(57)【要約】  本発明は、一般に、コハク酸塩などの代謝生成物を高濃度で生産するための新しい培養法に関する。本培養法は、バイオマスを増加させるためのｐＨ調節を行わない富酸素培養、酸素分圧＜５％の貧酸素条件下における順応、および無酸素条件下におけるコハク酸の高濃度の産生を使用する。本方法は単一のリアクター内で行うことができ、効率的なスケールアップが容易である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のリアクター内で微生物を培養して代謝物を製造する方法であって、次の工程：
ａ）代謝物の産生が可能な微生物をリアクター内の培地に接種する工程、
ｂ）前記リアクター内で、前記培地のｐＨを調節しながら、または調節せずに、好ましくは前記培地のｐＨを調節しながら、富酸素条件下、前記微生物を培養する工程、
ｃ）前記リアクター内で、酸素５％未満の貧酸素条件に前記微生物を順応させる工程、
ｄ）ＣＯ２または不活性ガスと混合したＣＯ２でパージすることにより、前記リアクター内を無酸素条件に変える工程、および
ｅ）前記代謝物を産生するのに十分な期間、前記微生物を前記無酸素条件下で培養する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記代謝物が、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸、グリセロール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールからなる群より選択され、好ましくはコハク酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、同量の利用可能なＮＡＤＨに対して野生型株より多量にコハク酸塩を産生するように遺伝子が組換えられた組換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、不活性化されたａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ａｃｋ−ｐｔａおよび／またはｉｃｌＲ遺伝子を有し、かつ、過剰発現したｐｙｃ遺伝子を有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、遺伝子型ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δａｃｋｐｔａ  ＰＹＣ、またはΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δａｃｋ  ＰＹＣもしくはΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｔａ  ＰＹＣを有する請求項４に記載の方法。
【請求項７】
微生物がＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３である請求項４に記載の方法。
【請求項８】
培地がミネラル培地であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）または工程ｅ）で少なくとも１回の追加炭素の添加を行うことを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記順応工程で培地のｐＨが約７未満の値に低下したときに追加の炭素を加えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培地のｐＨが約７．２に上昇したときに工程ｄ）を実施することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が少なくとも２時間、貧酸素条件下に置かれたとき、工程ｄ）を実施することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｔ＝０で培地に加えられた炭素源の大部分が、工程ｂ）で前記微生物により消費された後、工程ｃ）を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物により６００ｎｍの吸光度が１５超になったときに前記順応工程を開始することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）〜ｅ）を１つの発酵槽で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｅ）の終了時に、培地に存在するコハク酸塩イオンを酸性化して、コハク酸に変換する工程ｆ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
該当なし。
【背景技術】
【０００２】
嫌気的発酵および好気的呼吸は、化学製品の工業的製造にとって興味深い２つの代謝様式である。富酸素呼吸では、非常に効率的に細胞が成長（成長速度および収率）し、炭素源が高い割合で二酸化炭素および細胞に変換される（表１参照）。他方、嫌気的発酵では、細胞成長が遅く、数種の発酵生成物が高収率で合成される（例えば、乳酸塩、ギ酸塩、エタノール、酢酸塩、コハク酸塩など）。
【０００３】
【表１】
2011507541.tif 000002
【０００４】
しかしながら、富酸素プロセスによる化学製品の製造は、嫌気的方法の使用に較べて２つの理由でよりコストがかかる。第１に、好気的発酵槽は、１基当たりのコストがより高いこと、およびスケールメリットに劣るより小型の発酵槽が必要であることにより、製作費がより高い。第２に、好気的発酵槽は稼働させるにも嫌気的発酵槽よりコストがかかる。これは酸素の溶解度が低いため、細胞へ適切な酸素を確実に供給しようとすると、多くのエネルギー入力を必要とするからである。このことは、発酵コストが製造コスト全体の５０〜９０％を占めるような汎用の化学製品の製造に特に関係する。
【０００５】
したがって、可能であれば、嫌気的方法が通常好ましく、一般的には、細胞を好気的に数多く成長させ、その後、所望の分子を産生するために細胞を嫌気的な培養へと切り替える。しかしながら、その方法が失敗し、収率や速度の低下を招くことも少なくない。
【０００６】
イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発酵から出発して、コハク酸などの数種の酸の混合物を製造することは、１９４９年に、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５７：ｐ．１４７−１５８で発表されたＪＬ．Ｓｔｏｋｅｓによる「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」というタイトルの論文に記載されているように、古くから知られている。しかしながら、そのＳｔｏｋｅｓの方法では、発酵グルコース１モルに対し、僅かに０．３〜０．４モルのコハク酸が生産されたにすぎない。
【０００７】
したがって、収率を高めるために、コハク酸の産生に必要なＮＡＤＨを消費する代謝経路を不活性化し、コハク酸塩（コハク酸の塩）を産生する代謝経路を活性化させるように、細菌の遺伝子組換えが行われてきた。実際、オキサロ酢酸からリンゴ酸塩へ、次いでフマル酸塩へ、そして最終的にコハク酸塩へと変換する発酵代謝経路は、産生されるコハク酸塩１モル当たり、２モルのＮＡＤＨを必要とする。したがって、コハク酸塩の産生に主に代謝の障害となるのは、ＮＡＤＨに対する細胞のバイオアベイラビリティである。
【０００８】
この問題を解決するために、米国特許第７２２３５６７号明細書には、同量の使用可能なＮＡＤＨに対してコハク酸塩を過剰に産生する組換えイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の使用が記載されている。このイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株「ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３」は、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ遺伝子（ＮＡＤＨを消費する経路に関与する）を不活性化し、ａｃｋ−ｐｔａ遺伝子およびｉｃｌＲ遺伝子（グリオキシル酸経路を活性化する）を不活性化し、かつ外来遺伝子ｐｙｃを過剰に発現するプラスミドベクターを含んでいる。
【０００９】
Ｓａｎｃｈｅｚらの論文（タイトル「Ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（２００５）ｐ．２２９−２３９）、並びに、米国特許第７２２３５６７号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０４２７３６号明細書では、それぞれ、コハク酸の産生収率を高めるために、この菌株についての新しい培養および産生条件を開発している。これらの特許は参照することによりその全体が本明細書に援用される。
【００１０】
Ｓａｎｃｈｅｚら、米国特許第７２２３５６７号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０４２７３６号明細書では、最大量のバイオマスを生産するため、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３を、まず、三角フラスコ中、好気的条件のＬＢ培地で培養し、バイオマスを遠心分離により濃縮し、その後、富栄養培地を有するバイオリアクターへ嫌気的条件下で移し、コハク酸を産生させる。これらの実験では、グルコース１モル当たりのコハク酸塩のモル収率は、米国特許出願公開第２００５／０４２７３６号明細書で１．２または１．３であったが、一般的には１．５未満であり、しかし、米国特許第７２２３５６７号明細書では１．７に達した。
【００１１】
しかしながら、これらの実験の培養条件は実験室規模で開発されたものであって、三角フラスコでの最初の培養工程と、濃縮バイオマスを回収するための遠心分離は、大量処理に容易に適合するものではないから、工業規模に置き換えることは困難である。さらに、コハク酸の収率およびこの菌株の速度をさらに増加させ、かつ、コハク酸塩の高収率が大規模処理でより再現性のあるものにすることが望まれるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
この分野で必要な技術は、コハク酸塩などの化合物の高収率かつ高速度の産生を可能にしながらも、スケールアップが容易で、かつコスト効率が良好な新規な培養法である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一般に、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、エタノール、グリセロール、プロパノール、ブタノールなどの代謝産物を高濃度で産生する微生物を培養する新しい方法に関する。本発明は、また、そのような化合物を製造する方法に関する。本明細書ではコハク酸塩について例証するが、本発明は微生物の培養に広く利用することができ、多様な最終生成物を得ることができる。
【００１４】
本発明者らは、好気的条件から嫌気的条件へと直接切り替えると、グルコース１モル当たりのコハク酸塩のモル収率が０．４〜０．８という非常に低いオーダーになることを見出した。しかしながら、細胞を、酸素は存在するもののその量は少ない貧酸素フェーズを通すことによって、徐々に嫌気的条件へと切り替えると、驚いたことに、細胞は極めて高いモル収率で産生し（１ランで１．６８）、より高い比速度でコハク酸塩を産生する（１ランで０．１１６ｇ／ｌ／ｈｒ／ＯＤ）。このように、新しい培養手順によれば、モル収率は１．５超、好ましくは１．６、さらには１．７にまでも向上し、さらに重要なことに、産生速度が増大する。さらに、系をより最適化するならば、グルコース１モル当たりコハク酸塩１．８、１．９または２モルにまで増加させることも可能である。このように、本方法は、先行技術の手順に較べてはるかに効率的で再現性に優れており、規模を大きく拡大させることができる。
【００１５】
多くの実験を重ねた結果、同じバイオリアクターの中で、細胞の成長とコハク酸塩の産生をともに高収率で、かつ高速で行わせる新規な培養法を開発した。工程は次の工程を含む。１）ｐＨの調節なしでの富酸素条件下での成長段階；２）貧酸素条件下での順応段階。通常、これは０．５時間よりも長く、数時間以上のこともある。３）富二酸化炭素環境の無酸素条件下での産生フェーズ。このフェーズでは炭素は随時補給される。
【００１６】
順応段階の重要性は、十分な量の酸素を常に供給した次の実験により示すことができる。この実験では、８００ＲＰＭの高速攪拌下で細胞を成長させ、二酸化炭素を反応槽に送入することにより直ちに嫌気的フェーズに切り替えた。この場合、溶存酸素は殆どの時間で６０％超であった（データは示さず）。順応を行わないと、本方法の成績は芳しくなかった。モル収率は予想値のおよそ１．６より低く、比速度は０．０６ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ未満であった。
【００１７】
【表２】
2011507541.tif 000003
【００１８】
攪拌速度を遅くした、したがって酸素が少ない別のランの結果を下に示す。この場合、溶存酸素が非常に低かったにもかかわらず（＜５％）、モル収率および比産生速度は極めて大きかった。モル収率は理論的最大収率の１．６に近く、比産生速度は０．１ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤを超えた。
【００１９】
【表３】
2011507541.tif 000004
【００２０】
「富酸素条件」は、酸素が、一般的には空気の形態で、存在すること（例えば、好気性）を特徴とする培養条件を意味する。好ましくは、発酵培地の酸素分圧はｔ＝０で６０〜１００％、または８０〜９０％である。富酸素条件下での微生物の培養には、培地を攪拌することが推奨されるが、バブリングや富酸素ヘッドガス（ｈｅａｄ  ｇａｓ）の使用など、十分な酸素供給を確実に行う他の手段も使用可能である。
【００２１】
「貧酸素条件」は、供給された酸素が微生物により完全に消費される培養条件を意味するが、系から酸素が排除されるものではなく、したがって、培地の酸素分圧（ｐＯ２）は＜５％、好ましくは＜２％、好ましくは０〜１％になる。順応ないし貧酸素条件は、多くの方法で達成することができる。これには、攪拌速度の変化（例えば、４〜５００ｒｐｍへの低下）、ガス流量もしくは注入ガス組成の変化、または、より多くのグルコースを添加することによる細胞密度の増加（したがって、酸素要求量の増加）、あるいは、これらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
順応は、富酸素条件下で十分な量の細胞が蓄積、例えば６００ｎｍでの吸収が約１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０、またはそれ以上を示すまで（すなわち、乾燥微生物で４ｇ／ｌ以上になるまで）蓄積した時点で開始することが好ましい。また、低酸素順応工程は、ｔ＝０において培地に供給された炭素源の殆どまたは全てが消費された後に行うことが好ましい。
【００２３】
細胞が低酸素に十分順応したところで、培養を無酸素条件へと切り替えるが、本明細書中に記載するように、その最適な時点を試験することができる。本明細書で使用した細胞、培地および培養法では、順応は約２時間で十分であり、ｐＨの上昇がこの条件下の順応の指標になった。
【００２４】
「無酸素条件」は、有意な酸素が存在しない、例えば嫌気的な培養条件を意味する。当業者であれば無酸素培養条件へ変化させる方法を知っているであろう。このように、標準の方法で、例えば、酸素を、一般に二酸化炭素ガスもしくは炭酸塩の形態の二酸化炭素、または他の不活性ガスと混合した二酸化炭素で置換することによって変化させることが可能である。
【００２５】
無酸素条件は、ＣＯ２を一般に二酸化炭素または炭酸塩の形態で永続的に供給することを特徴とする発酵操作において実現することが好ましい。本発明では、例えば、ＣＯ２を０．１〜０．５ｖｖｍ、好ましくは０．３ｖｖｍ（培地１体積および１分間当たりのＣＯ２体積）の速度でバイオリアクターに注入する。
【００２６】
「培地」は、前記微生物の成長に必要な化学成分と、好ましくは有基質の少なくとも１種の炭素源および１種の窒素源を含む培地を意味する。
【００２７】
培地は一般に以下のものを含む。
【００２８】
【表４】
2011507541.tif 000005
【００２９】
本発明の培地は、また、必要に応じて、抗生物質（例えばアンピシリン、カルベニシリンまたはオキサシリンなど）を、もし微生物が前記抗生物質に対する耐性遺伝子を、例えばプラスミドなどのベクター上に、または有機体のＤＮＡに統合された状態で有する場合には含有することができる。
【００３０】
グルコースまたはデンプンの加水分解物は炭素源の例として挙げられる。本発明においては、炭素源は、好ましくはグルコースであるが、微生物に利用可能な炭素源であればいずれも使用することができる。例えば、グリセロール、デキストロース、コーン副生物、および穀類もしくは草類またはそれらの副生物は全て炭素源の供給に使用することができる。
【００３１】
炭素源を含む培地組成の例を次に示す。
【００３２】
【表５】
2011507541.tif 000006
【００３３】
培地はミネラル培地であることが好ましい。「ミネラル培地」は、タンパク質を含まない、すなわち、ミネラル経路により窒素が供給され、溶解したミネラルと炭素源、好ましくはグルコースとを基本的に含む培地を意味する。
【００３４】
ミネラル培地の組成の例を次に示す。
【００３５】
【表６】
2011507541.tif 000007
【００３６】
「コハク酸産生微生物」は、その自然の代謝によって、または遺伝子操作の結果として、コハク酸を産生することができる全ての微生物を意味する。
【００３７】
微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌種であることが好ましい。本発明においては、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、自然の菌株より、多くのコハク酸を産生するように遺伝子を組換えた組換え菌株であることがより好ましい。
【００３８】
より一層好ましくは、遺伝子型がΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δａｃｋｐｔａ  ＰＹＣ、またはΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δａｃｋ  ＰＹＣもしくはΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｔａ  ＰＹＣの菌株である。この遺伝子型はＣＯ２存在下の発酵におけるコハク酸の産生を促進する。記号Δは、その遺伝子が、例えば突然変異、欠失、妨害、挿入、または、読み枠の変更、点突然変異などを引き起こす例えば終止コドンの導入、挿入もしくは欠失による「ダウン」−レギュレーションによって不活性化されていることを示す。
【００３９】
したがって、遺伝子型ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｉｃｌＲ  Δａｃｋｐｔａ  ＰＹＣは以下のものに対応する。
【００４０】
【表７】
2011507541.tif 000008
【００４１】
非常に好ましい実施態様では、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３株である。この菌株は、Ｓａｎｃｈｅｚら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（２００５）ｐ．２２９−２３９）、並びに、米国特許第７２２３５６７号明細書および米国特許出願公開第２００５／００４２７３６号明細書に記載されている。他の菌種としては、ＳＢＳ３３０ＭＧ、ＳＢＳ３３０ＭＧ、ＳＢＳ３３０ＭＧ、ＳＢＳ６６０ＭＧおよびＳＢＳ９９０ＭＧが挙げられる。
【００４２】
本発明の新規な方法で有利に使用することができる他のコハク酸産生菌株としては、次のものが挙げられる。
【００４３】
【表８】
2011507541.tif 000009
【００４４】
本明細書に記載されているカルボン酸は、構造、ｐＨ、存在するイオン、エステル化の有無に応じて、塩、酸、塩基または誘導体とすることができる。例えば、「コハク酸塩」と「コハク酸」という用語は、本明細書では交換して使用することができる。本明細書で使用される化学物質としては、ギ酸塩、グリオキシル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）、およびピルビル酸塩が挙げられる。クレブス回路（クエン酸回路、トリカルボン酸回路、またはＴＣＡ回路とも呼ばれる）などの細菌の代謝経路については、ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙや他の生化学の教科書に記載されている。
【００４５】
本明細書では、「低活性」は、タンパク質活性が適当な対照種に較べて少なくとも７５％低下していることと定義される。活性の低下が少なくとも８０、８５、９０、９５％であることが好ましく、最も好ましい実施態様では、活性は消滅ないし「不活性化」されている（１００％）。タンパク質は、阻害剤、突然変異、または発現ないし翻訳の抑制などにより不活性化することができる。
【００４６】
本明細書では、「過剰発現」または「過剰発現した」は、タンパク質活性が適当な対照種に較べて少なくとも１５０％であることと定義される。過剰発現は、阻害物質の除去や活性化物質の添加などにより、タンパク質を突然変異させて、より活性な形態、または阻害に耐性を有する形態を作り出すことにより、達成することができる。過剰発現は、また、リプレッサーの除去、遺伝子の多数コピーの細胞への添加、内在性遺伝子のアップレギュレーションなどによっても達成することができる。
【００４７】
「培養」は、所望の目標に到達するまでの期間、例えば０．５〜７２時間、５〜４８時間、より一層好ましくは８〜２４時間、前記微生物を培養することを意味する。順応工程は、少なくとも２時間が好ましいが、０．５〜５時間または１〜２時間の範囲でもよい。
【００４８】
最適な培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは３６〜３９℃付近であり、３７℃がより好ましい。微生物が異なれば最適温度も異なることもあり得、微生物の最適温度を決定する方法はよく知られている。
【００４９】
本発明の方法は少なくとも１つの追加工程―順応および／または産生段階の間の第２（またはそれより多く）の炭素源添加工程を含むことが好ましい。炭素原およびその量は最初の投与量と同じ、好ましくは２〜１０ｇ／Ｌのグルコースであることが好ましい。しかしながら、炭素源およびその量は異ならせることもできる。
【００５０】
前記微生物を植菌する前の培地のｐＨは約７〜約８、有利には約７．５で、ｐＨが約７未満の値に低下したときに、炭素の追加を行うことが好ましい。その後、ｐＨを再び約７超、有利には約７．２超の値まで上昇したところで、無酸素条件へ切り替える。
【００５１】
ｐＨが約７未満の値に減少することが観察されるのは、有機酸を産生するという現象と結びつけることができ、その後、その有機酸の一部が消費されるとｐＨは約７超の値に再び上昇し、これにより、細胞が十分に順応したことがわかる。
【００５２】
「ｐＨの調節」は、所与の期間にわたって培地のｐＨ値を維持することを意味する。本発明においては、ｐＨは様々な方法で調節することができる。１）ある期間にわたっての調節：ｐＨ値をある範囲に維持する。その場合、ｐＨ値は時間とともに変化するが、考えられる範囲から外れることはない。２）「低値」調節：ｐＨ値を閾値より上に維持する。その場合、ｐＨ値は時間とともに変化するが、閾値より下になることはない。３）単一値調節：ｐＨ値をその時間この値に一定に維持する。ｐＨを調節する場合、好ましくはＮａＯＨまたはＮＨ４ＯＨの添加により調節することが有利である。
【００５３】
本発明の他の一実施態様では、本発明の方法は、産生フェーズの終了時に、コハク酸へ転換するために、培地に存在するコハク酸塩イオンを酸性化する工程を含む。
【００５４】
本発明の他の態様は、本発明は、コハク酸を調製する方法、コハク酸を精製する工程、および場合によりコハク酸を結晶化する工程を含むことを特徴とするコハク酸の製造方法に関する。精製工程はバイポーラ膜電気透析を含み、結晶化工程は蒸発結晶化および／または水冷による結晶化によって行うことが有利である。
【００５５】
添付の図面の説明を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２の条件による、富酸素および無酸素フェーズにおける酸素分圧（ｐＯ２）（左軸目盛り）およびｐＨ（右軸目盛り）の変化を示す曲線。
【図２】実施例３の条件による、バイオマスの産生成績に及ぼす富酸素フェーズにおける撹拌効果（ＣＯ２下、１８時間培養後に測定）。
【図３】図３：実施例４の条件による、富酸素および無酸素フェーズにおける酸素分圧（ｐＯ２）、ｐＨ、および培地に加えたＮａＯＨ量の変化を示す曲線。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下の実施例は、本発明の方法の好ましい実施形態を記載したものであるが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１：ｐＨの制御
富酸素細胞成長過程におけるｐＨ制御の悪影響を次のデータにより示した。塩の補給を行うか、または行わず、５００ＲＰＭの低速撹拌とし、ｐＨを７．０に制御すると、コハク酸塩のモル収率は予想値のおよそ１．６より常に低い。
【００５９】
【表９】
2011507541.tif 000010
【００６０】
実施例２：コハク酸の産生
この実施例は、十分に植菌するために行った三角フラスコ中での予備培養フェーズ、富酸素条件下、富栄養培地、すなわち微生物が吸収し得る窒素源としてタンパク質およびペプチドを含む培地による培養フェーズを含む。このフェーズはバイオマスの生成し、貧酸素順応フェーズが続き、その後、コハク酸塩を実際に産生する無酸素産生フェーズが続く。富酸素、貧酸素および無酸素フェーズは同一の発酵槽で行い、本明細書での例示に使用した菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３であった。
【００６１】
この方法は、特に、富酸素フェーズ終了時に、バイオマスの遠心分離による濃縮を行わないことと、貧酸素フェーズを含むことにより、先行技術と区別される。
【００６２】
予備培養フェーズ：三角フラスコ中で、３７℃で１７時間、１２５ｒｐｍで撹拌しながら、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３を予備培養する。２つのバッフルを備えた２リットルの三角フラスコ中で、４００ｍｌの培地に菌株を植え付ける。この予備培養培地の組成は次の通りである。
【００６３】
富酸素および貧酸素フェーズ：こうして予備培養した菌株を、４リットルの発酵槽内の次の組成の培地に入れる。
【００６４】
【表１０】
2011507541.tif 000011
【００６５】
実施例３：増殖過程における酸素の影響
この実施例は、撹拌速度を変化させることにより酸素の影響を調べることを目的としている。ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３株によるコハク酸の産生を、ＣＯ２下、成長させずに行う。成長フェーズを、実施例２の「富酸素フェーズ」にしたがって富酸素条件下で予め実施しておく。ＣＯ２下、１８時間の撹拌の効果を図２に示す。
【００６６】
【表１１】
2011507541.tif 000012
【００６７】
三角フラスコで予備培養して得た接種物は、発酵槽内の培養培地の全体積の３％である。富酸素フェーズにおける培養条件は、温度３７℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、曝気量２．５ｖｖｍで、ｐＨの調節は行わない（ｐＨは単に培地の滅菌前に７．５に調節したのみ）。
【００６８】
酸素分圧（ｐＯ２）（左軸目盛）およびｐＨ（右軸目盛）を示す曲線を図１に示す。８時間の終わりに観察されたｐＨの第１ピーク（７．２）の間に、２ｇ／ｌのグルコースを加える（培地組成中、「＋２ｇ／ｌ（ｐＨの再度上昇後）」と表記）。グルコースのこの添加の後、ｐＨの７未満への低下が観察され、その９．５時間後にｐＨの第２ピーク（７．４）が観察される。
【００６９】
注目されるのは、微生物が増殖した結果、７．５時間から酸素分圧（ｐＯ２）が＜１％（貧酸素条件）に低下し、２時間そのままの状態にあることである。これは、培養終了時、２時間で、培地に供給した酸素が微生物によってほぼ完全に消費されたことを反映している。増殖のこのフェーズを、本明細書では「貧酸素フェーズ」と呼ぶ。
【００７０】
無酸素フェーズ：次に、酸素供給を０．３ｖｖｍのＣＯ２注入に切り替えることによって、菌株を、無酸素条件下、３７℃に置き、２５０ｒｐｍで攪拌する。培地のｐＨを、５ＭのＮａＯＨの１０Ｍ溶液によりｐＨ７に調節する。
【００７１】
次の化合物を培地に加える。
【００７２】
【表１２】
2011507541.tif 000013
【００７３】
最終結果は次の通りである。
【００７４】
【表１３】
2011507541.tif 000014
【００７５】
したがって、本発明の方法を実施することにより、最終フェーズで相当量のコハク酸を生産できることがわかる。
【００７６】
成績に及ぼすこのパラメータの影響が非常に大きいことがわかる。生産性および収率の最適値は４００〜５００ｒｐｍにあり、両者とも６００ｒｐｍでは大きく減少している。
【００７７】
したがって、酸素の移動は、コハク酸の産生に関与する代謝経路の誘導に対して、重要なパラメータとなる。１つの仮説として、細胞を低酸素に順応させるために、言い換えれば、無酸素フェーズ下で系から酸素が除去される前に非常に低酸素の貧酸素フェーズに順応させるために、富酸素フェーズの終了時に溶存酸素（ｐＯ２）が殆どないか全くないフェーズが誘導に必要であるということができよう。
【００７８】
実施例４：ｐＨ調節の影響
この実施例は予備培養フェーズ、富酸素条件下、富栄養培地（ミネラルに対するものとして）での培養フェーズ、貧酸素フェーズ、および、発酵により実際にコハク酸を産生する無酸素フェーズを含む。これらのフェーズは同一の発酵槽で行い、例示のために使用した菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３株である。
【００７９】
この実施例は、富酸素フェーズおよび無酸素フェーズでｐＨを６．７５の低値に調節していることが上と異なる主な点である。
【００８０】
予備培養フェーズ：実施例２を参照。
【００８１】
富酸素および貧酸素フェーズ：この方法で予備培養した菌株を１５リットルの発酵槽の実施例２の組成の培地に入れる。三角フラスコで予備培養して得た接種物は、発酵槽内の培養培地の全体積の３％である。富酸素フェーズにおける培養条件は、温度３７℃、撹拌速度４００ｒｐｍ、曝気量１ｖｖｍ、５ＮのＮａＯＨ溶液による６．７５の低値調節である。酸素分圧は２時間にわたって＜１％である（貧酸素フェーズ）。
【００８２】
酸素分圧（ｐＯ２）（左軸目盛）と、ｐＨ（右軸目盛）、およびｐＨをバランスさせるために使用したＮａＯＨの変化を示す曲線を図３に示す。７時間の終わりに観察されたｐＨの第１ピーク（７．２）の間に、２ｇ／ｌのグルコースを加える（培地組成中、「＋２ｇ／ｌ（ｐＨの再度上昇後）」と表記）。グルコースのこの添加の後、ｐＨの７未満への低下が観察され、その後８時間の終わりにｐＨの第２ピーク（７．６）が観察される。同時に、７時間から酸素分圧（ｐＯ２）は＜２％に低下する（貧酸素条件）。その後、８時間培養してから培養を無酸素フェーズに変える。
【００８３】
無酸素フェーズ：次に、酸素供給を０．２ｖｖｍのＣＯ２注入に切り替えることによって、菌株を、無酸素条件下、３７℃に置き、２５０ｒｐｍで攪拌する。培地のｐＨを、５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ６．７５の低値に調節する。無酸素条件下の培地にグルコースを２０ｇ／Ｌ加える。
【００８４】
結果は次の通りである。
【００８５】
【表１４】
2011507541.tif 000015
【００８６】
実施例５：ミネラル培地
本発明で開発された２つの培地を次表に示す。培地ＭＩＮ−Ｎは、水酸化アンモニウムによるｐＨの調節を行って使用するよう定義される。
【００８７】
【表１５】
2011507541.tif 000016
【００８８】
上に示した培地は、２０ｇ／ｌのグルコースと相俟って、１８時間にわたるＣＯ２下の無酸素フェーズで相当量（＞１５ｇ／ｌ）のコハク酸を十分に生産し得るだけのバイオマス（６００ｎｍの吸光度＞１５）を得ることを可能にする。
【００８９】
実施例６：ｐＨ調節を行うミネラル培地
コハク酸を得る別の方法は、上で開発された培地を使用し、予備培養フェーズ、発酵槽での二次培養フェーズ、バイオマスを生産する、富酸素条件下のミネラル培地での培養フェーズ、貧酸素フェーズ、および発酵により実際にコハク酸を産生する無酸素フェーズを含む。これらのフェーズは同一の発酵槽内で行い、例示のために使用した菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３である。
【００９０】
予備培養フェーズ：ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３株を、三角フラスコ中、３７℃で２４時間より短い時間、１２５ｒｐｍで穏やかに撹拌しながら、予備培養を行う。５００ｍｌの予備培養培地は、凍結チューブの接種物が植菌され、２リットルの三角フラスコに入れられる。
【００９１】
この予備培養培地の組成は次の通りである。
【００９２】
【表１６】
2011507541.tif 000017
【００９３】
二次培養フェーズ：この二次培養培地の組成は次の通りである。
【００９４】
【表１７】
2011507541.tif 000018
【００９５】
三角フラスコで予備培養して得られた接種物は、発酵槽内の培養培地の全体積の６％である。二次培養を、温度３７℃で、２０時間超の時間にわたって発酵槽内で行う。その間、酸素分圧を０％超とし、１ｖｖｍの曝気を行いながら、４５０ｒｐｍで撹拌する。培地のｐＨを、５Ｎのソーダ溶液により６．７５の低値に調節する。
【００９６】
富酸素および貧酸素フェーズ：この二次培養の後、菌株を、２０Ｌの発酵槽内の次の組成の培地に入れる。
【００９７】
【表１８】
2011507541.tif 000019
【００９８】
三角フラスコ中で予備培養して得られた接種物は、発酵槽内の培養培地の全体積の１３％である。曝気は１ｖｖｍに、温度は３７℃に維持し、培地のｐＨは５Ｎソーダ溶液により６．７５の低値に調節する。最初、４５０ｒｐｍで培地を撹拌することにより、酸素分圧を２０％超に維持する。
【００９９】
菌株により１０ｇ／ｌのグルコースが消費されたなら、撹拌を４００ｒｐｍに減速し、貧酸素条件（酸素分圧＜１％）に変える。
【０１００】
無酸素フェーズ：富酸素および貧酸素フェーズの後、酸素供給を０．２ｖｖｍのＣＯ２注入に切り替えることによって、菌株を、無酸素条件下、３７℃に置き、２５０ｒｐｍで攪拌する。培地のｐＨを、５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ６．７５に調節する。無酸素条件下の培地にグルコースを２０ｇ／Ｌ加える。
【０１０１】
１８時間の産生後の結果を下表にまとめる。
【０１０２】
【表１９】
2011507541.tif 000020
【０１０３】
産生に対する富酸素フェーズの３つの重要な因子の影響を検証するために、新しい手順を使用した。
【０１０４】
・使用した塩基（ＮａＯＨ／ＮＨ３）
・富酸素フェーズの終わりの貧酸素フェーズ（低酸素含有）の存在
・貧酸素フェーズの終わりのｐＨの再上昇（生成した酸の消費）
これら因子の組み合わせのそれぞれについて得られた結果を下表にまとめる（１８時間の産生後）―上で示した基本手順で得られた結果はこの表の３番目の行に示されている。
【０１０５】
【表２０】
2011507541.tif 000021
【０１０６】
これは、バイオマスの高い比生産性（＞０．０１ｇ／ｈ／ＯＤ）を得るには、貧酸素フェーズが必要であることを示している。好気的フェーズにおける最後のｐＨの上昇もまた、収率および比速度の両者にプラスの効果をもたらす（コハク酸の収率は産生フェーズで消費されたグルコースに対して計算され、ｇ／ｇ×１００で示される）。
【０１０７】
全体として、観察された影響は富栄養培地で得られたものと類似しており、本手順の正当性を立証するものである。
【０１０８】
貧酸素フェーズの影響：これらの試験によりこの因子の優位性が確認される。このフェーズは、コハク酸の産生を誘導するためには絶対的に必須である。貧酸素フェーズが存在しないと（太字で示した行を参照）、コハク酸収率はごく僅かな値にまで低下する。
【０１０９】
ＮＨ３／ＮａおよびｐＨ操作の影響：富酸素フェーズの終了時に、ソーダベースの培地に対して再度ｐＨを上昇させることは、バイオマスの活性および収率（９２％）に明らかな改善をもたらす。
【０１１０】
水酸化アンモニウムを使用すると、産生フェーズにおける成長およびグルコースの比消費速度に一定の改善をもたらす。
【０１１１】
実施例７：ｐＨ調節をしないコーンベースの培地
この実施例は、予備培養フェーズ、コーンスティープを窒素源とし、グルコースを炭素源として含む培地中での富酸素条件下の培養フェーズ（このフェーズはバイオマスの生産を行う）、貧酸素フェーズおよび実際にコハク酸の産生を行う無酸素フェーズを含む。例示のために使用した菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３株である。
【０１１２】
予備培養フェーズ：実施例２を参照。
【０１１３】
富酸素および貧酸素フェーズ：予備培養の後、４００ｒｐｍで攪拌している４Ｌの発酵槽内の次の組成の培地に菌株を置く。
【０１１４】
【表２１】
2011507541.tif 000022
【０１１５】
無酸素フェーズ：次に、酸素供給を０．３ｖｖｍのＣＯ２注入に切り替えることによって、菌株を、無酸素条件下、３７℃に置き、２５０ｒｐｍで攪拌する。培地のｐＨを、５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ６．４に調節する。無酸素条件下の培地にグルコースを２０ｇ／Ｌ加える。２４時間の無酸素条件下での培養の後、グルコースを１５ｇ／ｌ加え、４８時間後に４ｇ／ｌ加える。
【０１１６】
得られた結果は次の通りである。
【０１１７】
【表２２】
2011507541.tif 000023
【図１】
2011507541.tif 000024
【図２】
2011507541.tif 000025
【図３】
2011507541.tif 000026
【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年7月8日(2010.7.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2011507541.tif 000027
【図２】
2011507541.tif 000028
【図３】
2011507541.tif 000029
【国際調査報告】
2011507541.tif 000030
2011507541.tif 000031
2011507541.tif 000032