(57)【要約】    遺伝子送達用の改良されたポリ（アミドエチレンイミン）コポリマーを開示する。例示的な一態様には、分岐ポリ（トリエチレンテトラミン／シスタミンビスアクリルアミド）コポリマー（ポリ（TETA／CBA））に対して共有結合したポリエチレングリコール（PEG）が含まれる。ポリエチレングリコールは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。例示的な別の態様には、ポリ（TETA／CBA）-PEG複合体に対して共有結合したRGDペプチドが含まれる。例示的なさらに別の態様には、細胞に核酸をトランスフェクトするためにこれらの組成物を使用する方法が含まれる。【選択図】  なし
2011504943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物。
【請求項２】
nが1、2、または3である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
nが3である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが直鎖である、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
ポリエチレングリコールが、約1,000〜約50,000の分子量を有する、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
ポリエチレングリコールが、約2,000〜約25,000の分子量を有する、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ポリエチレングリコールが、約3,400の分子量を有する、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］が約1,000〜約25,000の分子量を有する、請求項4に記載の組成物。
【請求項９】
ポリエチレングリコールに対して共有結合したRGDペプチドをさらに含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項１０】
RGDペプチドがSEQ ID NO:1を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールが分岐している、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物に対して、イオン結合した核酸を含む、複合体。
【請求項１３】
核酸がプラスミドを含む、請求項12に記載の複合体。
【請求項１４】
核酸がsiRNAを含む、請求項12に記載の複合体。
【請求項１５】
核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項12に記載の複合体。
【請求項１６】
ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む複合体に対して、イオン結合された選択された核酸を含む複合体と、細胞とを接触させ、それにより複合体を細胞内に導入することを含む、細胞に対して選択された核酸をトランスフェクトする方法。
【請求項１７】
nが1、2、または3である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
選択された核酸が、プラスミドを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
選択された核酸が、siRNAを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
選択された核酸が、オリゴヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子送達に関する。より具体的には、本発明は、非ウイルス性遺伝子送達担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、治療用遺伝子ベースの薬剤の送達および適用を介して、ヒトの遺伝的疾患および後天的疾患の治療において、幅広い潜在能力を有する。安全で効率的でそして調節可能な遺伝子担体を使用することは、臨床的遺伝子治療を成功させるために必要である。R.C. Mulligan, The basic science of gene therapy, 260 Science 926-932 (1993)；I.M. Verma & N. Somia, Gene therapy-promises, problems and prospects, 389 Nature 239-242 (1997)。ウイルスベクターは、遺伝子送達において非常に効率的であるが、それらの潜在的な安全性の懸念および免疫原性の懸念は、臨床的応用においてそれらのリスクを生じる。C. Baum et al., Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors, 17 Hum. Gene Ther. 253-263 (2006)。ウイルスベクターに代わるものとして、ポリ（L-リジン）（PLL）、ポリ（エチレンイミン）（PEI）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、およびカチオン性リポソームなどのカチオン性ポリマーを、遺伝子送達担体として合成した。これらのカチオン性ポリマー担体の利点には、安全性、安定性、大型のDNAおよびRNAのロード能、そして簡易かつラージスケールの生産、が含まれる。S. Li & L. Huang, Nonviral gene therapy: promises and challenges, 7 Gene Ther. 31-34 (2000) ；F. Liu et al., Non-immunostimulatory nonviral vectors, 18 Faseb J. 1779-1781 (2004) ；T. Niidome & L. Huang, Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors, 9 Gene Ther. 1647-1652 (2002)。カチオン性ポリマーは、静電相互作用を通じて、ナノサイズの粒子中で負に荷電したDNAを濃縮することができ、そして、ポリマー／pDNAポリプレクスを、エンドサイトーシスを通じて細胞に導入することができる。Y.W. Cho et al., Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol, 55 J. Pharm. Pharmacol. 721-734 (2003) ；L. De Laporte et al., Design of modular non-viral gene therapy vectors, 27 Biomaterials 947-954 (2006) ；E. Piskin et al., Gene delivery: intelligent but just at the beginning, 15 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1182-1202 (2004)。結果として、ポリマーは、pDNAをヌクレアーゼ分解から保護することができ、そして細胞取り込みを促進して、高度の遺伝子トランスフェクションを誘導することができる。O. Boussif et al., A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine, 92 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 7297-7301 (1995)；D.W. Pack et al., Design and development of polymers for gene delivery, 4 Nat. Rev. Drug. Discov. 581-593 (2005)。
【０００３】
しかしながら、現在利用可能なカチオン性ポリマーは、顕著な細胞傷害性の懸念を有しており、それはほぼ、生理学的条件下にて、それらの生体適合性が低いこと、そして非-分解性であることのためである。
【０００４】
従って、従来の非ウイルス性遺伝子送達担体が知られており、そして限定的な目的のためには一般的に適切である一方で、それらは遺伝子治療における全体的な有用性を損なう特定の固有の欠点を有する。
【０００５】
上述したように、ヌクレオチド送達を亢進させるための改良された担体を提供することが、当該技術分野における顕著な進歩となりうることが、理解される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】R.C. Mulligan, The basic science of gene therapy, 260 Science 926-932 (1993)
【非特許文献２】I.M. Verma & N. Somia, Gene therapy-promises, problems and prospects, 389 Nature 239-242 (1997)
【非特許文献３】C. Baum et al., Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors, 17 Hum. Gene Ther. 253-263 (2006)
【非特許文献４】S. Li & L. Huang, Nonviral gene therapy: promises and challenges, 7 Gene Ther. 31-34 (2000)
【非特許文献５】F. Liu et al., Non-immunostimulatory nonviral vectors, 18 Faseb J. 1779-1781 (2004)
【非特許文献６】T. Niidome & L. Huang, Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors, 9 Gene Ther. 1647-1652 (2002)
【非特許文献７】Y.W. Cho et al., Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol, 55 J. Pharm. Pharmacol. 721-734 (2003)
【非特許文献８】L. De Laporte et al., Design of modular non-viral gene therapy vectors, 27 Biomaterials 947-954 (2006)
【非特許文献９】E. Piskin et al., Gene delivery: intelligent but just at the beginning, 15 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1182-1202 (2004)
【非特許文献１０】O. Boussif et al., A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine, 92 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 7297-7301 (1995)
【非特許文献１１】D.W. Pack et al., Design and development of polymers for gene delivery, 4 Nat. Rev. Drug. Discov. 581-593 (2005).
【発明の概要】
【０００７】
本発明の例示的な態様は、ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物を含む。本発明の例示的な態様において、nは、1、2、または3である。本発明のいくつかの例示的な態様において、ポリエチレングリコールは直鎖であり、しかしその他の例示的な態様において、ポリエチレングリコールは分岐鎖である。ポリエチレングリコールは、典型的には、約1,000〜約50,000の分子量を有し、そしてより典型的には約2,000〜約25,000の分子量を有する。本発明の例示的な一態様において、ポリエチレングリコールは、約3,400の分子量を有する。ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H/CBA］は、典型的には、約1,000〜約25,000の分子量を有する。しかしながら、ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H/CBA］およびポリエチレングリコールの分子量は、担体としてのそれらの機能性によってのみ限定される。本発明のいくつかの例示的な態様において、組成物は、ポリエチレングリコールに対して共有結合したRGDペプチドをさらに含む。RGDペプチドの例示的な例は、SEQ ID NO:1に示される。
【０００８】
本発明の別の例示的な態様は、ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物に対してイオン結合した核酸を含む複合体を含む。例示的な核酸は、プラスミド、siRNA、およびオリゴヌクレオチドを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の例示的な態様は、ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物に対してイオン結合された選択された核酸を含む複合体と細胞とを接触させ、それにより複合体を細胞に導入することを含む、細胞に選択された核酸をトランスフェクトする方法を含む。
【００１０】
本発明のさらなる例示的な態様は、ポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H／CBA］に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物によりコーティングされた固体支持体を含む。ポリエチレングリコールは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の特定の例示的な態様において、nは1、2、または3である。さらに、追加的な例示的な態様において、RGDペプチドは、ポリエチレングリコールに対して結合されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、本発明に従うポリ［H2N-（CH2-CH2-N）n-H/CBA］の合成についてのスキームを示す。
【図２】図2は、30℃または40℃のいずれかで合成されたポリ（TETA/CBA）の分岐度を示す、MALDI-TOF解析の結果を示す。
【図３】図3は、50℃で合成されたポリ（TETA/CBA）の分岐度を示す、MALDI-TOF解析の結果を示す。
【図４】図4は、H9c2細胞におけるトランスフェクション効率に対する、ポリマー構造の効果を示す。左から右へ、結果は、担体なし対照（すなわち、リポータープラスミドのみ）、ポリ（TETA/CBA）とリポータープラスミドの複合体についての示され、ここでポリ（TETA/CBA）を30℃で合成し、そしてリポータープラスミドに対する担体の重量比が6のもの（“30 Deg w/w 6”）、30 Deg w/w 12、30 Dec w/w 24、40 Deg w/w 6、40 Deg w/w 12、40 Deg w/w 24、50 Deg w/w 6、50 Deg w/w 12、および50 Deg w/w 24である。
【図５】図5は、H9c2細胞における細胞生存率に対する、ポリマー構造の効果を示す。結果は、図4と同一の順番で示される。
【図６】図6は、ポリ（TETA/CBA）およびポリ（TETA/CBA）-g-PEG3400についての、一般的合成スキームを示す。
【図７】図7は、ポリ（TETA/CBA）の1,000（1K）；5,000（5K）；および10,000（10K）分子量カットオフ画分、および対応するPEGコポリマー（5K-PEG3.4K）を用いた、24時間までのあいだのPBS中20％FBSにおける、血清ヌクレアーゼからのプラスミドDNAの保護を示す。
【図８】図8は、ポリ（TETA/CBA）を有さない対照と比較した場合の、30℃および50℃で合成されたポリ（TETA/CBA）による、血清ヌクレアーゼからのプラスミドDNAの保護を示す。
【図９】図9は、プラスミドDNAおよびポリ（TETA/CBA（1k））（■）、ポリ（TETA/CBA（5k））（▲）、ポリ（TETA/CBA（10k））（▼）、およびポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400（◆）から形成されるポリプレックスの粒子サイズを示す。
【図１０】図10は、プラスミドDNAおよびポリ（TETA/CBA（1k））（■）、ポリ（TETA/CBA（5k））（▲）、ポリ（TETA/CBA（10k））（▼）、およびポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400（◆）から形成されたポリプレックスのゼータ電位を示す。
【図１１】図11は、プラスミドDNAおよび40℃で合成されたポリ（TETA/CBA（1k））から形成されたポリプレックスの動的光散乱（DSL）により測定された粒径を示す。
【図１２】図12は、プラスミドDNAおよび40℃で合成されたポリ（TETA/CBA（5k））から形成されたポリプレックスの動的光散乱（DSL）により測定された粒径を示す。
【図１３】図13は、プラスミドDNAおよび40℃で合成されたポリ（TETA/CBA（10k））から形成されたポリプレックスの動的光散乱（DSL）により測定された粒径を示す。
【図１４】図14は、プラスミドDNAおよび40℃で合成されたポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400から形成されたポリプレックスの動的光散乱（DSL）により測定された粒径を示す。
【図１５】図15は、ポリ（TETA/CBA）-g-PEG-RGDの合成についてのスキームを示す。
【図１６】図16は、bPEG-g-ポリ（TETA/CBA）の合成についてのスキームを示す。
【図１７】図17は、ポリ（TETA/CBA）（◇）、ポリ（TETA/CBA）-PEG3400（■）、およびポリ（TETA/CBA）-PEG-RGD（▽）の粒径を示す。
【図１８】図18は、ポリ（TETA/CBA）（■）、ポリ（TETA/CBA）-PEG3400（△）、およびポリ（TETA/CBA）-PEG-RGD（▽）のゼータ電位を示す。
【図１９】図19は、PEG-PEIおよび対照と比較した場合の、ポリ（TETA/CBA）およびbPEG-ポリ（TETA/CBA）の細胞傷害性を示す。
【図２０】図20は、PEG-PEIおよび対照と比較した場合の、ポリ（TETA/CBA）およびbPEG-ポリ（TETA/CBA）についてのルシフェラーゼ発現により測定された場合のトランスフェクションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
還元可能なポリ（アミドエチレンイミン）（SS-PAEI）および方法についての本発明の改良が開示されそして記述される前には、本発明は、特定の構成、プロセス工程、および本明細書中で開示される材料がいくらか変更され得るものであるため、そのような構成、プロセス工程、および材料に限定されないことが理解される。本明細書中で使用される用語用法は、特定の態様のみを記述することを目的として使用されるものであり、そして本発明の範囲は添付する請求の範囲およびその均等範囲によってのみ限定されるものであるため、限定を目的としたものではないこともまた、理解される。
【００１３】
本発明の背景を記述するため、そしてその実施に関して追加の詳細を提供するために、本件明細書中で参照する刊行物およびその他の参照物は、参照により本明細書中に援用される。本明細書中において検討される参考文献は、本件出願の出願日よりも前の開示についてのみ提供される。本明細書中のいずれも、本発明の発明者らが先行発明のためにそのような開示に先行するものとして権利を与えられないという了解と解釈されるべきものはない。
【００１４】
文脈から明らかに相ではないと解釈されない限り、本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形（“a”、“an”、および“the”）には、複数の指示対象が含まれることに注意されるべきである。
【００１５】
そうではないと規定されない場合、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００１６】
本発明を記述しそして請求の範囲に記載する際、以下の用語用法が、以下に記載される定義に従って、使用される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、“含む”、“含み”、”含有する”、“により特徴づけられる”、および文法的に同等の用語は、追加的な、記載されていない要素または方法工程を排除しない、包括的な、またはオープンエンドの用語である。“含む”は、より限定的な用語である“からなる”および“から本質的になる”を含むものと解釈される。本明細書中で使用される場合、“からなる”およびその文法的に同等の用語は、請求の範囲に記載されていないいずれの構成要素、工程、または有効成分をも排除する。本明細書中で使用される場合、“本質的に〜からなる”およびそれの文法的に同等の用語は、請求項の範囲を具体的な材料または工程および請求項に記載される発明の基本的で新規な（1または複数の）特徴に物質的に影響を及ぼさないものに限定される。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、“SS-PAEI”は、還元可能なジスルフィド結合を含有するポリ（アミドエチレンイミン）を意味する；“TETA”は、トリエチレンテトラミンを意味する；そして“CBA”は、N,N’-シスタミンビスアクリルアミドを意味する。
【００１９】
還元可能なポリ（アミドエチレンイミン）（SS-PAEI）は、核酸の送達のために使用される非ウイルス性担体のクラスである。L.V. Christensen et al., Reducible poly(amido ethyleneimine)s Designed for Triggered Intracellular Gene Delivery, 17 Bioconjugate Chem. 1233-1240 (2006)。ポリアミンモノマーおよびシスタミンビスアクリルアミド（CBA）のあいだのマイケル付加化学を使用したポリマーのこれらの種類の合成を、図1に示す。結果として得られるポリマーは、介在プラスミドDNAならびにsiRNAの効果的なトランスフェクション効率を媒介することが示された。L.V. Christensen, C.W. Chang, J.W. Yockman, et al., Reducible poly(amido ethylendiamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery, 118 J. Control. Rel. 254-261 (2007)；J. Hoon Jeong, L.V. Christensen, J.W. Yockman, Z. Zhong, J.F.J. Engbersen, W.J. Kim, J. Feijen, S.W. Kim, Reducible poly(amido ethyleneimine) directed to enhance RNA interference, 28 Biomaterials 1912-1917 (2007)。これらのポリマーは、目的の核酸を細胞の細胞質画分中に送達する誘発性放出メカニズムにより、細胞外環境と細胞内環境との間でのレドックス電位を利用する。そのような特徴は、非ウイルス性遺伝子送達としてこれまで使用された伝統的な切断不能ポリマーまたは加水分解性ポリマーを超える、顕著な利点を有する。
【００２０】
明確な利点は、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAなど）の送達によって見られ、それは示されるべきそれらの効果に関して、細胞質中に送達されることのみを必要とする。伝統的な切断不能ポリマーは、典型的に、高い静電相互作用のためにエンドソーム区画からいったん放出されたら、細胞質中で濃縮されたままになる。治療用ヌクレオチドのこの濃縮は、転写または翻訳阻害のための宿主機構中におけるそれらの使用を阻害する。しかしながら、SS-PAEIを、還元性タンパク質／酵素、すなわち、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GSH）、により細胞質中で還元し、治療用ヌクレオチドを放出し、そして転写または翻訳阻害のための利用可能なヌクレオチド量を顕著に増加させる。
【００２１】
最近まで、これらのポリマーは、in vivoでの注射を介して直接的に送達するために使用されてきた。負に荷電した血漿タンパク質との望まれない相互作用や、循環中の非特異的分解を含む全身送達の欠点は、非ウイルス性遺伝子送達がこれまで直面してきた主要な問題〜送達〜を克服することができるポリマーシステムの構築を導いた。最も重要なことには、ポリマーと追加のポリマー構造および／または標的化部分との間の反応性結合が、細胞質中のヌクレオチド／ポリマー複合体の完全な還元を可能にするために必須である。ポリマー構造の安定な結合は、ヌクレオチドの放出を阻害することによるかまたは核内での運動を妨害することによるかに関わらず、細胞中でのトランスフェクション効率を低下させる可能性があることが見出された。M. Meyer & E. Wagner, pH-Responsive shielding of non-viral gene vectors, 3 Expert Opin. Drug Deliv. 563-571 (2006)。SS-PAEIの還元が効果的なヌクレオチド送達のために必須であるため、in vivoでの負の相互作用から保護し、そして核酸を所望の標的化領域へと送達するSS-PAEIの効果的な修飾が、本明細書中で開示される。
【００２２】
全身性投与を介したin vivo適用のためのポリ（トリエチレンテトラミンシスタミン-ビスアクリルアミド）（ポリ（TETA/CBA））ポリマーを改良するため、付随する組織特異的標的化部分（RGDなど）を含有していてもしていなくてもよい親水性PEGスペーサーを使用して、ポリマーを立体的に安定化させることができる。さらに、以前の遺伝子送達研究により、in vivoでの遺伝子輸送は、分子量が高い分岐鎖ポリマーの場合に、最高であることが示された。これらの特徴を示すコ-ポリマーの例は、PEG3400-bPEI25kである。従って、高分子量の分岐鎖ポリ（TETA/CBA）（“bTETA/CBA”）を、合成し、そしてPEG3400およびPEG3400-RGDと複合化させて、ポリ（TETA/CBA）-PEG3400およびポリ（TETA/CBA）-PEG3400-RGDと呼ばれる生じるコポリマーを誘導した。
【００２３】
本発明の別の例示的な態様は、ポリ（TETA／CBA）に対して共有結合したポリエチレングリコールを含む組成物によりコーティングした固相支持体を含む。ポリエチレングリコールは、直鎖のものであっても分岐鎖のものであってもよい。さらに、RGDペプチドがポリエチレングリコールに対して結合されていてもよい。例えば、固相支持体は、ディッシュ底、マルチウェルプレート、または連続的表面であってもよい。固相支持体は、ガラス、プラスチック（ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリプロピレンなど）、シリコン、金属（金など）、メンブレン（ニトロセルロース、メチルセルロース、PTFE、またはセルロースなど）、紙、生体物質（タンパク質、ゼラチン、または寒天など）、組織（皮膚、内皮組織、骨、または軟骨など）、またはミネラル（ヒドロキシアパタイトまたはグラファイトなど）、スライド（ガラスまたはポリ-L-リジンコーティングスライドなど）またはマルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレートのウェル、であってもよい。典型的な固相支持体材料には、ポリスチレン樹脂、エポキシ樹脂、またはガラスが含まれる。コーティング量は、典型的には、約0.1〜約100μg/cm2である。組成物を、固相支持体の表面上にコーティングする。組成物を、タンパク質、ペプチド、多糖、またはポリマーなどのマトリクスと混合することができる。タンパク質は、ゼラチン、コラーゲン、ウシ血清アルブミン、またはタンパク質を表面に対して固定化する際に使用することができるいずれかその他のタンパク質であってもよい。ポリマーは、ヒドロゲル、コポリマー、非-分解性ポリマーまたは生体分解性ポリマー、および生体適合性材料であってもよい。多糖は、メンブレンを形成しそしてポリマーをコーティングすることができるいずれかの化合物、例えばキトサン、であってもよい。細胞傷害性還元性試薬、細胞結合試薬、細胞増殖性試薬、細胞刺激性試薬、または細胞阻害性試薬、などの試薬、および特定の細胞を培養するための化合物、もまた、組成物とともに固相表面に対して固定化することができる。
【００２４】
例えば、適切な溶媒（水など）に組成物およびゼラチンを含むゼラチン-組成物混合物を、固相表面に対して固定化することができる。フィブロネクチン、コラーゲン、塩、糖、タンパク質、またはペプチドなどの細胞培養試薬もまた、ゼラチン-ポリマー混合物中に存在していてもよい。この混合物を、スライドまたはマルチウェルプレートなどの固相支持体の表面に均等に広げる。生じる生成物は、適切な条件下で完全に乾燥させ、それによりゼラチン-ポリマー混合物を固相支持体に固定化させる。例えば、生じる生成物を選択された温度または湿度で乾燥させること、または減圧デシケーター中で乾燥させることができる。
【実施例】
【００２５】
実施例1
ポリ（TETA／CBA）は、図1に示されそしてL.V. Christensen et al.,上述に記述されるスキームに従って、30℃、40℃、および50℃で合成された。
【００２６】
本実施例に従って調製されるポリ（TETA/CBA）の分岐度は、マトリクス支援脱離／イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析法により、特徴づけられた。結果から、ポリ（TETA/CBA）の分岐は約90%であったことが示される。30℃または40℃での合成（図2）の結果、少なくとも1つの分岐鎖（アーム）を含有するポリ（TETA/CBA）リピート単位の約90％が、直鎖であるその他の10％とともに生じた。この集団の中において、約60％が1つのアームを含有し、そして約30％が2つのアームを含有した。50℃での合成（図3）の結果、直鎖であるコポリマー約7％を含み、約40％が1つのアームを含有し、約40％が2つのアームを含有し、そして約10％が3つのアームを含有する、より高密度の構造を生じた。
【００２７】
実施例2
ポリ（TETA/CBA）コポリマーによるトランスフェクションを、プラスミド、pBLuc、をリポーターとして使用して、H9c2細胞中で評価した。10％FBS、ストレプトマイシン（100μg/mL）およびペニシリン（100 units/mL）を含有するDMEM中、37℃、加湿雰囲気下、5％CO2の条件で、細胞を維持した。4.0×104細胞／ウェルの初期密度で、24-ウェルプレート中、トランスフェクションの前24時間、細胞をまいた。6、12、および24のポリマー／pBLuc w/w比で、DNAをポリ（TETA/CBA）ポリマーと複合化した。対照には、ポリ（TETA/CBA）ポリマーは含まれなかった。複合体をHEPESバッファー中で作製し、そして使用するまで30分間インキュベーションした。トランスフェクションの時点で、各ウェルの培養液を新鮮な血清-不含培養液に置換した。ポリプレックス（0.5μg DNA／ウェル）を、37℃で4時間、細胞とともにインキュベーションした。その後、培養液を500μLの新鮮な完全培養液に置換し、そして細胞をさらに44時間インキュベーションした。その後、細胞を予め暖めたPBSを用いて洗浄し、200μLの細胞溶解バッファーを用いて処理し、そして凍結-融解サイクルに供した。14,000 gで5分間、遠心分離することにより、細胞残屑を除去した。細胞溶解物（25μL）中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（100μLのルシフェラーゼアッセイバッファー）を用いて、照度計（Dynex Technologies Inc., Chantilly, Virginia）上で測定した。ルシフェラーゼ発現の比発光単位（RLU）を、細胞抽出物中のタンパク質濃度に対して正常化し、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, Illinois）により測定した。全てのトランスフェクションアッセイを、3連にして行った。結果を、図4に示す。それほど分岐していない構造の場合と比較した場合、より高度に分岐した構造により、トランスフェクション効率が低下した。
【００２８】
実施例3
H9c2細胞を24-ウェルプレートに4.0×104細胞／ウェルの密度でまき、そして24時間インキュベーションした。6、12、および24の重量比（w/w）のポリ（TETA/CBA）／pBLuc複合体およびポリマーなし（対照）を、血清-不含培養液中で4時間、細胞とともにインキュベーションし、その後完全培養液中で20時間インキュベーションした。その後、MTT溶液（50μL、2 mg/mL）を添加し、そして細胞をさらに2時間インキュベーションした。培養液を取り除き、そしてその後300μLのDMSOを各ウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（Model 680, Bio-Rad Lab, Hercules, California）を使用して、吸光度を570 nmで測定した。％比細胞生存率を、対照（非処理）細胞との比較で測定し、これはトランスフェクションシステムには曝露されておらず、そして100％の細胞生存率として採用された。全ての細胞傷害性実験は、3連にして行った。結果を、図5に示す。細胞傷害性を、本質的にゼロとした。
【００２９】
実施例4
実施例1の手順に従って調製したポリ（TETA/CBA）コポリマーを、分子量カットオフ値10,000；5,000；および1,000を有する限外ろ過膜を用いて、分画した。これらの画分を、ポリ（TETA/CBA（10k））、ポリ（TETA/CBA（5k））、およびポリ（TETA/CBA（1k））とそれぞれ呼んだ。
【００３０】
分子量3,400のポリエチレングリコール（PEG3.4kまたはPEG3400）を、等モル量でポリ（TETA/CBA（5k））と複合化させた。DPASをジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解し、そしてDMSO中過剰量のピリジンとともに、NH2-PEG-COOHに対して滴加し、そして一晩反応させた。次に、ジチオスレイトール（DTT）を反応混合物に対して添加し、そして4時間反応させた。次に、得られたPEG生成物を、限外ろ過（1000 MWCO）により精製した。HS-PEG-COOHおよび過剰量のジビニルスルホンを、溶媒としてのDMSO中に溶解し、そして一晩反応させた。得られた混合物を、限外ろ過（1000 MWCO）により再び精製した。次いで、得られたPEG生成物を炭酸ナトリウムバッファー、pH 9.0中に溶解し、そしてポリ（TETA/CBA（5k））炭酸塩溶液に対して滴加し、そして16時間反応させた。視覚的な明確さのため、ポリ（TETA/CBA（5k））を図6中直線的に表すが、しかしながら、ポリ（TETA/CBA（5k））は分岐していたことに注意すべきである。この反応から得られる生成物を、ポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400と呼んだ。
【００３１】
ポリ（TETA/CBA（1k））、ポリ（TETA/CBA（5k））、ポリ（TETA/CBA（10k））、ポリ（TETA/CBA）5k））-PEG3400、および超分岐ポリエチレンイミン（bPEI25k；Mw = 25,000；Aldrich, St. Louis, Missouri）を、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）により解析した。表1は、数平均分子量（Mn）、重量平均分子量（Mw）、およびGPC測定値から誘導される多分散性指数（Mw/Mn；PDI）を示す。ポリマー画分バッファー容量滴定を、0.1 M NaCl水溶液中、pHを7.4から5.1まで変化させるために必要なHClのモルにより決定した。TCEPを用いた各ポリマー画分の還元およびMALDI-TOFにより解析される場合のようにその後の遊離のスルフヒドリルNEM保護により、分岐度を測定した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
実施例5
ポリ（TETA/CBA（1k））、ポリ（TETA/CBA（5k））、ポリ（TETA/CBA（10k））、およびポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400のプラスミドDNAを血清ヌクレアーゼから保護する能力を、測定した。
【００３４】
ポリプレックスを、ポリ（TETA/CBA（1k））、ポリ（TETA/CBA（5k））、ポリ（TETA/CBA（10k））、およびポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400を未分画ポリ（TETA/CBA）の代わりに使用した点を除き、上述したように調製した。次いで、ポリプレックスおよびプラスミドDNA対照（ポリ（TETA/CBA）ポリマーと複合化されない）を、血清ヌクレアーゼ（20％FBS；HyClone, Logan, Utah）に対して、0、1、3、6、12、16、または24時間、曝露した。その後、ポリプレックスを、TAEバッファー（40 mM Tris-HCl、1%（v/v）酢酸、1 mM EDTA）中、ゲル電気泳動（レーンあたり150 ngのpDNA）に供した。エチジウムブロマイド染色後、UVトランスイルミネーター（GelDoc, BioRad, Hercules, California）を備えたイメージアナライザーを用いて、画像を可視化した。図7は、ポリマーが、24時間のヌクレアーゼ分解から、プラスミドDNAを保護することに成功したことを示す。
【００３５】
別の実験において、対照プラスミドDNAおよび30℃または50℃で合成された未分画ポリ（TETA/CBA）を用いて形成されたポリプレックスを、上述したように、20％FBS中で血清ヌクレアーゼに曝露した。図8は、50℃で形成されたより高密度の構造により、30℃で形成された構造の場合よりも、血清ヌクレアーゼからのよりよい保護がもたらされることを示す。
【００３６】
実施例6
様々なw/w比のプラスミドDNAとポリ（TETA/CBA（1k））、ポリ（TETA/CBA（5k））、ポリ（TETA/CBA（10k））、およびポリ（TETA/CBA（5k））-PEG3400とから形成されたポリプレックスの粒径およびゼータ電位を、Brookhaven Instruments Corp.（Holtsville, New York）ZetaPALS上で測定した。粒径についての価は、有効平均径である（n＝3 SEM）。これらの結果は、図9および図10に示される。
【００３７】
動的光散乱（DLS）測定値を、ポリ（TETA/CBA（1k））（図11）、ポリ（TETA/CBA（5k））（図12）、ポリ（TETA/CBA（10k））（図13）、およびポリ（TETA/CBA）5k））-PEG3.4k（図14）を使用して、測定した。
【００３８】
実施例7
ポリ（TETA/CBA）-g-PEG-RGDを、実施例1の手順に従って調製したポリ（TETA/CBA）および商業的に入手可能なビニルスルホン-PEG-RGD（VS-PEG-RGD）を使用して合成した。反応スキームを図15に示す。
【００３９】
実施例8
bPEG2000-COHなどの分岐PEG生成物が、高分子量PEG生成物に類似するポリマーであるタンパク質の保護を亢進することが示された。これらの複合体により、低分子量を維持しながら、同様の結果が得られた。分岐性PEG2000を、ポリ（TETA/CBA）と複合化し、遺伝子送達用の改良型コポリマーシステムを生成した。bPEG-g-TETA/CBAの合成を、図16に示す。
【００４０】
実施例9
ポリ（TETA/CBA）、ポリ（TETA/CBA）-PEG3400、およびポリ（TETA/CBA）-PEG-RGDの粒径およびゼータ電位を、Brookhaven Instruments Corp.（Holtsville, New York）ZetaPALS上で測定した。粒径についての価は、有効平均径である。結果は、図17および図18中に示される。
【００４１】
実施例10
PC-3細胞を、24-ウェルプレートに4.0×104細胞／ウェルの密度でまき、そして24時間インキュベーションした。ポリ（TETA/CBA）、ポリ（TETA/CBA）-PEG3400、および対照PEG-PEIおよびポリマーなしを、血清-不含培養液中で4時間、細胞とともにインキュベーションし、その後完全培養液中で20時間インキュベーションした。その後、MTT溶液（50μL、2 mg/mL）を添加し、そして細胞をさらに2時間インキュベーションした。培養液を取り除き、そしてその後300μLのDMSOを各ウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（Model 680, Bio-Rad Lab, Hercules, California）を使用して、吸光度を570 nmで測定した。％比細胞生存率を、トランスフェクションシステムには曝露されておらず、そして100％の細胞生存率として採用される、対照（非処理）細胞との比較で測定した。全ての細胞傷害性実験は、3連にして行った。結果を、図19に示す。
【００４２】
実施例11
トランスフェクションを、プラスミド、pCMV-Luc、をリポーターとして使用して、PC-3細胞中で評価した。10％FBS、ストレプトマイシン（100μg/mL）およびペニシリン（100 units/mL）を含有するDMEM中、37℃、加湿雰囲気下、5％CO2の条件で、細胞を維持した。4.0×104細胞／ウェルの初期密度で、24-ウェルプレート中、トランスフェクションの前24時間、細胞をまいた。DNAを、ポリ（TETA/CBA）およびPEG-ポリ（TETA/CBA）ポリマーと複合化した。対照は、PEG-PEIおよびポリマーなしであった。複合体を、HEPESバッファー中で作製し、そして使用するまで30分間インキュベーションした。トランスフェクションの時点で、各ウェルの培養液を新鮮な血清-不含培養液に置換した。ポリプレックス（0.5μg DNA／ウェル）を、37℃で4時間、細胞とともにインキュベーションした。その後、培養液を500μLの新鮮な完全培養液に置換し、そして細胞をさらに44時間インキュベーションした。その後、細胞を予め暖めたPBSを用いて洗浄し、200μLの細胞溶解バッファーを用いて処理し、そして凍結-融解サイクルに供した。14,000 gで5分間、遠心分離することにより、細胞残屑を除去した。細胞溶解物（25μL）中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（100μLのルシフェラーゼアッセイバッファー）を用いて、照度計（Dynex Technologies Inc., Chantilly, Virginia）上で測定した。ルシフェラーゼ発現の比発光単位（RLU）を、細胞抽出物中のタンパク質濃度に対して正常化し、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, Illinois）により測定した。全てのトランスフェクションアッセイを、3連にして行った。結果を、図20に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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