(57)【要約】【解決手段】  ピルビン酸ギ酸リアーゼ経路によって好熱性微生物が主に糖を代謝する条件下で、乳酸脱水素酵素活性を欠く好熱性微生物に糖を供給するステップを含む、エタノールを産生するための発酵方法。重要なことには、本方法は、糖の全てをエタノールに変換するのに充分なグリセロールを供給するステップも含む。本発明のさらなる実施形態では、バイオマス加水分解物中に存在する外因性酢酸をエタノールに変換するのに充分な追加のグリセロールを供給するステップを含む。いかなるタイプの発酵系も、これらの方法に使用することができるが、好ましい実施形態は、エタノールが真空蒸発によって連続的に除去される高温での連続培養を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸脱水素酵素活性を欠く少なくとも１株の好熱性微生物に糖を供給するステップであって、酢酸産生を最小にし、エタノール産生を最大にするのに充分なグリセロールを供給することによって、前記少なくとも１株の好熱性微生物が酸化還元均衡を維持するステップを含む、エタノールを産生するための発酵方法であり、好ましくは嫌気的発酵方法。
【請求項２】
部分的に好気的条件下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖をおよそ１％及び３０％の間の濃度で供給する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糖が、ペントース糖を含めた混合糖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
糖がバイオマスの加水分解に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物により内因的に産生された酢酸、及び／又はバイオマス加水分解物中に外因的に存在する酢酸などの副産物からエタノールを産生するために、割り増しのグリセロールを供給する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
バイオディーゼル生産など、プロセスの副産物としてグリセロールを供給する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
エタノール産生を最大にし、酢酸産生を最小にするように調節された糖及びグリセロールの連続的な供給を用いた連続培養にて行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
エタノール産生を最大にし、酢酸産生を最小にするように調節されたグリセロールの連続的又は断続的な供給を用いた回分又は流加培養において行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
５０℃を超える温度で行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エタノールを真空蒸発又は膜パーベーパレーションによって連続的に除去する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１株の好熱性微生物がバチルス属に属する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バチルスが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バチルスが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＭＢ  １２４０３）又は菌株ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＭＢ  １２４２８）の派生菌株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１株の好熱性微生物が、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の不活性化のために乳酸脱水素酵素活性を欠く、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルスなどの好熱性細菌によって、バイオマスの加水分解に由来する混合糖などの混合糖からの、増強されたエタノール産生に関する。より具体的には、本発明は、かかる方法においてエタノール収率を増加させるために、バイオディーゼルの生産から生じた廃棄グリセロールを補助原料として使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｈａｍａ，Ｇ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．（Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３２１，５５５−５６８，１９８７）は、最適な嫌気的増殖条件下で、乳酸脱水素酵素活性を欠く変異好熱性バチルス（菌株ＬＬＤ−１５）が、野生型菌株（ＬＬＤ−Ｒ）のように、幅広い糖を代謝することを観察した。しかし、主要産物として乳酸を主に産生する野生型菌株とは異なり、変異菌株は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）経路によりこれらの糖を代謝して、消費されるグルコース１モル当量につき、酢酸１モル、エタノール１モル及びギ酸２モルを産出する（図１）（Ｓａｎ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．、Ｂｕｓｓｈｅｌｌ，Ｄ．、Ｌｅａｋ，Ｄ．Ｊ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，１０３３−１０４０，（１９９３））。彼らはまた、変異菌株において、低いｐＨ及び／又は高い糖濃度などの条件下で、細胞数、ギ酸及び酢酸濃度が減少する一方で、発酵ブロス中におけるピルビン酸の出現と同時に、エタノール濃度が増加することも観察した。このことは、これらの条件下で、ＰＦＬ経路が抑制されてピルビン酸の蓄積を引き起こし、細胞中でＮＡＤＨの形態の還元当量が生じることを示唆する。細胞の増加したＮＡＤＨ濃度により、オーバーフローした嫌気的経路、すなわち消費されるグルコース１モル当量につき、エタノール２モル及びＣＯ２２モルを産出するピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）経路が刺激されるが（図１）、経路の流量程度は、全てのＮＡＤＨを再利用するのに充分ではない。したがって、余剰のＮＡＤＨは、細胞の酸化還元不均衡及び細胞死、すなわち「酸化還元死」と定義される現象を引き起こす。「酸化還元死」現象は、培養液中に投入される糖が２％以上のときに、より優勢であることも観察されている。
【０００３】
これにより、エタノール工業生産に必要とされるような高いエタノール収率が実現するが、回分又は連続発酵における非増殖細胞は、糖濃度が約２％ｗ／ｖより高くなるとすぐに死滅する又は洗い流されるため、かかる方法は商業的に実行不可能である。
【０００４】
この細胞死又は「酸化還元死」の理由は、国際公開第２００７／１１０６０８号パンフレットで分析されており、供給速度を制御して糖濃度を「臨界点」の２％より低く維持するように、様々なセンサーにより調節された流加発酵を用いることによって、酸化還元死を回避する方法が提案されている。これにより、濃縮された糖を使用して＞４％ｗ／ｖのエタノールを産生することが実際に可能になるが、エタノール収率及び／又は容量生産性が犠牲になる。
【０００５】
「酸化還元死」問題の代替解決法は、国際公開第２００７／１１０６０６号パンフレットで提案されており、他の細胞代謝産物からのエタノール産生を強化するための新しい代謝経路の構築が記載されている。
【０００６】
上記解決法は、糖からエタノールへの変換に、より適している。しかし、バイオマスから得た加水分解物は、Ｃ５＋Ｃ６糖に加えて、ヘミセルロースに存在するアセチル基から生じた高レベルの酢酸を含む。酢酸は細胞に入ることができ、アセチルＣｏＡに変換される。したがって、酢酸は望ましくない廃棄産物と考えられ、膜電位を低下させる「脱共役剤」として働くことにより、細胞増殖に害を及ぼす。
【０００７】
グリセロールは、植物トリグリセリドからバイオディーゼルへの変換で生じる価値の低い副産物であるため、グリセロールは潜在的に豊富であり、還元当量の安価な源であることが示されている（Ｓ．Ｓ．Ｙａｚｄａｎｉ及びＲ．Ｇｏｎｓａｌｅｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、２１３−２１９、２００７）。
【０００８】
Ｇｏｎｓａｌｅｚ及びＹａｚｄａｎｉ（国際公開第２００７／１１５２２８号パンフレット）は、機能的１，２−プロパンジオール経路、機能的ＩＩ型グリセロール脱水素酵素−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路、及び機能的Ｆ０Ｆｉ−ＡＴＰアーゼ経路を有するが、機能的１，３−プロパンジオール経路を欠くＥ．ｃｏｌｉ菌株によって、エタノールなどの、より価値の高い一連の産物を産生するために、グリセロールの嫌気的発酵を提案した。発酵条件は非常に正確でなければならず、ジヒドロキシアセトンなどの必須添加剤を含まなければならない。
【発明の概要】
【０００９】
グリセロールの嫌気的発酵のため、本発明で提案される経路は、既知の発酵方法とは完全に異なる。これらは、乳酸脱水素酵素（活性）を欠くがバイオマスの粗製加水分解物に由来するＣ５及びＣ６混合糖を代謝できる広範な好熱菌に適用される。
【００１０】
本発明では、酢酸をエタノールに変換する方法を記載する。加水分解物のＣ５＋Ｃ６糖はエタノール及びＣＯ２に変換できるが（例えば、国際公開第２００７／１１０６０６号パンフレットを参照されたい）、本発明は、グリセロールなど、より還元状態にある炭素基質から、より多くの還元当量（ＮＡＤＨ）をもたらし、酢酸をエタノールに変換することによって、加水分解物から、更に高いエタノール収率を得ることができる代替及び相補的手段を記載する（図３）。
【００１１】
したがって、本発明は、乳酸脱水素酵素活性を欠く少なくとも１株の好熱性微生物に糖を供給するステップであって、前記少なくとも１株の好熱性微生物に、酢酸産生を最小にするが、エタノール産生を最大にするのに充分な量のグリセロールも供給するステップを含む、エタノールを産生するための（工業的）嫌気的発酵方法を提供する。本明細書で議論するように、本発明の方法は、グリセロール経路により産生される追加のＮＡＤＨの存在のために、外因性酢酸を使用して、高レベルのエタノールを産生することが可能である。充分なグリセロールを供給して酢酸産生を最小にし、エタノール産生を最大にすることにより、細胞は本発明の発酵の間、酸化還元均衡を維持することができる。ある種の実施形態において、発酵は、少なくとも一部は好気的条件下で行われる。以下の実験の部に示すように、部分的な好気的条件も、優れたエタノール収率を依然としてもたらす。
【００１２】
図２は、エタノール産生に関するグリセロール利用の概念を図示したものである。乳酸脱水素酵素活性を欠き、ピルビン酸ギ酸リアーゼ経路により最大速度で増殖している好熱菌細胞による、バイオマス加水分解物の嫌気的発酵に、グリセロールを添加する。グリセロールは、グリセロキナーゼを使用してＡＴＰによりリン酸化され、グリセロール−３−リン酸は、グリセロリン酸脱水素酵素により３−ホスホグリセルアルデヒドに酸化される。これにより、糖の解糖経路と比較して、細胞中で他の成分を還元するのに使用できる追加のＮＡＤＨの還元当量が産生される。ホスホグリセルアルデヒドは、次いで解糖酵素によってピルビン酸に変換され、別のＮＡＤＨ分子を産生する。ＰＦＬ経路の流量が飽和状態のとき、本方法の操作条件下の場合、過剰なピルビン酸はオーバーフローした嫌気的ＰＤＨ経路により代謝されるであろう（図１）。しかし、追加のＮＡＤＨは、次いで糖代謝から生じたアセチルＣｏＡの全てをエタノールに還元するのに利用できる。正味の結果は、グルコース当量１モル＋グリセロール２モルが、エタノール４モル＋ギ酸２モル＋ＣＯ２２モルを産出する。
【００１３】
かかるグルコース／グリセロールの混合発酵は、従来の酵母発酵にも、好熱菌発酵にさえも優る明らかな利点を有し、これらの発酵はグルコース１モル当量につき、よくてもエタノール２モル＋ＣＯ２２モルしか産出しない。ギ酸は、細胞の接種材料の好気的産生又は他の発酵のための補助基質として使用できるため、エタノール収率は２倍であり、放出される大気ＣＯ２は酵母発酵のわずか半分である。
【００１４】
その上、本発明者らは、グリセロール経路が、バイオマス加水分解物において望ましくない残留物である外因性酢酸からエタノールを産生するためにも使用できることを見出した。図３に図示するように、酢酸はアセチルＣｏＡ合成酵素によりアセチルＣｏＡに容易に変換され、次にこれが、追加の還元当量（ＮＡＤＨ）を産生するグリセロール経路と協調してエタノールに還元される。物質収支は、外因性酢酸１モル＋グリセロール２モルがエタノール３モル＋ＣＯ２２モルを産出することになる。
【００１５】
したがって、バイオマス加水分解物の嫌気的発酵に供給するグリセロールレベルを調節することにより（例えば、追加の又は割り増しのグリセロールを供給することにより）、糖の全て及び外因性酢酸をエタノールに変換することができよう。副産物は、好気的発酵で動物飼料に変換できるギ酸及びＣＯ２（酵母発酵の場合の半分）のみであろう。後者は非常に純粋であることがわかったため、ドライアイス用及びソフトドリンク製品用の価値を有するであろう。
【００１６】
さらなる利点は、本発明で用いられるものなど、好熱菌細胞が、高温条件下で非常にはやく増殖し、この条件では濃縮されたエタノール蒸気が弱真空下で発酵から容易に直接的に除去されることである。したがって、本方法は冷却費用を排除し、蒸留費用を最小にすることにより、エネルギーを節約する。
【００１７】
この方法のためのヘミセルロース原料は、食品加工又は農業廃棄物から弱酸加水分解により得られるであろうから、最小の二酸化炭素排出量になるであろう。本発明の方法の主要産物は、より少ない量の大気ＣＯ２発生を伴う、エタノール及び高タンパク質の動物飼料であろう。したがって、この方法により産生されるバイオエタノールは、地球温暖化の緩和に大いに寄与できよう。
【００１８】
ほとんどのいかなるタイプの発酵系も、本発明に適合するが、特に連続培養に適しており、これにより培養が非常に速くなり、エタノール産生を最大にし、副産物の酢酸を最小にするようにグリセロールの供給速度を調節することにより、容易に最適化されよう。
【００１９】
好熱性微生物は、酵母より低いエタノール耐性を有するが（一般的には４％ｗ／ｖ未満）、エタノール産生は、エタノールが蒸発又は蒸留により容易に除去される、最適な増殖条件下で有利に行うことができる。したがって、本発明の発酵方法は、少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも７０℃以上の温度で行うことができる。
【００２０】
本発明のある種の実施形態では、発酵において産生されたエタノールは、発酵でのエタノール濃度を、少なくとも１株の好熱性微生物のエタノール耐性より低い濃度に減らすように、連続的に除去する。発酵プロセスの間に産生されたエタノールは、特定の実施形態において、膜及び／又は（弱）真空蒸発により高温発酵から連続的に及び都合よく除去することができる。これにより、バイオ燃料形成のための９５％ｗ／ｖのエタノールを産生するのに必要なプロセスコスト及びエネルギーが削減されよう。
【００２１】
任意の適した好熱性微生物を、本発明の方法に利用することができ、これには本明細書に記載されている特定の好熱性微生物が挙げられる。一実施形態では、少なくとも１株の好熱性微生物がバチルス属に属し、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む。特定の好ましい実施形態では、バチルスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＭＢ  １２４０３）又は菌株ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＭＢ  １２４２８）の派生菌株である。さらなる実施形態では、好熱性微生物はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである。
【００２２】
上述のように、本発明の発酵方法で使用される好熱性微生物は、乳酸脱水素酵素活性を欠く。これは、任意の適切な手段により得ることができる。一実施形態では、少なくとも１株の好熱性微生物が、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）の不活性化のために、乳酸脱水素酵素活性を欠く。遺伝子の不活性化は、任意の適切な手段により実現することができる。
【００２３】
一実施形態では、少なくとも１株の好熱性微生物が、非機能的乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換したために、乳酸脱水素酵素活性を欠き、非機能的乳酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列は、好熱性微生物のゲノムにおいて、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子と組換えることにより、乳酸脱水素酵素活性の不活性化を引き起こす。かかるＤＮＡ構築物は、当技術分野では既知であり、例えば国際公開第２００７／１１０６０６号パンフレットに記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明は下記の非限定的説明及び図面を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】消費されるグルコース１モルからそれぞれアセチルＣｏＡ２モル及びギ酸２モルが産生される、解糖経路及びピルビン酸ギ酸リアーゼ経路を要約した図であり、乳酸脱水素酵素活性を欠く好熱菌株における主な増殖経路の図である。解糖経路により産生されたＮＡＤＨは、アセチルＣｏＡ１モルを還元してエタノールを産生するのに充分なだけであるため、酸化還元均衡を維持するために、その他のアセチルＣｏＡは、ＡＴＰの産生を伴いつつ、アセチルリン酸を介して酢酸に変換される。高い糖濃度でこの経路は飽和状態になり、調節されていない解糖により産生された過剰なピルビン酸は、ピルビン酸脱水素酵素経路により代謝され、過剰なＮＡＤＨにより還元されて２エタノール＋２ＣＯ２を産生する。
【図２】本発明にしたがい、ＰＦＬ経路を支持する条件下で糖で増殖している菌株にグリセロールを供給する効果を示す図である。グリセロールは、グリセロキナーゼを使用してＡＴＰによりリン酸化され、グリセロール−３−リン酸は次いでグリセロリン酸脱水素酵素により３−ホスホグリセルアルデヒドに酸化される。これにより、細胞中で他の成分を還元するのに使用できる追加のＮＡＤＨ当量が産生される。ホスホグリセルアルデヒドは、次いで解糖及びＰＦＬ経路によりエタノールに変換される。しかし、追加のＮＡＤＨは、次いで糖代謝から生じたアセチルＣｏＡの全てをエタノールに還元するのに充分である。正味の結果は、グルコース当量１モル＋グリセロール２モルが、エタノール４モル＋ギ酸２モル＋ＣＯ２２モルを産出することになる。
【図３】本発明にしたがい、外因性酢酸がアセチルＣｏＡに変換され、次いでグリセロール経路により生じる過剰なＮＡＤＨによりエタノールに還元できること、及びオーバーフローしたピルビン酸脱水素酵素経路を示す図である。したがって、割り増しのエタノール３モルが、酢酸１モル及びグリセロール２モルから生じるであろう。
【図４】部分的な好気的条件の下、６５℃及び２００ｒｐｍで、グルコース５６ｍＭ及び様々な濃度のグリセロールとともに、２ＴＹ培地１０ｍｌを含む３０ｍｌのステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）瓶中における、ＢＣＴ２５−Ｈ菌株による産物の形成を示す図である。
【実施例】
【００２６】
菌株ＬＬＤ−Ｒに由来するバチルスの乳酸脱水素酵素欠損菌株であるＢＣＴ２５−Ｈ菌株（国際公開第２００７／１１０６０６号パンフレットの実施例３にしたがって構築した）を、グルコース５６ｍＭとともに２ＴＹ培地１０ｍｌ（トリプトン１６ｇ、酵母抽出液１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ及び蒸留水１０００ｍｌ。２０％ｗ／ｖのＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した）を含み、様々な濃度のグリセロール（５４、１０８及び２１６ｍＭ）を含む３０ｍｌのステリリン瓶中で、６５℃及び２００ｒｐｍで増殖させた。実験は、増殖状態が部分的に好気的になるように行った。
【００２７】
増殖試験は、グリセロールの添加が、エタノール産生を大いに改善し、一方、ギ酸濃度は非常に高くはなかったことを示した（表１及び図４を参照されたい）。グリセロールの添加によって酢酸の量が減少することが期待されたが、増殖条件が厳密に嫌気的ではなく、いくらかの酢酸はオーバーフローした代謝により産生されたという事実のために、この試験で得られた酢酸レベルがわずかに高かった可能性がある。
【００２８】
表１−変動濃度のグリセロール（ｍＭ）供給量でのエタノール、ギ酸及び酢酸産生（ｍＭ）の概要。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載されているものに加える本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含むことを意図している。更に、本明細書で記載されている全ての実施形態は幅広く応用でき、必要に応じてありとあらゆる他の一貫した実施形態と組み合わせることができるものと考えられる。
【００３１】
本明細書に引用された様々な文献の開示は、参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2011511643.tif 000008
2011511643.tif 000009
2011511643.tif 000010
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