(57)【要約】  本発明は、患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクターであって、前記ベクターが、（ａ）結合部分と、（ｂ）治療剤とを含み、前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、前記ベクターが、電磁石と、前記部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて投与されるベクターを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクターであって、前記ベクターが、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質若しくは磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、
前記ベクターが、電磁石を備えるデバイスと、前記部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを用いて投与されることを特徴とするベクター。
【請求項２】
部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントがカテーテルである請求項１に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項３】
治療剤が放射性同位体又は化学療法剤である請求項１から２のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項４】
治療剤が血栓溶解剤又は抗血栓剤である請求項１から２のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項５】
治療剤が抗トロンビンＩＩＩである請求項４に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項６】
治療剤が磁性物質又は磁化可能物質であり、前記磁性物質又は磁化可能物質が電磁場を印加して患者の体内のある部位で温熱療法を行うのに好適である請求項１に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項７】
ベクターが患者の体内のある部位を標的とするための認識部分を更に含む請求項１から６のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項８】
認識部分が抗体、抗体断片、受容体、受容体断片、タンパク質、ポリペプチド、核酸、及びアプタマーから選択される請求項７に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項９】
認識部分が抗体の可変ポリペプチド鎖（Ｆｖ）、Ｔ細胞受容体、又はＴ細胞受容体断片から選択される請求項８に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１０】
認識部分が抗体の単鎖可変部（ｓｃ−Ｆｖ）である請求項９に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１１】
結合部分がラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン、鉄結合タンパク質、又はメタロチオネイン（ＭＴ）から選択されるタンパク質又はタンパク質の金属結合ドメインを含む請求項１から１０のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１２】
結合部分がフェリチンを含む請求項１１に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１３】
磁性物質又は磁化可能物質が遷移金属原子、ランタニド金属原子、遷移金属イオン、ランタニド金属イオン、並びに遷移金属イオン、及びランタニド金属イオンを含む化合物の少なくともいずれかである請求項１から１２のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１４】
遷移金属イオン及びランタニド金属イオンの少なくともいずれかが、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｙ、Ｇｄ、Ｄｙ、又はＥｕのうちのいずれか１種以上を含む請求項１３に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１５】
１種以上の金属イオンがＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｇｄ３＋、及びＣｄ２＋のうちのいずれか１種以上を含む請求項１４に記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１６】
磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する部分を複数個含む請求項１から１５のいずれかに記載の患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクター。
【請求項１７】
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
（ｃ）認識部分と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
治療剤が磁性物質又は磁化可能物質であり、前記磁性物質又は磁化可能物質が電磁場を印加して患者の体内のある部位で温熱療法を行うのに好適である請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項３から５のいずれかに記載のベクターに含まれる治療剤を更に含む請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
結合部分がラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン、鉄結合タンパク質、フラタキシン、シデロホア、及びメタロチオネイン（ＭＴ）から選択されるタンパク質又はタンパク質の金属結合ドメインを含む請求項１７から１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
磁性物質又は磁化可能物質が請求項１３から１５のいずれかに記載のベクターに含まれる磁性物質又は磁化可能物質である請求項１７から２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
認識部分が請求項８から１０のいずれかに記載のベクターに含まれる認識部分である請求項１７から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
患者の温熱療法に対する感受性の高い罹患細胞又は罹患組織を治療するために用いられ、患者に電磁場を印加する前に投与される請求項１７から２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
患者の体内のある部位で治療を行う、又は前記部位における前記治療を止めるために用いられる薬剤を製造するためのベクターの使用であって、前記ベクターが、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、
前記ベクターが、電磁石と、前記部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて投与されることを特徴とする使用。
【請求項２５】
電磁石と、患者の体内のある部位の近傍にベクターを運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて前記部位にベクターを投与する方法であって、
電磁石を用いて前記ベクターを前記エレメントに接着させる工程と、
患者の体内に前記エレメントを挿入する工程と、
前記電磁石を用いて前記エレメントからの前記ベクターの放出を制御する工程と、
を含み、
前記ベクターが、結合部分と、治療剤とを含み、前記結合部分が、磁性物質若しくは磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
電磁石と、患者の体内のある部位の近傍にベクターを運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて前記部位からベクターを除去する方法であって、
患者の体内に前記エレメントを挿入する工程と、
前記電磁石を用いて前記ベクターを前記エレメントに接着させる工程と、
患者の体内から前記エレメントを取り出す工程と、
を含み、
前記ベクターが、結合部分と、治療剤とを含み、前記結合部分が、磁性物質若しくは磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療における磁性タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドの使用に関する。前記使用は、前記磁性タンパク質を用いる治療剤が身体の特定の領域を標的とすることを可能にするという優れた利点を有する。磁性物質の存在により、患者の体内で治療のためのより複雑な空間操作が可能になり、このことは、健常組織及び細胞と罹患組織及び細胞の双方に対して作用する治療剤に対して特に有益である。標的部位に治療剤を局在させることに加えて、本発明に係る磁性タンパク質を使用すると、治療剤の拘束及び制御、更には前記治療剤の除去も可能になる。更に、本発明は、磁化可能物質自体が治療効果をもたらすことができる医学的使用に関する。また本発明は、医薬組成物などの製品、及び医学的使用に関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト／動物体内の特定の部位に対する治療剤のターゲティングは、当該技術分野で知られている。標的療法の例は、放射標識された抗体を用いて癌組織に放射線治療剤を制御送達する療法である。前記抗体は、その抗原に結合することで、前記抗体に付着している放射性同位体を所望の標的に送達する。
【０００３】
非ホジキンリンパ腫について米国における臨床使用が現在承認されている放射標識抗体の例としては、９０Ｙ  Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブ又はチウキセタンとしても知られている）（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｃ．）及びＢｅｘｘａｒ（１３１Ｉ−トシツモマブとしても知られている）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。米国及び英国で使用が承認されている薬剤にコンジュゲートしている抗体の例は、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブ又はオゾガマイシンとしても知られている）（Ｗｙｅｔｈ）である。
【０００４】
かかるターゲティングアプローチの利点の１つは、健常組織及び細胞に及ぼされる有害な治療剤の作用を最小限に抑えられることである。
【０００５】
治療剤と細胞表面上の受容体との結合及びその後の架橋は、該細胞を破壊する、又は細胞応答を減じ得る（例えば免疫反応をダウンレギュレートする）拮抗的シグナル伝達反応を確立するのに十分であり得る。米国で使用が承認されている多くの抗体は、上記方法で作用するため有効である。例としては、冠動脈形成術で血小板による血餅を防ぐために用いられるＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブとしても知られている）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、並びに急性腎臓移植拒絶反応の予防のために用いられるＺｅｎａｐａｘ（ダクリズマブとしても知られている）（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ）及びＳｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブとしても知られている）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）が挙げられる。
【０００６】
また多くの抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により細胞を除去する。Ｆｃガンマ受容体（例えば、Ｆｃガンマ受容体ＩＩａ及びＩＩＩａ）に多型を有する患者は、抗体が受容体に効率よく結合しないため、有効なＡＤＣＣ反応を誘発することができなくなる場合があることが示唆されている。したがって、上記方法に代わるターゲティングを用いた治療アプローチは、これらの患者で有益であり得る。
【０００７】
当該技術分野で知られている他の標的アプローチは、治療剤が細胞に送達される改変ウイルス粒子中の遺伝子である遺伝子治療に用いられるアプローチである。このアプローチは、細胞表面上の受容体に対してウイルスカプシドタンパク質が本来有している親和性を利用しており、該親和性は、通常条件下で野生型ウイルスが特定の細胞種に感染するのを可能にしている性質である。放射標識抗体と同様に、治療用遺伝子を有する改変ウイルス粒子と標的細胞との結合によっても、特定の細胞種に遺伝子を送達させることができる。
【０００８】
或いは、治療には、特定の細胞種の表面上のホルモン（又は他の）受容体にそれ自体が結合し、生体が本来有するリガンドの結合をブロックすることができるタモキシフェンなどの小分子薬剤を利用してもよい。
【０００９】
標的治療剤は、現在ヒト及び動物の医療になくてはならないものになっている。しかし、体内の特定の細胞又は組織を標的とする抗体又はリガンドの使用に対して他の利点又は更なる利点を提供する異なるターゲティング方法の提供が現在も必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、前記要求に取り組み、ヒト又は動物の身体の特定の領域、組織、又は細胞に治療剤を導くために使用可能な代替送達系又はターゲティング系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクターであって、前記ベクターが、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、
前記ベクターが、電磁石と、前記部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて投与されるベクターを提供する。
【００１２】
本発明らは、磁性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを治療剤のベクター又は担体として用い得ることを見出した。更に本発明らは、驚くべきことに、かかるベクターを使用して、前記治療剤を患者の体内の特定の領域に局在させ得ること、及び前記ベクターを除去し得ることを見出した。これは、ベクターの磁性によるものである。磁場に反応する磁性タンパク質又は磁化可能物質が前記ベクターに組み込まれているため、前記ベクターを操作することができる。具体的には、前記ベクターは、金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド中に金属原子又は金属イオン（又は該金属原子若しくは金属イオンを含有している化合物）を含む。
【００１３】
他のターゲティングアプローチと同様に、かかるベクターを使用することにより、有害である可能性のある治療を治療が必要な領域においてのみ行うことができる。また、前記治療剤は、標的部位で治療濃度に達するのに十分な用量のみを局在させ得るため、治療剤のより効率的な使用につながり、全身で前記用量を得なければならない従来のアプローチとは対照的である。
【００１４】
しかし、他のターゲティングアプローチとは異なり、本発明を用いて治療剤を除去できることは、更なる利点をもたらす。具体的には、前記治療剤は、高用量剤を用いたときに生じることの多い副作用を増加させることなしに、短期間高用量で用いることができる。更に、体内から治療剤を除去できることにより、治療剤使用の妨げとなるであろう治療剤への長期間の曝露に付随するリスクなしに、高活性治療剤を用いた治療が可能になる。
【００１５】
更に、ベクター中に磁性要素が存在することにより、ベクターを患者に投与した後ベクターを可視化することができる。これにより、患者の体内のベクターの位置、ひいては治療剤の位置を判定することができる。例えば、該判定は、ＭＲＩスキャニングを用いて行うことができる。
【００１６】
更なる利点は、ベクターの磁性によりベクターの作製及び精製が容易になるという点である。具体的には、治療剤を含むベクターは、親和性精製又は磁場精製などの確立されている技術を用いて容易に精製される。本発明の送達ベクターは、単純な化学的手順を用いて磁化又は消磁することができるという更なる利点を有する。
【００１７】
また本発明者らは、本発明において使用するのに特に好ましい医薬組成物を見出した。具体的には、本発明に係る医薬組成物は、（ａ）結合部分と、（ｂ）治療剤と、（ｃ）認識部分とを含み、前記結合部分は、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む。
【００１８】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質自体が治療剤であり、磁場を用いる患者の治療と併用される。具体的には、医薬組成物は、温熱療法に対する感受性の高い患者の罹患細胞又は組織の治療に用いるためのものであり、前記医薬組成物は、患者に電磁場を印加する前に投与される。
【００１９】
本発明の更なる態様では、医薬組成物は、磁性物質又は磁化可能物質に加えて治療剤を含み、前記治療剤は、結合部分に付着している。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、患者の体内のある部位で治療を行う、又は前記部位における前記治療を止めるために用いられる薬剤を製造するためのベクターの使用であって、前記ベクターが、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、
前記ベクターが、電磁石と、前記部位の近傍に前記治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて投与される使用を提供する。
【００２１】
本発明の更なる態様は、電磁石と、患者の体内のある部位の近傍にベクターを運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて前記部位にベクターを投与する方法であって、
電磁石を用いて前記ベクターを前記エレメントに接着させる工程と、
患者の体内に前記エレメントを挿入する工程と、
前記電磁石を用いて前記エレメントからの前記ベクターの放出を制御する工程と、
を含み、
前記ベクターが、結合部分と、治療剤とを含み、前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様は、電磁石と、患者の体内のある部位の近傍にベクターを運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて前記部位からベクターを除去する方法であって、
患者の体内に前記エレメントを挿入する工程と、
前記電磁石を用いて前記ベクターを前記エレメントに接着させる工程と、
患者の体内から前記エレメント及び前記ベクターを取り出す工程と、
を含み、
前記ベクターが、結合部分と、治療剤とを含み、前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む方法を提供する。
【００２３】
次に、一例として添付図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の実施形態の模式図を示す。図１（Ａ）：バルーン血管形成術のように、動脈を通して血管性閉塞に達するまでカテーテルを挿入する。図１（Ｂ）：磁性粒子を内封している融合タンパク質を含む本発明に係るベクターは、電磁石を用いてカテーテルの外表面に拘束されている。図１（Ｃ）：カテーテルを適切な位置に配置すると、電磁石のスイッチを切ることによりベクターを放出させる。
【図２】図２は、本発明の医薬組成物を用いて温熱療法により腫瘍を治療する、本発明の実施形態の概略図を示す。具体的には、図２は、（Ａ）ヒト体内の腫瘍の位置、（Ｂ）本発明に係る医薬組成物の腫瘍への局在化、及び交番磁場を用いる身体の治療、（Ｃ）正常組織を無傷のまま残しながら、局所温熱療法による腫瘍の破壊を示す。
【図３】図３は、本発明のベクターで用いられる融合タンパク質の結合部分及び認識部分を作製するために、適切な遺伝子をプラスミドなどにクローニングする方法を示す。融合タンパク質中の磁化可能タンパク質ユニットの数は、必要に応じて多コピーの適切な遺伝子を含むことにより制御できる。この例では、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子のみが含まれているため、最終的な抗体ではなく、抗体のｓｃＦｖ部分が、最終的な好ましいキメラタンパク質に含まれる。
【図４】図４は、ＩｇＧなどの抗体の構造を単純化して概略的に示す。パパインなどの酵素を用いてプロテアーゼ処理した後、抗体は、ヒンジ領域の近くで３つの部分に分解される。抗体のエフェクタ機能部（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）は、Ｘ線回折分析のために結晶化することが比較的容易であるため、この部分は結晶化可能断片（Ｆｃ）領域として知られている。抗体の抗原結合部は、抗体断片（Ｆａｂ）として知られている。酵素分解後、Ｆａｂ断片は、ヒンジ領域で連結してＦ（ａｂ）２断片を形成する場合もある。他の抗体は、Ｆｃ領域内のドメイン数が異なる場合もあり、またヒンジ領域に変異が存在する場合もある。
【図５】図５は、ｓｃＦｖ−フェリチン融合タンパク質の構造を示す。
【図６】図６は、ｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質の構造を示す。
【図７】図７は、ｓｃＦｖ断片の構造を示す。
【図８】図８は、ｃＤＮＡライブラリの構築方法を示す。組織サンプルからｃＤＮＡライブラリを構築するために、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、プラスミドベクターにライゲーションする。次いで、これらベクターを用いて細菌細胞を形質転換する。形質転換された細胞は、必要になるまで凍結保存する。適切な培地で増殖させることにより凍結細胞を増やしてもよい。次いで、プラスミドを精製する。次いで、更に分析するために特異的プライマー対を用いて対象遺伝子をＰＣＲで増幅させてもよい。
【図９ａ】図９ａは、フェリチン重（Ｈ）鎖遺伝子及びフェリチン軽（Ｌ）鎖遺伝子のＰＣＲ増幅産物を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、フェリチン重鎖遺伝子及びフェリチン軽鎖遺伝子のオーバーラップＰＣＲ産物を示す
【図９ｃ】図９ｃは、コロニーＰＣＲの結果を示し、配列決定のためにクローン１、３、及び４が選択された。
【図１０ａ】図１０ａは、抗フィブロネクチンｓｃＦｖと、フェリチン重鎖及びフェリチン軽鎖ポリジーンとのＰＣＲ増幅産物（矢印）を示すゲルである。
【図１０ｂ】図１０ｂは、抗フィブロネクチンｓｃＦｖと、フェリチン重鎖及びフェリチン軽鎖ポリジーンとのオーバーラップＰＣＲ産物を示すゲルである。
【図１１】図１１は、ｓｃＦｖ：フェリチン融合コンストラクトとライゲーションされたプラスミドを用いて形質転換された多くのクローンのＰＣＲによるスクリーニング結果を示すゲルである。
【図１２】図１２は、細胞可溶化物のクマシーブルー染色ゲル及びウエスタンブロットを示す。記号：１．フェリチンで２時間誘導、２．フェリチンで３時間誘導、３．フェリチンで４時間誘導、４．ベンチマーク（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロテインラダー。
【図１３】図１３は、ヒト肝臓ライブラリ由来のＭＴ２のＰＣＲ増幅産物を示すゲルである。
【図１４】図１４は、ｓｃＦｖ：ＭＴ２コンストラクトを含むプラスミドで形質転換されたクローンのコロニー分析結果を示す。
【図１５】図１５は、ｓｃＦｖ：ＭＴ２（矢印）のクマシーゲル及びウエスタンブロットを示す。
【図１６】図１６は、再可溶化されたｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及びｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質のクマシーブルー染色ゲル及びウエスタンブロットの写真を示す。融合タンパク質を丸で囲んだ。両方のゲルのレーン２がフェリチンであり、両方のゲルのレーン３がＭＴ２である。レーン１は、タンパク質分子量ラダーである。
【図１７ａ】図１７ａは、ＭＴ２融合タンパク質の結合のＳＰＲ分析から得られたセンサグラムを重ねたものである。
【図１７ｂ】図１７ｂは、フェリチン融合タンパク質の結合のＳＰＲ分析から得られたセンサグラムを重ねたものである。
【図１８】図１８は、本発明で用いるために作製されたマグネトフェリチンの磁性を示す。
【図１９】図１９は、作製中のフェリチン濃度及びマグネトフェリチン濃度を示す。記号：ＭＦ；マグネトフェリチン、ｆｔ；フロースルー、前；Ｍａｃｓ（登録商標）カラムで濃縮されたマグネトフェリチンの透析前、後；Ｍａｃｓ（登録商標）カラムで濃縮されたマグネトフェリチンの透析後。
【図２０】図２０は、ｓｃＦｖ：フェリチン及び熱処理したｓｃＦｖ：フェリチンのフィブロネクチンに対する結合を示す。
【図２１ａ】図２１ａは、磁化された融合タンパク質に対してＶａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器を用いて記録した吸光度測定値を示す。濃縮後もモノクローナル抗フェリチン抗体はタンパク質を認識する。
【図２１ｂ】図２１ｂは、磁化された融合タンパク質に対してＶａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器を用いて記録した吸光度測定値を示す。磁化抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質は、その標的抗原に対する結合能を保持する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
上記のように、本発明は、患者の体内のある部位で治療を行う又は治療を止めるために用いられるベクターであって、前記ベクターが、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含み、
前記ベクターが、電磁石と、前記部位の近傍に治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて投与されるベクターに関する。
【００２６】
前記ベクターは、電磁石と、前記部位の近傍に前記治療剤を運ぶのに好適なエレメントとを備えるデバイスを用いて送達される。好ましい実施形態では、前記エレメントは患者の体内に挿入される。具体的には、前記エレメントは、治療される領域にベクターを物理的に送達するために片方の端部に電磁石を備えるカテーテル（例えば、血管形成術／密封小線源療法で日常的に用いられている種類のカテーテル）であることが好ましい。図１に示すように、一旦電磁石のスイッチを切ると、治療剤を有する磁性ベクターは周囲の組織に移動することができる。
【００２７】
磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する結合部分は、毒性がなく、前記物質に結合することができ、且つ前記治療剤に付着することができる限り、特に限定されない。結合部分は、金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド（又はかかるタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドの金属結合ドメイン）を含む。前記結合部分は、粒子又は集合体などの形態である磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する（又は特異的若しくは非特異的に付着する）ことができなければならない。
【００２８】
これら粒子又は集合体は、典型的には１００，０００未満、より好ましくは１０，０００未満、最も好ましくは５，０００未満の、部分全体（又は各部分）に結合している原子、イオン若しくは分子、又は部分全体（又は各部分）に内封されている原子、イオン若しくは分子を有する。最も好ましい物質は、最高３，０００の原子、イオン若しくは分子、特に約２，０００以下の原子、イオン若しくは分子、又は５００以下の原子、イオン若しくは分子に結合することができる。
【００２９】
本発明で使用される１つの具体例では、フェリチン（２４個のサブユニットのタンパク質シェル）の金属要素は、８ｎｍ（８×１０−９ｍ）の無機コアからなる。各コアは、約２，０００個のＦｅ原子を含む。別の例では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のＤｐｒ（１２個のサブユニットのシェル）は、４８０個のＦｅ原子を含む９ｎｍのシェルからなる。更なる例では、ラクトフェリンは、２個のＦｅ原子と結合し、ヘムに結合している鉄を含む（コア内の鉄分子に結合するフェリチンとは対照的である）。メタロチオネイン−２（ＭＴ）は、７個の二価遷移金属に結合する。ＭＴ中の亜鉛イオンは、Ｍｎ２＋及びＣｄ２＋に置換されて、室温で磁性を有するタンパク質を作製する。ＭＴは、１以上の更なる金属結合部位を更に組み込むよう改変されてもよく、これによりＭｎ、Ｃｄ  ＭＴタンパク質の磁性が増加する。
【００３０】
これら結合環境によって、単一部分に結合している又は単一部分に内封されている物質の総体積は、典型的には１×１０５ｎｍ３を超えない（物質の粒子又は集合体の平均直径が約５８ｎｍ以下であることを表す）。該物質は、１×１０４ｎｍ３以下の総体積を有し得ることがより好ましい（物質の粒子又は集合体の平均直径が約２７ｎｍ以下であることを表す）。該物質は、１×１０３ｎｍ３以下の総体積を有し得ることが更により好ましい（物質の粒子又は集合体の平均直径が約１３ｎｍ以下であることを表す）。該物質は、１００ｎｍ３以下の総体積を有し得ることが最も好ましい（物質の粒子又は集合体の平均直径が６ｎｍ以下であることを表す）。しかし、粒子のサイズは、体積の代わりに平均直径により決定することもできる。したがって、本発明では、結合している粒子の平均直径は、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下が好ましく、１０ｎｍ以下が最も好ましい。この状況において、平均とは、全粒子の直径の合計を粒子数で除した数を意味する。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質は、常磁性であり、より強力な磁石の影響下でのみ磁性を示す。
【００３２】
典型的には、結合部分は、１以上の遷移金属原子、ランタニド金属原子、遷移金属イオン、及びランタニド金属イオンの少なくともいずれか、又は遷移金属イオン及びランタニド金属イオンを含む任意の化合物を結合乃至内封する。遷移金属イオン及びランタニド金属イオンとしては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｙ、Ｇｄ、Ｄｙ、又はＥｕのうちのいずれか１種以上のイオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明のより好ましい実施形態では、前記１種以上の金属イオンは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｃｄ２＋、及びＮｉ２＋のうちのいずれか１種以上を含む。本発明で用いるための最も好ましいイオンは、Ｆｅ２＋イオン、Ｆｅ３＋イオン、Ｃｄ２＋イオン、及びＭｎ２＋イオンである。典型的には、これらイオンは、鉄の場合ラクトフェリン、トランスフェリン、及びフェリチンに結合し、カドミウム及びマンガンの場合メタロチオネイン−２に結合する。Ｆｅ２＋の結合は、酸性条件を用いることにより促進されることが好ましく、一方Ｆｅ３＋の結合は、中性条件又はアルカリ性条件を用いることにより促進されることが好ましい。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、金属結合部分は、ラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン（アポフェリチン）、メタロチオネイン（ＭＴ１又はＭＴ２）、第二鉄イオン結合タンパク質（例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＦＢＰ）、フラタキシン、及びシデロホア（細菌膜を貫通して鉄を輸送する機能を有する非常に小さなタンパク質）から選択されるタンパク質又はタンパク質の金属結合ドメインを含む。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、金属結合部分は、フェリチン、メタロチオネインＩＩ（ＭＴ２）、これらの断片、又はこれらのセグメントを含む。フェリチンは、直径１２ｎｍ、分子量４８０ｋＤａの大きなタンパク質である。該タンパク質は、数千の鉄イオンを貯蔵することができる大きな空洞（直径８ｎｍ）からなる。フェリチン内の内因性鉄は常磁性ではないため、典型的には、タンパク質に損傷を与えることなしに該内因性鉄を除去し、常磁性形態に置換することが必要である。フェリチンは、８個のＦｅ輸送孔と、１２個のミネラル核形成部位と、第二鉄及び酸素からミネラル前駆体を生成する最高２４個のオキシダーゼ部位とを有する大きな多機能性タンパク質である。脊椎動物では、２種のサブユニット（重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ））がフェリチンを形成しており、それぞれのサブユニットが触媒活性（Ｈ）オキシダーゼ部位及び触媒不活性（Ｌ）オキシダーゼ部位を有している。重鎖と軽鎖との比は、要件によって変化する。最高４，０００個の鉄が、フェリチンタンパク質の中心に局在し得る。
【００３６】
フェリチン内に貯蔵されている鉄は、通常酸化鉄フェリハイドライト水和物（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）の形態である。フェリハイドライトコアをフェリ磁性酸化鉄、即ちマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）に置換してもよい。これは、チオグリコール酸を用いて鉄を除去し、アポフェリチンを生成することにより達成され得る。次いで、空気又は他の酸化剤を導入することにより、酸化を緩徐に制御しながら、アルゴン又は他の不活性ガス下でＦｅ（ＩＩ）溶液を徐々に添加する。
【００３７】
対照的に、タンパク質メタロチオネインＩＩは、緩い格子配置中にフェリチンよりも少ない数の金属イオンを保持しているため、フェリチンよりも内因性イオンの除去及び置換が容易であり得る。メタロチオネインは、細胞内に存在する低分子量のシステインリッチなタンパク質である。
【００３８】
ＭＴ２は、カルボキシル（α−ドメイン）末端及びアミノ（β−ドメイン）末端において２つの金属結合クラスタを介して７つの二価遷移金属に結合する。２０個のシステイン残基が、結合プロセスに関与している。
【００３９】
Ｃｈａｎｇらは、７つの亜鉛（Ｚｎ２＋）イオンを、マンガン（Ｍｎ２＋）イオン及びカドミウム（Ｃｄ２＋）イオンに置換する方法について記載している。得られたタンパク質は、室温で磁性ヒステリシスループを呈することが示された。これは、タンパク質が常磁性であることを示唆する。
【００４０】
Ｔｏｙａｍａらは、ヒトＭＴ２を操作して更なる金属結合部位を構築した。これは、ＭＴ２の常磁性機能を潜在的に高めることができ、また本発明で使用することができる。
【００４１】
幾つかの実施形態では、本発明のベクターは、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する結合部分を複数含んでいてもよい。ベクターの磁性を制御するために、かかる部分の数を制御してもよい。典型的には、かかる実施形態では、ベクターは、２個〜１００個の磁性物質又は磁化可能物質の結合部分、好ましくは２個〜５０個の該部分、最も好ましくは２個〜２０個の該部分を含んでいてもよい。最終的なキメラタンパク質では、金属結合タンパク質の各コピーは、可動性のために非荷電アミノ酸リンカー配列により次の金属結合タンパク質に付着していてもよい。
【００４２】
更なる実施形態では、（電）磁性を調整するために、タンパク質／ペプチド結合部分にグリコシル化又はリン酸化などの修飾を行ってもよい。
【００４３】
ベクターによって運ばれる治療剤は、結合部分に付着することができる限り特に限定されない。本発明の状況において「付着する」とは、特異的結合及び非特異的結合を含む任意の種類の付着、また内封をも意味する。したがって、結合部分は、治療剤を結合乃至内封し（又は特異的若しくは非特異的に付着し）、前記ベクターが前記治療剤を運ぶことを可能にできるべきである。本発明の特定の態様では、治療剤は、結合部分を備える融合タンパク質として形成される。
【００４４】
本発明の特定の実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質の磁性が治療で用いられ、前記磁性物質又は磁化可能物質が治療剤である。具体的には、以下に詳細に記載されるように、患者の体内の特定の部位に局在する磁性物質又は磁化可能物質を含むベクターは、磁場を用いる患者の治療と併用してもよい。前記磁場により前記磁性物質又は磁化可能物質が加熱され、前記部位で温熱療法が行われる。かかる温熱療法を用いて、前記部位において細胞を破壊することができる。この実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質は、電磁場を印加して前記部位で温熱療法を行うのに好適である。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、治療剤は、放射性同位体、化学療法剤、血栓溶解剤、即ち抗血栓剤、及び抗血管新生剤から選択される。好ましい実施形態では、治療剤は、抗トロンビンＩＩＩであり、治療は、血餅の治療である。血餅部位に直接抗凝固剤を送達するための本発明の使用は、抗凝固剤の全身送達に比べて有益である。具体的には、本発明は、（局所治療濃度を維持しながら）抗凝固剤を低用量で使用し、抗凝固剤治療に付随するリスク、例えば非標的組織（特に脳）における過剰出血のリスクを低減することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターは、罹患細胞又は罹患組織上に存在する１以上の標的に結合することができる１以上の認識部分も含む。ベクターの一部として少なくとも１つの認識部分が存在することにより、ベクターのターゲティング能を高めることができる。可能性のある標的の例は、感染病原体若しくは感染病原体の構成要素（ウイルス、ウイルス粒子、又はウイルス構成要素など）、細胞表面上に存在する細胞の構成要素、内因性小分子若しくは外因性小分子などの小分子（例えば、代謝産物、医薬品、又は薬剤）、又は血餅などの身体であってもよい。細胞内ターゲティングも可能である。核局在シグナルを認識部分として用いて、ベクターに核を標的とさせることができる。或いは、ベクターがゴルジ体又は細胞膜の内側を標的とするよう認識部分を選択してもよい。細胞膜の内側に対するターゲティングは、ベクターが治療剤を放出し、前記治療剤が細胞から周囲組織に拡散することが望ましい箇所で特に有効であり得る。
【００４７】
具体的には、認識部分は、腫瘍細胞の表面上で発現している抗原を認識することができる。一部の腫瘍は、該腫瘍表面上で様々な抗原を発現する。したがって、ベクターは、腫瘍細胞表面上の少なくとも２種の異なる抗原を認識し、結合する少なくとも２種の認識部分を含むことが特に好ましい。他の方法では、ベクターは、受容体との架橋を達成するための少なくとも２種の認識部分を含む。例えば、認識部分のうちの１つが腫瘍マーカーを認識し、他の認識部分が免疫細胞上のＦｃ受容体に結合し活性化させてもよい。次いで、免疫細胞が、腫瘍細胞を「認識」し、殺傷する。かかる受容体との架橋は、治療の選択性を高めるため、有益である。
【００４８】
上記標的に結合できる認識部分は、標的に対する結合に適している限り、それ自体いずれの種類の物質又は分子であってもよい。一般的に、認識部分は、抗体、抗体断片、受容体、受容体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣体、核酸、オリゴヌクレオチド、及びアプタマーから選択される。より具体的には、前記認識部分は、抗体、抗体断片、受容体、受容体断片、タンパク質、及びポリペプチドから選択される。本発明のより好ましい実施形態では、認識部分は、抗体の可変ポリペプチド鎖（Ｆｖ）、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、アビジン、ストレプトアビジン、及びヘパリンから選択される。認識部分は、抗体の単鎖可変部（ｓｃ−Ｆｖ）から選択されることが最も好ましい。
【００４９】
本発明の特に好ましい態様では、結合部分と認識部分とが融合タンパク質を形成する。本発明の状況では、融合タンパク質は、単一の組み換えタンパク質として発現しているタンパク質である。融合タンパク質は、任意の既知の発現系から産生され得る。しかし、本発明の好ましい態様では、ベクターの融合タンパク質は、哺乳類の発現系で産生される。融合タンパク質の結合部分と認識部分とは、リンカーにより隔てられていることが好ましい。リンカーの長さは、１５アミノ酸残基未満が典型的であり、１０アミノ酸残基未満が好ましく、５アミノ酸残基未満が最も好ましい。
【００５０】
この好ましい態様の実施形態では、ベクターは、複数のフェリチンサブユニットである結合部分を含み、該サブユニットは、集合して、粒子の外表面上に認識部分が存在する粒子を形成する。かかる粒子は、更なる治療剤と共に、磁性物質又は磁化可能物質を内封していてもよい。
【００５１】
ベクターにおける融合タンパク質の使用は、多くの更なる利点を有する。ベクター中の融合タンパク質の認識腕部（例えばｓｃＦｖ）の配向が制御されるため、該融合タンパク質の標的に結合しやすくなる。また融合タンパク質は、単一融合タンパク質に複数の認識部分を組み込める可能性を高める。これら認識部位は、同じ標的に対するものであってもよく、異なる標的に対するものであってもよい。
【００５２】
融合タンパク質の使用は、結合部分がフェリチンを含む場合と同様に、結合部分が、集合して粒子を形成する幾つかのサブユニットで構成されている場合特に有利である。産生中、結合部分をコードする遺伝的に操作されたヌクレオチド配列がインビトロで発現する。産生されたタンパク質／ペプチドは、該タンパク質／ペプチドを粒子に集合させることができる条件に供される。多機能性粒子を作製するために、異なるヌクレオチド配列を一緒に発現させてもよい。例えば、サブユニットの一部のみが認識部分を提示する粒子を作製するために、フェリチンのみをコードする配列を、フェリチン及び認識部分の融合タンパク質をコードする配列と共に発現させてもよい。最適数の認識部分を提示する集合粒子を得るために、異なるヌクレオチド配列の発現比を制御してもよい。かかる系を用いて立体障害の作用を最低限に抑え、標的に対する粒子の結合を最適化することができる。
【００５３】
上記のように、好ましい態様では、ベクターは１以上の認識部分を含み、該認識部分は抗体又は抗体断片であることが好ましい。抗体は、外来抗原の認識に関与し、脊椎動物で発現する免疫グロブリン分子である。抗体は、Ｂリンパ球又はＢ細胞として知られている特殊な種類の細胞により産生される。個々のＢ細胞が生成するのは１種の抗体のみであり、該抗体は単一エピトープを標的とする。Ｂ細胞が抗原に遭遇すると、該抗原を認識し、分裂し、抗体産生細胞（又は形質細胞）に分化する。
【００５４】
大部分の抗体の基本構造は、２種の異なる種類の４本のポリペプチド鎖から構成される（図４）。小（軽）鎖の分子質量は、２５キロダルトン（ｋＤａ）であり、大（重）鎖の分子質量は、５０ｋＤａ〜７０ｋＤａである。軽鎖は、１個の可変（ＶＬ）領域と１個の定常（ＣＬ）領域とを有する。重鎖は、１個の可変領域（ＶＨ）と抗体のクラスによって３個〜４個の定常（ＣＨ）領域とを有する。重鎖の第１定常領域及び第２定常領域は、様々な長さのヒンジ領域によって隔てられている。２本の重鎖は、ジスルフィド架橋を介してヒンジ領域で連結されている。ヒンジ領域の下の重鎖領域は、Ｆｃ領域（結晶化可能断片）としても知られている。ヒンジ領域の上の軽鎖及び重鎖複合体は、Ｆａｂ（抗体断片）領域として知られており、２個の抗体結合部位を合わせてＦ（ａｂ）２領域として知られている。重鎖の定常領域は、補体カスケードの分子及び細胞表面上の抗体受容体を含む免疫系の他の構成要素に結合することができる。抗体の軽鎖及び重鎖は、多くの場合ジスルフィド架橋により連結している複合体を形成し、該複合体は、可変末端で所定のエピトープに結合することができる（図４）。
【００５５】
抗体の可変遺伝子は、突然変異、体細胞組み換え（遺伝子シャフリングとしても知られている）、遺伝子変換、及びヌクレオチド付加事象により形成される。
【００５６】
ｓｃＦｖ抗体は、以下を含む膨大な数の標的に対して産生され得る：
１．ウイルス：Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１３４（１−２）１６４−７０
２．Ｃ型肝炎ウイルス：Ｇａｌ−Ｔａｎａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５．ＨＣＶ  ＮＳ３  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４７（５）：９９１−１００３）及びＬｉ  ａｎｄ  Ａｌｌａｉｎ．２００５．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８６（６）１７０９−１６
３．癌：Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）１１２６−３６。
【００５７】
したがって、最も好ましい実施形態では、本発明は、体内の１以上の標的を認識するための、１以上の抗体の１以上の抗原結合腕部と、該抗原結合腕部に付着している金属結合タンパク質の１以上のコピーとから典型的には形成される、多認識部分ベクターを使用する。典型的には、用いられる抗体断片は、単鎖ペプチド（ｓｃ）を作製するために可動性リンカーにより接合されている重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を含み、これは通常ｓｃＦｖと呼ばれる。ベクター中の認識部分及び結合部分の双方がタンパク質及び／又はポリペプチドから形成されるとき（即ち、ベクターがキメラタンパク質を含むとき）、該ベクターは、当該技術分野で周知である組み換え技術を用いて部分的に形成することができる。これを図３に図示する。しかし、認識部分のいずれかが他の種から形成される場合、ベクターは、ある種を別の種に単純に付着させることにより作製できる。
【００５８】
本発明のベクターは、必要に応じてベクターを破壊することができるように、結合部分と認識部分との間、認識部分内、又は結合部分が集合粒子である場合は粒子のサブユニット間に特異的切断部位を所望により組み込んでもよい。これは、具体的には、ベクターに特異的プロテアーゼ切断部位を組み込むことにより達成され得る。
【００５９】
例えば、特定のプロテアーゼの切断部位をもたらす、ある長さのアミノ酸残基により結合部分のサブユニットを連結してもよい。使用中、ベクターがプロテアーゼに曝露されると、該ベクターは分解され、内封されていた治療剤を放出する。特定の細胞種又は組織においてのみ認識される特異的切断部位を用いてもよく、これにより治療剤の選択的放出が行われる。或いは、切断部位は、プロテアーゼの作用により認識部分の上方のセグメントを除去して、異なる特異性を有する第２の認識部分を「露出させる」ことができるように、認識部分内に存在してもよい。
【００６０】
本発明の更なる態様は、上記本発明における特定の用途に用いられる医薬組成物を提供する。具体的には、
（ａ）結合部分と、
（ｂ）治療剤と、
（ｃ）認識部分と、
を含み、
前記結合部分が、磁性物質又は磁化可能物質を結合乃至内封する金属結合タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【００６１】
前記結合部分及び前記認識部分が、上記種類の融合タンパク質の一部を形成することが特に好ましい。
【００６２】
上記ベクターの結合部分、治療剤、認識部分、及び磁性物質又は磁化可能物質に関する記載は、医薬組成物にも適用される。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、賦形剤、担体、溶媒、希釈剤、アジュバント、及びバッファから選択される更なる成分を含んでいてもよい。
【００６４】
ある実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質が治療剤として用いられるが、他の実施形態では、医薬組成物は、磁性物質又は磁化可能物質ではなく、結合部分に付着する治療剤を含む。
【００６５】
磁性物質又は磁化可能物質が治療剤である場合、医薬組成物は、患者における温熱療法に対する感受性の高い罹患細胞又は罹患組織の治療に用いるためのものであり、患者に電磁場を印加する前に投与される。この実施形態では、磁性物質又は磁化可能物質は、電磁場を印加して患者に温熱療法を行うのに好適である。
【００６６】
フェリチン仲介性電磁温熱療法を腫瘍性細胞の選択的治療で用い得ることが、当該技術分野において示唆されている（Ｂａｂｉｎｃｏｖａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ（２０００）Ｖｏｌｕｍｅ５４，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ１７７−１７９）。具体的には、癌細胞は正常非癌細胞よりも高温に対する感受性が高いことが知られている。Ｂａｂｉｎｃｏｖａらは、強磁性粒子又はフェライト粒子の懸濁液を含む磁性流体と共に腫瘍本体を注入するという初期の研究について記載した。交番磁場の印加により粒子は加熱される。Ｂａｂｉｎｃｏｖａらは、フェリチン遺伝子を患者の体内の癌細胞に特異的に送達して、これら悪性細胞におけるフェリチン濃度を高める遺伝子治療技術を提唱している。
【００６７】
本発明は、上記医薬組成物を用いる他のアプローチを提供する。具体的には、図２に示すように、認識部分を用いて、結合部分により結合乃至内封されている磁性物質又は磁化可能物質を癌細胞に送達することができる。具体的には、認識部分は、磁性物質又は磁化可能物質が腫瘍中に濃縮されるように、癌細胞上で発現しているマーカーを標的とする。交番磁場の印加により、結合部分中の磁性物質又は磁化可能物質が加熱され、温度が上昇する。これにより、腫瘍性細胞は死滅するが、非腫瘍性細胞は影響を受けず、生存し続ける。
【００６８】
本発明のこの態様の他の実施形態では、医薬組成物を用いて体内における他の種類の異常な組織増殖又は機能を治療することもできる。例えば、前記医薬組成物を用いて、甲状腺機能亢進症、嚢腫成長、及びアテローム性動脈硬化巣などの症状を治療することができる。具体的には、甲状腺組織を標的とする認識部分を含む医薬組成物を用いて、甲状腺機能亢進症の治療において甲状腺の一部を破壊又は除去することができる。更に、アテローム性動脈硬化巣は、多数の局在マーカーの増加に関連している。１以上のこれらマーカーを標的とする認識部分を含む医薬組成物を用いて、（特にその形成初期において）アテローム性動脈硬化巣を破壊することができる。
【００６９】
上の段落における薬剤は、認識部分を用いて局在するが、電磁石を用いる本発明の方法を用いてターゲティングされることが好ましい場合もある。
【実施例】
【００７０】
次に、一例として以下の具体的な実施形態を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００７１】
（実施例１：血餅の治療）
本発明のベクターを用いて患者の血管内の血餅が治療されると考えられる。ベクターは、フェリチン及び抗トロンビンＩＩＩ抗体断片を含む融合タンパク質を含む。ベクターは、磁性物質又は磁化可能物質としてＦｅ２Ｏ３を更に含む。
【００７２】
ベクターは、カテーテルの片方の端部の外側に存在する電磁石に付着し、前記カテーテルは、大腿動脈を通して患者に挿入される。一旦可能な限り血餅部位の近くにカテーテルが配置されると、電磁石のスイッチを切り、ベクターを放出させる。融合タンパク質の抗トロンビンＩＩＩ部分は、凝固系酵素に結合し、更なる凝固を防ぐと考えられる。
【００７３】
以下の実験の詳細は、融合タンパク質の認識部分及び結合部分を作製し得る方法について示す。
【００７４】
（実施例２：融合タンパク質の設計及び作製）
本発明を例証するために、市販のマウス抗フィブロネクチン抗体を用いて、融合タンパク質を設計した。短い可動性リンカーによりＭＴ２又はフェリチンのいずれかに遺伝的に連結している抗フィブロネクチンｓｃＦｖからなる融合タンパク質を作製した。この実施例は、融合タンパク質の構築、該融合タンパク質の特徴付け及び単離について詳述する。
【００７５】
抗フィブロネクチンフェリチン又はＭＴ２融合タンパク質の設計は、マウス抗フィブロネクチン抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のベクターへのクローニングに基づいていた。該ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子は、小さな非荷電アミノ酸から構成される短い可動性リンカーにより連結されていた。ＶＬ遺伝子の３’末端の直後において、別の短い可動性リンカーがフェリチン遺伝子又はＭＴ２遺伝子のいずれかにつながっていた。両方の融合タンパク質は、ニッケルカラムで精製するための６−ヒスチジン領域を有していた。融合タンパク質の翻訳は、フェリチン軽鎖遺伝子又はＭＴ２遺伝子の３’末端に挿入されている終止コドンで終結した。これらエレメントを全て含むプラスミドベクターを用いて、発現用細菌を形質転換した。
【００７６】
フェリチン及びＭＴ２遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリから入手した。ｃＤＮＡライブラリは、細胞又は組織からｍＲＮＡを得、逆転写酵素として知られている酵素を用いて該ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、各個別のｃＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングすることにより形成される（図８を参照）。
【００７７】
＜抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質の作製＞
＜＜背景＞＞
フェリチンは、直径１２ｎｍ、分子量４８０ｋＤａのタンパク質である。該タンパク質は、鉄を包む大きな空洞（直径８ｎｍ）からなる。該空洞は、非共有結合により保持されている４へリックスバンドルに折り畳まれた２４個のフェリチンポリペプチドの自発性集合により形成される。フェリチンのアミノ酸配列、延いては二次構造及び三次構造は、動物と植物との間で保存されている。細菌のタンパク質構造は、真核生物と同じであるが、配列は異なる。脊椎動物では、２種のサブユニット（重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ））がフェリチンを形成しており、それぞれのサブユニットが触媒活性（Ｈ）オキシダーゼ部位及び触媒不活性（Ｌ）オキシダーゼ部位を有している。重鎖と軽鎖との比は、要件によって変化する。融合タンパク質の構築で用いられるフェリチン重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
フェリチン重鎖（分子量２１，０９６．５Ｄａ）：
ＭＴＴＡＳＴＳＱＶＲＱＮＹＨＱＤＳＥＡＡＩＮＲＱＩＮＬＥＬＹＡＳＹＶＹＬＳＭＳＹＹＦＤＲＤＤＶＡＬＫＮＦＡＫＹＦＬＨＱＳＨＥＥＲＥＨＡＫＬＭＫＬＱＮＱＲＧＧＲＩＦＬＱＤＩＫＫＰＤＣＤＤＷＥＳＧＬＮＡＭＥＣＡＬＨＬＥＫＮＶＮＱＳＬＬＥＬＨＫＬＡＴＤＫＮＤＰＨＬＣＤＦＩＥＴＨＹＬＮＥＱＶＫＡＩＫＥＬＧＤＨＶＴＮＬＲＫＭＧＡＰＥＳＧＬＡＥＹＬＦＤＫＨＴＬＧＤＳＤＮＥＳ（配列番号３）
フェリチン軽鎖（分子量２０，０１９．６Ｄａ）：
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＫＨＤ（配列番号４）
【００７８】
抗フィブロネクチンｓｃＦｖアミノ酸配列と合わせた、融合タンパク質の単一ポリペプチドの予測配列は、以下の通りである（抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子との間、及び抗体軽鎖とフェリチン重鎖との間のリンカー配列を小文字で強調する）：
ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤｇｓｓｇｇｓｇｇＡＳＴＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫｓｇｇｇＭＴＴＡＳＴＳＱＶＲＱＮＹＨＱＤＳＥＡＡＩＮＲＱＩＮＬＥＬＹＡＳＹＶＹＬＳＭＳＹＹＦＤＲＤＤＶＡＬＫＮＦＡＫＹＦＬＨＱＳＨＥＥＲＥＨＡＫＬＭＫＬＱＮＱＲＧＧＲＩＦＬＱＤＩＫＫＰＤＣＤＤＷＥＳＧＬＮＡＭＥＣＡＬＨＬＥＫＮＶＮＱＳＬＬＥＬＨＫＬＡＴＤＫＮＤＰＨＬＣＤＦＩＥＴＨＹＬＮＥＱＶＫＡＩＫＥＬＧＤＨＶＴＮＬＲＫＭＧＡＰＥＳＧＬＡＥＹＬＦＤＫＨＴＬＧＤＳＤＮＥＳＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＫＨＤ（配列番号１）
ポリペプチド構成要素の分子量は、６５．５５０ｋＤａであった。
【００７９】
＜＜抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質遺伝子の組立＞＞
ＰＣＲを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリからフェリチン重鎖遺伝子及びフェリチン軽鎖遺伝子を増幅させた（図９ａを参照）。ＰＣＲ産物は、予想されたサイズ（〜５４０ｂｐ）であった。オーバーラップＰＣＲを用いてこれらＰＣＲ産物を用いてライゲーションした（図９ｂ−ＰＣＲ産物は、予想されたサイズである）。
【００８０】
オーバーラップＰＣＲ産物をゲル精製し、配列解析のために配列決定ベクターにライゲーションした。これは、フェリチン重鎖及び軽鎖がオーバーラップしている遺伝子を含む配列決定ベクターで細菌を形質転換することを含む。次いで、形質転換された細菌を抗生物質含有プレート上に広げ、クローンを分離させた。細胞を一晩インキュベートして、コロニーを形成させた。次いで、個々のクローンをプレートから取り、液体培地中で増殖させた。各クローン由来のプラスミドを単離し、ＰＣＲを用いて分析した（図９ｃ）。クローン４が、予想される配列を含んでいることが見出された。したがって、この後の全ての更なる研究では、このクローン由来のＤＮＡを用いた。
【００８１】
マウス抗ヒトフィブロネクチン抗体の可変重鎖及び軽鎖遺伝子を、モノクローナルハイブリドーマからＰＣＲで増幅させた。これら遺伝子は、可動性リンカー領域により既に連結され、ｓｃＦＶを形成していた。ＰＣＲを用いてこのｓｃＦｖ遺伝子融合体を増幅させた。フェリチンポリジーンオーバーラップ産物と並んで、このｓｃＦｖ遺伝子融合体増幅産物を図１０ａのＤＮＡゲルに見出すことができる。明らかなバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡを精製した。次いで、これを更なるオーバーラップＰＣＲで用いて、ｓｃＦｖ及びフェリチンポリジーンを複合体化させた（図１０ｂ）。矢印で示すバンドは、ｓｃＦｖ：フェリチン融合体の予想されるサイズのバンドである。これを切り出し、更に使用するためにＤＮＡを精製した。
【００８２】
これを行うために用いられたプライマーは、プラスミドにライゲーションするために、エンドヌクレアーゼ（二本鎖ＤＮＡの特定の配列を切断することができる酵素）でＤＮＡを切断できる配列を含んでいた。
【００８３】
ゲル精製後、制限酵素（エンドヌクレアーゼ）ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用いて、ｓｃＦｖ：フェリチンＰＣＲ産物を切断した。次いで、精製された切断産物を２つの発現ベクター：ｐＲＳＥＴ及びｐＥＴ２６ｂにクローニングした。上記の通りクローンを単離し、陽性クローンを同定するためのＰＣＲの結果を図１１に見出すことができる。
【００８４】
配列解析のために、プラスミドｐＲＳＥＴを含むセットからコロニー３〜５、及び７と、プラスミドｐＥＴ２６ｂを含むセットからコロニー６を選択した。
【００８５】
得られたデータは、ｐＲＳＥＴのクローン４及び５と、ｐＥＴ２６ｂのクローン６が、ｓｃＦｖ：フェリチンコンストラクトを含んでいることを示した。ｐＲＳＥＴのクローン４をタンパク質発現に用いた。
【００８６】
＜＜抗フィブロネクチンｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質の発現＞＞
融合タンパク質の発現を確認するために、ＬＢブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス：１リットル当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ）中で５ｍＬの培養物３つを増殖させた。様々な時間、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトプレノシド）を用いて細胞のタンパク質発現を誘導した。次いで８Ｍの尿素で培養物を溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。クマシーブルーを用いてゲル中のタンパク質内容物を染色した（結果は図１２を参照）。抗ポリヒスチジン抗体を用いてウエスタンブロットを実施し、融合タンパク質を特異的に同定した（図１２）。
【００８７】
接種の２時間後、３時間後、及び４時間後の時点で誘導を行った。
【００８８】
ブロット中に見られるバンドは、融合タンパク質が発現しており、且つ抗ヒスチジン抗体を用いて該融合タンパク質を検出できることを示した。ポリペプチドのサイズは、約７５ｋＤａ〜約８５ｋＤａであった。発現量は比較的多く、クマシーブルーで染色したゲル中に見られる非常に暗いバンドに対応する融合タンパク質のバンドと比べて高発現していることは明らかであった。接種の３時間後に誘導することにより、比較的高水準の発現が得られたため、これを次の発現のために用いた。
【００８９】
＜抗フィブロネクチン：ＭＴ２融合タンパク質の作製＞
＜＜背景＞＞
メタロチオネインは、細胞内に存在する低分子量のシステインリッチなタンパク質である。これらタンパク質は、全ての真核生物で見出され、強力な金属結合能及びレドックス能を有している。ＭＴ−１及びＭＴ−２は、様々な金属、薬剤、及び炎症メディエータにより肝臓において急速に誘導される。ＭＴ２は、カルボキシル（α−ドメイン）末端及びアミノ（β−ドメイン）末端において２つの金属結合クラスタを介して７つの二価遷移金属に結合する。２０個のシステイン残基が、結合プロセスに関与している。
【００９０】
ＭＴ２の配列は、以下の通りである：
ＭＤＰＮＣＳＣＡＡＧＤＳＣＴＣＡＧＳＣＫＣＫＥＣＫＣＴＳＣＫＫＳＣＣＳＣＣＰＶＧＣＡＫＣＡＱＧＣＩＣＫＧＡＳＤＫＣＳＣＣＡＰＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＭＡＥＶＱＬＬＥ（配列番号５）。
【００９１】
抗フィブロネクチンｓｃＦｖアミノ酸配列と合わせた、融合タンパク質の単一ポリペプチドの予測配列は、以下の通りである（抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子との間、及び抗体軽鎖とＭＴ２重鎖との間のリンカー配列を小文字で強調する）：ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤｇｓｓｇｇｓｇｇＡＳＴＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫｓｇｇｇＭＤＰＮＣＳＣＡＡＧＤＳＣＴＣＡＧＳＣＫＣＫＥＣＫＣＴＳＣＫＫＳＣＣＳＣＣＰＶＧＣＡＫＣＡＱＧＣＩＣＫＧＡＳＤＫＣＳＣＣＡＰＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＭＡＥＶＱＬＬＥ（配列番号２）。
【００９２】
＜＜抗フィブロネクチン：ＭＴ２融合タンパク質遺伝子の組立＞＞
ＰＣＲを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリからメタロチオネインＩＩ遺伝子を増幅させた（図１３）。ＰＣＲ産物は、予想されたサイズ（〜２００ｂｐ）であった。
【００９３】
ＢｇｌＩＩ制限酵素を用いてＰＣＲ産物を切断し、既に切断されているプラスミド（Ｘａ因子ベクター）にライゲーションした。
【００９４】
選択されたクローンのコロニーＰＣＲにより、選択された全てのクローンのバンドが見られた（図１４）。配列解析のためにクローン２、４、及び９を選択した。更なる研究ではクローン９を用いた。
【００９５】
＜＜抗フィブロネクチンｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の発現＞＞
ｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の発現を確認するために、フェリチン融合タンパク質のように、様々な時点において（ＩＰＴＧで）誘導されたＬＢブロス中で５ｍＬの培養物を３つ増殖させた。８Ｍの尿素を用いて培養物を溶解させ、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分析し、抗ヒスチジン抗体を用いてブロットした（図１５）。接種の４時間後に誘導された細胞は、僅かに多いタンパク質を産生した（両方のゲルのレーン３）。これら増殖条件を後のタンパク質発現で用いた。
【００９６】
＜＜融合タンパク質の精製＞＞
封入体を単離し、洗浄し、再可溶化させることによる可溶性タンパク質の単離を行った。
【００９７】
プロトコルの完了には約１週間かかった。クマシーブルーで染色されたゲルの写真と、再可溶化されたｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及びｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質のウエスタンブロットの写真とを、図１６中に見出すことができる。融合タンパク質を丸で囲んだ。両方のゲルのレーン２がフェリチンであり、両方のゲルのレーン３がＭＴ２である。レーン１は、タンパク質分子量ラダーである。
【００９８】
これから、融合タンパク質がうまく発現し、濃縮されていることが分かる。磁化プロトコル及び更なる実験でこれらタンパク質を用いた。
【００９９】
（実施例３：ＳＰＲ分析）
ＳｅｎｓｉＱ機器（ＩＣＸ  Ｎｏｍａｄｉｃｓ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいて、抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質及び抗フィブロネクチンＭＴ２融合タンパク質の封入体調製物を用いた。
【０１００】
これら実験では、フィブロネクチンペプチドをカルボキシルチップ表面にカップリングさせた。次いで、融合タンパク質調製物をチップ上に流し、会合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を測定した。
【０１０１】
＜分析用融合タンパク質サンプル＞
以下の表２及び表３に記載されるランニングバッファ中で０．００１３μＭ〜０．１３３μＭの濃度の融合タンパク質のサンプルを６種作製した。
【表２】
2011520791.tif 000002
【表３】
2011520791.tif 000003
【０１０２】
＜メタロチオネイン＞
サンプル（サイクル１〜６）＝０．００１３μＭ〜０．１３３μＭのメタロチオネイン融合タンパク質２０μＬ
アッセイラン＝Ｍａｂ＆Ｇｌｙアッセイサイクル（上記の通り）
【０１０３】
ＳｅｎｓｉＱ  Ｑｄａｔ分析ソフトウェア、及び動態パラメータ（Ｋａ、Ｋｄ）を算出するためのデータに適合したモデルを用いて上記サイクルのセンサグラムを重ねた。Ｋｄの最良推定値は、データの解離部分にのみモデルを適合させることにより得られた。結果を図１７ａに示す。０．００５０３ｓ−１のＫｄに対し、２．２８９×１０−９ＭのＫｄが得られた（Ｋａは２．１９７×１０６Ｍ−１ｓ−１）。
【０１０４】
＜フェリチン＞
サンプル（サイクル１〜６）＝０．００１３μＭ〜０．１３３μＭのフェリチン融合タンパク質２０μＬ
アッセイラン＝Ｍａｂ＆Ｇｌｙアッセイサイクル（上記の通り）
【０１０５】
ＳｅｎｓｉＱ  Ｑｄａｔ分析ソフトウェア、及び動態パラメータ（Ｋａ、Ｋｄ）を算出するためのデータに適合したモデルを用いて上記サイクルのセンサグラムを重ねた。Ｋｄの最良推定値は、データの解離部分にのみモデルを適合させることにより得られた。結果を図１７ｂに示す。０．００５３５ｓ−１のＫｄに対し、６．５３８×１０−１０ＭのＫｄが得られた（Ｋａは８．１８３×１０６Ｍ−１ｓ−１）。
【０１０６】
＜結果＞
上記実験データから、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ａａ１６〜４２）抗原が、うまくＳｅｎｓｉＱチップ上にコーティングされたことが分かった。予想通り、７５ｋＤａのメタロチオネイン融合タンパク質及び２７０ｋＤａのフェリチン融合タンパク質の両方が、抗原を特異的に認識し、結合した。融合タンパク質と抗原との相互作用に関する動態データを推定し、両方の融合タンパク質の動態データが類似しており、大部分の抗体／抗原相互作用の範囲である１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍと比べて、両方の融合タンパク質について予想される範囲であること、即ち、Ｋｄが１０−９Ｍの範囲であることを見出した。
【０１０７】
したがって、この機器を用いて得られた値は、比較的親和性の高い抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を示唆する。更に、得られたデータは、融合タンパク質が、抗原に対する複数の結合部位を有することを示唆する。このことは、フェリチン融合タンパク質については予想されていた。しかし、ＭＴ２融合タンパク質については予想されておらず、ＭＴ２融合タンパク質は、二量体又はより高次の多量体タンパク質を形成しているため、結合親和力が増加していることが示唆された。
【０１０８】
（実施例４：フェリチンの磁化）
フェリチンは、通常水和酸化鉄（ＩＩＩ）を含む。常磁性フェリチンを作製するために、より強い磁性を有するマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）にこれらイオンを置換した。この実験に用いられる方法には、制御条件下でアポフェリチンの鉄イオンを添加し、これらイオンを酸化させることが含まれていた。
【０１０９】
＜材料＞
・逆浸透水（ＲＯ水）
・５０ｍＭのＮ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）バッファ（ｐＨ８．６）（Ｓｉｇｍａ  Ａ６６５９）
・０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
・トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡ）（Ｓｉｇｍａ  ３１７５９４）
・０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）
・ウマ脾臓アポフェリチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ３６４１）
【０１１０】
＜方法＞
トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡ）をオーブン内で３０分間８０℃に加熱し、Ｍｅ３Ｎを除去した後、室温まで冷却した。１１４ｍｇのＴＭＡを１５ｍＬのＲＯ水に添加し、０．０７Ｍ溶液を作製した。使用前に鉄及びＴＭＡ溶液を１５分間窒素パージした。
【０１１１】
ＡＭＰＳＯバッファ（１リットル）を、１時間Ｎ２で脱気した。３．０ｍＬのアポフェリチン（６６ｍｇ／ｍＬ）をＡＭＰＳＯバッファに添加し、該溶液を更に３０分間脱気した。１リットルの容器中のＡＭＰＳＯ／アポフェリチン溶液を、６５℃に予め加熱しておいた水浴中に入れた。該溶液中からＮ２供給管を取り出し、該溶液の表面上に浮かせて該溶液を嫌気条件下に維持した。硫酸アンモニウム鉄の最初の添加により、溶液中に存在する可能性のある任意の残留酸素イオンを除去する。
【０１１２】
０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄及びＴＭＡバッファのアリコートを以下のように１５分間に１回添加した。
添加１回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄６００μＬ
添加２回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄６００μＬ及びＴＭＡ４００μＬ
添加３回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄６００μＬ及びＴＭＡ４００μＬ
添加４回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄６００μＬ及びＴＭＡ４００μＬ
添加５回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄９００μＬ及びＴＭＡ６００μＬ
添加６回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄９００μＬ及びＴＭＡ６００μＬ
添加７回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄９００μＬ及びＴＭＡ６００μＬ
添加８回目  ０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄９００μＬ及びＴＭＡ６００μＬ
【０１１３】
Ｆｅ及びＴＭＡの後半の添加時には、溶液の色が淡黄色から暗茶色に変化し、暗色沈殿が全体に分散した。この溶液を、この時点から「マグネトフェリチン」と呼ぶ。
【０１１４】
強いネオジムのリング状磁石を瓶に押しつけた状態で、マグネトフェリチン溶液を一晩室温でインキュベートした。次の日、図１８の写真から分かるように、暗色固体物質が磁石に引き寄せられていた。
【０１１５】
＜マグネトフェリチンの濃縮＞
５００ｍＬのマグネトフェリチン溶液を、磁石上の５つのＭａｃｓ（登録商標）ＬＳカラムに通した（約１００ｍＬのマグネトフェリチンが各カラムを通過した）。カラムを通過した溶液（「フロースルー」と呼ばれる）をＤｕｒａｎ瓶に回収した。磁石からカラムを取り外し、３ｍＬのＰＢＳを添加し、供給されているプランジャを用いることにより、３ｍＬのＰＢＳを用いて捕捉された物質を各カラムから溶出し、各カラムから約４．５ｍＬを得た。後で分析するために、約１ｍＬを２℃〜８℃で保存した（「透析前濃縮マグネトフェリチン」と呼ぶ）。溶出された溶液の残り（〜２０ｍＬ）を４℃で一晩５リットルのＰＢＳで透析し、過剰のＦｅ及びＴＭＡを除去した（「透析後濃縮マグネトフェリチン」と呼ぶ）。溶液の色の変化を記録した。マグネトフェリチンは元来暗茶色であったが、フロースルーは淡黄色になり、Ｍａｃｓ（登録商標）カラムで濃縮された物質は、暗茶色〜黒色であった。
【０１１６】
透析管（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．、分画分子量１２〜１４，０００ダルトン、〜１５ｃｍ）をＲＯ水中で１０分間インキュベートし、管を柔らかくした。磁性的に単離して濃縮したマグネトフェリチンを透析管に移し、一晩撹拌しながら２℃〜８℃で５リットルのＰＢＳ中にてインキュベートした。２℃〜８℃で透析を続けながら、ＰＢＳ溶液を３回交換し、次の日は２時間間隔で交換した。
【０１１７】
＜マグネトフェリチンの分析＞
磁石を用いて単離された磁性タンパク質の量を比較するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。
【０１１８】
＜＜材料＞＞
・炭酸塩バッファ（０．１５９ｇの炭酸ナトリウム及び０．３ｇの重炭酸ナトリウムの１００ｍＬ  ＲＯ水溶液）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
・１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ  ８２−０４５−２））−ＰＢＳ溶液
・ウマ脾臓アポフェリチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ３６４１）
・ウサギ抗ウマフェリチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ６１３６）
・ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３６８７）
・基質液体安定性フェノールフタレインリン酸塩
・停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇの水酸化ナトリウム、５リットルになるまで水）
・Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣカタログ番号：４６８６６７）
【０１１９】
＜＜方法＞＞
マグネトフェリチンを定量するために、アポフェリチンの希釈液（５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬ、及び１．５６２５μｇ／ｍＬ）を作製した。
【０１２０】
マグネトフェリチン（未精製）、透析前濃縮マグネトフェリチン、透析後マグネトフェリチン、及びフロースルーを、以下のように炭酸塩バッファで希釈した。
マグネトフェリチン、透析前、及び透析後の希釈：
１００倍希釈、２００倍希釈、４００倍希釈、８００倍希釈、１，６００倍希釈、３，２００倍希釈、６，４００倍希釈、及び１２，８００倍希釈
フロースルー：
１０倍希釈、２０倍希釈、４０倍希釈、８０倍希釈、１６０倍希釈、３２０倍希釈、６４０倍希釈、及び１，２８０倍希釈
【０１２１】
１００μＬの各溶液を、二連でマイクロタイタープレートのウェルに添加した。炭酸塩バッファ（１００μＬ）を陰性対照として２つのウェルに添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。次の日、溶液を軽くはじき飛ばし（ｆｌｉｃｋｅｄ  ｏｆｆ）、室温で１時間、２００μＬの１質量％ＢＳＡを用いてブロッキングした。１ウェル当たり３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルを軽く叩いて乾かし、１０μｇ／ｍＬの抗ウマフェリチン抗体１００μＬを添加した。これを室温で１時間インキュベートした後、上記のように除去し、ウェルを洗浄した。ＡＰ複合体化抗ウサギ抗体を、７．４３μｇ／ｍＬの濃度になるようＰＢＳで３，５００倍に希釈し、室温で１時間インキュベートした。抗体複合体を除去し、上記のようにウェルを洗浄した。ＡＰ基質（１００μＬ）を各ウェルに添加し、１５分間顕色させた後、停止液を添加した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて吸光度を記録した。
【０１２２】
Ｍａｃｓ（登録商標）カラムは、フロースルー中に見出されたマグネトフェリチンの量の３５倍のマグネトフェリチンを保持しており、これはタンパク質の磁化が成功したことを示す。
【０１２３】
＜アポフェリチンの作製／ウマ脾臓フェリチンの鉱質除去＞
＜＜材料＞＞
・０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）
・チオグリコール酸（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７５０）
・ウマ脾臓フェリチン（Ｓｉｇｍａ  ９６７０１）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
【０１２４】
＜＜方法＞＞
透析管をＲＯ水中で１０分間柔らかくした。０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ１０ｍＬを、切り取った透析管中のウマ脾臓フェリチン（１２５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに添加した。１時間窒素パージしておいた０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ（〜８００ｍＬ）中に透析袋を移した。チオグリコール酸（２ｍＬ）をバッファに添加し、２時間窒素パージを続けた。更なる１ｍＬのチオグリコール酸を酢酸ナトリウムバッファに添加し、その後更に３０分間窒素パージを行った。酢酸ナトリウムバッファ（８００ｍＬ）を交換し、窒素パージを続けた。フェリチン溶液が無色になるまで、鉱質除去手順を繰り返した。窒素パージを停止し、撹拌しながら１時間ＰＢＳ（２Ｌ）でアポフェリチン溶液を透析した。ＰＢＳを交換し（３リットル）、一晩２℃〜８℃にてＰＢＳでアポフェリチン溶液を透析した。
【０１２５】
＜＜結果＞＞
フェリチン溶液の色は、手順中に淡茶色から無色に変化し、これは鉄が除去されたことを示す。
【０１２６】
＜抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質に対する熱処理の分析＞
＜＜材料＞＞
・炭酸塩バッファ（０．１５９ｇの炭酸ナトリウム及び０．３ｇの重炭酸ナトリウムの１００ｍＬ水溶液）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
・１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ  ８２−０４５−２））−ＰＢＳ溶液
・フィブロネクチンペプチド
・抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
・抗ヒトフェリチンマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ５１８８７）
・抗マウスアルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５６２）
・基質液体安定性フェノールフタレインリン酸塩
・停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇの水酸化ナトリウム、５リットルになるまで水）
・Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣカタログ番号：４６８６６７）
【０１２７】
＜＜方法＞＞
１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ）のｓｃＦｖ：フェリチンを薄壁ＰＣＲチューブに移し、６０℃で３０分間サーモサイクラー内にて加熱した。
【０１２８】
マイクロタイタープレートのウェルを、炭酸塩バッファで１５μｇ／ｍＬに希釈したフィブロネクチンペプチド（１．５ｍｇ／ｍＬで供給）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。過剰の溶液を軽くはじき飛ばし、室温で１時間１質量％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を用いてプレートをブロッキングした。これを軽くはじき飛ばし、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及び熱処理したｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を、３３μｇ／ｍＬ（各１００μＬ）の濃度でウェルに添加した。フェリチン融合タンパク質を室温で２時間インキュベートした後、上記のように除去し、ウェルを洗浄した。マウス抗フェリチン抗体を２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、１００μＬの体積で各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。これを、上記のように除去し、ウェルを洗浄した。ヤギ抗マウスＡＰ複合体化抗体を希釈し（５０μＬ＋９５０μＬのＰＢＳ）、１００μＬの体積を全てのウェルに添加した。これを室温で１時間インキュベートし、上記のように除去した。全てのウェルに基質を添加し、室温で４５分間インキュベートし、停止液を用いて反応を停止させた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて吸光度を記録した。
【０１２９】
ｓｃＦｖ：フェリチンは、フィブロネクチンに対する結合能を保持しており、６０℃で３０分間加熱した後も抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体により検出可能である（図２０）。
【０１３０】
＜抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質の鉱質除去＞
＜＜材料＞＞
・抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
・０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ
・チオグリコール酸（７０％ｗ／ｗ  Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７５０）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
【０１３１】
＜＜方法＞＞
ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を、−２０℃から室温に解凍した。１００μｇ／ｍＬの該融合タンパク質を９ｍＬ、柔らかくした透析管に分注した。該融合タンパク質を収容している管を、合計１ｍＬの酢酸ナトリウムバッファですすぎ、これを９ｍＬのタンパク質に添加した（０．９ｍｇ／ｍＬ溶液が得られた）。８００ｍＬの酢酸ナトリウムバッファを１５分間窒素パージした後、透析袋を入れた。次いで、溶液を更に２時間パージした。窒素パージを続けていたバッファに、２ｍＬのチオグリコール酸を添加した。更に２時間後、１ｍＬのチオグリコール酸を更に添加した。バッファを交換し（３ｍＬのチオグリコール酸を含有している予めパージした酢酸ナトリウムバッファ８００ｍＬ）、窒素下で１時間透析を続けた。次いで、室温（Ｎ２無）の２リットルのＰＢＳに透析袋を移し、次いで３リットルのＰＢＳ中に移して４℃にて一晩放置した。次いで、鉱質除去された融合タンパク質を用いて、以下のように鉄添加及び制御酸化により常磁性融合タンパク質を作製した。
【０１３２】
＜磁性ｓｃＦｖ：フェリチンの作製＞
＜＜材料＞＞
・逆浸透水（ＲＯ水）
・５０ｍＭのＮ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）バッファ（ｐＨ８．６）（Ｓｉｇｍａ  Ａ６６５９）
・０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
・トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡ）（Ｓｉｇｍａ  ３１７５９４）
・０．１Ｍの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）
【０１３３】
トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡ）をオーブン内で３０分間８０℃に加熱して、Ｍｅ３Ｎを除去した後、室温まで冷却した。１１４ｍｇのＴＭＡを１５ｍＬのＲＯ水に添加して、０．０７Ｍの溶液を作製した。使用前に、鉄及びＴＭＡ溶液を１５分間窒素パージした。
【０１３４】
窒素下で撹拌しながら室温で２時間、１リットルのＡＭＰＳＯバッファを用いて、透析袋（上に詳述した）内に収容されている鉱質除去された融合タンパク質を透析した。鉱質除去されたｓｃＦｖ：フェリチン（〜１０ｍＬ）を三角フラスコに移した。窒素パージして残留酸素を除去しながら、鉱質除去されたタンパク質溶液に１８μＬの鉄溶液を添加した。２５分後、１５μＬの鉄及び１０μＬのＴＭＡを添加した。
【０１３５】
次いで、以下に記載する量の鉄及びＴＭＡバッファを１５分間隔で添加した。
添加３回目  鉄３０μＬ＋ＴＭＡ２０μＬ
添加４回目  鉄１５μＬ＋ＴＭＡ１０μＬ
添加５回目  鉄１５μＬ＋ＴＭＡ１０μＬ
添加６回目  鉄１５μＬ＋ＴＭＡ１０μＬ
【０１３６】
磁化されたタンパク質を、Ｍａｃｓ（登録商標）ＬＳカラムに通した。フロースルーをもう１度通過させ、捕捉効率を高めた。磁石からカラムを取り外し、１ｍＬのＰＢＳを添加し、プランジャを用いることにより、磁化されたタンパク質をカラムから溶出した（溶出液  約２ｍＬ）。これは、カラム上でタンパク質が２倍希釈されたことを表す。
【０１３７】
以下に詳述するような分析のために、溶出されたタンパク質及び対照をマイクロタイタープレートにコーティングした。
【０１３８】
＜ＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖ：マグネトフェリチン融合タンパク質の分析＞
磁化された融合タンパク質が、抗フェリチンモノクローナル抗体に対する結合能を保持しているかどうかを確認するために、酵素結合免疫吸着アッセイを行った。
【０１３９】
＜＜材料＞＞
・炭酸塩バッファ（０．１５９ｇの炭酸ナトリウム及び０．３ｇの重炭酸ナトリウムの１００ｍＬ水溶液、ｐＨ９．６）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＬのリン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
・フィブロネクチンペプチド
・抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
・抗ヒトフェリチンマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ５１８８７）
・抗マウスアルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５６２）
・基質液体安定性フェノールフタレインリン酸塩
・停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇの水酸化ナトリウム、５リットルになるまで水）
・Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ：４６８６６７）
【０１４０】
＜＜方法＞＞
−融合タンパク質によるウェルのコーティング−
炭酸塩バッファで３倍希釈したｓｃＦｖ：フェリチン（未処理）、ｓｃＦｖ：マグネトフェリチン、Ｍａｃｓ（登録商標）カラムから溶出されたｓｃＦｖ：マグネトフェリチン、及びフロースルーでウェルをコーティングした。プレートを週末の間４℃でインキュベートした。過剰の溶液を軽くはじき飛ばし、室温で１時間１質量％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を用いてブロッキングした。これを軽くはじき飛ばし、ＰＢＳ（各洗浄につき３００μＬ／ウェル）を用いてプレートを３回洗浄した。マウス抗フェリチン抗体を２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、１００μＬの体積を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。これを、上記のように除去し、ウェルを洗浄した。ヤギ抗マウスＡＰ複合体化抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬの体積を全てのウェルに添加した。これを室温で１時間インキュベートし、上記のように除去した。基質を全てのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、停止液を用いて反応を停止させた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて吸光度を記録した（図２１ａを参照）。
【０１４１】
−フィブロネクチンによるウェルのコーティング−
炭酸塩バッファで１５μｇ／ｍＬに希釈した１００μＬのフィブロネクチンペプチド（１．５ｍｇ／ｍＬで供給）で、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングした。該プレートを２℃〜８℃で一晩インキュベートした。過剰の溶液を軽くはじき飛ばし、３００μＬのＰＢＳでウェルを３回洗浄した。二連で適切なウェル（１００μＬ）に、ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を未希釈で添加した。次いで、プレートを室温で１時間インキュベートした。溶液を軽くはじき飛ばし、３００μＬのＰＢＳでウェルを３回洗浄した。マウス抗フェリチン抗体を２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、１００μＬの体積を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。これを、上記のように除去し、ウェルを洗浄した。ヤギ抗マウスＡＰ複合体化抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬの体積を全てのウェルに添加した。これを室温で１時間インキュベートし、上記のように除去した。基質を全てのウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートし、停止液を用いて反応を停止させた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて吸光度を記録した（図２１ｂを参照）。
【０１４２】
磁化された融合タンパク質をＭａｃｓ（登録商標）カラムにより濃縮しても、該タンパク質は、依然としてモノクローナル抗フェリチン抗体により認識された。これは、抗フィブロネクチン−フェリチン融合タンパク質が、磁化されても構造的完全性を保持していたことを示す。また上記データは、磁化された抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質が、その標的抗原に対する結合能を保持していることも示す。したがって、二機能性単鎖融合タンパク質は両方共磁化可能であり、標的に選択的に結合し得ることが示される。
【０１４３】
（実施例５：血小板の単離及びＦＡＣＳ分析）
抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）が、フィブロネクチンを発現している血小板を他の種類の細胞から選択する能力を示すために実験を行った。
【０１４４】
大部分の細胞を定着させるために３日間４℃でＥＤＴＡバキュテナー内に保存していた血液サンプル由来の血漿を、３０分間空気に曝露して、血小板を活性化させた。上記のように磁化されたｓｃＦｖ：フェリチン１００μＬを、１０μＬの該血漿と混合した。磁性融合タンパク質／血漿混合物を室温で３０分間インキュベートした後（１０μＬを分析用に残した）、磁化され、且つ予め平衡化されているＬＳ  ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に通した。フロースルーを分析用に残した。市販のプランジャを用いてカラムから結合画分を溶出した。該画分をＰＢＳで５００μＬに希釈し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により前方散乱及び側方散乱を用いて分析した。
【０１４５】
結果を表４に示す。ＦＡＣＳ分析では、設定されている数の事象（例えば１０，０００回）を記録するまでサンプルが分析されることを認識すべきである。したがって、サンプルの体積は、細胞の濃度によって大きく変動し得る。細胞濃度の高いサンプルを、細胞の多くが除去されているサンプルと比較するとき、これは特に重要である。細胞除去又は単離手順の効率を計算するとき、このサンプル体積の差を補正することが必要である。これを表４で行う。
【表４】
2011520791.tif 000004
【０１４６】
この最適化されていない手順により、リンパ球に対してほぼ１００％の選択性を有しながら、利用可能な血小板の９０％が捕捉されたことが分かる。これは、ｓｃＦｖ：フェリチンタンパク質のフィブロネクチンに結合する能力が血小板表面上で示されたことを示す。
【０１４７】
顕微鏡による目視検査の結果（結果は図示しない）がＦＡＣＳ分析の結果と相関していたことは、融合タンパク質が血小板に結合し、大きな粒状集合体の形成を導くことを示す。
【０１４８】
（実施例６：更なるプロトコル）
＜ｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の磁化＞
ｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質は、亜鉛イオンをマンガンイオン及びカドミウムイオンに置換することにより磁化できる。これを行う方法は、必要に応じて最適化してもよい。これを達成する方法としては、必要に応じて既に公開されているプロトコルを変更した透析を用いて、透析した後置換を行うことにより亜鉛を枯渇させることが挙げられる。
【０１４９】
詳細には、これらプロトコルは以下の通りである。
１．  ５ｍｇのＭＴ２を５ｍＬのバッファ（４．５Ｍの尿素、１０ｍＭのトリス塩基、０．１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１質量％のマンニトール、及び０．５ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ、ｐＨ１１）を溶解させて、タンパク質の金属イオンを取り除く。
２．  同バッファで１時間透析する。
３．  バッファ１（１０ｍＭのトリス塩基、２Ｍの尿素、０．１ＭのＤＴＴ、０．１質量％のマンニトール、０．５μＭのＰｅｆａｂｌｏｃ、及び１ｍＭのＣｄ２＋／Ｍｎ２＋、ｐＨ１１）で７２時間透析することにより、タンパク質を再度折り畳む。
４．  透析バッファをバッファ２に交換し（尿素の濃度が１Ｍであることを除いて上記の通り）、２４時間透析する。
５．  透析バッファを、尿素を含有していない上記バッファに交換する。２４時間透析する。
６．  工程５のように、透析バッファをｐＨ８．８のバッファに交換する。２４時間透析する。
７．  工程６のように、透析バッファをマンニトールを含有していないバッファに交換し、上記のように透析する。
８．  工程７のように、バッファをＣｄ２＋／Ｍｎ２＋を含有しているバッファに交換し、２４時間透析する。
【０１５０】
結合性は、フェリチン融合タンパク質について実施例３に記載したように評価することができる。
【図１】
2011520791.tif 000005
【図１７ａ】
2011520791.tif 000006
【図１７ｂ】
2011520791.tif 000007
【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
2011520791.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011520791.tif 000015
【図６】
2011520791.tif 000016
【図７】
2011520791.tif 000017
【図８】
2011520791.tif 000018
【図９ａ】
2011520791.tif 000019
【図９ｂ】
2011520791.tif 000020
【図９ｃ】
2011520791.tif 000021
【図１０ａ】
2011520791.tif 000022
【図１０ｂ】
2011520791.tif 000023
【図１１】
2011520791.tif 000024
【図１２】
2011520791.tif 000025
【図１３】
2011520791.tif 000026
【図１４】
2011520791.tif 000027
【図１５】
2011520791.tif 000028
【図１６】
2011520791.tif 000029
【図１８】
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【配列表】
2011520791000001.app
【国際調査報告】
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2011520791.tif 000032
2011520791.tif 000033
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