(57)【要約】  広範な態様において、本発明は概して、単一可変ドメインを含む、新規の二量体複合体（本明細書中では「非融合二量体」又はＮＦＤと呼ばれる）、これらの複合体の製造方法、及びそれらの使用に関する。これらの非共有結合した二量体複合体は、それぞれ単一可変ドメインを１つ若しくは複数含む２つの同一の単量体（ホモ二量体）、又はそれぞれ単一可変ドメインを１つ若しくは複数含む２つの異なる単量体（ヘテロ二量体）から成る。対象のＮＦＤは通常、結合特性が変性している、例えばそれらの単量体相当物を超えて改善している。安定性を改善するために、本発明のＮＦＤを可撓性ペプチド又はシステインによる連結によりさらに改変してもよい。本発明は、このようなＮＦＤが形成される条件、及びこのような二量体の形成を回避することができる条件も説明している。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの単一可変ドメインを含むポリペプチドを濃縮する工程を含む方法によって得ることができる安定したＮＦＤ。
【請求項２】
単一可変ドメインが、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、親和性成熟、安定化若しくはそうでなければ改変ＶＨＨ又はこれらの構築物等のナノボディである、請求項１に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項３】
単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択される、請求項１に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項４】
単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択される、請求項１に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項５】
単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のいずれかと少なくとも７０％同一性である機能的配列を有する、請求項１に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項６】
単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のいずれかと少なくとも７０％の同一性を示す機能的配列を有し、前記配列がそれらの標的分子の内の少なくとも１つと特異的に結合する、請求項１に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項７】
ポリペプチドが、単一可変ドメイン（単数又は複数）、リンカー（単数又は複数）から本質的に成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項８】
濃縮する工程をプロテインＡカラムで行い、大量のポリペプチド（例えば樹脂プロテインＡ  １ｍｌ当たり２ｍｇ〜５ｍｇ）が該カラムに装填される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項９】
ＮＦＤとその標的分子との解離定数がその対応する単量体構成要素と前記標的分子との解離定数とほぼ同じである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項１０】
ＮＦＤとその標的分子との特異的な結合が存在しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項１１】
ＮＦＤとその標的分子との解離定数が１００ｎＭ以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定したＮＦＤ。
【請求項１２】
少なくとも１つの単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記単一可変ドメインの少なくとも１つが請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＦＤを形成することができる、ポリペプチド。
【請求項１３】
疎水性相互作用が好まれる条件を有する方法工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＦＤを作製する方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの単一可変ドメイン、例えばナノボディを含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの単量体ポリペプチドを作製する方法であって、
前記ポリペプチドを作製する方法のそれぞれの工程が、５０％、好ましくは４０％、より好ましくは３０％、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは１０％を超える対応ＮＦＤを生成せず、及び
前記方法のそれぞれの工程が、疎水性相互作用が好まれる条件を避け、及び／又は
前記方法が、前記単一可変ドメインが一部アンフォールディングされる、例えばＣＤＲ３が、例えば数週間、例えば４週間のような長時間にわたって、該ポリペプチドの融点に近い温度又は例えば３７℃のような高温で一部アンフォールディングされる条件を避けるものである、
単量体ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１５】
ｉ）二量体化しやすいナノボディを含むポリペプチド、及びｉｉ）ポリオール
を含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
広範な態様において、本発明は概して、例えばナノボディ等の単一可変ドメインを含む、新規の二量体複合体（本明細書中では「非融合二量体」又はＮＦＤと呼ばれる）、これらの複合体の製造方法、及びそれらの使用に関する。これらの非共有結合した二量体複合体は、それぞれ単一可変ドメインを１つ若しくは複数含む２つの同一の単量体（ホモ二量体）、又はそれぞれ単一可変ドメインを１つ若しくは複数含む２つの異なる単量体（ヘテロ二量体）から成る。対象のＮＦＤは通常、結合特性が変化している、例えばそれらの単量体相当物を超えて改善又は低減している。安定性を改善するために、本発明のＮＦＤを可撓性（flexible）ペプチド又はシステインによる連結によりさらに改変してもよい。本発明は、このようなＮＦＤが形成される条件、及びこのような二量体の形成を回避することができる条件も説明している。例えば本発明は、例えばマンニトール又は他のポリオール等の、単一可変ドメインの融点を高くする１つ又は複数の賦形剤を液体製剤に添加することにより、（ヒト血清）アルブミン結合ナノボディの二量体化のようなＮＦＤを抑制する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗体の抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインからの超可変ループにより主に形成される。しかしながら、機能的な抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）単独でも形成することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、このような結合部位は抗体の一部としてラクダ及びラクダ科動物において発達し、これらの結合部位は２つの重鎖のみから成り、軽鎖を欠いている。さらに、これらのラクダの重鎖のみの抗体のＶＨ（ＶＨＨとも称される）と、従来のヒト抗体由来のＶＨドメインとのアミノ酸配列における差異の解析が、改変ヒトＶＨドメインを設計するのを助けた（非特許文献１）。同様に、抗ｈＣＧ  ＶＨＨ  Ｈ１４と並行して、抗Ｈｅｒ２抗体４Ｄ５の界面残基とＶＨ上でのＣＤＲ３との突然変異試験により、幾つかの突然変異が自律的なＶＨドメイン挙動（即ち有益な可溶性及び可逆的リフォールディング）を促進させることが見出された（非特許文献２）。曝された疎水性残基をより親水性の残基に置き換えることによる先の軽鎖界面の親水性の増大が、自律的なＶＨドメイン挙動を改善することも見出された。これらの改変ＶＨは、高濃度では大部分は単量体であることが分かっていたが、上記改変ＶＨの少量の二量体及び他の凝集体が、ＶＬ−ＶＨ対の相互作用に関して当該技術分野で説明されたものと同様の比較的弱い相互作用を形成すると推測されることも見出された。同様に、ラクダ化ＶＨ（ｃＶＨ−Ｅ２と呼ばれる）が、濃度依存的に、即ち７ｍｇ／ｍｌを超える濃度で溶液中に二量体を形成することも主張されている（しかし、データは試験では示されていないことに留意されたい、非特許文献３）。この濃度以下で、二量体は単量体へと解離すると考えられ、これらの二量体が活性（即ち結合抗原）であるか否かは不確かなままである。さらに最近、非常に短いＣＤＲ３（わずか６残基）を有する切断ラマ由来ＶＨＨ（最初の７つのアミノ酸が切断されている）（ＶＨＨ−Ｒ９と呼ばれる）が、結晶構造においてドメインスワップ（swapped）二量体を形成することが報告されている。ＶＨＨ−Ｒ９が、溶液中で機能的であり（ハプテンに対するＫｄが低い）、単量体のみから成ることが分かっているので、二量体化が、非常にゆっくりした結晶化プロセス（４週間〜５週間）中に起こり、Ｎ末端切断、高濃度条件及び短いＣＤＲ３等の要素が「縮合」現象に繋がり得る又はその一因となり得ると考えられる（特に非特許文献４の結論部も参照されたい）。非特許文献５は、ＶＨ二量体（ＶＨＤ）の自発的形成が多くの場合許容性であり、抗原結合特異性を有する分子を産生することを見出している。しかしながら、報告された自発的形成（対本明細書中で報告されるＰＩＡにより形成される二量体）と、非融合二量体に関する安定性データの欠如とに基づくと、これらは、非特許文献２（上記）により説明されたものと同程度の弱く相互作用する二量体であると考えられる。まとめると、この文献は、ａ）主として比較的弱い疎水性相互作用と相互作用し（例えば濃度に依存し、可逆的である）、及び／又はｂ）結晶化プロセスにおいてのみ別の原因で（例えば結晶充填力（crystal packing forces）の結果として）起こる、単一可変ドメイン及びその断片の二量体形成を説明している。さらに、こ���らの二量体がもはや結合抗原ではなかったことが説明されているか（非特許文献４（上記）等）、又はこれらの二量体が結合二量体であったか否かは不確かである（非特許文献３（上記）及び非特許文献２（上記）等）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lutz Riechmann and Serge Muyldermans, J. of Immunological Methods,Vol. 231, Issues 1 to 2, 1999, 25 - 38
【非特許文献２】Barthelemy PA et al., 2008, J. of Biol. Chemistry, Vol 283, No 6, pp3639-3654
【非特許文献３】Dottorini et al., Biochemistry, 2004, 43, 622-628
【非特許文献４】Spinelli et al., FEBS Letter 564, 2004, 35 - 40
【非特許文献５】Sepulveda et al. （J. Mol. Biol. （2003） 333, 355-365）
【発明の概要】
【０００４】
驚くべきことに現在では、単一可変ＶＨＨドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドのために、好ましくは本明細書中に記載の方法（即ち高温及び高濃度で残基及び／又は保存を脱安定化させる、プロセス誘導会合、ＣＤＲ３/フレームワーク領域４の導入）を使用して二量体を形成する単一可変ＶＨＨドメインを含むポリペプチドのために、より好ましくは配列番号１〜配列番号６の配列及び／又はその変異型を有する単一可変ＶＨＨドメイン、例えば配列番号１〜配列番号６と７０％以上同一性である配列を有する単一可変ＶＨＨドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドのために、安定した二量体複合体を溶液中に生成することができることが見出されている。これらの安定した二量体複合体（本明細書中で非融合二量体又はＮＦＤ（non-fused-dimers or NFDs; non-fused-dimer or NFD）とも称される）は、それらの単量体構成要素と比較して少なくとも５０％の結合機能性を保持することができるか、又はさらに結合親和性を増大させることができるものもあれば、結合機能性が低減している又はもはや結合機能性がないものもある。これらのＮＦＤは、例えば非特許文献２（上記）に記載の「一時的な」濃度依存的な二量体と比較してかなり安定しており、広範な濃度において一度安定して形成される。これらのＮＦＤは、単量体構成要素間でフレームワーク領域４をスワッピングする（swapping）ことにより形成することができ、それによって上記単量体構成要素の両方がかみ合う（ポリペプチドＢ  ＮＦＤの結晶構造の実験部を参照されたい）。これらの二量体は通常、本明細書中に記載の方法を使用してプロセス誘導会合（ＰＩＡ）時に、及び／又は数週間にわたり比較的高温で（例えば４週間にわたり３７℃で）、高濃度で（例えば５０ｍｇ／ｍｌを超える、例えば６５ｍｇ／ｍｌで）の保存時に形成される。また本発明は、ｉ）例えば非ストレス条件（即ち免疫グロブリンのアンフォールディングに有利に働かない条件）下での単一可変ドメイン（複数可）を含む上記ポリペプチドのスケールアップ（up-scaled）製造又は精製プロセスにおいて、ｉｉ）単一可変ドメイン（複数可）の融点を高くする賦形剤による適当な配合により、例えば製剤中にマンニトールを含有させる（having）ことにより、及び／又はｉｉｉ）ＣＤＲ３及び／又はフレームワーク４領域の立体配座の安定性を増大させることにより、どのように上記二量体複合体の形成を回避するかを教示している。
【０００５】
定義：
ａ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）, Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）、F.Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th.Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al.,"Immunobiology"（6th Ed.）, Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
【０００６】
ｂ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施する。また例えば、標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びにそこで言及されるさらなる参考文献並びに例えば以下の総説、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 （5-6）: 640-56、Levin and Weiss, Mol. Biosyst.2006, 2（1）: 49-57、Irving et al., J.Immunol. Methods, 2001, 248（1-2）, 31-45、Schmitzet al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12、Gonzaleset al., Tumour Biol., 2005, 26（1）, 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を記載している）を参照する。
【０００７】
ｃ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
【０００８】
表Ａ−２：１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コード
【表Ａ−２】
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【０００９】
ｄ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、その際、第１のヌクレオチド配列に比べて、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異とみなされる。
【００１０】
代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
【００１１】
配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、欧州特許第０９６７２８４号明細書、欧州特許第１０８５０８９号明細書、国際公開第００／５５３１８号パンフレット、国際公開第００／７８９７２号パンフレット、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット及び英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書に記載されている。通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
【００１２】
ｅ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセントを算出することができ、その際、第１のアミノ酸配列に比べて、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」とみなされる。
【００１３】
代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
【００１４】
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
【００１５】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が類似の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットから当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びにそこで言及されるさらなる参考文献からの関連の教示に基づいて選択することができる。
【００１６】
このような保存的な置換は、好ましくは以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びその（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【００１７】
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
【００１８】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析に、Chou andFasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149,1978によって開発された構造形成能（structure forming potentials）の解析に、並びにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984、Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al., Natural StructuralBiology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
【００１９】
ｆ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言える。
【００２０】
ｇ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差異」は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
【００２１】
ｈ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を「含む」、又は別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列「から本質的に成る」というとき、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、実際にどのように初めに言及された配列を生成又は入手するか（例えば本明細書に記載の任意の好適な方法によるものであり得る）に関係なく、その配列内にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例によって、本発明のナノボディがＣＤＲ配列を含むというとき、これは、上記ＣＤＲ配列が、本発明のナノボディに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、本発明のナノボディが、どのように上記本発明のナノボディを生成又は入手するかに関係なく、その配列内に上記ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基のストレッチを含有することを意味する。後者のアミノ酸配列が特異的な生物学的又は構造的な機能を有する場合、初めに言及されたアミノ酸配列において本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を有するのが好ましい（言い換えれば、初めに言及されたアミノ酸配列は、後者の配列が本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を果たすことができるようなものであるのが好ましい）ということにも留意すべきである。例えば、本発明のナノボディがそれぞれ、ＣＤＲ配列又はフレームワーク配列を含むというとき、ＣＤＲ配列及びフレームワークはそれぞれ、上記ナノボディでＣＤＲ配列又はフレームワーク配列として機能することができるのが好ましい。また、或るヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むというとき、初めに言及されたヌクレオチド配列は、発現産物（例えばポリペプチド）に発現する場合、後者のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列が上記発現産物の一部を形成するようなもの（言い換えれば後者のヌクレオチド配列が、初めに言及されたより大きなヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内にあるようなもの）であるのが好ましい。
【００２２】
ｉ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常上記供給源又は媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの混入物質、不純物若しくは微量成分から分離されている場合、（例えばその天然の生物学的供給源及び／又はこれが得られる反応媒体又は培養媒体に比べて）「本質的な単離（形態）」であるとみなされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離された」と考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して決定すると、本質的に均一であるのが好ましい。
【００２３】
ｊ）本明細書で使用される用語「ドメイン」は概して、アミノ酸配列の球状領域（例えば抗体鎖、特に重鎖抗体の球状領域）又は本質的にこのような球状領域から成るポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。用語「結合ドメイン」は（本明細書で規定されるように）抗原決定基に指向性を有するようなドメインを表す。
【００２４】
ｋ）用語「抗原決定基」は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）によって、及びより具体的には上記分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、本明細書で区別なく使用することもできる。
【００２５】
ｌ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片若しくはエピトープ）と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、上記抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」、又は「に指向性を有する」と言う。
【００２６】
ｍ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性（avidity：親和力）に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合力の評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の評価基準である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０−４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で所望の抗原と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
【００２７】
当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性（ＫＤ＝１／ＫＡ）から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤ即ち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値で分子相互作用の強さを特定することを、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）と関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
【００２８】
有意（例えば特異的）とみなされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、ＫＤは低くなる。
【００２９】
ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。結合速度ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。結合速度は、二分子相互作用に関する拡散律速結合速度定数に近づきながら１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【００３０】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定され、もう１つの分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定した分子上を通る）で測定することができる。例えば、既知のビアコアの機器を使用してこれを実施することができる。
【００３１】
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artefacts：人工産物）によって、示唆した分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかである。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性により影響され得る。
【００３２】
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods, 77,305-19, 1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子の１つの吸着に関連する、考えられ得るアーチファクトが避けられる。
【００３３】
しかし、ＫＤの正確な測定はかなりの労働集約型である可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして処理されるべきであることに留意すべきである。
【００３４】
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子との関係で結合親和性を決定するのに都合がいいと判断することができることに留意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、且つＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするためのフルオロフォア若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、又は他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持し、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化する。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃについて測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
【００３５】
ｎ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は概して、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば概して、好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドを温血動物（即ち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macacamulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus）））に好適に投与する工程と、血液試料又は他の試料を上記動物から採取する工程と、上記血液試料中の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば、以下の実験部、並びに標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbookfor Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis:A Practical Approach（1996））を参照する。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron,published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition（1982）も参照する。
【００３６】
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣの一方又は両方は増大しても又は増大しなくてもよい。
【００３７】
ｏ）本発明との関連で、「調節（"modulating" or "to modulate"）」は一般的に、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定するような標的又は抗原の活性の低減若しくは阻害のいずれか、又は代替的に活性の増大を意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（通常関与する標的又は抗原によって変わる）を用いて測定するような、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上、標的又は抗原の活性を低減若しくは阻害すること、又は代替的に（関連又は対象の）生物学的活性を増大させることを意味し得る。
【００３８】
当業者にとって明らかなように、「調節」は、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件に比べて、そのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体形態若しくはヘテロ多量体形態で結び付くパートナー、又は基質の１つ又は複数に対する標的又は抗原の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又は標的又は抗原が存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）も伴い得る。当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを用いてさらにこれを求めてもよい。
【００３９】
「調節」は、標的又は抗原が関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、そのシグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、反応、機能、経路又は活性に関して変化させる（即ち標的又は抗原及び所望の生物学的作用若しくは生理学的作用に応じて、それぞれ、アゴニストとしての、アンタゴニストとしての、又は逆アゴニストとしての活性を与える）ことも意味し得る。同様に、当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ内）アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのそのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
【００４０】
調節は例えば、標的又は抗原のアロステリック調節、及び／又は標的若しくは抗原とその基質若しくはリガンドの１つとの結合の低減若しくは阻害及び／又は標的若しくは抗原との結合に対する基質である天然リガンドとの競合も伴い得る。調節は、標的若しくは抗原、又はこれが関与する機構若しくは経路を活性化することも伴い得る。例えば、調節は、標的若しくは抗原のフォールディング若しくは立体配座に関して、又は標的若しくは抗原がフォールディングする能力、（例えばリガンドの結合の際に）その立体配座を変更する能力、他の（サブ）ユニットと会合する能力、又は解離する能力に関して変化させることも伴い得る。調節は例えば、標的若しくは抗原が、他の化合物を輸送する能力、又は他の化合物（イオン等）に対するチャネルとして働く能力を変化させることも伴い得る。
【００４１】
調節は、可逆的であっても又は不可逆的であってもよいが、薬学的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
【００４２】
ｐ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、リガンド、受容体若しくは他の結合パートナーとの結合に関する部位、触媒部位、開裂部位、アロステリック相互作用に関する部位、標的又は抗原の多量体化（ホモマー化又はヘテロ二量体化等）に関与する部位である、標的又は抗原上の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン若しくはアミノ酸残基のストレッチ、又は標的若しくは抗原の生物学的作用又は機構に関与する標的又は抗原上の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基のストレッチを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが、（本明細書中に規定のように）標的又は抗原（及び／又は標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的作用）を調節するように結合することができる、標的又は抗原上の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基のストレッチであり得る。
【００４３】
ｑ）アミノ酸配列又はポリペプチドは、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、及び最大１００００倍以上良好な親和性（上記のように、好適にＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度と表す）で第１の抗原と結合する場合、第２の標的又は抗原と比べて、第１の標的又は抗原「に特異的」であると言う。例えば、第１の抗原は、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合するＫＤよりも多くとも１０分の１、例えば多くとも１００分の１、及び好ましくは多くとも１０００分の１、例えば１００００分の１以下のＫＤ値で標的又は抗原と結合し得る。好ましくは、アミノ酸配列又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原に比べて第１の標的又は抗原「に特異的」である場合、そのアミノ酸配列又はポリペプチドは、（本明細書中に規定のように）上記第１の標的又は抗原に指向性を有するが、該第２の標的又は抗原に対しては指向性を有しない。
【００４４】
ｒ）用語「交差遮断（"cross-block", "cross-blocked" and"cross-blocking"）」は、本明細書中で区別なく使用し、アミノ酸配列又は他の結合剤（本発明のポリペプチド等）が、他の本発明のアミノ酸配列又は結合剤と所定の標的との結合を妨げる能力を意味する。本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が別のアミノ酸配列又は他の結合剤と［標的］との結合を妨げることができる範囲、ひいては本発明に従って交差遮断するということができるか否かを、競合結合アッセイを使用して求めることができる。特に好ましい定量的なアッセイの１つは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるビアコア機器を使用する。別の好適な定量的な交差遮断アッセイは、標的とのこれらの結合に関して、アミノ酸配列又は別の結合剤間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【００４５】
概して以下に、アミノ酸配列又は他の結合剤が、本発明に従って交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否かを求めるのに適したビアコアアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列又は他の結合剤のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。ビアコア機器（例えばビアコア３０００）は、製造元の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイでは、標的でコーティングされる表面を作製するのに、標準的なアミンカップリングケミストリを用いて、標的タンパク質をＣＭ５ビアコアチップと結合させる。典型的に２００個〜８００個の標的の共鳴単位をチップに結合させる（容易に測定可能なレベルの結合を与えるが、使用する試験試薬の濃度によって容易に飽和することができる量）。互いに交差遮断する能力を評価する、２つの試験アミノ酸配列（Ａ＊及びＢ＊と呼ばれる）を、好適なバッファー中で、１：１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を算出する場合、アミノ酸配列の分子量は、アミノ酸配列の全分子量を、このアミノ酸配列上の標的結合部位の数で除算したものであるとみなす。試験混合物中の各アミノ酸配列の濃度は、ビアコアチップ上に捕捉された標的分子上のこのアミノ酸配列に対する結合部位を容易に飽和するのに十分高いものとする。混合物中のアミノ酸配列は、典型的に（結合部位ベースで）１．００マイクロモル〜１．５マイクロモルである（結合ベースで）同じモル濃度にある。Ａ＊及びＢ＊を単独で含有する分離溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、試験混合物と同じバッファー中で、且つ試験混合物と同じ濃度であるとする。試験混合物を標的コーティングビアコアチップ上に通し、結合総量を記録する。それから、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を取り除くようにチップを処理する。典型的に、チップを３０ｍＭのＨＣｌで６０秒間処理することによってこれを行う。その後、Ａ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。さらに、チップを処理し、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を全て取り除く。それから、Ｂ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。次に、Ａ＊とＢ＊との混合物の最大理論結合を算出し、これは単独で標的表面上を通した際の各アミノ酸配列の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論最大よりも小さい場合、２つのアミノ酸配列は互いに交差遮断している。このように概して、交差遮断する本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤は、アッセイ中、及び本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で、記録された結合が、組合せた２つのアミノ酸配列又は結合剤の最大理論結合（直前に規定）の８０％〜０．１％（例えば８０％〜４％）、具体的に最大理論結合の７５％〜０．１％（例えば７５％〜４％）、及びより具体的に最大理論結合の７０％〜０．１％（例えば７０％〜４％）であるように、上記のビアコア交差遮断アッセイで標的と結合するものである。上記のビアコアアッセイは、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差遮断するかどうかを求めるのに使用する主なアッセイである。稀に、特定のアミノ酸配列又は他の結合剤が、ＣＭ５ビアコアチップとアミンケミストリを介して結合した標的と結合しないことがある（通常、標的上の関連の結合部位がチップとの結合によって塞がれるか、又は破壊される場合にこれが起こる）。このような場合、標識型、例えばＮ末端Ｈｉｓ標識型の標的（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA；2005  カタログ番号１４０６−ＳＴ−０２５）を用いて交差遮断を求めることができる。この特定のフォーマットで、抗Ｈｉｓアミノ酸配列をビアコアチップに結合させた後、Ｈｉｓ標識した標的をチップの表面上に通し、抗Ｈｉｓアミノ酸配列で捕捉する。各チップ再生サイクル後に、抗Ｈｉｓアミノ酸配列コーティング表面上に、新たなＨｉｓ標識した標的を充填し戻すことを除いて、本質的に上記のように、交差遮断解析を行う。Ｎ末端Ｈｉｓ標識した［標的］を使用する与えられた例の他に、代替的にＣ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用することができる。さらに、当該技術分野で既知の様々な他の標識及び標識結合タンパク質の組合せをこのような交差遮断解析に使用することができる（例えば、抗ＨＡ抗体によるＨＡ標識；抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ標識；ストレプトアビジンによるビオチン標識）。
【００４６】
概して以下に、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は他の結合剤が、本明細書中に規定のように、交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否か求めるＥＬＩＳＡアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列（又は本発明のポリペプチド等の他の結合剤）のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。このアッセイの一般原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングした標的に指向性を有するアミノ酸配列又は結合剤を有することである。過剰量の第２の、潜在的に交差遮断する抗標的アミノ酸配列を溶液中に添加する（即ちＥＬＩＳＡプレートと結合しない）。それから、限定量の標的をウェルに添加する。コーティングしたアミノ酸配列と溶液中のアミノ酸配列とは、限定数の標的分子の結合に対して競合する。プレートを洗浄し、コーティングしたアミノ酸配列と結合していない過剰な標的を取り除き、また第２の溶液相のアミノ酸配列及び第２の溶液相のアミノ酸配列と標的との間に形成される任意の複合体を取り除く。その後、標的を検出するのに適切な試薬を使用して、結合標的の量を測定する。コーティングしたアミノ酸配列を交差遮断することができる溶液中のアミノ酸配列によって、第２の溶液相のアミノ酸配列の非存在下でコーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数に比べて、コーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数を低減させることができる。アミノ酸配列を固定化させるように、第１のアミノ酸配列、例えばＡｂ−Ｘを選択する場合、第１のアミノ酸配列をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後、プレートを好適な遮断溶液で遮断し、その後添加する試薬の非特異的な結合を最小にする。Ａｂ−Ｙ［標的］結合部位の１つのウェル当たりのモル数が、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中に使用したＡｂ−Ｘ［標的］結合部位の１つのウェル当たりのモル数の少なくとも１０倍になるように、その後、過剰量の第２のアミノ酸配列、即ちＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。それから、添加した［標的］の１つのウェル当たりのモル数が、各ウェルをコーティングするのに使用したＡｂ−Ｘ［標的］結合部位のモル数の多くとも２５分の１になるように、［標的］を添加する。好適なインキュベート期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出する試薬を添加し、コーティングした抗［標的］アミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）と特異的に結合した標的の量を測定する。アッセイに関するバックグラウンドシグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｙ）、［標的］バッファーのみ（即ち標的が存在しない）及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。アッセイに関する陽性対照シグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列バッファーのみ（即ち第２の溶液相のアミノ酸配列が存在しない）、標的及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍になるように、ＥＬＩＳＡアッセイを行い得る。どのアミノ酸配列をコーティングアミノ酸配列として使用し、どのアミノ酸配列を第２の（競合）アミノ酸配列として使用するかという選択に起因する任意のアーチファクト（例えば有意に異なる、［標的］に対するＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙとの親和性）を避けるために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットで行い得る：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｙが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合であり、また２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｘが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１又はフォーマット２のいずれかで、溶液相の抗標的アミノ酸配列が、溶液相の抗標的アミノ酸配列の非存在下で得られた標的検出シグナル（即ち陽性対照ウェル）に比べて、標的検出シグナル（即ちコーティングしたアミノ酸配列で結合した標的の量）の６０％〜１００％、具体的に７０％〜１００％、及びより具体的に８０％〜１００％の低減をもたらすことができる場合、交差遮断すると定義する。
【００４７】
ｓ）本明細書でさらに記載されるように、ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０の範囲内、好ましくは１１２〜１１５、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディの部分、断片、類似体又は誘導体（本明細書中にさらに記載されるように）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意すべきである。
【００４８】
ｔ）ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 （1-2）:185-195の論文（例えばこの論文の図２を参照されたい）においてラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、又は本明細書に参照されるようにKabat et al.（"Sequence of proteins ofimmunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従うと、ナノボディのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（即ちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングで可能な数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）ことに留意すべきである。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）ということができる］。ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ由来のＶＨＨドメイン及びナノボディに適用することもできる）は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883（1989））によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、特許請求の範囲及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
【００４９】
ｕ）「標的分子（"Target Molecule" or "Target Molecules"）」又は「標的」という用語は、細菌及びウイルスを含む生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて、疾患の発症又は進行又は維持に関与し得る生物学的機能を有するタンパク質を意味する。 
【００５０】
ｖ）本発明の構築物中に存在する単一可変ドメインは単一抗原結合単位を形成する任意の可変ドメインであり得る。一般的に、このような単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、又は（この場合通常、本明細書中にさらに記載のように、少なくとも１つのＣＤＲを形成するアミノ酸残基を少なくとも幾つか含有する）このようなアミノ酸配列の任意の好適な断片から本質的に成るアミノ酸配列である。このような単一可変ドメイン及び断片は、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能であるようなものが最も好ましい。したがって、単一可変ドメインは、単一抗原結合単位（即ち例えば、機能的な抗原結合ドメインを形成するのに、例えばＶＨ／ＶＬ相互作用により別の可変ドメインと相互作用する必要がある、例えば従来の抗体及びＳｃＦｖ断片に存在する可変ドメインの場合のように、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないような本質的に単一可変ドメインから成る機能的な抗原結合単位）を形成することが可能であれば、例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）若しくはそれらの好適な断片を含み得る。
【００５１】
例えば、単一可変ドメインは、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（本明細書に規定のように、ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、又はこれらのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の概説に関しては、上記で言及された従来技術、及び欧州特許第０３６８６８４号明細書も参照する。用語「ｄＡｂ」に関しては、例えばWard et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 （6242）: 544-6）、Holtet al.（Trends Biotechnol., 2003, 21（11）:484-490）、例えば国際公開第０４／０６８８２０号パンフレット、国際公開第０６／０３０２２０号パンフレット、国際公開第０６／００３３８８号パンフレット、及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願を参照する。哺乳動物起源ではないため、本発明との関連ではあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、或る特定種のサメ由来である可能性があることにも留意すべきである（例えばいわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号パンフレットを参照されたい）。
【００５２】
特に、本発明のアミノ酸配列はナノボディ（登録商標）又はその好適な断片であり得る（備考：ナノボディ（Nanobody）（登録商標）、ナノボディ（Nanobodies）（登録商標）及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N. V.の商標である）。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる説明に関しては、Reviews in Molecular Biotechnology 74（2001）, 277-302におけるMuyldermansによる総説、及び一般的な背景技術として言及される以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；Algonomics N.V.及びAblynx N. V.の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；カナダの国家研究会議（National Research Council）による国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにAblynx N.V.による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、並びにAblynx N.V.によるさらなる公開特許出願を参照する。これらの出願で言及されるさらなる従来技術、特に国際出願国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの４１頁〜４３頁で言及される参考リストも参照する（このリスト及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。これらの参考文献で記載のように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、１つ又は複数のフレームワーク配列における１つ又は複数の「特徴的な（Hallmark）残基」の存在を特徴とし得る。
【００５３】
ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、及び他の修飾体（modifications）、その一部又は断片、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（リンカー配列の幾つかの非限定的な例を含む）、並びにナノボディ及びその調製物の半減期を増大する様々な修飾を含む、ナノボディのさらなる説明は例えば、国際公開第０７／１０４５２９号パンフレットに見ることができる。
【００５４】
ｗ）「非融合二量体」との関連で「非融合」という用語は、直接的な遺伝子連結を介して、又は文献で既知のような専用の二量体化配列（例えばＪｕｎ−Ｆｏｓ相互作用、重鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの相互作用等）を介しては得ることができない正常な（例えば保存及び／又は生理的）条件下で存在する全てが安定した連結（又はまた本明細書中で「安定した」と言及されるより特異的な条件）を意味する。このような連結は、例えばファンデルワールス力、水素結合及び／又はアミノ酸残基の反対の電荷を保有するペプチド間の力等の化学的な力によるものであり得る。さらに、構造変化等の付加的な構成要素が役割を果たし得る。このような構造変化は、例えばフレームワーク領域の交換、例えばフレームワーク領域４のフレームワーク領域に由来するβ鎖の交換（「ドメインスワッピングパターン」とも呼ばれる現象）であり、単量体構造立体配座におけるＣＤＲ３−ＦＲ４領域を安定化することにより防ぐことができる。対照的に、遺伝子的に連結した又は融合した構築物では、融合が２つのエンティティ（entities）を融合タンパク質として発現させ、連結が共有結合的性質を有する（例えば２つのエンティティ間にペプチドリンカーを使用して、或るタンパク質ドメインのＣ末端と他のタンパク質ドメインのＮ末端とを連結する）。「安定した二量体」又は「安定したＮＦＤ」（複数可）（stable NFDs）との関連で「安定した」という用語は、５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％が、測定の時点でＮＦＤの形態であることを意味し、ここで１００％はＮＦＤとその対応する単量体との量（例えば体積当たりのモル量、又は体積量当たりの重量）を表す。本明細書中で規定のような、即ちその二量体の性質に関する安定性の測定は、サイズ排除クロマトグラフィを使用する（室温でのＰＢＳバッファーのような標準的な実験室条件を使用する）こと、及び必要に応じて、試験される試料の前濃縮工程により実施することができる。同定された二量体及び単量体のピークのサイズ排除クロマトグラムにおけるピーク下面積は、単量体及び二量体、即ちＮＦＤの相対量を表す。ＮＦＤ（NFD and/or NFDs）は本明細書において区別なく使用し、このためＮＦＤが使用される場合はいつでも、ＮＦＤ（NFDs）も意味することとなり、ＮＦＤ（NFDs）が使用される場合はいつでも、ＮＦＤも意味することとなる。
【００５５】
非融合二量体（ＮＦＤ）
或る特定の条件又はアミノ酸配列変化は、それがなければ安定した単量体単一可変ドメインを安定した二量体分子、及び場合によっては多量体分子に変換させることができる。このプロセスにおける鍵は、２つの単一可変ドメインが非共有的相互作用の増大を示すことが可能である条件を提供することである。ＮＦＤは、例えばプロセス誘導会合と（以下「ＰＩＡ」とも）呼ばれるプロセスで作製される。この二量体化はとりわけ、濃度駆動型（driven）事象であり、例えば調製プロセスにおいて高タンパク質濃度（例えば５０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質）、迅速なｐＨ変動（例えば１カラム容量以内の２単位のｐＨ変動）及び／又は迅速な塩交換（例えば１カラム容量での塩交換）を組合せることにより高めることができる。高濃度は、個々の単量体分子の相互作用の可能性を高めるが、ｐＨ及び塩変化は、一時的（部分的）アンフォールディングを誘導し、及び／又はタンパク質構造の疎水性相互作用及び／又は転位を促進する可能性がある。これらのＮＦＤは最終的に治療剤若しくは予防剤中に、又は治療剤若しくは予防剤として使用することができるため、「ＮＦＤ（単数又は複数）」という用語は、ＮＦＤが、（ＮＦＤが安定している条件、例えば特別な選別条件、例えば最大２．５年間の保存条件が具体的に説明されていなければ）ＮＦＤ（単数又は複数）を含む溶液中、例えば生理学的調製物、例えば生理学的バッファー中にあることを意味するように（又は区別なく使用されることが）意図される。代替的に、ＮＦＤは、数週間、例えば４週間にわたって例えば比較的高温（例えば３７℃）のようなストレスの多い保存条件下でも作製することができる。さらに、ＮＦＤを、二量体化しやすい単一可変ドメインのＣＤＲ３及び／又はフレームワーク領域４の近くに不安定なアミノ酸残基を導入することにより（さらに改善した、即ちより迅速な反応速度で）作製することができる（実験部を参照されたい、ポリペプチドＦ（即ち突然変異ポリペプチドＢ）が、同じ条件下でポリペプチドＢよりも迅速にＮＦＤを形成している）。
【００５６】
二量体化する必要がある構成要素の高濃度は、例えばクロマトグラフィ（例えばプロテインＡ、イオン交換、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ、即ちＩＭＡＣ等のアフィニティクロマトグラフィ、及び疎水性相互作用クロマトグラフィ、即ちＨＩＣ）、単一可変ドメインのＴｍ付近の温度曝露、及びアンフォールディングペプチドである１Ｍ〜２Ｍのグアニジンのような溶媒により、単一可変ドメイン、例えばナノボディの免疫グロブリン構造を部分的にアンフォールディングする条件を含む多種多様の手順を用いて達成することができる。例えばクロマトグラフィでは、即ち例えばｐＨ変動又は塩勾配（後で説明する）を使用する、カラムからのタンパク質の溶出プロセス中に、ＮＦＤを形成することができる。通常要求される濃度及び／又はＮＦＤを形成する正確な方法は、本発明のポリペプチドそれぞれに対して確定しなければならず、本発明のポリペプチドそれぞれでは不可能であり得る。単独（例えばポリペプチドＢ及びＦ）及び／又は構築物（例えばポリペプチドＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）のいずれかで或る特定の単一可変ドメインが存在し、それらがＮＦＤを形成することは本発明者らの経験から得た知識（experience）である。二量体化に重要なのは、比較的短いＣＤＲ３（例えば３〜８アミノ酸、より好ましくは４〜７アミノ酸、さらにより好ましくは５〜６アミノ酸、例えば６アミノ酸））及びＣＤＲ３及び／又はＦＲ４の近くの不安定因子であり得る。さらに、例えば使用濃度での単一可変ドメイン（複数可）を含むポリペプチドの最大可溶性等の高濃度（例えばプロテインＡ樹脂１ｍｌ当たり５ｍｇのポリペプチドＡ−実験部を参照されたい）、又は数週間にわたる高温（例えば４週間にわたる３７℃）、低ｐＨ（例えばｐＨ６より低いｐＨ）、高濃度（５０ｍｇ／ｍｌを超える、例えば６５ｍｇ／ｍｌ）での保存が、適度な収率のＮＦＤ形成を得るのに要求され得る。
【００５７】
例えば最大カラム装填量で働くカラムクロマトグラフィの次に、ＮＦＤを得るのに同様に要求される高濃度を、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション（diafiltration：膜分離）等の濃縮方法、例えば低イオン強度バッファーでの限外濾過により達成することができる。
【００５８】
このプロセスは、ＮＦＤの形成が一価、二価及び三価の単量体構成要素（即ち単一可変ドメイン（複数可）を含むポリペプチド）で、またさらに単一可変ドメイン−ＨＳＡ融合体で観察されたので、特定数の単一可変ドメインとは連結していない。ポリペプチドが２つの異なる単一可変ドメインを含む場合、ＮＦＤは、同一の又は異なる（好ましくは同一の）単一可変ドメインのみで、及び通常単一可変ドメイン（複数可）の１つ、例えばＮＦＤを形成しやすいとして同定されるもの（例えばポリペプチドＢ）のみで形成され得る（図２ｂも参照されたい）。
【発明が解決しようとする課題】
【００５９】
本発明の目的は、可溶性で安定性した、例えば或る特定の濃度範囲、バッファー及び／又は温度条件内で安定している、分子を標的化し、及び／又はこれにより細胞応答を阻害又は促進するのに使用され得るＮＦＤと呼ばれる二量体複合体を提供することである。単一可変ドメイン等の単量体構成要素を含むＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｍｏとも呼ばれる）；２つの共有結合した単一可変ドメイン等の二量体構成要素を含むＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｄｉとも呼ばれる）；３つの共有結合した単一可変ドメイン等の三量体構成要素を含むＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｔｒｉとも呼ばれる）；４つの共有結合した単一可変ドメイン等の四量体構成要素を含むＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｔｅとも呼ばれる）；及び多量体で共有結合した単一可変ドメイン等の４つを超える（即ち多量体）構成要素を含むＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｍｕとも呼ばれる）が本明細書中に記載される（このような構造の概要図に関しては図２ａ及び図２ｂを参照されたい）。ＮＦＤは、同一の単一可変ドメイン又は異なる単一可変ドメインを含有してもよい（図２ｂ）。構成要素（ポリペプチド）が異なる単一可変ドメイン、例えばナノボディから成る場合、ポリペプチドにおける単一可変ドメインの１つだけが二量体化することが好ましいことは本発明者らの経験から得た知識である。例えば三価ポリペプチドの二量体化単位（単一可変ドメイン、例えばポリペプチドＢ又はポリペプチドＦ等のナノボディ）（図２ｂを参照されたい）は構築物の中心部、Ｃ末端又はＮ末端にあり得る。
【００６０】
本発明の別の目的は、上記ＮＦＤを作製方法及び使用を提供することである。
【００６１】
本発明のさらに別の目的は、このようなＮＦＤをどのように回避するかという情報を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００６２】
これらの上記の及び他の目的は本発明により提供され、本発明は広範な意味で、新生物性、免疫性又は他の障害の治療に使用され得る方法、キット、非融合二量体に関する。このため、本発明は、多種多様の障害を患う患者を治療するのに使用され得る、例えばナノボディ（単数又は複数）（例えばポリペプチドＢ）等の単一可変ドメイン（単数又は複数）を含む安定したＮＦＤを提供する。これに関して、本発明のＮＦＤは驚くべきことに、該ＮＦＤを、患者の治療に、患者における疾患の診断評価に、及び／又はそれを必要とする患者における疾患モニタリング評価に特に有用なものにする生化学的特性を示すことが見出されている。より具体的には、予想外なことに、或る特定の単一可変ドメイン、そのサブグループ（ヒト化ＶＨＨ又は真のラクダ化ヒトＶＨを含む）、及びそのフォーマット化型（実際、これはヒトＶＨ及びその誘導体でも実行可能である）を作製し、例えば製造可能性及び有効性に関して有益な特性を有する、安定した二量体（即ちＮＦＤ−Ｍｏ、ＮＦＤ−Ｄｉ、ＮＦＤ−Ｔｒｉ、ＮＦＤ−Ｔｅ又はＮＦＤ−Ｍｕ）を形成することができることが見出された。単一可変ドメインは、例えば温度変動時には変性しないが、冷却時には凝集を伴わず可逆的に再フォールディングし（Ewert et al Biochemistry 2002, 41:3628-36）、この特徴が抗原結合二量体の効率的な形成に寄与し得ることが知られている。
【００６３】
ＮＦＤには多くの用途で特定の利点がある。治療的用途では、ＮＦＤ−Ｍｕ、例えばＮＤＦ−Ｄｉ結合剤は、標的となる受容体のオリゴマー化が必要である状況で、例えば致死受容体（ＴＲＡＩＬ受容体とも称される）に関して有益であり得る。例えばＮＦＤ−Ｄｉは、その各構成要素の密接な相互作用のために、「従来の」共有結合した対応する四量体とは異なる空間的アラインメントを有すると推測され、このため抗原結合に対する正の又は負の効果を提供し得る（或る特定のＮＦＤの概略図に関しては図２を参照されたい）。さらに、ＮＦＤ、例えばＮＦＤ−Ｍｏは、従来の共有結合した単一可変ドメイン二量体よりも効果的に多量体標的分子と結合し得る。その上、ヘテロマーＮＦＤは、長い半減期を伴って、標的となる特異的な結合剤、及び血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンとの結合剤を含み得る。さらに、「従来の」共有結合した二量体（例えばアミノ酸配列リンカーを介する）は発現の課題を有し（或る特定の反復コドンに利用可能な十分なｔＲＮＡを有しないことによる）、このため初めに単量体を作製し、その後例えば本明細書中に記載のプロセスにより、発現後プロセスで単量体をＮＦＤに変換させることが有益であり得る。これにより、共有結合した二量体と比較してＮＦＤでより高い収率を得ることができる。同様に、例えばＮＦＤ−Ｄｉ又はＮＦＤ−Ｔｒｉの全収率が関連の共有結合した四量体又は六量体と比較して高くなることが期待され得る。全体的な発現レベルが高くなることは、ＮＦＤアプローチを選択するための、例えばコスト決定における最も重要な因子であり得る。例えば、組換えタンパク質の発現収率及び分泌効率は鎖の大きさに応じて決まることが報告されている（Skerra & Pluckthun, 1991, Protein Eng. 4, 971）。その上、低いリンカー領域は、タンパク質全体でプロテアーゼに対する感受性が低いリンカー領域を意味し得る。本明細書中に記載の方法に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで単一可変ドメインの多量体化の影響を試験することも有用であり得る。全体としてみれば、本発明の研究結果は、これまでに知られるアプローチ、即ち主に共有結合した単一可変ドメインフォーマットを用いるよりも、基本的なスカフォールド構造としてフォーマット化単一可変ドメインを使用して薬物開発においてさらに効果的な解決策を提供し得ることが期待される。
【００６４】
本発明のＮＦＤは、広範な濃度（即ち通常は低ｎＭ範囲）、温度（３７℃）、時間（数週間、例えば３週間〜４週間）及びｐＨ（中性、ｐＨ５、ｐＨ６又はｐＨ１のような胃ｐＨ）等の所望の範囲の生物学的に関連する条件下で安定であり得る。さらなる実施の形態では、本発明のＮＦＤは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばヒトの身体内で、長期間、例えば１週間〜４週間又は１ヶ月〜３ヶ月、及び最大６ヶ月〜１２ヶ月にわたって（例えば９５％の割合で、ここで１００％は単量体形態と二量体形態との量である）安定であり得る。さらに、本発明のＮＦＤは、広範な濃度（例えばｍｌ当たりでｍｇ範囲のような高濃度）、温度（−２０℃、４℃、２０℃又は２５℃）、時間（数ヶ月、数年間）、有機溶媒及び洗剤に対する耐性（配合、製剤を得るプロセスにおける）等の所望の範囲の保存に関連する条件下でも安定であり得る。さらに、驚くべきことに、グアニジンＨＣｌ（ＧｄｎＨＣｌ）による変性には、約１Ｍを超えるＧｄｎＨＣｌが必要であり、それ以外が同じ条件下ではポリペプチドＢ単量体よりもポリペプチドＢ二量体を変性することが見出されている（実験部を参照されたい）。さらに、ポリペプチドＢ  ＮＦＤ−ＭｏにおいてＦＲ４がスワッピングされているという驚くべき研究結果（本発明による他のＮＦＤでも同様である可能性がある）は、実際にこの二量体が安定した複合体を形成し、単一可変ドメイン又はナノボディ構造をさらに安定化することができることを示している。さらに、ヒト化部位の１つ（実験部：ポリペプチドＥ対ポリペプチドＢを参照されたい）がフレームワークとのより弱いＣＤＲ３相互作用を引き起こす可能性があり、このため二量体化を誘発しやすいより伸長可能なＣＤＲ３が利用可能であるという証拠が存在する。
【００６５】
このため、本発明の好ましいＮＦＤは以下の範囲内で（二量体性質に関して）安定している（ここで、上記範囲はさらに組合せてもよく、例えば２、３、４又はそれ以上の範囲を以下に記載のように組合せて、他の有用な実施の形態を形成してもよい）：
好ましい実施の形態のＮＦＤは、生理学的温度条件下で、即ち３７℃付近の温度で、長時間、例えば薬物を必要とする患者に送達した時点から最大１日間、より好ましくは１週間、より好ましくは２週間、さらにより好ましくは３週間、最も好ましくは４週間にわたって（二量体性質に関して）安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、様々な保存温度条件下で、即ち−２０℃、より好ましくは４℃、より好ましくは２０℃、最も好ましくは２５℃等の温度で、長時間、例えば最大６ヶ月、より好ましくは１年間、最も好ましくは２年間にわたって（二量体性質に関して）安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、様々な生理学的ｐＨ条件下で、即ちｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ５〜８、最も好ましくはｐＨ１〜８等のｐＨ範囲で、長時間、例えば薬物を必要とする患者に送達した時点から最大１週間、より好ましくは２週間、さらにより好ましくは３週間、最も好ましくは４週間にわたって（二量体性質に関して）安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、様々な生理学的濃度条件下で、即ち例えばリン酸緩衝溶液等のｐＨ７バッファー及び／又は例えばまた血清、例えばヒト血清中でＮＦＤ濃度が２００ｎｇ（ＮＦＤ）／ｍｌに満たない溶媒、より好ましくは１００ｎｇ（ＮＦＤ）／ｍｌに満たない溶媒、さらに好ましくは５０ｎｇ（ＮＦＤ）／ｍｌに満たない溶媒、最も好ましくは１０ｎｇ（ＮＦＤ）／ｍｌに満たない溶媒で（二量体性質に関して）安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の濃度で、３７℃で、最大１日及びそれ以上、例えば１週間、より好ましくは２週間、より好ましくは３週間、及び最も好ましくは最大４週間、安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、様々な生理学的濃度条件下で、即ち約１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは６０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは７０ｍｇ／ｍｌのＮＦＤ濃度で、３７℃付近の温度で、長時間、例えば薬物を必要とする患者に送達した時点から１日間、より好ましくは１週間、より好ましくは２週間、さらにより好ましくは３週間、最も好ましくは４週間にわたって（二量体性質に関して）安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、様々な保存濃度条件下で、即ち例えばリン酸緩衝溶液等のｐＨ７バッファー中でＮＦＤ濃度が０．１ｍｇ（ＮＦＤ）／ｍｌを超える溶媒、より好ましくは１ｍｇ（ＮＦＤ）／ｍｌを超える溶媒、より好ましくは５ｍｇ（ＮＦＤ）／ｍｌを超える溶媒、より好ましくは１０ｍｇ（ＮＦＤ）／ｍｌを超える溶媒、及び最も好ましくは２０ｍｇ（ＮＦＤ）／ｍｌを超える溶媒で（二量体性質に関して）安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の濃度で、−２０℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間、及び最も好ましくは最大４年間、安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の濃度で、４℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間、及び最も好ましくは最大４年間、安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の濃度で、２５℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間、及び最も好ましくは最大４年間、安定している；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、有機溶媒、例えばエタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサノール及び／又はその他等のアルコールとの混合物（例えば医薬製剤又はプロセス中間体）中で（二量体性質に関して）安定しており、ここでアルコール（好ましくはエタノール）は、長期間、特定の温度で、例えば−２０℃で最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間のような長期保存にわたって最大５％、より好ましくは１０％、さらにより好ましくは１５％、さらにより好ましくは２０％、最も好ましくは３０％で添加することができる。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の混合物中で、４℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間、安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の混合物中で、２５℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間、安定しており、ここで例えばアルコール（好ましくはエタノール）等の有機溶媒を、最大５％、より好ましくは１０％、さらにより好ましくは１５％、さらにより好ましくは２０％、最も好ましくは３０％で添加することができる；
好ましい実施の形態のＮＦＤは、長期間、特定の温度で、例えば−２０℃で最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間のような長期保存にわたって、最大０．０１％、より好ましくは０．１％、最も好ましくは１％の洗剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘのような非イオン系洗剤との混合物（例えば医薬製剤又はプロセス中間体）中で、（二量体性質に関して）安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の混合物中で、４℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間、安定している。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤは上記の混合物中で、２５℃で、最大６ヶ月及びそれ以上、例えば１年間、より好ましくは２年間、より好ましくは３年間及び最も好ましくは最大４年間、安定している。
【００６６】
本発明の別の実施の形態は、ＮＦＤが単量体と比較して、２つの構成要素の内の少なくとも１つの結合親和性を保持する、例えば上記親和性又はＮＦＤの親和性が、元の単量体ポリペプチドの結合親和性の１０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、若しくはさらに好ましくは９０％以上であり得る、又はＮＦＤが、単量体と比較して改善された見掛けの親和性を伴って複数の機能的な結合構成要素を有する、例えばＮＦＤが、元の単量体ポリペプチドと比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍、より好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍改善された親和性を有することである。
【００６７】
本発明の別の実施の形態は、ＮＦＤが、単量体と比較して、２つの構成要素の内の少なくとも１つの結合親和性を部分的に又は完全に喪失した、例えば上記親和性又はＮＦＤの親和性が、元の単量体ポリペプチドの結合親和性の９０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらにより好ましくは１０％以上、若しくはさらにより好ましくは１％以上であり得る、又は最も好ましくは結合親和性は全く検出することができない、又はＮＦＤが、単量体と比較して低減された見掛けの親和性を伴って複数の機能的な結合構成要素を有する、例えばＮＦＤが、元の単量体ポリペプチドと比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍、より好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍低減された親和性を有し得ることである。
【００６８】
さらに、本発明の実施の形態は、ＮＦＤとその単量体構成要素とを含む調製物、例えば３０％を超えるＮＦＤを含む調製物（例えば上記ＮＦＤを形成する２つの同一の単量体構成要素）、例えばより好ましくは３５％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは４０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは５０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは６０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは７０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは８０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは９０％を超えるＮＦＤを含む調製物、さらにより好ましくは９５％を超えるＮＦＤを含む調製物、及び／又は最も好ましくは９９％を超えるＮＦＤを含む調製物である（ここで１００％はＮＦＤとその対応する単量体単位との総量を表す）。好ましい実施の形態では、調製物中の上記比率は、例えばＮＦＤに関して本明細書中に記載のように決定することができる。
【００６９】
その上、本発明の別の実施の形態は、ＮＦＤを含む、より好ましくは３０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物（例えば２つの同一の単量体構成要素が上記ＮＦＤを形成する）、例えばより好ましくは３５％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは４０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは５０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは６０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは７０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは８０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは９０％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、さらにより好ましくは９５％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物、及び／又は最も好ましくは９９％を超えるＮＦＤを含む医薬組成物である（ここで１００％はＮＦＤとその対応する単量体単位との総量を表す）。
【００７０】
本発明の別の実施の形態は、単量体形態及び二量体形態、即ちＮＦＤのポリペプチドを含む混合物であり、上記調製物は、１ヶ月間、４℃で、１ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ、より好ましくは０．０１ｍＭ、より好ましくは０．００１ｍＭ又は最も好ましくは１００ｎＭの全濃度（即ち単量体形態及び二量体形態の濃度）で中性ｐＨバッファー中で安定しており、また上記調製物は、２５％を超える、より好ましくは３０％を超える、より好ましくは４０％を超える、より好ましくは５０％を超える、より好ましくは６０％を超える、より好ましくは７０％を超える、より好ましくは８０％を超える、又はより好ましくは９０％を超える二量体、即ちＮＦＤを含む。
【００７１】
本明細書中に記載の方法論は原則として、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片又は単一可変ドメインのいずれかを二量体化又は多量体化するのに適用可能である、又は適用可能であり得るが、単一可変ドメインに対して使用するのが最も有益である。この場合、二量体断片、即ちＮＦＤを構築することができ、該ＮＦＤは安定しており、明らかにされると共に、現在の展望を超えて上記単一可変ドメインの適用性を拡大する。好ましい実施の形態では、ＮＦＤは本明細書中に記載の方法に従って天然由来の、例えばラマ若しくはラクダ由来のＶＨＨから、又はそのヒト化型、特に例えば国際公開第２００６／１２２８２５号パンフレット、若しくは本明細書中の図１にも記載される、或る特定のいわゆる特徴的な（hallmark）残基、例えば前の軽鎖界面残基を形成する残基が自然状態で得られる単一可変ドメインに由来するものと変わらないままであるヒト化型から得ることができる。さらに好ましい実施の形態では、ＮＦＤはポリペプチドＢと類似のＣＤＲ３及びＦＲ４アミノ酸残基（配列番号９）を有する単一ドメイン抗体（又はナノボディ）を少なくとも１つ含むポリペプチドから得ることができ、例えばＮＦＤは、配列番号９と８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性であるＣＤＲ３及びＦＲ４領域を有するナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチドから得ることができる。
【００７２】
これまでは、単一可変ドメインに基づく結合部位の数の増大は、遺伝子レベルで又は他の相互作用ドメインを介して（例えばＦｃ、Ｊｕｎ−Ｆｏｓ、重鎖相互作用、ＶＬ−ＶＨ抗体ドメイン相互作用等のＣＨ２／ＣＨ３定常ドメインとの融合を介して）共有結合したドメインの調製を意味していたが、現在では代替的に後でタンパク質レベルでこのようなエンティティを形成することが可能である。これらの非融合二量体は３つの主な特徴を組合せている：（ａ）（遺伝子的方法に対して）生化学的方法により、（例えば半減期が長い、標的分子に対する及び血清タンパク質に対する）１つ又は複数の特異性を有する、１つ又は複数の単一可変ドメインをＮＦＤに組合せる可能性、（ｂ）（「制御していない（uncontrolled）」凝集に対して）抗原結合を保持又は消失させる制御した二量体相互作用、並びに（ｃ）（実用的及び経済的理由から）例えば長期保存に十分な安定性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ適用、即ち例えば３７℃での長時間にわたる適用（これらのＮＦＤの商業的使用に関する重要な要件）。 
【００７３】
このため、本発明のさらなる目的は、二重官能性又はさらに多重官能性の結合部位を有する新たな個々の及び安定したＮＦＤを作り出すことである。単一可変ドメインを含有する抗体断片融合タンパク質は、例えば本明細書中に記載のように特異的で且つ改善された特性を示す生化学的方法により作製することができることが見出されている。例えば、本発明の特定の実施の形態は、標的分子に対する、単一可変ドメイン（複数可）、例えばナノボディ（単数又は複数）を含む第１のポリペプチドと、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに対する、単一可変ドメイン（複数可）、例えばナノボディ（単数又は複数）を含む第２のポリペプチドとを含むＮＦＤ（単数又は複数）である（例えば実験部におけるポリペプチドＣ及びポリペプチドＥ（それぞれが受容体標的及びヒト血清アルブミンと結合する）を参照されたい；また図２ａ及び図２ｂも参照されたい）。二重特異性を利用する他の例は、Kufer et al, Trends in Immunology 22 : 238 （2004）で見出すことができる。２つの異なる抗原結合単一可変ドメインを使用する場合、ＮＦＤを産生する手順は、ホモ二量体に対してヘテロ二量体の形成を促進するように微調整することができ、又は代替的にその後にこれらの形態を分離する手順を続けることができる。
【００７４】
したがってさらに、本発明の目的は、第１の工程で本質的に単一可変ドメインから成る単量体ポリペプチドを提供する（又は選択する）ことであり、上記ポリペプチドは、プロセス誘導会合（ＰＩＡ）又は本明細書中に記載の他の代替方法により、互いに（with itself）二量体化することが可能である。
【００７５】
より具体的には、本発明者らは本発明において、例えば、本明細書中に記載のプロセスにより二量体を形成する、抗体断片を含む調製物又は単一可変ドメイン（複数可）を含むポリペプチドに関してスクリーニングする工程を含む方法により得ることができるＮＦＤを説明している。したがって上記ポリペプチドを同定することを含む上記スクリーニング方法は、ＮＦＤの生成における第１の工程であり得る。本明細書中に記載の複数の「ＰＩＡ」方法は、その単量体構成要素を含む出発調製物において二量体を形成させるのに使用することができる。現在のところ、二量体が好適な条件下で、例えば本明細書中に記載のようなプロセス誘導会合（ＰＩＡ）で形成され得るという兆候がある。兆候は、現在のところ十分であり、サイズ排除クロマトグラフィにおける例えばプロテインＡ精製画分が少量だけ、標準的な精製プロトコルにおいて二量体と推定されるものとして溶出されていることを単に意味し得る。二量体化が示唆され、後に（例えば解析用ＳＥＣ、動的光散乱及び／又は解析用超遠心分離により）確認されると、（例えばカラム装填量の増大、部分的なアンフォールディングに有利に働く条件、疎水性相互作用に有利に働く条件、多少の時間、例えば数週間、例えば４週間の例えば３７℃のような高温曝露、アミノ酸残基を不安定にさせるＣＤＲ３の導入等により）二量体化に有利に働くため、又は二量体化を最小限に抑えるため（反対の戦略）、さらなる改善を開始することができる（例えば収率の増大のために）。
【００７６】
本発明はさらに、本発明に従って及び本明細書中に規定のように、ＮＦＤを形成することが可能である、単一可変ドメインを少なくとも１つ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含む単量体ポリペプチドを選択する方法であって、ＮＦＤが安定しており、好ましくは単量体ポリペプチドに比べて、標的分子に対する見掛けの親和性が同程度である又はより良好であることを特徴とする、方法に関し、このことは結合部位が活性であるか、又は少なくとも一部が活性であることを示す。上記親和性が、元の単量体ポリペプチドの結合親和性の１０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、又はさらにより好ましくは９０％以上であり、例えば元の単量体ポリペプチドと比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍、より好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍改善された見掛けの親和性を有し得る。上記親和性は、当該技術分野で既知の特徴、例えば解離定数、即ちＫｄ、親和性定数、即ちＫａ値、ｋｏｆｆ値及び／又はｋｏｎ値で表すことができ、これら及び他のものはＮＦＤとその標的分子との結合強度を合理的に説明することができる。
【００７７】
その上さらに、本発明は、本発明に従って及び本明細書中に規定のように、ＮＦＤを形成することが可能である、単一可変ドメインを少なくとも１つ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含む単量体ポリペプチドを選択する方法であって、ＮＦＤが安定しており、好ましくは標的分子、例えばヒト血清アルブミンに対する見掛けの親和性を有しないことを特徴とする、方法に関する。
【００７８】
上記選択する方法は、単量体出発材料を含む調製物、即ち単一可変ドメインを少なくとも１つ含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドを、当業者に既知の方法により、例えば上記ポリペプチドをカラム、例えばプロテインＡカラムに装填することにより、樹脂において高濃度、例えば５ｍｇ／ｍｌを超える濃度に、カラム容積（capacity）の過装填量近くまで（例えば樹脂プロテインＡ  １ｍｌ当たり最大２ｍｇ〜５ｍｇのポリペプチド）濃縮する工程と、それから任意で「急な（steep）」ｐＨ変動で（「急な」とは、例えば特に１工程における（即ち迅速なバッファー交換）又は１カラム体積、２カラム体積若しくは３カラム体積以内での（より好ましくは１カラム体積又は迅速なバッファー交換）ｐＨの変動又は変化（例えばＨ＋濃度の１０倍、より好ましくは１００倍又はより好ましくは１０００倍の低減又は増大）を意味する）、上記ポリペプチドを溶出する工程とを含み得る。さらに、「急な」ｐＨ変動は選択されたｐＨ変化と同時に起こってもよい。即ちｐＨはポリペプチドのｐＩ超又はｐＩ未満から始まり、その後上記ポリペプチドのｐＩ未満又はｐＩ超のｐＨに変化し得る。代替的に、ＮＦＤ形成をもたらす上記ポリペプチドの濃度は、例えば固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）又は限外濾過等の他の手段により得ることができる。好ましくは、本発明のポリペプチドがアンフォールディングすると思われる条件（極端なｐＨ及び高温）、及び／又は例えばポリペプチドのｐＩ付近のｐＨ変化及び低い塩濃度のような疎水性相互作用に有利に働く条件の組合せが使用される。さらに、これらの二量体を離すのに使用される条件は、これらの二量体を産生するためのさらなる方法を決定する際に、即ちこれらの手順（例えばポリペプチド濃度が高いポリペプチドＡでは、約７０℃の温度への１５分間の曝露、及びその後の冷却）を組合せることを研究するのにも有用であり得る。
【００７９】
ＮＦＤを得る方法の例はさらに、本発明の実験部で非限定的に説明されている。
【００８０】
本発明の別の目的は、ＮＦＤを得る方法であって、単一可変ドメインを少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ又は４つの単一可変ドメイン）、又は単一可変ドメイン（複数可）の官能部分（例えば本明細書中に記載のスクリーニング法により得られるような）を含む完全な単量体ポリペプチドをコードする遺伝子が少なくとも１つの発現プラスミドにクローニングされ、宿主細胞を上記発現プラスミド（複数可）で形質転換すると共に、栄養溶液中で培養し、上記単量体ポリペプチドを細胞中で又は培地へと発現させ、融合タンパク質の一部分だけがクローニングされた場合、さらにタンパク質工学工程を標準的な技法に従って行うことを特徴とする、方法である。
【００８１】
さらに、本発明の別の目的は、単一可変ドメインを少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ又は４つの単一可変ドメイン）、又は単一可変ドメイン（複数可）の官能部分を含む２つの同一な単量体ポリペプチドを結び付け、ＮＦＤを形成する、結び付ける方法であって、上記方法が、上記ポリペプチドの疎水性相互作用及び／又は部分的な再フォールディングが、例えば単量体ポリペプチドを含む調製物の上方濃縮（up-concentrating）、塩析、洗剤又は有機溶媒の添加、上記ポリペプチドの総電荷の中和（即ち上記ポリペプチド（単数又は複数）のｐＩ付近のポリペプチド溶液のｐＨ）、及び／又は二量体化プロセス中、例えば数週間、例えば１週間、２週間、３週間、４週間又はそれ以上、好ましくは４週間のような長時間にわたる、二量体化しやすいポリペプチド又は単一可変ドメインの融点近くの高温、例えば３７℃付近又はそれ以上、例えば４０℃、４５℃若しくは５０℃以上の温度によって有利な影響を受け、したがってポリペプチド間の密接な相互作用を可能にする環境を作り出す工程を含む、方法である。興味深く且つ驚くべきことに、上記条件は、一度二量体が形成されれば、ＮＦＤを安定化するために展開させる必要はない。即ち溶液中のＮＦＤは、本明細書中で言及されるような広範な生物学的に関連した条件下で驚くほど安定している。 
【００８２】
本発明によるＮＦＤは、対応する抗原に対する高い結合活性及び十分な安定性を示し得る。これらの新規のＮＦＤ構造は例えば、ポリペプチドと、遺伝子操作した原核宿主生物又は例えば大腸菌及びメタノール資化酵母（Pichia pastoris：ピキア・パストリス）等の真核宿主細胞により得られる他のタンパク質及び／又はペプチドとの混合物から、精製プロセス中で容易に調製することができる。
【００８３】
さらに、ＮＦＤを形成することが可能な単量体構成要素は、本明細書中の上記で及びさらに記載されるような選択又はスクリーニング方法を行う前に、一次アミノ酸配列と利用可能であれば結晶構造情報とを考慮して予め選択することができる。その上、これらの非融合タンパク質ドメインにおける潜在的な相互作用を理解するために、非融合単一可変ドメイン、即ちＮＦＤの様々なＸ線又はＮＭＲ構造を解析することが望まれ得る。したがってこのことは、溶液中でＮＦＤにおいて相互作用がどのくらいの可能性で起こり得るかを例示するが、ＮＦＤ構成要素間で相互作用が起こり得る領域に関して完全に説明することは決してない。
【００８４】
さらに、二量体のさらなる安定化が有益であり、相互作用部位でポリペプチド末端及び／又はシステインを連結させる好適なリンカーにより行われ得る。例えば２つのドメインの共有結合は、例えばダイアボディ（diabodies）を用いて行われているように（Holliger &Hudson, Nat Biotech 2004, 23 （9）: 1126）、相互作用の新たな部位で、又はＮＦＤのＮ末端領域若しくはＣ末端領域でジスルフィド架橋を形成させるために、空間的に反対の位置にある２つの構成要素それぞれに２つのシステインを導入することにより可能であり得る。さらに、２つの単量体構成要素の末端間に可撓性ペプチドを導入することが有益であり得る。例としては、マウスＩｇＧ３の上方のヒンジ領域を使用することができる。しかしながら、多種多様のヒンジ又は他のリンカーを使用してもよい。これは、二量体化自体には必要ないが、２つの構成要素の固定（locking）を与える。抗体の自然発生的なヒンジはヒンジの合理的な実施の形態である。このような場合、本発明のポリペプチドは、精製中にＮＦＤが形成され、その後酸化によりシステイン対合がもたらされ、ＮＦＤを固定状態にし得るように、初めに還元条件下で存在している必要がある。ＮＦＤの場合、ヒンジ又はリンカーは、従来の共有結合した単一可変ドメイン含有ポリペプチドよりも短くてもよい。これは、単量体構成要素の期待される密接な相互作用を妨げることがなく、二量体の可撓性は必要とされない。ヒンジの選択は所望の残基配列の長さ（Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943-958）、二量体のフォールディング及び安定性との適合性（Richardson & Richardson, 1988, Science 240, 1648-1652）、プロテアーゼの分泌及びプロテアーゼに対する耐性に左右され、必要であれば実験により決定又は最適化することができる。
【００８５】
さらに、単量体のさらなる安定化（即ち二量体化又は場合によっては可能性として多量体化の回避）が有益であり、ＣＤＲ３領域及び／又はＦＲ４領域にある又はその近くのポリペプチド末端及び／又はシステインを連結させる好適なリンカーを選択することにより行われ、これにより単一可変ドメインが二量体化するのを防ぎ得る。例えば、ＣＤＲ３及び／又はＦＲ４の共有結合的な安定化は、例えば改変したジスルフィド結合によりスワッピングされる三次元ドメインに対して安定化したシスタチンを用いて行われているように（Wahlbom et al.,  J. ofBiological Chemistry Vol. 282, No. 25, pp. 18318-18326, June 22, 2007）、ジスルフィド架橋を形成させるために、空間的に反対の位置にあるＣＤＲ３領域及び／又はＦＲ４領域近くに、又は／及びそれらの領域内に２つのシステインを導入することにより可能であり得る。さらに、１つのシステイン（その後ＣＤＲ３領域の前に例えばシステインと結合したジスルフィドを形成する）を有するように改変させた可撓性ペプチドを導入することが有益であり得る。このような場合、本発明のポリペプチドは、単量体が形成され、その後酸化によりシステイン対合がもたらされ、単量体を固定された安定状態にし得るように、初めに還元条件下で存在している必要がある。
【００８６】
さらに、単量体のさらなる安定化（即ち二量体化又は場合によっては可能性として多量体化の回避）が有益であり、不安定なアミノ酸残基（単数又は複数）（例えば突然変異体のスクリーニングにより、例えば親和性成熟法により同定される、例えば国際公開第２００９／００４０６５号パンフレットを参照されたい）を、ＣＤＲ３及び／又はＦＲ４の近くの安定したアミノ酸残基（単数又は複数）に置き換えることにより行われ得る。
【００８７】
本発明の他の態様において、単量体のさらなる安定化（即ち二量体化又は場合によっては可能性として多量体化の回避）が、好適な製剤により達成され得る。特に、本発明はマンニトール又は他のポリオールを液体製剤に与えることにより、（ヒト血清）アルブミン結合ナノボディ（例えばポリペプチドＢ）及びナノボディを含む他のポリペプチドの二量体化及び多量体化を抑制する方法を提供する。マンニトールは一般的に液体タンパク質製剤の安定性及び等張性を維持するのに使用される。マンニトールは製剤の凍結乾燥のための一般的な増量剤でもある。驚くべきことに、本発明は、マンニトールが幾つかのアルブミン結合ナノボディの保存中（高温で）に観察される二量体の形成を特異的に阻害することができることを発見した。結果として、マンニトール含有製剤はタンパク質安定性を増大させ、生物学的活性を維持することにより、薬物製品の貯蔵寿命を延ばす。マンニトールの安定化効果は、マンニトール濃度が増大するにつれてタンパク質製剤におけるＴｍ（融点）値が高くなることを示すデータにより支持されている。
【００８８】
本発明は、他のポリオール、非還元型糖、ＮａＣｌ又はアミノ酸の使用も包含する。
【００８９】
例えば本発明の血清アルブミン結合ナノボディ「ポリペプチドＢ」により形成される二量体（配列番号２）は、ＨＳＡとの結合に関しては完全に不活性であることが分かっており（ビアコア解析）、このことにより二量体界面でのアルブミン結合部位が二量体形成により阻止されることが示唆された。したがって本発明により提起される液体製剤へのマンニトールの添加は二量体化プロセスを抑制するだけでなく、重要なことにナノボディのＨＳＡ結合活性を保存すると共に、不活性化を減速させる。概して、本発明によるマンニトール含有製剤は配合タンパク質／薬物製品の貯蔵寿命を延ばす。本発明は任意のアルブミン結合ナノボディに適用可能であると考えられ、一般的に二量体を形成する傾向があるナノボディ全てに適用可能であり得る。このため、本発明のマンニトール製剤はプロセス中間体、製剤原料又は薬物製品として任意のナノボディ製剤に用いられる。本発明は、任意の緩衝剤、生物学的に有効な量のタンパク質、およそ０．６Ｍほどの濃度のマンニトール、及びポリオール、非還元型糖、ＮａＣｌ又はアミノ酸を含む他の賦形剤とから成り得る多種多様の液体製剤で使用することができる。液体製剤は後の使用のために直接保存してもよく、又は例えば凍結乾燥により乾燥形態で調製してもよい。マンニトールは、凍結乾燥後の保存、凍結、解凍及び再構築中に観察される二量体のような高分子量種の形成を阻害するために、任意の製剤で使用することができる。
【００９０】
本発明に記載のＮＦＤの特定の利点は、例えば製造プロセス（例えば調製工程等）中に、制御可能に官能的に又は一部官能的に会合する能力である。ホモ二量体の形成を可能にする二量体化の原理を用いる。本明細書中に記載のＮＦＤの例としては、ＮＦＤ−Ｍｏ、ＮＦＤ−Ｄｉ及びＮＦＤ−Ｔｒｉが挙げられる。これらの場合、単量体構成要素は、細菌系で発現され、その後高濃度で分離クロマトグラフィ装置、例えばプロテインＡ又はＩＭＡＣと結合し、相当な収率で所望の二量体複合体、即ちＮＦＤを保持するように迅速に溶出する。これらの条件下では、ホモ二量体タンパク質自体が形成され、上記分離工程により二量体形態で直接単離することができ、及び／又はサイズ排除クロマトグラフィによりさらに単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】単一可変ドメインにおける特徴的な残基を示す図である。
【図２ａ】様々な非融合二量体（即ちＮＦＤ）と従来の遺伝子的に融合した分子との比較を表す図である。各構築物又はＮＦＤにおける単一可変ドメインは異なっていても又は同一であってもよい。点線はＮＦＤに安定性を与える２つのＶＨドメイン間での概略的な相互作用（本明細書では、表面相互作用を示しているが、これらは、本明細書中に記載のように他の相互作用であってもよい）。
【図２ｂ】様々な非融合二量体（即ちＮＦＤ）と従来の遺伝子的に融合した分子との比較を表す図である。各構築物又はＮＦＤにおける単一可変ドメインは異なっていてもよい。点線はＮＦＤに安定性を与える２つのＶＨドメイン間での概略的な相互作用（本明細書では、表面相互作用を示しているが、これらは、本明細書中に記載のように他の相互作用であってもよい）。
【図３】有意な量のＮＦＤが得られる条件下でのポリペプチドＡ（配列番号１）のプロテインＡ親和性精製を示す図である。タンパク質を小さなカラム（４００μｌの樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａ、GE Healthcare）に装填し、グリシン（１００ｍＭ、ｐＨ２．５）の注入により溶出させた。溶出ナノボディ（登録商標）溶液のｐＨを、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）を使用して迅速に中和した。
【図４】ポリペプチドＡの親和性精製したプロテインＡのサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（GE Healthcare）での濃縮ポリペプチドＡの分離を示す（画分６、図３を参照されたい）。ナノボディ画分を単量体及び二量体ポリペプチドＡの分子量に対応する２つの特異的な画分に分散する（resolved）（分子量マーカーの位置を示す）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析（右側のパネル）によると、２つの画分間では全く差異が示されず、このことは自然条件下ではこれらのナノボディが単量体及び二量体として挙動することを示す。二量体は変性すると（ＳＤＳ洗剤及び熱処理）単量体立体配座に変換される。
【図５】低カラム装填量でのポリペプチドＡのプロテインＡ親和性精製の結果を示す図である。限られた量のタンパク質（およそ２．５ｍｇ／ｍｌの樹脂）を小さなカラム（４００μｌの樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａ、GE Healthcare）に装填し、グリシン（１００ｍＭ、ｐＨ２．５）の注入により溶出した。溶出ナノボディ（登録商標）溶液のｐＨを、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）を使用して迅速に中和した。
【図６】ポリペプチドＡの親和性精製したプロテインＡのサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（GE Healthcare）での濃縮ポリペプチドＡの分離を示す（画分７、図５を参照されたい）。ナノボディ画分は単量体ポリペプチドの分子量に対応する特定の画分に分散される。
【図７】ポリペプチドＡのプロテインＡ溶出の結果を示す図である。前処理したペリプラズム抽出物をプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａカラムに装填した後、ベースラインが安定するまでＰＢＳ洗浄を行った。溶出を、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）を使用してｐＨ変動により行った（点線）。
【図８】ポリペプチドＡの単量体及び二量体のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。プレピーク（画分２）が安定性試験に使用された二量体ポリペプチドＡを含有している。
【図９】二量体ポリペプチドＡの熱処理試料のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。ポリペプチドＡ  ＮＦＤ（０．６８ｍｇ／ｍｌで）を幾つかの実験に使用した：２０μｌの二量体画分を９０μｌのＤ−ＰＢＳで希釈し、異なる温度でインキュベートし、１００μｌをＤ−ＰＢＳ中で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（商標）１０／３００ＧＬカラムで解析した。
【図１０】ポリペプチドＡ  ＮＦＤのｐＨ処理試料のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。ポリペプチドＡ  ＮＦＤ（０．６８ｍｇ／ｍｌで）を幾つかの実験に使用した：２０μｌの二量体試料を１００ｍＭのピペラジン（ｐＨ１０．２）又は１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）９０μｌで希釈し、４℃で一晩（ＯＮ）インキュベートした。対照をＤ−ＰＢＳ中でインキュベートした。翌日、試料をＳＥＣで解析した。高ｐＨでのインキュベーションは解離に対する影響はなかったが、低ｐＨ（グリシン（ｐＨ２．５））によりおよそ１５％の単量体が得られた。室温で１５分間、１％ＴＦＡ中でのより大胆な（drastic）インキュベーションによりほぼ１００％の単量体が得られた。
【図１１】ポリペプチドＡ  ＮＦＤの熱／有機溶媒処理を組合せた試料のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。ポリペプチドＡ  ＮＦＤ（０．６８ｍｇ／ｍｌで）を幾つかの実験に使用した：２０μｌの二量体画分を１０％イソプロパノール又は３０％イソプロパノール９０μｌで希釈し、４℃で一晩（ＯＮ）又は２０℃で１５分間インキュベートした。組合せた処理（熱及びイソプロパノール）を１５分間行った。対照をＤ−ＰＢＳ中でインキュベートした。試料をＳＥＣで解析した。有機溶媒との高温でのインキュベーションにより単量体への解離の加速が起こった。
【図１２】リガンド−ＮＦＤ複合体形成のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。リガンドＡ（配列番号６）の試料２０μｌをＨＢＳ−ＥＰ（Biacore）＋０．５ＭのＮａＣｌ  ９０μｌで希釈し、室温で数時間インキュベートした（リガンドミックス）。それから、ＮＦＤ又はポリペプチドＡを添加し、短時間のインキュベーション（通常３０分）後、材料をＳＥＣで分散させた。ポリペプチドＡ（３．９１ｍｇ／ｍｌ）：１７μｌ（ＨＢＳ−ＥＰで１０倍希釈）をリガンドミックスに添加し、１００μｌを注入した。
【図１３】ポリペプチドＡ、リガンドＡ、ポリペプチドＡ＋リガンドＡ、ポリペプチドＡのＮＦＤ−Ｄｉ及びポリペプチドＡ＋リガンドＡのＮＦＤ−Ｄｉの分子量（ＭＷ）を、同じ条件下で同じカラム上を移動する分子量標準（Biorad  ＃１５１−１９０１）の曲線適合を基に算出した図である（この図の読み取りに関しては表２を参照されたい）。
【図１４】二量体に存在する単量体Ａ（上部）及びポリペプチドＢの単離した単量体（下部）を示す図である。
【図１５】ポリペプチドＢ−二量体（ＮＦＤ−Ｍｏの例）を示す図である。単量体Ａのフレームワーク４を単量体Ｂのフレームワーク４に置き換え、また逆に単量体Ｂのフレームワーク４を単量体Ａのフレームワーク４に置き換える。
【図１６】単量体Ｂの電子密度を黒色で示す図である。単量体Ａは灰色のリボンで示している。
【図１７】ポリペプチドＢ（上部）及び４５位にＰｒｏを有するポリペプチドＦ（下部）を示す図である。
【図１８】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＸＫ  ２６／６０カラムでのプロテインＡアフィニティカラムから溶出した材料のサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す図である。
【図１９】ポリペプチドＢ及びポリペプチドＢ−二量体の存在下での蛍光発光Ｓｙｐｒｏオレンジを示す図である（Ａｌｂ１１＝ポリペプチドＢ）。
【図２０】グアニジン濃度に応じたポリペプチドＢ（即ちＡｌｂ１１）単量体及びポリペプチドＢ−二量体（即ちＡｌｂ１１−二量体）のアンフォールディング示す図である。固有の蛍光測定、及びそのためアンフォールディングパラメータとしてＣＳＭを使用することによりアンフォールディングをモニタリングした。
【図２１】純度をクマシー染色ゲルで解析した結果を示す図である（パネルＡ：ポリペプチドＧ、パネルＢ：ポリペプチドＨ）。
【図２２】ＨＳＡでのポリペプチドＦ、ポリペプチドＧ及びポリペプチドＨの結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９２】
実験部：
実施例１：ＮＦＤの生成
ポリペプチドＡ（配列番号１）産生大腸菌クローンの発酵
ポリペプチドＡ（配列番号１）クローン１（国際公開第２００６／１２２８２５号パンフレットで開示されるものとして特定される）の発酵を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Biostat Bplus, Sartorius）中で１０リットル規模で行った。前培養物の２％接種材料（ＴＢ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン中で一晩成長させた）を、生成物培養を開始するのに使用した（２２℃／１ｖｖｍ）。誘導（１ｍＭのＩＰＴＧを使用する）を８．０のＯＤ６００で開始させた。２２℃での短期間誘導の後、細胞ペーストを遠心分離により回収し（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ、ローター１２５１０、７０００ｒｐｍで３０分間）、−２０℃で凍結させた。
【００９３】
ポリペプチドＡの精製
精製ポリペプチドＡ（単量体及び二量体）を６つの工程から成るプロセスにより生成した：
１．細胞ペレットからの抽出
凍結細胞ペレットを解凍し、細胞をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ（Ika Works、Ｓ２５Ｎ−２５Ｇプローブ、１１０００ｒｐｍ）を使用して冷ＰＢＳ中で再懸濁し、４℃で１時間かき混ぜた。この第１のペリプラズム抽出物を遠心分離により回収し、第２の抽出を、得られた細胞ペレットで同様に行った。両方の抽出物は、ペリプラズムポリペプチドＡ含量が９０％超であった（第２の抽出の収率は約２５％であった）。
２．酸性化による主要な混入物質の除去
ペリプラズム抽出物を、１Ｍのクエン酸（ＶＷＲ（Merck）＃１．００２４４．０５００）を使用してｐＨ３．５まで酸性化し（１０ｍＭのモル濃度、最終ｐＨ３．５）、さらに１ＭのＨＣｌでｐＨを調整した。溶液を４℃で一晩かき混ぜた。析出したタンパク質及び残屑を遠心分離でペレット状にして沈降させた（pelleted down）。
３．抽出物の精密濾過及び濃縮
Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０.２０μｍ膜（３０５１８６０７０  １０−−ＳＧ、Sartorius）を備えたＳａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗシステム（１７５２１−１０１、Sartorius）を使用して上清を無粒子にし、限外濾過により陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）でさらに調製した。ＣＥＸに適用するのに必要となる量を、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  １００００ＭＷＣＯ膜（３０５１４４３９０  １Ｅ−−ＳＧ、Sartorius）を備えたＳａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗシステムを使用して限外濾過によりおよそ２リットルに減らした。ここでは、導電率（５ｍＳ／ｃｍ未満）及びｐＨ（＝３．５）が確認された。
４．ＣＥＸによる捕捉及び精製
清浄化及び酸性化した上清を、バッファーＡ（１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．５））中で平衡となったＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｓカラム（１７−１２７３−０１、GE Healthcare）に適用し、結合タンパク質を、１０ＣＶの線形勾配で１００％Ｂまで溶出した（１ＭのＮａＣｌのＰＢＳ溶液）。ポリペプチドＡ画分を回収し、４℃で保存した。
５．プロテインＡカラムでの親和性精製
ポリペプチドＡ（量はカラム容量よりはるかに少ない）をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（商標）、１７−５２６９−０７、GE Healthcare）でさらに精製した。１工程溶出を、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）を使用して行った。回収した試料を、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）を使用して迅速に中和した（図７を参照されたい）。
６．サイズ排除クロマトグラフィ（任意で、例えばＮＦＤを単離するため、及び／又はＮＦＤ量を決定するため）
精製ナノボディ（登録商標）画分を、Ｄ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−１６９）中で平衡になったＨｉｌｏａｄ（商標）ＸＫ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（１７−１０７０−０１、GE Healthcare）を使用してＳＥＣでさらに分離すると共に、Ｄ−ＰＢＳへと移した。画分２は二量体ポリペプチドＡを含有していた（図８を参照されたい）。
【００９４】
さらなる実験において、ポリペプチドＡ（配列番号１）をプロテインＡカラムに集積させ（その濃度は樹脂１ｍｌ当たり５ｍｇをはるかに超えるポリペプチドＡであった）、急なｐＨ変動（１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）への１工程のバッファー交換）により溶出した。カラムからのポリペプチドＡの溶出中、ポリペプチドＡは「局所的に」非常に高濃度で構成される（溶出後の実測値は５ｍｇ／ｍｌを超える）溶出の前面に「積み重ねられ（stacked）」、ｐＨ変動との組合せにより、約５０％の安定した二量体が単離された（図３を参照されたい）。
【００９５】
単量体から二量体への移行はサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により実証され、これにより二量体化パーセントを決定することが可能になる（図４を参照されたい）。プロテインＡでのポリペプチドＡの装填量が少ないと（即ちそうでなければ上記と同じ条件下で２ｍｇ／ｍｌの樹脂、即ち１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）による１工程溶出）、ＳＥＣ中では二量体がほとんど検出されなかった（５％未満）（図５及び図６を参照されたい）。同様に、単一可変ドメインを１つ含むポリペプチドのＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｍｏ）、単一可変ドメインを３つ含むポリペプチドのＮＦＤ（ＮＦＤ−Ｔｒｉ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むポリペプチドのＮＦＤ及び単一可変ドメイン融合体が得られた（表１を参照されたい）。
【００９６】
表１：得られたＮＦＤの例
【表１】
2011525476.tif 000004
【００９７】
実施例２：ＮＦＤの安定性
ポリペプチドＡの精製中、安定した非融合二量体（ＮＦＤ）を生成した（上記を参照されたい）。この非共有結合的相互作用の安定性及び性質をより理解するために、安定したポリペプチドＡ  ＮＦＤを、二量体を単量体に解離することを目的とする特殊な条件に供した。複合体の安定性を３つの基準で評価した：熱安定性、ｐＨ安定性、有機溶媒耐性及びそれらの組合せ。
【００９８】
実験構成
ポリペプチドＡの調製中、ポリペプチドＡ  ＮＦＤを生成し（上記を参照されたい）、−２０℃で２．５年間保存した。この二量体材料は、ＰＢＳ中でのプロテインＡクロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により得られた。ＳＥＣでは、単量体と二量体との材料を二量体純度が９５％を超える調製物に分離した。解凍時には、約５％の単量体材料が検出された（図９での矢印を参照されたい）。二量体材料の濃度は０．６８ｍｇ／ｍｌであった。
【００９９】
解析用サイズ排除クロマトグラフィ
Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０ワークステーション（GE Healthcare）を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  １０／３００ＧＬカラム（１７−５１７４−０１、GE Healthcare）での解析用ＳＥＣにより、ポリペプチドＡ  ＮＦＤ二量体の安定性を解析した。カラムは室温（２０℃）でＤ−ＰＢＳ中で平衡にした。流速は１ｍｌ／分を使用した。タンパク質を２１４ｎｍでの吸光により検出した。ポリペプチドＡ  ＮＦＤの試料１２μｇを注入した。
【０１００】
概略的な（Overview）解析用ＳＥＣを以下の通りに操作した：
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋９０μｌのＤ−ＰＢＳ→１５分／５０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋９０μｌのＤ−ＰＢＳ→１５分／２０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋９０μｌのＤ−ＰＢＳ→３０分／４５℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋９０μｌのＤ−ＰＢＳ→１５分／６０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋９０μｌのＤ−ＰＢＳ→１５分／７０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋１００ｍＭのピペラジン（ｐＨ１０．２）９０μｌ→ＯＮ／４℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）９０μｌ→ＯＮ／４℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋１０％のイソプロパノール９０μｌ→ＯＮ／４℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋３０％のイソプロパノール９０μｌ→ＯＮ／４℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋１％ＴＦＡ  ９０μｌ→ １５分／２０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋３０％のイソプロパノール９０μｌ→１５分／５０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋３０％のイソプロパノール９０μｌ→１５分／２０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋３０％のイソプロパノール９０μｌ→１５分／４０℃→１００μｌを解析
２０μｌのポリペプチドＡ  ＮＦＤ＋３０％のイソプロパノール９０μｌ→１５分／４５℃→１００μｌを解析
【０１０１】
この材料を幾つかの実験に使用した：２０μｌの二量体画分を９０μｌのＤ−ＰＢＳ又は他の溶媒で希釈し、異なる条件下でインキュベートして、１００μｌの試料を解析用ＳＥＣにより解析した。
【０１０２】
試験：
第１の実験組では、温度を上昇させて１５分間、インキュベーションを行った後（４５℃、５０℃、６０℃及び７０℃）、解析用ＳＥＣを行った（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（商標）  １０／３００ＧＬ）。７０℃で１５分間のインキュベーションにより、単量体ポリペプチドＡへとほぼ完全に移行したのに対し、低温（例えば５０℃）でのインキュベーションでは、このような劇的な効果は得られなかった。６０℃で１５分後、約２５％の解離材料を検出した（図９を参照されたい）。
【０１０３】
第２の実験組では、ポリペプチドＡ  ＮＦＤの安定性に対するｐＨの効果を探索した。２０μｌのＮＦＤを１００ｍＭのピペラジン（ｐＨ１０．２）９０μｌ又は１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）９０μｌと混合し、４℃で一晩（ＯＮ）インキュベートした。２０μｌのＮＦＤを室温で１５分間、１％のＴＦＡ  ９０μｌと混合し、それから迅速にＳＥＣにより解析した。対照をＤ−ＰＢＳ中でインキュベートした。翌日、試料をＳＥＣにより解析した（図１０を参照されたい）。
【０１０４】
第３の実験組は組合せた処理から成っていた：温度及び有機溶媒（イソプロパノール）。４℃で一晩、１０％又は３０％のイソプロパノール中でのインキュベーション、又は室温で１５分間の１０％又は３０％のイソプロパノール中でのインキュベーションのいずれによっても、何ら有意な解離は得られなかった。しかしながら、温度の上昇と有機溶媒との処理を組合せることで、単量体へのかなり迅速な解離が得られた。４５℃での又は３０％イソプロパノール中でのインキュベーションは単独では効果がなかったが、両方を組合せると（１５分間）、単量体へのほぼ完全な解離が得られた。４０℃でのイソプロパノール処理によりわずか３０％の解離が得られた（図１１を参照されたい）。
【０１０５】
考察
二量体／単量体平衡の濃度依存的な特性は、生理学的条件下での相互作用の略不可逆性によりさらに実証された。さらに、単量体への二量体の（部分的な）解離に適用するのに必要とされるさらに抜本的な対策（drastic measures）は固有の強い相互作用を提示している。解離は、条件を劇的に変える（例えば２．０より低いｐＨを適用する）こと、又は分子を高エネルギー条件に供することでしか得られない。温度安定性試験（データ図示せず）は、ポリペプチドＡ  ＮＦＤのＴｍが７３℃であり、このため観察される単量体への解離が実際、（部分的な）アンフォールディングと結び付き得ることを示している。 
【０１０６】
親水性を増大させる、極めて低いｐＨでプロトン付加と組合せたＴＦＡの可溶化特性によっても解離が起こる。
【０１０７】
高温と有機溶媒解離との組合せは、相互作用が主に、例えば疎水性（例えばファンデルワールス力）、水素結合及び／又はイオン相互作用に基づいていることを示している。
【０１０８】
これらの二量体を離すのに使用される条件を調べることは、これらの二量体を産生するためのさらなる方法を決定する際に、即ち高いポリペプチド濃度でこれらの手順（例えば７５℃より高い温度）を組合せることを研究するのにも有用であり得る。
【０１０９】
実施例３：ＮＦＤのリガンド結合
解析用サイズ排除クロマトグラフィによるポリペプチドＡ及びポリペプチドＡ  ＮＦＤ−ＤｉとのリガンドＡ（配列番号６）結合試験
リガンドＡ産生：
リガンドＡはポリペプチドＡの結合ドメインである、即ちポリペプチドＡのエピトープを含むことが知られている（即ちリガンドＡはｖＷＦのＡ１ドメインを表す）。
【０１１０】
リガンドＡ（１．４６ｍｇ／ｍｌ）は振盪フラスコ内でピチア属により産生された。バイオマスをＢＧＣＭ培地中に産生させた。誘導のために、標準培地をメタノール含有培地（ＢＭＣＭ）に切り替えた。分泌タンパク質を培地からＩＭＡＣにより捕捉し、さらにヘパリンアフィニティカラムで精製して、最終的にサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０）により、３５０ｍＭのＮａＣｌの入った５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー中に配合した。
【０１１１】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬでの解析用ＳＥＣ（図１２）：
ポリペプチドＡ（２つの予測結合部位を有する）及びその対応するＮＦＤ（４つの予測結合部位を有する）を実施例１に開示されるように得て、５倍過剰のリガンドＡ（配列番号１）に添加した。得られた分子量の変動をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により試験した。保持量（retention）の変動は、ポリペプチドＡ又は対応するＮＦＤと結合するリガンドＡ分子の数を示す。リガンドＡの分子量は約２０ｋＤａである。ＮＦＤ単独又はポリペプチドＡとのポリペプチド／リガンドＡ複合体と比較した、ＮＦＤ／リガンドＡ複合体の分子量変動は、結合したＮＦＤ又はポリペプチドＡ当たりのリガンドＡの数を示す（表２を参照されたい）。
【０１１２】
概略的な解析用ＳＥＣをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  １０／３００ＧＬで操作する
（Ｂ７）０４０３０８．１：リガンド−ＮＦＤ複合体５μｌミックス（４℃で一晩保存）＋８０μｌのバッファーＡ
（Ｂ７）０４０３０８．２：２０μｌの分子量マーカー＋８０μｌのバッファーＡ
（Ｂ７）０４０３０８．３：リガンド複合体２０μｌ＋９０μｌのバッファーＡ（室温で４時間）＋ポリペプチドＡ（１７μｌ  １０倍希釈）（解析前に室温で３０分）
（Ｂ７）０４０３０８．４：ポリペプチドＡ（９０μｌのバッファーＡ中、１７μｌ）
（Ｂ７）０４０３０８．５：バッファーＡ（室温で１時間）中のリガンド＋ポリペプチドＡ（解析前に室温で１５分）
（Ｂ７）０４０３０８．６：リガンド＋バッファーＡ＋ＮＦＤ
（Ｂ７）０４０３０８．７：室温で１時間後の停止（rest）試料番号６
（Ｂ７）０４０３０８．８：バッファーＡ＋ＮＦＤ
【０１１３】
表２：＊ＭＷは、同じ条件下で同じカラムで操作した分子量標準（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１５１−１９０１）の曲線適合に基づき算出した（図１３を参照されたい）。
【表２】
2011525476.tif 000005
【０１１４】
予測ＭＷの相関関係は、２つを超えるリガンド（ＳＥＣでのリガンドＡ複合体の不規則な挙動からおそらくは３つ、また４つの可能性もある）がＮＦＤに結合していることを示す。
【０１１５】
実施例４：ポリペプチドＢとのＮＦＤのさらなる特徴付け
実施例４．１：非融合二量体：ポリペプチドＢの結晶構造
結晶化
初めにタンパク質を約３０ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。精製タンパク質をおよそ１２００個の異なる条件による結晶化試験に使用した。標準的な戦略を使用し、温度、タンパク質濃度、滴下速度のような、結晶化に強く影響するパラメータを体系的に変更して、初めに得られた条件を最適化した。これらの条件は、ｐＨ又は沈殿剤濃度を体系的に変更することによっても改善された。
【０１１６】
データ回収及び処理
結晶を１００Ｋの温度で急速冷凍すると共に測定した。極低温状態を使用して、ＳＷＩＳＳ  ＬＩＧＨＴ  ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ、Villingen, Switzerland）で結晶からＸ線回折データを回収した。
【０１１７】
結晶は、非対称ユニットで２つの分子を有する空間群Ｐ２１に属する。データを、ＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥプログラムを使用して処理した。データ回収統計値を表３で要約する。
【０１１８】
【表３】
2011525476.tif 000006
【０１１９】
構造のモデル化及び精密化
構造を決定及び解析するのに必要となる位相情報を分子置換により得た。
【０１２０】
その後、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いた標準的なプロトコルに従って、モデル構築及び精密化を実施した。最終モデルの正確性を交差検証するための評価基準であるＲ因子の算出のために、１．６％の測定された反射を精密化手順から除いた（表４）。
【０１２１】
リガンドのパラメータ化を、ＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨプログラムで行った。ＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）を対応するライブラリファイルの作成に使用した。
【０１２２】
最終構造及び精密化プロセスの統計値を表４に列挙する。
【０１２３】
【表４】
2011525476.tif 000007
【０１２４】
全体構造
結晶の非対称ユニットは２つの単量体から構成される。ナノボディは電子密度図により十分に分散される。
【０１２５】
構造
ポリペプチドＢ二量体を形成する、２つのポリペプチドＢ−単量体（ＮＦＤ−Ｍｏ）は適切にフォールディングされたＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びフレームワーク１〜フレームワーク３を有する。フレームワーク４残基（カバットナンバリングスキームによると残基１０３〜１１３）を２つの単量体間で交換する。これにより、二量体に存在する両方の単量体のアンフォールディングＣＤＲ３が得られる（図１４を参照されたい）。二量体形成は、両方の単量体間でのＱ１０５からＳｅｒ１１３までのβ鎖の交換により媒介される（図１５を参照されたい）。鎖交換は電子密度により完全に規定される（図１６を参照されたい）。
【０１２６】
二量体を形成する単量体のフレームワーク１〜フレームワーク３並びにＣＤＲ１及びＣＤＲ２の残基は、従来のＶＨＨフォールドを有しており、正しくフォールディングされたポリペプチドＢのＶＨＨドメイン上でほぼ完璧に重ね合わせることができる（骨格ｒｍｓｄ＜０．６Å）。ポリペプチドＢと同様の配列を有するＶＨＨドメインの構造と比較した、ポリペプチドＢにおけるＣＤＲ３の安定化の低減は、フレームワーク４が交換された二量体化の原因の１つであり得る。４５位にプロリンを有するポリペプチドＢのわずかに変更された形態はＹ９１とＬ９８の主鎖との間の水素結合を示す。この水素結合はＣＤＲ３立体配座に対する安定化効果を有する。
【０１２７】
ポリペプチドＢでは４５位にロイシンがあるため、チロシン９１はロイシン９８の主鎖との水素結合を形成することができない。これにより、ポリペプチドＢにおけるＣＤＲ３立体配座の安定化の低減が起こる（図１７）。
【０１２８】
実施例４．２：ポリペプチドＢとのＮＦＤの安定性及び様々な他の研究
ポリペプチドＢの産生及び単離
標識していない（Tagless）ポリペプチドＢは、１ｍＭのＩＰＴＧによる一晩誘導後、２８℃で大腸菌ＴＯＰ１０株において過剰発現した。集菌後、培養物を４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、細胞ペレットを−２０℃で凍結させた。その後、ペレットを解凍し、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸バッファー中で再懸濁し、室温で２時間振盪した。懸濁液を４５００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、抽出物からの細胞残屑を取り除いた。その後、ポリペプチドＢを含有する上清を、Ａｋｔａクロマトグラフシステムに組み込んだＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａカラムに装填した。Ｄ−ＰＢＳで広範にアフィニティカラムを洗浄した後、結合ポリペプチドＢタンパク質を１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．７）バッファーで溶出した。酸でカラムから溶出した画分を、１．５ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．５）バッファーを添加することにより迅速に中和した。この段階で、タンパク質は既に、予測される分子量の単一バンドだけがクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察されるくらい非常に純粋である。ポリペプチドＢを含有する画分をプールし、その後カットオフ値が５ｋＤａであるポリエーテルスルホン膜（Millipore）による撹拌細胞での限外濾過により濃縮した。その後、濃縮タンパク質溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＸＫ  ２６／６０カラムに装填した。クロマトグラムで（図１０を参照されたい）、２１０ｍＬと２４０ｍＬとの間で溶出する主ピークとは別に、１８０ｍＬと１９５ｍＬとの間で溶出する微小ピークが存在した。
【０１２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの解析は、両方の主ピークが同じ移動度の単一ポリペプチドを含有していることを明らかにした（図１８）。この観察結果は、１８０ｍＬと１９５ｍＬとの間で溶出するピークが二量体種であり、２１０ｍＬと２４０ｍＬとの間で溶出する材料が単量体であることの第１の指標であった。二量体種及び単量体種の逆相クロマトグラフィ及びＬＣ／ＭＳでのさらなる解析は、その両方が分子量が約１２１１０ダルトンの同じポリペプチドを含有していることを明らかにした。このような方法で、作動させる１０Ｌ容の発酵槽から、全体で３０ｍｇのポリペプチドＢの二量体種と１２００ｍｇのポリペプチドＢの単量体形態とが単離された。
【０１３０】
抗原結合特性
ポリペプチドＢ単量体及びポリペプチドＢ二量体とヒト血清アルブミンとの結合をビアコア３０００機器で表面プラズモン共鳴により試験した。これらの実験では、ヒト血清アルブミンを標準的なアミンカップリング法によりＣＭ５チップ上で固定した。１０ナノモル濃度で単量体ポリペプチドＢ及び二量体ポリペプチドＢの両方の結合を試験した。単量体でのみ、結合が観察され、二量体ポリペプチドＢではシグナルの増大は全く観察されなかった。
【０１３１】
単量体ポリペプチドＢと二量体ポリペプチドＢとの間の物理化学的特性における差異
蛍光染料Ｓｙｐｒｏオレンジ（５０００×  分子プローブ）を、タンパク質の熱アンフォールディングをモニタリングするのに、又はタンパク質での疎水性パッチの存在を検出するのに使用することができる。本実験では、１５０マイクログラム／ｍＬ濃度で単量体ポリペプチドＢ及び二量体ポリペプチドＢをＳｙｐｒｏオレンジと混合した（最終濃度  １０×）。その後、溶液を石英キュベットに移し、蛍光スペクトルを日本分光株式会社のＦＰ６５００機器で読み取った。励起は４６５ｎｍであり、発光は４７５ｎｍ〜７００ｎｍでモニタリングした。図１９で示されるように、二量体ポリペプチドＢだけでシグナルが強く、ポリペプチドＢ単量体種では蛍光発光強度の増大は全く観察されなかった。この観察結果は、ポリペプチドＢの単量体形態及び二量体形態が異なる立体配座を有することを強く示唆している。
【０１３２】
ＡＵＣ−ＥＱ  −  沈降−拡散平衡
材料及び方法
Beckman-Coulter製の解析用超遠心分離機ＸＬ−Ｉを用いて、この機器の光学干渉（interference optics）を利用して実験を行った。２０℃の温度で２５０００ｒｐｍと４００００ｒｐｍとの回転速度でデータを回収した。１５０μＬを１２ｍｍ径の２つのセクターチタンセンターピース（sector titanium centerpieces）の試料セクターに充填した。試料を標準ＰＢＳで希釈し、この標準ＰＢＳを光学的参照にも使用した。見掛けの化学及び沈降平衡の到達は、経時的な濃度変化が観察されなくなるまで、連続スキャンを比較することにより検証した。データは、ＮＯＮＬＩＮを使用して、モデル非依存的なＭ＊−関数及び様々な明示的モデルを用いて評価した。タンパク質のν及び溶媒の濃度に関しては標準値を使用した。必要に応じて、９５％信頼限界を括弧内に与える。
【０１３３】
結果
ポリペプチドＢは、適合からモル質量が１１．９２ｋｇ／モル（１１．８６〜１１．９７ｋｇ／モル）であることを見出し、単一の単分散構成要素であると推測される。このことは、濃度０で１２．２５ｋｇ／モルであるモデルフリー解析からの結果と十分一致する。データから推測される自己会合、非理想性又は多分散性を説明する試みは適合の全体的なｒｍｓｄを改善しなかった。
【０１３４】
ポリペプチドＢは同様に明らかにされ、単一の単分散構成要素と推測される直接適合に基づき、モル質量が２３．０６ｋｇ／モル（２２．５６〜２３．４４ｋｇ／モル）である。モデルフリー解析はモル質量が２２．６９ｋｇ／モルであることを明らかにしている。熱力学的な非理想性からの小さな寄与により適合がわずかに改善したが、モル質量は変わらなかった。
【０１３５】
可逆的な自己会合に関する兆候は全く見出すことができなかった。
【０１３６】
Ｍ（ポリペプチドＢ−二量体）／Ｍ（ポリペプチドＢ）の比は１．９３である。予測される倍数２からの小さい偏差は、ポリペプチドＢと比較してポリペプチドＢ二量体の異なるν、ポリペプチドＢがわずかに異なることに起因する異なる希釈率でのわずかな密度差異、わずかに異なる使用バッファー（希釈溶液ではＰＢＳ、及びストック溶液ではＤ−ＰＢＳ）に起因する希釈率に関するわずかな密度差異、並びに利用可能なデータにより信頼性をもって説明するには小さすぎる非理想性からの寄与により説明することができる。 
【０１３７】
４℃、２５℃及び３７℃でのポリペプチドＦ及びポリペプチドＢの安定性試験
Ｄ−ＰＢＳ中で配合された単量体ポリペプチドＦ及びポリペプチドＢの溶液を２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、４℃、２５℃及び３７℃で保存した。３週間後及び６週間後、試料をPhenomenex製のＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ−２０００カラムでサイズ排除クロマトグラフィにより解析した。ポリペプチドＦ及びポリペプチドＢの両方のＳＥＣクロマトグラムでは、プレピークの存在は、３７℃で保存した試料のクロマトグラムでのみ観察された。二量体に対応するプレピークは、４℃、２５℃で保存した試料、又は−２０℃で保存した参照材料で観察されなかった。
【０１３８】
以下の表５では、ポリペプチドＦ及びポリペプチドＢの両方に関して、３７℃で保存した試料中に存在する二量体パーセント（総面積に対する二量体の面積パーセントとして表す）をまとめた。この表で観察され得るように、ポリペプチドＢはポリペプチドＦよりも二量体形成しやすいと考えられる。
【０１３９】
【表５】
2011525476.tif 000008
【０１４０】
別々の実験において、製剤バッファー中の賦形剤としてのマンニトールの効果を評価した。この場合、単量体ポリペプチドＢを、Ｄ−ＰＢＳ又は５％マンニトールを含有するＤ−ＰＢＳ中でそれぞれ、１８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で配合した。試料を３７℃で保存し、２週間、４週間、６週間及び８週間後のPhenomenex製のＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ−２０００カラムでサイズ排除クロマトグラフィにより解析した。
【０１４１】
以下の表６では、Ｄ−ＰＢＳ及びＤ−ＰＢＳ／５％マンニトール中で保存したポリペプチドＢに関して、３７℃で保存した試料中に存在する二量体パーセント（総面積に対する二量体の面積パーセントとして表す）をまとめた。この表で示されるように、バッファー中のマンニトールの存在は、３７℃でのポリペプチドＢの二量体形成の速度に明らかな影響がある。
【０１４２】
【表６】
2011525476.tif 000009
【０１４３】
別の実験において、Ｄ−ＰＢＳ中で、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度で単量体ポリペプチドＦ及びポリペプチドＢの両方の溶液を３７℃で保存した。６週間後、試料をPhenomenex製のＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ−２０００カラムでサイズ排除クロマトグラフィにより解析した。以下の表では、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬで保存したポリペプチドＦ及びポリペプチドＢに関して、３７℃で保存した試料中に存在する二量体パーセント（総面積に対する二量体の面積パーセントとして表す）をまとめた。本実験から、先で見られるように、ポリペプチドＦよりもポリペプチドＢでより迅速に二量体形成が進行することだけでなく、二量体形成の速度はタンパク質濃度に大きく依存することも分かった。
【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
同様に、二量体及び可能性としては多量体形成は、ポリペプチドＢ及び他の単一可変ドメインを含むポリペプチド、例えばポリペプチドＮを１つ及び治療標的と結合するナノボディを２つ（例えば治療標的に指向性を有する同一のナノボディを２つ）含むポリペプチドで観察された。例えばポリペプチドＢ及び他のナノボディを含む上記ポリペプチドの二量体／多量体形成は、液体製剤を含有するマンニトールで配合された場合、減速又は場合によってはほとんど回避される場合がある。二量体（ＮＦＤ）及び他の可能な高次の多量体の形成を低減又は回避するのが有益であると考えられる他のポリオール及び／又は糖が表８に挙げられる。任意の緩衝剤、生物学的に有効な量の本発明のポリペプチド、およそ０．６Ｍほどの濃度のマンニトール、及びポリオール、非還元型糖、ＮａＣｌ又はアミノ酸を含む他の賦形剤から成り得る、多種多様の液体製剤が有用であり得る。
【０１４６】
【表８】
2011525476.tif 000011
【０１４７】
ポリペプチドＢ及びポリペプチドＢ二量体のカオトロピック薬剤誘導性のアンフォールディング
カオトロピック薬剤誘導性のアンフォールディングはタンパク質の安定性を評価するのに頻繁に使用される技法である。カオトロピック薬剤誘導性のアンフォールディングをモニタリングするために、トリプトファン又はチロシン残基の固有の蛍光を使用することができる。アンフォールディングパラメータとして、「スペクトル質量中心」（ＣＳＭ＝Σ（蛍光強度×波数）／Σ（蛍光強度））を使用することができる。ポリペプチドＢ単量体及びポリペプチドＢ二量体によるアンフォールディング実験を、０Ｍ〜６Ｍの濃度範囲でグアニジン溶液中、２５μｇ／ｍＬで行った。これらの溶液の一晩インキュベーション後、蛍光スペクトルを日本分光株式会社のＦＰ−６５００機器で読み取った。励起は２９５ｎｍであり、スペクトルは３１０ｎｍ〜４４０ｎｍで読み取った。スペクトルデータを使用して、ＣＳＭ値を、上記式を使用して算出した。図２０では、グアニジン濃度に関してＣＳＭを示す。図２０で示されるように、ポリペプチドＢ（即ちＡｌｂ１１）二量体はより高いグアニジン濃度でアンフォールディングし、本発明者らは、単量体が、ポリペプチドＢ−二量体よりも安定性が低いと結論付けている。
【０１４８】
実施例５：ポリペプチドＧ及びポリペプチドＨとのＮＦＤのさらなる特徴付け
ポリペプチドＦの異なる突然変異体を構築、発現及び精製した。配列情報を以下に与える。
【０１４９】
純度をクマシー染色ゲル（図２１）及びウェスタンブロット法で解析した。
【０１５０】
ビアコアにおける血清アルブミンとの結合
ナノボディとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合は、ビアコア３０００機器での表面プラズモン共鳴により特徴付けされ、平衡定数ＫＤが決定される。要するに、ＨＳＡは、反応単位の増大が５００に達するまで、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ表面に共有結合した。残りの反応基は不活性化した。ナノボディ結合を、異なる濃度列を使用して評価した。それぞれのナノボディ（商標）濃度を４５μｌ／分の流速で４分間注入し、チップ結合抗原との結合を可能にした。次にナノボディなしで、結合バッファーを同じ流速でチップによって送り、結合ナノボディを解離させた。１５分後、残りの結合分析物を、再生溶液（５０ｍＭのＮａＯＨ）の注入により除去した。
【０１５１】
様々な濃度の分析物それぞれでセンサーグラムを得た（図２２）。ＫＤ値を速度論的データ解析により算出した。ポリペプチドＨ（ＥＰの代わりにＧＬを導入して、特にＰをＬに置き換える、図１７及び上記実施例も参照されたい）のｋｏｆｆ速度はより大きい。
【０１５２】
表９：ＨＳＡとの結合に関してビアコアで求められるような、ポリペプチドＦと、ヒト化誘導体であるポリペプチドＧ及びポリペプチドＨとのｋｏｆｆ値
【表９】
2011525476.tif 000012
【０１５３】
保存時の安定性
Ｄ−ＰＢＳ中に配合された単量体ポリペプチドＧ及びポリペプチドＨの溶液を２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、４℃、２５℃及び３７℃で保存した。３週間後及び６週間後、試料をPhenomenex製のＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ−２０００カラムでサイズ排除クロマトグラフィにより解析した。
【０１５４】
表Ａ：配列表：
【表１０】
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【０１５５】
用いられている用語及び表現は、説明するために使用され、限定するものではなく、図示及び説明される特徴、又はその一部の任意の同等物を排除するそれらの用語及び表現の使用は意図されない。様々な修正が本発明の範囲内で可能であることが認識される。
【０１５６】
本明細書中に記載の参考文献は全て、特に本明細書中の上記で言及される教示は、参照により援用される。
【０１５７】
好ましい態様：
１．  安定したＮＦＤ
２．  安定したＮＦＤ溶液。
３．  単一可変ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを濃縮する工程を含むプロセスによって、及び／又は例えば１週間〜４週間、例えば４週間のような長期間にわたって、高温、例えば融点に近い温度又は例えば３７℃で保存する工程を含むプロセスによって得ることができる安定したＮＦＤ。
４．  単一可変ドメイン（複数可）及びリンカーから成るポリペプチドを濃縮する工程を含むプロセスによって得ることができる安定したＮＦＤ。
５．  該濃縮する工程をアフィニティクロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィにより行う、態様２又は４に記載の安定したＮＦＤ。
６．  該濃縮する工程をプロテインＡカラムで行い、大量のポリペプチド（例えば樹脂プロテインＡ  １ｍｌ当たり２ｍｇ〜５ｍｇ）が該カラムに装填される、態様２〜５に記載の安定したＮＦＤ。
７．  該ポリペプチドが急なｐＨ勾配により溶出される、例えば１工程でのｐＨ変化が２である、態様５又は６に記載の安定したＮＦＤ。
８．  該ＮＦＤが−２０℃で最大２年間にわたって安定している、態様１〜７に記載の安定したＮＦＤ。
９．  該ＮＦＤが４℃で最大２週間にわたって安定している、態様１〜８に記載の安定したＮＦＤ。
１０．  該ＮＦＤが５０℃で最大１５分間にわたって安定している、態様１〜９に記載の安定したＮＦＤ。
１１．  該ＮＦＤが酸性ｐＨで安定している、態様１〜１０に記載の安定したＮＦＤ。
１２．  該ＮＦＤが長期間にわたって酸性ｐＨで安定している、態様１〜１１に記載の安定したＮＦＤ。
１３．  該ＮＦＤが長期間にわたって塩基性ｐＨで安定している、態様１〜１２に記載の安定したＮＦＤ。
１４．  該ＮＦＤがｐＨ３〜ｐＨ８で安定している、態様１〜１３に記載の安定したＮＦＤ。
１５．  該ＮＦＤがｐＨ２．５〜ｐＨ８で安定している、態様１〜１４に記載の安定したＮＦＤ。
１６．  該ＮＦＤが４℃で４週間、ｐＨ３〜ｐＨ８で安定している、態様１〜１５に記載の安定したＮＦＤ。
１７．  該ＮＦＤが有機溶媒と混合した場合に安定している、態様１〜１６に記載の安定したＮＦＤ。
１８．  該ＮＦＤがアルコール、例えばイソプロパノールと混合した場合に安定している、態様１〜１７に記載の安定したＮＦＤ。
１９．  該ＮＦＤが３０％（ｖ／ｖ）のアルコール、例えばイソプロパノールと混合した場合に安定している、態様１〜１８に記載の安定したＮＦＤ。
２０．  ＮＦＤとその標的分子との解離定数が、その対応する単量体構成要素と上記標的分子との解離定数とほぼ同じである、態様１〜１９に記載の安定したＮＦＤ。
２１．  その標的分子との特異的な結合が存在しない、態様１〜２０に記載の安定したＮＦＤ。
２２．  ＮＦＤとその標的分子との解離定数が、その対応する単量体構成要素と上記標的分子との解離定数の３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である、態様１〜２１に記載の安定したＮＦＤ。
２３．  ＮＦＤとその標的分子との解離定数が、１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下である、態様１〜２２に記載の安定したＮＦＤ。
２４．  ＮＦＤとその標的分子とのｋｏｆｆ値が、その対応する単量体構成要素のｋｏｆｆ値とほぼ同じである、態様１〜２３に記載の安定したＮＦＤ。
２５．  ＮＦＤとその標的分子とのｋｏｆｆ値が、その対応する単量体構成要素のｋｏｆｆ値よりも９０％超、より好ましくは５０％超、さらにより好ましくは４０％超、さらにより好ましくは３０％超、さらにより好ましくは２０％超、最も好ましくは１０％超高くない、態様１〜２４に記載の安定したＮＦＤ。
２６．  ＮＦＤとその標的分子とのｋｏｆｆ値が、その対応する単量体構成要素のｋｏｆｆ値よりも５０％超高くない、態様１〜２５に記載の安定したＮＦＤ。
２７．  ＮＦＤとその標的分子とのｋｏｆｆ値が、その対応する単量体構成要素のｋｏｆｆ値よりも１０％超高くない、態様１〜２６に記載の安定したＮＦＤ。
２８．  単一可変ドメインがＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、親和性成熟、安定化した若しくはそうでなければ改変ＶＨＨ又はこれらの構築物等のナノボディである、態様１〜２７に記載の安定したＮＦＤ。
２９．  単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、好ましくは配列番号２である、態様１〜２８に記載の安定したＮＦＤ。
３０．  単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、好ましくは配列番号２である、態様１〜２８に記載の安定したＮＦＤ。
３１．  単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、好ましくは配列番号２であり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のいずれか、好ましくは配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一性である機能的配列を有する、態様１〜３０に記載の安定したＮＦＤ。
３２．  単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択され、好ましくは配列番号２であり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のいずれか、好ましくは配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一性である機能的配列を有し、上記配列がそれらの標的分子（複数可）と特異的に結合し、より好ましくは二重特異性又は多重特異性であれば、それらの標的分子の少なくとも１つに対して１００ｎＭ以下の解離定数、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数、最も好ましく１ｎＭ以下の解離定数を有する、態様１〜３１に記載の安定したＮＦＤ。
３３．  態様１〜３２に記載のＮＦＤの機能的断片。
３４．  単一可変ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドであって、上記単一可変ドメインの少なくとも１つが例えば態様１〜３２に記載のＮＦＤを形成することができる、ポリペプチド。
３５．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３３に記載の機能的断片、又は態様３４に記載のポリペプチドを含む、調製物。
３６．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３３に記載の機能的断片、又は態様３４に記載のポリペプチドを含む、調製物であって、ＮＦＤとその対応する単量体構成要素との比が、約１部のＮＦＤ対１部の対応する単量体構成要素〜約１部のＮＦＤ対２部の対応する単量体構成要素である、調製物。
３７．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３３に記載の機能的断片、又は態様３４に記載のポリペプチドを含む、調製物であって、ＮＦＤとその対応する単量体構成要素との比が、約１部のＮＦＤ対１部の対応する単量体構成要素〜約２部のＮＦＤ対１部の対応する単量体構成要素である、調製物。
３８．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３２に記載の機能的断片、又は態様３３に記載のポリペプチドを含む、調製物であって、ＮＦＤとその対応する単量体構成要素との比が２５％ＮＦＤ：７５％単量体構成要素である、調製物。
３９．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３３に記載の機能的断片、又は態様３４に記載のポリペプチドを含む、調製物であって、ＮＦＤとその対応する単量体構成要素との比が７５％ＮＦＤ：２５％単量体構成要素である、調製物。
４０．  態様１〜３２に記載のＮＦＤ、態様３３に記載の機能的断片、又は態様３４に記載のポリペプチドを作製する方法であって、疎水性相互作用に有利に働く条件を有する方法工程を含む、方法。
４１．  上記方法工程が精製工程である、態様４０に記載のＮＦＤを作製する方法。
４２．  上記方法工程内で、該条件が、部分的なタンパク質のアンフォールディングを促進するようなものである、態様４０に記載のＮＦＤを作製する方法。
４３．  上記方法工程が精製工程である、態様４２に記載のＮＦＤを作製する方法。
４４．  ＮＦＤを作製する方法であって、例えばアフィニティクロマトグラフィカラム、例えばプロテインＡ又はＩＭＡＣで単一可変ドメイン（複数可）を含む上記ポリペプチドと結合することにより、上記ＮＦＤの単量体構成要素を上方濃縮する工程を含む、方法。
４５．  ＮＦＤを作製する方法であって、アフィニティクロマトグラフィカラム、例えばプロテインＡ又はＩＭＡＣで単一可変ドメイン（複数可）を含むポリペプチドと結合すると共に、上記ポリペプチドの放出を可能にするｐＨ工程で溶出する工程を含む、方法。
４６．  ＮＦＤを作製する方法であって、アフィニティクロマトグラフィカラム、例えばプロテインＡで単一可変ドメイン（複数可）を含むポリペプチドと結合すると共に、１カラム容量以内での上記ポリペプチドの放出を可能にするｐＨ工程で溶出する工程を含む、方法。
４７．  限外濾過の工程を含む、ＮＦＤを作製する方法。
４８．  限外濾過を低塩条件下で行う、態様４６に記載の方法。
４９．  高温で長時間にわたって単一可変ドメインを少なくとも１つ含む適切なポリペプチドを保存する方法工程を含む、態様１〜３２に記載のＮＦＤを作製する方法。
５０．  上記高温が３７℃であり、時間が１週間、２週間、３週間、４週間、５週間又は６週間、好ましくは４週間である、態様４９に記載のＮＦＤを作製する方法。
５１．  上記高温が部分的なタンパク質のアンフォールディングを促進するようなものであり、曝露が１週間、２週間、３週間、４週間、５週間又は６週間、好ましくは４週間にわたる、態様４９又は５０に記載のＮＦＤを作製する方法。
５２．  上記高温がポリペプチドの融点に近く、曝露が１週間、２週間、３週間、４週間、５週間又は６週間、好ましくは４週間にわたる、態様４９〜５１に記載のＮＦＤを作製する方法。
５３．  上記単一可変ドメインのＣＤＲ３が不安定化する、態様４８〜５２に記載のＮＦＤを作製する方法。
５４．  上記単一可変ドメインが、例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、親和性成熟、安定化又はそうでなければ改変ＶＨＨ等のナノボディである、態様４９〜５３に記載のＮＦＤを作製する方法。単一可変ドメイン（複数可）、例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、親和性成熟、安定化又はそうでなければ改変ＶＨＨ等のナノボディを含む単量体ポリペプチドを作製する方法であって、上記ポリペプチドの作製における工程のそれぞれが、１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは５％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは４％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは３％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは１％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）を超える対応するＮＦＤを生成しない、方法。
５５．  上記方法における工程のそれぞれが疎水性相互作用に有利に働く条件を避ける、態様５４に記載の方法。
５６．  疎水性相互作用に有利に働く上記条件が、高濃度の上記ポリペプチド、即ち例えば樹脂カラム材料１ｍｌ当たりポリペプチドが１０ｍｇを超える濃度の上記ポリペプチドであり、このため上記相互作用を避ける方法は、その作製工程のそれぞれにおいてこのような条件を避ける、態様５４又は５５に記載の方法。
５７．  例えばアフィニティカラムのカラム装填量を慎重に評価し、カラムの過剰装填を避ける、即ちカラム最大装填量を求める必要があり、ここで１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは５％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは４％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは３％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは１％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）を超えるＮＦＤは生成されない、態様５６に記載の方法。
５８．  ＮＦＤを欠いている、又はＮＦＤが５０％、より好ましくは４０％、さらにより好ましくは３０％、さらにより好ましくは２０％、最も好ましくは１０％以下である、態様５３〜５６に記載の単一可変ドメイン（複数可）、例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、親和性成熟、安定化又はそうでなければ改変ＶＨＨ等のナノボディを含む単量体ポリペプチドを作製する方法であって、上記方法における工程のそれぞれが疎水性相互作用に有利に働く条件を避け、ここで例えば該方法がプロテインＡ工程から成ることはない及び／又は該方法が、上記単一可変ドメインが部分的にアンフォールディングされる条件を避ける、例えばＣＤＲ３が、例えばポリペプチドの融点に近い温度又は例えば３７℃等の高温で、例えば数週間、例えば４週間のような長時間にわたって、不安定化及び／又は部分的にアンフォールディングされる、方法。
５９．  二量体化しやすいポリペプチド、例えば態様１〜態様３２に記載のポリペプチド、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０の少なくとも１つを含むポリペプチド、例えばポリペプチドＢを含むポリペプチドとポリオールとを含む医薬製剤。
６０．  ポリオールが例えば０．６Ｍ以下の濃度である、態様５９に記載の医薬製剤。
６１．  ポリオールがソルビトール、マンニトール、キシリトール、リビトール及び／又はエリスリトールである、態様５９又は６０に記載の医薬製剤。
６２．  ポリオールがマンニトールであり、例えば０．６Ｍ以下のマンニトール濃度である、態様５９〜６１に記載の医薬製剤。
６３．  ポリペプチドがポリペプチドＢを含む、態様５９〜６２に記載の医薬製剤。
６４．  例えばスクロース及び／又はトレハロース等の非還元型糖と、任意でＮａＣｌ及び／又はアミノ酸とをさらに含む、態様５９〜６３に記載の医薬製剤。
６５．  液体製剤である、態様５９〜６４に記載の医薬製剤。
６６．  乾燥形態で、例えば凍結乾燥により調製される、態様５９〜６４に記載の医薬製剤。
６７．  注入物質として使用される、態様５９〜６４に記載の医薬製剤。
６８．  皮下製剤として使用される、態様５９〜６４に記載の医薬製剤。
６９．  ＮＦＤ、ＮＦＤ断片、又は態様１〜６８に記載の、例えば本明細書中で記載のＮＦＤを形成することができる（又は形成している）単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、単一可変ドメインが、Spinelli et al, FEBS Letters 564 （2004） 35-40に記載のＶＨＨ−Ｒ９ではない、ＮＦＤ、ＮＦＤ断片、又は態様１〜６８に記載の、例えば本明細書中で記載のＮＦＤを形成することができる（又は形成している）単一可変ドメインを含むポリペプチド。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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