(57)【要約】  本発明は、診断手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、糖尿病を患っている被験体の、腎不全の発症リスク又は死亡リスクを予測する方法に関する。さらに、本発明は、糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを診断する方法に関する。最後に、本発明は、前記方法を実施するための診断デバイス及びキットを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎不全を発症するリスクを予測するステップ
を含む方法。
【請求項２】
参照量がULNである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の量の増加が腎不全の発症リスクの上昇を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎臓療法に感受性の被験体を判定するステップ
を含む方法。
【請求項５】
腎臓療法が、血圧低下剤、アスピリン、スタチン、ACE阻害剤又はアンギオテンシンII受容体遮断薬の投与を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
参照量がULNである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の量の増加は、被験体が腎臓療法に感受性であることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、死亡リスクを予測するステップ
を含む方法。
【請求項９】
参照量がULNである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の量の増加が死亡リスクの上昇を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
PLGFのULNが13pg/mlである、請求項２、３、６、７、９又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
sFLT1のULNが95pg/mlである、請求項２、３、６、７、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１４】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記デバイス。
【請求項１５】
糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記キット。
【請求項１７】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記キット。
【請求項１８】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、糖尿病を患っている被験体の、腎不全の発症リスク又は死亡リスクを予測する方法に関する。さらに、本発明は、糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを診断する方法に関する。最後に、本発明は、前記方法を実施するための診断デバイス及びキットを含む。
【背景技術】
【０００２】
腎不全は、I型糖尿病を患っている患者における主要な臨床的合併症である。具体的には、糖尿病を患っている又は少なくとも糖尿病を発症するリスクがある患者は、そうではない場合よりも腎不全を発症する有病率が高い（例えば、Villar 2007, Diabetes Care 30(12):3070-3076; Gilbert 2008, N Engl J Med 358:1628-1630参照）。腎不全は、慢性又は急性腎不全として出現する。腎不全の急性形態は、透析又は移植などの腎機能代用手段によってしか対処することができない場合が最も多いが、慢性形態は他の治療的介入も許容するように進行する。慢性腎不全は、その末期には、透析又は腎移植などの腎機能代用手段を必要とする。これらの手段は、その高コストのヘルスケアシステム、そして患者にとって重篤、不都合かつ重荷となる副作用の点で、回避すべきであることが理解されよう。従って、腎不全の進行に伴う早期介入が非常に望ましい。好適な治療手段には、血圧低下剤の投与、生活習慣の変更、及び栄養的食事が含まれる。しかしながら、慢性腎不全を扱う際に残る問題は、所定の糖尿病患者についての早期の診断又は個々のリスク評価である。
【０００３】
EP 1 615 036 A1には、心血管系事象のリスクを評価するための血管新生マーカーが糖尿病患者において報告されている。具体的には、胎盤増殖因子（PlGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）及び可溶性Flt 1（sFlt1）が、概して血管新生マーカーとして言及されている。患者の一部は糖尿病性腎症も示した。しかしながら、腎不全のリスク層化のための手段は報告されていない。 
【発明の概要】
【０００４】
従って、本発明の技術的課題は、例えば腎不全の進行を阻止する適切な治療法を選択するために、糖尿病を患っている被験体の腎不全のリスクを予測するための手段及び方法の提供とみなすことができる。この技術的課題は、添付の特許請求の範囲及び以下で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００５】
従って、本発明は、糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎不全を発症するリスクを予測するステップ
を含む方法に関する。
【０００６】
本発明の方法は、好ましくは、in vitro法である。さらに、上記で明確に言及したステップに加えて追加のステップを含むことができる。例えば、さらなるステップは、サンプルの前処理又は前記方法によって得られた結果の評価に関連してもよい。前記方法は、手動で実行することができ、又は自動的に支援することができる。好ましくは、ステップ（a）及び／又は（b）は、全て又は一部を自動化によって、例えば、ステップ（a）では測定用の適当なロボット装置及びセンサ装置によって、又はステップ（b）ではコンピュータにより実行される比較によって、支援されてもよい。
【０００７】
本明細書で使用する用語「リスクを予測（する）」とは、特定の時間窓（すなわち予測窓）内で被験体が腎不全を発症する確率を評価することを指す。本発明においては、予測窓は、好ましくは少なくとも2年、少なくとも4年、少なくとも6年、少なくとも8年、少なくとも10年、又は少なくとも12年である。また、予測窓は、被験体の全寿命であることも好ましい。しかしながら、当業者であれば理解できるように、このような評価は、通常、診断対象の被験体の100％について正しいことを目的としていない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な一部について適切かつ正確に予測がなされることを要する。一部が統計的に有意かどうかについては、様々な周知の統計的評価ツール（例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定等）を用いて、当業者は難なく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005又は0.001である。本発明によって予想される確率は、リスクの増大、正常又は低減の予測が被験体の所定のコホート又は母集団の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％又は少なくとも90％について正しいことが好ましい。この用語は、好ましくは、糖尿病を患っている被験体集団における腎不全を発症する平均リスクと比較して、腎不全のリスクの上昇を予測することに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】I型糖尿病を患っている患者の、sFLT1及びPlGFの線形回帰分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用する用語「腎不全」とは、腎機能不全を指す。従って、腎不全の間は、腎機能は著しく低下し、これは糸球体ろ過率（GFR）又は尿中タンパク質量によって測定される。さらに、腎不全の症候は当技術分野で周知であり、医学の標準的な教科書に記載されている。好ましくは、GFRが3ヶ月以上にわたって少なくとも60 ml/分であること又は同じ時間にわたって尿中タンパク質が検出可能であることは、慢性腎不全の指標である。より好ましくは、本明細書において用いる「腎不全」は慢性腎不全である。重篤な慢性腎不全では、そのような不全を示す腎臓の透析又は移植が必要となることが理解されるだろう。従って、本発明の方法は、患者の透析又は腎移植の必要性を予測するために適用することも可能である。本明細書において使用する用語「糖尿病」とは、好ましくはI型糖尿病を指す。I型糖尿病に付随する症候及び臨床的指標は当技術分野で周知である。
【００１０】
本明細書で使用する用語「被験体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに関する。しかし、本発明は、前記被験体が本明細書中で特定される糖尿病を患っていることを想定している。糖尿病以外は、特に腎機能に関して、被験体は見かけ上健康であることがより好ましい。
【００１１】
用語「サンプル」は、体液サンプル、分離細胞サンプル、又は組織若しくは器官由来のサンプルをいう。体液サンプルは、周知技術によって得ることができ、好ましくは血液、血漿、血清、又は尿のサンプルを、より好ましくは血液、血漿又は血清のサンプルを含む。組織又は器官サンプルは、あらゆる組織又は器官から、例えば、バイオプシーによって得ることができる。分離細胞は、体液、又は組織若しくは器官から、遠心又はセルソーティングのような分離技術によって得ることができる。細胞、組織又は器官のサンプルは、本明細書に記載のペプチドを発現又は生産する細胞、組織又は器官から得ることが好ましい。
【００１２】
本明細書で使用する用語「PlGF（胎盤増殖因子）」とは、149アミノ酸長のポリペプチドからなり、ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）の血小板由来増殖因子様領域と高い相同性（53％同一性）を有する胎盤由来の増殖因子をいう。VEGFと同様、PlGFはインビトロ及びインビボで血管新生活性を有する。例えば、トランスフェクトしたCOS-1細胞由来のPlGFの生化学的及び機能的特徴により、PlGFは、インビトロで内皮細胞の増殖を刺激することができるグリコシル化二量体性分泌タンパク質であることが明らかとなった（Maqlione1993, Oncogene 8(4):925-31）。PlGFは、好ましくはヒトPlGFをいい、より好ましくはGenebankアクセッション番号P49763, GI: 17380553（Genebankは、米国NCBIのwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrezから利用可能である）で示されるアミノ酸配列を有するヒトPlGF又はその変異体をいう。さらに、本発明に従って記載される変異体とは、少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、その変異体のアミノ酸配列が、特定のPlGFのアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％又は99％同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、スプライス変異体又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書に記載の変異体は、特定のPlGF又は上述のタイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り、包含する。このような断片は、例えばPlGFの分解産物などである。さらに、変異体は、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００１３】
本明細書で使用する用語「可溶性(s)Flt-1」は、VEGF受容体FLT1の可溶性形態であるポリペプチドを言う。sFLT1は、ヒト臍帯静脈内皮細胞のならし培養培地中で同定された。内因性可溶性FLT1（sFLT1）受容体は、グロマトグラフィーにおいて及び免疫学的に組換えヒトsFLT1と類似し、同程度の高親和性で［125I］VEGFと結合する。ヒトsFLT1は、in vitroでKDR/Flk-1の細胞外ドメインと共にVEGF安定化複合体を形成することが示されている。sFLT1は、ヒトsFLT1又はその変異体であることが好ましい。ヒトsFLT1は、Genebankアクセッション番号P17948, GI: 125361で示されるFlt-1のアミノ酸配列から導びかれることがより好ましい。マウスsFLT1のアミノ酸配列は、Genebankアクセッション番号BAA24499.1, GI: 2809071で示される。さらに、本発明において記載される変異体は、少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、その変異体のアミノ酸配列が、特定のsFLT1のアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％又は99％同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、スプライス変異体又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書に記載の変異体は、特定のsFLT1又は上述のタイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り、包含する。このような断片は、例えばsFLT1の分解産物などである。さらに、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００１４】
本明細書で言及されるポリペプチドの量を測定するとは、量又は濃度を、好ましくは半定量的に又は定量的に測定することに関する。測定は、直接的に又は間接的に行うことができる。直接的測定は、ポリペプチドの量又は濃度を、ポリペプチド自身から得られるシグナル、及びサンプル中に存在するポリペプチドの分子数と直接的に相関する強度が得られるシグナル、に基づいて測定することに関する。このようなシグナル（本明細書では、しばしば強度シグナルと呼ぶ）は、例えば、そのポリペプチドの特異的な物理的又は化学的性質の強度値を測定することによって得ることができる。間接的測定は、二次的な成分（すなわち、成分それ自体はポリペプチドではない）又は生物学的読出系（例えば、測定可能な細胞応答、リガンド、標識若しくは酵素反応産物）から得られるシグナルの測定を含む。
【００１５】
本発明においては、ポリペプチドの量の測定は、サンプル中のポリペプチドの量を測定するための公知のあらゆる手段によって達成することができる。前記手段は、多様なサンドイッチ、競合又は他のアッセイ形式で標識分子を利用できる免疫アッセイデバイス及び方法を含む。前記アッセイは、ポリペプチドの存在の有無を示すシグナルを発し得る。さらに、シグナルの強さは、好ましくは、直接的に又は間接的に（例えば、反比例で）サンプル中に存在するポリペプチドの量と相関することができる。さらなる好適な方法は、正確な分子量又はNMRスペクトルといったポリペプチドに特異的な物理的又は化学的性質を測定することを含む。前記方法は、好ましくは、バイオセンサ、免疫アッセイと連動した光学装置、バイオチップ、質量分析装置、NMR分析機又はクロマトグラフィー装置のような分析装置を含む。さらに、方法は、マイクロプレートELISAベースの方法、完全自動化若しくはロボット免疫アッセイ（例えば、ElecsysTM アナライザで利用できる）、CBA（酵素的コバルト結合アッセイ：Cobalt Binding Assay；例えばRoche-HitachiTMアナライザで利用できる）、及びラテックス凝集アッセイ（例えばRoche-HitachiTMアナライザで利用できる）を含む。
【００１６】
ポリペプチドの量の測定は、（a）細胞応答（その強度がポリペプチドの量を示す）を誘発することのできる細胞を前記ポリペプチドと適当な時間で接触させるステップ、及び（b）前記細胞応答を測定するステップ、を含むことが好ましい。細胞応答を測定するために、サンプル又は処理済みのサンプルは、好ましくは細胞培養液に添加され、細胞内応答及び細胞外応答が測定される。細胞応答は、レポーター遺伝子の測定可能な発現、又は物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド若しくは低分子）の分泌を含んでいてもよい。発現又は物質は、ポリペプチドの量と相関する強度シグナルを生じるものとする。
【００１７】
また、ポリペプチドの量の測定は、サンプル中のポリペプチドから得られる特異的な強度のシグナルを測定するステップを含むことが好ましい。上記のように、このようなシグナルは、そのポリペプチドに特異的なNMRスペクトル又は質量スペクトルで観察されるそのポリペプチドに特異的な質量電荷(m/z)変数、で観察されるシグナル強度であってよい。
【００１８】
ポリペプチドの量の測定は、好ましくは、（a）ポリペプチドと特異的リガンドとを接触させるステップ、（b）（任意で）非結合リガンドを除去するステップ、（c）結合リガンドの量を測定するステップを含むことができる。結合したリガンドは、強度シグナルを生成する。本発明において、結合は、共有及び非共有結合の両方を包含する。本発明において、リガンドは、本明細書に記載のポリペプチドに結合するあらゆる化合物、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は低分子である。好ましいリガンドは、抗体、核酸、ペプチド又はポリペプチド（例えば、ポリペプチドに対する受容体又は結合パートナー、及びペプチドに対する結合ドメインを含むそれらの断片）、及びアプタマー（例えば、核酸若しくはペプチドアプタマー）を含む。そのようなリガンドを調製する方法は、当該分野で周知である。例えば、好適な抗体又はアプタマーの同定及び調製は、販売業者からも提供されている。当業者であれば、高い親和性又は特異性を持った前記リガンドの誘導体を開発する方法には精通している。例えば、ランダム突然変異を核酸、ペプチド又はポリペプチド中に導入することができる。これらの誘導体は、その後、当該分野で公知のスクリーニング方法、例えばファージディスプレイにより、結合について検証することができる。本明細書において記載する抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方、並びにそれらのフラグメント（例えば、抗原又はハプテンに結合することができるFv、Fab及びF(ab)2フラグメント等）を包含する。本発明は、一本鎖抗体、及び所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と組み合わされているヒト化ハイブリッド抗体も包含する。ドナー配列は、通常、少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、さらにドナー抗体の他の構造的及び／又は機能的に関係のあるアミノ酸残基を含むことができる。このようなハイブリッドは、当該分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。リガンド又は作用剤は、ポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。本発明に記載の特異的結合とは、リガンド又は作用剤が解析対象のサンプル中に存在する他のペプチド、ポリペプチド又は物質と実質的に結合（「交差反応」）しないことを意味する。好ましくは、特異的に結合したポリペプチドは、他の関連する任意のペプチド又はポリペプチドよりも、少なくとも3倍高い、より好ましくは少なくとも10倍高い、さらに好ましくは少なくとも50倍高い親和性で結合すべきである。非特異的結合は、例えば、ウェスタンブロットでのサイズによって、又はサンプル中に比較的多量に存在することで、区別でき、かつ明白に測定可能であるのであれば、許容することができる。リガンドの結合は、当該分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。前記方法は、半定量的又は定量的であることが好ましい。好適な方法を以下で説明する。
【００１９】
第一に、リガンドの結合は、例えば、NMR又は表面プラズモン共鳴によって、直接的に測定することができる。
【００２０】
第二に、リガンドが目的のポリペプチドの酵素活性の基質としても機能する場合には、酵素反応産物を測定することができる（例えば、プロテアーゼの量は、切断された基質の量を、例えばウェスタンブロット等で測定することによって測定することができる）。あるいは、リガンドは、それ自身が酵素的性質を示してもよく、「リガンド／ポリペプチド」複合体又はポリペプチドとそれぞれ結合したリガンドを、強度シグナルの生成による検出を可能にする好適な基質と接触させてもよい。酵素反応産物の測定のために、基質の量を飽和しておくことが好ましい。基質は、反応前に検出可能な標識で標識することもできる。サンプルは、基質と適当な時間にわたり接触させることが好ましい。適当な時間とは、検出可能な、好ましくは測定可能な量の産物が生産されるのに必要な時間をいう。産物の量を測定する代わりに、所与の（例えば、検出可能な）産物の量が出現するのに必要な時間を測定することができる。
【００２１】
第三に、リガンドは、共有結合又は非共有結合により、リガンドの検出及び測定を可能にする標識と結合させることができる。標識は、直接的又は間接的方法によって行うことができる。直接的な標識は、標識を直接（共有結合又は非共有結合により）リガンドに結合することを含む。間接的な標識は、二次リガンドと一次リガンドとの結合(共有結合又は非共有結合)を含む。二次リガンドは、一次リガンドと特異的に結合する必要がある。その二次リガンドは、好適な標識と結合していてもよく、及び／又は二次リガンドと結合する三次リガンドの標的（受容体）であってもよい。二次リガンド、三次リガンド又はさらに高次のリガンドの使用は、しばしばシグナルを増加するのに用いられる。好適な二次及びより高次のリガンドは、抗体、二次抗体、及び周知のストレプトアビジン−ビオチン系（Vector Laboratories, Inc.）を包含することができる。また、リガンド又は基質は、当該分野で公知の一以上のタグで「タグ標識」されてもよい。前記タグは、その後、より高次のリガンドの標的となることができる。好適なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Hisタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG、GFP、myc-tag、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）、マルトース結合性タンパク質等が含まれる。ペプチド又はポリペプチドの場合には、前記タグは、N末端及び／又はC末端にあることが好ましい。好適な標識は、適当な検出方法によって検出可能なあらゆる標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性標識、放射性標識、磁気標識（例えば、常磁性及び超磁性標識を含む「磁気ビーズ」）及び蛍光標識が含まれる。酵素活性標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びそれらの誘導体が含まれる。検出に好適な基質には、ジアミノベンジジン（DAB）、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸：Roche Diagnostics社から既製品ストック溶液として入手可能）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences社）、ECFTM（Amersham Biosciences社）が含まれる。好適な酵素と基質の組み合わせは、当該分野で公知の方法によって（例えば、感光フィルム又は適当なカメラシステムを用いて）測定することのできる呈色反応産物、蛍光又は化学発光をもたらし得る。酵素反応を測定することに関しては、上述した基準が同様に適用される。典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（例えば、GFPやその誘導体等）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン及びAlexa色素（例えば、Alexa 568）が含まれる。さらなる蛍光標識は、例えば、Molecular Probe社（オレゴン州）から入手可能である。また、蛍光標識として量子ドットの使用も考えられる。代表的な放射性標識には、35S、125I、32P、33P等が含まれる。放射性標識は、公知及び適当な任意の方法、例えば、感光フィルム又はフォスフォイメージャで検出することができる。本発明において好適な測定方法は、沈降（特に、免疫沈降）、電気化学発光（電気的に生じる化学発光）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫テスト��電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ECLIA）、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、比濁法、ネフェロメトリー、ラテックス増強比濁法若しくはネフェロメトリー、又は固相免疫テストが含まれる。当該分野で公知のさらなる方法（例えば、ゲル電気泳動法、2次元ゲル電気泳動法、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、及び質量分析法）を単独で又は上述した標識化若しくは他の検出方法と組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
また、好ましくは、ポリペプチドの量は、以下のように測定することができる。すなわち、（a）上記特定のポリペプチドに対するリガンドを含む固体支持体と該ポリペプチドを含むサンプルとを接触させ、（b）前記支持体に結合したポリペプチドの量を測定する。リガンド（好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びアプタマーからなる群から選択される）は、固定された形態で固体支持体上に存在することが好ましい。固体支持体を製造するための材料は、当該分野では周知であり、とりわけ、市販のカラム材、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンチップ及び表面、ニトロセルロースストリップ、メンブレン、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレイのウェル及び壁、プラスチックチューブ等が挙げられる。リガンドまたは作用剤は多くの異なる担体に結合することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的用に可溶性又は不溶性のいずれであってもよい。前記リガンドを固定化／不動化するための適当な方法は周知であり、限定されるものではないが、イオン、疎水性、共有結合相互作用等が含まれる。本発明において、アレイとして「サスペンションアレイ」を利用することも意図している（Nolan, 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12)。前記サスペンションアレイにおいて、サスペンション中に担体、例えばマイクロビーズ又はマイクロスフェアが存在する。アレイは、場合によっては標識され、異なるリガンドを担持する、種々のマイクロビーズ又はマイクロスフェアからなる。このようなアレイを、例えば、固相化学及び光分解性保護基をベースとして作製する方法は、一般的に公知である（米国特許第5,744,305号）。
【００２３】
本明細書で使用する用語「量」は、ポリペプチドの絶対量、該ポリペプチドの相対量又は濃度、及びそれらに相関する又はそれらから導き得る任意の値又はパラメータを包含する。前記値又はパラメータは、ポリペプチドから直接的測定（例えば、質量スペクトル又はNMRスペクトルにおける強度値）によって得られるあらゆる特有の物理的又は化学的性質からの強度シグナル値を含む。さらに、本明細書中に明記された間接的測定（例えば、ペプチドに応答して生物学的読出系から測定される応答レベル、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナル）によって得られる全ての値又はパラメータを包含する。前述の量又はパラメータに相関する値は、全ての数学的標準手法によって得ることも可能であると理解される。
【００２４】
本明細書で使用する用語「比較する」とは、解析対象のサンプルに含まれるポリペプチドの量を本明細書中で特定した適切な参照源の量と比較することを包含する。本明細書で使用する比較するとは、対応するパラメータ又は値の比較を言うものと理解される。例えば、絶対量が絶対参照量と比較され、濃度は参照濃度と比較され、又はテストサンプルから得られた強度シグナルは、参照サンプルの同タイプの強度シグナルと比較される。本発明の方法のステップ（b）でいう比較は、手動で又はコンピュータを使って実行することができる。コンピュータを使った比較については、測定量の値は、コンピュータプログラムによってデータベース中に保存された適当な参照に対応する値と比較することができる。コンピュータプログラムは、さらに比較結果を評価することができる。すなわち、適切なアウトプットフォーマットで所望の評価を自動的に提供することができる。ステップ（a）で測定された量と参照量との比較に基づいて、腎不全を発症するリスクを予測することが可能である。したがって、前記参照量は、比較される量の差異又は類似性のいずれかにより、腎不全を発症するリスクが増大している、低減している又は正常である被験体の同定が可能であるように選択される。
【００２５】
それ故、本明細書で使用する用語「参照量」は、腎不全を発症する個体のリスクを、リスク増大、低減又は正常群のいずれかに割り当てることを可能にするポリペプチドの量をいう。したがって、参照は、（i）腎不全を発症するリスクが低い若しくは正常であることがわかっている被験体、又は（ii）腎不全を発症するリスクが高いことがわかっている被験体のいずれかから導くことができる。さらに、参照量は、閾値を規定することが好ましい。好適な参照量又は閾値量は、本発明の方法によって共に分析すべき参照サンプルから、試験サンプルと共に、すなわち同時に又は連続的に、決定することができる。閾値となる好ましい参照量は、正常上限（ULN）、すなわち被験体の集団（例えば、臨床試験に登録された患者）中に見出されるべき生理学的量の上限、から導き出すことができる。所与の被験体集団のULNは、様々な周知の技術によって測定することができる。好適な技術は、本発明の方法で測定されるべきペプチド量又はポリペプチド量について集団の中央値を測定することであってもよい。本発明において記載するPlGFのULNは、好ましくは、10〜20pg/mlの範囲で変化する。前記ULNは、より好ましくは12〜15pg/mlであり、最も好ましくは13pg/mlである。本発明において記載するsFLT1のULNは、好ましくは80〜150pg/mlの範囲で変化する。sFLT1のULNは、より好ましくは90〜120pg/mlであり、最も好ましくは95pg/mlである。
【００２６】
原則として、ULNに関して、PlGF及びsFLT1量の増加は、糖尿病を患い、かつ腎不全を発症するリスクが高い被験体を示す。故に、本明細書の方法の好ましい実施形態において、ULNに関して、PLGF及びsFLT1量の増加は、腎不全を発症するリスクの上昇を示す。
【００２７】
好都合なことに、本発明の基礎となる研究において、バイオマーカーとしてのPlGF及びsFLT1の組み合わせが、糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを信頼性をもってかつ効率的に予測するのに必要なことが明らかとなった。さらに、前記バイオマーカーの各々は、統計的に互いに独立していることが判明した。したがって、本発明の方法は、信頼性の高いリスク層化を提供する。個体のリスクに基づいて、好適な治療手段（透析又は移植など）を開始して、慢性心不全への進行の重篤な結果を回避することができる。さらに、本発明の方法は、テストストリップのような携帯式アッセイであっても実行することができる。したがって、本方法は、糖尿病患者の大きな集団内で、外来患者でさえも、その予測に特に適している。本発明の知見のおかけで、慢性腎不全の重篤な結果を回避することができる。さらに、透析又は腎移植の必要性を予測することも可能である。
【００２８】
また、本発明は、糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎臓療法に感受性の被験体を判定するステップ
を含む方法に関する。
【００２９】
本明細書において使用する用語「腎臓療法」は、好ましくは、腎不全の進行を抑制する治療手段に関する。より好ましくは、腎臓療法は、血圧低下剤、最も好ましくはアスピリン、スタチン、ACE阻害剤及びアンギオテンシンII受容体遮断薬の投与を含む（Eddy 2005, Advances in Chronic Kidney Diseases 12(4):353-365参照）。あるいは又はそれに加えて、この用語は、被験体に与えられる生活習慣のアドバイス及び／又は好ましくは血糖値コントロールと組み合わせた栄養的食事に関する。
【００３０】
本明細書において使用する用語「感受性」とは、被験体に行われる腎臓療法が、腎不全又はそれに付随する症候の進行を抑制する又は少なくとも緩和するだろうことを意味する。腎臓療法についての感受性の評価は、調べる被験体の全て（100％）について正確ではないことが理解されるだろう。しかしながら、少なくとも統計的に有意な一部について腎臓療法の適用が成功しうることについて決定できることを想定している。一部が統計的に有意かどうかについては、本明細書に記載の技法により決定することができる。
【００３１】
上述の方法の好ましい実施形態において、参照量はULNである。より好ましくは、ULNに関して、PLGF及びsFLT1量の増加は、腎臓療法に感受性の被験体を示す。
【００３２】
本発明はまた、糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体のサンプルにおけるPLGF及びsFLT1の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、死亡リスクを予測するステップ
を含む方法を包含する。
【００３３】
本明細書において使用する用語「死亡」は、全ての原因の死亡を包含する。好ましくは、この用語は、心血管系事象を原因とする死亡に関する。
【００３４】
上述の方法の好ましい実施形態において、参照量はULNである。より好ましくは、ULNに関して、PLGF及びsFLT1量の増加は、死亡リスクの上昇を示す。
【００３５】
本発明はまた、糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記デバイスに関する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「デバイス」とは、予測を可能にするために、動作可能なように互いに連結された前述の手段を少なくとも含む、手段のシステムをいう。上記ポリペプチドの一つの量を測定するための好ましい手段及び前記比較を実行するための手段は、本発明の方法に関連して上述している。動作様式でどのように手段を連結するかは、デバイス内に含まれる手段の種類によって異なるであろう。例えば、ペプチドの量を自動的に測定する手段が適用されている場合、前記自動化動作手段によって得られるデータは、所望の結果を得るために、例えばコンピュータプログラムによって処理することができる。このような場合には、手段は、単一デバイスに含まれることが好ましい。したがって、前記デバイスは、アプライされたサンプル中のポリペプチドの量を測定するための分析ユニット、及び得られたデータを評価のために処理するコンピュータユニットを含むことができる。コンピュータユニットは、本明細書中に記載する記憶参照量又は記憶参照値を包含するデータベース、及びポリペプチドの測定量とデータベースの記憶参照量との比較を実行するためのコンピュータ実行アルゴリズムを含むことが好ましい。本明細書で使用するコンピュータ実行とは、コンピュータユニット中に具体的に包含されるコンピュータ可読プログラムコードをいう。あるいは、テストストリップのような手段をペプチド又はポリペプチドの量を測定するのに使用する場合、比較用手段は、対照ストリップ、又は参照量に測定量を割り当てる対照表を含んでもよい。テストストリップは、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドと特異的に結合するリガンドと結合されていることが好ましい。ストリップ又はデバイスは、好ましくは、前記ペプチド又はポリペプチドと前記リガンドとの結合を検出するための手段を含む。検出のための好ましい手段は、本発明の方法に関する実施形態に関連して開示されている。この場合、該手段は、システムのユーザが量の測定結果及びその診断値又は予後値をマニュアル中に記載の指示及び説明によってまとめるという点において、動作可能なように連結されている。前記手段は、このような実施形態において分離したデバイスとみなすことができ、かつ好ましくはキットとして一緒にパッケージングされる。当業者は、さらなる苦労をすることなくその手段を連結する方法を理解することができる。好ましいデバイスは、専門の臨床医の特別な知識がなくても適用することができるものであり、例えば、単にサンプルを付加すればよいテストストリップ又は電子デバイスである。結果は、臨床医による解釈を必要とする未加工データのアウトプットとして得ることができる。しかし好ましくは、デバイスのアウトプットは、その解釈にあたり臨床医を必要としないように処理された、即ち評価された未加工データである。さらに好ましいデバイスには、分析ユニット／デバイス（例えば、バイオセンサー、アレイ、本明細書で記載するポリペプチドを特異的に認識するリガンドと結合した固相支持体、表面プラズモン共鳴装置、NMR分析装置、質量分析装置等）、及び／又は本発明の方法における上記の評価ユニット／デバイスが含まれる。
【００３７】
またさらに、本発明は、糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記デバイスに関する。
【００３８】
さらにまた、本発明は、糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記デバイスを包含する。
【００３９】
本発明はまた、本発明の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記キットを包含する。
【００４０】
本明細書で使用する用語「キット」とは、上述の手段の集合であって、好ましくは、別々に又は単一容器に内包して提供される。容器はまた、好ましくは、本発明の方法を実施するための説明書を含んでもよい。好ましくは、キットは本発明の前記方法を実施するための説明書を含む。
【００４１】
さらに本発明は、本発明の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記キットを包含する。
【００４２】
最後に本発明は、本発明の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF及びsFLT1の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記キットに関する。
【００４３】
本明細書に引用した全ての文献は、それらの開示内容の全て及び本明細書で具体的に記載した開示内容に関し、参照によって本明細書に援用される。
【００４４】
以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものに過ぎない。それ故、本発明の範囲は、下記実施例によって全く制限されないものとする。
【実施例】
【００４５】
PlGF及びsFLT1は、I型糖尿病を患っている患者における腎不全の発症リスクの上昇に関する予測因子である
総数891人のI型糖尿病を患っている患者において、sFLT1及びPlGFの血中レベルについて調べた。sFLT1及びPlGFの血中レベルは市販のElecsys Immunoassays（Roche Diagnostics, DE）を用いて測定した。
【００４６】
評価項目「全死因死亡」及び「腎不全」は、本転帰試験において12年後に判定した。
【００４７】
試験結果を以下の表にまとめる。さらに、PlGF及びsFLT1は、線形回帰分析によって示したように統計的に互いに独立している（図参照）。
【００４８】
［表］
患者数  N＝891
全死因死亡の患者数  N＝178
ERSDの患者数  N＝89
四分位数  n＝223
全死因死亡         ERSD
PlGF (四分位点の中央値)    n＝178          n＝89
10 pg/ml                       27              7
13                             34              9
16                             40             11
31                             77             62
全死因死亡          ERSD
sFlT1                     n＝178           n＝89
69 pg/ml                      32              19
79                            34              18
95                            37              15
169                           75              43
【図１】
2011520115.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月5日(2010.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体の血液、血漿又は血清サンプルにおけるPLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎不全を発症するリスクを予測するステップ
を含む方法。
【請求項２】
被験体が腎機能に関して見かけ上健康である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
参照量がULNである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1（可溶性Flt1）の量の増加が腎不全の発症リスクの上昇を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体の血液、血漿又は血清サンプルにおけるPLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎臓療法に感受性の被験体を判定するステップ
を含み、腎臓療法が、血圧低下剤、アスピリン、スタチン、ACE阻害剤又はアンギオテンシンII受容体遮断薬の投与を含む、上記方法。
【請求項６】
被験体が腎機能に関して見かけ上健康である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
参照量がULNである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1（可溶性Flt1）の量の増加は、被験体が腎臓療法に感受性であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１０】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記デバイス。
【請求項１１】
糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記キット。
【請求項１３】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記キット。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記キット。
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月4日(2010.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体の血液、血漿又は血清サンプルにおけるPLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎不全を発症するリスクを予測するステップ
を含む方法。
【請求項２】
被験体が腎機能に関して見かけ上健康である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
参照量がULNである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1（可溶性Flt1）の量の増加が腎不全の発症リスクの上昇を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定する方法であって、
（a）糖尿病を患っている被験体の血液、血漿又は血清サンプルにおけるPLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するステップと、
（b）ステップ（a）で測定した量と参照量とを比較することによって、腎臓療法に感受性の被験体を判定するステップ
を含み、腎臓療法が、血圧低下剤、アスピリン、スタチン、ACE阻害剤又はアンギオテンシンII受容体遮断薬の投与を含む、上記方法。
【請求項６】
被験体が腎機能に関して見かけ上健康である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
参照量がULNである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1（可溶性Flt1）の量の増加は、被験体が腎臓療法に感受性であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糖尿病を患っている被験体の腎不全を発症するリスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１０】
糖尿病を患っている被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記デバイス。
【請求項１１】
糖尿病を患っている被験体の死亡リスクを予測するためのデバイスであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、死亡リスクを予測するために適合されている上記デバイス。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、腎不全の発症リスクを予測するために適合されている上記キット。
【請求項１３】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用されるキットであって、
（a）PLGF（胎盤増殖因子）及びsFLT1（可溶性Flt1）の量を測定するための手段と、
（b）前記（a）の手段で測定された量と参照量とを比較するための手段と
を含み、被験体が腎臓療法に感受性か否かを判定するために適合されている上記キット。
【国際調査報告】
2011520115.tif 000004
2011520115.tif 000005
2011520115.tif 000006