(57)【要約】特定の実施形態に従った、エネルギー源と、少なくとも１つの共役マスクと、拡大デバイスと、加工材料とを備える、システムであって、少なくとも１つの共役マスクは、エネルギー源と拡大デバイスとの間に配置され、加工材料は、拡大デバイスに動作可能に配置される、システム。他の実施形態に従った、上記のようなシステムを採用する方法および組成物。上記エネルギー源は、レーザであり得る。上記少なくとも１つの共役マスクは、静的マスクであり得る。上記少なくとも１つの共役マスクは、動的マスクであり得る。上記少なくとも１つの共役マスクは、反射性であるか、または透過性であるか、あるいは両方の性質であり得る。
2011511432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー源と、少なくとも１つの共役マスクと、拡大デバイスと、加工材料とを備えているシステムであって、該少なくとも１つの共役マスクは、該エネルギー源と該拡大デバイスとの間に配置され、該加工材料は、該拡大デバイスに動作可能に配置される、システム。
【請求項２】
前記エネルギー源は、レーザである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記少なくとも１つの共役マスクは、静的マスクである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記少なくとも１つの共役マスクは、動的マスクである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記少なくとも１つの共役マスクは、反射性であるか、または透過性であるか、あるいは両方の性質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記少なくとも１つの共役マスクは、より多くの透過領域およびより少ない透過領域を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記少なくとも１つの共役マスクは、デジタルマイクロミラーデバイスである、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記少なくとも１つの共役マスクは、液晶ディスプレイである、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
コンピュータをさらに備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記拡大デバイスは、レンズを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記拡大デバイスは、顕微鏡対物レンズを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記加工材料の少なくとも一部は、生物学的材料、光硬化性樹脂、エラストマー、無機有機ハイブリッドポリマー、ポジ型フォトレジスト、ネガ型フォトレジスト、金属、ならびに電気活性材料および触媒材料のうちの１つ以上から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
ビームスキャンデバイスをさらに備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
マスク平行移動デバイスをさらに備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
加工材料平行移動デバイスをさらに備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
エネルギー源と、少なくとも１つの共役マスクと、拡大デバイスと、加工材料とを提供することであって、該少なくとも１つの共役マスクは、該エネルギー源と該拡大デバイスとの間に配置され、該加工材料は、該拡大デバイスに動作可能に配置される、ことと、該加工材料を、該エネルギー源から放出されるエネルギーに曝露させることとを含む、方法。
【請求項１７】
前記エネルギー源は、レーザである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの共役マスクは、静的マスクである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの共役マスクは、動的マスクである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの共役マスクは、反射性であるか、または透過性であるか、あるいは両方の性質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの共役マスクは、より多くの透過の領域およびより少ない透過の領域を備えている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの共役マスクは、デジタルマイクロミラーデバイスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの共役マスクは、液晶ディスプレイである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記拡大デバイスは、レンズを備えている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記拡大デバイスは、顕微鏡対物レンズを備えている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記加工材料の少なくとも一部は、生物学的材料、光硬化性樹脂、エラストマー、無機有機ハイブリッドポリマー、ポジ型フォトレジスト、ネガ型フォトレジスト、金属、ならびに電気活性材料および触媒材料のうちの１つ以上より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記加工材料は、１つ以上の細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エネルギー源からの前記エネルギーは、走査される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの共役マスクは、加工中に、平行移動されるか、または回転されるか、あるいは両方が行われ得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
加工平面は、加工中に、平行移動されるか、または回転されるか、あるいは両方が行われ得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
エネルギー源と、少なくとも１つの共役マスクと、拡大デバイスと、１つ以上の細胞を含む加工材料とを提供することであって、該共役マスクは、該エネルギー源と該拡大デバイスとの間に配置され、該加工材料は、該拡大デバイスに動作可能に配置される、ことと、パターン化された加工材料を形成するように、該加工材料を、該エネルギー源から放出されるエネルギーに曝露させることと、該１つ以上の細胞を該パターン化された加工材料内で培養することとを含む、方法。
【請求項３２】
前記加工材料の少なくとも一部は、生物学的材料、光硬化性樹脂、エラストマー、無機有機ハイブリッドポリマー、ポジ型フォトレジスト、ネガ型フォトレジスト、金属、ならびに電気活性材料および触媒材料のうちの１つ以上より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エネルギー源からの前記エネルギーは、走査される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの共役マスクは、加工中に、平行移動されるか、または回転されるか、あるいは両方が行われ得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
加工平面は、加工中に、平行移動されるか、または回転されるか、あるいは両方が行われ得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１６〜３５に記載の方法のうちの１つ以上から形成される組成物。
【請求項３７】
光学デバイス、機械的デバイス、電気デバイス、化学的／生物学的デバイス、正、負、および中立キューを有するデバイス、（バイオ）センサ、ならびにアレイのうちの１つ以上を形成するために、請求項１６〜３５に記載の方法のうちの１つ以上から形成される組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願への参照）
本出願は、２００８年１月２日出願の米国特許出願第６１／０１８，５９９号の利益を主張し、この米国特許出願の全内容が本明細書において参照により援用される。
（政府の権利についての声明）
本発明は、米国科学財団からの政府支援を用いて行われた（助成金第０３１７０３２号）。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
現在、細胞パターン化、神経回路工学、幹細胞研究、細胞バイオセンサ、細胞駆動機械、ならびにマイクロ流体およびマイクロメカニカルデバイスを含む、諸用途において使用するための小規模デバイスを、加工および評価する方法に、著しい関心が寄せられている。この需要の結果として、このようなデバイスを加工するために、種々の技術が開発されている。
【０００２】
Ｘ線または深紫外線の使用を含む、フォトリソグラフィ等の方法は、２次元微細構造を生成するための公知の方法である。ミクロ接触プリンティング、および自己集合単分子層による界面化学の改変に基づく、マイクロスケール加工のための方法も、開発されている。しかしながら、これらの方法の両方は、特に興味深い、任意の３次元構造を生成するそれらの能力において、大幅に制限される。さらに、これらの方法によって生成される構造は、しばしば、制限された生体適合性を有する。
【０００３】
生体模倣トポグラフィ、および二光子もしくは多光子リソグラフィを含む、３次元構造に対するこの関心に対処するために、いくつかの方法が開発されている。生体模倣トポグラフィは、支持基底膜またはマトリクスを曝露するように、上皮または内皮層を、生物学的表面から除去し、その後、基底膜またはマトリクスを、ポリマーキャスティングのための鋳型として使用することによって、３次元構造を生成する。次いで、キャストポリマーは、バイオ材料キャスティングのためのネガとして使用される。しかしながら、この技術は、生物学的表面の使用が必要であり、これは、このような方法から生成することができる構造のトポグラフィを制限する。
【０００４】
多光子リソグラフィは、レーザビームが、通常、所望の硬化ポリマー構造を形成するように、固有の染料を含有するポリマー樹脂で被覆された基材にわたって走査される、技術である。レーザ書込プロセスは、架橋の化学反応が、分子が光の多光子を吸収した場合のみに生じるという事実を利用する。多光子−光子吸収の速度は、レーザの焦点からの距離に伴って急速に減少することから、焦点に非常に近い分子のみが、二光子を吸収するように、十分な光を受容する。したがって、このような方法により、生成された構造のトポグラフィへの大幅な制御が可能となる。しかしながら、このような方法には、現在、このようなデバイスのプロトタイプを生成するために、高価かつ高度に専門的なプロセス、ならびに経済的に著しい量の時間および材料が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
経済的かつ時間効果の高い様態で、複雑な３次元微細構造を加工および評価するために、高度に専門的な装置を使用することなく、このようなデバイスの加工を可能にする方法が提供されなければならない。さらに、このようなミクロデバイスを、生物学的科学および他の関連分野において広く有用なものとするために、このような方法は、多様な材料の使用を可能にしなければならない。本開示は、特定の実施形態によると、迅速なプロトタイピングおよび反復に適した、容易なプロセスを使用する、複雑な３次元ナノおよび微細構造を形成するための手段を提供する、マスク志向性リソグラフィシステムおよび方法に関する。本開示は、特定の実施形態によると、このような方法およびシステムを使用して形成される組成物も提供する。
【０００６】
本発明の特徴および利点は、以下の実施形態の説明を一読することにより、当業者には容易に明らかとなる。
【０００７】
本開示の一部の特定の例示的実施形態は、以下の説明および添付の図面を一部参照することにより、理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、顕微鏡対物レンズの前焦点面と共役な面へのマスクオブジェクト（左パネル内のイエバエ、スケールバー、２ｍｍ）の定置から、ウシ血清アルブミンＢＳＡと、多光子リソグラフィを利用する光感受性物質としてのメチレンブルーとを使用するオブジェクトネガ（微分干渉コントラスト［ＤＩＣ］画像のモンタージュ、中央パネル、スケールバー、２０μｍ）の加工への流れを示す。本画像中、１および２で区別される領域は、走査型電子顕微鏡写真、ＳＥＭに詳細に示される（右パネル、スケールバー、１μｍ）。
【図２】図２は、２つの別個のマスクを順次使用して加工された２段階ＢＳＡ微細構造を示す（Ａ）。重複領域は、細菌を、１階から２階ロフトに入れ替える。（Ｂ）得られた２段階ＢＳＡ微細構造のＳＥＭ。（Ｃ）１階通路に入り、重複領域（矢印、中間パネル）およびロフト（右パネル）まで通過する、大腸菌細胞（ＲＰ９５３５）を示すＤＩＣ画像（左パネル）であり、これは、最終的に、細胞で満たされる（差込図）。スケールバー（Ｂ、Ｃ）は、５μｍである。
【図３】図３は、単一細菌を捕捉するための生体適合性微細加工を示す。（Ａ、Ｂ）ＣおよびＤ部分に示されるものと同様のＢＳＡ微細容器のＳＥＭ画像。（Ｃ）細菌内部で入口を閉栓させた後のＢＳＡ容器のＳＥＭ。（Ｄ）細菌を捕捉するための栓の加工の前（１）、および直後（２）のＢＳＡ容器を示すシーケンス（矢印、スケールバー、１０μｍ）。細胞分裂により、最終的に、細菌を損失することなく、トラップを満たす（３〜６）。時点は、（３）１７２分、（４）３６０分、（５）５９０分、（６）１６時間である。スケールバーは、Ａ／Ｏが１０μｍ、Ｂ／Ｃが２μｍである。
【図４】図４は、タンパク質微細構造にわたる、厚さおよび化学的機能化の両方における勾配を形成するための、移動マスクの使用を示す。勾配微細構造は、９０％ＢＳＡおよび１０％アビジン（重量／重量、総タンパク質濃度は、３２０ｍｇ  ｍＬ−１であった）、ならびにメチレンブルー（３ｍＭ）を含有する溶液から加工した。レーザ走査中、完全に不透明なストレートエッジマスクを、加工平面内のその画像が２μｍ秒−１の速度で一掃されるように、平行移動させた。得られたＢＳＡ／アビジン微細構造を、２μｍのフルオレセインビオチン中で１０分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０回すすぎ、蛍光により画像化した。（Ａ、Ｂ）ＤＩＣおよびＳＥＭ顕微鏡検査では、タンパク質構造にわたるレーザ暴露時間の変化が、厚さ勾配を生じることが、明らかとなる。（Ｃ）構造にわたって描画される水平線（矢印から）の蛍光強度を表すプロット（緑線）。この強度を、構造の厚さによって除算し（差込図）、機能勾配密度を得た（即ち、構造の厚さに対して正規化）。このデータから、蛍光強度勾配は、構造の厚さおよび機能密度の重畳であることが示される（即ち、アビジンのビオチン結合能力）。パネルＤは、パネルＣ内の蛍光画像の３Ｄ表面強度プロットであり、勾配が微細構造の表面にわたり維持されることを示す。
【図５】図５は、平行移動可能なマスクが、微細構造においてミクロ勾配を生成することを示す。（Ａ）勾配傾斜の方向は、ビーム軸に直交するマスク平行移動の方向（例えば、東西［左構造］、南北［右構造］、東西［下構造］）によって決定され得る。このアプローチは、機能的ミクロ勾配、ならびにタンパク質および光感受性物質の勾配を形成するために有用である。（Ｂ）加工中、可変開口虹彩の作動（閉から開へ）は、半径方向のミクロ勾配を生成する。（Ｃ）ミクロ勾配境界は、静止ネガマスクにより画定することができる。ここでは、線状（下部差込図）または非線状勾配（点線矢印に沿って）が、それぞれ線状および加速された速度で平行移動されるマスクを使用して加工される。このプロットは、微細構造の周縁を画定するために使用されるネガの透明度よりも小さな寸法の不透明マスクを平行移動させることによって生成される、Ｃ内の点線矢印の方向に沿った勾配プロファイルを示す。すべての微細構造は、５ｍＭのメチレンブルーを使用して光増感された４００ｍｇ  ｍｌ−１のＢＳＡから加工した。蛍光強度は、捕捉された光増感剤からのものである。スケールバー、５μｍ。
【図６】図６は、ＭＤＭＬを使用したラピッドプロトタイピングを示す。（Ａ）運動性細菌の定方向運動性に対する、マイクロチャンバのラピッドプロトタイピングのためのスキーム。チャンバを加工するプロセスにおいて、構造の複数の平面は、マスクを走査し、焦点の位置を試薬溶液の異なる深さに段階的に進み、走査を繰り返すことによって、順次形成される。このプロセスは、所望の高さの微細構造を形成するために繰り返すことができる。（Ｂ）このアプローチは、任意のマイクロチャンバ形状の迅速な反復および加工を可能にする。マイクロチャンバは、高さ約５μｍであり、上部は、適所にフォトマスクを用いることなくレーザビームを走査することによって封止される。スケールバー、１５μｍ。
【図７】図７は、ＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス）指向の多光子リソグラフィの一実施形態に関する概略図を示す。点線（「ビーム平行移動」）は、ビーム軸の走査位置の限界を示す。Ｌ１〜４は、レンズの位置を指す。
【図８】図８は、ヒト頭部ＭＲＩ走査からの水平平面からなる画像スタックの複数の垂直平面の加工のためのＤＭＤ指向ＭＤＭＬが、アクリレートマイクロレプリカの加工を誘導することを示す。数字は、加工を誘導するために使用されるマスクの総シーケンス（合計＝１５０）における、マスクの位置を示す。スケールバー、５μｍ。
【図９】図９は、水平「キルティング」構造のためのＤＭＤ指向ＭＤＭＬに関する一実施形態を示し、単一の水平走査平面で達成することができるものよりも大きな構造の迅速な加工を可能にする。（ａ）画像は、一連の水平走査平面を比較するためにセグメントに分割される（プログラムＬａｂｖｉｅｗを使用）。（１）は、セグメント化された領域を示す。（２）セグメント化された領域の拡張の描写（ここでは加工順に標識）。（３）は、加工された構造間の重複の量を描写する。（４）は、８つの別個のマスクをまとめた最終構造を示す。（ｂ）ＪＰＥＧファイルから作製された８つのセグメントキルト構造。左から：カフェインのモデル、ワイヤ上のヒタキ、およびＳｈｅａｒ  Ｌａｂロゴ。スケールバー、１０μｍ。
【図１０】図１０は、ＤＭＤ指向ＭＤＭＬを使用して加工される生物学的生命体の微小再構成を示す。ＤＭＤ画像シーケンス（ｄｉｇｉｍｏｒｐｈ．ｏｒｇより提供された高解像Ｘ線ＣＴデータ）の、垂直サンプル平面ステップとの同期化により、光架橋ＢＳＡからなる、動物（ａ〜ｅ）およびピンクッションプロテア（ｆ、上部）レプリカを、迅速に加工することが可能となる（１〜２秒  平面−１）。また、パネルｆは、加工中（側面図）および加工後（上面図）に取得されたタンパク質プロテアの予想された（左）および実際の蛍光画像（右）を示す。
【図１１】図１１は、マスク切断が、切断された微細構造を生成することを示す。冠状積層体としてＤＭＤで表示される画像の切断により、光架橋ＢＳＡからなるチンパンジーの頭蓋骨の矢状断面を生成する（ａ、左および右）。完全な画像シーケンスからの連続平面の差し引きは、水平に切断された微細構造をもたらす（ｂ、差込図は上面図を示す）。スケールバー、１０μｍ。
【図１２】図１２は、単純なマスクシーケンスが、複雑な３Ｄオブジェクトを形成することができることを示す。左：１μｍの垂直ステップを使用してそれぞれ離間した、１５０の連続平面を使用して加工されたタンパク質マイクロブレイズのＳＥＭ。それぞれの平面のマスクデータは、交錯した「図７」のパターンで移動する３つの円のアニメーションである。右：マスク画像に基づく、予想される３Ｄ再構成。微細構造は、４００ｍｇ  ｍＬ−１のＢＳＡおよび５ｍＭのメチレンブルーを使用して加工した。すべてのスケールバー、１０μｍ。
【図１３】図１３は、細胞運動性を誘導し、３Ｄ細胞コロニーを成形するための、マイクロアーキテクチャのプロトタイピングを示す。ａ．封入された中央レセプタクルの上前部およびその中へと通じる螺旋傾斜（２０°ピッチ、２７０°ツイスト）への単一の入口を有するマイクロチャンバプロトタイプの３Ｄ再構成（マスク画像に基づく）（標識は、マイクロメータでの寸法）。ｂ．無傷（上左パネル）および切断された（上右および下パネル）上面を有するマイクロチャンバプロトタイプのＳＥＭ。ｃ．入口を通過し、螺旋通路に誘導される、単一の、活発に泳動する大腸菌細菌（楕円で囲まれている）のＤＩＣ画像シーケンス。点線は、通路の上縁部を示し、シーケンスの経過時間は、１秒である。マイクロチャンバ内の大腸菌（パネルｃから）のＴブロス内での終夜のインキュベーションは、内部アーキテクチャの形状に一致する、成形された細胞コロニーの成長をもたらす。差込図は、それぞれのパネルの細胞コロニー、および焦点の位置の概略を示す。すべての構造は、１２０のマスクシーケンスを使用して、約２分以内にＢＳＡの溶液から加工し、標本は、マスク間の光学軸に沿って０．３μｍずつ段階状とした。公称構造高（ｃおよびｄ）、３２ミクロン。スケールバー、１０μｍ。
【図１４】図１４は、ＭＤＭＬを使用したマイクロ作動のためのＢＳＡ勾配ロッドの加工を示す。（ａ）加工溶液内のレーザ走査は、構造周縁に沿った材料勾配を生成する（パネル１のとおり）。この「周縁効果」は、ラスタ走査中、パターン周縁でのより長いレーザ滞留時間により生成される。不透明フォトマスクを、加工平面に共役する平面に定置することによって（即ち、ＭＤＭＬ）、構造の中央領域（パネル１の「マスク領域」）は、排除され、走査縁部（パネル１の「非マスク領域」）のみを残す。このように、それらの幅に沿った材料勾配を有する走査縁部領域から形成される、ロッドが画定可能な曲げ耐力をもたらす手順である。パネル２は、ｓｈｏｗｓ非マスク領域を、左走査縁部（「Ｌ」）または右走査縁部（「Ｒ」）のみに残して形成された、ロッドを示す。非マスク領域は、表面連結ロッドを形成するように、ラスタ走査（５００Ｈｚで実施）に直交する方向に、１μｍ／秒で顕微鏡ステージによって平行移動される（付着点は、破線の近傍に位置する。詳細については、方法の項を参照のこと）。パネル３は、ｐＨ２．２（ＨＣｌ）の洗流液による処置後のロッド湾曲を示す。スケールバー、３μｍ。（ｂ）走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）により、ロッドの縁部に沿った厚さ勾配が明らかとなる。初期の研究では、密度勾配は、特異的に放射されたタンパク質微細構造の厚さ勾配に付随し得ることを示している（参考文献２０）。（ｃ）勾配ロッドを有する表面に連結されたＰＭＭＡ微粒子を示すＳＥＭ。スケールバー、３μｍ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。（１または複数の）カラー図面を伴う本特許または特許出願公開の複製は、要望、および必要手数料の支払により、米国特許商標庁により提供される。
【００１０】
本開示は、種々の修正および代替形態が可能であるが、特定の例示的実施形態を図示し、以下にさらに詳細に説明する。しかしながら、特定の例示的実施形態の説明が、本発明を開示される特定の形態に制限することを意図せず、逆に、本開示が、一部、添付の請求項によって、説明されるすべての修正および均等物を網羅することを理解されたい。
【００１１】
（説明）
本開示は、特定の実施形態によると、概して、ナノおよび微細構造加工のためのシステムおよび方法に関する。
【００１２】
本開示は、特定の実施形態において、エネルギー源と、少なくとも１つの共役マスクと、拡大デバイスと、加工材料と、を備える、３次元加工のためのシステムを提供し、共役マスクは、エネルギー源と、拡大デバイスとの間に配置され、加工材料は、拡大デバイスに動作可能に配置される。本明細書で使用する際、共役マスクは、加工平面への空間位置の近似の一対一写像を有する焦点平面に定置されたマスクを指す。動作中、エネルギーは、エネルギー源から、拡大デバイスを介して、加工材料へ放出される（例えば、図１を参照のこと）。共役マスクは、少なくとも部分的に、それに接触するエネルギー源から放出されるエネルギーを遮断する。したがって、マスクの異なる性質が、種々の特徴を有する構造の加工を可能にする加工材料に平行移動される。
【００１３】
エネルギー源は、加工材料の変化を誘発することが可能ないかなる源であってもよい。したがって、選択されるエネルギー源は、特定の用途および加工材料に依存する。好適なエネルギー源の一実施例は、レーザ光源である。このようなレーザとしては、フェムト秒チタン／サファイアまたは周波数逓倍Ｑ切替Ｎｄ：ＹＡＧレーザが挙げられるが、これに限定されない。エネルギー源は、共役マスクに向けられ、以下にさらに詳細に説明するように、共役マスクに焦点化されてもよい、および／または共役マスクの位置で空間的に走査されてもよい。
【００１４】
一部の実施形態において、エネルギー源は、１つ以上のレーザビームを備えてもよい。このような構成は、共役マスクの異なる領域にわたる同時走査を可能にする。このように、微細構造／マイクロデバイスの異なる領域は、並行して加工することができる。このアプローチは、例えば、所与の空間パターンを形成するのに必要とされる加工時間を減少させるために使用することができる。
【００１５】
一部の実施形態において、該システムは、ビーム走査デバイスをさらに備えてもよい。ビーム走査デバイスは、とりわけ、共役マスクの複数の位置への入射エネルギーの走査を可能にする。さらに、エネルギー源からのエネルギーは、長方形のラスタ様式、円形様式、ランダム等の種々の様態で走査されてもよい。好適なビーム走査デバイスは、当該技術分野では既知であり、検流計駆動ミラーおよび音響光学偏向器が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
共役マスクは、エネルギー源と拡大デバイスとの間に配置される。該マスクは、少なくとも部分的に、拡大デバイスおよび／または加工材料へのエネルギー源からのエネルギーの透過を遮断するべきである。共役マスクは、静的マスク（例えば、物理的オブジェクトおよびフォトマスク）、または動的マスク（例えば、拡大デバイスによって加工材料に転写することができる形状を呈するように、エネルギー源からのエネルギーを空間的にパターン化することが可能なデバイス）であってもよい。
【００１７】
フォトマスクおよび物理的オブジェクト等の静的マスクは、それらが呈するパターンに関して固定されているという点で、静的であると見なされてもよい。しかしながら、以下に述べるとおり、静的マスクは、加工中に、加工材料に対して、移動されてもよく、例えば、材料の勾配の加工を可能とする（図２、５、６を参照のこと）。対照的に、動的マスクは、それらが呈するパターンに関して固定されない。動的マスクは、概して、とりわけ、デジタルで画定されたマスク（即ち、デジタルマスク）が、例えば、コンピュータのグラフィック出力によって、迅速に形成、処理、および修正されることを可能にするように、電子的に制御される。
【００１８】
特定の実施形態において、共役マスクは、フォトマスク（例えば、規定のパターンで光が輝くことを可能にする孔または透明度を有する不透明なプレート）であってもよい。また、好適なフォトマスクは、完全に不透明でも完全に透明でもないが、入射光の一部分が通過するのを可能にする部分を有してもよい。例えば、勾配を形成する上で、部分的に透明なマスクが有用であり得る。また、好適なフォトマスクは、全部または一部が、透過性または反射性であってもよい。
【００１９】
特定の実施形態において、共役マスクは、物理的オブジェクトであってもよく、その形状は、加工材料に転写される。３次元物理的オブジェクトは、光学軸に沿って大幅に延在してもよいが、実質的な部分は、加工平面との近似の一対一空間写像によって位置付けられてもよい。
【００２０】
上に記載するとおり、共役マスクは、動的マスクであってもよい。好適な動的マスクの実施例としては、反射性および／または透過性要素を使用する、電気的および光学的にアドレスされた空間光変調器が挙げられるが、これに限定されない。反射性要素の実施例としては、マイクロミラーデバイス、液晶ディスプレイ、回折格子、回折光学要素、および反射性ライトバルブが挙げられるが、これらに限定されない。透過性要素の実施例としては、液晶ディスプレイおよび透過ライトバルブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
動的マスクは電子的に制御されることから、それらは、コンピュータのグラフィック出力によって、デジタルで画定されたマスクが迅速に形成、処理、修正されることを可能にしてもよい。したがって、一部の実施形態において、デジタルオブジェクト共役マスクを有する本開示のシステムは、コンピュータをさらに備えてもよい。動作中、動的マスクは、それぞれの対応するセクションの加工の領域に対する、加工基材の垂直な位置付けでもって、より大きな構造の部分を画定する、デジタルマスクの連続表示を調整することによって、広範な３次元微細構造の迅速な加工を可能にしてもよい。さらに、諸部分は、加工材料の水平平行移動による、変動するデジタルマスクの連続表示を調整することによって、デジタルマスクに対応する特徴を有する基材上で並べて加工することができる。このように、任意の２Ｄおよび３Ｄの複雑性の構造は、マスクのアレイから迅速に加工されてもよい。また、加工曝露の寸法を超過する寸法を有する構造は、曝露を（例えば、２Ｄ、３Ｄ座標に沿って）加工材料に平行移動させることによって加工されてもよい（図９を参照のこと）。
【００２２】
加工を誘導する情報は、例えば、３Ｄ画像化技術を使用して取得された３Ｄデータとして、コンピュータ内に存在してもよい。このような技術としては、Ｘ線ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法、ポジトロン放出トモグラフィ、他のトモグラフィ、共焦点画像化、二光子および多光子画像化、干渉に基づく画像化技術、ならびに音波および超音波に基づく技術が挙げられるが、これらに限定されない。このような情報は、例えば、別個の２Ｄ画像のスタックとして、容易に格納することができ、これは、加工中、連続マスクとして使用することができる。代替として、３Ｄ情報は、３Ｄコンピュータ支援設計、幾何学的パラメータに基づく他の３Ｄマッピングアプローチ（図１３を参照のこと）、および１つのマスクから次への連続した幾何学的形状の増分再配向（図１２を参照のこと）を使用することによって等、他のアプローチを使用して作成されてもよい。３Ｄ情報の格納は、加工の部位に対して遠隔にあるコンピュータ上で可能であり、加工プロセス中またはその後のいずれかに、リポジトリからの加工指示の転送を可能にする。
【００２３】
拡大デバイスは、少なくとも１つの形状を共役マスクから加工材料に転写することが可能ないかなるデバイスであってもよい。拡大デバイスは典型的に、１を上回る拡大係数を有するが、他の拡大係数が本開示によって企図される。本開示で使用する際、１を上回る拡大係数は、エネルギーを共役マスクから加工材料内の共役平面へ転写する上で、焦点のサイズを低減する拡大システムを指す。一部の実施形態において、拡大デバイスは、形状のサイズを低減してもよい。この低減は、例えば、その画像を生成する上で、形状のサイズの増加を導く、標本から光を回収する一般的習慣とは対照的に、一般的な拡大オプティクスを加工材料に集光するために使用する際に生じる。例えば、拡大デバイスは、レンズ（例えば、チューブレンズ）および／または他のオプティクス（例えば、高開口数無限遠補正顕微鏡対物レンズ等の顕微鏡対物レンズ）であってもよい。
【００２４】
加工材料は、変性材料の空間的にパターン化された配設を形成することが可能な、いかなる感光性材料であってもよい。このような材料は、露光から直接、またはその後の開発プロセスを介して、光誘起相変化が可能であってもよい。選択される加工材料は、少なくとも一部において、特定の用途に依存する。好適な加工材料の実施例としては、生物学的材料、光硬化性樹脂、エラストマー、無機有機ハイブリッドポリマー、ポジ型フォトレジスト、ネガ型フォトレジスト、金属、ならびに電気活性および触媒材料が挙げられるが、これらに限定されない。加工材料は、２つ以上の材料の複合物であってもよい。
【００２５】
生物学的材料は、加工材料として使用されるか、または加工材料に組み込まれてもよい。このような生物学的材料としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー等）、糖（例えば、単糖および多等、炭水化物、糖部分、ヒアルロン酸等）、ならびにリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、細胞構成要素（例えば、細胞消化からの構成要素）、全生物学的細胞（例えば、細菌性、真核性）、ならびに細胞群（例えば、組織）をさらに含むことができる。例えば、加工材料は、複数のタンパク質分子を含むか、または加工材料内に配置された１つ以上の細胞を含んでもよい。このような加工材料は、細胞の存在下でのリソグラフィのために使用されてもよい。
【００２６】
加工材料は、光硬化性樹脂（例えば、アクリル酸ウレタン、メタクリル酸、グルタルイミド、エポキシ等）、エラストマー（例えば、ＰＤＭＳ）、無機有機ハイブリッドポリマー（ＯＲＯＭＯＣＥＲ）、ポジ型フォトレジスト、ならびにネガ型フォトレジスト（例えば、ＳＵ−８）をさらに含んでもよい。加工材料は、金属性、電気活性、および触媒構成要素（例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、およびこれらのナノ粒子）をさらに含有することができる。
【００２７】
一部の実施形態において、該システムは、加工中、共役マスクの移動を可能にする、マスク平行移動デバイスを含んでもよい。マスク平行移動デバイスは、静的透過性マスク（例えば、図５の透明性フォトマスク）、または反射性マスク（例えば、マイクロミラーデバイス）と併せて使用されてもよい。このようなシステムにおいて、２Ｄおよび３Ｄマスクオブジェクトは、加工中に平行移動および／または回転され、それによって、加工材料へのエネルギー曝露の領域を変化させてもよい。さらに、加工平面は、例えば、単一のマスクまたはオブジェクトを使用して複数の形状の加工を可能にするように、ならびに３次元オブジェクトの加工における材料の規定の勾配を可能にするように、マスクオブジェクト平行移動と併せて、加工材料平行移動デバイスを使用して、平行移動（ｘ、ｙ、ｚ座標に沿って）することができる。
【００２８】
一部の実施形態において、本開示は、３次元まで、および３次元を含む、マイクロデバイスを加工するための方法を提供し、エネルギー源と、加工平面への空間位置の近似の一対一写像を有する平面に定置された少なくとも１つのマスクと、拡大デバイスと、加工材料とを提供するステップであって、マスクは、エネルギー源と拡大デバイスとの間に配置され、加工材料は、拡大デバイスに動作可能に配置される、ステップと、エネルギー源から放出されるエネルギーに、加工材料を曝露するステップと、を含む。
【００２９】
マスクを正確な配置を伴って迅速に切り替えるＤＭＤの能力は、加工された構造の空間分解能を増加させるための手順へと導き得る。ＤＭＤは、個別にマスクが、所与の平面で加工された微細構造に対応しなかったが、マスクシーケンスが設計された構造をもたらす場合、一連のマスクを表示するために使用され得る。例えば、システムの分解能の限界近くで構造を生成するように設計されるマスク特徴は、最小特徴サイズを画定する化学的および光学的制限により、部分的忠実度でもって複製される構造をもたらす可能性がある。しかしながら、単一のマスクの代わりに、設計されたオブジェクトの異なる部分を強調した一連のマスクを使用することによって、設計された微細構造は、正確に複製され得る。
【００３０】
上に言及するとおり、加工材料は、加工材料内に配置された１つ以上の細胞を含んでもよい。したがって、特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の細胞を培養するための方法を提供し、エネルギー源と、共役マスクと、拡大デバイスと、加工材料および１つ以上の細胞とを提供するステップであって、共役マスクは、エネルギー源と拡大デバイスとの間に配置され、加工材料は、拡大デバイスに動作可能に配置される、ステップと、エネルギー源から放出されるエネルギーに、加工材料を曝露するステップと、１つ以上の細胞をマイクロデバイス内で培養するステップと、を含む。一部の実施形態において、１つ以上の細胞を培養するための方法は、マイクロデバイスが形成された後に、１つ以上の細胞が、マイクロデバイスに入るように、実施される。他の実施形態において、１つ以上の細胞を培養するための方法は、マイクロデバイスの形成時に１つ以上の細胞を封入するように、マイクロデバイスが形成されるように、実施される。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明の方法は、電子ベースのデバイス等、共役マスク上に表示することができる、一連の平面画像に符号化された、３次元データを利用してもよい。入力データは、共焦点顕微鏡検査、Ｘ線コンピュータトモグラフィ、または磁気共鳴映像法等の３次元画像化技術を使用して、細胞もしくは組織等の生物学的標本の画像から生成されてもよい。加工ボクセルの位置は、画像化された生物学的標本のトポグラフィが、加工された材料に複製されるように、画像／マスクのシーケンスと適切に対応するようにシフトされてもよい。
【００３２】
一部の実施形態において、例えば、電子ベースのデバイスに提示されるような、共役マスクのシーケンスは、編組ロープ群等の設計形態の３次元トポグラフィを表すアルゴリズムを使用して生成される。加工ボクセルの位置は、計算された形態のトポグラフィが、加工された材料に形成されるように、画像／マスクのシーケンスと適切に対応するようにシフトされてもよい。
【００３３】
また、本開示は、特定の実施形態によると、説明される方法および／またはシステムを使用して形成される組成物も提供する。このようなデバイスとしては、電磁放射の透過、放出、変調、および検出が可能であるもの、ならびに光の幾何学的特性を操作するもの（例えば、ミラー、レンズ、フォトマスク）等の、光学デバイスおよびデバイス構成要素（例えば、偏光子、プリズム、フィルタ、光子および調波生成結晶、回折光学要素、位相マスク、光増幅および光子検出デバイス）；能動的要素（電源、インダクタ、アクチュエータ）およびデバイス構成要素アーキテクチャ（例えば、３次元微小電気機械デバイス）の両方を含む機械的デバイスおよびデバイス構成要素；流体輸送要素（ポンプ、弁、ミキサ）ならびに流体およびデバイスアーキテクチャ（例えば、Ｔ字接合部、弁もしくはポンプを形成する等のための流体封入式および中空チャネルの接合部等の、流体チャネルの接合部、３Ｄマイクロ流体デバイス）を含む、流体デバイス；導電性、半導電性、および抵抗性要素（例えば、金属性ワイヤおよび高誘電性／抵抗性材料；キャパシタ、ダイオード、トランジスタ、レジスタ等）を含む電気デバイス；細胞、組織、および細胞／組織類似体の開発および操作のための化学的および生物学的デバイス（例えば、細胞インキュベータおよび足場、細胞および組織レプリカ等）、化学的要素（即ち、特定の元素同一性、アイソトープ、レドックス状態等）、分子、ポリマー（例えば、多糖、ポリペプチド）、生物学的細胞（例えば、細菌性、真核細胞）、組織もしくは細胞収集物、または基質を含むが、これらに限定されない、追加の（二次的）結合要素との相互作用に実質的な影響を促進する、抵抗する、および／または及ぼさない、化学的およびトポグラフィックなキューを有する、デバイスおよび基材が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、二次的要素との相互作用は、二次的要素の検出／測定を可能にし得（例えば、化学的もしくは生物学的センサ）、追加の要素の結合をさらに可能にし得る（即ち、ヌクレオチド／ペプチド／タンパク質アレイ等の、第三級、第四級等）、２つの要素間の相乗的機能性を提供してもよい（例えば、化学、機械、電気、または電磁挙動の変調）。上記の実施形態は、さらに、上記の要素の１つ以上からなるアレイ（例えば、光学、機械、流体、電気、化学／生物学的足場、もしくはセンサ、ラボオンチップ、またはこれらの組み合わせのアレイ）に実装されてもよい。
【００３４】
したがって、本発明は、言及される目的および利点、ならびに本発明固有のものを達成するために良好に適合される。多数の変更が当業者によって行われ得るが、このような変更は、一部、添付の特許請求の範囲によって、説明される本発明の精神内に網羅される。
【実施例】
【００３５】
（材料）
メチレンブルー（Ｍ−４１５９）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、Ｆ−６６２５）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって供給された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＢＡＨ６４−０１００）は、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ（Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって供給された。アビジン（Ａ−８８７）およびフルオレセインビオチン（Ｂ−１３７０）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって供給された。すべての化学物質および溶媒は、供給元の仕様に従って保管し、さらなる精製を行うことなく使用した。レーザプリンタ用のオフィスグレードの透明度フィルムを使用して、ＨＰ  Ｌａｓｅｒ  Ｊｅｔ  ２１００ＴＮでフォトマスクを生成した。
【００３６】
（株）
Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ）によって善意により提供された、大腸菌株ＲＰ４３７（野生型、ｗｔ）およびＲＰ９５３５（活発に泳動、△ｃｈｅＡ）は、トリプトンブロス（３２℃）内で好気的に成長させ、中間対数期で採取した。細胞を、加工されたマイクロチャンバによる実験のために、ＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．０）に２０〜１００倍に希釈した。
【００３７】
（マトリクス加工）
光架橋タンパク質からなるマトリクスは、７３０から７４０ｎｍで動作する、モードロックチタン：サファイアレーザ（Ｔｓｕｎａｍｉ；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の出力を使用して、未処理の＃１顕微鏡カバーガラス上へ加工された。レーザビームは、共焦点スキャナ（ＢｉｏＲａｄ  ＭＲＣ６００）を使用して四角形パターンにラスタ走査され、スキャンボックスと顕微鏡との間に焦点を当てた。スキャンボックスと顕微鏡との間の任意の位置（１８ｃｍ）に定置される際、マスクが使用され得るが（より少ないエッジ分解能で）、マスク平面が、顕微鏡標本平面と共役することから、マスクをこの焦点平面（本文中、「マスク平面」と称する）に定置することによって、加工されたオブジェクトにおいて最大の忠実度を可能にした。例えば、図１ＢのＴｅｘａｓ形状ミクロ勾配は、２つのマスクを同時に使用して加工した。勾配エッジを画定するために使用されるネガ型フォトマスクを、マスク平面に定置し、一方、第２のストレートエッジの完全不透明マスクを、加工中、マスク平面から約７．５ｃｍに平行移動させた。マスクを、試験光加工手順中、マスクのＸＹ位置を手動で調節することによって整合させた。移動するマスクは、３Ｈｚの四角形の走査周波数（ラスタ走査された四角形を完了するための時間の逆数）を使用して、１００から２００μｍ秒−１の直線速度でほぼ平行に移動させた。
【００３８】
レーザ出力は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡システム上に位置する、油浸対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ  １００ｘ  Ｆｌｕａｒ、１．３開口数）の後開口をほぼ充填するように調節された。所望の電力（顕微鏡対物レンズの後開口前３０〜４０ｍＷ）は、二分の一波長板／偏光ビームスプリッタ対を使用して、レーザビームを減衰させることによって得た。構造をｚ次元に沿って（即ち、光学軸に沿って）拡張するために、レーザ焦点の位置を、顕微鏡微動ハンドルを使用して、加工溶液内において手動で平行移動させた。所望の構造高さが達成されてからマスクを除去することによって、マイクロチャンバは、閉鎖した四角形ルーフで上部から容易に封止し得る。２〜１０μｍの高さを有する典型的なマイクロチャンバは、ミクロン毎の垂直移動につき、サンプルにわたってラスタされる２回の完全走査を可能にすることによって生成した。この手順は、完全に形成された３Ｄオブジェクトが、１０〜３０秒の時間スケールで加工されることを可能にする。
【００３９】
光架橋ＢＳＡからなる微細構造は、３２０〜４００ｍｇ  ｍＬ−１のタンパク質、および光感受性物質として２〜３ｍＭのメチレンブルーを含有する溶液から加工した。生体適合性加工（例えば、図２）に関しては、フラビンアデニンジヌクレオチド（５ｍＭ）を光感受性物質として使用した。これらの研究において、微細構造に対して達成され得る、実用（方位）分解能、約０．５μｍは、タンパク質光架橋、マスク品質の結果、構造が加工された速度、およびＳＥＭ画像の場合における、画像化のための調製プロセスに関するいくつかの先の例において、我々が達成したものよりも低かった。高開口数多光子励起に関して典型的であるとおり、ボクセルは、垂直次元に多少伸長される。微細構造加工が必要である場合、先に光架橋されたタンパク質分解能の実質的な厚さを介した垂直の焦点化はさらに減退された。図４および関連図に示される微細構造のタンパク質の厚さの不均一性は、マスクが使用されない一部の例においても関されているため、走査プロセスにおける人為的結果である可能性が高い。
【００４０】
（デジタルマイクロミラーデバイスによるマトリクス加工）
７３０〜７４０ｎｍに調節されたモードロックチタンサファイアレーザ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｔｓｕｎａｍｉ）からの出力は、検流計駆動ミラーがラスタパターンでビームを走査する、共焦点スキャンボックス（Ｂｉｏｒａｄ，ＭＲＣ６００）に整合された。デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を、高開口数対物レンズの前焦点平面に共役する中間画像平面に定置した。これらの実験で使用されたＤＭＤ（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，０．５５ＳＶＧＡ）は、部分的に分解された業務用プロジェクタ（Ｂｅｎｑ，ＭＰ５１０）の構成要素であった。ＤＭＤの反射性表面は、１６μｍ×１６μｍアルミニウムミラーの８４８×６００アレイであった。それぞれの個々のミラーは、±１０°傾斜角に対応する、「オン」および「オフ」状態の間で切り替わり得る。個々のミラーは、コンピュータのグラフィック出力を表示する（オンおよびオフ状態の間で変調することによって）ようにプログラムされた、無傷のプロジェクタ電子機器によって制御した。１５．２ｃｍ焦点距離レンズで、レーザをＤＭＤに焦点化し、これは、約３０μｍのチップ面上の推定ビーム直径をもたらした。ビームスポットは、ＤＭＤミラーの約１／４を走査した。白色表示を複製する際のＤＭＤ反射性は、約４０％であった。光学経路に反射された光は、１５．２ｃｍ焦点距離チューブレンズによってコリメートし、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）に伝送した。Ｚｅｉｓｓ  Ｆｌｕａｒ、１００ｘ／１．３ＮＡ、油浸対物レンズを使用した。
【００４１】
（構造に関するデジタル情報）
ＤＭＤを有する微細加工のためのシステムは、最小限の処理を必要とする入力データからの特定のプログラミングを必要としないプロセスにおいて、複雑な３Ｄ微細構造を素早く構築するために使用され得る。それぞれの加工された平面の情報は、Ｘ線コンピュータトモグラフィデータから導出された画像、コンピュータ支援設計ソフトウェアで形成された３次元モデルによって定義され、その後、個々の平面に切断された画像、３次元微細構造に対して薄片データを定義するように、段階的に連続的に変化することができる、グラフィックスソフトウェアで表示される、数学的に定義された幾何学的画像、または多光子もしくは共焦点顕微鏡検査によって取得された光学的薄片データからの画像が挙げられるが、これらに限定されない、源からもたらされ得るデジタル画像に含有され得る。
【００４２】
（ＢＳＡマイクロチャンバ内での細胞インキュベーション）
マイクロチャンバ（図２Ｄパネル２；チャンバ寸法、１０×１０×４μｍ）で単一の細菌を捕捉するためのタンパク栓を加工した後、細胞を、１ｍＬ皿内のトリプトンブロス中で周辺温度（２２℃）にてインキュベートした。培地を約６時間間隔で入れ替え、マイクロチャンバを３日間監視した。
【００４３】
（蛍光顕微鏡検査）
広視野蛍光画像化は、水銀ランプならびに標準「赤」および「緑」フィルタセット（Ｃｈｒｏｍａ，Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ，ＶＴ）を具備する、Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡上で実施した。蛍光放出は、Ｆｌｕａｒ  １００ｘ対物レンズを使用して回収し、１２ビット１３９２×１０４０画素ＣＣＤ（Ｃｏｏｌ  Ｓｎａｐ  ＨＱ；Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して検出した。データは、Ｉｍａｇｅ  ＪおよびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）画像解析ソフトウェアを使用して処理した。
【００４４】
（走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）調製）
サンプルを２０分間、３．５％グルタルアルデヒド溶液に固定し、１０分間の連続洗浄（２：１  エタノール／Ｈ２Ｏ；１００％エタノールで２回；１：１  エタノール／メタノール；１００％メタノール；すべての溶液はｖ／ｖとして記載）を使用して脱水し、３時間空気乾燥させ、Ａｕ／Ｐｄで１２〜１５ｎｍの公称厚さまでスパッタ被覆した。
【００４５】
したがって、本発明は、言及される目的および利点、ならびに本発明固有のものを達成するために良好に適合される。多数の変更が当業者によって行われ得るが、このような変更は、一部、添付の特許請求の範囲によって、説明される本発明の精神内に網羅される。
【図３Ａ】
2011511432.tif 000003
【図３Ｂ】
2011511432.tif 000004
【図３Ｃ】
2011511432.tif 000005
【図３Ｄ】
2011511432.tif 000006
【図８】
2011511432.tif 000007
【図９ａ】
2011511432.tif 000008
【図９ｂ】
2011511432.tif 000009
【図１０ａ】
2011511432.tif 000010
【図１０ｂ】
2011511432.tif 000011
【図１０ｃ】
2011511432.tif 000012
【図１０ｄ】
2011511432.tif 000013
【図１０ｅ】
2011511432.tif 000014
【図１０ｆ】
2011511432.tif 000015
【図１１ａ】
2011511432.tif 000016
【図１１ｂ】
2011511432.tif 000017
【図１２ａ】
2011511432.tif 000018
【図１２ｂ】
2011511432.tif 000019
【図１】
2011511432.tif 000020
【図２】
2011511432.tif 000021
【図４】
2011511432.tif 000022
【図５】
2011511432.tif 000023
【図６】
2011511432.tif 000024
【図７】
2011511432.tif 000025
【図１３】
2011511432.tif 000026
【図１４】
2011511432.tif 000027
【国際調査報告】
2011511432.tif 000028
2011511432.tif 000029