(57)【要約】ヒドロキシアパタイト粒子などのリン酸カルシウム粒子を生産する方法が開示される。より詳細には粉末形状、または酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体（例えば、チタン、チタン合金、ステンレス鋼、ジルコニア、ガラス、ならびにポリ（スチレン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）およびポリ（イミド）など）上のコーティングとしての該粒子を生産する方法に関する。該方法は以下の工程を含む工程Ｉ）：カルシウムイオンと、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物とを含む水溶液を調製し、工程II）：リン酸イオンと、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物とを含む別の水溶液を調製し、続いて、工程III）：工程I)および工程II）で得られた溶液を混合することにより、水溶性の有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を形成させる。その後、該粒子を洗浄および乾燥させ、該被覆された粒子は、足場として使用してもよく、またはリン酸カルシウム粒子または結晶の粉末を生産するために使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末形状のリン酸カルシウム粒子、あるいは酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体上のコーティング形状のリン酸カルシウム粒子を生産する方法であって、
以下の工程を含む該方法：
Ｉ）カルシウムイオンと、少なくとも官能基の１つが負に帯電している基であり少なくとも１つが正に帯電している基である、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物とを含む、第１の水溶液を調製し、
II）リン酸イオンと、少なくとも官能基の１つが負に帯電している基であり少なくとも１つが正に帯電している基である、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物とを含む、第２の水溶液を調製し、
III）工程Ｉ）およびII）で得られた溶液を周囲温度で混合することにより、負に帯電した基を介して水溶性の有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を生成させ（得られる混合液のｐＨは中性または塩基性である）、次いで、以下の工程IV）とV）をおこなうか、または以下の工程VI)とVII)もしくはVI）とVIII）をおこなう：
IV)  該有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を工程III）の混合物から抽出し、該被覆された粒子を洗浄した後に乾燥させることにより、該有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子の粉末を調製し、次いで、
V)２５０℃〜６００℃の温度範囲で加熱することにより該有機化合物を除去することによって、リン酸カルシウム粒子の粉末を生産する；
VI)酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体を、工程III）の混合物中に浸漬させることにより、リン酸カルシウム粒子を被覆する有機化合物の正に帯電した官能基を固体支持体に結合させ、続いて、該混合物から該固体支持体を取りだした後、乾燥させることにより、有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を該固体支持体に結合させ、次いで、
VII)過剰量の有機化合物を除去することによって、被覆されたリン酸カルシウム粒子のコーティングを固体支持体上に形成させるか、もしくは、
VIII)２００℃〜６００℃の温度範囲で加熱することにより該有機化合物を除去することによって、リン酸カルシウム粒子のコーティングを固体支持体上に形成させる。
【請求項２】
粒子が結晶形態である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
負に帯電した基が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ３Ｈ２基および−ＯＳＯ３Ｈ基を含有する群から選択され、正に帯電した基がアミン基である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リン酸カルシウム粒子または結晶がヒドロキシアパタイトである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程Ｉ）および／または工程II）における有機化合物が、３つの官能基を有する水溶性の有機化合物から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程Ｉ）および／または工程II）における有機化合物が、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸を含有する群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酸化物表面を含む固体支持体が、チタン、チタン合金、ステンレス鋼、ジルコニアおよびガラスから選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリマー表面が、ポリ（スチレン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）およびポリ（イミド）から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記固体支持体が、インプラントまたは細胞培養用の支持体である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
酸化物表面またはポリマー表面を有する固体支持体上のコーティング形状の被覆リン酸カルシウム粒子であって、
該粒子は、少なくとも官能基の１つが負に帯電した基であり少なくとも１つが正に帯電した基である少なくとも２つの官能基を含む水溶性の有機化合物で被覆され、
該有機化合物は、負に帯電した基を介してリン酸カルシウム粒子に結合し、
リン酸カルシウム粒子を被覆する該有機化合物の正に帯電した基が該固体支持体に結合する、該被覆粒子。
【請求項１１】
粒子が結晶形態である請求項１０に記載の被覆粒子。
【請求項１２】
負に帯電した基が−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ３Ｈ２基および−ＯＳＯ３Ｈ基を含有する群から選択され、正に帯電した基がアミン基である請求項１０または１１に記載の被覆粒子または結晶。
【請求項１３】
リン酸カルシウム粒子がヒドロキシアパタイトである請求項１０〜１２のいずれかに記載の被覆粒子または結晶。
【請求項１４】
有機化合物が３つの官能基を有する水溶性の有機化合物から選択される請求項１０〜１３のいずれかに記載の被覆粒子または結晶。
【請求項１５】
有機化合物が、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸からなる群から選択される請求項１０〜１４のいずれかに記載の被覆粒子または結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二官能性の前駆体を用いる、粉末形状またはコーティング形状のナノサイズリン酸カルシウム粒子の生産に関する。より詳細には、本発明は、粉末形状または固体支持体上のコーティング形状のリン酸カルシウム粒子（例えばヒドロキシアパタイト粒子など）を生産する方法に関する。また、本発明は、酸化物表面またはポリマー表面を含有する固体支持体上のコーティング形状の被覆リン酸カルシウム粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料は、生体組織と相互作用して該組織内に取り込まれるように設計される材料である。生体材料の一例は、歯科用および整形外科用のインプラント、外科用縫合材および骨セメントである。
【０００３】
生体材料は、生体内でのその挙動に従って分類される。生体不活性材料、例えば、酸化アルミニウム、ステンレス鋼、ジルコニアおよびポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）などは、人体に適合して拒絶されないが、材料と生体組織間の一体化を促進しない。再吸収性材料は、生体内で分解して生体組織に取って代わるように設計される。該再吸収性材料には、無機物質、例えば硫酸カルシウムおよびリン酸三カルシウムが含まれるだけでなく、生分解性の有機ポリマーも含まれる。生体活性材料は、材料と生体組織間の化学結合と生物学的結合とを導く、生物学的反応を開始させる材料であると考えられている。ヒドロキシアパタイトおよび所謂バイオガラスが、生体活性材料の一例として開示されている（文献１：レイスＲおよびワイナーＳ著、「自然から学ぶ、新規の移植可能な生体材料の設計方法」、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ロンドン、第９０頁〜第９２頁（２００４年））。
【０００４】
化学式Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨで表されるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、骨および歯に含まれているリン酸カルシウムミネラルと酷似しているミネラルである。骨組織内において、リン酸カルシウム結晶は、長さ２０〜４０ｎｍ、厚さ２ｎｍ、幅２〜４ｎｍの棒状結晶の状態で存在し、該結晶はコラーゲン網によって取り囲まれている（文献２：ロウンスタンＨＡおよびワイナーＳ著、「バイオミネラ化」オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク、（１９８９年））。合成ＨＡは、その生体活性能力に起因して、生体材料と骨組織の間で優れた適合性が所望される生体材料用途において、幅広く使用されている。市販の合成ＨＡは、とりわけ、骨セメント材料および複合体インプラント、歯科用コーティングおよび整形外科用インプラント、および骨の移植材料等として使用されている。
【０００５】
ある種の生体材料用途においては、粒子サイズが１〜１００ｎｍであるナノサイズＨＡを使用することが強く要求されている。一般に、ＨＡの生体活性は、ＨＡ結晶が人体で生産されるものと同等のサイズおよび形状を有する場合に向上すると考えられている。生体は、ナノサイズＨＡを生体の骨組織の一部として認識することにより、外来物の周囲で新たに骨の成長を開始させる。インプラントをナノサイズＨＡで被覆することによって、マイクロサイズＨＡによる被覆と比べて骨細胞の活性を著しく増加させ得る（文献３：グオ他著、Ｊ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｍａｔｅｒ.Ｒｅｓ.Ａ、ＤＯＩ１０.１００２／ｊｂｍ.a.３１２００)。また、ＨＡとポリマーの複合材料に関する生体活性および強度は、ナノサイズＨＡを使用することで大いに向上する（文献４：ウェイＪ他、Ｃｏｍｐｏｓ.パートＢ.Ｅｎｇ.、第３８巻、第３号、第３０１頁〜第３０５頁、２００７年；ラーメイＨＲＲおよびツァンＭ、バイオマテリアルズ、第２５巻、第２１号、第５１７１頁〜第５１８０頁（２００４年））。
【０００６】
粉末形状のナノサイズリン酸カルシウム（特にＨＡ）の合成
合成ＨＡは、一般に水性沈殿法によって生産される。該方法は、可溶性のカルシウム塩（例えば、硝酸カルシウム）を水中でリン酸と混合させる（Ｃａ／Ｐの割合を５／３とする）ことにより行える。次いで、例えば水酸化アンモニウムを使用して該溶液のｐＨを上昇させることにより、結晶化が誘発される（下記式参照）：
【０００７】
【化１】
2011504454.tif 000002
【０００８】
水酸化アンモニウムの添加後直ぐに形成される、非常に多数のリン酸カルシウムの核は、一般的に数ナノメーターの直径を示す。時間が経つと共に、該系はより少量でより大きな粒子へとシフトし得る。この現象に関して、幾つかの原因がある。比較的小さな結晶の溶解性は比較的高いので、小さな結晶は溶解してさらに大きな結晶へと結晶化する傾向がある。また、小さな核はさらに大きな結晶と衝突して結晶の塊となり得るので、平均するとさらに大きな結晶サイズがもたらされる。この駆動力により、系全体の自由表面エネルギーが減少する（文献５：ミューリンＪＷ著、「結晶化」、エルゼビア・バターワース−ハインマン、オックスフォード、第３２０頁〜第３２５頁（２００１年））。これらの効果に起因して、硝酸カルシウム、リン酸およびアンモニアを使用する常温での結晶化により、通常５〜１０ｍ２／ｇの比表面積を示すＨＡ粉末が生成される。結晶化パラメータ、例えば、ｐＨ、濃度、塩の前駆体、温度および養生時間などをさらに注意深く制御することで、４０〜６０ｍ２／ｇの間の比表面積を示すＨＡ粉末が得られる。また、結晶をさらに小さな均一サイズへ砕く粉砕処理によって、結晶サイズをさらに減少させることができる（文献６：インＪ他、米国再発行特許第３９１９６号Ｅ明細書、セナＭ他、米国特許第６５９２９８９号Ｂ１明細書）。
【０００９】
結晶溶液中に添加剤を存在させることで、結晶化の過程を変えることができる。
添加剤が結晶表面に吸着することにより、小さな結晶の溶解を防ぐことができ、さらに、結晶を衝突から保護することもできる。これらの効果によって、結晶サイズの分布を、比較的小さな結晶サイズの方へとシフトさせることができる。添加剤、例えば、ポリ（エチレングリコール）（文献７：ワンＡ他、Ｍａｔｅｒ.Ｌｅｔｔ.、第６１巻、第１０号、第２０８４頁〜第２０８８頁（２００７年））およびエタノール（文献８：クリアコセＴＡ他、Ｊ．Ｃｒｙｓｔ.Ｇｒｏｗｔｈ、第２６３巻、第１−４号、第５１７頁〜第５２３頁（２００４年））が、ＨＡの結晶成長に影響を及ぼすことがこれらの文献に開示されている。
【００１０】
界面活性剤は、結晶の表面上に吸着して小さな結晶を安定させることができるので、結晶成長阻害剤としても使用できる。界面活性剤の自己集合法を使用することで、ＨＡの高い比表面積を得ることができる。内側に水を含み外側に疎水性の溶媒を含むナノサイズの界面活性体の球体からなるマイクロエマルションは、自己集合性の界面活性剤の一例である。結晶化を水領域内部で開始させる場合、マイクロエマルション液滴は沈殿結晶の核を更なる凝集から保護し、均一サイズの反応槽として役割を果たすので、ナノメーター範囲の結晶が生産される（文献９：コウモウリジスＧＣ他、Ｊ.Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆ.Ｓｃｉ.、第２５９巻、第２号、第２５４頁〜第２６０頁（２００３年））。
【００１１】
ボーゼ他は、マイクロエマルションを用いて、比表面積が１３０ｍ２／ｇであるヒドロキシアパタイト粉末を合成する方法を開示している（文献１０：ボーゼＳおよびクマールサハＳＫ、Ｃｈｅｍ.Ｍａｔｅｒ.、第１５巻、第４４６４頁〜第４４６９頁（２００３年））。
【００１２】
界面活性剤の種類に応じて、例えば液晶相などの別の自己集合構造が形成され得る。液晶相は、界面活性剤／水の高い濃度比の利用により調製できる自己集合構造である。マイクロエマルションと比較して、液晶相はより強固な構造であるので、水性領域が衝突することをさらに効果的に防ぐ。液晶相を使用することで、比表面積が１５０〜３００ｍ２／ｇのＨＡ結晶を合成することができる（文献１１：チェリンＰおよびアンダーソンＭ、欧州特許出願公開第１７８１５６８号明細書、ウオータＭ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第２１巻、第１０号、第４７２４頁〜第４７２８頁（２００５年））。ステアリン酸などの添加剤を液晶相中での合成法と併用することも研究されている。ステアリン酸が液晶相の水領域内に存在することにより、カルボキシレート基がＨＡ結晶の表面に付着するので、結晶の凝集が妨げられる。この結果、ステアリン酸の層でカプセル化されたＨＡ結晶を含む粉末が得られる。この粉末を熱処理に付すことで、炭酸カルシウムでカプセル化されたＨＡ結晶のＨＡ粉末が生産される（文献１２：ウオータＭ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第２１巻、第１０号、第４７２４頁〜第４７２８頁（２００５年））。
【００１３】
界面活性剤の自己集合を利用する方法の主な不都合は、収率が比較的低いことである。多くの場合、界面活性剤／ＨＡ結晶の重量比は１００／１である。この結果、結晶を精製するために大規模な濾過装置が必要となると共に、工程で使用する界面活性剤を注意深く扱わなければならないので、該方法によりナノ結晶性のＨＡ粉末を大規模に合成することを面倒な方法にする。したがって、ＨＡのナノサイズ結晶を効率的に生産できる方法が要求されている。
【００１４】
ナノサイズリン酸カルシウム（特にＨＡ）のコーティングとしての合成
ＨＡでインプラントを被覆する方法が多数存在する。例えば、プラズマスプレー法は、高温でインプラント上にＨＡ層を蒸着させる。その結果、支持体に強固に付着して比較的厚みがある（通常６０〜８０μｍ）リン酸カルシウム層が形成される（文献１３：ストーリーＢおよびバーゲスＡ、米国特許第５７３０５９８号明細書）。プラズマによる高温（約３００００℃）に起因して、リン酸カルシウムは高いアモルファス含有量を示す（文献１４：サンＬ他、Ｊ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｍａｔｅｒ.Ｒｅｓ.Ａ、第５８巻、第５号、第５７０頁〜第５９２頁（２００１年））。この技術は、多孔質インプラント上に起伏のある被膜を形成し、ＨＡの厚い層も形成するので、支持体が有する元の表面構造を維持できない。
【００１５】
ゾル・ゲル技術を用いる場合には、浸漬被覆法などの湿式塗布方法を使用することによって、インプラントの表面上にリン酸カルシウムの薄層を形成させることができる。しかしながら、該技術は、ＨＡ層の高い結晶化度を得るためには高温（通常約８００℃）またはこのような高温の条件下での長時間暴露を必要とするので、チタンインプラント上で使用することは不適当である。擬似体液（ＳＢＦ）浸漬技術を用いてＨＡの薄層を得ることも可能であり、該技術は、インプラントの表面上にＨＡを結晶化させるために、長い時間をかけてインプラントをＳＢＦ中に浸漬させる技術である（文献１５：ウェイ−クイ・ヤン他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１８巻、第１７号、第１１８５頁〜第１１９０頁（１９９７年））。該ＳＢＦ技術は室温でおこなえるが、インプラントの表面上に安定したＨＡ層を形成するためには、長い暴露時間（少なくとも２４時間）が必要である。
【００１６】
欧州特許出願公開第１７８１５６８号明細書等（文献１１：チェリンＰおよびアンダーソンＭ、欧州特許出願公開第１７８１５６８号明細書、ウオータＭ他、Langmuir第２１巻、第１０号、第４７２４頁〜第４７２８頁）に記載されている、界面活性剤を介在させる技術によれば、リン酸カルシウムの非常に薄い層（５〜１０ｎｍ）でインプラントを被覆することが可能である。この場合、熱処理工程は５００℃で５分間おこなわれる。この温度は、支持体上に残存する界面活性剤の分解を確実におこなうために必要である。
【００１７】
ニシムラ他は、ＨＡナノ結晶で表面を被覆する二段階に被覆する技術を開示する（文献１６：ニシムラ他著、カナダ国特許出願公開第２５６３２９９号明細書）。まず、支持体をアミノプロピルトリメトキシシランなどのアルコキシドで被覆する。その後、該支持体を、ナノ結晶質のＨＡ粒子を含有する溶液中に浸漬させて、該支持体の表面上にＨＡ粒子の層を形成させる。この方法の不便な点は、ＨＡ結晶を付着させる前に支持体をアルコキシドで処理しなければならない、二段階の工程が必要なことである。したがって、１回の工程で、固体表面をＨＡナノ粒子で被覆する方法が要求されている。
【００１８】
表面を改質したＨＡ結晶
すでに記載したように、ステアリン酸の層でカプセル化されたＨＡ結晶の粉末が生産されており、該粉末を加熱処理することで、炭酸カルシウムでカプセル化されたＨＡ結晶のＨＡ粉末がもたらされる（文献１２：ウオータＭ他、Langmuir、第２１巻、第１０号、第４７２４頁〜第４７２８頁）。
【００１９】
スタップ他は、ポリ（Ｌ−リジン）などの重合アミノ酸をリン酸カルシウム結晶に付着させる技術を開示する（文献１７：スタップＳＩ他、米国特許出願公開第２００４／０２５８７２６Ａ１号明細書）。ポリ（アミノ酸）とリン酸カルシウムの凝集体は、リン酸カルシウム結晶の層で予め被覆した金属表面に結合させる。得られるものは、ポリ（アミノ酸）繊維の網状構造内に分散したリン酸カルシウム結晶の層（通常マイクロメータ領域）である。個々の結晶の平均サイズは１００〜５００ｎｍである。
【００２０】
ゴンザレス−マックカイア他は、アミノ酸が結合したＨＡを生産する技術を開示する（文献１８：ゴンザレス−マックカイアＲ他、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ、第１４巻、第２２７７頁〜第２２８１頁（２００４年））。結晶化は、ｐＨ９、温度８０℃の条件下で、Ｃａ（ＮＯ３）２とリン酸アンモニウムとアミノ酸とを、Ｃａ：Ｐ：アミノ酸のモル比を３：１：６の割合で混合しておこなわれる。該方法によると、凝集した形態で、ナノサイズの表面改質したＨＡ結晶が生成される。
【００２１】
しかしながら、良好に実現できるナノサイズのリン酸カルシウム粒子および結晶を生産する技術と、小さなサイズで高い比表面積を示すＨＡ粒子を提供する技術とを兼ね備える技術を見出すための技術的な解決法が依然として要請されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国再発行特許第３９１９６号Ｅ明細書
【特許文献２】米国特許第６５９２９８９号Ｂ１明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第１７８１５６８号明細書
【特許文献４】米国特許第５７３０５９８号明細書
【特許文献５】カナダ国特許出願公開第２５６３２９９号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／０２５８７２６Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】レイスＲおよびワイナーＳ著、「自然から学ぶ、新規の移植可能な生体材料の設計方法」、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、ロンドン、第９０頁〜第９２頁（２００４年）
【非特許文献２】ロウンスタンＨＡおよびワイナーＳ著、「バイオミネラ化」オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク、（１９８９年）
【非特許文献３】グオ他、Ｊ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｍａｔｅｒ.Ｒｅｓ.Ａ、ＤＯＩ１０.１００２／ｊｂｍ.a.３１２００
【非特許文献４】ウェイＪ他、Ｃｏｍｐｏｓ.パートＢ.Ｅｎｇ.、第３８巻、第３号、第３０１頁〜第３０５頁、２００７年
【非特許文献５】ラーメイＨＲＲおよびツァンＭ、生体材料、第２５巻、第２１号、第５１７１頁〜第５１８０頁（２００４年）
【非特許文献６】ミューリンＪＷ著、「結晶化」、エルゼビア・バターワース−ハインマン、オックスフォード、第３２０頁〜第３２５頁（２００１年）
【非特許文献７】ワンＡ他、Ｍａｔｅｒ.Ｌｅｔｔ.、第６１巻、第１０号、第２０８４頁〜第２０８８頁（２００７年）
【非特許文献８】クリアコセＴＡ他、Ｊ．Ｃｒｙｓｔ.Ｇｒｏｗｔｈ、第２６３巻、第１−４号、第５１７頁〜第５２３頁（２００４年）
【非特許文献９】コウモウリジスＧＣ他、Ｊ.Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆ.Ｓｃｉ.第２５９巻、第２号、第２５４頁〜第２６０頁（２００３年）
【非特許文献１０】ボーゼＳおよびクマールサハＳＫ、Ｃｈｅｍ.Ｍａｔｅｒ.、第１５巻、第４４６４頁〜第４４６９頁（２００３年）
【非特許文献１１】ウオータＭ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第２１巻、第１０号、第４７２４頁〜第４７２８頁（２００５年）
【非特許文献１２】サンＬ著、Ｊ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｍａｔｅｒ.Ｒｅｓ.Ａ、第５８巻、第５号、第５７０頁〜第５９２頁（２００１年）
【非特許文献１３】ウェイ−クイ・ヤン他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１８巻、第１７号、第１１８５頁〜第１１９０頁（１９９７年）
【非特許文献１４】ゴンザレス−マックカイアＲ他、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ、第１４巻、第２２７７頁〜第２２８１頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、二官能性の前駆体を用いて、粉末形状または酸化物表面もしくはポリマー表面を有する固体支持体上のコーティング形状でナノサイズのリン酸カルシウム粒子を生産する方法を提供する。該方法によれば上記の問題が解決される。
【００２５】
また、本発明は、前駆体、すなわち、少なくとも二つの官能基を有する水溶性の有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
二官能性分子を使用することによって、粒子表面または結晶表面を種々のコーティングで被覆したリン酸カルシウム粒子または結晶を、目的に応じて調製できる。特に、二官能性分子の一方の末端をリン酸カルシウム粒子または結晶の表面に結合させ、他端を溶液に向けて対置させることが好ましい。溶液に向けて対置する分子の一部は、結晶同士が衝突することを防ぎ、結晶のさらなる成長を停止させる。その後、ナノサイズの粒子または結晶を濾過し、加熱することによって有機分子が除去される。粒子または結晶を加熱することは、該有機分子を焼失させるのに充分な高温域でおこなわれるべきであるが、該結晶の相変態が生じる温度よりも低い温度で行わなければならない。また、正電荷または負電荷を帯びた分子が粒子または結晶の表面に結合する場合、粒子または結晶の凝集も防ぐことができる。従って、粒子または結晶表面が強い負電荷または正電荷を帯びる、いわゆる静電反発力によって、粒子または結晶が相互に反発するようになる。
【００２７】
リン酸カルシウム粒子または結晶上のコーティングが正に帯電している場合、該粒子または結晶は、負に帯電した表面に付着できる。このようにして、リン酸カルシウム粒子または結晶の表面を改質することによって、粒子または結晶上に正味の正電荷が付与され、負に帯電した表面上に該粒子または該結晶を結合させることが可能となる。ｐＨが約７の水性溶液中で負の電荷を帯びている表面の材質の例としては、金属、例えばチタン、チタン合金、チタン−アルミニウム−バナジウム合金およびステンレス鋼など、セラミック、例えばジルコニアおよびガラスなど、および、ポリ（スチレン）などのポリマー（文献１９：ヒダルゴ−アルバーツＲ他、Ａｄｖ.Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ.、第６７巻、第１頁〜第１１８頁（１９９６年））、並びにポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）が含まれる（文献２０：ワイドンハーマーＰおよびヤコバッシュＨ-Ｊ、Ｊ.Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆ.Ｓｃｉ.、第１８０巻、第２３２頁〜第２３６頁（１９９６年））。固体支持体としてのポリマーは、ポリマー表面を有する。該固体支持体は、全体がホモポリマーまたはコポリマーから構成されてもよい。あるいは、金属をホモポリマーまたはコポリマーで被覆してもよい。該固体担支持体はインプラントとして使用してもよく、また、例えば骨細胞の増殖を補助する表面をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
改質されたリン酸カルシウム粒子または結晶を、負に帯電している支持体の表面上に結合させた後、二官能性の分子は加熱することによって該表面から除去できる。したがって、表面改質されたリン酸カルシウム粒子または結晶を含む溶液は、該粒子または結晶を濾過して乾燥させた後、加熱することによって、ナノサイズの粒子または結晶の生産に使用できるだけでなく、該溶液は種々の表面に対するコーティング溶液としても使用できる。改質されたリン酸カルシウム粒子が静電的に表面に結合するので、加熱手順を省略することによって、被覆されたリン酸カルシウム粒子または結晶からなるコーティングが形成される。
【００２９】
分子の一端をＨＡ粒子または結晶に結合させて、他端を溶液に向けて対置させるという目的に使用してもよい分子が多種存在する。ＨＡ結晶の表面に結合させてもよい官能基の例としては、−ＣＯＯＨ基、ＯＰＯ３Ｈ２基および−ＯＳＯ３Ｈ基が含まれる。溶液に向けて対置させてもよい正に帯電した官能基の例としては、−ＮＨ２が含まれる。
【００３０】
本発明において有用な二官能性分子の例は、一端にカルボン酸基を有し他端にアミノ基を有するガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。ＨＡの結晶化の間にＧＡＢＡが存在する場合、一端のカルボン酸基が結晶表面上のカルシウムイオンに結合して、他端のアミノ基が溶液に面する。６−アミノヘキサン酸は、より長い炭素鎖を有する類似アミノ酸の更なる例である。これらのアミノ酸を加熱する場合、該アミノ酸は、例えば直鎖状のカルボン酸よりも著しく不安定であるので、２００〜２５０℃の比較的低い温度で取り除くことができる。低温で分子を除去できることは、ＨＡ粉末の小さな粒径と、高い比表面積とを維持するために重要である。また、コーティング形状のナノ結晶質ＨＡを、チタンなどの酸化に敏感なインプラントの表面上に塗布する場合、有機分子の除去が低温でおこなわれることも重要である。あるいは、加熱工程は省略してもよく、過剰なアミノ酸を洗浄、抽出または濾過してもよく、これによって、被覆されたリン酸カルシウム粒子または結晶からなるコーティングが形成される。例えばポリ（スチレン）などの低い融点を示すポリマーを被覆する場合、加熱工程を省略することが望しい。この方法により、例えば骨細胞の培養において有用なペトリ皿およびマルチウェルプレートなどのポリマーを基材とする細胞培養用支持体上に該コーティングを形成させることが可能になる。
【００３１】
結晶化工程は、ＧＡＢＡ：Ｈ３ＰＯ４のモル比が３：１の条件下で、リン酸水溶液とＧＡＢＡとを反応させる方法によって開始される。
以下の化学式のようにして、アミノ酸はリン酸を中和する：
【００３２】
【化２】
2011504454.tif 000003
【００３３】
カルシウム溶液は、酸化カルシウムまたは水酸化カルシウムの水溶液とＧＡＢＡを反応させることにより調製される（下記式参照）：
【００３４】
【化３】
2011504454.tif 000004
【００３５】
その後、上記の２種類の溶液を混合する（下記式参照）：
【００３６】
【化４】
2011504454.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ナノ結晶質ＨＡで被覆されたチタン表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。目盛尺は２００ｎｍである。この図から判るように、ＨＡ結晶は針状の形状であり、長さ５０〜１５０ｎｍ、幅５〜１０ｎｍである。
【図２】図２は、加熱処理したナノ結晶質ＨＡ粉末のＸ線回折図である。この図から判るように、小さな粒径に起因するピークの著しい幅拡大が示される。
【図３】図３は、ナノ結晶質ＨＡで被覆されたチタン表面のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトル図を示す。図から判るように、チタンの含有量は１．３％である。
【図４】図４は、被覆リン酸カルシウム粒子で被覆されたポリ（スチレン）皿のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトル図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
したがって、本発明の１つの対象は、粉末形状のリン酸カルシウム粒子、あるいは酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体上のコーティング形状のリン酸カルシウム粒子を生産する方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
Ｉ）カルシウムイオンと、少なくとも官能基の１つが負に帯電している基であり少なくとも１つが正に帯電している基である、少なくとも２つの官能基を含有する水溶性の有機化合物とを含む、第１の水溶液を調製し、
II）リン酸イオンと、少なくとも官能基の１つが負に帯電している基であり少なくとも１つが正に帯電している基である、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物とを含む、第２の水溶液を調製し、
III）工程Ｉ）およびII）で得られた溶液を周囲温度で混合することにより、負に帯電した基を介して水溶性の有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を生成させ（得られる混合液のｐＨは中性または塩基性である）、次いで、以下の工程IV）とV）をおこなうか、または以下の工程VI)とVII)もしくはVI）とVIII）をおこなう：
IV)  該有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を工程III）の混合物から抽出し、該被覆された粒子を洗浄した後に乾燥させることにより、該有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子の粉末を調製し、次いで、
V)２５０℃〜６００℃の温度範囲で加熱することにより該有機化合物を除去することによって、リン酸カルシウム粒子の粉末を生産する。
VI)酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体を、工程III）の混合物中に浸漬させることにより、リン酸カルシウム粒子を被覆する有機化合物の正に帯電した官能基を固体支持体に結合させ、続いて、該混合物から該固体支持体を取りだした後、乾燥させることにより、有機化合物で被覆されたリン酸カルシウム粒子を該固体支持体に結合させる、次いで
VII)過剰量の有機化合物を除去することによって、被覆されたリン酸カルシウム粒子のコーティングを固体支持体上に形成させるか、もしくは、
VIII)２００℃〜６００℃の温度範囲で加熱することにより該有機化合物を除去することによって、リン酸カルシウム粒子のコーティングを固体支持体上に形成させる。
【００３９】
本明細書において「過剰量の有機化合物を除去すること」とは、「洗浄、抽出または濾過によって有機化合物を除去すること」と定義され、したがって、加熱工程が省略される。その結果、被覆されたリン酸カルシウム粒子の一部を構成する有機化合物は、該粒子から除去されない。
【００４０】
工程Ｖ)における、２５０℃〜６００℃の範囲での加熱温度の例は、２５０℃〜３００℃、２５０℃〜３５０℃、２５０℃〜４００℃、２５０℃〜４５０℃、２５０℃〜５００℃、または２５０℃〜５５０℃の温度範囲から選択される任意の温度であり、例えば３００℃〜５００℃であり、例えば約４００℃である。
【００４１】
工程VII)における、２００℃〜６００℃の範囲での加熱温度の例は、２００℃〜２５０℃、２００℃〜３００℃、２００℃〜３５０℃、２００℃〜４００℃、２００℃〜４５０℃、２００℃〜５００℃または２５０℃〜５５０℃の温度範囲から選択される任意の温度であり、例えば２００℃〜５００℃または２５０℃〜４５０℃であり、例えば約４００℃である。
【００４２】
工程I）およびII)における、少なくとも官能基の１つが負に帯電している基であり少なくとも１つが正に帯電している基である、少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物は、同一の化合物であってもよく、異なる化合物であってもよく、および、上記のような水溶性の有機化合物から、それぞれ２種またはそれよりも多くの種類から選択された混合物であってもよい。
【００４３】
本明細書および請求項において使用される「水溶性の有機化合物」という用語は、本発明による方法において機能できる程度に、水に溶解する有機化合物を意味する。本発明において使用される、有機化合物の水溶性が高ければ高いほど、水中での該有機化合物濃度をさらに高く維持できるので、得られる最終生産物の収率をさらに高くできる。
【００４４】
本発明の１実施態様において、リン酸カルシウム粒子は結晶形態である。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、有機化合物の負に帯電する官能基は、−ＣＯＯＨ基、ＯＰＯ３Ｈ２基および−ＯＳＯ３Ｈ基を含有する群から選択され、有機化合物の正に帯電する官能基はアミン基である。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施態様によると、リン酸カルシウム粒子はヒドロキシアパタイトである。
【００４７】
したがって、本発明の方法を使用することにより、Ｃａ／Ｐ比が１.６７（該割合は、天然に存在するヒドロキシアパタイトの割合である）を示すヒドロキシアパタイトが得られる。しかしながら、本発明において、水中でカルシウムイオンとリンイオンを発生する化合物の割合を変化させることによって、別のリン酸塩化合物、例えばリン酸二カルシウムまたはリン酸八カルシウムなども生産させてもよい。
【００４８】
水中でリンイオンを発生する化合物の例には、リン酸、亜リン酸、次亜リン酸および亜リン酸トリエチルなどの亜リン酸エステルが含まれる。
【００４９】
水中でカルシウムイオンを解離する化合物の例には、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、およびカルシウムエトキシドなどのカルシウムアルコキシドが含まれる。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、工程Ｉ）および／または工程ＩＩ）における有機化合物は、例えばリジンなどの３つの官能基を有する水溶性の有機化合物から選択される。
【００５１】
本発明の更に別の実施態様において、工程Ｉ）および／または工程ＩＩ）における有機化合物は、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸からなる群より選択される。したがって、同数のアミン基とカルボン酸基を有する中性アミノ酸を使用するだけではなく、リジンなどの塩基性アミノ酸およびアスパラギン酸などの酸性アミノ酸も使用できる。
【００５２】
本発明の別の対象において、コーティングが結合される酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体は、チタン、チタン合金、ステンレス鋼、ジルコニア、ガラス、ポリ（スチレン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）（ＰＥＥＫ）およびポリ（イミド）から選択される。
【００５３】
本発明の実施態様において、固体支持体は歯科用インプラントなどのインプラントである。本発明の別の実施態様においては、固体支持体はペトリ皿などの細胞培養支持体である。
【００５４】
本発明の別の対象は、粉末形状の被覆リン酸カルシウム粒子、あるいは酸化物表面またはポリマー表面を含む固体支持体上のコーティング形状の被覆リン酸カルシウム粒子に関する。該被覆粒子は、少なくとも官能基の１つが負に帯電した基であり少なくとも１つが正に帯電した基である少なくとも２つの官能基を有する水溶性の有機化合物で被覆される。該有機化合物は、負に帯電した基を介してリン酸カルシウム粒子に結合し、リン酸カルシウム粒子を被覆する有機化合物の正に帯電した基は固体支持体に結合する。本発明の実施態様において、このような被覆リン酸カルシウム粒子は結晶形態である。被覆粒子または結晶は、有機分子を例えば加熱または洗浄により除去することによって、本発明による粉末形状のリン酸カルシウム粒子または結晶、あるいはコーティング形状のリン酸カルシウム粒子または結晶を生産する場合に有用である。また、該粒子または該結晶は、例えば細胞培養用の足場として使用してもよい。
【００５５】
また、本発明によるこの態様は、本発明による方法の態様に関連して言及した実施態様をも包含する。即ち、この態様は以下の実施態様を含む：負に帯電した基は、−ＣＯＯＨ基、ＯＰＯ３Ｈ２基および−ＯＳＯ３Ｈ基を含有する群から選択され、正に帯電した基はアミノ基であること：リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイトであること：有機化合物が、３つの官能基を有する水溶性の有機化合物から選択されること：および有機化合物が、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸からなる群より選択されること。
【００５６】
本発明は実施例および図面を参照することで説明されるが、本発明の範囲は、開示されたこれらの詳細な説明に限定されない。
【実施例】
【００５７】
実施例１.
Ａ）一般的な実施例：１０．４ｇのガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を１５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた。２．８２ｇのＣａＯを該溶液に添加し、１０分間攪拌した。得られた溶液は１１．７のｐＨを示した（溶液１）。９.３ｇのＧＡＢＡを１５０ｍｌのＨ２Ｏに添加して、溶液２を調製した。３．４５ｇのＨ３ＰＯ４を該溶液に添加し、１０分間攪拌した。得られた溶液は４．５０のｐＨを示した。続いて、溶液１と溶液２とを混合することにより、結晶化が生じた。該結晶化を周囲温度で行った。この混合液のｐＨは９．１２を示した。
Ｂ）結晶をＨ２Ｏ−イソプロパノール混合物で充分に洗浄し、１２０℃で１２時間乾燥させた。次いで、有機化合物を除去するために、該結晶をオーブンの中で４００℃にて５時間加熱した。ＢＥＴアルゴリズムを使用する機器であるマイクロメリティクス社製のトライスターで測定した比表面積は１８０ｍ２／ｇであった。得られた粉末を、シーメンス社製Ｄ５０００粉末Ｘ線回折計（ＣｕＫα放射）で分析し、回折図を図２に示す。
【００５８】
実施例２.
別の実施例：１１．５ｇの６−アミノヘキサン酸を１５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた。２．８２ｇのＣａＯを該溶液に添加し、１０分間攪拌した。この溶液のｐＨは１２．０であった（溶液１）。１３．２ｇの６−アミノヘキサン酸を１５０ｍｌのＨ２Ｏに添加して溶液２を調製した。３．４５ｇのＨ３ＰＯ４をこの溶液に添加し、１０分間攪拌した。この溶液のｐＨは４.７０であった。溶液１と溶液２とを混合することにより、結晶化が生じた。該結晶化を周囲温度でおこなった。得られた混合液のｐＨは９.５３を示した。実施例１の工程Ｂ）に従って結晶を洗浄し、４００℃に加熱して乾燥させた。比表面積は１６０ｍ２／ｇであった。
【００５９】
実施例３.
別の実施例：溶液１を、２．８２ｇのＣａＯと、６．７０ｇのＬ−アスパラギン酸と１５０ｍｌのＨ２Ｏから調製した。この溶液のｐＨは１０．１であった。溶液２を、３．４５ｇのＨ３ＰＯ４と、６.６５ｇのＬ−リジンと１５０ｍｌのＨ２Ｏから調製した。この溶液のｐＨは６.４６であった。室温で該溶液を混合し、この混合液のｐＨは８.１０を示した。沈殿した結晶をＨ２Ｏで洗浄し、４００℃に加熱して乾燥した。比表面積は１５９ｍ２／ｇであった。
【００６０】
実施例４.
別の実施例：実施例１の工程Ａ）に従って結晶を沈殿させた。粒子表面が両性のＧＡＢＡ分子で被覆されたナノ結晶のＨＡ粒子を含有する溶液を、コーティング溶液として使用した。チタンディスクを該溶液中に浸漬させて取り出した後、室温で１時間乾燥させた。次いで、該ディスクを、３００℃の空気中で５分間熱処理した。該ディスクを室温まで冷却させ、水とイソプロパノールで充分に洗浄した。該ディスクの表面上に結晶層が観察された。レオ社製のウルトラ５５ＳＥＭ装置を用いて、該チタンディスクを分析し、観察された顕微鏡写真を図１に示す。図から判るように、ディスク上の結晶は、５０〜１５０ｎｍの長さと、５〜１０ｎｍの直径を有する小繊維状形態であった。ＥＤＳ測定によるＣａ／Ｐ比は１.６５を示し、天然のＨＡの理論値１.６７に近似であった。パーキンエルマー社製ＰＨＩ５０００Ｃ機器を使用し、被覆されたチタンディスクのＸＰＳスペクトルを測定し、結果を図３に示す。この図から判るように、チタンの量は１．３％であり、この結果は、ディスクがほぼ完全にＨＡ結晶で被覆されたことを示す。
【００６１】
実施例５.
別の実施例：実施例１の工程Ａ）に従って結晶を沈殿させた。粒子表面が両極性のＧＡＢＡ分子で被覆されたナノ結晶のＨＡ粒子を含有する溶液を、コーティング溶液として使用した。ポリスチレンディスクを該溶液中に浸漬させて取り出した後、８０℃で１時間乾燥させた。次いで、該ディスクを水で充分に洗浄した。該ディスクの表面上に結晶層が観察された。パーキンエルマー社製のＰＨＩ５０００Ｃ機器を使用して該ディスクを分析し、この測定結果を図４に示す。この図から判るように、カルシウムとリンの含有量はそれぞれ１３．７％と９．０％であった。
【図１】
2011504454.tif 000006
【図２】
2011504454.tif 000007
【図３】
2011504454.tif 000008
【図４】
2011504454.tif 000009
【国際調査報告】
2011504454.tif 000010
2011504454.tif 000011
2011504454.tif 000012
2011504454.tif 000013