(57)【要約】  本発明は、一態様において、（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドと；（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている細胞表面アンカーである第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドと、を具えているベクターであって、前記ベクターが、真核性宿主細胞において作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド及び前記第２（ポリ）ペプチドを発現し、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基と前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、選択的に、前記第１（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。【選択図】図５
2011525103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドと；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている細胞表面アンカーである第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドと、を具え、
前記ベクターが、真核性宿主細胞において作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド及び前記第２（ポリ）ペプチドを発現し、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基と前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、選択的に、前記第１（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞の表面で提示されることを特徴とするベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターが、前記第１ポリヌクレオチドに作用可能な状態で連結されているシグナル配列をさらに具えていることを特徴とするベクター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のベクターが、前記第２ポリヌクレオチドに作用可能な状態で連結されているシグナル配列をさらに具えていることを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記第１（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第１鎖を具えていることを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが：（ａ１）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第２鎖を具えている第３（ポリ）ペプチドをコードすることができる第３ポリヌクレオチドをさらに具えていることを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターが：（ａ２）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第３鎖を具えている第４（ポリ）ペプチドをコードすることができる第４ポリヌクレオチドをさらに具えていることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが：（ａ３）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第４鎖を具えている第５（ポリ）ペプチドをコードすることができる第５ポリヌクレオチドをさらに具えていることを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド、及び／又は、第５ポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項４乃至８のいずれか１項に記載のベクターが、前記複数鎖（ポリ）ペプチドが２本鎖（ポリ）ペプチドを具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項４乃至８のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記複数鎖（ポリ）ペプチドが４本鎖（ポリ）ペプチドを具えており、前記４本鎖（ポリ）ペプチドが２つの第１鎖と２つの第２鎖とで構成されていることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項４乃至８のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記複数鎖（ポリ）ペプチドが：免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメイン、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子からなる群より選択される２本鎖（ポリ）ペプチドを具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにおいて、前記複数鎖（ポリ）ペプチドが免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＩｇ断片を具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターにおいて、前記複数鎖（ポリ）ペプチドが：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンを具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のベクターにおいて、発現時に、前記第１鎖及び／又は第２鎖及び／又は第３鎖及び／又は第４鎖が、前記ジスルフィド結合を介して細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドに付着することを特徴とするベクター。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記細胞表面アンカーが、真核細胞の細胞表面（ポリ）ペプチド又は真核細胞のタンパクを具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターにおいて、前記細胞表面アンカーが、真核細胞の細胞表面（ポリ）ペプチド又は真核細胞のタンパクの一部分であって、真核性宿主細胞の細胞表面に付着する一部分を具えていることを特徴とするベクター。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のベクターにおいて、前記細胞表面アンカーが：凝集素、凝集素成分Ａｇａｌｐ及びＡｇａ２ｐ、ＦＬＯ１、ＰＤＧＦＲ、ＰＲＩＭＡ及びｍＤＡＦからなる群より選択されることを特徴とするベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターにおいて、前記細胞表面（ポリ）ペプチド又は前記タンパクの一部分が、前記細胞表面（ポリ）ペプチド又は前記タンパクの膜貫通領域であることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターにおいて、前記細胞表面（ポリ）ペプチド又は前記タンパクの前記膜貫通領域がＰＤＧＦＲの膜貫通領域であることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる前記少なくとも１つのシステイン残基又は前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記少なくとも１つのシステイン残基が、人為的に導入されたものであることを特徴とするベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターにおいて、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる少なくとも１つのシステイン残基が人為的に導入されたものであることを特徴とするベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターにおいて、前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記少なくとも１つのシステイン残基が人為的に導入されたものであることを特徴とするベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターにおいて、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる前記少なくとも１つのシステイン残基及び前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記少なくとも１つのシステイン残基が、人為的に導入されたものであることを特徴とするベクター。
【請求項２４】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載のベクターにおいて、前記真核宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とするベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターにおいて、前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞又はＣＨＯ細胞であることを特徴とするベクター。
【請求項２６】
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドを具えている第１ベクターであって、前記第１（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第１鎖を具えている第１ベクターと；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基を具え、細胞表面アンカーである第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドを具えている第２ベクターと；
選択的に、（ｃ）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第２鎖を具えている第３（ポリ）ペプチドをコードすることができる第３ポリヌクレオチドを具えている第３ベクターと；
選択的に、（ｄ）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第３鎖を具えている第４（ポリ）ペプチドをコードすることができる第４ポリヌクレオチドを具えている第４ベクターと；
選択的に、（ｅ）前記結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第４鎖を具えている第５（ポリ）ペプチドをコードすることができる第５ポリヌクレオチドを具えている第５ベクターと、を具えている組成物において、
前記ベクターが、真核性宿主細胞において作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド及び前記第２（ポリ）ペプチドを発現し、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基と前記第２（ポリ）ペプチドに含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、
選択的に、前記第１（ポリ）ペプチド、及び、任意に前記第３（ポリ）ペプチド、第４（ポリ）ペプチド、第５（ポリ）ペプチドが、真核性宿主細胞の表面で提示されることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
（ｉ）請求項１乃至２５のいずれか１項で定義されているベクター又は（ｉｉ）請求項２６に記載の組成物のいずれかを具えていることを特徴とする真核性宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の真核性宿主細胞において、前記真核性宿主細胞が哺乳動物宿主細胞であることを特徴とする真核宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の哺乳動物宿主細胞において、前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞又はＣＨＯ細胞であることを特徴とする哺乳動物宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の複数のベクターを具えているベクターライブラリにおいて、前記複数のベクターが、前記第１（ポリ）ペプチド及び／又は前記第２（ポリ）ペプチド及び／又は前記第３（ポリ）ペプチド及び／又は前記第４（ポリ）ペプチド及び／又は前記第５（ポリ）ペプチドの異種混合群に由来することを特徴とするベクターライブラリ。
【請求項３１】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のベクターによってコードされる少なくとも１０２個の（ポリ）ペプチドの異種混合群を集団的に提示する真核細胞群を具えていることを特徴とする真核性ディスプレイライブラリ。
【請求項３２】
複数の宿主細胞中に請求項３０に記載のベクターライブラリーをトランスフェクトすることによって入手可能であることを特徴とする真核性宿主細胞ライブラリ。
【請求項３３】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のベクターによってコードされる（ポリ）ペプチドを真核性宿主細胞の表面に提示させる方法において：
（ａ）請求項１乃至２５のいずれか１項に定義されている少なくとも１つのベクター又は請求項２６に記載の複数のベクターを真核性宿主細胞に導入するステップと；
（ｂ）前記ベクター又は前記組成物に含まれている（ポリ）ペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップとを具えていることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法又は請求項３１若しくは３２に記載のライブラリーであって、前記宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする方法又はライブラリー。
【請求項３５】
（ａ）請求項４乃至２５のいずれか１項に定義されている少なくとも１つのベクター、又は、請求項２６に記載の複数のベクター、又は、請求項３０に記載のベクターライブラリーを真核性宿主細胞群にトランスフェクトして、実質的に各細胞が互いに異なる結合成分をコードするベクターを具えているようにするステップと；
（ｂ）前記ベクターに含まれる前記結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適している条件下で前記宿主細胞を培養するステップであって、細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドへの前記結合成分の付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；
（ｃ）細胞表面に提示されている少なくとも１つの結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）の少なくとも１つの特異的結合成分を提示する細胞を溶出させるステップと、
を具えていることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、ステップ（ｃ）の後に実行される追加ステップ（ｃ１）：特異的にターゲットに結合していない細胞を洗い流すステップをさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３５又は３６に記載の方法において、特異的結合成分の核酸配列を決定するステップをさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項３８】
（ａ）請求項４乃至２５のいずれか１項で定義されている少なくとも１つのベクター又は請求項２６に記載の複数のベクターを真核性宿主細胞群にトランスフェクトするステップであって、前記ベクター又は前記組成物が、ターゲットに結合することができる結合成分を具えている（ポリ）ペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドを具えているステップと；
（ｂ）前記ベクターに含まれる前記結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップであって、細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドへの前記結合成分の付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；
（ｃ）細胞表面に提示されている少なくとも１つの結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）の少なくとも１つの特異的結合成分を提示する細胞を溶出させるステップと、
を具えていることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、ステップ（ｃ）の後に実行される追加ステップ（ｃ１）：特異的にターゲットに結合していない細胞の洗い流すステップをさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８又は３９に記載の方法において、前記対象遺伝子が、治療用（ポリ）ペプチド、工業用（ポリ）ペプチド、及び、研究において用いられる（ポリ）ペプチドからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３５乃至４０のいずれか１項に記載の方法において、前記宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞又はＣＨＯ細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ディスプレイ技術は、原核生物系において適切に確立されている。最も著名なものは、古典的ファージディスプレー方法（Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５−１３１７）の変形であるが、リボソームディスプレイのような他の様々な技術が存在している。対照的に、真核系における各技術には、様々な技術的な落とし穴や障害がある。
【０００２】
本発明は、真核性宿主細胞などの宿主細胞表面に（ポリ）ペプチドを初めて効率的にディスプレイできるようにした新規な方法及び組成物を提供する。そのようにディスプレイされた（ポリ）ペプチドは、真核性宿主細胞であってもよい宿主細胞の一以上の成分とのジスルフィド結合を形成する反応性システイン残基を特徴とする。宿主細胞のそのような成分は、細胞表面アンカーである別の第２の（ポリ）ペプチドであってもよい。この系は、真核細胞などの細胞の表面でポリペプチドの効率的なディスプレイが可能であり、融合ポリペプチドの生成を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】図１は、本発明のディスプレイベクターの例を示している。
【図２】図２は、本発明のディスプレイベクターの例を示している。
【図３】図３は、ＰＤＧＦＲの膜貫通領域と、本発明において用いる構築物の周辺を示している。その構築物は、直列ｍｙｃエピトープと、並びにＰＤＧＦＲの膜貫通領域に対するＶ  ｋａｐｐａリーダー配列Ｎ末端を具えている。頂部においては、比較のために、原核細胞のシステイン（Ｃｙｓ）ディスプレイのための典型的な構築物（例えばＷＯ０１／０５９５０及びＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０９３１を参照されたい）を示している。
【図４】図４は、ＰＤＧＦＲ膜貫通領域と反応性システイン残基とを具えるポリペプチドをコードするベクターのベクター地図を示している。
【図５】図５は、本研究において用いるいくつかの免疫グロブリンの概略を示している。ＭＯＲ３０８０（ＭＯＲ０３０８０）のオリジナルバージョンが一番上に示されている。中央部のスケッチは、重鎖がＰＤＧＦレセプタの膜貫通領域に融合している融合タンパクを示している。このＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ融合ポリペプチドをコントロールとして用いた。下部のスケッチは、重鎖のＣ末端にシステイン残基を導入したＭＯＲ３０８０の誘導体を示している（本研究においてそのような構築物を様々に生成した。実施例５を参照されたい）。このポリペプチドは、ＰＤＧＦＲの膜貫通領域を具えるポリペプチドとのジスルフィド架橋を形成しており、これにシステイン残基がＮ末端導入される（この部分についても、本研究において様々な構築物を生成した。実施例６を参照されたい）。
【図６】図６は、本研究で用いる免疫グロブリンの反応性システイン残基の周辺の概略を示している。反応性システイン残基を、下に示されている配列において矢印で示す。中央の配列は、上に示されているオリジナルのＭＯＲ３０８０と同様に、反応性システイン残基を具えていない対応する免疫グロブリン−ＰＤＧＦＲＴＭ融合タンパクに由来する。
【図７】図７は、本発明で用いる免疫グロブリン−ＰＤＧＦＲＴＭ融合タンパクをコードする代表的なベクターのベクター地図を示している。重鎖は、ＣＤ３８に対して特異的な免疫グロブリンであるＭＯＲ３０８０に由来している。
【図８】図８は、本発明で用いる免疫グロブリンをコードする代表的なベクターのベクター地図を示しており、その免疫グロブリンの重鎖のＣ末端には、システイン残基が導入されている。重鎖は、ＣＤ３８に対して特異的な免疫グロブリンＭＯＲ３０８０に由来している。
【図９】図９は、ＦＡＣＳ分析で測定される本発明の様々な構築物の発現を示している。列１は、トランスフェクトされていない（疑似トランスフェクション）細胞を用いた結果を示している。列２は、システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物をトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列３は、システイン−ＩｇＧ構築物をトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列４は、二重トランスフェクションとして、システイン−ＩｇＧ構築物とシステイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物を組み合わせて共トランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列５は、ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ融合構築物をトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。Ａ欄における検出は、抗ｍｙｃ抗体を用いて行い、Ｂ欄における検出は、抗ＩｇＧ抗体を用いて行った。Ｃ欄においては、ビオチン化された抗原を用い、その検出は、ラベルされたストレプトアビジンを用いて行った。すべて染色を別々に行い、ＰＤＧＦＲＴＭが（単独で、システイン−ＩｇＧと共に、又は、融合タンパクの一部分として）発現されたときに、ｍｙｃ含有細胞表面タンパクが検出された。同様に、ＩｇＧが発現されたときにＩｇＧが検出された。システイン−ＩｇＧのトランスフェクションは、顕著な表面発現及びリガンド結合活性をもたらした。システイン−ＰＤＧＦＲＴＭと共にシステイン−ＩｇＧを共トランスフェクトしたときに、ＩｇＧ染色及びＣＤ３８結合の増加が認められた（破線）。
【図１０−１】図１０は、本研究で試験した４つのシステイン−ＩｇＧ変異体のアミノ酸配列を示している。
【図１０−２】図１０は、本研究で試験した４つのシステイン−ＩｇＧ変異体のアミノ酸配列を示している。
【図１１】図１１は、本研究で試験した４つのシステイン−ＩｇＧ変異体の発現を示している。それぞれＩｇＧ（Ａ欄）及び抗原（Ｂ欄）を検出した。列１−５は、トランスフェクトされていない（模擬トランスフェクトした）細胞（列１）及びシステイン−ＩｇＧ構築物（Ａ−Ｄ）をトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリーの結果（列２−５）をそれぞれ示している。ＩｇＧの表面発現及び抗原結合活性（ＣＤ３８結合活性）を分析した。反応性システイン残基（システイン−ＩｇＧ）を具える免疫グロブリンであって、ＭＯＲ３０８０に由来する免疫グロブリンをＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。ＩｇＧ（抗ＩｇＧ）のフローサイトメトリー分析によって発現をモニターした。ＭＯＲ０３０８０配位子の結合は、ビオチン化されたＣＤ３８を培地中に加えてストレプトアビジンと結合したリガンドを検出することによって分析した。すべての染色を別々に行った。４つすべてのシステイン−ＩｇＧ変異体のトランスフェクションは、顕著な表面発現及びリガンド結合活性をもたらした。
【図１２】図１２は、本研究で試験した３つのシステイン−ＰＤＧＦＲＴＭ変異体のアミノ酸配列を示している。
【図１３】図１３は、分泌されたＩｇＧの再結合の分析結果を示している。ＩｇＧの表面発現及びＥＧＦＰの細胞内発現を分析した。ＭＯＲ３０８０に由来している免疫グロブリンであって、反応性システイン残基（システイン−ＩｇＧ）を具える免疫グロブリンをＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。他のＣＨＯ−Ｋ１細胞にＥＧＦＰをトランスフェクトした。ＩｇＧ（抗ＩｇＧ）及びＥＧＦＰのフローサイトメトリー分析によって発現をモニターした。両種類の細胞を共培養した後にでＩｇＧの低染色を観察してＥＧＦＰを発現する細胞を観察できた。Ａ欄は、抗体染色を用いていない製剤を示しており、システイン−ＩｇＧの細胞表面発現をＢ欄に示す。ＥＧＦＰを発現するトランスフェクトされていない細胞を列１に示し、システイン−ＩｇＧをトランスフェクトした親細胞を列２に示す。列３は、細胞内でＥＧＦＰを発現するように安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞であって、システイン−ＩｇＧ変異体構築物を一時的にトランスフェクトした細胞と共に共培養したＣＨＯ細胞を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明は、一態様において、（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドと、（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている細胞表面アンカーである第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドとを具えているベクターであって、当該ベクターは、真核性宿主細胞であってもよい宿主細胞において発現するように作用可能であり、それぞれ前記第１（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基と、前記第２（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチドが宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。本発明は、別の一態様において、少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドを具えているベクターであって、前記ベクターは、真核性宿主細胞であってもよい宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に具えられた前記システイン残基と宿主細胞の成分との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記宿主細胞への前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチドが宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。
【０００５】
本発明は、他の一態様において、（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドと、（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている細胞表面アンカーである第２（ポリ）ペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを具えるベクターであって、前記ベクターが真核性宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基と前記第２（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。本発明は、別の一態様において、少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドを具えているベクターであって、前記ベクターが宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基と宿主細胞の成分との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記宿主細胞への前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチドが宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。本発明は、別の一態様において、少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドを具えているベクターであって、前記ベクターは、真核性宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に具えられた前記システイン残基と真核性宿主細胞の成分との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記真核性宿主細胞への前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞の表面で提示されるベクターに関する。
【０００６】
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、第１ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合しているシグナル配列をさらに具えている。
【０００７】
別の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、第２ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合しているシグナル配列をさらに具えている。
【０００８】
本発明に関して用いる用語「ベクター」は、宿主細胞（好ましくは真核性宿主細胞）において作用可能な任意のベクターを意味する。このベクターは、例えばプロモータ、エンドヌクレアーゼ分解物のための制限部位、選択用遺伝子、内部リボソーム侵入部位のように、ベクターが宿主細胞（例えば真核細胞）において機能を発揮するのに必要とされる遺伝因子を具えていてもよい。当業者は、真核性ベクターを特徴付ける本質的な前記遺伝因子を知っている。本発明のベクターは、システイン残基を具えている遺伝因子をさらに具えている。
【０００９】
本発明に関して「作用可能である」という用語は、「機能的である」という用語と同じ意味に解釈する。従って、宿主細胞（例えば真核細胞）において「作用可能な」ベクターは、前記ベクターにそれぞれ含まれている宿主細胞特異的な遺伝因子に基づいてその機能を発揮するベクターである。
【００１０】
本発明に関して「（ポリ）ペプチド」という用語は、当業者によって理解される最も広い意味に考えるべきである。従って、ここで用いられている「（ポリ）ペプチド」という用語は、ポリペプチド群のみならず、ペプチド群を包含する分子群を意味する。このペプチド群は、３０個までのアミノ酸を有する分子からなり、ポリペプチド又はタンパクの群は、３０個を超えるアミノ酸を有する分子からなる。さらに以下に概説するように、本発明に関して特に興味深い（ポリ）ペプチドは、結合成分（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒｓ）である。
【００１１】
「細胞表面アンカー」、「アンカー」、「アンカー（ポリ）ペプチド」という用語は、特に、真核細胞の表面に接続されているか又は付着している任意の分子構造を表す。この用語は、当業者に知られている構造のみならず、未だ知られていない表面に付着することができる構造も含む。
【００１２】
言いかえれば、「細胞表面アンカー」、「アンカー」、「アンカー（ポリ）ペプチド」という用語は、宿主細胞における発現時に、付着するか、又は、宿主細胞の外側表面に結合されている（ポリ）ペプチド部位を意味する。アンカー（ポリ）ペプチドは、膜貫通タンパク部位であってもよいし、又は、（例えば、フォスファチジルイノシトール又はジスルフィド架橋などの翻訳後修飾によって）細胞表面に連結されている（ポリ）ペプチド部位であってもよい。この用語は、宿主細胞に対する天然タンパク、又は、細胞表面に付着させる目的で導入される外因性タンパクを包含している。
【００１３】
アンカーは、任意の合成修飾又は天然に存在するアンカーの切断片であって、宿主細胞又はファージ粒子の表面に付着する能力を保持しているものを含む。
【００１４】
好ましいアンカータンパク部位は、例えば、真核細胞の細胞表面タンパクに含まれている。有効なアンカーは、本発明による複数鎖（ポリ）ペプチドの１つの鎖などの別の（ポリ）ペプチドに結合したときに、表面アンカーを与えるのに充分な細胞表面タンパク部分を含んでいる。別々にコードされて発現されるが、細胞表面で共有結合（例えばジスルフィド）又は非共有結合によって結合されるタンパクペアを、適切なアンカーとして使用することも意図されている。
【００１５】
本発明のより好ましい他の実施形態においては、細胞表面アンカーが：凝集素、凝集素成分であるＡｇａｌｐ及びＡｇａ２ｐ、ＦＬＯ１、ＰＤＧＦ、ＰＲＩＭＡ、ｍＤＡＦ、及び、当業者に知られている他の天然又は合成の膜アンカー分子からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態においては、細胞表面アンカーがＰＤＧＦ若しくはその誘導体又はそれらの断片である。さらに好ましい他の実施形態においては、細胞表面アンカーが、ＰＤＧＦの膜貫通領域（以下「ＰＤＧＦＴＭ」）を具えている。
【００１６】
真核細胞などの細胞の表面上で又はその表面において「提示されている」という用語は、真核細胞などの細胞の表面上で又はその表面において「ディスプレイされている」という用語と同じ意味である。そのように提示されている又はディスプレイされているポリペプチドは機能性であり、本発明のベクター、方法及び使用において用いられる。特に、提示されている又はディスプレイされているポリペプチドは、反応性システイン残基を介して他のポリペプチドと相互に作用することができる。
【００１７】
「真核性宿主細胞の表面」という用語の「表面」という用語は、知られている任意の真核性宿主細胞の細胞本体を包囲するすべての構造を意味する。当業者は、例えば原形質膜に加えて、例えば植物細胞又は真菌細胞の細胞の壁を含むそのような構造も知っている。本発明に関する「原形質膜」という用語は、当業者によって前記用語に包含されると理解される、あらゆる真核膜を包含するものと解釈される。従って、この用語は、例えば真核細胞内の小胞体又はゴルジ小胞などの構造も包含している。
【００１８】
本発明に関して「少なくとも１つのシステイン残基」という用語は、（ポリ）ペプチドが正確に１個のシステイン残基のみならず、少なくとも２、少なくとも３、５、少なくとも５、１０、少なくとも１０、少なくとも２０、５０、少なくとも５０、少なくとも１００以上のシステイン残基を含んでいてもよいと理解される。
【００１９】
「前記ベクターが［真核性］宿主細胞において発現するように作用可能であり、ジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にする・・・」という文脈、又は同様の文脈における「発現」するという用語は、ベクターが、例えば（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を駆動させることができる遺伝因子を具えている状況を意味する。前記因子は当業者に周知であり、例えば真核性プロモータ及びポリアデニル化シグナルなどを包含している。特に、（ポリ）ペプチドが細胞表面に付着する前に、真核性宿主細胞において（ポリ）ペプチドが発現されることは理解されるであろう。前記（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現と、付着を生じさせるか又は可能にするステップとは、別々のステップ及び／又は環境で行ってもよい。しかしながら、好ましくは、発現と、付着を生じさせるか又は可能にするステップとは、適切な宿主細胞において連続的に行う。
【００２０】
「シグナル配列」又は「リーダー配列」という用語は、当業者に周知であり、細胞内の特定位置に対する前記シグナル配列を具えているポリヌクレオチドから発現される（ポリ）ペプチドをターゲットにすることができる任意の配列を意味する。本発明における好ましい細胞内位置は、真核細胞の細胞表面を形成する原形質膜である。シグナル配列は、本発明の目的から理解されるように、第１ポリヌクレオチド及び／又は第２ポリヌクレオチドの一部分であってもよい。
【００２１】
真核性宿主細胞などの宿主細胞にベクターをトランスフェクトすると、第１（ポリ）ペプチド及び／又は第２（ポリ）ペプチドの発現が恒常的であってもよいし、又は、誘導可能なものでもよい。結果的に生じる（ポリ）ペプチドは、ジスルフィド結合の形成を介して連結され得るので、従って、第１（ポリ）ペプチドと第２（ポリ）ペプチドとを結合させる。従って、第１（ポリ）ペプチドは、第２（ポリ）ペプチド、すなわち、細胞表面アンカーへの結合を介して宿主細胞の細胞表面に提示され得る。代替的に、第１（ポリ）ペプチドは、ジスルフィド結合の形成を介して真核性宿主細胞などの宿主細胞の成分と連結され得る。従って、第１（ポリ）ペプチドは、真核性宿主細胞などの宿主細胞の細胞表面に提示され得る。
【００２２】
宿主細胞
好ましい実施形態において、前記第１（ポリ）ペプチドは、当業者に周知の用語である１本鎖の（ポリ）ペプチドである。以下にさらに概説するように、本発明の文脈において、１本鎖の（ポリ）ペプチドが結合部材として機能する能力を有していることが好ましい。最も好ましい１本鎖の（ポリ）ペプチドは、ｓｃＦｖｓである。
【００２３】
別の好ましい実施形態においては、本発明のベクターの第１（ポリ）ペプチドが、結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第１鎖を具えている。本発明のベクターは：（ａ１）結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第２鎖を具えている第３（ポリ）ペプチドをコードすることができる第３ポリヌクレオチドをさらに具えていることがより好ましい。本発明のベクターは：（ａ２）結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第３鎖を具えている第４（ポリ）ペプチドをコードすることができる第４ポリヌクレオチドをさらに具えていることがより好ましい。別の好ましい実施形態においては、本発明のベクターが：（ａ３）結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第４鎖を具えている第５（ポリ）ペプチドをコードすることができる第５ポリヌクレオチドをさらに具えている。
【００２４】
さらに好ましい実施形態においては、本発明のベクターの第１、第２、第３、第４、及び／又は、第５ポリヌクレオチドが機能的に連結されている。
【００２５】
本発明に関して用いられる「機能的に連結されている」、又は、「作用可能に連結されている」という用語は、協調的発現などの何らかの機能的関係が各鎖間に存在している限り、上記ポリヌクレオチドのいずれもが同一のベクター上に必ずしも存在している必要がない状況を意味する。追加的に、本発明のベクターは、２つのポリヌクレオチドの発現及び翻訳を連結させるためのプロモータに代えてＩＲＥＳ配列を具えていてもよい。上記文脈において当業者が気がつくあらゆる関連性を予想することができる。
【００２６】
本発明のベクターのさらに他の好ましい実施形態においては、複数鎖（ポリ）ペプチドが２本鎖（ポリ）ペプチドで構成されている。
【００２７】
本発明のベクターの好ましい実施形態においては、複数鎖（ポリ）ペプチドが、２つの第１鎖と２つの第２鎖とで構成される４本鎖（ポリ）ペプチドで構成されている。
【００２８】
本発明の特に好ましい上記の実施形態は、真核性宿主細胞などの宿主細胞の表面に提示されるか又はディスプレイされる（ポリ）ペプチドが複数鎖（ポリ）ペプチドであるベクターを意味する。本発明に関する前記用語は、ペプチド結合形成以外の分子集合によって、共有結合又は非共有結合で互いに連結されている２個以上の別個の（ポリ）ペプチド成分（すなわち「鎖」）で構成されている機能的な（ポリ）ペプチドを意味する。
【００２９】
複数鎖（ポリ）ペプチドの各鎖は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。複数鎖（ポリ）ペプチドの顕著な例は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）であり、一般に、２つの重鎖と２つの軽鎖とで構成されている４本鎖であって、いくつかのジスルフィド（共有結合）結合を介して鎖が連結されている複数鎖（ポリ）ペプチドを構築する４本鎖で構成されている。軽鎖（ＬＣ）ドメインと重鎖（ＨＣ）ドメインとの組合せを含む活性免疫グロブリンＦａｂ断片は、複数鎖（ポリ）ペプチドの特に重要なクラスを形成する。ジスルフィド結合の形成だけでなく、ジスルフィド架橋が全く存在しなくても、Ｆａｂの軽鎖と重鎖とが有効に（非共有結合で）結合することが知られている。複数鎖（ポリ）ペプチドの他の例は、限定されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外ドメインを含む。
【００３０】
好ましくは、本発明のベクターによってコードされる複数鎖（ポリ）ペプチドは、２本鎖、３本鎖、４本鎖、又は、複数鎖（ポリ）ペプチドのいずれかとして存在する。より好ましくは、複数鎖（ポリ）ペプチドは、２つの異なる鎖で構成されている２本鎖又は４本鎖の（ポリ）ペプチドである。より好ましくは、複数鎖（ポリ）ペプチドは、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、及び、免疫グロブリンＦａｂ断片からなる複数鎖（ポリ）ペプチドの群から選択される。より好ましくは、複数鎖（ポリ）ペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は、これらの生物学的に活性な断片である。また、より好ましくは、複数鎖（ポリ）ペプチドはＦａｂである。
【００３１】
複数鎖（ポリ）ペプチドは、当業者に知られている任意の複数鎖ペプチドを意味することもある。本発明の文脈においては、結合分子が好ましい。この結合分子は、接触すると、特異的なターゲットと複合体を形成することができる。好ましい結合分子は、免疫グロブリン及びＦａｂである。免疫グロブリンは、システイン残基が付加された完全長の免疫グロブリンであってもよい。そのような付加システイン残基は、免疫グロブリン重鎖のＮ末端、免疫グロブリン重鎖のＣ末端、免疫グロブリン軽鎖のＮ末端、又は、免疫グロブリン軽鎖のＣ末端などの免疫グロブリン鎖の末端のどこに付加させてもよい。特定の実施形態においては、重鎖のＣ末端に前記付加システイン残基を付加する。そのような付加システイン残基は、任意の免疫グロブリン鎖末端（例えば重鎖のＣ末端）の近傍、例えば、免疫グロブリン鎖末端の２個以内、３個以内、５個以内、１０個以内、２０個以内、５０個以内、１００個以内、２００個以内又は５００個以内のアミノ酸に付加させてもよい。
【００３２】
免疫グロブリンは、天然の免疫グロブリンの結合特性を保持している免疫グロブリンの変異体であってもよい。例えば、免疫グロブリンは、Ｃ末端又はＮ末端において、末端の２個、末端の３個、末端の４個、末端の５個、末端の少なくとも５個、末端の少なくとも１０個、末端の少なくとも２０個、末端の少なくとも５０個、又は、末端の少なくとも１００個のアミノ酸を欠損していてもよい。さらに他の実施例において、免疫グロブリンは、Ｃ末端又はＮ末端に、例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、又は、少なくとも１００個の付加アミノ酸を具えていてもよい。さらに他の実施例においては、天然の免疫グロブリンの１個のアミノ酸がシステイン残基に置換されている。
【００３３】
さらに別の実施形態においては、宿主細胞の細胞表面に（ポリ）ペプチドを提示させるジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基は、ペプチド配列内に位置しているか、又は、システイン残基の反応性にポジティブに影響を与える他のアミノ酸残基に隣接している。本発明の文脈で用いられている「ポジティブに影響を与える」という用語は、ジスルフィド結合を形成する２個のチオール基の反応の平衡が生成物側にシフトする状況、すなわち、多くのジスルフィド結合が形成される状況を意味する。ある実施形態においては、前記ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の一方は、正に帯電しているペプチド配列内に位置しているか、又は、正に帯電しているアミノ酸に隣接している。他の実施形態においては、前記ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の一方は、負に帯電しているペプチド配列内に位置しているか、又は、負に帯電しているアミノ酸に隣接している。さらに別の実施形態においては、前記ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の一方が、正に帯電しているペプチド配列内に位置しているか、又は、正に帯電しているアミノ酸に隣接しており、前記ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の他方が、負に帯電しているペプチド配列内に位置しているか、又は、負に帯電しているアミノ酸に隣接している。前記システイン残基の反応性にポジティブに影響を与えた場合、２個のアミノ酸内において、３個のアミノ酸内において、５個のアミノ酸内において、１０個のアミノ酸内において、２０個のアミノ酸内において、又は、前記システイン残基に隣接している２個のアミノ酸内において、前記正に又は負に帯電しているアミノ酸が直接に隣接していてもよい。ある好ましい実施形態においては、前記システイン残基の反応性にポジティブに影響する帯電環境の生成に関与する１個より多い、２個より多い、３個より多い、５個より多い、又は、１０個より多い（それぞれ、正又は負に帯電している）アミノ酸が存在する。正に帯電している好ましいアミノ酸は、ヒスチジン、リジン及びアルギニンである。正に帯電している最も好ましいアミノ酸は、リジン及びアルギニンである。負に帯電している好ましいアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００３４】
本発明のベクターのさらに他の好ましい実施形態において、第１鎖及び／又は第２鎖及び／又は第３鎖及び／又は第４鎖は、前記ジスルフィド結合を介して細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドに付着している。本発明のベクターのさらに他の好ましい実施形態において、第１鎖及び／又は第２鎖及び／又は第３鎖及び／又は第４鎖は、前記ジスルフィド結合を介して宿主細胞の成分に付着している。
【００３５】
本発明による（ポリ）ペプチド及び／又は複数鎖（ポリ）ペプチドは、１個又は複数のジスルフィド結合を介して細胞表面アンカー又は宿主細胞の成分に付着していてもよい。複数鎖（ポリ）ペプチドに関して上に概説したように、１より多い１本鎖を具えている任意の（ポリ）ペプチドについては、前記付着が、いずれか一方の鎖と細胞表面アンカーとの間（すなわち、例えば、第１鎖とアンカー分子、又は、第２鎖とアンカー分子）のジスルフィド結合の形成によって、又は、いずれかの鎖と宿主細胞の成分との間（すなわち、例えば、第１鎖と宿主細胞の成分、又は、第２鎖と宿主細胞の成分）のジスルフィド結合の形成によって生じてもよい。１より多い（ポリ）ペプチド鎖へのアンカー分子又は宿主細胞成分の付着が生じてもよい。
【００３６】
本発明のベクターの好ましい実施形態においては、前記アンカーが、真核細胞の細胞表面タンパクで構成されている。前記細胞表面タンパクは当業者に周知である。
【００３７】
本発明のベクターのより好ましい実施形態においては、前記アンカーが、真核性宿主細胞の細胞表面に付着する真核細胞の細胞表面タンパクの一部分で構成されている。
【００３８】
本発明のベクターのより好ましい他の実施形態においては、前記アンカーが：凝集素、凝集素成分であるＡｇａｌｐ及びＡｇａ２ｐ、ＦＬＯ１、ＰＤＧＦ、ＰＲＩＭＡ、ｍＤＡＦ、及び、当業者に知られている他の天然又は合成の膜アンカー分子からなる群より選択される。
【００３９】
「宿主細胞の成分」という用語は、（一般に人工又は外因性の分子である本発明の細胞表面アンカーとは対照的に）本発明の宿主細胞の任意の天然又は内因性の成分を意味する。宿主細胞のそのような成分は、少なくとも１つのシステイン残基を具えている［第１］（ポリ）ペプチドの反応パートナーとして機能し、ジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合の前記形成によってホスト細胞表面に［第１］（ポリ）ペプチドが提示される。一般的に、本発明において用いられる宿主細胞の成分は、細胞壁、細胞膜、内膜、外膜、ペリプラスムの成分、又は、上記のいずれかに付着している成分などような、宿主細胞の外側部の分子である。
【００４０】
本発明のベクターのさらに他の好ましい実施形態において、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基、又は、前記第２（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基のいずれかは、人為的に導入されたものである。より好ましい実施形態において、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基は、人為的に導入されたものである。より好ましい他の実施形態において、前記第２（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基は、人為的に導入されたものである。本発明のベクターの最も好ましい実施形態において、前記第１（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基及び前記第２（ポリ）ペプチドに含まれている前記少なくとも１つのシステイン残基は、人為的に導入されたものである。
【００４１】
上記の特に好ましい実施形態は、例えば細胞表面アンカーの中に及び／又は例えば宿主細胞の表面に提示される（ポリ）ペプチドの中に、１つ以上のシステイン残基が人為的に導入された状況に関する。この文脈において、「人為的に導入された」という用語は、「天然に存在しない」と同様の意味で解釈される。それは、野生型又は天然に存在する（ポリ）ペプチドが、例えば組み換え手段によって修飾された状況を意味する。例えば、天然に存在するＰＤＧＦＲ膜貫通領域をコードする核酸を、標準的な手順で操作して、修飾されたドメインをコードする核酸配列を作り出すシステインコドンを導入してもよく、ここでは、システイン残基を、前記ドメインへ挿入する若しくは前記ドメインへ前記システイン残基を付加させることによって、又は、前記システイン残基で前記ドメインに含まれているアミノ酸残基を置換することによって、又は、前記挿入若しく付加若しくは置換の任意の組合せによって、人為的に導入する。上記文脈中の当業者に知られている他の方法も本発明の範囲内である考えられる。本発明のベクターから、例えば組み換え技術によって導入されたシステインコドンを具えているポリヌクレオチドを発現させることによって、システイン残基を具えている変異体（ポリ）ペプチドが形成される。
【００４２】
好ましい実施形態においては、ベクターがゲノムに統合されている。当業者は、真核性ベクター統合系を知っている。本発明のベクターに関して前記系を用いてもよい。
【００４３】
任意の原核生物又は真核細胞を本発明において宿主細胞として用いてもよい。好ましい宿主細胞は真核性宿主細胞である。より好ましい宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞である。さらに好ましい宿主細胞は霊長類の宿主細胞である。最も好ましい宿主細胞はヒト宿主細胞である。本発明に関して意図されている真核性宿主細胞は、当業者に知られている任意の真核細胞を表す。従って、前記用語は、特に、動物細胞、酵母、菌類及び植物細胞を包含している。例示的な真核細胞には、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）、ＨＫＢ１１細胞（Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａ）及びＣＨＯ細胞が含まれる。本発明の真核細胞によって生成されるポリペプチドは、それぞれの真核性宿主細胞の糖鎖付加パターンなどの翻訳後修飾を含んでいる。
【００４４】
本発明は：（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドを具え、前記第１（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第１鎖を具えている、第１ベクターと；（ｂ）細胞表面アンカーである少なくとも１つのシステイン残基を具えている第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドを具える第２ベクターと；選択的に、（ｃ）第３（ポリ）ペプチドをコードすることができる第３ポリヌクレオチドを具え、前記第３（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第２鎖を具えている第３ベクターと；選択的に、（ｄ）第４（ポリ）ペプチドをコードすることができる第４ポリヌクレオチドを具え、前記第４（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第３鎖を具える第４ベクターと；選択的に、（ｅ）第５（ポリ）ペプチドをコードすることができる第５ポリヌクレオチドを具え、前記第５（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第４鎖を具える第５ベクターとを具え、前記ベクターが真核性宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基と前記第２（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基との間でのジスルフィド結合の形成によって、前記第２（ポリ）ペプチドへの前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチド、及び、選択的に、前記第３、第４、第５（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞の表面で提示される組成物に関する。
【００４５】
本発明は：（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を具えている第１（ポリ）ペプチドをコードすることができる第１ポリヌクレオチドを具え、前記第１（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第１鎖を具える第１ベクターと；選択的に、（ｂ）第２（ポリ）ペプチドをコードすることができる第２ポリヌクレオチドを具え、前記第２（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第２鎖を具える第２ベクターと；選択的に、（ｃ）第３（ポリ）ペプチドをコードすることができる第３ポリヌクレオチドを具え、前記第３（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第３鎖を具える第３ベクターと；選択的に、（ｄ）第４（ポリ）ペプチドをコードすることができる第４ポリヌクレオチドを具え、前記第４（ポリ）ペプチドが結合分子複数鎖（ポリ）ペプチドの第４鎖を具える第４ベクターとを具える組成物であって、前記ベクターが、真核性宿主細胞などの宿主細胞において発現するように作用可能であり、前記第１（ポリ）ペプチド内に含まれる前記システイン残基と宿主細胞の前記成分との間でのジスルフィド結合の形成によって、宿主細胞への前記第１（ポリ）ペプチドの付着を生じさせるか又は可能にし、前記第１（ポリ）ペプチド、及び、選択的に、前記第２、第３、第４（ポリ）ペプチドが真核性宿主細胞などの宿主細胞の表面で提示される組成物にも関する。
【００４６】
上記にさらに定義されている本発明のあらゆるポリヌクレオチド、すなわち、第１、第２、第３、第４、第５ポリヌクレオチドは、１個、２個、３個、４個又は５個又はそれより多いベクターに含まれていてもよいと、本発明の上記実施形態を解釈する。当業者が考えつくそれらに由来する任意の置換は、本発明の範囲に含まれる。上記において既に概説したので、当業者は、細胞表面アンカーをコードすることができるポリヌクレオチドと、細胞表面に提示される１本鎖又は複数鎖の（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドとが機能的に連結されることを知っている。従って、ベクター又はベクターセットの組合せも本発明の範囲内であると想定される。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は、本発明のベクター又は本発明の組成物を具えている宿主細胞に関する。好ましい実施形態においては、本発明の宿主細胞が真核性宿主細胞である。より好ましい実施形態においては、本発明の真核性宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞である。さらに好ましい実施形態においては、本発明の哺乳動物宿主細胞が霊長類の宿主細胞である。最も好ましい実施形態においては、本発明の霊長類宿主細胞がヒト宿主細胞である。
【００４８】
本発明は、本発明の複数のベクターを具えるベクターライブラリであって、前記複数が第１及び／又は第３及び／又は第４及び／又は第５（ポリ）ペプチドの異種混合群に由来するものであるベクターライブラリにも関する。
【００４９】
上記実施形態に関して、１より多い細胞表面アンカーを用いてもよいことも意図されている。従って、第２（ポリ）ペプチド（すなわち、細胞表面アンカー）が異種混合であってもよい。
【００５０】
追加的に、本発明は、本発明のベクターにおいて定義されている少なくとも１０２個の（ポリ）ペプチドの異種混合群を集団的に提示する、真核細胞などの細胞群を具えている、真核性ディスプレイライブラリなどのディスプレイライブラリに関する。好ましくは、少なくとも１０３個、１０４個、１０５個、より好ましくは少なくとも１０６個又は少なくとも１０７個の（ポリ）ペプチドを具えている、真核性ディスプレイライブラリーなどのライブラリーは、本発明の範囲内であると想定される。
【００５１】
更に、本発明は、複数の宿主細胞に本発明のベクターライブラリーをトランスフェクトすることによって入手可能な、真核性宿主細胞ライブラリのような、宿主細胞ライブラリに関する。
【００５２】
当業者は、上記実施形態で意図されているライブラリの構築方法を知っている。
【００５３】
本発明は、本発明のベクターにおいて定義されている（ポリ）ペプチドを宿主細胞の表面に提示させる方法であって：（ａ）本発明の少なくとも１つのベクター又は本発明の組成物を宿主細胞に導入するステップと；（ｂ）前記ベクター又は前記組成物に含まれている（ポリ）ペプチドの発現に適している条件下で宿主細胞を培養するステップとを具えている方法にも関する。好ましくは、前記宿主細胞が真核性宿主細胞である。
【００５４】
上記に概説したように、他の表現によれば、本発明における特段の関心は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の表面に対象とする（ポリ）ペプチドをディスプレイすることである。この点における特別な長所は、提示される（ポリ）ペプチドが１以上のジスルフィド結合を介して細胞表面アンカーに連結されている状況である。前記結合を穏やかな還元条件下で開裂してもよく、従って、当業者は、以下に示すような新規な驚くべき応用分野を開発することができる。
【００５５】
上記に概説したように、他の表現によれば、本発明における特段の関心は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞の表面に対象とする（ポリ）ペプチドをディスプレイすることである。この点における特別な長所は、提示される（ポリ）ペプチドが１以上のジスルフィド結合を介して宿主細胞の成分に連結されている状況である。前記結合を穏やかな還元条件下で開裂してもよく、従って、当業者は、以下に示すような新規な驚くべき応用分野を開発することができる。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明の方法又は本発明のライブラリーにおける宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
【００５７】
追加的に、本発明は：（ａ）本発明に定義されている少なくとも１つのベクター、又は、本発明の組成物若しくは本発明のベクターライブラリーを、真核性宿主細胞群にトランスフェクトするステップであって、実質的に各細胞が異なる結合成分をコードするベクター又は組成物を具えているステップと；（ｂ）前記ベクター又は前記組成物に含まれている結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適している条件下で宿主細胞を培養するステップであって、細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドへの結合成分の付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；（ｃ）細胞表面に提示されている少なくとも１つの結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）の少なくとも１つの特異的な結合成分を提示する細胞を還元条件下で溶出させるステップと、を具えている方法に関する。上記方法は、好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の後に実行する追加的ステップ（ｃ１）：ターゲットに特異的に結合していない細胞を洗い出すステップをさらに具えている。
【００５８】
追加的に、本発明は：（ａ）本発明において定義されている少なくとも１つのベクター、又は、本発明の組成物若しくは本発明のベクターライブラリーを、真核性宿主細胞などの宿主細胞群にトランスフェクトするステップであって、実質的に各細胞が異なる結合成分をコードするベクター又は組成物を具えているステップと；（ｂ）前記ベクター又は前記組成物に含まれている結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適している条件下で宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞の成分への結合成分の前記付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；（ｃ）細胞表面に提示されている少なくとも１つの結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）の少なくとも１つの特異的結合成分を提示する細胞を還元条件下で溶出させるステップと、を具える方法に関する。上記方法は、好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の後に実行する追加的ステップ（ｃ１）：ターゲットに特異的に結合していない細胞を洗い出すステップをさらに具えている。
【００５９】
上記方法に関して、また本発明に関しても用いられているように、「結合成分」という用語は、「結合分子」又は「結合部位」との用語と同じ意味で用いられる。この用語は、本発明に関して、当業者に知られている任意の骨格を特に包含するように解釈される。本発明に関する「骨格」は、共通の骨格及び少なくとも１つの可変領域を有する（ポリ）ペプチドの任意の集合を表す。当業者に知られている骨格は、例えば、フィブロネクチンをベースとする骨格又はアンキリン反復タンパクをベースとする骨格である。
【００６０】
例えば実施例において以下に示すように、上記の方法は、バインダー分子を特異的に溶出させることができる。従って、特異的（又は、ネガティブセレクションを用いるときは：非特異的、すなわち、非結合性）ライブラリー成分を分離することができる。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、上記方法は、特異的結合成分の核酸配列を決定するステップをさらに具えている。次いで、その同定された結合分子を、当業者に知られているさらなる応用に用いてもよい。その同定された結合分子は、例えば、可溶性形態又は結合した形態で発現し得る。
【００６２】
更に、本発明は、別の一態様において：（ａ）本発明において定義されている少なくとも１つのベクター又は本発明の組成物を、真核性宿主細胞群にトランスフェクトするステップであって、前記ベクター又は前記組成物が、ターゲットに結合することができる結合成分を具えている（ポリ）ペプチドをコードすることができるポリヌクレオチド、及び、細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドに機能的に連結されている及び／又は前記結合成分に機能的に連結されている対象遺伝子を具えるステップと；（ｂ）前記ベクターに含まれている結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適している条件下で宿主細胞を培養するステップであって、細胞表面アンカーである（ポリ）ペプチドへの結合成分の前記付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；（ｃ）細胞表面に提示されている結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）の特異的結合成分を提示する細胞を還元条件下で溶出させるステップと、を具える方法に関する。上記方法は、好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の後に実行する追加的ステップ（ｃ１）：ターゲットに特異的に結合していない細胞を洗い出すステップをさらに具えている。
【００６３】
更に、本発明は、別の態様において：（ａ）本発明において定義されている少なくとも１つのベクター又は本発明の組成物を、真核性宿主細胞などの宿主細胞群にトランスフェクトするステップであって、前記ベクター又は前記組成物が、ターゲットに結合することができる結合成分を具える（ポリ）ペプチドをコードすることができるポリヌクレオチド、及び、前記結合成分に機能的に連結されている対象遺伝子を具えているステップと；（ｂ）前記ベクターに含まれている結合成分の細胞表面での発現及びディスプレイに適している条件下で宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞の成分への結合成分の前記付着が、ジスルフィド結合の形成によって達成されるステップと；（ｃ）細胞表面に提示されている結合成分をそのターゲットに結合させて、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体の形成を可能にするステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）の特異的結合成分を提示する細胞を還元条件下で溶出させるステップと、を具える方法に関する。上記方法は、好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の後に実行する追加的ステップ（ｃ１）：ターゲットに特異的に結合していない細胞を洗い出すステップをさらに具えている。
【００６４】
最も好ましくは、前記対象遺伝子は、治療用タンパク、工業用酵素、及び、研究で使用されるタンパクからなる群より選択される。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞又はヒト細胞である。
【００６６】
更なる一態様において、本発明は、上にさらに概説したライブラリを構築するための、本発明のベクター及び／又は組成物の使用に関する。
【００６７】
本発明は、宿主細胞と少なくとも１つのシステイン残基を具えている（ポリ）ペプチドとを具えている組成物であって、前記（ポリ）ペプチドが前記宿主細胞の表面で提示されるものである組成物を更に提供する。好ましくは、前記宿主細胞は、前記（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を具えている。
【００６８】
ある実施形態においては、前記宿主細胞は真核性宿主細胞である。別の実施形態においては、前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞、霊長類宿主細胞又はヒト宿主細胞である。別の実施形態においては、前記宿主細胞が、バクテリア宿主細胞などの原核生物の宿主細胞である。
【００６９】
本発明のある態様においては、前記（ポリ）ペプチドに含まれているシステイン残基が、宿主細胞の成分とのジスルフィド結合を形成する。好ましい実施形態においては、前記宿主細胞の成分が、宿主細胞の内因性成分、宿主細胞の野生型成分、宿主細胞に生来的に存在する成分、又は、宿主細胞に人為的に導入されたものではない成分である。好ましい実施形態においては、少なくとも１つのシステイン残基を具えている前記（ポリ）ペプチドが、宿主細胞に対して外因性（ポリ）ペプチド、宿主細胞に生来的に存在しない（ポリ）ペプチド、又は、宿主細胞に人為的に導入された（ポリ）ペプチドである。ある態様においては、少なくとも１つのシステイン残基を具えている前記（ポリ）ペプチドが、結合成分である。好ましい態様においては、前記結合成分が免疫グロブリンである。
【００７０】
ある態様において、本発明は、宿主細胞と、少なくとも１つのシステイン残基を具えている（ポリ）ペプチドとを具える複数の組成物で構成されるライブラリであって、前記（ポリ）ペプチドが前記宿主細胞の表面に提示され、前記組成物に含まれている少なくとも２つ（ポリ）ペプチドが互いに異なっているライブラリを提供する。別の態様においては、前記組成物に含まれている少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、又は、少なくとも１００００個の（ポリ）ペプチドが互いに異なっている。別の態様においては、前記（ポリ）ペプチドが、免疫グロブリンなどの結合成分である。ある態様においては、ライブラリに含まれている前記結合成分の少なくとも１つがそのターゲットに結合しており、それによって特異的結合成分とターゲットとの複合体を形成する。
【００７１】
ある態様において、本発明は、前記ライブラリに含まれている前記結合成分の少なくとも１つがそのターゲットに結合しているライブラリと、前記ターゲットに結合していない結合成分から前記ターゲットに結合している少なくとも１つの結合成分を分離する装置と、を具えているアセンブリを提供する。ある態様においては、前記装置がＦＡＣＳ機器などのフローサイトメーターである。それぞれの装置が当業者に知られており、商業的に入手可能である（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）。
【００７２】
ある態様において、本発明は、ターゲットに結合している結合成分を本発明のライブラリから分離する方法であって：（ａ）前記ライブラリを、前記結合成分をコードする核酸分子を具える細胞を分離できる条件に供するステップと、（ｂ）前記核酸分子を回収するステップとを具える方法を提供する。
【００７３】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されており、本発明を限定するように解釈してはならない。
【００７４】
実施例
実施例１：ライブラリー選択
システイン残基と各シグナル配列とポリアデニル化部位とを有し、抗生物質耐性も有する膜アンカータンパクをコードするポリヌクレオチドを具えている真核性発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡベクター）において、結合部位のライブラリを挿入してシステインを導入する。得られたベクターを、結合部位及び細胞膜アンカープラスミドが発現される条件下でＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトする。
【００７５】
ジスルフィド結合の形成によって細胞膜アンカーと結合分子とを連結させてもよく、結合部位は、細胞に含まれている遺伝情報と共に細胞表面に提示される。
【００７６】
様々なライブラリー成分を提示する細胞群を、細胞群が選択されるターゲットを提示するマトリックス又は表面（例えばセファロース）に接触させる。ターゲット分子に結合しているライブラリー成分を提示する細胞は、マトリックス又は表面に張り付くが、結合していない成分は洗浄によってなくなる。次いで、穏やかな条件（例えば０．０１ｎＭ  ＤＤＴ）で、結合部位を細胞膜アンカーにつないでいるジスルフィド結合を減少させることによってターゲット分子に結合している細胞を溶出させる。その後で、バインダー特異性をコードする遺伝情報をＲＴ−ＰＣＲによって回復させる。
【００７７】
実施例２：対象遺伝子をトランスフェクトした細胞の増殖
システイン残基と各シグナル配列とポリアデニル化部位とを有し、抗生物質耐性も有する膜アンカータンパクをコードするポリヌクレオチドを具えている真核性発現ベクターと、ターゲット（例えば、ハプテン（例えばフルオレセイン）、ペプチド（例えばｍｙｃ）又はタンパク）及びトランスフェクトする対象遺伝子に対して特異的なシステインを有する高親和性結合分子とを、結合分子及び細胞膜アンカープラスミドが発現される条件下で真核細胞内にトランスフェクトする。
【００７８】
対象遺伝子を含む細胞は、細胞膜アンカー、及び、その細胞表面にジスルフィド結合を介して提示される特異的な結合分子も提示するので、従って、細胞トランスフェクション用マーカーとして使用できる。
【００７９】
トランスフェクトした細胞とトランスフェクトされていない細胞との混合物を、結合分子が標的にしているターゲットを提示する固体支持体（例えばセファロース）に接触させる。結合分子を提示するトランスフェクトされた細胞は支持体に結合する。提示していない（すなわち、トランスフェクトされていない細胞）を洗い流し、トランスフェクトされた細胞を、穏やかな条件（例えば０．０１ｎＭ  ＤＤＴ）で、結合分子を細胞膜アンカーに連結しているジスルフィド結合を減少させることによって回収する。
【００８０】
実施例３：概念実証試験のための構築物のクローニング
概念実証試験において用いる細胞膜アンカータンパクは、ヒト血小板由来成長因子レセプタＢ（ＰＤＧＦＲＢ；ＮＰ００２６００．１）の膜貫通領域を具えている。同様の融合タンパクが、別の者によって別の目的で使用されてきた（Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｆｆｌｅｒ  ２００８，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２８（６），第８８５−９２８頁；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、カリフォルニア）のｔｈｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＨｏｏｋ−１も参照されたい。)。
【００８１】
３つのタイプの構築物、（ａ）システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ：ＰＤＧＦＲＢの膜貫通領域及び反応性システイン残基を具えているポリペプチド（この構築物の様々なバージョンを作成した。この実施例に記載されている構築物は、実施例６及び図１３のシステイン−ＰＤＧＦＲＴＭ＿構築物Ａと同一である。）、（ｂ）システイン−ＩｇＧ：重鎖のＣ末端に反応性システイン残基を具えているＩｇＧ１―タイプの免疫グロブリン、及び、（ｃ）ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ：ＩｇＧ１タイプの免疫グロブリン及びＰＤＧＦＲＢの膜貫通領域を具えている融合タンパクを作成した。後者をコントロール構築物として用いた。
【００８２】
システイン−ＰＤＧＦＲＴＭのクローニング
前記システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物は、（ａ）Ｎ末端の免疫グロブリンのκ鎖（Ｖカッパ）に対する可変ドメインのリーダー配列と、その後に続く（ｂ）反応性システイン残基を含むショートペプチドと、その後に続く（ｃ）直列ｍｙｃエピトープと、（ｄ）ヒト血小板由来成長因子レセプタＢの膜貫通領域（ＰＤＧＦＲＢ；ＮＰ００２６００．１のアミノ酸５１２−５６１）とを具えている。反応性システイン残基を含むショートペプチド伸長部（上記構築物の部位（ｂ））は、親水性の酸性ペプチド伸長部であってもよい。この構築物をコードする核酸配列は、発現に最適化されたコドンを用いて合成され、その後のクローニングのための制限部位をコードするさらなる隣接ヌクレオチドと、翻訳を開始するためのコザック配列とを含んでいた。標準的な分子生物学技術を用いて、標準的な発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）の中にこの構築物をクローンした。最終構築物のベクター地図を図４に示す。
【００８３】
システイン−ＰＤＧＦＲＴＭをコードする核酸配列は、以下のとおりである（コザック配列を下線で示す。）。
2011525103.tif 000003
【００８４】
システイン−ＰＤＧＦＲＴＭのアミノ酸配列は、以下のとおり（リーダー配列を下線で示し；反応性システイン残基を具えているペプチドをイタリック体で示し；直接ｍｙｃエピトープを太字で示し；膜貫通領域を二重線で示す。）である：
2011525103.tif 000004
【００８５】
システイン−ＩｇＧのクローニング
概念実証試験において用いられる免疫グロブリンは、本明細書中においてシステイン−ＩｇＧと呼ばれ、ＭＯＲ３０８０、抗ＣＤ３８抗体（ＷＯ０５／１０３０８３を参照されたい。）に基づいている。この免疫グロブリンは、それぞれがリーダー配列を有している２つの軽鎖を具えている。システイン残基を重鎖のＣ末端に導入した。軽鎖は変更しなかった。
【００８６】
クローニングのためのさらなる制限部位、発現カセットのためのコザック配列（軽鎖から始まる）、及び、重鎖中のシステイン残基のためのコドンをコードするオリゴヌクレオチドを用いて、標準的なＰＣＲ法によって核酸を得た。ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ融合タンパク（以下を参照されたい。）をコードする核酸配列をテンプレートとして用いた。この挿入物を、ＣＭＶプロモータ及びＩＲＥＳエレメントを含む標準的な発現ベクター中にクローンして、１つのプロモータによって制御される両方の鎖のカセット発現を可能にした。
【００８７】
システイン−ＩｇＧの軽鎖をコードする核酸配列は、以下のとおりである。この核酸配列は、ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭの軽鎖でもある；コザック配列を下線で示す。：
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【００８８】
システイン−ＩｇＧの重鎖をコードする核酸配列は、以下のとおりである（システインコドンをイタリック体で示す）。
2011525103.tif 000006
【００８９】
システイン−ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は、以下のとおりである。これはＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭのための軽鎖でもある。
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【００９０】
システイン−ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
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【００９１】
融合ポリペプチドＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ
融合タンパクＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭは、システイン−ＩｇＧ構築物と同じＩｇＧ１軽鎖を有している。しかしながら、この構築物においては、ＩｇＧ１重鎖がＰＤＧＦＲＴＭにインフレームで融合されている。この構築物をコントロールとして用いる。
【００９２】
ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭの重鎖をコードする核酸配列は、以下のとおりである。
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【００９３】
ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭの重鎖のアミノ酸配列は、以下のとおりである。ＩｇＧ部分を下線で示す。
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【００９４】
図５は、本研究において用いるいくつかのポリペプチドの概略である。図６は、本研究において用いる免疫グロブリンの反応性システイン残基の周辺を示している。図７は、本発明において用いる免疫グロブリン−ＰＤＧＦＲＴＭ融合タンパクをコードするベクターのベクター地図を示している。図８は、重鎖のＣ末端にシステイン残基を導入した本発明において用いる免疫グロブリンをコードするベクターのベクター地図を示している。
【００９５】
実施例４：細胞表面におけるＩｇＧの発現
Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、カリフォルニア））に本発明の様々な構築物を一時的にトランスフェクトした（実施例３を参照されたい）。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって発現を分析した。細胞培養、トランスフェクション、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析を、当業界において知られている標準的な技術によって行った。
【００９６】
結果を図９に示す。列１は、トランスフェクトされなかった（疑似トランスフェクション）細胞を用いた結果を示している。列２は、システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物をトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列３は、システイン−ＩｇＧ構築物をトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列４は、二重トランスフェクションとして、システイン−ＩｇＧ構築物とシステインーＰＤＧＦＲＴＭ構築物とを組み合わせてトランスフェクトした細胞を用いた結果を示している。列５は、ＩｇＧ−ＰＤＧＦＲＴＭ融合構築物をトランスフェクトした細胞の結果を示している。抗ｍｙｃ抗体を用いてＡ欄の検出を行い、抗ＩｇＧ抗体を用いてＢ欄の検出を行った。Ｃ欄においては、ビオチン化した抗原を用い、ラベルしたストレプトアビジンを用いてその検出行った。
【００９７】
事前にシステイン−ＩｇＧのみをトランスフェクトした（すなわち、反応性システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ相当物と共トランスフェクションしてない）細胞においては、実質的な抗ＩｇＧ治療シグナルを検出することができた。これらの細胞はＣＤ３８抗原にも結合できた（図９列３を参照されたい）。システイン−ＰＤＧＦＲＴＭを共トランスフェクトした細胞は、ＣＤ３８抗原への結合において明瞭で顕著な増加を示した（図９列４を参照されたい）。このことは、ジスルフィド結合の機能的な形成、及び、それに伴う、抗原に結合するＩｇＧ部位の真核細胞表面での提示を証明している。
【００９８】
予想通りに、システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物を（単独で又はシステイン−ＩｇＧと組み合わせて）トランスフェクトした細胞は、ＦＡＣＳで実証されているようにｍｙｃを発現した（図９参照）。同様に、システイン−ＩｇＧが発現されたときにＩｇＧが検出された。
【００９９】
システイン−ＩｇＧのトランスフェクションによっても、表面発現及び抗原結合活性がもたらされた。しかしながら、システイン−ＰＤＧＦＲＴＭとの共トランスフェクションは、ＩｇＧ染色及び抗原結合活性の著しい上昇をもたらした。
【０１００】
ＨＫＢ１１懸濁液細胞を用いると、ＦＡＣＳによって概して強い発現がみられた。システイン−ＰＤＧＦＲＴＭとシステイン−ＩｇＧとの共トランスフェクションも、システイン−ＩｇＧのみのトランスフェクションと比較すると、抗原結合活性の増加をもたらした。
【０１０１】
実施例５：システイン−ＩｇＧ変異体の比較
システイン−ＩｇＧの４つの変異体をＣＨＯ細胞に一時的にトランスフェクトした。４つの変異体は、Ｃ末端（これらの末端は反応性システイン残基を具えている）が異なっていた。４つの変異体すべての配列を図１０に示す。変異体（構築物Ｃ）の１つは、Ｃ末端だけに付加システイン残基を有する完全長のＩｇＧ重鎖を示していた。構築物Ａ及びＢは、ＩｇＧ重鎖がわずかに短いバージョンであり、構築物Ｄは、ＩｇＧ重鎖がわずかに長いバージョンである。すべての構築物は、Ｃ末端のみに付加システイン残基を具えている。構築物Ａは、実施例４で用いたシステイン−ＩｇＧ構築物と同一である。
【０１０２】
実験装置は、上述したものと同一であった。細胞表面のＩｇＧ又は抗原結合活性の検出を、上述したように行った（それぞれ、図１１のＡ欄又はＢ欄）。（図１１の）列１−５は、それぞれ、トランスフェクトしていない又はシステイン−ＩｇＧ構築物Ａ−Ｄをトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示している。
【０１０３】
すべての構築物によって、真核細胞表面でのＩｇＧの発現及びそれぞれの抗原結合活性がもたらされた。結果を図１１に示す。
【０１０４】
実施例６：システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ変異体の比較
ＣＨＯ細胞にも、反応性システイン残基の近傍アミノ酸が異なっている（下線で示されている）システイン−ＰＤＧＦＲＴＭの３つの変異体を一時的に共トランスフェクトした。４つの変異体のすべての配列を図１２に示す。図１２に表されている構築物Ａは、実施例３のシステイン−ＰＤＧＦＲＴＭ構築物と同一である。
【０１０５】
システイン−ＩｇＧの各変異体と共にシステイン−ＰＤＧＦＲＴＭの各変異体を試験した。すべての組合せは、真核細胞表面でのＩｇＧの発現及びそれぞれの抗原結合活性を著しくもたらした。システイン−ＰＤＧＦＲＴＭ変異体のすべてが同様の結果を示した。
【０１０６】
実施例７：分泌されたＩｇＧの再結合の分析
この試験の目的は、本発明において意図されているように実際にジスルフィド結合が形成されていること、及び、真核細胞表面でのＩｇＧ分子の提示が分泌されたＩｇＧの非特異的な再結合によるものではないことをを確認することであった。
【０１０７】
細胞内でＥＧＦＰが発現されるように、１セットのＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞の別の１セットに、異なるシステイン−ＩｇＧ構築物Ａを一時的に共トランスフェクトした（実施例５を参照）。トランスフェクション試薬の除去後（すなわち、トランスフェクション開始の６．５時間後）に細胞の２つのセットを混合して１６時間共培養した（図１３の列３を参照されたい。）。コントロール試験においては、ＥＧＦＰを発現するトランスフェクトされていない細胞、又は、システイン−ＩｇＧをトランスフェクトした親細胞を、疑似処理と同一の条件下で別々に培養した（それぞれ図１３の列１及び列２）。その後、細胞群を、ＥＧＦＰの発現又は非発現に起因して、ＦＡＣＳによって別々に分析した。
【０１０８】
システイン−ＩｇＧの細胞表面発現を図１３（図のｘ軸）のＢ欄に示す。図１３のＡ欄は、抗体染色をしていない試料を示している。これらの試料においては、永続的にＥＧＦＰを発現する細胞のみにおいてシグナルを検出でき（図のｙ軸）、システイン−ＩｇＧをトランスフェクトした親細胞についてはバックグラウンドシグナルだけを検出できた。
【０１０９】
コントロール群と比較して、トランスフェクトした細胞から分泌されたシステイン−ＩｇＧのわずかに小量だけが、ＥＧＦＰを発現する細胞によって捕捉された。これは、表現型と遺伝子型とのカップリングが完全に保持されていることを説得力を持って実証している。ＨＫＢ１１懸濁液細胞を用いて同じ結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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