(57)【要約】本発明は、修飾サイトカインの効率的な精製方法を提供する。そのプロセスは、望ましいサイトカインの精製のためにクロマトグラフィー技術を使用することを含む。その精製サイトカインを、治療組成物として使用し得る。本発明の局面は、ダルベポエチンのアイソフォームを単離するためのプロセスを提供する。実施態様において、そのプロセスを、ダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームの単離のために使用する。特定の実施態様において、そのプロセスを、約４．５またはそれより低いｐＩのアイソフォームの単離のために使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダルボポエチンアイソフォームの混合物から、ダルボポエチンの低ｐＩアイソフォームを単離するためのプロセスであって、該プロセスは、少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、プロセス。
【請求項２】
前記アイソフォームが、約４．５未満のｐＩ値を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項７】
２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１１】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１５】
２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１６】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１８】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１９】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２０】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、前記陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、前記陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２２】
少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２３】
少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも１つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２４】
２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記フロースルーが、約２〜５．５のｐＨ値において得られる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記フロースルーが、約３〜５のｐＨ値において得られる、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記フロースルーが、約３．３のｐＨ値において得られる、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記フロースルーが、約４．８のｐＨ値において得られる、請求項３１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の局面は、アイソフォームの混合物から、ダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを分離するためのプロセスに関連する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンまたはＥＰＯは、肝臓細胞および腎臓細胞によって産生される、糖鎖付加サイトカインであり、そして赤血球の産生を調節する。精製組換えヒトＥＰＯを、不適切な赤血球の供給に関連する医学的問題、例えば貧血および慢性腎不全の治療のために、ヒト患者に投与し得る。
【０００３】
ヒトＥＰＯ分子のポリペプチド主鎖は、不変のアミノ酸配列を有する；しかし、炭水化物の側鎖は、糖含有量および構造において微小不均一性を示す（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。負に荷電したシアル酸分子が、典型的には炭水化物鎖の各アームの末端にキャップをする。結果として、一般的な炭水化物鎖の可変性の性質および特にシアル酸含有量が、電荷に差を有するＥＰＯアイソフォームを生じる（非特許文献４）。Ｅｇｒｉｅおよび同僚ら（非特許文献５および非特許文献６）は、ｒＨｕＥＰＯの炭水化物部分におけるシアル酸基の数とその血清半減期および生物学的活性両方との間の直接的な関連を発見した。シアル酸残基は、インビボで迅速なクリアランスを防止するので、より多くのシアル酸残基を有するエリスロポエチンアイソフォームは、より高い生物学的活性を発揮する。
【０００４】
ダルベポエチンは、新規の赤血球生成刺激タンパク質または５本のＮ結合型炭水化物鎖および２２個までのシアル酸を有するＥＰＯアナログである。対照的に、組換えヒトＥＰＯは、３本のＮ結合型炭水化物鎖および最大１４個のシアル酸を有する（非特許文献７および非特許文献８）。さらなる糖鎖付加の結果として、ダルベポエチンは、組換えヒトＥＰＯに関して、３倍長い血清半減期および増加したインビボ活性を示す。ダルベポエチンアイソフォームは、主に種々の数の負に荷電した末端シアル酸残基を有する、種々の糖鎖含有量に起因して生じる。より高いシアル酸含有量を有するアイソフォームは、低いｐＩを有する。ダルベポエチンのこれらの低ｐＩアイソフォーム、例えばＡｍｇｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによってＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）として販売される製品は、より高い治療的価値を有することが証明された。
【０００５】
文献は、単独、または疎水性相互作用またはサイズ排除クロマトグラフィー技術と組み合わせた、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＥＰＯおよびそのアナログの精製を開示する。
【０００６】
特許文献１は、一連の疎水性相互作用、陰イオン交換、陽イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー工程から成るエリスロポエチンの精製のためのプロセスを開示する。特許文献２は、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによる、組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製を開示する。Ｇｏｋａｎａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第７０１巻、１９９７、１０９−１１８頁は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌクロマトグラフィーによる、組換えヒトエリスロポエチンアイソフォームのクロマトグラフィーによる分離の方法を記載する。
【０００７】
従って、その開示は、エリスロポエチンおよびそのアナログの精製のために複雑な一連のクロマトグラフィー工程を有する。しかし、アイソフォームの混合物からダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを分離するために、効率的および単純なプロセスが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第００／２７８６９号
【特許文献２】国際公開第０３／０４５９９６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓａｓａｋｉ  Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８７；２６２：１２０５９−７６
【非特許文献２】Ｒｕｓｈ  ＲＳら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５；６７：１４４２−５２
【非特許文献３】Ｒｕｓｈ  ＲＳら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９３；６５：１８３４−４２
【非特許文献４】Ｒｕｓｈ  ＲＳら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５；６７：１４４２−５２
【非特許文献５】Ｅｇｒｉｅ  ＪＣ、およびＢｒｏｗｎｅ  ＪＫ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１；８４、３−１０
【非特許文献６】Ｅｇｒｉｅら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、１９９３；１０：２６３−２６９
【非特許文献７】Ｅｇｒｉｅ  ＪＣ、およびＢｒｏｗｎｅ  ＪＫ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１；８４、３−１０
【非特許文献８】Ｅｌｌｉｏｔ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ、２０００；９６：８２ａ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の局面は、ダルベポエチンのアイソフォームを単離するためのプロセスを提供する。実施態様において、そのプロセスを、ダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームの単離のために使用する。特定の実施態様において、そのプロセスを、約４．５またはそれより低いｐＩのアイソフォームの単離のために使用する。
【００１１】
アイソフォームの単離または精製を、少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて行う。そのプロセスは、ダルベポエチンのアイソフォームの混合物から低ｐＩアイソフォームを単離するために、ある範囲のｐＨおよび塩濃度を使用する。
【００１２】
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
【００１３】
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、そしてさらに少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
【００１４】
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、そしてさらに少なくとも１つの混合方式交換クロマトグラフィー工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例６の実験において得られた等電点電気泳動ゲルであり、実施例５で記載されたＱセファロース工程の溶出液において得られた低ｐＩアイソフォームを示す。
【図２】図２は、実施例６の実験において得られた等電点電気泳動ゲルであり、実施例４で記載されたように行ったＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程のフロースルーにおいて得られた低ｐＩアイソフォームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の局面は、フロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィーによって、ダルベポエチンの低ｐＩアイソフォームを単離するためのプロセスに関連する。
【００１７】
本発明は、少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、低ｐＩアイソフォームを、アイソフォームの混合物から分離する方法を含む。望ましいアイソフォームを得るための工程において使用する、低いｐＨ範囲の緩衝液のために、これは同時にウイルス不活性化工程として作用する。
【００１８】
本明細書中で使用される「アイソフォーム」という用語は、同一のアミノ酸配列を有するが、糖鎖付加、アシル化、脱アミド、または硫酸化における差異の結果として、荷電および従って等電点に関して異なるタンパク質を指す。
【００１９】
「等電点」または「ｐＩ」は、特定の分子または表面が、正味の電荷を有さないｐＨである。ポリペプチドの「ｐＩ」は、ポリペプチドの正電荷が、その負電荷と釣り合うｐＨを指す。ｐＩを、様々な公知の方法を用いて、例えばポリペプチドのアミノ酸残基および／またはシアル酸残基の正味の電荷から、または等電点電気泳動、クロマトフォーカシング等を用いることによって推定し得る。
【００２０】
低ｐＩアイソフォームは、約４．５またはそれより低いｐＩを有するアイソフォームである。
【００２１】
１つの実施態様において、低ｐＩアイソフォームを、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、または少なくとも１つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって単離する。
【００２２】
別の実施態様において、低ｐＩアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程、およびフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、アイソフォームの混合物から単離し、それに続いて任意で別の陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程を行い得る。
【００２３】
さらに別の実施態様において、低ｐＩアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程、第１のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および第２のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、アイソフォームの混合物から単離する。
【００２４】
さらに別の実施態様において、低ｐＩアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー、第１のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、および第２のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、続いて別の陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、他のアイソフォームの混合物から分離または精製する。
【００２５】
さらに別の実施態様において、低ｐＩアイソフォームを、陰イオン交換クロマトグラフィー、第１のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、および第２のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィーの工程、続いて混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、他のアイソフォームの混合物から分離または精製する。
【００２６】
本明細書中で述べられた実施態様は、クロマトグラフィー工程の間に、任意でタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＴＦＦ）、濃縮、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過工程のいずれかを含み得る。
【００２７】
ここで述べられた実施態様は、１つまたはそれ以上のウイルス不活性化工程または滅菌ろ過またはナノろ過工程を含み得る。
【００２８】
上記実施態様において述べられた陰イオン交換クロマトグラフィーを、あらゆる弱いもしくは強い陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、または弱いもしくは強い陰イオン交換体として機能し得る膜を用いて行い得る。陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂または膜の例は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー樹脂または膜である。
【００２９】
上記実施態様において述べられた陽イオン交換クロマトグラフィーを、あらゆる弱いもしくは強い陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、または弱いもしくは強い陽イオン交換体として機能し得る膜を用いて行い得る。弱い陽イオン交換樹脂の例は、カルボキシメチル−セファロース（ＣＭ−セファロース）または同様のカルボキシメチルリガンドを有する樹脂である。
【００３０】
上記実施態様において述べられた混合方式クロマトグラフィーは、１つより多くのクロマトグラフィー分離原理、典型的にはイオン性および疎水性が作用するクロマトグラフィー樹脂を指す。従って、混合方式樹脂は、陽イオンまたは陰イオン、疎水性部分またはリガンドを有する固相を指す。「固相」という用語は、あらゆる非水性マトリックスを意味して使用する。混合方式クロマトグラフィーリガンドは、疎水性相互作用もしくは荷電相互作用のいずれかまたは両方を示す。混合方式樹脂の例は、Ｃａｐｔｏａｄｈｅｒｅ樹脂または同様の方法で機能するあらゆる混合方式樹脂である。
【００３１】
陽イオン交換工程における「フロースルー方式」は、望ましいタンパク質が、カラムに結合せず、そして注入または注入後の洗浄工程の間に、フロースルー溶液において得られるプロセスを指す。フロースルーにおける望ましいタンパク質を、様々な画分として回収し、そして一緒にプールし得る、または単一の画分として回収し得る。
【００３２】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、タンパク質を注入するために本明細書中で使用する緩衝液は、約２から約５、または２．８から約４．８、または約３から約３．５のｐＨ値を有する。洗浄工程の間にタンパク質を得るために本明細書中で使用する緩衝液は、約２から約５、または約２．８から約４、または約３から約３．５のｐＨ値を有する。
【００３３】
第１の陽イオン交換工程において使用する緩衝液のｐＨは、第２の陽イオン交換工程において使用するｐＨと異なり得る。
【００３４】
緩衝溶液を作製するために使用する緩衝剤は、酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムまたはリン酸緩衝液、およびその塩または誘導体を含み得る。実施態様において、その緩衝剤は、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、または約４０から約９０ｍＭ、または約７５から約８５ｍＭの濃度を有する。
【００３５】
本発明のある特定の局面および実施態様を、説明の目的のためにのみ提供される、以下の実施例を参照することによってより完全に記載する。これらの実施例は、いかなる様式においても本発明の範囲を制限するとは解釈されない。
【実施例】
【００３６】
実施例１
タンパク質の発現および回収（ｈａｒｖｅｓｔ）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）産生細胞系を、ダルベポエチンアルファ発現ベクター（ｐＣＳ−ダルベポエチン−ＷＰＥ（ｎｅｗ  ｏｒｉ））由来のレトロベクターによる、ＣＨＯ−Ｓ親細胞系の形質導入によって作製する。形質導入後、プールした細胞の集団は、Ｔフラスコにおいて１０−１４日後、３６μｇ／ｍｌまでのダルベポエチンアルファを発現する。プールした細胞の集団を、非常に低い細胞濃度（１〜３生細胞／２００μｌ培地）まで希釈し、そして９６穴マイクロタイタープレートにまいて、単一の細胞由来のクローン細胞系を確立する。ダルベポエチンアルファの産生に関してクローンをスクリーニングし、そして高い生産性を有するクローンを発現のために選択する。
【００３７】
ダルベポエチンアルファを発現する細胞を、生産反応器に播種する前に、３段階のスピナーおよび１段階のシード反応器において、マスター細胞バンクから増殖させる（ｅｘｐａｎｄ）。
【００３８】
良好な細胞の増殖および高い生存能を得るために、スピナー中で細胞を培養するためにＰＦ  ＣＨＯ培地を使用する。ＰＦ−ＣＨＯ培地は、培地１リットル当たり以下のものを含む：ＰＦ−ＣＨＯ主粉末６．０ｇ、ＰＦ−ＣＨＯ基本粉末１０．４ｇ、Ｌ−グルタミン０．５８ｇ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  １．０ｇ、炭酸水素ナトリウム２．０ｇ。培地のｐＨを播種前に７に設定した。マスター細胞バンク由来の細胞を、ＰＦ−ＣＨＯ培地を含むスピナーボトルに、２０万細胞／ｍＬの最初の細胞数で播種する。そのスピナーボトルを、３７℃に維持した５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。細胞密度が１００万細胞／ｍＬに達する７２時間のインキュベーション後に、細胞を回収し、そして別の段階に移す。スピナーボトルにおける３段階の移動の後、細胞を、４ＬのＳＦＭ−６（１）培地を含む６．５Ｌのシード反応器に、２０万細胞／ｍＬの最初の細胞濃度で播種する。ＳＦＭ−６（１）培地は、「ＤＭＥＭ／Ｆ−１２」基本培地、アミノ酸、インスリン、ビタミン、微量元素、植物ペプトン、炭酸水素塩およびフルクトース糖を含む。シード反応器において、ｐＨを７．０に維持し、そして培養の温度を３７．０℃に調節する。撹拌および通気を調節することによって、溶解酸素を４０％に維持する。細胞密度が１００万細胞／ｍＬに達する７２時間後、培養を無菌的に回収し、そして細胞を、１０ＬのＳＦＭ−６（２）培地を含む１１Ｌの生産反応器へ、２０万細胞／ｍＬの最初の細胞密度で移す。１２日後に培養を回収して、望ましい産物を含む上清を回収する。
【００３９】
実施例２
陰イオン交換クロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーによる捕捉
未精製の抽出物の浄化後、浄化した細胞培養液を濃縮し、そしてｐＨ７．１の２５ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて、ダイアフィルトレーション（３０ｋＤａの分子量カットオフによるタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて）によって伝導率を減少させる。次いで濃縮した細胞培養液を、５カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１緩衝液で前平衡化した、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。次いでカラムを５ＣＶの平衡化緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１）で洗浄した。続いてｐＨ４．０の８０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０−１２０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で、低ｐＨ洗浄を行った。平衡化緩衝液による洗浄をもう１度行った。カラムに注入された望ましいタンパク質を、ｐＨ７．１の２５ｍＭのＴｒｉｓ、１４０−３００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出した。
【００４０】
あるいは、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（混合方式クロマトグラフィーカラム）を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの代わりに使用し得る。Ｃａｐｔｏａｄｈｅｒｅカラムを、５ＣＶの２０ｍＭのリン酸塩、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１±０．２緩衝液で前平衡化する。次いでそのカラムを５ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１±０．２）で洗浄する。続いてｐＨ４．０の８０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０−１２０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で、低ｐＨ洗浄を行う。平衡化緩衝液による洗浄をもう１度行う。カラムに注入された望ましいタンパク質を、ｐＨ７．１±０．２で平衡化した２０ｍＭのリン酸塩、１４０−３００ｍＭのＮａＣｌで溶出する。
【００４１】
実施例３
第１の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例２からの溶出液の画分をプールおよび濃縮し、そしてｐＨ４．８の７３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を用いたＴＦＦ工程によるダイアフィルトレーションによって伝導率を減少させる。この工程は、緩衝液交換工程として作用し、ここでＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムのプールした溶出液を、ｐＨ４．８の７３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中にする。次いで緩衝液を交換したサンプルを、５ＣＶのｐＨ４．８の７３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムへ注入する。サンプルを注入する間に、望ましい産物をフロースルー中に得て、一方不純物はカラムに結合する。注入後、カラムを３ＣＶのｐＨ４．８の７３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程においてもフロースルーとして得る。続いてカラムに結合した不純物を、ｐＨ７．１の２５ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出する。
【００４２】
実施例４
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例３からのフロースルー画分、または実施例２からの溶出液の画分をプールし、濃縮し、そしてＴＦＦを用いて８３ｍＭの酢酸ナトリウム（または８０−８５ｍＭの酢酸ナトリウム）を含む緩衝液、ｐＨ３．３（またはｐＨ３．０−３．５）で交換する。ＴＦＦ由来のサンプルを、５ＣＶのｐＨ３．３の８３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。望ましい産物を、サンプルを注入中にフロースルーにおいて得る。この工程において使用する緩衝液のｐＨが、フロースルー中に必要なアイソフォームを得るために重要であることが見出された。また上記のプロセスを、３０分より長く続け、従って同時にそれはウイルス不活性化工程として作用する。注入後、カラムを９ＣＶのｐＨ４．８の７３ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程のフロースルーにおいて同様に得る。続いてカラムに結合した不純物を、ｐＨ７．１の２５ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出する。
【００４３】
実施例５
陰イオン交換クロマトグラフィー工程またはＣａｐｔｏａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー工程
実施例４由来のフロースルー画分を、２５ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．１の緩衝液で前平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。そのカラムを、同じ緩衝液で洗浄する。望ましい産物がカラムに結合し、そしてｐＨ６．０で緩衝化した４０ｍＭのリン酸塩、２８０ｍＭのＮａＣｌで溶出する。
【００４４】
あるいは、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（混合方式クロマトグラフィーカラム）を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの代わりに使用し得る。この場合、カラムを５ＣＶのｐＨ６．０の２０ｍＭのリン酸緩衝液で前平衡化し、そして同じ緩衝液（５ＣＶ）で再び洗浄する。次いでカラムに結合した望ましいタンパク質を、４ＣＶの４０ｍＭのリン酸塩および２８０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．０の緩衝液で溶出する。
【００４５】
この工程（実施例５）は、濃縮および緩衝液交換工程として作用し、従って別のＴＦＦの必要性を排除する。これはまた通常のＴＦＦよりもコントロールされた環境を提供する。
【００４６】
実施例６
等電点電気泳動
実施例４のフロースルー画分および実施例５由来の溶出液を、等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって分析する。ＩＥＦゲルを、水、尿素、３０％アクリルアミド、および両性電解質（ｐＨ範囲２−４および３−１０）を用いて調製する。上記の成分を静かに混合し、そして１０％ｗ／ｖの過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤを混合物に加え、そしてその混合物をゲルサンドイッチ装置（ＢＩＯＲＡＤ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｃｅｌｌ）中に入れ、そしてコームをはめる。ゲルを室温で４５分間ポリマー化させる。少量のタンパク質溶液を、同じ容積のサンプル緩衝液（グリセロール、両性電解質およびＭｉｌｌｉ  Ｑ水）と混合し、そしてゲルに添加する。次いでゲルをＢＩＯＲＡＤ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｃｅｌｌアセンブリーに置き、そして別の区画においてアノード緩衝液（２５ｍＭの水酸化ナトリウム）およびカソード緩衝液（２５ｍＭのオルトリン酸）を満たす。実施例４由来のフロースルー画分または実施例５由来の溶出液を、室温において両性電解質の前電気泳動（ｐｒｅ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）のために２００Ｖの定電圧で１．５時間流し、そして次いで電圧を４００Ｖに上げて、そして室温で次の１．５時間流す。流した後、当該分野で開示されるように、ゲルを注意深く除去し、そしてクーマシーまたは銀染色のいずれかを用いて染色する。
【００４７】
図１は、上記で記載したように行った実験からの等電点電気泳動ゲルを示し、実施例５で記載したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程の溶出液において得られた低ｐＩアイソフォームを示す。レーンＡからＦは、本発明によって行った異なる精製バッチである；すなわち、ダルベポエチンアルファを発現する細胞培養の回収物を、実施例２で記載したように陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて実施例４で記載したように、フロースルー方式で陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、続いて実施例５で記載したように、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。
【００４８】
図２は、上記で記載したように行った実験からの等電点電気泳動ゲルを示し、実施例４で記載したように行ったＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程のフロースルーにおいて得られた低ｐＩアイソフォームを示す。図のレーンＡからＣおよびＦからＩは、本発明によって行った異なる精製バッチである；すなわち、ダルベポエチンアルファを発現する細胞培養の回収物を、実施例２で記載したように陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて実施例４で記載したように、フロースルー方式で陽イオン交換クロマトグラフィーを行う。レーンＤおよびＥは、ダルベポエチン（ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）アルファＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）（ｐＩ２．８〜３．３）の市販で入手可能なサンプルにおいて観察されたアイソフォームであり、そして比較のための標準として使用する。
【図２】
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【図１】
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【国際調査報告】
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