(57)【要約】  本発明は、脳内で島状に生長し、吸収した腫瘍血管を内包する脳内初期星状細胞腫モデルに特異的にホーミングするペプチドに関する。本ペプチドは、治療物質の浸潤性悪性脳腫瘍および転移性病変への標的送達の単独実施や、外科的処置、放射線療法、抗血管新生療法などの従来の療法と組み合わせて実施する標的送達にも有用であり、さらには浸潤性悪性脳腫瘍および転移性脳病変などの診断のための手段としても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡ（配列番号１）を包含するペプチド。
【請求項２】
浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変の診断用である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
薬学的に活性な薬剤の浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変へのターゲティング用である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１のペプチドと共に、担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する組成物。
【請求項５】
請求項１のペプチドと共に薬学的に活性な薬剤を含み、さらに担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する医薬組成物。
【請求項６】
薬学的に活性な薬剤が、アポトーシス促進性ペプチド、化学療法剤または放射線療法剤であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変の標的療法のための方法であって、治療を必要とする患者に、効果的な量の請求項５または６の医薬組成物を投与することを包含する方法。
【請求項８】
該標的療法を、従来の癌治療法と組み合わせて実施することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
従来の癌治療法が、外科的処置、放射線療法および抗血管新生療法からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１のペプチドおよび検出可能な標識を包含する、診断用または画像診断用の組成物。 
【請求項１１】
患者の浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変の診断方法であって、
（ａ）請求項１のペプチドに検出可能な標識を結合させて標識ペプチドを得、
（ｂ）標識ペプチドを患者に投与し、そして
（ｃ）標識を検出する
ことを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳内で島状に生長し、吸収した腫瘍血管を内包する脳内初期星状細胞腫モデル、および種々の神経膠腫モデルに特異的にホーミングするペプチドに関する。本ペプチドは、治療物質の脳腫瘍への標的送達の単独実施や、外科的処置、放射線療法、抗血管新生療法などの従来の療法と組み合わせて実施する標的送達にも有用である。さらに本ペプチドは、例えば、浸潤性悪性脳腫瘍および脳内の他の腫瘍型の転移性病変の診断においても効果的な手段となる。
【背景技術】
【０００２】
星状細胞は多機能型神経幹細胞から発生し、その生存期間中は分裂能を維持する。この特性は、星状細胞を癌化しやすくし、さらには成人において最も一般的な脳腫瘍が星状細胞由来の腫瘍であるという事実の一因となっている。低グレード星状細胞腫は、「血管吸収（vessel cooption）」と呼ばれる過程において、現存する正常な血管に沿って増殖することにより、血液源を獲得する（Holash et al., 1999、Kim et al., 2002）。これにより、腫瘍細胞が真の腫瘍塊を形成することのない、脳内の長距離にわたるびまん性浸潤が引き起こされる。グレードIIIの星状細胞腫がグレードIVの星状細胞腫に進行するにつれて、その大きさが増し、増大した栄養および酸素の要求量に対応するために、血管新生スイッチが入る。最も悪性な星状細胞腫である多形神経膠芽腫は、高度に血管新生化され、腫瘍は低グレード星状細胞腫よりも局所的に出現する。過去数年にわたり癌研究の主な焦点であった血管新生性腫瘍の血管構造とは異なり、吸収血管床の生物学はほとんど理解されていない。
【０００３】
脳腫瘍患者の予後は悪く、過去数十年にわたり向上していない。特に低グレードの星状細胞腫は、放射線療法や外科的処置などの従来の処置方法では到達不能であることが示されており、厳しい状況にある。さらに星状細胞腫は、抗血管新生療法の後も脳内に残る。腫瘍の血管新生の阻害は、種々の悪性腫瘍の処置に効果的な治療法であることが立証されている。しかし、悪性脳腫瘍の全身性抗血管新生処置は、実験動物モデルにおいて衛星腫瘍数の増加をもたらす傾向が見られ、腫瘍細胞をより浸潤性の表現型へと変化させる可能性すらある（Kunkel et al., 2001、Rubenstein et al., 2000）。従って、非常に進行性の高い腫瘍を発症した患者の生存率を向上させるためには、新たな療法が早急に必要である。
【０００４】
最近になって、各組織は血管内皮細胞上にそれぞれに固有の一群の細胞表面タンパク質を発現することが明らかになった。さらに、腫瘍、糖尿病、アテローム性動脈硬化症および炎症性疾患を含む多くの病的状態において、罹患した組織の内皮に疾患に特有のタグが付される。ファージディスプレイしたペプチドライブラリーを使用したin vivoのバイオパニングは、この血管の不均一性のプロファイルを決定し、血管構造における領域別の違いおよび疾患特異的な違いを位置づけるための強力な手段となる。
【０００５】
この技術を使用することによって、我々は腫瘍の血管構造に特異的にホーミングする数種のペプチドを単離した（Laakkonen and Ruoslahti, 2006、Ruoslahti, 2002）。さらに我々は、前癌性病変の血管構造は、成熟した腫瘍の血管構造や対応する正常組織の血管構造とは異なることも明らかにした（Hoffman et al., 2003、Joyce et al., 2003）。腫瘍にホーミングするペプチドの数種は、共通した血管新生マーカーを認識し、数種の腫瘍にホーミングすることができる。一方、他のペプチドは、腫瘍型特異的な違いを認識する。最近になって我々は、新規なホーミング特異性を有するするペプチド、例えば、腫瘍のリンパ管にホーミングするペプチド、を単離した（Zhang et al. 2006、Laakkonen et al. 2004、Laakkonen et al. 2002）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、配列番号１に示した、長さが９アミノ酸の新規なペプチドＣＧＬＳＧＬＧＶＡを開示する。このペプチドは、Hoffman et al. (2004）に記載のex vivo／in vivoファージディスプレイスクリーンを使用して、星状細胞腫／神経膠芽腫のステージ特異的マーカーのスクリーニングを行った際に同定したものである。ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、星状細胞腫（初期の神経膠芽腫）のマウスモデルにおいて、吸収した腫瘍血管を内包する島状の星状細胞腫に極めて特異的にホーミングする。
【０００７】
従って、本発明の主な目的は、アミノ酸配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡ（配列番号１）を包含するペプチドを提供することである。好ましい態様は、ペプチドＣＧＬＳＧＬＧＶＡそのものである。
【０００８】
本発明の他の目的は、アミノ酸配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡを包含するペプチド、ならびに担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、本発明のペプチドと共に薬学的に活性な薬剤を含み、さらに担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、アミノ酸配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡを包含するペプチドおよび検出可能な標識を包含する、診断用または画像診断用の組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、浸潤性悪性脳腫瘍または脳の転移性病変の標的療法のための方法であって、治療を必要とする患者に効果的な量の本発明の医薬組成物を投与することを包含する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、患者の浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変を診断するための方法を提供することである。この方法は、本発明のペプチドに検出可能な標識を結合させて標識ペプチドを得、標識ペプチドを患者に投与し、そして標識を検出することを包含する。
【００１３】
本発明のペプチドは、浸潤性悪性脳腫瘍または転移性脳病変の診断、およびこれら部位への薬学的に活性な薬剤のターゲティングに少なくとも有用である。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明のために、我々は、Hoffman et al., 2004に記載のex vivo／in vivo ファージディスプレイスクリーンを使用し、星状細胞腫／神経膠芽腫のステージ特異的マーカーを同定した。簡単に説明すると、無胸腺の免疫不全マウスの脳内にＨＩＦｋｏ星状細胞（Blouw et al., 2003）を注入し、実験開始前の９日間〜１１日間にわたりで腫瘍を形成させた。Ｔ７ファージにディスプレイされたＣＸ７Ｃペプチドライブラリーを、腫瘍を含む脳から調製した細胞懸濁液と共に一晩インキュベートし、続いて結合ファージの回収と増幅を実施した。増幅したファージプールに対してこのex vivoの工程を繰り返し、腫瘍に含まれる全ての細胞に結合するタンパク質を濃縮した。次に、脳腫瘍を有するマウスの尾静脈に濃縮したファージプールを注射し、１５分間循環させた。未結合のファージは、心臓に生理食塩水を灌流することによって除去し、結合したファージを回収し、増幅した。このin vivoのパニング工程を２回繰り返し、循環器系を介して腫瘍にホーミングすることが可能なペプチドを濃縮した。我々は、３回目のin vivoの工程で出現した５０個の個別のファージに含まれるペプチド挿入物の配列を決定した。そして、配列を決定したプールに濃縮されていた様々なペプチドの腫瘍特異性を試験した。
【００１５】
その結果、我々は、脳内で島状に生長し、吸収した腫瘍血管を内包する脳内初期星状細胞腫モデルおよび種々の神経膠腫モデルに非常に特異的にホーミングする、新規な長さ９アミノ酸のペプチド（ＣＧＬＳＧＬＧＶＡ）を同定した。
【００１６】
本ペプチドの腫瘍組織へのホーミングは、フルオレセイン結合合成ペプチドの組織学的解析によって確認した。我々が得た結果は、本ペプチドが血管新生性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を過剰発現する星状細胞腫や正常な脳を認識しないだけででなく、皮下で培養した初期星状細胞腫モデル（ＨＩＦｋｏ）にもホーミングしないことを示した。さらに本発明のペプチドは、Ｕ８７ＭＧ ヒト神経膠芽腫異種移植片にホーミングする。興味深いことに、Ｕ８７ＭＧ異種移植片に対するペプチドのホーミングパターンは、星状細胞腫の異種移植片で見られるものとは異なっていた。即ち、Ｕ８７ＭＧ腫瘍の場合、本ペプチドの分布はＵ８７ＭＧ腫瘍を有するマウスの尾静脈に静脈内注射した血管内皮細胞マーカーの分布に類似しており、一方、島状腫瘍モデル（ＨＩＦｋｏ）の場合、ペプチドは腫瘍組織の全体にわたってびまん的に検出された。
【００１７】
しかし、本ペプチドは、厳密には内皮マーカーＰＥＣＡＭ−１と共存したわけではなく、内皮の近傍で検出された。この結果は、組織学的解析のための注射の１５分〜６０分後に組織を回収したために、ペプチドが既に腫瘍組織内に移動していたことを示している。本ペプチドは、治療物質の脳腫瘍への標的送達の単独実施、および外科的処置、放射線療法、抗血管新生療法などの従来の療法と組み合わせて実施する標的送達のいずれにおいても非常に有望な候補物質である。
【００１８】
本発明においては、「従来の療法と組み合わせる」という表現には、従来の療法と同時に実施する場合だけではなく、順次実施する場合も含まれる。
【００１９】
抗血管新生療法は、当業者に広く知られた療法である。いかなる抗血管新生療法も、本発明の医薬組成物を用いる療法と組み合わせることができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に活性な薬剤は、例えば、浸潤性脳腫瘍または転移性脳病変を有する患者の標的療法に使用することのできる、アポトーシス促進性ペプチド、化学療法剤または放射線療法剤などである。このような目的で使用可能な当業界で知られているいかなるアポトーシス促進性ペプチドも、本発明の医薬組成物に使用することができる。同様に、当業界で知られているいかなる化学療法剤や放射線療法剤も本発明で使用することができる。適切な化学療法剤や放射線療法剤の選択は、当業者の専門知識の範囲内で可能である。本発明の組成物に使用する薬学的に活性な薬剤の量および濃度の決定は、本発明の技術分野の当業者の知識の範囲内において可能である。
【００２１】
本発明のペプチドは、公知の方法、例えば、化学合成、によって作製することが可能であり、そうすることによってペプチドの粉末が得られる。次に、患者に静脈内注射するために、得られたペプチドを水、生理食塩水または薬学的に許容される有機溶媒で可溶化する。
【００２２】
本発明の組成物は、本発明のペプチドに担体または希釈剤を化学的に結合することで調製し、その結果、水、生理食塩水または有機溶媒によって可溶化可能な粉体が得られる。医薬組成物を調製する際には、本発明のペプチドに薬学的に許容される担体または希釈剤を結合し、次に薬学的に活性な薬剤の溶液を結合物に加えて溶液とする。得られた溶液は、患者への静脈注射に適したものとなる。この溶液は、滅菌したものが好ましい。
【００２３】
医薬組成物に含まれる本発明のペプチドの濃度は、広い範囲内で設定可能である。至適濃度と実際の使用量は、通常、例えば、処置を受ける患者の臨床状態に基づいて、変化することを理解されたい。
【００２４】
本発明のペプチドまたは医薬組成物の好ましい投与方法は、静脈内投与である。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、このような組成物の有益な効果を享受することができる、いかなる動物にも投与可能である。このような動物においてヒトは最重要であるが、本発明は、ヒトの医療または診断に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
ファージディスプレイされたペプチド配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡの、脳内島状腫瘍へのホーミング
脳内にＨＩＦ−１ ａｌｆａ ＫＯ（ＨＩＦｋｏ）腫瘍を有するマウスの尾静脈に、ＣＧＬＳＧＬＧＶＡまたは対照ファージ（１０9 ｐｆｕ＝プラーク形成単位）を注射した。１５分間循環させた後、マウスの心臓に生理食塩水を灌流して未結合のファージを除去し、続いて腫瘍を含む脳、正常な脳、肝臓、腎臓および肺を切除した。これら臓器にホーミングしたファージの数を滴定で求めた。図１の棒グラフは、脳内で島状に生長し、吸収した腫瘍血管を内包する脳内初期星状細胞腫モデル（ＨＩＦｋｏ）にペプチドが非常に特異的にホーミングすることを示している。
【実施例２】
【００２７】
フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドの、脳内の島状腫瘍へのホーミング
ＨＩＦｋｏ腫瘍を有するマウスの尾静脈に、フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチド（１０μｇ）を注射した。６０分間循環させた後、腫瘍を含む脳を切除し、組織学的解析のために処理した。フルオレセインに対する抗体（ウサギ抗ＦＩＴＣ、Zymed Laboratories製）を使用してペプチドを可視化した。図２は、ペプチド（図２のＡ中の赤色）は島状の腫瘍にのみ検出され、取り囲む正常脳組織からは検出されなかったことを示している。腫瘍細胞の存在は、連続切片に対する腫瘍細胞特異的なＳＶ４０ Ｔ抗原の染色（図２のＢ中の緑色）によって確認した。図２のＣとＤは、それぞれ図２のＡおよびＢと同じ顕微鏡視野を表している。核はＤＡＰＩ染色（青色）によって可視化した。
【実施例３】
【００２８】
フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、脳内のＶＥＧＦ過剰発現腫瘍にはホーミングしない
ＶＥＧＦ過剰発現（ＶＥＧＦ＋）腫瘍を有するマウスの尾静脈に、フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチド（１０μｇ）を注射した。６０分間循環させた後、腫瘍を切除し、組織学的解析のために処理した。フルオレセインに対する抗体（ウサギ抗ＦＩＴＣ、Zymed Laboratories製）を使用して、ペプチドを可視化した。図３のＡ： ペプチドは腫瘍組織から検出されなかった。図３のＢ： 図３のＡと同じ顕微鏡視野。核はＤＡＰＩ染色（青色）によって可視化した。
【実施例４】
【００２９】
フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、皮下のＨＩＦｋｏ腫瘍にはホーミングしない
皮下ＨＩＦｋｏ腫瘍を有するマウスの尾静脈に、フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチド（１０μｇ）を注射した。６０分間循環させた後、腫瘍を切除し、組織学的解析のために処理した。フルオレセインに対する抗体（ウサギ抗ＦＩＴＣ、Zymed Laboratories製）を使用してペプチドを可視化した。図４のＡ： ペプチドは腫瘍組織から検出されなかった。図４のＢ： 図４のＡと同じ顕微鏡視野。核はＤＡＰＩ染色（青色）によって可視化した。
【実施例５】
【００３０】
フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドのホーミングパターンは、種々の脳内腫瘍において異なる
マウスＨＩＦｋｏ脳内異種移植片またはヒトＵ８７ＭＧ脳内異種移植片のいずれかを有するマウスの尾静脈に、フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチド（１０μｇ）を注射した。６０分間循環させた後、腫瘍を含む脳を切除し、組織学的解析のために処理した。フルオレセインに対する抗体（ウサギ抗ＦＩＴＣ、Zymed Laboratories製）を使用して、ペプチドを可視化した。図５のＡ： ペプチド（赤色）は、ＨＩＦｋｏ島状腫瘍の腫瘍組織全体からびまん的に検出されたが、Ｕ８７ＭＧ腫瘍においては、ペプチドの分布は血管の分布と類似していた（図５のＢ）。核はＤＡＰＩ染色（青色）によって可視化した。
【実施例６】
【００３１】
フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ−１と共存しない
脳内にヒトＵ８７ＭＧ異種移植片を有するマウスの尾静脈に、フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチド（１０μｇ）を注射した。６０分間循環させた後、腫瘍を含む脳を切除し、組織学的解析のために処理した。フルオレセインに対する抗体（ウサギ抗ＦＩＴＣ、Zymed Laboratories製）を使用して、ペプチドを可視化した。図６のＡとＢ： ペプチド（赤色）は、血管マーカーＰＥＣＡＭ−１（緑色）（ラット抗マウスＰＥＣＡＭ−１、BD Pharmingen製）と共存しなかったが、血管の非常に近傍から検出された。倍率は図６のＡが２００倍、図６のＢが４００倍。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３２】
Blouw, B., Song, H., Tihan, T., Bosze, J., Ferrara, N., Gerber, H. P., Johnson, R. S., and Bergers, G. (2003). The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell 4, 133-146.
Hoffman, J. A., Giraudo, E., Singh, M., Zhang, L., Inoue, M., Porkka, K., Hanahan, D., and Ruoslahti, E. (2003). Progressive vascular changes in a transgenic mouse model of squamous cell carcinoma. Cancer Cell 4, 383-391.
Hoffman, J. A., Laakkonen, P., Porkka, K., Bernasconi, M., and Ruoslahti, E. (2004). In vivo and ex vivo selections using phage-displayed libraries. 出典：Phage Display, T. Clackson, and H. B. Lowman ed. (Oxford, U.K: Oxford University Press), pp. 171-192. 
Holash, J., Maisonpierre, P. C, Compton, D., Boland, P., Alexander, C. R., Zagzag, D., Yancopoulos, G. D., and Wiegand, S. J. (1999). Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science 284, 1994-1998.
Joyce, J. A., Laakkonen, P., Bernasconi, M., Bergers, G., Ruoslahti, E., and Hanahan, D. (2003). Stage-specific vascular markers revealed by phage display in a mouse model of pancreatic islet tumorigenesis. Cancer Cell 4, 393-403.
Kim, E. S., Serur, A., Huang, J., Manley, C. A., McCrudden, K. W., Frischer, J. S., Soffer, S. Z., Ring, L., New, T., Zabski, S., et al. (2002). Potent VEGF blockade causes regression of coopted vessels in a model of neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11399-11404.
Kunkel, P., Ulbricht, U., Bohlen, P., Brockmann, M. A., Fillbrandt, R., Stavrou, D., Westphal, M., and Lamszus, K. (2001). Inhibition of glioma angiogenesis and growth in vivo by systemic treatment with a monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor receptor-2. Cancer Research 61, 6624-6628.
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【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ファージディスプレイされたペプチド配列ＣＧＬＳＧＬＧＶＡの、脳内島状腫瘍へのホーミング
【図２】（Ａ〜Ｄ）フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドの、脳内の島状腫瘍へのホーミング
【図３】（ＡとＢ）フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、脳内のＶＥＧＦ過剰発現腫瘍にはホーミングしない
【図４】（ＡとＢ）フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、皮下のＨＩＦｋｏ腫瘍にはホーミングしない
【図５】（ＡとＢ）フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドのホーミングパターンは、種々の脳内腫瘍において異なる
【図６】（ＡとＢ）フルオレセイン結合ＣＧＬＳＧＬＧＶＡペプチドは、内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ−１と共存しない
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列番号１：  脳にホーミングするペプチド
【図１】
2011523632.tif 000002
【図２】
2011523632.tif 000003
【図３】
2011523632.tif 000004
【図４】
2011523632.tif 000005
【図５】
2011523632.tif 000006
【図６】
2011523632.tif 000007
【配列表】
2011523632000001.app
【国際調査報告】
2011523632.tif 000008
2011523632.tif 000009
2011523632.tif 000010
2011523632.tif 000011
2011523632.tif 000012