(57)【要約】本発明は、タンパク質を精製するための方法および組成物に関する。非イオン性ポリマー（例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび、ポリマーとしてポリエチレングリコール）を用い、タンパク質凝集物を除去するクロマトグラフィー工程と、その後に、溶解度を高める添加剤（例えば、尿素化合物、アルキレングリコールまたは双性イオン、特に、グリシン）を用いたイオン交換クロマトグラフィー工程とを含む、タンパク質、特に、ＩｇＭを精製するための方法が本発明により提供される。
2011522055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク産物と、該タンパク産物の凝集物とを含むサンプルから、該タンパク産物を精製するプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）該タンパク産物の凝集物を除去するために非イオン性ポリマーの使用を含む第１のクロマトグラフィー工程で、該非イオン性ポリマーが、該クロマトグラフィー条件で該タンパク産物の凝集物からの該タンパク産物の分離を促進するのに十分な濃度で存在し、その結果、実質的に凝集物を含まないタンパク産物を含むフラクションが、この工程の後に集められる、第１のクロマトグラフィー工程と；
（ｂ）溶解度を高める添加剤と、該第１のクロマトグラフィー工程で得たタンパク産物を含むフラクション、またはその後で、前記第１のクロマトグラフィー工程で得たタンパク産物を含むフラクションから誘導される、得られたタンパク産物を含むフラクションとを混合し、該溶解度を高める添加剤が、双性イオン、尿素化合物、アルキレングリコールからなる群より選択される工程と；
（ｃ）イオン交換クロマトグラフィーの使用を含む第２のクロマトグラフィー工程で、前記溶解度を高める添加剤が、タンパク産物の溶解度を高め、該クロマトグラフィー条件で実質的に閉塞を防ぐのに十分な濃度で存在し、該溶解度を高める添加剤が、第２のクロマトグラフィー工程を妨害しないような、第２のクロマトグラフィー工程と、を含み、該プロセスによって、実質的に凝集物を含まない、精製されたタンパク産物が得られる、プロセス。
【請求項２】
前記サンプルが、細胞培養物の上澄みである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記タンパク産物が、免疫グロブリンまたはそのフラグメントである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記免疫グロブリンがＩｇＭである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記溶解度を高める添加剤が、グリシン、ベタイン、尿素、エチレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記第１のクロマトグラフィー工程の非イオン性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記第１のクロマトグラフィー工程が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含み、前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー条件で、前記凝集物からの前記タンパク産物の分離性を高めるのに十分な濃度で存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記非イオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールであり、前記溶解度を高める添加剤が、グリシン、尿素からなる群より選択される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの後に集めたフラクションを、前記溶解度を高める添加剤を含む組成物に集める、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
第１のクロマトグラフィー工程の後に集めたタンパク産物を含むフラクションに、さらに分離工程または精製工程を行い、第１のクロマトグラフィーから得たフラクションから誘導されるタンパク産物を含むフラクションを得た後、このようなフラクションと溶解度を高める添加剤とを混合する工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記第２のクロマトグラフィー工程が、アニオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記第２のクロマトグラフィー工程が、カチオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記第２のクロマトグラフィー工程が、カチオン交換クロマトグラフィーをさらに含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記第１のクロマトグラフィー工程から得られたタンパク産物を含むフラクションを、前記溶解度を高める添加剤を含む組成物と混合する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記溶解度を高める添加剤が双性イオンである、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記第２のクロマトグラフィー工程から得たフラクションのイオン交換クロマトグラフィーを含む、第３のクロマトグラフィー工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記第２のクロマトグラフィー工程が、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記第３のクロマトグラフィー工程が、カチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記第２のクロマトグラフィー工程が、カチオン交換クロマトグラフィーであり、前記第３のクロマトグラフィー工程が、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記溶解度を高める薬剤がグリシンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第１のクロマトグラフィー工程が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含み、前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー条件で、ＩｇＭ凝集物からのＩｇＭの分離性を高めるのに十分な濃度で存在する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記非イオン性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記非イオン性ポリマーが、約１０％の濃度のポリエチレングリコールである、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記非イオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールであり、前記溶解度を高める添加剤が、双性イオン、尿素からなる群より選択される、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記溶解度を高める添加剤がグリシンである、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
約０．５Ｍ〜約１Ｍの濃度のグリシン存在下で前記第２のクロマトグラフィー工程を行い、このプロセスによって、ＩｇＭ凝集物を実質的に含まないＩｇＭが得られ、ＩｇＭが、約９９％を超える純度を有する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
さらに、前記第１のクロマトグラフィー工程のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの後に集めたフラクションが、約１Ｍの濃度のグリシンを含む組成物に集められる、請求項２５に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願との相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／０５８５４５号（２００８年６月３日出願）からの優先権を主張する。この仮特許出願は、その全体が参照により、本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、タンパク質を精製するための方法および組成物に関し、特に、イオン交換クロマトグラフィー中に、抗体の溶解度を高め、凝集物の生成または閉塞を防ぐために、凝集物を除去し、溶解度を高める添加剤（例えば、双性イオンを含有する組成物）を使用することを含み、凝集物を実質的に含まない高純度タンパク産物が得られるような、抗体精製プロセスのための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩｇＭ抗体は、血液およびリンパ液中にみられ、通常は、感染に対する反応時に作られる第１の種類の抗体であり、これにより、他の免疫系細胞が、異物を破壊するようにしむけることができる。ＩｇＭは、有望な治療用途を有しているが、ＩｇＭは、標準的な抗体精製ツールの適用を限定してしまうような、いくつかの特性を有する。ＩｇＭは、ＩｇＧよりも溶解度が低い傾向があり、極端なｐＨ条件や、導電率の低い条件では変性（凝集物精製を含め、析出）しやすい。ＩｇＭは、一般的に、イオン交換クロマトグラフィーでは有用であり得る高い塩濃度には強いが、疎水性の強い表面にさらされると変性しやすく、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）での有用性が限定されてしまう場合がある。さらに、ＩｇＭは、適度に低い塩濃度であれば、十分に規定されるピークとして、ＨＩＣで使用するような疎水性が中程度の担持体から溶出させることができるが、疎水性が中程度の媒体に対して良好な能力を担保するのに好ましいような、もっと高い塩濃度では、ＩｇＭは析出してしまうであろう。ＩｇＭは、典型的に、ＩｇＧよりも帯電しているため、ＩｇＭは、イオン交換体およびヒドロキシアパタイトに対してＩｇＧよりも強く結合し、ほとんどの夾雑物よりもかなり強く結合することが多い。ＩｇＭが大きいことも、拡散定数が小さくなるため、精製の際に課題となることがあり、物質移動が拡散に依存する、多孔性粒子に基づくクロマトグラフィー媒体の場合には問題となることがある。拡散速度が遅いことは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にとっては特に制限事項となり、すでに、容量が低くなり、流速が遅くなるという問題をかかえている。
【０００４】
ＩｇＭのいくつかの特性が、標準的な生成ツールの用途を限定する場合があるが、ＩｇＭモノクローナルの電荷特性は、ＩｇＧではほとんどうまくいかないか、まったくうまくいかないような精製の機会を与えることもある。これらの電荷特性によって、生成物に不必要なストレスを与えることなく、少ない工程で精製する、全く異なるプロセスを開発することができる。実際に、臨床品質のＩｇＭの精製は、一般的に、ヒドロキシアパタイト、アニオン交換、カチオン交換を用いた３種類の結合−溶出クロマトグラフィー工程で達成することができる。ＩｇＭ精製の改良は、ほとんど、高い結合能を有し、大きな流速に耐えることができる能力を有するモノリス状イオン交換体を使用することによる。さらに、モノリス状および膜状のイオン交換体は、拡散ではなく、物質移動の対流に依存しており、拡散は、大きさおよび流速に依存しないため、容量および分解能は、ＩｇＭが大きいことによって影響を受けない。また、アフィニティ工程を行わないことは、精製を効率的に行い、経済的な精製プロセスにするために、良い影響を与える。サンプルをローディングするためにライン内での希釈を用いることによって、中間的なダイアフィルトレーションを避けることは、プロセスの経済性を高める場合がある。それぞれの工程で、回収率は、ＩｇＧ精製で達成される回収率に匹敵している非特許文献１；Ｇａｇｎｏｎら、ＩｇＭ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，１３ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｗａｔｅｒｓｉｄｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ４−６，２００８、ｗｗｗ．ｖａｌｉｄａｔｅｄ．ｃｏｍで、Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｎｏ．ＰＳＧ−０８０１２９として入手可能）。
【０００５】
（凝集物除去）
ＩｇＧ、ＩｇＭのような抗体を含む多くのタンパク質は、凝集物を生成してしまうことがあり、治療用タンパク質として必要とされる純度を有するタンパク産物を得て、生成物の安全性を担保するために、精製中に除去しなければならない。凝集物の除去は、生成物の安全性を決める鍵となる因子であるが、プロセス開発の困難性が増し、精製コストが上昇し、最後の（「最終」）精製のオプションの中で、選択肢が制限されてしまうことがある。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、凝集物を除去し、バッファーを交換することができるが、ＳＥＣは、遅く、容量が少なく、過度に大きなカラムが必要な場合には、優れた充填技術が必要となり、必要なバッファー容積も大量となる。吸着による方法も、選択性が、タンパク質の大きさに直接関係しておらず、凝集物は、凝集していないタンパク質よりも強く保持される傾向があり（おそらく、吸着性固相との多くの相互作用が関与している）、クローン間の電荷分布、生成物の凝集している形態と凝集していない形態との電荷分布が変動するため、分離度が予測できないことから、凝集物を除去することに対する有用性は制限されている。
【０００６】
非イオン性ポリマーおよびタンパク質は、抗体を沈殿させる薬剤として使用されることが多く、バッファーに加えると、タンパク質の大きさに比例した効果を与えることができる。非イオン性ポリマーおよびタンパク質は、吸着方法と適合する添加剤を与え、吸着方法によって凝集していない抗体から凝集物を分離する性能を高め、ヒトに注射可能な製品を処理するための規制基準を満たすように選択することができる。例えば、非イオン性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、毒性がないと考えられ、ＵＳＰグレードのものが容易に入手可能であり、タンパク質を安定化させる性質を有し、高価ではない。ＰＥＧは、タンパク質表面から優先的に除外されるため、タンパク質の周りに、純粋な水による水和の覆いが作られ、純水による覆いと、ＰＥＧが濃縮した塊状の溶媒との間の不連続性が、熱力学的に好ましくない。タンパク質がＰＥＧ溶液と接触すると、互いに水和水をいくらか共有し、それによって、塊状の溶媒にいくらかが放出され、個々のタンパク質の表面積があわさったものよりも小さな表面で存在する。タンパク質の表面積が、タンパク質の大きさに比例するため、非イオン性有機ポリマーが与える影響の大きさは、タンパク質の大きさに比例し、ポリマーの長さおよび濃度を選ぶことによって高めることが可能な、サイズ選択性が得られる。例えば、ＩｇＭを沈殿させるＰＥＧ−６０００（バッファー添加剤として）の割合の範囲は、ＩｇＧを沈殿させる割合の範囲よりも低い。
【０００７】
ＰＥＧによって付与されるサイズ選択性は、他の用途にも用いることができ、その結果、ＰＥＧの効果を、種々のクロマトグラフィー分離中に活用することができる。ＰＥＧが、イオン交換条件でバッファー添加剤として含まれる場合、イオン交換によって、凝集していない小さなタンパク質を、大きな凝集物から分離することができる。また、ＰＥＧを含有するバッファーを用い、ヒドロキシアパタイトで凝集物を分離することができ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって凝集物を除去することができる。通常は、他の夾雑物に対するＰＥＧの効果を予想することができ、これらの効果を考慮し、生成物精製中に、最適なクリアランスを達成することができる。例えば、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）は、一般的に、ＩｇＧよりも小さく、ＰＥＧがこれらのカラム保持時間を長くする効果は少ないはずであり、一方、ＤＮＡ、内毒素、ウイルスは、一般的に、ＩｇＧよりも大きく、ＰＥＧがこれらのカラム保持時間を長くする効果は大きいはずであり、生成物からの夾雑物の分離性は良好になるはずである。したがって、ＰＥＧを用い、凝集物の除去効率を顕著に高め、所望な場合、他の夾雑物、特に、ウイルス粒子を含む夾雑物の除去性を高めることができる（Ｇａｇｎｏｎら、サンファン、プエルトリコ、２００７年４月２３〜２５日の１２ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｗａｔｅｒｓｉｄｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで示された「Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、ｗｗｗ．ｖａｌｉｄａｔｅｄ．ｃｏｍで、Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｎｏ．ＰＳＧ−０７０４３０として入手可能）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇａｇｎｏｎら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＭ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｍａｒｃｈ  ２００８，ｐａｇｅｓ  ２６−３５（２００８年３月２日）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特定の実施形態では、タンパク産物と、このタンパク産物の凝集物とを含むサンプルから、タンパク産物を精製するプロセスを提供し、このプロセスは、（ｉ）上述のタンパク産物の凝集物を除去するために非イオン性ポリマーの使用を含む第１のクロマトグラフィー工程で、上述の非イオン性ポリマーが、このクロマトグラフィー条件で上述のタンパク産物の凝集物からの上述のタンパク産物の分離を促進するのに十分な濃度で存在し、その結果、実質的に凝集物を含まないタンパク産物を含むフラクションが、この工程の後に集められる、第１のクロマトグラフィー工程と；（ｉｉ）溶解度を高める添加剤と、上述の第１のクロマトグラフィー工程で得たタンパク産物を含むフラクション、またはその後で、上述の第１のクロマトグラフィー工程で得たタンパク産物を含むフラクションから誘導され、得られたタンパク産物を含むフラクションとを混合し、上述の溶解度を高める添加剤が、双性イオン、尿素化合物、アルキレングリコールからなる群より選択される工程と；（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー（または、第１のクロマトグラフィー工程がイオン交換クロマトグラフィーである場合、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）の使用を含む第２のクロマトグラフィー工程で、上述の溶解度を高める添加剤が、タンパク産物の溶解度を高め、このクロマトグラフィー条件で実質的に閉塞を防ぐのに十分な濃度で存在し、この溶解度を高める添加剤が、第２のクロマトグラフィー工程を妨害しないような、第２のクロマトグラフィー工程と、を含み、このプロセスによって、実質的に凝集物を含まない、精製されたタンパク産物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例３に記載したような、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーによる、ＩｇＭ抗体ＬＭ１を初期精製する際のリファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【図２】図２は、実施例３に記載したような、アニオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１を中間精製する際のリファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【図３】図３は、実施例３に記載したような、アニオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１中間精製中のＬＭ１溶出ピークの高分解能リファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【図４】図４は、実施例３に記載したような、カチオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１を最終（最後の）精製する際のリファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【図５】図５は、実施例３に記載したような、カチオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１最終精製中のＬＭ１溶出ピークの高分解能リファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【図６】図６は、最終精製後に、精製されたＬＭ１をＨＰＳＥＣによってサイズ排除クロマトグラフィー分析する際のリファレンスプロフィールを示し、タンパク質の合計量（Ａ２８０、Ａ３００）、濁度（Ａ６００）、導電性、ｐＨを連続して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー分離工程において、凝集物の除去を促進するための非イオン性ポリマーの使用を含み、次いで、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む精製プロセスによる、タンパク産物を精製するための方法および組成物を提供し、ここで、この方法以外では閉塞しやすいプロセス条件で、イオン交換クロマトグラフィーを含む第２のクロマトグラフィー工程において、特定の溶解度を高める添加剤は、タンパク産物の溶解度を高め、閉塞を阻止するのに十分高い濃度で使用される。本明細書で使用する場合、クロマトグラフィー工程に関連する第１および第２という表示は、相対的な順序を指すが、第１工程の前、または第１工程と第２工程との間にある、クロマトグラフィー工程を含むプロセスを除外するものではない。
【００１２】
本開示は、特定の実施形態では、非イオン性ポリマーの使用を含む第１のクロマトグラフィー工程と、イオン交換クロマトグラフィーを含む第２のクロマトグラフィー工程とを含み、本発明の溶解度を高める添加剤を用いない場合、精製プロセス条件のイオン交換中に、タンパク産物は、凝集物を生成するか、またはそれ以外の方法で閉塞を促進してしまう場合がある、混合物からタンパク産物を精製する多段階工程プロセスのための方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、このプロセスは、溶解度を高める添加剤を使用する前に、混合物からの凝集物の除去を促進するための少なくとも１つの工程で、非イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を使用することを含む。
【００１３】
非イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を用いることを含む第１のクロマトグラフィー工程から下流の地点で、タンパク産物の凝集物からのタンパク産物の分離を促進するために、溶解度を高める添加剤と、タンパク産物を含むフラクションとを混合する。特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程から集めたタンパク産物を含むフラクションを、溶解度を高める添加剤を含む組成物に集める。さらなる実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程の後に集めたタンパク産物を含むフラクションに、さらに分離工程または精製工程を行い、次いで、これらから誘導され、得られたフラクションを、溶解度を高める添加剤と混合する。
【００１４】
溶解度を高める添加剤は、特定の実施形態では、タンパク産物の溶解度を促進するが、イオン交換クロマトグラフィーの実施を妨害しないような十分に低い導電性を有する双性イオンである。特定の実施形態では、このプロセスは、この方法以外では凝集または閉塞しやすいプロセス条件で、双性イオン（例えば、グリシン）を、タンパク産物の溶解度を高め、閉塞を阻止するのに十分な濃度で使用することを含み、双性イオンを含有する組成物は、少なくとも１つのイオン交換工程で使用するのに適しており、このプロセスによって、凝集物を実質的に含まない高純度タンパク産物が得られる。
【００１５】
ある例示的で非限定的な実施形態では、混合物から、例えば、細胞培養物の上澄みからＩｇＭを精製する多段階工程プロセスで使用するための方法および組成物が提供され、このプロセスは、少なくともいくつかのＩｇＭ凝集物を除去する少なくとも１つの工程で、ＰＥＧを含有するバッファーを使用することを含み、ＩｇＭ（ＩｇＭモノマー）を豊富に含むサンプルを提供し、このプロセスは、導電率が低い双性イオンを含有する組成物を使用することをさらに含み、プロセス条件下でのイオン交換工程の下流で、この方法以外では凝集しやすいか、または閉塞しやすいプロセス条件での、ＩｇＭの溶解度を高め、ＩｇＭの凝集物生成を阻止するのに十分な濃度で双性イオンは、存在し、このプロセスは、少なくとも１つのイオン交換工程を含み、このプロセスによって、凝集物を実質的に含まない高純度ＩｇＭ産物が得られる。
【００１６】
本明細書で提供される場合、特定の精製プロセス工程中に、タンパク質の溶解度を高め、凝集物の生成または閉塞を防ぐために、双性イオンを含有する組成物を使用することによって、タンパク質の溶解度を高め、凝集物の生成を防ぐために高濃度の塩バッファーを使用する場合（高濃度の塩バッファーは、イオン交換媒体と直接適合可能ではない）とは対照的に、イオン交換媒体と直接適合可能な、導電率が低いサンプルバッファーが得られる。さらに、本明細書で提供される場合、凝集物の除去性を高めるために、非イオン性ポリマーを含有するバッファーを、双性イオンを含有する組成物に直接導入し、タンパク質の溶解度を高め、凝集物の生成を実質的に防ぎ、それによって、精製されたタンパク産物の収率および／または品質に影響を与えるような、脱塩、ポリマーの除去、またはバッファーの交換といったさらなる操作を避けることができる。本方法および本組成物によって、別個の全く異なる精製工程と適合させることが可能になる。
【００１７】
本開示は、ある例示的で非限定的な実施形態では、細胞培養物の上澄みからＩｇＭを精製する多段階工程プロセスで使用するための方法および組成物を提供し、このプロセスは、ＩｇＭ凝集物からのＩｇＭモノマーの分離性を高め、少なくともいくつかのＩｇＭ凝集物の除去を可能にする様式で、少なくとも１つの工程でＰＥＧを使用することを含み、このプロセスは、その後の工程で、導電率が低い双性イオンを含有する組成物を使用することをさらに含み、双性イオンは、この方法以外では凝集しやすい条件で、ＩｇＭの溶解度を高め、ＩｇＭの凝集物生成を阻止するのに十分な濃度で存在する。このプロセスは、さらに、イオン交換精製工程を含み、双性イオンを含有する組成物は、このようなイオン交換工程を妨害しない。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー中に凝集物が生成しやすいか、または閉塞しやすい条件で、ＩｇＭの溶解度を高め、ＩｇＭの凝集物の生成または閉塞を阻止するのに十分な濃度で、グリシンを、双性イオンとして使用する。さらに、多くの用途で、この精製プロセスを一旦開始したら、高められた溶解度を維持し、凝集物生成のリスクを減らすために、中断せずに確実に完結させることに注意をはらうべきである。
【００１８】
溶解度を高める添加剤は、特定の実施形態では、双性イオン、尿素、尿素誘導体、例えば、アルキル尿素（メチル尿素、エチル尿素など）またはアルキレングリコール（例えば、エチレングリコールまたはプロピレングリコール）である。本発明の異なる種類の溶解度を高める添加剤について、機構は異なっていると考えられるが、すべて、タンパク産物を含むフラクションと、タンパク産物を含むフラクション中にその前のクロマトグラフィー工程でこれらを使用した結果存在する非イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）とが関与するイオン交換クロマトグラフィー工程において、タンパク産物の精製度を高めると考えられる。特定の実施形態では、溶解度を高める添加剤が尿素である場合、尿素は、６モル濃度までの濃度で存在してもよいが、好ましくは、２モル濃度未満の濃度で存在する。特定の実施形態では、溶解度を高める添加剤がエチレングリコールである場合、エチレングリコールは、５０％までの濃度で存在してもよいが、好ましくは、２０％未満の濃度で存在する。過剰な濃度のエチレングリコールまたは尿素は、ＩｇＭ抗体にいくらか損傷を与える場合があるため、ある実施形態では、溶解度を高める添加剤の濃度は、第２のクロマトグラフィー工程中の閉塞を防ぐのに必要な、ほぼ最少の濃度になるように調節される。
【００１９】
（双性イオンを含有する組成物）
本方法および本組成物で使用するのに適した双性イオンは、電気的に中性であるが、形式的に、異なる原子に正電荷と負電荷を有する化学化合物であると理解される。双性イオンは、極性であり、通常は、水に対し高い溶解度を有し、ほとんどの有機溶媒への溶解度は低い。
【００２０】
グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）は、イオン化可能なアミノ基と、イオン化可能なカルボン酸基とを有する小さなアミノ酸である。水溶液中、中性ｐＨまたは中性付近のｐＨで、グリシンは、大部分は双性イオンとして存在するであろう。グリシンの等電点または電位が等しくなるｐＨは、グリシン分子が存在する環境下で、アミノ基のｐＫａ値とカルボン酸基のｐＫａ値との中央に位置すると理解される。グリシンは、１モル濃度あたりの誘電率の増分が約１８であり、グリシンは、溶媒の極性をかなり高めると理解され、これにより、タンパク質のような帯電した分子の溶解能が高くなるはずである。水の誘電率は約８０であるが、ほとんどの生命体では、水の誘電率は約１００である。１．０Ｍグリシンの誘電率も約１００である。グリシンは、本明細書で提供する方法および組成物で使用するのに適した双性イオンである。この理論によって限定されることを望まないが、グリシンは、特に、本明細書で提供される方法および組成物で使用されるｐＨ範囲でグリシンが双性イオンであり、その結果、グリシンが、溶液の導電性になんら寄与せず、したがって、その後のイオン交換工程を妨害しないため、本方法および本組成物で使用するのに適していることがわかっている。グリシンの緩衝能は、本明細書中で提供される方法および組成物で使用するｐＨ範囲では、低いか、ゼロであるため、グリシンは、バッファー調製を顕著に妨害するわけではないことを理解されたい。グリシンが、タンパク質とイオン交換体との相互作用に及ぼす影響は、ゼロであるか、ほとんど測定できないレベルであることが観察されており、本明細書で提供される精製プロセスの実施に対し、グリシンが望ましくない影響を与えることは観察されていない。
【００２１】
他の適切な双性イオンとしては、限定されないが、酸性基と塩基性基の両方を含む（両性）ような、両性電解質の等電点では双性イオンとして存在する両性電解質、「グッド（Ｇｏｏｄ）」バッファー、例えば、アミノスルホン酸系バッファーであるＭＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ＣＡＰＳバッファー、アミノ酸（アミノ−カルボン酸）バッファー、例えば、グリシン、その誘導体であるビシンおよびトリシン、アラニン、洗浄剤として使用可能なバッファー、例えば、ＣＨＡＰＳＯ、特定のアルカロイドおよびベタインを含む天然産物があげられる。
【００２２】
用語「双性イオンを含有する組成物」は、本明細書全体で使用する場合、この方法以外では凝集しやすい条件で、タンパク質の溶解度を高め、凝集物の生成を阻止するのに十分な濃度で双性イオンを含有する、緩衝化された溶液および緩衝化されていない溶液を包含する。本明細書で提供されるような双性イオンを含有する組成物の含有量は、組成物の目的となる使用によって変わってもよく、当業者は、特定の使用を目的とする双性イオンを含有する組成物にとって適切な含有量を決定することができる。以下の実施例で記載する非限定的で例示的な実施形態では、双性イオンを含有する組成物のいくつかは緩衝化されておらず、例えば、約ｐＨ７（±０．２）の１．０Ｍグリシン（緩衝化されていない）水溶液であり、他の例示的な実施形態では、双性イオンを含有する組成物は、緩衝化剤と、他の要素（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、または５０ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍグリシン（ｐＨ６．２）、またはバッファーＢ：２０ｍＭクエン酸塩、１．０Ｍグリシン（ｐＨ６．２））とを含む。例示的な実施形態で示されるように、目的の機能にとって十分な双性イオン（例えば、１．０Ｍグリシン）を含む、双性イオンを含有する組成物は、双性イオン系緩衝化剤（例えば、ＭＥＳ）または非双性イオン系緩衝化剤（例えば、Ｔｒｉｓ）をさらに含んでいてもよい。
【００２３】
本明細書で提供される双性イオンを含有する組成物が、特定の使用に十分な濃度で双性イオンを含む場合、この組成物は、特定の使用に必要な最少濃度よりも過剰な濃度で双性イオンを含んでいてもよいことが理解される。双性イオンを含有する組成物は、予防的な手段として、なんらかの望ましくない影響を与えずに、特定の使用に必要な最低量よりも高い濃度で双性イオンを含んでいてもよい。当業者は、特定の使用に適した双性イオン濃度を決定することができ、同様に、双性イオン濃度を上げた場合、または下げた場合の影響を決定することができる。
【００２４】
さらに、この方法以外では凝集しやすいか、または閉塞しやすいイオン交換プロセス条件で、本明細書で提供される双性イオンを含有する組成物を使用すると、凝集または閉塞のリスクは下がるが、凝集または閉塞のようなリスクをなくすことはできないことも理解されたい。したがって、凝集しやすい条件にさらされる時間を最小限にするために、このプロセスを中断せずに完結させることが有益な場合がある。
【００２５】
（精製プロセス）
本開示は、限定されないが、サンプルを捕捉し、凝集物を除去する工程、および種々の精製段階を含む、多段階工程の精製プロセスのための方法および組成物を提供し、プロセス条件が、精製されたタンパク質が凝集しやすい条件である場合に、溶解度を高める添加剤を含有する組成物を使用する。
【００２６】
特に、本開示は、ＩｇＭまたはＩｇＡのような抗体を精製するのに有益に使用可能な、多段階工程の精製プロセスのための方法および組成物を提供する。当業者は、任意のタンパク質を精製するために、本明細書で提供される方法および組成物を実施することができることが理解されるが、以下に記載する非限定的な記載は、本方法および本組成物を抗体精製に使用することに特に注目している。さらに、当業者は、任意の抗体を精製するために、本明細書で提供される方法および組成物を実施することができることが理解されるが、以下に記載する非限定的な記載、および実施例で与えられる例示的な実施形態は、ＩｇＭを精製するために、本方法および本組成物を使用することに特に対処したものである。ＩｇＭを精製するために本方法および本組成物を使用する、以下の非限定的な記載および実施例中の非限定的な記載は、当業者が、他のタンパク質を精製するために本発明を行うことができるように、十分な助言と、作業例を与える。
【００２７】
本開示は、タンパク質を精製する多段階工程プロセスのための方法および組成物を提供し、この工程を行うための物質、試薬、条件は、特定の用途の条件および環境に依存して、当業者が選択することができる。同様に、本開示は、タンパク質を精製する多段階工程プロセスのための方法および組成物を提供し、この工程は、任意の順序で行ってもよい。
【００２８】
ある局面によれば、凝集物の除去は、非イオン性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含むバッファー中にタンパク産物を含有する溶液を、サイズ排除では機能しないクロマトグラフィー媒体（例えば、ヒドロキシアパタイトまたはイオン交換媒体）にローディングして提供され、その結果、タンパク産物（モノマー）が、少なくともいくつかの凝集物から分離され、タンパク産物を豊富に含み、凝集物を実質的に含まないサンプルが集められる。当業者は、異なるクロマトグラフィー媒体および条件を用いる、ＰＥＧを含有するバッファーの最適な使用を決定することができる。本開示によって限定されることは望まないが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（特に、セラミックヒドロキシアパタイトを用いる）中にＰＥＧを含有するバッファーを用いて凝集物を除去することは、信頼性が高く、達成しやすいことがわかったが、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー中にＰＥＧを含有するバッファーを用いて凝集物を除去することは、問題がある場合があり、さらに、アニオン交換媒体またはカチオン交換媒体から、ＰＥＧを含有するバッファーで溶出したサンプルは、新しく凝集物を生成することがあり、再び懸濁させるさらなる処理（例えば、高濃度の塩および／またはグリシン）が必要であった。
【００２９】
別の局面によれば、プロセス条件が、凝集しやすいと思われる場合、タンパク産物を含む溶液は、冷却、低いｐＨ、または低い導電性のような、凝集しやすいプロセス条件で、タンパク産物の溶解度を高め、凝集物の生成を阻止するのに十分な濃度で、双性イオンを含む。一実施形態では、タンパク産物を含む溶液を、双性イオンを含有する環境に導入する。例えば、タンパク産物を含む溶液を希釈した後に、双性イオンの有効性が維持されるような、双性イオンの濃度が十分に高い、双性イオンを含有する組成物に上述の溶液を集める。特に、グリシンを含有する組成物は、プロセス条件が凝集しやすい条件である場合に使用するのに適している。当業者は、グリシンを含有する溶液の溶媒の極性が上がることにより、タンパク質のような帯電した分子に対する、溶液の溶解能が上がるため、グリシンによって、タンパク質の溶解度が上がるであろうことを理解するであろう。一例として、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌで濁るポリクローナルＩｇＭ溶液は、１Ｍグリシン中、１００ｍｇ／ｍｌで無色透明である。グリシンが、この精製プロセスで使用するｐＨ範囲で双性イオンであるため、グリシンが、導電性になんら寄与せず、したがって、その後のイオン交換工程を妨害しないことを、当業者は理解するであろう。同様に、グリシンの緩衝能は、本方法および本組成物で使用するｐＨ範囲ではゼロであるため、グリシンは、バッファー調製を顕著に妨害するわけではない。最後に、タンパク質とイオン交換体との相互作用は、高い誘電率を有する溶媒中では、わずかに弱くなるが、イオン交換基が、溶媒と競争しなければならないことが理解されているため、約１００の誘電率を有するグリシンが、タンパク質とイオン交換体との相互作用に及ぼす影響は、多様な例示的な実施形態では、ほとんど測定可能なレベルではないことが観察されており、その結果、グリシンは、本精製プロセスに及ぼす現実的な影響はなんら観察されなかった。グリシンを、約５０ｍＭ〜約５Ｍ、または約１００ｍＭ〜約４Ｍ、または約２５０ｍＭ〜約３Ｍ、または約５００ｍＭ〜約２Ｍ、または約７５０ｍＭ〜約１Ｍの範囲の濃度で、本明細書で提供するような、溶解度を高める添加剤として使用することができる。グリシンを、約５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約２５０ｍＭ、または約５００ｍＭ、または約７５０ｍＭ、または約１Ｍ、または約１．１Ｍ、または約１．２Ｍ、または約１．３Ｍ、または約１．４Ｍ、または約１．５Ｍ、または約１．６Ｍ、または約１．７Ｍ、または約１．８Ｍ、または約１．９Ｍ、または約２Ｍの溶液で使用することができる。グリシンを、予防的な手段として、所望の効果（例えば、タンパク質の溶解度を高めること、および／または凝集物の生成を避けること）を達成するのに必要な濃度よりも高い濃度で使用することができ、当業者は、特定の用途で許容されるグリシン濃度を決定することができることが理解される。
【００３０】
本明細書に提供されるようなタンパク産物の精製によって、凝集物を実質的に含まない、精製されたタンパク産物が得られる。凝集物を実質的に含まない、精製されたタンパク質サンプルの凝集物の含有量は、本明細書で提供されるように、約５％未満であってもよく、約１％未満、または約０．５％未満、または約０．１％未満であると予想され、凝集物の含有量を測定するのに使用する方法の検出限界未満であってもよい。特に、凝集物を実質的に含まない、精製されたＩｇＭサンプルの凝集物含有量は、約５％未満であってもよく、約１％未満、または約０．５％未満、または約０．１％未満であると予想され、凝集物の含有量を測定するのに使用する方法の検出限界未満であってもよい。
【００３１】
本明細書で提供されるタンパク産物精製を、生成物を分離し、回収するために、線形勾配、段階的な勾配、または線形勾配と段階的な勾配との組み合わせを用いて行ってもよい。ある局面によれば、凝集物および／または他の夾雑物（例えば、ＨＣＰ）からタンパク産物を良好に分離するために、線形勾配を用いてもよい。別の局面によれば、溶出した生成物の容積を減らすために、段階的な勾配を使用してもよい。同じ終点に到達するための、線形勾配および／または段階的な勾配の選択は、どちらの選択によって、純度および凝集物の含有量に影響を与え得る選択性をわずかに移動させるかという理解によってなされる。段階的な勾配および／または線形勾配の選択は、段階の間隔の設定点が、部分的に、カラムローディングの関数であり、貫流容量の９５％までローディングされたカラムの設定点が、５０％までローディングされたカラムの設定点よりもかなり低いという理解からなされる。特定の実施形態に対し、勾配を選択し、使用することは、当業者に既知の因子および方法を用いて行うことができる。
【００３２】
（初期精製）
初期精製を達成するために、第１工程を実施し、タンパク産物を豊富に含むフラクションが得られる。初期精製が、サンプルの捕捉を含む場合、初期精製の後に集めた、タンパク産物を豊富に含むフラクションは、出発物質よりも、タンパク産物の濃度が高いと予想される。初期精製が、サンプルの捕捉を含まない場合、タンパク産物を豊富に含むフラクションは、タンパク産物の濃度が顕著に高くなっているわけではないが、それでも、出発物質中の少なくともいくらかの夾雑物から分離するため、タンパク産物を豊富に含むであろう（例えば、出発物質が、特定の夾雑物と結合するが、タンパク産物とは結合しない媒体を通る）。初期精製が、凝集物の除去を含む場合、タンパク産物を豊富に含むフラクションは、凝集物を実質的に含まないと予想される。初期精製が、凝集物の除去を含まない場合、凝集物は、別の精製工程で除去されるであろう。一実施形態では、第１工程によって、サンプルが捕捉され、凝集物が除去され、初期精製が達成され、タンパク産物を非常に豊富に含み、凝集物を実質的に含まないフラクションが得られ、タンパク産物の濃度は、出発物質中の濃度よりも高い。別の実施形態では、第１工程によって、サンプルが捕捉され、初期精製が達成されるが、第１工程は凝集物の除去は含まず、出発物質中の濃度よりも高いタンパク産物濃度を有するフラクションが得られ、このフラクションは、タンパク産物を少なくともいくらかの夾雑物から分離するため、タンパク産物を豊富に含み、フラクションは、第１工程の前および／または第１工程の間に生成した凝集物を含む。場合により、このプロセス条件が凝集しやすい条件であると予想される場合、初期精製は、双性イオンを含有する組成物を用いて行ってもよい。
【００３３】
（中間精製）
中間精製を達成するために別の工程を行い、初期精製の後に集めたフラクションよりもタンパク産物をさらに非常に豊富に含む、タンパク産物フラクションが得られる。初期精製が、サンプルの捕捉を含まなかった場合、タンパク産物の濃度を高めるためのサンプル捕捉を、中間精製の間に行ってもよい。初期精製が、凝集物の除去を含まなかった場合、凝集物の除去を、中間精製の間に行ってもよい。一実施形態では、サンプルの捕捉と凝集物の除去を含む初期精製の後、さらに濃縮され、実質的に凝集物を含まないタンパク産物フラクションを、イオン交換（例えば、アニオン交換またはカチオン交換）でさらに精製し、もっと高い純度を有する、濃縮され、実質的に凝集物を含まないタンパク産物フラクションが得られる。別の実施形態では、サンプルの捕捉を含む初期精製の後、濃縮されたタンパク産物フラクションを、凝集物の除去を含む中間精製でさらに精製し、より高い純度を有する、濃縮され、実質的に凝集物を含まないタンパク産物フラクションが得られる。別の実施形態では、タンパク産物を特定の夾雑物から分離する初期精製の後、サンプルの捕捉および凝集物の除去を含め、タンパク産物フラクションをさらに精製し、より高い純度を有する、濃縮され、実質的に凝集物を含まないタンパク産物フラクションが得られる。中間精製を、双性イオンを含む組成物存在下で行ってもよいし、存在しない状態で行ってもよく、このプロセス条件が、凝集しやすい条件である場合、中間精製を、双性イオンを含有する組成物を用いて行うであろうことが理解される。
【００３４】
（最後の、最終精製）
タンパク産物の最後の、または「最終」精製を達成するために、さらなる工程を行う。この工程の後に集めたタンパク産物フラクションは、９９％を超える純度を有すると予想され、検出可能な夾雑物または凝集物は存在しない。最終精製を、双性イオンを含有する組成物または他の溶解度を高める添加剤存在下で行ってもよいし、存在しない状態で行ってもよく、このプロセス条件が、凝集しやすい条件である場合、最終精製を、双性イオンを含有する組成物を用いて行うであろうことが理解される。最終精製を、限定されないが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む任意の適切な方法を用いて行うことができる。
【００３５】
（さらなる工程）
本明細書で提供されるような精製プロセスは、限定されないが、濾過、ウイルス不活性化（例えば、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）による方法）、またはさらなる夾雑物除去工程を含むさらなる工程を含んでいてもよい。このプロセスは、任意の濾過、脱塩、ダイアフィルトレーション、またはバッファー交換工程を含んでいてもよいが、本明細書で提供される方法および組成物は、多くのこのような工程を減らすか、またはなくすと予想される。例えば、多段階工程で集めたサンプルの純度、サンプルの凝集物含有量を評価するため、種々のプロセスパラメーターの効果を決定するために、分析のための測定は、このプロセス中の任意の時間点で行われてもよい。最終精製の後で集めたＩｇＭフラクションの純度を、ＳＥＣ分析（例えば、実施例４のＨＰＳＥＣ）、電気泳動による測定（例えば、変性ゲルまたは未変性ゲルによる電気泳動、ＩＥＦ、１−Ｄ電気泳動または２−Ｄ電気泳動など）、ペプチドフィンガープリンティング（ＧＣ−ＭＳ、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦなど）のような種々の分析による測定で評価することができる。ある局面によれば、最終精製した後のタンパク産物フラクションのＳＥＣ分析（例えば、ＨＰＳＥＣ）を行い、タンパク産物の純度が９９％を超え、検出可能な夾雑物を含まないことを確認することができる。
【００３６】
（プロセス工程の順番）
本明細書で提供されるプロセス工程の順序は、非イオン性ポリマーを用いて凝集物が除去され、必要な場合、溶解度を高める添加剤（例えば、双性イオンを含有する組成物）を用いて、高められた溶解度を維持し、クロマトグラフィー態様との適合性を付与するような予防措置がとられる限り、任意の順序にしたがってもよい。以下の実施例で記載する例示的な実施形態では、第１の精製工程は、ＰＥＧ存在下（凝集物の分離、除去のための）、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）でのサンプルの捕捉、凝集物の除去、初期精製を含み、ＣＨＴから得たフラクションを、次の工程であるアニオン交換媒体での中間精製と適合性である双性イオンを含有する組成物に集め、次いで、カチオン交換媒体での最終精製工程へと続く。本発明にしたがって、異なる工程順序を用い、精製を行うことができる。別の実施形態では、第１工程は、サンプルの捕捉、カチオン交換での初期精製、次いで、ＣＨＴ（ＰＥＧを含む）での中間精製および凝集物の除去、最後の工程であるアニオン交換による最終精製を含む。さらに別の実施形態では、第１工程は、アニオン交換でのサンプルの捕捉、初期精製、次いで、ＣＨＴ（ＰＥＧを含む）での中間精製および凝集物の除去、最後の工程であるカチオン交換による最終精製を含む。さらに別の実施形態では、第１工程は、カチオン交換でのサンプルの捕捉、初期精製、次いで、アニオン交換による中間精製、ＣＨＴでの凝集物の除去、最後の工程である最終精製を含む。さらに別の実施形態では、第１工程は、アニオン交換でのサンプルの捕捉、初期精製、次いで、カチオン交換での中間精製、次いで、ＣＨＴでの凝集物の除去、最後の工程である最終精製を含む。
【００３７】
特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程は、凝集物を除去するのに十分な量でポリエチレングリコールを含むカチオン交換クロマトグラフィーを含み、第２のクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の他の実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程は、凝集物を除去するのに十分な量でポリエチレングリコールを含むアニオン交換クロマトグラフィーを含み、第２のクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００３８】
（ＩｇＭ抗体の精製）
本開示は、ＩｇＭを精製するのに有益に使用可能な特定の方法および組成物を提供する。ＩｇＭの特定の特性によって、少ない工程で有意なＩｇＭの精製が達成される条件で、全く異なる精製手順を開発し、用いることができ、これにより、回収されるＩｇＭの収率および／または純度を下げるような不必要な工程をなくすことができる。例えば、ほとんどのＩｇＭ（モノクローナルＩｇＭを含む）は、高度に帯電しており、したがって、中程度のｐＨ値で、高い結合能を保持するイオン交換体によって、十分強く保持される。それに加えて、ＩｇＭは、ＩｇＭ精製でヒドロキシアパタイトを使用しやすい生理学的なｐＨ値および導電性で、ヒドロキシアパタイトに強く結合する。
【００３９】
したがって、精製に有益であろうＩｇＭの特定の特徴を利用し、ＩｇＭの特定の特徴のために、精製中に生じ得る問題を減らすか、または避ける方法および組成物が提供される。例えば、ＩｇＭの精製は、ＩｇＧの精製とは異なっており、ＩｇＭは、ＩｇＧよりも可溶性である条件範囲が狭い傾向があり、ＩｇＭは、ＩｇＧよりも変性しやすく、ＩｇＭは、疎水性表面（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー中）にさらされると変性してしまうことが多く、ＩｇＭは、極端なｐＨに感受性であり、ＩｇＧのアニオン交換またはアフィニティ精製で通常使用する条件で沈殿する傾向があり、導電性の低い溶液は、ＩｇＭのｐＨ感受性を悪化させる傾向がある。したがって、特定の実施形態では、溶解度を高める添加剤を使用すると、イオン交換クロマトグラフィー中の閉塞が抑制される。
【００４０】
本方法および本組成物は、ＰＥＧを含有する溶液を使用し、細胞培養物の上澄みのような複雑な混合物からのＩｇＭ凝集物の除去性を高めることを含み、さらに、この方法以外では凝集しやすい条件で、イオン交換クロマトグラフィー中に双性イオンを含有する組成物（例えば、グリシンを約１．０Ｍで含む）を使用し、ＩｇＭの溶解度を高め、ＩｇＭを安定化させることを含む、ＩｇＭ精製プロセスを提供し、ここで、このプロセスは、ＩｇＭ精製プロセス中の新しい凝集物の生成を避けるか、または少なくとも減らすことを目的とする。
【００４１】
本方法および本組成物の非限定的で例示的な実施形態を、以下の実施例に示す。実施例において、３種類の異なるモノクローナルＩｇＭであるＳＡＭ６、ＣＭ１、ＬＭ１を、本明細書で提供したように精製する。以下に記載した実施形態では、以下の精製工程を実施する。（Ｉ）ＰＥＧを含有するバッファー存在下、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるサンプルの捕捉、初期精製；（ＩＩ）双性イオンを含有する組成物存在下、アニオン交換クロマトグラフィーによる中間精製；（ＩＩＩ）双性イオンを含有する組成物存在下、カチオン交換クロマトグラフィーによる最終精製によって、凝集物を実質的に含まない、非常に精製されたＩｇＭを得る。本明細書で提供される精製工程の順序は、このプロセスが、凝集物の除去を達成し、ＩｇＭの溶解度を高め、ＩｇＭの凝集を避けるために、双性イオンを含有する組成物を使用することを達成する様式で実施される限り、任意の順序にしたがってもよい。本明細書で提示する別の局面によれば、精製工程の順序は、異なる工程で、異なるクロマトグラフィー様式に適合するバッファーを与える様式で行ってもよい。
【００４２】
（細胞培養物からのＩｇＭの初期精製）
以下の実施例に示す例示的な実施形態では、ＰＥＧを含有するバッファー存在下、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、サンプルの捕捉、凝集物の除去、初期精製工程に用い、ＩｇＭを非常に豊富に含み、凝集物を実質的に含まないフラクションが得られ、次いで、ＩｇＭを含有するフラクションを、双性イオンを含有する組成物に入れる。ＰＥＧ存在下、ＩｇＭ（モノマー）およびＩｇＭ凝集物は、ヒドロキシアパタイトに結合するが、バッファー添加剤としてのＰＥＧが有するサイズ選択性の効果によって、異なる溶出プロフィールを有する。セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）は、この工程に適している。
【００４３】
サンプルをローディングした後に十分に洗浄することは、この工程で最適な精製性能を達成するのに重要であることを理解されたい。サンプルをローディングし、カラム（媒体）を十分に洗浄した後、線形勾配または段階的な勾配によって、塩濃度を所定の濃度まで高めることによってサンプルを溶出させ、その後、抗体ピークが溶出するまで、カラムをこの塩濃度に維持する。一例として、ＩｇＭは、５ＣＶでリン酸ナトリウム１２５ｍＭから３５０ｍＭまでの線形勾配（実施例１、バッファーＢ２５％から７０％）を用いて、または、５ＣＶでリン酸ナトリウム１６５ｍＭから３６５ｍＭまでの線形勾配（実施例２、バッファーＢ３３％から７３％）によって、または５ＣＶでリン酸ナトリウム１００ｍＭから３２５ｍＭまでの線形勾配（実施例３、バッファーＢ２０％から６５％）によって、ＣＨＴから溶出させることができる。すべてのバッファーは、ｐＨ７．０であり、１０％  ＰＥＧ−６００を含んでいた。
【００４４】
ヒドロキシアパタイトから溶出させている間、溶出ピークの前側で初期に溶出する夾雑物を除外することが予想される戦略にしたがって、ＩｇＭ溶出ピークの中心部からフラクションを集めることによって、サンプル精製度を高めることができ、さらに重要なことに、ＩｇＭ溶出ピークの後側で、ＩｇＭより後に溶出する凝集物を除外することが予想される。以下に記載するように、ＩｇＭ溶出ピークを、双性イオン（例えば、１Ｍグリシン）を含有する組成物に直接集めることができる。凝集物が存在することによって濁りが生じることがあるため、「無色透明」のＩｇＭ溶出ピークは、おおよそ凝集物を含んでいないと考えられ、ＩｇＭフラクションは、１Ｍグリシンに集めた後も透明なままである。線形勾配の部分を、段階的な勾配に変換し、溶出する生成物の容積を減らすことができる。
【００４５】
初期精製工程の後のサンプルの純度（例えば、タンパク質合計量の％として、保存されているＩｇＭ溶出ピークフラクションのＩｇＭ含有量）は、約５０％を超えていてもよく、または約６０％を超えていてもよく、または約７０％を超えていてもよく、または約８０％を超えていてもよく、または約８５％を超えていてもよく、または約９０％を超えていてもよく、または約９５％を超えていてもよい。当業者は、特定の用途のために、この工程の後にサンプルの純度を測定することができ、所望な場合、サンプルの純度を高めるために、プロセス条件を変えてもよい。以下の例示的な実施形態では、ＣＨＴの後のＳＡＭ６サンプルの純度は、９０％を超えており、可能な場合、９５％を超えており（実施例１）、ＣＨＴの後のＬＭ１サンプルの純度は、９０％であった。以下の実施例２の例示的な実施形態では、ＣＨＴの後のＣＭ１サンプルの純度は、わずか約５０％であったようだが、その後のアニオン交換工程で、夾雑物が簡単に除外されたので、許容範囲であると考える。
【００４６】
初期精製工程が、ＰＥＧを含有するバッファー存在下、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである場合、この工程は、主要な凝集物除去工程を提供する。タンパク質サンプルの凝集物の含有量（サイズ排除クロマトグラフィー分析によって、タンパク質合計量の％として測定）は、約５％未満であってもよく、約１％未満であると予想される。特に、ＩｇＭサンプルの凝集物の含有量は、約５％未満であってもよく、約１％未満であると予想される。凝集物の含有量が、約１％よりも大きい場合、当業者は、凝集物からＩｇＭを良好に分離するために、例えば、ヒドロキシアパタイトから溶出させるときの最終塩濃度を下げることによって、溶出条件を変えることができる。特定の実施形態では、凝集物の存在は、Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析で検出することができず、検出限界は、約０．１％であると推定され、その結果、検出可能な凝集物が存在しないことは、一般的に、凝集物の含有量が０．１％未満であることを示すと解釈する。その後の精製工程からのＩｇＭフラクションを分析し、凝集物は、完全に存在しないか、またはほとんど存在せず、このことは、出発物質中にみられた凝集物が、細胞培養中に生成していることを示唆している。この結果は、ＩｇＧでみられる凝集物生成パターンと一致している。しかし、この工程の後で、残りの精製プロセス中に新しい凝集物が生成してしまう条件を避けなければならない。したがって、残りの精製プロセス中に、ＩｇＭの溶解度を高め、凝集物の生成を避けるために、双性イオンを含有する組成物を使用すべきである。
【００４７】
当業者は、この工程で適切であろうＰＥＧポリマーおよび濃度を特定することができる。以下に記載する非限定的な実施形態では、ＰＥＧ−６００およびＰＥＧ−１０００は、同じ濃度で、相互に置き換え可能に使用することができる。ＰＥＧ−１０００の効果の方がわずかに大きく、抗体の溶出を少し遅らせ、同様に、凝集物の除去性を高めることが観察されている。ＰＥＧを完全に取り除くと、ＩｇＭは、かなり速く溶出すると考えられ、洗浄バッファーおよび溶出バッファーの塩濃度をそれに応じて調節した。
【００４８】
１Ｍグリシンの双性イオン濃度は、必要な濃度より高くてもよく、このように、予防的な措置であると考えてもよい。ＩｇＭ産物の収率および／または純度に対するリスクがない状態で、グリシンの濃度を下げることが可能であるが、分取用の精製であっても、大スケールの精製であっても、グリシン濃度を下げる前に、双性イオン濃度を下げたときの影響を実験的に確認しておくべきである。
【００４９】
以下に示すように、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）によってウイルスを不活性化する方法を、この工程中、抗体がＣＨＴに結合している間、またはＣＨＴから溶出させた後に行ってもよい。
【００５０】
（ＩＩ．アニオン交換クロマトグラフィーによる、ＩｇＭの中間精製）
以下の実施例に示す例示的な実施形態では、中間精製工程中にＩｇＭサンプルをさらに精製するために、双性イオンを含有する組成物存在下、アニオン交換を行ってもよい。例示的な実施形態では、凝集物の除去は、ＣＨＴでの初期精製中に、ＰＥＧを含有するバッファーを用いて達成されたため、その後の精製工程中の溶液は、ＰＥＧを含んでおらず、ＩｇＭ溶解度を高め、凝集物の生成を避けるのに十分な濃度で双性イオン（グリシン）を含んでいる。アニオン交換クロマトグラフィーによるＩｇＭの中間精製を、ＣＨＴでの初期精製の後、可能な限りすぐに、例えば、ＣＨＴでの初期精製が終了して２４時間以内に開始することが推奨される。
【００５１】
例示的な実施形態では、サンプル溶液のｐＨ（ＣＨＴから集めたＩｇＭ溶出ピークを１Ｍグリシンに入れ、保存しておいたフラクション）を、適切な高いｐＨ（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に調節し、アニオン交換媒体（例えば、ＣＩＭ（登録商標）  ＱＡ（ＣＩＭ（登録商標）Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ，ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｋｌａｇｅｎｆｕｒｔ，Ａｕｓｔｒｉａ）のような、四級アミン強アニオン交換体）にローディングした。ＤＥＡＥまたはＥＤＡのような弱イオン交換体を含む、ＱＡよりも容量が高いであろう、他のアニオン交換媒体を使用してもよいが、弱アニオン交換体に対する選択性および緩衝効果の違いにより、もっと広範囲なカラム平衡化のような調整が必要になる場合があり、溶出中のｐＨコントロールがうまくいかない場合もある。利用可能な場合、以下の実施例に示すような、モノリス形態のアニオン交換体を使用してもよいが、モノリス型ではないアニオン交換体を使用してもよく、流速のようなプロセスパラメーターを調節し、容量および夾雑物除去性、特に、ウイルス除去性の低下の可能性を考慮に入れておく。工程は、任意の順序で行ってもよいが、サンプルが、高い塩濃度で第１工程から溶出する場合（例えば、ＩｇＭがＣＨＴから高い塩濃度で溶出する場合）、アニオン交換は、カチオン交換よりも塩耐性が高いため、第２の工程としてアニオン交換クロマトグラフィーを行うことが有益な場合があり、その結果、比較的高い塩濃度でＣＨＴから溶出したフラクションは、特に、サンプルローディング中に、かなり希釈した後に、アニオン交換にともなう適合性の問題点を示さない。
【００５２】
ＩｇＭを含有するサンプルを、ライン内で希釈することによってカラムにローディングし、凝集（変性）しやすいであろう、ｐＨ、バッファー組成または塩濃度の突然の変化にＩｇＭがさらされるのを避ける。実施例に示される例示的な実施形態では、あるポンプで供給される、ＩｇＭを含有するサンプル１部を、異なるポンプで供給されるローディングバッファー２部に対してライン内で希釈することによって、全体的な希釈率は、ＣＨＴカラムから溶出したＩｇＭフラクションの容積の１０倍になった。他のライン内での希釈または異なるサンプルローディング技術を用い、中間精製にサンプルを導入することができた。
【００５３】
サンプルをローディングした後、カラムを十分に洗浄し、物質の小さなピークを溶出させてもよい。線形勾配または段階的な勾配によって、塩濃度を所定の濃度まで高めることによってＩｇＭを溶出させ、その後、抗体ピークが溶出するまで、カラムをこの塩濃度に維持する。実施例の例示的な実施形態では、ＮａＣｌの勾配によって、約２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ＭグリシンでＳＡＭ６が溶出し（実施例１）、約２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ＭグリシンでＣＭ１が溶出し（実施例２）、リン酸ナトリウムバッファーは、約２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭグリシンでＬＭ１を溶出させる。前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを集め、集めたフラクションを保存しておいた。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。溶出バッファーのｐＨが低い（６．２）ため、ＩｇＭを含有するフラクションの保存は、この工程の後、約２４時間未満とすることが推奨される。アニオン交換は１時間未満で終了するが、流速を下げても、カラム性能は上がりも下がりもしないことが理解されているように、簡便化のために、ゆっくりと行ってもよい。ウイルス濾過工程が想定され、この工程があらかじめ行われていない場合、ウイルス濾過をアニオン交換工程による中間精製の後に行ってもよい。
【００５４】
（カチオン交換クロマトグラフィーによる、ＩｇＭの最終精製）
次いで、中間精製の後に保存しておいたフラクションに、最後の精製または「最終」精製を実施する。実施例で示す例示的な実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーによる中間精製から溶出し、保存しておいたＩｇＭを含有するフラクションを、双性イオンを含有する組成物を用いたカチオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。初期のバッファーの導電性値が低い（塩濃度が低い）ので、カチオン交換条件で、タンパク質の溶解度を維持し、凝集物の生成を避けるのに、双性イオンを含有する組成物（例えば、１Ｍグリシン）を用いることが重要である。適切な媒体としては、本方法および本組成物を当業者が実施することによって選択され、使用されることが可能な、スルホン酸系の強カチオン交換体であるＣＩＭ（登録商標）ＳＯ３（モノリス）、または種々の形態での他の強カチオン交換媒体または弱カチオン交換媒体が挙げられる。
【００５５】
サンプルをローディングした後、カラムを十分に洗浄する。バッファー交換およびカラム適合性の問題は、ＩｇＭサンプルを、１Ｍグリシンを含むカチオン交換カラム平衡バッファーでライン内希釈する（例えば、１０倍）ことによって避けることができる。
【００５６】
線形勾配または段階的な勾配によって、塩濃度を所定の濃度まで高めることによってＩｇＭを溶出させ、その後、抗体ピークが溶出するまで、カラムをこの塩濃度に維持する。前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側の所定のカットオフ値のところまでを集め、集めたフラクションを保存することによって高純度ＩｇＭを回収する。この溶液に任意の凝集物が存在する場合、任意の残留凝集物は、ＩｇＭピークの後側で溶出すると予想される。ＩｇＭピークの後側で、ＩｇＭフラクションを集めるためのカットオフ値は、最大ピーク高さの４０％、または最大ピーク高さの３０％、または最大ピーク高さの２５％、または最大ピーク高さの２０％、または最大ピーク高さの１５％、または最大ピーク高さの１０％であってもよい。
【００５７】
この工程の回収効率は、カラムに添加された検出可能な全ＩｇＭの約７５％を超えていてもよく、または、約８０％を超えていてもよく、または、約８５％を超えていてもよく、または、約９０％を超えていてもよく、または、約９５％を超えていてもよい。最終精製の後に集めたＩｇＭフラクションの純度を、種々の分析による測定（例えば、実施例４のＨＰＳＥＣ）によって、評価することができる。最終精製の後の純度は、約８０％を超えていてもよく、または、約９０％を超えていてもよく、または、約９５％を超えていてもよく、または、約９９％を超えていてもよい。最終的なＩｇＭ調製物は、検出可能な凝集物を含まないことが予想される（すなわち、任意の凝集物が存在する場合、検出限界未満の量で存在する）。
【００５８】
カチオン交換工程が行われる場合、凝集物の生成を避けるという観点から、カチオン交換によって、抗体が、凝集しやすい条件（低いｐＨ、低い導電性）にさらされるため、カチオン交換工程が、プロセス全体で最も重要なプロセスであろうことを理解されたい。溶解度を最大にするために、高いグリシン濃度が非常に重要であるが、グリシン濃度または別の適切な双性イオンの濃度が高くても、凝集のリスクは減るだけで、相殺はされないことも理解されたい。本明細書で提供される方法および組成物は、望ましくない凝集生成を避ける、さらなる手段を提供する。例えば、カチオン交換中の中断は避けるべきであり、カチオン交換プロセスを一旦開始したら、中断せずに完結させることに注意をはらうべきである。
【００５９】
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、他の意味であると特定されていない限り、その用語が属する意味を有する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「〜である（ｉｓ）」は、他の内容であることが明確に示されていない限り、複数形のものも含む。したがって、例えば、「１つの化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」と言えば、複数の化合物を含み、「１つの残基（ａ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」または「１つのアミノ酸（ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」と言えば、１つ以上の残基およびアミノ酸を指す場合も含む。
【００６１】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許、特許明細書を、明確に、あらゆる目的のために本明細書に参考として援用する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１．ＳＡＭ６の精製手順）
（Ｉ．ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる、サンプル捕捉および初期精製）
細胞培養物の上澄み１ｍｌあたり、約２００μｇのＩｇＭを含む細胞培養物の透明な上澄み１Ｌの出発物質から、ＳＡＭ６  ＩｇＭを精製した。第１に、０．２２ミクロン（０．２２μｍ）フィルターを用い、細胞培養物の上澄みを濾過し、次いで、５００ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なリン酸塩濃度が５ｍＭのものを得た。サンプルにすでにリン酸塩が含まれている場合、リン酸塩濃度を少なくとも５ｍＭにするのに必要な最小限の量の５００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７）を、上述の濾過した上澄みに加えた。１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なＴｒｉｓ濃度を１０ｍＭにすると、最終的なｐＨは６．８〜７．２になると予想された。このサンプル溶液を室温（１８〜２３℃）にした。
【００６３】
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＨＴ  ＩＩ型、４０ミクロン、ＡＴＯＬＬ  １１．３×１００ｍｍカラム
流速：１００〜２００ｃｍ／時間（Ａｔｏｌｌカラムで、１．６７〜３．３４ｍｌ／分）
バッファーＡ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＢ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＣ：１．０Ｍグリシン（緩衝化されていない）ｐＨ７（±０．２）
バッファーＤ：６００ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７
バッファーＥ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＦ：０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール、５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
カラム（セラミックヒドロキシアパタイトＣＨＴＴＭ  ＩＩ型  ４０ミクロン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）、ＡＴＯＬＬ  Ｇｍｂｈであらかじめ充填された１１．３×１００ｍｍカラム）を、バッファーＡ（上述）で平衡化した。サンプルを、バッファーＡ  １００カラム容積（１００ＣＶ）に添加した。サンプルをローディングした後、カラムを、２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１）。次いで、２８０ｎｍでの吸光度Ａ２８０を測定することによって決定される読みがベースライン値に戻るまで、カラムをバッファーＢ２５％（１２５ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）で洗浄した（洗浄２）。
【００６４】
バッファーＢ７０％（３５０ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）までの線形勾配を有する１ＣＶで、サンプルをカラムから溶出させ、次いで、生成物のピークが溶出するまで、カラムをバッファーＢ７０％に保持した。０．５ＣＶのフラクションを、１．１５ＣＶの１Ｍグリシン（バッファーＣ）に直接集めた。溶出したピークは、無色透明であり、グリシンで希釈しても無色透明のままであった。フラクションを４℃で保存した。推奨されるように、前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを、さらなる精製のために保存しておいた。この収集／保存方法によって、このサンプルピークの後側で溶出し始めると思われる凝集物が除外されると予想された。ＣＨＴカラムを５〜１０ＣＶのバッファーＤで浄化し、バッファーＥで再生させ、バッファーＦ中で保存した。
【００６５】
流速２０ｍｇ／時間、層の高さ１０ｃｍで、ＣＨＴでの初期精製には、サンプルをローディングするための約５時間を含め、約６時間が必要であった。サンプルのＩｇＭ純度は、９０％を超えており、凝集物濃度は、１％未満であった。
【００６６】
（初期精製に関する見解）
予備データから、１００容積をＣＨＴ  １容積に添加した場合、ＩｇＭのほとんどが結合していることが示唆された。後で、カラムを通ったフラクションにおいて、生成物が顕著に失われていることが検出された場合には、サンプルの添加容積をそれに応じて減らすべきである。処理時間は、層の高さにともなって長くなり、その結果、層の高さを２倍にすると、処理時間が２倍になると算出された。したがって、このような条件で、層１５ｃｍで十分であるようなフルスケールの処理および、良好な充填剤性能を一定して与えることができるかによるが、層が１０ｃｍで、十分であると考えられ得る、フルスケールの処理の場合、層２０ｃｍを超えるべきではないと結論づけられた。
【００６７】
サンプルをローディングした後に十分に洗浄することは、この工程で最適な精製性能を達成するのに重要である。この洗浄で大量のピークが溶出する場合、可能であれば、その後のＩｇＭ溶出ピークの大きさの２倍のピークが溶出する場合、生成物の見かけ損失は５％までであることが示唆され、このピークは、完全なＩｇＭとフラグメントとを区別できない抗ＩｇＭ抗体によって依然として検出されてしまうことが多いＩｇＭフラグメントだけではなく、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）のような種々の夾雑物を含んでいると考えられた。見かけのＩｇＭ損失を防ぐために洗浄バッファーの塩濃度を下げても、ＨＰＣによる夾雑物が増える場合がある。
【００６８】
望ましい場合、または必要な場合、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）によってウイルスを不活性化する方法を、この工程中、抗体がＣＨＴに結合している間、またはＣＨＴから溶出させた後に行ってもよい。抗体がＣＨＴに結合している間に行う場合、この操作は、第１の洗浄（バッファーＡ）の後に行うべきである。ある方法では、ＣＶのＳ／Ｄ試薬を、当該技術分野で知られている方法にしたがって調製し、第１のＣＶのＳ／Ｄ試薬を、すばやく（２００ｃｍ／時間）カラムに通し、その後、第２のＣＶのＳ／Ｄ試薬を、１時間かけてカラムにゆっくりと通す。Ｓ／Ｄ工程中に、カラムを、少なくとも１０ＣＶの１０ｍＭリン酸塩＋洗浄剤を使用して洗浄し、残留する２％のトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を除去し、次いで、５ＣＶのバッファーＡで洗浄し、残留する洗浄剤を除去し、精製を再開する。または、Ｓ／Ｄ処理がその後のアニオン交換工程と相性が良いため、Ｓ／Ｄ処理をＣＨＴ工程の後に行ってもよい。この抗体に対してＳ／Ｄ処理が及ぼす影響は、評価していないことを注記しておく。
【００６９】
（ＩＩ．アニオン交換クロマトグラフィーによる、中間精製）
ＣＨＴによる初期精製を終了してから２４時間以内に、アニオン交換クロマトグラフィーによる中間精製を開始した。
【００７０】
（アニオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ（登録商標）ＱＡモノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
バッファーＢ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０Ｍグリシン、ｐＨ６．２
バッファーＣ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（アニオン交換クロマトグラフィー）
ＣＨＴから集め、保存しておいたフラクションに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を５％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なＴｒｉｓ濃度が５０ｍＭのものを得て、このサンプル溶液を室温（１８〜２３℃）にした。
【００７１】
８ｍｌの強アニオン交換剤であるＣＩＭ（登録商標）ＱＡモノリスを含むカラムをバッファーＡで平衡化し、サンプル溶液を、バッファーＡ２部（ポンプＢで供給）に対し、サンプル１部（ポンプＡで供給）になるようにライン内で希釈して、カラムにローディングした。このサンプル希釈によって、全体で、ＣＨＴカラムから溶出した容積の１０倍に希釈した。この工程で使用したＱＡモノリスの推定カラム容量は、モノリス１ｍｌあたり、ＩｇＭ約３０ｍｇであった。このカラムをバッファーＢで洗浄し（洗浄１）、バッファーＢ７７％、バッファーＣ２３％で洗浄し（洗浄２）、小さなピークを溶出させた。所望な場合、バッファーＣは、もっと有効に浄化するために、１Ｍ  ＮａＣｌを含むように配合してもよいが、勾配の設定値は、それに応じて調節する。
【００７２】
次いで、サンプルを、バッファーＢ５２％、バッファーＣ４８％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ５２％、バッファーＣ４８％に保持した。ＩｇＭを含有するサンプルピークを、約２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍ  グリシンで溶出させ、これは透明であった。前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを集め、保存しておいた。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。カラムをバッファーＣ１００％で浄化し、数種類の夾雑物と混合した少量のＩｇＭを含む、小さな鋭いピークが得られ、その後、連続してその他の小さな夾雑物ピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。この中間精製工程は、１時間未満で終了した。
【００７３】
バッファーＡにおいて、ＥＤＴＡは、ＣＨＴ工程中にサンプルにとりこまれているかもしれない任意のカルシウムを除去すると予想され、この媒体の結合能を高めるために、ｐＨ８．０を用いた。宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）の除去性を高め、その後のカチオン交換による精製で使用するバッファーと直接適合するようなｐＨで溶出サンプルを得るために、ｐＨ６．２で洗浄および溶出を行った。溶出バッファーのｐＨが低い（６．２）ため、ＩｇＭを含有するフラクションの保存は、この工程の後、約２４時間未満とした。
【００７４】
（中間精製に関する見解）
ウイルス濾過工程が想定され、この工程があらかじめ行われていない場合、アニオン交換工程の後に行ってもよく、この場合、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．２）のチェイス（ｃｈａｓｅ）溶液を使用すべきであり、以下のカチオン交換工程中に、抗体を再び濃縮すべきである。
【００７５】
溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）によってウイルスを不活性化する方法をＣＨＴ工程の後で行う場合（上の見解を参照）、例えば、アニオン交換バッファーＡに洗浄剤を加え、サンプルを加えた後に少なくとも１０ＣＶのバッファーＡを加えることによって、アニオン交換プロセスに、さらなる洗浄剤による洗浄を適用すべきである。この場合、バッファーＢによる洗浄で精製を再開する。
【００７６】
この抗体は、アニオン交換剤に対する結合が強いので、溶出ｐＨをさらに下げることが可能であることを示唆している。しかし、これにより、生成物が変性するリスクが高まり、高濃度のグリシン溶液はこのリスクを下げるものの、相殺することはできない。
【００７７】
（ＩＩＩ．カチオン交換クロマトグラフィーによる、最終精製）
アニオン交換工程（上述）から２４時間以内に、カチオン交換クロマトグラフィーを開始した。
【００７８】
（カチオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ（登録商標）ＳＯ３モノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、１．０Ｍグリシン、ｐＨ６．２
バッファーＢ：２０ｍＭクエン酸塩、１．０Ｍグリシン、ｐＨ６．２
バッファーＣ：２５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．２
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（カチオン交換クロマトグラフィー）
一旦開始したら、カチオン交換クロマトグラフィーを用いた最後の精製工程は、中断することなく終了させた。
【００７９】
サンプル（アニオン交換から保存しておいたフラクション）を室温（１８〜２３℃）にした。バッファーＡでカラムを平衡化した。バッファーＡ９部に対し、サンプル溶液１部になるようにライン内で希釈し、サンプルをローディングした。ＣＩＭ  ＳＯ３媒体の容量は、約３０ｍｇ  ＩｇＭ／ｍｌであると思われた。カラムを２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄し（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えない）、次いで、５ＣＶのバッファーＢ９５％、バッファーＣ５％で洗浄し（洗浄２）、小さなピークを得た。
【００８０】
サンプルを、バッファーＢ６０％、バッファーＣ４０％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ６０％、バッファーＣ４０％に保持した。前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを集め、保存しておいた。溶出したＩｇＭは透明であった。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。この保存しておいたフラクションに、５００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）溶液を１０％（ｖ：ｖ）で加えてｐＨを上げ、この溶液を４℃で保存した。カラムをバッファーＢで洗浄し、小さなピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。
【００８１】
（最終精製に関する見解）
カチオン交換工程は、低いｐＨ、低い導電性を含む、抗体が凝集しやすい条件にさらされるため、プロセス全体で最も重要な工程であろう。溶解度を最大にするために、高いグリシン濃度が非常に重要であるが、リスクは減るだけで、相殺はされない。中断は避けるべきであり、カチオン交換プロセスを一旦開始したら、確実に中断せずに完結させることに注意を払わなければならない。
【００８２】
（実施例２．ＣＭ１の精製手順）
（Ｉ．ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる、捕捉および初期精製）
細胞培養物の上澄み１ｍｌあたり、約２００μｇのＩｇＭを含む細胞培養物の透明な上澄み５００ｍｌの出発物質から、ＣＭ１  ＩｇＭを精製した。第１に、細胞培養物の上澄みを室温（１８〜２３℃）にし、次いで、０．２２ミクロン（０．２２μｍ）フィルターを用い、細胞培養物の上澄みを濾過し、次いで、５００ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なリン酸塩濃度が５ｍＭのものを得た。上澄みにすでにリン酸塩が含まれている場合、リン酸塩濃度を少なくとも５ｍＭにするのに必要な最小限の量の５００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）を、上述の濾過した上澄みに加えた。
【００８３】
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＨＴ  ＩＩ型、４０ミクロン、ＡＴＯＬＬ  １１．３×１００ｍｍカラム
流速：２００ｃｍ／時間（Ａｔｏｌｌカラムで３．３４ｍｌ／分）まで
バッファーＡ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＢ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＣ：１．０Ｍグリシン（緩衝化されていない）ｐＨ７（±０．２）
バッファーＤ：６００ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７
バッファーＥ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＦ：０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール、５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
カラム（セラミックヒドロキシアパタイトＣＨＴ  ＩＩ型  ４０ミクロン、１１．３×１００ｍｍカラム、ＡＴＯＬＬ  Ｇｍｂｈ）を、バッファーＡで平衡化した。サンプル溶液を、５０カラム容積（ＣＶ）に添加した。サンプルをローディングした後、カラムを、２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えないことが必要であり、ベースラインになるまで洗浄する必要はない）。次いで、読みがベースラインに戻るまで、カラムをバッファーＢ２３％（１６５ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）で洗浄した（洗浄２）。第２の洗浄工程で、生成物ピークとほぼ同じ大きなピークが溶出し、ＩｇＭフラグメントは、この洗浄で溶出すると予想された。上に示したように、５〜１０％の範囲の生成物の見かけ損失は、この洗浄で移動したフラグメントであると考えられ、完全な生成物の損失が多すぎると思われる場合、バッファーＢの濃度を減らしてもよいが、この場合、ＨＰＣによる夾雑物が増える場合がある。
【００８４】
バッファーＢ７３％（３６５ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）までの線形勾配を有する５ＣＶで、サンプルをカラムから溶出させ、その後、生成物のピークが溶出するまで、カラムをバッファーＢ７３％に保持した。０．５ＣＶのフラクションを、１．１５ＣＶの１Ｍグリシン（バッファーＣ）に直接集めた。溶出したピークは、無色透明であり、グリシンで希釈しても無色透明のままであった。前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを、さらなる精製のために保存しておいた。この収集／保存方法によって、このピークの後側で溶出し始めると思われる凝集物が除外されると予想された。フラクションを４℃で保存した。ＣＨＴカラムを５〜１０ＣＭのバッファーＤで浄化し、バッファーＥで再生させ、バッファーＦ中で保存した。
【００８５】
流速２００ｃｍ／時間、層の高さ１０ｃｍで、ＣＨＴでの初期精製には、サンプルをローディングするための約２．５時間を含め、約３．５時間が必要であった。ＣＨＴ後のサンプル純度は、アニオン交換の結果に依存し、約５０％であった。このサンプル純度は、実質的に、ＳＡＭ６の場合（上の実施例１）またはＬＭ１の場合（以下の実施例３）よりも低いが、以下のアニオン交換工程で、夾雑物は簡単に除去された。ＣＨＴ工程は、このプロセスで主要な凝集物除去工程であることが確立されており、凝集物は、Ｇ４０００ＳＷＸＬでの分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって検出することができなかっため（データは示していない）、凝集物含有量が０．１％未満であることを示していると解釈した。洗浄工程で主にＩｇＭフラグメントが失われ、浄化工程で凝集物が失われるため、カラムにローディングした最初のサンプルと比較して、合計回収率は低かった。
【００８６】
（初期精製に関する見解）
ＣＨＴ工程の結合能は、精製プロセスの定義されているパラメーターのうち、最も小さなものであってもよい。予備データから、５０容積のサンプルをＣＨＴ  １容積に添加した場合、ＩｇＭのほとんどが結合していることが示唆された。ＣＨＴに対するＣＭ１の結合が強いので（ＬＭ１およびＳＡＭ６のどちらよりも強い）、実質的に、カラム容量を高くすることが可能であるが、主要な夾雑物（以下に記載）による競争が、制限事項となる場合があることが示唆された。任意の用途で通常どおり、流れ込むフラクションは、最初の何回かの操作中、保持されており、カラム容量を確認するために、ＩｇＭ含有量について試験した。有効な結合を確認する場合、ローディング容積を増やしてもよい。後で、カラムを通ったフラクションにおいて、生成物が顕著に失われていることが検出された場合には、サンプルを添加する容積をそれに応じて減らすべきである。同様に、カラム寿命を予測することができないため、ＣＨＴの高い密度および高い沈降速度になじむように設計されたＣＨＴ工程専用のカラムを調製することが示唆され、この専用カラムは、空気を導入することが必要な場合や、性能が度重なって低下している場合を除き、決して開封しない方がよい。
【００８７】
予想されるように、この工程の回収率は、特に、フラグメントが失われ（洗浄中）、凝集物が失われる（浄化工程中）ことによって、最も低かった。その後の両イオン交換工程からは９０％の回収率が得られるため、全体的なプロセス回収率６０％を達成するには、ＣＨＴ工程では、必要な回収率は、７５％あればよかった。ほとんどの商業的なＩｇＧプロセスは、初期の凝集物濃度が高くない限り、全体的なプロセス回収率５０〜６０％を達成しており、初期の凝集物濃度が高い場合には、全体的なプロセス回収率は、２５％以下になることもある。この段階でのデータを、臨床に適した品質の物質を得るという目的にしたがって評価した。ここで、このプロセスについて、プロセスの経済的な効率を最適にしておく必要はなく、プロセス開発段階中は、必要とされない。
【００８８】
ＣＭ１とＬＭ１は、カチオン交換体に対する結合が弱いという、重要な共通の化学的特徴を有しており、ＬＭ１は、ＰＥＧをいくつかの条件で用いた場合に問題があったため、ＣＭ１を用いてさらなる実験を行い、同様の感度を示すかどうかを決定した。１０％  ＰＥＧ−６００中、ＣＨＴから溶出させたＣＭ１は、溶出の際に無色透明であり、室温でも透明性を維持していたが、４℃では速やかに濁ってしまった。１Ｍグリシンで希釈することによって濁りはすぐにとれたが、ＬＭ１で観察されたように、この結果から、１．０Ｍグリシン希釈剤にＣＭ１を直接集めることが望ましいことがわかった（１．０Ｍ（緩衝化されていない）グリシン（ｐＨ７）２．３部に対し、サンプル１部）。希釈した後、溶解度の問題はみられなかったが、ＣＨＴ工程を終了させてから２４時間以内に次の工程を開始することを推奨しておくのが賢明だと思われた。冷却の可能性および／またはＣＭ１が不溶性であるという問題についても考慮した。ＣＨＴ工程で使用されるようなＰＥＧは、新しく溶解性をもたらす現象を作り出すことはないが、すでに存在する状況を補強する。さらに、過去に凍結した物質の場合、任意の種類の処理を行う前に、完全に再溶解させておくことにも、十分に注意をはらうべきであることがわかった。
【００８９】
このプロセスのすべての工程で、サンプルを１８〜２３℃にしておくという仕様が予防手段となり得るであろう。４℃で保存しておいた物質を直接取り出して実施した実験について品質確認したところによれば、物質を４℃で使うことも可能であり、プロセス全体の速度が上がり、より簡便なものとなった。わかっている場合には、予想される容器詰め濃度で、または容器詰め濃度がわからない場合は、２０ｍｇ／ｍｌで、４℃〜約２３℃の温度溶解度曲線を作成した。
【００９０】
ＰＥＧ−６００およびＰＥＧ−１０００は、このプロセスで、相互に置き換え可能に使用することができる。ＰＥＧ−１０００の効果は、ＰＥＧ−６００の効果よりもわずかに大きく、抗体の溶出を少し遅らせ、同様に、凝集物の除去性を高めるであろう。ＰＥＧを完全に取り除くと、抗体は、かなり速く溶出し、洗浄時の溶出／溶出の設定値は、それぞれ、約７５ｍＭリン酸塩、２３５ｍＭリン酸塩であった。
【００９１】
現時点でのグリシン濃度は、予防的なものであり、生成物に対するリスクがなければ減らすことも可能であるが、大スケールで実施する前に実験的に確認すべきである。
【００９２】
ＣＨＴ後の放置時間は、１週間まで長くすることも可能であるが、実験的に確認すべきである。長い放置時間を評価する１つの様式は、濁度を確認すること（６００ｎｍでの分光光度法で）であってもよく、サイズ排除分析によるプロフィールを確認すること（凝集物の含有量について）であってもよく、どちらも日常的に確認される。
【００９３】
上述のように、溶媒／洗浄剤によってウイルスを不活性化する方法を、抗体がＣＨＴに結合している間、またはＣＨＴから溶出させた後に行ってもよい。
【００９４】
（ＩＩ．アニオン交換クロマトグラフィーによる、中間精製）
ＣＨＴによる初期精製を終了してから２４時間以内に、アニオン交換クロマトグラフィーによる中間精製を開始した。
【００９５】
（アニオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ（登録商標）ＱＡモノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
バッファーＢ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０Ｍグリシン、ｐＨ６．２
バッファーＣ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（アニオン交換クロマトグラフィー）
ＣＨＴから集め、保存しておいたフラクションに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を５％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なＴｒｉｓ濃度が５０ｍＭのものを得た。バッファーＡでカラムを平衡化した。サンプル溶液を、バッファーＡ２部に対し、サンプル溶液１部になるようにライン内で希釈して、カラムにローディングした。このサンプル希釈によって、全体で、ＣＨＴ工程から溶出したサンプル溶液の容積の１０倍に希釈した。カラムの容積は、モノリス（媒体）１ｍｌあたり、ＩｇＭが少なくとも３０ｍｇであると予想され、結合能をさらに高めるために、アルカリ性のｐＨが予想された。このカラムをバッファーＢで洗浄し（洗浄１）、種々の宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）を含有する小さなピークを得た。次いで、このカラムをバッファーＢ７１％、バッファーＣ２９％で洗浄し（洗浄２）、ＩｇＭもいくらか含んでいるかもしれない大きな夾雑物ピークを得た。ＭＥＳバッファーは、この実施例で使用される場合、双性イオンであり、アニオン交換体およびカチオン交換体の両方を良好に緩衝化させることができる。
【００９６】
サンプルを、バッファーＢ５３％、バッファーＣ４７％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、次いで、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ５３％、バッファーＣ４７％に保持した。最大ピーク高さの１０％のところから集め始め、ピーク高さの１０％まで下がったところまで（後側）のフラクションを集め、保存しておいた。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。カラムをバッファーＣ１００％で浄化し、数種類の夾雑物と混合した少量のＩｇＭを含む、大きなピークが得られ、その後、連続してその他の小さな夾雑物ピークが得られた。バッファーＣは、もっと有効に浄化するために、５００ｍＭ  ＣａＣｌの代わりに１Ｍ  ＮａＣｌを含むように配合してもよいが、任意の混合物または勾配は、ＮａＣｌ濃度がもっと高くなるように調節しなければならないであろう。次いで、カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。この中間精製工程は、１時間未満で終了した。約０．５ＭグリシンおよびＮａＣｌの平均濃度が約２２５ｍＭで、アニオン交換体から溶出した生成物（ＣＭ１）は、ＳＡＭ６（上の実施例１）またはＬＭ１（下の実施例３）よりもわずかに多かった。この工程後のＩｇＭ純度は、約９５〜９８％であった。この工程の回収率は、約９０％であった。
【００９７】
８ｍｌのＣＩＭ  ＱＡモノリスカラムは、上に引用した供給容積でＣＨＴ工程から回収されるＩｇＭの量に対し、十分に大きいものであった。別の実験では、１ｍｌのモノリス（多量の３×０．３４ｍｌの円盤状）を４ｍｌ／分で操作すると、細胞培養物の上澄み２５０ｍｌをローディングしたＣＨＴカラム５ｍｌから得られたＩｇＭがすべて結合していることがわかり、このことから、８ｍｌのモノリスは、少なくとも２Ｌの細胞培養物の上澄みをローディングしたＣＨＴカラムから得られるＩｇＭを保持することが可能であることが示唆された。上述のように、平衡バッファー中のＥＤＴＡは、ＣＨＴ工程中に生成物にとりこまれているかもしれない任意のカルシウムを除去すると予想され、この媒体の結合能を高めるために、ｐＨ８が予想された。洗浄工程および溶出工程は、ＨＣＰの除去性を高め、その後のカチオン交換工程で使用するバッファーと直接適合するような溶出サンプルを得るために、ｐＨ６．２で行われた。しかし、溶出サンプルがｐＨ６．２の状態にある時間をできるだけ短くするために、次の工程は、可能な限りすぐに、好ましくは２４時間以内に行うことが推奨された。以下のカチオン交換工程で使用するために溶液のｐＨを上げることは、結合効率を低下させ、ＣＭ１  ＩｇＭは、最良の環境下でさえカチオン交換媒体との結合が弱いため、現実的ではない。
【００９８】
（ＩＩＩ．カチオン交換クロマトグラフィーによる、最終精製）
アニオン交換工程（上述）から２４時間以内に、カチオン交換クロマトグラフィーを開始した。
【００９９】
（カチオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ  ＳＯ３モノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：１０ｍＭ  クエン酸塩、１．０Ｍグリシン、ｐＨ６．２
バッファーＢ：２５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．２
バッファーＣ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＤ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（カチオン交換クロマトグラフィー）
サンプル溶液（アニオン交換から保存しておいたフラクション）を室温（１８〜２３℃）にした。バッファーＡでカラムを平衡化した。サンプル１部、バッファーＡ９部で、ライン内で希釈することによってサンプルをローディングした。バッファーＡは、１０ｍＭクエン酸塩を含有しており、他の実施例のカチオン交換クロマトグラフィーで使用するバッファーＡとは異なっていることを注記しておく。この媒体の容量は、モノリス１ｍｌあたり、少なくとも３０ｍｇ  ＩｇＭであると思われた。カラムを２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えない）。サンプルを、バッファーＢ１２％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、次いで、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ１２％に保持した。ＩｇＭは、透明な、非常に鋭いピークで溶出した。最大ピーク高さの１０％のところから集め始め、ピーク高さの１０％まで下がったところまで（後側）のフラクションを集め、保存しておいた。凝集物は、この後側に、高さの低い長く続くピークで溶出すると予想されたため、後側に最大ピーク高さの１０％のところより後ろの部分から最大ピーク高さの約５％のところまで集めたものは、主要ピークから集めたフラクションと一緒には保存しなかった。保存しておいた主要ピークのフラクションに、５００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）溶液を１０％（ｖ：ｖ）で加え、ｐＨと導電性を上げた。高度に精製されたＩｇＭの溶液が得られ、この溶液は、約２５ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭリン酸塩、８００ｍＭグリシン（ｐＨ約６．７）を含んでおり、４℃で保存するか、または、フラクションをリン酸塩希釈剤（５００ｍＭリン酸塩、ｐＨ７）に直接集めてもよい。カラムをバッファーＢで浄化し、小さなピークが得られ、このピークは、主に凝集物を含んでいた。カラムをバッファーＣで再生し、バッファーＤ中で保存した。
【０１００】
この工程は１時間未満で終了するが、所望な場合、ゆっくりと行ってもよい。流速を下げても、カラム性能は上がりも下がりもしないことがわかった。合計回収率は約９０％であり、主要な溶出ピークから集めたフラクションのＩｇＭ純度は、９９％を超えていた。
【０１０１】
ＩｇＭ  ＣＭ１がさらされるカチオン交換条件は、凝集しやすい条件であり（低いｐＨ、極端に低い溶液導電性）、溶液中のグリシンによって溶解度を高めることができるが、グリシンは、凝集のリスクを下げるだけであり、完全になくすことはできないため、一旦開始したら、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最後の精製工程は、中断せずに完結させた。
【０１０２】
８ｍｌのカラムは、上述の供給容積でＣＨＴ工程から回収されるＩｇＭの量に対し、十分に大きいものであった。別の実験では、１ｍｌのモノリス（重ね合わせた３×０．３４ｍｌの円盤状）は、細胞培養物の上澄み２５０ｍｌをローディングしたＣＨＴカラム５ｍｌの後、アニオン交換工程から溶出するＩｇＭを、すべて結合させることができた。この結果から、８ｍｌのモノリスは、少なくとも２Ｌの細胞培養物の上澄みをローディングしたＣＨＴ（「ＣＨＴ供給物」）から得られるＩｇＭを保持し、放出させることが可能であることが示唆された。
【０１０３】
（実施例３．ＬＭ１の精製手順）
（Ｉ．ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる、捕捉および初期精製）
細胞培養物の上澄み１ｍｌあたり、約２００μｇのＩｇＭを含む細胞培養物の透明な上澄み１Ｌの出発物質から、ＬＭ１  ＩｇＭを精製した。第１に、０．２２ミクロン（０．２２μｍ）フィルターを用い、細胞培養物の上澄みを濾過した。５００ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）溶液を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なリン酸塩濃度が５ｍＭの溶液を得た。上澄みにすでにリン酸塩が含まれている場合、リン酸塩濃度を少なくとも５ｍＭにするのに必要な最小限の量の５００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）を、上述の濾過した上澄みに加えた。溶液ｐＨを測定し、ｐＨが６．８未満の場合、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を加え、最終的なｐＨを６．８〜７．２にした。サンプル溶液を室温（１８〜２３℃）にした。
【０１０４】
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＨＴ  ＩＩ型、４０ミクロン、ＡＴＯＬＬ  １１．３×１００ｍｍカラム
流速：１００〜２００ｃｍ／時間（Ａｔｏｌｌカラムで、１．６７〜３．３４ｍｌ／分）
バッファーＡ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＢ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＣ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８（±０．２）
バッファーＤ：６００ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７
バッファーＥ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＦ：０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール、５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
バッファーＡでカラムを平衡化した。サンプル溶液を、１００カラム容積（ＣＶ）で添加した。カラムを、２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えず、ベースラインになるまで洗浄する必要はない）。次いで、カラムをバッファーＢ２０％（１００ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）で洗浄し、この洗浄で大きなピークが溶出した（洗浄２）。このピークには、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）が含まれていた。この工程で、ＩｇＭを最適に精製するのに、「ベースラインになるまで洗浄すること」が重要であったため、読みがベースラインに戻るまで、カラムをバッファーＢ２０％で洗浄した。
【０１０５】
この第２の洗浄工程中に溶出したピークの内容物は、時には、５％までの生成物の見かけ損失が示されることもあるが、これらの生成物は、ＩｇＭフラグメントであると思われた。しかし、生成物の損失が多すぎると思われる場合、バッファーＢの濃度を減らしてもよいが、バッファーＢの濃度を下げると、ＨＣＰによる夾雑物が増える場合があることを理解されたい（すなわち、洗浄工程中にＨＣＰの除去が完全に行われず、ＨＣＰが他の工程に持ち越される）。または、生成物の損失がほとんどみられないか、まったくみられない場合、洗浄工程中のリン酸塩濃度を上げ、もっと少ない洗浄容積で、読み（２８０ｎｍでのＵＶ吸光度）をベースラインに戻し、多くのＨＣＰを除去した。
【０１０６】
バッファーＢ６５％（３２５ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）に到達する線形勾配を有する５ＣＶで溶出を行い、その後、生成物のピークが溶出するまで、カラムをＢ６５％に保持した。０．５ＣＶのフラクションを、１．１５ＣＶの１Ｍグリシン（バッファーＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に直接集めた。溶出したピークは、無色透明であり、グリシンで希釈しても無色透明のままであった。前側に溶出ピーク高さの１０％のところからフラクションを集め始め、夾雑物のピークが、後側にかぶり始めると思われるところまでを集めた（図１に示す、ＣＨＴからＬＭ１が溶出するリファレンスプロフィールを参照）。このピークの後側で凝集物が溶出し始めると思われるが、この収集／保存戦略によって、凝集物が除外されるはずである。よりよい生成物純度を得るために、勾配の終点（おそらく、３００ｍＭリン酸塩）ではわずかに低下しているであろうことがわかったが、後のプロセス工程で夾雑物が除外されるので、この段階でこの戦略を続けざるを得ない理由もないことが理解された。フラクションを４℃で保存した。このカラムを５〜１０ＣＶのバッファーＤで浄化し、バッファーＥで再生させ、バッファーＦ中で保存した。
【０１０７】
希釈すると、サンプルのローディング時間が倍になり、希釈したサンプルの塩化ナトリウム含有量が下がるほど、結合する夾雑物の量が増え、ＩｇＭフラクションの純度が低くなるため、この例では、実施例１および２で記載したようなサンプルの希釈は行わなかった。結果から、１００容積をＣＨＴ  １容積に添加した場合（すなわち、サンプル容積１００ＣＶ）、ＩｇＭのほとんどが結合していることが示されたが、サンプルのローディング容積とカラム容量との関係が確認されるまで、最初の数回の操作では、流れ込んだフラクションは保持されているはずである。効率的な結合が確認されたら、ローディング容積を増やしてもよい。後でカラムを通ったフラクションにおいて、生成物が顕著に失われていることが検出された場合には、サンプルの添加容積をそれに応じて減らすべきである。異なる生成物濃度で、異なる細胞培地を用いる場合、動的結合能を独立して決定する必要がある。
【０１０８】
ＣＨＴでの初期精製には、流速２００ｃｍ／時間、層の高さ１０ｃｍで、サンプルをローディングするための約５時間を含め、約６時間が必要であった。処理時間は、層の高さに直接比例して長くなり、層の高さを２倍にすると、処理時間が２倍になることがわかり、このことは、初期精製のためのＣＨＴカラムは、層１５ｃｍで十分であるようなフルスケールの処理および、層が１０ｃｍの場合、良好な充填剤性能を一定して与えることができるかによるが、十分であると考えられ得るフルスケールの処理では、層２０ｃｍを超えるべきではないことを示していることがわかった。ＣＨＴから溶出した後のサンプルの純度は、９０％であった。ＣＨＴでの初期精製によって、ＩｇＭ精製中に主要な凝集物除去工程が提供され、ＣＨＴから溶出させた後の凝集物濃度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した場合、１％未満であった。凝集物濃度が１％よりも高い場合、バッファーＢの濃度を下げる（例えば、上述のように、バッファーＢを６０％まで下げる）と、ＳＥＣから得られる結果は、一貫して、１％未満の凝集濃度を示していたが、この段階でプロセスを調整する明らかな理由はみられなかった。
【０１０９】
（初期精製に関する見解）
ＰＥＧ−６００およびＰＥＧ−１０００は、ＣＨＴ工程で、同じ濃度で、相互に置き換え可能に使用することができることがわかった。ＰＥＧ−１０００の効果の方がわずかに大きく、抗体の溶出を少し遅らせ、同様に、凝集物の除去性を高めるであろう。しかし、ＰＥＧ−６００の方が融点が低く、わずかに粘性が低い。ＰＥＧを完全に取り除くと、抗体は、かなり速く溶出し、洗浄時の溶出／溶出の設定値は、それぞれ、約５０ｍＭリン酸塩、２１０ｍＭリン酸塩であり、凝集物はほとんど除去されなかった。臨床で使用する生成物を精製するためのプロセスを開発する目的で、凝集物の除去性を損なうことなく、ＰＥＧ濃度をどれほど多く減らすことが可能かを調べることは、価値が高いであろう。これの代わりに、またはこれに加え、ＰＥＧ−４００に置き換えてもよく、ＰＥＧ−４００は室温で液体であるため、バッファーの調製が単純化されるであろう。
【０１１０】
すでに示したように、溶媒／洗浄剤によってウイルスを不活性化する方法を、抗体がＣＨＴに結合している間、またはＣＨＴから溶出させた後に行ってもよい。
（ＩＩ．アニオン交換クロマトグラフィーによる、中間精製）
（アニオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ  ＱＡモノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１  Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
バッファーＢ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍグリシン、ｐＨ７．０
バッファーＣ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（アニオン交換クロマトグラフィー）
サンプルを室温（１８〜２３℃）にした。バッファーＡでカラムを平衡化した。通常は、２．５ＣＶ／分での８ｍｌのモノリスについて、流速２．５ＣＶ／分を使用し、サンプル容量の測定は、１２ＣＶ／分で行った。サンプルを、バッファーＡ２部に対し、サンプル溶液１部になるようにライン内で希釈して、カラムにローディングし、全体的な希釈率は、ＣＨＴ工程から溶出したサンプル容積の１０倍を示した。サンプルを完全に希釈した状態で、抗体の溶解度を高め、ＩｇＭの凝集を抑制するために、ローディング溶液にグリシンが含まれていた。カラムの容量は、モノリス１ｍｌあたり、ＩｇＭが少なくとも３０ｍｇであると予想された。このカラムをバッファーＢで洗浄し（洗浄１）、５ＣＶまでのバッファーＢ８５％、バッファーＣ１５％で洗浄し（洗浄２）、小さなピークが得られたが、顕著なＩｇＭの消失をもたらさなかった。
【０１１１】
サンプルを、バッファーＢ５１％、バッファーＣ４９％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、その後、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ５１％、バッファーＣ４９％に保持した。ＬＭ１は、約２５０ｍＭリン酸ナトリウム（約０．５Ｍグリシン）で溶出した。ＩｇＭを含むフラクションは、透明な状態で溶出した。最大ピーク高さの１０％のところから集め始め、ピーク高さの１０％まで下がったところまで（後側）のフラクションを集め、保存しておいた。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。次いで、カラムをバッファーＣ１００％で浄化し、数種類の夾雑物と混合した少量のＩｇＭを含む、小さな鋭いピークが得られ、その後、連続してその他の小さな夾雑物ピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。この中間精製工程は、１時間未満で終了したが、所望な場合、もっとゆっくりと行ってもよい。
【０１１２】
図２および図３は、以下に示す特定の条件で、アニオン交換クロマトグラフィーによってＬＭ１を中間精製する場合のリファレンスプロフィールを示している。図２は、精製工程全体のリファレンスプロフィールを示しており、図３は、アニオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１の中間精製中に溶出したピークの高分解能プロフィールを示している。
【０１１３】
（図２および図３における、ＬＭ１のアニオン交換クロマトグラフィーの運転条件）
ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ、１つのハウジングに重ねられた、３×０．３４ｍｌの円盤、４ｍｌ／分
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８
バッファーＢ：１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍグリシン、ｐＨ７
バッファーＣ：５００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７
カラムを平衡化
ＣＨＴから保存しておいたフラクションのサンプル（バッファーＡで、すでに３．３倍に希釈したもの）を、サンプル１部、バッファーＡ２部を用いて、ライン内で希釈することによってローディング
バッファーＡで洗浄
バッファーＢで洗浄
溶出：Ｂ１００％になるまで、線形勾配で４８ＣＶ
上述のように、平衡バッファー中のＥＤＴＡは、ＣＨＴが、タンパク質調製物から、カルシウム以外の金属を除去し、カルシウムと置き換える能力を有するため、ＣＨＴ工程中に生成物にとりこまれているかもしれない任意のカルシウムを除去すると予想された。この媒体の結合能を高めるために、ローディング溶液をｐＨ８に維持して媒体の結合能を高めた。洗浄工程および溶出工程は、ＨＣＰの除去性を高め、その後のカチオン交換工程のバッファーと直接適合するような溶出サンプルを得るために、ｐＨ７．０で行われた。ウイルス濾過工程を行っていなかった場合、および所望な場合、アニオン交換の後に、ウイルス濾過を行ってもよい。
【０１１４】
（ＩＩＩ．カチオン交換クロマトグラフィーによる、ＬＭ１の最終精製）
（カチオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ  ＳＯ３モノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで；流速を下げても、性能は下がらないが、顕著に上がりもしなかった
バッファーＡ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１Ｍグリシン、ｐＨ７
バッファーＢ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７
バッファーＣ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＤ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（カチオン交換クロマトグラフィー）
サンプル溶液（アニオン交換から保存しておいたフラクション）を室温にした。バッファーＡでカラムを平衡化した。サンプルを、サンプル溶液１部、バッファーＡ９部で、ライン内で希釈することによってローディングした。この条件でのカラム容量は、モノリス１ｍｌあたり、少なくとも３０ｍｇ  ＩｇＭであると思われた。カラムを２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えない）。サンプルを、バッファーＢ１５％（７５ｍＭリン酸塩）に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、その後、ピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ１５％に保持した。ＩｇＭを含有するフラクションは、透明な状態で溶出した。ＬＭ１は、導電性値が低い（塩濃度が低い）状態で溶出するため、抗体を安定化させ、凝集を防ぐために、ＮａＣｌを、例えば、最終濃度が０．１Ｍになるように加えてもよいことがわかった。溶出させたすぐ後にＮａＣｌを加えるか、または高濃度の塩を含む希釈剤にフラクションを直接集めてもよい。集めたフラクションを４℃で保存した。カラムをバッファーＢで浄化し、かなりの量のＩｇＭを含むピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。
【０１１５】
図４および図５は、以下に示す特定の条件で、カチオン交換クロマトグラフィーによってＬＭ１を最終精製する場合のリファレンスプロフィールを示している。図４は、精製工程全体のリファレンスプロフィールを示しており、図５は、ＬＭ１の最終精製中に溶出したピークの高分解能プロフィールを示している。
【０１１６】
（図４および図５における、最終精製の運転条件）
ＣＩＭ（登録商標）ＳＯ３、１つのハウジングに重ねられた、３×０．３４ｍｌの円盤、４ｍｌ／分
バッファーＡ：１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍグリシン、ｐＨ７
バッファーＢ：：５００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７
カラムを平衡化
アニオン交換から保存しておいたフラクションのサンプルを、サンプル１部、バッファーＡ９部を用いて、ライン内で希釈することによってローディング
バッファーＡで洗浄
溶出：Ｂ１００％になるまで、線形勾配で４８ＣＶ
カチオン交換クロマトグラフィーによってＬＭ１を精製する場合、溶出ピークの形状は、ピークの後側で鮮明さを欠き、不定型な形であった（図４および図５、特に図５を参照）。したがって、凝集物を集めてしまうのを避けるために、後側をほとんど除外するように保存の仕方を設定した。例えば、ＩｇＭピークとともに、その後側に溶出しているおそれがある凝集物を確実に集めないために、フラクションを、後側に、ピークが最大ピーク高さの２５％まで減少したところまでを集めた。この戦略の有効性を、実施例４で開示したような最終精製の後、ＬＭ１ピークのフラクションを高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で分析して評価すると、凝集物の存在は検出できず（すなわち、凝集物の濃度は、検出限界未満（約０．１％未満）であり）、このアプローチによって、検出可能な凝集物を含まないＩｇＭが調製されたことが確認された。
【０１１７】
（実施例４．精製されたＬＭ１のサイズ排除クロマトグラフィー分析）
最終精製クロマトグラフィーから得たＩｇＭを含有するフラクションの、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を行い、精製されたＩｇＭの大きさ（分子半径）、純度、ＩｇＭを含有するサンプルの他の特性を評価した。上の実施例４に記載したようなカチオン交換クロマトグラフィーによって、ＬＭ１を最終精製し、溶出したピークから集め、保存しておいたフラクションから、１００μｌのＬＭ１サンプルを、ＧＳＷ４０００  ＳＥＣ媒体（Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｅｐ、シュトゥットガルト、ドイツ）にローディングし、ＳＥＣバッファー（２５ｍＭ  ＭＥＳ、０．５Ｍグリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍアルギニン、ｐＨ６．８）を用い、流速０．５ｍｌ／分で操作した。２８０ｎｍおよび３００ｎｍでの吸光度を測定することによって、ＳＥＣ溶出物を分析し、タンパク質の合計量を測定し、６００ｎｍでの吸光度を測定することによって、濁度を測定した。溶液の導電性も測定した。このサンプルのＳＥＣ分析プロフィールを図６に示している。ＬＭ１は、１本のピークで溶出し、このことは、ＩｇＭフラグメントやＩｇＭ凝集物のような夾雑物がほぼ完全に含まれていないことを示している。ＬＭ１ピークの中心は、注入後、８．５５分であった（図６）。ＬＭ１の溶出時間は、精製されたＣＭ１で観察されたＳＥＣ溶出ピーク（データは示していない）よりも１．０３分遅く、精製されたＳＡＭ６のＳＥＣ溶出ピーク（データは示していない）よりも約０．８５分遅かった。ＳＥＣバッファーは、非特異的な水素結合、イオン性相互作用および疎水性相互作用を防ぐように、特に配合されており、この結果、ＬＭ１  ＩｇＭは、他の２つの抗体（ＣＭ１およびＳＡＭ６）よりも流体力学半径が小さいことが示された。また、ＬＭ１は、カチオン交換媒体からの溶出プロフィールが一般的なものではなく、カチオン交換溶出プロフィール、ＬＭ１で観察したｐＨに対する感度を示した。
【０１１８】
ＬＭ１を含有するフラクションのＳＥＣ中、注入して２０分後にみられる溶出ピークは、Ａ２８０およびＡ３００の測定値を並行して調べることによって示されるように、バッファーによるアーチファクトであった。注入してから２９分後および３０分後に観察されたアーチファクトピークは、Ａ２８０、Ａ３００、Ａ６００の測定値を並行して調べることと、導電性の測定値が同時に増加していることによって示されるように、カラムから溶出したサンプルバッファーの屈折率が変わったことによって生じたものであった。
【０１１９】
（実施例５．ＳＡＭ６の精製手順）
（Ｉ．ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる、サンプル捕捉および初期精製）
実施例１のプロセスで、１Ｍグリシンの代わりに２Ｍ尿素を用いることによって、ＳＡＭ６の精製手順を行った。尿素を含有するバッファーを、使用前にアニオン交換フィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（ＳｉｎｇｌｅＳｔｅｐ  ｎａｎｏ  １ｍｌ）で濾過した。ＡＣＳグレードまたはそれ以上のグレードの尿素を用いることを強く勧める。尿素を含有するバッファーは、カルバミル化の可能性を最小限にするという予防の意味で、使用期限は７日を超えないようにした。
【０１２０】
細胞培養物の上澄み１ｍｌあたり、約２００μｇのＩｇＭを含む細胞培養物の透明な上澄み１Ｌの出発物質から、ＳＡＭ６  ＩｇＭを精製した。第１に、０．２２ミクロン（０．２２μｍ）フィルターを用い、細胞培養物の上澄みを濾過し、次いで、５００ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なリン酸塩濃度が５ｍＭのものを得た。サンプルにすでにリン酸塩が含まれている場合、リン酸塩濃度を少なくとも５ｍＭにするのに必要な最小限の量の５００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７）を、上述の濾過した上澄みに加えた。１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を１％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なＴｒｉｓ濃度を１０ｍＭにすると、最終的なｐＨは６．８〜７．２になると予想された。このサンプル溶液を室温（１８〜２３℃）にした。
【０１２１】
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＨＴ  ＩＩ型、４０ミクロン、ＡＴＯＬＬ  １１．３×１００ｍｍカラム
流速：１００〜２００ｃｍ／時間（Ａｔｏｌｌカラムで、１．６７〜３．３４ｍｌ／分）
バッファーＡ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＢ：５００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０％  ＰＥＧ−６００、ｐＨ７．０
バッファーＣ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７
バッファーＤ：６００ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７
バッファーＥ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＦ：０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール、５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７
（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
カラム（セラミックヒドロキシアパタイトＣＨＴＴＭ  ＩＩ型  ４０ミクロン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）、ＡＴＯＬＬ  Ｇｍｂｈであらかじめ充填された１１．３×１００ｍｍカラム）を、バッファーＡ（上述）で平衡化した。サンプルを、バッファーＡ  １００カラム容積（１００ＣＶ）に約０．１ｍｌ／分で添加した。サンプルをローディングした後、カラムを、２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄した（洗浄１）。次いで、２８０ｎｍでの吸光度Ａ２８０を測定することによって決定される読みがベースライン値に戻るまで、カラムをバッファーＢ２５％（１２５ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）で洗浄した（洗浄２）。
【０１２２】
流れを止め、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜アニオン交換フィルターをＣＨＴカラムの底部に接続し、次いで、監視によって、Ｑカートリッジが平衡状態に達するまで、流れを洗浄条件で再開させた（１ｍＬのカートリッジを１０ｍＬのＣＨＴカラムに加える、ほぼ１０倍であるが、これより多くてもよい）。
【０１２３】
バッファーＢ７０％（３５０ｍＭリン酸塩、１０％  ＰＥＧ−６００）までの線形勾配を有する１ＣＶで、サンプルをカラムから溶出させ、次いで、生成物のピークが溶出するまで、カラムをバッファーＢ７０％に保持した。０．５ＣＶ以下のフラクションを集め、保存したものを、もともとの保存容積の３．３倍になるまでバッファーＣで希釈した。溶出したピークは、無色透明であり、尿素で希釈しても無色透明のままであった。フラクションを４℃で保存した。推奨されるように、前側に最大ピーク高さの１０％のところから、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを、さらなる精製のために保存しておいた。この収集／保存戦略によって、このサンプルピークの後側で溶出し始めると思われる凝集物が除外されると予想された。ＣＨＴカラムを５〜１０ＣＶのバッファーＤで浄化し、バッファーＥで再生させ、バッファーＦ中で保存した。
【０１２４】
（ＩＩ．アニオン交換クロマトグラフィーによる、中間精製）
ＣＨＴによる初期精製を終了してから２４時間以内に、アニオン交換クロマトグラフィーによる中間精製を開始し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００を用い、最小流速４ｍｌ／分で行った。
【０１２５】
（アニオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ（登録商標）ＱＡモノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７
バッファーＢ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ６．２
バッファーＣ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（アニオン交換クロマトグラフィー）
ＣＨＴから集め、保存しておいたフラクションに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を５％（ｖ：ｖ）で加え、最終的なＴｒｉｓ濃度が５０ｍＭのものを得て、このサンプル溶液を室温（１８〜２３℃）にした。
【０１２６】
８ｍｌの強アニオン交換剤であるＣＩＭ（登録商標）ＱＡモノリスを含むカラムをバッファーＡで平衡化し、サンプル溶液を、バッファーＡ４部（ポンプＢで供給）に対し、サンプル１部（ポンプＡで供給）になるようにライン内で希釈して、カラムにローディングした。このサンプル希釈によって、全体で、ＣＨＴカラムから溶出した容積の１０倍に希釈した。この工程で使用したＱＡモノリスの推定カラム容量は、モノリス１ｍｌあたり、ＩｇＭ約３０ｍｇであった。このカラムをバッファーＢで洗浄し（洗浄１）、次いで、バッファーＢ９５％、バッファーＣ５％で洗浄した（洗浄２）。
【０１２７】
次いで、サンプルを、バッファーＢ５２％、バッファーＣ４８％に到達する線形勾配を有する５ＣＶを用いて溶出させ、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ５２％、バッファーＣ４８％に保持した。前側に最大ピーク高さの１０％のところから集め始め、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを集め、保存しておいた。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。カラムをバッファーＣ１００％で浄化し、数種類の夾雑物と混合した少量のＩｇＭを含む、小さな鋭いピークが得られ、その後、連続してその他の小さな夾雑物ピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。中間精製工程は、１時間未満で終了した。
【０１２８】
（中間精製に関する見解）
１〜２Ｍ  ＮａＣｌが、カラムの浄化性を上げる可能性があることを注記しておく。唯一の欠点は、さらなるバッファーを調製することである。カラムをベンゾナーゼで時々浄化し、蓄積したＤＮＡを除去すると、カラムの寿命が延びる場合がある（例えば、１０回の操作後、または背圧が大きくなりすぎたらいつでも）。
【０１２９】
精製は、合理的な範囲で生成物ができるだけ尿素にさらされないように可能な限り素早く、次の工程に進むべきである。Ｔｒｉｓ尿素バッファーがアルカリ性ｐＨであることによって、カルバミル化のリスクが高まるが、接触時間を短くすることによって打ち消される。このプロセスの初期の態様では、ｐＨ７のリン酸塩を用い、容量の仕様をこのｐＨで設定しており、そのため、精製性能を損なうことなく、もともとのこのバッファーをＴｒｉｓのｐＨ８に代えることも可能であろう。
【０１３０】
（ＩＩＩ．カチオン交換クロマトグラフィーによる、最終精製）
アニオン交換工程（上述）から２４時間以内にカチオン交換クロマトグラフィーを開始し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００を用い、最小流速４ｍｌ／分で行った。
【０１３１】
（カチオン交換クロマトグラフィーの条件および試薬）
媒体／カラム：ＣＩＭ（登録商標）ＳＯ３モノリス（８ｍｌ）
流速：１分あたり、１０ＣＶまで
バッファーＡ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７
バッファーＢ：２０ｍＭクエン酸塩、２Ｍ尿素、ｐＨ６．２
バッファーＣ：２５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．２
バッファーＤ：１．０Ｍ  ＮａＯＨ
バッファーＥ：０．０１Ｍ  ＮａＯＨまたは２０％エタノール
（カチオン交換クロマトグラフィー）
一旦開始したら、カチオン交換クロマトグラフィーを用いた最後の精製工程を、中断せずに完結させた。
【０１３２】
サンプル（アニオン交換から保存しておいたフラクション）を室温（１８〜２３℃）にした。バッファーＡでカラムを平衡化した。バッファーＡ９部に対し、サンプル溶液１部になるようにライン内で希釈し、サンプルをローディングした。ＣＩＭ  ＳＯ３媒体の容量は、約３０ｍｇ  ＩｇＭ／ｍｌであると思われた。カラムを２〜５ＣＶのバッファーＡで洗浄し（洗浄１：２ＣＶは十分な量であり、５ＣＶを超えない）、次いで、５ＣＶのバッファーＢ９５％、バッファーＣ５％で洗浄し（洗浄２）、小さなピークを得た。
【０１３３】
サンプルを、バッファーＢ６０％、バッファーＣ４０％に到達する５ＣＶの線形勾配を用いて溶出させ、次いで、サンプルのピークが完全に溶出し終わるまで、カラムをバッファーＢ６０％、バッファーＣ４０％に保持した。前側に最大ピーク高さの１０％のところから集め始め、後側に最大ピーク高さの１０％のところまでのフラクションを集め、保存しておいた。溶出したＩｇＭは透明であった。任意の残留凝集物は、この後側で溶出すると予想された。この保存しておいたフラクションに、５００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）溶液を１０％（ｖ：ｖ）で加えてｐＨを上げ、この溶液を４℃で保存した。カラムをバッファーＢで洗浄し、小さなピークが得られた。カラムをバッファーＤで再生し、バッファーＥ中で保存した。
【０１３４】
（最終精製に関する見解）
ＩｇＭは、精製して尿素を除去してすぐに、最終的な配合物になるようにダイアフィルトレーションすべきである。
【０１３５】
（実施例６．ＬＭ１の精製手順）
実施例５のプロセスで、ＳＡＭ６をＬＭ１に代え、使用するバッファーをいくらか変更し、ＬＭ１の精製手順を行った。アニオン交換クロマトグラフィー工程を用いた中間精製の間、バッファーＡおよびバッファーＢを以下のように調製した。
【０１３６】
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ尿素、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
バッファーＢ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．０
カチオン交換クロマトグラフィー工程による最終精製の間、第２の洗浄を行わず、バッファーＢと、バッファーＢおよびＣの混合物を、以下のバッファーＢと交換した。５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７。バッファーＢ１５％（７５ｍｌリン酸塩）までの５ＣＶの線形勾配を用いて、溶出工程を行った。最大ピーク高さの１０％のところから、ピークの後ろの最大ピーク高さの２５％のところまでを保存した。抗体を安定化させ、凝集を阻止するために、ＮａＣｌを、濃度が０．１Ｍになるまで加えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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