(57)【要約】本出願はTim-3活性を調節することにより慢性ウイルス感染症を処置する方法に関する。さらに、本出願はTim-3の発現を用いて免疫系の活性または機能、慢性ウイルス感染症および炎症性疾患を診断またはモニタリングする方法に関する。2011500730.tif 000008
2011500730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする被験者において機能障害のあるT細胞の機能を改善するためのTim-3の阻害剤の有効量の使用。
【請求項２】
ウイルス感染症に罹患している被験者を処置するための、請求項1記載の使用。
【請求項３】
ウイルス感染症が慢性ウイルス感染症である、請求項2記載の使用。
【請求項４】
慢性ウイルス感染症がHIV感染症またはHCV感染症である、請求項3記載の使用。
【請求項５】
ウイルス感染症が急性ウイルス感染症である、請求項2記載の使用。
【請求項６】
Tim-3の阻害剤が抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
Tim-3の阻害剤がTim-3の可溶型である、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
Tim-3の可溶型がSEQ ID NO:2もしくは6のアミノ酸配列またはその変種を含む、請求項7記載の使用。
【請求項９】
被験者において慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用。
【請求項１０】
慢性ウイルスがHIV-1またはHCVである、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
被験者における慢性ウイルス感染症を処置または予防するための、請求項9または10記載の使用。
【請求項１２】
SEQ ID NO:2もしくは6のアミノ酸配列またはその変種を含む単離アミノ酸配列。
【請求項１３】
Tim-3の阻害剤を含む薬学的組成物。
【請求項１４】
Tim-3の阻害剤がTim-3の可溶型である、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
HIV-1抗原をさらに含む、請求項13または14記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
ヒト内在性レトロウイルス(HERV)抗原または長鎖散在反復配列(LINE)抗原をさらに含む、請求項13または14記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
Tim-3の発現を検出することによって、機能障害のあるT細胞を検出または単離する方法。
【請求項１８】
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者における機能障害のあるT細胞の存在を示す、
被験者における機能障害のあるT細胞を検出する方法。
【請求項１９】
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階;
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス負荷を示す、
被験者におけるウイルス負荷をモニタリングまたは評価する方法。
【請求項２０】
被験者が慢性ウイルスに感染している、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスがHIVウイルスまたはHCVウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
被験者が急性ウイルスに感染している、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス感染症を示す、
被験者におけるウイルス感染症をモニタリングまたは診断する方法。
【請求項２４】
ウイルス感染症が慢性ウイルス感染症である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
慢性ウイルス感染症がHIV感染症またはHCV感染症である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス感染症が急性ウイルス感染症である、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べてサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の増加が疾患の進行を示し、かつ対照と比べてサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の減少が疾患の寛解を示す、
慢性ウイルス感染症を有する被験者における疾患の進行をモニタリングまたは評価する方法。
【請求項２８】
対照が、同一の被験者から過去の時点より得たサンプルを含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の有効性をモニタリングする方法であって、
(a) HAARTを開始する前に被験者におけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) HAARTの開始後の少なくとも一つの時点で得たT細胞表面上のTim-3の発現を比較する段階
を含み、
Tim-3の発現の減少が治療法の有効性を示す、方法。
【請求項３０】
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が免疫系の活性または機能を示す、
被験者における免疫系の活性または機能をモニタリングする方法。
【請求項３１】
免疫系の機能がT細胞増殖および/またはサイトカイン産生である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
T細胞がCD4+ T細胞である、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願の分野
本出願はTim-3活性を調節することによりウイルス感染症を処置する方法および免疫系の活性を増加する方法に関する。さらに、本出願はTim-3の発現を用いて免疫系の活性、急性および慢性ウイルス感染症ならびに炎症性疾患を診断またはモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出願の背景
HIV-1特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答は、ウイルスの複製を制御するうえで主要な役割を果たすことが多くの研究から明らかである(1-4)。しかし、ほとんどの場合、HIV-1に対する細胞性免疫はウイルス血症の長期制御ができないと分かっており、抗レトロウイルス療法がなければ、AIDSへの進行が起こる。HIV-1を含む宿主免疫系の究極的な不全は、進行性HIV-1感染症を伴ったウイルス特異的CD8+およびCD4+ T細胞の機能障害、つまりT細胞疲弊といわれる現象に関連していることが明らかになっている(5-7)。
【０００３】
効果的なT細胞応答は抗原に応じた多機能性サイトカインの産生、細胞傷害能および強力な増殖によって特徴付けられる(11-14)。HIV-1の慢性感染症との関連では、特徴的パターンの後にT細胞応答の悪化が起きる。増殖能、細胞傷害能およびIL-2産生能は早くに失われるが、IFN-γの産生はもっと持続的である。最終的に、抗原に慢性的に曝露されたCD8+およびCD4+の両T細胞の大部分がIFN-γ産生能を失い、末梢でアネルギーの状態に入る(8-13)。これは、HIV-1特異的T細胞のごく一部しか抗原に応じてサイトカインを産生しないことを観察した、四量体での研究によって実証された(14-18)。最近、原因となるPD-1を介したシグナル伝達の寄与が特定されT細胞疲弊の理解において前進があった(5-7)。T細胞の調節に特徴的な複雑さを考慮すると、慢性的に活性化された細胞のエフェクタ機能を抑制するための他の機構が存在する可能性が高い。
【０００４】
T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子3 (Tim-3)は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの一員である。Tim-3のマウス相同体はTh1 CD4+ T細胞の特異的細胞表面マーカーとして同定された。マウスTim-3とそのインターフェロン誘導性リガンドであるガレクチン-9との相互作用は、T細胞の凝集およびIFN-γ産生Th1細胞の死を促進することによってTh1応答を調節することが明らかにされている(20)。マウスでは、Tim-3経路の遮断によって、共刺激の遮断により誘導される移植寛容の獲得が阻止される(21) (22)。さらに、Tim-3欠損マウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルでの高用量寛容の誘導に対して抵抗性であり、SJL/Jマウスの抗Tim-3 mAb処置はEAEを悪化させた(23) (19)。合わせて、これらの結果は、Tim-3の相互作用がエフェクターTh1細胞の終わりを通じてマウスでのTh1媒介性免疫応答の抑制に関与していることを示している。
【発明の概要】
【０００５】
出願の概要
本発明者らは、HIVなどの、急性および慢性ウイルスに感染した被験者において機能障害のあるT細胞の新規集団を特定した。この細胞集団はその表面に糖タンパク質Tim-3を発現する。さらに本発明者らは、この細胞集団の存在が、HIVなどのウイルスに急性または慢性感染した被験者におけるCD38発現と相関し、ウイルス負荷と相関すること、およびこの細胞集団の存在がCD4+ T細胞数と逆相関することを特定した。さらに、本発明者らは、Tim-3活性の遮断が免疫系の機能を改善することを明らかにした。特に、本発明者らは、Tim-3シグナル伝達の遮断がT細胞の機能を改善することを明らかにした。
【０００６】
したがって、本出願は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が免疫系の活性または機能を示す、
被験者における免疫系の活性または機能をモニタリングする方法を含む。
【０００７】
本出願の別の局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者における機能障害のあるT細胞の存在を示す、
被験者における機能障害のあるT細胞を検出する方法である。
【０００８】
本出願のさらなる局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階;
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス負荷を示す、
被験者におけるウイルス負荷をモニタリングまたは評価する方法である。
【０００９】
本出願の別の局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階;
(b) サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べてサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の増加が疾患の進行を示し、サンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の減少が疾患の寛解を示す、
慢性ウイルス感染症を有する被験者における疾患の進行をモニタリングまたは評価する方法である。一つの態様において、対照は同一の個体から過去の時点より得たサンプルを含む。
【００１０】
本出願のさらなる局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス感染症を示す、
被験者におけるウイルス感染症をモニタリングまたは診断する方法である。このウイルス感染症は急性または慢性ウイルス感染症でありうる。
【００１１】
本出願のさらなる局面は高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の有効性をモニタリングする方法であって、
(a) HAARTを開始する前に被験者におけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) HAARTの開始後の少なくとも一つの時点で得たT細胞表面上のTim-3の発現を比較する段階
を含み、
Tim-3の発現の減少が有効な治療法を示す、方法である。
【００１２】
本出願のさらなる局面は、ウイルス感染症に罹患している被験者にTim-3阻害剤の有効量を投与する段階を含む、ウイルス感染症を有する被験者を処置する方法である。
【００１３】
本出願は、ウイルス感染症に罹患した被験者を処置するためのTim-3の阻害剤の有効量の使用、およびウイルス感染症に罹患した被験者を処置するための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願はウイルス感染症の処置で用いるTim-3の阻害剤に関する。一つの態様において、ウイルス感染症は急性ウイルス感染症である。別の態様において、ウイルス感染症は慢性ウイルス感染症である。
【００１４】
本発明の別の局面は、Tim-3の阻害剤の有効量をそれを必要とする被験者に投与する段階を含む、高活性抗レトロウイルス処置(HAART)療法で持続する免疫欠如を覆す方法である。
【００１５】
本出願は、HAART療法で持続する免疫欠如を覆すためのTim-3の阻害剤の使用およびHAART療法で持続する免疫欠如を覆すための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の使用も含む。さらに、本出願はHAART療法で持続する免疫欠如を覆すのに用いるTim-3の阻害剤に関する。
【００１６】
本出願のさらなる局面は、機能障害のあるT細胞をTim-3の阻害剤で処置する段階を含む、機能障害のあるT細胞の機能を改善する方法である。
【００１７】
本出願は、機能障害のあるT細胞の機能を改善するためのTim-3の阻害剤の使用、および機能障害のあるT細胞の機能を改善するための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の使用も含む。さらに、本出願は機能障害のあるT細胞の機能の改善で用いるTim-3の阻害剤に関する。
【００１８】
さらに、本出願は、HIV-1抗原またはHCV抗原などの、慢性ウイルス抗原、およびTim-3の阻害剤の有効量を被験者に同時投与する段階を含む、該被験者においてHIV-1またはHCVなどの、慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を含む。
【００１９】
本出願は、被験者において慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用、ならびに被験者において慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬を製造するための慢性ウイルス抗原(chronic antigen)およびTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は被験者における慢性ウイルスに対する免疫応答の誘導で用いる慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤に関する。
【００２０】
さらに、本出願は、被験者においてヒト内在性レトロウイルス(HERV)または長鎖散在反復配列(LINE)抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、LINEまたはHERV免疫原、およびTim-3の阻害剤の有効量を該被験者に同時投与する段階を含む方法を提供する。一つの態様において、この方法は、HERVまたはLINE抗原を発現するHIV感染細胞に対する免疫応答を誘導するために用いられる。HERV抗原は、参照により本明細書に組み入れられるUSSN 11/880,126に記述されている。
【００２１】
本出願は、被験者において免疫応答を誘導するためのLINEまたはHERV免疫原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用、ならびに被験者において免疫応答を誘導するための医薬を製造するためのLINEまたはHERV免疫原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は被験者における免疫応答の誘導で用いるLINEまたはHERV免疫原およびTim-3の阻害剤に関する。
【００２２】
さらに、本出願は、HIV-1抗原、HCV抗原、HERV抗原またはLINE抗原などの、慢性ウイルス抗原、およびTim-3の阻害剤の有効量を被験者に同時投与する段階を含む、該被験者においてHIV-1感染症またはHCV感染症などの、慢性ウイルス感染症を処置または予防する方法を含む。
【００２３】
本出願は、被験者における慢性ウイルス感染症を処置または予防するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用、ならびに被験者における慢性ウイルス感染症を処置または予防するための医薬を製造するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は被験者における慢性ウイルス感染症の処置または予防で用いる慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤に関する。
【００２４】
本出願はTim-3の可溶型を含んだ組成物ならびにその方法および使用も含む。
【００２５】
本出願の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい態様を示しているとはいえ、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正が明らかになるものと考えられるので、これらは単に例証として与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
これから本発明を図面に関連して記述する。
【００２７】
【図１】HIV-1感染症ではTim-3がT細胞上にて上方制御され、その発現がHIV-1疾患の進行のパラメータと相関することを示す。(A〜F) HIV-1感染個体およびHIV-1非感染対照由来のPBMCをTim-3、CD4、CD8およびCD3に対する抗体で染色した。示したものは、ビオチン化ポリクローナルヤギ抗Tim-3抗体、引き続き二次ストレプトアビジン-APC結合体を用いた染色で得たデータである。PE結合モノクローナル抗Tim-3を用いて確認実験を行ったところ、これら二つのデータセット間に良好な相関を認め、ポリクローナル抗Tim-3ではTim-3発現細胞の出現率がわずかに高いことを認めた(図12も参照)。代表的なプロットはCD3+集団に対してゲーティングし、引き続きCD8+ (A、B、C)集団またはCD4+ (D、E、F)集団に対してゲーティングした事象を示す。ポリクローナルヤギ抗Tim-3の非特異的結合の可能性があるために、ビオチン化正常ヤギ対照抗血清および対照に対するストレプトアビジン-APCを用いて染色を行った(A、D)。示したものは、HIV-1感染被験者(C、F)と比べたHIV-1非感染被験者(B、E)のTim-3の代表的レベルである。CD8+およびCD4+ T細胞に関するTim-3+細胞の割合(G、H)を、以下の群: HIV-1非感染群、HIV-1感染の急性/早期群、HIV-1感染の慢性群、およびHIV-1感染のコントローラ群に分けた個体31名について示した。群は次のように定義した: 急性/早期 = 最近4ヶ月以内にHIV-1に感染; 慢性 = 感染1年超で、CD4の減少あり; コントローラ = 感染1年超、CD4減少のエビデンスなし、かつウイルス負荷5,000コピー/ml bDNA未満。マンホイットニー検定を用いて統計解析を行った。(I〜R) CD8+ (I〜K、O、P)およびCD4+ (L〜N、Q、R) T細胞上のTim-3の発現とウイルス負荷(I、L、O、Q)、CD4 T細胞数(J、M)およびCD38発現レベル(K、N、P、R)との間の相関を示す。スピアマンの順位相関検定を用いて統計解析を行った。
【図２】慢性HIV-1感染個体8名由来のPBMCをA2拘束性CMV、EBVおよびHIV-1エピトープに対する五量体で染色したものを示す(A〜H)。(A〜D) 示したものは、CMV pp65エピトープ「NLVPMVATV」(O)、EBVエピトープ「GLCTLVAML」(P)、HIV-1-Polエピトープ「ILKEPVHGV」(Q)およびHIV-1-Gagエピトープ「SLYNTVATL」に対する四量体を用いて個体1名から得た代表的なフローサイトメトリーデータである。五量体+細胞の平均蛍光強度(MFI)を各エピトープに対して検出可能な全ての応答について比較した。Tim-3の発現はHIV-1特異的応答の中で不均一となり、非常に高いTim-3レベルを示すものもあれば、他方では、ベースラインレベルしか示さないものもあった(F、H)。ウィルコクソン対応対T検定を用いて統計解析を行った。
【図３】慢性HIV-1感染症におけるTim-3の発現レベルに及ぼすHAARTの効果を示す。CIRCコホートの慢性HIV-1感染個体7名をベースラインの時点で、ならびにHAARTの開始後1、2、3および6ヶ月の時点でサンプリングした。示したものは、(a) コンパイル済みのCD8+ T細胞上のTim-3の発現 vs HAARTの開始後の月数 (b) CD4+ T細胞の絶対数およびHIV-1ウイルス負荷の臨床データとともに、フローサイトメトリーによって測定したTim-3およびCD38の発現レベルである。6ヶ月間追跡した個体6名は検出不能なウイルス負荷(bDNA <50コピー/ml)を達成した。パネル(b)の図表には、CD8+ T細胞上のTim-3の発現とHIV-1ウイルス負荷、CD38の発現によって測定したときのCD8+ T細胞活性化(MFI)、およびCD4+ T細胞の絶対数との間の関連について調べた、混合効果の縦断的解析から得られたp値をまとめた。
【図４】CD8+およびCD4+の両T細胞サブセット内でTim-3+およびTim-3-の集団について選別され、qPCRによりT-bet (Th1)、GATA-3 (Th2)およびIFN-γ (Th1) mRNAについて定量化された、HIV-1感染個体および非感染個体の両者由来のPBMCを示す。CD8+およびCD4+の両T細胞集団について、GATA-3はTim-3+画分におけるよりもTim-3-画分において高いレベルで発現されたのに対し、T-betはTim-3+集団のほうでより高発現された。
【図５】抗原刺激に低反応性のTim-3の発現CD8+およびCD4+ T細胞集団を示す。HIV-1感染および非感染個体に由来するPBMCをプールペプチドまたはSEB超抗原で12時間刺激し、次いでモノクローナル抗体を用いIFN-γ、TNF-αおよびTim-3について染色し、多重パラメータフローサイトメトリーによって解析した。(A〜D) HIV-1感染個体およびHIV-1非感染個体由来のCD8+およびCD4+ T細胞におけるサイトカイン応答を示す代表的なプロット。(E〜G) A2*SLYNTVATLを用い慢性HIV-1感染個体由来のPBMCに関して四量体解析を行った(E)。同一個体由来のPBMCをSLYNTVATL (SEQ ID NO:7)ペプチドで、または対照としてDMSOで刺激し、サイトカイン産生 vs Tim-3の発現をフローサイトメトリーによって解析した(F、G)。CD8+ T細胞を精製Tim-3+/hi CD8+ T細胞およびTim-3-/lo (H、I、J) CD8+ T細胞の集団に選別し、CFSEで標識した。次にこれらの二つの集団を抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体の存在下で5日間培養した。次に細胞をCFSEの減少について細胞分裂の読み出しとして評価した(K、L)。(M〜R) HIV-1非感染個体5名、およびHIV-1慢性感染の進行者5名由来のPBMCを、エクスビボでTim-3およびKi67抗原により共染色した。Ki67+細胞の出現率上昇を、HIV-1感染PBMCのCD4+およびCD8+の両T細胞サブセットにおいて、HIV-1非感染PBMCと対比して観察した(M〜N)。Tim-3+細胞の大部分はKi67-であり、Tim-3の発現細胞に対してKi67+ CD8+およびCD4+ T細胞がかなり濃縮された(R)。
【図６】可溶性Tim-3の添加によるTim-3シグナル伝達経路の遮断は、HIV-1特異的T細胞の増殖およびサイトカイン産生を増強することを示す。(A) sTim-3の添加はHIV-1慢性感染の進行者においてHLA-A*0201拘束HIV-1-Gagエピトープ「SLYNTVATL」(SL9)に特異的なCD8+ T細胞の増殖を2 μg/mlまで用量依存的に増強した。(B、C) HIV-1感染患者6名由来のPBMCをCFSEで染色し、PBMCのサイトカイン産生および増殖に及ぼすsTim-3の効果を6日間にわたる刺激アッセイ法で個体4名において判定した。示したものは、1 μg/ml sTim-3または等量の発現対照のいずれかの存在下または非存在下のDMSO (上列)、プールGag/Nefペプチド(中列)またはCEFプールペプチド(下列)に応じたCD8+ (B)およびCD4+ (C) T細胞集団でのCFSE (x軸)によるIFN-γ分泌(y軸)を示す、培養6日目の急性HIV-1感染個体由来の代表的なデータである。(D) CD8+およびCD4+の両T細胞の増殖の増加が、慢性進行者由来のPBMCをプールGagおよびNefペプチドで刺激した場合にも観察された。(E) 10 μg/mlのmAb 2E2の添加がHIV-1-Gag T細胞増殖応答の著明なレスキューをもたらした。
【図７】Tim-3およびPD-1について共染色した慢性進行性HIV-1感染症を有する個体10名由来のPBMCを示す。CD8+またはCD4+ T細胞に対してゲーティングした後に、フローサイトメトリーによって発現を解析した。(A〜B) 被験者9/10名中、Tim-3およびPD-1が異なるCD8+ T細胞集団によって主に発現されたことを実証する。被験者の1名OM513は、高出現率のTim-3+PD-1+集団(23.6%)を示したが、Tim-3+PD-1-集団もTim-3-PD-1+集団もともに保持していた(それぞれ23.0%および16.7%)。(C〜D) 被験者9/10名がCD4+ T細胞上のPD-1およびTim-3について主に異なる染色を示したことを実証する。(E〜F) HIV-1特異的CD8+ T細胞において、2通りの発現パターンが観察された: 四量体+の集団は主にTim-3+PD-1-であった(E)、またはそれらは主にTim-3-およびPD-1+であった(F)。どちらのパターンも少数集団がTim-3もPD-1も共発現することを示し、Tim-3およびPD-1発現が主に異なる集団を規定することを実証した。
【図８】(A〜B) CD4+およびCD8+の両T細胞上のTim-3およびCD25に対する二重染色を示す。Tim-3およびCD25は異なるT細胞集団によって主に発現されており、CD4+ T細胞上のTim-3の発現が古典的な調節性T細胞の集団を特徴付けるものではないことを実証する。(C〜E) 慢性HIV-1感染個体由来のTim-3+ (D) vs Tim-3- (E) CD8+ T細胞亜集団の表現型のフローサイトメトリー評価を実証する。PBMCをTim-3、CD3、CD8、CD28、CD27、CD45RA、CCR7およびCD57に対するモノクローナル抗体で染色し、同様に死細胞識別マーカーで染色した。ゲーティングを初めに行って、その後の解析の中でCD3+ CD8+生存集団だけを含むようにした。成熟/分化マーカーに対するゲーティングは蛍光1試薬除外(fluorescence minus one)対照に基づいて決定し、SPICEソフトウェアを用いて結果を解析した。示したものは、対応する表現型マーカーの組み合わせを有する集団の出現率であり、各個別に単一の棒で表した。これらのデータは、慢性HIV-1感染個体由来のTim-3を発現するCD8+ T細胞が表現型プロファイルの全範囲にわたって分布していたことを支持している。
【図９】(A) HIV-1感染被験者由来のTim-3+ vs Tim-3- CD8+ T細胞におけるStat5、p38およびERK-1/2のリン酸化状態のホスホフローサイトメトリー解析を実証する。CD8+ T細胞をそのTim-3の発現状態に基づいて選別し、各サンプル由来の三つ組のウェル中にてrIL-2またはPMA/イオノマイシンのいずれかで刺激した。示したものは、Tim-3+/hiおよびTim-3-/lo PBMCを選別するための代表的なFACSゲーティングである。示したものは、慢性HIV-1感染個体4名由来のデータの概要である。(B) 個体1名由来の代表的な経時変化。(C〜E) 示したものは、以下の各CD8+ T細胞亜集団: ナイーブ(CD27+ CD45RA+)、メモリー(CD27+ CD45RA-)、エフェクターメモリー(CD27-、CD45RA-)またはエフェクター(CD27-、CD45RA+)内でのTim-3+ vs Tim-3-細胞における(平均蛍光強度の変化によって測定した)標的リン酸化の差次的な変化レベルを示す(C) Stat5、(D) ERK-1/2および(E) p38に対するコンパイルデータである。
【図１０】(A〜E) 健常被験者由来のPBMC中のNKT細胞および単球亜集団におけるTim-3の発現を示す。n=8のうちの代表的なプロット。
【図１１】被験者3名: (A) HIV-1感染コントローラ、(B) 中度のウイルス負荷を有するHIV-1慢性感染の進行者、ならびに(C) 進行型疾患および高ウイルス負荷を有するHIV-1慢性感染の進行者由来のCD8+ T細胞上のCD38 vs Tim-3の発現のフローサイトメトリープロットを示す。
【図１２】Tim-3に対するウサギモノクローナル抗体(X軸)またはヤギポリクローナル抗体(Y軸)のいずれかによって判定したときのHIV-1感染個体由来のCD8+ T細胞上の表面Tim-3の発現の頻度の相関を示す。
【図１３】急性/早期感染個体、慢性進行者、ウイルスコントローラおよびHIV-1非感染被験者に、類似のサイトカイン産生パターンが認められたことを示す。
【図１４】抗原に応じたTNF-αおよびCD107aの発現がTim-3-細胞に同様に限定されたことを示す。
【図１５】精製した可溶性Tim-3 (レーン3)および発現対照(レーン2)のSDS PAGEの銀染色である。
【図１６】インビトロにおいて増殖した細胞が高レベルのTim-3の発現を示したことを示す。
【図１７】対照存在下よりもsTim-3存在下で、図16中の細胞は高いレベルのIFN-γを一貫して発現することを実証する。
【図１８】慢性HIV-1感染症におけるTim-3の発現レベルに及ぼすHAARTの効果を示す。CIRCコホートの慢性HIV-1感染個体7名をベースラインの時点で、ならびにHAARTの開始後1、2、3および6ヶ月の時点でサンプリングした。示したものは、CD4+ T細胞の絶対数およびHIV-1ウイルス負荷の臨床データとともに、フローサイトメトリーによって測定したTim-3およびCD38の発現レベルである。CD4+ T細胞の絶対数を細胞/mm3/10として表示した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
出願の詳細な説明
上記のように、本発明者らは、Tim-3を発現する新規の機能障害のあるT細胞集団を特定した。このT細胞集団は、HIV感染症などの、急性および慢性ウイルス感染症に罹患している被験者において見出される。本発明者らは、慢性ウイルスに感染した被験者におけるこの集団の存在がウイルス負荷およびCD38の発現と比例的に相関し、CD4+ T細胞数と逆相関することを特定した。さらに、本発明者らは、Tim-3活性の遮断が免疫系の機能を改善することを明らかにした。
【００２９】
したがって、本出願は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が免疫系の活性または機能を示す、
被験者における免疫系の活性または機能をモニタリングする方法を含む。
【００３０】
本明細書において用いられる「Tim-3」という用語は、T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子3をいう。一つの態様において、Tim-3はヒト由来のものである。別の態様において、Tim-3は配列:
mfshlpfdcv lllllllltr sseveyraev gqnaylpcfy tpaapgnlvp vcwgkgacpv
fecgnvvlrt derdvnywts rywlngdfrk gdvsltienv tladsgiycc riqipgimnd
ekfnlklvik pakvtpaptr qrdftaafpr mlttrghgpa etqtlgslpd inltqistla
nelrdsrlan dlrdsgatir igiyigagic aglalalifg alifkwyshs kekiqnlsli
slanlppsgl anavaegirs eeniytieen vyeveepney ycyvssrqqp sqplgcrfamp (SEQ ID NO:5)またはその変種を有する。
【００３１】
本明細書において用いられる「変種」という用語は、本明細書において開示されるTim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤と実質的に同じ機能を実質的に同じように行う、本明細書において開示されるTim-3アミノ酸配列の修飾、置換、付加、誘導体、類似体、断片または化学的等価体を含む。例えば、Tim-3ペプチドの変種は、免疫系の活性または機能のモニタリングに、機能障害のある細胞の検出に、ウイルス負荷のモニタリングにおよび慢性ウイルス感染症のモニタリングまたは診断に有用であるという同じ機能を有するであろう。Tim-3ペプチド阻害剤の変種は、Tim-3を阻害するのに有用であるのと同じ機能を有するであろう。
【００３２】
変種は、SEQ ID NO:5、2または6のアミノ酸配列と実質的にまたは本質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドも含む。
【００３３】
本明細書において用いられる「実質的に同一の」または「本質的に同一の」という用語は、例えば本明細書において記述される方法を用いて、最適に整列された場合、第二のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
本明細書において用いられる「配列同一性」という用語は、二つのポリペプチドおよび/またはヌクレオチド配列間の配列同一性の割合をいう。
【００３５】
二つのアミノ酸配列の同一性の割合を判定するため、最適な比較を目的にそれらの配列を整列させる(例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる)。次いで、対応するアミノ酸の位置のアミノ酸残基を比較する。第一の配列中のある位置が、第二の配列中のその対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているなら、それらの分子はその位置で同一である。二つの配列間の同一性の割合は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数(すなわち、同一性% = 同一の重複位置の数/位置の総数×100%)である。一つの態様において、二つの配列は同じ長さのものである。二つの配列間の同一性の割合の判定は数学的アルゴリズムを用いて行うこともできる。二つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例はKarlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877にあるように修正された、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、例えばスコア=100、ワード長=12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータにより行って、本出願の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、例えばスコア-50、ワード長=3に設定されたXBLASTプログラムパラメータにより行って、本開示のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的にギャップ有りのアライメントを得るため、Gapped BLASTをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されているように利用することができる。あるいは、PSI-BLASTを用いて、分子間の距離関係(Id.)を検出する反復検索を行うこともできる。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラムの(例えば、XBLASTおよびNBLASTの)デフォルトパラメータを用いることができる(例えば、NCBIウェブサイトを参照のこと)。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい、非限定的な例はMyers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウェイト残基テーブル（weight residue table）、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを用いることができる。二つの配列間の同一性の割合は、ギャップの許容の有無にかかわらず、上記のものに類似の技術を用いて判定することができる。同一性の割合を計算する際には、通常、完全な一致だけがカウントされる。
【００３６】
二つのポリペプチド配列間の同一性の割合では、このような二つの配列のアミノ酸配列を、配列の一方の全長の少なくとも50%がアライメントの中に含まれた、二つの配列間での最高次の一致が得られるように、例えば、Clustal Wアルゴリズム(Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-4680.)を、BLOSUM 62スコアリングマトリックス(Henikoff S. and Henikoff J. G., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.)ならびに10のギャップオープニングペナルティーおよび0.1のギャップ伸長ペナルティーとともに用いて整列させる。
【００３７】
配列を整列させるのに使用できる他の方法は、二つの配列間で最高次の一致が得られ、二つの配列間で同一アミノ酸の数が判定されるようにSmithおよびWaterman (Smith and Waterman. Adv. Appl. Math. 1981, 2:482)によって修正されている、NeedlemanおよびWunschのアライメント方法(Needleman and Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, 48:443)である。二つのアミノ酸配列間の同一性の割合を計算するための他の方法は一般に、当技術分野において認識されており、例えば、CarilloおよびLipton (Carillo and Lipton SIAM J. Applied Math. 1988, 48:1073)によって記述されているもの、ならびにComputational Molecular Biology (Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects)に記述されているものを含む。一般に、そのような計算にはコンピュータプログラムが利用されるであろう。
【００３８】
本明細書において開示されるTim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤の変種は、非限定的に、保存的アミノ酸置換も含む。本明細書において用いられる「保存的アミノ酸置換」とは、本明細書において開示されるペプチド阻害剤の望ましい機能または活性を消失させることなく、一つのアミノ酸残基がもう一つのアミノ酸残基と置き換えられているものである。保存的置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む: グリシン、アラニン; バリン、イソロイシン、ロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン; セリン、トレオニン; リジン、アルギニン; およびフェニルアラニン、チロシン。保存的アミノ酸置換は、本開示のポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸を、類似の電荷、サイズおよび/または疎水性特性のアミノ酸と置き換えることを伴う。保存的置換しかなされなければ、得られる変種は機能的に等価なはずである。化学的に等価のまたは化学的に類似のアミノ酸配列の作出をもたらす変化は、本開示の範囲内に含まれる。本出願のペプチド阻害剤が組換えDNA技術を用いて作出されるなら、ペプチド阻害剤の変種を、アミノ酸の置換のために当技術分野において周知である、部位特異的突然変異誘発法などのポリペプチド操作法を用いることによって作出することができる。例えば、グリシンなどの、疎水性残基をアラニンなどの別の疎水性残基の代わりに用いることができる。アラニン残基をロイシン、バリンまたはイソロイシンなどの、さらに疎水性の残基と置き換えてもよい。アスパラギン酸などの負電荷アミノ酸をグルタミン酸の代わりに用いてもよい。リジンなどの正電荷アミノ酸をアルギニンなどの、別の正電荷アミノ酸の代わりに用いてもよい。「保存的置換」という語句には、誘導体化していない残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基を用いることも含まれるが、そのようなポリペプチドが必須の活性を示すことを条件とする。
【００３９】
本出願のTim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤の変種は、本明細書において開示されるアミノ酸配列に対する付加および欠失も含む。
【００４０】
本出願のTim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤の変種は、その類似体も含む。本明細書において用いられる「類似体」という用語は、本明細書において開示されるTim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤の機能を果たすことができる任意の活性薬剤を含み、ペプチド模倣体などを含むことができる。「活性(な)」という用語は、本明細書において開示されるペプチド阻害剤と実質的に同じ機能を実質的に同じように行うのに適した高次構造にある分子をいう。ペプチド模倣体は、分子間の相互作用においてペプチドの代わりに働きうる合成構造体を含む(概要はMorgan and Gainor. (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252を参照のこと)。ペプチド模倣体は、アミノ酸および/またはペプチド結合を含んでも含まなくてもよい合成構造体を含むが、所望の構造的および機能的特徴を保持するようにデザインされており、したがって本出願において開示されるペプチド阻害剤類似体の適当な代用体でありうる。
【００４１】
ペプチド模倣体は、(例えば、WO 99/25044に記述されているように)ペプチドを、他の機能要素を有するもっと大きな分子に組み込んだ分子も含む。ペプチド模倣体は、ペプトイド、オリゴペプトイド(Simon et al (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367)、および本開示の単離ペプチドに対応する、あらゆる可能なアミノ酸配列に相当するデザインされた長さのペプチドを含んだペプチドライブラリも含む。ペプチド模倣体は、D-アミノ酸によるL-アミノ酸の系統的置換により、異なる電子的特性を有する基との側鎖の置換により、およびアミド結合の置換によるペプチド結合の系統的置換により得られる情報に基づいてデザインされてもよい。また、候補となるペプチド模倣体の活性についての高次構造上の要件を判定するために、局部的な高次構造上の制約を導入することができる。模倣体は、逆向ターンの高次構造を安定化もしくは促進するために、および分子の安定化を助けるために、等配電子のアミド結合またはD-アミノ酸を含んでもよい。特定の高次構造の状態にアミノ酸残基を拘束するために、環状アミノ酸類似体を用いてもよい。模倣体は、ペプチドの二次構造の阻害剤の模倣体を含むこともできる。これらの構造では、既知のタンパク質の二次高次構造内のアミノ酸残基の3次元的な向きをモデル化することができる。また、N置換されたアミノ酸のオリゴマーであるペプトイドを用いてもよく、新規分子の化学的に多様なライブラリを作製するためのモチーフとして用いることができる。
【００４２】
本出願の変種Tim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤はその誘導体も含む。「誘導体」という用語は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数の残基を有するペプチドをいう。そのような誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基を誘導体化してアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成させた分子を含む。遊離カルボキシル基を誘導体化して塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルもしくはヒドラジドを形成させてもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化してO-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成させてもよい。ヒスチジンのイミダゾールの窒素を誘導体化してN-im-ベンジルヒスチジンを形成させてもよい。誘導体として同様に含まれるのは、20種類の標準アミノ酸のうちの1つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含んだペプチドである。例えば、4-ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いてもよく、5-ヒドロキシリジンをリジンの代わりに用いてもよく、3-メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いてもよく、ホモセリンをセリンの代わりに用いてもよく、およびオルニチンをリジンの代わりに用いてもよい。ポリペプチドの誘導体は任意で、酸化されているアミノ酸の形態を含むポリペプチドを含んでもよい。
【００４３】
本出願の変種Tim-3ペプチドおよびペプチド阻害剤はその断片も含む。本明細書において用いられる「断片」という用語は、好ましくは、基準ポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の長さを含んだポリペプチドの一部分を意味する。
【００４４】
本明細書において用いられる「T細胞表面上のTim-3の発現を判定する」という語句は、T細胞表面上の、質的および量的発現を含む、Tim-3の発現を評価することを意味する。これには個々の細胞または細胞の集団に関するTim-3の発現の頻度またはレベルを評価することが含まれる。これにはTim-3発現細胞の出現率または数を評価することも含まれる。当業者は、ウエスタンブロット、免疫沈降とその後のSDS-PAGE、免疫細胞化学、FACS、タンパク質アレイなどのような免疫アッセイ法を含む、いくつかの方法を用いて、Tim-3の細胞表面での発現を検出、判定および/または定量化できることを理解するであろう。
【００４５】
例えば、Tim-3に特異的な抗体を用いて、T細胞表面上のTim-3の発現を判定することができる。
【００４６】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体を含むよう意図される。抗体は組換え起源であってもおよび/またはトランスジェニック動物において産生されてもよい。本明細書において用いられる「抗体断片」という用語は非限定的に、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ(minobodies)、ダイアボディ(diabodies)およびその多量体、多重特異性抗体断片、ならびにドメイン抗体を含むよう意図される。抗体は従来の技術を用いて断片化することができる。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシンで処理することにより作出することができる。得られたF(ab')2断片は、ジスルフィド架橋を還元するように処理してFab'断片を産生することができる。パパイン消化によって、Fab断片の形成をもたらすことができる。Fab、Fab'およびF(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片ならびにその他の断片を組換え技術によって合成することもできる。
【００４７】
Tim-3に対する抗体は市販されている(R&D Systems)。しかしながら、当業者は、Tim-3に特異的である他の抗体を産生できることを理解するであろう。
【００４８】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞(リンパ球)を、関心対象の抗原(例えばTim-3)で免疫された動物から収集し、標準的な体細胞融合手順により骨髄腫細胞と融合させ、かくしてこれらの細胞を不死化させ、ハイブリドーマ細胞を生成させることができる。このような技術(例えば、初めはKohlerおよびMilsteinにより開発されたハイブリドーマ技術(Nature 256:495-497 (1975))、ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunol.Today 4:72 (1983))、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., Methods Enzymol, 121:140-67 (1986))およびコンビナトリアル抗体ライブラリのスクリーニング(Huse et al., Science 246:1275 (1989))などの他の技術は当技術分野において周知である。関心対象の抗原と特異的に反応する抗体の産生のためにハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００４９】
本明細書において用いられる「免疫系の活性または機能をモニタリングする方法」という語句は、免疫系の活性または機能の程度を含め、免疫系の活性または機能を判定または評価する方法または過程をいう。この用語にはT細胞を含む、免疫細胞の出現率、機能および/または活性を判定または評価することも含まれる。
【００５０】
本明細書において用いられる「免疫系の機能」という用語は、体液性および細胞性を含む免疫系の機能をいう。免疫系の機能は、抗体アッセイ法(例えばELISAアッセイ法)、増殖アッセイ法、抗原特異的な細胞傷害アッセイ法、ならびにIFN-γ、TNF-α、IL-2および/またはIL-17などのサイトカインの産生(例えばELISPOTアッセイ法)を含むが、これらに限定されない、当業者に公知のアッセイ法を用いて評価することができる。一つの態様において、免疫系の機能はCD4+および/またはCD8+ T細胞の数、CD4+および/またはCD8+ T細胞の増殖ならびに/あるいはCD4+および/またはCD8+ T細胞によるサイトカイン産生をいう。
【００５１】
本明細書において用いられる「免疫系の活性」という用語は、免疫系の活性化状態をいう。例えば、活性化状態はCD38などの、T細胞上の表面マーカーを用いて評価することができる。
【００５２】
当業者は免疫系の活性および免疫系の機能が異なることを認識するであろう。例えば、Tim-3を発現する、本発明者らによって特定された機能障害のあるT細胞は、機能障害(例えば増殖するおよびサイトカインを産生する能力の障害)を有する。しかしながら、本発明者らは、Tim-3の発現がT細胞活性化の予測因子であるCD38発現と相関することも明らかにした。したがって、理論に限定されないが、Tim-3は活性化T細胞のエフェクタ機能を抑制するように作用する。
【００５３】
本明細書において用いられる「被験者」という用語は、動物界の任意の成員、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをいう。一つの態様において、被験者はHIV感染症のような慢性ウイルス感染症またはHCVのような他の慢性ウイルス感染症を有する。別の態様において、被験者は急性HIV感染症、急性HCV 感染症、インフルエンザ感染症、SARS感染症、B型肝炎感染症、C型肝炎感染症、ライノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、麻疹、水痘帯状疱疹ウイルス感染症、単純ヘルペス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、エンテロウイルス感染症、風疹感染症、デング熱ウイルス、HTLV-I感染症、HTLV-II感染症、西ナイルウイルス感染症などのような、急性ウイルス感染症を有する。さらなる態様において、被験者は関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、または他のリウマチ疾患のような、慢性リウマチ疾患を有する。さらなる態様において、被験者は、例えば移植後など、免疫抑制状態であり、または免疫抑制されている。
【００５４】
本明細書において用いられる「サンプル」という用語は、T細胞を含む被験者由来の任意の液体、細胞または組織サンプルをいう。例えば、サンプルは血液、血清またはリンパ液など、循環系またはリンパ系由来でありうる。
【００５５】
「T細胞」という用語はCD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む。例えば、CD4+またはCD8+ T細胞の一方または両方に関してTim-3の発現を判定することができる。
【００５６】
本明細書において用いられる「対照」という用語は、特定の状態もしくは形質を有すると分かっているか、または特定の状態もしくは形質を有さないと分かっているかのいずれかである被験者または被験者の群に由来するサンプルをいう。対照はモニタリング、評価または診断されているものに応じて変わりうる。例えば、免疫系の活性または機能をモニタリングしているなら、対照は、抑制された免疫系または活性化された免疫系を有することが分かっている被験者に由来することができる。別の態様において、対照は、そのT細胞表面上に特定のレベルまたは量のTim-3を発現することが分かっている被験者または被験者の群に由来する。対照は所定の標準または基準範囲の値であることもできる。
【００５７】
「対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違」という用語は、Tim-3が被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上に、対照と比べて差次的に発現されることを意味する。
【００５８】
本明細書において用いられる「差次的に発現される」または「差次的な発現」という用語は、Tim-3の発現レベルの相違をいう。「発現レベルの相違」という用語は、第二のサンプルまたは対照における測定可能なTim-3の発現レベルと比べて、測定可能なTim-3の発現レベルの増加または減少をいう。この用語は第二のサンプル集団における測定可能なTim-3の発現レベルと比べて、サンプル集団における測定可能なTim-3の発現レベルの増加または減少をいうこともできる。一つの態様において、差次的な発現は、対照のTim-3の発現レベルと比べたTim-3の発現レベルの比率を用いて比較することができ、この比率は1.0に等しくない。例えば、第二のサンプルと比べた第一のサンプルにおける発現レベルの比率が1.0超または未満であれば、タンパク質は差次的に発現されている。例えば、1、1.2、1.5、1.7、2、3、5、10、15、20以上よりも大きい比率、または1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.001以下よりも小さい比率。別の態様において、差次的な発現はp値を用いて測定される。例えば、p値を用いる場合、Tim-3は、p値が0.1未満、好ましくは0.05未満、より好ましくは0.01未満、さらにより好ましくは0.005未満、最も好ましくは0.001未満である場合に、第一の集団と第二の集団との間で差次的に発現されると特定される。
【００５９】
本明細書において用いられる「免疫系の活性または機能を示す」という語句は、サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較すること、ならびに発現の相違が存在するかどうか、および被験者の免疫系が対照と比べて活性または機能の低下または増加を有することが結果から示唆されるかどうかを判定することをいう。上記のように、Tim-3の発現は機能障害のあるT細胞を示し、したがって、免疫系の機能障害を示す。したがって一つの態様において、対照が健常でありかつウイルス感染症または炎症性疾患を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者が健常対照と比べて免疫系の機能の低下を有することを示唆する。別の例において、対照が健常でありかつウイルス感染症または炎症性疾患を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照と比べて免疫系の機能の増大を有することを示唆する。さらなる態様において、対照がウイルス感染症または炎症性疾患を持たない健常個体を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べてTim-3発現の増加が被験者由来のT細胞上にあることは、被験者が対照と比べて免疫系の機能の低下を有することを示唆する。対照がウイルス感染症または炎症性疾患を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べて被験者由来のTim-3発現の減少は、被験者が対照と比べて免疫系の機能の増大を有することを示唆する。
【００６０】
正常免疫系の活性よりも高いことは、炎症性疾患の指標となりうる。したがって、本方法を用いて、炎症性疾患をモニターまたは診断することができる。これには、被験者が炎症性疾患を有するかどうか、または対照と比べた炎症性疾患の程度または重症度を判定する段階が含まれる。この方法を炎症性疾患のための他の従来の診断技術と組み合わせて用いることができる。
【００６１】
一つの態様において、炎症性疾患は自己免疫疾患である。一つの態様において、自己免疫疾患は多発性硬化症、移植片拒絶反応、GVHD、急性散在性脳脊髄炎、セリアック病、クローン病、糖尿病1型、グレーブス病、川崎病、重症筋無力症または慢性リウマチ疾患である。具体的な態様において、リウマチ疾患は関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、または強直性脊椎炎である。
【００６２】
免疫抑制状態における炎症活性をモニターするために、例えば移植などで臓器拒絶反応をモニターするために本方法を用いることもできる。
【００６３】
本出願の別の局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者における機能障害のあるT細胞の存在を示す、
被験者における機能障害T細胞を検出する方法である。
【００６４】
本明細書において用いられる「機能障害のあるT細胞」という用語は、抗原に対する応答を開始することがないT細胞である、低応答性T細胞をいう。一つの態様において、T細胞は抗原特異的なCD8+および/またはCD4+ T細胞であるが、サイトカイン(IFN-γ、TNF-α、IL-2および/またはIL-17などの)を産生することはなく、もはや細胞傷害性ではなく、ならびに/あるいは抗原に応答して増殖することはない。具体的な態様において、抗原はHIV抗原などの、ウイルス抗原である。
【００６５】
本明細書において用いられる「被験者における機能障害のあるT細胞の存在を示す」という語句は、サンプル由来のT細胞表面上のTim-3発現を対照と比較すること、ならびに発現の相違が存在するかどうか、および被験者が対照と比べてさらに多いまたは少ない機能障害のあるT細胞を有することが結果から示唆されるかどうかを判定することをいう。
【００６６】
本発明者らは、機能障害のあるT細胞がTim-3を発現することを特定した。したがって、対照が健常でありかつウイルス感染症または炎症性疾患を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者が健常対照よりも多くの機能障害のあるT細胞を有することを示唆する。別の例において、対照が健常でありかつウイルス感染症または炎症性疾患を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照よりも少ない機能障害のあるT細胞を有することを示唆する。さらなる態様において、対照がウイルス感染症または炎症性疾患を持たない健常個体を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者が健常対照よりも多くの機能障害のあるT細胞を有することを示唆する。対照がウイルス感染症または炎症性疾患を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べて被験者由来のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照よりも少ない機能障害のあるT細胞を有することを示唆する。
【００６７】
本出願の別の局面は、Tim-3の発現を検出することによって機能障害のあるT細胞を検出または単離する方法である。例えば、Tim-3を発現するT細胞を、さらなる研究のためにサンプルまたは細胞集団から検出または単離することができる。
【００６８】
本出願のさらなる局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階;
(b) サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス負荷を示す、
被験者におけるウイルス負荷をモニタリングまたは評価する方法である。
【００６９】
「ウイルス負荷」という用語は、ウイルスに感染した被験者におけるウイルスの量をいう。例えば、これは循環血液中のウイルスの量をいう。本方法を用いて、HIV感染症またはC型肝炎ウイルス感染症(HCV)などの、慢性ウイルス感染症を含む、いくつかの異なるタイプのウイルス感染症のウイルス負荷をモニターまたは評価することができる。具体的な態様において、慢性ウイルス感染症はHIV感染症である。
【００７０】
本明細書において用いられる「HIV」という用語は、ヒト免疫不全ウイルスをいい、HIV-1およびHIV-2を含む。
【００７１】
本明細書において用いられる「被験者におけるウイルス負荷を示す」という語句は、サンプル由来のT細胞表面上のTim-3発現を対照と比較すること、ならびに発現の相違が存在するかどうか、および被験者が対照と比べてさらに高いまたは低いウイルス負荷を有することが結果から示唆されるかどうかを判定することをいう。
【００７２】
本発明者らは、被験者におけるウイルス負荷が被験者におけるT細胞上のTim-3の発現と相関することを特定した。したがって、対照が健常でありかつ慢性ウイルス感染症を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者が健常対照よりも高いウイルス負荷を有することを示唆する。別の例において、対照が健常でありかつ慢性ウイルス感染症を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照よりも低いウイルス負荷を有することを示唆する。
【００７３】
本出願のさらなる局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(b) サンプル由来のT細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べての被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の相違が被験者におけるウイルス感染症を示す、
被験者におけるウイルス感染症をモニタリングまたは診断する方法である。一つの態様において、ウイルス感染症は慢性ウイルス感染症である。別の態様において、ウイルス感染症は急性ウイルス感染症である。
【００７４】
本明細書において用いられる「慢性ウイルス感染症」という用語は、慢性ウイルスに罹患または感染している被験者をいう。一つの態様において、慢性ウイルス感染症はHIV感染症またはC型肝炎ウイルス感染症(HCV)である。具体的な態様において、慢性ウイルス感染症はHIV感染症である。
【００７５】
本明細書において用いられる「急性ウイルス感染症」という用語は、急性ウイルスに罹患または感染している被験者をいう。急性ウイルス感染症は非限定的に、急性HIV感染症、急性HCV感染症、インフルエンザ感染症、SARS感染症、B型肝炎感染症、C型肝炎感染症、ライノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、麻疹、水痘帯状ヘルペスウイルス感染症、単純ヘルペス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、エンテロウイルス感染症、風疹感染症、デング熱ウイルス、HTLV-I感染症、HTLV-II感染症、西ナイルウイルス感染症などを含む。
【００７６】
本明細書において用いられる「被験者におけるウイルス感染症を示す」という語句は、サンプル由来のT細胞表面上のTim-3発現を対照と比較すること、ならびに発現の相違が存在するかどうか、および被験者が対照と比べてウイルス感染症を持つ、あるいはウイルス感染症を持たないかまたはウイルス感染症の程度もしくは重症度を持たないことが、結果から示唆されるかどうかを判定することをいう。
【００７７】
本発明者らは、被験者におけるウイルス感染症が被験者におけるT細胞上のTim-3発現と相関することを特定した。したがって、対照が健常でありかつウイルス感染症を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者がウイルス感染症を有すること、健常対照よりも多いウイルス感染症または重症度の高いウイルス感染症を有することを示唆する。別の例において、対照が健常でありかつウイルス感染症を持たないと分かっている健常被験者に由来するなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照よりも少ないウイルス感染症または重症度の低いウイルス感染症を有することを示唆する。さらなる態様において、対照がウイルス感染症を持たない健常個体を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べて被験者由来のT細胞上のTim-3発現の増加は、被験者がウイルス感染症を有すること、健常対照よりも多いウイルス感染症または重症度の高いウイルス感染症を有することを示唆する。対照がウイルス感染症を示すと分かっている参照基準であるなら、対照と比べて被験者由来のTim-3発現の減少は、被験者が健常対照よりも少ないウイルス感染症または重症度の低いウイルス感染症を有することを示唆する。
【００７８】
本出願の別の局面は、
(a) 被験者由来のサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階;
(b) サンプル由来の該T細胞表面上のTim-3の発現を対照と比較する段階
を含み、
対照と比べてサンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の増加が疾患の進行を示し、サンプルにおけるT細胞表面上のTim-3の発現の減少が疾患の寛解を示す、
慢性ウイルス感染症を有する被験者における疾患の進行をモニタリングまたは評価する方法である。一つの態様において、対照は同一の個体から過去の時点より得たサンプルを含む。
【００７９】
本出願のさらなる局面は高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の有効性をモニタリングする方法であって、
(c) HAARTを開始する前に個体におけるT細胞表面上のTim-3の発現を判定する段階; および
(d) HAARTの開始後の少なくとも一つの時点でT細胞表面上のTim-3発現を比較する段階
を含み、
Tim-3発現の減少が有効な治療法を示す、方法である。
【００８０】
本出願のさらなる局面は、ウイルス感染症に罹患している被験者にTim-3阻害剤の有効量を投与する段階を含む、ウイルス感染症を有する被験者を処置する方法である。一つの態様において、被験者は慢性ウイルス感染症に罹患している。別の態様において、被験者は急性ウイルス感染症に罹患している。
【００８１】
本明細書において用いられる「慢性ウイルス感染症に罹患している」という用語は、長期のウイルス感染を有する被験者をいう。一つの態様において、ウイルス感染症はHIV感染症またはC型肝炎ウイルス感染症(HCV)である。具体的な態様において、慢性ウイルス感染症はHIV感染症である。
【００８２】
本明細書において用いられる「急性ウイルス感染症に罹患している」という用語は、短期のウイルス感染を有する被験者をいう。一つの態様において、ウイルス感染症は急性HIV感染症、急性HCV感染症、インフルエンザ感染症、SARS感染症、B型肝炎感染症、C型肝炎感染症、ライノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、麻疹、水痘帯状ヘルペスウイルス感染症、単純ヘルペス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、エンテロウイルス感染症、風疹感染症、デング熱ウイルス、HTLV-I感染症、HTLV-II感染症、西ナイルウイルス感染症である。
【００８３】
当業者は、感染症が慢性または急性であるかどうかを容易に判定することができる。
【００８４】
本明細書において用いられる「ウイルス感染症を有する被験者を処置する方法」という語句は、感染症を阻止すること、感染症を予防すること、または感染症に関連する症状を軽減することを含む。
【００８５】
本出願の化合物または組成物の「治療的有効量」、「有効量」または「十分量」という用語は、哺乳類、例えばヒトを含む被験者に投与された場合に、臨床結果を含む、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」またはその同義語は、それが適用されている文脈に依る。例えば、慢性ウイルス感染症を処置するという文脈で、例えば、それは化合物または組成物の投与なしで得られる応答に比べて、そのような処置を達成するのに十分な化合物または組成物の量である。疾患という文脈で、本出願において開示される化合物または組成物の治療的有効量は、哺乳類における慢性ウイルス感染症を処置する、調節する、減弱する、回復に向かわせる、またはその感染症に影響を及ぼすために用いられる。「有効量」とは、慢性ウイルス感染症を処置、予防または阻止するのに十分である化合物または組成物のその量を意味するよう意図される。いくつかの適当な態様において、所与の化合物または組成物の量は、所与の薬物または化合物、薬学的処方物、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置されている被験者または宿主の固有性などのような、種々の要因に応じて変わりうるが、それでもなお、当業者によって日常的に判定されうる。同様に、本明細書において用いられる場合、本出願の化合物または組成物の「治療的有効量」とは、対照と比べて被験者における慢性ウイルス感染症を予防、阻止、抑制または軽減する量である。本明細書において定義される場合、本出願の化合物または組成物の治療的有効量は、当技術分野において公知の常法によって当業者により容易に判定されうる。
【００８６】
本明細書において用いられる「Tim-3の阻害剤」または「Tim-3阻害剤」という用語は、Tim-3の機能を阻害できる化合物、物質または組成物をいう。例えば、阻害剤はTim-3の発現もしくは活性を阻害することができ、Tim-3シグナル伝達経路を調節もしくは遮断することができ、および/またはリガンドとのTim-3の結合を遮断することができる。このような阻害剤にはペプチド、抗体、核酸分子および小分子が含まれる。一つの態様において、阻害剤はTim-3リガンドに結合する。別の態様において、阻害剤はTim-3および/またはそのリガンドに特異的な抗体である。Tim-3に対する抗体は既報のように調製することができる。
【００８７】
一つの態様において、阻害剤はTim-3の可溶型である。Tim-3の可溶型は非限定的に、膜貫通および細胞内ドメインを欠いた分子、例えば、Tim-3のIgVおよび/またはムチンドメインを含んだ分子を含む。一つの態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列またはその変種を含む。別の態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなる。別の態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列またはその変種を含む。別の態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列からなる。
【００８８】
本出願は、SEQ ID NO:2もしくは6のアミノ酸配列またはその変種を含む単離アミノ酸配列も含む。変種という用語は先に定義されている。
【００８９】
別の態様において、Tim-3阻害剤は核酸分子である。核酸分子は、Tim-3核酸配列の発現を標的にするおよび阻害する低分子干渉RNA (SiRNA)またはアンチセンス分子でありうる。
【００９０】
本明細書において用いられる「アンチセンス核酸」という用語は、その標的、例えば、Tim-3転写産物に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。核酸は、標的遺伝子により産生される伝令RNAに結合する、DNA、RNAまたは化学的類似体を含むことができる。アンチセンス核酸の結合により、翻訳が阻止され、それによって標的タンパク質の発現が阻止または低減される。アンチセンス核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増加するように、またはmRNAもしくは天然遺伝子と形成される二重鎖の物理的安定性を増加するようにデザインされている種々に改変されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。アンチセンス配列は、高効率の調節領域の制御下で、アンチセンス配列が産生される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で細胞に導入される発現ベクターを用いて生物学的に産生することができ、その活性はベクターが導入される細胞型によって決定されうる。
【００９１】
「siRNA」という用語は、特定の遺伝子の遺伝子発現を発現抑制させるために使用できる低分子で阻害性のRNAをいう。siRNAは、siRNAに対応するmRNAに対して行われる細胞での分解経路を活性化する、低分子RNAヘアピン(例えばshRNA)でありうる。特異的なsiRNA分子をデザインし、それらを投与する方法は、当業者に知られている。効率的な発現抑制が、二つのヌクレオチド3'突出部を有するように対合されるsiRNA二重鎖複合体により得られることは当技術分野において公知である。ヌクレアーゼ耐性を付与するために、二つのチミジンヌクレオチドを付加することが考えられる。その他のヌクレオチドも付加できることを当業者は認識するであろう。
【００９２】
アプタマーは、高度に特異的な3次元立体構造を取りうる核酸の短鎖である。アプタマーは、標的分子に対して高い結合親和性および特異性を示すことができる。これらの特性によって、そのような分子はタンパク質の機能的活性を特異的に阻害することができる。したがって、別の態様において、Tim-3阻害剤は、Tim-3に結合してTim-3活性を阻害するアプタマーである。
【００９３】
本出願はTim-3の可溶型などの、Tim-3の阻害剤を含んだ組成物も含む。一つの態様において、Tim-3の可溶型などの、Tim-3の阻害剤は、インビボでの投与に適した生物学的に適合する形態で被験者に投与するための薬学的組成物に処方される。「インビボでの投与に適した生物学的に適合する形態」とは、治療効果がいかなる毒性効果も上回る、物質の投与形態を意味する。別の態様は、Tim-3の可溶型などの、Tim-3の阻害剤、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、慢性ウイルス感染症を有する被験者を処置するための薬学的組成物である。
【００９４】
本明細書において記述される組成物は、活性物質の有効量が混合物中で薬学的に許容される媒体と混合されるような、被験者に投与できる薬学的に許容される組成物の公知の調製方法によって調製することができる。適当な媒体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)に記述されている。これに基づき、組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される媒体または希釈剤と関連する、ならびに適したpHおよび等浸透圧を伴い、生理学的液体を伴う緩衝液に含有される物質の溶液を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
薬学的組成物は、非限定的に、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性の無菌注射溶液もしくは懸濁液を含み、これらは抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および対象とする受容者の組織または血液と組成物を実質的に適合させる溶質をさらに含有してもよい。このような組成物に存在してもよい他の成分には、例えば、水、界面活性剤(Tweenなど)、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。即時調製注射溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒、錠剤、または濃縮溶液もしくは懸濁液から調製することができる。薬学的組成物は、例えば、限定する目的ではないが、患者への投与の前に無菌水または生理食塩液で再構成される凍結乾燥粉末として供給することができる。
【００９６】
本出願の薬学的組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される適当な担体は、薬学的組成物の生物学的活性の有効性を妨害することのない、本質的に化学的に不活性なかつ無毒性の組成物を含む。適当な薬学的担体の例としては、水、生理食塩溶液、グリセロール溶液、エタノール、N-(1(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、ジオレオイルフォスファチジル-エタノールアミン(DOPE)、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されることはない。このような組成物は、患者への直接投与のための形態をもたらすよう適当な量の担体とともに、治療的有効量の化合物を含有すべきである。
【００９７】
この組成物は、非限定的に、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの遊離カルボキシル基で形成されるものを含む薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００９８】
本明細書において開示される方法により、当業者には理解されるように、Tim-3の阻害剤を、選択した投与経路に応じて種々の形態で患者に投与することができる。Tim-3の阻害剤は、例えば、経口投与、非経口投与、頬での投与、舌下投与、経鼻投与、直腸投与、パッチ投与、ポンプ投与または経皮投与によって投与することができ、それに応じて薬学的組成物を処方することができる。非経口投与には、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経上皮投与、経鼻投与、肺内投与、髄腔内投与、直腸投与および局所様式の投与が含まれる。非経口投与は選択した期間にわたる持続注入によるものであってもよい。
【００９９】
Tim-3の阻害剤は、例えば、不活性希釈剤もしくは同化性の食用担体とともに経口的に投与されてもよく、または硬殻もしくは軟殻ゼラチンカプセルに封入されてもよく、または錠剤に圧縮されてもよく、または食事の食物とともに直接的に取り込まれてもよい。経口での治療的投与のため、本発明の化合物を賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用することができる。
【０１００】
Tim-3の阻害剤は非経口的に投与されてもよい。Tim-3の阻害剤の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合された水の中で調製することができる。分散液を、アルコールを含むまたは含まないグリセロール、液体ポリエチレングリコール、DMSOおよびその混合物中で、ならびに油中で調製することもできる。通常の保存および使用条件の下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。当業者は、適当な処方物を調製する方法を承知しているであろう。適当な処方物の選択および調製のための従来の手順および成分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (2000 - 20th edition)および1999年に刊行されたThe United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)に記述されている。
【０１０１】
注射用途に適した薬学的形態は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。いかなる場合でも、その形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。
【０１０２】
経鼻投与用の組成物は、エアロゾル、点滴薬、ゲルおよび粉末として都合よく処方することができる。エアロゾル処方物は、典型的には生理的に許容される水性または非水性溶媒中の活性物質の溶液または微細懸濁液を含み、通常は密封容器中、滅菌形態の単回または複数回用量で提供され、この容器は噴霧装置とともに用いるためにカートリッジまたは詰め替え品の形態を取ることができる。あるいは、密封容器は単回用量の鼻吸入器または使用後の廃棄が意図される計量弁を装着したエアロゾル分注器などの単位分注装置であってもよい。剤形にエアロゾル分注器が含まれる場合、それには圧縮空気などの圧縮ガスまたはフルオロクロロ炭化水素などの有機噴射剤でありうる噴射剤が含まれよう。エアロゾル剤形はポンプ噴霧器の形態を取ることもできる。
【０１０３】
頬での投与または舌下投与に適した組成物には、活性成分が糖、アカシア、トラガカントまたはゼラチンおよびグリセリンなどの担体とともに処方される錠剤、ロゼンジおよび香錠が含まれる。直腸投与のための組成物は、好都合には、カカオ脂などの従来の坐剤基剤を含む坐剤の形態である。
【０１０４】
Tim-3の阻害剤は小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞などの、リポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。
【０１０５】
Tim-3の阻害剤は、Tim-3の阻害剤を結合させる個々の担体として、モノクローナル抗体を用いることにより送達することもできる。本出願の化合物は標的を定めることができる薬物担体としての可溶性重合体と結合させてもよい。このような重合体は、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド-フェノール、ポリヒドロキシ-エチルアスパルトアミド-フェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド-ポリリジンを含むことができる。さらに、本出願の化合物は、薬物の制御された放出の達成に有用な生分解性重合体の類、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸の共重合体、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートならびにヒドロゲルの架橋性または両親媒性ブロック共重合体に結合させてもよい。
【０１０６】
本出願の化合物は、単独で、または慢性ウイルス感染症の処置もしくは予防に有用な他の公知の薬剤との組み合わせで用いることができる。
【０１０７】
慢性ウイルス感染症の処置に有用な他の薬剤との組み合わせで用いられる場合、Tim-3の阻害剤はそれらの薬剤と同時に投与されることがふさわしい。本明細書において用いられる場合、個体への2種類の物質の「同時投与」とは、2種類の物質のそれぞれを、それらがともに個体中で同時に生物学的に活性であるように与えることを意味する。その投与の厳密な詳細は、それら2種類の物質の互いの存在下での薬物動態に依存すると考えられ、かつ、2種類の物質を互いに数時間以内に投与すること、または薬物動態が適当であれば、一方の物質を他方の投与の24時間以内に投与することさえも含むことができる。適当な投与計画のデザインは、当業者には常套である。特定の態様において、2種類の物質は実質的に同時に、すなわち、互いに数分以内に、または両方の物質を含有する単一の組成物中で投与されよう。
【０１０８】
本出願の化合物は、上記のように、単独でまたは同様に薬学的に許容される担体との組み合わせで動物に投与することができ、その割合は化合物の溶解性および化学的性質、選択した投与経路ならびに標準的な薬学的実践によって判定される。
【０１０９】
Tim-3の阻害剤の投与量は、化合物の薬力学的特性、投与様式、受容者の年齢、健康状態および体重、症状の性質および程度、処置の頻度、および併用処置を行っている場合にはその種類、ならびに処置される動物における化合物の排出速度などの多くの要因に応じて変わりうる。当業者は、上記の要因に基づき適切な投与量を判定することができる。本出願の化合物は、最初は適当な投与量で投与されてもよく、これを臨床応答に応じて必要があれば調節してもよい。代表例として、本発明の化合物の経口投与量は、成人では約1 mg/日〜約400 mg/日、適切には約1 mg/日〜約200 mg/日、より適切には約1 mg/日〜約20 mg/日に及ぶであろう。経口投与のために処方される場合、化合物は、錠剤あたり0.25、0.5、0.75、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、75.0、80.0、90.0、100.0、150、200、250、300、350または400 mgの活性成分を含有する錠剤の形態であることがふさわしい。適当には、経口投与の場合、化合物は、錠剤あたり0.25、0.5、0.75、1.0、5.0または10.0 mgの活性成分を含有する錠剤の形態であることがふさわしい。本発明の化合物は単回の一日量で投与されてもよく、または一日量の総量が2回、3回もしくは4回の一日量に分けられてもよい。本出願の化合物が、例えば、当業者に周知である経皮皮膚パッチの形態を用いて経皮的に投与されるなら、投与量の投与は全投与量の範囲を通じて断続的であるよりもむしろ持続的であろう。
【０１１０】
本出願は、慢性ウイルス感染症に罹患した被験者を処置するためのTim-3の阻害剤の有効量の使用および慢性ウイルス感染症に罹患した被験者を処置するための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は慢性ウイルス感染症の処置で用いるTim-3の阻害剤に関する。
【０１１１】
本出願のさらなる局面は、機能障害のあるT細胞をTim-3の阻害剤で処置する段階を含む、機能障害のあるT細胞の機能を改善する方法である。
【０１１２】
本明細書において用いられる「機能障害のあるT細胞の機能を改善する」という用語は、Tim-3の阻害剤と接触しなかった機能障害のあるT細胞と比べて、機能障害のあるT細胞の機能を改善または回復することを意味する。例えば、機能の改善した機能障害Tのある細胞は、抗原に対する応答を開始する能力が改善または回復しているであろう。一つの態様において、機能障害のあるT細胞は、抗原に応答してサイトカイン、細胞傷害活性および/または増殖をもたらす能力が改善または回復している。具体的な態様において、抗原はHIVまたはHCV抗原などの、ウイルス抗原である。
【０１１３】
本出願は、機能障害のあるT細胞の機能を改善するためのTim-3の阻害剤の使用および機能障害のあるT細胞の機能を改善するための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の使用も含む。さらに、本出願は機能障害のあるT細胞の機能の改善で用いるTim-3の阻害剤に関する。
【０１１４】
一つの態様において、本方法はエクスビボで行われる。例えば、Tim-3を発現する機能障害のあるT細胞を被験者から得る。これらの機能障害のあるT細胞を、機能障害のあるT細胞の機能が回復または改善されるようにインビトロで一定期間、可溶性Tim-3またはTim-3および/もしくはそのリガンドに特異的な抗体などの、Tim-3の阻害剤と接触させるか、またはそれで処理し、その後、これらのT細胞を被験者に再注入して戻す。
【０１１５】
本発明の別の局面は、Tim-3の阻害剤の有効量をその必要がある被験者に投与する段階を含む、高活性抗レトロウイルス処置(HAART)療法で持続する免疫欠如を覆す方法である。
【０１１６】
本出願は、HAART療法で持続する免疫欠如を覆すためのTim-3の阻害剤の使用、およびHAART療法で持続する免疫欠如を覆すための医薬を製造するためのTim-3の阻害剤の使用も含む。さらに、本出願はHAART療法で持続する免疫欠如を覆すのに用いるTim-3の阻害剤に関する。
【０１１７】
上記のように、Tim-3の阻害剤は、抗原に対する応答をもはや開始しないT細胞である、低応答性T細胞などの、機能障害のあるT細胞の機能を改善することができる。したがって、Tim-3の阻害剤は、被験者においてHIV-1またはHCVなどの、慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチン調製物に用いることができる。これにはDNAワクチンによる手法が含まれる。
【０１１８】
したがって、本出願は、HIV-1抗原またはHCV抗原などの、慢性ウイルス抗原、およびTim-3の阻害剤の有効量を被験者に同時投与する段階を含む、被験者においてHIV-1またはHCVなどの、慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を含む。
【０１１９】
本明細書において用いられる「免疫応答を誘導する」または「免疫応答を誘発する」という用語は、例えば、体液性または細胞性のいずれかの、免疫系の任意の応答を開始する、誘因する、引き起こす、増強する、改善するまたは増大することを意味する。免疫応答の開始または増強は、抗体アッセイ法(例えばELISAアッセイ法)、抗原特異的な細胞傷害性アッセイ法およびサイトカインの産生(例えばELISPOTアッセイ法)を含むが、これらに限定されない、当業者に公知のアッセイ法を用いて評価することができる。
【０１２０】
本明細書において用いられる「同時投与する」という用語は、Tim-3の阻害剤および慢性ウイルス抗原が同時に投与されることを意味する。上記のように、個体への2種類の物質の「同時投与」という用語は、2種類の物質のそれぞれを、それらがともに個体中で同時に生物学的に活性であるように与えることを意味する。その投与の厳密な詳細は、それら2種類の物質の互いの存在下での薬物動態に依存するであろう。一つの態様において、Tim-3の阻害剤を、例えば、機能障害のあるT細胞の活性を予備刺激または改善するために、慢性ウイルス抗原の前に投与する。別の態様において、Tim-3の阻害剤を慢性ウイルス抗原と同時に投与する。
【０１２１】
一つの態様において、慢性ウイルス抗原はHIV-1抗原である。
【０１２２】
本明細書において用いられる「HIV-1抗原」という用語は、HIV-1に対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるHIVの一部分をいう。この用語には非限定的に、(gagおよびnefを含む) HIVペプチドに基づくワクチン、(gp120、gp140およびgp160を含む)組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン、ベクターに基づく生ワクチン、ならびに(Gag、Pol、Env、Nef、Tat、Vpu、Vpr、VifおよびRevを含む)いずれかのHIV-1遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。この用語には、HIV-1によって直接コードされないが、HIV-1感染の結果として発現され、HIV-1感染細胞の有効な代用マーカーとして標的にされうる抗原も包含される。これには、ヒト内在性レトロウイルスによってコードされる一部のペプチドおよびポリペプチド(Garrison and Jones et al, T cell responses to human endogenous retroviruses in HIV-1 infection. PLoS Pathog. 2007 Nov;3(11):e165. PMID: 17997601)、ならびにヒト長鎖散在反復配列が含まれる。
【０１２３】
別の態様において、ウイルス抗原はHCV抗原である。本明細書において用いられる「HCV抗原」という用語は、HCVに対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるHCVの一部分をいう。この用語には非限定的に、(C、E1、E2、NS1 NS2、NS3、NS4、NS5を含む) HCVペプチドに基づくワクチン、(C、E1、E2、NS1 NS2、NS3、NS4、NS5を含む)組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン、ベクターに基づく生ワクチン、および(Gag、C、E1、E2、NS1 NS2、NS3、NS4、NS5を含む)いずれかのHCV遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。
【０１２４】
別の態様において、慢性ウイルス抗原はHIV-2抗原である。本明細書において用いられる「HIV-2抗原」という用語は、HIV-2に対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるHIV-2の一部分をいう。この用語には非限定的に、(gagおよびnefを含む) HIV-2ペプチドに基づくワクチン、(gp120、gp140およびgp160を含む)組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン、ベクターに基づく生ワクチン、ならびに(Gag、Pol、Env、Nef、Tat、Vpr、VifおよびRevを含む)いずれかのHIV-1遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。この用語には、HIV-2によって直接コードされないが、HIV-2感染の結果として発現され、HIV-2感染細胞の有効な代用マーカーとして標的にされうる抗原も包含される。これには、ヒト内在性レトロウイルスによってコードされる一部のペプチドおよびポリペプチド、ならびにヒト長鎖散在反復配列が含まれる。
【０１２５】
別の態様において、慢性ウイルス抗原はHTLV-I抗原である。本明細書において用いられる「HTLV-I抗原」という用語は、HTLV-Iに対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるHTLV-Iの一部分をいう。この用語には非限定的に、HTLV-Iペプチドに基づくワクチン、組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン、ベクターに基づく生ワクチン、ならびにいずれかのHTLV-I遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。この用語には、HTLV-Iによって直接コードされないが、HTLV-I感染の結果として発現され、HTLV-I感染細胞の有効な代用マーカーとして標的にされうる抗原も包含される。
【０１２６】
別の態様において、抗原はヒト内在性レトロウイルス(HERV)に由来する。本明細書において用いられる「HERV抗原」という用語は、HERVを発現する細胞に対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるHERVの一部分をいう。この用語には非限定的に、HERVペプチドに基づくワクチン、組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン、ベクターに基づく生ワクチン、ならびに(HERV-K/HML-2、HERV-L、HERV-H、HERV-R、HERV-FRD、HERV-Eファミリーを含むが、これらに限定されない)いずれかのHERV遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。これには、(欠失、停止コドン、フレームシフト突然変異により)全長の遺伝子産物に相当しない、HERV由来の読み取り枠(ORF)からの抗原も含まれる。
【０１２７】
別の態様において、抗原は長鎖散在反復配列(LINE)に由来する。本明細書において用いられる「LINE抗原」という用語は、LINE-1またはLINE-2を発現する細胞に対する被験者の免疫系を刺激または誘導できるLINE-1またはLINE-2の一部分をいう。この用語には非限定的に、LINEペプチドに基づくワクチン、組換えサブユニットタンパク質に基づくワクチン(ORF1pまたはORF2p)、ベクターに基づく生ワクチン(ORF1またはORF2)、ならびにORF1pおよびORF2pを含むいずれかのLINE遺伝子産物のコード配列を含んだDNAワクチン接種が含まれる。これには、(欠失、停止コドン、フレームシフト突然変異により)全長の遺伝子産物に相当しない、LINE由来の読み取り枠(ORF)からの抗原も含まれる。
【０１２８】
免疫化剤(すなわちTim-3の阻害剤と同時投与される慢性ウイルス抗原)および/または組成物を、投与形式にかかわらず、アジュバントと同時免疫すれば、免疫原性を顕著に改善することができる。アジュバントは、免疫原の免疫原性を増強するが、しかしそれ自体が必ずしも免疫原性であるとは限らない。アジュバントは、免疫原を投与部位の近くで局所的に保持して、免疫系の細胞への免疫原の緩徐な持続放出を促進するデポー効果をもたらすことによって、作用することができる。アジュバントは同様に、免疫系の細胞を免疫原デポーに誘引し、このような細胞を刺激して免疫応答を誘発しうる。したがって、本出願の態様には、アジュバントをさらに含む薬学的組成物が包含される。
【０１２９】
アジュバントは、例えば、ワクチンに対する宿主免疫応答を改善するよう長年にわたって使用されてきた。内因性のアジュバント(リポ多糖類などの)は、通常、ワクチンとして使用される、殺処理されたまたは弱毒化された細菌の成分である。外因性のアジュバントは、典型的には抗原に非共有結合的に連結される免疫調節物質であり、宿主免疫応答を増強するように配合される。このように、非経口的に送達される抗原に対する免疫応答を増強するアジュバントが特定されている。しかしながら、これらのアジュバントの中には有毒なものもあり、それらをヒトおよび多くの動物で用いるのに不適当とする望ましくない副作用を引き起こすことがある。実際には、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(通常まとめてミョウバンといわれる)のみが、ヒトおよび動物ワクチンでのアジュバントとして日常的に使用されている。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増大させるうえでのミョウバンの効力が十分に確立されている。
【０１３０】
幅広い外因性のアジュバントが免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こすことができる。これらには膜タンパク質抗原と複合体を形成したサポニン(免疫刺激複合体)、ミネラルオイルとのプルロニック重合体、殺処理されたマイコバクテリウムおよびミネラルオイル、フロインド完全アジュバント、ムラミルジペプチド(MDP)およびリポ多糖類(LPS)のような細菌産物、ならびにリピドA、およびリポソームが含まれる。
【０１３１】
本出願の一つの局面において、本明細書において記述される態様のいずれかにおいて有用なアジュバントは、次の通りである。非経口免疫のためのアジュバントは、アルミニウム化合物(水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウムなど)を含む。抗原は標準的なプロトコルによってアルミニウム化合物で沈殿されても、またはアルミニウム化合物に吸着されてもよい。RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)のような他のアジュバントを非経口投与において使用することもできる。
【０１３２】
粘膜免疫のためのアジュバントは、細菌毒素(例えば、コレラ毒素(CT)、大腸菌(E. coli)易熱性毒素(LT)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)毒素Aおよび百日咳毒素(PT)、またはそれらの組み合わせ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体)を含む。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットB (CTB)の精製調製物が有用でありうる。これらの毒素のいずれかに対する断片、相同体、誘導体、および融合体も、アジュバント活性を保持している場合には、適当である。毒性の低下した変異体が使用されることが好ましい。適当な変異体は(例えば、WO95/17211号(Arg-7-Lys CT変異体)、WO96/6627号(Arg-192-Gly LT変異体)、およびWO95/34323号(Arg-9-LysおよびGlu-129-Gly PT変異体)に)記述されている。本明細書において開示される方法および組成物において使用できるさらなるLT変異体は、例えばSer-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-AspおよびGlu-112-Asp変異体を含む。その他のアジュバント(さまざまな供給源(例えば、大腸菌、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)もしくはシゲラ・フレキシネリ(Shigella flexneri))の細菌モノホスホリルリピドA (MPLA)、サポニン、またはポリ乳酸グリコール酸(PLGA)ミクロスフェアなどの)を粘膜投与において使用することもできる。
【０１３３】
粘膜免疫および非経口免疫の両方に有用なアジュバントは、ポリホスファゼン(例えば、WO95/2415号)、DC-chol (3 b-(N-(N',N'-ジメチルアミノメタン)-カルバモイル)コレステロール(例えば、米国特許第5,283,185号およびWO96/14831号)ならびにQS-21 (例えば、WO88/9336号)を含む。
【０１３４】
被験者は、当業者には公知であるように、任意の従来経路によって本出願において開示するTim-3の阻害剤と同時投与される、HIV-1抗原またはHCV抗原などの、慢性ウイルス抗原を含む薬学的組成物で免疫することができる。これは、例えば、粘膜の(例えば、眼の、鼻腔内の、経口の、胃の、肺の、腸の、直腸の、膣のもしくは尿路の)表面を介した、非経口の(例えば、皮下の、皮内の、筋肉内の、静脈内のもしくは腹腔内の)経路を介した、または結節内での免疫付与を含むことができる。好ましい経路は、当業者には明らかであるように、免疫原の選択に依る。投与は単回用量で達成されても、または間隔をあけて繰り返されてもよい。適切な投与量は、免疫原それ自体、投与経路およびワクチン接種される動物の状態(体重、年齢など)のような、当業者によって理解されている種々のパラメータに依る。
【０１３５】
本出願は、被験者において慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用、ならびに被験者において慢性ウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬を製造するための、慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は被験者における慢性ウイルスに対する免疫応答の誘導で用いる慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤に関する。
【０１３６】
さらに、本出願は、HIV-1抗原またはHCV抗原などの、慢性ウイルス抗原、およびTim-3の阻害剤の有効量を被験者に同時投与する段階を含む、被験者においてHIV-1またはHCVなどの、慢性ウイルス感染症を処置または予防する方法を含む。
【０１３７】
本明細書において用いられる場合、「慢性ウイルス感染症を処置または予防する」という語句は、慢性ウイルス感染症を阻止すること、慢性ウイルス感染症を予防すること、慢性ウイルス感染症の重症度を低減すること、または慢性ウイルス感染症に関連する兆候および症状を改善することをいう。一つの態様において、慢性ウイルス感染症はHIV-1感染症またはHCV感染症である。
【０１３８】
本出願は、被験者における慢性ウイルス感染症を処置または予防するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用、ならびに被験者における慢性ウイルス感染症を処置または予防するための医薬を製造するための慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤の有効量の使用も含む。さらに、本出願は被験者における慢性ウイルス感染症の処置または予防で用いる慢性ウイルス抗原およびTim-3の阻害剤に関する。
【０１３９】
本出願はTim-3の可溶型ならびにその方法および使用も含む。一つの態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:2または6のアミノ酸配列を含む。別の態様において、Tim-3の可溶型はSEQ ID NO:2または6のアミノ酸配列からなる。
【０１４０】
Tim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤などの、本発明のタンパク質は、いくつかの方法のいずれかにて調製されうるが、組換え法を用いて調製されるのが最も好ましいことを当業者は理解するであろう。
【０１４１】
したがって、Tim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤をコードする核酸分子を公知の方法において、タンパク質の十分な発現を確実にする適切な発現ベクターに組み込むことができる。考えられる発現ベクターは、使用される宿主細胞とベクターが適合する限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むが、これらに限定されることはない。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適して」おり、これは、本出願の核酸分子およびこの核酸分子に機能的に連結されている、発現用に使用される宿主細胞に基づき選択された調節配列を、発現ベクターが含有することを意味する。機能的に連結されているとは、核酸の発現を可能にする方法で、核酸が調節配列に連結されていることを意味するよう意図される。
【０１４２】
本出願はそれゆえに、Tim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤をコードする核酸分子、ならびに挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列を含有する本出願の組換え発現ベクターを企図する。
【０１４３】
適当な調節配列は、細菌の、真菌の、ウイルスの、哺乳類の、または昆虫の遺伝子を含む、さまざまな供給源から得ることができる(例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記述されている調節配列を参照のこと)。適切な調節配列の選択は、以下に論じられているように選択の宿主細胞に依り、当業者によって容易に達成されることができる。このような調節配列の例としては、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、複製起点、さらなるDNA制限部位、エンハンサー、および転写の誘導を与える配列のようなその他の配列を、発現ベクターに組み込むことができる。
【０１４４】
本出願の組換え発現ベクターは、本出願の組換え分子を形質転換したまたはトランスフェクトした宿主細胞の選択を容易にする、選択可能なマーカー遺伝子を含有することもできる。選択可能なマーカー遺伝子の例は、ある種の薬物に対する耐性を与えるG418およびハイグロマイシン、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリン、もしくは免疫グロブリン、好ましくは、IgGのFc部分のようなその一部分などのタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼのような選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によってモニターされる。選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性のような抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする場合には、形質転換細胞はG418で選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するはずであり、一方でその他の細胞は死滅する。これによって、本出願の組換え発現ベクターの発現を可視化することおよびアッセイすることが可能になり、特に、発現および表現型に及ぼす突然変異の影響を判定することが可能になる。選択可能なマーカーは関心対象の核酸とは別のベクターに導入できることを理解されたい。
【０１４５】
組換え発現ベクターは同様に、組換えタンパク質の発現の増加をもたらす、組換えタンパク質の溶解性の増加をもたらす、およびアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製での補助をもたらす、融合部分をコードする遺伝子を含有することもできる。例えば、タンパク質分解性の切断部位を標的組換えタンパク質に付加して、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にすることができる。典型的な融合発現ベクターは組換えタンパク質に、それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを融合するpGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia)、pMal (New England Biolabs, Beverly, MA)およびpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。
【０１４６】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換された宿主細胞を作出することができる。「で形質転換した」、「でトランスフェクトした」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野において公知の多くの可能な技術の一つによる細胞への核酸(例えば、ベクター)の導入を包含するよう意図される。本明細書において用いられる「形質転換された宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換された、グリコシル化が可能な細胞を同様に含むよう意図される。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムによる形質転換によって、核酸で形質転換されることができる。例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのような従来の技術によって核酸を哺乳類細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換するおよびトランスフェクトするのに適した方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)および他の実験室教本において見出すことができる。
【０１４７】
適当な宿主細胞は多種多様の真核宿主細胞および原核細胞を含む。例えば、本出願のタンパク質は酵母細胞または哺乳類細胞において発現することができる。他の適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)において見出すことができる。さらに、本出願のタンパク質は、大腸菌(Escherichia coli)のような、原核細胞において発現することができる(Zhang et al., Science 303 (5656): 371-3 (2004))。さらに、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)のような、緑膿菌に基づく発現系を使用することができる(米国特許出願公開第2005/0186666号、Schneider, Jane C et al.)。
【０１４８】
本発明を行うのに適した酵母および真菌宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア(Pichia)属またはクルイベロマイセス(Kluyveromyces)属およびアスペルギルス(Aspergillus)属の種々の種を含むが、これらに限定されることはない。酵母S.セレビシエでの発現用ベクターの例としては、pYepSec1 (Baldari. et al., Embo J. 6:229-234 (1987))、pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933-943 (1982))、pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113-123 (1987))、およびpYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)が挙げられる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコルは当業者に周知である(Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978); Itoh et al., J. Bacteriology 153:163 (1983)、およびCullen et al. (BiolTechnology 5:369 (1987)を参照のこと)。
【０１４９】
本出願を行うのに適した哺乳類細胞は、特に、COS (例えば、ATCC No. CRL 1650または1651)、BHK (例えば、ATCC No. CRL 6281)、CHO (ATCC No. CCL 61)、HeLa (例えば、ATCC No. CCL 2)、293 (ATCC No. 1573)およびNS-1細胞を含む。哺乳類細胞で発現させるのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス40のようなウイルス材料に由来する)、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B., Nature 329:840 (1987))およびpMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187-195 (1987))が挙げられる。
【０１５０】
本明細書において示されている教示を考慮すると、適切な種類の発現ベクターを植物、鳥類、および昆虫細胞に導入するためのプロモーター、ターミネーター、および方法も容易に達成することができる。例えば、一つの態様において、植物細胞から本出願のタンパク質を発現させることができる(Sinkar et al., J. Biosci (Bangalore) 11:47-58 (1987)を参照されたく、これはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)ベクターの使用を概説している; Zambryski et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow (eds.), Vol. VI, pp. 253-278, Plenum Press, New York (1984)も参照されたく、これは、特にPAPS2022、PAPS2023、およびPAPS2034を含む、植物細胞用の発現ベクターの使用について記述している)。
【０１５１】
本出願を行うのに適した昆虫細胞は、カイコガ属(Bombyx)、トリコプルシア(Trichoplusia)またはスポドプテラ(Spodotera)種由来の細胞および細胞株を含む。培養昆虫細胞(SF9細胞)でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAc系列(Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983))およびpVL系列(Lucklow, V.A., and Summers, M. D., Virology 170:31-39 (1989))を含む。本出願の組換えタンパク質の発現に適した一部のバキュロウイルス-昆虫細胞発現系がPCT/US/02442に記述されている。
【０１５２】
あるいは、本出願のタンパク質はラット、ウサギ、ヤギおよびブタのような非ヒトトランスジェニック動物において発現されてもよい(Hammer et al. Nature 315:680-683 (1985); Palmiter et al. Science 222:809-814 (1983); Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); Palmiter and Brinster Cell 41:343-345 (1985)および米国特許第4,736,866号)。
【０１５３】
タンパク質は固相合成(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154 (1964); Frische et al., J. Pept. Sci. 2(4): 212-22 (1996))または均一溶液での合成(Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart (1987))のようなタンパク質化学において周知の技術を用いた化学的合成によって調製することもできる。
【０１５４】
タンパク質のような、他の分子と結合したTim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤を含むN末端またはC末端融合タンパク質は、組換え技術により、融合によって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書において記述されている選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたTim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤を含有する。本出願の組換えタンパク質は、公知の技術によって他のタンパク質に結合することもできる。例えば、このタンパク質は、WO90/10457号に記述されているヘテロ二官能性チオール含有リンカー、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ-プロプリオネート)またはN-スクシンイミジル-5チオアセテートを用いて結合することができる。融合タンパク質または結合体を調製するために使用できるタンパク質の例としては、免疫グロブリン、ホルモン、増殖因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ヘマグルチニン(HA)、および切断型mycのような細胞結合タンパク質が挙げられる。
【０１５５】
したがって、本出願は、Tim-3の可溶型または他のタンパク質に基づくTim-3の阻害剤をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供する。さらに、本出願は、本明細書において開示される核酸配列または組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１５６】
一つの態様において、「単離アミノ酸配列」という用語は、組換え技術により産生される場合には、細胞材料または培地を実質的に含まないアミノ酸をいう。
【０１５７】
上記の開示は一般に本出願について記述するものである。以下の具体例を参照することによって、さらに完全な理解を得ることができる。これらの例は例示の目的で単に記述されるものであって、本出願の範囲を限定しようとするものではない。状況から示唆されまたは好都合とされうる場合、形態の変更および同等物との置換が企図される。特定の用語が本明細書において利用されているが、そのような用語は記述的な意味で意図したものであり、限定しようとするものではない。
【０１５８】
以下の非限定的な例により本出願を例示する。
【０１５９】
実施例
T細胞の機能性の進行性の喪失は、HIV-1を含むウイルスによる慢性HIV-1感染症の顕著な特徴である。アネルギーT細胞の新規の集団が糖タンパク質Tim-3の表面発現を特徴とするHIV-1感染症において特定された。この集団の出現率はHIV-1ウイルス負荷と正に相関し、CD4+ T細胞数と逆相関した。可溶性Tim-3を用いたTim-3シグナル伝達経路の遮断は、HIV-1特異的T細胞において増殖を回復し、サイトカイン産生を増強した。このように、本発明者らは、HIV-1誘導性のT細胞機能障害の新規の機構を明らかにし、強力な介入の機会を与えた。
【０１６０】
材料および方法
被験者
カナダ・トロントのthe Canadian Immunodeficiency Research Collaborative(CIRC)コホート、およびUniversity of California San Francisco(UCSF)によるOPTIONSコホートの参加者から被験者を選択した。CIRCコホートに当たるのは、急性/早期のHIV-1感染被験者、HIV-1感染の慢性進行者、およびHIV-1感染ウイルスコントローラであった。急性/早期被験者は最近4ヶ月以内にHIV-1に感染した個体と定義された。慢性進行者は1年超の間HIV-1に感染し、CD4+ T細胞数の減少が50細胞/mm3/年超の個体と定義された。ウイルスコントローラは1年超の間HIV-1に感染し、CD4+ T細胞数の減少のエビデンスがなく、ウイルス負荷5,000コピー/ml bDNA未満の個体と定義された。本研究に利用されたコホートの臨床データは、急性/早期 - CD4+ T細胞の絶対数(中央値、542; 範囲、180〜1240の細胞/mm3)およびウイルス負荷(中央値、227,567; 範囲、79,000〜500,000超のコピー/ml); 慢性進行者 - CD4+ T細胞の絶対数(中央値、250; 範囲、132〜660の細胞/ml)およびウイルス負荷(中央値、50,000; 範囲、290〜500,000のコピー/ml)、ならびにウイルスコントローラ - CD4+ T細胞絶対数(中央値、936; 範囲、600〜1440の細胞/mm3)およびウイルス負荷(中央値、100; 範囲、50〜250のコピー/mm3)であった。慢性進行者と定義された、290コピー/mlのウイルス負荷を有する被験者は、200細胞/mm3に減少していたCD4+ T細胞数に基づいてこの群の中に含めた。慢性進行者の群においてその次に最低のウイルス負荷は11,608コピー/mlであった。660細胞/mm3の比較的健常なCD4+ T細胞の絶対数を有する慢性進行者は、51,250コピー/mlのウイルス負荷を有し、CD4+ T細胞数の減少を示した。この個体における比較的高いCD4+ T細胞数は、その感染が比較的最近(13ヶ月)であるという可能性が高かった。対照は同一の人口学的地域における、年齢および性別プロファイルが類似の、HIV-1非感染患者から採取し、同じように処理した。OPTIONSコホート: 動員された全被験者由来のベースラインサンプルのHIV-1感染状態を確証するために評価されている。スクリーニングされる被験者は、急性/早期HIV-1感染症を有すると定義される3つの基準: (1) HIV-1抗体検査が陰性もしくは不確定でHIV-1 RNAが5,000コピー/ml超、または(2) 6ヶ月以内のHIV-1抗体検査が陰性で、現在は抗体陽転を伴うと立証済み、または(3) 検査室での非反応性の低感度抗体検査に基づく確認で急性/早期HIV-1感染症に適合する病歴、の一つを満たすものとした。全被験者が早期抗レトロウイルス治療法の利点および不利点について研究スタッフと議論し、処置を始めると決めた者について治療の準備をした。半数をわずかに超える参加者は治療を辞退した。OPTIONSコホートの急性/早期HIV-1感染個体計60名; CD4+ T細胞数の中央値544 (四分位範囲429.5、721)細胞/mm3およびHIV-1ウイルス負荷の中央値4.7 (四分位範囲3.66、5.20) log10 コピー/mlを本研究において調べた。対照はスタンフォード血液バンク(Stanford Blood Bank)由来のHIV-1非感染患者およびコホート人口統計由来の非感染個体から得た。HAARTに関するさらなる被験者は、これらのコホートから動員された。本研究はUniversity of Toronto lnstitutional Review Boardにより、およびUCSF Committee on Human Researchにより認可されており、被験者は書面による同意書を提出した。研究は凍結保存されたPBMCに関して融解直後に行われた。本研究の開始時に新鮮PBMCと凍結PBMCとの比較を行い、Tim-3レベルは、凍結/融解後では比例が保たれ��いることが分かった。しかし細胞の終夜培養はTim-3発現のレベルに影響を及ぼすので、融解と染色との間の時間を最小限に抑えることが重要である。
【０１６１】
ペプチドおよび刺激試薬
重複するHIV-1 Clade BのGagおよびNefプールペプチド(10 μg/ml)は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)のAIDS Research and Reference Reagent Program (Rockville, MD)から入手した。CEF (ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス)プールペプチド(10 μg/ml) (Anaspec)、SEB (Sigma)、ならびに精製抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体(BD)をさらなる試薬として使用した。
【０１６２】
マルチカラー・サイトカイン・フローサイトメトリー
健常なHIV-1非感染個体およびHIV-1感染個体由来のPBMCを、CD4、CD8、CD57、CCR7、CD27、CD45RA、CD25、Ki67 (BD)、CD28、PD-1 (Biolegend)、CD3 (Beckman Coulter)およびTIM-3 (R&D Systems)に対するフルオロフォア結合モノクローナル抗体で染色して、表現型の評価を定めた。生細胞および死細胞の識別マーカーとしてAquaアミン色素(Invitrogen)を使用した。いくつかの実験では、細胞を融解後にHIV-1のGagおよびNefペプチドプール、CMV/EBV/インフルエンザ(CEF)ペプチドプールまたはSEBで刺激し、続けて固定化および透過処理段階を行った。抗TNF-αおよび抗IFN-γ (BD)を用いサイトカインについて細胞内染色を行った。細胞はPBS + 2%パラホルムアルデヒドの中で固定化した。細胞は改良FACSAria、改良LSRIIシステム、またはFACSCalibur (Becton-Dickinson)で得た。計100000超の事象を収集し、FlowJoソフトウェア(TreeStar)で解析した。SPICEソフトウェア(バージョン3.0, Mario Roederer, Vaccine Research Center, NIAID, NIH)を用いてマルチカラー・フローデータの編成および表示を支援した(ホスホフローサイトメトリー法については下記を参照のこと)。
【０１６３】
五量体/四量体解析
五量体は全てProimmune Ltdから入手し、四量体は全てBeckman Coulterから入手した。五量体は図2に示した実験に用い、四量体は図7にまとめた実験に用いた。慢性HIV-1感染個体由来の凍結保存PBMCサンプルを融解し、2 mM EDTAを含む1% FBS PBS 10 mlで2回洗浄した。融解直後に染色を、CD8 (BD)、Tim-3 (R&D Systems)、CD3 (BD)に対するフルオロフォア結合抗体、および表示の五量体(非標識)で行い、続けてAPC標識五量体フルオロタグで二次染色段階を行った。細胞を1% FBS PBSで2回洗浄し、その後、2%パラホルムアルデヒドの中で固定化した。FACSCalibur機器(BD Biosciences)を用いて解析を行った。
【０１６４】
組換えTim-3の合成
発現ベクターpPA-TEVは以前にpIRESpuro3 (Clontech)から由来しており、これを改変してトランシンリーダー配列およびN末端プロテインAタグを組み入れた。Tim-3挿入断片は以下のプライマー
2011500730.tif 000003
を用いてPCRから得た。各プライマーについて下線の塩基は、鋳型アニーリング配列に相当する。付加された5'配列は制限部位および停止コドンを含む。これらのプライマーによって増幅される領域は、Tim-3のIgVおよびムチンドメインのみを構成する。得られたTim-3単位複製配列をpPA-TEVのFse I/Not Iクローニング部位にクローニングした。次にリン酸カルシウム法(Invitrogen)を用いてHEK293T細胞に環状DNAプラスミド10 μgをトランスフェクトした。1/5000希釈のポリクローナル抗Tim-3抗体(R&D Systems)および1/5000希釈のHRP結合ストレプトアビジン(Pierce)を用いてウエスタンブロットによりTim-3の発現を確認した。次にトランスフェクションを線状化pPA-TEV-Tim-3プラスミドで繰り返して、安定細胞株を作出した。並行してトランスフェクションを空の線状化pPA-TEVで行った。トランスフェクションから3日後に、培地を、1〜5 μg/mlのピューロマイシンを補充した新鮮培地と交換することで、ピューロマイシンによる薬物選択を開始した。2日ごとに培地を新鮮なピューロマイシン含有培地と交換した。10日後に、pPA-TEV-Tim-3トランスフェクションから6コロニー、およびpPA-TEVトランスフェクションから6コロニーを単離し、6ウェル組織培養プレート中で増殖させた。pPA-TEV-Tim-3の場合には抗Tim-3抗体、およびpPA-TEVの場合には抗プロテインA抗体を用いたウエスタンブロット分析により、分泌タンパク質を検出した。(pPA-TEV-Tim-3をトランスフェクトした) Tim-3分泌クローン、および(pPA-TEVをトランスフェクトした)対照のプロテインA分泌クローンを選択し、6つのT175組織培養フラスコ中、2% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、HEPES、L-グルタミンおよび1 μg/Lのアポプロチニン(Sigma)を補充した各CHO-SFM-II培地2 Lの中で増殖させた。細胞を50%の細胞密度でプレーティングし、タンパク質分泌を5日間継続させた。セントリコンプラス70遠心分離フィルタユニット(Millipore)を用いて、上清を2 Lから10 mlに濃縮した。IgG Sepharose 6 Fast Flowビーズ(GE Healthcare)を製造元の使用説明書にしたがって使用し、タンパク質を精製した。次いで0.33 mg/mlのHisタグ付TEVプロテアーゼ200 μlをビーズに加え、終夜4℃で切断を進行させた。上清をビーズから取り除き、ビーズをTST 1 mlで3回洗浄し、上清を洗浄溶出液とプールした。この混合した溶出液を1 mlのニッケルカラム(B-PRE 6×His融合タンパク質精製キット、Pierce)に通してTEVプロテアーゼを除去し、同じキットの洗浄用緩衝液2 2 mlで3回洗浄した。引き続き、溶出液を製造元の使用説明書にしたがってデトキシゲル内毒素除去カラム(Pierce)に通し、その後、セントリコンプラス20遠心分離フィルタユニット(Millipore)を用いて0.5 mlに濃縮した。次に容量を滅菌PBSによって15 mlに調整し、0.5 mlに再び濃縮した。産物の純度および同一性をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析によって確認した。タンパク質濃度をBradfordアッセイ法によって決定した。予想通り、プロテインA対照の精製においては少量の残存タンパク質しか検出できなかった。このサンプルは増殖またはサイトカイン産生に及ぼす精製過程由来の混入タンパク質または試薬の何らかの影響に対する対照となる。
【０１６５】
増殖アッセイ法
細胞分裂を追跡するため、慢性HIV-1感染個体由来のPBMCをPBS中1 mMの蛍光細胞内色素5-(および-6)カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル(CFSE; Molecular Probes)で標識し、室温で10分間周期的に混合した。等量の完全培地(RPMI中15%のFBS)を2分間加えておくことで標識をクエンチした。次いで標識細胞を2回洗浄し、カウントし、細胞培地に再懸濁した。CFSE標識細胞をsTim-3または等量の発現対照のいずれかの存在下または非存在下において、DMSOのみ、SLYNTVATLペプチド(SEQ ID NO:7)、プールHIV-1由来のGagおよびNefペプチドまたはサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス(Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Flu Virus; CEF)プールペプチドのいずれかで5〜6日間刺激した。培養期間の終わりに、細胞を洗浄し、以下の結合抗ヒトモノクローナル抗体の組み合わせとともにインキュベートした: CD4、CD8 (BD Biosciences, San Jose, CA)および。細胞を固定化し透過処理した後、IFN-γ、IL-2 (BD, San Diego, CA)およびCD3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)に対する細胞内染色を行った。次に細胞を2 mM EDTAおよび1%ウシ血清アルブミンの入ったPBS中で洗浄し、次に1%パラホルムアルデヒド中で固定化した後に、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)に流した。Flowjoソフトウェア・バージョン6.4 (Treestar Inc, Ashland, OR)を用いることにより、データを解析した。
【０１６６】
シグナル伝達分析
細胞シグナル伝達の分析前に、生存可能に凍結させて保管したPBMCを、5% FBSを含有するRPMI (HyClone; RPMI+)細胞培地(Mediatech) 15 mLの中で融解し、2% FBSを含有するPBS (PBS+)中で洗浄し、その後、RPMI+中5×106細胞/mLにて終夜37℃、5% CO2に置いておいた。翌日、細胞を氷冷PBS+で洗浄し、96ウェルV底プレートに移動し、氷上にて40分間CD3、CD8、CD27、CD45RAおよびTim-3に対するフルオロフォア結合モノクローナル抗体で細胞表面マーカーを染色した。アミン反応性色素(Invitrogen)を用いて死細胞を染色した。洗浄後、細胞を37℃の、IL-2 (SIGMA; 最終100 ng/mL)、またはホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)およびイオノマイシン(P+I) (SIGMA; それぞれ最終100 ng/mLおよび1 μg/ml)の組み合わせを含有するPBSに移動して、シグナル伝達を誘導した。15、30および45分後に4%パラホルムアルデヒド(終濃度2%)を加える直接固定化によって、シグナル伝達を停止させた。20分の固定化および引き続く洗浄の後、細胞を氷上にて20分間70%氷冷メタノール中で透過処理した。細胞を洗浄し、リン酸化型: p-Erk1/2(pT202/pY204)、p-p38(pT180/pY182)およびp-Stat5(pY694)に特異的な抗体を含有する抗体カクテル(BD)で氷上にて60分間染色した。分析前に、細胞を洗浄し、0.05%ホルムアルデヒドの入ったPBS+に再懸濁した。同じ操作を刺激していない対照細胞に行った。特製のLSR II Flow Cytometer (BD)にて細胞を解析した。データの解析はFlowJo (Tree Star)を用いて行った。リン酸化の変化倍率を、刺激していない細胞に対する刺激した細胞の平均蛍光強度(MFI)の比率として計算した。
【０１６７】
定量的PCR
使用したプライマー配列は次の通りである。
2011500730.tif 000004
特に断りのない限り、適用可能な場合には製造元のプロトコルにしたがった。RNAをTrizol (Invitrogen)でサンプルから単離し、DEPC水44 μlに再懸濁し、DNA-Free (Ambion Inc.)を用いてDNAseで処理した。RNA濃度を分光光度法によって測定し、DEPC処理水での希釈によって最低濃度のサンプルに適合させた。50 μMオリゴ(dT)20 1 μlとの各Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) RT反応にRNA 4 μlを用いた。RT酵素を欠いた反応を並行して行い、その後の段階において増幅のないことを一貫して示した。ABI Prism 7900HT (PE Applied Biosystems)を用い384マイクロウェルプレートの中でリアルタイムPCRを行った。外部標準物質、非鋳型対照およびRT対照を含む、全てのサンプルを三つ組で操作した。各10 μlの反応液には1×PCR緩衝液(Invitrogen)、3 mM MgCl2、0.2 mM dNTP (Applied Biosystems)、1 nMフォワードおよびリバースプライマー(Invitrogen)、1/50希釈のROX基準色素(Sigma-Aldrich Co.)、3/100 000希釈のSYBR Green I (Sigma-Aldrich Co.)、0.05 UのPlatinum Taqポリメラーゼ(Invitrogen)ならびに鋳型DNAが含まれた。鋳型は、標準曲線を作成するための連続する7倍希釈のgDNA、cDNA合成反応液5 μl、または適合するRT対照5 μlのいずれかであった。反応条件は、95℃で3分間、引き続き95℃で15秒、64℃で15秒、72℃で20秒を36サイクルとした。最終の解離段階を行って、増幅産物の特異性検証のための融解曲線を作成した。リアルタイムPCRをモニターし、Sequence Detection Systemバージョン2.0 (Applied Biosystems)によって解析した。
【０１６８】
統計解析
混合効果の縦断的解析を用いて、CD8+ T細胞の活性化レベルが抗レトロウイルス療法の間のCD8+ T細胞上のTim3の割合と独立相関するかどうかを判定した。時間および個体に関するランダム効果を特定した。このモデルをSAS System 9.2のProc Mixedで。利用した他の統計的検定は、対応する図の説明文において特定されている。
【０１６９】
結果および考察
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を用いたフローサイトメトリーによってHIV-1非感染被験者9名からPBMC上のTim-3発現をプロファイルした。Tim-3は単球上に均一に発現され(図11A〜C)、CD3-リンパ球集団において高発現され、より低い頻度でCD8+、CD4+ T細胞ならびにNKT細胞上に発現された(図1A、B、E、Fおよび11D、E)。ウイルスコントローラ(非進行者)も進行者もともに含めた、HAART未処置の、急性/早期および慢性感染HIV-1感染患者のコホートにおいて、Tim-3発現CD8+ T細胞の出現率上昇が非感染個体と比べて、急性/早期、および慢性進行性HIV-1感染個体において観察されたが、ウイルスコントローラでは観察されなかった(HIV-1非感染の場合28.5± 6.8% vs 慢性進行者の場合49.0±16.2%、p=0.0008; 急性/早期感染個体の場合52.8±17.5%、p=0.0015; および31.6±4.5%、p=0.48) (図1A〜H)。慢性進行性HIV-1感染個体由来のCD4+ T細胞上のTim-3発現上昇は、ウイルスコントローラと比べてもHIV-1非感染個体と比べても観察された(図1A〜H)。
【０１７０】
疾患の進行はHIVウイルス負荷およびCD4の数によって予測されるので、Tim-3発現とこれらの代用マーカーとの間の関係について調べた。Tim-3+ CD8+ T細胞の出現率とHIV-1ウイルス負荷との間で有意な正相関を認め(p < 0.0001、図1l)、CD4+ T細胞の絶対数との逆相関を認めた(p = 0.0397、p < 0.05、図1J)。同様に、Tim-3+ CD4+ T細胞の出現率はウイルス負荷(p=0.0087)およびCD4+ T細胞の絶対数(0.0273)とも有意に関連していた(図1L、M)。CD38発現によって報告されるT細胞活性化の状態は、疾患の進行のさらに強力な予測因子である(24)。CD8+ T細胞上のCD38発現はCD8+ T細胞上のTim-3発現のレベルと相関し(p < 0.0001、図1K)、CD4+ T細胞上のCD38発現はCD4+ T細胞上のTim-3発現のレベルと相関していた(p < 0.05、図1N)。急性/早期および慢性進行性HIV-1感染症において、CD8+ T細胞のうち高頻度の二重のTim-3+ CD38+集団として、Tim-3とCD38の両方の発現の増加が明らかであった(図11)。未処置の、急性/早期HIV-1感染個体60名の別個のコホート(OPTIONSコホート)において、モノクローナル抗Tim-3抗体で評価したときにTim-3+ CD8+およびCD4+ T細胞の出現率について類似の増加が認められた(図1H、図12A)。HIV-1ウイルス血症、T細胞上のCD38およびTim-3発現との間で同様の正相関がこの急性/早期感染コホートにおいても認められた(図1 O〜R)。
【０１７１】
次にTim-3発現レベルをHLA A＊0201+、HLA-B＊0702+、およびHLA-B＊0801+の慢性HIV-1感染個体９名において、適合させたMHC-I五量体を用いEBV-GLCTLVAML、CMV-NLVPMVATV、HIV-1-Gag-SLYNTVATLおよびHIV-1-PoI-ILKEPVHGV特異的CD8+ T細胞に関して判定した。CMV特異的CD8+ T細胞に対して、有意に高いTim-3レベルがHIV-1特異的CD8+ T細胞で認められた(MFIではp=0.0065、%Tim-3+ではp=0.0026) (図2A〜H)。CMV-pp65-TPRVTGGGAMに対する応答1例を除き、CMV特異的CD8+ T細胞は低いTim-3発現レベルを示した。この1例はMFIにより測定したときに、AIDSを有する個体由来の細胞で認められた、高いTim-3発現レベルを示した(Abs CD4の数 = 132細胞/μl)。Tim-3発現はHIV-1特異的応答の中で不均一となり、非常に高いTim-3レベルを示すものもあれば、他方では、ベースラインレベルしか示さないものもあった(図2F、H)。HIV-1特異的なCD8+ T細胞においてTim-3発現レベルで認められた不均一性は、同一個体内で低いTim-3発現レベルを示す応答と同時に高いTim-3発現レベルでの応答も頻繁に認められたので、単に被験者間の差異に起因するとは考えられない。
【０１７２】
HIV-1感染および非感染の両個体由来のPBMCを用い、CD8+およびCD4+の両T細胞サブセット内でTim-3+集団をTim-3-集団と選別し、qPCRによりT-bet (Th1)、GATA-3 (Th2)およびIFN-γ (Th1) mRNAを定量化した。CD8+およびCD4+の両T細胞集団について、GATA-3はTim-3+画分におけるよりもTim-3-画分において高いレベルで発現されたのに対し、T-betはTim-3+集団のほうで高発現された(図4)。Tim-3+細胞のTh1/Tc1特性にもかかわらず、IFN-γ mRNAの大部分はTim-3- CD8+集団において検出された。次いで急性/早期HIV-1感染個体10名、慢性進行者10名、ウイルスコントローラ10名、およびHIV-1非感染個体5名由来のPBMCにおいてプールHIV-1-Gagペプチド、CMV/EBV/インフルエンザ(CEF)ペプチド、またはブドウ球菌腸管毒素B (staphylococcus enterotoxin B; SEB)による刺激に応じたIFN-γおよびTNF-αの産生について調べた。HIV-1感染被験者でもHIV-1非感染被験者でもともに、刺激に応じたCD4+およびCD8+ T細胞由来のIFN-γ産生は、Tim-3-集団から主に認められ、Tim-3loまたはTim-3hi集団のいずれでも最小限のサイトカイン産生が認められた(図5 A〜D)。急性/早期感染個体、慢性進行者、ウイルスコントローラおよびHIV-1非感染被験者に、類似のサイトカイン産生パターンが認められた(図13 A〜B)。抗原に応じたTNF-αおよびCD107aの発現はTim-3-細胞に同様に限定された(図13 A〜B、図14 A〜D)。当然の結果として、HIV-1特異的CD8+ T細胞はMHC-I四量体での染色により特定され、同種のペプチドに応じて、IFN-γはTim-3-/lo画分によってのみ産生され、四量体+Tim-3hi細胞からのIFN-γの産生はないことが認められた(図5 E〜G)。かくして、Tim-3hi集団からのサイトカイン分泌の欠如は、抗原特異的細胞が存在しないことによるものとは考えられない。
【０１７３】
その後、処置を受けていない慢性進行HIV-1感染個体由来のエクスビボPBMCを用いてTim-3-/lo細とTim-3+/hi細胞を選別した。両サブセットを抗CD3および抗CD28で刺激し、CFSE希釈によって増殖を評価した。Tim-3-/lo細胞の増殖が認められ、その一方でTim-3hi集団においては最低限の増殖が検出された(図5H〜L)。HIV-1非感染個体5名およびHIV-1感染慢性進行者5名由来のエクスビボPBMCをTim-3およびKi67抗原で共染色した。Ki67抗原は、細胞周期のG1後期、S期、G2期およびM期の細胞においてのみ通常発現される核タンパク質であり(30)、ゆえに増殖細胞のマーカーとして一般に使用される。しかしながら、慢性HIV-1感染症においては、末梢血中のKi67+ T細胞の大部分(92±5%)が、細胞周期のG0/G1期に静止された活性化細胞であることが実証されている(31)。いくつかの研究により、HIV-1感染個体由来のT細胞のKi67発現が機能不全またはアネルギーと関連していることが指摘されている(32〜34)。過去の研究と一致して、HIV-1非感染PBMCと比べ、Ki67+細胞の出現率上昇がHIV-1感染PBMCのCD4+およびCD8+の両T細胞サブセットにおいて認められた(35) (図5 M〜N)。Tim-3+細胞の大部分はKi67-であったが、Tim-3発現細胞に関してKi67+ CD8+およびCD4+ T細胞をかなり濃縮した(図5R、p=0.0159)。活性化されているが細胞周期は静止していると特徴付けられたこの集団のTim-3の発現は、Tim-3発現細胞の増殖の欠如を示すインビトロデータと一致している。まとめると、これらの研究から、Tim-3の発現はHIV-1感染症において活性化されているが機能不全であるT細胞の集団を規定することが示唆される。
【０１７４】
Tim-3発現とT細胞機能不全との間の因果関係を描き出すため、Tim-3とそのリガンドとの相互作用の遮断によって、Tim-3+細胞のサイトカイン産生、および増殖が回復しうるかどうか試験した。マウスでは、ガレクチン-9はTim-3に対する炭水化物依存的なリガンドと特定されている(10)。ヒトでは、Tim-3はまた、まだ今のところ特定されていない、炭水化物非依存的なリガンドを有する可能性のあることが示唆されている(5)。Tim-3シグナル伝達の包括的な遮断を確実にするため、組換え可溶性Tim-3糖タンパク質を利用して、全てのTim-3結合リガンドを飽和した(図15)。sTim-3の添加はHIV-1感染慢性進行者においてHLA-A*0201拘束HIV-1-Gagエピトープ「SLYNTVATL」(SL9)に特異的なCD8+ T細胞の増殖を2 μg/mlまで用量依存的に増強した(図6A)。CD8+およびCD4+の両T細胞の増殖の増強が、慢性進行者由来のPBMCをプールGagおよびNefペプチドで刺激した場合にも観察された(図6B〜D)。これらのデータは、類似の増殖アッセイ実験においてTim-3経路を破壊するために遮断性の抗Tim-3 mAbクローン(2E2)を利用することによって確証された。10 μg/mlのmAb 2E2の添加がHIV-1-Gag T細胞増殖応答の著明なレスキューをもたらした(図6E)。これらの実験からのさらなる所見は、インビトロで増殖していた細胞が高いTim-3発現レベルを示したということである(図16)。抗CD3/抗CD28に応じたTim-3の上方制御は早くも刺激後20時間に認められ、少なくとも120時間まで徐々に増加した。これは、Tim-3が負の免疫調節因子として働くこと、そこで抗原刺激細胞がエフェクタ機能を行い、次いで応答を終結させる手段としてTim-3を上方制御することと一致する。Tim-3+細胞からのサイトカイン産生の欠如を示すエクスビボデータを、IFN-γ産生と高いTim-3発現レベルとの間の関連性を実証する既報のインビトロデータと調和させるうえで、区別すべき重要な差異がある。エクスビボでTim-3を発現している細胞は、インビボで慢性刺激に曝されており、さらなるインビトロ刺激に対して機能不全である。対照的に、Tim-3-培養細胞がインビトロで刺激される場合、それらはエフェクタ機能を行い、例えばIFN-γを産生し、次にTim-3を上方制御してこれらの応答を弱める。このように、これらの培養を観察する場合に応じて、高レベルのTim-3およびIFN-γが関連して観察されうる。このモデルから、sTim-3でのインビトロ処理は、疲弊したHIV-1特異的T細胞の機能を回復することに加え、他の抗原に応じてエフェクタ機能を引き延ばすものと予測される。これは、抗CD3/CD28でのインビトロ刺激から5日目の時点でIFN-γ産生のレベルを調べることによって支持されている。これらの条件の下で、分裂を起こした全細胞が、高レベルのTim-3を発現する。sTim-3の存在下でこれらの細胞は、対照の存在下でよりも高いレベルのIFN-γを一貫して発現する(図17)。
【０１７５】
PD-1は、これまで、疲弊したHIV-1特異的T細胞のマーカーと特定されているので、Tim-3発現がこの同一の疲弊集団の別のマーカーとなるか、さもなければ異なる集団を規定するかどうかについて判定した。慢性進行性HIV-1感染症を有する個体10名由来のPBMCをTim-3およびPD-1について共染色した。CD8+またはCD4+ T細胞に対してゲーティングした後に、フローサイトメトリーによって発現を解析した(図7)。被験者9/10名中、Tim-3およびPD-1が異なるCD8+ T細胞集団によって主に発現された。被験者の1名OM513は、高出現率のTim-3+PD-1+集団(23.6%)を示したが、Tim-3+PD-1-集団もTim-3-PD-1+集団もともに保持していた(それぞれ23.0%および16.7%)。同様に被験者9/10名がCD4+ T細胞上のPD-1およびTim-3について主に異なる染色を示した(図7C、D)。HIV-1特異的CD8+ T細胞において、2通りの発現パターンが観察された: 四量体+の集団は主にTim-3+PD-1-であった(図7E)、またはそれらは主にTim-3-およびPD-1+であった(図7F)。どちらのパターンでも、少数集団がTim-3もPD-1も共発現した(図7E、F)。かくしてTim-3およびPD-1発現は主に異なる集団を規定した。Tim-3およびCD25に対する二重染色をCD4+およびCD8+の両T細胞について行った(図8A、B)。Tim-3およびCD25は異なるT細胞集団によって主に発現された。これらのデータは、CD4+ T細胞上のTim-3発現が古典的な調節性T細胞の集団を特徴付けるものではないことを実証する。次いでTim-3hi集団をT細胞の成熟/分化状態を規定するために使用された他の細胞表面マーカーにより、つまりCD57、CD45RA、CD27、CD28およびCCR7に対する共染色により規定できるかどうかについて判定した(26〜28、36)。慢性HIV-1感染個体由来のTim-3発現CD8+ T細胞が表現型プロファイルの全範囲にわたって分布していた(図8C〜E)。
【０１７６】
HIV-1感染個体3名でのTim-3hi vs Tim-3-/lo CD8+ T細胞において、刺激後にSTAT5、Erkおよびp38リン酸化(それぞれpSTAT5、pErkおよびp38)の動態が評価されている(37)。Tim-3hi CD8+ T細胞はTim-3-/lo CD8+ T細胞に比べてSTAT5、p38およびERK1/2の基礎的なリン酸化のレベルが高く、インビトロにおいて、STAT5経路の場合IL-2で、ならびにp38およびERK1/2 (MAPキナーゼ経路)の場合PMA/イオノマイシン(P+I)で刺激されたときに、これらの分子のリン酸化の変化倍率が低いことを示した(図9A、B)。このシグナル伝達応答の障害は、Tim-3発現細胞の分化のあらゆる段階で見られた(図9C〜E)。すなわち、Tim-3発現CD8+ T細胞では「予め活性化された」シグナル伝達タンパク質のリン酸化の変化が鈍くなったことを示す。これは、HIV-1感染症が、基礎的なリン酸化の増強および再刺激に応じたシグナル伝達の撹乱をもたらすT細胞の慢性的活性化を誘導するというSchwenekerらによって最近提唱されたモデルと一致している(37)。Tim-3の細胞内ドメインは、保存された5つのチロシン残基を含むが、ITIMコンセンサスに対応する配列を含まず、その下流のシグナル伝達標的は依然として不明である。
【０１７７】
これらのデータは、ヒトTim-3が慢性ウイルス感染症において活性化T細胞のエフェクタ機能を抑えるように働くという証拠を提供する。これは、免疫調節におけるTim-3の重要な役割を特定した、ならびに多発性硬化症および他の自己免疫疾患の病因におけるTim-3シグナル伝達の欠損を関連付けた、過去の研究を補完かつ統合する(38〜40)。HIV-1感染症において、Tim-3を発現する末梢血中のCD8+およびCD4+ T細胞の割合は、(HIV-1非感染個体における28.5%および17.6%の平均とは対照的に)それぞれ70%および30%超に達しうる。これらの出現率は末梢でHIV-1特異的細胞の割合を超えるので、Tim-3によるT細胞機能の抑制は、機能的なウイルス特異的応答の喪失に寄与するだけでなく、他の抗原に対する応答障害にも寄与する可能性が高い。これは、慢性HIV-1感染個体におけるCMVおよびEBV特異的なCD8+ T細胞のサブセットが高レベルのTim-3を発現するという本出願の所見によって支持され、HIV-1感染個体はリコール抗原(recall antigen)およびワクチン接種に対する応答が低下していたという所見と一致する(41)。Tim-3のこの広汎性の発現をもたらす因子は、十分に解明されていない。しかしながら、本出願のデータは、慢性HIV-1感染症におけるHIV-1特異的CD8+ T細胞の選択的機能不全と一致して、HIV-1特異的CD8+ T細胞上の過度に高いTim-3発現レベルを示す。PD-1について記述されているように、エスケープ変異の固定化がエピトープ特異的T細胞上のTim-3発現の低下および機能性の改善をもたらすかどうかについて判定することができる(42)。
【０１７８】
HAARTの開始によるTim-3発現の低下は、持続的なT細胞活性化(CD38発現)のレベルと相関する。Tim-3発現に及ぼす高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の効果を慢性HIV-1感染個体7名においてベースラインの時点で、ならびにHAARTの開始後1、2、3および6ヶ月の時点で調べた(図3)。慢性感染症を有する被験者4名は、HAARTによりCD4+およびCD8+の両T細胞上のTim-3レベルの着実な減少を示したが、被験者3名(OM 304、331、287)は、検出不能なHIV-1ウイルス負荷(50未満のコピー/ml bDNA)に達したにもかかわらず、高レベルのTim-3発現を維持していた(図3a、b)。混合効果の縦断的解析において、CD38発現によって測定したときに、CD8+ T細胞活性化がHAARTの期間にわたってTim-3発現と有意に関連しているものと考えられることが認められた。CD38を発現するCD8+ T細胞の割合も、CD8+ T細胞上のCD38の平均蛍光強度も、それぞれ、治療中のCD8+ T細胞上の高いTim-3の割合と関連していた(CD8+ T細胞上の各1%高いCD38発現につき、CD8+上の0.38 (SE =0.11) %ポイント高いTim-3発現(p=0.001; 図3b)、およびCD8+ T細胞上の各1ユニット高いCD38 MFIにつきCD8+上の0.7 (SE=0.19) %ポイント高いTim-3発現(p=0.001))。これらの効果は、CD4+ T細胞数で調整された場合、未変化のままであった。対照的に、HIV-1ウイルス負荷(p=0.25)もCD4+ T細胞絶対数(p=0.07)も、HAART後のTim-3発現と有意に関連していなかった。HAART療法で処置された慢性HIV-1感染個体の一部における高いTim-3発現レベルの維持はかくして、持続的なT細胞活性化(CD38発現)と関連している。
【０１７９】
Tim-3経路の機能不全が多発性硬化症の病変に寄与しうることを支持する最近のデータは、潜在的に有害な免疫応答を調節するうえでのTim-3の重要性を強調するものである(38、43)。この状況はPD-1を治療標的として追跡するうえで必要とされる考慮事項に似ている。治療標的としてのTim-3の重要な差異は、生存能および増殖能が損なわれているだけでなく、サイトカイン産生能も損なわれているT細胞とのその固有の関連性である。したがって、Tim-3経路の遮断は、HIV-1感染症におけるT細胞の数を高めるだけでなく、HIV-1感染個体におけるCD8+およびCD4+の両T細胞の機能性を改善もする新規の可能性をもたらす。一見有効なHAART療法にもかかわらず一部の被験者は高いTim-3発現レベルを維持しているので、Tim-3治療用物質はまた、HAARTで持続する免疫欠如を覆すうえで一翼を担う可能性がある。
【０１８０】
本明細書において提示されるデータは、Tim-3発現が、最近特定されたPD-1発現集団のものとは異なる疲弊T細胞集団を規定することを明らかに実証する。これは、PD-1発現細胞が慢性進行者において機能不全のHIV-1特異的CD8+ T細胞の亜集団のみを含むと報じた最近の研究を裏付けるものである(44)。HIV-1感染症との関連でT細胞疲弊をもたらす機構は、明らかに複雑であり、単一の経路に起因しえない。さらに、Tim-3経路もPD-1経路も同時に遮断することの相加効果、または相乗効果もあり、これによってさらに包括的なT細胞疲弊を覆すことが可能なり、強力な併用療法につながる可能性があるかもしれない。
【０１８１】
好ましい例であると現在考えられるものに関連して本発明を記述してきたが、本発明は開示の例に限定されないと理解されるべきである。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲の中に含まれるさまざまな変更および等価な組み合わせ方を網羅するよう意図される。
【０１８２】
全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願がその全体として参照により組み入れられると具体的かつ個別的に示されているかのようにその全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８３】
参考文献
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【０１８４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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