(57)【要約】  本発明は、造血幹細胞の生着を増加させるためのＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の調節、およびそのための化合物に関する。いくつかの実施形態において、造血幹細胞の生着を増強するための、単離されたＳＩＲＰαおよびＣＤ４７のポリペプチド、断片および融合タンパク質が提供される。上記のポリペプチドを投与することによって造血幹細胞の生着を増加させるための方法がさらに提供される。
2011500005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、ここで、断片は、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチド；ならびに
ｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含み、かつヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；ならびに
ｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで：
ｉ．ポリペプチドにおける配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位における残基のうちの少なくとも１つが、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６で置換されているか；または
ｉｉ．ポリペプチドにおける配列番号２の残基１２９および１３０のうちの少なくとも１つが欠失している；
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ａ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；ならびに
ｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、ヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、断片であり、配列番号１の残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５または１２８〜１４１の両端の残基を含む領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも３つ連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが、断片であり、配列番号２の残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５または１２８〜１４３の両端の残基を含む領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも３つ連続したアミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、断片であり、配列番号４、７、８、９および１２のいずれか１つの残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９〜７４、７７〜８３、８８〜９９もしくは１０２〜１１６の両端の残基を含む領域；または配列番号５、６、１０、１１および１３の残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９−７４、７７〜８３、８８〜９９もしくは１０２〜１１５の両端の残基を含む領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも３つ連続したアミノ酸を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸の挿入、欠失または置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸の挿入、欠失または置換を有しない、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが、ヒトＣＤ４７に結合する、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが、断片であり、６から３０アミノ酸長である、請求項１から９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
断片が、８から２８アミノ酸長である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
断片が、１０から２６アミノ酸長である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
断片が、１２から２４アミノ酸長である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
断片が、１４から２２アミノ酸長である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
第２のポリペプチドに融合された請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
哺乳動物において造血幹細胞の生着を増加させるための方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
造血幹細胞の生着の増加が、マクロファージの抑制に起因する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２１】
哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２２】
哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項２４】
発現調節配列に作動可能に連結された請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項２６】
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項２５に記載の細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを生成する方法。
【請求項２７】
ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用を調節する工程を包含する、ヒトにおいて造血幹細胞の生着を増加させるための方法。
【請求項２８】
ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用が、治療有効量の、以下のもの：
ａ）ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＣＤ４７に対する抗体
のうちの少なくとも１つを投与することによって調節される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドが、可溶性ヒトＳｉｒｐαまたはその断片を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが、ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが、第２のタンパク質に融合されている、請求項２９および３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用が、治療有効量の、以下のもの：
ａ）ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＳｉｒｐαに対する抗体
のうちの少なくとも１つを投与することによって調節される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
Ｓｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドが、可溶性ヒトＣＤ４７またはその断片を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが、ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが、第２のタンパク質に融合されている、請求項３４および３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
造血幹細胞の生着の増加が、マクロファージの抑制に起因する、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための化合物の使用であって、化合物は：
ａ）ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＣＤ４７に対する抗体
を含む、使用。
【請求項４０】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の化合物の使用であって、化合物は：
ａ）ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＣＤ４７に対する抗体
を含む、使用。
【請求項４１】
ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドが、可溶性ヒトＳｉｒｐαまたはその断片を含む、請求項３９および４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
ポリペプチドが、ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
ポリペプチドが、第２のタンパク質に融合されている、請求項４１および４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための化合物の使用であって、化合物は：
ａ）ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＳｉｒｐαに対する抗体
を含む、使用。
【請求項４６】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の化合物の使用であって、化合物は：
ａ）ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＳｉｒｐαに対する抗体
を含む、使用。
【請求項４７】
Ｓｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドが、可溶性ヒトＣＤ４７またはその断片を含む、請求項４５および４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
ポリペプチドが、ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
ポリペプチドが、第２のタンパク質に融合されている、請求項４７および４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
さらにマクロファージを抑制するための、請求項３９〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
ＩｇＧのＦｃ部分に融合されたＣＤ４７の細胞外ドメインを含むポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、配列番号１２４、１２５および１２６によって連続してコードされる、５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
請求項５２および５３のいずれか１項に記載のポリペプチドならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項５５】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための請求項５２および５３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
請求項５２および５３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項５７】
発現調節配列に作動可能に連結された請求項５６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５８】
核酸のＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
請求項５７および５８のいずれか１項に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項６０】
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項５９に記載の細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法。
【請求項６１】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させる化合物を同定する方法であって：
ａ）ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の細胞外ドメインのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの試験化合物と接触させる工程；
ｂ）その少なくとも１つの試験化合物を、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７のうちの少なくとも１つに結合すると判定する工程；
ｃ）その試験化合物を間質の環境においてヒト造血細胞と接触させる工程；ならびに
ｄ）造血幹細胞の生着がその試験化合物の存在下において増加しているか否かを判定する工程
を包含する、方法。
【請求項６２】
造血幹細胞の生着に影響を及ぼすヒトにおける遺伝的多型を決定する方法であって：
ａ）造血移植を受けた複数のヒト由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；
ｂ）それら複数のヒトの中のＳｉｒｐα遺伝子におけるヌクレオチドの差異を判定する工程；および
ｃ）ヌクレオチドの差異を造血幹細胞の生着と相関させることにより、関連性のある多型を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項６３】
ヌクレオチドの差異が、アミノ酸の差異をもたらす、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
レシピエントにおける造血幹細胞の生着の可能性を判定する方法であって：
ａ）レシピエント由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；および
ｂ）請求項６２に記載の関連性のある多型が存在するか否かを判定する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
ヌクレオチドの差異が、アミノ酸の差異をもたらす、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
アミノ酸の差異が、
ａ）配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位における残基のうちの少なくとも１つの、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６による置換；または
ｂ）配列番号２の残基１２９および１３０のうちの少なくとも１つの欠失
のうちの少なくとも１つである、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、造血幹細胞の生着を増加させるためにＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用を調節することおよびそのための化合物に関する。いくつかの実施形態において、造血幹細胞の生着を増強するための、単離されたＳＩＲＰαおよびＣＤ４７のポリペプチド、断片および融合タンパク質が提供される。上記ポリペプチドの投与によって造血幹細胞の生着を増加させるための方法がさらに提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨髄（ＢＭ）由来のヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）またはＧ−ＣＳＦによって動員された末梢血（ＰＢ）の移植は、幹細胞生物学の最も重要な臨床応用の１つである。腫瘍性疾患を有する個体におけるＨＳＣ移植は、高用量化学療法レジメン、およびそれに続く、化学療法に起因し、結果として生じる造血不全を克服するＨＳＣレスキューの使用を可能にし、血液腫瘍および非血液腫瘍の両方に対する治癒率を高める。さらに、サラセミアなどの遺伝性疾患およびある特定の免疫不全は、遺伝子が訂正されたＨＳＣの自家移植または同種ＨＳＣの移植によってうまく対処され得る。ＨＳＣ移植の成功を可能にする重要な発見は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体としてのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系の同定であった。ドナーと宿主とのＨＬＡの不一致が、移植片拒絶において主要な役割を果たすが、移植片の不全は、操作されていないＨＬＡ同一移植片を移植された患者でさえも起こり得る（Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｂｌｏｏｄ  ４９，５１１−３３；Ｓｔｏｒｂ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２９６，６１−６）。この状況における移植片拒絶は、マイナー組織適合抗原のミスマッチに一部関連し得る（Ｇａｌｅ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｌｏｏｄ  ５７，９−１２）。ＨＳＣの生着を調節するＨＬＡハプロタイプ以外のさらなる遺伝子は、特徴付けられていない。
【０００３】
ＨＳＣは、線維芽細胞の間質、骨芽細胞、破骨細胞、マクロファージおよび内皮細胞を含む支持的な微小環境のニッシェに存在する（Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６，４２６−３３）。例えば、特定の接着タンパク質またはケモカイン受容体の遮断によってそのようなニッシェとＨＳＣとの相互作用を抑止することにより、ＨＳＣの生着が妨げられる（Ｌａｐｉｄｏｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６，１９０１−１０）。さらに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージ（両方ともが先天性免疫系の構成要素である）は、それぞれマウスのＨＳＣ移植（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６５，１２１２−７）およびヒトの造血性異種移植（ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６，１２５９−６１）に関与することが示されている。制御経路を調節する遺伝子をはじめとした移植後の造血幹細胞の生着の基礎をなす機序のよりよい理解は、最終的には、よりよい臨床成績につながりうる。
【０００４】
非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全ＮＯＤ．Ｐｒｄｃｋｓｃ／ｓｃ（ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）マウスにおける異種移植は、ヒトＨＳＣの生着に対する「ゴールドスタンダード」なアッセイになっている。このアッセイは、ヒトＨＳＣが静脈内注射後にこれらの動物の免疫系を再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）する能力に基づくものである（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ−Ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．）９９−１１８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２００１の中のＷａｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓａｙｅｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ”）。ヒト異種移植片を惹起する細胞は、ＳＣＩＤ再配置細胞（ＳＲＣ）として操作上定義されており、ＨＳＣに起因する特性を有し、インビトロにおいてアッセイされるより成熟した先祖と異なる。この系のおかげで、ヒトＨＳＣ区画内でのＳＲＣの増殖、分化および自己再生の特性の解析が可能になった。
【０００５】
シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）は、骨髄性細胞上（マクロファージ、顆粒球、骨髄性樹状細胞およびマスト細胞を含む）および神経細胞上に発現される細胞表面糖タンパク質のファミリを構成する（Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，４５７−６４（２００６）に要約されている；ＷＯ９７／４８７２３もまた参照のこと）。ＳＩＲＰは、抑制性メンバー（ＳＩＲＰα）、活性化メンバー（ＳＩＲＰβ）、非シグナル伝達メンバー（ＳＩＲＰγ）および可溶性メンバー（ＳＩＲＰδ）を含む、免疫受容体の多様な多重遺伝子ファミリを構成する。広く発現される膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ４７は、ＳＩＲＰαに対する細胞リガンドとして機能し、ＳＩＲＰαのＮＨ２末端の細胞外末端に結合する。ＳＩＲＰαの役割は、マクロファージによる宿主細胞のファゴサイトーシスにおける抑制性の役割に関して最もよく証明されている。特に、標的細胞上に発現されるＣＤ４７によるマクロファージ上のＳＩＲＰαの結合は、食作用を負に制御する抑制性シグナルを生成する。しかし、より最近の知見からは、ＳＩＲＰα結合に媒介される追加の正のシグナル伝達作用も証明されている（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４，１８０−９１）。
【０００６】
生物学的結果に影響を及ぼす試みでＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を乱す種々のアプローチが提唱されている。これらには、免疫機能を改変するため（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９９／４０９４０；ならびに米国特許出願公開番号２００３／００２６８０３および２００７／０１１３２９７を参照のこと）および異種移植のため（例えば、米国特許出願公開番号２００５／０２５５５５０および２００７／０１５７３２８を参照のこと）の、断片型／切断型のＳＩＲＰαおよび／またはＣＤ４７タンパク質ならびにそれらに対する抗体の使用（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９９／４０９４０；米国特許出願公開番号２００３／００２６８０３および２００６／０１３５７４９；ならびに米国特許第６，９１３，８９４号を参照のこと）が包含される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
移植の際にＨＳＣの生着および造血を支援することができる分子を同定する必要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
一態様によると、ａ）配列番号１のアミノ酸配列；ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、ここで、断片は、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含み、かつヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなるポリペプチドからなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【０００９】
さらなる態様によると、ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、ｉ）ポリペプチドにおける配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位における残基のうちの少なくとも１つが、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６で置換されているか；またはｉｉ）ポリペプチドにおける配列番号２の残基１２９および１３０のうちの少なくとも１つが欠失している；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００１０】
さらなる態様によると、ａ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、ヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００１１】
さらなる態様によると、ヒトＳｉｒｐαに結合することができるポリペプチド；およびヒトＳｉｒｐαに対する抗体が提供される。好ましくは、ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分に融合されたヒトＣＤ４７の細胞外ドメインである。
【００１２】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
【００１３】
さらなる態様によると、哺乳動物において造血幹細胞の生着を増加させるための方法であって、哺乳動物に治療有効量の本明細書中に記載されるポリペプチドを投与する工程を包含する方法が提供される。
【００１４】
さらなる態様によると、哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための、または哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の、本明細書中に記載されるポリペプチドの使用が提供される。
【００１５】
さらなる態様によると、哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための本明細書中に記載されるポリペプチドが提供される。
【００１６】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸が提供される。
【００１７】
さらなる態様によると、本明細書中に記載される核酸を含む発現ベクターが提供される。
【００１８】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるベクターを含む培養細胞が提供される。
【００１９】
さらなる態様によると、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本明細書中に記載される細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを生成する方法が提供される。
【００２０】
さらなる態様によると、ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用を調節する工程を包含する、ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様によると、ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させる化合物を同定する方法であって、ａ）ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の細胞外ドメインのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの試験化合物と接触させる工程；ｂ）その少なくとも１つの試験化合物を、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７のうちの少なくとも１つに結合すると判定する工程；ｃ）その試験化合物を間質の環境においてヒト造血細胞と接触させる工程；ならびにｄ）造血幹細胞の生着がその試験化合物の存在下において増加しているか否かを判定する工程を包含する方法が提供される。
【００２２】
さらなる態様によると、造血幹細胞の生着に影響を及ぼすヒトにおける遺伝的多型を決定する方法であって、ａ）造血移植を受けた複数のヒト由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；ｂ）それら複数のヒトの中のＳｉｒｐα遺伝子におけるヌクレオチドの差異を判定する工程；およびｃ）ヌクレオチドの差異を造血幹細胞の生着と相関させることにより、関連性のある多型を決定する工程を包含する方法が提供される。
【００２３】
さらなる態様によると、レシピエントにおける造血幹細胞の生着の可能性を判定する方法であって、ａ）レシピエント由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；およびｂ）関連性のある多型が存在するか否かを判定する工程を包含する方法が提供される。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてより明らかになるだろう：
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＮＯＤ系統バックグラウンドにおけるインビボおよびインビトロでのヒト造血の支援を示している。（ａ）ヒトＢＭ細胞（上パネル；細胞用量：ＲＡＧ−２ノックアウト系統４０×１０６個の単核細胞、ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス２０×１０６個の細胞）またはヒトＣＢ細胞（下パネル、１５×１０６個の単核細胞／レシピエント）による移植後４週間のマウスのＢＭから抽出されたＤＮＡのサザンブロット解析。サンプルレーンにおける２．７ｋｂのα−サテライトバンド（矢印）の強度をコントロールヒト／マウスＤＮＡ混合物と比較することによって、ヒト細胞の生着のレベルを測定した。（ｂ、ｃ）照射マウスＢＭ間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおいて生成されたＣＦＣの数。記載されるようなＮＯＤ、ＮＯＲ、Ｂ６、ＩＣＲ、Ｃ３ＨおよびＢＡＬＢ／ｃ雄マウス由来のＢＭ細胞を５週間にわたって培養した後、照射し、続いて１．１×１０５（ｂ）または０．６〜６．０×１０５（ｃ）個のＬｉｎ−ＣＢ細胞で接種した。培養後５週間で細胞を回収し、ＣＦＣの総数を標準的なクローン原性メチルセルロースアッセイにおいて測定した。データは、３〜６回の独立した実験の平均値として示されている。
【図２】図２は、インビトロおよびインビボにおけるヒト造血性生着の支援に対するＩｄｄ１３遺伝子座における系統特異的差異の作用を示している。（ａ）ＮＯＤコンジェニックマウス（ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ４、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ５、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ９、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３）、ＮＯＲコンジェニックマウス（ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３）およびＢ６．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウス由来のマウス間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおけるＣＦＣの生成。図１ｂに記載されているようにマウスＢＭ間質層を樹立し、０．３６〜２．０×１０５個のヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞とともに播種した。培養の５週間後、細胞を回収し、メチルセルロースアッセイにおいてプレーティングすることによってＣＦＣの数を測定した。各実験において、ＮＯＤ間質をポジティブコントロールとして使用し、Ｂ６およびＮＯＲストローマ細胞をネガティブコントロールとして使用した。データは、ＮＯＤ培養物において生成されたＣＦＣの数（＝１００％）に対して正規化され、少なくとも３回の独立した培養の平均値として示される。ＢＢ、Ｉｄｄ１３ホモ接合Ｂ６  ＢＭ間質；ＮＮ、Ｉｄｄ１３遺伝子型ホモ接合ＮＯＤ  ＢＭ間質。（ｂ）８〜９週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１１）またはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８）に３５０ｃＧｙを照射し、０．３７〜１．５×１０５個のＬｉｎ−ＣＤ３４＋細胞）を静脈内注射した。移植の６〜７週間後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリによってヒトＣＤ４５＋細胞の生着についてレシピエントのＢＭを評価した。
【図３】図３は、ヒト造血の支援に関連するＩｄｄ１３の重大な領域の同定を示している。（ａ）ＮＯＤバックグラウンドおよびＮＯＲバックグラウンドの両方における様々なコンジェニック系統における２番染色体の図示。染色体の表示の右の縞のあるバーによって、候補間隔の遺伝的マッピングが表示されている。正式なコンジェニック系統の名称は、以下のとおりである：１．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｍｉｔ４５２、２．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、３．ＮＯＲ．ＢＮ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、４．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ１Ｎｇｕｌ４６−Ｒａｍｐ１／Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１１９２、５．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｇｕｌ４８２、６．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ３９４１、７．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ１Ｎｇｕｌ４６−Ｒａｍｐ１／Ｄ２Ｇｕｌｌ８８−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、８．ＮＯＲ．ＢＮ−Ｄ２Ｊｙｈ７６７−Ｆｌｉｚ１。（ｂ）ａにおいて表されたＮＯＤまたはＮＯＲ  Ｉｄｄ１３サブコンジェニックマウス由来のマウス間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおけるＣＦＣの生成。培養が行われ、データは、図２ａにおけるように表現される。系統の名称は、ａに記載されるとおりである。
【図４】図４は、ＳＩＲＰαのタンパク質配列アラインメントを示している。ＢＭ由来マクロファージから調製されたｃＤＮＡを、ＮＯＤおよびＮＯＲマウス由来のＳｉｒｐα転写物のＰＣＲ増幅に対する鋳型として使用した。Ｂ６マウス配列は、ＥｎｓＥＭＢＬデータベースからのものである。タンパク質ドメインは、白四角によって示されている。
【図５】図５は、ＮＯＤ、ＮＯＲおよびコンジェニックＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウス系統のＢＭ由来マクロファージにおけるＳＩＲＰαの免疫ブロット解析を示している。（ａ）処理されていないか、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理された、ＢＭ由来マクロファージから調製された溶解産物を、ＳＩＲＰαの細胞質ドメイン、または充填コントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット解析に供した。（ｂ）ＢＭ由来マクロファージから調製された溶解産物を３７℃において、１２時間にわたってＮ−グリコシダーゼＦの非存在下（−）または存在下（＋）においてインキュベートし、次いで、ＳＩＲＰαの細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット解析に供した。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプルおよび処理していないサンプルを同時に電気泳動した。分子サイズの規格は、キロダルトン（ｋＤ）で示されている。
【図６】図６は、ヒト造血のマウスマクロファージ媒介性抑制のＳｉｒｐα調節を示している。（ａ）ＬＴＣにおけるヒト造血のマクロファージ媒介性抑制。ＭＳ−５細胞を９６ウェル組織培養プレート上に播種した（２０００細胞／ウェル）。ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３ヘテロ接合マウスから回収された腹腔マクロファージを２００〜２０，０００細胞／ウェルの用量で播種し（５反復／用量）、翌日、２０００個のヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞／ウェルを加えた。培養の３〜４週間後、細胞を回収し、メチルセルロースアッセイにおいてプレーティングすることによって、ヒトＣＦＣの数を測定した。エラーバーは、標準偏差を表している。（ｂ）コントロールウイルス（ＣＥＰ）またはＮＯＤ由来Ｓｉｒｐαを発現しているウイルス（ＳＩＲＰ）による感染前および感染後のＪｕｒｋａｔ細胞およびＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージにおけるＳＩＲＰα発現を示しているウエスタンブロット解析。タンパク質溶解産物を、ＳＩＲＰαに対するポリクローナル抗体で免疫ブロットした。レーン１：Ｊｕｒｋａｔ細胞；レーン２：ＣＥＰで感染されたＪｕｒｋａｔ細胞；レーン３：ＳＩＲＰで感染されたＪｕｒｋａｔ細胞；レーン４：ＮＯＲマクロファージ；レーン５：ＳＩＲＰで感染されたＮＯＲマクロファージ；レーン６：ＮＯＤマクロファージ。ＳＩＲＰレンチウイルスによる感染は、ＮＯＲマクロファージにおいてＮＯＤ  ＳＩＲＰαの高レベル発現をもたらした（レーン５）。（ｃ）ヒト造血のマクロファージ媒介性抑制に対するＳｉｒｐαの作用。ＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージにコントロールレンチウイルス（ＮＯＲ−ＣＥＰ）またはＮＯＤ由来Ｓｉｒｐα遺伝子を発現しているレンチウイルス（ＮＯＲ−ＮＯＤ  ＳＩＲＰ）を感染させた後、２０〜２０，０００細胞／ウェルの用量で（５反復／用量）、樹立されたＭＳ−５間質培養物上に播種した。翌日、２０００個のＬｉｎ−ＣＢ細胞／ウェルを加え、３．５週間後の培養物中の生成されたヒトＣＦＣを記載されるようにアッセイした。ＮＯＲ−ＮＯＤ  ＳＩＲＰウェルにおけるヒト造血の支援は、ＮＯＲ−ＣＥＰウェルよりも有意に良好だった（２０細胞／ウェルにおいてＰ＝０．０３２；２０００および２０，０００細胞／ウェルにおいてＰ＝０．００８）。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図７】図７は、ＮＯＤ  ＳＩＲＰαによる、ヒトＣＤ４７に対する高い異種間反応性の付与を示している。（ａ〜ｄ）ＮＯＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３コンジェニックマウスのＢＭ由来マクロファージ上のマウスＳＩＲＰαに結合するヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）のフローサイトメトリ解析。（ａ）ＣＤ１１ｂ発現のヒストグラム；水平バーは、ＣＤ１１ｂ＋ゲートを示している。ｂ〜ｄにおけるプロットは、ＣＤ１１ｂについてゲーティングされている。（ｂ）ＳＩＲＰαおよびｈＣＤ４７−Ｆｃ染色を示す２次元等高線図。（ｃ）アイソタイプコントロール（黒色）と比較したＳＩＲＰα発現（灰色）のヒストグラム。（ｄ）ヒトＩｇＧ−Ｆｃコントロール（黒色）とオーバーレイされたｈＣＤ４７−Ｆｃ染色（灰色）のヒストグラム。（ｅ）ｈＣＤ４７−ＦｃによるマウスＳＩＲＰαの免疫沈降。ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３コンジェニックマウスのＢＭ由来マクロファージからのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて電気泳動し、ポリクローナル抗ＳＩＲＰα抗体を用いて免疫ブロットした。各パネルは、全溶解産物、コントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質との免疫沈降物（ＩＰ  ｈＦｃ）およびｈＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質との免疫沈降物（ＩＰ  ｈＣＤ４７−Ｆｃ）を表している。上パネルは、ＮＯＤおよびＮＯＲ抽出物を比較しており、下パネルは、ＮＯＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３（Ｉｄｄ１３ｃｇ）抽出物を比較している。
【図８】図８は、マウスおよびヒトのＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインのタンパク質配列アラインメントを示している。（ａ）ＢＭマクロファージから調製されたｃＤＮＡをＮＯＤおよびＮＯＲマウス由来のＳｉｒｐα転写物のＰＣＲ増幅に対する鋳型として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／Ｓｖ配列をＥｎｓＥＭＢＬおよびＮＣＢＩデータベースから入手した。白四角は、ＳＩＲＰαのＸ線結晶構造において同定されたｂ−プリーツシートを表しており、Ｉｇ重鎖可変領域における類似領域に対応する。マウス系統間で異なるアミノ酸に影をつけた。Ｂ６を親配列として使用した。（ｂ）ＩｇＶドメインを含むＳＩＲＰαのエキソン３を、ヒトＨａｐＭａｌ第１期リリース（ｐｈａｓｅ  １  ｒｅｌｅａｓｅ）からの３７個体のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。白四角で囲まれた領域および影がつけられたアミノ酸は、（ａ）におけるものと同じ特徴を表しており、Ｖ１は、親配列として機能する。種間のオルソロガス位置に＊と標識された残基は、ＮＯＤと他の系統との間およびヒト間で多型である。＋と標識された残基は、ヒトにおいて多型であり、タンパク質の「上部」の溶媒に露出した表面（ＣＤ４７が結合すると予測される）上に存在する。
【図９】図９は、示されるヒトＨａｐＭａｐサンプル（表の左側）の各々からＰＣＲ増幅されたＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの独立した配列決定による、３つのＳＮＰアッセイの識別力の確認を示している。
【図１０】図１０は、細胞外ＩｇＶ様ループ、５回膜貫通領域および短い細胞質テイルを含むＣＤ４７タンパク質を示している。
【図１１】図１１は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃおよび異なるプラスミド骨格（ｐｃＤＮＡおよびｐＩＡＰ３６９）を用いて調製された２つのｈＣＤ４７−Ｆｃ構築物でトランスフェクトされた培養細胞の上清におけるタンパク質生成を表しているヒストグラム、および（ｂ）培養上清からの精製後の融合タンパク質を表しているＳＤＳ−ＰＡＧＥの免疫ブロットを示している。
【図１２Ａ】図１２は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃを含むｐＩＡＰ３６９プラスミド構築物へのＫｏｚａｋ配列の導入、および（ｂ）ｐＩＡＰ３６９プラスミドに挿入された配列ｈＣＤ４７−Ｆｃを示しており、Ｋｏｚａｋコンセンサス、ｈＣＤ４７断片、リンカーおよびＦｃを示している。
【図１２Ｂ】図１２は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃを含むｐＩＡＰ３６９プラスミド構築物へのＫｏｚａｋ配列の導入、および（ｂ）ｐＩＡＰ３６９プラスミドに挿入された配列ｈＣＤ４７−Ｆｃを示しており、Ｋｏｚａｋコンセンサス、ｈＣＤ４７断片、リンカーおよびＦｃを示している。
【図１３】図１３は、（ａ）Ｋｏｚａｋ含有プラスミドでトランスフェクトされた細胞の上清においてアッセイされたマウスおよびヒトＣＤ４７−Ｆｃの生成、ならびに（ｂ）プロテインＧ精製ＣＤ４７−Ｆｃタンパク質と反応する抗ヒトＦｃ抗体を示している免疫ブロットを示している。
【図１４】図１４は、ＳＩＲＰαのＮＯＤおよびＮＯＲマウスバージョンに対するｈＣＤ４７−ＦｃおよびｍＣＤ４７−Ｆｃ（図示せず）の結合親和性を定量化するために設計されたアッセイを示している。
【図１５Ａ】図１５は、（ａ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｍＣＤ４７の結合の結果；および（ｂ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７の結合の結果を示している。
【図１５Ｂ】図１５は、（ａ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｍＣＤ４７の結合の結果；および（ｂ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７の結合の結果を示している。
【図１６】図１６は、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７媒介性のシグナル伝達を示している模式図である。
【図１７】図１７は、ＳＩＲＰαのヒトＨＳＣ「許容性」ＮＯＤバージョンの切断型（「ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ」）（左側）の調製を示している。
【図１８】図１８は、「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＣＥＰ「菱形」）、ウイルスで感染されていないＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ非感染；黒三角）、「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ−ＣＥＰ；丸）、完全長ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＳＩＲＰ；四角）および切断型ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ；白三角）によるヒトＨＳＣの生存を示している。
【図１９】図１９は、ＨＳＣ生着に対するＣＤ４７融合タンパク質の作用をインビボにおいて評価する研究の模式図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
以下の説明では、本発明の完全な理解を提供するために数多くの具体的な詳細が示される。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細なしに実施され得ることが理解される。
【００２７】
本明細書中で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」とは、ある特定の共通特性に基づくアミノ酸の分類のことを指す。個別のアミノ酸間の共通特性を定義する機能的な方法は、相同な生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような解析によると、ある群内のアミノ酸が、優先的に互いで交換し、それゆえタンパク質構造全体に対する影響が互いに最も似ているアミノ酸の群が定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この様式において定義されるアミノ酸の群の例としては：
（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる帯電している群
（ｉｉ）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる正に帯電している群
（ｉｉｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負に帯電している群
（ｉｖ）Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる芳香族の群
（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環の群
（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる大きな脂肪族非極性の群
（ｖｉｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性の群
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＰｒｏからなる小さい残基の群
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族の群、ならびに
（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さいヒドロキシルの群
が挙げられる。
【００２８】
上に示された群に加えて、各アミノ酸残基は、それ自体の基を形成し得、個々のアミノ酸によって形成される基は、当該分野において通常使用されるアミノ酸に対する１文字および／または３文字の省略形によって簡単に言及され得る。
【００２９】
本明細書中で使用されるとき、「培養細胞」とは、インビトロにおいて維持されているおよび／または増殖している細胞を意味する。培養細胞には、初代培養細胞および細胞株が包含される。本明細書中で使用されるとき、「細胞を培養する」とは、ポリペプチドの発現を促す培養条件を提供することを意味する。そのような培養条件は、当該分野で周知である。
【００３０】
本明細書中で使用されるとき、幹細胞、好ましくは、拡大した造血幹細胞を「生着させる」とは、幹細胞を、例えば注射によって、動物内に入れることを意味し、ここで、幹細胞は、インビボにおいて存続する。これは、造血幹細胞が、例えば血液細胞の継続した形成に寄与する能力によって容易に判定され得る。
【００３１】
本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「断片」とは、完全なポリペプチド配列および構造または参照遺伝子のヌクレオチド配列および構造のほんの一部分からなるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチド断片は、天然のポリペプチドのＣ末端の欠失および／もしくはＮ末端の欠失を含み得るか、または分子の内部の部分から得ることができる。同様に、ポリヌクレオチド断片は、天然のポリヌクレオチドの３’および／もしくは５’欠失を含み得るか、または分子の内部の部分から得ることができる。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、「融合タンパク質」とは、通常は共に単一のアミノ酸配列に融合されていない２つ（またはそれ以上）の異なる異種ポリペプチドで構成されている複合性のポリペプチド、すなわち、単一の連続的なアミノ酸配列を指す。したがって、融合タンパク質は、全体的に異なる２つのアミノ酸配列または２つの類似もしくは同一のポリペプチド配列を含む単一のアミノ酸配列を含み得るが、但し、これらの配列は、通常、天然に見られる単一のアミノ酸配列において同じ配置で共に見られない。融合タンパク質は、一般に、組換え核酸法を用いて、すなわち、組換え遺伝子融合産物（その融合は、本発明のポリペプチドをコードするセグメントおよび異種ポリペプチドをコードするセグメントを含む）の転写および翻訳の結果として、または当該分野で周知の化学合成法によって、調製され得る。融合タンパク質は、その構成ポリペプチドの間にリンカーポリペプチドも含み得る。用語「融合構築物」または「融合タンパク質構築物」は、一般に、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指すと意味される。一実施形態において、融合タンパク質は、Ｉｇ分子の一部に融合された本明細書中に記載されるようなポリペプチドである。融合タンパク質のＩｇ部分は、免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域）を含み得る（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１１６，９６４号；同第５，５８０，７５６号；同第５，８４４，０９５号などを参照のこと）。１つの好ましい実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）に結合された本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「造血幹細胞」とは、任意の成熟した骨髄性細胞および／またはリンパ系細胞に発達することができる、骨髄、肝臓、脾臓または臍帯血が起源の細胞を指す。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、核酸分子、ポリペプチドまたは他の生体分子に関連した「単離された」とは、核酸またはポリペプチドが、そのポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝的環境から分離されていることを意味する。それは、天然の状態から変更されていることも意味し得る。当該用語が本明細書中で使用されるとき、例えば、生存している動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態の共存している材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。したがって、組換え宿主細胞内で生成されるおよび／または含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されていると考えられる。組換え宿主細胞または天然源から部分的または実質的に精製されているポリペプチドまたは核酸分子は、「単離されたポリペプチド」または「単離された核酸分子」とも意図される。
【００３５】
本発明のペプチドは、細胞内の事象などの生物学的事象を調節する能力を示し得るとも企図される。本明細書中で使用されるとき、「調節する」とは、本発明のペプチドの非存在下における目的の生物学的プロセスのレベルまたは活性と比べたときの、そのようなプロセスに対する刺激性または抑制性の作用を指す。
【００３６】
用語「マクロファージ抑制」または「マクロファージの抑制」とは、本明細書中で使用されるとき、マクロファージの役割、活性および／または作用の減少または阻止を指す。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに例えばヌクレオチドアナログの使用によって作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを意味する。核酸分子は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素が通常の機能を発揮するために構成されるエレメントの配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された調節エレメントは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる。調節エレメントは、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモータとコード配列との間に存在し得、プロモータは、なおもコード配列と「作動可能に連結されている」と考えられ得る。同様に、「被験体における発現に適合する調節エレメント」は、その被験体においてコード配列の発現に影響を及ぼすことができるものである。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容可能なキャリア」とは、生理的に適合する、任意およびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容可能なキャリアの例としては、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。薬学的に許容可能なキャリアは、薬理学的物質の有効期間または有効性を高める少量の補助剤物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤）をさらに含み得る。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、タンパク質、タンパク質断片、改変タンパク質、アミノ酸配列および合成アミノ酸配列を意味する。ポリペプチドは、グリコシル化されていても、されていなくてもよい。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、「間質」とは、支持組織、または器官の機能的なエレメントもしくは実質と区別可能なその器官の基質を指す。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および特定の時間における有効な量を指す。薬理学的物質の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに薬理学的物質が個体において所望の反応を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、治療上の有益な作用が、薬理学的物質の任意の有毒または有害な作用に勝る量でもある。
【００４３】
一態様によると、ａ）配列番号１のアミノ酸配列；ｂ）配列番号１アミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、ここで、断片は、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含み、かつヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなるポリペプチドからなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００４４】
さらなる態様によると、ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；およびｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、ｉ）ポリペプチドにおける配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位における残基のうちの少なくとも１つが、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６で置換されているか；またはｉｉ）ポリペプチドにおける配列番号２の残基１２９および１３０のうちの少なくとも１つが欠失している；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００４５】
さらなる態様によると、ａ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号４〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド；およびｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、ヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【００４６】
さらなる態様によると、ヒトＳｉｒｐαに結合することができるポリペプチド；およびヒトＳｉｒｐαに対する抗体が提供される。好ましくは、ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分に融合されたヒトＣＤ４７の細胞外ドメインである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、その断片であり、以下の場合があり得るとき、配列番号１の残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５もしくは１２８〜１４１、配列番号２の残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５もしくは１２８〜１４３、配列番号４、７、８、９および１２のいずれか１つの残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９〜７４、７７〜８３、８８〜９９もしくは１０２〜１１６；または配列番号５、６、１０、１１および１３の残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９〜７４、７７〜８３、８８〜９９もしくは１０２〜１１５の両端の残基を含む領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも３つ連続したアミノ酸を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、アミノ酸の挿入、欠失または置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００４９】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＣＤ４７に結合する。
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＳＩＲＰαに結合する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、断片であり、好ましい順で、６〜３０アミノ酸長、８〜２８アミノ酸長、１０〜２６アミノ酸長、１２〜２４アミノ酸長および１４〜２２アミノ酸長である。
【００５１】
本明細書中に記載されるポリペプチドは、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分である第２のポリペプチドに融合され得る。
【００５２】
１つの好ましい実施形態によると、好ましくはヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための、ＩｇＧのＦｃ部分に融合されたＣＤ４７の細胞外ドメインを含むポリペプチドが提供される。
【００５３】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
【００５４】
さらなる態様によると、哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための方法であって、哺乳動物に治療有効量の本明細書中に記載されるポリペプチドを投与する工程を包含する方法が提供される。好ましくは、造血幹細胞の生着の増加は、マクロファージの抑制に起因する。
【００５５】
さらなる態様によると、哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための、または哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の、本明細書中に記載されるポリペプチドの使用が提供される。
【００５６】
さらなる態様によると、哺乳動物における造血幹細胞の生着を増加させるための本明細書中に記載されるポリペプチドが提供される。
【００５７】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸が提供される。
【００５８】
さらなる態様によると、本明細書中に記載される核酸を含む、好ましくは、Ｋｏｚａｋコンセンサスを含む、発現ベクターが提供される。
【００５９】
さらなる態様によると、本明細書中に記載されるベクターを含む培養細胞が提供される。
【００６０】
さらなる態様によると、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本明細書中に記載される細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを生成する方法が提供される。
【００６１】
さらなる態様によると、ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用を調節する工程を包含する、ヒトにおいて造血幹細胞の生着を増加させるための方法が提供される。好ましくは、ヒトＳｉｒｐαとヒトＣＤ４７との相互作用は、治療有効量のａ）ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；ｂ）ヒトＳｉｒｐαに対する抗体；ｃ）ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；およびｄ）ヒトＣＤ４７に対する抗体のうちの少なくとも１つを投与することによって調節される。
【００６２】
対応して、ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるためまたは同じことのための薬物を調製するための前述のものの使用も提供される。好ましくは、造血幹細胞の生着の増加は、マクロファージの抑制に起因する。
【００６３】
一実施形態において、ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドは、可溶性ヒトＣＤ４７またはその断片、好ましくは、ＣＤ４７の細胞外ドメインを含む。好ましくは、可溶性ヒトＣＤ４７またはその断片は、第２のタンパク質に融合されている。別の実施形態において、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドは、可溶性ヒトＳｉｒｐαまたはその断片、好ましくは、Ｓｉｒｐαの細胞外ドメインを含む。好ましくは、可溶性ヒトＳｉｒｐαまたはその断片は、第２のタンパク質に融合されている。好ましい実施形態において、第２のタンパク質は、ＩｇＧのＦｃ部分である。
【００６４】
さらなる態様によると、ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させる化合物を同定する方法であって、ａ）ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の細胞外ドメインのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの試験化合物と接触させる工程；ｂ）その少なくとも１つの試験化合物を、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７のうちの少なくとも１つに結合すると判定する工程；ｃ）その試験化合物を間質の環境においてヒト造血細胞と接触させる工程；およびｄ）造血幹細胞の生着がその試験化合物の存在下において増加しているか否かを判定する工程を包含する方法が提供される。
【００６５】
さらなる態様によると、造血幹細胞の生着に影響を及ぼすヒトにおける遺伝的多型を決定する方法であって、ａ）造血移植を受けた複数のヒト由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；ｂ）それら複数のヒトの中のＳｉｒｐα遺伝子におけるヌクレオチドの差異を判定する工程；およびｃ）そのヌクレオチドの差異を造血幹細胞の生着と相関させることにより、関連性のある多型を決定する工程を包含する方法が提供される。好ましくは、そのヌクレオチドの差異は、アミノ酸の差異をもたらす。
【００６６】
さらなる態様によると、レシピエントにおける造血幹細胞の生着の可能性を判定する方法であって、ａ）レシピエント由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定する工程；およびｂ）関連性のある多型が存在するか否かを判定する工程を包含する方法が提供される。好ましくは、その関連性のある多型は、好ましくは、（ａ）配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位の残基のうちの少なくとも１つの、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６による置換；または（ｂ）配列番号２の残基１２９および１３０のうちの少なくとも１つの欠失のうちの少なくとも１つであるアミノ酸の差異をもたらす。
【００６７】
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに説明される。本明細書中に示される実施例およびその特定の詳細は、説明のためだけに提示されるものであって、本発明の請求項に対する限定と解釈してはならない。
【実施例】
【００６８】
材料および方法
マウス
ＣＢ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−Ｐｒｄｋｃｓｃ／ｓｃ（ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４，１８０−９１）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、Ｃ３Ｈ、ＩＣＲおよびＢＡＬＢ／ｃマウスをＯｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）において滅菌条件下で飼育し、維持した。Ｒａｇ−２−／−（ＲＡＧ−２）、ＲＡＧ−２．Ｐｒｆ−／−およびＲＡＧ−２．β２ｍ−／−マウス（すべてＢ６バックグラウンド）をＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手した。ＮＯＤ、ＮＯＤ．ＳＣＩＤ、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ４、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ５、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ９、ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３およびＢ６．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウスを、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）において特定病原体を含まない条件または特定病原体から隔離された条件で維持した。
【００６９】
すべてのコンジェニックマウスを、ＮＯＤ／Ｊｓｄ先祖とＮＯＲ／Ｌｔ先祖との最初の交雑から飼育者のマーカー特異的選択によって作出した。ＮＯＤゲノムとＮＯＲゲノムとは、血統によって約８８％同一であり、それらのゲノムの異なる部分は、１、２、４、５、７、１０、１１、１２、１４および１８番染色体上に分布する。飼育者は、すべてのコンジェニック系統の創始者が、バックグラウンドの対立遺伝子についてホモ接合であるように、ＮＯＤとＮＯＲとの間で異なるすべての遺伝子座に対するマイクロサテライトマーカーを用いてスクリーニングした。本研究において使用されたコンジェニックマウスを定義するために使用されたマイクロサテライトマーカーを表１に列挙する。
【００７０】
【表１】
2011500005.tif 000003
【００７１】
【表２】
2011500005.tif 000004
【００７２】
ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マウスとＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスとの交雑の後、Ｉｄｄ１３およびＳＣＩＤの両方の遺伝子座においてホモ接合性が達成されるまでマーカー補助の遺伝子型同定によってスクリーニングされる兄妹交配によって、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウスを作出した。
【００７３】
マイクロサテライト遺伝子型同定のために、プロテイナーゼＫおよび消化緩衝液（ＡｕｔｏＧｅｎ  ＡＧ００１２２）の溶液中、５５℃で一晩消化した０．６〜０．８ｃｍの尾の小片からゲノムＤＮＡを調製した。その粗消化物を希釈し、加熱することにより、プロテイナーゼＫを不活性化した。蛍光タグで５’末端を修飾されたオリゴヌクレオチドプライマを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、すべてのマイクロサテライトプライマについて同じだった：１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分を１０サイクルの後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で１分を３５サイクル。ＡＢＩ  ３７３０ＸＬ配列分析装置を用いてＰＣＲアンプリコンを検出し、そしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアバージョン３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて対立遺伝子を命名した。
【００７４】
ＭＳ−５マウスストローマ細胞に対するＬＴＣのために、Ｇａｎ，Ｏ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７，１０９７−１０６に記載されているように、照射されていないＭＳ−５細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種した（２０００細胞／ウェル）。３日後、１用量あたり５反復、２０〜２０，０００細胞／ウェルの用量でマウスの腹腔マクロファージを播種した。翌日、１ウェルあたり２０００個のヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞を、ヒドロコルチゾンを含まない２００μｌのヒトＬＴＢＭＣ培地中に加えた。毎週、半分の培地を交換しながら、培養物を３３℃（または遺伝子導入実験の場合は３７℃）において維持した。３〜４週間後に、細胞をトリプシン処理し、そして各ウェルの細胞の半分を、記載されるような前駆体アッセイにプレーティングした。
【００７５】
ヒト特異的造血性前駆細胞アッセイ
Ｔ２５フラスコからの７５００個の細胞または９６ウェルプレートからのウェルの含有量の半分を、以前にＬａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２，１３２９−３７において記載されているような、ヒト細胞について選択的な条件下で１ｍｌのメチルセルロース培養液にプレーティングした。培養液を３７℃において１４日間にわたってインキュベートし、そしてコロニー形成細胞（ＣＦＣ）によってもたらされるコロニーの総数を数えた。Ｔ２５フラスコからの細胞は、３つ組でプレーティングした。
【００７６】
マウスマクロファージ調製
１０％ＦＣＳを含む１０ｍｌのαＭＥＭを用いた腹膜灌流によってマウス腹腔マクロファージを得た。１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５０ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１×可欠アミノ酸および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充された１０ｍｌのＤＭＥＭ（「完全ＤＭＥＭ」）で大腿骨、脛骨および腸骨稜を洗い流すことによってＢＭ由来のマクロファージを得た。１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む完全ＤＭＥＭにおいて１×１０６細胞／ｍｌの濃度でＢＭ細胞をプレーティングした。培地を、ＧＭ−ＣＳＦを含む新しい完全ＤＭＥＭで１日おきに交換し、７日後に穏やかに掻き取ることによってマクロファージを回収した。
【００７７】
Ｉｄｄ１３候補遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析
０．９６Ｍｂの重大なＩｄｄ１３間隔の中の遺伝子の発現をＢＭ間質および精製マクロファージから調製されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって解析した。以下の条件：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて９５℃で１５秒および５９℃で１分を４０サイクルにおいて、ＡＢＩ／ＰＲＩＺＭ  ７９００  ＨＴサイクラ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。検量線の計算のための参照として、上記遺伝子配列を含むプラスミドの段階希釈物を使用した。蛍光閾値および対応するコピー数を、ＳＤＳ  ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて計算した。反応は、３つ組で行い、転写物の量をβ−アクチンに対して正規化した。
【００７８】
マウスＳｉｒｐαの分子遺伝学的解析
ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＢＡＬＢ／ｃ系統由来のＳｉｒｐαのコード領域を配列決定した。ｃＤＮＡをＢＭ由来のマクロファージから調製し、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、以下の条件：２ｍＭ  ＭｇＳＯ４において９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および６８℃で１分を３０サイクルにおいてＰＣＲ鋳型として使用した。鋳型としてゲノムＤＮＡを用い、そして同じＰＣＲ条件を用いて、ＮＯＤおよびＮＯＲ系統において、Ｓｉｒｐαの非翻訳（ＵＴＲ）領域も増幅し、配列決定した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ１．５ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定プライマを設計し、そのプライマを表２に列挙する。ＰＣＲ産物を、製造者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って精製し、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ（ＴＣＡＧ；ｗｗｗ．ｔｃａｇ．ｃａ）において両方の鎖について配列決定した。Ｂ６、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／ＳｖマウスのＳｉｒｐα配列ファイルは、ＥｎｓＥＭＢＬ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）およびＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）データベースから入手した。配列ファイルをアラインメントし、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて解析した。
【００７９】
【表３】
2011500005.tif 000005
【００８０】
ヒトＳＩＲＰαの分子遺伝学的解析
エキソン３においてコードされるＩｇＶドメインに隣接する２つのマーカー（ｒｓ６０７５３４０およびｒｓ６１１９６８）における遺伝子型の変異に基づいて配列決定するために、ＨａｐＭａｐコレクションからの無関係な３７の個体を選択した。ＤＮＡサンプルをＴＣＡＧから入手し、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるＰＣＲによってエキソン３を増幅した。得られたアンプリコンをクローニングし、１個体あたり２〜４個の独立したクローンのエキソン３領域を、プラスミドマルチクローニングサイトに隣接するプライマを用いて、両方の鎖についてＴＣＡＧにおいて配列決定した（表２）。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いて配列をアラインメントした。
【００８１】
ＳＩＲＰαの生化学的解析
ＢＭ由来マクロファージを氷冷ＰＢＳで洗浄し、次いで、５ｍＭ  ＮａＦ、アプロチニン（１０μｇ／ｍｌ）および１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含む緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０）中で溶解した。溶解産物を４℃にて１００００ｇで１５分間遠心分離し、得られた上清を以下のとおり免疫ブロット解析に供した：タンパク質（２０μｇ／ウェル）を１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動し、０．２μＭニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に転写した。抗ＳＩＲＰα抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いてウエスタンブロットを解析し、そしてＨＲＰ−ＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて現像した。糖タンパク質を変性させるために細胞溶解産物を０．５％ＳＤＳおよび１％βメルカプトエタノール中で５分間煮沸し、次いで、Ｎ−グリコシダーゼＦ（４０単位／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とともに３７℃にて１２時間インキュベートすることによって、Ｎ結合型オリゴ糖をＳＩＲＰαから除去した。免疫沈降のために、２５０μｇのＢＭ由来マクロファージ溶解産物を、５０μｌのプロテインＧ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともにｈＣＤ４７−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）またはコントロールヒトＩｇＧ  Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）に加えた。氷上で６０分間インキュベートした後、製造者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に従ってμＭＡＣＳセパレータにおいて免疫複合体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディング緩衝液を用いてカラムから溶出した。
【００８２】
Ｓｉｒｐαレンチウイルス感染プロトコル
ヒトＰＧＫプロモータによって動かされるレポータＧｆｐ遺伝子を含む第３世代レンチウイルスベクターのバックボーン内のＥ１Ｆαプロモータの下流にＮＯＤ  Ｓｉｒｐα  ｃＤＮＡをクローニングした（ＳＩＲＰ）。コントロールベクター（ＣＥＰ）は、Ｇｆｐだけを含んでいた。ベクター構築物は、配列決定によって確認された。水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質を有するシュードタイプのウイルスを、Ｇｕｅｎｅｃｈｅａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １，５６６−７３に記載されているように２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって作製し、超遠心分離によって濃縮した。ＨｅＬａ細胞の感染によって測定されるＳＩＲＰおよびＣＥＰウイルスの機能的力価は、それぞれ１ｍｌあたり２．１〜５．１×１０８および４〜７．６×１０８感染性粒子であった。培養の５日後のＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージのフラスコに、２０〜２５の感染多重度でウイルスを加え、感染したマクロファージを１２日目に回収した。マクロファージへの遺伝子導入効率は、フローサイトメトリを用いてＧＦＰ蛍光によって評価したところ、５１〜８８％だった。感染したマクロファージをＰＥ結合体化抗マウスＣＤ１１ｂ  ｍＡｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で染色し、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｏＦｌｏ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）において選別することにより、ＧＦＰ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を得た。感染していないコントロールマクロファージを染色し、選別することにより、ＣＤ１１ｂ＋細胞を得た。精製されたマクロファージ（純度９７〜９９％）をさらなる実験に使用した。
【００８３】
可溶性ヒトＣＤ４７−Ｆｃ調製
Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＣＭＶプロモータによって指示されるヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合されたヒトＣＤ４７細胞外ドメインを含むｐｃＤＮＡ−ＣＤ４７Ｆｃ（Ｌａｔｏｕｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７，２５４７−５４）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて選択した。培養上清の免疫ブロット解析によって、可溶性ヒトＣＤ４７−Ｆｃ（ｈＣＤ４７−Ｆｃ）を産生する細胞株を同定した。ｈＣＤ４７−Ｆｃタンパク質を、プロテインＧ−セファロース（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上で精製し、フローサイトメトリ解析において使用するために、ビオチンに共有結合的に結合体化した。
【００８４】
フローサイトメトリ
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてフローサイトメトリ解析を行った。マウスにおけるヒト細胞の生着を解析するために、マウスのＢＭから回収した細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）シアニン５結合体化抗ヒトＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色した。ＳＩＲＰαの細胞表面発現およびｈＣＤ４７−Ｆｃの結合を解析するために、１×１０６個のマウスＢＭ白血球を、Ａｌｅｘａ６３３結合体化ヤギ抗ラットを有する精製抗ＳＩＲＰα  ｍＡｂＰ８４（ＢＤ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂ（ＳＷＲＩ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）、ならびにアビジン−ＡＰＣを有するビオチン化ｈＣＤ４７−Ｆｃまたはビオチン化抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂおよびアビジン−ＡＰＣを有するコントロールヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片で染色した。ヨウ化プロピジウムの排除によって生存可能な白血球を選択した。アイソタイプコントロールは、適切な蛍光色素に結合体化されたマウスまたはラットのＩｇＧであった。フルオレセインイソチオシアネート発光プロファイルに対して較正されたＦＬ１において、ＧＦＰ蛍光を検出した。
【００８５】
統計解析
１元配置ＡＮＯＶＡ分析を用いて群を比較し、差が見られたとき、Ｄｕｎｎ法を用いてすべての対多重比較を行った。遺伝子導入実験の場合、ウィルコクソン順位検定を用いてＣＥＰおよびＳＩＲＰ条件を比較した。
【００８６】
タンパク質合成
ヒトＣＤ４７ＩｇＶドメインｃＤＮＡ配列を、適切な発現ベクターに挿入されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ｃＤＮＡ配列の上流にインフレームでクローニングし、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、得られた融合タンパク質（ｈＣＤ４７−Ｆｃ）を、プロテインＧビーズにおけるアフィニティクロマトグラフィによって培養上清から精製した。同じストラテジーを用いて、マウスＣＤ４７−Ｆｃ（ｍＣＤ４７−Ｆｃ）融合タンパク質を調製した。
【００８７】
マウスマクロファージ上に発現されるｍＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７およびｍＣＤ４７の結合親和性のアッセイ
図１４は、ＳＩＲＰαのＮＯＤおよびＮＯＲマウスバージョンに対するｈＣＤ４７−ＦｃおよびｍＣＤ４７−Ｆｃ（図示せず）の結合親和性を定量化するために設計されたアッセイの模式的な表示である。ＮＯＤまたはＮＯＲマウスから得られたマクロファージを２時間にわたって組織培養プレートに接着させ、次いで、緩衝食塩水で洗浄した。段階的な量の精製ｈＣＤ４７−ＦｃまたはｍＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質をウェルに加え、３７℃において２０分間結合させ、ウェルを緩衝食塩水で完全に洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合的に結合体化された市販の抗ヒトＦｃ抗体を加え、結合させ、プレートを緩衝食塩水で完全に洗浄した。結合したｈＣＤ４７の量を、過酸化水素とのＨＲＰの反応およびペルオキシダーゼ処理の後の分光光度計を用いる比色定量アッセイによって評価した。
【００８８】
実施例１
ＮＯＤ系統のバックグラウンドを有する免疫不全マウスはインビボにおいてヒト造血細胞の生着を支援する
本発明者ら自身を含むいくつかのグループが、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）変異についてホモ接合であるＮＯＤマウスが、ＣＢ１７をはじめとした他の系統のバックグラウンドにおけるＳＣＩＤマウスと比べて、優れたヒト造血細胞の生着を可能にすることを示している（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４６，８８８−９０２；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２，１３２９−３７）。異種移植片効率のこの系統差異についての分子的および細胞的な根拠は、不明である。しかし、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスは、長期間の実験に対する有用性を限定する高発生率の自然発症胸腺リンパ腫を有する。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）バックグラウンドにおいてリコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ−２）のヌル対立遺伝子を有するマウスは、ＴおよびＢ細胞の発達において、ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスと同様の妨害を有するが、自然発症リンパ系悪性腫瘍を示さない（Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８，８５５−６７）。また、β２ミクログロブリン（ＲＡＧ−２．β２ｍ−／−）またはパーフォリン（ＲＡＧ−２．Ｐｒｆ−／−）のホモ接合ヌル対立遺伝子を有するＲａｇ−２−／−（ＲＡＧ−２）マウスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能のさらなる欠損を有する（Ｚｉｊｌｓｔｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，７４２−６；Ｋａｇｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９，３１−７）。ゆえに、本発明者らは、いくつかの他の免疫不全系統のマウスを、ヒト造血を支援する能力について試験した。
【００８９】
ヒトＢＭ細胞およびヒトＣＢ細胞を各系統からのマウスに移植し、生着をサザンブロット解析によって評価した（図１Ａ）。一貫して、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて高レベルの生着が検出されたのに対し、ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスは、以前に報告されているように（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２，１３２９−３７）低頻度および低レベルの生着を示した。予想どおり、免疫応答能のある（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＮＯＤレシピエントでは、生着は検出されなかった。驚いたことに、Ｂ６バックグラウンドにおけるＲＡＧ−２、ＲＡＧ−２．Ｐｒｆ−／−およびＲＡＧ−２．β２ｍ−／−マウスでは、それらの著明な免疫不全にもかかわらず、生着しなかった。対照的に、ＮＯＤ．ＲＡＧ−１−／−マウスは、高レベルのヒト造血細胞の生着を支援すると示されている（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４，２４９６−５０７）。これらの観察結果から、マウス系統のバックグラウンドにおける免疫不全および／または宿主のＢＭ微小環境以外のさらなる因子が、異種移植の状況における造血性の生着に劇的に影響を及ぼすことが示唆される。
【００９０】
実施例２
ヒト長期培養開始細胞の支援は２番染色体上のＮＯＤ対立遺伝子を必要とする
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）は、インビトロにおいてアッセイされ得る最も原始的なヒト造血細胞であり（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ−Ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．）の中のＷａｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓａｙｅｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ”９９−１１８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２００１）、調節される微小環境条件下においてヒト造血の代替尺度として機能する。ＬＴＣ−ＩＣは、間質培養の５週間後のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）を生成する能力に基づいて定量化される。ヒト造血の支援における系統の差を特徴付けるために、本発明者らは、ＬＴＣ−ＩＣを支援するＮＯＤ／Ｊｓｄ（ＮＯＤ）および他の系統由来のＢＭストローマ細胞の能力を比較した。ＮＯＤマウス由来の間質層は、５週間の培養にわたってヒトＣＦＣの生成を支援したのに対し、他のすべての系統由来のＢＭ間質は、同数のＬｉｎ−ＣＢ細胞が接種された後、ヒトＬＴＣ−ＩＣを支援しなかった（図１Ｂ）。ＮＯＤ間質は、少ない投与数のＬｉｎ−ＣＢ細胞（０．６×１０５；図１Ｃ）でも支持的であった。ＮＯＲ／Ｌｔ（ＮＯＲ）マウスは、ＮＯＤと血統によって８８％同一である（４つのＩｄｄ遺伝子座（Ｉｄｄ４、Ｉｄｄ５、Ｉｄｄ９およびＩｄｄ１３）だけが異なる）組換え近交系であるので（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４１，９８−１０６）、本発明者らは、このアッセイにおいてそれらのマウスを調べた。ＮＯＤとは対照的に、ＮＯＲ培養物は、１０倍多い数のＬｉｎ−ＣＢ細胞で播種したときだけＬＴＣ−ＩＣを支援し（図１Ｃ）、少ない量のＣＦＣをもたらした。これらのデータから、インビトロおよびインビボのＮＯＤマウスにおいて観察される原始的なヒト造血の独特の支援が、ＮＯＤマウスとＮＯＲマウスとの間で遺伝的に非同一な領域によって調節されることが示唆される。
【００９１】
ＮＯＤ系統がヒト造血を支援する優れた能力を付与した遺伝子座をマッピングするために、一連のＮＯＤおよびＮＯＲ−Ｉｄｄ１３コンジェニック系統であるＮＯＤおよびＮＯＲの親マウスならびにＢ６．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウスに由来するストローマ細胞をキメラＬＴＣにおいて試験した（図２Ａ）。Ｂ６親系統およびＮＯＲ親系統の両方が、ＮＯＤ間質と比べてヒトＬＴＣ−ＩＣの発生を支援できなかった。Ｉｄｄ４、Ｉｄｄ５およびＩｄｄ９におけるＮＯＲ対立遺伝子に関してコンジェニックなＮＯＤマウスは、ＮＯＤ親動物と等価なＬＴＣ−ＩＣ結果を示した。対照的に、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マウスから単離されたストローマ細胞（Ｉｄｄ１３−ＢＢ遺伝子型）は、ヒトＬＴＣ−ＩＣを支援できなかったのに対し、ＮＯＤ  Ｉｄｄ１３に関してコンジェニックなＢ６マウスとＮＯＲマウスとの両方（Ｉｄｄ１３−ＮＮ遺伝子型；Ｂ６．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３およびＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３）が、支持的であった。したがって、２番染色体上のＮＯＤ由来Ｉｄｄ１３遺伝子座（Ｓｅｒｒｅｚｅ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，１５５３−１５５８）は、インビトロにおいてＢＭストローマ細胞がヒトＬＴＣ−ＩＣを支援する非常に高い能力を付与した。
【００９２】
実施例３
Ｉｄｄ１３遺伝子型はインビボにおいてヒト造血幹細胞の生着の支援を決定する
Ｉｄｄ１３遺伝子座が、インビボにおいて再配置の能力を有するヒト造血細胞（ＳＣＩＤ再配置細胞、ＳＲＣと呼ばれる）の支援を調節するか否かを試験するために、本発明者らは、ＮＯＲ由来Ｉｄｄ１３についてホモ接合の免疫不全ＮＯＤコンジェニック系統（ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３−ＳＣＩＤ）を作出した。亜致死的照射を受けたＮＯＤ．ＳＣＩＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３−ＳＣＩＤマウスの静脈内にＬｉｎ−ＣＢ細胞（０．３７〜１．５×１０５個のＣＤ３４＋細胞と等価）を移植し、６〜７週間後にフローサイトメトリによってヒトＣＤ４５＋細胞生着を評価した（図２Ｂ）。予想されたとおり、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスは、ＣＢ細胞の用量範囲全体にわたってヒト生着を支援した。対照的に、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３−ＳＣＩＤマウスでは、ヒト細胞の生着は、検出されなかった。これらの結果は、インビトロにおけるＬＴＣ−ＩＣデータを裏付け、Ｉｄｄ１３遺伝子座におけるＮＯＤ対立遺伝子が、インビボにおいてヒト造血の支援を付与することを証明している。
【００９３】
実施例４
ヒト造血の支援を制御するＩｄｄ１３における候補遺伝子の精細マッピング
ヒト造血の支援を制御したＩｄｄ１３における遺伝子の位置を洗練させるために、本発明者らは、ＮＯＤおよびＮＯＲバックグラウンドの両方に対するＩｄｄ１３コンジェニック系統の作出を含むマッピングストラテジーを用いた（図３Ａ）。これらのコンジェニック動物由来のストローマ細胞をキメラＬＴＣアッセイにおいて試験した（図３ＡおよびＢ）。興味深いことに、Ｉｄｄ１３ヘテロ接合マウス（Ｉｄｄ１３−ＢＮ）由来のストローマ細胞は、ヒトＬＴＣ−ＩＣを支援したが、生成されたＣＦＣの数は、一貫して、ＮＯＤ培養物において見られた数の約５０％だった（図３ＡおよびＢ；左から３番目のバー）。これらのデータは、ヒトＬＴＣ−ＩＣの支援に対するＮＯＤ  Ｉｄｄ１３対立遺伝子の優性な作用と一致した。ＮＯＤおよびＮＯＲバックグラウンドの両方における８つの新規Ｉｄｄ１３コンジェニック系統においてこれらの解析を繰り返すことによって、ヒトＬＴＣ−ＩＣ表現型の支援は、Ｆｌｉｚ１およびマイクロサテライトＤ２Ｎｇｕｌ１８４９における単一ヌクレオチド多型によって定義される９６０ｋｂの領域（図３ＡおよびＢ）に帰着された（表３）。その間隔における１５個の遺伝子のうち、８つが、機能アノテーションを有した。その８つの遺伝子のうちの７つの、ＮＯＤおよびＮＯＲ系統のＢＭ間質およびマクロファージにおける発現を、リアルタイムＰＣＲを用いて評価した（表４）。Ｓｉｒｐα（Ｓｈｐｓ−１およびＰｔｐｎｓ１とも呼ばれる）が、ＮＯＤとＮＯＲとの間でコード配列多型を示したＢＭ間質において発現される唯一の遺伝子であったので、それを最も有望な候補としてさらなる研究のために選択した。
【００９４】
【表４】
2011500005.tif 000006
【００９５】
ヒトＬＴＣ−ＩＣを支援する候補間隔は、Ｆｌｉｚ１とＤ２Ｎｇｕｌ１８４９とに挟まれており（図３Ａを参照のこと）、１５個の遺伝子を含む２番染色体上の０．９６Ｍｂの間隔を定義している。最小候補遺伝子座をマイクロサテライトマーカーＤ２Ｎｇｕｌ１７２５およびＤ２Ｊｙｈ３９４１によって定義したところ、１３個の遺伝子を含んでいた。すべてのゲノム位置および遺伝子特質は、ＥｎｓＥＭＢＬバージョン２６．３３ｂ．１に基づくものである。５’ＵＴＲにおけるＮＯＤ系統とＮＯＲ系統との間の多型を検出するために、Ｆｌｉｚ１プライマを設計した。
【００９６】
【表５】
2011500005.tif 000007
【００９７】
実施例５
Ｉｄｄ１３候補遺伝子Ｓｉｒｐαにおける系統依存的配列および生化学的バリエーション
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）は、２つのＳｒｃ相同ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２に対する細胞内ドッキング部位を有するＩｇスーパーファミリの膜貫通タンパク質である（Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｈ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，４５７−６４）。Ｓｉｒｐαは、ＢＭストローマ細胞および造血細胞において大量に発現される（データ示さず）。本発明者らは、ＢＭ由来マクロファージからのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および双方向配列決定を用いることにより、ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＢＡＬＢ／ｃマウスのコード領域における変異を同定した。ＮＯＲの配列は、エキソン７における２つのスプライス供与部位間の変異をおそらく反映するＢ６由来細胞質ドメインにおける４つの付加アミノ酸を除いて（図４）Ｂ６と同一である（Ｓａｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４４  Ｐｔ  ３，６６７−７５）。ＮＯＤとＮＯＲとの間のＳｉｒｐαコード配列の比較によって、２４個のアミノ酸の差異が明らかになり、これらのうちの２０個は、分子の細胞外ＩｇＶ様ドメインに存在し、ＮＯＤ配列は、ＮＯＲおよびＢ６と比べて１８個の置換および２個の欠失を示す（図４および図８Ａ）。ＮＯＤとＮＯＲまたはＢ６との間のＳｉｒｐαのＮ末端のＩｇＶ様ドメインにおいて観察されたこの変異は、この領域において以前に報告されていた、Ｂ６、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／Ｓｖ系統の間における変異（Ｓａｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４４  Ｐｔ  ３，６６７−７５）よりも広範囲である。
【００９８】
ＮＯＤマウスとＮＯＲマウスとの間のＳＩＲＰα配列変異の結果を評価するために、タンパク質溶解産物をＢＭ由来マクロファージから調製し、ＮＯＤおよびＮＯＲマウスにおいて同一の配列である細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット法によって、ＳＩＲＰα発現を調べた（図４）。ＳＩＲＰα発現の定量的な系統差は、調べた条件下において検出されなかった。ＮＯＤタンパク質の電気泳動移動度は、ＮＯＲタンパク質の電気泳動移動度よりもわずかに小さかった（図５Ａ）。ＳＩＲＰαは、グリコシル化される（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｏｆ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４，１３２１−９）ので、本発明者らは、見かけの分子量の系統差が、異なるグリコシル化を反映する可能性を調べた。ＢＭ由来マクロファージからのタンパク質溶解産物をＮ−グリコシダーゼＦで処理し、免疫ブロット法によって調べた（図５Ｂ）。Ｎ結合型グリカンを除去した後、両方の系統由来のＳＩＲＰαが、さらに速く移動し、ほぼ等しい移動度だった。これらの結果から、本発明者らがＮＯＤおよびＮＯＲタンパク質の細胞外部分において検出した広範な多型が、異なるグリコシル化をもたらすことが示唆される。したがって、ＮＯＤ系統とＮＯＲ系統との間のアミノ酸配列および翻訳後修飾の相違は、Ｓｉｒｐαが、ヒト造血の支援においてＩｄｄ１３遺伝子が付与する系統特異的な差異であることと一致する。
【００９９】
実施例６
マウスマクロファージはヒトＬＴＣ−ＩＣの支援において系統特異的な変異を示す
マウスＳＩＲＰαは、ニューロンおよび骨髄性細胞において最も大量に発現され（Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，２２７１９−２８）、心臓、肝臓、腎臓および他の組織において、異なってグリコシル化された形態の証拠が存在する（Ｓａｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４４  Ｐｔ  ３，６６７−７５）。ＳＩＲＰαへの連結は、ファゴサイトーシス（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３，８５５−６２；Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４，５４１−９）およびＴＮＦα産生（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２，２５３２−４０）の阻害、ならびに一酸化窒素産生の増加（Ａｌｂｌａｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５，７１８１−９２）を含む複数のマクロファージの機能を制御する。本発明者らおよび他の研究者らは、ＮＫ細胞と異なるヒトＣＤ１２２＋細胞サブセット（おそらくマクロファージ）が、異種移植の状況においてヒト造血性生着に対する宿主の抵抗性に関与し得ることを示した（ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６，１２５９−６１；Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３１，５５１−８）。さらに、マクロファージは、造血支援的なＢＭ間質培養物の構成要素である（Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４３，３７１−９）。これらの観察結果に基づいて、本発明者らは、本発明者らがキメラＬＴＣ−ＩＣアッセイにおいて観察したヒト造血性支援における系統特異的な差異をマクロファージが付与するか否かを試験した。ＮＯＤ、ＮＯＲ、およびＩｄｄ１３遺伝子座においてヘテロ接合のＮＯＲコンジェニックマウス（ＮＯＲ．ＢＮ−Ｉｄｄ１３）から腹腔マクロファージを回収し、ヒト造血を支援するマウス細胞株であるＭＳ−５ストローマ細胞（Ｉｓｓａａｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８１，２９１６−２４）を含むヒトＬＴＣ−ＩＣ培養物に加えた。確立されたＭＳ−５培養物上にマウスマクロファージを２００、２，０００および２０，０００細胞／ウェルの用量で播種した後、２４時間後に２，０００個のＬｉｎ−ＣＢ細胞を加えた。すべての系統のマクロファージが、ＬＴＣにおいて３〜４週間後に生成されたＣＦＣの数に対して用量依存的な作用を有した（図６Ａ）。ＮＯＲマクロファージは、すべての細胞用量において、ＮＯＤマクロファージよりも大きなヒトＬＴＣ抑制を示した；２，０００および２０，０００個マクロファージ／ウェルでは、系統差は、有意であった（ｐ＜０．００８）。ＮＯＲ．ＢＮ−Ｉｄｄ１３は、ＮＯＲマクロファージとＮＯＤマクロファージとの中間の作用を有し、これは、ヒト造血の支援に対するＳｉｒｐα対立遺伝子の（共）優性作用に関する本発明者らの以前の観察結果と一致した。ＢＭ由来マクロファージを用いて行われた反復実験は、同様の結果を示した（データ示さず）。これらの知見から、インビトロにおけるヒト造血に対するマウスマクロファージ��Ｉｄｄ１３遺伝子型特異的かつ用量依存的な抑制作用が証明される。
【０１００】
実施例７
Ｓｉｒｐαはヒト造血を支援するＮＯＤマクロファージの特異な能力を付与する
ＮＯＤ  Ｓｉｒｐαバリアントが、ヒト造血のマクロファージ媒介性抑制の観察された系統特異的作用を付与するか否かを直接試験するために、本発明者らは、ＮＯＤ由来Ｓｉｒｐα＋Ｇｆｐ（ＳＩＲＰ）またはＧｆｐのみ（ＣＥＰ）を発現するレンチウイルスベクターを構築した。Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージをＳＩＲＰに感染させることによって、ＳＩＲＰαタンパク質の高レベルの発現がもたらされ、それが、マクロファージにおいてウエスタンブロット解析でＮＯＤ型の移動度を示したことから、これらの細胞において適切にグリコシル化されたことが示唆される（図６Ｂ）。キメラＬＴＣにおけるＳｉｒｐαの作用を評価するために、ＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージをＳＩＲＰまたはコントロールＣＥＰレンチウイルスに感染させた後、ＭＳ−５間質培養物上に播種した。翌日、ヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞を加え、ＣＦＣの生成を２５〜３１日後に評価した。細胞用量の作用は、Ｓｉｒｐα遺伝子型に関係なく、２０，０００個マクロファージ／ウェルでの播種がヒト造血を抑制したこの状況においても明らかだった。しかしながら、ＮＯＲマクロファージによるＮＯＤ由来ＳＩＲＰαの発現は、操作されていないＮＯＲマクロファージまたはＣＥＰに感染したＮＯＲマクロファージよりも実質的に高いヒトＣＦＣ支援をもたらした（図６Ｃおよびデータ示さず）。これらの機能獲得実験の結果から、ＳＩＲＰαが、キメラＬＴＣにおいて系統特異的かつマクロファージ媒介性の作用を付与することが裏付けられ、この遺伝子は、インビトロおよびインビボの両方においてヒト造血の支援に対するＩｄｄ１３遺伝子座の作用に関与する直接的な支援を提供する。
【０１０１】
実施例８
マウスＳｉｒｐにおける対立遺伝子変異はヒトＣＤ４７に対する特異な結合性を付与する
ＳＩＲＰαの細胞性リガンドは、遍在的に発現されるインテグリン関連タンパク質のＣＤ４７であり、これは、Ｉｇスーパーファミリのメンバーでもある（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９４，３６３３−４３）。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαの細胞外ＩｇＶ様ドメインに結合する（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７，２７４１−９；Ｖｅｒｎｏｎ−Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０，２１３０−７）。以前の研究では、ヒトＳＩＲＰαは、ブタＣＤ４７への異種間結合を示すが、マウス（Ｂ６）、ラットまたはウシ由来のＣＤ４７への異種間結合を示さないことが示されている（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７，２５４８−５６）。ＳＩＲＰαのＮＯＤ対立遺伝子とＮＯＲ対立遺伝子との間にＩｇＶ様ドメインにおける２０個のアミノ酸差異を同定したので（図４）、本発明者らは、これらの変異が、ヒトＣＤ４７に対するマウスＳＩＲＰαの異なる結合性を付与するか否かを問うた。ＮＯＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マウスからのＢＭ由来マクロファージは、同様の比率のＣＤ１１ｂ＋細胞を有し（図７Ａ）、これらの細胞は、等量のＳＩＲＰαを発現した（図７ＢおよびＣ）。しかし、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたヒトＣＤ４７細胞外ドメイン（ｈＣＤ４７−Ｆｃ）（Ｌａｔｏｕｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７，２５４７−５４）は、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マクロファージよりもＮＯＤに対してはるかに大きな結合性を示したことから（図７ＢおよびＤ）、マウスＳＩＲＰαとヒトＣＤ４７とのＩｄｄ１３遺伝子型依存的な相互作用が証明された。ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マクロファージ抽出物は、等量のＳＩＲＰαを含んでいたが、ＮＯＲおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３の両方の溶解産物からのｈＣＤ４７−ＦｃによるＳＩＲＰαの免疫沈降は、ＮＯＤ溶解産物からの有効な回収と対照的に、わずかであった（図７Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＮＯＤ由来ＳＩＲＰαが、ＮＯＲ（またはＢ６）由来タンパク質よりもはるかに大きなヒトＣＤ４７との反応性を示すことを示唆し、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおけるヒト造血の高い支援についての分子機序が提供される。
【０１０２】
実施例９
マウスおよびヒトＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインのタンパク質配列アライメントならびにヒト集団内のＳｉｒｐα多型
さらに、本発明者らは、造血の機能アッセイと組み合わせて位置的な遺伝学アプローチを用いることにより、インビトロおよびインビボにおいて、ヒトの幹細胞および前駆細胞とＢＭ微小環境との相互作用の重要な制御因子としてＳｉｒｐαを同定した。本発明者らは、ヒトＣＤ４７に結合することができるＳＩＲＰαタンパク質バリアントのマウスマクロファージ上の発現が、キメラＬＴＣにおけるヒト造血の支援に必要かつ十分であることを示す。これらの知見は、造血幹細胞移植後の生着の重要なメディエータとしてマクロファージを意味づける。
【０１０３】
他の免疫不全マウス系統と比べてＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて達成された優れたヒト造血性生着は、さらなる宿主系統特異的因子が造血性生着に影響を及ぼすことを示唆する。本発明者らは、マウスマクロファージにおけるＩｄｄ１３遺伝子座と、キメラ培養物およびインビボにおけるヒト造血の支援との頑強な遺伝的関連を見出した。レンチウイルス遺伝子導入を用いる直接的な機能獲得型研究は、インビトロにおけるＬＴＣ−ＩＣデータを裏付け、そしてＳｉｒｐαをＩｄｄ１３遺伝子座の作用に関与する遺伝子として意味づける。造血系において、ＳＩＲＰαは、主に骨髄性細胞上に発現され、マクロファージによるファゴサイトーシスの減少、好中球遊走の阻害および炎症性サイトカインＴＮＦα産生の減弱をもたらす抑制性シグナルを媒介する細胞質免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｈ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，４５７−６４に概説されている）。唯一知られているＳＩＲＰαの細胞性リガンドであるＣＤ４７は、遍在的に発現され、血小板の活性化、遊走および接着、白血球の接着およびサイトカイン産生、ならびにＴ細胞の応答性をはじめとした、造血細胞に対する複数の細胞作用を調節する（Ｂｒｏｗｎ，ＥＪ．＆  Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｗ．Ａ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，１３０−５に概説されている）。ＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の両方が、免疫グロブリンスーパーファミリのメンバーであり、それらの相互作用は、それらのそれぞれのＩｇＶ様ドメインを介して媒介される（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７，２７４１−９）。本発明者らは、ＮＯＤ  ＳＩＲＰαとＮＯＲ  ＳＩＲＰαとの間のＩｇＶ様ドメインにおける２０個のアミノ酸差異、ならびにその２つのタンパク質間の異なるグリコシル化を同定しており、このことは、ヒトＣＤ４７との異なる相互作用が、インビトロおよびインビボにおけるヒト造血の支援に対するＳｉｒｐα変異の強力な作用の基礎をなし得ることが示唆される。この機序は、ＮＯＲ由来タンパク質と比べてＮＯＤ由来ＳＩＲＰαによるヒトＣＤ４７に対する高い結合を証明する、本発明者らの生化学的解析およびフローサイトメトリ解析によって支持される。
【０１０４】
ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用は、赤血球（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，２０５１−４）および白血球（Ｇａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ  １２３，３２１−３４）の食作用媒介性クリアランスの制御に関わっており、ここで、造血細胞上のＣＤ４７の発現は、ＳＩＲＰαを発現しているマクロファージによるファゴサイトーシスを阻害する「自己マーカー」として機能する。同様の機序が、ヒトマクロファージをヒトＣＤ４７−Ｆｃとともに事前にインキュベートすることによって、またはブタリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）トランスフェクタント上でのヒトＣＤ４７の異所発現によって、ファゴサイトーシスが減弱したというインビトロにおける観察結果に基づいて、肝臓同種移植片から回収されたヒトマクロファージによるＬＣＬのファゴサイトーシスを調節すると提唱されている（Ｉｄｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，５０６２−６）。本発明者らの証拠は、Ｓｉｒｐα  ＩｇＶドメインにおける遺伝的変異が、ＣＤ４７相互作用の程度に影響を及ぼし、ヒトＨＳＣの生着に対して「全か無かの」作用を発揮し得ることを証明することによって、これらの以前の観察結果を広げるものであり、これは、以前の知見を、結果が宿主のマクロファージによって調節されるインビボ移植の状況に対すると結びつけるものである。いかなる理論にも拘束されないが、重要なことには、本発明者らは、ＮＯＲキメラ培養物においてヒト造血細胞が徐々に消失したことを観察した（データ示さず）（これは、迅速な食作用ベースのクリアランスと直ちに一致するものではない観察結果である）ので、マクロファージ媒介性ファゴサイトーシスは、インビトロまたはインビボにおける造血性支援の基礎をなす唯一のまたは主要なエフェクタ機構でない場合がある。さらに、すべてのマウス系統由来のマクロファージが、ヒトＬＴＣ−ＩＣの成長に対して用量依存的な抑制作用を示したことから、ＳＩＲＰαシグナルが、病原体産物によって刺激されたマクロファージについて以前に示されているように（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２，２５３２−４０）ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインのマクロファージ分泌を阻害することが示唆される。マクロファージに対するＳＩＲＰαの作用に加えて、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７結合は、ヒト造血細胞内のＣＤ４７誘導性のシグナル伝達経路を活性化し得る。したがって、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用のかなり多数の多面発現効果が、ヒトＨＳＣの生存および生着に影響を及ぼし得る。
【０１０５】
異種移植の状況における本発明者らの観察結果は、臨床上のＨＳＣ移植に対する大きな暗示を有し得る。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに移植された原始的な造血幹細胞／前駆細胞の観察された挙動が臨床の状況を予測することを証明する大多数の証拠が存在する（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ−Ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．）におけるＷａｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓａｙｅｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ”９９−１１８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２００１）。
【０１０６】
本発明者らがマウスの系において観察した機能的なバリエーションがヒトにおいて関連性があるか否かをさらに調査するために、本発明者らは、ヒト集団においてＳＩＲＰα多型を調べた。本発明者らは、ヒトＨａｐＭａｐゲノムプロジェクトからの無関係な３７人の正常なコーカサス人（ＣＥＵ）、アフリカ人（ＹＲＩ）、中国人（ＣＨＢ）および日本人（ＪＰＴ）の個体由来のＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインを配列決定し（表５）、そして１８個のアミノ酸における組み合わせの変異を反映する１０個の異なるＳＩＲＰα  ＩｇＶ対立遺伝子を同定した（図８ｂ）。最近報告されたＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの高分解能Ｘ線結晶構造は、ＣＤ４７結合表面に寄与する重大な残基を予測している（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ  ３６，３６４−７２）。驚くべきことに、本発明者らは、予測されたＣＤ４７結合残基においてヒト対立遺伝子変異を認めた（図８ｂ）。さらに、本発明者らは、ＮＯＤ対立遺伝子をＮＯＲ対立遺伝子（ならびに他のマウス系統；図４および図８ｂ）と識別する、ＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの同じ小領域に密集したヒト対立遺伝子変異を認めた。ヒト多型は、本発明者らがこれらのマウス系統において観察したＳＩＲＰα  Ｎ結合型炭水化物付加の異なるパターン（図５ｂおよび図８ｂ）に寄与し得るＮＯＤとＮＯＲとの間の変異のオルソロガスな位置にも見られた（アミノ酸７２のアスパラギンに対してセリン）。まとめると、これらのデータは、実験マウスにおけるようにヒトＳＩＲＰαがＩｇＶドメインにおいて高度に多型であることを示しており、そして対立遺伝子変異体が翻訳後プロセシングおよびＣＤ４７リガンド相互作用に影響することを示唆している。
【０１０７】
本発明者らの知見は、遺伝的に制御されるＨＳＣ生着の新しい軸を明らかにする。従来の移植片拒絶は、残留する宿主Ｔ細胞またはＮＫ細胞によって媒介される免疫学的現象であり、拒絶率は、レシピエントとドナーとの間のＨＬＡ不一致の程度に関連する。本発明者らは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に加えて、宿主マクロファージが、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用によって媒介される生着において重要な役割を果たすことを示す。さらに、本発明者らの知見は、免疫介在性の病原を有し得るＢＭ不全症候群に対して関連性があり得る。
【０１０８】
ヒトＨＳＣの支援に対するマウスマクロファージの作用が、ＳＩＲＰα対立遺伝子に依存し（配列依存性であり）、また、ＬＴＣ−ＩＣアッセイにおけるマウスマクロファージの数に依存することが示される。投入細胞数が多いときは、ＮＯＤ由来マクロファージでさえも、これらのアッセイにおいてヒトＨＳＣに対する支援を減少させた。移植されるヒトＨＳＣの数が限られていて、ＳＩＲＰαを有するレシピエントマクロファージの数が多い、臨床の状況では、生着の増加は、治療用量のＣＤ４７−Ｆｃ、またはレシピエントマクロファージにおいてＳＩＲＰα抑制性シグナルを効率的かつ特異的に引き起こすことができる等価な可溶性試薬でレシピエントを処置することによって達成され得る。いったん、ＨＳＣおよびそれらの系統特異的（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）子孫が生着し、レシピエントを再配置すると、確立された移植片が、残りのレシピエント由来マクロファージに対して好ましい比をもたらす多数のＣＤ４７＋細胞を生成するので、ＳＩＲＰαの治療的な関与に対する必要性は、低下し得る。
【０１０９】
当業者は、例えば、Ｓｉｃｋ  Ｋｉｄｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を介して入手可能で利用可能なヒトＨａｐＭａｐサンプルから無関係な正常個体を配列決定することによってＳＩＲＰαにおけるヒト多型の程度が解析し続けられ得ることを理解するだろう。例えば、ＨＬＡ研究室におけるドナーおよびレシピエントのアーカイブ血液サンプルからの１〜２マイクログラムのＤＮＡサンプルが、標準的な配列決定設備を用いてＳＩＲＰαを配列決定するために使用され得る。ドナー／レシピエント凍結血液サンプル対は、いかなる診断またはいかなる結果の詳細も含まれていない独自の匿名ＩＤが与えられ得る。リガンドの結合および機能に絶対不可欠なＩｇＶドメインをコードするこの遺伝子のエキソン３を配列決定すること、また、ＳＩＲＰαから発するシグナルの伝達にとって重要なアミノ酸残基を含むその遺伝子の細胞内領域をコードするさらなる２つのエキソンも配列決定することに特定の注意が払われ得る。任意の患者識別名が取り除かれたこれらの個体のＳＩＲＰα配列データベースが作製され、そしてドナー−宿主対におけるＳＩＲＰα変異と骨髄生着結果との関連性についての統計解析が行われ得る。
【０１１０】
図９を参照すると、本発明者らがヒトＨａｐＭａｐサンプル間で検出したいくつかの非同義コーディング多型に内在する変異ヌクレオチドを検出する３つのＳＮＰアッセイ（Ｄｓ＃表記が与えられている）が確立された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマおよび検出プローブをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎシステム（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）に基づいて設計した。ＳＩＲＰαバリアント（Ｖ１、Ｖ２．．．など）間の識別を図９中の表の下に示す。図９は、表の左側に示されるヒトＨａｐＭａｐサンプルの各々から増幅されたＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインＰＣＲの独立した配列決定による各ＳＮＰアッセイの識別力の確認を示している。ＳＩＲＰα  ＩｇＶドメイン配列における正常なヒト多型の程度が、決定され、ＳＮＰアッセイと臨床研究において使用するための配列決定との両方の使用が、最適化される。用いた方法およびデータは、広く入手可能なものであり、当業者に公知であり、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ）を参照のこと。
【０１１１】
実施例１０
ｈＣＤ４７−Ｆｃタンパク質の生成
図１０ａは、細胞外ＩｇＶ様ループ、５回膜貫通領域および短い細胞質テイルを含むＣＤ４７タンパク質の図画描写である。図１０ｂは、ヒトＩｇＦｃ領域に融合されたＣＤ４７  ＩｇＶ様ドメインを表しているＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質を表している。
【０１１２】
ＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質を、上記の方法および材料に記載のように調製した。
図１１ａは、ｍＣＤ４７−Ｆｃ、および異なるプラスミド骨格（ｐｃＤＮＡおよびｐＩＡＰ３６９）を用いて調製された２つのｈＣＤ４７−Ｆｃ構築物でトランスフェクトされた培養細胞の上清におけるタンパク質生成を表しているヒストグラムを示している。図１１ｂは、培養上清からの精製後の融合タンパク質を表しているＳＤＳ−ＰＡＧＥの免疫ブロットである。いずれのｈＣＤ４７−Ｆｃ構築物も、さらなる最適化を促すｍＣＤ４７−Ｆｃ構築物ほど生成しなかった。
【０１１３】
実施例１１
ｈＣＤ４７−Ｆｃタンパク質生成の最適化
本出願人は、タンパク質生成を高めるためにコンセンサス開始部位を導入した。図１２ａを参照すると、ｍＣＤ４７−Ｆｃを含むｐＩＡＰ３６９プラスミド構築物をスキャフォールドとして使用して、Ｋｏｚａｋ配列と呼ばれる真核生物の翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８４，１２（２）：８５７−７２）を導入した。次いで、得られたプラスミドを制限酵素で消化することによりｍＣＤ４７ドメインを除去し、それを、細菌におけるライゲーションおよび再クローニングによってｈＣＤ４７  ＩｇＶ様ドメイン配列で置き換えた。得られたプラスミドの配列決定を行うことにより、インフレームでのｈＣＤ４７配列の導入およびＫｏｚａｋ配列の確認を確実にした。前述の利用された典型的な分子クローニング手法は、当業者に公知のものであり得る。図１２ｂは、ｐＩＡＰ３６９プラスミドに挿入された配列ｈＣＤ４７−Ｆｃを示し、Ｋｏｚａｋコンセンサス（配列番号１２３）、ｈＣＤ４７断片（配列番号１２４）、リンカー（配列番号１２５）およびＦｃ（配列番号１２６）を示している。
【０１１４】
図１３ａは、上記のように調製された４つの異なる構築物のうちの１つでトランスフェクトされた細胞の上清においてアッセイされたマウスおよびヒトＣＤ４７−Ｆｃの生成を示している。このデータは、真核生物の開始（Ｋｏｚａｋ）配列の導入が、ｈＣＤ４７−Ｆｃの生成を上清の３０ｍｇ／Ｌに高めたこと（右側２つのカラムを比較）を示している。図１３ｂは、プロテインＧで精製されたＣＤ４７−Ｆｃタンパク質と反応する抗ヒトＦｃ抗体を示している免疫ブロットを示している。炭水化物部分が翻訳後に異なって付加されることによって、マウスおよびヒトＣＤ４７−Ｆｃに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度に差が生じることに注意すること。
【０１１５】
本出願人は、ＮＯＤ．ＳＣＩＤ異種移植モデルのインビボにおける試験に適するかなりの量の高度に精製されたＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の生成に成功した。
【０１１６】
実施例１２
ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するマウスＣＤ４７−Ｆｃの結合
新しく調製されたＮＯＤおよびＮＯＲマクロファージの表面上のＳＩＲＰαに対するｍＣＤ４７−Ｆｃの結合のアッセイを、図１４に関する材料および方法の項に記載されるアッセイを用いて測定した。図１５は、ＮＯＤ  ＳＩＲＰα−ｍＣＤ４７結合のＫｄが、ＮＯＲ  ＳＩＲＰα−ｍＣＤ４７相互作用のＫｄよりも４倍超（約４．７倍）小さい（ＳＩＲＰαのＮＯＲバリアントと比べてＮＯＤによる相互作用の方が４倍超高い親和性を示す）という結果を示している。これらのデータから、本発明者らがヒトＳＩＲＰα  ＩｇＶドメイン配列において観察していたＳＩＲＰα変異が、ＨＳＣ移植の効率に影響を及ぼし得る、ヒトＣＤ４７に対する結合の有意差をもたらすと予測されることが示唆される。
【０１１７】
実施例１３
ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するヒトＣＤ４７−Ｆｃの結合
新しく調製されたＮＯＤおよびＮＯＲマクロファージの表面上のＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７−Ｆｃ結合のアッセイを、図１４に関する材料および方法の項に記載されるアッセイを用いて測定した。２つの条件を試験した：第１に、操作されていない新鮮マクロファージ上のＳＩＲＰαに対する結合（「非クラスター化」；三角）および第２に、ＳＩＲＰα外部ドメインに対するモノクローナル抗体で前処理されたマクロファージに対する結合（「クラスター化」；四角）。ヒトＨＳＣおよびそれらの子孫細胞の表面上にディスプレイされるＣＤ４７と会合する作用を模倣する後者の条件を調べた。その状況において、ＣＤ４７の結合は、マウスマクロファージ上の結合したＳＩＲＰαタンパク質を「クラスター化する」高い結合価をもたらし得る。図１５ｂにおいて、結果は、ＮＯＤ  ＳＩＲＰα−ｈＣＤ４７結合のＫｄが、高親和性の相互作用を表す１．６ｎＭであることを示している。驚くべきことに、クラスター化条件下において、親和性は、１０倍超上昇し、０．１６ｎＭのＫｄをもたらす。これらのデータから、ＮＯＤ由来ＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインへのヒトＣＤ４７の結合は、非常に高く、インビボにおけるＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の強力な治療効果を予測するものであることが示唆される。
【０１１８】
実施例１４
ＨＳＣの生着に対するＳＩＲＰα媒介性シグナル伝達の役割の評価
他の研究から、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７結合がタンパク質の各々を介して双方向シグナルを誘発すること（図１６に示される模式図によって表されている）が示唆されている。本出願人は、ＣＤ４７結合によって媒介されるＳＩＲＰαを介したシグナルがＨＳＣ生着に必要であるか否かを評価した。図１７は、重大な下流のホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２への連結に必要な２つの免疫チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）（右側）が故意に欠失していることによってシグナルを伝達することができない、ＳＩＲＰαのヒトＨＳＣ「許容性」ＮＯＤ型の切断型（「ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ」）（左側）の調製を示している。
【０１１９】
ヒトＨＳＣ生存におけるＳＩＲＰα−ＣＤ４７媒介性のシグナル伝達についての必要条件を判定する長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ（Ｔａｋｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７  Ｄｅｃ，８（１２）：１３１３−２３に記載されている方法を用いて行った）。
【０１２０】
この実験は、完全長細胞質切断型ＮＯＤ  ＳＩＲＰαがＬＴＣ−ＩＣアッセイにおいてヒトＨＳＣ生存を支援する能力を比較するものである。様々なレンチウイルスを用いて形質導入された、段階的な用量のＮＯＤまたはＮＯＲ起源のマウスマクロファージを用いて、５つの条件を試験した：
１）「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＣＥＰ「菱形」）
２）ウイルスで感染されていないＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ非感染；黒三角）
３）「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ−ＣＥＰ；丸）
４）完全長ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＳＩＲＰ；四角）
５）切断型ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ；白三角）
図１８を参照すると、完全長ＮＯＤ  ＳＩＲＰα構築物を含むレンチウイルスによるＮＯＲマクロファージの感染は、空のウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージと比べてヒトＨＳＣの生存を著しく高める（菱形に対する四角）。対照的に、細胞質切断型のＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスによるＮＯＲマクロファージの感染は、空のウイルスによるＮＯＲマクロファージの感染と区別できなかった（白三角に対する菱形）。これらのデータは、ヒトＨＳＣの支援は、ＳＩＲＰαを介するＣＤ４７依存性のシグナル伝達に依存することを示している。ゆえに、患者においてヒトＨＳＣの移植、生存および分化を高める療法の開発は、ＳＩＲＰαを介するシグナルの操作に焦点を合わせるべきである。
【０１２１】
本出願人は、Ｔａｋｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ（前出）に報告されているＮＯＤ．ＳＣＩＤ異種移植データが、小集団のＨＳＣを投与された患者がＳＩＲＰαを発現している大量のマクロファージを有する臨床状況を模倣したものと推論した。この「非骨髄破壊的」状況において、ドナーＨＳＣ上のＣＤ４７と患者のマクロファージ上に発現されるＳＩＲＰαとの結合親和性は、ＳＩＲＰα媒介性のシグナルを引き起こす効率を調節し得、ＨＳＣが持続するかまたは排除されるかを決定し得る。
【０１２２】
実施例１５
ヒトＨＳＣ生着におけるｈＣＤ４７−Ｆｃ治療のインビボにおける評価
図１９は、ＨＳＣ生着に対するＣＤ４７融合タンパク質の作用をインビボにおいて評価するために設計された研究の全体的な概要である。ｈＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質を、段階的な用量のヒト新生児臍帯血造血幹細胞の導入と共にＮＯＤ．ＳＣＩＤ宿主に注射した。以前に記載されているように（Ｊ．Ｌ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，１１：１２２５−３３）、モノクローナル抗体と免疫磁気ビーズとの混合物を用いて、成熟した系統特異的細胞を除去することによってヒトＨＳＣを調製した。ＨＳＣ生着の後、レシピエントマウスの血液、脾臓および骨髄において、細胞表面マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ４５）に対するヒト特異的抗体を用いてフローサイトメトリ検査を行う。
【０１２３】
ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質はヒトＨＳＣの高い生着をもたらす
行われた研究は、ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質による処置が、ΝＯＤ．ＳＣＩＤマウスへの移植の際にヒト臍帯血幹細胞の生着に影響し得るか否かを判定するためのものであった。ＨＳＣの濃縮集団をもたらす本発明者らの以前に公開された方法（Ｖｏｒｍｏｏｒ  Ｊ，Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｔ，Ｐｆｌｕｍｉｏ  Ｆ，Ｒｉｓｄｏｎ  Ｇ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｂ，Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ＨＥ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ．Ｂｌｏｏｄ．１９９４，８３（９）：２４８９−９７）を用いて、血液細胞株マーカーに対する抗体の混合物を使用し、ヒト新生児臍帯血細胞を枯渇させた。同齢の雌ΝＯＤ．ＳＣＩＤマウスのコホートを、本発明者らが以前に記載したように（Ｖｏｒｍｏｏｒ  Ｊ，Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｔ，Ｐｆｌｕｍｉｏ  Ｆ，Ｒｉｓｄｏｎ  Ｇ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｂ，Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ＨＥ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ．Ｂｌｏｏｄ．１９９４，８３（９）：２４８９−９７）低線量照射によって予め調整した。精製ヒトＣＤ４７−Ｆｃタンパク質または無関係のヒトＦｃアイソタイプコントロール調製物を腹腔内に注射したΝＯＤ．ＳＣＩＤマウスに、２万〜４万個の系統枯渇ＣＢ細胞を注射した。当該処置を、ＣＢ細胞の注射の３時間前に施し、次いで、３週間にわたって３回／週（７．５〜３０マイクログラム／用量）で施した。実験の終わりに、すべてのマウスを屠殺し、骨髄細胞を脛骨および大腿骨から調製した。骨髄細胞を一連のモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリによって解析した。ヒトＨＳＣの生着の程度を測定するために、抗ヒトＣＤ４５で染色された細胞を定量化した。
【０１２４】
図２０を参照すると、ヒトＣＤ４５＋細胞は、コントロールヒトＦｃタンパク質を投与した８匹のΝＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて検出不可能であった。対照的に、ｈＣＤ４７−Ｆｃタンパク質で処置した３匹中２匹のマウスが、ヒトＨＳＣ生着の明らかな証拠を示した。これらのデータは、ＳＩＲＰαのタンパク質または小分子のアゴニストによる処置が、臨床の移植の状況においてヒトＨＳＣの生着を促進し得るという考えと一致する。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されてきたが、本発明の精神または添付の請求項の範囲から逸脱することなく、その好ましい実施形態に対して変更がなされ得ることが当業者によって理解されるだろう。本明細書中に開示されるすべての文献が、参考によって組み込まれる。
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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