(57)【要約】  本発明は、免疫原性組成物の調製に使用するための、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の遺伝子改変および弱毒化した株を作製する方法に関する。より詳細には、本発明は、免疫原性組成物を調製するための、ウイルスの収量の増加および弱毒化した株の安定性の増加をもたらす弱毒化ＶＳＶの特定の遺伝子改変の同定に関する。細胞培養物の増殖方法およびＶＳＶの大スケールの産生における使用も開示されている。【図１】2011507523.tif 000010
2011507523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、単離された遺伝子改変水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【請求項２】
遺伝子改変ＶＳＶをコードしている核酸が、少なくとも１つの異種抗原をコードしている核酸またはその断片をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項３】
１つの異種抗原またはその断片が病原性微生物に由来する、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項４】
異種抗原をコードしている核酸を得る病原性微生物が、ウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択される、請求項３に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項５】
異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群から選択される、請求項４に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項６】
異種抗原がＨＩＶタンパク質を含む、請求項５に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項７】
ＨＩＶタンパク質が、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖおよびｖｐｕからなる群から選択される遺伝子によってコードされている、請求項６に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項８】
ＨＩＶタンパク質がＨＩＶ  ｇａｇタンパク質である、請求項６に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項９】
ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質が、位置１６５、２７０、３２９、または３４８に少なくとも１つの突然変異を有する、請求項８に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１０】
突然変異が保存的または非保存的なアミノ酸変化を含む、請求項１から９のいずれかに記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１１】
突然変異が、Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方である、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１２】
Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異がＴ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異がＰ→Ｔ突然変異である、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１３】
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１のアミノ酸の突然変異が、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、Ａ→Ｖ／Ｇ→Ｌ、またはＶ→Ｉの突然変異である、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１４】
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸の突然変異が、それぞれＰ→Ｌ、Ｋ→Ｅ、またはＬ→Ｉである、請求項１に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１５】
ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸の突然変異が、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→ＮまたはＴ→Ｋである、請求項９に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１６】
アミノ酸のいずれか１つまたは複数の突然変異が、ウイルスの遺伝子型および／または表現型の安定性の増加をもたらす、請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１７】
アミノ酸のいずれか１つまたは複数の突然変異が、前記ウイルスに感染した細胞からのウイルス産生の収量の増加をさらにもたらす、請求項１６に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１８】
そのゲノム中に少なくとも２つの他の突然変異をさらに含み、突然変異が、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＶＳＶ。
【請求項１９】
ＶＳＶを、連続哺乳動物細胞系中で、約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの範囲の低い感染多重度（ＭＯＩ）で少なくとも５〜１５継代連続して継代培養することを含み、ウイルスが、少なくとも１×１０６ＰＦＵ／ｍｌの力価および請求項１から１４のいずれか一項に記載の突然変異のうちの少なくとも１つまたは複数を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＶＳＶを産生する方法。
【請求項２０】
ウイルスが少なくとも１×１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞系が、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、または２９３細胞系である、請求項１９または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の低ＭＯＩで約５〜１５回継代培養していないウイルス株で得られるものと比較して、５〜１００倍高いウイルスの収量をもたらす、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子改変ＶＳＶにより、ウイルスの遺伝子型および／または表現型の安定性の増加が実証される、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＶＳＶのいずれか１つまたは複数と、薬学的に許容できる担体とを含む免疫原性組成物。
【請求項２５】
アジュバントをさらに含む、請求項２４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
免疫学的に有効な量の、請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＶＳＶを投与することを含む、哺乳動物を病原性微生物による感染に対して保護する方法。
【請求項２７】
免疫学的に有効な量の、請求項２４または２５のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物を病原性微生物による感染に対して保護する方法。
【請求項２８】
ウイルスを細胞培養物中での成長に適応させる方法であって、
ａ．細胞培養物を、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の低い感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスに感染させるステップと、
ｂ．ウイルスを含有する細胞培地を収集するステップと、
ｃ．細胞培地を清澄にするステップと、
ｄ．細胞培地を凍結するステップと、
ｅ．ステップａ）からｄ）を約５〜約１５回繰り返すステップと
を含み、ウイルスの産生／収量の５〜１００倍の増加ならびにウイルスの遺伝子型および表現型の特徴の安定性の増加をもたらす方法。
【請求項２９】
ウイルスが弱毒化したウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスの弱毒化に関連する任意の既存の突然変異の維持が可能となる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ウイルスの弱毒化に関連する低い神経毒性プロフィールの維持が可能となる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
免疫原性組成物の大スケールの産生に使用する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位の範囲の低い感染多重度で約５〜１５回継代培養していないウイルス株で得られるものと比較して、５〜１００倍高いウイルスの収量をもたらす、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスの弱毒化に関連する既存の突然変異が、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
弱毒化したウイルスが水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の株である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
ＶＳＶが、以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、請求項３０に記載の方法：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【請求項３７】
突然変異が保存的または非保存的なアミノ酸変化を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
突然変異が、Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異がＴ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異がＰ→Ｔ突然変異である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１のアミノ酸の突然変異が、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、（Ａ→Ｖ／Ｇ→Ｌ）、またはＶ→Ｉの突然変異である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸の突然変異が、それぞれＰ→Ｌ、Ｋ→Ｅ、またはＬ→Ｉである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ＶＳＶの株が、インディアナ株またはニュージャージー株またはイスファハン血清型または他のベシクロウイルスから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
ＶＳＶの株が、少なくとも１つの異種抗原をコードしている核酸を含有する、請求項３６または４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
異種抗原が、ウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択される病原性微生物から得られる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
異種抗原がＨＩＶタンパク質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ＨＩＶタンパク質が、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖおよびｖｐｕからなる群から選択される遺伝子によってコードされている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＨＩＶタンパク質がＨＩＶ  ｇａｇタンパク質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質が、位置１６５、２７０、３２９または３４８に少なくとも１つの突然変異を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸の突然変異が、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→Ｎ、またはＴ→Ｋである、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の条項
本発明を導いた研究は、国立衛生研究所の契約番号Ｎ０１−Ａ１−２５４５８によって少なくとも部分的に支援されたものである。したがって、政府が本発明の特定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明は、一般に、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに関する。より詳細には、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）粒子を、産生で使用する細胞培養物中での成長に適応させる方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）とは、高度に保存された遺伝子配列順を有する一本鎖かつ非分割型のマイナスセンスＲＮＡウイルスが含まれる、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）目に属するラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科のプロトタイプウイルスである。１１ｋｂのＶＳＶゲノムは、５つのウイルスタンパク質をコードしている５つの遺伝子を含有する：ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、付着糖タンパク質（Ｇ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）。ゲノム中の遺伝子配列順は３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’であり、いくつかの研究により、遺伝子発現は、単一の３’プロモーターから強制的に連続していることが実証されている（ＲｏｓｅおよびＷｈｉｔｔ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第４版、第１巻．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１２２１〜１２４４、２００１）。
【０００４】
Ｎ遺伝子は、ゲノムのカプシド形成を司っているヌクレオカプシドタンパク質をコードしている一方で、Ｐ（リンタンパク質）およびＬ（大）コード配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットを特定する。マトリックスタンパク質（Ｍ）は、ビリオン成熟を促進し、ウイルス（ＶＳＶ）粒子の内部表面を裏打ちしている。ＶＳＶは、細胞付着タンパク質として役割を果たし、膜融合を媒介し、中和抗体の標的である、単一の外被糖タンパク質（Ｇ）をコードしている。
【０００５】
西半球におけるＶＳＶの２つの最も一般的な血清型は、インディアナ型（Ｉｎｄｉａｎａ）（ＶＳＶｉｎ）およびニュージャージー型（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）（ＶＳＶｎｊ）と命名されている。事実上、ＶＳＶは家畜に感染して自己限定性の疾患を引き起こす。ＶＳＶによる自然発生のヒト感染は稀であるが、ＶＳＶ感染の症例は、感染した家畜に直接曝露した個体または実験室環境内で報告されている。ヒトのＶＳＶ感染は、典型的には無症候性であるか、または緩和なインフルエンザ様の疾病をもたらす（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．、およびＫ．Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２７７：９８９〜９４、１９６７）。小哺乳動物の中では、マウスは、様々な接種経路を介して容易に実験的に感染させることができ、したがって、免疫原性、病原性および神経毒性の研究の優れた小動物モデルとして役割を果たす（Ｂｒｕｎｏ−Ｌｏｂｏら、Ａｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｒｉｏ  Ｊ．）１５：５３〜６８、１９６８、Ｂｒｕｎｏ−Ｌｏｂｏら、Ａｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｒｉｏ  Ｊ．）１５：６９〜８０、１９６８、Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｅ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５７４０〜８、２００３、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１０：３０９〜３１５、１９７４、Ｈｕｎｅｙｃｕｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６９８〜７０６、１９９３）。
【０００６】
過去数年で、ＶＳＶは、ＨＩＶ、パピローマウイルス、ＲＳＶ、Ｃ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスを含めたいくつかのヒト病原体を含有する免疫原性組成物のベクターとしての見込みが実証されている。数々の特性により、ＶＳＶは、ヒトで使用するための魅力的な候補ベクターとなっている（Ｂｕｋｒｅｙｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１０２９３〜３０６、２００６、Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２８：２３９〜２５３、２００６）。これらの特性には、１）ＶＳＶはヒト病原体でないこと、２）ヒトにおけるその使用を妨害し得る既存の免疫がわずかしか存在しないこと、３）ＶＳＶは多くの細胞種に容易に感染すること、４）免疫原性組成物の製造に適した細胞系中で効率的に増殖すること、５）遺伝的に安定していること、６）組換えウイルスを産生することができる方法が存在すること、７）ＶＳＶは、１つまたは複数の外来遺伝子挿入物を許容し、感染の際に高い発現レベルを指示できること、ならびに８）ＶＳＶ感染は、細胞性および液性免疫の両方の効率的な誘導因子であることが含まれる。そのような研究は、ｒＶＳＶをゲノムｃＤＮＡから容易に回収することを許容する逆遺伝学技術の出現によって大いに促進されている（Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：４４７７〜８１、１９９５、Ｓｃｈｎｅｌｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３：４１９５〜２０３、１９９４）。さらに、比較的小さくかつ単純なＶＳＶのゲノム構成は外来遺伝子の挿入を受け入れられることが証明されており、生じるウイルスは高レベルの外来タンパク質を産生する。最初のベクターは、必須の遺伝子間転写制御エレメントと共に、外来コード配列がＧおよびＬ遺伝子の間に挿入されて設計された。これらのプロトタイプベクターは、外来抗原に対して強力な免疫応答を誘発し、それらを試験した動物モデルにおいて良好に許容されたことが見出された（Ｇｒｉｇｅｒａら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ、６９：３〜１５、２０００、Ｋａｈｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５：１１０７９〜８７、２００１、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：３７２３〜３２、１９９９、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：４７０４〜１１、１９９８、Ｒｏｓｅら、Ｃｅｌｌ、１０６：５３９〜４９、２００１、Ｒｏｓｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：１０９０３〜１０、２０００、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：４６５２〜７、２０００）。注目すべきことに、Ｒｏｓｅらは、一方がＨＩＶ−１  ｅｎｖをコードしており、他方がＳＩＶ  ｇａｇをコードしている２つのベクターの同時投与により、免疫化したマカクにおいて、病原性ＳＨＩＶを用いたアレルギー誘発に対して保護した免疫応答が生じたことを見出している（Ｒｏｓｅら、Ｃｅｌｌ、１０６：５３９〜４９、２００１）。これらの研究のほとんどは、野生型（ｗｔ）ＶＳＶ主鎖から誘導したプロトタイプＶＳＶベクターを用いて実施し、ｗｔ  ＶＳＶと比較して顕著に弱毒化されていることが示された（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４７０４〜１１、１９９８）。より最近の研究では、プロトタイプＶＳＶベクターは、神経毒性の非ヒト霊長類モデルに���いて評価した場合に、野生型ウイルスと比較して減少したレベルではあるが、神経組織において顕著なレベルの傷害を引き起こしたことが示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．、３６０、３６〜４９、２００７）。これらの観察により、プロトタイプｒＶＳＶベクターは、ヒトで使用するためには十分に弱毒化されていない可能性があるという結論が導かれた。
【０００７】
ヒトに投与するための免疫原性組成物の製造を管理している規制に準拠した拡張可能な増殖方法の開発は、依然として、臨床評価を正当化できる前に対処しなければならないハードルである。ヒトに投与するためのベクターを設計する際、ウイルスの弱毒化をもたらす突然変異が安定しており、ウイルスの収量が拡張した産生に十分であることが不可避である。単一のヒト用量は少なくとも１×１０７ＩＵであると予測され、したがって、ベクターの製造は、培地１ｍｌあたり１０７ＩＵより多くが産生される場合にのみ実用的となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当分野では、回収された弱毒化ＶＳＶ粒子の収量が大スケールの製造で有用となるのに十分である、弱毒化したＶＳＶ粒子を細胞培養物中での成長の増加に適応させる方法が必要である。望ましくは、そのような方法では、商業的生産について認定された細胞を用いる。さらに、そのような方法は、ウイルスの弱毒化をもたらした最初の突然変異を保持すると同時に、収量を拡張した産生に十分なレベルまで向上させるべきである。
【０００９】
本明細書中の任意の引用文献の引用は、そのような引用文献が本発明の従来技術として利用可能であることを承認するものとみなされるべきでない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、Ｖｅｒｏ細胞または任意の感受性のある細胞基質中における低い感染多重度（ＭＯＩ）での連続継代培養による、高度に弱毒化したＶＳＶ組換え体を組織培養条件に適応させるプロセスまたは方法を提供する。複数の連続継代培養のプロセスは、ウイルスゲノム全体にわたるいくつかのヌクレオチド（ＮＴ）置換の進行性の自然増加によって特徴づけられている遺伝型の変化をもたらす。これらのヌクレオチド置換のほとんどは、ＶＳＶタンパク質中のアミノ酸（ＡＡ）置換をもたらす。このプロセスは、ウイルス収量の実質的な向上を伴った、ウイルスの表現型の適応をもたらした。Ｖｅｒｏ細胞中での継代は、遺伝型および表現型の安定性が達成されるまで、通常は１０〜１５回の連続継代（Ｐ１０〜Ｐ１５）続ける。Ｐ１５を越えるウイルスのさらなる継代培養では、追加の置換がわずかしかまたはまったく示されず、ウイルス収量のさらなる増強はもたらされなかった。このプロセスは、製造収量の実質的な向上および製造の一貫性の増強をもたらす。適応的突然変異は、高感度マウス頭蓋内ＮＶ動物モデルにおいて試験した場合に、継代培養したウイルスの神経毒性（ＮＶ）に実質的に影響を与えなかった。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、単離された遺伝子改変水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を提供する：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【００１２】
本発明の一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶをコードしている核酸は、少なくとも１つの異種抗原をコードしている核酸またはその断片をさらに含む。１つの異種抗原またはその断片が、病原性微生物に由来することが想定される。異種抗原をコードしている核酸を得る病原性微生物は、ウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択され得る。一実施形態では、異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群から選択され得る。
【００１３】
本発明の一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶをコードしている核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質である異種抗原をコードしている核酸をさらに含む。一実施形態では、ＨＩＶタンパク質は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖおよびｖｐｕからなる群から選択される遺伝子によってコードされている。一実施形態では、ＨＩＶタンパク質はＨＩＶ  ｇａｇタンパク質である。一実施形態では、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、位置１６５、２７０、３２９、または３４８に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００１４】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、保存的または非保存的なアミノ酸変化を含む突然変異を有する。
【００１５】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方の突然変異を有する。一実施形態では、Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異は、Ｔ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異は、Ｐ→Ｔ突然変異またはＰ→Ｑ突然変異である。
【００１６】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、Ａ→Ｖ／Ｇ→ＬまたはＶ→Ｉの突然変異である、Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１のアミノ酸の突然変異を有する。
【００１７】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、それぞれＰ→Ｌ、Ｋ→Ｅ、またはＬ→Ｉである、Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸の突然変異を有する。
【００１８】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質をコードしている核酸分子をさらに含み、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸のうちの少なくとも１つに突然変異を有し、突然変異は、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→ＮまたはＴ→Ｋである。
【００１９】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶについて上述した突然変異は、ウイルスの遺伝子型および／または表現型の安定性の増加をもたらす。一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶについて上述した突然変異は、遺伝子改変ＶＳＶに感染した細胞からのウイルス産生の収量の増加をさらにもたらす。
【００２０】
一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に少なくとも２つの他の突然変異をさらに含む。一実施形態では、突然変異は、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群から選択され得る。
【００２１】
本発明の第２の態様は、ＶＳＶを、感受性のある哺乳動物細胞系中で、約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの範囲の低い感染多重度（ＭＯＩ）で少なくとも５〜１５継代連続して継代培養することを含み、ウイルスが、少なくとも１×１０６ＰＦＵ／ｍｌの力価および本明細書中に記載の突然変異のうちの少なくとも１つまたは複数を有することを含む、本明細書中に記載の遺伝子改変ＶＳＶを産生する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態では、上述の方法により、少なくとも１×１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価を有する、遺伝子改変および弱毒化したウイルスがもたらされる。
【００２３】
一実施形態では、上述の方法は、感受性のある細胞系、すなわち、本明細書中に記載の遺伝子改変ＶＳＶに感染させることができる任意の細胞系を利用する。たとえば、感受性のある細胞系には、それだけには限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞系、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、または２９３細胞系などのヒト胎児腎臓細胞系が含まれ得る。
【００２４】
一実施形態では、上述の方法により、約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの範囲の低ＭＯＩで約５〜１５回継代培養していないウイルス株で得られるものと比較して、５〜１００倍高いウイルスの収量がもたらされる。
【００２５】
一実施形態では、上述の方法により、ウイルスの遺伝子型および／または表現型の安定性の増加がもたらされる。
【００２６】
本発明の第３の態様は、上述の遺伝子改変ＶＳＶのいずれか１つまたは複数と薬学的に許容できる担体とを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２７】
一実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００２８】
本発明の第４の態様は、免疫学的に有効な量の、本明細書中に記載の遺伝子改変ＶＳＶのいずれか１つまたは複数を投与することを含む、哺乳動物を病原性微生物による感染に対して保護する方法を提供する。
【００２９】
本発明の第５の態様は、ウイルスを細胞培養物中での成長に適応させる方法であって、
ａ．細胞培養物を、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の低い感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスに感染させるステップと、
ｂ．ウイルスを含有する細胞培地を収集するステップと、
ｃ．細胞培地を清澄にするステップと、
ｄ．細胞培地を凍結するステップと、
ｅ．ステップａ）からｄ）を約５〜約１５回繰り返すステップと
を含み、ウイルスの産生／収量の５〜１００倍の増加ならびにウイルスの遺伝子型および表現型の安定性の増加をもたらす方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、本明細書中に記載の方法では、弱毒化したウイルスであるウイルスを利用する。一実施形態では、この方法は、ウイルス免疫原性組成物の大スケールの産生に適応している。一実施形態では、この方法は、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位の範囲の低い感染多重度で約５〜１５回継代培養していないウイルス株で得られるものと比較して、５〜１００倍高いウイルスの収量をもたらす。一実施形態では、上述の方法により、ウイルスの弱毒化に関連する任意の既存の突然変異の維持が可能となる。ウイルスの弱毒化に関連する既存の突然変異は、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群から選択され得る。一実施形態では、この方法により、ウイルスの弱毒化に関連する低い神経毒性プロフィールの維持が可能となる。一実施形態では、上述の方法で使用する弱毒化したウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の株である。一実施形態では、上述の方法では、以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、遺伝子改変ＶＳＶを利用する：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【００３１】
一実施形態では、本明細書中に記載の方法では、保存的または非保存的なアミノ酸変化を含む突然変異を有する水疱性口内炎ウイルスを利用する。一実施形態では、突然変異は、ＶＳＶ  Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方であり得る。一実施形態では、Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異は、Ｔ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異は、Ｐ→ＴまたはＰ→Ｑの突然変異である。
【００３２】
一実施形態では、突然変異は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１であってよく、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、Ａ→Ｖ／Ｇ→Ｌ、またはＶ→Ｉの突然変異であり得る。
【００３３】
一実施形態では、突然変異は、ＶＳＶ  Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０であり得る。
【００３４】
本発明の一実施形態では、本明細書中に記載の方法では、インディアナ血清型（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１２３８）、ニュージャージー血清型（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１２３９）、イスファハン（Ｉｓｈａｆａｎ）血清型（ＰＭＩＤ：１９２０９４）、チャンディプラ血清型（ＡＴＣＣ、ＶＲ−４７６）または他のベシクロウイルスから選択され得るＶＳＶの株を利用する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、本明細書中に記載の方法では、少なくとも１つの異種抗原をコードしている核酸を含有するＶＳＶの株を利用する。異種抗原は、ウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択される病原性微生物から得る。異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群から選択され得る。
【００３６】
一実施形態では、異種抗原はＨＩＶタンパク質を含む。一実施形態では、ＨＩＶタンパク質は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖおよびｖｐｕからなる群から選択される遺伝子によってコードされている。一実施形態では、ＨＩＶタンパク質はＨＩＶ  ｇａｇタンパク質である。一実施形態では、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、位置１６５、２７０、３２９または３４８に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００３７】
一実施形態では、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸の突然変異は、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→Ｎ、またはＴ→Ｋである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｗｔ  ＶＳＶおよびａｔｔｎ  ＶＳＶＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１（ＩＮおよびＮＪ血清型）のゲノム構成を示す模式図である。
【図２】ウイルスをＶｅｒｏ細胞中で連続継代培養するために使用した実験プロトコルの概要を示す図である。５継代ごとのウイルスを、示したアッセイによって分析した。
【図３】連続Ｖｅｒｏ細胞中での継代後にＩＮ血清型の弱毒化したＶＳＶ（ｒＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１）ウイルスで生じた適応的アミノ酸置換を示す図である。
【図４】連続Ｖｅｒｏ細胞中での継代後にＮＪ血清型の弱毒化したＶＳＶ（ｒＶＳＶｎｊＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１）ウイルスで生じた適応的アミノ酸置換を示す図である。
【図５】ＩＮ血清型の弱毒化したｒＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１ウイルスの成長動態に対する継代レベルの効果を示す図である。連続継代培養により、≧１０７ＰＦＵ／ｍｌの製造目標を超える、収量の顕著な増加がもたらされた。継代１５回目より後では、顕著な成長の変化がなかった。
【図６】ＮＪ血清型の弱毒化したｒＶＳＶｎｊＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１ウイルスの成長動態に対する継代レベルの効果を示す図である。
【図７】Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２、２０７−２９、２００８に記載のように、マウス頭蓋内（ＩＣ）ＬＤ５０動物モデルにおけるｒＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１継代培養ウイルスＰ０〜Ｐ２５の神経毒性（ＮＶ）試験の結果を示す図である。
【図８−１】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−２】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−３】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−４】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−５】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−６】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−７】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−８】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−９】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−１０】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−１１】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図８−１２】ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−１】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−２】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−３】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−４】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−５】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−６】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−７】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−８】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−９】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−１０】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−１１】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−１２】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図９−１３】ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す図である。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。
【図１０】低および高継代のウイルスを用いた、ＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のバイオリアクターの実行の成長動態を示す図である。
【図１１】低および高継代のウイルスを用いた、ＶＳＶｎｊＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のバイオリアクターの実行の成長動態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本方法および治療方法を記載する前に、方法および条件は変動し得るため、本発明は特定の方法および記載した実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみが目的であり、限定することを意図しないことを理解されたい。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形の言及が含まれる。したがって、たとえば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及には、１つまたは複数の、方法、および／または本明細書中に記載した種類のステップ、および／または本開示を読むことによって当業者に明らかとなるものなどが含まれる。
【００４１】
したがって、本出願中では、当分野の技術範囲内にある慣用の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術を用い得る。そのような技術は、文献中に十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００４２】
本明細書中に記載のものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての出版物は、その全体が参照により組み込まれている。
【００４３】
定義
本明細書中で使用する用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、利便性および完全性のため、特定の用語およびその意味を以下に記載する。
【００４４】
用語「約」とは、２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００４５】
用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポーとして、また、免疫応答を非特異的に増強させるリンパ系活性化剤として役割を果たすことができる（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ページ３８４）。状況次第では、アジュバントの非存在下における、抗原を単独で用いた一次アレルギー誘発は、十分な液性または細胞性免疫応答の誘発に失敗する場合がある。それだけには限定されないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（たとえば米国特許第５，７２３，１２７号を参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（ならびにその突然変異体）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（たとえば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子αおよびβを含めた、いくつかのサイトカインまたはリンホカインが、免疫変調活性を有しており、したがってアジュバントとして有用であることが示されている。本明細書中に記載の免疫原性組成物と共にして有用なさらに他のアジュバントには、それだけには限定されないがＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含めたケモカイン、接着分子、たとえばセレクチン、たとえば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチン、ムチン様分子、たとえば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリンファミリーのメンバー、たとえば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、たとえば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、たとえば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２ならびにＬＦＡ−３、共刺激分子、たとえば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を含めた成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含めた受容体分子、カスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。
【００４６】
免疫応答を増強させるために使用する適切なアジュバントには、それだけには限定されないが、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）がさらに含まれる。また、Ｃｏｒｉｘａ（モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、合成脂質Ａ類似体またはアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体も、アジュバントとしての使用に適している。そのようなＡＧＰの１つは、５２９としても知られる（以前はＲＣ５２９として知られていた）、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは、水性形態として（ＡＦ）または安定な乳濁液として（ＳＥ）配合する。
【００４７】
さらに他のアジュバントには、ムラミルペプチド、たとえば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、水中油乳濁液、たとえば、ＭＦ５９（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１４８３７号）（５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５を含有する（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを任意選択で含有する）モデル１１０Ｙ微小流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州Ｎｅｗｔｏｎ）などの微小流動化装置を用いてサブミクロンの粒子を形成）、ならびにＳＡＦ（１０％のスクワレン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、サブミクロンの乳濁液に微小流動化するか、もしくは渦攪拌してより大きな粒子径乳濁液を作製）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリ乳酸／グリコシド、プルロニックポリオール、死滅させたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サポニン、たとえば、米国特許第５，０５７，５４０号に記載のＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）、米国特許第５，２５４，３３９号に記載のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリアＰａｒｋｖｉｌｌｅ）、および免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、合成ポリヌクレオチド、たとえばＣｐＧ  モチーフを含有するオリゴヌクレオチド（たとえば米国特許第６，２０７，６４６号）、欧州特許第１，２９６，７１３号および第１，３２６，６３４号に記載のＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ、オーストリアＶｉｅｎｎａ）、百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（たとえば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／１８４３４号、ＷＯ０２／０９８３６８号およびＷＯ０２／０９８３６９号）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（たとえば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１３３０２号およびＷＯ９２／１９２６５号を参照）が含まれる。
【００４８】
用語「抗原」とは、動物において抗体の産生もしくはＴ細胞応答、または両方を刺激することができる化合物、組成物、または免疫原性物質をいい、動物に注射するまたは吸収される組成物が含まれる。免疫応答は、全分子に対して、または分子の一部分（たとえば、エピトープもしくはハプテン）に対して生じさせ得る。この用語は、個々の巨大分子または抗原性巨大分子の同種もしくは異種の集団をいうために使用し得る。抗原は、特異的な液性および／または細胞性免疫の産物と反応する。用語「抗原」には、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、核酸、オリゴ糖、多糖類、有機または無機の化合物または組成物などを含めた部分が、広く包含される。用語「抗原」には、すべての関連する抗原性エピトープが含まれる。所定の抗原のエピトープは、当分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａを参照されたい。たとえば、直鎖状エピトープは、たとえば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体担体上で同時に合成し、ペプチドが支持体に付着しているままでペプチドを抗体と反応させることによって、決定し得る。そのような技術は当分野で知られており、たとえば、すべてその全体で本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第４，７０８，８７１号、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８〜４００２、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、たとえば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸の空間的な立体構造を決定することによって容易に同定される。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照されたい。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持している限りは、天然の配列への、欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であり得る）が含まれるタンパク質をいうためにも使用することができる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発、もしくは特定の合成手順、もしくは遺伝子操作手法などによる意図的なものであってよく、または、抗原を産生する宿主の突然変異などによる偶発的なものであってもよい。さらに、抗原は、任意のウイルス、細菌、寄生生物、原虫、または真菌に由来するまたはそれから得ることもでき、全生物でもあり得る。同様に、核酸免疫化用途などにおける、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義内に含まれる。合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、隣接するエピトープ、および他の組換えまたは合成によって誘導した抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２７７７〜２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ��．、１５７：３２４２〜３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２〜４０８、Ｇａｒｄｎｅｒら、（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、スイスＧｅｎｅｖａ、１９９８年６月２８日〜７月３日）。
【００４９】
用語「弱毒化した」とは、特定の疾患を生じさせずに免疫応答が開始されるように、病原性が減少されている病原体の株をいう。ウイルスの弱毒化した株は、それが由来する親株よりも病原性が低い。化学突然変異原を加えた細胞培養物中でのウイルスの成長中の化学突然変異誘発などの慣用の手段を用いて、弱毒化突然変異を導入して改変したウイルスを作製する。弱毒化突然変異を導入する代替手段は、部位特異的突然変異誘発を用いて事前に決定された突然変異を作製することを含む。１つまたは複数の突然変異を導入し得る。その後、これらのウイルスを、細胞培養物中および／または動物モデル中において、その生物活性の弱毒化についてスクリーニングする。救済したウイルスの弱毒化された表現型が存在する場合は、アレルギー誘発実験を適切な動物モデルで実施することができる。非ヒト霊長類が、ヒト疾患の病因の適切な動物モデルとして役割を果たすことができる。これらの霊長類は、最初に、弱毒化した、組換えによって産生したウイルスを用いて免疫化し、その後、ウイルスの野生型でアレルギー誘発する。
【００５０】
本明細書中で使用する用語「細胞」、「宿主細胞」、「細胞培養物」などには、ウイルス、ベクターまたは外因性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質の取り込みのレシピエントとなり得る、またはそうであった、任意の個々の細胞または細胞培養物が含まれることを意図する。また、単一の細胞の子孫も含まれることを意図する。しかし、子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異が原因で、元の親細胞と必ずしも完全に同一でなくてもよい（形態学またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において）。細胞は、好ましくは真核であるが、原核であってもよく、それだけには限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（たとえば、ネズミ、ラット、サルまたはヒト）が含まれる。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「清澄にすること」とは、細胞または細胞培養物を本発明のウイルスに感染させた後に細胞および細胞細片を除去する、ウイルス精製の初期ステップをいう。たとえば、ウイルス精製の初期ステップは、細胞培地を「清澄」して、低速遠心分離（≦１０，０００ＲＰＭ）または濾過などの方法を用いて細胞細片を除去することを含む。その後、米国特許公開第２００７０２４９０１９号に記載されているものなどの、スクロースクッションを通した高速遠心分離（たとえば１００，０００×ｇ）またはイオン交換カラムを通した単離などの当業者に知られている方法を用いて、上清中に存在するウイルスを単離および精製する。
【００５２】
本開示中、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有することができ、たとえば、これらは、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含めた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含めること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができることに注記されたい。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属させられる意味を有し、たとえば、これらは、本発明の新規または基本的な特徴を損ねない追加の成分またはステップの包含を許容する、すなわち、これらは、本発明の新規または基本的な特徴を損ねる追加の列挙していない成分またはステップを排除し、本明細書中で引用するまたは本明細書中に参照により再組み込みされている当分野の文書などの、従来技術の成分またはステップを排除する。これは、特に、本文書の目的が、従来技術を超えて、たとえば、本明細書中で引用するまたは本明細書中に参照により組み込まれている文書を超えて、特許性のある、たとえば、新規であり、非自明であり、発明性のある、実施形態を定義することであるためである。また、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有する、すなわち、これらの用語はクローズドエンドである。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を、同様の物理的および／または化学的な特性を有する他のアミノ酸残基で置換することをいう。配列内のアミノ酸の置換体は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。たとえば、無極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または等電点によって決定する見かけの分子量には影響を与えないと予測される。特に好ましい置換は、正電荷が維持され得るようにＬｙｓでＡｒｇを、その逆、負電荷が維持され得るようにＧｌｕでＡｓｐを、その逆、遊離−ＯＨを維持できるようにＳｅｒでＴｈｒを、ならびに遊離ＮＨ２が維持できるようにＧｌｎでＡｓｎを置換することである。
【００５４】
用語「培養液」、「細胞培養液」、「細胞培養培地」、「培地」および／または「バイオリアクター液」とは、互換性があるように使用され、細胞培養物を成長させる培地または溶液をいう。
【００５５】
「によってコードされている」または「コードしている」とは、ポリペプチド配列をコードしている核酸配列をいい、ポリペプチド配列は、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含有し、ポリペプチドは核酸配列によってコードされている。また、配列によってコードされているポリペプチドを用いて免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も包含される。したがって、抗原の「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「アミノ酸」の配列は、抗原のポリペプチドまたはアミノ酸配列と少なくとも７０％の類似度、好ましくは少なくとも約８０％の類似度、より好ましくは約９０〜９５％の類似度、最も好ましくは約９９％の類似度を有し得る。
【００５６】
「断片」とは、親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０個のアミノ酸残基）のアミノ酸配列、または、親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０塩基対（好ましくは少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対）のヌクレオチド配列を含む核酸を含む、タンパク質またはポリペプチドのどちらかをいう。任意の所定の断片は、親の核酸またはタンパク質もしくはポリペプチドの機能的活性を保有していても保有していなくてもよい。
【００５７】
本発明の場面で使用する「遺伝子」とは、遺伝機能が関連している、核酸分子（染色体、プラスミドなど）中のヌクレオチドの配列である。遺伝子とは、たとえば生物の遺伝単位であり、生物のゲノム内の特定の物理的位置（「遺伝子座（ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ）」または「遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ）」）を占有するポリヌクレオチド配列（たとえば哺乳動物のＤＮＡ配列）を含む。遺伝子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（たとえばｔＲＮＡ）などの発現産物をコードしていることができる。あるいは、遺伝子は、タンパク質および／または核酸の結合などの、特定の事象／機能のゲノムの位置（たとえばファージ付着部位）を定義していてもよく、遺伝子が発現産物をコードしていない。典型的には、遺伝子には、ポリペプチドコード配列などのコード配列、およびプロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写調節配列（たとえばエンハンサー配列）などの非コード配列が含まれる。多くの真核遺伝子は、「イントロン」（非コード配列）によって中断された「エクソン」（コード配列）を有する。特定の事例では、１つの遺伝子が別の遺伝子（複数可）と配列を共有し得る（たとえば重複遺伝子）。用語「遺伝子」には、たとえば遺伝子が発現される条件下を決定する、プロモーター配列などの調節性ＤＮＡ配列が含まれていても含まれていなくてもよい。構造遺伝子でない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写されるが、アミノ酸配列へと翻訳されない場合がある。他の遺伝子が構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。
【００５８】
本明細書中で定義する用語「遺伝子シャフリング」、「シャフリングした遺伝子」、「シャフリングした」、「シャフリング」、「遺伝子再配置」および「遺伝子転座」とは、互換性があるように使用され、野生型ＶＳＶゲノムの順序の変化（突然変異）をいう。本明細書中で定義する野生型ＶＳＶゲノムは、３’−ＮＰＭＧＬ−５’の遺伝子配列順を有する。
【００５９】
用語「遺伝子改変した」とは、一般に、当業者に知られている任意の手段によって、１つまたは複数の突然変異をウイルスゲノム内に導入することをいう。しかし、特定の「遺伝子改変」は、特定の欠失、挿入、もしくは置換によって、または標準の遺伝子操作技術を用いて遺伝物質をウイルスゲノム内に移すことによって行い得る一方で、本発明におけるＶＳＶゲノムの特定の遺伝子改変は、弱毒化したＶＳＶを低い感染多重度で連続継代培養することによって生じた。この低ＭＯＩでの連続継代培養は、ウイルスゲノム全体にわたるいくつかのヌクレオチド置換の進行性の自然増加をもたらし、また、ＶＳＶタンパク質中のアミノ酸置換ももたらした。これらの「遺伝子改変した」ＶＳＶ粒子は、細胞中での増加した成長に適応していることが示されたが、神経毒性の小動物モデルにおいて神経病理の増加はなかった。本発明では、「低継代ウイルス」、「継代０回目」または「Ｐ０」、および「元のウイルス」とは、互換性があるように使用され、本発明の遺伝子改変したウイルスの出発物質として役割を果たしたｒＶＳＶＮ４ＣＴ１ｇａｇ１ウイルスを表す。一部の事例、特にバイオリアクターの実行では、低継代ウイルスを示すために１〜３回継代培養したウイルスも含まれる。「高継代ウイルス」、「継代培養したウイルス」、「遺伝子改変したウイルス」、「組織培養に適応させた」または「細胞に適応させたウイルス」とは、互換性があるように使用され、５回より多く、一般に５〜２５回、好ましくは１５回継代培養したウイルスを表す。
【００６０】
本明細書中で使用する用語「成長させる」または「成長」とは、様々な種類の細胞中でのウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖をいう。実験室において細胞中でウイルスを成長させること／その成長は、細胞にウイルスを接種することと、続いてインキュベーションしてウイルス産生を可能にすることと、その後、ウイルスを含有する細胞培地を収集することとを含む。ウイルスに感染した細胞は、通常、培養容器（接着細胞にはフラスコもしくは皿または懸濁液中の細胞には常に動かすボトルもしくはフラスコなど）内の成長培地で成長させ、培養物は、一定の温度、湿度および気体組成を有する細胞インキュベーター内で維持した。しかし、培養条件は細胞種に応じて変動することができ、細胞の変化を誘導するため、または細胞によるウイルス産生を支援もしくは増強するために変更することができる。
【００６１】
本明細書中で使用する用語「収集すること」とは、本明細書中に記載のウイルス株または血清型のいずれかで細胞または細胞系を感染させた後にウイルスの単離および精製に備えて、細胞または細胞培地を回収することをいう。
【００６２】
用語「異種」とは、ウイルスまたは細胞中に天然で存在しないエレメントの組合せをいう。たとえば、異種ＤＮＡとは、天然で細胞内、または細胞の染色体部位内に位置しないＤＮＡをいう。異種ＤＮＡには、細胞に外来の遺伝子が含まれ得る。本明細書中で使用する用語「異種抗原」とは、抗原がその生物に由来しないか、またはその正常な位置もしくはその天然の形態でコードされていない、核酸配列にコードされている抗原である。異種発現調節エレメントとは、それが天然で作動可能に会合しているものとは異なる遺伝子と作動可能に会合したエレメントである。
【００６３】
用語「免疫原性組成物」とは、抗原、たとえば微生物を含有する任意の医薬組成物に関し、組成物は、哺乳動物において免疫応答を誘発するために使用することができる。免疫応答には、Ｔ細胞応答、Ｂ細胞応答、またはＴ細胞およびＢ細胞の応答両方が含まれ得る。組成物は、細胞表面でＭＨＣ分子と会合した抗原を提示することによって、哺乳動物を感作させるために役割を果たし得る。さらに、免疫化した宿主の将来の保護を可能にするために、抗原に特異的なＴリンパ球または抗体を作製することができる。「免疫原性組成物」は、全微生物あるいは細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫応答もしくは抗体媒介性（Ｂ細胞）免疫応答、または両方を誘導する、それに由来する免疫原性部分を含む、生きた、弱毒化した、または死滅／失活させた配合物を含有していてもよく、また、動物を微生物による感染に関連する１つもしくは複数の症状から保護するか、または動物を微生物による感染が原因の死から保護し得る。
【００６４】
本明細書中で使用する「免疫学的に有効な量」または「免疫原性的に有効な量」とは、当業者に知られている標準のアッセイによって測定した、細胞性（Ｔ細胞）または液性（Ｂ細胞もしくは抗体）の応答のどちらかの免疫応答を誘発するために十分な、抗原または配合物の量をいう。たとえば、本発明に関して、「免疫学的に有効な量」とは、≧５．０〜７．０Ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍＬの最小の保護用量（力価）である。免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイによって、その特異的な標的細胞を溶解するＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイなどの細胞溶解アッセイによって、または、抗原に特異的な循環抗体の血清中のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレベルを測定することによって、測定することができる。さらに、免疫応答の保護のレベルは、免疫化した宿主を、注射した抗原でアレルギー誘発することによって測定し得る。たとえば、免疫応答が所望される抗原がウイルスまたは腫瘍細胞である場合、「免疫学的に有効な量」の抗原によって誘導される保護のレベルは、動物のウイルス、細菌、原虫、または真菌のアレルギー誘発後の％生存または％死亡率を検出することによって測定する。
【００６５】
用語「単離した」または「精製した」とは、物質が、その元の環境（たとえば、それが天然に存在するものである場合は天然の環境）から取り除かれていることを意味する。たとえば、「単離した」または「精製した」ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または、化学合成の場合は化合物前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない。本発明では、免疫原性組成物の製造に有用な形態で提供されるように、ウイルスを感染した細胞または細胞細片から単離または精製する。言葉「細胞物質を実質的に含まない」には、ウイルスまたはポリペプチド／タンパク質が、それが単離されたまたは組換えによって産生された細胞の細胞成分から分離された、ウイルスまたはポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まないウイルスまたはポリペプチド／タンパク質には、約３０％未満、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％（乾重量）の汚染タンパク質を有する、ウイルスまたはポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。ウイルスまたはポリペプチド／タンパク質を組換えによって産生する場合は、培地を実質的に含まないことも好ましい、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％、５％、１％、０．５％、または０．２％を表す。ポリペプチド／タンパク質を化学合成によって生成する場合は、化合物前駆体または他の化合物を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、これは、タンパク質の合成に関与している化合物前駆体または他の化合物から分離されている。したがって、そのようなポリペプチド／タンパク質の調製物は、約３０％未満、２０％、１０％、５％（乾重量）の、化合物前駆体または目的のポリペプチド／タンパク質断片以外の化合物を有する。「単離した」または「精製した」核酸分子とは、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、ｃＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などの「単離した」核酸分子は、他の細胞物質を実質的に含まないことができ、あるいは、組換え技術によって産生する場合は培地、または化学合成する場合は化合物前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない。
【００６６】
用語「感染多重度」または「ＭＯＩ」とは、単一の細胞に感染するウイルス粒子の平均数をいう。「ＭＯＩ」は、ウイルスのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の合計数を、感染させる細胞の合計数で除算することによって計算する。
【００６７】
本明細書中で以下に定義する用語「突然変異クラス」、「複数の突然変異クラス」または「突然変異のクラス」とは、互換性があるように使用され、当分野において、単独で使用した場合にＶＳＶを弱毒化することで知られている突然変異をいう。たとえば、本発明の「突然変異クラス」には、それだけには限定されないが、ＶＳＶ温度感受性Ｎ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｎ（ｔｓ）」）、温度感受性Ｌ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｌ（ｔｓ）」）、点突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異（本明細書中で以降「Ｇ（ｓｔｅｍ）」）、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｍ（ｎｃｐ）」）、遺伝子シャフリングまたは再配置突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異（本明細書中で以降「Ｇ（ｃｔ）」）、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異などが含まれる。本明細書中で以下に定義する「突然変異」には、当分野において挿入、欠失、置換、遺伝子再配置またはシャフリングの修飾として知られている突然変異が含まれる。
【００６８】
「非保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を、上記定義した特徴を用いて、異なる物理的および／または化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置換することをいう。
【００６９】
本明細書中で使用する語句「核酸」または「核酸分子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体またはそれから形成されたキメラのいずれかをいう。したがって、「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン、「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合体をいう。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのヘリックスが可能である。用語、核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、任意の特定の三次形態には限定されない。したがって、この用語には、とりわけ、直鎖または環状のＤＮＡ分子（たとえば制限断片）、プラスミド、および染色体中に見つかる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにあたって、配列は、配列を、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５Ｎから３Ｎの方向でのみ示す、通常の習慣に従って記載し得る。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子をいう。
【００７０】
用語「病原性」とは、細菌またはウイルスなどの任意の感染因子の、疾患を引き起こす能力をいう。「非病原性」微生物とは、微生物の「病原性」株の、疾患を引き起こす特徴を欠く微生物をいう。
【００７１】
用語「薬学的に許容できる担体」とは、連邦政府の規制機関、州政府、もしくは他の規制機関によって認可された担体、またはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた動物での使用において、米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に記載されている担体を意味する。用語「担体」とは、医薬組成物と共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような薬学担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、野菜または合成起源のものを含めた、水および油などの無菌的な液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射用液剤のために、液体担体として用いることができる。適切な薬学賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望する場合は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、持続放出配合物などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と共に、坐薬として配合することができる。経口製剤には、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体が含まれ得る。適切な薬学担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。配合物は投与様式に適しているべきである。
【００７２】
用語「プラーク」または「ウイルスプラーク」とは、それ以外は不透明な細胞培養物の層中の、溶解細胞の、透明な、しばしば円形のパッチをいう。「プラーク形成単位」または「ＰＦＵ」とは、単位体積あたりの感染性ウイルス粒子の平均数をいう。たとえば、ウイルス溶液が１００ＰＦＵ／ｍｌを有する場合、これは、１ミリリットルのこのウイルス溶液が、それぞれプラークを形成することができる１００個のウイルス粒子を有することを意味する。ＰＦＵ／ｍｌは、プラークを形成するウイルス調製物の濃度に言及するための慣用の手段である。しかし、ＰＦＵは、一般に、「感染単位」または「ＩＵ」と互換性があるように使用され、ウイルス調製物中の感染性ウイルスの単位を表す。
【００７３】
用語「保護する」とは、特定の病原体に対する免疫応答を誘導することによって、たとえば哺乳動物を、感染症または疾患から遮蔽することをいう。そのような保護は、一般に、哺乳動物を免疫原性組成物で治療した後に達成される。もたらされる保護は絶対的である必要はない、すなわち、哺乳動物の対照集団、たとえば、免疫原性組成物を投与しない感染動物と比較して統計的に有意な向上が存在する場合は、感染症は完全に予防または根絶される必要はない。保護は、感染症の症状の重篤度または発症の速度を和らげることによって達成し得る。
【００７４】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、生成物の最小の長さに制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。完全長のタンパク質およびその断片の両方が、この定義によって包含される。また、この用語には、好ましくは、タンパク質が、タンパク質を投与する動物内において免疫学的応答を誘発する能力を維持するような、天然の配列への欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であってもよい）も含まれる。また、発現後の修飾、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。用語「アミノ酸」とは、ＤまたはＬ光学異性体、およびアミノ酸類似体をどちらも含めた、天然および／または非天然の合成アミノ酸をいう。天然のアミノ酸のそれぞれの１文字および３文字のコードは、当業者に知られている。
【００７５】
組換えＲＮＡウイルスを産生する方法は、当分野において「救済」または「逆遺伝学」方法と呼ばれる。ＶＳＶの例示的な救済方法は、それぞれ本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，０３３，８８６号、米国特許第６，５９６，５２９号およびＷＯ２００４／１１３５１７号に記載されている。マイナスセンスの一本鎖かつ非分割型のＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク質核（ヌクレオカプシド）に作用する多量体タンパク質複合体の酵素活性によって達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型として役割を果たすことができない。その代わり、これらのゲノム配列は、Ｎタンパク質によってヌクレオカプシド構造へと完全にカプシド形成された際にのみ、認識される。この場面においてのみ、ゲノムおよびアンチゲノムの末端プロモーター配列が認識されて転写または複製経路が開始される。
【００７６】
本明細書中で以下に定義する用語「相乗的な」弱毒化とは、相加的なものよりも大きい、ＶＳＶの弱毒化のレベルをいう。たとえば、本発明によるＶＳＶの相乗的な弱毒化は、同じＶＳＶゲノム中の少なくとも２つの突然変異のクラスを組み合わせ、それにより、それぞれのＶＳＶ突然変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベルよりもはるかに大きな、ＶＳＶの病原性の減少をもたらすことを含む。したがって、特定の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、それぞれの突然変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベル（すなわち、２つの突然変異クラスの合計）よりも少なくとも高いＬＤ５０として定義され、弱毒化レベル（すなわちＬＤ５０）は、小動物神経毒性モデルにおいて決定する。ＶＳＶの相乗的な弱毒化の例は、本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ２００５／０９８００９号に記載されている。
【００７７】
本明細書中で以下に定義するＶＳＶ「温度感受性」（「ｔｓ」）突然変異とは、非許容的な温度でのＶＳＶの成長を制限する、ＶＳＶゲノム中の突然変異である。たとえば、本発明のＶＳＶ  ｔｓ突然変異体は、許容的な温度（たとえば３１℃）で正常かつ高い力価まで成長するが、その成長または繁殖は、非許容的な温度（たとえば、３７℃または３９℃）で制限される。
【００７８】
用語「免疫原性組成物」とは、動物において免疫応答を誘導する医薬組成物をいう。免疫原性組成物は、動物を感染症が原因の疾患または場合によっては死から保護する場合があり、活性構成要素の免疫学的活性を増強させる１つまたは複数の追加の構成要素が含まれていても含まれていなくてもよい。免疫原性組成物は、たとえば、アジュバントまたは免疫調節物質を含めた、免疫原性組成物に典型的なさらなる構成要素をさらに含み得る。免疫原性組成物の免疫原性的に活性のある構成要素は、その元の形態もしくは弱毒化した生物としての完全な生きた生物、または死滅もしくは失活させた免疫原性組成物中の適切な方法によって失活させた生物、またはウイルスの１つもしくは複数の免疫原性構成要素を含むサブユニット免疫原性組成物、または当業者に知られている方法によって調製した遺伝子操作、突然変異もしくはクローニングした免疫原性組成物を含み得る。免疫原性組成物は、上述のエレメントのうちの１つまたは複数を同時に含み得る。
【００７９】
一般的な説明
本発明によれば、Ｖｅｒｏ細胞または任意の感受性のある細胞基質中における低い感染多重度（ＭＯＩ）での連続継代培養による、高度に弱毒化した組換えＶＳＶを組織培養条件に適応させるプロセスまたは方法を提供する。複数の連続継代培養のプロセスは、ウイルスゲノム全体にわたるいくつかのヌクレオチド置換の進行性の自然増加によって特徴づけられている遺伝型の変化をもたらす。これらのヌクレオチド置換のほとんどは、ＶＳＶタンパク質中のアミノ酸（ＡＡ）置換をもたらす。このプロセスは、ウイルス収量の実質的な向上を伴った、ウイルスの表現型の適応をもたらした。Ｖｅｒｏ細胞中での継代は、遺伝型および表現型の安定性が達成されるまで、通常は１０〜１５回の連続継代（Ｐ１０〜Ｐ１５）続ける。Ｐ１５を越えるウイルスのさらなる継代培養では、追加の置換がわずかしかまたはまったく示されず、ウイルス収量のさらなる増強はもたらされなかった。このプロセスは、製造収量の実質的な向上および製造の一貫性の増強をもたらす。適応的突然変異は、高感度マウス頭蓋内ＮＶ動物モデルにおいて試験した場合に、継代培養したウイルスの神経毒性（ＮＶ）に実質的に影響を与えなかった。
【００８０】
米国特許公開第２００７／０２１８０７８Ａ１号によれば、ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子を発現する高度に弱毒化したＶＳＶベクター、ｒＶＳＶＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１を作製し、これは、３つのウイルス弱毒化手法を組み合わせることによって作製した：ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子をゲノムの最初の位置（ｇａｇ１）中に挿入し、それにより、すべてのＶＳＶ遺伝子を３’−プロモーターから１つの位置シフトすること、ＶＳＶ  Ｎ遺伝子を第４位置（Ｎ４）に転座すること、およびその細胞質側末端が１つのアミノ酸にまで切断された（ＣＴ１）ＶＳＶ  Ｇを使用すること（Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７：１２８９〜１２９６、１９９８）。プロトタイプｒＶＳＶと比較して、このベクターは、より小さなプラークの表現型、遅延された成長動態および細胞培養物中の大きく減少したピーク力価によって特徴づけられるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで弱毒化の顕著な増加を示した。高感度ネズミ頭蓋内（ＩＣ）動物モデルで試験した場合に同様の弱毒化パターンが示され、プロトタイプと弱毒化したＶＳＶとの間で何桁ものＬＤ５０の差が示された（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２：２０７〜２２９、２００８）。さらに、プロトタイプＶＳＶと比較して、弱毒化したウイルスは、非ヒト霊長類において最小限から検出不可能な神経病理を示した。このベクターはマウスおよびマカクにおいて、プロトタイプベクターで得られたものに匹敵する強力な免疫応答を誘導するが、細胞培養物中での複製が乏しく、スケールアップおよび製造には最適以下となる。
【００８１】
奨励する前臨床の安全性および免疫原性プロフィールに基づくと、このベクターは、ヒトにおける試験の有望なベクター候補となる。ヒトにおけるこのベクターの試験に重要な２つの要素は、上述の３つの弱毒化突然変異の安定性および製造収量の増加である。本研究では、Ｖｅｒｏ細胞中のｒＶＳＶベクターの連続継代からなる、遺伝的安定性研究を実施した。ウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞中、低い感染多重度（ＭＯＩ、０．０１）で継代培養した。２５回継代培養したウイルスから得られたデータにより、ベクターを弱毒化する３つすべての突然変異が保持された一方で、追加のアミノ酸（ＡＡ）置換が早くも継代５回目（Ｐ５）で現れたことが明らかとなった。ウイルスをさらに継代培養するにつれて、突然変異は継代１５回目（Ｐ１５）までに固定された。さらに、Ｖｅｒｏ細胞中で継代培養したウイルスの成長動態は、Ｐ１５までウイルス収量の進行性の向上を示し、これは、ＡＡ置換の自然増加が、ウイルスのＶｅｒｏ細胞への継続適応を表していることを示唆している。ウイルス収量のさらなる増強は、Ｐ１５以降は見られなかった。継代培養したウイルスを用いた成長動態の結果により、Ｐ１５ウイルスを用いたウイルス収量がＰ０で得られたものよりも５〜１００倍高かったことが示された（図３〜６を参照）。
【００８２】
したがって、本発明により、Ｐ１５ウイルスが遺伝型および表現型の安定性を示し、毒性および臨床評価に適切な臨床治験材料の大スケールの製造に適したレベルまで成長することが実証される。
【００８３】
ＶＳＶの成長／増殖に適切な細胞
本発明内で使用するための適切な宿主細胞は、遺伝子改変した弱毒化ＶＳＶの生産的な感染を支援することができ、ウイルスの産生を支援するために必要な、必須のベクターおよびそのコードされている産物の発現を可能にする。本発明の方法で使用するための宿主細胞の例には、それだけには限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、および２９３細胞などのヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞が含まれる。本明細書中に記載の遺伝子改変した弱毒化ＶＳＶ株または血清型による感染に感受性のある任意の他の細胞を、本発明の方法で使用し得る。
【００８４】
哺乳動物細胞培養物中でのＶＳＶの産生
哺乳動物細胞培養物中でのＶＳＶの産生は当業者に周知であり、一般に、細胞培養物（宿主細胞）をＶＳＶに感染させること、ＶＳＶを細胞培養物中で成長させること、および適切な時に細胞培養物を収集することが含まれる。ＶＳＶは、宿主細胞から培地中へと分泌されるため、ＶＳＶ産物は細胞培養液から回収される。
【００８５】
哺乳動物細胞培養物からのＶＳＶの産生では、当分野で知られている、ＶＳＶを増殖（または成長）させるために使用する適切な哺乳動物細胞培養物を用いる。そのような細胞培養物には、それだけには限定されないが、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、Ｖｅｒｏ細胞などのアフリカミドリザル腎臓（ＡＧＭＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が含まれる。
【００８６】
さらに、細胞培養の材料、方法および技術は、当業者に周知である。たとえば、組換えＶＳＶの種ストックを用いて、コンフルエントな宿主細胞集団または特定の密度の宿主細胞集団（たとえばＶｅｒｏ細胞培養物）を、バイオリアクター中、所定の感染多重度で感染させ、ＶＳＶを所定の時間および温度において細胞培養物中で成長させ、新生のＶＳＶ子孫を細胞培養物液中で収集する。本明細書中で以下に定義する用語「培養液」、「細胞培養液」、「細胞培養培地」、「培地」および／または「バイオリアクター液」とは、互換性があるように使用され、細胞培養物を成長させる培地または溶液をいう。
【００８７】
哺乳動物細胞培養物からのＶＳＶの精製
ＶＳＶに感染した哺乳動物細胞培養物の細胞培養液からＶＳＶを精製するプロセスは、一般に当業者に知られている。たとえば、Ｍｉｌｌｅｒら、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第３３巻、第１号、２００４年１月、ページ９２〜１０３）に記載されているように、ウイルスを含有する培養上清を回収し、低速遠心分離（たとえば１０００×ｇ）に供して細胞および細片を除去し、続いて２０％のスクロースクッション上の高速遠心分離（たとえば１００，０００×ｇ）に供してウイルスを除去し得る。
【００８８】
細胞培養物からＶＳＶを精製する別の方法は、米国特許公開第２００７／０２４９０１９号に記載されている。手短に述べると、この手順には、（ａ）一次清澄、（ｂ）二次清澄、（ｃ）陰イオン交換膜吸着、（ｄ）接線流濾過および（ｅ）濾過のステップが含まれる。より詳細には、そのようなステップは、（ａ）細胞培養液を低速遠心分離によって清澄にすること、（ｂ）０．２〜０．４５ミクロンのフィルターを通した濾過によって上清をさらに清澄にすること、（ｃ）ＶＳＶの濾過した溶液を陰イオン交換膜吸着剤上で精製すること、（ｄ）緩衝液を交換し、ＶＳＶを接線流濾過（ＴＦＦ）によって濃縮すること、および（ｅ）０．２〜０．２２ミクロンのフィルターを通してＶＳＶ濃縮水の最終濾過を行うことを含む。上記の精製プロセスのステップ（ａ）〜（ｅ）は室温で行う。
【００８９】
清澄手順
一次清澄
また、米国特許公開第２００７／０２４９０１９号には、ウイルスを単離および精製するための、細胞培養液の一次清澄の方法も記載されている。たとえば、ＶＳＶに感染した哺乳動物細胞培養物の細胞培養液を低速遠心分離によって（またはデプスフィルターによって）清澄にし、ＶＳＶを上清中で回収してもよく、これは本明細書中で細胞培養物液の「一次清澄」とも呼ばれる。特定の実施形態では、細胞培養液の一次清澄は室温で実施する。
【００９０】
遠心分離方法および細胞培養液の一次清澄で使用する装置は当業者で周知である。本明細書中で以下に定義する「低速」遠心分離とは、１０，０００ｒｐｍ以下の遠心分離速度である。
【００９１】
上述のように、ＶＳＶに感染した哺乳動物細胞培養物の細胞培養液は、代わりに、デプスフィルターによって（すなわち、低速遠心分離の代わりに）清澄にし得る。デプスフィルターは、ステップ（ａ）の一次清澄から低速遠心分離を省略する場合に使用することができる。デプスフィルター（表面濾過とは対照的）とは、一般に、その構造内に汚染物質を捕捉する「厚い」フィルターをいう。デプスフィルター材料および方法は当業者に周知である。たとえば、フィルター材料は、典型的には、珪藻土粒子などの無機濾過助剤が繊維の開口部に包埋されている、厚く繊維状のセルロース構造からなる。このフィルター材料は大きな内部表面積を有し、これが粒子の捕捉およびフィルターの能力のキーである。そのようなデプスフィルターのモジュールは、１．０ミクロン〜４．５ミクロンの孔を含有する。例示的なデプスフィルターのモジュールには、それだけには限定されないが、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｐｏｌｙｃａｐ（商標）．ＨＤモジュール（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ（商標）Ｐモジュール（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州Ｅｄｇｅｗｏｏｄ）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）が含まれる。細胞培養液をデプスフィルター（室温で行う）によって清澄にしてよく、ＶＳＶが濾液中に回収される。
【００９２】
二次清澄
また、米国特許公開第２００７／０２４９０１９号には、ウイルスを単離および精製するための、細胞培養液の二次清澄の方法も記載されている。遠心分離（またはデプスフィルター）による一次清澄の後、ＶＳＶの上清（または濾液）を、濾過または０．２〜０．２５ミクロンのフィルターを通した微量濾過、および濾過した溶液中のＶＳＶの回収によってさらに清澄にする。微量濾過は、上記定義したように室温で行い得る。濾過／微量濾過の媒体は、様々な材料および製造方法が利用可能であり、当業者に知られている。例示的な微量濾過フィルター単位には、それだけには限定されないが、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ．（登録商標）．−ＧＶフィルター単位（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ．（登録商標）−ＧＰフィルター単位、Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）フィルター単位（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルター単位（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州Ｅｄｇｅｗｏｏｄ）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２フィルター単位が含まれる。特定の実施形態では、これらのフィルター単位は、０．２〜０．４５ミクロンの大きさのフィルターを保有する。濾過したＶＳＶは、濾過した溶液中で回収される。
【００９３】
陰イオン交換膜吸着
清澄後にＶＳＶを回収した後、ＶＳＶを陰イオン交換膜吸着剤上でさらに精製し得る。膜吸着剤の材料は当業者に周知であり、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐ．（ニューヨーク州Ｅｄｇｅｗｏｏｄ）、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．（ニューヨーク州Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）などの販売業者から入手可能である。例示的な陰イオン交換膜吸着剤には、それだけには限定されないが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐ．）およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着剤（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）が含まれる。特定の一実施形態では、陰イオン交換膜吸着剤はＰａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着剤である。一般に、当業者に知られている慣用のイオン交換クロマトグラフィーから知られている方法および緩衝液を、膜吸着剤クロマトグラフィーに直接適用することができる。特定の実施形態では、陰イオン交換膜吸着剤クロマトグラフィーは、上記定義したように室温で行う。
【００９４】
したがって、ＶＳＶは陰イオン交換膜吸着剤によって精製してもよく、二次清澄からのＶＳＶの濾過した溶液を、第１のｐＨ緩衝塩溶液（「平衡化緩衝液」またはＶＳＶ「結合緩衝液」とも呼ぶ）で平衡化した陰イオン交換膜吸着剤上に載せる。ＶＳＶを第２のｐＨ緩衝塩溶液（「溶出緩衝液」）で陰イオン交換膜吸着剤から溶出させ、溶出されたＶＳＶ画分を回収する（たとえば、米国特許公開第２００７／０２４９０１９号を参照）。
【００９５】
第１のｐＨ緩衝塩溶液または平衡化緩衝液は、ＮａＣｌまたはＫＣＬ塩溶液であり得る。ＮａＣｌまたはＫＣｌは、少なくとも約０．１Ｍ〜約０．４Ｍのイオン強度（その間の分数のイオン強度が含まれる）で溶液中に存在し得る。緩衝溶液は、リン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液であり得る。これらの緩衝液は、約６．０〜約８．０のｐＨを有し得る。
【００９６】
平衡化緩衝液は、約１％のスクロース〜約５％のスクロースをさらに含み得る。また、第２のｐＨ緩衝塩溶液（「溶出緩衝液」）も、第１の（平衡化）緩衝液と同じ緩衝構成要素を含み得る。溶出緩衝液は、約１％のスクロース〜約５％のスクロースをさらに含み得る。
【００９７】
ＶＳＶを膜から溶出させるために、溶出緩衝液の塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）濃度（イオン強度）を、直線勾配または単一ステップの溶出プロセスで増加し得る（やはり米国特許公開第２００７／０２４９０１９号に記載されている）。どちらのステップも、ＶＳＶを陰イオン交換膜吸着剤から溶出させるために同等に有効である。第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、０．５Ｍ〜０．７５Ｍであるべきである。
【００９８】
第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、０．００１Ｍから０．７５Ｍまで、約１０ＣＶ／分〜３０ＣＶ／分の溶出流速で直線的に増加するべきである。
【００９９】
接線流濾過（ＴＦＦ）
陰イオン交換膜吸着剤クロマトグラフィーによるＶＳＶの精製の後、ＶＳＶを接線流濾過（ＴＦＦ）によってさらに精製し得る。一般に、ＴＦＦとは、液体の溶液（または懸濁液）中の構成要素を分離するために膜（複数可）を使用する圧力駆動のプロセスであり、液（供給流）を膜の表面に沿って接線方向にポンピングし、かけられる圧力が、液の「一部分」を（膜の）濾液側へと膜に押し通す役割を果たす。ＴＦＦは、室温で行い得る。このプロセスでは、緩衝液を交換し、ＶＳＶを濃縮する。ＴＦＦステップは、陰イオン交換膜吸着ステップから回収されたＶＳＶを少なくとも５回濃縮し、続いて少なくとも１回の緩衝液交換を行うことを含み得る。
【０１００】
ＴＦＦ材料（たとえば、中空繊維、渦巻き形の平板）および方法（たとえば、限外濾過（ＵＦ）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）、微量濾過）は、当業者に周知である。ＴＦＦ膜は、３００〜７５０ｋＤａの分子量カットオフを有し得る。
【０１０１】
ＴＦＦの緩衝液交換に使用する緩衝液は、上述のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはトリス緩衝液であり得る。しかし、緩衝液は、約５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度（その間のｍＭ濃度が含まれる）を有し得る。緩衝液交換の緩衝液は、０．１０Ｍ〜０．２０ＭのＮａＣｌおよび３．５％〜４．５％のスクロースをさらに含み得る。
【０１０２】
陰イオン交換膜吸着剤の精製からのＶＳＶ画分をプールし、プールした溶液を濃縮し、約７５０ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維ＴＦＦ膜カートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて、ＴＦＦによって緩衝液を交換し得る。
【０１０３】
濾過
米国特許公開第２００７／０２４９０１９号に記載の方法では、ウイルス精製における最後のプロセスステップは、ＴＦＦからＶＳＶ濃縮水の最終微量濾過を行うことであり、濃縮水は、微量濾過による二次清澄について上述したように、０．２〜０．２５ミクロンのフィルターを通して濾過する。
【０１０４】
組換えまたは遺伝子改変水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
本明細書中に記載のように、ＶＳＶは、上述の精製方法のいずれかを用いることによって、哺乳動物細胞培養物から得て精製し得る。「向上した純度」とは、精製したＶＳＶが、細胞培養物のタンパク質および核酸汚染物質を少なくとも９０．０％含まず、好ましくは細胞培養物のタンパク質および核酸汚染物質を９９．０％〜９９．８％含まないことを意味する。
【０１０５】
特定の実施形態では、上述のプロセスのいずれかによって哺乳動物細胞培養物の細胞培養液から精製したＶＳＶは、組換えもしくは遺伝子改変および／または弱毒化ＶＳＶである。ＶＳＶなどの組換えＲＮＡウイルスを産生する方法は周知であり、当分野において「救済」または「逆遺伝学」方法と呼ばれる。ＶＳＶの例示的な救済方法には、それだけには限定されないが、それぞれ本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，０３３，８８６号および米国特許第６，１６８，９４３号に記載の方法が含まれる。ＶＳＶなどのウイルスの救済を実施するためのさらなる技術は、本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，６７３，５７２号およびＷＯ２００４／１１３５１７号に記載されている。
【０１０６】
ＶＳＶは、特定の血清型のＶＳＶであり得る。特定の実施形態では、精製したＶＳＶは、インディアナ血清型、ニュージャージー血清型、イスファハン血清型、チャンディプラ血清型、または他のベシクロウイルスである。特定の実施形態では、ＶＳＶは、複数のそのような血清型由来の配列を含有し得る。
【０１０７】
ＶＳＶベクター（およびその免疫原性組成物）は、しばしばＶＳＶゲノム中に１つまたは複数の弱毒化突然変異を含む。特定の実施形態では、精製したＶＳＶは、ＶＳＶの病原性を弱毒化する少なくとも１つの突然変異を含むゲノム配列を有する。他の実施形態では、精製したＶＳＶは、ＶＳＶの病原性を弱毒化する少なくとも２つの突然変異を含むゲノム配列を有する。たとえば、弱毒化したＶＳＶは、本明細書中に参照により組み込まれている、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１４９９号（国際公開ＷＯ２００５／０９８００９号）および米国特許公開第２００７／０２１８０７８Ａ１号に記載の弱毒化突然変異などの、２つ以上の既知の弱毒化突然変異を含み得る。たとえば、既知のＶＳＶ弱毒化突然変異には、それだけには限定されないが、それぞれ国際公開ＷＯ２００５／０９８００９号に詳述されている、遺伝子シャフリング突然変異（ＶＳＶゲノムを形成し、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬと命名されたＶＳＶ遺伝子の遺伝子シャフリングが含まれる）、Ｇタンパク質挿入突然変異、Ｇタンパク質切断突然変異、温度感受性（ｔｓ）突然変異（および他の点突然変異）、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異ならびに遺伝子欠失突然変異が含まれる。したがって、特定の実施形態では、精製したＶＳＶは、それだけには限定されないが、温度感受性（ｔｓ）突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異を含めた、１つまたは複数の弱毒化突然変異を含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、上述の精製プロセスのいずれかによって精製したＶＳＶは、ウイルスの弱毒化をもたらす１つまたは複数の突然変異、ならびに哺乳動物細胞または細胞系からの成長の増加およびウイルス収量の増加をもたらす１つまたは複数の突然変異を有する。たとえば、本発明は、Ｖｅｒｏ細胞または任意の感受性のある細胞基質中における低い感染多重度（ＭＯＩ）での連続継代培養による、高度に弱毒化したＶＳＶ組換え体を組織培養条件に適応させるプロセスまたは方法を提供する。複数の連続継代培養のプロセスは、ウイルスゲノム全体にわたるいくつかのヌクレオチド（ＮＴ）置換の進行性の自然増加によって特徴づけられている遺伝型の変化をもたらす。これらのヌクレオチド置換のほとんどは、ＶＳＶタンパク質中のアミノ酸（ＡＡ）置換をもたらす。本明細書中に記載のプロセスは、ウイルス収量の実質的な向上を伴った、ウイルスの表現型の適応をもたらした。Ｖｅｒｏ細胞中での継代は、遺伝型および表現型の安定性が達成されるまで、通常は１０〜１５回の連続継代（Ｐ１０〜Ｐ１５）続けた。Ｐ１５を越えるウイルスのさらなる継代培養では、追加の置換がわずかしかまたはまったく示されず、ウイルス収量のさらなる増強はもたらされなかった。このプロセスは、製造収量の実質的な向上および製造の一貫性の増強をもたらす。適応的突然変異は、高感度マウス頭蓋内ＮＶ動物モデルにおいて試験した場合に、継代培養したウイルスの神経毒性（ＮＶ）に実質的に影響を与えなかった。
【０１０９】
本発明の一実施形態は、以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、単離された遺伝子改変水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を提供する：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【０１１０】
特定の実施形態では、突然変異は、Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方である。他の特定の実施形態では、Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異は、Ｔ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異は、Ｐ→Ｔ突然変異またはＰ→Ｑ突然変異である。
【０１１１】
一実施形態では、Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１のアミノ酸の突然変異は、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、Ａ→Ｖ／Ｇ→ＬまたはＶ→Ｉの突然変異である。
【０１１２】
一実施形態では、Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸の突然変異は、それぞれＰ→Ｌ、Ｋ→Ｅ、またはＬ→Ｉである。
【０１１３】
特定の実施形態では、本明細書中に記載の遺伝子改変および弱毒化したＶＳＶは、外来ＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などの、１つまたは複数の外来または異種（もしくは外来）ポリヌクレオチド配列を含むゲノム配列を有する。異種ポリヌクレオチド配列は所望に応じて変動させることができ、それだけには限定されないが、サイトカイン（インターロイキンなど）をコードしている遺伝子、Ｔ−ヘルパーエピトープをコードしている遺伝子、ＣＴＬエピトープをコードしている遺伝子、アジュバントをコードしている遺伝子および補因子をコードしている遺伝子、制限マーカーをコードしている遺伝子、治療タンパク質または様々な微生物病原体（たとえば、ウイルス、細菌、寄生生物もしくは真菌）のタンパク質、特に望ましい免疫応答を誘発することができるタンパク質をコードしている遺伝子が含まれる。たとえば、様々な微生物病原体のタンパク質をコードしている異種ポリヌクレオチド配列は、ＨＩＶ遺伝子、ＨＴＬＶ遺伝子、ＳＩＶ遺伝子、ＲＳＶ遺伝子、ＰＩＶ遺伝子、ＨＳＶ遺伝子、ＣＭＶ遺伝子、エプスタイン−バーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、流行性耳下腺炎ウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、パピローマウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）遺伝子、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）遺伝子、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）遺伝子、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）遺伝子、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）遺伝子、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）遺伝子、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）遺伝子、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）遺伝子、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）遺伝子のうちの１つまたは複数であり得る。特定の実施形態では、精製したＶＳＶは、ＨＩＶ遺伝子の配列を含み、ＨＩＶ配列は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖまたはｖｐｕからなる群から選択される。具体的な一実施形態では、ＨＩＶ遺伝子はｇａｇまたはｅｎｖである。
【０１１４】
特定の他の実施形態では、精製したＶＳＶは、上述のように、少なくとも１つの弱毒化突然変異および少なくとも１つの異種タンパク質をどちらも含有する。他の特定の実施形態では、ＶＳＶ免疫原性組成物は、遺伝子改変ＶＳＶは、２つの弱毒化突然変異およびＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質をコードしているｏｒｆを含む。一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質をコードしている核酸分子をさらに含み、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸のうちの少なくとも１つに突然変異を有し、突然変異は、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→ＮまたはＴ→Ｋである。
【０１１５】
他の実施形態では、本明細書中に記載した遺伝子改変ＶＳＶは、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子をコードしており、ｇａｇ遺伝子は、ＶＳＶゲノム内の位置１（３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’）、位置２（３’−Ｎ−ｇａｇ２−ＰＭＧＬ−５’）、位置３（３’−ＮＰ−ｇａｇ３−ＭＧＬ−５’）、位置４（３’−ＮＰＭ−ｇａｇ４−ＧＬ−５’）、位置５（３’−ＮＰＭＧ−ｇａｇ５−Ｌ−５’）または位置６（３’−ＮＰＭＧＬ−ｇａｇ６−５’）に挿入される。他の実施形態では、本明細書中に記載のＶＳＶは、ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子をコードしており、ｅｎｖ遺伝子は、ＶＳＶゲノム内の位置１（３’−ｅｎｖ１−ＮＰＭＧＬ−５’）、位置２（３’−Ｎ−ｅｎｖ２−ＰＭＧＬ−５’）、位置３（３’−ＮＰ−ｅｎｖ３−ＭＧＬ−５’）、位置４（３’−ＮＰＭ−ｅｎｖ４−ＧＬ−５’）、位置５（３’−ＮＰＭＧ−ｅｎｖ５−Ｌ−５’）または位置６（３’−ＮＰＭＧＬ−ｅｎｖ６−５’）に挿入される。
【０１１６】
当業者は、上記説明から、細胞培養物中、低ＭＯＩでウイルスを連続継代培養する間に、ＶＳＶゲノム中の様々な遺伝子改変が起こったことを理解されよう。これらの遺伝子改変により、感染した細胞からのウイルス収量の増加がもたらされた。さらに、ウイルスの他の遺伝型または表現型の変化は存在せず、ウイルスの弱毒化の変更も存在しなかった。これらの遺伝子改変は、ウイルス収量をウイルスベクター産生のスケールアップに有用なレベルまで増加させることに関して、顕著な利点であることが証明された。
【０１１７】
本明細書中で以降記載する本発明は、当分野における、哺乳動物において顕著に弱毒化された病原性を有する、特に、動物神経毒性モデルにおいて明らかとなる弱毒化した神経病理を有する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクターの必要性に対処している。上述のように、ＶＳＶは多くの特徴を有し、それにより、これが免疫原性組成物の適切なベクターとなる。たとえば、ヒトのＶＳＶ感染症は稀であり、無症候性であるか、または合併症なしに３〜８日間で回復する緩和なインフルエンザ様の症状によって特徴づけられており、したがって、ＶＳＶはヒトの病原体とみなされていない。ＶＳＶを魅力的なベクターにするの他の特徴には、（ａ）細胞培養物中で頑強に複製する能力を有すること、（ｂ）宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれないこと、または遺伝的組換えを受けることができないこと、（ｃ）複数の血清型が存在し、プライム−ブースト免疫化戦略の可能性が許容されること、（ｄ）目的の外来遺伝子をＶＳＶゲノム内に挿入し、ウイルス転写酵素によって豊富に発現させることができること、（ｅ）ウイルスゲノムのｃＤＮＡコピーから感染性ウイルスを救済するための高度に特化した系の開発（米国特許第６，０３３，８８６号、米国特許第６，１６８，９４３号）および（ｆ）ヒト集団におけるＶＳＶに対する既存の免疫が稀であることが含まれる。
【０１１８】
弱毒化した水疱性口内炎ウイルス
特定の実施形態では、本発明で使用するための弱毒化したＶＳＶは、以下に記載の突然変異のクラスからの１つまたは複数の突然変異を含む。さらに、これらの弱毒化したウイルスは、本発明の方法、たとえば、低ＭＯＩを用いた約５〜１５回の連続継代培養を用いて、さらに遺伝子改変する。この方法は、弱毒化したの遺伝子型および表現型の保持をもたらすが、細胞培養物中での成長により良好に適応しているＶＳＶをもたらす、本明細書中に記載のさらなる遺伝子改変を提供する。これらのウイルスを使用することによって達成されるより高いウイルス収量により、これらが、ベクター産生の優れた候補となる。
【０１１９】
Ａ．水疱性口内炎ウイルスの突然変異クラス
一実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶベクターは、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラスを含む。以前に注記したように、用語「突然変異クラス」、「突然変異クラス」または「突然変異のクラス」とは、互換性があるように使用され、当分野において、単独で使用した場合にＶＳＶを弱毒化することが知られている突然変異をいう。たとえば、本発明の「突然変異クラス」には、それだけには限定されないが、ＶＳＶ温度感受性Ｎ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｎ（ｔｓ）」）、温度感受性Ｌ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｌ（ｔｓ）」）、点突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異（本明細書中で以降「Ｇ（ｓｔｅｍ）」）、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｍ（ｎｃｐ）」）、遺伝子シャフリングまたは再配置突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異（本明細書中で以降「Ｇ（ｃｔ）」）、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異などが含まれる。本明細書中で以下に定義する「突然変異」には、当分野において挿入、欠失、置換、遺伝子再配置またはシャフリングの修飾として知られている突然変異が含まれる。
【０１２０】
さらに、以前に注記したように、用語「相乗的な」弱毒化とは、相加的なものよりも大きい、ＶＳＶの弱毒化のレベルをいう。たとえば、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、同じＶＳＶゲノム中の少なくとも２つの突然変異のクラスを組み合わせ、それにより、それぞれのＶＳＶ突然変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベルよりもはるかに大きな、ＶＳＶの病原性の減少をもたらすことを含む。したがって、特定の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、それぞれの突然変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベル（すなわち、２つの突然変異クラスの合計）よりも少なくとも高いＬＤ５０として定義され、弱毒化レベル（すなわちＬＤ５０）は、小動物神経毒性モデルにおいて決定する。
【０１２１】
非限定的な例として、方程式（１）がＶＳＶの「相加的な弱毒化」を記載する場合：
（１）ΔａＬＤ５０＋ΔｂＬＤ５０＝ｘＬＤ５０
［式中、ΔａＬＤ５０は、そのゲノム中に第１の突然変異クラスを有するＶＳＶのＬＤ５０であり、ΔｂＬＤ５０は、そのゲノム中に第２の突然変異クラスを有するＶＳＶのＬＤ５０であり、ｘＬＤ５０は、ΔａＬＤ５０およびΔｂＬＤ５０の合計である］、それぞれの突然変異クラス単独で観察される相加的な弱毒化レベルよりも少なくとも高いＬＤ５０を有する、本発明のＶＳＶの「相乗的な弱毒化」は、方程式（２）によって説明される：
（２）Δａ，ｂＬＤ５０＞（ΔａＬＤ５０＋ΔｂＬＤ５０）
［式中、Δａ，ｂＬＤ５０は、そのゲノム中に２つの突然変異クラスの組合せを有するＶＳＶのＬＤ５０であり、ΔａＬＤ５０は、そのゲノム中に第１の突然変異クラスを有するＶＳＶのＬＤ５０であり、ΔｂＬＤ５０は、そのゲノム中に第２の突然変異クラスを有するＶＳＶのＬＤ５０である］。したがって、特定の実施形態では、ＶＳＶの弱毒化の相乗作用（すなわち、同じＶＳＶゲノム中に２つの突然変異クラス）は、２つのＶＳＶ構築体のＬＤ５０（それぞれのＶＳＶ構築体は、そのゲノム中に単一の突然変異クラスを有する）に相対的に記載しており、そのゲノム中に２つの突然変異クラスを有するＶＳＶの相乗的な弱毒化は、そのゲノム中に単一の突然変異クラスを有する２つのＶＳＶ構築体の相加的なＬＤ５０より少なくとも高いＬＤ５０として定義される。
【０１２２】
特定の他の実施形態では、ＶＳＶの弱毒化の相乗作用は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０に相対的に記載されている。したがって、一実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。一実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも１０倍高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。別の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも１００倍高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。別の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも１，０００倍高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。さらに他の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも１０，０００倍高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。特定の他の実施形態では、ＶＳＶの相乗的な弱毒化は、野生型ＶＳＶのＬＤ５０よりも少なくとも１００，０００倍高いＬＤ５０として定義され、ＬＤ５０は、動物神経毒性モデル中で定義する。特定のＶＳＶベクターの５０％の致死的用量（ＬＤ５０）の決定は、当業者によって、既知の試験方法および動物モデルを用いて容易に決定される。
【０１２３】
遺伝子シャフリング突然変異
特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に遺伝子シャフリング突然変異を含む。本明細書中で定義する用語「遺伝子シャフリング」、「シャフリングした遺伝子」、「シャフリングした」、「シャフリング」、「遺伝子再配置」および「遺伝子転座」とは、互換性があるように使用され、野生型ＶＳＶゲノムの順序の変化（突然変異）をいう。本明細書中で定義する野生型ＶＳＶゲノムは、３’−ＮＰＭＧＬ−５’の遺伝子配列順を有する。
【０１２４】
３’プロモーターに対するＶＳＶ遺伝子の位置により発現レベルおよびウイルスの弱毒化が決定されることは、当分野で知られている（それぞれ具体的に本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，５９６，５２９号およびＷｅｒｔｚら、１９９８を参照）。発現の勾配が存在し、３’プロモーターに近位の遺伝子は３’プロモーターに遠位の遺伝子よりも豊富に発現される。ＶＳＶ  Ｇ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、当分野で知られている（ＲｏｓｅおよびＧａｌｌｉｏｎｅ、１９８１、Ｇａｌｌｉｏｎｅら、１９８１）。たとえば、米国特許第６，５９６，５２９号は、Ｎタンパク質の遺伝子がその野生型プロモーターから転座した（シャフリングされた）遺伝子シャフリング突然変異（Ｎタンパク質発現を次々に低下させるために、近位の第１の位置、次々にゲノム上のより遠位の位置へ）を記載している（たとえば、３’−ＰＮＭＧＬ−５’、３’−ＰＭＮＧＬ−５’、３’−ＰＭＧＮＬ−５’、それぞれＮ２、Ｎ３およびＮ４と呼ぶ）。したがって、特定の実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に遺伝子シャフリング突然変異を含む。突然変異の１つのクラスでは、特定の一実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、Ｎ遺伝子の転座を含む遺伝子シャフリング突然変異を含む（たとえば、３’−ＰＮＭＧＬ−５’または３’−ＰＭＮＧＬ−５’）。
【０１２５】
本明細書中では、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のいずれかの３’側のＶＳＶゲノムに外来核酸配列（たとえばＨＩＶ  ｇａｇ）を挿入することにより、上記定義した「遺伝子シャフリング突然変異」が有効にもたらされることに言及したい。たとえば、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子を位置１（たとえば３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’）でＶＳＶゲノム内に挿入する場合、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬ遺伝子は、それぞれ、その野生型の位置からゲノム上のより遠位の位置に移動される。したがって、本発明の特定の実施形態では、遺伝子シャフリング突然変異には、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のいずれかの３’側のＶＳＶゲノムに外来核酸配列を挿入することが含まれる（たとえば、３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’、３’−Ｎ−ｇａｇ２−ＰＭＧＬ−５’、３’−ＮＰ−ｇａｇ３−ＭＧＬ−５’など）。
【０１２６】
Ｇタンパク質の挿入および切断突然変異体
特定の他の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、突然変異したＧ遺伝子を含み、コードされているＧタンパク質は、Ｇタンパク質の「細胞質側末端領域」とも呼ばれるその細胞質ドメイン（カルボキシ末端）で切断されている。細胞質ドメインのカルボキシ末端を切断するＧ遺伝子突然変異は、ＶＳＶの出芽に影響を与え、ウイルス産生を弱毒化することが、当分野で知られている（Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７（５）：１２８９〜１２９６、１９９８、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：３７２３〜３７３２、１９９９）。野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞質ドメインは、２９個のアミノ酸（ＲＶＧＩＨＬＣＩＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ−ＣＯＯＨ、配列番号１）を含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明の切断されたＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、細胞質ドメインの最後の２８個のカルボキシ末端のアミノ酸残基が欠失している（配列番号１の２９個のアミノ酸の野生型細胞質ドメインからアルギニンのみを保持）Ｇタンパク質をコードしている。特定の他の実施形態では、本発明の切断されたＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、細胞質ドメインの最後の２０個のカルボキシ末端のアミノ酸残基が欠失している（配列番号１の２９個のアミノ酸の野生型細胞質ドメインと比較して）Ｇタンパク質をコードしている。
【０１２８】
特定の他の実施形態では、本発明の切断されたＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、その細胞質ドメイン（細胞質側末端領域）中に単一のアミノ酸を含むＧタンパク質をコードしており、単一のアミノ酸は、任意の天然に存在するアミノ酸である。さらに他の実施形態では、本発明の切断されたＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、その細胞質ドメイン（細胞質側末端領域）中に９個のアミノ酸を含むＧタンパク質をコードしており、９個のアミノ酸は、任意の天然に存在するアミノ酸である。特定の他の実施形態では、本発明の突然変異したＶＳＶ遺伝子は、外来エピトープを表す挿入物を含有するＧタンパク質をコードしている。そのような突然変異体は当分野で知られている（たとえばＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒおよびＲｏｓｅ、２００３を参照）。
【０１２９】
本明細書中で定義する、配列番号１の野生型配列と比較して、細胞質ドメインの最後の２８個のカルボキシ末端のアミノ酸残基が欠失しているＧタンパク質をコードしているＧ遺伝子突然変異体は、「Ｇ（ｃｔ−１）」、または単に「ＣＴ１」と命名され、Ｇ（ｃｔ−１）の細胞質ドメインは、（Ｒ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列を有する。本明細書中で定義する、配列番号１の野生型配列と比較して、細胞質ドメインの最後の２０個のカルボキシ末端のアミノ酸残基が欠失しているＧタンパク質をコードしているＧ遺伝子突然変異体は、「Ｇ（ｃｔ−９）」と命名され、Ｇ（ｃｔ−９）、または単に「ＣＴ９」の細胞質ドメインは、（ＲＶＧＩＨＬＣＩＫ−ＣＯＯＨ、配列番号２）のアミノ酸配列を有する。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、突然変異したＧ遺伝子を含み、コードされているＧタンパク質は、Ｇ（ｃｔ−１）またはＧ（ｃｔ−９）である。
【０１３０】
温度感受性および他の点突然変異
本明細書中で以下に定義するＶＳＶ「温度感受性」（「ｔｓ」）突然変異とは、非許容的な温度でのＶＳＶの成長を制限する、ＶＳＶゲノム中の突然変異である。たとえば、本発明のＶＳＶ  ｔｓ突然変異体は、許容的な温度（たとえば３１℃）で正常かつ高い力価まで成長するが、その成長または繁殖は、非許容的な温度（たとえば、３７℃または３９℃）で制限される。化学的および部位特異的突然変異誘発によるｔｓ突然変異体の作製は当分野で周知であり（たとえば、Ｐｒｉｎｇｌｅ、１９７０、Ｌｉら、１９８８を参照）、数々のｔｓ突然変異体が、特徴づけられ、記載されている（たとえば、ＦｌａｍａｎｄおよびＰｒｉｎｇｌｅ、１９７１、ＦｌａｍａｎｄおよびＢｉｓｈｏｐ、１９７３、ＰｒｉｎｔｚおよびＷａｇｎｅｒ、１９７１、ＧｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａおよびＬｅｎａｒｄ、１９８５、Ｐｒｉｎｇｌｅら、１９８１、Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、Ｌｉら、１９８８、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、１９７７、Ｌｕｎｄｈら、１９８８、Ｄａｌ  Ｃａｎｔｏら、１９７６、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、１９７６を参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中にｔｓ突然変異を含み、ｔｓ突然変異は、Ｇ、Ｍ、Ｎ、ＰまたはＬタンパク質をコードしている核酸配列の１つまたは複数の突然変異である。
【０１３１】
本明細書中で定義する、ＶＳＶ  Ｇ、Ｍ、Ｎ、ＰまたはＬ遺伝子のいずれか１つのｔｓ突然変異は、本発明の別個の「突然変異クラス」である。たとえば、本発明の特定の実施形態では、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラスを含む遺伝子改変ＶＳＶ（２つの突然変異がＶＳＶの病原性を相乗的に弱毒化する）は、１つまたは複数のｔｓ  Ｎ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｎ（ｔｓ）」）を第１の突然変異のクラスとして含み、１つまたは複数のｔｓ  Ｌ遺伝子突然変異（本明細書中で以降「Ｌ（ｔｓ）」）を第２の突然変異のクラスとして含む。非限定的な例として、３’−Ｎ（ｔｓ）ＰＭＧＬ（ｔｓ）−５’などのゲノムを含む遺伝子改変ＶＳＶは、２つの突然変異のクラス（すなわち、（１）Ｎ（ｔｓ）遺伝子突然変異および（２）Ｌ（ｔｓ）遺伝子突然変異）を含み、３’−ｇａｇ１−Ｎ（ｔｓ）ＰＭＧＬ（ｔｓ）−５’などのゲノムを含む遺伝子改変ＶＳＶは、３つの突然変異のクラス（すなわち、（１）Ｎ（ｔｓ）遺伝子突然変異、（２）Ｌ（ｔｓ）遺伝子突然変異、および（３）ｇａｇ１挿入による遺伝子シャフリング突然変異）を含む。
【０１３２】
特定の他の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に点突然変異を含み、点突然変異は、Ｇ、Ｍ、Ｎ、ＰまたはＬタンパク質をコードしている核酸配列の１つまたは複数の突然変異であり、突然変異は、低温適応、融合低下または細胞変性効率などの弱毒化表現型を与える（たとえば、ＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓｅｎおよびＷｈｉｔｔ、１９９８、ＡｈｍｅｄおよびＬｙｌｅｓ、１９９７を参照）。たとえば、ＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓｅｎおよびＷｈｉｔｔ（１９９８）は、シフトされた融合活性のｐＨ閾値を有する、Ｇ遺伝子の３つの弱毒化点突然変異（たとえば、Ｄ１３７−Ｌ、Ｅ１３９−ＬまたはＤＥ−ＳＳ）を記載している。ＡｈｍｅｄおよびＬｙｌｅｓ（１９９７）は、宿主の遺伝子発現の阻害において欠損性が高く、野生型Ｍタンパク質よりも迅速にターンオーバーされた、Ｍ遺伝子の弱毒化点突然変異（Ｎ１６３Ｄ）を記載している。したがって、特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に１つまたは複数の点突然変異を含む。
【０１３３】
非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異
特定の他の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、Ｍ遺伝子中に非細胞変性性突然変異を含む。ＶＳＶ（インディアナ血清型）Ｍ遺伝子は、２２９個のアミノ酸のＭ（マトリックス）タンパク質をコードしており、ＮＨ２末端の最初の３０個のアミノ酸がＰＰＰＹモチーフを含む。Ｊａｙａｋａｒら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４：９８１８〜２７、（２０００））により、ＰＰＰＹモチーフ中の突然変異（たとえば、ＡＰＰＹ、ＡＡＰＹ、ＰＰＡＹ、ＡＰＰＡ、ＡＡＰＡおよびＰＰＰＡ）により、ウイルス出芽の後期段階を遮断することによってウイルス収量が減少されることが実証された。したがって、特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、Ｍ遺伝子中に非細胞変性性突然変異を含み、突然変異は、コードされているＭタンパク質のＰＰＰＹモチーフである。
【０１３４】
ＭのｍＲＮＡがＭ２およびＭ３と呼ばれる２つの追加のタンパク質をさらにコードしていることが、最近報告されている（ＪａｙａｋａｒおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６：８０１１−１８、２００２）。Ｍ２およびＭ３タンパク質は、２２９個のアミノ酸のＭタンパク質（Ｍ１と呼ぶ）をコードしているものと同じリーディングフレーム中で、下流のメチオニンから合成され、Ｍ１タンパク質の最初の３２個（Ｍ２タンパク質）または５０個（Ｍ３タンパク質）のアミノ酸を欠く。Ｍタンパク質を発現するがＭ２およびＭ３を発現しない組換えＶＳＶに感染した細胞は、（特定の細胞種で）胞変性効果の開始の遅延を示すが、それでも正常なウイルス収量を生じることが観察されている。したがって、特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、Ｍ遺伝子中に非細胞変性性突然変異を含み、Ｍ遺伝子突然変異は、Ｍ２またはＭ３タンパク質を発現しないウイルスをもたらす（たとえば、ＪａｙａｋａｒおよびＷｈｉｔｔ、２００２を参照）。
【０１３５】
Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異
特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、Ｇ遺伝子中に突然変異を含み、コードされているＧタンパク質は、Ｇタンパク質外部ドメインの膜近位の基部（ｓｔｅｍ）領域中に突然変異を有し、Ｇ−ｓｔｅｍタンパク質と呼ばれる。Ｇ−ｓｔｅｍ領域は、Ｇタンパク質のアミノ酸残基４２１〜４６２を含む。最近の研究により、Ｇタンパク質のＧ−ｓｔｅｍ中の挿入および／または欠失（たとえば切断）の突然変異による、ＶＳＶの弱毒化が実証されている（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＷｈｉｔｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４、２２３９〜４６、２０００、Ｊｅｅｔｅｎｄｒａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７６、１２３００〜３１１、２００２、Ｊｅｅｔｅｎｄｒａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７７、１２８０７〜１８、２００３）。したがって、特定の実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、Ｇ−ｓｔｅｍの挿入、欠失、置換またはその組合せを含む。１つの特定の実施形態では、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異を含む本発明の遺伝子改変ＶＳＶベクター（およびその免疫原性組成物）は、３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧ（ｓｔｅｍ）Ｌ−５’のゲノムを含む。
【０１３６】
アンビセンスＲＮＡ突然変異
特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、５’アンチゲノムプロモーター（ＡＧＰ）が３’ゲノムプロモーター（ＧＰ）の１つのコピーで置き換えられている、アンビセンスＲＮＡ突然変異を含む。ＶＳＶの５’ＡＧＰ、および他の非分割型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、強力な複製プロモーターとして作用する一方で、３’ＧＰは、転写プロモーターおよび弱い複製プロモーターとして作用する。通常のＶＳＶ感染の過程では、アンチゲノムコピーよりもゲノムコピーが３〜４倍の優勢にあり、この比は、ラブドウイルス科の別のメンバーである狂犬病ウイルスでさらに高い（ＦｉｎｋｅおよびＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３（５）：３８１８〜２５、１９９９）。狂犬病ウイルスを用いた以前の研究により、５’ＡＧＰを１つのＧＰのコピー（アンビセンスＲＮＡ突然変異として知られる）で置き換えることにより、同レベルのゲノムおよびアンチゲノムＲＮＡのコピーが感染した細胞中にもたらされたことが実証された。さらに、ゲノムの５’末端に配置したＧＰのコピーから外来遺伝子が発現された。培養細胞物中で連続継代培養した際、アンビセンスＲＮＡ突然変異を含有する狂犬病ウイルスは、組換え野生型狂犬病ウイルスよりも１０〜１５倍低い力価を一貫して複製した（ＦｉｎｋｅおよびＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３（５）：３８１８〜２５、１９９９）。そのような突然変異は、ウイルス複製の弱毒化および外来遺伝子の発現の両方のために、ＶＳＶベクター中で使用した。したがって、特定の実施形態では、遺伝子改変ＶＳＶは、アンビセンスＲＮＡ突然変異を含む。
【０１３７】
遺伝子欠失
特定の他の実施形態では、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、ＶＳＶ遺伝子（ＧまたはＭなど）がゲノムから欠失しているウイルスを含む。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、３７２３〜３２、１９９９）は、Ｇタンパク質をコードしている遺伝子全体が欠失しており（ΔＧ）、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質で置換されているＶＳＶベクターを記載しており、ＶＳＶベクター（ΔＧ−ＨＡ）は、弱毒化した病因を実証した。
【０１３８】
Ｂ．弱毒化したＶＳＶのさらなる遺伝子改変を作製する方法
特定の実施形態では、本発明は、以下に記載する少なくとも２つの異なる突然変異のクラスを含む、遺伝子改変ＶＳＶを対象とする。これらの遺伝子改変および弱毒化したＶＳＶのいずれかを、本発明中に記載の方法によってさらに遺伝子改変し得る。すなわち、これらの弱毒化したＶＳＶのいずれかを、感受性のある細胞または細胞系中、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１ＰＦＵの範囲の低い感染多重度で約５〜１５回連続継代培養し、そのゲノムを、本明細書中に記載の突然変異のうちの少なくとも１つの存在について分析し得る。
【０１３９】
したがって、本発明の一態様では、ウイルスを細胞培養物中での成長に適応させる方法であって、
ａ）細胞培養物を、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の低い感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスに感染させるステップと、
ｂ）ウイルスを含有する細胞培地を収集するステップと、
ｃ）細胞培地を清澄にするステップと、
ｄ）細胞培地を凍結するステップと、
ｅ）ステップａ）からｄ）を約５〜約１５回繰り返すステップと
を含む方法を提供する。
【０１４０】
この方法を使用することにより、低ＭＯＩで、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１ＰＦＵの低ＭＯＩで約５〜１５回継代培養していないＶＳＶを用いたウイルスの産生または収量と比較して、ウイルスの産生／収量の５〜１００倍の増加ならびにウイルスの遺伝子型および表現型の特徴の安定性の増加がもたらされる。
【０１４１】
そのような方法を使用することにより、以下の位置のうちの少なくとも１つに対応する領域中に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する、遺伝子改変した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）がもたらされる：
Ｍタンパク質の位置１１９または１４２のアミノ酸、
Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７、または４８１のアミノ酸、および
Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸。
【０１４２】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、保存的または非保存的なアミノ酸変化を含む突然変異を有する。
【０１４３】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、Ｍタンパク質の位置１１９もしくは１４２の一方またはＭタンパク質の位置１１９および１４２の両方の突然変異を有する。一実施形態では、Ｍタンパク質の位置１１９のアミノ酸の突然変異は、Ｔ→Ｎ突然変異であり、Ｍタンパク質の位置１４２のアミノ酸の突然変異は、Ｐ→Ｔ突然変異またはＰ→Ｑ突然変異である。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、それぞれＫ→Ｎ、Ｎ→Ｔ、Ｓ→Ｉ、Ａ→Ｖ／Ｇ→ＬまたはＶ→Ｉの突然変異である、Ｇタンパク質の位置１０９、２２４、４３８、４７７または４８１のアミノ酸の突然変異を有する。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、それぞれＰ→Ｌ、Ｋ→Ｅ、またはＬ→Ｉである、Ｌタンパク質の位置２０５、２２０または１４５０のアミノ酸の突然変異を有する。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質をコードしている核酸分子をさらに含み、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、位置１６５、２７０、３２９または３４８のアミノ酸のうちの少なくとも１つに突然変異を有し、突然変異は、それぞれＳ→Ｇ、Ｌ→Ｓ、Ｄ→ＮまたはＴ→Ｋである。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶについて上述した突然変異は、ウイルスの遺伝子型および／または表現型の安定性の増加をもたらし、遺伝子改変ＶＳＶに感染した細胞からのウイルス産生の収量の増加をさらにもたらす。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の方法によって産生した、遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に少なくとも２つの他の突然変異をさらに含む、上述したもののいずれかから選択される。一実施形態では、突然変異は、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群から選択され得る。
【０１４９】
一実施形態では、本明細書中に記載の方法では、弱毒化したウイルスであるウイルスを利用する。一実施形態では、遺伝子改変したウイルスを産生する方法は、ウイルスベクターまたは免疫原性組成物の大スケールの産生に適応している。一実施形態では、この方法は、細胞１個あたり約０．００１〜約０．１プラーク形成単位の範囲の低い感染多重度で約５〜１５回継代培養していないウイルス株で得られるものと比較して、５〜１００倍高いウイルスの収量をもたらす。一実施形態では、上述の方法により、ウイルスの弱毒化に関連する任意の既存の突然変異の維持が可能となる。ウイルスの弱毒化に関連する既存の突然変異は、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Ｇ−ｓｔｅｍ突然変異、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異、アンビセンスＲＮＡ突然変異、Ｇ遺伝子切断突然変異、Ｇ遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異から選択され得る。一実施形態では、この方法により、ウイルスの弱毒化に関連する低い神経毒性プロフィールの維持が可能となる。一実施形態では、上述の方法で使用する弱毒化したウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の株である。
【０１５０】
Ｃ．組換え水疱性口内炎ウイルスベクター
特定の実施形態では、本発明は、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラス、および複製に必須でないＶＳＶゲノムの領域内に挿入されたまたはそれを置き換える、別個の転写単位としての少なくとも１つの外来ＲＮＡ配列を含む、組換えＶＳＶベクターを提供する。この組換えＶＳＶベクターは、上述の改変のうちの少なくとも１つを含有するようにさらに遺伝子改変してもよく、これにより、ウイルスが細胞培養物中での成長に適応することがもたらされ、したがって、細胞１個あたりのウイルスの収量が増加する。
【０１５１】
組換えＲＮＡウイルスを産生する方法は、当分野において「救済」または「逆遺伝学」方法と呼ばれる。ＶＳＶの例示的な救済方法は、それぞれ本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，０３３，８８６号、米国特許第６，５９６，５２９号およびＷＯ２００４／１１３５１７号に記載されている。マイナスセンスの一本鎖かつ非分割型のＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク質核（ヌクレオカプシド）に作用する多量体タンパク質複合体の酵素活性によって達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型として役割を果たすことができない。その代わり、これらのゲノム配列は、Ｎタンパク質によってヌクレオカプシド構造へと完全にカプシド形成された際にのみ、認識される。この場面においてのみ、ゲノムおよびアンチゲノムの末端プロモーター配列が認識されて転写または複製経路が開始される。
【０１５２】
ＶＳＶゲノムと同等のクローニングしたＤＮＡを、適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と自己切断リボザイム配列（たとえばデルタ型肝炎リボザイム）との間に配置し、これを適切な転写ベクター（たとえば増殖可能な細菌プラスミド）内に挿入する。この転写ベクターにより、容易に操作可能なＤＮＡ鋳型が提供され、これから、ＲＮＡポリメラーゼ（たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）が、正確またはほぼ正確な５’および３’末端を有する、ＶＳＶアンチゲノム（またはゲノム）の一本鎖ＲＮＡコピーを忠実に転写することができる。ＶＳＶゲノムＤＮＡコピーの配向ならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列により、アンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ均等物のどちらが転写されるかが決定される。また、新しいＶＳＶ子孫の救済には、裸の一本鎖ＶＳＶアンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ転写物を、機能的なヌクレオカプシド鋳型であるウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ関連リンタンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質へとカプシド形成するために必要な、ＶＳＶに特異的なトランス作用性支援タンパク質も必要である。これらのタンパク質は、転写および複製を達成するためにこのヌクレオカプシド鋳型と結合する必要がある、活性ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０１５３】
したがって、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラス（たとえばセクションＡを参照）を含む、本発明の遺伝子改変および弱毒化したＶＳＶは、当分野で知られている救済方法に従って産生する。たとえば、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラスを含む、遺伝子改変ＶＳＶベクターは、（１）ＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を含む転写ベクター、ならびに（２）カプシド形成、転写および複製に必要なトランス作用性Ｎ、ＰおよびＬタンパク質をコードしている少なくとも１つの単離した核酸分子を含む、少なくとも１つの発現ベクターを用いて、宿主細胞中、これらのベクターの同時発現および組換えＶＳＶの産生を許容するために十分な条件下で産生する。それだけには限定されないが、ＶＳＶインディアナ、ＶＳＶニュージャージー、ＶＳＶチャンディプラ、ＶＳＶグラスゴーなどを含めた、任意の適切なＶＳＶ株または血清型を本発明に従って使用し得る。
【０１５４】
ＶＳＶの弱毒化した形態をコードしているポリヌクレオチド配列に加えて、ポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の異種（または外来）ポリヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もコードしていてよい。異種ポリヌクレオチド配列は所望に応じて変動させることができ、それだけには限定されないが、補因子、サイトカイン（インターロイキンなど）、Ｔ−ヘルパーエピトープ、ＣＴＬエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または様々な微生物病原体（たとえば、ウイルス、細菌、寄生生物もしくは真菌）のタンパク質、特に望ましい免疫応答を誘発することができるタンパク質が含まれる。特定の実施形態では、異種ＯＲＦは、ＨＩＶ遺伝子（たとえば、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖまたはｖｐｕ）を含有する。１つの特定の実施形態では、ＨＩＶ遺伝子はｇａｇであり、ｇａｇ遺伝子は、ＶＳＶゲノム内の位置１（３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’）または位置５（３’−ＮＰＭＧ−ｇａｇ５−Ｌ−５’）に挿入される。別の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、組換えＶＳＶの予防的または治療的特徴を向上させるために選択される、インターロイキン−１２などのサイトカインをさらにコードしている。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変および弱毒化したＶＳＶは、化学突然変異誘発などの慣用の手段によって突然変異させる。たとえば、細胞培養物中でのウイルスの成長中に化学突然変異原を加え、続いて、（ａ）温度感受性および／または低温適応させた突然変異を選択するために最適以下の温度での継代培養に供したウイルスを選択し、（ｂ）細胞培養物中で小さなプラークを生じる突然変異ウイルスを同定し、（ｃ）宿主域突然変異を選択するために異種宿主を介して継代培養する。他の実施形態では、弱毒化突然変異は、部位特異的突然変異誘発を用いて事前に決定された突然変異を作成し、その後、これらの突然変異を含有するウイルスを救済することを含む。以前に記載したように、本発明の遺伝子改変ＶＳＶは、そのゲノム中に少なくとも２つの突然変異のクラスを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の突然変異のクラスは、二重突然変異（たとえば、欠失、挿入、置換など）、三重突然変異などを有するＧ−ｓｔｅｍ突然変異クラスなどの、複数の突然変異をさらに含む。その後、これらの弱毒化したＶＳＶベクターを、動物モデルにおけるその病原性の弱毒化についてスクリーニングする。
【０１５６】
救済の典型的な（ただし、必ずしも排他的ではない）状況には、Ｔ７ポリメラーゼがウイルスゲノムｃＤＮＡを含有する転写ベクターからのアンチゲノム（またはゲノム）一本鎖ＲＮＡの転写を駆動するために存在する、適切な哺乳動物細胞環境が含まれる。転写と同時にまたはそのすぐ後に、このウイルスアンチゲノム（またはゲノム）ＲＮＡ転写物は、ヌクレオカプシドタンパク質によって機能的な鋳型へとカプシド形成され、必要なウイルス特異的トランス作用性タンパク質をコードしている同時形質移入した発現プラスミドから同時に産生される、必要なポリメラーゼ構成要素によって結合される。これらの事象およびプロセスは、ウイルスｍＲＮＡの必須の転写、新しいゲノムの複製および増幅、それにより、新規ＶＳＶ子孫の産生、すなわち救済をもたらす。
【０１５７】
転写ベクターおよび発現ベクターは、典型的には、宿主細胞中での発現のために設計されたプラスミドベクターである。カプシド形成、転写および複製に必要なトランス作用性タンパク質をコードしている少なくとも１つの単離した核酸分子を含む発現ベクターは、これらのタンパク質を、同じ発現ベクターまたは少なくとも２つの異なるベクターから発現する。これらのベクターは、一般に、基本的な救済方法から知られており、本発明の向上した方法で使用するために変更する必要はない。
【０１５８】
ＶＳＶなどのウイルスの救済を実施するためのさらなる技術は、本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第６，６７３，５７２号および米国公開特許出願ＵＳ２００６０１５３８７０号に記載されている。
【０１５９】
ＶＳＶの救済に使用する宿主細胞は、組換えＶＳＶの産生に必要な必須の、構成要素のベクターの発現を可能にするものである。そのような宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞から選択することができる。一般に、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓細胞（たとえば２９３）などのヒト細胞に由来する。Ｖｅｒｏ細胞および多くの他の種類の細胞も宿主細胞として使用される。適切な宿主細胞の非限定的な例は以下のとおりである：（１）ヒト二倍体初代細胞系（たとえば、ＷＩ−３８およびＭＲＣ５細胞）、（２）サル二倍体細胞系（たとえばＦＲｈＬ−アカゲザル胎児肺細胞）、（３）準初代連続細胞系（たとえばＡＧＭＫ−アフリカミドリザル腎細胞）、（４）ヒト２９３細胞および（５）他の潜在的な細胞系、たとえば、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ（マディンダービーイヌ腎臓）、初代ヒヨコ胚線維芽細胞。特定の実施形態では、細胞によるＤＮＡの取り込みを増加させるために、形質移入促進試薬を加える。これらの試薬の多くが当分野で知られている（たとえばリン酸カルシウム）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）およびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）が一般的な例である。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｃｅおよびＥｆｆｅｃｔｅｎｅはどちらもカチオン性脂質である。これらはどちらも、ＤＮＡをコーティングし、細胞によるＤＮＡの取り込みを増強させる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅは、ＤＮＡを取り囲むリポソームを形成する一方で、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅは、ＤＮＡをコーティングするが、リポソームを形成しない。あるいは、プラスミドＤＮＡの取り込みは、細胞の電気穿孔によっても増強させることができ、高圧電流を、細胞およびＤＮＡを含有するキュベットに数ミリ秒間かける。
【０１６０】
その後、救済された弱毒化したＶＳＶを、まずはｉｎ  ｖｉｔｒｏ手段によって、その所望の表現型（温度感度、低温適応、プラーク形態学、ならびに転写および複製の弱毒化）について試験する。また、突然変異は、必要なトランス作用性カプシド形成およびポリメラーゼ活性が、野生型もしくは改変したヘルパーウイルスによって、または遺伝子に特異的な弱毒化突然変異を保有するＮ、Ｐおよび様々なＬ遺伝子を発現するプラスミドによって提供されるミニレプリコン系を用いても、試験する。また、弱毒化したＶＳＶは、動物神経毒性モデルにおける相乗的な弱毒化についてｉｎ  ｖｉｖｏでも試験する。たとえば、マウスおよび／またはフェレットモデルは、神経毒性の検出に確立されている。手短に述べると、１０匹のマウスのグループに、予測されるＬＤ５０用量（動物の５０％に致死的な用量）にわたるウイルス濃度の範囲のそれぞれを頭蓋内（ＩＣ）注射する。たとえば、ウイルスの予測されるＬＤ５０が１０３〜１０４ｐｆｕの範囲である場合は、１０２、１０３、１０４および１０５ｐｆｕのウイルスを用いたＩＣ接種を使用する。ウイルス配合物は、精製したウイルスストックをＰＢＳ中で段階希釈することによって調製する。その後、マウスの頭蓋上部に、５０〜１００μｌのＰＢＳ中の必須の用量を注射する。動物は、重量減少、罹患率および死亡について毎日監視する。その後、試験した濃度の範囲にわたるマウスの累積死亡から、ウイルスベクターのＬＤ５０を計算する。
【０１６１】
異種核酸配列および抗原
特定の実施形態では、本発明は、複製に必須でないゲノムの部位内に挿入されたまたはそれを置き換える、別個の転写単位としての外来ＲＮＡ配列をさらに含む、（低ＭＯＩでの本発明の連続継代培養方法を用いて）相乗的に弱毒化し、遺伝子改変ＶＳＶを提供し、外来ＲＮＡ配列（マイナスのセンスである）は、ＶＳＶに感染した宿主細胞中で発現させることができるタンパク質の産生を指示する。この組換えゲノムは、タンパク質をコードしている外来ＤＮＡをＶＳＶ  ｃＤＮＡ内に挿入することによって、最初に産生する。特定の実施形態では、疾患または障害に対する予防的または治療的免疫を生じる免疫原性抗原をコードしている任意のＤＮＡ配列は、本発明の組換え相乗的に弱毒化したＶＳＶ中で融合または非融合タンパク質として発現させた場合に、単独でまたは同じもしくは異なるＶＳＶによって発現された他の抗原と組み合わせて単離し、本発明の免疫原性組成物で使用するためのＶＳＶベクター中に取り込ませる。
【０１６２】
特定の実施形態では、相乗的に弱毒化し、（本発明の方法を用いて）さらに遺伝子改変した組換えＶＳＶによる抗原の発現は、病原性微生物に対する免疫応答を誘導する。たとえば、抗原は、疾患または障害の原因物質である細菌、寄生生物、ウイルス、または真菌上に見つかる抗原の免疫原性または抗原性を示し得る。一実施形態では、ヒト病原体または他の目的の抗原の抗原性または免疫原性を示す抗原を使用する。
【０１６３】
抗体との結合を検出することによって免疫原性または抗原性を決定するために、それだけには限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫アッセイ（たとえば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いたもの）、ウエスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、中和アッセイなどの技術を用いた、競合的および非競合的アッセイ系を含めた、当分野で知られている様々な免疫アッセイを使用する。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって測定する。別の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬と一次抗体との結合を測定することによって検出する。さらなる実施形態では、二次抗体を標識する。免疫アッセイにおける結合を検出するための、多くの手段が当分野で知られている。免疫原性を検出する一実施形態では、Ｔ細胞媒介性応答を、標準方法、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞毒性アッセイ、四量体アッセイ、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏ遅延型過感受性アッセイによってアッセイする。
【０１６４】
相乗的に弱毒化したＶＳＶによって発現されるエピトープ（抗原決定基）を発現する寄生生物および細菌（外来ＲＮＡが、寄生生物もしくは細菌の抗原またはそのエピトープを含有するその誘導体の産生を指示するもの）には、それだけには限定されないが、表１に記載のものが含まれる。
【０１６５】
別の実施形態では、抗原は、線虫によって引き起こされる障害に対して保護するために、線虫の抗原のエピトープを含む。別の実施形態では、組換えＶＳＶによって発現された場合に脊椎動物宿主中で免疫原性である、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）エピトープをコードしている任意のＤＮＡ配列を単離して、本発明によるＶＳＶ（−）ＤＮＡ内に挿入する。ＤＮＡ源として役割を果たすプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種には、それだけには限定されないが、ヒトマラリア寄生生物の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、ならびに動物マラリア寄生生物のネズミマラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）、二日熱マラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、およびサルマラリア原虫（Ｐ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）が含まれる。さらに別の実施形態では、抗原は、コレラ毒素のβ−サブユニットのペプチドを含む。
【０１６６】
相乗的に弱毒化したＶＳＶによって発現されるエピトープを発現するウイルス（外来ＲＮＡが、ウイルスの抗原またはそのエピトープを含むその誘導体の産生を指示するもの）には、それだけには限定されないが、表２に記載のものが含まれ、これは、利便性のためにそのようなウイルスを科ごとに記載し、限定するものではない。
【０１６７】
具体的な実施形態では、弱毒化したＶＳＶによる宿主の感染の際に発現される、外来配列によってコードされている抗原は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質（Ｇ）、麻疹ウイルス赤血球凝集素または２型単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＤの抗原性または免疫原性を示す。
【０１６８】
【表１】
2011507523.tif 000003
【０１６９】
【表２−１】
2011507523.tif 000004
【０１７０】
【表２−２】
2011507523.tif 000005
【０１７１】
【表２−３】
2011507523.tif 000006
【０１７２】
弱毒化したＶＳＶによって発現される他の抗原には、それだけには限定されないが、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  Ｉの外被糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）２４Ｍエピトープ、ＳｐｅＡ、ＳｐｅＢ、ＳｐｅＣまたはＣ５ａペプチダーゼ、および淋菌性ピリンの抗原の抗原性または免疫原性を示すものが含まれる。
【０１７３】
他の実施形態では、弱毒化し、さらに遺伝子改変ＶＳＶによって発現された抗原は、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、セルプリナ・ハイドディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）保護抗原、ウシウイルス下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ赤血球凝集素、またはブタインフルエンザノイラミニダーゼの抗原性または免疫原性を示す。
【０１７４】
特定の実施形態では、弱毒化し、さらに遺伝子改変ＶＳＶによって発現された抗原は、それだけには限定されないが、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルスなどを含めた、イヌ科動物またはネコ科動物の病原体に由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１７５】
特定の他の実施形態では、弱毒化し、さらに遺伝子改変ＶＳＶによって発現された抗原は、セルプリナ・ハイオディセンテリア（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ発熱ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（たとえば、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅもしくは糖タンパク質Ｇ）、または感染性喉頭気管炎ウイルス（たとえば、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇもしくは糖タンパク質Ｉ）に由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１７６】
別の実施形態では、抗原は、ラクロスウイルス、新生子ウシ下痢ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、プンタトロウイルス、ネズミ白血病ウイルスまたはマウス乳癌ウイルスの糖タンパク質の抗原性または免疫原性を示す。
【０１７７】
他の実施形態では、抗原は、それだけには限定されないが、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（１型および／または２型）、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ならびに百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を含めた、ヒト病原体の抗原の抗原性または免疫原性を示す。
【０１７８】
弱毒化したＶＳＶによって発現される抗原として使用するための、潜在的に有用な抗原またはその誘導体は、病原体の感染力の中和における抗原の関与、種類または群の特異性、患者の抗血清もしくは免疫細胞による認識、および／または抗原に特異的な抗血清もしくは免疫細胞の保護効果の実証などの、様々な基準によって同定する。
【０１７９】
別の実施形態では、弱毒化したＶＳＶの外来ＲＮＡは、エピトープを含む抗原の産生を指示し、これは、弱毒化したＶＳＶを所望の宿主内に導入した際に、エピトープを含有する部分によって引き起こされる状態または障害に対して保護する免疫応答を誘導する。たとえば、抗原は、腫瘍（たとえば悪性腫瘍）に対する保護的免疫応答を誘導するために、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。そのような腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原には、それだけには限定されないが、ＫＳ１／４汎癌腫（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、子宮癌抗原（ＣＡ１２５）、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原ｐ９７、黒色腫抗原ｇｐ７５、高分子量黒色腫抗原および前立腺特異的膜抗原が含まれる。
【０１８０】
弱毒化したＶＳＶ  ＤＮＡの非必須部位内に挿入される抗原をコードしている外来ＤＮＡは、弱毒化したＶＳＶに感染した宿主において発現され、免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードしている外来ＤＮＡ配列を、さらに含んでいてもよい。たとえば、そのようなサイトカインには、それだけには限定されないが、インターロイキン１α、１β、２、４、５、６、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ならびに腫瘍壊死因子αおよびβが含まれる。
【０１８１】
免疫原性および医薬組成物
特定の実施形態では、本発明は、免疫原性的な用量の、そのゲノム中に少なくとも２つの異なる突然変異のクラスおよび複製に必須でないＶＳＶゲノムの領域内に挿入されたまたはそれを置き換える少なくとも１つの外来ＲＮＡ配列を含む遺伝子改変ＶＳＶベクターを含む免疫原性組成物を対象とし、２つの突然変異は、ＶＳＶの病原性を相乗的に弱毒化する。遺伝子改変ＶＳＶは、本明細書中に記載のように、ウイルスを低ＭＯＩで約５〜１５継代培養することによって、細胞培養物中での成長にさらに適応させてもよく、このさらに遺伝子改変および弱毒化したＶＳＶを用いて、免疫原性組成物を調製し得る。
【０１８２】
本発明の相乗的に弱毒化し、遺伝子改変ＶＳＶベクターは、哺乳動物対象（たとえばヒト）に投与するために配合する。そのような組成物は、典型的には、ＶＳＶベクターと薬学的に許容できる担体とを含む。本明細書中で以降使用する言葉「薬学的に許容できる担体」には、薬学的投与に適合している任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることが意図される。薬学活性のある物質用のそのような培地および薬剤の使用は、当分野で周知である。任意の慣用の培地または薬剤がＶＳＶベクターと不適合である場合を除いて、そのような培地を本発明の免疫原性組成物中で使用する。また、補助活性化合物も組成物中に取り込ませ得る。
【０１８３】
したがって、本発明のＶＳＶ免疫原性組成物は、その意図する投与経路に適合するように配合する。投与経路の例には、非経口（たとえば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内）および粘膜（たとえば、経口、直腸、鼻腔内、頬側、経膣、呼吸器）が含まれる。非経口、皮内、または皮下の施用に使用する液剤または懸濁液には、以下の構成要素が含まれる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌的な希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節する。非経口調節物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアルに封入することができる。
【０１８４】
注射使用に適した医薬組成物には、無菌的な水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌的な注射用液剤または分散液を即時調製するための無菌的な散剤が含まれる。静脈内投与では、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。これは製造および保存の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒である。たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性が維持される。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などによって達成する。多くの場合、組成物中に等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされる。
【０１８５】
無菌的な注射用液剤は、所要量（または用量）のＶＳＶベクターを、適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって調製する。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものの中からの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル中に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用液剤を調製するための無菌的な散剤の場合は、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、事前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分および任意の追加の所望の成分の散剤が得られる。
【０１８６】
吸入による投与では、化合物は、適切な噴霧剤（たとえば、二酸化炭素または霧化剤などの気体）を含有する圧力容器またはディスペンサーから、エアロゾルスプレーの形態で送達する。また、全身投与は、粘膜または経皮手段によるものであり得る。粘膜または経皮投与では、透過させるバリアに対して適切な浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野で知られており、たとえば、粘膜投与では、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を使用することによって達成される。また、化合物は、坐薬（たとえば、カカオ脂および他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いて）または直腸送達のための保留浣腸の形態でも調製する。
【０１８７】
特定の実施形態では、投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で配合することが有利である。本明細書中で以降使用する単位剤形とは、治療する対象の単位用量として適切な、物理的に別々の単位をいい、それぞれの単位は、所望の治療効果が生じるように計算した、事前に決定された量の活性化合物を、所要の薬学担体と会合して含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特徴および達成する特定の治療効果、ならびに個体を治療するためにそのような活性化合物を配合する分野に特有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０１８８】
本明細書中で引用するすべての特許および出版物は、本明細書中に参照により組み込まれている。
【０１８９】
ＶＳＶをベクター化した（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）免疫原性組成物の産生には、一般に、適切な細胞培養物（宿主）を組換えＶＳＶに感染させることと、ＶＳＶを細胞培養物中で成長させることと、細胞培養液を適切な時に収集することと、ＶＳＶを細胞培養物液から精製することとが含まれる。臨床応用においてＶＳＶベクターおよびその免疫原性組成物を使用することは、世界中の様々な薬物安全性の当局（たとえば、食品薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）、カナダ健康製品食品局（ＨＰＦＢ）など）の安全性の規制に準拠するために、適切な純度のＶＳＶ試料（または用量）を必要とする。
【０１９０】
しかし、典型的には、ＶＳＶを細胞培養汚染物質（たとえば、細胞培養物の不純タンパク質およびＤＮＡ）から分離し、現在利用可能なＶＳＶ精製プロセス（たとえばスクロース勾配遠心分離による精製）を用いて適切な純度および収量のＶＳＶを得ることは、困難である。たとえば、現在利用可能な精製プロセスを用いた場合、典型的には、ＶＳＶ試料の純度と回収率（収量パーセント）との間には反比例の関係が存在し、これにより、十分な量の精製したＶＳＶの製造が困難となる。さらに、現在のバイオリアクターに基づいたプロセスでは、細胞濃度の増加および培養時間の延長は、より高いＶＳＶ力価をもたらし、同時にバイオリアクター液中の細胞細片および有機構成要素の濃度を増加させ、ＶＳＶ精製プロセスがさらに複雑となる。
【０１９１】
スクロース勾配超遠心は、１９６４年以降、ウイルス精製（ＶＳＶ精製が含まれる）の標準方法である（Ｙａｍａｄａら、２００３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４（５）：１０７４〜１０７８、１０８０、Ｂｒｏｗｎら、１９６７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、９９（１）：１７１〜７、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９６５、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、５４（１）：１３７〜４４、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９６４、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．、１７（６）：２９５〜３０５）。しかし、ウイルス濃度が増加するにつれて、細胞細片、宿主ＤＮＡおよびタンパク質不純物の増加も同時に起こり、これらは、高濃度ではスクロース勾配超遠心によって除去することが非常に困難である。さらに、スクロース勾配超遠心はスケールアップした場合に非常に高価であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿（ＭｃＳｈａｒｒｙら、１９７０
Ｖｉｒｏｌ．、４０（３）：７４５〜６）によるＶＳＶの濃縮および精製も、高い不純物レベルの同様の問題を有する。
【０１９２】
比較的高品質なウイルスがサイズ排除クロマトグラフィーによって得られている（Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｉｏｎら、２００３、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４（１２）：１１３９〜１１５３、Ｖｅｌｌｅｋａｍｐら、２００１、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１２（１５）：１９２３〜３６、Ｒａｂｏｔｔｉら、１９７１、Ｃｏｍｐｔｅｓ  Ｒｅｎｄｕｓ  ｄｅｓ  Ｓｅａｎｃｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｒｉｅ  Ｄ：Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎａｔｕｒｅｌｌｅｓ、２７２（２）：３４３〜６、Ｊａｃｏｌｉら、１９６８、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｇｅｎｌ  Ｓｕｂｊ．、１６５（２）：９９〜３０２）。しかし、プロセスの費用および稼働の困難さにより、これは、一般に大スケールのウイルス産生に実現可能でない。ヘパリン（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６（６）：９７３〜９８５）、レクチン（Ｋａａｒｓｎａｅｓら、１９８３、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．、２６６：６４３〜９、Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、１９７６、Ｐｒｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｆｌｕｉｄｓ、２３：６６３〜５）およびＭａｔｒｅｘ（商標）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）スルフェート（Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３８（２）：２１５〜２２８）などのアフィニティークロマトグラフィーでは、ウイルス精製においてある程度の応用が見つかっている。ヘパリンおよびレクチンは、漏出の可能性の問題があり、製品をリリースする前にさらなる試験が必要となるため、一般にｃＧＭＰウイルス産生に好ましくない（使用されない）。
【０１９３】
Ｍａｔｒｅｘ（商標）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）スルフェートを用いたウイルスの親和性精製は、ウイルス精製、ウイルス品質およびカラム再生の効率が原因で、未解決の問題である。ＶＳＶ精製には、非常に大きな親和性カラムが必要である（たとえば、１リットルの細胞培養物あたり０．２ＬのＭａｔｒｅｘ（商標）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）スルフェート樹脂、Ｗｙｅｔｈ  Ｖａｃｃｉｎｅの未発表の結果）。イオン交換クロマトグラフィーによって、単独で、またはウイルス精製で使用される他の種類の従来のクロマトグラフィー技術と組み合わせて精製した場合は、低いウイルス収量が観察された（国際公開公報ＷＯ２００６／０１１５８０号、Ｓｐｅｃｈｔら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８８（４）：４６５〜１７３、Ｙａｍａｄａら、２００３、上記引用、Ｖｅｌｌｅｋａｍｐら、２００１、上記引用、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、１９９９、上記引用、（国際公開公報ＷＯ１９９７／０６２４３号、Ｋａａｒｓｎａｅｓら、１９８３、上記引用）。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は例示のためのみであり、本発明の条件および範囲に関して完全に決定的であることを意図しないことを理解されたい。典型的な反応条件（たとえば、温度、反応時間など）を与えた場合、指定した範囲を超える条件および下回る条件も、一般に利便性は低下するが、どちらも使用できることを理解されたい。別段に指定しない限りは、本明細書中で言及するすべての部および％は重量に基づいており、すべての温度は摂氏で表す。
【０１９５】
（実施例１）
ＶＳＶインディアナ（ＩＮ）およびＶＳＶニュージャージー（ＮＪ）血清型を用いたウイルスの継代培養研究
図１は、ｗｔ  ＶＳＶおよびａｔｔｎ  ＶＳＶＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のゲノム構成を例示している。図２は、ウイルスをＶｅｒｏ細胞中で連続継代培養するために使用した実験プロトコルの概要である。５継代ごとのウイルスを、示したアッセイによって分析した。図８Ａ〜８Ｌは、ＶＳＶインディアナ血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。図９Ａ〜９Ｍは、ＶＳＶニュージャージー血清型の元の（継代０回目またはＰ０）ウイルスと継代２５回目とのヌクレオチド（ＮＴ）およびアミノ酸（ＡＡ）配列の比較を示す。継代培養したウイルス中のＮＴおよびＡＡ置換を太字で示す。これらの配列は、表５および配列表中に要約されている。
【０１９６】
弱毒化したｒＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１Ｇａｇ１を、Ｖｅｒｏの静置培養物中での継代培養の出発物質として使用した。Ｔ２５フラスコ中のＶｅｒｏ細胞に、弱毒化したウイルスを、０．０１の感染多重度で、ＤＭＥＭ（無血清、抗生物質を含まない）中で接種した。ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞単層の９０〜１００％で明らかとなった際に、フラスコを３２℃で２〜３日間インキュベーションした。培地を収集し、低速遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）によって清澄にした。１×スクロースリン酸（ＳＰ）緩衝液（最終濃度）を加えた後、清澄にしたウイルスをドライアイスエタノール浴中でフラッシュ凍結し、≦−６０℃で保存した。このウイルスを、継代１回目またはＰ１のｒｒＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１Ｇａｇとして標識した。このウイルスを同様に用いて、新鮮なＶｅｒｏ細胞のＴ２５フラスコを０．０１のｍｏｉで接種して、Ｐ２が生じた。連続継代培養と呼ばれるこのプロセスを２５回繰り返して、Ｐ１〜Ｐ２５のウイルスを作製した。それぞれの継代で、Ｖｅｒｏ単層上で行った感染力アッセイによってウイルスの力価決定を行った。
【０１９７】
ＶＳＶｉｎ血清型を用いた連続継代後のアミノ酸置換の自然増加を図３に示す。Ｖｅｒｏ細胞中、０．０１のＭＯＩで継代培養したＶＳＶｉｎウイルスの成長動態を図５に示す。
【０１９８】
ＶＳＶｎｊ血清型を用いた連続継代後のアミノ酸置換の自然増加を図４に示す。Ｖｅｒｏ細胞中、０．０１のＭＯＩで継代培養したＶＳＶｎｊウイルスの成長動態を図６に示す。
【０１９９】
（実施例２）
組換えＶＳＶＮ４ＣＴ１ｇａｇ１の産生
ＶＳＶインディアン血清型（ＶＳＶｉｎ）の組織培養に適応させたサンフアン株およびその対応するゲノムｃＤＮＡは、エール大学、コネチカット州Ｎｅｗ  ＨａｖｅｎのＪｏｈｎ  Ｋ．Ｒｏｓｅ博士から提供され、ｒＶＳＶＮ４ＣＴ１ｇａｇ１組換え体の誘導に使用した。
【０２００】
ｒＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１ｇａｇ１プラスミドＤＮＡを調製する詳細な手順は、既に記載されている（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８１、２０５６〜６４、２００７およびＣｏｏｐｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２：２０７〜２９、２００８）。類似体のＮＪ血清型の糖タンパク質ベクター、ｒＶＳＶｎｊＮ４ＣＴ１ｇａｇ１は、Ｇｉｎ遺伝子を、Ｇｎｊ遺伝子の切断された形態で置き換えることによって作製し、Ｃｏｏｐｅｒら、２００８に記載されている。図１は、ｗｔ  ＶＳＶに由来する弱毒化したＶＳＶ組換え体の、ウイルスゲノム内のウイルス遺伝子の順序を模式的に示す。
【０２０１】
感染性ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞を、完全長ゲノムを含有するウイルスゲノムプラスミドならびにＶＳＶ  Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＭおよびＧタンパク質を個別にコードしている５つの発現プラスミドで形質移入した後に、ゲノムｃＤＮＡから回収した。これらのプラスミドからの発現は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にある。ポリメラーゼは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー領域の制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドの電気穿孔によって供給した。救済されたｒＶＳＶは、３〜４回のクローン単離によって精製し、３回のＶｅｒｏ細胞中での継代培養によって増幅した。ウイルス救済ならびにすべての続く精製および増幅は、Ｖｅｒｏ細胞中で行った。ウイルスの救済に使用したウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ニュージーランド起源のものであった。救済後のすべてのステップは、無血清培地（ＤＭＥＭ）中で行った。クローン精製後のすべてのステップは、無血清の抗生物質を含まない培地（ＤＭＥＭ）中で行った。
【０２０２】
手短に述べると、Ｔ１５０フラスコからの約２．０×１０７個のＶｅｒｏ細胞を、１０μｇのｒＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１Ｇａｇ１の完全長ウイルスｃＤＮＡプラスミド、ならびに、Ｔ７プロモーターの制御下にある、ＶＳＶ  Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、およびＧタンパク質をコードしている５つの支援プラスミド（それぞれ１０、４、１、１、２μｇ）を含有するチューブ内に入れた。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを供給するために７つ目のプラスミドを５０μｇで加え、このプラスミドは、細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって制御される。懸濁液を電気穿孔に供し、細胞を再懸濁させ、Ｔ１５０フラスコに移した。フラスコを３７℃で３時間インキュベーションし、４３℃で５時間の熱ショックを与え、その後、３７℃で終夜インキュベーションした。培地を翌日交換し、２日目にフラスコを３２℃でインキュベーションした。フラスコはそれぞれの営業日にＣＰＥの兆候について検査した。ＣＰＥの兆候を示すフラスコを、８０〜１００％のＣＰＥに達するまで追跡した。この時点で、救済したウイルスを含有する培地（救済上清）を収集し、ウイルス安定化剤として１×ＳＰ１を添加し、フラッシュ凍結し、≦−６０℃で保存した。すべての救済上清を、Ｇａｇに特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析によって、Ｇａｇ発現についてスクリーニングした。Ｇａｇ発現を示す救済したウイルスを、ウイルスゲノムの配列決定に供した。正しい配列を有するそれぞれの血清型の１つまたは複数のウイルスクローンを、さらなるプラークの精製および増幅のために選択した。
【０２０３】
ウイルスのプラーク形成は、寒天重層を有する６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞で、ゲンタマイシンを含み、血清を含まないＤＭＥＭ中で行った。≦５個のプラーク／ウェルを達成するために、感染性ウイルスを含有する救済上清をＤＭＥＭで希釈した。いくつかの十分に単離されたプラークを選択し、ＤＭＥＭに懸濁させ、２〜３回のさらなるプラークの精製ラウンドに供した。４回目のクローニングからのリードプラークを選択し、ＤＭＥＭに懸濁させ、その後、それぞれ６ウェルプレート、Ｔ２５フラスコおよびＴ１５０フラスコ中のＶｅｒｏ細胞での３回の連続的なウイルス増幅に使用した。増幅は、血清を含まず、抗生物質を含まないＤＭＥＭを用いて行った。このプロセスによって得られた組換えウイルスは低継代ウイルスと呼ばれ、以下に記載の細胞適応のための、Ｖｅｒｏ細胞でのさらなる継代培養に使用した。
【０２０４】
（実施例３）
連続継代培養の実験プロトコル
それぞれの血清型の低継代ＶＳＶ組換え体（Ｐ０）を、図２に示すように、Ｔ２５フラスコ中のＶｅｒｏ細胞単層で連続２５回継代培養した。無血清培地上で成長させたＶｅｒｏ細胞を、約０．０１までの感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスに感染させ、大規模なＣＰＥが明白となるまで、通常は感染後４８〜７２時間まで、３２℃／５％のＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。それぞれの増幅後、ウイルス培養物を低速の遠心分離によって清澄にし、１×ＳＰスクロースリン酸緩衝液で安定化させた。１０×ＳＰは、１リットルあたり、１２．２ｇｍの二塩基性リン酸カリウム、５．１７ｇｍの一塩基性リン酸カリウム、７４６．２ｇｍのスクロースを含有する）。継代１〜２５回目からのウイルス培養物は、以前に記載したプラークアッセイによって力価決定した（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１：２０５６〜６４、２００７。ヌクレオチドの配列決定は５継代ごとに行った。
【０２０５】
（実施例４）
マウスのＩＣ  ＬＤ５０研究の結果
マウスのＩＣ  ＬＤ５０研究
若いマウスは、頭蓋内接種（ＩＣ）後にＶＳＶの感染に感受性が高く、迅速な罹患および死亡が引き起こされる。マウスのＩＣ  ＬＤ５０神経毒性動物モデルは、高感度であり、ＶＳＶ組換え体の病原性における変化を識別可能であることが示されている（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１、２０５６〜６４、２００７）。したがって、ｗｔ  ＶＳＶｉｎを受けたマウスは、重量が劇的に減少し、１〜２ｐｆｕのＬＤ５０の接種後２〜４日間に死亡した。他方で、ＣＴ切断または遺伝子シャッフルのどちらかを含有するウイルスは、１２〜２１ｐｆｕのＬＤ５０を有するｗｔ  ＶＳＶよりも弱毒化されていることが示された（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１、２０５６〜６４、２００７）。しかし、ＣＴ１突然変異を遺伝子シャッフル（Ｎ４およびまたはｇａｇ１）突然変異と組み合わせた場合に、病原性の劇的な減少が見られた。たとえば、低継代ｒＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１ｇａｇ１は、この動物モデルで試験した最高用量である＞１０７ｐｆｕのＬＤ５０で非常に低いレベルの病原性を示した。このウイルスを接種したマウスは、接種後にその重量が最初に１０〜２０％減少したが、約２〜３週間以内に正常な重量まで回復した。同様の結果がウイルスのＮＪ血清型で見られた（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２、２０７〜２９、２００８）。
【０２０６】
それぞれの血清型（ＩＮおよびＮＪ）で継代１５〜２５回目の本発明のＶｅｒｏに適応させたＶＳＶＮ４ＣＴ１ｇａｇ１を、ネズミＩＣ  ＬＤ５０動物モデルで試験した。病原性の増加は見られず、図７に示すように、すべての継代培養したウイルスで＞１０７ｐｆｕのＬＤ５０であった。これらの結果により、細胞培養物中で継代培養したウイルス中で生じた適応的突然変異は、ウイルスの病原性に影響を与えなかったことが示された。低い病原性、および高い力価でのその増強された複製により、継代培養したウイルスが、ヒト臨床治験における試験に適切となる。
【０２０７】
方法
マウスのＩＣ  ＬＤ５０研究の実験の詳細は、Ｃｌａｒｋｅら（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１、２０５６〜６４、２００７）およびＣｏｏｐｅｒら（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２、２０７〜２９、２００８）に示されている。５週齢の雌のスイスウェブスターマウスに麻酔をし、体積３０μｌのウイルスの１０倍希釈液をＩＣ注射した（１つの希釈あたり１０匹の動物、希釈は、ほぼ予測されるＬＤ５０の範囲となるように行った）。重量および健康状態を２週間の間毎日記録した。両側が麻痺した、または苦痛もしくは重篤な疾病の顕著な兆候を示すマウスを屠殺し、ＶＳＶ疾患に屈したと記録した。ＬＤ５０は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、２７、４９３〜９７、１９３８）の方法によって決定した。
【０２０８】
要約
初期継代のｒＶＳＶＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１ウイルス（Ｐ０）と比較して、連続継代培養したＰ１５ウイルスは、はるかに高い力価まで成長した。これにより、臨床治験材料の（ＣＴＭ）大スケールの製造が容易となった。さらに、Ｐ１５による適応的突然変異の安定化により、ウイルスに、ＣＴＭの製造中に製造ロット間の一貫性がもたらされた。さらに、継代培養したウイルスの安全性プロフィールは、ネズミＩＣ  ＬＤ５０動物モデルによって試験して変化しないまま保たれ、それにより、臨床評価における適切性が維持された。
【０２０９】
（実施例５）
ベクター化したＨＩＶのスケールアップ
７．５グラム／ＬのＣｙｔｏｄｅｘ  Ｉマイクロキャリアを含有する１０Ｌのバイオリアクター（８Ｌの作業体積）に、約５×１０５個の細胞／ｍＬのＶｅｒｏ細胞を接種した。バイオリアクターを、０．５倍の培養体積／日のＧｉｂｃｏ  ＶＰ−ＳＦＭ培地（フェノールレッドを含むまたは含まない）を用いて、３７℃で灌流した。７０〜９０時間後、または細胞密度が≧２×１０６個の細胞／ｍＬとなった際に、培養物を、０．００１のＭＯＩ、３２℃で、低継代（≦Ｐ５）または高継代（Ｐ１５）のＶＳＶ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１ウイルスのどちらかに感染させた。培養物を毎日２〜３回試料採取し、最終的には感染後４８〜６０時間に収集した。
【０２１０】
インディアナ血清型を１０リットルのバイオリアクターにスケールアップして、低継代（≦Ｐ５）および高継代（Ｐ１５）のウイルスをどちらも試験した。バイオリアクターの実行、Ｘ−ＢＲＮ１０−ＶＳＶ−１４、１７、および２８は、低継代のウイルス物質（実線）を用いて培養物を感染させて、完了させた。バイオリアクターの実行、Ｘ−ＢＲＮ１０−ＶＳＶ−３１、３３および３４は、高継代の研究ウイルス種（破線）を用いて完了させた。それぞれの実行の成長動態を図１０に示す。ウイルスの継代数は、図の凡例中の角括弧内に示す。
【０２１１】
高および低継代の実行のどちらにおいても、それぞれの実行の組は互いに矛盾がなかった。高継代のバイオリアクターの実行は、低継代の実行よりも２ｌｏｇまで高い力価を生じた。高継代の物質の成長動態に基づいて、収集時点は、感染後約４８時間と決定された。
【０２１２】
ニュージャージー血清型を１０リットルのバイオリアクターにスケールアップして、低継代（≦Ｐ５）および高継代（Ｐ１５）のウイルスをどちらも再度試験した。バイオリアクターの実行、Ｘ−ＢＲＮ１０−ＶＳＶ−１５、１８、１９、２０、２２および２３は、低継代のウイルス物質（実線）を用いて培養物を感染させて、完了させた。バイオリアクターの実行、Ｘ−ＢＲＮ１０−ＶＳＶ−３６、および３７は、高継代の研究ウイルス種（破線）を用いて完了させた。それぞれの実行の成長動態を図１１に示す。
【０２１３】
ニュージャージー構築体の低継代および高継代の実行の間では、インディアナ構築体で観察されたよりも差異が少なかった。高継代の物質の成長動態に基づいて、ＶＳＶｎｊＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１の収集時点は、ＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１と同様に、感染後約４８時間と決定された。結論として、Ｐ１５のＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１は、インディアナでは、バイオリアクター力価の約３５倍までの増加および細胞１個あたり産生されたウイルス粒子の数の４５倍の増加、ニュージャージーでは、バイオリアクター力価の約５倍までの増加および細胞１個あたり産生されたウイルス粒子の数の７倍の増加をもたらした。（表３および４を参照）
【０２１４】
【表３】
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【０２１５】
【表４】
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【０２１６】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
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【図９−１９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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