(57)【要約】  生物医学用製造物における使用のために好適であるダイズ系生体材料を製造する方法である。この方法は、ダイズ粉を、溶媒抽出を行う前または同時かのどちらかで脱脂し、様々な量のダイズのタンパク質、炭水化物およびイソフラボンを含む生体材料を製造する工程、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物医学用製造物における使用のために好適であるダイズ系生体材料を製造する方法であって、
ダイズ粉を、溶媒抽出を行う前または同時かのどちらかで脱脂し、様々な量のダイズのタンパク質、炭水化物およびイソフラボンを含む生体材料を製造する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
溶媒抽出が、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンおよび水またはそれらの混合物を含む溶媒系を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶媒抽出が、２時間〜４時間にわたって３０℃〜５０℃の温度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
架橋剤を導入する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
生体材料における炭水化物の量を制御する目的のための透析の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
熱硬化工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１種以上の生物活性ペプチドで生体材料を機能化する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ダイズ系生体材料がヒドロゲルの形である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ダイズ系生体材料を１種以上の天然または合成の生体適合性の生体材料とともにブレンドするか、または相互貫入するか、またはグラフト化するか、または、そうでなければ組み合わせて、生分解性または生体安定性の複合材料を形成する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって製造されたダイズ系生体材料。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって製造されたダイズ系生体材料の生物医学用製造物における使用。
【請求項１２】
ダイズ系生体材料がヒドロゲルの形である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ヒドロゲルは注入可能な形態である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
生物医学用製造物が、創傷包帯、組織工学のための足場、手術に使用するための充填剤またはインプラント、歯科手技または外科手技における使用のための、あるいは手術後の組織接着を防止するための一時的バリア、薬物、生物活性ペプチドまたはプラスミドを送達するためのキャリア、抗炎症性作用因、創傷包帯のための、あるいは歯科、内科、外科または獣医科デバイスまたはインプラントのための被覆材、または皮膚あるいは歯肉の炎症を緩和するための組成物である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって製造されたダイズ系生体材料を含む生物医学用製造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイズ系（ｓｏｙｂｅａｎ−ｂａｓｅｄ）生体材料を製造するための方法に関連する。得られる生体材料は様々な生物医学用途を有しており、そのイソフラボン含有量のために特に望ましい。
【背景技術】
【０００２】
当業者によって理解されるように、生体材料は、生物学的システムと相互作用するために意図される医療デバイス（例えば、インプラントなど）において使用される非生命材料である。再生医療の将来は、（ｉ）組織再生プロセスに介入し、生理学的形態学を示す新しい組織の形成を高めることができ、かつ、（ｉｉ）新しく形成された組織に対して空間を残して最終的には分解することができる新規な生体材料が入手可能であるかに密接に依存する。入手可能な生体材料はどれも、非常に高価で、かつ、不安定な様々な増殖因子が材料原体に取り込まれ、それらの制御された送達が最適化される場合を除いて、または、幹細胞および分化した細胞が被包される場合を除いて、これらの目的を実現することができない（１、２）。
【０００３】
軟組織（例えば、血管および皮膚）、ならびに、硬組織（すなわち、骨および軟骨）の再生が今までのところは、新しい組織を傷害部位において内側に成長させるための足場を提供することができる合成または天然のポリマーおよびセラミックスの使用によって追求されている（２、３および４）。しかしながら、現在入手可能な生体材料は、組織再生プロセスの主要な段階に対して、すなわち、（ｉ）凝固カスケード、（ｉｉ）炎症性応答、（ｉｉｉ）組織細胞分化、および、（ｉｖ）新しい細胞外マトリックスの合成である段階に対して選択的に作用することができない。
【０００４】
加えて、インプラントの存在は、宿主組織によって異物として認識された場合、通常的には炎症性応答を誘発する（５）。この異物応答の結果として、（ｉ）永続的なインプラントは成長途中の組織と必ずしも完全には一体化されずに、線維性被膜によって被包され、また、（ｉｉ）一時的なインプラントの生分解／生物再吸収速度が影響を受け、新しい組織の成長速度と同調していないことがある。後者が、食品医薬品局によって承認された生分解性の生体材料に関して、例えば、ポリ（乳酸／グリコール酸）（ＰＧＬＡ）の様々な配合物などに関して当てはまる（６）。例えば、骨に適用する場合、ＰＧＬＡの分解が比較的遅いことで、組織再生が遅れる（７）。分解時間が、一部のＰＧＬＡ配合物の場合のように短くなる場合でさえ、インプラントのまわりに形成される骨の形態学は、組織再生の変化した機構を示唆する非生理学的な特徴（すなわち、海綿骨の代わりに皮質骨）を示す（７）。これらの材料の埋め込みの後で認められる非生理学的な治癒はまた、材料表面の物理化学的性質によって誘発される炎症性応答、および、ＰＬＧＡの場合には分解産物の結果であると考えられている（８）。
【０００５】
セラミックス、例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸カルシウム（ＣａＰ）セメントおよび生体ガラスなどもまた、主に骨再生に適用するために開発されている。生分解性ではないが、これらの材料は、高い骨一体化能を示している（９、１０）。ＨＡおよびＣａＰセメントの場合には、骨一体化能が、骨細胞（すなわち、骨芽細胞）による表面でのコロニー形成を可能にする材料の細胞基質特性によって生じているようである（１１）。
【０００６】
生体ガラスの場合には、ある程度の生物活性は、分解途中の材料からの元素（例えば、ケイ素）の放出か、または、生体ガラス分解時に境界で形成されるゲル環境における増殖因子の捕捉および濃縮によるものであると考えられている（１２）。
【０００７】
しかしながら、これらのセラミックス材料の性能は、それらの脆弱性と展性の無さから、特定の適用に対してだけ限定される。モノリシック型セラミックスは、埋め込み手技時において取り扱いが困難であり、一方、セラミックス被覆物は、機械的負荷がかかっているもとでは剥離する（９、１３）。
【０００８】
タンパク質組成または多糖組成の天然ポリマー、例えば、コラーゲン、アガロース、アルギン酸塩、キトサン、フィブリン糊、絹フィブロイン、ヒアルロン酸およびカルボキシメチルセルロースなどもまた、生分解性の生体材料として使用され、それらの一部は、止血性を有すること、および、細胞接着を支援することが示されている（１４、１５および１６）。フィブリン糊、ヒアルロン酸およびコラーゲンは再生途中の組織の天然成分であり、生物医学におけるそれらの成績が明らかにされている（１４）。しかしながら、生体材料としてのそれらの使用に関しての問題が、抗原になり得るそれらの潜在的可能性、伝染性疾患の危険性、および、比較的高い製造コストによって生じている。骨充填剤の具体的な場合には、伝染性疾患の危険性がまた、骨の同種移植片の使用に関連し、一方、自家移植片は、骨を得るための異なる部位において行われ、かつ、入手可能な量において限界がある、患者に対する別の手術を引き起こす。
【０００９】
ダイズ系生体材料の使用もまた提案されている（１７、１８）。研究が、ダイズタンパク質のヒドロゲル、フィルム、膜および繊維をダイズタンパク質分画物から製造することに向けられている（１８）。非常に展性ではあるが、このタイプの生体材料は、他の天然の生分解性ポリマーと同じ制限（主に、抗原になり得る潜在的可能性、および、制御されない（調整できない）分解速度）に悩まされる（１９）。さらに、それらは、免疫担当細胞および組織細胞（例えば、骨芽細胞および破骨細胞など）の両方に対する立証された生物活性を有するイソフラボン画分を含まない（２０、２１）。骨粗鬆症における骨喪失を、破骨細胞の酸性活性を阻害することによって低下させるための医薬剤としてのゲニステイン（ダイズイソフラボンの１つ）の使用を包含する特許が出願されている（２１）。
【００１０】
これらの理由のために、より近年では、新しい種類のダイズ系生体材料が、ダイズ成分のすべて（タンパク質、炭水化物、ミネラルおよびイソフラボン）を含む脱脂されたダイズカードを使用して開発されている（２２）。この種類の生体材料は、モノリシック物として、または、他の従来の生体材料との組合せでのどちらかで、フィルム、膜および顆粒として配合され得る。その上、この新しい種類のダイズ系生体材料およびその分解産物は、生物医学的適用のために好適な多くの性質を示しており、それらには、（ｉ）炎症性応答を抑制すること、（ｉｉ）制御された（調整可能な）分解速度を有すること、（ｉｉｉ）細胞活動を促進させること、および、（ｉｖ）リン酸カルシウム鉱物相の沈着を誘導することが含まれる（２２）。
【００１１】
ダイズタンパク質系生体材料は、ヒドロゲル、フィルムおよび繊維の形態で処理されているが、それらは、組織細胞に対するダイズイソフラボンの認識されている生物活性を欠いている。逆に、脱脂されたダイズカードに由来する生体材料から得られるダイズ系生体材料は今までのところ、例えば、注入による埋め込みのために好適な軟らかいヒドロゲルの形態では配合されていない。加えて、それらの製造方法は、カードを事前に調製することに依存しており、また、その量を変更することが不可能である天然のダイズイソフラボン含有量に頼っている。
【００１２】
イソフラボンが多いダイズタンパク質濃縮物の抽出を示す様々な方法が発表されている（２３）。これらの方法は食品産業目的のためにだけ最適化されており、生物医学的適用のための生物活性なヒドロゲルの調製には焦点が当てられていない。さらに、タンパク質画分および炭水化物画分を、生体材料が製造されるダイズ粉およびダイズカードの調整されたイソフラボン含有量と一緒に共抽出することに関しては、何ら研究が行われていない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明によれば、生物医学用製造物における使用のために好適であるダイズ系生体材料を製造する方法が提供され、この場合、この方法は、
様々な量のダイズのタンパク質、炭水化物およびイソフラボンを含む生体材料を製造するために、
ダイズ粉を、溶媒抽出を行う前または同時かのどちらかで脱脂する工程、
を含む。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、上記の方法によって製造されるダイズ系生体材料に関連する。例えば、そのような生体材料は、フィルム、膜、顆粒、ヒドロゲルおよびペーストの形態であり得る。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、上記の方法によって製造されるダイズ系生体材料の、生物医学用製造物における使用、および、そのような製造物自体に関連する。当業者によって理解されるように、生物医学用製造物は、組織修復処置、手術および組織再生における使用のために意図される医療用の製造物またはデバイスである。それらには、食品製造物は含まれない。
【００１６】
上記で議論された以前から知られている技術とは対照的に、本発明の方法は、ダイズ系生体材料が、脱脂されたダイズ粉から直接調製されることを可能にする。この方法は効率的であり、また、最も重要なことではあるが、所定の組成または制御可能な（調整された、または、調整可能な）組成を有する生体材料の製造をもたらす。例えば、本発明の生体材料に含有されるイソフラボンおよび／または他の成分の量を、特定の製造物の意図された使用領域のために最も好適であるように事前に決定することができるか、または制御することができる。
【００１７】
本発明の方法は、ダイズ系生体材料をダイズ粉から抽出する工程を伴う。本発明の方法は、ダイズ粉に存在するタイズのタンパク質、炭水化物およびイソフラボンの量が保たれる（または、所望されるように変化させられる）ことを可能にする。このことは、ダイズのタンパク質を保持することに集中するが、炭水化物およびイソフラボンを失う以前の取り組みとは対照的である。これらの成分の３つすべての量および割合が変化させられるか、または調節されることを可能にする方法を提供することによって、本発明は、生体材料の物理的特性および化学的特性、同様にまた、その生物活性、ならびに、結果として、得られる生物医学用製造物の性質を制御することを可能にする。
【００１８】
得られる生体材料は、モノリシック物として、あるいは、得られる生体材料自体の中での組合せ、または、ブレンド配合物、相互貫入ポリマー網目物および被覆物の形態での、他の従来からのポリマー材料、セラミックス材料および金属材料との組合せで使用することができる。得られる生体材料は、
（ｉ）トランスグルタミナーゼ酵素のための基質として作用するダイズタンパク質の知られている能力に基づいて血餅の形成に関与し（２４、２５）、
（ｉｉ）コラーゲンの合成を線維芽細胞および骨芽細胞において誘導し、
（ｉｉｉ）骨芽細胞の石灰化を誘導し、かつ、
（ｉｖ）破骨細胞の活性を阻害するので、
生物活性である。
【００１９】
それらの様々な適用には、例えば、組織欠損充填剤；創傷包帯；骨、皮膚および神経の再生のための足場およびガイド；歯科手技または外科手技における使用のための、あるいは、手術後の組織接着を防止するための一時的バリア；抗炎症性作用因；薬物、生物活性ペプチドまたはプラスミドを送達するためのキャリア；ポリマーおよび金属の整形外科インプラント、神経学インプラント、婦人科インプラント、泌尿器科インプラント、頭蓋顔面インプラント、歯科インプラントおよび心臓血管インプラントのための生物活性な被覆材、ならびに、生体糊としての生物活性な被覆材が含まれる。本発明の生体材料はまた、炎症を起こした歯肉および皮膚を処置するために好適な炎症緩和物にするために、種々の配合物で調製することができるか、または、水溶液に溶解することができる。これらの配合物のすべてが臨床適用および獣医適用において使用され得る。
【００２０】
本発明の方法における溶媒抽出工程は、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンおよび水またはそれらの混合物を含む溶媒系を使用して行うことができる。溶媒抽出工程は典型的には、２時間〜４時間にわたって、かつ、３０℃〜５０℃の温度で行われる。本発明の方法は、必ずしも必要としないが、下記のさらなる工程の１つ以上を含むことができる：
ｉ）架橋剤を導入する工程；
ｉｉ）生体材料における炭水化物の量を制御する目的のための透析；
ｉｉｉ）熱硬化する工程；
ｉｖ）生分解性または生体安定性の複合材料を形成するために、ダイズ系生体材料を１種以上の天然または合成の生体適合性の生体材料とともにブレンドするか、または相互貫入するか、またはグラフト化するか、または、そうでなければ組み合わせること。
【００２１】
工程ｉｖ）は、生体材料がヒドロゲルの形態であるときには重要な選択肢であることが理解される。１つの実施形態において、ヒドロゲルは注入可能な形態である。
【００２２】
次に、本発明が、下記の実施例（実施例１は、続く実施例において使用される脱脂プロセスを記載する）によって、また、添付されている図面を参照してさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】ダイズ系生体材料のＦＴ−ＩＲ：（ａ）ダイズ粉。
【図１ｂ】ダイズ系生体材料のＦＴ−ＩＲ：（ｂ）脱脂されたダイズ粉。
【図１ｃ】ダイズ系生体材料のＦＴ−ＩＲ：（ｃ）脱脂および熱硬化が行われたダイズ生体材料。
【００２４】
【図２】凍結乾燥された抽出ダイズゲルのＦＴ−ＩＲ。
【００２５】
【図３】典型的なダイズ系ゲルのＨＰＬＣ測定されたイソフラボン量：（ａ）グリコシル化イソフラボン、（ｂ）非グリコシル化イソフラボン。
【００２６】
【図４】典型的なダイズ系ヒドロゲル；（ａ）非架橋ゲル、（ｂ）生体糊を形成するゲニピン架橋されたゲル。
【００２７】
【図５】０．１Ｍの架橋剤濃度におけるダイズ系ヒドロゲルのレオロジー性質：（ａ）貯蔵弾性率Ｇ’、（ｂ）粘性係数Ｇ”。
【００２８】
【図６】０．１Ｍの架橋剤濃度におけるダイズ系ヒドロゲルについての粘度測定。
【００２９】
【図７】異なる抽出条件から得られるダイズ系ヒドロゲルの収量。
【００３０】
【図８ａ−ｂ】異なる抽出条件から得られるダイズ系ヒドロゲルのＨＰＬＣ測定されたイソフラボン量：（ａ）ダイジン、（ｂ）ダイゼイン。
【図８ｃ−ｄ】異なる抽出条件から得られるダイズ系ヒドロゲルのＨＰＬＣ測定されたイソフラボン量：（ｃ）ゲニスチン、（ｄ）ゲニステイン。
【００３１】
【図９】ダイズ系ヒドロゲルと、他の従来の生体材料とのブレンド配合物のＳＥＭ：（ａ）ダイズゲル／ダイズ顆粒／キサンタンガムの目視検査、（ｂ）ダイズゲル／ダイズ顆粒／キサンタンガムのＳＥＭ分析、（ｃ）ダイズゲル／ナノ結晶ヒドロキシアパタイト、（ｄ）ダイズゲル／ヒドロキシアパタイトビーズ。
【００３２】
【図１０】ダイズ系生体材料からの典型的なＨＰＬＣ測定されたイソフラボン放出。凡例は、試験された種々のブレンド配合物におけるキサンタンガム／ダイズ顆粒／ダイズヒドロゲルの比率を示す。
【００３３】
【図１１】創傷包帯または骨充填剤として使用される典型的なダイズゲル配合物（注入可能物）。
【００３４】
【図１２】細胞分化のダイズ系生体材料での典型的な誘導：（ａ）１日の培養の後でのコントロール線維芽細胞のコラーゲン染色、（ｂ）１日の培養の後での、ダイズ系生体材料により処理された線維芽細胞のコラーゲン染色、（ｃ）２日の培養の後でのコントロール骨芽細胞のカルシウム染色、（ｄ）２日の培養の後での、ダイズ系生体材料により処理された骨芽細胞のカルシウム染色。
【００３５】
【図１３】血餅におけるダイズ系生体材料の一体化：（ａ）２つの異なる配合物の目視検査、（ｂ）光学顕微鏡観察。
【００３６】
【図１４】破骨細胞の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに対するダイズ系生体材料の阻害作用：（ａ）コントロールの破骨細胞、（ｂ）ダイズ系生体材料により処理された破骨細胞。矢印は破骨細胞を示す。
【００３７】
【図１５】生物医学用デバイス（心臓血管ステント）のまわりでの典型的なダイズ系生体材料被覆の後方散乱ＳＥＭ：（ａ）被覆された心臓血管ステント、（ｂ）ダイズゲルで被覆された心臓血管ステントの表面形態学、（ｃ）被覆されていない心臓血管ステントの表面形態学。
【実施例】
【００３８】
実施例１−脱脂されたダイズ粉からの生体材料調製の方法
方法
ダイズ粉を凍結乾燥して、水分含有量を除いた。ダイズ粉を、食品産業において通常用いられる方法に従って脱脂した（２６、２７）。簡単に記載すると、凍結乾燥された粉を、４５度の角度および２００ｒｐｍでの振とうインキュベーターにおいて、３０℃で４時間、ヘキサン（１：５の比率）に懸濁して、溶媒／粉を効果的に混合した。懸濁物をインキュベーターから取り出し、冷却し、１０分間〜１５分間沈降させた。粉が沈降したら、ヘキサン画分を捨て、新鮮なヘキサンを加え、粉を再懸濁し、１０分間〜１５分間沈降させた。このヘキサン洗浄を３回繰り返して、いかなる脂質の痕跡をも除き、脱脂された粉を室温で４８時間乾燥させた。脂質抽出を比重測定法で評価し、これに対して、イソフラボン含有量をＨＰＬＣによって評価した。ＨＰＬＣを、ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（３μｍ）ガードカラムを備えるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）−１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ（３μｍの粒子サイズ）カラムを使用して行った。ヒーターを２５℃で設定した。クロマトグラフィーを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ２００ｌｃ二成分勾配によって送液される二成分勾配（溶媒Ａ：脱イオン水および０．１％酢酸、溶媒Ｂ：アセトニトリルおよび０．１％酢酸）からなる移動相において行った：ポンプが、溶媒Ａ／溶媒Ｂの混合物を下記の条件で送達するようにプログラム化された：１０／９０（０分）−１５／８５（０．１分）−２０／８０（４分）−４０／６０（９分）−６０／４０（０．１分）、６０／４０で保持（４分）。総実行時間−１７．２分。溶出イソフラボンを２６２ｎｍにおいてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−６Ａ  ＵＶ検出器によって検出した（２．５６ＡＵＦＳ、高速応答）。クロマトグラムを、４ｍｍ／分の速度で、かつ、面積およびベースライン／積分のプリント（チャート上でのＲＴなし）を含めて、１５０μＶ／分の傾き、μＶ  １０／分のドリフト、５０μＶ分のピーク面積、０の減衰によりプログラム化されたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｃ−Ｒ５Ａ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ積分装置／チャートレコーダーによって得た。サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ７１７＋を２５０μｌの挿入物による９６シェルバイアル回転ラックオートサンプラーとともに使用する自動サンプリングによって注入した。回転ラックは、１０μｌの注入体積、２５℃の注入温度、２１分の分析および３．５分のレポートによりプログラム化された。ベースラインの安定性を確実にするために、総実行時間は２４．５分であった。
【００３９】
ダイズ系生体材料を、脱脂された粉を６０℃で一晩熱硬化することによって、事前のカード調製を行うことなく得た。この方法によって、種々の形状、サイズおよび多孔性の顆粒、フィルム、膜およびブロックの形態での生体材料を得ることができる。
【００４０】
結果
用いられた従来の抽出方法では、文献において報告されるように１８％のダイズ脂質成分に対応する１グラムのダイズあたり０．１７５ｇのダイズ脂質の除去が保証された。抽出後の主要なダイズイソフラボンの含有量はゲニスチンの最小限の除去（０．７ｍｇ／ｇダイズ粉）のみを示し、それ以外のイソフラボン（例えば、ゲニステインおよびダイゼイン）の検出可能な共抽出がなかったことを示した。脂質の効果的な除去が、２９２２ｃｍ−１、２８５２ｃｍ−１および１７３４ｃｍ−１における脂質ピークが存在しないことを示したＦＴＩＲによって確認された（図１ａおよび図１ｂ）。脱脂されたダイズ粉を可塑物に変換するために採用された熱的架橋の効力もまた、ダイズタンパク質のピークのいくつかの移動によって、同様にまた、それらの相対的比率の変化によって証明される（図１ｃ）。特に、アミンＩピークが１６２６ｃｍ−１〜１６３３ｃｍ−１に変化し、一方、アミンＩＩピーク（１５１５ｃｍ−１〜１５１６ｃｍ−１に）およびアミンＩＩＩピーク（１３８５ｃｍ−１〜１３８９ｃｍ−１に、および、１２３１ｃｍ−１〜１２３３ｃｍ−１に）は何ら著しい移動を示さなかった（図１ｂおよび図１ｃ）。しかしながら、アミンＩＩピークはより大きい強度を示し、アミンＩピークとのその比率が変化した。１０３８ｃｍ−１におけるピーク（これはダイズの炭水化物画分に帰属される）もまた、熱硬化の後では移動し、また、肩の強度が増大したので、その肩との比率が変化した（図１ｂおよび図１ｃ、矢印）。
【００４１】
実施例２−脱脂されたダイズ粉からのダイズ系ヒドロゲル生体材料の調製方法
方法
ダイズ粉を、実施例１に記載されるように脱脂した。ダイズ系ヒドロゲルを調製するために、脱脂された粉を適切な溶媒系（１：１０の粉／溶媒比）に懸濁した。使用された溶媒系には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、脱イオン水、０．０５ＮのＨＣｌ、または、種々の比率での上記の混合物（例えば、エタノール／水の８０：２０）が含まれたが、これらに限定されなかった。サンプルを、異なる時間（例えば、２時間〜４時間）、異なる温度（例えば、３０℃〜５０℃）で、振とうインキュベーター（２００ｒｐｍ）に４５度の角度で置いた。サンプルを室温で冷却し、３０分間沈降させた。上清を集め、２５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。得られた上清を、ガラスウールを詰めた清浄なガラスシリンジに通してろ過した。溶媒を窒素流のもとで蒸発させ、その後、凍結乾燥した。異なる密度のゲルを、凍結乾燥された粉末を脱イオン水または架橋剤溶液（例えば、０．１ＭのＣａＣｌ２水溶液またはＭｇＣｌ２水溶液、ジアルデヒド系水溶液）に再懸濁することによって得た。代替では、得られたゲルが、架橋剤の有無にかかわらず、６０℃で一晩熱硬化することによるさらなる安定化工程を受けた。
【００４２】
代わりの方法では、ダイズ系ヒドロゲルを、ダイズ粉の脱脂プロセスの期間中における同時（同時期）抽出によって得た。粉を共溶媒系（例えば、エタノール：水：ヘキサン（８０：２０：１０の比率）など、これに限定されない）において５０℃で２時間撹拌した。懸濁物を５分間静置して沈降させ、冷却した。上層のヘキサン層を捨て、残留する上清および固体をデカンテーションによって分離した。固体を上記のように新鮮な溶媒系によりさらに数回洗浄し、異なる抽出から得られる上清をプールした。ろ過およびプールされた上清を窒素流のもとで蒸発させ、その後、凍結乾燥した。ヘキサン上清を、実施例１に記載されるようにその脂質含有量およびイソフラボン含有量について特徴づけした。
【００４３】
ダイズ系ヒドロゲルを、架橋剤溶液の存在下および非存在下、ならびに、熱硬化を伴って、または、熱硬化を伴うことなく、上記のように得た。架橋を伴うか、または、架橋を伴わない得られた粉末および比較ヒドロゲルを、ＦＴＩＲによってそれらの全体的な組成について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によってそれらのタンパク質含有量について、Ａｎｔｈｒｏｎ法によってそれらの炭水化物含有量について、また、実施例１に記載されるようにＨＰＬＣによってそれらのイソフラボン含有量について特徴づけした。
【００４４】
原料および抽出物の両方のタンパク質含有量を従来のＢｒａｄｆｏｒｄ法によって求めた。簡単に記載すると、ダイズサンプルを０．１ＮのＮａＯＨに溶解し、振とう下、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、１００μｌのサンプルを９６ウエルプレートにおいて１００μｌのＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬色素（Ｂｉｏｒａｄ、英国、カタログ番号５００−０００６）と混合し、室温で５分間インキュベーションした。サンプルの５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、値を、０〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲でのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ７０３０）溶液から得られる標準曲線（Ｒ２＝０．９９５）によってタンパク質濃度に変換した。実験を、種々の回分調製物に由来するサンプルについて三連で行った。
【００４５】
Ａｎｔｈｒｏｎ法アッセイを、出発原料と、８０／２０のエタノール／水の溶媒系によって得られる最終的なダイス抽出物との両方において総糖類量を評価するために行った。簡単に記載すると、サンプルを７５％硫酸（２００ｍｌ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）における新たに調製されたＡｎｔｈｒｏｎ溶液（０．４ｇ、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、英国）と１３０℃で１０分間インキュベーションした。溶液を氷で冷却し、サンプルにおける炭水化物の総量を５７８ｎｍにおいて分光側光法によって測定した。Ｒ２値が０．９９８である標準曲線を、０〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲でのグルコース標準物の吸光度読み取りによって得た。実験を、種々の回分調製物に由来するサンプルについて三連で行った。
【００４６】
剪断速度の関数としての粘度、弾性係数Ｇ’および粘性係数Ｇ”を、応力制御型レオメーター（Ｂｏｈｉｌｉｎ  Ｍｏｄ．Ｇｅｍｉｎｉ）をコーン−プレート・ツールとともに使用して３７℃で求めた。実験期間中、ゲルを、湿度チャンバーによって、制御された環境で保った。ダイズ系ヒドロゲルを、異なる架橋剤濃度（０．１Ｍおよび１．０ＭのＣａＣｌ２）において、また、異なる水含有量を有するヒドロゲル（１００ｍｇのダイズ抽出物粉末が、５０μｌまたは８０μｌのどちらかの架橋剤溶液においてヒドロゲルとして再構成された）を調製することによって試験した。
【００４７】
結果
脱脂プロセスに対して同時（同時期）に行われたヒドロゲル抽出は、実施例１に記載される方法によって得られる脱脂レベルと同程度の脱脂レベルを示した。図２は、抽出、溶媒蒸発および凍結乾燥の後で得られたダイズ系粉末のＦＴＩＲを示す。タンパク質画分における立体配座変化が観測され得るが、脱脂されたダイズ粉のタンパク質および炭水化物の全体的な組成は保存されていた（図１および図２）。
【００４８】
抽出物におけるタンパク質画分および炭水化物画分の両方の量が定量され、これにより、抽出手法はタンパク質および炭水化物の濃縮物をもたらしたことが示された（乾燥粉末の重量比で、タンパク質画分＝５６％、炭水化物画分＝３５％）。脱脂プロセスに対して同時期で得られた抽出は、逐次的方法によって得られる脱脂レベルと同程度の脱脂レベルを示した。
【００４９】
図３ａおよび図３ｂは、ダイズ系ゲルに見出されるグリコシル化イソフラボン（ａ）および非グリコシル化イソフラボン（ｂ）の典型的な量を示す。図４は、実施例２に記載される方法により得られる典型的なダイズ系ヒドロゲルを示す。
【００５０】
図５ａおよび図５ｂならびに図６は、架橋剤（ＣａＣｌ２）の異なる濃度におけるダイズ系ヒドロゲルのレオロジー特性を示す。架橋剤の濃度が０．１Ｍであったとき、ダイズヒドロゲル（０．１Ｍ）については、Ｇ”がＧ’よりも常に大きいことを観測することが可能であった。このことは溶液の粘性的挙動を示している。
【００５１】
粘度測定（図６）は、粘度の変化がダイズ生体材料の濃度の関数であることを示唆する；ダイズ抽出物含有量が増大するにつれ、より粘性の材料が得られる。流動挙動の観点（図６）から、両方の濃度が偽塑性挙動を示すことを観測することが可能である。しかしながら、大きいひずみ速度では、粘度がひずみ速度にそれほど依存しなくなり、ニュートン挙動が検出される。これらのレオロジー分析データは、ヒドロゲルが注入のために好適であることを示している。
【００５２】
実施例３−制御された炭水化物含有量を有するダイズ系ヒドロゲル生体材料を得るための方法
方法
ダイズ抽出物を、実施例２に記載される２つの方法に従って水性媒体において再構成した。再構成後、架橋する前に、サンプルを、異なる時間、過剰の脱イオン水に対して透析した。典型的なダイズ抽出物透析プロセスは、サンプルを過剰な脱イオン水において８ｋＤａの分子カットオフの透析膜でインキュベーションすることからなった。しかし、透析プロセスはこれに限定されなかった。このプロセスを、撹拌および透析媒体の定期的な交換を伴って、室温で、５日間に至るまで行った。透析画分（タンパク質が多い）および外側の透析媒体（炭水化物画分）を集め、凍結乾燥し、分析のために１ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。タンパク質および炭水化物の量を、炭水化物画分の部分的または完全な除去およびタンパク質画分の保存をモニターするために種々の時間で、実施例２に記載されるように評価した。
【００５３】
結果
透析膜の内側に保持されたサンプルのＡｎｔｈｒｏｎアッセイでは、炭水化物画分が３５％（初期値）から検出不能な値（延長された透析）にまで段々に低下したことが示された。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイでは、著しいタンパク質喪失がサンプルの透析期間中に生じなかったことが確認された。最終的な抽出物におけるタンパク質割合は５３％前後のままであった。凍結乾燥後、透析媒体から得られた粉末は、サンプルからの炭水化物の放出を裏付ける膠状の粘稠度を有するようであった。この目視検査が、放出された炭水化物が時間とともに徐々に増大したことを示したＡｎｔｈｒｏｎアッセイによって確認された。透析膜の内側に保持された画分の目視検査は溶液の増大した密度を示した。このことは、異なる粘稠度のダイズ生体材料を炭水化物画分の除去によって得ることができたことを示している。
【００５４】
実施例４−制御されたイソフラボン含有量を有するダイズ系ヒドロゲル生体材料を得るための方法。
方法
制御されたイソフラボン含有量を有するダイズヒドロゲルを、実施例２に記載される方法に従って行われた抽出によって、一方で、異なる溶媒系および温度を組み合わせることによって得た。溶媒／温度／時間の条件の例が表Ｉに示される。しかし、条件は表Ｉに限定されない。異なる抽出方法の効率を比重測定法で調べ、これに対して、イソフラボン含有量をＨＰＬＣによって評価した。溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドおよびメタノールなど）におけるイソフラボンの溶解性を考えた場合、異なるイソフラボン組成を有する生体材料はまた、抽出媒体におけるこれらの溶媒の異なる割合を導入することによって調製することができる。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
結果
図７は、それぞれのタイプの抽出から得られるダイズ抽出物の量を示す。抽出量が比較的正確な様式で調整され得たことが示される。図８ａ〜図８ｄは、異なる溶媒系および温度の組合せから得られる種々のダイズ系ヒドロゲルのＨＰＬＣによるイソフラボンプロフィルを示す。グラフは、イソフラボン濃度が生体材料の製造プロセスの期間中に制御され得ることを示す。したがって、このことは、イソフラボン量が最終的な生物医学的適用の要求に合わせて調整されるゲルを得ることを可能にする。
【００５７】
実施例５−生体材料ブレンド配合物、相互貫入ポリマー網目物および複合物ならびに機能化された足場
方法
実施例１に記載されるように調製される脱脂および熱硬化されたダイズ粉、ならびに、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系ヒドロゲルを、典型的な合成ポリマーおよび天然ポリマーと、同様にまた、セラミックス材料と、種々の重量／重量比率でブレンドした。ポリマーブレンド配合物および相互貫入ポリマー網目物は、線状ポリマーおよび分岐ポリマー（デンドリマー）を伴うのと同様に、キサンタンガム、異なる分子量のポリカプロラクトン、ポリ（エチレングリコール）、異なるコポリマー比率のポリ（乳酸／グリコール酸）、アガロース、アルギン酸塩、キトサン、絹フィブロインおよびフィブリン糊など（これらに限定されない）を含む。
【００５８】
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を、種々の割合のＨＡ粉末およびＨＡビーズと、同様にまた、リン酸カルシウムセメントと混合した。
【００５９】
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を、いくつかの増粘性物質（例えば、キサンタンガムなど）と混合した。
【００６０】
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を単独または他の生体材料との組合せで、従来のペプチド合成により合成され、通常の生化学（例えば、Ｓｃｈｉｆｆ塩基およびチオール基など）によって、または、酵素活性によって生体材料にグラフト結合された、種々の細胞タイプによって認識される配列（例えば、−ＲＧＤ−および−ＦＨＲＲＩＫＡ−など）および酵素（例えば、第ＸＩＩＩａ因子）によって認識される配列を含有するペプチドにより機能化した。
【００６１】
目視検査および走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）分析を使用して、これらの異なる配合物の形態学を特徴づけした。
【００６２】
結果
異なる材料割合の一連のブレンド配合物を得ることができた。図９ａおよび図９ｂは、実施例２、実施例３および実施例４のダイズ系生体材料と、別のポリマー（例えば、キサンタンガム）、および、実施例１において使用され、国際公開ＷＯ０２／１０２６１（２２）に記載される方法によって得られるダイズ系顆粒との典型的なポリマーブレンド配合物の目視分析およびＳＥＭ分析を示す。図９ｃおよび図９ｄは、セラミックス材料、例えば、ナノ結晶形態（ｃ）およびビーズ形態（ｄ）でのヒドロキシアパタイトなどと混合された実施例２〜実施例４のダイズ系生体材料の典型的な例を示す。他のセラミックス、例えば、リン酸カルシウムセメントおよび生体ガラスなどもまた、この目的に合わせて使用することができる。
【００６３】
実施例６−ダイズ系生体材料からのイソフラボンの制御された放出
方法
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を、静的条件下、異なる時間（６時間〜１２０時間まで）、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７．４）（１ｍｌ）においてインキュベーションした。上清アリコート（０．１ｍｌ）を抜き取り、それらのイソフラボン含有量についてＨＰＬＣによって分析した。インキュベーション媒体に放出された種々のイソフラボンの濃度をクロマトグラムピークの積分によって評価した。データを、目的とするそれぞれの単一イソフラボンについての標準曲線から変換し、ｍｇ／ｍｌ±標準偏差（ｎ＝３）として表した。
【００６４】
結果
図１０に示されるデータは、実施例１および実施例２のダイズ系生体材料は主要なイソフラボンの放出を少なくとも１２０時間のインキュベーションにわたって持続することができることを示す。
【００６５】
実施例７−生物医学用デバイスを製造するための生体材料としてのダイズ系の固体物およびヒドロゲル
方法
（ａ）ダイズ系モノリス生体材料。実施例１、実施例２、実施例３および実施例４に記載されるように調製されるダイズ系モノリス生体材料を、生物医学用デバイス（例えば、骨充填剤（注入可能なゲルとしてもまた）、創傷包帯（注入可能なゲルとしてもまた）、組織シーラント／生体糊（注入可能なゲルとしてもまた）、軟骨および骨の足場（注入可能なゲルとしてもまた）、神経ガイド、ならびに、心臓血管ステントなど）を製造するために、単独で、または、国際公開ＷＯ０２／１０２６１号のダイズ系生体材料との組合せ、および、他の生体材料との組合せで使用した。非多孔性または多孔性のブロック、顆粒、膜およびフィルムを、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４において調製される生体材料の顆粒およびゲルの、鋳型における異なる充填度によって得た。多孔性はまた、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４の生体材料を糖および塩の結晶と、同様にまた、異なる網目のポリマービーズと混合することによって作製された。その場合、添加物はそれらの溶媒によって素早く溶解され、これにより、空隙がダイズ系生体材料の内部に残った。成形はまた、ダイズ系生体材料を形状化して、ダイズ系生体材料を特定の生物医学的適用に適合化させることを可能にした。例えば、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を、中空ファイバーおよび管類を形成するために熱硬化後に除かれた金属ワイヤのまわりに熱硬化させた。
【００６６】
（ｂ）被覆材としてのダイズ系生体材料。国際公開ＷＯ０２／１０２６１号において調製されるようなダイズ系生体材料、ならびに、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４に記載される方法に従って調製されるダイズ系生体材料を、歯科用および整形外科用のインプラント、心臓血管インプラント、ならびに、神経再生ガイドを被覆するために、単独または他の生体材料との組合せで使用した。ヒドロゲル、粉末、フィルムおよびスポンジなどを医療デバイスのまわりに堆積させることができ、または混合することができ、またはグラフト化することができ、または巻くことができる。例えば、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製される軟らかいダイズヒドロゲルを、イソフラボンを実施例６で記載されるように放出することができる、実施例４に記載されるように調製される種々の配合物を使用して浸漬被覆手順によって被覆材として塗布することができる。被覆は、６０℃を超える温度での熱硬化プロセスによって、および／または、架橋剤（例えば、二価カチオン（例えば、カルシウム溶液およびマグネシウム溶液）またはジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドおよびゲニピン）など、これらに限定されない）におけるそのインキュベーションによってさらなる安定化を受けることができる。代替では、脱脂されたダイズカードを、金属インプラント、ポリマーインプラントまたはセラミックインプラントの表面のまわりに置き、その後、熱硬化および／または化学的架橋して、異なる粗さ、厚さおよび構造様式の被覆を形成することができる。そのような被覆手法の成功が、種々の倍率での後方散乱ＳＥＭによって明らかにされた。
【００６７】
本実施例の方法（ａ）および方法（ｂ）から得られる材料の生物活性を、標準的なＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色法に従って、線維芽細胞および骨芽細胞によるコラーゲンの合成を刺激するそれらの能力について試験した。骨芽細胞の石灰化能を、Ａｌｉｚｅｒｉｎ染色法を使用することによって試験し、これに対して、破骨細胞の活性化を、破骨細胞がコロニー刺激因子によって刺激される培養系において酒石酸抵抗性の酸性ホスファターゼ酵素の活性を強調するための染色法を使用して、同様にまた、骨芽細胞と共培養することによって評価した。実施例１において報告される方法に従って得られる顆粒および国際公開ＷＯ０２／１０２６１号の顆粒と混合された実施例２のダイズ系ゲル（これらに限定されない）を含めて、ダイズ系生体材料の配合物はまた、新たに採取された血液における生体材料のインキュベーションによる血餅形成に関与するそれらの能力について、また、目視検査および光学顕微鏡観察による形成途中の凝塊におけるそれらの一体化の評価のために試験された。
【００６８】
結果
種々の物理化学的性質を有する創傷包帯および骨充填剤が得られた。典型的な注入可能な配合物が図１１に示される。創傷包帯および骨充填剤の両方が、線維芽細胞および骨芽細胞の両方によるコラーゲン合成の誘導（図１２ａおよび図１２ｂ）、ならびに、骨芽細胞培養物の石灰化（図１２ｃおよび図１２ｄ）をもたらした生物活性を示した。組織シーラント（すなわち、生体糊）はまた、例えば、国際公開ＷＯ０２／１０２６１のダイズ系生体材料顆粒または実施例１のダイズ系生体材料顆粒を、実施例２、実施例３および実施例４のダイズ系ヒドロゲルと混合することによって得られた（図９ａおよび図９ｂ）。図１３ａおよび図１３ｂは、単独または他の材料との組合せでのダイズ系ゲルがシーラント（すなわち、生物糊）として使用され得ることを示す。これは、そのようなシーラント（すなわち、生物糊）はそれらの構造における血餅の一体化に好都合であるからである。光学顕微鏡観察では、凝塊がゲルに侵入し、この生体材料配合物の調製時にゲルに分散された顆粒を取り囲んでいたことが示された。図１４ａおよび図１４ｂは、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４に記載される方法に従って作製されるダイズ系生体材料の、破骨細胞の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの阻害作用を示す。矢印は、骨芽細胞との８日間の共培養の後での酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに対して陽性であるコントロールの破骨細胞（赤色染色）を示す（図１４ａ）。図１４ｂは、ダイズ生体材料により処理されたサンプルにおける破骨細胞の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの阻害を示す淡赤色または黄色を有する細胞を示す。図１５ａおよび図１５ｃは、熱硬化させたダイズ系ヒドロゲルによるその被覆の後における心臓血管ステントの比較ＳＥＭを示す。低倍率像は、塗布された被覆が、その表面の密着するステント支柱設計に影響を及ぼさないことを示す（図１５ａ）。後方散乱ＳＥＭはまた、典型的な炭素系の軟らかい材料として高倍率では現れる被覆の成功した付着を証明し（図１５ｂ）、一方、被覆されていない表面はその金属構造を明瞭に示す（図１５ｃ）。
【００６９】
実施例７−炎症緩和物としてのダイズ系生体材料
方法
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４に記載されるように調製されるダイズ系生体材料を、炎症を起こした歯肉および皮膚のための炎症緩和物を製造するために、単独で、または、国際公開ＷＯ０２／１０２６１のダイズ系生体材料との組合せ、および、他の生体材料との組合せで使用した。異なる粘稠性のヒドロゲルおよびペーストを、前記実施例に記載される方法に従って調製し、組織表面に広げるために好適にした。代替では、実施例２、実施例３および実施例４でのように調製されるダイズ系生体材料を、種々の範囲の濃度（例えば、１ｍｇ／ｍｌおよびそれ以上の希釈度）で過剰の水溶液に溶解することによって容易に可溶性にした。
【００７０】
結果
ヒドロゲルおよびペーストは、軟組織（例えば、皮膚および歯肉など）に対して容易に適用可能であることを示した。水溶液の場合、ダイズ系生体材料の種々の濃度物を、異なる生物活性を有する炎症緩和物を得るために容易に溶解することができた。
【００７１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ−ｂ】
2011504406.tif 000016
【図８ｃ−ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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