(57)【要約】  本発明は、新規修飾ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、該タンパク質をコードする核酸、該タンパク質を取り込むコンジュゲート、および該タンパク質を作製しそして使用する方法を提供する。本発明はまた、特定の細胞に毒素を導く目的のため、該コンジュゲートを動物に投与する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未結合（ｆｒｅｅ）システインを有する組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む物質の組成物。
【請求項２】
前記組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が全長ＰＡＰである、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記未結合システインが末端システインである、請求項２の組成物。
【請求項４】
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−全長ＰＡＰを含む、請求項３の組成物。
【請求項５】
請求項１の組成物をコードする核酸を含む核酸。
【請求項６】
請求項５の核酸を含むプラスミド。
【請求項７】
請求項６の核酸を含む細胞。
【請求項８】
大腸菌である、請求項７の細胞。
【請求項９】
構造：
Ｘ−Ｙ−Ｚ、
式中、Ｘは未結合システインを有する全長ｒＰＡＰであり；Ｙは存在しないかまたは化学的リンカーであり、そしてＺは化合物である
を有するコンジュゲート。
【請求項１０】
前記化合物が細胞ターゲティング・タンパク質である、請求項９のコンジュゲート。
【請求項１１】
抗体；ホルモン；修飾ホルモン放出因子；およびホルモン放出因子からなる群より選択される、請求項１０のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記リンカーが：ＧＭＢＳ；ＥＭＣＳ；ＳＭＰＨ；ＳＰＤＰ；およびＬＣ−ＳＰＤＰからなる群より選択される、請求項１０のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記リンカーがＧＭＢＳであり、そして前記タンパク質がｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンである、請求項１０のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１の化合物を別の化合物とコンジュゲート化する方法であって、組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質の前記未結合システインおよび別の化合物間に、化学結合を誘導する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記化学結合が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して誘導される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記ヘテロ二官能性架橋剤がＧＭＢＳである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
化合物がｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
ＧＭＢＳリンカーをｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンに結合させる方法であって、ＧＭＢＳとｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンを、非水性条件下でインキュベーションする工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記非水性条件が：ＧＭＢＳをメタノール中に溶解させて、第一の非水性溶液を生成し；ｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンをメタノール中に溶解させて、第二の非水性溶液を生成し；前記の第一および第二の非水性溶液を、１．１：１のモル比で混合する工程を含む、請求項１９の方法。
【請求項２０】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）において、全長ｒＰＡＰをコードする核酸を発現する工程を含む、請求項１の組成物を作製する方法。
【請求項２１】
細胞を増殖させる方法であって、Ｔ７プロモーター系の調節下にある全長ｒＰＡＰを含む核酸で形質転換された細胞をインキュベーションする工程を含み、前記Ｔ７プロモーター系がアラビノース・プロモーターの調節下にあるＲＮＡポリメラーゼを有し、前記インキュベーションが細胞増殖を生じる、前記方法。
【請求項２２】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記細胞増殖後に前記全長ｒＰＡＰの発現を誘導する工程をさらに含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記の発現誘導後に、前記細胞から前記全長ｒＰＡＰを単離する工程をさらに含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記全長ｒＰＡＰが：化学的に修飾されたｒＰＡＰ、天然変異体ｒＰＡＰ、および遺伝子操作されたｒＰＡＰからなる群より選択される、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
連邦政府が資金援助した研究に関する言及
[0002]なし
技術分野
[0003]本発明は、一般的に、分子生物学および生化学に関し、より詳細には、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）植物由来の修飾リボソーム不活性化タンパク質に関する。ヨウシュヤマゴボウ植物はまた、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａとしても知られ、そしてヨウシュヤマゴボウ・リボソーム不活性化タンパク質はまた、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質とも呼ばれ、しばしば「ＰＡＰ」と略される。本発明はまた、獣医学的薬剤を含む薬剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
[0004]化合物コンジュゲート化ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ならびにリシンおよびジフテリア毒素などの他の天然毒素のコンジュゲートは、長らく、療法的有効性の可能性を秘めてきた。理論的には、コンジュゲートの「化合物」部分としての天然リガンドの存在は、ターゲット細胞損傷を生じ、そして他の細胞損傷を生じない。実際には、部分的に、コンジュゲート化されていない毒素が、意図されない細胞損傷を生じるために、不正確なターゲティング毒性を生じる。ＰＡＰに関しては、１つの問題は、コンジュゲート化ＰＡＰおよび非コンジュゲート化ＰＡＰのサイズが非常に類似であるため、分離技術がこれらを区別不能であることである。
【０００３】
[0005]自然（「天然」とも称される）ＰＡＰはヨウシュヤマゴボウ植物から単離され、そして天然ＰＡＰを化合物−毒素コンジュゲートにおいて利用しようとする試みがなされてきたが、こうした試みは信頼性があることを示していない。予期されるように、年ごとおよびバッチごとのアイソフォームの変動が、薬学的品質調節の背景では、厄介でそして実現不能であることがわかった。さらに、いくつかのアイソフォームはコンジュゲートを形成せず、そして異なるアイソフォームは互いに異なってコンジュゲートを形成した。
【０００４】
[0006]理想的には、組換え発現は、これらの変動に対する調節を提供するであろう。しかし、ＰＡＰの組換え発現もまた、困難に遭遇してきた。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）における以前の発現は、毒性および成長阻害、ならびに封入体における組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ｒＰＡＰ）の集積を生じた。これに関連して、組換えＰＡＰは、別個の可溶化工程およびそれに続くタンパク質の再フォールディングを必要とし、その結果、収量が劣り、そしてスケールアップが困難であった。大腸菌、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、植物およびＰ．パストリス（Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における他の試みは低収量を生じ、またはＰ．パストリスの場合、潜在的に炎症反応を誘導しうる配列が導入された。さらに、組換えＰＡＰ−化合物融合タンパク質は、毒素と結合するのに失敗するかまたはターゲット細胞に毒素を導くのに失敗するか、あるいは天然ＰＡＰに比較して、はるかに減少した活性を示すか、いずれかであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0007]したがって、未結合（ｆｒｅｅ）システインを有するｒＰＡＰ分子、該分子から作製されるコンジュゲート、およびｒＰＡＰを産生する方法、特に、高収量であり、容易にフォールディングし、そして精製されるｒＰＡＰを生じ、そして場合によってコンジュゲート化に化学的に利用可能なｒＰＡＰを提供する方法は、大きな貢献となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0008]一般論として、本発明は、未結合システイン、好ましくは末端システイン、より好ましくはＮ末端システインを有する組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む組成物を提供する。やはり提供するのは、ＰＡＰが全長ｒＰＡＰ、より好ましくは未結合システインを含む全長ｒＰＡＰ、最も好ましくは未結合システインおよびアミノ酸リンカーを含む全長ｒＰＡＰである、ｒＰＡＰ分子である。好ましいのは、Ｎ末端Ｃｙｓおよびアミノ酸リンカーを含むｒＰＡＰ分子であり、最も好ましくは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの少なくとも１つの反復を有するものである。より好ましくは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−全長ｒＰＡＰおよびＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−全長ｒＰＡＰである。
【０００７】
[0009]本発明は、本発明の方法にしたがって発現された場合、宿主細胞を殺さないｒＰＡＰを提供する。本発明の組成物および方法で利用されるｒＰＡＰは、好ましくは、２９．５ダルトン以上であり、より好ましくは３０ダルトン以上であり、最も好ましくは３０．５ダルトン以上である。しかし、３１．５、３１．７５および３２ダルトン以上の分子量を有する全長ｒＰＡＰを利用する組成物および方法もまた、本発明の範囲内である。全長ｒＰＡＰタンパク質（翻訳後修飾されていない天然ＰＡＰの分子量と一致するもの）が、本発明で用いるのに好ましい物質である。
【０００８】
[00010]核酸、プラスミド、ならびに本発明の核酸およびタンパク質を含む細胞もまた提供し、好ましい細胞は大腸菌である。
[00011]構造：
Ｘ−Ｙ−Ｚ、
式中、Ｘは未結合システインを有する全長ｒＰＡＰであり；Ｙは存在しないかまたは化学的リンカーであり、そしてＺは化合物である
を有するコンジュゲートもまた提供する。
【０００９】
[00012]細胞ターゲティング化タンパク質である化合物が好ましく、より好ましくは：抗体；ホルモン；修飾ホルモン放出因子；およびホルモン放出因子からなる群より選択されるものが好ましい。化学的リンカーが柔軟なリンカーである化合物が好ましく、ヘテロ二官能性リンカーを持つものがより好ましく、マレイミド基を有するリンカーを持つものが最も好ましい。リンカーがＧＭＢＳ；ＥＭＣＳ；ＳＭＰＨ；ＳＰＤＰ；およびＬＣ−ＳＰＤＰからなる群より選択される、本明細書に記載するようなコンジュゲートが好ましい。前記リンカーがＧＭＢＳであり、そして前記タンパク質がｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンであるコンジュゲートが最も好ましい。
【００１０】
[00013]本明細書のｒＰＡＰを別の化合物とコンジュゲート化する方法であって、組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質の前記の未結合システインおよび別の化合物間に、化学結合を誘導する工程を含む、前記方法もまた提供する。好ましい方法は、前記化学結合が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して誘導されるものであり、より好ましくは、化学結合が、未結合システインおよび化合物上のマレイミド基間に誘導されるものである。ヘテロ二官能性架橋剤がＧＭＢＳであり、そして／または化合物がｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンであるものが最も好ましい。
【００１１】
[00014]ＧＭＢＳリンカーをｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンに結合させる方法であって、ＧＭＢＳとｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンを、非水性条件下でインキュベーションする工程を含む、前記方法もまた提供し、好ましくは、前記非水性条件は：ＧＭＢＳをメタノール中に溶解させて、第一の非水性溶液を生成し；ｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンをメタノール中に溶解させて、第二の非水性溶液を生成し；前記の第一および第二の非水性溶液を、１．１：１のモル比で混合する工程を含む。
【００１２】
[00015]大腸菌において、全長ｒＰＡＰをコードする核酸を発現する工程を含む、ｒＰＡＰを得る方法もまた提供する。
[00016]全長ｒＰＡＰを含む核酸で形質転換された細胞をインキュベーションする工程を含み、ｒＰＡＰがＴ７プロモーター系の調節下にあり、そして前記Ｔ７プロモーター系がアラビノース・プロモーターの調節下にあるＲＮＡポリメラーゼを有する、細胞を増殖させる方法もまた提供する。前記細胞が大腸菌細胞である方法が好ましい。ｒＰＡＰが未結合システインを含む方法が好ましく、ｒＰＡＰが末端システインを含むものが最も好ましい。全長ｒＰＡＰが：化学的に修飾されたｒＰＡＰ、天然変異体ｒＰＡＰ、および遺伝子操作されたｒＰＡＰからなる群より選択される方法もまた好ましい。
【００１３】
[00017]本明細書のＰＡＰ組成物を含むコンジュゲートもまた提供する。構造：
Ｘ−Ｙ−Ｚ、
式中、ＸはＮ末端Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有する全長ｒＰＡＰであり；Ｙは化学的リンカーであり、そしてＺはタンパク質である
を有するものが特に好ましい。ＸがＧＭＢＳであり、そしてＺがｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨであるものが最も好ましい。
【００１４】
定義
[00018]「未結合システイン」は、ジスルフヒドリル結合を介して別のシステインに結合しているもの以外の任意のシステインを意味する。これに関連して、「未結合システイン」には、システインがジスルフヒドリル結合を介して別のシステインに結合していない限り、別の残基または化合物に結合しているシステインが含まれる。
【００１５】
[00019]「全長ｒＰＡＰ」は、毒素活性を有し、そして２９，５００ダルトン以上の分子量を有する、任意の組換えＰＡＰを意味する。
[00020]本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、好ましい態様の詳細な説明から、当業者にはより明らかとなるであろう。詳細な説明に付随する図を以下に記載する：
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[00021]図１は、全長ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質の構造の定型化された描写であり、翻訳後プロセシング中、植物において通常は切断されるＣ末端残基、およびさらなる非天然存在Ｎ末端残基を示す。
【図２】[00022]図２は：翻訳後プロセシング中、植物において通常は切断されるＣ末端；およびさらなる非天然存在Ｎ末端残基を示す、全長ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；Ｎ末端リンカー；ならびに例示的な化合物、修飾ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の構造の定型化された描写である。
【図３】[00023]図３は、組換え切断不能（「ｎｃ」と略され、そしてリンカーがジスルフィド切断部位を所持しないことを意味する）ヨウシュヤマゴボウ・コンジュゲートの構造の定型化された描写であり、リンカーおよび修飾ゴナドトロピン放出ホルモンを示すアミノ末端の詳細を伴う。
【図４】[00024]図４は、ゴナドトロピン放出ホルモンおよびゴナドトロピン放出ホルモン受容体の細胞外ドメインの相互作用の定型化された描写である。
【図５】[00025]図５は、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイにおいて、ルシフェラーゼｍＲＮＡのタンパク質合成阻害によって測定されるようなｒＰＡＰの生物学的活性を示すグラフである。
【図６】[00026]図６は、競合的ラジオイムノ受容体結合アッセイの結果を示すグラフである。Ｘ軸に最も近い曲線は、標準に関するデータを反映する。次の曲線は、ＰＡＰが植物部分から精製された（自然または天然ＰＡＰとしても知られる）ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ＰＡＰに関するデータを反映する。データ点が三角形で示される曲線は、ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ｒＰＡＰに関するデータを反映する。データ点がＸとして示される線は、非コンジュゲート化組換えＰＡＰ（ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳに結合していない）を反映する。
【図７】[00027]図７。本発明の核酸−ｒＰＡＰ  ＤＮＡ配列−配列番号＿＿。
【図８】[00028]図８。本発明のアミノ酸配列−ｒＰＡＰタンパク質配列−配列番号１。太字：ＡＴＧおよびリンカー配列；黒字：天然成熟ＰＡＰ配列；太字および下線：植物において翻訳後切断されるタンパク質のＣ末端部分をコードする天然プレＰＡＰ配列。
【図９】[00029]図９。本発明のｒＰＡＰ（上部）−配列番号２、および天然成熟（植物において翻訳後修飾されたもの）ＰＡＰ（下部）発現ＤＮＡ配列のアライメント。
【図１０】[00030]図１０。ｒＰＡＰ（上部）、および天然成熟ＰＡＰ（下部）タンパク質配列のアライメント。
【図１１】[00031]図１１。大きな太字で示す内部ジスルフィド結合システインを含む、発現されたｒＰＡＰの配列：Ｃｙｓ−３４はＣｙｓ−２５８に結合し、そしてＣｙｓ−８４はＣｙｓ−１０５に結合する；太字；Ｎ末端システインを伴う操作されたリンカー；ＶＮＴＩＩ．．．．：天然ＰＡＰ配列；太字および下線は天然プレＰＡＰ（植物において翻訳後修飾されたもの）のＣ末端である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[00032]本発明は、大腸菌において高収量で発現可能であり、そしていかなる他の組換えＰＡＰよりも３０〜４０倍高い比活性（生物学的活性／単位質量）を有する、組換えヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を提供する。さらに、本発明は、薬学的な量で、ｒＰＡＰを産生するための方法を提供する。
【００１８】
[00033]本発明のｒＰＡＰ物質（タンパク質、核酸、構築物、細胞等）を用いて、ｒＰＡＰ、およびリンカーを介すかまたは直接のいずれかで、これらに結合されたターゲティング化合物を有する、ｒＰＡＰコンジュゲートを産生してもよい。１つの態様において、ｒＰＡＰは、別の化合物に対するリンカーを連結するのに場合によって使用するための、未結合システインを有する。１つのこうした態様において、本発明のｒＰＡＰタンパク質は、こうした目的のために都合のよいＮ末端システインを提供するが、本発明のｒＰＡＰの使用はＮ末端コンジュゲート化に限定されない。例えば、本発明のｒＰＡＰを、コンジュゲート化なしの毒素として用いてもよいし、あるいは、末端システインまたは内部システインの未結合システインを介して、コンジュゲート化してもよい。
【００１９】
[00034]本明細書記載のｒＰＡＰ分子は、これらにコンジュゲート化されたリンカーまたはターゲティング化合物を伴いまたは伴わず、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイにおいて活性である。
【００２０】
[00035]本発明には、組換えＰＡＰを発現させ、再フォールディングさせ、コンジュゲート化し、そして精製する方法が含まれる。いくつかの障害を克服して、発現成功を達成した。非ヨウシュヤマゴボウ宿主細胞においてｒＰＡＰを発現するのに伴う基本的な問題は、これが毒素であり、そして宿主細胞を殺すことである。Ｔ７系を用いて、大腸菌において成熟（翻訳後切断された）ＰＡＰを発現する試みを行った。細胞はまったくではなくてもあまり増殖せず、そしてｒＰＡＰタンパク質誘導前に弱っているように見えた。続いて、大腸菌において、Ｔ７誘導性プロモーター系を用いて、全長ｒＰＡＰ（植物において通常は翻訳後に切断されるＣ末端部分を加えた成熟ＰＡＰ）を発現する試みもまた失敗した。細胞はやはり、増殖期中およびｒＰＡＰの誘導前に、弱っているように見えた。最後に、２つの制御調節シグナル下の全長ｒＰＡＰを、大腸菌において試みた。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをアラビノース（ＡｒａＤ）プロモーターの調節下に置き、Ｔ７プロモーターを全長ｒＰＡＰ配列の上流に置いた。アラビノース・プロモーターが厳重に抑制されていると、プラスミド上にｒＰＡＰ遺伝子を宿する場合であっても、細胞は増殖可能であった。抑制の除去を介して誘導すると、薬学的に作業しうる収量のｒＰＡＰが生じた。
【００２１】
[00036]本発明のｒＰＡＰを再フォールティングする多様な方法がある。最も成功した１つは、実施例２に記載するようなものである。別の方法は、スクロースの代わりに０．５Ｍ  Ｌ−アルギニンを代用して、実施例２のプロトコルを用いるものである。さらに、実施例２のプロトコルにおいて、システアミンの代わりに、グルタチオンを用いてもよい。場合によって、８Ｍ尿素の代わりに６Ｍグアニジン−ＨＣｌで封入体を可溶化してもよい。再フォールディングは、理想的には、塩基性ｐＨ範囲で行われる。
【００２２】
[00037]すべて当該技術分野でよく記載される、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む多様な方法によって、タンパク質を精製してもよい。好ましい方法は、特に実施例５に記載するような陽イオン交換クロマトグラフィーである。
【００２３】
[0038]さらに、この組換えタンパク質に対して行う実験に基づいて、本発明のｒＰＡＰの比活性（生物学的活性／単位質量）が、ウサギ網状赤血球溶解物におけるタンパク質翻訳の阻害において、別の報告されるｒＰＡＰよりも、３０〜４０ｘ高い活性であることが決定された。非常に感受性であり、そしてナノモル未満の量のｒＰＡＰを検出可能なｒＰＡＰ特異的放射免疫アッセイによって、ｒＰＡＰ濃度を決定した。
【００２４】
[00039]理想的には毒素機能を保持するようにフォールティングされた組換えＰＡＰタンパク質、好ましくは天然存在システインの天然ジスルフィド架橋を保持するもの、そして好ましくは少なくとも１つの未結合システイン（例えば天然存在配列には存在しないもの）、最も好ましくは、他の化合物に選択的に結合可能な末端未結合システインを有するものが、本明細書に提供される。当該技術分野の技術のように、任意のＰＡＰ配列が、本発明の出発物質として使用するのに適している。任意の既知のアイソタイプ、または明らかになる任意のものが、本発明を用意するのに有用であろう。
【００２５】
[00040]全長ＰＡＰは、Ｃ末端に以下のアミノ酸配列を有する：ＹＮＱＮＡＭＦＰＱＬＩＭＳＴＹＹＮＹＶＮＬＧＤＬＦＥＧＦ−ＣＯＯＨ。該配列は、通常、ヨウシュヤマゴボウ植物において、翻訳後に切断されるが、本発明の好ましい態様においては保持される。天然存在翻訳後切断ＰＡＰは、２９，３０８．５ダルトンの分子量を有する。
【００２６】
[00041]特に、配列番号１；未結合システインを含み、そしてデフォルト設定でＢＬＡＳＴソフトウェアバージョン２．２．２１を用いて、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質；配列番号２にコードされるタンパク質；未結合システインを含み、そしてデフォルト設定でＢＬＡＳＴバージョン２．２．２１ソフトウェアを用いて、配列番号２に対して少なくとも９０％同一である核酸によってコードされるタンパク質からなる群より選択される、上述のようなｒＰＡＰ組成物。しかし、配列同一性が：９５％；９６％；９７％；９８％；および９９％からなる群より選択される、上述のような組成物もまた好ましい。
【００２７】
[00042]配列番号２；デフォルト設定でＢＬＡＳＴソフトウェアバージョン２．２．２１を用いて、配列番号２に対して少なくとも８５％同一であり、そして未結合システインを有するタンパク質をコードする核酸；配列番号１をコードする核酸；および未結合システインを有するタンパク質をコードし、そしてデフォルト設定でＢＬＡＳＴソフトウェアバージョン２．２．２１を用いて、配列番号１に対して少なくとも８５％同一である核酸からなる群より選択される、核酸もまた提供する。しかし、配列同一性が：９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；および９９％からなる群より選択される、上述のような組成物もまた好ましい。好ましい核酸は、本明細書のタンパク質をコードする核酸を含む。
【００２８】
[00043]ＧＭＢＳリンカーをｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンに結合させる方法であって、ＧＭＢＳとｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンを、非水性条件下でインキュベーションする工程を含む、前記方法もまた提供する。この方法のより好ましい態様は、前記非水性条件が：ＧＭＢＳをメタノール中に溶解させて、第一の非水性溶液を生成し；ｄ−ｌｙｓ６−ゴナドトロピン放出ホルモンをメタノール中に溶解させて、第二の非水性溶液を生成し；前記の第一および第二の非水性溶液を、１．１：１のモル比で混合する工程を含むものである。
【００２９】
[00044]特に、配列番号１に対して、少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一であるｒＰＡＰが、本発明の方法において有用である。未結合ＣＹＳ残基もまた含むものが最も有用である。さらに、保存配列は変更されてはならず、そして非保存配列は場合によって変更可能である。ＰＡＰにおいて、天然存在システイン間のジスルフィド結合は、毒素機能に必要な三次構造を提供し、そして理想的には本発明の分子および方法において保存される。Ｃ末端ドメインにおける突然変異は、ＰＡＰの局在化プロセシングに影響を及ぼし、そして改変されたプロセシングが望ましい場合には、改変可能である。ＲＮＡ結合ならびに脱プリン化に影響を及ぼす突然変異が知られる。例えば、最初の１６アミノ酸の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）によって、ＰＡＰ細胞毒性およびリボソームを脱プリン化する能力が排除される。さらに、リボソーム脱プリン化は、アミノ酸がＣ末端から除去されるにつれて減少し、そしてＧｌｕ−２４４に停止コドンが導入されると排除される。さらに、特に毒性が高い化合物を得るために、既知の方法によって、過剰活性突然変異体をスクリーニングすることも可能である。本発明の機能を最適化するために、これらの突然変異効果を利用してもよい。さらに、これらの突然変異ｒＰＡＰおよびこうした突然変異体を利用する組成物は、本発明の範囲内である。
【００３０】
[00045]発現された際に、ｒＰＡＰタンパク質を生じるヌクレオチドもまた本発明に含まれる。特に、配列番号２が好ましい。しかし、上記配列における特定の変化は、本発明の基本的な側面を改変しないであろうことを当業者は認識する。したがって、本発明には、本発明の核酸と、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを用いて相同であるか、ＢＬＡＳＴを用いて同一であるか、タンパク質配列を変化させない点突然変異、タンパク質配列を変化させないコドン変化などの、機能に影響を及ぼさない重要でない変化を有する核酸などが含まれる。
【００３１】
[00046]本明細書のコンジュゲートおよび本明細書の化合物をコンジュゲート化する方法もまた提供する。コンジュゲートは、理想的には、細胞損傷が望ましい受容体に選択的に結合するよう設計される。一般的に、ターゲティング化合物を介して受容体に結合した後、コンジュゲートは、受容体が仲介するエンドサイトーシスによって取り込まれ、そしてコンジュゲートを細胞に送達する。取り込み後、コンジュゲートのｒＰＡＰ部分は、大リボソームＲＮＡの保存されたサルシン（ｓａｒｃｉｎ）／リシンループを脱プリン化することによって、リボソームＲＮＡに結合する。脱プリン化されたリボソームは、伸長因子２に結合不能であり、そしてしたがって、伸長サイクルの転位置工程が阻害され、タンパク質合成のシャットダウンが生じる。細胞は最終的に死ぬ。
【００３２】
[00047]本明細書の特定のｒＰＡＰタンパク質に化合物をコンジュゲート化するための１つの特定の方法は、Ｎ末端システインおよび別の化合物間に化学結合を導入する工程を含む。化合物が抗体、ホルモン、修飾ホルモン放出因子、またはホルモン放出因子であるような、こうした方法が好ましい。特に、ホルモン放出因子がＧｎＲＨであるものがより好ましいが、ｄ−ｌｙｓ６−修飾ＧｎＲＨへのコンジュゲート化が最も好ましい。コンジュゲート化は、任意の既知の方法を介して実行可能であるが、好ましくは、リンカーまたは他の架橋化合物を介すかのいずれかで、ターゲティング化化合物およびｒＰＡＰ間にスルフヒドリル結合を生成することを介する。言い換えると、未結合システインを利用して、ｒＰＡＰにおける他のシステインへの結合を排除することが理想的であるが、当業者は、機能性を最適にするため、ｒＰＡＰおよびそれにコンジュゲート化される化合物の両方を修飾する方法を知っている。
【００３３】
[00048]本発明の好ましい態様において、修飾ゴナドトロピン放出ホルモン「ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ」を全長ｒＰＡＰにコンジュゲート化する。ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨは、好ましくは、全長ｒＰＡＰ上の未結合システインへの結合を容易にするため、リンカーＧＭＢＳで活性化される。ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨのＧＭＢＳでのこうした「活性化」は、通常試みられるような水性条件下で試みた場合には障害であることが証明された。水性条件下では、１つのｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ分子は、２〜３分子のＧＭＢＳに結合し、これはｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨあたり１つのｒＰＡＰを結合させるためには許容しえない。しかし、ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨを非水性条件下（メタノール）で活性化すると、障害は克服され：１つのＧＭＢＳリンカー分子に対する１つのｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨの比が達成された。したがって、ｒＰＡＰ対ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨの１対１比もまた達成された。
【００３４】
[00049]ヘテロ二官能性架橋剤、特にＧＭＢＳを利用する方法が好ましいが、リンカー上に位置するＮＨＳエステル基を介してｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨに結合するか、またはリンカー上に位置するマレイミド基を介してｒＰＡＰ上の未結合スルフヒドリル基に付着するのを容易にするであろう任意のヘテロ二官能性架橋剤もまた好ましい。
【００３５】
[00050]ＧｎＲＨ分子の両端が受容体への結合に必要である。ＧｎＲＨおよびｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ（交換可能に、「ＤＫ６」または「ｄＫ６」または「ｄ−ｌｙｓ６」または「ｄ−Ｌｙｓ６」とも称される）の唯一の相違は、６位のグリシンのＤ−リジンでの置換である。さらに、末端がブロッキングされる。Ｃ末端はエチルアミド基（ＥＴ−ＮＨ２）でブロッキングされ、それによって天然化合物の１０位のグリシンが置換される。天然ＧｎＲＨ化合物は、ＮＨ２Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＧｌｙＣＯＯＨである。好ましい類似体は、ｄＫ６：  Ｈｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｅｔ−ＮＨ２である。
【００３６】
[00051]別の態様において、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが全長ｒＰＡＰに付加され、そしてターゲティング化合物に結合するのに用いられる。Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、天然ＰＡＰ配列の一部ではない。Ｖａｌ−Ａｓｐは、天然ＰＡＰ配列の最初の２つのアミノ酸である。
【００３７】
[00052]本発明の最も好ましいコンジュゲートは、以下の構造：
Ｘ−Ｙ−Ｚ
式中、Ｘはｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨであり；ＹはＧＭＢＳであり；そしてＺはＮ末端にＣＧＧＧＧＳを有する全長ｒＰＡＰである
を有する。
【００３８】
[0053]本明細書記載の方法、あるいは当該技術分野で知られるかまたは発展される任意の方法を介して、コンジュゲートを作製してもよい。さらに、当該技術分野に知られるように、任意の望ましい機能性を提供するため、コンジュゲートを修飾してもよい。実施例は好ましいコンジュゲート化法を記載する。
【００３９】
[0054]本発明のコンジュゲートを投与するため、任意の塩、懸濁物、分散物等を用いてもよい。無菌であり、そして非発熱性である、０．７％〜１０％、より好ましくは０．９％の塩化ナトリウム溶液が好ましく、より好ましくは、４．５〜７のｐＨでもある溶液が好ましい。さらに、コンジュゲートが適切な影響を提供するならば、任意の投与法が許容されうる。本発明の最も好ましい態様は、不妊処置の目的のために動物に注射するため、溶液中のｒＰＡＰ−ＧＮＲＨ塩を用いるものである。不妊は完全である必要も、可逆的である必要もない；しかし、意図される最適な様式は、動物、特にイヌ、ネコ、ウマ、食物または他の製品のための家畜（畜牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、バイソン、バイソン／畜牛種等）、労働する家畜、動物園の動物、および野生生物（特にシカ、エルク、および慢性消耗病に感受性である他の有蹄動物）で使用するための非可逆性ｒＰＡＰ−ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ注射液である。
【００４０】
[00055]前述の発明は、適切な法律基準にしたがって記載されてきており、したがって、説明は、事実上、限定するのではなく例示的である。開示する態様に対する変動および修飾が、当業者に明らかになることも可能であり、そしてこれらは本発明の範囲内である。
【実施例】
【００４１】
実施例１．  大腸菌におけるｒＰＡＰの発現。
[00056]順方向プライマー、ｒＰＡＰ−Ｆ：  ５’−ＣＣＣＧＧＧ  ＣＡＴＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＡＣＣ−３、および逆方向プライマー、ｒＰＡＰ−Ｒ：  ５’−ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  Ｃを用いて、ＰＣＲ増幅によって、全長配列（配列番号２）を得た。
【００４２】
[00057]反応混合物は、以下の構成要素からなった：  ６００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４  （ｐＨ  ８．９）、１８０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ｒＰＡＰ−Ｆプライマー、０．２μＭ  ｒＰＡＰ−Ｒプライマー、１ｎｇテンプレートＤＮＡ、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍＲ  Ｔａｑ高忠実度ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：  ９４℃ｘ２分間（１サイクル）、９４℃ｘ３０秒間、５２℃ｘ３０秒間、６８℃ｘ１分間（１５サイクル）、９４℃ｘ３０秒間、５５℃ｘ３０秒間、６８℃ｘｌ分間（２５サイクル）。
【００４３】
[00058]製造者の説明書にしたがってＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いて、ｐＥＴ３ａ発現プラスミド中、Ｔ７プロモーターの下流に、ｒＰＡＰをコードする全長配列を導入した（連結した）。
【００４４】
[00059]ｒＰＡＰ配列含有プラスミドを用いて、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を形質転換した。いくつかのコロニーを摘み取り、そして挿入物の存在に関して、ＤＮＡ配列分析によってスクリーニングした。正しいｒＰＡＰ配列を含有するプラスミドを宿することが示されたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを精製し、そして続いて、アンピシリン耐性選択可能マーカーとともに厳重に制御されるアラビノース・プロモーター（ＡｒａＤ）の調節下のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを所持する大腸菌ＢＬ２１（ＡＩ）株を形質転換するのに、該プラスミドＤＮＡを用いた。形質転換体を選択し、そしてｒＰＡＰ発現を抑制するため、推定される形質転換体をＬＢ選択培地およびグルコース上にプレーティングした。
【００４５】
[00060]２つの単離体を研究用に選択し、そしてｒＰＡＰ配列を含まない発現プラスミドを含有する対照を生成した。各単離体を別個に、ラクトースおよびアラビノースを含まず、そしてグルコースが存在する最少培地中で、振盪しながら３７℃でおよそ１２時間（一晩）増殖させた。対照を同じ条件下で増殖させた。アラビノース・プロモーター系の誘導を抑制する目的のために増殖培地を選択し、それによって、ｒＰＡＰ  ＲＮＡ発現／タンパク質翻訳を抑制した。
【００４６】
[00061]結果は以下の通りである。
【００４７】
【表１】
2011528230.tif 000002
【００４８】
[00062]少量の各一晩培養物を、アンピシリンを含有するＬＢ培地に移し、そしてＡ６００が０．４に到達した後、続いて、Ｌ−アラビノースを最終濃度０．２％に、そしてイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを１ｍＭの濃度に添加することによって、ｒＰＡＰを大腸菌細胞から誘導した。誘導をさらに３．５時間行った。
【００４９】
実施例２．  ｒＰＡＰの再フォールディングおよび精製。
[00063]スナップ希釈によってｒＰＡＰを再フォールディングした。封入体の単離後、８Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で封入体を可溶化した。ＤＴＴを最終濃度１０ｍＭまで添加し、そして混合物を室温で９０分間攪拌した。次いで、可溶化されたタンパク質を室温で攪拌しながら、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．４Ｍスクロース、０．０５％ポリエチレングリコール−３５５０、０．９ｍＭ酸化システアミン（ＴＰＥＧＳ）を含有する溶液内に一滴ずつ添加した。再フォールディング溶液中のｒＰＡＰの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの間であった。可溶化されたｒＰＡＰを再フォールディング溶液に添加した後、混合物を４℃でさらに２４時間攪拌した。２４時間後、混合物を１６０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清をデカントし、そして再フォールディング後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に対して、タンパク質溶液を透析した。緩衝液ｐＨは、６．８〜８．５の範囲を有した。透析後、溶液を１６０００ｘｇで１５分間遠心分離し、そして上清を陽イオン交換樹脂上に置いた。次いで、カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液でタンパク質を溶出させる。５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するコンジュゲート化緩衝液に対して、溶出タンパク質を透析する。タンパク質濃度を、０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整する。
【００５０】
実施例３．  ｄ−ｌｙｓ６修飾ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のマレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）リンカーでの活性化。
[00064]１２２４ダルトンの分子量を有するｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨを、固相合成（Ａｎａｓｐｅｃ社、カリフォルニア州フレモント）によって調製した。６ミリグラムのｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨを１．５ｍｌ脱イオン化メタノールと混合し、そしてジイソプロピルエタノールアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて、ｐＨ７．０に調整した。
【００５１】
[00065]Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（イリノイ州ロックフォード）からＧＭＢＳを購入した。１．２５ｍｇのＧＭＢＳを１．５ｍｌ脱イオン化メタノールと混合した。
【００５２】
[00066]１．５ｍｌのｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−メタノールおよび１．５ｍｌのＧＭＢＳ−メタノールを、キャップ付血清ボトル中で一緒に混合し、そしてＤＩＰＥＡを用いてｐＨ７．０に調整した。金属キャップを用いて血清ボトルを密封した。溶液を脱気し、そして窒素で４回パージした。血清ボトルをアルミニウムホイルで覆い、そして反応を攪拌しながら室温で９０分間進行させた。
【００５３】
[00067]生じたｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳは、およそ１４２１ダルトンの分子量を有し、１分子のＧＭＢＳが１分子のｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨに結合したことが示された。これを質量分析によって確認した。
【００５４】
実施例４．  ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎｒＨ−ＧＭＢＳへのｒＰＡＰのコンジュゲート化。
[00068]実施例３の溶液を遠心分離蒸発装置で蒸発させた。ＴＣＥＰ・ＨＣｌ  Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を、コンジュゲート化緩衝液中に溶解され、再フォールディングされた組換えＰＡＰに、最終濃度０．０５ｍＭまで添加した。混合物を室温で１〜２時間インキュベーションした。インキュベーション後、コンジュゲート化緩衝液中に溶解され、再フォールディングされたｒＰＡＰを、ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ対ｒＰＡＰの比が２０：１であるように、乾燥させたｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳに直接添加した。Ｔｗｅｅｎ  ２０を最終濃度０．２５％まで添加した。必要であれば、１０ｍＭリン酸を用いて、ｐＨを７．３に調整し、そして反応を暗所中、室温（７０°Ｆ）でおよそ２〜３時間進行させた。
【００５５】
実施例５．  ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ｒＰＡＰの精製
[00069]コンジュゲート化後、コンジュゲート化反応後に残った過剰のｄＫ６を除去するために、１０ｍｌ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ１０カラムを用いて、ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ｒＰＡＰをサイズ排除クロマトグラフィーにさらに供した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に対して、タンパク質溶液を透析した。緩衝液のｐＨは、６．８〜８．５の範囲を有した。透析後、溶液を１６０００ｘｇで１５分間遠心分離し、そして上清を陽イオン交換樹脂上に置いた。次いで、カラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で、タンパク質を溶出させた。
【００５６】
実施例６．  受容体結合アッセイ
[00070]実施例５の精製され、再フォールディングされたｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ｒＰＡＰを、競合的ラジオイムノ受容体結合アッセイで用いた。ゴナドトロピン放出ホルモン受容体を有する精製下垂体膜をＩ１２５放射標識ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨに浸した。続いて、異なる濃度のｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−ｒＰＡＰを膜に添加し、膜を１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ、１％ＢＳＡで洗浄した。反応を４時間インキュベーションし、同じ緩衝液で希釈した。希釈後、試験管を４℃、１６０００ｘｇで１５分間遠心分離し、試験管をデカントし、そして放射能の減少を測定した。ｄ−ｌｙｓ６−ＧｎＲＨ−ＧＭＢＳ−植物由来成熟ＰＡＰに関して、同じ方法にしたがった。濃度を本実施例のついての表に記載する。
【００５７】
[00071]図６は本研究の結果を示す。天然ＰＡＰに基づくコンジュゲートおよびｒＰＡＰに基づくコンジュゲートは７０〜２００ｎＭ範囲のＩＣ５０を有する。ｒＰＡＰ単独では結合せず、そしてしたがって、濃度依存応答を示さない。
【００５８】
[00072]実施例６に関する表
【００５９】
【表２】
2011528230.tif 000003
【００６０】
実施例７．  ウサギ網状赤血球溶解物アッセイ
[00073]本実施例において、以下の材料を用いた：  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物系：  Ｌ４５４０；  Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ試薬：  Ｌ１４８３；  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｏｐｔｉｚｙｍｅ組換えＲＮアーゼ阻害剤：  ＢＰ３２２２−５；  ルミノメーター：  Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ−２０ｅ。すべての緩衝液および溶液を、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏで調製した。試験しようとする毒素および／または毒素緩衝液用に、希釈緩衝液を調製した［０．５ｍｌ〜１ｍｌの０．５Ｍストック（ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、希釈緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．５％フラクションＶ  ＢＳＡ）］。
【００６１】
[00074]プロトコルは以下の通りであった：
[00075]まず、０．５ｎＭの毒素／コンジュゲート希釈物を調製した。次いで、０．５ｎＭ（５００ｐＭ）ストックを用いて、１００μＬ連続希釈（各希釈に関して１：２．５）の毒素／コンジュゲートを調製した。以下の希釈物を調製した：  ２００ｐＭ；  ８０ｐＭ；  ３２ｐＭ；  １２．８ｐＭ；  ５．１２ｐＭ。
【００６２】
[00076]アッセイをセットアップするため、５００ｐＭから開始して、上述の希釈各々に関して、２．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏおよび２．５μＬの毒素／コンジュゲート希釈物を無菌０．６５ｍｌエッペンドルフ試験管に添加した。
【００６３】
[00077]以下の対照反応もまた調製した：希釈緩衝液：ＲＲ溶解物に関する陽性対照；  ０．５μＭ毒素／コンジュゲート：毒素／コンジュゲート活性に関する高濃度陽性対照。
【００６４】
[00078]溶解物を氷上で融解し、そして１７．５μＬの試験希釈物または対照を各試験管に氷上で添加し、そしてピペットで穏やかに混合した。次いで、溶解物／試験または対照を氷上で１５分間プレインキュベーションし、そして１５分間のプレインキュベーション期間後、２．５μｌの栄養プレミックスを添加した（アミノ酸（−ｌｕｅ）；  ４．２μＬ；アミノ酸（−ｍｅｔ）；  ４．２μＬ；  ２．５Ｍ  ＫＣｌ  １１．７６μＬ；  ＲＮＡｓｉｎ  ８．４μＬ；  ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ  １０．９２μＬ；ルシフェラーゼｍＲＮＡ  ２．５２μＬ；総体積４２μＬまで）。１５分間のプレインキュベーション期間中、ｍＲＮＡをプレミックスに添加する。各反応試験管の総体積は２５μＬであった。
【００６５】
[00079]各反応試験管の内容物をピペットで穏やかに混合し、そして３０℃水槽中で９０分間インキュベーションした。５０μＬの融解した室温のルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）のアリコットを、ルミノメーター試験管（３つ組）内に移し、そして１μＬの反応試験管内容物をルミノメーター試験管に添加した。ルミノメーターで明度を計測した。各毒素／コンジュゲート希釈シリーズに関する最高カウントのパーセンテージに対して、濃度の対数をプロットした。各試料に関して、グラフからＩＣ５０を決定した。図５は、本実施例にしたがったデータから産生したグラフである。
【００６６】
実施例８．  大腸菌に対する成熟ｒＰＡＰの毒性
[00080]植物由来成熟ＰＡＰの成熟型と同じ構造を有するＰＡＰの組換え型の生物学的活性を調べるため、４つの成熟ＰＡＰコード配列のうちの１つの上流にＴ７プロモーターを含有するｐＥＴ３ａ発現プラスミド（各プラスミドは、植物由来ＰＡＰの翻訳後修飾型と同一のｒＰＡＰの成熟型をコードするＤＮＡ配列を含有する：クローン１−４．１、１−４．２、１−４．３、および１−４．４）を、アラビノース・プロモーター（ＡｒａＤ）の調節下のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを有する大腸菌ＢＬ２１（ＡＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）に形質転換した。細胞を振盪しながら、グルコースおよびアンピシリンを含有する最少培地中、３７℃でおよそ１２時間（一晩）増殖させた。朝、細胞をルリアブロスに移した。全長クローン（３．２）に関して、同じプロセスにしたがった。２時間増殖させた後、アラビノースを最終濃度０．２％に、そしてイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを１ｍＭの濃度に添加することによって、プラスミドを宿する細胞を誘導した。その後、３時間に渡って１時間ごとにＡ６００を測定した。結果を実施例８についての表に示す。
【００６７】
[00081]実施例８についての表
【００６８】
【表３】
2011528230.tif 000004
【００６９】
実施例９．  特定の発現条件下での全長ｒＰＡＰの毒性
[00082]２つの異なる単離体およびｒＰＡＰ挿入物を含まないプラスミドを宿する対照由来の単一コロニーを、各々、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリアブロス培地内に接種した。次いで、３つの培養物を振盪しながら、３７℃でおよそ１８時間（一晩）増殖させた。各増殖培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンの存在下で、新鮮なルリアブロス培地内に１：２５で希釈し、そして振盪しながら３７℃で２時間増殖させた。
【００７０】
[00083]結果は以下の通りであった：
【００７１】
【表４】
2011528230.tif 000005
【図１】
2011528230.tif 000006
【図２】
2011528230.tif 000007
【図６】
2011528230.tif 000008
【図７】
2011528230.tif 000009
【図８】
2011528230.tif 000010
【図９】
2011528230.tif 000011
【図１０】
2011528230.tif 000012
【図１１】
2011528230.tif 000013
【図３】
2011528230.tif 000014
【図４】
2011528230.tif 000015
【図５】
2011528230.tif 000016
【国際調査報告】
2011528230.tif 000017
2011528230.tif 000018
2011528230.tif 000019
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