(57)【要約】  本発明は、細胞において高容量組換えアデノウイルスを生成するための系の開発を可能とし、該高容量アデノウイルスに対するヘルパーアデノウイルスの混入を最適に減少させる自己不活性化ヘルパーアデノウイルスを得るための試薬および方法に関する。
2011520440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）誘導プロモーターの機能的制御下にあり、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
ｂ）配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接された、アデノウイルスゲノムの複製および／またはパッケージングのための必須領域（該認識配列は、該リコンビナーゼの存在下で該必須領域の除去を行うように配向されている）
を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムのパッケージングまたは複製のための必須領域（ｂ）が、パッケージングシグナルΨである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
転写アクチベーターのリガンドの存在下で、配列（ａ）によりコードされるリコンビナーゼの発現を調節するプロモーターを特異的に活性化することができる転写アクチベーターをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記転写アクチベーターが、テトラサイクリン類似体依存性トランスアクチベーターである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
転写アクチベーターが、ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
リコンビナーゼが、ＣｒｅまたはＣｒｅリコンビナーゼの配列を含んでなる融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
リコンビナーゼが、ホルモン結合ドメインまたは活性化可能な核局在配列、好ましくは、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメインをさらに含んでなる、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド含んでなる、発現ベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの配列を含んでなる、アデノウイルス粒子。
【請求項１１】
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの複製およびパッケージングのための系であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項８もしくは９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載のアデノウイルス粒子と、
ｂ）真核細胞
を含んでなる、系。
【請求項１２】
要素（ｂ）を形成する細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーター特異的転写レプレッサーを含んでなる、請求項１１に記載の系。
【請求項１３】
転写レプレッサーが、部位特異的リコンビナーゼの発現を促進することができるリガンドの不在下で活性である、請求項１２に記載の系。
【請求項１４】
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスを得るための方法であって、
（ｉ）細胞と、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８もしくは９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載のアデノウイルス粒子とを、また所望により、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質をコードする１または数個のポリヌクレオチドとを、アデノウイルスゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件下で接触させること、
（ｉｉ）該細胞を、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製を可能とし、かつ、部位特異的リコンビナーゼの発現を妨げるのに好適な条件で保持すること、および
（ｉｉｉ）培地からアデノウイルスを回収すること
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーター特異的転写レプレッサーを含んでなり、該レプレッサーが、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターを活性化することができるリガンドの類似体の不在下で活性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記転写レプレッサーが、ドキシサイクリン依存性ｔＴＳレプレッサーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法に得られたヘルパーアデノウイルス。
【請求項１８】
高容量アデノウイルスの生産およびパッケージングのための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項８もしくは９に記載のベクター、または該ポリヌクレオチドを含んでなる請求項１０に記載のアデノウイルス粒子の使用。
【請求項１９】
高容量組換えアデノウイルスを生産するための系であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項８もしくは９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載のアデノウイルス粒子；
（ｂ）そのゲノムが、目的遺伝子を含んでなり、かつ、該アデノウイルスの複製に必須の少なくとも１つのタンパク質もしくはパッケージングに必須の少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を欠いたアデノウイルス、または該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）真核細胞
を含んでなる、系。
【請求項２０】
真核細胞が、系の要素（ａ）によりコードされる部位特異的リコンビナーゼを発現するポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１９に記載の系。
【請求項２１】
部位特異的リコンビナーゼをコードする領域が、誘導プロモーターの機能的制御下にある、請求項２０に記載の系。
【請求項２２】
目的遺伝子を発現する高容量アデノウイルスを作出する方法であって、
（ｉ）細胞とアデノウイルスとを、該アデノウイルスのゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉ）該細胞と、
（ａ）
１．誘導プロモーターの機能的制御下にあり、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
２．配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接されたアデノウイルスパッケージングシグナルΨ（該認識配列は、該リコンビナーゼの存在下でパッケージングシグナルΨの除去が起こるように配向されている）
を含んでなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルスベクター、および
（ｃ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルス粒子
の群から選択される第二の成分とを、該ポリヌクレオチド、該アデノウイルスベクターまたは該アデノウイルス粒子のゲノムが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉｉ）両ウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質の発現、両アデノウイルスのゲノムの複製、および工程（ｉｉ）で用いたポリヌクレオチド、ベクターまたはアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼの発現に好適な条件で細胞を保持する工程、および
（ｉｖ）細胞培養物から高容量アデノウイルスを回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２３】
（ａ）で定義されたポリヌクレオチドおよび／または細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターの特異的トランスアクチベーターをコードする配列をさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターの特異的トランスアクチベーターと結合し、それを活性化することができるリガンドの存在下で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスアクチベーターが、ｒｔＴＡ−Ｍ２であり、前記リガンドが、ドキシサイクリンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、部位特異的リコンビナーゼをコードする配列を含んでなり、該リコンビナーゼが（ａ）で定義されたポリヌクレオチドによりコードされるものと同じである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
部位特異的リコンビナーゼが、ＣｒｅまたはＣｒｅリコンビナーゼの配列を含んでなる融合タンパク質である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
リコンビナーゼが、ｍｅｒＣｒｅｍｅｒである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、タモキシフェンの存在下で行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前のサイクルの工程（ｉｖ）で回収されたアデノウイルスを各サイクルの工程（ｉ）で用いて、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を少なくとも１回繰り返すこと、および所望により、各サイクルの工程（ｉ）で新たな用量のヘルパーアデノウイルスを加えることを含んでなる、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アデノウイルスベクターの分野、より具体的には、高容量アデノウイルスに対して最少のヘルパーアデノウイルス混入で、細胞において組換えアデノウイルスを生成することができる自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの使用による、第三世代、すなわちガットレスアデノウイルスベクターの生産系の分野に関する。
【発明の背景】
【０００２】
高容量アデノウイルス（ＨＣ−Ａｄ）は、ガットレスアデノウイルスまたはヘルパー依存性アデノウイルスとしても知られ、齧歯類および霊長類の双方において高い形質導入効率と他のアデノウイルスベクターの向性を維持していることから遺伝子療法用のベクターとして大きな魅力を持っているが、感染細胞におけるウイルスタンパク質の発現に関連した免疫原性を妨げる。さらに、これらのウイルスベクターは他のウイルスベクターよりもはるかに高い、大きな目的導入遺伝子挿入能（最大およそ３６Ｋｂ）を持っている。
【０００３】
高容量アデノウイルスベクターは、総てのウイルスコード配列が「空」となったアデノウイルスに基づく。これらのベクターは、最小要件として、ウイルスの複製に必要なアデノウイルスゲノムの末端領域（ＩＴＲ、逆方向末端反復配列）とパッケージングシグナル（Ψ）（これもまたシスで働く）を有する。
【０００４】
高容量アデノウイルスが総てのウイルスコード領域を欠いているとすれば、それらの増殖には、ウイルスタンパク質をトランスで提供する、Ｅ１領域が欠損したヘルパーウイルスの存在が必要となる。増殖は、ヘルパーウイルスで欠損しているＥ１領域が組み込まれた２９３細胞系統における同時トランスフェクションまたは同時感染の手段によって行われる。
【０００５】
しかしながら、この増殖系では、ヘルパーウイルスゲノムをキャプシドに封入し、高容量アデノウイルスの最終調製物を汚染する、望ましくないウイルス粒子が生成する。ヘルパーウイルスの蓄積は変動が大きいが、極めて強力で高容量ウイルスに取って代わってしまう場合があり、これが現行の生産方法が臨床使用に十分信頼できるものではない理由の１つである。もう１つの限定要因は、ヘルパーウイルスの様相の問題にも一部関係がある性能である。現在までに、ヘルパーウイルスのパッケージング効率を引き下げるための種々の形が開発および記載されている。これらの系は一般に、ヘルパーウイルスのパッケージングシグナルにおける突然変異の導入、そのゲノムサイズの増大、そして、より詳しくは、ウイルス生産プロセス中のパッケージングシグナルの特異的排除に基づくものである。
【０００６】
Parks et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:13565-13570)は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系（この場合、該ウイルスのシグナルΨはｌｏｘＰ部位により隣接されている）によりヘルパーウイルスのパッケージングシグナルを排除する方法を記載している。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞で増殖が起これば、リコンビナーゼはヘルパーウイルスのシグナルΨを除去し、それをパッケージングできないようにするが、その結果、高容量アデノウイルスのパッケージングに必要なコード配列が保持される。あるいは、米国特許第７，０４５，３４７号およびNg et al. (Mol Ther 2001; 3: 809-815)には、パッケージング配列がＦＬＰリコンビナーゼのｆｒｔ認識部位により隣接され、その結果、酵母ＦＬＰリコンビナーゼを発現する２９３細胞内でのヘルパーウイルスの増殖がパッケージング配列の除去をもたらす、ヘルパーウイルスに基づく、ヘルパーウイルスの不活性化系が記載されている。
【０００７】
これらの系には、リコンビナーゼにより触媒される反応が双方向性であり、それにより、パッケージング配列がヘルパーウイルスのゲノムに再導入されてしまうという欠点がある。この問題を避けるため、Groth et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97:5995-6000)は、特異的ａｔｔＢ／ａｔｔＰ認識配列を用いてシグナルΨを隣接し、一方向性リコンビナーゼ、特に、ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼを使用することを提案している。ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼはａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位により隣接された配列を除去し、認識配列を改変し、それらをａｔｔＲ／ａｔｔＬ配列に変換し、（シグナルΨの再組み込みによる）その認識が再び起こらないようにする。
【０００８】
しかしながら、これらの方法は総て、ヘルパーウイルスのパッケージング配列を排除するのに、宿主細胞のゲノムに存在するそのコード配列からリコンビナーゼを発現させる必要があるという問題に直面する。前記のプロセスはウイルスの周期に即して起こり、そこでは、細胞タンパク質の発現がアデノウイルスによる感染に関連した細胞変性効果のために若干阻害され、従って、ヘルパーアデノウイルスの総てのコピーを排除するのに十分高い細胞内リコンビナーゼレベルには達しない可能性がある。
【０００９】
従って、パッケージされ得るヘルパーアデノウイルスの生成を回避するため、または少なくともその形成をガットレスベクターの形成よりも遅らせるための別法が提案されている。例えば、特許文献ＷＯ２００７１２５１４６には、ヘルパーアデノウイルスベクターが、パッケージング配列とそのパッケージング配列に近接するＩＴＲの間にファージΦＣ３１  ａｔｔＢ配列を含んでなる、これまでに記載されている方法の変形が記載されている。このａｔｔＢ部位が含まれると、ΦＣ３１リコンビナーゼが存在しなくても、ガットレスアデノウイルスよりもヘルパーアデノウイルスのパッケージングが遅れ、ガットレスウイルスの調製物へのヘルパーアデノウイルスの混入量が減る。しかしながら、この方法では、ヘルパーアデノウイルスの形成が遅延するだけでなく、パッケージング能のあるヘルパーアデノウイルスの形成を避けることができない。
【００１０】
この問題はＤＥ１０１５９１６７に記載されているアデノウイルス系により解決された。この系では、リコンビナーゼはガットレスアデノウイルスによりコードされ、ヘルパーアデノウイルスが、パッケージングシグナルを含んでなる領域の範囲を定めるリコンビナーゼ認識標的部位を含み、それが排除されると、ヘルパーアデノウイルス中にＡＡＶ  ｐ５転写プロモーターに近接して、発現サイレンサーに対して３’方向に存在するＥ１アデノウイルス遺伝子が生じる。従って、このガットレスアデノウイルスが存在すれば、リコンビナーゼはヘルパーアデノウイルスのゲノムのパッケージング領域を排除し、同時に、ガットレスアデノウイルスのパッケージングに必要なＥ１遺伝子を発現させる。しかしながら、このアデノウイルス系は、Ｅ１を発現するヘルパーウイルスを含むことから複製可能なウイルスであり、従って、従来のヘルパーウイルスよりも危険性が大きい。さらに、このガットレスウイルスはリコンビナーゼを発現し、臨床用途の治療ベクターとしては望ましくない。
【００１１】
パッケージング細胞からのリコンビナーゼに頼らなくてすむもう１つの解決法が、ヘルパーウイルス自体によってコードされるリコンビナーゼの使用である。特許文献ＵＳ２００２００７２１２０には、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインにより形成される融合タンパク質をコードするヘルパーアデノウイルスベクターが記載されており、この融合タンパク質は構成プロモーターの機能的制御下にある配列によりコードされている。このＣｒｅ−ＥＲ融合タンパク質は核にのみ移行し、エストロゲンまたは類似体の存在下でそのリコンビナーゼ活性を発揮し、それにより、リコンビナーゼを発現する細胞を使用する必要を無くすと同時に、その活性が培養培地へエストロゲンを加えることによって調節され得るということを考えれば、リコンビナーゼの毒性作用を回避する。
【００１２】
よって、当技術分野では、これまでに知られていた系の欠点を無くす、アデノウイルスベクター用のパッケージング系、特に、ガットレスアデノウイルスの増殖中にヘルパーアデノウイルスの生成を最大限減少させる方法が必要である。
【発明の概要】
【００１３】
第１の態様において、本発明は、
ａ）誘導プロモーターの機能的制御下にあり、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
ｂ）配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接された、アデノウイルスゲノムの複製および／またはパッケージングのための必須領域（該認識配列は該リコンビナーゼの存在下で該必須領域の除去を行うように配向されている）
を含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。
【００１５】
第３の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの配列を含んでなるアデノウイルス粒子に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、
ａ）本発明によるポリヌクレオチド、発現ベクターまたはアデノウイルス粒子；と
ｂ）真核細胞
を含んでなる、自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの複製およびパッケージングのための系に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、自己不活性化ヘルパーアデノウイルスを得るための方法であって、
（ｉ）細胞と、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターまたはアデノウイルス粒子とを、また所望により、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質をコードする１または数個のポリヌクレオチドとを、アデノウイルスゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件下で接触させること、
（ｉｉ）該細胞を、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製を可能とし、かつ、部位特異的リコンビナーゼの発現を妨げるのに好適な条件で保持すること、および
（ｉｉｉ）培地からアデノウイルスを回収すること
を含んでなる方法に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、前段の方法に従って得られたヘルパーアデノウイルスに関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、高容量アデノウイルスの生産およびパッケージングのための、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたはアデノウイルス粒子の使用に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、高容量組換えアデノウイルスを生産するための系であって、
（ａ）本発明によるポリヌクレオチド、発現ベクターまたはアデノウイルス粒子；
（ｂ）そのゲノムが、目的遺伝子を含んでなり、かつ、該アデノウイルスの複製に必須の少なくとも１つのタンパク質またはパッケージングに必須の少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を欠いたアデノウイルス、あるいは該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）真核細胞
を含んでなる系に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、
目的遺伝子を発現する高容量アデノウイルスを作出する方法であって、
（ｉ）細胞とアデノウイルスとを、該アデノウイルスのゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉ）該細胞と、
（ａ）
１．誘導プロモーターの機能的制御下にあり、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
２．配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接されたアデノウイルスパッケージングシグナルΨ（該認識配列は該リコンビナーゼの存在下でパッケージングシグナルΨの除去が起こるように配向されている）
を含んでなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルスベクター、および
（ｃ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルス粒子
の群から選択される第二の成分とを、該ポリヌクレオチド、該アデノウイルスベクターまたは該アデノウイルス粒子のゲノムが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉｉ）両ウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質の発現、両アデノウイルスのゲノムの複製、および工程（ｉｉ）で用いたポリヌクレオチド、ベクターまたはアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼの発現に好適な条件で細胞を保持する工程、および
（ｉｖ）細胞培養物から高容量アデノウイルスを回収する工程
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの操作図を示す。パネルＡは、パッケージング細胞によるＣｒｅの生産に基づく従来の方法を示す。強力なウイルス複製条件では、Ｃｒｅの発現は、指数関数的に増幅するウイルスゲノムの数のパッケージング配列を除去するには不十分である場合がある。パネルＢは、各自己不活性化ヘルパーウイルスがどのようにしてＣｒｅ遺伝子の担体となり、ウイルスゲノムの増加と平衡してＣｒｅの発現能を高めるかを示す。
【図２】Ｃｒｅの発現のための誘導系の操作図を示す。構成プロモーター（ＰＧＫ）はトランス活性化タンパク質ｒｔＴＡ−Ｍ２の発現を命令する。インデューサー（ドキシサイクリン）の存在下では、ｒｔＴＡ−Ｍ２は二量体を形成し、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を制御する誘導プロモーター（ｔｅｔＯ−ｐＡｌｂ）を活性化する。ｐＡは、ポリアデニル化配列。
【図３】タンパク質ｔＴＳの操作図を示す。ドキシサイクリンの不在下で、ｔＴＳは誘導プロモーターと結合し、Ｃｒｅの発現を阻害する。ドキシサイクリンを加えると、ｔＴＳはこのプロモーターとの親和性を失い、Ｃｒｅの発現阻害をやめ、二量体により媒介される、トランス活性化タンパク質の活性化が可能となる。
【図４】２９３細胞におけるｔＴＳの安定な発現を示す。ｔＴＳを発現するプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞の種々のクローンのＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｔＴＳ  ｍＲＮＡの産生を検出した。ｃＤＮＡを含むプラスミドを対照として含めた。ＭＷは、分子量マーカー。
【図５】誘導プラスミドにおけるＣｒｅの発現の制御を示す。２９３細胞を示されたプラスミドでトランスフェクトした。すなわち、ｐＢＳ１８５は構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＣｒｅを発現し；ｐａｌｂＣｒｅはＣｒｅの発現を制御することによる誘導プロモーターを含み；ｐＧＫｒｔＴＡはＰＧＫプロモーターの制御下でトランスアクチベーターを発現し；ｐｒｔＴＡＣｒｅは１つの同じプラスミドにＣｒｅの発現カセットとトランスアクチベーターの発現カセットを含む。Ａでは、総ての細胞をドキシサイクリンの存在下で維持した。Ｂでは、それらをドキシサイクリンの存在下または不在下で比較した。Ｃｒｅの発現はウエスタンブロットにより検出した。
【図６】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスとその機能を表した図である。パッケージングシグナルΨは、同じ配向のＬｏｘＰ部位により隣接されている。ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターはネズミＰＧＫ遺伝子の構成プロモーターの制御下にあり、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質はそのＴｅｔＯ−ｐａｌｂ誘導プロモーターの制御下にある。ドキシサイクリンの存在下では、ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターは二量体を形成し、ＴｅｔＯ−ｐａｌｂプロモーターに結合する。これはＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の発現を活性化し、このタンパク質はタモキシフェンの存在下で活性となり、ＬｏｘＰ部位を認識し、パッケージングシグナルを排除してヘルパーウイルスがキャプシドに封入されないようにする。ＩＴＲは、逆方向末端反復配列。
【図７】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスのゲノムを生成するためのｐＡｄＬｏｘＰＭｅｒＣｒｅプラスミドとｐＳｈｕｔＭｅｒプラスミドの間の組換えを示す。２９３ｔＴｓ細胞において、ｐＳｈｕｔＭｅｒプラスミドとｐＡｄＬｏｘＰＭｅｒＣｒｅプラスミドをどちらもＰａｃ  Ｉ制限酵素で消化し、同時トランスフェクトした。組換えは両プラスミドの相同領域間で起こり、感染力のあるアデノウイルスのゲノムを、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒの完全発現カセットおよびＬｏｘＰ部位により隣接されたパッケージングシグナルを用いて回復させた。
【図８】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスにおけるＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の発現の制御を示す。タモキシフェンおよびドキシサイクリン処理有り（ライン７〜９）または無し（ライン４〜６）で、２９３ｔＴｓ細胞を、ウイルス２個／細胞のＭＯＩで８時間、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスに感染させた。抗体による野生型リコンビナーゼの検出を証明するために、ライン２に２９３細胞の抽出液をのせた。ライン３は、ｐＡＮＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドでトランスフェクトした２９３ｔＴｓ細胞である。ライン１は、陰性対照としての非感染２９３細胞に相当する。ＣｒｅおよびＭｅｒＣｒｅＭｅｒの発現は免疫ブロット法により検出した。
【図９】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの生産の調節を示す。２９３ｔＴｓ、２９３および２９３Ｃｒｅ４細胞をＡｄＴｅｔＣｒｅウイルス２個／細胞のＭＯＩで４８時間感染させ、細胞抽出液において感染力のあるウイルスの生産を定量した。示されているように、これらの細胞には事前にドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、タモキシフェン（Ｔａｍ）、同時に両方（Ｔ／Ｄ）で２４時間の処理を施すか、またはこの期間無処理とした（Ｃｏｎｔ）。
【図１０】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの生産の調節を標準的なヘルパーアデノウイルスと比較して示す。２９３ｔＴｓ、２９３および２９３Ｃｒｅ４細胞にＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスまたはＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルス２個／細胞のＭＯＩで感染させた。示されているように、これらの細胞には事前にドキシサイクリンおよびタモキシフェン（Ｔ／Ｄ）で２４時間の処理を施すか、またはこの期間無処理とした（Ｃｏｎｔ）。感染期間中、処理を維持した。４８時間が終わったところで、細胞抽出液において感染力のあるウイルスの生産を定量した。
【図１１】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスおよびＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルスのパッケージングシグナルの除去を示す。（Ａ）２９３細胞をＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスにウイルス２個／細胞のＭＯＩで４８時間感染させた。示されているように、これらの細胞には事前にドキシサイクリンおよびタモキシフェン（ライン４）で２４時間の処理を施すか、またはまたはこの期間無処理とした（ライン３）。感染期間中、処理を維持し、その後、感染細胞のＤＮＡを抽出し、ウイルスゲノムの始まりに相当する領域をＰＣＲにより増幅した。ｐＳｈｕｔＭｅｒプラスミド（このプラスミドは同じゲノム領域を含む）を鋳型として用いたＰＣＲ産物（ライン２）または２９３ｔＴｓ細胞で生産された精製ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルス（ライン１）を対照として示す。（Ｂ）２９３Ｃｒｅ４細胞（ライン２）は、ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルスにウイルス２個／細胞のＭＯＩで感染させ、４８時間後にＤＮＡを抽出した。従前の節と同様にＰＣＲ分析を行った。２９３細胞で生産された精製ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルスのＤＮＡ（ライン１）を対照として用いた。完全なパッケージングシグナルまたは除去されたパッケージングシグナルを有するフラグメントに相当する大きさをそれぞれ黒と白の矢印で示す。
【図１２】ＨＣ−Ａｄの生産におけるＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの使用を示す。（Ａ）２９３Ｃｒｅ４細胞をＨＣ−Ａｄ  ＫＣＺのゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトし、６時間後、それらにＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルス１個のＭＯＩで感染させた。４８時間後にこれらの細胞を回収した（０代目）。より多くの２９３Ｃｒｅ４細胞を感染させるため、一連の継代培養に、それまでの継代培養物の溶解液を、ＭＯＩ  １のＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスとともに用いた。０代目〜３代目は６０ｍｍプレートで行う。４代目は２枚の１５０ｍｍプレート、５代目は８枚の１５０ｍｍプレート、６代目は３０枚の１５０ｍｍプレートに相当する。ＫＣＺウイルスおよびＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの量は免疫細胞化学の手段により、継代培養ごとに定量した。どの場合にも、細胞をドキシサイクリンおよびタモキシフェンで処理した。（Ｂ）２９３細胞では、同じプロトコールを４代目まで繰り返した。（Ｃ）２９３Ｃｒｅ４細胞では、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンで処理しないＡｄＬＣ８ｃｌｕｃヘルパーウイルスを用いて、同じプロトコールを繰り返した。
【図１３】ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスにおけるＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の発現動態。２９３細胞に２４時間のタモキシフェンおよびドキシサイクリン前処理を施し、その後、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスにウイルス２個／細胞のＭＯＩで感染させた。６、１２、３６および４８時間後に細胞を回収し、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒの発現を免疫ブロット法により分析した。対照ラインには非感染２９３細胞の抽出液を添加した。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明者らは、パッケージング配列がリコンビナーゼの認識標的部位により隣接され、かつ、リコンビナーゼをコードする配列（該配列は誘導プロモーターに作動可能に連結されている）をさらに含んでなるヘルパーアデノウイルスベクターが、驚くべきことに、ヘルパーウイルス混入程度の低いガットレスアデノウイルスを作出可能とすることを示した。特定の理論に関連するものではないが、実際のヘルパーアデノウイルスにコード配列を含ませると、実際のウイルスのコピーの増加と並行してリコンビナーゼの発現が高まり、従って、ヘルパーアデノウイルスゲノムの全コピーのパッケージング配列を切り出すのに十分な量のリコンビナーゼは常に存在し、それは実際のウイルスにより引き起こされる細胞タンパク質の発現阻害に常に感受しないと考えられる。図１は、リコンビナーゼが、パッケージングが行われる細胞により発現される従来のアデノウイルスパッケージング法（左のパネル）、またはリコンビナーゼが実際のヘルパーウイルスのゲノムにより発現される本発明の方法（右のパネル）による比較図を示す。実験の部では、本発明の特徴を含んでなるアデノウイルスが培地中のドキシサイクリンの存在に依存してリコンビナーゼを発現する方法例を記載する（実施例３参照）。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチド
よって、第１の態様において、本発明は、
ａ）誘導プロモーターの機能的制御下にある、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
ｂ）配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接された、アデノウイルスゲノムの複製および／またはパッケージングのための必須領域（該認識配列は該リコンビナーゼの存在下で該必須領域の除去を行うように配向されている）
を含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
本発明によれば、部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼの標的部位間での部位特異的組換えを促進することができるタンパク質として理解される。本発明で用いるのに好適なリコンビナーゼとしては、Ｐ１ファージのＣｒｅリコンビナーゼ（ＬｏｘＰ）、枯草菌(S. cerevisiae)のＦＬＰリコンビナーゼ（Ｆｒｔ）、放線菌ΦＣ３１ファージ由来のインテグラーゼ（ａｔｔＢ、ａｔｔＰ）、ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ、Ｒ４リコンビナーゼまたはλインテグラーゼが含まれる。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼは、最初にAbreinski and Hoess (J. Biol. Chem. 1984, 259:1509-1514)により記載されたＰ１ファージのＣｒｅリコンビナーゼ、ならびにリコンビナーゼの配列とリコンビナーゼの活性を調節する第二のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の双方を含むＣｒｅリコンビナーゼである。Ｃｒｅリコンビナーゼは、それ自体を用いる場合も融合体の形態で用いる場合も、ＷＯ２００００６００９１に記載されているように、標的配列に対して広い特異性を有するように改変することができる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドが、リコンビナーゼを含んでなる融合タンパク質をコードする配列を含んでなる場合、活性化可能な核局在配列として働くポリペプチドの使用（すなわち、それらは特定のリガンドの存在下などでのみ働く）が可能である。従って、リコンビナーゼの活性を自由に調節することができ、その結果、核に移行し、該リガンドの存在下でのみ、その活性を発揮する。好ましい実施形態では、活性化可能な核局在配列は核受容体からくる。本発明で用いるのに好適な核局在配列としては、１５−デオキシ−［デルタ］−プロスタグランジンＪ２の存在下で核に移行するＰＰＡＲ（ペルオキシソーム成長因子活性化受容体）、９−シス−レチノイン酸のα、βまたはγ異性体の存在下で核へ移行するレチノイン酸受容体、レチノイン酸およびＴＴＮＰＢにより活性化可能なファルネソイドＸ受容体、２４−ヒドロキシコレステロールにより活性化可能な肝臓Ｘ受容体、安息香酸４−アミノブチルにより活性化可能な安息好酸Ｘ受容体、構成的アンドロスタン受容体、プレグノロン−１６カルボニトリルおよびステロイドにより誘導可能なプレグナン受容体、リファンピシンにより誘導可能な生体異物受容体、メドロキシプロゲステロンならびにミフェリプリストンアゴニストおよびアンタゴニストおよび１９−ノルエチステロン誘導体により誘導可能なプロゲステロン受容体、グルココルチコイドにより活性化可能なグルココルチコイド受容体、Ｔ３および／またはＴ４により活性化可能な甲状腺ホルモン受容体、エストロゲンおよびそれらの誘導体（１７β−エストラジオールおよびエストラジオールなど）により活性化可能なエストロゲン受容体由来の局在配列が挙げられる。あるいは、別のタンパク質と結合することで不活性化され、かつ、リガンドの存在下でその付加的タンパク質から解離される融合タンパク質を使用することができ、その結果、その融合タンパク質の誘導性の活性化が得られる。
【００２７】
活性化可能な核局在配列は好ましくは、ＷＯ０２２８１７５に記載されているように、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに対応する。本発明の文脈で「リガンド結合ドメイン」とは、エストロゲン受容体のエストロゲン結合ドメインの配列、および好ましくは、１以上のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換による１以上の突然変異を含んでなるが、特定のリガンド（ただし、これらの変異体の好ましいリガンドは野生型受容体に対するものとは異なる可能性がある）の存在下で核への移行能を実質的に完全に維持しているその変異体として理解される。よって、本発明は、好ましくはエストロゲン受容体の天然リガンド（エストラジオール、エストリオールまたはエストロン）またはその種々のアゴニストおよびそのアンタゴニスト、例えば、タモキシフェン、ＩＣＩ  １６４３８４、ＲＵ  ５４８７６、ジエチルスチルベストロール、ラロキシフェン、ズクロミフェンおよびトレミフェンに応答する核局在配列の使用を含む。
リコンビナーゼおよび核局在配列は融合タンパク質の他のエレメントに対していずれの相対的位置に見られてもよい。よって、本発明は、核局在配列のＣ末端領域がリコンビナーゼのＮ末端領域に接続された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、リコンビナーゼのＣ末端領域が核局在配列のＮ末端領域に接続された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および好ましくは、同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じ２つの核局在配列により隣接されたリコンビナーゼにより形成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は、野生型受容体の核局在配列により示されるものとは異なるリガンドに対して親和性を示す核局在配列の変異体の使用を含む。よって、本発明は、Ｇ５１２Ｒ突然変異（ヒトエストロゲン受容体に従って符番）を含んでなるエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインの配列の使用を含む。この突然変異は、野生型受容体のリガンド結合ドメインにより示されるものの１０００分の１の、天然リガンドに対するリガンド結合ドメインの親和性をもたらすが、これは４−ヒドロキシタモキシフェンに対する親和性には影響を及ぼさない。従って、エストロゲンに対するパッケージング細胞の応答に影響を及ぼさずに４−ヒドロキシタモキシフェンを用いて、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質との融合物の移行を促進することができる。あるいは、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインはＧ４００Ｖ／Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａ突然変異を含むこともでき、それにより、その核移行がＧ５１２Ｒ変異体の核移行を活性化するのに必要なものの４分の１の用量を用いて活性化することができる、１０倍の感受性のリガンド結合ドメインが得られる。
【００２８】
あるいは、リガンド結合ドメインはＭ５４３およびＬ５４４Ａ突然変異を含み、タモキシフェンおよび４−ヒドロキシタモキシフェンに対して、Ｇ４００Ｖ／Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａ変異体により示されるものの１０倍の感受性を示す分子を生じる。好ましい実施形態では、活性化可能な核局在配列はヒトエストロゲン受容体(Metger et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:6991-6995)またはFeil et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:10887-10890)により記載されているようなそのＧ５２１Ｒ変異体のリガンド結合ドメインである。別の好ましい実施形態では、リコンビナーゼは、例えば、Verrou et al. (Biol. Chem., 1999, 380:1435-1438)およびTannour Louet M. et al. (Hepatology, 2002; 35;1072-1081)（これらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる）により詳細に記載されているＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質などのタンパク質の各末端に、ネズミエストロゲン受容体に由来するエストロゲンにより活性化可能な核局在配列（該受容体のアミノ酸２８１〜５９９）のＧ５２５Ｒ変異体を含んでなる。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、リコンビナーゼをコードし、誘導プロモーターの機能的制御下にある配列を含んでなる。本発明の文脈で、誘導プロモーターは、化合物または特定の条件の存在下で、３’方向に配置されているポリヌクレオチドの転写を促進することができるＤＮＡ配列として理解される。好ましくは、本発明の文脈で使用可能な誘導プロモーターは、誘導剤の不在下ではゼロまたは無視できる基底発現を示し、かつ、３’位にある遺伝子の活性化を促進することができる誘導剤に応答したものである。誘導剤の種類によって、誘導プロモーターはＴｅｔオン／オフプロモーター(Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Gossen, M. et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456)；Ｐｉｐオン／オフプロモーター（米国特許第６，２８７，８１３号）；抗プロゲスチン依存性プロモーター（ＵＳ２００４１３２０８６）、エクジソン依存性プロモーター（Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004およびＷＯ９７３８１１７）、メタロチオネイン依存性プロモーター（ＷＯ８６０４９２０）およびラパマイシン依存性プロモーター(Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32)に分類される。
【００３０】
好ましい実施形態では、誘導プロモーターはテトラサイクリン依存系である。この系によれば、テトラサイクリン、またはドキシサイクリンなどのその誘導体により調節される様式で高い発現レベルが得られる。この系では、遺伝子の発現はドキシサイクリンの存在下で活性化され、ドキシサイクリンの不在下で不活性化される。この系は大腸菌(E.coli)のテトラサイクリン耐性オペロン、具体的には、テトラサイクリンレプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーティング配列に存在する２つの調節エレメントに基づく。目的遺伝子は、テトラサイクリンに対するいくつかの応答エレメントを含んでなるプロモーターに対して３’方向にクローニングする。第二のプラスミドは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６転写因子および野生型テトラサイクリンレプレッサーからなるテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ−Ｍ２、Zabala et al., Cancer Res., 64:2799-2804）と呼ばれる調節エレメントをコードする配列を含む。従って、ドキシサイクリンの存在下で、テトラサイクリンレプレッサーとＶＰ１６からなる融合タンパク質は、プロモーターに対して３’方向にある遺伝子の転写を促進することにより、誘導プロモーターと相互作用する。該誘導プロモーターは好ましくは、例えば、ＣＭＶの最小プロモーター、ヒトＢ型肝炎ウイルスの中央タンパク質の２９塩基対のプロモーターまたは１９６もしくは８４塩基対のマウスアルブミン遺伝子の５’領域のプロモーターなどの最小プロモーターと融合したＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）、あるいはアルブミンプロモーターの数個ピーからなる（Zabala et al., 2004, 前掲）。
【００３１】
当業者ならば、テトラサイクリンに対する応答のトランスアクチベーターが、パッケージングのために用いられる細胞のゲノムにより、またはテトラサイクリン感受性プロモーターの制御下にリコンビナーゼをコードする配列を含んでなる実際のポリヌクレオチドにより、あるいは好ましい実施形態では、その双方によりコードされ得ることが理解できるであろう。よって、生産されるトランスアクチベーターの量は、細胞内のアデノウイルスゲノムのコピー数に依存し、そして、このトランスアクチベーターの量は細胞内に存在するプロモーターの量に合わされる。トランスアクチベーターをコードする配列は構成プロモーターにより調節される。リガンド依存性トランスアクチベーターを調節するのに好適な構成プロモーターとしては、とりわけ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、延長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡ１プロモーター、ケラチンプロモーター、ＣＤ３プロモーター、免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター、神経フィラメントプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、Ｌ７プロモーター、ＣＤ２プロモーター、ミオシン軽鎖キナーゼプロモーター、ＨＯＸ遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＭｙｏＤ遺伝子プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）プロモーター、アクチン遺伝子プロモーターがある。好ましい実施形態では、トランスアクチベーターの発現を調節するプロモーターはＰＧＫ遺伝子プロモーターである。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、該ポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼの標的部位により隣接されたアデノウイルスの複製および／またはパッケージングのための必須領域も含んでなる。該ゲノムの複製および／またはパッケージングのために必須のアデノウイルスゲノムの領域は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびアデノウイルスパッケージング配列Ψを含む。
【００３３】
本発明によれば、逆方向末端反復配列、すなわちＩＴＲは、アデノウイルスの線状ゲノムの両側にあり、アデノウイルスゲノムの複製に必須の、およそ１００塩基対の配列として理解される(Stow., N.D., 1982, Nucl. Acid. Res, 10:5105-5109)。
【００３４】
本発明によれば、アデノウイルスパッケージングシグナルΨは、血清型２および５のアデノウイルスに場合には、ゲノムの１９０番と３５０番にわたるおよそ１６０塩基対の配列として理解される。アデノウイルスゲノムでこの配列を排除すると、ウイルスの増殖中に生成されるＤＮＡ分子が、形成されたばかりのキャプシドに効率的に組み込まれないようになる(Hearing, P. et al., 1987, J. Virol., 61:2555-2558)が、ＩＴＲの排除とは異なり、パッケージング細胞でのこのゲノムの複製は妨げられない。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの一部を形成するアデノウイルスゲノムの領域は、アデノウイルスパッケージングシグナルである。明らかに、このアデノウイルスパッケージングシグナルを隣接する対応標的部位は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼに基づいて選択される。従って、このポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである場合には、パッケージング配列はＬｏｘＰ部位により隣接される。このポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼがＦＬＰリコンビナーゼである場合には、パッケージング配列はＦＲＴ部位により隣接される。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、該リコンビナーゼの標的部位（ＬｏｘＰ部位）は、それらの間に含まれる配列の除去が起こるように同じ配向でパッケージング配列Ψを隣接する。
【００３６】
ＬｏｘＰ部位は３４塩基対の配列からなり、これは８塩基対の中央領域を隣接する１３塩基対の２つの逆方向反復配列により形成されている。本発明はまた、ＬｏｘＰ配列と組換えを起こすことはできないが、ＷＯ１９９９２５８５１およびＷＯ２００７０８５９０６に記載されているものなどの同一のＬｏｘＰ変異体とのみ組換えを起こすことができる、野生型ＬｏｘＰ配列の変異体の使用を含む。これらの変異型ＬｏｘＰ配列は、アデノウイルスのパッケージングに使用しようとする細胞がそのゲノム内に野生型ＬｏｘＰ配列により隣接された領域を含んでなる場合に特に有用である。本発明の文脈で有用な変異型ＬｏｘＰ配列としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ２、ｌｏｘＰ５１１、ｌｏｘＰ５１４、ｌｏｘＢ、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＬ、ｌｏｘＲ、ｌｏｘＡ８６、ｌｏｘＡ１１７、ｌｏｘＰ３およびｌｏｘＰ２３配列が挙げられる。
【００３７】
本発明のヘルパーアデノウイルスベクター
これまでに記載した本発明のポリヌクレオチドは、アデノウイルスベクターとしてのその機能に必要な配列を含む発現ベクターの一部を形成することができるか、またはその構築に有用であり得る。よって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターはヘルパーアデノウイルスベクターである。
【００３８】
本発明の文脈で「ヘルパーベクター」は、複製不能の組換えウイルスベクターを部分的または完全にトランスで補足することができるベクターとして理解される。従って、それは、組換えベクターが生産できず、また、ウイルス粒子の形成に必要な、初期または後期の少なくとも１つのポリペプチドを生産することができるベクターである。これらのヘルパーベクターはアデノウイルスベクターを完全に補足することができる（すなわち、このヘルパーベクターは、アデノウイルスベクターが欠いている複製に必要なアデノウイルスの総ての成分を提供することができる）か、またはアデノウイルスベクターを部分的にだけ補足することができる（すなわち、デノウイルスベクターが欠いている機能の一部だけを補足することができる）。
【００３９】
当業者ならば、アデノウイルスベクターに存在しないアデノウイルスゲノムのコード配列の数に応じて、ヘルパーベクターが該アデノウイルスベクターの複製およびパッケージングを可能とするのにより多いまたは少ない数の配列を含めなければならないということを考えれば、ヘルパーアデノウイルスベクターの配列が、用いるアデノウイルスベクターによって異なることが理解できるであろう。アデノウイルスベクターがガットレスベクター（高容量アデノウイルスベクターまたはヘルパー依存性ベクターとしても知られる）である場合、本発明のヘルパーベクターは、in vitroウイルス複製に不要の初期Ｅ３領域、および好ましくは、パッケージング細胞により提供可能なＥ１領域を除いた、初期および後期アデノウイルス転写領域の実質的に総てを含む。好ましい実施形態では、本発明のヘルパーベクターは、Ｅ１およびＥ３タンパク質のコード配列を欠き、そのＥ１タンパク質をコードする領域の代わりにリコンビナーゼをコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする、第一世代アデノウイルスベクターのゲノムを含んでなる。よって、本発明のヘルパーアデノウイルスベクターは以下のエレメント：
・５’逆方向末端反復配列、
・リコンビナーゼの認識標的部位により隣接されたパッケージング配列Ψ、
・誘導プロモーターの制御下に、リコンビナーゼの配列、
・Ｅ１およびＥ３領域を除くアデノウイルスコード配列、
・３’逆方向末端反復配列
を含んでなる。
【００４０】
好ましい実施形態では、ヘルパーアデノウイルスのゲノムは、リガンドの存在下でリコンビナーゼの発現を促進することができるトランスアクチベーターをコードする。いっそうより好ましい実施形態では、トランスアクチベーターは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質に結合されたテトラサイクリンレプレッサーにより形成されるｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターであり、この場合、この方法の工程（ｉｉｉ）はテトラサイクリン類似体、好ましくはドキシサイクリンの存在下で行われる。
【００４１】
図２は、ＰＧＫ遺伝子プロモーターの制御下に転写トランスアクチベーターをコードする配列を含み、リコンビナーゼが、アルブミン遺伝子の最小プロモーターに連結された数個のｔｅｔオペレーターリピートにより形成されたプロモーターの制御下にある、本発明のアデノウイルスベクターの図を示す。
【００４２】
パッケージング配列Ψは好ましくはＬｏｘＰ部位により隣接されている。いっそうより好ましい実施形態では、リコンビナーゼは、一連のＴｅｔＯオペレーターリピートにより、また、例えばアルブミンプロモーターなどの最小プロモーターにより形成されたプロモーターの制御下にあり得るＣｒｅリコンビナーゼまたはＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼである。また、これもまたリコンビナーゼ標的部位により隣接された減弱されたパッケージング配列を使用することもできる。これらのシグナルは低いキャプシド形成能を示し、例えば、ＷＯ９４２８１５２に記載されているように、パッケージング領域の削除によって得ることができる。
【００４３】
また、付加的に、例えばＩＴＲ領域などのアデノウイルスゲノムの別の必須領域を隣接するリコンビナーゼの認識標的部位の対を用いることによってヘルパーベクターの安全性を高めることもでき、その結果、リコンビナーゼが存在することで、その複製またはキャプシド形成に不可欠なアデノウイルスゲノムの１を超える領域の排除が起こる。
【００４４】
当業者ならば、ヘルパーベクターが複製可能なウイルスであり得ること、すなわち、それがその複製およびパッケージングに必要な総ての遺伝子を持っていること、またはその周辺領域でアデノウイルスベクターの増殖を妨げる目的では、１または数個の遺伝子を欠損したアデノウイルスであってもよいことが理解できるであろう。これらのタンパク質がアデノウイルスの増殖に必須であるとすれば、それらは、好ましくは、パッケージングのために用いる細胞によってトランスで提供される。このために好適な細胞系統は、ヒト胎児腎細胞に由来し、そのゲノムに組み込まれた５型アデノウイルスの５’末端を含む場合にはＥ１機能を補足することができる２９３細胞系統(Graham et al., 1977, J. Gene. Virol. 36, 59-72)、アデノウイルスのＥ１および／またはＥ４機能を補足することができるＷ１６２細胞系統(Weinberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80:5383-5386)、５型アデノウイルスの全ゲノムまたはＥ１およびＥ４機能を補足することができる細胞系統（ＷＯ９４２８１５２）、Ｎ５２系統、Ｐｅｒｃ系統などである。
【００４５】
本発明のヘルパーアデノウイルスベクターは従前に記載した総ての機能を含んでなるポリヌクレオチドとして見出すこともできるし、あるいは、もしこのポリヌクレオチドが許容細胞におけるその転写により生成および／または増幅されたならば、それは、パッケージング細胞から回収し、ポリヌクレオチドの代わりにヘルパーベクターとして使用することができる完全なアデノウイルス粒子を生じる。従って、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの配列を含んでなるアデノウイルス粒子に関する。本発明の文脈で、アデノウイルス粒子は、例えば、Shenk, T. (Adenoviridae: The viruses and their replication, 1996, In Fields Virology. B.N. Fields, D.M. Knipe, and P.M. Howley, eds. (Lippincott-Raven, Philadelphia, PA) pp. 2111-2147)により記載されているように、アデノウイルスゲノムを形成する二本鎖ＤＮＡ分子により形成される粒子として理解される。
【００４６】
本発明のヘルパーアデノウイルスの製造の系および方法
本発明のヘルパーベクターは、許容される真核細胞における連続的複製サイクルにより増幅させることができる。よって、別の態様において、本発明は、
ａ）本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクターまたは本発明のアデノウイルス粒子と、
ｂ）真核細胞
を含んでなる、アデノウイルス組換え体の複製およびパッケージングのための系に関する。
【００４７】
当業者ならば、もしリコンビナーゼが発現されれば、そのリコンビナーゼの標的部位により隣接されたアデノウイルスゲノムの領域の除去が起こり、新たなヘルパーウイルスの増殖が妨げられるということを考えれば、真核細胞におけるアデノウイルスの複製には、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるリコンビナーゼの発現が起こらないことが必要であるということを理解することができるであろう。リコンビナーゼをコードする配列がテトラサイクリンオペレーターの制御下にある場合には、低い基底発現レベルを持つ。しかしながら、この基底発現は、ヘルパーアデノウイルスの増殖が行われる細胞が、ドキシサイクリンの不在下でテトラサイクリンオペレーターに対して３’方向にある遺伝子の転写を妨げることができるテトラサイクリン依存性レプレッサーを発現すれば、さらにいっそう低下させることができる。よって、好ましい実施形態では、本発明によるアデノウイルス複製のための系の要素（ｂ）を形成する細胞は、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーター特異的転写レプレッサーを含んでなる。好ましい実施形態では、このリコンビナーゼの発現を調節するプロモーターがテトラサイクリンまたはその類似体（ドキシサイクリン）により活性化可能なプロモーターであれば、パッケージング細胞を発現するレプレッサーは該リガンドの不在下で活性化されるレプレッサーである。よって、好ましい実施形態では、本発明のパッケージング細胞は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの不在下でＴｅｔオペレーターと結合して転写を遮断するテトラサイクリン依存性レプレッサーを発現するポリヌクレオチドを含む。このｔｅｔオペレーター特異的レプレッサーは好ましくはｒｔＴＳレプレッサーである。
【００４８】
いっそうより好ましい実施形態では、ｒｔＴＳレプレッサーは、構成プロモーターの機能的制御下にある。ｒｔＴＳ発現を調節するプロモーターは好ましくは、真核生物延長因子ＥＦ１αプロモーターである。
【００４９】
図３の左のパネルは、ドキシサイクリンの不在下でリコンビナーゼをコードする遺伝子の発現の抑制を可能とするメカニズムを示す。
【００５０】
さらに、リコンビナーゼが活性化可能な核局在配列を含んでなる場合には、ヘルパーアデノウイルスの増殖は、該核局在配列を活性化することができるリガンドの不在下でなされ、従って、該遺伝子の基底転写のために最少量のリコンビナーゼが存在したとしても、それは細胞質に留まり、残留し、アデノウイルスゲノムに対してそのリコンビナーゼ活性を発揮することはできない。
【００５１】
本発明のヘルパーベクターおよびそのパッケージング系は、該ベクターの増幅に使用することができる。よって、別の態様において、本発明は、ヘルパー組換えアデノウイルスを得るための方法（以下、本発明の第一の方法）であって、
（ｉ）細胞と、本発明のポリヌクレオチド、本発明による発現ベクターまたは本発明によるアデノウイルス粒子とを、また所望により、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質をコードする１または数個のポリヌクレオチドとを、アデノウイルスゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件下で接触させること、
（ｉｉ）該細胞を、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製を可能とし、かつ、部位特異的リコンビナーゼの発現を妨げるのに好適な条件で保持すること、および
（ｉｉｉ）培地からアデノウイルスを回収すること
を含んでなる方法に関する。
【００５２】
本発明の第一の方法の工程（ｉ）は、該アデノウイルスのゲノムを細胞に導入することを含んでなる。当業者ならば、アデノウイルスゲノムの存在形態によって工程（ｉ）の実施方法が異なることを理解することができるであろう。該ゲノムがポリヌクレオチドとして見られる場合には、工程（ｉ）は、このポリヌクレオチドを、その細胞への侵入を可能とする条件で細胞と接触させることを含んでなる。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを含んでなる組成物のマイクロインジェクションにより、あるいは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの存在下での共沈殿により、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、ならびに先行技術に基づく一連の市販トランスフェクションキットによって行うことができる。トランスフェクションの有効性は、細胞の種類、継代数、集密度ならびにトランスフェクション条件（時間、リポソームまたは沈殿の作製形態など）を含む一連の因子によって異なる。これらのパラメーターは総て、慣例の実験により決定および調整することができる。
【００５３】
アデノウイルスベクターが本発明によるアデノウイルス粒子である場合には、アデノウイルスを細胞と接触させて、アデノウイルスを細胞に自然に感染させることで十分である。ウイルスは好ましくは、少なくともおよそ１、２、１０、２０、３０、５０、１００、２００、２０００のウイルス粒子数／細胞比（多重感染度またはＭＯＩ）または他のいずれかの好適なＭＯＩ値を用いて細胞と接触させると、その培養物の総ての細胞が実質的に感染する。
【００５４】
ヘルパーアデノウイルスベクターがその複製および／またはパッケージングのために必須の成分をコードする配列のいずれかを欠いている場合には、それらの成分をトランスで提供する必要がある。これらの成分は好ましくは、パッケージャーとして用いられる細胞のゲノムの一部を形成するポリヌクレオチドの発現から提供される。よって、ゲノムにＥ１および／またはＥ４領域を欠いているアデノウイルスベクターの場合、本発明の方法の工程（ｉ）に用いられる細胞はとりわけ２９３細胞系統(Graham et al., 1977, J. Gene. Virol. 36, 59-72)およびＷ１６２細胞系統(Weinberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80:5383-5386)および従前に記載されているようなＷＯ９４２８１５２に記載の細胞系統に属する細胞である。
【００５５】
工程（ｉｉ）では、本発明の第一の方法は、工程（ｉ）でアデノウイルスゲノムを組み込んだ細胞を、細胞においてアデノウイルスのパッケージングおよび複製を可能とし、かつ、部位特異的リコンビナーゼの発現を妨げるのに好適な条件で保持することを含む。
【００５６】
リコンビナーゼが誘導プロモーターの機能的制御下にあるとすれば、理想的な条件において、該プロモーターは活性化剤の存在下でなければ転写は活性化されない。しかしながら、総ての誘導プロモーターはある程度の基底活性を有し、手近なヘルパーベクターの場合には、必須配列（好ましくは、パッケージング配列Ψ）の排除を生じ、従って、キャプシド形成できないアデノウイルスを生じ、ひいては、プロセスの収量が低下する。よって、好ましい実施形態では、このキャプシド形成プロセスは、リコンビナーゼの発現を調節する（転写レプレッサーに基づいて転写を遮断することによる）プロモーターの結合部位に結合する転写レプレッサーを発現する細胞において行われる。該転写レプレッサーは、該転写プロモーターを活性化するリガンドの不在下で活性であることが好ましい。ｒｔＴＡテトラサイクリン依存性アクチベーターにより活性化されたプロモーターの特定の場合において、転写レプレッサーはドキシサイクリンの不在下でテトラサイクリンオペレーターと特異的に結合し、これにより、リコンビナーゼ遺伝子の発現を遮断する。
【００５７】
工程（ｉｉ）は、Shabram et al., (Hum. Gene Ther. 1997, 8:453-465)により記載されているようなＨＰＬＣに基づくＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ法などの標準的手段または間接的に細胞の細胞変性効果のウイルス検査により決定されるように、ウイルス粒子の濃度が十分高くなるように必要な回数行う。細胞培養は所望により新鮮な培養培地の添加を含んでもよい。
【００５８】
第三の工程では、工程（ｉｉ）で生成したアデノウイルスを細胞培養物から回収する。このためには、当業者に公知のいずれかの方法（トリプシン処理または機械的粉砕、および遠心分離または濾過）により培養培地から細胞を分離し、それらの細胞を不活性な溶液中で破砕し（凍結／解凍サイクル、ホモジナイゼーション、音波処理、キャビテーション、洗剤の使用など）、アデノウイルス粒子を、ＣｓＣｌ勾配での超遠心分離などの既知の方法により、またはイオン交換クロマトグラフィーと金属キレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーの組合せ(Huyghe et al., 1996, Human Gene Therapy, 6:1403-1416)、イオン交換クロマトグラフィーとゲルでの分画クロマトグラフィーの組合せ（ＷＯ０７０５９４７３）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースでのクロマトグラフィー(Haruna et al., 1961, Virology 13, 264-267)、ヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィー（ＵＳ２００２／００６４８６０）ならびにソフトゲル（アガロース）、透過クロマトグラフィーを含む合成ポリマーに基づく多孔質ポリマー（フラクトゲル）および硬質カプセル中のソフトゲルに基づく材料（例えば、Ｃｅｒａｍｉｃａ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ）(Rodrigues, 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl 699:47-61)などの他の樹脂でのクロマトグラフィーといった種々のタイプのクロマトグラフィーにより精製することが必要である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、本発明の第一の方法に従って得られるヘルパーアデノウイルスを含む。
【００６０】
本発明のヘルパーアデノウイルスを用いた目的遺伝子を含んでなるアデノウイルスの増殖系および方法
本発明のヘルパーアデノウイルスは目的遺伝子を含んでなる高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングのための系およびプロセスに使用することができる。よって、一態様において、本発明は、高容量アデノウイルスの生産およびパッケージングのための本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターまたは本発明によるアデノウイルス粒子の使用に関する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、高容量組換えアデノウイルスの生産のための系であって、
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、本発明による発現ベクターまたは本発明によるアデノウイルス粒子；
（ｂ）そのゲノムが、目的遺伝子を含んでなり、かつ、該アデノウイルスの複製のための少なくとも１つの必須タンパク質またはパッケージングのための少なくとも１つの必須タンパク質をコードする配列を欠くアデノウイルス、または該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）真核細胞
を含んでなる系に関する。
【００６２】
この系では、第一の成分は本質的に、ヘルパーアデノウイルスの増幅系において記載され、高容量アデノウイルスの複製およびパッケージングに必要な成分を完全にまたは部分的に提供するヘルパーアデノウイルスのゲノムの少なくとも一部を含んでなるポリヌクレオチドからなるものである。
【００６３】
第二の成分は、高容量アデノウイルスまたは該ウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチドを含んでなり、該ゲノムは、該アデノウイルスの複製のための少なくとも１つの必須タンパク質またはパッケージングのための少なくとも１つの必須タンパク質をコードする配列を欠き、本発明の系を用いて増幅させようとするものである。本発明による「高容量アデノウイルス」は、Alba et al (Gene Therapy, 2005, 12:S18-S27)により記載されているように、アデノウイルスゲノムの、５’および３’ＩＴＲ領域とパッケージング領域Ψを除く総ての遺伝子が排除されていることを特徴とする、ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスと呼ばれるタイプの組換えアデノウイルスとして理解される。これらのアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムの特徴的配列を欠いていることを考えれば、３６ｋＤａまでの異種配列を許容する。
【００６４】
本発明の方法に従ってこのガットレスベクターに組み込むことができる異種遺伝子はとしては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、レプチン、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラトニン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン阻害すホルモン（ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピンまたは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロトロピン（ＴＳＨまたは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨまたはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管阻害因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、Ｉ型インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＩ型インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、組織因子、ＶＩＩ因子、Ｘ因子、トロンビン、Ｖ因子、ＸＩ因子、ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８およびケモカイン）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン２４（ＩＬ−２４）、インターフェロン−α、−β、−γ、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ１α、ＭＩＰ−Ｉα、ＭＩＰ−１βを含む）、ニューロン成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦおよびＫＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦなど）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア成長因子、ケラチノサイト成長因子、内皮成長因子、α−１抗トリプシン、腫瘍壊死因子、顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、シクロスポリン、フィブリノゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルディン、スーパーオキシドジスムターゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−グリコシダーゼ−α、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズ路ネート−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、アデノシンデアミナーゼ、免疫グロブリン、アルブミン、Ａ型およびＢ型ボツリヌス菌毒素、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ��パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、ＷＯ０３３１１５５、ＷＯ２００５１９２４４およびＷＯ０３９３２９３（その内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなどのβ細胞トランスフォーメーション因子（ＴＧＦ−β）阻害ペプチド、干渉ＲＮＡ分子転写（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、改変型Ｕ１リボヌクレオプロテインＲＮＡ）に好適な発現カセットをコードする遺伝子が挙げられる。
【００６５】
これらの異種遺伝子の他、本発明で用いるガットレスアデノウイルスは、Parks et al. (J. Virol., 1999, 73:8027-8034)により記載されているλファージゲノムに由来するｓｔｕｆｆｅｒ領域またはSandig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1002-7) により記載されているようなｐＳＴＫ１２０に見られるｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡを含み得る。これらの領域は通常、ヒトゲノムに存在し、かつ、該ヒトｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡの代わりにParks et al. (J. Virol., 1999, 73:8027-8034)に記載されているλファージの２２ｋｂフラグメントを含んでなる、対照アデノウイルスに対して異種の遺伝子の発現を増強することができる配列を含む。
【００６６】
ヒトｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡの全長は様々であるが、２０〜３０ｋｂ、好ましくは２０〜２５ｋｂ、またはいっそうより好ましくは２１〜２３ｋｂの範囲であり、例えば２２ｋｂである。該ｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡにおいてシスで働く配列の数は、２、３もしくは４またはそれ以上の中で様々であり、限定されるものではないが、１６．２ｋｂのａｌｐｈｏｉｄリピートドメイン（Smith J G et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15:5165-72に記載）；例えば６型アデノウイルス６の左端を含む４．２ｋｂのフラグメントまたは免疫グロブリンκの２コピーのマトリックス付着領域などのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）（Betz A G et al., 1994, Cell, 77:239-248に記載）；肝細胞制御領域（ＨＣＲ）、例えば、該ＨＣＲを含んでなる１．２ｋｂのフラグメント（Miao et al., Molecular Therapy, 1:522-32に記載）；またはニワトリリゾチームの２．８ｋｂ領域（Phi-Van Let al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:2302-2307により記載）、インターフェロンβの５’領域のマトリックス付着領域（Bode J et al. 1992, Science, 10:195-197により記載）などの別のマトリックス付着領域またはテロメアもしくはセントロメア配列などの他の非コードヒト配列が挙げられる。
【００６７】
最後に、本発明による高容量組換えアデノウイルスの生産のための系は、該アデノウイルスの増幅プロセスが行われる真核細胞をさらに含んでなる。該系におけるそれらの使用に好適な真核細胞としては、アデノウイルスに自然感染し得るあらゆる細胞系統（それらのアデノウイルスがこの系の要素（ａ）および（ｂ）を形成するならば）または高容量およびヘルパーアデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチドでトランスフェクトされやすい細胞系統が含まれる。さらに、ヘルパーアデノウイルスゲノムのゲノムがリコンビナーゼの発現を活性化することができるトランスアクチベーターをコードする配列を含んでいなければ、要素（ｃ）を形成する細胞は、好ましくは安定な様式で、好ましくは構成プロモーターの制御下で、該トランスアクチベーターを発現する。これはヘルパーアデノウイルスに含まれるリコンビナーゼ発現速度を加速化し、従って、そのパッケージング配列の除去を助長するのに有益であり得る。好ましい実施形態では、その標的部位がヘルパーアデノウイルスのゲノムの必須領域を隣接しているリコンビナーゼを発現する細胞を用いることもでき、これにより、実際のヘルパーアデノウイルスにより生産されるリコンビナーゼに加えて、実際の細胞により生産されるさらなる量のリコンビナーゼが存在し、ヘルパーアデノウイルスの複製可能なゲノムの総てを排除する上でより高い効率が得られる。本発明は好ましくは、２９３Ｃｒｅ系統(Parks et al., 前掲)などの、安定な様式でＣｒｅリコンビナーゼを発現する確立された細胞系統の使用を含む。リコンビナーゼ発現細胞は構成プロモーターの制御下にあってもよいし、あるいは  ヘルパーアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼの発現を調節するために用いるものと同じであっても異なっていてもよい誘導プロモーターの制御下にあってもよい。細胞によりコードされるリコンビナーゼの発現を調節するために使用できる構成プロモーターおよび誘導プロモーターは上記のものと同じである。
【００６８】
別の態様において、本発明は、目的遺伝子を発現する高容量アデノウイルスベクターを作出するための方法（以下、本発明の第二の方法）であって、
（ｉ）細胞と、そのゲノムが目的遺伝子を含んでなり、該アデノウイルスの複製またはパッケージングのための少なくとも１つの必須タンパク質をコードする配列を欠くアデノウイルス、または該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチドとを、該アデノウイルスのゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉ）該細胞と、
（ａ）
１．誘導プロモーターの機能的制御下にある、部位特異的リコンビナーゼをコードする領域と、
２．配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接されたアデノウイルスパッケージングシグナルΨ（該認識配列は該リコンビナーゼの存在下でパッケージングシグナルΨの除去が起こるように配向されている）
を含んでなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルスベクター、および
（ｃ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルス粒子
の群から選択される第二の成分とを、該ポリヌクレオチド、該アデノウイルスベクターまたは該アデノウイルス粒子のゲノムが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉｉ）両ウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質の発現、両アデノウイルスのゲノムの複製、および工程（ｉｉ）で用いたポリヌクレオチド、ベクターまたはアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼの発現に好適な条件で細胞を保持する工程、および
（ｉｖ）細胞培養物から高容量アデノウイルスを回収する工程
を含んでなる方法に関する。
【００６９】
本発明の第二の方法の工程（ｉ）は、細胞をアデノウイルスゲノムと接触させることからなり、そのアデノウイルスゲノムが裸のポリヌクレオチドの形態であっても、アデノウイルス粒子の一部を形成していてもよいということを考えれば、本発明の第一の方法の第一の工程に似ている。第一の場合では、本方法の工程（ｉ）は、従前に記載されたようにポリヌクレオチドは細胞内部に接近するような既知の方法に使用を含む。第二の場合では、アデノウイルス粒子が細胞に接触するだけで十分であり、もしこれがアデノウイルスにとって受容体として働く表面分子を発現すれば、後者は細胞内でそれらのゲノムを自発的に組み込む。好ましい実施形態では、工程（ｉ）で用いられるアデノウイルスは高容量またはガットレスアデノウイルスである。
【００７０】
本発明の第二の方法の工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の前または後に同時に行うこともできるが、後の場合には、アデノウイルスの構造タンパク質および調節タンパク質により生じる細胞変性効果が、目的遺伝子を含んでなるゲノムの効率的複製を妨げないように行うべきである。ヘルパーアデノウイルスゲノムの細胞への侵入は、そのゲノムが裸のポリヌクレオチドとして見られる場合には既知のトランスフェクション技術により、またはアデノウイルス粒子を形成するゲノムが提供されている場合には、アデノウイルスの自然の感染経路に従って行う。
【００７１】
本発明の第二の方法の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）で導入されたヘルパーアデノウイルスのゲノムによりコードされる構造タンパク質の細胞転写／翻訳機構による発現を可能とする、また、目的遺伝子を含んでなるアデノウイルスのゲノムの複製を可能とする、好適な条件で細胞を保持することを含んでなる。この工程では、その複製および／またはキャプシド封入に必須の該ゲノムの領域の除去が起こり、ヘルパーアデノウイルスのゲノムを含んでなるアデノウイルス粒子の形成が最大限少なくなるように、ヘルパーアデノウイルスのゲノムによりコードされるリコンビナーゼの、細胞における発現および活性を確保することが不可欠である。好ましい実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターの特異的トランスアクチベーターインデューサーの存在下で行われる。このトランスアクチベーターは、それをコードするポリヌクレオチドが安定な様式で細胞のゲノムの組み込まれている場合にはパッケージングプロセスが行われる実際の細胞により提供させることもでき、あるいは、好ましい実施形態では、このトランスアクチベーターをコードする実際のヘルパーアデノウイルスゲノムである。いっそうより好ましい実施形態では、トランスアクチベーターはヘルパーアデノウイルスおよびパッケージング細胞のゲノムから発現される。いっそうより好ましい実施形態では、このトランスアクチベーターは、そのトランス活性化活性を発揮するのにリガンドの存在を必要とし、この場合には、本方法の工程（ｉｉｉ）は、リコンビナーゼの最大発現を確保するためにリガンドの存在下で行われる。いっそうより好ましい実施形態では、このトランスアクチベーターは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質に結合されたテトラサイクリンレプレッサーにより形成されるｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターであり、この場合には、本方法の工程（ｉｉｉ）はテトラサイクリン類似体、好ましくはドキシサイクリンの存在下で行われる。
【００７２】
図３の右のパネルは、ドキシサイクリンの存在下でリコンビナーゼの発現の活性化が起こるメカニズムを示す。
【００７３】
従前に記載されているように、パッケージングシグナルがリコンビナーゼの標的部位により、両シグナル間に含まれる配列の除去が起こるように好適な配向で隣接されている限り、本質的にいずれのリコンビナーゼもパッケージングシグナルの排除に好適である。好ましい実施形態では、ヘルパーアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼか、または該リコンビナーゼを含んでなる融合タンパク質である。目的のアデノウイルスのパッケージングプロセスに用いられない場合にリコンビナーゼが不活性であることを保証するさらなる方法として、その核への移行が、外から加えることができ、かつ、特定のリガンドの不在下でその機能を妨げる細胞タンパク質と結合するリガンドの存在に依存するリコンビナーゼの使用がある。よって、好ましい実施形態では、本発明は、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体の少なくとも１つのリガンド結合領域により形成される融合タンパク質の使用を含む。これらのタイプの融合タンパク質は不履行の場合は細胞質に存在し、ある特定の細胞タンパク質と結合しているのでそれらのリコンビナーゼ機能を発揮することができない。しかしながら、エストロゲンまたは誘導体（例えば、タモキシフェン）の存在下では、この融合タンパク質は該細胞タンパク質との結合から遊離して核へ移行し、そこでそのリコンビナーゼ機能を発揮する。いっそうより好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムによりコードされるリコンビナーゼは、エストロゲン受容体のＮ末端位とＣ末端位のリガンド結合領域が突然変異したＣｒｅリコンビナーゼにより形成されるＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼである。
【００７４】
図６は、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンの存在下でリコンビナーゼの発現および活性化が起こるメカニズムを図示する。
【００７５】
本発明の第二の方法の工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）で形成されたガットレスアデノウイルスの精製を含んでなり、上記で詳細に記載されているように、本発明の第一の方法の工程（ｉｉｉ）でヘルパーアデノウイルスが精製されるのと本質的同様に行われる。
【００７６】
当業者ならば、本発明の第二の方法により精製された目的遺伝子を含んでなるアデノウイルスは、このアデノウイルスを再び細胞と接触させた後、その細胞を本発明の第一の方法により得られたさらなる用量のヘルパーアデノウイルスと接触させることによる連続的増殖法に使用可能であることを理解することができるであろう。よって、本発明のプロセスは連続して何回も繰り返し、各サイクルにおいてより多数のアデノウイルス粒子を得ることができる。
【００７７】
以下、本発明を、本発明の範囲の例として非限定的に示す下記実施例を基に説明する。
【実施例】
【００７８】
実施例１
ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの構築
誘導ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ発現カセットの構築
誘導系は２つの独立した転写ユニットからなる。それらのうちの一方は誘導プロモーターの制御下にリコンビナーゼをコードし、他方は構成プロモーター（ネズミＰＧＫ遺伝子のプロモーター）の制御下にトランスアクチベーターをコードする。第一のユニットを得るためには、従前に記載されているｐＯ７Ｐａｌ−ｌｕｃプラスミド(Zabala et al., 2004, Cancer Res. 64:2799-2804)を用いて始める。このプラスミドはトランスアクチベーターに対して７つの結合部位と、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御するネズミアルブミンプロモーターの５’末端の１９６ｂｐ領域と、ＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナルを含む。ｐＡＮＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドに由来するＭｅｒＣｒｅＭｅｒ融合タンパク質のコード配列(Dr.M. Reth, Max-Planck Institute for Immunobiology, Freiburg, Germany)(Verrou et al., 1999, Biol Chem. 380:1435-8)をこのプラスミドに導入した。ｐＡＮＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とｐＯ７Ｐａｌ−ｌｕｃプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を用いてクローニングを行い、ｐａｌｂＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドを作製した。ネズミホスホグリセンリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターを用いて、ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２トランスアクチベーターの発現を制御する第二のユニット(Zabala et al., 2004,前掲)とマウスβ−グロビン遺伝子に基づく合成ポリアデニル化シグナル(Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3:1019-25)を得た。得られたプラスミドをｐＧＫｒｔＴＡと呼称した。両方の転写ユニットをｒｔＴＡＭｅｒＣｒｅと呼ばれる単一のプラスミドにおいて、ｐａｌｂＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドのＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐＧＫｒｔＴＡプラスミドにサブクローニングすることにより融合した。
【００７９】
ＡｄＴｅｔＣｒｅベクターのゲノムの構築
まず、左末端アデノウイルスＩＴＲと、ＬｏｘＰ部位により隣接されたパッケージングシグナルとを含んでなる配列をＰＣＲにより得た。このために、ヘルパーアデノウイルスのゲノム(E. Ayuso, Doctoral Thesis. School of Veterinary Medicine. Universidad Autonoma de Barcelona. CBATEG. 2006)を含むｐＧＳ１０２プラスミドを鋳型として用いた。用いたオリゴヌクレオチドは
2011520440.tif 000003
であった。
【００８０】
このフラグメントをｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミド(He et al., 1998)に導入し、ｐＳｈｕｔ−ＶＨプラスミドを作製した。次に、プラスミドに含まれる細菌配列（カナマイシン耐性および複製起点）の配向を、ＰａｃＩ酵素で消化し、それらのフラグメントを再連結することにより変えた。得られたプラスミドをｐＳｈｕｔＬｏｘＰと呼称した。次に、ＳｗａＩ酵素の単一の制限部位をこのプラスミドのＮｏｔＩとＳａｌＩ位の間に挿入した。このために、これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによってカセットを構築した。
2011520440.tif 000004
それをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ酵素で消化し、ｐＳｈｕｔＬｏｘＰプラスミドに連結した。得られたプラスミドをｐＳｈｕｔＳｗａと呼称した。次に、このプラスミドを鋳型として用いて、アデノウイルスゲノムの左部分（ＬｏｘＰ部位により隣接されたキャプシド形成配列とＳｗａＩ認識部位を含む）を含むフラグメントを増幅した。用いたオリゴヌクレオチドは
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であった。
【００８１】
このフラグメントをｐＡｄＥａｓｙ１プラスミド(He et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2509-14)のＣｌａＩ部位に導入した。このようにして、第一世代アデノウイルスベクターのゲノム（Ｅ１領域とＥ３領域が欠失）を含み、キャプシド形成シグナルがＬｏｘＰ部位により隣接されているｐＡｄＬｏｘＰ２プラスミドを得た。このプラスミドに、ＳｗａＩ部位のみを用い、ｐｒｔＴＡＭｅｒＣｒｅプラスミドに由来するＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の誘導発現カセットを導入した。この新たなプラスミド（ｐＡｄＬｏｘＰＭｅｒＣｒｅ）は自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの配列を含むはずであるが、このキャプシド形成配列は、大腸菌におけるこのプラスミドの増幅過程の間に、おそらくはＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼの発現により、自発的に切除されたことが認められた。この問題を解決するために、哺乳類細胞における相同組換えに基づく戦略を用いた。このために、誘導発現カセットを含むが，末端切断型のＭｅｒＣｒｅＭｅｒコード配列は含まないｐｒｔＴＡＭｅｒＣｒｅプラスミドのＳｎａＢＩ−ＳａｐＩフラグメントをｐＳｈｕｔＳｗａプラスミドに導入した。従って、同プラスミドでは、ＬｏｘＰ部位の共存とリコンビナーゼ活性発現能が回避される。得られたプラスミドをｐＳｈｕｔＭｅｒと呼称した。新たなヘルパーウイルスを生産するために、ｐＡｄＬｏｘＰＭｅｒＣｒｅプラスミドとｐＳｈｕｔＭｅｒプラスミドを２９３ｔＴＳ細胞に同時にトランスフェクトした。これらのプラスミドは相同な領域を増幅するので、機能的なウイルスゲノムを生じ得る組換えが促進される（図７）。細胞培養物に明らかな細胞変性効果が見られた場合（トランスフェクション後およそ１０〜１５日）には、それらの細胞を溶解させ、ＰＣＲおよび最も重要な領域の配列決定によりウイルスの構造を確認した。２９３ｔＴＳ細胞での制限希釈により個々のクローンを得た。新たな自己不活性化ヘルパーアデノウイルスをＡｄＴｅｔＣｒｅと呼称した。
【００８２】
ウイルスの増幅、精製および定量
ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを２９３ｔＴＳ細胞で増幅した。ほとんどの細胞で細胞変性効果が見られたところで、それらを培養培地とともに回収し、遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を少量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．１に再懸濁させた。次に、それらを、凍結および解凍を３回繰り返すことで溶解させ、放出されたウイルスを塩化セシウム二重勾配により精製した。ウイルスに相当するバンドを回収し、サイズ排除カラム(Sephadex)により脱塩した。無効なユニットにおけるウイルスの定量は、市販のＡｄｅｎｏＸラピッドタイターキット(BD Biosciences)を製造者の説明書に従って行った。
【００８３】
ＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の発現
２９３ｔＴＳ細胞を６穴のマルチウェルプレートに播種した（７．５×１０５細胞／ウェル）。２４時間後にそれらをタモキシフェン（０．８μＭ）およびドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）で前処理するか、無処理とした。４８時間の時点で、それらにＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスをウイルス２個／細胞のＭＯＩで感染させ、感染中もタモキシフェンおよびドキシサイクリンの処理を維持した。これらの細胞を４８時間後に回収した。対照２９３細胞の場合には、それらを６穴のマルチウェルプレートで培養し、先の感染と同じ時点で回収した。対照２９３Ｃｒｅ４細胞の場合も同様にした。ＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の発現速度を調べるため、これらの細胞に同様の処理を施し、種々の時点で回収した（６時間、１２時間、３６時間および４８時間）。ＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質の陽性対照を得るために、２９３ｔＴＳ細胞をｐＡＮＭｅｒＣｒｅＭｅｒプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションは２０μｌのリポフェクタミン２０００と１５μｇの非消化プラスミドを用いて行った。これらの細胞を４８時間の時点で回収した。いずれの場合にも、細胞を、１％  Ｉｇｅｐａｌおよびプロテアーゼ阻害剤の混合物(Complete Tablets, Roche)を添加したＴＮＥバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）からなる溶液を用いて氷中で１５分間溶解させ、その後、音波処理し、４℃で４５分間、１５，０００ｇで遠心分離した。タンパク質の量をブラッドフォード法で測定した後、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の電気泳動分離を行った（１サンプル当たり２０μｇのタンパク質を添加した）。ＣｒｅまたはＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質をウエスタンブロット法により、１：１０．０００希釈のＣｒｅ特異的一次抗体(Novagen)と１：５．０００希釈のペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗ウサギ抗体(BioRad)を用いて検出した。それらをウエスタンライトニング化学発光試薬(Perkin Elmer)により現像した。
【００８４】
ドキシサイクリンおよびタモキシフェンによるウイルス生産の制御
種々の細胞（２９３、２９３ｔＴＳまたは２９３Ｃｒｅ４）を１２穴プレートに１穴当たり４×１０４細胞で播種し、１０％ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培養培地で維持した。２４時間後、これらの細胞をドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）、タモキシフェン（０．８μＭ）または双方で同時に処理するか、または無処理とした。２４時間後、ＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルスまたはＡｄＬＣ８ｃｌｕｃでウイルス２個／細胞のＭＯＩにて感染を行い、４８時間後に細胞を回収した。感染力のあるウイルスの定量は、ＡｄｅｎｏＸラピッドタイターキット(BD Biosciences)により、製造者の説明書に従って行った。
【００８５】
ＨＣ−Ａｄの生産プロトコール
ＨＣ−Ａｄ  ＫＣＺのゲノムを含むｐＫＣＺプラスミドをＰｍｅＩ制限酵素で消化してそれを線状化し、抗生物質に対する耐性を排除した。次に、酢酸ナトリウム（３００ｍＭ）および２．５容量の無水エタノールを加えることによりこれを沈殿させた。このサンプルを−２０℃で少なくとも１時間維持した後、４℃で３０分間、１１，０００ｇで遠心分離した。この沈殿を７０％エタノールで洗浄し、風乾した。これを水に再懸濁させ、１５μｇを用い、タモキシフェンおよびドキシサイクリンで２４時間前処理した６０ｍｍプレート中の１×１０６個の２９３Ｃｒｅ４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは２０μｌのリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いて行った。６時間の時点で培地を交換し、２％ＦＢＳとウイルス１個／細胞のＭＯＩでＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを含むＤＭＥＮ培地を加えた。このＭＯＩは事前の実験で決定し、その場合、感染４８時間の時点で９０％の細胞変性効果をもたらすのに必要なウイルスの量を検定した。感染は４８時間進行させ、その後、細胞を２００μｌのＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ８．１中に回収した。このトランスフェクション−感染工程を０代目と呼ぶ。この段階で生産されたウイルスを、凍結／解凍を３回繰り返すことで細胞から放出させ、１５０μｌの溶解液を用い、ＭＯＩ  １のＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルスとともに新たなプレートの２９３Ｃｒｅ４細胞に感染させた。従前の場合と同様に、細胞をドキシサイクリンおよびタモキシフェンで２４時間前処理した。このようにして、いわゆる１代目〜３代目を行った。４代目では、各１×１０７個の２９３Ｃｒｅ４細胞を含む２枚の１５０ｍｍプレートを感染させ、５代目では８枚の１５０ｍｍプレートととし、中規模生産の最後の代は３０枚の１５０ｍｍプレートからなる。生産されたウイルスは二重塩化セシウム勾配により精製し、サイズ排除カラム(Sephadex)により生成物から脱塩した。継代ごとにＡｄＴｅｔＣｒｅを、市販のＡｄｅｎｏＸラピッドタイターキット(BD Biosciences)により、製造者の説明書に従って定量した。ＨＣ−Ａｄ  ＫＣＺをＸ−Ｇａｌでの染色により定量した。
【００８６】
同様にして２９３細胞で生産を行い、４代目まで達した。ドキシサイクリンおよびタモキシフェンによる処理無しの２９３Ｃｒｅ４細胞において、ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃヘルパーウイルスを用いた生産を行い、６代目まで達した。
【００８７】
実施例２
ドキシサイクリンおよびタモキシフェンにより調節される様式でＣｒｅ発現を可能とするプラスミド系の構築
Ｃｒｅ発現の制御を達成するため、従前に至適化されている「ｔｅｔ−ｏｎ」型誘導系(Zabala et al., 2004,前掲)を用いた。この系は、「ｔｅｔ」結合配列を含むプロモーターに結合することができる活性コンフォメーションを採用して、外から加えられたドキシサイクリンの存在下で二量体を形成するトランス活性化タンパク質（ｒｔＴＡＭ２）の構成的発現に基づく（図２）。このようにして、誘導プロモーター（「ｔｅｔ」部位を有する）の制御下にある遺伝子はドキシサイクリンの存在下でのみ用量依存的に発現されるということが達成された。この場合、どのＨＣ−Ａｄパッケージング細胞においても確実に活性となるように、ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターが構成プロモーター（ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＰＧＫ）の制御下にあるプラスミドが構築されている。さらに、Ｃｒｅは、最小プロモーター（この場合、アルブミンプロモーター）に結合されたいくつかの「ｔｅｔ」部位により形成された誘導プロモーター下にある。そして、Ｃｒｅの完全誘導発現系を備えたプラスミドが得られるように両構築物が融合されている（図２）。
【００８８】
Ｃｒｅの基底発現が新たなヘルパーウイルスの生産を妨げないようにするため、２つの補足的戦略を行った。
【００８９】
一方では、ｔＴＳレプレッサーを構成的に発現する細胞を作製した。このｔＴＳタンパク質はドキシサイクリンの不在下で誘導プロモーターと結合し、転写を遮断することができる。ドキシサイクリンインデューサーを加えると、ｔＴＳはコンフォメーションを変化させ、もはやプロモーターに属さず、ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターのためのオープンパスを残してＣｒｅと結合し、その発現を活性化させる（図３）。従って、この方法は、ヘルパーアデノウイルスの生産のためのｔＴＳを発現する２９３細胞と、ＨＣ−Ａｄの生産のための２９３細胞（Ｃｒｅのおよび／またはｒｔＴＡ−Ｍ２の構成的発現を伴うまたは伴わない）の２つのタイプのパッケージング細胞に基づく。ｔＴＳをコードする遺伝子がＣＭＶウイルスプロモーターの制御下で発現される市販のプラスミドを入手した。このプロモーターは長期間サイレンシングを受け得ると考えられたので、それをＥＦ１αプロモーターに置き換えて、より安定な系統でより持続的な発現を得た。図４は、２９３細胞においてクローンを選択した後の導入遺伝子の発現を確認するためのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【００９０】
さらに、そのカルボキシ末端およびアミノ末端で個々の変異型エストロゲン受容体に結合したＣｒｅリコンビナーゼからなる融合タンパク質をコードする配列が得られている。このタンパク質（ＭｅｒＣｒｅＭｅｒと呼ばれる）はタモキシフェンの存在下でのみＣｒｅに特徴的なリコンビナーゼ活性を呈することが記載されている(Verrou et al., 1999, Biol Chem. 380:1435-8)。よって、誘導ｔｅｔ−ｏｎ系はドキシサイクリンの不在下ではＣｒｅ発現の効率的な制御を得ることはできず、この酵素は不活性化され、ヘルパーウイルスの生産を可能とする。これに対して、ＨＣ−Ａｄを生産する場合には、ドキシサイクリンで処理されたｔＴＳを含まない細胞にタモキシフェンが加えられるので、この系の活性化は最大となる。
【００９１】
ＣｒｅまたはＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼのための調節系を組み込んだプラスミドの構築が完了したところで、その誘導系の作動を確認した。図５は、例として、２９３細胞におけるＣｒｅの発現の制御を示す。誘導プロモーターとともにトランスアクチベーターとＣｒｅをコードする個々のプラスミドを同時にトランスフェクトすると、ドキシサイクリンの存在下でリコンビナーゼの発現が得られるが、両プラスミドは個別には発現しない。この完成系を含むプラスミドもまたＣｒｅを発現するが、程度は低い。図５Ｂは、いかにこのプラスミドが細胞をドキシサイクリンで処理した場合にのみ相当量のＣｒｅを発現するかを示す。
【００９２】
実施例３
ドキシサイクリンおよびタモキシフェンにより調節される様式でＣｒｅを発現するヘルパーアデノウイルスベクター
次に、第一世代アデノウイルスベクターのゲノムを含むプラスミドに種々のエレメントを組み込むことにより、ＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼの自己不活性化ベクター担体を構築するプロセスを開始した。このベクターのゲノム構造を、推定される作動メカニズムとともに図６に示す。しかしながら、大腸菌でのこれらのプラスミドの増幅過程で、ＬｏｘＰ部位により隣接されたパッケージング配列の切除が見られたことから、この完成系は単一のプラスミドでは得ることができない。このために、新たなベクターを得るための第一の工程は、細胞において相同組換えを行った後に完全なゲノムを回復させる２つのプラスミドを２９３ｔＴＳ細胞で同時トランスフェクトすることからなる（図７）。ウイルスを２９３ｔＴＳ細胞で増殖させ、他の第一世代アデノウイルスベクターと同様のプロセスを用いて精製した。
【００９３】
ウイルスが得られたところで、ウエスタンブロットにより、それがドキシサイクリンにより誘導可能な様式でＭｅｒＣｒｅＭｅｒタンパク質を発現することができることを確認した（図８）。次に、種々のタイプの細胞におけるドキシサイクリンおよびタモキシフェンの存在下でのその挙動を検討した。このために、Ｃｒｅリコンビナーゼ（２９３Ｃｒｅ４）を構成的に発現する２９３、２９３ｔＴＳまたは２９３細胞を、記載されている処理の存在下または不在下で感染させた(Parks et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13565-70)。感染４８時間後に、各場合で生産された感染力のあるウイルスの量を定量した。図９で分かるように、ウイルス産物は２９３ｔＴＳ細胞においてドキシサイクリンおよびタモキシフェンの存在下でのみ劇的に減少し、これはキャプシド形成配列の切除によるウイルスのキャプシド形成の予測される阻害と一致している。ＭｅｒＣｒｅＭｅの基底発現レベルが高い可能性のある２９３細胞では、ドキシサイクリンまたはタモキシフェンを独立に添加するとウイルス生産の相対的低下を生じたが、この場合にも処理の組合せがより顕著な低下をもたらす。２９３Ｃｒｅ４細胞を用いる場合、予測されたように、ウイルス生産は誘導系の活性化とは独立に低い。この系の特異性を実証するために、類似の研究を行い、この時、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスと、ＬｏｘＰにより隣接されたキャプシド形成シグナルを有するがリコンビナーゼを発現しない標準的なヘルパーウイルス（ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃ）と比較した(Parks et al., 1996,前掲)。図１０で分かるように、タモキシフェンおよびドキシサイクリンによる処置は、ウイルスの生産レベルに有意な変化を引き起こさなかった。ウイルスのパッケージングは、２９３Ｃｒｅ４細胞を用いた場合にのみ減少する。これに対して、ＡｄＴｅｔＣｒｅの場合には劇的な減少が確認され、そのレベルは２９３Ｃｒｅ４細胞においてＡｄＬＣ８ｃｌｕｃで見られるものよりはるかに低い。この減少がパッケージング配列の除去のためであることを実証するために、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンで処理した２９３細胞に存在するＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの最初の領域をＰＣＲにより増幅した。図１１Ａで分かるように、増幅されたフラグメントは非修飾ゲノムに相当するものよりも小さく、そのサイズはパッケージング配列の完全な欠損に匹敵する。このことをさらに配列決定により確認した。図１１Ｂは、標準的なヘルパーウイルス（ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃ）の場合、２９３Ｃｒｅ４細胞に感染させた際にどのようにパッケージング配列が欠損するかを示す。さらに、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスとは対照的に、この除去がいかに完全とは思われないかも分かる。
【００９４】
実施例４
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの使用によるガットレスアデノウイルスの生産
ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスが誘導性の様式で不活性性（自己不活性性）であることが確認されたところで、次に、ＨＣ−Ａｄの生産プロセスにおいてヘルパーウイルスとして機能するその能力を調べた。このために、ＨＣ−Ａｄ（この場合には、ＬａｃＺ遺伝子を発現するＫＣＺ）をコードするプラスミドの標準的なプロトコールとその後のヘルパーウイルス感染を行った。次に、従前の工程で生産されたＨＣ−Ａｄを用い、新たなヘルパーウイルスの添加を伴って、新たな細胞プレートを感染させる連続的増幅工程を行う。プレートの大きさと数を段階的に増す。このプロセスを、ヘルパーとしてＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを用い、２９３細胞と２９３Ｃｒｅ４細胞の双方で行った。標準的な方法と比べるために、ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃヘルパーウイルスを２９３Ｃｒｅ４細胞において同様に用いた。各工程で、ＨＣ−Ａｄおよびヘルパーウイルスに相当する無効ユニットの量を定量した。図１２Ａで分かるように、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを用いたＨＣ−Ａｄの生産は、２９３Ｃｒｅ４細胞で行った連続工程では段階的に高まったが、ヘルパーアデノウイルスの混入は常にそれにより十分下に維持された。この例で行った最後の継代（６代目）では、高容量アデノウイルス量は合計ＩＵとして１．２×１０１１で、ヘルパーアデノウイルスの混入は０．０５％未満であった。この収量および純度は、中規模のＨＣ−Ａｄ生産では許容されるとみなされる。これに対し、ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルスを用いた場合には、このウイルスの混入程度は工程中に増大し、やがて高容量ベクターの量を超えた（図１２Ｃ）。この混入が低く、ＨＣ−Ａｄの生産に標準的な方法を使用することができる場合もあるが、このヘルパーウイルスの過剰な蓄積はよく記載されており、この方法のロバスト性の欠如を示す。ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを用いた２９３細胞での生産に関する混入程度も高すぎた（図１２Ｂ）。これは、パッケージング細胞により発現されたＣｒｅリコンビナーゼがウイルスにより発現されたＭｅｒＣｒｅＭｅｒリコンビナーゼと協働して最適な効果を達成することを示す。この構成的発現は、ヘルパーウイルス感染後の初期のリコンビナーゼの存在を確保するのに重要である可能性がある。これまでに行った数回の連続試験で、ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスの量は、２９３Ｃｒｅ４細胞が用いられた場合の高容量ウイルスの量より下に常に維持されたが、このことは従来のヘルパーアデノウイルスに基づく技術に比べてこの生産方法の大きな信頼性を示唆する。
【００９５】
実施例５
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスに使用による治療用導入遺伝子を運ぶガットレスアデノウイルスの生産
ＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスが誘導性の様式で不活性性（自己不活性性）であり、ＨＣ−Ａｄの生産プロセスにおいてヘルパーウイルスとして機能する能力を持つことが確認されたところで、治療遺伝子を運ぶＨＣ−Ａｄを生産する能力を調べた。例えば、ＧＬ−Ａｄ／ＲＵｍＩＬ−１２ウイルス（ＨＣ−Ａｄ−ｍＩＬ−１２とも呼ばれる）は、ミフェリプリストン活性化肝臓特異的誘導プロモーターの制御下でネズミインターロイキン１２（ｍＩＬ−１２）サイトカインを発現する。このベクターはいくつかの動物肝臓癌モデルで抗腫瘍効果が示されている(Wang et al., Gastroenterology 2004, 126: 278-289)。ＧＬＡｄ／ＲＵｍＩＬ−１２のゲノムを含むｐＧＬＡｄ−ＲＵｍＩＬ−１２プラスミドを従前に記載されているように(Wang, L., et al., 2004 Gastroenterology 126: 278-89)に生産し、それをＰｍｅＩ制限酵素で消化して線状化し、抗生物質耐性を除去した。次に、酢酸ナトリウム（３００ｍＭ）と２．５容量の無水エタノールを加えることによりこれを沈殿させた。このサンプルを−２０℃で少なくとも１時間維持した後、４℃で３０分間、１１，０００ｇで遠心分離し、この沈殿を７０％エタノールで洗浄し、風乾した。これを水に再懸濁させ、１５μｇを用い、タモキシフェンおよびドキシサイクリンで２４時間前処理した６０ｍｍプレート中の１×１０６個の２９３Ｃｒｅ４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは２０μｌのリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いて行った。６時間後に培地を交換し、２％ＦＢＳとウイルス１個／細胞のＭＯＩでＡｄＴｅｔＣｒｅウイルスを含むＤＭＥＮ培地を加えた。このＭＯＩは事前の実験で決定し、その場合、感染４８時間の時点で９０％の細胞変性効果をもたらすのに必要なウイルスの量を検定した。感染は４８時間進行させ、その後、細胞を２００μｌのＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ８．１中に回収した。このトランスフェクション−感染工程を０代目と呼ぶ。この段階で生産されたウイルスを、凍結／解凍を３回繰り返すことで細胞から放出させ、１５０μｌの溶解液を用い、ＭＯＩ  １のＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルスとともに新たなプレートの２９３Ｃｒｅ４細胞に感染させた。従前の場合と同様に、細胞をドキシサイクリンおよびタモキシフェンで２４時間前処理した。このようにして、１代目〜３代目と呼ばれる継代を行った。４代目では、各１×１０７個の２９３Ｃｒｅ４細胞を含む２枚の１５０ｍｍプレートを感染させ、５代目では１２枚の１５０ｍｍプレートととし、中規模生産の最後の代は３０枚の１５０ｍｍプレートからなり、その溶解液は４枚の１５０ｍｍプレートに相当する。生産されたウイルスは二重塩化セシウム勾配により精製し、サイズ排除カラム(Sephadex)により生成物から脱塩した。ＧＬ−Ａｄ／ＲｕｍＩＬ−１２の生産は１．５×１０１２のウイルス粒子（ｖｐ）という能力に達し、ＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーアデノウイルスの混入は２．６×１０６ｉｕ未満であった。このベクターがリポーター遺伝子を発現しないと考えられ、その機能を感染細胞における導入遺伝子（ｍＩＬ−１２）の生産を測定することにより確認した。図１４Ａは、ＨｕＨ−７細胞（ヒト肝臓癌由来）を、ミフェリプリストンインデューサーの存在下で、種々の量の高容量ア��ノウイルスベクターＧＬ−Ａｄ／ＲＵｍＩＬ−１２に感染させた後に得られたｍＩＬ−１２レベルを示す。次に、このベクターの機能をin vivoで確認した。このため、ベクターをマウスの内部に注入し、ミフェリプリストンインデューサーを腹腔内投与した後に、血清中に存在するｍＩＬ−１２の量を測定した。ｍＩＬ−１２の誘導および測定をベクター注射の７、４８および６２日後に行い、そのマウスが多量の導入遺伝子を安定発現することを確認した（図１４Ｂ）。このデータは、この新規な方法が臨床上着目されるベクターの生産に有効であることを示す。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月1日(2011.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）部位特異的リコンビナーゼをコードする領域であって、該領域は誘導プロモーターの機能的制御下にあり、該リコンビナーゼの活性はリガンドの存在下で増加する、領域と、
ｂ）配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接された、アデノウイルスゲノムの複製および／またはパッケージングのための必須領域（該認識配列は、該リコンビナーゼの存在下で該必須領域の除去を行うように配向されている）
とを含んでなる、ポリヌクレオチドを含んでなる、ヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムのパッケージングまたは複製のための必須領域（ｂ）が、パッケージングシグナルΨである、請求項１に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項３】
転写アクチベーターのリガンドの存在下で、配列（ａ）によりコードされるリコンビナーゼの発現を調節するプロモーターを特異的に活性化することができる転写アクチベーターをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記転写アクチベーターが、テトラサイクリン類似体依存性トランスアクチベーターである、請求項３に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項５】
転写アクチベーターが、ｒｔＴＡ−Ｍ２トランスアクチベーターである、請求項４に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項６】
リコンビナーゼが、ＣｒｅまたはＣｒｅリコンビナーゼの配列を含んでなる融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項７】
リコンビナーゼが、ホルモン結合ドメインまたは活性化可能な核局在配列、好ましくは、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン、をさらに含んでなる、請求項６に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項８】
リコンビナーゼが、ｍｅｒＣｒｅｍｅｒである、請求項７に記載のヘルパーアデノウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクターの配列を含んでなる、アデノウイルス粒子。
【請求項１０】
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスの複製およびパッケージングのための系であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、または請求項９に記載のアデノウイルス粒子と、
ｂ）真核細胞
を含んでなる、系。
【請求項１１】
要素（ｂ）を形成する細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーター特異的転写レプレッサーを含んでなる、請求項１０に記載の系。
【請求項１２】
転写レプレッサーが、部位特異的リコンビナーゼの発現を促進することができるリガンドの不在下で活性である、請求項１１に記載の系。
【請求項１３】
自己不活性化ヘルパーアデノウイルスを得るための方法であって、
（ｉ）細胞と、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、または請求項９に記載のアデノウイルス粒子とを、また所望により、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質をコードする１または数個のポリヌクレオチドとを、アデノウイルスゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件下で接触させること、
（ｉｉ）該細胞を、細胞内でのアデノウイルスのパッケージングおよび複製を可能とし、かつ、部位特異的リコンビナーゼの発現を妨げるのに好適な条件で保持すること、および
（ｉｉｉ）培地からアデノウイルスを回収すること
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーター特異的転写レプレッサーを含んでなり、該レプレッサーが、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターを活性化することができるリガンドの類似体の不在下で活性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写レプレッサーが、ドキシサイクリン依存性ｔＴＳレプレッサーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法に得られたヘルパーアデノウイルス。
【請求項１７】
高容量アデノウイルスの生産およびパッケージングのための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、または該ポリヌクレオチドを含んでなる請求項９に記載のアデノウイルス粒子の使用。
【請求項１８】
高容量組換えアデノウイルスを生産するための系であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘルパーアデノウイルスベクター、または請求項９に記載のアデノウイルス粒子；
（ｂ）そのゲノムが、目的遺伝子を含んでなり、かつ、該アデノウイルスの複製に必須の少なくとも１つのタンパク質もしくはパッケージングに必須の少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を欠いたアデノウイルス、または該アデノウイルスのゲノムを含んでなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）真核細胞
を含んでなる、系。
【請求項１９】
真核細胞が、系の要素（ａ）によりコードされる部位特異的リコンビナーゼを発現するポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１８に記載の系。
【請求項２０】
部位特異的リコンビナーゼをコードする領域が、誘導プロモーターの機能的制御下にある、請求項１９に記載の系。
【請求項２１】
目的遺伝子を発現する高容量アデノウイルスを作出する方法であって、
（ｉ）細胞とアデノウイルスとを、該アデノウイルスのゲノムまたは該ゲノムを含んでなるポリヌクレオチドが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉ）該細胞と、
（ａ）
１．部位特異的リコンビナーゼをコードする領域であって、該領域は誘導プロモーターの機能的制御下にあり、該リコンビナーゼの活性はリガンドの存在下で増加する、領域と、
２．配列ａ）によりコードされるリコンビナーゼに特異的な認識配列により隣接されたアデノウイルスパッケージングシグナルΨ（該認識配列は、該リコンビナーゼの存在下でパッケージングシグナルΨの除去が起こるように配向されている）
とを含んでなるポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルスベクター、および
（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルス粒子
の群から選択される第二の成分とを、該アデノウイルスベクターまたは該アデノウイルス粒子のゲノムが細胞に侵入する好適な条件で接触させる工程、
（ｉｉｉ）両ウイルスのゲノムによりコードされるタンパク質の発現、両アデノウイルスのゲノムの複製、および工程（ｉｉ）で用いたベクターまたはアデノウイルスによりコードされるリコンビナーゼの発現に好適な条件で細胞を保持する工程、および
（ｉｖ）細胞培養物から高容量アデノウイルスを回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２２】
（ａ）で定義されたアデノウイルスベクターおよび／または細胞が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターの特異的トランスアクチベーターをコードする配列をさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、部位特異的リコンビナーゼの発現を調節するプロモーターの特異的トランスアクチベーターと結合し、それを活性化することができるリガンドの存在下で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスアクチベーターが、ｒｔＴＡ−Ｍ２であり、前記リガンドが、ドキシサイクリンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、部位特異的リコンビナーゼをコードする配列を含んでなり、該リコンビナーゼが（ａ）で定義されたポリヌクレオチドによりコードされるものと同じである、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
部位特異的リコンビナーゼが、ＣｒｅまたはＣｒｅリコンビナーゼの配列を含んでなる融合タンパク質である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
リコンビナーゼが、ｍｅｒＣｒｅｍｅｒである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、タモキシフェンの存在下で行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前のサイクルの工程（ｉｖ）で回収されたアデノウイルスを各サイクルの工程（ｉ）で用いて、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を少なくとも１回繰り返すこと、および所望により、各サイクルの工程（ｉ）で新たな用量のヘルパーアデノウイルスを加えることを含んでなる、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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