(57)【要約】本発明は癌細胞、特に結腸、直腸および肺の癌、並びに前癌病変に、特異的に発現する結腸癌関連転写産物１（ＣＣＡＴ−１）と呼ばれる固有の核酸転写産物の、識別、分離、および配列決定に関する。従って、本発明はＣＣＡＴ−１並びに分離したポリヌクレオチドの発現を検出することによる癌を診断する方法、本発明の検出方法で使用する組成物およびキットを提供する。
2011511635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  １（ＣＣＡＴ−１）またはその断片の発現レベルを測定する工程を含む癌または前癌病変の診断方法であって、生体サンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  １  （ＣＣＡＴ−１）またはその断片の発現は癌または前癌病変を示す癌または前癌病変の診断方法。
【請求項２】
前記方法はさらに生体サンプルで測定した前記発現レベルと基準を比較する工程を含み、
生体サンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  １  （ＣＣＡＴ−１）またはその断片の比較的に高い発現レベルは癌または前癌病変を示す、請求項１に記載の癌または前癌病変を診断方法。
【請求項３】
（ａ）対象から得た生体サンプルからの核酸を分離する工程と、
（ｂ）ハイブリッド複合体の形成を可能にする状況下で、ＣＣＡＴ−１と前記核酸を認識できるプローブをハイブリッドさせる工程と、
（ｃ）ハイブリッド複合体形成体を基準と比較する工程とを含み、
生体サンプルにおけるハイブリッド複合体の比較的高いレベルは癌または前癌病変を示す、請求項２に係る癌または前癌病変の診断方法。
【請求項４】
（ａ）対象から得た生体サンプルから核酸を分離する工程と、
（ｂ）前記分離した核酸で、ＣＣＡＴ−１またはそのいずれかの断片を増幅する工程と、
（ｃ）ＣＣＡＴ−１増幅産物を視覚化する工程と、
（ｄ）ＣＣＡＴ−１増幅産物の量と基準を比較する工程とを含み、
ＣＣＡＴ−１増幅産物の比較的高いレベルの存在は癌または前癌病変を示す、請求項２に記載の癌または前癌病変の診断方法。
【請求項５】
前記増幅を、ＣＣＡＴ−１の特異的なプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行う、請求項４に係る癌または前癌病変の診断方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲはリアルタイム定量ＰＣＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基準を、癌を患っていない対象で、ＣＣＡＴ−１の発現レベルを測定して決定する、請求項２〜４いずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記基準を、前記と同じ対象の非癌組織で、ＣＣＡＴ−１発現のレベルを測定することで決める、請求項２〜４に記載の方法。
【請求項９】
癌は、大腸癌、直腸癌、肺癌および前記癌の転移から成る群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前癌病変は、腺腫性ポリープである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体サンプルは、組織、血液、尿、糞便、および骨髄サンプルから成る群から選択される前記請求項のいずれか一項に方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルは、組織生検である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
発現レベルはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで測定される、請求項１の方法。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  １  （ＣＣＡＴ−１）またはその相補体の、少なくとも８つ隣接したヌクレオチドを含む、分離オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
プローブまたはプライマーとして使用する、請求項１４に記載の分離オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  ５を含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１７】
生体サンプルで、ＣＣＡＴ−１発現の検出に使用する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の分離オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
癌の検出に使用される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の分離オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
（ａ）前記生体サンプルから核酸を分離する工程と、
（ｂ）請求項１５または請求項１６のオリゴヌクレオチドプローブと前記核酸を、ハイブリッド複合体を形成することが可能である条件下でハイブリダイズする工程と、
（ｃ）ハイブリッド複合体形成体と基準を比較する工程を含む、生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１発現の検出方法であって、生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の比較的高いレベルはサンプルにおけるＣＣＡＴ−１発現を示す検出方法。
【請求項２０】
ハイブリダイズする前に生体サンプルの転写された核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＣＡＴ−１またはその断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １またはその断片と少なくとも８５％相同性を有する分離された核酸。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １またはその断片の核酸配列を含む、請求項２１に記載の分離された核酸。
【請求項２３】
請求項１４、１５、１７、もしくは１８に記載の分離オリゴヌクレオチド、請求項１６に記載の分離オリゴヌクレオチドのプローブ、または請求項２１もしくは２２に記載の分離された核酸を含む、組成物。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の分離された核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２６】
組成物は基質に付着される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
対象から得られた生体サンプルにおいて、ＣＣＡＴ−１の発現レベルを測定するための少なくとも１種の試薬を収容するように区別されたキットであって、前記少なくとも１の試薬は、少なくともＣＣＡＴ−１転写産物の断片にハイブリダイズする少なくとも１のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含むキット。
【請求項２８】
複数のセグメントを有する基質を含む配列であって、少なくとも１の前記セグメントはＣＣＡＴ−１またはその断片とハイブリダイズするプローブを含む配列。
【請求項２９】
（ａ）請求項１５または１６に記載のプローブを投与する工程であって、前記プローブを標識プローブに接合する工程と、
（ｂ）前記プローブに接合する標識分子を画像化装置で検出する工程を含む、
癌または前癌病変の画像化方法。
【請求項３０】
前記標識分子は放射線同位体、蛍光色素、可視色素、またはナノ粒子からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌マーカーＣＣＡＴ−１、ならびに癌の診断および画像化におけるＣＣＡＴ−１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸および直腸（ＣＲＣ）の腺癌は、世界的に毎年１００万人以上に影響を及ぼす一般的な病気である（１）。現在のＣＲＣスクリーニングは主に便潜血検査に基づき、そして診断は結腸内視術および生検に基づく。現在のスクリーニングプログラムはＣＲＣに関する死亡率を減少することにいくつかの効果があるが（２）、さらなる詳細なスクリーニングおよび診断方法が必要である。化学療法剤単体または標的療法との組み合わせは転移性患者の平均生存期間を改善し、ＣＲＣを完全に切除して、再発の危険性が高い患者で病気の再発を減少させた（リンパ節転移または好ましくない組織学（３））。ＣＲＣ療法の主な進歩にも関わらず、ＣＲＣと診断された患者の約５０％が診断の５年以内に疾患によって死亡する。
【０００３】
ＣＲＣに特異的な分子は、通常組織で発現されていなく、治療の潜在的標識となる。ＣＲＣで独自に発現される分子マーカーはわずかで、通常組織ではそれがない。ｃＤＮＡ配列を用いたマススクリーニングは、診断および治療の標識で用いることができるＣＲＣに関連した分子マーカーを識別することに至らなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は癌細胞、特に結腸癌、直腸癌で特異的に発現する特有な核酸転写の識別、分離、およびシークエンシングに基づく。それの特有な発現プロフィールによると、分子は結腸癌関連転写因子１（ＣＣＡＴ−１））と呼ばれている。分子の完全な配列を本願明細書の以下で開示し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に規定する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
次に、ＣＣＡＴ−１は肺がんで発現することも発見した。したがって、第一の態様として、本発明は、生体サンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １（ＣＣＡＴ−１）またはその断片の発現レベルを測定する工程を含む癌または前癌病変を診断する方法であって、生体サンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １  （ＣＣＡＴ−１）またはその断片の発現は癌または前癌病変を示す癌または前癌病変を診断する方法を提供する。
【０００６】
一の実施形態において、本発明は、さらに生体サンプルにおける前期発現レベルを基準と比較する方法を含み、生体サンプルにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １（ＣＣＡＴ−１）またはその断片の比較的高いレベルの発現は癌または前癌病変を示す。
【０００７】
一の実施形態において、本発明は
（ａ）  被写体から得た生体サンプルから核酸を分離する工程と、
（ｂ）  ハイブリダイゼーション複合体が形成できる状況下で、ＣＣＡＴ−１と前記核酸を認識できるプローブとハイブリッドする工程と、そして
（ｃ）  ハイブリッド複合体形成と基準とを比較する工程を含む、生体サンプルでのハイブリッド複合体は癌または前癌病変を示すことを含む診断方法である。
【０００８】
他の実施形態で、本発明は、
（ａ）対象から得た生体サンプルからの核酸を分離する工程と、
（ｂ）ハイブリッド複合体の形成を可能にする状況下で、ＣＣＡＴ−１と前記核酸を認識できるプローブをハイブリッドさせる工程と、
（ｃ）ハイブリッド複合体形成体を基準と比較する工程とを含み、
生体サンプルにおけるハイブリッド複合体の比較的高いレベルは癌または前癌病変を示す。
【０００９】
他の実施形態において、本発明の方法は、
（ａ）対象から得た生体サンプルから核酸を分離する工程と、
（ｂ）前記分離した核酸で、ＣＣＡＴ−１またはそのいずれかの断片を増幅する工程と、
（ｃ）ＣＣＡＴ−１増幅産物を視覚化する工程と、
（ｄ）ＣＣＡＴ−１増幅産物の量と基準を比較する工程とを含み、
ＣＣＡＴ−１増幅産物の比較的高いレベルの存在は癌または前癌病変を示す。
【００１０】
特定の実施形態において、前記増幅はＣＣＡＴ−１の特異的なプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。好ましい実施形態において、前記ＰＣＲはリアルタイム定量ＰＣＲである。
【００１１】
本発明に従って癌または前癌病変診断という用語はまた、癌または前癌病変の段階並びに生体内の画像化を含む。
【００１２】
本発明の一の実施形態によると、前記基準を、癌を患っていない対象でＣＣＡＴ−１の発現レベルを測定することによって決定する。
【００１３】
他の実施形態において、前記基準を、前記同一の対象の非癌組織における、ＣＣＡＴ−１の発現レベルを測定することによって決定する。
【００１４】
本発明の一定の実施形態によると、癌は、結腸癌、直腸癌、肺癌、およびマイクロ転移を含む前記癌の転移からなる群から選択される。
【００１５】
他の実施形態によると、本発明の方法は前癌病変、腺腫性ポリープを診断する。
【００１６】
本発明の一の実施形態によると、生体サンプルは組織、血液、糞便、および骨髄サンプルの群から選択される。好ましくは、前記生体サンプルは組織生検である。組織生検を例えば、結腸、直腸、肝臓、肺およびリンパ節から得ることができる。
【００１７】
他の実施形態において、ＣＣＡＴ−１の発現レベルをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド法で測定する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １  （ＣＣＡＴ−１）またはその相補体の少なくとも隣接した８核酸を含む分離オリゴヌクレオチドを、好ましくはプローブまたはプライマーとして使用するためのものを提供する。
【００１９】
一定の実施形態によると、本発明の分離オリゴヌクレオチドは生体サンプルにおいてＣＣＡＴ−１発現の検出での使用することを目的とする。
【００２０】
一定の実施形態によると、本発明の分離オリゴヌクレオチドは癌の診断での使用することを目的とする。
【００２１】
他の態様において、本発明は、生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１の発現を検出する方法であって、
（ａ）前記生体サンプルから核酸を分離する工程と、
（ｂ）前記核酸に本発明のオリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリッド複合体の形成を可能にする状態でハイブリッドする工程と、
（ｃ）ハイブリッド複合体の形成体と基準を比較する工程とを含み、生体サンプルにおけるハイブリッド複合体の比較的に高いレベルはサンプルでＣＣＡＴ−１を発現することを示すものを提供する。
【００２２】
一の実施形態において、前記方法はさらにハイブリッドする前に生体サンプルの転写される核酸の増幅を含む。
【００２３】
他の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と少なくとも８５％相同性があるＣＣＡＴ−１またはその断片を含む分離される核酸を提供する。一の実施形態において、分離される核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １またはその断片を含む。一の実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。他の実施形態において、核酸はｃＤＮＡである。
【００２４】
他の態様において、本発明は、上記に記載したような本発明の、分離オリゴヌクレオチドを含む、薬学的構成を含有する、組成物、分離オリゴヌクレオチドのプローブ、または分離される核酸を提供する。特定の実施形態において、組成物を基質に付着する。
【００２５】
本発明は、さらに本発明の分離される核酸を含むベクター、並びにベクターを含む宿主細胞を意図する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、対象から得た生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１発現レベルを測定するために少なくとも一つの試薬を収容する区分されたキットであって、前記少なくとも一種の試薬は、少なくともＣＣＡＴ−１転写因子の断片にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを含むものを提供する。
【００２７】
また他の態様において、本発明は複数の区域を有する基質を含む配列であって、少なくとも１種の前記区域はＣＣＡＴ−１またはその断片をハイブリッドするプローブを含むものを提供する。
【００２８】
本発明はまた、腺腫様ポリープ、結腸または直腸の一次腺癌、肺癌、リンパ節転移、遠隔転移を含むがこれに限定されない癌または前癌病変の画像を、対象にＣＣＡＴ−１が認識できるプローブを投与することにより意図するものであって、前記プローブは放射性同位元素、蛍光色素、可視染料またはナノ粒子を含むが、これに限定されない標識分子と結合する。
【００２９】
本発明を理解して、実際に実行する方法を参照するために、実施形態は一例として添付の図面を参照にして記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は通常組織からｃＤＮＡの市販パネルにおける、ＣＣＡＴ−１転写レベルのリアルタイムＰＣＲ定量分析したグラフを示す。左の列は、結腸癌細胞系ＳＫ−Ｃｏ−１ＯでのＣＣＡＴ−１転写レベルを示す。
【図２】図２は結腸癌腫（黒い棒）および隣接した通常の組織（白い棒）でＣＣＡＴ−１転写レベルのリアルタイムＰＣＲ定量分析したグラフを示す。サンプル数をＸ軸に示す。Ｃ＝コントロール／ＳＫ−ＣＯ−１０。
【図３】図３はＨＴ−２９細胞が低濃度のときのＣＣＡＴ−１に対する校正曲線グラフを示す図である。ＨＴ−２９結腸癌細胞の増加した濃度におけるＣＣＡＴ−１の増幅は、結腸癌を患っていない対象から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）で希釈する。増幅されたＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量（ＲＱ）をｙ軸に示し、結腸癌を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓ単独の参照サンプルを用いて算出した。ＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量はＨＴ−２９腫瘍細胞濃度と相関性があった。最も低い投与量：１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞５個、１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞（ＨＴ２９）最大５００個。
【図４】図４はＨＴ−２９細胞の中間濃度の測定を示すグラフを示す図である。ＨＴ−２９結腸癌細胞の増加した濃度でＣＣＡＴ−１の増幅は、結腸癌を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓで希釈する。増幅されるＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量（ＲＱ）を、結腸癌を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓ単独の参照サンプルを用いて算出した。ＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡ（ｙ軸）の相対量はＨＴ−２９腫瘍細胞濃度と相関性があった。最も低い投与量：１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞５００個、１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞（ＨＴ２９）最大１０，０００個。右の列はコントロールで、ＰＢＭＣｓのみである。
【図５】図５は高濃度のＨＴ−２９細胞における測定を示す。ＨＴ−２９結腸癌細胞の増加した濃度でＣＣＡＴ−１の増幅は、結腸癌を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓで希釈する。増幅されるＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量（ＲＱ）をｙ軸に示し、結腸癌を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓ単独の参照サンプルを用いて算出した。ＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量はＨＴ−２９腫瘍細胞濃度と相関性がある。最も低い投与量：１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞１，０００個、１×１０６個ＰＢＭＣｓに腫瘍細胞（ＨＴ２９）最大１，０００，０００個。右の列は結腸癌を患っていない対象から得たＰＭＢＣｓのみから成るコントロールサンプルである。
【図６】図６は結腸腺癌由来の結腸腺腫（腺腫ポリープ）および肝転移におけるＣＣＡＴ−１発現をグラフに示す。４１０ＴＣｏ−腫瘍組織、３１６ＴＣＯ−腫瘍組織、ＮＮ＝正常の結腸粘膜は結腸癌以外の疾患を伴う患者から得た。Ｐ１およびＰ２＝結腸腺腫ポリープから得た組織。Ｍ＝肝転移（転移性結腸癌）から得た組織。
【図７】図７はヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、種々の検出方法によって同定した前哨リンパ節（ＳＬＮｓ）の割合を示したグラフである。
【図８】図８はサイトケラチン−２０（ＣＫ２０）の増幅プロットをリアルタイム定量ＰＣＲで示すグラフである。
【図９】図９はＣＣＡＴ−１の増幅プロットをリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で示すグラフである。
【図１０】図１０は糞便サンプルでＣＣＡＴ−１の結果を示すグラフである。その結果をＣＣＡＴ−１とハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現との間の関係で示す。それぞれの列は同じサンプルから増幅されるＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの量と比較したＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量（ＲＱ）を示す。ＮＴＣ（左の列）は結腸癌を患っていない対象から得た内在的なネガティブコントロールの末梢血リンパ球を示す。ＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡは全く存在しない。サンプルｔ３９１およびｔ３７４は結腸組織のポジティブコントロールの一次性腺癌である。これらのサンプルはＣＣＡＴ−１の高い発現を示す。健康な志願者からの糞便サンプル：（Ｃ４６〜Ｃ８）。いずれのサンプル（ｎ＝９）もＣＣＡＴ−１発現は全くなかった。結腸または直腸の腺癌を有する患者の糞便サンプル（Ｐ２５−Ｐ１）。４／１２サンプルでＣＣＡＴ−１の発現が見られた。
【図１１】図１１はリアルタイムＰＣＲ定量的解析で、９個のネガティブコントロール（健康な志願者）の末梢血および２個のサンプルの結腸腺癌（左の列）で測定した、ＣＣＡＴ−１の発現を示すグラフである。
【図１２】図１２は結腸癌患者の末梢血サンプルで、ＣＣＡＴ−１の発現を示すグラフである。増幅されるＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの相対量（ＲＱ；ｙ軸に示す）は結腸癌（ＮＣ）を患っていない対象から得たＰＢＭＣｓのコントロールサンプルと比較した。
【図１３】図１３は１８種の結腸直腸癌細胞株における相対的なＣＣＡＴ−１の発現をＨＴ−２９と比較して示すグラフである。発現レベルはリアルタイム（定量的）ＰＣＲで測定した。いずれかの特定サンプルで相対的ＣＣＡＴ−１発現を、ＨＴ−２９直腸癌細胞株（＝１）におけるＣＣＡＴ−１発現と比較した。
【図１４】図１４は１６種の肺癌細胞株における相対的なＣＣＡＴ−１の発現をＨＴ−２９と比較して示すグラフである。発現レベルをリアルタイム（定量的）ＰＣＲで測定した。いずれかの特定サンプルで相対的ＣＣＡＴ−１発現を、ＨＴ−２９直腸癌細胞株（＝１）におけるＣＣＡＴ−１発現と比較した。
【図１５】図１５Ａはｉｎ−ｓｉｔｕプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  Ｘ）として用いられる、１６５ｂｐ核酸配列を示す。図１５ＢはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのノーザンブロット分析を示す写真である。レーン１：ラダー。レーン２：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターとインサート部位。
【図１６】図１６はスクリーニングに基づくＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの例示である。結腸腺癌（ａ）および隣接した正常粘膜（ｂ）におけるＣＣＡＴ−１の相対的染色。隣接した正常粘膜におけるＣＣＡＴ−１染色の低い濃度と比較して、腫瘍組織（ａ）では強いＣＣＡＴ−１の染色が見られた。
【図１７】図１７は健康な志願者の末梢血サンプルにおけるＣＣＡＴ−１の発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本願明細書では、「ＣＣＡＴ−１」という用語は結腸癌の関連転写産物１（Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １）を指す。
【００３２】
本願明細書では、「ＣＣＡＴ−１の断片」または「ＣＣＡＴ−１転写産物の断片」はＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物の断片であり、オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ、プライマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして役立つことができる。
【００３３】
本願明細書では、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を同じ意味で使い、そしていかなる長さのヌクレオチドのポリマーの形態で、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその類似体を含む。以下は制限しないポリヌクレオチドの例：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換え型ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれの配列の分離されるＤＮＡ、いずれの配列の分離されるＲＮＡ、核酸プローブ、プライマーである。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化されるヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような、修飾したヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分で隔てられることができる。ポリヌクレオチドはポリメリゼーション後、例えば標識成分との結合によってさらに修飾することができる。用語はまた、二重鎖および一重鎖の分子の両方を含む。
【００３４】
ＣＣＡＴ−１に関する「相補的転写」または「プローブ」は、核酸分子またはそれとの相補的配列をいい、少なくともＣＣＡＴ−１のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を検出するために使用した。検出をプローブと分析配列との間のハイブリッド複合体の同定によって行う。プローブは固体支持体または検出可能なラベルに付着することができる。プローブは通常一重鎖であるだろう。（複数の）プローブは通常１０から２０ヌクレオチドを含む。プローブの特有の性質は、特定的な使用に依存して、決定する当業者の能力の範囲内である。通常、非常に厳しい条件化でプローブはＣＣＡＴ−１のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズするだろう。
【００３５】
本願明細書では、「プライマー」とは、標的、または標的とハイブリッドして、その後標的と相補的なポリヌクレオチドとポリメライゼーションを促進することによって関連のサンプルに存在する「鋳型」標的に結合する短いポリヌクレオチドを指す。
【００３６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、プライマーセット、通常フォワードプライマーとバックワードプライマーから成るプライマーの対と、ポリメリゼーションの触媒としてＤＮＡポリメラーゼとを用いて標的ポリヌクレオチドして、複製コピーを作製する反応である。
【００３７】
プライマーはまた、例えば下記に記載したサザンまたはノーザンブロッティング解析のような、ハイブリッド形成反応でプローブとして使うことができることを理解すべきである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８９）。
【００３８】
本願明細書では、用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は分離されるポリヌクレオチド、核酸分子、またはいずれかの断片もしくはその相補物を指す。それは組み換え技術または合成から始まり、二重鎖または一重鎖で、５´および３´配列のコーディングおよび／または非コーディングを表す。本願明細書では、「結腸癌」または「ＣＲＣ」は盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸および直腸を含む腸管細胞の癌によって特徴付けられる医学的状態を指す。
【００３９】
本願明細書では、「前癌病変」または「腺腫性ポリープ」は、基底膜内に浸潤している組織学的証拠がない結腸粘膜の悪性転換によって特徴付けられる医学的状態を指す。
【００４０】
本願明細書では、「肺癌」は肺細胞癌によって特徴付けられる医学的状態を指す。
【００４１】
「ベクター」は、インサートポリヌクレオチドを宿主細胞内で転写する自己複製の核酸分子を含む。この用語は細胞内で核酸分子のインサートで主に機能するベクター、主に核酸の複製で主に機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳で機能する発現ベクターを含むことを意図する。また１つ以上の上記機能を備えるベクターを意図する。
【００４２】
「宿主細胞」という用語はベクター、または例えばポリヌクレオチドのような外因生の核酸分子の結合に対する受容体として役割を果たす個々の細胞、または細胞培養を含む。特に、宿主細胞は少なくともＣＣＡＴ−１の一部を含むベクターに対する受容体として役割を果たすことができる細胞を含む。それはまた、場合によっては、その遺伝子型または表現型で本来の親細胞に、自然、事故的、または故意の突然変異による必ずしも同一でない子孫細胞を含む。原核細胞または真核細胞は本発明における宿主細胞として役割を果たすのに適している。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ネズミ、ラット、サルまたはヒト細胞のような哺乳類細胞を含む動物細胞を含むが、これに限定されない。
【００４３】
本願明細書では、「差次的発現」とは、生体サンプルで転写されたオリゴヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の量の欠乏、存在、または変動から検出される遺伝子発現の上昇、さらに高い（発現上昇または存在）、または減少（発現低下または欠乏）を指す。「比較的高い発現レベル」とはコントロールサンプルまたは基準で検出される発現レベルより少なくとも２倍、２．５倍、３倍、５倍、１０倍、またはそれ以上である発現レベルを含む。この用語はまた、細胞または組織で核酸配列の発現を指す一方、発現が全くないことをコントロール細胞で検出した。
【００４４】
本願明細書では、「ハイブリダイゼーション」とは、少なくも１つのポリヌクレチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基との間で水素結合により安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合はワトソン・クリック型塩基対により、いずれかの配列特異的な方法で起こる。ハイブリダイゼーション反応は例えばＰＣＲ反応開始といった比較的広範囲な処理で工程を構成する。
【００４５】
ハイブリダイゼーション反応は種々の厳密な状況下で行うことができる。厳密な状況で、互いに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一の核酸分子は、互いにハイブリッドしたままである。非常に厳密なハイブリダイゼーション状況下の非制限的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）でハイブリダイゼーションを行い、その後に５０℃、５５℃、または６０℃またはそれ以上の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで一回以上洗浄する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションが逆平行の構成で、２本の一重鎖ポリヌクレオチドの間で起こるとき、それらのポリヌクレオチドは相補的であるといわれる。
【００４７】
本発明の核酸分子ＳＥＱ  ＮＯ：  １（ＣＣＡＴ）とハイブリダイゼーションができる分子はまた、それにハイブリダイズできるポリヌクレオチド断片を含む。ここで、断片はＣＣＡＴ−１転写産物とハイブリッドするのに十分な長さである核酸分子の一部という意味で理解されている。したがって、断片という用語は、これらの分子の配列がＣＣＡＴ−１転写産物配列と一以上の位置で異なり、そしてこれらの配列またはその一部と高い割合で相同性を示していることを意味する。この文脈において、相同性とは、少なくとも４０％、特に少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９５％を超える同一性がある配列を意味する。
【００４８】
好ましくは、相同性の度合いは、それぞれの配列を核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と比較して確定される。このような場合、比較される配列は同じ長さを有していなく、好ましくは相同性の度合いは、比較的長い配列の核酸残渣と同一である比較的短い配列のヌクレオチド残渣の割合をいう。相同性または同一性の度合いは、ヨーロッパ生物情報学研究所（ＥＢＩ）およびヨーロッパ分子生物研究所（ＥＭＢＬ）で配布されている例えばＣｌｕｓｔａｌＷといった周知のコンピューター配列に基づくプログラムによって評価する。ＣｌｕｓｔａｌＷは例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗといった様々な情報源からダウンロードできる。ＣｌｕｓｔａｌＷパッケージバージョン２．０を使用して特定の配列であるかどうか決めるときは、例えば、本発明のＳＥＱ  ＮＯ：  １と８５％相同性があって、比較はそこで提供されるデフォルト設定の条件で行われる。
【００４９】
「生体サンプル」を広い意味で本願明細書において使用して、体液；細胞調製の可溶性分画、または細胞を成長させる培養液のアリコート；細胞から分離または抽出された染色体、細胞小器官または膜；液体の中または基質に付着されるゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ；細胞；腫瘍組織、結腸直腸サンプルおよび非結腸直腸サンプルを含む生検、組織；組織プリント；指紋、頬側細胞、皮膚または髪；およびその他を含むことができる。
【００５０】
「基質」とは核酸が結合する固定または半固定される支持体をいい、そして膜、フィルター、チップ、スライド、ウェーハー、繊維、磁性または非磁性のビーズ、ゲル、キャピラリーまたは他の管、プレート、ポリマー、ナノ粒子および微粒子と、溝、栓、水管および孔を含む様々な表層形を含む。
【００５１】
本発明は、結腸癌関連転写産物―１（ＣＣＡＴ−１）、２５２８塩基対（ｂｐ）の長さである新規非コードＲＮＡ、および染色体の８ｑ  ２４．２１に位置する新規非コードＲＮＡの同定に基づく。
【００５２】
ＣＣＡＴ−１は結腸、直腸、肺癌、および結腸の中の前癌病変（腺腫ポリープ）を含む様々な癌組織および細胞株に存在するが、仮にあったとしても本願明細書に記載される通常組織において、とても低いレベルで検出されたことが発明者によって見つけられた。したがってＣＣＡＴ−１は癌細胞標識として役立ち、そして特に生体サンプルで結腸直腸、肺癌、および前癌病変（腺腫ポリープ）の同定に有効である。
【００５３】
したがって、本発明はＣＣＡＴ−１またはその配列のいずれか一部の使用を特定分子診断標識として、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、前癌病変（腺腫ポリープ）および肺癌で患者の診断、病気診断（病理学的診断）、画像化、および手術後の査察として提供する。
【００５４】
これらの活性は生体外または生体内で組成物の伝達によって患者の腫瘍で映像化するために実行することができる。
【００５５】
検出はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法、または公知の他の検出方法を用いて成し遂げることができる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物および方法を、ＣＣＡＴ−１発現の証拠を検証するために、患者および／または患者のサンプルを検査、診断、および分析で提供する。ＣＣＡＴ−１の発現は一次性もしくは転移性の結腸直腸癌、または一次性もしくは転移性の肺癌を示唆する。本発明のさらなる態様において、組成物および方法は、一次性もしくは転移性の結腸直腸癌、または一次性もしくは転移性の肺癌細胞を視覚化するのに実用的であるものを提供する。
【００５７】
検査および診断の組成物および方法は、結腸直腸癌の高リスク群である個人のモニターイング、例えば、過去に局所疾患、転移性疾患と診断されたもの、または疾患に遺伝的に関連したもの、または過去に癌と診断された一次的および二次的段階の家族の一員を有するもので使用することができる。例えば潰瘍性大腸炎またはクローン大腸炎のような結腸の炎症状態の病歴を持つ個人および煙草喫煙の経歴を持つ個人は、結腸直腸または肺癌の高いリスク群である個人と考えられる。生体内検査ならびに診断の組成物および方法は、結腸直腸または肺癌を患っているまたは治療された個人を診断する際に、癌が取り除かれたかどうかを確定するために使用する。検査ならびに診断の組成物および方法は、例えば遺伝学的検査および／または家族の病歴などの遺伝的素因として識別された個人の監視に用いることができる。
【００５８】
したがって、結腸直腸および肺の癌を発現するリスクがある個人を識別することができ、サンプルはこのような個人から分離することができる。本発明は、少なくとも１つの癌の徴候または特徴、例えば関連のある組織でポリープの存在を示す個人を診断するのに実用的である。本発明は、結腸直腸または肺の癌を患う親類を含む家族に病歴を有すると識別された個人を検査するのに特に実用的である。同様に、本発明は治療、腫瘍を摘出、または回復を感じている個人での検査に特に実用的である。
【００５９】
本発明によると、化合物はＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物と結合するものを提供する。
【００６０】
結腸、大腸、または肺の癌の発見は癌患者または癌の疑いのある個人から得られるいずれかの生体サンプル、組織、血液、骨髄、糞便、尿、リンパ節、またはいずれかの体液を含むが制限されないものを用いて行われる。特定の実施形態において、生体サンプルは癌とみなされる組織から得た生検（例えば、針生検または結腸内手術時に除去された組織）である。特定の実施形態では、サンプルは糞便サンプルである。
【００６１】
組織サンプルは外科技術によって得られる。当業者は本発明による分析および検査で得ることができる複数のテストサンプルを正しく評価する。さらに、当業者は、本発明が組織サンプルを得る目的で更なる手法を使用できることを理解する。
【００６２】
一の実施形態では、血液を生体サンプルとして用いる。この場合、その中に構成される細胞は、例えば遠心分離によって、血液サンプルから分離することができる。
【００６３】
好ましい実施形態では、生体サンプルをヒトから得る。
【００６４】
いずれかの生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１遺伝子転写物の存在を検出することは、生体サンプルが腫瘍細胞を含有することを示唆する。
【００６５】
組織サンプルを、例えば、超音波処理、物理的な拡散または化学的溶解といった標準の技術で任意に均質にした。
【００６６】
外科病理学のための組織断面の調製は、凍結して、標準の技術を用いて調製できる。組織断片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を固定し細胞で行う。
【００６７】
ＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物の存在を、様々な公知技術、例えば、特異的なプライマーおよび増幅される産物の検出を用いて遺伝子転写産物またはその断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびＣＣＡＴ−１に特異的なプローブとハイブリダイゼーションを使用して確定する。
【００６８】
ＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物の存在はまた、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術を用いて組織断片から確定できる。
【００６９】
そのためには、本発明は、本発明の手順でＣＣＡＴ−１を識別するために用いたオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００７０】
他の態様において、本発明はこのような部分としてオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットを提供する。本願明細書で提供した例は本発明の範囲を制限することを意味しないことを認識すべきである。
【００７１】
上記のように、生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物を検出することはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行することができる。ＰＣＲは従来技術において知られていて、そして診断および研究の両方で通常実践されている。例えばそれは米国特許４，６８３，２０２号および５，０７５，２１６号で開示される。要約すると、ＰＣＲはＤＮＡ／ＲＮＡ配列の増幅を、増幅すべき標的核酸配列とハイブリダイズするプライマーを与えることによって提供する。プライマーセットは、通常２つのプライマー（＋フォワードおよび−バックワード）を含む。反応はまたヌクレオチドおよびポリメラーゼ酵素を使用する。ポリメラーゼはハイブリダイズされるプライマーと隣接した配列に従って、相補的なヌクレオチドを満たす。増幅サイクルは所望の産物の急速な増幅を生じる。
【００７２】
ＰＣＲプライマーは配列情報の基礎に通常のプロトコールに従って設計する。ＣＣＡＴ−１転写産物の核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載する。
【００７３】
ＰＣＲのために、ＲＮＡは、通常生体サンプルの細胞から抽出して、分析、あるいはｃＤＮＡに変換する。このような変換はまた通常の実務である。
【００７４】
ＣＣＡＴ−１転写産物が生体サンプルに存在するとき、ＰＣＲはＣＣＡＴ−１転写産物を含む元のｍＲＮＡを急速な複製といった結果になる。
【００７５】
ＣＣＡＴ−１が欠乏していると、ＰＣＲは検出可能な増幅産物を生じないだろう。ＰＣＲに適したプライマーは、通常８〜２５塩基長、１５〜３０塩基長、または１８〜５０塩基長である。典型的なプライマーは１５〜２５塩基を含む。これらのプライマーはＣＣＡＴ−１転写産物またはそれの対応するｃＤＮＡと同一または相補的である。これは、これらのプライマーがＣＣＡＴ−１転写産物またはその断片にハイブリダイズする理由である。
【００７６】
生体サンプルから以前に得られたｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡをプライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼ酵素と混合して、既知のＰＣＲプロトコールに従った。混合物は一連の温度サイクルを受ける。ＣＣＡＴ−１転写産物またはそれに対応するｃＤＮＡが混合物に存在して、プライマーはハイブリダイズして、ＣＣＡＴ−１転写産物は急速に増幅される。ＣＣＡＴ−１転写産物が欠乏しているとき、全く検出できない増幅を認めた。増幅産物は例えばゲル電気泳動といった、従来技術において多くの手法によって検出できる。
【００７７】
ＰＣＲは、少量の転写されたポリヌクレオチドを生体サンプルから回収するときに好ましい。
【００７８】
さらに本発明はＣＣＡＴ−１転写産物を増幅することを目的としたＰＣＲ反応に適したポリヌクレオチドプライマーを提供する。
【００７９】
本発明によると、生体サンプル内のＣＣＡＴ−１転写産物の存在の検出に役立つ診断キットとしてまとめられる。このような診断キットはＣＣＡＴ−１を検出するのに適した試薬を含む。制限しない例として、このようなキットは、少なくとも一種のオリゴヌクレオチドプローブおよび／または少なくとも一種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。通常、本発明のキットは、使用した試薬の容器をさらに含む。さらに、これらのキットは検出した核酸の大きさを測定するためにゲル分析で使用するヌクレオチドサイズマーカーを含む。本発明のキットは分析を行うための説明書とプロトコールをさらに含む。ポジティブおよびネガティブのコントロールを、組み立てキットの一部としてさらに提供することができる。
【００８０】
他の実施形態では、サンプルがＣＣＡＴ−１を発現する細胞を含有するサンプルかどうかの決定を、生体サンプルから抽出したｍＲＮＡのノーザンブロッティング分析で確定する。ノーザンブロッティング分析は当業者に既知の方法である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．参照。
【００８１】
さらに、ｍＲＮＡ抽出、電気泳動によるｍＲＮＡ分離、ブロット分析、プローブおよびプライマー調製ならびにハイブリダイゼーション技術が既知で、そしてこれらの技術を実施するための材料は市販である。
【００８２】
メッセンジャーＲＮＡを、例えば、ポリｄＴカラムを用いて抽出でき、そして材料を電気泳動で分離して、例えば、ニトロセルロース紙に転写する。
【００８３】
ラベルしたプローブは、紙に固定したｍＲＮＡの存在を可視化するために一般的に用いられる。これらのプローブはＣＣＡＴ−１転写因子またはその断片に相補的である核酸配列を有する。
【００８４】
そのために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １における配列情報を、プローブを調製、またはＣＣＡＴ−１転写産物を分離および複製するために使用する。このようなプローブは少なくとも８、１５、３０、４０、または１００塩基配列伸縮である。プローブはＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、それは好ましくは一重鎖で、一般的にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に対応する断片に配列の相同性が少なくとも６５％有する。
【００８５】
プローブを、オリゴラベリング、またはレポーター分子が存在する場合はＰＣＲ増幅で作成することができる。ＣＣＡＴ−１またはその断片のｃＤＮＡを含有するベクターを、例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドを加えて、メッセンジャーＲＮＡプローブを作成するために使用することができる。当業者はこれらの手法を市販のキットと材料で実行することができる。
【００８６】
ハイブリダイゼーションの厳格さは、例えばプローブの中のＧＣ容量、温度、および塩濃度といった様々な要因によって確定される。特に、厳格さは塩濃度の減少またはハイブリダイゼーション温度の上昇によって増加することができる。高い厳格さで、ハイブリダイゼーション複合体は、核酸が非常に相補性ある場合にのみで安定を保てるだろう。
【００８７】
ハイブリダイゼーションに関する条件は、上記のように、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の、等業者に周知である。
【００８８】
従って本発明のキットは、生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１転写産物の存在を検出するためのノーザンブロット技術を実施するために実用的な試薬を含むことができる。キットは、任意に、転写されたＣＣＡＴ−１またはその断片にハイブリダイゼーションするためのプローブとして使用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プローブは放射性同位元素で識別することができる。ポジティブおよびネガティブのコントロールまた、適切なサイズマーカーと共に任意に提供することができる。
【００８９】
ＣＣＡＴ−１転写産物の存在を検出するための他の技術は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは等業者に既知である。この方法はまたＣＣＡＴ−１転写産物の核酸配列にハイブリダイズする特異的な核酸配列検出プローブを使用する。
【００９０】
生体サンプルからのＲＮＡを、一般的にフィルター紙またはその他に固定する。プローブを加えて、プローブが固定材料を適度に相補する場合にのみ、ハイブリダイゼーションを可能にする状態に保持する。
【００９１】
これらの条件は、固定材料にハイブリダイズするプローブを部分的に洗浄するために十分に厳しくすべきである。フィルター上でプローブの検出は、ＣＣＡＴ−１転写産物の存在を示す。
【００９２】
ハイブリダイゼーション分析のためのプローブは、ＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物の配列に相補的な少なくとも８、１２、１５、２０、３０、５０または１００塩基を含む。
【００９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に開示した配列情報を、等業者によって使用して本発明のプローブを調製することができる。ハイブリダイゼーション方法に関する条件は、サンプルにおける十分に相補的でないポリヌクレオチドを生じるバックグラウンド信号を最小限にすることで最適化できる。
【００９４】
従って、本発明はさらにオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに関するプローブとして実用的である標識されたオリゴヌクレオチドを含む。ラベルされたプローブは放射性標識ヌクレオチド、またもう一方で、容易に利用できる系による検出できるプローブを含む。ラベルされたプローブは一般的に、分光器、光化学、生化学、免疫化学、または化学の手段によって測定できるラベルを組み込む。制限しない例によって、このようなラベルは放射性物質（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）、蛍光色素（ジゴキシゲニン、フルオレセイン、５−ブロモデソキシウリジン、アセチルアミノフルオレン）、ビオチン、ナノ粒子などを含むことができる。このようなオリゴヌクレオチドを、通常これらの３’から５’末端でラベルする。
【００９５】
特に、ＣＣＡＴ−１に相補的な転写産物（例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ４）またはその配列のいずれかの部分を、生体外もしくは生体内の検出、または結腸もしくは直腸の癌、および肺癌の映像化のために、可視領域（例えば、ＣＹ３．０またはＣＹ  ５．０）の蛍光タグまたは赤外領域（例えばＣｙ  ５．５）のプローブを含むが、これに制限されない蛍光プローブと結合することができる。さらに、ＣＣＡＴ−１またはその配列のいずれかの部分に相補的な転写産物を、ナノ分子、微粒子、リポソームに、癌の検出または映像化のために接合または組み込むことができる。
【００９６】
ＣＣＡＴ−１またはその配列のいずれか部分に相補的な転写産物は、癌の検出または映像化のため、放射線同位元素に接合する。ＣＣＡＴ−１またはその配列のいずれかの部分に相補的な転写産物は、癌の検出または映像化のために、合成ポリマーに接合する。
【００９７】
ＣＣＡＴ−１またはその配列のいずれかの部分に相補的な転写産物は、癌の検出または映像化のために、抗体、毒素、または他のペプチドを含むが、これに制限されない他の生物学的物質と接合する。
【００９８】
キットは、本発明のハイブリダイゼーション方法を実施するために役立つものを集めることができる。これらのキットは、さらにＣＣＡＴ−１転写産物にハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。一の実施形態において、ラベルされたプローブは放射性標識である。ポジティブおよびネガティブのコントロールは、さらに前記キット並びに例えばポリヌクレオチドラダーといったサイズマーカーを含むことができる。これらのキットはさらに分析を行うための説明書を含むことができる。
【００９９】
本発明のハイブリダイゼーション技術は、例えば組織断片といった生体サンプルで、ＣＣＡＴ−１を発現する細胞をさらに検出するためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。したがって、本発明は、さらにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに実用的であるプローブに関する。これらのプローブを生体サンプルに存在する相補的な核酸配列とハイブリダイズするように設計する。蛍光顕微鏡を、蛍光マーカーで標識されたプローブを可視化するために利用することができる。
【０１００】
そのためには、本発明はまた、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するためのキットを提供する。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して組織断片でＣＣＡＴ−１配列のｍＲＮＡを検出することができる。蛍光マーカーを使用して、ＣＣＡＴ−１転写産物またはそれの相補的な配列と対応する配列を検出することができる。
【０１０１】
本発明は、さらにＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物、その断片、またはその相補体を含む発現ベクターを含有する組み換えベクターに関する。
【０１０２】
本発明は、さらにこのようなベクターを含む宿主細胞、およびこのような組み換え細胞を使用するＣＣＡＴ−１を発現する方法に関する。宿主細胞の例は、例えばＳ．セレビシエといった酵母細胞、例えばＳ．フルギペルダといった昆虫細胞、例えば大腸菌といった細菌、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞といった哺乳類細胞を含む。
【０１０３】
本発明はまた、ＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその断片の配列を含む、分離されるオリゴヌクレオチドを提供するためにある。特に、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８５％相関を有する分離されたオリゴヌクレオチドに向ける。
【０１０４】
本発明の組み換え発現ベクターは、本発明の分離されるオリゴヌクレオチドの調製のための組み換え発現系を調製すために宿主の形質転換が実用的である。発現ベクターは転写制御要素（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）を含むことができる。これらの要素を、特定の宿主において、それらの効率で選択される様々な供与源から選択することができる。ベクター、ｃＤＮＡ、および調節エレメントは、組み換えＤＮＡ技術または合成技術を用いて組み合わせる。
【０１０５】
等業者は、本発明のＣＣＡＴ−１ポリヌクレオチドを含むこのような分子を、例えば本願明細書で記載したもののような周知の発現系で用いる市販の発現ベクターの使用によって導入することができる。
【０１０６】
組み換え技術によるこれらポリヌクレオチド分子の作成に加えて、自動核酸合成をまたＣＣＡＴ−１またはその断片の作成に用いることができる。このような技術は当業者の通常の技術を有するものにとって周知である。
【０１０７】
上述したいずれかのＣＣＡＴ−１転写産物、ＣＣＡＴ−１に対応するｃＤＮＡｓ、その断片、オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、更にはＰＮＡｓを、使用して、差次的ＣＣＡＴ−１の発現を検出または測定することができ、発現レベルを増加させる。これらの測定は、療的介入の間にｍＲＮＡレベルを観測できる。それはまた、本発明の診断法、実際には予後の測定に活用することができる。これらの測定はまた、例えばＣＲＣまたは肺癌のような癌組織を分類するのに利用することができる。
【０１０８】
差次的発現に関連のある癌は、特異的な結腸または直腸の癌並びに肺癌を含む。診断分析は、上記のようなハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いることができる。それらは患者から通常サンプルまで得られた生体サンプルで、遺伝子の差次的発現またはＣＣＡＴ−１の発現レベルの増加を検出するために、遺伝子発現を比較することを利用することができる。この比較に関する定量的方法は等業者に公知である。特に、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析を使用して、生体サンプルからＣＣＡＴ−１発現レベルを定量化することができる。要するに、リアルタイム定量的ＰＣＲは、増幅過程にわたって同時に観測することを設ける。増幅産物を、進行が続いて蓄積しながら、絶え間なく検出する。定量的ＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲは等業者に既知の手法である。
【０１０９】
制限しない例として、ラベルされたプローブを、患者から得た生体サンプルから調製した核酸と混合することができる。混合物を、ハイブリダイゼーション複合体の形成のための状態で維持する。特定の培養後に、サンプルを洗浄して、ハイブリダイゼーション複合体に関するシグナル量を定量化した。このシグナルをまた基準値と比較することができる。通常基準と比較して個人から得た生体サンプルにおけるＣＣＡＴ−１の比較的高い信号シグナルは、癌（例えばＣＲＣまたは肺癌）を示す。
【０１１０】
識別的発現の設定またはＣＣＡＴ−１の増加した発現に関する基準を設けるために、正常および疾患での発現レベルを評価した。正常の対象から得た核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションが可能である条件下で、ＣＣＡＴ−１と相補的なオリゴヌクレオチドプローブと反応させる。その後、ハイブリダイゼーション複合体の量を測定した。この様に得た基準値を、検査した個人の生体サンプルから得た値と比較することができる。
【０１１１】
基準レベルを、癌を患っていない個人で、ＣＣＡＴ−１発現を測定して確定することができる（「正常の対象」という）。あるいは、標準レベルを生体サンプル参照遺伝子、任意に検査した個人の発現レベルに従って確定することができる。参照遺伝子を、例えば本願明細書で例証したようなハウスキーピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ）であることができる。したがって生体サンプルにおける差次的ＣＣＡＴ−１発現は、参照遺伝子の発現レベルを比較したＣＣＡＴ−１発現の比率の増加、またそれ以外で標準化されたＣＣＡＴ−１発現の測定の増加によって識別することができる。
【０１１２】
基準をまた、組織のＣＣＡＴ−１レベルを癌がない（「非癌組織」または「正常の組織」とも称する）と考慮した周囲の組織との比較によって確定することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＣＡＴ−１プライマーおよび／またはプローブを、液体、溶液、懸濁液、乳液または凍結乾燥粉末を含む様々な形態で形成することができる。
【０１１４】
他の態様において、本発明は複数のセグメントを有する基質を含むオリゴヌクレオチドの配列であって、少なくとも１種の前記セグメントはＣＣＡＴ−１またはその断片とハイブリダイズするプローブを含むものを提供する。特定の実施態様において、配列は例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５といった本発明のプローブを含む。
【実施例】
【０１１５】
以下に提供した実施例は、本発明を例示して、発明の要旨の範囲を制限することを目的としない。
【０１１６】
実施例１：ＣＣＡＴ−１の発見
患者、細胞株、組織およびＲＮＡ
結腸癌細胞株ＨＴ−２９およびＳＫ−ＣＯ−１０をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から得た。ＨＴ２９を使用して、差次的発現分析（ＲＤＡ）装置で、テスターＲＮＡを調製した。結腸腺癌および隣接した正常の組織試料を、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （＃４  ｔｏ  ２９）またはＨａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（＃９６−２１８）によって保持した組織貯蔵所のいずれかから得た。全てのサンプルは外科的腫瘍切除を受けた患者からのものであり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）の承認を得た書面での告知に基づく同意の書面に署名した患者である。全ＲＮＡを、グアニジウムイソチオシアナート／ＣｓＣｌ勾配精製方法またはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のいずれかから得た。正常組織のＲＮＡのパネルを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  （Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ，  ＣＡ）から得た。
【０１１７】
ＲＤＡおよびｃＤＮＡのクローニング
差次的発現分析（ＲＤＡ）を前述したように行った（４）。ＨＴ２９はテスターＲＮＡを構成する。ドライバーのために、ＲＮＡを３種の正常結腸組織から混合した。Ｔｓｐ５０９ＩまたはＤｐｎＩＩを制限エンドヌークレアーゼとして利用して、３回の増幅を実施した。
２、３回の増幅サイクルの後に生成されたフラグメントを分離して、配列を決定した。ＲＤＡによって識別した部分的な長さのＣＣＡＴ−１の転写産物を使用して、ｃＤＮＡの全長を得たλ−ＺＡＰＩＩベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）で、ＨＴ２９  ｃＤＮＡライブラリーを評価した。
【０１１８】
ＣＣＡＴ−１遺伝子転写産物と発現
ＨＴ２９  ｃＤＮＡライブラリーから複製される全長のＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡは２５２８ｂｐ長さである。転写産物を、２つの染色体８ゲノムクローンに対する（ＡＣ０２７５３１  ａｎｄ  ＡＣ０２０６８８）ＢＬＡＳＴ分析により示すように、ｎｔｓ．１−１９４および１９５−２５２８にわたる２つのエクソンに、約９ｋｂの長いイントロンで示す。ｃＤＮＡはＡＫ１２５３１０と同一であり、テラトカーシノマ（５）と識別された。ＡＫ１２５３１０と比較して、ＣＣＡＴ−１はその５´末端で８６塩基を欠損し、３´末端で３１３の付加を有する。
【０１１９】
ＣＣＡＴ−１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １）の全配列は下記に示す：
2011511635.tif 000003
2011511635.tif 000004
【０１２０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡ１μｇを１０μｇ反応で逆転写に用いて、その２μＬをＰＣＲに用いた。全ての実験を２回または３回繰り返した。ＰＣＲを４５サイクル（熱変性：９５℃、１５秒；アニーリング／伸長：６０℃、１分）を、以下のプライマー：フォワードプライマー：５´−ＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）；リバースプライマー５´−ＧＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）；プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）：  ６Ｆａｍ−ＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡ−Ｔａｍｒａで実行した。絶対的な定量を、製造業者説明書（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ  ２）に従って行った。ＧＡＰＤＨ遺伝子を参照遺伝子として用いた。したがって、それぞれのサンプルを、そのＧＡＰＤＨ含有量（発現のレベル）に従って、また標準物質（ＳＫ−ＣＯ−１０）に対して標準化した。相対量を次式によって確定した：２（ΔＣＴＣＣＡＴ−１−ΔＣＴＳＫ−ＣＯ−１０）。プラスミドＤＮＡを含有するＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡの希釈に対応する基準曲線を描き、そしてＳＫ−ＣＯ−１０の中でＣＣＡＴ−１  ｍＲＮＡの量を定めるのに使用した。この因子を、それぞれのサンプルの相対量と乗算して、ＣＣＡＴ−１の量を１００ｎｇ  ｃＤＮＡ毎のｆｇとして得た。すべての実験はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて実施した。
【０１２１】
実施例２：結腸および直腸の正常組織および腺癌におけるＣＣＡＴ−１発現
ＣＣＡＴ−１発現を、１８の正常組織で定量リアルタイムＰＣＲにて試験した（図１）。ＣＣＡＴ−１発現は、腎臓における０．００８ｆｇ（骨格筋肉）から４０２ｆｇの範囲である。ＳＫ−ＣＯ−１０と比較して、正常組織におけるＣＣＡＴ−１レベルは、２０倍（腎臓）で、３５０倍を超える（結腸）低さであった。対照的に、腫瘍組織における平均ＣＣＡＴ−１  ｍＲＮＡレベルは２０９０ｆｇ（通常の結腸と比較して、ｐ＜０．０００１）で、そして２８０ｆｇ（２７）から８０００ｆｇ（１１）以上で変動する（図２）。腫瘍に隣接した正常組織において、平均ＣＣＡＴ−１  ｍＲＮＡレベルは５８７ｆｇ（正常の結腸と比較して、ｐ＝０．０４）で、そして０．１ｆｇ（Ｎ２９）から６６３１ｆｇ（Ｎ１４）まで変動する（図２）。図２で、腫瘍サンプルと正常組織に隣接した組織の対を研究した。
【０１２２】
実施例３：末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＣＣＡＴ−１の校正曲線
研究のこの部分における全ての実験を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて実施した。所定のサンプルにおけるＣＣＡＴ−１含有量の定量的測定値を有するために、校正曲線を作成した。結腸癌細胞株ＨＴ−２９およびＣＯＬＯ−２０５をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０人の健康な志願者の末梢血液から得た。ＰＢＭＣｓをフィコールの勾配方法で分離し、そして−７０℃で保存した。ＰＢＭＣｓと結腸癌細胞を、濃度結腸癌細胞を増加（１：１×１０６，  １：５×１０５，  １：１×１０５，  １：５×１０４，  １：１×１０４，  １：５×１０３，  １：１×１０３，  １：５００，  １：１００，  １  ：５０，  １：１０，  １：１，  および純粋な結腸癌細胞）して混合した。
【０１２３】
ＲＮＡを抽出して、ＣＣＡＴ−１に関してリアルタイムＰＣＲを実施した。癌細胞の小集団の検出で、ＣＣＡＴ−１に対するＲＴ＿ＰＣＲの感度を研究するために、校正曲線を作成した（図３〜５）。増加した濃度で結腸癌細胞株（ＨＴ２９）の細胞を１０６個ＰＢＭＣｓと混合した。癌細胞の検出に関する最も低い閾値は、１０６個ＰＢＭＣｓに対して５癌細胞濃度であった（図３）。
【０１２４】
実施例４：正常の結腸粘膜、前癌状態の粘膜、腺腫ポリープ、一次性結腸腺癌、および遠隔転移におけるＣＣＡＴ−１発現
良好状態、結腸腺癌部と隣接した正常粘膜、線種ポリープ、一次性結腸腺または直腸の癌、および肝臓または腹膜転移からのサンプルの結腸切除を受ける患者から得た正常の結腸粘膜サンプルを、液体窒素の中で凍結状態にする。ＲＮＡを、前述したように、全ての組織サンプルから抽出して、ＣＣＡＴ−１に関するリアルタイム定量ＰＣＲを実施した（図６）。
【０１２５】
実施例５：血液の潜在性転移性疾患および大腸癌患者のリンパ節の検出
患者
組織学的に慢性一次性結腸腺癌を有する１８歳以上の患者を、研究の参加に申し出た。遠隔転移を伴う患者、または前に放射線もしくは化学療法を受けた患者を、研究から除外した。研究のプロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  （ＩＲＢ，  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）  Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒに承認された。書面での告知に基づく同意を、全ての研究参加者から得た。
【０１２６】
標識リンパ節のマッピングおよび採取
患者は、流入領域リンパ管を含有する腸間膜の通常の楔状切除（ｗｅｄｇｅ）を含む結腸腺癌の標準外科的切除を受けた。外科的試験片（結腸および腸間膜）切除後すぐに、イソスルファンブルー染料２〜５ｍＬ（特許Ｂｌｕｅ  Ｖ，  Ｆｒａｎｃｅ）をツベルクリンの注射器および針を使用して、腫瘍の周りを４つの四半部で副漿膜（ｓｕｂｓｅｒｏｓａｌｌｙ）に注入した。それから腫瘍およびリンパ管の一括切除は、後ろの表で評価し、腸間膜から全ての青い結節を切開した。
【０１２７】
結節の縦軸に沿って門で分けた（複数の）ＳＬＮの半分を、（複数の）ＳＬＮの生体外での識別後、液体窒素で凍結状態にした。一次腫瘍の小さな部分（全体の腫瘍の体積の〜２５％）と正常粘膜の小さなサンプル（０．５ｇｒ）を同様に凍結状態にした。別々な器材を（複数の）ＳＬＮと一次腫瘍の切除に用いて、生体外で結節の腫瘍細胞の汚染を最小限にする。
【０１２８】
病理学的処理およびサイトケラチン免疫組織化学
付着される腸間膜および残り半分の（複数の）ＳＬＮと共に一次腫瘍試料片を、別々にラベルした試料としてＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒに提出した。結腸腺癌の診断が確認されると、フォルマリン固定、パラフィン包埋ブルー節を、４段階で約４０μｍの厚さに切断した連続的な方法を受け、Ｈ＆Ｅ染色した。さらに２つの染色されていないスライドを、免疫組織化学的染色で第２および第４レベルのブロックに調製し、１つはサイトケラチン抗体染色で、他はネガティブコントロールとしてもたらすものである。免疫組織化学的染色を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体方法を使用して、ＳＬＮのフォルマリン固定およびパラフィン包埋切片に行った。商業的に得られるサイトケラチン抗体複合物を本研究で使用した（Ｐａｎ−ｋｅｒａｔｉｎ  ＡＥ１／ＡＥ３，  ＣＡＭ  ５．２，  ３５ｂＨｌｌ，  Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）。内在性ペルオキシダーゼは、１％の過酸化水素と培養して抑制された。ジアミノベンジジンテトラヒドロ塩化物（ＤＡＢ，  Ｂｉｏｇｅｎｅｘ，  ＳａｎＲａｍｏｎ，  ＣＡ）をクロモゲンとして使用した。扁桃腺のフォルマリン固定パラフィン包埋切片をポジティブコントロールとして、そしてＳＬＮブロックからの切片をネガティブコントロールバッファーと培養した。合計で４個のＨ＆Ｅと２個のサイトケラチン免疫染色切片を、ＳＬＮからの組織のそれぞれのブロックで検査した。陽性が強い個体の細胞または細胞集団を、結腸癌細胞の解剖学的および細胞学的な特徴を示したものと確認した場合には、サイトケラチン免疫染色を陽性とみなした。
【０１２９】
実施例６：サイトケラチン−２０に関するＲＴ−ＰＣＲ、標識リンパ節のＣＣＡＴ−１
ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡ抽出をＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ方法により、全てのサンプル（腫瘍、リンパ節、血液、および正常組織）で行った。産物を、ｃＤＮＡ合成の前にＲＮＡ品質評価のためゲルに流した。
【０１３０】
凍結したサンプルをドライアイスの中で粉末にして、ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｎｔｅｒ，  ｉｎｃ．，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  ｏｈ，  ｕｓａ）の中でポリトロンホモジナイザーを用いて均質にして、そして製造業者の説明書に従って処理した。
【０１３１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡ１μｇを２０μＬ反応でランダムプライマーと逆転写するために用い、その２μＬをＰＣＲに用いた。全ての実験を２回行った。ＰＣＲを４０サイクル（変性：９５℃、１５秒；アニーリング／伸長：６０℃，１分）で、ＣＫ２０に対して特異的なプライマーおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）で行った。ＣＣＡＴ−１発現分析のために、使用したプライマーは上記の通りであった。それぞれのサンプルを、そのＧＡＰＤＨ量に従って標準化した。相対量をＣＫ２０発現で標準物質に対して算出した。
【０１３２】
ＣＣＡＴ−１陰性サンプルを、リンパ節と末梢血白血球でリアルタイムＰＣＲでさえも、完全に検出できず、相対量の判定は無関係であり、分析したサンプルをこの転写産物の発現に関して陽性または陰性かで単純に評価した。この部分の研究の全ての実験を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて実施した。
【０１３３】
ＲＮＡを抽出し、そしてＣＣＡＴ−１に対してリアルタイムＰＣＲを行った。
【０１３４】
大腸癌患者の標識リンパ節におけるＣＣＡＴ―１発現
リアルタイムＰＣＲを、全ての腫瘍およびＳＬＮ組織、並びに悪性のない患者から得た２つの正常リンパ節および健康な個人から得た３つのＰＢＭＣサンプルで行った。５つのネガティブコントロール全てで、ＣＣＡＴ−１の発現が全くなく、ほんの微量のＣＫ２０があった。したがって「陽性」ＰＣＲを、ＣＫ−２０値に対するネガティブコントロール値と比較して５０倍高いＲＮＡ量で設定して、ネガティブコントロールではＣＣＡＴ−１増幅が全くないため、我々は陽性としてＣＣＡＴ−１量を有する全てのＳＬＮを使用した。ＣＲＣ転移を含む標識リンパ節を、７／４４患者でＨ＆Ｅ、１４／４４患者でＣＫに対するＩＨＣ（カイ二乗検定でＨ＆Ｅと比較してｐ＜０．０００１）、そしてＰＣＲで２３／４４（カイ二乗検定でＨ＆Ｅと比較してｐ＝０．００６、図６、表１）と識別した。全てのＨ＆Ｅ陽性ＳＬＮｓはまた、ＣＫに対するＩＨＣおよびＰＣＲでも陽性であった。しかし、７つのＳＬＮｓはＣＫのみに対するＩＨＣで陽性だったが、４つはまたＰＣＲで陽性であった。Ｈ＆ＥおよびＩＨＣで１２個のＳＬＮｓ陰性に加えて、ＰＣＲで陽性であった（図７）。
【０１３５】
ＣＫ−２０およびＣＣＡＴ−１に関するｑＰＣＲの増幅グラフを示す（図８〜９）。ｃＤＮＡの比較的高い量をＣＣＡＴ−１と比較してＣＫ−２０で増幅する。
【０１３６】
【表１】
2011511635.tif 000005
【０１３７】
実施例７：ＣＣＡＴ−１を使用したＣＲＣの早期発見に関する糞便分析法に基づくＲＮＡ
ＣＣＡＴ−１陰性サンプルを、リンパ節および末梢血白血球において、リアルタイムＰＣＲでさえも、完全に検知できないため、相対的な量の測定は不適切であり、分析したサンプルを、この転写因子の発現に関して、陽性または陰性として単純に評価した。研究のこの部分における全ての実験をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて実施した。
【０１３８】
ＲＮＡを抽出して、ＣＣＡＴ−１に対してリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１３９】
糞便サンプル
診断された胃腸病学の介護で、完全な結腸内視術を受ける予定に入れた一次性で、非転移性（臨床ステージＩ−ＩＩＩ）結腸腺癌の１８歳以上の男性もしくは女性または患者を、この研究に登録した。
【０１４０】
群１−（Ｎ＝１５）組織学的に証明した大腸癌の切除のため手術を受ける患者；
群２−（Ｎ＝１５）結腸内視術で発見した腫瘍またはポリープが全くなく完全な結腸内視術を受ける患者。
【０１４１】
研究設計
糞便サンプルを収集して、液体窒素内ですぐに凍結状態にした。
【０１４２】
組織学的に実証された結腸腺癌からの全ＲＮＡを、ＰＣＲに関するポジティブコントロールとして使用した。ネガティブＰＣＲコントロールは健康な志願者のＰＢＭＣｓと鋳型（内部制御）なしの反応混合物からなる。
【０１４３】
ＣＲＣ患者の糞便におけるＣＣＡＴ−１発現
糞便サンプルを、腺癌の１５名の患者、および腺癌でない１５名の患者から収集した。
【０１４４】
ＲＮＡ抽出
糞便サンプルを全ての研究参加者から得た（ｎ＝３０）。
【０１４５】
ＲＮＡを新鮮なサンプルから抽出したが、このようなサンプルは分析で十分な量のＲＮＡ量を有することができない。結腸内視術、または結腸手術のための腸管前処置の前に、患者からの結腸洗浄物を、十分な量および質で、ＲＮＡ抽出に使用することができる。しかしながら、この方法は遠心による複数の濃縮工程を必要とする。ＲＮＡ抽出の好ましい方法を、液体窒素の中で凍結状態の検便であることが分かった。この方法は分析で十分な量のＲＮＡを得た。様々な量の糞便を、１５０ｍｇの新鮮な凍結糞便から最も高い量および質で達成した。３種類の異なったＲＮＡ抽出キットを、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）  ＫＩＴによって達成した最も最適な結果と比較した。ＲＮＡ抽出プロトコールを終了後、ＲＮＡを、研究群のサンプル１２／１５（８０．０％）とコントロール群のサンプル９／１５（６０．０％）から効率よく抽出した。
【０１４６】
ＰＣＲの結果
全ての３つのマーカー（Ａ３３、Ｃｏ５８、およびＣＣＡＴ−１）を、まず最初に通常の結腸サンプルにおいて研究した。Ａ−３３およびＣＯ−５８の両方を正常組織で発現して、したがって我々はＣＣＡＴ−１を我々の分析の単一のマーカーとして決めた。
【０１４７】
リアルタイム（定量的）ＰＣＲを、十分なＲＮＡを有する全てのサンプルで行った（ｎ＝２１）。健康な個人（ｎ＝９）の糞便で、ＣＣＡＴ−１の所見はなかった。ＣＲＣ患者からの４／１２（３３．３％）の糞便サンプルで、ＣＣＡＴ−１の有意な発現があった（ｐ＝０００．１，表２および図１０）。
【０１４８】
【表２】
2011511635.tif 000006
【０１４９】
実施例８：大腸癌患者の末梢血におけるＣＣＡＴ−１の存在
血液サンプル
１５ｍＬの血液を研究に参加している患者から得た（ｎ＝２０）。血液サンプルをフィコール勾配方法で分離し、そして−７０℃で保存した。ＲＮＡを抽出し、そしてＣＣＡＴ−１に対してリアルタイムＰＣＲを行った。結果を校正曲線と比較した。
【０１５０】
大腸癌患者の末梢血におけるＣＣＡＴ−１の発現
少数の癌細胞の検出に関して、ＣＣＡＴ−１に対するＲＴ―ＰＣＲの感度を研究するために、我々は校正曲線を作成した。
【０１５１】
増加した濃度における結腸癌細胞株（ＨＴ２９）の細胞を、１０６個のＰＢＭＣｓと混合した。癌細胞検出で最も低い閾値は、１０６個のＰＢＭＣｓに対して５０個の癌細胞濃度の濃度であった（図３〜５）。
【０１５２】
図１１で見られるように、ＣＣＡＴ−１発現を健康な個人の末梢血サンプルで検出できなかった。対照的に、様々な程度のＣＣＡＴ−１の発現を、結腸癌患者の末梢血サンプルで容易に検出することができる。
【０１５３】
実施例９：付加的な結腸直腸癌細胞株の中でのＣＣＡＴ−１発現
ＣＣＡＴ−１の発現は、広範囲の結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞株で検討した。１８種のＣＲＣ細胞株を実験のために選択した。この状況において、ＨＴ−２９をＣＣＡＴ−１発現の参照として設定した。ＲＮＡを全ての細胞株から抽出して、ｃＤＮＡを確立された方法を用いて作製した。リアルタイム定量ＰＣＲ、すなわちｑＰＣＲを用いて、ＣＲＣ細胞株のこの群で、相対的なＣＣＡＴ−１発現を測定した。
【０１５４】
【表３】
2011511635.tif 000007
【０１５５】
平均Ｃｔ＝増幅のＰＣＲサイクル（サイクルが低いほど、サンプルにおける特異的なｃＤＮＡ容量が高く、ＣＣＡＴ−１発現が高い）。
【０１５６】
図１３はＨＴ−２９と比較して１８種の結腸直腸癌細胞株の相対的なＣＣＡＴ−１の発現を示す。いずれかの所定のサンプルにおける相対的ＣＣＡＴ−１発現を、ＨＴ−２９（＝１）のＣＣＡＴ−１発現と比較した。相対的発現値を、所定のサンプル、サンプルでのハウスキーピング遺伝子（ＧＰＡＤＨ）、およびＨＴ−２９サンプルの間の平均Ｃｔの差から算出した。
【０１５７】
実施例１０：結腸直腸癌以外の癌に相当する細胞株におけるＣＣＡＴ−１発現
他の種のヒトの癌におけるＣＣＡＴ−１発現を例証するために、いくつかの普通のヒトの癌に相当する多数の細胞株を、ＣＣＡＴ−１発現のためにｑＰＣＲを検査した。
【０１５８】
非小細胞肺癌
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は最も一般的なヒトの肺癌である。それは、いまだ世界的に癌関連の死の主な原因である。
【０１５９】
ＣＣＡＴ−１の発現を、ＮＳＣＬＣ患者対正常の肺組織に相当するものから、ヒトの腫瘍組織で研究した。ＮＳＣＬＣに相当する１６種の細胞株を同様に研究した。ＣＣＡＴ−１発現を定量ＰＣＲ分析によって決定した。
【０１６０】
【表４】
2011511635.tif 000008
【０１６１】
平均Ｃｔ＝増幅のＰＣＲサイクル（サイクルが低いほど、サンプルにおける特異的なｃＤＮＡ容量が高く、ＣＣＡＴ−１発現が高い）。２−ｄｄＣｔ．＝ハウスキーピング遺伝子（ＧＰＡＤＨ）Ｃｔ、ＨＴ−２９  Ｃｔおよび関連Ｃｔのサンプルの間で算出したＬｏｇの差。ＣＣＡＴ−１の過剰発現を２／１６細胞株（１２．５％）で測定して、２種の細胞株はｓｋ−ｌｃ−１およびＬｕｃｉ−１３であった（表４参照）。
【０１６２】
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＣＣＡＴ−１発現：相対的な発現を、ハウスキーピング遺伝子、ＨＴ−２９（＝１）および関連のサンプルの間のＣｔにおける差から算出した。
【０１６３】
図１４は、ＨＴ−２９と比較した１６種のＮＳＣＬＣ癌細胞株の相対的ＣＣＡＴ−１発現を示す。いかなる所定のサンプルで相対的ＣＣＡＴ−１発現を、ＨＴ−２９（＝１）のＣＣＡＴ−１発現と比較した。相対的発現値を、所定のサンプル、ハウスキーピング遺伝子（ＧＰＡＤＨ）、およびＨＴ−２９サンプルの間の平均Ｃｔの差から算出した。
【０１６４】
実施例１１：乳癌細胞株におけるＣＣＡＴ−１発現
乳癌は、女性における癌に関連した死亡率の主要な原因である。診断および治療の大きな進歩にもかかわらず、進行期で患者の全体的結果は劣っている。診断、病気診断および治療に関する新規標的は両方の疾患で結果を改善することが重要である。したがって、乳癌を示す１３種の細胞株を、ｑＰＣＲを使用してＣＣＡＴ−１の発現でスクリーニングした。
【０１６５】
【表５】
2011511635.tif 000009
【０１６６】
平均Ｃｔ＝増幅のＰＣＲサイクル（サイクルが低いほど、サンプルにおける特異的なｃＤＮＡ量が高く、ＣＣＡＴ−１発現が高い）。
【０１６７】
２−ｄｄＣｔ．＝ハウスキーピング遺伝子（ＧＰＡＤＨ）Ｃｔ、ＨＴ−２９  Ｃｔおよび関連Ｃｔのサンプルの間で算出したＬｏｇの差。
【０１６８】
研究した１３種の乳癌細胞株で有意なＣＣＡＴ−１発現は全くなかった。さらに、ＣＣＡＴ−１発現を６種の黒色腫細胞株において調査した。黒色腫細胞株のいずれも、有意なＣＣＡＴ−１発現を示さなかった。
【０１６９】
実施例１２：Ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
結腸癌組織でＣＣＡＴ−１の発現を検証して、発現の形態的なパターンを研究するために、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【０１７０】
腫瘍組織（ｎ＝２）および隣接した正常の粘膜（ｎ＝２）を含むパラフィンの固まりからのスライドを染色に使用した。
【０１７１】
ＣＣＡＴ−１に関するプローブ（図１６Ａに示す；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ５）を、以下の配列を有するＣＣＡＴ−１発現の形態的なパターンの分析で使用するために調整した：
2011511635.tif 000010
【０１７２】
遺伝子が翻訳されないので、プローブをセンスプローブとアンチセンスプローブを作成するために、２つの異なったプラスミドで複製した。アンチセンスＲＮＡプローブを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（ｐＢＳＫＳ、３Ｋｂｐの長さのバクテリアベクター）の中への挿入でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって合成して、センスＲＮＡプローブをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ｐＢＳＫＳ、３Ｋｂｐの長さのバクテリアベクター）の中への挿入でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって合成した。挿入の大きさは１６５ｂｐであった（図１５）。２つのプラスミドは：
１．  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ  （＋）  ［ｐＢＳＳＫ＋］、バクテリアベクター３Ｋｂｐの長さ
２．  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ  （−）  ［ｐＢＳＳＫ−］、バクテリアベクター３Ｋｂｐの長さ
【０１７３】
これらのベクターは、市販で例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ＣＡからのものである。他のベクターおよび同様のものはこの点において利用できることを理解すべきである。
【０１７４】
図１６Ｂは、結腸腺癌（ａ）および隣接した通常組織（ｂ）におけるＣＣＡＴ−１染色を示すスクリーニングに基づくＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを例証する。ＣＣＡＴ−１が隣接した正常の粘膜で染色した場合の比較的低い強度に比べて、比較的強いＣＣＡＴ−１染色を腫瘍組織（ａ）に見た。これは、腫瘍に隣接する正常粘膜における低いＣＣＡＴ−１発現を示すリアルタイムＰＣＲの結果と相関する。
【０１７５】
実施例１３：健康な志願者の末梢血におけるＣＣＡＴ−１発現
健康な志願者（ｎ＝１０）の血液サンプルにおけるＣＣＡＴ−１発現をさらに研究した。
【０１７６】
図１７は健康な志願者の末梢血サンプルにおけるＣＣＡＴ−１の発現を示すグラフである。ＣＣＡＴ−１  ｃＤＮＡ（発現）の相対量を、全ての血液サンプルにおいて検出しなかった。予想通り、ポジティブコントロールとして腫瘍組織を含むＴ−４００サンプルで強いＣＣＡＴ−１増幅があった。
【０１７７】
[参照]
１．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  ２０００．  Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＲＴ  −  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  −  ２０００  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；  ５０（１）：  ７−３３．
２．  Ｍｉｄｇｌｅｙ  Ｒ，  Ｋｅｒｒ  Ｄ．  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９９；  ３５３：３９１−３９９．
３．  Ｃｏｈｅｎ  Ａｍ，  Ｋｅｌｓｅｎ  Ｄ，  Ｓｌａｔｚ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｂ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；  ２２：５−６５．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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