(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染の治療に関する組成物および方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療に関する。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染を治療するためのオリゴヌクレオチド組成物の投与方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の投与に関する。さらなる実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド中の免疫刺激モチーフの操作に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）以下のもの：
（ａ）ウイルス感染の症状を有する被験体、および
（ｂ）少なくとも１つの免疫刺激モチーフを含む少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
を準備するステップ、ならびに
（ｉｉ）免疫応答が生起される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ウイルス感染を引き起こすウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎を引き起こすウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスが、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、水素、アルキル、アミノ、チオール、カルボキシル、アミド、ホスフェート、ポリホスフェート、ホスホロチオエート、ハロゲン化物、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコールに基づく置換基、プリンおよび誘導体化プリン、ピリミジンおよび誘導体化ピリミジン、脂肪酸、アミノ酸、ならびに含酸素複素環および含窒素複素環などの複素環式化合物からなる群より選択される少なくとも１つの化学修飾基を含むように修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
免疫刺激モチーフがＣｐＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
免疫刺激モチーフがＣｐＧでない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第２の医薬組成物が、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ウイルス剤が、バカビル(vacavir)、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル(denavir)、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース(fortovase)、ヒビド(hivid)、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル(norvir)、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール(rescriptor)、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン(symdine)、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス(videx)、ビラセプト、ビラミジン(viramidine)、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン(ziagen)、ジドブジン、ゾビラックス、およびザナミビルからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コルチコステロイドが、デキサメタゾン(Decadron)、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン(Medrol)、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
免疫調節剤が、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−γ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン不応剤(Interferon Nonresponder)、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、アクチミューン(Actimmune)、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン(Neupogen)、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ(Raptiva)、エファリズマブ、チモグロブリン(Thymoglobulin)、インフェルゲン(Infergen)、ムロモナブ(Muromaonab)、ゼナパックス(Zenapax)、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
投与ステップが、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ、ペネトラチン(Penetratin)、ブフォリンＩＩ(Buforin II)、トランスポルタン(Transportan)、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体または抗体フラグメントが免疫化により生成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体の少なくとも一部分が合成的に生成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
以下のステップ：
（ｉ）以下のもの：
（ａ）ウイルス感染の危険性がある被験体、および
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列および配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
を準備するステップ、ならびに
（ｉｉ）該感染が予防される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記ウイルス感染を引き起こすウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎を引き起こすウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスが、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＲＮＡウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性となるように修飾されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
第２の医薬組成物が、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗ウイルス剤が、バカビル(vacavir)、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル(denavir)、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース(fortovase)、ヒビド(hivid)、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル(norvir)、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール(rescriptor)、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン(symdine)、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス(videx)、ビラセプト、ビラミジン(viramidine)、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン(ziagen)、ジドブジン、ゾビラックス、およびザナミビルからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
コルチコステロイドが、デキサメタゾン(Decadron)、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン(Medrol)、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
免疫調節剤が、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−γ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン不応剤(Interferon Nonresponder)、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、アクチミューン(Actimmune)、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン(Neupogen)、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ(Raptiva)、エファリズマブ、チモグロブリン(Thymoglobulin)、インフェルゲン(Infergen)、ムロモナブ(Muromaonab)、ゼナパックス(Zenapax)、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
投与ステップが、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ、ペネトラチン(Penetratin)、ブフォリンＩＩ(Buforin II)、トランスポルタン(Transportan)、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
抗体または抗体フラグメントが免疫化により生成される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体の少なくとも一部分が合成的に生成される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
以下のステップ：
（ｉ）以下のもの：
（ａ）無症候性のウイルス感染被験体、および
（ｂ）少なくとも１つの免疫刺激モチーフを含む少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
を準備するステップ、ならびに
（ｉｉ）免疫応答が生起される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップ
を含む方法。
【請求項４６】
前記ウイルス感染を引き起こすウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎を引き起こすウイルスである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスが、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＲＮＡウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性となるように修飾されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
第２の医薬組成物が、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
抗ウイルス剤が、バカビル(vacavir)、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル(denavir)、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース(fortovase)、ヒビド(hivid)、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル(norvir)、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール(rescriptor)、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン(symdine)、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス(videx)、ビラセプト、ビラミジン(viramidine)、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン(ziagen)、ジドブジン、ゾビラックス、およびザナミビルからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
コルチコステロイドが、デキサメタゾン(Decadron)、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン(Medrol)、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
免疫調節剤が、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−γ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン不応剤(Interferon Nonresponder)、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、アクチミューン(Actimmune)、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン(Neupogen)、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ(Raptiva)、エファリズマブ、チモグロブリン(Thymoglobulin)、インフェルゲン(Infergen)、ムロモナブ(Muromaonab)、ゼナパックス(Zenapax)、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
投与ステップが、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ、ペネトラチン(Penetratin)、ブフォリンＩＩ(Buforin II)、トランスポルタン(Transportan)、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
抗体または抗体フラグメントが免疫化により生成される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体の少なくとも一部分が合成的に生成される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染の治療に関する組成物および方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療に関する。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染を治療するためのオリゴヌクレオチド組成物の投与方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の投与に関する。さらなる実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド中の免疫刺激モチーフの操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科（Flavivirideae）のメンバーであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ｍＲＮＡとしても機能するプラス一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する。米国で約４００万人および世界中でおそらく１億人以上がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。このウイルスは、非経口または経皮伝染後に感受性宿主での持続感染を引き起こす独特の能力を有する。防御とウイルスクリアランスとの免疫学的相関、ならびに肝臓傷害の発生機序は未だ明らかになっていない。感染者の７０％〜８０％近くが慢性キャリアになり、慢性および進行性ＨＣＶ感染は重大な罹病率および死亡率を有する（例えば、硬変、末期肝疾患、および肝癌の主因である）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、慢性ＨＣＶ感染の治療のための唯一の認可されている治療は２４〜４８週間のＩ型インターフェロン（ＩＦＮα／β）およびリバビリンの組み合わせであり、持続したウイルスクリアランスが４２％〜８２％の治療個体で観察される。特定の患者集団で無効であることに加えて、この治療はかなりの有害な副作用のせいで問題がある。リバビリンは用量依存的溶血および貧血を引き起こし、重度の副作用が併用療法で頻繁に観察される。多くの場合、治療をインターフェロンのみの単独療法に縮小しなければならない。ＨＣＶおよび他のＲＮＡウイルスの抗ウイルス治療中のＩＦＮ（またはＩＦＮに対する抵抗性）の作用機構（群）はよく理解されていないが、そのような理解は新規抗ウイルス治療の開発を導くために望ましい。ゆえに、ＨＣＶ感染を低下または阻害するための組成物および方法であって、限られた有害な影響しか有さずかつ広い範囲の患者集団に有効な組成物および方法を特定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、ウイルス感染の治療に関する組成物および方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療に関する。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染を治療するためのオリゴヌクレオチド組成物の投与方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の投与に関する。さらなる実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド中の免疫刺激モチーフの操作に関する。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明は、ウイルス感染の症状を有する被験体、および少なくとも１つの免疫刺激モチーフを含む少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を準備するステップ、ならびに免疫応答が生起される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップを含む方法に関する。別の実施形態では、前記ウイルス感染を引き起こすウイルスはＲＮＡウイルスである。さらに別の実施形態では、ＲＮＡウイルスはＣ型肝炎を引き起こすウイルスである。さらなる実施形態では、Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスは、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、水素、アルキル、アミノ、チオール、カルボキシル、アミド、ホスフェート、ポリホスフェート、ホスホロチオエート（phosphothioate）、ハロゲン化物、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコールに基づく置換基、プリンおよび誘導体化プリン、ピリミジンおよび誘導体化ピリミジン、脂肪酸、アミノ酸ならびに含酸素複素環および含窒素複素環などの複素環式化合物からなる群より選択される少なくとも１つの化学修飾基を含むように修飾される。さらなる実施形態では、免疫刺激モチーフはＣｐＧである。一部の実施形態では、免疫刺激モチーフはＣｐＧでない。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる。さらなる実施形態では、本発明は、前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の医薬組成物は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される。別の実施形態では、抗ウイルス剤は、バカビル（bacavir）、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル（denavir）、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース（fortovase）、ヒビド（hivid）、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル（norvir）、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール（rescriptor）、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン（symdine）、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス（videx）、ビラセプト、ビラミジン（viramidine）、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン（ziagen）、ジドブジン、ゾビラック���、およびザナミビルからなる群より選択される。さらに別の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン（Decadron）、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（Medrol）、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される。さらなる実施形態では、免疫調節剤は、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロンγ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン不応剤（Interferon Nonresponders）、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、アクチミューン（Actimmune）、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン（Neupogen）、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ（Raptiva）、エファリズマブ、チモグロブリン（Thymoglobulin）、インフェルゲン（Infergen）、ムロモナブ（Muromaonab）、ゼナパックス（Zenapax）、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される。一部の実施形態では、投与ステップは、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化される。さらに別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む。さらなる実施形態では、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、ペネトラチン（Penetratin）、ブフォリンＩＩ（Buforin II）、トランスポルタン（Transportan）、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される。一部の実施形態では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む。別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは免疫化により生成される。さらに別の実施形態では、前記抗体の少なくとも一部分は合成的に生成される。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明は、ウイルス感染の危険性がある被験体、および配列番号１に示されるヌクレオチド配列および配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を準備するステップ、ならびに該感染が予防される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップを含む方法に関する。別の実施形態では、前記ウイルス感染を引き起こすウイルスはＲＮＡウイルスである。さらに別の実施形態では、ＲＮＡウイルスはＣ型肝炎を引き起こすウイルスである。さらなる実施形態では、Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスは、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性となるように修飾されている。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている。さらなる実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている。一部の実施形態では、本発明は、前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、第２の医薬組成物は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、抗ウイルス剤は、バカビル（bacavir）、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル（denavir）、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース（fortovase）、ヒビド（hivid）、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル（norvir）、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール（rescriptor）、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン（symdine）、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス（videx）、ビラセプト、ビラミジン（viramidine）、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン（ziagen）、ジドブジン、ゾビラックス、およびザナミビルからなる群より選択される。さらなる実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン（Decadron）、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（Medrol）、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される。一部の実施形態では、免疫調節剤は、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロンγ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン不応剤（Interferon Nonresponders）、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、アクチミューン（Actimmune）、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、��ューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン（Neupogen）、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ（Raptiva）、エファリズマブ、チモグロブリン（Thymoglobulin）、インフェルゲン（Infergen）、ムロモナブ（Muromaonab）、ゼナパックス（Zenapax）、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される。別の実施形態では、投与ステップは、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化される。さらなる実施形態では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、ペネトラチン（Penetratin）、ブフォリンＩＩ（Buforin II）、トランスポルタン（Transportan）、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される。別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは免疫化により生成される。さらなる実施形態では、前記抗体の少なくとも一部分は合成的に生成される。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、無症候性のウイルス感染被験体、および少なくとも１つの免疫刺激モチーフを含む少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を準備するステップ、ならびに免疫応答が生起される条件下で、該医薬組成物を該被験体に投与するステップを含む方法に関する。別の実施形態では、前記ウイルス感染を引き起こすウイルスはＲＮＡウイルスである。さらに別の実施形態では、ＲＮＡウイルスはＣ型肝炎を引き起こすウイルスである。さらなる実施形態では、Ｃ型肝炎を引き起こすウイルスは、修飾インターフェロン、リバビリンおよびヌクレオシドアナログからなる群より選択される抗ウイルス剤を用いる治療に抵抗性である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性となるように修飾されている。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、塩基間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾されている。さらなる実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞膜を通過する輸送を増強するように修飾されている。一部の実施形態では、本発明は、前記被験体に第２の医薬組成物を投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、第２の医薬組成物は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、抗ウイルス剤は、バカビル（bacavir）、アシクロビル、アゲネラーゼ、アマタジン、アンプレナビル、クリキシバン、デラビルジン、デナビル（denavir）、ジダノシン、エファビレンツ、エピビル、ファムシクロビル、ファムビル、フォルトベース（fortovase）、ヒビド（hivid）、インジナビル、リバビリン、インビラーゼ、ラミブジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ノルビル（norvir）、オセルタミビル、ペンシクロビル、リレンザ、レスクリプトール（rescriptor）、レトロビル、リバビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、サスティバ、シムジン（symdine）、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビデックス（videx）、ビラセプト、ビラミジン（viramidine）、ビラミューン、ザルシタビン、ゼリット、ジアゲン（ziagen）、ジドブジン、ゾビラックス、およびザナミビルからなる群より選択される。さらなる実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン（Decadron）、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（Medrol）、プレドニゾン、コルチゾン、ベタメタゾン、およびプレドニゾロンからなる群より選択される。一部の実施形態では、免疫調節剤は、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロンγ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン不応剤（Interferon Nonresponders）、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、アクチミューン（Actimmune）、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン（Neupogen）、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ（Raptiva）、エファリズマブ、チモグロブリン（Thymoglobulin）、インフェルゲン（Infergen）、ムロモナブ（Muromaonab）、ゼナパックス（Zenapax）、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択される。別の実施形態では、投与ステップは、皮下、経口、静脈内、経皮、および鼻内経路からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するために乳化剤とコンジュゲート化される。さらなる実施形態では、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと細胞透過性ペプチドとの結合ステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、ペネトラチン（Penetratin）、ブフォリンＩＩ（Buforin II）、トランスポルタン（Transportan）、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１からなる群より選択される。別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の前に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと抗体または抗体フラグメントとの結合ステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは免疫化により生成される。さらなる実施形態では、前記抗体の少なくとも一部分は合成的に生成される。
【０００８】
定義
本明細書中で使用される「ウイルス」とは、宿主細胞の外部で生育または繁殖できない超顕微鏡的感染因子を表す。各ウイルス粒子、すなわちビリオンは、キャプシドと称される防御タンパク質被膜内の遺伝物質、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる。その形状は、単純ならせん状および正二十面体（多面体またはほぼ球状）の形状から、尾部またはエンベロープを有する、より複雑な構造までさまざまである。ウイルスは細胞型生命体に感染し、動物ウイルス、植物ウイルスおよび細菌ウイルスに分類される。ライノウイルス、エンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスおよび肝炎ウイルスなどの動物ＤＮＡウイルスは、細胞が外部環境から物質を取り込むプロセスであるエンドサイトーシスによって宿主に侵入することがよくある。本発明は、いかなる意味においても、感染方法または、感染宿主に関してウイルスによって組み入れられる活性によって限定されないものとする。
【０００９】
本明細書中で使用される「感染」とは、身体中のウイルスの存在を表す。ウイルスおよびヒトの健康状態に応じて、種々のウイルスは脳から皮膚までほとんど任意のタイプの体組織に感染することができる。ウイルス感染は抗生物質で治療することができない；実際に、一部の例では、抗生物質の使用は感染を悪化させる。多数のヒトウイルス感染は身体自体の免疫系によって効果的に攻撃されるが、残りのウイルス感染は抗ウイルス剤または他の薬物で治療する必要がある。
【００１０】
本明細書中で使用される「ヌクレオチド」とは、複素環式塩基、糖および１つ以上のリン酸基からなる化学物質を表す。塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体であり、糖は五炭糖であり、デオキシリボースまたはリボースである。ヌクレオチドは核酸の単量体であり、３個以上が結合して一緒になり、核酸を形成する。「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのヌクレオチドの短い配列であり、典型的に、生理的環境下で２０個以下のヌクレオチド塩基を含む。しかし、自動合成機を使用するオリゴヌクレオチドの合成により、１６０〜２００塩基またはそれ以上のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。
【００１１】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、慣用の医薬用担体および賦形剤（すなわちビヒクル）と混合されていて、水性溶液、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの剤形で使用される、医薬的に活性な化合物である。場合により、医薬組成物は、バッファー、界面活性剤、酸化防止剤、粘度調整剤、保存剤などの他の製薬的に許容される成分を含有してよい。液体組成物は、一般に、懸濁化剤、保存剤、界面活性剤、湿潤剤、香味物質または着色剤を含む、好適な液体担体（群）、例えば、エタノール、グリセリン、ソルビトール、非水性溶媒、例えばポリエチレングリコール、油または水中の化合物または製薬的に許容される塩の懸濁液または溶液からなる。さらに、共溶媒、例えば、ポリエチレングリコールを製剤に含ませてよい。これらの成分はすべて当技術分野において周知である。
【００１２】
本明細書中で使用される「抗体」または「抗体フラグメント」は、細菌およびウイルスなどの異物を特定および中和するために免疫系によって使用されるタンパク質またはタンパク質フラグメントである。本発明は、抗体または抗体フラグメントが生成される手段に限定されないものとする。例えば、抗体または抗体フラグメントは天然または非天然の手段によって生成される。それらは、鎖と称される少数の基本構造単位でできている；各抗体は２つの大きい重鎖および２つの小さい軽鎖を有する。いくつかの抗体はＢ細胞と称される一種の白血球によって生産される。いくつかの異なるタイプの抗体重鎖、およびいくつかの異なる種類の抗体が存在し、該抗体はそれらがどの重鎖を有するかに基づいて異なるアイソタイプに分類される。
【００１３】
本明細書中で使用される「免疫調節剤」は、被験体の免疫系を増強するか、抑制するか、または別の様式で影響する医薬的に活性な化合物を表す。これらの化合物の例には、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロンγ−１ｂ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ａ、Ｐｅｇ化インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン不応剤、Ｐｅｇ化インターフェロン不応剤、アクチミューン、タイサブリ、ナタリズマブ、ゾレア、オマリズマブ、ニューラスタ、ペグフィルグラスチム、ニューポゲン、フィルグラスチム、アナキンラ、ヒューミラ、アダリムマブ、エンブレル、ＴＮＦ、エタネルセプト、アレファセプト、レミケード、インフリキシマブ、ラプティバ、エファリズマブ、チモグロブリン、インフェルゲン、ムロモナブ、ゼナパックス、ダクリズマブ、およびバシリキシマブが含まれる。しかし、本発明はいかなる特定の免疫調節剤の使用にも限定されないものとする。
【００１４】
本明細書中で使用される「乳化剤」または「エマルゲント（emulgent）」は、エマルジョンを安定化する物質である。脂肪酸、ポリエチレングリコールエステル、例えばＰＥＧ−２０ステアラート、および脂肪酸／グリセリンエステル、例えばステアリン酸グリセリンは乳化剤の例である。本発明はいかなる特定の乳化剤の選択にも限定されないものとする。
【００１５】
「修飾」とは、タンパク質または核酸、例えばオリゴヌクレオチドを化学試薬と化学反応させる技術を表す。本発明を任意の１つの特定の化学置換基だけに基づく修飾に限定することは意図されないが、好ましい化学置換基には、水素、アルキル、アミノ、チオール、カルボキシル、アミド、ホスフェート、ポリホスフェート、ホスホチオエート、ハロゲン化物、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコールに基づく置換基、プリンおよび誘導体化プリン、ピリミジンおよび誘導体化ピリミジン、脂肪酸、アミノ酸ならびに含酸素複素環および含窒素複素環などの複素環式化合物が含まれる。
【００１６】
「免疫刺激モチーフ」とは、免疫系の任意の成分の活性化を誘発するかまたは活性を増加させるヌクレオチドパターンを表す。免疫刺激モチーフの例には、非限定的に、ＡＡＣＧＣＣ、ＡＡＣＧＣＴ、ＡＡＣＧＴＣ、ＡＡＣＧＴＴ、ＡＧＣＧＣＣ、ＡＧＣＧＣＴ、ＡＧＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＣＣ、ＧＡＣＧＣＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＧＣＧＣＣ、ＧＧＣＧＣＴ、ＧＧＣＧＴＣ、ＧＧＣＧＴＴ、ＡＴＣＧＣＣ、ＡＴＣＧＣＴ、ＡＴＣＧＴＣ、ＡＴＣＧＴＴ、ＧＴＣＧＣＣ、ＧＴＣＧＣＴ、ＧＴＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴ、ＴＣＧＴＣＧ、ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ、ＡＡＣＧＣＣＣＧ、ＡＡＣＧＣＴＣＧ、ＡＡＣＧＴＣＣＧ、ＡＡＣＧＴＴＣＧ、ＡＧＣＧＣＣＣＧ、ＡＧＣＧＣＴＣＧ、ＡＧＣＧＴＣＣＧ、ＡＧＣＧＴＴＣＧ、ＧＡＣＧＣＣＣＧ、ＧＡＣＧＣＴＣＧ、ＧＡＣＧＴＣＣＧ、ＧＡＣＧＴＴＣＧ、ＧＧＣＧＣＣＣＧ、ＧＧＣＧＣＴＣＧ、ＧＧＣＧＴＣＣＧ、ＧＧＣＧＴＴＣＧ、ＡＴＣＧＣＣＣＧ、ＡＴＣＧＣＴＣＧ、ＡＴＣＧＴＣＣＧ、ＡＴＣＧＴＴＣＧ、ＧＴＣＧＣＣＣＧ、ＧＴＣＧＣＴＣＧ、ＧＴＣＧＴＣＣＧ、およびＧＴＣＧＴＴＣＧが含まれる。
【００１７】
「細胞透過性ペプチド」とは、生物に導入されると細胞の細胞質および／または核区画に輸送される能力を有するペプチドを表す。細胞透過性ペプチドの例には、非限定的に、Ｔａｔ、ペネトラチン、ブフォリンＩＩ、トランスポルタン、ＭＡＰ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７およびＨＮ−１が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＦＴ３−７細胞でのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に関するオリゴヌクレオチドＯＤＮ２００６とＯＤＮ２１１６との間の相互作用の蛍光顕微鏡写真を示す。緑色の物体はＨＣＶコアタンパク質を表す。
【図２】図２は、Ｈｕｈ７．５細胞でのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に関するオリゴヌクレオチドＯＤＮ２００６とＯＤＮ２１１６との間の相互作用の蛍光顕微鏡写真を示す。緑色の物体はＨＣＶコアタンパク質を表す。
【図３】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨｕｈ７．５細胞に関するＨＣＶ力価に対するオリゴヌクレオチドＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２１１６およびＯＤＮ２１１６の影響のグラフを示す。
【図４】図４は、ＨＣＶ発現に対するＯＤＮの影響を示すウエスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ウイルス感染の治療に関する組成物および方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療に関する。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染を治療するためのオリゴヌクレオチド組成物の投与方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、抗ウイルス剤、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の投与に関する。さらなる実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド中の免疫刺激モチーフの操作に関する。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの免疫刺激モチーフを含む少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の使用に関する。修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは培養細胞での２つのＨＣＶ単離体の感染を阻害することができる。該阻害はオリゴヌクレオチドの濃度および修飾状態に依存する。本発明を任意の特定の機構に限定することは意図されないが、オリゴヌクレオチドは強力な阻害活性にＣｐＧモチーフを必要としないと考えられ、それらはＴｏｌｌ様受容体９によるシグナル伝達経由で作用しないことが示される。また、該インヒビターはＨＣＶの２つの異なる系統の感染を阻害した。サイトカイン産生に対するＯＤＮの影響は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス感染に対する大きな影響の可能性を示す。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ耐性となるように修飾されている一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用に関する。Bjersing, J. L. et al., Inflammation 28, 39-51 (2004)に記載されるように、ヌクレアーゼ保護ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを有する免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡは当技術分野において周知である。そのようなモチーフを使用する利点には、宿主の免疫応答の誘導が含まれ、ゆえに免疫調節性核酸分子の使用は耐性生物の選択を実質的に招かない。さらに、免疫調節性核酸は、Raz et al.の米国特許第６，５５２，００６号で開示されるように抗ウイルス剤および慣用の抗生物質などの医薬品と相乗的に作用することが見出されている。
【００２２】
生得的免疫受容体は、サイトカイン産生を導くイベントの複雑なカスケードを制御するための有望な標的である。これらの受容体は病原性および内因性リガンドをその分子的サインによって認識し、そして、いくつかのシグナル伝達経路を使用して遺伝子発現を変化させる。以後のサイトカインおよびケモカイン生産はウイルス感染の転帰に劇的に影響する。
【００２３】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は構造的に関連するクラスＩ  １回膜貫通タンパク質のファミリーであり、病原体感染の見張りとしての機能を果たす。少なくとも１１のＴＬＲが哺乳動物ゲノムで特定されており、高度に保存された病原体タンパク質、細胞壁成分、および核酸を含む、最初にＴＬＲ依存的シグナル伝達を活性化するリガンドによって分類される。
【００２４】
核酸と反応する４つのＴＬＲが存在する。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、低メチル化ＣｐＧモチーフを含むｓｓＤＮＡ分子を認識し、ＴＬＲ３は二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを認識する。これらのＴＬＲによって開始されるシグナル伝達のモジュレーションはＴＬＲの応答に影響することが示されている。このモジュレーションの例には、（１）ＣｐＧ含有ＤＮＡはマウスマクロファージおよび樹状細胞でＳＴＡＴ１およびインターフェロンβを活性化できたこと；（２）ホモチミジンからなるオリゴヌクレオチドはレシキモド（Resiquimod）で誘発されるＴＬＲ７特異的シグナル伝達を阻害したこと；（３）ＣｐＧモチーフを欠くオリゴヌクレオチドはヒトケラチノサイトでＩＬ−８生産を抑制できたことが含まれる。現在、炎症反応を制御して、サイトカインの影響を改善しかつ大腸炎、クローン病、喘息、および敗血症などの炎症および疾患の転帰を変化させることに高いレベルの関心が存在する。
【００２５】
いくつかのＴＬＲは、ヘテロ二量体化によってまたはリガンドおよび／またはシグナル伝達分子によって媒介されるクロストークによって互いのシグナル伝達を制御することもできる。修飾ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、ヒト細胞株ならびにヒト末梢血単核細胞でのシグナル伝達のＴＬＲ３活性化を阻害可能である。この効果は、ＯＤＮがＴＬＲ９に作用することを必要としない。その理由は、ＴＬＲ９を活性化しないＯＤＮが、それにもかかわらず、ＴＬＲ３経路に対して強力な阻害活性を有するからである。ＴＬＲ３を負に制御するＯＤＮによって他の生得的免疫受容体が正に影響されるかまたは負に影響されるかは、現在、知られていない。
【００２６】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を実証し、さらに説明するために提供され、その範囲を限定すると解釈されないものとする。
【００２７】
以下の実験の開示では、以下の略語を適用する：Ｎ（正常）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｃ（摂氏温度）；ＩＦＮ（インターフェロン）；ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）；ＭＯＩ（感染多重度）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）。
【実施例】
【００２８】
実施例１
材料および方法
オリゴヌクレオチド
使用された修飾オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）：ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２００６ｃ、およびＯＤＮ２１１６はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（www.invivogen.com）から購入した。ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ２２１６は、ＣｐＧモチーフ（下記下線部分）が存在するためにＴｏｌｌ様受容体９のリガンドである。ＯＤＮ２００６ｃはＴＬＲ９のリガンドではない。この研究で使用されるＯＤＮの配列を以下に挙げる。「s」はホスホチオエート結合の存在を示し、「s」がなければ通常のホスホジエステル基の存在を示す。各ＯＤＮ中の塩基の数を括弧内に示す。 
配列番号１：ODN2006: 5’-TsCsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsT -3’ (24-nt)
配列番号２：ODN2006c: 5’-TsGsCsTsGsCsTsTsTsTsGsTsGsCsTsTsTsTsGsTsGsCsTsT-3’ (24-nt)
配列番号３：ODN2216: 5’-GsGsGGGACGATCGTCGsGsGsGsGsG-3’ (20-nt)
配列番号４：dODN2006: ODN2006: 5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT -3’ (24-nt)
配列番号５：5’D+:AsCsAsAsAsCATAACAGTGTTGGCCCTTACCCATAATCAACTCACAAA-CAsTsAsAsCsA (52-nt)
配列番号６：3’Δ6: TsCsGsTCGTTTTGTCGTsTsTsT (18-nt)
配列番号７：3’Δ6c: TsCsGsTGCTTTTGTGCTsTsTsT (18-nt)
【００２９】
ウイルス
ＪＦＨ１ウイルスは劇症Ｃ型肝炎を有する日本人患者から回収された遺伝子型２ａのＨＣＶである。それは、培養中の細胞に効率的に感染することが発見された最初のＨＣＶ株であり、ＨＣＶ感染の研究および抗ウイルス剤の特定のためのモデルとしての役割を果たしてきた。
【００３０】
細胞
Ｈｕｈ７．５細胞はヒト肝細胞に由来し、Ｃ型肝炎ウイルスに感染して、ＲＩＧ−Ｉと命名される細胞内ヘリカーゼ遺伝子中の突然変異に起因して高いウイルス力価を生じさせることができる（２２）。
【００３１】
ＦＴ３−７細胞株はＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）を発現するプラスミドベクターでの形質転換後のＨｕｈ７肝細胞に由来する。ＦＴ３−７細胞は少量のＴＬＲ３しか発現しないが、未知の理由により、Ｈｕｈ−７．５細胞と比較して感染性ＨＣＶを生産する高い能力を有する。
【００３２】
２−３＋細胞はＨｕｈ７由来の肝細胞腫細胞株であり、複製型ＨＣＶ Ｎ株ゲノムの完全長コピーを含有する。
【００３３】
２−３ｃ細胞は２−３＋細胞株に由来し、ＩＦＮ−α２ｂでの処理によってＨＣＶ ＲＮＡが排除されている。
【００３４】
修飾オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の抗ウイルス効果の検討
Ｈｕｈ７．５細胞株を使用してＨＣＶ感染に対するＯＤＮの効果を測定した。８ウェルチャンバーのウェルあたり２×１０４細胞の密度で細胞をプレートした。２４時間後、ＭＯＩ０．５のウイルスＨＣＶ ＪＦＨ１とともに、１０ｎＭ〜５μＭの範囲の濃度でＯＤＮを細胞に加えた。各ＯＤＮ濃度を３回実施した。この実験の対照は、３ウェルの各ＯＤＮで処理された細胞（上記）だけでなく、３ウェルの無処理の細胞を含んだ。２４時間後、同濃度のＯＤＮを含有する新鮮な培地で培地交換した。４８時間後、培地の上清を回収して保存した。ＨＣＶコアタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために細胞を回収した。
【００３５】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡで室温で３０分間固定した。１００ｍＭグリシンを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１５分間透過化処理し、ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清でブロッキングした。ＨＣＶコアタンパク質に対するモノクローナル抗体を加え、１時間インキュベートした。ＩＦＡ洗浄溶液（１×ＰＢＳ中の０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して未結合抗体を除去し、次いで一次抗体の（マウス）Ｆｃ部分に特異的な蛍光タグ付き抗体とインキュベートした。インキュベーションを暗所で室温で１時間実施した。ＩＦＡ洗浄溶液で未結合抗体を除去し、次いでＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１０００）と５分間インキュベートし、最後にＰＢＳでリンスした。チャンバー中の培地を除去し、１滴のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを各チャンバーに加えた。カバーガラスを各ウェルに加え、マニキュア液で密封した。顕微鏡検査によって蛍光細胞を数えた。
【００３６】
最大半値有効濃度（ＥＣ５０）の決定
感染性ＪＦＨ−１を５０％減少させるために必要とされるＯＤＮの有効濃度を決定するために、Ｈｕｈ７．５細胞を培地の希釈物で再感染させた後に、培地中に放出されたウイルスの力価を測定した。ＦＴ３−７細胞を使用して各ＯＤＮのＥＣ５０を測定した。８ウェルチャンバーのウェルあたり１．５×１０４細胞をプレートした。２５ｎＭ〜１μＭのＯＤＮとともに約１００ウイルス粒子を各ウェルの培地に加えた。ＩＦＡを上記のように実施し、ウイルス感染細胞の数を定量した。異なるＯＤＮ濃度での感染細胞の平均数に基づいてＥＣ５０値を決定した。
【００３７】
ＨＣＶ力価の決定
感染性接種ウイルスおよび上記ＩＦＡアッセイによって特定された感染細胞の数に基づいて培地上清中に放出されたウイルスの力価を決定した。
【００３８】
ウエスタンブロット分析
Ｈｕｈ７肝細胞腫細胞株；ＮＮｅｏ／Ｃ−５Ｂクローン２−３＋（ＨＣＶ−Ｎ株のすべてのタンパク質を発現する複製型ゲノム長ＲＮＡを含有する）、および２−３ｃ（ＩＦＮ−α２ｂでの前処理によってＨＣＶ ＲＮＡが排除されている）を使用して、ウイルスタンパク質発現に対するＯＤＮの効果を決定した。リポフェクタミン（lipofectamine）を使用して細胞株２−３＋および２−３ｃにＯＤＮをトランスフェクトし、４８時間後に細胞溶解によって回収した。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質およびＨＣＶコアタンパク質の両者に対する抗体を使用して溶解細胞のウエスタンブロットをプローブした。
【００３９】
結果
ＯＤＮ２００６の存在はＪＦＨ−Ｉ感染を劇的に減少させた（図１）。さらに、感染の減少はＯＤＮ２００６の濃度に依存した（図１）。ＯＤＮ２００６の効果は特異的でもあった。その理由は、別のＯＤＮであるＯＤＮ２２１６はＦＴ３−７細胞のＪＦＨ−１感染を減少させなかったからである（図１）。ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ２２１６はともにＴＬＲ９のリガンドであることを考慮すると、これらの結果は、該阻害効果がＴＬＲ９経由で働くものではないことを示唆する。ＯＤＮ２００６が２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎細胞由来）のアデノウイルス感染に明らかには影響しないことおよびＯＤＮ２００６がプラス鎖ＲＮＡコロナウイルスであるマウス肝炎ウイルスの感染に対して２倍未満の効果しか有さないことも観察された（データは示していない）。これらの結果は、ＯＤＮ２００６が肝細胞由来の細胞株のＨＣＶ感染を阻害し得る特徴を含有することを示す。
【００４０】
ＪＦＨ−１感染の阻害がウイルス侵入のレベルであるかどうかを調べるために、ＦＴ３−７細胞を８時間感染させた後、ＯＤＮ２００６を加えた。４０時間後にコアタンパク質レベルを検出し、ＪＦＨ−１の濃度依存的阻害がやはり観察されたが、ウイルスが８時間先に開始されると、より高濃度のＯＤＮ２００６が必要とされた。それにもかかわらず、結果は、ＯＤＮ２００６がウイルス侵入のレベルでＨＣＶ感染を単にブロックしているわけではないことを示す。
【００４１】
ＯＤＮ２００６がＨｕｈ７．５細胞のＨＣＶ感染に影響できるかどうかを調べる実験では、５０ｎＭのＯＤＮ２００５の存在下でさえ、ＯＤＮ２００６の不存在下で観察されるレベルの半分未満にＪＦＨ−１感染が減少することが示される。ＦＴ３−７細胞での結果と一致して、ＯＤＮ２２１６は、試験された最高濃度の１μＭでさえ阻害効果を有しなかった。
【００４２】
感染性ＪＦＨ−１を５０％減少させるために必要とされるＯＤＮの有効濃度の決定を目的とする実験は、ＯＤＮ２００６のＥＣ５０が３２ｎＭであることを示し；一方、ＯＤＮ２００６で見出されるＣｐＧモチーフを欠き、ＴＬＲ９リガンドでないＯＤＮ２００６ｃのＥＣ５０は３９ｎＭであると決定された。これにより、ＴＬＲ９シグナル伝達を活性化するために必要とされるＯＤＮ中のモチーフがＨＣＶ感染の阻害に必須でないことが確認される。
【００４３】
ＯＤＮ２１１６、３’Δ６、３’Δ６ｃ、およびｄＯＤＮ２００６（すべてのホスホチオエートがホスホジエステルで置換されていることを除きＯＤＮ２００６と同一である）を含めたさらなるＯＤＮは、１０００ｎＭの濃度でＦＴ３−７細胞のＨＣＶ感染に対して観察可能な効果を有しないことが発見された。ゆえに、修飾されたＤＮＡ主鎖がＯＤＮの阻害活性に必要とされ、特定の塩基配列は阻害活性に十分ではない。ホスホロチオエートは体液中の核酸ミメティクスの分解速度に影響することが知られ、その影響をＯＤＮのターンオーバーに関連付けることが可能である。
【００４４】
ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ２００６ｃがＨＣＶを阻害しうるかどうかを決定するための実験では、ＯＤＮ２００６およびＯＤＮ２００６ｃがともにＮＳ５Ｂおよびコアタンパク質の両者の量を再現可能に減少させるが、ＧＡＰＤＨのレベルに対する明らかな影響を有しないことが示された。ＦＴ２でのコアタンパク質産生の阻害は、コアタンパク質を検出する抗体で染色された細胞の顕微鏡検査によっても確認された。
【００４５】
ＯＤＮの末端、長さ、塩基、およびホスホジエステルの他の人工または天然の修飾によりＯＤＮの阻害活性をモジュレートできることが予測される。これらの修飾は、受容体に対する結合の改善、ＯＤＮの正常なターンオーバーの変化、または細胞および組織での局在化の変化によってＯＤＮの阻害活性を改善しうる。ＨＣＶ感染を阻害するためのＯＤＮの選択に必要とされる受容体の特定およびＯＤＮ中の必要とされるモチーフの特定はこの潜在能力を高める。ＯＤＮに由来する安全かつ有効な抗ウイルス性インヒビターの使用は、阻害性ＯＤＮの作用機序の詳細な理解を得るための研究と並行して実施することができる。生得的免疫受容体と相互作用して培養細胞のＨＣＶ感染を阻害するＯＤＮの能力は、このクラスのＨＣＶインヒビターの開発において見返りを保証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年9月9日(2011.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011528319000001.app
【国際調査報告】
2011528319.tif 000006
2011528319.tif 000007