(57)【要約】本発明は、細胞において腫瘍発生を予防、阻害、阻止または無効化する方法ならびに腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する方法に関する。この方法は、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および／または活性を増加させることを含む。本発明はまた、一般式（Ｉ）の化合物（式中、ＡはＣＨまたはＮであり、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、Ｈ、０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族基、脂環式基、芳香族基、アリール脂肪族基、およびアリール脂環式基である。ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＳｉであってよい。Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよい。Ｒ２は、Ｈまたはハロゲン、たとえばＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＬである。Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌまたは１〜８個の主鎖炭素原子および０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族基である）を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤も含む。
2011504462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における腫瘍発生を予防、阻害、阻止または無効化する方法であって、ＤＡＣＴ（「ダッパー、ベータ−カテニンの拮抗薬、ホモログ」）タンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が体細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が直腸細胞または結腸細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍発生が発癌現象である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることを含む、方法。
【請求項６】
腫瘍細胞におけるアポトーシスを検出することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍が、癌または潰瘍性大腸炎である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、結腸直腸癌、黒色腫、食道癌、肺癌、卵巣癌、肝細胞癌、および子宮内膜癌のうちの１つである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を宿主生物から得るか、または前記細胞が宿主生物中に含まれている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主生物が、微生物、魚、両生類、鳥および哺乳動物のうちの１つである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、モルモット、チンパンジー、およびヒトからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、増殖性疾患もしくは障害の治療または予防に含まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
治療される前記増殖性疾患または障害が癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントの発現および／または活性を増加させる化合物を投与することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸分子、無機化合物および低分子量有機分子のうちの１つである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子が、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする配列を含む、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量を増加させることが、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの発現を増加させることを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法がエピジェネティック法である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を実施または予防することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記翻訳後のヒストン修飾が、ヒストンのメチル化またはヒストンのアセチル化である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンの変更が、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座で行われる、請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を実施することが、（ｉ）あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去および（ｉｉ）あるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加のうちの少なくとも１つを実施することを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を予防することが、（ｉ）あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の付加および（ｉｉ）あるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の除去のうちの少なくとも１つを阻害することを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去と、前記転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加との組み合わせを実施することを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性化翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化のうちの１つであり、前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化のうちの１つである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることが、タンパク質ベータ−カテニンのリン酸化状態を増加させることをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質ベータ−カテニンのリン酸化状態を増加させることが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３を活性化することを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性の少なくとも１つを増加させることが、細胞における、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量を減少させることをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のうちの１つである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
細胞におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量が分解によって減少する、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が前記ＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量および活性のうちの少なくとも１つを評価することをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＡＣＴタンパク質の量および／または活性を評価することが、前記量および／または活性をある期間にわたって評価することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量を評価することが、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の遺伝子発現を測定することによって達成される、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
ＤＡＣＴ遺伝子発現の測定結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記対照測定がＤＡＣＴタンパク質の遺伝子発現を少なくとも本質的に調節しない条件の使用を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞と、所定の量の一般式（Ｉ）：
【化１】
2011504462.tif 000012
（式（Ｉ）中、
Ａは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物とを接触させることを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞と、所定の量の一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせとを接触させることを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、一般式（ＩＩ）または一般式（ＩＩＩ）：
【化２】
2011504462.tif 000013
（式中、Ｒ６は、Ｈ、アミノ基、エーテル基、脂肪族基およびアリール脂肪族基のうちの１つであり、
Ｌは、１〜８個の主鎖炭素原子ならびにＮ、ＯおよびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族またはアリール脂肪族基を含むブリッジである）
の化合物である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ６のアミノ基もしくはエーテル基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、またはアリール脂環式基で置換されている、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記一般式（Ｉ）の化合物が、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール（３−デアザンプラノシン）である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記一般式（ＩＩ）の化合物が、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（トリコスタチン−Ａ）である、請求項４３または４４記載の方法。
【請求項４６】
細胞における腫瘍発生の危険性を診断する方法であって、（ｉ）細胞中のＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）細胞中のＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）細胞中の翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む方法。
【請求項４７】
翻訳後のヒストン修飾が、ヒストンのメチル化およびヒストンのアセチル化の少なくとも１つである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が腫瘍原性になる傾向を有する細胞を同定する方法である、請求項４６または４７記載の方法。
【請求項４９】
得られた結果を対照測定と比較することを含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対照測定が、少なくとも本質的に腫瘍原性になる危険性のないことが知られている細胞における（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ヒストンのアセチル化の前記パターンの評価において、ヒストン３上の（ｉ）リシン９および（ｉｉ）リシン１４のうちの少なくとも１つのアセチル化の減少は、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ヒストンのメチル化の前記パターンの評価において、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の増大が、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との組み合わせは、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記活性化翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化のうちの１つであり、前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化のうちの１つである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化が、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量の評価において、前記ＤＡＣＴタンパク質の量の減少は、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
被検体において新生物が発現する危険性を診断する方法であって、（ｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む、方法。
【請求項５９】
前記新生物が腫瘍である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記腫瘍が、黒色腫、乳房腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、類腱腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫および毛母基細胞腫瘍のうちの１つである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記翻訳後ヒストン修飾が、ヒストンメチル化およびヒストンアセチル化のうちの少なくとも１つである、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との組み合わせが、被検体において新生物が発現する危険性の徴候である、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との前記組み合わせが、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の組み合わせである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
新生物が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）
【化３】
2011504462.tif 000014
（式（Ｉ）中、ＡはＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む、脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物との組み合わせに対して感受性であるかどうかを予測する方法であって、
前記新生物における（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含み、
（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量の減少、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性の減少、（ｉｉｉ）および翻訳後ヒストン修飾の変更のうちの１つが、前記新生物が一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることの徴候である、方法。
【請求項６６】
前記新生物が哺乳動物中に含まれる、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記新生物が腫瘍である、請求項６５または６６記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍が、黒色腫、乳房腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、類腱腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫および毛母基細胞腫瘍のうちの１つである、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記変更された翻訳後ヒストン修飾が、ヒストンメチル化およびヒストンアセチル化のうちの少なくとも１つである、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ヒストンのメチル化および／またはヒストンのアセチル化の前記パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
腫瘍の予防または治療用医薬の製造での、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の絶対量を増加させる核酸分子および／または低分子量有機分子の使用。
【請求項７２】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２およびＤＡＣＴ３のうちの１つである、請求項７１記載の使用。
【請求項７３】
（ｉ）一般式（Ｉ）
【化４】
2011504462.tif 000015
（式（Ｉ）中、
Ａは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物；および
（ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の組み合わせ
を含む医薬組成物。
【請求項７４】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（登録商標））またはＰＸＤ１０１（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ（登録商標））である、請求項７３記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、一般式（ＩＩ）または一般式（ＩＩＩ）：
【化５】
2011504462.tif 000016
（式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、
Ｒ６は、Ｈ、アミノ基、エーテル基、脂肪族基およびアリール脂肪族基のうちの１つであり、かつ、
Ｌは、１〜８個の主鎖炭素原子ならびにＮ、ＯおよびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族またはアリール脂肪族基を含むブリッジである）
の化合物である、請求項７３記載の医薬組成物。
【請求項７６】
Ｒ６がアミノ基またはエーテル基であり、前記アミノ基またはエーテル基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族およびアリール脂環式基のうちの１つで置換されている、請求項７５記載の医薬組成物。
【請求項７７】
一般式（Ｉ）
【化６】
2011504462.tif 000017
（式（Ｉ）中、
ＡはＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、ならびにハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物の、結腸直腸癌または黒色腫の治療における使用。
【請求項７８】
前記使用がヒストンデアセチラーゼ阻害剤の使用をさらに含む、請求項７７記載の使用。
【請求項７９】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な候補化合物を同定する方法であって、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に前記化合物を導入し、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現を測定することを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現の増大は、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項８０】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な候補化合物を同定する方法であって、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現する細胞中に前記化合物を導入し、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性を測定することを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性の増大は、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項８２】
得られた結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
前記対照測定が、ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性を調節しない化合物の使用を含む、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞が癌細胞である、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が、結腸直腸組織、皮膚組織、胸部組織、肺組織、膀胱組織および卵管の組織のうちの１つに由来する、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が、細胞株の細胞である、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な化合物を同定する生体外法であって、化合物、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメント、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を接触させることを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質と前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成の増進が、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項８９】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のうちの１つである，請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）試験管に、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントと、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との複合体形成を増進させることができると予想される化合物を添加する工程と、
（ｂ）前記ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを前記試験管に添加する工程と、
（ｃ）前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を添加する工程と、
（ｄ）前記複合体形成を検出する工程と
を含む、請求項８８または８９記載の方法。
【請求項９１】
前記検出が、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光定量法、放射線学的方法、酵素法または熱力学的方法によって行われる、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍を予防し、治療するための方法および化合物を提供する。さらに、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する方法および被検体において新生物が発生する危険性を診断する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界的にみて主な死因であり、先進国では２番目に多い死因であり、さらには、たとえば、オーストラリア、日本、韓国、シンガポールならびにＵＫおよびスペインの男性人口においては、死因の第１位である。毎年、癌を発症する人の数は増加している。
【０００３】
現在、癌治療は、外科手術を伴うか、または細胞が悪性細胞に変わることに関連する機能的変化または遺伝子変化に着目している。理想的な抗癌剤は、非癌性細胞には影響を及ぼさないで、急速に増殖する癌性細胞を選択的に殺すか、または少なくとも抑制しなければならない。最近の方法としては、選択された種類の癌細胞のマーカーに向けられた抗体を用いた免疫療法（例えば特許文献１）、ある種の癌細胞上で発現されるレセプターに対する作用薬の適用（特許文献２）、インターフェロン含有キトサン−脂質粒子の適用（特許文献３）、ならびにある種の前立腺癌細胞に関して未知のメカニズムにより細胞毒性薬として作用する化合物の適用（特許文献４）が挙げられる。
【０００４】
癌細胞におけるＤＮＡメチル化の異常パターンは２０年以上知られているので、近年、研究努力がなされているさらなる方法は、エピジェネティック癌治療の開発である（概説に関しては、例えば非特許文献１、または非特許文献２を参照）。とはいっても、２つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、５−アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ（登録商標））およびデシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ（登録商標））しか売り出されていない。これらは、「前白血病」としても知られている血液学的疾患である骨髄異形成症候群の治療に関して承認されている。したがって、癌性細胞を優先的に迅速に殺す、癌もしくは腫瘍性疾患の治療または予防のための新規化合物および組成物が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２４４４１７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１４７４５６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２６６０９３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２４５５５９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ，Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８，４（Ｓｕｐｐｌ．），Ｓ４３−Ｓ４８
【非特許文献２】Ｙｏｏ，Ｃ．Ｂ．Ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００６）５，１，３７−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の１つの目的は、非癌性細胞に影響を及ぼすことなく、癌細胞を優先的に殺すことができる方法、ならびに化合物および組成物を提供することである。腫瘍発生の危険性を診断する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、細胞における腫瘍発生を予防、阻害、阻止または無効にする方法を提供する。この方法は、細胞において、ＤＡＣＴ（「ベータ−カテニンホモログダッパー（ｄａｐｐｅｒ）拮抗薬」）タンパク質、またはその機能的フラグメントの量および／または活性を増加させることを含む。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する方法を提供する。この方法は、細胞において、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および／または活性を増加させることを含む。一般的に、アポトーシスは腫瘍細胞において優先的に誘発され、一方、非腫瘍細胞は概して影響を受けないままである。いくつかの実施形態において、アポトーシスは腫瘍細胞においてのみ選択的に誘発され、一方、非腫瘍細胞は影響を受けないままである。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、次の２つの化合物の組み合わせを含む。第１の化合物は、一般式（Ｉ）の化合物である。
【００１１】
【化１】
2011504462.tif 000003
式（Ｉ）中、Ａは、ＣＨまたはＮである。Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、Ｈ、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、アリール脂肪族基、およびアリール脂環式基であり、これらは任意に０〜３個のヘテロ原子を含んでもよい。ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＳｉであってよい。Ｒ４およびＲ５は任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよい。Ｒ２は、Ｈまたはハロゲン、たとえばＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子および０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族基である。ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、またはハロゲン、例えば、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒもしくはＩであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２はＦまたはＣｌである。いくつかの実施形態において、Ｒ３も（独立して、またはＲ２と同時に）ＦまたはＣｌであってよい。第２の化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば、ヒドロキサム酸化合物（ｈｙｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、環状テトラペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（登録商標））、ＰＸＤ１０１（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ（登録商標））、ＭＳ２７５、ＬＡＱ８２４／ＬＢＨ５８９、ＣＩ９９４、ＭＧＣＤ０１０３またはサーチュイン阻害剤である。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、直腸腫瘍および結腸腫瘍をはじめとする腸腫瘍の治療における一般式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。これに関連して、本発明は、腸腫瘍、たとえば腸癌の治療用医薬の製造における一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００１３】
第５の態様において、本発明は、細胞における腫瘍形成の危険性を診断する方法を提供する。この方法は、（ｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の活性、および（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１以上を評価することを含む。この翻訳後のヒストン修飾は、典型的にはヒストンメチル化および／またはヒストンアセチル化である。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、新生物が、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であるかどうかを予測する方法に関する。この方法は、新生物において、（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性、および（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む。ＤＡＣＴタンパク質の量の評価において、その量が減少することは、新生物が一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることを意味する。ＤＡＣＴタンパク質の活性の評価において、活性が減少することは、新生物が、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることを意味する。翻訳後ヒストン修飾パターンの評価において、翻訳後ヒストン修飾の変更は、新生物が、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることを意味する。翻訳後ヒストン修飾パターンは、たとえば、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座で修飾することができる。
【００１５】
第７の態様において、本発明は、腫瘍の予防または治療用医薬の製造における、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量、すなわち絶対量を増加させる核酸分子および／または低分子量有機分子の使用に関する。
【００１６】
第８の態様において、本発明は、細胞における腫瘍発生の予防および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に化合物を導入することを含む。さらに、この方法は、ＤＡＣＴタンパク質の発現を測定することを含む。ＤＡＣＴタンパク質の発現の増加は、この化合物が、細胞における腫瘍発生の予防および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを意味するものである。
【００１７】
第９の態様において、本発明は、細胞における腫瘍発生の予防および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な化合物を同定する生体外法を提供する。この方法は、化合物、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメント、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を接触させることを含む。ＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成の増進は、この化合物が、細胞における腫瘍発生の予防および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを意味する。
【００１８】
本発明は、非制限的実施例および添付の図面と併せて考慮した場合に、詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ｗｎｔ／β−カテニン経路の特徴の簡略図。Ｗｎｔシグナルがないと、β−カテニンは分解する。
【図１Ｂ】Ｗｎｔ／β−カテニン経路の特徴の簡略図。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの活性化に際して、ＤｖｌはＦｒｚレセプターと結合し、これによってβ−カテニンが核に入り、転写を活性化することが可能になる。
【図１Ｃ】Ｗｎｔ／β−カテニン経路の特徴の簡略図。本発明の方法の実施形態において、Ｄｖｌは、ＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成し、その結果、図１Ａの状態に戻ると予想される。
【図２】ヒトＤＡＣＴ３の転写開始部位のマッピングを表す図。
【図３Ａ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。腫瘍（Ｔ）対正常粘膜（Ｎ）におけるＷｎｔ阻害剤の階層的クラスタリング（上）およびＷｎｔ／β−カテニン標的遺伝子（下）。
【図３Ｂ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。腫瘍および粘膜試料由来のＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図３Ｃ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。腫瘍におけるＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ３のメチル化状態。
【図３Ｄ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。癌細胞株対正常組織におけるＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図３Ｅ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。癌細胞株におけるＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ遺伝子のメチル化状態。
【図３Ｆ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。非癌性細胞株および癌細胞株のＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化状態。
【図３Ｇ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。５−ＡｚａＣを含まないかまたは含む癌細胞ならびにＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１および３ｂが欠損した細胞におけるＤＡＣＴ遺伝子プロモータのメチル化特異的ＰＣＲ。
【図３Ｈ】結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現とＤＮＡメチル化とを比較した図。５−ＡｚａＣで処理された癌細胞におけるＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図４Ａａ】ＣｈＩＰ技術によるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾の分析を表した図であり、ヒストンマークを示す。
【図４Ａｂ】ＣｈＩＰ技術によるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾の分析を表した図であり、ヒストンマークを示す。
【図４Ｂ】ＣｈＩＰ技術によるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾の分析を表した図であり、癌細胞におけるＤＡＣＴ３でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３を示す。
【図４Ｃ】ＣｈＩＰ技術によるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾の分析を表した図であり、非癌細胞におけるＤＡＣＴ３でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３を示す。
【図５Ａ】癌細胞におけるＤＡＣＴ３発現に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図５Ｂ】癌細胞におけるＤＡＣＴ３発現に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図５Ｃ】癌細胞におけるヒストン修飾に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図５Ｄ】癌細胞におけるヒストン修飾に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ａ】癌細胞における、β−カテニンリン酸化に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｂ】癌細胞における、β−カテニンのロケーションに対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｃ】癌細胞における、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング成分の発現に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｄ】癌細胞における、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング成分の発現に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｅ】癌細胞における、アポトーシスに対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｆ】癌細胞における、アポトーシスに対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図６Ｇ】癌細胞における、アポトーシスに対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせの効果を示す図。
【図７Ａ】癌細胞におけるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾を示す図。
【図７Ｂ】癌細胞におけるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾を示す図。
【図７Ｃ】癌細胞におけるＤＡＣＴ遺伝子でのヒストン修飾を示す図。
【図８Ａ】ｍＲＮＡレベルの観点からの、ｓｈＲＮＡを用いたＤＡＣＴ３欠失癌細胞に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの影響を示す図。
【図８Ｂ】アポトーシスの観点からの、ｓｈＲＮＡを用いたＤＡＣＴ３欠失癌細胞に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの影響を示す図。
【図８Ｃ】ｍＲＮＡレベルおよびアポトーシスの観点からの、ｓｉＲＮＡを用いたＤＡＣＴ３欠失癌細胞に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの影響を示す図。
【図８Ｄ】ｓｉＲＮＡを用いたＤＡＣＴ１欠失癌細胞と比較した、ｓｉＲＮＡを用いたＤＡＣＴ３欠失癌細胞に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの影響を示す図。
【図９Ａ】ウェスタンブロットによる、結腸直腸癌細胞におけるＤｖｌ２およびβ−カテニンに対する異種過剰発現ＤＡＣＴ３の影響を示す図。
【図９Ｂ】ウェスタンブロットによる、結腸直腸癌細胞におけるＤｖｌ２およびβ−カテニンに対する異種過剰発現ＤＡＣＴ３の影響を示す図。
【図９Ｃ】免疫蛍光イメージングによる、結腸直腸癌細胞におけるＤｖｌ２およびβ−カテニンに対する異種過剰発現ＤＡＣＴ３の影響を示す図。
【図９Ｄ】細胞増殖による、結腸直腸癌細胞におけるＤｖｌ２およびβ−カテニンに対する異種過剰発現ＤＡＣＴ３の影響を示す図。
【図１０】ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの存在下および非存在下でのβ−カテニンレベルに対するＧＳＫ−３阻害（ＬＹ２１１９３０１）の影響を示す図。
【図１１Ａ】癌細胞株におけるＤＡＣＴ３ｍＲＮＡレベルを示す図。
【図１１Ｂ】癌細胞株におけるＤＡＣＴ３タンパク質レベルを示す図。
【図１２Ａ】癌細胞におけるＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理によって再活性化された遺伝子を一覧表にした図。
【図１２Ｂ】癌細胞におけるＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理によって再活性化された遺伝子を一覧表にした図。
【図１２Ｃ】癌細胞におけるＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理によって再活性化された遺伝子を一覧表にした図。
【図１２Ｄ】癌細胞におけるＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理によって再活性化された遺伝子を一覧表にした図。
【図１３Ａ】アポトーシスの誘発における、ＤＺＮｅｐと、さらなるヒストンデアセチラーゼ阻害剤との相乗効果を示す図。
【図１３Ｂ】ＤＡＣＴ３の誘発およびβ−カテニンの阻害における、ＤＺＮｅｐと、さらなるヒストンデアセチラーゼ阻害剤との相乗効果を示す図。
【図１４Ａ】腫瘍容積に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ投与の生体内効果を示す図。
【図１４Ｂ】腫瘍容積に対するＤＺＮｅｐとさらなるヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせの生体内効果を示す図。
【図１５】図１４Ｂのデータを得るのに使用されたプロトコルデザインを示す図。
【図１６】ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを用いたＨＣＴ１１６異種移植腫瘍成長阻害中の体重変化を示す図。
【図１７】ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを用いたＨＣＴ１１６異種移植腫瘍成長阻害中の腫瘍容積を示す図。
【図１８】ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを用いた生体内処置中の腫瘍成長阻害をまとめた表。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＤＡＣＴタンパク質、および特にＤＡＣＴ３が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの負の調節因子としての役割を果たすという発見に基づく。Ｄａｐｐｅｒ（Ｄｐｒ）、Ｆｒｏｄｏ（Ｆｒｄ）、ＴＨＹＥＸ３、ＨＮＧ３、およびＭＴＮＧ３という名称もある、様々な生物におけるＤＡＣＴタンパク質のファミリーは、現在、ＤＡＣＴ１〜ＤＡＣＴ３という名称の３つの構成要素を含むことが知られている（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（２００６）２３５，２６２０−２６３０）。ＤＡＣＴ３としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９６Ｂ１８（ヒト）、Ｑ０ＰＨＶ７（マウス）、ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＨ１６１６１（ヒト）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ａ８ＩＰ７３（マウス）のタンパク質、またはＮＣＢＩ受入番号ＮＷ＿００１８３８４９６（ヒト）、ＮＭ＿１４５０５６（ヒト）、ＮＭ＿１４５０５６（アフリカツメガエル）、ＸＲ＿０２７７８９（ウシ）、ＮＷ＿００１０８４７６３（ラット）、ＮＷ＿０４７５５６（ラット）、ＮＭ＿００１０８１６５５（マウス）、ＮＷ＿００１０３０８３２（マウス）、ＤＱ８３２３１９（マウス）、もしくはＮＷ＿８７６２７０（イヌ）の核酸分子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＡＣＴ２としては、たとえば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ６７３Ｇ８（ゼブラフィッシュ）、Ｑ５ＳＷ２４（ヒト）、もしくはＱ７ＴＮ０８（マウス）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ受入番号Ｑ４Ｖ９Ｑ８（ゼブラフィッシュ）のタンパク質、またはＮＣＢＩ受入番号ＢＣ１１１７９０（ヒト）、ＢＣ１１１７６４（ヒト）、ＢＣ０９２４９８（ヒト）、ＮＭ＿００１０７７７９４（ゼブラフィッシュ）、ＮＷ＿００１１０７４６４（ラット）、ＮＷ＿００１２３６５７８（チンパンジー）、ＸＭ＿００１１４５１２２（チンパンジー）、ＢＶ６７７５３８（アカゲザル）、ＡＣ＿００００３９（マウス）、ＮＭ＿１７２８２６（マウス）、ＮＷ＿００１０３０５９８（マウス）、ＮＴ＿０３９６４９（マウス）もしくはＢＣ０５８７４０（マウス）の核酸分子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ヒトＤＡＣＴ１をコードするＨＤＰＲ１遺伝子のαおよびβと称する２つの選択的スプライスによる転写物が同定されている（Ｙａｕ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，１６０７−１６１４）。
【００２１】
「シグナリング」および「シグナル変換経路」という用語は、ある状態もしくは変化に反応して、細胞成分に作用する細胞機構および分子を意味する。典型的には、このような機構および分子は、細胞膜を通して細胞外シグナルを伝播させて、細胞内シグナルとなる。このシグナルは次いで細胞応答を刺激できる。「Ｗｎｔシグナリング経路成分」は、典型的には、Ｗｎｔタンパク質とＦｒｚレセプターとの間の相互作用および／またはＷｎｔタンパク質とＬＲＰタンパク質（ＬＤＬ関連レセプタータンパク質）、例えば、ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６との間の相互作用に由来するシグナルを変換する成分である。Ｗｎｔシグナリング経路は複雑であり、そして広範囲なフィードバック制御を伴うので、Ｗｎｔシグナリング経路の多くのまだ見いだされていない可能性のあるメンバーが存在する。Ｗｎｔシグナリング経路成分の例としては、（少なくとも一時的）膜結合タンパク質ＡｘｉｎおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、細胞外Ｗｎｔ相互作用タンパク質ｓＦＲＰ、ＷＩＦ−Ｉ、ＬＲＰ不活性化タンパク質ＤｋｋおよびＫｒｎ、細胞質タンパク質β−カテニン、β−カテニン「分解複合体」のメンバーＡＰＣ、ＧＳＫ３β、ＣＫＩαおよびＰＰ２Ａ、核移行タンパク質ＡＰＣ、ｐｙｇｏｐｕｓおよびｂｃｌ９／ｌｅｇｌｅｓｓ、ならびに転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ、Ｇｒｏｕｃｈｏおよび様々なヒストンアセチラーゼ、たとえばＣＢＰ／ｐ３００およびＢｒｇ−１が挙げられる。
【００２２】
ＤＡＣＴ（Ｄｐｒ／Ｆｒｏｄｏ）遺伝子ファミリーのメンバーは、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）（Ｃｈｅｙｅｔｔｅ，Ｂ．Ｎ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ（２００２）２，４４９−４６１）、すなわち、Ｗｎｔシグナリングの中心的成分である細胞質骨格タンパク質と相互作用することによって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングに関与することが証明されている（Ｂｉｌｉｃ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６，１６１９−１６２２；Ｌｏｇａｎ，Ｃ．Ｙ．，＆Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００４）２０，７８１−８１０）。ＤＡＣＴ１は、保存されたＣ末端ＰＤＺ−結合モチーフを介してＤｖｌ  ＰＤＺドメインと結合することによって、Ｄｖｌと複合体を形成することが証明されている（Ｃｈｅｙｅｔｔｅら、２００２、上記；Ｗｏｎｇ，Ｈ．−Ｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００３）１２，５，１２５１−１２６０）。発表されたデータは、ＤＡＣＴ１のＰＤＺ結合ペプチドが、Ｄｖｌ−１の同じ部位のＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターと競合できることを示唆している（Ｗｏｎｇ，Ｈ．−Ｃら、２００３、上記）。しかし、ＤＡＣＴタンパク質の正確な役割は、今までのところまだ立証されていない。あるデータは、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２は、ある生物学的状況においてＷｎｔシグナリングを拮抗することを示すようであり、一方、他のデータは、これらが他の生物学的状況ではＷｎｔシグナリングを活性化し、これらはＴＧＦ−β／Ｎｏｄａｌシグナリングにおいても役割を果たすことを示すようである（Ｇｌｏｙ，Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）４，３５１−３５７；Ｈｉｋａｓａ，Ｈ．，＆Ｓｏｋｏｌ，Ｓ．Ｙ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００４）１３１，４７２５−４７３４；Ｓｕ，Ｙ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ（２００７）２１，６８２−６９０；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００６）２８１，８６０７−８６１２；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０６，１１４−１１７；Ｂｉｋｋａｖｉｌｌｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８），１２１，２，２３４−２４５）。本出願の優先日後、ＤＡＣＴ１は、本発明とは独立して、β−カテニンの転写因子のリンパ球エンハンサー因子１（ＬＥＦ１）との複合体の形成を予防すること、および核におけるＬＥＦ１とヒストンデアセチラーゼ１との間の相互作用を増進させることによって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを制御することが報告されている（Ｇａｏ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００８）ｄｏｉ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０４０８８２００）。特に、ＤＡＣＴ３に関して、シグナリング機能は、今までのところ、どの生物においても知られておらず、腫瘍形成などの疾患との関連性について何も知られていない。
【００２３】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング（最近の簡単な概説については、例えば、Ｃａｄｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）１８，２０，Ｒ９４３−Ｒ９４７を参照）は、様々な生理学的プロセス、たとえば胚発生、たとえば前駆細胞形成および増殖をはじめとする組織再生、前駆細胞および幹細胞系統の特定化および維持または幹細胞自己再生に関与する、古くからの、高度に保存されたシグナリング経路である。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化は、体細胞の誘導多能性幹細胞への再プログラミングを増進させる（Ｍａｒｓｏｎ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００８）３，１３２−１３５）。この経路は、様々な状態、例えば心臓血管疾患、骨奇形、老化、肥満、真性糖尿病、統合失調症またはアルツハイマー病をはじめとする神経変性、急性腎不全および多嚢胞性腎、および炎症にも関与する。これはまた、付属器再生および創傷修復を促進することもできる。さらに、酸化的ストレスが、このシグナル変換経路を活性化することが判明している。この点に関して、網膜色素上皮において、この経路は、白色光暴露によって活性化され、その結果、上皮マーカーが失われ、間葉性マーカーが増えることが報告されている（Ｉｒｉｙａｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００８）３７５，１７３−１７７）。
【００２４】
異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナリングは、さらに、癌と関連することが知られている。異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナリングは、潰瘍性大腸炎においても見いだされ、潰瘍性大腸炎では、この経路は、悪性進行の初期段階で活性化される（ｖａｎ  Ｄｅｋｋｅｎ，Ｈ．ら、Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ（２００７）１０９，４，２６６／２７２）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの異常な活性化は、例えば、結腸癌における重要な原動力となる（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８７，１５９−１７０；Ｓｕ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６，６６８−６７０；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（２００２）１１１，２４１−２５０）。すべての結腸直腸癌の９０％超は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化突然変異を含み、このために、この癌は分子干渉の魅力的なモデルとなる。
【００２５】
ＡＰＣ、Ａｘｉｎ、およびβ−カテニン自体を含むＷｎｔ／β−カテニン経路成分における突然変異は、癌に至る異常なシグナリング活性化のよく確立された原因である（Ｌａｍｍｉ，Ｌ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（２００４）７４，１０４３−１０５０．；Ｌｉｕ，Ｗ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２０００）２６，１４６−１４７．；Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５，１７８７−１７９０．；Ｓｕら、１９９２、上記）。説明に役立つ実例として、フレームシフト、ナンセンスもしくはスプライス部位の変異によって引き起こされる両ＡＰＣ対立遺伝子の短縮型変異は、ヒト結腸癌の一種である腺腫様ポリープの原因となる。さらなる例として、乳腺および表皮の癌幹細胞の形成は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路によって活性化されることが証明されている。β−カテニンシグナリングは、癌幹細胞の集団の維持にも関与することが証明されている（Ｍａｌａｎｃｈｉ，Ｉら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５２，７１８７，６５０−６５３）。ＤＭＢＡ−ＴＰＡまたはＲａｓ誘発腫瘍におけるβ−カテニン遺伝子の欠失は、腫瘍の完全な退縮をもたらすことが証明されている。
【００２６】
癌の原因となるＷｎｔ／β−カテニン経路の成分の遺伝子欠陥は、ともに核におけるβ−カテニンの蓄積の原因となる。非癌性細胞において、β−カテニンの細胞質レベルは、カゼインキナーゼ１およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３によるリン酸化のために、Ｗｎｔリガンドの非存在下で低く保たれる。リン酸化β−カテニンは、ユビキチン化され、その後、分解する（図１Ａを参照）。しかし、突然変異は、細胞質β−カテニンの蓄積の原因となり得、その結果、構成的Ｗｎｔシグナリングを模倣する。β−カテニン遺伝子を含むＷｎｔ／β−カテニン経路の成分における突然変異は、例えば黒色腫、食道癌、甲状腺癌、小腸の腺癌、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、乳癌、毛母基細胞腫瘍（毛母腫）、類腱腫、ウィルムス腫瘍（腎臓）、髄芽細胞腫（幼児期で最も多い脳腫瘍）、滑膜肉腫および子宮内膜癌などの様々な癌形態において見いだされている（概説に関しては、例えば、Ｇｉｌｅｓ，ＲＨら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００３）１６５３，１−２４を参照）。Ｗｎｔシグナリングは、腫瘍進行および転移にも役割を果たすことが判明している。
【００２７】
非リン酸化され、したがって安定化されたβ−カテニンは、核へ移行すると考えられる（図１Ｂを参照）。核β−カテニンは、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写補因子ファミリーのメンバーと相互作用して、下流標的遺伝子、例えばサイクリンＤ１およびＭｙｃを活性化し、これは細胞形質転換の原因となり得る（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１，１５０９−１５１２；Ｍｏｒｉｎら、１９９７、上記；Ｔｅｔｓｕ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９９、上記；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、２００２、上記）。結腸癌細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻止は、生体外および生体内の両方でアポトーシスまたは成長阻害を誘発するという事実（Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００７）６７，５７３−５７９；Ｈｅ，Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，３０５４−３０５８；Ｋｗｏｎｇ，Ｋ．Ｙ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００２）２１，８３４０−８３４６）によって、この経路を標的とする治療方針を開発するための集中的な試みが推進された（Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．，＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ（２００６）５，９９７−１０１４；Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００４）５，９１−１０２；Ｌｉ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００２）１，６２１−６２５）。
【００２８】
前述のように、ＤＡＣＴ１は、そのＣ末端ドメインを介してβ−カテニンと相互作用できることも、最近、他の者によって見いだされている（Ｇａｏら、２００８、上記）。ＤＡＣＴ１は、核局在化シグナルならびに核外搬出シグナルをさらに有し、細胞質から核へ移行し、そしてその逆も同様である（同書）。ＤＡＣＴ１と相互作用するβ−カテニンの領域は、ＬＥＦ／ＴＣＦと相互作用する領域に対応することが示唆され、β−カテニンとＬＥＦ１との間の複合体の形成は、ＤＡＣＴ１によって妨害されることが証明されている（同書）。このメカニズムによって、ＤＡＣＴ１は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを拮抗する可能性が高い。ＤＡＣＴ１は、そのＣ末端ドメインを介してヒストンデアセチラーゼ１と結合することができ、ヒストンデアセチラーゼ１のＬＥＦ１との相互作用を増大させることがさらに証明された（同書）。このことは、ＤＡＣＴ１が、Ｗｎｔ／β−カテニンの標的、例えば、ｃ−ＭＹＣまたはサイクリンＤ１の発現を制御することができ、コリプレッサーヒストンデアセチラーゼ１の作用を増進させることによって、シグナリングを行うことを示唆する。
【００２９】
本発明者らは、ＤＡＣＴ３をはじめとするＤＡＣＴタンパク質は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＶＬ）タンパク質と複合体を形成することを見いだしした。「複合体」という用語は、互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を意味する。Ｄｖｌタンパク質は、Ｎ末端ＤＩＸドメイン、中心ＰＤＺドメインおよびＣ末端ＤＥＰドメインから構成される。これら３つのうち、ＰＤＺドメインは、Ｗｎｔシグナル伝達において最も重要な役割を果たす。２０を超える天然のリガンドが、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインと結合することが報告されており、そのほとんどが、標準もしくは非標準Ｗｎｔシグナル経路に関して生物学的に重要であることが示されている。Ｄｖｌも、Ｗｎｔシグナル変換の中心となる（Ｂｉｌｉｃら、２００７、上記；Ｌｏｇａｎ，Ｃ．Ｙ．，＆Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００４）２０，７８１−８１０）。癌細胞および他の状況におけるＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化は、核および細胞質における未リン酸化非膜結合β−カテニンの蓄積として分子的に観察できる（Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，＆Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７，１６０６−１６０９；Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ（２００７）１７，４５−５１）。Ｄｖｌタンパク質の過剰発現は、数種の癌、例えば非小細胞肺癌および中皮腫において観察されている。Ｄｖｌタンパク質の発現は、肺癌の不十分な分化と関連することが証明されており、Ｄｖｌタンパク質は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを介して肺癌の転移に貢献することが証明されている（Ｗｅｉ，Ｑ．ら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｌｕｎｇｃａｎ．２００８．０６．０１８）。
【００３０】
前述のように、酵母二重ハイブリッド系および免疫沈降によって、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の重要なアクチベータである、ＤＡＣＴ１とＤｖｌとの間の複合体を形成できることが以前に示されている（Ｇｌｏｙ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４，３５１−３５７，Ｃｈｅｙｅｔｔｅら、２００２、上記）。Ｇｌｏｙら（上記）は、ＤＡＣＴの保存されたＣ末端ドメインとＮ末端ＤＩＸドメインとＤｖｌの隣接する配列（同書）（ＰＤＺドメインを含む）との相互作用を同定した。構造データに基づいて、Ｃｈｅｙｅｔｔｅら（上記）は、複合体形成においてＤｖｌ１のＰＤＺドメインとＤＡＣＴのＣ末端領域との間の相互作用を同定した。化学シフト変動ＮＭＲ分光法および酵母二重ハイブリッドスクリーンを用いて、Ｗｏｎｇら（２００３、上記）は、ＤＡＣＴのＣ末端ドメインがＰＤＺ−結合モチーフであり、Ｄｖｌ１中心結合領域がＤｖｌ１のＰＤＺドメインであることを同定した。ＰＤＺドメインは、今のところ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプター、ならびにタンパク質キナーゼ、ホスファターゼおよびアダプタータンパク質のＣ末端領域をはじめとする多くのタンパク質のドッキング部位を提供することが判明しているが、一方、ＤＩＸドメインは、Ｄｖｌタンパク質のＤｖｌファミリーの他のメンバーならびにＡｘｉｎとの二量体化を可能にすることが判明している。
【００３１】
３つのＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質はすべて、ＰＤＺドメインおよびＤＩＸドメインを含むドメインの同じ配置を有する。また、３つのタンパク質はすべて、細胞株において発現され、Ｄｖｌ２が主に発現される（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｎ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（２００８）２０，４４３−４５２）。ｓｉＲＮＡを用いたノックアウトおよび欠乏は、３つのタンパク質のそれぞれの役割を示唆し、少なくともＷｎｔ／β−カテニンシグナリングにおけるそれらの役割は、互いの存在に依存し、協同的に機能するようである（同書）。
【００３２】
理論に拘束されることを望まないが、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量および／または活性の増加の影響の１つは、ＤＡＣＴタンパク質間の複合体形成およびその後のＤｖｌタンパク質の分解を伴うことが推測される。この点に関して、発明者等の発見は、増加したＤＡＣＴタンパク質レベルの１つの影響は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＶ１）タンパク質の分解であり得るという先の見解と一致している（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０６，１１４−１１７）。いくつかの実施形態において、本発明の使用および方法は、したがって、細胞において、Ｄｖｌタンパク質、例えばＤｖｌ−１、Ｄｖ１−２またはＤｖ１−３の全量を減少させる方法である。本発明者らの発見は、ＤＡＣＴ１の発現はヒト結腸直腸癌において下方制御されたという以前の報告を新たに解明する（Ｙａｕ，Ｔ．−Ｏ．ら、２００５、上記）。
【００３３】
一般的基準で、本発明はまた、Ｗｎｔが関与する障害、すなわち生理学的障害、状態、または異常なＷｎｔシグナリングによって特徴づけられる疾患状態の診断、予防および／または治療の方法および使用にも関する（例に関しては前記を参照）。この点に関して、本発明は、医薬組成物、ならびにＷｎｔが関与する障害のかかる組成物に対する反応性を予測する方法も提供する。特定の態様において、異常なＷｎｔシグナリングは、病気に罹っている疑いのある細胞または組織におけるＷｎｔシグナリングのレベルであって、病気に罹っていない類似した細胞または組織におけるＷｎｔシグナリングのレベルを超えるレベルである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔが関与する障害としては、癌を包含する腫瘍が挙げられる。このような実施形態において、本発明の方法、化合物および組成物は、癌を包含する腫瘍に関連して診断および／または治療目的で使用できる。いくつかの実施形態において、これらの方法、化合物および組成物は、例えば、神経変性状態、心臓血管疾患、急性腎不全および多嚢胞性腎、骨奇形、老化、肥満、真性糖尿病または炎症から選択される生理学的状態に関連する診断および／または治療目的で使用できる。さらなる好適な使用としては、幹細胞もしくは前駆細胞の多能性状態および／または自己複製特性の維持、前駆細胞の形成、前駆細胞の増殖、または体細胞の誘導多能性幹細胞への再プログラミングの調節／制御が挙げられる。
【００３４】
「癌」という用語は、悪性腫瘍細胞の増殖によって引き起こされる任意の癌、例えば腫瘍、新生物、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫を意味する。たとえば、癌としては、これらに限定されないが、中皮腫、白血病およびリンパ腫、例えば皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、非皮膚末梢Ｔ細胞リンパ腫、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）に関連するリンパ腫、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または肝細胞癌が挙げられる。さらなる例としては、骨髄異形成症候群、小児期の固形腫瘍、例えば脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、骨腫瘍および軟組織肉腫、成人によく見られる固形腫瘍、例えば頭部および頸部癌、たとえば口腔、咽頭部、鼻咽頭および食道；泌尿生殖器癌、たとえば、前立腺、膀胱、腎臓、子宮、卵巣、精巣；肺癌、たとえば小細胞および非小細胞；乳癌；膵臓癌；黒色腫および他の皮膚癌；胃癌；脳腫瘍；ゴーリン症候群に関連する腫瘍、たとえば髄芽細胞腫もしくは髄膜腫；ならびに肝臓癌が挙げられる。本発明の方法が取り組む癌の形態のさらなる例としては、これらに限定されないが、骨格筋もしくは平滑筋の癌、胃癌、小腸癌、直腸癌腫、唾液腺の癌、子宮内膜癌、副腎癌、肛門癌、直腸癌、副甲状腺癌、および下垂体癌が挙げられる。
【００３５】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞における発癌現象を予防する方法に関する。本明細書において用いられる発癌現象（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）という用語は、正常細胞が増殖性疾患を有する細胞、特に、腫瘍細胞に変化するプロセスを意味する。各細胞は、良性腫瘍および／または悪性腫瘍（癌）を生じさせ得る。良性腫瘍は、身体の他の部分へ広がったり、他の組織に侵入したりしない。それにもかかわらず、体内の重要な構造物を圧迫するか、または（例えば、ホルモンを生成させることによって）生理学的に活性である場合に、生命への脅威になる可能性がある。悪性腫瘍は、他の器官に侵入し、遠隔部位へ広がり（転移）、生命の脅威になる可能性がある。各方法は、式（Ｉ）の化合物および場合によって前記定義のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、個体における治療を、個体の細胞、たとえば腫瘍細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量を測定することによってモニターする。疾患の治療または進行のモニタリングにおいて、たとえば、癌などの疾患の治療前、治療中、および／または治療後などの様々な時点で、個体から試料を得ることができる。特定の実施形態において、個体の試料から得られるＤＡＣＴタンパク質の量、その活性レベルおよび／またはエピジェネティックな変化の存在（下記参照）を、異なる時点で得られるそれぞれのカウンターパートと比較する。ＤＡＣＴタンパク質の量または活性および／またはエピジェネティックな変化の存在における違いを、たとえば、治療の成功および／または疾患の進行と関連づける。
【００３６】
本発明のいくつかの方法および使用において、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および／または活性は細胞において増加している。細胞は、Ｄａｃｔタンパク質を発現できる任意の細胞であり得る。例えば、個々の細胞であってもよいし、あるいは細胞集団の中の細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は体細胞である。好適な体細胞の例としては、これらに限定されないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチン生成細胞、脂肪細胞、間葉性細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋細胞（例えば、平滑筋細胞もしくは骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン形成細胞、造血細胞、筋細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞が挙げられる。体細胞は、任意の組織、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、心臓、眼または神経組織の細胞が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、細胞は、宿主生物から得ることができるか、または誘導することができ、宿主生物は任意の生物であってよい。細胞は、各宿主生物から、生検または血液試料などの試料の形態で、直接採取することができ、たとえば単離することができる。細胞は、宿主生物から単離するなどして得ることができ、その後、培養し、成長させ、形質転換し、選択された処理にさらすこともできる。いくつかの実施形態において、細胞は、宿主生物中に含まれていてもよい。細胞は、たとえば、宿主生物の血液中、または器官をはじめとする組織中に存在することができる。細胞がそこから由来するか、または細胞を単離、精製、または濃縮などで得ることができるか、または細胞がその中に含まれている宿主生物は、任意の生物、例えば微生物、動物、例えば魚、両生類、は虫類、鳥、齧歯類をはじめとする哺乳動物、無脊椎動物種、例えば、食用ガエル、ヒキガエル、サンショウウオまたはイモリを包含する亜種Ｌｉｓｓａｍｐｈｉｂｉａのもの、あるいは植物であり得る。哺乳動物の例としては、これらに限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イヌ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、マカク、チンパンジーまたはヒトが挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞は、腫瘍細胞、例えば、癌細胞である。各腫瘍細胞は、生物から、例えば、哺乳動物から得ることもできる。他の実施形態において、腫瘍細胞は、哺乳動物、例えばラット、ウシ、ブタ、ヒト中に含まれていてもよい。各腫瘍細胞を、培養することもできる。腫瘍細胞は、たとえば、これらに限定されないが、結腸直腸癌細胞株ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＲＫＯ、ＬＳＴ−Ｒｌ、Ｃａｃｏ−２、ＷｉＤｒ、ＧＰ２ｄ、ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＶＡＣＯ５  ＨＣＡ７、ＬＳ４１１、Ｃ７０、ＬＩＭ１８６３、ＳＬ−１７４Ｔ、ＳＷ１４１７、ＳＷ４０３、ＳＷ６２０、ＳＷ８３７もしくはＶＡＣＯ４Ａ、黒色腫細胞株Ａ３７５、Ｂ１６（Ｂ１６−Ｆ１０を包含する）、ＢＮ１、Ｋ１７３５−Ｍ２、Ｍ１４、ＯＣＭ−１もしくはＷＭ７９３、肝臓癌細胞株ＦＨＣＣ−９８、Ｈ４ＩＩＥ  Ｈｅｐ  Ｇ２、Ｈｅｐ  Ｇ２ｆ、Ｈｕｈ−７、ＰＬＨＣ−１、ＳＭＭＣ−７７２１、ＳＫ−Ｈｅｐ１もしくはＱＧＹ、肺癌細胞株Ａ５４９、ＡＢＣ−１、ＥＢＣ−１、ＬＣ−１／ｓｑ、ＬＣＤ、ＬＣＯＫ、ＬＫ−２、Ｌｕｌ３５、ＭＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ  Ｈ１５７、ＮＣＩ−Ｎ２３１、ＮＬ９９８０、ＰＣ１、ＰＣ３、ＰＣ７、ＰＣ９、ＰＣ１０、ＰＣ１４、ＱＧ５６、ＲＥＲＦ−ＬＣＭＳ、ＲＥＲＦ−ＬＣＡＩ、ＲＥＲＦ−ＬＣＫＪ、ＳＢＣ３もしくはＳＱ５、食道癌細胞株Ａ５４９、ＥＣ１０９、ＥＣ９７０６もしくはＨＫＥＳＣ−４、胃癌細胞株ＢＧＣ８２３、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＭＧＣ８０３、ＭＫＮ−４５、ＳＧＣ７９０１または卵巣癌細胞株Ａ２７８０、Ｃ１３＊、ＣＡＯＶ３、ＤＯＶ−１３、ＨＯ８９１０（ＨＯ−８９１０ＰＭを包含する）、ＯｖＣＡ３、ＯｖＣＡ４２０、ＯｖＣＡ４２９、ＯｖＣＡ４３２、ＯｖＣＡ４３３、ＯｖＣａｒ３、ＯｖＣａｒ５、ＯｖＣＡ４２０、ＯＶＨＭもしくはＳＫＯＶ−３などの細胞株の細胞であり得る。
【００３９】
本発明の方法において用いられる細胞は、典型的には、ＤＡＣＴタンパク質、例えばＤＡＣＴ２もしくはＤＡＣＴ３をコードする核酸配列を、一般的には、ＤＡＣＴタンパク質の機能遺伝子の形態（内因性もしくは外因性のいずれか）で含むので、ＤＡＣＴタンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、細胞はＤＡＣＴタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、ＤＡＣＴタンパク質をコードするそれぞれの、たとえば内因性遺伝子は、機能的に活性であり、ＤＡＣＴタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、ＤＡＣＴタンパク質をコードする内因性核酸配列は、機能的に不活性である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＤＡＣＴタンパク質はそれでも、一般的には外因性ＤＡＣＴ遺伝子から発現される。組換え技術によって、たとえばＤＡＣＴタンパク質遺伝子を担うベクター（これについても下記を参照）によって、ＤＡＣＴタンパク質をコードする外因性遺伝子を導入することができる。この点に関して、各宿主細胞（内因性もしくは外因性起源のいずれか）において転写を開始するために有効なプロモータを含むベクターをさらに使用することが有利であり得る。
【００４０】
「ベクター」という用語は、細胞中にトランスフェクトでき、かつ細胞ゲノム内で複製できるか、または細胞ゲノムとは独立して複製できる１本鎖もしくは２本鎖環状核酸分子に関する。環状２本鎖核酸分子を、制限酵素を用いた処理によって切断し、これによって直線化することができる。各種核酸ベクター、制限酵素、および制限酵素によって切断されるヌクレオチド配列の知識は、当業者には容易に利用可能である。ベクターを制限酵素で切断し、２片を連結させることによって、ＤＡＣＴタンパク質をコードする核酸分子をベクター中に挿入することができる。
【００４１】
本明細書において用いられる「プロモータ」という用語は、遺伝子配列発現に必要な核酸配列を意味する。プロモータ領域は生物によって異なるが、様々な生物について当業者には周知である。たとえば、原核生物において、プロモータ領域は、プロモータ（ＲＮＡ転写を開始させる）と、ＲＮＡ中に転写された場合に合成開始のシグナルを出すＤＮＡ配列との両方を含む。このような領域は、通常、転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディング配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。構成的プロモータと誘導プロモータとの両方を、本発明において、特定の実施形態の要求にしたがって用いることができる。様々な可能な宿主細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。選択されたプロモータは、制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロモータを除去し、そして単離されたプロモータ配列を最適なベクター中に挿入することによって、本明細書に記載するポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡと機能し得るように結合させることができる。天然のプロモータ配列と多くのヘテロローガスなプロモータとの両方を用いて、選択された核酸配列の増幅および／または発現をさせることができる。
【００４２】
本明細書において用いられる「核酸」という用語は、例えば１本鎖、２本鎖またはこれらの組み合わせなどの任意の可能な構造の任意の核酸分子を意味する。核酸としては、たとえば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体を用いるかまたは核酸化学反応を用いて生成させたＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体、ロックト核酸分子（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、ペプチド核酸分子（ＰＮＡ）およびｔｅｃｔｏ−ＲＮＡ分子が挙げられる（例えば、Ｌｉｕ，Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６，４０７６−４０７７）。ＰＮＡ分子は、骨格が糖ではなく疑似ペプチドである核酸分子である。したがって、ＰＮＡは、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡとは対照的に、一般的に電荷中性骨格を有する。それでも、ＰＮＡは、少なくとも相補的であり、実質的に相補的な核酸ストランド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＰＮＡが構造的に模倣すると考えられるもの）とハイブリダイズすることができる。ＬＮＡ分子は、Ｃ４’とＯ２’との間にメチレンブリッジを有する、修飾されたＲＮＡ骨格を有し、これによって、フラノース環がＮ型配置に固定され、それぞれの分子にさらに高い２本鎖安定性およびヌクレアーゼ耐性が付与される。ＰＮＡ分子と異なり、ＬＮＡ分子は荷電した骨格を有する。ＤＮＡまたはＲＮＡはゲノムもしくは合成起源であってよく、１本鎖であっても、または２本鎖であってもよい。核酸分子は一般的に、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー核酸分子は、おおむね約６〜約１５モノマー単位を有する分子であると理解される。このような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであり得る。それぞれの核酸は、さらに非天然ヌクレオチド類似体を含み得るか、または親和性タグもしくは標識と結合し得るか、あるいはその両方であり得る。
【００４３】
多くのヌクレオチド類似体は公知であり、本発明の方法で使用できる。ヌクレオチド類似体は、たとえば、塩基、糖、またはホスフェート部分で修飾を含むヌクレオチドである。説明に役立つ実例として、ｓｉＲＮＡの２’−ＯＨ残基を２’Ｆ、２’Ｏ−Ｍｅもしくは２’Ｈ残基で置換することは、各ＲＮＡの生体内安定性を改善することが知られている。塩基部分での修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、様々なプリンもしくはピリミジン塩基、例えばウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イル、ならびに非プリンもしくは非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然および合成修飾が含まれる。他のヌクレオチド類似体は、普遍的塩基として機能する。普遍的塩基としては、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。普遍的塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成できる。塩基修飾は、しばしば、例えば糖修飾、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルと組み合わせて、例えば、独自の特性、例えば増大した２本鎖安定性を得ることができる。
【００４４】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量は、発現の増大、分解の減少またはこれらの組み合わせによって増加し得る。ＤＡＣＴタンパク質の増加した発現は、細胞における内因性ＤＡＣＴタンパク質の発現を刺激することによって確立することができる。したがって、各ＤＡＣＴタンパク質をコードする細胞の各内因性遺伝子の転写および翻訳を刺激することができるか、またはその阻害の状態を軽減もしくは終結させることができる。
【００４５】
ＤＡＣＴタンパク質の増加した発現は、外因性ＤＡＣＴタンパク質を発現することによっても達成できる（上記）。説明に役立つ実例としては、例えば、ベクターの形態のＤＡＣＴタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を、各細胞中に導入することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、細胞においてＤＡＣＴタンパク質の活性を増加させることには、ＤＡＣＴタンパク質と化合物、例えば有機低分子量化合物、無機化合物、ペプチドまたはタンパク質との間で複合体を形成することが含まれる。
【００４７】
前述のように、いくつかの実施形態において、細胞は、ＤＡＣＴタンパク質を発現しない。このような実施形態において、本発明の方法は、ＤＡＣＴタンパク質をコードする内因性遺伝子を活性化することを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞中に核酸分子、典型的には、細胞中でその発現を可能にできるＤＡＣＴタンパク質をコードする異種核酸分子（上記）を導入することを含む。このような実施形態における方法は、外因性ＤＡＣＴタンパク質を発現することをさらに含む。
【００４８】
本発明の方法および使用は、細胞において、ＤＡＣＴタンパク質、もしくはＤＡＣＴタンパク質の対応する機能的フラグメントの量または活性を評価することをさらに含み得る。
【００４９】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量は、例えば、抗体、例えば、標識と結合し得る免疫グロブリンによって評価することができる。細胞が単離された細胞または微生物である場合、細胞内免疫グロブリンを、たとえば、細胞膜の透過処理後に、細胞中に導入することができる。検出を次に、生体内または体外で実施できる。いくつかの実施形態において、検出を生体外、例えば、細胞抽出物または細胞可溶化物上で実施できる。このような技術としては、電気泳動、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリー、蛍光相関分光法またはこれらの技術の修飾形態もしくは組み合わせが挙げられる。
【００５０】
「抗体」という用語は、一般的に、免疫グロブリン、そのフラグメントまたは免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子を意味する。（組換え）免疫グロブリンフラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメントｓ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体（Ｉｌｉａｄｅｓ，Ｐ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９７）４０９，４３７−４４１）、十重特異性抗体（Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）３１８，８８−９４）および他のドメイン抗体（Ｈｏｌｔ，ＬＪ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），２１，１１，４８４−４９０）である。免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子の一例は、リポカリンファミリーのポリペプチドベースのムテインである（ＷＯ２００３／０２９４６２；ＷＯ２００５／０１９２５４；ＷＯ２００５／０１９２５５；ＷＯ２００５／０１９２５６；Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，１８９８−１９０３）。リポカリン、例えばビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ、ヒト涙液リポカリン、またはグリコデリンは、ハプテンとして知られる選択された小タンパク質領域と結合するように修飾できる、天然のリガンド結合部位を有する。さらなるタンパク質性結合分子の他の非制限的例としては、いわゆるグルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）（ＷＯ９６／２３８７９を参照）、アンキリン骨格に基づくタンパク質（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３，６，１４３５−１４４８）または結晶性骨格（ＷＯ２００１／０４１４４）、Ｓｋｅｒｒａによって記載されたタンパク質（Ｊ．ＭｏＩ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３，１６７−１８７）、アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、テトラネクチン、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）およびペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）が挙げられる。アビマーは、いくつかの細胞表面レセプターにおいて複数のドメインのストリングとして存在するいわゆるＡ−ドメインを含む（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ，ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，１５５６−１５６１）。ヒトフィブロネクチン由来のアドネクチンは、標的と免疫グロブリン様結合するように操作できる３つのループを含む（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７，６５３−６５８）。各ヒトホモトリマータンパク質由来のテトラネクチンも、同様に、所望の結合のために操作できるＣ型レクチンドメイン中にループ領域を含む（同書）。タンパク質リガンドとして作用できるペプトイドは、側鎖が、α炭素原子ではなくアミド窒素と結合する点で、ペプチドとは異なるオリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは、典型的には、プロテアーゼおよび他の修飾酵素に対して耐性であり、ペプチドよりも高い細胞透過性を有し得る（例えば、Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．，ａｎｄ  Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１５０８−１５０９を参照）。所望により、任意の、またはある形態、種類の標的に対する各部分の親和性をさらに増加させる修飾剤を使用することができる。
【００５１】
ＤＡＣＴタンパク質の活性の評価は、タンパク質のＤｖｌタンパク質に対する結合の測定を含み得る。このような測定は、たとえば、分光学的、光化学的、測光、蛍光定量、放射線学的、酵素的または熱力学的手段（生体内および生体外のいずれも）に依存する。分光学的検出法の一例は、蛍光相関分光法である（例えば、Ｈａｕｓｔｅｉｎ，Ｅ．，＆Ｓｃｈｗｉｌｌｅ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（２００７）１５１−１６９を参照）。光化学的方法は、たとえば光化学的架橋である。光活性、蛍光性、放射性または酵素標識の使用は、それぞれ、測光、蛍光定量、放射線学的および酵素検出法の説明に役立つ実例である。説明に役立つ実例としては、フルオロフォアとして量子ドットも、たとえば生体内測定において使用することができる（例えば、Ｌｉｄｋｅ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）２５．１．１−２５．１．１８，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２５０１ｓ３６を参照）。生体内での蛍光の使用の説明に役立つさらなる実例は、好適なタンパク質、例えば、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、「スーパーフォルダ（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰ」（ｓｆＧＦＰ）または増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を生体分子蛍光相補性方法において用いることである（概説については、例えば、Ｓｈｙｕ，ＹＪ．，＆Ｈｕ  Ｃ−Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００８）２６，１１，６２２−６３０を参照）。蛍光性プローブの使用に関する一般評論は、Ｘｉｅらにより記載されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８）３７，４１７−４４）。検出は、たとえば蛍光共鳴エネルギー移動に基づくか、または分光学的であり得る。熱力学的検出法の一例は、等温滴定熱量測定法である。ＤＡＣＴタンパク質のＤｖｌタンパク質に対する結合を測定する好適な方法のさらに別の例は、表面プラズモン共鳴技術、例えば局在表面プラズモン共鳴である（例えば、Ｅｎｄｏ，Ｔ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ（２００８）６１４，２，１８２−１８９）。これらの方法のうちのいくつかは、追加の分離技術、例えば電気泳動またはＨＰＬＣを含み得る。詳細には、標識の使用例は、プローブとしての化合物、または酵素に結合した免疫グロブリンを含み、これによって触媒される反応の結果、検出可能なシグナルが得られる。放射性標識および電気泳動による分離を用いる方法の一例は、電気泳動移動度シフト解析である。
【００５２】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量の評価は、各ＤＡＣＴタンパク質をコードする細胞における核酸、たとえばＲＮＡの量を評価することも含み得る。核酸プローブを用いて、任意の一般的なハイブリダイゼーション法によって試料をプローブして、ＤＡＣＴタンパク質の核酸分子の量を検出することができる。核酸プローブを得るために、化学合成を行うことができる。合成された核酸プローブをまず、認められているＰＣＲ技術にしたがって、基本的に適切なテンプレートを利用する標準的ＰＣＲプロトコルにしたがって、本発明のプローブを得るために実施される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用することができる。当業者は、このようなプローブを、ＤＡＣＴタンパク質について入手可能な配列に基づいて容易に設計することができるであろう。ハイブリダイゼーションプローブを、放射標識、酵素標識、蛍光性標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光、ナノ粒子などを用いる標準的標識技術によって標識することができる。ハイブリダイゼーション後、標準的技術を用いてプローブを可視化することができる。当業者はこの事実を十分承知しているにもかかわらず、セーフガードとして、ほとんどの実施形態において、細胞における各タンパク質の半減期は、コード化核酸にのみ基づいて評価できないために、細胞における核酸量の評価は、細胞におけるタンパク質量を評価するために十分ではないことに留意する。それでも、この技術を、ある実施形態において、タンパク質結合剤の使用と組み合わせて、たとえば確認目的で使用することができる。
【００５３】
前述のように、いくつかの実施形態において、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量は、ＤＡＣＴタンパク質をコードする細胞における内因性核酸配列、典型的には遺伝子の発現の増加によって増加する。この発現の増加は、エピジェネティックな変化を行うことよって達成できる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、エピジェネティックな方法である。ＤＡＣＴタンパク質の発現の増強は、たとえば、１以上の翻訳後ヒストン修飾パターンを変更することによって、実施することができる。これはたとえば、ヒストンメチル化を変更することによって実施することができる。これは、ヒストンのアセチル化パターンを変更することによっても実施できる（これについても下記を参照）。いくつかの実施形態において、ヒストンメチル化およびヒストンアセチル化の両パターンを変更する。一実施形態において、ヒストンメチル化および／またはヒストンのアセチル化パターンを、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座、例えばＤＡＣＴ３の遺伝子座で変更する。一例として、ＤＡＣＴ３タンパク質をコードするＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ６２９３７８の遺伝子は、マウスゲノム中、第７番染色体上、７Ａ２位に位置する。ＤＡＣＴ３タンパク質をコードするＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ５３９２０９を有する対応する遺伝子は、ウシゲノム中、第１８番染色体上、ＬＯＣ５３９２０９位に位置する。対応する遺伝子は、チンパンジーゲノム中、ＬＯＣ７４５６７７位、第１９番染色体上およびヒトゲノム中、１９ｑｌ３．３２位、第１９番染色体上で見いだされる。ＤＡＣＴ２タンパク質をコードするＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ２４００２５の遺伝子は、マウスゲノム中、第１７染色体上、１７Ａ２位に位置する。対応する遺伝子は、チンパンジーゲノム（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ７４２１３０）中、ＬＯＣ７４１９０６〜ＬＯＣ７４２３２０位、第６番染色体上、アカゲザルゲノム中、第４番染色体上、ＬＯＣ６９４４６７位、ヒトゲノム（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１６８００２）中、６ｑ２７位、第６染色体上、ラットゲノム中、１ｑｌ２位、第１番染色体上、ゼブラフィッシュゲノム中、ＬＯＣ７９９１２３〜ＬＯＣ１００００００９９位、第６番染色体上、およびニワトリゲノム（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４２１５６１）中、第３番染色体上、ＬＯＣ３９５９３３に近接した位置で見いだされる。いくつかの実施形態において、前記で挙げたエピジェネティックな変化の１以上またはいずれかが検出される（これについても下記を参照）。いくつかの実施形態において、１以上のエピジェネティックな変化を選択された期間にわたってモニターする。このような変更をモニターすることは、例えば、治療のモニタリング、治療反応性の予測、または診断の決定の役割を果たす。エピジェネティックな変化のモニタリング、ならびにＤＡＣＴタンパク質のレベルまたは活性のモニタリングは、個体の癌治療に対する耐性の決定として、特に、式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対する耐性の決定として定義することができる。個体がこのような癌治療に対して耐性を有する場合、別の癌治療を個体に実施することができる。
【００５４】
可逆性変化として当業者に公知のエピジェネティックな変化（概略紹介に関しては、例えば、Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｃ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｉｓ．（２００９）４，２２９−２４９を参照）は、当該分野において確立された従来の方法を用いて検出することができる。一例として、メチル化特異的ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応の亜硫酸水素塩変換に基づく技術である。この目的のために、非メチル化ＤＮＡ（Ｕ）に対して特異的な１対のプライマー、およびメチル化ＤＮＡ（Ｍ）に対して特異的な１対のプライマーを用いる（これについても下記実施例を参照）。各対の少なくとも１つのプライマーは、１以上のＣｐＧ部位を有する配列を有する。４つのさらなる例として、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、亜硫酸水素塩パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸張法（ＭＳ−ＳｎｕＰＥ）およびメチル化感受性１本鎖高次構造解析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）を用いて、ＤＮＡ分子のシトシン残基のメチル化を測定することができる。これらの方法において、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、シトシン残基を脱アミノ化してウラシルにし、一方、５−メチルシトシン残基はほとんど無変化のままにする。２つのさらなる例として、メチル化特異的限定解析およびメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）を用いてＤＮＡメチル化を評価することができる。
【００５５】
エピジェネティックな変化は、一般的に、別の遺伝子発現パターンを伴う。このような変更としては、例えば、ＤＮＡの１以上の共有結合修飾、例えばシトシンメチル化、１以上の染色体タンパク質、特にヒストンの１以上の共有結合修飾、および染色体外調節低分子ＲＮＡおよび非コーディングＲＮＡ分子の集団の形成が挙げられる。この点に関して、肉眼で見えるクロマチンは、ＤＮＡおよび、その周りにＤＮＡが巻き付けられているヒストンタンパク質から構成される。ヒストンを、２コピーのヒストン２Ａ、ヒストン２Ｂ、ヒストン３およびヒストン４で構成される８量体に組み立てる。
【００５６】
今までのところ、生体外だけでなく、生体内でも利用可能なデータは、エピジェネティックな変化が遺伝子発現の兆候にとどまらず、むしろこの関連で遺伝子またはプライム遺伝子（ｐｒｉｍｅ  ｇｅｎｅ）を発現させることを意味する。これらの変更のあるものは、転写サイレンシングを引き起こし、一方、他のものは転写を活性化する。したがって、各細胞において、翻訳後のエピジェネティック修飾のパターンが存在する。これらの修飾の１つの変更、例えば、ゲノム中の１塩基のメチル化の変化は、したがって、翻訳後エピジェネティック修飾の細胞のパターンの変更をもたらし、変化した遺伝子活性状態をもたらし得る。したがって、１つの遺伝子型は、異なる表現型を付与する複数のエピ遺伝子型（ｅｐｉｇｅｎｏｔｙｐｅ）を採用することができる。対立遺伝子の存在と同様に、エピ対立遺伝子も存在する。エピジェネティックな変化は、例えば、全体的なＤＮＡ低メチル化またはプロモータ高メチル化が様々な癌において見いだされている（Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，２００９、上記を参照）。
【００５７】
ヒストンのエピジェネティック修飾は、したがって翻訳後修飾である。多くのヒストンの翻訳後修飾が公知であり、さらに多くのものが未知である可能性がある。任意のこのようなヒストン修飾を、本発明の方法の過程で、変更することができ、例えば、付加、除去、または変更から保護することができる。ヒストンのアセチル化、リン酸化およびユビキチン化は、今までのところ転写を増加させることが観察され、一方、ＳＵＭＯ化は、転写を減少させることが判明している。ヒストンのメチル化は、ある場合には、転写を増大させ、他の場合には、転写を減少させる。これらの修飾の変化は、特異的酵素、例えばヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼまたはある転写因子、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する活性化転写因子２（ＡＴＦ２）またはＣＬＯＣＫによって行われる。ヒストンメチル化は、特に複雑であり、モノメチル化、ジメチル化（ｍｅ２）またはトリメチル化（ｍｅ３）状態で存在し得る。これらの状態のそれぞれは、特有の共調節因子を動員することができ、転写活性に対して異なる影響をおよぼすことができる。さらに、ヒストンの各リシン残基のメチル化は、転写に対して、異なり、そしてしばしば反対である影響を及ぼす。
【００５８】
（特に、高度に保存されたコアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の）ヒストン修飾、例えばモノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、アセチル化またはリン酸化は、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって検出することができる。ヒストンは、典型的には、架橋分子、例えばホルムアルデヒドまたはジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートを用いてＤＮＡと架橋される。細胞溶解およびＤＮＡの分解後、変化もしくは非変化ヒストンの存在を次いで、特異的抗体を用いて検出することができる。ヒストン修飾の検出に適した技術のさらなる例は、質量分析技術である（例えば、Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ，Ｊ．ら、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００８）３，５；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｎｄｅｓｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ／ａｒｔｉｃｌｅ／７００５で入手可能を参照）。ヒストンの任意の修飾の位置は、たとえば、タンデムＭＳ法によって決定することができる。第一段階として、ヒストンフラグメントをタンパク分解によって生成させることができる。その後、例えば、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ＭＳ／ＭＳによる配列決定を行うことができる。さらなるこのような方法として、亜硫酸水素塩変換を前述のようにして行うことができる。その後、ＤＮＡ分子またはその対象となるフラグメントを、例えば、生体外でＲＮＡに転写し、次いでＲＮａｓｅＡを用いて塩基特異的に切断し、切断されたフラグメントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析することができる。
【００５９】
前述のように、エピジェネティック事象は、ＤＮＡ突然変異の非存在下で遺伝子発現において変化を誘発することが知られている。これに関連して、本発明の方法は、ＤＡＣＴタンパク質の変更された発現に関連するエピジェネティックパターンを同定することにも関する。腫瘍細胞および、特に癌細胞によって利用されて不適切な遺伝子発現に関与する遺伝子調節の２つの主なエピジェネティック機構は、典型的には、リシンまたはアルギニン側鎖でのＤＮＡメチル化およびヒストン修飾である。転写因子のアクセスをブロックすることによるか、または転写リプレッサーの結合を増進させることによって、遺伝子のプロモータ領域におけるＣｐＧ豊富な部分の高メチル化は、転写サイレンシングを誘発し、腫瘍抑制遺伝子の発現における減少を引き起こすことによって、癌において重要な役割を果たすと考えられている。異常なヒストン修飾、例えば低アセチル化は、同様に、腫瘍抑制遺伝子の転写サイレンシングによって悪性腫瘍と関連する。ヒストンはＤＮＡと結合し、クロマチン構造を調節し、そしてヒストン脱アセチル化は、アセチル基をヒストンから除去することによって、これらがＤＮＡとより密接に相互作用することを可能にし、これによって、転写に関するＤＮＡの近接性を制限するという事実のために、転写抑制に関与する。ヒストンのアセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼとヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）酵素との相対する作用によって調節される。
【００６０】
エピジェネティック事象が、癌細胞におけるものを含む、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング経路の異常な活性化に寄与し得ることは、以前から公知である。細胞外Ｗｎｔ阻害剤、例えば分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）、Ｗｎｔ抑制因子１（ＷＩＦ−１）、およびＤＩＣＫＫＯＰＦ−１（ＤＫＫ−１）の転写サイレンシングをもたらすプロモータメチル化が、ヒト結腸直腸癌細胞において報告されている（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｏ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）２５，４１１６−４１２１；Ｈｅら、２００５、上記；Ｍｏｒｉｎら、１９９７、上記；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００２）３１，１４１−１４９）。反対に、ＳＦＲＰ１／２などのＷｎｔ阻害剤発現の修復の結果、下流ＡＰＣもしくはβ−カテニン突然変異の存在下でも、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングが阻害され、結腸直腸癌細胞のアポトーシスが起こる（Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，＆Ｏｈｍ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６，１０７−１１６；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００４）３６，４１７−４２２）。しかし、本発明の方法および使用と対照的に、エピジェネティックサイレンシングの分野における試みは、今までのところ、癌細胞におけるＴＣＦ／β−カテニンが関与する転写活性化を直接的に妨害することに重点的に取り組んできた（Ｂａｒｋｅｒ＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，２００６、上記；Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔら、２００４、上記）。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態は、翻訳後ヒストン修飾パターンの変更、例えばヒストンメチル化および／またはヒストンアセチル化を実施または予防することを含む。翻訳後ヒストン修飾パターンの変更の実施は、１以上のアミノ酸の位置での１以上の翻訳後ヒストン修飾の除去を行うことを含み得る。このような修飾は、例えば、転写抑制修飾であり得る。翻訳後ヒストン修飾パターンの変更の実施は、１以上のアミノ酸の位置で１以上の翻訳後のヒストン修飾を付加することを含む。「付加」という用語は、この点に関して、対応するアミノ酸に対する共有結合、たとえば、メチルまたはアセチル基の共有結合を形成することを意味する。このような修飾は、例えば、転写活性化修飾であり得る。翻訳後ヒストン修飾パターンの変更の実施は、１以上のアミノの酸位置で１以上の翻訳後ヒストン修飾の除去を阻害または予防することも含み得る。いくつかの実施形態において、翻訳後ヒストン修飾パターンの変更は、２つのアミノ酸の位置での翻訳後ヒストン修飾の変更を含む。いくつかの実施形態において、活性化翻訳後ヒストン修飾と不活性化（抑制）翻訳後ヒストン修飾との組み合わせを行うことができる。いくつかの実施形態において、１以上の転写抑制翻訳後ヒストン修飾の除去と１以上の転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加との組み合わせを行うことができる。
【００６２】
これもまた下記実施例において例示するように、本発明者らは、抑制的ヒストンメチル化事象および活性化ヒストンメチル化事象の両方が同時に存在することを含む、ＤＡＣＴ３プロモータでのヒストンメチル化パターンを同定した。いくつかの実施形態において、本発明の予後および診断法は、かかるヒストンのメチル化パターンの存在を検出することを含む。それに対応して、細胞における腫瘍発生を予防、阻止もしくは無効にする方法のいくつかの実施形態は、メチル化などの活性化ヒストン修飾と、メチル化などの不活性化ヒストン修飾との組み合わせを減少させるかもしくは除去すること、またはこのような組み合わせの形成を予防することを含む。いくつかの本発明の方法は、活性化ヒストンメチル化と不活性化ヒストンメチル化とのこのような組み合わせの存在を検出することを含む。いくつかの本発明の方法は、他のエピジェネティック修飾、例えばＤＮＡメチル化の検出をさらに含む。このような他のエピジェネティック修飾は、本発明の方法のいくつかの実施形態において、変更され得るか、または変更されることから保護され得る。
【００６３】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更の実施を含む本発明の方法のいくつかの実施形態においては、１以上のヒストンアミノ酸位置で転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去が行われる。翻訳後ヒストン修飾パターンの変更の実施を含む本発明の方法のいくつかの実施形態においては、１以上のヒストンアミノ酸の位置で転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加が実施される。翻訳後ヒストン修飾パターン変更を予防するいくつかの実施形態においては、あるヒストンアミノ酸の位置で転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の付加が阻害もしくは阻止が実施される。翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を予防するいくつかの実施形態において、あるヒストンアミノ酸の位置で転写活性化翻訳後ヒストン修飾の除去が阻害もしくは阻止が実施される。
【００６４】
このような方法のいくつかの実施形態において、転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去と、転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加との組み合わせが実施される。好適な活性化翻訳後ヒストン修飾の例としては、これらに限定されないが、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化が挙げられる。好適な抑制的翻訳後ヒストン修飾の例としては、これらに限定されないが、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化が挙げられる。
【００６５】
ヒストンのメチル化および／またはヒストンのアセチル化のパターンの変更は、本発明のある方法および使用のいくつかの実施形態において、化合物または化合物の組み合わせを適用、例えば投与することによって行われる。このような化合物は、以下で説明するように、この点に関して有効である化合物を同定する方法を用いて同定することができる。好適な化合物のさらなる例は、一般式（Ｉ）の化合物である（上記、下記も参照）。化合物の組み合わせの説明に役立つ実例は、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせである。
【００６６】
各細胞の内因性ヒストンのメチル化および／またはアセチル化パターンを変更する代わりに、または変更することに加えて、異種ヒストンを用いることができる。このような異種ヒストンは、例えば、従来の組換え技術によってヒストンをコードする異種核酸分子を発現することによって、細胞において形成することができる。あるメチル化／アセチル化パターンを有するヒストンを模倣するか、または対象となる位置でメチル化および／またはアセチル化できない細胞の内因性ヒストンと比較した場合、このようなヒストンは、突然変異／変更を有し得る。生体外法を実施する場合、１以上の単離されたヒストンを化学的修飾に付すこともできる。ヒストンは、１以上のアミノ酸誘導体、例えば、１以上のメチル化リシン類似体を用いて生体外で形成することもできる。
【００６７】
本発明のいくつかの方法および使用は、細胞増殖性疾患、例えば過形成、異形成および前癌病変に関与する１以上の細胞においてアポトーシスを誘発することを含むか、または目的とする。いくつかの実施形態において、これらの方法は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発することを含むか、または目的とする。アポトーシスは、プログラムされた細胞の死であり、典型的には、望ましくない細胞を除去するための多細胞生物における機構である。細胞がアポトーシスを起こすか、または開始する能力が減少または消失する場合、損傷した細胞は、抑制がきかない方法で増殖し得、その結果、癌細胞になる。アポトーシスを起こした細胞は、特徴的な形態を示し、これによって、顕微鏡下で同定することができる。腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発することによって、対応する方法を、癌を治療するかまたは予防するための治療法として用いることもできる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、癌細胞を包含する腫瘍細胞におけるアポトーシスは、タンパク質β−カテニンのリン酸化状態を変更、例えば増加させることによって誘発される。タンパク質β−カテニンのリン酸化状態は、このような実施形態において、例えば、腫瘍細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量および／または活性を変更することによって、典型的に変更され、例えば増加する。説明に役立つ実例として、ＤＡＣＴタンパク質の量を腫瘍細胞において増加させることができ、これによって、腫瘍細胞におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量を減少させる。腫瘍細胞におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量は、例えば、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質とＤＡＣＴタンパク質との間に複合体が形成されたら、分解によって減少させることができる。その結果、タンパク質グリコーゲンシンターゼキナーゼ３を活性化させることができ、その結果、タンパク質β−カテニンのリン酸化状態を増大させることができる。
【００６９】
所望により、腫瘍細胞におけるアポトーシスの進行は、例えば、ヨウ化プロポジウム染色、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色、フローサイトメトリー分析、またはこれらの組み合わせ、ならびにミトコンドリア機能障害またはカスパーゼ３活性化によってモニターすることができる。典型的には、本発明の方法は、ミトコンドリア分裂およびカスパーゼ活性化を含む、アポトーシスを起こした細胞死の応答を引き起こす。しかし、非癌性細胞は、もしあったとしてもごくわずかの細胞死応答しか示さない。各細胞におけるアポトーシスを検出することに加えて、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、各細胞における細胞生存性を決定することを含み得る。各方法は、当該分野において十分に確立されている。
【００７０】
前述のように、本発明の方法のいくつかの実施形態において、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質および／またはＤＡＣＴタンパク質の量を、各細胞において減少させる。これは、異種分子を細胞、例えば核酸分子中に導入することによって行うことができる。一例として、非コーディング核酸分子、例えばアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（ＷＯ０１／９２６５５に記載）を使用することができる。非コーディング核酸分子は、ｎｃ−ＲＮＡ分子でもあり得る（例えば、天然のｎｃ−ＲＮＡ分子に関する序論に関しては、Ｃｏｓｔａ，ＦＦ，Ｇｅｎｅ（２００５），３５７，８３−９４を参照）。ｎｃ−ＲＮＡ分子の例としては、これらに限定されないが、アンチセンスＲＮＡ分子、Ｌ−ＲＮＡ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、サイレンサー−ＲＮＡ分子（例えば、２本鎖神経特異的サイレンサーエレメント）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子またはＰｉｗｉタンパク質と相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）（簡単な概説に関しては、例えば、Ｌｉｎ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６，３９７を参照）が挙げられる。例えば、このような非コーディング核酸分子を用いて、ｍＲＮＡ分解を行うか、またはｍＲＮＡ翻訳を妨害することができる。
【００７１】
低分子干渉ＲＮＡの使用は、特異的遺伝子を「ノックダウン」するためのツールになっている。合成低分子有機化合物およびＲＮＡｉの使用間の違いに関する概説は、Ｗｅｉｓｓらによって記載されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００７）３，１２，７３９−７４４）。低分子干渉ＲＮＡは、転写後レベルで起こり、ｍＲＮＡ分解を伴う、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機構である。ＳｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡを複数の酵素複合体と結合させて、いわゆるＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することによって、それらの相補的ＲＮＡの分解に関与する。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣの一部となり、相補的ＲＮＡ種によって標的とされ、その後切断される。これによって、各遺伝子の発現が失われる（簡単な概説に関しては、Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ，＆Ｈａｌｅｙ，Ｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３０９，１５１９−１５２４を参照）。この技術は、例えば、サイレンシング寄生ＤＮＡ配列、例えば米国特許出願２００５／０１９１６１８に開示されているようなＨＩＶ  ＲＮＡの切断に応用されている。
【００７２】
ｓｉＲＮＡ分子は外因性２本鎖ＲＮＡから形成され、一方、ｍｉＲＮＡ分子はゲノムから転写されたＲＮＡの分子であるが、これは、ｓｉＲＮＡ分子と構造的に類似している。主に、ｍｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子と同様に機能することができる（概説については、例えば、Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）２０，２１４−２２１を参照）。当初は、ｍｉＲＮＡのみが転写物の３’−未翻訳領域に作用することが知られていたが、ｍｉＲＮＡは、単一のｍＲＮＡ分子のコーディング配列または異なるｍＲＮＡ分子のＣＤＳにおけるいくつかの部位を同時に標的とすることが記載されている（Ｔａｙ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７２９９）。低分子干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡに対する部分的相補性のみを有するコーディング配列内の部位を介して遺伝子発現を調節することができることも示唆されていた（同書）。これらの発見は、またはタンパク質の選択されたイソ型、スプライス変異または突然変異体の分解を行うか、あるいは翻訳を妨害する可能性を広げる。
【００７３】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの典型的な実施形態は、生体外または生体内で合成された、約１０〜３５個のヌクレオチドの分子を包含し、いくつかの実施形態においては、約１５〜２５個のヌクレオチドを包含する。各ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子は、微生物および動物の一部である細胞を包含する、対象となる細胞内で直接合成することができる。これは、各細胞への導入および／または送達も可能である。ｓｉＲＮＡ分子を生体内で選択された細胞中へ送達する実例は、重鎖抗体フラグメントの融合タンパク質（Ｆａｂ）および核酸結合タンパク質プロタミンとのその非共有結合である（Ｓｏｎｇ，Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３，６，７０９−７１７）。本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ分子を用いて、対象となる１以上のＤＡＣＴタンパク質またはＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘発する。
【００７４】
前述のように、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化は、癌幹細胞の形成に関する役割を果たす（Ｍａｌａｎｃｈｉら、２００８、上記）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングが、上皮幹細胞および初期幹細胞の維持において中心的役割を果たすことの証拠がある（ｄｅ  Ｌａｕ，Ｗ．ら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（２００７）１２，４７１−４９１；Ｆｏｄｄｅ，Ｒ．，＆Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｔ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００７）１９，１５０−１５８）。Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化するＧＳＫ−３阻害剤６−ブロモインジルビン−３’−オキシムは、多能性ヒトおよびマウス胚幹細胞の未分化状態を維持することが証明されている（Ｓａｔｏ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）１０，１，５５−６３）。衛星細胞、成人骨格筋の幹細胞集団の増殖は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化によって行われることが証明されている（Ｏｔｔｏ，Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）１２１，２９３９−２９５０）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害は、ウサギ胚幹細胞の多能性および増殖能を減少させ、そして結果として、それらの分化を向上させることが証明されている（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００８）ｄｏｉ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０４０９１２００）。ショウジョウバエの多能性腸幹細胞の維持および自己再生は、無翅（Ｗｇ）経路である、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングに対応する経路に依存することも証明されている（Ｌｉｎ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５５，１１１９−１１２４）。同様に、幹細胞を誘発するための体細胞の再プログラミングは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の活性化によって増進されることが証明されている（Ｍａｒｓｏｎら、２００８、上記）。この点に関して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを上方制御する初期エピジェネティック事象が、ＡＰＣ突然変異を完全に形質転換する前に、結腸直腸腺腫において起こり得ることを示唆するデータも存在する（Ｓｉｕ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９９）５９，６３−６６；Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記）。ＤＡＣＴ３での二価ヒストン修飾は、１つのこのようなエピジェネティック事象であり得る。いくつかの実施形態においては、特に結腸直腸癌細胞のエピジェネティックシグニチャー特性を標的とし、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを無効にできる、本発明の複合薬理学的アプローチは、遺伝子サイレンシングのこの機構に依存し、自己再生および生存のために高レベルのＷｎｔ／β−カテニンシグナリング活性を必要とする癌幹細胞を標的とする可能性を有し得る。
【００７５】
したがって、本発明の方法は、幹細胞の維持および／または増殖の制御（予防および終結を包含する）のために使用することもできる。このような幹細胞は、いくつかの実施形態において、癌幹細胞、たとえば結腸癌幹細胞であり得る。結腸癌腫瘍開始細胞とも呼ばれる結腸癌幹細胞は、典型的には原発性結腸癌において見いだされる（例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，＆Ｗｉｃｈａ，Ｍ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ＭｏＩ．Ｍｅｄ．（２００８）１４，１１，５０３−５０９）。本発明の方法は、少なくとも部分的に分化した細胞、たとえば体細胞を多能性細胞へ、特に、幹細胞へ再プログラミングするのを制御（予防または終結を包含する）するためにも使用できる。後者の場合の典型的な実施形態において、この方法は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化の制御（予防および終結を包含する）の方法である。いくつかの実施形態において、このような方法は、癌細胞の形成を予防する方法である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、心臓血管疾患もしくは障害、例えば心筋梗塞の治療および／または予防の方法あるいは治療および／または予防における使用であり得る。国際特許出願ＷＯ２００８／１２２４４０で開示されているように、β−カテニンの欠損は、心臓に対して保護効果を有する。この開示では、β−カテニンの下方制御が、成人心臓において適応型心筋細胞肥大を開始し、アンギオテンシンＩＩ誘発性ストレス後の保護的肥大に必要とされるシグナリング経路を回復させることが証明された。本発明の方法は、活性化されたβ−カテニンのレベルの減少（例えば、図６Ａを参照）およびＴＣＦ／β−カテニン標的遺伝子の発現（例えば、図６Ｃおよび図６Ｄを参照）をもたらす。このような効果の結果、心臓保護機能を有する適応型心肥大となることが証明されている（ＷＯ／２００８／１２２４４０）。当業者らは、従来の方法（同書）と対照的に、本発明の方法のいくつかの実施形態は、外来ＤＮＡを標的細胞中に挿入することを必要とせずに、この効果を達成できることを理解するであろう。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法または使用は、次の一般式（Ｉ）：
【００７８】
【化２】
2011504462.tif 000004
の化合物の使用を含む。この一般式（Ｉ）中、Ａは、ＣＨまたはＮを表す。Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈであるか、または任意に０〜６個、いくつかの実施形態においては０〜４個、いくつかの実施形態においては０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族基、脂環式基、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式基から独立して選択され得る。ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｅまたはＳｉであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は同一であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は結合して、脂肪族ブリッジ、例えば、ヒドロカルビルブリッジを形成し得る。各ブリッジは、例えば、１〜１２個、いくつかの実施形態においては２〜１０個、いくつかの実施形態においては２〜８個の主鎖炭素原子を含み、１〜５個、いくつかの実施形態においては１〜４個、いくつかの実施形態においては１〜３個の、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｅ、およびＳｉの群から選択されるヘテロ原子を含有する。Ｒ２は、Ｈまたはハロゲン原子、例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２はＦまたはＣｌである。Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン原子、例えばＦもしくはＣｌ、または脂肪族基、脂環式基、芳香族基、アリール脂肪族基もしくはアリール脂環式ヒドロカルビル基であり得る。このヒドロカルビル基は、１〜１２個、いくつかの実施形態においては１〜８個、いくつかの実施形態においては１〜４個の主鎖炭素原子および０〜４個、例えば０〜３個または０〜２個の、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｅもしくはＳｉの群から選択されるヘテロ原子を含み得る。ヒドロカルビル基は、１以上の官能基、例えばハロゲン、例えば、ＦもしくはＣｌを含む任意の置換基とさらに結合し得る（下記参照）。
【００７９】
ヘテロ原子は、炭素とは異なる任意の原子である。例としては、これらに限定されないが、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｉおよびＳｅが挙げられる。いくつかのヘテロ原子が本発明のプロセスの反応物質または生成物内に存在する場合、これらは独立して選択される。
【００８０】
「脂肪族」という用語は、特に別の記載がない限り、直線状もしくは分岐炭化水素鎖（飽和または一不飽和もしくは多不飽和であってもよい）を意味する。不飽和脂肪族基は、１以上の二重および／または三重結合を含む。炭化水素鎖の分岐は、直鎖ならびに非芳香族環状要素を含み得る。炭化水素鎖は、特に別の記載がない限り、任意の長さのものであり得、任意の数の分岐を含み得る。主鎖ならびに分岐はどちらも、さらに多くのヘテロ原子、たとえばＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＳｉを含み得る。
【００８１】
「脂環式」という用語は、特に別の記載がない限り、非芳香族環状炭化水素部分（飽和または一不飽和もしくは多不飽和であってもよい）を含み得る。環状炭化水素部分は、非芳香族環状ならびに鎖エレメントで置換されていてもよい。環状炭化水素部分の主鎖は、特に別の記載がない限り、任意の長さであり得、任意の数の非芳香族環状および鎖エレメントを含み得る。環状炭化水素部分ならびに環状および鎖置換基はどちらも、ヘテロ原子、たとえばＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＳｉをさらに含み得る。
【００８２】
「芳香族」という用語は、特に別の記載がない限り、単環であるか、または複数の縮合環もしくは共役結合した環を含み得る、共役二重結合を有する平面的環状炭化水素部分を意味する。環状炭化水素部分の主鎖は、特に別の記載がない限り、任意の長さを有するものであり得、任意の数のヘテロ原子，例えば、Ｎ、ＯおよびＳを含み得る。
【００８３】
「アリール脂肪族」という用語によって、１以上のアリール基が１以上の脂肪族基上の置換基と結合しているか、または１以上の脂肪族基上の置換基である炭化水素部分を意味する。したがって、「アリール脂肪族」という用語は、例えば、２以上のアリール基が、１以上の脂肪族鎖または任意の長さの鎖、例えばメチレン基を介して結合している炭化水素部分を含む。
【００８４】
本明細書において用いられる「脂肪族」、「脂環式」、「芳香族」および「アリール脂肪族」という用語のそれぞれは、それぞれの部分の置換形態および非置換形態の両方を包含することを意味する。置換基は、任意の官能基、たとえばこれらに限定されないが、アミノ、アミド、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、イソシアノ、ジチアン、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、有機金属、有機ホウ素、セレノ、シリル、シラノ、スルホニル、チオ、チオシアノ、トリフルオロメチルスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ブロモベンゼンスルホニル、ニトロベンゼンスルホニル、およびメタンスルホニルであり得る。
【００８５】
式（Ｉ）の典型的な化合物は、アデノシンの類似体（炭素環式類似体を包含する）と呼ぶことができる。好適な化合物の実例は、３−デアザンプラノシンＡ（５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０２０５２−９５−９）、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（１−ヒドロキシエチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１４６４２４−８１−９、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（１，１−ジヒドロキシプロピル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−６３−１、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−［１−ヒドロキシ−２−プロペニル］−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−６１−９、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−４−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−６７−５、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（２−プロペニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−５８−４、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−メチル−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．２２４４５３−１３−８、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１１１００５−７１−１、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−４−クロロ−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−６４−２、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８８８２４−０６−０、４−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３ａ，６ａ−ジヒドロ−２，２−ジメチル−４Ｈ−シクロペンタ−１，３−ジオキソール−６−メタノール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８８８２４−０８−２、Ｎ−［９−［５−（アセチルオキシ）−４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン−１−イル］−９Ｈ−プリン−６−イル］−ベンズアミド、ＣＡＳ−Ｎｏ．８３８４４−３３−１，５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（メトキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１３８５７１−４８−９、４−メチル−安息香酸［３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシ−５−［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−１−シクロペンテン−１−イル］メチルエステル、ＣＡＳ−Ｎｏ．１４２８８８−０７−１、５−（６−アミノ−２−フルオロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．（塩酸塩）１３８６６０−０７−８、５−（６−アミノ−８−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−クロロ−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−７２−２、３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４，５−ジヒドロキシ−１−シクロペンテン−１−カルボン酸、ＣＡＳ−Ｎｏ．１７９９２９−２９−４、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−プロピル−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−４９−３、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（フルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．３０３９６４−１４−９、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−（フルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８０５２４５−５１−６、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−（メルカプトメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８０５２４５−５４−９、５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（１−ヒドロキシ−２−プロピニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１４１７９４−３６−７、９−［（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−６−［［［（１，１−ジメチルエチル）ジフェニルシリル］オキシ］メチル］−３ａ，６ａ−ジヒドロ−２，２−ジメチル−４Ｈ−シクロペンタ−１，３−ジオキソール−４−イル］−９Ｈ−プリン−６−アミン、ＣＡＳ−Ｎｏ．９５２４１８−１２−１、９−［（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−３ａ，６ａ−ジヒドロ−２，２−ジメチル−６ａ−［２−（トリフェニルメトキシ）エチル］−４Ｈ−シクロペンタ−１，３−ジオキソール−４−イル］−９Ｈ−プリン−６−アミン、ＣＡＳ−Ｎｏ．９０２４５５−２９−２、９−［（３’ａＳ，６’ａＲ）−３’ａ，６’ａ−ジヒドロスピロ［シクロヘキサン−１，２’−［４Ｈ］シクロペンタ［１，３］ジオキソール］−４’−イル］−９Ｈ−プリン−６−アミン、ＣＡＳ−Ｎｏ．８７４４４３−９７−７、９−［（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−３ａ，６ａ−ジヒドロ−２，２−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−シクロペンタ−１，３−ジオキソール−４−イル］−９Ｈ−プリン−６−アミン、ＣＡＳ−Ｎｏ．８７２６２４−４１−４、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（トリフルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８７２６２４−３５−６、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（１，１−ジヒドロキシ−２−プロペニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−５４−０、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（２−プロペニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ８５１０７１−５０−６、１−［３’ａＳ，６’ａＲ）−３’ａ，６’ａ−ジヒドロスピロ［シクロヘキサン−１，２’−［４Ｈ］シクロペンタ［１，３］ジオキソール］−４’−イル］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−アミン、ＣＡＳ−Ｎｏ．８７４４４３−９８−８、（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ−［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．９４８３０６−８７−４、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｓ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−（フルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８０５２４５−５１−６、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−８９−４の化合物、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−８５−０の化合物、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−８２−７の化合物、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−７９−２の化合物、ＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−７７−０の化合物、およびＣＡＳ−Ｎｏ．１０６２２３８−６６−７の化合物である。
【００８６】
一般式（Ｉ）の化合物は、たとえば典型的には、翻訳後ヒストン修飾パターンの変更、特に、１以上のヒストンメチル化もしくはヒストンアセチル化の変更を実施または予防することができる。このような化合物は、典型的には、図５Ｃに示すように、ヒストン３上のリシン２７の脱メチル化またはヒストン４上のリシン２０の脱メチル化の実施および／または（特に、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座での）これらのリシン残基のメチル化の予防が可能である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と併用される。任意のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を本発明に関連して使用することができる。様々な化学的分類からヒストンデアセチラーゼ阻害剤が記載され、その最も重要な４種類は（ｉ）ヒドロキサム酸類似体、（ｉｉ）ベンズアミド類似体、（ｉｉｉ）環状ペプチド（一般的にテトラペプチド）／ペプトリド（ｐｅｐｔｏｌｉｄｅ）および（ｉｖ）脂肪酸類似体である。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、様々なヒストンデアセチラーゼに対する特異性が異なる。これらの酵素は、それらの配列相同性および発現パターンにしたがって４つの主な種類に分類される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、主な４種類のヒストンデアセチラーゼに対する特異性が異なる。これらの酵素は、それらの配列相同性および発現パターンにしたがって４種類に分類される。一般的に、ヒドロキサム酸類似体は、クラスＩ、ＩＩ、ＩＶ酵素に対して有効であり、ベンズアミド類似体は、クラスＩに対して有効であり、一部はクラスＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶに対しても有効であり、環状ペプチド／ペプトリドはクラスＩに対して有効であり、脂肪酸類似体はクラスＩおよびＩＩに対して有効である。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対する簡単な概説が最近、ＳｍｉｔｈおよびＷｏｒｋｍａｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｃｅｌ．２００８．０９．００８）によって記載され、さらに広い意味では、Ｓｚｙｆ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００９）４９，２４３−２６３）によって記載されている。
【００８８】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の好適な例としては、これらに限定されないが、Ｎ’−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−オクタンジアミド（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ）、ピロキサミド、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキシアミド（ＣＢＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、トリコスタチンＣ、サリチルヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、アゼライックビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）、アゼライック−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（ＡＡＨＡ）、６−（３−クロロフェニエルウレイド）カルポイック（ｃａｒｐｏｉｃ）ヒドロキサム酸（３Ｃｌ−ＵＣＨＡ）、オキサムフラチン、Ａ−１６１９０６、スクリプタイド、ＰＸＤ−１０１、ＬＡＱ−８２４、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド（ＣＨＡＰ）、ＩＴＦ−２３５７、ＭＷ２７９６、ＭＷ２９９６、トラポキシンＡ、ＦＲ９０１２２８（ＦＫ２２８もしくはデプシペプチド）、ＦＲ２２５４９７、アピシジン、ＣＨＡＰ、ＨＣ毒素、ＷＦ２７０８２、クラミドシン、酪酸ナトリウム、イソ吉草酸塩、吉草酸塩、４−フェニル酪酸塩（４−ＰＢＡ）、４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＳ）、アルギニンブチレート、プロピオネート、ブチルアミド、イソブチルアミド、フェニルアセテート、３−ブロモプロピオネート、トリブチリン、バルプロ酸、バルプロエート、ＣＩ−９９４、ＭＳ−２７−２７５（ＭＳ−２７５もしくはＳＮＤＸ−２７５）、ＭＳ−２７−２７５の３’−アミノ誘導体、ＭＧＣＤ０１０３またはデプデシン、およびＳＮＤＸ−２７５が挙げられる。多くのヒストンデアセチラーゼ阻害剤が現在、臨床試験中であり、ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（登録商標））が最近、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療に関してＦＤＡによって承認された。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、一般式（ＩＩ）または一般式（ＩＩＩ）：
【００９０】
【化３】
2011504462.tif 000005
の化合物である。これらの一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、Ｌは、１〜約８個の主鎖炭素原子および０〜約３個のヘテロ原子、例えばＮ、ＯもしくはＳｉを含む脂肪族もしくはアリール脂肪族基を含むブリッジである。Ｒ６は、Ｈ、アミノ基、エーテル基、脂肪族基またはアリール脂肪族基である。Ｒ６がアミノ基である場合、このアミノ基は、独立して２個の部分で置換されていてもよい。これらは、たとえばＨ、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、アリール脂肪族基またはアリール脂環式基であり得る。このような基は、独立して、０〜約３個のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、ＳまたはＳｉを含み得る。Ｒ６がエーテル基である場合、エーテル基の酸素原子は、０〜約３個のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、ＳまたはＳｉを含み得る脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、またはアリール脂環式基で置換されていてもよい。
【００９１】
一般式（ＩＩ）の化合物の例としては、これらに限定されないが、７−［Ｒ−（Ｅ，Ｅ）］−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（トリコスタチンＡ、ＣＡＳ  Ｎｏ．５８８８０−１９−６）、７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６，６−トリメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−８４−３）、４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−δ−オキソ−ベンゼンペンタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３９６７５−９０−４）、Ｎ−ヒドロキシ−６−（ベンゾイル）ヘキサンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．９１４８９−６３−３）、３−ｐ−トルオイル−アクリロヒドロキサム酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．９６９８５−８８−５）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（シクロヘキシルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７９−６）、Ｎ−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−７−（４−メトキシベンゾイル）ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６６９−７６−９）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−６−［４−（ジメチルアミノ）ベンゾイル］−Ｎ−ヒドロキシ−４−メチル−２，４−オクタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−８３−２）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−７−［４−（１−ピペリジニル）フェニル］−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−８１−０）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−７−［４−（１−ピロリジニル）フェニル］−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−８０−９）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−７−［４−［［（４−メトキシフェニル）メチル］アミノ］フェニル］−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７７−４）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（シクロペンチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７８−５）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−７−［４−［（フェニルメチル）アミノ］フェニル］−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７６−３）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−［４−［（１−メチルエチル）アミノ］−フェニル］−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７４−１）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジブチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７２−９）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７０−７），（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジプロピルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメ��ル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７１−８）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−［４−［（２−メチルプロピル）アミノ］フェニル］−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７５−２），（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−［ビス［（４−メトキシフェニル）メチル］アミノ］フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０５１９４４−７３−０）、Ｎ−ヒドロキシ−４−メトキシ−ε，ε−ジメチル−ζ−オキソ−ベンゼンヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０４４２３８−８０−３）、９−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−Ｎ−ヒドロキシ−９−オキソ−２，４−ノナジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０２５３０４−９６−４）、６−［［４−［３−（ヒドロキシアミノ）−１，３−ジオキソプロピル］フェニル］アミノ］−３−ピリジンカルボン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．８６７３３６−５９−２）、Ｎ−ヒドロキシ−β，４−ジメチル−γ−オキソ−ベンゼンブタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．８６１７７７−２１−１）、７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．５０３６１０−７７−３）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−６−メチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．６７４７６７−３２−９）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−（４−アミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．５２８８５４−９３−５）、Ｎ−ヒドロキシ−ε−オキソ−４−フェノキシ−ベンゼンヘキサンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４６１４０４−９９−９）、（Ｅ，Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−７−［（４−ビフェニル）カルボニル］−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７１−６０−１）、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−［４−（メチルアミノ）フェニル］−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．５２８８５４−９２−４）、４’−クロロ−Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−［１，１’−ビフェニル］−４−オクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４６１４０４−９３−３）、４’−クロロ−Ｎ−ヒドロキシ−ζ−オキソ−［１，１’−ビフェニル］−４−ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４６１４０４−９２−２）、Ｎ−ヒドロキシ−７−［４−（４−モルホリニル）ベンゾイル］ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−８８−０）、Ｎ−ヒドロキシ−７−［４−（１−ピペリジニル）ベンゾイル］ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−８５−７）、Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−４−（４−フェニル−１−ピペラジニル）−ベンゼンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−８２−４）、Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−４−［（３−ピリジニルメチル）−アミノ］−ベンゼンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−７９−９）、Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−４−（１−ピペラジニル）−ベンゼンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−７２−２）、Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−４−（２−ピリジニルアミノ）−ベンゼンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−７３−３）、４−［４−［８−（ヒドロキシアミノ）−１，８−ジオキソオクチル］フェニル］−１−ピペラジンカルボン酸１，１−ジメチルエチルエステル（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−６９−７）、Ｎ−ヒドロキシ−４−（メチルフェニルアミノ）−η−オキソ−ベンゼンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−６６−４）、Ｎ−ヒドロキシ−７−［４−（４−メトキシフェニル）ベンゾイル］ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−４８−２）、Ｎ−ヒドロキシ−６−（４−メトキシベンゾイル）−ヘキサンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３７−９）、Ｎ−ヒドロキシ−８−（ベンゾイル）オクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３６−８）、Ｎ−ヒドロキシ−５−（ベンゾイル）ペンタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３５−７）、Ｎ−ヒドロキシ−７−（４−フェノキシベンゾイル）ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３１−３）、Ｎ−ヒドロキシ−７−［（４−ビフェニル）カルボニル］ヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−０１−７）および４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ε，γ−ジメチル−ζ−オキソ−ベンゼンヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６６９−８２−７）が挙げられる。
【００９２】
一般式（ＩＩＩ）の化合物の説明に役立つ実例としては、これらに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシ−６−メトキシ−ε−オキソ−２−ナフタレンヘキサンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１１０８４２−４０−５），Ｎ−ヒドロキシ−ζ−オキソ−２−ナフタレンヘプタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３８−０）、Ｎ−ヒドロキシ−η−オキソ−２−ナフタレンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６６９−６８−９）、Ｎ−ヒドロキシ−α−メチル−η−オキソ−２−ナフタレン−オクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７１−２９−２）、Ｎ−ヒドロキシ−６−メトキシ−η−オキソ−２−ナフタレンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７０−３２−４）、Ｎ−ヒドロキシ−ε−オキソ−２−ナフタレンヘキサンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４６１４０４−９４−４）およびＮ−ヒドロキシ−β−メチル−η−オキソ−２−ナフタレンオクタンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２６７１−５５−４）が挙げられる。
【００９３】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば一般式（ＩＩ）の化合物と、一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせは、一般的に、例えば、翻訳後ヒストン修飾パターン、例えばヒストンメチル化およびヒストンアセチル化の変更の実施、たとえば引き起こさせるかもしくは誘発させるか、または予防することができる。翻訳後ヒストン修飾パターンは、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座であり得る。典型的には、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせは、あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去および／またはあるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加を行うことができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせは、あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の付加および／またはあるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の除去の予防も可能である。各組み合わせは、通常、転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去と、転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加との組み合わせを実施することもできる。転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の付加と、転写活性化翻訳後ヒストン修飾の除去との組み合わせを予防することもできる。
【００９４】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせが一般的に実施可能、および／またはその除去が典型的に防止可能な活性化翻訳後ヒストン修飾の例としては、これらに限定されないが、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化が挙げられる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせが一般的に除去可能、および／またはその付加が典型的に防止可能である、転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の例としては、これらに限定されないが、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化が挙げられる。実例として、図５Ｃは、３−デアザンプラノシンＡとトリコスタチンＡとの組み合わせが、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９および／またはリシン１４のアセチル化のレベルを増大させることができることを示す。この図は、これら２つの化合物の組み合わせが、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、ヒストン３上のリシン９のメチル化およびヒストン４上のリシン２０のメチル化のレベルを減少させることができることも示す。
【００９５】
いくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物（上記）およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を連続して投与する。いくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、少なくとも実質的に同時に投与する。いくつかの実施形態において、一般式（Ｉ）の化合物およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、同じ医薬組成物中に含められる。いくつかの実施形態において、この組み合わせを患者に、腸、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口からなる経路の１以上によって投与する。いくつかの実施形態においては、一般式（Ｉ）の化合物およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を同じ経路によって投与する。他の実施形態においては、一般式（Ｉ）の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤とは異なる経路によって投与する。
【００９６】
１以上のさらなる治療剤と「組み合わせた」投与は、同時（並行）および任意の順序での連続投与を包含する。
１１のヒトヒストンデアセチラーゼが同定され、これらは配列および機能的相同性に基づいてクラスＩ（ヒストンデアセチラーゼ１、２、３、８、１１）とクラスＩＩヒストンデアセチラーゼ（ヒストンデアセチラーゼ４、５、６、７、９、１０）とにさらに細分される。加えて、クラスＩＩＩヒストンデアセチラーゼまたはサーチュインとして分類される７の補因子依存性デアセチラーゼがある。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はヒストン尾部の高アセチル化を誘発し、その結果、ＤＮＡクロマチン構造の緩和および抑制された遺伝子の再活性化が起こる。
【００９７】
疾患もしくは障害を治療または予防するための方法であって、かかる治療を必要とする患者に、ＤＡＣＴタンパク質の活性および／または量を調節する物質を投与することによる方法も提供する。いくつかの実施形態において、治療または予防される疾患もしくは障害は、突然変異もしくは生殖細胞株の変更によるものであり得るＷｎｔ／β−カテニンシグナリング変換経路の異常な成分を含む。本発明の方法を用いて治療または予防される疾患もしくは障害は、例えば癌である。
【００９８】
「予防する」という用語は、生物が異常な状態になるか、または異常な状態を起こす可能性を減少させることを意味する。
「治療する」もしくは「治療」または「軽減」とは、治療的処置と予防的対策との両方を意味し、この場合、目的は、生物における異常な状態（病的状態を含む）を予防、減速（減少）または少なくとも部分的に軽減もしくは無効にすることである。治療を必要とするものとしては、すでに障害にかかっているもの、ならびに障害に罹りやすいもの、または障害が阻止（予防）されるべきものが挙げられる。Ｗｎｔが関与する障害が癌である場合、本発明のＤＡＣＴタンパク質の量および／または活性を増加させることを含む治療を受けた後、個体が、以下のものの１以上において、観察可能および／または測定可能な減少を示すか、またはこれらが存在しないならば、この被検体または哺乳動物は、「治療」に成功するか、または減少した全身腫瘍組織量を示す：癌細胞の数の減少または癌細胞の非存在；腫瘍サイズの減少；軟組織および骨中への癌の拡大を包含する末梢器官中への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度減速させ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）；腫瘍成長のある程度までの阻害；および／または特定の癌に関連する１以上の症状のある程度までの緩和；罹患率および死亡率の減少、ならびに生活の質の問題の改善。本発明の使用または方法は、既存の癌細胞の成長の予防および／または殺すことが可能な範囲で、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。これらの兆候または症状の減少も、各患者には感じられる。
【００９９】
治療の成功および障害の改善を評価するための前記パラメータは、医師によく知られている常法によって容易に測定可能である。癌治療に関して、有効性は、たとえば、病状進行までの時間（ＴＤＰ）の評価および／または奏効率（ＲＲ）の決定によって、測定することができる。転移は、病期分類試験および骨のスキャンならびにカルシウムレベルおよび骨への拡大を検出するための他の酵素についての試験によって検出することができる。ＣＴスキャンも、骨盤およびその部分のリンパ節への拡大を探すために行うことができる。胸部Ｘ線および公知方法による肝臓酵素レベルの測定を用いて、それぞれ肺および肝臓への転移を探す。疾患をモニターするための他の常法としては、経直腸超音波検査（ＴＲＵＳ）および経直腸針生検（ＴＲＮＢ）が挙げられる。
【０１００】
「投与する」という用語は、化合物を生物の１以上の細胞または組織中に組み入れる方法に関する。
「治療効果」という用語は、異常な状態を引き起こすか、または異常な状態に貢献する因子の阻害または活性化を意味する。治療効果とは、異常な状態の症状の１以上をある程度軽減する。
【０１０１】
「異常性」または「異常な」という用語は、細胞シグナル変換プロセスの機能とあわせて、生物において過剰発現されるかまたは過小発現され、その触媒活性が、対応する野生型活性よりも低くなるかもしくは高くなるように変更され、天然の結合パートナーとそれ以上相互作用できなくなるか、別の因子、例えば、タンパク質もしくはタンパク質ホスファターゼによってそれ以上修飾されないか、または天然の結合パートナーとそれ以上相互作用しなくなるように変更されている、このようなプロセスの成分、例えばキナーゼを意味する。
【０１０２】
ＤＡＣＴタンパク質の量もしくは活性の減少によって引き起こされる異常な状態は、生物の細胞または組織が、生物内または生物の外部に存在する場合、予防または処置することができる。生物の外側に存在する細胞は、細胞培養皿中で維持または成長させることができる。生物内に含まれる細胞に関して、経口、非経口、経皮、注射、およびエアロゾル適用をはじめとする（これらに限定されない）、化合物を投与するための多くの技術が当該分野には存在する。生物の外側の細胞に関して、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術、および担体技術をはじめとする（これらに限定されない）、化合物を投与するための多数の技術が当該分野において存在する。
【０１０３】
異常な状態は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換経路に異常を有する細胞群に化合物を投与することによっても予防もしくは処置することができ、細胞は、生物に含まれるか、または生物の一部である。化合物を投与することが生物機能に及ぼす影響を次いでモニターすることができる。生物は、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、イヌ、サルまたは類人猿などの哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態において、生物はヒトである。
【０１０４】
「異常な状態」という用語は、生物の正常または標準的機能から逸脱した、生物の細胞または組織における機能を意味する。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、または細胞生存と関連づけることができる。「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害、たとえば腫瘍を意味する。「腫瘍」という語は、本明細書で用いる場合、すべての新生細胞成長および増殖（悪性もしくは良性）、ならびに全ての前癌ならびに癌性細胞および組織を意味する。したがって、「腫瘍発生」という語は、新生細胞成長および増殖の誘発を包含する生成を意味する。腫瘍発生の一例は、発癌現象、つまり癌細胞の生成であり、これは典型的には、体細胞の癌細胞（癌幹細胞を包含する）への形質転換の結果である。
【０１０５】
異常な細胞増殖状態としては、癌、線維性および糸球体間質障害、異常な血管新生および血管形成、創傷治癒、乾癬、真性糖尿病、および炎症が挙げられる。さらに、増殖性疾患は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が無効になった状態に関連し得る。その発現がＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換経路の制御下にある多くのタンパク質は、アポトーシス経路と関連するので、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換経路における異常性は、細胞不死をもたらし得る。
【０１０６】
本発明の方法および使用において、さらなる化合物、例えば、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の活性を変更する化合物、例えば、その拮抗薬を用いることができる。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメイン相互作用の拮抗薬である低分子量有機化合物の例は、Ｙｏｕら（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２００８）７，６，１６３３−１６３８）によって開示されたインドール−２−カルビノール誘導体である。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメイン相互作用拮抗薬のさらなる好適な例は、Ｍａｈｉｎｄｒｏｏら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００８）１８，９４６−９４９）によって開示されたインドール−２−カルボン酸アミド誘導体である。
【０１０７】
たとえば３−デアザンプラノシンＡおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤と、または前述の組成物と組み合わせて使用することができるさらなる化合物のさらなる例は、タンパク質キナーゼの機能を阻害する化合物である。タンパク質キナーゼの機能を阻害することが報告されている低分子量化合物の例としては、これらに限定されないが、ビス単環式、二環式または複素環式アリール化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２０６４２）、ビニレン−アザインドール誘導体（国際特許出願ＷＯ９４／１４８０８）、１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン（米国特許第５，３３０，９９２号）、スチリル化合物（米国特許第５，２１７，９９９号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第５，３０２，６０６号）、あるキナゾリン誘導体（ＥＰ特許出願番号０５６６２６６Ａ１）、セレオインドールおよびセレン化物（国際特許出願ＷＯ９４／０３４２７）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際特許出願ＷＯ９２／２１６６０）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際特許出願ＷＯ９１／１５４９５）が挙げられる。
【０１０８】
タンパク質キナーゼ活性を調節できる物質の他の例としては、これらに限定されないが、インドリノン、チロホスチン、キナゾリン、キノキサリン、およびキノリンが挙げられる。前記のインドリノン、キナゾリン、チロホスチン、キノリン、およびキノキサリンは、文献に記載されている周知の化合物を包含する。
【０１０９】
本発明の化合物、医薬組成物、方法または使用と併せて使用できる化合物のさらなる例は、癌の成長を促進できるホルモンの影響を調節、減少、阻止、または阻害するように作用する抗ホルモン剤である。このような化合物は、多くの場合、全身的または身体全体の治療の形態である。これらは、ホルモン自体であり得る。例としては、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン・レセプター・モジュレータ（ＳＥＲＭ）、たとえば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを包含する）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹｌ１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方制御因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または活動停止させる働きをする薬剤、たとえば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作用薬、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン；他の抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、たとえば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールが挙げられる。加えて、化学療法薬のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロネート（たとえば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴ  Ａ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの、たとえば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、たとえば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても知られる、ＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。「薬学的に許容される」という用語は、本明���書において用いられる場合、使用される用量もしくは量で、望ましくない生理学的作用、例えば吐き気、めまいまたは急性胃蠕動異常高進を少なくとも基本的に引き起こすことなく、ヒトに投与できる被投与物質、例えば、組成物、担体、希釈剤または活性化合物の性質を意味する。特に、かかる物質の使用量もしくは用量は、組成物の投与を禁止する程度までのこのような作用を起こさない。
【０１１０】
「成長阻害剤」という用語は、本明細書において用いられる場合、生体外もしくは生体内のいずれかで、細胞、特にＷｎｔシグナリング活性を有する癌細胞の成長を阻害する化合物または組成物を意味する。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期のかかる細胞の割合を有意に減少させるものであり得る。成長阻害剤の例としては、細胞周期の進行（Ｓ期以外の場所で）を阻止する薬剤、例えばＧ１抑制およびＭ期抑制を誘発する薬剤が挙げられる。伝統的なＭ期ブロッカーとしては、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン類、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンが挙げられる。Ｇ１を抑制するこれらの薬剤、たとえば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃはまた、Ｓ期抑制にまでも波及する。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、どちらもイチイ由来の抗癌剤である。ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））は、ヨーロッパイチイ由来であって、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管を組み立てるのを促進し、解重合を予防することによって微小管を安定化させ、その結果、細胞における有糸分裂を阻害する。
【０１１１】
医薬組成物中に含めることができる他の活性成分の例としては、これらに限定されないが、核酸アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、アロマターゼ阻害剤、葉酸拮抗薬、エストロゲン・レセプター・モジュレータ、無機ヒ酸塩、ニトロソウレア、破骨細胞阻害剤、白金含有化合物、レチノイド、トポイソメラーゼ１阻害剤、トポイソメラーゼ２阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、イソフラボン、チロシンキナーゼ阻害剤、成長因子、ビスホスホネート、およびモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１１２】
本発明の医薬組成物中に含めることができるアルキル化剤としては、これらに限定されないが、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）、Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標）、ＭＥＳＮＡを含むか、または含まない）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標））、グルフォスファミド、メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、およびテモゾラミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））が挙げられる。説明に役立つ実例として、化合物２−ビス［（２−クロロエチル）アミノ］テトラ−ヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン、２−オキシド（一般的にはシクロホスファミドとしても知られる）は、ＩＩＩ期およびＩＶ期悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、卵巣腺癌、網膜芽腫、および乳癌の治療において使用されるアルキル化剤である。
【０１１３】
本発明の医薬組成物中に含めることができるアントラサイクリンとしては、これらに限定されないが、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、バルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ（登録商標））、およびエピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））が挙げられる。一例として、化合物（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−（４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオン（より一般的には、ドキソルビシンとして知られる）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．  ｃａｅｓｉｕｓの培養物から単離される、細胞毒性アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンを用いて、播種性腫瘍性状態、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、軟組織および骨肉腫、乳癌、卵巣癌、移行細胞膀胱癌、甲状腺癌、ホジキン型および非ホジキン型の両リンパ腫、気管支癌、および胃癌において退縮をもたらすのに成功している。  本発明の医薬組成物中に含めることができる抗生物質としては、これらに限定されないが、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））、ダウノルビシン／ダウノマイシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）、ＤａｎｕｏＸｏｍｅ（登録商標））、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、エピルビシン（Ｐｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ（登録商標））およびミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））が挙げられる。本発明の実施において有用なアロマターゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））およびレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））が挙げられる。本発明の医薬組成物中に含めることができるビスホスホネート阻害剤としては、これに限定されないが、ゾレドロネート（Ｚｏｍｅｔａ（登録商標））が挙げられる。
【０１１４】
本発明の組成物中に含めることができるシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、アセチルサリチル酸（Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標））、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標）、Ｃｅｏｘｘ（登録商標）、Ｃｅｅｏｘｘ（登録商標））が挙げられる。本発明の組成物中に含めることができるエストロゲン・レセプター・モジュレータとしては、これらに限定されないが、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））およびフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））が挙げられる。本発明の組成物中に含めることができる葉酸拮抗薬としては、これらに限定されないが、メトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標））およびトリメトレキサート（Ｎｅｕｔｒｅｘｉｎ（登録商標））が挙げられる。説明に役立つ実例として、化合物（Ｓ）−２−（４−（（（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル）メチルアミノ）ベンズアミド）ペンタン二酸（一般的にはメトトレキサートとして知られる）は、妊娠性絨毛癌の治療ならびに破壊性絨毛腺腫および胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｆｏｒｍ  ｍｏｌｅ）の患者の治療で用いられてきた抗葉酸薬である。これは、末期の悪性リンパ腫の治療および進行した菌状息肉腫の治療においても有用である。
【０１１５】
前述のように、本発明は、発癌性を包含する腫瘍原性になる危険性がある細胞、および／または腫瘍原性に変わる傾向を有する細胞を同定する方法にも関する。本発明はさらに、予後の方法、病状を評価する方法、個体の腫瘍を含む個体の治療に対する反応性を予測する方法、治療に対する反応の可能性を評価する方法、疾患の経過を予想する方法、および癌などの腫瘍を有することが知られているか、または発症することが疑われる個体の癌の治療効果をモニターする方法に関する。いくつかの実施形態において、各方法は、新生物が一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であるかどうかを予測する方法である。新生物、例えば、癌などの腫瘍は、いくつかの実施形態においては、哺乳動物中に含まれていてもよい。
【０１１６】
これらの方法は、３つのパラメータのうちの１以上を評価することを含む。これらのパラメータの第１のものは、各細胞中または各個体の細胞中のＤＡＣＴタンパク質の量である。このような細胞はまた、対応する個体から単離されているか、または対応する個体から採取された組織試料の細胞でもあり得る。
【０１１７】
前記の３つのパラメータのうちの第２のものは、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の活性であり、第３のパラメータは、ヒストン修飾、一般的には、ヒストンのメチル化および／またはヒストンのアセチル化のパターンである。細胞または組織試料におけるＤＡＣＴタンパク質の量もしくは活性を評価する場合、ＤＡＣＴタンパク質の量または活性の減少は、細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である。診断に関連して、ＤＡＣＴタンパク質の活性および／または細胞量のこのような減少は、個体が癌を発症する危険性が増大したことを意味する。新生物の感受性を予想する場合、ＤＡＣＴタンパク質の量または活性の減少は、新生物が一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることの徴候であり得る。
【０１１８】
ヒストンのメチル化および／またはヒストンのアセチル化のパターンは、たとえば、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座で評価することができる。ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座とは、ＤＡＣＴタンパク質をコードする配列を含む領域をさすと理解される。いくつかの実施形態においては、各遺伝子の転写開始の約９００ｂｐ下流、たとえばその約６００ｂｐ下流から、ＤＡＣＴタンパク質をコードする配列の端部までの領域をさす。いくつかの実施形態においては、領域ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子の転写開始の約６００ｂｐ下流から、遺伝子の転写開始までの領域をさし、遺伝子のコーディング領域を含み得る。ヒストン３上のリシン９および／またはリシン１４の減少したアセチル化は、細胞が、腫瘍原性に変わる傾向を有することの徴候である。診断に関連して、ヒストン３上のリシン９および／またはリシン１４の減少したアセチル化は、個体が癌を発症する危険性が増大したことの徴候である。ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の増加も、細胞が腫瘍原性に変わる傾向を有することの徴候である。ヒストン４上のリシン２０およびヒストン３上のリシン９のさらに増加したメチル化は、典型的には、細胞が腫瘍原性に変わる傾向を有することのさらなる徴候である。同様に、診断に関連して、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の上昇した値は、個体が癌を発症する危険性が増大したことの徴候である。ヒストン４上のリシン２０およびヒストン３上のリシン９のメチル化のさらなる増加は、典型的には、個体が癌を発症する危険性が増大したことのさらなる徴候である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、このような方法は、一般式（Ｉ）の化合物（上記）とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との併用投与を含む治療法に対して個体が反応する可能性を評価する方法である。ヒストン３上のリシン９および／またはリシン１４のアセチル化の減少は、各個体が、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との併用投与を含む治療法に対して反応することの徴候である。さらに、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の増加は、各個体がこのような治療法に対して反応することの徴候である。ヒストン４上のリシン２０およびヒストン３上のリシン９のメチル化のさらなる増加は、典型的には、個体がこのような治療法に対して反応することのさらなる徴候である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、発現、細胞下の局在化および／またはＤＡＣＴタンパク質の活性を、例えば、生物またはその組織もしくは細胞において検出することを含む。説明に役立つ実例として、細胞量、発現、細胞下の局在化および／またはＤＡＣＴタンパク質の活性を、長時間にわたってモニターすることができる。
【０１２１】
本発明の方法は、ＤＡＣＴタンパク質の細胞量、発現、細胞下の局在化および／または活性の測定結果を、対照測定（すなわち「参考」測定）の結果と比較することをさらに含む。このような対照測定において、１以上の前記パラメータ、すなわちＤＡＣＴタンパク質の量、ＤＡＣＴタンパク質の活性、およびヒストン修飾のパターンを、対照組織もしくは対照細胞において評価する。このような対照組織もしくは対照細胞は、一般的に、腫瘍原性になる危険性が少なくとも本質的にないものである。いくつかの実施形態において、１以上のパラメータを、多くの事前の対照測定で得られ、おそらくは統計的に分析された平均値と比較する。診断的背景のいくつかの実施形態において、たとえば既存の平均データに対する差が潜在的にわずかであることを考慮して疑わしい場合、１以上の対照測定を実施するために、同じ個体から得られる１以上の組織試料を使用することができる。各試料は、典型的には、腫瘍原性に変わる危険性が比較的低いと予想されるか、または腫瘍原性になる潜在的な危険性がなく、健常な組織であることが既知の組織から採取することができる。
【０１２２】
腫瘍発生の阻止、阻害または予防に適した化合物の同定法（下記参照）に関連して、対照測定は、ＤＡＣＴタンパク質の細胞量、発現、細胞下の局在化および／または活性を調節しない条件の使用を含み得る。細胞量、発現、および／または活性の比較において、検出されたレベルを、例えば、対照レベルと比較することができる。本明細書において用いられる「対照レベル」という用語は、例えば、細胞における各タンパク質の分子の数、ＤＡＣＴタンパク質のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベル、ならびに対照試料におけるＤＡＣＴタンパク質の活性レベルを意味する。この用語は、したがって、正常な対照レベルと癌対照レベルの両方を包含する（これについても下記を参照）。この用語は、１つの参考測定または複数の参考測定を意味し得る。いくつかの実施形態において、対照レベルは、事前に行われた測定から得られる発現もしくは活性値のデータベースであり得る。「慣例的レベル」とは、正常で健康な個体または癌をはじめとする新生物に罹っていないことが既知の個体の集団において検出されたＤＡＣＴタンパク質の発現レベルまたはＤＡＣＴタンパク質の活性レベルを意味する。正常な個体とは、各新生物の臨床的症状のないものである。
【０１２３】
本発明によると、例えば、タンパク質の遺伝子発現／活性／量が、対照レベルと比較して、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれ以上増加または減少する場合、たとえば細胞における、タンパク質の遺伝子発現レベルまたは活性レベルまたは量は、「変わる」か、または「異なる」と見なされる。あるいは、発現レベルまたは活性レベルは、遺伝子発現／または活性が、対照レベルと比較して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．２倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍またはそれ以上増加もしくは減少した場合に、「増加」または「減少」したと見なされる。
【０１２４】
本発明の方法は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、例えばＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−１、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−２もしくはＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−３の細胞における量を変更することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の活性化を予防、阻害、阻止もしくは無効化することを含む。典型的な実施形態において、ＤＡＣＴタンパク質の量もしくは活性を調節すると、その結果、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の活性が調節され、細胞においてＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が分解される。
【０１２５】
一般式（Ｉ）の化合物およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、代謝産物またはプロドラッグの形態でも用いることができる。
本明細書で用いる場合、「プロドラッグ」という用語は、ヒトまたは動物の体内で、例えば、酵素的、機械的、電磁的に、医学的効果を有するその活性形態に変換されるか、またはそのような形態で放出される化合物である。「プロドラッグ」とは、したがって、親「薬物」分子の薬理学的に不活性な誘導体である。これは、投与されるヒトもしくは動物の生理系内での自発的または酵素生体内変換を必要とする。「プロドラッグ」は、安定性、毒性、特異性の欠如、または限定されたバイオアベイラビリティーと関連する問題を克服するために、当該分野で一般的に使用される。これらはしばしば、哺乳動物において、溶解度、組織適合性、または遅延放出の利点をもたらす。説明に役立つ実例として、「プロドラッグ」は、その部分もしくは官能基を遮蔽し、これによって金属トライアンギュロ（ｔｒｉａｎｇｕｌｏ）化合物の活性を可逆的に抑制する保護基を有する、金属トライアンギュロ化合物であり得る。各「プロドラッグ」は、保護基が加溶媒分解もしくは酵素除去を受けた場合に、生体内もしくは生体外で薬物学的に活性になり得る。さらなる実例として、官能基は、生化学的変換、例えば酸化、リン酸化、またはグリコシル化によってのみ、一般式（Ｉ）の化合物中に導入することができる。したがって、各「プロドラッグ」は、ヒトもしくは動物の体内で、酵素、胃酸等によってのみ、一般式（Ｉ）の化合物に変換され得る。一般式（Ｉ）の化合物の「プロドラッグ」は、水和物であってもよいし、非水和物であってもよい。一般的な「プロドラッグ」としては、酸誘導体、例えば、親酸の好適なアルコール（たとえば、低級アルカノール）との反応によって調製されるエステル、親酸化合物のアミン（たとえば、前述のようなもの）との反応によって調製されるアミド、または反応してアセチル化塩基誘導体（たとえば、低級アルキルアミド）を形成する塩基性基が挙げられる。
【０１２６】
本明細書において記載する化合物、ならびに本発明の方法によって同定される化合物は、細胞、動物またはヒト患者にそれ自体で、または医薬組成物で投与することができ、医薬投与形態においては、これらは併用療法として他の活性成分と混合されるか、または、安定剤、可溶化剤および乳化剤をはじめとする好適な担体または賦形剤と混合される。このような担体、賦形剤または安定剤は、通常、用いられる投与量および濃度で、これにさらされる細胞もしくは哺乳動物に対して無毒であるという点で、薬学的に許容される。多くの場合、生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリセリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩を形成するカウンターイオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）が挙げられる。経路の例としては、これらに限定されないが、経口、経皮、および非経口送達が挙げられる。
【０１２７】
好適な投与経路は、たとえば、デポー、経口、直腸、経粘膜、もしくは腸投与；筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻内、もしくは眼内注射をはじめとする非経口送達が挙げられる。好適な投与経路としては、たとえば、デポー、経口、直腸、経粘膜、または腸投与、非経口送達、たとえば筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻内、もしくは眼内注射が挙げられる。化合物もしくは医薬組成物を、全身的ではなく局所的方法で、たとえば、化合物の注射によって、固形腫瘍中に直接、例えばデポーもしくは持続放出処方で投与することもできる。さらに、各化合物もしくは医薬組成物を、標的薬物送達系、たとえば、腫瘍特異性抗体でコーティングされたリポソーム中で用いることができる。このようなリポソームは、例えば、腫瘍によって選択的に標的とされ、吸収され得る。
【０１２８】
さらに、薬物を、標的薬物送達系中、たとえば、腫瘍特異性抗体でコーティングされたリポソーム中で投与することができる。リポソームは腫瘍によって選択的に標的とされ、吸収される。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、たとえば通常の混合、溶解、造粒、糖衣錠化、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【０１３０】
本発明にしたがって用いられる医薬組成物は、このように従来の方法で、賦形剤および活性化合物を薬剤的に使用できる製剤に加工するのを促進する助剤をはじめとする、１以上の生理学的に許容される担体を用いて処方できる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
【０１３１】
注射に関して、本発明の化合物を、水溶液、たとえば生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩緩衝液中に処方することができる。経粘膜投与に関して、バリアに浸透させるために適切な浸透剤を処方中で用いる。このような浸透剤は、当該分野において一般的に公知である。
【０１３２】
経口投与に関して、化合物は、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に処方することができる。かかる担体は、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、本発明の化合物が処方されるのを可能にする。
【０１３３】
経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤を添加し、場合によって、結果として得られた混合物を粉砕し、所望により好適な助剤を添加した後に、顆粒混合物を加工して、錠剤もしくは糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤は、特に、フィラー、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールをはじめとする糖；セルロース調製物、たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【０１３４】
所望により、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。
糖衣錠コアに、好適なコーティングを提供する。この目的のために、濃縮糖溶液を使用することができ、濃縮糖溶液は、場合によって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。識別のため、または活性化合物用量の様々な組み合わせを特徴づけるために、色素または顔料を錠剤もしくは糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０１３５】
経口的に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールもしくはソルビトールで作られた軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、フィラー、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または潤滑剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウムおよび、場合によって、安定剤との混合物中で活性成分を含むことができる。ソフトカプセル中、活性化合物を、好適な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶解もしくは懸濁させることができる。加えて、安定剤を添加することができる。すべての経口投与用処方は、かかる投与に適した用量でなければならない。口腔投与に関して、組成物は、通常の方法で処方される錠剤もしくはロゼンジの形態をとることができる。
【０１３６】
吸入による投与に関して、本発明による使用のための化合物は、好適なプロペラント、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するためのバルブを提供することによって投与単位を決定することができる。吸入器もしくは注入器中で使用するための、たとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物および好適な粉末基剤、例えばラクトースもしくはデンプンとの粉末ミックスを含んで処方することができる。
【０１３７】
化合物を、注射、たとえば、ボーラス注入法もしくは持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用処方を、単位投与形態で、たとえば、アンプル中もしくは多用量容器中、保存料を添加して提示することができる。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、製剤化剤、例えば、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤を含み得る。
【０１３８】
非経口投与用医薬処方は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含む物質を含有し得る。場合によって、懸濁液は、好適な安定剤または、化合物の溶解度を増加させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤も含み得る。
【０１３９】
あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、たとえば、滅菌脱パイロゲン水で構成するための粉末形態であり得る。化合物は、たとえば、通常の坐剤基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを含む直腸組成物、例えば坐剤または停留浣腸に処方することもできる。
【０１４０】
すでに記載した処方に加えて、化合物は、デポー製剤として処方することもできる。このような長時間作用型処方は、移植（たとえば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、好適なポリマーもしくは疎水性材料（たとえば、許容される油中エマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、たとえば難溶性塩として、化合物を処方することができる。
【０１４１】
本発明の疎水性化合物用医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の無水エタノール溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は、５％の水中デキストロース溶液で１：１に希釈されたＶＰＤから構成される。
【０１４２】
この共溶媒系は、疎水性化合物を十分溶解させ、それ自身、全身的投与に際して低毒性である。必然的に、共溶媒系の割合は、その溶解度および毒性特性を損なうことなく大幅に変化し得る。
【０１４３】
さらに、共溶媒成分の同一性は変化し得る。たとえば、他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに使用することができ、ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えることができ、他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンと置換することができ、他の糖もしくは多糖類をデキストロースと置換することができる。
【０１４４】
疎水性医薬化合物用の他の送達系も用いることができる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物の送達ビヒクルまたは担体のよく知られた例である。ある有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも使用できるが、通常、代償として毒性が高くなる。さらに、化合物は、持続放出系、例えば治療剤を含む固体疎水性ポリマー半透性マトリックスを用いて送達することができる。さまざまな種類の持続放出性物質が確立され、当業者には周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に応じて、化合物を数週間から１００日に及ぶまで放出することができる。治療剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のためのさらなる方略を用いることができる。
【０１４５】
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相担体もしくは賦形剤も含み得る。かかる担体または賦形剤の例としては、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えばポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４６】
本発明において使用できる化合物の多くは、薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供することができる。薬学的に適合性の塩は、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等などをはじめとする多くの酸を用いて形成することができる。塩は、水性または対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒中により可溶性である傾向がある。
【０１４７】
本発明における使用に適した医薬組成物は、活性成分が意図される目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を包含する。さらに具体的には、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減もしくは改善するため、または治療される被検体の生存を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４８】
本発明の方法において用いられる任意の化合物に関して、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。たとえば、投与量は、細胞培養において測定されるＩＣ５０（すなわち、ＤＡＣＴ活性の最大阻害の半量または細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の減少を達成する試験化合物の濃度）を含む血中濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定することができる。
【０１４９】
本明細書において記載する化合物の毒性および治療効果を、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な医療的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との投与量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物を使用することが望ましい。ヒトにおいて使用される投与量範囲を策定する際に、これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いることができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、各医師が選択することができる。
【０１５０】
投与量および投与間隔は、ＤＡＣＴ、調節効果、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために十分な活性成分の血漿レベルを提供するために、それぞれ調節することができる。ＭＥＣは、各化合物について異なり得るが、生体外データ、たとえば、ＤＡＣＴタンパク質の５０〜９０％阻害を達成するために必要な濃度から推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、それぞれの特性および投与経路に依存するであろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を測定することができる。
【０１５１】
投与間隔は、ＭＥＣ値を用いて決定することもできる。化合物は、１０〜９０％、例えば、約３０〜約９０％、例えば約５０〜約９０％の時間でＭＥＣより高い血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与すべきである。局所投与または選択的摂取の場合、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連し得ない。投与される組成物の量は、もちろん、治療される被検体、被検体の体重、苦痛の重篤度、投与方法および処方医師の判断に依存するであろう。
【０１５２】
組成物は、所望により、活性成分を含む１以上の単位投与形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置中で提示することができる。パック、例えばブリスターパックは、例えば、金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書を添付することができる。パックまたはディスペンサーには、医薬の製造、使用または販売を規制する行政機関によって指示された形式で、容器に関連する注意書を添付することもでき、この注意書は、ヒトまたは動物への投与用化合物の形態が行政機関によって承認されたことを反映する。このような注意書は、たとえば、米国食品医薬品局または処方薬についての他の行政機関によって承認されたラベルであるか、または承認された製品への折り込み物であり得る。
【０１５３】
適合性医薬担体中に配合された本発明の組成物を、調製し、適切な容器中に入れ、そして適応症の治療について表示することができる。ラベル上に表示される好適な状態としては、癌の治療が挙げられる。
【０１５４】
本発明によれば、方法、化合物および医薬組成物を、細胞増殖性疾患、例えば腫瘍または癌の治療において使用できる。たとえば良性腫瘍および転移性悪性腫瘍をはじめとする任意の腫瘍または癌を治療のために選択することができる。例としては、これらに限定されないが、血液学的悪性腫瘍および固形腫瘍が挙げられる。固形腫瘍としては、たとえば、結合もしくは支持組織から生じる肉腫、身体の腺細胞および上皮細胞から生じる癌腫、またはリンパ腫、つまりリンパ組織、例えばリンパ節、脾臓、および胸腺の癌が挙げられる。固形腫瘍の例としては、これらに限定されないが、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、肝臓腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣癌、前立腺癌および黒色腫が挙げられる。
【０１５５】
すでに説明したように、本発明は、その量または活性を含む、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の診断的、予後的、および治療的使用を包含する。特に、量または活性に基づいて、特に、治療のモニター、治療に対する反応の予測、最小残存疾患および／または疾患予後の検出の方法および使用を提供する。本発明者等の発見に基づいて、本発明は、細胞における発癌現象を包含する腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な化合物を同定する方法も提供する。これらの方法のいくつかは生体内法または体外法である。この方法のいくつかは、各化合物を同定する生体外法である。化合物は、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントとの複合体を形成することができる。本発明のいくつかの方法は、生体外または生体内のいずれかにかかわらず、この複合体の成分を違いに暴露することを含む。このような一方法は生体外法であり、複合体を形成するか、または形成すると思われる成分を互いに接触させることを含む。例えば、ＤＡＣＴタンパク質および、ＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成すると思われる薬物候補分子を、互いに接触させることができる。化合物は、ＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成を変更することができる。いくつかの実施形態において、各方法は、化合物、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメント、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を接触させることを含む。このような実施形態において、ＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成を検出する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、方法は、複合体の形成を検出することをさらに含む。複合体形成を検出する任意の好適な方法を使用することができる。検出法は、たとえば、電気泳動、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリー、蛍光相関分光法またはこれらの技術の変形態様を含む（これについても前記を参照）。他の技術は、生体分子結合自体の測定を含む。このような測定は、たとえば、分光手段、光化学的手段、測光手段、蛍光定量的手段、放射線学的手段、酵素手段または熱力学手段（上記）に依存し得る。ＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成の増進は、化合物が、細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを意味する。
【０１５７】
方法が生体内法または体外法である場合、これは微生物を提供することを含み得る。微生物はＤＡＣＴ結合タンパク質を発現し、化合物はこのＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成できると考えられ、化合物は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との複合体の形成を増加させると考えられるか、または化合物はその発現を増加させることができると考えられる。微生物は、いくつかの実施形態において、ＤＡＣＴ結合タンパク質を内因的に発現する。いくつかの実施形態において、微生物は、組換え細胞またはトランスジェニック微生物である（前記事項も参照）。
【０１５８】
本発明の方法は、各化合物を微生物に添加することを含む。各方法のいくつかの実施形態においては、ＤＡＣＴタンパク質の発現をモニターする。各方法のいくつかの実施形態においては、ＤＡＣＴタンパク質の活性をモニターする。いくつかの実施形態においては、細胞表現型における変化をモニターする。いくつかの実施形態においては、このような方法は対照測定を包含する（前記事項も参照）。対照測定の結果を、化合物を用いて得られる結果と比較する。対照測定は、例えば、ＤＡＣＴ結合タンパク質の発現または活性に影響をおよぼさないことが知られているか、またはＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の形成に影響を及ぼさないことが知られている化合物の使用を含み得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、各微生物、例えば腫瘍細胞などの細胞を、所定の量の一般式（Ｉ）の化合物（前記を参照）および所定の量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる所定の量の一般式（Ｉ）の化合物を使用する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる所定の量の一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせを使用する。これらの実施形態のいくつかにおいて、少なくとも第１の細胞および第２の細胞を使用する。第１の細胞を、２つの所定の量のうちの少ない方と接触させ、第２の細胞を、２つの所定の量のうちの多い方と接触させる。各実施形態は、例えば、スクリーニングアッセイ、細胞毒性試験または投与量／応答曲線の決定であり得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、第１の細胞（例えば、腫瘍細胞）および第２の細胞（例えば、腫瘍細胞）を同じ患者から入手する。このような方法は、たとえば、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対する患者または動物それぞれの反応を予測する方法であり得る。単一ヌクレオチド多型性および遺伝子発現における個々の違いは、通常、投与された化合物に反応する患者間のそれぞれの差の原因となる。いくつかの実施形態において、本発明の各方法は、それぞれは、一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対する患者の反応に影響を及ぼす遺伝的変異を同定する方法でもあり得る。典型的には、動物または患者に薬物として投与される化合物の影響は、多くのタンパク質によって決定され、したがって、複数の遺伝子における複合遺伝的多型は、非遺伝的要因とあわせて、化合物に対する反応を決定する。本発明の各方法は、したがって、例えば、最小の副作用で最大の有効性を保証するために、患者の遺伝子型を決定する方法であり得る。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態に関して、化合物をライブラリーの形態で使用することができる。かかるライブラリーの例は、モデル化合物として化学的に合成された様々な有機小分子、または多数の配列変化を含む核酸分子の集まりである。
【０１６２】
腫瘍発生を予防、阻害、阻止または無効化できる化合物を同定するために、本発明の方法にしたがって複数の候補化合物を分析する実施形態において、このような実施形態は、典型的には、スクリーニングプロセスと呼ばれる。これらの候補化合物を、互いに独立して、例えば、同時、連続的、または位相がずれた任意の方法で分析することができる。生体内または体外実施形態において、候補阻害剤を、例えば、細胞培地に添加することができるか、または生物、例えばマウスもしくはミバエに投与することができる。いくつかの生体外実施形態において、複数の候補化合物を分析する任意の数のステップを、例えば、自動的に反復して、たとえば市販のロボットを使用して行うことができる。このような目的で、任意の数の自動化装置、たとえば自動化読み取りシステム、ピペットロボット、リンスロボット、または完全自動化スクリーニングシステムを用いることができる。実例として、プロセスは、生体外スクリーニングプロセス、例えば、多孔マイクロプレート（例えば、通常の４８穴、９６穴、３８４穴もしくは１５３６穴プレート）中、１以上の自動化ワークステーションを用いて実施することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、高スループット・スクリーニング・プロセスを提供する。この方法は、たとえば、本発明の方法を実施するために設計されたパーツのキットを用いて実施することもできる。
【０１６３】
さらに他の関連する方法は、宿主生物を提供することを含む生体内法である。腫瘍細胞、例えば、癌細胞に適合し、成長させることができる限り、任意の望ましい宿主生物を提供することができる。宿主生物の例としては、これらに限定されないが、哺乳動物、魚、両生類および鳥が挙げられる。好適な哺乳動物の例については、前記を参照。任意の望ましい癌細胞をこの目的のために使用することができる（例については前記を参照）。方法は、宿主生物中に癌細胞を導入することをさらに含む。さらに、方法は、前記の化合物、すなわち、ＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成することができると予想されるか、ＤＡＣＴ結合タンパク質の量を調節できると予想されるか、ＤＡＣＴ結合タンパク質の活性を調節できると予想されるか、またはＤＡＣＴタンパク質とＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成を増進させることができると予想される化合物の使用を包含する。いくつかの実施形態において、癌細胞はこの化合物を含む。したがって、化合物を癌細胞中に導入した後、これを宿主生物中に導入することができる。いくつかの実施形態において、化合物を、癌細胞を宿主生物中に導入する前、導入後、または導入と同時に宿主生物に投与する。典型的には、化合物を癌細胞中に、方法のある段階で導入する。方法は、宿主生物における腫瘍の成長をモニターすることをさらに含む。
【０１６４】
本発明を、以下の非制限的実施例および添付の図面によってさらに説明する。当業者には本発明の開示から容易にわかるように、本明細書において記載する対応する実施形態例と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、既存または今後開発される物質の他の組成物、手段、使用、方法、またはステップを、同様に、本発明にしたがって利用できる。
【０１６５】
図１。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の重要な特徴の簡略図：（Ａ）Ｗｎｔシグナルの非存在下で、β−カテニンレベルは、細胞質破壊複合体を規定する多タンパク質複合体の形成によって調節される。この複合体は、腫瘍抑制因子腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、骨格タンパク質アキシン、カゼインキナーゼ１（ＣＫＩ））およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を含む。これは、β−カテニンリン酸化を引き起こし、その結果、ユビキチン化について、したがってプロテアソームを介した分解についてこれをマークする。（Ｂ）ＷｎｔのＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）レセプターおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター関連タンパク質、例えばＬＤＬレセプター関連タンパク質６（ＬＲＰ６）との結合によって、Ｄｖｌはこのレセプターに動員され、その活性化をもたらし、これによって、事象のカスケードが開始される。その結果、破壊複合体は抑制され、低リン酸化β−カテニンは安定化され、蓄積し、そして核に移行する。これはＴ細胞因子（ＴＣＦ）および／またはリンパ球エンハンサー結合因子（ＬＥＦ）と複合体を形成し、その結果、ｃ−ＭＹＣ、サイクリンＤ１、ガストリンまたはマトリリシンをはじめとする多くの遺伝子の転写を活性化する。（Ｃ）本発明にしたがってＤＡＣＴの量および／または活性を増加させることは、Ｄｖｌとの複合体形成に至り、その結果、図１Ｂに図示するシグナル変換経路を妨害することが想定される。その結果、図１Ａに示す多タンパク質複合体、β−カテニンはリン酸化し、分解する。
【０１６６】
図２は、ヒトＤＡＣＴ３の転写開始部分におよぶゲノム領域のマッピングを図示する。５’ＲＡＣＥを使用して、実験の手順に記載するように、ＤＡＣＴ３の転写開始部位を決定した。転写開始部位を、背後で「（ＯＲＦ開始コドンに対する）クローンＸの数」で示す。プロモータ領域およびエクソン１におけるＤＮＡ配列を示す。イタリック体の配列（白抜きの長方形）は、エクソン１におけるコーディング領域を示す。
【０１６７】
図３は、ＤＮＡメチル化とは独立した、結腸癌におけるＤＡＣＴ３発現の欠失を示す。Ａ：ヒト結腸直腸腫瘍（Ｔ）および対応した正常粘膜（Ｎ）におけるＷｎｔ阻害剤（上）およびＷｎｔ／β−カテニン標的遺伝子（下）の階層的クラスタリング。上図の白色シグナルは、平均を上回る発現を示し；下図の白色シグナルは、平均を下回る発現を示す。Ｂ：ランダムに選択された８対のヒト結腸直腸腫瘍および対応した粘膜から得られるＳＦＲＰ１ならびにＤＡＣＴ１、２および３のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｃ：メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）アッセイによって検出される８の腫瘍におけるＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ３のメチル化状態。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４は、ＤＡＣＴ３プロモータの全ＣｐＧアイランド（ｉｓｌａｎｄ）を含む調査したＰＣＲ領域を表す。Ｄ：正常組織と比較した、結腸直腸癌細胞株のパネルにおけるＳＦＲＰ１ならびにＤＡＣＴ１、２および３のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｅ：結腸直腸癌細胞株におけるＳＦＲＰ１ならびにＤＡＣＴ１、２および３のメチル化状態。Ｆ：正常および結腸直腸癌細胞株由来の亜硫酸水素塩で修飾されたＤＮＡを配列決定することによる、ＣｐＧ部位のメチル化状態の決定。矢印は、転写開始部位を示す。白丸は、非メチル化ＣｐＧを表し、黒丸は、メチル化ＣｐＧを表す。Ｇ：未処理であるか、または５−ＡｚａＣで処理されたＨＣＴ１１６細胞およびＨＣＴ１１６−ＤＮＭＴ１／ＤＮＭＴ３ｂ−／−（ＤＫＯ）細胞におけるＤＡＣＴ１、２および３プロモータのＭＳＰ分析。Ｈ：５−ＡｚａＣ（５μＭ）で３日間処理されたＨＣＴ１１６およびＤＬＤ１細胞ならびにＤＫＯ細胞における、ＳＦＲＰ１ならびにＤＡＣＴ１、２および３のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【０１６８】
図４。結腸癌細胞におけるＤＡＣＴ１、２および３でのヒストン修飾。ＣｈＩＰアッセイを、表示されたヒストン修飾に対する抗体を用いて実施し、定量ＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ分析のためにＤＡＣＴ１、２および３の転写開始部位に対する−３．５ｋｂ〜＋３．５ｋｂ領域を含むゲノムＤＮＡフラグメントを、数字を用いて表示した。表示された領域を含む相対的濃縮（結合／インプット）（３連測定の平均±ＳＤ）を、各遺伝子座での各ヒストンマークについて示す。Ａ：ＨＴ−２９細胞におけるＤＡＣＴ１〜３でのヒストンマーク。Ｂ：ＳＷ４８０およびＲＫＯ細胞におけるＤＡＣＴ３遺伝子座でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３の濃縮。Ｃ：正常ヒト腸上皮細胞（ＦＨｓ  ７４  Ｉｎｔ）、非癌性胸部上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞および肺線維芽細胞ＭＲＣ５細胞におけるＤＡＣＴ３遺伝子座でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３の濃縮。
【０１６９】
図５。ＤＡＣＴ３およびヒストン修飾に対するＤＺＮｅｐとＴＳＡとの組み合わせの影響。Ａ：５μＭのＤＺＮｅｐ、５μＭの５−ＡｚａＣ、２００ｎＭのＴＳＡまたはこれらの組み合わせで処理されたＤＬＤ１細胞におけるＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄａｒｒａｙを用いたＤＡＣＴ３ｍＲＮＡ発現分析。示したデータは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。Ｂ：表示された結腸直腸癌細胞株をＤＺＮｅｐ、ＴＳＡまたは両者で処理した。ＲＮＡを回収し、アレイ分析に付した（１：ＤＣＡＴ２、２：ＤＡＣＴ２、３：ＤＣＡＴ３、４：ＤＫＫ４、５：ＤＫＫ３、６：ＤＫＫＬ１、７：ＤＫＫ２、８：ＤＫＫ３、９：ＤＫＫ１、１０：ＳＦＲＰ４、１１：ＳＦＲＰ２、１２：ＳＦＲＰ５、１３：ＳＦＲＰ３、１４：ＳＦＲＰ１）。既知Ｗｎｔ／β−カテニン拮抗薬の発現の変化を示す。Ｃ：ＨＴ２９細胞およびＳＷ４８０細胞においてＤＺＮｅｐ、ＴＳＡまたは両者によって誘発されたバルクヒストン修飾の免疫ブロット分析。Ｄ：未処理（白色棒グラフ）またはＤＺＮｅｐおよびＴＳＡで処理されたＨＴ２９細胞（黒色棒グラフ）におけるＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ３遺伝子座での表示されたヒストンマークの変化のＣｈＩＰ分析。値は、薬物処理前および処理後の低バックグラウンド領域の変化に対する正規化濃縮を表す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【０１７０】
図６。ＤＺＮｅｐとＴＳＡとの組み合わせは、結腸直腸癌細胞においてＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻止および広範なアポトーシスをもたらす。Ａ：ＤＺＮｅｐ（５μＭ）、ＴＳＡ（１００ｎＭ）または両者で処理されたＳＷ４８０およびＤＬＤ１細胞におけるＤＡＣＴ３、ＤＶＬ２、全β−カテニン、および非リン酸化β−カテニン（活性−β−カテニン）の免疫ブロット分析。Ｂ：ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡで処理されたＤＬＤ１およびＳＷ４８０細胞の免疫蛍光像。β−カテニン染色は赤であり、核染色は緑色である（ＤＲＡＱ５）。Ｃ：表示された結腸直腸癌細胞株を前記のようにして処理した；ＲＮＡを回収し、アレイ分析に付した。既知Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子の発現の変化を、遺伝子クラスタリングプログラムを用いて示した。上図の白色は、上方制御された遺伝子を示し、下図の白色は、下方制御された遺伝子を示す。Ｄ：図６Ｃに図示したデータの数値（Ｄ＋Ｔ＝ＤＺＮｅｐ＋ＴＳＡ）。Ｅ：ＤＬＤ１およびＨＴ２９細胞を、Ａにおいてと同様に処理し、細胞死を、ＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析によって検出した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。Ｆ：ＨＴ２９細胞をＡにおいてと同様に処理し、カスパーゼ３活性をＦＡＣＳ分析によって測定した。Ｇ：ＨＴ２９細胞をＡにおいてと同様に処理し、続いてＪＣ−１染色およびＦＡＣＳ分析を行った。
【０１７１】
図７。ＳＷ４８０細胞におけるＤＡＣＴ１〜ＤＡＣＴ３遺伝子座でのヒストンマーク。ＳＷ４８０細胞の表示されたヒストンマークのＣｈＩＰ配列決定を、Ｓｏｌｅｘａ技術を用いて実施した。全ＤＡＣＴ１、２および３遺伝子座でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ９／１４ａｃの濃縮を示した。
【０１７２】
図８。ＤＡＣＴ３は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害およびアポトーシス誘発に関与する。Ａ：ＤＡＣＴＳｓｈＲＮＡを発現する２つのＤＬＤ１安定クローン（ＤＡＣＴ３−ｓｈ１およびＤＡＣＴ３−ｓｈ２）または非標的対照ｓｈＲＮＡ（ＮＣ）を発現するＤＬＤ１細胞を、ＤＺＮｅｐ、ＴＳＡまたは両者で処理した。ＤＡＣＴ３およびアクチンｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定し、ＤＶＬ２、活性β−カテニンおよび全β−アクチンタンパク質レベルを免疫ブロッティングによって評価した。Ｂ：ＮＣ、ＤＡＣＴ３−ｓｈ１およびＤＡＣＴ３−ｓｈ２細胞を前記のように処理し、アポトーシスをＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析によって検出した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。＊＊、ｐ＜０．０１。Ｃ：ＤＡＣＴ３ＳｍａｒｔＰｏｏｌｓｉＲＮＡ（ＤＡＣＴ３−ＳＰ）および独立したＤＡＣＴ３ｓｉＲＮＡ（ＤＡＣＴ３−２）でトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を、Ａにおいてと同様にして処理した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。＊＊、ｐ＜０．０５。アポトーシス、ＤＡＣＴ３ｍＲＮＡレベル、ＤＶＬ２、活性β−カテニンタンパク質レベル、およびアポトーシスを先と同様にして決定した。Ｄ：ＤＡＣＴ１ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を処理しないか、またはＤＺＮｅｐ／ＴＳＡで処理し、前述のようなｍＲＮＡおよびアポトーシス分析のために回収した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【０１７３】
図９。結腸直腸癌細胞におけるＤｖｌ２およびβ−カテニンに対するＤＡＣＴ３過剰発現の影響。Ａ：外因的に発現されたＤＡＣＴ３は、Ｄｖｌ２と結合する。ＳＷ４８０細胞を、表示されたＦｌａｇまたはＨＡ標識発現構築物で一時的にトランスフェクトした。ＤＡＣＴ３を抗Ｆｌａｇで免疫沈降させ、免疫沈降物を、抗ＨＡ抗体を用いてプローブした。ＤＡＣＴ３およびＤｖｌ２間の相互免疫共沈降を下図に示す。Ｂ：Ｆｌａｇ−ＤＡＣＴ３または空ベクターで共トランスフェクトされたＳＷ４８０細胞におけるＨＡ標識Ｄｖｌ２タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。Ｃ：Ｍｙｃ標識ＤＡＣＴ１またはＤＡＣＴ３発現構築物で７２時間トランスフェクトされたＳＷ４８０細胞の免疫蛍光像。Ｍｙｃ標識ＤＡＣＴ１またはＤＡＣＴ３およびβ−カテニンレベルを、抗ｍｙｃ（緑）および抗β−カテニン（赤）を用いた染色によって検出した。核をＤＲＡＱ５（青）によって染色した。矢印は、ＤＡＣＴ３−ｍｙｃを発現するトランスフェクトされた細胞を示す。Ｄ：ＤＡＣＴ３の異所発現を示すコロニー形成アッセイは、結腸細胞成長を抑制した。ＤＬＤ１細胞をＤＡＣＴ３発現ベクターまたは空ベクターでトランスフェクトし、Ｚｅｏｃｉｎを用いて１２日間選択した。３連試験における対照に対するコロニーの数を右側に示す（エラーバー：平均±ＳＤ）。
【０１７４】
図１０。ＧＳＫ−３処理の低分子量有機化合物阻害は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるβ−カテニンの下方制御を救済する。ＤＬＤ１細胞を、必要があれば、ＧＳＫ−３阻害剤ＬＹ２１１９３０１（５ｍＭ）の存在下または非存在下で処理した。細胞を次に、表示された抗体を用いた免疫ブロッティングのために回収した。
【０１７５】
図１１。ＤＡＣＴ３抗血清は予想されるサイズ（６９ｋＤ）のＤＡＣＴ３を検出する。ＲＫＯ、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞におけるＤＡＣＴ３ｍＲＮＡの発現レベルを図１１Ａに示す。図１１Ｂは、下記実施例で記載するようにヒトＤＡＣＴ３ペプチドに対して生じた抗体を用いて検出される、これらの細胞における対応するＤＡＣＴ３タンパク質レベルを示す。
【０１７６】
図１２は、ＤＬＤ１、ＳＷ４８０およびＨＴ２９細胞においてＤＺＮｅｐおよびＴＳＡの組み合わせ処理によって再活性化されることが判明した８１の遺伝子を掲載する。３つの癌細胞株における８１遺伝子すべての発現における増加を数値で表す。驚くべきことに、ＤＡＣＴ３の誘発は圧倒的に最高である。
【０１７７】
図１３。ＤＺＮｅｐは、他のＨＤＡＣ阻害剤とも相乗作用して、アポトーシス（Ａ）、ならびにＤＡＣＴ３の誘発およびβ−カテニンの阻害（Ｂ）を誘発する。ＳＡＨＡ（２μＭ）、ＰＸＤ１０１（１μＭ）およびＤＺＮｅｐ（５μＭ）。
【０１７８】
図１４Ａ。ビヒクル、ＴＳＡ［０．５ｍｇ／ｋｇ］、ＤＺＮｅｐ［２ｍｇ／ｋｇ］およびＤＺＮｅｐ［２ｍｇ／ｋｇ］とＴＳＡ［０．５ｍｇ／ｋｇ］との組み合わせで処理された動物に対する生体内効果を示す結腸癌ＨＴ−２９細胞異種移植片モデル。
【０１７９】
図１４Ｂ。ＨＣＴ１１６異種移植腫瘍成長阻害におけるＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡの相乗効果。腫瘍容積（ＳＢ−０３０）を表す。＊は、ビヒクル対照と比較してワンウェイＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔにおいてｐ＜０．０５であることを示す。
【０１８０】
図１５。その腫瘍容積データが図１４Ｂに示された、ＳＢ−ＨＣＴ−１１６−０３０のプロトコルデザイン。腫瘍を、メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、５×１０６のＨＣＴ−１１６細胞を−７日目に皮下注射移植することによって確立させ、動物にＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡの表示された組み合わせの投与を０日目に開始し、このとき、動物を腫瘍サイズによってランダム化して、均一な群を得た（平均腫瘍容積９１〜１０７ｍｍ３、一部のマウスは、腫瘍を発現しないか、または過大／不規則な形状の腫瘍を発現するかのいずれかであったので、実験に含めなかった）。４群に対するＤＺＮｅｐ、ＳＡＨＡおよび各ビヒクルでの投与を表示されたように０日目で開始し（赤および青矢印）、体重（ＢＷ）および腫瘍容積を灰色矢印で表示した日に評価した。すべての処理を１４日目に終了した。
【０１８１】
図１６。ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを用いたＨＣＴ１１６異種移植腫瘍成長阻害中の体重変化。腫瘍を、メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて５×１０６のＨＣＴ−１１６細胞を−７日目で皮下注射移植することによって確立させ、ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡの表示された組み合わせの動物への投与を０日目で開始し、このとき、平均腫瘍容積は９１〜１０７ｍｍ３であった。体重はすべての群において＞８０％で維持された。ＳＡＨＡ群で、１ＮＴＲＤ（４日目）および１ＴＲＤ（１０日目、体重８２％）が記録された（ｎ＝７／群）。
【０１８２】
図１７。ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを用いたＨＣＴ１１６異種移植腫瘍成長阻害中の腫瘍容積。腫瘍を、メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、５×１０６のＨＣＴ−１１６細胞を−７日目で皮下注射移植することによって確立させ、ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡの表示された組み合わせの動物への投与を０日目で開始し、このときの平均腫瘍容積は９１〜１０７ｍｍ３であった。全身腫瘍組織量（容積はｍｍ３で表す）を１４日目で評価し、腫瘍容積の中央値／分布（Ｂｏｘ＆Ｗｈｉｓｋｅｒｓ  Ｄｉａｇｒａｍ）として示した。ＤＺＮｅｐ＋ＳＡＨＡで処理した動物の腫瘍容積のみが、ビヒクル対照群と比較して有意に異なっていた（ワンウェイＡＮＯＶＡとそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの事後試験によってｐ＜０．０１）。
【０１８３】
図１８。パーセントで表したＳＢ−ＨＣＴ−１１６−０３０における腫瘍成長阻害（図１４Ｂから図１７を参照）。腫瘍を、メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、５×１０６のＨＣＴ−１１６細胞を−７日目で皮下注射移植することによって確立させ、ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡを表示された組み合わせの動物への投与を０日目で開始し、このとき、平均腫瘍容積は９１〜１０７ｍｍ３であった。全身腫瘍組織量（容積をｍｍ３で表す）を３、７、１０および１４日目で評価し、以下で概略を記載するようにして腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を計算した。平均値に基づく計算ならびに中央値に基づく計算の両データセットを示す。ＳＡＨＡ群の１匹の動物が４日目で強制飼養の過誤のために死亡し（ＮＴＲＤ）、２匹目のマウスもＳＡＨＡ群の８２％の体重で死んだ（ＴＲＤ）。
【実施例】
【０１８４】
１  実験手順
１．１  試料、細胞株および薬物処理
ヒト組織試料を、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋから、シンガポール国立大学の施設内治験審査委員会によって承認されたプロトコルを用いて入手し；組織を提供した各個人からインフォームド・コンセントを得た。結腸直腸癌細胞株およびこの実験で用いた非形質転換細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＤＮＭＴ１（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１）およびＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂ）（ＨＣＴ１１６ＤＫＯ）の遺伝子破壊を有するＨＣＴ１１６細胞は、Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ博士（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＭＤ）が快く提供してくれた。薬物処理のために、薬物処理の前日に細胞に播種した。細胞を５μＭの３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡのＶｉｃｔｏｒ  Ｅ．  Ｍａｒｑｕｅｚ博士から入手）または５μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡｚａＣ；Ｓｉｇｍａ）で７２時間処理し、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ；細胞シグナリング）（１００〜２００ｎＭ）で２４時間処理した。５−ＡｚａＣ処理に関して、培地を、２４時間ごとに新たに添加された５−ＡｚａＣ２４で置換した。細胞のＤＺＮｅｐおよびＴＳＡでの同時処理に関して、ＤＺＮｅｐを２４時間添加し、続いてＴＳＡを遺伝子発現分析のためにさらに２４時間、ＦＡＣＳ分析のために４８時間添加した。
【０１８５】
１．２  マウスおよび飼育
メス無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ、１０〜１２週齢）を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｂｉｏｐｏｌｉｓ（ＢＲＣ）中、個別の換気ケージ中、管理条件下（１２時間光サイクル、２１〜２２℃、４０〜６０％湿度、滅菌された水道水および１９％タンパク質／５％脂肪／５％繊維からなる照射された標準的齧歯類用食餌を自由に摂取可能）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  ＡＤｖｌｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＡＣＬＡＲ）のガイドラインに従って飼育した。動物飼育は、Ｂｉｏｐｏｌｉｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｂｉｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＣＵＣ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ＃０５００７６）から認可された。
【０１８６】
１．３  ＤＡＣＴ３転写開始部位のマッピングおよび完全長ＤＡＣＴ３ｃＤＮＡのクローニング
１０μｇの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞から単離した。ＤＡＣＴ３転写開始部位を、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）を、逆転写およびＰＣＲステップ以外は製造業者のプロトコルにしたがって用いて、ＲＮＡライゲーションによる５’ＲＡＣＥによってマップした。リンカーライゲーション後の逆転写を、６４℃で１時間、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および遺伝子特異的なオリゴ：５−ＧＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣ−３’（配列番号１）を用いて行った。ＰｆｕＵｌｔｒａＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥキットによって提供された順プライマーならびに遺伝子特異的な逆プライマー：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡ−３’（配列番号２）および５’−ＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴ−３’（配列番号３）を用いて、ネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンし、Ｍ１３プライマーを用いて配列決定した。ｍＲＮＡ開始部位マッピングに基づいて、最長のオープンリーディングフレームを含む標識ＤＡＣＴ３発現構築物を過剰発現研究のために生成させた。完全長ＤＡＣＴ３コーディング領域を、ＨＥＫ２９３細胞由来の５μｇの全ｍＲＮＡおよび以下のプライマー：５’−ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＴ−３’（配列番号４）および５’−ＡＴＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＡ−３’（配列番号５）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０中、ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩ部位間にクローンし、配列決定した。
【０１８７】
１．４  ＲＮＡ干渉
ＤＡＣＴ３を標的とするＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）ｓｉＲＮＡおよび非標的対照を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔ、ＣＯ）から購入した。次の配列：５’−ＧＧＵＵＣＵＣＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号６）を標的とする別個のＤＡＣＴ３ｓｉＲＮＡをＳｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏから入手した。ＤＡＣＴ３低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）安定細胞を生成させるために、ＤＡＣＴ３ｓｉＲＮＡ配列（ＧＧＡＧＡＡＵＣＧＣＣＵＧＣＣＵＵＣＡ）（配列番号７）をｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱレトロウイルス発現ベクター中にクローンした。ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−Ｎｅｇベクターを負の対照ｓｈＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）として使用し、細胞を記載されているようにして選択し、拡大させた（Ｔａｎ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（２００７）２１，１０５０−１０６３）。
【０１８８】
１．５  免疫ブロット分析
免疫ブロッティングをすでに記載されているようにして実施した（Ｔａｎら、２００７、上記）。ブロットを、次の抗体を用いてプローブした：抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９）、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（０７−４４２）、抗Ｈ３Ｋ９／Ｋ１４ａｃ（０６−５９９）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（０７−４７３）および抗活性β−カテニン（０５−６６５）はＵｐｓｔａｔｅから購入した。抗Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３（ａｂ９０５３）はＡｂｃａｍから入手した。抗β−カテニン（６Ｂ３）および抗Ｈ３（３Ｈｌ）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手し、抗ＤＶＬ２（ｓｃ−８０２６）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手した。ＤＡＣＴ３に対するウサギポリクローナル抗体をヒトＤＡＣＴ３由来の１４のアミノ酸ペプチド（ＬＳＬＥＳＧＧＬＥＱＥＳＧＲ（配列番号８）に対して生じさせ、アフィニティーカラムを通して精製した。
【０１８９】
１．６  トランスフェクションおよび免疫沈降
ＳＷ４８０細胞を、Ｆｕｇｅｎ６．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＦ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）＋プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いて３０分間４℃で溶解させた。３０分間の１２，０００ｇ遠心分離後、溶解物を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）または抗ＨＡアフィニティーマトリックス（Ｒｏｃｈｅ）を用いて一夜４℃で免疫沈降させた。沈殿を洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ）で３回洗浄し、免疫複合体を、１％のＳＤＳを含む試料緩衝液を用いて５分間９５℃で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＡタグ（ｓｃ−８０５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはＦＬＡＧタグ（Ｆｌ８０４、Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を用いて、免疫ブロッティングを実施した。
【０１９０】
１．７  アポトーシスおよびフローサイトメトリー分析
細胞を集め、７０％エタノール中で固定した。固定された細胞を、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）での処理後にヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（５０μｇ／ｍＬ）で染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＤＮＡ含有量に関して分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてアポトーシス性サブ−Ｇ１フラクションを定量化した。ミトコンドリア膜電位（ＭＴＰ）を測定するために、製造業者の指示に従って（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＪＣ−Ｉを用いて細胞を染色し、ＪＣ−Ｉ検出に関して陽性の細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。カスパーゼ−３活性を測定するために、指示どおりにＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を固定し、次いで、フルオレセインイソチオシアネート共役ウサギ抗活性カスパーゼ−３モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。カスパーゼ−３検出に関して陽性の細胞の定量化を、フローサイトメトリーによって実施した。
【０１９１】
１．８  マイクロアレイ遺伝子発現分析および半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて逆転写を実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）ＢｅａｄＣｈｉｐ  ヒトＲｅｆ−８＿Ｖ２を用いてマイクロアレイハイブリダイゼーションを実施し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手したＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを記載通りに使用してデータ分析を実施した（Ｔａｎら、２００７、上記）。ＲＴ−ＰＣＲに関して、全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）を用いて逆転写した。１００ｎｇのｃＤＮＡをＰＣＲに使用し、プライマー配列は次のとおりであった：
【０１９２】
【表１】
2011504462.tif 000006
１．９  ＤＮＡメチル化分析
ＣｐＧアイランドＤＮＡメチル化状態を、亜硫酸水素塩修飾後にＰＣＲ分析によって決定し、続いてメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）および亜硫酸水素塩ゲノム配列決定（ＢＧＳ）を行った（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００１）２８，２９−３５）。すべての亜硫酸水素塩ゲノム配列決定およびメチル化特異的ＰＣＲプライマーは、転写開始部位付近で、かつ調査される遺伝子のＣｐＧアイランド中にあるように設計した。プライマー配列は次のとおりであった：
【０１９３】
【表２】
2011504462.tif 000007
【０１９４】
【表３】
2011504462.tif 000008
１．１０クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
ＣｈＩＰアッセイをすでに記載されているようにして実施した（Ｚｈａｏら、２００５、上記）。免疫沈降したＤＮＡを、ＰＲＩＳＭ７９００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるリアルタイム定量ＰＣＲによって定量化した。プライマーセットは、表示された領域のまわり約１００〜１５０ｂｐを増幅するように選択した。次の抗体をＣｈＩＰ実験において使用した：抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３および抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ２（Ａｂｃａｍ）、抗Ｈ３Ｋ２０ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗Ｈ３Ｋ９／Ｋ１４ａｃおよび抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）。これらのヒストンマークの検査される領域での濃縮を、インプット量に対して定量化した。未処理の細胞および処理細胞由来のＤＮＡ材料の２つのプールを比較するために、低いバックグラウンド濃縮を示す領域に対するΔＣｔ値の正規化を再度行った。ＰＣＲプライマーの配列は次の通りであった：
【０１９５】
【表４】
2011504462.tif 000009
2011504462.tif 000010
2011504462.tif 000011
１．１１  免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法
細胞を、４穴または８穴培養チャンバースライド中に播種した。７２時間の処理またはトランスフェクション後、細胞をＰＢＳ中３．７％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理した。細胞を連続して、一次抗体抗体（抗Ｍｙｃもしくは抗β−カテニン）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６共役二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにそれぞれ１時間インキュベートし、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｍｅｒｃｋ）マウンティング培地中にマウントした。ＤＲＡＱ５（Ｂｉｏｓｔａｔｓ、ＵＫ）を核染色のためにマウンティング培地中で希釈した。染色した細胞をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡法によって調べた。
【０１９６】
１．１２  コロニー形成アッセイ
コロニー形成アッセイをすでに記載されているようにして実施して、生体外腫瘍細胞増殖を評価した（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、２００１、上記）。ＤＬＤ１細胞を、ウェルあたり３０×１０４の密度で６穴プレートを用いてプレートし、製造業者の指示に従ってＦｕｇｅｎ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ｐｃＤＮＡ４．０−ＤＡＣＴ３または骨格ｐｃＤＮＡ４．０（２．０μｇ）のいずれかでトランスフェクトさせた。細胞を３連で再プレートし、Ｚｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）を含む完全ＤＭＥＭ培地中で１０〜１５日間培養した。生存するコロニーをメタノール固定化後、Ｇｅｎｔｉａｎ  Ｖｉｏｌｅｔで染色し、眼に見えるコロニー（×５０細胞）を計数した。
【０１９７】
１．１３マウスにおける腫瘍移植
マウスの右側腹部に５×１０６のＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌腫細胞を５０μｌの容積で、Ｇ２３ニードルを用いて皮下移植した。腫瘍成長を週に２回モニターした。７日後、動物をさまざまな治療群に分け、３つの郡それぞれにおいて９１〜１０７ｍｍ３の平均腫瘍体積が達成されるようにした。腫瘍容積は、式：腫瘍容積（ｍｍ３）−（ｗ２×ｌ）／２（ｗ＝ＨＣＴ−１１６癌腫の幅（ｍｍ）、ｌ＝ＨＣＴ−１１６癌腫長さ（ｍｍ））を用いて計算した。
【０１９８】
１．１４  マウスにおいて使用した薬物
ＤＺＮｅｐは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（ＧＩＳ、ｖｉａｌ  ＃１１）より得て、生理食塩水中に溶解させた。ＤＺＮｅｐ投薬のために、すべてのマウスに、体重１キログラムあたり１０ｍｌの体積の、生理食塩水中に適当に溶解させたＤＺＮｅｐ（５ｍｇ／ｋｇの投与量に関しては０．５ｍｇ／ｍｌの濃度など）を投与した。Ｓ＊ＢＩＯで製造されたＳＡＨＡロット８を使用し、ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ（２００ｍｇ／ｋｇ投薬については２０ｍｇ／ｍｌの濃度）中に溶解させた。
【０１９９】
１．１５  治療スケジュール
初期ＭＴＤ研究に関して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、それぞれ動物３匹の４群にランダムに割り当てた。ＤＺＮｅｐを０日目に、２．５、５、１０、および１５ｍｇ／ｋｇの投与量で、１週間につき３回、ｉ．ｐ．投与した。このＭＴＤ研究は５日目で終了した。
【０２００】
ＨＣＴ−１１６研究に関して、−７日目でＨＣＴ−１１６異種移植片を受けたヌードマウスを、それぞれ動物７匹の４群に割り当て、薬物治療を０日目で開始した（プロトコルの概要については図１を参照）：１群−両使用化合物についてのビヒクル対照（生理食塩水ｉ．ｐ．週３回、午前中、ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ｐ．ｏ．  ｑ．ｄ．午後；２群−ＳＡＨＡ（２００ｍｇ／ｋｇ  ｑ．ｄ．  ｐ．ｏ．午後）＋ＤＺＮｅｐビヒクル生理食塩水、週３回、午前中）；３群−ＤＺＮｅｐ（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．午前＋ＳＡＨＡビヒクル  ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ｐ．ｏ．  ｑ．ｄ．午後）：４群−ＤＺＮｅｐ＋ＳＡＨＡ（５ｍｇ／ｋｇ  ＤＺＮｅｐ  ｉ．ｐ．午前＋２００ｍｇ／ｋｇ  ｑ．ｄ．  ｐ．ｏ．午後）。研究を＋１４日目で終了した。
【０２０１】
１．１６  有効性評価
ＤＺＮｅｐ処理の有効性を腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）法によって評価し、この方法では、様々な治療群の腫瘍容積における治療による減少をビヒクル群と比較した。腫瘍成長阻害を、式：
％ＴＧＩ＝（ＶＣｏｎｄａｙ  ｘ−ＶＴｒｄａｙ  ｘ）／（ＶＣｏｎｄａｙ  ｘ−ＶＣｏｎｄａｙ  ０）×１００
（％ＴＧＩ＝腫瘍成長阻害の百分率、ＶＣｏｎｄａｙ  ｘ＝ｘ日目の対照／ビヒクル群についての腫瘍容積の中央値または平均値、ＶＴｒｄａｙ  ｘ＝ｘ日目の治療群の腫瘍容積の中央値または平均値、ＶＣｏｎｄａｙ  ０＝０日目（研究の開始）の対照／ビヒクル群の腫瘍容積の中央値または平均値）
を用いて計算した。
【０２０２】
１．１７  毒性
動物の体重を毎日測定し、活性（不活性／高活性）、皮膚水和／脱水、姿勢（たとえば円背）、歩行、体重計に載せる際の発作、体温（たとえば、手で触れると冷たい）および発声をはじめとする、薬物に関連する有害な副作用の臨床的徴候について頻繁に調べた。マウスにおいて癌薬物の許容される毒性は、試験中の平均の群体重減少が２０％未満、および治療動物１０匹中で中毒死が１匹以下として、ＮＣＩによって定義されている。１匹より多い動物の治療に関連する死（ＴＲＤ）が群において見られたならば、または治療群の体重が０日目の体重の８０％より少なくなった場合、群の治療を停止した。
【０２０３】
１．１８  生体内データに関する統計値
一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）とそれに続くダネットの事後検定を用いて、腫瘍容積中央値の統計的有意性を決定した。＜０．０５のｐ値を、＊で表示する。すべての統計分析およびグラフ表示についてソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン４）を使用した。
【０２０４】
２  結果
２．１  ＤＡＣＴ３発現は、プロモータメチル化と独立して結腸直腸癌において抑制される。
【０２０５】
前述のように、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング経路、その病原性変更を研究するため、および医療介入のためのほぼ理想的モデルは、結腸直腸癌である。したがって、当業者らは、このモデルを用いて得られる結果を、異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナリングに関連する任意の他の障害に容易に応用できることを理解するであろう。したがって、本実施例は、このモデルに基づく。
【０２０６】
結腸直腸癌におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングのエピジェネティックエフェクタを特徴づけるために、本発明者らは、まず、ＳＦＲＰ、ＷＩＦｌ、ＤＫＫ、およびＤＡＣＴ遺伝子ファミリーのメンバーを含む、１４の代表的なＷｎｔシグナリング阻害剤に目を向けた。これらの一部は、様々なヒト癌において転写不活性化されるか、または抑制されることが示されている（Ｈｅら；２００５、上記；Ａｇｕｉｌｅｒａら、２００６、上記；Ｈｅら、２００５、上記；Ｓｕｚｕｋｉら、２００２、上記；Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記）。本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆ−８＿Ｖ２  Ｓｅｎｔｒｉｘ（登録商標）ＢｅａｄＣｈｉｐ（図３Ａを参照）を用いて、対応する正常粘膜に対して、２４のヒト結腸直腸腫瘍において遺伝子発現を確認した。ＳＦＲＰファミリーのメンバーの発現は、正常対照と比較した場合、ほぼすべてのヒト結腸直腸腫瘍試料において有意に減少することが見いだされ（ｐ＜０．００１）、以前の報告と一致した発見である（Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記）。対照的に、腫瘍試料におけるＷＩＦ−１およびＤＫＫの発現は、確立された結腸直腸癌細胞株において以前に報告されているＷＩＦ−１およびＤＫＫ１サイレンシング（Ａｇｕｉｌｅｒａら、２００６、上記；Ｈｅら、２００５、上記）に反して、対照と有意に異ならなかった。興味深いことに、ＤＡＣＴ３の発現は、２４の腫瘍試料すべてにおいて減少し（ｐ＜０．００１）、一方、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２の発現レベルは、腫瘍と対照組織との間で有意な差を示さなかった（それぞれ、ｐ＝０．２４およびｐ＝０．６４）。ベースラインＷｎｔ／β−カテニンシグナル活性化の向上をもたらすＷｎｔ阻害剤の発現の減少と一致して、これらの腫瘍は、対照組織と比較して、ＭＹＣ（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１，１５０９−１５１２）、サイクリンＤ１遺伝子ＣＣＮＤｌ（Ｔｅｔｓｕ，Ｏ．，＆ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９８，４２２−４２６）、ＬＥＦ１（リンパ球エンハンサー結合因子１；Ｆｉｌａｌｉ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７，３３３９８−３３４１０を参照）およびＣＤ４４（Ｗｉｅｌｅｎｇａ，Ｖ．Ｊ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４，５１５−５２３）をはじめとする確立されたβ−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子の発現の増加を示す。８対のランダムに選択された患者試料のＲＴ−ＰＣＲ分析によって、対照と比較して、結腸直腸癌において、ＳＦＲＰ１およびＤＡＣＴ３の抑制を確認したが、ＤＡＣＴ１の抑制は確認されなかった（図３Ｂ）。特に、ＤＡＣＴ２発現における減少も、８つの腫瘍試料のうちの３つで観察された。したがって、Ｗｎｔ阻害剤、例えばＳＦＲＰの発現における以前に確認された減少を超えて、ＤＡＣＴ３の発現も、結腸直腸癌において一貫して減少することが見いだされた。さらに、少なくとも一部の結腸直腸腫瘍において、ＤＡＣＴ２発現も減少するという証拠が見いだされた。
【０２０７】
ＳＦＲＰは、プロモータメチル化によって癌細胞において転写不活性化されることが示された（Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記）。ＤＡＣＴ３プロモータのメチル化状態を決定するために、本発明者らは、５’−ＲＡＣＥによって決定されたように、転写開始部位の周りの８つの結腸直腸腫瘍試料においてメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析を実施した（図２）。ＤＡＣＴ３プロモータは、ＣｐＧアイランドを含む（図３Ｃ）。全ＣｐＧアイランドを含むＭＳＰ分析は、結腸直腸腫瘍試料においてＤＡＣＴ３プロモータでＤＮＡメチル化の欠失を示す（図３Ｃ）。正の対照として、同じ技術を用いて、ＳＦＲＰ１のプロモータ領域が、これらの同じ腫瘍試料においてメチル化されることを確認した（図３Ｃ）。この発見は、ＤＡＣＴ３発現は結腸直腸癌において減少するが、これは、これらの細胞において遺伝子サイレンシングにすでに関与したＤＮＡメチル化とは独立して起こることを示唆する。
【０２０８】
前記観察結果が結腸直腸癌細胞株において反復されるかどうかを確かめるために、本発明者らは、７つのかかる系において、ＤＡＣＴ遺伝子およびＳＦＲＰ１のＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（図３Ｄ）。結腸癌において一貫して発現抑制されるＳＦＲＰ１と異なり、ＤＡＣＴ３は、様々な細胞株において異なる発現の基礎レベルを示す。特に、他の２つのＤＡＣＴファミリーメンバーであるＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２の発現も、これらの細胞株のうちのいくつかにおいて欠失しているが、これは、前記で調べた原発腫瘍組織においては観察されなかった。したがって、これらの結腸直腸癌細胞株における３つのＤＡＣＴ遺伝子すべてのメチル化状態を調べた。原発腫瘍試料においてと同様に、ＤＡＣＴ３プロモータは、試験したすべての細胞株においてメチル化されず、一方、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２プロモータは、それぞれ、部分メチル化および完全メチル化されることが見いだされた（図３Ｅ）。ＲＫＯおよびＨＴ２９癌細胞株における亜硫酸水素塩ゲノム配列決定は、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２プロモータにおいてそれぞれ部分メチル化およびほぼ完全なメチル化を示すが、ＤＡＣＴ３プロモータにおいてはメチル化シトシンをほとんど示さない、このＭＳＰ分析の結果を裏付けた（図３Ｆ）。
【０２０９】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−アザ−２’デオキシシチジン（５−ＡｚａＣ）を用いて、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞株におけるプロモータメチル化を薬理学的に妨害した。５−ＡｚａＣ処理は、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２プロモータでのメチル化を減少させ（図３Ｇ）、ＳＦＲＰ１、ＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２の発現を増加させたが、ＤＡＣＴ３は増加させなかった（図３Ｈ）。同様に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ１およびＤＮＭＴ３Ｂが遺伝子的に分裂されたＨＣＴ１１６細胞株（Ｒｈｅｅ，Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１６，５５２−５５６）は、ＤＡＣＴ１、ＤＡＣＴ２およびＳＦＲＰ１のプロモータメチル化の減少（図３Ｇ；ＤＫＯ）ならびに発現の増加（図３Ｈ）を示したが、ＤＡＣＴ３においては明らかな変化を示さなかった（図１ＧおよびＨ）。同様の結果が、ＤＬＤ１細胞においても得られた（図３Ｈ）。これらの結果は、ＳＦＲＰ１ならびにＤＡＣＴ１およびＤＡＣＴ２遺伝子と異なり、プロモータメチル化が、結腸直腸癌細胞におけるＤＡＣＴ３のエピジェネティック抑制に貢献しないという結論を裏付ける。さらに、患者の腫瘍試料において、ＤＡＣＴ１プロモータはメチル化されないことが判明し、ＤＡＣＴ２プロモータメチル化が、ＤＡＣＴ２発現が減少したいくつかの腫瘍試料において検出されるだけである（データ不掲載）。したがって、調査した臨床的腫瘍試料におけるＤＡＣＴ１／２のメチル化の欠失は、これらの腫瘍が一般的になぜ下方制御されないかを明らかにする。
【０２１０】
２．２  ＤＡＣＴ３のエピジェネティック抑制は、二価ヒストン修飾と関連する。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを用いて、クロマチン状態がＤＡＣＴ３抑制と関連するかどうかを確認した。潜在的に関与するクロマチンマークを特徴づけるために、このアッセイを定量ＰＣＲと組み合わせた。３つのＤＡＣＴ遺伝子のそれぞれの転写開始部位に近接した＞７ｋｂ領域を含む８〜１０のプライマー対のパネルを設計した。抑制的マーク（例えば、Ｓｚｙｆ、２００９、上記を参照）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、およびＨ４Ｋ２０ｍｅ３、ならびに活性化マークＨ３Ｋ４ｍｅ３（同書）およびＨ３Ｋ９／１４ａｃ（図４Ａ）の存在を包含する、ヒストンマークの存在を確認した。抑制的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の十分な濃縮と、それほどではない抑制Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３の濃縮を、ＨＴ２９細胞におけるＤＡＣＴ３の転写開始部位の５００ｂｐ下流で検出した。加えて、より弱いＨ３Ｋ２７ｍｅ３もＤＡＣＴ３のさらに上流のプロモータ領域で検出された。この発見は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のほとんどが、癌および胚幹細胞の両方において転写開始部位の近位下流領域で検出されることを示す、いくつかの最近のゲノム規模での研究と一致する（Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００７）１，２９９；Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００７）６７，１０６５７−１０６６３；Ｚｈａｏ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００５）１０２，１６０９０−１６０９５）。対照的に、抑制的Ｈ３Ｋ９メチル化マークは、ＨＴ２９細胞中のＤＡＣＴ３プロモータ領域において検出されなかった。
【０２１１】
活性化マークＨ３Ｋ４ｍｅ３は、ＨＴ２９細胞中のＤＡＣＴ３転写開始部位付近でも高レベルで検出され、このことは、ＤＡＣＴ３プロモータが、これらの細胞において抑制的および活性化（二価）ヒストンのメチル化事象の両方によって同時に修飾されることを示唆する。このような二価ヒストン状態は、すでに、低レベルで転写された遺伝子に関連づけられている（Ａｚｕａｒａ，Ｖ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００６）８，５３２−５３８；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ（２００６）１２５，３１５−３２６；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８，５５３−５６０；Ｐａｎら、２００７、上記；Ｚｈａｏ，Ｘ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００７）３，２８６）。これがＤＡＣＴ３遺伝子座にも当てはまるならば、抑制的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の存在は、ＤＡＣＴ３発現レベルと逆相関するはずであると予想できる。この仮定と一致して、高レベルのＨ３Ｋ２７ｍｅ３が、低レベルのＤＡＣＴ３を発現するＳＷ４８０細胞中のＤＡＣＴ３でも検出され、軽度のＤＡＣＴ３発現を有するＲＫＯ細胞ではそれより劣るレベルで検出された（図４Ｂ）。さらに、高レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３だけ（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は検出されない）が、正常ヒト腸上皮細胞（ＦＨｓ  ７４  Ｉｎｔ）中のＤＡＣＴ３および２つの他の非癌性細胞株である、胸部上皮ＭＣＦ１０Ａおよび肺線維芽細胞ＭＲＣ５で検出され（図４Ｃ）、このことは、ＤＡＣＴ３でのこの二価修飾は癌特異的であることを示唆する。ＤＡＣＴ３プロモータが、その発現が抑制される細胞において二価ヒストン状態にあることをさらに確認するために、ＳＷ４８０細胞における主要ヒストンマークの全ゲノムマッピングを、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  Ｓｏｌｅｘａ技術を用いておこなった。ヒストン修飾のこのような高分解能マッピングは、ＤＡＣＴ３でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３の共修飾を明確に実証する（図７）。
【０２１２】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の濃縮と、それより劣る程度のＨ３Ｋ２７ｍｅ３の濃縮が、ＤＡＣＴ１でも検出されたが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３を含むこれらのヒストンマークの濃縮ピークは、ＤＡＣＴ２遺伝子座で検出されなかった（図４Ａ）。一般的にＤＡＣＴ遺伝子ファミリーについて、これらの結果は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３のレベルがＤＮＡメチル化状態と逆相関することを示唆する。すなわち、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、ＤＡＣＴ１プロモータ（部分的にメチル化されている）、およびＤＡＣＴ３プロモータ（メチル化されていない）で検出されるが、ＤＡＣＴ２プロモータ（完全にメチル化されている）では検出されない（図ＩＦおよび図２を参照）。この発見は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが非メチル化Ｈ３Ｋ４と優先的に結合し（Ｏｏｉ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８，７１４−７１７）、Ｈ３Ｋ４のメチル化は、周りを取り囲むヌクレオチドをメチル化から保護する傾向がある（Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９，４５７−４６６）という最近の報告と一致する。ＤＡＣＴ３の発現がＣｐＧアイランドメチル化に対して無反応であることを示す先のデータと同様に、本発明者らのデータは、結腸癌細胞において、ＤＡＣＴ３は主にヒストン修飾によって抑制され、特に、かかる細胞におけるＤＡＣＴ３遺伝子座は、抑制的ヒストン修飾と活性化ヒストン修飾の両方を同時に含む二価クロマチン状態で存在するという仮定と一致する。
【０２１３】
２．３  ヒストンのメチル化と脱アセチル化の両方を阻害する薬理学的方法による、ＤＡＣＴ３の着実な抑制解除
Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ阻害剤３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）は、ポリコーム抑制的複合体２の成分を除去し、抑制的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ４Ｋ２０ｍｅ３を含むヒストンのメチル化を阻害することが最近開示された（Ｔａｎら、２００７、上記）。ＤＺＮｅｐ（単独またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−ＡｚａＣ、または両者との組み合わせ）が、結腸直腸癌細胞におけるＤＡＣＴ３発現を回復できるかどうかを試験した。遺伝子発現における変化の最も正確な測定を可能にするために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｂｅａｄａｒｒａｙを用いた。このツールを使用して、中間の核酸増幅ステップなしに転写物レベルを正確に測定することが可能になる。単一薬剤として使用する場合、これらの薬物は、ＤＬＤ１細胞におけるＤＡＣＴ３の発現を最小限しか誘発しないことが観察された（図５Ａ）。しかし、ＤＺＮｅｐおよびＴＳＡとの併用治療は、ＤＡＣＴ３発現を強力に誘発し、一方、ＤＺＮｅｐ／ＡｚａまたはＴＳＡ／Ａｚａなどの他の組み合わせは誘発しなかった（図５Ａ）。それに反して、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡの組み合わせは、ＤＡＣＴ１発現において中程度の増加を誘発するだけであった（図５Ｂ）。一方、ＤＡＣＴ２の発現は、５−ＡｚａＣを含む治療によってのみ誘発され（図３Ｈおよび３Ｂ）、このことは、より典型的なプロモータメチル化によるそのエピジェネティックサイレンシングと一致する。
【０２１４】
他の既知Ｗｎｔ／β−カテニン経路阻害剤の発現における変化に対する、ＤＡＣＴ３抑制解除についてのＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ併用治療の特異性を決定するために、２つの結腸癌細胞株（ＤＬＤ１およびＨＴ−２９）（未処理またはＤＺＮｅｐ、ＴＳＡもしくは両者で処理）から得られたＲＮＡを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ遺伝子発現データを再度分析した。この分析によって、ＤＡＣＴ３はＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ治療によって強力に誘発される唯一のＷｎｔ／β−カテニン経路阻害剤であり、これは、両結腸癌細胞株で起こることが明らかになった（図５Ｂ）。あわせると、本発明者らの発見は、ＤＡＣＴ３は、結腸癌細胞におけるその抑制が、二価ヒストン修飾と関連するが、ＤＮＡメチル化と関連せず、したがって、ヒストン修飾のみを標的とする薬理学的アプローチによって確実に抑制解除できるようである点で、他のＷｎｔ経路阻害剤と区別されることを示す。
【０２１５】
医薬的に活性な化合物ＤＺＮｅｐおよびＴＳＡの組み合わせが、ＤＡＣＴ３発現を再活性化させる機構をよりよく理解するために、ヒストン修飾プロファイルを、ウェスタンブロットによって処理および未処理細胞において調べた（図５Ｃ）。すでに報告されているように、ＤＺＮｅｐ処理単独の結果、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ４Ｋ２０ｍｅ３が強力に減少し、一方、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に対してはほとんど影響がなかった（Ｔａｎら、２００７、上記）。併用療法の結果、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の軽度の阻害が得られたが、ＤＺＮｅｐまたはＴＳＡ単独を用いた処理と比較して最も顕著な相乗的変化は、Ｈ３Ｋ９／１４アセチル化の確実な誘発であった（図５Ｃ）。興味深いことに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、ＤＺＮｅｐ処理単独での若干の減少と関係なく、この併用療法によっても誘発される。したがって、ＤＺＮｅｐのＴＳＡとの薬理学的組み合わせは、ヒストン修飾において興味深い広範囲のシフトを引き起こす。すなわち、ある抑制的ヒストンマーク（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３）を減少させ、一方、いくつかの活性化ヒストンマークｓ（Ｈ３Ｋ９／１４ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３）を大幅に増大させる。機構的に、このことは、これらのクロマチンマーク間にクロストークが存在し、ＤＺＮｅｐによる抑制的ヒストンメチル化の阻害が、ＴＳＡによって誘発されるヒストンのアセチル化に有利なクロマチン環境を作り出すことを示唆する。これらの処理細胞における一般的ヒストンプロファイルについて観察される効果の大きさは、この現象が、ゲノム全体に広まっていることをさらに示唆する。このことは、次にはとりわけＤＡＣＴ３を含む特異的標的遺伝子の発現の増加に至る。
【０２１６】
ＣｈＩＰを使用して、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ併用療法に反応してＤＡＣＴ３遺伝子座で特異的なヒストン修飾における変化をさらに評価する。ウェスタンブロット分析によって見いだされる修飾ヒストンレベルにおける広範囲の変化と一致して、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡで処理された細胞は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ４Ｋ２０ｍｅ３において減少し、ＤＡＣＴ３遺伝子座でＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ９／Ｋ１４ａｃにおいて同時に増加した（図５Ｄ）。このような効果は、ＤＡＣＴ１遺伝子座ではかなり弱く、したがって、それぞれＤＡＣＴ３およびＤＡＣＴ１遺伝子発現に関するこの薬理学的処理の相対的効果と十分に相関する。ＤＡＣＴ３遺伝子座でのヒストンメチル化およびアセチル化マークにおける際だった変化は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理後のＤＡＣＴ３発現レベルにおける等しく際立った変化と一致し、これを明らかにするのに役立つ。
【０２１７】
要約すると、添付の図面に示される、前記生化学的、薬理学的、および発現データはすべて、ＤＡＣＴＳ発現の抑制が二価ヒストンドメインを介して起こるモデルを支持する。さらに、この抑制は、主にＤＡＣＴ３遺伝子座を含むこのような二価修飾遺伝子のサブセットで染色体構造の主な変化をもたらす複合薬理学的アプローチによって有効に逆転することができる。
【０２１８】
２．４  ＤＡＣＴ３の抑制解除は、結腸直腸癌細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害および広範なアポトーシスと関連する。
前記の薬理学的に活性な化合物（単独および組み合わせ）の、ＤＶＬ２およびβ−カテニンレベルに対する影響を調べた。ＤＶＬ２は、すべてまたはほとんどの細胞型において発現される、３つの機能的に重複した保存ＤＶ１ファミリーメンバーのうちの１つであるので、ＤＶ１遺伝子ファミリーの代表例として任意に選択した（Ｈａｍｂｌｅｔ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）１２９，５８２７−５８３８）。転写物レベルにおける観察された変化と一致して、ウェスタンブロット分析によって測定されたようにＤＺＮｅｐおよびＴＳＡ併用療法によってＤＡＣＴ３タンパク質レベルは著しく増加した（ＳＷ４８０およびＤｌＤｌ細胞の両方で）（図６Ａおよび図１１）。併用療法はさらに、ＤＶＬ２レベルにおいて減少をもたらした。対照的に、ＤＺＮｅｐまたはＴＳＡのいずれか単独を用いた処理は、このような変化を起こさなかった（図６Ａ）。
【０２１９】
同時に、活性化（非リン酸化）β−カテニンのレベルは、ウェスタンブロットによって示されるように、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理細胞において降下した（図６Ａを参照）。この発見は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡでの処理によって減少した核β−カテニン染色を示す免疫細胞化学によって裏付けられた（図６Ｂ）。最後に、ＭＹＣ、ＬＥＦ、ＣＣＮＤ１およびＣＤ４４をはじめとするＴＣＦ／β−カテニン標的遺伝子の発現は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理細胞において著しく減少するが、ＤＺＮｅｐまたはＴＳＡのいずれか単独で処理された細胞においては減少しなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）。これらの発見は、一致して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングがＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ併用療法によって阻害されることを示す。さらに、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるβ−カテニンの減少は、ＧＳＫ−３の小分子阻害剤で細胞を処理することによって有効に減少させることができるが、ＤＶＬ２の下方制御は、影響を受けないままであることが観察された（図１０）。このことは、ＤＡＣＴ３−ＤＶＬ２がＧＳＫ−３を経由して、β−カテニン安定性を調節することを示唆する。
【０２２０】
その発現が、３つの癌細胞株全てにおいてＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理によって増加する８１の遺伝子のうち、ＤＡＣＴ３が断然、最も強力に誘発される（図１２を参照）。本発明者らの知る限りでは、このリスト（図１２を参照）以外の遺伝子は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングに直接関連しない。あわせると、ここで得られた結果は、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ併用療法が、ＤＡＣＴ３遺伝子発現およびタンパク質レベルを増加させ、第２に有効なＷｎｔシグナル伝達に必要な内因性ＤＶＬタンパク質を不安定化することによって、結腸直腸癌細胞株におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換を減少させることを裏付ける。反対に、これらは、ＤＡＣＴ３の抑制が、結腸直腸癌形成における重要なエピジェネティック事象であることを示唆する。
【０２２１】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害は、生存促進経路を阻止し、この経路に依存する癌細胞におけるアポトーシスを誘発することが予想される（Ｆｕｊｉｉら、２００７、上記；Ｈｅら、２００５、上記）。実際、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換の阻害は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって評価されるように、ＤＬＤ１およびＨＴ２９細胞における細胞死の強力な相乗的誘発を伴うことが判明した（図６Ｅ）。他の結腸癌細胞株を用いて同様の結果が得られた（データは不掲載）。ＤＺＮｅｐ／Ａｚａで処理された細胞と対照的に、ＤＡＣＴ３発現を効率よく抑制解除しない処理は、匹敵するレベルの細胞死を起こさなかった。同様に、５−ＡｚａＣの、ＤＡＣＴ３遺伝子発現においてさらなる増加をもたらさないＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ組み合わせへの添加は、細胞死においてもさらなる増加をもたらさない。このことは、５−ＡｚａＣによるＤＮＡメチル化および他の潜在的な遺伝子標的に対するその結果としての影響の調節は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングに対するさらなる影響に寄与せず、およびＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるＤＡＣＴ３単独の誘発は、最大の細胞死と関連することを示唆する。ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによって誘発される細胞死は、アポトーシス性であることがさらに確認された。図６Ｆに示すように、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ併用療法の結果、ＨＴ２９細胞においてカスパーゼ３の大幅な活性化が得られたが、これらの医薬活性剤の１つだけでの処理では得られなかった（図６Ｆを参照）。さらに、併用療法はミトコンドリア膜電位（ＭＴＰ）（ΔΨｍ）において急激な降下を誘発し、アポトーシスに特徴的なミトコンドリア機能障害を示すものである（図６Ｇを参照）。
【０２２２】
ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理の、ヒストン修飾、ＤＡＣＴ３遺伝子発現、活性化β−カテニンタンパク質レベル、およびアポトーシスに対する特異的影響は、ＤＺＮｅｐを他のＨＤＡＣ阻害剤、例えばＰＸＤ１０１およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）と組み合わせた処理においても見られた（図１３を参照）。このことは、定義されたこの薬理学的方法の影響がＤＺＮｅｐのＨＤＡＣ阻害剤との複合作用に依存し、ＤＺＮｅｐと組み合わせて投与されたＴＳＡに特有の結果ではないことを示す。
【０２２３】
２．５  Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの重要な調節因子としてのＤＡＣＴ３の機能的検証
ＤＡＣＴ３転写抑制解除が処理された結腸直腸癌細胞においてＷｎｔ／β−カテニンシグナリングを減少させるために必要であるかどうかを評価するために、細胞株を、ＤＡＣＴ３を標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡを安定して発現するＤＬＤ１から誘導して生成させた。ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理後のＤＡＣＴ３  ｍＲＮＡのレベルは、対照ｓｈＲＮＡ細胞と比較して、ＤＡＣＴ３  ｓｈＲＮＡを発現する２つのＤＬＤ１クローンにおいて大幅に減少した（図８Ａ）。ウェスタンブロット分析は、ＤＶＬ２と未リン酸化β−カテニンレベルの両方に対するＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ誘発性効果がＤＡＣＴ３  ｓｈＲＮＡ細胞において減少することを示した（図８Ａ）。さらに、アポトーシスを評価した場合、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡによるアポトーシスの誘発は、ＤＡＣＴ３  ｓｈＲＮＡを発現する細胞株において著しく減少した（図８Ｂ）。これらのＤＡＣＴ３ノックダウン効果はｓｉＲＮＡの非特異的な効果によって引き起こされる可能性は低い。その理由は、これらが２つの他の独立したＤＡＣＴ３ｓｉＲＮＡで一時的にトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞においても観察されたからである（図８Ｃ）。一方、ＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理に際してごくわずかの増加しか示さないＤＡＣＴ１のノックダウンは、アポトーシスに対して阻害効果を有さなかった（図８Ｄ）。要約すると、これらの結果は、転写的ＤＡＣＴ３の抑制解除が、結腸直腸癌細胞のＤＺＮｅｐ／ＴＳＡ処理後に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換の阻害およびアポトーシスに寄与することを示す。
【０２２４】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換の調節におけるＤＡＣＴ３の機能を、さらに直接試験した。様々な種におけるＤＡＣＴファミリーメンバーは、以前に、高度に保存されたＣ末端モチーフによってＤＶＬタンパク質と相互作用し、β−カテニン機能を負に調節することが証明されている（Ｃｈｅｙｅｔｔｅら、２００２、上記；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００６）２８１，８６０７−８６１２）。ＤＡＣＴ３もＤＶＬタンパク質と相互作用することを確認するために、Ｆｌａｇ標識ＤＡＣＴ３およびＨＡ−標識Ｄｖｌ２の発現ベクターでＳＷ４８０細胞をトランスフェクトすることによって、免疫共沈降実験を実施した。いずれかのタグ抗体を用いたこれらの条件下で、Ｄｖｌ２はＤＡＣＴ３と効率よく免疫共沈降し、反対に、ＤＡＣＴ３は効率よくＤｖｌ２と免疫共沈降する（図９Ａ）。さらに、空のベクターで共トランスフェクトされたＤｖｌ２−ＨＡ発現細胞と比較すると、Ｄｖｌ２−ＨＡとＤＡＣＴ３−Ｆｌａｇとの共トランスフェクションは、Ｄｖｌ２−ＨＡタンパク質発現において顕著な減少をもたらした（図９Ｂ）。これらの結果は、他のＤＡＣＴファミリーメンバーとの相同性から予想されるように、ＤＡＣＴ３が、Ｄｖｌ２によって例示されるＤＶＬファミリーメンバーと実際に相互作用できることを示す。これらはさらに、この相互作用が、少なくともこれらの共トランスフェクション条件下で、ＤＶＬタンパク質安定性を減少させ得ることを示す。
【０２２５】
ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニンレベルに対する異所性ＤＡＣＴ３発現の影響を、共焦点免疫化学を用いて同様に調査した。Ｍｙｃ標識ＤＡＣＴ３またはＤＡＣＴ１を発現するＳＷ４８０細胞は、ほぼ検出できないレベルの核β−カテニンを有し、一方、トランスフェクトされていない細胞または、非関連性遺伝子産物、Ｍｙｃ標識ＲＰＳ２７Ｌでトランスフェクトされた細胞は、高レベルの核β−カテニンを保持していた（図９Ｃ）。さらに、ＤＡＣＴ３を異所発現するＳＷ４８０細胞は、アポトーシスに典型的な核濃縮を示した。これらの結果は、異所発現されたＤＡＣＴ３が、他のＤＡＣＴファミリーメンバー（Ｃｈｅｙｅｔｔｅら、２００２、上記；Ｈｉｋａｓａ，Ｈ．，＆Ｓｏｋｏｌ，Ｓ．Ｙ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００４）１３１，４７２５−４７３４；Ｚｈａｎｇら、２００６、上記）と同様に、結腸直腸癌細胞においてなどのＷｎｔ／β−カテニンシグナリングを負に調節できることを示す。
【０２２６】
腫瘍形成性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害の結果として、ＤＡＣＴ３が細胞増殖を抑制するかどうかを確認するために、ＤＡＣＴ３発現プラスミドでトランスフェクトされたＤＬＤ１細胞または対照空ベクターを用いてコロニー形成アッセイを実施した。ＤＡＣＴ３でトランスフェクトされた細胞は、対照細胞と比較して、コロニー数の大幅な減少を示す（図９Ｄ）。この結果は、ＤＡＣＴ３が、結腸癌における潜在的な腫瘍抑制因子として機能することをさらに示す。
【０２２７】
２．６  生体内初期最大耐量（ＭＴＤ）研究におけるＤＺＮｅｐ毒性
この研究の目的は、（ｉ）ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて週３回投与された３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）の最大耐量（ＭＴＤ）を評価すること、および（ｉｉ）ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌腫異種移植片モデルにおいて、ＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡと組み合わせたＤＺＮｅｐの有効性を評価することであった。
【０２２８】
有効性研究のためのＨＣＴ−１１６細胞接種の時点で、３匹／群のマウスに、２．５、５、１０および１５ｍｇ／ｋｇのＤＺＮｅｐを０、２、および４日目にｉ．ｐ．注射して、初期ＭＴＤデータを集めた。体重減少は非常に限定され、最高の体重減少は、１０ｍｇ／ｋｇ群で見られた（２日目で２．２％、生データは不掲載）。３匹のマウスのうちの２匹が、１５ｍｇ／ｋｇ群で３日目に有意な体重減少がなく死亡した（生データは不掲載）。したがって、このレジメンにおけるＤＺＮｅｐのＭＴＤは、１０ｍｇ／ｋｇである。ＤＺＮｅｐを感作物質として使用した以下の複合研究に関して、本発明者らは、ＤＺＮｅｐをＭＴＤよりも十分低い投与量、すなわち５ｍｇ／ｋｇで投与することを決定した。
【０２２９】
この研究を、図１５に記載するプロトコルを用いておこなった。この複合研究は、ＨＣＴ−１１６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス４群（ｎ＝７匹マウス／群、接種後６日目の初期平均腫瘍容積：９１〜１０７ｍｍ３）を用いて開始した。本発明者らは、１つの群のマウスを、使用した化合物の両方についてのビヒクル対照とし（生理食塩水ｉ．ｐ．週３回、午前中、ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ｐ．ｏ．  ｑ．ｄ．午後）、第２の群にＳＡＨＡ（２００ｍｇ／ｋｇ  ｑ．ｄ．  ｐ．ｏ．午後）＋ＤＺＮｅｐビヒクル（生理食塩水ｉ．ｐ．週３回、午前中）を投与し、第３の群をＤＺＮｅｐ（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．午前中）＋ＳＡＨＡビヒクル（ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ｐ．ｏ．  ｑ．ｄ．午後）で処理し、最後の群をＤＺＮｅｐ＋ＳＡＨＡ（５ｍｇ／ｋｇ  ＤＺＮｅｐ  ｉ．ｐ．午前中＋２００ｍｇ／ｋｇ  ｑ．ｄ．  ｐ．ｏ．午後）で処理することで、研究を完全ビヒクル対照でおこなった。
【０２３０】
図１６から、ビヒクル群における体重は１４日以内で順調に１０６．８％まで増加したが、ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡ処理単独はどちらも、非常に少ない体重減少を示した（それぞれ９４．５％および９６．８％）ことがわかる。併用療法群は、１４日目で８７．９％までの、有意であるが、許容できる体重減少を示した。ＳＡＨＡ群において１匹の動物が強制飼養の過誤のために４日目で死亡し、２匹目のマウスもＳＡＨＡ群で８２％の体重で死亡した（ＴＲＤと見なされる）。しかし、５ｍｇ／ｋｇのＤＺＮｅｐ（週３回）＋２００ｍｇ／ｋｇのＳＡＨＡ（ｑ．ｄ）の組み合わせは、この実験においてはＢＡＬＢ／ｃヌードマウスによって十分許容されなかった。
【０２３１】
２．７  ＨＣＴ−１１６モデルにおけるＳＡＨＡと組み合わせたＤＺＮｅｐの有効性
ビヒクル対照群における全腫瘍は、図１４Ｂに示すように１４日にわたって順調に成長し、治療後１４日目の平均腫瘍容積は３９５．４ｍｍ３であった。ＭＴＶ腫瘍分配データを図１７にグラフで表示し、３、７、１０および１４日目のすべてのＴＧＩデータを図１８に示す。個々の腫瘍キャリパー測定値および体重（生データ）は掲載しない。
【０２３２】
処理の１４日後に、ＳＡＨＡ群は５５％（有意でない）の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を有していたが、ＤＺＮｅｐ処理動物は、ＴＧＩを全く示さなかった。ＤＺＮｅｐ＋ＳＡＨＡを用いた併用療法は、８３％の有意なＴＧＩを誘発した（１４５．１ｍｍ３の平均腫瘍容積、Ｐ＜０．０５  ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ）。
【０２３３】
３  考察
本発明は、ヒト結腸直腸癌におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの構成的活性化に寄与するエピジェネティック事象の発見に基づく。ここでは、ＤＡＣＴ３遺伝子の転写抑制が、結腸直腸癌細胞株および患者由来の腫瘍の両方においてしばしば起こることを示す。ＤＡＣＴ３は、ＳＦＲＰとあわせて、この疾患プロセスにおけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路の重要なエピジェネティック調節因子であり得ることを示唆するデータを提示する。ＤＡＣＴ３は、したがって、異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの制御を目的とする癌治療の潜在的に重要な標的である。前述の技術は、本発明の方法および使用において容易に用いることができる。
【０２３４】
その発現が多くの場合、プロモータＤＮＡメチル化によって完全に抑制されるＳＦＲＰ遺伝子とは異なり、ＤＡＣＴ３は、結腸癌細胞株において低レベルで発現される。本発明は、このエピジェネティック事象が、ＤＡＣＴ３遺伝子座で抑制的（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）および活性化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）ヒストンマークの両方を含む二価ヒストン修飾によって起こり、プロモータＤＮＡのメチル化を伴わないかまたは必要としないことを示す。このエピジェネティック調節の結果、ＤＡＣＴ３のレベルを、ヒストン修飾を標的とする薬理学的治療、特に、ヒストンメチル化および脱アセチル化の両方を同時に妨害する併用治療によって強力に誘発することができる。一方、この治療は、ＤＮＡメチル化によって主に抑制された遺伝子、例えばＳＦＲＰ１またはＤＡＣＴ２を再活性化せず、ＤＡＣＴを適度に誘発するだけであり、結腸癌細胞におけるその抑制は、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾の両方と関連している。このデータは、ＤＺＮｅｐおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えばＴＳＡの併用投与が、ＤＮＡメチル化が最小の二価ヒストン修飾によって主に抑制された遺伝子を優先的に再活性化することを示す。
【０２３５】
二価クロマチンは、以前に胚幹（ＥＳ）細胞および一部の分化細胞の両方において記載され、これらは一般的に低レベルで発現された遺伝子と関連する（Ａｚｕａｒａら、２００６、上記；Ｂａｒｓｋｉ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２００７）１２９，８２３−８３７；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００６、上記；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、２００７、上記；Ｐａｎら、２００７、上記；Ｚｈａｏら、２００７、上記）。ＥＳ細胞において二価ヒストンマークを有する腫瘍抑制遺伝子の中には、腫瘍形成中にＨ３Ｋ４ｍｅ３マークを失うが、その代わりに、ＤＮＡメチル化によって完全に抑制されるようになるものもある（Ｏｈｍ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９，２３７−２４２；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｙ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９，２３２−２３６；Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９，１５７−１５８）。本発明者らによって得られたデータは、癌細胞において起こる二価クロマチン状態が、癌性変化にも寄与し得ることを示唆する。重要なことに、ＤＡＣＴ３遺伝子座でのこのエピジェネティック修飾は、正常な腸上皮細胞中のＤＡＣＴ３遺伝子座ではこのような修飾は観察されなかったので、明らかに癌特異的である。癌細胞においてこのような二価クロマチン状態で見いだされる遺伝子（たとえばＤＡＣＴ３）は、したがって、独自の治療標的である。ＤＮＡメチル化によって抑制される腫瘍抑制因子と異なり、二価クロマチンを有する遺伝子、例えばＤＡＣＴ３を、ヒストンメチル化および脱アセチル化の両方を標的とするＤＺＮｅｐおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤での処理による操作に特に付すことができる。これらの交互に調節された腫瘍抑制遺伝子は、ＤＮＡメチル化のみを標的とする治療薬、例えばＡｚａに対して無反応である可能性が高いので、これらを同定することも重要である。
【０２３６】
現在のところ推測であるが、本発明に関連して、結腸直腸癌細胞中のＤＡＣＴ３遺伝子座で観察されるクロマチンパターンは、幹細胞様癌細胞の分子署名の一部であることが可能である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングが上皮幹細胞および初期幹細胞の維持において中心的役割を果たすこと、およびｉＰＳ細胞の生成に関与することの証拠がある（前記参照）。いくつかの実施形態において、特に結腸直腸癌細胞に特徴的なエピジェネティックシグニチャーを標的とし、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを無効にできる本発明の複合薬学的アプローチは、遺伝子サイレンシングのこの機構に依存し、その自己再生および生存のために高レベルのＷｎｔ／β−カテニンシグナリング活性を必要とする癌幹細胞を標的とする可能性を有し得る。
【０２３７】
得られた結果は、癌細胞における遺伝子抑制に関与するエピジェネティック機構の多様性および複雑さを示す。ＤＺＮｅｐをヒストンメチル化阻害剤として、他のクロマチン再構成化合物と組み合わせて使用することによって、様々なエピジェネティック機構によって調節される他の癌遺伝子を発見することが可能になり得る。ＤＺＮｅｐとＨＤＡＣ阻害剤、例えばＴＳＡとの全体的なヒストン修飾プロファイルに対する複合効果は、この薬物の組み合わせが、抑制的ヒストンマーク（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を減少させ、同時に活性化マーク（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ９／１４ａｃ）を増加させることによって、抑制的クロマチン状態を活性なものに切り替えるらしいので、誘発的である。したがって、この薬理学的介入は、ＤＮＡメチル化阻害剤とあわせて、一部の癌細胞において見いだされる全体的に「悪性」のクロマチン状態を、より正常な「良性」状態に戻す可能性を有し得る。ＤＺＮｅｐおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた処理がどのようにしてヒストンのアセチル化においてこのように強力な相乗効果をもたらすかは生化学的に確認しなければならない状態であるが、それでもこれは、これら２種類のヒストン修飾間の直接的クロストークを反映する可能性が高い。提示したデータは、ゲノム全体にわたるヒストン修飾プロファイルのこのような薬理学的エピジェネティック「再プログラミング」は、遺伝子発現における著しい変化をもたらし得、複数のシグナリング経路に同時に影響を及ぼすことをさらに示唆する。実際、本発明者らのマイクロアレイデータは、ＤＡＣＴ３が、この方法で調節された遺伝子だけでなく、少なくとも８１の他の遺伝子の発現が、ＤＺＮｅｐとヒストンデアセチラーゼ阻害剤との併用療法によって著しく影響を受けたことを示す。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害が他のシグナリング効果と協働して、この併用療法によって観察される最大アポトーシス反応をもたらすことが可能である。
【０２３８】
本発明は、薬理学的抑制解除によるかまたは異所性発現によるかのいずれかで、結腸直腸癌細胞におけるＤＡＣＴ３タンパク質のレベルを増加させると、その結果、ＤＶＬ２が確実に分解され、活性化β−カテニンが減少することを示す。このＤＡＣＴ３−ＤＶＬ２シグナリング相互作用は、ＧＳＫ−３を経由してβ−カテニン安定性を調節する。この概念は、ＧＳＫ−３の小分子阻害剤が、ＤＺＮｅｐおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた処理によって引き起こされた活性化β−カテニンにおける減少を救済するという発見によって裏付けられる。本明細書で報告するように、本発明者らは、ＤＡＣＴ３増加させることによって引き起こされる活性化β−カテニンにおける減少は、ＡＰＣ突然変異の存在下でも起こり得ることも見いだした。この発見は、無秩序なβ−カテニンリン酸化および分解が、ＡＰＣ突然変異を有する結腸直腸癌細胞において依然として起こることを示唆する多くの報告と一致する（Ｃａｌｖｉｅｌｌｏ，Ｇ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２００７）２８，１２０２−１２０９；Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌ．ら、ＭｏＩ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２００３）２，８８５−８９２；Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記；Ｙａｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００６）２８１，１７７５１−１７７５７）。特に、ＳＦＲＰ１／２の回復された発現は、これらの下流突然変異を有する結腸直腸癌細胞においてβ−カテニンを有効に分解できることが示されている（Ｃａｌｖｉｅｌｌｏら、２００７、上記；Ｒｉｃｅら、２００３、上記；Ｓｕｚｕｋｉら、２００４、上記）。これらの発見は、進行中の研究と併せて、結腸直腸癌細胞においてＡＰＣと独立してβ−カテニン調節に寄与する代替分子機構が存在することを示唆する。
【０２３９】
本発明に関連して得られたデータは、複数の異常なエピジェネティック事象が、結腸癌におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路の異常な活性化に寄与し得ることも示唆する。これらの複数の事象は、同じ細胞で起こり得るか、または腫瘍内の異なる細胞中に存在し得る。腫瘍細胞集団における不均一性を増大させることによって、エピジェネティック事象は癌進行に寄与し得、治療抵抗性および癌再発にも寄与し得る。
【０２４０】
簡単に言うと、本開示のデータは、ＤＡＣＴ３のエピジェネティック抑制が、結腸直腸癌細胞における異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナリングに至ることを示す。本発明者らのデータは、今まで知られていなかったエピジェネティック事象がどのようにして結腸直腸癌におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナリングの規制解除に貢献するかの理解に向けての重要な進歩である。この研究は、このようなエピジェネティック事象が薬理学的戦略によって特異的に標的とされ、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングに対して確実な影響をもたらし、癌撲滅のための重要な結果をもたらし得るという重要な原理の証明も提供する。
【０２４１】
生体内研究において得られた結果は、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ阻害剤ＤＺＮｅｐとＳＡＨＡとの組み合わせが、低く十分許容される投与量でＤＺＮｅｐを投与した場合に、固形腫瘍に対して有効であり得ることを示す。８３％のＴＧＩデータは有意であり、一方、ＤＺＮｅｐ単独を用いた治療は、全く有効ではなかった（０％ＴＧＩ）。いくつかの従来の実験においてと同様に、ＳＡＨＡ単独は５０％付近の中程度のＴＧＩを有していたので、ＤＺＮｅｐおよびＳＡＨＡの効果間には相乗作用が存在すると結論づけることができる。
４  使用した略語のリスト
略語              説明
ｂ．ｉ．ｄ．      ｂｉｓ  ｄｉｅ、１日２回
ＢＲＣ            バイオポリスの生物遺伝資源部門（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｂｉｏｐｏｌｉｓ）
ＢＷ              体重
ＣＲ              完全退縮
ＤＺＮｅｐ        ３−デアザンプラノシンＡ
ＨＤＡＣ          ヒストンデアセチラーゼ
ＩＡＣＵＣ        研究機関の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）
ｉ．ｐ．          腹腔内的
ＬＴＴＦＳ        長期間無腫瘍生存者
ＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ０．５％のメチルセルロース＋０．１％のＴｗｅｅｎ８０
ＭＴＤ            最大耐量
ＭＴＶ            腫瘍容積中央値
ＮＴＲＤ          治療に関連しない死
ｐ．ｏ．          ｐｅｒ  ｏｓ、経口的
ＰＲ              部分退縮
ｑ．ｄ．          ｑｕａｑｕｅ  ｄｉｅ、１日１回
ＳＡＨＡ          スベロイルアニリドヒドロキサム酸
ＴＧＩ            腫瘍成長阻害
ＴＲＤ            治療に関連する死
ＴＳＡ            トリコスタチンＡ
本発明を本明細書において広範で一般的に記載してきた。一般的開示内のさらに狭い種および亜属分類のそれぞれも本発明の一部を形成する。これは、除去された物質が本明細書において具体的に記載されているかどうかに関係なく、この属から任意の対象物を除去するという仮定または小さな制限つきで、本発明の一般的記述を包含する。他の実施形態は、以下のクレーム内に含まれる。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者らは、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることを理解するであろう。
【０２４２】
当業者は、本発明が、目的を実施し、言及された目的および利点、ならびに固有のものを得るために十分適応されることを容易に理解するであろう。さらに、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された発明に対して様々な置換および修飾をなすことができることは、当業者には容易に明らかになるであろう。本明細書に記載された組成物、方法、手順、処理、分子および特定の化合物は、現在のところ、典型例であって本発明の範囲に対する制限として意図されない好適な実施形態の代表例である。請求の範囲によって規定される本発明の趣旨内に含まれる変更および他の使用を、当業者は思いつくであろう。本明細書における、すでに公開された文書の掲載または検討は、この文書が最新技術の一部であるか、または一般常識であることを必ずしも認めるものではない。
【０２４３】
本明細書において実例として記載した発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素、制限の非存在下で、好適に実施できる。したがって、たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、拡張的に、制限なく読み取られるべきである。「含む」という用語またはその変形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、したがって、記載した完全体または完全体の群を含むことを意味するが、他の完全体または完全体の群を排除することを意味しないと理解される。さらに、本明細書において用いた用語および表現は、説明のための表現であって、制限するものではなく、図示し、説明した特徴の任意の同等物またはその一部を排除する意図はなく、様々な修飾はクレームされる本発明の範囲内に含まれ得ると認識される。したがって、本発明を典型的な実施形態および任意の特徴によって具体的に開示したが、本明細書において具体化した本発明の修飾および変形を当業者は使用することができ、このような修飾および変形は本発明の範囲内にあるとみなされると理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2011504462.tif 000028
【図３Ｈ】
2011504462.tif 000029
【図４Ａａ】
2011504462.tif 000030
【図４Ａｂ】
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【図４Ｂ】
2011504462.tif 000032
【図４Ｃ】
2011504462.tif 000033
【図５Ａ】
2011504462.tif 000034
【図５Ｂ】
2011504462.tif 000035
【図５Ｃ】
2011504462.tif 000036
【図５Ｄ】
2011504462.tif 000037
【図６Ａ】
2011504462.tif 000038
【図６Ｂ】
2011504462.tif 000039
【図６Ｃ】
2011504462.tif 000040
【図６Ｄ】
2011504462.tif 000041
【図６Ｅ】
2011504462.tif 000042
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
2011504462.tif 000045
【図７Ｂ】
2011504462.tif 000046
【図７Ｃ】
2011504462.tif 000047
【図８Ａ】
2011504462.tif 000048
【図８Ｂ】
2011504462.tif 000049
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2011504462.tif 000051
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2011504462.tif 000055
【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
2011504462.tif 000063
【図１３Ｂ】
2011504462.tif 000064
【図１４Ａ】
2011504462.tif 000065
【図１４Ｂ】
2011504462.tif 000066
【図１５】
2011504462.tif 000067
【図１６】
2011504462.tif 000068
【図１７】
2011504462.tif 000069
【図１８】
2011504462.tif 000070
【配列表】
2011504462000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月2日(2010.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における腫瘍発生を予防、阻害、阻止または無効化する方法であって、ＤＡＣＴ（「ダッパー、ベータ−カテニンの拮抗薬、ホモログ」）タンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることを含み、
ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントの量および活性の増加が、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントの発現および／または活性を増加させる化合物を投与することにより達成され、かつ、
前記化合物は、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする配列を含む核酸分子、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメント自体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、および一般式（Ｉ）
【化１】
2011504462.tif 000071
（式（Ｉ）中、
Ａは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物からなる群から選択される方法。
【請求項２】
前記細胞が体細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が直腸細胞または結腸細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍発生が発癌現象である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることを含み、
ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントの量および活性の増加が、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントの発現および／または活性を増加させる化合物を投与することにより達成され、かつ、
前記化合物は、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントのをコードする配列を含む核酸分子、ＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメント自体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、および一般式（Ｉ）
【化２】
2011504462.tif 000072
（式（Ｉ）中、
Ａは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
方法。
【請求項６】
腫瘍細胞におけるアポトーシスを検出することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍が、癌または潰瘍性大腸炎である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、結腸直腸癌、黒色腫、食道癌、肺癌、卵巣癌、肝細胞癌、および子宮内膜癌のうちの１つである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を宿主生物から得るか、または前記細胞が宿主生物中に含まれている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主生物が、微生物、魚、両生類、鳥および哺乳動物のうちの１つである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、モルモット、チンパンジー、およびヒトからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、増殖性疾患もしくは障害の治療または予防に含まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
治療される前記増殖性疾患または障害が癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法がエピジェネティック法である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を実施または予防することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記翻訳後のヒストン修飾が、ヒストンのメチル化またはヒストンのアセチル化である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンの変更が、ＤＡＣＴタンパク質の遺伝子座で行われる、請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を実施することが、（ｉ）あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去および（ｉｉ）あるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加のうちの少なくとも１つを実施することを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
翻訳後ヒストン修飾パターンの変更を予防することが、（ｉ）あるアミノ酸の位置での転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の付加および（ｉｉ）あるアミノ酸の位置での転写活性化翻訳後ヒストン修飾の除去のうちの少なくとも１つを阻害することを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾の除去と、前記転写活性化翻訳後ヒストン修飾の付加との組み合わせを実施することを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化のうちの１つであり、前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化のうちの１つである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性のうちの少なくとも１つを増加させることが、タンパク質ベータ−カテニンのリン酸化状態を増加させることをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質ベータ−カテニンのリン酸化状態を増加させることが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３を活性化することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントの量および活性の少なくとも１つを増加させることが、細胞における、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量を減少させることをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のうちの１つである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
細胞におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質の量が分解によって減少する、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が前記ＤＡＣＴタンパク質と複合体を形成する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量および活性のうちの少なくとも１つを評価することをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＡＣＴタンパク質の量および／または活性を評価することが、前記量および／または活性をある期間にわたって評価することを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量を評価することが、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の遺伝子発現を測定することによって達成される、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
ＤＡＣＴ遺伝子発現の測定結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記対照測定がＤＡＣＴタンパク質の遺伝子発現を少なくとも本質的に調節しない条件の使用を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞と、所定の量の一般式（Ｉ）：
【化３】
2011504462.tif 000073
（式（Ｉ）中、
Ａは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物とを接触させることを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞と、所定の量の一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせとを接触させることを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、一般式（ＩＩ）または一般式（ＩＩＩ）：
【化４】
2011504462.tif 000074
（式中、Ｒ６は、Ｈ、アミノ基、エーテル基、脂肪族基およびアリール脂肪族基のうちの１つであり、
Ｌは、１〜８個の主鎖炭素原子ならびにＮ、ＯおよびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族またはアリール脂肪族基を含むブリッジである）
の化合物である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ６のアミノ基もしくはエーテル基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、またはアリール脂環式基で置換されている、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記一般式（Ｉ）の化合物が、（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール（３−デアザンプラノシン）である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記一般式（ＩＩ）の化合物が、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド（トリコスタチン−Ａ）である、請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４２】
細胞における腫瘍発生の危険性を診断する方法であって、（ｉ）細胞中のＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）細胞中のＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）細胞中の翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む方法。
【請求項４３】
翻訳後のヒストン修飾が、ヒストンのメチル化およびヒストンのアセチル化の少なくとも１つである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が腫瘍原性になる傾向を有する細胞を同定する方法である、請求項４２または４３記載の方法。
【請求項４５】
得られた結果を対照測定と比較することを含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記対照測定が、少なくとも本質的に腫瘍原性になる危険性のないことが知られている細胞における（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ヒストンのアセチル化の前記パターンの評価において、ヒストン３上の（ｉ）リシン９および（ｉｉ）リシン１４のうちの少なくとも１つのアセチル化の減少は、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ヒストンのメチル化の前記パターンの評価において、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の増大が、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との組み合わせは、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記活性化翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン４のメチル化、ヒストン３上のリシン９のアセチル化、およびヒストン３上のリシン１４のアセチル化のうちの１つであり、前記転写抑制的翻訳後ヒストン修飾が、ヒストン３上のリシン９のメチル化、ヒストン３上のリシン２７のメチル化、およびヒストン４上のリシン２０のメチル化のうちの１つである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化が、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項５０または５１記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量の評価において、前記ＤＡＣＴタンパク質の量の減少は、前記細胞が腫瘍原性になる危険性が増大したことの徴候である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
被検体において新生物が発現する危険性を診断する方法であって、（ｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含む、方法。
【請求項５５】
前記新生物が腫瘍である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍が、黒色腫、乳房腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、類腱腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫および毛母基細胞腫瘍のうちの１つである、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記翻訳後ヒストン修飾が、ヒストンメチル化およびヒストンアセチル化のうちの少なくとも１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との組み合わせが、被検体において新生物が発現する危険性の徴候である、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
転写活性化翻訳後ヒストン修飾と転写抑制的ヒストン翻訳後ヒストン修飾との前記組み合わせが、ヒストン３上のリシン４および２７のメチル化の組み合わせである、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記翻訳後ヒストン修飾パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
新生物が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と一般式（Ｉ）
【化５】
2011504462.tif 000075
（式（Ｉ）中、ＡはＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む、脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は、任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、およびハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物との組み合わせに対して感受性であるかどうかを予測する方法であって、
前記新生物における（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性、（ｉｉｉ）翻訳後ヒストン修飾パターンのうちの１つを評価することを含み、
（ｉ）ＤＡＣＴタンパク質の量の減少、（ｉｉ）ＤＡＣＴタンパク質の活性の減少、（ｉｉｉ）および翻訳後ヒストン修飾の変更のうちの１つが、前記新生物が一般式（Ｉ）の化合物とヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組み合わせに対して感受性であることの徴候である、方法。
【請求項６２】
前記新生物が哺乳動物中に含まれる、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記新生物が腫瘍である、請求項６１または６２記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍が、黒色腫、乳房腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、類腱腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫および毛母基細胞腫瘍のうちの１つである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記変更された翻訳後ヒストン修飾が、ヒストンメチル化およびヒストンアセチル化のうちの少なくとも１つである、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ヒストンのメチル化および／またはヒストンのアセチル化の前記パターンが、ＤＡＣＴタンパク質の前記遺伝子座で評価される、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍の予防または治療用医薬の製造での、細胞におけるＤＡＣＴタンパク質の絶対量を増加させるＤＡＣＴタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする配列を含む核酸分子、またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／または一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項６８】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２およびＤＡＣＴ３のうちの１つである、請求項６７記載の使用。
【請求項６９】
黒色腫の治療における、一般式（Ｉ）
【化６】
2011504462.tif 000076
（式（Ｉ）中、
ＡはＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、ならびにハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物、およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤の使用。
【請求項７０】
結腸直腸癌の治療における、一般式（Ｉ）
【化７】
2011504462.tif 000077
（式（Ｉ）中、
ＡはＣＨまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、およびアリール脂環式ヒドロカルビル基からなる群から独立して選択され、
ここで、Ｒ４およびＲ５は任意に結合して脂肪族ヒドロカルビルブリッジを形成してもよく、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、かつ、
Ｒ３は、Ｈ、または１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、ならびにハロゲンの群から選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族ヒドロカルビル基である）
の化合物、およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤の使用。
【請求項７１】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な候補化合物を同定する方法であって、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に前記化合物を導入し、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現を測定することを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現の増大は、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項７２】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な候補化合物を同定する方法であって、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現する細胞中に前記化合物を導入し、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性を測定することを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性の増大は、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項７４】
得られた結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記対照測定が、ＤＡＣＴタンパク質の発現および／または活性を調節しない化合物の使用を含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が癌細胞である、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が、結腸直腸組織、皮膚組織、胸部組織、肺組織、膀胱組織および卵管の組織のうちの１つに由来する、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が、細胞株の細胞である、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能な化合物を同定する生体外法であって、化合物、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメント、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を接触させることを含み、前記ＤＡＣＴタンパク質と前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との間の複合体形成の増進が、前記化合物による細胞における腫瘍発生の予防、阻害、阻止もしくは無効化および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発が可能であることを示す、方法。
【請求項８１】
前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が、Ｄｖｌ１、Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のうちの１つである，請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
（ａ）試験管に、ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントと、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質との複合体形成を増進させることができると予想される化合物を添加する工程と、
（ｂ）前記ＤＡＣＴタンパク質、またはその機能的フラグメントを前記試験管に添加する工程と、
（ｃ）前記Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質を添加する工程と、
（ｄ）前記複合体形成を検出する工程と
を含む、請求項８０または８１記載の方法。
【請求項８３】
前記検出が、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光定量法、放射線学的方法、酵素法または熱力学的方法によって行われる、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記ＤＡＣＴタンパク質が、ＤＡＣＴ２またはＤＡＣＴ３である、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2011504462.tif 000078
2011504462.tif 000079
2011504462.tif 000080