(57)【要約】  本発明は、例えばポリクローナル及びモノクローナル抗体、天然又は合成由来のタンパク質又はペプチドのようなキャリアとの治療的に有用なアントラサイクリンのコンジュゲート；その調製方法、それらを含む薬学的組成物及びある種の哺乳動物の腫瘍の治療におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）
2011528360.tif 000117
［上式中、
Ａｎｔはアントラサイクリン誘導体残基であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｚはスペーサーであり、
ｍは１から３０の整数であり、
Ｔは、タンパク質、ペプチド、モノクローナル又はポリクローナル抗体又は［Ａｎｔ−Ｌ−Ｚ−］部分への結合に適したその化学的に修飾された誘導体、又はポリマーキャリアから選択されるキャリアであり、
Ｑは、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、フェニル又はベンジル基であり；
Ａｎｔは、遊離して式（ＩＩ）
2011528360.tif 000118
（上式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ又はメトキシ基であり、Ｒ２はＣ１−Ｃ５アルコキシ基である）
のアントラサイクリン誘導体を生じ得る］のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
スペーサーＺは、
ａ）−ＮＨ−、
ｂ）−Ｓ−、
ｃ）更なるチオール又はアミノ基又はカルボキシ残基を有するアミノアルキレン、チオアルキレン、アミノシクロアルキレン又はチオシクロアルキレン、又は
ｄ）アミド結合又はジスルフィド結合を形成することによりＴキャリアにＬ１リンカーを結合させ得るペプチド残基
から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）又は（Ｉ’）のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
キャリアＴが、腫瘍関連抗原に結合可能な抗原結合部位を含むポリクローナル抗体又はその断片；腫瘍細胞集団上に優先的又は選択的に発現される抗原に結合可能な抗原結合部位を含むモノクローナル抗体又はその断片；腫瘍細胞に優先的に又は選択的に結合可能な天然又は組換えペプチド又はタンパク質；［Ａｎｔ−Ｌ１−Ｚ−］部分への結合に適した化学的に修飾された誘導体、又は天然又は合成ポリマーキャリアから選択される、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉ）又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
式（Ｉａ）
2011528360.tif 000119
［上式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｚ、ｍ及びＴは請求項１に記載の通りであり、
Ｌ１は式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）
2011528360.tif 000120
（ここで、Ｂはヘテロ原子が介在されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン部分であり、ｖ、ｊ、ｋ及びｙは独立して０又は１である）のリンカーであり；Ａｎｔが式（ＩＩ）のＣ−１４の第一級アルコールにアセタール結合を介してリンカーＬ１を結合させる。］
のものである、請求項１記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
スペーサーＺが、
ｉ）式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される−ＮＨ−；
ｉｉ）Ｔ−［ＳＨ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される−Ｓ−；
ｉｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又はＤ−ＮＨ−が、式Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離アミノ酸を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｉｖ）−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−ＣＯ−が、式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離カルボキシル基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖ）−ＮＨ−Ｄ−Ｎ＝ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、−Ｄ−Ｎ−は、式Ｔ−［ＣＨＯ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離アミノ基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式（Ｖ）：
2011528360.tif 000121
のキャリア誘導体から誘導される少なくとも一の遊離チオール基を有する１から４のアミノ酸で構成されるペプチド残基である）；
ｖｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式（ＶＩ）：
2011528360.tif 000122
のキャリアから誘導される少なくとも一の遊離チオール基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）
から選択される、請求項４に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。 
【請求項６】
式（Ｉｂ）
2011528360.tif 000123
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ、ｍ及びＴは請求項１に記載の通りであり、Ｌ２は式（ＶＩＩ）は（ＶＩＩＩ）：
2011528360.tif 000124
（上式中、ｎは１から９の整数である）のリンカーである］
のものである、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
Ｌ２が、請求項６に記載の式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｚが、
ｉ）式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される−ＮＨ−；
ｉｉ）式Ｔ−［ＳＨ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される−Ｓ−；
ｉｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−ＮＨ−は、式Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離アミノ基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｉｖ）−ＮＨ−Ｄ−ＣＯ−ＮＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−ＣＯ−は、式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが遊離される少なくとも一の遊離カルボキシル基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖ）−ＮＨ−Ｄ−Ｎ＝ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｎ−は、式Ｔ−［ＣＨＯ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離アミノ基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は、式（Ｖ）：
2011528360.tif 000125
のキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが遊離される少なくとも一の遊離チオール基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は、式（ＶＩ）：
2011528360.tif 000126
のキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔが誘導される少なくとも一の遊離チオール基を有する１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖｉｉｉ）−Ｓ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−（ここで、−Ｄ−ＮＨ−は、少なくとも一つの遊離アミノ基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｉｘ）−Ｓ−Ｄ−ＣＯ−ＮＨ−（ここで、−Ｄ−ＣＯ−は少なくとも一つの遊離カルボキシル基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｘ）−Ｓ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｎ−は少なくとも一の遊離アミノ基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｘｉ）Ｓ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン又はＣ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は少なくとも一の遊離チオール基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｘｉｉ）−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン又はＣ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は少なくとも一の遊離チオール基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）］
から選択される、請求項６に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項８】
Ｌ２が、請求項６に記載の式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｚが、
ｉ）式Ｔ−［ＳＨ］ｍのキャリアから［−Ｚ−］ｍ−Ｔ−が誘導される−Ｓ−；
ｉｉ）−Ｓ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−（ここで、−Ｄ−ＮＨ−が少なくとも一の遊離アミノ基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である、）
ｉｉｉ）−Ｓ−Ｄ−ＣＯ−ＮＨ−（ここで、−Ｄ−ＣＯ−が少なくとも一の遊離カルボキシル基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）
ｉｖ）−Ｓ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｎ−は少なくとも一の遊離アミノ基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖ）Ｓ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は少なくとも一の遊離チオール基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）；
ｖｉ）−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−（ここで、−Ｄ−はＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレンであり、又は−Ｄ−Ｓ−は少なくとも一の遊離チオール基を持つ１から４のアミノ酸から構成されるペプチド残基である）
から選択されるものである、請求項６記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
式（Ｉ’ａ）又は（Ｉ’ｂ）：
2011528360.tif 000127
［上式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１及びＲ２は請求項４、６に記載の通り、Ｚは−ＮＨ−又は１から３のアミノ酸から構成されるペプチド残基であり、Ｑは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、フェニル又はベンジル基である］
のものである、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１０】
Ｌは式（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）
2011528360.tif 000128
［ここで、ｖとｋは独立して０又は１であり；又はＬが、式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）
2011528360.tif 000129
（ここでｎは２から５の整数である）
のものである、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
請求項３に記載の重合体のキャリアは、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びそのアナログ又は誘導体、デキストラン、ポリマー炭水化物及びそのアナログ又は誘導体；又はＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリアミド（ＨＰＭＡ）から誘導された合成コポリマーである。
【請求項１２】
請求項３に記載される抗体は、抗Ｔ細胞抗体Ｔ１０１ Ｒｏｙｓｔｏｎ、抗ＣＤ５抗体 ＯＫＴ１（Ｏｒｔｈｏ）ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０００、抗ＣＤ２０抗体ＩｇＧ１イブリツモマブ、抗ＣＤ３３抗体ｈｕＣＤ３３、抗トランスファーレセプター抗体ＯＫＴ９（Ｏｒｔｈｏ）ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０２１、抗メラノーマ抗体ＭＡｂ９．２．２７、抗ＣＥＡ１１１６ ＮＳ−３ｄ ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０１９、抗αフェトプロテインＯＭ ３−１．１ ＡＴＣＣ ＨＢ１３４、７９１Ｔ／３６ Ｅｍｂｌｅｔｏｎ、及びＢ７２．３、抗卵巣癌抗体ＯＶＢ３ ＡＴＣＣ ＨＢ９１４７、抗乳癌抗体、抗膀胱癌１Ｇ３．１０、抗ＣａｎＡｇ抗体ｈｕＣ２４２抗体、又は抗前立腺癌抗体ＭＬＮ５９１である。
【請求項１３】
請求項３に記載のペプチド又はタンパク質は、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−  ＡＬＰＨＡ、ＡＬＰＨＡ−ＭＳ、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）又はＭｃｍ２である。
【請求項１４】
請求項５に記載のキャリアＴ−［ＣＨＯ］ｍは、Ｆｃ部に優先的に位置し、化学的又は酵素的方法により選択的にアルデヒド基へと酸化される糖鎖部分を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体から誘導される。
【請求項１５】
式Ｉが［Ａｎｔ−Ｌ−Ｚ−］ｍ−Ｔであり、式（Ｉ’）がＡｎｔ−Ｌ−Ｚ−Ｑであり；
Ａｎｔが、式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）；
2011528360.tif 000130
であり、Ｌ、Ｚ、ｍ、Ｑ及びＴが、
2011528360.tif 000131
2011528360.tif 000132
の通りである化合物から選択される、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート。
【請求項１６】
２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド、
Ｎ−メチル−２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド、
Ｎ−ベンゾイル−２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド、
Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ６−｛［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセチル｝−Ｌ−リジン、
Ｎ−メチル−２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド、
２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド、
Ｎ−ベンゾイル−２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド、
Ｎ−アセチル−Ｓ−（１−｛６−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−６−オキソヘキシル｝−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）−Ｌ−システイン、
Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ６−（１−｛６−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−６−オキソヘキシル｝−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）−Ｌ−リジン、
Ｎ−アセチル−３−（｛３−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−３−オキソプロピル｝ジスルファニル）−Ｌ−アラニン
からなる群から選択される、請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩と薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含有する薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又は薬学的に許容可能な塩、又は請求項１７に記載の薬学的な構成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌又は細胞増殖疾患の治療方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載される癌が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌; 扁平細胞癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫からなる群から選択されるリンパ系統の造血系腫瘍；急性、慢性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、前骨髄球性白血病からなる群から選択される骨髄系統の造血性腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫からなる群から選択される間葉系起源の腫瘍；星状細胞腫、神経膠腫、シュワン細胞腫からなる群から選択される中枢及び末梢神経の腫瘍；メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌 又はカポジ肉腫から選択される。
【請求項２０】
請求項１８に記載される細胞性増殖疾患が、良性前立腺肥大症、家族性大腸ポリポーシス、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎及び手術後血管狭窄及び再狭窄からなる群から選択される。
【請求項２１】
式（ＩＩｃ）
2011528360.tif 000133
［上式中、Ａｎｔは
2011528360.tif 000134
（ここで、波線はＬへの結合を示す）
の構造式から選択され；
Ｌが、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、及び構造：
2011528360.tif 000135
（ここで、波線はＡｎｔ及びＺへの結合を示す）
から選択され、
Ｚが、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−及び構造式
2011528360.tif 000136
2011528360.tif 000137
から選択される任意スペーサーであり、
Ｘが、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ｐ−トルエンスルホン酸、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基であり；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又はＣ６−Ｃ２０アリールであり；
Ｒ１、Ｒ２は、アミノ酸側鎖から独立して選択され；
Ｚ１は、−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、
ｍが０又は１であり、ｎが１から６である］のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２２】
構造：
2011528360.tif 000138
（上式中、Ｚ−Ｘは
2011528360.tif 000139
から選択される）から選択される請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２３】
構造：
2011528360.tif 000140
を有する請求項２２に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２４】
構造：
2011528360.tif 000141
を有する請求項２２に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２５】
構造：
2011528360.tif 000142
を有する請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２６】
構造：
2011528360.tif 000143
を有する請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２７】
構造：
2011528360.tif 000144
（上式中、ＺはＣ１−Ｃ１２アルキレンである）
を有する請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。.
【請求項２８】
構造：
2011528360.tif 000145
を有する請求項２７に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項２９】
構造：
2011528360.tif 000146
を有する請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３０】
構造：
2011528360.tif 000147
を有する請求項２９に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３１】
構造：
2011528360.tif 000148
を有する請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３２】
構造：
2011528360.tif 000149
から選択される請求項２９に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３３】
Ｚ１が−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−である請求項３２に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３４】
構造：
2011528360.tif 000150
を有する請求項３２に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３５】
Ｒ１及びＲ２が、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンゾイル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジイルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、及び次の構造：
2011528360.tif 000151
から独立して選択される、請求項２１に記載のアントラサイクリン誘導体。
【請求項３６】
一又は複数のアントラサイクリン誘導体薬物部分ＤにリンカーＬ及び任意スペーサーＺによって共有的に結合された抗体を含む抗体−薬剤コンジュゲートであって、該化合物が、式（Ｉｃ）
2011528360.tif 000152
有し、又はその薬学的に許容可能な塩であり、ここで、
Ａｂが抗体であり；
Ｄが構造：
2011528360.tif 000153
（上式中、波線はＬへの結合を示す）
から選択されるアントラサイクリン誘導体であり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ１−Ｃ１２  アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８  アルケニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８  アルキニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、及び構造：
2011528360.tif 000154
（上式中、波線はＤ、Ｚへの結合を示す）
から選択されるリンカーであり；
Ｚは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ（Ｃ１−Ｃ１２  アルキレン）−、及び構造：
2011528360.tif 000155
から任意に選択されるスペンサーであり、：
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はＣ６−Ｃ２０アリールであり；
Ｒ１及びＲ２は、独立してアミノ酸側鎖から選択され；
Ｚ１が、−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、
ｍが０又は１であり；
ｎが１から６の整数である
抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３７】
Ｒ１及びＲ２が、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンゾイル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジイルメチル−、３−ピリジイルメチル−、４−ピリジイルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、及び次の構造：
2011528360.tif 000156
から独立して選択される、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３８】
スペーサーＺがパラ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）基を含む、請求項３６記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９】
リンカー−スペーサー単位Ｌ−Ｚがマレイミドカプロイル（ＭＣ）基を含む、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４０】
Ｚがバリン−シトルリン（ｖｃ）基を含む、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４１】
Ａｂが、（１）−（３６）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプター−タイプＩＢ）
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５）；
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺癌六回膜貫通型上皮抗原）；
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）；
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）；
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、ソリュートキャリアファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、タイプＩＩナトリウム−リン酸共輸送体３ｂ）；
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂＨｌｏｇ、セマドメイン、７トロンボスポンジンレセプター（タイプ１及びタイプ１様）、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）及びショート細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂＨｌｏｇ、セマドメイン、７トロンボスポンジンリピート（タイプ１及びタイプ１様）、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）及びショート細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、ハイポセティカルタンパク質ＦＬＪ２０３１５）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌癌関連タンパク質１、前立腺癌六回膜貫通型上皮抗原２、六回膜貫通型前立腺癌タンパク質）；
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、トランジェントレセプターポテンシャルカチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌腫由来増殖因子）；
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルスレセプター）又はＨｓ７３７９２）；
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９ｂ、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９）；
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカー型タンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；
（１７）ＨＥＲ２；
（１８）ＮＣＡ；
（１９）ＭＤＰ；
（２０）ＩＬ２０Ｒａ；
（２１）ブレビカン；
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ；
（２３）ＡＳＬＧ６５９；
（２４）ＰＳＣＡ；
（２５）ＧＥＤＡ；
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター、ＢＬｙＳレセプター３、ＢＲ３）；
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）；
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９ａ、免疫グロブリン関連α）；
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１）；
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（主要組織適合複合体クラスＩＩ分子βサブユニット（Ｉａ抗原））；
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン作動性レセプターＰ２Ｘリガンドゲートイオンチャネル５）；
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）；
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１）；
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２）；及び
（３６）ＴＥＮＢ２（推定膜貫通型プロテオグリカン）
から選択される一又は複数の腫瘍関連抗原又は細胞表面レセプターに結合する抗体である、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４２】
Ａｂが、システイン遺伝子操作抗体である、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４３】
ＡｂがＥｒｂＢレセプターに結合する抗体である、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４４】
Ａｂがトラスツズマブである請求項４３に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４５】
ｐが１、２、３又は４である、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４６】
抗体−薬剤コンジュゲート化合物の混合物を含み、ここで、抗体−薬剤コンジュゲート化合物の混合物中の抗体当たりの平均薬剤負荷は約２から５である、請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４７】
抗体−薬剤コンジュゲート化合物の混合物中の抗体当たりの平均薬剤負荷が約３から約４である、請求項４６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項４８】
請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項４９】
治療的有効量の化学療法剤を更に含む、請求項４８に記載の薬学的組成物
【請求項５０】
請求項４８に記載の薬学的組成物を患者へ投与することを含む癌治療方法。
【請求項５１】
患者に、抗体−薬剤コンジュゲート化合物と併用して、化学療法剤を投与される、請求項５０に記載の方法
【請求項５２】
哺乳動物における癌の治療のための医薬の製造における請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物の使用。
【請求項５３】
哺乳動物がヒトである請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
請求項３６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物；
容器物；及び
化合物を癌治療に使用し得ることを示すパッケージ挿入物又はラベル
を含む製造品。
【請求項５５】
抗体−薬剤コンジュゲート化合物を製造する方法において、
アントラサイクリン誘導体と抗体Ａｂを反応させて、抗体−薬剤コンジュゲート化合物を形成し、ここで、アントラサイクリン誘導体が式（ＩＩｃ）：
2011528360.tif 000157
［上式中、Ａｎｔは、構造：
2011528360.tif 000158
（ここで、破線はＬへの結合を示す）
から選択され、
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、及び構造：
2011528360.tif 000159
（ここで、破線はＡｎｔ及びＺへの結合を示す）から選択されるリンカーであり；
Ｚは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ（Ｃ１−Ｃ１２  アルキレン）−、及び構造：
2011528360.tif 000160
から選択される任意スペーサーであり、
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ｐ−トルエンスルホン酸、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルヂスルフィド、及びＮ−ヒドロキシサクシイミドから選択される活性官能基であり；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はＣ６ーＣ２０アリールであり；
Ｒ１及びＲ２はアミノ酸側鎖から独立して選択され；
Ｚ１は、−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、
ｍは０又は１であり、ｎは１から６である」
を有し；
抗体−薬剤コンジュゲート化合物が式Ｉｃ：
2011528360.tif 000161
（ここで、Abは抗体であり；ｐは１から８の整数である）
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
この非仮出願は、出典明示により全体が援用される２００８年７月１５日出願の米国仮出願第６１／０８０９４４号の米国特許法第１１９条第（ｅ）項の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、天然又は合成由来のタンパク質又はペプチドのようなキャリアとの治療的に有用なアントラサイクリンのコンジュゲート；その調製方法、それらを含む薬学的組成物及びある種の哺乳動物の腫瘍の治療におけるその使用に関する。本発明はまた新規なアントラサイクリン誘導体とその調製方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アントラサイクリンは細胞傷害活性を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンは、１）細胞のＤＮＡ中に薬剤分子を挿入せしめることによりＤＮＡ依存性核酸合成を阻害するか；２）薬剤によりフリーラジカルを生成せしめ、ついでこれを細胞性巨大分子と反応させて細胞に損傷を生じせしめるか、又は３）薬剤分子を細胞膜と相互作用させることを含む、多くの異なった機序によって細胞を死滅させるように作用しうることを研究は示している［例えば、C. Peterson等, ”Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia” Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R. Bachur、“Free Radical Damage”同上, pp.97-102を参照］。その細胞傷害性の潜在性のため、アントラサイクリンは、数多くの癌、例えば白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌及び肉腫の治療において使用されている［例えば、P.H-Wiernik, Anthracycline:Current Status And New Developments p 11］。よく使用されるアントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びダウノマイシンを含む。
【０００４】
近年、多くの新規な高度に細胞傷害性のアントラサイクリンが合成されている。例えば、糖部分のＣ−３’位に置換モルホリノ環が結合しているアントラサイクリン誘導体であるネモルビシンは、実験的マウス腫瘍に対して有望な抗腫瘍活性を示しており［J. W. Lown,  Bioactive Molecules (1988) vol 6:55-101を参照]、現在、肝細胞癌の治療のための臨床治験段階にある［C. Sessa、O. Valota、C. Geroni、Cardiovascular Toxicology (2007) 7(2):75-79を参照］。これらの化合物は、新生物及び選択された細胞集団が除去されることが求められる他の疾患状態の治療に有用である場合があるが、その治療効果は、その投与に伴う用量依存的毒性によってしばしば制約を受ける。
【０００５】
これらの化合物の治療効果を改善する試みは、アントラサイクリンを抗体又は様々なキャリアに結合させることによって試みられている。抗体にコンジュゲートさせられたアントラサイクリンの例は、例えばBristol Myersの欧州特許出願公開第０３２８１４７号、Farmitalia Carlo Erba の国際公開第 ９２０２２５５号又はPharmacia & Upjohnの米国特許第 ５７７６４５８号において報告されている。
【０００６】
高活性を特徴とする他の興味深い三環系モルホリノアントラサイクリン誘導体が、M. Caruso等の国際特許出願の国際公開第９８／０２４４６号（１９９７）に記載され、クレームされている。これらの誘導体のなかで、特に活性のある化合物は、Quintieri, L., Geroni, C.等 Clinical Cancer Research (2005) 11(4):1608-1617によって記載されているPNU-159682である。化合物PNU-159682はここで以下に記載の式 (IIA)を有し、次の化学名を有している：
５，１２−ネフタセンジオン，７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−［［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−オクタヒドロ−９−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ］−，（８Ｓ，１０Ｓ）−（９ＣＩ）；
５，１２−ネフタセンジオン，７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−［（オクタヒドロ−９−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル）オキシ］−，［１Ｓ−［１α，３β（８Ｒ＊，１０Ｒ＊），４ａβ，９α，９ａα，１０ａβ］］又は（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオン。
【０００７】
抗体療法は、癌、免疫及び血管新生疾患の患者のターゲット治療法に対して確立されている（Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357）。細胞毒性又は細胞分裂阻害剤、つまり癌の治療において腫瘍細胞を死滅させ又は阻害するための薬剤を局所的にデリバリーするためにの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、つまり免疫コンジュゲートの使用は、腫瘍への薬剤部分の送達とそこでの細胞内蓄積を標的とする一方、これらの非コンジュゲート薬剤の全身性投与は、正常な細胞と除去が求められる腫瘍細胞に許容できないレベルの毒性を生じせしめうる（Xie等(2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291；Kovtun等(2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121；Law等(2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337；Wu等(2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145；Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549；Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103；Payne、G. (2003) Cancer Cell 3:207-212；Trail等(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614）。最小の毒性で最大の効能が求められている。ＡＤＣを設計し精密にする努力は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の選択並びに薬剤の作用機序、薬剤結合、薬剤／抗体比（負荷）、及び薬剤放出特性に焦点が当てられている（McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.；Doronina等(2006) Bioconj. Chem. 17:114-124；Erickson等(2006) Cancer Res. 66(8):1-8；Sanderson等(2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852；Jeffrey等(2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358；Hamblett等(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070）。薬剤部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機序によってその細胞傷害又は細胞分裂抑制効果を付与しうる。ある細胞傷害性薬剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートされたときに不活性になるか又は活性が少なくなる傾向がある。
【０００８】
アントラサイクリンアナログであるドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)）は、挿入と、転写のためにＤＮＡをほどく酵素トポイソメラーゼＩＩの進行阻害によってＤＮＡと相互作用すると思われる。ドキソルビシンは、それが複製のためにＤＮＡ鎖を破壊した跡にトポイソメラーゼＩＩ複合体を安定にし、ＤＮＡ二重ヘリックスが再シールされることを防ぎ、それによって複製過程を停止させる。ドキソルビシン及びダウノルビシン（DAUNOMYCIN）はプロトタイプの細胞傷害性天然産物アントラサイクリン化学療法剤である（Sessa等(2007) Cardiovasc. Toxicol. 7:75-79）。ダウノルビシン及びドキソルビシンの免疫コンジュゲート及びプロドラッグが調製され、研究されている（Kratz等(2006) Current Med. Chem. 13:477-523；Jeffrey等(2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362；Torgov等(2005) Bioconj. Chem. 16:717-721；Nagy等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:829-834；Dubowchik等(2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532；King等(2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; US 6630579）。抗体−薬剤コンジュゲートＢＲ９６−ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原Lewis-Yと特異的に反応し、Ｉ相及びＩＩ相の治験で評価されている（Saleh等(2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292；Ajani等(2000) Cancer Jour. 6:78-81；Tolcher等(1999) J. Clin. Oncology 17:478-484)。
【０００９】
グリコシドアミノ基での環化によって形成されたドキソルビシンとダウノルビシンのモルホリノアナログは、より大きな効力を有している（Acton等(1984) J. Med. Chem. 638-645；米国特許第４４６４５２９号；同第４６７２０５７号；同第５３０４６８７号）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノに２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成アナログであり、臨床評価下にあり（Grandi等(1990) Cancer Treat. Rew. 17:133；Ripamonti等(1992) Brit. J. Cancer 65:703）、肝細胞癌に対するＩＩ／ＩＩＩ相治験を含む（Sun等(2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448；Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1版, Abs 4649；Pacciarini等(2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116)。
【００１０】
ネモルビシンは、（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−１０−（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−４−（（Ｓ）−２−メトキシモルホリノ）−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオンと命名され、ＣＡＳ登録番号第１０８８５２−９０−０号を有し、構造：
2011528360.tif 000002
を有している。
【００１１】
ＰＮＵ−１５９６８２を含む、肝臓ミクロソーム由来のネモルビシンの幾つかの代謝物（ＭＭＤＸ）が特徴付けられている（Quintieri等(2005) Clinical Cancer Research, 11(4):1608-1617；Beulz-Riche等(2001) Fundamental & Clinical Pharmacology, 15(6):373-378；欧州特許出願公開第０８８９８９８号；国際公開第２００４／０８２６８９号；国際公開第２００４／０８２５７９号）。ＰＮＵ−１５９６８２ はインビトロでネモルビシン及びドキソルビシンよりも顕著により細胞傷害性であり、インビボ腫瘍モデルで効果的であった。ＰＮＵ−１５９６８２（式ＩＩＡ）は３’−デアミノ−３’’，４’−アンヒドロ−［２’’（Ｓ）−メトキシ−３’’（Ｒ）−オキシ−４’’−モノフォリニル］ドキソルビシンと命名され、構造：
2011528360.tif 000003
を有している。
【００１２】
あるＰＮＵ−１５９６８２抗体−薬剤コンジュゲートが記載されている("NEMORUBICIN METABOLITE AND ANALOG ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND METHODS"、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１１９９、２００９年１月１６日出願）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一態様は、選択された細胞集団と反応性のモノクローナル又はポリクローナル抗体のようなキャリア、レセプター組織と反応性のタンパク質、ペプチド又は合成由来の他のキャリアとの新規なアントラサイクリン誘導体コンジュゲートを提供することである。
【００１４】
本発明の一態様は、キャリア、例えば選択された細胞集団と反応性のモノクローナル又はポリクローナル抗体、レセプター組織と反応性のタンパク質、ペプチド又は他の合成由来のキャリアとの新規なアントラサイクリン誘導体コンジュゲートを提供することである。
【００１５】
他の態様は、かかるコンジュゲート並びに有用な中間体の調製方法である。
【００１６】
本発明のコンジュゲートは、式（Ｉ）
2011528360.tif 000004
（上式中、
Ａｎｔはアントラサイクリン誘導体残基であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｚはスペーサーであり、
ｍは１から３０の整数であり、
Ｔは、タンパク質、ペプチド、モノクローナル又はポリクローナル抗体、又は［Ａｎｔ−Ｌ−Ｚ−］部分への結合に適したその化学的に修飾された誘導体から選択されるキャリア又はポリマーキャリアのようなキャリアであり；
Ａｎｔが表すアントラサイクリン誘導体残基は遊離して、式（ＩＩ）：
2011528360.tif 000005
（上記中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ又はメトキシ基及びＲ２はＣ１−Ｃ５アルコキシ基又はその化学的に許容可能な塩である）のアントラサイクリン誘導体を生じうることを特徴とする。
【００１７】
アントラサイクリン誘導体残基はリンカースペーサー[L-Z-]を介してキャリアに結合し、アントラサイクリン誘導体とリンカーアームの間の結合が、上記の式（ＩＩ）のアントラサイクリン誘導体つまり生理活性剤を遊離させるような生理学的条件下で切断されうる。
例えば、アントラサイクリン誘導体とリンカー間の結合が酸条件又は還元条件に感受性であるコンジュゲートは、細胞内、例えばリソソームベジクル中で典型的に遭遇する条件でアントラサイクリン誘導体を放出しうる。
【００１８】
本発明の好適な方法は、限定しないが、癌、例えば膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、及び皮膚癌、例えば扁平細胞癌；白血病を含むリンパ分化系列造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫；急性、慢性骨髄性白血病を含む骨髄分化系腫瘍、骨髄異形性症候群及び前骨髄球性白血病；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；星状細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢、末梢神経系の腫瘍；他の腫瘍、メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスを含む特定のタイプの癌を治療することにある。
【００１９】
本発明の他の好ましい方法は、特定の細胞増殖性疾患、例えば、前立腺肥大症、家族性大腸ポリポーシス、神経線維腫症、乾癬、アテローム動脈硬を伴う血管平滑細胞増殖関連、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎及び手術前狭窄及び再狭窄を治療することである。
【００２０】
式（Ｉ）のアントラサイクリン誘導体コンジュゲートは標準的な合成変換からなる方法によって調製することができ；そのような方法及びそのような方法で使用される中間体もまた本発明によって提供される。
【００２１】
本発明はまた式（Ｉ）のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩と薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤を含有する薬学的組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一態様は、式（ＩＩｃ）
2011528360.tif 000006
［上式中、Ａｎｔは、構造：
2011528360.tif 000007
から選択されるアントラサイクリン誘導体であり、
ここで、波線はリンカーＬへの結合を示し；Ｚは任意成分のスペーサーであり；ｍは０又は１であり；Ｘは反応性官能基であり；ｎは１から６の整数である］
のアントラサイクリン誘導体である。
【００２３】
本発明の一態様は、リンカーＬ及び任意成分のスペーサーＺによって一又は複数のアントラサイクリン誘導体薬剤部分Ｄに共有的に結合された抗体を含み、式（Ｉｃ）
2011528360.tif 000008
を有する抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、ここで、ｐは１から８の整数である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１はｐＨ５．２での表１に示す化合物２の安定性をグラフの形で示し、（Ｙ）軸は、以下に定義される式（ＩＩＡ）の化合物のパーセント量であり、（Ｘ）軸は時間（ｈｒ）である。このグラフは、酸性ｐＨでのコンジュゲートからの式（ＩＩＡ）の遊離化合物の放出増加によって示されるように本発明のアセタール結合の酸感受性を証明している。
【図２】図２は、式ＩＩのアントラサイクリン誘導体をビニルエーテル化合物（Ｘ）又は（ＩＸ）と反応させてアセタール化合物（ＸＩ）を生じさせ、カルボキシ化合物（ＸＩＩ）に加水分解し、活性化させてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＸＩＩＩ）を形成させ、キャリア化合物とのコンジュゲーションの準備を整えることによって式Ｉａの化合物を調製する例示的な方法を示す。
【図３ａ】図３ａは、活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＸＩＩＩ）をアミノ−チオール試薬（ＸＸＩ）と反応させてＸＸＩＩを得、これをピリジイル−ジスルフィドキャリア（Ｔ）中間体（ＶＩ）と反応させてジスルフィド結合アントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉａ）を得、又はマレイミドキャリア（Ｔ）中間体（ＸＸＩＩ）と反応させて、マレイミド結合アントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉａ）を得ることによって式Ｉａの化合物を調製する例示的な方法を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＸＩＩＩ）をアミノ−エステル試薬（ＸＶＩＩＩ）と反応させ、ついでエステル加水分解によってカルボキシアントラサイクリン誘導体（ＸＩＸ）を得、これを、ＮＨＳエステルとして活性化させ、アミノキャリアＴ中間体、例えば抗体とカップリングさせて、アミド結合アントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉａ）．を得ることによって式Ｉａの化合物を調製する例示的な方法を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＸＩＩＩ）を例えば抗体のようなキャリアＴ（ＸＩＶ）のアミノ又はチオール基と反応させて、アミド又はチオアミド結合アントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉａ）を得ることによって式Ｉａの化合物を調製する例示的な方法を示す。
【図４】図４は、アントラサイクリン誘導体（ＩＩ）をアシルヒドラジド誘導体（ＸＸＶ）と反応させてヒドラゾン（ＸＸＶＩ）を得た後、キャリアＴ試薬とコンジュゲートさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る例示的な方法を示す。
【図５ａ】図５ａは、（２ａ）アントラサイクリン誘導体ヒドラゾン（ＸＸＶＩ）をチオール−又はアミノ−キャリアＴ化合物（ＸＩＶ）と反応させてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る；（２ｂ）アントラサイクリン誘導体ヒドラゾン（ＸＸＶＩ）を試薬（ＸＸＶＩＩ）と反応させ、（ＸＸＶＩＩＩ）に脱保護し、カルボキシル−キャリアＴ化合物（ＸＶＩＩ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る；及び（２ｄ）脱保護された（ＸＸＶＩＩＩ）をアルデヒド−キャリアＴ化合物（ＸＸ）と縮合させてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、例示的な方法を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、（２ｃ）アントラサイクリン誘導体ヒドラゾン（ＸＸＶＩ）を試薬（ＸＸＩＸ）と反応させた後、脱保護し、アミノ−キャリアＴ化合物とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、例示的な方法を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、（２ｅ）アントラサイクリン誘導体ヒドラゾン（ＸＸＶＩ）を試薬（ＸＸＸＩ）と反応させて（ＸＸＸＩＩ）を得る、及び（２ｅ”）ピリジイルジスルフィドキャリア化合物（ＶＩ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、及び（２ｅ’）（ＸＸＸＩＩ）をマレイミドキャリア化合物（Ｖ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、例示的な方法を示す。
【図６】図６は、アントラサイクリン誘導体（ＩＩ）をアシルヒドラジド、ピリジイルジスルフィド（ＸＸＸＩＩＩ）と反応させてピリジイルジスルフィドヒドラゾン（ＸＸＸＩＶ）を得、ついでキャリアＴ試薬とコンジュゲートさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る例示的な方法を示す。
【図７ａ】図７ａは、（３ａ）アントラサイクリン誘導体（ＸＸＸＩＶ）をチオール−キャリア（ＸＩＶ）と反応させてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る；（３ｂ）アントラサイクリン誘導体（ＸＸＸＩＶ）をチオール化合物（ＸＸＸＶ）と反応させてアミンジスルフィド化合物（ＸＸＸＶＩ）を得、これをカルボキシル−キャリアＴ試薬とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る；及び（３ｄ）脱保護された（ＸＸＸＶＩ）をアルデヒド−キャリアＴ化合物（ＸＸ）と縮合させてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、例示的な方法を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、（３ｃ）アントラサイクリン誘導体（ＸＸＸＩＶ）をチオールエステル（ＸＸＸＶＩＩ）と反応させ、ついで脱保護してカルボキシルジスルフィド化合物（ＸＸＸＶＩＩＩ）を得、アミノ−キャリアＴ（ＸＩＶ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る例示的な方法を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、（３ｅ）アントラサイクリン誘導体（ＸＸＸＩＶ）をチオール試薬（ＸＸＸＩＸ）と反応させてジスルフィドチオール（ＸＬ）を得る、（３ｅ’）ジスルフィドチオール（ＸＬ）をピリジイルジスルフィドキャリア化合物（ＶＩ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る；及びジスルフィドチオール（ＸＬ）をマレイミドキャリア化合物（Ｖ）とカップリングさせてアントラサイクリン誘導体コンジュゲート（Ｉｂ）を得る、例示的な方法を示す。
【図７ｄ】図７ｄは、薬剤−リンカー中間体Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−｛［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］｝ピペラジン−１−イル）］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド５５への合成経路を示す。
【図８】図８は、遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２及びチオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３のｎＭ濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図９】図９は、遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２及びチオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３のｎＭ濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１０】図１０は、遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２及びチオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３のｎＭ濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１１】図１１は、遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２及びチオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３のｎＭ濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＤｏｘＲｅｓ Ｈｅｒ２細胞株はまた「ＡｄｒＲｅｓ Ｈｅｒ２」としても知られている。
【図１２】図１２は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。（重鎖抗体はＫａｂａｔ番号付けスキームによる）
【図１３】図１３は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１４】図１４は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣＡ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣＡ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１５】図１５は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣＡ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣＡ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１６】図１６は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１７】図１７は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１８】図１８は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図１９】図１９は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２０】図２０は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度（μｇ／ｍｌ）に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２１】図２１は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２２】図２２は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２３】図２３は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２４】図２４は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１１０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２５】図２５は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２６】図２６は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２７】図２７は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２８】図２８は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図２９】図２９は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤、全てに加えてベラパミルの濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【図３０】図３０は、（１）ビヒクル、（２）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１１ １ｍｇ／ｋｇ、（３）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ １ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ５ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３ １ｍｇ／ｋｇ、（８）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８ １ｍｇ／ｋｇ、（９）ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤８．７７ｕｇ／ｋｇ（２６ｕｇ／ｍ２暴露）で、１ｍｇ／ｋｇの抗体−薬剤コンジュゲートの薬剤用量に適合させたもので０日目に単一の静脈内（ｉｖ）投薬後のＣＢ１７ＳＣＩＤマウス中に播種したバーキットリンパ腫Ｂｊａｂ−ｌｕｃ異種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。
【図３１】図３１は、（１）ビヒクル、（２）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ ５／ｍｇ／ｋｇ、（３）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ １０ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ １０ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ５ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １０ｍｇ／ｋｇ、（８）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ ５ｍｇ／ｋｇ＋チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇで０日目に単一のｉｖ投薬後のＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウス中に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５乳腺同種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。
【図３２】図３２は、（１）ビヒクル、（２）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１２ １ｍｇ／ｋｇ、（３）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１２ ３ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ １ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ ３ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ ６ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １ｍｇ／ｋｇ、（８）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ３ｍｇ／ｋｇ、（９）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ６ｍｇ／ｋｇで０日目に単一のｉｖ投薬後の雄のＳＣＩＤ−ベージュマウス中に播種したＬｎＣａｐ−Ｎｅｒ異種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のある実施態様を詳細に参照するが、その例を添付の構造及び式で例証する。本発明を列挙する実施態様に関連して説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことは理解されよう。それどころか、本発明は特許請求の範囲によって定まる本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替例、変形例、及び均等物を包含することが意図される。当業者であれば、本発明の実施において使用されうるここに記載のものと同様な又は均等な多くの方法及び材料が分かるであろう。本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。特に別に定義しない限り、ここで使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、例えば、Singleton等, (1994) Dictionary of Microbiology及びMolecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons, New York, NY；及びJaneway、C.、Travers、P.、Walport、M., Shlomchik (2001) Immuno Biology、第5版, Garland Publishing、New Yorkに従っている。
【００２６】
定義
別の定義をしない限り、ここで使用される次の用語と語句は次の意味を有しているものである。
商品名がここで使用される場合、本出願人は商品名の製品製剤、ジェネリック薬剤、商品名の製品の活性な薬学的成分を独立に含むものである。
【００２７】
「アントラサイクリン誘導体」は、限定しないがＰＮＵ−１５９６８２を含むネモルビシン代謝物、又はアナログ化合物である。
「アントラサイクリン誘導体コンジュゲート」は、抗体、タンパク質又はペプチドを含むキャリア部分にリンカーを介して共有的に結合されたアントラサイクリン誘導体からなる化合物である。アントラサイクリン誘導体コンジュゲート化合物は、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物を含む。
【００２８】
「アミノ酸側鎖」なる用語は、（ｉ）天然に生じるアミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン；（ｉｉ）少ないアミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、β−アミノ酸、天然に生じるアミノ酸の合成アナログ及び誘導体；及び（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的にリッチにされ、同位体で標識され（例えば２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態、及びそのラセミ混合物に見出される基を含む。
【００２９】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含する(Miller 等(2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861)。抗体はマウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来であり得る。抗体は特定の抗原を認識し結合することができる免疫系によって産生されるタンパク質である。(Janeway,C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5版, Garland Publishing, New York)。標的抗原は、一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる多くの結合部位を有している。異なったエピトープに特異的に結合する各抗体は異なった構造を有している。よって、一つの抗原は一を越える対応の抗体を有しうる。抗体は、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり、対象の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、かかる標的は、限定しないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブラスでありうる。免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ由来を含む任意の種から誘導されうる。
【００３０】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には、その抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ、線状抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原、単鎖抗体分子に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３１】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる可能な天然に生じる変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等(1975), Nature, 256:495に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる（米国特許第４８１６５６７号を参照）。またモノクローナル抗体は、例えば、Clackson等(1991), Nature, 352：624-628；Marks等(1991), J. Mol. biol. 222: 581-597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３２】
ここでモノクローナル抗体は、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである「キメラ」抗体を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)。キメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル又は類人猿）由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ」抗体を含む。
【００３３】
「インタクトな」抗体は、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなるものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味する一又は複数の「エフェクター機能」を有しうる。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；Ｂ細胞レセプター及びＢＣＲのような細胞表面レセプターのダウンレギュレーションを含む。
【００３４】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体には異なったクラスがあてがわれうる。インタクトな抗体の５つの主要なクラス；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に更に分割されうる。抗体の異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び三次元立体構造はよく知られている。
【００３５】
「ＥｒｂＢレセプター」は、細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターであるＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼである。ＥｒｂＢレセプターファミリーは、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢ１，ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの区別されるメンバーを含む。ＥｒｂＢレセプターは一般に、ＥｒｂＢリガンドと結合しうる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうる幾つかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＥｒｂＢレセプターは「天然配列」ＥｒｂＢレセプター又はその「アミノ酸配列変異体」でありうる。ＥｒｂＢレセプターは天然配列ヒトＥｒｂＢレセプターでありうる。従って、「ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー」は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又は現在知られており又は将来同定されることになる任意の他のＥｒｂＢレセプターである。配列同一性スクリーニングにより２つの他のＥｒｂＢレセプターファミリーメンバーが得られた；ＥｒｂＢ３（米国特許第５１８３８８４号；同第５４８０９６８号；Kraus等(1989) PNAS (USA) 86:9193-9197）及びＥｒｂＢ４（欧州特許出願公開第５９９２７４号；Plowman等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:1746-1750；及びPlowman等(1993) Nature 366:473-475）。これらのレセプターの双方共少なくとも幾つかの乳癌細胞株で発現増加を示す。抗ＥｒｂＢ２抗体は特徴付けられている（米国特許５６７７１７１；米国特許５８２１３３７；米国特許６０５４２９７；米国特許６１６５４６４；米国特許６４０７２１３；米国特許６７１９９７１；米国特許６８００７３８； Fendly等(1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts等 (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup等(1991) Growth Regulation 1:72-82；Shepard等 J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar等(1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis等(1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras等(1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta等(1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski等(1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott等(1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza等Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis等(1996) Cancer Research 56:1457-1465; 及びSchaefer等(1997) Oncogene 15:1385-1394。
【００３６】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる（Jones等(1986) Nature、321:522-525；Riechmann等 (1988) Nature 332:323-329；及びPresta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596）。ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体は、出典明示によりここに援用される米国特許第５８２１３３７号の表３に記載されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ハーセプチン、トラスツズマブ）；ヒト化５２０Ｃ９（国際公開第９３／２１３１９号）及びヒト化２Ｃ４抗体を含む。
【００３７】
「治療する」及び「治療」なる用語は、治癒的処置と、目的が例えば癌の発症又は広がりのような望まれない生理学的変化又は疾患を防止し又は遅延させる（少なくする）ことである予防的又は防止的手段の双方を意味する。この発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、限定するものではないが、検出可能であれ検出不可能であれ、徴候の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化（つまり悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解（部分的又は完全）を含む。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して生存を延長することを意味しうる。治療を必要とする者は、既に症状又は疾患を持つ者並びに症状又は疾患になりやすい者又は症状又は疾患が防止される者を含む。
【００３８】
「疾患」とは、本発明の治療の恩恵を受け得る任意の状態である。これには、哺乳動物にとって問題になっている疾患の素因となる病理学的な状態を含む、慢性及び急性疾患又は疾病を含む。ここで治療される疾患の非限定的な例は、良性及び悪性の腫瘍；白血病及びリンパ系悪性腫瘍、特に乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸、甲状腺癌、膵臓癌、立腺癌又は膀胱癌、ニューロン、グリア、アストロサイト、視床下部及び他の腺性、マクロファージ、上皮、ストローマ、胞胚腔、炎症性、血管新生及び免疫疾患を含む。本発明に従って治療される例示的疾患は固形の悪性腫瘍である。
【００３９】
「治療的に有効な量」なる語句は、哺乳動物における疾病又は疾患を治療するのに有効な薬剤の量を意味する。癌の場合、薬剤の治療的に有効な量は、（ｉ）癌細胞の数を減少させ；（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させ；（ｉｉｉ）周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し、遅延させ、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害し；及び／又は（ｖｉ）癌に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。薬剤が増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性でありうる。動物モデルでは、効能は、ＡＤＣの投与後の過程中における腫瘍の物理的測定と、腫瘍の部分的及び完全な寛解の決定によって評価されうる。癌治療では、効能は、例えば無増悪期間（ＴＴＰ）を評価し、及び／又は奏功率（ＲＲ）を決定することにより測定することができる。
【００４０】
「生物学的利用能」なる用語は患者に投与される薬剤の所定の量の全身性利用率（つまり、血液／血漿レベル）を意味する。生物学的利用能は、投与された投薬形態から全身循環に達する時間（速度）及び薬剤の全量（度合い）の双方を示す絶対的用語である。
【００４１】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。「腫瘍」は一又は複数の癌細胞を含む。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma))、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、例えば胃腸癌、消化管間葉性腫瘍(GIST)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌を含む。
【００４２】
「ＥｒｂＢ発現癌」はその細胞表面に存在するＥｒｂＢタンパク質を有する細胞を含むものである。「ＥｒｂＢ２発現癌」は、その細胞表面に十分なレベルのＥｒｂＢ２を産生するものであり、抗ＥｒｂＢ２抗体がそれに結合し得、癌に対して治療効果を奏する。
【００４３】
レセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の非癌細胞と比較して、その細胞表面に有意に高いレベルのＥｒｂＢ２のようなレセプターを有しているものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされうる。レセプター過剰発現は、細胞の表面のレセプタータンパク質の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる(例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる)。あるいは、又は加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；国際公開第98/45479号参照)、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)を介して、細胞中のレセプターコード化核酸のレベルを測定してもよい。レセプターリガンドの過剰発現は、例えば、腫瘍バイオプシーで、又はＩＨＣ，ＦＩＳＨ、サザンブロット法、ＰＣＲ又は前記のインビボアッセイのような様々な診断アッセイにより、患者におけるリガンド（又はそれをコードする核酸）のレベルを評価することによって診断的に決定してもよい。また、血清のような生体液中の脱落抗原(例えば、ＥｒｂＢ細胞外ドメイン)を測定することにより(例えば、米国特許第4933294号；国際公開第91/15264号；米国特許第5401638号；及びSias等(1990), J. Immunol. Methods 132: 73-80）、レセプター過剰発現を研究することもできる。上記アッセイの他に、様々な他のインビボアッセイが技術熟練者には利用できる。例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位体で場合によっては標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射性の外部からのスキャンニングにより、又は抗体に先に暴露された患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価されうる。
【００４４】
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞の破壊を生じせしめる物質を意味する。該用語は、放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び毒素、例えばその合成アナログ及び誘導体を含む、小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むことが意図されている。
【００４５】
「化学療法剤」は、作用機序に関わりなく、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤のクラスは、限定しないが、アルキル化剤、代謝拮抗薬、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼインヒビター、抗体、腫瘍親和性感光色素、及びキナーゼ阻害剤を含む。化学療法剤は、「標的療法」及び一般的な化学療法で使用される化合物を含む。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡＲ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ，Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲＲ，Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン，ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬＲ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７、９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲＲ，ＴＥＭＯＤＡＬＲ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸＲ，ＩＳＴＵＢＡＬＲ，ＶＡＬＯＤＥＸＲ）、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮＲ）、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ、及びラパマイシンが含まれる。
【００４６】
化学療法剤の更なる例は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標），ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、国際公開２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸＲ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィニチブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（クレモフォア・フリー）、パクリタキセルのアルブミン遺伝子操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡＲ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスアミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標），ＮＥＯＳＡ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレデパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミン；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎ）（特に、ブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（例えば合成アナログのトポテカン）；ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；ドゥオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログのＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）であり、特に、カリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６））；ディネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、例えばディネマイシンＡ；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルチノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例え���、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、葉酸；アセグラトン；アルドホスファミド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフオルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（例えば、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ））；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ Ａ）及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ(登録商標)（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを含まない）、パクリタキセルのアルブミン処理されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトザントロン；ビンクリスチ���；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；並びに上記の任意のものの薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体が挙げられる。
【００４７】
「化学療法剤」の定義にまた含まれるものは、（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）；クエン酸タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミファイン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）））；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害する、アロマターゼインヒビター、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ））、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；（ｉｉｉ）抗男性ホルモン、例えば、フルタミド、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ））；（ｉｖ）プロテインキナーゼインヒビター、例えばＭＥＫインヒビター（国際公開第２００７／０４４５１５号）；（ｖ）脂質キナーゼインヒビター；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ及びＨ−Ｒａｓ、例えばオブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標），Ｇｅｎｔａ社）；（ｖｉｉ）リボザイム、例えば、ＶＥＧＦインヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））及びＨＥＲ２発現インヒビター；（ｖｉｉｉ）ワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；トポイソメラーゼ１インヒビター、例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｉｘ）抗脈管形成剤、例えばベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），ジェネンテック）；及び上記のものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体である。
【００４８】
「化学療法剤」の定義にまた含まれるものは、治療用抗体、例えばアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），ジェネンテック）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標），Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標），Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標），ジェネンテック／バイオジェン社）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）、２Ｃ４，ジェネンテック）、トラスツズマブ（ハーセプチン、ジェネンテック）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬剤コンジュゲート、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧＲ，Ｗｙｅｔｈ）である。
【００４９】
本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤と併用される化学療法剤として治療上の潜在性を有するヒト化モノクローナル抗体は、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌバビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、トクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、及びビシリズマブを含む。
【００５０】
「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販用パッケージに通常含まれる指示書を意味するために使用される。
【００５１】
「アルキル」はノルマル、第二級、第三級又は環状炭素原子を含むＣ１−Ｃ８炭化水素である。アルキル基の例は、限定しないが、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３を含む。
【００５２】
ここで使用される「アルキレン」なる用語は、１から１２の炭素原子（Ｃ１−Ｃ１２）の飽和した直鎖又は分岐鎖二価炭化水素基を意味し、ここで、アルキレン基は以下に記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい。他の実施態様では、アルキレン基は１から８の炭素原子（Ｃ１−Ｃ８）、又は１から６の炭素原子（Ｃ１−Ｃ６）である。アルキレン基の例は、限定しないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピエン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）等を含む。
【００５３】
「アルケニル」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する２から８の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖状又は分枝鎖状の一価炭化水素を意味し、ここで、アルケニル基はここに記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、又は「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を含む。例には、限定されないが、エチレニル又はビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）等が含まれる。
【００５４】
「アルケニレン」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する２から８の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖状又は分枝鎖状の二価炭化水素を意味し、ここで、アルケニル基は置換されていてもよく、「シス」及び「トランス」配向、又は「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を含む。例には、限定されないが、エチレニレン又はビニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−）等が含まれる。
【００５５】
「アルキニル」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する２から８の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖の一価炭化水素基を意味し、ここで、アルキニル基は場合によってはここに記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい。限定しないが、例にはエチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロピニル（プロパルギル、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）等が含まれる。
【００５６】
「アルキニレン」なる用語は、少なくとも一の不飽和部位、つまり炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する２から８の炭素原子（Ｃ２−Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖の二価炭化水素基を意味し、ここで、アルキニル基は場合によっては置換されていてもよい。限定しないが、例にはエチニレン（−Ｃ≡ＣＨ−）、プロピニレン（プロパルギレン、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ−）等が含まれる。
【００５７】
「炭素環」、「カルボシクリル」、「炭素環式環」及び「シクロアルキル」という用語は、単環として３から１２の炭素原子（Ｃ３−Ｃ１２）を単環式環として、又は７から１２の炭素原子を二環式環として有する一価の非芳香族の飽和又は部分的に不飽和の環を意味する。７から１２の原子を有する二環式炭素環は、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］又は［６，６］系として配置され得、９又は１０の環原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］又は［６，６］系として、又はビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン及びビシクロ［３．２．２］ノナンのような架橋系として配置され得る。単環式炭素環の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル等々が含まれる。
【００５８】
「アリール」は、親芳香族環系の単一炭素原子から一つの水素原子を取り除くことによって誘導される６−２０の炭素原子(C6-C20)の一価芳香族炭化水素基を意味する。幾つかのアリール基は「Ａｒ」として例示構造において表される。アリールは飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環に縮合した芳香族環を含む二環式基を含む。典型的なアリール基には、限定されないが、ベンゼンから誘導された基（フェニル）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等々が含まれる。アリール基はここに記載された一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい。
【００５９】
「アリーレン」は、親芳香族環系の二つの炭素原子から二つの水素原子を取り除くことによって誘導される６−２０の炭素原子(C6-C20)の二価芳香族炭化水素基を意味する。幾つかのアリール基は「Ａｒ」として例示構造において表される。アリールは飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環に縮合した芳香族環を含む二環式基を含む。典型的なアリーレン基には、限定されないが、ベンゼンから誘導された基（フェニレン）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニレン、インデニレン、インダニレン、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等々が含まれる。アリーレン基は置換基で置換されていてもよい。
【００６０】
「複素環」、「ヘテロシクリル」及び「複素環式環」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、少なくとも一の環原子が、窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子がＣであり、一又は複数の環原子は以下に記載の一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい、３から２０の環原子の飽和又は部分的不飽和（つまり、環内に一又は複数の二重及び／又は三重結合を有する）炭素環式基を意味する。複素環は、３から７の環員（２から６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１から４のヘテロ原子）を有する単環、又は７から１０の環員（４から９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１から６のヘテロ原子）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、又は［６，６］系でありうる。複素環はPaquette, Leo A.;"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に１、３、４、６、７、及び９章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs"(John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)、特に１３、１４、１６、１９、及び２８巻；及びJ. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載されている。「ヘテロシクリル」はまた複素環基に飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環又は複素環式環が縮合した基を含む。複素環式環の例には、限定されないが、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、及びアザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリルキノジリニル及びＮ−ピリジルウレアが含まれる。スピロ部分がまたこの定義の範囲内に含まれる。２つの環原子がオキソ（＝Ｏ）部分で置換されている複素環基の例はピリミジノイル及び１，１−ジオキソ−チオモルホリニルである。ここでの複素環基はここに記載された一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい。
【００６１】
「ヘテロアリール」なる用語は、５員、６員又は７員環の一価芳香族基を意味し、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される一又は複数のヘテロ原子を含む５−２０原子の縮合環系（少なくとも一が芳香族）を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル（例えば２−ヒドロキシピリジニルを含む）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば４−ヒドロキシピリミジニルを含む）、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シノリニル、インダゾリニル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基はここに記載された一又は複数の置換基で独立して置換されていてもよい。
【００６２】
複素環基又はヘテロアリール基は、可能である場合、炭素で結合（炭素結合）しても窒素で結合（窒素結合）してもよい。例えば、限定ではなく、炭素結合した複素環又はヘテロアリールは、ピリジンの２位、３位、４位、５位、又は６位、ピリダジンの３位、４位、５位、又は６、ピリミジンの２位、４位、５位、又は６、ピラジンの２位、３位、５位、又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールのの２位、３位、４位、又は５位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの２位、４位、又は５位、イソオキサゾール、ピラゾール、又はイソチアゾールの３位、４位、又は５位、アジリジンの２位又は３位、アゼチジンの２位、３位、又は４位、キノリンの２位、３位、４位、５位、６位、７位、又は８位、あるいはイソキノリンの１位、３位、４位、５位、６位、７位、又は８位で結合する。
【００６３】
例えば、限定ではなく、窒素が結合した複素環又はヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ−カルボリンの９位で結合する。
【００６４】
「リンカー」又は「リンク」は、抗体を薬剤部分に共有的に結合させる共有結合又は原子鎖を含む二価の化学的部分を意味する。式Ｉの様々な実施態様では、リンカーはＬと特定されている。
【００６５】
「キラル」なる用語は、鏡像対に重ね合わせできない特性を有する分子を意味する一方、「アキラル」なる用語は、その鏡像対に重ね合わせ可能である分子を意味する。
【００６６】
「立体異性体」なる用語は、同一の化学的構成を有しているが、空間における原子又は基の配置に関しては異なっている化合物を意味する。
【００６７】
「ジアステレオマー」は、二以上のキラル中心を有し、その分子が互いの鏡像ではない立体異性体を意味する。ジアステレオマーは、異なった物理的特性、例えば融点、沸点、スペクトル特性、及び反応性を有している。ジアステレオマーの混合物は、例えば電気泳動及びクロマトグラフィーのような高分解能分析手順下で分離しうる。
【００６８】
「エナンチオマー」は互いに重ねることができない鏡像である化合物の二つの立体異性体を意味する。
【００６９】
ここで使用される立体化学の定義及び慣習は一般にS. P. Parker編, McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及びEliel, E.及びWilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物は光学的に活性な形態で存在する、つまり、それらは直線偏光の面を回転させる能力を有している。光学的に活性な化合物を記述する場合、接頭辞Ｄ及びＬ、又はＲ及びＳは、そのキラル中心の回りの分子の絶対配置を示すために使用される。接頭辞ｄ及びｌ又は(＋)及び(−)は化合物による直線偏光の回転の符号を示すために使用され、(−)又はｌは化合物が左旋性であることを意味する。(＋)又はｄの接頭辞の化合物は右旋性である。所定の化学構造に対して、これらの立体異性体は、それらが互いに鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体は、エナンチオマーとも称されることがあり、そのような異性体の混合物はしばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物はラセミ混合物又はラセミ体と呼ばれ、化学反応又はプロセスに立体選択又は立体特異性がなかった場合に生じうる。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」なる用語は、光学活性を欠いている２つのエナンチオマー種の等モル混合物を意味する。
【００７０】
ここで使用される「薬学的に許容可能な塩」なる語句は、ＡＤＣの薬学的に許容可能な有機又は無機塩を意味する。例示的な塩には、限定されるものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸ホスフェート、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸シトレート、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（つまり、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、アセテートイオン、スクシネートイオン又は他の対イオンのような他の分子を含みうる。対イオンは親化合物上の電荷を安定化する任意の有機又は無機部分でありうる。更に、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に一を越える荷電原子を有しうる。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である場合は、複数の対イオンを有しうる。よって、薬学的に許容可能な塩は一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有しうる。
【００７１】
「薬学的に許容可能な溶媒和物」は一又は複数の溶媒分子とＡＤＣの結合体を意味する。薬学的に許容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例には、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが含まれる。
【００７２】
アントラサイクリン誘導体及びアントラサイクリン誘導体コンジュゲート
上に述べたように、第一の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
2011528360.tif 000009
（上式中、Ａｎｔ、Ｌ、Ｚ、ｍ及びＴは上に記載の通りである）のアントラサイクリン誘導体のコンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩に関する。
【００７３】
第二の態様では、式（Ｉ’）
2011528360.tif 000010
（上式中、Ａｎｔ、Ｌ及びＺが上に記載の通りであり、Ｑが水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、フェニル又はベンゾイル基である）
のアントラサイクリン誘導体又はその薬学的な塩が提供される。
【００７４】
好ましくは、Ａｎｔが表すアントラサイクリン誘導体残基は遊離されて、式（ＩＩＡ）：
2011528360.tif 000011
のアントラサイクリン誘導体を生じうる。
【００７５】
他の好ましい態様では、本発明は、式（Ｉａ）：
2011528360.tif 000012
（ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｚ、ｍ及びＴは上に記載の通りであり、Ｌ１は、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
2011528360.tif 000013
（上式中、Ｂはヘテロが介在されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキレン部分であり、ｖ、ｊ、ｋ及びｙは独立して０又は１である）のリンカーである］
のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的な塩を提供する。
【００７６】
この例では、Ａｎｔが表すアントラサイクリン誘導体残基は、アントラサイクリン骨格のＣ１４の１級アルコールを含むアセタール結合を介するリンカーＬ１へのテザーであることは明らかである。
【００７７】
上述のように、式（Ｉ）のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的な塩は、式（Ｉａ）
2011528360.tif 000014
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｚ、ｍ及びＴは上に記載の通りである）
の好ましいコンジュゲートに対して以下に示すように、所望される遊離のアントラサイクリン誘導体を放出する。
【００７８】
好ましくは、Ｚはスペーサー基、例えば
ａ）−ＮＨ−、
ｂ）−Ｓ−、
ｃ）アミノアルキレン、チオアルキレン、アミノシクロアルキレン又はチオシクロアルキレンで更なるチオール又はアミノ基又はカルボキシル残基を担持するもの、
ｄ）例えばアミド結合、ジスルフィド結合のような新規な結合を形成することによって、Ｌ１リンカーをＴキャリアに結合させることができるペプチド残基
である。
【００７９】
Ｔは、腫瘍関連抗原に結合可能な抗原結合部位を含むポリクローナル抗体、又はその断片；腫瘍細胞集団上に優先的に又は選択的に発現された抗原に結合可能な抗原結合部位を含むモノクローナル抗体、又はその断片；腫瘍細胞に優先的に又は選択的に場合によっては結合可能なペプチド又はタンパク質；又は［Ａｎｔ−Ｌ１−Ｚ−］部分（複数も含む）への結合に適した化学的に修飾された誘導体、又はポリマーキャリアから好ましくは選択される。
【００８０】
式（Ｉａ）の特に好ましい化合物は、Ｚが表すスペーサー基が、
ｉ）−ＮＨ−、つまり、［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから誘導され、ここでｍが上に記載の通りであるもの；
ｉｉ）−Ｓ−、つまり、［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式Ｔ−［ＳＨ］ｍのキャリアから誘導され、ここでｍが上に記載の通りであるもの；
ｉｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−、ここで−Ｄ−がＣ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン、又は−Ｄ−ＮＨ−が少なくとも一つの遊離アミノ基を有する１から４のアミノ酸から構成されているペプチド残基、つまり［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍのキャリアから誘導され、ｍが上に記載の通りであるもの；
ｉｖ）−ＮＨ−Ｄ−ＣＯ−ＮＨ−、ここで、−Ｄ−が上に記載の通りであり、又は−Ｄ−ＣＯ−が、少なくとも一つの遊離カルボキシル基を有する１から４のアミノ酸から構成されているペプチド残基、つまり、［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式Ｔ−［ＮＨ２］ｍのキャリアから誘導され、ｍが上に記載の通りであるもの；
ｖ）−ＮＨ−Ｄ−Ｎ＝ＣＨ−、ここで−Ｄ−が上に記載の通りであり、また−Ｄ−Ｎ−が−Ｄ−ＮＨについて上に記載した通りであるもの、つまり、［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式Ｔ−［ＣＨＯ］ｍのキャリアから誘導され、ｍが上に記載の通りであるもの；
ｖｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−、ここで−Ｄ−が上に記載の通りであり、又は−Ｄ−Ｓ−が、少なくとも一つの遊離チオール基を有する１から４のアミノ酸から構成されているペプチド残基、つまり、［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式（Ｖ）；
2011528360.tif 000015
のキャリア誘導体から誘導され、ｍが上に記載した通りであるもの；
ｖｉｉ）−ＮＨ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−、ここで−Ｄ−及び−Ｄ−Ｓ−が上に記載の通りであるもの、つまり［−Ｚ−］ｍ−Ｔが式（ＶＩ）：
2011528360.tif 000016
のキャリア誘導体から誘導され、ｍが上に記載した通りであるもの
である。
【００８１】
更なる好ましい態様では、本発明は、式（Ｉｂ）：
2011528360.tif 000017
（上式中、Ｒ１、及びＲ２、Ｚ及びＴは上に記載の通りであり、Ｌ２は式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）
2011528360.tif 000018
のリンカーであり、ここでｎが１から９の整数であるものである）
のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート又はその薬学的な塩を提供する。
【００８２】
この場合、所望される遊離のアントラサイクリン誘導体の放出を、式（Ｉｂ）の好ましいコンジュゲートから、次のように概略的に例示する：
2011528360.tif 000019
【００８３】
式（Ｉｂ）の特に好ましい化合物は、
ａ）Ｌ２が上述のような式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｚが、
ｖｉｉｉ）ポイントｉ）で上述した通りであり；
ｉｘ）ポイントｉｉ）で上述した通りであり；
ｘ）ポイントｉｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｉ）ポイントｉｖ）で上述した通りであり；
ｘｉｉ）ポイントｖ）で上述した通りであり；
ｘｉｉｉ）ポイントｖｉ）で上述した通りであり；
ｘｉｖ）ポイントｖｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｖ）−Ｓ−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−、ここで−Ｄ−ＮＨ−ＣＯ−がポイントｉｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｖｉ）−Ｓ−Ｄ−ＣＯ−ＮＨ−、ここで−Ｄ−ＣＯ−ＮＨがポイントｉｖ）で上述した通りであり；
ｘｖｉｉ）−Ｓ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−、ここでＤ及びＤ−Ｎ−がポイントｖ）で上述した通りであり；
ｘｖｉｉｉ）Ｓ−Ｄ−Ｓ−ＣＨ−、ここでＤ及び−Ｄ−Ｓ−がポイントｖｉ）で上述した通りであり；
ｘｉｘ）−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−、ここでＤ及び−Ｄ−Ｓ−がポイントｖｉｉ）で上述した通りである
スペーサー基であるものである。
【００８４】
式（Ｉｂ）の他の特に好ましい化合物は、
ｂ）Ｌ２が上述のような式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｚが、
ｘｘ）ポイントｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｘｉ）ポイントｘｖ）で上述した通りであり；
ｘｘｉｉ）ポイントｘｖｉ）で上述した通りであり；
ｘｘｉｉｉ）ポイントｘｖｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｘｉｖ）ポイントｘｖｉｉｉ）で上述した通りであり；
ｘｘｖ）ポイントｘｉｘ）で上述した通りである
ものである。
【００８５】
本発明の他の特に好ましい目的は、式（Ｉ’ａ）及び（Ｉ’ｂ）：
2011528360.tif 000020
の化合物であり、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１及びＲ２は上に記載の通りであり、Ｚは−ＮＨ−又は１から３のアミノ酸から構成されるペプチド残基であり、Ｑは、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、フェニル又はベンゾイル基である。
【００８６】
またこの場合、式（Ｉ’ａ）及び（Ｉ’ｂ）の化合物は、適切な条件下で放出されて、上述の式（ＩＩ）の化合物を生じる。
【００８７】
化合物の他の特に好ましいクラスは、Ｌが、
−式（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）の残基、
2011528360.tif 000021
（ここで、ｖ及びｋは上に記載の通りである）；
又は上述の式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）の残基で、ｎが２から５の整数であることを特徴とするもの
である式（Ｉ）又は（Ｉ’）の化合物である。
【００８８】
リンカー及びスペーサー
リンカーＬ及びスペーサーＺ単位は、キャリア、例えば抗体を、アントラサイクリン誘導体薬剤部分Ｄに共有結合を介して結合させる。リンカーは、式Ｉｃの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために一又は複数の薬剤部分（Ｄ）及び抗体単位（Ａｂ）に結合させるために使用されうる二官能性又は多官能性部分である。リンカー（Ｌ）は、細胞の外側、つまり細胞外で安定であり得、又は酵素活性、加水分解、又は他の代謝条件によって開裂されうる。抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬剤部分及び抗体への結合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して簡便に調製されうる。抗体（Ａｂ）のシステインチオール、又はアミン、例えばＮ末端又はアミノ酸側鎖、例えばリジンが、リンカー又はスペーサー試薬、薬剤部分（Ｄ）又は薬剤−リンカー試薬（Ｄ−Ｌ）の官能基と結合を形成しうる。
【００８９】
アントラサイクリン誘導体化合物上の多くの位置が、結合のタイプに応じて、結合位置として有用でありうる。例えば、エステル、アミド、チオアミド、チオカルバメート、又はカルバメート結合が、Ｃ１４のヒドロキシメチルケトンのヒドロキシル基から形成され得；ケタール及びヒドラゾン結合が薬剤部分のＣ１３基から形成され得；アミド、カルバメート、及び尿素結合が薬剤部分Ｄのアミノ基から形成され得；様々なアルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、及びアシル結合が、フリーデル・クラフツタイプのアルキル化及びアシル化反応によって薬剤部分のフェニル及びアリール環から形成されうる。
【００９０】
リンカー及びスペーサーは好ましくは細胞外で安定である。細胞中への輸送又は送達の前では、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は好ましくは安定で、無傷のままであり、つまり抗体は薬剤部分に結合したままである。リンカーは標的細胞の外側では安定であり、細胞の内部において所定の効果的な速度で開裂されうる。効果的なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲート又は薬剤部分の細胞内デリバリーを可能にし；（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的とする部位に送達するか輸送されるまでは安定で無傷のまま、つまり開裂せず；及びアントラサイクリン誘導体薬剤部分の細胞傷害性、細胞死滅効果又は細胞分裂阻害効果を維持する。ＡＤＣの安定性は、質量分析法、ＨＰＬＣ、及び分離／解析技術ＬＣ／ＭＳのような標準的な分析技術によって測定されうる。
【００９１】
抗体及び薬剤部分の共有的結合はリンカーと任意のスペーサーが２つの反応性官能基を有する、つまり反応性の意味で二価であることを必要とする。二以上の官能性又は生物学的に活性名部分、例えばペプチド、核酸、薬剤、毒素、抗体、ハプテン、及びレポーター群を結合させるのに有用な二価のリンカー試薬は知られており、方法はその得られたコンジュゲートと共に記載されている（Hermanson、G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York、p 234-242）。
【００９２】
他の実施態様では、リンカー又はスペーサーは、溶解性又は反応性を調節する基で置換されうる。例えば、スルホネート置換基は試薬の水溶性を改善し、抗体又は薬剤部分とのリンカー試薬のカップリング反応を容易にし、又はＡＤＣを調製するために用いられる合成経路に応じてＡｂ−ＬのＤとの、又はＤ−ＬのＡｂとのカップリング反応を容易にしうる。
【００９３】
抗体上の求核基には、限定するものでないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される場合は糖ヒドロキシル基又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核であり、反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合を形成することができる。ある抗体は、還元性の鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性であるようにしてもよい。よって、各システイン架橋は、理論的には２の反応性のチオール求核基を形成する。更なる求核基は、チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウト試薬）を用いてリジンを反応させることによって抗体に導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体（又はその断片）に導入されうる。米国特許出願第２００７／００９２９４０号は反応性システインアミノ酸の導入により抗体を操作することを教示している。
【００９４】
ある実施態様では、リンカーは抗体上に存在する求電子基と反応性である反応性求核置換基を有している。抗体上の有用な求電子基は、限定しないが、アルでヒト及びケトン基を含む。リンカーの求核基のヘテロ原子が抗体上の求電子基と反応し、抗体単位に対する共有結合を形成しうる。リンカー上の有用な求核基は、限定しないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドを含む。抗体上の求電子基はリンカーへの簡便な結合部分を提供する。
【００９５】
薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、リンカー部分上の求電子性の基及び（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基を含む。
【００９６】
スペーサー（Ｚ）は、一又は複数のアミノ酸単位を含むペプチド性でありうる。ペプチドリンカー試薬は、ペプチド化学の分野でよく知られている固相又は液相合成法(E. Schroder及びK. Lubke、The Peptides、volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press)、例えば t-BOC化学(Geiser等 "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing及びSynthesis、Alan R. Liss、Inc.、1988、pp. 199-218)及びFmoc/HBTU化学(Fields、G.及びNoble、R. (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)によって、自動化合成機、例えばRainin Symphonyペプチド合成機(Protein Technologies、Inc.、Tucson、AZ)、又はモデル433 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて調製されうる。
【００９７】
例示的なアミノ酸リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドを含む。例示的なジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸アナログ、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設計でき、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性において最適化できる。
【００９８】
アミノ酸側鎖は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸アナログ、例えばシトルリンを含む。アミノ酸側鎖は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンゾイル、ｐ−ヒドロキシベンゾイル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジイルメチル−、３−ピリジイルメチル−、４−ピリジイルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、並びに次の構造を含む：
2011528360.tif 000022
【００９９】
アミノ酸側鎖が水素以外を含む場合（グリシン）、アミノ酸側鎖が結合している炭素原子はキラルである。アミノ酸側鎖が結合している各炭素原子は独立して（Ｓ）又は（Ｒ）配置、又はラセミ混合物である。よって、薬剤−リンカー試薬は、鏡像異性的に純粋であり、ラセミであり、又はジアステレオマーでありうる。
【０１００】
例示的な実施態様では、アミノ酸側鎖は、天然及び非天然のアミノ酸のもの、例えばアラニン、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−２−フェニル酢酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ−アミノ酪酸、α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸、β，β−ジメチルγ−アミノ酪酸、オルニチン、及びシトルリン（Ｃｉｔ）から選択される。
【０１０１】
薬剤−リンカー中間体
本発明は、タンパク質、ペプチド、及び抗体へのコンジュゲーションに有用な薬剤−リンカー中間体を含む。かかる薬剤−リンカー中間体は、式（ＩＩｃ）：
2011528360.tif 000023
のアントラサイクリン誘導体を含み、ここで、Ａｎｔは
2011528360.tif 000024
から選択され、ここで、波線はＬへの結合を示し；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、及び構造：
2011528360.tif 000025
から選択されるリンカーであり、ここで、波線はＡｎｔ及びＺへの結合を示し；及び
Ｚは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、及び構造：
2011528360.tif 000026
2011528360.tif 000027
から選択される任意のスペーサーであり；
Ｘは、マレイミド、チオール、アミノ、臭化物、ｐ−トルエンスルホネート、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジイルジスルフィド、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基であり；
ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又はＣ６−Ｃ２０アリールであり；
Ｒ１及びＲ２は独立してアミノ酸側鎖から選択され；
Ｚ１は、−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、
ｍは０又は１であり；ｎは１から６である。
【０１０２】
式ＩＩｃのアントラサイクリン誘導体は、構造：
2011528360.tif 000028
を含み、ここで、Ｚ−Ｘは
2011528360.tif 000029
から選択される。
【０１０３】
アントラサイクリン薬剤部分及びリンカー−スペーサー単位を含む式ＩＩｃの例示的な薬剤−リンカー中間体の実施態様は、化合物５０−５３を含む：
2011528360.tif 000030
2011528360.tif 000031
【０１０４】
式ＩＩｃのアントラサイクリン誘導体は構造:
2011528360.tif 000032
を含み、ここで、ＺはＣ１−Ｃ１２アルキレンである。
【０１０５】
アントラサイクリン薬剤部分及びリンカー−スペーサー単位を含む式ＩＩｃの例示的な薬剤−リンカー中間体の実施態様は、化合物５４（実施例３ａ）を含む：
2011528360.tif 000033
【０１０６】
式ＩＩｃのアントラサイクリン誘導体は構造：
2011528360.tif 000034
を含み、ここでＸはマレイミドである:
2011528360.tif 000035
【０１０７】
アントラサイクリン薬剤部分及びリンカー−スペーサー単位を含む式ＩＩｃの例示的な薬剤−リンカー中間体の実施態様は、化合物５５（実施例３ｂ）を含む。
ＰＮＵ−１５９６８２Ｃ−１４カルボキシル誘導体５６及びリンカー−スペーサー中間体６０からの薬剤−リンカー中間体５５への合成経路は図７ｄに示す。
2011528360.tif 000036
【０１０８】
式ＩＩｃのアントラサイクリン誘導体は構造：
2011528360.tif 000037
を含み、ここで、Z1 は-(C1-C12 アルキレン)-である。
【０１０９】
アントラサイクリン薬剤部分及びリンカー−スペーサー単位を含む式ＩＩｃの例示的な薬剤−リンカー中間体の実施態様は、化合物：
2011528360.tif 000038
を含む。
【０１１０】
リンカー及びスペーサー試薬
抗体及び薬剤部分間のβ-グルクロニドリンカーは、β-グルクロニダーゼによる開裂のための基質である(Jeffrey等(2006) Bioconjugate Chem. 17:831-840;国際公開第 2007/011968号)。β-グルクロニドのアセタール結合は、アリール環上のフェニール性ヒドロキシルを遊離させ、ベンゾイルオキシ基の「セルフイモレーション」及び１，６−脱離を増強する。
【０１１１】
マレイミドストレッチャー及びパラ−アミノベンゾイルカルバモイル（ＰＡＢ）セルフイモレーションスペーサーを有する例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ又はｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は、構造：
2011528360.tif 000039
を有しており、ここで、ＱはＣ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ＮＯ２又は−ＣＮであり；ｍは０−４の範囲の整数である。
【０１１２】
マレイミドストレッチャー単位及びｐ−アミノベンゾイルセルフイモレーションスペーサー単位を有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ）ジペプチドリンカー試薬は、Dubowchik、等(1997) Tetrahedron Letters、38:5257-60に従って調製することができ、構造：
2011528360.tif 000040
を有しており、ここでＭｔｒはモノ−４−メトキシトリチルであり、ＱはＣ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ＮＯ２又は−ＣＮであり；ｍは０−４の範囲の整数である。
【０１１３】
「セルフイモレーションリンカー」のＰＡＢＣ又はＰＡＢ（パラ−アミノベンゾイルオキシ）は、コンジュゲートにおいて薬剤部分を抗体に結合させる（Carl等(1981) J. Med. Chem. 24:479-480; Chakravarty等(1983) J. Med. Chem. 26:638-644；米国特許６２１４３４５；米国特許２００３０１３０１８９；米国特許２００３００９６７４３；米国特許６７５９５０９；米国特許２００４００５２７９３；米国特許６２１８５１９；米国特許６８３５８０７；米国特許６２６８４８８；米国特許２００４００１８１９４；ＷＯ９８／１３０５９；米国特許出願公開２００４００５２７９３；米国特許６６７７４３５；米国特許５６２１００２；米国特許出願公開ＵＳ２００４０１２１９４０；国際公開２００４／０３２８２８）。ＰＡＢ以外のセルフイモレーションスペーサーの他の例は、限定しないが、(i) 2-アミノイミダゾl-5-メタノール誘導体のようなPAB基に電子的に類似する芳香族化合物(Hay等(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、チアゾール(US 2005/0256030)、複数の長いPAB 単位(de Groot等(2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830;及びオルト又はパラ-アミノベンゾイルアセタール;及び(ii) ホモログ化されたスチリルPABアナログ(US 7223837)を含む。アミド結合加水分解時に環化を受けるスペーサー、例えば置換及び未置換4-アミノ酪酸アミド(Rodrigues等(1995) Chemistry Biology 2:223)、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Storm等(1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815）及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberry、等(1990) J. Org. Chem. 55:5867)を使用することができる。グリシンで置換されたアミン含有薬剤の除去(Kingsbury等(1984) J. Med. Chem. 27:1447）はまたＡＤＣにおいて有用なセルフイモレーションスペーサーの例である。
【０１１４】
本発明の抗体薬剤コンジュゲートに対して有用なリンカー試薬は、限定しないが、ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ，スルホ−ＧＭＢＳ，スルホ−ＫＭＵＳ，スルホ−ＭＢＳ，スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含み、ビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）２）、及び１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）３）を含み、これらはPierce Biotechnology社、ThermoScientific、Rockford、IL、及び他の試薬供給者から商業的に入手できる。ビス-マレイミド 試薬は、チオール含有薬剤部分、標識、又はリンカー中間体への抗体のシステイン残基の遊離チオール基の逐次的又は同時形式での結合を可能にする。抗体、アントラサイクリン誘導体薬剤部分、又はリンカー中間体のチオール基と反応性であるマレイミド以外の他の官能基は、ヨードアセトアミド、ブロモセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジイルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含む。
2011528360.tif 000041
【０１１５】
他のリンカー試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジイルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジイルジチオ）プロピオネート（SPDP、Carlsson等(1978) Biochem. J. 173:723-737）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフロロ−２，４−ジニトロベンゼン）を含む。有用なリンカー試薬はまた他の商業的供給先から得ることができ、例えばMolecular Biosciences社(Boulder、CO)であり、又はToki等(2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; US 6214345; 国際公開０２／０８８１７２；米国特許出願公開２００３１３０１８９；米国特許出願公開２００３０９６７４３；国際公開０３／０２６５７７；国際公開０３／０４３５８３；及び国際公開０４／０３２８２８に記載された手順に従って合成される。
【０１１６】
リンカーは、抗体へ分岐した多官能性リンカー部分を介して一を越える薬剤部分を共有的に結合させるための樹状タイプのリンカーでありうる(US 2006/116422; US 2005/271615; de Groot等(2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494; Amir等(2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499; Shamis等(2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731; Sun等(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun等(2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King等(2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹状リンカーは、抗体への薬剤のモル比、つまりＡＤＣの効力に関連する負荷を増加させうる。よって、抗体がシステインチオール基を一つだけ有している場合、多数の薬剤部分は樹状又は分岐リンカーを介して結合されうる。
【０１１７】
キャリア
アントラサイクリン誘導体コンジュゲートのキャリア部分はポリクローナル及びモノクローナル抗体、天然又は合成由来のタンパク質又はペプチドから誘導される。キャリア化合物T-NH2, T-COOH、T-CHO、T-SH、(V)又は(VI) は、アントラサイクリン誘導体化合物とのコンジュゲーションに適している。キャリア部分は、腫瘍関連抗原に対して産生されたポリクローナル抗体から；又は腫瘍細胞集団上に優先的に又は選択的に発現された抗原に結合するモノクローナル抗体から；又は腫瘍細胞に優先的に又は選択的に結合する天然又は組換えペプチド又はタンパク質又は増殖因子から；又は天然又は合成のポリマーキャリア、例えばポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びそのアナログ及び誘導体、又は例えばデキストラン又は他のポリマー炭水化物アナログ及びその誘導体から；又は合成コポリマー、例えばN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド (HPMA)から誘導されたものから（J. Kopecek、Macromolecules. H. Benoit & P. Rempp編: 505-520 (1982) Pergamon Press. Oxford、England)；又はポリ(アミノ酸)コポリマー、例えば肺癌組織への標的化可能薬剤−キャリアとして有用なポリ(GluNa、Ala、Tyr)（R. Duncan等, Journal of Bioactive及びCompatible Polymers、Vol 4, July 1989)から誘導されうる。キャリアタンパク質はまた、組換えＤＮＡ技術によって得られる上述のペプチド又はタンパク質の一部から誘導されうる。
【０１１８】
抗体
上述の抗体及びそれぞれの可能な治療用途の代表的な例は、抗T-cell 抗体 T101 (Royston、I. 等, J. Immunol. 1980、125:725); 抗CD5 抗体 OKT1 (Ortho) ATCC CRL 8000 慢性リンパ性白血病); 抗CD20 抗体 IgG1イブリツモマブ、(Theuer、C. P.等Biotechnology Annual Review 2004 non-hodgkin’s リンパ腫); 抗CD33 抗体 huCD33, (Drug of the future 2000 25(7):686 acute myeloid leukemia); 抗トランスフェリンレセプター 抗体 OKT9 (Ortho) ATCC CRL 8021 卵巣及び他の腫瘍; 抗メラノーマ 抗体 MAb 9.2.27 (Bumol、T. F.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79:1245 melanomas); 抗癌マーカー 抗体 、例えば抗CEA 1116 NS-3d ATCC CRL 8019)、抗αフェトプロテイン OM 3-1.1 ATCC HB 134も肝細胞癌)、791T/36 (Embleton、M. J.等, Br. J. Cancer 1981, 43, 582もまた骨肉腫)、B 72.3 (US 4522918 結腸直腸癌及び他の腫瘍)、抗卵巣癌 抗体 OVB 3 ATCC HB 9147、抗乳癌 抗体 HMGF 抗原(Aboud-Pirak、E. 等, Cancer Res. 1988, 48:3188)、抗膀胱癌 1G3.10 (Yu, D. S. 等, Eur. J. Urol. 1987、13:198)、抗CanAg 抗体 huC242 抗体 (Olcher, Anthony W. 等, Journal of Clinical Oncology 2003, 21(2):211-222 結腸、膵臓癌、胃癌)、抗前立腺癌 抗体 MLN591 (Henry、Michael D.等, Cancer Research 2004 advanced hormone-refractory prostate cancer)である。
【０１１９】
天然又は組換え由来の上述の増殖因子及びタンパク質の代表的な例は、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−ＡＬＰＨＡ、ＡＬＰＨＡ−ＭＳ、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、Ｍｃｍ２等である。キャリアＴ−ＣＨＯは、好ましくは、米国特許第４６７１９５８号に記載されたような、化学的又は酵素的方法によってアルデヒド基に選択的に酸化された、Ｆｃ領域に優先的に位置する炭水化物部分を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体から誘導される。
【０１２０】
式ＩＩｃの抗体単位（Ａｂ）は、与えられた標的細胞集団と関連したレセプター、抗原又は他の受容性部分と結合し又は反応的に関連し又は複合体化する任意の単位、タイプ、又はクラスの抗体を含む。抗体は、治療的又はその他生物学的に修飾されることが求められる細胞集団の一部と結合し、複合体を形成し、又は反応する任意のタンパク質又はタンパク質様分子でありうる。一態様では、抗体単位は、アントラサイクリン誘導体薬剤部分を、抗体単位が反応する特定の標的細胞集団に移送するように作用する。このような抗体は、限定しないが、大きな分子量のタンパク質、例えば完全長抗体及び抗体断片を含む。式Ｉの抗体は、癌細胞において高濃度の活性な代謝物分子を達成することを可能にする。細胞内ターゲティングは、細胞内における生物学的に活性な薬剤の蓄積又は保持を可能にする方法及び化合物によって達成されうる。このような効果的なターゲティングは様々な治療製剤及び手順に適用可能であり得る。
【０１２１】
一実施態様では、ＡＤＣは、ＥｒｂＢ遺伝子によってコードされるレセプター、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に特異的に結合する。ＡＤＣはＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメインに特異的に結合しうる。ＡＤＣは、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害しうる。
【０１２２】
他の実施態様では、式ＩＩｃの抗体（Ａｂ）はヒト化抗体、例えばｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７又はｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ）である。
【０１２３】
本発明の抗体は、野生型又は親抗体の任意の形態の一又は複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されているシステイン操作抗体を含む。操作されたシステインアミノ酸は遊離システイン酸であり、鎖内又は鎖間ジスルフィド単位の一部ではない。抗体の任意の形態、タイプ、又は変異体もまた操作され得、つまり変異される。例えば、親Ｆａｂ抗体  断片はシステイン操作Ｆａｂを形成するように操作され得、ここでは「ＴｈｉｏＦａｂ」と称される。同様に、親モノクローナル抗体は、「ＴｈｉｏＭａｂ」を形成するように操作されうる。単一部位の変異はＴｈｉｏＦａｂにおいて単一の操作システイン残基を生じる一方、単一部位の変異はＴｈｉｏＭａｂにおいてはＩｇＧ抗体の二量体の性質のため、二つの操作システイン残基を生じることに留意されなければならない。本発明のシステイン操作抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体、抗体の抗原結合断片、細胞関連ポリペプチドに優先的に結合する融合ポリペプチド及びアナログを含む。
【０１２４】
システイン操作抗体は、Ｆａｂ抗体断片（チオＦａｂ）として設計され、完全長のＩｇＧモノクローナル（チオＭａｂ）抗体として発現されている（その内容を出典明示により援用する米国特許第７５２１５４１号）。ＴｈｉｏＦａｂ及びＴｈｉｏＭａｂ抗体は、抗ＨＥＲ２（米国特許第７５２１５４１号）、抗ＣＤ２２（米国特許出願公開２００８／００５０３１０）、及び抗ｓｔｅａｐ１（国際公開２００８／０５２１８７）、並びに他のシステイン操作抗体及び抗体−薬剤コンジュゲートを含む、抗体−薬剤コンジュゲート（ＴｈｉｏＡＤＣ）を調製するために、チオール反応性リンカー試薬及び薬剤−リンカー試薬と新たに導入されるシステインチオールにおいてリンカーを介してコンジュゲートされている。
【０１２５】
式ＩＩｃの抗体-薬剤コンジュゲートを含む抗体は、その天然の野生型対応物の抗原結合能を好ましくは保持する。よって、本発明の抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合可能である。このような抗原には、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化に関連する（例えば、それに機能的に寄与することが知られているか又は疑われる）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子及び血管形成に関連する（例えば、それに機能的に寄与することが知られているか又は疑われる）分子が含まれる。腫瘍関連抗原はクラスター分化因子（つまり、ＣＤタンパク質）でありうる。本発明の抗体が結合可能な抗原は、上述のカテゴリーのサブセットのメンバーであり得、上記カテゴリーの他のサブセットは、（対象の抗原に対して）区別される特性を有する他の分子／抗原を含む。
【０１２６】
一実施態様では、式ＩＩｃの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗体は、ＥｒｂＢ遺伝子によってコードされるレセプターに特異的に結合する。抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢレセプターに特異的に結合しうる。ＡＤＣは、ＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合し得、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害しうる。ＡＤＣの抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体でありうる。ヒト化抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７又はｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ）でありうる。抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ断片でありうる。
【０１２７】
癌の治療に有用であり得る式ＩＩｃの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗体は、限定しないが、細胞表面レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体を含む。そのような腫瘍関連抗原は当該分野で知られており、当該分野で良く知られている方法及び情報を使用して抗体生産に使用するために調製することができる。癌診断及び治療法のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、一又は複数の正常な非癌性細胞上と比較して一又は複数の特定のタイプの癌細胞の表面に特異的に発現される膜貫通型又は他の腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとした。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して癌細胞の表面上により豊富に発現される。そのような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの療法を介した破壊のために癌細胞に特異的に標的とする能力を生じせしめた。
【０１２８】
ＴＡＡの例は、限定しないが、以下に列挙する腫瘍関連抗原（１）−（３６）を含む。簡単のために、その全てが当該分野で知られているこれらの抗原に関する情報を以下に列挙するが、これは、名前、別名、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主要な文献、その後に国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列同定コンベンションを含む。ＴＡＡ（１）−（３６）に対応する核酸及びタンパク質配列は公的データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋから入手できる。抗体によって標的とされる腫瘍関連抗原は、引用された文献で同定された配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含み、又は引用された文献に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同じ生物学的性質又は特性を示す。例えば、変異配列を有するＴＡＡは、一般に、列挙された対応の配列を持つＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。ここに特に記載された文献中の配列及び開示は出典明示により明示的に援用される。
【０１２９】
腫瘍関連抗原（１）−（３６）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプター−タイプＩＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）; ten Dijke、P.等 Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); 国際公開2004063362 (クレーム2); 国際公開2003042661 (クレーム12); 米国特許出願公開2003134790-A1 (p38-39); 国際公開2002102235 (クレーム13; p296); 国際公開2003055443 (p91-92); 国際公開200299122 (実施例2; p528-530); 国際公開2003029421 (クレーム6); 国際公開2003024392 (クレーム2; 図112); 国際公開200298358 (クレーム1; p183); 国際公開200254940 (p100-101); 国際公開200259377(p349-350); 国際公開200230268 (クレーム27; p376); 国際公開200148204 (実施例; 図4); NP_001194骨形成タンパク質レセプター、 タイプIB /pid=NP_001194.1; クロスリファレンス: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
【０１３０】
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）；Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2)、 283-288 (1999)、 Nature 395 (6699):288-291 (1998)、 Gaugitsch、 H.W.、等(1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); 国際公開2004048938 (実施例2); 国際公開2004032842 (実施例IV); 国際公開2003042661 (クレーム12); 国際公開2003016475 (クレーム1); 国際公開200278524 (実施例2); 国際公開200299074 (クレーム19; p127-129); 国際公開200286443 (クレーム27; ｐ222, 393); 国際公開2003003906 (クレーム10; p293); 国際公開200264798 (クレーム33; p93-95); 国際公開200014228 (クレーム5; p133-136); 米国特許出願公開2003224454 (図3); 国際公開2003025138 (クレーム12; p150); 米国特許出願公開 20050107595; 米国特許出願公開 20050106644; NP_003477ソリュート キャリアファミリー 7 (カチオンアミノ 酸 トランスポーター、 y+ システム)、 メンバー5 /pid=NP_003477.3 - ホモサピエンス; クロスリファレンス: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
【０１３１】
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺癌六回膜貫通型上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）；Cancer Res. 61 (15)、 5857-5860 (2001)、 Hubert、 R.S.、等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); 国際公開2004065577 (クレーム6); 国際公開2004027049 (図1L); EP1394274 (実施例11); 国際公開2004016225 (クレーム2); 国際公開2003042661 (クレーム12); 米国特許出願公開2003157089 (実施例5); 米国特許出願公開2003185830 (実施例5); 米国特許出願公開2003064397 (図2); 国際公開200289747 (実施例5; p618-619); 国際公開2003022995 (実施例9; 図13A、実施例53; p173,実施例2; 図2A); NP_036581六回膜貫通型上皮抗原; クロスリファレンス: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
【０１３２】
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）； J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); 国際公開2004045553 (クレーム14); 国際公開200292836 (クレーム6; 図12); 国際公開200283866 (クレーム15; p116-121); 米国特許出願公開2003124140 (実施例16); 米国特許出願公開2003091580 (クレーム6); 国際公開200206317 (クレーム6; p400-408); クロスリファレンス: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
【０１３３】
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）； Yamaguchi、 N.、等Biol. Chem. 269 (2)、 805-808 (1994)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996)、 J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); 国際公開2003101283 (クレーム14); (国際公開2002102235 (クレーム13; p287-288); 国際公開2002101075 (クレーム4; p308-309); 国際公開200271928 (p320-321); WO9410312 (p52-57); クロスリファレンス: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
【０１３４】
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、ソリュートキャリアファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、タイプＩＩナトリウム−リン酸共輸送体３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）；J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002)、 Genomics 62 (2):281-284 (1999)、 Feild、 J.A.、等(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); 国際公開2004022778 (クレーム2);欧州特許出願公開1394274 (実施例11); 国際公開2002102235 (クレーム13; p326);欧州特許出願公開875569 (クレーム1; p17-19); 国際公開200157188 (クレーム20; p329); 国際公開2004032842 (実施例IV); 国際公開200175177 (クレーム24; p139-140); クロスリファレンス: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
【０１３５】
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７トロンボスポンジンリピート（タイプ１及びタイプ１様）、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）及びショート細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）；Nagase T.、等(2000) DNA Res. 7 (2):143-150); 国際公開2004000997 (クレーム1); 国際公開2003003984 (クレーム1); 国際公開200206339 (クレーム1; p50); 国際公開200188133 (クレーム1; p41-43, 48-58); 国際公開2003054152 (クレーム20); 国際公開2003101400 (クレーム11); 受託: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737;
【０１３６】
（８）ＰＳＣＡｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）；Ross等(2002) Cancer Res. 62:2546-2553; 米国特許出願公開2003129192 (クレーム2); 米国特許出願公開2004044180 (クレーム12); 米国特許出願公開2004044179 (クレーム11); 米国特許出願公開2003096961 (クレーム11); 米国特許出願公開2003232056 (実施例5); 国際公開2003105758 (クレーム12); 米国特許出願公開2003206918 (実施例5);欧州特許出願公開1347046 (クレーム1); 国際公開2003025148 (クレーム20); クロスリファレンス: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
【０１３７】
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）；Nakamuta M.、等Biochem. Biophys. Res. Commun. 177、 34-39、 1991; Ogawa Y.、等Biochem. Biophys. Res. Commun. 178、 248-255、 1991; Arai H.、等Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307、 1992; Arai H.、等J. Biol. Chem. 268、 3463-3470、 1993; Sakamoto A.、 Yanagisawa M.、等Biochem. Biophys. Res. Commun. 178、 656-663, 1991; Elshourbagy N.A.、等J. Biol. Chem. 268、 3873-3879、 1993; Haendler B.、等J. Cardiovasc. Pharmacol. 20、 s1-S4, 1992; Tsutsumi M.、等Gene 228、 43-49、 1999; Strausberg R.L.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99、 16899-16903, 2002; Bourgeois C.、等J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y.、等Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B.、等Am. J. Med. Genet. 108、 223-225、 2002; Hofstra R.M.W.、等Eur. J. Hum. Genet. 5、 180-185、 1997; Puffenberger E.G.、等Cell 79、 1257-1266, 1994; Attie T.、 et al、 Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409、 1995; Auricchio A.、等Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J.、等Hum. Mol. Genet. 5、 355-357、 1996; Hofstra R.M.W.、等Nat. Genet. 12, 445-447、 1996; Svensson P.J.、等Hum. Genet. 103, 145-148、 1998; Fuchs S.、等Mol. Med. 7、 115-124, 2001; Pingault V.、等(2002) Hum. Genet. 111, 198-206; 国際公開2004045516 (クレーム1); 国際公開2004048938 (実施例2); 国際公開2004040000 (クレーム151); 国際公開2003087768 (クレーム1); 国際公開2003016475 (クレーム1); 国際公開2003016475 (クレーム1); 国際公開200261087 (図1); 国際公開2003016494 (図6); 国際公開2003025138 (クレーム12; p144); 国際公開200198351 (クレーム1; p124-125);欧州特許出願公開522868 (クレーム8; 図2); 国際公開200177172 (クレーム1; p297-299); 米国特許出願公開2003109676; 米国特許6518404 (図3); 米国特許5773223 (クレーム1a; Col 31-34); 国際公開2004001004.
【０１３８】
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、ハイポセティカルタンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）；国際公開2003104275 (クレーム1); 国際公開2004046342 (実施例2); 国際公開2003042661 (クレーム12); 国際公開2003083074 (クレーム14; p61); 国際公開2003018621 (クレーム1); 国際公開2003024392 (クレーム2; 図93); 国際公開200166689 (実施例6); クロスリファレンス: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
【０１３９】
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌癌関連タンパク質１、前立腺癌六回膜貫通型上皮抗原２、六回膜貫通型前立腺癌タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）； Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); 国際公開2003087306; 米国特許出願公開2003064397 (クレーム1; 図1); 国際公開200272596 (クレーム13; p54-55); 国際公開200172962 (クレーム1; 図4B); 国際公開2003104270 (クレーム11); 国際公開2003104270 (クレーム16); 米国特許出願公開2004005598 (クレーム22); 国際公開2003042661 (クレーム12); 米国特許出願公開2003060612 (クレーム12; 図10); 国際公開200226822 (クレーム23; 図2); 国際公開200216429 (クレーム12; 図10); クロスリファレンス: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
【０１４０】
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、トランジェントレセプターポテンシャルカチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）； Xu、 X.Z.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001)、 Cell 109 (3):397-407 (2002)、 J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); 米国特許出願公開2003143557 (クレーム4); 国際公開200040614 (クレーム14; p100-103); 国際公開200210382 (クレーム1; 図9A); 国際公開2003042661 (クレーム12); 国際公開200230268 (クレーム27; p391); 米国特許出願公開2003219806 (クレーム4); 国際公開200162794 (クレーム14; 図1A-D); クロスリファレンス: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
【０１４１】
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌腫由来増殖因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）；Ciccodicola、 A.、等EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989)、 Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); 米国特許出願公開2003224411 (クレーム1); 国際公開2003083041 (実施例1); 国際公開2003034984 (クレーム12); 国際公開200288170 (クレーム2; p52-53); 国際公開2003024392 (クレーム2; 図58); 国際公開200216413 (クレーム1; p94-95、 105); 国際公開200222808 (クレーム2; 図1); 米国特許5854399 (実施例2; Col 17-18); 米国特許5792616 (図2); クロスリファレンス: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
【０１４２】
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルスレセプター）又はＨｓ．７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）； Fujisaku等(1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J.、等J. Exp. Med. 167、 1047-1066, 1988; Moore M.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198、 1987; Barel M.、等Mol. Immunol. 35、 1025-1031, 1998; Weis J.J.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K.、等(1993) J. Immunol. 150、 5311-5320; 国際公開2004045520 (実施例4); 米国特許出願公開2004005538 (実施例1); 国際公開2003062401 (クレーム9); 国際公開2004045520 (実施例4); WO9102536 (図9.1-9.9); 国際公開2004020595 (クレーム1); 受託: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
【０１４３】
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９ｂ、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）； Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller等(1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); 国際公開2004016225 (クレーム 2, 図140); 国際公開2003087768、 米国特許出願公開2004101874 (クレーム 1, ｐ 102); 国際公開2003062401 (クレーム 9); 国際公開200278524 (実施例2); 米国特許出願公開2002150573 (クレーム 5、 ｐ 15); 米国特許5644033; 国際公開2003048202 (クレーム 1, ｐs 306及び309); 国際公開99/558658、 米国特許6534482 (クレーム 13, 図17A/B); 国際公開200055351 (クレーム 11, ｐs 1145-1146); クロスリファレンス: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
【０１４４】
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカー型タンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４、ＡＹ３５８１３０）；Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003)、 Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002)、 Blood 99 (8):2662-2669 (2002)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001)、 Xu、 M.J.、等(2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; 国際公開2004016225 (クレーム2); 国際公開2003077836; 国際公開200138490 (クレーム5; 図18D-1-18D-2); 国際公開2003097803 (クレーム12); 国際公開2003089624 (クレーム25); クロスリファレンス: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
【０１４５】
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）；Coussens L.、等Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T.、等Nature 319、 230-234, 1986; Semba K.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M.、等J. Cell Biol. 165、 869-880、 2004; Kuhns J.J.、等J. Biol. Chem. 274, 36422-36427、 1999; Cho H.-S.、等Nature 421, 756-760、 2003; Ehsani A.、等(1993) Genomics 15、 426-429; 国際公開2004048938 (実施例2); 国際公開2004027049 (図1I); 国際公開2004009622; 国際公開2003081210; 国際公開2003089904 (クレーム9); 国際公開2003016475 (クレーム1); 米国特許出願公開2003118592; 国際公開2003008537 (クレーム1); 国際公開2003055439 (クレーム29; 図1A-B); 国際公開2003025228 (クレーム37; 図5C); 国際公開200222636 (実施例13; p95-107); 国際公開200212341 (クレーム68; 図7); 国際公開200213847 (p71-74); 国際公開200214503 (p114-117); 国際公開200153463 (クレーム2; p41-46); 国際公開200141787 (p15); 国際公開200044899 (クレーム52; 図7); 国際公開200020579 (クレーム3; 図2); 米国特許5869445 (クレーム3; Col 31-38); WO9630514 (クレーム2; p56-61);欧州特許出願公開1439393 (クレーム7); 国際公開2004043361 (クレーム7); 国際公開2004022709; 国際公開200100244 (実施例3; 図4); 受託: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1.
【０１４６】
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；Barnett T.、等Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y.、等Biochem. Biophys. Res. Commun. 150、 89-96, 1988; Strausberg R.L.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; 国際公開2004063709;欧州特許出願公開1439393 (クレーム7); 国際公開2004044178 (実施例4); 国際公開2004031238; 国際公開2003042661 (クレーム12); 国際公開200278524 (実施例2); 国際公開200286443 (クレーム27; p427); 国際公開200260317 (クレーム2); Accession: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
【０１４７】
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); 国際公開2003016475 (クレーム1); 国際公開200264798 (クレーム33; p85-87); JP05003790 (図6-8); WO9946284 (図9); クロスリファレンス: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
【０１４８】
（２０）ＩＬ２０Ｒａ（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）；Clark H.F.、等Genome Res. 13, 2265-2270、 2003; Mungall A.J.、等Nature 425、 805-811, 2003; Blumberg H.、等Cell 104, 9-19、 2001; Dumoutier L.、等J. Immunol. 167、 3545-3549、 2001; Parrish-Novak J.、等J. Biol. Chem. 277、 47517-47523, 2002; Pletnev S.、等(2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F.、等(2004) J. Immunol. 172, 2006-2010;欧州特許出願公開1394274 (実施例11); 米国特許出願公開2004005320 (実施例5); 国際公開2003029262 (p74-75); 国際公開2003002717 (クレーム2; p63); 国際公開200222153 (p45-47); 米国特許出願公開2002042366 (p20-21); 国際公開200146261 (p57-59); 国際公開200146232 (p63-65); 国際公開9837193 (クレーム1; p55-59); 受託: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1. 
【０１４９】
（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）；Gary S.C.、等Gene 256, 139-147、 2000; Clark H.F.、等Genome Res. 13, 2265-2270、 2003; Strausberg R.L.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99、 16899-16903, 2002; 米国特許出願公開2003186372 (クレーム11); 米国特許出願公開2003186373 (クレーム11); 米国特許出願公開2003119131 (クレーム1; 図52); 米国特許出願公開2003119122 (クレーム1; 図52); 米国特許出願公開2003119126 (クレーム1); 米国特許出願公開2003119121 (クレーム1; 図52); 米国特許出願公開2003119129 (クレーム1); 米国特許出願公開2003119130 (クレーム1); 米国特許出願公開2003119128 (クレーム1; 図52); 米国特許出願公開2003119125 (クレーム1); 国際公開2003016475 (クレーム1); 国際公開200202634 (クレーム1);
【０１５０】
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）； Chan、J.及びWatt、 V.M.、 Oncogene 6 (6)、 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995)、 Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998)、 Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); 国際公開2003042661 (クレーム12); 国際公開200053216 (クレーム1; p41); 国際公開2004065576 (クレーム1); 国際公開2004020583 (クレーム9); 国際公開2003004529 (p128-132); 国際公開200053216 (クレーム1; p42); クロスリファレンス: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
【０１５１】
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）；米国特許出願公開20040101899 (クレーム2); 国際公開2003104399 (クレーム11); 国際公開2004000221 (図3); 米国特許出願公開2003165504 (クレーム1); 米国特許出願公開2003124140 (実施例2); 米国特許出願公開2003065143 (図60); 国際公開2002102235 (クレーム13; p299); 米国特許出願公開2003091580 (実施例2); 国際公開200210187 (クレーム6; 図10); 国際公開200194641 (クレーム12; 図7b); 国際公開200202624 (クレーム13; 図1A-1B); 米国特許出願公開2002034749 (クレーム54; p45-46); 国際公開200206317 (実施例2; p320-321, クレーム34; p321-322); 国際公開200271928 (p468-469); 国際公開200202587 (実施例1; 図1); 国際公開200140269 (実施例3; ｐ 190-192); 国際公開200036107 (実施例2; p205-207); 国際公開2004053079 (クレーム12); 国際公開2003004989 (クレーム1); 国際公開200271928 (p233-234, 452-453); 国際公開0116318; 
【０１５２】
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺肝細胞抗原前駆物質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）； Reiter R.E.、等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95、 1735-1740、 1998; Gu Z.、等Oncogene 19、 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; 国際公開2004022709;欧州特許出願公開1394274 (実施例11); 米国特許出願公開2004018553 (クレーム17); 国際公開2003008537 (クレーム1); 国際公開200281646 (クレーム1; p164); 国際公開2003003906 (クレーム10; p288); 国際公開200140309 (実施例1; 図17); 米国特許出願公開2001055751 (実施例1; 図1b); 国際公開200032752 (クレーム18; 図1); 国際公開9851805 (クレーム17; p97); 国際公開9851824 (クレーム10; p94); 国際公開9840403 (クレーム2; 図1B); Accession: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
【０１５３】
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）；AAP14954脂肪腫HMGIC融合対様タンパク質 /pid=AAP14954.1 ホモサピエンス (human); 国際公開2003054152 (クレーム20); 国際公開2003000842 (クレーム1); 国際公開2003023013 (実施例3, クレーム20); 米国特許出願公開2003194704 (クレーム45); クロスリファレンス: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
【０１５４】
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター、ＢＬｙＳレセプター３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）；BAFF レセプター /pid=NP_443177.1 - ホモサピエンス; Thompson、 J.S.、等Science 293 (5537)、 2108-2111 (2001); 国際公開2004058309; 国際公開2004011611; 国際公開2003045422 (実施例; p32-33); 国際公開2003014294 (クレーム35; 図6B); 国際公開2003035846 (クレーム70; p615-616); 国際公開200294852 (Col 136-137); 国際公開200238766 (クレーム3; p133); 国際公開200224909 (実施例3; 図3); クロスリファレンス: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
【０１５５】
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｌｙｂ−８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）； Wilson等(1991) J. Exp. Med. 173:137-146; 国際公開2003072036 (クレーム1; 図1); クロスリファレンス: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
【０１５６】
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９ａ、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ（ＣＤ７９Ｂ）と共有的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上に複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞−特異タンパク質）；226 aa)、 pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gene Chromosome: 19q13.2, Genbank accession No. NP_001774.10); 国際公開2003088808、 米国特許出願公開20030228319; 国際公開2003062401 (クレーム 9); 米国特許出願公開2002150573 (クレーム 4, ｐs 13-14); 国際公開9958658 (クレーム 13, 図16); 国際公開9207574 (図1); 米国特許5644033; Ha等(1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller等(1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto等(1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud’homme等(1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu等(1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi等(1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
【０１５７】
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１、ＣＸＣＬ１３ケモカイン二より活性化され、リンパ球遊走機能及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染とおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において所定の役割を担うＧタンパク質結合レセプター）； 372 aa)、 pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: 11q23.3, Genbank accession No. NP_001707.1); 国際公開2004040000; 国際公開2004015426; 米国特許出願公開2003105292 (実施例2); 米国特許6555339 (実施例2); 国際公開200261087 (図1); 国際公開200157188 (クレーム20、 ｐ 269); 国際公開200172830 (ｐs 12-13); 国際公開200022129 (実施例1, ｐs 152-153,実施例2, ｐs 254-256); 国際公開9928468 (クレーム 1, ｐ 38); 米国特許5440021 (実施例2, col 49-52); 国際公開9428931 (ｐs 56-58); 国際公開9217497 (クレーム 7、 図5); Dobner等(1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella等(1995) Biochem. J. 309:773-779
【０１５８】
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（主要組織適合複合体クラスＩＩ分子βサブユニット（Ｉａ抗原））；273 aa、 pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, Genbank accession No. NP_002111.1); Tonnelle等(1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson等(1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck等(1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius等(1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck等(1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse等(2002) Tissue Antigens 59:512-519; 国際公開9958658 (クレーム 13, 図15); 米国特許6153408 (Col 35-38); 米国特許5976551 (col 168-170); 米国特許6011146 (col 145-146); Kasahara等(1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar等(1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119
【０１５９】
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン作動性レセプターＰ２Ｘリガンドゲートイオンチャネル５、細胞外ＡＴＰによってゲートされるイオンチャネル、シナプス伝達及びニューロン新生に関与し得、欠損は突発性排尿筋不安定性の病態生理に寄与しうる）； 422 aa)、 pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17p13.3, Genbank 受託番号 NP_002552.2); Le等(1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; 国際公開2004047749; 国際公開2003072035 (クレーム 10); Touchman等(2000) Genome Res. 10:165-173; 国際公開200222660 (クレーム 20); 国際公開2003093444 (クレーム1); 国際公開2003087768 (クレーム1); 国際公開2003029277 (p82)
【０１６０】
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）；３５９ａａ）、ｐＩ：８．６６，ＭＷ：４０２２５ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）；国際公開2004042346 (クレーム65); 国際公開2003026493 (ｐs 51-52, 57-58); 国際公開200075655 (ｐs 105-106); Von Hoegen等(1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903
【０１６１】
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質、Ｂ細胞活性化及びアポトーシスを調節し、機能喪失が全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の増加に関連）； 661 aa)、 pI: 6.20、 MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 5q12, Genbank 受託番号NP_005573.1); 米国特許出願公開2002193567; 国際公開9707198 (クレーム11, p39-42); Miura等(1996) Genomics 38(3):299-304; Miura等(1998) Blood 92:2815-2822; 国際公開2003083047; 国際公開9744452 (クレーム8、 p 57-61); 国際公開200012130 (p24-26)
【０１６２】
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１、Ｃ２タイプＩｇ様及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインに対する推定レセプター、Ｂリンパ球分化において役割を有しうる）；429 aa)、 pI: 5.28、 MW: 46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21-1q22, Genbank 受託番号NP_443170.1); 国際公開2003077836; 国際公開200138490 (クレーム6, 図18E-1-18-E-2); Davis等(2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; 国際公開2003089624 (クレーム8);欧州特許出願公開1347046 (クレーム1); 国際公開2003089624 (クレーム7)
【０１６３】
（３５）ＩＲＴＡ２（ＦｃＲＨ５、免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２、Ｂ細胞発達及びリンパ腫発生に可能な役割のある推定イムノレセプター；トランスロケーションによる遺伝子の調節解除がある種のＢ細胞悪性腫瘍で生じる）；977 aa)、 pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21, (Genbank 受託番号ヒト:AF343662、 AF343663、 AF343664、 AF343665、 AF369794、 AF397453、 AK090423、 AK090475、 AL834187、 AY358085; マウス:AK089756、 AY158090、 AY506558; NP_112571.1); 国際公開2003024392 (クレーム2, 図97); Nakayama等(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; 国際公開2003077836; 国際公開200138490 (クレーム3, 図18B-1-18B-2)
【０１６４】
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定膜貫通型プロテオグリカン、ＥＧＦ／ヘレグリンファミリー増殖因子及びフォリスタチン関連）； 374 aa、 NCBI受託: AAD55776、 AAF91397、 AAG49451、 NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; (Genbank 受託番号AF179274; AY358907、 CAF85723, CQ782436); 国際公開2004074320; JP2004113151; 国際公開2003042661; 国際公開2003009814;欧州特許出願公開1295944 (ｐs 69-70); 国際公開200230268 (ｐ 329); 国際公開200190304; 米国特許出願公開2004249130; 米国特許出願公開2004022727; 国際公開2004063355; 米国特許出願公開2004197325; 米国特許出願公開2003232350; 米国特許出願公開2004005563; 米国特許出願公開2003124579; 米国特許6410506; 米国特許6642006l; Horie等(2000) Genomics 67:146-152; Uchida等(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang等(2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones等(2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84.
【０１６５】
更に好ましい化合物は、以下の表１：
2011528360.tif 000042
2011528360.tif 000043
に化合物１−１４として報告される式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉ’ａ）及び（Ｉ’ｂ）の化合物であり、ここで、［Ａｎｔ］残基は以下の式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の化合物によって表され、つまり、［Ａｎｔ］は上に記載された通りの式ＩＩＡのアントラサイクリンの残基である、
2011528360.tif 000044
【０１６６】
キラル中心又は異性体中心の他の形態が本発明の化合物に存在している場合、エナンチオマー及びジアステレオマーを含むそのような異性体の全ての形態がここでは包含されるものである。キラル中心を含む化合物は、鏡像異性的にリッチ化された混合物のラセミ混合物として使用され得、又はラセミ混合物はよく知られた技術を使用して分離することができ、また個々のエナンチオマーを単独で使用することもできる。化合物が炭素・炭素二重結合を有する場合には、シス（Ｚ）及びトランス（Ｅ）型の双方が本発明の範囲内にある。
【０１６７】
例えばケトーエノール互変異性体のように、化合物が互変異性体形態で存在する場合、各互変異性体形態は、平衡状態で存在しているか又は主に一形態で存在しているかによらず、本発明に含まれると考えられる。
【０１６８】
式（Ｉ’）のアントラサイクリン誘導体又は式（Ｉ）のアントラサイクリン誘導体のコンジュゲートの薬学的に許容可能な塩は、無機又は有機酸、例えば、硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トルフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸及びサリチル酸での酸付加塩を含む。好ましくは、本発明の化合物の酸付加塩は、塩酸又はメシル酸塩である。
【０１６９】
式（Ｉ’）のアントラサイクリン誘導体又は式（Ｉ）のアントラサイクリン誘導体のコンジュゲートの薬学的に許容可能な塩は、また無機又は有機塩基、例えばアルカリ又はアルカリ土類金属、特にナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム又はマグネシウム水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩、非環式又は環式アミン、好ましくはメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン等との塩を含む。
【０１７０】
ここで使用される場合、他の記載がない限り、Ｃ１−Ｃ６アルキルなる用語は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル等のような基を意味する。
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基なる用語は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等を意味する。
Ｃ１−Ｃ６アルキレン基なる用語は、二価残基、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、ネオペンチレン、ｎ−ヘキシレン、イソヘキシレン等を意味する。
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基なる用語は、二価残基、例えばシクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロペンテニレン、シクロヘキセニレン等を意味する。
【０１７１】
ここで定義される基又は置換基の何れもそれらが由来する基の名前から解釈されうることは当業者には明らかである。
一例として、特に別の記載がない限り、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基では、アルキル部分は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル等を含む。例示的なＣ１−Ｃ５アルコキシ基はメトキシ（−ＯＣＨ３）、エトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ３）、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ等である。
【０１７２】
「１から４のアミノから構成されるペプチド残基」は、１から４の天然又は合成のアミノ酸からの配列を含むペプチドを意味する。
本発明はまた上述の式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供する。
上述の式（Ｉａ）の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は図２に示されるようにして調製されうる。
【０１７３】
アントラサイクリン誘導体コンジュゲート式（Ｉａ）を調製するための方法
従って、上述の式（Ｉａ）の化合物及びその薬学的に許容可能な塩を調製するための本発明の第一の方法は、次の工程を含む：
工程１  上述の式（ＩＩ）の化合物を、式（ＩＸ）又は（Ｘ）
2011528360.tif 000045
（ここで、ｖ、ｊ、ｋ、ｙ、及びＢは上に記載の通りであり、Ｒ３はＣ１−Ｃ３アルキル基である）の化合物と反応させ；
工程２  得られたエステル中間体（ＸＩ）：
2011528360.tif 000046
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上に記載の通りであり、Ｌ１は上述の式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の基である）を加水分解し；
工程３  式（ＸＩＩ）：
2011528360.tif 000047
（ここで、Ｒ１、Ｒ２，及びＬ１は上に記載の通りである）の得られた酸を活性化させ、そして
工程４  式（ＸＩＩＩ）：
2011528360.tif 000048
（ここで、Ｒ１、Ｒ２，及びＬ１は上に記載の通りであり、Ｗは酸基の活性化基、例えばＮ−オキシスクシンイミド、Ｎ−オキシスルホスクシンイミド又は２，４−ジニトロフェノキシ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ又はｔ−ブトキシカルボニルオキシである）の得られた活性化化合物を所望のキャリアに結合させて式（Ｉａ）の化合物を得、場合によっては、得られた化合物を薬学的に許容可能な塩に転換させる。
【０１７４】
上述の式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）の化合物がまた本発明の目的である。
【０１７５】
工程１の反応は、０℃から８０℃の範囲の温度で、１時間から２４時間の範囲の時間、ｐ−トルエンスルホン酸の存在下、有機溶媒、例えばジメトキシエタン又は好ましくはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で実施される。
【０１７６】
工程２の反応は、０℃から室温の範囲の温度で、１から４８時間の間、塩基性加水分解条件下、好ましくはＮａＯＨのような強塩基を用いて実施した。
【０１７７】
工程３の反応は、よく知られた方法に従って実施した。例えば、Ｎ−オキシスクシンイミド誘導体を、０℃から５０℃の温度で１から２４時間の時間、例えばジクロロメタン又はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドのような溶媒中でＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミドの存在下、酸（ＸＩＩ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はその水溶性３−置換スルホン酸ナトリウム塩と反応させて、調製することができる。
【０１７８】
工程４の反応は、得られる上述の式（Ｉａ）の所望の化合物に応じて、図３ａ、３ｂ、３ｃにまとめた方法の一つに従って実施することができる。
特に、上述の式（Ｉａ）の化合物を調製するための最終の縮合は、上述の式（ＸＩＩＩ）の化合物を、
１ａ）式Ｔ−［Ｘ］ｍ（ＸＩＶ）の化合物（ここで、Ｘは−ＮＨ２又は−ＳＨであり、ｍは上に記載の通りである）と反応させ、ポイントｉ）又はｉｉ）でそれぞれ上述したように式（Ｉａ）の化合物を得ることを含む。
【０１７９】
縮合は、アミドタイプ又はチオエステルタイプで、キャリアの構造と適合性のある共有結合を作製することが可能な条件下で実施される。好ましい条件は、数時間から数日までの時間、４℃から３７℃の温度で、ｐＨ７−９．５の緩衝水溶液を使用することを包含する。
【０１８０】
例えば、式（ＸＩＩＩ）の化合物と抗体Ｔ−ＮＨ２間の縮合の条件は次の通りである：１ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む、水性０．１Ｍのリン酸ナトリウム及び水性０．１Ｍの塩化ナトリウムを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの６の３０倍モル過剰の１０％ｗ／ｖ溶液で、２０℃にて２４時間処理。コンジュゲートをＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５カラム（Pharmacia Fine Chemical、Piscataway、N.J.）でのゲル濾過によって精製し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で溶離させる。
【０１８１】
上述の式（Ｉａ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＩＩＩ）の化合物を、
１ｂ）式（ＸＶ）ＮＨ２−Ｄ−ＮＨ−Ｐ（ここで、−Ｄ−又は−Ｄ−ＮＨ−は上に記載の通りであり、Ｐは水素原子又は好ましくは保護基である）の化合物と、反応させ、
１ｂ’）必要ならば、式（ＸＶＩ）：
2011528360.tif 000049
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＤは上に報告の通りであり、Ｐは保護基である）の得られた化合物のＮＨ官能基を脱保護し、ついで
１”ｂ）式（ＸＶＩ）：
2011528360.tif 000050
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＤは上に報告の通りであり、Ｐは水素原子である）の得られた化合物を、式Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍ（ＸＶＩＩ）（ここで、Ｔ及びｍは上に記載の通りである）のキャリア残基とカップリングさせて、［Ｔ−Ｚ］−は−ＮＨ−Ｄ−ＮＨＣＯ−Ｔであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＴが上に記載の通りである上記ポイント（ｉｉｉ）で定義された式（Ｉａ）の化合物を得ることを含む。
【０１８２】
工程１ｂの反応は、アミドタイプの共有結合を形成可能で文献中でよく知られ、またスペーサー構造と適合性がある条件下で実施される。好ましい条件は、４℃から５０℃の範囲の温度で数時間から数日の時間、ｐＨ７−９．５の緩衝水溶液、又は有機溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又は酢酸エチルを使用することを包含する。
【０１８３】
工程１’ｂの任意工程の脱保護は、文献に報告されたよく知られた方法を使用して実施される［例えばGreen T.W., Wuts P.G.M Protective Groups in Organic Chemistryを参照］。工程１”ｂのカップリング反応は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−ｎ’−エチルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、又は好ましくはＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミドのような縮合剤の存在下、有機溶媒、好ましくはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で実施される。反応は５℃から５０℃の範囲の温度で１時間から２４時間の範囲の時間、実施される。
【０１８４】
別の方法では、式（ＸＶＩＩ）の化合物を、上の工程３において上述されたような適切な活性化酸基Ｗで活性化させ、ついで、上に報告されたものと同じ条件を使用して脱保護されたアミンとカップリングさせうる。
【０１８５】
上述の式（Ｉａ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＩＩＩ）の化合物を、
１ｃ）式（ＸＶＩＩＩ）ＮＨ２−Ｄ−ＣＯＯ−Ｐ１（ここで、Ｄ又はＤ−ＣＯ−は上に記載の通りであり、Ｐ１は適切な保護酸基、例えばカップリング反応後に除去されるアルキルエステルである）の化合物と反応させて、式（ＸＩＸ）：
2011528360.tif 000051
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＤは上に記載の通りである）
の酸化合物を得ることを含む。
【０１８６】
式（ＸＩＸ）の得られた化合物は、そのまま使用することができ、又は好ましくは工程３において上述した適切な活性化酸基によって活性化し、ついで式（ＸＩＶ）Ｔ−［Ｘ］ｍ（ここで、ＸはＮＨ２であり、ｍ及びＴは上に記載の通りである）のキャリア残基とカップリングさせ、［Ｔ−Ｚ］−が−ＮＨ−Ｄ−ＣＯＮＨ−Ｔであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＴが上に記載の通りであるポイント（ｉｖ）で定義された式（Ｉａ）の化合物を調製する。
【０１８７】
式（ＸＩＩＩ）の化合物を上述の式（ＸＶＩＩＩ）の化合物にカップリングさせるための好ましい反応条件は、上記の工程１ｂに報告されたものと同じである。酸保護基の除去は、よく概説された方法を使用して実施され [例えばGreen T.W., Wuts P.G.M Protective Groups in Organic Chemistryを参照] 、例えば酸官能基がエチルエステル誘導体として保護されている場合、脱保護は、好ましくは０℃から室温の範囲の温度で１時間から４８時間の範囲の時間、ＮａＯＨを使用する塩基性加水分解条件下で実施されうる。式（ＸＩＶ）の化合物との式（ＸＩＸ）の化合物の反応は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−ｎ’−エチルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、又は好ましくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミドのような縮合剤の存在下、有機溶媒、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で実施される。反応は、５℃から５０℃の範囲の温度で、１時間から２４時間の範囲の時間、実施され、又は代替の合成法では、酸（ＸＩＸ）を、該プロセスの工程３で報告されたような適切な活性化基を用いて活性化させ、ついで活性化された酸を、工程１において上に報告された合成条件下で式（ＸＩＶ）の化合物とカップリングさせる。
【０１８８】
上述の式（Ｉａ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＩＩＩ）の化合物を、
１ｄ）上述の式（ＸＶ）の化合物と反応させ、ついでＰが水素原子である上述の式（ＸＶＩ）の得られた中間体を、ｍ及びＴが上記の通りである式Ｔ−［ＣＨＯ］ｍ（ＸＸ）のキャリア残基とカップリングさせ、［Ｔ−Ｚ］−残基が−ＮＨ−Ｄ−Ｎ＝ＣＨ−Ｔを表す上記ポイント（ｖ）に記載された式（Ｉａ）の化合物を得ることを含む。
【０１８９】
式（ＸＶＩ）の脱保護されたアミノ誘導体の式（ＸＸ）のキャリアとのコンジュゲーションは、ヒドラゾンタイプの共有結合を形成可能でキャリアの構造と適合性がある条件下で実施されうる。好ましい条件は、４℃から３７℃の温度で、数時間から数日の時間、ｐＨ４−７．５の緩衝水溶液、アルコール又はその混合物を使用することを包含する。式（ＸＶＩ）の脱保護された誘導体の化合物と抗体Ｔ−ＣＨＯの間のカップリングの条件は次の通りである：
１ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む、水性０．１Ｍの酢酸ナトリウム及び水性０．１Ｍの塩化ナトリウムｐＨ６を、同じバッファー中の８の３０倍モル過剰の５％ｗ／ｖ溶液で、２０℃にて２４時間処理。コンジュゲートは上述のようなゲル濾過によって精製される。
【０１９０】
上述の式（Ｉａ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＩＩＩ）の化合物を、
１ｅ）Ｄが上述の通りである式（ＸＸＩ）ＮＨ２−Ｄ−ＳＨの化合物と、該プロセスの工程１で報告されたものと同じ反応条件下で反応させ、ついで式（ＸＸＩＩ）：
2011528360.tif 000052
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１及びＤは以下に報告された通りである）
の得られた化合物を、
１ｅ’）式（Ｖ）：
2011528360.tif 000053
（ここで、Ｔ及びｍは上記の通りである）のキャリア残基と反応させて、マイケル付加後に、［Ｔ−Ｚ］−が式（ＸＸＩＩＩ）：
2011528360.tif 000054
（ここで、Ｄ及びＴは上記の通りである）の残基であるポイント（ｖｉ）に記載された式（Ｉａ）の化合物を得；又は
１ｅ’’）式（ＶＩ）：
2011528360.tif 000055
（ここで、Ｔ及びｍは上記の通りである）のキャリア残基と反応させて、ピリジン−２−チオール基の置換後に、［Ｔ−Ｚ］−が式（ＸＸＩＶ）：
2011528360.tif 000056
（ここで、Ｄ及びＴは上記の通りである）の残基であるポイント（ｖｉｉ）に記載された式（Ｉａ）の化合物を得ることを含む。
【０１９１】
上述の式（ＸＸＩＩ）の化合物の、上述の式（Ｖ）の化合物との反応は、４℃から室温までの温度で１から６時間の間、ｐＨ７−９．５の緩衝水溶液、アルコール又はその混合物中で実施されうる［例えば、Willner D.等, Bioconjugate Chem. (1993) 4:521-527を参照］。化合物（ＶＩ）との化合物（ＸＸＩＩ）のカップリングは、好ましくは、上述の化合物（ＶＩ）の各反応基について上述したように１から１．５当量の式（ＸＸＩＩ）の化合物と共に、ｐＨ７．２のメタノール及びリン酸緩衝溶液の混合物中で実施される。反応は好ましくは４℃から室温の温度で保温される［例えば、欧州特許出願公開３２８１４７を参照］。
【０１９２】
上述の式（Ｉｂ）の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、図４に示されたようにして調製されうる。
【０１９３】
アントラサイクリン誘導体コンジュゲート式（Ｉｂ）を調製するための方法
従って、本発明は、上述の式（Ｉｂ）の化合物及びその薬学的に許容可能な塩を調製するための方法を提供し、該方法は次の工程を含む：
工程１  上述の式（ＩＩ）の化合物を式（ＸＸＶ）：
2011528360.tif 000057
のアシルヒドラジド誘導体と、アシルヒドラゾンタイプの共有結合を形成可能でキャリアの構造と適合性がある条件下で反応させ；
工程２  式（ＸＸＶＩ）：
2011528360.tif 000058
の得られた化合物を、適切な方法によって上述の式（Ｉｂ）の最終化合物に転換させる。
【０１９４】
上述の式（ＸＸＶＩ）の化合物がまた本発明の目的である。
上記工程１の好ましい条件は、４から７．５のｐＨの緩衝水溶液又は好ましくは有機溶媒、例えばエタノール、テトラヒドロフラン、又はより好ましくはメタノールを、４℃から５０℃の温度で、１時間から数日の期間、使用することを包含する。
【０１９５】
最終転換は、図５ａ、５ｂ、５ｃにまとめられた方法の一つに従って実施することができる。
【０１９６】
特に、上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための最終縮合は、上述の式（ＸＸＶＩ）の化合物を、
２ａ）式  Ｔ−［Ｘ］ｍ（ＸＩＶ）（ここで、ＸはＮＨ２又はＳＨであり、ｍは上記の通りである）のキャリア化合物と反応させて、Ｌ２が上述の式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２が上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−がＴ−ＮＨ−又はＴ−Ｓ−であり、Ｔが上記の通りである上記ポイント（ｖｉｉｉ）及び（ｉｘ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。コンジュゲーション反応は、工程１ｅにおいて上で報告したものと同じ条件を使用して実施される。
【０１９７】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＶＩ）の化合物を、
２ｂ）式（ＸＸＶＩＩ）Ｈ−Ｒ４−Ｄ−ＮＨ−Ｐ（ここで、Ｄは上記の通りであり、Ｒ４が−ＮＨ−又は−Ｓ−であり、Ｐが水素原子又は、好ましくは、カップリング反応後に除去されるアミノ保護基である）の化合物と反応させ、ついで、
２’ｂ）式（ＸＸＶＩＩＩ）：
2011528360.tif 000059
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＤは上記の通りである）の得られたアシルヒドラゾン誘導体を、Ｔ及びｍが上記の通りである式（ＸＶＩＩ）Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍのキャリア誘導体とカップリングさせて、［Ｔ−Ｚ］−残基が−ＮＨ−Ｄ−ＮＨＣＯ−Ｔ又は−Ｓ−Ｄ−ＮＨＣＯ−Ｔであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ２、Ｔが上記の通りであるポイント（ｘ）及び（ｘｖ）に定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。コンジュゲーション反応は、上記ポイント１ｂにおいて報告したものと同じ条件を使用して実施される。
【０１９８】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＶＩ）の化合物を、
２ｃ）式（ＸＸＩＸ）Ｈ−Ｒ４−Ｄ−ＣＯ−Ｐ１（ここで、Ｒ４、Ｄ、Ｄ−ＣＯ−及びＰ１は上記の通りである）の化合物と反応させ、もし存在するならば保護基を除去し；
２’ｃ）式（ＸＸＸ）：
2011528360.tif 000060
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＤは上記の通りである）の得られたアシルヒドラゾン誘導体を、好ましくは適切な活性化酸基Ｗ（ここで、Ｗは上で報告した通りである）での活性化後に式（ＸＩＶ）Ｔ−［Ｘ］ｍ、（ここで、ＸはＮＨ２，であり、Ｔ及びｍは上記の通りである）のキャリアとカップリングさせて、［Ｔ−Ｚ］−残基が−ＮＨ−Ｄ−ＣＯＮＨ−Ｔ又は−Ｓ−Ｄ−ＣＯＮＨ−Ｔであり、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｔが上記の通りである上記ポイント（ｘｉ）及び（ｘｖｉ）に定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。コンジュゲーション反応は、該プロセスのポイント（１ｃ）において報告したものと同じ条件を使用して実施される。
【０１９９】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、
２ｄ）上述のようにして得られた式（ＸＸＶＩ）の化合物を式（ＸＸ）Ｔ−［ＣＨＯ］ｍのキャリアとカップリングさせ、［Ｔ−Ｚ］−残基が−ＮＨ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−Ｔ又は−Ｓ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−Ｔであり、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｔが上記の通りである上記ポイント（ｘｉｉ）及び（ｘｖｉｉ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を、上記のポイント１ｄで報告されたものと同じ反応条件を使用して得ることを含む。
【０２００】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＶＩ）の化合物を、
２ｅ）式（ＸＸＸＩ）Ｈ−Ｒ４−Ｄ−Ｓ−Ｐ２（ここで、Ｒ４及びＤは上に記載の通りであり、Ｐ２は水素原子又は好ましくは、チオール保護基である）の化合物と反応させた後、式（ＸＸＸＩＩ）：
2011528360.tif 000061
（ここで、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＤは上記の通りである）の得られた化合物を、もし存在する場合はチオール保護基の除去後に、
２ｅ’）上述の式（Ｖ）のキャリア誘導体とカップリングさせて、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｄが上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−が上述の式（ＸＸＩＩＩ）の残基、又は（ＸＸＩＩＩａ）又は、
2011528360.tif 000062
の残基である上記ポイント（ｘｉｉｉ）及び（ｘｖｉｉｉ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得るか、
２ｅ’’）上述の式（ＶＩ）のキャリア誘導体とカップリングさせて、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｄが上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−が上述の式（ＸＸＩＶ）又は（ＸＸＩＶａ）
2011528360.tif 000063
の残基である上記ポイント（ｘｉｖ）及び（ｘｉｘ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。
【０２０１】
コンジュゲーション反応は、該プロセスのポイント（１ｅ）で報告されたものと同じ条件を使用して実施される一方、選択されたチオール保護基の除去を文献に報告された条件下で実施されうる［例えばGreen T.W., Wuts P.G.M Protective Groups in Organic Chemistryを参照]。
【０２０２】
Ｌ２が式（ＶＩＩＩ）のスペーサーである式（Ｉｂ）の化合物及び薬学的に許容可能な塩は、図６によって示された方法によって得ることができ、ここで、Ｇは炭素又は窒素原子、好ましくは窒素原子であり、Ｒ５はハロゲン又は水素原子、好ましくは水素原子であり、及びｎ、Ｒ１及びＲ２は上記の通りである。
【０２０３】
従って、本発明は、Ｌ２は式（ＶＩＩＩ）のスペーサーである上述の式（Ｉｂ）の化合物及びその薬学的に許容可能な塩を調製するための方法を提供し、該方法は、次の工程を含む：
工程１  上述の式（ＩＩ）の化合物を式（ＸＸＸＩＩＩ）：
2011528360.tif 000064
（ここで、Ｇ及びＲ５は上に記載の通りである）のアシルヒドラジド誘導体と、式（Ｉｂ）の化合物を調製するためのプロセスにおいて上述した工程１で報告されたものと同じ条件を使用して反応させ、及び
工程２  式（ＸＸＸＩＶ）：
2011528360.tif 000065
（ここで、ｎ、Ｒ１、Ｒ２，及びＧは上記の通りである）得られたアシルヒドラゾン誘導体の適切な方法によって式（Ｉｂ）の最終化合物に転換させる。
【０２０４】
上述の式（ＸＸＸＩＶ）の化合物がまた本発明の目的である。
【０２０５】
最終の転換は、図７ａ、７ｂ、７ｃにまとめられた方法の一つに従って実施することができ、ここで、ｎ、ｍ、Ｔ、Ｄ、Ｐ、Ｐ１、Ｐ２及びＲ４は上記の通りである。特に、上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための最終の縮合は、式（ＸＸＸＩＶ）の化合物を、
（３ａ）式（ＸＩＶ）Ｔ−［Ｘ］ｍ（ここで、Ｘは−ＳＨであり、ｍは上記の通りである）のキャリア誘導体と反応させ、Ｌ２が上述の式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１及びＲ２が上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］が−Ｓ−Ｔであり、ここでＴが上記の通りである上記ポイント（ｘｘ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。式（ＸＸＸＩＶ）の化合物にキャリアを結合させる反応条件は、上記ポイント（１ｅ”’）で記載されたものと同じである。
【０２０６】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＸＩＶ）の化合物を、
（３ｂ）式（ＸＸＸＶ）ＳＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｐ（ここで、Ｄ及びＰは上記の通りである）の化合物と上記ポイント１ｅ”で記載されたものと同じ条件下で反応させ、及び
（３’ｂ）もし存在するならばアミノ保護基の除去後に、式（ＸＸＸＶＩ）：
2011528360.tif 000066
（ここで、ｎ、Ｒ１、Ｒ２，及びＤは上記の通りである）の得られたアシルヒドラゾン誘導体を、Ｔ及びｍが上記の通りである式（ＸＶＩＩ）Ｔ−［ＣＯＯＨ］ｍのキャリア誘導体とカップリングさせ、Ｌ２が上記の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−残基が−Ｓ−Ｄ−ＮＨＣＯ−Ｔである上記ポイント（ｘｘｉ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。反応は上記ポイント（１ｂ）で最終化合物を生成するために使用されたものと同じ条件を使用して実施される。
【０２０７】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＸＩＶ）の化合物を、
（３ｃ）式（ＸＸＸＶＩＩ）ＨＳ−Ｄ−ＣＯ−ＯＰ１（ここで、Ｄ及びＰ１は上記の通りである）の化合物と上記ポイント１ｅ”で記載されたものと同じ条件下で、もし存在するならばアミノ保護基の除去後に反応させ、及び
（３’ｃ）適切な活性化酸基Ｗ（ここでＷは上記の通りの基である）の反応により好ましくは活性化された式（ＸＸＸＶＩＩＩ）
2011528360.tif 000067
（ここで、ｎ、Ｒ１、Ｒ２，及びＤは上記の通りである）の得られたアシルヒドラゾン誘導体を式（ＸＩＶ）Ｔ−［Ｘ］ｍ（ここで、ＸはＮＨ２，であり、Ｔ及びｍは上記の通りである）のキャリアと、上記のポイント１ｃで報告されたものと同じ条件を使用してカップリングさせ、［Ｔ−Ｚ］−残基が−Ｓ−Ｄ−ＣＯＮＨ−Ｔであり、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｔが上記の通りである上記ポイント（ｘｘｉｉ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。
【０２０８】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、
（３ｄ）上述のようにして得られた式（ＸＸＸＶＩ）の化合物を、Ｔ及びｍが上記の通りである式（ＸＸ）Ｔ−［ＣＨＯ］ｍのキャリア誘導体とカップリングさせ、［Ｔ−Ｚ］−残基が−Ｓ−Ｄ−Ｎ＝Ｃ−Ｔであり、Ｄ、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｔが上記の通りである上記ポイント（ｘｘｉｉｉ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。反応条件は上記ポイント１ｄで報告されたものと同じである。
【０２０９】
上述の式（Ｉｂ）の化合物を調製するための他の縮合は、上述の式（ＸＸＸＩＶ）の化合物を、
（３ｅ）式（ＸＸＸＩＸ）ＨＳ−Ｄ−Ｓ−Ｐ２（ここで、Ｄ及びＰ２は上記の通りであり、Ｐ２は好ましくはチオール保護基である）の化合物と、上記ポイント１ｅ’’で報告されたものと同じ条件下で、存在するならば保護基の除去後に、文献で知られた条件を使用して反応させ、式（ＸＬ）：
2011528360.tif 000068
（ここで、ｎ、Ｒ１、Ｒ２，及びＤは上記の通りである）の得られたアシルヒドラゾン誘導体を、
（３’ｅ）上記の式（Ｖ）のキャリアとカップリングさせ、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｄが上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−が上記の式（ＸＸＩＩＩａ）の残基である上記ポイント（ｘｉｖ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得るか、又は
（３’’ｅ）上記の式（ＶＩ）のキャリアとカップリングさせ、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２及びＤが上に記載の通りであり、［Ｔ−Ｚ］−が上記ｍの式（ＸＸＩＶａ）の残基である上記ポイント（ｘｘｖ）で定義された式（Ｉｂ）の化合物を得ることを含む。
【０２１０】
上記化合物（ＸＬ）と上記式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）の化合物との反応は、それぞれポイント１ｅ’及び１ｅ”で報告されたものと同じ条件で実施される。
【０２１１】
ＬがＬ１である上述の式（Ｉ’）の本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、スキーム７−１０で以下に示したプロセスによって得ることができ、ここで、全ての符号は上述のものと同じ意味を有する。
【０２１２】
スキーム７
2011528360.tif 000069
【０２１３】
式（ＸＩＩＩ）の化合物を式Ｑ−ＮＨ２又はＱ−ＳＨ（ここで、Ｑは上記の通りである）の化合物と反応させることにより、ＬがＬ１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＬ１が上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。カップリング反応はポイント１ａで上述したものと同じである。
スキーム８
2011528360.tif 000070
【０２１４】
式（ＸＩＸ）の化合物を上記の式Ｑ−ＮＨ２の化合物と反応させることにより、ＬがＬ１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。カップリング反応はポイント１ｃで上述したものと同じである。
スキーム９
2011528360.tif 000071
【０２１５】
Ｐが水素原子である式（ＸＶＩ）の化合物を、式Ｑ−ＣＨＯ（ここで、Ｑは上記の通りである）の化合物と反応させることにより、ＬがＬ１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ、Ｌ１及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。カップリング反応はポイント１ｄで上述したものと同じである。
スキーム１０
2011528360.tif 000072
【０２１６】
Ｐが水素原子であり、Ｌ１及びＤが上記の通りである式（ＸＶＩ）の化合物を、式Ｑ−ＣＯＯＨ（ここで、Ｑは上記の通りである）の化合物と反応させることにより、ＬがＬ１であり、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
【０２１７】
カップリング反応条件はポイント１ｂで上述したものと同じである。ＬがＬ１である上述の式（Ｉ’）の本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、スキーム１１−１５で以下に示したプロセスによって得ることができ、ここで、全ての符号は上述のものと同じ意味を有する。
スキーム１１
2011528360.tif 000073
【０２１８】
式（ＸＸＶＩ）の化合物を上述の式Ｑ−ＮＨ２又はＱ−ＳＨの化合物と反応させることにより、ＬがＬ２，でありＬ２が上記の式（ＶＩＩ）のものであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１２
2011528360.tif 000074
【０２１９】
式（ＸＸＸ）の化合物を上述の式Ｑ−ＮＨ２の化合物と反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２が上記の式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｄ、Ｑが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１３
2011528360.tif 000075
【０２２０】
式（ＸＸＶＩＩＩ）の酸化合物を上述の式Ｑ−ＣＨＯの化合物と反応させることにより、Ｌ２が上記の式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｄ、Ｑが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１４
2011528360.tif 000076
【０２２１】
式（ＸＸＶＩＩＩ）の酸化合物を上述の式Ｑ−ＣＯＯＨの化合物と反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２が上記式（ＶＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｄ、Ｑが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。上述のカップリング反応条件はポイント１ｅ’で記載されたものと同じである。
スキーム１５
2011528360.tif 000077
【０２２２】
式（ＸＸＸＩＶ）の化合物を上述の式Ｑ−ＳＨの化合物と反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２が上記式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１６
2011528360.tif 000078
【０２２３】
式（ＸＸＸＶＩＩＩ）の化合物を上述の式Ｑ−ＮＨ２の化合物を反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２は式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１７
2011528360.tif 000079
【０２２４】
式（ＸＸＸＶＩ）の化合物を上述の式Ｑ−ＣＨＯの化合物を反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２が式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。
スキーム１８
2011528360.tif 000080
【０２２５】
式（ＸＸＸＶＩ）の化合物を上述の式Ｑ−ＣＯＯＨの化合物と反応させることにより、ＬがＬ２であり、Ｌ２が式（ＶＩＩＩ）のリンカーであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ及びＤが上記の通りである式（Ｉ’）の化合物が得られる。上述のカップリング反応条件は上記ポイント１ｅ’で記載されたものと同じである。
【０２２６】
出発の化合物及び試薬は市販されているか、又は文献で報告された既知の方法に従って調製することができる。例えば、式（ＩＩ）の化合物は国際公開第９８／０２４４６号に記載され、式（ＩＸ）及び（Ｘ）の化合物は国際公開第９２０２２５５号に記載される。
【０２２７】
抗体−薬剤コンジュゲート
本発明のアントラサイクリン誘導体コンジュゲート化合物は、抗癌活性の有用性を持つものを含む。一実施態様では、アントラサイクリン誘導体薬剤部分にコンジュゲートされた、つまりリンカーによって共有的に結合された抗体を含み、ここで薬剤は抗体にコンジュゲートしていないとき細胞傷害性又は細胞分裂抑制効果を有している。よって、薬剤部分の生物学的活性は抗体へのコンジュゲーションによって調節される。本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効用量の細胞傷害剤を腫瘍組織に選択的に送達させることができ、それによって、より大きな選択性、つまりより低い有効投薬量が達成されうる。
【０２２８】
一実施態様では、ＡＤＣ、又はＡＤＣの細胞内代謝物の生物学的利用能は、対応するＰＮＵ−１５９６８２、つまりアントラサイクリン誘導体化合物単独と比較した場合、哺乳動物において改善される。また、ＡＤＣ、又はＡＤＣの細胞内代謝物の生物学的利用能は、対応する抗体単独（薬剤部分又はリンカーのないＡＤＣの抗体）と比較した場合、哺乳動物において改善される。
【０２２９】
一実施態様では、ＡＤＣのアントラサイクリン誘導体薬剤部分は、抗体-薬剤コンジュゲートが細胞表面レセプターに結合し又は抗体-薬剤コンジュゲートの抗体に特異的な細胞表面レセプターを有する細胞に入るまで、抗体から開裂されない。薬剤部分は、抗体-薬剤コンジュゲートが細胞に入った後、抗体から開裂されうる。アントラサイクリン誘導体薬剤部分は、哺乳動物において、化合物の抗体、又は化合物の細胞内代謝物から酵素作用、加水分解、酸化、又は他の機序によって細胞内的に開裂されうる。
【０２３０】
本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応しうる求電子部分を導入するための抗体の修飾によってまた生産することができる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸酸化試薬で酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成せしめることができる。得られたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得、又は例えば水素化ホウ素試薬によって還元して安定なアミン結合を形成せしめることができる。一実施態様では、グリコシル化抗体の糖鎖部分のグラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応は、薬剤上の適切な基と反応しうるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基をタンパク質に生じせしめる（Hermanson、G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York、p 234-242。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含むタンパク質がメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し得、第一アミノ酸の代わりにアルデヒドの生産を生じる（Geoghegan及びStroh、(1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; 米国特許5362852）。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー求核試薬と反応しうる。
【０２３１】
一実施態様では、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、一又は複数のアントラサイクリン誘導体薬剤部分ＤにリンカーＬ及び任意成分のスペーサーＺによって共有的に結合された抗体であって、該化合物が式（Ｉｃ）
2011528360.tif 000081
を有するもの又はその薬学的に許容可能な塩を含み、ここで、
Ａｂは抗体であり；
Ｄは構造：
2011528360.tif 000082
（ここで、波線はＬへの結合を示す）から選択されるアントラサイクリン誘導体であり、
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、−Ｎ（Ｒ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、及び構造：
2011528360.tif 000083
（ここで、波線はＤ及びＺへの結合を示す）から選択され；
Ｚは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、及び構造：
2011528360.tif 000084
2011528360.tif 000085
から選択される任意成分のスペーサーであり
ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又はＣ６−Ｃ２０アリールであり；
Ｒ１及びＲ２は独立してアミノ酸側鎖から選択され；
Ｚ１は、−（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）−、−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）−、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、
ｍは０又は１であり；
ｎは１から６であり；及び
ｐは１から８の整数である。
【０２３２】
式Ｉの化合物は、１、２、３、４、５、６、７、及び８の薬剤部分が抗体に共有的に結合された様々に負荷され結合された抗体−薬剤コンジュゲートの全ての混合物を含む。
【０２３３】
抗体−薬剤コンジュゲートの例示的実施態様は、
2011528360.tif 000086
2011528360.tif 000087
を含み、ここで、Ａａは、抗体（Ａｂ）をアミノ酸単位、例えばバリン−シトルリンに結合させることが可能な二価単位、例えばＭＣ（マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）又はＭＰＥＧ（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）アセチル）であり；Ｙｙは、アミノ酸単位が存在する場合にアミノ酸単位を薬剤部分（Ｄ）に結合させる二価単位、例えばＰＡＢ（パラ−アミノベンゾイルオキシ）である。他の実施態様では、アミノ酸単位が存在しないとき、ＡａはＹｙを直接、薬剤部分に結合させる。他の実施態様では、Ｙｙ単位は、アミノ酸単位とＡａ単位の双方が存在しないとき、抗体単位に薬剤部分を直接結合させる。
【０２３４】
例示的な抗体−ジスルフィドリンカー薬剤コンジュゲートは、構造：
2011528360.tif 000088
によって表される。
【０２３５】
ジスルフィドリンカーＳＰＰは、リンカー試薬４−（２−ピリジイルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジルを用いて構築することができる。
【０２３６】
式（Ｉ）の抗体−薬剤コンジュゲート及び式（Ｉ’）の化合物はエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的にリッチ化されたラセミ混合物、異性体的に標識され及び異性体的にリッチ化された形態（例えば２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、及びその保護形態を全て含む。
【０２３７】
如何なる特定の作用機序に限定されるものではないが、本発明の式（Ｉ）の抗体−薬剤コンジュゲート及び本発明の式（Ｉ’）の化合物は、それらが、ヒドロニウムイオン触媒加水分解又は「インビボ」酵素的開裂時に親薬剤（ＩＩ）を放出するアセタール結合又はヒドラゾン結合を含んでいるので、有用な治療剤でありうる。哺乳動物の腫瘍では、正常な組織と比較して高い速度の解糖が存在し、乳酸生産の増加を生じ、よって腫瘍のｐＨの減少を生じることがよく知られている：H. M. Rauen 等, Z. Naturforsch, Teil B, 23 (1968) 1461を参照。本発明は化合物の作用の二つのレベルの特異性を許容し、最初のものは抗原認識による腫瘍組織中のコンジュゲートの優先的な局在化からなり、第二のものは優先的な酸開裂による腫瘍組織におけるその活性型の薬剤の優先的な放出からなる。本発明の組成物又は組成物の範囲又は有用性を限定するものではないが、ここに記載された酸感受性アセタールリンカーは、局在化された又は全身性の酸条件下でインビボで開裂され得、よって薬剤部分から標的化抗体を分離させる。
【０２３８】
記載された方法によって生産されるコンジュゲートは異なった化学的物理的方法に従って特徴付けされる。元の分子量の保持と凝集体形成の欠如は、異なった波長でのアントラサイクリン及び抗体の同時で独立した検出を行うクロマトグラフィーゲル濾過手順(Yu、D. S. 等, J. Urol. 140, 415, 1988)によって、またゲル電気泳動法によって評価されうる。得られた化合物の全体的な電荷分布はクロマトグラフィーイオン交換法によって評価されうる。アントラサイクリン濃度は、親アントラサイクリンから得られた標準的較正曲線に対して分光光度的滴定によって評価されうる。タンパク質濃度は比色分析アッセイ、例えばビシンコニン酸アッセイ(Smith、P. K. 等, Anal. Biochem. 150, 76, 1985)又は Bradford 染料アッセイ(Bradford, M. M., (1976) Anal. Biochem. 72:248)によって評価されうる。コンジュゲーション手順後に、抗体の抗原結合活性の保持は、ELISA法(Yu, D. S. 等, J. Urol. 140, 415, 1988)によって、また細胞蛍光測定法(Gallego, J. 等, Int. J. Cancer 33, 737, 1984)によって評価されうる。コンジュゲートの酸感受性は、適切な緩衝溶液中での化合物のインキュベーション後にクロマトグラフィー法によって評価されうる。
【０２３９】
薬剤負荷
薬剤負荷は、抗体当たりのアントラサイクリン誘導体の平均数であり、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート分子においてｐによって表される。薬剤負荷は抗体（Ａｂ）当たり１から８の薬剤（Ｄ）の範囲であり得、つまり、１、２、３、４、５、６、７、及び８の薬剤部分が抗体に共有的に結合される。式ＩのＡＤＣの組成物は、１から８のある範囲の薬剤とコンジュゲートした抗体の収集体を含む。コンジュゲーション反応からＡＤＣの調製物における抗体当たりの薬剤の平均数は、一般的な手段、例えば質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気泳動、及びＨＰＬＣにより特徴付けられうる。ｐに関してＡＤＣの定量的分布がまた決定されうる。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定の調製物におけるｐの平均値を決定することができる（Hamblett等(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Sanderson等(2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852）。しかしながら、ｐ（薬剤）値の分布は、抗体−抗原結合及びＥＬＩＳＡの検出限界によって識別可能ではない。また、抗体−薬剤コンジュゲートの検出に対するＥＬＩＳＡアッセイは、どこで薬剤部分が抗体に結合しているか、例えば重鎖又は軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基を決定はしない。ある例では、他の薬剤負荷を持つＡＤＣからのｐがある値である均一なＡＤＣの分離、精製、及び特徴付けは、例えば逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動により達成されうる。
【０２４０】
ある抗体−薬剤コンジュゲートでは、ｐは抗体上の結合部位の数によって制限されうる。例えば、抗体は一又は数個だけのシステインチオール基を有し得、又はリンカーが結合されうる一又は数個だけの十分に反応性のチオール基を有しうる。例えばｐ＞５のより高い薬剤負荷は、ある種の抗体−薬剤コンジュゲートの凝集、非溶解性、毒性、又は細胞透過性の喪失を生じうる。
【０２４１】
典型的には、薬剤部分の理論的最大値よりも少ないものがコンジュゲーション反応中に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、薬剤−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）又はリンカー試薬と反応しない多くのリジン残基を含みうる。最も反応性のリジン基のみがアミン反応性リンカー試薬と反応しうる。また、最も反応性のシステインチオール基だけがチオール反応性リンカー試薬と反応しうる。一般に、抗体は、薬剤部分に結合されうる多くの、あるならば遊離の及び反応性のシステインチオール基は含まない。化合物の抗体中の殆どのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的又は全体的還元条件下で、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はＴＣＥＰのような還元剤で還元されなければならない。また、抗体には、例えばリジン又はシステインのような反応性求核基を暴露させる変性条件を施さなければならない。ＡＤＣの負荷（薬剤／抗体比）は、（ｉ）抗体に対してモル過剰の薬剤−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）又はリンカー試薬を制限し、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間又は温度を制限し、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する還元的条件を部分的にするか制限することを含む幾つかの異なった形で制御されうる。
【０２４２】
鎖内又は分子間ジスルフィド結合を形成しないシステインアミノ酸を、抗体中の反応性部位に操作しうる（米国特許第７５２１５４１号）。操作されたシステインチオールは、チオール反応性の、電子吸引基、例えばマレイミド又はα−ハロアミドを有する本発明のリンカー試薬又は薬剤−リンカー試薬と反応して、システイン操作抗体及びアントラサイクリン誘導体薬剤部分とＡＤＣを形成しうる。よって、薬剤部分の位置は設計され、制御され、既知でありうる。薬剤負荷は、操作されたシステインチオール基が典型的には高収率でチオール反応性リンカー試薬又は薬剤−リンカー試薬と反応するので、制御されうる。重鎖又は軽鎖上の単一部位の置換によりシステインアミノ酸を導入するためにＩｇＧ抗体を操作することにより対称抗体上に二つの新しいシステインが得られる。２に近く、コンジュゲーション生成物ＡＤＣの均一性に近い薬剤負荷を達成することができる。
【０２４３】
抗体の一を越える求核又は求電子基が薬剤−リンカー中間体、又は薬剤部分試薬が続くリンカー試薬に反応する場合、得られる生成物は、抗体に結合した１、２、３等の薬剤部分の分布を持つＡＤＣ化合物の混合物である。液体クロマトグラフィー法、例えばポリマー逆相（ＰＬＲＰ）及び疎水性相互作用（ＨＩＣ）は、薬剤負荷値によって化合物を分離しうる。単一の薬剤負荷値（ｐ）のＡＤＣの調製物は単離されうるが、これらの単一の負荷値ＡＤＣは、薬剤部分が抗体上の異なった部位にリンカーを介して結合されうるので、なお均一混合物でありうる。
【０２４４】
よって、本発明の抗体−薬剤コンジュゲート組成物は、抗体が一又は複数のアントラサイクリン誘導体薬剤部分を有し、薬剤部分が様々なアミノ酸残基で抗体に結合されうる抗体−薬剤コンジュゲート化合物の混合物を含む。
【０２４５】
抗体−薬剤コンジュゲートの調製
式ＩのＡＤＣは、（１）共有結合を介して抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成するための二価リンカー試薬との抗体の求核基又は求電子基の反応と、続く活性化された薬剤部分試薬との反応；及び（２）共有結合を介して薬剤−リンカー試薬Ｄ−Ｌを形成するためのリンカー試薬との薬剤部分試薬の求核基又は求電子基の反応と、続く抗体の求核基又は求電子基との反応を含む、当業者に知られた有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、幾つかの経路によって調製されうる。コンジュゲーション方法（１）及び（２）を様々な抗体、薬剤部分、及びリンカーと共に用いて、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲートを調製することができる。
【０２４６】
抗体上の求核基には、限定するものでないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される場合は糖ヒドロキシル基又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核であり、反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合を形成することができる。ある抗体は、還元性の鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（Cleland試薬、ジチオトレイトール)又はTCEP (トリス(2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Getz等(1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures、Beverly、MA）による処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性であるようにしてもよい。よって、各システイン架橋は、理論的には２の反応性のチオール求核基を形成する。更なる求核基は、チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウト試薬）を用いてリジンを反応させることによって抗体に導入することができる。
【０２４７】
抗体−薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応しうる求電子部分を導入するための抗体の修飾によってまた生産することができる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸酸化試薬で酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成せしめることができる。得られたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得、又は例えば水素化ホウ素試薬によって還元して安定なアミン結合を形成せしめることができる。一実施態様では、グリコシル化抗体の糖鎖部分のガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応は、薬剤上の適切な基と反応しうるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基をタンパク質に生じせしめる（Hermanson、G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York、p 234-242。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含むタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し得、第一アミノ酸の代わりにアルデヒドの生産を生じる（Geoghegan及びStroh、(1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; 米国特許５３６２８５２）。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー求核試薬と反応しうる。
【０２４８】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、リンカー部分上の求電子基及び（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基を含む。反応性求核基は標準的な官能基相互変換によってアントラサイクリン誘導体化合物に導入されうる。例えば、ヒドロキシル基を光延型反応によってチオール基に転換して、チオール修飾薬剤化合物を形成することができる。
【０２４９】
表２中の抗体-薬剤コンジュゲートは実施例中の記載方法に従って調製し、インビトロ細胞増殖アッセイ及びインビボ腫瘍異種移植増殖阻害によって効能を試験した。
2011528360.tif 000089
2011528360.tif 000090
【０２５０】
腫瘍関連抗原及び細胞表面レセプターに対する抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）のスクリーニング
癌細胞を検出するためのアッセイ方法は、細胞を抗体−薬剤コンジュゲート化合物に暴露し、細胞に対する抗体−薬剤コンジュゲート化合物の結合の度合いを決定することを含む。動物モデル及び細胞ベースアッセイにおいて同定される式ＩのＡＤＣ化合物を腫瘍を持つより高等の霊長類及びヒト臨床治験で更に試験することができる。
【０２５１】
トランスジェニック動物及び細胞株は、腫瘍関連抗原及び細胞表面レセプター、例えばＨＥＲ２の過剰発現を含む疾病又は疾患の予防的又は治療的処置として潜在性を有している抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）のスクリーニングにおいて特に有用である（米国特許第６６３２９７９号）。有用なＡＤＣのスクリーニングは、トランスジェニック動物にある範囲の用量にわたって候補ＡＤＣを投与し、評価されている疾病又は疾患に対するＡＤＣの効果を様々な時点でアッセイすることを含みうる。あるいは、又は付加的に、薬剤は、もし適用されるならば、疾患のインデューサーへの暴露の前又は暴露と同時に投与されうる。候補ＡＤＣは、中程度又は高スループットのスクリーニング設定で連続的に及び個々に、又は平行にスクリーニングされうる。ＡＤＣが疾病又は疾患の予防的又は治療的処置に対する有用性に対してＡＤＣをスクリーニングすることができる速度は、データの検出／測定／解析を含む合成又はスクリーニング方法の速度によってのみ制限される。
【０２５２】
一実施態様は、（ａ）安定な乳癌細胞からの細胞を非ヒト動物に移植し、（ｂ）ＡＤＣ薬剤候補剤を非ヒト動物に投与し、及び（ｃ）移植された細胞株からの腫瘍の形成を阻害する候補剤の能力を決定することを含むスクリーニング法である。本発明はまたレセプタータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる疾病又は疾患の治療のためのＡＤＣ候補剤をスクリーニング方法であって、（ａ）安定な乳癌細胞株由来の細胞を薬剤候補に接触させ、（ｂ）安定な細胞株の増殖を阻害するＡＤＣ候補の能力を評価することを含む方法に関する。
【０２５３】
一実施態様は、（ａ）安定な乳癌細胞からの細胞をＡＤＣ薬剤候補と接触させ、（ｂ）ＡＤＣ候補の、細胞死を誘発し、アポトーシスを誘導し、ヘレグリン結合をブロックし、リガンド刺激チロシンリン酸化をブロックし、又はＨＥＲ２のリガンド活性化をブロックする能力を評価することを含むスクリーニング法である。他の実施態様では、ＡＤＣ候補の能力が評価される。他の実施態様では、ＡＤＣ候補の能力が評価される。
【０２５４】
他の実施態様は、（ａ）例えばその乳腺細胞において天然ヒトタンパク質、例えばＨＥＲ２又はその断片を過剰発現し、腫瘍を発症するトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ここで、かかるトランスジェニック哺乳動物はそのゲノム中に天然ヒトタンパク質の生物学的活性を有するその発現を仕向ける転写調節配列に作用可能に結合した天然ヒトタンパク質をコードする核酸配列又はその断片をそのゲノム中に安定に組み込んでいる）にＡＤＣ薬剤を投与することを含むスクリーニング方法である。候補ＡＤＣは、ある範囲の用量にわたってトランスジェニック動物に投与され、化合物に対する動物の生理学的応答を経時的に評価することにより評価される。投与は、評価される化合物の化学的性質に応じて経口的又は適切な注射によりうる。ある場合には、化合物の効果を亢進しうる共因子と共に化合物を投与するのが適切でありうる。被験体のトランスジェニック動物から取り出された細胞株を用いて、ある種の腫瘍関連抗原タンパク質又は細胞表面レセプターの過剰発現、例えばＨＥＲ２過剰発現に関連する様々な疾患を治療するのに有用な化合物をスクリーニングするために使用される。ＨＥＲ２を特異的に標的とする増殖阻害性ＡＤＣ化合物を同定するために、トランスジェニック動物から由来されたＨＥＲ２過剰発現癌細胞の増殖を阻害するＡＤＣをスクリーニングしうる（米国特許第５６７７１７１号）。
【０２５５】
インビトロ細胞増殖アッセイ
一般に、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞傷害性又は細胞分裂抑制活性は、細胞培養培地中のＡＤＣの抗体に腫瘍関連抗原又はレセプタータンパク質を有する哺乳動物細胞を暴露し；約６時間から約５日の期間、細胞を培養し；細胞生存率を測定することにより、測定される。細胞ベースのインビトロアッセイを使用して、ＡＤＣの生存率、すなわち、増殖（ＩＣ５０）、細胞傷害性（ＥＣ５０）、及びアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定することができる。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイは商業的に入手可能であり（Promega Corp., Madison, WI)、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ  ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ方法である（米国特許第５５８３０２４号；米国特許第５６７４７１３号；米国特許第５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である（Crouch等(1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; 米国特許6602677）存在しているＡＴＰの定量に基づき培養中の生存細胞の数を決定する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは９６ウェル形式で実施され、それを自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に受け入れられるものにする（Cree等(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404）。該均一アッセイ手順は、血清補填培地で培養された細胞に直接単一の試薬(CellTiter-Glo（登録商標）試薬)を加えることを含む。細胞洗浄、培地の除去及び複数のピペット操作工程は必要とされない。該システムは、試薬を添加し混合した後、１０分で３８４ウェル形式で１５細胞／ウェルと少ない検出を行う。
【０２５６】
親薬剤との比較でのコンジュゲートの細胞傷害性の保持の評価は、ＡＴＰの定量に基づく試験によって評価することができる。Ａ２７８０ヒト卵巣及びＭＣＦ７ヒト乳癌細胞（１２５０細胞／ウェル）を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０又はＥＭＥＭプラス１０％の仔ウシ血清）中の白い３８４ウェルプレートに播種し、播種から２４時間後に０．１％のＤＭＳＯ中に溶解した化合物で処理した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートし、７２時間後にプレートを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Promega）を製造者の指示書に従って使用して処理した。
【０２５７】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏは、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づく均一な方法である。ＡＴＰは、光発生を生じるルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンに基づくシステムを使用して定量される。発光シグナルは培養中に存在する細胞数に比例する。簡潔に述べると、２５μＬ／ウェルの試薬溶液を各ウェルに添加し、５分後にシャッキングマイクロプレートをルミノメーターによって読み取った。発光シグナルは培養中に存在する細胞数に比例する。
【０２５８】
式Ｉｃの抗体−薬剤コンジュゲートの抗増殖効果（表６）を、３日の連続暴露実験において図８−２９においてＨＥＲ２発現腫瘍細胞株に対してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ(実施例９）によって測定した。
【０２５９】
図８は、遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、リンカー薬剤：ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、リンカー薬剤：マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、リンカー薬剤：マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２、及びリンカー薬剤：チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞のＨＥＲ２発現レベルは３＋である。ＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖はＰＮＵ−１５９６８２への連続暴露によって最も強力に阻害された。短い（１時間）暴露がまたＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を効果的に阻害した。ヒドラゾン結合Ａｎｔ５２及び５３は遊離のＡｎｔよりも効力は少なかったが、ケタール結合Ａｎｔ５０及び５１リンカー薬剤中間体が最小の抗体増殖活性を示した。
【０２６０】
図９は、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、リンカー薬剤：ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、リンカー薬剤：マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、リンカー薬剤：マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２、及びリンカー薬剤：チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＢＴ−４７４細胞のＨＥＲ２発現レベルは３＋である。ＢＴ−４７４細胞増殖は、ＰＮＵ−１５９６８２への連続暴露によって最も強力に阻害された。短い（１時間）暴露がまたＢＴ−４７４細胞の増殖を効果的に阻害した。ヒドラゾン結合Ａｎｔ５２及び５３は最小の抗増殖活性を示したが、ケタール結合Ａｎｔ５０及び５１は不活性であった。
【０２６１】
図１０は、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、リンカー薬剤：ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、リンカー薬剤：マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、リンカー薬剤：マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２、及びリンカー薬剤：チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３の濃度に対するＭＣＦ７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＭＣＦ７細胞増殖は、ＰＮＵ−１５９６８２への連続暴露によって最も強力に阻害された。短い（１時間）暴露がまたＭＣＦ７細胞の増殖を効果的に阻害した。ヒドラゾン結合Ａｎｔ５２及び５３は最小の抗増殖活性を示したが、ケタール結合Ａｎｔ５０及び５１は不活性であった。
【０２６２】
図１１は、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の連続暴露、遊離薬剤：ＰＮＵ−１５９６８２の１時間のインキュベーション、リンカー薬剤：ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ５０、リンカー薬剤：マレイミド−ケタール−Ａｎｔ５１、リンカー薬剤：マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ５２、及びリンカー薬剤：チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ５３の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＤｏｘＲｅｓ ＨＥＲ２細胞のＨＥＲ２発現レベルは３＋であり、高ＰｇＰ／ＭＤＲ１である。ＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞増殖は、ＰＮＵ−１５９６８２への連続暴露によって最も強力に阻害された。短い（１時間）暴露がまたＡｄｒＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞の増殖を阻害した。ヒドラゾン結合Ａｎｔ５２及び５３は遊離のＡｎｔよりも効力は少なかったが、ケタール結合Ａｎｔ５０及び５１は最小の抗体増殖活性を示した。ＤｏｘＲｅｓ Ｈｅｒ２細胞株はまた「ＡｄｒＲｅｓ Ｈｅｒ２」としても知られている。
【０２６３】
図１２は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２，及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０３がＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して最も強力な抗増殖活性を示した。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０２及びＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１はＩＣ５０に関して等しく強力であったが、１０２でのＳＫ−ＢＲ−３細胞の処理は１０１より大きい細胞死滅を生じた。試験した全てのコンジュゲートはトラスツズマブよりも強力であった。
【０２６４】
図１３は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２，及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３がＢＴ−４７４細胞に対して最も強力な抗増殖活性を示した。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０２及びＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ＢＴ−４７４細胞の増殖の阻害において等しく強力であった。試験した全てのコンジュゲートはトラスツズマブよりも強力であった。
【０２６５】
図１４は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２，及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。ＭＣＦ７細胞のＨＥＲ２発現レベルは正常である。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０３は、Ｈｅｒ２−正常ＭＣＦ７細胞株に対して強力な抗増殖活性を示した。トラスツズマブ、Ｔｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１及びチオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０２はＭＣＦ７細胞には活性ではなかった。
【０２６６】
図１５は、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０３は、高レベルのＨＥＲ２及び多薬剤耐性トランスポーターＭＤＲ１／ＰｇＰの双方を発現するＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞に対して強い抗増殖活性を示した。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０３は、試験した二つの最も高い濃度（３．３及び１０ｕｇ／ｍｌ）でのみ活性であり、Ｔｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１及びトラスツズマブはこの細胞株ついて最小の活性を示した。
【０２６７】
図１６は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５及びＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１は、ＩＣ５０に関してＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖について等価な効力を示し、１０５での処理は大きな細胞死滅を生じた。標的化されていないコントロール抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０はまたＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して強い抗増殖活性を示した。試験した全てのコンジュゲートはトラスツズマブよりもより強力であった。
【０２６８】
図１７は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１０５はＢＴ−４７４細胞について最も強力な抗増殖活性を示した。Ｔｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１での処理はまたＢＴ−４７４細胞の増殖阻害を生じた。標的化されていないコントロール抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０はＢＴ−４７４細胞に対して強い抗増殖活性を示した。試験した全てのコンジュゲートはトラスツズマブよりもより強力であった。
【０２６９】
図１８は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５及び抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０は、低ＨＥＲ２−発現ＭＣＦ７細胞に対して等価な活性を示した。トラスツズマブ及びＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１はＭＣＦ７には活性ではなかった。
【０２７０】
図１９は、抗ＣＤ２２ＮＨＳケタール−Ａｎｔ１１０、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）Ｈｅｒ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５及び抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０はＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞に対して等価な活性を示した。Ｔｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１は中程度の活性を示し、トラスツズマブはＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２に効果はなかった。
【０２７１】
図２０は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。
【０２７２】
図２１は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、及びＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＳＫ−ＢＲ−３の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。過去に報告されたように、トラスツズマブは細胞分裂抑制機序を通してＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を中程度に阻害する。標的化されていないコントロールＡＤＣチオ−抗ＣＤ２２−ＨＣ−ケタール−Ａｎｔ１０７及び抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０は、試験された最も高い用量でのみ抗増殖活性を示した。標的化されていないコントロールＡＤＣｓチオ−抗ＣＤ２２−ＨＣ−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８及びチオ−抗ＣＤ２２−Ｈ−チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０９は、ＨＥＲ２−標的化ＡＤＣｓと等価なＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖阻害能力を示し（図２０）、ヒドラゾン結合ＡＤＣｓの不安定さを示している。μＭ濃度で投与された遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２は、全ての試験用量で細胞傷害性を生じさせた。
【０２７３】
図２２は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。試験した全てのＡＤＣｓはＢＴ−４７４細胞増殖に対して類似の活性を示した。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ１０６は最も低いＩＣ５０（０．０１μｇ／ｍｌ）を有し、チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０３及びチオ−Ｔｒ−ＨＣ−チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０４での処置は最も多量の全増殖阻害を生じた。
【０２７４】
図２３は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、及びＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＢＴ−４７４の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。過去に報告されたように、トラスツズマブは細胞分裂抑制機序を通してＢＴ−４７４細胞の増殖を中程度に阻害する。標的化されていないコントロールＡＤＣｓのチオ−抗ＣＤ２２−ＨＣ−ケタール−Ａｎｔ１０７及び抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０はＢＴ−４７４細胞に対して抗増殖効果を有していなかった。標的化されていないコントロールＡＤＣｓのチオ−抗ＣＤ２２−ＨＣ−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８及びチオ−抗ＣＤ２２−Ｈ−チオピリジン−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０９は、ＨＥＲ２標的化ＡＤＣｓと均等のＢＴ−４７４細胞増殖阻害の能力を示し（図２２）、ヒドラゾン結合ＡＤＣｓの不安定性を示している。μＭ濃度で投与された遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２は試験した全ての用量で細胞傷害性を生じさせた。
【０２７５】
図２４は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ヒドラゾン−Ａｎｔ１０３及びチオ−Ｔｒ−ＨＣ−チオピリジン−Ａｎｔ１０４のみがＨＥＲ２−低ＭＣＦ７細胞に対する抗増殖効果を有しており、ヒドラゾン結合ＡＤＣｓの不安定性を示している。試験された全ての他のＡＤＣｓ（チオ−Ｔｒ−ＨＣ−ｖｃ−ＭＭＡＥ１０６、Ｔｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１、チオ−Ｔｒ−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０２及びチオ−Ｔｒ−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５）はＭＣＦ７細胞増殖に効果はなかった。
【０２７６】
図２５は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、及びＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するＭＣＦ−７の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。過去の報告と一致して、トラスツズマブは低ＨＥＲ２発現ＭＣＦ７細胞に対して完全に不活性であった。標的化されていないコントロールＡＤＣｓのチオ−抗ＣＤ２２−ＨＣ−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０７及びチオ−抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０もまたＭＣＦ７細胞の増殖を阻害せず、安定なケタールリンカーからの薬剤放出欠如を示している。ヒドラゾン結合非標的化コントロールＡＤＣｓ１０８及び１０９はＭＣＦ７細胞に対して抗増殖効果を示しており、不安定なヒドラゾン結合ＡＤＣｓからの薬剤の放出を示している。μＭ用量で投与された遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２は全ての試験濃度で細胞傷害性を生じさせた。
【０２７７】
図２６は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１，及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）／ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。１０６はＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞の増殖について効果がなくＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１は最小の効果を有していたが、ケタール結合ＡＤＣ１０２及び１０５は試験した最も高い濃度でのみ活性である一方、ヒドラゾン結合ＡＤＣ１０３及び１０４はＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞の増殖を強力に阻害した。
【０２７８】
図２７は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、及びＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）／ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示す。トラスツズマブ単独ではＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞の増殖に対して効果がなかった。ケタール結合非標的コントロールＡＤＣ１０７及び１１０は試験された最も高い濃度でのみＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞の増殖を阻害する一方、ヒドラゾン結合非標的コントロールＡＤＣ１０８及び１０９はＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞に対する強力な抗増殖活性を示した。全ての４種の非標的抗ＣＤ２２−ＡｎｔコントロールＡＤＣの活性はＨＥＲ２標的チオ−ＡｎｔＡＤＣと同様であった（図２６）。μＭ用量で投与された遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２は試験した全ての濃度で増殖を阻害した。
【０２７９】
図２８は、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０４、チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１０５、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１，及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１０６の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）／ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示し、全てベラパミル（１０μｇ／ｍ）の存在下で投与された。ベラパミルは、ＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞上に高度に発現される多剤耐性トランスポーターＭＤＲ１／Ｐ−糖タンパク質（ＰｇＰ）の基質であることが知られている多種の薬剤の流出を阻害する。ベラパミルの添加は、ＤｏｘＲｅｓ／ＨＥＲ２細胞をＴｒ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１の細胞傷害性効果に感受性にし、ＤＭ１がＭＤＲ１／ＰｇＰの基質であることを示している。ベラパミルは試験した他のＡＤＣｓ（１０２−１０６）に対する応答では効果がなく、これらのＡＤＣｓの薬剤効果はＮＤＲ１／ＰｇＰによっては阻害されないことを示している。
【０２８０】
図２９は、トラスツズマブ、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８、チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−チオピリジンヒドラゾン−Ａｎｔ１０９、抗ＣＤ２２−ＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ１１０、及びＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤の濃度に対するドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）／ＨＥＲ２の３日目のインビトロ細胞生存率のプロットを示し、全てベラパミルの存在下で投与された。試験した全てのＡＤＣｓ（１０７−１１０）はベラパミルの存在下で等しく活性であり（図２７と比較）、Ａｎｔ薬剤がＭＤＲ１／ＰｇＰの基質ではないことを示している。
【０２８１】
表３は、図２０−２９の試験化合物の細胞増殖のＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ７、ドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）、及びドキソルビシン耐性（ＤｏｘＲｅｓ）とベラパミルの阻害に対するＩＣ５０値（ｕｇ／ｍｌ）をまとめている。ＳＫ−ＢＲ−３及びＢＴ−４７４をＭＣＦ７と比較すると、マレイミド−ケタール−Ａｎｔ及びＮＨＳ−ケタール−Ａｎｔ ＡＤＣは標的依存性死滅を示す一方、ヒドラゾン結合Ａｎｔ ＡＤＣは標的独立性で非選択的な死滅を示す。
【０２８２】
2011528360.tif 000091
2011528360.tif 000092
【０２８３】
式Ｉｃの抗体−薬剤コンジュゲートの抗増殖効果（表６）を、３日の連続暴露実験において、ＣＤ２２陽性、Ｂ−リンパ腫細胞株：ＢＪＡＢ、ＧＲＡＮＴＡ、ＤｏＨＨ２及びＳｕＤＨＬ４に対してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイによって測定した（実施例９）。ジャーカット細胞（ＣＤ２２陰性）をネガティブコントロールとして抗体−薬剤コンジュゲートで処理した。
【０２８４】
表４は、３日の連続暴露実験において、試験抗体−薬剤コンジュゲート化合物によるＢＪＡＢ、ＧＲＡＮＴＡ、ＤｏＨＨ２ ＳｕＤＨＬ４及びジャーカット細胞株の阻害に対するＩＣ５０値（ｕｇ／ｍｌ）をまとめる。抗ＣＤ２２抗体−薬剤コンジュゲート１０７−１１０は、非常に強力な細胞死滅効果を示した。有意な細胞死滅がネガティブコントロール抗ＨＥＲ２抗体薬剤コンジュゲート１０２−１０５で観察された。ＣＤ２２陰性ジャーカット細胞に対して有意な細胞死滅が、抗ＣＤ２２抗体−薬剤コンジュゲート１０７−１１０で観察された。
【０２８５】
2011528360.tif 000093
【０２８６】
マウスにおけるインビボ血清クリアランス及び安定性
ＡＤＣの血清クリアランス及び安定性を、実施例１０の手順に従って、ヌードの未処置（外因的移植片から受容した腫瘍がない）マウスにおいて調べることができる。全抗体及びＡＤＣの量の差が、リンカーの開裂とその薬剤部分からの抗体の分離を示している。
【０２８７】
コンジュゲートの安定性をＨＰＬＣ分析を使用して研究した。コンジュゲートを３７℃でｐＨ４及び５．２の酢酸アンモニウムバッファー中でインキュベートした。ついで、各溶液を、周期的に取り上げて、上に報告した方法を使用してＨＰＬＣカラムに適用した。コンジュゲートから遊離させられた物質の量を決定し、遊離された材料の割合として表した。
【０２８８】
インビボ効力
抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の治療効果と親薬剤との比較でのその治療効果の改善を、ヒト移植腫瘍の動物モデルで評価した。ヒト腫瘍の異種移植片を有するマウスを適切な用量の抗体−薬剤コンジュゲート、ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤、及びネイキッド抗体（所定用量）で処置し、腫瘍増殖を記録し、異なった処置群で比較した。図３０−３２は、マウスにおける異種移植腫瘍阻害による式Ｉｃの抗体−薬剤コンジュゲートの効果を示す。
【０２８９】
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートの効力は、齧歯類に癌細胞又は原発性腫瘍の同種移植又は異種移植片を移植し、実施例１２の手順に従ってＡＤＣで腫瘍を処置することによってインビボで測定されうる。細胞株、癌細胞上に存在するレセプターへのＡＤＣの抗体結合の特異性、投薬レジメン、及び他の因子に応じて様々な結果が予想される。例えば、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣのインビボ効力は、高度にＨＥＲ２を発現するトランスジェニック外植マウスモデルによって測定することができる。同種移植片は、ハーセプチン治療法に応答しないか僅かにしか応答しないＦｏ５ｍｍｔｖトランスジェニックマウスから増殖されうる。被験者はＡＤＣで一回処置され、３−６週にわたってモニターされて、腫瘍が倍になる時間、対数細胞死滅、及び腫瘍収縮が測定される。追跡用量応答及び多用量実験を更に実施しうる。
【０２９０】
図３０は、（１）ビヒクル、（２）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１１ １ｍｇ／ｋｇ、（３）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ １ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ５ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０３ １ｍｇ／ｋｇ、（８）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドヒドラゾン−Ａｎｔ１０８ １ｍｇ／ｋｇ、（９）ＰＮＵ−１５９６８２遊離薬剤８．７７ｕｇ／ｋｇで、０日目に単一の投薬後のＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス中に播種したバーキットリンパ腫Ｂｊａｂ−ｌｕｃ異種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。全ての抗ＣＤ２２コンジュゲート（１０７、１０８及び１１１）が標的特異的腫瘍増殖阻害を示し、ケタール結合抗ＣＤ２２ＡＤＣ１０７の阻害活性は用量依存的であった。等価な用量の遊離薬剤ＰＮＵ−１５９６８２及び非標的コントロールＡＤＣｓ（１０２及び１０３）は腫瘍増殖について効果がなかった。
【０２９１】
表５は、４８日のインビボＢｊａｂ−ｌｕｃ異種移植腫瘍効力研究における図３０の各試験化合物処置群に対する薬剤暴露レベル、平均薬剤負荷、腫瘍発生率、及び応答を示す。Ｂｊａｂ−ｌｕｃ（ＥＢＶ−陰性バーキットリンパ腫、ルシフェラーゼ発現Ｂｊａｂ細胞）腫瘍はＣＤ２２レセプタータンパク質を発現する（Polson等(2009)Cancer Res. 69(6):2358-2364；米国特許２００８／００５０３１０；米国特許２００５／０２７６８１２）。ＣＤ２２は殆どのＮＨＬ細胞のＢ細胞区画内及び表面上にのみ発現される（D'Arena等（2000)Am J Hematol. 64:275-81； Olejniczak等(2006)Immunol Invest. 35:93-114）。モデル系としてのマウスのＢｊａｂ−ｌｕｃ異種移植腫瘍の阻害における効力は、例えば非ホジキンリンパ腫のような造血性腫瘍の患者の治療における臨床的応答を予測しうる。抗ＣＤ２２ＡＤＣの全て（１０７、１０８、１１１）が、Ｂｊａｂ−ｌｕｃ細胞に結合しなかったビヒクル及びコントロールＡＤＣ（１０２及び１０３）と比較して腫瘍阻害において効果的であった。コントロールＡＤＣでの活性の欠如は、標的化ＡＤＣで見られる活性が特異的であり、例えば、遊離薬剤の全身性放出によるものではないことを示している。数例では、抗ＣＤ２２コンジュゲート（１０７、１０８、１１１）により、腫瘍が阻害されたばかりでなく、部分的及び完全に消失した。これらのデータは、抗ＣＤ２２表面抗原が、本発明のアントラサイクリン−誘導体ＡＤＣのための潜在的に効果的な標的であることを示している。
【０２９２】
2011528360.tif 000094
2011528360.tif 000095
【０２９３】
図３１は、（１）ビヒクル、（２）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ ５ｍｇ／ｋｇ、（３）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ １０ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ １０ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ５ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １０ｍｇ／ｋｇ、（８）トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１ ５ｍｇ／ｋｇ＋チオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０２ ５ｍｇ／ｋｇで、０日目に単一の投薬後のＣＲＬ ｎｕ／ｎｕマウス中に播種したＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５乳房同種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。抗Ｈｅｒ２コンジュゲート（１０１及び１０２）の全てが標的特異的腫瘍増殖阻害を示し、阻害活性は用量依存的であった。等価な用量の標的化されていないコントロールＡＤＣ１０７は腫瘍増殖に効果はなかった。
【０２９４】
表６は、３８日のインビボＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５乳房同種移植腫瘍効力研究（Phillips等(2008) Cancer Res. 68(22):9280-9290; 米国特許２００５／０２７６８１２）における図３１の各試験化合物処置群に対する７日目の腫瘍増殖阻害、薬剤暴露レベル、平均薬剤負荷、腫瘍発生率、及び応答を示す。Ｂｊａｂ−ｌｕｃ（ＥＢＶ−陰性バーキットリンパ腫、ルシフェラーゼ発現Ｂｊａｂ細胞）腫瘍はＣＤ２２レセプタータンパク質を発現する（Polson等(2009) Cancer Res. 69(6):2358-2364; 米国特許２００８／００５０３１０；米国特許２００５／０２７６８１２）。ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５乳房同種移植腫瘍はトラスツズマブ非感受性のＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞株である。標的化抗ＨＥＲ２ＡＤＣ（１０１、１０２，及び１０１と１０２の組合せ）は、ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ Ｆｏ５細胞に結合しないビヒクル及びコントロールＡＤＣ（１０７）と比較して腫瘍増殖において効果的であった。コントロールＡＤＣでの活性の欠如は、標的化ＡＤＣで見られる活性が特異的であり、例えば、遊離薬剤の全身性放出によるものではないことを示している。抗ＨＥＲ２コンジュゲート（１０１、１０２，及び１０１と１０２の組合せ）により、腫瘍が阻害されたばかりでなく、部分的及び完全に消失した。トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１ １０１及びチオ−トラスツズマブ（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミド−ケタール−Ａｎｔ１０２の併用は単剤１０２のものを越える更なる応答を示さなかった。これらのデータは、抗ＨＥＲ２表面抗原が、本発明のアントラサイクリン−誘導体ＡＤＣのための潜在的に効果的な標的であることを示している。
【０２９５】
2011528360.tif 000096
2011528360.tif 000097
【０２９６】
図３２は、（１）ビヒクル、（２）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１２ １ｍｇ／ｋｇ、（３）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ１１２ ３ｍｇ／ｋｇ、（４）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ １ｍｇ／ｋｇ、（５）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ ３ｍｇ／ｋｇ、（６）チオ−抗ｓｔｅａｐ１（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１１３ ６ｍｇ／ｋｇ、（７）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ １ｍｇ／ｋｇ、（８）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ３ｍｇ／ｋｇ、（９）チオ−抗ＣＤ２２（ＨＣ Ａ１１４Ｃ）−マレイミドケタール−Ａｎｔ１０７ ６ｍｇ／ｋｇで、０日目に単一の投薬後の雄ＳＣＩＤ−ベージュマウス中に播種したＬｎＣａｐ−Ｎｅｒ異種移植腫瘍におけるインビボ平均腫瘍体積の経時変化のプロットを示す。抗ｓｔｅａｐ１コンジュゲート（１１２及び１１３）の全てが標的特異的腫瘍増殖阻害を示し、ケタール結合抗ｓｔｅａｐ１ＡＤＣ１１３の阻害活性は用量依存的であった。等価な用量の標的化されていないコントロールＡＤＣ１０７は腫瘍増殖に効果はなかった。
【０２９７】
表７は、４９日のインビボＬｎＣａｐ−Ｎｅｒ異種移植腫瘍効力研究における図３２の各試験化合物処置群に対する薬剤暴露レベル、平均薬剤負荷、腫瘍発生率、及び応答を示す。Ｓｔｅａｐ１（前立腺癌の６回膜貫通型上皮抗原）はヒト前立腺腫瘍に高度に発現される前立腺癌特異的細胞表面抗原である（Ｈｕｂｅｒｔ等(1999) PNAS 96(25):14523-14528）。ＬｎＣａｐ細胞株はｓｔｅａｐ１を高度に発現する。マウスにおけるＬｎＣａｐ−Ｎｅｒ異種移植（Ｊｉｎ等(2004) Cancer Res. 64:5489-5495）腫瘍阻害研究は、患者における前立腺癌の治療の効果的な予知指標でありうる。標的化抗ｓｔｅａｐ１ ＡＤＣ（１１２及び１１３）は、ＬｎＣａｐ細胞に結合しなかったビヒクル及びコントロールＡＤＣ（１０７）と比較して腫瘍阻害において効果的であった。コントロールＡＤＣでの活性の欠如は、標的化ＡＤＣで見られる活性が特異的であり、例えば、遊離薬剤の全身性放出によるものではないことを示している。抗ＨＥＲ２コンジュゲート（１１２及び１１３）により、腫瘍が阻害されたばかりでなく、部分的に消失した。これらのデータは、抗ｓｔｅａｐ１表面抗原が、本発明のアントラサイクリン−誘導体ＡＤＣのための潜在的に効果的な標的であることを示している。
【０２９８】
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【０２９９】
齧歯類毒性
抗体−薬剤コンジュゲート及びＡＤＣマイナスコントロール、「ビヒクル」は、実施例１１に従って、また急性ラットモデル（Brown等(2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 50:333-340）において評価されうる。ＡＤＣの毒性は、雌のスプラーグドーリーラットをＡＤＣで処置した後、様々な器官に対するその効果を調べ分析することによって調査される。全体の観察（体重）、臨床的病理パラメータ（血清化学及び血液検査）及び病理組織診断に基づいて、ＡＤＣの毒性を観察し、特徴付け、測定することができる。
【０３００】
青年期雌ラットにおける複数日急性毒性実験は一又は複数の用量の候補ＡＤＣ、コントロールＡＤＣ、遊離アントラサイクリン誘導体化合物（ＰＮＵ−１５９６８２）及びコントロールビヒクル（０日目）によって実施することができる。体重を周期的に測定する。臨床的化学、血清酵素及び血液学的分析をまた周期的に実施し、病理組織学的評価と共に完全な剖検で結論を出す。体重減少の臨床的観察を含み、ＡＤＣの投与後に動物中においてビヒクルのみが投与された動物に対する体重減少又は体重変化を考慮する毒性シグナルは、全身的又は局所化された毒性の全体的及び一般的指標である。肝毒性は、（ｉ）肝臓酵素、例えばＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（ｇ−グルタミルトランスフェラーゼ）の上昇；（ｉｉ）有糸分裂及びアポトーシス像の数の増加；及び（ｉｉｉ）肝細胞壊死によって測定されうる。血液リンパ系毒性は、白血球、主に顆粒球（好中球）、及び／又は血小板の枯渇、及びリンパ球系器官の関与、つまり萎縮又はアポトーシス活性によって観察される。毒性はまた胃腸管病巣、例えば有糸分裂及びアポトーシス像の数の増加及び変性腸炎によっても気づかれる。
【０３０１】
抗体−薬剤コンジュゲートの薬学的製剤の投与
治療用抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は治療される症状に適した任意の経路によって投与されうる。ＡＤＣは、典型的には非経口的、つまり、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、ボーラス、腫瘍内注射又は硬膜外投与される（Shire等(2004) J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402）。治療用抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的製剤は、典型的には薬学的に許容可能な非経口ビヒクルでの非経口投与用として、また単位投薬形態の注射可能形態で調製される。所望の度合いの純度を有する抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、場合によっては薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤と混合される（Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)16版、Osol、A.編）。
【０３０２】
ＡＤＣは薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と共に薬学的組成物として製剤化されうる。任意の適切な担体又は希釈剤を使用することができる。適切な担体及び希釈剤は生理学的な食塩水及びリンゲルデキストロース液を含む。
【０３０３】
許容されるビヒクル、希釈剤、担体、賦形剤、及び安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、（ｉ）リン酸塩、クエン酸塩、二塩基性リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及び他の有機酸などの緩衝剤；（ｉｉ）アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；（ｉｉｉ）保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンゾイルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンゾイルアルコール；（ｉｖ）アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール、レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；（ｖ）低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；（ｖｉ）ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；（ｖｉｉ）グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；（ｖｉｉｉ）グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グリコール酸ナトリウムスターチ、ソルビトールマンノース、カルボキシメチルセルロース、又はデキストロースを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；（ｉｘ）ＥＤＴＡ等のキレート剤；（ｘ）ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；（ｘｉ）トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商品名）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商品名）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤；（ｘｉｉ）流動促進剤又は顆粒化剤、例えばステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、タルク、シリカ、及び水素化植物油；（ｘｉｉｉ）崩壊剤、例えばクロスポビドン、グリコール酸ナトリウムスターチ又はコーンスターチ；（ｘｉｖ）増粘剤、例えばゼラチン及びポリエチレングリコール；（ｘｖ）腸溶コーティング、例えばクエン酸トリエチル；及び／又は（ｘｖｉ）味覚又はテクスチャー改変剤、消泡剤、顔料、及び乾燥剤を含む。例えば、凍結乾燥抗ＥｒｂＢ２抗体製剤は、出典明示によりここに援用される国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。ＡＤＣの例示的な製剤は、約１００ｍｇ／ｍｌのトレハロース（２−（ヒドロキシメチル）−６−［３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラン−２−イル］オキシ−テトラヒドロピラン−３，４，５−トリオール；Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１；ＣＡＳ番号９９−２０−７）及び約０．１％のＴＷＥＥＮ（商品名）２０（ポリソルベート２０；ドデカン酸２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロフラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチルエステル；Ｃ２６Ｈ５０Ｏ１０；ＣＡＳ番号９００５−６４−５）を約ｐＨ６で含む。
【０３０４】
治療用抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的製剤は、ある量の未反応薬剤部分（Ｄ）、抗体−リンカー中間体（Ａｂ−Ｌ）、及び／又は薬剤−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）を、ＡＤＣの生産プロセスにおける過剰な試薬、不純物、及び副産物の不完全な精製及び分離又は原体ＡＤＣ又は製剤化組成物の貯蔵時における時間的／温度的加水分解又は分解の結果として含みうる。例えば、ＡＤＣの製剤は、検出可能な量の遊離薬剤を含みうる。あるいは又は加えて、それは、検出可能な量の薬剤−リンカー中間体を含みうる。あるいは又は加えて、それは検出可能な量の抗体を含みうる。また活性な薬学的成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical sciences 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０３０５】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例は、ＡＤＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)等の分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。
【０３０６】
製剤は簡便には単位投薬形態で提供することができ、薬学の分野でよく知られている方法の任意のものによって調製することができる。一般に技術及び製剤はRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co., Easton, PA）に見出される。このような方法は、一又は複数の補助成分を構成する担体と活性成分を混合する工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を、液体の担体又は細かく粉砕された固体担体又はその両方と均一にかつ密に混合し、ついで必要ならば生成物を成形することによって調製される。
【０３０７】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合せしめられて活性物質（ＡＤＣ）を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメローゼ、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガム、及び分散又は湿潤剤、例えば天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合産物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとのエチレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液はまた一又は複数の保存料、例えばエチル又はｎ-プロピルｐ-ヒドロキシ-ベンゾアート、一又は複数の着色剤、一又は複数の香味剤及び一又は複数の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンを含みうる。
【０３０８】
ＡＤＣの薬物学的組成物は滅菌された注射用製剤の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液であってもよい。この懸濁液は上に述べた好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術に従って処方することができる。滅菌された注射用製剤はまた１,３-ブタン-ジオール溶液又は凍結乾燥粉末として調製したもののように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒は水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として常套的に用いることができる。この目的に対して、合成のモノ-又はジグリセリドを含む任意のブランドの固定化油を用いることができる。また、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
【０３０９】
単位投薬形態を製造するために担体物質と混合されうる活性成分の量は治療されるホストと特定の投与形式に応じて変わる。例えば、静脈点滴のための水溶液は、約３０ｍＬ／ｈｒの割合で適した体積の点滴が生じうるようにするために溶液１ミリリットル当たり約３から５００μｇの活性成分を含みうる。皮下（ボーラス）投与は、約１．５ｍｌ以下の全容量及び１ｍｌ当たり約１００ｍｇのＡＤＣの濃度でなされうる。頻繁で慢性的な投与を必要とするＡＤＣでは、皮下経路は例えば予め充填されたシリンジ又は自動注入装置技術によって用いられうる。
【０３１０】
一般的提案としては、一用量当たりに投与されるＡＤＣの当初の薬学的に有効な量は、約０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ、つまり一日当たり患者の体重に対して約０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される化合物の典型的な当初の範囲は、０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。例えば、ヒト患者はｋｇ患者体重当たり約１．５ｍｇのＡＤＣが初期投与されうる。投与量は、最大の許容容量（ＭＴＤ）まで増加されうる。投薬スケジュールは約３週間毎でありうるが、診断症状又は応答に応じて、スケジュールはより頻繁にされ又は頻度が少なくされうる。用量はまた例えば約４回又はそれ以上のような複数サイクルで安全に投与されうるＭＴＤ又はそれ以下になるように治療の過程において更に調節することができる。
【０３１１】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。
【０３１２】
タンパク質治療剤の経口投与は腸での加水分解又は変性のために一般に好ましくないが、経口投与に適したＡＤＣの製剤は、予め決められた量のＡＤＣをそれぞれ含むカプセル、カチェット(cachets)又は錠剤のような個別単位として調製することができる。
【０３１３】
製剤は、単位投薬又は複数投薬容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時混合注射溶液及び懸濁液は既に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。例示的な単位投薬製剤は、活性成分の、毎日の投薬又は毎日の部分用量単位、又はその適切なフラクションを含むものである。
【０３１４】
抗体-薬剤コンジュゲート治療法
本発明の抗体-薬剤コンジュゲートは抗腫瘍剤として有用である。哺乳動物、例えばヒト又は動物は、従って、上で定義された式Ｉの薬学的に有効な量をそれに投与することを含む方法によって治療されうる。ヒト又は動物の症状はこのようにして和らげられ又は改善されうる。
【０３１５】
式ＩのＡＤＣを使用して、腫瘍関連抗原の過剰発現によって特徴付けられるものを含む癌及び自己免疫症状のような様々な疾病又は疾患を治療することができる。例示的な症状又は疾患は、良性又は悪性腫瘍；白血病及びリンパ系悪性腫瘍；他の疾患、例えばニューロン、グリア、アストロサイト、視床下部、腺性、マクロファージ、上皮、ストローマ、胞胚腔、炎症性、血管新生及び免疫疾患を含む。ＡＤＣ治療に感受性の癌タイプは、ある種の腫瘍関連抗原又は細胞表面レセプター、例えばＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるものを含む。
【０３１６】
一方法は哺乳動物における癌の治療のもので、ここで、癌はＥｒｂＢレセプターの過剰発現によって特徴付けられるものである。哺乳動物は場合によっては未コンジュゲート抗ＥｒｂＢ抗体での治療に応答しないか又は乏しく応答する。該方法は、抗体−薬剤コンジュゲート化合物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む。増殖因子レセプター、例えばＨＥＲ２レセプター又はＥＧＦレセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖は、上記増殖因子レセプターに特異的に結合する式ＩのＡＤＣ及び化学療法剤を患者に投与することによって阻害され得、ここで、上記抗体−薬剤コンジュゲート及び上記化学療法剤はそれぞれ患者において腫瘍細胞の増殖を阻害する量で投与される。
【０３１７】
ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴付けられる疾患に感受性であるかその診断を受けているヒト患者は、式ＩのＡＤＣ及び化学療法剤の組合せを投与することによって治療されうる。このような過剰な活性化はＥｒｂＢレセプター又はＥｒｂＢリガンドの過剰発現又は生産の増加に起因しうる。一実施態様では、診断又は予後アッセイは、患者の癌がＥｒｂＢレセプターの過剰な活性化によって特徴付けられるかどうかを決定するために実施される。例えば、癌におけるＥｒｂＢ遺伝子増幅及び／又はＥｒｂＢレセプターの過剰発現が決定されうる。このような増幅／過剰発現を決定するための様々なアッセイが当該分野で利用可能であり、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ及びシェッド（ｓｈｅｄ）抗原アッセイを含む。
【０３１８】
ここで治療される癌の例は、限定しないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉芽腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含む。このような癌のより特定の例は、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺癌の腺癌及び肺癌の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（gastric又はstomach）、例えば胃腸癌、消化管間葉性腫瘍(GIST)、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌を含む。
【０３１９】
疾患の予防又は治療のために、ＡＤＣの適切な用量は、上述のような治療されるべき疾患のタイプ、疾患の重篤度及び過程、分子が予防目的か治療目的で投与されるかどうか、患者の臨床歴、及び抗体への応答、及び担当医師の裁量に依存する。ＡＤＣ製剤は、好適には一回で又は一連の治療で患者に投与される。疾患のタイプ及び重篤度に応じて、ＡＤＣの約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば一又は複数回の別個の投与か又は連続注入にかかわらず、患者への投与に対する最初の候補用量である。典型的な用量レジメンは、上述の要因に応じて、約１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲となるかも知れない。患者に投与されるＡＤＣの例示的な用量は、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。症状に応じて、数日以上にわたる繰り返し投与に対して、疾患兆候の所望の抑制が生じるまで、治療が維持される。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量と、これに続く約２ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの毎週の維持用量の投与を含む。他の投薬レジメンが有用でありうる。
【０３２０】
併用療法
抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗癌特性を有する第二化合物と、薬学的併用製剤又は併用療法としての投薬計画で併用することができる。薬学的併用製剤又は投薬計画の第二化合物は好ましくは互いに悪影響を及ぼさないように併用のＡＤＣに相補的な活性を持つ。
【０３２１】
第二化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、抗アンドロゲン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子療法ワクチン、抗血管新生剤及び／又は心保護剤でありうる。このような分子は、適切には、意図される目的に効果的である量で併用されて存在する。ＡＤＣを含む薬学的組成物はまた治療的有効量の化学療法剤、例えばチューブリン形成阻害剤、ポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡバインダーを有しうる。
【０３２２】
あるいは、又は加えて、第二化合物は、腫瘍関連抗原又はレセプターに結合し又はそのリガンド活性化をブロックする抗体でありうる。第二抗体は、細胞傷害性又は化学療法剤、例えば大環状デプシペプチド、オーリスタチン、カリケアマイシン、又は１，８ビス−ナフタルイミド部分とコンジュゲートされうる。例えば、一製剤又は投薬レジメンでＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４，又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を更に提供することが望ましい場合がある。
【０３２３】
併用療法は同時又は逐次の計画として投与されうる。逐次的に投与される場合、併用薬は二回以上の投与で投与することができる。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与、何れかの順での逐次投与が含まれ、その場合、両方の（又は全ての）活性剤が同時にその生物学的活性を作用させる時間がある。
【０３２４】
一実施態様では、本発明のＡＤＣでの治療は、ここで同定された抗癌剤、及び一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害剤の併用投与を含む。そのような化学療法剤に対する調製及び投薬スケジュールは、製造者の指示書に従って又は熟練の当業者によって経験的に決定されて使用されうる。このような化学療法のための調製及び投薬はまたChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)に記載されている。
【０３２５】
ＡＤＣは、抗ホルモン化合物；例えば、抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン（欧州特許出願公開６１６８１２）；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドと、このような分子に対して知られた投薬量で組み合わされうる。治療される癌がホルモン依存性癌である場合、患者は抗ホルモン治療法を過去に受けている場合があり、癌がホルモン非依存性になった後に、抗ＥｒｂＢ２抗体（及び場合によってはここに記載の他の薬剤）が患者に投与されうる。患者に（治療法に伴う心筋機能不全を防止又は低減するために）心保護剤又は一又は複数のサイトカインを同時投与することが有益な場合がある。上記治療レジメンに加えて、患者には癌細胞の外科的除去及び／又は放射線療法を施しうる。
【０３２６】
上記の同時投与薬剤の任意のものに適した投薬量は現在使用されているものであり、新たに同定された薬剤と他の化学療法剤又は治療の併用作用（相乗作用）のために低下させることができる。
【０３２７】
併用療法は、併せて使用される活性成分が化合物を別個に使用して得られた効果の合計よりも大きい場合に「相乗効果」をもたらし、「相乗的」、つまり効果が達成されることが分かる。相乗効果は、活性成分が：（１）同時処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達され；（２）別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合；又は（３）ある種の他の計画によって、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個にシリンジで異なった注射によって逐次的に投与され又は送達されるときに達成できる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量が逐次的、つまり連続的に投与される一方、併用療法では二又はそれ以上の活性成分の有効用量が併せて投与される。
【０３２８】
抗体−薬剤コンジュゲートの代謝物
本発明の範囲にまた入るものは、その生成物が先行技術に対して新規で非自明である範囲で、ここに記載されたＡＤＣ化合物のインビボ代謝産物である。そのような産物は例えば投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素分解等々から生じうる。従って、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物を生じるのに十分な時間、哺乳動物に接触させることを含む方法によって産生される新規で非自明な化合物を含む。
【０３２９】
代謝産物は、放射標識（例えば１４Ｃ又は３Ｈ）ＡＤＣを調製し、それを動物、例えばラット、マウス、モルモット、サルのような動物、又はヒトに検出可能な用量（例えば約０．５ｍｇ／ｋｇより多い）で非経口的に投与し、十分な時間かけて代謝を生じさせ（典型的には約３０秒から３０時間）、尿、血液又は他の生物学的試料からその転換産物を単離することによって同定される。これらの産物は、標識されているので容易に単離される（他のものは代謝産物中で生存するエピトープに結合可能な抗体の使用によって単離される）。代謝産物の構造は常套的な方法、例えばＭＳ、ＬＣ／ＭＳ又はＮＭＲ分析によって決定される。一般に、代謝産物の分析は当業者によく知られた一般的な薬剤代謝研究と同じ方法でなされる。転換産物は、それらがインビボで別に見出されない限り、ＡＤＣ化合物の治療用投薬の診断アッセイにおいて有用である。
【０３３０】
代謝産物は薬剤部分を抗体に結合させる任意の結合の開裂が生じるＡＤＣのインビボ開裂の産物を含む。よって、代謝開裂はネイキッド抗体又は抗体断片を生じうる。抗体代謝産物は、リンカーの一部又は全てに結合されうる。代謝開裂はまた薬剤部分又はその一部の生産を生じうる。薬剤部分はリンカーの一部又は全てに結合されうる。
【０３３１】
製造品
他の実施態様では、上述の疾患の治療に有用な物質を含む製造品又は「キット」が提供される。製造品は容器と該容器上の又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤はＡＤＣである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療のために使用されることを示している。
【０３３２】
一実施態様では、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器、及び第一及び第二の化合物を癌の治療に使用できることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【実施例】
【０３３３】
次の実施例に従って調製した本発明の化合物を、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析データによって特徴付けた；ＨＰＬＣ／ＭＳデータは方法１，２の何れか一方に従って集めた。
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析法１
Ｗａｔｅｒｓ ７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ ＨＰＬＣシステムには、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン源を備えた２９９６Ｗａｔｅｒｓ ＰＤＡ検出器及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ ｍｏｄ．ＺＱシングル四重極質量分析計が装備された。機器制御、データ獲得及びデータ処理はＥｍｐｏｗｅｒ及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアによって提供された。ＨＰＬＣは、Ｃ１８，３ミクロンＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（４．６×５０ｍｍ）カラムを使用し１．０ｍＬ／分の流量で３０℃で実施した。移動相Ａは酢酸アンモニウム５ｍＭ ｐＨ５．２バッファーとアセトニトリル（９５：５）であり、移動相ＢはＨ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）であり；勾配は１０から９０％のＢまで８分でついで１．０分で１００％のＢまでの勾配であった。注入体積は１０ｕＬであった。質量分析計は正及び負のイオンモードで操作し、キャピラリー電圧は３．５ＫＶ（ＥＳ＋）及び２８Ｖ（ＥＳ−）に設定した；ソース温度は１２０℃であった；コーンは１４Ｖ（ＥＳ＋）及び２．８ＫＶ（ＥＳ−）であった；フルスキャン、質量範囲１００から１０００ｍ／ｚ。
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析法２
Ｗａｔｅｒｓ ２７９５ＨＰＬＣシステムには、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン源を備えた９９６  Ｗａｔｅｒｓ  ＰＤＡ検出器及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ ｍｏｄ．ＺＱシングル四重極質量分析計が装備された。機器制御、データ獲得及びデータ処理はＥｍｐｏｗｅｒ及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアによって提供された。ＨＰＬＣは、ＲＰ１８ Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｔｅｒｒａ（４．６ｍＭ×５０ｍｍ）カラムを使用し１ｍＬ／分の流量で３０℃で実施した。移動相Ａは水酸化アンモニウム０．０５％ｐＨ＝１０バッファーとアセトニトリル（９５：５）であり、移動相ＢはＨ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）であり；勾配は１０から９０％のＢまで８分で、ついで２分、１００％のＢを維持した。注入体積は１０ｍＬであった。質量分析計を正及び負のイオンモードで操作し、キャピラリー電圧を２．５ＫＶに設定した；ソース温度は１２０℃であった；コーンは１０Ｖであった；フルスキャン、質量範囲１００から１０００ｍ／ｚ。
【０３３４】
実施例１  Ｎ−メチル−２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド（化合物２）
【０３３５】
工程１  中間体［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］酢酸エチル４５の合成
2011528360.tif 000100
アルゴン下に維持した２ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８、１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７、８、９、１０−テトラヒドロテトラセン−５、１２−ジオン（５０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）［ＰＮＵ−１５９６８２、化合物ＩＩＡ、国際公開９８０２４４６で報告されたようにして調製］の溶液に（シクロヘキサ−１−エニルオキシ）−酢酸エチルエステル（０．５ｍＬ、［J. Org. Chem.(1978)43:1244-1245に報告されたようにして調製］及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物（５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、重炭酸ナトリウム飽和溶液（２０ｍＬ）を加え、生成物をジクロロメタンで抽出した（２×２０ｍＬ）。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去して、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９７．５：２．５）によって部分的に精製して、３０ｍｇ（３７％）のエステル中間体を得、これを工程２にそのまま使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：８２６［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝７．４８分，方法２
【０３３６】
工程２  中間体［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］酢酸４６の合成
2011528360.tif 000101
３０ｍｇの４５に、０１ＮのＮａＯＨ中の５ｍＬを加えた。懸濁液を５℃で冷却し、アルゴン下で３時間撹拌した。水溶液を１０％の酢酸水溶液でｐＨを約８にし、ジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去して、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）によって精製して５ｍｇ（ｙ＝８％ ２工程）の酸中間体４６を赤色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：７９８［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝３．９４分。方法２
【０３３７】
工程３  中間体１−（｛［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセチル｝オキシ）ピロリジン−２，５−ジオン４７の合成
2011528360.tif 000102
＋５℃に維持した無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の酸中間体４６（４ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で６時間撹拌し、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をエチルエーテル（５ｍＬ）で処理した。懸濁液を３０分撹拌し、固形物を濾過によって除去し、有機溶液を真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／アセトン８０：２０）による粗物質の精製により、１．５ｍｇ（ｙ＝３３％）の４７を赤色固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８９５［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝３．２２分。方法１。
【０３３８】
工程４  表題化合物２の合成
2011528360.tif 000103
無水テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の工程３から得られた４７（１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（３ｍＬ、０．００３ｍｍｏｌ）中の１Ｍのメチルアミンを加えた。溶液を室温で３０分攪拌し、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール９０：１０）によって精製して０．９ｍｇ（ｙ＝９９％）の２を赤色固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８１１［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝６．１０分。方法２、保持時間＝５．９９分。方法１。
【０３３９】
類似の手順により、適切な出発材料を使用して、次の化合物を調製した：
【０３４０】
２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド（化合物１）ＭＳ（ＥＳＩ）：８８７［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．８６分，方法２
【０３４１】
Ｎ−ベンゾイル−２−［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセトアミド（化合物３）ＭＳ（ＥＳＩ）：７９７［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝７．１６分，方法２
【０３４２】
Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ６−｛［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセチル｝−Ｌ−リジン（化合物４）ＭＳ（ＥＳＩ）：１０２６［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．２６分，方法１；保持時間＝４．６４分，方法２
【０３４３】
実施例２  Ｎ−メチル−２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド（化合物７）
工程１  中間体：（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシ）酢酸エチルの合成
2011528360.tif 000104
アルゴン雰囲気下で乾燥させられた丸底フラスコにおいて、
６０％の水素化ナトリウム（２４０ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ）を無水ｎ−ペンタンで３回すすいだ。テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中の２−ヒドロキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（５７０．８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で冷却した後、ＮａＨに加えた。反応混合物を水素の発生が終わるまで０℃で撹拌した。テトラヒドロフラン（６ｍｌ）中のブロモ酢酸エチル（１２５３ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に加え、出発アルコールの消失まで（ＴＬＣ分析）撹拌を室温で継続させた。冷却後、Ｈ２Ｏを加え、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を、シリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：ヘキサン＝１：１２）で精製して、６２６ｍｇ（収率５７％）の（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシ）酢酸エチルを無色の油として得た；１Ｈ  ＮＭＲ（４０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ１．１８−１．２３（ｍ、３Ｈ）３．５５−３．５９（ｍ、２Ｈ）３．９３（ｍ、Ｊ＝１０．０８、５．１１、５．１１、２．３８Ｈｚ、１Ｈ）４．１３（ｑ、Ｊ＝７．０７Ｈｚ、２Ｈ）４．１４（ｓ、２Ｈ）４．６７（ｄｄｄｄ、Ｊ＝６．１４、４．８３、２．５６、１．３４Ｈｚ、１Ｈ）６．３６（ｄｔ、Ｊ＝６．１３、１．７５Ｈｚ、１Ｈ）。
【０３４４】
工程２  中間体：［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］酢酸エチル４８の合成
2011528360.tif 000105
アルゴン雰囲気下で４ｍｌの無水ジクロロメタン中の（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８、１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７、８、９、１０−テトラヒドロテトラセン−５、１２−ジオン（５０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）［ＰＮＵ−１５９６８２、式ＩＩＡ、国際公開第９８０２４４６号で報告されたようにして調製］の溶液に、工程１からの（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシ）酢酸エチル（１１８．５ｍｇ、０．５９２ｍｍｏｌ）及び無水ｐ−トルエンスルホン酸（２２．３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、出発物質が検出可能ではなくなるまで（ＴＬＣ分析、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．３：９．７）、室温で４時間攪拌した。重炭酸ナトリウムの１０％の水溶液をついで反応混合物に加え、水性相をジクロロメタン（４×２０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．３：９．７）で精製して、４１ｍｇ（赤色ワックス、収率６２％）の４８を、４種のジアステレオ異性体の混合物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８４２［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝７．４７、７．８３分（方法２）。
【０３４５】
工程３  中間体：［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］酢酸４９の合成
2011528360.tif 000106
０℃で冷却された工程２から得られたエチルエステル中間体４８（４０ｍｇ、０．０４７５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で０．１Ｎの水性水酸化ナトリウム（１．５ｍｌ）で処理した。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。反応の過程を逆相ＨＰＬＣ−ＭＳによってフォローした。その後、反応混合物を１０％の酢酸水溶液でｐＨを約８にし、水で飽和させたｎ−ブタノールで抽出した（８×１０ｍＬ）。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：９）で精製して、４．５ｍｇ（赤色固形物、収率１２％）の４９をジアステレオ異性体混合物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８１４［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝２．９９、３．５０、３．６６（方法２）。保持時間＝４．２４（方法１）。
【０３４６】
工程４  中間体：１−（｛［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセチル｝オキシ）ピロリジン−２，５−ジオン５０の合成
2011528360.tif 000107
０℃で冷却した無水ジクロロメタン（１ｍｌ）中の該プロセスの工程３から得られた酸中間体４９（２ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１ｍｇ、０．００７９２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１ｍｇ、０．００４５５６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、０℃で２．５時間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をエチルエーテル（２×４ｍｌ）で処理した。懸濁液を１０分間撹拌し、固形物を濾過によって除去し、有機溶液を真空で濃縮し、２ｍｇの５０（赤色固形物）をジアステレオ異性体混合物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：９１１［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝６．１２、６．３０、６．４２分（方法１）。
【０３４７】
工程５  表題化合物７
2011528360.tif 000108
無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の該方法の工程４から得られた５０（１ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の２．０Ｍのメチルアミン（６５ｍＬ、０．００３３ｍｍｏｌ）を加えた。出発物質が検出可能ではなくなるまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、溶液を室温で４時間攪拌し、溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．３：９．７）で精製して、０．４６ｍｇ（赤色固形物、収率５１％）の７をジアステレオ異性体混合物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８２７［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．３４、５．５４、５．６６分（方法１）。
【０３４８】
類似の手順により、適切な出発材料を使用して、次の化合物を調製した：
【０３４９】
２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド（化合物６）ＭＳ（ＥＳＩ）：８１３［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．４２分（方法２）。
【０３５０】
Ｎ−ベンゾイル−２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミド（化合物８）ＭＳ（ＥＳＩ）：９０３［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝６．９２分（方法１）。保持時間＝６．９４分（方法２）。
【０３５１】
実施例３  Ｎ−アセチル−３−（｛３−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−３−オキソプロピル｝ジスルファニル）−Ｌ−アラニン（化合物１２）
【０３５２】
工程１  Ｎ’−｛（１Ｅ）−２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝−３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンヒドラジド５３
2011528360.tif 000109
【０３５３】
無水メタノール（５ｍｌ）中の３−（２−ピリジイルジチオ）プリピオン酸ヒドラジドＨＣｌ（４１．５ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）の溶液を、（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８、１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７、８、９、１０−テトラヒドロテトラセン−５、１２−ジオン［ＰＮＵ−１５９６８２、化合物ＩＩＡ、国際公開第９８０２４４６号で報告されたようにして調製］（５０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）に加えた。溶液を室温で暗所で２０時間撹拌した。反応の過程を逆相ＨＰＬＣ−ＭＳによってフォローした。この期間後、溶媒を蒸発させ、残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．２：９．８）によって精製して、１８ｍｇ（収率２７％）の５３を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：８５３［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．５２分（方法２）。
【０３５４】
類似の手順により、適切な出発材料を使用して、次の化合物を調製した：６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ’−｛（１Ｅ）−２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヘキサンヒドラジド５２。ＭＳ（ＥＳＩ）：８４９［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．１５分（方法２）。
2011528360.tif 000110
【０３５５】
工程２  工程１から得られた５３（８．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ．）の溶液にＮ−アセチルシステイン（０．３２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で２４時間攪拌し、溶媒を蒸発させ、残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝２：８）で精製して、７．２ｍｇ（収率８０％）の１２を赤色固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：９０５［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝３．６２分（方法２）。
【０３５６】
類似の手順により、適切な出発材料を使用して、次の化合物を調製した：
【０３５７】
Ｎ−アセチル−Ｓ−（１−｛６−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−６−オキソヘキシル｝−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）−Ｌ−システイン（化合物９）。ＭＳ（ＥＳＩ）：１０１２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３５８】
Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ６−（１−｛６−［（２Ｅ）−２−｛２−ヒドロキシ−１−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エチリデン｝ヒドラジニル］−６−オキソヘキシル｝−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）−Ｌ−リジン（化合物１０、表１）ＭＳ（ＥＳＩ）：１０９５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３５９】
実施例３ａ（２Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−カルボキサミド５４の調製
2011528360.tif 000111
３ｍｌのメタノール及び２ｍｌのＨ２Ｏ中の国際公開第９８／０２４４６号に報告されたようにして調製されたＰＮＵ−１５９６８２（１５．３ｍｇ、０．０２０３８ｍｍｏｌ）の溶液に、１ｍｌのＨ２Ｏ中のＮａＩＯ４（５．１ｍｇ、０．０２３８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、出発物質が検出可能ではなくなるまで（ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析）、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗赤色固形物（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−カルボン酸５６を、更なる精製なしで次の工程で使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：６２８［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝２．１−３．２分（方法１，実施例３ｂ）。
2011528360.tif 000112
【０３６０】
アルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（１．５ｍｌ）中の粗中間体５６（４．４ｍｇ）の溶液に、無水トリエチルアミン（２．２ｍｇ、０．０２０４ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４．４ｍｇ、０．０１３８８ｍｍｏｌ）及び市販のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（３．６ｍｇ、０．００６９４ｍｍｏｌ）を加えた。出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、反応混合物を室温で３０分攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、ついで残留物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．２：９．８）によって精製して、１．１ｍｇ（赤色固形物、ＰＮＵ−１５９６８２で計算した収率＝２１％）の５４を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：７５０［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．１８分（方法１，実施例３ｂ）。
【０３６１】
実施例３ｂ  Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−｛［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］｝ピペラジン−１−イル）］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド５５の調製
2011528360.tif 000113
【０３６２】
工程１  ４−ニトロフェニルカルボン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンゾイル５８（３０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下室温で無水ＤＭＳＯ中のピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５．３ｍｇ、０．０２８７ｍｍｏｌ）と反応させた（図７ｄ）。反応混合物を、出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、１時間撹拌した。ついで、ジエチルエーテル（８０ｍｌ）を反応混合物に加え、このようにして得られた沈殿物を濾過によって集めて、Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（｛［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペラジン−１−イル］｝オキシ）メチル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド５９を黄色固形物として得、２２．０ｍｇを単離し、更なる精製なしに次の工程で使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：７８５［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝４．８７分（方法１）。
【０３６３】
工程２  中間体５９（２２．０ｍｇ）を無水ジクロロメタン（０．１２ｍｌ）中のトリフルオロ酢酸（３２７ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を、出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、室温で１５分攪拌した。その後、反応混合物をジエチルエーテル（２０ｍｌ）で処理し、このようにして得られた残留物をジエチルエーテル（２×１０ｍｌ）ですすいだ：生成物Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−（４−｛［（ピペラジン−１−イル）オキシ］メチル｝フェニル）−Ｌ−オルニチンアミド６０（白色ワックス、２０．０ｍｇ）をこのようにして単離し、更なる精製なしに次の工程で使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：６８５［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝２．９７分（方法１）。
【０３６４】
工程３  中間体６０（１３．２ｍｇ）に、無水ジクロロメタン（２．６ｍｌ）、ＴＢＴＵ（５．３ｍｇ、０．０１６５ｍｍｏｌ）、及び無水トリエチルアミン（２．８ｍｇ、０．０２７５ｍｇ）中の粗（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−カルボン酸５６（９．３ｍｇ）溶液を加えた。反応混合物を、出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、アルゴン下で室温にて１５分撹拌した。ついで、溶媒を真空下で蒸発させ、粗物質をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＨ：ＡｃＯＥｔ＝１．５：８．５）によって精製して、４．８ｍｇ（赤色固形物、ＰＮＵ−１５９６８２で計算した収率＝３４％）の５５を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：１２９５［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．５１分（方法１）。
【０３６５】
化合物はＨＰＬＣ／ＭＳ分析データによって特徴付けた；ＨＰＬＣ／ＭＳデータを、次の方法１又は２の何れか一方に従って集めた。
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析法１：  ＨＰＬＣ装置は、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン源を備えた２９９６ Ｗａｔｅｒｓ ＰＤＡ検出器及びＭｉｃｒｏｍａｓｓｍｏｄ．ＺＱシングル四重極質量分析計を装備したＷａｔｅｒｓ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴシステムから構成された。機器制御、データ獲得及びデータ処理はＥｍｐｏｗｅｒ及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアによって提供された。ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８−３．５ｍＭ（４．６×５０ｍｍ）カラムを使用し、１．０ｍＬ／分の流量で３０℃で実施された。移動相Ａは酢酸アンモニウム５ｍＭ ｐＨ＝５．２バッファーとアセトニトリル（９５：５）であり、移動相ＢはＨ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）であり；勾配は１０から９０％のＢを８分とついで１．０分で１００％のＢまでの勾配であった。質量分析計は正及び負のイオンモードで操作し、キャピラリー電圧は３．５ｋＶ（ＥＳ＋）及び２８Ｖ（ＥＳ−）に設定し；ソース温度は１２０℃であｓり；コーンは１４Ｖ（ＥＳ＋）及び２．８ｋＶ（ＥＳ−）であった；フルスキャン、質量範囲１００から１０００ｍ／ｚを設定した。
【０３６６】
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析法２：  ＨＰＬＣ装置は、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン源を備えた９９６ Ｗａｔｅｒｓ ＰＤＡ検出器及びＭｉｃｒｏｍａｓｓｍｏｄ．ＺＱシングル四重極質量分析計を装備したＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＰＬＣシステムから構成された。機器制御、データ獲得及びデータ処理はＥｍｐｏｗｅｒ及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアによって提供された。ＨＰＬＣは、ＲＰ１８ Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｔｅｒｒａ（４．６ｍＭ×５０ｍｍ）カラムを使用し、１ｍＬ／分の流量で３０℃で実施された。移動相Ａは水酸化アンモニウム０．０５％ ｐＨ＝１０バッファーとアセトニトリル（９５：５）であり、移動相ＢはＨ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）であり；勾配は１０から９０％のＢまで８分とついで１００％のＢに２分保持された。質量分析計は正及び負のイオンモードで操作し、キャピラリー電圧は２．５ｋＶに設定した；ソース温度は１２０℃であった；コーンは１０Ｖであり；フルスキャン、質量範囲１００から１０００ｍ／ｚを設定した。
【０３６７】
実施例３ｃ（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８、１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−８−（ピペラジン−１−イル）−７、８、９、１０−テトラヒドロテトラセン−５、１２−ジオン５７の調製
2011528360.tif 000114
アルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（５ｍｌ）中の５６（９ｍｇ）の溶液に、無水トリエチルアミン（１．６ｍｇ、０．０１５８ｍｍｏｌ）、ピペラジン（３．６ｍｇ、０．０４２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．１ｍｇ、０．０１５８ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（３．０ｍｇ、０．０１５８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、ついで残留物を、シリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ ４５／４／１／０．５）によって精製した。得られた生成物をＤＣＭに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（×２）及び水（×２）で洗浄した。有機溶媒を真空下で蒸発させて５．０ｍｇの５７を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：６９６［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝４．０１分（方法１，実施例３ｂ）。
【０３６８】
実施例３ｄ  Ｎ−［２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル］−２−［（６−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６−メチリデン−１１−オキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メトキシ］アセトアミドの調製
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アルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（２９．７ｍｌ）中の粗中間体５０（１０３．８ｍｇ）の溶液に、市販のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（５７．９ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）及び無水トリエチルアミン（２３．１ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、出発物質が消失するまで（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析）、室温で１時間攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をＥｔ２Ｏ／ｎ−ヘキサン混合物（１ｍｌ／２０ｍｌ）ですすいだ。ついで、粗物質をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝０．２：９．８）によって精製して、１２．２ｍｇ（赤色固形物、ＰＮＵ−１５９６８２で計算した収率＝２０％）の５１をジアステレオ異性体混合物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：９３６［Ｍ＋Ｈ］＋。保持時間＝５．８６（次の方法による：）
【０３６９】
Ｗａｔｅｒｓ ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ ＨＰＬＣシステムは２９９６ Ｗａｔｅｒｓ ＰＤＡ検出器及びＭｉｃｒｏｍａｓｓｍｏｄ．ＺＱシングル四重極質量分析計を含み、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン源を備える。機器制御、データ獲得及びデータ処理はＥｍｐｏｗｅｒ及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアによった。ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８−３．５ｍＭ（４．６×５０ｍｍ）カラムを使用し、１．０ｍＬ／分の流量で３０℃で実施された。移動相Ａは酢酸アンモニウム５ｍＭ ｐＨ＝５．２バッファーとアセトニトリル（９５：５）であり、移動相ＢはＨ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）であり；勾配は１０から９０％のＢが８分でついで１．０分で１００％のＢまでの勾配であった。質量分析計は正及び負のイオンモードで操作し、キャピラリー電圧は３．５ｋＶ（ＥＳ＋）及び２８Ｖ（ＥＳ−）に設定され；ソース温度は１２０℃であった；コーンは１４Ｖ（ＥＳ＋）及び２．８ｋＶ（ＥＳ−）であり；フルスキャン、質量範囲１００から１０００ｍ／ｚ。
【０３７０】
実施例４  表１に特定したＭＣＭ２コンジュゲート化合物５の調製
ＭＣＭ２（１０−２９４）タンパク質［Ishimi等(2001)Jour. Biol Chem. 276(46):42744-42752］（１．５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に溶解させ、ｐＨ値を５５μｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）の添加により８．５に調節し、０．５ｍｇの１−（｛［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセチル｝オキシ）ピロリジン−２，５−ジオン（０．５５ｍｍｏｌ）［実施例１の工程３に報告されたようにして調製］を１０ｍｇ／ｍｌのアセトニトリル溶液から加えた。反応を室温で１時間インキュベートした後、反応混合物を、リン酸緩衝生理食塩水で条件化したＮＡＰ−１０カラムで脱塩し、タンパク質を含む画分を集めプール化した。
【０３７１】
反応したタンパク質を、上で報告された未反応ＭＣＭ２及び異なった量の１−（｛［（１−｛２−オキソ−２−［（２Ｓ，４Ｓ）−２，５、１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−４−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−６，１１−ジオキソ−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル］エトキシ｝シクロヘキシル）オキシ］アセチル｝オキシ）ピロリジン−２，５−ジオンと比較してＳＤＳ ＰＡＧＥによっって分析した。
【０３７２】
類似の手順により、適切な出発材料を使用して、次の化合物（表１）を調製した：ＭＣＭ２コンジュゲート化合物１１；ＭＣＭ２コンジュゲート化合物１３；ＭＣＭ２コンジュゲート化合物１４。
【０３７３】
実施例５  コンジュゲートの安定性：一般的手順
０．５ｍｇのコンジュゲートに、酢酸アンモニウム５ｍＭ ｐＨ＝５．２の緩衝溶液（２００ｍＬ）を加えた。溶液を３７℃に温め、試料を周期的に取り上げ、ＨＰＬＣ（方法２）によって分析した。結果を、コンジュゲートからの放出物質（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８、１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７、８、９、１０−テトラヒドロテトラセン−５、１２−ジオン（化合物ＩＩＡ）の％として表す。
【０３７４】
類似の手順によって、酢酸アンモニウム５ｍＭ ｐＨ＝４．５の緩衝溶液を使用して、ｐＨ４．５での安定性をまた決定した。
【０３７５】
類似の手順によって、安定性を化合物１２（表１）について実施し、４時間のインキュベーション後に、コンジュゲートから（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−１０−｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）−９−メトキシ−１−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−ピラノ［４’、３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３−ｃ］［１，４］オキサジン−３−イル］オキシ｝−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオン（化合物ＩＩＡ）の、ｐＨ５．２の緩衝溶液で９０％の放出及びｐＨ４．２の緩衝溶液で１００％の放出を示している。
【０３７６】
実施例６  還元及び再酸化によるコンジュゲーションのためのシステイン操作抗体の調製
軽鎖及び重鎖アミノ酸は、Ｋａｂａｔ（Kabat 等, Sequences of タンパク質s of immunological interest、 (1991) 5版, US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD）に従って番号付けした。単一文字アミノ酸略語が使用される。
ＣＨＯ細胞中で発現された完全長のシステイン操作モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂｓ）は細胞培養条件のためにシステイン付加物（シスチン）を有するか又は操作されたシステインにグルタチオン化される。操作されたシステインの反応性チオール基を遊離させるために、ＴｈｉｏＭａｂｓを５００ｍＭのホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウム（約ｐＨ８．０）に溶解させ、３７℃で約５０−１００倍過剰の１ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩； Getz等(1999) Anal. Biochem. 273:73-80; Soltec Ventures、 Beverly、 MA）で約１−２時間還元した。あるいは、ＤＴＴを還元剤として使用することができる。鎖間ジスルフィド結合の形成を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥか又は変性逆相ＨＰＬＣ ＰＬＲＰカラムクロマトグラフィーの何れかによってモニターした。還元されたシステイン操作抗体を希釈し、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中でＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに充填し、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶離させた。溶離され還元されたシステイン操作抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）をｐＨ７の２ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）で３時間、又は２ｍＭの水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）で室温で一晩処理した。雰囲気空気酸化がまた効果的な場合がある。バッファーをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂に対して溶離によって交換し、１ｍＭのＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶離させた。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍでの吸光度とＤＴＮＢ（Aldrich, Milwaukee, WI）との反応によるチオール濃度から還元された抗体濃度を決定し、また４１２ｎｍでの吸光度を決定することによりチェックした。
【０３７７】
液体クロマトグラフィー／質量分析を、拡張された質量範囲のＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ トリプル四重極質量分析計（Thermo Electron、 San Jose California)で実施した。試料に７５℃に加熱したPRLP-S, 1000 A、マイクロボアカラム(50mm×2.1mm, Polymer Laboratories、 Shropshire, UK）でクロマトグラフィーを施した。３０−４０％の線形勾配（溶媒Ａ：水中０．０５％のＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．０４％のＴＦＡ）を使用し、溶離剤を、エレクトロスプレー源を使用して直接イオン化した。データをＸｃａｌｉｂｕｒデータシステムによって集め、デコンボリューションをＰｒｏＭａｓｓ（Novatia、 LLC、 New Jersey)を使用して実施した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、抗体又は抗体−薬剤コンジュゲート（５０ｍｇ）を３７℃で２時間、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（２単位／ｍｌ； PROzyme, San Leandro, CA）で処理してＮ結合糖鎖を除去した。
【０３７８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）試料をブチルＨＩＣ ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）（Tosoh Bioscience）に注入し、０．８ｍｌ／分で０から７０％のＢの線形勾配で溶離させた（Ａ：５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）中の１．５Ｍの硫酸アンモニウム、Ｂ：５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）、２０％のイソプロパノール）。多波長検出器及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して、異なった抗体当たりの薬剤比を持つ抗体種を分離し定量した。
【０３７９】
実施例７  抗体及びアントラサイクリン誘導体薬剤−リンカー中間体のコンジュゲーション
一般に、抗体及びアントラサイクリン誘導体薬剤−リンカー中間体を、米国特許第７５２１５４１号；米国特許第７４９８２９８号；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号；米国特許出願公開第２００８／０３１１１３４号；及び"NEMORUBICIN METABOLITE AND ANALOG ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND METHODS", ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１１９９（２００９年１月１６日出願）（それぞれを出典明示により援用）の方法に従ってコンジュゲートする。
【０３８０】
インーゲル蛍光検出によるコンジュゲート定量分析を、ＰｒｏＸｐｒｅｓｓ ＣＣＤベースのスキャナー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して実施した。機器励起及び発光フィルターはそれぞれ４８０／３０ｎｍ及び５９０／３５ｎｍに設定した。定量分析を、ゲル上に参照として充填した異なった量の出発材料を使用する機器を用いて、Ｐｒｏｆｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して実施した。ついで、全負荷タンパク質をクーマシーブルータンパク質染色によって評価した。
【０３８１】
実施例８  システイン操作抗体及びマレイミド薬剤−リンカー中間体のコンジュゲーション
実施例６の還元及び再酸化手順後に、システイン操作抗体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーに溶解し、氷で冷却した。抗体当たり操作システインに対して約１．５モル当量のチオール反応性官能基を有するアントラサイクリン誘導体、例えばピリジン−ジスルフィド、例えば薬剤−リンカー中間体５３又は；ブロモ−アセトアミド及びマレイミド、例えば薬剤−リンカー中間体５１及び５２をＤＭＳＯに溶解させ、アセトニトリル及び水に希釈し、ＰＢＳ中の冷却された還元、再酸化抗体に加える。約１時間後、過剰のマレイミドを反応をクエンチし、未反応の抗体チオール基をキャップするために添加する。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、システイン操作抗体−薬剤コンジュゲートを精製し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂を通過させる溶離によって精製し脱塩し、滅菌条件下で０．２μｍのフィルターで濾過し、保存のために凍結させた。
【０３８２】
上記の手順によって、次のシステイン操作抗体薬剤コンジュゲートを調製した：１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２，及び１１３（表２）。抗体−薬剤コンジュゲートを含むシステイン操作抗体１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、及び１１３の各々は重鎖（ＨＣ）Ａ１１４Ｃ（Ｋａｂａｔ）システイン操作変異体（米国特許第７５２１５４１号）であった。トラスツズマブ抗体では、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによるＡ１１４Ｃ変異体は、ＥＵ番号付けスキームによるＡ１１８Ｃ変異体と、及びシーケンシャル番号付けスキームによるＡ１２１Ｃ変異体と同じである。
【０３８３】
マレイミドカプロイル（ＭＣ）、バリン−シトルリン（ｖｃ）、ｐ−アミノベンゾイルオキシカルバモイル（ＰＡＢ）、及びオーリスタチン薬剤（ＭＭＡＥ）薬剤−リンカー部分を持つシステイン操作抗体薬剤コンジュゲート（１０６、１１１，及び１１２）を、薬剤−リンカー中間体ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ：
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を用いて、米国特許出願公開第２００８／０３１１１３４号の実施例３、及び米国特許第７４９８２９８号の実施例２７及び２９（出典明示により援用）の方法によって調製した。
【０３８４】
実施例９  インビトロ細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞株である乳癌ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３，及びＭＣＦ７をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。
抗体−薬剤コンジュゲートのインビトロ効力を細胞増殖アッセイによって測定した（図８−２９）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイは商業的に入手可能であり (Promega Corp., Madison, WI)、これは鞘翅目ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ法(米国特許第5583024号;米国特許第5674713号; 米国特許第5700670号)である。このアッセイは、代謝的に活性な細胞 の指標であるATPの存在を定量することに基づき(Crouch等(1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; 米国特許6602677)、培養中の生細胞の数を決定する。CellTiter-Glo（登録商標）アッセイは９６ウェル形式で実施し、自動化高スループットスクリーニング(HTS) (Cree等(1995) AntiCancer Drugs 6:398-404)に受け入れられるものとした。均一アッセイ手順は、 単一の試薬(CellTiter-Glo（登録商標）試薬)を血清補填培地で培養した細胞に加えることを含む。
【０３８５】
均一「アドミックス手段」形式は存在するＡＴＰの量に比例した細胞溶解及び発光シグナルの生成を生じる。基質のカブトムシルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱カルボキシル化され、ＡＴＰからＡＭＰへの同時の転換と光子の発生を伴う。生細胞は相対発光単位（ＲＬＵ）で反映される。データはルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像化装置によって記録することができる。発光出力は、経時的に測定されるＲＬＵとして提示される。あるいは、発光からの光子がシンチラントの存在下でシンチレーションカウンターで計数されうる。光単位はその場合、秒当たりのカウントであるＣＰＳとして表すことができる。
【０３８６】
ＡＤＣの効力は、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay、 Promega Corp. Technical Bulletin TB288及びMendoza等(2002) Cancer Res. 62:5485-5488から適合化された次のプロトコルを用いる細胞生存率アッセイによって測定した：
１．  ＨＥＲ２発現及びＣＤ２２発現細胞を含む約１０００又はそれ以上の細胞を培地に含む５０μｌの細胞培養物のアリコートを、９６ウェルの不透明な壁部で透明な底部のプレートの各ウェルに付着させた。
２．  ＡＤＣ（５０μｌ）を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度まで、三通りの実験ウェルに添加し、培地単独のものを「ＡＤＣなし」コントロールウェルとし、３日以上インキュベートした。
３．  プレートをおよそ３０分室温まで平衡化した。
４．  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（１００μｌ）を加えた。
５．  内容物をオービタルシェーカーで２分混合して細胞溶解を誘導した。
６．  プレートを室温で１０分間インキュベートし、発光シグナルを安定化させた。
７．  発光を記録し、ＲＬＵ＝相対発光単位としてグラフで報告した。
【０３８７】
実施例１０  薬物動態−血清クリアランス及び安定性
インビボでの抗体−薬剤コンジュゲートの排除を、スプラーグドーリーラット中への単一静脈内ボーラス投薬後に抗体及び薬剤コンジュゲートの血清中濃度を測定することにより分析する。少なくとも一つの細胞傷害性薬剤を有する抗体−薬剤コンジュゲートの濃度を、捕捉のために細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質を、検出のために抗アントラサイクリン及び西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＦｃ抗体を使用したＥＬＩＳＡで測定する。血清中の全抗体濃度を、捕捉のためにＥＣＤを、検出のために抗ヒト−ＦｃＨＲＰを使用するＥＬＩＳＡで測定し、コンジュゲートされたアントラサイクリン誘導体を伴うものと伴わないものの双方の抗体を測定した。各動物からの血清中濃度−時間データを、ＩＶボーラスインプット、一次除去、及びマクロ速度定数を用いた２区画モデルを使用して分析する(Model 8、 WinNonlin Pro v.5.0.1, Pharsight Corporation, Mountain View, CA）。
【０３８８】
実施例１１  動物毒性
青年期雌ラット（１００−１２５ｇｍｓ）での１２日の急性毒性研究を、１日目での約１−１０ｍｇ／ｋｇの抗体−薬剤コンジュゲート、及びコントロールビヒクルの単一注入により実施する。試験品の注入は典型的には静脈内ボーラスとして投与される。体重は毎日測定される。臨床化学検査、血清酵素及び血液学的分析は周期的に実施される。毒性シグナルは体重減少の臨床的観察を含んでいた。
【０３８９】
実施例１２  インビボ効力マウスモデルでの腫瘍増殖阻害
全ての動物実験は、実験動物のケア及び使用のためのＮＩＨガイドラインに従って実施し、ジェネンテックの Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
【０３９０】
効力研究を、ＳＣＩＤマウス（Charles River Laboratories）を使用して実施した。図３０−３２に実証された実験に対する効力モデルは、記載された様にして使用され（Polson等(2009) Cancer Res. 69(6):2358-2364; Phillips等(2008) Cancer Res. 68(22):9280-9290；米国特許出願公開第２００８／００５０３１０号；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号)、単一静脈内投与後の腫瘍体積を評価した。移植モデルは、腹腔内腫瘍を有するマウスから切除した腫瘍を使用し、ついでレシピエントマウスに連続的に継代して発症させた。例えば、移植のための細胞を洗浄し、ＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に懸濁させ、０．２ｍＬ／マウスの体積で雌のＣＢ１７ ＩＣＲ合併免疫不全マウス（Charles Rivers Laboratoriesの７−１６週齢）の側腹部中に皮下的に接種した。インビボでの抗体薬剤コンジュゲートの効力を試験するために、ＳＣＩＤマウス当たりおよそ数百万の細胞を一度に播種し、注入後約１０から６０日の間、増殖させた。腫瘍体積が１５０−２００ｍｍ３（典型的には播種後１４日目から２１日目）に達したときに、マウスを１群当たり９−１０匹のマウスの試料群に分け、腫瘍体積を各マウスにおいて決定した。平均腫瘍サイズが所望の体積に達したときに、マウスを同じ平均腫瘍サイズを持つ８から１０匹のマウスの群に分け、尾部の静脈を介して静脈内的に試料にＡＤＣ、抗体、又はビヒクルを投与した。ＡＤＣ用量をマウスの表面積当たりのコンジュゲートされた細胞傷害性小分子薬剤の質量として、又はマウスの質量当たりのＡＤＣの一定質量として（例えば、５ｍｇのＡＤＣ／ｋｇマウス）、測定した。一般に、任意の与えられた実験における抗体上への薬剤負荷は同様であるか又は正規化され、よってこれらの測定値は等価であると考えることができた。腫瘍体積は、式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２，（ここで、Ａ及びＢはそれぞれ長径及び短径である）に従ってノギスを使用して測定した。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達する前に、又は腫瘍が切迫した潰瘍の徴候を示す前にマウスを安楽死させた。各実験群から集めたデータは平均±ＳＥとして表した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
2011528360.tif 000174
【図７ｄ】
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【図８】
2011528360.tif 000176
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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