(57)【要約】α,α-ジ置換グリシンエステルと標的の細胞内酵素又は受容体の活性のモジュレーターとの共有結合型複合体であって、該複合体のエステル基が、１つ又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能であり、そして前記α,α-ジ置換グリシンエステルが、阻害剤と標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた位置で前記モジュレーターと複合体化している共有結合型複合体は、細胞内に入り、活性な酸加水分解産物が細胞内で蓄積する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α,α-ジ置換グリシンエステルと標的細胞内酵素又は標的細胞内受容体の活性モジュレーターとの共有結合型複合体であって、
該複合体のエステル基が、１つ又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能であり、そして
前記α,α-ジ置換グリシンエステルが、阻害剤と標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた位置で前記モジュレーターと複合体化している共有結合型複合体。
【請求項２】
α,α-ジ置換グリシンエステルと標的細胞内酵素又は標的細胞内受容体の活性モジュレーターとの共有結合型複合体であって、
該複合体のエステル基が、１つ又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能であり、そして
前記α,α-ジ置換グリシンエステルが、複合体化モジュレーター及び前記対応する酸の標的酵素又は受容体への結合様式が非複合体化モジュレーターの結合様式と同じであるように前記モジュレーターと複合体化している共有結合型複合体。
【請求項３】
阻害剤と標的細胞内酵素又は標的細胞内受容体との間の結合界面から離れた位置で、標的酵素又は受容体の活性モジュレーターにα,α-ジ置換グリシンエステルを共有結合させることによる該モジュレーターの構造的改変を含み、複合体のエステル基が、１つ又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能である、標的細胞内酵素及び/又は受容体の活性モジュレーターの細胞内での効力及び/又は残存時間を増加又は延長する方法。
【請求項４】
複合体化した標的細胞内酵素又は標的細胞内受容体の活性モジュレーター及び対応する酸の標的酵素又は受容体への結合様式が非複合体化モジュレーターの結合様式と同じであるように、モジュレーターにα,α-ジ置換グリシンエステルを共有結合させることによる該モジュレーターの構造的改変を含み、該複合体のエステル基が、１つ又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能である、標的細胞内酵素又は受容体の活性のモジュレーターの細胞内での効力及び/又は残存時間を増加又は延長する方法。
【請求項５】
モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基が、独立して、フェニル及び式-CRaRbRcの基
(式中：
Ra、Rb及びRcの各々は、独立して、水素、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキルから選択されるか；又は、
Rcは水素であり、Ra及びRbは、独立して、フェニル、若しくはピリジルのようなへテロアリールであるか；又は、
Rcは水素、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル若しくは(C3〜C8)シクロアルキルであり、Ra及びRbはそれらが結合する炭素原子と一緒になって三員〜八員のシクロアルキル若しくは五員〜六員のへテロ環式環であるか；又は、
Ra、Rb及びRcはそれらが結合する炭素原子と一緒になって三環式環(例えばアダマンチル)を形成するか；又は、
Ra及びRbは、各々独立して、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル、若しくは下記でRcについて定義する水素以外の基であるか、又はRa及びRbはそれらが結合する炭素原子と一緒になってシクロアルキル若しくはへテロ環式環を形成し、Rcは水素、-OH、-SH、ハロゲン、-CN、-CO2H、(C1〜C4)パーフルオロアルキル、-CH2OH、-O(C1〜C6)アルキル、-O(C2〜C6)アルケニル、-S(C1〜C6)アルキル、-SO(C1〜C6)アルキル、-SO2(C1〜C6)アルキル、-S(C2〜C6)アルケニル、-SO(C2〜C6)アルケニル、-SO2(C2〜C6)アルケニル、若しくは基-Q-W(式中、Ｑは結合手又は-O-、-S-、-SO-若しくは-SO2-を表し、Ｗはフェニル、フェニルアルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C3〜C8)シクロアルキルアルキル、(C4〜C8)シクロアルケニル、(C4〜C8)シクロアルケニルアルキル、へテロアリール又はへテロアリールアルキル基を表し、基Ｗは、ヒロドキシル、ハロゲン、-CN、-CONH2、-CONH(C1〜C6)アルキル、-CONH(C1〜C6アルキル)2、-CHO、-CH2OH、(C1〜C4)パーフルオロアルキル、-O(C1〜C6)アルキル、-S(C1〜C6)アルキル、-SO(C1〜C6)アルキル、-SO2(C1〜C6)アルキル、-NO2、-NH2、-NH(C1〜C6)アルキル、-N((C1〜C6)アルキル)2、-NHCO(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C4〜C8)シクロアルケニル、フェニル若しくはベンジルから独立して選択される１又は複数の置換基により任意に置換されていてもよい)を表す)
から選択される請求項１若しくは２に記載の複合体又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項６】
モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基がα-炭素自体と一緒になって、三員〜六員の飽和スピロシクロアルキル又はスピロへテロ環式環を形成するか；又は前記α-置換基の少なくとも一方がC1〜C6アルキル置換基である、請求項１若しくは２に記載の複合体又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項７】
モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基の一方がC1〜C6アルキル置換基であり、他方がメチル、エチル、ｎ-及びイソ-プロピル、ｎ-、sec-及びtert-ブチル、フェニル、ベンジル、チエニル、シクロヘキシル及びシクロヘキシルメチルからなる群より選択される、請求項１若しくは２に記載の複合体又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項８】
モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基の一方がメチルであり、他方がメチル、メチル、エチル又はｎ-若しくはイソ-プロピルであるか、又は前記α-置換基がそれらが結合する炭素と一緒になってシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル若しくはシクロヘキシル環を形成する、請求項１若しくは２に記載の複合体又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項９】
前記α,α-ジ置換グリシンエステルが、該α,α-ジ置換グリシンエステルのアミノ基を介して前記モジュレーターに共有結合型複合体化している請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体又は方法。
【請求項１０】
前記α,α-ジ置換グリシンエステルが、該α,α-ジ置換グリシンエステルのα置換基の一方を介して前記モジュレーターに共有結合型複合体化している請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体又は方法。
【請求項１１】
前記エステルが、細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素hCE-2又はhCE-3を含むがhCE-1を含まない細胞と比べてhCE-1を含む細胞によって、選択的に、対応するα,α-ジ置換グリシン複合体に加水分解可能である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体又は方法。
【請求項１２】
請求項１、２及び５〜１１のいずれか１項に記載の複合体と医薬的に許容される担体又は賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
(ｉ)標的細胞内酵素若しくは標的細胞内受容体の活性モジュレーター又は標的細胞内酵素若しくは標的細胞内受容体に関して同じ結合様式を有する該標的酵素若しくは受容体の複数の活性モジュレーターの、該モジュレーターと該標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた１又は複数の位置を同定し、
(ii)(ｉ)で同定された１又は複数の位置にてα,α-ジ置換グリシンエステル基又は一連の異なるα,α-ジ置換グリシンエステル基を連結させることにより前記モジュレーターを共有結合的に改変し、
(iii)(ii)で製造したαアミノ酸との複合体化モジュレーターを試験して、前記標的酵素又は受容体に対する活性を決定し、そして
(iv)(iii)で獲得したデータから、試験したα,α-ジ置換グリシンエステルとの複合体化モジュレーターのうち、細胞内での酵素活性又は受容体活性のモジュレーションを引き起こし、細胞内で対応するカルボン酸に変換され該カルボン酸として蓄積し、そして増加又は延長した細胞効力を示す１又は複数の複合体を選択する
ことを含む、標的細胞内酵素又は標的細胞内受容体の活性モジュレーターに比べて増加又は延長した細胞効力を有する該モジュレーターのα,α-ジ置換グリシンエステルとの共有結合型複合体を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内酵素又は細胞内受容体の活性をモジュレート(modulate)する化合物の活性を、該モジュレーターへのα,α-ジ置換グリシンエステルモチーフの共有結合型複合体化(covalent conjugation)により増加又は延長する一般的方法に関する。本発明は、α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフと共有結合型複合体化したモジュレーター及び親の非複合体化モジュレーターに比べてより優れた特性を有する前記複合体の同定方法に関する。本発明は、更に、アミノ酸複合体が単球-マクロファージ系列の細胞内で選択的に蓄積することを可能にする、α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフを含有するモジュレーターの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの細胞内の酵素及び受容体は、活性部位に結合することによってその活性をモジュレートする医薬的に有用な薬剤の標的である。例を下記表１に示す。標的の酵素及び受容体に到達するために、モジュレーター化合物は、当然のことながら、血漿／細胞外液から細胞膜を横切らなければならない。一般に、電荷が中性のモジュレーターは、荷電種より容易に細胞膜を横切る。次いで、動的平衡が確立されることにより、モジュレーターは血漿と細胞内部との間で平衡する。平衡の結果、細胞内酵素及び受容体の多くのモジュレーターの細胞内での残存時間及び濃度は、しばしば、特に該モジュレーターが血漿から迅速に除去される場合、非常に低い。したがって、モジュレーターの効力は、標的の酵素又は受容体に対する高結合親和性にもかかわらず、乏しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本出願人の国際特許出願WO 2006/117567は、細胞内カルボキシルエステラーゼhCE-1、hCE-2及びhCE-3の１又は複数により加水分解されるα-アミノ酸エステルモチーフと複合体化することによって、細胞内酵素又は受容体の或るモジュレーターの細胞内濃度を増加させる方法を開示している。これは、細胞内での該モジュレーターの残存を延長することによって増大した効力をもたらし、改善された薬理動態学的特性及び薬力学的特性を導く。より一貫した曝露及び投与頻度の減少を達成することができる。α-アミノ酸エステルモチーフをモジュレーターと複合体化して、該薬剤の治療的作用を担う特定の標的細胞に該薬剤を標的化すると、全身曝露が低減し、引いては副作用が低減して、更なる利点が得られる。
【０００４】
国際特許出願WO 2006/117567に開示されるα-アミノ酸エステル複合体は、全て、α-炭素でモノ置換されている。この公報は、α,α-ジ置換グリシンエステル複合体が細胞内カルボキシルエステラーゼにより加水分解され得ることを示唆していない。実際、細胞内カルボキシルエステラーゼ(主に、hCE-1、hCE-2及びhCE-3)がα,α-ジ置換グリシンエステルを加水分解する能力は、以前には、調べられていないようである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の簡単な説明
本発明は、α,α-ジ置換グリシンエステルの複合体が細胞内カルボキシルエステラーゼにより加水分解され得、よってWO 2006/117567に記載の方法及び利点は前記複合体でも得られるという新規な知見に基づく。前記利点には、酸加水分解産物の細胞内蓄積、場合によっては特定のタイプの細胞内への選択的蓄積が含まれる。WO 2006/117567と同様に、本発明は、脂肪親和性(低極性又は電荷が中性の)分子は、比較的容易に細胞膜を通過して細胞内に入るが、親水性(より高極性の荷電)分子は入らないという事実を利用する。よって、脂肪親和性モチーフを或るモジュレーターに連結する場合、該モジュレーターは細胞内に入ることが可能になり、該モチーフが細胞内でより高極性のものに変換される場合、より高極性のモチーフが連結しているモジュレーターは細胞内に蓄積すると予測される。前記モチーフが標的の酵素又は受容体との結合様式を変更しない方法でモジュレーターに連結する場合、より高極性のモチーフが連結したモジュレーターの蓄積は、延長及び/又は増大した活性を生じると予測される。
【０００６】
WO 2006/117567と同様に、本発明は、或るモジュレーターに結合したα,α-ジ置換グリシンエステルモチーフを親の酸に加水分解するために用い得るカルボキシルエステラーゼ酵素が細胞内に存在するという事実を利用する。したがって、モジュレーターは、α,α-ジ置換グリシンエステルとの共有結合型複合体(covalent conjugate)として投与でき、この形態で該モジュレーターは容易に細胞内に入り、該細胞内で１又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼにより効率的に加水分解され、得られるα,α-ジ置換グリシン-モジュレーター複合体が該細胞内に蓄積して、全体の効力及び/又は活性残存時間を増加させる。α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフの改変又は該モチーフを複合体化する方法により、モジュレーターを単球及びマクロファージに標的化し得ることも見出している。本明細書において、「単球」と明記しない限りは、用語マクロファージは、マクロファージ(腫瘍関連マクロファージを含む)及び/又は単球を意味するために用いられる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
よって、１つの広い観点では、本発明は、α,α-ジ置換グリシンエステルと標的の細胞内酵素又は細胞内受容体の活性モジュレーターとの共有結合型複合体を提供する。ここで、該複合体のエステル基は、１又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能であり；α,α-ジ置換グリシンエステルは、該モジュレーターと該標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた(remote)位置で該モジュレーターに共有結合し、及び/又は複合体化モジュレーター及び対応する酸の標的酵素又は受容体への結合様式が、非複合体化モジュレーターの結合様式と同じであるように該モジュレーターと複合体化している。
【０００８】
別の観点では、本発明は、標的の細胞内酵素又は細胞内受容体の活性モジュレーターの細胞内での効力及び/又は残存時間を増大又は延長させる方法を提供する。この方法は、該モジュレーターと該標的酵素又は受容体との結合界面から離れた位置での、及び/又は複合体化モジュレーター及び対応する酸の該標的酵素又は受容体への結合様式が非複合体化モジュレーターの結合様式と同じであるような、α,α-ジ置換グリシンエステルの共有結合による該モジュレーターの構造的改変を含み、該複合体のエステル基は、１又は複数の細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により対応する酸に加水分解可能である。
【０００９】
モジュレーターにα,α-ジ置換グリシンエステル部分を、標的酵素又は受容体への該モジュレーターの結合様式が保存されるように共有結合させることにより、エステル複合体及び対応する酸α,α-ジ置換グリシン複合体の両方が、親の非複合体化モジュレーターのモジュレーター活性を保持する。該エステル及び酸複合体の絶対的な酵素阻害効力又は受容体アゴニスト若しくはアンタゴニスト効力は、必ずしも、非複合体化モジュレーターの対応する効力と同程度に高いことを要しない。なぜなら、エステル複合体の酸複合体への細胞内加水分解が酸複合体の細胞内蓄積を生じ、得られる酸複合体の細胞内濃度が非複合体化モジュレーターで達成可能な濃度より高くなり、そのため、たとえエステル及び酸複合体の効力が非複合体化モジュレーターに比べて本来的には低かったとしても補償されることになるからである。したがって、本発明の複合体化ストラテジーは、従来の「プロドラッグ」アプローチとは異なっていることは明らかである。従来の「プロドラッグ」アプローチでは、親モジュレーターは、インビボでプロセッシングされて元のモジュレーターを放出する誘導体への変換により改変され、最終的な活性を担うのは元のモジュレーターの放出である。本発明のストラテジーでは、元のモジュレーターは、最終的な活性が該モジュレーターのα,α-ジ置換グリシン複合体及び該モジュレーターの蓄積性α,α-ジ置換グリシン複合体に起因する細胞内活性の組合せの結果であるように改変される。活性種は複合体であり、元の非複合体化モジュレーターではない。
【００１０】
上記のように、本発明は、細胞内酵素又は受容体のモジュレーターの改変に関する。本発明の原理は、モジュレーターの化学的同一性又は標的酵素若しくは受容体の同一性により限定されず、一般的に適用されるものであるが、モジュレーターは、その効果が標的酵素又は受容体への共有結合に起因するものではなく、標的酵素又は受容体への可逆的結合により効果を発揮するものであることが非常に好ましい。
【００１１】
実用性のためには、カルボキシルエステラーゼ加水分解複合体は、親モジュレーターと標的酵素又は受容体との細胞内結合活性を保持する必要があるので、エステルモチーフの連結は、この要件を考慮しなければならない。この要件は、カルボキシルエステラーゼ-加水分解可能なα,α-ジ置換グリシンエステルモチーフがモジュレーターに、対応するカルボキシルエステラーゼ加水分解産物(すなわち、対応する酸)の標的への結合様式が非複合体化モジュレーターと本質的に同じであるように連結されていれば充足する。一般に、これは、モジュレーターと標的酵素又は受容体との結合界面から離れた位置での、カルボキシルエステラーゼエステルモチーフのモジュレーターへの共有結合により達成される。このように、モチーフは、結合様式に干渉することになりかねないようにむしろ、溶媒中に伸びるように配置される。
【００１２】
加えて、α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフは、該モチーフが細胞内でカルボキシルエステラーゼにより加水分解されのであれば、明白に、カルボキシルエステラーゼの基質であるに違いない。細胞内カルボキシルエステラーゼの能力は、α,α-ジ置換グリシンエステル基質の構造に非常に厳格には依存しないように見える。よって、α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフのモジュレーターへの共有結合型複合体化のほとんどの様式は、加水分解を可能にする。可撓性リンカー鎖による連結は、通常、これを達成する方法である。
【００１３】
薬剤の化学的改変は結合配置を微妙に変更するかもしれず、α,α-ジ置換グリシンエステルカルボキシルエステラーゼモチーフの結合のための化学ストラテジーは、標的との更なる結合相互作用を導入し又はそのような相互作用の１若しくは複数が置換されることがあり得ると理解される。よって、加水分解複合体の標的への結合様式が非複合体化モジュレーターと同じであるという要件は、結合様式の重大な乱れがないこと、換言すれば、結合様式が非複合体化モジュレーターの結合様式と本質的に同じであることを要求していると解釈されるべきである。この要件が満たされると、親モジュレーターの主要な結合特性が保持され、改変及び非改変モジュレーターは全体的に共通する結合特性を有している。「同じ結合様式」の視点及び「離れた連結」の視点は同様である。なぜなら、上記のように、「同じ結合様式」という要件を達成する通常の方法は、カルボキシルエステラーゼモチーフを、阻害剤と標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた、モジュレーター分子内の点で連結することであるからである。しかし、これら要件は、複合体及び/又はその対応する酸が、親モジュレーターと同じインビトロ又はインビボでのモジュレーション効力を有さなければならないことを意味しないことに留意すべきである。しかし、一般的には、エステラーゼ加水分解カルボン酸は、インビトロの酵素又は受容体結合アッセイにおける効力が親モジュレーターの効力の1/10以上であり、エステルは、細胞活性アッセイにおける効力が親モジュレーターの効力と少なくとも同程度に高いことが好ましい。
【００１４】
構造−活性の関係をマッピングする従来の薬品化学の方法は、上記の「同じ結合様式」及び「離れた連結」の要件を満たす連結ストラテジーを特定することが全く可能であるが、NMR及びＸ線結晶解析のような最新技術は、酵素又は受容体の既知のモジュレーターの結合様式を解明又は決定することが非常に一般的となるまで進歩している。このような情報は、大多数の場合当該分野で共有されているか、或いは構造的に類似のモジュレーターの既知の結合様式又は標的酵素若しくは受容体の活性部位の既知の構造に基づいてコンピュータベースのモデリング法(例えば、リガンドドッキング及びホモロジーモデリング)を用いて設計できる。これら技術により得られたモジュレーターの結合様式についての知見を用いて、カルボキシルエステラーゼエステルモチーフの連結に適する位置、通常は(上記のように)阻害剤と標的酵素又は受容体との結合界面から離れたモジュレーター上の点、を同定できる。
【００１５】
複合体化αアミノ酸のエステル基を対応する酸に加水分解できる細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素としては、３つの既知のヒトカルボキシルエステラーゼ(「hCE」)酵素アイソタイプhCE-1(CES-1としても知られる)、hCE-2(CES-2としても知られる)及びhCE-3が挙げられる(Drug Disc. Today 2005, 10, 313-325)。これらは主要な酵素であると考えられるが、他のカルボキシルエステラーゼ酵素、例えばビフェニルヒドロラーゼ(BPH)も、前記複合体を加水分解する役割を有し得る。
【００１６】
下記の破砕細胞アッセイは、モジュレーターとα,α-ジ置換グリシンエステルとの複合体又は可能なカルボキシルエステラーゼエステルモチーフとして評価されるべきα,α-ジ置換グリシンエステルが要求されるように加水分解されることを確証する単純な方法である。これら酵素は組換え技術を用いて容易に発現され得、加水分解が起こることを決定又は確証するために組換え酵素を用いることができる。
【００１７】
所望の複合体が、細胞内でカルボキシルエステラーゼにより加水分解されたとき、共有結合α,α-ジ置換グリシンモチーフを保持することが、本発明の特徴である。なぜなら、加水分解複合体の細胞からの除去を防ぐか又は低減させ、そのことにより細胞内での蓄積に寄与するのは、このモチーフの極性カルボキシ基であるからである。実際、改変モジュレーターの細胞での効力は、主に、酸の蓄積及び該酸による標的の活性のモジュレーションに起因する(しかし、非加水分解エステルも、加水分解されないままである限り、標的に対して活性を発揮する)。細胞一般は、数種のペプチダーゼ酵素を含有するので、複合体、特に加水分解複合体(対応する酸)は、このようなペプチダーゼの基質でないことが好ましい。特に、α,α-ジ置換グリシンエステル基は、複合体中のジペプチドモチーフのＣ-末端要素でないことが非常に好ましい。しかし、共有結合の様式についてのこの制限は別として、α,α-ジ置換グリシンエステル基は、アミノ基又はα-置換基の一方を介してモジュレーターに共有結合できる。モジュレーターがカルボキシルエステラーゼエステルモチーフ用に便利な連結点を有する場合も、連結のために合成ストラテジーを工夫しなければならない場合もある。
【００１８】
カルボキシルエステラーゼhCE-2及び/又はhCE-3並びにこれら酵素の組換え形態のみを発現する細胞は、α,α-ジ置換グリシンエステルのアミノ窒素が非置換であるか又はカルボニル基に直接結合している(すなわち、アミノ基がアミドモチーフの一部を形成している)かのいずれかである場合のみ、α,α-ジ置換グリシンエステルを加水分解し、その結果として酸を生じるが、hCE-1を含有する細胞(すなわち、マクロファージ)又は組換えhCE-1を含有する細胞は、窒素に種々の基を有するα,α-ジ置換グリシンエステルを加水分解できる。hCE-2及びhCE-3のこの選択性要件は、モジュレーターが或る細胞タイプ中の酵素又は受容体のみを標的すべきことが要求される場合、利点となり得る。これら３種のカルボキシルエステラーゼ酵素の相対量は、細胞タイプ間で変動する(WO2006/117567の図１及びhttp:/symatlas.gnf.org/SymAtlasのデータベース(このデータベースでは、hCE3/CES3は記号FLJ21736で表されていることに留意)を参照)。hCE-1が見出される細胞タイプでのみモジュレーターが作用することを意図する場合、アミノ基がカルボニルに直接結合しない方法でのα,α-ジ置換グリシンエステルカルボキシルエステラーゼエステルモチーフの連結は、有効濃度のhCE-1を有する細胞において優先的に加水分解モジュレーター複合体の蓄積を生じる。換言すれば、hCE-1発現細胞におけるモジュレーター複合体に由来する酸の特異的蓄積は、アミノ酸エステルの窒素原子がカルボニルに直接結合しないか又は非置換のままである方法で、アミノ酸エステルモチーフをモジュレーターに結合させることにより達成できる。
【００１９】
マクロファージは、サイトカイン、特にTNFα及びIL-1の放出を通じて炎症性障害において鍵となる役割を演じることが知られている(van Roonら Arthritis and Rheumatism, 2003, 1229-1238)。リウマチ性関節炎では、マクロファージは、関節の炎症及び関節の破壊に主に寄与する(Conell, N.Eng J. Med. 2004, 350, 2591-2602)。マクロファージは、腫瘍の成長及び発生にも関与する(Naldini及びCarraro Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 3-8)。よって、マクロファージ細胞を選択的に標的する剤は、癌、炎症及び自己免疫疾患の治療において有用であり得る。特定の細胞タイプを標的することは、副作用の低減を導くと予測される。本発明は、モジュレーターをマクロファージに標的させる方法を可能にする。この方法は、α,α-ジ置換グリシンエステルカルボキシルエステラーゼエステルモチーフをモジュレーターに結合させる方法が、特定のカルボキシルエステラーゼにより加水分解されるかを決定し、よって得られる酸が異なる細胞タイプにおいて蓄積するか否かを決定するという上記の知見に基づく。
【００２０】
具体的には、WO2006/117567に開示されるように、マクロファージはヒトカルボキシルエステラーゼhCE-1を含有するが、他の細胞タイプは含有しないことが見出されている。本発明の複合体では、エステルモチーフの窒素は置換されているがカルボニル基成分には直接結合していないとき、エステルはhCE-1によってのみ加水分解され、よってエステラーゼ加水分解モジュレーター複合体は、マクロファージにのみ蓄積する。
【００２１】
更に、本発明のα,α-ジ置換グリシン複合体は、概して、カルボキシルエステラーゼHCE-2及びHCE-3のみを含有する細胞より、カルボキシルエステラーゼHCE-1を含有する細胞(すなわちマクロファージ)において強力である。
【００２２】
また、α,α-ジ置換グリシンエステルモチーフがα,α-ジ置換グリシンエステルのα置換基の一方を介してモジュレーターに連結されている本発明の複合体は、概して、カルボキシルエステラーゼHCE-2及びHCE-3のみを含有する細胞より、カルボキシルエステラーゼHCE-1を含有する細胞(すなわちマクロファージ)において強力であることが見出されている。したがって、活性な加水分解酸複合体は、このような(一般的に)Ｃ-連結エステル複合体の場合、非選択的に蓄積する。
【００２３】
用語法
本明細書中で使用する場合、用語「α,α-ジ置換グリシン」又は「α,α-ジ置換グリシン酸」は、式H2N-C(R2R3)-COOH(式中、R2及びR3はα-置換基(当然のことながら水素ではない)を表す)の化合物を意味し、「α,α-ジ置換グリシンエステル」はカルボン酸基がエステル化されている化合物である。用語「エステル」又は「エステル化カルボキシ基」は、R9O(C=O)-基(ここで、R9は、概念上アルコールR9OHに由来するエステルを特徴付ける基である)を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、用語「(Ca〜Cb)アルキル」(ここで、ａ及びｂは整数である)は、ａ〜ｂ個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基をいう。よって、例えばａが１でｂが６であるとき、この用語は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ｎ-ペンチル及びｎ-ヘキシルを含む。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、用語「二価の(Ca〜Cb)アルキレン基」(ここで、ａ及びｂは整数である)は、ａ〜ｂ個の炭素原子と２つの不対原子価(unsatisfied valences)を有する飽和炭化水素鎖をいう。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「(Ca〜Cb)アルケニル」(ここで、ａ及びｂは整数である)は、ａ〜ｂ個の炭素原子を有し、当てはまる場合にＥ又はＺの立体化学の少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐鎖のアルケニル成分をいう。この用語は、例えばビニル、アリル、1-及び2-ブテニル及び2-メチル-2-プロペニルを含む。
本明細書中で使用する場合、用語「二価の(Ca〜Cb)アルケニレン基」は、ａ〜ｂ個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合及び２つの不対原子価を有する炭化水素鎖をいう。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「(Ca〜Cb)アルキニル」(ここで、ａ及びｂは整数である)は、２〜６個の炭素原子を有し、加えて１つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素基をいう。この用語は、例えばエチニル、1-プロピニル、1-及び2-ブチニル、2-メチル-2-プロピニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル及び5-ヘキシニルを含む。
本明細書中で使用する場合、用語「二価の(Ca〜Cb)アルキニレン基」(ここで、ａ及びｂは整数である)は、２〜６個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する二価の炭化水素鎖をいう。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「炭素環式」は、全てが炭素である16個までの環原子を有する単環式、橋架け単環式、二環式又は三環式の基をいい、アリール及びシクロアルキルを含む。
本明細書中で使用する場合、用語「シクロアルキル」は、３〜８個の炭素原子を有する単環式の飽和炭素環式基をいい、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル及びノルボルニルを含む。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、限定が付されていない用語「アリール」は、単環式、橋架け単環式、二環式又は三環式の炭素環式芳香族基をいい、共有結合により直接連結された２つの単環式の炭素環式芳香族環を有する基を含む。このような基の例は、フェニル、ビフェニル及びナフチルである。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、限定が付されていない用語「ヘテロアリール」は、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子を含有する単環式、橋架け単環式、二環式又は三環式の芳香族基をいい、このような単環式環を２つ有する基、又はこのような単環式環１つと単環式アリール環１つが共有結合により直接連結された基を含む。このような基の例は、チエニル、ベンズチエニル、フリル、ベンズフリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンズチアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イソキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、ベンズトリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、インドリル及びインダゾリルである。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、限定が付されていない用語「ヘテロシクリル」又は「複素環式」は、上記で定義される「ヘテロアリール」を含み、非芳香族の意味では、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１又は複数のヘテロ原子を含有する単環式、橋架け単環式、二環式又は三環式の非芳香族基、及びこのようなへテロ原子を１又は複数含有する単環式の非芳香族基からなり該非芳香族基が別のそのような基又は単環式の炭素環式基に共有結合した基に関する。このような基の例は、ピロリル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、モルホリニル、ベンズフラニル、ピラニル、イソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、マレイミド及びスクシンイミド基である。
【００３２】
出現する文脈において特に言及しない限り、本明細書中のいずれの成分にも適用される用語「任意に置換されていてもよい」は、４つまでの適合性の置換基で置換され得る成分を意味する。該置換基の各々は、独立して、例えば(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜C6)アルキル、メルカプト、メルカプト(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキルチオ、フェニル、ハロ(フルオロ、ブロモ及びクロロを含む)、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル(-CN)、オキソ、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB又は-NRACONRARB(ここで、RA及びRBは独立して(C1〜C6)アルキル、(C3〜C6)シクロアルキル、フェニル又は５若しくは６個の環原子を有する単環式ヘテロアリールであるか、或いはRA及びRBは同じ窒素原子に結合して環状アミノ基(例えば、モルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル又はテトラヒドロピロリル)を形成する)であり得る。「任意の置換基」は、上記の置換基の１つであり得る。
【００３３】
用語「天然又は非天然のα-アミノ酸の側鎖」は、グリシン(R1が水素である)以外の式NH2-CH(R1)-COOHの天然又は非天然アミノ酸のR1基をいう。
天然のαアミノ酸の側鎖の例は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、ヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、4-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、α-アミノアジピン酸、α-アミノ-ｎ-酪酸、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモセリン、α-メチルセリン、オルニチン、ピペコリン酸及びチロキシンの側鎖を含む。
【００３４】
特徴的な側鎖に機能的置換基、例えばアミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、グアニジル、イミダゾリル又はインドリル基を含む天然α-アミノ酸は、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン及びシステインを含む。本発明の化合物中のα,α-ジ置換グリシンエステルモチーフのα-置換基の一方又は両方がこれらの側鎖の１つである場合、機能的置換基は任意に保護されていてもよい。
【００３５】
用語「保護された」は、天然α-アミノ酸の側鎖中の機能的置換基に関して用いる場合、その置換基の実質的に機能的でない誘導体を意味する。例えば、カルボキシ基は(例えばC1〜C6アルキルエステルとして)エステル化され得、アミノ基はアミド(例えばNHCOC1〜C6アルキルアミドとして)又はカルバメート(例えばNHC(=O)OC1〜C6アルキルカルバメート又はNHC(=O)OCH2Phカルバメートとして)に変換し得、ヒドロキシ基は、エーテル(例えばOC1〜C6アルキルエーテル又はO(C1〜C6アルキル)フェニルエーテル)又はエステル(例えばOC(=O)C1〜C6アルキルエステル)に変換し得、チオール基は、チオエーテル(例えばtert-ブチルチオエーテル又はベンジルチオエーテル)又はチオエステル(例えばSC(=O)C1〜C6アルキルチオエステル)に変換し得る。
【００３６】
モジュレーターとの結合用に、α,α-ジ置換グリシンエステルカルボキシルエステラーゼエステルモチーフ中に原理的に存在し得る可能性のあるエステル基が多く存在する。同様に、カルボキシルエステラーゼエステルモチーフにおいてエステルとして使用し得る、α-置換基R2及びR3が異なる多くのα,α-ジ置換グリシンが存在する。hCE-1、hCE-2及びhCE-3イソタイプの１つ又は複数又はこれら酵素を含有する細胞により迅速に加水分解されるα,α-ジ置換グリシンエステルもあれば、より緩慢に加水分解されるか又は非常に低い程度にしか加水分解されないα,α-ジ置換グリシンエステルもある。一般に、カルボキシルエステラーゼが遊離α,α-ジ置換グリシンエステルを親の酸に加水分解する場合、該カルボキシルエステラーゼは、上記のhCE-2及びhCE-3のＮ-カルボニル依存性に従って、モジュレーターに共有結合型複合体化されたときのエステルモチーフも加水分解する。
【００３７】
よって、本明細書に記載の破砕細胞アッセイ及び/又は単離カルボキシルエステラーゼアッセイは、要求する加水分解プロフィールを有するエステルについての直接的で、迅速、簡便な最初のスクリーニングを提供する。この方法で選択したエステルモチーフは、次いで、選択した複合体化化学によりモジュレーターと複合体化されたとき、同じカルボキシルエステラーゼアッセイで再アッセイして、そのようなバックグランドで依然としてカルボキシルエステラーゼ基質であることを確証する。
【００３８】
エステル基
上記のように、本発明の化合物のエステル基を対応する酸に加水分解し得る細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素としては、既知の３つのヒト酵素イソタイプhCE-1、hCE-2及びhCE-3が挙げられる。これらが主要な酵素と考えられるが、ビフェニルヒドロラーゼ(BPH)のような他の酵素もまたエステルを加水分解する役割を有し得る。一般に、カルボキシルエステラーゼが遊離アミノ酸エステルを親の酸に加水分解する場合、該カルボキシルエステラーゼは、阻害剤と共有結合型複合体化されているときのエステルモチーフも加水分解する。よって、本明細書に記載の破砕細胞アッセイ及び/又は単離カルボキシルエステラーゼアッセイは、要求する加水分解プロフィールを有するエステルについての直接的で、迅速、簡便な最初のスクリーニングを提供する。この方法で選択したエステルモチーフは、次いで、選択した複合体化化学により阻害剤と複合体化されたとき、同じカルボキシルエステラーゼアッセイで再アッセイして、そのようなバックグランドで依然としてカルボキシルエステラーゼ基質であることを確証する。
【００３９】
細胞内カルボキシルエステラーゼ酵素により加水分解可能であるという要件を前提として、α,α-ジ置換グリシンエステルカルボキシルエステラーゼエステルモチーフ中の特定のエステル基の例として、式-(C=O)OR14のものが挙げられる(式中、R14はR8R9R10C-であり、
【００４０】
ここで、
(ｉ)R8は水素又は任意に置換されていてもよい(C1〜C3)アルキル-(Z1)a-[(C1〜C3)アルキル]b-若しくは(C2〜C3)アルケニル-(Z1)a-[(C1〜C3)アルキル]b-(ここで、ａ及びｂは独立して０又は１であり、Z1は-O-、-S-又は-NR11-(式中、R11は水素又は(C1〜C3)アルキルである)であり；R9及びR10は独立して水素又は(C1〜C3)アルキル-である；又は
【００４１】
(ii)R8は水素又は任意に置換されていてもよいR12R13N-(C1〜C3)アルキル-(ここで、R12は水素又は(C1〜C3)アルキルであり、R13は水素又は(C1〜C3)アルキルであり；或いはR12及びR13は、それらが結合する窒素と一緒になって、任意に置換されていてもよい、５若しくは６個の環原子の単環式へテロ環式環又は８〜10個の環原子の二環式へテロ環式環系を形成する)であり、R9及びR10は独立して水素又は(C1〜C3)アルキル-である；又は
【００４２】
(iii)R8及びR9は、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されていてもよい、３〜７個の環原子の単環式若しくは橋架け単環式炭素環式環又は８〜10個の環原子の二環式若しくは橋架け単環式炭素環式環系を形成し、R10は水素である)。
【００４３】
上記(ｉ)、(ii)及び(iii)の場合、「アルキル」にはフルオロアルキルが含まれる。
これらクラス(ｉ)、(ii)及び(iii)では、R10は水素であることが多い。R14の具体例としては、メチル、トリフルオロメチル、エチル、ｎ-若しくはイソ-プロピル、ｎ-、sec-若しくはtert-ブチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、アリル、フェニル、ベンジル、2-、3-若しくは4-ピリジルメチル、N-メチルピペリジン-4-イル、テトラヒドロフラン-3-イル又はメトキシエチルが挙げられる。現時点で好ましいのは、R14がシクロペンチルであるものである。
【００４４】
α-置換基
モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3の例は、天然又は非天然のα-アミノ酸の側鎖から選択されると考えられ、そのような側鎖では、任意の官能基が保護され得る。
【００４５】
例えば、モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3としては、フェニル及び式-CRaRbRcの基が挙げられる。
【００４６】
ここで：
Ra、Rb及びRcの各々は、独立して、水素、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキルであるか、又は
Rcは、水素であり、Ra及びRbは独立して、フェニル又はヘテロアリール、例えばピリジルであるか、又は
Rcは、水素、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル又は(C3〜C8)シクロアルキルであり、Ra及びRbは、それらが連結している炭素と一緒に、三〜八員のシクロアルキル又は五若しくは六員の複素環式環を形成するか、又は
Ra、Rb及びRcは、それらが連結している炭素原子と一緒に、三環式環(例えばアダマンチル)を形成するか、又は
【００４７】
Ra及びRbは、各々独立して、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フェニル(C1〜C6)アルキル、又は下記のRcについて定義される基の水素以外の基であるか、又はRa及びRbは、それらが連結している炭素原子と一緒に、シクロアルキル又は複素環式環を形成し、Rcは、水素、-OH、-SH、ハロゲン、-CN、-CO2H、(C1〜C4)ペルフルオロアルキル、-CH2OH、-O(C1〜C6)アルキル、-O(C2〜C6)アルケニル、-S(C1〜C6)アルキル、-SO(C1〜C6)アルキル、-SO2(C1〜C6)アルキル、-S(C2〜C6)アルケニル、-SO(C2〜C6)アルケニル、-SO2(C2〜C6)アルケニル又は-Q-W基(ここで、Ｑは、結合手又は-O-、-S-、-SO-若しくは-SO2-を表し、Ｗは、フェニル、フェニルアルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C3〜C8)シクロアルキルアルキル、(C4〜C8)シクロアルケニル、(C4〜C8)シクロアルケニルアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキル基を表し、この基Ｗは、ヒドロキシ、ハロゲン、-CN、-CONH2、-CONH(C1〜C6)アルキル、-CONH(C1〜C6アルキル)2、-CHO、-CH2OH、(C1〜C4)ペルフルオロアルキル、-O(C1〜C6)アルキル、-S(C1〜C6)アルキル、-SO(C1〜C6)アルキル、-SO2(C1〜C6)アルキル、-NO2、-NH2、-NH(C1〜C6)アルキル、-N((C1〜C6)アルキル)2、-NHCO(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C4〜C8)シクロアルケニル、フェニル又はベンジルから独立して選択される１つ又は複数の置換基で任意に置換されていてもよい)である。
【００４８】
或いは、モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3は、α-炭素自体と一緒になって、三〜六員の飽和スピロシクロアルキル環(例えばシクロプロピル、シクロペンチル又はシクロヘキシル環)又はスピロへテロサイクリル環(例えばピペリジン-4-イル環)を形成し得る。
【００４９】
幾つかの場合、モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3の少なくとも一方は、C1〜C6アルキル置換基(例えば、メチル、エチル又はｎ-若しくはイソ-プロピル)である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3の一方は、C1〜C6アルキル置換基(例えば、メチル、エチル又はｎ-若しくはイソ-プロピル)であり、他方は、メチル、エチル、ｎ-及びイソ-プロピル、ｎ-、sec-及びtert-ブチル、フェニル、ベンジル、チエニル、シクロヘキシル並びにシクロヘキシルメチルからなる群より選択される。
【００５１】
現時点で好ましいのは、R2及びR3の一方がメチルであり他方がメチル、エチル又はｎ-若しくはイソ-プロピルである場合か；R2及びR3がそれらが結合する炭素と一緒になってシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル環を形成する場合である。特定の場合には、モジュレーターと複合体化したα,α-ジ置換グリシンエステルのα-置換基R2及びR3は各々メチルである。
【００５２】
複合体化
上記のように、α,α-ジ置換グリシンエステルは、アミノ基を介して又はα-置換基の一方を介してモジュレーターと複合体化していてもよい。カルボキシルエステラーゼエステルモチーフとモジュレーターとの間にリンカー基が存在していてもよい。カルボキシルエステラーゼエステルモチーフをモジュレーターの残部に連結する基の構造は、そのような連結のために選択される特定の化学ストラテジーに明らかに依存する。明らかに、そのカップリングのための化学ストラテジーは広範に変化し得、したがって多くの連結構造が可能である。アミノ酸エステルモチーフと分子の残部との間の連結化学を作り上げる変数の正確な組合せは、全体としての基本の結合様式とはしばしば無関係である。他方、幾つかの場合で、連結化学は酵素との更なる結合界面を取得し、そのことにより結合が亢進し得る。
【００５３】
上記のα,α-ジ置換グリシンエステルモチーフの利点(細胞内への容易な進入、細胞内でのカルボキシルエステラーゼ加水分解及び活性なカルボン酸加水分解産物の細胞内での蓄積)は、アミノ酸エステルモチーフと分子の残部との間の連結が細胞内でペプチダーゼ活性(分子からのアミノ酸の切断を生じ得る)の基質でないときに最善に達成されることにも留意すべきである。当然のことながら、細胞内ペプチダーゼに対する安定性は化合物を破砕細胞内容物とインキュベートし、そのよな切断について分析することによって容易に検査される。
【００５４】
例えば、α,α-ジ置換グリシンエステル(式H2N-C(R2R3)-COOH)は、
(ａ)式-(CH2)z-X1-L1-Y-NH-C(R2)(R3)-R1の基、又は
(ｂ)式-(CH2)z-Y1-L1-R3-C(R2)(NH2)(R1)の基
としてモジュレーターと複合体化され得る。
【００５５】
ここで：
R1はカルボキシルエステラーゼ-加水分解可能なエステル基であり；
R2及びR3はα,α-ジ置換グリシンのα-置換基であり;
R2は天然又は非天然のαアミノ酸の側鎖であり；
Yは結合手、-C(=O)-、-S(=O)2-、-C(=O)O-、-C(=O)NR3-、-C(=S)-NR4、-C(=NH)-NR4又は-S(=O)2NR4-(ここで、R4は水素又は任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルである)であり;
Y1は結合手、-C(=O)-、-S(=O)2-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NR5-、-NR5(C=O)-、-S(=O)2NR5-、-NR5S(=O)2-又は-NR6(C=O)NR5-(ここで、R5及びR6は独立して水素又は任意に置換されていてもよい(C1〜C6)アルキルである)であり
【００５６】
L1は式-(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-の二価基(式中、
ｍ、ｎ及びｐは独立して０又は１であり、
Ｑは、(ｉ)五〜十三員環の、任意に置換されていてもよい、二価の単環式又は二環式の炭素環又はへテロ環基であるか、又は(ii)ｐが０である場合、式-Q1-X2-(ここで、X2は-O-、-S-又はNRA-(ここで、RAは水素又は任意に置換されていてもよいC1〜C3アルキルであり、Q1は五〜十三員環の、任意に置換されていてもよい、二価の単環式又は二環式の炭素環又はへテロ環基である)であり、
【００５７】
Alk1及びAlk2は独立して任意に置換されていてもよい二価のC3〜C7シクロアルキル基又は任意に置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C6アルキレン、C2〜C6アルケニレン若しくはC2〜C6アルキニレン基(これら基は、エーテル(-O-)、チオエーテル(-S-)又はアミノ(-NRA-)連結(ここで、RAは水素又は任意に置換されていてもよいC1〜C3アルキルである)を任意に含有していてもよいし、前記連結を末端に有していてもよい)を表し；
X1は結合手、-C(=O)-；又は-S(=O)2-；-NR7C(=O)-、-C(=O)NR7-、-NR7C(=O)-NR8-、-NR7S(=O)2-又は-S(=O)2NR7-(ここで、R7及びR8は独立して水素又は任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルである)であり；
ｚは０又は１である。
【００５８】
次に、連結基に存在する可変部を考慮すれば：
ｚは０又は１であり得るので、モジュレーターに結合するメチレン基は必須でない。
Ｙの特に好ましい例は、結合手、-(C=O)-、-(C=O)NH-及び-(C=O)O-を含む。しかし、hCE-1特異性のために、αアミノ酸エステルを式(IA)の基として阻害剤と複合体化する場合は、Ｙは結合手であるべきである。
【００５９】
基Ｌにおいて、存在する場合、Alk1及びAlk2基の例は、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH=CH-、-CH=CHCH2-、-CH2CH=CH-、CH2CH=CHCH2-、-C≡C-、-C≡CCH2-、CH2C≡C-及びCH2C≡CCH2を含む。Alk1及びAlk2の追加の例は、-CH2W-、-CH2CH2W-、-CH2CH2WCH2-、-CH2CH2WCH(CH3)-、-CH2WCH2CH2-、-CH2WCH2CH2WCH2-及び-WCH2CH2-(ここで、Ｗは、-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-又は-CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-である)を含む。Alk1及びAlk2の更なる例は、二価のシクロプロピル、シクロペンチル及びシクロヘキシル基を含む。
【００６０】
L1において、ｎが０である場合、該基は炭化水素鎖である(任意に置換されていてもよく、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合を有するかもしれない)。現在のところ、L1には任意の置換基が存在しないことが好ましい。ｍ及びｐが共に０である場合、L1は、二価の単環式又は二環式の５〜13個の環原子の炭素環式又は複素環式基である(任意に置換されていてもよい)。ｎが１であり、ｍ及びｐの少なくとも一方が１である場合、L1は、炭化水素鎖及び単環式又は二環式の５〜13個の環原子の炭素環式又は複素環式基(任意に置換されていてもよい)を含む二価の基である。存在する場合、Ｑは、例えば二価のフェニル、ナフチル、シクロプロピル、シクロペンチル若しくはシクロヘキシル基、又は単環式若しくは二環式の五〜十三員環の複素環式基、例えばピペリジニル、ピペラジニル、インドリル、ピリジル、チエニル若しくはピロリル基であり得るが、1,4-フェニレンが、現在のところ好ましい。
【００６１】
特に、本発明のある実施形態においては、ｍ及びｐが０であり得、ｎが１であり得る。別の実施形態においては、ｎ及びｐが０であり得、ｍが１であり得る。更に別の実施形態においては、ｍ、ｎ及びｐは全て０であり得る。更に別の実施形態においては、ｍが０であり得、ｎが１であり得、Ｑが単環式の複素環式基であり、ｐが０又は１であり得る。存在する場合、Alk1及びAlk2は、-CH2-、-CH2CH2-及び-CH2CH2CH2-から選択され得、Ｑが1,4-フェニレンであり得る。
【００６２】
細胞内酵素及び受容体のモジュレーター
本発明の原理は、広範囲の疾患に関連する広範囲の細胞内標的のモジュレーターに適用可能である。上記のように、既知のモジュレーターの標的への結合様式は、モジュレーター自体が既知になれば、程なく広く理解される。加えて、Ｘ線結晶解析及びNMRのような最新技術は、構造−活性の関係を特徴付ける従来の薬品化学の方法と同様に、このような結合トポロジー及び幾何学的配置を明らかにすることができる。このような知見が得られれば、構造データを用いて、モジュレーターと酵素又は受容体との結合を乱すことなく、カルボキシルエステラーゼエステルモチーフを連結させることができるモジュレーター構造中の位置を同定することは用意である。例えば、表１は、結晶構造データが公表されている幾つかの細胞内酵素又は受容体標的を列挙する。
【００６３】
【表１−１】
2011513289.tif 000002
【００６４】
【表１−２】
2011513289.tif 000003
【００６５】
【表１−３】
2011513289.tif 000004
【００６６】
説明の目的で、上記の細胞内標的のうち５つものの、標的への結合様式が既知である既知の阻害剤に言及する。これら例は、このような構造データを用いてα,α-ジ置換グリシンカルボキシルエステラーゼエステルモチーフの連結に適切な位置を決定する方法を説明する。活性部位の模式図を代表的阻害剤と共に示す。一般に、モジュレーターと標的との間の結合界面から離れた位置、したがって酵素結合界面から離れた溶媒中の位置が、カルボキシルエステラーゼエステルモチーフの連結に適切な位置である。このことを模式図で示す。
【００６７】
【化１】
2011513289.tif 000005
【００６８】
【化２】
2011513289.tif 000006
【００６９】
表１で特定する他の例についても同様のアプローチを用いることができる。標的細胞内酵素又は受容体の活性のモジュレーターの細胞での効力及び/又は細胞内残存時間を増大させる本発明の方法は、幾つかの工程を含み得る。
【００７０】
工程１：標的酵素又は受容体について同じ結合様式を有する１又は複数のモジュレーター分子の、モジュレーターと標的酵素又は受容体との間の結合界面から離れた位置を特定する。
【００７１】
通常、このような位置は、既知のモジュレーター(又は構造が近いそのアナログ)が結合している標的酵素又は受容体のＸ線共結晶構造(又はnmrにより導かれる構造)から、その構造を検討することによって特定される。或いは、モジュレーターが活性部位にドッキングしている標的酵素又は受容体のＸ線結晶構造を、コンピュータグラフィック法によりモデル化し、このモデルを検討する。結合界面から離れた位置でのモジュレーターの構造的改変は酵素又は受容体の活性部位へのモジュレーターの結合に有意に干渉する可能性はないと推定される。適切な位置は、共結晶構造又はドッキングモデルから、通常、溶媒の方に向いているようである。
【００７２】
工程２：工程１で特定された１又は複数の位置での、α,α-ジ置換グリシンエステル基又は一連の異なるα,α-ジ置換グリシンエステル基の連結によってモジュレーターを共有結合的に改変する。
【００７３】
α,α-ジ置換グリシンエステル基(すなわち、潜在的なカルボキシルエステラーゼモチーフ)の連結は、モジュレーターに存在する共有結合している官能基を介するか又はこの目的のために特に導入された適切な官能基を介し得る。カルボキシルエステラーゼモチーフは、スペーサ又はリンカー要素により主要な分子塊(molecular bulk)から間隔があけられて、モチーフを溶媒中により深く位置させることによってモジュレーターの結合様式に対する該モチーフの何らかの些細な効果も更に低減させ、及び/又はモジュレーターの主要な分子塊に起因し得る立体障害を低減させることによってモチーフを確実にカルボキシルエステラーゼに接近可能とする。
【００７４】
工程２を行うことにより、１つの候補モジュレーター又は(より通常には)候補モジュレーターの小さなライブラリーが作製される。該候補モジュレーターの各々は、工程１で特定された１又は複数の連結位置で種々のα,α-ジ置換グリシンエステル基を導入することによって、親の阻害剤に関して共有結合的に改変されている。
【００７５】
工程３：工程２で作製したα,α-ジ置換グリシンエステル複合体化モジュレーターを、標的の酵素又は受容体に対する活性を決定するために試験する。
【００７６】
薬品化学では通常であるが、工程１及び２を行うことにより作製された親のモジュレーターのカルボキシルエステラーゼモチーフ形態は、期待されたモジュレーター活性の維持が実際に維持されているか、そしてどの程度まで、どのような効力プロフィールであるかを決定するに適切なアッセイにおいて試験されることが好ましい。細胞内にモジュレーター活性を蓄積させるという本発明の根底にある目的によると、適切なアッセイは、通常、改変モジュレーターの細胞活性の程度及び効力プロフィールを評価するための細胞株におけるアッセイを含む。工程３で用い得る他のアッセイは、改変モジュレーター及びその推定カルボキシルエステラーゼ加水分解産物の固有の活性を決定するインビトロ酵素アッセイ又はインビトロ受容体モジュレーションアッセイ；カルボキシルエステラーゼによる改変モジュレーターの対応するカルボン酸への変換速度を決定するアッセイ；及び細胞内のカルボキシルエステラーゼ加水分解産物(カルボン酸)の蓄積の速度及び/又はレベルを決定するアッセイを含む。このようなアッセイにおいて、単球及び非単球細胞の両方及び/又は一連の単離カルボキシルエステラーゼを、細胞選択性を示す化合物を同定するために用いることができる。
【００７７】
必要又は所望であれば、工程３は、親モジュレーターの候補αアミノ酸エステル複合体化形態の異なる組を用いて繰り返すことができる。
【００７８】
工程４：工程３で獲得したデータから、親モジュレーターの試験したα,α-ジ置換グリシンエステル複合体化形態のうち、細胞内で酵素活性又は受容体活性のモジュレーションを引き起こし、細胞内で対応するカルボン酸に変換されて蓄積し、そして増大又は延長した細胞効力を示す１又は複数のものを選択する。
【００７９】
上記の工程１〜４は、本発明の原理の実施のための一般的なアルゴリズムを表す。
【００８０】
合成
本発明に係る化合物の合成のために多数の合成ストラテジーが存在するが、それらは全て、合成有機化学者に既知の公知化学に依拠する。よって、式(Ｉ)の化合物は、標準的な文献に記載される手順及び当業者に周知の手順に従って合成することができる。代表的な文献情報源は、「Advanced organic chemistry」，第４版(Wiley), J March、「Comprehensive Organic Transformation」，第２版(Wiley), R.C. Larock、「Handbook of Heterocyclic Chemistry」，第２版(Pergamon), A.R. Katritzkyや、「Synthesis」、「Acc. Chem. Res.」、「Chem. Rev」に、或いはオンラインの標準的文献検索により特定される一次的文献情報源に、又は「Chemical Abstracts」若しくは「Beilstein」のような二次的情報源から見出されるような総説文献である。
【００８１】
本発明の化合物は、下記で概説し、実施例でより具体的に記載する多くの方法により製造することができる。下記の反応において、反応性官能基、例えばヒロドキシル、アミノ及びカルボキシ基(これらが最終生成物中で望ましい場合)を保護して、反応への望まない関与を回避することが必要であり得る[例えば、Greene, T.W., 「Protecting Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, 1999を参照]。従来の保護基を標準的な技法と組み合せて使用し得る。例えば、脱保護が一般式(Ｉ)の化合物の合成における最終工程であり得、下記に記載する本発明の方法は保護基の除去まで拡張し得ると理解される。
【００８２】
本発明の化合物は以下の実施例に従って製造し得る。全ての温度は℃で表す。以下の略称を用いる。
EtOAc = 酢酸エチル
MeCN = アセトニトリル
MeOH = メタノール
Boc = tert-ブトキシカルボニル
CDI = 1,1'-カルボニルジイミダゾール
DCM = ジクロロメタン
DBU = 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン
DMAP = ジメチルアミノピリジン
DMF = ジメチルホルムアミド
DMSO = ジメチルスルホキシド
【００８３】
THF = テトラヒドロフラン
HCl = 塩酸
NaHCO3 = 炭酸水素ナトリウム
TBDMSCl = tert-ブチルジメチルクロロシラン
NBS = N-ブロモスクシンイミド
NMM = N-メチルモルホリン
NH4Cl = 塩化アンモニウム
KHMDS = カリウムビス(トリメチルシリル)アミド
Pd/C = パラジウムカーボン
MgSO4 = 硫酸マグネシウム
EDC = N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド
【００８４】
Et2O = ジエチルエーテル
NaBH(OAc)3 = ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド
HOBt = 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
TFA = トリフルオロ酢酸
TLC = 薄膜クロマトグラフィー
mL = ミリリットル
g = グラム
mg = ミリグラム
mol = モル
mmol = ミリモル
LCMS = 高速液体クロマトグラフィー/質量分析
NMR = 核磁気共鳴
RT = 室温
【００８５】
市販の試薬及び溶媒(HPLCグレード)は更なる精製を行わずに用いた。溶媒は、Buchiロータリーエバポレータ又はVirTis Benchtop SLC Freeze-Dryerを用いて除去した。マイクロ波照射は、Biotage InitiatorTM Eight microwave synthesizerを用いて行った。フラッシュクロマトグラフィーカラムによる化合物の精製は、Fluorochemから入手した粒子サイズ40〜63μm(230〜400メッシュ)のシリカゲルを用いて行った。分取HPLCによる化合物の精製は、逆相AxiaTM prep Luna C18カラム(10μm，100×21.2mm)、10分にわたるグラジエント０〜100％ Ｂ(Ａ = 水＋0.05％ TFA、Ｂ = アセトニトリル)、流速 = 25mL/分、254nmでのUV検出を用いるGilsonシステムで行った。
1H NMRスペクトルは、Bruker 300 MHz AV分光計において、重水素化溶媒中で記録した。ケミカルシフトδは百万分率で表す。薄層クロマトグラフィー(TLC)分析は、Kieselgel 60 F254(Merck)プレートで行い、UV光を用いて可視化した。
【００８６】
分析HPLC/MSは、逆相Luna C18カラム(３μm，50×4.6mm)、2.25分間にわたるグラジエント５〜95％ Ｂ(Ａ = 水＋0.1％ギ酸，Ｂ = アセトニトリル＋0.1％ギ酸)、流速 = 2.25mL/分を用いるAgilent HP1100 LCシステムで行った。UVスペクトルは、G1315B DAD検出器を用いて220nm及び254nmで記録した。質量スペクトルは、LC/MSD SL G1956B検出器で、m/z 150〜800の範囲にわたって取得した。データは、ChemStation及びChemStation Data Browserソフトウェアを用いて積分して報告した。
【００８７】
実施例１〜６
化合物6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロ-ベンゾイル-1-フェニル-1H-ピリジン-2-オン(化合物Ｉ)及び6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロ-ベンゾイル-1-(2,5-ジフルオロフェニル-1H-ピリジン-2-オン(化合物II)：
【化３】
2011513289.tif 000007
は、細胞内酵素p38 MAPキナーゼの既知の阻害剤である(WO 03/076405)。下記実施例１、３及び５は、阻害剤と標的酵素との間の結合界面から離れた位置での、アミノ酸エステルのα炭素にジ-置換を有するエステラーゼモチーフのこれら化合物への共有結合型複合体化に関する(モデルp38 MAPキナーゼ阻害剤の結合様式に関する上記のコメントを参照)。下記実施例２、４及び６は、それぞれ実施例１、３及び５のカルボン酸エステラーゼ加水分解産物に関する。
【００８８】
実施例１〜６の合成
中間体１：4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート
【化４】
2011513289.tif 000008
中間体１は、WO 2003076405に記載の実験手順を用いて製造することができる。
【００８９】
中間体２：[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)イル]-フェニル]アセトアルデヒド
【化５】
2011513289.tif 000009
【００９０】
[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)イル]-フェニル]アセトアルデヒドは、下記スキーム１に示す経路を用いて合成した。
【化６】
2011513289.tif 000010
【００９１】
段階１−2-(4-[[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミジル]アミノ]フェニル)エチルアセテート
4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート(中間体１)(69.7g，192mmol)を氷酢酸(700mL)に懸濁し、2-(4-アミノフェニル)エタノール(27.71g，202mmol，1.05当量)を加えた。この混合物を80℃で2.5時間加熱した後、室温まで冷却し減圧下で濃縮した。残留物を、Et2O(500mL)を用いて粉砕し、Et2O(２×250mL)で洗浄して白色固体を得た。これを飽和NaHCO3(700mL)に懸濁し、30分間激しく撹拌した。濾過及び水での洗浄によりベージュ色の固体を得た。これを減圧下で乾燥させ標記化合物を得た(64.12g，92％収率)。
LC/MS：m/z 361 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：7.79-7.71 (1H, m), 7.45-7.07 (6H, m), 5.26 (1H, s), 4.21 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.89 (2H, t, J=6.5 Hz), 2.00 (3H, s)。
【００９２】
段階２−2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチルアセテート
CDI(43.26g，267mmol，1.5当量)を窒素雰囲気下で無水THF(１ｌ)中に溶解し、０℃に冷却した。プロピオル酸(16.43mL，267mmol，1.5当量)を滴下して加え、この混合物を室温まで温め、１時間撹拌した。無水THF(500mL)中2-(4-[[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミジル]-アミノ]フェニル)エチルアセテート(64.12g，178mmol)の懸濁液を加え、この混合物を80℃に６時間加熱した後、室温にて一晩撹拌した。得られる沈降物を濾過により集め、Et2Oで洗浄し、減圧下で乾燥させて標記化合物を淡黄色固体として得た(39.56g)。濾液を減圧下で濃縮して褐色油を得た。これをEtOAc(500mL)を用いて粉砕し、濾過により生成物の第２バッチを得た(7.21g)。２つのバッチを合わせて標記化合物を黄色固体として得た(46.77g，64％収率)。
LC/MS：m/z 413 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：7.55- 7.37 (4H, m), 7.3-7.20 (4H, m), 5.72 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.30 (2H, t, J=6.9 Hz), 3.01 (2H, t, J=6.9 Hz), 2.04 (3H, s)。
【００９３】
段階３−6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]ピリジン-2(1H)-オン
2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチルアセテート(46.77g，113mmol)を６ＮのHCl水溶液(500mL)に懸濁し、還流に２時間加熱した。室温までの冷却に際して形成される沈降物を濾過により集め、飽和NaHCO3水溶液(1000mL)に懸濁し、30分間激しく撹拌した。濾過、水での洗浄(２×500mL)及び減圧下での乾燥により、標記化合物をオフホワイト色固体として得た(40.11g，96％収率)。
LC/MS：m/z 371 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：7.55-7.37 (4H, m), 7.31-7.20 (4H, m), 5.71 (1H, d, J=9.9 Hz), 4.69 (1H, t, J=5.3 Hz), 3.71 (2H, m), 2.84 (2H, d, J=6.9 Hz)。
【００９４】
段階４−[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]-アセトアルデヒド
０℃の無水DCM(750mL)中6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]-ピリジン-2(1H)-オン(15.00g，40.5mmol)の懸濁液に、デス-マーチン ペルヨージナン(20.62g，48.6mmol，1.2当量)を少しずつ加えた。この混合物を室温まで温め３時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液(400mL)及び飽和Na2S2O3水溶液(400mL)中に注ぎ、30分間激しく撹拌した。水層を分離し、DCMで抽出し(２×500mL)、有機抽出物を合わせて、MgSO4で乾燥させた。濾過及び減圧下での濃縮により、標記化合物を粗製淡黄色固体として得た(15.13g)。これを更なる精製なしで使用した。
LC/MS：m/z 369 [M+H]+。
【００９５】
中間体３：シクロペンチル 2-メチルアラニネート ヒドロクロリド
【化７】
2011513289.tif 000011
【００９６】
中間体３を下記スキーム２に示す経路を用いて合成した。
【化８】
2011513289.tif 000012
【００９７】
段階１−シクロペンチル N-(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルアラニネート
【化９】
2011513289.tif 000013
【００９８】
０℃のDCM(10mL)中N-(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルアラニン(1.00g，4.92mmol)の溶液に、シクロペンタノール(0.83mL，9.84mmol)、EDCI(1.06g，5.42mmol)及び最後にDMAP(60mg，0.49mmol)を加えた。反応混合物をRTまで温め、18時間撹拌した。DCMを減圧下で除去して明澄な油を得た。この粗製残留物をEtOAc(100mL)に溶解し、水、１Ｍ NaHCO3及び塩水で洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。粗製抽出物をカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中10％のEtOAc)により精製し、所望の生成物を明澄な油として得た(0.254g，20％収率)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：5.25-5.17 (1H, m), 5.04 (1H, br s), 1.93-1.54 (8H, m), 1.49 (6H, s), 1.45 (9H, s)。
【００９９】
段階２−シクロペンチル 2-メチルアラニネート ヒドロクロリド(中間体３)
【化１０】
2011513289.tif 000014
【０１００】
シクロペンチル N-(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルアラニネート(0.254g，0.93mmol)をTHF(５mL)中に溶解し、４Ｍ HCl/ジオキサン(２mL)で処理し、反応混合物をRTにて24時間撹拌した。粗製混合物を減圧下に濃縮し、Et2Oで粉砕して、白色沈降物を得た。これを更にEt2Oで洗浄して、所望の生成物を白色粉体として得た(0.16g，82％収率)。
1H NMR (300MHz, DMSO-d6)δ：8.58 (3H, br s), 5.21-5.14 (1H, m), 1.93-1.78 (2H, m), 1.74-1.53 (6H, m), 1.45 (6H, s)。
【０１０１】
中間体４：tert-ブチル 2-メチルアラニネート
【化１１】
2011513289.tif 000015
【０１０２】
中間体４を下記スキーム３に示す経路を使用して合成した。
【化１２】
2011513289.tif 000016
【０１０３】
段階１−tert-ブチル N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-2-メチルアラニネート
【化１３】
2011513289.tif 000017
【０１０４】
０℃のDCM(10mL 無水)及びシクロヘキサン(10mL)中N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-2-メチルアラニン(１g，4.21mmol)の溶液に、窒素下で、三フッ化ホウ素ジエチルエテレート(7.7ul，触媒量)を加えた。次いで、シクロヘキサン(10mL)中のtert-ブチル 2,2,2-トリクロロアセトイミデート(1.51mL，8.43mmol)を、30分間にわたってゆっくりと加えた後、RTまで温めた。反応物をRTにて16時間撹拌した。粗製反応混合物に190mgのNaHCO3を加え、反応物を濾過した。母液を減圧下で濃縮した。粗製抽出物をカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中10％ EtOAc)により精製し、所望の生成物を得た(0.863g，70％収率)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：7.39-7.31 (5H, m), 5.46 (1H, br s), 5.10 (2H, s), 1.54 (6H, s), 1.45 (9H, s)。
【０１０５】
段階２−tert-ブチル 2-メチルアラニネート(中間体４)
【化１４】
2011513289.tif 000018
【０１０６】
EtOAc(20mL)中tert-ブチル N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-2-メチルアラニネート(0.863mg，2.90mmol)の溶液に、100mgのPd/C触媒を加えた。この混合物を排気し、水素雰囲気で18時間撹拌し、濾過し(セライト)、EtOAcで洗浄し、減圧下で濃縮した。生成物を黄色油として単離した(0.45mg，96％)。これは痕跡量のEtOAcを含んでいた。生成物は揮発性であると考えられるので、減圧下での蒸発の間に注意が必要である。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：1.48 (9H, s), 1.32 (6H, s)。
【０１０７】
中間体５：シクロペンチル 1-アミノシクロペンタンカルボキシレート
【化１５】
2011513289.tif 000019
【０１０８】
中間体５を下記スキーム４に示す経路を使用して合成した。
【化１６】
2011513289.tif 000020
【０１０９】
段階１−シクロペンチル 1-アミノシクロペンタンカルボキシレート
シクロペンタノール(20mL)中1-アミノシクロペンタンカルボン酸(2.58g，19.97mmol)の溶液に濃硫酸(2.15g，21.97mmol)を加え、この混合物を70℃にて一晩撹拌した。反応物をRTに冷却し、シクロペンタノールを減圧下で除去した。残留物をEtOAc(30mL)に溶解し、飽和NaHCO3(30mL)及び水(３×20mL)で洗浄し、次いで乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧下で濃縮すると、濃黄色油が残った。カラムクロマトグラフィー(EtOAc中15％の1.2Ｍ NH3/MeOH)による精製によって所望の生成物を得た(1.97g，50％収率)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：5.21-5.17 (1H, m), 2.15-1.90 (2H, m), 1.85-1.57 (14H, m)。
【０１１０】
中間体６：tert-ブチル 1-アミノシクロペンタンカルボキシレート
【化１７】
2011513289.tif 000021
【０１１１】
中間体６を下記スキーム５に示す経路を使用して合成した。
【化１８】
2011513289.tif 000022
【０１１２】
段階１−1-[[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ]シクロペンタンカルボン酸
1:1 ジオキサン/水(60mL)中1-アミノシクロペンタンカルボン酸(3.0g，23.2mmol)の溶液に、Na2CO3(12.3g，116mmol)、続いてベンジルクロロホルメート(3.6mL，25.5mmol)をゆっくりと加え、混合物をRTにて一晩撹拌した。反応混合物を１Ｍ HClでpH = ２まで注意深く酸性化し、次いでEtOAcで抽出した(３×30mL)。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し(30mL)、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧下で濃縮して、淡黄色油が残った。LCMS及びNMRにより、粗製生成物が所望の生成物と対応するベンジルエステルとの混合物であることが示された。この粗製生成物を1:1 THF/水(60mL)に溶解し、水酸化リチウム(2.67g，116mmol)で処理した。この混合物をRTにて一晩撹拌し、次いでEt2Oで洗浄し(３×30mL)、pH = ２まで酸性化し、EtOAcで抽出した(３×30mL)。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し(30mL)、乾燥させ(MgSO4)、濾過し減圧下で濃縮して、標記化合物を得た(4.76g，78％)。LCMS：m/z 264 [M+H]+。
【０１１３】
段階２−tert-ブチル 1-[[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ]シクロペンタンカルボキシレート
tert-ブチル 1-[[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ]シクロペンタンカルボキシレートを中間体４の段階１(スキーム３)と同様にして製造した。
LC/MS：m/z 320 [M+H]+。
【０１１４】
段階３−tert-ブチル 1-アミノシクロペンタンカルボキシレート
tert-ブチル 1-アミノシクロペンタンカルボキシレートを中間体４の段階２(スキーム３)と同様にして製造した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：2.08-2.02 (2H, m), 1.87-1.72 (4H, m), 1.64-1.58 (2H, m), 1.47 (9H, s)。
【０１１５】
実施例１：シクロペンチル N-(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)-2-メチルアラニネート
【化１９】
2011513289.tif 000023
【０１１６】
本発明のこの例示化合物では、ジメチルグリシンシクロペンチルエステルモチーフを、親のp38 MAPキナーゼ阻害剤に、ジメチルグリシンシクロペンチルエステルのアミノ基を介して-CH2CH2-リンカー基により共有結合型複合体化する。
この化合物を、下記のように中間体２及び中間体３を用いて合成した。
【０１１７】
無水THF(４mL)中の中間体２(189mg，0514mmol)の溶液にシクロペンチル 2-メチルアラニネート ヒドロクロリド(中間体３)(160mg，0.77mmol，1.5当量)及びNaBH(OAc)3(326mg，1.54mmol，３当量)を加えた。この混合物を室温にて16時間撹拌し、次いで水(20mL)でクエンチした。水層をEtOAcで抽出し(３×20mL)、合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し(40mL)、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を分取HPLCにより精製して、標記化合物を得た(130mg，48％収率)。
LC/MS：m/z 524 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：10.43 (1H, br s), 7.51-7.34 (4H, m), 7.28-7.26 (2H, m), 7.04-6.90 (2H, m), 5.93 (1H, d, J=9.6 Hz), 5.20-5.10 (1H,m), 2.93-2.75 (4H, m), 1.95-1.55 (8H, m), 1.31 (6H, s)。
【０１１８】
実施例２：N-(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)-2-メチルアラニン
【化２０】
2011513289.tif 000024
【０１１９】
本実施例は実施例１の化合物のカルボン酸加水分解産物に関する。
本化合物は、中間体２及び中間体４を使用して下記スキーム６に記載のように合成した。
【化２１】
2011513289.tif 000025
【０１２０】
段階１−tert-ブチル N-(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)-2-メチルアラニネート
THF(３mL)中の中間体２(180mg，0.489mmol)の溶液にtert-ブチル 2-メチルアラニネート(中間体４)(117mg，0.73mmol)を加え、30分間撹拌し、次いでNaBH(OAc)3(310mg，1.467mmol)を加えた。反応物を24時間撹拌し、EtOAcで希釈し、有機相を飽和NaHCO3、塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。残留物を分取HPLCにより精製して標記化合物を得た(120mg，48％収率)。
LC/MS：m/z 512 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ：10.41 (1H, br s), 7.51-7.34 (4H, m), 7.28-7.26 (2H, m), 7.05-6.90 (2H, m), 5.93 (1H, d, J=9.9 Hz), 5.15 (1H, br s), 2.93-2.78 (4H, m), 1.46 (9H, s), 1.29 (6H, s)。
【０１２１】
段階２−N-(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)-2-メチルアラニン
DCM(２mL)中tert-ブチル N-(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)-2-メチルアラニネート(100mg，0.19mmol)の溶液にトリフルオロ酢酸(３mL)を加えた。この混合物を室温にて16時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残留物をEt2Oを用いて粉砕し、濾過により集め、減圧下で乾燥させて標記化合物をオフホワイト色の固体として得た(50mg，56％収率)。
LC/MS：m/z 456 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：10.05 (1H, br s), 7.60-7.15 (9H, m), 6.95 (1H, br s), 5.72 (1H, d, J=9.6 Hz), 3.15-2.95 (4H, m), 1.33 (6H, br s)。
【０１２２】
実施例３：シクロペンチル 1-[(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)アミノ]シクロペンタンカルボキシレート
【化２２】
2011513289.tif 000026
【０１２３】
実施例３を、中間体２及び中間体５を用いて実施例１と同様に合成した。
LC/MS：m/z 550 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：7.55-7.34 (6H, m), 7.29-7.21 (2H, m), 5.72 (1H, d, J=9.8 Hz), 5.27-5.21 (1H, m), 3.31-3.20 (2H, m), 3.10-3.00 (2H, m), 2.22-2.12 (2H, m), 2.08-1.98 (2H, m), 1.90-1.58 (12H, m)
【０１２４】
実施例４：1-[(2-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]フェニル]エチル)アミノ]シクロペンタンカルボン酸
【化２３】
2011513289.tif 000027
【０１２５】
実施例４を、中間体２及び中間体６を用い実施例２と同様に合成した。
LCMS：m/z 482 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ：7.52-7.37 (4H, m), 7.31-7.20 (4H, m), 5.71 (1H, d, J=10.0 Hz), 3.08-2.93 (4H, m), 2.10-1.99 (2H, m), 1.78-1.68 (6H, m)。
【０１２６】
実施例５：シクロペンチル 5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-2-メチルノルバリネート
【化２４】
2011513289.tif 000028
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 10.14 (1H, br s), 8.06 (3H, br s), 7.57 (1H, dd, J=8.5, 15.1 Hz), 7.42 (1H, td, J=2.3, 10.0 Hz), ), 7.34 (1H, dd, J=2.5, 9.8 Hz), 7.24 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 7.03 (2H, d, J=10.2 Hz) 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 5.23-5.19 (1H, m), 4.13-4.07 (2H, m), 1.97-1.83 (5H, m), 1.70-1.57 (7H, m), 1.45 (3H, s)。LCMS 純度95％, m/z 576 [M+H]+。
【０１２７】
実施例５をスキーム７に示す経路により合成した。
【化２５】
2011513289.tif 000029
【０１２８】
工程１：5-ベンジル1-シクロペンチル N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-グルタメート
DCM(100mL)中(2S)-5-(ベンジルオキシ)-2-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-5-オキソペンタン酸(10g，30mmol)の溶液にシクロペンタノール(30mL，33mmol)、EDC(6.25g，33mmol)及びDMAP(362mg，3mmol)を加えた。完全な反応のために、反応物を20時間撹拌した。反応物をDCMで希釈し、１Ｍ HCl、飽和NaHCO3、塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー(20％ EtOAc/ヘプタン)により精製して、標記化合物を白色固体として得た(8.48g，71％収率)。m/z 406 [M+H]+。
【０１２９】
工程２：5-ベンジル1-シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-グルタメート
アセトニトリル(100mL)中5-ベンジル1-シクロペンチル N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-グルタメート(8.48g，21mmol)の溶液にジ-tert-ブチルジカルボネート(13.69g，63mmol)及びDMAP(255mg，2.1mmol)を加えた。反応物を50℃に加熱し、一晩撹拌した後、室温に冷却して減圧下で濃縮した。粗製残留物をEtOAcに溶解し、１Ｍ HCl、飽和NaHCO3及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、褐色油を得た。カラムクロマトグラフィー(10〜20％ EtOAc/ヘプタン)による精製によって、標記化合物を無色油として得た(10.16g，96％収率)。m/z 506 [M+H]+。
【０１３０】
工程３：(4S)-4-[ビス(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-5-(シクロペンチルオキシ)-5-オキソペンタン酸
EtOAc(200mL)中5-ベンジル1-シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-グルタメート(10.16g，20.1mmol)の溶液にPd/C(１g)を加えた。この混合物をH2雰囲気下で19時間撹拌し、セライトに通して濾過し、減圧下で濃縮して、標記化合物を淡黄色油として得た(8.28g，99％収率)。m/z 416 [M+H]+。
【０１３１】
工程４：シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-ヒドロキシ-L-ノルバリネート
(4S)-4-[ビス(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-5-(シクロペンチルオキシ)-5-オキソペンタン酸(8.28g，20mmol)をTHF(80mL)に溶解し、氷浴中で冷却した。NMM(3.3mL，30mmol)を加え、続いてイソブチルクロロホルメート(3.6mL，28mmol)を滴下して加えた。反応物を０℃にて1.5時間撹拌した後、反応物を濾過し、沈降物をTHFで洗浄した。母液を再度０℃に冷却し、NaBH4(1.51g，40mmol)を少しずつ加え、３時間撹拌した。反応混合物を水(80mL)でクエンチし、EtOAcで抽出した(３×100mL)。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮して、黄色油を得た。カラムクロマトグラフィー(40％ EtOAc/ヘプタン)による精製によって、標記化合物を無色油として得た(4.34g，54％収率)。m/z 402 [M+H]+。
【０１３２】
工程５：シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-[[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]-L-ノルバリネート
シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-ヒドロキシ-L-ノルバリネート(4.34g，10.8mmol)をアセトニトリル(45mL)に溶解し、氷浴中で冷却した。DBU(1.7mL，11.3mmol)を加え、続いてTBDMSCl(1.71g，11.3mmol)を加えた。反応物を一晩、室温にて撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。粗製残留物をEtOAcに溶解し、１Ｍ HCl、飽和NaHCO3及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、黄色油を得た。カラムクロマトグラフィー(20％ EtOAc/ヘプタン)による精製によって、標記化合物を無色油として得た(3.82g，69％収率)。m/z 516 [M+H]+。
【０１３３】
工程６：シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-[[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]-2-メチルノルバリネート
-78℃のTHF(50mL)中シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-[[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]-L-ノルバリネート(3.82g，7.4mmol)の溶液に、N2雰囲気下、THF(16.3mL，14.8mmol)中0.91Ｍ KHMDSを加えた。反応混合物を-78℃にて１時間撹拌した後、ヨウ化メチル(0.92mL，14.8mmol)を加えた。反応物を室温に温め、一晩撹拌した。反応混合物を飽和NH4Clでクエンチし、水層をEtOAcで抽出した(2×50mL)。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、圧下で濃縮して、黄色油を得た(3.50g，89％収率)。これを更なる精製なしで使用した。m/z 530 [M+H]+。
【０１３４】
工程７：シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-ヒドロキシ-2-メチルノルバリネート
シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-[[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]-2-メチルノルバリネートを酢酸(45mL)、THF(15mL)及び水(15mL)に溶解した。完全な反応のために、反応物を30℃にて20時間撹拌した。次いで、反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、濃黄色油を得た(3.08g)。これを更なる精製なしで用いた。m/z 416 [M+H]+。
【０１３５】
工程８：シクロペンチル 5-ブロモ-N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルノルバリネート
NBS(3.95g，22.2mmol)をDCM(30mL)に懸濁し、トリフェニルホスフィン(5.44g，20.7mmol)を加えた。反応物を５分間撹拌した後、ピリジン(0.94mL，8.9mmol)を加えた。次いで、シクロペンチル N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-5-ヒドロキシ-2-メチルノルバリネート(3.08g，7.4mmol)をDCM(30mL)中の溶液として加え、一晩室温にて撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、褐色油を得た。これをカラムクロマトグラフィー(15％ EtOAc/ヘプタン)により精製して、標記化合物を無色油として得た(二工程にわたって1.05g，30％収率)。m/z 479 [M+H]+。
【０１３６】
工程９：シクロペンチル 5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルノルバリネート
6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-(2,6-ジフルオロ-4-ヒドロキシフェニル)ピリジン-2(1H)-オン[実施例51 WO 03076405](500mg，1.32mmol)及びシクロペンチル 5-ブロモ-N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルノルバリネート(696mg，1.45mmol)を一緒にDMF(10mL)中で混合した。炭酸カリウム(365mg，2.64mmol)及びヨウ化ナトリウム(396mg，2.64mmol)を加え、次いで40℃にて一晩撹拌した。次いで、反応混合物をEtOAc(50mL)で希釈し、水及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、黄色固体を得た。これをカラムクロマトグラフィー(30〜40％ EtOAc/ヘプタン)により精製して、標記化合物を白色固体として得た(604mg，59％収率)。m/z 776 [M+H]+。
【０１３７】
工程10：シクロペンチル 5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-2-メチルノルバリネート
シクロペンチル 5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルノルバリネート(604mg)をTFA(10mL)及びDCM(10mL)中に溶解した。反応物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、褐色油を得た。次いで、粗製残留物をEtOAc(50mL)で希釈し、飽和NaHCO3、水及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、淡黄色固体の実施例５を得た(387mg，46％収率)。
【０１３８】
実施例６：5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-2-メチルノルバリン
【化２６】
2011513289.tif 000030
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 10.16 (1H, br s), 8.17 (3H, br s), 7.63-7.51 (1H, m), 7.47-7.18 (3H, m), 7.14-6.99 (2H, m), 6.23 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.10 (2H, br s), 1.96-1.63 (4H, m), 1.41 (3H, s)。LCMS 純度95％, m/z 508 [M+H]+。
【０１３９】
実施例６をスキーム８に示す経路により合成した。
【化２７】
2011513289.tif 000031
【０１４０】
工程１：5-ベンジル1-tert-ブチル N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-グルタメート
DCM(50mL)中のN-α-tert-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-tert-ブチルエステル(５g，16.5mmol)の溶液にベンジルアルコール(3.4mL，33mmol)、EDC(3.48g，18mmol)及びDMAP(201mg，1.6mmol)を加えた。完全な反応のために反応物を20時間撹拌した。反応物をDCMで希釈し、１Ｍ HCl、飽和NaHCO3,、塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー(20％ EtOAc/ヘプタン)により精製して、標記化合物を無色油として得た(5.98g，92％収率)。m/z 416 [M+Na]+。
工程２〜９は、実施例５(スキーム７)に記載のものと同じ方法に従う。
【０１４１】
工程10：5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-2-メチルノルバリン
tert-ブチル 5-[4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェノキシ]-N,N-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-2-メチルノルバリネート(70mg)をTFA(２mL)及びDCM(2mL)に溶解した。反応物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して桃色の油を得た。次いで、粗製残留物を、ジエチルエーテルを用いて粉砕してオフホワイト色の固体を得た(23mg，40％収率)。これを濾取し、減圧下で乾燥させて実施例６をTFA塩として得た。
【０１４２】
化合物IV(N-ヒドロキシ-3-フェニル-プロピオンアミド)
【化２８】
2011513289.tif 000032
【０１４３】
化合物IVを下記スキーム９に示すように製造した。
【化２９】
2011513289.tif 000033
【０１４４】
N-(1-イソブトキシエトキシ)-3-フェニルプロピオンアミド
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(EDC)(151mg)及び4-ジメチルアミノピリジン(触媒量)を、RTにて窒素雰囲気下で、ヒドロ桂皮酸(100mg)、保護ヒロドキシアミン(WO2008/040934)(136μL)及びジクロロメタン(５mL)の撹拌溶液に加えた。反応物を２時間撹拌し、次いで水(50mL)に注いだ。これをジクロロメタンで抽出した(２×50mL)。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、グラジエントを介して達成するヘプタン中０〜100％の酢酸エチルの溶離剤を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、産物を無色油として得た(58mg)。
【０１４５】
化合物IV：N-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオンアミド
N-(1-イソブトキシエトキシ)-3-フェニルプロピオンアミド(58mg)をDCM(２mL)及びMeOH(0.5mL)中に溶解し、RTにて窒素雰囲気下で撹拌した。ジオキサン(275μL)４ＭのHClを溶液に加え、反応物を２時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留物をHPLCにより精製して、産物を桃色固体として得た(９mg)。
m/z 166 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 10.37 (1H, bs), 7.21 (5H, m), 2.81 (2H, t, J = 7.5Hz), 2.61 (1H, m), 2.58 (2H, t, J = 7.5 Hz)。
【０１４６】
実施例７、８、９及び10の合成
上記化合物を、下記に記載の中間体及び方法を使用して合成した。
中間体
中間体７：(2E)-3-(5-ホルミルピリジン-2-イル)-N-(1-イソブトキシエトキシ)アクリルアミド
【化３０】
2011513289.tif 000034
中間体７をWO2008/040934に記載の方法により製造した。
【０１４７】
中間体８：3-(4-ホルミルフェニル)-N-(1-イソブトキシエトキシ)プロパンアミド
【化３１】
2011513289.tif 000035
中間体8をWO2008/040934に記載の方法により製造した。
【０１４８】
中間体９：シクロペンチル 1-アミノシクロヘキサンカルボキシレート
【化３２】
2011513289.tif 000036
【０１４９】
シクロヘキサン(250mL)中の1-アミノシクロヘキサンカルボン酸(4.2g，29mmol)にシクロペンタノール(50mL)及びパラ-トルエンスルホン酸(5.89g)を加え、得られる懸濁液をDean-Stark装置中で還流に72時間加熱した。室温への冷却に際して得られる白色固体を濾過により集め、シクロヘキサンで洗浄し(２×100mL)、減圧下で乾燥させて標記化合物(4.1g)を無色固体として得た。m/z 212.3 [M+H]+。
【０１５０】
中間体10：シクロペンチル 2-メチル-D,L-ロイシネート
【化３３】
2011513289.tif 000037
【０１５１】
シクロペンタノール(１mL)及び濃H2SO4(0.36mL)中の(R,S)-α-メチルロイシン(500mg,3.44mmol)の溶液を80℃に28時間加熱した。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を飽和NaHCO3(aq)(20mL)とジクロロメタン(20mL)との間で分配した。有機層を乾燥させ(MgSO4)、蒸発させて所望の材料(650mg)を淡褐色油として得た。これを更なる精製なしで使用した。m/z 214.3 [M+H]+。
【０１５２】
実施例
実施例７：シクロペンチル 1-([4-[3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロピル]ベンジル]アミノ)シクロペンタンカルボキシレート
【化３４】
2011513289.tif 000038
【０１５３】
ジクロロメタン(20mL)中の中間体８(208mg，0.68mmol)及び中間体５(184mg，0.68mmol)の溶液に、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(430mg，2.04mmol)及び酢酸(47μL)を加えた。得られる溶液を室温にて５時間撹拌し、次いで飽和NH4Clでクエンチした。反応物をジクロロメタンで抽出し(２×50mL)、合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。得られる残留物をジオキサン(１mL)中４ＭのHClに溶解し、室温にて１時間撹拌した。反応物をNaHCO3でクエンチし、酢酸エチルで抽出した(２×150mL)。合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、蒸発させた。残留物をHPLCにより精製して、標記化合物(80mg)を無色固体として得た。
m/z 375 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.46 (2H, d J=7.9 Hz), 7.36 (2H, d J=8.1 Hz), 5.40 (1H, m), 4.18 (2H, s), 2.98 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.38 (4H, m), 2.08-1.52 (14H, m)。
【０１５４】
実施例８：1-([4-[3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロピル]ベンジル]アミノ)シクロペンタンカルボン酸
【化３５】
2011513289.tif 000039
【０１５５】
シクロペンチル 1-([4-[3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロピル]ベンジル]アミノ)シクロペンタンカルボキシレート(実施例７)(40mg)を、THF(１mL)及び水(１mL)中の水酸化リチウム(40mg，15mmol)と共に、45℃にて36時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、得られる残留物をGilson分取HPLCにより精製した。精製カルボン酸誘導体をジクロロメタン：TFA(１mL，1:1 v/v)中で１時間室温にて撹拌し、反応物を減圧下で濃縮した。標記化合物(３mg)を無色固体として単離した。
1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.47 (2H, d J=7.9 Hz), 7.36 (2H, d J=8.1 Hz), 4.18 (2H, s), 3.01-2.95 (2H, t J=7.5 Hz), 2.38 (4H, m), 1.97-1.59 (6H, m)
【０１５６】
実施例９：シクロペンチル N-[4-[3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロピル]ベンジル]-2-メチル-D,L-ロイシネート
【化３６】
2011513289.tif 000040
【０１５７】
これは、中間体８(209mg，0.68mmol)及び中間体10(146mg，0.61mmol)を用い、実施例７と同様にして作製した。標記化合物(200mg)は無色固体として得られた。m/z 391.51 [M+H]+。
1H NMR (300 MHz, MeOD) 7.44 (2H, d J=8.1 Hz), 7.35 (2H, d J=8.1 Hz), 5.38-5.33 (1H, m), 4.21 (1H, d J=12.8 Hz), 4.06 (1H, d, J=12.8 Hz), 2.98 (2H, t J=7.6 Hz), 2.41 (2H, t J=7.6 Hz), 2.04-1.72 (11H, m), 1.68 (3H, s), 0.99 (6H, t J=7.6 Hz)。
【０１５８】
以下の実施例は、実施例９を使用し、実施例８の標記化合物と同様にして作製した。
実施例10：N-[4-[3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロピル]ベンジル]-2-メチル-D,L-ロイシン
【化３７】
2011513289.tif 000041
m/z 323 [M+H]+。1H NMR (300 MHz, MeOD), 7.44 (2H, d J=8.1Hz), 7.35(2H, d J=8.1Hz), 4.20 (1H, d J=12.4Hz), 4.09 (1H, dJ=12.6Hz), 2.97 (2H, t J=7.3Hz), 2.41 (2H, t J=7.7Hz), 2.01-1.87 (3H, m), 1.76 (3H, s), 1.01 (6H, t J=6.3Hz)。
【０１５９】
実施例11：シクロペンチル 1-[([6-[(1E)-3-(ヒドロキシアミノ)-3-オキソプロプ-1-エン-1-イル]ピリジン-3-イル]メチル)アミノ]シクロヘキサンカルボキシレート
【化３８】
2011513289.tif 000042
【０１６０】
THF(20mL)中の中間体７(386mg，1.83mmol)及び中間体９(902mg，3.02mmol)の溶液にパウダー状のモレキュラーシーブ４Å(100mg)を加え、得られる混合物を還流温度に12時間加熱した。室温への冷却に際し、水素化ホウ素ナトリウム(317mg，85mmol)を加え、撹拌を20分間続けた。反応を飽和NH4Cl(50mL)でクエンチし、次いでジクロロメタンで抽出した(３×100mL)。合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮し、得られる残留物をカラムクロマトグラフィー[シリカゲル，DCM中５％メタノール]に供した。精製材料をジクロロメタン(20mL)に溶解し、これにジオキサン中４ＭのHClを加え、得られる溶液を室温にて１時間撹拌した。反応をNaHCO3でクエンチし、酢酸エチルで抽出した(２×150mL)。合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、蒸発させた。残留物をHPLCにより精製して、標記化合物(80mg)を無色固体として得た。m/z 388.25 (M+H)+。1H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 10.95 (1H, br s), 9.43 (1H, br s), 8.65 (1H, d, J=1.7 Hz), 7.92 (1H, dd, J=2.0, 8.0), 7.67 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.50 (1H, d, J=15.4 Hz), 6.98 (1H, d, J=15.4 Hz), 5.23 (1H, t, J=5.3 Hz), 4.16 (2H, br s), 2.15-2.30 (2H, m), 1.16-1.96 (16H, m)。
【０１６１】
生物学的活性
ヒストン脱アセチル化酵素活性
化合物がヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害する能力を、Biomolから市販されているHDAC蛍光活性アッセイを用いて測定した。簡潔には、ε-アミノがアセチル化されたリジンであるFluor de LysTM基質を、ヒストン脱アセチル化酵素活性の供給源(HeLa核抽出物)と、阻害剤の存在下又は非存在下でインキュベートする。この基質の脱アセチル化は、基質をFluor de LysTMデベロッパー(これが蛍光体を生じる)に対して高感度にする。よって、基質をHDAC活性の供給源とインキュベートすることにより、シグナルの増加が生じる。シグナルはHDAC阻害剤の存在下では低減する。
【０１６２】
データは、以下のように、全てのサンプルからバックグラウンドシグナルを減じて、阻害剤の非存在下で測定したコントロールのパーセンテージとして表す。
％活性 ＝ ［(Si − Ｂ) ／ (S0 − Ｂ)］× 100
(式中、Siは、基質、酵素及び阻害剤の存在下でのシグナルであり、S0は基質、酵素及び阻害剤を溶解するビヒクルの存在下でのシグナルであり、Ｂは、酵素の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナルである)
【０１６３】
IC50値は、非線形回帰分析により、Graphpad Prismソフトウェアを用い、８個のデータ点の結果を、種々の傾きのＳ字状用量応答式(化合物のlog濃度に対する％活性)にフィッティングさせた後に決定した。
【０１６４】
HeLa細胞由来の粗製核抽出物のヒストン脱アセチル化酵素活性を、スクリーニングに用いた。4C(Seneffe, Belgium)から購入した調製物は、対数増殖期に採集したHeLa細胞から調製した。核抽出物は、J.D. Dignam, Nucl. Acid. Res., 1983, 11, 1475-1489に記載された方法に従って調製し、液体窒素中で素早く凍結させ(snap frozen)、-80℃にて保存した。最終の緩衝剤組成は、20mM Hepes、100mM KCl、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF及び20％(v/v)グリセロールであった。
【０１６５】
U937及びHUT細胞阻害アッセイ
対数増殖しているガン細胞株(U937及びHUT)を採集し、1000〜2000細胞/ウェル(最終容量100μl)で96ウェル組織培養プレートに播種した。24時間の増殖後に、細胞を化合物で処理した。次いで、プレートを更に72〜96時間、再インキュベートした後、WST-1細胞生存能アッセイを、供給業者(Roche Applied Science)の指示に従って行った。
【０１６６】
データは、以下のようにして、阻害剤の非存在下で測定したコントロールのパーセンテージ阻害として表した。
％阻害 ＝ 100 −［(Si ／ S0) × 100］
(式中、Siは阻害剤の存在下でのシグナルであり、S0はDMSOの存在下でのシグナルである)
【０１６７】
用量応答曲線は、六連の８つの濃度(最高の最終濃度10μM、３倍希釈)から作成した。
IC50値は、非線形回帰分析により、Graphpad Prismソフトウェアを用い、結果を、種々の傾きを有するＳ字状用量応答式(化合物のlog濃度に対する％活性)にフィッティングさせた後に決定した。
【０１６８】
p38 MAPキナーゼ酵素アッセイ
化合物がp38 MAPαキナーゼ活性を阻害する能力を、Upstate(Dundee UK)により行われるアッセイにおいて測定した。25μlの最終反応容量において、p38 MAPキナーゼα(５〜10mU)を、25mM Tris pH7.5、0.02mM EGTA、0.33mg/mLミエリン塩基性タンパク質、10mM酢酸Mg及び[γ-33P]-ATP(比活性約500cpm/pmol、必要に応じた濃度)とインキュベートする。反応は、MgATPミックスの添加により開始した。室温にて40分間のインキュベーションの後に、反応を、５μLの３％リン酸溶液の添加により停止した。次いで、10μlの反応物を、P30フィルターマットにスポットし、75mMリン酸中５分間で３回、メタノール中で１回洗浄した後に、乾燥させてシンチレーション計数を行った。
【０１６９】
DMSO中のストック溶液の1/3 log希釈系列から二連のデータ点を作成した。最高濃度10μMから９つの希釈物を作成し、「化合物なし」のブランクを含めた。標準の放射測定フィルター-結合アッセイを、Km又はKmに近いATP濃度で行った。シンチレーション計数からのデータを収集して、Prismソフトウェアによるフリーフィット分析に供した。作成した曲線から、50％阻害を与える濃度を決定し、報告する。
【０１７０】
p38 MAPキナーゼ細胞アッセイ：MAPKAP2のリン酸化の阻害
U937又はHUT78細胞をRPMI 1640中にプレートし、37℃にて５％ CO2で18時間インキュベートした。化合物の10mMストックを培地/0.1％ DMSOで希釈してlog又はsemi-log希釈系列を得た。「未処理」及び「アニソマイシン」のウェルは、0.1％ DMSOのみで処理した。細胞を37℃にて５％ CO2で更に４時間インキュベートした。アニソマシンを、「未処理」以外の全ウェルに、最終濃度10μMで加えた。細胞を37℃にて５％ CO2で30分間インキュベートした後に採集した。採集の間プレートを氷上に置き、後続の全工程を４℃で行った。４℃にて10分間1000rpmで細胞をペレット化し、培地を吸引し、ペレットを冷PBSで洗浄した。ペレットを120μlのSDS溶解緩衝剤(62.5mM Tris，pH6.8，２％ SDS，10％グリセロール，50mM DTT，製造業者の推奨に従ってプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加した)中で溶解させた。氷上で30分後、サンプルを５秒間超音波処理した後、13,000rpmで４℃にて10分間遠心分離して細胞残渣を除去した。10μlの得られるゲルサンプルをNOVEX 4-12％ Bis-Tris MOPSゲルにレーンごとにロードした。ゲルのウェスタントランスファーからのメンブレンを、製造業者の指示に従って、抗-ホスホMAPKAP2、抗-ホスホHSP27及び抗GAPDHでブロットした。シグナルを、HRP-結合抗-ウサギ又は抗-マウス抗体、ECL試薬及びECLフィルムを用いて可視化した。種々の化合物についてのIC50値を、得られる写真画像からバンドシフト及びシグナル強度の両方を使用して視覚化した。
【０１７１】
THP-1細胞のLPS-刺激
THP-1細胞を、Ｖ底96ウェル組織培養処理プレートにおいて、100μl中４×104細胞/ウェルの密度でプレートし、37℃にて５％ CO2中で16時間インキュベートした。100μlの組織培養培地中の阻害剤を添加した２時間後、細胞を、最終濃度１μg/mLのLPS(E coli strain 005:B5，Sigma)で刺激し、37℃にて５％ CO2中６時間インキュベートした。サンドウィッチELISA(R&D Systems #QTA00B)により無細胞上清からTNF-αレベルを測定した。
【０１７２】
HCE-1カルボキシルエステラーゼアッセイ
hCE-1によるエステルの対応するカルボン酸への加水分解は以下の手順を使用して測定することができる。ゼロ時間で、ホスフェートアッセイ緩衝剤(K2PO4 100mM，KCl 40mM，pH7.4)中６μg/mLの濃度の組換えhCE-1 100μlを、５μMエステル基質を含有する等量のアッセイ緩衝剤に加えた。十分に混合した後、三連のサンプルを37℃にて０、20又は80分間インキュベートした。適切な時点で、600μlのアセトニトリルを添加することにより加水分解を停止させた。ゼロ時間のサンプルについては、酵素より前にアセトニトリルを加えた。サンプルを、エステル及び対応するカルボン酸について、室温にてLCMS(Sciex API 3000，HP1100バイナリポンプ，CTC PAL)により分析した。クロマトグラフィーは、MeCN(75×2.1mm)カラム及び水/0.1％ギ酸中の５〜95％アセトニトリルの移動相に基づいた。80分後の酸及び加水分解産物のレベルはng/mLで表す。
【０１７３】
破砕細胞カルボキシルエステラーゼアッセイ
エステルが本発明に従って複合体化された本発明の任意の化合物は、以下のアッセイで試験することによって、細胞内エステラーゼにより加水分解されるという要件を満たすかどうかを決定するために試験され得る。
【０１７４】
細胞抽出物の調製
U937又はHCT 116腫瘍細胞(約109)を、４容量のDulbeccos PBS(約１リットル)中で洗浄し、525gで10分間、４℃にてペレット化した。これを２回繰り返し、最終の細胞ペレットを35mLの冷ホモジナイジング緩衝液(Trizma 10mM，NaCl 130mM，CaCl2 0.5mM pH7.0 25℃)に再懸濁した。ホモジネートを、窒素キャビテーション(700psiを４℃にて50分間)により調製した。ホモジネートを氷上に維持し、以下の最終濃度の阻害剤カクテルを補った。
【０１７５】
ロイペプチン    １μM
アプロチニン    0.1μM
E64             ８μM
ペプスタチン    1.5μM
ベスタチン      162μM
キモスタチン    33μM
【０１７６】
525gにて10分間の遠心分離により細胞ホモジネートを明澄化した後、得られた上清をエステラーゼ活性の供給源として用い、必要になるまで-80℃にて貯蔵した。
【０１７７】
エステル開裂の測定
対応するカルボン酸へのエステルの加水分解は、上記のように調製した細胞抽出物を用いて測定できる。このために、細胞抽出物(約30μg/総アッセイ容量0.5mL)を、37℃にて、Tris-HCl 25mM、125mM NaCl緩衝剤(pH7.5、25℃)中でインキュベートした。ゼロ時間に、エステル(基質)を最終濃度2.5μMで加え、サンプルを37℃にて適切な時間(通常、０又は80分間)インキュベートした。反応は、３×容量のアセトニトリルの添加により停止させた。ゼロ時間のサンプルについては、アセトニトリルをエステル化合物より前に加えた。12000gで５分間の遠心分離の後、サンプルを、エステル及び対応するカルボン酸について、室温にてLCMS(Sciex API 3000，HP1100バイナリポンプ，CTC PAL)により分析した。クロマトグラフィーは、MeCN(75×2.1mm)カラム及び水/0.1％ギ酸中の５〜95％アセトニトリルの移動相に基づいた。加水分解の速度は、pg/mL/分で表す。
【０１７８】
細胞蓄積アッセイ
細胞(８×104/mL)を、６μMの化合物を含有する培養培地中、５％(v/v)CO2-加湿雰囲気で37℃にてインキュベートした。６時間後に、細胞懸濁液の25mLアリコートを300gで５分間、４℃にて遠心分離することによりインキュベーションを終了した。培養培地上清の0.2mLサンプルを４容量のアセトニトリル(Sigma-Aldrich)に加えた。上清をデカントした後、残存する細胞ペレット(２×106細胞)を１mLのアセトニトリル中に抽出した。次いで、サンプルを、エステル及び酸代謝物について、室温にてLC/MS/MS(Sciex API 3000)により分析した。クロマトグラフィーは、MeCN(75×21mm)カラム及び５〜95％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)ギ酸の移動相に基づいた。ゼロ時間サンプルについては、エステルを加えた後直ぐに細胞懸濁液をチルドして遠心分離し、次いで上記のようにアセトニトリル中に抽出した。細胞中のレベルをng/mLとして表した。
【０１７９】
【表２】
2011513289.tif 000043
【０１８０】
表１は、実施例１の酸が酵素アッセイにおいて親化合物(化合物Ｉ：WO 03/076405)と同様なIC50を有することを示す。これは、酵素への結合がエステラーゼモチーフの結合によって妨げられていないことを示す。ジ-置換化合物(例えば実施例１)はhCE-1により加水分解され、結果として酸が細胞内に蓄積する。この酸の蓄積は、実施例１が細胞アッセイにおいて親化合物より有意に強力であるという結果をもたらす。これらデータは、エステラーゼモチーフの結合及び得られる対応酸の細胞蓄積により達成され得る効力の利益を強調する。
【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
表２は、親化合物(化合物Ｉ)が単球細胞株及び非単球細胞株で等しい効力である一方、実施例１及び３は単球細胞株で100倍強力であることを示す。実施例１のみが単球細胞株に蓄積する。このことは、単球細胞株でのみ切断されるエステラーゼモチーフの結合により細胞選択性が達成されることを示している。
【０１８３】
【表４】
2011513289.tif 000045
【０１８４】
表３は、Ｃ-連結ジアルキル化合物(実施例５)がマクロファージ選択性である一方、親化合物(化合物II；WO 03/076405)及びアミノ酸誘導体のα炭素にアルキル基を欠く化合物(化合物III；WO 2007/129036)はそうでないことを示す。このことは、マクロファージ選択性がアミノ酸エステルモチーフのα炭素での第２の置換基の導入により達成されることを示す。
【０１８５】
【表５】
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【０１８６】
表４は、実施例７及び９の酸が酵素アッセイにおいて親化合物(化合物IV)と同様なIC50を有することを示す：このことは、酵素への結合がエステラーゼモチーフの結合により妨げられないことを示す。ジ-置換化合物(例えば、実施例７)はhCE-1により加水分解され、結果として酸が単球細胞内に蓄積する。この酸の蓄積は、実施例７及び９が細胞アッセイにおいて親化合物より有意に強力であるという結果をもたらす。これらデータは、エステラーゼモチーフの結合により達成され得る効力の利益を強調する。
【０１８７】
【表６】
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【０１８８】
表５は、親化合物(化合物IV)が単球細胞株(U937)及び非単球細胞株(Hut78)において同様な効力を有する一方、実施例７及び９は単球細胞株において非単球細胞株より30倍強力であることを示す。このことは、アミノ酸モチーフのα位での第２の置換基がマクロファージ選択性を化合物に付与することを示している。
【国際調査報告】
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