(57)【要約】  気道組織リモデリングを調節するための方法及び組成物、並びに気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は防止するための方法及び組成物を提供する。方法は、組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することを含む。一実施形態では、前記方法は、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を、患者が必要とする有効な量で患者に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための方法であって、前記症状の治療又は予防を必要とする患者に、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む方法。
【請求項２】
前記物質がファイブリン−１ポリペプチドの活性のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質がファイブリン−１の発現を阻害又は抑制することができる分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発現の阻害がファイブリン−１ヌクレオチド配列のレベルで生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記物質が、ファイブリン−１又はその１種以上のアイソフォームをコードするヌクレオチド配列に特異的に結合することができるアンチセンス構造体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ファイブリン−１の発現及び／又は活性の阻害が、１以上の細胞及び／又はそのような細胞に関連する細胞外マトリックスにおいて生じる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
喘息を治療又は予防するための方法であって、喘息に罹患しているか、喘息に罹患する素因を有している患者に、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む方法。
【請求項８】
患者における気道組織リモデリングの発生を調節する方法であって、前記患者の気道組織におけるファイブリン−１レベルを調節することを含み、前記組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することによって組織リモデリングの発生を抑制するか、組織リモデリングを阻害する方法。
【請求項９】
前記ファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することは、ファイブリン−１の発現又は産生を減少させることができる１種以上の物質を有効な量で投与することによってファイブリン−１を減少させることを含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することは、ファイブリン−１、その誘導体、変異体又は同族体又はファイブリン−１の発現又は産生を増加させることができる物質を有効な量で投与することによってファイブリン−１を増加させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
患者における気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための方法であって、前記患者の気道組織におけるファイブリン−１レベルを調節することを含み、前記組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することによって組織リモデリングの発生をダウンレギュレートする方法。
【請求項１２】
前記ファイブリン−１がアイソフォームのファイブリン−１Ｃである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記症状が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び特発性肺線維症、嚢胞性繊維症及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）などの肺線維症から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
患者における気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状又は前記症状に対する罹患性又は素因を診断するための方法であって、前記患者の体液、気道組織又は細胞におけるファイブリン−１レベルを決定することを含む方法。
【請求項１５】
前記体液が血清又は気管支肺胞洗浄液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が気道平滑筋細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者から体液又は気道細胞を採取し、前記体液又は気道細胞中の少なくとも１種のファイブリン−１アイソフォームの発現レベルを判定することを含み、前記少なくとも１種のファイブリン−１アイソフォームの発現レベルが前記症状又は前記症状に対する罹患性又は素因を示す、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記気道細胞を採取し、１種以上の増殖又は線維化因子を使用してファイブリン−１の発現を判定する前にインビボで刺激を与える、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための医薬組成物であって、気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を、所望により１種以上の薬学的に許容し得るアジュバント、担体及び／又は希釈剤と共に含む組成物。
【請求項２０】
患者の組織における異常、過度又は望ましくない創傷治癒を阻害する為の方法であって、前記患者は気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状に罹患しているか、前記症状に罹患する素因を有し、前記患者にファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記症状が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び特発性肺線維症、嚢胞性繊維症及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）などの肺線維症から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記創傷治癒の阻害が、１以上の異常細胞におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することを含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が気道平滑筋細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記創傷治癒の阻害が、細胞外マトリックスにおけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することを含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、気道組織リモデリングを調節するための方法、特に、異常な気道組織リモデリングに関連する症状（喘息等）を治療又は防止するための方法に関する。より詳細には、本発明は、気道組織におけるファイブリンファイブリン−１のレベル及び／又は活性の調節に関する。また、本発明はそのような方法に有用な組成物に関する。本発明は、さらに、望ましくない気道組織リモデリングの発現又は気道組織リモデリングの発現に対する素因及び気道組織リモデリングに関連する症状（喘息等）を診断するための方法に関する。 本発明はまた、特に、異常な又は過度な又はそうでなければ望ましくない組織創傷治癒が生じる異常な気道組織リモデリングに関連する症状に罹患した患者における創傷治癒を阻害するための方法及び組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は気道の発作性疾患である。欧米では最も広まっている慢性的な健康問題となっており、世界中でもますます広がりを見せている。オーストラリアだけでも２００万人を超える患者がおり、子供の約４人に１人が罹患している。気管支喘息は世界中で最も一般的な小児慢性疾患であり、全年齢にわたる全体の有病率は５〜２０％となっている。喘息の病因は複雑であることが示唆されており、息切れ、喘鳴音、咳及び生命に危険を及ぼす呼吸困難等の症状を引き起こす気道の発作性収縮を伴う気管壁の炎症をもたらす吸入性アレルゲンに対する異常な免疫反応が主要な要因である。
【０００３】
また、喘息は、（自発的又は治療によって）症状を改善することが可能な場合がある可変性の気道閉塞、気道過敏性の存在、及び多くの細胞及び細胞要素、特に肥満細胞、好酸球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好中球、上皮細胞が役割を演じる、慢性気道炎症によって特徴付けられる。特定の喘息患者にこれらの特徴の全てが見られる訳ではない。広く受け入れられている喘息の診断を確立するための絶対的な「最低評価基準」はないが、現在の症状及び活動性喘息に罹患した患者には気道過敏性の存在が共通して見られる。
【０００４】
過敏な人の場合には、ペットのフケ、塵ダニ、ゴキブリアレルゲン、カビ又は花粉等のアレルゲン（アレルギー誘発物質）の吸入によって喘息症状が引き起こされる場合がある。また、喘息症状は、呼吸器感染症、運動、冷気、タバコの煙及びその他の汚染物質、ストレス、食品又は薬剤アレルギーによっても引き起こされる場合がある。ある患者によっては、アスピリンやその他の非ステロイド系抗炎症薬によって喘息が引き起こされる。喘息の発作が生じると、気管支樹の筋肉がこわばると共に気道の内層が膨張し、空気の流れが減少すると共に特徴的な喘鳴音が発生する。そして、粘液産生が増加する。ほとんどの喘息患者は、無症状期間とは異なる周期的な喘鳴発作を示す。ある喘息患者によっては慢性的な息切れを示し、息切れが激しくなると発作が発生する。
【０００５】
喘息は炎症性疾患であり、単に過度の平滑筋収縮によるものではない。しかしながら、喘息は慢性的な気道疾患であり、炎症が喘息を引き起こすのか、あるいは喘息が炎症を引き起こすのかについては分かっていない。健常者の肺では炎症が普通に発生し、空気中に存在する細菌及びウイルスや汚染物質等の病原体を除去して正常な肺ホメオスタシスを維持することが実際に必要である。喘息患者の肺では、刺激物に対する過剰な反応が発生し、過度の気道狭窄（過敏性）が生じる傾向が高まる。アレルゲンやウイルス等の誘発物質への暴露、運動又は非特異的な刺激物の吸入に引き続いて気道炎症が悪化する。炎症が悪化すると、呼吸困難、喘鳴音、咳嗽及び胸部絞扼感を特徴とする症状の増悪が発生する。浮腫、上皮細胞剥離及び炎症性細胞浸潤等の異常な組織病理学的損傷は、重症の喘息患者だけではなく、非常に軽症の喘息患者にさえも見られる。比較的十分に理解されていない喘息病因論の１つ見方は、気道組織リモデリングの発生である。病理学的に、気道リモデリングは、平滑筋肉量の増加、粘液腺過形成増殖、慢性炎症性細胞浸潤物の残存、細胞外マトリックス沈着の変化、線維形成性成長因子の放出を含む様々な特徴を有するように思われる。
【０００６】
従って、喘息は、気道の炎症が気道閉塞と気道過敏性を引き起こし、気道の表面の構造的な変化又は「リモデリング」が発生する疾患である。気道組織リモデリングが気道炎症に続いて発生するか又は気道炎症によって引き起こされるか否か、あるいは気道炎症とは別の現象であるか否かについては分かっていない。喘息等の疾患における気道リモデリングは、気道平滑筋細胞等の細胞の異常肥大及び増殖に関連し、それによって臨床症状が悪化し得る。また、組織リモデリングは創傷治癒の基本的な要素であり、喘息等の病的状態では修復が過度になって症状を悪化させる可能性がある。
【０００７】
現在の喘息の治療は、既知のアレルゲン及び呼吸刺激物を回避し、薬物投与によって症状及び気道炎症を制御することを通常は目的としている。薬物投与に関しては、短期及び／又は長期治療計画を使用する場合がある。例えば喘息発作時における短期的な「迅速な」緩和の場合は、短時間作用型の気管支拡張剤（例えば、サルブタモール、フェノテロール、テルブタリン、アルブテロール等）を使用する場合がある。より長期的な抑制措置を行う場合には、例えば、炎症を防ぐ吸入ステロイド、通常はコルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド等）、ロイコトリエン阻害剤（例えば、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト等）、気道を開かせるのを支援する長時間作用型気管支拡張薬（例えば、ホルモテロール、サルメテロール等）、別々の吸入器又は単一の吸入器を使用するコルチコステロイドと気管支拡張剤の組み合わせ（例えば、フルチカゾン／サルメテロール、ブデソニド／ホルモテロール等）、及び免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）又はインターロイキン５（ＩＬ−５）を中和する抗体（例えば、オマリズマブ等）を投与する。別の最新療法は、短時間又は長時間作用型β−２受容体アゴニスト（それぞれ「緩和剤」及び「調節剤」という）を経由して気道においてβ−２受容体を刺激することによって気道の収縮を抑制することを目的とする。
【０００８】
しかしながら、既存の療法は、喘息時に気道内で活性化される経路の複雑な性質に分子レベルで対処するものではない。むしろ、異常な免疫反応を促進する多くの疾患メカニズムの１つ又はいくつかのみを抑制すること又は症状を軽減することを目的としている。また、最新の療法は、重篤な副作用（例えば、ステロイドを使用する場合）又はタキフィラキシー（例えば、以下の長時間作用型β−２受容体アンタゴニストを投与する場合）を通常は伴う。さらに、喘息の細胞学的根拠の理解に関して顕著に進展し、様々な治療選択肢が開発されているにもかかわらず、喘息の原因は完全には解明されておらず、治療法も開発されていない。
【０００９】
従って、喘息等の炎症性疾患の治療のための有効な療法の開発だけではなく、喘息の原因を解明すると共に一般に公開されている治療及び予防法の既存の範囲を拡張するために貢献し得る新しい治療法の開発の両方のレベルで喘息関連の研究を達成することが求められている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞外マトリックスタンパク質であるファイブリンファイブリン−１が気道平滑筋細胞内で、喘息患者と非喘息患者では異なって発現するという本発明者らの予想外の知見に基づくものである。ファイブリンファイブリン−１の発現は胎児ウシ血清や形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β等の増殖及び線維化因子によって刺激され、ファイブリンファイブリン−１レベルは喘息患者の血清及び気管支肺胞洗浄液中において増加する。また、本明細書において、本発明者らは、マウス喘息モデルにおけるＴＧＦβ誘発気道過敏性をファイブリン−１の発現を阻害することによって減少させることができることを実証している。さらに、本明細書に例証したように、本発明者らは、予期せぬことに、ファイブリン−１は喘息患者における気道平滑筋細胞の創傷治癒を促進し、ファイブリン−１の発現を阻害することによって当該能力が見られなくなることを見出した。
【００１１】
これらの知見により、喘息等の気道疾患に罹患した患者における組織リモデリングの発生及び／又は重症度を低減する方法を開発することが可能となった。喘息の場合には、気道組織の「瘢痕化」の発生を最小化又は低減するための補助的な治療計画を行うことができるという点でこれらの知見は非常に貴重である。従って、治療の有無を問わず、喘息等の気道疾患のより重篤な結果の重症度を減少させる手段が提供される。また、本発明者らの知見により、例えば、ファイブリン−１  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルの解析に基づいて、喘息等の気道リモデリング疾患の発生又は当該疾患に対する素因を診断するための新規な手段が提供される。
【００１２】
本発明の第１の態様は、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための方法であって、前記症状の治療又は予防を必要とする患者に、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、前記物質はファイブリン−１ポリペプチドの活性のアンタゴニストであってもよい。前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体等の抗体であってもよい。別の実施形態では、前記物質はファイブリン−１の発現を阻害又は抑制することができる分子であってもよい。発現の阻害はファイブリン−１ヌクレオチド配列のレベルで生じてもよく、前記阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、触媒アンチセンス構造体、モルホリノ又はその他のアンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス構造体であってもよい。
【００１４】
一実施形態で、前記ファイブリン−１は、アイソフォームのファイブリン−１Ｂ又はファイブリン−１Ｃである。
【００１５】
ファイブリン−１の発現及び／又は活性の阻害は、１以上の細胞、通常は前記症状に関連する異常細胞及び／又はそのような細胞に関連する細胞外マトリックスにおいて生じ得る。
【００１６】
前記症状は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、嚢胞性繊維症及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）から選択されてもよい。前記患者は、前記症状に罹患しているか、又は前記症状に罹患する素因を有していてもよい。
【００１７】
本発明の第２の態様は、喘息を治療又は予防するための方法が提供され、該方法は、喘息に罹患しているか、喘息に罹患する素因を有している患者に、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む。
【００１８】
第３の態様によれば、本発明は、患者における気道組織リモデリングの発生を調節する方法を提供し、該方法は前記患者の気道組織におけるファイブリン−１レベルを調節することを含み、前記組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することによって組織リモデリングの発生を低減するか、組織リモデリングを阻害する。ファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することはファイブリン−１を減少させることを含み、ファイブリン−１レベルは、ファイブリン−１の発現又は産生を減少させることができる１種以上の物質を有効な量で投与することによって正常化することができる。
【００１９】
一実施形態では、前記ファイブリン−１は、アイソフォームのファイブリン−１Ｂ又はファイブリン−１Ｃである。
【００２０】
ファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することはファイブリン−１を増加させることを含み、ファイブリン−１レベルは、ファイブリン−１、その誘導体、変異体又は同族体又はファイブリン−１の発現又は産生を増加させることができる物質を有効な量で投与することによって増加させることができる。
【００２１】
第４の態様によれば、本発明は、患者における気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状又は前記症状に対する罹患性又は素因を診断する方法を提供し、該方法は前記患者の体液、気道組織又は細胞におけるファイブリン−１レベルを決定することを含む。
【００２２】
前記体液は、血清又は気管支肺胞洗浄液であってもよい。前記細胞は、気道平滑筋細胞であってもよい。
【００２３】
前記方法は、前記患者から体液又は気道細胞を採取し、前記体液又は気道細胞中の少なくとも１種のファイブリン−１アイソフォームの発現レベルを判定することを含むことができ、前記少なくとも１種のファイブリン−１アイソフォームの発現レベルは前記症状、又は前記症状に対する罹患性又は素因を示す。気道細胞を単離した後、１種以上の増殖又は線維化因子を使用してファイブリン−１の発現を判定する前に前記細胞にインビトロで刺激を与えることができる。一例として、前記増殖因子は胎児ウシ血清であってもよく、前記線維化因子は形質転換増殖因子−βであってもよい。
【００２４】
前記少なくとも１個のファイブリン−１アイソフォームは、ファイブリン−１Ｂ又はファイブリン−１Ｃであってもよい。
【００２５】
第５の態様によれば、本発明は、患者の気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる物質の、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための薬剤の製造における使用を提供する。
【００２６】
第６の態様よれば、本発明は、患者の気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる物質の、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状の治療又は予防のための使用を提供する。
【００２７】
第７の態様よれば、本発明は、患者の気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる物質の、喘息を治療又は予防するための薬剤の製造における使用を提供する。
【００２８】
第８の態様よれば、本発明は、患者の気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる物質の、喘息の治療又は予防のための使用を提供する。
【００２９】
第９の態様よれば、本発明は、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための医薬組成物を提供し、該組成物は気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を、所望により１種以上の薬学的に許容し得るアジュバント、担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【００３０】
第１０の態様よれば、本発明は、喘息を治療又は予防するための医薬組成物を提供し、該組成物は気道組織におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を、所望により１種以上の薬学的に許容し得るアジュバント、担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【００３１】
第１１の態様よれば、本発明は、患者における気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は前記患者の気道組織におけるファイブリン−１レベルを調節することを含み、前記組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することによって組織リモデリングの発生をダウンレギュレートする。
【００３２】
第１２の態様よれば、本発明は、患者における喘息を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は前記患者の気管支及び／又は細気管支組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することを含み、前記ファイブリン−１レベルを正常化することによって前記気管支及び／又は細気管支組織における組織リモデリングをダウンレギュレートする。
【００３３】
第１３の態様よれば、本発明は、患者の組織における異常、過度又はさもなければ望ましくない創傷治癒を阻害する為の方法を提供し、そして、患者は気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状に罹患しているか、前記症状に罹患する素因を有し、前記方法はファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で患者に投与することを含む。
【００３４】
気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する前記症状は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、嚢胞性繊維症及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）から選択されてもよい。
【００３５】
創傷治癒の阻害は、１以上の異常細胞におけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することを含むことができる。前記細胞は、例えば、気道平滑筋細胞、上皮細胞又は線維芽細胞など、銅のような細胞の種類であってもよい。あるいは又はさらに、創傷治癒の阻害は、細胞外マトリックスにおけるファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することを含むことができる。
【００３６】
一実施形態では、前記物質は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド等のファイブリン−１の発現を阻害又は抑制することができる分子である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、本発明を限定するものではない実施例によって説明する。
【００３８】
【図１】ハウスキーピング遺伝子１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現に対して正規化したファイブリン−１をコードするｍＲＮＡの発現をリアルタイム定量ＰＣＲを使用して測定した。試料を０．１％ＢＳＡ値と比較した。５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１  ｍＲＮＡの発現（両ケースでｐ＜０．００１）が有意にアップレギュレートされた（ｎ＝９以下）。 この増加は、非喘息患者ボランティアでは観察されなかった（ｎ＝１２）。
【図２】ハウスキーピング遺伝子１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現に対して正規化したファイブリン−１Ａ（Ａ）、ファイブリン−１Ｂ（Ｂ）、ファイブリン−１Ｃ（Ｃ）及びファイブリン−１Ｄ（Ｄ）をコードするｍＲＮＡの発現をリアルタイム定量ＰＣＲを使用して測定した。試料を０．１％ＢＳＡ値と比較した。  Ａ．５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティア（両ケースでｐ＜０．００１、ｎ＝８）及び非喘息患者ボランティア（両ケースでｐ＜０．００１、ｎ＝１２）から採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１ＡｍＲＮＡの発現が有意にダウンレギュレートされた。  Ｂ．１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１ＢｍＲＮＡの発現が有意にアップレギュレートされた（ｐ＜０．００１、ｎ＝８）。  Ｃ．５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｃの発現が有意にアップレギュレートされた（両ケースでｐ＜０．００１、ｎ＝８）。一方、５％ＦＢＳにより、非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｃの発現が有意にダウンレギュレートされた（両ケースでｐ＜０．００１、ｎ＝１２）。  Ｄ．５％ＦＢＳにより、喘息患者ボランティア（ｐ＜０．００１、ｎ＝８）及び非喘息患者ボランティア（ｐ＜０．００１、ｎ＝１２）から採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｄの発現が有意にダウンレギュレートされた。ＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｄの発現が有意にダウンレギュレートされた（ｐ＜０．００１、ｎ＝８）。
【図３】Ａ．ウエスタンブロッティングを使用した４人の非喘息患者ボランティア（左図、白いバー）及び４人の喘息患者ボランティア（右図、黒いバー）から採取したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の変化の濃度測定評価。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１タンパク質がアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５）。データは非刺激細胞に対する倍率変化として表した。Ｂ．ウエスタンブロッティングを使用した４人の非喘息患者ボランティア及び４人の喘息患者ボランティアから採取し、５％ＦＢＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで刺激したＡＳＭ細胞に含まれるファイブリン−１の量の濃度測定評価。ＳＫＢＲ３の細胞溶解物を陽性対照として使用した。ファイブリン−１タンパク質の発現レベルはＳＫＢＲ３及びハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨに対して正規化した。基本的に、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の間でファイブリン−１タンパク質の発現に差はなかった。
【図４】Ａ．１人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の染色と、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下におけるアイソタイプ対照を使用して観察された染色との比較。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで刺激したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の強度が増加している。これらの免疫組織化学的画像は試験した４人の喘息患者ボランティア全部の結果を示している。Ｂ．１人の非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の染色と、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下におけるアイソタイプ対照を使用して観察された染色との比較。これらの免疫組織化学的画像は試験した５人の非喘息患者ボランティア全部の結果を示している。
【図５】免疫組織化学解析による、ＴＧＦβで処理した気管支生検材料におけるファイブリン−１の染色。生検材料は（Ａ）１人の非喘息患者ボランティア及び（Ｂ）１人の喘息患者ボランティアから得たものであり、０．１％ＢＳＡ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを用いて２４時間処理した。ヘマトキシリン及びエオシン染色によって気管支生検のモフォロジを示している。ファイブリン−１の染色をアイソタイプ対照の存在下で観察された染色のレベルと比較した。画像を４０倍の倍率で撮影し、３人の非喘息患者ボランティアと３人の喘息患者ボランティアから得た試験した生検材料を代表している。  Ａ．ＴＧＦβによる処理によって、非喘息患者ボランティアから得た生検材料におけるファイブリン−１の染色強度が変化することはなかった。  Ｂ．１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで刺激した喘息患者ボランティアから得た生検材料ではファイブリン−１の強度が増加している。
【図６】Ａ．ＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１及びフィブロネクチンの基底部への共局在化。非喘息患者ボランティア及び喘息患者ボランティアから採取した細胞を０．１％ＢＳＡで２４時間処理した。重ね合わせた画像がファイブリン−１及びフィブロネクチンの合計を示す。画像を４０倍の倍率で撮影し、５人の非喘息患者ボランティアと４人の喘息患者ボランティアから採取し、検討した細胞株を代表する。Ｂ．免疫組織化学解析によるＴＧＦβで処理した気管支リング組織部におけるファイブリン−１及びフィブロネクチンの共局在化。非喘息患者ボランティアから採取したリングを１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで２４時間処理した。ヘマトキシリン及びエオシン染色によって気管支リングのモフォロジを示している。ファイブリン−１及びフィブロネクチンの染色をアイソタイプの存在下で観察された染色のレベルと比較した。画像を２０倍の倍率で撮影し、７人の非喘息患者ボランティアから採取し、試験した試料を代表している。ファイブリン−１及びフィブロネクチンは基底膜及びＡＳＭバルクにおいて共局在化した。
【図７】Ａ．ＡＳＭ細胞により産生したＥＣＭへのファイブリン−１の沈着。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる処理によって非喘息患者（ｎ＝１０）ボランティア（左図、白いバー）から採取したＥＣＭへのファイブリン−１の沈着は変化しなかったが、喘息患者（ｎ＝１０）ボランティア（ｐ＜０．０５）（右図、黒いバー）から採取したＥＣＭへのファイブリン−１の沈着は増加した（ＥＣＭ  ＥＬＩＳＡを使用して測定）。データは非刺激細胞に対比する倍率変化として表した。Ｂ．ＡＳＭ細胞により産生したＥＣＭへのフィブロネクチンの沈着。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる処理によって非喘息患者（ｎ＝１０）ボランティア（左図、白いバー）から採取したＥＣＭへのフィブロネクチンの沈着は変化しなかったが、喘息患者（ｎ＝１０）ボランティア（ｐ＜０．０１）（右図、黒いバー）から採取したＥＣＭへのフィブロネクチンの沈着は増加した（ＥＣＭ  ＥＬＩＳＡを使用して測定）。データは非刺激細胞に対比する倍率変化として表した。
【図８】ドットブロット法を使用した、５人の喘息患者ボランティア及び４人の非喘息患者ボランティアから採取し、０．１％ＢＳＡ、５％ＦＢＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで処理したＡＳＭ細胞の上清に含まれるファイブリン−１の量の濃度測定評価。データは陽性対照との関連で表した。
【図９】Ａ．ドットブロット技法を使用した、治療を行っていない２１人の喘息患者ボランティア、コルチコステロイドを投与された１５人の喘息患者ボランティア及び２０人の非喘息患者ボランティアの血清に含まれるファイブリン−１の量の濃度測定評価。喘息患者ボランティアの血清中のファイブリン−１の量は非喘息患者ボランティアよりも多かった（ｐ＜０．０１）（左図）。しかしながら、コルチコステロイドは、喘息患者ボランティアから採取した血清中のファイブリン−１の量に影響を及ぼさなかった（右図）。データは陽性対照との関連で表した。Ｂ．ドットブロット法を使用した、２０人の喘息患者ボランティア及び１１人の非喘息患者ボランティアのＢＡＬＦに含まれるファイブリン−１の量の濃度測定評価。コルチコステロイドによる治療を受けていない喘息患者ボランティアのＢＡＬＦ中のファイブリン−１の量は非喘息患者ボランティアの３倍である（ｐ＜０．０１）（左図）。しかしながら、コルチコステロイドは、喘息患者ボランティアから採取したＢＡＬＦ中のファイブリン−１の量に影響を及ぼさなかった（右図）。データは陽性対照との関連で表した。
【図１０】Ａ．ＴＧＦβにより、生理的食塩水を投与した（投薬を受けたことがない）動物と比較してメタコリンに対する特異的気道抵抗が増加した。抗ファイブリン−１アンチセンスオリゴヌクレオチド混合物（ＡＯ）とＴＧＦβの併用療法により、メタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道抵抗の進行が阻害された。すなわち、投薬を受けていない動物と比較してメタコリンに対する特異的気道抵抗に差はなかった。また、スクランブルファイブリンＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道抵抗の上昇を示した。ＴＧＦβを投与しない場合には、ＡＯ又はスクランブルＡＯを投与したマウスはメタコリンに対する特異的気道抵抗の変化を示さなかった。＊＊＊ｐ＜０．０１、生理的食塩水／生理的食塩水との比較。Ｂ．ＴＧＦβのみを投与した場合には、投薬せず、生理的食塩水を投与した動物と比較してメタコリンに対する特異的気道コンプライアンスが減少した。ＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスでは、投薬をしないマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道コンプライアンスの変化は見られなかった。スクランブルＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、投薬をしないマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道コンプライアンスの減少を示した。ＴＧＦβを投与しない場合には、ＡＯ又はスクランブルＡＯを投与したマウスはメタコリンに対する減少した特異的気道コンプライアンスで変化を示さなかった。  ＊＊＊ｐ＜０．０１、生理的食塩水／生理的食塩水との比較。
【図１１】Ａ．創傷治癒解析を使用した喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率。非喘息患者（ｎ＝４）ボランティア及び喘息患者（ｎ＝３）ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を０．１％ＢＳＡで７２時間を超えて処理した。データは、閉鎖した当初の創傷面積の割合として表し、（平均±ＳＥＭ）として示し、０時間と比較した。創傷誘発後２４時間が経過した時点では、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒が増加した（Ｐ＜０．０５）。Ｂ及びＣ．創傷治癒解析を使用したＴＧＦβで処理したＡＳＭ細胞における創傷治癒率。（Ｂ）喘息患者（ｎ＝３）ボランティア及び（Ｃ）非喘息患者（ｎ＝４）ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を０．１％ＢＳＡ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで７２時間を超えて処理した。データは、閉鎖した創傷面積の割合として表し、（平均±ＳＥＭ）として示し、０時間と比較した。創傷誘発後４８時間が経過した時点では、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティア両方から得たＡＳＭ細胞の創傷治癒率は増加した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。
【図１２】ＴＧＦβで処理したＡＳＭ細胞の創傷治癒率に対するファイブリン−１の影響。非喘息患者（ｎ＝４）ボランティア及び喘息患者（ｎ＝３）ボランティアから細胞を採取した。ＡＳＭ細胞に対して２００ｎＭスクランブルアンチセンス又はＪＳＲ１３０７によるトランスフェクションを７２時間行い、そして１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで７２時間を超えて処理した。データは、閉鎖した当初の創傷面積の割合として表し、（平均±ＳＥＭ）として示した。統計値を７２時間において非喘息患者ボランティア、ＴＧＦβ、スクランブルアンチセンスの値と比較した。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで刺激することにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてのみ創傷治癒率が上昇した。喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１をサイレンシングすることにより、創傷治癒率の上昇は発生せず、非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率に戻った。
【図１３】ＡＳＭ細胞の創傷治癒率に対する喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭにおけるファイブリン−１の影響。非喘息患者（ｎ＝８）ボランティア及び喘息患者（ｎ＝４）ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を喘息患者（ｎ＝４）ボランティアから採取したＥＣＭに播種した。ＥＣＭに対して２００ｎＭスクランブルアンチセンス又はＪＳＲ１３０７を用い７２時間トランスフェクションを行い、（Ａ）０．１％ＢＳＡ又は（Ｂ）１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを用い７２時間を超えて処理した。データは、初期の創傷サイズに対する閉鎖した創傷面積の割合として表し、（平均±ＳＥＭ）として示した。統計値を７２時間においてスクランブルアンチセンスによるトランスフェクションを行った喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭに播種した非喘息患者ボランティアの細胞と比較した。Ａ及びＢ．１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下では、喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭに播種した喘息患者ボランティアから採取した細胞は早い創傷閉鎖を示した（両ケースでＰ＜０．００１）。Ａ．喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭにおいてファイブリン−１をサイレンシングすることにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の創傷閉鎖率は非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷閉鎖率に戻った。Ｂ．喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭにおいてファイブリン−１をサイレンシングすることにより、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の創傷治癒率は、喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭに播種した非喘息患者ボランティアから採取した細胞と比較してさらに低下した（両ケースでＰ＜０．０５）。
【図１４】創傷治癒率に対するＡＳＭ及びＥＣＭにおけるファイブリン−１の影響。（Ａ及びＢ）非喘息患者（ｎ＝４）ボランティア及び（Ｃ及びＤ）喘息患者（ｎ＝２）ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を喘息患者（ｎ＝４）ボランティアから採取したＥＣＭに播種した。ＥＣＭ及びＡＳＭ細胞に対してアンチセンス処理を行わないか、２００ｎＭ  ＪＳＲ１３０７によるトランスフェクションを７２時間行った。ＡＳＭ細胞は、（Ａ及びＣ）０．１％ＢＳＡ又は（Ｂ及びＤ）１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで７２時間を超えてさらに処理した。データは、初期の創傷面積に対する閉鎖した創傷面積の割合として表し、（平均±ＳＥＭ）でとして示した。ＡＳＭ細胞及びＥＣＭに対してファイブリン−１のサイレンシングを行った場合に創傷治癒率が減少している（全ケースでＰ＜０．０５）。  本明細書は、ＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．１を使用して作成したアミノ酸及びヌクレオチド配列情報を含む（文献情報の後に記載）。各アミノ酸及びヌクレオチド配列は、配列識別子で示している数値表示＜２１０＞で、配列表において特定している（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２等）。配列の長さ及び種類（アミノ酸、ＤＮＡ等）及び各配列のための由来生物は、それぞれ数値表示フィールド＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞の情報によって示される。本明細書におけるアミノ酸及びヌクレオチド配列は、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」及び配列識別子で示している（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２等）。本明細書における配列識別子は、配列表における数値表示フィールド＜４００＞の情報と相関関係を有し、その後に配列識別子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２等）が続く。すなわち、本明細書で詳述するようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、配列表における＜４００＞１として示される配列と相関関係を有する。  特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７で示されるアミノ酸配列は、ヒトファイブリン−１のアイソフォームＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６４８７）、Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６４８５）、Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９９６）及びＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６４８６）の配列をそれぞれ示す。これらのアイソフォームの対応するヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８で示される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から１４のヌクレオチド配列は、本明細書に記載するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書において、冠詞「１つの（a及びan）」は、その冠詞の文法的目的語の「一つ」又は「１以上」（すなわち少なくとも１）を意味する。
一例として、「構成要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、「１つの構成要素（ｏｎｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」又は「２以上の構成要素（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」を意味する。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなその変形は、文脈上特に断らない限り、記載した実在物又は工程又は実在物の群又は工程の群を含むことを意味するが、その他の実在物又は工程又は実在物の群又は工程の群を排除するものではないと解釈される。
【００４１】
本明細書において、ファイブリン−１に関して使用する「活性」という用語は、ファイブリン−１、ファイブリン−１をコードする核酸配列又はそのフラグメントあるいはファイブリン−１遺伝子産物自身又はそのフラグメントが及ぼすあらゆる細胞又は細胞外の機能、作用又は影響を意味する。従って、「活性」という用語は、ファイブリン−１の下流において作用する遺伝子又は遺伝子産物に対する１の活性に関連し、ファイブリン−１の発現とこれらの下流の遺伝子及び遺伝子産物の活性を含むものと解釈される。
【００４２】
本明細書において、ファイブリン−１の「発現及び／又は活性を阻害することができる物質」又はファイブリン−１の「阻害剤」とは、ファイブリン−１の発現及び活性のいずれか又は双方を直接又は間接的に阻害することができる物質又は作用を意味する。従って、阻害剤は、ファイブリン−１（その１種以上のアイソフォーム）、ファイブリン−１  ｍＲＮＡ（その１種以上のスプライス変異体）又はファイブリン−１遺伝子に直接又は間接的に作用するか、あるいは、ファイブリン−１関連経路の１種以上の要素を直接又は間接的に阻害することによって作用することができる。そのような要素は、ファイブリン−１の活性が生じる前、ファイブリン−１の活性と同時又はファイブリン−１の活性の結果として活性化、阻害又は調節される分子であってもよい。従って、阻害剤は、直接又は間接的に、転写、翻訳、転写後又は翻訳後プロセシングを防止するか、さもなければファイブリン−１又はファイブリン−１関連経路の成分の活性を阻害するように作用することができる。例えば、阻害剤は、核酸、ペプチド、その他の適当な化合物又は分子又はそれらの組み合わせであってもよい。当然のことながら、ファイブリン−１又はファイブリン−１関連経路の成分の活性を間接的に阻害する場合に、阻害剤は、ファイブリン−１又はファイブリン−１関連経路の成分によって調節又は修飾される分子の活性に作用することができる。
【００４３】
本明細書において、「有効な量」という用語は、無毒だが、所期の効果を得るために十分な物質又は化合物の量又は用量を含む。要求される正確な量又は用量は、治療対象の種、患者の年齢及び全身状態、治療対象の症状の重症度、投与する物質、投与方法等々の要因に応じて患者によって異なる。そのため、正確な「有効な量」を特定することはできない。しかしながら、当業者は、所与の患者に適切な「有効な量」を通常の実験のみによって決定することができる。
【００４４】
本明細書において、「発現」という用語は、コードされたタンパク質を含む遺伝子又は遺伝子産物の発現を意味する。遺伝子の発現は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写量を測定することによって判定することができる。ポリペプチド遺伝子産物の発現は、例えば、ポリペプチドに結合する抗体を使用した免疫測定法によって判定することができる。
【００４５】
本明細書において、「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語及び「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」や「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）」などの変形は、特定の事象、活性又は機能の完全な阻害を必ずしも意味するものではない。むしろ阻害は、所期の効果を得るために十分な程度及び／又は時間の阻害であってもよい。阻害は、事象、活性又は機能の予防、遅延、減少又は妨害であってもよい。そのような阻害は、大きさ及び／又は一時的なものであってもよい。特に、「阻害」及び「予防（防止）」という用語及びそれらの変形は同じ意味で使用する場合がある。
【００４６】
本明細書において、「ファイブリン−１レベルの正常化」という用語は、１以上の細胞におけるファイブリン−１の量、発現又は活性を調節する任意の手段を意味する。
【００４７】
本明細書において、「ファイブリン−１」という用語は、ｆｂｌｎ１、ｆｂｌｎ又はｏｔｔｈｕｍｐ００００００２８５８９としても知られる分泌性糖タンパク質を意味する。ヒトの場合には、ファイブリン−１の４つのアイソフォーム（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が知られており、本明細書のからみで「ファイブリン−１」という用語は、これらのアイソフォームの１種又は全て、又はそれらをコードする核酸分子について使用する場合がある。従って、本明細書における「ファイブリン−１」という用語は、全ての形態の分子、それらの機能的誘導体又は同族体、全てのアイソフォーム、それらの機能的変異体及び多型変異体を含む。
【００４８】
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸からなるポリマーを意味する。本明細書において、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味で使用する。ただし、本発明の目的において、「ポリペプチド」は全長タンパク質の一部であってもよい。
【００４９】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基、それらの公知の類似体、天然ヌクレオチド又はそれらの混合物の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味する。本明細書においては、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は同じ意味で使用する場合がある。
【００５０】
本明細書において、「患者」という用語は、ヒト、霊長動物、家畜動物（例えば、羊、豚、牛、馬、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオン・アニマル（例えば、犬、猫）、捕獲された野生動物（例えば、キツネ、カンガルー、シカ）を含む。 通常、哺乳動物はヒト又は実験動物である。さらに、哺乳動物は通常はヒトである。
【００５１】
本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ、ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ、ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、病態又は症状を改善し、病態又は疾患を予防、あるいはさもなければ病態又は疾患の進行、又は他の望ましくない症状を予防、防止、遅延又は回復させるあらゆる全ての手段（ｕｓｅ）を意味する。従って、「治療」、「予防」等という用語は、それらの最も広い意味において解釈される。例えば、「治療」という用語は、患者が完全に回復するまで治療することを必ずしも意味する訳ではない。同様に、「予防」という用語は、患者が特定の症状又は疾患に最終的に罹患しないことを必ずしも意味する訳ではない。むしろ「予防」という用語は、特定の症状又は疾患の重症度を軽減するか、特定の症状又は疾患の徴候を遅らせることも含む。喘息等のいくつかの症状との関連で、本発明の方法は、症状の進行の結果として生じる非常に望ましくない不可逆的な結果の発生を低減し又は解消する点において症状を「治療」することを含むが、症状の最初の発生、例えば喘息の発作の発生を予防するものではない場合もある。従って、「治療」及び「予防」という用語は、特定の症状を改善あるいは特定の症状を発展するリスクを予防又は軽減することを含む。
【００５２】
ファイブリン−１は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を構成し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の安定化を支援する分泌性糖タンパク質である。ファイブリン−１は、インビボでフィブロネクチン、ラミニン、フィブリノゲン、アグレカン等のプロテオグリカンを含む他の様々なタンパク質と結合することが分かっている。ファイブリン−１は、細胞接着、細胞移動及び細胞分化を調停する役割を果たすと考えられている。 例えば、ファイブリン−１はフィブリノゲンに結合することによって血小板接着を調停することが分かっている。ファイブリン−１は、反復性の表皮成長因子様ドメインの存在によって特徴付けられる分泌性糖タンパク質ファミリーに属する。ファイブリン−１の４つのアイソフォームがヒトにおいて今までに特定されており、ファイブリン−１Ａ、ファイブリン−１Ｂ、ファイブリン−１Ｃ、ファイブリン−１Ｄと呼ばれている。これらのアイソフォームは、異なるＣ末端配列を有するスプライス変異体である。
【００５３】
ファイブリン−１の発現又は活性の調節異常の影響についてはほとんど知られていない。近年、ファイブリン−１は卵巣癌及び乳癌を含むいくつかの癌に関連付けられている。
【００５４】
本明細書に開示及び例示するように、本発明者らは、ファイブリン−１が喘息患者と非喘息患者との間で気道組織において異なる形態で発現することを初めて特定した。また、本発明者らは、ファイブリン−１レベルは非喘息患者と比較して喘息患者の血清及び気管支肺胞洗浄液の両方において増加し、ファイブリン−１の発現は胎児ウシ血清（ＦＢＳ）や形質転換増殖因子β等の増殖及び線維化因子によって顕著に刺激されることを見出した。本明細書には、マウス喘息モデルにおいてファイブリン−１の発現を阻害することによって気道過敏性を減少させることができることのインビボの証拠を開示している。さらに、本明細書に例示するように、本発明者らは、予期せぬことに、ファイブリン−１は喘息患者における気道平滑筋細胞の創傷治癒を促進し、ファイブリン−１の発現を阻害することによって当該能力が見られなくなることを見出した。
【００５５】
従って、これらの知見は、喘息等の異常な気道組織リモデリングに関連する症状の識別及びそのような症状に対する素因の識別のための新規な診断ツールだけではなく、そのような症状の治療のための新たな治療的なアプローチも提供するものである。組織リモデリングは、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症や嚢胞性繊維症などの肺線維症、及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）等のいくつかの気道疾患の望ましくない結果である。従って、これらの疾患の治療方法が開発されなければ、組織リモデリングを減少させるための手段の本発明者らによる開発は、多くの気道疾患の非常に望ましくない不可逆的な結果の発生又は重症度を減少させるための治療・予防方法の合理的な設計を可能とする重要な知見である。
【００５６】
従って、本発明の１つの態様は、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は前記症状の治療又は予防を必要とする患者に、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で投与することを含む。
【００５７】
本発明の別の態様は、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状又は前記症状に対する罹患性又は素因を診断するための方法を提供し、患者の体液、気道組織又は細胞におけるファイブリン−１レベルを決定することを含む方法を提供する。前記体液は、血清又は気管支肺胞洗浄液であってもよい。前記細胞は、気道平滑筋細胞であってもよい。
【００５８】
また、本発明の実施形態は、本発明の方法に従って使用するための医薬組成物をも提供する。
【００５９】
以下に詳細に説明するように、本発明の実施形態は、異常な気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状の治療、予防及び／又は診断に適用することができる。そのような症状の例としては、例えば、これらに限定するものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、嚢胞性繊維症及びリンパ管平滑筋腫（ＬＡＭ）が挙げられる。
【００６０】
本発明を単一の理論又は作用形態に制限するものではないが、ファイブリン−１は喘息等の多くの症状の根底にある気道組織リモデリングプロセスにおいて直接又は間接的な役割を果たす可能性があると仮定される。従って、本発明は、気道組織リモデリングの発生を調節する方法意図し、該方法は患者の気道組織におけるファイブリン−１レベルを調節することを含み、前記組織におけるファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して正常化することによって組織リモデリングの発生をダウンレギュレートする。
【００６１】
ファイブリン−１レベルを調節することによって気道組織リモデリングの「発生」を調節するとは、ファイブリン−１が、「組織リモデリング」を通常構成する細胞的事象に対して直接的に作用しないかもしれないが、１以上の組織リモデリング病理の進行に順に影響を与える関連した細胞的事象に作用し得ることを意味する。そのために、当然のことながら、「組織リモデリング」とは、組織リモデリング現象を構成する細胞的事象及び病理学的結果の１以上を意味する。気道組織リモデリングは完全に解明されている訳ではないが、病理学的レベルでは、気道リモデリングは、平滑筋肉量の増加、粘液腺増殖、慢性炎症性細胞浸潤物の残存、線維形成性成長因子の放出、コラーゲン沈着、網状板の肥大及び増加した細胞外マトリックスの沈着の１以上を通常は含む。従って、ある疾患の症状との関連で気道組織リモデリングに関連する病理学的範囲は別の症状に対して異なる場合があるため、「組織リモデリング」は上記事象の１以上を意味する。
【００６２】
「気道組織」とは、口及び鼻の奥から肺（肺胞とともに）につながる通路の組織を意味する。これらの通路のうちで最も大きな通路は気管（trachea）、（windpipeとしても公知）である。胸では、気管は気管支と呼ばれる２つの小さな通路に分かれ、各気管支は、主気管支、葉気管支、区気管支と呼ばれる３つの領域によってさらに特徴付けられる。各気管支は肺の１つに入り、細気管支と呼ばれる狭い通路に分かれる。終末細気管支は肺胞がつながっている。このような通路のネットワークは口語表現では「気管支樹」と呼ばれる場合が多く、喘息の場合にはそれらの内層の炎症、筋肉収縮、膨張が生じ、肺内及び肺外への気流が減少する。この組織は最終的にリモデリングされ、それによって肺機能の不可逆的な低下に関してさらに合併症が生じる。
【００６３】
「正常な内因性レベル」とは、異常な気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状に罹患しておらず、また前記症状に対する素因を有していない患者の気道組織において発現するファイブリン−１のレベルである。当業者には、個人の群の間に差があるために、「正常なレベル」とは、単一の均一な離散的レベルとは対照的に、ある範囲のレベルに対応することを理解されるだろう。「群」とは、治療を受けている患者に特有の１以上の特徴によって特徴付けられる群を意味する。これらの特徴の例としては、これらに限定するものではないが、例えば、年齢、性別又は民族性が挙げられる。従って、ファイブリン−１レベルを正常な内因性レベルに対して調節することは、治療される個人と同じ群の代表である正常な個人について決定した別のファイブリン−１レベルに対して、又は異なる群の領域の個人に対応する個人群によって発現されたものに相当する確定したファイブリン−１レベルの範囲に対して気道組織におけるファイブリン−１レベルを増減させることを意味する。ファイブリン−１レベルの調節に関して、本発明の実施形態では、正常な内因性レベルに近付けるために気道組織におけるファイブリン−１レベルをダウンレギュレートすることを提供する。そのために、完全な正常化が通常は望ましいけれども、望ましい結果を得るために患者のファイブリン−１レベルを必ずしも完全に正常化する必要はない。当然のことながら、本発明の方法は、特定の状況の要件に応じて一時的に又は継続的に適用することができる。さらに、当然のことながら、正常な内因性レベルを超えてファイブリン−１レベルを減少させることが望ましい又は有益な場合もある。正常な内因性レベルを超えてファイブリン−１レベルを減少させることも本明細書の意図するところであり、本明細書の囲に含まれる。
【００６４】
当業者には明らかなように、状況次第で、例えば、補助療法又は予防的治療の有効性のスクリーニングや気道組織リモデリングの現行の解析を容易にするためのシステムを提供するなどの結果を容易に得るために、例えばインビトロモデル又は動物モデルにおいて気道炎症及び／又は組織リモデリングの発生を誘発又はアップレギュレートすることが望ましい場合がある。そのために、患者の気道組織の内因性ファイブリン−１レベルを増加させることによりこの結果を達成することができる。この場合、「増加させる」とは、前記増加が部分的又は全体的であり、所望の事象の発生を容易化する程度に依存する点において、「正常化する」と類似した意味を有する。
【００６５】
また、本発明は、気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状に罹患した、もしくは前記症状に対する素因を有する患者の組織における、異常、過度又は望ましくない創傷治癒を阻害するための方法を提供する。通常、創傷治癒の阻害がファイブリン−１の発現及び／又は活性の阻害を含む場合には、前記方法は、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害することができる少なくとも１種の物質を有効な量で患者に投与することを含む。
【００６６】
本発明の実施形態によれば、通常、患者の１以上の異常細胞及び／又はそのような細胞に関連する細胞外マトリックスにおいて創傷治癒を阻害する。この場合、異常細胞は、本明細書に記載する気道の疾患の発現、進行又は症状に関わる又は関連付けられる、あらゆる種類の細胞を意味する。例として、異常細胞は、気道平滑筋細胞、上皮細胞又は線維芽細胞であってもよい。ただし、当業者には明らかなように、本発明の実施形態はそれらの細胞に限定されるものではない。ファイブリン−１の発現又は活性を阻害する場合には、本発明の実施形態は前記細胞及びそのような細胞に関連する細胞外マトリックスのいずれか又は双方においてファイブリン−１の発現又は活性を阻害することができる。
【００６７】
当業者には明らかなように、本発明の方法は生体内、生体外又は体外で実施することができる。通常、方法は治療的又は予防的に個人の治療を生体内で行うものだが、それにもかかわらず当然のことながら、本発明の方法は以下に詳述するように生体外ないし体外の環境に適用することが望ましい場合もある。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、ファイブリン−１の発現及び／又は活性を阻害又は抑制することができる１種以上の物質を投与することができる。そのような阻害剤は、直接又は間接的にファイブリン−１の発現に作用し、ファイブリン−１遺伝子のレベルで、又はファイブリン−１  ｍＲＮＡ（前駆体又は成熟体）又はファイブリン−１ポリペプチドを含むファイブリン−１遺伝子のあらゆる産物のレベルで作用することができる。阻害剤は、ファイブリン−１遺伝子又はその機能的部分（プロモータ部位等）の転写及び／又は翻訳を調節するか、あるいはファイブリン−１の発現を直接又は間接的に調節する別の遺伝子又は遺伝子産物又はその機能的部分の転写及び／又は翻訳を調節するタンパク質分子又は非タンパク質分子又であってもよい。阻害剤はアンタゴニストであってもよい。アンタゴニストは、ファイブリン−１が通常の生物学的機能を実施することを妨害、阻害又は防止することができるあらゆる化合物であってもよい。本明細書では、「アンタゴニスト」という用語は、ファイブリン−１の活性及び発現に対する阻害剤を意味するものとして使用する。
【００６９】
様々な適当なアンタゴニストを使用することができ、本発明の範囲は何らかの１つの特定の分子又は化合物の選択によって限定されるものではない。好適なアンタゴニストとしては、モノクローナル抗体等の抗体及びファイブリン−１遺伝子又はｍＲＮＡの転写又は翻訳を防止するアンチセンス核酸が挙げられる。発現の調節は、抗原、ＲＮＡ、リボソーム、ＤＮＡザイム、アプタマー、抗体又は共抑制における使用に適した分子を利用して行うことができる。
【００７０】
好適な抗体の例としては、これらに限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。抗体は、ファイブリン−１ポリペプチド又はそのフラグメント又は類似体のアンタゴニストとして機能し得る。好ましくは、抗体はファイブリン−１ポリペプチドの不連続部位又はフラグメントから調製する。好適な抗体の生成方法は既に当業者には明らかだろう。例えば、好適なモノクローナル抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されたハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。上記文献の開示内容はこの参照によって本明細書に援用する。
【００７１】
ファイブリン−１活性を阻害することができるモノクローナル抗体は公知である。例えば、マウス抗ヒトファイブリン−１モノクローナル抗体Ｐ５Ｂ１、Ｐ３Ｂ４、Ｐ１Ｂ２、ＭＥＭ−２及び３Ａ１１が既に開示されている（Ａｒｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０及びＰｕｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照；上記文献の開示内容はこの参照によって本明細書に援用する）。本発明に従ってそのような抗体も使用することができる。
【００７２】
本発明に従って使用される好適なアンチセンス構造体としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、触媒アンチセンス核酸構造体が挙げられる。好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは当業者に周知の方法によって調製することができる。通常、オリゴヌクレオチドは自動合成機によって化学的に合成する。当業者には明らかなように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的配列に対して１００％の配列相補性を有する必要はない。オリゴヌクレオチドが標的に対して特異性及びアンタゴニスト活性を有しながらも相補性が１００％未満となるように１以上の塩基を変更してもよい。好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ヌクレオチドがデオキシリボース又はリボース環の代わりにモルホリン環を含み、フォスフェートではなくホスホロジアミダート基で結合されたモルホリノが挙げられる。例として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及び１０の配列は、気道平滑筋細胞においてファイブリン−１の発現を阻害することができる２つのオリゴヌクレオチドを示す。
【００７３】
業界で公知の方法（例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３−２９６；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８；ＷＯ  ９９／４９０２９及びＷＯ  ０１／７０９４９を参照；上記文献の開示内容はこの参照によって本明細書に援用する）に従って、ファイブリン−１をコードする核酸分子の発現又は活性を阻害するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：４９８５を参照）として知られる新しいアンチセンス技術も使用することができる。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）による特異的ＲＮＡの破壊を利用した選択的転写後遺伝子抑制手段である。ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡの開裂によって生じ、一本の鎖は不活性化するメッセージと同一である。一本の鎖がファイブリン−１転写の特定領域と同一であり、直接導入された二本鎖ＲＮＡ分子は合成することができる。あるいは、細胞内において二本鎖ＲＮＡに変換される対応する二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。ＲＮＡｉに使用する好適な分子の合成方法及び転写後遺伝子抑制方法は当業者に公知である。
【００７４】
ファイブリン−１の発現又は活性を阻害する別の手段としては、ファイブリン−１  ｍＲＮＡ転写産物を開裂させることができるリボザイム等の触媒アンチセンス核酸構造体を導入することが挙げられる。リボザイムは、リボザイム触媒部位を攻撃する標的との配列相補性を有する２つの領域によって特定の配列を標的とし、アニーリングされる。結合後、リボザイムは部位特異的方法で標的を開裂させる。ファイブリン−１  ｍＲＮＡ配列を特異的に認識し、開裂するリボザイムの設計及び試験は当業者に周知の技法で達成できる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，（１９９５）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：５４０−５５１を参照；上記文献の開示内容はこの参照によって本明細書に援用する）。
【００７５】
必要に応じて、本発明に従って使用する物質は、ペプチド、ポリペプチド又は他のタンパク質又は非タンパク質分子等の他の化合物に融合させることができる。例えば、物質を気道組織への局在化を容易にする分子に融合することができる。
【００７６】
本発明に従って使用する好適な調節物質のスクリーニングは、しかしそれらに全く限定するものでないが、例えば、ファイブリン−１遺伝子又はその機能的等価物又は誘導体を含む細胞に物質を接触させ、ファイブリン−１タンパク質の産生又は機能的活性の調節、ファイブリン−１をコードする核酸分子の発現の調節又は下流のファイブリン−１細胞標的の活性又は発現の調節をスクリーニングする方法等のいくつかの適当な方法のどれか１つによって行うことができる。そのような調節の検出は、ウェスタンブロット法、電気泳動移動度シフト解析及び／又はルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のレポーターの読み取りなどの技法を利用することによって行うことができる。
【００７７】
本発明に従って使用する物質は、１以上のファイブリン−１アイソフォームの発現又は活性を調節することができる。例えば、ヒトにおいて、４つのアイソフォーム（ファイブリン−１Ａ、ファイブリン−１Ｂ、ファイブリン−１Ｃ及びファイブリン−１Ｄ）が特定されている。 これらのヒトアイソフォームのアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５及び７としてそれぞれ示す。コードするヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６及び８としてそれぞれここに示す。従って、本発明に従って使用するアンタゴニストは、調節対象のファイブリン−１がヒトに由来するこれらの配列の１以上を標的とするか、結合するか、さもなければ相互作用することができる。
【００７８】
医薬組成物
１種以上の製薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができる医薬組成物の形態で物質を本発明に従って投与することができる。そのような組成物は、非経口、経口、経鼻又は局所経路等の簡便かつ適当な任意の経路で投与することができる。通常は、呼吸の通路を通して投与する。 適切な濃度の所望の物質を治療すべき体の部位に直接供給することが必要な場合には、全身よりむしろ局所に投与することができる。局所投与により、非常に高い局所濃度で所望の物質を必要な部位に供給することができ、身体のその他の臓器がその化合物に曝されることを回避しながら（副作用を潜在的に減少させながら）、所望の治療又は予防効果を適切に達成することができ、その結果副作用が減少する可能性がある。
【００７９】
当然のことながら、任意の特定の個人に投与する本発明の組成物の用量レベルは、例えば、使用する特定物質の活性、治療対象の個人の年齢、体重、健康状態及び食事、投与時間、排せつ量、他の治療又は療法との組み合わせを含む様々な要因に依存する。治療にあたる医師の選択する用量レベル及び投与パターンで、１回又は複数回の投与を行うことができる。広範囲な用量を適用することができる。患者を考慮して、例えば、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１ｍｇ／日で物質を投与することができる。投薬計画は、最適な治療反応が得られるように調節することができる。例えば、幾つかに分割した用量を、毎日、毎週、毎月又はその他の適当な時間間隔で投与することができ、その用量は、状況の危急の兆候に応じて釣り合うように減少することができる。
【００８０】
調節物質は、製薬学的に許容し得る無毒性塩の形態で、酸付加塩又は例えば亜鉛又は鉄等との金属錯体（この用途では塩と見なされる）として投与することができる。 酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。製薬学的に許容しうる担体又は希釈剤の例としては、脱塩又は蒸留水；生理的食塩水；落花生油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、胡麻油、落花生油又はココナツ油等の植物油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等のポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアラン等の鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルカノール；低級アラルカノール；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸エチル等の脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラギーナン；トラガカントゴム、アラビアガム、ワセリンが挙げられる。通常、担体の含有量は組成物の１０〜９９．９重量％である。
【００８１】
注射による使用に好適な医薬の形態としては、無菌水溶液（水溶性）又は分散液及び無菌注射剤又は分散液の即時調合のための無菌粉末が挙げられる。製剤は、製造及び保管条件下において安定していなければならず、細菌や真菌等の微生物に汚染されないように保管する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物及び植物油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持又は界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。微生物の作用は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の各種の抗菌剤・抗真菌剤を使用することによって防止することができる。多くの場合、砂糖又は塩化ナトリウム等の等張物質を含むことが好ましい。注射用組成物の吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収遅延物質を組成物に用いることによって遅延させることができる。
【００８２】
無菌注射剤は、必要量の活性化合物を上記列挙した様々なその他の成分を含む適当な溶媒に添加し、必要に応じて濾過滅菌を行うことによって調製する。通常、分散液は、基本分散媒及び上記に列挙したその他の成分からの所要の成分を含む無菌賦形剤に各種無菌活性成分を添加することによって調製する。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合には、前もって無菌濾過した溶液から活性成分及び所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥技法が調製方法として好ましい。
【００８３】
活性成分が適当に保護されている場合には、例えば、不活性希釈剤又は吸収性食用担体と共に経口投与するか、ハード又はソフトゼラチンカプセルに充填するか、錠剤に圧縮成型するか、食品に直接添加することができる。治療のための経口投与の場合には、活性化合物を賦形剤と組み合わせ、錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハ等摂取可能な形態で使用することができる。そのような組成物及び製剤は、活性化合物を少なくとも１重量％含むものとする。もちろん、組成物及び製剤の含有量は、単位重量の約５〜約８０％の範囲で適宜変更することができる。そのような治療に有用な組成物における活性化合物の量は、適当な用量が得られるように調節する。本発明において好ましい組成物又は製剤は、経口投薬単位形態として約０．１μｇ〜２０００ｍｇの活性化合物を含むように調製する。
【００８４】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は、以下にリストアップするような化合物；ガム、アラビアガム、コーンスターチ、ゼラチン等のバインダ；第二リン酸カルシウム等の賦形剤；トウモロコシ澱粉、バレイショ澱粉、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；スクロース、乳糖、サッカリン等の甘味剤；、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバー等の香味剤をさらに含むことができる。投薬単位形態がカプセルである場合には、上述した材料に加えて液体担体を含むことができる。その他の様々な材料をコーティングとして使用したり、投薬単位の物理的形状を変えるために使用することができる。例えば、錠剤、丸薬又はカプセルは、シェラック又は糖又はそれらの両方でコーティングすることができる。シロップ又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、染料、チェリー又はオレンジフレーバー等の香味剤、を含むことができる。もちろん、投薬単位形態を調製する際に使用される如何なる材料も、製薬学的に純粋かつ使用量において実質的に無毒でなければならない。また、活性化合物は徐放性薬剤及び製剤に組み込むことができる。
【００８５】
本発明は、本明細書に記載する物質を、所望の治療又は予防結果を容易に得ることができるその他の適当な物質と共に投与する併用療法も意図するものである。例えば、喘息の場合には、本発明の実施形態に従って物質を使用しながら、炎症の発生を制御するために継続中の抗炎症療法を維持しようとする場合がある。「共に投与する」とは、同一又は異なる経路を通る同一の製剤又は２つの異なる製剤における同時投与、又は同一又は異なる経路による連続投与を意味する。「連続」投与とは、２種類の分子の投与間に数秒、数分、数時間又は数日の時間差があることを意味する。これらの分子は任意の順番で投与することができる。
【００８６】
ファイブリン−１の投与
本発明のいくつかの実施形態では、ファイブリン−１又はその誘導体、変異体又は同族体の投与を意図する。ファイブリン−１はヒトに由来するものであってもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５又は７のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６又は８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。ファイブリン−１は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドとして投与することができる。従って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを投与することも想定できる。また、本発明は、ヒト由来ファイブリン−１の誘導体、変異体又は同族体を使用することも意図する。
【００８７】
ファイブリン−１ポリヌクレオチドは、天然の又は組換え型の又は合成のポリヌクレオチドであってもよく、適当な供給源から精製して得るか、当業者に周知の標準的な遺伝子組換えＤＮＡ技術によって製造することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。上記文献の開示内容はこの参照によって本明細書に援用する。ファイブリン−１をコードするポリヌクレオチドを投与する場合には、ポリヌクレオチドは、通常、細胞によってコード配列を発現させることができる適当な調節配列に作動的に結合されたベクター内に存在する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現調節シグナルを含む。これらの調節配列は、発現ベクターの設計対象である細胞と適合するように選択することができる。β−アクチンプロモータ及びミオシン軽鎖プロモーター等の哺乳類プロモーターを使用することができる。ただし、他のプロモーターを使用して、同じ効果を得ることもできる。これらの代替プロモーターは、通常は当業者に周知である。
【００８８】
ファイブリン−１の誘導体は、天然又は非天然供給源からの機能的フラグメント、部分又は変異体を含む。非天然供給源としては、例えば組換え型又は合成供給源が挙げられる。「組換え型供給源」とは、対象分子を採取する細胞供給源が遺伝子操作されていることを意味する。これは、例えば、特定の細胞供給源による産生率及び産生量を増加又は高めるために行われる。部分又はフラグメントの例としては、当業者に周知の合成又は組換え手段によって得ることができる分子の機能的に活性な領域が挙げられる。また、誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換によっても得ることもできる。また、誘導体は、ペプチド、ポリペプチド又はその他のタンパク質分子又は非タンパク質分子に融合したタンパク質の特定の部分を有するフラグメントであってもよい。例えば、ファイブリン−１を分子に融合させて気道組織の局在化を容易にすることができる。
【００８９】
本明細書において、ファイブリン−１の「変異体」とは、変異体であるファイブリン−１の形態の機能的活性を少なくともいくつか示す分子を意味する。変異体は任意の形態を有することができ、天然又は非天然で生みだされてもよい。
【００９０】
本明細書において、「同族体」とは、分子が本発明の方法に従って使用される種以外の種に由来することを意味する。例えば、使用される種以外の種が、治療されている患者によって自然に産生されるファイブリン−１と同様かつ好適な機能的特性を示す形態のファイブリン−１を産生する場合が挙げられる。
【００９１】
診断
喘息に罹患した個人の気道組織、血清及び気管支肺胞洗浄液においてファイブリン−１レベルの増加が見られることを判定することにより、個人が喘息等の気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状に罹患しているか、さもなければ前記症状に罹患しやすい又は前記症状に対する素因を有していることを判断するための個人のスクリーニング手段を提供することができる。
【００９２】
従って、本発明の１態様は、患者における気道炎症及び／又は気道組織リモデリングに関連する症状又は前記症状に対する罹患性又は素因を診断するための方法を提供し、前記患者の生体試料におけるファイブリン−１レベルを決定することを含む方法を提供する。
【００９３】
当然のことながら、本発明の本態様に従ってスクリーニングされる生体試料は、気道組織のファイブリン−１レベルを示す任意の好適な試料であってもよい。試料は、気道組織の生検標本であり、又は血液（血清）、誘発痰、呼気凝縮液又は洗浄試料等のその他の形態の試料であってもよい。
【００９４】
好適な方法は、症状に対する罹患性を診断するためにファイブリン−１レベルの増加についてスクリーニングするものであるが、例えば、治療又は予防的な治療計画の改善又は治療又は予防的な治療計画にたいする反応性を監視するために、ある状況下ではこの分子のレベルの減少を検出することが望ましい場合もある。従って、本発明は、ファイブリン−１レベルの減少のスクリーニングも含むものであると理解される。当業者には明らかなように、このようなタイプのスクリーニング法では、正常レベルに対してのみではなく、以前に得られた結果に対してスクリーニング結果を分析する場合がある。
【００９５】
ファイブリン−１レベルの減少のスクリーニング法は、当業者に周知の任意の適切な方法によって実施することができる。この関連で、当然のことながら「患者における」タンパク質及び／又は遺伝子発現レベルのスクリーニングとは、患者の関連組織におけるファイブリン−１の発現レベルに関連する情報を提供する任意の適当な技法の使用を意味するものである。従って、これらにスクリーニング技法は、インビボ・スクリーニング技法及び患者から抽出した生体試料に適用されるインビトロ・スクリーニング技法を含む。インビトロ・スクリーニング技法は、非常に簡単で一般的なために好ましい場合が多い。
【００９６】
本発明の実施形態は部分的にファイブリン−１レベルの変化のスクリーニングに基づくものであるため、そのような変化は実際タンパク質レベル又は核酸レベルにおいて、ファイブリン−１  ｍＲＮＡ転写物のレベルにおける増加をスクリーニングすることによる等、スクリーニングすることができる。当業者は、所与の状況における最も適切な分析手段を決定することができるだろう。しかしながら、利用されやすい技術の相対的な簡易性のために、タンパク質分子に対してスクリーニングを行うことが通常は好ましい。にもかかわらずある状況下において特定の生体試料を使用する場合には、遺伝子転写を直接分析することが望ましい、或いは有用な場合もある。
【００９７】
本発明の範囲を決して制限するものではないが、ファイブリン−１レベルの好適な識別方法としてはインビボ・分子イメージング（例えば、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：３５１−３５５，２０００）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＲＴＰＣＲ）、フローサイトメトリー、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫測定法が挙げられる。好適な免疫測定法は、例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号、第４，０１８，６５３号に記載されている。これらの測定法は、非競合的１サイト及び２サイト測定法及び従来の競合的タンパク結合測定法を含む。これらの測定法は、標識された抗原結合分子を標的抗原に直接結合させることを含む。
【００９８】
そのような方法を採用するための技術及びプロトコルは当業者に周知である。ファイブリン−１又はファイブリン−１をコードする核酸分子を検出するために任意の好適な技術を利用することができる。選択する技術の特質により、分析に要求される生体試料の種類が決まる場合がある。そのような判断は当業者が行うことができる。分析しようとする典型的な試料は気道の生検標本である。
【００９９】
また、本発明は、本発明の方法に従って使用するのに好適なキットを提供する。そのようなキットは、例えば、ファイブリン−１又はファイブリン−１をコードする核酸分子を検出するための物質、及び前記物質による検出を容易にするために有用な試薬を含む生体試料を分析するための診断キットを含む。さらに例えば、生体試料を収容するための手段も含むことができる。前記物質は、任意の好適な検出分子であってもよい。本発明に係るキットは、緩衝液及び／又は希釈剤等の、本発明の方法を行うために必要なその他の成分も含むことができる。キットは、通常は、各種の成分を収容するための容器と、キット成分を本発明の方法において使用するための取扱説明書を含む。
【０１００】
本明細書におけるどんな刊行物（又は刊行物から得られた情報）又は公知のどんな事項への言及も、刊行物（又は刊行物から得られた情報）又は公知の事項が本明細書の関連する活動の技術分野における一般的な共通常識の一部を形成するとの認識又は承認又は何ら形の示唆ではなく、かつ前記認識又は承認又は何ら形の示唆と解釈すべきでない。以下、詳細な実施例によって本発明について説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を制限すると決して解釈されない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１−気道平滑筋細胞におけるマイクロアレイ遺伝子発現解析
ヒトの喘息患者及び非喘息患者の気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞における遺伝子発現解析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムマイクロアレイを使用して行った。特に、非刺激ＡＳＭ細胞における遺伝子発現と、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（増殖因子）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）（炎症因子）又は形質転換増殖因子−β（ＴＧＦβ）（線維化因子）で刺激したＡＳＭ細胞における遺伝子発現とを比較した。
【０１０２】
ＡＳＭ細胞は、年齢及び性別を一致させた６人の提供者（男性：４人、女性：２人、３人は非喘息患者（平均年齢：２３．３３歳）、３人は喘息患者（平均年齢：２３歳））から採取した。喘息患者のうち、１人は軽度／アトピー性喘息に罹患しており、２人は中度／アトピー性喘息に罹患していた。ＡＳＭ細胞は、気管支鏡検査法によって得た気管支組織、肺移植によって得た肺組織又は顕微解剖による開胸術で切除した肺組織から採取した。肺組織の生体外実験における使用に対する倫理的承認は、Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ及びＳｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｒｅａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから得た。また、全ての患者からインフォームドコンセントを得た。
【０１０３】
ＡＳＭ細胞の単離と培養は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；２００１に記載された方法に従って行った。簡単に説明すると、解剖顕微鏡、無菌機器、無菌法を使用して、気管支気道は周囲の実質から切り取り、縦方向に切断した。次に、気管支を７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にしばらく浸漬して表面の微生物を殺滅した。次に、気管支を無菌ハンクス平衡塩溶液内で３回洗浄した。そして、上皮表面を上方に向けた状態で、気管支を無菌ペトリ皿内にピンで留めた。解剖顕微鏡を使用して、平滑筋束を露出させるために細い鉗子で上皮層を除去した。平滑筋束を周辺組織から切り離し、ハンクスを含む無菌Ｆａｌｃｏｎチューブ（１５ｍＬ）に入れた。次に、Ｆａｌｃｏｎチューブに対して２００ｇで５分間遠心分離を行った。分離した筋肉片を、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン、２μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを補完したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内に２．５ｍＬの１０％ＦＢＳを含むベント付き組織培養フラスコ（２５ｃｍ２）（Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に入れた。次に、フラスコを加湿されたＣＯ２インキュベータ（空気中に５％ＣＯ２）内に配置し、３７℃に維持した。
【０１０４】
７５ｃｍ２フラスコ内において、５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストラリア、ブルックリン）、１％抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、ハイデルバーグ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、ハイデルバーグ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、ハイデルバーグ）（増殖培地）内にＡＳＭ細胞（ｐａｓｓａｇｅ  ７）を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、加湿インキュベータ内において３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。細胞を３日間、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、１％抗菌−抗真菌剤、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ・サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、ハイデルバーグ）、ＤＭＥＭ（静止培地）内で静止させ、１つのフラスコのＡＳＭ細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、ハイデルバーグ）で２回洗浄し、氷上で保存し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  ｃｏ、ドイツ、デューレン）内に備わった溶解緩衝液を使用してリボ核酸（ＲＮＡ）抽出のために溶解し、抽出前に−２０℃で保存した。残りのフラスコは、静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ、静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国イリノイ州）又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）のいずれかで処理し、処理８時間後に同様にＲＮＡ抽出のために溶解した。
【０１０５】
全細胞ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  ｃｏ、ドイツ、デューレン）及びＱＩＡＧＥＮ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、オーストラリア、ドンカスター）を使用して以下のように変更したプロトコルで単離した。細胞は、７μＬのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）及びＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキットの７００μＬのＲＡ１を使用して溶解させた。ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮキットからの製造者の取扱説明書に従って単離した。ただし、ＲＮＡは５０μＬのＲＮａｓｅ遊離水で溶離した。ＲＮＡの品質及び純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ‘  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア、フォレストヒル）及び分光光度計をそれぞれ使用して定量化した。ＲＮＡの品質は２８Ｓ／１８Ｓ比で示した。２８Ｓ／１８Ｓ比が１．７以上の場合、ＲＮＡが分解していないことを示す。ＲＮＡ試料は−８０℃で保存した。
【０１０６】
５μｇのＲＮＡを相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に逆転写し、製造者の取扱説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州）に詳細に記しているようにさらにｃＲＮＡに転写した。ｃＲＮＡの品質をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（同上）を使用して調べたところ、使用したＲＮＡ試料の分解は見られなかった。製造者の取扱説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州）に従ってｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ−１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイにハイブリダイズした。マイクロアレイチップにおける１６時間のハイブリダイズ後、試料を取り出し、チップをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州）を使用して洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州）を使用してスキャンした。
【０１０７】
マイクロアレイから得られたデータをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ（バージョン７．３．１）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア、フォレストヒル）を使用して解析し、
（ｉ）静止培地、
（ｉｉ）５％ＦＢＳ、
（ｉｉｉ）１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１β、又は
（ｉｖ）１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ
を使用した場合の喘息患者及び非喘息患者から採取したＡＳＭ細胞の遺伝子発現を比較した。非喘息患者群と比較して１０倍を超えるアップレギュレーションを示した喘息患者群における遺伝子を可能性のある標的とみなした。
【０１０８】
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸバージョン７．３．１を使用して、生物情報学的解析を行った。マイクロアレイの５４６７５プローブから、５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１β又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる刺激によって４３４０遺伝子は１０倍以上になった。さらに、これらの遺伝子のうちの６６７遺伝子が有意にアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５）。これらのデータセットから、７６遺伝子が非喘息患者ボランティアと比較して喘息患者ボランティアにおいてアップレギュレーションされたことが分かった。
【０１０９】
さらに解析すると、喘息患者に由来するＡＳＭ細胞と非喘息患者に由来するＡＳＭ細胞との間で異なる発現した遺伝子の１つはファイブリン−１であることが特定された。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアからのＡＳＭ細胞においてファイブリン−１がアップレギュレート（２４．１１倍の増加±１５．８５）されたが、非喘息患者ボランティアではファイブリン−１がダウンレギュレート（７．６９倍の減少±０．０４）された。
【０１１０】
実施例２−ＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析
喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアの両方に由来するＡＳＭ細胞において、５％ＦＢＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによってファイブリン−１及びそのアイソフォームをコードするｍＲＮＡがアップレギュレートされたか否かを確認するために、リアルタイムＰＣＲを使用した。ファイブリン−１の４つのアイソフォーム（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）がヒトにおいて今までに特定されている。これらの４つのアイソフォームのそれぞれの発現を調べた。
【０１１１】
１２人の非喘息患者ボランティア及び８人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞（実施例１に記したように単離した）を６ウェルプレートの、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ）、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ内に、密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）（静止培地）内で３日間静止させ、２つのウェルのＡＳＭ細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、氷上で保存し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  ｃｏ、ドイツ、デューレン）に備わる溶解緩衝液を使用してＲＮＡ抽出のために溶解させ、抽出前−２０℃で保存した。残りのウェルは、静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）で処理し、そして、同様に処理８時間後にＲＮＡ抽出のために溶解させた。
【０１１２】
全細胞ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキットを使用して製造者の取扱説明書に従って抽出した。抽出後、試料を５０μＬのＲＮａｓｅ遊離水で溶離し、使用時まで−２０℃で保存した。５μＬのＲＮＡを、ランダムプライマー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州）の存在下で、組換え型リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州グレンバーニー）及びｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）を含むＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（登録商標）Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州グレンバーニー）を使用し、製造者の取扱説明書に従ってｃＤＮＡに変換した。
【０１１３】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国フォスターシティ）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを３回行った。各２５μＬの反応は、３μＬの前記ｃＤＮＡ、１２．５μＬの２ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ試薬キット、１．２５μＬの２０ｘ  ｐｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ａｓｓａｙ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒ（ＦＢＬＮ１：Ｈｓ００２４２５４５＿ｍ１；ＦＢＬＮ１Ａ：Ｃｕｓｔｏｍ  Ｍａｄｅ；ＦＢＬＮ１Ｂ：Ｈｓ００９７２６２５＿ｍ１；ＦＢＬＮ１Ｃ：Ｈｓ００２４２５４６＿ｍ１；ＦＢＬＮ１Ｄ：Ｈｓ００１９７７７４＿ｍ１）、及び内因真核性対照１８ＳリボソームＲＮＡプライマ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国フォスターシティ）からなる。熱サイクル条件は、９５℃で１５秒及び６０℃で１分の４０サイクルとした。データファイルは７０００  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅｖ１．２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国フォスターシティ）を使用して生成した。
【０１１４】
増幅プロット（ＣＴ）の指数部に設定された閾値蛍光（ＴＦ）に達するまでに必要なサイクル数を求めた（ＦＢＬＮ１  ＴＦ＝０．４４７；ＦＢＬＮ１Ａ  ＴＦ＝０．４４６；ＦＢＬＮ１Ｂ  ＴＦ＝０．３２２；ＦＢＬＮ１Ｃ  ＴＦ＝０．２４８；ＦＢＬＮ１Ｄ  ＴＦ＝０．３０２）。ファイブリン−１の共通領域及びアイソタイプの結果は１８Ｓ  ｒＲＮＡの結果に対して正規化した。各個々の試料の３ウェルの結果を平均し、サイクル数について全体平均及び標準誤差を計算した。データは非刺激細胞に対する倍率変化として表した。
【０１１５】
５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者から採取したＡＳＭ細胞において、４つの公知のヒト由来ファイブリン−１のアイソフォーム（それぞれ非刺激の場合と比較して、３．１６±０．１３及び３．７７±０．２２倍の増加、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）の共通領域をコードするｍＲＮＡは有意にアップレギュレートされた（図１）。このような増加は、非喘息患者ボランティアから採取した細胞では観察されなかった。さらに、ファイブリン−１の４つのアイソフォーム（ファイブリン−１Ａ、ファイブリン−１Ｂ、ファイブリン−１Ｃ、ファイブリン−１Ｄ）のそれぞれについて解析を行った。
【０１１６】
ファイブリン−１Ａ
５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティア（それぞれ非刺激の場合と比較して４．３７±０．０１及び２．７６±０．０３倍の減少、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及び非喘息患者ボランティア（それぞれ非刺激の場合と比較して２．９６±０．０２及び２．３９±０．０１倍の減少、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）から採取したＡＳＭ細胞において、ファイブリン−１Ａは有意に減少した（図２Ａ）。
【０１１７】
ファイブリン−１Ｂ
１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアのみから採取したＡＳＭ細胞において、ファイブリン−１Ｂが有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して１３．９５±４．６０倍の増加、ｐ＜０．００１、非ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図２Ｂ）。このような増加は、非喘息患者ボランティアから採取した細胞では観察されなかった。
【０１１８】
ファイブリン−１Ｃ
５％ＦＢＳにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｃが有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して３．９１±０．８０倍の増加、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）が、非喘息患者ボランティアでは１Ｃがダウンレギュレートされた（非刺激の場合と比較して、１．３７±０．１４倍の減少、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。また、ファイブリン−１Ｃの発現は、非喘息患者ボランティアと比較して喘息患者から採取したＡＳＭ細胞において多かった（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図２Ｃ）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてのみ、ファイブリン−１Ｃが有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して２．４６±０．５３倍の増加、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図２Ｃ）。
【０１１９】
ファイブリン−１Ｄ
５％ＦＢＳにより、喘息患者ボランティア（非刺激の場合と比較して、２．９７±０．０５倍の減少、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及び非喘息患者ボランティア（非刺激の場合と比較して、１．４７±０．１１倍の減少、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）から採取したＡＳＭ細胞において、ファイブリン−１Ｃは有意に減少した（図２Ｄ）。減少量は喘息患者の方が大きかった。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてのみ、ファイブリン−１Ｄが有意にダウンレギュレートされた（非刺激の場合と比較して２．４３±０．１０倍の減少、ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図２Ｄ）。また、ファイブリン−１Ｄの発現は、非喘息患者と比較して喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞において少なかった（ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図２Ｄ）。
【０１２０】
実施例３−ＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の発現のウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットを使用して、ＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１タンパク質の変化を測定した。
０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）又は１０ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）を使用して２４時間刺激した喘息患者及び非喘息患者のＡＳＭ細胞における１タンパク質の量を比較した。
【０１２１】
６ウェルプレートを使用して、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ）、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（増殖培地）内に、４人の非喘息患者ボランティア及び４人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）（静止培地）内で細胞を３日間静止させ、２つのウェルのＡＳＭ細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、氷上で保存し、ウェル当たり５０μＬの緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、２ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、及び１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国カリフォルニア州））を使用してタンパク質抽出のために溶解させ、−２０℃で保存した。残りのウェルは、静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）の１つで処理し、同様に処理２４時間後のタンパク質抽出のために溶解させた。
【０１２２】
ウェスタンブロット解析を既に述べた（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）ように行った。簡単に説明すると、使用に先立ち、試料を１５分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、０．１Ｍ  １，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール（ＤＤＴ）、１０％グリセリン、０．０１％ブロモフェノールブルー（ローディングバッファー）と１：５の比率で混合し、９５℃で５分間変性させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上に搭載して分離させた。２５μｇの陽性対照（ＳＫ−ＢＲ−３、ヒト乳癌細胞株）（Ａｂｇｅｎｔ、米国カリフォルニア州）も搭載した。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、孔径：０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）を切断し、１００％メタノールを使用して１０分間湿潤させ、トランスファーバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１９２ｍＭグリシン（ｐＨ８．５）、１０％メタノール）で１５分間滴定した。一旦タンパク質が膜に移動すると、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗ）を含有する、５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳを使用して４℃で一晩、オービタルシェーカー上でブロックした。膜は、モノクローナルマウス抗ヒトファイブリン−１（１０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗ中に１０μｇ）抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）を使用して室温で１時間培養した。次に、膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗにおいて１：２０，０００の希釈比となるようにビオチン化ヤギ抗マウス抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）を添加し、室温で１時間培養した。膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗ中に５μｇ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）を室温で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗによる洗浄後、発光基質（Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州）を添加して膜を可視化し、画像を撮影し、Ｋｏｄａｋ  ｉｍａｇｅ  ｓｔａｔｉｏｎ  ＩＳ４０００  ＭＭを使用してデンシメトリーを算出した。
【０１２３】
モノクローナルマウス抗ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（１０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗ中に０．５μｇ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）を使用して膜を室温で２時間再プローブした。膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（１０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗ中に４μｇ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州）を室温で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗによる洗浄後、膜を上述したように可視化し、画像化した。濃度測定データは、Ｋｏｄａｋ  ＭＩソフトウェア（バージョン４．０．５）によって分析した。ファイブリン−１濃度測定値は同一の膜においてＧＡＰＤＨに対して得られた値に対して正規化し、非刺激細胞に対する倍率変化として表した。また、ファイブリン−１レベルは陽性対照であるＳＫ−ＢＲ−３全細胞溶解液に対して正規化した。
【０１２４】
ファイブリン−１タンパク質は、４人の喘息患者ボランティア及び４人の非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞において検出された。図３Ａに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてのみ、ファイブリン−１タンパク質が有意にアップレギュレートされた（４．７５±０．９１倍の増加、ｐ＜０．０５、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。喘息患者及び非喘息患者から採取したＡＳＭ細胞の間において、ファイブリン−１タンパク質の基底発現の有意な差は見られなかった（それぞれ０．０９±０．０３ｎｄｕ（ｎｏｒｍａｌｉｓｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｕｎｉｔ）、それぞれ０．０６±０．０１ｎｄｕ、ｐ＞０．０５、独立スチューデントｔ−検定）（図３Ｂ）。
【０１２５】
実施例４−ＡＳＭ細胞及び気道組織におけるファイブリン−１の発現の免疫組織化学解析
４人の喘息患者ボランティアと５人の非喘息患者ボランティア全員から採取したＡＳＭ細胞、７人の非喘息患者ボランティアから採取した気道部及び３人の喘息患者ボランティアと３人の非喘息患者ボランティアから採取した気管支生検標本について免疫組織化学解析を使用して調べた。
【０１２６】
細胞を染色するために、８ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、米国ニューヨーク州）において、５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ）、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（増殖培地）内に、５人の非喘息患者ボランティア及び４人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）（静止培地）内で細胞を３日間静止させ、ＡＳＭ細胞を静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ、又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）で処理した。２４時間の刺激後、冷却した４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃で２０分間細胞を固定した。
【０１２７】
気道リングの場合には、ヒト気管支の断片を７人の非喘息患者ボランティアから採取した肺試料から切り取り、横方向にリング状に切断した。１ウェル当たり１つのリングを２４ウェルプレートに配置し、１ウェル当たり１ｍＬの静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ、又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで２４時間刺激した。リングを最適切削温度（ＯＣＴ）化合物に埋め込み、−８０℃で凍結した。
【０１２８】
気道生検材料について、該生検材料は、右肺中葉の気管支鏡検査法によって３人の非喘息患者ボランティアと３人の喘息患者ボランティアの気管支気道から得た。生検材料を４８ウェルプレートに配置し、５００μＬの静止培地、静止培地＋１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ、又は静止培地＋５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβで２４時間刺激した。試料をＯＣＴ化合物に埋め込み、−８０℃で凍結した。
【０１２９】
気道リング及び生検材料をクリオスタットを使用して７μｍの切片に切断し、ガラス製スライド（Ｍｅｎｚｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ、ドイツ、ブラウンシュバイク）に載せた。７５％（ｖ／ｖ）無水エタノール及び２５％（ｖ／ｖ）アセトンを使用して切片を１０分間固定し、５分間空気乾燥した。スライドは染色まで−８０℃で保存した。
【０１３０】
染色を行う日には、水で１０分間再水和させる前に、スライドを室温で５分間放置した。次に、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にさらに１０分間浸漬した。試料は、室温で３０分〜１時間、ＰＢＳで希釈した１０％（ｖ／ｖ）非免疫性ウマ血清内でブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナルマウス抗ヒトファイブリン−１抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）又はＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＭアイソタイプ対照（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）のいずれかを細胞の場合には１００μＬ／ウェル、切片の場合は５０μＬ／試料で各ウェル又は切片に添加し、室温で１時間培養した。培養後、スライドをＰＢＳで３回洗浄した。抗ヒトファイブリン−１抗体として、ＰＢＳで１：１００に希釈したモノクローナルマウス抗ヒトファイブリン−１抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）又はＰＢＳで１：１００に希釈したマウスＩｇＭアイソタイプ対照（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）を細胞の場合は１００μＬ／ウェル、切片の場合は５０μＬ／試料で各ウェル又は切片に添加し、室温で１時間培養した。培養後、スライドをＰＢＳで３回洗浄した。ファイブリン−１の一次抗体及びアイソタイプ対照抗体は、暗室において室温で３０分間、ＰＢＳで１：１００に希釈したテキサスレッド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州）又はフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストラリア、ノースライド）結合抗マウス抗体を添加することによって検出した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州）を使用して封入した。Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（ＢＸ５１）を使用して画像を撮影し、Ｌｅｉｃａ  ＩＭ１０００画像取込ソフトウェアを使用して取り込んだ。蛍光閾値は、対応するアイソタイプ対照を使用して設定した。同じ閾値を使用して、ファイブリン−１又はフィブロネクチンに特異的な染色を測定した。連続した部分はヘマトキシリンとエオシンによって染色し、試料の方位が分かるようにした。
【０１３１】
図４Ａに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１の染色強度が増加した。これは、研究を行った４人の喘息患者のＡＳＭ細胞において一貫していた。一方、図４Ｂに示すように、５人の非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における刺激の存在下ではファイブリン−１の染色強度は一定のままだった。
【０１３２】
気管支リング組織におけるファイブリン−１の発現を確認するために、気管支リング組織の切片を７人の非喘息患者ボランティアから採取した。しかしながら、図５Ａに示すように、陽性かつ着実なファイブリン−１の染色が全ての気管支リング組織の切片において観察され、いかなる刺激によっても調節されなかった。
【０１３３】
図５Ｂに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、３人の喘息患者ボランティアのみから採取した気管支生検切片においてファイブリン−１の染色強度が増加した。
【０１３４】
実施例５−気道組織におけるファイブリン−１及びフィブロネクチンの共局在化及び相互作用
ファイブリン−１はフィブロネクチンと相互作用することが知られている。従って、本発明者らは、これらの２種類のタンパク質が気道の細胞及び組織において共局在化するか否かについて調べた。４人の喘息患者ボランティアと５人の非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞及び７人の非喘息患者ボランティアから採取した気道切片についてＦＲＥＴ及び免疫組織化学解析を使用してそれぞれ調べた。
【０１３５】
８ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、米国ニューヨーク州）において、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ）、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（増殖培地）内にＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（静止培地）内で３日間静止させ、ＡＳＭ細胞を静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の１つで処理した。２４時間の刺激後、細胞を冷却した４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃で２０分間固定した。
【０１３６】
気道リングの場合には、ヒト気管支の断片を採取した肺試料から切り取り、横方向にリング状に切断した。１ウェル当たり１つのリングを２４ウェルプレートに配置し、１ウェル当たり１ｍＬの静止培地、静止培地＋５％ＦＢＳ又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの１つで２４時間刺激した。リングを最適切削温度（ＯＣＴ）化合物に埋め込み、−８０℃で凍結した。気道リングをクリオスタットを使用して７μｍの切片に切断し、ガラス製スライド（Ｍｅｎｚｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ、ドイツ、ブラウンシュバイク）に載せた。７５％（ｖ／ｖ）無水エタノール及び２５％（ｖ／ｖ）アセトンを使用して切片を１０分間固定し、５分間空気乾燥した。スライドは染色まで−８０℃で保存した。
【０１３７】
ＡＳＭ細胞の場合には、試料を室温で３０分間、ＰＢＳで希釈した１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ内でブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。ＺｅｎｏｎウサギＩｇＧ標識化キットを使用して抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オーストラリア、ハイデルバーグ）で標識した。ポリクローナルウサギ抗ヒトファイブリン−１抗体（ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルス）及びポリクローナルウサギ抗ヒトフィブロネクチン抗体（ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬ）を、１０μＬのＰＢＳ内においてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（ＰＢＳちゅう１２μｇ／ｍＬ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）とそれぞれ結合させた。暗室における５分間の培養後、非結合Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒフラグメントをブロックするために、非特異的ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５：３００μｇ／ｍＬ、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７：両方ともＰＢＳ中２５μｇ／ｍＬ）を各試料に添加し、暗室においてさらに５分間培養した。２種類の抗体試料をＰＢＳ（抗体：Ｚｅｎｏｎ複合体）内において一緒に結合した。１００μＬの抗体：Ｚｅｎｏｎ複合体をチャンバースライドの各ウェルに添加し、暗室において室温で１．５時間培養した。培養後、スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、冷却した４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃で２０分間再度固定した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１５％（ｖ／ｖ）グリセリン（ｐＨ８．０）を使用してカバースリップした。
【０１３８】
気道リングの場合には、試料を室温で３０分〜１時間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１０％（ｖ／ｖ）非免疫性ウマ血清内でブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナルマウス抗ヒトファイブリン−１抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）及びＰＢＳで１．２μｇ／ｍＬに希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトフィブロネクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）又は２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＭアイソタイプ対照（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）及び１．２μｇ／ｍＬに希釈したウサギＩｇＧイソタイプ対照（Ｄａｋｏ、オーストラリア、ボタニー）（５０μＬ／試料）を各切片に添加し、室温で１時間培養した。培養後、スライドをＰＢＳで３回洗浄した。ファイブリン−１の一次抗体及び対応するアイソタイプ対照抗体は、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、暗室において室温で３０分間培養したヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストラリア、ノースライド）を使用して検出した。フィブロネクチン及び対応するアイソタイプ対照は、ＰＢＳで６．６７μｇ／ｍＬに希釈し、暗室において室温で３０分間培養したヤギ抗ウサギテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）結合抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）を使用して検出した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１５％（ｖ／ｖ）グリセリンを使用してマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（ＢＸ５１）を使用して画像を撮影し、Ｌｅｉｃａ  ＩＭ１０００画像取込ソフトウェアを使用して取り込んだ。蛍光閾値は、対応するアイソタイプ対照を使用して設定した。同じ閾値を使用して、ファイブリン−１又はフィブロネクチンに特異的な染色を測定した。画像はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、オーストラリア、チャッツウッド）を使用して重ね合わせた。
【０１３９】
図６Ａに示すように、ファイブリン−１とフィブロネクチンは、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティア両方から採取したＡＳＭ細胞の同じ領域で共局在化していた。これは、４人の喘息患者ボランティア及び５人の非喘息患者ボランティアのＡＳＭ細胞において一貫していた。ファイブリン−１とフィブロネクチンの共局在化が気管支リング組織でも観察されることを確認するために、７人の非喘息患者ボランティアから気管支リング組織の切片を採取し、免疫組織化学的に調べた。図６Ｂに示すように、アイソタイプ対照の染色と比較して、７人の非喘息患者ボランティアの気管支リング組織の切片においてファイブリン−１とフィブロネクチンの染色が観察された。ファイブリン−１とフィブロネクチンは、組織の同じ領域、特に、基底膜及び気道平滑筋において共局在化することが分かった。
【０１４０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法を使用して、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞におけるファイブリン−１とフィブロネクチンの物理相互作用を実証した（データは示さず）。
【０１４１】
実施例６−ＡＳＭ細胞の細胞外マトリックスへのファイブリン−１とフィブロネクチンの沈着
ファイブリン−１は細胞外タンパク質である。そのため、本発明者らは、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取した気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞によって形成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）にファイブリン−１が沈着するか否かについて調べた。ファイブリン−１のＥＣＭへの沈着は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ファイブリン−１とフィブロネクチンの相互作用を考慮して、ＥＬＩＳＡを使用してフィブロネクチンのＥＣＭへの沈着も測定した。
【０１４２】
９６ウェルプレートを使用して、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤（１Ｕ／ｍｌのペニシリン、１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１２５ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ）、及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（増殖培地）内に、１０人の非喘息患者ボランティア及び１０人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で９日間増殖させた。細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％（ｖ／ｖ）抗菌−抗真菌剤、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）を含むＤＭＥＭ（静止培地）内で３日間静止させ、静止培地又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの１つで処理した。２４時間の刺激後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗ）を含有するリン酸緩衝液で細胞を５回洗浄し、余分な溶液を除去し、０．０１６ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを使用して溶解させた。３７℃で２０分間放置した後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗで５回洗浄し、１ウェル当たり１５０μＬのＰＢＳ−Ｔｗと共に−２０℃で分析時まで保存した。
【０１４３】
ＥＬＩＳＡを行う前日に、９６ウェルプレートを解凍し、さらに５回洗浄し、１ウェル当たり２００μＬの１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗを使用して４℃で一晩ブロックした。ＥＬＩＳＡを行う当日に、プレートをＰＢＳ−Ｔｗで５回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナルマウス抗ヒトファイブリン−１抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで１．２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナルマウス抗ヒトフィブロネクチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＭアイソタイプ対照（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）又は１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで１．２μｇ／ｍＬに希釈した抗マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストラリア、ノースライド）のいずれかを５０μＬ／ウェルで使用して解析を行った。プレートはオービタルシェーカーを使用して室温で２時間培養した後、ＰＢＳ−Ｔｗで５回洗浄した。ファイブリン−１又はそのアイソタイプ対照を測定するウェルには、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで５μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化ヒツジ抗マウス抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オーストラリア、ボロニア）を５０μＬ／ウェルで各ウェルに添加した。フィブロネクチン又はそのアイソタイプ対照を測定するウェルには、ＰＢＳ−Ｔｗを５０μＬ／ウェルで添加した。プレートはオービタルシェーカーを使用して室温で１時間培養した後、ＰＢＳ−Ｔｗで５回洗浄した。ファイブリン−１又はそのアイソタイプ対照を測定するウェルには、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで０．５μｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン（ＨＲＰ結合）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）を５０μＬ／ウェルで添加した。フィブロネクチン又はそのアイソタイプ対照を測定するウェルには、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗで０．５μｇ／ｍＬに希釈したウサギ抗マウス抗体（ＨＲＰと結合）（Ｄａｋｏ、オーストラリア、ボタニー）を５０μＬ／ウェル添加した。プレートはオービタルシェーカーを使用して室温で４５分間培養した。次に、プレートを５回洗浄し、オービタルシェーカー上において、発色が生じるまで２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）液体基質（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を５０μＬ／ウェルで処理した。１ｍＭリン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸収を読み取ることによって定量した。
【０１４４】
３ウェルの結果を平均し、各試料についてアイソタイプ対照の平均吸収値を特定の抗体の平均吸収値から減算した。データは非刺激細胞に対する倍率変化として表した。
【０１４５】
１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、１０人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞からのＥＣＭへのファイブリン−１の沈着が有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して１．６０±０．１２倍の増加、ｐ＜０．０５、独立スチューデントｔ−検定）。一方、調査した１０人の非喘息患者ボランティアではそのような増加は観察されなかった（非刺激の場合と比較して１．２６±０．０３倍の増加、ｐ＞０．０５、独立スチューデントｔ−検定）（図７Ａ）。
【０１４６】
同様に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、１０人の喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞からのＥＣＭへのフィブロネクチンの沈着が有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して１．３０±０．０３倍の増加、ｐ＜０．０１、独立スチューデントｔ−検定）。調査した９人の非喘息患者ボランティアではそのような増加は観察されなかった（非刺激の場合と比較して１．０１±０．０３倍の増加、ｐ＞０．０５、独立スチューデントｔ−検定）（図７Ｂ）。
【０１４７】
実施例７−ＡＳＭ細胞上清、血清、気管支肺胞洗浄液におけるファイブリン−１レベル
喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞からの可溶性ファイブリン−１の放出をドットブロット法を使用して測定した。具体的には、専用のドットブロット装置（ＰＲ６４８  Ｓｌｏｔ  Ｂｌｏｔ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、又は１０ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）を使用して２４時間刺激した喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアのＡＳＭ細胞の上清におけるファイブリン−１の量を測定した。また、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアの血清及びＢＡＬＦにおけるファイブリン−１の量を比較した。
【０１４８】
間欠性、軽度持続性又は中度持続性アトピー性喘息（Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ，２００５，Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎのガイドラインによる）に罹患したボランティアを広告によって募った（年齢：１９〜３０歳）。試験対象患者基準としては、過去１２カ月における喘息症状、マンニトール気管支誘発負荷試験における陽性結果及び５年以上の喫煙がないことを含めた。喘息にり患した全てのボランティアは、少なくとも８年間持続して喘息症状を有していた。基準％予測１秒量（ＦＥＶ１）が６０％未満のボランティア、吸入又は全身性コルチコステロイドを過去２カ月以内に投与されたボランティア、呼吸機能不全又は挿管法の既往歴のあるボランティア、過去１２カ月以内に喫煙したボランティア、又は上気道感染症状のあるボランティアは除いた。
【０１４９】
喘息又はその他の肺疾患の既往歴のない健康なボランティアを広告によって募った（年齢：１９〜３３歳）。基準としては、正常な基線肺活量（少なくとも８０％）、マンニトール気管支誘発負荷試験における陰性結果、及び有意な気管支拡張剤による可逆性がないこと（１２％、及びＦＥＶ１で２００ｍＬの改善）を含めた。
【０１５０】
研究の承認は、Ｅｔｈｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｒｅａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｒｏｙａｌ  Ｐｒｉｎｃｅ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｚｏｎｅ、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。
【０１５１】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び血清の試料は、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取した。喘息患者ボランティアからは、吸入コルチコステロイド治療前後の７週間に試料を採取した。全ての喘息患者ボランティアは、計量投与エーロゾル（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ（ＧＳＫ））及び大容量スペーサ器具（Ｖｏｌｕｍａｔｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ、ＧＳＫ）によって吸入プロピオン酸フルチカゾン（１００μｇ又は５００μｇ、１日２回）を吸入した。また、ボランティアには、試験期間中に必要に応じて呼吸困難、胸部絞扼感、喘鳴、咳等の喘息の症状を軽減するためにサルブタモール（計量投与エーロゾル、１００ｍｃｇ、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ、ＧＳＫ）、短時間作用型β２アゴニストを与えた。喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアのＢＡＬＦ試料は、３７℃の０．９％塩化ナトリウム溶液（合計２４０ｍＬ、６０ｍＬずつの４連続アリコート）の右肺中葉への点滴によって得た。試料は吸引によって無菌ガラス瓶に回収した。ＢＡＬＦは滅菌ガーゼで濾過し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。５０ｍＬの無細胞上清を除去し、−７０℃で保存した。
【０１５２】
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、孔径：０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）を切断し、１００％メタノールを使用して１０分間事前湿潤させ、ブロット装置に入れる前に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  （ＰＢＳ−Ｔｗ）を含むリン酸緩衝生理食塩水で１５分間滴定した。５０μＬのヒト血清（ＰＢＳ−Ｔｗで１：１０００に希釈）、ＢＡＬＦ（希釈せず）、上清（希釈せず）、胎児ウシ血清（ＰＢＳ−Ｔｗで１：２に希釈）（陽性対照）、又はＰＢＳ−Ｔｗ（陰性対照）を各スロットに入れ、試料が通るまで真空状態とした。膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、真空を利用して流出液を除去し、膜を装置から取り除いた。次に、膜を５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。一次抗体であるマウス抗ヒトファイブリン−１（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）を添加して１％（ｖ／ｗ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗの１μｇ／ｍＬの希釈液とし、室温で１時間培養した。次に、膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗにおいて１：２０，０００の希釈比となるようにビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）を添加し、室温で１時間培養した。膜をＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔｗにおいて０．５μｇ／ｍＬの希釈となるようにストレプトアビジン西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）を添加し、室温で１時間培養した。膜をＰＢＳ−Ｔｗで１５分間洗浄し、発光基質（Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州）を添加して可視化した。画像を撮影し、Ｋｏｄａｋ  ｉｍａｇｅ  ｓｔａｔｉｏｎ  ＩＳ４０００  ＭＭ及びＫｏｄａｋ  ＭＩ（バージョン４．０．５）ソフトウェアを使用してデンシメトリーバリューを算出した。  ファイブリン−１のデンシトメトリー解析は、陰性対照（ＰＢＳのみ）の値を減算して正規化し、陽性対照（５０％ＦＢＳ）に対する倍率変化として表した。
【０１５３】
ファイブリン−１タンパク質は、５人の喘息患者ボランティア及び４人の非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の上清において検出された（図８）。０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（０．２５±０．０５ｎｄｕ（ｎｏｒｍａｌｉｓｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｕｎｉｔ）、ｎ＝５；０．１６±０．０１ｎｄｕ、ｎ＝４、ｐ＝０．２３）、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（０．２７±０．０３ｎｄｕ、ｎ＝５；０．２２±０．０２ｎｄｕ、ｎ＝４、ｐ＝０．２４）又は１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβ（０．２１±０．０２ｎｄｕ、ｎ＝５；０．１７±０．０１ｎｄｕ、ｎ＝４、ｐ＝０．１５）で刺激した場合の喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアのＡＳＭ細胞の上清におけるファイブリン−１の濃度には有意な差は認められなかった。
【０１５４】
図９Ａに示すように、ファイブリン−１レベルの増加は、非喘息患者ボランティア（０．１８±０．０３ｎｄｕ、ｎ＝２０、ｐ＝０．００９、独立スチューデントｔ−検定）と比較して、コルチコステロイドを投与されていない喘息患者ボランティアの血清において観察された（０．４１±０．０８ｎｄｕ、ｎ＝２１）。コルチコステロイドは、喘息患者ボランティアから採取した血清におけるファイブリン−１レベルに何らの影響も及ぼさなかった。図９Ｂに示すように、ファイブリン−１レベルの増加は、非喘息患者ボランティア（１．９±０．３７ｎｄｕ、ｎ＝１１、ｐ＝０．００６、独立スチューデントｔ−検定）と比較して、コルチコステロイドを投与されていない喘息患者ボランティアのＢＡＬＦにおいて観察された（６．０±１．６ｎｄｕ、ｎ＝２０）。コルチコステロイドは、喘息患者ボランティアから採取したＢＡＬＦにおけるファイブリン−１レベルに何らの影響も及ぼさなかった。
【０１５５】
実施例８−ファイブリン−１によるマウス喘息モデルにおける気道過敏性の発症抑制
ファイブリン−１の阻害が喘息病理に与える影響を調べるために、ファイブリン−１Ｃに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した（ウエスタン・オーストラリア大学のＳｔｅｖｅ  Ｗｉｌｔｏｎ教授）。２種類のファイブリン−１Ｃに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＪＳＲ１３０６及びＪＳＲ１３０７）及び１種類のスクランブル・オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。ＪＳＲ１３０６：５’−ｇｃａ  ａｇｃ  ｇｃｕ  ｃａｃ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｕｇｃ  ａａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
ＪＳＲ１３０７：５’−ｃｕｕ  ｇｃｕ  ａａｇ  ａｃｕ  ｕｕａ  ｕｕａ  ａｃｇ  ｃｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ｓｃｒａｍｂｌｅｄ：５’−ａｕｕ  ｕｕｇ  ｕｃｕ  ｇａａ  ａｃｃ  ｃｕｇ  ｕａａ  ａｇａ  ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
【０１５６】
ＡＳＭ細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ、オーストラリア、ドンカスター）を使用して成功裏に達成した。アンチセンスオリゴヌクレオチドのＡＳＭ細胞への取り込みの成否及びアンチセンスオリゴヌクレオチドがファイブリン−１Ｃをサイレンシングする能力をについてに確認するために、上述した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びウエスタンブロッティングを使用した。
【０１５７】
刺激がない場合には、ＪＳＲ１３０６により、非喘息患者から採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１ＣをコードするｍＲＮＡは有意に減少した（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅのみの場合と比較、１．５０±０．１９倍の減少、ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（データは示さず）。ＪＳＲ１３０７により、非喘息患者ボランティア及び喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１ＣをコードするｍＲＮＡは有意に減少した（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅのみの場合と比較して１．８２±０．１１及び１．７３±０．０５倍の減少、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβにより、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅのみ又はスクランブル・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションを行った喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１Ｃが有意にアップレギュレートされた（非刺激の場合と比較して１．５５±０．１５及び１．７２±０．２７倍の増加、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。一方、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる刺激の存在下では、ＪＳＲ１３０６及びＪＳＲ１３０７により、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１ＣをコードするｍＲＮＡは有意に減少した（１．５６±０．１３及び１．５１±０．０５倍の減少、ｐ＜０．０１、ＴＧＦβによる刺激及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅのみによるトランスフェクションの場合と比較、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（データは示さず）。
【０１５８】
本発明者らは、マウス喘息モデルの気道過敏性（ＡＨＲ）におけるファイブリン−１の役割を調べ、ファイブリン−１の阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチド）がマウス喘息モデルのＡＨＲを逆転させることができるか否かを判定した。マウスは１種類のファイブリン−１アイソフォームのみを含むため（ヒトゲノムは４種類のアイソフォームをコードする）、マウスの研究のために新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物（ＡＯ）を設計した。以下に記載する研究では、以下の３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれを等量でＡＯに使用した。
１７Ａ／１４９７：５’-ｃａｃ  ｕｕｇ  ｇｃｇ  ｃａｃ  ｇａｃ  ａｃｃ  ｕｇｇ  ｇｇａ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
１５Ｄ／１４９８：５’-ｕｇａ  ａｃｕ  ｕｇａ  ｕｃｃ  ａｃｕ  ｃａｃ  ｃｃｕ  ｃａｇ  ｇ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
１５Ａ／１４９９：５’-ｕｕｕ  ｕｃｕ  ｃｕｕ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｕｇｃ  ａｇａ-３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
【０１５９】
成体のＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）に、ＰＢＳで希釈した２００ｎｇの組替え型ヒトＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を鼻腔内（ＩＮ）投与した（０日目及び１日目に）。簡単に説明すると、加熱ランプを使用してマウスを一時的に暖め、１２．５ｍｇ／ｋｇのＡｌｆａｘａｌｏｎｅ（Ｊｕｒｏｘ、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州）を静脈注射することによって麻酔をかけた。次に、マウスは垂直に吊し、２２ゲージの軟質プラスチックカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｓｕｒｅｆｌｏ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い経口気管内に挿管を行った。気管内位置決めは、カテーテルの先端による気管リング（ｔｒａｃｈｅａｌ  ｒｉｎｇ）への触診によって確認した。０日目及び１日目に、４０μＬのＰＢＳで希釈した２００ｎｇのＴＧＦβ又は４０μＬのＰＢＳのみをマウスに投与した。マウスは、投与後１〜２分間にわたって垂直に保ち、接種物が肺に確実に残るようにした。
【０１６０】
喘息モデル（ＴＧＦ）マウス及び対照群のマウスにファイブリンに対するＡＯ又はスクランブルＡＯ（ファイブリンＡＯ対照）を鼻腔内（ＩＮ）投与した。簡単に説明すると、マウスにイソフルオラン（４％）で麻酔をかけ、鼻腔内液滴によって、４０μｇのＡＯ又は４０μＬのＰＢＳで希釈した４０μｇのスクランブル・オリゴヌクレオチド又は４０μＬのＰＢＳのみを投与した。投与は最初の７日間は毎日行い、その後３週間にわたって週に３回行った。
【０１６１】
ＡＨＲは、Ｂｕｘｃｏ（Ｂｕｘｃｏ、シャロン、米国）マウスプレチスモグラフを使用して２９日目に経肺圧（ｔｒａｎｓｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）及び動的コンプライアンスの変化を測定することによってインビボで評価した。ケタミン／キシラジン（それぞれ８０〜１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によってマウスに麻酔をかけ、１８Ｇ金属管を気管に挿入した。その後、マウスに対して機械的換気（１５０ストローク／分、１７５μＬのストローク体積）を行った。プレチスモグラフのフローチャンバーに接続された変換器を使用して換気による胸廓拡張による容量変化を測定した。安定化後、マウスを生理的食塩水で刺激し、メタコリンの濃度を増加させ（０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０ｍｇ／ｍｌ）、超音波ネブライザによってエアロゾル化し、吸気ラインを介して肺に直接投与した（１０μＬ）。各エーロゾルは５分間供給した。供給時に圧力及び流量データを連続的に記録し、コンピュータプログラム（ＢｉｏＳｙｓｔｅｍＸＡ；Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して経肺圧及びコンプライアンスを算出した。ピーク値を試験に使用したメタコリンの濃度に対する最大反応とみなし、生理的食塩水対照に対する変化率として表した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用してｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって行った。その後、ナトリウムペントバルビタールの過剰投与によってマウスを安楽死させ、上述したように組織を採集した。
【０１６２】
図１０Ａで分かるように、ＴＧＦβのみを投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリンに対する特異的気道抵抗の上昇を示し、これは、本発明者らがマウス喘息モデルの確立に成功したことを示した（ｐ＜０．０５、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  ＴＧＦβ  メタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ファイブリンＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道抵抗に変化を示さなかった（ｐ＜０．０５、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  ファイブリンＡＯ＋ＴＧＦβ、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。また、スクランブルファイブリンＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道抵抗の上昇を示した（ｐ＜０．０１、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  スクランブルＡＯ＋ＴＧＦβ、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ＴＧＦβを投与しない場合には、ファイブリンＡＯ又はスクランブルＡＯを投与したマウスはメタコリンに対する特異的気道抵抗の変化を示さなかった。
【０１６３】
同様に、図１０Ｂに示すように、ＴＧＦβのみを投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリンに対する特異的気道コンプライアンスの低下を示した（ｐ＜０．０１、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  ＴＧＦβ  ２０ｎｇ／ｍｌ／メタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ファイブリンＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道コンプライアンスの変化は示さなかった（ｐ＜０．０５、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  ファイブリンＡＯ＋ＴＧＦβ  メタコリン、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。また、スクランブルファイブリンＡＯ及びＴＧＦβを同時投与したマウスは、生理的食塩水を投与したマウスと比較してメタコリン（２０ｍｇ／ｍｌ）に対する特異的気道コンプライアンスの低下を示した（ｐ＜０．０１、ｎ＝６  生理的食塩水、ｎ＝７  スクランブルＡＯ＋ＴＧＦβ、ダネットの事後検定と一体化したｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ＴＧＦβを投与しない場合には、ファイブリンＡＯ又はスクランブルＡＯを投与したマウスはメタコリンに対する低下した特異的気道コンプライアンスにおいて変化を示さなかった。
【０１６４】
実施例９−ファイブリン−１による喘息患者の気道平滑筋細胞の創傷治癒の促進
ファイブリン−１の潜在的な機能的役割を調べるために、以下のように創傷治癒プロトコルを使用してＡＳＭ細胞創傷治癒率を調べた。
【０１６５】
自律的細胞外マトリックスのＡＳＭ細胞
実施例８に記載したプロトコルを使用したトランスフェクションを行う前に、２４ウェルプレートを使用し、５％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（登録商標）、１％抗菌剤（１Ｕ／ｍｌのペニシリン、１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１２５ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）（増殖培地）内においてＡＳＭ細胞（密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を１日間増殖させた。ＡＳＭ細胞は、アンチセンス処理を行わないか、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）のみで処理するか、２００ｎＭスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドＪＳＲ１３０７によるトランスフェクションを３日間行った。その後、ＡＳＭ細胞を静止培地において３日間静止させた。黄色ピペットチップ（ＱＳＰ、Ｐａｔｈｔｅｃｈ、オーストラリア、プレストン）を使用して、細胞の単層に創傷（長さ：約１ｃｍ）を形成した。ウェルを無菌ＰＢＳで２回洗浄し、７２時間にわたって静止培地又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを補充した。
【０１６６】
非自律的細胞外マトリックスのＡＳＭ細胞
ＥＣＭ内におけるファイブリン−１の影響を観察するために、７５ｃｍ２のフラスコ内において、３７℃／５％ＣＯ２で培養する増殖培地にＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。２４時間後、培地（増殖培地）を取り替えるか、実施例８に記載したプロトコルを使用して増殖培地内でＪＳＲ１３０７を用いトランスフェクションをさらに３日間行った。次に、細胞にトリプシン処理を行い、２４ウェルプレートを使用して増殖培地に密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で再び播種した（ＪＳＲ１３０７の有無は維持）。細胞を４日間増殖させた後、０．０１６ｍＭ無菌ＮＨ４ＯＨを使用して溶解させた。３７℃で２０分間放置した後、ウェルを無菌ＰＢＳで５回洗浄し、１ウェル当たり５００μＬの無菌ＰＢＳと共に−２０℃で保存した。
【０１６７】
播種日に、予め用意したＥＣＭを解凍し、ＤＭＥＭで１回洗浄した。３７℃／５％ＣＯ２で増殖培地にＡＳＭ細胞を密度：１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。２４時間の増殖後、細胞を３日間にわたって増殖培地又はＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）のみで処理するか、実施例８に記載したプロトコルを使用して２００ｎＭスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＪＳＲ１３０７によるトランスフェクションを行った。その後、ＡＳＭ細胞を静止培地において３日間静止させた。黄色ピペットチップ（ＱＳＰ、Ｐａｔｈｔｅｃｈ、オーストラリア、プレストン）を使用して、細胞の単層に創傷（長さ：約１ｃｍ）を形成した。ウェルを無菌ＰＢＳで２回洗浄し、静止培地又は静止培地＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβと取り替えた。
【０１６８】
Ｏｌｙｍｐｕｓ製顕微鏡（ＣＫ２）に位相差顕微鏡法を使用して創傷を観察し、Ｏｌｙｍｐｕｓ製デジタルカメラ（モデルＣ−４０００）を使用して創傷誘発後０、１６、２４、４８、７２時間が経過した時に創傷全体の画像を撮影した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３を使用して、画像が創傷全体を含むように各創傷の画像を１つの画像に統合した。各画素における異なる時点での各創傷の面積を、ＩｍａｇｅＪ  １．３７ｖソフトウェアを使用して創傷の周囲をデジタル的に描くことによって測定した。以下に記載する各調査では、初期の創傷サイズは各処理群間で等しいものとした（データは示さず）。初期の創傷サイズに対する創傷閉鎖率を以下の式によって計算した。
【０１６９】
創傷閉鎖率（％）＝１００−１００×（創傷面積ｔｘ）／（創傷面積ｔ０）
式中、ｔｘは所与の時点の創傷面積であり、ｔ０は初期の創傷面積である。
【０１７０】
まず、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞間における創傷治癒の差について調べた。基本的に、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷閉鎖は、創傷誘発１６及び７２時間後に発生した（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図１１Ａ）。創傷誘発２４時間後では、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷閉鎖は非喘息患者ボランティアからのものよりも早かった（ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。創傷誘発４８時間後では、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる刺激により、喘息患者ボランティア（図１１Ｂ）及び非喘息患者ボランティア（図１１Ｃ）の両方から採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率は有意に増加した（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１７１】
ＡＳＭ細胞における創傷治癒に対するファイブリン−１の効果をさらに調べるために、ファイブリン−１Ｃの発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドＪＳＲ１３０７を使用してサイレンシングした（実施例８を参照）。その結果を、対照としてのスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果と比較した。
【０１７２】
ファイブリン−１のサイレンシングは、非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率に影響を与えなかった（図１２）。喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の場合には、ファイブリン−１のサイレンシングによって創傷治癒率は基本的に変化しなかったが、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβによる刺激により、ファイブリン−１のサイレンシングによって創傷誘発７２時間後には創傷治癒率が低下した（ｐ＜０．０１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。図１２に示すように、創傷誘発後７２時間が経過した時点では、スクランブル・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションを行った喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒は、同様に処理した非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞よりも早かった（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。しかしながら、ＪＳＲ１３０７を使用して喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞においてファイブリン−１をサイレンシングした場合には、創傷治癒率の増加は発生せず、非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞と差はなかった（ｐ＞０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１７３】
喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞において創傷治癒率が異なったため、創傷治癒の増加の根底にあるメカニズムを調べるために、ＡＳＭ細胞を喘息患者ボランティア又は非喘息患者ボランティアから採取した非自己ＥＣＭに播種した。喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞は、非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞と比較して高い創傷治癒率を示した。このことは、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下又は非存在下で喘息由来非自己ＥＣＭに播種したＡＳＭ細胞において確認された。基本的に、喘息由来非自己ＥＣＭ（ｎ＝１）に播種した喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷閉鎖は、創傷誘発２４時間後に発生した（そえぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。創傷誘発７２時間後では、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率は非喘息患者ボランティアと比較して高かった（ｐ＜０．０１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを使用した場合には、喘息由来ＥＣＭ（ｎ＝１）に播種した喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷閉鎖は、創傷誘発１６時間後に発生した（両ケースともｐ＜０．０１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。創傷誘発４８時間後では、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率は非喘息患者ボランティアからのものと比較して高かった（ｐ＜０．０１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１７４】
ＴＧＦβを使用した場合又はない場合には、創傷誘発１６時間後において、ファイブリン−１のサイレンシングを行った、喘息由来ＥＣＭに播種した喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞は創傷閉鎖を阻害した（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。興味深いことに、喘息由来ＡＳＭ細胞を非喘息患者ボランティアから採取したＥＣＭに播種した場合には同様なパターンは観察されなかった。ファイブリン−１をサイレンシングした場合には、非喘息由来ＥＣＭに播種した喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞の創傷治癒率は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの有無による変化を示さなかった（両ケースともｐ＞０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１７５】
喘息由来ＥＣＭに播種したＡＳＭ細胞がＥＣＭにおける創傷治癒率の増加とファイブリン−１沈着レベルの増加を示したため、ＥＣＭにおけるファイブリン−１の創傷治癒に与える影響を調べた。ＥＣＭにおけるファイブリン−１の影響を効果的に調べるために非喘息由来ＥＣＭにおいてファイブリン−１をさらにサイレンシングすることはできなかったため、喘息由来ＥＣＭを使用した。また、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）とスクランブルアンチセンストランスフェクションによって創傷治癒率は変化しないことが既に実証されていることから、これらは以降の実験では省略した。
【０１７６】
要約すると、ＥＣＭにおけるファイブリン−１のサイレンシングにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率は低下した。図１３Ａに示すように、創傷誘発７２時間後では、ファイブリン−１のサイレンシングを行ったＥＣＭに播種した喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒は、ファイブリン−１が存在するＥＣＭに播種した場合と比べて遅かった（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。また、ＥＣＭにおけるファイブリン−１のサイレンシングにより、創傷治癒率の上昇は発生せず、ファイブリン−１が存在するＥＣＭに播種した非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞と創傷治癒率に差はなかった（ｐ＞０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下では、創傷誘発７２時間後に同様なパターンが観察された（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図１３Ｂ）。また、ファイブリン−１のサイレンシングを行ったＥＣＭに播種した非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率も、ファイブリン−１が存在するＥＣＭに播種した場合よりも遅かった（ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ＥＣＭにおけるファイブリン−１のサイレンシングにより、喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率の上昇は発生せず、創傷治癒率は、ファイブリン−１が存在するＥＣＭに播種した非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞よりもさらに低下した（ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１７７】
ファイブリン−１のサイレンシングによって各区画（ＡＳＭ細胞又はＡＳＭ細胞が沈着したＥＣＭ）において創傷治癒率が有意に低下することが示されたため、両区画におけるファイブリン−１のサイレンシングの影響について調べた。各区画においてファイブリン−１のサイレンシングが付加的影響を及ぼすことを証明するために、ファイブリン−１が各区画に存在する系をファイブリン−１が各区画に存在しない系と比較した。創傷誘発７２時間後において、各区画においてファイブリン−１Ｃのサイレンシングを行うことにより、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの有無にかかわらず、喘息患者ボランティア及び非喘息患者ボランティアから採取したＡＳＭ細胞における創傷治癒率は有意に低下した（両ケースともｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（図１４）。
【０１７８】
また、基本的にいずれかの区画（ＡＳＭ又はＥＣＭ）においてファイブリン−１Ｃをサイレンシングした場合には、両区画においてファイブリン−１Ｃをサイレンシングした場合と比較して創傷治癒率に差は見られなかった（ｐ＞０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（データは示さず）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下では、ファイブリン−１のサイレンシングを行ったＥＣＭでは、ファイブリン−１がＥＣＭ及びＡＳＭの両方に存在する系と比較して創傷治癒率は低下した（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。各区画においてファイブリン−１をサイレンシングした場合には、ＥＣＭにおいてのみファイブリン−１をサイレンシングした場合と比較して創傷治癒率はさらに低下した（ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。しかしながら、ＡＳＭにおいてファイブリン−１をサイレンシングした場合と各区画においてファイブリン−１をサイレンシングした場合では創傷治癒率の差は見られなかった（ｐ＞０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。ＡＳＭ又はＥＣＭにおいてファイブリン−１をサイレンシングすることにより、ＡＳＭ細胞の創傷閉鎖率は有意に低下したが、ＡＳＭ及びＥＣＭにおいてファイブリン−１をサイレンシングする付加的影響は観察されなかった。従って、いずれかの区画においてファイブリン−１をサイレンシングすれば、創傷閉鎖を減少させるためには十分であると思われる。
【０１７９】
参考文献
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Pupa, SM et al., 2003, Monoclonal antibody to fibulin-1 generated by genetic immunization. J Cell Biochem 89:647-652.
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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