(57)【要約】  本発明は、非加水分解性ヌクレオシドポリリン酸誘導体、例えば、２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＣｌ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジクロロメチレン−二リン酸、２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジフルオロメチレン−二リン酸及び２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（１−ボラノ二リン酸）、並びにその医薬組成物を提供する。これらの化合物は、２型糖尿病等のＰ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害の予防又は治療及び疼痛管理に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉの化合物：
【化１】
2011504489.tif 000024
［式中、
Ｘは、９位を介して結合した式Ｉａのアデニン残基：
【化２】
2011504489.tif 000025
であり、ここで、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ＮＲ４Ｒ５、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又はハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ４、ＳＲ４、ＮＲ４Ｒ５若しくはヘテロアリールで置換されているヒドロカルビルであり、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ４及びＲ５は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５又は６員の飽和又は不飽和複素環を形成し、前記追加の窒素は、置換されていないか、又はハロゲン、ヒドロキシル若しくはフェニルによって置換されているアルキルで置換されており、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、
或いは、Ｘは、１位を介して結合した式Ｉｂのウラシル残基：
【化３】
2011504489.tif 000026
であり、ここで、
Ｒ６は、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ＮＲ８Ｒ９、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又はハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ８、ＳＲ８、ＮＲ８Ｒ９若しくはヘテロアリールで置換されているヒドロカルビルであり、ここで、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ８及びＲ９は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５又は６員の飽和又は不飽和複素環を形成し、前記追加の窒素は、置換されていないか、又はハロゲン、ヒドロキシル若しくはフェニルによって置換されているアルキルで置換されており、
Ｒ７はＯ又はＳであり、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、それぞれ独立に、Ｏ−又はＢＨ３−であり、
Ｗ１及びＷ２は、それぞれ独立に、Ｏ、ＣＨ２、Ｃ（Ｈａｌ）２又はＮＨであり、ここで、Ｈａｌは、ハロゲン、好ましくはＦ又はＣｌであり、
ｎは０又は１であり、但し、ｎが０であり、Ｗ２がＯである場合、Ｚ１はＢＨ３−であり、ｎが１である場合、Ｗ１及びＷ２の少なくとも一方はＯではなく、
ｍは３又は４であり、
Ｂ＋は、薬学的に許容されるカチオンを表す］
（ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がそれぞれＯ−であり、Ｗ２がＣＨ２又はＮＨである化合物、並びにｎが１であり、Ｚ１〜Ｚ３がそれぞれＯ−である化合物を除く）
並びにそのジアステレオ異性体。
【請求項２】
ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯであるか、又はｎが０であり、Ｚ１及びＺ３の少なくとも一方がＢＨ３−であるか、又はｎが１であり、Ｚ１〜Ｚ３の少なくとも１つがＢＨ３−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが０であり、唯１個のボラノ基を位置αに含む、すなわち、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２がＯ−である；若しくは位置βに含む、すなわち、Ｚ３がＢＨ３−であり、Ｚ１がＯ−である；又は２個のボラノ基を位置α、βに含む、すなわち、Ｚ１及びＺ３がＢＨ３−である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ｎが１であり、唯１個のボラノ基を位置αに含む、すなわち、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−である；位置βに含む、すなわち、Ｚ２がＢＨ３−であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−である；若しくは位置γに含む、すなわち、Ｚ３がＢＨ３−であり、Ｚ１及びＺ２がＯ−である；２個のボラノ基を位置α及びβに含む、すなわち、Ｚ１及びＺ２がＢＨ３−であり、Ｚ３がＯ−である；位置α及びγに含む、すなわち、Ｚ１及びＺ３がＢＨ３−であり、Ｚ２がＯ−である；若しくは位置β及びγに含む、すなわち、Ｚ２及びＺ３がＢＨ３−であり、Ｚ１がＯ−である；又は３個のボラノ基を位置α、β及びγに含む、すなわち、Ｚ１〜Ｚ３がＢＨ３−である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１が、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビルであり、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＨ又はＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ４及びＲ５が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和又は不飽和複素環を形成し、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１が、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビルであり、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、（ｉ）Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２であるか、或いは（ｉｉ）Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｗ２がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＨ又はＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ４及びＲ５が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和又は不飽和複素環を形成し、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＨであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２がＣＨ２である（化合物３）、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２がＣＨ２である（化合物４）、請求項５に記載の化合物。
【請求項１１】
半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０ｍｍ、５ミクロン）及び定組成溶離［１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７：ＭｅＯＨ、８５：１５］を流速５ｍｌ／分で使用して、ジアステレオ異性体の混合物から分離した際に、５．５７分の保持時間（Ｒｔ）を有する異性体であることを特徴とする（化合物４Ｂ）、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２がＣＣｌ２又はＣＦ２である（それぞれ化合物２１及び２２）、請求項５に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＣｌ２又はＣＦ２である（それぞれ化合物１７及び１８）、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘがアデニン残基であり、ここで、Ｒ１がＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３がＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ３がＯ−であり、Ｗ２がＯである（化合物１９）、請求項７に記載の化合物。
【請求項１５】
半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０ｍｍ、５ミクロン）及び定組成溶離［１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７：アセトニトリル、８８：１２］を流速１ｍｌ／分で使用して、ジアステレオ異性体の混合物から分離した際に、８．０７３分の保持時間（Ｒｔ）を有する異性体であることを特徴とする（化合物１９Ａ）、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｘがウラシル残基であり、ここで、Ｒ６が、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビルであり、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｘがウラシル残基であり、ここで、Ｒ６がＨ又はＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８及びＲ９が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ８及びＲ９が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和又は不飽和複素環を形成し、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｘがウラシル残基であり、ここで、Ｒ６が、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビルであり、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘがウラシル残基であり、ここで、Ｒ６がＨ又はＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８及びＲ９が、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ８及びＲ９が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和又は不飽和複素環を形成し、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｂが、アルカリ金属のカチオン、ＮＨ４＋、式Ｒ４Ｎ＋の有機カチオン［式中、Ｒの各１個は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ２２、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキルである］、カチオン性脂質又はカチオン性脂質の混合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１に記載の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の医薬組成物。
【請求項２３】
前記Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害が２型糖尿病である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
疼痛管理用である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
化合物４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ若しくは２１Ｂから選択される化合物又は一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、ここで、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１〜Ｚ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＨ２である］（化合物２）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の医薬組成物の調製のための、請求項１に記載の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項２７】
Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の、請求項１に記載の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項２８】
必要とする個体における、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療方法であって、前記個体に、有効量の請求項１に記載の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
前記Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害が２型糖尿病である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
必要とする個体における疼痛を管理するための、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非加水分解性ヌクレオシドポリリン酸誘導体及びそれらを含む医薬組成物に関する。該化合物は、２型糖尿病等のＰ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害の予防又は治療及び疼痛管理に有用である。
【背景技術】
【０００２】
リガンド作動性イオンチャネル（Ｐ２ＸＲ）及びＧタンパク質共役受容体（Ｐ２ＹＲ）からなるＰ２受容体（Ｐ２Ｒ）スーパーファミリーは、主として、細胞外ヌクレオチドＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰによって活性化される（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００２）。加えて、Ｐ２受容体は、いくつかのジヌクレオシドポリリン酸（ジヌクレオチド）によって活性化される（ＷＯ２００３／０２０７８２５；Ｓｈａｖｅｒら、２００５）。
【０００３】
Ｐ２ＹＲは、正常及び病態生理学的条件下の両方で、多くの組織及び器官中での種々の機能の調節にそれらが関与することから、魅力的な医薬標的であり（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪａｒｖｉｓ、２０００；Ｇｕｉｌｅら、２００１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９９）、このことがＰ２ＹＲアゴニストを潜在的な薬物としている。現在、薬物として提案されているＰ２ＹＲアゴニストは、酵素的及び化学的に不安定なヌクレオチド骨格からなる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪａｒｖｉｓ、２０００；Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９９；Ａｂｂｒａｃｃｈｉｏら、２００６；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００２；Ｌａｘｍａｎ及びＢｅａｖｏ、２００７）。
【０００４】
ヌクレオチドベースの薬物候補の固有の不安定性を克服するためのアプローチは、（ｉ）対応するヌクレオチドよりも代謝的に安定なジヌクレオチド、（ｉｉ）非ヌクレオチドＰ２Ｒリガンド、（ｉｉｉ）ヌクレオチドプロドラッグ、及び（ｉｖ）等価体ベースの非加水分解性ヌクレオチドの使用を含む。
【０００５】
第１のアプローチはかなり有望であり、実際にヒトの前臨床試験においていくつかのジヌクレオチドが投与されている。例えば、Ａｐ４Ａ、Ｕｐ４Ｕ及びＵｐ４ｄＣは、麻酔中の血圧を低下させるため、並びにドライアイ疾患、嚢胞性線維症及び網膜剥離の治療としてそれぞれ有効であると立証された（Ｋｉｋｕｔａら、１９９９；Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら、２００２；Ｍｕｎｄａｓａｄら、２００１；Ｙｅｒｘａら、２００２）。
【０００６】
第２のアプローチは、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／ＢＭＳ）という、二次的な血管イベントの予防に使用される血小板抗凝集剤の場合に成功を収めており（Ｃｈｏｗ及びＺｉｅｇｅｌｓｔｅｉｎ、２００７）、これは、現在利用可能な唯一のＰ２ＹＲ標的薬物である。Ｐ２Ｙ１２受容体アンタゴニストとして作用するクロピドグレル（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら、２００６ａ及び２００６ｂ）は、非ヌクレオチドである。
【０００７】
第３のアプローチは、マスクされたトリエステルヌクレオチドプロドラッグの調製に関与する。これらのプロドラッグ、例えば、抗ＨＩＶヌクレオシド類似体ｄ４Ｔは、膜可溶性であると立証され、細胞内で活性ヌクレオチドを放出した（ＭｃＧｕｉｇａｎら、１９９３、１９９６ａ及び１９９６ｂ；ＷＯ／２００２／０５５５２１）。
【０００８】
生物学的等価体アプローチによって、ヌクレオチドベースの薬物候補、酵素阻害剤又は受容体リガンドいずれかの安定性を改善するための試みは、ごくわずかしか報告されていない（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９８７；Ｃｕｓａｃｋら、１９８７；Ｈｅら、１９９７；Ｋｏｗａｌｓｋａら、２００７；Ｌｉｎら、２００１；Ｍｉｓｉｕｒａら、２００５；Ｒｏｍａｎｉｕｋ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９８１；Ｓｔｉｎｇｅｌｉｎら、１９８０）。
【０００９】
真性糖尿病は、西欧諸国において最も蔓延している慢性疾患の１つであり、人口の最大５％を侵している。これは、脂質及びタンパク質代謝における追加の異常を伴う慢性高血糖（インスリン分泌、インスリン作用又は両方の組合せにおける欠陥に起因する）を特徴とする障害の混成群である。その慢性的代謝異常に加えて、糖尿病は、種々の器官、特に、眼、神経、血管、心臓及び腎臓に関与する長期合併症に関連し、これらは、失明、切断、心臓血管疾患及び末期腎不全をもたらし得る。糖尿病性合併症の発症は、血中グルコースの慢性的上昇と関係しているように思われる。現在のところ糖尿病の治癒法はないが、有効な血糖管理は、糖尿病性合併症の発生率を低下させ、その重症度を軽減することができる。
【００１０】
非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とも称される２型糖尿病は、糖尿病に罹患している患者の約９５％を侵しており、インスリン抵抗性及び相対的インスリン欠乏が共存する複雑な多遺伝子性疾患であるように思われる。よって、インスリン分泌の改善が主な治療目的である。インスリン放出の欠乏は、グルコースに対する第１相インスリン応答の欠如によってだけでなく、インスリン放出の規模が正常な分泌能力の１０〜２０％まで全体的に低減することによっても現れる。２型糖尿病に罹患している患者は、種々の経口抗糖尿病剤、インスリン注射又は両方の組合せによって治療される。現在利用可能な経口抗糖尿薬物は、膵臓ベータ細胞からのインスリン分泌を増加させること、末梢インスリン抵抗性を低減させること、又は腸からの糖質の吸収を遅らせることのいずれかを目的としている。
【００１１】
２型糖尿病に罹患している患者の約半分は経口剤で治療され、該経口剤のかなりの割合がインスリン分泌を刺激する作用物質である。インスリン分泌促進物質の選定は、スルホニル尿素及び関連化合物（「グリニド系薬」）に限定され、これらは、膜ＡＴＰ感受性カリウムチャネルの制御サブユニットと結合し、その閉鎖を誘導することによりインスリン分泌を誘発する。しかしながら、スルホニル尿素は、その特異的標的である膵臓ベータ細胞への起こり得る長期的な悪影響に加えて、いくつかの望ましくない作用を有する。これらの副作用は、低グルコース濃度でのインスリン分泌の刺激による低血糖のリスク、多数の患者において正常な血糖を達成することの難しさ、年間５〜１０％という十分な血糖管理の二次的な失敗率、及び心臓血管系への起こり得る負の作用を含む。
【００１２】
膵臓ベータ細胞におけるＰ２ＹＲの存在は、文書による十分な裏付けがあり、それらの活性化は、刺激性のグルコース濃度でのインスリン分泌の刺激をもたらす。グルコースによって引き起こされるインスリン放出をＰ２ＹＲアゴニストが増強する機序は、環状ＡＭＰ／タンパク質キナーゼＡシグナル伝達経路に関与し得、該経路は、グルコースのＫ＋ＡＴＰチャネル非依存性作用の有効性を増大させると報告されている。
【００１３】
種々のＰ２Ｒ選択的リガンドは、インビボにおいて、インスリン分泌を増加させ、血糖を減少させることを示した。リガンドのリストは、２−ＭｅＳ−アデノシンに迅速に分解し、よって膵十二指腸動脈に直接注射された２−メチルチオ−ＡＴＰ、及び酵素加水分解に安定であり、よって静脈内又は経口のいずれかで投与されたアデノシン５’−Ｏ−（２−チオ）二リン酸を含む。
【００１４】
現在の合成Ｐ２受容体アゴニストは殆どすべて、ＡＴＰ又はＵＴＰ薬理作用団の修飾物である。プリン（ピリミジン）環系、リボース部分又は三リン酸鎖は、１つ又は複数の位置で修飾される（Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９９）。以前、本発明者らは、２−チオエーテル−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）アデノシン誘導体等、Ｃ−２位に長いチオエーテル置換を有するＡＴＰ誘導体の合成について報告した（Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９９）。
【００１５】
ＵＳ７，３１９，０９３に対応するＷＯ２００３／０３４９７８は、ＡＴＰ類似体（アデノシン−５’−α−ボラノ−三リン酸類似体）のボラノリン酸等価体に基づく一連の強力且つ選択的なＰ２Ｙ１Ｒアゴニストを開示している（Ｎａｈｕｍら、２００２；Ｍａｊｏｒら、２００４；Ｔｕｌａｐｕｒｋａｒら、２００４；Ｆａｒｒｅｔら、２００６）。これらの類似体は、生理的ｐＨにおいて高度に安定であり、ｐＨ１．４及び３７℃において比較的安定であることが立証された。さらに、これらのアゴニストは、エクト−ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ（ｅ−ＮＴＰＤアーゼ）による加水分解に対して比較的耐性があり、灌流ラット膵臓において極めて強力なインスリン分泌促進物質であることが立証された。最も有効なアゴニストは、２−ＭｅＳ−ＡＴＰ−α−Ｂ、１であり、これは、２８ｎＭのＥＣ５０を有する基礎分泌と比較して、９倍のインスリン分泌増強を引き起こした。２−ＭｅＳ−ＡＴＰ−α−Ｂのインスリン放出作用はグルコース依存性であり、この化合物が２型糖尿病の治療用の薬物候補となり得ることを示唆しているが、アルカリホスファターゼに不安定であるという観察により、この化合物を薬物として使用するには不適格と判定された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様において、本発明は、一般式Ｉの化合物：
【化１】
2011504489.tif 000002
［式中、
Ｘは、９位を介して結合した式Ｉａのアデニン残基：
【化２】
2011504489.tif 000003
であり、ここで、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ＮＲ４Ｒ５、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又はハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ４、ＳＲ４、ＮＲ４Ｒ５若しくはヘテロアリールで置換されているヒドロカルビルであり、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ４及びＲ５は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５又は６員の飽和又は不飽和複素環を形成し、該追加の窒素は、置換されていないか、又はハロゲン、ヒドロキシル若しくはフェニルによって置換されているアルキルで置換されており、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、
或いは、Ｘは、１位を介して結合した式Ｉｂのウラシル残基：
【化３】
2011504489.tif 000004
であり、ここで、
Ｒ６は、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ＮＲ８Ｒ９、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又はハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ８、ＳＲ８、ＮＲ８Ｒ９若しくはヘテロアリールで置換されているヒドロカルビルであり、ここで、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ又はヒドロカルビルであるか、或いはＲ８及びＲ９は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、酸素、窒素又は硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５又は６員の飽和又は不飽和複素環を形成し、該追加の窒素は、置換されていないか、又はハロゲン、ヒドロキシル若しくはフェニルによって置換されているアルキルで置換されており、
Ｒ７はＯ又はＳであり、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、それぞれ独立に、Ｏ−又はＢＨ３−であり、
Ｗ１及びＷ２は、それぞれ独立に、Ｏ、ＣＨ２、Ｃ（Ｈａｌ）２又はＮＨであり、ここで、Ｈａｌは、ハロゲン、好ましくはＦ又はＣｌであり、
ｎは０又は１であり、但し、ｎが０であり、Ｗ２がＯである場合、Ｚ１はＢＨ３−であり、ｎが１である場合、Ｗ１及びＷ２の少なくとも一方はＯではなく、
ｍは３又は４であり、
Ｂ＋は、薬学的に許容されるカチオンを表す］
（ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がそれぞれＯ−であり、Ｗ２がＣＨ２又はＮＨである化合物、並びにｎが１であり、Ｚ１〜Ｚ３がそれぞれＯ−である化合物を除く）
並びにそのジアステレオ異性体に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、一般式Ｉの化合物（ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がそれぞれＯ−であり、Ｗ２がＣＨ２又はＮＨである化合物、並びにｎが１であり、Ｚ１〜Ｚ３がそれぞれＯ−である化合物を除く）又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明は、一般式Ｉの化合物を含む、２型糖尿病又は疼痛等のＰ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の医薬組成物をさらに提供する。
【００１９】
よって、さらなる態様において、本発明は、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の医薬組成物の調製のための、一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用に関する。
【００２０】
一層さらなる態様において、本発明は、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の、一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【００２１】
またさらなる態様において、本発明は、必要とする個体における、２型糖尿病又は疼痛等のＰ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療方法であって、前記個体に、有効量の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ：８１ＭＨｚの３１Ｐ  ＮＭＲによってモニターした際の、胃液様条件下（ｐＨ１．４及び３７℃のＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液中）における、本明細書において２と指定される化合物の加水分解を示す図である。化合物２の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルの変化が時間の関数として示されている。図１Ｂ：８１ＭＨｚの３１Ｐ  ＮＭＲによってモニターした際の、胃液様条件下（ｐＨ１．４及び３７℃のＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液中）における、本明細書において２と指定される化合物の加水分解を示す図である。６５時間のｔ１／２を示す、上記加水分解反応のｔ１／２の測定が示されている。
【図２】図２Ａ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、胃液様条件下（ｐＨ１．４及び３７℃のＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液中）における、本明細書において３Ｂと指定される化合物の加水分解を示す図である。ｔ＝１９時間における３ＢのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図２Ｂ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、胃液様条件下（ｐＨ１．４及び３７℃のＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液中）における、本明細書において３Ｂと指定される化合物の加水分解を示す図である。ｔ＝７１時間における３ＢのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図２Ｃ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、胃液様条件下（ｐＨ１．４及び３７℃のＫＣｌ／ＨＣｌ緩衝液中）における、本明細書において３Ｂ及び４Ｂと指定される化合物の加水分解を示す図である。３Ｂ及び４Ｂについてそれぞれ１９及び１４．５時間のｔ１／２を示す、上記加水分解反応のｔ１／２の測定を示している。
【図３】ＡＴＰについて３．６時間のｔ１／２を示す、ＨＰＬＣによってモニターした際の、３７℃のヒト血清中におけるＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの酵素加水分解を示す図である。
【図４】図４Ａ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、３７℃のヒト血清中におけるβ，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−ＡＴＰ、２の酵素加水分解を示す図である。ｔ＝８時間におけるヒト血清中の加水分解混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図４Ｂ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、３７℃のヒト血清中におけるβ，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−ＡＴＰ、２の酵素加水分解を示す図である。ｔ＝１５時間におけるヒト血清中の加水分解混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図４Ｃ：ＨＰＬＣによってモニターした際の、３７℃のヒト血清中におけるβ，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−ＡＴＰ、２の酵素加水分解を示す図である。１２．７時間のｔ１／２を示す、上記加水分解反応のｋ（ｔ１／２）の測定を示している。
【図５】２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（１−ボラノ二リン酸）、１９が、ラットにおけるグルコース負荷後に血糖を低減させることを示す図である。絶食させたウィスター系ラット（ｎ＝５）を、例１２に記載されている通り、グルコース負荷の１０分後に２．５ｍｇ／ｋｇ又は生理食塩水の静脈注射（ＩＶ）で処置した。３０分前に、陽性対照としてグリベンクラミド（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を経口で与えた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、一態様において、非加水分解性ヌクレオシド二又は三リン酸誘導体に関し、これらは、以上で定義された通り、本明細書における一般式ＩのＰ２Ｙ受容体サブタイプ選択的アゴニストである。
【００２４】
本明細書において使用される場合、用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含み、好ましくは、フルオロ又はクロロである。
【００２５】
用語「ヒドロカルビル」は、異なる基Ｒ１〜Ｒ９の定義のいずれかにおいて、飽和若しくは不飽和、直鎖若しくは分枝鎖、環式若しくは非環式、又は芳香族であってよい炭素及び水素原子のみを含有する基を指し、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール及び（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルを含む。
【００２６】
用語「Ｃ１〜Ｃ８アルキル」は、典型的には、１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の炭化水素基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等を含む。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基が好ましく、最も好ましくはメチルである。用語「Ｃ２〜Ｃ８アルケニル」及び「Ｃ２〜Ｃ８アルキニル」は、典型的には、２〜８個の炭素原子及び１個の二重又は三重結合を有する直鎖及び分枝鎖の炭化水素基をそれそれ意味し、エテニル、３−ブテン−１−イル、２−エテニルブチル、３−オクテン−１−イル等及びプロピニル、２−ブチン−１−イル、３−ペンチン−１−イル等を含む。Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基が好ましい。用語「Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル等の環式又は二環式ヒドロカルビル基を意味する。用語「Ｃ６〜Ｃ１４アリール」は、フェニル及びナフチル等の炭素環式芳香族基を表し、用語「アリル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル」は、ベンジル及びフェネチル等のアリールアルキル基を表す。
【００２７】
基Ｒ１が、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビル基であるか、又はＯＲ４若しくはＳＲ４基［ここで、Ｒ４はヒドロカルビルである］で置換されているヒドロカルビルである場合、前記ヒドロカルビルの各１個は、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、最も好ましくはメチル、又はアリール、最も好ましくはフェニル、又はアラルキル、最も好ましくはベンジル基である。
【００２８】
基Ｒ２及びＲ３の一方又は両方がヒドロカルビルである場合、これらのヒドロカルビルのそれぞれは、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、最も好ましくはメチル、又はアリール、最も好ましくはフェニル、又はアラルキル、最も好ましくはベンジル基である。
【００２９】
基Ｒ６が、Ｏ−ヒドロカルビル又はＳ−ヒドロカルビル基であるか、又はＯＲ８若しくはＳＲ８基［ここで、Ｒ８はヒドロカルビルである］で置換されているヒドロカルビルである場合、前記ヒドロカルビルの各１個は、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、最も好ましくはメチル、又はアリール、最も好ましくはフェニル、又はアラルキル、最も好ましくはベンジル基である。
【００３０】
基ＮＲ４Ｒ５において、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ又は上記で定義された通りのヒドロカルビルであるか、或いはそれらが結合したＮ原子と一緒になって、窒素、酸素及び硫黄から選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する、飽和又は不飽和の、好ましくは５又は６員の複素環を形成する。そのような環は、例えばピペラジン環中、環の第２の窒素原子において、例えば、１若しくは２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で、又は１個のアルキル若しくはヒドロキシアルキル基で置換されていてよい。基ＮＲ４Ｒ５の例は、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、フェニルメチル−アミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、テトラヒドロピリジノ、ピペラジノ、エチルピペラジノ、ヒドロキシエチルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チアゾリノ等を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
基ＮＲ８Ｒ９において、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ又は上記で定義された通りのヒドロカルビルであるか、或いはそれらが結合したＮ原子と一緒になって、窒素、酸素及び硫黄から選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する、飽和又は不飽和の、好ましくは５又は６員の複素環を形成する。そのような環は、例えばピペラジン環中、環の第２の窒素原子において、例えば、１若しくは２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で、又は１個のアルキル若しくはヒドロキシアルキル基で置換されていてよい。基ＮＲ８Ｒ９の例は、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、フェニルメチル−アミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、テトラヒドロピリジノ、ピペラジノ、エチルピペラジノ、ヒドロキシエチルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チアゾリノ等を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有し、芳香族性の不飽和を有する単又は多環式環から誘導された基を指す。ヘテロアリールの非限定的な例は、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、１，３−ベンゾジオキシニル、ピラジニル、ピリミジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、チアジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ピリド［１，２−ａ］ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾオキサゾリルを含む。ヘテロアリール環は、置換されていてよい。多環式芳香族複素環が置換されている場合、該置換は、ヘテロ環中又は炭素環中であり得ることを理解されたい。
【００３３】
本明細書に記載されている化合物、式Ｉの化合物、出発化合物及び中間体、並びに既知の化合物の両方は、本明細書において、太字のアラビア数字１〜２２によって識別される。全化学構造は、本明細書の附属書Ａ、スキーム１〜５において描写されている。化合物２は名称β，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−アデノシン−５’−三リン酸によっても識別され、化合物３は名称アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）によっても識別され、化合物４は名称２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）によっても識別され、化合物１７は名称２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジクロロメチレン−二リン酸によっても識別され、化合物１８は名称２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジフルオロメチレン−二リン酸によっても識別され、化合物１９は名称２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸によっても識別され、化合物２０は名称アデノシン−β，γ−ＣＣｌ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）によっても識別され、化合物２１は名称２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＣｌ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）によっても識別され、化合物２２は名称２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＦ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）によっても識別される。
【００３４】
一実施形態において、本発明の化合物は、０〜２個のＢＨ３−基を含有する二リン酸誘導体（ここで、ｎは０である）である。好ましい実施形態において、該化合物は、ボラノ基を含まないか、或いは該化合物は、唯１個のボラノ基を位置αに含み、ここで、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２はＯ−であるか、若しくは位置βに含み、ここで、Ｚ３はＢＨ３−であり、Ｚ１はＯ−である；又は２個のボラノ基を位置α及びβに含む、すなわち、Ｚ１及びＺ３はＢＨ３−である。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の化合物は、１〜３個のＢＨ３−基を含有する三リン酸誘導体（すなわち、ｎが１である）である。好ましい実施形態において、該化合物は、唯１個のボラノ基を位置αに含み、ここで、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−である、位置βに含み、ここで、Ｚ２はＢＨ３−であり、Ｚ１及びＺ３はＯ−であるか、若しくは位置γに含み、ここで、Ｚ３はＢＨ３−であり、Ｚ１及びＺ２はＯ−である；２個のボラノ基を位置α及びβに含み、ここで、Ｚ１及びＺ２はＢＨ３−であり、Ｚ３はＯ−である、位置α及びγに含み、ここで、Ｚ１及びＺ３はＢＨ３−であり、Ｚ２はＯ−である、若しくは位置β及びγに含み、ここで、Ｚ２及びＺ３はＢＨ３−であり、Ｚ１はＯ−である；又は３個のボラノ基を位置α、β及びγに含み、ここで、Ｚ１〜Ｚ３はＢＨ３−である。
【００３６】
一実施形態において、Ｘはアデニン残基である、すなわち、本発明の化合物はＡＴＰ又はＡＤＰ誘導体である。好ましくは、該化合物は、Ｘがアデニン残基であり、Ｒ１がＨ又はＳ−アルキル、好ましくはＳ−メチルであり、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立にＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である化合物；Ｘがアデニン残基であり、Ｒ１がＨ又はＳ−アルキル、好ましくはＳ−メチルであり、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立にＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２である化合物；並びに、Ｘがアデニン残基であり、Ｒ１がＨ又はＳ−アルキル、好ましくはＳ−メチルであり、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立にＨであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｗ２がＯである化合物である。
【００３７】
好ましい一実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＨ２である］（化合物３）である。Ｐαにおけるキラル中心により、この化合物は、２個のジアステレオ異性体（化合物３Ａ及び３Ｂ）の対を有する。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＨ２である］（化合物４）である。より好ましくは、本発明の化合物は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０ｍｍ、５ミクロン）及び定組成溶離［１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７（Ａ）：ＭｅＯＨ（Ｂ）、８５：１５］を流速５ｍｌ／分で使用して、ジアステレオ異性体の混合物から分離した際に、５．５７分の保持時間（Ｒｔ）を有する異性体であることを特徴とする、化合物４のジアステレオ異性体Ｂ（化合物４Ｂ）である。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、ここで、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは０であり、Ｚ１及びＺ３はＯ−であり、Ｗ２はＣＣｌ２である］（化合物１７）である。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、ここで、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは０であり、Ｚ１及びＺ３はＯ−であり、Ｗ２はＣＦ２である］（化合物１８）である。
【００４１】
また別の実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、ここで、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは０であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ３はＯ−であり、Ｗ２はＯである］（化合物１９）である。より好ましくは、本発明の化合物は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０ｍｍ、５ミクロン）及び定組成溶離［１００ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７（Ａ）アセトニトリル（Ｂ）、８８：１２］を流速１ｍｌ／分で使用して、ジアステレオ異性体の混合物から分離した際に、８．０７３分の保持時間（Ｒｔ）を有する異性体であることを特徴とする、化合物１９のジアステレオ異性体Ａ（化合物１９Ａ）である。
【００４２】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＣｌ２である］（化合物２０）である。この化合物は、２個のジアステレオ異性体（化合物２０Ａ及び２０Ｂ）を有する。
【００４３】
またさらなる好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＣｌ２である］（化合物２１）である。この化合物は、２個のジアステレオ異性体（化合物２１Ａ及び２１Ｂ）を有する。
【００４４】
一層さらなる好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般式Ｉの化合物［式中、Ｘはアデニン残基であり、Ｒ１はＳＭｅであり、Ｒ２及びＲ３はＨであり、ＹはＯＨであり、ｎは１であり、Ｚ１はＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３はＯ−であり、Ｗ１はＯであり、Ｗ２はＣＦ２である］（化合物２２）である。この化合物は、２個のジアステレオ異性体（化合物２２Ａ及び２２Ｂ）を有する。
【００４５】
別の実施形態において、Ｘはウラシル残基である、すなわち、本発明の化合物はＵＴＰ又はＵＤＰ誘導体である。好ましくは、該化合物は、Ｘがウラシル残基であり、Ｒ６がＨ又はＳ−アルキル、好ましくはＳ−メチルであり、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが１であり、Ｚ１がＢＨ３−であり、Ｚ２及びＺ３がＯ−であり、Ｗ１がＯであり、Ｗ２が、ＣＨ２、ＣＦ２又はＣＣｌ２である化合物；並びに、Ｘがウラシル残基であり、Ｒ６がＨ又はＳ−アルキル、好ましくはＳ−メチルであり、Ｒ７がＯ又はＳであり、ＹがＯＨであり、ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がＯ−であり、Ｗ２がＣＦ２又はＣＣｌ２である化合物である。
【００４６】
本発明は、上記で定義された通りの式Ｉの化合物、そのジアステレオ異性体及び薬学的に許容されるその塩を包含する。
【００４７】
一実施形態において、カチオンＢは、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＬｉ＋等であるがこれらに限定されないアルカリ金属の無機カチオンである。
【００４８】
別の実施形態において、カチオンＢは、アンモニウム（ＮＨ４＋）であるか、又は式Ｒ４Ｎ＋のアミンから誘導された有機カチオンであり、ここで、Ｒの各１個は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２２、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等のＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、又はピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル等のヘテロアリールから選択されるか、或いは２個のＲは、それらが結合した窒素原子と一緒になって、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｄｉｎｅ）、ピペリジン及びモルホリン等、Ｎ、Ｓ及びＯから選択されるさらなるヘテロ原子を場合によって含有する３〜７員環を形成する。
【００４９】
さらなる実施形態において、カチオンＢは、カチオン性脂質又はカチオン性脂質の混合物である。カチオン性脂質は、多くの場合、送達剤として使用する前に中性脂質と混合される。中性脂質は、レシチン；ホスファチジル−エタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のジアシルホスファチジルエタノールアミン類；ホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリン等のジアシルホスファチジルコリン類；脂肪酸エステル；グリセロールエステル；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド；セラミド；並びにそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。中性脂質は、コレステロール及び他の３βヒドロキシ−ステロールも含む。
【００５０】
本明細書において企図されている他の中性脂質は、ホスファチジルグリセロール；ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等のジアシルホスファチジルグリセロール類；ホスファチジルセリン；ジオレオイル−又はジパルミトイルホスファチジルセリン等のジアシルホスファチジルセリン類；並びにジホスファチジルグリセロールを含む。
【００５１】
カチオン性脂質化合物の例は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）（カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及びジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンの１：１（ｗ／ｗ）配合物）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）（ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミン−イウムトリフルオロアセテート及びジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンの３：１（ｗ／ｗ）配合物）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｌｕｓ試薬）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）（カチオン性脂質）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）（非リポソーム脂質配合物）、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（ポリカチオン性脂質）、Ｅｕ−ｆｅｃｔｉｎｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ、Ｃａｌｉｆ．）（エタノールカチオン性脂質番号１〜１２：Ｃ５２Ｈ１０６Ｎ６Ｏ４・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ８８Ｈ１７８Ｎ８Ｏ４Ｓ２・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４０Ｈ８４ＮＯ３Ｐ・ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ５０Ｈ１０３Ｎ７Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ５５Ｈ１１６Ｎ８Ｏ２・６ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４９Ｈ１０２Ｎ６Ｏ３・４ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４４Ｈ８９Ｎ５Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ１００Ｈ２０６Ｎ１２Ｏ４Ｓ２・８ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ１６２Ｈ３３０Ｎ２２Ｏ９・１３ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４３Ｈ８８Ｎ４Ｏ２・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４３Ｈ８８Ｎ４Ｏ３・２ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ８Ｐ）；Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）（カチオン性脂質及び中性脂質の混合物）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（登録商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）（中性脂質（Ｄｏｐｅ）及びカチオン性脂質の配合物）並びにＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）（多成分脂質ベースの非リポソーム試薬）を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
非加水分解性ヌクレオシドポリリン酸類似体は、ヌクレオチド加水分解酵素のプローブ及び阻害剤として広く使用されてきた（Ｌａｂａｔａｉｌｌｅら、１９９５；Ｙａｎａｃｈｋｏｖら、１９９７；Ｓｐｅｌｔａら、２００３）。ＡＴＰ中のβ，γ架橋酸素をメチレン基で置き換えること（すなわち、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ）は、ヌクレオチドホスホヒドロラーゼによる加水分解に対する著しい抵抗性を付与する。例えば、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰはグリセロールキナーゼの阻害剤として同定され（Ｂｙｓｔｒｏｍら、１９９７）、３’−アジド−３’−デオキシ−チミジン−５’−β，γ−ＣＦ２−ＴＰ中の５’−β，γ−ＣＦ２−ＴＰ部分（ＡＺＴ−５’−β，γ−ＣＦ２−ＴＰ）は、ＡＺＴを、血清及び細胞抽出物中で安定なヒト免疫不全逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）の強力阻害剤にした（Ｗａｎｇら、２００４）。同様に、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰは、界面活性剤で可溶化したｅ−ＮＴＰＤアーゼを阻害した（Ｐｉｃｈｅｒら、１９９６）。その上、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰは、ｅ−ＮＰＰ及びｅ−ＮＴＰＤアーゼによって触媒されるＡＴＰ加水分解を選択的に阻害した（Ｊｏｓｅｐｈら、２００４）。
【００５３】
β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ及び類似体は、いくつかのＰ２受容体サブタイプについて代謝的に安定なリガンドとして評価されている（Ｓｐｅｌｔａら、２００３；Ｅｌ−Ｔａｙｅｂら、２００５；Ｃｈｅｎ及びＬｉｎ、１９９７；Ｙｅｇｕｔｋｉｎ及びＢｕｒｎｓｔｏｃｋ、２０００；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、２０００；Ｊｏｓｅｐｈら、２００３）。例えば、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰは、強力なＰ２Ｘ１Ｒアゴニストである（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋら、１９９４；Ｊａｎｓｓｅｎｓら、１９９６）が、Ｐ２Ｘ２／３Ｒに対しては弱いアゴニストである（Ｓｐｅｌｔａら、２００３）ことが分かった。β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰはＰ２Ｙ１Ｒを活性化しなかった（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋら、１９９４；Ｊａｎｓｓｅｎｓら、１９９６）が、２−ＭｅＳ−ＡＤＰによって誘発された応答を阻害するＰ２Ｙ１Ｒに対しては弱い競合的アンタゴニストであった（Ｓａｋら、２０００）。
【００５４】
酵素アッセイにおいては加水分解に安定であったが、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰは、１３２１Ｎ１星状細胞腫及びＣ６神経膠腫細胞中、ｅ−ＮＰＰ（β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ→ＡＭＰ）及びＣＤ７３（ＡＭＰ→アデノシン）による連続触媒を含む緊密な共役反応により、アデノシンに迅速に代謝された（Ｊｏｓｅｐｈら、２００４）。
【００５５】
本発明者らは、ＮＴＰＤアーゼによって媒介される加水分解に対するβ，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ中の安定化等価体としてのβ，γ−メチレン基の利点については承知していたが、これは不安定なα，β−リン酸ジエステル結合を保護し得ないことを認識した。さらに、本発明者らは、このメチレン等価体が、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰについて上述した通り、Ｐ２Ｙ１Ｒにおけるヌクレオチドの活性を低減させるのではないかと疑った。そこで、ＡＴＰ中におけるこの加水分解に不安定な結合を保護するために選択されたβ，γ−ＣＨ２−基に加えて、αリン酸をボラノリン酸部分で置換して、ＡＴＰのα，β−リン酸ジエステル結合をＮＴＰＤアーゼ（Ｎａｈｕｍら、２００２）及びＮＰＰ（Ｎａｈｕｍら、２００６）による加水分解に対して安定化した。β，γ−メチレン基の作用に対抗し、Ｐ２Ｙ１Ｒにおける効力を増強するために、本発明者らは、ＡＴＰのＣ２位をＳＭｅ基で置換した（Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９３）。
【００５６】
ヌクレオチド中でピロホスホネート結合を形成するための、いくつかの化学的方法が開発された。β，γ架橋酸素がメチレン基で置換されているヌクレオチド類似体は、ヌクレオシド−一リン酸（ＮＭＰ）の５’−リン酸の活性化によってホスホリル供与体を形成し、続いてメチレンビスホスホネート塩（ホスホリルアクセプター）と反応させることにより、慣習的に調製される。ヌクレオシド−５’−一リン酸及びメチレンビスホスホネートの無水物は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（Ｐａｄｙｕｋｏｖａら、１９９９）、トリフルオロ酢酸無水物及びＮ−メチルイミダゾール（Ｍｏｈａｍａｄｙ及びＪａｋｅｍａｎ、２００５）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Ｍｙｅｒｓら、１９６３）によるＮＭＰの活性化、続いてメチレンビスホスホン酸又はその塩との縮合によって調製した。
【００５７】
２−ＭｅＳ−β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ、２は、３ステップ合成：最初に２−ＭｅＳ−ＡＭＰの調製、次いでカルボニルジイミダゾールによるＡＭＰ類似体の活性化、最後にメチレン−ジホスホン酸との反応（Ｃｕｓａｃｋら、１９８７）で予め得た。これらの反応のための条件及び生成物収率は報告されていなかった。そこで、本発明者らは、以下の例１で詳細に記載され、スキーム１で描写される通り、この化合物の合成を改善し、簡潔なワンポット合成を提案しようと試みた。
【００５８】
５’−ＯＨにおける２−ＭｅＳ−アデノシン（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ、１９９２）の選択的反応を確実にするために、本発明者らは、２’，３’−メトキシメチリデン−２−ＭｅＳ−アデノシン、５ａを出発材料として使用した。よって、最初に５ａを、Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（商標）（Ａｌｄｒｉｃｈ）（１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン）の存在下、０℃で３時間、トリメチルリン酸（ＴＭＰ）中のＰＯＣｌ３で処理し、続いてビス（トリブチルアンモニウム）メチレン−ジホスホネート及びトリブチルアミンを０℃で添加した。最後に、０．５ＭのＴＥＡＢ中での加水分解及びメトキシメチリデン基の脱保護により、２を９％の全収率で生成した。
【００５９】
２の全収率が低かったため、本発明者らは、非保護ヌクレオシド５ｂを出発材料として使用した。実際に、５ｂをＴＭＰ中のＰＯＣｌ３により（Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（商標）の存在下）０℃で２時間処理し、続いてビス（トリブチルアンモニウム）メチレン−ジホスホネート及びトリブチルアミンを０℃で２５分間添加し、０．５ＭのＴＥＡＢ中で加水分解することにより、生成物２を２０％の全収率で得た。主な副生成物は２−ＭｅＳ−ＡＭＰであり、２’，３’−環状リン酸−２−ＭｅＳ−（β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ）は得られず（すなわち、＋２０ｐｐｍにおいてシグナルは観察されなかった）、２’，３’−ヒドロキシルの保護は必要ないことを示している。
【００６０】
以前、本発明者らは、類似体１の効率的な４ステップワンポット合成を開発した（Ｎａｈｕｍら、２００２）。今回、本発明者らは、例２〜３で詳細に記載され、スキーム２で描写される通り、３及び４の調製用に合成を修正した。合成法におけるホスフィチル化及びホウ素化試薬の使用は、保護されたヌクレオシド出発材料の使用を必要とする。この目的のために、本発明者らは、ヌクレオシド２’，３’−ヒドロキシルを、合成全体を通して安定であり続けるメトキシ−メチリデン基で保護し、最終ステップにおいて効率的に除去した。
【００６１】
最初の合成ステップは、化合物９の５’−ＯＨのホスフィチル化を含んでいた。この目的のために、本発明者らは、いくつかのホスフィチル化試薬を試した。このようにして、９を［（ｉＰｒ）２Ｎ］２ＰＣｌにより０℃で数時間処理したが、殆どの出発材料は室温で１４時間経った後も消費されていなかった。クロロベンゾジオキサホスホリンを用いると、殆どの出発材料９は室温で１５分後に消費された。しかしながら、１．５当量のメチレン−ビスホスホネートを室温で１０分間及び１０当量のＢＨ３・ＳＭｅ２を室温で３０分間添加した場合には、微量の生成物３しか得られなかった。最終的に、ＰＣｌ３が最良のホスフィチル化試薬であることが分かった。出発材料９は、３０分未満で消費された。さらに、ＰＣｌ３の高反応性により、メチレン−ビスホスホネート塩とのカップリングはかなり迅速（１１分）であった。最後に、ＢＨ３・ＳＭｅ２を０℃で添加し、次いで、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。これらの条件は、８１ＭＨｚ  ３１Ｐ  ＮＭＲの粗反応混合物に基づいて、生成物３を３９％の収率で提供した。３に加えて、ＡＭＰ−α−ＢＨ３及びアデノシン−５’−Ｈ−ホスホネートが、それぞれ１：０．４６：約１の比率で副生成物として得られた。これらの副生成物を、３１Ｐ  ＮＭＲ及びＭＳ（エレクトロンスプレーイオン化）の両方によって同定した。
【００６２】
生成物４は、同じ手法で、ＬＣ分離後、２８％の全収率で５ａから得られた。
【００６３】
生成物の同一性及び純度は、１Ｈ及び３１Ｐ  ＮＭＲ、高分解能高速原子衝撃（ＦＡＢ）ＭＳ、並びに２つの溶媒系中でのＨＰＬＣによって確立した。生成物３及び４の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、典型的なＰαシグナルを約８３ｐｐｍの多重項として示した。３及び４の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ボラン水素原子を約０．４ｐｐｍの非常に広域のシグナルとして示した。
【００６４】
Ｐαにおけるキラル中心により、類似体３及び４は、それぞれ２個のジアステレオ異性体の対として得られる。１Ｈ及び３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルの両方において、３及び４の２個のジアステレオ異性体についての化学シフトの間にはわずかな差異があった。例えば、３のジアステレオ異性体について、Ｈ８に対し、８．５９及び８．５６ｐｐｍの２セットのシグナルが観察された。これらの異性体を、その保持時間中に逆相ＨＰＬＣにより約２分の差異で十分に分離した。最初に溶離した異性体をＡ異性体と指定し、他方をＢ異性体と指定した。
【００６５】
Ｐ２Ｙ１Ｒアゴニスト２〜４の薬物候補としての適合性を調査するために、本発明者らはその加水分解安定性を評価した。詳細には、β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ類似体２〜４の加水分解安定性を、３１Ｐ  ＮＭＲ分光法又はＨＰＬＣ−ＭＳのいずれかによって、胃液の酸性度を模した条件、すなわち、ｐＨ１．４／３７℃でモニターした。
【００６６】
以下の例４〜５に示すように、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルに基づき、これらの条件下で、化合物２は、比較的高い安定性及びその濃度に関する擬１次速度指数関数的減衰速度式を呈し、ここで、ｐＨ１．４／３７℃において測定されたその半減期は６５時間であった。同様に、ＨＰＬＣに基づいて、化合物３（異性体Ｂ）は、擬１次速度指数関数的減衰速度式を呈した（化合物３の加水分解は、スキーム３において描写されている）。化合物３Ｂについて、ｐＨ１．４／３７℃において測定された半減期は１９時間であった。同様に、同じ手法で測定された化合物４の半減期は１４．５時間であった。２及び３の加水分解速度定数は、同じ条件下（５．９時間のｔ１／２）での２−ＭｅＳ−ＡＴＰ−α−ＢＨ３の加水分解速度定数と比較して、約３〜１０倍の化学安定性の改善を表す。
【００６７】
以前、本発明者らは、化合物１はアルカリホスファターゼによる加水分解を起こしやすく、大部分が２−ＭｅＳ−ＡＭＰ−α−ＢＨ３に分解するが、少量の２−ＭｅＳ−ＡＤＰ−α−ＢＨ３も検出され得ることを見いだした。具体的には、１をアルカリホスファターゼ中、３７℃で１２分間インキュベートした後、１は４０％しか残っておらず、一方、１００分後、ＨＰＬＣ−ＭＳによって微量の１しか検出できなかった。
【００６８】
そこで、化合物２〜４のアルカリホスファターゼに対する加水分解抵抗性と１のそれを比較するために、本発明者らは、種々の類似体を酵素とともに３７℃で３０分間インキュベートした。例６に示すように、酵素反応混合物のＨＰＬＣ分析は、化合物２〜４がこれらの条件下において完全に無傷のままであることを示した。
【００６９】
治療目的のためのヌクレオシド−５’−三リン酸の使用法は、細胞外培地におけるその迅速な脱リン酸化によって限定される。合成ヌクレオチドの細胞外濃度は、エクト−ＡＴＰアーゼによる加水分解（及びエクト−ヌクレオチド二リン酸キナーゼによる合成；細胞外ＡＴＰの制御を参照）によって制御される（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、２０００；Ｙｅｇｕｔｋｉｎら、２００１及び２００２；Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉら、１９９７及び２０００）。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（２０００）に記載されている通り、４つの主なエクト−ヌクレオチダーゼのファミリー；（ｉ）エクト−ヌクレオシド５’−三リン酸ジホスホヒドロラーゼ（ｅ−ＮＴＰＤアーゼ）、（ｉｉ）エクト−ヌクレオチドピロホスファターゼ（ｅ−ＮＰＰ）、（ｉｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型エクト−５’−ヌクレオチダーゼ及び（ｉｖ）ＧＰＩアンカー型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）が同定されている。ｅ−ＮＴＰＤアーゼ１〜３は、細胞表面酵素であり、細胞外ＡＴＰをＡＤＰに及びＡＤＰをＡＭＰに分解して無機リン酸を放出し、一方、ｅ−ＮＰＰ１〜３は、ＡＴＰをＡＭＰ及びピロリン酸塩に直接加水分解する。細胞外ＡＭＰは、その後、エクト−アルカリホスファターゼによりアデノシンに分解することができる。血清は脱リン酸酵素を含有し、したがって、インビボにおいて細胞外環境の良好なモデル系を提供する。
【００７０】
ホスホン酸で修飾されたｄＮＴＰ類似体は、ヒト血清中（Ａｒｚｕｍａｎｏｖら、１９９６；Ｄｙａｔｋｉｎａら、１９９６；Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ及びＤｙａｔｋｉｎａ、１９９６）及び筋肉切片標本中（Ｃｕｓａｃｋら、１９８７）において、脱リン酸酵素に対する安定性の増強を見せた。よって、後者の標本では、６０分のインキュベーション後に、エクト−ヌクレオチダーゼによるβ，γ−ＣＨ２−ＡＴＰ及び２−ＭｅＳ−β，γ−ＣＨ２−ＡＴＰの分解は検出されず、その間にＡＴＰは完全に脱リン酸化された（Ｃｕｓａｃｋら、１９８７）。
【００７１】
ヒト血清中における化合物２〜４の半減期を測定するために、これらの化合物を、ヒト血清及びＲＰＭＩ−１６４０中、３７℃で１〜最大１４４時間インキュベートし、それらの加水分解を同じ条件下におけるＡＴＰの加水分解と比較した。例７に示すように、ＡＴＰは３．６時間の半減期でＡＤＰ及びＡＭＰに加水分解され、一方、同じ条件下において、化合物２、３Ａ及び３Ｂは、それぞれ１２．７、１４．１及び４７．１時間の半減期で、対応するヌクレオシド−一リン酸（ボラノリン酸）に大部分が加水分解された。異なる評価方法を使用して、ＡＴＰは７．７時間の半減期で加水分解され、一方、同じ条件下において、化合物４Ｂは７１．９時間の半減期で加水分解された。これらの値は、ＡＴＰの代謝的安定性の３．５〜２０倍の置換依存性増強を表す。
【００７２】
例１１に記載されている実験において、ヒト星状細胞腫細胞で発現されている式Ｉの種々の化合物のＧタンパク質共役Ｐ２ＹＲ  Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４及びＰ２Ｙ６における活性を検査した。最初に検査した化合物は化合物２〜４であり、示されている通り、化合物２及び４Ｂは、２−ＭｅＳ−ＡＤＰについての０．００４μＭと比較して、それぞれ０．０８及び１７．２μＭのＥＣ５０を有するＰ２Ｙ１Ｒのアゴニストであり、Ｐ２Ｙ６Ｒに対して１００μＭのわずかなアゴニスト作用を有していた。試験されたＰ２ＹＲにおいて化合物３Ａ、３Ｂ及び４Ａが有していた活性は、微々たるものであった。
【００７３】
化合物２は、化合物４Ｂと比較して、より強力且つ選択的なＰ２Ｙ１Ｒアゴニストであることが分かったが、関連系において２−ＭｅＳ−ＡＤＰ（ＥＣ５０  ４ｎＭ）又は２−ＭｅＳ−ＡＴＰよりも約１桁効力が弱かった（ｒＰ２Ｙ１Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞においてＥＣ５０  １ｎＭ。ＥＣ５０はＣａ２＋動員によって測定した）（Ｍａｊｏｒら、２００４）。２の比較的低減された効力は、より高いｐＫａ値のホスホネート対ホスフェート（８．４対６．５）と関係し得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９８１）。特に、アッセイ条件下、ｐＨ７．４（及び恐らく受容体結合ポケット内）では、９１％の２−ＭｅＳ−ＡＤＰ（ＡＴＰ）がイオン化されるのに対し、化合物２（ホスホネート部分）は９％しかイオン化されない。この２の低度のイオン化の結果として、以下に記載する通り、受容体との相互作用がより弱いことになる。この仮説が正しいかを評価するために、本発明者らは、次いで、Ｐ２Ｙ１Ｒにおける２−ＭｅＳ−ＡＤＰ−α，β−ＣＣｌ２（又はＣＦ２）（それぞれ１７及び１８）、２−ＭｅＳ−ＡＤＰαＢ（異性体１９Ａ）及び２−ＭｅＳ−ＡＴＰαＢ−β，γ−ＣＣｌ２（異性体２１Ａ及び２１Ｂ）のアゴニスト作用を検査した。化合物１７、１８及び２１、並びに、特にＣＦ２類似体における末端ホスホアネート（ｐｈｏｓｐｈｏａｎａｔｅ）のｐＫａ値は約６．７であり、これらの類似体は、Ｐ２Ｙ１受容体との相互作用が改善しており、よって該受容体における活性が著しく改善しているはずであることを示唆している。それにもかかわらず、例１１においてさらに示すように、これらの化合物の各１個が化合物２と比較して効力が弱く選択性が弱いＰ２Ｙ１Ｒアゴニストであることが分かった一方で、Ｐ２Ｙ１Ｒに対して最も強力且つ選択的であることが分かったのは化合物１９Ａであった（化合物１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１Ｂについて、それぞれ３．１、０．９８、０．０３８、０．５７及び１．２μＭのＥＣ５０）。
【００７４】
以前、本発明者らは、２−ＢｕＳ−ＡＴＰ：Ｐ２Ｙ１Ｒ複合体のモデルを算出し、このヌクレオチド類似体のＰβ，γがＰ２Ｙ１Ｒ結合部位内の正電荷を有するＬｙｓ２４０及びＡｒｇ１２８と相互作用することを見いだした（Ｍａｊｏｒ及びＦｉｓｃｈｅｒ、２００４）。よって、本発明者らは、化合物２のホスホネート部分のｐＫａが高いほど、Ｐ２Ｙ１Ｒ結合ポケットとの重要なイオン相互作用の喪失をもたらし得、結果的にＥＣ５０値を低減させ得ると推測している。
【００７５】
ＰＣＰ対ＰＯＰの角度及びＣ−Ｐ対Ｏ−Ｐの結合の長さにおける差異による幾何学的考察は、２対２−ＭｅＳ−ＡＤＰ（ＡＴＰ）の分子認識においても役割を果たし得るが、これらの差異は依然としてかなり小さく（それぞれ、ＰＣＰ及びＰＯＰの角度−１１７．０及び１２８．７；並びにＣ−Ｐ及びＯ−Ｐの結合の長さ−１．７９及び１．６３Å）、２の親和性及び活性を決定する主なパラメーターはホスホネート基のｐＫａ値であることを示唆している。
【００７６】
化合物３Ａ及び３Ｂが事実上不活性であったのに対し、化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１ＢがＰ２Ｙ１Ｒにおいて活性であったという事実は、２−ＭｅＳ−アデニン部分対アデニンのＰ２Ｙ１Ｒ結合ポケットとの相互作用の改善によるものであり得る（Ｍａｊｏｒら、２００４、Ｍａｊｏｒ及びＦｉｓｃｈｅｒ、２００４）。特に、Ｐ２Ｙ１ＲにおけるＡＴＰ類似体の三リン酸部分について観察された強い認識ネットワークに加えて、それよりも弱いが別の重要な相互作用のネットワークがアデニン環について観察された（Ｍａｊｏｒ及びＦｉｓｃｈｅｒ、２００４）。これらの相互作用は、受容体との親和性を改善し、受容体サブタイプ選択性を決定するため、重要である。Ｎ１、Ｎ６及びＮ７との特異的Ｈ結合相互作用は、Ａｒｇ３１０、Ｓｅｒ３１４及び恐らくＴｙｒ５８によって提供される。これらの相互作用は、Ｃ２におけるＳＭｅ基の存在下で、電子的作用により増強される。すなわち、チオメチル基はアデニンＮ１位における電子密度を増大させ、よって、Ｈ結合アクセプターにとしてのその効力を増大させる。加えて、アデニン環のＰｈｅ１３１とのπスタッキング相互作用は、Ｃ２のＳＭｅ基による置換時には、この誘導体において、アデニン環がπスタッキング電荷移動錯体における電荷供与体分子として機能するため、さらに増強される。その上、この置換基は、アデニン部分と受容体との間により強固な適合を生み出す。具体的には、化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１ＢにおけるＣ２−チオメチル基は、Ｌｅｕ１０４、Ｐｒｏ１０５、Ｉｌｅ１３０及びＬｅｕ１３５を含むＰ２Ｙ１Ｒ疎水性ポケットと疎水性相互作用を形成する。
【００７７】
本発明者らは、Ｃ２置換ＡＴＰ−α−Ｂ類似体はＰ２Ｙ２Ｒにより十分な耐性がないことを報告した（Ｔｕｌａｐｕｒｋａｒら、２００４）。２−Ｃｌ−及び２−ＭｅＳ−ＡＴＰ−α−Ｂは、Ｐ２Ｙ２Ｒにおいて非常に弱いアゴニストであることが分かった。このことを考慮しても、Ｐ２Ｙ２Ｒにおけるホスホネート２及び４Ａの不活性についての本発明者らの所見は、これらの先の報告と一致する。Ｐ２Ｙ４／６−Ｒにおける化合物２〜４の不活性は、これらの受容体がウリジンヌクレオチドアゴニストに対して選択的であるため、予期された。
【００７８】
手短に述べると、ＡＴＰ又はＡＤＰ類似体の相対的な効力は、通常、加水分解に対するそれらの抵抗性と関係している（Ａｄａｍｓ、１９９４；Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ及びＫｅｎｎｅｄｙ、１９８５；Ｅｖａｎｓ及びＫｅｎｎｅｄｙ、１９９４）ため、本発明者らは、新規非加水分解性Ｐ２Ｙ１Ｒアゴニストを開発した。化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１ＢのＥＣ５０値は、対応するリン酸類似体、２−ＭｅＳ−ＡＴＰ及び１ＡのＥＣ５０値よりも１〜３桁大きい範囲内である（Ｎａｈｕｍら、２００２；Ｍａｊｏｒら、２００４）。さらに、前者の類似体の大きな利点は、ヒト血清中及び胃液の過酷な条件におけるその著しく高い生存率である。これらの特徴は、これらの類似体を、Ｐ２Ｙ１Ｒが関与する健康障害のための魅力的且つ選択的な治療候補にする。
【００７９】
別の態様において、本発明は、一般式Ｉの化合物（ｎが０であり、Ｚ１及びＺ３がそれぞれＯ−であり、Ｗ２がＣＨ２又はＮＨである化合物、並びにｎが１であり、Ｚ１〜Ｚ３がそれぞれＯ−である化合物を除く）又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、一般式Ｉの化合物を含む、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療用の医薬組成物を提供する。そのような使用のための好ましい化合物は、化合物２、４、より好ましくは４Ｂ、１７、１８、１９、より好ましくは１９Ａ、２１Ａ及び２１Ｂ、又は薬学的に許容されるその塩を含む。
【００８１】
Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害は、癌、血小板凝集に関連する障害、心臓血管疾患若しくは障害、粘液の水和、分泌及び排泄の障害に関連する疾患、又は２型糖尿病であり得る。
【００８２】
一般式Ｉの化合物によって治療され得る癌の種類は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、前立腺癌、脳腫瘍、結腸癌、卵巣癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、食道癌及び膀胱癌であり得るがこれらに限定されない。
【００８３】
心臓血管疾患又は障害は、虚血／再灌流損傷、心筋梗塞及び長期心不全であり得るがこれらに限定されない。
【００８４】
粘液の水和、分泌及び排泄の障害に関連する疾患は、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、気管支炎、嚢胞性線維症、原発性線毛機能不全、副鼻腔炎、中耳炎、ドライアイ疾患、緑内障、鼻涙管閉塞、浮腫性網膜障害、網膜変性、膣の乾燥、口内乾燥、胃食道逆流及び便秘を含むがこれらに限定されない。
【００８５】
前述のＷＯ０３／０３４９７８において開示されている通り、ＡＴＰ類似体のボラノリン酸等価体に基づく選択的Ｐ２Ｙ１Ｒアゴニストは、灌流ラット膵臓における極めて強力なインスリン分泌促進物質であることが分かっており、ここで、最も有効なアゴニストは、２−ＭｅＳ−ＡＴＰ−α−Ｂ、１であり、これは、２８ｎＭのＥＣ５０を有する基礎分泌と比較して、９倍のインスリン分泌増強を引き起こした。よって、高度に選択的なＰ２Ｙ１Ｒアゴニストである一般式Ｉの化合物、好ましくは化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１Ｂを含む医薬組成物は、２型糖尿病の治療用のインスリン分泌促進物質として使用され得る。
【００８６】
よって、好ましい実施形態において、Ｐ２Ｙ受容体によって調節される疾患又は障害は、２型糖尿病である。
【００８７】
疼痛もＰ２Ｙ１受容体によって少なくとも部分的に調節されるため、一般式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、疼痛管理のためにさらに使用され得る。
【００８８】
一般式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５において記載されている通りの従来の技術によって調製できる。組成物は、従来の形態、例えば、カプセル剤、錠剤、液剤又は懸濁剤、乳剤、クリーム、噴霧剤等で出現し得る。
【００８９】
投与経路は、活性化合物を適切な又は望ましい作用部位へ有効に輸送する任意の経路であってよく、経口経路が好ましい。固体担体が経口投与に使用される場合、製剤は錠剤化され、粉末又はペレット形態で硬ゼラチンカプセル剤に入れられてよく、又は舐剤の形態であってよい。液体担体が使用される場合、製剤は、シロップ剤、乳剤又は軟ゼラチンカプセル剤の形態であってよい。タルク及び／又は炭水化物担体又は結合剤等を有する錠剤、糖衣丸又はカプセル剤は、経口適用に特に適している。錠剤、糖衣丸又はカプセル剤に好ましい担体は、ラクトース、コーンスターチ及び／又はジャガイモデンプンを含む。
【００９０】
さらなる態様において、本発明は、必要とする個体における、２型糖尿病又は疼痛等のＰ２Ｙ受容体によって調節される疾患、障害又は状態の治療方法であって、前記個体に、有効量の一般式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。
【００９１】
ここで、下記の非限定的な例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００９２】
実験
概略
空気及び水分感受性の反応はすべて、ゴム隔膜で密閉された、火炎乾燥しアルゴンフラッシュした二口フラスコ内で行い、試薬はシリンジを用いて導入した。反応の進行を、プレコートしたＭｅｒｃｋシリカゲルプレート（６０Ｆ−２５４）上でのＴＬＣによってモニターした。ＵＶ光によって可視化を達成した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−３００、ＤＭＸ−６００又はＡＣ−２００分光計を使用する核磁気共鳴により、化合物を特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、２００、３００又は６００ＭＨｚで計測した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＣ−２００及びＤＭＸ−６００分光計上で８５％のＨ３ＰＯ４を外部標準として使用する、Ｄ２Ｏ中での３１Ｐ  ＮＭＲにより、ヌクレオチドも特徴付けた。高分解能質量スペクトルは、化学イオン化により、オートスペック−Ｅ  ＦＩＳＩＯＮ  ＶＧ質量分析計で記録した。ヌクレオチドは、Ｑ−ＴＯＦマイクロ機器（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＫ）上でのＥＳＩ（エレクトロンスプレーイオン化）で分析した。ヌクレオチドの一次精製は、１ＭのＮａＨＣＯ３中、４℃で１日間膨張させたセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５のカラムを使用するＬＣ（Ｉｓｃｏ  ＵＡ−６）システムで遂行した。樹脂は、使用前に脱イオン水で洗浄した。ＬＣ分離を、２８０ｎｍのＵＶ検出によりモニターした。緩衝液勾配０〜０．８ＭのＮＨ４ＨＣＯ３（５００ｍｌの水：５００ｍｌの緩衝液）を適用した。ヌクレオチドの最終精製及びジアステレオマー対の分離は、半分取逆相カラム（Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０．００ｍｍ、５ミクロン、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用するＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ−日立）システムで遂行した。ヌクレオチドの純度は、以下に記載する通りの２つの溶媒系中、分析用逆相カラムシステム（Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕ、Ｃ−１８、１１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ、５ミクロン、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で評価した。
【００９３】
市販の試薬はすべて、特に断りのない限り、さらに精製することなく使用した。水分感受性の反応におけるすべての反応物質は、真空オーブン内で終夜乾燥させた。ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０緩衝液は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。２’，３’−Ｏ−メトキシメチリデンアデノシン誘導体は、Ｎａｈｕｍら（２００２）によって記載されている通りに調製した。２’，３’−Ｏ−メトキシメチリデン−２−ＭｅＳ−アデノシンは、シリカゲルカラム（２５＋Ｍカラム）及び下記の勾配スキームを流速１２．５ｍｌ／分で使用するＭＰＬＣシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｋｕｎｇｓｇａｔａｎ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で分離した：３カラム体積（ＣＶ）の１００：０の（Ａ）ＣＨＣｌ３（Ａ）：（Ｂ）ＥｔＯＨ、５ＣＶの１００：０〜９０：１０のＡ：Ｂの勾配及び４ＣＶの９０：１０のＡ：Ｂ。化学安定性の評価及びｐＨ計測は、ＯｒｉｏｎマイクロコンビネーションｐＨ電極及びＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｐＨ計測器を用いて実施した。
【００９４】
細胞内カルシウム計測
シチメンチョウＰ２Ｙ１、ヒトＰ２Ｙ２、ヒトＰ２Ｙ４又はラットＰ２Ｙ６を安定発現しているヒト１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞を、５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ−４１８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地中で成長させた。細胞内遊離カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉにおける変化を、前述した通り、フラ−２を充填した細胞懸濁液の二重励起蛍光分光分析によって検出した（Ｇａｒｒａｄら、１９９８；Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）。１ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＭのヘペス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で細胞をアッセイした。微量遠心管中で細胞を沈殿させ、２ｍｌの緩衝液に再懸濁させた。濃度応答データを、プリズム曲線当てはめプログラム（ＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により分析した。３つの実験は、各Ｐ２Ｙ受容体サブタイプについて別の日に実行した。
【００９５】
（例１）
β，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−アデノシン−５’−三リン酸、２の合成
β，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−アデノシン−５’−三リン酸、２は、スキーム１に描写され、以下に記載されている通りの２つの方法によって調製した。
【００９６】
方法Ａ．ビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩を上記で記載した通りに調製した。１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（１１７ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１．５当量）を、Ｎ２下、火炎乾燥した二口フラスコ内のトリメチルリン酸（２ｍｌ）中の２’，３’−Ｏ−メトキシメチリデン−２−ＭｅＳ−アデノシン、５ａ（１３０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）に０℃で添加し、透明な溶液になるまで２０分間反応物を撹拌した。ＰＯＣｌ３（６７μｌ、１．０９ｍｍｏｌ、３当量）を０℃で添加した。溶液を０℃で３時間撹拌した。乾燥ＤＭＦ（４．３ｍｌ）中のビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩の０．５Ｍ溶液（３８６ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、６当量）及びトリブチルアミン（３６０μｌ、１．４６ｍｍｏｌ、４当量）を０℃で添加し、反応混合物を１．６分間撹拌した。酢酸アンモニウムの０．２５Ｍ溶液（１０ｍｌ）を室温で添加し、反応混合物を３０分間撹拌し、次いで凍結乾燥させた。得られた残留物を、活性化したセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５カラム（０〜０．８ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、全容積１ｌ）に塗布した。関連画分を収集し、凍結乾燥させ、脱イオン水を用いる凍結乾燥の繰り返しによって過剰なＮＨ４ＨＣＯ３を除去して、生成物８ａを白色固体として得た。生成物５を、ｐＨ２．３になるまで１８％のＨＣｌ溶液で処理し、次いで室温で３時間撹拌した。最後に、混合物を２４％のＮＨ４ＯＨ溶液で処理し、ｐＨを９に調整した。溶液を４５分間撹拌し、次いで凍結乾燥させた。残留物をＨＰＬＣカラム上で分離して、純粋な２を得た。分離は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａカラム（２５０×１０．００ｍｍ、５ミクロン）及び８５：１５の（Ａ）１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７〜（Ｂ）ＭｅＯＨを流速５ｍｌ／分で適用することにより溶媒系Ｉを使用する定組成溶離を使用して達成した。関連画分（保持時間＝１２．０９分）を凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰な緩衝液を除去し、固体残留物を毎回脱イオン水に溶解した。最後に、純粋生成物１をセファデックス−ＣＭ  Ｃ−２５  Ｎａ＋型カラムに通過させることにより、ヌクレオチドトリエチルアンモニウム対イオンをＮａ＋イオンと交換した。ＬＣ分離後、生成物２が１０％（２３ｍｇ）の収率で得られた。半分取カラム上での保持時間：１２．０９分。２についてのスペクトルデータは、Ｍｏｈａｍａｄｙ及びＪａｋｅｍａｎ（２００５）によって記載されているデータと一致していた。
【００９７】
方法Ｂ：ビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩を上記で記載した通りに調製した。１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（４１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、２当量）を、Ｎ２下、火炎乾燥した二口フラスコ内のトリメチルリン酸（１ｍｌ）中の２−ＭｅＳ−アデノシン、５ｂ（３０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）に０℃で添加し、透明な溶液になるまで２０分間反応物を撹拌した。ＰＯＣｌ３（２６μｌ、０．２８ｍｍｏｌ、３当量）を０℃で添加した。溶液を０℃で２時間撹拌した。乾燥ＤＭＦ（４８０μｌ）中のビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩の１Ｍ溶液（１０１ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、６当量）及びトリブチルアミン（９１μｌ、０．３８ｍｍｏｌ、４当量）を０℃で添加し、反応混合物を１．６分間撹拌した。次いで、０．５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）溶液（１０ｍｌ）を室温で添加し、反応混合物を３０分間撹拌し、次いで凍結乾燥させた。得られた残留物を、活性化したセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５カラム（０〜０．８ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、全容積１ｌ）に塗布した。関連画分を収集し、凍結乾燥させ、脱イオン水を用いる凍結乾燥の繰り返しによって過剰なＮＨ４ＨＣＯ３を除去して、生成物２を白色固体として得た。残留物をＨＰＬＣカラム上で分離して、純粋な２を得た。分離は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａカラム（２５０×１０．００ｍｍ、５ミクロン）及び流速５ｍｌ／分で２０分間にわたる勾配（９２：８〜７０：３０のＡ：Ｂ）の溶媒系Ｉ（上記を参照）を使用して達成した。関連画分（保持時間＝１１．９４分）を凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰な緩衝液を除去し、固体残留物を毎回脱イオン水に溶解した。最後に、純粋生成物１をセファデックス−ＣＭ  Ｃ−２５  Ｎａ＋型カラムに通過させることにより、ヌクレオチドトリエチルアンモニウム対イオンをＮａ＋イオンと交換した。ＬＣ分離後、生成物２が１０％（１１ｍｇ）の収率で得られた。２についてのスペクトルデータは、Ｍｏｈａｍａｄｙ及びＪａｋｅｍａｎ（２００５）によって記載されているデータと一致していた。
【００９８】
（例２）
アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、３の合成、分離及び特徴付け
アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、３の合成
ビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩は、Ｂｕ３Ｎ（２当量）をＥｔＯＨ中のメチレンジホスホン遊離酸に添加し、室温で２時間撹拌し、続いて減圧下で溶媒を除去して白色固体を得ることによって調製した。スキーム２で描写される通り、２’，３’−Ｏ−メトキシメチリデンアデノシン、９（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、火炎乾燥した二口フラスコ内のトリメチルリン酸（２．５ｍｌ）に溶解した。１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（１３８ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、２当量）を０℃で添加し、透明な溶液になるまで２０分間反応物を撹拌した。ＰＣｌ３（５６μｌ、０．６５ｍｍｏｌ、２当量）を０℃で添加すると、白色固体が沈殿した。懸濁液を０℃で３０分間撹拌した。次いで、乾燥ＤＭＦ（１．８ｍ）中のビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート塩の１Ｍ溶液（６４２ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ、６当量）及びトリブチルアミン（３０８μｌ、１．２９ｍｍｏｌ、４当量）を０℃で添加し、反応混合物を１１分間撹拌した。ＴＨＦ中のＢＨ３・ＳＭｅ２錯体の２Ｍ溶液（２．２ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ、１０当量）を０℃で添加すると、反応混合物は透明になった。溶液を０℃で５分間、次いで室温で３０分間撹拌した。最後に、０．５ＭのＴＥＡＢ溶液（１０ｍｌ）を室温で添加し、混合物を６０分間撹拌し、次いで凍結乾燥させた。得られた残留物を、活性化したセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５カラム（０〜０．８ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、全容積１ｌ）に塗布した。関連画分を収集し、凍結乾燥させ、脱イオン水を用いる凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰なＮＨ４ＨＣＯ３を除去した。生成物１３ａが白色固体として得られた。生成物１３ａを、ｐＨ２．３になるまで１８％のＨＣｌ溶液で処理し、次いで室温で３時間撹拌した。最後に、混合物を２４％のＮＨ４ＯＨ溶液で処理し、ｐＨを９に調整した。溶液を室温で４５分間撹拌し、次いで凍結乾燥させた。生成物３のジアステレオマー対を、以下に記載する条件下、ＨＰＬＣカラム上で分離した。最後に、精製された異性体３Ａ及び３Ｂをセファデックス−ＣＭ  Ｃ−２５Ｎａ＋型カラムに通過させて、トリエチルアンモニウム対イオンをＮａ＋イオンと交換した。
【００９９】
アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、３の分離
３のジアステレオマー対の分離は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０．００ｍｍ、５ミクロン）及び８９：１１のＡ：Ｂ、流速５ｍｌ／分で溶媒系Ｉ（例１を参照）を使用する定組成溶離を使用して達成し、続いて、２個のジアステレオ異性体の最終分離は、流速１ｍｌ／分で２０分間にわたる９０：１０〜７０：３０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系Ｉ（例１を参照）を適用することにより分析用Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ）を使用して達成した。同じ異性体［保持時間＝６．３３分（異性体Ａ）、７．７３分（異性体Ｂ）］を含有する画分を収集し、凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰な緩衝液を除去し、固体残留物を毎回脱イオン水に溶解した。ＬＣ分離後、ジアステレオ異性体３Ａ及び３Ｂが３６％（６６ｍｇ）の全収率で得られた。
【０１００】
アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、３Ａの特徴付け
半分取カラム上での保持時間：７．６４分。
【化４】
2011504489.tif 000005
ＴＬＣ（ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ：イソプロパノール  ２：８：１１）、Ｒｆ＝０．２３。分析用カラム上で得られた純度データ：流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる９０：１０〜７０：３０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系Ｉ（例１を参照）を使用して、保持時間：３．５５分（純度１００％）。溶媒系ＩＩ、流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる９０：１０〜８０：２０の（Ａ）０．０１ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝４．５〜（Ｂ）ＭｅＯＨの勾配を使用して、保持時間：２．５３分（純度９５．５％）。
【０１０１】
アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、３Ｂの特徴付け
半分取カラム上での保持時間：９．６７分。
【化５】
2011504489.tif 000006
ＴＬＣ（ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ：イソプロパノール  ２：８：１１）、Ｒｆ＝０．２３。分析用カラム上で得られた純度データ：流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる９０：１０〜７０：３０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系Ｉ（例１を参照）を使用して、保持時間：４．０９分（純度９２．６％）。流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる９５：１０〜８０：２０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系ＩＩ（上記を参照）を使用して、保持時間：３．６６分（純度９５．５％）。
【０１０２】
（例３）
２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、４の合成、分離及び特徴付け
２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、４の合成
生成物４は、生成物３について例２に記載され、以下のスキーム２で描写されるのと同じ手法で、ＬＣ分離後、２８％の全収率で５ａから得られた。
【０１０３】
２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、４の分離
４のジアステレオ異性体の分離は、半分取逆相Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、２５０×１０．００ｍｍ、５ミクロン）及び７５：２５のＡ：Ｂ、流速５ｍｌ／分で溶媒系Ｉ（例１を参照）を適用することにより定組成溶離を使用して達成した。２個のジアステレオ異性体の最終分離は、分析用Ｇｅｍｉｎｉ  ５ｕカラム（Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６ｍｍ）及び流速１ｍｌ／分で２０分間にわたる８２：１８〜７４：２６のＡ：Ｂの勾配の溶媒系Ｉ（例１を参照）を使用して遂行した。同じ異性体［保持時間＝９．７９分（異性体Ａ）、１１．５３分（異性体Ｂ）］を含有する画分を収集し、凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰な緩衝液を除去し、固体残留物を毎回脱イオン水に溶解した。ＬＣ分離後、ジアステレオ異性体４Ａ及び４Ｂが２８％（３８ｍｇ）の全収率で得られた。
【０１０４】
２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、４Ａの特徴付け
半分取カラム上での保持時間：５．２９分。
【化６】
2011504489.tif 000007
ＴＬＣ（ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ：イソプロパノール  ２：８：１１）、Ｒｆ＝０．４４。分析用カラム上で得られた純度データ：流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる８０：２０〜６０：４０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系Ｉ（例１を参照）を使用して、保持時間：４．２４分（純度９４．３％）。流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる７５：２５〜６５：３５のＡ：Ｂの勾配の溶媒系ＩＩ（例２を参照）を使用して、保持時間：２．９９分（純度９９．５％）。
【０１０５】
２ＭｅＳ−アデノシン−β，γ−ＣＨ２−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）、４Ｂの特徴付け
半分取カラム上での保持時間：５．５７分。
【化７】
2011504489.tif 000008
ＴＬＣ（ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ：イソプロパノール  ２：８：１１）、Ｒｆ＝０．４４。流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる７０：３０〜４０：６０のＡ：Ｂの（Ａ）１００ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７〜（Ｂ）ＣＨ３ＣＮの勾配を使用して、保持時間：２．１２分（純度９４％）。流速１ｍｌ／分で１０分間にわたる５０：５０〜４０：６０のＡ：Ｂの勾配の溶媒系ＩＩ（例２を参照）を使用して、保持時間：１．３８分（純度１００％）。
【０１０６】
（例４）
３１Ｐ  ＮＭＲによって評価した化合物２の化学安定性
ｐＨ１．４及び３７℃における２の安定性を３１Ｐ  ＮＭＲによって評価して、生じ得る脱リン酸化生成物をモニターした。化合物２（１．５ｍｇ）を０．２ＭのＨＣｌ／ＫＣｌ（０．３５ｍｌ）及びＤ２Ｏ（４０μｌ）に溶解した。０．２ＭのＨＣｌ（２０μｌ）を添加することにより、最終ｐＨを１．４に調整した。溶液を３７℃の油浴中で維持した。スペクトルを１２時間間隔で１１日間記録した。すべての実験におけるスキャン数は５００であった。リン酸エステル加水分解の割合は、β，γ−ＣＨ２−２ＭｅＳ−ＡＴＰのＰαシグナル（−１０．５ｐｐｍ）及び加水分解生成物２ＭｅＳ−ＡＭＰ、９のＰαシグナル（０．７ｐｐｍ）の積分に基づく。それぞれのＮＭＲシグナルの積分における変化を時間とともに計測することにより、加水分解率を決定した。
【０１０７】
図１Ａに示すように、これらの条件下で、化合物２は比較的高い安定性を呈した。特に、出発材料２に加えて、時間とともに２−ＭｅＳ−ＡＭＰの量の増加が観察された。よって、０ｐｐｍのシグナル（２−ＭｅＳ−ＡＭＰのＰα）が次第に現れ、一方で、−１１ｐｐｍのシグナル（２のＰα）が時間とともに減少した。２−ＭｅＳ−ＡＭＰのＰαの３１Ｐ  ＮＭＲシグナルの時間に伴う強度変化を（β，γ−ＣＨ２−２−ＭｅＳ−ＡＴＰ及び２−ＭｅＳ−ＡＭＰの全Ｐα積分の割合として）、２の濃度に関する擬１次速度指数関数的減衰速度式に当てはめた。２についてｐＨ１．４／３７℃で測定された半減期は、図１Ｂに示す通り、６５時間であった。
【０１０８】
（例５）
ＨＰＬＣによって評価した化合物３及び４の化学安定性
３７℃の適切な緩衝溶液（０．２ＭのＨＣｌ／ＫＣｌ、ｐＨ＝１．４）中における３（異性体Ｂ）の安定性を、７〜１７時間間隔で５日間のＨＰＬＣ−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳによって評価し、時間に伴う３ＢピークのＨＰＬＣ積分変化に基づくその加水分解率を、図２Ａ〜２Ｂに示す通り、擬１次速度指数関数的減衰速度式に当てはめた。３Ｂに加えて、スキーム３で描写される通り、分解生成物６、７及び８が加水分解混合物中で同定された。例えば、１９時間後、５０％の３Ｂが分解されて、３７％のＡＭＰ−α−Ｂ及びＡＭＰ−α−Ｈ（それぞれ６及び７。いずれも同じ保持時間で出現するが、ＭＳはこれらの化合物の識別を可能にした）並びに１３％のアデノシン（図２Ａ）が生じた。時間に伴う加水分解混合物の組成変化を図２Ｃに描写する。３Ｂの半減期は１９時間であった。
【０１０９】
３７℃の適切な緩衝溶液（ｐＨ＝１．４）中における４（異性体Ｂ）の安定性をＨＰＬＣによって評価して、生じ得る脱リン酸化生成物をモニターした。化合物４（１．６ｍｇ）を０．２ＭのＨＣｌ／ＫＣｌ緩衝液（０．４ｍｌ）に溶解し、０．２ＭのＨＣｌ（１５μｌ）を添加することにより、最終ｐＨを１．４に調整した。溶液を３７℃の油浴中で維持し、Ｇｅｍｉｎｉ分析用カラム（５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ）及び流速１ｍｌ／分で１５分間にわたる８９：１１のＡ：Ｂ、次いで２０分間にわたる８２：１８〜７４：２６のＡ：Ｂの溶媒系Ｉ（例１を参照）での勾配溶離を使用するＨＰＬＣ−ＭＳによってその組成を分析した。１２時間間隔で５日間、検体を採取した。分解生成物６、７及び８のＨＰＬＣピークの積分における変化を時間とともに計測することにより、４の加水分解率を決定した。図２Ｃに示すように、化合物４Ｂの半減期は１４．５時間であった。
【０１１０】
（例６）
アルカリホスファターゼに対する化合物２〜４の酵素安定性
酵素活性は、ＵＶ−可視分光光度計を４０５ｎｍで使用し、ヌクレオチド誘導体からのｐ−ニトロフェノールの放出により計測した。酵素加水分解に対するヌクレオチドの相対活性及び抵抗性は、３７℃で測定した。手短に述べると、３２．５μｌのヌクレオチド誘導体（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ及び０．１ＭのＭｇＣｌ２中７７μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）及び６μｌの脱イオン水を、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ、１ユニット／μｌ、３７℃で６．２５μｌ。最終ｐＨ＝９．８）とともにインキュベートした。３０分後、８０℃における３０分間のインキュベーションにより、反応を停止させた。ヌクレオチド誘導体の安定性をＨＰＬＣによって評価して、生じ得る脱リン酸化生成物をモニターした。混合物を、流速１ｍｌ／分で２０分間にわたる、３Ａ及び３Ｂについては９０：１０〜７０：３０のＡ：Ｂ、４Ａ、４Ｂ及び２については８２：１８〜５０：５０の溶媒系Ｉ（例１を参照）での勾配溶離を使用するＧｅｍｉｎｉ分析用カラム（５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ）上で分離した。それぞれのＨＰＬＣピークの積分における変化を時間とともに計測することにより加水分解率を決定し、また観察される通り、類似体２〜４はこれらの条件下において完全に無傷のままであった。
【０１１１】
（例７）
ヒト血清中におけるＡＴＰ及び化合物２〜４の安定性
ヒト血清の調製：健康な志願者から採取した血液を血液バンク（Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ  ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｉｓｒａｅｌ）から入手し、４℃で１２時間保存し、プラスチックチューブ中、１５００ｇ、室温で１５分間遠心分離した。血清を分離し、−８０℃で保存した。
【０１１２】
ヒト血清中における２〜３の安定性の評価、方法Ａ
脱イオン水中４０ｍＭのヌクレオチド誘導体溶液（４．５μｌ）、ヒト血清（１８０μｌ）及びＲＰＭＩ−１６４０（５４０μｌ）を含有するアッセイ混合物を、３７℃で１、４、８、１６、２４、４８、７２及び９６時間インキュベートした。次いで、検体を０．６Ｍの塩酸（４３０μｌ）で処理し、２分間遠心分離し（１３，０００ｇ、４℃）、４ＭのＫＯＨの添加によって中和し、２分間遠心分離し（１３，０００ｇ、４℃）、凍結乾燥させた。生じ得る脱リン酸化生成物をモニターするために、ヌクレオチドの安定性をＨＰＬＣによって評価した。混合物を、勾配溶離［０．０１ＭのＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ＝４．５（Ａ）／アセトニトリル（Ｂ）、２、３Ａ及び３Ｂについては１００：０→６０：４０のＡ：Ｂ、２０分間；ＡＴＰについては１００：０→９５：５のＡ：Ｂ、１０分間］及び流速１ｍｌ／分のＧｅｍｉｎｉ分析用カラム（５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ）上で分離した。それぞれのＨＰＬＣピークの積分における変化を時間とともに計測することにより、加水分解率を決定した。
【０１１３】
ヒト血清中における４の安定性の評価、方法Ｂ
脱イオン水中４０ｍＭのヌクレオチド誘導体溶液（４．５μｌ）、ヒト血清（１８０μｌ）及びＲＰＭＩ−１６４０（５４０μｌ）を含有するアッセイ混合物を、３７℃で１、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間インキュベートした。次いで、検体を８０℃に３０分間加熱し、ＣＭセファデックス（１〜２ｍｇ）で２時間処理し、６分間遠心分離し（１２，０００ｒｐｍ）、クロロホルム（２×５００μｌ）で抽出した。水層を凍結乾燥させた。生じ得る脱リン酸化生成物をモニターするために、ヌクレオチドの安定性をＨＰＬＣによって評価した。混合物を、勾配溶離［４Ａ及び４Ｂについては、１００ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７（Ａ）／ＭｅＯＨ（Ｂ）、７９：２１のＡ：Ｂ、１５分間；ＡＴＰについては、１００ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７（Ａ）／アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｙｌ）（Ｂ）、Ａ：Ｂ、１０分間、１００：０→９０：１０のＡ：Ｂ、１０分間、９０：１０→８０：２０のＡ：Ｂ、４分間、８０：２０のＡ：Ｂ、１分間］及び流速１ｍｌ／分のＧｅｍｉｎｉ分析用カラム（５ｕ  Ｃ−１８  １１０Ａ、１５０×４．６０ｍｍ）上で分離した。それぞれのＨＰＬＣピークの積分における変化を時間とともに計測することにより、加水分解率を決定した。
【０１１４】
図３に示すように、ＡＴＰは３．６時間の半減期でＡＤＰ及びＡＭＰに加水分解され（方法Ａ）、一方、同じ条件下において、化合物２、３Ａ及び３Ｂは、それぞれ１２．７、１４．１及び４７．１時間の半減期で、対応するヌクレオシド−一リン酸（ボラノリン酸）に大部分が加水分解された（化合物２の加水分解率に関するデータを図４Ａ〜４Ｃに示す）。化合物４Ｂは、７１．９時間の半減期で加水分解され（方法Ｂ）、一方、同じ条件下において、ＡＴＰは７．７時間の半減期で加水分解された。これらの値は、ＡＴＰの代謝的安定性の３．５〜２０倍の置換依存性増強を表す。
【０１１５】
（例８）
２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジハロゲノメチレン−二リン酸、１７〜１８の合成
２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジクロロメチレン−二リン酸及び２−ＭｅＳ−アデノシン−５’−ジフルオロメチレン−二リン酸、それぞれ１７及び１８を調製するために、最初に５’−Ｏ−トシル−２’，３’−Ｏ−アセトニド−２ＭｅＳ−アデノシン、１６を、スキーム４で描写され、以下に記載する通りに調製した。
【０１１６】
２’，３’アセトニド−２−ＭｅＳ−アデノシン、１５（Ｎａｈｕｍら、２００２）（９７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、火炎乾燥した二口フラスコ内の乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解した。乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）中のＤＭＡＰの溶液（１３４ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、４当量）及び乾燥ジクロロメタン（０．５ｍｌ）中のＴｓＣｌの溶液（１５６ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、得られた溶液を、Ｎ２下、室温で１２時間撹拌した。反応物をジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を除去し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて白色固体を得、これを、シリカゲルカラム［２５＋Ｍカラム、下記の勾配スキームを使用：流速２５ｍｌ／分で、ＣＨＣｌ３（Ａ）：ＥｔＯＨ（Ｂ）、０：０、３ＣＶ、Ａ：Ｂ、ＣＨＣｌ３（Ａ）：ＥｔＯＨ（Ｂ）、０：０→０：１０、５ＣＶ、Ａ：Ｂ、ＣＨＣｌ３（Ａ）：ＥｔＯＨ（Ｂ）、１０：０、４ＣＶ］を使用するＭＰＬＣシステム上で分離した。化合物１６が５２％の収率で得られた。
【化８】
2011504489.tif 000009
【０１１７】
次いで、化合物１６（４２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、火炎乾燥した二口フラスコ内の乾燥ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解した。乾燥ＤＭＦ（０．３ｍｌ）中のトリス（テトラブチルアンモニウム）ジハロゲンメチレンジホスホネート（ｄｉｈａｌｏｇｅｎｅｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）の溶液（０．１６ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を室温で７２時間撹拌した。ＴＦＡ原液（２ｍｌ）を添加し、反応物を、Ｎ２通気下、室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して黄色固体を得、これを、活性化したセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５カラム（０〜０．３ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、全容積１．４ｌ）上で分離した。化合物１７又は１８のいずれかを含有する関連画分を収集し、凍結乾燥させ、脱イオン水を用いる凍結乾燥サイクルの繰り返しによって過剰なＮＨ４ＨＣＯ３を除去した。
【０１１８】
（例９）
２−ＳＭｅ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸、１９の合成、分離及び特徴付け
スキーム５で描写される通り、２’，３’−メトキシメチリデンヌクレオシド（４９０．４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を、アルゴン下、火炎乾燥し隔膜で密閉したフラスコ内のＤＭＦ（３ｍｌ）／ピリジン（０．６ｍｌ、５当量）に溶解した。次いで、ジオキサン（１ｍｌ）中のサリチルホスホクロリダイトの新たに調製した溶液（３０７ｍｇ、１．１当量）を、シリンジを介してフラスコに移した。室温で１０分間撹拌後、ＤＭＦ中のビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の新たに調製した１Ｍ溶液（２．１ｍｌ、１．５当量）及びトリ−ｎ−ブチルアミン（１．３ｍｌ、４当量）を、隔膜を通して同時に注入した。ＴＨＦ中のＢＨ３：ＳＭｅ２錯体の２Ｍ溶液（７ｍｌ、１０当量）をフラスコに添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、エチレンジアミン（０．５ｍｌ、５当量）を、シリンジによってフラスコに注入した。６０分間撹拌後、脱イオン水（４ｍｌ）をフラスコに添加した。１０分後、反応混合物を蒸発させた。残留物を脱イオン水によって希釈し、エチルエーテルで抽出した。次いで、水層を凍結乾燥させ、得られた残留物を、活性化したセファデックスＤＥＡＥ−Ａ２５カラム（０〜０．４ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、全容積９００ｍｌ）に塗布した。関連画分を収集し、凍結乾燥させ、脱イオン水を用いる凍結乾燥の繰り返しによって過剰なＮＨ４ＨＣＯ３を除去して、化合物１９をアンモニウム塩として得た。メトキシメチリデン保護基を酸加水分解によって除去した（ｐＨ２．３に達するまで１０％のＨＣｌ溶液を添加した）。室温で３時間後、ＮＨ４ＯＨ溶液（ｐＨ１１）の添加によってｐＨを９まで迅速に上昇させ、溶液を室温で４０分間維持した。ＬＣ分離後、化合物１９が４６％の収率で得られた。ジアステレオ異性体の最終精製及び分離は、ＨＰＬＣ、ＴＥＡＡ：アセトニトリル  ８８：１２を用いる定組成溶離によって遂行した。
【０１１９】
２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸、１９Ａの特徴付け
保持時間：８．０７３分。
【化９】
2011504489.tif 000010
分析用カラム上で得られた純度データ：溶媒系ＩＩＩ（１００ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７（Ａ）／アセトニトリル（Ｂ）、８８：１２のＡ：Ｂ、流速１ｍｌ／分）を使用して、保持時間：４．１１３分（純度９８％）。溶媒系ＩＶ（０．０１ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５（Ａ）／アセトニトリル（Ｂ）、９０：１０のＡ：Ｂ流速１ｍｌ／分）を使用して、保持時間：３．１５８分（純度９８．５％）。
【０１２０】
２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸、１９Ｂの特徴付け
保持時間：９．１２７分。
【化１０】
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分析用カラム上で得られた純度データ：溶媒系ＩＩＩ（上記を参照）を使用して、保持時間：４．７２０分（純度９５％）。溶媒系ＩＶ（上記を参照）を使用して、保持時間：３．７６４分（純度９４％）。
【０１２１】
（例１０）
アルカリホスファターゼに対する及びヒト血清中における、２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸、１９の安定性
アルカリホスファターゼに対する化合物１９（異性体Ａ）の安定性を、例６に記載されている通りに計測し、そのｔ１／２は、ＡＤＰについては４時間であるのに対し、約６時間であることが分かった。
【０１２２】
加えて、この化合物の安定性をヒト血清中において計測し、判明したところでは、この化合物は、ＡＤＰについては約２時間であるのに対し、２４時間超の半減期で加水分解された。詳細には、２４時間後に加水分解された化合物の割合は、約２５〜４０％だけであった。
【０１２３】
（例１１）
Ｐ２Ｙ１／６受容体の潜在的なアゴニストとしての化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１Ａ及び２１Ｂ
化合物２、４Ｂ、１７、１８、１９Ａ、２１（異性体Ａ及びＢ）の活性を、ヒト１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞で発現されているＧタンパク質共役Ｐ２ＹＲ、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４及びＰ２Ｙ６において、上記の実験に記載されている通り、細胞内カルシウム計測に基づいて検査した。詳細には、化合物２、４Ｂ及び１９の活性はＰ２Ｙ１Ｒ、Ｐ２Ｙ２Ｒ、Ｐ２Ｙ４Ｒ及びＰ２Ｙ６Ｒにおいて検査し、化合物１７、１８及び２１の活性はＰ２Ｙ１Ｒのみにおいて検査した。実験は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ−Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ、ＵＳＡのＧａｒｙ  Ａ．Ｗｅｉｓｍａｎ教授によって実行された。
【０１２４】
以下の表１に示すように、化合物１９Ａは、２−ＭｅＳ−ＡＤＰについては０．００４μＭであるのと比較して、０．０３８μＭのＥＣ５０を有する、最も強力且つ選択的なＰ２Ｙ１Ｒのアゴニストであることが分かった。化合物２及び４Ｂは、それぞれ０．０８及び１７．２μＭのＥＣ５０を有するＰ２Ｙ１Ｒのアゴニストであり、Ｐ２Ｙ６Ｒに対して１００μＭのわずかなアゴニスト作用を有していた。化合物１７、１８、２１Ａ及び２１Ｂは、それぞれ３．１、０．９８、０．５７及び１．２μＭのＥＣ５０を有するＰ２Ｙ１Ｒのアゴニストであった。
【表１】
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【０１２５】
（例１２）
インスリン分泌促進物質としての本発明の化合物の効能のインビボ研究
パラダイム
この実験の目的は、カニューレを挿入したウィスター系ラットへのグルコースの単回経口強制飼養（経口）投与後の、インスリン分泌増強分子としての本発明の化合物の効能を、カニューレを挿入したラット細静脈内へのカニューレを介する試験化合物投与後の血中グルコース及びインスリンレベルを計測することにより、インビボで研究することである。
【０１２６】
合計約４０匹の健康な１０〜１３週齢ウィスター系ラットを使用する。動物を処置開始前に少なくとも４日間気候順化させ、薬用でない市販の滅菌げっ歯類飼料を自由に摂食させる。飲料用水道水は自由に利用可能とする。
【０１２７】
処置の約４８時間前、ラットを計量し、重量が均一な個体群（動物の約９０％）を挿管用にする。詳細には、２．５％イソフルラン９７．５％乾燥空気吸入によって動物に麻酔をかけ、Ｐ５２カニューレを外科的に挿入し、頸静脈内に固定し、挿管後（及びその後は、各血液収集の直後）に０．３〜０．５ｍｌの５％へパリン化生理食塩水で洗い流す。ラットの留置カニューレによって生じる固着又は凝固等の技術的問題の場合には、別のラットにカニューレを挿入し、予め割り当てられた研究中のラットと置き換える。
【０１２８】
処置日に、ラットの各１匹のカニューレを確認し、ラットを計量し、ラットの各１匹のグルコースレベルを尾静脈によって確認する。グルコースレベル及び重量が均一な個体群を３つの群に分割し、ここで、第１の群を試験化合物で処置し、第２の群を生理食塩水で処置した陰性対照群とし、第３の群を、グリベンクラミド（グリブリドとしても知られる）で処置した陽性対照群とする。後者は、ＩＩ型糖尿病の治療に使用されるスルホニル尿素に分類される抗糖尿病薬物であり、これは、現在、ＷＨＯ  Ｍｏｄｅｌ  Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓにおいて２つしかない経口糖尿病薬の１つである。グリベンクラミドは、膵臓ベータ細胞においてＡＴＰ感受性カリウムチャネルを阻害することによって作用し、細胞膜脱分極及び電位依存性カルシウムチャネルの開口を引き起こし、それが、インスリン放出を刺激するベータ細胞内への細胞内カルシウムの増加の誘因となる。
【０１２９】
実験に関与するすべてのラットに、体重１ｋｇにつき２ｇのグルコース負荷を（経口で）投与し、ここで、ラット１匹当たりのグルコース投与の全容積は、０．６７ｇ／ｍｌの溶液から体重１ｋｇにつき３ｍｌである。グルコース投与の１０分後、第１の群のラットに試験化合物を投与し、陰性対照群のラットに生理食塩水を投与する。いずれの場合も、投与はカニューレを介して静脈内へ実施する。試験化合物の投与量レベルは体重１ｋｇにつき２．５ｍｇであり、投与容積は体重１ｋｇにつき１ｍｌであり、投与される生理食塩水の容積は体重１ｋｇにつき１ｍｌである。陽性対照群のラットには、グルコース投与の３０分前にグリベンクラミドを（経口で）投与する。グリベンクラミドの投与量レベルは体重１ｋｇにつき１ｍｇであり、投与容積は０．２ｍｇ／ｍｌの溶液から体重１ｋｇにつき５ｍｌである。投薬後、採血までの間、ラットをケージに戻しておく。
【０１３０】
グルコース及びインスリンレベルは、グルコース投与（及び陽性対照群の場合はグリベンクラミド投与）の３０分前；グルコース投与の直前及び５分後；グルコース投与の１５分後、すなわち、試験化合物又は生理食塩水（それぞれ第１及び陰性対照群の場合）の投与の５分後；次いで、グルコース投与の３０、４５、６０、１２０及び１５０分後に計測する。
【０１３１】
グルコースレベル計測のために、血液検体を各ラットから尾静脈を介して抜き取り、グルコメーターで直ちに試験する。インスリンレベル計測のために、血液検体を各ラットから頸動脈カニューレを介して抜き取る。各処置ラットから収集する血液の容積は１５０μｌである。インスリンレベルのために抜き取られた血液検体を、Ｚ血清／ゲルを加えた０．８ｍｌチューブ中に収集する。血液を室温で少なくとも３０分間放置して凝固させ、凝固後、これを約４℃で遠心分離する（３０００×ｇ、１５分）。血清を取り出し、２つの０．２ｍｌフラットキャップＰＣＲタブに等分し（アリコート当たり少なくとも２５μｌ）、次いで、分析するまで−２０℃で冷凍保存する。臨床的観察は、各個別の動物の投薬後及び出血期間内に実施する。全血中のグルコースレベルの血液分析は、出血中に、血中グルコースモニタリングシステムをこのシステムに適した試験紙上で使用して、その場で行う。血清中のインスリンレベルの血液分析は、ラット／マウスインスリンキットを使用して行う。
【０１３２】
この実験の生存段階は、最終血液検体収集及び血清の取り出しに続いて、グルコース投与の１５０分後に完了する。
【０１３３】
試験化合物で処置したラットは、グルコース投与の１５分後、すなわち、試験化合物の投与の５分後から開始して、採取された血液検体中に著しく低レベルのグルコースを有することが予期される。予期されるグルコースのレベルは、事実上、絶食後に計測されるグルコースレベルに極めて類似している。
【０１３４】
グルコース投与の約１５分後、すなわち、健康な個体においてグルコース投与後に通常計測されるインスリンレベルの増加の約１５分前には既に、試験化合物で処置したラットのインスリンレベルに著しい増加が見られることがさらに予期される。増加したインスリンのレベルは、３０〜４５分間維持され、次いで、血液中における試験化合物の安定性に応じ、ある速度で減少することが予期される。
【０１３５】
結果
予備研究において、２ＭｅＳ−アデノシン−５’−Ｏ−（Ｐα−ボラノ）二リン酸、１９（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、以上に記載した通り、絶食させたウィスター系ラット（ｎ＝５）に静脈内投与し、一方、生理食塩水を陰性対照群のラットに投与し、グリベンクラミド（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照群のラットにグルコース投与の３０分前に与えた。図５に示すように、化合物１９は、グリベンクラミドと同様に、生理食塩水で処置したラットにおいて計測されるグルコースレベルに対し、計測されるグルコースレベルを低減させた。
【化１１】
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【化１２】
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反応条件：
方法Ａ：５ａから出発し、ａ）トリメチルリン酸、ＰＯＣｌ３、Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（商標）、０℃、３時間；ｂ）乾燥ＤＭＦ中０．５Ｍのビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート、Ｂｕ３Ｎ、０℃、１．６分；ｃ）０．５ＭのＴＥＡＢ、ｐＨ＝７、室温、０．５時間；並びにｄ）１）１８％のＨＣｌ、ｐＨ２．３、室温、３時間；及び２）２４％のＮＨ４ＯＨ、ｐＨ９、室温、４５分。
方法Ｂ：５ｂから出発し、ａ）トリメチルリン酸、ＰＯＣｌ３、Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（商標）、０℃、２時間；ｂ）乾燥ＤＭＦ中１Ｍのビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート、Ｂｕ３Ｎ、０℃、２５分；及びｃ）０．５ＭのＴＥＡＢ、ｐＨ７、室温、０．５時間。
【化１３】
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反応条件：ａ）トリメチルリン酸、ＰＣｌ３、Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（商標）、０℃、３０分；ｂ）乾燥ＤＭＦ中１Ｍのビス（トリブチルアンモニウム）メチレンジホスホネート、Ｂｕ３Ｎ、０℃、１１分；ｃ）ＴＨＦ中２ＭのＢＨ３・ＳＭｅ、０℃、５分、次いで室温、３０分；ｄ）１ＭのＴＥＡＢ、ｐＨ７、室温、０．５時間；並びにｅ）１）１８％のＨＣｌ、ｐＨ２．３、室温、３時間；及び２）２４％のＮＨ４ＯＨ、ｐＨ９、室温、４５分。
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【０１３６】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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