(57)【要約】  本発明は、少なくとも一の透明生体のデジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器、少なくとも一の透明生体のデジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器蓋、並びに、少なくとも一の透明生体と、少なくとも一の媒体を含むサンプルをデジタルホログラフィック顕微鏡で分析する方法、に関する。【選択図】図１
2011525252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器において、
第１の保持手段と、第２の保持手段を具え、
前記第１の保持手段が第１の外側面と第１の内側面を具え、前記第２の保持手段が第２の内側面と第２の外側面を具え、
前記第１及び第２の内側面が、少なくとも一の透明生体と、少なくとも一の媒体を含むサンプルを保持し、当該サンプルに接触するように提供されている、
ことを特徴とする顕微鏡用観察容器。
【請求項２】
請求項１に記載の観察容器において、前記第１及び第２の内側及び外側面に反射防止処理が行われていることを特徴とする観察容器。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の観察容器において、前記第１及び第２の内側面が互いに平行であることを特徴とする観察容器。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の観察容器において、前記第１及び第２の保持手段の少なくとも一つが少なくとも部分的にガス透過性であることを特徴とする観察容器。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の観察容器において、前記第１及び第２の保持手段の一方が他方から取り外し可能であることを特徴とする観察容器。
【請求項６】
請求項５に記載の観察容器において、前記取り外し可能な保持手段が前記サンプル中に浸かることができることを特徴とする観察容器。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の観察容器において、前記第１及び第２の内側及び外側面の少なくとも一つが、前記第１の外側面に入射する光ビームに対して前記観察容器を位置決めするパターンを具えることを特徴とする観察容器。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の観察容器において、前記観察容器が生体の発生が低減されるあるいは発生がない少なくとも一の基準点を具えることを特徴とする観察容器。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の観察容器において、前記観察容器が少なくとも一の較正基準を具えることを特徴とする観察容器。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の観察容器において、前記少なくとも一の透明生体が少なくとも一の細胞であることを特徴とする観察容器。
【請求項１１】
デジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器蓋において、第１の保持手段を具え、当該第１の保持手段が第１の外側面と第１の内側面を具え、
前記第１の内側面が少なくとも一の透明生体と少なくとも一の媒体を含むサンプルに浸かって、当該サンプルと接触するように提供されていることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１２】
請求項１１に記載の観察容器蓋において、前記第１の内側及び外側面の少なくとも一方が反射防止処理されていることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の観察容器蓋において、前記第１の保持手段が少なくとも部分的にガス透過性であることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の観察容器蓋において、前記第１の内側及び外側面の少なくとも一方が、前記観察容器蓋を前記第１の外側面に対して入射するビームに対して位置決めするパターンを具えることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の観察容器蓋において、前記観察容器蓋が生体の発生が低減されるあるいは発生がない少なくとも一の基準点を具えることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１６】
請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の観察容器蓋において、前記観察容器蓋が少なくとも一の較正基準を具えることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１７】
請求項１１乃至１６のいずれか１項に記載の観察容器蓋において、前記少なくとも一の透明生体が少なくとも一の細胞であることを特徴とする観察容器。
【請求項１８】
請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の観察容器蓋において、前記蓋が、複数の第１保持手段を具え、各第１保持手段が第１の外側面と第１の内側面を具え、
前記第１の内側面の各々が、少なくとも一の透明生体と少なくとも一の媒体を含むサンプル中に浸かって、当該サンプルと接触するように提供されていることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項１９】
少なくとも一の透明生体と少なくとも一の媒体を含むサンプルをデジタルホログラフィック顕微鏡によって分析する方法であって、前記サンプルが請求項１乃至１０に記載の観察容器に保持されるか、あるいは、請求項１１乃至１８のいずれか１項に記載の観察容器蓋の下に配置されるかしており、前記サンプルが前記第１の内側面と、存在するのであれば、前記第２の内側面に接触している、方法において：
ａ）少なくとも一の物体ビームと少なくとも一の基準光ビームを作るステップであって、当該少なくとも一の物体ビームと、少なくとも一の基準ビームが互いにコヒーレントであるステップと；
ｂ）前記少なくとも一の物体ビームを前記第１の内側及び外側面と、存在するのであれば、前記第２の内側及び外側面を通過させて、これによって前記サンプルを前記少なくとも一の物体ビームに露出させるステップと；
ｃ）前記サンプルを通過した少なくとも一の物体ビームを前記少なくとも一の基準ビームと重畳させ、これによって、干渉縞を作るステップと；
ｄ）ホログラムと呼ばれる前記干渉縞を検出するステップと；
ｅ）前記干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築するステップと；
を具えることを特徴とする観察容器蓋。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記少なくとも一の物体ビームが前記第１の内側及び外側面と、存在するのであれば、前記第２の内側及び外側面を通過するときに生じる反射が低減されるあるいはなくなることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の方法が更に、前記観察容器／観察容器蓋を前記少なくとも一の物体ビームに対して位置決めするステップを具え、このステップがステップｂの前に行われることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の方法が更に、前記少なくとも一の生体によって影響を受けない光の位相及び／又は振幅を測定するステップを具え、このステップがステップｅの後に行われることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１９乃至２２のいずれか１項に記載の方法が更に、長さのスケールを較正するステップであって、このステップがステップｅの後に行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一の透明な生体のデジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器、少なくとも一の透明な生体のデジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器蓋、及び少なくとも一の透明な生体を含むサンプルのデジタルホログラフィック顕微鏡による分析方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト、動物、植物、その他の生命体中の、細胞などの生体に関する、更なるより正確な情報を求める要求には際限がない。細胞は長い間、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、位相差顕微鏡などの光学顕微鏡を用いて研究されてきた。しかしながら、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いる場合、細胞にマークを付けるか細胞を染色する必要があり、使用したマーカや染料が細胞に影響し、細胞の発達が妨げられる潜在的な有毒作用がある、更に、このマーカは時間がたつと破壊されて、かなりの時間がたつと細胞の発達を研究することが困難になる。蛍光顕微鏡を使用する場合も、焦点面を機械的に設定する必要があり、これが、例えば周囲環境の温度変化によって、時間が経つと歪んでしまうことがある。更に、共焦点顕微鏡では、一回に一点のみが照明され、２次元画像あるいは３次元画像を得るためには、スキャニングが必要である。
【０００３】
多くの場合、毒性のあるマーカーや染料による細胞と細胞の発達に影響を与えるリスクなしで、生体細胞を研究できることが重要である。位相差顕微鏡は、マーカーを必要とすることなく生体の研究を可能にする。しかしながら、位相差顕微鏡は、研究対象の位相シフトの定量化ができず、これは細胞の分布域や厚さを定量化することが困難であることを意味する。焦点面の機械的設定という欠点は、位相差顕微鏡にも当てはまる。更に、通常は研究対象の表面が不規則であるため、焦点面はスポットによって異なる。従って、一の画像で対象のすべての部分の鮮明な画像を得ることは不可能である。対象のすべての部分について鮮明に見るためには、焦点面の設定を変えていくつかの画像を作る必要がある。特に、研究対象に突起がある場合、一の画像の鮮明さは満足のゆくものではない。なぜなら、これらの突起は同じ焦点面にないからである。
【０００４】
デジタルホログラフィック顕微鏡は、マーカーや染料を使う必要なく生体細胞を研究することが可能であり、研究対象の定量化を行うことができる。デジタルホログラフィック顕微鏡の可能性は、デジタルセンサとコンピュータの劇的な発達によって、ここ数年間で大きく発展している。
【０００５】
デジタルホログラフィック顕微鏡で細胞を研究する一方法が、ＷＯ２００７／０７３３４５号公報に開示されている。ここには、細胞の発達段階を分析する方法と、この分析を可能にする装置が開示されている。細胞のサンプルは、標準型の細胞培地容器に保持される。しかしながら、ホログラムの品質と、従って、この方法と装置によって得られる情報の正確さが制限されている。このため、研究対象について、高品質で、正しい情報を有するホログラムを作ることができる改善された技術がいまだに求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、透明な生体に関する正確な位相及び振幅情報を提供することである。この正確な情報を用いて、透明な生体についての解像度の高いホログラフィック画像を作ることができる。
【０００７】
この目的及び更なる目的は、第１の保持手段と、第２の保持手段とを具え、第１の保持手段が第１の外側面と第１の内側面を具え、第２の保持手段が第２の内側面と第２の外側面を具え、第１及び第２の内側面が少なくとも一の透明な生体と少なくとも一の媒体を含むサンプルを保持し、サンプルに接触するように提供されている、デジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器によって達成される。
【０００８】
この観察容器によって、生体の可視化が可能になる。この可視化は、時間とコストがかかる生体のマークや生体の染色を行うことなく、行うことができる。従って、この観察容器によって、生体細胞と、細胞の成長といった細胞の発達を観察することができる。この観察容器は、また、少量のサンプルで対象を研究することが可能である。特に、この観察容器によれば、所望しない妨害率が低く、ノイズレベルが低く、透明な生体の位相と振幅情報が正確であり、高解像度の生体ホログラフィック画像を得ることができる。
【０００９】
本発明による観察容器の更なる特徴と実施例が、従属請求項２乃至１０に開示されている。
【００１０】
上述の目的は、第１の保持手段を具え、当該第１の保持手段が第１の外側面と第１の内側面を具え、第１の内側面が、少なくとも一の透明な生体と少なくとも一の媒体を含むサンプル中に浸かって、このサンプルに接触するように提供されている、デジタルホログラフィック顕微鏡用観察容器蓋によっても達成される。
【００１１】
この観察容器蓋は生体の可視化を可能にする。可視化は、時間と費用がかかる生体のマークや染色を行うことなく、行うことができる。従って、この観察容器蓋によって、生体細胞と、細胞の成長といった細胞の発達を研究することができる。この観察容器蓋は、また、少量のサンプルで対象を研究することが可能である。特に、この観察容器蓋によれば、所望しない妨害率が低く、ノイズレベルが低く、透明な生体の位相と振幅情報が正確であり、高解像度の生体ホログラフィック画像を得ることができる。
【００１２】
本発明による観察容器蓋の更なる特徴と実施例が、従属請求項１２乃至１８に開示されている。
【００１３】
上述の目的は、少なくとも一の透明な生体と少なくとも一の媒体を含むサンプルをデジタルホログラフィック顕微鏡で分析する方法であって、このサンプルが関連するいずれかの請求項に規定されている観察容器中に保持されているか、あるいはいずれかの請求項に規定されている観察容器蓋の下に配置されており、サンプルが第１の内側面及び存在する場合は第２の内側面と接触している方法において、
ａ）少なくとも一の物体ビームと、少なくとも一の参照ビームを作り、少なくとも一の物体ビームと少なくとも一の参照ビームが互いにコヒーレントであるステップと；
ｂ）少なくとも一の物体ビームを第１の内側面と外側面と、存在するのであれば、第２の内側面と外側面を通過させ、これによってサンプルを少なくとも一の物体ビームに露呈させるステップと；
ｃ）サンプルを通過した少なくとも一の物体ビームを少なくとも一の参照ビームに重ねて、干渉縞を作るステップと；
ｄ）このホログラムと呼ばれる干渉縞を削除するステップと；
ｅ）この干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築するステップと；
を具える方法によっても達成される。
【００１４】
この方法によって、生体の可視化が可能になる。この可視化は、時間とコストがかかる生体のマークや染色を行うことなく、行うことができる。分析対象が分析によって影響を受けないので、この方法は非破壊的である。この方法によって、生体細胞と、細胞の成長などの細胞の発達を研究することができる。この方法は、細胞周期のステージと共に、形状、密度、体積、生存能力（生体細胞分画）といった細胞の状態の測定も可能である。また、この方法によって、少量のサンプル中での細胞の研究が可能になる。この方法は、その領域をスキャニングする必要なくサンプルが分析される全技術分野に及ぶ。更に、この方法は、達成したデータを保存して、後に別の環境で、あるいは別の時点でこのデータを分析したり処理することができることを意味する。異なる焦点面に顕微鏡を機械的に設定する必要なく、いくつかの焦点面を観察することができる。代わりに、達成したデータを処理することで、異なる焦点面を観察するようにしても良い。これによって、３次元画像が得られる。特に、この方法は、所望しない干渉を低いレートに抑え、ノイズレベルを低減し、透明な生体に関して正確な位相と振幅情報を得て、生体の高解像度のホログラフィック画像を得ることができる。
【００１５】
本発明の方法の更なる特徴及び実施例は、従属請求項２０乃至２３に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
添付の図面を参照した以下の詳細な説明によって、本発明をより完全に理解することができる。
【図１】図１は、本発明による観察容器の一実施例を示す概略図である。
【図２】図２は、透明な生体を通過する前後の物体ビームの波面を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の観察容器の一実施例を示す斜視図である。
【図４】図４は、本発明の観察容器の別の実施例を示す斜視図である。
【図５】図５は、図４に示す実施例の側面図である。
【図６】図６は、本発明の観察容器蓋の一実施例を示す平面図である。
【図７】図７は、図６に示す実施例の側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１に示すように、本発明の観察容器は第１の保持手段１と第２の保持手段２を具えている。第１の保持手段１は、第１の外側面１ａと第１の内側面１ｂを具える。第２の保持手段２は、第２の内側面２ａと第２の外側面２ｂを具える。第１の内側面１ｂと第２の内側面２ａは、少なくとも一の透明な生体３と少なくとも一の媒体４を含むサンプルを保持し、このサンプルに接触するように提供されている。更に、図１は、物体ビーム５と、第１の保持手段１と第２の保持手段２に対する物体ビームの関係を示す。
【００１８】
本発明に係る方法の一実施例では、例えばビームスプリッタによるなどして、コヒーレント光源からでた光ビームを二本のビームに分割することによって互いに対してコヒーレントである少なくとも一の物体ビームと少なくとも一の基準ビームが作られる。コヒーレント光源からでるこの光ビームは、レーザービームであっても良い。レーザービームは、波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー出射光など、どんな種類のレーザー源からでも発せられる。
【００１９】
物体ビームと基準ビームは相互にコヒーレントであり、これはこれらのビームが同じ周波数を持っており、時間が経過する間、定位相関係を示すことを意味する。
【００２０】
物体ビームは第１の外側及び内側面を通過して、少なくとも一の生体を通過し、その後物体ビームは、第２の内側及び外側面を通過する。あるいは、本発明に係る観察容器蓋が別のタイプの容器と組み合わされている場合、その容器の底の内側及び外側面を通過する。基準ビームは、少なくとも一の生体によって影響を受けることなく残る。なぜなら、基準ビームは例えばミラーや光ファイバーなど、物体ビームとは別の経路で案内されるからである。
【００２１】
サンプルは、第１及び第２の内側面の間に保持される。
【００２２】
図２に示すように、物体ビームは、少なくとも一の透明生体３を含むサンプルを通過する前は、既知の波面１１を有する。物体ビームが少なくとも一の透明生体を通過するとき、生体は実質的になんら光を吸収することはないが、この生体を伝達する光は、周辺の媒体と比べて光路長に差がある。生体から発する波面、すなわち、対象波面１２は、従って、図２に示すように位相がシフトされる。もちろん、基準ビームも既知の波面を有する。この光路長は、物理的／幾何学的厚さに屈折率を乗じて決まる。
【００２３】
本発明に係る方法の一実施例では、少なくとも一の透明生体を含むサンプルを通過した少なくとも一の物体ビームと、少なくとも一の基準ビームとの重畳が、例えば別のビームスプリッタなどによって、二本のビームを一緒にすることによって行われる。この重畳によって、例えば、少なくとも一の生体によって影響される対象波面についての情報を含む干渉縞が生じる。
【００２４】
本発明の方法の一の実施例では、この干渉縞は、ＣＣＤやＣＭＯＳなどのデジタルセンサによって検出される。検出された干渉縞は、ホログラムと呼ばれる。
【００２５】
少なくとも一の透明生体を含むサンプルを通過した少なくとも一の物体ビームと、少なくとも一の基準ビームとを重畳して、干渉縞を作り、この干渉縞を検出するには、例えばフーリエセットアップや、フレネルセットアップを使用することができる。フレネルセットアップが好ましく使用される。
【００２６】
検出した干渉縞から、対象波面の位相及び／又は振幅情報が再構築される。この再構築は、通常の再構築プロセスによって行われる。振幅情報を用いて、対象の焦点面を設定することができる。再構築情報は、例えば、調べた少なくとも一の生体の２次元あるいは３次元画像を得るのに使用することができる。この情報は、例えば、少なくとも一の生体の形状と光学密度を決定し、一又はそれ以上の細胞を細胞周期におけるステージで検証するのに使用することもできる。
【００２７】
一の物体ビームと一の基準ビームを作るための代替として、インラインデジタルホログラフィを用いることもできる。当業者には、この明細書を読めば、インラインデジタルホログラフィを使用するために、本発明の方法をどのように変更するかは自明である。
【００２８】
従来のシステムにおいては、サンプルが第１の保持手段を持たない解放容器に保持されている場合、サンプルの自由表面がある。この自由表面はフラットではなく、これを取り囲む地面や装置の振動、及び／又は、大気の移動によって常に振動するであろう。このサンプル表面の不規則性と振動が、物体ビームに不規則な散乱とノイズを生じさせ、従って、質の低いホログラムと不正確な位相及び振幅情報となる。本発明によるサンプルが第１の内側面、及び、存在するのであれば、第２の内側面に接触しているという事実は、サンプル表面が常に第１の内側面の表面、及び、存在するのであれば、第２の内側面と同様にフラットであることを意味する。更に、サンプルの表面の振動がなくなる。これによって、物体ビームの散乱とノイズが低減される。このため、ホログラムの質が改善され、従って、位相と振幅情報の正確さが改善される。
【００２９】
本発明に係るサンプルが第１の内側面に、及び、存在するのであれば、第２の内側面に接触していることは、少なくとも一の物体ビームが通過する異なる材料間のインターフェースの数が少なくなることを意味する。サンプルのみが第２の内側面、あるいは別のタイプの容器の対応する内側面に接触しており、サンプル表面と第１の内側面との間にスペース（空気又は別の媒体で満たされている）があるシステムでは、物体ビームが第１の保持手段とこのスペース、及びこのスペースとサンプルの間のインターフェースを通過する。更に、このようなシステムでは、通常第１の内側面上で凝縮が生じ、物体ビームが第１の保持手段とこの凝縮物との間、及び、凝縮物とスペースとの間のインターフェースを、スペースとサンプルの間のインターフェースを通過する前に通過するので、物体ビームが通過するインターフェースの数が更に増える。本発明では、これに代えて、第１の保持手段とサンプルとの間を物体ビームが通過して、これによって少なくとも一つ、通常は二つのインターフェースの通過がなくなる。これによって、一の内部干渉源がなくなり、物体ビームの散乱とノイズが低減される。従って、ホログラムの品質と、位相及び振幅情報の精度が改善される。更に、解放容器と同じ問題がこのシステムに当てはまり、本発明をより有利なものにしている。
【００３０】
サンプル表面の不規則性と振動や、物体ビームのインターフェース経路数の低減は、本発明に関連する非常に重要な改善である。これらの改善によって、散乱が減り、従って、物体ビームのノイズが大幅に減少する。これによって、所望しない内部干渉がかなり低減される。上述した通り、干渉縞は、物体の波面に関する情報を含んでいる。好ましくは、物体の波面のみが、透明な生体によって影響され、図２に示すように、物体の波面を決定する装置によっては影響を受けないのが良い。存在するのであれば、この装置の効果が所望しない内部干渉を生じさせる。このアーチファクト、すなわち使用した装置によって生じるエラーと歪は、上述の改善によって低減される。結果的に、これらの改善によって、位相と振幅情報の精度が実質的に改善される。
【００３１】
本発明の一の実施例によれば、少なくとも一の物体ビームが一又はそれ以上の第１の内側及び外側面を通過し、存在するのであれば、第２の内側及び外側面を通過するときに生じる反射が低減されるか又はなくなる。異なる材料間のインターフェースにビームが入射して、このインターフェースを通過するための反射は、光を散乱させ、従ってノイズがホログラムに加わる。この反射の低減又は排除は、散乱光の量を減らす。これが内部干渉を低減する。従って、ノイズが減って、ホログラムの品質と位相及び振幅情報の精度が改善される。反射の低減又は排除は、更に、保持手段とおそらく少なくとも一の生体を通る所望の光路を伝送される光量を増やす。一の実施例では、少なくとも一の第１の内側及び外側面、及び、存在するのであれば、第２の内側及び外側面に反射防止処理が行われることによって、反射が低減あるいは排除される。これらの面の反射防止処理は、物体ビームが第１の内側及び外側面と、存在するのであれば、第２の内側及び外側面を通過するときに生じる反射を低減する有効な方法である。反射の低減は、ホログラムの品質、同様に位相及び振幅情報の精度を改善する。一の実施例では、少なくとも一の第１の外側面と、存在するのであれば、第２の外側面に反射防止処理がされていることによって、反射が低減されあるいは排除される。好ましくは、第２の外側面が反射防止処理されている。反射は、第１の外側面及び／又は第２の外側面、特に、第２の外側面が反射防止処理されている場合に、大幅に低減され、ホログラムの品質及び、位相と振幅情報の精度も実質的に改善することになる。一の実施例では、反射防止処理を行った面は、好ましくは、干渉反射防止コーティングによって、この面をコーティングすることによって行われる。
【００３２】
本発明の一の実施例では、第１及び第２の内側面が互いに平行である。平行な面を使用することによって、観察容器のジオメトリが単純になり、それ自体が周知である。従って、ビームの光路の予測が容易である。これによって、理論的表現と計算が容易になる。
【００３３】
本発明の一実施例によれば、第１の保持手段及び、存在するのであれば、第２の保持手段の少なくとも一方が、少なくとも部分的に、酸素及び/又は二酸化炭素などのガスに対して透過性である。これによって、細胞などの生体の生存に不可欠なガスが、サンプル中に搬送され、これによって、かなりの期間一又はそれ以上の生きた細胞を研究することが可能である。また、観察容器中で細胞を保持し成長させて、細胞を、デジタルホログラフィック顕微鏡の使用した一の容器から細胞の発現あるいは成長の間に使用した一の容器へと移すことなく、異なる時間における細胞を研究することができる。
【００３４】
本発明の一実施例によれば、ガラスを使用することで保持手段の光学特性が良くなるため、第１の保持手段が少なくとも部分的にガラスでできている。非晶質材料であるガラスは、通常、その成分の特定の方向性をもつことなく製造され、従って、ガラスは非偏向性である。押出成型や圧縮成型などのプラスチックの製造工程は、通常、その成分に方向性を与えるため、プラスチック材料が材料を通過する光ビームを偏向させる。プラスチック製の保持手段を通過する物体ビームは、従って、偏向されて所望しない内部干渉を生じさせる。非偏向性ガラスは、偏向を生じさせず、従って、ホログラムの品質と位相及び振幅情報の精度を改善する。更に、ガラスは、非常に平坦な表面にして製造が可能である光学的に有利な材料であるため、物体ビームがガラス製の第１保持手段を通過するときの散乱が更に抑えられる。これによって、ホログラムの品質と、位相及び振幅情報の精度が向上する。
【００３５】
本発明の一実施例によれば、第２の保持手段は少なくとも部分的にプラスチックでできている。プラスチックを使用する場合、プラスチックはガス透過性にすることができるので、透過性のある保持手段を達成することが可能である。
【００３６】
本発明の一実施例では、少なくとも一の第１及び第２の内側及び外側面が、第１の外側面に対して入射する光ビーム、すなわち少なくとも一の物体光ビームに対して、観察容器又は観察容器蓋を位置決めするパターンを具えている。このパターンは、例えばグリッド状のライン又はドットのようなグリッド、又はコンパスの指針面のような形であってもよい。このパターンにより、観察容器又は観察容器蓋を分析するごとに同じスポットに位置決めすることができるようになる。このことは、同じ少なくとも一の生体が、長期間にわたって、異なるときにその生体を分析することによって研究できることを意味する。なぜなら、この位置決めパターンがあるため、同じ生体を分析のたびに容易に配置できるからである。本発明の方法の一実施例は、観察容器又は観察容器蓋を少なくとも一の物体ビームに対して、好ましくは位置決めパターンによって位置決めするステップを具え、このステップはステップｂの前に行われる。このステップは、ステップａの前又は後に、好ましくは、ステップａの後に行うことができる。このパターンは、好ましくは、第１の内側及び外側面、及び存在するのであれば、第２の内側及び外側面のうちの少なくとも一方の上あるいは中に配置される。
【００３７】
本発明の一実施例によれば、観察容器又は観察容器蓋は、生体の発生が低減されるあるいは発生がない少なくとも一の基準点を具える。第１の内側面と、存在するのであれば、第２の内側面のうちの少なくとも一方、好ましくは第２の内側面が、通常細胞などの生体の付着を促進するように処理されている。この細胞の付着を促進する処理は、その面を、ポリリジンなどの正に荷電させたポリマで被覆することによって、あるいはその面をプラズマ処理にさらすことによって、細胞の親和性を強化して達成することができる。生体の発生が低減されるあるいは発生がない基準点は、このように、面の一又はそれ以上のスポットから処理を排除する又はなくすことによって達成することができる。スポットは、グリッドなどのパターンで配置することができる。基準点は、基準の決定を容易にする。好ましくは、生体の発生がなくなり、これによって、少なくとも一の生体によって影響を受けていない光の位相と振幅を知ることができ、生体によって影響を受けていない光のゼロレベルがわかることを意味する。これは、分析の計算において用いられ、これによって計算が単純化される。このことはまた、分析の品質が改善されることを意味する。生体によって影響を受けていない光のゼロレベルに関する情報が、生体の高さの測定を可能にすることを意味する。なぜなら、この情報なしでは、高さの相対測定値のみしか得られないからである。本発明に係る方法の一実施例は、少なくとも一の生体によって影響を受けていない光の位相及び／又は振幅を、好ましくは少なくとも一の生体の発生が低減されるあるいは発生がない少なくとも一の基準点によって、測定するステップを具える。このステップは、ステップｅの後に行われる。好ましくは、少なくとも一の基準点は、生体の発生をなくすことが好ましい。
【００３８】
本発明の一実施例では、観察容器又は観察容器蓋が少なくとも一の較正基準を具える。この較正基準の大きさ自体は公知であり、長さの基準設定が容易である。これによって、較正基準を用いて分析を行った少なくとも一の生体の寸法を測定することができる。このことが、細胞の成長などの生体の発現の調査を容易にする。較正基準の高さは公知であり、従って位相シフトの較正が可能である。一般的に、媒体の屈折率は既知であるが、較正基準は分析の計算は既知の記載の較正基準に基づいているため、媒体の屈折率を知ることなくサンプルの分析が可能である。一の実施例では、少なくとも一の較正基準が、第１の内側及び外側面、及び、存在するのであれば、第２の内側及び外側面の上に配置されている。一の実施例では、少なくとも一の較正基準が、ライン、スクラッチ、あるいは半球などの少なくとも一のマークである。較正基準は、半球グリッドなどの既知の距離だけ離れている二つ又はそれ以上のマークであっても良い。ライン、スクラッチ、あるいは半球の長さ、半球の高さ、グリッドの半球管の距離といった、マークの大きさも、それ自体が既知である。較正基準は、観察容器又は観察容器蓋を製造するときに、例えば、溝又は突起がついたモールドを使って、物体を観察容器又は観察容器蓋に固定させて、あるいは、スクラッチを観察容器又は観察容器蓋に付けることによって、作ることができる。この方法の一実施例は、好ましくは少なくとも一の較正基準を用いて、長さの基準を較正するステップを具える。このステップは、ステップｅの後に行われる。
【００３９】
好ましくは、観察容器又は観察容器蓋を位置決めするパターンと、較正基準を組み合わせるのが良い。例えば、位置決め用パターンの部分あるいはすべてを較正基準として使用しても良く、逆も行うことができる。
【００４０】
透明な生体によるとは、光が透過する生体という意味であるが、この生体は、細胞小器官などの吸収部分を含むものでもよい。生体は、例えば、細胞、花粉粒、精子、スライド培養、組織塗布標本、あるいは生検サンプルであっても良い。本発明の一実施例では、少なくとも一の透明生体が、少なくとも一の細胞である。好ましくは、少なくとも一の透明生体が少なくとも一の生細胞である。
【００４１】
分析すべきサンプルは、少なくとも一の透明生体と少なくとも一の媒体を含む。少なくとも一の媒体は、流体であり、好ましくは細胞培地などの成長培地である。サンプルは、第１の内側面と、存在するのであれば、第２の内側面と接触していなければならない、すなわち、媒体及び／又は生体が第１の内側面と、存在するのであれば、第２の内側面と接触していなければならない。通常は、この媒体はこれらの面と接触しているが、生体は二つの面の間のどこかにある、すなわち、第１及び第２の内側面の間で静止しているか、あるいは、第２の内側面上又は第２の内側面上に配置されている。好ましくは、少なくとも一の透明生体が、第２の内側面上に配置されている。
【００４２】
本発明の一実施例によれば、観察容器は、好ましくは立方体のボックスを具え、その中にサンプルを保持する。第１及び第２の保持手段は、このボックスの対向する二つの側部である。物体ビームが上方から入射する場合は、第１の保持手段はボックスの上側部であり、第２の保持手段はボックスの底側部である。物体ビームが下方から入射する場合は、第１の保持手段はボックスの底側部であり、第２の保持手段はボックスの上側部である。物体ビームが横から入射する場合は、第１の保持手段は一方の横側部であり、第２の保持手段が反対側の横側部である。ボックスは、角を丸める、エッジを丸める、面取りする、溝及び／又はその他の幾何学的変更がなされていても良いことは自明である。一の実施例では、ボックスが、例えばボックスの内側キャビティを一又はそれ以上のコンテナに連結して、相当の体積のあるサンプルを保持する、あるいはそこでサンプルの一部のみを分析するための、一又はそれ以上の開口を有する。このコンテナは、媒体の体積が、生体が生存するのに不可欠な栄養を、生きている生体に提供するのに十分大きいので、相当時間以上生きている生体の研究を容易にする。開口は、また、観察容器を介してサンプル又は媒体の面合わせを可能にして、少なくとも一の透明生体又は媒体を含むサンプルが第１及び第２の内側面の間を流れるようにする。
【００４３】
立方体のボックスを具える観察容器の一実施例は、図３に示されており、そこでは、第１の保持手段１、第２の保持手段２、及び開口６、７を見ることができる。
【００４４】
別の実施例では、観察容器がシリンダ、好ましくは、平坦な底側部と平坦な上側部を有するシリンダを具え、このシリンダ中にサンプルを保持している。物体ビームが上方から入射する場合は、第１の保持手段がシリンダの上側部であり、第２の保持手段がシリンダの底側部である。物体ビームが下方から入射する場合は、第１の保持手段がシリンダの底側部であり、第２の保持手段がシリンダの上側部となる。シリンダも、エッジを丸める、面取りする、溝及び／又はその他の幾何学的変更がなされていても良いことは自明である。一の実施例では、シリンダが、例えばシリンダの内側キャビティを一又はそれ以上のコンテナに連結して、相当の体積のサンプルを保持する、あるいはそこでサンプルの一部のみを分析するための、一又はそれ以上の開口を有する。このコンテナは、媒体の体積が、生体が生存するのに不可欠な栄養を、生きている生体に提供するのに十分大きいので、相当時間以上生きている生体の研究を容易にする。開口は、また、観察容器を介してサンプル又は媒体の面合わせを可能にして、少なくとも一の透明生体又は媒体を含むサンプルが第１及び第２の内側面の間を流れるようにする。
【００４５】
本発明の一実施例では、第１及び第２の保持手段の一方が他方から取り外し可能である。一の実施例では、この取り外し可能な保持部材が、サンプル中に埋まっている。第１の保持手段が第２の保持手段から取り外し可能な場合は、第１の保持手段が本発明による観察容器蓋の一部であっても良い。
【００４６】
本発明の更なる一実施例では、観察容器が底側部を伴う一の底部分と、一又はそれ以上の横壁を具え、好ましくは底側部が平坦なボウル状容器を形成している。この実施例では、観察容器は、好ましくは底部分が平坦な、底側部を伴う上部分を具えており、この上部分が底部分から取り外し可能である。上部分及び／又は底部分は、上部分の底側部が、底部分に保持されている分析するべきサンプルの中に浸かるように、上部分を底部分に対して配置する手段を具える。物体ビームが上方から入射する場合は、第１の保持部分は上部分の底側部であり、第２の保持手段が底部分の底側部である。物体ビームが下方から入射する場合は、第１の保持手段が底部分の底側部であり、第２の保持手段が上部分の底側部である。好ましくは、この底部分の底側部は円形であり、従って、底部分は一の（円形）壁を具えるのみである。一の実施例では、上部分の底側部は、実質的に底部分の底側部より小さく、従って、上部分の底側部は、サンプル表面の一部に接触しているのみである。このように、サンプル表面の一部は、大気に露出しており、一又はそれ以上の細胞など、少なくとも一の生体の研究に、ガス透過可能な保持部材を使用することなく研究対象である生体の生存に不可欠なガスを提供できるようにしている。
【００４７】
図４及び５には、底部分８から取り外し可能な上側部分９を具える観察容器の一実施例が示されている。上部分９は第１の保持手段１を具え、底部分８は第２の保持手段２を具えており、第１の保持手段１は第２の保持手段２から取り外し可能である。上部分９は、上部分９を底部分８に対して、第１の保持手段１がサンプルに浸かって底部分８に保存されるように配置する手段１０を具える。
【００４８】
本発明に係る観察手段蓋は、標準細胞培地容器の底部分の上側に置くようにしても良い。この培地容器の底部分は、従って、第２の保持手段を意味し、第２の保持手段として考えられる部分を具える。標準細胞培地容器の第２の保持手段を意味するこの部分は、少なくともこの部分を通過する光、すなわち、物体ビームの波長に対して、透明でなくてはならない。標準細胞培地容器は、例えばペトリ皿であっても良い。
【００４９】
本発明に係る観察手段蓋の一実施例では、観察手段蓋は、観察手段蓋の第１の保持手段が分析するべきサンプル中に浸かっており、このサンプルが標準細胞培地容器の底部分に保持されるように、観察手段蓋を標準細胞培地容器の底部分に対して配置するための手段を具える。
【００５０】
本発明に係る観察容器蓋の一実施例では、観察容器蓋の第１の保持手段が、標準細胞培地容器の底部分の内側底表面より実質的に小さい。これは、観察容器蓋の第１の保持手段がサンプル表面の一部にのみ接触していることを意味する。従って、サンプル表面の一部が大気に露出して、一又はそれ以上の細胞など、少なくとも一の生体の研究に、ガス透過可能な保持部材を使用することなく研究対象である生体の生存に不可欠なガスを提供できるようにしている。
【００５１】
本発明の観察容器蓋の一実施例では、第１内側面が標準細胞培地容器の底部分の内側底面に平行である。平行な面を利用して、観察容器蓋と標準細胞培地容器を具えるユニットのジオメトリは簡単で自明である。ビームの光路は、従って予測がより容易である。これによって、理論式と計算が容易になる。
【００５２】
本発明の観察容器蓋の一実施例では、観察容器蓋が図４及び５に示す観察容器の実施例の上部分９である。
【００５３】
一実施例では、観察容器蓋が複数の第１保持手段を具えており、第１の保持手段の各々が第１の外側面と第１の内側面を具え、第１の内側面の各々は、少なくとも一の透明生体と少なくとも一の媒体を具えるサンプルに浸かった状態で、サンプルに接触して提供されている。この観察容器蓋は、標準ウエル型細胞培地プレートの底部分の上に配置することができる。プレートの底部分は、従って、複数の第２の保持手段を意味する部分であって、複数の第２の保持手段として使用されている。標準ウエル型細胞培地プレートは、６ウエル型細胞培地プレート、２４ウエル型細胞培地プレート、あるいは９６ウエル型細胞培地プレートであってもよい。このような複数の第１保持手段を具える一実施例が、図６及び７に示されている。この観察容器蓋は、第１の保持手段１を具える。観察容器蓋は、標準ウェル型細胞培地プレートに対して、各第１保持手段１がサンプルに浸かって、標準ウエル型細胞培地プレートの嵌め合わせウエルに保存されるように、観察容器蓋を配置する手段１０を具える。
【００５４】
第１の内側面と第２の内側面との間の距離は、分析しようとしている少なくとも一の透明生体を収納するのに十分大きいことが好ましい。細胞を分析する場合、第１の内側面と第２の内側面との間の距離が、少なくとも一の細胞の寸法と同じくらい大きいことが有利である。
【００５５】
少なくとも、サンプルを物体ビームに露出させるために、物体ビームが第１及び第２の内側及び外側面を通過する第１及び第２の保持手段の部分において、第１及び第２の保持手段が透明であり、第１及び第２の保持手段は、少なくとも第１及び第２の内側及び外側面を通過する光、すなわち、物体ビームの波長に対して透明である。
【００５６】
本発明の一実施例によれば、観察容器は第１及び第２の保持手段の間にエンクロージャを具えており、そのエンクロージャ内にサンプルが保持されている。このエンクロージャは、例えば、エンクロージャを一又はそれ以上の所定の体積を有するサンプル保持用容器に連結するための一又はそれ以上の開口を具えており、そこでサンプルの一部のみを分析する。この容器は、相当の時間にわたって生きているサンプルの研究を容易にする。なぜなら、媒体の体積が、その生体が生き延びるのに不可欠な栄養を、生きている生体に提供するのに十分に大きいためである。この開口によっても、観察容器を介してサンプル又は媒体を洗い流すことができ、従って、少なくとも一の透明生体又は媒体を含むサンプルは、第１及び第２の内側面の間を流れている。
【００５７】
本出願を通して、「第１及び第２の内側面」という表現は、第１の内側面、第１の外側面、第２の内側面、及び第２の外側面を意味する。
【００５８】
従って、「第１及び第２の内側面」は、第１の内側面と第２の内側面を意味し、「第１及び第２の外側面」は、第１の外側面と第２の外側面を意味し、「第１の内側及び外側面」は、第１の内側面と第１の外側面を意味し、「第２の内側及び外側面」は、第２の内側面と第２の外側面を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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