(57)【要約】  マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ）装置および方法は、レーザ（１００）と、レーザ光をＭＡＤＬＩイオン源（１０４）に伝達するマルチモード光ファイバ（１０１）とを具える。光ファイバ（１０１）の長さに沿った領域に振動連結部（１０９）が設けられており、光ファイバ（１０１）に振動運動を与えて試料（１０４）の照射強度の最大点を移動させ、効果的に照射表面域を増加させる。本装置および方法は、画像感度を増加させて、対応するデータ収集時間を減少させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を生成する手段と；
前記レーザ光をイオン源に送達するマルチモード光ファイバと；
前記イオン源における前記レーザ光の空間的な強度分布が１よりも多くの強度ピークを示すように、前記光ファイバを振動させるよう構成された振動手段とを具える質量分析計。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析計において、前記振動手段が、機械的な振動装置を具えることを特徴とする質量分析計。
【請求項３】
請求項１に記載の質量分析計において、前記振動手段が、圧電スイッチを具えることを特徴とする
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の質量分析計において、前記振動手段が、前記光ファイバと物理的に連結されることを特徴とする質量分析計。
【請求項５】
請求項１に記載の質量分析計において、前記振動手段が、前記光ファイバを振動させるために当該光ファイバの領域に空気の波動を生成する手段を具えることを特徴とする質量分析計。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の質量分析計において、前記レーザ光を生成する手段が利得媒体を具えており、当該利得媒体が：
ＹＡＧと；
イットリウムオルソバナジウム（Yttrium ortho vanadate）と；
イットリウム・フッ化リチウム（Yttrium lithium fluoride)のうちの任意の１つまたはこれらの組合せを含むことを特徴とする質量分析計。
【請求項７】
請求項６に記載の質量分析計において、前記レーザ光を生成する手段がさらに：
ネオジムと；
イッテルビウムのうちの任意の１つまたはこれらの組合せを含むことを特徴とする質量分析計。
【請求項８】
請求項６に記載の質量分析計において、前記レーザ光を生成する手段がさらに、周波数を変換する１またはそれ以上の非線形結晶を具えることを特徴とする質量分析計。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか一項に記載の質量分析計がさらに試料チャンバを具えており、前記レーザ光が前記試料チャンバ内を向くように前記光ファイバが前記試料チャンバと連結されることを特徴とする質量分析計。
【請求項１０】
請求項９に記載の質量分析計において、前記振動手段が、前記光ファイバを振動させるために当該光ファイバの長さに沿って前記試料チャンバから１乃至５ｃｍ離れて配置されることを特徴とする質量分析計。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか一項に記載の質量分析計が、イメージング質量分析計であることを特徴とする質量分析計。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載の質量分析計が、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析計であることを特徴とする質量分析計。
【請求項１３】
マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析の一部としてレーザ光を試料に送達する方法において：
レーザ光を生成するステップと；
マルチモード光ファイバを用いて前記レーザ光をイオン源に送達するステップと；
前記イオン源における前記レーザ光の空間的な強度分布が１よりも多くの強度ピークを示すように、前記光ファイバの長さに沿った領域において振動手段を用いて前記光ファイバを振動させるステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法が、質量分析イメージング法であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析に関し、具体的には、排他的ではないが、マルチモード光ファイバの供給によって対象にレーザ光を与えるマトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、質量分析（ＭＳ）に対して適応性が高いソフトイオン化法である。１９８０年代後半に開発され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳはプロテオミクスにおける多くの用途に見出されると同時に、薄い生物の組織部の表面から直接的に蛋白質の分析および画像化できるようになり、その万能性は近年拡大してきた。
【０００３】
画像を得る質量分析の利用は、二次イオンイメージング質量分析（ＳＩＭＳ）の開発で始まった。イメージングＳＩＭＳでは、試料の表面に、表面からニュートラルと荷電種の排出（またはスパッタ）を誘発する高エネルギイオンが衝突する。排出された種は、原子、原子および分子片のクラスタを含んでもよい。従来のＳＩＭＳでは、質量分析されるのは正イオンのみである。この技術はプローブとして原子イオンのビーム（すなわち、荷電粒子）を用いるため、入射ビームを集束させて、次いで表面にわたって走査することは比較的簡単なことである。ラスタ地点において選択された質量の検出反応が、画像の画素となる。イオンビームを用いることにより、サブミクロンの空間解像度が生じる。
【０００４】
イメージングＳＩＭＳは、細胞レベルおよび細胞レベル下における薬物の監視を含む様々な医薬の用途に用いられてきた。今では、ＳＩＭＳを生物試料における低質量（＜５００ｕ）の有機化合物および代謝産物に利用するまで発展した。しかしながら、この技術によって分析できる質量の範囲は大幅に制限されている。
【０００５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳイメージングにおける最初のステップは、マトリックスの薄層を試料に適用するステップを含む。試料の化学構造は、静止したレーザの下に試料を移動させ、各点から質量スペクトルを得ることによって画像化される。絶対イオン存在量に対するｘとｙの空間次元をプロットすることによって３次元画像を得ることができ、これは被分析物濃度に比例するとみなされる。
【０００６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳの更なる発展は、ビームを形成し、光ファイバの供給を用いてレーザ媒体から試料に送達するステップを必要とする。通常、内部反射によって複数の光路を生成する単一のマルチモード光ファイバが用いられる。光ファイバは、試料の表面に分布した強度が空間的に調整された分析結果となるように機能する。空間的に成形することなく、試料のビーム強度は、従来用いられる固体レーザのように、単一の最大値（強度ピーク）を有するガウス（Gaussian）分布またはガウス分布に近いものを示す。
【０００７】
しかしながら、マルチモード光ファイバの供給は試料に複数の強度ピークをもたらし、データ収集の感度および速度は光ファイバの物理的構成に制限される。
【０００８】
英国特許第２４２２９５４号は、試料の空間的な強度分布が１またはそれ以上の強度ピークを示すように、空間的に適合されたパルス状レーザ光を生成するよう構成されたＭＡＬＤＩを基礎としたレーザシステムを開示している。レーザ光の強度を空間的に適合させる光学要素または電気光学要素が開示されており、中心点においてレーザ光を完全にまたは部分的に吸収、反射または拡散させるレンズアレイ、デジタル光学要素またはマスクを具えている。光学要素または電気光学要素は、試料に異なるビームの空間的強度分布を生成するように調整することができる。
【０００９】
しかしながら、英国特許第２４２２９５４号のレーザシステムは通常、４乃至１０時間程度の膨大なデータ収集時間を必要としており、重要なことに感度を制限してしまう。
【００１０】
イメージング質量分析法（ＩＭＳ）を実施する場合に、解像度を可能な程度に改善しながら、感度を上げてデータ収集時間を減少させるＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置が必要である。
【００１１】
本発明は、現在の質量分析技術に優る、高い感度を提供しながら対応するデータ収集時間を減少させる質量分析を用いる分析システムを提供するものである。特に、本発明は、幅広い非生物および生物試料を画像化するのに適したＭＡＬＤＩ−ＭＳに用いる装置および方法を提供するものである。特定の実施例によると、現在のＭＡＬＤＩイメージング技術よりも優れ、感度が十倍も増加することが確認された。
【００１２】
本発明者は、レーザ光を試料／イオン源に伝達するために用いる光ファイバの領域を振動させることにより、強度最大点が試料において繰り返し移動し、これにより単一の画素領域範囲内の試料のイオン化の程度が増加することを発見した。
【００１３】
本発明はマルチモード光ファイバを使用し、特に、単一のマルチモードファイバは、試料に伝達されるときのレーザ光が空間的に分布するように構成され、複数の強度最大点が発生する。適切な振動手段を用いて光ファイバを調整することにより、複数の強度最大点が効果的に増加し、試料の表面領域の照射が増加する。
【００１４】
本発明はさらに、試料における入射強度の最大点が増加するようにスペックルの発生を乱す手段と共に、試料に複数の強度最大点を生じさせる代替的な手段および方法を具える。
【００１５】
本発明の第１の態様によると、レーザ光を生成する手段と、レーザ光をイオン源に伝達するマルチモード光ファイバと、イオン源におけるレーザ光の空間的な強度分布が１よりも多くの強度ピークを示すように光ファイバを振動させるよう構成された振動手段とを具える質量分析計が設けられている。
【００１６】
本発明は、所望の波長、一般に約２００乃至３６０ｎｍの波長を提供するよう構成された、幅広い異なるレーザでの使用に適している。特定の一実施例によると、レーザは、３５５ｎｍの波長を与えるために周波数が３倍された、ネオジムドープのイットリウムオルソバナジウム（neodynium doped yttrium ortho vanadate）Ｎｄ：ＹＶＯ４である。代替的なレーザは、例として、ネオジムドープのイットリウムアルミニウムガーネット（neodymium doped yttrium aluminium garnet）（Ｎｄ：ＹＡＧ）である。特に、当該技術分野の当業者は理解するであろうが、本発明の特定の実施例は、ネオジム、イッテルビウムを含む能動イオン、または他のホストと適切な波長のレーザ出力をもたらすように設計された非線形結晶などの様々な周波数を変換する手段を有するか有さない能動イオンとの組合せを有する、ＹＡＧ、バナジウム、イットリウム・フッ化リチウム（ＹＬＦ）を含んでもよい。
【００１７】
光ファイバを発振／振動させる手段は、光ファイバと物理的に連結された、または連結されていない、縦軸に対して横または垂直方向に光ファイバの振動運動を付与するように設計された任意の機械的、電気的、音波または空気変位ベースの装置を具えていてもよい。例示的な振動手段は、運動を誘発するために光ファイバの領域に触知性音波パルスを生成するよう設計された電気モータ、圧電スイッチまたはスピーカシステムを含む。
【００１８】
当該技術分野の当業者は理解するであろうが、この質量分析計は、３つの基礎要素、すなわちイオン化源と、分析計と、検出器とを具える。好適には、このシステムは、ＭＡＬＤＩイオン化源、特に直交ＭＡＬＤＩ（ｏＭＡＬＤＩ）イオン源に用いられる適切な検出システムを有するハイブリッド四重極飛行型分析計を具える。
【００１９】
好適には、振動手段は、イオン源／試料チャンバまたは試料支持部に近位の光ファイバの一端を向いた領域における質量分析計に取り付けられる。特に、光ファイバが試料チャンバに向かって物理的に連結された領域からおよそ１乃至５ｃｍ離して振動連結器を取付けることが有意であることが見出された。当該技術分野における当業者は理解するであろうが、この振動手段を光ファイバの長さに沿った任意の領域に配置すると、ＭＡＬＤＩイオン源の強度最大点が物理的に移動するように作用する振動運動を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の特定の実施例を例示としてのみ、添付の図面を参照して示す。
【図１】図１は、本発明の特定の実施例による光ファイバの縦軸に対して横方向に振動運動を付与するように光ファイバに配置された振動連結器を具える質量分析計を概略的に示す。
【図２】図２は、振動手段が動作している動的調整モードでの動作と、振動手段が動作していない別のモードのＭＡＬＤＩ試料のイオン化強度を対比した、図１の質量分析計での時間に対する強度のイオンクロマトグラフを示す。
【図３】図３は、図２の最高かつ最大強度の領域による、振動手段が動作して光ファイバの調整をしている状態で得られる質量スペクトルを示す。
【図４】図４は、図２における別の低い強度の領域による、振動連結部が動作していない状態で得られる質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
質量分析計は、第１の端部１０５で光ファイバ１０１が連結されたレーザ１００（Ｎｄ：ＹＶＯ４のような媒体に基づく）を具える。ファイバ１０１の第２の端部１０６は、適切なねじ型の連結部１０７によって、試料ハウジング１０２に連結される。光ファイバ１０１の送達端部１０６は、ハウジング１０２の内部チャンバ１０８内の適切な試料支持部１０３に取り付けられた試料／ＭＡＬＤＩイオン源１０４の領域を照射するように方向付けられる。
【００２２】
振動連結部１０９は、ビーム送達端部１０６を向いて光ファイバ１０１に連結されており、端部１０６からおよそ１乃至５ｃｍ離れている。振動手段１０９は、ファイバ１０１の外面と物理的に連結するために、適切な台部（図示せず）を用いて分析計内に支持されて取り付けられてもよい。本発明のさらなる特定の実施例によると、振動連結部１０９は光ファイバ１０１の外面とは物理的に連結されないが、流体、特に空気などの光ファイバ１０１の外面を覆っている媒体を介して振動運動を付与する。特に、振動手段１０９は、ファイバ１０１の外面に向かって空気パルスを誘導するよう設計された空気ポンプまたはスピーカシステムを具えていてもよい。
【００２３】
使用時、かつ振動連結部１０９が動作している状態では、光ファイバ１０１は、当該光ファイバ１０１の縦軸に対して横向き、特に垂直に調整された方向１１０に沿って、前後に振動させられる。
【００２４】
振動連結部１０９の領域における振動運動１１０は、光ファイバ１０１の長さに沿って伝達され、照射端部１０６において振動運動は比較的小さくなる。これには、試料表面１０４における照射強度の最大点を物理的に移動させる効果がある。振動連結部１０９は、端部１０６における光ファイバ１０１の調整運動が、およそ１５０×１００μｍの寸法の単一ピクセル内にのみ強度最大点を配置させるには十分となるように構成される。現行の質量分析計装置の感度を高めるため、本発明者は２５×２５μｍ程度の画素範囲で解像度を高めることが可能なシステムを提供する。
【００２５】
［ＭＡＬＤＩ質量分析イメージングによる調査］
振動連結部１０９が動作モードおよび非動作モードであるＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ機器の感度における効果を測定して、比較調査を実施した。この結果を図２乃至図４に示す。
【００２６】
この質量分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ社（カナダ、オンタリオ州、コンコード）による、ＡＰＩ「Ｑ−Ｓｔａｒ」パルサー・アイ・ハイブリッド四重極の飛行時間型機器を使用して実施され、これは、直交ＭＡＬＤＩ源および「ｏ−ＭＡＤＬＩサーバ４．０」、イオン画像化ソフトに適している。画像処理は、ＢｉｏＭａｐ画像ソフト（www.maldi-msi.org）を用いて実施した。
【００２７】
ネオジムドープのイットリウムオルソバナジウム（neodynium doped yttrium ortho vanadate）（Ｎｄ：ＹＶＯ４）のレーザを、およそ１５０×１００μｍの寸法のレーザスポットに使用した。画像は、３０％のレーザ出力および（更に高いか低い周波数を用いてもよいが）１ｋＨｚのレーザ反復速度を用いて、２００μｍのインクリメントにおいて各スポット毎におよそ２秒間の焼灼時間で得られた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ社「Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｉｘｅｌ」のＭＡＬＤＩ  ＭＳＩ取得モードのベータ試験版を総ての調査に使用した。
【００２８】
図２は、振動連結部１０９が動作してビームプロファイルを調整している状態（領域２００）、および光ファイバ１０１が方向１１０に振動せずに動作していない（領域２０２）状態の合計イオンクロマトグラフを図示している。図２は、試料１０４を照射しながら光ファイバの端部１０６が前後に移動しているときに試料の表面域を照射することによって得られる、試料のイオン化の強度差を示している。図２に示すように、領域２００と領域２０２との間の強度差は、およそ一桁である。この突然変化する領域２０１は、機械的な振動連結部１０９の動力の終了に相当し、強度が急に低下する。
【００２９】
図３は、図２の領域２０２による、振動連結部１０９が動作していない状態で得られる質量スペクトルを示している。
【００３０】
図４は、図３の調査に用いたものと同一のＭＡＬＤＩイオン化源および機器パラメータを利用した、図２の領域２００による連結部１０９が動作している状態で得られる質量スペクトルを示している。
【００３１】
図３および図４を参照すると、イオン化データは、振動連結部１０９が動作していない状態では領域３００および３０１にのみ現れている。対照的に、連結部１０９が動作している状態では強度特性は著しく増加し、強度の領域４００および４０１によると広い試料表面域を照射している。特に、本発明の感度が増加したため、このデータは図３の装置では不可能であるデータが、領域４０２では得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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