(57)【要約】  本発明の目的は、Ｔ細胞応答を増強し、長時間の電気波形印加に起因する及び筋収縮に起因する疼痛及び不快感を軽減するために、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中へ送達するための方法及び装置を提供することである。本方法は、ポリヌクレオチドワクチンを投与部位の皮膚中に投与する段階と、（ｂ）投与部位周辺の皮膚に針電極を当てる段階と、（ｃ）１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、狭間隔電気波形を印加して、１５塩基のポリヌクレオチドワクチンをエレクトロポレーションによって皮膚細胞中に送達する段階とを含む。
2011504111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法であって、
（ａ．）ポリヌクレオチドワクチンを投与部位の皮膚中に投与する段階と、
（ｂ．）投与部位周辺の皮膚に針電極を当てる段階と、
（ｃ．）１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、狭間隔電気波形を印加して、ポリヌクレオチドワクチンをエレクトロポレーションによって皮膚細胞中に送達する段階と
を含み、
前記一連の少なくとも３個の波形が、以下の特徴：（１）前記少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形振幅が互いに異なること；（２）前記少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形幅が互いに異なること；及び（３）前記少なくとも３個の波形のうち２個の第１の組の第１の波形間隔が、前記少なくとも３個の波形のうち２個の第２の組の第２の波形間隔と異なることのうちの１つ、２つ、又は３つを有する、
上記方法。
【請求項２】
段階（ａ．）及び段階（ｂ．）が連続的に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ．）及び段階（ｂ．）が、ポリヌクレオチドワクチンでプレコーティングされた電極を使用して同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための装置であって、
１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、狭間隔電気波形を印加できる狭間隔電気波形発生装置であって、前記一連の少なくとも３個の波形が、以下の特徴：（１）前記少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形振幅が互いに異なること；（２）前記少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形幅が互いに異なること；及び（３）前記少なくとも３個の波形のうち２個の第１の組の第１の波形間隔が、前記少なくとも３個の波形のうち２個の第２の組の第２の波形間隔と異なることのうちの１つ、２つ、又は３つを有する装置と、
前記狭間隔電気波形発生装置に接続された、ポリヌクレオチドワクチンが適用された皮膚に接触するように適合されている電極と
を含む、上記装置。
【請求項５】
皮膚に電極を接触させる前にポリヌクレオチドワクチンが皮膚に適用される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
ポリヌクレオチドワクチンが電極にプレコーティングされ、電極が皮膚と接触すると同時に皮膚に適用される、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法であって、
（ａ．）ポリヌクレオチドワクチンを投与部位の皮膚中に投与する段階と、
（ｂ．）投与部位周辺の皮膚に針電極を当てる段階と、
（ｃ．）１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する一連の狭間隔電気波形を印加して、ポリヌクレオチドワクチンをエレクトロポレーションによって皮膚細胞中に送達する段階と
を含む、上記方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞に送達するための装置であって、
１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する一連の狭間隔電気波形を印加できる狭間隔電気波形発生装置と、
前記狭間隔電気波形発生装置に接続された、ポリヌクレオチドワクチンが適用された皮膚に接触するように適合された電極と
を含む、上記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年５月２１日に出願された同時係属中の米国仮出願第６０／９２４，９６８号に基づいて優先権を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置に関する。より具体的には、本発明は電気波形及びエレクトロポレーションを使用してポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本開示の目的上、「パルス間隔」という用語は、１個のパルスの開始から次のパルスの開始までの時間を意味する。
【０００４】
以下の刊行物について、下記で述べる：
米国特許第６，０１０，６１３号；
米国特許第６，６０３，９９８号；
米国特許第６，７１３，２９１号；
「皮内エレクトロポレーションによる前立腺癌ＤＮＡワクチンに対する細胞性免疫応答の強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」Ｒｏｏｓら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１３巻、第２号、２００６年２月、３２０〜３２７頁（以下、Ｒｏｏｓらと称する）；
「電気化学療法において可能な適用による、インビトロでの電気的に透過性にした細胞中への取り込みに対するパルス繰り返し周波数の効果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｕｌｓｅ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｐｕｃｉｈａｒら著、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５７（２００２年）１６７〜１７２頁（以下、Ｐｕｃｉｈａｒらと称する）。
Ｖｅｒｎｈｅｓ  ＭＣ、Ｃａｂａｎｅｓ  ＰＡ、Ｔｅｓｓｉｅ  Ｊ．局所的な電気的ストレスに対するチャイニーズハムスター卵巣細胞感受性（Ｃｈｉｎｅａｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｓｔｒｅｓｓ）。Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ。１９９９年、４８：１７〜２５；
Ｄａｓｋａｌｏｖ  Ｉ、Ｍｕｄｒｏｖ  Ｎ、Ｐｅｙｃｈｅｖａ  Ｅ．新しい機器の検討（Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｎｅｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）。電気化学療法のためのパラメータ（Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）。単一パルスの代わりに２相パルスのバーストを用いた腫瘍攻撃（Ａｔｔａｃｋｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｂｕｒｓｔｓ  ｏｆ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｐｕｌｓｅｓ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｕｌｓｅｓ）。１９９９年、ＩＥＥＥ  Ｅｎｇ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ６２〜６６；
Ｃｈａｎｇ  ＤＣ、振動電界を使用した細胞穿孔及び細胞融合（Ｃｅｌｌ  ｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ）。１９８９年Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５６：６４１〜６５２；及び
Ｔｅｋｌｅ  Ｅ、Ａｓｔｕｍｉａｎ  ＲＤ、Ｃｈｏｃｋ  ＰＢ．両極性振動電界の使用によるエレクトロポレーション：ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＤＮＡトランスフェクションのための改良法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ：Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ）。１９９１年Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４２３０〜４２３４。
【０００５】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１０，６１３号は、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ社、８１０  Ｃｒｏｍｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ  Ｔ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ２１０６１のＰＡ−４０００Ｓｙｓｔｅｍ（以下ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅと称する）によって提供されるような間隔の広い電気波形によるエレクトロポレーションの使用を開示する。より具体的には、米国特許第６，０１０，６１３号は、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、ＤＣ電気パルスを材料に印加する段階を開示し、この一連の少なくとも３個のＤＣ電気パルスは、以下の特徴：（１）少なくとも３個のパルスのうち少なくとも２個のパルス振幅が互いに異なること；（２）少なくとも３個のパルスのうち少なくとも２個のパルス幅が互いに異なること；及び（３）少なくとも３個のパルスのうち２個の第１の組の第１のパルス間隔が、少なくとも３個のパルスのうち２個の第２の組の第２のパルス間隔と異なることのうちの１つ、２つ、又は３つを有する。
【０００６】
本明細書における論議及び開示を目的として、記載された特徴（１）、（２）及び（３）を有する、上述の一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、ＤＣ電気パルスの材料への印加を、以下「ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ」と称する。
【０００７】
米国特許第６，０１０，６１３号に開示されている明細書及びＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅシステムに付属されている説明書は、パルス間隔が０．１秒（１００ミリ秒）以上であると規定している。以下、１００ミリ秒以上のパルス間隔を有する、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅが発生させる電気波形を「間隔の広いＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形」又は「低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形」と称する。
【０００８】
米国特許第６，０１０，６１３号において、投与されたワクチンがワクチンの良好な遺伝子発現をもたらす、又はワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる完全なタンパク質の分泌改善を伴うＴ細胞応答の改善をもたらすという具体的な証拠は提示されていない。
【０００９】
どちらも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０３，９９８号及び米国特許第６，７１３，２９１号は共に、間隔の広いＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用した、ポリヌクレオチドワクチンの生体細胞への送達を開示する。
【００１０】
Ｒｏｏｓらは、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための、間隔の広いＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形の使用を開示する。ルシフェラーゼタンパク質を発現する遺伝子マーカーの検出によってポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現が示されることもまた、Ｒｏｏｓらによって開示されている。加えてＲｏｏｓらは、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための、間隔の広いＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形の使用によって、ポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる完全なタンパク質の分泌改善を伴ってＴ細胞応答が改善することを開示する。Ｒｏｏｓらにおいて、Ｔ細胞応答はＰＳＡ特異的ＩＦＮ（γ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞によって表される。
【００１１】
Ｒｏｏｓらの刊行物において開示された有益な結果は別として、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用することによって２つの望ましくない結果が観察されている。１つ目の望ましくない結果とは、各低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形投与プロトコールが約３．５秒かかったことである。哺乳類の皮膚に貫入する針の使用を利用する投与は不快感又は疼痛を引き起こすので、このような３．５秒の投与プロトコールでは哺乳動物は約３．５秒間不快感又は疼痛に耐えなければならない。
【００１２】
Ｒｏｏｓらにおいて開示された２つ目の望ましくない結果とは、各低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形が知覚可能な筋収縮を引き起こすことである。筋収縮はそれ自体でも不快感又は疼痛を引き起こし得る。通常、ポリヌクレオチドワクチン投与では、複数のパルス波形が哺乳動物に印加されるはずである。その結果、そのような低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形によって、複数のさらなる筋肉の不快感又は疼痛を伴って複数の筋収縮が起こることになる。
【００１３】
２００２年の刊行日前にＰｕｃｉｈａｒらは、癌細胞を治療するために電気パルスを化学療法剤と組み合わせて使用したことを開示している。以前の電気パルスは１Ｈｚの周波数を有し、それによって各パルスは関連した強直性収縮（筋収縮）を生じさせた。１Ｈｚは１サイクル当たり１０００ミリ秒と解釈されることに留意されたい。論じられた電気パルスプロトコールは全て、均一なパルス振幅、均一なパルス幅、及び均一なパルス間隔のパルスを有するパルスシーケンスである。化学療法剤は非透過性の親水性小分子を含む。Ｐｕｃｉｈａｒらによって実施された研究の開示は、非透過性の親水性小分子であるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗで治療中の癌細胞を用いたインビトロの（インビボではない）実験に関する。Ｐｕｃｉｈａｒらによって実施された研究の開示は、（連続する筋収縮が融合して滑らかな運動になるように）強直性収縮の周波数を上回るために様々なパルス繰り返し周波数を検討している。Ｐｕｃｉｈａｒらにおいて、４０Ｈｚ以上の励起周波数によって連続する筋収縮が融合して滑らかな運動になるという記述がある。４０Ｈｚのパルス周波数は均一なパルス振幅、均一なパルス幅、及び均一なパルス間隔のパルスを利用する。４０Ｈｚは１サイクル当たり２５ミリ秒と解釈されることに留意されたい。
【００１４】
Ｖｅｒｎｈｅｓらは、インビトロでエレクトロポレーションされたＣＨＯ細胞の生存能力及び透過性が０．５〜１００ＨＺのエレクトロポレーションパルス周波数にわたって高かったことを開示する。
【００１５】
Ｄａｓｋａｌｏｖらは、インビボで腫瘍細胞に供給された８個の両極性パルスが、１ＨＺ及び１ｋＨＺで供給された場合に電気化学療法と同様の応答を生じさせたことを開示する。
【００１６】
Ｃｈａｎｇは、短パルスとして供給された高周波数正弦波波形がインビトロでＣＯＳ−Ｍ−６細胞を効率良くエレクトロポレーションしたことを開示する。
【００１７】
Ｔｅｋｌｅらは、６０ｋＨＺ〜１ＭＨＺの範囲の周波数で供給された単極性又は両極性矩形波パルスがインビトロでＮＩＨ３Ｔ３細胞を効率良くトランスフェクトしたことを開示する。
【００１８】
Ｐｕｃｉｈａｒ、Ｖｅｒｎｈｅｓら、Ｄａｓｋａｌｏｖら、Ｃｈａｎｇ、又はＴｅｋｌｅらのいずれにおいても、ポリヌクレオチドワクチン接種との、ポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現との、又はポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる所望のタンパク質の分泌改善を伴うＴ細胞応答の改善との関係を記述する開示はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上述のことを考慮して、ポリヌクレオチドワクチンを投与するのに３．５秒未満しかかからない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置を提供することが望ましい。
【００２０】
加えて、複数のＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を哺乳類の皮膚に印加し、複数の印加された電気波形に対して１回の筋収縮しか引き起こさない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置を提供することが望ましい。
【００２１】
ポリヌクレオチドワクチンの投与は、成功であるというためには、投与されたポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の証拠を示さなければならない。さらに、成功であるというためには、投与されたポリヌクレオチドの遺伝子発現は、ポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる所望のタンパク質を提供するという証拠を示さなければならない。
【００２２】
上記のように、前述の先行技術本文はエレクトロポレーション装置の使用がよく知られていることを示すが、上述の先行技術は、次の望ましい特徴の組合せ：（１）ポリヌクレオチドワクチンを投与するのに３．５秒未満しかかからない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置を提供すること；（２）複数のＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を哺乳類の皮膚に印加し、複数の印加された電気波形に対して１回の筋収縮しか引き起こさないこと；（３）投与されたポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の証拠を示すこと；及び（４）ポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる所望のタンパク質を提供するという証拠を示すこと、を有するポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置を教示又は示唆していない。前述の所望の特徴は、以下のその説明から明らかになるように、本発明のポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための独自の方法及び装置によって提供される。先行技術より優れている本発明の他の利点もまた明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前述の所望の特徴は、以下のその説明から明らかになるように、本発明のポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための独自の方法及び装置によって提供される。先行技術より優れている本発明の他の利点もまた明らかになるであろう。
【００２４】
本発明の一態様によれば、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法は、
（ａ．）ポリヌクレオチドワクチンを投与部位の皮膚中に投与する段階と、
（ｂ．）投与部位周辺の皮膚に針電極を当てる段階と、
（ｃ．）１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた、狭間隔電気波形を印加して、ポリヌクレオチドワクチンをエレクトロポレーションによって皮膚細胞中に送達する段階と
を含む。この一連の少なくとも３個の波形は、以下の特徴：（１）少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形振幅が互いに異なること；（２）少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形幅が互いに異なること；及び（３）少なくとも３個の波形のうち２個の第１の組の第１の波形間隔が、少なくとも３個の波形のうち２個の第２の組の第２の波形間隔と異なることのうちの１つ、２つ、又は３つを有する。
【００２５】
１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた狭間隔電気波形を、本明細書において「高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形」又は「狭間隔ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形」と称する。
【００２６】
好ましくは、狭間隔電気波形は数ミリ秒未満のパルス間隔を有する。
【００２７】
本発明の方法の一実施形態では、段階（ａ．）及び段階（ｂ．）は連続的に実施される。例えば、ＤＮＡワクチンをまず皮膚中に注射して水疱を形成させる。次いで、水疱の両側に位置する皮膚に針電極を置く。これに関しては、「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムを利用することができる。
【００２８】
本発明の方法の別の実施形態では、段階（ａ．）及び段階（ｂ．）は、ポリヌクレオチドワクチンでプレコーティングされた電極を使用して同時に実施される。これに関しては、「Ｅａｓｙ  Ｖａｘ」システムを利用することができる。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する、一連の少なくとも３個の単一の、オペレータ制御され、独立してプログラムされた狭間隔電気波形を印加できる狭間隔電気波形発生装置を含み、ポリヌクレオチドワクチンが適用された皮膚に接触するように適合された電極を含む、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための装置が提供される。
【００３０】
この一連の少なくとも３個の波形は、以下の特徴：（１）少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形振幅が互いに異なること；（２）少なくとも３個の波形のうち少なくとも２個の波形幅が互いに異なること；及び（３）少なくとも３個の波形のうち２個の第１の組の第１の波形間隔が、少なくとも３個の波形のうち２個の第２の組の第２の波形間隔と異なることのうちの１つ、２つ、又は３つを有し、電極は狭間隔電気波形発生装置に接続されている。
【００３１】
本発明の装置の一実施形態では、皮膚に電極を接触させる前にポリヌクレオチドワクチンは皮膚に適用される。これは皮下注射針を使用することによって達成できる。
【００３２】
本発明の装置の別の実施形態では、ポリヌクレオチドワクチンは電極にプレコーティングされ、電極が皮膚に接触すると同時に皮膚に適用される。
【００３３】
高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は狭間隔ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を提供し、哺乳類の皮膚への適用に適した任意の電極を利用する装置は、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ社、８１０  Ｃｒｏｍｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ  Ｔ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ２１０６１により製造され、「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」の名称で知られている。
【００３４】
Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ社「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムについての詳細な情報は次の刊行物：「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ（商標）臨床評価皮内システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｒａ−ｄｅｒｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）」と題するＤａｔａ  Ｓｈｅｅｔにあり、これはインターネット上で、次のＵＲＬアドレス、ｗｗｗ．ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ．ｃｏｍ／ｄｎａ＿ｖａｃｃｉｎｅ．ｓｈｔｍｌで「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ（９９Ｋｂ）」と題するリンクをクリックすると一般に公開されている。Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ自体は次のＵＲＬアドレス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／Ｄａｔａｓｈｅｅｔ％２０Ｄｅｒｍａ％２０Ｖａｘ．ｐｄｆにある。
【００３５】
高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は狭間隔ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を提供し、哺乳類の皮膚への適用に適したプレコーティングされた電極を利用する装置もまた、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ社により製造され、「Ｅａｓｙ  Ｖａｘ」の名称で知られている。
【００３６】
高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形又は狭間隔ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を提供する装置はまた、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ社により製造され、「ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」の名称で知られている。上述のように、「ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」の仕様書は上記の「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ（商標）臨床評価皮内システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｒａ−ｄｅｒｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）」と題するＤａｔａ  Ｓｈｅｅｔに提供されている。
【００３７】
上記の簡単な説明は、以下のその詳細な説明がより良く理解されるように、及び当技術分野に対する本発明の貢献がより良く評価されるように、本発明のより重要な特徴をやや大まかに記載している。当然ながら、以下に説明される本発明のさらなる特徴があり、これは本明細書に添付の特許請求の範囲の主題を支持するであろう。
【００３８】
この点において、本発明の原理のいくつかの実践を下記でより詳細に説明する前に、本発明の適用は、構成の詳細に及び以下の説明に記載された又は図面に例示された構成要素の配置に限定されないことが理解される。本発明は別の実施形態が可能であり、様々な方法で実践及び実施することができる。また、本明細書中で使用される表現及び用語は、説明を目的とするものであり限定するものとみなすべきではないことも理解されるべきである。
【００３９】
したがって、当業者であれば、開示の基となる概念が、本発明のいくつかの目的を実施するための別の構造、方法、及びシステムを設計する基礎として容易に利用され得ることを理解するはずである。したがって、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、特許請求の範囲がそのような等価の構成を含むとみなされることが重要である。
【００４０】
したがって本発明の目的は、ポリヌクレオチドワクチンを投与するのに３．５秒未満しかかからない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための新たな改善された方法及び装置を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、複数のＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を哺乳類の皮膚に印加し、複数の印加された電気波形に対して１回の筋収縮しか引き起こさない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための新たな改善された方法及び装置を提供することである。
【００４２】
本発明のなお別の目的は、投与されたポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の証拠を示す、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための新たな改善された方法及び装置を提供することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、ポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる所望のタンパク質を提供するという証拠を示す、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための新たな改善された方法及び装置を提供することである。
【００４４】
本発明を特徴づける新規性の様々な特徴に加えて、これらは本発明のさらに別の目的と共に、添付された特許請求の範囲における特殊性と共に指摘され、本開示の一部を形成している。本発明、その操作上の利点及びその使用によって達成される特定の目的をより良く理解するために、添付の図面及び本発明の好ましい実施形態が例示されている説明内容を参照されたい。
【００４５】
本発明は以下のその詳細な説明の検討後、より良く理解され、上記の目的に加えて上記のもの以外の目的がより明らかになるであろう。そのような説明は以下の添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」装置を使用してエレクトロポレーションによりルシフェラーゼプラスミドを送達するための、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形印加に対する高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形印加の結果得られるルシフェラーゼ発現の比較を示すグラフである。
【図２】「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」装置を使用してエレクトロポレーションによりワクチンを送達するための、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形印加に対する高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形印加の結果得られるＤｅｎｇｕｅ１ＤＮＡワクチンを使用したワクチン接種へのＴ細胞応答の比較を示すグラフである。
【図３】「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」装置を使用してエレクトロポレーションによりルシフェラーゼプラスミドを送達するための、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形に対する高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形印加の結果得られるルシフェラーゼ発現の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置が提供され、図面を参照して前記方法及び装置を以下に説明する。
【００４８】
「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」及び「ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」の仕様は以下の通りである。
ＤＥＲＭＡ  ＶＡＸ仕様
操作
モード１−熟練した医療専門家によるワクチン送達
タッチスクリーン
パラメータ入力のための開始画面
患者ＩＤ入力
ワクチンＩＤ入力
電極ＩＤ入力
ワクチン接種画面
ＳＫＩＮ−皮膚抵抗を毎秒測定及び表示
ＲＥＡＤＹ−高圧電源をオンにする
ＳＴＲＡＴ−パルス発生を開始
ＤＯＮＥ−ワクチン接種完了
モード２−熟練したＩＴ専門家による設定
パルスパラメータ
データファイルをダウンロード
送達電極
ワクチン送達量−−
２個の水疱×各２５μｌのＩＤＡ−４−６
２個の水疱×各５０μｌのＩＤＡ−６−６
送達標的−−皮膚／真皮
電極
ハンドル−−アルコール洗浄により再使用可能
先端−−
滅菌
単一包装
使い捨て
【表１】
2011504111.tif 000003
【００４９】
ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ
パルス発生
皮膚抵抗パルス発生−−毎秒５ボルトで４μｓ
パルスプロトコールパラメータ
グループ内パラメータ
パルス幅  ５０μｓ〜１ｍｓ  ５０〜１０００ボルト
５０μｓ〜１０ｍｓ  ５０〜３００ボルト
パルス電流トリップ  ２６アンペア
負荷範囲  １５〜１５００オーム
パルス数  １〜１０
最大デューティサイクル  ５０％
間隔  ２００μｓ〜１秒（パルス開始からパルス開始）
グループ数  ３
パルス測定
内部デジタイザ
レベル  １２ビット
サンプル  パルス幅／８  最小１００μｓ
データは内部及び外部ＵＳＢキーに保存される
データタイプ
未加工データ：ＤＶ＜Ｄａｔｅ＞．ｘｍｌ
ログデータ  ＤＶ＜Ｄａｔｅ＞．ｔｘｔ
ＣＳＶデータ  ＤＶ＜Ｄａｔｅ＞．ｃｓｖ
全データは内部メモリに自動的に保存され、外部ＵＳＢキーにダウンロードすることができる
保存され、内部フラッシュメモリから回収可能な最大データログ＞２０，０００
前面パネル
コンピュータ
オペレーティングシステム  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（商標）Ｍｏｂｉｌｅ６．０
インターフェース  タッチスクリーン
照明付き回線／幹線スイッチ
緊急停止ボタン（コンピュータをレディ状態にリセット）
タッチスクリーン
ＵＳＢポート  ２
電極コネクター  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０３２
背面パネル
電源入力  ＩＥＣ３２０
イーサネット（登録商標）ＲＪ４５
電気及び機械
ハンドル付きＣＣＥＰ−４０Ａキャビネット
３２ｍｍ幅×２０ｍｍ高さ×４０ｍｍ長さ
幅１２．６×高さ７．９×長さ１５．７
重量  ２５ポンド、１１．３ｋｇ
使用温度  １０〜４０℃
幹線電圧  １００〜２５０ｖａｃ
ヒューズ  ５Ａスローブロー、５ｍｍ×２０ｍｍ
予備電源  停電後、＞５分間
【００５０】
ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための本発明の装置を利用する本発明の方法を実施するための実験を以下に記載する。
【００５１】
（実験１）
目的及び範囲
本実験の目的は、（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムを使用した）高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を、（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  ＰＡ−４０００システムを使用した）低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形と比較することである。新しいＤｅｒｍａ  Ｖａｘシステムは、ＰＡ−４０００よりも速やかにパルスを供給することができる。
【００５２】
背景
Ａｎｎａ−Ｋａｒｉｎ  Ｒｏｏｓ博士は、マウスの皮膚において良好なルシフェラーゼ発現を誘導する少なくとも２個の波形を発表した。使用されたシステムはＰＡ−４０００であり、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形が使用された。新しい性能が、「ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」を利用するＤｅｒｍａ  Ｖａｘシステムに巧みに設計された。１つの顕著な違いは、Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘシステムがより短いパルス間隔でパルスを供給できる点である。すなわち、「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムによって、１００ミリ秒未満のパルス間隔が提供できる。本実験は、高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用して、インビボのルシフェラーゼ発現に対する効果を評価する。
【００５３】
研究手法
使用したプラスミド：５ｍｇ／ｍｌのＡｌｄｅｖｅｒｏｎのｇＷｉｚＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを滅菌ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
システム：Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ＃Ｆ２ＬＱ２６０８８５１
電極：皮内アレイ（ギャップ４ｍｍ、１列につき６個の針、２列）並列電極。
注射：マウスを、通気孔を有するように変更した５０ｍｌコニカルチューブを使用して拘束した。マウスはまず頭をチューブに入れさせた。尾を本発明者の左手人指し指に掛けた。小さいハサミを使用して尾の基部の小区画の毛を除去した。ツベルクリンシリンジにつけた２７ゲージ、０．５インチの針を使用して、尾の基部及び仙骨の右側に２０マイクロリットルの皮内注射を行った。部位にシャープペンを使用して印をつけた。電極ギャップを左から右を向かせて針の列を注射部位の周辺に挿入し、それによって列を頭側及び尾側に一列に並べた。選択したエレクトロポレーションプロトコールを開始し、針を除去した。このプロセスを仙骨の左側において繰り返した。
【００５４】
グループ（結果でケージとして示した）。全ての時間はミリ秒で示す。
【表２】
2011504111.tif 000004
マウスはもとのケージに戻した。
【００５５】
１８〜２４時間後、ＣＯ２吸入を使用してマウスを安楽死させた。各２箇所の部位の組織を、６ｍｍのパンチ生検を使用して切り取った。ハサミを使用して皮下組織を除去し、皮膚を皮下組織と一緒に１ｍｌの溶解緩衝液に加えた。サンプルは、アッセイまで氷上に置いた。
【００５６】
ＩＫＡ組織ホモジナイザーモデルを使用して組織をホモジナイズした。１ｍｌのホモジネートのうち５０マイクロリットルのサンプルを、白色アッセイプレートに添加した。３倍希釈系列を使用して、既知量のルシフェラーゼを溶解緩衝液で希釈することによって標準を作製した。５０マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイキットの試薬Ａを各ウェルに添加した。プレートを９６ウェルルミノメーターに入れた。５０マイクロリットルの試薬Ｂを添加し、得られる光を１秒間測定した。
【００５７】
データ解析のために、データをＥｘｃｅｌｌ表計算ソフトにエクスポートした。
【００５８】
結果のグラフ表示については図面の図１を参照されたい。高速及び低速電気波形プロトコールは遺伝子発現について統計的に等価である。
【００５９】
結果
【表３】
2011504111.tif 000005
【００６０】
１００ミリ秒未満のパルス間隔を有する高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形によって、ポリヌクレオチドワクチンの哺乳類の皮膚細胞中へのエレクトロポレーションが良好な遺伝子発現と共に起こり得るということは、驚くべき予想外の結果である。
【００６１】
数ミリ秒未満のパルス間隔を有する高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形によって、ポリヌクレオチドワクチンの哺乳類の皮膚細胞中へのエレクトロポレーションが良好な遺伝子発現と共に起こり得るということは、さらに非常に驚くべき予想外の結果である。従来は、わずか数ミリ秒のパルス間隔の時定数ではエレクトロポレーションを成功させるには低すぎるはずであると予想されていた。
【００６２】
（実験２）
目的及び範囲
本実験の目的は、（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  ＰＡ−４０００システムを使用した）低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形に対して（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムを使用した）高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用したＤＮＡ免疫化によって誘導されるＴ細胞応答を、比較することである。新しいＤｅｒｍａ  Ｖａｘシステムは、ＰＡ−４０００よりも速やかにパルスを供給することができる。より具体的には、本研究の目的は、ｐｒＭ−Ｅ及びＮＳ１−ＮＳ３を発現するＤｅｎｇｕｅ１プラスミドを用いるＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ  Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ送達を使用したＤＮＡ免疫化によって誘導されるＴ細胞応答を比較することである。
【００６３】
背景
Ａｎｎａ−Ｋａｒｉｎ  Ｒｏｏｓ博士は、マウスの皮膚において良好なルシフェラーゼ発現を誘導する少なくとも２個の波形を発表した。使用されたシステムはＰＡ−４０００であり、低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形が使用された。新しい性能が、「ＣＣＥＰ−４０Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」を利用するＤｅｒｍａ  Ｖａｘシステムに巧みに設計された。１つの顕著な違いは、Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘシステムがより短いパルス間隔でパルスを供給できる点である。すなわち、「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムによって、１００ミリ秒未満のパルス間隔が提供できる。本実験は、高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用して、インビボのＴ細胞応答に対する効果を評価する。
【００６４】
研究手法
使用したプラスミド：５ｍｇ／ｍｌのＤｅｎｇｕｅ１ｐｒＭ−Ｅ及びＤｅｎｇｕｅ１ＮＳ１−ＮＳ３を同じ滅菌ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌまでそれぞれ希釈した。
システム：Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ＃０７−０２１５ＤＶ
電極：皮内アレイ（ギャップ４ｍｍ、１列につき６個の針、２列）並列電極。
注射：マウスを、通気孔を有するように変更した５０ｍｌコニカルチューブを使用して拘束した。マウスはまず頭をチューブに入れさせた。尾を本発明者の左手人指し指に掛けた。小さいハサミを使用して尾の基部の小区画の毛を除去した。ツベルクリンシリンジにつけた２７ゲージ、０．５インチの針を使用して、尾及び仙骨の基部の右側に２０μｌの皮内注射を行った。電極ギャップを左から右を向かせて針の列を注射部位の周辺に挿入し、それによって列を頭側及び尾側に一列に並べた。選択したエレクトロポレーションプロトコールを開始し、針を除去した。このプロセスを仙骨の左側において繰り返した。
【００６５】
グループ（結果でケージとして示した）。全ての時間はミリ秒で示す。
【表４】
2011504111.tif 000006
マウスはもとのケージに戻した。
【００６６】
免疫化の２週間後、ＣＯ２吸入を使用してマウスを安楽死させ、細胞内サイトカインアッセイ用に脾臓を採取した。
【００６７】
結果
下記に示す結果は、γインターフェロン陽性のＣＤ８陽性細胞のパーセントである。
【００６８】
結果を、免疫化されていない動物によるバックグラウンドを差し引いて示す。
【表５】
2011504111.tif 000007
【００６９】
試験結果のグラフ表示については図面の図２を参照されたい。この点において、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定の実施によって、試験結果は高速及び低速電気波形プロトコール間で統計的に有意でない差異を示す。この点において、高速及び低速電気波形プロトコールはＴ細胞の強化について統計的に等価である。
【００７０】
結論
「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムによる高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形によって誘導されるＴ細胞応答は、インビボエレクトロポレーションによって「Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ」システムによる低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形によって誘導されるＴ細胞応答と等価である。
【００７１】
表Ｉ
低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形とは対照的に、高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を使用するエレクトロポレーションによって知覚可能な筋収縮は減少する。
【表６】
2011504111.tif 000008
【００７２】
明らかに、（低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形と比較すると）高速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形では、供給時間が３．５秒よりはるかに短く、１０個のパルスを供給する場合でも１回の筋収縮しか認められない。
【００７３】
図３に関して、ＤＮＡ送達（ＤＮＡはポリヌクレオチドである）を以下の通り実施した。
【００７４】
４％イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢ、Ｋｉｓｔａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で麻酔をかけ、免疫化の間マスクでイソフルランを２〜２．５％に維持した。ＰＢＳ中のＤＮＡ２０μｇを、２９Ｇインスリン注射用シリンジ（Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ  Ｕ−１００、ＢＤ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用してそれぞれの尾の基部近くの脇腹に皮内注射した。
【００７５】
続いて、盛り上がった皮膚の注射領域に針アレイ電極を置き、電圧を印加した（パルス数２、１１２５Ｖ／ｃｍ、５０μ秒＋８パルス、２７５Ｖ／ｃｍ、１０ｍ秒）。パルス間隔を変化させて高速及び低速ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅプロトコールを行った。
【００７６】
使用した針アレイ電極はＣｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌアレイ（４針、ギャップ４ｍｍ、２列）（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）であった。Ｄｅｒｍａ  Ｖａｘ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用してエレクトロポレーションを行った。
【００７７】
本発明は、有利に使用でき、ポリヌクレオチドワクチンを投与するのに３．５秒未満しかかからない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための新たな改善された方法及び装置を提供することによって、記載の目的の全てを達成することが上記から明らかである。本発明によって、複数のＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ電気波形を哺乳類の皮膚に印加し、複数の印加された電気波形に対して１回の筋収縮しか引き起こさない、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置が提供される。本発明によって、投与されたポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の証拠を示す、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置が提供される。本発明によって、投与されたポリヌクレオチドワクチンの良好な遺伝子発現の結果得られる所望のタンパク質を提供するという証拠を示す、ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類の皮膚細胞中に送達するための方法及び装置が提供される。
【００７８】
本発明の使用方法及び操作方法については、上記の開示から明らかであり、したがって、使用方法及び操作方法に関するさらなる論議は提供される必要がない。
【００７９】
したがって本発明を、本発明の最も実用的で好ましい実施形態（単数又は複数）であると現在のところみなされるものと関連して上記で図面に示し、具体的及び詳細に十分に説明したが、本明細書に記載の原理及び概念から逸脱することなく、寸法、材料、形状、形態、操作機能及び操作方法、組み立て並びに使用の変形形態を含むがこれらに限定されない本発明の多くの変更形態を実施できることが当業者には明らかになるであろう。
【図１】
2011504111.tif 000009
【図２】
2011504111.tif 000010
【図３】
2011504111.tif 000011
【国際調査報告】
2011504111.tif 000012