒの触媒の三つ組と、特徴的なタンパク質フォールド部位を有することが示されている。酵素の研究は、それがホモ二量体化によるアロステリック活性を呈することを示した。その解離定数は、ほぼ１μＭであり、相対的に、構造を強化する（コスモトロピックな）塩類（例えばＮａ２ＳＯ４）によって、約２桁のオーダーまで減少させることができる。
【０１４３】
当初、ＣＭＶプロテアーゼは、ＣＭＶによって作られる内在性プロテアーゼを模した酵素の供給源としてクローンされた。組換えプロテアーゼのさらなる用途は、陽性対照、分析の評価、最適化及び正常化を含む。
【０１４４】
ヘルペスウイルス５（ＣＭＶ）、ＡＤ−１６９株（ＡＴＣＣ番号、ＶＲ−３５８）をクローニングのテンプレートとして、ＡＴＣＣから購入した。製造業者の指示に従ってトポイソメラーゼ・クローニングベクター（ｐＥＴ１５１／Ｄ−ＴＯＰＯ、インビトロジェン）への定方向クローニングを容易にするために、フォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号６０）に、５’プライマー伸長分ＣＡＣＣ（配列番号６１）が加えられた。リバースプライマー（５’−ＴＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＣＧ−３’）（配列番号６２）は停止コドン（ＴＧＡ）を３’プライマー末端に導入するため用いられた。ＣＭＶプロテアーゼ遺伝子を増幅するためのＰＣＲには、校正ポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ、ＮＥＢ）が用いられた。ＰＣＲ産物は精製され、それらの完全性は塩基配列決定により検査された。それらは、ｐＥＴ１５１／Ｄ−ＴＯＰＯ (インビトロジェン)に直接クローニングされ、大腸菌ＢＬ２１表現株に形質転換された。
【０１４５】
ＣＭＶプロテアーゼはＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン、カタログ番号３０２１０）によって精製された。それは変性（８Ｍ尿素によって）条件下にあり、６×Ｈｉｓタグを利用して発現ベクターのプロテアーゼによって行われた。純度は、概して濃度測定分析によって、ほぼ９５％近かった。精製後は、ＣＭＶプロテアーゼは見かけ上の分子量６−８ｋＤａカットの透析バッグを使用し、一連のグアニジン塩酸バッファーによって、リフォールドされた。透析の後、リフォールドされたプロテアーゼは、ストレージバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、  １５０ｍＭのＮａｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％  グリセロールｐＨ７．５）において、等分されて−７０℃で保存した。プロテアーゼの濃度は、フルオロプロファイル（商標）タンパク質定量キットを用いて蛍光分光学により算出された（シグマ、カタログＦＰ００１０）。
【０１４６】
（基質）
ペプチドは、ＣＭＶプロテアーゼのための競争的基質として用いられるように設計された。ペプチド配列は、ＣＭＶプロテアーゼの第一の開裂配列を模倣するように設計されていた。ＨＣＭＶプロテアーゼ切断部位配列は公知であり（バウムなど、「ヒトサイトメガロウイルスｕ１８０のプロテアーゼ切断部位変異体のタンパク質分解活性」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９４年６月；６８（６）：３７４２−３７５２）、そして、以下の表５においても提供される。
【０１４７】
【表５】
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【０１４８】
ＣＭＶのＵＬ８０ポリタンパク質の３つの周知のプロテアーゼ切断部位から推論されるＨＣＭＶコンセンサス切断部位は、ＶＸＡ（Ａ／Ｓ）である（配列番号２３、上の表５を参照）。ＣＭＶ感染症も発見するために有用な基質についての知見では、コンセンサス配列はＶＶ（ＸはＫでない）Ａ−／−Ｓ (配列番号２４）又はＶＶＮＡ−／−ＳＣＲ(配列番号２５）である。ＵＬ８０切断部位の範囲内の１つのアミノ酸置換突然変異の研究は、切れやすい結合と関連する位置であるＰ３、Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸の重要性を確認した。
【０１４９】
ＣＭＶ感染症を発見するための役立つ基質の具体的な例としては、以下があげられる。
（Ｄａｂｃｙｌ）−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ−／−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−（ＥＤＡＮＳ）（ここではＢａｃｈ１という）（配列番号２６）。
ＱＳＹ９−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ−／−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｃ（ａｌｅｘａ５３２）−ＮＨ２（ここではＣａｍｂ３という）（配列番号２７）
ＱＳＹ９−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ａ−／−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｃ（ａｌｅｘａ５３２）−６ＸＰＥＧ−Ｋ（ビオチン）−ＮＨ２（ここではＣａｍｂ４という）（配列番号２８）
“−／−“の記号は、プロテアーゼによる切断部位を意味する。
【０１５０】
Ｂａｃｈ１は、バッヘム（ロット番号０５６３７８９）の市販のペプチドである。ペプチドＣａｍｂ３及びＣａｍｂ４は、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ社、クリーブランド、英国により合成されたものである。
【０１５１】
組換えプロテアーゼの活性は、基質（Ｂａｃｈ１）を使用して検査された。組換えプロテアーゼは、標準検定バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、  ５％グリセロール、０．９ＭのＮａ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．５）中でＢａｃｈ１を混合した。反応は、マルチ・プレート蛍光リーダーを使用してモニターされた（ＢＭＧフルオスター、Ｅｘ．３４０ｎｍ、  Ｅｍ．４９０ｎｍ）。図１９に、４μＭのＢａｃｈ１に対する２００ｎＭのＣＭＶプロテアーゼの活性を示す。
【０１５２】
（基質特異性および交差反応性）
この試験方法がＣＭＶの検出に特異的であるか、試験されたヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）、エンテロウイルス（ＥＶ）（ＣＯＸ及びＥｃｈｏ）、ＳＡＲＳ及びＣＭＶのプロテアーゼ間の交差反応に特異的であるかについて測定を行った。反応は、基質のストック溶液の１００μＬを標準検定バッファーの各プロテアーゼの１００μＬに加えることにより開始された。４μＭの基質には、ＰＥＰ１（ＨＲＶに対する）［（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｑ−／−Ｇ−Ｐ−Ｄ（ＥＤＡＮＳ）−Ｓ−Ｑ］（配列番号６３）、Ｅｌｍ１（ＥＶに対する）［Ｋ（ＤＡＢＣＹＬ）Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｙ−Ｅ（ＥＤＡＮＳ）Ａ］（配列番号６４）、ＰＥＰ６（ＳＡＲＳに対する）［（ＤＡＢＣＹＬ）Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ（ＥＤＡＮＳ）Ｋ］  （配列番号６５）、及びＢａｃｈ１（ＣＭＶに対する）［（ＤＡＢＣＹＬ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−（ＥＤＡＮＳ）］が使用され、それぞれ、ＨＲＶ、ＥＶ、ＳＡＲＳ及びＣＭＶのプロテアーゼの５０ｎＭ、１００ｎＭ、１．５μＭ及び２００ｎＭが使われた。実験は３つ組試験で行い、２回繰り返された。
【０１５３】
表６に示すように、ＣＭＶプロテアーゼが完全に特異的であるとわかった。ＣＭＶプロテアーゼはＣＭＶプロテアーゼ切断部位を含む基質のみを切断し、他のプロテアーゼの切断部位に対しては切断しなかった。
【０１５４】
【表６】
2011528916.tif 000010
【０１５５】
この方法により、少なくとも、次のウイルスを検出できる：アカゲザル・サイトメガロウイルス６８−１株、ヒト・ヘルペスウイルス５（１０４２株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（１１９株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（２３８７株）、ヒト・ヘルペスウイルス（４６５４株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（５０３５株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（５０４０株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（５１６０株）、ヒト・ヘルペスウイルス５（５５０８株）、ヒト・ヘルペスウイルス５ＡＤ１６９株、ヒト・ヘルペスウイルス５アイゼンハート株、ヒト・ヘルペスウイルス５マーリン株、ヒト・ヘルペスウイルス５ＰＴ株、ヒト・ヘルペスウイルストレド株、ヒト・ヘルペスウイルス５タウン株、チンパンジー・サイトメガロウイルス、ヨザル・ヘルペスウイルス１、ヒヒ・サイトメガロウイルスＯＣＯＭ４−３７、オナガザル・サイトメガロウイルス１、クチヒゲグエノン・サイトメガロウイルス１、アカコロブス・サイトメガロウイルス１、コロブスゲレザ・サイトメガロウイルス１、ヨーロッパジネズミ・サイトメガロウイルス１、カニクイザル・サイトメガロウイルス１、マンドリル・サイトメガロウイルス、イボイノシシ・サイトメガロウイルス１、オランウータン・サイトメガロウイルス１、ブタ・サイトメガロウイルス、類人猿サイトメガロウイルス。
【実施例９】
【０１５６】
（白血球（ＷＢＣ）中のＣＭＶの検出）
ＣＭＶは、内皮、上皮、線維芽細胞及び白血球を含む多くのタイプの細胞に感染する。ＣＭＶプロテアーゼは、血液へ放出される可能性がある。血液試料のＣＭＶプロテアーゼの検出の第一段階は、全血において機能することであった。しかしながら、ＣＭＶプロテアーゼ活性は全血試料において、検出されなかった。次のステップは、扱うことが容易な血漿において機能することであった。ＣＭＶ患者からの血漿試料による第一のテストは、明白な活性を明らかにしなかった。６０の血液試料から分離された血漿がテストされ、そして、２０はＣＭＶ陽性で、４０は陰性だった。後述する方法によって得られた結果とＰＣＲ（デーナ・ウルフ教授により行われる）間の相関は、良くない成績であった。活性ＣＭＶプロテアーゼを分離するため、ＷＢＣは全血試料から分離された。驚くべきことに、ＷＢＣが使われるときに、即時の方法の結果とＰＣＲの間には高い相関があった。このように、ＷＢＣはＣＭＶの検出のために用いられた。
【０１５７】
白血球の検体を得る方法の実施例は、以下に設けられている。１．５から５ｍｌまでの静脈血は、無菌静脈穿刺を用いてＥＤＴＡ処理を行ったチューブに集められる。血液試料は、処理まで室温で保たれる（保存のためには他の温度を用いている場合にも、２０〜２５℃とする）。しかしながら、通常、試料収集の処理はＷＢＣの溶解を回避するために６〜８時間の範囲内で実行されなければならない。高度の好中球減少（好中球の絶対計測値が２００個／μＬ未満）を有する患者の場合は最低１０ｍＬの血液が必要とされることがある。
【０１５８】
赤血球溶解溶液（防腐剤を含有しない）が、ＷＢＣの分離のために用いられる。１０×ストック溶液は、１ＬのＨ２Ｏに８９．９ｇのＮＨ４Ｃｌ、１０．０ｇのＫＨＣＯ３、３７０．０ｍｇのＥＤＴＡ４ナトリウム塩を溶解することにより準備される。ｐＨは７．３に調整される。溶液は、完全な、しっかりと閉じた５０ｍＬのチューブに４℃で格納される。１×実験用溶液は、５０ｍＬの１０×溶解ストック溶液を４５０ｍＬのＨ２Ｏに加えることにより調製され、よく混合される。それは、最大１週間の間は室温で保存することができる。
【０１５９】
３０ｍＬの溶解バッファーは２ｍＬの血液と混合され、４分間室温でインキュベートされ、５分間１０００回転／分で遠心分離される。上清は吸引除去され、そしてペレットは３０ｍＬのリン酸バッファー（ＰＢＳ）の中に再懸濁される。この混合物は５分間１０００回転／分で遠心分離される。そして上清は吸引除去される。次いで、ペレットは１ｍＬのＰＢＳにおいて再懸濁される。細胞は、それから、血球計算器またはオートメーション化した細胞カウンターを使用して計数される。細胞は、ＰＢＳによって１０００細胞／μＬとなるよう希釈される。
【０１６０】
ＣＭＶプロテアーゼの検出の典型的な生体外検査法は、室温において標準検定バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、５％グリセロール、０．９Ｍの  Ｎａ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．５）で実行される。蛍光標識基質は、典型的には４μＭで用いられる。酵素は１μＭから５００ｐＭまでの濃度で用いることができる。
【０１６１】
（阻害剤の使用）
若干の臨床標本では、酵素活性の検出を損なうような高いバックグラウンド活性を有することがある。これは基質を切断できる特異性のないプロテアーゼの存在による可能性がある。バックグラウンド・ノイズは、テストされている特定の酵素に最小の影響を及ぼすと共に、バックグラウンド活性を阻害できる１つ以上の阻害剤を分析に含むことによって、減少することができる。
【０１６２】
ＷＢＣ溶解物も、非特異性の細胞プロテアーゼから生じている高いバックグラウンド活性を有することが見出されている。広範囲の生物情報科学研究に基づいて、バックグラウンド活性原因の可能性があるいくつかのプロテアーゼが確認されている。８つの阻害剤のカクテルが、望ましくないバックグラウンドを減少させるために選択されている：ペスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、Ｅ−６４、ヘパリン、ベスタチン、ＧＷ３１１６１６Ａ及びエグリンＣ（エグリンＣはアレクシスから、他の全ての阻害剤はシグマ−アルドリッチから得られた）。
【０１６３】
全ての阻害剤は、製造業者の指示に従い、２００×に溶解し、分注し、保存して用いた。阻害剤は凍結状態から解凍して用いた。分析を開始するために基質の追加の前に、カクテルは、生体試料／ＣＭＶプロテアーゼと共に２．５分間インキュベートされた。
【０１６４】
阻害剤カクテルの有無にかかわらず、ＷＢＣ試料のバックグラウンド活性は、ＣＭＶプロテアーゼ基質Ｃａｍｂ４を４μＭ加えることにより試験された。図２０に示すように、阻害剤カクテルのないＷＢＣ試料は、高いバックグラウンド・ノイズを示した。阻害剤カクテルを含むＷＢＣ試料に５０ｎＭの組換えＣＭＶプロテアーゼを添加することは、阻害剤カクテルが軽微な阻害効果（最高２０％）ＣＭＶプロテアーゼ活性を呈することを示した。
【０１６５】
（臨床標本）
臨床標本は、ヘルシンキ委員会の承認を得て、ソロカメディカルセンター、ビア・シェヴァ、イスラエル、ハダッサ・エインケレム総合病院、  エルサレム、イスラエル及びシバ病院、テル・アビブ、イスラエルから集められた。合計１０の血液試料、先天的なＣＭＶをもつ新生児からの４試料、ＣＭＶ感染症の治療を受けている移植患者からの５試料及び対照実験としての健常なドナーからの１試料が得られた。具体的には、ＷＢＣは収集から６時間後に単離され、計数されてＰＢＳに１０００ＷＢＣ／μＬとなるよう希釈された。各試料からの５００００のＷＢＣ（５０μＬ）は、阻害剤カクテル（１０μＭのペスタチンＡ、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、７５μＭのアプロチニン、５０μＭのＥ−６４、２０Ｕ／ｍＬのヘパリン、６μＭのベスタチン、１０μＭのＧＷ３１１６１６Ａ及び５００μＭのエグリンＣからなる）によって２．５分間インキュベートされた。反応は、最適化した１×分析バッファー（２５ｍＭの  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、５％グリセロール、０．９ＭのＮａ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、  ｐＨ８．５）及び基質として４μＭのＣａｍｂ４を５０μＬ加えることによって開始した。反応は３つ組試験で行われ、５分間測定された。結果は健常な個人（試料１０）から得られるコントロール試料と比較された。健常な個人のそれらより高い信号を有した試料は、ＣＭＶが陽性であるとみなされた。すべての試料は、イスラエルのハダッサ・エインケレム総合病院のウイルス学研究室で、デーナ・ウルフ教授（試料１−４）によって、またテル・アヒブのシバ病院でエラ・メンデルスン教授（試料５―９）、ＰＣＲを用いてＣＭＶについて分析された。結果を表７にまとめる。
【０１６６】
【表７】
2011528916.tif 000011
【０１６７】
表８において示される結果の分析は、即時のプロテアーゼ活性試験が１００％の陽性予測値および６６％の陰性予測値を有することを示唆する。偽陽性値は１２．５％であった、そして、偽陰性値は０％であった。これらの結果の全体の精度は、９０％であった。
【０１６８】
【表８】
2011528916.tif 000012
【実施例１０】
【０１６９】
（レトロウイルスの検出のための基質）
提供された方法は、以下のウイルスを検出するためにも利用できる：オルソレトロウイルス科、レンチウイルス、霊長類レンチウイルス群、ヒト免疫不全ウイルス１：ＨＩＶ−１のＭ：Ｃ＿９２ＢＲ０２５、ＨＩＶ−１のＭ：Ｃ＿ＥＴＨ２２２０、ＨＩＶ−１のＭ：Ｆ１＿９３ＢＲ０２０、ＨＩＶ−１のＭ：Ｆ１＿ＶＩ８５０、ＨＩＶ−１の５Ｍ：Ｆ２＿ＭＰ２５５Ｃ、ＨＩＶ−１のＭ：Ｆ２＿ＭＰ２５７Ｃ、ＨＩＶ−１のＭ：Ｇ＿９２ＮＧ０８３、ＨＩＶ−１のＭ：Ｇ＿ＳＥ６１６５、ＨＩＶ−１のＭ：Ｈ＿９０ＣＦ０５６、ＨＩＶ−１のＭ：Ｈ＿ＶＩ９９１、ＨＩＶ−１のＭ：Ｊ＿ＳＥ９１７３、ＨＩＶ−１のＭ：Ｊ＿ＳＥ９２８０、ＨＩＶ−１のＭ：Ｋ＿９６ＣＭＭＰ５３５、ＨＩＶ−１のＭ：Ｋ＿９７ＺＲ−ＥＱＴＢ１１、ＨＩＶ−１のＮ＿ＹＢＦ１０６、ＨＩＶ−１のＮ＿ＹＢＦ３０、ＨＩＶ−１のＯ＿ＡＮＴ７０、ＨＩＶ−１のＯ＿ＭＶＰ５１８０、ヒト免疫不全ウイルス３、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＡＲＶ２／ＳＦ２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＢＨ１０分離株）、  ヒト免疫不全ウイルス１型（ＢＨ５分離株）、ヒト免疫不全ウイルス  １型（ＢＨ７分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＢＨ８分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＢＲＡＩＮ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＢＲＵ分離株）、１５ヒト免疫不全ウイルス１型（ＣＤＣ−４５１分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（クローン１２）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＥＬＩ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＸＢ２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＸＢ３分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＹＵ２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＪＨ３分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＪＲＣＳＦ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＫＢ−１分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｌａｉ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＭＡＬ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＭＦＡ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＭＮ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＮＤＫ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ニューヨーク５分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＮＩＴ−Ａ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＯＹＩ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＰＶ２２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＲＦ／ＨＡＴ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＳＣ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＳＦ１６２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＳＦ３３分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ウガンダ株／Ｕ４５５分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＷＭＪ１分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＷＭＪ２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｚ−８４分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｚ２／ＣＤＣ−Ｚ３４分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ザイール３分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ザイール６分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ザイールＨＺ３２１分離株）、ヒト免疫不全ウイルス１型のｌｗ１２．３分離株。ヒト免疫不全ウイルス２：ヒト免疫不全５ウイルス２型（ＢＥＮ分離株）、  ヒト免疫不全ウイルス２型（ＲＯＤ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス  ２型（ＳＴ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＳＴ／２４．１Ｃ＃２分離株）、ＨＩ���−２のＢ＿ＥＨＯ、ＨＩＶ−２のＢ＿ＵＣ１、ＨＩＶ−２．Ｄ２０５、ヒト免疫不全ウイルス２型（Ｄ２０５，７分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（７３１２Ａ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＣＡＭ２分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（Ｄ１９４分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ガーナ１分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＫＲ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＮＩＨ−Ｚ分離株）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＳＢＬＩＳＹ分離株）。
【０１７０】
上記のウイルスの検出のために、以下の化学式での競合的基質を用いることが可能である：
（Ｓ／Ｇ）（Ｑ／Ｇ／Ｒ／Ｋ）（Ｎ／Ｃ／Ｄ）（Ｙ／疎水性／芳香族）  −／−Ｐ（Ｉ／Ｖ／疎水性）（Ｖ／Ｑ）（配列番号２８）
【０１７１】
特に限定されないが、検出のために以下のような他のウイルスを含むこともできる：レトロウイルス科、オルソレトロウイルス科、デルタレトロウイルス、霊長類Ｔリンパ好性ヒトＴ細胞好性ウイルス１型（Ｃａｒｉｂｂｅａｎ分離株）、ヒトＴ細胞好性ウイルス１型（ＭＴ−２分離株）、ヒトＴ細胞好性ウイルス１型（ＡＴＫ株）、ヒトＴ細胞好性ウイルス１型（アフリカ分離株）、ヒトＴ細胞好性ウイルス１型（北アメリカ分離株）。ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞好性ウイルス）。
【０１７２】
ＨＴＬＶの検出のための競合基質として用いられるキャプシド及びヌクレオカプシド（ＣＡ／ＮＣ）及びＰｒ／Ｐ３の切断部位を有するペプチドとしては、特に限定されないが、以下を含むことができる：
（Ｖ／Ｌ／Ｔ／Ｐ）Ｘ（疎水性）（Ｆ／Ｌ）−／−Ｖ（疎水性）Ｑ（配列番号２９）
ＫＶＫＶ（Ｆ／Ｌ）−／−ＶＶＱＰＫ（配列番号３０）
ＰＰＸ（疎水性）Ｌ−／−ＰＩ（配列番号３１）
【実施例１１】
【０１７３】
（オリゴ糖ビーズおよび蛍光標識リガンド（レクチン）に基づくノイラミニダーゼ活性の検出）
髄膜炎の原因がウイルス性であるか細菌かどうかについて決定することは、髄膜炎感染の疑いがある患者の治療の性質及びコースの改善を可能にする。髄膜炎を引き起こしている細菌株は細胞外ノイラミニダーゼ活性に関連し、ＣＳＦ中にはないため、血清中のノイラミニダーゼ活性のモニタリングは細菌性髄膜炎感染症の指標として用いることができる。ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌノイラミニダーゼ系を使用するシステムは細菌株に関連する全ての３つの髄膜炎の検出を可能とする。
【０１７４】
【化２】
2011528916.tif 000013
【０１７５】
（試薬）
Ｓｉ−ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ、分子量６００ダルトン（デクストララボラトリーズＵＫ、カタログ＃ＮＨ３１２）
６−Ｊｏｅ−ＳＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル）、分子量６００ダルトン（アナスペックＵＳＡ、カタログ＃８１０１１）
レクチン：ＭＡＬ−イヌエンジュレクチン、Ｎｅｕ５ＡＣ（２−３）Ｇａｌ＾＾。分子量１５００００ダルトン。（シグマ、カタログ＃Ｌ８０２５）
ビーズ：Ｍ２８０／ＭｙＯｎｅ−ｄｙｎａｂｅａｄｓ−ｔｏｓ。活性化済（インビトロジェン）
ノイラミダーゼ酵素：肺炎レンサ球菌由来のａ（２−３）−Ｎノイラミニダーゼ（シグマ、カタログ＃Ｎ７２７１）
その他の全ての塩類はシグマ−アルドリッチから購入した。
【０１７６】
（Ｓｉ−糖／ダイナビーズ−ｔｏｓ．）
●０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５（標識バッファーＡ）
●０．１Ｍホウ酸ナトリウムにおける３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．５（標識バッファーＢ）
●ＨＥＰＥＳバッファー（３５ｍＭ）ｐＨ＝７．４、ＭｎＣｌ２１０ｍＭ及びＣａＣｌ２２０ｍＭ（結合バッファー）
●０．１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ＝９．０
【０１７７】
１）５０μＬのペレットビーズ（５００μｌ試薬より、許容量２５０ｎＭ）を１００μＬの５ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｇ、７５０ｎｍ）のＮＨ２−ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ−Ｓｉ、３３０μｌのバッファーＢと５２０μｌのバッファーＡとを、室温で３６時間、２ｍｌの丸底チューブでローリングする。
２）１ｍＬの０．１ＭのＴｒｉｓを加え、室温でオーバーナイトでインキュベートする。
３）５回の洗浄を１０ｍＬの結合バッファーで行い、１５００μＬの結合バッファーで再懸濁する。
【０１７８】
（レクチン−Ｊｏｅ（ＳＥ−ＮＨ２反応）
●１．０Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ＝８．０を調製
●０．１Ｍホウ酸３ナトリウム、ｐＨ８．５（標識バッファーＣ）を調製
【０１７９】
１）１０００μｇ（１．６μＭ）の６−Ｊｏｅ−ＳＥを６０μＬのＤＭＳＯに溶解させる。  
２）５μＬの＃１を丸底チューブに移し、５ｍｇ／ｍｌのＭＡＬを２００μＬ、バッファーＣに加える（１ｍｇ、０．００６５μＭ−１：２０ｍ：ｍ、Ｊｏｅに対して）
３）ローリングしながら室温、オーバーナイトでインキュベートする。
６）３０μＬの１．０ＭのＴｒｉｓを加え、室温、オーバーナイトでインキュベートする。
７）２５０μＬを乾いた５ｍｌのセファデックスＧ−２５カラム（結合バッファでキャリブレートした）にロードし、上清を回収し、４℃で保存する。
【０１８０】
（レクチンのビーズＳｉへの結合の調製）
７５０μＬの磁気ビーズを丸底黒色２ｍＬチューブにプルダウンし、５００μＬの結合バッファーに再懸濁した。１００μＬの標識したレクチンを加えた。アルミニウム紙の下で、ローリングを加えつつ６時間室温でインキュベートした。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ結合バッファーで７回洗浄し、２０００μＬの結合バッファーに再懸濁した。
【０１８１】
（酵素反応）
５０μＬのレクチン結合ビーズは、１ユニットのａ−（２−３）−ノイラミニダーゼ（部位特異的に肺炎レンサ球菌由来）の存在下又は非存在下で、１５分間室温でインキュベートされた。磁気ビーズはプルダウンされ、蛍光が計測された。
【０１８２】
（結果）
肺炎レンサ球菌ノイラミニダーゼの一種によるビーズからのレクチンの放出量を下の表９に示す。
【０１８３】
【表９】
2011528916.tif 000014
【０１８４】
これらの結果は、遊離酵素によるレクチンに結合したビーズのノイラミニダーゼ処理が、シアル酸を糖骨格から切断する能力を有し、ビーズからのレクチンの放出をひきおこすことを示す。
【０１８５】
（レクチン結合前のビーズ−Ｓｉとノイラミニダーゼの前処理）
１００μＬのオリゴ糖標識されたビーズは１ユニットのａ−（２−３）−ノイラミニダーゼ（部位特異的に肺炎レンサ球菌由来）と共に１５分間室温でインキュベートした。ビーズをプルダウンし、２００μＬの結合バッファーに再懸濁し、蛍光ラベルされたレクチンを１０μＬ加えた。ローリングを加えつつ室温で２．５時間インキュベートしたあと、ビーズは結合バッファーで５回洗浄の後、蛍光を測定した。表１０は、処理されたビーズのレクチン結合の％値の結果を示す。
【０１８６】
【表１０】
2011528916.tif 000015
【０１８７】
これらの結果は、ノイラミニダーゼを有するビーズ−Ｓｉの前処理がレクチンとビーズの間の結合を高く減少させたことを示す。
【実施例１２】
【０１８８】
（非特異的プロテアーゼ活性の阻害剤）
提供される方法を妨げるような非特異的なプロテアーゼに対する阻害剤は、バックグラウンド・ノイズを減らして、生体試料での病原体、疾患、医学的状態、またはそのバイオマーカーの検出の精度を増加させることに役立てることに有用な可能性がある。バイオインフォマティクスに関する研究では最初に、各組織／器官の非特異的なプロテアーゼ及びそれらのプロテアーゼに対して効果的な可能性がある阻害剤を確認するために実行された。
【０１８９】
バイオインフォマティックスの調査は、以下のステージに従って実施された：
１）第１ステージにおいて、今日公知であるすべてのプロテアーゼについて、文献において検索された。プロテアーゼ検索はＭｅｄｌｉｎｅ文献検索（そして、それが引用した論文）及びＭｅｄｉｌｎｅヌクレオチド検索を通じて検索された。余剰のプロテアーゼ名については除去された。検索結果は４４２のプロテアーゼであった。
２）このステージにおいて、あらゆる周知のプロテアーゼは、それが示される組織と関係していた。あらゆるプロテアーゼは、以下のタンパク質データベースに対して検索された：
ａ．Ｍｅｄｌｉｎｅ
ｂ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ
ｃ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ．ｕｎｉ−ｋｏｅｈｉ．ｄｅ
【０１９０】
それらのデータベースは、その触媒活性部位（セリン、システイン、アスパラギン、メタロプロテアーゼ又はユビキチン−プロテアソーム系タンパク質）に従ってあらゆるプロテアーゼを分類するためにも用いた。
【０１９１】
各組織は、その問題のある生体系または器官に起因していた。ビジュアルベーシックのプログラムがエクセルに基づくデータベースに作成された。そのアプリケーションによって、ユーザは興味がある組織をマークすることができる。一旦ユーザが興味のある組織をマークすると、これらの組織において発現しているプロテアーゼが示される。以下は、分析される組織のリストである：リンパ球、副睾丸、食道、遍在組織、好中球、肝細胞、リンパ節、Ｔｈ（２）細胞、小脳、子宮内頸部、メラニン形成細胞、腸細胞、Ｔｈ（Ｉ）細胞、糸球体、好酸球、尿管上皮、心筋、精子、骨髄、ライディヒ細胞、空洞、舌、盲腸、空腸、筋細胞、胃、気管、歯肉、脱落膜、果核、尿道、絨毛膜、咽頭、蝸牛、前立腺、膵臓、血小板、胎盤、大脳、中脳、単球、気管支、十二指腸、視床、扁桃体、好塩基球、腸、軟骨、小膠細胞、ＣＤ８＋細胞、白血球、表皮、心室、Ｔ細胞、星状細胞、胆管、神経膠、ＣＤ４＋細胞、大グリア細胞、脂肪細胞、マクロファージ、ＣＮＳ、目、肺、乳、橋（きょう）、骨、虹彩、レンズ、大動脈、卵巣、回腸、結腸、精液、血清、脳、胎児、肝臓、心臓、肝臓、血液、尿、血清、歯、心臓、精巣、腎臓、子宮、角膜、血漿、膣、直腸、扁桃腺、脾臓、胸腺、頸部、胚、心房、Ｂ細胞、筋肉、網膜、Ｔ細胞、動脈、ニューロン、破歯細胞、海馬、子宮内膜、脊髄、灰白質、副甲状腺、杯状細胞、子宮内膜、軟骨細胞、顆粒白血球、栄養芽層、精母細胞、ケラチン生成細胞、筋線維、血管、毛様体、胆嚢、前頭葉、白質、シュワン細胞、精管、視床下部、腎尿細管、松果体、セルトリ細胞、腎臓皮質、鼻粘膜、甲状腺、乳腺、巨大核細胞、側頭葉、副腎、ヘンレ係蹄、平滑筋、精原細胞、プルキンエ細胞、心房中隔、腎臓骨髄、頭頂葉、胃粘膜、副腎皮質、神経系、硝子体液、赤血球、後頭葉、樹枝細胞、唾液腺、ファローピウス管、脈絡叢、上衣細胞、羊水、固有層、脂肪組織、嗅球、心筋、頸部粘液、臍帯、皮膚線維芽細胞、副腎髄質、小腸、肺上皮、大脳皮質、膀胱、脳神経単位、骨格の筋肉、有歯の核、角質層、集合管、下垂体、冠状動脈、脳梁、細胞栄養芽層、尾状核、精嚢、大腸、腺下垂体、乏枝神経膠細胞、皮脂腺、クロム親和細胞、細菌細胞層、上行結腸、小腸、黒質、肺動脈、血管内皮、ランゲルハンス島、単核食細胞、腸の上皮、末梢血細胞、顆粒ルテイン細胞、消化管、角膜上皮細胞、血液生成幹細胞、胆嚢上皮、遠位曲尿細管、卵巣の小胞流体、気管支の上皮細胞、血管内皮細胞、膵管上皮、近位尿細管曲部、近位管状上皮、臍静脈内皮細胞、網膜色素性上皮細胞、脳脊髄液、角膜内皮、合胞栄養芽層、束状層、横行結腸、下行結腸、卵胞、絨毛膜絨毛、滑液膜、延髄、膵腺房、小脳皮質、脊髄幹細胞、中心傍回、核側坐核、顎下腺、虫垂、乳房上皮、心室中隔、胎盤膜、子宮筋層、毛様体上皮、ナチュラルキラー細胞、肺胞大食細胞、視床下核。
【０１９２】
３）前述した組織を選択するアプリケーションを用いて、呼吸器系において、発現するプロテアーゼが特定された。選択された組織は、以下の通りである：顎下腺、唾液、気管支、肺胞大食細胞、歯、毛様体上皮、咽頭、舌、白血球、大食細胞及び顆粒白血球、肺、唾液腺、舌、鼻粘膜、肺上皮、気管、気管支上皮細胞、歯肉、鼻粘膜、好中球。
【０１９３】
これらの組織の選択は、呼吸器系において発現している以下の７２種のプロテアーゼをマークして行われた：トリプターゼα、デヒドロペプチダーゼ、トリプターゼε、腎臓ジペプチダーゼ、セリンプロテアーゼＥＯＳ、セリンプロテアーゼ１５、セリンプロテアーゼ２５、セリンプロテアーゼ８、システインプロテアーゼ２、プロテアーゼセリン１１、エラスターゼ、白血球、胎盤タンパク質１１、セリンプロテアーゼ、ＨＴＲＡ３、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ、ＣＩｐＰカゼイノリチックプロテアーゼ、トリペプチジルアミノペプチダーゼ、気道トリプシン様プロテアーゼ、ＣＩｐＸカゼイノリチックプロテアーゼＸ、モザイクセリンプロテアーゼコリン、βサイトＡｐｐ切断酵素、ユビキチン特異プロテアーゼ３５、βサイトＡｐｐ切断酵素２、プラスミノゲン活性化ウロキナーゼ、膜貫通セリンプロテアーゼ２、シグナルペプチドペプチダーゼ様２Ｂ、Ｏシアロ糖タンパク質エンドペプチターゼ、色素上皮由来因子、扁平上皮癌抗原２、上皮角質層キモトリプシン様酵素、タンパク質コンバターゼ・サブチリシン／ケキシン、タイプ５、粘膜関連リンパ組織リンパ腫移動タンパク質、レニン、ヘプシン、ナプシン１、テスティシン、カルパイン７、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ７、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、グランチームＫ、カリクレイン、マトリプターゼ、カテプシンＥ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＺ、パンクレアシン、プロテイナーゼ３、カテプシンＡ、カテプシンＯ、カリクレイン、カリクレイン５、カリクレイン７、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１３、カリクレイン１５、カリクレイン６、トリプシノーゲン２、すべてのカリクレイン、カテプシンＦ、トリプターゼβ１。
【０１９４】
４）すべてのプロテアーゼについて、情報はその切断部位選択およびその周知の阻害剤に関して集められた。このプロセスの間、我々は、文献および以下のデータベースを使用した：
ａ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ．ｕｎｉ−ｋｏｅｌｎ．ｄｅ
ｂ．ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ
ｃ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ
ｄ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏ．ｊｐ
ｅ．ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ
ｆ．ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ
【０１９５】
５）特定されたプロテアーゼの切断プロファイルは、プロテアーゼのうちどちらがヒト・ライノウイルス属（ＨＲＶ）ペプチド、Ｐｅｐ９（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｐ−Ｄ（ＥＤＡＮＳ）−Ｓ−Ｑ−ＮＨ２（配列番号３２）を切断する可能性について決定するために用いられた。周知の切断部位がないプロテアーゼは、Ｐｅｐ９も切断する可能性のあるプロテアーゼと考えられた。非特異的なメタロプロテアーゼはＥＤＴＡによって、強く阻害される。そして、それはほとんどすべての試料に加えられることが可能であり、したがって、この分析では考慮されなかった。Ｐｅｐ９を切断できるプロテアーゼは、以下を含む：トリプターゼε、セリンプロテアーゼ５、セリンプロテアーゼ１５、セリンプロテアーゼ２５、セリンプロテアーゼ８、胎盤タンパク質１１、ＣＩｐＰカゼイノリチィックプロテアーゼ、トリペプチジルアミノペプチダーゼ、気道トリプシン様プロテアーゼ、モザイクセリンプロテアーゼコリン、色素上皮由来因子、パラカスパーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＯ、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレインＢ、カリクレイン１０、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１３、カリクレイン６、プロテイナーゼ３、カリクレイン１５、カテプシンＦ、レニン、プロターゼ、ナプシン１、カルパイン７、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ７、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、エラスターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、パンクレアシン、カテプシンＥ。
【０１９６】
６）最もペプチドＰｅｐ９の切断に適したプロテアーゼが確認されたあと、これらのプロテアーゼを阻害できるプロテアーゼ阻害剤で最も小さいグループを確認した。ステップ４の阻害剤についてプロテアーゼ、毒性および入手可能性について文献をチェックした。他に考慮した点としては、ワンなど、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５２：２３８−２４５（１９９７）の記載によるＨＲＶの阻害剤による周知の影響であった。
【０１９７】
７）下記の表１１に示されるように、非特異的なプロテアーゼ活性及びバックグラウンド・ノイズを減らすために阻害を必要とする可能性がある約４０のプロテアーゼがある。文献の再調査に基づいて、５つの阻害剤によってこれらのプロテアーゼを阻害する必要があり、ＨＲＶの３Ｃプロテアーゼ活性を下げることなく、呼吸器系由来の流体中で分析の読み取りに生じるバックグラウンドを下げることができる。表８において、ＥＤＴＡは、メタロプロテアーゼに対するその阻害効果のために加えられた。
【０１９８】
【表１１】
2011528916.tif 000016
【０１９９】
2011528916.tif 000017
【実施例１３】
【０２００】
（ＨＲＶ検出のための鼻腔洗浄阻害剤カクテル）
前の実施例において集められる情報を用いて、理論的に非特異的なプロテアーゼの働きを抑制する７つの阻害剤を選択する。これらの阻害剤は、以下を含む：ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、Ｅ−６４、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、ＥＤＴＡ＋ＥＧＴＡ及びエグリンＣ。アミノペプチダーゼ阻害剤として有用なものとして、ベスタチンも選択された。これらの阻害剤は、バックグラウンド・ノイズおよびＨＲＶプロテアーゼ特異的な活性に対してそれらの活性を試験された。
【０２０１】
すべての阻害剤は、製造業者の指示に従って１００×で溶解され、分注され、保存され、用いられた。凍結と解凍のサイクルは阻害剤に課されなかった。基質を追加し、分析を始める前に、カクテルまたは個々の阻害剤の１０μＬは、９０μＬの試料／バッファー＋ＨＲＶプロテアーゼと共に５分間インキュベートした。
【０２０２】
プロテアーゼ活性（バッファ＋３Ｃ）上の、そして、鼻腔洗浄標本プールに存在するバックグラウンド・ノイズ上の阻害剤の作用を試験するために、反応速度は、問題となる阻害剤の有無にかかわらず比較された（表１２）。反応は、開始バッファー環境下で、４μＭのＰｅｐ１および５０ｎＭ組換えＨＲＶの３Ｃプロテアーゼによって５分間で実行された。ＲＴ−ＰＣＲによる４つのＨＲＶ陰性標本の鼻腔洗浄標本プールは、不十分な量の個々の標本に対して実験の全体にわたって等しい条件を再現するために使われた。
【０２０３】
これらの結果（表１２）に基づいて、最終的な鼻腔洗浄阻害剤カクテルは選択された：１ｍＭのＡＥＢＳＦ、７．５μＭのアプロチニン、５  ｍＭのＥＤＴＡ＋ＥＧＴＡ各々（通常の分析用バッファーに含有されている）、５０μＭのＥ−６４及び０．５μＭのエグリンＣ。ペプスタチンＡ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ及びベスタチンは省略した。阻害剤Ｅ−６４はその強いシステインプロテアーゼ阻害ポテンシャルのために含有された。そして、それはＨＲＶの３Ｃプロテアーゼ活性（表１２）に対しては阻害を示さなかった。
【０２０４】
【表１２】
2011528916.tif 000018
【０２０５】
Ｎｉ：阻害なし、(+-）:３つ組試験のＳＤ。
【０２０６】
阻害剤カクテルは、カクテルの有無にかかわらず、そして、添加された５０ｎＭの組換えＨＲＶの３Ｃプロテアーゼによって、標本プール及びＷＢＣに対してもテストされた。図２１のＡ−Ｂを参照のこと。ＷＢＣは炎症性の鼻腔洗浄液に豊富に含まれ、ＷＢＣ溶解物がテストされた。ＷＢＣ溶解物は、非特異的な細胞プロテアーゼから生じているＨＲＶ分析（基質ｐｅｐ１による）の高いバックグラウンドを有した。標本プールにおいて、観察されるバックグラウンドの一部はＷＢＣに由来していると仮定された。
【０２０７】
そして、阻害剤カクテルの存在、非存在、及びカクテル＋組換え型ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼ存在下での結果は、両方の標本プール（図２１  Ａ）に示され、ヒトＷＢＣで１ｘ１０６細胞／ｍｌである（図２１Ｂ）。カクテルは、高い効力（＞８７％）を有する標本プールおよびＷＢＣのバックグラウンドを阻害した。阻害剤カクテルを有する反応に組換えＨＲＶの３Ｃプロテアーゼを妨げることは、通常の率で特定のＨＲＶプロテアーゼ活性を誘導した。それが示された（＋３Ｃ）箇所では、反応は４μＭのＰｅｐ１および５０ｎｍ組換えＨＲＶの３Ｃプロテアーゼにより実行された。データは、２つの独立繰り返しから代表的なものである。
【０２０８】
更に阻害剤カクテルを改善して、それがカバーする非特異的プロテアーゼの範囲を広げるために、さらに４つの阻害剤が加えられた：ベスタチン、ペプスタチンＡ、ヘパリン及びＧＷ３１１６１６Ａである。これらの阻害剤はＨＲＶの３Ｃ組換え型プロテアーゼを阻害しなかった。そして、それらの周知の標的となるプロテアーゼを主成分として、それらは他の人間の体液標本に関連性がある可能性がある。これらの４つの阻害剤の追加の後、Ｉ８と呼ばれる新しい阻害剤カクテルが決められた。表１３を参照のこと。
【０２０９】
【表１３】
2011528916.tif 000019
【実施例１４】
【０２１０】
（脳脊髄液（ＣＳＦ）のエンテロウイルスの検出のための阻害剤カクテル）
髄膜炎を発見する方法および組成物は、国際公開２００７／０２９２６２号において開示された。しかしながら、エンテロウイルス基質Ｃａｍｂ２を有するエンテロウイルスを検出するために使用するＣＳＦ（脳脊髄液）試料は、バックグラウンドを発生させる。バックグラウンド・ノイズを減らすために用いることができる阻害剤を確認するために、ＣＳＦおよびそれらの阻害剤に併用可能な非特異的プロテアーゼを、実施例１２に記載されている方法を使用して確認した。
【０２１１】
（活性、設計及び結果）
１）ＣＳＦと関連のある全ての組織において、発現されるすべてのプロテアーゼを見つけるために、文献検索およびデータベース検索を実行した。使われたデータベースには以下が含まれた：ＭＥＲＯＰＳ、ＢＲＥＮＤＡ、ＯＭＩＭ、ＮＣＢＩ及びＨＰＡ。この検索は、以下の組織が含まれた：リンパ球、脳、白血球、神経系、腎臓骨髄、腎臓皮質、大脳皮質、脳神経単位、ＣＮＳ、脊髄、Ｔ細胞、黒質、大脳、マクロファージ、海馬、Ｂ細胞、好中球、小脳、延髄、前頭葉、側頭葉、視床、扁桃体、灰白質、白物質、シュワン細胞、脳下垂体、脳脊髄液、神経グリア、甲状副腺、視床下部、索状層、大脳皮質、松下腺、ニューロン、好酸球、プルキンエ細胞、顆粒球、好塩基球。
【０２１２】
２）この検索によって、２２７のプロテアーゼが検索された。それらのシーケンスのホモロジーによれば、また、文献によると、これらのプロテアーゼは、３つのカテゴリに分けられた：
ａ．メタロプロテアーゼ（３９種）。
ｂ．ＡＴＰ依存的なプロテアーゼ（４１種）。
ｃ．セリン／システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ（１４７種）。
【０２１３】
３）標本の予想されるＡＴＰ濃度では、ＡＴＰ依存的なプロテアーゼが基質を切断する確率を低下させる。さらにまた、反応バッファーのキレート化剤（ＥＤＴＡ）の使用は、非特異的なメタロプロテアーゼの活性を阻害する。従って、メタロプロテアーゼの除去および可能性がある非特異的な切断試薬としてのＡＴＰ依存的なプロテアーゼの後には、セリン／システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼは、ＣＳＦにおける非特異性のプロテアーゼ活性の候補であった。
【０２１４】
４）各セリン／システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼのために、総合的な文献およびデータベース検索を、それらの切断部位選択のために実行した。それらの切断部位が重要な基質（Ｃａｍｂ２）を切断しないことを示したので、これらのプロテアーゼについて多くは排除した。この排除のプロセスは、可能性のあるプロテアーゼを２２７から５１まで削減した。
【０２１５】
５）残留する５１のプロテアーゼについて、カクテルにおいて使用する阻害剤の数を最小化する（可能な限り）ために、それらのプロテアーゼ阻害剤（そして、場合によっては阻害剤間の相互作用）、阻害剤のｐＨ依存およびプロテアーゼ（プロテアーゼ／阻害剤のインキュベーション時間）、そして、その阻害剤は、市販かどうかのために、さらなる文献検索を行った。
【０２１６】
６）Ｃａｍｂ２を使用しているＣＳＦ試料のエンテロウイルスの検出に役立つことを提案された阻害剤は、下にリストされる：
グランチームＨ、プロテイナーゼ３：α−１−プロテイナーゼ阻害剤。
ジペプチジル・ペプチダーゼ：ディプロチンＡ、Ｌ−２，４−ジアミノブチリルピペリジンアミド。 
ＰｒＳＳ１１：ＨｔｒＡ１阻害剤（ノバルティス）。
ＨｔｒＡ２：Ｕｃｆ−１０１（カルバイオケム）
カルパイン７：３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸（シグマ−アルドリッチ）。
カリクレイン１２：ＨＡＩ−２Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、エコチン  （シグマ）。
カテプシンＡ：エベラクトンＢ；キモスタチン。
カテプシンＨ：ヒトステフィンＡ及びヒトステフィンＢ。
カルパイン１１：カルパスタチン。
【実施例１５】
【０２１７】
（細菌的に感染したＣＳＦ試料のための阻害剤カクテル）
これまでウイルス性および細菌性髄膜炎の共同感染については報告されていなかった。このように、ウイルス性髄膜炎感染症に対する検査は、細菌性髄膜炎の否定的結果を意味する。しかしながら、細菌性髄膜炎に感染しているＣＳＦ試料はエンテロウイルスに対する検査の偽陽性結果につながるバックグラウンドでない特異的な活性を有する場合があり、それによって結果は混同する。ＣＳＦ試料のバックグラウンドの非特異的な活性は基質を切断できる細菌プロテアーゼに関連があり、それによって陽性シグナルとなった可能性があった。ＣＳＦの細菌性髄膜炎で最も頻繁に見出されるものは、以下を含む：肺炎レンサ球菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（髄膜炎菌）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、肺炎桿菌。したがって、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ（肺炎レンサ球菌、異なる２種の株６Ｂ及び２３Ｆ）、そして、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）は、ＣＳＦ試料において、観察される非特異的なバックグラウンドの活性をシミュレーションして、それを減らすための阻害剤を確認するために添加された。阻害剤の異なるグループからの４０以上の阻害剤の総量がテストされた。
【０２１８】
２つの阻害剤（ホスホラミドン及び２，６−ピリジンジカルボン酸酸）は、これらの細菌（図２２Ａ、Ｂ）において誘導されるシグナルを著しく減少させた。コラゲナーゼの弱い阻害剤以外の、ホスホラミドンは、多くの細菌メタロエンドプロテイナーゼ、セルモリシン及びエラスターゼの強い阻害剤である。それは、トリプシン、パパイン、キモトリプシンおよびペプシンを阻害しない。ホスホラミドンは、実験系に添加したエコウイルス３Ｃ組換え型および肺炎球菌（タイプ６Ｂ及び２３Ｆ）を使用して試験された。
【０２１９】
図２２Ａに示される実験は、Ｅｃｈｏ組換え型プロテアーゼ（５０ｎｍ）、または、肺炎球菌６Ｂ及び２３Ｆ（１μＬ）の２つの異なる種の存在下で実行された。阻害効果は、ホスホラミドン（２０μＭ）の存在下／非存在下において、測定された。ホスホラミドンは、組み替えプロテアーゼについて７％、６Ｂ及び２３Ｆによる肺炎球菌の活性を９１％及び８０％阻害した。この結果は、両方の株に対する９０％の阻害のどの類似の結果が判断されたかという少なくとも３件の独立した実験を代表するものである。
【０２２０】
２，６−ピリジンジカルボン酸は、エコウイルス３Ｃ組み換え型、そして、実験系に添加されている髄膜炎菌についてテストされた。図２２Ｂに示される実験は、エコ組換え型プロテアーゼ（１：１８）存在下で、又は髄膜菌炎の３μＬ）の存在下で、または、血液（２０μＬ）の存在下で実行された。ＲＦＵ／分は、２，６−ピリジンジカルボン酸（２．５ｍＭ）の存在下／非存在下において、決定された。２，６−ピリジンジカルボン酸は、組換えプロテアーゼの活性を４．５％、髄膜炎菌の活性を８１％及び血液活性を０％阻害した。
【０２２１】
ホスホラミドン及び２，６−ピリジンジカルボン酸は従って、上記する阻害剤カクテルＩ１８、そして、阻害剤カクテルＩ９ａ（１８＋ホスホラミドン）、１９ｂ（１８＋２，６−ピリジンジカルボン酸）および１１０（１８＋ホスホラミドン＋２，６−ピリジンジカルボン酸）に従って添加した。
【０２２２】
Ｉ９ａ阻害カクテルの最終組成は、表１４ａにまとめる。
【０２２３】
【表１４ａ】
2011528916.tif 000020
【０２２４】
Ｉ９ｂ阻害カクテルの最終組成は、表１４ｂにまとめる。
【０２２５】
【表１４ｂ】
2011528916.tif 000021
【０２２６】
Ｉ１０阻害剤カクテルの最終組成は、表１５にまとめる。
【０２２７】
【表１５】
2011528916.tif 000022
【０２２８】
エンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ（エコ）、ＷＢＣ（１テスト当たり細胞数２ｘ１０３）、肺炎球菌（１テスト当たりバクテリア数１×１０６）および髄膜炎菌（１テスト当たりバクテリア数１ｘ１０８）（それぞれ５μＬ）は人工ＣＳＦ（４５μＬ）に添加した。そして、示された阻害剤カクテル（それぞれ５μＬ）を続けて添加した：Ｉ８、Ｉ９ａ＝Ｉ８＋ホスホラミドン（９０μＭ）、Ｉ９ｂ＝Ｉ８＋２，６−ピリジンジカルボン酸（２．５ｍＭ）及びＩ１０＝１８＋ホスホラミドン＋２，６−ピリジンジカルボン酸。示された阻害剤カクテルを有する試料は、基質Ｃａｍｂ２（最終濃度２μＭ）を含んでいる５０μＬの２×反応バッファーを追加し、２．５分間室温でインキュベートした。その後すみやかに蛍光定量的な測定を開始した。ＷＢＣ溶解物はＷＢＣの死及び組織炎症効果をシミュレーションする。そして、それによって、試料のアポトーシスを受けている細胞からプロテアーゼの放出が生じる。細菌総計は、感染したＣＳＦ試料５０μＬで見つかる平均（肺炎球菌）、及び高い（髄膜炎菌）濃度と相関している。
【０２２９】
図２３の結果は、それにＩ１０、Ｉ９ａ、そして、Ｉ９ｂ阻害剤カクテルがエンテロウイルスの３Ｃプロテアーゼを約２０％、そして、ＷＢＣ溶解物を約９０％阻害することを示す。この結果は、これらの阻害剤カクテルが、エンテロウイルス  ３Ｃプロテアーゼに関連したプロテアーゼ活性を妨げずに、ＷＢＣの死に関連したＣＳＦタンパク質分解活性を妨害できることを示す。一方で、Ｉ１０を混合することが両方の細菌のタンパク質分解活性の８０〜９０％を阻害すると共に、Ｉ９ａおよびＩ９ｂ阻害剤カクテルは選択された細菌の方へ特定の阻害活動を有した。髄膜炎菌タンパク質分解活性に影響を及ぼさずに、Ｉ９ａは肺炎球菌タンパク質分解活性を阻害する。そして、Ｉ９ｂは髄膜炎菌によって誘発されたものだけでなく肺炎球菌によるタンパク質分解活性を阻害する。
【０２３０】
髄膜炎試験結果の理論的な実施例は、表１６に示される。試験は、５つのチューブにおいて実行される。最初の３つのチューブは、Ｉ１０阻害剤カクテルによってインキュベートされる：陰性対照（人工ＣＳＦ）、陰性対照（組換えエンテロウイルスの３Ｃプロテアーゼに添加される人工ＣＳＦ）、及びＣＳＦ試料である。ＣＳＦ試料を含んでいる更に２つのチューブは、阻害剤カクテルＩ９ａまたはＩ９ｂとインキュベートされる。
【０２３１】
信号が検出されない場合、試料は（または分析の検出範囲の下で）エンテロウイルスおよび細菌（表１６の結果＃１）が陰性であると予測できる。ウイルスおよび細菌の共同感染が報告されなかったように、Ｉ１０がある場合には、陽性シグナルはテストされたＣＳＦ試料（結果＃２）の生きているエンテロウイルスの存在を示す。Ｉ９ｂが２，６−ピリジンジカルボン酸を含むとき、それは髄膜炎菌の活性のみを阻害する。したがって、チューブ＃４（Ｉ９ａとインキュベート）の陽性シグナルおよびチューブ＃３および５（１１０および２，６−ピリジンジカルボン酸を含むＩ９ｂとインキュベート）の陰性シグナルは、試料（結果＃３）の髄膜炎菌の存在を示す。Ｉ９ａがホスホラミドンを含む場合、それは肺炎球菌の活性だけを阻害する。従って、チューブ＃５（Ｉ９ｂとインキュベート）の陽性シグナルおよびチューブ＃３および４（Ｉ１０およびホスホラミドンを含むＩ９ｂとインキュベート）の陰性シグナルは、試料（結果＃４）の肺炎球菌の存在を示す。
【０２３２】
したがって、ウイルス性髄膜炎感染症を発見するため国際公開２００７／０２９２６２号において開示された方法および組成物は、現在の方法の阻害剤に関連して用いることが可能である。例えば、ウイルス性髄膜炎感染症を発見するために用いられることできる基質は、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルスおよびエンテロウイルスを検出するものを含む。ヘルペスウイルスの検出のために用いられることができる基質の具体例は、配列番号４８のものを含む。西ナイルウイルスの検出のために用いることができる基質の例としては、配列番号４９、５０及び５１のものを含む。エンテロウイルスの検出のために用いることができる基質の例としては、配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８が含まれる。加えて、阻害剤は、細菌性およびウイルス性髄膜炎感染症をと区別するために用いることができる。
【０２３３】
【表１６】
2011528916.tif 000023
【実施例１６】
【０２３４】
（分析最適化前のエンテロウイルス用の臨床試料分析）
２つの臨床現場から得られたＣＳＦ試料は、分析条件が最適化される前に、本発明の方法によりエンテロウイルスの存在が試験された。さらに、試料は、ＲＴ−ＰＣＲと他の臨床パラメーターとの組合せでもテストされた。ＲＴ−ＰＣＲ／臨床パラメーターの組合せにおいては、炎症が示されたとき、すなわち、１μＬのＣＳＦ中に７以上の白血球（ＷＢＣ）が示され、そして、ＲＴ−ＰＣＲが陽性の場合にのみ試料は陽性であるとみなされた。炎症（≦７細胞／μＬ）を示さないか、または、炎症を示すけれどもＲＴ−ＰＣＲでは陰性の場合に、試料は陰性であるとみなされた。赤血球（ＲＢＣ）数が１００／μＬ（１セット）を越えた場合、または、試料の色が赤みがかっていた場合に（別のセット、ＲＢＣの数は条件とされない）、試料は溶血性であるとみなされた。
【０２３５】
反応率カットオフ値は、特性と感度とが最も良い相関関係を示すように、本発明の方法のために遡及的に最初に決定された。反応率がカットオフ値を超えた試料は陽性とみなされ、カットオフ値以下の試料は陰性であるとみなされた。
【０２３６】
本発明の方法に従ってエンテロウイルスを検出するための手順：各測定は、５０μＬのＣＳＦ試料を用いて行われた。試料に阻害剤カクテル（Ｉ８）を５μＬ加え、２．５分インキュベートした。この反応は、Ｃａｍｂ２基質（最終濃度２μＭ）を含む５０μＬの２×反応バッファー（“２×ＲＢ”各々、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１．８ＭのＮａ２ＳＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＥＧＴＡ）を加えることにより開始された。
【０２３７】
（臨床現場１：前向き試料ｆ）
ヘルシンキ委員会の承認を得て、臨床現場１から余った４６ものＣＳＦ試料が将来的な患者から集められた。試料は、ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにウイルス学研究室に送られた。本発明の方法は、上述した通りに行われた。
【０２３８】
表１７は、臨床現場の結果を要約したものである。最も良い相関関係を表わす反応率カットオフは、３３５ＲＦＵ／分（陽性対照の約２０％；５０ｎＭ組換え３Ｃプロテアーゼ）に設定された。
【０２３９】
【表１７】
2011528916.tif 000024
【０２４０】
凡例：Ｂ−溶血性、Ｐ−陽性、Ｎ−陰性、ＦＰ−偽陽性、ＦＮ−偽陰性、Ｘ−不十分なデータのため除外。
【０２４１】
阻害剤カクテルの必要性：はじめに、試料の一連の実験は、プロテアーゼ阻害剤カクテルなしで行われた。しかしながら、試料Ｄ１は、肺炎連鎖球菌に陽性であったため、ウイルス陽性試料と区別することができなかった。よって、この実験は、反応バッファーを追加する２．５分前に、Ｉ８カクテルを加えて再び行われた。その結果、試料Ｄ１は陰性であったが、他のウイルス陽性試料は陽性のままであった。全体として、ＲＴ−ＰＣＲ方法に対するより良好な相関関係が、阻害剤カクテルＩ８を加えることにより得ることができた。カットオフは、６００（阻害剤なし）から３３５ＲＦＵ／分（阻害剤あり）までの４５％減少した。興味深いことには、組換えプロテアーゼ活性が阻害剤の有無それぞれで測定された際に、同じような４０％の減少が観察された。この結果は、陽性ＣＳＦ試料の活性が３Ｃプロテアーゼ活性に起因するという見解を強めるものである。
【０２４２】
（臨床現場２：後ろ向き試料）
ヘルシンキ委員会の承認の下、エンテロウイルスについて予備試験された３０の陽性および３０の陰性のＣＳＦ試料が、別のウイルス学研究室の余ったものから遡及的に集められた。試料はＲＴ−ＰＣＲ試験のために送られる前に、炎症（＞７ＷＢＣ／μＬ）の臨床基準を既にパスしていたため、この方法はＲＴ−ＰＣＲのみと比較された。本発明の方法は、上述した通りに行われた。
【０２４３】
表１８は、これらの試料の結果を要約したものである。３３５ＲＦＵ／分の同じカットオフ（陽性対照の約２０％；５０ｎＭ組換え３Ｃプロテアーゼ）が用いられた。
【０２４４】
【表１８】
2011528916.tif 000025
【０２４５】
凡例：Ｂ−溶血性、Ｐ−陽性、Ｎ−陰性、ＦＰ−偽陽性、ＦＮ−偽陰性
【０２４６】
（臨床結果の分析）
（溶血性試料）
この結果は、この分析が赤血球を含む試料（１００を超えるＲＢＣ又は赤みを呈する試料）を効率的に取り扱えていないことを示す。この分析は、１７の溶血性試料のうち、５つを正しく認定できなかった。５つの試料のうち、４つは偽陽性であり、１つは偽陰性であった。残りの１２の試料のうち、９つは陽性で、３つは陰性であった。したがって、例えば分析前の遠心分離によって、赤血球は試料から除去されてもよい。さらに、赤血球は、保存のため試料を凍結する前に除去され得る。
【０２４７】
（偽陰性）
この分析は、４１の陽性試料のうち（そのうちの１つは、赤みがかっていた）、８つ（７１０００２、７１８９６８、７１８８１８、７１８５４９、７１８４９８、６０３７５４、Ｄ１７及びＤ１８）を正しく認定できなかった。偽陰性試料がプロテアーゼを阻害したという可能性を除外するため、Ｄ１７以外のすべての試料は、５０ｎＭの組換え酵素を混合した。これらの７つの試料において、阻害は検出されなかった。これらの偽陰性は、本願の方法の感度が、ＲＴ−ＰＣＲよりも低いことによるかもしれない。あるいは、試料が保存または凍結／解凍サイクルを経たことによりプロテアーゼが不活性化したためとも考えられる。
【０２４８】
（偽陽性）
５８の試料のうち、１１は偽陽性であり（Ｄ１１、Ｄ１３、Ｄ２３、Ｄ２９、Ｄ３２、Ｄ４３、Ｄ４５、７１９１０４、７１８７８５、７１８３６６及び７１８３４６）、それらのうちの４つは赤みがかっていた（Ｄ３２、Ｄ４５、７１８３６６及び７１８３４６）。
【０２４９】
偽陽性（ＦＰ）反応は、炎症因子による非特異的基質切断から生じたものと思われる。しかしながら、白血球数と非特異的バックグラウンド・ノイズの大きさとの間には相関は認められなかった。さらに、炎症を有する９つの陰性試料（Ｄ１、Ｄ４６、７１００２２、７１８６５７、７１８９０９、７１８９１０、７１８４８８、７１８１１５及び７１８０５１）はカットオフ値以下で反応を示したことから、本願の方法が炎症性試料に対応できることを示唆した。
【０２５０】
ＦＰ試料のうちの５つには炎症はなかった（Ｄ１１、Ｄ１３、Ｄ２３、Ｄ２９及びＤ４３）。これは、炎症のない溶血性及びＦＰ試料が含まれない場合には、２つのＦＰ試料だけが残ることを示唆する。
【０２５１】
（臨床的指標の矛盾に対するＲＴ−ＰＣＲ）
４つの試料は、陰性の臨床的特徴（炎症でない）を示しており、ＲＴ−ＰＣＲ陽性（Ｄ１０、Ｄ１９、Ｄ２３及びＤ２７）が試験された。これらのうち、Ｄ２３だけは本願の方法で陽性反応があった。これは、次の理由のいずれかに起因する可能性を有する：ＲＴ−ＰＣＲシグナルの偽陽性又は、活動的感染でないウイルスのゲノム要素の残りによる。
【０２５２】
（結論）
１００以上のＣＳＦ試料は、本願発明に従ってエンテロウイルス髄膜炎を発見する方法を評価するために用いられた。表１９は、この結果を要約する。本発明の方法を用いた感度および特性はそれぞれ、８０％および８１％であった。溶血性試料が除外される場合には、より高い特性（８６％）が得られることが可能である。
【０２５３】
【表１９】
2011528916.tif 000026
【実施例１７】
【０２５４】
（分析の最適化−プレートとチューブ）
（プラスチックの反応）
背景：ブランク反応において負の傾きが観察された。いくつかある原因の中で特にこの原因の一つとしては、反応中、プレートの穴に基質が付着することによるものであると判断された。他の見解としては、遠心分離の後、基質のペレットがチューブ内壁の全周面に固着することであった。したがって、非付着性（ＮＢ）プレート及びチューブが試験された。
【０２５５】
（プレート）
グライナー、カタログ番号６５５９００の黒プレートを入手し、試験を行った。基質付着性を試験するにあたり、標準検定緩衝液（＋基質）は、標準的なプレートとＮＢプレートの両方で１５分間インキュベートされた。各々の穴（ウェル）は、２００μＬのＰＢＳで２回洗われ、激しくボルテックスされた。最後に、どの程度プレートに付着したままであるのか評価するために、穴を１００μＬの１×反応バッファーで再懸濁した。各々の洗浄液は、蛍光で測定された。結果を表２０に示す。
【０２５６】
【表２０】
2011528916.tif 000027
【０２５７】
この結果は、１回目の洗浄で、ＮＢプレートでは、より多くの基質が洗い落されことを示す。２回目の洗浄の後、標準プレートはＮＢプレートより〜３倍多い基質を保持した。最終的には、２回の洗浄後、標準プレートはＮＢプレートより〜３倍多い基質を保持した。ＮＢプレートの付加的な特徴とは、ブランクの曲線形状に対するその効果である。標準プレートに典型的な波形のブランク曲線（図２４Ａ）は、わずかな正の傾きによって、より線形となった（図２４Ｂ、〜２００ＲＦＵ／分）。
【０２５８】
ＮＢプレートの他の特徴としては、ｃ．ｖ．値低減に対する貢献である。表２１に示されるように、標準プレートにおける標準ｃ．ｖ．値は１０〜１５％であるのに比べて、ＮＢプレートにおける標準ｃ．ｖ．値は５〜６％である。
【０２５９】
【表２１】
2011528916.tif 000028
【０２６０】
（チューブ）
背景：
ＮＢチューブに対してアンバーチューブを用いた際に、ブランクおよび陽性対照反応の反応速度（ＲＦＵ±分）が著しく変化することが分かった。ブランク値（ＲＦＵ±分）および蛍光の基準値は、ＮＢチューブよりも高かった。したがって、蛍光基準値、ブランク及び陽性対照の反応速度におけるＮＢチューブに対するアンバーチューブの影響が調べられた。
【０２６１】
（試薬および器具）
阻害剤カクテル：阻害剤カクテルＩ１０
酵素希釈バッファー：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１Ｍスクロース、０．１％アジ化ナトリウム。
２×反応バッファー、バッファーＢ：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１．２Ｍ硫酸Ｎａ２ＳＯ４、アジ化ナトリウム０．１％、ｐＨ８．５。
人工ＣＳＦ：１２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭグルコース、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．１％アジ化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４５。
酵素：エンテロウイルス株“Ｅｃｈｏ”由来の組換えプロテアーゼ［希釈１：１８。
基質：Ｃａｍｂ２．３、１ｍＭ、Ｃａｍｂ２．４、２ｍＭ。（同じＣａｍｂ２配列用の異なるバッチ）
ＨＥＰＥＳバッファー：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ
ＮＢチューブ：シグマ  カタログ番号＃Ｚ６６６５０５
アンバーチューブ：ＵＳＡ  サイエンティフィック社  カタログ番号１６２０−２７０７。
９６穴プレート：黒底ＮＢプレート−グライナーカタログ番号６５５９００。
【０２６２】
2011528916.tif 000029
【０２６３】
（チューブのパラメーターの違いの評価）
準備：
基質：Ｃａｍｂ２．３および２．４は、ＤＭＳＯで０．３３３ｍＭに希釈された。
１：８３のさらなる希釈が、ＨＥＰＥＳバッファー±２×ＲＢで行われた（ワーキング濃度としては、４．８３μＬの基質に対して４００μＬのＲＢ±ＨＥＰＥＳバッファー）。
【０２６４】
ウェルの内容物は、表２２に示す通りであった。
【０２６５】
【表２２】
2011528916.tif 000030
【０２６６】
１．人工ＣＳＦ±ＨＥＰＥＳバッファーをプレートに入れる
２．４００μＬのＨＥＰＥＳバッファー±ＲＢ＋基質（Ｃａｍｂ２．３および２．４）をアンバー及びＮＢチューブ両方にて準備する。
３．酵素をウェルに加える
４．ＨＥＰＥＳバッファー±ＲＢ＋基質をメカニカルピペットでウェルに加える。
【０２６７】
（結果）
結果は、表２３、２４および２５並びに図２５Ａおよび２５Ｂに示される。５回の独立した反復実験から、蛍光基準値とブランクの比率が、アンバーチューブよりも低付着性の方が５０％高いことがＣａｍｂ２．３及び２．４の両方共に観察された。それにもかかわらず、反応速度（ブランクが負）は、相対的に同じままであった。平均反応速度の２５％の増大は、Ｃａｍｂ２．４のＮＢチューブにおいてのみ観察された。これらの違いが塩に依存するのかどうか検証するために、同じ実験が、ＨＥＰＥＳバッファーで非依存的に３回繰り返された。蛍光基準値の差異は、アンバー対ＮＢチューブにおいて、それぞれ３０〜４０％まで減少しており、このことの一部は少なくとも、この現象が塩の効果によることを示唆している。
【０２６８】
異なる蛍光の特性および反応速度が、アンバー対ＮＢチューブにおいて観察された。そのため、相違の原因が更に調査された。
【０２６９】
【表２３】
2011528916.tif 000031
【０２７０】
【表２４】
2011528916.tif 000032
【０２７１】
【表２５】
2011528916.tif 000033
【０２７２】
（蛍光および反応速度の相違の原因が、吸着であるのか、蛍光放出であるかの評価）
基質：Ｃａｍｂ２．４は、ＤＭＳＯで０．３３３ｍＭに希釈された。
１：８３のさらなる希釈が、２×ＲＢで行われた（ワーキング濃度としては、４．８μＬの基質に対して４００μＬのＲＢバッファー）。
【０２７３】
ウェルの内容物は、表２６に示す通りであった。
【０２７４】
【表２６】
2011528916.tif 000034
【０２７５】
１．人工ＣＳｒをプレートに入れる
２．３×４００μＬのＲＢ＋基質をアンバー及びＮＢチューブ両方にて準備する。室温で５分間インキュベートする。
３．新しいアンバー／ＮＢチューブに移す。室温で５分間インキュベートする。
４．ＲＢ＋基質をウェルに加える。
【０２７６】
（結果）
結果を表２７に示す。
異なる特性の原因は、アンバーチューブへの吸着にあると思われる。
アンバーチューブを経たＲＢ＋基質は、低いＲＦＵ測定値を示す。２度アンバーチューブを経た場合に最も低い測定値が得られた。ＲＢが２度ＮＢチューブを経た際には、ＲＦＵの有意な変化は観察されなかった。さらに、ＲＦＵ／分がＲＦＵ開始点（Ｒ２＝０．９４１）に相関することが見出された。これは、ブランク率への主な影響は基質濃度に起因することを示唆するものと思われる。
【０２７７】
【表２７】
2011528916.tif 000035
【０２７８】
（活性又は非活性物質のいずれがチューブに吸着するのかの評価）
基質：Ｃａｍｂ２．４は、ＤＭＳＯで０．３３３ｍＭに希釈された。
アンバーとＮＢチューブの両方において、１：８３のさらなる希釈が、２×ＲＢで行われた（最終濃度２μＭ、４．８μＬの基質に対して４００μＬのＲＢ）。
アンバーチューブにおいて、１：４６のさらなる希釈が、２×ＲＢで行われた（最終濃度４μＭ、９．６μＬの基質に対して４００μＬのＲＢ）。
ＮＢチューブにおいて、１：１１６のさらなる希釈が、２×ＲＢで行われた（最終濃度１μＭ、２．４μＬの基質に対して４００μＬのＲＢ）。
【０２７９】
ウェルの内容物は、表２８に示す通りであった。
【０２８０】
【表２８】
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【０２８１】
１．人工ＣＳＦ±ＨＥＰＥＳバッファーをプレートに入れる
２．４００μＬのＲＢ＋基質をアンバー及びＮＢチューブ両方にて準備する。
３．酵素／希釈バッファーをウェルに加える。
４．ＲＢ＋基質をウェルに加える。
【０２８２】
（結果）
結果は、表２９および３０に示される。吸収される物質の少なくとも一部は活性物質であるように見える。蛍光基準値がＮＢおよびアンバーチューブにおいて略同じとなるように基質濃度が調整された（アンバー及びＮＢチューブにおいて、それぞれ４μＭと２μＭ、または、アンバー及びＮＢチューブにおいて、それぞれ２μＭと１μＭ）。両チューブにおけるブランクおよび反応速度は、ほとんど同じであった。
【０２８３】
【表２９】
2011528916.tif 000037
【０２８４】
【表３０】
2011528916.tif 000038
【実施例１８】
【０２８５】
（分析の最適化−バッファー）
反応バッファーは、本発明のエンテロウイルス試験キットの一部である。Ｃａｍｂ２基質は、反応バッファーで溶解される。反応バッファーは、試験に用いられた酵素が最適条件で作用できるための異なる塩類を含む。ここでの反応バッファーの組成は、以下の通りである：ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１．８ＭのＮａ２ＳＯ４、０．１％のアジ化ナトリウム。反応バッファー中の塩濃度は高く、最適な酵素活性とする。しかしながら、これらの条件下で、基質溶解度が影響を受ける。したがって、反応バッファーは、試験された３Ｃプロテアーゼの酵素活性を減少させずに、基質溶解度を増すように改良された。
【０２８６】
（結果）
３００ｍＭのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールが反応バッファーから除かれ、Ｎａ２ＳＯ４（０．９Ｍから）の低減された濃度のいくつかが、分析の最低の塩要求量を決定するため試験された（表３１−３４）。実験は、２人の異なる科学者によって、少なくとも３回繰り返された。
【０２８７】
【表３１】
2011528916.tif 000039
【０２８８】
【表３２】
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【０２８９】
【表３３】
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【０２９０】
【表３４】
2011528916.tif 000042
【０２９１】
上記の結果は、試験された各Ｎａ２ＳＯ４濃度において（０．９−０．６Ｍ−表３１−３４）、３００ｍＭのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールの両方が除去された際、酵素活性が改善されたことを示す。ＣＶのわずかな改善も観察された。従って、反応バッファーは、ＮａＣｌおよびグリセロールが除かれ、修正された。次に、Ｎａ２ＳＯ４濃度が、酵素活性に影響を及ぼさない最小量の許容レベルの試験を受けた（表３５−３６）。
【０２９２】
【表３５】
2011528916.tif 000043
【０２９３】
結果は、ＮａＣｌなし及びグリセロールなしの０．６Ｍが同等であるいか、試験された他のＮａ２ＳＯ４濃度より変動係数の範囲内で効率的であることを示す。このようにして、０．６Ｍが選択された。０．６Ｍ以下にＮａ２ＳＯ４濃度を下げることは、さらに低いゲイン設定を必要とし、分析感度の低下を示した。０．４ＭのＮａ２ＳＯ４以下では、反応速度の急激な減少が観察された（表３６）。
【０２９４】
【表３６】
2011528916.tif 000044
【０２９５】
（０．６ＭのＮａ２ＳＯ４での再現性試験）
ＣＳＦ試料は、０．６ＭのＮａ２ＳＯ４を有する５０ｎｍのＥｃｈｏ  プロテアーゼおよび２×反応バッファーでインキュベートされた。また、３つのブランクおよび９つの陽性対照の反復試験が含まれた。代表的な実験のひとつを、表３７に示す。
【０２９６】
【表３７】
2011528916.tif 000045
【０２９７】
０．６ＭのＮａ２ＳＯ４での２×反応バッファーの再現性実験は、０．９ＭのＮａ２ＳＯ４を含むバッファーと比較して、同じであるか、または、それよりも良い反応速度を示す。
【０２９８】
新しいバッファー液組成は、２つの陽性および２つの陰性のＣＳＦ試料で試験された。結果（表３８）は、バッファー液組成に関係なく、試験された試料は同じ特性を維持したことを示す。新しいバッファーでの反応速度のわずかな増加が観察された。この増加により、将来の試験において、カットオフ値の増加が必要になる可能性を有する。
【０２９９】
【表３８】
2011528916.tif 000046
【実施例１９】
【０３００】
（分析の最適化−溶媒）
さまざまな溶媒が、基質溶解度および安定性を最適化するために試験された。試験された溶媒には：イソプロパノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、エチレングリコール、ジオキサン、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオール、が含まれる。テストされたすべての溶媒は２×反応バッファーで０−１０％濃度に調整され、試験された最終濃度は０−５％であった。イソプロパノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、エチレングリコールおよびジオキサンは、適当な溶媒濃度にて最終的に２×反応バッファーとなるように、３×反応バッファーに加えられた。Ｃａｍｂ２は、最終的な２×バッファーに加えられた。１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールについては、Ｃａｍｂ２は、溶媒中に適切な濃度で最初に溶解させられた。それから、溶媒＋Ｃａｍｂ２は、最終的に２×反応バッファー＋２μＭのＣａｍｂ２となるように、３×反応バッファーに加えられた。すべての実験はテカン社ポーラスターで行われ、ｎ＝１、三つ組で行われた。
【０３０１】
（結果）
イソプロパノール：
【０３０２】
【表３９】
2011528916.tif 000047
【０３０３】
【表４０】
2011528916.tif 000048
【０３０４】
テストされたすべてのイソプロパノール濃度で、反応速度の低下が観察された。さらに、試験された高濃度のものでは（最終濃度４及び５％）、塩析沈殿が生じた。従って、この溶媒はＥＶ分析に使用されるには不適当であると結論された。
【０３０５】
ＤＭＳＯ：
【０３０６】
【表４１】
2011528916.tif 000049
【０３０７】
テストされたすべてのＤＭＳＯ濃度（１−５％）で、反応速度の低下は観察されなかった。しかしながら、ブランクの安定性の向上は観察されなかった。ＤＭＳＯは、テストされたパラメーターのいずれにおいて、著しい効果を示さなかった。従って、この溶媒はＥＶ分析に使用され得ると結論された。
【０３０８】
アセトニトリル：
【０３０９】
【表４２】
2011528916.tif 000050
【０３１０】
【表４３】
2011528916.tif 000051
【０３１１】
テストされたすべてのアセトニトリル濃度（１−５％）で、反応速度の低下が観察された。しかしながら、ブランクの安定性の向上が観察された（図２６Ａおよび２６Ｂ）。アセトニトリル濃度は反応速度阻害の最小点に減少させた（〜７％の低下）、しかし、この濃度で、ブランクの安定性に対する寄与は不十分であった。
【０３１２】
ジオキサン：
【０３１３】
【表４４】
2011528916.tif 000052
【０３１４】
【表４５】
2011528916.tif 000053
【０３１５】
【表４６】
2011528916.tif 000054
【０３１６】
ジオキサン溶媒は、テストされた最も低い濃度においても酵素活性を阻害した。
【０３１７】
ＣＯＸ酵素（１：１０）を有する１，３−プロパンジオール：
【０３１８】
【表４７】
2011528916.tif 000055
【０３１９】
【表４８】
2011528916.tif 000056
【０３２０】
１，３−プロパンジオールの結果は、３つの実験間で反応速度の変動性が大きいことを示す。ブランク値の減少も観察された。
【０３２１】
ＣＯＸ酵素（１：１０）を有する１，２−プロパンジオール：
【０３２２】
【表４９】
2011528916.tif 000057
【０３２３】
【表５０】
2011528916.tif 000058
【０３２４】
１％の１，２−プロパンジオールを除いて、試験されたすべての濃度は酵素活性が阻害された。
【０３２５】
（溶媒の概要）
ＤＭＳＯ、エチレングリコール及び１，３−プロパンジオールを除き、テストされた溶媒はＥＶ分析に最適ではなかった。
【実施例２０】
【０３２６】
（分析最適化−反応条件）
以下の反応条件が、分析を最適化するために検討された：
ａ．基質濃度の低減及び測定時間の増加。
ｂ．Ｎａ２ＳＯ４濃度の最適化。
ｃ．脱イオン水（ｄｄｗ）対ＤＭＳＯでの基質溶解。
【０３２７】
（基質濃度の低減及び測定時間の増加）
基質（Ｃａｍｂ２）濃度の減少および測定時間の増加の効果が試験された。実験は最終的な基質（Ｃａｍｂ２．５）濃度、１、０．５、０．２５および０．１２５μＭで行われ、データ分析は異なる時間間隔：１．５−５、５−１２および５−２２分で行われた（図２７Ａ−Ｃ）。
【０３２８】
反応速度と基質濃度間の線形相関が示された（傾き＝２１００および２８００ＲＦＵ／分／μＭ、それぞれ１．５−５分および５−１２分）。測定時間間隔が１．５−５から５−１２分に変化した際に、ブランク値の減少および陽性対照値のわずかな増加が観察された（図２８Ａ）。よって、ブランクと陽性対照との比率がそれぞれ３．２から４．８まで（０．２５μＭのＣａｍｂ２．５で）増加した（図２８Ｂ）。さらに、測定時間間隔を５−２２分に変えると、その比率が６まで（０．２５ｕＭのＣａｍｂ２．５で、図２８Ｂ）増加した。図２８Ｂも、異なる基質濃度でのブランクと陽性対照の間に同程度の比率を示す。図２８Ｃは測定時間間隔が１．５−５分から５−１２分に変化した際、陽性対照とブランクの両方においてＣＶ値の向上を示す。これらの結果によると、ブランク値の減少およびブランク値の安定性の増大が達成された。これらの結果に基づくと、基質濃度は最終濃度０．２５μＭに減少され、結果は５−１０分間で分析されうる。
【０３２９】
（Ｎａ２ＳＯ４濃度の最適化）
硫酸ナトリウムは、一般に両価性の効果：３Ｃプロテアーゼ活性を増加させると共に基質溶解度を減少させる、を有する。基質濃度が０．２５μＭに低減させることと、５−１０分間で結果が分析されることがいったん決定されると、Ｎａ２ＳＯ４濃度は最適化された。硫酸ナトリウムの最終濃度は分析の活性に影響を及ぼさない可能な限り低減させたが、溶解度は向上した。０．６−０．４ＭのＮａ２ＳＯ４は、新しい分析条件で試験された。
【０３３０】
【表５１】
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【０３３１】
●データ分析は、５−１０分間で行われた。
●分析活性は３人の科学者によって、三つ組試験で測定された。表５１の結果は３つの三つ組の平均である。
【０３３２】
結果によると、硫酸ナトリウム濃度の減少は酵素活性を０．６Ｍでの８２５から、０．５Ｍでの７００、０．４Ｍでの４４４まで低くさせた。これらの結果に基づき、硫酸ナトリウム濃度は変えず、０．６Ｍの硫酸ナトリウムで作用を持続させることが決定された。
【０３３３】
（脱イオン水（ｄｄｗ）対ＤＭＳＯでの基質溶解）
新しい分析条件下で、ＤＭＳＯ対ＤＤＷでの基質溶解の効果を調べるために、基質原料（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）がＤＭＳＯ又はＤＤＷで１：８に希釈され、作用ストックとした。作用ストックは、さらに２×ＲＢで１：２５０に希釈されて０．５μＭ濃度とされた（ウェルにて最終濃度０．２５μＭ）。
【０３３４】
分析活性は、３人の科学者によって、三つ組試験で測定された。表５２の結果は、３つの三つ組の平均である。
【０３３５】
【表５２】
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【０３３６】
●データ分析は、５−１０分間で行われた。
【０３３７】
第１回目の反復において、ブランクの傾きはＤＭＳＯおよびＤＤＷの両方とも同じであった。２回目の反復において、ＤＤＷストックは、ブランクの傾きの減少を示した；しかしながら、その値は、標準偏差に対する有意差はなかった。さらに結果は、基質がＤＭＳＯと比較してＤＤＷで希釈された際に、反応速度が２５％低かったことを示す。これらの結果及びＣａｍｂ２がＤＤＷよりＤＭＳＯにおいて安定であるとする事実に基づいて、ＤＭＳＯは基質の希釈剤に選択された。
【０３３８】
（妥当性確認試験）
２つの陽性および２つの陰性ＣＳＦ試料は、新しい分析条件下でテストされた。
【０３３９】
【表５３】
2011528916.tif 000061
【０３４０】
これらの結果は、テストされた試料が新しい分析条件において、適切に機能したことを示す。陰性試料（７１００２２および１８９１１）は、ブランク以上の反応速度を示さなかった。陽性試料は高い反応速度（陽性対照の反応よりも高い）を有した。
【０３４１】
（結論）
分析条件は、２５％のＣａｍｂ２基質濃度および反応速度測定時間を５−１０分に変更された。Ｎａ２ＳＯ４濃度は、０．６Ｍのままであった。これらの分析条件は、臨床試料により実証された。
【実施例２１】
【０３４２】
部分的な分析最適化後のエンテロウイルス用の臨床試料分析
エンテロウイルス分析を最適化する前、この分析は最終濃度０．９ＭのＮａ２ＳＯ４と阻害剤カクテル（Ｉ８）とを含む２×反応バッファ（２×ＲＢ）へ基質を添加したＣＳＦ試料（組織全体、冷凍）を分析することから構成されており、主にＷＢＣバックグラウンドを減らすことが目的であった。その分析は、感度および特異性をそれぞれ８０％および８１％得た。実施例１６を参照のこと。以下の変化は、分析によりなされた：
−反応バッファーのＮａ２ＳＯ４の最終濃度は０．６Ｍまで下げられた。
−基質濃度は２５％に低減され、２×反応バッファーに加えられた。
−算出時間は、５−１０分に変更された。ゲインは１００に上げられた。
−阻害剤カクテルは、基質添加前に２．５分のインキュベーションを有するＩ１０と置き換えられた。
−非付着性プレートおよびチューブ管が用いられた。
【０３４３】
ＣＳＦ試料は、以下の条件下で分析された：
【０３４４】
（試薬および器具）
阻害剤カクテル−Ｉ１０
ＨＥＰＥＳバッファー：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ
２×反応バッファー：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１．２Ｍ硫酸Ｎａ２ＳＯ４、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．５。
人工ＣＳＦ：１２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭグルコース、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．１％アジ化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４５。
酵素：希釈バッファーで１：１８に希釈された“Ｅｃｈｏ”株由来の組換えエンテロウイルスプロテアーゼ。
基質：ＤＭＳＯで１：８に希釈されたＣａｍｂ２．５（１ｍＭ）。
蛍光光度計：ＢＭＧ社製、ポーラスターギャラクシー。
Ｅｘ：５２０／１０ｎｍ、Ｅｍ：５７０／２０ｎｍ。
温度：室温。
総読み込み時間：１０分
ゲイン：１００
反応プレート：非付着性黒底プレート（カタログ番号−６５５９００、グライナー社）
【０３４５】
（分析手順）
１．クリーンベンチの中にて３０分間室温で試料を解凍する。
２．ＢＭＧ蛍光光度計で測定する試料の数に従って分析配置を準備する。ウェルの組成を表５４に示す。
【０３４６】
【表５４】
2011528916.tif 000062
【０３４７】
３．阻害剤カクテルＩ１０の充分な量を準備する（２４ウェルあたり１５０μＬ）。
４．人工ＣＳＦ／試料をウェルに加える（黒プレートＮＢ  ｃａｔ．６５５９００）。
５．Ｅｃｈｏプロテアーゼをｐ．ｃ．（陽性対照）ウェルに加える。
６．２×ＲＢでＣａｍｂ２．５（０．１２５ｍＭ）を１：２５０に希釈する。
７．阻害剤カクテルをすべてのウェルに加える。
８．５０μＬの２×ＲＢ＋基質をすべてのウェルに加える。
９．ウェルをシーラーで覆う。
１０．蛍光光度計で直ちに測定を行う。
【０３４８】
試料：試料は、実施例１６にて上述したように、髄膜炎の疑いのある患者から集められた臨床試料であって、「全部の」試料として凍結されたものである。
【０３４９】
【表５５】
2011528916.tif 000063
【０３５０】
カットオフ値は、２５０ＲＦＵ／分にセットされた。表５５に示すように、前の実験に起因するすべての陰性（１−９）及び陽性（４０−４５）は、新しい分析条件下でのＲＴ−ＰＣＲ分析との相関を保持した。最大の改善点は偽陽性群において観察された（１０−１７）。これらの８つの前の偽陽性結果のうち、新しい分析条件下では、１つのみが偽陽性（１７）のままであり、その他７つは陰性であった。さらにこれらの試料のうち、２つが溶血性試料であった（１４および１６）。このことは、新しい分析条件が溶血性試料によりうまく対応できることを示唆する。他の興味深い所見が境界域陰性群において観察された（１８−２２）。試験されたこれら５つの試料のうち４つは、新しい分析条件下でカットオフ値より著しく低かった。カットオフよりも僅かに低いままであった１つの試料は、溶血性試料であった。偽陽性および境界域陰性群の改善はブランクの傾きが改善されたことによるものであり、システムをよりしっかりとしたものにする。
【０３５１】
他方、新しい条件の効果が弱陽性群において観察された（３２−３９）。以前に弱陽性反応を示した８つの試料のうち５つは、新しい分析条件下で陰性であった。しかしながら、以前弱陽性反応を示した２つの試料は、新しい分析条件で強い陽性反応を示した（３５および３７）。１つの試料は弱陽性のままであった（３９）。これらの所見は、古い分析条件下では、カットオフ値をわずかに超える反応速度を有する試料の大多数は、ロバスト性の不足による不自然な結果となっていたことを示唆する。偽陰性群での変化は観察されなかった（２６−３１）。
【０３５２】
さらに、陽性シグナルが、試験された３つの細菌性試料から得られた（２３−２５）。分析は問題になっている細菌に対して特異的に標的化された阻害剤（肺炎球菌に対してホスホラミドン（２３及び２４）、髄膜炎菌に対して２，６ピリジン（２５））を添加して行われたにもかかわらず、結果として、非特異的なバックグラウンド活性を除去することができなかった。
【０３５３】
表５６に示すように、新しい分析条件は、カットオフを僅かに超える反応速度を示した過去の偽陽性との結果を主に低減することによって、特異性を改善することが可能であった。この改善は、新しい分析条件でブランクのロバスト性を高めたことに起因し得る。偽陽性試料の大多数は、細菌性であった（４つのうち、３つ）。しかしながら、新しい分析条件で、検出感度は７０％から４５％まで低下した。この減少は、前に弱陽性と試験された試料（３２−３４、３６および３８）だけから生じた。この減少も新しい分析条件でのブランクの向上したロバスト性に起因するものであり、古い分析条件による陽性の不自然な結果を排除する。
【０３５４】
【表５６】
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【図１】
2011528916.tif 000065
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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