(57)【要約】  ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）および／または他の治療剤の生細胞への送達に対して安定な高分子キャリアが提供される。【選択図】      図１Ａ、図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおいて第１のアニオン性の種を含む複数のモノマー単位と
を含む複数のポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチドと
を含む高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドは前記高分子キャリアのコアには存在しない高分子キャリア。
【請求項２】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記第１のアニオン性の種は、約５．０〜約６．５のｐＨにおいて、実質的に中性であるか、または電荷を有さない高分子キャリア。
【請求項３】
請求項１または２に記載の高分子キャリアであって、前記少なくとも１のポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである高分子キャリア。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータである高分子キャリア。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドノックダウン剤である高分子キャリア。
【請求項６】
請求項５に記載の高分子キャリアであって、前記ノックダウン剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである高分子キャリア。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、さらにターゲティング部分を含む高分子キャリア。
【請求項８】
請求項７に記載の高分子キャリアであって、前記ターゲティング部分は、前記高分子キャリアの外殻部分に結合する高分子キャリア。
【請求項９】
請求項８に記載の高分子キャリアであって、前記ターゲティング部分は、ポリマーとの共有結合により前記外殻部分に結合する高分子キャリア。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリマーはグラジエントポリマーである高分子キャリア。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリマーは、２未満、１．８未満、１．５未満、１．４未満、または１．３未満の多分散指数を有する高分子キャリア。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記複数のポリマーは、会合してミセルを形成する高分子キャリア。
【請求項１３】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、膜を不安定化する高分子キャリア。
【請求項１４】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、複数の第１の荷電可能な種を含む高分子キャリア。
【請求項１５】
請求項１４に記載の高分子キャリアであって、前記複数の第１の荷電可能な種は、エンドソームのｐＨにおいて実質的に電荷を有さない高分子キャリア。
【請求項１６】
請求項１４に記載の高分子キャリアであって、前記複数の第１の荷電可能な種は、約６以下のｐＨにおいて実質的に電荷を有さない高分子キャリア。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、複数の疎水性モノマー単位をさらに含み、該疎水性モノマー単位は、前記疎水性ブロックの一部であるか、または前記疎水性ブロックとは別に存在する高分子キャリア。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記複数のポリマーは、自発的に会合して高分子キャリアを形成する高分子キャリア。
【請求項１９】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドはポリマーのブロック中に存在する高分子キャリア。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアの外殻は、ポリヌクレオチドを含む高分子キャリア。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記複数のポリマーの少なくとも１つは、ポリヌクレオチドキャリアブロックを含む高分子キャリア。
【請求項２２】
請求項２１に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアの外殻は、ポリヌクレオチドキャリアブロックを含む高分子キャリア。
【請求項２３】
請求項２２に記載の高分子キャリアであって、前記少なくとも１のポリヌクレオチドは、共有結合、非共有結合性の相互作用、またはこれらの組み合わせにより前記ポリヌクレオチドキャリアブロックに結合する高分子キャリア。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、およそ中性のｐＨおよび／またはおよそエンドソームのｐＨにおいて電荷を有さない高分子キャリア。
【請求項２５】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、およそ中性のｐＨおよび／またはおよそエンドソームのｐＨにおいてポリアニオン性である高分子キャリア。
【請求項２６】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、およそ中性のｐＨおよび／またはおよそエンドソームのｐＨにおいて両性イオン性である高分子キャリア。
【請求項２７】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、およそ中性のｐＨおよび／またはおよそエンドソームのｐＨにおいてポリカチオン性である高分子キャリア。
【請求項２８】
請求項２７に記載の高分子キャリアであって、前記少なくとも１のポリヌクレオチドは、ｘのアニオンを含むポリアニオンであり、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約０．７ｘ以上のカチオンを含む高分子キャリア。
【請求項２９】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、ホモポリマーブロックである高分子キャリア。
【請求項３０】
請求項２９に記載の高分子キャリアであって、前記ホモポリマーブロックは、ポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-エタクリレート、ポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-メタクリレート、またはポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレートである高分子キャリア。
【請求項３１】
請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、（i）少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-エタクリレートモノマー単位、少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-メタクリレート、少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレート、またはこれらの組み合わせ；および（ii）少なくとも１のスペーサーモノマー単位を含む高分子キャリア。
【請求項３２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記第１のアニオン性の種は、カルボン酸基、スルホンアミド基、ボロン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、硫酸基、リン酸基、ホスフィン酸基、もしくは亜リン酸基、またはこれらの共役塩基である高分子キャリア。
【請求項３３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、少なくとも１のスペーサーモノマー単位をさらに含む高分子キャリア。
【請求項３４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、第２の荷電可能な種をさらに含む高分子キャリア。
【請求項３５】
請求項３４に記載の高分子キャリアであって、前記第２の荷電可能な種は、プロトン化を受けてカチオン性の種になる高分子キャリア。
【請求項３６】
請求項３５に記載の高分子キャリアであって、前記カチオン性の種は、約６．５〜約９のｐＫａを有する高分子キャリア。
【請求項３７】
請求項３６に記載の高分子キャリアであって、前記第２の荷電可能な種は、非環式アミンもしくはイミン、環状アミンもしくはイミン、または窒素含有ヘテロアリールである高分子キャリア。
【請求項３８】
請求項３４に記載の高分子キャリアであって、前記少なくとも１の第１の荷電可能な種および前記少なくとも１の第２の荷電可能な種は、単一のモノマー単位上に存在する高分子キャリア。
【請求項３９】
請求項３４に記載の高分子キャリアであって、前記第１の荷電可能な種は第１の荷電可能なモノマー単位上に存在し、前記第２の荷電可能な種は第２の荷電可能なモノマー単位上に存在する高分子キャリア。
【請求項４０】
請求項３４に記載の高分子キャリアであって、前記第１の荷電可能な種は脱プロトン化を受けてアニオン性の種になり、前記第２の荷電可能な種はプロトン化を受けてカチオン性の種になり、前記アニオン性の種と前記カチオン性の種の比は、およそ中性のｐＨにおいて約１：４〜約４：１である高分子キャリア。
【請求項４１】
請求項３９に記載の高分子キャリアであって、前記第１の荷電可能なモノマー単位と前記第２の荷電可能なモノマー単位の比は、約１：４〜約４：１である高分子キャリア。
【請求項４２】
請求項３９に記載の高分子キャリアであって、前記第１の荷電可能なモノマー単位は、(C2〜C8)アルキルアクリル酸である高分子キャリア。
【請求項４３】
請求項３９に記載の高分子キャリアであって、前記第２の荷電可能なモノマー単位の５０％未満は、約８のｐＨにおいてカチオン性の種に荷電する高分子キャリア。
【請求項４４】
請求項３９に記載の高分子キャリアであって、前記第２の荷電可能なモノマー単位は、N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレートである高分子キャリア。
【請求項４５】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、少なくとも１の荷電可能でないモノマー単位を含む高分子キャリア。
【請求項４６】
請求項４５に記載の高分子キャリアであって、前記荷電可能でないモノマー単位は、(C2〜C8)アルキル-エタクリレート、(C2〜C8)アルキル-メタクリレート、または(C2〜C8)アルキル-アクリレートである高分子キャリア。
【請求項４７】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記ポリマーは、さらにスペーサーブロックを含む高分子キャリア。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、約７．４のｐＨの水性媒質中において、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均流体力学的径を有する高分子キャリア。
【請求項４９】
請求項４８に記載の高分子キャリアであって、約７．４のｐＨの水性媒質中において、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均流体力学的径を有する高分子キャリア。
【請求項５０】
請求項４９に記載の高分子キャリアであって、約７．４のｐＨの水性媒質中において、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均流体力学的径を有する高分子キャリア。
【請求項５１】
請求項５に記載の高分子キャリアであって、前記ノックダウン剤はｓｉＲＮＡである高分子キャリア。
【請求項５２】
請求項５１に記載の高分子キャリアであって、１〜５のｓｉＲＮＡを含む高分子キャリア。
【請求項５３】
請求項５１に記載の高分子キャリアであって、５〜１０のｓｉＲＮＡを含む高分子キャリア。
【請求項５４】
請求項５１に記載の高分子キャリアであって、１０〜１００のｓｉＲＮＡを含む高分子キャリア。
【請求項５５】
請求項２０に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックの数平均分子量と前記ポリヌクレオチドキャリアブロックの数平均分子量の比は、約１：１〜約５：１である高分子キャリア。
【請求項５６】
請求項２０に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックの数平均分子量と前記ポリヌクレオチドキャリアブロックの数平均分子量の比は、約２：１である高分子キャリア。
【請求項５７】
請求項２０に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、ｓｉＲＮＡキャリアブロックである高分子キャリア。
【請求項５８】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約７，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項５９】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約１０，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項６０】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約１０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項６１】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記ｓｉＲＮＡキャリアブロックは、約２０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項６２】
請求項１に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、約１０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項６３】
請求項６２に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、約２０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する高分子キャリア。
【請求項６４】
請求項１〜６３に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、約７．４のｐＨにおいて安定である高分子キャリア。
【請求項６５】
請求項６４に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、約７．４のｐＨよりも約５．８のｐＨにおいて実質的に安定性が低い高分子キャリア。
【請求項６６】
請求項６５に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアはポリヌクレオチドを含み、前記高分子キャリアの９０％より多くは、約５．８のｐＨおよび約１８μｇ／ｍＬの濃度においてポリヌクレオチドを細胞に送達する能力を喪失し、前記高分子キャリアの１０％未満は、約７．４のｐＨおよび約１８μｇ／ｍＬの濃度においてポリヌクレオチドを細胞に送達する能力を喪失する高分子キャリア。
【請求項６７】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、５０％ヒト血清中で少なくとも２時間、少なくとも５０％のヒト血漿中で少なくとも２時間、５０％マウス血清中で少なくとも２時間、５０％マウス血漿中で少なくとも２時間、またはこれらの組み合わせにおいて安定である高分子キャリア。
【請求項６８】
請求項１〜６７のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、少なくとも２の異なるポリヌクレオチドを含む高分子キャリア。
【請求項６９】
請求項１〜６８のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第１の荷電可能な種を含み、該第１の荷電可能な種のそれぞれは、アニオン性の種に荷電しているか、または荷電可能である高分子キャリア。
【請求項７０】
請求項１〜６９のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第２の荷電可能な種を含み、該第２の荷電可能な種のそれぞれは、カチオン性の種に荷電しているか、または荷電可能である高分子キャリア。
【請求項７１】
請求項１〜７０のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第１の荷電可能な種を含み、該第１の荷電可能な種のそれぞれは、アニオン性の種に荷電しているか、または荷電可能である高分子キャリア。
【請求項７２】
請求項１〜７１のいずれか１項に記載の高分子キャリアであって、前記疎水性ブロックは共重合ブロックである高分子キャリア。
【請求項７３】
ａ．集合して高分子キャリアを構築するコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．およそ中性のｐＨにおいてアニオン性である複数の種を含む少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおいてポリカチオン性であるポリヌクレオチドキャリアブロックと
を含む複数のポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチドと
を含む高分子キャリア。
【請求項７４】
請求項７３に記載の高分子キャリアであって、前記ポリヌクレオチドは、高分子キャリアのコアには存在しない高分子キャリア。
【請求項７５】
請求項７３または７４に記載の高分子キャリアであって、前記少なくとも１の疎水性ブロックは、およそ中性のｐＨにおいて複数のカチオン性の種を含む高分子キャリア。
【請求項７６】
ａ．集合して高分子キャリアを構築するコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．およそ中性のｐＨにおいてアニオン性である複数の種を含む少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．ポリヌクレオチドキャリアブロックと
を含む複数のポリマーと；
ｂ．前記高分子キャリアのコアには存在しない少なくとも１０のポリヌクレオチドと
を含む高分子キャリア。
【請求項７７】
請求項７６に記載の高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、少なくとも２０のポリヌクレオチドを含む高分子キャリア。
【請求項７８】
ａ．集合して高分子キャリアを構築するコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨでアニオン性である複数の種を含む複数のモノマー単位と
を含む複数のポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチドと
を含む高分子キャリアであって、前記高分子キャリアは、約７．４のｐＨの水性媒質中において、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの流体力学的径を有する高分子キャリア。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２００８年５月１３日に提出された米国仮出願第６１／０５２，９０８号、２００８年５月１３日に提出された米国仮出願第６１／０５２，９１４号、２００８年８月２２日に提出された米国仮出願第６１／０９１，２９４号、２００８年１１月６日に提出された米国仮出願第６１／１１２，０５４号、２００８年１２月２４日に提出された米国仮出願第６１／１４０，７７９号、２００９年４月２１日に提出された米国仮出願第６１／１７１，３５８号（これらの出願は、参照として本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
〔連邦政府に助成された研究に関する陳述〕
本発明は、国立保健研究所により認められ、契約番号NIH1RO1EB002991のもとで政府の助成を受けてなされたものである。政府は、本発明において正当な権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ある場合において、生細胞にポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を提供することは有益である。いくつかの場合において、そのようなポリヌクレオチドの生細胞への送達は、治療的な利益を与える。
【発明の概要】
【０００４】
ここに記載するのは、少なくとも１つのヌクレオチドおよび／または他の治療薬を細胞に送達するための組成物である（すなわち細胞内送達）。ある実施形態において、そのような細胞内送達はインビトロであり、別の実施形態において、そのような細胞内送達はインビボである。ある実施形態において、送達のための組成物は、高分子キャリアを含むポリマーを含んでなる。そのような高分子キャリアは、任意にミセルの形態であり、特に順ミセル（true micelle）である。それから、ここに記載するのは、高分子キャリア（例えばミセル）と、少なくとも１のヌクレオチドおよび／または治療薬との組み合わせである。そのような組み合わせは、任意に、共有結合性および／または非共有結合性の相互作用の形態である。そのような組み合わせは、任意に、例えば所望の細胞にその組み合わせを向けるための薬剤のようなさらに付加的な薬剤を含む。さらにここに記載するのは、治療および／または診断のためのそのような細胞内送達組成物の使用である。そのような使用は、細胞内の遺伝子発現を変化させること、例えば細胞内の遺伝子の活性化またはノックダウンを含む。
【０００５】
ここで、ある実施形態において提供されるのは、（i）集合して高分子キャリアを構築する複数のポリマー（前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、；前記ポリマーは、少なくとも１の疎水性部分、およそ中性のｐＨにおいて第１のアニオン性の種を含む複数のモノマー単位を含む）；ならびに（ii）少なくとも１のヌクレオチド（例えば、少なくとも１のポリヌクレオチド）を含んでなる高分子キャリアである。ある実施形態において、前記ポリマーには、コポリマー、ブロックコポリマー等が含まれる。ｐＨがおよそ荷電可能な種のｐＫａである場合、両方の形態の荷電可能な種の平衡分布が存在する。アニオン性の種において、ｐＨがアニオン性の種のｐＫａである場合、約５０％の集合はアニオン性であり、約５０％は電荷を持たない。さらに、ｐＨが荷電可能な種のｐＫａから離れると、この平衡において対応するシフトがあり、より高いｐＨ値においてはアニオン形態が優勢になり、より低いｐＨにおいては電荷を持たない形態が優勢になる。ここに記載する組み合わせには、いずれかのｐＨ値におけるコポリマーの形態が含まれる。
【０００６】
ここで、ある実施形態において提供されるのは、以下を含む高分子キャリアである：
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおいて複数のアニオン性の種を含む複数のモノマー単位と
を含むポリマーと；
ｂ．少なくとも１のヌクレオチド（例えば、少なくとも１のポリヌクレオチド）。
【０００７】
特定の実施形態において、前記少なくとも１のヌクレオチド（例えば、少なくとも１のポリヌクレオチド）は、高分子キャリアのコアには存在しない。
【０００８】
ここで、いくつかの実施形態において提供されるのは、以下を含む高分子キャリア（高分子組成物）である：
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記コポリマーは、
i．およそ中性のｐＨにおいて複数のアニオン性の種を含む少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおいて疎水性であるポリヌクレオチドキャリアブロック（polynucleotide carrier block）と
を含むポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチド。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドキャリアブロックは、およそ中性のｐＨにおいてポリカチオン性であり、およそ中性のｐＨにおいてポリアニオン性であり、およそ中性のｐＨにおいて電荷を持たず（例えば、実質的に電荷を持たない）、あるいはおよそ中性のｐＨにおいて両性イオン性である。いくつかの実施形態において、およそ中性のｐＨは、ｐＨが約７である（例えば、約７．２〜約７．４）。
【００１０】
ここで、いくつかの実施形態において提供されるのは、以下を含む高分子キャリア（高分子組成物）である：
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記コポリマーは、
i．およそ中性のｐＨにおいて複数のアニオン性の種を含む少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおいてポリカチオン性であるポリヌクレオチドキャリアブロックと
を含むポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチド。
【００１１】
特定の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、高分子キャリアのコアには存在しない。いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１の疎水性ブロックは、およそ中性のｐＨにおいて複数のカチオン性の種を含む。
【００１２】
ここで、ある実施形態において提供されるのは、以下を含む高分子キャリア（または高分子組成物）である：
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．およそ中性のｐＨにおいて複数のアニオン性の種を含む少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．ポリヌクレオチドキャリアブロックと
を含むポリマーと；
ｂ．高分子キャリアのコアには存在しない少なくとも１０のポリヌクレオチド。
【００１３】
特定の実施形態において、高分子キャリア（高分子組成物）は、少なくとも２０のポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
ここで、いくつかの実施形態において提供されるのは、以下を含む高分子キャリアである：
ａ．集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、
i．少なくとも１の疎水性ブロックと；
ii．およそ中性のｐＨにおける複数のアニオン性の種と
を含むポリマーと；
ｂ．少なくとも１のポリヌクレオチド。
【００１５】
特定の実施形態において、高分子キャリアは、約７．４のｐＨの水性媒質において、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの流体力学的径を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ここに記載するいずれかの高分子キャリアにおける少なくとも１のヌクレオチドは、高分子キャリア（またはその成分ポリマー）に結合し、そのような結合は、いずれかの適切な態様で達成される（例えば、静電気的相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用等の非共有結合性の相互作用；共有結合性の相互作用；あるいはその組み合わせ）。ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアにおける少なくとも１のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例えば第１のポリヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、複数のポリヌクレオチド（例えば、複数の第１のポリヌクレオチドおよび／または複数の第２のポリヌクレオチド、および記載したのと同じくらいの量の付加的な異なるポリヌクレオチド）を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現修飾因子である。さらに特定の実施形態において、遺伝子発現修飾因子には、ノックダウン剤（例えばノックダウンオリゴヌクレオチド）が含まれる。さらに特定の実施形態において、ノックダウン剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。さらに特定の実施形態において、ノックダウン剤は、ｓｉＲＮＡである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ここに記載するいくつかの高分子キャリアは、ターゲティング部分を含む。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、高分子キャリアの外殻部分に結合する。さらに特定の実施形態において、ターゲティング部分は、ポリヌクレオチドへの共有結合により、外殻部分に結合する。
【００１８】
ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアにおけるポリマーは、ブロックコポリマー、モノブロックコポリマー、またはグラジエントポリマー（gradient polymer）である。いくつかの実施形態において、ここに記載されるいずれかの高分子キャリアは、ポリヌクレオチドに結合しない付加的なポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態において、付加的なポリマーは、希釈ポリマーまたはターゲティング部分キャリアポリマーである。ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、少なくとも１の第２のヌクレオチド（例えば第２のポリヌクレオチド）に結合する付加的なポリマーをさらに含む。ある実施形態において、前記少なくとも１の第２のヌクレオチド（例えば第２のポリヌクレオチド）は、前記少なくとも１のヌクレオチド（例えば第１のポリヌクレオチド）とは異なる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ここに記載されるいずれかの高分子キャリアは、ぞれぞれ（全て）が高分子キャリアにおけるコア部分を有し、実質的に同一である複数のポリマーを含む。
【００２０】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、膜を不安定化する。特定の実施形態において、高分子キャリアは、酸性のｐＨ（例えばエンドソームのｐＨ）において膜を不安定化するが、およそ中性のｐＨにおいては不安定化しない。
【００２１】
特定の実施形態において、ここで提供されるのは、ミセル、特に順ミセルである高分子キャリアである。
【００２２】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、疎水性ブロックを有するポリマーを含み、疎水性ブロックは、複数の第１の荷電可能な種を含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、およそ中性のｐＨにおいて実質的にアニオン性である。ある実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、酸性のｐＨまたはエンドソームのｐＨにおいて、実質的に電荷を持たない。いくつかの実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、約７以下、約６．８以下、約６．６以下、約６．４以下、約６．２以下、約６以下、約５．８以下、または約５．６以下のｐＨにおいて実質的に電荷を持たない。特定の実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、約６以下のｐＨにおいて実質的に電荷を持たない。特定の実施形態において、酸性ｐＨ（例えばエンドソームｐＨ）におけるポリヌクレオチドキャリアブロックの形態（例えば、ポリカチオン性、ポリアニオン性、中性または両性イオン性）は、およそ中性のｐＨにおける形態と実質的に同じである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、１より大きいπ値を有する複数の疎水性モノマー単位をさらに含み、疎水性モノマー単位は、疎水性ブロックの一部であるか、または疎水性ブロックのほかにある。化合物のπ値は、その相対的な親水性−親油性の値の目安である（例えば、Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45:11-13 (1981)を参照されたい）。
【００２４】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、高分子キャリア中に自発的に自己組織化した複数のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、１以上のポリマーを含み、少なくとも１のヌクレオチド（例えばポリヌクレオチド）は、ポリマーのブロックである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、高分子キャリアの外殻を形成するか、または外殻中に存在する。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、高分子キャリアの外殻中に少なくとも１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、膜を不安定化する荷電可能な疎水性ブロックを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、ポリヌクレオチドキャリアブロックを含む少なくとも１のポリマーを含む。ある実施形態において、高分子キャリアの外殻は、ポリヌクレオチドキャリアブロックを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックはペプチド性でない（すなわちポリアミノ酸でない）。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアにおける少なくとも１のヌクレオチドは、共有結合、非共有結合性の相互作用、またはこれらの組み合わせによりポリヌクレオチドキャリアブロックに結合する。いくつかの実施形態において、ここに記載されるいずれかの高分子キャリアにおけるポリヌクレオチドキャリアブロックは、ポリカチオン性である。ある実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、ｓｉＲＮＡキャリアブロックである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロック（例えばｓｉＲＮＡキャリアブロック）は、ＰＥＧ化されない。さらに特定の実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックの主鎖は、ＰＥＧ化されない。ある実施形態において、少なくとも１のヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）は、ｘのアニオンを含むポリアニオンであり、ポリヌクレオチドキャリアブロック（例えばｓｉＲＮＡキャリアブロック）は、約０．７ｘ以上のカチオンを含む。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアにおけるポリヌクレオチドキャリアブロックは、ホモポリマーブロックである。特定の実施形態において、ホモポリマーブロックは、ポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、ポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはポリ-N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレートである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、例えば（i）少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-エタクリレートモノマー単位、少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-メタクリレート、少なくとも１のN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレート、またはこれらの組み合わせ；および（ii）少なくとも１のスペーサーモノマー単位を含むコポリマーである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、カルボン酸基、スルホンアミド基、スルホン酸基、スルフィン酸基、硫酸基、リン酸基、ホスフィン酸基、または亜リン酸基である第１の荷電可能な種を含む。ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアのポリマーは、いずれかのブロック（例えば、疎水性ブロック、親水性ブロック、外殻ブロック、コアブロック等）においてスペーサーモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、少なくとも１のスペーサーモノマー単位を含む疎水性ブロックを含んでなる。
【００２７】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、第１および第２の荷電可能な種を含む疎水性ブロックを含んでなる。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な種はここに記載した通りであり、第２の荷電可能な種はプロトン化を受けてカチオン性の種になる。特定の実施形態において、第２の荷電可能な種のｐＫａは、約６．５〜約９である。いくつかの実施形態において、第２の荷電可能な種は、非環式アミンもしくはイミン、環状アミンもしくはイミン、または窒素含有ヘテロアリールである。ある実施形態において、少なくとも１の第１の荷電可能な種および少なくとも１の第２の荷電可能な種は、単一のモノマー単位に存在する。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な種は第１の荷電可能なモノマー単位に見られ、第２の荷電可能な種は第２の荷電可能なモノマー単位に見られる。ある実施形態において、第１の荷電可能な種は脱保護を受けてアニオン性の種になり、第２の荷電可能な種はプロトン化を受けてカチオン性の種になり、アニオン性の種とカチオン性の種の比は、およそ中性のｐＨにおいて、約１：４〜約４：１である。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能なモノマー単位と第２の荷電可能なモノマー単位の比は、約１：４〜約４：１である。ある実施形態において、第１の荷電可能なモノマー単位は、(C2〜C8)アルキルアクリル酸である。いくつかの実施形態において、第２の荷電可能なモノマー単位の５０％未満は、ｐＨが約８である場合において、カチオン性の種に荷電する。ある実施形態において、第２の荷電可能なモノマー単位は、N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1〜C6)アルキル-アミノ(C1〜C6)アルキル-アクリレートである。
【００２８】
ある実施形態において、高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い、アニオン性の種に荷電した、または荷電可能な種を含む。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い、カチオン性の種に荷電した、または荷電可能な種を含む。ある実施形態において、高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第１の荷電可能な種を含む。特定の実施形態において、それぞれの第１の荷電可能な種は、アニオン性の種に荷電し、または荷電可能である。ある実施形態において、高分子キャリアは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第２の荷電可能な種を含む。特定の実施形態において、それぞれの第２の荷電可能な種は、カチオン性の種に荷電し、または荷電可能である。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリア中に存在するブロックコポリマーの疎水性ブロックは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第１の荷電可能な種を含む。特定の実施形態において、それぞれの第１の荷電可能な種は、アニオン性の種に荷電し、または荷電可能である。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア中に存在するブロックコポリマーの疎水性ブロックは、５より多い、２０より多い、５０より多い、または１００より多い第２の荷電可能な種を含む。特定の実施形態において、それぞれの第２の荷電可能な種は、カチオン性の種に荷電し、または荷電可能である。
【００２９】
ここに記載するいずれかの高分子キャリアの実施形態のさらなるまたは代替の実施形態において提供されるのは、複数の荷電可能でないモノマー単位を含む、膜を不安定化する荷電可能な疎水性ブロックを含んでなる高分子キャリアである。いくつかの例において、荷電可能でないモノマー単位は、疎水性の種を含む。他の例において、第１および／または第２の荷電可能な種は、疎水性の種を含む、または疎水性の種も含む。いくつかの実施形態において、荷電可能でないモノマー単位は、(C2〜C8)アルキル-エタクリレート、(C2〜C8)アルキル-メタクリレート、または(C2〜C8)アルキル-アクリレートである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、ｐＨが約７．４の水性媒質中で、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均流体力学的径を有する。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ｐＨが約７．４の水性媒質中で、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均流体力学的径を有する。ある実施形態において、高分子キャリアは、ｐＨが約７．４の水性媒質中で、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均流体力学的径を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるのは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも２５０のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含む高分子キャリアである。いくつかの実施形態において、ここで提供されるのは、１〜約２５０、５〜約２５０、２０〜約２５０、約２５〜約２５０、約３０〜約２５０、４０〜約２５０、５０〜約２５０、約１００〜約２５０、２００〜約２５０の個々のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含む高分子キャリアである。ある実施形態において、ここで提供されるのは、少なくとも２のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含む高分子キャリアである。ある実施形態において、そのようなポリヌクレオチドは、いずれかの適切な様式で、高分子キャリアおよび／またはその中のポリマーに結合する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００３２】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ブロックコポリマーを含み、疎水性ブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックの数平均分子量の比は、約１：５〜約５：１であるか、または約１：１〜約５：１（または、例えば約５：４〜５：１）である。いくつかの実施形態において、疎水性ブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックの数平均分子量の比は、約３：２〜約３：１である。特定の実施形態において、疎水性ブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックの数平均分子量の比は、約２：１である。
【００３３】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ｓｉＲＮＡキャリアブロックであるポリヌクレオチドキャリアブロックを含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡキャリアブロックは、約７，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡキャリアブロックは、約７，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡキャリアブロックは、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡキャリアブロックは、約２０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態において、疎水性ブロックは、約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、または約１０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態において、疎水性ブロックは、約１０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。ある実施形態において、疎水性ブロックは、約２０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、１００，０００ダルトンより大きな数平均分子量（Ｍｎ）を有するコアブロックを含む、膜を不安定化するブロックコポリマーを複数含んでなる。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、５０，０００ダルトンより大きな数平均分子量（Ｍｎ）を有する外殻を含む、膜を不安定化するブロックコポリマーを複数含んでなる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるいくつかの高分子キャリアのブロックコポリマーは、２未満、１．８未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、または１．３未満の多分散指数（polydispersity index）を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、約７．４のｐＨで安定である。ある実施形態において、高分子キャリアは、約７．４のｐＨよりも約５．８のｐＨにおいて安定性が低い。いくつかの実施形態において、高分子キャリアの９０％より多くは、約５．８のｐＨおよび約１８μｇ／ｍＬの濃度において不安定化され、高分子キャリアの１０％未満は、約７．４のｐＨおよび約１８μｇ／ｍＬの濃度において不安定化される。
【００３６】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上の間、５０％ヒト血清中で安定である。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上の間、５０％ヒト血漿中で安定である。ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上の間、５０％マウス血清中で安定である。ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間以上の間、５０％マウス血漿中安定である。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、５０％ヒト血清中で少なくとも２時間、少なくとも５０％のヒト血漿中で少なくとも２時間、５０％マウス血清中で少なくとも２時間、５０％マウス血漿中で少なくとも２時間、またはこれらの組み合わせにおいて安定である。
【００３７】
ある実施形態において、ここに記載されるのは、ここに記載されている高分子キャリアを形成するポリマーのいずれかである。すなわち、高分子サブユニット（例えば、膜不安定化ブロックコポリマー）または個々のポリマー（いずれにせよ高分子キャリアの形態）も、ここに記載された実施形態である。明示的に、ここに提示するそれぞれおよび全ての膜不安定化ブロックコポリマーは、ここに記載される個々のポリマーとして、または高分子キャリアの高分子ユニット／鎖／成分として、ここに記載される発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】RAFT合成ポリマーの組成および特性の実例。
【図１Ｂ】PEGMA-DMAEMAコポリマーの組成および特性の実例。
【図２】ブロックコポリマーPRx0729v6のNMR分光分析の実例。
【図３】siRNAと複合体をなすポリマーPRx0729v6の粒子サイズの動的光散乱法 (DLS) による測定の実例。
【図４】異なる電荷比におけるポリマーPRx0729v6 / siRNA 複合体のゲルシフト分析の実例。
【図５】ポリマーPRx0729v6の臨界ミセル濃度（CMC）の実例。
【図６】有機溶媒におけるポリマーPRx0729v6粒子の安定性の実例。
【図７】siRNAのノックダウン活性−培養哺乳動物細胞におけるミセル複合体の実例。
【図８】高分子ミセルおよびそのsiRNA複合体の膜不安定化活性の実証の実例。
【図９】ポリマーPRx0729v6の透過型電子顕微鏡（TEM）分析の実例。
【図１０】ポリマー-siRNA複合体の細胞取り込みおよび細胞内分布の蛍光顕微鏡分析の実例。
【図１１】ポリマー構造におけるpHの影響の実例。
【図１２】siRNAのノックダウン活性−培養哺乳動物細胞におけるミセル複合体の実例。
【図１３】末端がガラクトースで官能化されたポリ[DMAEMA]-マクロCTAの実例。
【図１４】[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]の合成の実例。
【図１５】PEGMAおよびMAA-NHSのRAFT共重合の実例。
【図１６】ガラクトース官能化DMAEMA-MAA(NHS)またはPEGMA-MAA(NHS)ジブロックコポリマーの実例。
【図１７】結合可能なsiRNA、ペプチドおよびピリジルジスルフィドアミンの構造の実例。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
ここで提供されるのは、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドを含む）を生細胞に送達するのに適した高分子キャリアである。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、複数の高分子ユニットおよび任意に少なくとも１のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、生体適合性であり、安定であり（化学的安定および／または物理的安定を含む）、および／または合成を再現できる。さらに、いくつかの実施形態において、ここで提供されるキャリアは、無毒であり（例えば、低い毒性を示す）、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を分解から保護し、自然に生じる工程（例えばエンドサイトーシス）を介して生細胞に入り、および／または細胞と接触させた後にポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を生細胞の細胞質に送達させる。ある例において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、ｓｉＲＮＡおよび／または細胞において少なくとも１の遺伝子の発現を変化させる他の「ヌクレオチドベースの」薬剤である。従って、ある実施形態において、ここで提供されるキャリアは、ｓｉＲＮＡを細胞に送達するのに有用である。ある例において、細胞はインビトロであり、他の例において、細胞はインビボである。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡを含む治療的に有効な量の高分子キャリアは、それを必要とする個体に投与される（例えば、遺伝子ノックダウンを有することの必要性であり、ｓｉＲＮＡを投与することにより、遺伝子をノックダウンすることができる）。特定の例において、高分子キャリアは、個体の特定の標的細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに有用であり、そのために特異的に設計される。
【００４０】
特に、ここである実施形態において提供されるのは、コア−外殻構造を有する高分子キャリアであり、（i）集合して高分子キャリアを構築する複数のブロックコポリマーと、（ii）キャリアの外殻にある少なくとも１のオリゴヌクレオチドとを含む。ある実施形態において、高分子キャリアはナノ粒子である。特定の実施形態において、高分子キャリアはミセルであり、特に順ミセルである。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ａ）集合して高分子キャリアを構築するブロックコポリマーである複数のポリマーであって、前記高分子キャリアは、コアおよび外殻を含み、前記ブロックコポリマーは、（i）少なくとも１の疎水性ブロックと、（ii）およそ中性のｐＨにおいて複数のアニオン性の種を含む複数のモノマー単位とを含むポリマー、および；ｂ）少なくとも１のヌクレオチドを含む。
【００４１】
１つの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）またはその構成要素は、膜を不安定化する（例えば、膜を不安定化するブロック、基、部分等を含む）。さらなるまたは代替の実施形態において、複数のブロックコポリマーは、高分子キャリア（例えばミセル）の外殻およびコアを形成する。特定の実施形態において、高分子キャリアは、疎水性のおよび／または荷電した外殻を含む。さらなるまたは代替の実施形態において、高分子キャリアは、実質的に疎水性のコアを含む（例えば、コアは、疎水性の基、モノマー単位、部分、ブロック等を含む）。特定の実施形態において、１以上のブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する、親水性の荷電したブロックと；（２）高分子キャリア（例えばミセル）のコアを形成する、実質的に疎水性のブロックとを含む。いくつかの実施形態において、１以上のブロックコポリマーは、複数の荷電可能な種および複数の疎水性エンハンサーを含む。特定の実施形態において、第１の荷電可能な種は、アニオン性の荷電可能な種である（例えば、特定のｐＨにおいて荷電する）。さらなる実施形態において、１以上のブロックコポリマーは、第２の荷電可能な種を含む（すなわち、親水性ブロックは、２以上の異なるタイプのアニオン性の種を有してよい）。ある実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも１のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、高分子キャリア（ミセル）のコアにはない。
【００４２】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアのいくつかは、疎水性ブロックを有するポリマーを含み、疎水性ブロックは、複数の第１の荷電可能な種を含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、実質的に、およそ中性のｐＨにおいてアニオン性である。ある実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、実施的に、酸性のｐＨまたはエンドソームのｐＨにおいて電荷を持たない。いくつかの実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、約７以下、約６．８以下、約６．６以下、約６．４以下、約６．２以下、約６以下、約５．８以下、または約５．６以下のｐＨにおいて、実質的に電荷を持たない。特定の実施形態において、複数の第１の荷電可能な種は、実質的に、約６以下のｐＨにおいて電荷を持たない。ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、第１および第２の荷電可能な種を含む疎水性ブロックを含む。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な種はここに記載した通りであり、第２の荷電可能な種は、プロトン化を受けてカチオン性の種になる。特定の実施形態において、第２の荷電可能な種のｐＫａは、約６．５〜約９、約５〜約９、約６〜約９、約６〜約８、または約６．５〜約８である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、さらに、複数の疎水性のモノマー単位を含み、疎水性モノマー単位は、疎水性ブロックの一部であるか、または疎水性ブロックのほかにある。
【００４４】
いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）および／またはその中のポリマーは、非ペプチド性である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、複数のモノブロックポリマーを含む。ある実施形態において、モノブロックポリマーおよび／または高分子キャリア（たとえば、モノマーのユニット、部分、種および／または群）は、膜を不安定化する。ある実施形態において、少なくとも１のモノブロックポリマーは、複数のアニオン性の荷電可能な種、および複数の疎水性の種を含む。高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも１のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、高分子キャリア（例えばミセル）のコアにはない。
【００４６】
１つの実施形態において、ここで提供される膜を不安定化する高分子キャリア（例えばミセル）は、複数のブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、これらのブロックコポリマーは、高分子キャリア（例えばミセル）の外殻およびコアを形成する。ある実施形態において、外殻および／または外殻ブロックは、親水性であるか、および／または電荷を有する。いくつかの実施形態において、コアおよび／またはコアブロックは、実質的に疎水性である。いくつかの実施形態において、実質的に疎水性のコアは、正および／または負の電荷を含む。さらに特定の実施形態において、疎水性コアおよび／またはコアブロックは、実質的に等しい数の正および負の電荷を含む（すなわち、コアおよび／またはコアブロックの電荷は、実質的に正味中性である）。いくつかの実施形態において、１以上、または全てのブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する親水性の電荷を有するブロックと；（２）高分子キャリア（例えばミセル）のコアを形成する実質的に疎水性のブロックとを含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、複数のアニオン性の荷電可能な種、複数の疎水性部分を含み、膜を不安定化する。高分子キャリア（例えばミセル）のコアまたはブロックコポリマーのコアブロックは、カチオン性の種を含む。いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）またはブロックコポリマーのコアブロックは、任意に、アニオン性の種を含む。特定の実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）またはブロックコポリマーのコアブロックは、少なくとも１のカチオン性の種および少なくとも１のアニオン性の種を含む。ミセルは、少なくとも１のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）も含む。特定の実施形態において、少なくとも１のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、ミセルのコア中にはない。
【００４７】
いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、ブロックコポリマーの疎水性ブロック（例えばコアブロックの）相互作用を通して自己会合する複数のブロックコポリマーから形成され、および／またはそれらのコアにおける疎水性相互作用を通して安定化される。いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、異なる構造および機能を有する２以上の異なる種のブロックコポリマーを含む。
【００４８】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を、それを必要とする個体に送達するのに有用である。いくつかの実施形態において、ここに記載する高分子キャリアにおけるポリマー（例えば、ブロックコポリマーまたはモノブロックポリマー）は、ポリヌクレオチドキャリアブロック（またはモノブロックポリマーの場合におけるポリヌクレオチドキャリア）を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの親水性ブロックまたは外殻ブロックは、ポリヌクレオチドキャリアブロックであるか、またはポリヌクレオチドキャリアブロックを含む。ポリヌクレオチドキャリアブロックは、１以上のタイプのモノマー単位を含む（例えば、ホモポリマーブロックまたはヘテロポリマーブロック）。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、高分子キャリアにおける１以上のブロックコポリマーのポリヌクレオチドキャリアブロックに、非共有結合性および／または共有結合性に結合したポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、高分子キャリア（例えばミセル）のブロックコポリマーに共有結合性に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、高分子キャリア（例えばミセル）のブロックコポリマーに非共有結合性に結合する。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、高分子キャリア（例えばミセル）のブロックコポリマーに、非共有結合性および共有結合性に結合する。いくつかの特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、高分子キャリアの外殻の少なくとも一部を形成する（例えば、その中に存在する）。いくつかの特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、疎水性ブロックに共有結合性に結合する。
【００４９】
ある実施形態において、ここで提供されるいずれかの高分子キャリアは、ブロックコポリマーを含み、そこでの疎水性ブロックおよび／またはコアブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックおよび／または外殻ブロックの数平均分子量の比は、約１:１０〜約５:１、約１:５〜約５:１、または約１:１〜約５:１（または、例えば約５:４〜５:１）である。いくつかの実施形態において、疎水性ブロックおよび／またはコアブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックおよび／または外殻ブロックの数平均分子量の比は、約３：２〜約３：１である。特定の実施形態において、疎水性ブロックおよび／またはコアブロックの数平均分子量とポリヌクレオチドキャリアブロックおよび／または外殻ブロックの数平均分子量の比は、約２：１である。
【００５０】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、膜を不安定化するブロックコポリマーを複数含む。少なくとも部分的に、高分子キャリアは膜を不安定化するブロックコポリマーで構成されるため、高分子キャリアはそれ自体が膜を不安定化するとして、ここに記載される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、膜を不安定化するブロックコポリマーは、（i）複数の疎水性モノマー残基と、（ii）荷電可能な種を有し、荷電可能な種は、血清の生理学的なｐＨにおいてアニオン性であり、エンドソームのｐＨにおいて実質的に中性または電荷を持たない、複数のアニオン性モノマー残基と、（iii）任意に複数のカチオン性モノマー残基とを含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーにおけるアニオン性の種とカチオン性の種の比を修飾することにより、ここに記載する高分子キャリアの膜不安定化活性の修飾を可能にする。そのような実施形態のいくつかにおいて、ブロックコポリマーにおけるアニオン性の種とカチオン性の種の比は、血清の生理学的なｐＨにおいて、約４：１〜約１：４の範囲である。そのような実施形態のいくつかにおいて、ブロックコポリマーの疎水性ブロックにおけるアニオン性の種とカチオン性の種の比を修飾することにより、ここに記載する高分子キャリアの膜不安定化活性の修飾を可能にする。そのような実施形態のいくつかにおいて、ここに記載するブロックコポリマーの疎水性ブロックにおけるアニオン性の種とカチオン性の種の比は、血清の生物学的ｐＨにおいて、約１：２〜約３：１または約１：１〜約２：１の範囲である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、ｐＨ依存性の態様で、エンドソームの膜を不安定化する。種々の実施形態において、膜を不安定化するブロックコポリマーは、高分子キャリア中に集合した場合、および／または集合した高分子キャリア形態とは独立に存在する場合（例えば、高分子キャリアが分離し、および／または不安定化した場合）に、膜を不安定化する。いくつかの実施形態において、生理学的ｐＨまたはそれに近いｐＨ（例えば、循環する生理学的ｐＨ）において、高分子キャリアを構成するポリマーは、最小限に膜を不安定化するが、低下したｐＨ（例えばエンドソームのｐＨ）に曝された場合、ポリマーは膜を不安定化する。ある場合において、この膜不安定化状態への遷移は、ポリマーに組み込まれる弱酸性の残基のプロトン化を介して生じ、そのようなプロトン化は、ポリマーの疎水性を増大させる。ある場合において、ポリマーの疎水性を増大させることは、高分子キャリアの高次構造上の変化を引き起こし、高分子キャリアを膜不安定化の状態にする（例えば、膜の不安定化を引き起こす）。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアの膜不安定化のメカニズムは、ＰＥＩまたは他のポリカチオンのようなポリカチオンの、純粋にプロトン吸収性（proton-sponge）の膜を不安定化するメカニズムに依拠しない。
【００５３】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、１以上のポリヌクレオチド、例えば、１以上のオリゴヌクレオチド、１以上のＲＮＡｉ薬、１以上のＲＮＡ、１以上のＤＮＡ、１以上のｃＤＮＡ、１以上のｍｉＲＮＡ、１以上のｓｉＲＮＡ、１以上のｓｈＲＮＡ、１以上のＲＮＡａ、１以上のダイサー（dicer）基質等、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５４】
高分子キャリア
ある実施形態において、高分子キャリアはナノ粒子である。特定の実施形態において、高分子キャリアはミセルである。さらなる実施形態において、高分子キャリアは、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約３０〜８０ｎｍの大きさのミセルである。粒子サイズは、いずれかの方法で測定することができ、限定するものではないが、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、電子鏡検法技術（例えばＴＥＭ）、および他の方法が含まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、ここに記載するポリマーの自発的な自己会合により調製される。ある実施形態において、ここに記載するポリマーは、（ａ）水混和性の有機溶媒におけるポリマー溶液を水性媒質中に希釈して、または（ｂ）水溶液中に直接溶解して、集合してここで提供される高分子キャリアを構築する。いくつかの実施形態において、ここに記載するポリマーは、ポリヌクレオチドの非存在下において、集合してここで提供される高分子キャリアを構築する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、安定に水溶液中に希釈される。特定の実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、およそ中性のｐＨにおいて、約50〜約100μg/mL、または約10〜約50μg/mL、10μg/mL未満、5μg/mL未満、2μg/mL未満、0.5μg/mL未満、または0.1μg/mL未満の臨界安定濃度（例えば、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ））で、安定に希釈される。ここで使用される場合、「ミセルの不安定化」は、ミセルを形成する高分子鎖が、少なくとも部分的に脱凝集し、構造的に変化し（例えば、サイズの拡大および／または形状の変化）、および／または結晶性超分子構造（例えば、非ミセル性超分子構造）を形成することを意味する。臨界安定濃度（ＣＳＣ）および臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）という用語は、ここでは互換性に使用される。
【００５７】
特定の実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）は、高分子キャリア（例えばミセル）の外殻およびコアを形成する複数のブロックコポリマーを含む。ある実施形態において、外殻および／または外殻ブロックは、親水性であり、および／または電荷を有する（例えば、カチオン性、ポリカチオン性、または両性イオン性）。特定の実施形態において、外殻および／または外殻ブロックは、正味正の電荷を含む。いくつかの実施形態において、コアおよび／またはコアブロックは疎水性であり、および／または疎水性の基、部分、モノマー単位、種等を含む。特定の実施形態において、疎水性のコアおよび／またはコアブロックは、複数の疎水性の基、部分、モノマー単位、または種等、および複数の荷電可能な種またはモノマー単位を含む。さらに特定の実施形態において、複数の荷電可能なモノマー単位または種は、複数のアニオン性の荷電可能なモノマー単位または種を含む。さらに特定の実施形態において、複数の荷電可能なモノマー単位または種は、複数のカチオン性および複数のアニオン性の荷電可能なモノマー単位または種を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する親水性の、電荷を有するブロック（例えば、カチオン性またはポリカチオン性）、（２）疎水性ブロック、および（３）複数のアニオン性に荷電可能な種を有し、膜を不安定化する（例えば、ｐＨ依存性の態様で、膜を不安定化する）。ある実施形態において、疎水性のコアおよびコアブロックは、任意に、疎水性の基、荷電可能な基、またはそれらの組み合わせを含んでも含まなくてもよいスペーサーモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）のコアを形成する、またはコア中に存在するポリマーブロック（例えば、１以上のコポリマーのコアブロック）は、荷電可能である（例えば、生理的ｐＨにおいて、カチオン性および／またはアニオン性の種を含む）。ここで使用する場合、荷電可能な種および／またはモノマー単位は、電荷を有する状態および電荷を有しない状態で種およびモノマー単位を含む。いくつかの場合において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、自己会合する複数のブロックコポリマーから形成される。ある場合において、自己会合は、ブロックコポリマーの疎水性ブロックの相互作用を介して生じ、高分子キャリアのコア中に存在する疎水性ブロックの疎水性相互作用を介して安定化される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、約７．４のｐＨで安定であり、ｐＨが約５．８の場合は、ｐＨが約７．４の場合よりも実質的に不安定である。いくつかの場合において、高分子キャリアの９０％より多くは、約５．８のｐＨおよび約１０μg/mLの濃度において不安定化され、高分子キャリアの１０％未満は、約７．４のｐＨおよび約１０μg/mLの濃度で不安定化される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、５０％ヒト血清において、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、活性を保持する（例えば、ポリヌクレオチドを送達する高分子キャリアの活性）。さらなるまたは代替の実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも５０％のヒト血漿中において、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、活性を保持する（例えば、ポリヌクレオチドを送達する高分子キャリアの活性）。さらなるまたは代替の実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、５０％マウス血清中において、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、活性を保持する（例えば、ポリヌクレオチドを送達する高分子キャリアの活性）。さらなるまたは代替の実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも５０％のマウス血漿中において、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、活性を保持する（例えば、ポリヌクレオチドを送達する高分子キャリアの活性）。特定の実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、５０％ヒト血清中で少なくとも２時間、少なくとも５０％のヒト血漿中で少なくとも２時間、５０％マウス血清中で少なくとも２時間、少なくとも５０％のマウス血漿中で少なくとも２時間、またはこれらの組み合わせにおいて活性を保持する（例えば、ポリヌクレオチドを送達する高分子キャリアの活性）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、以下に示す特性の１以上により特徴付けられる：（１）高分子キャリア（例えばミセル）は、
水混和性溶媒（限定するものではないが、例えばエタノール）から水性溶媒（例えばリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）に希釈し、ブロックコポリマーが自主的に自己会合して組織化された集合体（例えばミセル）を形成することにより形成される；（２）高分子キャリア（例えばミセル）は、安定に希釈される（例えば、臨界安定濃度または臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を構成する100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、5μg/mL、2μg/mL、0.5μg/mL、または0.1μg/mLのポリマー濃度まで下げる）；（３）高分子キャリア（例えばミセル）は、周囲の媒質（例えば、０．５Ｍ ＮａＣｌ）の高いイオン強度に対して安定である；および／または（４）高分子キャリア（例えばミセル）は、有機溶媒の濃度が増大するにつれて不安定さが増大し、そのような有機溶媒には、限定するものではないが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）、およびジオキサンが含まれる。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも２の上述した特性を有することにより特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、少なくとも３の上述した特性を有することにより特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、上述した特性の全てを有することにより特徴付けられる。
【００６１】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、以下の基準により、さらに、あるいは代わりに特徴付けられる：（１）個々のブロックの分子量およびその相対的な長さ比が増大することにより、形成されるミセルの大きさおよびその相対的な安定性が制御される；（２）外殻を形成するポリマーカチオン性ブロックの大きさが変化することにより、効率的な複合体形成および／またはオリゴヌクレオチド薬剤の電荷中和を提供する。
【００６２】
ある実施形態において、本発明のミセルは、ピレンのような小さな疎水性分子をミセルの疎水性コアに選択的に取り込む。
【００６３】
ポリヌクレオチドを含む高分子キャリア
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を、それを必要とする個体に送達するのに有用である。ある実施形態において、ここで提供されるのは、少なくとも１のポリヌクレオチドを含む高分子キャリアである。さらに特定の実施形態において、高分子キャリアは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、２〜５０のポリヌクレオチド、５〜４０のポリヌクレオチド、５〜３０のポリヌクレオチド、５〜２５のポリヌクレオチド、２０〜４０のポリヌクレオチド等を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド遺伝子発現修飾因子である。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドノックダウン剤である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、ダイサー基質、またはｓｉＲＮＡである。他の特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはａｉＲＮＡである（Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A Rogoff , Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379 - 1382 (2008)）。ある実施形態において、高分子キャリアは、コア、外殻および１以上のポリヌクレオチドを含むナノ粒子（例えばミセル）であり、ここでのポリヌクレオチドは、ミセルのコアには存在しない。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、高分子キャリアの外殻に組み込まれる（例えば、外殻中に存在する、および／または外殻の一部を形成する）。いくつかの実施形態において、１以上のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）は、高分子キャリアを形成する複数のブロックコポリマーのｓｉＲＮＡポリヌクレオチドキャリアブロックに結合する。種々の実施形態において、結合は、1以上の共有結合、1以上の非共有結合性の相互作用、またはこれらの組み合わせを介して達成される。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ブロックコポリマー（例えばコアブロック）の疎水性ブロックに共有結合性に結合する。特定の実施形態において。ｓｉＲＮＡは、ブロックコポリマーの疎水性ブロック（例えばコアブロック）に共有結合性に結合し、高分子キャリアの外殻の少なくとも一部分を形成する。さらに特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ブロックコポリマーの親水性ブロック（例えば外殻ブロック）である。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ブロックコポリマーの親水性ブロックまたは任意のポリマーブロックに結合する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、１以上のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）は、いずれかの適切な態様で（例えば、非共有結合性の会合により）、ここで提供されるブロックコポリマーに結合する。（i）ポリマーおよび／またはここで提供されるポリマーの集合（例えば、複数のポリマーにより形成されるミセル）と、（ii）１以上のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）との間の非共有結合性の会合は、いずれかの適切な態様で達成され、限定するものではないが、静電気的相互作用（カチオン性の基を有するポリマーとアニオン性の基を有するポリヌクレオチドの静電気的相互作用を含む）、疎水性相互作用、親和性相互作用、またはこれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態において、１以上のポリヌクレオチドおよび／または高分子キャリア（例えばミセル）のポリマーは、相互に親和性を有する（例えば商業的に実施可能である）１以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリマーを提供する化学成分で修飾され、例えば、アリールボロン酸−サリチルヒドロキサム酸、ロイシンジッパーまたは他のペプチドモチーフ、ミセルおよびポリヌクレオチドにおける正電荷と負電荷の間のイオン性相互作用、または他のタイプの非共有結合性の化学的親和性結合である。さらに、いくつかの実施形態において、２本鎖ポリヌクレオチドは、ここに記載されるポリマーまたは高分子キャリア（例えばミセル）に結合する（例えば複合体をなす）。いくつかの実施形態において、ポリマーまたは高分子キャリア（例えばミセル）は、高分子キャリア（例えばミセル）の成分（例えばポリマー）に（例えば共有結合性に）結合する插入剤または核酸副溝結合剤と結合する（例えば、複合体をなす）。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、少なくとも１の負電荷を含み（例えば、負の電荷を有する主鎖を含み）、高分子キャリア（例えばミセル）のカチオン性の外殻および／または高分子キャリアのブロックコポリマーのカチオン性の外殻ブロックと結合する。特定の実施形態において、カチオン性の外殻または外殻ブロックは、高分子ポリマーに結合するか、または高分子ポリマー中に存在する１以上のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）中に存在する負電荷を少なくとも部分的に中和する。ある実施形態において、１以上のポリヌクレオチド（例えば、１以上のオリゴヌクレオチド、１以上のｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせ）は、高分子キャリア（例えばミセル）のポリカチオン性ポリヌクレオチドキャリアブロックとの会合（例えば複合体）を形成する。いくつかの実施形態において、高分子キャリア（例えばミセル）とポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の間の会合（例えば複合体）は、いずれかの望ましい電荷比の高分子キャリア（例えばミセル）を形成するブロックコポリマーとポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）で形成され、例えば、１：１〜１６：１である。特定の実施形態において、ミセルとｓｉＲＮＡの間の複合体は、２：１、４：１または８：１の電荷比で形成される。言い換えると、いくつかの実施形態において、高分子キャリアの外殻中に存在するカチオン性の電荷の数とポリヌクレオチド中に存在するアニオン性の電荷の数の比は、いずれかの望ましい値であり、例えば、約１：１〜約１６：１、約２：１〜約８：１、約４：１〜約１２：１、約２：１、約４：１、または約８：１である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ミセルを形成するブロックコポリマーのポリカチオン性ブロックにより電荷を中和される。例えば、いくつかの特定の実施形態において、生理的ｐＨにおいて４０の負電荷を含む２０塩基対のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）は、約７．４のｐＫａを有するポリＤＭＡＥＭＡポリヌクレオチドキャリアブロック（８０のモノマー単位長、ＭＷ＝１１，６８０）を含む高分子キャリア（例えばミセル）と会合する（例えば、複合体をなす）。このｐＨにおいて、ポリＤＭＡＥＭＡは４０の負電荷を含むため、実質的に電荷が正味中性であるポリヌクレオチド−ポリヌクレオチドキャリアブロック会合（例えば複合体）を生じる。ある場合において、多くの過剰な正電荷を避けることは、インビトロおよびインビボでの毒性を低減する助けとなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）は、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）の正の電荷を有する外殻と自発的に会合する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、いずれかの適切な化学的連結技術により、高分子キャリア（例えばミセル）および／または高分子キャリア（例えばミセル）における１以上のポリマーと化学的に連結する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤を含有する高分子キャリア（例えばミセル）は、ＲＮＡｉ剤と、既に形成された複数のポリマー（例えばブロックコポリマー）を含む高分子キャリア（例えばミセル）との連結により形成される。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤を含有する高分子キャリア（例えばミセル）は、ＲＮＡｉ剤とポリマー（例えばブロックコポリマー）の連結により形成され、続いて、いずれかの適切な態様、例えば、得られる連結体のＲＮＡｉ剤を含む高分子キャリア（例えばミセル）への自己会合により、高分子キャリア（例えばミセル）が形成される。種々の実施形態において、そのような高分子キャリアは、任意に、ＲＮＡｉ剤に連結するものと類似の、同じ、または異なる連結しないポリマー（例えばブロックコポリマー）をさらに含む。ここに記載される高分子キャリアにおけるポリマーとポリヌクレオチドの間の共有結合は、任意に、切断できないか、または切断できる。ある実施形態において、１以上のＲＮＡｉ剤（例えばダイサー基質）の前駆体は、高分子キャリア（例えばミセル）または高分子キャリア（切断できない結合によるミセル）のポリマーユニットに結合する。いくつかの実施形態において、１以上のＲＮＡｉ剤は、切断可能な結合を介して結合する。ある実施形態において、ここに記載される高分子キャリアにおいて利用される切断可能な結合には、非限定的な例によると、ジスルフィド結合（例えば、細胞質の減少環境において解離するジスルフィド結合）が含まれる。いくつかの実施形態において、高分子キャリア（その成分を含む）とポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の間の共有結合性の会合は、いずれかの適切な化学的連結方法を介して達成され、限定するものではないが、アミン−カルボキシルリンカー、アミン−スルフヒドリルリンカー、アミン−糖リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−糖リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−糖リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル−スルフヒドリルリンカー、糖−ヒドロキシルリンカー、糖−糖リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーが含まれる。いくつかの実施形態において、連結は、ｐＨ感受性の結合およびリンカーを用いても行われ、限定するものではないが、ヒドラゾンおよびアセタール結合が含まれる。いずれかの他の適切な連結方法は、任意に同様に利用することができ、例えば、多くの種類の連結化学を利用可能である（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびその中の章を参照されたい）。
【００６７】
ある実施形態において、ポリマーがユニマー（unimer）であるか、または集合した高分子キャリアである、ここで提供される１以上のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）とポリマー（例えばブロックコポリマー）の連結体は、以下の２つの工程を含む方法により調製される：（１）限定するものではないが、1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド (EDAC)、イミダゾール、N-ヒドロスクシンイミド(NHS) およびジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、HOBt (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、p-ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール (CDI)、およびN,N'-ジスクシンイミジルカルボネート (DSC) のようないずれかの適切な活性化試薬を使用して、オリゴヌクレオチドの修飾可能な末端基（例えば、５’-または３’-ヒドロキシル）を活性化することと；（２）ブロックコポリマーをオリゴヌクレオチドの末端に共有結合性に結合させること。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの5'-または3'-末端の修飾可能な基は、ブロックコポリマーとの連結の前に、他の官能基で置換される。例えば、ヒドロキシル基(--OH) は、スルフヒドリル基 (--SH)、カルボキシル基 (--COOH)、またはアミノ基 (--NH2)を有するリンカーで任意に置換される。
【００６８】
さらに別の実施形態において、１以上の塩基に導入された官能基を含むオリゴヌクレオチド（例えば、５−アミノアルキルピリミジン）は、いずれかの適切な方法により、活性化剤または反応性の二官能リンカーを用いて、ユニマーであるか、または集合した高分子キャリア中に存在するポリマー（例えばブロックコポリマー）に連結する。種々のそのような活性化剤および二官能リンカーは、Sigma、Pierce、Invitrogen等のような供給業者から商業的に入手可能である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、１または複数のオリゴヌクレオチドを含む高分子キャリア（例えばミセル）は、自主的な自己会合により形成される。高分子キャリアの自主的な自己会合は、いくつかの実施形態において、単一の容器中で達成される。例えば、いくつかの実施形態において、ここに記載されるポリマー（例えばブロックコポリマー）の溶液を、水性媒質（例えば、水またはＰＢＳ）を含む有機溶媒（例えばエタノール）中に希釈することにより自己会合する高分子キャリア（例えばミセル）は、１以上のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）と結合し、それにより、ポリマーおよび１以上のポリヌクレオチドを含む高分子キャリアが自発的に形成される。別の実施形態において、（１）１以上の関心のあるポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）をここに記載されるポリマー（例えば、ブロックコポリマーまたはモノブロックポリマー）と接触させることにより、高分子−ポリヌクレオチド連結体を形成することと；（２）高分子−ポリヌクレオチド連結体を適切な条件に供することにより、高分子−ポリヌクレオチド連結体の自主的な自己会合を生じ、ここに記載する高分子キャリアを提供する。
【００７０】
高分子構造
特定の実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ブロックコポリマー、例えば異なるブロックを有するコポリマーおよびグラジエントコポリマーを含む。ある実施形態において、グラジエントコポリマーは、親水性セグメント（ここに記載するブロックコポリマーの親水性ブロックの一種として理解されるべきである）および疎水性セグメント（ここに記載するブロックコポリマーの疎水性ブロックの一種として理解されるべきである）を有する。ある実施形態において、親水性セグメントは親水性ブロックであり、疎水性セグメントは疎水性ブロックである。いくつかの実施形態において、これらのポリマーは非ペプチド性である。別の実施形態において、親水性セグメントおよび疎水性セグメントは、単一ブロックのグラジエントコポリマーの異なる領域にある。種々の場合において、「高分子セグメント」は、与えられた生理学的特性（例えば、疎水性、親水性、荷電可能性等の、ここに記載するブロックの生理学的特性）を有するポリマー部分であるか、または同様の生理学的特性（例えば、疎水性、親水性、荷電可能性等）を有する１以上のブロックを含む。
【００７１】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアのブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する親水性ブロック（例えば外殻ブロック）と；（２）コアを形成する高分子部分の疎水性相互作用を介して安定化される、高分子キャリア（例えばミセル）の疎水性コアを形成する実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）とを有する。
【００７２】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する、中性または電荷を持たない（例えば、実質的に電荷を持たない）親水性ブロック（例えば外殻ブロック）と；（２）コアを形成する高分子部分の疎水性相互作用を介して安定化される、高分子キャリア（例えばミセル）の疎水性コアを形成する実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）とを有する。ある実施形態において、中性または電荷を持たない親水性ブロックは、ＨＰＭＡのような中性のモノマー残基のモノマー単位を含む。
【００７３】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアのブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する、カチオン性またはポリカチオン性の電荷を有する親水性ブロック（例えば外殻ブロック）と；（２）コアを形成する高分子部分の疎水性相互作用を介して安定化される、高分子キャリア（例えばミセル）の疎水性コアを形成する実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）とを有する。ある実施形態において、親水性ブロックは、ＤＭＡＥＭＡのようなカチオン性残基のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、親水性ブロックは、さらに、少なくとも部分的に親水性ブロックの電荷を遮蔽された種を含む。
【００７４】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアのブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する、アニオン性またはポリアニオン性の電荷を有する親水性ブロック（例えば外殻ブロック）と；（２）コアを形成する高分子部分の疎水性相互作用を介して安定化される、高分子キャリア（例えばミセル）の疎水性コアを形成する実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）とを有する。ある実施形態において、アニオン性またはポリアニオン性の電荷を有する親水性ブロックは、アクリル酸または加水分解されたマレイン酸無水物のようなアニオン性残基を有するモノマー単位を含む。
【００７５】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアのブロックコポリマーは、それぞれ、（１）高分子キャリア（例えばミセル）の外殻を形成する、両性イオン性またはポリ両性イオン性の電荷を有する親水性ブロック（例えば外殻ブロック）と；（２）コアを形成する高分子部分の疎水性相互作用を介して安定化される、高分子キャリア（例えばミセル）の疎水性コアを形成する実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）とを有する。
【００７６】
特定の実施形態において、親水性ブロックの性質（例えば、カチオン性、アニオン性、中性、または両性イオン性）は、およそ中性のｐＨにおいて、酸性のｐＨ（例えばエンドソームのｐＨ）における性質と実質的に同一である。結果として、高分子キャリアのエンドソームへの取り込みにおいて、親水性ブロックは、エンドソームに取り込まれる前と実質的に同一の形態である。
【００７７】
いくつかの場合において、親水性部分は、少なくとも２つの機能を有し得る：１つ目はミセル構造の外殻を形成することであり、２つ目は１以上のポリヌクレオチド（例えば、放射標識、質量標識、フルオロフォア、ＰＥＴ標識、発色団等の検出可能な薬剤で標識された、ｓｉＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドベースの治療分子またはｓｉＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドベースの診断剤）と結合することである。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、荷電可能な種または電荷を有する種（例えば、生理学的ｐＨにおいてアニオン性および／またはカチオン性の種／モノマー単位）も含み、膜を不安定化する（例えば、ｐＨ依存性の様式で膜を不安定化する）。いくつかの実施形態において、高分子キャリアにおける実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）および／またはコアは、実質的に正味中性である（すなわち、全体として見ると、正電荷および負電荷が実質的に平衡である）。いくつかの実施形態において、高分子キャリアにおける実質的に疎水性のブロック（例えばコアブロック）および／またはコアは、１以上の荷電可能な種（例えば、モノマー単位、部分、基等）を含む。さらに特定の実施形態において、高分子キャリアにおける実質的に疎水性のブロックおよび／またはコアは、複数のカチオン性の種および複数のアニオン性の種を含む。さらに特定の実施形態において、高分子キャリアにおける実質的に疎水性のブロックおよび／またはコアは、実質的に同数のカチオン性の種およびアニオン性の種を含む（すなわち、疎水性ブロックおよび／またはコアは、実質的に正味中性である）。
【００７８】
ある実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、第１および第２の荷電可能な種を含む。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な種はここに記載した通りであり、第２の荷電可能な種は、プロトン化を受けてカチオン性の種になる。特定の実施形態において、第１の荷電可能な種は、酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ、約６．５未満のｐＨ、約６．０未満のｐＨ、約５．８未満のｐＨ、約５．７未満のｐＨ等）において電荷を持たない。特定の実施形態において、第２の荷電可能な種のｐＫａは、約６〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７．５、またはいずれかの他の適切なｐＫａである。ある実施形態において、少なくとも１の第１の荷電可能な種および少なくとも１の第２の荷電可能な種は、単一のモノマー単位上に存在する。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能な種は第１の荷電可能なモノマー単位上に見られ、第２の荷電可能な種は第２の荷電可能なモノマー単位上に見られる。ある実施形態において、第１の荷電可能な種は、脱プロトン化を受けてアニオン性の種になり、第２の荷電可能な種は、プロトン化を受けてカチオン性の種になり、アニオン性の種とカチオン性の種の比は、中性のｐＨにおいて、約１:１０〜約１０:１、約１:６〜約６:１、約１:４〜約４:１、約１:２〜約２:１、約１:２〜３:２、または約１:１である。いくつかの実施形態において、第１の荷電可能なモノマー単位と第２の荷電可能なモノマー単位の比は、約１:１０〜約１０:１、約１:６〜約６:１、約１:４〜約４:１、約１:２〜約２:１、約１:２〜約３:２、または約１:１である。
【００７９】
ここで使用する場合、「コポリマー」という用語は、２以上の異なるモノマーの重合により生じるポリマーを意味する。
【００８０】
「モノブロックポリマー」は、単一の重合ステップの合成産物である。モノブロックポリマーという用語には、コポリマー（すなわち、２以上のタイプのモノマーの重合産物）およびホモポリマー（すなわち、単一のタイプのモノマーの重合産物）が含まれる。
【００８１】
「ブロック」コポリマーは、構造単位またはモノマー単位の１以上のサブコンビネーション（sub-combination）を含む構造を意味する。いくつかの実施形態において、構造単位は、１以上の重合可能なモノマーからの付加的なプロセスを介して生じる。いくつかの実施形態において、ここに記載するブロックコポリマーは、脂質でない構造単位またはモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーはジブロックコポリマーである。ジブロックコポリマーは、２つのブロックを含み；そのようなポリマーを模式的に一般化すると、以下の式により表される：[ＡａＢｂＣｃ ・・・]ｍ − [ＸｘＹｙＺｚ ・・・]ｎ；式中、それぞれの文字は構造単位またはモノマー単位を意味し、構造単位に対するそれぞれの添え字は、特定のブロックにおける構造単位のモル分率を意味し、３つの点は、各ブロックにさらなる（より少ない場合もある）構造単位が存在することを意味し、ｍおよびｎは、ジブロックコポリマーにおける各ブロックの分子量を意味する。いくつかの場合において、模式的に示したように、各構造単位の数および性質は、各ブロックにつて別々に制御される。前記図式は、各ブロックにおける構造単位の数または異なるタイプの構造単位の数の間におけるいずれかの関係を暗示することを意味せず、そのように理解されるべきではない。また、前記図式は、特定のブロック内の構造単位のいずれかの特定の数または配列を記載することも意図していない。各ブロックにおいて、構造単位は、特に言及しない限り、全くランダムな配置で、交互にランダムな配置で、規則的に交互の配置で、規則的なブロック配置で、またはランダムなブロック配置で配置されてよい。例えば、全くランダムな配列は、形態x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z…を有してよい。代表的な交互にランダムな配置は、形態x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z…を有してよく、代表的な規則的に交互の配置は、形態x-y-z-x-y-z-x-y-z…を有してよい。代表的な規則的なブロック配置は、以下の一般的な配置…x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x…を有してよい一方、代表的なランダムなブロック配置は、以下の一般的な配置…x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-…を有してよい。グラジエントポリマーにおいて、１以上のモノマー単位の含量は、ポリマーのα末端からω末端において、勾配の様式で増大または減少する。上述した一般的な例のいずれも、特定の近位の個々の構造単位もしくはブロックまたはブロックにおける構造単位の数もしくはブロックの数を意味するものではなく、本発明の高分子キャリアを形成するブロックコポリマーの実際の構造と関係のある、または前記実際の構造を限定するいずれかの様式として解釈されるべきではない。
【００８２】
ここで使用する場合、構造単位を囲う括弧は、構造単位自体がブロックを形成することを意味せず、そのような意味に解釈されるべきでもない。すなわち、大括弧内の構造単位は、ブロック内の他の構造単位といずれかの様式で、すなわち、全くランダムな配置で、交互にランダムな配置で、規則的に交互の配置で、規則的なブロック配置で、またはランダムなブロック配置で結合してよい。ここに記載するブロックコポリマーは、任意に、交互ブロックコポリマー、グラジエントブロックコポリマーまたはランダムブロックコポリマーである。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、デンドリマー、スターコポリマーまたはグラフトコポリマーである。
【００８３】
ある実施形態において、ブロックコポリマーは、エチレン不飽和モノマーを含む。「エチレン不飽和モノマー」という用語は、少なくとも１の炭素二重結合または三重結合を有する化合物としてここでは定義される。エチレン不飽和モノマーの非限定的な例は、アルキル (アルキル)アクリレート、メタクリレート、アクリレート、アルキルアクリルアミド、メタクリルアミド、アクリルアミド、スチレン、アリルアミン、アリルアンモニウム、ジアリルアミン、ジアリルアンモニウム、N-ビニルホルムアミド、ビニルエーテル、ビニルスルホネート、アクリル酸、スルホベタイン、カルボキシベタイン、ホスホベタイン、またはマレイン酸無水物である。
【００８４】
種々の実施形態において、ここに記載するポリマーおよび／または高分子キャリアを提供するのに適したいずれかのモノマーが使用される。いくつかの実施形態において、ここで提供されるポリマーおよび高分子キャリアの調製において使用するのに適したモノマーの非限定的な例には、１以上の以下に示すモノマーが含まれる：メチルメタクリレート、エチルアクリレート、プロピルメタクリレート（全ての異性体）、ブチルメタクリレート（全ての異性体）、2-エチルヘキシルメタクリレート、イソボロニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、α-メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（全ての異性体）、ブチルアクリレート（全ての異性体）、2-エチルヘキシルアクリレート、イソボロニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレンおよびグリシジルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（全ての異性体）、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、オリゴエチレングリコールメタクリレート、イタコン酸無水物、イタコン酸、グリシジルアクリレート、2-ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（全ての異性体）、N,N-ジメチルアミノエチルアクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、N-メチルアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-tert-ブチルメタクリルアミド、N-n-ブチルメタクリルアミド、N-メチロールアクリルアミド、N-エチロールアクリルアミド、ビニル安息香酸（全ての異性体）、ジエチルアミノスチレン（全ての異性体）、α-メチルビニル安息香酸（全ての異性体）、ジエチルアミノα-メチルスチレン（全ての異性体）、p-ビニルベンゼンスルホン酸、p-ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリ��ート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、ビニルアセテート、ビニルブチレート、ビニルベンゾエート、ビニルクロリド、ビニルフルオリド、ビニルブロミド、マレイン酸無水物、N-アリールマレイミド、N-フェニルマレイミド、N-アルキルマレイミド、N-ブチルマレイミド、N-ビニルピロリドン、N-ビニルカルバゾール、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、エチレン、プロピレン、1,5-ヘキサジエン、1,4-ヘキサジエン、1,3-ブタジエン、1,4-ペンタジエン、ビニルアルコール、ビニルアミン、N-アルキルビニルアミン、アリルアミン、N-アルキルアリルアミン、ジアリルアミン、N-アルキルジアリルアミン、アルキルエニミン、アクリル酸、アルキルアクリレート、アクリルアミド、メタクリル酸、アルキルメタクリレート、メタクリルアミド、N-アルキルアクリルアミド、N-アルキルメタクリルアミド、スチレン、N-イソプロピルアクリルアミド、ビニルナフタレン、ビニルピリジン、エチルビニルベンゼン、アミノスチレン、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、ビニルビフェニル、ビニルアニソール、ビニルイミダゾリル、ビニルピリジニル、ビニルポリエチレングリコール、ジメチルアミノメチルスチレン、トリメチルアンモニウム、エチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムプロピルアクリルアミド、ドデシルアクリレート、オクタデシルアクリレート、またはオクタデシルメタクリレートモノマーから選択されるアクリレートおよびスチレン、またはこれらの組み合わせ。
【００８５】
いくつかの実施形態において、これらのモノマーに官能基を持たせたものが任意に使用される。ここで使用される場合、官能基を持たせたモノマーは、マスクされた官能基またはマスクされていない官能基、例えば重合後に他の部分が結合し得る基を含むモノマーである。そのような基の非限定的な例は、１級アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、アジド基、およびシアノ基である。いくつかの適切なマスキング基を利用できる（例えば、T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994を参照されたい）
ここに記載するポリマーは、いずれかの適切な方法で調製される。ここで提供されるポリマーを作るために使用される適切な合成方法の非限定的な例には、カチオン重合、アニオン重合およびフリーラジカル重合が含まれる。いくつかの場合において、カチオン重合が使用される場合、モノマーを触媒で処理することにより重合が惹起される。任意に１以上のモノマーが使用され、コポリマーを形成してもよい。いくつかの実施形態において、そのような触媒はイニシエーターであり、例えば、プロトン酸（ブレンステッド酸）またはルイス酸が含まれ、ルイス酸を使用する場合、水またはアルコールのようないくつかのプロモーターも任意に使用される。いくつかの実施形態において、触媒の非限定的な例は、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、リン酸、フッ化水素、クロロスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、三塩化アルミニウム、アルキルアルミニウムクロリド、三フッ化ホウ素複合体、四塩化スズ、五塩化アンチモン、塩化スズ、四塩化チタン、五塩化リン、オキシ塩化リン、またはオキシ塩化クロムである。ある実施形態において、ポリマー合成は、簡潔に、またはいずれかの適切な溶媒中で行われる。適切な溶媒には、限定するものではないが、ペンタン、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が含まれる。ある実施形態において、ポリマー合成は、いずれかの適切な反応温度で行われ、例えば、約−50℃〜約100℃、または約0℃〜約70℃が含まれる。
【００８６】
ある実施形態において、ポリマーは、フリーラジカル重合により調製される。フリーラジカル重合が使用される場合、（i）モノマー、（ii）任意にコモノマー、および（iii）任意の源のフリーラジカルが、フリーラジカル重合をトリガーするために提供される。いくつかの実施形態において、高い温度に加熱することによりいくつかのモノマーは自己開始するため、フリーラジカルの源は任意である。ある場合において、重合混合物を形成した後、混合物を重合条件に供する。重合条件は、ここで述べたように、少なくとも１のモノマーが少なくとも１のポリマーの形成を引き起こす条件である。そのような条件は、任意に、いずれかの適切なレベルに変化させ、非限定的な例として、温度、圧力、雰囲気、重合混合物中に使用される出発成分の割合および反応時間が含まれる。重合は、いずれかの適切な様式で行われ、例えば、溶液、分散、懸濁液、エマルジョンまたはバルクが含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、イニシエーターが反応混合物中に存在する。ここに記載する重合プロセスにおいて有用である場合、いずれかの適切なイニシエーターが任意に利用される。そのようなイニシエーターの非限定的な例には、１以上のアルキル過酸化物、置換アルキル過酸化物、アリール過酸化物、置換アリール過酸化物、アクリル過酸化物、アルキルヒドロペルオキシド、置換アルキルヒドロペルオキシド、アリールヒドロペルオキシド、置換アリールヒドロペルオキシド、ヘテロアルキル過酸化物、置換へテロアルキル過酸化物、ヘテロアルキルヒドロペルオキシド、置換へテロアルキルヒドロペルオキシド、ヘテロアリール過酸化物、置換ヘテロアリール過酸化物、ヘテロアリールヒドロペルオキシド、置換ヘテロアリールヒドロペルオキシド、アルキル過酸エステル、置換アルキル過酸エステル、アリール過酸エステル、置換アリール過酸エステル、またはアゾ化合物が含まれる。特定の実施形態において、ベンゾイル過酸化物（ＢＰＯ）および／またはＡＩＢＮがイニシエーターとして使用される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、重合プロセスは、いずれかの適切な様式で、リビングモード（living mode）で行われ、限定するものではないが、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介リビングフリーラジカル重合（ＮＭＰ）、開環重合（ＲＯＰ）、デジェネレイティブ移動（退化的移動；ＤＴ）、または可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）である。通常のおよび／またはリビング／制御重合法を使用する場合、限定するものではないが、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、スターコポリマーおよびグラジエントコポリマーのような種々のポリマー構築物が作られ、それにより、モノマー単位は、鎖中に統計学的に分布するか、または勾配の様式で分布し、あるいはブロック配列もしくはペンダントグラフトでホモ重合する。別の実施形態において、ポリマーは、ザンテート（ＭＡＤＩＸ）の可逆的付加開裂連鎖移動を介して、マクロ分子設計により合成される（Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, No. 18, 1497-1503 (2001)）。
【００８９】
ある実施形態において、可逆的付加開裂連鎖移動またはＲＡＦＴは、本発明のエチレン骨格ポリマーの合成において使用される。ＲＡＦＴは、リビング重合プロセスである。ＲＡＦＴは、フリーラジカルデジェネレイティブ鎖移動（free radical degenerative chain transfer）プロセスを含む。いくつかの実施形態において、ここに記載するポリマーの調製のためのＲＡＦＴ法は、限定するものではないが、ジチオエステル、ジチオカルバメート、トリチオカルボネートおよびキサンテートのようなチオカルボニルチオ化合物を使用し、可逆的鎖移動メカニズムにより重合を媒介する。ある場合において、ポリマーラジカルと上述した化合物のいずれかのＣ＝Ｓ基との反応により、安定化されたラジカル中間体の形成を生じる。典型的に、これらの安定化されたラジカル中間体は、典型的なラジカル重合の停止反応を受けないが、むしろ、モノマーと共に再開または伝播可能なラジカルを再導入することにより、工程においてＣ＝Ｓ結合を再編成する。ほとんどの場合において、Ｃ＝Ｓ結合の添加後に次のラジカルの開裂が生じるこのサイクルは、モノマーが消費されるか、または反応がクエンチされるまで続く。一般的に、低い濃度の活性ラジカルは、いずれかの特定の時間において、通常の停止反応を制限する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）において利用されるブロックコポリマーは、低い多分散指数（ＰＤＩ）を有するか、または鎖長により異なる。多分散指数（ＰＤＩ）は、例えばポリマー鎖の重量平均分子量をその数平均分子量で割ることにより、いずれかの適切な様式で決定されてよい。数平均分子量は、個々の鎖の分子量を鎖の数で割ったものの和である。重量平均分子量は、分子量の平方をその分子量の分子の数で割ったものに比例する。重量平均分子量は、常に数平均分子量より大きいため、多分散性は、常に１以上である。数値が同一に近づくほど、すなわち多分散性が１の値に近づくほど、ポリマーは、各鎖が正確に同じ数の構造単位を有する単分散に近づく。１に近い多分散性の値は、ラジカルリビング重合を用いて達成可能である。多分散性を決定する方法は、例えば、限定するものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化クロマトグラフィーおよびエレクトロスプレーマスクロマトグラフィーが、当該分野で周知である。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）のブロックコポリマーは、多分散指数（ＰＤＩ）が２．０未満、または１．５未満、または１．４未満、または１．３未満、または１．２未満である。
【００９１】
ここに記載する高分子化プロセスは、任意に、いずれかの任意の適切な溶媒またはその混合物において生じる。適切な溶媒には、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アセトニトリル、ヘキサメチルホスホラミド、酢酸、ギ酸、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジオキサン、メチレンクロリド、エーテル（例えばジエチルエーテル）、クロロホルム、および酢酸エチルが含まれる。１つの実施形態において、溶媒には、水、および水とＤＭＦのような水混和性の有機溶媒との混合物が含まれる。
【００９２】
ある実施形態において、ここで使用されるポリ（ＤＭＡＥＭＡ）および他のポリマー要素（例えば、ＢＭＡ、ＤＭＡＥＭＡおよびＰＡＡのコポリマーブロックまたはコポリマー）は、いずれかの適切な様式で調製される。１つの実施形態において、ポリ（ＤＭＡＥＭＡ）は、ＲＡＦＴ ＣＴＡ、ＥＣＴおよびラジカルイニシエーターの存在下、ＤＭＡＥＭＡを重合することにより調製される。いくつかの実施形態において、ブロックのポリ（ＤＭＡＥＭＡ）マクロＣＴＡは、第２のブロックがＢＭＡ、ＤＭＡＥＭＡおよびＰＡＡを含む一連のジブロックコポリマーを調製するために使用される。他の特定の実施形態において、ジブロックポリマーにおけるブロックの配向は、自己組織化と同時に逆転し、ポリマーのω末端は、ミセルまたは高分子キャリアの親水性セグメント上に露出する。種々の実施形態において、これは、多数の合成的な方法を含むいずれかの適切な様式で達成される。例えば、いくつかの実施形態において、ここに記載するブロックコポリマーの合成は、コアを形成する疎水性ブロックであるＰＡＡ／ＢＭＡ／ＤＭＡＥＭＡを調製することから始まり、第２の合成ステップにおいて、得られたＰＡＡ／ＢＭＡ／ＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡを第２のＲＡＦＴ重合ステップに供することにより、外殻を形成する親水性の荷電ブロックが加えられる。代替のアプローチには、ＰＡＡ／ＢＭＡ／ＤＭＡＥＭＡマクロＣＴＡを還元することによりチオール末端を形成し、その後、予め形成した親水性の荷電ポリマーを形成されたチオールに共有結合性に結合させることが含まれる。この合成アプローチは、ミセルの表面に露出した高分子鎖のω末端に反応性の基を導入するための方法を提供し、化学的結合によりミセルを形成するための代替のアプローチを提供する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、別々の重合プロセスにより調製されたいくつかのポリマーブロックの化学的結合により合成される。
【００９４】
電荷を有する種および疎水性コア
ある実施形態において、疎水性ブロックは、１以上のタイプの荷電可能な種をさらに含む。特定の実施形態において、荷電可能な種は、カチオン性の種に荷電可能である。ここに記載する荷電可能な種を含む高分子キャリアには、それぞれの荷電可能な種が、電荷を有する状態または電荷を有さない状態で、高分子キャリア中にそれぞれ個別に存在する高分子キャリアが含まれる。さらに、ここに記載する高分子キャリアは、第１の荷電可能な種の集合、第２の荷電可能な種の集合および／またはいずれかの付加的な荷電可能な種の集合を含み、ここに記載する高分子キャリアには、第１、第２およびいずれかの付加的な荷電可能な種の集合のそれぞれが、各々独立して、完全に荷電した状態、部分的に荷電した状態または完全に電荷を有さない状態で高分子キャリア中に存在する高分子キャリアが含まれる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、アニオン性の荷電可能な種は、保護された種（例えばエステル）として、または遊離酸として、選択された重合プロセスにおいて任意に存在するいずれかの有機酸または無機酸の残基である。いくつかの実施形態において、アニオン性の荷電可能な種は、限定するものではないが、以下の群に示すような弱酸である：ボロン酸、スルホンアミド、ホスホン酸、アルソン酸、ホスフィン酸、リン酸塩、カルボン酸、キサンテン、テトラゾールまたはこれらの誘導体（例えばエステル）。ある実施形態において、マレイン酸無水物のようなモノマーは、マレイン酸無水物モノマー単位の重合後加水分解による第１の荷電可能な種の導入のために使用される（Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S. Stayton pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414）。特定の実施形態において、通常の生理的ｐＨにおいてアニオン性である荷電可能な種は、限定するものではないが、２−プロピルアクリル酸または、より正確には、それに由来する構造単位である２−プロピルプロピオン酸、-CH2C((CH2)2CH3)(COOH)（ＰＡＡ）のようなカルボン酸である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、荷電可能な種はカチオン性である。ある実施形態において、荷電可能な種は、生理的ｐＨにおいてカチオン性である。特定の実施形態において、生理的ｐＨにおいてカチオン性の種は、アンモニウム、-NRR'R"、グアニジウム（-NRC(=NR'H)+NR"R"'、当業者に周知のカチオン形態を含む）のような窒素種であり、式中のＲ基は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールであるか、または同じもしくは隣接する窒素原子に結合した２つのＲ基が互いに連結して複素環（限定するものではないが、例えば、ピロール、イミダゾール、もしくはインドール）を形成してよい。いくつかの実施形態において、（ａ）ポリカチオン（例えばＤＭＡＥＭＡ）および（ｂ）疎水化されたポリアニオン（たとえばプロピルアクリル酸）の一緒に作用する膜破壊の２つのメカニズムの組み合わせは、ポリマーにより与えられる膜不安定化の効力において、相加的または相乗的な効果を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、複数の疎水性種を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、疎水性モノマー単位を含む。ある実施形態において、疎水性モノマー単位は、ビニル置換された芳香族または芳香族複素環化合物である。さらに特定の実施形態において、疎水性モノマーは、アルキル（アルキル）アクリレートである。特定の実施形態において、疎水性モノマーは、スチレン誘導体である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、アニオン性およびカチオン性に荷電可能な種が同じモノマー単位中に存在する両性イオン性モノマー単位を含む。
【００９９】
いくつかの場合において、ブロックコポリマーは、当該分野で既知の化学（例えば、「クリック」ケミストリー）によって付加的な官能基を重合後に導入するために使用され得る反応性基を有するモノマーを含む（「クリック」反応の例は、Wu, P.; Fokin,V.V., Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17を参照されたい）。ある実施形態において、反応性基は活性化基であり、限定するものではないが、Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ピリジルジスルフィド基等が含まれる。
【０１００】
特定の場合において、ここで提供されるのは、以下の構造のポリマーである：
α-[Ds-Xt]b- [Bx-Py-Dz]a-ω [構造1]
α-[Bx-Py-Dz]a-[Ds-Xt]b-ω [構造2]
式中、x、y、z、sおよびtは、ポリマーブロック中の個々のモノマー単位D（DMAEMA）、B（BMA）、P（PAA）、および親水性中性モノマー（X）のモル％組成（一般的に、0〜50％）であり、aおよびbは、ブロックのモル重量であり、[Ds-Xt] は、親水性ブロックであり、αおよびωは、ポリマーの反対側の末端を意味する。ある実施形態において、xは50％、yは25％およびzは25％である。ある実施形態において、xは60％、yは20％およびzは20％である。ある実施形態において、xは70％、yは15％およびzは15％である。ある実施形態において、xは50％、yは25％およびzは25％である。ある実施形態において、xは33％、yは33％およびzは33％である。ある実施形態において、xは50％、yは20％およびzは30％である。ある実施形態において、xは20％、yは40％およびzは40％である。ある実施形態において、xは30％、yは40％およびzは30％である。いくつかの実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、約2,000 Da〜約30,000 Da、約5,000 Da〜約20,000 Da、または約7,000 Da〜約15,000 Daの親水性ブロックを含む。特定の実施形態において、親水性ブロックは、約7,000 Da、8,000 Da、9,000 Da、10,000 Da、11,000 Da、12,000 Da、13,000 Da、14,000 Da、または15,000 Daである。ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、約2,000 Da〜約50,000 Da、10,000 Da〜約50,000 Da、約15,000 Da〜約35,000 Da、または約20,000 Da〜約30,000 Daの疎水性ブロックを含む。いくつかの実施形態において、12,500 Daの親水性ブロックおよび25,000 Daの疎水性ブロックを有するポリマー（長さ比１：２）は、高分子キャリア（例えばミセル）を形成する。いくつかの実施形態において、10,000 Daの親水性ブロックおよび30,000 Daの疎水性ブロックを有するポリマー（長さ比１：３）は、高分子キャリア（例えばミセル）を形成する。いくつかの実施形態において、10,000 Daの親水性ブロックおよび25,
000 Daの疎水性ブロックを有するポリマー（長さ比１：２．５）は、約４５ｎｍの高分子キャリア（例えばミセル）を形成する（動的光散乱法または電子鏡検法により測定）。いくつかの特定の実施形態において、ミセルは、80または130 nmである（動的光散乱法または電子鏡検法により測定）。典型的に、ミセル外殻を形成する[Ds-Xt]の分子量（または長さ）は、コアを形成する疎水性ブロック[Bx-Py-Dz]に相関して増大するため、ミセルのサイズも増大する。いくつかの場合において、外殻を形成するポリマーのカチオン性ブロック[Ds-Xt]は、オリゴヌクレオチド薬剤との効率的な複合体形成／電荷中和を提供することにおいて重要である。例えば、約２０塩基対（すなわち、４０のアニオン性の電荷）のｓｉＲＮＡの場合において、カチオン性ブロックは、効率的な結合を提供するのに適した長さを有する（例えば４０のカチオン性の電荷）。80 DMAEMA モノマー (MW = 11,680)を含み、7.4のpKa値を有する外殻ブロックの場合、ブロックは、pH 7.4において40のカチオン性の電荷を有する。いくつかの場合において、安定なポリマー-siRNA結合体（例えば複合体）は、同じくらいの数の逆の電荷の間での静電気的相互作用により形成される。ある場合において、多量の過剰な正電荷を避けることは、インビトロおよびインビボでの毒性を有意に妨げる。
【０１０１】
特定の実施形態において、ブロックコポリマーの疎水性ブロックは、例えばジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のような複数のカチオン性の荷電可能な種を含む。それ故、いくつかの実施形態において、そのようなポリマーセグメントの構造は、以下の構造３のように表される：
Q1-[BMAx-PAAy-DMAEMAz]-Q2 [構造3]
式中、x、y、およびzは、個々のモノマー単位のモル％組成であり（一般的に、0〜50％）、上述した名称は、他のポリマーブロックまたは末端基の官能基を意味する。ある場合において、個々のモノマー単位は、個々の機能および相乗的な機能に貢献する。例えば、アニオン性の種および疎水性の種の両方を含み、pKa値が6.7以下であるポリプロピルアクリル酸は、約6.7より大きいｐＨで親水性であり、カルボン酸塩がプロトン化される約6.7より低いｐＨではだんだん疎水性になる。ある場合において、例えばブロック中の大部分が疎水性のモノマー単位BMAのモル％を増大させることにより、局所的な環境の疎水性を増大させることは、PAA pKaを上昇させ、より高いpHにおいてPAAのプロトン化を生じ、すなわち、PAA含有ブロックは、より高いpHにおいてより膜不安定化作用を有するようになり、それ故、生理学的pH以下のpH（7.4以下）において同様の酸性変化に対してより応答性になる。いくつかの実施形態において、PAAのプロトン化は、疎水性の大きな増大を生じ、続いて膜不安定化特性を有する形態への立体配置的な変化を生じる。 上述したモノマーブロックにおける第３のモノマー単位は、例えばDMAEMAのようなカチオン性の種であり、いくつかの場合において、複数の機能を与え、非限定的な例には以下のものが含まれる。PAAのアニオン性の種と等しいモル量において一致した場合、それは電荷を中和し、ミセル構造の疎水性コアの安定性に寄与し得る静電気相互作用を形成するためのポテンシャルを形成し、上記構造におけるQ1またはQ2は、例えばポリDMAEMAのような親水性ホモポリマーブロックである。
【０１０２】
ブロック配列
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、生理学的ｐＨ（例えば、ヒト血漿循環のｐＨ）付近においてカチオン性である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、ポリカチオンを含む。いくつかの実施形態において、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）は、ｘのアニオンを含むポリアニオン性であり、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約0.6 x、約0.7・x、約0.8 x、約0.9 x、約1.0 x、約1.1 xまたはそれ以上のカチオンを含む。特定の実施形態において、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）は、ｘのアニオンを含むポリアニオン性であり、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約0.7・xまたはそれ以上のカチオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックのカチオン性の種は、窒素種であり、その非限定的な例は、アンモニウム、-NRR'R"、グアニジニウム (-NRC(=NR'H)+NR"R"'、当業者が既知の標準的な形態を含む) であり、式中のＲ基は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールであるか、または同じもしくは隣接する窒素原子に結合した２つのＲ基が相互に連結して複素環種（例えば、ピロール、イミダゾール、もしくはインドール）を形成してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、核酸結合ポリアミド、インターカレーター、または二本鎖もしくは三本鎖を形成するオリゴヌクレオチドである。ポリヌクレオチドキャリアブロックは、ブロックコポリマーのα末端ブロックまたはω末端ブロックであってよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロックは、約10,000ダルトン〜約20,000ダルトンの数平均分子量（Mn）を有する。別の実施形態において、疎水性ブロックは、約2,000ダルトン〜約50,000 ダルトン、または約10,000ダルトン〜約50,000ダルトンの数平均分子量（Mn）を有する。
【０１０３】
特定の実施形態において、ブロックコポリマー（例えば、ジブロックコポリマー）は、以下に示す化学式Iを有する：
【化１】
2011523641.tif 000003
【０１０４】
いくつかの実施例において、
A0、A1、A2、A3およびA4は、-C-、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-および-O(C)bO-からなる群より選択され；式中、
aは1〜4であり；
bは2〜4であり；
Y4は、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、C(O)NR6(1C-10C)、(4C-10C)ヘテロアリールおよびアリール(6C-10C)アリールからなる群より選択され、そのいずれかは、１以上のフッ素基で任意に置換され；
Y0、Y1およびY2は、独立して、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C) アルキル-、-OC(O)(1C-10C) アルキル-、-O(2C-10C)アルキル- および-S(2C-10C)アルキル-、-C(O)NR6(2C-10C) アルキル-; (4C-10C)ヘテロアリールおよび (6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y3は、共有結合、(1C-10C)アルキル、(4C-10C)ヘテロアリールおよび(6C-10C)アリールからなる群より選択され；式中
R1〜R5で完全には置換されていないA1〜A4の四価の炭素原子およびY0〜Y4は、適切な数の水素原子で完結しており；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、水素、-CN、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは、1以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Q0は、生理的pHにおいて親水性の残基、および生理的pHにおいて少なくとも部分的に正に荷電する残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理的pHにおいて少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いpHにおいてプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩等）；生理的pHにおいて実質的に中性（または電荷を有さない）の残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；生理的pHにおいて少なくとも部分的に両性イオン性の残基（例えば、生理的pHにおいてアンモニウム基およびリン酸基を含むモノマー残基）；結合可能な残基または官能化が可能な残基（例えば、反応性基（例えば、アジド、アルキン、スクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、p-ニトロフェニルエステル、ピリジルジスルフィド等）を含む残基）；または水素からなる群より選択され；
Q1は、生理的pHにおいて親水性の残基および生理的pHにおいて少なくとも部分的に正に荷電する残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理的pHにおいて少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いpHにおいてプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩等）；生理的pHにおいて実質的に中性の残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；または生理的pHにおいて少なくとも部分的に両性イオン性の残基（例えば、生理的pHにおいてアンモニウム基およびリン酸基を含む）；
Q2は、生理的pHにおいて正の電荷を有する残基であり、非限定的な例として、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、およびピリジルが含まれ；
Q3は、生理的pHにおいて負の電荷を有するが、より低いpHにおいてプロトン化を受ける残基であり、非限定的な例として、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩およびリン酸塩が含まれ；
mは、約0〜1.0未満であり (例えば、0〜約0.49);
nは、0より大きい〜約1.0であり (例えば、約0.51〜約1.0);
m + n = 1であり；
pは、約0.1〜約0.9であり (例えば、約0.2〜約0.5);
qは、約0.1〜約0.9であり (例えば、約0.2〜約0.5);
rは、0〜約0.8であり (例えば、0〜約0.6);
p + q + r = 1であり；
vは、約1〜約25 kDaまたは約5〜約25 kDaであり;
wは、約1〜約50 kDaまたは約5〜約50 kDaである。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、pおよびqにより表されるモノマー残基の数または比は、互いに約30％以内、互いに約20％以内、または互いに約10％以内である。ある実施形態において、少なくとも部分的に荷電したということは、一般的に、微量より多い荷電した種を含み、例えば、少なくとも20％の残基が電荷を有し、少なくとも30％の残基が電荷を有し、少なくとも40％の残基が電荷を有し、少なくとも50％の残基が電荷を有し、少なくとも60％の残基が電荷を有し、または少なくとも70％の残基が電荷を有する。
【０１０６】
ある実施形態において、mは0であり、Q1は、親水性であり、生理的pHにおいて実質的に中性の（または電荷を有さない）残基である。いくつかの実施形態において、実質的に電荷を有さないとは、例えば、5％未満が電荷を有し、3％未満が電荷を有し、または1％未満が電荷を有することを含む。ある実施形態において、mは0であり、Q1は、親水性で、生理的pHにおいて少なくとも部分的にカチオン性の残基である。ある実施形態において、mは0であり、Q1は、親水性で、生理的pHにおいて少なくとも部分的にアニオン性の残基である。ある実施気形態において、m＞0であり、n＞0であり、Q0またはQ1のいずれか一方は、親水性で、生理的pHにおいて少なくとも部分的にカチオン性の残基であり、他方のQ0またはQ1は、親水性で、生理的pHにおいて実質的に中性の残基である。ある実施形態において、m＞0であり、n＞0であり、Q0またはQ1のいずれか一方は、親水性で、生理的pHにおいて少なくとも部分的にアニオン性の残基であり、他方のQ0またはQ1は、親水性で、生理的pHにおいて実質的に中性の残基である。ある実施形態において、m＞0であり、n＞0であり、Q1は、親水性で、生理的pHにおいて少なくとも部分的にカチオン性の残基であり、Q0は、結合可能（conjugatable）または官能化可能（functionalizable）な残基である。ある実施形態において、m＞0であり、n＞0であり、Q1は、親水性で、生理的pHにおいて実質的に中性の残基であり、Q0は、結合可能または官能化可能な残基である。
【０１０７】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、以下に示す式IIのブロックコポリマーを含む。
【化２】
2011523641.tif 000004
【０１０８】
いくつかの実施形態において、
A0、A1、A2、A3およびA4は、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-および-O(C)bO-からなる群より選択され;
aは、1〜4であり;
bは、2〜4であり;
Y0およびY4は、独立して、水素、(1C〜10C)アルキル、(3C〜6C)シクロアルキル、O-(1C〜10C)アルキル、-C(O)O(1C〜10C)アルキル、C(O)NR6(1C〜10C)、(4C〜10C)ヘテロアリールおよび(6C〜10C)アリールからなる群より選択され；これらのいずれかは、1以上のフッ素基で任意に置換され；
Y1およびY2は、独立して、共有結合、(1C〜10C)アルキル-、-C(O)O(2C〜10C)アルキル-、-OC(O)(1C〜10C)アルキル-、-O(2C〜10C)アルキル-および-S(2C〜10C)アルキル-、-C(O)NR6(2C〜10C)アルキル、(4C〜10C)へテロアリールおよび(6C〜10C)アリールからなる群より選択され;
Y3は、共有結合、(1C〜10C)アルキル、(4C〜10C)ヘテロアリールおよび(6C〜10C)アリールからなる群より選択され；
R1〜R5で完全には置換されていないA1〜A4の四価の炭素原子およびY0〜Y4は、適切な数の水素原子で完結し；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、水素、-CN、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは、1以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Q1およびQ2は、生理的pHにおいて正の電荷を有する残基であり、非限定的な例としては、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリルおよびピリジルが含まれ；
Q3は、生理的pHにおいて負の電荷を有するが、より低いpHにおいてプロトン化を受ける残基であり、非限定的な例としては、カルボキシル、スルホンアミド、ボロン酸塩、ホスホン酸塩、およびリン酸塩が含まれ；
mは、0〜約0.49であり;
nは、約0.51〜約1.0であり;
m + n = 1であり；
pは、約0.2〜約0.5であり;
qは、約0.2〜約0.5であり;
pは、実質的にqと同じであり;
rは、0〜約0.6であり;
p + q + r = 1であり；
vは、約5〜約25 kDaであり;
wは、約5〜約50 kDaである。
【０１０９】
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、以下に示す式IIIのブロックコポリマー（例えば、正常な生理的pHにおいて）を含む。
【化３】
2011523641.tif 000005
【０１１０】
ある実施形態において、上述したように置換されたA0、A1、A2、A3、およびA4は、式IIIのポリマーの構造単位（ここでは、「モノマー単位」および「モノマー残基」と互換性に使用される）を含む。特定の実施形態において、式IIIのA基を構成するモノマー単位は、適切な条件下で重合可能である。ある場合において、エチレン骨格または構造単位である-(C-C-)m-ポリマー（それぞれのCは、Hおよび／または他の適切な基で二置換される）は、炭素−炭素二重結合>C=C<を含むモノマーを用いて重合される。ある実施形態において、A基のそれぞれ（例えば、A0、A1、A2、A3、およびA4のそれぞれ）は、-C-C-（すなわち、エチレンモノマー単位もしくはポリマー骨格）、-C(O)(C)aC(O)O-（すなわち、ポリ無水物モノマー単位もしくはポリマー骨格）、-O(C)aC(O)-（すなわち、ポリエステルモノマー単位またはポリマー骨格）、または-O(C)bO-（すなわち、ポリアルキレングリコールモノマー単位またはポリマー骨格）等である（ここで、Cはそれぞれ、Hおよび／またはここに記載するようないずれかの他の適切な基（上記のようなR12および／またはR13を含む）で二置換される）。特定の実施形態において、「a」は１〜４の整数であり、「b」は２〜４の整数である。ある実施形態において、式IIIの骨格に結合する「Y」および「R」基のそれぞれ（すなわち、Y0、Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R3、R4、R5のいずれか１つ）は、特定のモノマー単位のいずれかの「C」（いずれかの(C)aまたは(C)bを含む）に結合する。特定の実施形態において、特定のモノマー単位のYおよびRは、共に同じ「C」に結合する。ある特定の実施形態において、特定のモノマー単位のYおよびRは、共に同じ「C」に結合し、「C」は、モノマー単位のカルボニル基が存在する場合、そのαである。
【０１１１】
特定の実施形態において、R1〜R11は、独立して、水素、アルキル（例えば、1C〜5Cアルキル）、シクロアルキル（例えば、3C〜6Cシクロアルキル）、またはフェニルから選択され、R1〜R11のいずれかは、フッ素、シクロアルキル、または１以上のアルキル基で任意に置換されてよいフェニルにより任意に置換される。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、Y0およびY4は、独立して、水素、アルキル（例えば、1C〜10Cアルキル）、シクロアルキル（例えば、3C〜6Cシクロアルキル）、O-アルキル（例えば、O-(2C〜10C)アルキル、-C(O)O-アルキル（例えば、-C(O)O-(2C〜10C)アルキル）、またはフェニルから選択され、そのそれぞれは、１以上のフッ素で任意に置換される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、Y1およびY2は、独立して、共有結合、アルキル、好ましくは(1C〜10C)アルキル、-C(O)O-アルキル、好ましくは-C(O)O-(2C〜10C)アルキル、-OC(O)アルキル、好ましくは-OC(O)-(2C〜10C)アルキル、O-アルキル、好ましくは-O(2C〜10C)アルキル、および-S-アルキル、好ましくは-S-(2C〜10C)アルキルからなる群より選択される。ある実施形態において、Y3は、共有結合、アルキル（好ましくは(1C〜5C)アルキル）およびフェニルからなる群より選択される。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、Zは存在するか、または存在しない。ある実施形態において、R1および／またはR4は水素であり、Z-はOH-である。ある実施形態において、Z-はいずれかの対イオン（例えば、１以上の対イオン）であり、非限定的な例としては、クロリド、無機もしくは有機のホスフェート、スルフェート、スルホネート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、バレレート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、ミリステート、パルメート（palmate）、ステアレート、パルミトレート、オレエート、リノレート（linolate）、アラキデート（arachidate）、ガドレエート（gadoleate）、ワクチネート（vaccinate）、ラクテート、グリコラート、サリチレート、デスアミノフェニルアラニン（desamionphenylalanine）、デスアミノセリン（desaminoserine）、デスアミノスレオニン（desaminothreonine）ε-ヒドロキシカプロエート、3-ヒドロキシブチレート、4-ヒドロキシブチレートまたは3-ヒドロキシバレレートが挙げられる。いくつかの実施形態において、Y、Rおよび任意のフッ素が選択された骨格の炭素に共有結合した場合、完全には置換されていないいずれかの炭素は、適切な数の水素原子で終結（complete）する。数m、n、p、qおよびrは、ブロックにおける各構造単位のモル分率を意味し、vおよびwは、各ブロックの分子量を意味する。
【０１１５】
ある実施形態において、
A0、A1、A2、A3およびA4は、-C-、-C-C-、-C(O)(CR12R13)aC(O)O-、-O(CR12R13)aC(O)-およびO(CR12R13)bOからなる群より選択され；
aは1〜4であり；
bは2〜4であり；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、およびR13は、独立して、水素、(1C〜5C)アルキル、(3C〜6C)シクロアルキル、(5C〜10C)アリール、および(4C〜10C)ヘテロアリールからなる群より選択され、そのいずれかは、１以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Y0およびY4は、独立して、水素、(1C〜10C)アルキル、(3C〜6C)シクロアルキル、O-(1C〜10C)アルキル、-C(O)O(1C〜10C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは、1以上のフッ素基で任意に置換され；
Y1およびY2は、独立して、共有結合、(1C〜10C)アルキル-、-C(O)O(2C〜10C)アルキル-、-OC(O)(1C〜10C)アルキル-、-O(2C〜10C)アルキル-および-S(2C〜10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y3は、共有結合、(1C〜5C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；R1〜R5およびY0〜Y4で完全には置換されていないA1〜A4の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子で終結し；
Zは、1以上の生理的に許容可能な対イオンであり；
mは、0〜約0.49であり；
nは、約0.51〜約1.0であり；
m + n = 1であり；
pは、約0.2〜約0.5であり；
qは、約0.2〜約0.5であり；
pは、実質的にqと同じであり；
rは、0〜約0.6であり；
p + q + r = 1であり；
vは、約1〜約25 kDaであるか、または約5〜約25 kDaであり；
wは、約1〜約50 kDaであるか、または約5〜約50 kDaである。
【０１１６】
特定の実施形態において、A0、A1、A2、A3およびA4は、独立して、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-および-O(C)bO-からなる群より選択され；
aは、1〜4であり；
bは、2〜4であり；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10およびR11は、独立して、水素、(1C〜5C)アルキル、(3C〜6C)シクロアルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは、１以上のフッ素原子で任意に置換されてよく；
Y0およびY4は、独立して、水素、(1C〜10C)アルキル、(3C〜6C)シクロアルキル、O-(1C〜10C)アルキル、-C(O)O(1C〜10C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、そのいずれかは、1以上のフッ素基で任意に置換され；
Y1およびY2は、独立して、共有結合、(1C〜10C)アルキル-、-C(O)O(2C〜10C)アルキル-、-OC(O)(1C〜10C)アルキル-、-O(2C〜10C)アルキル-および-S(2C〜10C)アルキル-からなる群より選択され；
Y3は、共有結合、(1C〜5C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；
R1〜R5およびY0〜Y4で完全には置換されていないA1〜A4の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子で終結し；
Zは、生理的に許容可能な対イオンであり；
mは、0〜約0.49であり；
nは、約0.51〜約1.0であり；
m + n = 1であり；
pは、約0.2〜約0.5であり；
qは、約0.2〜約0.5であり；
pは、実質的にqと同じであり；
rは、0〜約0.6であり；
p + q + r = 1であり；
vは、約5〜約25 kDaであり；
wは、約5〜約25 kDaである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、
A1は、-C-C-であり；
Y1は、-C(O)OCH2CH2-であり；
R6は、水素であり；
R7およびR8は、それぞれ-CH3であり；
R2は、-CH3である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、
A2は、-C-C-であり；
Y2は、-C(O)OCH2CH2-であり；
R9は、水素であり；
R10およびR11は、それぞれ-CH3であり；
R3は、-CH3である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、
A3は、-C-C-であり；
R4は、CH3CH2CH2-であり；
Y3は、共有結合であり；
Zは、生理的に許容可能なアニオンである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、
A4は、-C-C-であり；
R5は、水素および-CH3からなる群より選択され；
Y4は、-C(O)O(CH2)3CH3である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、
A0は、C-C-であり；
R1は、水素および(1C〜3C)アルキルからなる群より選択され；
Y0は、-C(O)O(1C〜3C)アルキルからなる群より選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、mは0である。  
いくつかの実施形態において、rは0である。  
いくつかの実施形態において、mおよびrは共に0である。
【０１２３】
ここに記載する種々の実施形態において、ここに記載する生理的pHにおいてカチオン性または正の電荷を有する構造単位（例えば、ある一定の親水性構造単位を含む）は、1以上のアミノ基、アルキルアミノ基、グアニジン基、イミダゾリル基、ピリジル基等、またはそのプロトン化形態、アルキル化形態、またはその他の電荷を有する形態を含む。いくつかの実施形態において、ここで利用される通常のpHにおいてカチオン性の構造単位には、非限定的な例として、ジアルキルアミノアルキルメタクリレート（例えば、DMAEMA）のモノマー残基が含まれる。ここに記載する種々の実施形態において、ここに記載する生理的pHにおいてアニオン性または負の電荷を有する構造単位（例えば、ある一定の親水性構造単位を含む）は、非限定的な例として、カルボキシレート、スルホンアミド、ボロネート、ホスホネート、ホスフェート等が含まれる1以上の酸性基またはその共役塩基を含む。いくつかの実施形態において、ここで利用される通常の生理的pHにおいてアニオン性または負の電荷を有する構造単位には、非限定的な例として、アクリル酸、アルキルアクリル酸等（例えば、メチルアクリル酸、エチルアクリル酸、プロピルアクリル酸等）のモノマー残基が含まれる。ここに記載する種々の実施形態において、生理的pHにおいて中性である親水性の構造単位は、1以上の親水性基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）を含む。いくつかの実施形態において、ここで利用される通常の生理的pHにおいて中性である親水性の構造単位には、非限定的な例として、PEG化アクリル酸、PEG化メタクリル酸、ヒドロキシアルキルアクリル酸（例えば、HPMA）等が含まれる。ここに記載する種々の実施形態において、生理的pHにおいて両性イオン性である親水性の構造単位は、生理的pHにおいてアニオン性または負の電荷を有する基および生理的pHにおいてカチオン性または正の電荷を有する基を含む。いくつかの実施形態において、ここで利用される通常の生理的pHにおいて両性イオン性である親水性の構造単位には、非限定的な例として、生理的pHにおいてホスフェート基およびアンモニウム基を含むモノマー残基等が含まれる（本明細書中に組み込まれるUS 7,300,990を参照されたい）。
【０１２４】
ある実施形態において、ここで提供されるポリマーは、さらに、結合可能または官能化可能な側鎖（例えば、モノマー残基のペンダント基）を含む１以上の構造単位を含む。いくつかの場合において、結合可能または官能化可能な側鎖は、重合後に化学の分野で既知の方法（例えば、「クリック」ケミストリー）により付加的な官能性を導入するために使用され得る1以上の反応性基を有する基である（「クリック」反応の例として、Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17を参照されたい）。
【０１２５】
ある実施形態において、ここで提供される結合可能または官能化可能な側鎖は、１以上のいずれかの適切な活性化基を含み、その非限定的な例として、N-ヒドロスクシンイミド (NHS)エステル、HOBt (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)エステル、p-ニトロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ピリジルジスルフィド基等が挙げられる。
【０１２６】
ある実施形態において、ブロックコポリマーは、以下に示す式１の化学式を有する（通常の生理学的pHまたはおよそ中性のpHにおいて）ジブロックコポリマーである：
【化４】
2011523641.tif 000006
【０１２７】
ある場合において、化合物IV１の構造単位は、左側の角括弧および右側の角括弧の中に示されており、それらは以下のモノマーに由来する：
【化５】
2011523641.tif 000007
【０１２８】
p、qおよびrの文字は、そのブロック内の各構造単位のモル分率を意味する。vおよびwの文字は、ジブロックコポリマーにおける各ブロックの分子量（数平均）を意味する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ここで提供される化合物は、以下に示す構造を有する化合物である：
【化６】
2011523641.tif 000008
【０１３０】
上述したように、文字p、qおよびrは、ブロック内の各構造単位のモル分率を意味する。文字vおよびwは、ジブロックコポリマーにおける各ブロックの分子量（数平均）を意味する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、以下に示すポリマーがここで提供される：
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV3
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV4
[PEGMAm-/-DMAEMAn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV5
[PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV6
[DMAEMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV7
[HPMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV8
[PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV9。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Bは、ブチルメタクリレート残基であり；Pは、プロピルアクリル酸残基であり；DおよびDMAEMAは、ジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり；PEGMAは、ポリエチレングリコールメタクリレート残基（例えば、化合物IV2に示したように1〜20のエチレンオキシド単位を有するか、または4〜5のエチレンオキシド単位、または7〜8のエチレンオキシド単位を有する）であり；MAA(NHS)は、メチルアクリル酸-N-ヒドロキシスクシンアミド残基であり；HPMAは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド残基であり；PDSMは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基である。ある実施形態において、m、n、p、q、r、wおよびvは、上記に記載した通りである。特定の実施形態において、wは、約0.1x〜約5x、または約1x〜約5x vである。
【０１３３】
式IV1〜IV9の化合物は、ここで提供される化合物ポリマーの例であり、ポリマーの第１のブロックを作る種々の構造単位を含む。いくつかの実施形態において、第１のブロックの構造単位は、ポリマーを作るために変化させるか、または化学的に処理され、第１のブロックは、中性（例えばPEGMA）、カチオン性（例えばDMAEMA）、アニオン性（例えば、NHSが加水分解されて酸になるPEGMA-NHS、もしくはアクリル酸）、両性電解質（例えば、NHSが加水分解されて酸になるDMAEMA-NHS）、または両性イオン性（例えばポリ[2-メタクリロイルオキシ-2'トリメチルアンモニウムエチルホスフェート])であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、第１のブロックにおいてピリジルジスルフィド官能基を含むポリマー（例えば[PEGMA-PDSM]-[B-P-D]）は、チオール化（thiolated）siRNAと任意に反応し、ポリマー-siRNA結合体を形成する。
【０１３４】
特定の実施形態において、式IV3の化合物は、ここに記載するようにP7クラスのポリマーであり、以下の表１に示すような分子量、多分散性およびモノマー組成を有する。
【表１】
2011523641.tif 000009
【０１３５】
ａ Viscotek GPCmax VE2001および屈折計VE3580 (Viscotek, Houston, TX)に連続して連結したSEC Tosoh TSK-GEL R-3000およびR-4000カラム (Tosoh Bioscience, Mongomeryville, PA)により測定。HPLC-グレードのDMF含有0.1 wt % LiBrを、移動相として使用した。合成したコポリマーの分子量は、一連のポリ(メチルメタクリレート)標準を用いて決定した。
【０１３６】
b 1H NMR分光分析により測定 (CDCL3中、3 wt % ; Bruker DRX 499)。
【０１３７】
いくつかの特定の実施形態において、式IV3のポリマーは、表２によるP7クラスのポリマーである。
【表２】
2011523641.tif 000010
【０１３８】
特定の実施形態において、式IV3の化合物は、PRx0729v6と呼ばれるP7クラスのポリマーである。PRx0729v6は、本明細書および種々の優先権明細書において、P7v6と互換性に使用される。
【０１３９】
スペーサーブロック
いくつかの実施形態において、本発明のブロックコポリマーは、１以上の任意のブロックを含む。これらのブロックは、スペーサーブロックであってよい。
【０１４０】
ある実施形態において、ここに記載される少なくとも１のブロックコポリマーは、さらにスペーサーブロックを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーブロックは、疎水性ブロックとポリヌクレオチドキャリアブロックの間の親水性ブロックである。
【０１４１】
親水性セグメント／ブロックの遮蔽
ある実施形態において、ここに記載する高分子キャリアは、1以上の遮蔽剤を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロック／セグメントは、PEG置換モノマー単位を含む（例えば、PEGは側鎖であり、ポリヌクレオチドキャリアブロックの骨格を含まない）。いくつかの場合において、ここに記載する高分子キャリアにおいて使用される１以上のポリマー（例えばブロックコポリマー）は、分子量が約1,000〜約30,000のブロックまたはポリエチレングリコール（PEG）鎖を含む。いくつかの実施形態において、PEGはポリマーの末端基またはここで提供される高分子キャリアのポリマー中に存在する1以上のペンダント状の修飾可能な基に結合する。いくつかの実施形態において、PEG残基は、ここで提供される高分子キャリアのポリマー（例えばブロックコポリマー）の親水性セグメントまたはブロック（例えば外殻ブロック）内の修飾可能な基に結合する。ある実施形態において、2〜20のエチレンオキシド単位のPEG残基を含むモノマーは、共重合し、ここで提供される高分子キャリアを形成するポリマーの親水性部分を形成する。
【０１４２】
いくつかの場合において、遮蔽剤は、血漿における酵素的消化に対する治療薬（例えば、ポリヌクレオチドまたはペプチド等）の安定性を増強する。いくつかの場合において、遮蔽剤は、ここに記載する高分子キャリア（例えば、ポリヌクレオチドに結合したブロックコポリマー）の毒性を低減する。いくつかの場合において、遮蔽剤は、高分子キャリアに好ましい表面特性を与える。いくつかの実施形態において、遮蔽剤は、複数の中性の親水性モノマー残基を含む。いくつかの場合において、遮蔽ポリマーは、ポリマーの末端基を介して膜不安定化ブロックコポリマーに共有結合する。いくつかの実施形態において、遮蔽剤は、ポリマーの１以上のモノマー残基に結合する共有結合したペンダント部分である。いくつかの実施形態において、ここに記載する高分子キャリアにおける複数のモノマー残基は、官能基を介してポリエチレングリコールオリゴマーまたはポリマーに共有結合したペンダント状の遮蔽種（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマー（例えば、２０以下の繰り返し単位）またはポリマー（例えば、２０より多い繰り返し単位））を含む。いくつかの場合において、ブロックコポリマーは、コポリマーの膜不安定化ブロックのα末端またはω末端に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマーまたはポリマーを含む。
【０１４３】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドキャリアブロック／セグメントは、ポリヌクレオチドキャリアブロック／セグメントにおける電荷（例えば、カチオン性の電荷）を少なくとも部分的に遮蔽するために役立つモノマー単位を含む。特定の実施形態において、遮蔽は、少なくとも部分的に、ポリヌクレオチドキャリアブロック／セグメントの少なくとも一部を含むモノマー単位におけるペンダント部分に起因する。そのような遮蔽は、任意に、このセグメントにおける過剰な電荷に由来する細胞毒性を低下させる。
【０１４４】
高分子キャリアのポリマーに対するポリヌクレオチドの結合
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）は、ここに記載するいずれかの高分子キャリアの１以上の複数のポリマーに結合する（例えば、共有結合または非共有結合）。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドは、いずれかの適切な技術（例えば、化学的結合技術）により、ポリマーに結合し得る。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、高分子キャリアのポリマーのポリヌクレオチドキャリアブロックまたはセグメントに結合する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ここに記載するいずれかの高分子キャリアのポリマーのα末端（すなわち、重合が開始される末端）もしくはその付近またはω末端（すなわち、重合が終結する末端）もしくはその付近に結合する。いくつかの特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリマーのα末端における結合可能部分とポリヌクレオチドの結合により、ここに記載するいずれかの高分子キャリアのポリマーに結合する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリマーのω末端における結合可能部分とポリヌクレオチドの結合により、ここに記載するいずれかの高分子キャリアのポリマーに結合する。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、リンキング部分（例えば、共有結合または化学結合）を介してポリマーに結合したポリマーのα末端における結合可能部分とポリヌクレオチドとの結合により、ここに記載するいずれかの高分子キャリアのポリマーに結合する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリマーのモノマー単位に結合したペンダント基に結合する。種々の実施形態において、リンキング部分は、任意に、切断可能でないか、または切断可能である。ある実施形態において、ポリヌクレオチドとここに記載する高分子キャリアのポリマーを結合する切断可能な結合には、非限定的な例として、ジスルフィド結合（例えば、細胞質の還元性の環境において解離する）が含まれる。いくつかの実施形態において、リンキング部分は切断可能であり、および／またはエンドソームの条件において切断可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、リンキング部分は切断可能であり、および／または特定の酵素（例えば、ホスファターゼまたはプロテアーゼ）により切断可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、リンキング部分は切断可能であり、および／または細胞内のパラメータ（例えば、ｐＨ、酸化還元電位）における変化に基づいて切断可能な結合を含む。いくつかの実施形態において、ポリマー（例えば、ポリマーのαまたはω末端の結合可能な基）とポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の間の共有結合性の会合は、いずれかの適切な化学的結合手法を用いて達成され、限定するものではないが、アミン−カルボキシルリンカー、アミン−アルデヒドリンカー、アミン−ケトンリンカー、アミン−糖リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−糖リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−糖リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリ���−スルフヒドリルリンカー、糖−ヒドロキシルリンカー、糖−糖リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの適切な結合可能な基と、ここに記載する高分子キャリアのポリマーとの間の共有結合を達成するために、二官能価の架橋結合試薬が使用される。いくつかの実施形態において、結合は、ｐＨ感受性の結合およびリンカーを用いても行われ、限定するものではないが、ヒドラゾンおよびアセタール結合が含まれる。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ボロン酸とポリヌクレオチドの末端リボース残基の2’および3’-ヒドロキシルとによるエステルの形成を介して、ポリマーのαまたはω末端に組み込まれたボロン酸官能基（例えば、フェニルボロン酸残基）に共有結合する。いずれかの他の適切な結合（conjugation/attachment）手法を、同様に任意に利用でき、例えば、多くの種類の結合化学が利用可能である（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998 およびその中のチャプターを参照されたい）。さらに、ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、イオン性相互作用（すなわち、アニオン−カチオン）を介してポリヌクレオチドとポリマーの複合体を形成することにより、高分子キャリアのポリマーまたはそのポリヌクレオチドキャリアブロック（例えば、カチオン性に荷電したポリヌクレオチドキャリアブロック）に結合する。
【０１４５】
ターゲティング
特定の場合において、ここで提供される高分子キャリアは、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を個体の細胞に送達するのに有用であり、選択された細胞タイプを特異的に標的にし得る。ある場合において、高分子キャリア（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNAのようなポリヌクレオチドを含む高分子キャリア）の細胞取り込みの効率は、ターゲティング部分を高分子キャリア内または高分子キャリア表面に取り込むことにより増強される。従って、いくつかの実施形態において、ターゲティング剤を含む高分子キャリアが提供される。「ターゲティング部分」（「ターゲティング剤」と互換性に使用される）は、細胞（例えば、選択された細胞）の表面を認識する。特定の実施形態において、ターゲティング剤は、細胞（例えば、選択された細胞）の表面に結合する。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、細胞表面の抗原を認識するか、または標的細胞の表面における受容体に結合する。適切なターゲティング部分の非限定的な例には、抗体、抗体様分子、またはペプチド（例えば、ＲＧＤ含有ペプチドのようなインテグリン結合ペプチド）、またはビタミンのような小分子（例えば、葉酸、ラクトースおよびガラクトースのような糖、または他の小分子）が含まれる。細胞表面の抗原には、タンパク質、糖、脂質または他の細胞上の抗原が含まれる。特定の実施形態において、細胞表面の抗原は、インターナリゼーションを受ける。高分子キャリア（例えばミセル）のターゲティング部分により標的にされる細胞表面の抗原の非限定的な例には、トランスフェリン受容体タイプ１および２、EGF受容体、HER2/Neu、VEGF受容体、インテグリン、NGF、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、およびアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。
【０１４６】
種々の実施形態において、ターゲティング部分は、ポリマー（例えば、ブロックコポリマー）のいずれかの末端またはモノマー単位の側鎖に結合するか、またはポリマーブロックに組み込まれる。ポリマーへのターゲティング部分の結合は、いずれかの適切な様式で達成され、例えば、限定するものではないが、アミン−カルボキシルリンカー、アミン−スルフヒドリルリンカー、アミン−糖リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−糖リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−糖リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル−スルフヒドリルリンカー、糖−ヒドロキシルリンカー、糖−糖リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーが含まれる多数の結合化学アプローチのいずれか１つにより達成される。特定の実施形態において、「クリック」ケミストリーは、ここで提供される高分子キャリアを形成するブロックコポリマーにターゲティングリガンドを結合させるために使用される（「クリック」反応の例については、Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta 2007, 40, 7-17を参照されたい。）。多くの種類の結合化学が、任意に利用される（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびその中のチャプターを参照されたい）。いくつかの実施形態において、ターゲティングリガンドはモノマーに結合し、結果として得られる化合物は、ここに記載される高分子キャリアにおいて利用されるポリマー（例えば、ブロックコポリマー）の重合合成において使用される。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、第１のブロックコポリマーのブロックまたは第２のブロックコポリマーのブロックに結合する（例えば、ここでの第１のブロックコポリマーは、siRNAのようなポリヌクレオチドに結合する）。いくつかの実施形態において、ターゲティングリガンドは、ブロックコポリマーに結合したsiRNAのセンスまたはアンチセンス鎖に結合する。ある実施形態において、ターゲティング剤は、センスまたはアンチセンス鎖の5’または3’末端に結合する。
【０１４７】
特定の実施形態において、ここで提供される高分子キャリアを形成するブロックコポリマーは、生体適合性である。ここで使用される場合、「生体適合性である」とは、それ自体またはそのインビボ分解産物により特徴付けられるポリマーの特性が、生組織に対して有害でないか、または少なくとも最小および／または修繕可能な程度に有害であり；および／または生組織における免疫反応を引き起こさないか、または免疫反応が少なくとも最小限および制御可能であることを意味する。塩に関しては、現在、カチオン性の種とアニオン性の種の両方が生体適合性であることが好ましい。ここで使用される場合、「生理学的に許容可能である」とは、「生体適合性である」と互換性である。いくつかの場合において、ここで使用される高分子キャリアおよびポリマー（例えば、ブロックコポリマー）は、カチオン性の脂質と比較して低い毒性を示す。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ポリヌクレオチドを送達するための他の技術に対して優れた商業的実行可能性を有し、限定するものではないが、インビボ投与を繰り返すことによりキャリアの免疫原性が低下し；送達媒体の複数の要素を集めるために必要なステップがより少ないため、商品のコストを下げることができ；製造の再現性が、例えば繰り返しバッチで製品を製造する能力により判断した場合、生物物理学的なアッセイ特性（例えば、HPLC、GPC、DLS、およびTEMが含まれる）において、バッチ間の変動が５％未満、１０％未満、または２０％未満である。
【０１４９】
細胞取り込み
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含む高分子キャリアは、エンドサイトーシスにより細胞に送達される。細胞内小胞とエンドソームは、本明細書全体にわたって互換性に使用される。細胞質へのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の首尾のよい送達は、一般的に、エンドソームの逸脱のためのメカニズムを有する。ある場合において、ここで提供されるポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）を含む高分子キャリアは、エンドサイトーシスを受けるエンドソーム区画におけるより低いｐＨに対して感受性である。ある場合において、エンドサイトーシスは、高分子キャリアのアニオン性に荷電可能な種（例えば、プロピルアクリル酸単位）の電化中和またはプロトン化をトリガーし、結果として高分子キャリアにおいて構造遷移を生じる。ある場合において、この構造遷移は、エンドソームから細胞質へのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ）の放出を媒介するより疎水性の膜不安定化形態を生じる。ｓｉＲＮＡを含むこのような高分子キャリアにおいて、ｓｉＲＮＡの細胞質への送達は、そのｍＲＮＡノックダウン効果を生じさせる。他のタイプのオリゴヌクレオチドを含むこのような高分子キャリアにおいて、細胞質への送達は、それらの望ましい作用を生じさせる。
【０１５０】
ポリヌクレオチド
ここに記載する高分子キャリアは、ポリヌクレオチドをそれを必要とする患者に送達するのにも有用である。ポリヌクレオチドは、複数のヌクレオチド（例えば２００を超えるヌクレオチド）を有する核酸ポリマーである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳類の発現ベクターである。もう１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトにおける内因性の遺伝子配列と再結合し、修正する。いくつかの実施形態において、ここに記載する高分子キャリア中に提供されるポリヌクレオチドは、遺伝子発現モジュレータである。ある実施形態において、ここに記載する子分子キャリア中に提供されるポリヌクレオチドは、ノックダウン剤（例えば、ｓｉＲＮＡのようなノックダウンオリゴヌクレオチド）である。ここで使用されるポリヌクレオチドには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびデコイＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、内因性の核酸配列とその細胞内標的の結合を争う）、または核酸アプタマー（例えば、細胞内高分子と結合する）も任意に含まれる。
【０１５１】
哺乳動物の発現ベクターは、プロモーター領域に機能的に連結する相補的ＤＮＡ配列（「ｃＤＮＡ」またはミニ遺伝子）を含み、プロモーターは、ｃＤＮＡの発現を促進する。ある場合において、哺乳動物の発現ベクターは、ｃＤＮＡの３’末端にポリアデニル化シグナルも含む。プロモーター領域は、ＲＮＡ合成（すなわち、転写）を開始するためにＲＮＡポリメラーゼ分子により認識されるヌクレオチドセグメントであり、エンハンサーのような他の転写調節要素を含んでもよい。いくつかの転写調節配列は、哺乳動物の発現ベクター中の連鎖遺伝子の発現を媒介するために使用されてよい。プロモーターには、限定するものではないが、レトロウイルスプロモーター、ＨＳＶまたはＣＭＶに由来するような他のウイルスプロモーター、および内因性の細胞遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。哺乳動物の発現ベクターは、典型的に、大腸菌由来の複製の開始点を有し、細菌中でプラスミドとして増殖することが可能である。
【０１５２】
培地またはインビボで、哺乳動物の発現ベクターを哺乳動物細胞に導入できることが望ましい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、本発明の高分子キャリアを用いて哺乳動物細胞に形質移入される。
【０１５３】
ここに記載するように、いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、ポリヌクレオチドを細胞またはそれを必要とする個体に送達するために使用される。ある実施形態において、高分子キャリアのポリカチオン性ブロックは哺乳動物の発現ベクターＤＮＡに結合し、ＤＮＡと高分子キャリアの複合体を形成する。ある場合において、ポリカチオンは、哺乳動物の発現ベクターＤＮＡに結合し、複合体を形成する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド複合体を含む高分子キャリアは、電荷が中和されている（例えば、高分子キャリアの外殻または高分子キャリアのポリマーの外殻ブロックおよびポリヌクレオチドは、実質的に電荷が中和されている。）。ポリヌクレオチドの長さに依存して、ポリカチオン性ブロックの長さは、任意に、ポリヌクレオチドの電荷を中和するように調節される。いくつかの場合において、電荷の中和は、カチオンおよび／またはポリカチオンを構築物中に添加することにより達成される。いくつかの実施形態において、ポリマーおよびポリヌクレオチド（例えば、２００＋ｍｅｒ）を含む高分子キャリアは、適切なバッファーにおいて必要に応じて希釈され、培地中の細胞に直接添加される。得られた細胞における形質移入された遺伝子またはｃＤＮＡの発現は、哺乳動物の発現ベクター中に、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはＧＦＰのような指標遺伝子を駆動する発現カセットを含めることにより、容易に測定できる。これらの遺伝子は容易に入手可能であり、レポーターアッセイについても述べられている。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、遺伝子治療のために使用される。遺伝子治療による疾患および障害の治療は、一般的に、新たな遺伝情報を細胞へ導入することを含む。「遺伝子治療ベクター」は、送達されるべき新たな遺伝形質を、任意に哺乳動物の発現ベクター中に含む。高分子キャリアの使用は、遺伝子置換、遺伝子発現の阻害、遺伝子修復または遺伝子増強のためのＤＮＡの送達、あるいは免疫応答の調節のような他の望ましい効果を有する遺伝子の導入を含む。遺伝子発現の阻害は、いずれかの適切な方法で達成され、非限定的な例として、ｓｈＲＮＡを発現する細胞における遺伝子カセットまたは他のＲＮＡｉ剤の発現により行われる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、コアでないポリカチオン性ブロックを有する高分子キャリアを遺伝子治療ベクターと混合し、これらを結合する。適切な賦形剤（以下に示す）中の高分子キャリア−遺伝子治療ベクター複合体は、限定するものではないが、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、頭蓋内、吸入、皮下または眼内を含む経路により、生体に投与される。
【０１５６】
使用−Gene-Rx
ポリヌクレオチドを含む高分子キャリアは、多くの疾患の治療において有用である。ここで提供される高分子キャリア−遺伝子治療ベクターを用いた治療に適した疾患の非限定的なリストには、血友病ＡおよびＢ；嚢胞性線維症；高コレステロール血症；サラセミアおよび鎌状赤血球貧血のような異常血色素症；癌；炎症性疾患ならびにリソソーム貯蔵障害が含まれる。
【０１５７】
標的遺伝子ファミリーおよび疾患
ここで提供される高分子キャリア（例えば、ｓｉＲＮＡを含むもの）を用いて任意に治療される疾患には、限定するものではないが、病原性の障害、癌、炎症性疾患、酵素欠乏症、代謝の先天的異常、感染症、自己免疫疾患、循環器疾患、神経性疾患、神経変性疾患、神経筋疾患、血液障害および凝固障害が含まれる。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの非限定的な例は、PTP1B、二重特異性ホスファターゼ(DSP)、c-myc、c-myb、c-fos、c-jun、c-raf、c-src、bcl-2、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、またはPIGFの発現を減少または下方制御するか、あるいはこれらに由来し得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、コレステロール、アポタンパク質ｂ、および／またはＬＤＬコレステロールの高い血漿レベルに伴う、および／またはこれらにより引き起こされる疾患（例えば高コレステロール血漿）の危険にさらされている患者または罹患している患者の治療において有用である。いくつかの実施形態において、治療は、ポリヌクレオチド剤（例えば、オリゴヌクレオチド剤）を含む高分子キャリアを提供することを含み、ポリヌクレオチド剤は、そのような状態を促進する遺伝子または遺伝子産物を抑制する（例えば、切断により）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド剤は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬＲ）レベルおよび機能の制御を担うプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）遺伝子を抑制し、そのようなポリヌクレオチド剤を含む高分子キャリアは、不必要なＰＣＳＫ９発現により特徴付けられる障害（例えば、コレステロール、アポリポタンパク質ｂ、および／またはＬＤＬコレステロールの高い血漿レベルに伴う、および／またはそれにより引き起こされる障害、例えば高コレステロール血症）に罹患している、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ＰＣＳＫ９サイレンシングポリヌクレオチド剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を、ＰＣＳＫ９を発現している細胞に送達する。いくつかの実施形態において、前記細胞は肝細胞である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えばミセル）は、不必要な細胞増殖（例えば、悪性または良性の細胞増殖）の危険性があるか、またはそれに罹患した対象の治療において有用である。治療は、ポリヌクレオチド剤（例えば、オリゴヌクレオチド剤）を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、ポリヌクレオチドは、不必要な細胞増殖を促進する遺伝子と相同であり、（例えば、切断により）それを抑制することができる）；治療的に有効な量の高分子キャリアを対象（例えば、ヒトの対象）に投与することを含む。
【０１６０】
ある実施形態において、遺伝子は、限定するものではないが、増殖因子または増殖因子受容体遺伝子、ホスファターゼ、キナーゼ（例えば、タンパク質チロシン、セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子）、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子である。いくつかの場合において、高分子キャリアは、限定するものではないが、肺、膵臓、肝臓、腎臓、卵巣、筋肉、皮膚、乳房、大腸、胃等を含む特定の組織または臓器中に発現した遺伝子を抑制するポリヌクレオチドを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、以下に示す遺伝子の１以上を抑制する：PDGFβ遺伝子、不必要なPDGFβの発現により特徴付けられる障害（例えば、精巣癌および肺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；Erb-B遺伝子 (例えば、Erb-B-2もしくはErb-B-3)、不必要なErb-B発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌または肺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；Src遺伝子、不必要なSrc発現により特徴付けられる障害（例えば、大腸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；CRK遺伝子、不必要なCRK発現により特徴付けられる障害（例えば、大腸癌および肺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；GRB2遺伝子、不必要なGRB2発現により特徴付けられる障害（例えば、扁平上皮癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；RAS遺伝子、不必要なRAS発現により特徴付けられる障害（例えば、膵臓癌、大腸癌および肺癌ならびに慢性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；MEKK遺伝子、不必要なMEKK発現により特徴付けられる障害（例えば、扁平上皮癌、黒色腫または白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；JNK遺伝子、不必要なJNK発現により特徴付けられる障害（例えば、膵臓癌または乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；RAF遺伝子、不必要なRAF発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌または白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；Erk1/2遺伝子、不必要なErk1/2発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；PCNA(p21)遺伝子、不必要なPCNA発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；MYB遺伝子、不必要なMYB発現により特徴付けられる障害（例えば、大腸癌または慢性骨髄性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；c-MYC遺伝子、不必要なc-MYC発現により特徴付けられる障害（例えば、バーキットリンパ腫または神経芽細胞腫）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；JUN遺伝子、不必要なJUN発現により特徴付けられる障害（例えば、卵巣癌、前立腺癌または乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；FOS遺伝子、不必要なFOS発現により特徴付けられる障害（例えば、皮膚癌または前立腺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；BCL-2遺伝子、不必要なBCL-2発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌もしくは前立腺癌または非ホジキンリンパ腫）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；サイクリンD遺伝子、不必要なサイクリンD発現により特徴付けられる障害（例えば、食道癌および大腸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；VEGF遺伝子、不必要なVEGF発現により特徴付けられる障害（例えば、食道癌および大腸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；EGFR遺伝子、不必要なEGFR発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；サイクリンA遺伝子、不必要なサイクリンA発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌および子宮頸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；サイクリンE遺伝子、不必要なサイクリンE発現により特徴付けられる障害（例えば、肺癌および乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；WNT-1遺伝子、不必要なWNT-1発現により特徴付けられる障害（例えば、基底細胞癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；β-カテニン遺伝子、不必要なβ−カテニン発現により特徴付けられる障害（例えば、腺癌または肝臓癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；c-MET遺伝子、不必要なc-MET発現により特徴付けられる障害（例えば、肝臓癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；PKC遺伝子、不必要なPKC発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；NFKB遺伝子、不必要なNFKB発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；STAT3遺伝子、不必要なSTAT3発現により特徴付けられる障害（例えば、前立腺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；サバイビン遺伝子、不必要なサバイビン発現により特徴付けられる障害（例えば、子宮頸癌または膵臓癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；Her2/Neu遺伝子、不必要なHer2/Neu発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；トポイソメラーゼI遺伝子、不必要なトポイソメラーゼI発現により特徴付けられる障害（例えば、卵巣癌および大腸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；トポイソメラーゼIIα遺伝子、不必要なトポイソメラーゼII発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌および大腸癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る。
【０１６２】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、以下に示す遺伝子の１つにおける変異を抑制する：p73遺伝子、不必要なp73発現により特徴付けられる障害（例えば、直腸結腸の腺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；p21(WAF1/CIP1)遺伝子、不必要なp21(WAF1/CIP1)発現により特徴付けられる障害（例えば、肝臓癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；p27(KIP1)遺伝子、不必要なp27(KIP1)発現により特徴付けられる障害（例えば、肝臓癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る； PPM1D遺伝子、不必要なPPM1D発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；RAS遺伝子、不必要なRAS発現により特徴付けられる障害（例えば、乳癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；カベオリンI遺伝子、不必要なカベオリンI発現により特徴付けられる障害（例えば、食道扁平上皮癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る； MIB I遺伝子、不必要なMIB I発現により特徴付けられる障害（例えば、男性の乳癌（MBC））を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；MTAI遺伝子、不必要なMTAI発現により特徴付けられる障害（例えば、卵巣癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；M68遺伝子、不必要なM68発現により特徴付けられる障害（例えば、食道、胃、大腸および直腸のヒト腺癌）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、腫瘍サプレッサー遺伝子における変異を抑制するため、化学療法と組み合わせてアポトーシス活性を促進する方法として使用され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍サプレッサー遺伝子は、以下に示す１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子のから選択される：p53腫瘍サプレッサー遺伝子、p53ファミリーメンバーDN-p63、pRb腫瘍サプレッサー遺伝子、APC1腫瘍サプレッサー遺伝子、BRCA1種瘍サプレッサー遺伝子、PTEN腫瘍サプレッサー遺伝子。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、以下に示す融合遺伝子の１つを抑制する：mLL融合遺伝子（例えばmLL-AF9）、不必要なmLL融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、急性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；BCR/ABL融合遺伝子、不必要なBCR/ABL融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、急性および慢性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；TEL/AML1融合遺伝子、不必要なTEL/AML1融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、小児急性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；EWS/FLI1融合遺伝子、不必要なEWS/FLI1融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、ユーイング肉腫）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る； TLS/FUS1融合遺伝子、不必要なTLS/FUS1融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、ミクソイド脂肪肉腫）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；PAX3/FKHR融合タンパク質、不必要なPAX3/FKHR融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、ミクソイド脂肪肉腫）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；AML1/ETO融合遺伝子、不必要なAML1/ETO融合遺伝子発現により特徴付けられる障害（例えば、急性白血病）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る。
【０１６５】
ここでのいくつかの側面において、高分子キャリアは、例えば癌または網膜変性のような脈管形成阻害により利益を受け得る疾患または障害の危険性があるか、またはそれに罹患した対象（例えばヒト）を治療するための治療剤を提供する。治療は、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、前記オリゴヌクレオチド剤は、脈管形成を媒介する遺伝子（例えば、VEGF-R1、VEGF-R2またはこれらの受容体の経路に対するシグナルタンパク質をコードする遺伝子）と相同である、および／または例えば切断によりそれを抑制することができる）；治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを対象（例えば、ヒトの対象）に投与することを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、以下の遺伝子の１つを抑制する：αｖ−インテグリン遺伝子、不必要なαVインテグリンにより特徴付けられる障害（例えば、脳腫瘍または上皮由来の腫瘍）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；Flt-1受容体遺伝子、不必要なFlt-1受容体により特徴付けられる障害（例えば、癌および関節リウマチ）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る；チューブリン遺伝子、不必要なチューブリンにより特徴付けられる障害（例えば、癌および網膜の新血管新生）を有する、またはその危険にさらされている対象を治療するために使用され得る。
【０１６７】
いくつかの側面において、ここで提供されるオリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアは、ウイルスに感染した対象またはウイルス感染に関連する障害もしくは疾患に罹患した対象を治療する方法に関する。前記方法は、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、前記オリゴヌクレオチド剤は、ウイルスの機能（例えば、侵入または増殖）を媒介するウイルス遺伝子または細胞遺伝子と相同である、および／または例えば切断することによりそれを抑制することができる）；治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド剤を対象（例えば、ヒトの対象）に投与することを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した対象、あるいはＨＰＶ（例えば子宮頸癌）により媒介される障害の危険性があるか、またはそれに罹患した対象の治療において有用である。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ＨＰＶ遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶ遺伝子は、Ｅ２、Ｅ６またはＥ７から選択される。
【０１７０】
別の実施形態において、ＨＰＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している、あるいはＨＩＶにより媒介される障害（例えば、後天性免疫不全症候群；ＡＩＤＳ）の危険性があるか、またはそれに罹患した患者の治療において有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ遺伝子の発現は減少する。別の実施形態において、ＨＩＶ遺伝子は、CCR5、Gag、またはRevである。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。いくつかの実施形態において、遺伝子はCD4またはTsg101である。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、あるいはＨＶＢにより媒介される障害（例えば、肝硬変および肝細胞癌）の危険性を有するか、またはそれに罹患した患者を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。１つの実施形態において、ＨＢＶ遺伝子の発現は減少する。別の実施形態において、標的とされるＨＢＶ遺伝子はＨＢＶコアタンパク質のテール領域、pre-cregious (pre-c)領域、またはcregious (c)領域の群のうちの１つをコードする。別の実施形態において、標的とされるHBV-RNA配列は、ポリ（Ａ）テールを含んで構成される。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、以下に示すウイルスから選択されるウイルスにより媒介される障害に感染した患者、あるいは前記障害に対する危険性があるか、または該障害に罹患した患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド剤を含む：Ａ型肝炎ウイルス (HAV); Ｃ型肝炎ウイルス (HCV); Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはＨ型肝炎を含む肝炎ウイルス株の群のいずれか;呼吸器合胞体ウイルス (RSV); ヘルペスサイトメガロウイルス (CMV); ヘルペスエプスタイン・バーウイルス (EBV); カポジ肉腫に関連するヘルペスウイルス (KSHV); JCウイルス (JCV); ミクソウイルス (例えば、インフルエンザを引き起こすウイルス)、ライノウイルス (例えば、一般的な風邪を引き起こすウイルス)、またはコロナウイルス (例えば、一般的な風邪を引き起こすウイルス); セントルイス脳炎フラビウイルス; ダニ媒介脳炎フラビウイルス; マーレーバレー脳炎フラビウイルス; デング熱フラビウイルス; シミアンウイルス40 (SV40); 脳心筋炎ウイルス(EMCV); はしかウイルス (MV); 水痘帯状疱疹ウイルス (VZV); アデノウイルス (例えば、気道感染症を引き起こすウイルス); ポリオウイルス; またはポックスウイルス (天然痘を引き起こすポックスウイルス)。いくつかの実施形態において、これらのウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、単純ヘルペスウイルス(HSV) に感染した患者、あるいはHSVにより媒介される障害（例えば、陰部疱疹および単純疱疹）ならびに命にかかわる、または視力を障害する疾患（例えば、主に免疫無防備状態の患者における）対する危険性があるか、または該障害に罹患した患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、HSV遺伝子の発現は減少する。別の実施形態において、標的とされるHSV遺伝子は、DNAポリメラーゼまたはヘリカーゼ−プライマーゼをコードする。いくつかの実施形態において、HSV複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、西ナイルウイルスに感染した患者、あるいは西ナイルウイルスにより媒介される疾患に対する危険性があるか、または該疾患に罹患した患者を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施消えたいにおいて、西ナイルウイルス遺伝子の発現は減少する。別の好ましい実施形態において、西ナイルウイルス遺伝子は、E、NS3、またはNS5からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、西ナイルウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)またはこのウイルスに関連する疾患もしくは障害（例えば、白血病またはミエロパシー）に感染した患者を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施形態において、HTLV遺伝子の発現は減少する。いくつかの実施形態において、HTLV1遺伝子は、Tax転写性活性因子である。いくつかの実施形態において、HTLV複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７７】
いくつかの側面において、高分子キャリアは、病原体（例えば、細菌性、アメーバ性、寄生性、または真菌性の病原体）に感染した対象を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。治療方法は、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、前記オリゴヌクレオチドは、病原体または病原体の増殖に関連する遺伝子と相同であるか、または切断によりこれらを抑制できる）；治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド剤を対象（例えば、ヒトの対象）に投与することを含む。標的遺伝子は、病原体の増殖、細胞壁合成、タンパク質合成、転写、エネルギー代謝（例えば、クレブス回路）、または毒素酸性に関連する遺伝子から選択されてよい。
【０１７８】
それから、いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、マラリアを引き起こすプラスモディウムに感染した患者を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施形態において、プラスモディウム遺伝子の発現は減少する。別の実施形態において、遺伝子は、頂端膜抗原１（AMA1）である。いくつかの実施形態において、プラスモディウムの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、高分子キャリアは、ミコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、マイコプラズマ肺炎（Mycoplasma pneumoniae）、またはこれらの病原体のいずれかに関連する疾患もしくは障害に感染した患者の治療に有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。いくつかの実施形態において、これら細菌の複製に必要とされる細菌遺伝子および／またはヒト遺伝子の発現は減少する。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアにより治療される疾患は、全身性であってもよいし、特定の組織（例えば、肺、皮膚、肝臓、乳房、腎臓、膵臓、CNS等）に存在してもよい。ある側面において、オリゴヌクレオチドは、代謝性の疾患または障害（例えば、糖尿病、肥満等）を媒介する、またはこれらに関連する遺伝子を抑制する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、肺の疾患または障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、または肺癌）を媒介する、またはこれらに関連する遺伝子を抑制する。
【０１８１】
ここでのいくつかの側面において、高分子キャリアは、不必要な免疫応答により特徴付けられる疾患または障害（例えば、炎症性の疾患もしくは障害または自己免疫性の疾患もしくは障害）に対する危険性がある、あるいはそれに罹患している対象（例えばヒト）を治療するのに有用な、および／または治療方法に関するオリゴヌクレオチド剤を含む。前記方法は、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、前記オリゴヌクレオチドは、不必要な免疫応答を媒介する遺伝子と相同であるか、または切断によりこれらを抑制できる）；治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド剤を対象（例えば、ヒトの対象）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記疾患または障害は、虚血または再灌流障害、例えば、急性心筋梗塞、不安定アンギナ、人工心肺、外科的処置（例えば、経皮的冠動脈形成術のような血管形成術）、移植された臓器もしくは組織に対する拒絶反応（例えば、移植された心臓または血管の組織）に関連する虚血または再灌流障害；あるいは血栓溶解である。別の実施形態において、前記疾患または障害は、再狭窄、例えば、外科的処置（例えば経皮的冠動脈形成術のような血管形成術）に関連する再狭窄である。別の実施形態において、前記疾患または障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎）である。いくつかの実施形態において、前記疾患または障害は、感染症または傷害に関連する炎症である。別の実施形態において、前記疾患又は障害は、喘息、アレルギー、ループス、多発性硬化症、糖尿病（例えば、2型糖尿病）、関節炎（例えば、関節リウマチもしくは乾癬性関節炎）である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、インテグリンまたはそのco-リガンド（例えば、VLA4、VCAM、ICAM）を抑制する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、セレクチンまたはそのco-リガンド（例えば、P-セレクチン、E-セレクチン (ELAM)、I-セレクチン、P-セレクチン糖タンパク質-1 (PSGL-1)）を抑制する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、補体系の成分（例えば、C3、C5、C3aR、C5aR、C3コンバターゼ、およびC5コンバターゼ）を抑制する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、ケモカインまたはその受容体（例えば、TNFI、TNFJ、IL-1I、IL-1J、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11、およびCCR3）を抑制する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、GCSF、Gro1、Gro2、Gro3、PF4、MIG、Pro-Platelet Basic Protein (PPBP)、MIP-1I、MIP-1J、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、CMBKR1、CMBKR2、CMBKR3、CMBKR5、AIF-1、またはI-309を抑制する。
【０１８２】
いくつかの側面において、高分子キャリアは、神経性の疾患または障害に対する危険性がある、あるいはそれに罹患した対象（例えばヒト）を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤を含む。前記方法は、オリゴヌクレオチド剤を含む高分子キャリアを提供することと（ここで、前記オリゴヌクレオチドは、神経性の疾患または障害を媒介する遺伝子と相同であり、および／または例えば切断によりこれを抑制できる）；治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド剤を対象（例えばヒト）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記疾患または障害は、アルツハイマー病またはパーキンソン病である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、アミロイドファミリー遺伝子（例えばAPP）；プレセニリン遺伝子（例えばPSEN1およびPSEN2）またはI-シヌクレインを抑制する。別の実施形態において、前記疾患または障害は、神経変性トリヌクレオチド反復疾患（例えば、ハンチントン舞踏病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症または脊髄小脳性運動失調、例えばSCA1、SCA2、SCA3 (マチャド-ジョセフ病)、SCA7またはSCA8）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、HD、DRPLA、SCA1、SCA2、MJD1、CACNL1A4、SCA7、またはSCA8を抑制する。
【０１８３】
ある側面において、ここで提供される高分子キャリアは、1より多い遺伝子を切断または抑制することができるオリゴヌクレオチド剤を含む。これらの実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、１より多い遺伝子において見られる配列（例えば、これら遺伝子の間で保存された配列）に対して十分な相同性を有するように選択される。それ故、いくつかの実施形態において、そのような配列を標的とするオリゴヌクレオチドは、遺伝子の全体を効果的に抑制する。
【０１８４】
いくつかの側面において、ここで提供される高分子キャリアは、2以上のタイプのオリゴヌクレオチド剤を含み、該オリゴヌクレオチド剤は、同じ疾患または異なる疾患の異なる遺伝子を抑制する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えば、オリゴヌクレオチドを含む）は、標的とする疾患状態に対する他の治療と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリア（例えば、オリゴヌクレオチドを含む）は、RAまたは乾癬のような炎症性疾患に対して有効な治療剤と組み合わせて投与される。この状況において、組み合わせて有用且つ有効な薬剤には、非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）、メトトレキサート、金化合物、D-ぺニシラミン、抗マラリア薬、スルファサラジン、糖質コルチコイド、ならびにインフリキシマブおよびエントラセプトのような他のTNF-α中和剤が含まれる。ある場合において、非オリゴヌクレオチドは、ミセルのコア中に入れられる。
【０１８６】
組み合わせの治療方法または予防方法について考慮する場合、ここで提供される薬剤は、特定の性質の組み合わせにより限定されない。例えば、ここで提供される薬剤は、任意に、単純な混合物ならびに化学的ハイブリッドとして投与される。さらに、組み合わせの治療は、任意に、別々または同時に投与される。
【０１８７】
ここで使用される場合、「薬学的な組み合わせ」、「付加的な治療を行う」、「付加的な治療剤を投与する」等の用語は、２以上の活性成分の混合または組み合わせの結果として得られる医薬治療を意味し、活性成分の固定された（fixed）および固定されない（non-fixed）組み合わせの両方を含む。「固定された組み合わせ」という用語は、ここに記載する少なくとも１の薬剤および少なくとも１のco-薬剤が共に、単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されない組み合わせ」という用語は、ここに記載される少なくとも１の薬剤および少なくとも１のco-薬剤が、別々の実体として、同時に、並行して、または可変の時間を空けて経時的に患者に投与されることを意味し、そのような投与は、患者の体内に2以上の薬剤の有効レベルを与える。いくつかの場合において、co-薬剤が1回または一定の期間投与され、その後、薬剤が１回または一定期間にわたって投与される。別の場合において、co-薬剤が一定期間投与され、その後、co-薬剤および薬剤の両方の投与を含む治療剤が投与される。さらに別の実施形態において、薬剤が１回または一定期間にわたって投与され、その後、co-薬剤が1回または一定期間にわたって投与される。これらは、カクテル療法、例えば３以上の活性成分の投与にも適用される。
【０１８８】
ここで使用される場合、「同時投与」、「組み合わせ投与」およびそれらの文法的に均等な用語は、選択された治療剤を単一の患者に投与することを包含することを意味し、薬剤が同じまたは異なる投与ルートで、同時または異なる時間に投与される治療計画を含むものである。いくつかの実施形態において、ここに記載される薬剤は、他の薬剤と同時投与される。これらの用語は、２以上の薬剤および／またはその代謝産物が動物中に同時に存在するように両方の薬剤を投与することを包含する。それには、別々の組成物による同時投与、別々の組成物による異なる時間における投与、および／または両方の薬剤が存在する組成物による投与が含まれる。いくつかの実施形態において、ここに記載する薬剤および他の薬剤は、単一の組成物として投与される。いくつかの実施形態において、個々に記載する薬剤および他の薬剤は、組成物中に混合される。
【０１８９】
ここで使用する場合、「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、望ましい結果を達成する、例えば、治療される疾患または状態の１以上の症状がある程度軽減されるのに十分な少なくとも１の薬剤の量を意味する。ある場合において、前記結果は、徴候、症状、もしくは疾患の原因の低減および／または緩和、あるいは生物学的な系の他の望ましい変化である。特定の場合において、前記結果は、一定の結果、例えば、治療される疾患もしくは障害またはそれに関連する症状の軽減を提供するための、標的遺伝子の十分なノックダウンである。ある場合において、治療的使用のための「有効量」は、疾患において臨床的に十分な減少を提供するために必要とされる、ここで示した薬剤を含む組成物の量である。いずれかの個体の場合における適切な「有効」量は、用量増大試験のようないずれかの適切な技術を用いて決定される。
【０１９０】
「投与する（administer）」、「投与する（administering）」、「投与（administration）」等の用語は、ここで使用する場合、薬剤または組成物を生物学的作用の望ましい部位に送達することを可能にするために使用され得る方法を意味する。これらの方法には、限定するものではないが、経口経路、十二指腸内経路、非経口経路（静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、血管内投与または輸液が含まれる）、経皮投与、局所投与および直腸投与が含まれる。当業者は、ここに記載する薬剤および方法に使用することのできる投与技術に精通しており、例えば、Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon; および Remington's Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Paに記載されている。ある実施形態において、ここに記載される高分子キャリアは、非経口的な注射により投与される（例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、血管内投与または輸液）。
【０１９１】
製剤
高分子キャリア
高分子キャリア−本開示におけるオリゴヌクレオチド組成物は、いずれかの適切な態様、例えば、安定剤または緩衝剤等を含み、または含まずに医薬組成物を形成して、患者に投与されてよい。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、経口投与のための錠剤、カプセルもしくはエリキシル、直腸投与のための坐剤、注射投与のための無菌溶液、懸濁剤、およびいずれかの他の適切な組成として製剤化され、使用される。
【０１９２】
提供されるのは、ここに記載する組成物の薬学的に許容可能な製剤である。これらの製剤には、上記化合物の塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩のような酸付加塩）が含まれる。薬理学的な組成物または製剤は、細胞または患者（例えば、ヒトを含む）への投与（例えば、全身性の投与）に適した形態の組成物または製剤を意味する。適切な形態は、一部は、使用または投与経路（例えば、経口投与、経皮投与、または注射）に依存する。高分子キャリアがポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを送達する特定の実施形態において、製剤は、高分子キャリア、特にポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）が完全なまま、および／または機能を有したまま標的細胞に到達することを妨げない形態である。例えば、ある実施形態において、血中に注入される薬理学的組成物は、可溶性であり、および／または分散性である。さらに、ここに記載する薬理学的組成物は、好ましくは無毒である。いくつかの実施形態において、ここで提供される高分子キャリアは、治療的な利益のために投与され、治療的に有効な量のポリヌクレオチド（例えばsiRNA）を含む高分子キャリアが投与される。代表的な実施形態において、治療的に有効な量には、個体1 kg当り約10 mg以下のsiRNAを提供するのに十分な量の高分子キャリアが含まれる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）を含む高分子キャリアを含んでなる医薬組成物は、全身性に投与される。ここで使用する場合、「全身性の投与」とは、インビボにおいて薬物が血中に全身性に吸収されるか、または蓄積され、その後全身にわたって分布することを意味する。全身性の吸収を導く投与経路には、限定するものではないが、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、吸入、経口投与、肺内投与および筋肉内投与が含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−高分子キャリア組成物は、局所的に投与される。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、組成物は、保存または投与のために調製され、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤中における薬学的に有効な量のオリゴヌクレオチド−高分子キャリア組成物を含む。いずれかの許容可能なキャリアまたは希釈剤は、任意にここで利用される。特定のキャリアおよび希釈剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro Ed., 1985に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、色素およびフレーバー剤が任意に添加される。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤が任意に使用される。ここで使用する場合、「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、無毒の、不活性な固体、半固体または液体の、充填剤、希釈剤、封入材料またはいずれかのタイプの製剤化補助剤を意味する。薬学的に許容可能なキャリアとして任意に使用される物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびショ糖のような糖；コーンスターチおよびポテトスターチのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油のような油；ベニバナ油；ごま油；オリーブオイル；コーン油および大豆油；プロピレングリコールのようなグリコール；エチルオレエートおよびエチルラウレートのようなエステル；アガー；Tween80のような界面活性剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張の生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液であり、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような他の無毒の適合性の滑沢剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も、配合する者の判断により組成物中に存在させてよい。いくつかの実施形態において、ここで提供される医薬組成物は、ヒトおよび／または動物に対して、経口的に、直腸に、非経口的に、槽内に、膣内に、鼻腔内に、腹腔内に、局所的に（粉末、クリーム、軟膏または液滴により）、皮下に、頬に、または経口もしくは経鼻のスプレーとして投与される。
【０１９５】
種々の実施形態において、経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容可能なエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。活性成分（例えば、本発明のミセル−オリゴヌクレオチド複合体）に加えて、液体剤形は、任意に、不活性な希釈剤もしくは賦形剤をさらに含み、その非限定的な例は、水もしくは他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブオイル、ヒマシ油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、プロピレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステルのような乳化剤および可溶化剤、ならびにこれらの混合物である。不活性な希釈剤に加えて、経口組成物は、任意に、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、フレーバー剤、および芳香剤も含まれる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、注射可能な製剤（例えば、無菌の注射用水または油性懸濁液）は、例えば、分散剤、湿潤剤および／または懸濁剤を用いて、いずれかの適切な方法に従って製剤化される。無菌の注射製剤は、任意に、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒（例えば、1,3-ブタンジオール）中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョンである。任意に使用される許容可能な賦形剤および溶媒は、水、リンゲル液、U.S.P.および等張の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として慣例的に使用される。この目的のために、いずれかの無刺激の揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として慣例的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいずれかの無刺激の不揮発性油が任意に使用される。さらなる実施形態において、オレイン酸のような脂肪酸が、注射可能な製剤中に使用される。特定の実施形態において、高分子キャリア粒子は、1％ (w/v) カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび0.1％ (v/v) Tween 80を含むキャリア液中に懸濁される。
【０１９７】
ある実施形態において、直腸または膣への投与のための組成物は、坐剤である。坐剤は、任意に、高分子キャリア−オリゴヌクレオチド複合体と、外界温度では固体であるが体温では液体であるため、直腸または膣の腔で溶解し、高分子キャリアのミクロ粒子を放出するココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスのような適切な無刺激の賦形剤またはキャリアとを混合することにより調製される。
【０１９８】
経口投与のための適切な固体剤形には、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形において、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を含む高分子キャリアは、少なくとも１のクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムのような不活性且つ薬学的に許容可能な賦形剤もしくはキャリアおよび／またはａ）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸のような充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、およびアラビアゴムのような結合剤、ｃ）グリセロールのような湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ポテトデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、ｅ）パラフィンのような溶液緩染剤、ｆ）４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、ｇ）例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートのような湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムのような滑沢剤、およびこれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、製剤は、緩衝剤を含んでもよい。
【０１９９】
同様のタイプの固体組成物は、任意に、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量のポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用されてもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態において、錠剤、ドラジェ、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体製剤は、腸溶コーティングおよび他の適切なコーティングのようなコーティングおよび外殻を用いて調製される。ある実施形態において、それらは、好ましくは腸管のある部分において、任意に遅延性の態様で、活性成分のみを放出する組成物である。適切な包埋組成物の非限定的な例には、高分子物質およびワックスが含まれる。
【０２０１】
同様のタイプの固体組成物は、任意に、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量のポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用されてもよい。
【０２０２】
本発明の医薬組成物の局所投与または経皮投与のための剤形の非限定的な例には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入薬、またはパッチが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）を含む高分子キャリアは、無菌条件下で、薬学的に許容可能なキャリアおよび任意に、１以上の保存剤、１以上のバッファー、またはこれらの組み合わせ（例えば、必要な場合）と混合される。眼用製剤、点耳薬、および点眼薬も、本発明の範囲内であると考えられる。
【０２０３】
ここで提供される軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）を含む高分子キャリアに加えて、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはこれらの混合物のような賦形剤を任意に含む。
【０２０４】
粉末およびスプレーは、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）を含む高分子キャリアに加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を任意に含む。いくつかの実施形態において、スプレーは、任意に、クロロフルオロ炭化水素のような慣習的な噴霧剤を含む。
【０２０５】
経皮パッチは、化合物の体への制御された送達を提供する付加的な利点を有する。そのような製剤は、いずれかの適切な方法、例えば適切な媒質中にミクロ粒子またはナノ粒子を溶解または分散することにより作られる。吸収増強剤は、任意に、皮膚中への化合物の流入を増大させるために使用される。その速度は、速度制御膜を使用するか、またはポリマーマトリックスまたはゲル中に高分子キャリア−オリゴヌクレオチド複合体を分散させることにより制御され得る。
【０２０６】
本発明のいくつかの側面において、高分子キャリアは、通常賦形剤により達成されるいくつかの特性（例えば、機械的、熱的等）を提供するため、製剤中に必要とされるそのような賦形剤の量を減らすことができる。
【０２０７】
リサーチ試薬としての使用
ここで提供される高分子キャリアは、任意に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入に対するリサーチ試薬またはキットとしても使用される。哺乳動物の発現ベクターのようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを哺乳動物細胞にインビトロで導入（形質移入）するための現存の方法は、リン酸カルシウム形質移入（Graham and Vander Eb. (1973) Virol. 52:456-467）、およびDEAE-デキストラン形質移入（Lopata, M. A. et al., (1984) Nuclo Acids Res. 12:5707）により、ならびにリポフェクタミン（ref.）のような商業的に入手可能な試薬を用いて効果的に行われ得る。そのような方法は、毒性の問題があるため、ここに記載するように、毒性は低いが効果的な形質移入システムを有することが望ましい。ここで提供される高分子キャリアを用いて送達され得る他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには、限定するものではないが、タンパク質をコードするRNA；リボザイム、アプタマー、ノックダウン剤、およびデコイが含まれる。ここで提供される高分子キャリアは、細胞培養またはインビボにおいて、RNAi剤の送達のためのリサーチ試薬として特に有用であり得る。
【０２０８】
いくつかの定義
本明細書に関して、単数形の使用には複数形が含まれ、特に言及しない限り逆もまた同じであると理解される。すなわち、「a」および「the」は、その文言が修飾する１以上のものを意味する。例えば、「the polymer」または「a nucleotide」は、１つのポリマーもしくはヌクレオチドまたは複数のポリマーもしくはヌクレオチドを意味し得る。同じように、「polymers」および「nucleotides」は、特に言及しない限り、またはそのような意味ではないことが文脈から明らかな場合を除き、１つのポリマーもしくは１つのヌクレオチドならびに複数のポリマーもしくはヌクレオチドを意味する。
【０２０９】
ここで使用する場合、いずれかの相互作用により結合する場合において、２つの部分または化合物が「結合する」または「会合する」という用語は、互換性に使用される。その非限定的な例は、１以上の共有結合、１以上の非共有結合性の相互作用（例えば、イオン結合、静電気力、ファンデルワールス相互作用、これらの組み合わせ等）、またはこれらの組み合わせである。
【０２１０】
ここで使用する場合、ここに記載する高分子キャリアは、ポリマーが解離するか、または不安定化されない限り「安定」である。ある場合において、安定な高分子キャリアは、pH 7.4の水溶液中で最初に形成される同じsiRNAおよびブロックコポリマーを含む高分子キャリアの流体力学的粒子サイズの60％、50％、40％、30％、20％または10％以内の流体力学的粒子サイズを有するものである。いくつかの場合において、安定な高分子キャリアは、pH 7.4の水溶液中で最初に形成される同じsiRNAおよびマルチブロックポリマーを含む高分子キャリアの構築物の濃度の60％、50％、40％、30％、20％または10％以内の構築物の濃度を有するものである。
【０２１１】
ここで使用する場合、「荷電可能な種」、「荷電可能な基」、または「荷電可能なモノマー単位」は、電荷を有するまたは電荷を有さない状態の種、基またはモノマー単位である。ある場合において、「荷電可能なモノマー単位」は、求電子剤（例えば、プロトン（H+））の添加または除去により（例えばpH依存性の様式で）、電荷を有する状態（アニオン性またはカチオン性に荷電した状態）に変換され得るものである。「荷電可能な種」、「荷電可能な基」、または「荷電可能なモノマー単位」という用語のいずれかの使用には、特に言及しない限り、「荷電可能な種」、「荷電可能な基」、または「荷電可能なモノマー単位」のいずれかの他のものの開示が含まれる。「荷電可能な種」、すなわち「アニオンに荷電した、もしくは荷電可能」または「アニオン性の種に荷電した、もしくは荷電可能」は、アニオン性の電荷を有する状態または電荷を有さない状態の種または基を意味するが、電荷を有さない状態は、例えばプロトン（H+）のような求電子剤を除去することにより、アニオン性の電荷を有する状態に変換され得る。特定の実施形態において、荷電可能な種は、およそ中性のpHにおいてアニオンに荷電する種である。ポリマー上の全ての荷電可能な種が、荷電可能な種のpKa（酸解離定数）付近のpHにおいてアニオン性になるわけではないことを強調すべきであり、むしろ、平衡状態のアニオン性の種とアニオン性でない種が共存し得る。「荷電可能な種」、すなわち「カチオンに荷電した、もしくは荷電可能」または「カチオン性の種に荷電した、もしくは荷電可能」は、カチオン性の電荷を有する状態または電荷を有さない状態の種または基を意味するが、電荷を有さない状態は、例えばプロトン（H+）のような求電子剤を添加することにより、カチオン性の電荷を有する状態に変換され得る。特定の実施形態において、荷電可能な種は、およそ中性のpHにおいてカチオンに荷電する種である。ポリマー上の全ての荷電可能な種が、荷電可能な種のpKa（酸解離定数）付近のpHにおいてカチオン性になるわけではないことを強調すべきであり、むしろ、平衡状態のカチオン性の種とカチオン性でない種が共存し得る。ここに記載する「荷電可能なモノマー単位」は、「荷電可能なモノマー残基」と互換性に使用される。
【０２１２】
ここで使用する場合、「中和された電荷」は、±10 〜 ±30 mVの間のゼータ電位を有する粒子を意味し、および／または第１の数（z）の負電荷に荷電可能な荷電可能な種（例えば、脱プロトン化によりアニオン性になる酸性種）および第２の数（0.5・z）の正電荷に荷電可能な荷電可能な種（例えば、プロトン化によりカチオン性になる塩基性種）が存在する。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータ：ここで使用する場合、「オリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータ」は、限定するものではないがアンチセンスメカニズムを含むメカニズムまたはRNA干渉(RNAi)-媒介経路（(i)転写不活性化; (ii) mRNAの分解もしくは封鎖; (iii) 転写の阻害もしくは減衰または (iv) 翻訳の阻害もしくは減衰が含まれる）により、生細胞における遺伝子発現の選択的調節を引き起こすことができるオリゴヌクレオチド剤である。オリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータには、調節性RNA（例えば、実質的にいずれかの調節性RNA）、例えば、限定するものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、miRNA、siRNA、RNAi、shRNA、aiRNA、ダイサー（Dicer）基質、アプタマーおよびこれらのいずれかのアナログまたは前駆体が含まれる。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドノックダウン剤：ここで使用する場合、「オリゴヌクレオチドノックダウン剤」は、配列特異的な様式で細胞内核酸をターゲティングまたは該核酸に結合することにより遺伝子発現を阻害することができるオリゴヌクレオチド種である。オリゴヌクレオチドノックダウン剤の非限定的な例には、siRNA、miRNA、shRNA、ダイサー基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイDNAまたはRNA、アンチジーンオリゴヌクレオチドならびにこれらのいずれかのアナログおよび前駆体が含まれる。
【０２１５】
阻害：「阻害」、「抑制」、および「減衰」という用語は、ノックダウン剤の非存在下における標的mRNAまたは対応するタンパク質と比較して、標的mRNAまたは対応するタンパク質の発現が測定可能な程度に減少することを意味する。「ノックダウン」または標的mRNAもしくは対応するタンパク質の発現における減少は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）増幅、RNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション、ならびにマイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリングのような当該分野で周知の技術を用いてmRNAレベルを測定することにより評価することができ；タンパク質の場合、SDS-PAGE、抗体結合、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光活性化細胞分析および免疫細胞化学のような当該分野で周知の技術により評価することができる。
【０２１６】
ヌクレオチド：ここで使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、その最も広い意味で、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）鎖に導入されるいずれかの化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）鎖に導入されるいずれかの化合物および／または物質である。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を意味する。ある実施形態において、「少なくとも１のヌクレオチド」は、１以上のヌクレオチドが存在することを意味する。種々の実施形態において、１以上のヌクレオチドは、非共有結合性に相互に結合するか、または共有結合性に相互に結合した別々のヌクレオチドである。ある場合において、「少なくとも１のヌクレオチド」は、１以上のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）を意味する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２のヌクレオチドモノマー単位を含むポリマーである。
【０２１７】
ここで使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、７〜２００のヌクレオチドモノマー単位を含むポリマーを意味する。いくつかの実施形態において、「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖および／または二本鎖のＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡを意味する。さらに、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語および／または同様の用語には、核酸アナログ、すなわち、修飾された骨格を有するアナログを含み、その非限定的な例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた（locked）核酸（ＬＮＡ）、ホスホノ−ＰＮＡ，モルフォリノ核酸、または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオネート、ホスホネート、5’-N-ホスホラミダイト結合）を有する核酸が含まれる。ヌクレオチドは、天然のソースから精製されてよく、組換発現系を用いて製造し、任意に精製されてよく、化学的に合成されてよい。ここで使用する場合、「ヌクレオシド」は、単糖および塩基を含む化合物を意味する用語である。単糖には、限定するものではないが、ペントースおよびヘキソース単糖が含まれる。単糖には、擬態の単糖（monosaccharide mimetics）、およびハロゲン、メトキシ、水素もしくはアミノ基でヒドロキシル基を置換することにより、あるいは付加的なヒドロキシル基のエステル化により修飾された単糖も含まれる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、天然のヌクレオシドリン酸塩（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジンリン酸塩）であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、塩基には、種々の核酸中に天然に発生するいずれかの塩基ならびにそのような天然発生性の塩基に擬態の、または類似の他の修飾物が含まれる。修飾された塩基または誘導体化された塩基の非限定的な例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュエオシン（queosine）、イノシン（inosine）、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メトキシチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、2-アミノアデニン、ピロロピリミジン、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。ヌクレオシド塩基には、ジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリル、または���トロイミダゾリルのような一般的な核酸塩基も含まれる。ヌクレオチドには、標識を有する、または脱塩基を含む（すなわち塩基を欠いている）モノマーであるヌクレオチドも含まれる。核酸配列は、特に示さない限り、5’から3’の方向に表される。ヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対による水素結合を介して、配列特異的な様式で、他のヌクレオチドに結合し得る。そのような塩基対は、相互に相補的であると言われる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってよい。
【０２１８】
ある場合において、ここに記載する高分子キャリア（またはポリマー物質／組成物）は、集合して高分子キャリアを構築する複数のコポリマー、および任意に、少なくとも１のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含む。
【０２１９】
ここで使用する場合、正常な生理的pHとは、血液、血清、正常な細胞のサイトゾルのような哺乳動物の体の主要な液体のpHを意味する。ある場合において、正常な生理的pHは、およそ中性のpHであり、例えば約7.2〜約7.4のpHが含まれる。ここで使用する場合、中性pHおよび生理的pHという用語は、同義であり互換性である。
【０２２０】
RNA緩衝（RNAi）：ここで使用する場合、「RNA干渉」または「RNAi」という用語は、実質的に標的RNAと相補的な部分も含む少なくとも部分的に二本鎖のRNAにより媒介される、遺伝子発現の配列特異的な阻害および／または標的のmRNAおよびタンパク質のレベルの減少を意味する。
【０２２１】
ＲＮＡｉ剤：ここで使用する場合、「RNAi剤」という用語は、RNAi剤メカニズムを介して遺伝子発現の阻害を媒介することができるオリゴヌクレオチドを意味し、限定するものではないが、siRNA、ミクロRNA (miRNA)、短ヘアピンRNA (short hairpin RNA; shRNA)、非対称干渉RNA (asymmetrical interfering RNA; aiRNA)、ダイサー基質およびこれらの前駆体が含まれる。
【０２２２】
短干渉RNA（short interfering RNA; siRNA）：ここで使用する場合、「短干渉RNA」または「siRNA」という用語は、約15〜50塩基対の長さであるヌクレオチド二本鎖を意味し、任意に、0〜2の一本鎖の突出部分をさらに含む。siRNAの１つの鎖には、相補的な様式で標的ＲＮＡとハイブリダイズする部分が含まれる。いくつかの実施形態において、siRNAと標的RNAの標的部分との間の１以上のミスマッチが存在してよい。いくつかの実施形態において、siRNAは、標的転写物の分解を引き起こすことにより、遺伝子発現の阻害を媒介する。
【０２２３】
短ヘアピンＲＮＡ（shRNA）：短ヘアピンRNA（shRNA）は、相互にハイブリダイズして二本鎖（二重鎖）構造および少なくとも１の一本鎖部分を形成した、または形成することができる少なくとも2の相補的部分を有するオリゴヌクレオチドを意味する。遺伝子発現の阻害：ここで使用する場合、「遺伝子発現を阻害する」とは、遺伝子の発現産物の量において測定可能な減少を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、mRNA）および／または遺伝子から転写されたmRNAから翻訳されたポリペプチドであってよい。発現レベルは、mRNAまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を用いて測定されてよい。
【０２２４】
ダイサー基質：「ダイサー基質」は、細胞におけるRNase III ファミリーメンバーのダイサーに対する基質である約25以上の塩基対の二本鎖ＲＮＡである。ダイサー基質は、切断されて約２１塩基対の二本鎖の小干渉RNA（siRNA）を作り、mRNAノックダウンによる遺伝子サイレンシングを生じるRNA干渉効果を惹起する。
【０２２５】
治療剤：ここで使用する場合、「治療剤」という用語は、対象、臓器、組織、または細胞に投与した場合に、治療効果を有する、および／または望ましい生物学的および／または薬理学的効果を誘発するいずれかの薬剤を意味する。
【０２２６】
治療的に有効な量：ここで使用する場合、治療剤の「治療的に有効な量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患している、またはそれらに対する感受性が高い対象に投与した場合に、疾患、障害、および／または状態の症状の発症を治療、診断、予防、および／または遅延するのに十分な量を意味する。
【０２２７】
ナノ粒子：ここで使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、1000ナノメートル（nm）未満の直径を有するいずれかの粒子を意味する。一般的に、ナノ粒子は、真核細胞によるそれらの取り込みを可能にするのに十分に小さい大きさであるべきである。典型的に、ナノ粒子は、200nm以下の最も長い直線的な大きさ（例えば直径）を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、100 nm以下の直径を有する。例えば、約10 nm〜約200 nm、約20 nm〜約100 nm、または50 nm以下、例えば5 nm〜30 nmの直径を有するより小さいナノ粒子は、いくつかの実施形態において使用される。
【０２２８】
ここで使用する場合、「ミセル」には、コアおよび親水性の外殻を含む粒子が含まれ、コアは、少なくとも部分的に、主に、または実質的に、疎水性相互作用を介して結合する。ある場合において、ここで使用する場合、「ミセル」とは、少なくとも２のドメイン、すなわち内側ドメインまたはコアおよび外側ドメインまたは外殻を含む、複数成分のナノ粒子である。コアは、少なくとも部分的に、主に、または実質的に、疎水性相互作用により結合し、ミセルの中心に存在する。ここで使用する場合、「ミセルの外殻」は、ミセルのコアでない部分として定義される。
【０２２９】
アニオン性モノマー：「アニオン性モノマー」または「アニオン性モノマー単位」は、ここで使用する場合、アニオン性に荷電した状態の基、または電荷を有さない状態で存在するが、例えば求電子剤（例えばプロトン（H+）、例えばpH依存性の様式で）の除去を受けてアニオン性に荷電することができる基を有するモノマーまたはモノマー単位である。ある場合において、前記基は、およそ生理的なpHにおいて実質的に負に荷電するが、プロトン化を受けて、弱酸性のpHにおいて実質的に中性のpHになる。そのような基の非限定的な例には、カルボキシル基、バルビツール酸およびその誘導体、キサンチンおよびその誘導体、ボロン酸、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルフィン酸、リン酸塩およびスルホンアミドが含まれる。
【０２３０】
アニオン性の種：「アニオン性の種」は、ここで使用する場合、およそ中性のpH（例えば、約7、例えば約7.2〜約7.4）または生理的pHにおいてアニオン性に荷電した状態で存在するが、プロトン化を受けて、弱酸性のpHにおいて実質的に中性になる基、残基または分子である。
【０２３１】
請求項に明確に記載していない理論により結合することなく、膜不安定化ポリマーは、細胞膜構造（例えば、エンドソームの膜）において電荷（例えば、透過性の電荷）を直接的または間接的に誘発することができ、薬剤（例えばポリヌクレオチド）を高分子キャリア（またはその構成要素のポリマー）に結合させてまたはそれとは独立に、そのような膜構造を通して通過させることを可能にする−例えば、細胞に入れるか、または細胞の小胞（例えばエンドソーム）から出す。膜不安定化ポリマーは、（必ずしも必要ではないが）膜崩壊性のポリマーであってよい。膜崩壊性のポリマーは、（例えば、細胞膜の集合の実質的な機能について観察する場合、）細胞小胞の溶解または細胞膜の崩壊を直接的または間接的に誘発し得る。
【０２３２】
一般的に、ポリマーまたは高分子キャリアの膜を不安定化する特性または膜を崩壊させる特性は、種々の方法により評価され得る。１つの非限定的なアプローチにおいて、細胞膜構造における変化は、例えば、細胞の外側の環境において薬剤の存在もしくは非存在、または薬剤の活性を測定することにより、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）からのそのような薬剤（例えばポリヌクレオチド）の放出を、（直接的または間接的に）測定分析する評価により観察される。もう１つの非限定的なアプローチは、例えば、関心のある細胞膜を分析する代わりに、赤血球溶解（溶血）を測定することを含む。そのような分析は、単一のpH値において、または一定範囲のpH値にわたって行われてよい。
【０２３３】
疎水性の種：ここで使用する場合、「疎水性の種」（ここでは「疎水性増強部分」と互換性に使用される）は、モノマーまたはポリマーのような分子が共有結合した場合に、分子の疎水性を増大させるか、または疎水性増強部分として作用する置換基、残基または基のような部分である。
【０２３４】
「疎水性」という用語は、無極性溶媒と水の間の化合物の自由エネルギーの移動により測定される化合物の物理的性質を意味する（Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6: 1302-1307）。化合物の疎水性は、そのlogP値、すなわち分配係数（P）の対数により評価され、分配係数は、2つの不混和溶液（例えば、オクタノールと水）の混合物の2層における化合物の濃度比として定義される。疎水性の測定の実験的方法ならびにlogP値のコンピュータ計算の方法は、当業者に周知である。本発明の疎水性の種には、限定するものではないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、およびヘテロアリール基が含まれる。
【０２３５】
脂肪族または脂肪族基：「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、ここで使用する場合、直鎖状（すなわち、枝分かれしていない）、分枝鎖状、または環状（融合し、結合し、およびスピロ融合した多環を含む）であってよい炭化水素部分を意味し、完全に飽和しているか、または１以上の不飽和単位を含んでよいが、芳香族ではない。特に指定しない限り、脂肪族基は、1〜20の炭素原子を含む。
【０２３６】
ヘテロ原子：「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、ホウ素、ヒ素、セレン、またはケイ素原子のような、水素または炭素以外の原子を意味する。
【０２３７】
アリールまたはアリール基：ここで使用する場合、「アリール」または「アリール基」という用語は、全部で5〜14の環員を有する単環構造、二環構造、および三環構造を意味し、構造中の少なくとも１つの環は芳香族であり、構造中の各環は、3〜7員環である。
【０２３８】
ヘテロアルキル：「ヘテロアルキル」という用語は、少なくとも１の骨格炭素原子がヘテロ原子で置換されたアルキル基を意味する。
【０２３９】
ヘテロアリール：「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１の環員がヘテロ原子であるアリール基を意味する。
【０２４０】
いかの実施例は、説明を目的とするものであり、発明を限定するものと解釈されるべきではない。ここに記載する全ての出版物は、その出版物に記載されている情報について、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２４１】
実施例：
本明細書全体にわたって、種々の既知の頭文字および略語は、モノマーの重合に由来するモノマーまたはモノマー残基を表すために使用される。限定することなく、特に示さない限り；"BMA" (または略式表示としての文字 "B") は、ブチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を意味し； "DMAEMA" (または略式表示としての文字 "D" ) は、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を意味し; "Gal" は、ガラクトースまたはガラクトース残基（任意に、ヒドロキシル保護部分、例えばアセチルを含む）、またはそのPEG化誘導体（以下に記載する）を意味し； HPMAは、2-ヒドロキシプロピルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を意味し; "MAA" は、メチルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を意味し; "MAA(NHS)" は、メタクリル酸のN-ヒドロキシル-スクシンイミドエステルまたはそれに由来するモノマー残基を意味し; "PAA" (または略式表示としての文字"P" )は、2-プロピルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を意味し； "PEGMA" は、PEG化メタクリルモノマー、rCH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2 またはそれらに由来するモノマー残基を意味する。それぞれの場合において、そのような名称のいずれかは、モノマー（全ての塩、もしくはそのイオン性アナログを含む）またはモノマーの重合に由来するモノマー残基（その全ての塩またはイオン性アナログを含む）を示し、特に示した形態は、当業者の背景により明白である。
【０２４２】
例１：コポリマーの調製
以下の一般式で表されるジブロックポリマーおよびコポリマーを調製する：
[A1x-/-A2y]n -[B1x-/-B2y-/-B3z]1-5n
式中、[A1-A2]は、モノマーA1およびA2の残基からなる第１のブロックコポリマーであり、
[B1-B2-B3]は、モノマーB1、B2、B3の残基からなる第２のブロックコポリマーであり、
x、y、zは、ポリマーの組成を表すモル％モノマー残基であり；
nは、分子量である。
【０２４３】
代表的なジブロックコポリマー：
[DMAEMA]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw-DMAEMA]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D]
[DMAEMA-/-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D]
[HPMA-/-PDSM]-[B-/-P-/-D]
式中：
Bは、ブチルメタクリレートであり、
Pは、プロピルアクリル酸であり、
Dは、DMAEMA、ジメチルアミノエチルメタクリレートであり、
PEGMAは、ポリエチレングリコールメタクリレートであり、例えば、w＝4〜5または7〜8 のエチレンオキシド単位であり、
MAA(NHS)は、メチルアクリル酸-N-ヒドロキシスクシンイミドであり、
HPMAは、N-(2-ヒドロキシプロピル) メタクリルアミドであり、
PDSMは、ピリジルジスルフィドメタクリレートである。
【０２４４】
これらのポリマーは、ポリマーまたはコポリマーの第１のブロックの組成が変化し、または化学的に処理されて、第１のブロックが中性であり（例えばPEGMA)、カチオン性であり(DMAEMA)、アニオン性であり(PEGMA-NHS、ここで、NHSは加水分解されて酸になる)、両性であり (DMAEMA-NHS、ここで、NHSは加水分解されて酸になる)、または両性イオン性である(例えば、ポリ[2-メタクリロイルオキシ-2'トリメチルアンモニウムエチルホスフェート])ポリマーを作る。さらに、[PEGMA-PDSM]-[B-P-D]ポリマーは、第１のブロック中にピリジルジスルフィド官能基を含み、チオール化siRNAと反応して、ポリマー-siRNA 結合体を形成する。
【０２４５】
例１：RAFT重合を用いたブロックコポリマーの合成  
Ａ．RAFT連鎖移動剤
以下に示すRAFT重合において使用される連鎖移動剤（CTA）である4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸 (ECT)は、Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68による方法により得た。簡単に言うと、エタンチオール (4.72 g, 76 mmol) を、0℃で10分間にわたって、ジエチルエーテル(150 ml)中の水素化ナトリウム(油中60%) (3.15 g, 79 mmol)の撹拌溶液に加えた。その後、溶液を10分間撹拌し、二硫化炭素 (6.0 g, 79 mmol)を加えた。粗製のS-エチルトリチオカルボン酸ナトリウム (7.85 g, 0.049 mol)をろ過により回収し、ジエチルエーテル (100 mL)中に懸濁し、ヨウ素 (6.3 g, 0.025 mol)と反応させた。1時間後、溶液をろ過し、チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。粗製のビス(エチルスルファニルチオカルボニル)ジスルフィドを、ロータリーエバポレーションにより単離した。酢酸エチル(50 mL)中のビス-(エチルスルファニルチオカルボニル)ジスルフィド (1.37 g, 0.005 mol) および4,4'-アゾビス(4-シアノペンタン酸) (2.10 g, 0.0075 mol)の溶液を、還流で18時間加熱した。溶液をロータリーエバポレーションにより蒸発させ、固定相としてシリカゲル、溶出液として50:50の酢酸エチルおよびヘキサンを使用して、カラムクロマトグラフィーにより粗製の4-シアノ-4 (エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸 (ECT) を単離した。
【０２４６】
Ｂ．ポリ(N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート)マクロ連鎖移動剤 (ポリDMAEMAマクロCTA)。  
DMAEMAのRAFT重合は、DMF中、30℃において、窒素雰囲気下で18時間、ラジカルイニシエータとしてECTおよび2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2.4-ジメチルバレロニトリル) (V-70) (和光化学)を用いて行った。最初のモノマーとCTAとの比 ([CTA]0/[M]0)は、100％変換における理論的なMn が10,000 (g/mol)になるようにした。最初のCTAとイニシエータの比 ([CTA]o/[I]o) は10：1とした。結果として得られるポリDMAEMAマクロ連鎖移動剤をアセトンに再溶解し、続いてペンタン中に沈殿させ（×3）、真空中で一晩乾燥した。
【０２４７】
Ｃ．ポリ(DMAMEA)マクロCTAからのDMAEMA、PAA、およびBMAのブロック共重合  
望ましい理論量のDMAEMA、PAA、およびBMAを、N,N-ジメチルホルムアミド中に溶解したポリ(DMAEMA) マクロCTAに加えた(溶媒に対して25 wt %のモノマーおよびマクロCTA to solvent)。全ての重合のために、 [M]o/[CTA]o および [CTA]o/[I]o をそれぞれ250:1および10:1とした。V70の添加後、窒素を用いて溶液を30分間浄化し、30℃で18時間反応させた。結果として得られたジブロックコポリマーを、50:50 v:vのジエチルエーテル/ペンタンへの沈殿により単離した。その後、沈殿したポリマーをアセトンに再溶解し、続いてペンタン（×3）に沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。ゲル透過クロマトグラフィー (GPC)を使用して、ポリメチルメタクリレート標準に関して、DMF中のポリ(DMAEMA) マクロCTAおよびジブロックコポリマーサンプルの両方の分子量および多分散性 (PDI, Mw/Mn)を測定した(SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 および R-4000 カラム (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)をViscotek GPCmax VE2001 および屈折計VE3580 (Viscotek, Houston, TX)に直列に連結)。1.0 wt % LiBr を含むHPLC-グレードのDMFを移動相として使用した。図１Ａは、RAFT合成ポリマーのいくつかの分子量、粗製、およびブロック比の概要を示す。
【０２４８】
例１．２．ポリ(PEGMA) マクロCTAからのDMAEMA、PAA、およびBMAの第２のブロック(B1-B2-B3) 共重合体の調製
望ましい理論量のDMAEMA、PAA、およびBMAを、N,N-ジメチルホルムアミド中に溶解したポリ(PEGMA) マクロCTAに加えた(溶媒に対して25 wt %のモノマーおよびマクロCTA to solvent)。全ての重合のために、 [M]o/[CTA]o および [CTA]o/[I]o をそれぞれ250:1および10:1とした。AIBNの添加後、窒素を用いて溶液を30分間浄化し、68℃で6〜12時間反応させた。結果として得られたジブロックコポリマーを、50:50 v:vのジエチルエーテル/ペンタンへの沈殿により単離した。その後、沈殿したポリマーをアセトンに再溶解し、続いてペンタン（×3）に沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。Viscotek GPCmax VE2001および屈折計VE3580 (Viscotek, Houston, TX)を用いたゲル透過クロマトグラフィー (GPC)により、DMF中のポリ(PEGMA) マクロCTAおよびジブロックコポリマーサンプルの両方の分子量および多分散性 (PDI, Mw/Mn)を測定した。1.0 wt % LiBr を含むHPLC-グレードのDMFを移動相として使用した。CDCl3中のNMR分光分析は、ポリマー構造を確認し、第２のブロックの組成を計算するために使用した。
【０２４９】
例１．３．PEGMA-DMAEMA コポリマーの調製および特徴づけ
ポリマー合成は、実施例1.1および1.2に記載したように行った。異なる添加比で個々のモノマーを使用することにより第１のブロックにおけるPEGMとDMAEMAの比を変化させ、図１Ｂに示すようなコポリマーを作製した。
【０２５０】
例１．４．PEGMA-MAA(NHS) コポリマーの調製および特徴づけ
ポリマー合成は、望ましい組成の第１のブロックを得られるようなモノマーの添加比を使用して、実施例1.1および1.2に記載したように行った。いくつかの場合において、[PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D] ポリマーは、第１のブロックにおけるモノマーのコポリマー比が70:30になるように調製する。NHS含有ポリマーを、7.4〜8.5のpHで、1〜4時間、室温または37℃で、水性バッファー（リン酸塩または炭酸水素塩）中でインキュベートし、加水分解された（酸性の）形態を作る。
【０２５１】
例１．５．DMAEMA-MAA(NHS) コポリマーの調製および特徴づけ
ポリマー合成は、望ましい組成の第１のブロックを得られるようなモノマーの添加比を使用して、実施例1.1および1.2に記載したように行った。ある場合において、[DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]ポリマーは、第１のブロックにおけるモノマーのコポリマー比が70:30になるように調製する。NHS含有ポリマーを、7.4〜8.5のpHで、1〜4時間、室温または37℃で、水性バッファー（リン酸塩または炭酸水素塩）中でインキュベートし、加水分解された（酸性の）形態を作る。
【０２５２】
例２．siRNAドラッグデリバリーのためのHPMA-PDS(RNA)コポリマー結合体の調製および特徴づけ
Ａ．ピリジルジスルフィドメタクリレートモノマー (PDSMA)の合成
アルドリチオール-2（商標）(5 g, 22.59 mmol)を、40 mlのメタノールおよび1.8 mlのAcOHに溶解した。その溶液を、20 mlメタノール中の 2-アミノエタンチオール.HCl (1.28 g, 11.30 mmol)の溶液として、30分にわたって添加した。反応は、N2下、室温で48時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残留した油を40 mlのジエチルエーテルで2回洗浄した。粗製の化合物を10 mlのメタノール中に溶解し、生成物を50 mlのジエチルエーテルに2回沈殿させ、所望の化合物１を淡黄色の固体として得た。収率: 95％。
【０２５３】
ピリジンジチオエチルアミン (6.7 g, 30.07 mmol) およびトリエチルアミン (4.23 ml, 30.37 mmol) をDMF (25ml) およびピリジン (25 ml)中に溶解し、メタクリロイルクロリド (3.33 ml, 33.08 mmol) をシリンジを用いて0℃でゆっくりと加えた。反応混合物を、室温で2時間撹拌した。反応後、sat. NaHCO3 (350 ml)により反応を停止させ、酢酸エチル (350 ml)により抽出した。混合性の有機層を、10 % HCl (100 ml, 1 回)および純水(100 ml, 2回)により洗浄し、MaSO4により乾燥した。純粋な生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製し(EA/Hex : 1/10〜2/1)、黄色のシロップを得た。Rf = 0.28 (EA/Hex = 1/1)。収率 : 55 %。
【０２５４】
Ｂ．HPMA-PDSMAコポリマー合成
N-(2-ヒドロキシプロピル) メタクリルアミド (HPMA) およびピリジルメタクリレート (典型的に、70:30のモノマー比)のRAFT重合は、DMF中（50重量％モノマー：溶媒）、68℃において、窒素雰囲気下で8時間、フリーラジカルイニシエータとして2,2'-アゾビスイソブチリルニトリル(AIBN)を用いて行った。CTAとAIBNの比は10：1でありモノマーとCTAの比は、100％変換の場合に25,000g/molの分子量が達成されるようにした。ポリ(HPMA-PDS) マクロ-CTAをジエチルエーテル中に繰り返し沈殿させることにより、メタノールから単離した。
【０２５５】
マクロ-CTAを減圧下で24時間乾燥し、その後、ジメチルアミノエチルメタクリレート (DMAEMA)、プロピルアクリル酸(PAA)、およびブチルメタクリレート (BMA)のブロック共重合のために使用する。等モルのDMAEMA、PAA、およびBMA ([M]o / [CTA]o = 250)を、N,N-ジメチルホルムアミド中に溶解した HPMA-PDS マクロCTA に加える(溶媒に対して25 wt %のモノマーおよびマクロCTA)。ラジカルイニシエータAIBN を、CTA：イニシエータの比が 10：1となるように加える。重合は、窒素雰囲気下、68℃で8時間行う。その後、結果として得られたジブロックコポリマーを、50:50 v:vのジエチルエーテル/ペンタンへの4回の沈殿により単離し、沈殿の間にエタノールに再溶解させる。その後、生成物をジエチルエーテルで1回洗浄し、真空中で一晩乾燥させる。
【０２５６】
Ｃ．siRNAのHPMA-PDSMAコポリマーへの結合
ジスルフィド修飾された5’-センス鎖を有する二本鎖RNAとして、チオール化siRNAを商業的に入手した (Agilent, Boulder, CO)。結合のための遊離チオール形態は、凍結乾燥した化合物を水に溶解し、アガロースゲルで固定したジスルフィド還元剤TCEPで1時間処理することにより調製する。その後、還元されたRNA (400μM)を、5 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有するリン酸緩衝液(pH 7) 中のピリジルジスルフィド官能化ポリマーと24時間反応させた。
【０２５７】
ピリジルジスルフィドポリマーとRNAチオールの反応は、2-ピリジンチオンを精製し、分光光度的に測定することにより、結合効率を特徴付けることができる。さらにジスルフィド交換を確認するために、結合体をSDS-PAGE 16.5% トリシンゲル上で泳動させる。平行して、一定の結合反応物を、SDS-PAGEの前に固定化したTCEPで処理し、還元環境下でのポリマーからのRNAの放出を検証した。結合反応は、1、2、および5のポリマー／RNA化学量論で行う。2-ピリジンチオン放出に対する343nmにおけるUV分光光度吸収測定は、結合効率を測定するために使用される。
【０２５８】
例３：細胞ターゲティング剤を有するポリマーの合成：アジド末端ポリマーとプロパルギル葉酸塩のクリック反応
制御されたラジカル重合とアジド−アルキンクリックケミストリーの組み合わせは、関心のある特定の受容体（例えば、葉酸）を含む特定の組織／細胞の活性ターゲティングに対するポテンシャルを有する生物学的リガンド（例えば、葉酸塩）と結合したブロックコポリマーミセルを調製するために使用される。ブロックコポリマーは、アジド連鎖移動剤（CTA）を試用することを除き、実施例１に示したような可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により合成される。その後、ポリマーのアジド末端は、ターゲティング剤（例えば、葉酸）のアルキン誘導体と反応し、ターゲティング剤を含有するポリマーを生成する。
【０２５９】
RAFT剤の合成
RAFT連鎖移動剤 (CTA) 2-ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル-2-メチル-プロピオン酸 3-アジドプロピルエステル (C12-CTAN3) は、以下のように調製する:
3-アジドプロパノールの合成。3-クロロ-1-プロパノール (5.0 g, 53 mmol, 1.0 当量)およびアジ化ナトリウム(8.59 g, 132 mmol, 2.5 当量)を、DMF (26.5 mL)中、100℃で48時間反応させる。反応混合物を室温まで冷却し、エチルエーテル (200 mL)に注ぎ、飽和NaCl水溶液 (500 mL)で抽出する。有機層を分離し、MgSO4により乾燥し、ろ過する。上清を集め、生成物を得る (5.1 g, 95% 収率)。
【０２６０】
2-ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル-2-メチルプロピオン酸塩化物(DMP-Cl)の合成。2-ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル-2-メチル-プロピオン酸 (DMP, Noveon >95%)  (1.0 g, 2.7 mmol, 1.0 当量) を、50 mL 丸底フラスコ中の塩化メチレン (15 mL) に溶解し、溶液を約0℃まで冷却する。塩化オキサリル (0.417 g, 3.3 mmol, 1.2 当量) を窒素雰囲気下でゆっくりと添加し、室温に到達させ、全部で3時間撹拌する。結果として得られる溶液を減圧濃縮し、酸塩化物の生成物を得る(1.0 g, 99% 収率)。
【０２６１】
2-ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル-2-メチルプロピオン酸 3-アジドプロピルエステルの合成。3-アジドプロパノール (265 mg, 2.62 mmol, 1.0 当量) を、50 mL丸底フラスコ中の塩化メチレン (5 mL) に溶解し、溶液を約0℃まで冷却する。塩化メチレン (5 mL)中のトリエチルアミン(0.73 mL)の溶液を10分間にわたって滴下する。塩化メチレン (5 mL)中のDMP-Cl (1.0 g, 2.6 mmol) 溶液を滴下し、3時間撹拌しながら溶液を室温にする。溶液を減圧濃縮し、エチルエーテル (100 mL)で希釈し、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液(50 mL)、水(50 mL)、およびNaCl飽和溶液 (50 mL)で続けて洗浄する。有機層を分離し、MgSO4 (1.0 g)で乾燥し、ろ過する。上清を減圧濃縮し、残留油として生成物を得る(1.05 g, 90% 収率)。
【０２６２】
葉酸プロパルギルの合成
葉酸 (1.0 g, 0.0022 mol) をDMF (10 mL)に溶解し、水/氷バッチ中で冷却する。 N-ヒドロキシスクシンイミド (260 mg, 0.0025 mol) およびEDC (440 mg, 0.0025 mol) を加え、結果として得られる混合物を氷浴中で30分間撹拌する。DMF (5.0 mL)中のプロパルギルアミン (124 mg, 2.25 mmol) の溶液を加え、結果として得られる溶液を室温まで温め、24時間撹拌する。反応混合物を水 (100 mL)に注ぎ、30分間撹拌し、沈殿を形成する。橙黄色の沈殿をろ過し、アセトンで洗浄し、6時間減圧乾燥して1.01 g の生成物を得る (93% 収率)。
【０２６３】
アジド末端ポリマーと葉酸プロパルギルのクリック反応
アジド末端ポリマーを以下の例示的方法により反応させる。DMF (7 mL)中のN3-α-[Ds-Xt]b- [Bx-Py-Dz]a-ω (0.0800 mmol) の溶液およびペンタメチルジエチレントリアミン (PMDETA, Aldrich, 99%), (8.7 mg, 0.050 mmol) を60分間窒素でパージし、シリンジを用いて、磁気撹拌子を備え、CuBr (7.2 mg, 0.050 mmol) および葉酸プロパルギル (42 mg, 0.088 mmol) を含むバイアルに窒素雰囲気下で移す。反応混合物を、酸素の非存在下、26 ℃で22時間撹拌する。反応混合物を空気に暴露し、中性アルミナのカラムを通して溶液を通過させる。DMFを減圧除去し、生成物をヘキサン中に沈殿させる。得られる葉酸末端ブロックコポリマーである葉酸-α-[Ds-Xt]b- [Bx-Py-Dz]a-ωをTHF中に溶解し、ろ過して過剰な葉酸プロパルギルを除去する。THFを除去し、その後、ポリマーを脱イオン化(DI)水に溶解し、1000 Da の分子量カットオフを有する分子膜を用いて6時間透析する。ポリマーを凍結乾燥により単離する。
【０２６４】
例４：ブロックコポリマーPRx0729v6 (P7v6としても既知)のNMR分光分析（図２）
この実施例は、NMR分光分析を用いて、ポリマーPRx0729v6が水溶液中でミセル様の構造を形成することの証拠を提供する。
【０２６５】
1H NMR スペクトルは、重水素化クロロホルム(CDCl3) および重水 (D2O) 中、25℃において、Bruker AV301で記録した。重水素ロック (CDCl3, D2O) を使用し、化学シフトは、テトラメチルシラン (CDCl3に対して)および3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3-d4 酸、ナトリウム塩 (D2Oに対して)からのppmで測定した。ポリマー濃度は、6 mg/mlであった。
【０２６６】
一例としてポリマーPRx0729v6を用た、水性バッファー中における合成されたポリマーのNMR分光分析は、本発明のジブロックコポリマーが水溶液中でミセルを形成することの証拠を提供する。ミセルの形成は、結果として、コアセグメントを形成するプロトンの動きを制限し、溶媒とコアのプロトンとの間の重水素交換を妨げる遮蔽された粘性のある内側のコアの形成を生じる。これは、対応するプロトンの1H NMRシグナルの有意な抑制または消失により示される。我々は、ミセルのコアの疎水性ブロックが効果的に遮蔽されていることを示すために、溶液NMR分光分析のこの特有の性質を使用した。ミセルが水性媒質中に形成される場合、疎水性コポリマーのプロトンによるシグナルの消失が生じるはずである。
【０２６７】
図２は、CDCl3 (有機溶媒)およびD2O (水性溶媒)におけるポリマーPRx0729v6の1H NMR実験を示す。室温でのCDCl3 中のポリマーの1H NMRスペクトル（図２Ａ）は、全てのポリマープロトンに起因するシグナルを示しており、ポリマー鎖がCDCl3 中に分散したままであり（凝集していない）、その運動を保持しているため、そのプロトンを溶媒と交換することができることを示す。これは、遮蔽されたコアを有する安定なミセルが有機溶媒中のPRx0729v6からは形成されないことを示す。図２Ｂは、D2O中のPRx0729v6の1H NMRスペクトルを示す。疎水性ブロック (BMA, PAA, DMAEMA) のプロトンを表すシグナルがスペクトルから消えている。これは、遮蔽されたコアを有する安定なミセルが、水溶液中のPRx0729v6からは形成されることを示す。さらに、同じスペクトルにおいて、 DMAEMAの2つのメチル基のプロトンの共鳴に起因するシグナル(2.28 ppm)は、有意な抑制を受け、外殻を構成する第１のポリDMAEMAブロックのみが水に曝露されることを意味する（すなわち、主にDMAEMAの電荷を有する基）。単純な計算によると、疎水性ブロックのPAA, DMAEMAの積分されたパーセンテージ(2900) をCDCl3におけるシグナル(5600)から減算すると、同じシグナルのD2Oにおけるおよその値(2811)が得られ、この結果と一致する。
【０２６８】
まとめると、1H NMR実験の結果は、ポリマーPRx0729v6が規則正しいコア−外殻構造を有するミセルを形成し、第１のブロックポリDMAEMAが疎水性単位(BMA)および電気的に安定化する反対の電荷を有する単位(PAA, DMAEMA)で構成されるコアを囲む水和した外側の外殻を形成することを示す。
【０２６９】
例５：siRNAと複合体をなすポリマーPRx0729v6の粒子サイズの動的光散乱法 (DLS) による測定（図３）
以下の実施例は、ポリマーPRx0729v6が単独で45nmの大きさの均一な粒子を形成するか、siRNAとの結合により47nmの大きさの粒子を形成することを示す。
【０２７０】
ポリマー単独またはポリマー/siRNA複合体の粒子サイズは、Malvern Zetasizer Nano ZSを用いて、動的光散乱法 (DLS)により測定した。凍結乾燥したポリマーを100% エタノール中に10〜50 mg/mlで溶解し、pH 7.4のリン酸緩衝液で10倍に希釈した。ポリマーは、PRx0729v6単独の場合についてはpH 7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）中、1 mg/mlで測定し、1 μM GAPDH-特異的 21 mer-siRNA (Ambion)と複合体を形成したPRx0729v6については0.7 mg/mlで測定し、ポリマーにおける正電荷：siRNAにおける負電荷の理論的な電荷比は4:1であった。PRx0729v6単独 (45 nm) およびPRx0729v6とsiRNAの複合体 (47 nm) (図３)は、近い一様分散を有する同様の粒子サイズを示す（PDI <0.1）。
【０２７１】
例６：異なる電荷比におけるポリマーPRx0729v6 / siRNA 複合体のゲルシフト分析（図４）
以下の実施例は、ポリマーPRx0729v6が種々の電荷比でsiRNAと結合し、その結果として電気泳動易動度の減少した複合体が生じることを示す。
【０２７２】
ポリマーとsiRNAの結合は、ゲル電気泳動により分析され（図４）、siRNAとポリマーの完全な結合は、4:1以上のポリマー/siRNAにおいて生じる。
【０２７３】
例７：ポリマーPRx0729v6の臨界ミセル濃度（CMC）（図５）
以下の実施例は、ポリマーPRx0729v6により形成されるミセルが、100倍希釈に対して安定であることを示す。
【０２７４】
1 mg/ml ± 0.5 M NaClの濃度におけるPBSバッファー（pH 7.4）中のポリマーPRx0729v6の粒子サイズ。粒子サイズは、PBS ± 0.5 M NaCl を用いて、1 mg/ml〜1.6 μg/mlの5倍の範囲の連続的な希釈について動的光散乱法により測定した。図５は、約45nmの大きさの粒子が約10μg/mlの濃度まで下げても安定であることを示す。ポリマーPRx0729v6は、約 5 μg/ml (CMC)より低い濃度では不安定になり、個々のポリマー鎖は分離し、非特異的な凝集体を形成する。
【０２７５】
例８：有機溶媒におけるポリマーPRx0729v6粒子の安定性（図６）
この実施例は、ポリマーPRx0729v6のミセル構造が有機溶媒中で分離し、ミセルコアの疎水性の性質と一致することを示す。
【０２７６】
ポリマーPRx0729v6を1 mg/mlの濃度で種々の有機溶媒の溶解し、動的光散乱法により粒子サイズを測定した。図６は、ジメチルホルムアミド（DMF）の濃度を増大させることによりミセルが分解し、凝集鎖を生じることを示す。
【０２７７】
例９：siRNAのノックダウン活性−培養哺乳動物細胞におけるミセル複合体（図７および図１２）
siRNA/ ポリマーPRx0729v6複合体のノックダウン(KD)活性は、PRx0729v6:siRNA 複合体で24時間処理した後、特異的な遺伝子発現を測定することにより96ウェル型式において分析した。ポリマーおよびGAPDHターゲティングsiRNAまたはネガティブコントロールsiRNA (Ambion)を25 μL内で混合し、種々の電荷比および5倍以上の最終的な形質移入濃度を得て、30分間混合し、10% FBS を含有する100μL通常培地中にHeLa細胞を加えた。最終的なsiRNA濃度は、100、50、25、および12.5μMで評価した。ポリマーは、4:1、2:1または1:1の電荷比または18、9、4.5、および2.2μg/ml の固定されたポリマー濃度で加え、どの条件が最も高いKD活性を生じるかを測定した。電荷比については（図７Ａ）、複合体をより高い濃度で調製し、30分間インキュベートし、細胞を添加する直前に、グラフに示すように5倍以上の濃度で連続的に希釈した。固定されたポリマー濃度の場合（図７Ｂ）、siRNAおよびポリマーをグラフに示すように5倍以上の濃度で複合体化し、30分間インキュベートし、図７に示す最終濃度で細胞に添加した。図７Ｃは、ネガティブコントロールを示す。RNA全体は、処理の24時間後に単離され、GAPDH発現は、定量的PCRにより、2つの内部の正規化遺伝子（normalized gene）であるRPL13AおよびHPRTに関して測定された。図７、図１２Ａおよび図１２Ｂにおける結果は、試験した全てのsiRNA濃度において、9μg/ml以上のPRx0729v6濃度で、60%より大きいKD活性が得られた。この濃度は、粒子サイズ分析による安定なミセル形成と一致した。高いKD活性は、より低い濃度における複合体形成と比較して、複合体が高い濃度で調製され、段階的に希釈された場合にのみ（4：1の電荷比）、4.5μg/ml PRx0729v6 /12.5 nM siRNAで観察された。さらに、100 nM siRNAおよび4.5μg/ml PRx0729v6は、高いKD活性を示す一方、より低いsiRNA濃度の場合はKD活性を示さなかった。まとめると、PRx0729v6ミセルは、10μg/mlまでの濃度で安定であり、KD活性は5μg/ml以下で喪失し、安定
なミセルはよりよいKD活性を必要とすることを示す。
【０２７８】
例１０：ダイサー基質GAPDH siRNAのノックダウン活性−培養哺乳動物細胞におけるポリマー発現
GAPDH特異的ダイサー基質siRNA/ポリマー複合体のノックダウン(KD)活性は、ポリマー：GAPDH ダイサーsiRNA複合体で24時間処理した後のGAPDH遺伝子発現を測定することにより、96ウェル型式において分析する。GAPDH ダイサーsiRNA配列は、センス鎖： rGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC、アンチセンス鎖： rGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrUである。ポリマーおよびGAPDHターゲティングsiRNAまたはネガティブコントロールsiRNA (IDT)を25 μL内で混合し、種々の電荷比および5倍以上の最終的な形質移入濃度を得て、30分間混合し、10% FBS を含有する100μL通常培地中にHeLa細胞を加える。最終的なsiRNA濃度は、100、50、25、および12.5μMで評価する。ポリマーは、4:1、2:1または1:1の電荷比または40、20、10、および5μg/ml の固定されたポリマー濃度で加え、どの条件が最も高いKD活性を生じるかを測定する。RNA全体は、処理の24時間後に単離され、GAPDH発現は、定量的PCRにより、2つの内部の正規化遺伝子（normalized gene）であるRPL13AおよびHPRTに関して測定する。結果は、試験した全てのsiRNA濃度において、10μg/ml以上のポリマー濃度で、60%より大きいKD活性が得られる。この濃度は、粒子サイズ分析による安定なミセル形成と一致する。
【０２７９】
例１１：ApoB100 siRNAのノックダウン活性−培養哺乳動物におけるポリマー複合体
ApoB100特異的siRNAまたはダイサー基質siRNAとポリマーの複合体のノックダウン(KD)活性は、ポリマー：ApoB siRNA複合体で24時間処理した後のApoB100遺伝子発現を評価することにより、96ウェル型式において分析する。ApoB100 siRNA配列は：センス鎖5'-rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-3'、アンチセンス鎖： 5'-rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3'である。ApoB100ダイサー基質siRNA配列は、センス鎖：5'- rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA、アンチセンス鎖：5'- rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3'である。ポリマーおよびApoBターゲティングsiRNAまたはネガティブコントロールsiRNA (IDT) を25 μL内で混合し、種々の電荷比および5倍以上の最終的な形質移入濃度を得て、30分間混合し、10% FBS を含有する100μL通常培地中にHepG2細胞を加える。最終的なsiRNA濃度は、100、50、25、および12.5μMで評価する。ポリマーは、4:1、2:1または1:1の電荷比または40、20、10、および5μg/ml の固定されたポリマー濃度で加え、どの条件が最も高いKD活性を生じるかを測定する。RNA全体は、処理の24時間後に単離され、ApoB100発現は、定量的PCRにより、2つの内部の正規化遺伝子（normalized gene）であるRPL13AおよびHPRTに関して測定する。結果は、試験した全てのsiRNA濃度において、10μg/ml以上のポリマー濃度で、60%より大きいKD活性が得られる。この濃度は、粒子サイズ分析による安定なミセル形成と一致する。
【０２８０】
例１２：ApoB100 siRNAのノックダウン活性−マウスモデルにおけるポリマー複合体
ApoB100特異的siRNA/ポリマー複合体のノックダウン活性は、肝組織および血清コレステロールレベルにおけるApoB100の発現を測定することにより、マウスモデルにおいて測定する。Balb/Cマウスに、尾静脈から、1:1、2:1または4:1の電荷比（ポリマー:siRNA）の1、2または5 mg/kgのApoB特異的なsiRNAとポリマーの複合体を投与するか、または生理食塩水対照を投与する。最終投与の48時間後にマウスを屠殺し、血液および肝臓のサンプルを単離する。コレステロールレベルは、血清中で測定する。全RNAが肝臓から単離され、ApoB100発現は、定量的PCRにより、2つの正規化遺伝子HPRTおよびGAPDHに関して測定される。
【０２８１】
例１３：ApoB100アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドのノックダウン活性−培養哺乳動物におけるポリマー複合体
ApoB100特異的アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドとポリマーの複合体のノックダウン(KD)活性は、ポリマー：ApoBアンチセンスDNAオリゴヌクレオチド複合体で24時間処理した後のApoB100遺伝子発現を測定することにより、96ウェル型式において分析する。マウスApoBに特異的な2つのApoB100アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
（１）5'-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3'、コード領域の541位および
（２）5'-ATGTCAATGCCACATGTCCA-3'、コード領域の531位である。
【０２８２】
ポリマーおよびApoBターゲティングアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドまたはネガティブコントロールDNAオリゴヌクレオチド (スクランブル配列) を25 μL内で混合し、種々の電荷比および5倍以上の最終的な形質移入濃度を得て、30分間混合し、10% FBS を含有する100μL通常培地中にHepG2細胞を加える。最終的なオリゴヌクレオチド濃度は、100、50、25、および12.5μMで評価する。ポリマーは、4:1、2:1または1:1の電荷比または40、20、10、および5μg/ml の固定されたポリマー濃度で加え、どの条件が最も高いKD活性を生じるかを測定する。RNA全体は、処理の24時間後に単離され、ApoB100発現は、定量的PCRにより、2つの内部の正規化遺伝子（normalized gene）であるRPL13AおよびHPRTに関して測定する。
【０２８３】
例１４：高分子ミセルおよびそのsiRNA複合体の膜不安定化活性の実証
pH応答性の膜不安体化活性は、ポリマー単独またはPRx0729v6 :siRNA複合体をヒト赤血球細胞(RBC)の標本中に滴定し、ヘモグロビン放出による膜溶解活性を測定することにより分析した（540nmにおける吸収）。3つの異なるpH条件を使用し、エンドソームのpH環境を模擬した（細胞外pH = 7.4、初期エンドソーム = 6.6、後期エンドソーム= 5.8)。EDTAを含む採血管中に集めた全血から、遠心分離によりヒト赤血球細胞 (RBC) を単離した。RBCを通常の生理食塩水中で3回洗浄し、特定のpH(5.8、6.6または7.4)におけるPBS中で最終濃度2％のRBCとした。PRx0729v6単独またはPRx0729v6 /siRNA複合体を、図5に示した臨界ミセル濃度（CMC）より少し高い濃度および少し低い濃度で試験した。ポリマー/siRNA複合体の場合は、25 nM siRNAをPRx0729v6に1:1、2:1、4:1および8:1の電荷比で加えた (ポリマー単独の場合と同じポリマー濃度)。ポリマー単独またはポリマー-siRNA複合体の溶液を30分間で20倍の最終分析濃度にし、各RBC標本中に希釈した。2つの異なるPRx0729v6ポリマーを入れた標本は、調製から4℃で保存し、調製の9日後および15日後に活性の安定性を比較した。RBCとポリマー単独またはポリマー/siRNA複合体を37℃で60分間インキュベートし、遠心分離して完全なRBCを除去した。上清をキュベットに移し、540nmにおける吸収を測定した。パーセント溶血は、A540サンプル/1% Triton X-100処理されたRBCのA540として表す(100%溶血に対するコントロール)。結果は、PRx0729v6単独 (図8A)またはPRx0729v6 /siRNA 複合体(図8B) が、pH 7.4において非溶血性であり、エンドソームに付随するより低いpHおよびポリマーのより高い濃度において、溶血性が増大することを示す。
【０２８４】
例１５：ポリマーPRx0729v6の透過型電子顕微鏡（TEM）分析（図９）
この例は、電子分光法を用いて、ポリマーPRx0729v6が球状のミセル様粒子を形成することの証拠を提供する。
【０２８５】
PBS中のポリマーPRx0729v6の0.5 mg/ml溶液を、カーボンで被覆された銅格子に30分間塗布した。格子をKarnovskyの溶液中に固定し、カコジラートバッファー中で1回洗浄し、その後、水で8回洗浄した。格子を6％酢酸ウラニル溶液で15分間染色し、分析まで乾燥した。透過型電子顕微鏡分析（TEM）は、JEOL顕微鏡を用いて行った。図９は、動的光散乱法により溶液中で測定したような望ましいミセルの大きさと同様のおよその直径を有する球状粒子であることを実証する、ポリマーPRx0729v6の典型的な電子顕微鏡写真を示す。
【０２８６】
例１６：ポリマー-siRNA複合体の細胞取り込みおよび細胞内分布の蛍光顕微鏡分析（図１０）
この実施例は、ポリマーPRx0729v6が、脂質ベースの形質移入試薬よりも効率的に蛍光標識したsiRNAの細胞取り込みおよびエンドソーム放出を媒介できることを示す。
【０２８７】
HeLa 細胞を、Lab-Tek IIチャンバーカバーグラス上に蒔いた。一晩インキュベートした後、100 nM FAM-siRNA/リポフェクタミン 2000または100 nM FAM-siRNAを、ポリマー-siRNA 4:1の電荷比で細胞に形質移入した。pH 7.4のPBS中で30分間、5倍の濃度で複合体を形成し、1倍の最終濃度で細胞に加え、一晩インキュベートした。細胞をDAPIで10分間染色し (核の可視化のため)、その後、3.7% ホルムアルデヒド-1X PBS中で5分間固定化し、PBSで洗浄した。Zeiss Axiovert蛍光顕微鏡を用いて、サンプルを画像化した。図１０Ｂは、リポフェクタミン（図１０Ａ）と比較したポリマー-siRNAの細胞取り込みおよび細胞内分布の蛍光顕微鏡写真を示す。リポフェクタミン-siRNA複合体の粒子染色は、エンドソーム領域を示唆し、一方、ポリマー-siRNA複合体の拡散性の細胞質染色は、それらがエンドソームから細胞質へ放出されたことを示す。
【０２８８】
例１７：疎水性小分子のポリマーPRx0729v6ミセルへの取り込み
この実施例は、疎水性小分子が、ポリマーPRx0729v6の主に疎水性のミセルコアにより取り込まれることを示す。
【０２８９】
siRNAを有するまたは有さないポリマーミセルの形成を、ピレン(C16H10, MW = 202)を用いた蛍光プローブ技術により確認した。ここで、ピレンのミセルコアへの分配は、ピレンスペクトルの2つの発光極大を用いて決定した。ポリマーミセル溶液におけるピレンの蛍光発光スペクトルは、395nmの固定された励起波長を用いて、ピレンを6×10-7 Mの一定濃度として、300〜360 nmで測定した。ポリマーは、100 nM siRNAを有する場合と有さない場合について、0.001%〜20% (w/w)で変化させた。スペクトルデータは、Varian蛍光分光光度計を用いて得た。全ての蛍光実験は、25℃で行った。ポリマー濃度の関数として強度比I336/I333をプロットすることにより、臨界ミセル濃度(CMC)を決定した。CMC値は、約2μg/mlであると算出された。
【０２９０】
同様に、モデルの小分子薬であるジピリダモール(2-{[9-(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)-2,7-ビス(1-ピペリジル)-3,5,8,10-テトラザビシクロ[4.4.0]デカ-2,4,7,9,11-ペンタエン-4-イル]-(2-ヒドロキシエチル)アミノ}エタノール; C24H40N8O4,  MW = 505)を、以下に示すようにPRx0729v6のミセルコアに導入する。ポリマー(1.0 mg)およびジピリダモール (DIP) (0.2 mg) をTHF (0.5 mL)に溶解する。脱イオン化水 (10 mL) を滴下し、溶液を50℃で6時間撹拌し、薬物をミセルの疎水性コアに導入する。溶液(2.5 mL)を分取し、25℃および37℃において、紫外可視分光光度計により415 nmにおけるジピリダモールの吸収を測定する。対照の測定は、コポリマーの非存在下において、脱イオン化水中のジピリダモールの吸収の時間依存的な減少を測定することにより行った。 25℃および37℃の両方における吸収を各時間点において測定し、その値は溶液において観察された値から減算される。
【０２９１】
例１８：ポリマー構造におけるpHの影響（図１１）
この実施例は、pHを7.4から4.7に下げることにより、ポリマーPRx0729v6.2のミセル構造が解離することを示す。
【０２９２】
ポリマーPRx0729v6.2の粒子サイズは、PBS中において、0.5 mg/ml〜0.004 mg/mlの5倍の連続した希釈において、pH4.7までの一連の酸性pH値およびpH 7.4で、動的光散乱法により測定した。図１１Ａは、pH 7.4において、ポリマーが、凝集体を形成する形態に解離し始める4 μg/mlまでの希釈では安定であることを示す。図１１Ｂは、pH 4.7まで酸性を増大させたpHにおいて、ミセル構造からのポリマー解離が促進されることを示し、すなわち、より高いポリマー濃度において生じ、1〜8 nmの大きさのポリマーモノマーのレベルを増大させることを示す。
【０２９３】
例１９：ターゲティングリガンドおよびポリヌクレオチドをコポリマーに結合させる方法
以下の実施例は、ターゲティングリガンド（例えば、ガラクトース）またはポリヌクレオチド治療剤（例えばsiRNA）をジブロックコポリマーに結合させる方法を示す。（１）過逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)を用いて、ポリマーを調製し(Chiefari et al. Macromolecules. 1998;31(16):5559-5562)、R基置換としてガラクトースを有する連鎖移動剤を用いて、ガラクトース末端官能化ジブロックコポリマーを形成する。（２）ジブロックコポリマーの第１のブロックは、メチルアクリル酸-N-ヒドロキシスクシンアミド (MAA(NHS))を含有するコポリマーとして調製し、ガラクトース-PEG-アミンは、NHS基と結合するか、またはアミノジスルフィドsiRNAがNHSと結合し、あるいは、ピリジルジスルフィドアミンをNHS基と反応させて、チオール化RNAとその後反応してポリマー-RNA結合体を形成するピリジルジスルフィドを形成する。
【０２９４】
例１９．１：ガラクトース-PEG-アミンおよびガラクトース-CTAの調製
スキーム１は、ガラクトース-PEG-アミン（化合物3）およびガラクトース-CTA（連鎖移動剤）（化合物4）の合成スキームを示す。
【０２９５】
化合物1：ペンタアセテートガラクトース (10 g, 25.6mmol) および2-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]エタノール (5.6 mL, 38.4 mmol) を乾燥CH2Cl2 (64 mL)中に溶解し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。氷浴中で1時間にわたって、BF3.OEt2 (9.5 ml, 76.8 mmol) を前記混合物に滴下した。反応混合物を室温で48時間撹拌した。反応後、30 mLのCH2Cl2を加えて反応液を希釈した。飽和NaHCO3(aq)を用いて有機層を中和し、ブラインで洗浄し、その後MgSO4により乾燥した。CH2Cl2を減圧除去し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、最終生成物1をわずかに黄色の油として得た。収率 : 55 % TLC (I2 およびp-アニスアルデヒド): EA/Hex : 1/1 (Rf: β = 0.33; α = 0.32; 未反応S.M 0.30)。
【０２９６】
化合物2：化合物1 (1.46 g, 2.9 mmol) を乾燥DMF (35 mL)中に溶解し、NaN3 (1.5 g, 23.2 mmol)を室温で混合物に加えた。反応混合物を85〜90℃に一晩加熱した。反応後、EA (15 mL)を溶液に加え、水(50 mL) で有機層を5回洗浄した。有機層をMgSO4により乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の油として化合物2を得た。収率: 80 %, TLC (I2 およびp-アニスアルデヒド): EA/Hex : 1/1 (Rf: 0.33)。
【０２９７】
化合物3：化合物2  (1.034 g, 2.05 mmol) をMeOH (24 mL)に溶解し、N2で10分間泡立たせ、その後、Pd/C (10%) (90 mg) およびTFA (80 uL)を前記溶液に加えた。反応混合物をH2で30分間再び泡立たせ、その後、反応液を室温でH2下、さらに3時間撹拌した。セライトによりPd/Cを除去し、MeOHを蒸発させ、粘着性のゲルとして化合物3を得た。化合物3は、さらなる精製を行わずに使用することができる。収率: 95 %. TLC (p-アニスアルデヒド): MeOH/CH2Cl2 : 1/4 (Rf: 0.05)。
【０２９８】
化合物4：ECT (0.5 g, 1.9 mmol)、NHS (0.33 g, 2.85 mmol)およびDCC (0.45 g, 2.19 mmol) をCHCl3 (15 mL)に0℃で溶解した。反応混合物を室温で一晩連続して撹拌した。CHCl3 (10 mL)中の化合物3 (1.13 g, 1.9 mmol) およびTEA (0.28 mL, 2.00 mmol)を、前記反応液に0℃でゆっくりと加えた。反応混合物を室温で一晩、連続的に撹拌した。CH3Clを減圧除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色のゲルとして化合物4を得た。収率 (35 %). TLC : MeOH/ CH2Cl2 : 1/9 (Rf : 0.75)。
【化７】
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【０２９９】
スキーム１：ガラクトース-PEG-アミン（化合物3）およびガラクトース-CTA（化合物4）の合成
例１９．２
Ａ．DMAEMAマクロCTAの合成
重合：: 20 mLガラスバイアル(隔壁キャップ（septa cap）を具備する)に、33.5 mg ECT (RAFT CTA)、2.1 mg AIBN (メタノールから2回再結晶)、3.0 g DMAEMA (Aldrich, 98%, 阻害剤を除去するために、使用する直前に小アルミナカラムを通過させる)および3.0 g DMF (阻害剤がなく、高純度)を入れた。セプタカップでガラスバイアルを閉じ、乾燥窒素を30分間パージした（撹拌しながら、氷浴中で行う）。反応バイアルを、予め70℃に加熱した反応ブロック中に置いた。反応混合物を2時間40分撹拌した。隔壁キャップを開き、混合物を氷浴中のバイアルにおいて2〜3分間撹拌し、重合反応を停止させた。
【０３００】
精製：: 3 mLのアセトンを反応混合物に加えた。 300 mLビーカーに、240 mLへキサンおよび60 mL エーテル (80/20 (v/v))を入れ、撹拌しながら反応混合物をビーカーに一滴ずつ加えた。最初に、濁った溶液を遠心沈殿することにより回収される油が生成した；収率 = 1.35 g (45%)。ヘキサン/エーテル(80/20 (v/v))混合溶液からアセトン中に、何回かの沈殿を行った（例えば6回）。最後に、ポリマーを8時間室温で減圧乾燥した；収量 ≒ 1 g。
【表３】
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【０３０１】
DMF＝3.0 g; N2 パージング: 30分; 70℃、2時間45分で重合を行う。
【０３０２】
Ｂ．DMAEMAマクロCTAからの[BMA-PAA-DMAEMA]の合成
全ての化学物質および試薬は、特に言及しない限り、Sigma-Aldrich Companyから購入した。ブチルメタクリレート (BMA) (99%)、2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート (DMAEMA) (98%)を、塩基性アルミナのカラム(150 mesh)を通し、重合阻害剤を除去した。阻害剤を含まない2-プロピルアクリル酸 (PAA) (>99%)を購入し、入手したままの状態で使用した。アゾビスイソブチロニトリル(AIBN) (99%) をメタノールから再結晶し、減圧乾燥した。上述したようにDMAEMA マクロCTAを合成し、精製した (Mn〜10000; PDI〜1.3; > 98%)。N, N-ジメチルホルムアミド(DMF) (99.99%) (EMDから購入)は試薬グレードであり、そのまま使用した。ヘキサン、ペンタンおよびエーテルはEMDから購入し、それらはポリマー生成のために入手したままの状態で使用した。
【０３０３】
重合：BMA (2.1 g, 14.7 mmoles)、PAA (0.8389 g, 7.5 mmoles)、DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmoles)、マクロCTA (0.8 g, 0.0816 mmoles)、AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmoles; CTA:AIBN 10:1)およびDMF (5.34 ml)を窒素雰囲気下で封をしたバイアルに加えた。使用したCTA:モノマーの比は、1:360であった (50%の変換を想定)。モノマー濃度は3 Mであった。窒素を混合物中に30分間バブリングすることにより混合物を脱気し、ヒーターブロック中に置いた (温度計: 67℃;ディスプレイ: 70〜71; 撹拌スピード300〜400 rpm)。反応を6時間続け、バイアルを氷中に置き、混合物を空気に曝露することにより反応を停止させた。
【０３０４】
精製：ポリマー精製は、アセトン/DMF 1:1からヘキサン/エーテル75/25中に行った (3回)。結果として得られるポリマーを少なくとも18時間減圧乾燥した。NMRスペクトルは、ポリマーが高純度であることを示した。ビニル基は観察されなかった。エタノールから2回脱イオン化した水に対して4日間透析し、その後凍結乾燥した。以下の条件を用いて、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)によりポリマーを分析した：溶媒: DMF/LiBr 1%、流速: 0.75 ml/min、注入容積: 100μl。
【０３０５】
カラム温度: 60℃。検出器を較正するために、ポリ(スチレン)を使用した。結果として得られるポリマーのGPC分析: Mn=40889 g/mol。PDI=1.43。 dn/dc= 0.049967。
【０３０６】
例１９．３．gal-[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]の合成
合成は、例１９．２に記載したように行った。始めに、連鎖移動剤としてECTの代わりにガラクトース-CTA(例19.1, 化合物4)を使用したことを除いて、ガラクトース-DMAEMA マクロ-CTA を調製した (例19.2.A.)。結果として、末端がガラクトースで官能化されたポリDMAEMAが得られた (図13)。その後、例19.2.Bに記載した第2のブロック[BMA-PAA-DMAEMA]を合成するために、ガラクトース-[DMAEMA]-マクロ-CTAを使用した。合成の後、100 mM炭酸水素ナトリウムバッファー（pH 8.5）中で2時間インキュベーションすることにより、ガラクトースにおけるアセチル保護基を除去した。NMR分光分析を使用して、ポリマーにおける脱保護されたガラクトースの存在を確認した。
【０３０７】
例１９．４．[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]およびDMAEMA-MMA(NHS)-[B-P-D]ジブロックコポリマーの調製および特徴づけ
図１４は、第１のブロックにおけるモノマーのコポリマー比が70：30である[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]ポリマーの合成の概要を示し、図１５は、第1のブロックにおけるコポリマー比が70：30である[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]の特徴づけの概要を示す。
【０３０８】
例１９．５．ガラクトース-PEG-アミンとPEGMA-MAA(NHS)の結合による[PEGMA-MAA(Gal)]-[B-P-D]ポリマーの作製
図１６は、ガラクトース官能化DMAEMA-MAA(NHS)またはPEGMA-MAA(NHS)ジブロックコポリマーの調製を示す。ポリマー[DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] または[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]を、1〜20 mg/mlの濃度でDMF中に溶解した。例19.1（化合物3）に記載したように調製したガラクトース-PEG-アミンを、1〜2当量のトリエチルアミンで中和し、5：1のアミン：ポリマー比で反応混合物に加えた。反応は、35℃で6〜12時間行い、等容量のアセトンを加え、脱イオン化水に対して1日間透析し、凍結乾燥した。
【０３０９】
例１９．６．siRNAとPEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]の結合による [PEGMA-MAA(RNA)]-[B-P-D]ポリマーの作製
図１７Ａおよび図１７Ｂは、NHS含有ポリマーに結合し得る2つの修飾されたsiRNAの構造を示す。siRNAsは、Agilent (Boulder, CO)から得た。図１７Ｃは、NHS含有ポリマーを誘導体化してチオール化RNA（図１７Ｂ）の結合に対するジスルフィド反応基を提供するピリジルジスルフィドアミンの構造を示す。
【０３１０】
NHS含有ポリマーとアミノ-ジスルフィド-siRNAの反応。この反応は、有機溶媒からなる標準的な条件下（例えば、DMFもしくはDMSO、または混合溶媒DMSO / バッファー pH 7.8.)、35℃で4〜8時間行い、等容量のアセトンを加え、脱イオン化水に対して1日間透析し、凍結乾燥した。
【０３１１】
NHS含有ポリマーとピリジル-ジスルフィド-アミンおよびチオール化siRNAとの反応。ピリジルジスルフィドアミンとNHS含有ポリマーの反応を行う。続いて、凍結乾燥されたポリマーをエタノール中に50 mg/mlで溶解し、pH8の炭酸水素ナトリウムバッファー中に10倍に希釈する。チオール化siRNA (図16 B)を、ポリマーNHS基に対して過剰な2〜5モル濃度で、35℃、4〜8時間反応させ、リン酸緩衝液（pH 7.4）に対して透析する。
【０３１２】
例２１．７．治療用ペプチドとピリジル-ジスルフィド修飾ポリマーの結合
例21.6に記載したピリジル-ジスルフィド修飾ポリマーPEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]は、治療用ペプチドとの結合のためにも使用し得る（図１７Ｄ）。ペプチドを合成し、結合のために調製し、結合反応を以下に示すように行い、[PEGMA-MAA(ペプチド)]-[B-P-D]ポリマーを作製する。
【０３１３】
ペプチド形質導入ドメインペプチドトランスポルチン（アンテナペディアペプチド(Antp)配列としても既知）との融合は、カルボキシ末端システイン残基を含むBak-BH3ペプチド(Antp-BH3) (NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSC-COOH)の細胞内部移行形態を合成するために使用される。結合のための遊離チオールを保証するために、ペプチドを水中に再構築し、アガロースゲル内に固定化されたジスルフィド還元剤TCEPで1時間処理する。還元ペプチド(400 μM)を、その後、5 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有するリン酸緩衝液(pH 7)中で、ピリジルジスルフィドで末端を官能化されたポリマーと24時間反応させる。
【０３１４】
ピリジルジスルフィドポリマー末端基とペプチドシステインの反応は、2-ピリジンチオンを作り、結合効率を特徴付けるために分光光度的に測定され得る。ジスルフィド交換のさらなる確認のために、結合体をSDS-PAGE 16.5%トリシンゲル上を泳動させる。平行して、結合反応の一部をSDS-PAGEの前に固定化したTCEPで処理し、還元環境下におけるポリマーからのペプチドの放出を確認する。
【０３１５】
結合反応は、1、2および5のポリマー/ペプチド化学量論で行う。2-ピリジンチオン放出に対する343 nmでのUV分光光度吸収測定は、結合効率を示す。SDS PAGEゲルは、ペプチド-ポリマー結合体をさらに特徴付けるために使用する。ポリマー/ペプチドモル比が1の場合、検出可能な量のペプチドは、末端システインを介したジスルフィド架橋によりダイマーを形成する。しかしながら、ピリジルジスルフィドに対するチオール反応が有利であり、遊離ペプチドのバンドは、等しい〜2より大きいポリマー/ペプチド比において、もはや見られない。これらのサンプルにおけるペプチドバンドの出現により示されるように、結合体を還元剤TCEPで処理することにより、ポリマー-ペプチドジスルフィド結合を切断することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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