(57)【要約】特異的結合対（ＳＢＰ）を提供するための改善された方法が提供される。この方法により、事前に選択した標的に対して親和性を有する、ＳＢＰの一方のメンバーの大集団と、ＳＢＰの他方のメンバーのより小さな事前に選択した集団の両方を用いて、ＳＢＰメンバーのライブラリーを作製することができる。特定の実施形態では、所定の標的または特定の配列に対して親和性がある１〜２０種の、ＨＣまたはＬＣを、遺伝的に多様なＬＣまたはＨＣの大集団と組み合わせて（必要に応じて）ライブラリーを作製する。
2011511647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の標的に対して親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、該ＳＢＰは第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、該方法は、
（ｉ）１またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択された該第１のポリペプチド鎖の１またはそれより多くの種類をコードする遺伝物質の集団を含む第１のベクター集団を含む宿主細胞を提供する工程であって、該第１のポリペプチド鎖が該宿主細胞から分泌される工程と、
（ｉｉ）該第２のポリペプチド鎖をコードする遺伝物質の多様な集団を含む第２のベクター集団を、該細胞に感染させる工程であって、該第２のポリペプチド鎖は、該第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための、分泌型ＲＧＤＰの成分と融合している工程と、
（ｉｉｉ）該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を該宿主細胞内で発現させて、該ＲＧＤＰの表面に提示されるＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該第１のポリペプチド鎖と該第２のポリペプチド鎖とが該ＲＧＤＰの表面で結合している工程と、
（ｉｖ）ＳＢＰメンバーを該所定の標的に対する結合について選択する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のポリペプチド鎖が抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のポリペプチド鎖が抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のベクターがプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のベクターがファージベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のベクターがファージベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のベクター集団が１〜１０００種の異なる第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のベクターが、１０５種以上の異なる第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択する工程がＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記所定の標的に結合する特異的結合対メンバーを単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｖ）から選択された前記ＲＧＤＰを工程（ｉ）の宿主細胞の新鮮な試料に感染させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の集団が２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
所定の標的に対して改善された親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、該ＳＢＰは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、該方法は、
（ｉ）該ポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた、該所定の標的に対して親和性を有するように選択された該第１のポリペプチド鎖の１またはそれより多くの種類をコードする核酸を含む第１のベクター集団と、
（ｉｉ）該第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクター集団と、
を宿主細胞に導入する工程であって、
該第１のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを該第２のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第１のベクターを宿主細胞に導入するか、または、
該第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを該第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第２のベクターを宿主細胞に導入する工程と、
該宿主細胞内で該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を発現させて、ＲＧＤＰによって提示される該ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該集団の少なくとも１つが、該ＲＧＤＰ成分を用いてパッケージング可能な核酸から発現され、それによって該ＲＧＤＰのそれぞれの遺伝物質が、ＲＧＤＰの表面に提示される該ＳＢＰメンバーのポリペプチド鎖をコードする工程と、
該集団のメンバーを該所定の標的に対する高親和性結合について選択する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
前記第１の集団が、２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のベクター集団が１０００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のベクター集団が１００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のベクター集団が２０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のベクター集団が１０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のベクター集団が１種の第１のポリペプチド鎖をコードする、請求項１または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２００８年２月１３日出願の米国特許出願第６１／０２８，２６５号および２００８年４月１０日出願の米国特許出願６１／０４３，９３８号に対する優先権を主張する。これらの先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ（そして参考として援用され）る。
【背景技術】
【０００２】
背景
ファージディスプレイ法は、生物科学およびバイオテクノロジーにおいて公知であり広く応用されている（例えば、特許文献１、特許文献２、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。この方法では、対象の外来ポリペプチドをコードする核酸配列をファージの外殻タンパク質をコードする配列と融合させて、ファージまたはファージミドから調製した粒子の表面に外来ポリペプチドを提示させることを利用する。この技術の応用には、属するメンバーが個々のファージ粒子の表面に提示されるポリペプチドライブラリーから、特定のクローンを選択するために親和性相互作用を使用することが含まれる。ポリペプチドの提示は、そのポリペプチドをコードする配列が挿入されたファージベクターから、その配列が発現されることによってなされる。したがって、対象のポリペプチドを選択するために用いることができるファージライブラリーを形成するために、ポリペプチドをコードする配列のライブラリーを個々の提示ファージベクターに移入する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４０３，４８４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
ファージまたはファージミドにおいてＦａｂおよびｓｃＦｖのライブラリーを構築するために用いられる現行の方法は、１つにはＭｈ種の重鎖（ＨＣ）とＮｌ種の軽鎖（ＬＣ）を組み合わせるために、Ｍｈ×ＮｌのＤＮＡ分子を構築し、Ｅ．ｃｏｌｉに導入して形質転換することが必要なことから、面倒で効率が悪い。本方法により、例えば、Ｍｈ種の（プラスミド）＋Ｎｌ種の（ファージ）新規ＤＮＡ分子を構築することを通して、Ｍｈ種のＨＣとＮｌ種のＬＣを組み合わせることが可能になる。組み合わせの混合は、ＤＮＡファージまたはファージミド分子の組換えライゲーションよりもはるかに効率的なファージ感染によって実現される。Ｎｌ種からなるＬＣは何回も繰り返し使用することができる。それゆえ、例えば１０７種からなるＬＣの集団を用いて１０種のＨＣを試験するために必要なライゲーションおよび形質転換は、１０８回ではなく、１０回である。我々の知る限りでは、同様の研究系は報告されておらず、細胞ライブラリーが大き過ぎる場合にこの方法の効率が減少するという希釈効果については考察されていない。
【０００５】
本方法において、１０４種より大きい集団は、選択されたファージがファージにコードされたＬＣを含む機会、および選択の間担持されるＨＣを産生する細胞が細胞由来のＨＣによって見出される機会は、使用されるＨＣ集団が大きくなるほど少なくなる、すなわち、細胞が大集団の中で「希釈」されるために、効率的に機能しない可能性が非常に高い。したがって、細胞ライブラリーに数多くのＨＣを使用することで可能性のある組み合わせが数多くもたらされると思われるにもかかわらず、「希釈」のために、実際の結合対が回収される可能性は低くなっている。結合性によって選択すると、特異的結合分子をラウンド当たり１００〜１，０００倍に濃縮することができるため、１００種からなる細胞ライブラリーが良好に機能するであろうと推定される。２０種、１０種、６種、またはそれ以下からなるライブラリーがより良好に機能すると思われる。この方法は、単一のＨＣに適用でき、ＨＣを数多くのＬＣと試験することが可能になる。
【０００６】
比較的少数（１０５種以上と対照的に、１〜１０００種（例えば、１〜５００種、１〜２５０種、１〜１００種、１〜５０種、１〜２５種、１〜１５種、または例えば、１種、５種、６種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、１２５種、１５０種、２００種、２５０種、３００種、４００種、５００種または７５０種））の、所定の標的または特定の配列に対して親和性があるＨＣまたはＬＣを、遺伝的に多様なＬＣまたはＨＣの大集団と組み合わせて（必要に応じて）特異的結合対、例えばＦａｂなどの免疫グロブリン断片のライブラリーを作製する方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態において、所定の標的または特定の配列に対して親和性がある１〜２０種の、ＨＣまたはＬＣを、遺伝的に多様なＬＣまたはＨＣの大集団と組み合わせて（必要に応じて）ライブラリーを作製する。本方法を用いることができる他種の特異的結合対の例としては、全長の抗体およびその抗原結合断片（例えば、ＨＣおよびＬＣの可変ドメイン、Ｆａｂなど）、Ｔ細胞受容体分子（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子の細胞外ドメイン（α鎖およびβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖）を含む）、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、β２ミクログロブリンと非共有結合したα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む）、およびＭＨＣクラスＩＩ分子（α鎖およびβ鎖を含む）が挙げられる。
【０００８】
一態様において、軽鎖の迅速最適化（Ｒａｐｉｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎｓ）または「ＲＯＬＩＣ」と称される方法では、ＬＣの大集団を、ファージ上でそのＬＣの提示を引き起こすファージベクター内に置く。所定の標的に対して特異性を有するＨＣの小集団（例えば、プラスミドなどのベクター内）をＥ．ｃｏｌｉにクローニングし、ＨＣが発現されて周辺質に分泌されるようにする。次いでＥ．ｃｏｌｉにＬＣの大集団をコードするファージベクターを感染させ、ファージ上にＨＣ／ＬＣタンパク質対合を作製する。そのファージ粒子はＬＣ遺伝子のみを担持する。ファージ粒子が結合について選択されると、そのファージを、元の細胞集団（例えば、ＨＣ含有Ｅ．ｃｏｌｉ集団）に戻さなければならない。ファージが適正なＨＣを有する細胞に入る機会は、集団内のＨＣの数に反比例する。効率を良くするために、例えば、ＨＣ１５０種からなる集団を、例えばＨＣ１０種からなる亜集団１５個の集団に分割することができる。各亜集団に、全ＬＣレパートリーを感染させ、ファージを隔離したままに保ち、同時に選択し、ファージの各セットを元の亜集団に戻す。したがって、ファージが適当な細胞に入る機会は、１／１５０から１／１０までに増加する。対象のＬＣおよびＨＣ（例えば、所定の標的に結合する結合対を形成するもの）を、それらを含有する細胞から単離することができ（例えば、対象のＬＣおよび／またはＨＣをコードする核酸をＰＣＲ増幅し、単離することにより）、任意選択で、標準のＦａｂ提示形式または可溶性Ｆａｂ（ｓＦａｂ）を分泌させるためのベクターに再結合させることができる。ＬＣ含有ベクターとＨＣ含有ベクターのいずれか、またはその両方は、選択マーカー、例えば薬剤耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を含有することができる。ＨＣのためのプラスミドとＬＣのためのファージとは異なる選択マーカー遺伝子を有することが好ましい。
【０００９】
１回または複数回の選択ラウンドを行ったら、ＰＣＲ以外の方法によって適正な対合を確立することができる。例えば、親ＬＣ−ＨＣ対を保持しているベクターから親ＬＣを切り出し、それを新規に単離されたＬＣと置き換えることができる。１回の追加的な選択ラウンドにより、標的に結合するＬＣ−ＨＣ対が単離される。例えば、ＨＣが８種あり、３００種のＬＣが単離された場合、細胞ライブラリーを樹立するために８回のライゲーション、８×３００種のＨＣ−ＬＣの組み合わせを十分にサンプリングするために１０４回のライゲーションを行う必要があり得る。
【００１０】
別の態様において、重鎖の経済的選択（Ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎｓ）または「ＥＳＣＨ」と称される方法では、ＬＣの小集団を、Ｅ．ｃｏｌｉに導入された後にそのＬＣの小集団の分泌を引き起こすベクター（例えばプラスミド）内に置くことができる。ファージ内のＨＣの新規ライブラリーを構築し、例えば、ＨＣを、例えばファージ上でＨＣの提示を引き起こすファージベクター内に置く。次いで、ＬＣおよびＨＣを、非常に効率的な感染方法によって組み合わせることができる。有効なＨＣの少数のセットが選択されたら、それらをそのまま使用することができ、ＲＯＬＩＣにかけて最適なＨＣ／ＬＣ対合を得るか、古典的な選択のためにＬＣのＦａｂライブラリーにクローニングすることができる。ＬＣ含有ベクターとＨＣ含有ベクターのいずれか、またはその両方は、選択マーカー、例えば薬剤耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を含有することができる。プラスミドとファージは異なる選択マーカー遺伝子を有することが好ましい。
【００１１】
一部の態様において、本明細書に記載の方法（例えば、ＲＯＬＩＣまたはＥＳＣＨ）は、抗体などの特異的結合対を親和性成熟させるために使用することができる。例えば、所定の標的に結合する公知の抗体由来の１つまたはいくつかのＨＣまたはＬＣを本明細書に記載の技法で使用し、それぞれ、ＬＣライブラリーまたはＨＣライブラリーと組み合わせる。得られた結合対について、所定の標的への結合を試験し、１またはそれより多くの性質（例えば、抗体の可変ドメインのフレームワーク領域または抗体の抗原結合断片における結合親和性、アミノ酸配列または核酸配列、生殖系列配列の存在など）について公知の抗体のものと比較することができる。好都合な性質（例えば、同一のアッセイ条件下で、所定の標的への結合親和性が公知の抗体よりも高いこと）との特異的結合対についてさらに評価することができる。実施例４も参照されたい。
【００１２】
これらの方法により、ＦＡＢ３１０ライブラリーまたはＦＡＢ４１０ライブラリー（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００５年、２３巻、３４４〜３４８頁）よりも１０５倍大きいライブラリー（約１０１０のメンバーを持つ）が構築されたかのようにＨＣおよびＬＣの実際の対合が確立された。
【００１３】
一部の態様において、本開示は、所定の標的に対して親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、該ＳＢＰは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、該方法は、（ｉ）該所定の標的に対して親和性を有するように選択された第１のポリペプチド鎖、またはその全てが該所定の標的に対して親和性を有するように選択された該第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第１のベクターを含む宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）を提供するか、または該第１のベクターを宿主細胞に導入する工程であって、該第１のポリペプチド鎖が該宿主細胞から分泌される工程と、（ｉｉ）該第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクターを、該宿主細胞に導入する工程であって、該第２のポリペプチド鎖は、該第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための、分泌型ＲＧＤＰの成分と融合されている工程（例えば、該第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを該第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第２のベクターを宿主細胞に導入する）と、（ｉｉｉ）該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を該宿主細胞内で発現させて、ＲＧＤＰによって提示される該ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成し、該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を該宿主細胞内で発現させて、該ＲＧＤＰの表面に提示されるＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖が該ＲＧＤＰの表面で結合している工程と、（ｉｖ）該集団のメンバーを該所定の標的に対する結合について選択する工程と、を含む方法を提供する。任意選択で、この方法は、第１のベクターを含有する宿主細胞の新鮮な試料に、選択されたＲＧＤＰを感染させる工程を包含することができる。
【００１４】
一部の実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００１６】
一部の実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、第１のベクターはプラスミドである。
【００１９】
一部の実施形態において、第１のベクターはファージベクターである。
【００２０】
一部の実施形態において、第２のベクターはファージベクターである。
【００２１】
一部の実施形態において、第１のベクターは、１〜１０００種（例えば、１〜１０００種（例えば、１〜５００種、１〜２５０種、１〜１００種、１〜５０種、１〜２５種、１〜１５種または例えば、１種、５種、６種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、１２５種、１５０種、２００種、２５０種、３００種、４００種、５００種、または７５０種）の異なる第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする。一部の実施形態において、第１のベクターは、１つの第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクターは、２〜１００種（例えば、２〜５００種、２〜２５０種、２〜１００種、２〜５０種、２〜２５種、２〜１５種、または例えば２種、５種、６種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、１２５種、１５０種、２００種、２５０種、３００種、４００種、５００種、または７５０種）の異なる第１のポリペプチド鎖をコードする。
【００２２】
一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、２０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１種の第１のポリペプチド鎖をコードする。
【００２３】
一部の実施形態において、第２のベクターは、１０５種以上の異なる第２のポリペプチド鎖からなる遺伝的に多様な集団をコードする。
【００２４】
一部の実施形態において、選択する工程は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を含む。
【００２５】
一部の実施形態において、この方法は、所定の標的に結合する特異的結合対メンバーを単離する工程をさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態において、第１の集団は２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージは、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖する。
【００２７】
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、（ｉ）１またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択された第１のポリペプチド鎖の１種または複数をコードする遺伝物質の集団を含む第１のベクター集団を含む宿主細胞を提供する工程であって、前記第１のポリペプチド鎖が前記宿主細胞から分泌される工程と、（ｉｉ）前記第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた前記第２のポリペプチド鎖をコードする遺伝物質の多様な集団を含む第２のベクター集団を、前記細胞に感染させる工程と、（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖を前記宿主細胞内で発現させて、前記ＲＧＤＰの表面に提示されるＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖が前記ＲＧＤＰの表面で結合している工程と、（ｉｖ）ＳＢＰメンバーを前記所定の標的に対する結合について選択する工程とを含む方法を提供する。
【００２８】
一部の実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００３０】
一部の実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む。
【００３２】
一部の実施形態において、第１のベクターはプラスミドである。
【００３３】
一部の実施形態において、第１のベクターはファージベクターである。
【００３４】
一部の実施形態において、第２のベクターはファージベクターである。
【００３５】
一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１〜１０００種（例えば、１〜１０００種（例えば、１〜５００種、１〜２５０種、１〜１００種、１〜５０種、１〜２５種、１〜１５種または例えば、１種、５種、６種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、１２５種、１５０種、２００種、２５０種、３００種、４００種、５００種、または７５０種）の異なる第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクターは、１種の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクターは、２〜１０００種（例えば、２〜５００種、２〜２５０種、２〜１００種、２〜５０種、２〜２５種、２〜１５種、または例えば２種、５種、６種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、１２５種、１５０種、２００種、２５０種、３００種、４００種、５００種、または７５０種）の異なる第１のポリペプチド鎖をコードする。
【００３６】
一部の実施形態において、第２のベクターは、１０５個以上の異なる第２のポリペプチド鎖からなる遺伝的に多様な集団をコードする。
【００３７】
一部の実施形態において、選択する工程は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を含む。
【００３８】
一部の実施形態において、この方法は、所定の標的に結合する特異的結合対メンバーを単離する工程をさらに含む。
【００３９】
一部の実施形態において、この方法は、工程（ｉ）の宿主細胞の新鮮な試料に工程（ｉｖ）から選択されるＲＧＤＰを感染させる工程をさらに含む。
【００４０】
一部の実施形態において、第１の集団は２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージは、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖する。
【００４１】
一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、２０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１種の第１のポリペプチド鎖をコードする。
【００４２】
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して改善された親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、（ｉ）複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に前記第１のポリペプチド鎖を提示するための分泌型ＲＧＤＰの成分に融合させた、所定の標的に対して親和性を有するように選択された前記第１のポリペプチド鎖の１種または複数をコードする核酸を含む第１のベクター集団を含む宿主細胞を提供する、または前記第１のベクター集団を宿主細胞に導入する工程と、（ｉｉ）前記第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクター集団を前記宿主細胞に導入する工程であって、前記第１のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第２のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第１のベクターを宿主細胞に導入する、または前記第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第２のベクターを宿主細胞に導入する工程と、前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖を前記宿主細胞内で発現させて、ＲＧＤＰによって提示される前記ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、前記集団の少なくとも１つが、前記ＲＧＤＰ成分を用いてパッケージング可能な核酸から発現され、それによって前記ＲＧＤＰのそれぞれの遺伝物質が、ＲＧＤＰの表面に提示される前記ＳＢＰメンバーのポリペプチド鎖をコードする工程と、前記集団のメンバーを前記所定の標的に対する高親和性結合について選択する工程と、を含む方法を提供する。
【００４３】
一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、２０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする。一部の実施形態において、第１のベクター集団は、１種の第１のポリペプチド鎖をコードする。
【００４４】
一部の実施形態において、第１の集団は２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージは、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖する。
【００４５】
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して親和性を有する特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、（ｉ）前記第１のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた前記第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団であって、その各メンバーが可変ドメインのフレームワーク領域に生殖系列配列を有することが公知である多様な集団をコードする核酸を含む第１のベクターと、（ｉｉ）各メンバーがＣＤＲ３を含み、そのＣＤＲ３において合成多様性を有する、前記第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクターと、を宿主細胞に導入する工程であって、前記第１のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第２のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第１のベクターを宿主細胞に導入する、または、前記第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第２のベクターを宿主細胞に導入する工程と、前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖を前記宿主細胞内で発現させて、ＲＧＤＰによって提示される前記ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、前記集団の少なくとも１つが、前記ＲＧＤＰ成分を用いてパッケージング可能な核酸から発現され、それによって前記ＲＧＤＰのそれぞれの遺伝物質が、ＲＧＤＰの表面に提示される前記ＳＢＰメンバーのポリペプチド鎖をコードする工程と、を含む方法を提供する。
【００４６】
これらの方法を実施するための組成物およびキットも本明細書に記載されている。本発明のこれらの実施形態、他の実施形態、およびその特徴および特性は、下記の説明、図、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１に記載のＲＯＬＩＣ法の実施形態を示す図である。
【図２】図２は、従来のファージ選択スキーム（左側）と例示的なＲＯＬＩＣ  ＬＣ選択スキーム（右側）とを比較して示す図であり、ＲＯＬＩＣの効率および対合率が優れていること、ならびに対合の見込み数を多くするためのライブラリーの必要性が除かれることが例証されている。
【図３】図３は、選択／スクリーニングの方法にＲＯＬＩＣを組み込むことで、方法の工程数がどれだけ削減されるかを示す図である。
【図４】図４は、実施例１に記載されている、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦおよび他の細胞系についての細胞株評価の結果を示す図である。
【図５】図５は、ＲＯＬＩＣ法で使用される例示的なＨＣベクターを示す図である。
【図６】図６は、実施例１に記載されている、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣの軽鎖２０種がｐＨＣＳＫ２２内の重鎖２０種と対合してファージ上に機能的Ｆａｂを創出することができるかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１の記載されている、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣの軽鎖２０種がｐＨＣＳＫ２２の重鎖２０種と対合してファージ上に機能的Ｆａｂを創出することができるかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図８】図８は、ファージの力価と提示とをＥＬＩＳＡにより比較した結果を示す図である。
【図９】図９は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を要約した図である。
【図１５】図１５は、実施例２に記載されている、ＲＯＬＩＣ選択の後にＶＨとＶＬ−ＣＬとを再連結させるための「ジッピング」法の設計概略図である。ＬＣ−ＤＹ３Ｐ８５はＤＹ３Ｆ８５ＬＣと同一である。カセットがｐＭＩＤ２１にクローニングされた場合、提示ファージミドを得る。カセットがｐＭＩＤ２１．０３にクローニングされた場合、ｓＦａｂ発現のためのベクターを得る。
【図１６】図１６は、実施例２に記載されている、「ジッピング」法の成功利用を例証しているＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
便宜上、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用した特定の用語についてここで定義する。
【００４９】
単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」、および「この／その（ｔｈｅ）」は、その文脈で他に明らかに指示がなければ、複数を参照することも包含する。
【００５０】
「親和性」または「結合親和性」という用語は、見かけの結合定数またはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合性タンパク質は、例えば、特定の標的分子に対して、１Ｍ当たり少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１の結合親和性を有し得る。第２の標的と比べて第１の標的に対して結合性タンパク質の結合の親和性が高いことは、第２の標的への結合についてのＫａ（またはＫｄ数値）よりも第１の標的への結合についてのＫａの方が高い（またはＫｄ数値が小さい）ことにより示され得る。そのような場合、結合性タンパク質は、第２の標的（例えば、第２のコンフォメーションをとっている同じタンパク質またはその模倣体）に比べて、第１の標的（例えば、第１のコンフォメーションをとっているタンパク質またはその模倣体）に対して特異性を有する。結合親和性における相違（例えば、特異性または他の比較）は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、または１０５倍になり得る。
【００５１】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば蛍光測定を使用）を含めた種々の方法によって決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）内である。これらの技法は、結合した結合性タンパク質および遊離の結合性タンパク質の濃度を結合性タンパク質（または標的）の濃度の関数として測定するために用いることができる。結合した結合性タンパク質（［結合］）の濃度は、遊離の結合性タンパク質（［遊離］）の濃度および標的上にある結合性タンパク質の結合部位の濃度に関連しており、次の方程式によれば（Ｎ）は標的分子あたりの結合部位の数である。
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
しかし、親和性の定性的または半定量的な測定値を得ることで十分なこともあるので、Ｋａを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を用いて決定した親和性の定性的または半定量的な測定値はＫａに比例し、したがって、例えば機能アッセイ、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおける活性によって、親和性の定性的測定値を得るため、または親和性についての推論を得るために、高い親和性が、例えば２倍高いかどうかを決定することなどの比較のために使用することができる。
【００５２】
「抗体」という用語は、少なくとも１種の免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を含み得る。別の例では、抗体は、２種の重（Ｈ）鎖可変領域および２種の軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖおよびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６年、２６巻（３号）、６２９〜３９頁））ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）の構造的特徴を有し得る。抗体は任意の供給源由来であってよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）由来抗体および霊長類化抗体であることが好ましい。
【００５３】
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域と、それが組み入れられた、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる保存された領域に細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．ら、（１９８７年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻、９０１〜９１７頁を参照されたい。また、ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照されたい）。本明細書ではＫａｂａｔによる定義を使用する。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、一般には、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。
【００５４】
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、重鎖定常領域または軽鎖定常領域の全部または一部をさらに含んでよく、それによって、それぞれ、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を形成する。一実施形態において、抗体は２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、そこで免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互結合している。ＩｇＧでは、重鎖定常領域は３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、一般には、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主の組織または因子への、抗体の結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型またはラムダ型であってよい。一実施形態において、抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性毒性および／または補体媒介毒性に対して機能し得る。
【００５５】
抗体の１またはそれより多くの領域はヒトのもの、または事実上ヒトのものであり得る。例えば、１またはそれより多くの可変領域はヒトのもの、または事実上ヒトのものであり得る。例えば、１またはそれより多くのＣＤＲは、ヒトの、例えばＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３であってよい。軽鎖ＣＤＲはそれぞれ、ヒトのものであり得る。ＨＣ  ＣＤＲ３はヒトのものであり得る。１またはそれより多くのフレームワーク領域は、ヒトの、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４であり得る。例えば、Ｆｃ領域はヒトのものであり得る。一実施形態において、全てのフレームワーク領域はヒトのもの、例えば、ヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞由来のフレームワーク領域である。一実施形態において、ヒトの配列は、例えば、生殖系列核酸によってコードされている生殖系列配列である。一実施形態において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似した霊長類の生殖系列遺伝子、特にヒト生殖系列遺伝子内の対応する残基のアミノ酸型に変換することができる。１またはそれより多くの定常領域は、ヒトのもの、または事実上ヒトのものであり得る。例えば、免疫グロブリンの可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％、または抗体全体は、ヒトのもの、または事実上ヒトのものであり得る。
【００５６】
抗体の全部または一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによってコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ型、ラムダ型、アルファ型（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ型（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ型、イプシロン型およびミュー型の定常領域遺伝子、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端において可変領域（約１１０アミノ酸）遺伝子によって、およびＣＯＯＨ末端においてカッパ型またはラムダ型の定常領域遺伝子によってコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）遺伝子によって、および他の前述の定常領域遺伝子の１つ、例えばガンマ型定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされている。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ  ＣＤＲ３が約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基を超えるまで変動するために、相当変動する。
【００５７】
「ライブラリー」とは、ヌクレオチド、例えばＤＮＡ、クローン内の配列のコレクション、またはポリペプチド、または特異的結合対（ＳＢＰ）メンバー、または個々のポリペプチドもしくはＳＢＰメンバーを提供するために選択またはスクリーニングすることが可能なＲＧＤＰ上に提示されるポリペプチドもしくはＳＢＰメンバー、またはポリペプチドもしくはＳＢＰメンバーの混合集団の、遺伝的に多様なコレクションを指す。
【００５８】
本明細書では、「パッケージ」という用語は、その中の粒子が表面に特異的結合対のメンバーを提示している、複製可能な遺伝子提示パッケージを指す。このパッケージは、その表面に抗原結合ドメインを提示しているバクテリオファージであり得る。この種類のパッケージは、ファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれている。
【００５９】
「所定の標的」とは、任意の開示された方法で使用する前にその正体が公知である標的分子を指す。
【００６０】
本明細書では、「複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）」という用語は、粒子に複製能力を与える遺伝情報を有する生物学的粒子を指す。この粒子は、その表面にポリペプチドの少なくとも一部を提示することができる。このポリペプチドは、粒子固有の遺伝情報によってコードすることができ、かつ／またはその粒子内またはその粒子の祖先内に人為的に入れることができる。提示されるポリペプチドは、特異的結合対の任意のメンバー、例えば、免疫グロブリン分子、酵素または受容体などに基づいた重鎖ドメインまたは軽鎖ドメインであってよい。この粒子は、例えば、ウイルス、例えばｆｄまたはＭ１３などのバクテリオファージであってよい。
【００６１】
「分泌型」という用語は、ＳＢＰメンバーおよび／または分子が折りたたまり、パッケージが細胞サイトゾル外部に集まっている状態のＲＧＤＰまたはＲＧＤＰ上に提示されるＳＢＰのメンバーに結合した分子を指す。
【００６２】
本明細書では、「特異的結合対（ＳＢＰ）」という用語は、天然由来または合成的に作製された分子の対（それぞれが特異的結合対のメンバーになっている）を指す。対がお互いに特異的に結合する性質を有するように、分子対の一方は、他方の分子の特定の空間および極性組織に特異的に結合する表面区域または腔を有し、それゆえ、その他方の分子の特定の空間および極性組織と相補的であると定義される。特異的結合対の種類の例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。
【００６３】
「ベクター」という用語は、宿主生物内で複製する能力があるＤＮＡ分子を指し、その中に遺伝子を挿入して組換えＤＮＡ分子を構築する。「ファージベクター」は、ファージゲノムを修飾することにより得られるベクターであり、バクテリオファージの複製起点を含有するが、プラスミドの複製起点は含有しない。「ファージミドベクター」は、プラスミドゲノムを修飾することにより得られるベクターであり、バクテリオファージの複製起点ならびにプラスミドの複製起点を含有している。ファージミドベクターは、提示ファージよりもずっと小さいベクターにクローニングする利便性を提供する。ファージミドを感染させた細胞はヘルパーファージに救出されるに違いない。
【００６４】
一態様において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、（ｉ）その全てが１またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択された前記第１のポリペプチド鎖の１種または複数をコードする遺伝子の集団を含む第１のベクターを有する宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）の集団を提供する工程であって、前記第１のポリペプチド鎖が前記宿主細胞から分泌される工程と、（ｉｉ）前記第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた前記第２のポリペプチド鎖の集団（例えば、遺伝的に多様な集団）をコードする第２のベクター集団を、前記宿主細胞に感染させる工程と、（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖を前記宿主細胞内で発現させて、ＲＧＤＰによって提示される前記ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、それによって前記ＲＧＤＰのそれぞれの遺伝物質が、ＲＧＤＰの表面に提示される前記ＳＢＰメンバーの前記第２の集団のポリペプチド鎖をコードする工程と、（ｉｖ）前記集団のメンバーを前記所定の標的に対する結合について選択する工程と、任意選択で、（ｖ）工程（ｉ）の宿主細胞の新鮮な試料に、選択された前記ＲＧＤＰを感染させる工程とを含む方法が提供される。
【００６５】
一態様において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して改善された親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、（ｉ）その全てが１またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択され、可溶性分子として周辺質内に分泌されるようにそのそれぞれに対する遺伝子がシグナル配列に作動可能に連結されている前記第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第１のベクターと、（ｉｉ）前記第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた前記第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクターとを宿主細胞に導入する工程であって、前記第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第２のベクターを宿主細胞に導入する工程を含む方法が提供される。選択され得る第１の集団に望ましい性質としては、ａ）所定の標的に対して親和性を有すること、ｂ）フレームワーク領域内の生殖系列アミノ酸配列をコードすること、ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度が最適であること、ｄ）ＣＨＯ細胞のコドン使用頻度が最適であること、ｅ）特定の制限酵素認識部位がないこと、およびｆ）１またはそれより多くのＣＤＲ（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、および／またはＬＣ  ＣＤＲ３）において合成または選択された多様性を有することが挙げられる。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ３に合成または選択された多様性がある。
【００６６】
所定の標的は、任意の対象の標的、例えば、治療介入のための標的、例えばＴｉｅ−１、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−９、ＦｃＲＮ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−アルファ、血漿カリクレインなどであってよい。特定の標的に対する親和性は、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。
【００６７】
特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖はＬＣまたはＨＣを含み、第２のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチドが含むものの正体が何かに応じてＬＣまたはＨＣを含む。例えば、第１のポリペプチド鎖がＬＣを含む実施形態では、第２のポリペプチドはＨＣを含む。第１のポリペプチド鎖がＨＣを含む他の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＬＣを含む。
【００６８】
第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団は、全てが望ましい性質を有するように選択されており、少なくとも約５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約７５０、約１０００までのメンバーを含み得る。第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団は一般にはるかに大きく、少なくとも約１０５、１０６、１０７以上に匹敵する。
【００６９】
特定の実施形態において、前記ポリペプチド鎖のそれぞれまたはいずれかは、前記成分融合産物を用いてＲＧＤＰとしてパッケージング可能な核酸から発現され得る。
【００７０】
この方法は、前記第１のポリペプチド鎖の集団を発現させる能力があるベクターを、前記発現を抑制する条件下で宿主生物に導入する工程を含み得る。第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖両方が発現できる条件下で、細胞のこの集団内に、前記第２のポリペプチド鎖をファージベクターの外被タンパク質との融合として発現させる能力があるファージベクターを導入する。
【００７１】
ファージをＲＧＤＰとして使用する場合、そのファージはクラスＩファージのｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｌｋｅ、ＺＪ／Ｚ、ＦｆおよびクラスＩＩファージのＸｆ、Ｐｆ１およびＰｆ３から選択することができる。特定の実施形態において、繊維状Ｆ特異的バクテリオファージを用いて、その表面に結合性分子、例えば抗体および抗体断片およびその派生体を提示するためのビヒクルを提供し、続く選択および操作を容易にすることができる。ｆｄの一本鎖ＤＮＡゲノム（およそ６．４Ｋｂ）を、カプシドサブユニットを隔離している細菌細胞膜を通して押し出し、成熟ビリオンを作製する。これらのビリオンは直径６ｎｍ、長さ１μｍであり、それぞれがおよそ２，８００分子の、ウイルス遺伝子ＶＩＩＩによってコードされている主要外被タンパク質および４分子の吸着分子遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）を含有し、後者はビリオンの一端に位置している。この構造は、Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９７８年、Ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｈａｇｅｓ、５５７〜５６９頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに総説がある。遺伝子ＩＩＩ産物は、ファージの細菌のＦ線毛への結合に関連する。ｆｄファージの遺伝子ＩＩＩには、生物学的に活性な外来配列を挿入するための魅力的な可能性があることが認められている。しかし、例えば遺伝子ＶＩＩＩおよび遺伝子ＶＩを含めた、他の候補部位もある。特定の実施形態において、遺伝子ＩＩＩ断端（ｓｔｕｍｐ）が本発明の方法に使用されている。
【００７２】
宿主細胞は、ファージを感染させることが可能な任意の宿主細胞であってよい。特定の実施形態において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉの株、例えばＴＧ１、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’、ＥｃｌｏｎｉまたはＴｏｐ１０Ｆ’である。
【００７３】
以下のＲＧＤＰの組み合わせを選択またはスクリーニングして、ポリペプチド鎖をコードする核酸を持つそれぞれのＲＧＤＰに関連する個々のＳＢＰメンバーまたは前記ＳＢＰメンバーの混合集団を提供することができる。次に、このように提供されるポリペプチド鎖の少なくとも１種類の限定された集団を、個々の相補的な鎖、または相補的な鎖の限定された集団を選択する、さらなる二重の組み合わせの方法に使用することができる。
【００７４】
前記第１のポリペプチド鎖をコードする限定されたＲＧＤＰ集団から取り出した核酸を、前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の遺伝的に多様なレパートリー由来の核酸も導入される組換えベクターに導入することができ、または前記第２のポリペプチド鎖をコードする限定されたＲＧＤＰ集団から取り出した核酸を、前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の遺伝的に多様なレパートリー由来の核酸も導入される組換えベクターに導入することができる。
【００７５】
この組換えベクターは、２つのベクター間の細胞内組換えによって作製することができ、これは、ベクターの部位特異的組換えが起こり得る配列に、大腸菌ファージＰ１から得られるｌｏｘＰ配列などの配列を含めることにより促進することができる。次いで、部位特異的組換えを、同様に大腸菌ファージＰ１から得られるＣｒｅリコンビナーゼによって触媒することができる。
【００７６】
使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、調節可能なプロモーターの制御下で発現可能になり得る。
【００７７】
別の態様において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、所定の標的に対して親和性を有する特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法は、（ｉ）各メンバーが可変ドメインのフレームワーク領域に生殖系列配列を有することが公知である、前記第１のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第１のベクターと、（ｉｉ）前記第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた前記第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団であって、その各メンバーがＣＤＲ３の合成多様性を有する集団をコードする核酸を含む第２のベクターとを宿主細胞に導入する工程であって、前記第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを前記第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより前記第２のベクターを宿主細胞に導入する工程を含む。
【００７８】
ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．Ａ．ら、１９９２年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ，  Ｇ．  Ｐ．ら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、１６巻（５号）、２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｄ．ら、１９９２年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、２２７巻、７９９〜８１７頁に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の幅広いディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫによる編集）。抗体は、結合性質が実質的に保たれる限りは、フレームワーク領域内の１またはそれより多くの非生殖系列アミノ酸を、抗体の対応する生殖系列アミノ酸に戻すことにより「生殖系列化」される。定常領域、例えば免疫グロブリン定常ドメインにおいても同様の方法を用いることができる。
【００７９】
抗体は、その抗体の可変領域を１またはそれより多くの生殖系列配列により相似させるために修飾することができる。例えば、抗体は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワーク、ＣＤＲ、または定常領域に含めて参照生殖系列配列により相似させることができる。例示的な生殖系列化の方法の１つとして、単離された抗体の配列に相似した１またはそれより多くの生殖系列配列（例えば、特定のデータベースにおいて最も相似した配列）を同定することが挙げられる。次いで、単離された抗体において、増加的に、または他の突然変異との組み合わせて突然変異させる（アミノ酸レベルで）。例えば、可能性のある生殖系列突然変異の一部または全部をコードする配列を包含する核酸ライブラリーを作出する。次いで、例えば、単離された抗体と比較して１またはそれより多くの追加的な生殖系統残基を有し、それがなお有効である（例えば、機能活性を有する）抗体を同定するために、突然変異した抗体を評価する。一実施形態において、できるだけ多くの生殖系列残基を、単離された抗体に導入する。
【００８０】
一実施形態において、突然変異誘発を用いてフレームワーク領域および／または定常領域内に１またはそれより多くの生殖系列残基を置換または挿入する。例えば、生殖系列のフレームワーク領域残基および／または定常領域残基は、修飾される非可変領域に相似している（例えば、最も相似している）生殖系列配列から得ることができる。突然変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能活性）を評価して、生殖系列残基（１つまたは複数）が許容される（すなわち、活性を抑止しない）かどうかを決定することができる。同様の突然変異誘発をフレームワーク領域において行うことができる。
【００８１】
生殖系列配列の選択をさまざまな様式で行うことができる。例えば、生殖系列配列は、選択性または相似性、例えば、少なくともある特定の割合の同一性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％。９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性について所定の基準を満たす場合に選択することができる。選択は、少なくとも２種、３種、５種または１０種の生殖系列配列を用いて行うことができる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、相似している生殖系列配列の同定には、そのような配列を１つ選択することが含まれる。ＣＤＲ３の場合、相似している生殖系列配列の同定には、そのような配列を１つ選択することが含まれ得るが、アミノ末端部とカルボキシ末端部に別々に寄与する２つの生殖系列配列を使用することが含まれてもよい。他の実施では、１つまたは２つを超える生殖系列配列が、例えば、コンセンサス配列を形成するために使用される。
【００８２】
本発明の任意の態様による方法を実行する際に使用するためのキットも提供される。キットには、必要なベクターを含めることができる。そのようなベクターの１つは、一般には一本鎖バクテリオファージの複製起点を有し、ＳＢＰメンバーの核酸を含有するか、そのベクターをファージカプシドタンパク質の成熟コード配列の５’末端領域に挿入するための制限部位を有するかいずれかであり、カプシドタンパク質外因性ポリペプチドと細胞膜周辺腔の融合を導く前記部位の上流の分泌に関するリーダーコード配列を持つ。
【００８３】
上記で定義したＲＧＤＰおよび上記で定義した任意の方法を用いることによって得られる特異的結合対のメンバー、例えば、抗体、酵素、受容体、それらの断片および派生体などの結合性分子も提供される。派生体は、酵素またはＦｃ尾部などの別の分子と融合した特異的結合対のメンバーを含み得る。
【００８４】
キットには、コードされているポリペプチドを遊離型で発現させるためのＳＢＰメンバーの核酸の上記の特性を有し得る、またはコードされているポリペプチドを遊離型で発現させるためのＳＢＰメンバーの核酸を含有し得る、またはコードされているポリペプチドを遊離型で発現させるためのＳＢＰメンバーの核酸を挿入する部位を有するファージベクター（例えば、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣ、表２に配列を示す）を含めることができる。キットには、可溶性の鎖、例えば、ｐＨＣＳＫ２２（表３に配列を示す）を発現させるためのプラスミドベクターも含めることができる。キットには、適切な細胞系（例えば、ＴＧ１）も含めることができる。
【００８５】
キットには、方法を実行するために必要な補助的な成分を含めることができ、そのような成分の特質は、採用した特定の方法の過程に左右される。有用な補助的な成分は、ヘルパーファージ、ＰＣＲプライマー、およびさまざまな種類の緩衝液および酵素を含み得る。緩衝液および酵素は、一般には、本明細書に記載の戦略による、再配列した免疫グロブリン遺伝子または再配列していない免疫グロブリン遺伝子由来のＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列を調製可能にするために使用する。
【実施例】
【００８６】
例示
本発明を以下の実施例によりさらに例示し、これは限定的なものと決して解釈すべきではない。本願を通して引用した全ての参考文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【００８７】
（実施例１）
軽鎖の迅速最適化（ＲＯＬＩＣ）
ＲＯＬＩＣとは、軽鎖の迅速最適化である。この方法の例示的な実施形態において、ＳＳ−ＶＨ（ｉ）−ＣＨ１の集団をコードする遺伝子を、ＰｌａｃＺなどの適切な調節可能なプロモーターの制御下で、ベクター内（ｐＨＣＳＫ２２など）に置く。ＳＳは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＶＨ（ｉ）−ＣＨ１の分泌を引き起こし得るシグナル配列である（ｉは、集団におけるこのＶＨの指数であり、ｉは１、２、・・・Ｎであり得る）。ＶＨ（ｉ）は、抗体の重鎖の可変ドメインであり、ＣＨ１は、ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）の第１の定常ドメインである。ベクターｐＨＣＳＫ２２もｐＢＲ３２２の複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎＲ）を含有する。ｐＨＣＳＫ２２内に入れられたＨＣ集団は、特定の標的抗原に対して親和性を有するようにまたは他の一部の望ましい性質を選択されることになる。
【００８８】
第２のベクター、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣは、Ｍ１３ｍｐ１８から得たファージ由来ベクターである。野生型Ｍ１３の全ての遺伝子に加えて、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣは、アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）および抗体の軽鎖（ＬＣ）の提示カセットを担持している。ＬＣ定常領域は、Ｍ１３ｉｉｉの断端とインフレーム融合する。ＳＳ−ＶＬ−ＣＬ−ＩＩＩ断端遺伝子はＰｌａｃＺによって調節される。ヒトＬＣの大規模レパートリーをＤＹ３Ｆ８５ＬＣにクローニングする。
【００８９】
一実施例において、ヒトＴＩＥ−１に対して親和性を有する２０種のＨＣをｐＨＣＳＫ２２にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＧ１株を形質転換して細胞集団を作出するために使用する。これらの細胞はＦ＋であり、Ｍ１３を感染させることができる。細胞が、ｐＨＣＳＫ２２集団の一メンバーとＤＹ３Ｆ８５ＬＣ集団の一メンバーの両方を有する場合、その細胞はＡｍｐとＫａｎの両方に対して耐性である。ＩＰＴＧを用いて誘導された場合、またはグルコース非存在下で増殖させた場合、ＨＣは周辺質に分泌され、各細胞はＨＣ集団の一メンバーをなしている。Ｍ１３は、多重感染を避けるためによく発達した系を有しているので、各細胞はＬＣ集団の単一のメンバーを含有する。したがって、ＡｍｐＲ細胞、ＫａｎＲ細胞から作製されたファージは、ＩＩＩｓｔｕｍｐに固定されたＬＣの遺伝子を担持する。ＤＹ３Ｆ８５ＬＣが野生型ｉｉｉと提示型ｖｌ：：ｃｌ：：ｉｉｉｓｔｕｍｐの両方を有するため、ファージは概ね全長ＩＩＩを有する。多くのファージは、野生型ＩＩＩのみを有し、抗体は提示されない。ＶＬ：：ＣＬ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐタンパク質を担持しているファージは、細胞の周辺質からＶＨ：：ＣＨ１タンパク質を得る。
【００９０】
例えば、５×１０７種のＬＣおよび２０種の別々のＨＣがある場合、ＬＣ／ＨＣの組み合わせは１０９通りになり得る。これらのファージは、標的、例えばＴＩＥ−１に結合させるために選択することができる。最初のＦＡＢ−３１０ライブラリーにおいて、各ＨＣをおよそ２５種の異なるＬＣと対合させる。ここで、その全てがＴＩＥ−１に対していくらかの親和性を有するＨＣの少数のセットを取り、それらを我々のコレクション中の全てのＬＣと組み合わせる。我々のベクターｐＭＩＤ２２において１０９種からなるライブラリーを作出することが可能であり得るが、このサイズのライブラリーを作出することは非常に大きな労働力を要する。ＲＯＬＩＣにおいて必要なのは、ｐＨＣＳＫ２２において２０種のＨＣのライブラリーのみを作出し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換することである。これらの細胞にＤＹ３Ｆ８５ＬＣライブラリーを感染させることにより、全組み合わせが可能になる。ＤＹ３Ｆ８５ＬＣライブラリーを樹立する必要があるが、一度である。
【００９１】
結合のために選択されたファージは、ＨＣ遺伝子を担持していないので、そのファージを得た同じ細胞系で増殖させなければならない。選択されたＬＣファージを感染させた細胞（ＨＣ集団を担持している）を、液体中で一晩増殖させる。増幅したファージを沈殿させ、精製し、該標的に暴露させる。ファージが結合した標的を、ファージが感染、増幅することを可能にし、潜在的に新規ＬＣ  ＨＣ対合を可能にする元のＨＣ  ｐＨＣＳＫ２２細菌と混合する。最終的にこのファージを含有する細胞が培養されるまで、このプロセスを２回または３回繰り返す。個々のコロニーを選び取り、増殖させる。単離されたコロニー（例えば、９６０）から得たファージをファージＥＬＩＳＡで試験する。標的に結合するファージを産生するコロニーにおいて、所望の対合を得たが、ＬＣ遺伝子およびＨＣ遺伝子は別々のＤＮＡ分子上にある。ＰＣＲを用いて、ＬＣおよびＨＣを、Ｈｏｅｔ，  Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻、３４４〜３４８頁（２００５年）に記載の標準のＦａｂ提示形式に再結合させることができる。あるいは、可溶性Ｆａｂ（ｓＦａｂ）発現カセットを作製し、ｓＦａｂを試験することができる。
【００９２】
ＲＯＬＩＣにより、１〜１００個（あるいは１〜５００個）の抗体を一度に親和性成熟させることができる。利用できるレパートリー中に良好なＬＣがないという危険性を伴って１つの抗体を選び取ることは強制されない。１００ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の親和性を有する抗体を最初に選択し、それらの３分の１が１０倍の改善を示した場合、ほんの少しの追加的な努力に対して２０ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の親和性を持つ抗体が得られるはずである。
【００９３】
Ａ．例示的なＲＯＬＩＣ法
１．ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０からの選択を１〜２ラウンド行う。
【００９４】
２．プラスミドの集団内のＨＣを、つないでいないＨＣとして細胞ライブラリー内に移動させる（１〜１０００種のＨＣレパートリー；ほとんどまたは全く特性付けしない）。
【００９５】
３．細胞ライブラリーに、ＩＩＩｓｔｕｍｐに固定した５Ｅ７カッパ型＆５Ｅ７ラムダ型を担持し、ＨＣを担持していないファージライブラリーを感染させる。
【００９６】
４．ファージを選択し、１回繰り返す（同じ細胞ライブラリーを使用する）
５．ファージＥＬＩＳＡを使用して役立つＬＣ／ＨＣ対を有するコロニーを選び取る。
【００９７】
６．ｐＭＩＤ２１．０３においてＥＬＩＳＡ陽性コロニーからｓＦａｂカセットを構築する（ｐＭＩＤ２１．０３は、ｐＭＩＤ２１由来のベクターであり、ＩＩＩｓｔｕｍｐを欠失しているのでｓＦａｂが分泌される）。
【００９８】
この方法により、ライブラリーがＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０よりも１０５倍大きいかのように、実際のＨＣとＬＣとの対合が確立される。このことは図１に例証している。上記の工程２において、任意の前もって設定した程度にＨＣを特徴付ける必要はない。酵素を阻害することなどの望ましい特徴を全てが現している複数のＨＣを自由に選び取ることができる。ファージライブラリーＦＡＢ−４１０を、表４に示すファージベクターＤＹ３Ｆ６３において樹立した。ファージミドライブラリーＦＡＢ−３１０を、表５に示すファージミドベクターｐＭＩＤ２１において樹立した。
【００９９】
Ｂ．ＬＣの選択−例
図２は、ＲＯＬＩＣを用いてＬＣを選択する１つの方法を例証している。図３は、潜在的に高速な方法を例証している。
【０１００】
Ｃ．カッパ型ＬＣおよびラムダ型ＬＣライブラリーの構築
完全なライブラリーを樹立する前に、以下の評価実験を完了させた。
【０１０１】
１．κ型ＬＣおよびλ型ＬＣを、小規模で、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣにライゲーションさせた。
【０１０２】
２．最終ベクター２０ｎｇをＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞に電気穿孔処理し培養した。
【０１０３】
３．各ライブラリーに対して４つのプレートを選び取った。
【０１０４】
４．ファージ上でＬＣが発現していることを確認した（κ＆λＬＣ  ＥＬＩＳＡ）
５．各ライブラリーに対して４つのプレートについて配列決定することにより、各ライブラリーの多様性を評価した。
【０１０５】
６．３つのＥ．ｃｏｌｉ株を評価した。
【０１０６】
各ライブラリーに対して、ウサギおよびヤギの２種の抗ヒトＬＣ抗体を試験した。ｐＭＩＤ１７由来のカッパ型ＬＣおよびラムダ型ＬＣが、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣファージ上に首尾よく提示され、大規模な軽鎖ライブラリーの構築が可能になった。ベクターｐＭＩＤ１７は、ＬＣ−ＨＣ  Ａｂ（抗体）カセットのためのホールディングベクターであり、ｂｌａ遺伝子を含有するが、提示アンカーを欠乏している。
【０１０７】
３つのＥ．ｃｏｌｉ株を評価した：ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅｃｌｏｎｉ（Ｌｕｓｉｇｅｎ）およびＴｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。以下のパラメーターについて試験した：カッパＬＣ発現（ＥＬＩＳＡ）、形質転換効率（力価）およびファージ産生能力（ファージの増殖および力価）。図４は、３株におけるカッパ型ＬＣ発現についてのＥＬＩＳＡによる評価の結果を示す。各株の形質転換効率は以下の通りであった：ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’−７．３×１０６ＣＦＵ／μｇ、Ｅｃｌｏｎｉ−４．３×１０６ＣＦＵ／μｇおよびＴｏｐ１０Ｆ’−６．８×１０６ＣＦＵ／μｇ。精製したファージの力価測定値は以下の通りであった：
ＰＦＵ：ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’−３．５８×１０９；Ｅｃｌｏｎｉ−１．５６×１０９およびＴｏｐ１０Ｆ’−５．０７×１０９
ＣＦＵ：ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’−１．１９×１０９；Ｅｃｌｏｎｉ−５．３６×１０８およびＴｏｐ１０Ｆ’−６．３０×１０８
軽鎖の発現、形質転換効率およびファージの産生能力は、試験したＥ．ｃｏｌｉ株全てで同等であった。
【０１０８】
ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を選択して大規模ライブラリーを創出した。大規模ライブラリーの構築を含む工程／パラメーターは、
１．試験ライゲーション
２．大規模ライゲーション（×６０）
３．試験電気穿孔処理（ＥＰｓ）
４．大規模ＥＰｓ（ライブラリーごと６０回のＥＰｓ）
５．力価（ライブラリーのサイズ）：カッパ型−全ＣＦＵ２×１０７およびラムダ型−全ＣＦＵ１×１０７
６．ＮＵＮＣ培養／スクラッピング
７．ＰＥＧ沈殿およびファージの精製
８．最終力価：カッパ型−６×１０７／μＬおよびラムダ型−８×１０６／μＬ
ＨＣを発現させてＬＣライブラリーと対合させるために用いるＨＣベクター、およびその構築に関する情報を図５に示す。
【０１０９】
Ｄ．ＲＯＬＩＣの実証
実証実験のために、Ｔｉｅ−１に対して特異性を有するＨＣ２０種を選択した。抗Ｔｉｅ−１および抗重鎖（Ｖ５）および抗軽鎖についてのＥＬＩＳＡを用いて、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣの軽鎖２０種とｐＨＣＳＫ２２の重鎖２０種が対合してファージ上で機能的Ｆａｂが創出され得るどうかを評価した（ＬＣ１種×ＨＣ１種）。例示的なＥＬＩＳＡの結果を図６および７に示し、それにより、ＬＣがＨＣと対合して抗Ｔｉｅ−１活性を持つＦａｂ（ＬＣとＨＣの両方を有する）が創出され得ることが示されている。
【０１１０】
このライブラリー由来の提示と、ｐＭＩＤ２１およびＤＹ３Ｆ６３（Ｆａｂ３１０およびＦａｂ４１０）由来の提示との比較を、抗Ｔｉｅ−１ＥＬＩＳＡ滴定および抗Ｆａｂ（またはＨＣ特異的およびＬＣ特異的）ＥＬＩＳＡ滴定を用いて行った。特に、抗Ｔｉｅ−１ＥＬＩＳＡを以下の通り行った。対応する（元の）１０個の個々のＴｉｅ−１ＬＣ−ＤＹ３Ｆ８５ＬＣを持つ１０個の個々のＴｉｅ−１ＨＣ−ｐＨＣＳＫ２２クローンを救出し３０℃で一晩インキュベートした。ファージをＰＥＧ沈殿させ、ファージ滴定（ＣＦＵ）を行った。ＥＬＩＳＡを下記の通り行った：１）抗Ｆａｂ抗体（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬ、１００ｕｌ／ウェル）で９６ウェルプレートを４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）コーティングし、２）ＰＢＳ中４％ＢＳＡを用いて室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングし、３）ＰＢＳＴ（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で洗浄し、４）ウェルにファージを加え、室温で１時間インキュベートし、４）ＰＢＳＴ（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で洗浄し、５）抗Ｍ１３−ＨＲＰを加え、室温で１時間インキュベートし、６）洗浄し、基質を加え、６）４５０ｎｍで読み取った。ライブラリー間のファージ力価および提示の比較を図８に示す。
【０１１１】
次に、ＲＯＬＩＣ選択が、抗Ｔｉｅ−１軽鎖および重鎖の混合集団（（ＬＣ２０種×ＨＣ１種）または（ＬＣ２０種×ＨＣ２０種））でうまくいくかどうかを評価した。Ｔｉｅ−１ＨＣ−ｐＨＣＳＫ２２クローンをＴｉｅ１ＬＣ−ＤＹ３Ｆ８５ＬＣで救出し、その結果を抗Ｔｉｅ−１ＥＬＩＳＡで分析し、配列決定した。例示的な結果を図９〜１３に示し、図１４の表に要約している。
【０１１２】
ＲＯＬＩＣ選択が、完全な軽鎖多様性および抗Ｔｉｅ−１重鎖２０種（４×１０７ＬＣ×２０ＨＣ）でうまくいくかどうかを、Ｔｉｅ１Ｈｃ−ｐＨＣＳＫ２２クローンをＫ−ＤＹ３Ｆ８５ＬＣおよびＬ−ＤＹ３Ｆ８５ＬＣで救出することにより決定し、その結果を抗Ｔｉｅ１ＥＬＩＳＡで分析し、配列決定した。ＨＣ２０種を全ＬＣ多様性（ファージＤＹ３Ｆ８５）で救出し、精製した。ファージ溶液をＭＰＢＳＴ（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０＆２％スキムミルク）でブロッキングした。ブロッキングしたファージを、ビオチン化抗ＦｃでコーティングしたビーズおよびＴｒａｉｌ−Ｆｃでコーティングしたビーズ上で、各１０分間、全部で５回の除去処理で除去した。Ｔｉｅ−１−Ｆｃ２００ｐｍｏｌを、バイオ−抗Ｆｃ（総体積５００μＬ）でコーティングしたビーズを用いて４℃で一晩インキュベートした。除去したファージ溶液を標的ビーズに加え、室温で３０分インキュベートした。ビーズをＰＢＳＴで１２回洗浄し、ファージが結合したビーズを用いてＨＣ細胞２０ｍＬに感染させた。産出物をＡｍｐプレートおよびＫａｎプレートにおいて滴定した。ＥＬＩＳＡ用の３８４ウェルプレートをＴｉｅ−１，抗Ｖ５、抗カッパ、抗ラムダまたはＴｒａｉｌ−Ｆｃ（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル）を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で洗浄した。上清をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。抗Ｍ１３−ＨＲＰを加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質を加え、６３０ｎｍで読み取った。プレート＃１について、３４単離株がＴ＞０．５かつＴ／Ｂ＞３の基準を満たした。プレート＃２について、２９単離株がＴ＞０．５かつＴ／Ｂ＞３の基準を満たした。
【０１１３】
（実施例２）
ＲＯＬＩＣ法におけるＶＨ／ＶＬ−ＣＬ再連結
この方法は、ＲＯＬＩＣクローニングの手順中に失われた軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子との間の遺伝子型連結の再確立を可能にする１つの様式である（軽鎖と重鎖に対して異なるＲＯＬＩＣベクター）。これにより、抗体カセットをＡｐａｌＩ−ＮｈｅＩ断片としてｐＭＩＤ２１ベクター内に１工程でクローニングして戻すことができる。ｐＭＩＤ２１．０３をレピシエントとして使用する場合、次いでｓＦａｂを作製するためのベクターを得る。簡単に述べると、この方法工程は、
１．ＨＣ細菌にＬＣファージを感染させる。
【０１１４】
２．ファージをＰＥＧ沈殿させ、またはＰＥＧなしで単に上清を取る。
【０１１５】
３．標的への結合のために選択する。
【０１１６】
４．ＬＣ  ＤＮＡのみを有する結合ファージを採取する。
【０１１７】
５．ＨＣ細菌にＬＣファージを感染させる。
【０１１８】
６．ＬＣとＨＣを一緒に維持するために単一のコロニーを培養するが、選択における対と同じではない。
【０１１９】
７．ＥＬＩＳＡによってスクリーニングできるように、９６ウェルプレートの単一のコロニーを選び取る。
【０１２０】
８．一晩置いたファージの上清を採取してＥＬＩＳＡを行い、標的への結合を調べる。
【０１２１】
９．工程７で得られた細菌培養物（まだＨＣ遺伝子とＬＣ遺伝子の両方を含有する）を使用し、軽鎖と重鎖を別々に増幅し、ＲＢＳ様リンカーを用いてジッピングを行う（プライマーの詳細については下記を参照されたい）。
【０１２２】
１０．ジッピングされた抗体カセットを、ＡｐａｌＩ−ＮｈｅＩ  ＰＣＲ挿入片としてｐＭＩＤ２１に再クローニングできるように準備する。
【０１２３】
この方法の概要を図１５に示す。
【０１２４】
軽鎖と重鎖をジッピングし、ｐＭＩＤ２１ベクターへの１工程クローニングを可能にするためのプライマー：
１−重鎖遺伝子の増幅−付加ＲＢＳリンカー：
【０１２５】
【化１】
2011511647.tif 000003
【０１２６】
ライブラリーのさまざまなメンバーが３つの配列のうち任意の１つを含有し得るので３種のプライマーを一緒に使用する。
【０１２７】
【化２】
2011511647.tif 000004
【０１２８】
２−軽鎖遺伝子の増幅−付加ＲＢＳリンカー：
【０１２９】
【化３】
2011511647.tif 000005
【０１３０】
ライブラリーはＣラムダ２またはＣラムダ７のいずれかを持つメンバーを含有するため、ラムダ型に対するプライマーは２種ある。
【０１３１】
３−ジッピング工程
【０１３２】
【化４】
2011511647.tif 000006
【０１３３】
１つのクローンを選択し、ジッピングの概念を実証し、１工程反応として最適化した。図１６は、ジッピングされた構築物とＬＣ単独およびＨＣ単独とを比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１３４】
（実施例３）
重鎖の経済的選択（ＥＳＣＨ）
抗体の親和性および特異性の大部分はＨＣ由来であり、ＬＣは許容状態であることのみが必要であることが頻繁に指摘されてきた。したがって、実施例１に記載のＲＯＬＩＣにおける役割を逆にすることが可能である。ＬＣの小集団を、その分泌を引き起こすベクター内に置き、ファージにおいてＨＣの新規ライブラリーを樹立する。次にこれらを非常に効率的な感染方法により組み合わせることができる。有効なＨＣの少数のセットが選択されたら、ＲＯＬＩＣにかけて最適なＨＣ／ＬＣ対合を得ることができ、または有効なＨＣの少数のセットをそのまま使用することができる。
【０１３５】
ヒトの治療に使用するための抗体を選び取ることの一態様は、抗体の所望の親和性、特異性、溶解性、および安定性を分け与えるために必須ではない生殖系列配列からの逸脱を避けることを望むことである。したがって、マウス由来、またはヒト化マウス由来のファージライブラリーから選択された抗体は、「生殖系列化」される必要がある。つまり、生殖系列でないフレームワーク残基は全て生殖系列に戻し、抗体の性質への影響を試験するが、これは大変である。それゆえ、非常に有益な手法は、細胞において、全てのＬＣが完全に生殖系列化されたフレームワーク領域を有するようなＬＣライブラリーを作出することであり得る。例えば、完全に生殖系列化されたフレームワークおよび特にＬＣ−ＣＤＲ３にいくらかの多様性を有するＬＣのセットを現存のライブラリーから選択することができる。ベクターｐＬＣＳＫ２４は、ＬＣ遺伝子を受容し、それらを周辺質に分泌するように調製されていることを除いて、ｐＨＣＳＫ２２と同様である。ＤＹ３Ｆ８７ＨＣは、ＶＨ−ＣＨ１遺伝子を受容し、ＩＩＩｓｔｕｍｐに付着したそれらを提示するように準備されていることを除いて、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣと同様である。
【０１３６】
（実施例４）
親和性成熟のためのＲＯＬＩＣの使用
ＲＯＬＩＣ法を、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）の抗体阻害剤６種に対する親和性成熟方法として用いた。簡単に述べると、この方法は、これらの抗体の６種のＨＣを我々の全ＬＣレパートリーと試験することを可能にする手段を提供する。
【０１３７】
ＲＯＬＩＣ法を用いて、阻害の基準および成熟させる異種間の反応性研究に基づいて６種の重鎖を選択した。６種の重鎖をｐＨＣＳＫ２２発現ベクターにクローニングし、そのプラスミドを用いてＴＧ１細胞を形質転換した。次にＤＹ３Ｆ８５ＬＣベクター内に軽鎖レパートリーをクローニングすることによって創出した軽鎖含有ファージを細菌に感染させた。ファージは、ＬＣがファージに固定されるように、Ｍ１３のＩＩＩ遺伝子によってコードされたタンパク質の３−膜貫通細胞内アンカードメインと融合した軽鎖を含有して集合する。これらのファージは、ＨＣ成分を含有しない。ＨＣタンパク質は、細胞性ＨＣライブラリーによって提供される。
【０１３８】
他のファージは、ＨＣがファージに固定されるように、Ｍ１３のＩＩＩ遺伝子によってコードされたタンパク質の３−膜貫通細胞内アンカードメインにＨＣを融合させて構築した。これらのファージは、ＬＣ成分を含有しない。ＬＣタンパク質は、細胞性ＬＣライブラリーによって提供される。ストレプトアビジン磁気ビーズ上のビオチン化ヒトｐＫａｌタンパク質またはストレプトアビジン磁気ビーズ上のビオチン化マウスｐＫａｌタンパク質を用いて選択を下記の通り行った。
Ｉ．ヒトのみ
ａ．ラウンド１：ヒトタンパク質２００ｐｍｏｌ
ｂ．ラウンド２：ヒトタンパク質１００ｐｍｏｌ
ＩＩ．マウスのみ
ａ．ラウンド１：マウスタンパク質２００ｐｍｏｌ
ｂ．ラウンド２：マウスタンパク質１００ｐｍｏｌ
ＩＩＩ．ヒトおよびマウス
ａ．ラウンド１：ヒトタンパク質２００ｐｍｏｌ
ｂ．ラウンド２：マウスタンパク質１００ｐｍｏｌ
ｐＨＣＳＫ２２内に６種の重鎖を含有する新鮮なＴＧ１細胞に、ラウンド間に得られたファージ産出物を感染させた。ファージを一晩増幅させてその後の選択ラウンドに使用した。ラウンド２の最後に、６種の重鎖を含有する新しいＴＧ１細胞にこのファージ産出物を感染させ、単一のコロニーを増殖させるために培養した。分離したコロニーを９６ウェルプレート中の液体培養で一晩増殖させ、ファージを含有する上清の、ビオチン化ヒトｐＫａｌおよびビオチン化マウスｐＫａｌへの結合性を標準ＥＬＩＳＡによって試験した。
【０１３９】
全部で６７２コロニーをＥＬＩＳＡによって試験し、１３６コロニーが、マウスｐＫａｌとヒトｐＫａｌの両方に結合した。いくつかの単離株は、マウスｐＫａｌのみに結合し、他のいくつかの単離株はヒトｐＫａｌのみに結合した。これら１３６の両結合性の単離株の軽鎖および重鎖を個々にＰＣＲ増幅し、オーバーラッピングＰＣＲオリゴを介して単一のＤＮＡ鎖内に一緒にジッピングし、ｐＭＩＤ２１ｓＦａｂ発現ベクター（遺伝子ＩＩＩを持たない）にクローニングした。配列決定分析の結果、１４８種の特有の軽鎖が、最初の重鎖６種のうち３種と対合した。ＰＣＲにおいていくつかの突然変異が起こり、ＬＣ−ＨＣ対の数が増長した。
【０１４０】
（実施例５）
ＬＣとＨＣを一緒にジッピングするための代替プライマー
以下は、ＬＣとＨＣを一緒に再連結するために使用することができる試薬および方法の追加例である。
・重鎖はｐＨＣＳＫ２２ベクター由来であり得る。
・全ての重鎖は、ｐＨＣＳＫ２２ベクターの構築による雑種７シグナル配列を含有し得る。
・実際の雑種７シグナル配列：
【０１４１】
【化５】
2011511647.tif 000007
【０１４２】
・軽鎖はＤＹ３Ｆ８５ＬＣファージベクター由来であり得る。
・ＤＹ３Ｆ８５ＬＣベクター内には停止コドンがなく、したがって、さらにＲＢＳに樹立し戻す必要があり得る。
・ＲＢＳ配列は、ベクターの全配列に記したようにｐＭＩＤ２１ベクターストックに含有される実際の配列に基づいて樹立し戻すことができる。
・ラムダ型定常領域オリゴは生殖系列および繊維状ファージに基づき、したがってＣ０プライマーである。
・ＬＣの最後のコドンとＨＣ  ＳＳの最初のコドンとの間の配列は、以下の通りである。
【０１４３】
【化６】
2011511647.tif 000008
【０１４４】
・理論的な構築物を、雑種７および実際のＲＢＳを用いてカッパ型または仮定上のラムダ型を含有して樹立した。
【０１４５】
ＲＯＬＩＣで得たｐＭＩＤ２１カッパ型ジッピング試料
ＲＯＬＩＣで得たｐＭｉＤ２１ラムダ型ジッピング試料
・任意選択の工程：ジッピングする前に、軽鎖および重鎖を長い尾部なしで持ち上げ、その結果全部で３つのＰＣＲ事象がもたらされる。
・全てのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）配列を下記の表１に示す。
・方法：
ＬＣｓｓ（ＡｐａＬＩ）からＬＣｃｏｎｓｔまでのＰＣＲ
・Ｇ３ｓｓ．Ｆｏｒおよび
・Ｋｃｏｎｓｔ  Ｒｅｖおよび
・ラムダ型Ｃ０  Ｒｅｖおよび
・ラムダ型Ｃ２  Ｒｅｖおよび
・ラムダ型Ｃ３  Ｒｅｖおよび
・ラムダ型Ｃ７  Ｒｅｖ
ＨＣｓｓからＮｈｅＩ部位までのＰＣＲ
・ＨＣｓｓ．Ｆｏｒおよび
・ＨＣ．ｃｏｎｓｔ．ｒｅｖ．
ＬＣｓｓ（ＡｐａＬＩ）からＬＣ＋ＲＢＳ突出までのＰＣＲ
・Ｇ３ｓｓ．Ｆｏｒおよび
・Ｋ．ＲＢＳ．Ｒｅｖまたは
・ＬＣ０．ＲＢＳ．Ｒｅｖ
・ＬＣ２．ＲＢＳ．Ｒｅｖ
・ＬＣ３．ＲＢＳ．Ｒｅｖ
・ＬＣ７．ＲＢＳ．Ｒｅｖ
ＲＢＳ＋ＨＣｓｓからＨＣｃｏｎｓｔ（ＮｈｅＩ部位）までのＰＣＲ
・ＨＣｓｓ．ＲＢＳ．Ｆｏｒおよび
・ＨＣ．ｃｏｎｓｔ．ｒｅｖ
ＬＣｓｓ（ＡｐａＬＩ）からＨＣｃｏｎｓｔ（ＮｈｅＩ部位）までのジッピング
・Ｇ３ｓｓ．Ｆｏｒおよび
・ＨＣ．ｃｏｎｓｔ．ｒｅｖ
ＡｐａＬＩからＮｈｅＩを介したｐＭＩＤ２１へのクローニング
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２−１】
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【０１４８】
【表２−２】
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【０１４９】
【表２−３】
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【０１５０】
【表２−４】
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【０１５１】
【表２−５】
2011511647.tif 000014
【０１５２】
【表２−６】
2011511647.tif 000015
【０１５３】
【表３−１】
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【０１５４】
【表３−２】
2011511647.tif 000017
【０１５５】
【表３−３】
2011511647.tif 000018
【０１５６】
【表４−１】
2011511647.tif 000019
【０１５７】
【表４−２】
2011511647.tif 000020
【０１５８】
【表４−３】
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【０１５９】
【表４−４】
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【０１６０】
【表４−５】
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【０１６１】
【表５−１】
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【０１６２】
【表５−２】
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【０１６３】
【表５−３】
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【０１６４】
参考文献
本願を通して引用した参考文献、交付済み特許、公開または非公開特許出願ならびに以下に列挙したそれらを含めた、全ての引用した参考文献の内容は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
【０１６５】
【数１】
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【０１６６】
均等物
本発明の実施形態をいくつも記載した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることを理解されたい。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2011511647.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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