(57)【要約】  本発明は、新規サイトカインであって、それらの同種受容体に対する改変された選択性／特異性を有するサイトカインに関する。特に、本発明は、死受容体５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を有する変異ＴＲＡＩＬタンパク質に関する。加えて、本発明は、囮受容体であるＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）およびＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を示す変異ＴＲＡＩＬタンパク質に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
死受容体５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を有する、変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２】
囮受容体であるＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）およびＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を示す、請求項１に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項３】
死受容体５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対する親和性よりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対する親和性が実質的に高い、請求項１または請求項２に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項４】
囮受容体であるＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対する親和性よりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対する親和性が実質的に高い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項５】
野生型ＴＲＡＩＬ分子よりも、ＤＲ４に対する結合親和性が高い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項６】
野生型ＴＲＡＩＬ分子よりも、ＤＲ５、ＤｃＲ１および／またはＤｃＲ２に対する結合親和性が低い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項７】
１３１位、１４９位、１５９位、１９３位、１９９位、２０１位、２０４位、２１２位、２１５位、２１８位および２５１位からなる群から選択される１以上の位置において突然変異している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項８】
前記１つ以上の突然変異が、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ  Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、およびＫ２５１Ｑからなる群から選択される、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項９】
１９９位および２０１位の両方が突然変異している、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１０】
突然変異Ｎ１９９ＲおよびＫ２０１Ｈ、またはＮ１９９ＨおよびＫ２０１Ｒを含む、請求項８に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１１】
１３１位および２１８位の両方が突然変異している、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１２】
突然変異Ｇ１３１ＲおよびＤ２１８Ｈを含む、請求項１１に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１３】
１３１位、１９９位および２０１位の全てが突然変異している、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１４】
突然変異Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９ＲおよびＫ２０１Ｈを含む、請求項１３に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１５】
１４９位、１５９位、１９３位、２０４位、２１２位、２１５位、２１８位および２５１位に１つ以上の突然変異をさらに含んでなる、請求項１３または請求項１４に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１６】
前記１つ以上の突然変異が１４９位、１５９位および２１５位にある、請求項１５に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１７】
１５９位において、さらに１４９位、１９３位、２０４位、２１２位、２１５位、２１８位および２５１位からなる群から選択される１以上の位置において突然変異している、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１８】
１５９位において、さらに１４９位および／または２１５位において突然変異している、請求項１７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項１９】
１３１位および２１８位の両方が突然変異している、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２０】
１３１位、１９９位、２０１位、２１５位および２１８位のアミノ酸の１以上が塩基性アミノ酸に置換されている、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２１】
前記塩基性アミノ酸がリジン、アルギニンまたはヒスチジンである、請求項１８に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２２】
２１５位のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されている、請求項７に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２３】
前記酸性アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項２０に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２４】
表３に示す突然変異の１つ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２５】
所望によりメチオニン残基が前に付いていてよい、全長ＴＲＡＩＬ配列のアミノ酸１１４〜２８１の変異体を含んでなるまたはからなる断片である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２６】
配列番号３で示されるアミノ酸配列の変異体を含んでなるまたはからなる、請求項２５に記載のＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２７】
癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の変異ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号２の変異体；配列番号２のヌクレオチド８８〜９３３の変異体；配列番号４の変異体：である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載のポリヌクレオチドを発現する、宿主細胞。
【請求項３１】
哺乳類細胞においてアポトーシスを誘導するための、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＤＲ４特異的ＴＲＡＩＬ変異体。
【請求項３２】
前記哺乳類細胞が、主としてＤＲ４特異的経路を介してシグナルを伝達する、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記哺乳類細胞が癌細胞である、請求項３１または請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記癌細胞が卵巣癌、結腸癌または白血病の細胞である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のＴＲＡＩＬ変異体を含んでなる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規サイトカインであって、それらの関連した受容体に対する改変された選択性／特異性を有するサイトカインに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、主として白血球から分泌される増殖因子のファミリーであり、ナノモル以下の濃度で細胞過程をもたらし得る強力な調節因子として作用するメッセンジャータンパク質である。サイトカインは、それらのサイズから、体内に迅速に輸送され必要に応じて分解され得る。広範な細胞機能（特に免疫応答および細胞増殖）の制御におけるサイトカインの役割は、過去２０年にわたる広範な研究により明らかになっている(非特許文献１)。これらの役割には、免疫応答の調節(非特許文献２)、炎症(非特許文献３)、創傷治癒(非特許文献４)、胚形成および発生、ならびにアポトーシス(非特許文献５)が含まれる。
【０００３】
これまでのサイトカインの臨床用途は、免疫系の調節因子としてのそれらの役割(非特許文献６)、例えば、甲状腺癌に対する応答の促進におけるそれらの役割(非特許文献７)に重点が置かれていた。サイトカインは細胞増殖および分化を制御することから、サイトカインは抗癌標的にもなっている(非特許文献８，９)。サイトカインおよびサイトカイン受容体の新規突然変異は、耐病性を与える場合があることが示されている(非特許文献１０)。活性を修飾し潜在的副作用を取り除くための合成サイトカイン（突然変異タンパク質）の創出も重要な研究方法となっている(非特許文献１１)。
【０００４】
このように、サイトカイン分子は、多様な生理学的機能において役割を果たし、それらの多くは疾患過程において役割を果たすことが分かっている。サイトカインの活性または特異性の改変は、疾患表現型を変えるための手段であり、そのようなものとして、新規サイトカイン分子の同定は科学的に非常に興味深い。
【０００５】
特に興味深いのは、腫瘍壊死因子リガンド（ＴＮＦ）ファミリーに属するリガンドである。これらのタンパク質は細胞増殖からアポトーシスに及ぶ広範な生物学的活性に関与している。
【０００６】
ＴＮＦリガンドファミリーの一メンバーであるＴＲＡＩＬは、その可溶性形態で、in vitroおよびin vivoにて腫瘍細胞においてアポトーシスを選択的に誘導する。他のアポトーシス誘導ＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、ＴＲＡＩＬは、正常な健康組織に対して不活性であるように思われるため、潜在的癌治療用物質として高い関心を集めている(非特許文献１２)。そのため、ＴＲＡＩＬは腫瘍細胞に対する安全で強力な治療薬となる可能性がある。複数のin vitro研究により、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣および結腸の癌ならびに黒色腫、白血病および多発性骨髄腫などの異なる起源の多くの腫瘍細胞系統は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性が高いことが分かっている。
【０００７】
また、ＴＲＡＩＬは、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）などの免疫系修飾において重要な役割を果たし得ることも報告されている。
【０００８】
最近の重要な刊行物により、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）は、遺伝毒性薬であるドキソルビシンの使用により、乳房腫瘍細胞においてｐ５３によりアップレギュレートされることが示された(非特許文献１３)。これは、野生型（ＷＴ）ＴＲＡＩＬが囮受容体（アポトーシスを起こさない）とも結合するために、抗腫瘍療法においてその有効性が弱まる可能性があることを意味している。そのため、選択性／特異性が改変されたＴＲＡＩＬの変異体は、アポトーシス促進性受容体であるＤＲ４（死受容体４、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（死受容体５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に直接結合するということも考えられる。さらに、そのような変異体は、囮受容体による結合を逃れ、アポプトトシス誘導性受容体(the apoptotosis-inducing receptors)であるＤＲ４またはＤＲ５に利用可能な状態を維持することができ、理論上は、癌治療における最大限に改善された用途を有するかもしれない。
【０００９】
この点において、新規分子の選択性は、種々の受容体の活性化の特定の役割、それゆえいくつかの受容体と結合するリガンドの機能的効果、およびシグナル活性化に関係する関連疾患の病因への付随影響を理解するのに最も重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Boppana, S.B (1996), Indian. J. Pediatr. 63(4):447-52
【非特許文献２】Nishihira, J. (1998), Int. J. Mol. Med. 2(1):17-28
【非特許文献３】Kim, P.K. et al (2000), Surg. Clin. North. Am. 80(3):885-894
【非特許文献４】Clark, R.A. (1991), J. Cell Biochem. 46(1):1-2
【非特許文献５】Flad, H.D. et al (1999), Pathobiology. 67(5-6):291-293
【非特許文献６】Rodriguez, F.H. et al (2000), Curr. Pharm. Des. 6(6):665-680
【非特許文献７】Schmutzler, C. et al (2000), 143(1):15-24
【非特許文献８】Lazar-Molnar, E. et al (2000), Cytokine. 12(6), 547-554
【非特許文献９】Gado, K. (2000), 24(4):195-209
【非特許文献１０】van Deventer, S.J. et al (2000), Intensive Care Med. 26 (Suppl 1):S98:S102
【非特許文献１１】Shanafelt, A.B. et al (1998), 95(16):9454-9458
【非特許文献１２】Ashkenazi et al (1999), J. Clin. Invest 104, 155-162
【非特許文献１３】Ruiz de Almodovar et al. (2003), Nov 17, Manuscript M311243200
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
死受容体５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を有する、変異ＴＲＡＩＬタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＦｏｌｄＸによる計算の結果。負のΔΔＧｉは受容体結合の改善を示し、正のΔΔＧｉは受容体結合の低減を示す。
【図２Ａ】精製リガンドＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、固定化したＤＲ４−Ｉｇ、ＤＲ５−Ｉｇ、ＤｃＲ１−ＩｇおよびＤｃＲ２−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。（Ａ）ＳＰＲにより測定したＤＲ５−Ｉｇに対するまたはＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合；（Ｂ）ＳＰＲにより測定したＤｃＲ１−Ｉｇに対するまたはＤｃＲ２−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。（Ｃ）前記精製リガンドと、固定化したＯＰＧ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＯＰＧに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合をＳＰＲにより測定した。ＢＳＡとともに処方したＯＰＧ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇ（Ｄ）または競合相手としての可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｅ）を使用して実施した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比較して計算した。
【図２Ｂ】精製リガンドＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、固定化したＤＲ４−Ｉｇ、ＤＲ５−Ｉｇ、ＤｃＲ１−ＩｇおよびＤｃＲ２−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。（Ａ）ＳＰＲにより測定したＤＲ５−Ｉｇに対するまたはＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合；（Ｂ）ＳＰＲにより測定したＤｃＲ１−Ｉｇに対するまたはＤｃＲ２−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。（Ｃ）前記精製リガンドと、固定化したＯＰＧ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＯＰＧに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合をＳＰＲにより測定した。ＢＳＡとともに処方したＯＰＧ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇ（Ｄ）または競合相手としての可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｅ）を使用して実施した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比較して計算した。
【図２Ｃ】精製リガンドＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、固定化したＤＲ４−Ｉｇ、ＤＲ５−Ｉｇ、ＤｃＲ１−ＩｇおよびＤｃＲ２−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。（Ａ）ＳＰＲにより測定したＤＲ５−Ｉｇに対するまたはＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合；（Ｂ）ＳＰＲにより測定したＤｃＲ１−Ｉｇに対するまたはＤｃＲ２−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。（Ｃ）前記精製リガンドと、固定化したＯＰＧ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＯＰＧに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合をＳＰＲにより測定した。ＢＳＡとともに処方したＯＰＧ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇ（Ｄ）または競合相手としての可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｅ）を使用して実施した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比較して計算した。
【図２Ｄ】精製リガンドＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、固定化したＤＲ４−Ｉｇ、ＤＲ５−Ｉｇ、ＤｃＲ１−ＩｇおよびＤｃＲ２−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。（Ａ）ＳＰＲにより測定したＤＲ５−Ｉｇに対するまたはＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合；（Ｂ）ＳＰＲにより測定したＤｃＲ１−Ｉｇに対するまたはＤｃＲ２−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。（Ｃ）前記精製リガンドと、固定化したＯＰＧ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＯＰＧに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合をＳＰＲにより測定した。ＢＳＡとともに処方したＯＰＧ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇ（Ｄ）または競合相手としての可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｅ）を使用して実施した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比較して計算した。
【図２Ｅ】精製リガンドＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、固定化したＤＲ４−Ｉｇ、ＤＲ５−Ｉｇ、ＤｃＲ１−ＩｇおよびＤｃＲ２−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。（Ａ）ＳＰＲにより測定したＤＲ５−Ｉｇに対するまたはＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合；（Ｂ）ＳＰＲにより測定したＤｃＲ１−Ｉｇに対するまたはＤｃＲ２−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。（Ｃ）前記精製リガンドと、固定化したＯＰＧ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＯＰＧに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの受容体結合をＳＰＲにより測定した。ＢＳＡとともに処方したＯＰＧ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇ（Ｄ）または競合相手としての可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｅ）を使用して実施した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比較して計算した。
【図３】ＤＲ５感受性Ｃｏｌｏ２０５細胞（Ａ）ならびにＤＲ４感受性ＭＬ−１細胞（Ｂ）およびＥＭ−２細胞（Ｃ）における、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８Ｙ変異体およびＤＲ５選択的リガンドＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒの生物活性。２０ｎｇ／ｍｌ（Ｃｏｌｏ２０５）または１００ｎｇ／ｍｌ（ＥＭ−２）のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたは変異体との３時間のインキュベーション後に、アポトーシス率をアネキシンＶ陽性率として測定した。これらの濃度は、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬがその最大アポトーシス誘導活性を表し始める濃度であることから選択した。アポトーシス誘導活性は、これらの濃度のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性と比較して計算する。
【図４】ＤＲ４選択性に関する２０種の突然変異体の設計について計算したΔΔＧ値（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の表および座標表示グラフ。
【図５】前記精製リガンドと、固定化したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＳＰＲにより測定したＤＲ５−ＩｇおよびＤＲ４−Ｉｇに対するＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９ＲＫ２０１ＨおよびＧ１３１ＲＮ１９９ＲＫ２０１Ｈの受容体結合。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。
【図６Ａ】（Ａ）ＭＬ−１細胞、ＥＭ−２細胞およびＡ２７８０細胞ならびに（Ｂ）ＨＬ−６０、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３およびＭＯＬＭ−１３におけるＴＲＡＩＬ受容体の細胞表面発現。細胞を播種し（ＭＬ−１：３０００００細胞／ｍｌ、ＥＭ−２：３０００００細胞／ｍｌ、Ａ２７８０：３５００００細胞／ｍｌ、ＨＬ−６０：３０００００細胞／ｍｌ、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３：７５００００細胞／ｍｌ、ＭＯＬＭ−１３：１００００００細胞／ｍｌ）、２４時間後にＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の免疫蛍光標識のために回収した。培養皿から細胞を取り出し（Ａ２７８０細胞は、軽いトリプシン処理により回収した）、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２回洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡによる一次抗体の１：１００希釈物中で室温で４０分間インキュベートした（ＤＲ４およびＤＲ５：中和抗体、Alexis、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２：中和ヤギポリクローナル抗体、R&D Systems）。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ標識二次抗体(Sigma)の１：５０希釈物中に再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡで１回そしてＰＢＳで１回洗浄することにより過剰の二次抗体を除去した。フローサイトメトリーによる解析(FacsCalibur, Beckton Dickinson)の前に、これらの細胞をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド中に固定した。ＡＦ：自己蛍光、ＩＣ：アイソタイプ対照。
【図６Ｂ】（Ａ）ＭＬ−１細胞、ＥＭ−２細胞およびＡ２７８０細胞ならびに（Ｂ）ＨＬ−６０、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３およびＭＯＬＭ−１３におけるＴＲＡＩＬ受容体の細胞表面発現。細胞を播種し（ＭＬ−１：３０００００細胞／ｍｌ、ＥＭ−２：３０００００細胞／ｍｌ、Ａ２７８０：３５００００細胞／ｍｌ、ＨＬ−６０：３０００００細胞／ｍｌ、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３：７５００００細胞／ｍｌ、ＭＯＬＭ−１３：１００００００細胞／ｍｌ）、２４時間後にＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の免疫蛍光標識のために回収した。培養皿から細胞を取り出し（Ａ２７８０細胞は、軽いトリプシン処理により回収した）、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２回洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡによる一次抗体の１：１００希釈物中で室温で４０分間インキュベートした（ＤＲ４およびＤＲ５：中和抗体、Alexis、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２：中和ヤギポリクローナル抗体、R&D Systems）。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ標識二次抗体(Sigma)の１：５０希釈物中に再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡで１回そしてＰＢＳで１回洗浄することにより過剰の二次抗体を除去した。フローサイトメトリーによる解析(FacsCalibur, Beckton Dickinson)の前に、これらの細胞をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド中に固定した。ＡＦ：自己蛍光、ＩＣ：アイソタイプ対照。
【図７】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１ＨとＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、ＭＬ−１細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図８】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１ＨとＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、ＥＭ−２細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度でを播種した。このグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図９】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈと、ＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒと、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、Ａ２７８０細胞を３５００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図１０Ａ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＭＬ−１細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（この図ではＥ１９５Ｒと示している）での２４時間処置の２４時間前にＭＬ−１急性骨髄性白血病細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）との効果の比較。
【図１０Ｂ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＭＬ−１細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（この図ではＥ１９５Ｒと示している）での２４時間処置の２４時間前にＭＬ−１急性骨髄性白血病細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）との効果の比較。
【図１１Ａ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＥＭ−２細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＥＭ−２慢性骨髄性白血病細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）との効果の比較。
【図１１Ｂ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＥＭ−２細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＥＭ−２慢性骨髄性白血病細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）との効果の比較。
【図１２】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒと、ＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）と、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、Ａ２７８０細胞を３５００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ染色のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図１３Ａ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＨＬ−６０（前骨髄性白血病細胞、ＰＭＬ、ＡＭＬのサブタイプ）細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１３Ｂ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＨＬ−６０（前骨髄性白血病細胞、ＰＭＬ、ＡＭＬのサブタイプ）細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１４Ａ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３（ＡＭＬ）細胞を７５００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１４Ｂ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３（ＡＭＬ）細胞を７５００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１５Ａ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＭＯＬＭ−１３細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＭＯＬＭ−１３（ＡＭＬ）細胞を１００００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１５Ｂ】ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（Ｅ１９５Ｒ）の、ＭＯＬＭ−１３細胞におけるアポトーシス促進能。漸増用量のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒでの２４時間処置の２４時間前に、ＭＯＬＭ−１３（ＡＭＬ）細胞を１００００００細胞／ｍｌの密度で播種した。これらのグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。（Ａ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ４選択的突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒとの効果の比較。（Ｂ）ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒとの効果の比較。
【図１６】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの、ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応するＣｏｌｏ２０５細胞における生物活性。漸増用量のＮ１９９ＲＫ２０１ＨＧ１３１ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、Ｃｏｌｏ２０５細胞を９６ウェルプレートに増殖培地１ｍｌ当たり４０００００細胞の密度で播種し、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。
【図１７】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８ＨとＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＧ１３１Ｒ／Ｄ２１８ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、ＭＬ−１細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ陽性のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図１８】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８ＨとＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＧ１３１Ｒ／Ｄ２１８ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、ＥＭ−２細胞を３０００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ染色のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図１９】潜在的にＤＲ４選択的なＴＲＡＩＬ突然変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈと、ＤＲ５選択的突然変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒと、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとのアポトーシス促進能の比較。漸増用量のＧ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬでの２４時間処置の２４時間前に、Ａ２７８０細胞を３５００００細胞／ｍｌの密度で播種した。このグラフは、アネキシンＶ染色のフローサイトメトリー解析により決定した死細胞の割合を示している。
【図２０Ａ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの、ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応するＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢｗｔ）（Ａ）およびＤＲ５について欠損しているＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ）（Ｂ）における生物活性。ＢＪＡＢ細胞を９６ウェルプレートに増殖培地（＋１．０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）１ｍｌ当たり４０００００細胞の密度で播種し、漸増用量のＧ１３１ＲＮ１９９ＲＫ２０１ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬを２４時間加えた。ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。
【図２０Ｂ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの、ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応するＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢｗｔ）（Ａ）およびＤＲ５について欠損しているＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ）（Ｂ）における生物活性。ＢＪＡＢ細胞を９６ウェルプレートに増殖培地（＋１．０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）１ｍｌ当たり４０００００細胞の密度で播種し、漸増用量のＧ１３１ＲＮ１９９ＲＫ２０１ＨまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬを２４時間加えた。ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。
【図２１Ａ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｇ１３１Ｒの、ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応するＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢｗｔ）（Ａ）およびＤＲ５について欠損しているＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ）（Ｂ）における生物活性。ＢＪＡＢ細胞を９６ウェルプレートに増殖培地（＋１．０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）１ｍｌ当たり２０００００細胞の密度で播種し、漸増用量のＧ１３１ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬを２４時間加えた。ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。
【図２１Ｂ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｇ１３１Ｒの、ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応するＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢｗｔ）（Ａ）およびＤＲ５について欠損しているＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ）（Ｂ）における生物活性。ＢＪＡＢ細胞を９６ウェルプレートに増殖培地（＋１．０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）１ｍｌ当たり２０００００細胞の密度で播種し、漸増用量のＧ１３１ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬを２４時間加えた。ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。
【図２２】競合相手として可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ａ）、可溶性ＤＲ４−Ｉｇ（Ｂ）、可溶性ＤｃＲ１−Ｉｇ（Ｃ）、または可溶性ＤｃＲ２−Ｉｇ（Ｄ）を使用した、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬとの比較による変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの競合ＥＬＩＳＡ．固定化したＤＲ４−Ｉｇへの結合率は、可溶性競合相手の０ｎｇ／ウェルにおいて結合した量と比較して計算する。ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４およびＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。
【図２３Ａ】変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈは、ＨＬ−６０細胞において、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬよりも効率的に死誘導ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する。ミトコンドリア膜電位の決定により（Ａ）またはプロカスパーゼ８活性化の決定により（Ｂ、上のパネル）、アポトーシスを測定した。上のバンドはプロカスパーゼ−８であり（５５／５３ｋＤａ）、一方、下の二重バンドはプロセッシングを受けたカスパーゼ−８（４３／４１ｋＤａ）である。この下のパネルは、同等のタンパク質負荷の指標としてβ−アクチンの発現を示している（Ｂ）。
【図２３Ｂ】変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈは、ＨＬ−６０細胞において、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬよりも効率的に死誘導ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する。ミトコンドリア膜電位の決定により（Ａ）またはプロカスパーゼ８活性化の決定により（Ｂ、上のパネル）、アポトーシスを測定した。上のバンドはプロカスパーゼ−８であり（５５／５３ｋＤａ）、一方、下の二重バンドはプロセッシングを受けたカスパーゼ−８（４３／４１ｋＤａ）である。この下のパネルは、同等のタンパク質負荷の指標としてβ−アクチンの発現を示している（Ｂ）。
【図２４Ａ】阻害剤であるκ−Ｂキナーゼ（ＩＫＫ）阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１(Calbiochem)でのＮＦ−κＢ活性の阻害は、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの両方の生物活性を増強した。ＨＬ−６０細胞を指示濃度のＢＭＳ−３４５５４１の存在または不在下で１００ｎｇ／ｍｌ（Ａ）または１０ｎｇ／ｍｌ（Ｂ）のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈで１２時間処置した。ＴＭＲＥを用いてミトコンドリア膜電位の損失を測定することにより、細胞死の誘導を判断した。これらのグラフは、低ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を有する細胞の平均割合を示している。
【図２４Ｂ】阻害剤であるκ−Ｂキナーゼ（ＩＫＫ）阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１(Calbiochem)でのＮＦ−κＢ活性の阻害は、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの両方の生物活性を増強した。ＨＬ−６０細胞を指示濃度のＢＭＳ−３４５５４１の存在または不在下で１００ｎｇ／ｍｌ（Ａ）または１０ｎｇ／ｍｌ（Ｂ）のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬまたはＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈで１２時間処置した。ＴＭＲＥを用いてミトコンドリア膜電位の損失を測定することにより、細胞死の誘導を判断した。これらのグラフは、低ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を有する細胞の平均割合を示している。
【図２５】精製ＴＲＡＩＬ変異体Ｒ１４９Ｉと、固定化したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物を約７００ＲＵの密度でＣＭ５センサー表面上に直接固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。
【図２６】精製ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９ＲおよびＫ２０１Ｒと、固定化したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物を約７００ＲＵの密度でＣＭ５センサー表面上に直接固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。
【図２７】変異体Ｓ１５９ＲおよびＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと、直接固定化したＤＲ４−Ｉｇ（Ａ）またはＤＲ５−Ｉｇ（Ｂ）との結合のセンサーグラム。
【図２８】競合相手として可溶性ＤＲ４−Ｉｇ（Ａ）、可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｂ）、可溶性ＤｃＲ１−Ｉｇ（Ｃ）、または可溶性ＤｃＲ２−Ｉｇ（Ｄ）を使用した、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＳ１５９Ｒの競合ＥＬＩＳＡ試験。
【図２９】精製ＴＲＡＩＬ変異体Ｋ２０４Ｙと、固定化したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物を約８００ＲＵの密度でＣＭ５センサー表面上に直接固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。
【図３０】精製ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ２１５Ｄと、固定化したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体キメラとの前定常状態結合を、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。ＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物を約８００ＲＵの密度でＣＭ５センサー表面上に直接固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。ＤＨＥＲ：Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的ｒｈＴＲＡＩＬ変異体、ＤＲ５結合についての陽性対照として使用した）。
【図３１】変異体Ｓ２１５ＤおよびＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの競合ＥＬＩＳＡ。（Ａ）競合相手として可溶性ＤＲ４−Ｉｇを使用した競合ＥＬＩＳＡ。（Ｂ）競合相手として可溶性ＤＲ５−Ｉｇを使用した競合ＥＬＩＳＡ。固定化したＤＲ４−Ｉｇへ結合したリガンドの割合は、可溶性競合相手の０ｎｇ／ウェルにおいて結合した量と比較して計算する。ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４およびＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。
【図３２】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｓ１５９Ｒの骨髄性ＭＬ−１（Ａ）細胞系統およびＥＭ−２（Ｂ）細胞系統に対する細胞傷害効果。アネビンＶアッセイ（Annevin V assay）により細胞死の誘導を定量する際、ＭＬ−１細胞およびＥＭ−２細胞を指示濃度のＷＥＴｒｈＴＲＡＩＬまたは変異体Ｓ１５９Ｒで２４時間処置した。これらのグラフは、細胞死の１つの指標として誘導した平均アネキシンＶ陽性率を示している。
【図３３】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｓ１５９Ｒの結腸癌ＳＷ９４８細胞系統に対する細胞傷害効果。
【図３４Ａ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、Ｓ１５９Ｒの、ＷＴ  ＨＣＴ１１６（上のパネル）およびｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６（下のパネル）ヒト結腸癌細胞系統における細胞傷害効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、細胞傷害効果を評価した。このグラフは、対照と比較して平均生存率を示している。
【図３４Ｂ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、Ｓ１５９Ｒの、ＷＴ  ＨＣＴ１１６（上のパネル）およびｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６（下のパネル）ヒト結腸癌細胞系統における細胞傷害効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、細胞傷害効果を評価した。このグラフは、対照と比較して平均生存率を示している。
【図３４Ｃ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、Ｓ１５９Ｒの、ＷＴ  ＨＣＴ１１６（上のパネル）およびｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６（下のパネル）ヒト結腸癌細胞系統における細胞傷害効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、細胞傷害効果を評価した。このグラフは、対照と比較して平均生存率を示している。
【図３５Ａ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト膵臓癌細胞系統、ＢｘＰｃに対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３５Ｂ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト膵臓癌細胞系統、ＢｘＰｃに対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３５Ｃ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト膵臓癌細胞系統、ＢｘＰｃに対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３６Ａ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞系統に対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３６Ｂ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞系統に対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３６Ｃ】ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤ２６９ＨＥ１９５Ｒ（ＤＲ５選択的変異体、グラフにおけるＥ１９５Ｒ）と比較した、ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞系統に対する生物学的効果。２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）のインキュベーション後の細胞生存率をタンパク質濃度の関数として測定することにより、生物学的効果を評価した。
【図３７】フローサイトメトリーを用いた２４時間処置後にアネキシンＶ染色により測定した、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｒ１４９ＩおよびＳ２１５Ｄの、ＥＭ−２（Ａ）細胞およびＭＬ−１（Ｂ）細胞における生物活性。このグラフは、アポトーシス細胞の割合を示している。
【図３８】ＳＰＲにより測定したｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴおよびＤＲ４選択的突然変異体の受容体結合ならびに競合ＥＬＩＳＡ。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙと、ＤＲ４−Ｉｇとの受容体結合をＳＰＲにより測定し（Ａ）またはＤＲ５−Ｉｇ（Ｂ）との受容体結合を測定した。適当な高親和性複合体形成を表す前定常状態データを得るために、より少数の複合体を表す初期の速い解離速度を仮定して、注射終了の３０秒後に各濃度での応答を記録した。２５０ｎｍのｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴの応答と比較して受容体結合を計算した。競合ＥＬＩＳＡでは、競合相手としてＤＲ４−Ｉｇ（Ｃ）または競合相手として可溶性ＤＲ５−Ｉｇ（Ｄ）を使用した。ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴまたは変異体を０〜５００ｎｇ／ウェルのＤＲ４またはＤＲ５とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした溶液を、ＤＲ４−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。様々な可溶性受容体濃度において、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対する選択的変異体の結合を、０ｎｇ／ウェルの可溶性の受容体の存在下で測定した値と比べて計算した。
【図３９】Ｇｌｙ１３１  突然変異体の結合エネルギー予測。ＦｏｌｄＸバージョン２．８により決定した、野生型ｒｈＴＲＡＩＬと比較したときの、種々の死受容体とのＧｌｙ−１３１変異体の結合についての結合エネルギーの予測差（ΔΔＧ）。エネルギーの変化は、ｋｃａｌ／ｍｏｌで測定し、単一受容体と結合している単一結合界面の変化に当てはまる。負のΔΔＧｉは受容体結合の改善を示し、正のΔΔＧｉは受容体結合の低減を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、死受容体５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を有する変異ＴＲＡＩＬタンパク質を提供する。
【００１４】
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０、ＴＬ２；ＡＰＯ２Ｌ；ＣＤ２５３；Ａｐｏ−２Ｌとしても知られる）は、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーであり１４  １５、末端切断型細胞内ドメインを欠くまたは有する囮受容体などの２以上の受容体と結合するサイトカインの例である。ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ受容体ファミリーの５つの関連する受容体とも；死受容体４（ＤＲ４、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、死受容体５（ＤＲ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＫＩＬＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２）とも、囮受容体１、（ＤｃＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＩＤＤ）、囮受容体２（ＤｃＲ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＴＲＵＮＤＤ）とも、可溶性分泌受容体であるオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）とも結合するため、無差別のリガンドである。ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）だけが機能的死ドメイン（ＤＤ）を含み、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２またはＯＰＧは機能的死ドメイン（ＤＤ）を含まないことから、これらの受容体とＴＲＡＩＬが結合するだけで、細胞外因性または死受容体媒介のアポトーシス経路の活性化を介して、アポトーシスが誘導される。また、ＴＲＡＩＬは、そのような受容体を通じてだけでなくＤｃＲ２を通じて、生存促進ＮＦ−κΒ経路も誘導することができるように思われる。ある特定の細胞において支配する経路（アポトーシスまたは生存）を決定する因子については、ほとんど解明されていない。
【００１５】
受容体ＤＲ４および／またはＤＲ５は、ＤＮＡ損傷性化学療法薬での治療後にアップレギュレートされ得ることは知られている。このような細胞では、化学療法薬はＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対する応答を著しく増加させることができる。文献では、ＤＲ５が死シグナルを伝達する主要な受容体であることが示唆されている。しかしながら、本発明者らは、少なくともいくつかの癌細胞ではアポトーシスシグナルはＤＲ４により主として伝達されると考える。よって、この理由で、ＷＴ  ＴＲＡＩＬはＤＲ５に対してより高い親和性を有することから、このような癌はＷＴ  ＴＲＡＩＬに対する反応性が低い。このような癌の例としては、限定されるものではないが、慢性リンパ性白血病およびマントル細胞リンパ腫が挙げられる２７。
【００１６】
従って、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）シグナル伝達の選択的誘導因子を得ることは、非常に興味深いことである。よって、本発明者らは、ＤＲ４受容体選択的ＴＲＡＩＬ変異体を使用することで、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、有効性がより高い、また場合によっては副作用がより少ないより良好な療法が可能になり得ると考える。
【００１７】
死受容体５に対してよりも、死受容体４に対して優れている選択性に加えて、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、囮受容体であるＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）およびＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）およびＯＰＧに対してよりも、死受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対して優れた選択性を示すことが好ましい。ＤｃＲ１およびＯＰＧは死ドメインを含まないが、ＤｃＲ２は末端切断型死ドメインを含む。ＴＲＡＩＬがこれらの受容体と結合してもアポトーシスは誘導されず；それどころか、その結合により、ＤＲ４およびＤＲ５から利用可能なＴＲＡＩＬが封鎖されることによって、またはＤｃＲ２を介してＮＦ−κＢ活性化が誘導されることによって、実際にはアポトーシスが阻止されることもある。従って、本発明のＴＲＡＩＬ変異体は、この経路を介して封鎖されないことが好ましい。
【００１８】
本発明の変異ＴＲＡＩＬ分子は、細胞におけるアポトーシスの誘導において大変有用である。アポトーシスは、in vivoでも、ex vivoでもまたはin vitroでも誘導され得る。アポトーシスは癌性細胞で誘導されるが、健康な細胞では誘導されないことが好ましい。
【００１９】
「変異体」ＴＲＡＩＬタンパク質とは、ＴＲＡＩＬタンパク質が、ＷＴ  ＴＲＡＩＬタンパク質（ＴＮＦＳＦ１０、ＴＬ２；ＡＰＯ２Ｌ；ＣＤ２５３；Ａｐｏ−２Ｌとしても知られる）、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ：８７４３；受託番号ＮＭ＿００３８１０．２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５０５９１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ６ＩＢＡ９と、少なくとも１つのアミノ酸位置（２、３、４、５、６以上の一アミノ酸位置など）に関して異なっているということを意味する。
【００２０】
「選択性」とは、本発明の変異体が、相対語であるＤＲ５に対する親和性、好ましくは、さらに囮受容体であるＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）およびＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対する親和性よりも、ＤＲ４に対して実質的に高い親和性を有するということを意味する。「実質的により高い親和性」とは、ＤＲ４に対するＴＲＡＩＬ変異体の親和性が、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧに対する親和性と比べて、計れる程度により高いということである。好ましくは、ＴＲＡＩＬ変異体の親和性は、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧの１以上に対してよりも、ＤＲ４に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１０００倍以上である。より好ましくは、ＴＲＡＩＬ変異体の親和性は、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧの全てに対してよりも、ＤＲ４に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１０００倍以上である。結合相手に対するタンパク質の結合親和性の測定方法は、当技術分野で周知であり、例えば、競合アッセイ、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【００２１】
また、ＤＲ４に対する本発明のＴＲＡＩＬ変異体の結合親和性は、ＤＲ４に対するＷＴ  ＴＲＡＩＬ分子の結合親和性よりも絶対的に高いことが好ましい。さらに、ＤＲ５に対する本発明のＴＲＡＩＬ変異体の結合親和性は、ＤＲ５に対するＷＴ  ＴＲＡＩＬ分子の結合親和性よりも低くなければならない。ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧに対して証明されている結合親和性にも同じことが当てはまることが好ましい。
【００２２】
好ましくは、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、ＤＲ４に対して、上記の表面プラズモン共鳴(Van der Sloot, et. al.16)により測定した（この場合、ＷＴ  ＴＲＡＩＬの親和性の測定値は７．２ｎＭであった）、Ｋｄ＝１０００ｎＭ未満、好ましくはＫｄ＝１００ｎＭ未満、より好ましくはＫｄ＝１０ｎＭ未満、より好ましくはＫｄ＝５ｎＭ未満、より好ましくはＫｄ＝１ｎＭ未満の結合親和性を示す。
【００２３】
好ましくは、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、ＤＲ５に対して、上記の表面プラズモン共鳴(Van der Sloot, et. al.16)により測定した（この場合、ＷＴ  ＴＲＡＩＬの親和性の測定値は２．５ｎＭであった）、Ｋｄ＝１ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝５ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝１０ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝１００ｎＭより高い、より好ましくはＫｄ＝１０００ｎＭより高い結合親和性を示す。
【００２４】
好ましくは、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、ＤｃＲ１に対して、上記の表面プラズモン共鳴(Van der Sloot, et. al.16)により測定した（この場合、ＷＴ  ＴＲＡＩＬの親和性の測定値は約２５ｎＭであった）、Ｋｄ＝１０ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝２５ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝５０ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝１００ｎＭより高い、より好ましくはＫｄ＝１０００ｎＭより高いの結合親和性を示す。
【００２５】
好ましくは、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、ＤｃＲ２に対して、上記の表面プラズモン共鳴(Van der Sloot, et. al.16)により測定した（この場合、ＷＴ  ＴＲＡＩＬの親和性の測定値は約８ｎＭであった）、Ｋｄ＝１０ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝２５ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝５０ｎＭより高い、好ましくはＫｄ＝１００ｎＭより高い、より好ましくはＫｄ＝１０００ｎＭより高い結合親和性を示す。
【００２６】
突然変異に好適な残基の特定の例としては、限定されるものではないが、次の位置：１３１位、１９９位、２０１位、２０４位、２１５位および２１８位が挙げられる。好適な残基のさらなる例については表３に示す（すなわち、１２７位、１２９位、１３１位、１３３位、１４３位、１４４位、１４９位、１５５位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１７９位、１９３位、１９４位、１９７位、１９８位、１９９位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０７位、２１２位、２１４位、２１５位、２１６位、２１８位、２２１位、２２４位、２３２位、２３９位、２４９位、２５１位、２５２位、２６１位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位のもの）。これらの突然変異のうち、１４９位、１５９位、１９３位、２０１位、２１２位および２５１位の残基が好ましい。
【００２７】
本明細書において示すＴＲＡＩＬタンパク質配列におけるアミノ酸位置について、および特定のＴＲＡＩＬ突然変異体についての全ての言及は、配列番号１に示すアミノ酸配列を指すように意図されている。本発明の一態様は、これらの位置の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上において突然変異しているサイトカインに関する。これらの残基は、種々の受容体間で保存されない場所の、またはＤＲ４に特有の場所の、本発明者らによって側鎖がＤＲ４の結合界面に適合すると予測されているアミノ酸であるため、好ましい。
【００２８】
本発明者らは複数の好ましい突然変異体を同定しており、これらを表３に示している。これらの突然変異体は全て、ＤＲ４受容体に対する親和性が増加しかつ／またはＤＲ５受容体との結合が低減したことから選択された。安定していると見込めない突然変異体は表に含めなかった。これらの突然変異体の設計方法、それらの結合親和性の決定方法およびこれらの突然変異体の安定性の評価方法に関する説明については、実施例２を参照。１４９位、１５９位、１９３位、２０１位、２０４位、２１２位、２１５位および２５１位の突然変異が好ましい。次の突然変異Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑが特に好ましい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、表３の突然変異体の組合せを含んでなるＴＲＡＩＬ変異体を提供する。このような組合せは、表３の突然変異の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上を含み得る。本発明のさらなる実施形態において、前記ＴＲＡＩＬ変異体は、表３の突然変異および本明細書に開示するさらなる突然変異を含んでなる突然変異の組合せを含み得る。
【００３０】
当業者ならば分かるように、このようなアミノ酸の変化は、ＷＴ  ＴＲＡＩＬの結合特異性を変えるのに十分なものでなければならない。そのため、あるアミノ酸を、異なる生理化学的性質を有する別のアミノ酸の代わりに用いることが好ましい。このような置換としては、限定されるものではないが、塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸への置換または酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。このアミノ酸置換は非保存的であることがさらに好ましい。このような置換は、その突然変異周囲の領域の電荷および／または構造が変わる可能性があるため、そのタンパク質の結合特異性が変わる可能性が高い。しかしながら、ＦｏｌｄＸのようなタンパク質設計アルゴリズムの使用により、アミノ酸を、同等の生理化学的性質を有するアミノ酸（例えばＫ２０１Ｒ）と置換する効果を評価することも可能になる。例えば、特定のアミノ酸を、類似の生理化学的性質を有しているがサイズが異なるアミノ酸と置換することで、１つの受容体との相互作用を最適化することができ、その一方でもう１つの受容体との相互作用が最適でなくなる。
【００３１】
生理化学的性質に基づいたアミノ酸の分類を以下の表に示す。同等の生理化学的性質を有するアミノ酸を同じ行に示し、括弧内にそのアミノ酸の１文字略号を示している。同じ行内でのアミノ酸置換は保存的である：
【表１】
2011504369.tif 000002
【００３２】
特定のタイプの残基との上記位置における等価置換が好ましい。例えば、１３１位、１９９位および２０１位における好ましい突然変異は、塩基性アミノ酸へのものである。１３１位において特に好ましいのは、アルギニンまたはリジンへの突然変異である。突然変異体Ｇ１３１Ｒは、例えば、ＷＴ  ＴＲＡＩＬと比べて、ＤＲ４と、このリガンドの広範な生理的濃度にわたって優れた結合を示す。これに対し、ＤＲ５に対する親和性の増加ははっきりと分からない（図５）。
【００３３】
本発明者らは、ＦｏｌｄＸ解析に基づいて、ＤＲ４−選択性を増加させる次のＷＴ  ＴＲＡＩＬ内突然変異部位を予測している：
【表２】
2011504369.tif 000003
【００３４】
１３１位における好ましい突然変異は、塩基性残基であるアルギニンおよびリジンへのものである（図３９）。１４９位における好ましい突然変異は、イソロイシンまたはメチオニンまたはアスパラギンまたはリジンへのものである。これらの突然変異は、ＤＲ５に対する親和性の低下をもたらすと予測されるが、ＤＲ４に対する親和性には影響を及ぼさない（図４）。１５９位においては、好ましい突然変異はアルギニンへのものである。予測によれば、この突然変異は、ＤＲ５に対する親和性の実質的な低下をもたらすはずである。ヒスチジンおよびリジンへの突然変異は、１９３位において好ましい突然変異であり、これらの突然変異はどちらもＤＲ４に対して比較的わずかな親和性の増加をもたらすはずであり、この場合、ヒスチジンへの突然変異は、ＤＲ５についての親和性のさらなる低下を起こすと予測される（図４）。１９９位における好ましい突然変異は、アルギニンまたはヒスチジンへのものである。アルギニンへの突然変異は、例えば、ＤＲ４に対する親和性の増加をもたらすと予測されるが、一方、ＤＲ５に対する親和性は低下する（図４）。２０１位における好ましい突然変異は、ヒスチジンまたはアルギニンへのものである。Ｋ２０１のアルギニンへの突然変異は、例えば、ＤＲ４に対する親和性を増加させると予測されるが、一方、ＤＲ５に対する親和性は低下する（図１）。２０４位における好ましい突然変異は、酸性アミノ酸（特にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）、またはロイシンもしくはチロシンへのものである。これらの突然変異体は、ＤＲ５に対する親和性が低下していると予測されたが、酸性残基への突然変異の場合には、それに伴ってＤＲ４に対する親和性がわずかに増加している（図４）。残基Ｌｙｓ２１２のアルギニンへの突然変異は、ＤＲ４に対する親和性のわずかな増加もたらすと予測される。
【００３５】
２１５位においては、突然変異は酸性アミノ酸へのものでも塩基性アミノ酸へのものでもよく；グルタミン酸、ヒスチジン、リジンおよびアスパラギン酸が好ましい。Ｓ２１５のグルタミン酸およびリジンへの突然変異は、ＤＲ４受容体に対するＴＲＡＩＬ変異体の親和性を増加させると予測されたが、一方、ＤＲ５に対する親和性は低下する（図４）。前記残基のアスパラギン酸への突然変異は、ＴＲＡＩＬ変異体のＤＲ５結合親和性の劇的な低下をもたらすと予測されるが、一方、ＤＲ４受容体に対するその親和性はほんのわずかに低下すると予測される（図４）。
【００３６】
２１８位においては、突然変異は塩基性アミノ酸へのものでも芳香族アミノ酸へのものでもよく；ヒスチジン、チロシン、グルタミン酸、リジンおよびフェニルアラニンが好ましい。これらの突然変異は全て、ＤＲ４受容体に対する親和性の増加とともに、ＤＲ５との結合能の低下を特徴としている。特に、Ｄ２１８Ｈは、ＤＲ４との結合の変化を示さないが、一方、ＤＲ５に対するその結合親和性は１．５〜３倍低下している（図２Ａ）。また、これらの突然変異体は、ＷＴ  ＴＲＡＩＬと比べて、ＤＲ５と形成された複合体の解離速度がより速いのに対し、ＤＲ４複合体のものはほとんど影響を受けない（データは示していない）。さらに、突然変異体Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙは、囮受容体であるＤｃＲ１およびＤｃＲ２ならびにＯＰＧとの結合の低減も示す（図２Ｂ、２Ｃ）。
【００３７】
２５１位における好ましい突然変異は、酸性アミノ酸（アスパラギン酸もしくはグルタミン酸）、またはグルタミンへのものである。これらの突然変異体は、ＤＲ５に対する親和性が低下していると予測された（図４）
これらの突然変異体は全て、コンピューターによる設計モデル（例えばＦｏｌｄＸ）においてＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）受容体に対する親和性および／または選択性の増加を示すことから好ましい。これらの突然変異体のいくつかは、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）との結合の低減をさらに示す。このような性質を有する好ましい突然変異としては、これまでに同定されているように、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑが挙げられる。最も好ましいのは、突然変異体Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｓ１５９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈである。
【００３８】
これらの突然変異の多くは、ＤＲ４受容体との優れた結合を示し、突然変異Ｑ１９２Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５ＨおよびＳ２１５Ｋの場合には、ＤＲ５受容体との結合の低減も示すと予測される。突然変異Ｋ２０１Ｒは、突然変異ＴＲＡＩＬの、ＤＲ４およびＤＲ５の両方との結合の増加をもたらした。しかしながら、ＤＲ４との結合の増加は、ＤＲ５との結合の増加よりもずっと高い。突然変異Ｓ２１５Ｄは、ＤＲ５との結合能が大幅に低下しているが、一方、ＤＲ４に対する結合親和性がほとんど変化していないというＴＲＡＩＬタンパク質をもたらす。
【００３９】
また、突然変異の組合せも想定される。好ましい組合せは、１３１位、１４９位、１５９位、１９３位、１９９位、２０１位、２０４位、２１５位および２１８位における２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ全ての突然変異のものである。好ましい二重突然変異としては、１９９位と２０１位および１３１位と２１８位が挙げられる。特に好ましい組合せは、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｎ１９９Ｈ／Ｋ２０１ＲおよびＧ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈである。好ましい三重突然変異としては、１３１位、１９９位および２０１位が挙げられる。このような３つの組合せの好ましい例はＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈである。この突然変異体は、ＷＴ  ＴＲＡＩＬや単一突然変異体Ｇ１３１Ｒと比べて、ＤＲ４受容体に対する親和性のかなりの増加を示すのに対し、ＤＲ５に対する親和性の増加は、ＷＴ  ＴＲＡＩＬと比べて、あまりはっきりと分からない（図５）。さらに好ましい組合せは、３つの組合せＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈと、リスト：１４９位、１５９位、１９３位、２０４位、２１２位、２１５位、２１８位、および２５１位、のうちの１以上の位置における突然変異との組合せを含んでなる。より具体的には、前記３つの組合せは、次のリスト：Ｒ１４９Ｉ、Ｓ１５９Ｒ、Ｓ２１５Ｄのうちの１つ以上の突然変異と組み合わせることができる。
【００４０】
さらに好ましい組合せは、Ｓ１５９Ｒと、リスト：１４９位、１９３位、２０４位、２１２位、２１５位、２１８位、および２５１位、のうちの１つ以上の突然変異との組合せを含んでなる。より具体的には、Ｓ１５９Ｒは、リスト：Ｒ１４９Ｉ、Ｓ２１５Ｄのうちの１つ以上の突然変異と組み合わせることができる。
【００４１】
これらの組合せは、単一突然変異と比べて、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）に対する親和性および／または選択性が優れていることから好ましい。類似の効果を示すその他の組合せも本発明の実施形態に含められる。
【００４２】
上記突然変異は、全長ＴＲＡＩＬ配列に導入することができる。しかしながら、好ましくは、上記突然変異はＴＲＡＩＬ配列の可溶性形態、例えばアミノ酸１１４〜２８１を含んでなるまたはアミノ酸９５〜２８１を含んでなる形態に導入されるが；当業者ならば他の例も分かるであろう。よって、本発明による好ましいＴＲＡＩＬ変異体は、配列番号１に示す全長ＴＲＡＩＬ配列の可溶性断片の変異体である。
【００４３】
好ましい可溶性断片鋳型は、アミノ酸１１４〜２８１（本明細書ではｒｈＴＲＡＩＬと呼ぶ）を含んでなり、本明細書に記載する全ての突然変異体はこの長さのものである。メチオニンが前に付いたｒｈＴＲＡＩＬのＷＴ  ＴＲＡＩＬ配列（１１４−２８１）は、配列番号３で示され、好ましいコード配列は配列番号４で示される；従って、本発明の変異体はこの配列から誘導することができる。
【００４４】
しかしながら、当業者には理解されるように、これらの可溶性鋳型内の変異はこの可溶性形態の性質を保持する可能性が非常に高く、前記ポリペプチド配列内のこれらの境界のＣ末端および／またはＮ末端に追加の残基が含まれる場合には生物活性を示す。例えば、前記ポリペプチド断片が正確にフォールディングし生物活性を示す能力を損なうことなく、ＷＴ  ＴＲＡＩＬ配列から、または相同配列からの追加の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個あるいは３０個以上のアミノ酸残基を、これらの境界のＣ末端および／またはＮ末端の一方または両方に含め得る。同様に、生物活性を損なうことなく、Ｃ末端またはＮ末端の一方または両方において１または数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個以上）が欠失したこの鋳型の末端切断型変異体も可能である。
【００４５】
本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、好ましくは、標的細胞においてアポトーシスを誘導する働きをする。「アポトーシスを誘導する」とは、本発明による化合物が標的細胞において細胞死を引き起こすように作用するということを意味する。本発明による化合物はin vivoおよび/またはin vitroにてアポトーシスを誘導し得る。
【００４６】
当業者には明らかなように、アポトーシスは複数の異なるアッセイによって測定することができる。例としては、ＤＮＡラダーリングアッセイ（例えば、ＥＰ０８３５３０５；Immunex参照）；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によるクロマチン断片化および凝縮の検出、アネキシンＶおよびプロピジウムヨージドでの染色により測定される膜透過性と組み合わせたホスファチジルセリン露出の染色および検出が挙げられる。これらのアッセイに共通することは、活性を測定中のある濃度の化合物と持続的に接触させることにより死にかけている細胞で起こる生化学的または形態学的変化を測定するということである。細胞死は、前記化合物への暴露に応じた死にかけている細胞の割合の増加として表すことができる（すなわち未処理の対照細胞集団における死にかけている細胞の割合を、前記薬物に暴露した細胞集団におけるその割合から差し引く）。有効濃度は、一般に、ＩＣ５０値（細胞の５０％がアポトーシスを遂げる化合物の濃度である）として計算される。好ましくは、本発明による化合物は、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ間、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ間、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ間の濃度において細胞の５０％にアポトーシスを誘導する。
【００４７】
好ましくは、本発明によれば、有用な化合物は、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ間、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ間、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ間のＩＣ５０値を有する。
【００４８】
また、アポトーシスは、カスパーゼの活性化や当業者に公知の他のアッセイによっても測定することができる。
【００４９】
本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、様々な標的細胞においてアポトーシスを誘導する。標的細胞は癌性細胞であり、健康な細胞は含まない。本発明の変異体が標的とする癌性細胞はそれらの細胞表面においてＤＲ４受容体を発現し、これにより癌性細胞には本発明の変異体の標的としてのしるしが付けられている。好ましい標的細胞としては、卵巣癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、白血病（例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫（例えばマントル細胞リンパ腫）、バーキットリンパ腫（ＢＪＡＢ）などが挙げられる。当業者には他の例も公知であろう。標的細胞は、好ましくは、ＤＲ４およびＤＲ５などの特定の細胞表面マーカーの相対的発現レベルによって特徴付けられ得る。
【００５０】
本発明による化合物の標的細胞に対する特異的効果は、種々の種類の細胞を、そのＩＣ５０値の両側の範囲にある前記化合物濃度に暴露しもたらされた細胞死の程度を評価することにより判断することができる。実際には、細胞は特定の増殖状態にかなり正確な条件が必要であるため、大部分の化合物はある濃度でしかある程度のアポトーシスを引き起こさないということは事実である。よって、本発明による化合物が標的細胞において特異的にアポトーシスを引き起こすという場合には、これらの標的細胞でのみおよび他の種類の細胞に対して有害作用がないこの濃度領域でのみアポトーシスを引き起こすという濃度領域があるということである。
【００５１】
以上に挙げた好適な突然変異は、以下に示す方法論を用いて同定されている。当然、この方法論は、本明細書においてこれまでに挙げ示したものと組み合わせるためのさらなる興味深い突然変異を選択するために繰り返し用いてよい。
【００５２】
前記方法は、好ましくは、ＴＲＡＩＬリガンド内の残基を、その標的受容体に対する結合親和性の増加をもたらすように、標的受容体との結合界面に適合すると予測されているアミノ酸側鎖コンホメーションを含む置換残基で置換することを必要とする。本発明者らは、コンピューター設計アルゴリズム  ＦｏｌｄＸを使用し、これにより逆フォールディングを実行した。簡潔には、このアルゴリズムは、固定主鎖構造に回転異性体ライブラリーのアミノ酸側鎖を施す。例えば、ＦｏｌｄＸは、タンパク質リガンドとその受容体との予想される相互作用をモデリングすることを目的として、より良好な側鎖コンホメーションを探す回転異性体検索を行う。
【００５３】
ＦｏｌｄＸは、新規残基とその周囲のアミノ酸を適合させるアミノ酸突然変異を次のように行うことができる：まず選択した位置をアラニンへと突然変異させ、その周囲残基の側鎖エネルギーに注釈を付ける。次いで、このアラニンを選択したアミノ酸へと突然変異させ、その同じ周囲残基の側鎖エネルギーを再計算する。さらに、エネルギー差を示すものはそれら自体で変化させ、より有利である別の回転異性体があるかどうかを確認する。変性タンパク質をシミュレートするために、スコアリング関数の大部分の項を基準状態に対して釣り合わせる。側鎖配座異性体を全て基準状態と比較し、最後にモデリングした構造（ＰＤＢ座標）を有する候補配列が得られる。モデリングした構造のエネルギー評価も、この方法論の一部として、同じプログラム（ＦｏｌｄＸ、h ttp://foldx.crg.esで入手可能なものなど）を使用して同時に行う。別のステップにおいて、受容体−リガンド複合体とリガンドおよび受容体単独のエネルギーを、ＦｏｌｄＸを使用して計算し、これによりリガンドと受容体との相互作用の自由エネルギー（ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）の計算が可能である。ＦｏｌｄＸの力場モジュールは、前記タンパク質の水素結合ネットワークおよび静電ネットワークに加えて、その原子接触地図、その原子および残基の接近可能性、主鎖二面角のような構造特性を判断する。前記タンパク質と２以上の水素結合を起こす水分子の寄与も考慮する。ＦｏｌｄＸは、続いて、全ての力場成分：極性および疎水性溶媒和エネルギー、ファンデルワールス相互作用、ファンデルワールス衝突、水素結合エネルギー、静電気、ならびに主鎖および側鎖エントロピーの計算を行う。
【００５４】
次いで、このプログラムを使用して、考えられる全てのアミノ酸置換（好ましくは、グリシン、プロリン、およびシステインを除く）を、残りの構造に適合するコンホメーション（側鎖回転異性体）で前記タンパク質リガンド内の選択残基位置に導入する。グリシン、プロリン、およびシステインは、ＧｌｙおよびＰｒｏが他のアミノ酸よりも主鎖コンホメーションに及ぼす影響が比較的大きいことから、好ましくは除外する（Ｇｌｙはより柔軟であり、Ｐｒｏはそれほどでもない）。また、これらの残基は、変性状態において比較的大きな影響を及ぼす（Ｇｌｙは高エントロピー、Ｐｒｏはより低い）。ＣｙｓのＳＨ基も望ましくない凝集などをもたらす場合がある。次いで、有利な突然変異を自由エネルギー（ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）に関して評価し、不利な突然変異（例えば高度ファンデルワールス衝突）を排除する。続いて、配列および座標の出力を得て、例えば、Ｆｏｌｄ−Ｘプログラムを使用して、自由エネルギーの変化に関してランク付けする。このようにして、本発明のこの態様の方法は、置換するリガンドタンパク質内の１個以上の残基を、その標的受容体に対する結合親和性の増加をもたらすように、標的受容体との結合界面に適合すると予測されているアミノ酸側鎖コンホメーションを含む置換残基で置換する。
【００５５】
有利な突然変異を組み合わせ、自由エネルギー（ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）の変化に関して評価することができる。不利な組合せ（例えば高度ファンデルワールス衝突）は排除することができる。必要に応じて、設計プロセス後に、さらなる設計ラウンドのために配列および座標の出力を設計アルゴリズムに再導入する。第２、第３、第４、第５またはそれ以降の設計ラウンドを用いることがある。
【００５６】
一度アミノ酸置換を同定したら、突然変異タンパク質を、部位特異的突然変異誘発を用いて実験的に作り出し、これらを発現させ、精製した後、安定性または選択性／特異性についてさらに生物活性の保持について試験する。より特異的な治療用リード分子を開発するために、同定された分子を、通常の分子進化技術を用いてさらに突然変異させることができる。分子進化の場合、１つの特に有用な技術はファージディスプレイである。
【００５７】
本発明の第１の態様のＴＲＡＩＬ変異体は、融合タンパク質の一部を構成し得る。例えば、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列、または例えば組換え生産中に、より高いタンパク質安定性を与える配列を含み得る１以上の追加アミノ酸配列を含むことが有利である場合が多い。あるいはまたは加えて、成熟ＴＲＡＩＬ変異体は、別の化合物（ＴＲＡＩＬ変異体の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）など）と融合させてもよい。
【００５８】
これらの融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ変異体をコードするポリヌクレオチドを異種タンパク質配列のコード配列にインフレームでクローニングすることにより得ることができる。
【００５９】
本明細書において用いる際の「異種」という用語は、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体以外の任意のポリペプチドを示すように意図されている。Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに連結される融合タンパク質に含めることができる異種配列の例としては、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、マルチマー化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、輸送配列、腫瘍標的ペプチドおよびアフィニティークロマトグラフィーにより精製可能な配列：が挙げられる。
【００６０】
これらの異種配列の多くは、それらと融合するタンパク質の特異的生物活性を損なうことなく追加の性質を与えるために融合タンパク質中に一般に含められることから、発現プラスミドとして市販されている１７。このような追加の性質の例は、体液中でのより長く続く半減期、細胞外局在性、またはいわゆる「ヒスチジンタグ」を形成するヒスチジンのストレッチ１８によりまたはインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープである「ＨＡ」タグ１８により可能になる、より簡単な精製手順である。必要に応じて、異種配列は、タンパク質分解切断により、例えばタンパク質と異種配列との間にタンパク質分解切断部位を挿入し、精製した融合タンパク質を適当なプロテアーゼに暴露することにより、除去することができる。これらの特徴は、医薬組成物の調製における融合タンパク質の生産および使用を容易にすることから、融合タンパク質には特に重要である。例えば、ＴＲＡＩＬ変異体は、Ｃ末端に融合されたヘキサヒスチジンペプチドによって精製し得る。融合タンパク質が免疫グロブリン領域を含んでなる場合、この融合は、直接であってもよく、１〜３個のアミノ酸残基長以上（例えば、１３個のアミノ酸残基長）であり得る短いリンカーペプチドを介してもよい。前記リンカーは、例えば、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチドであってよく、または本発明の物質の配列と免疫グロブリン配列との間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含んでなる１３−アミノ酸リンカー配列であってよい。得られた融合タンパク質は、体液内での滞留時間の延長（すなわち半減期の増加）、特異的活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製の簡便化など性質が改善されている。
【００６１】
一実施形態において、前記タンパク質はＩｇ分子の定常領域に融合される。Ｉｇ分子の例としては、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域が挙げられる。Ｉｇ分子の他のイソ型も本発明による融合タンパク質の作製に好適である（イソ型ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、または例えばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスなど）。融合タンパク質は、モノマーまたはマルチマー、ヘテロ−もしくはホモマルチマーであってよい。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、ＴＲＡＩＬ変異体は、アミノ酸残基上で１以上の側鎖として存在する１個以上の官能基と結合する少なくとも１つの部分を含んでなり得る。好ましくは、前記部分はポリエチレン（ＰＥＧ）部分である。ペグ化は、公知の方法、例えば、ＷＯ９９／５５３７７に記載されているものなどにより行ってよい。
【００６３】
ＴＲＡＩＬ変異体の生物学的合成を容易にするために、本発明の一態様は、以上に挙げたＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を提供する。ＷＴ  ＴＲＡＩＬのコード配列は、登録番号ＮＭ＿００３８１０で与えられている。本発明によるＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子は、突然変異点に適当なコード配列を補うことによってこの配列から誘導し得る。本発明による好ましい核酸分子の例は、配列番号２で示される配列の変異体（全長遺伝子）；またはコード配列である配列番号２のヌクレオチド８８〜９３３（８４６ヌクレオチド長）である。ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの好ましいコード配列（アミノ酸１１４〜２８１）は、配列番号４で示され（メチオニンが前に付いたｒｈＴＲＡＩＬ１１４〜２８１）、それゆえ、本発明の変異体は、この配列の変異体により好ましくはコードされる。
【００６４】
突然変異を全長またはｒｈＴＲＡＩＬコード配列に導入するために、当業者ならば、完璧に、前記配列内の関連位置において必要なコドンを置換することができるであろう。本明細書において記述する全てのアミノ酸数は全長ＴＲＡＩＬタンパク質配列に関する。異なる宿主生物間のコドンバイアスを明らかにするために、当業者ならばこの件に関して公開されているテキストまたは周知の一般知識を参照し得る。
【００６５】
例えば、様々な異なる種におけるコドン使用頻度は、h ttp://www.kazusa.or.jp/codon/：において見つけることができ；特に大腸菌(Escherichia coli)のコドン使用頻度情報については、h ttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=155864：において見つけることができる。
【００６６】
加えて、本明細書に記載の様々な突然変異体を作製するのに用いるプライマーを以下の表に例示する。当業者ならば、これから、完璧に、本発明による全長および可溶性断片突然変異体のコード配列を誘導することができるであろう。
【表３】
2011504369.tif 000004
【００６７】
2011504369.tif 000005
【００６８】
核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（またはそれらのハイブリッド）、あるいはそれらの類似体（修飾主鎖を含有するもの（例えばホスホロチオエート）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）など）であってよい。核酸は、一本鎖（例えばｍＲＮＡ）でも二本鎖でもよく、本発明は、（例えばアンチセンス、プライミングまたはプロービングを目的とする）二本鎖核酸の個々の鎖の両方を含む。核酸は線状でも環状でもよい。核酸は標識してもよい。核酸は固相支持体に結合してもよい。
【００６９】
本発明による核酸は、当然、多くの方法によって（例えば全体または一部の化学合成（例えばＤＮＡのホスホルアミダイト合成）により、長い分子のヌクレアーゼ消化により、短い分子の連結により、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、核酸ポリメラーゼの使用によるなど）調製することができる。
【００７０】
よって、本発明はまた、本発明の核酸を含んでなるベクター（例えばプラスミド）（例えば発現ベクターおよびクローニングベクター）ならびにこのようなベクターで形質転換した（原核生物または真核生物の）宿主細胞も提供する。
【００７１】
本発明はまた、本発明のＴＲＡＩＬ変異体を生産する方法であって、本発明の核酸で形質転換した宿主細胞を、前記変異体の発現を誘導する条件下で培養するステップを含む方法も提供する。
【００７２】
本発明における使用に好適な発現系は、当業者に周知であり、多くはSambrook (1989)２０およびFernandez et al. (1998)２１に詳細に記載されている。一般的には、必要な宿主においてポリペプチドを生産するために核酸分子を維持、増殖または発現させるのに好適ないかなる系またはベクターも使用し得る。適当なヌクレオチド配列は、様々な周知の通常の技術（例えば、Sambrook２０に記載されているものなど）のいずれかによって発現系に挿入し得る。一般的には、コード遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現の場合）、場合によってはオペレーターなどの制御エレメントの制御下におくことができ、その結果所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列は、形質転換を受けた宿主細胞のＲＮＡに転写される。
【００７３】
好適な発現系の例としては、例えば、染色体系、エピソーム系およびウイルス由来の系が挙げられ、それらには、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス（バキュロウイルス、パポーベウイルス（ＳＶ４０など）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなど）、またはそれらの組合せ：由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドを含む、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のものが含まれる。プラスミド内に含め発現させることができないよりも大きなＤＮＡ断片を送達するために、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）も使用し得る。
【００７４】
特に好適な発現系としては、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物（細菌など）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でまたは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。本発明のペプチドを生産するために無細胞翻訳系も使用することができる。
【００７５】
組換えポリペプチドを長期にわたり高収量で生産するためには、安定した発現が好ましい。例えば、対象となるペプチドを安定に発現する細胞系統を、同じベクターまたは別のベクター上にウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含み得る発現ベクターを用いて形質転換させてよい。ベクターの導入後、選択培地に変更する前に、細胞を富栄養培地で１〜２日間増殖させてよい。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を与えることであり、選択マーカーの存在によって導入した配列の発現に成功した細胞の増殖および回主が可能になる。安定形質転換細胞の耐性クローンは、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させ得る。
【００７６】
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系統は当技術分野で公知であり、それらには、the American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系統が含まれる。そのような細胞系統としては、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞およびヒト肝細胞癌（例えばＨｅｐ  Ｇ２）細胞および複数の他の細胞系統が挙げられる。
【００７７】
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料は、とりわけ、Invitrogen, San Diego CAからキットとして市販されている(「MaxBac」キット)。これらの技術は当業者に一般的に公知であり、Summers et al. 22に十分に記載されている。この系での使用に特に好適な宿主細胞としては、昆虫細胞例えばショウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２細胞およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【００７８】
当技術分野で公知の多くの植物細胞培養物および全植物遺伝子発現系が存在する。好適な植物細胞遺伝子発現系の例としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号およびZenk (1991)23に記載されているものが挙げられる。特に、プロトプラストを単離し培養して完全な再生植物を得ることが可能な植物は全て利用することができ、それによって移入された遺伝子を含む完全な植物を回収することができる。限定されるものではないが、サトウキビ、サトウダイコン、綿、果実および他の樹木、マメ類および野菜の全ての主要な種を含む、ほとんど全ての植物は、培養細胞または組織から再生させることができる。
【００７９】
特に好ましい原核生物発現系の例としては、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセス属の放線菌(Streptomyces)および枯草菌(Bacillus subtilis)を宿主細胞として使用するものが挙げられる。
【００８０】
特に好適な真菌発現系の例としては、酵母(例えば、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae))およびアスペルギウス属の菌(Aspergillus)を宿主細胞として使用するものが挙げられる。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、上記の突然変異体サイトカイン、核酸またはベクターを、製薬上許容される担体とともに含んでなる医薬組成物を含んでなり得る。本発明は、（ａ）上記のＴＲＡＩＬ変異体、核酸またはベクターと、（ｂ）医薬担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００８２】
成分（ａ）は前記組成物中の有効成分であり、これは治療上有効な量、例えばアポトーシスを誘導するのに十分な量で存在する。特定の患者に対する正確な有効量は、それらの患者のサイズおよび健康状態、疾患の性質および程度、ならびに投与のために選択された組成物または組成物の組合せによって決まるであろう。有効量は、通常の実験によって決めることができ、臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的では、有効用量は、一般的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇであろう。好適な用量は、患者における濃度が血液中０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ間、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜およそ１μｇ／ｍｌ間、より好ましくはヒト血液中およそ１０〜１００ｎｇ／ｍｌに達するように用いるべきである。ＴＲＡＩＬ変異体は、前記組成物中に塩および／またはエステル形態で含めてよい。
【００８３】
担体（ｂ）は、それ自体は前記組成物を受ける患者に有害な抗体の産生を誘導せず、かつ過度に毒性をもたらすことなく投与することができる任意の物質であり得る。好適な担体は、大型でゆっくりと代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子であり得る。このような担体は当業者に周知である。製薬上許容される担体には、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が含まれ得る。このようなビヒクル中には、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助剤も存在し得る。リポソームは好適な担体である。医薬担体の詳細な考察はGennaro２４にある。
【００８４】
本発明の医薬組成物は様々な形態に調製し得る。例えば、前記組成物は、注射可能物質として（溶液または懸濁液のいずれかとして）調製し得る。注射の前に液体ビヒクルで溶液または懸濁液とするのに好適な固体も調製することができる。前記組成物は、凍結乾燥してもよい。
【００８５】
前記医薬組成物は、好ましくは無菌である。前記医薬組成物は、好ましくはパイロジェンフリーである。前記医薬組成物は、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８間、一般的にはおよそｐＨ７に緩衝化されている。
【００８６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達装置も提供する。前記装置は、例えば、シリンジであってよい。
【００８７】
本発明のＴＲＡＩＬ変異体は、１種以上の他の化合物、好ましくは抗腫瘍化合物、より好ましくは本発明の変異体が標的とする癌性細胞に対して活性を有するものおよび／またはＴＲＡＩＬ変異体に対する腫瘍の反応性を高めるものと同時投与してよい。よって、本発明の組成物は１種以上の抗腫瘍薬を含んでよく、それらの例は当業者には公知であり、γ線照射ならびに化学療法薬、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイドおよびテルペノイド、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン誘導体、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、モノクローナル抗体、ＤＮＡ損傷薬、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ホルモンなどが含まれる。好ましくは、使用する化学療法薬は、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）受容体の表面発現を増加させかつ／またはＤＲ４によるアポトーシス誘導を強化するように作用する。
【００８８】
「アポトーシス誘導の強化」とは、化学療法薬が、その化学療法薬を受けていないサンプルと比べて、その化学療法薬の存在下でアポトーシスを遂げる細胞の数を増加させるということを意味する。好ましくは、この増加は１．５倍（より好ましくは２倍、４倍、８倍、１０倍、２０倍、１００倍あるいは１０００倍）である。
【００８９】
本発明は、医薬として用いる本発明のＴＲＡＩＬ変異体を提供する。本発明はまた、疾患に罹患しているまたは罹患の危険性がある対象を治療するための方法であって、前記対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法も提供する。本発明はまた、対象を治療するための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用も提供する。特に好適な疾患には、自己免疫障害および癌が含まれる。本発明者らが受容体選択的ＴＲＡＩＬ変異体の医学的使用の可能性を考えている自己免疫障害の例は、様々な自己免疫性関節炎および多発性硬化症である。好適な癌としては、白血病、リンパ腫、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌、肝臓癌および乳癌、肺、卵巣および結腸の癌が挙げられる。好ましい実施形態において、前記癌は、卵巣癌、結腸癌、リンパ腫（例えばマントル細胞リンパ腫）または白血病（例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））である。
【００９０】
好ましくは、好適な癌は、細胞表面でＤＲ４受容体を発現する細胞を含む。このような癌細胞は、当業者に公知の様々な手段により容易に同定することができ、それらの手段としては、限定されるものではないが、受容体特異的抗体を用いた免疫細胞化学、受容体特異的抗体を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、受容体特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析などが挙げられる。ＤＲ４特異的抗体は、例えば、Abcam (ab8414)から得ることができる。ＤＲ５抗体も同様に入手可能である(Sigma-Aldrich, D3938)。
【００９１】
本発明のある特定の実施形態において、上記のように、本発明による化合物は、別の薬剤、例えば抗腫瘍薬とともに投与されることが好ましい。本発明の医薬組成物と組み合わせて使用するこのような薬剤の好適な例は、当技術分野で公知であり、例は以上に挙げている。
【００９２】
また、本発明の変異ＴＲＡＩＬを含んでなる医薬組成物は、場合によって、１以上のＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２に対する抗体とともに投与され得ることも想定される。このようにして、ＤＲ５特異的経路またはＴＲＡＩＬ変異体の囮受容体との結合を介してシグナル伝達を遮断することがさらに可能である。ＤＲ４以外の受容体との残存結合活性が阻害され、本発明の突然変異サイトカインの特異性がさらにもっと高まることから、これは有利である。
【００９３】
前記対象は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。ヒトは成人であっても小児であってもよい。小児を対象とする組成物は、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に対しても投与してよい。
【００９４】
本発明の組成物は、一般的には、対象に直接投与されるであろう。直接送達は、注射剤により（例えば皮下、腹膜内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ；さらに腫瘍内への直接注射によっても）達成され得る。
【００９５】
投薬治療は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
【００９６】
本発明の使用および方法は、治療的に（例えば既存の疾患を治療するために）または予防的に（例えば遺伝子検査または家族歴などによって疾患の罹患率が予想される状況において）使用することができる。治療的使用が好ましく、治療の有効性は、本発明の医薬組成物の投与後に細胞力価をモニタリングすることにより、または症状をモニタリングすることにより検証することができる。
【００９７】
よって、さらなる態様において、本発明は、サイトカインが関係している疾患の療法または診断において使用する、ＴＲＡＩＬ変異体、またはこのような分子をコードする核酸分子、または記載した核酸分子を含有するベクターを提供する。本発明のこの態様は、このような疾患の治療のための方法であって、患者に、上記のサイトカイン、核酸またはベクターを、治療上許容される量で投与することを含む方法を含む。好ましい患者には哺乳類が含まれ、好ましくはヒトである。
【００９８】
また、本発明によるＴＲＡＩＬ変異体は、例えば、前記患者の組織における遺伝子またはタンパク質（過剰発現した受容体など）の発現または活性レベルを評価すること、および前記発現または活性レベルを対照レベルと比較すること（ここで、レベルが前記対照レベルと異なっていることが疾患を示す）により、診断において使用し得る。
【００９９】
ＴＲＡＩＬ変異体は、さらに、例えば、候補化合物の潜在的抗癌活性について試験するための細胞系統において、アッセイにも使用し得る。特に興味深いのは、哺乳類、例えばヒトの癌性組織に由来する細胞系統である。このような細胞系統は疾患の研究に有用なモデルを提供し、疾患の治療または診断において有効な化合物の同定のためのスクリーニング法にも使用し得る。
【０１００】
本発明はまた、主としてＤＲ４特異的経路を介してシグナルを伝達する細胞系統においてアポトーシスを誘導するための方法も提供する。このような細胞系統は、様々な手段により容易に同定することができる。例えば、受容体特異的中和抗体は、１つの特定の受容体を介してシグナル伝達を阻害するために使用することができる。例えば、ＤＲ４およびＤＲ５に対する抗体はそれぞれ、ＤＲ４またはＤＲ５を介してシグナル伝達を阻害するために使用することができる。このような細胞系統の良好な候補は、ＤＲ５特異的抗体ではＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを低減することができないが、ＤＲ４特異的抗体ではＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを低減することができる細胞系統である。それに関する能力低下とは、アポトーシスを遂げる細胞の数が、ＤＲ４抗体が存在しないサンプルと比べて２０％（より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）減少することを意味する。このような細胞のさらなる同定方法は、当業者ならば容易に入手できる。このような細胞系統の例としては、限定されるものではないが、ＭＬ−１、ＥＭ−２、ＨＬ−６０およびＭＯＬＭ−１３が挙げられる。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、上記の突然変異サイトカインを発現するように形質転換させたトランスジェニックまたはヒト化非ヒト動物を含んでなり得る。このようなトランスジェニック動物は疾患の研究に有用なモデルを提供し、疾患の治療または診断において有効な化合物の同定のためのスクリーニング法にも使用し得る。好ましいこのような動物は齧歯類、特にマウスである。
【０１０２】
次に、本発明の様々な態様および実施形態を、例としてさらに詳細に記載する。本発明の範囲を逸脱することなく、細部にわたる修飾を行い得ることは理解されよう。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
ＷＴ  ｒｈ  ＴＲＡＩＬおよび突然変異体の発現および精製
ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ突然変異体構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）(Invitrogen)に形質転換した。ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび突然変異体を、２ｘＬＢ培地、１％（ｗ／ｖ）グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび追加の微量元素を用いて７．５ｌ発酵槽(Applicon)において５ｌバッチ規模で増殖させた。この培養物を３７℃、３０％酸素飽和で対数増殖中期に増殖させ、続いて０．１〜１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。トリマー形成を促進するために、ＺｎＳＯ４を１００μＭの濃度で加えた。温度を１７〜２８℃に下げ、培養物を静止期まで増殖させた。あるいは、同様のプロトコールを用いて、タンパク質を振盪フラスコにおいて１ｌ規模で２５０ｒｐｍにて増殖させた。培養物がＯＤ６００  ０．５に達したときにタンパク質発現を誘導し、誘導を５〜１６時間続けた。この場合、使用した培地は追加の微量元素を含まない２ｘＬＢであった。
【０１０４】
単離したペレットを３容量の抽出バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ８、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７ｍＭ  β−メルカプト−エタノール）中に再懸濁した。音波処理を利用して細胞を破壊し、抽出物を４０，０００ｇでの遠心分離により清澄化した。続いて、この上清を、ニッケルをチャージしたＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ−ｆｌｏｗカラムに流し、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ突然変異体を、Hymowitz25に記載されているとおり、次の修飾を加えて精製した：１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび最小濃度の１００ｍＭ  ＮａＣｌを全バッファーに用いた。これにより精製中の凝集を防いだ。ＩＭＡＣ分画ステップ後、全バッファーに２０μＭ  ＺｎＳＯ４および５ｍＭのＤＴＴ（β−メルカプト−エタノールの代わりに）を加えた。最後に、Ｈｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを使用するゲル濾過ステップを含めた。コロイド状Coomassieブリリアントブルーにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて決定した精製されたタンパク質の純度は９８％を超えていた。精製タンパク質溶液を液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【０１０５】
実施例２
選択性設計
ＷＴ  ＴＲＡＩＬの受容体結合界面を、ＤＲ４受容体に対する親和性を増加させる（＝相互作用エネルギー（ΔΔＧｉ）を減少させる）またはＤＲ５に対する親和性を低下させる単一アミノ酸置換についてスクリーニングした。ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５受容体複合体では、結晶構造を使用し、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４受容体複合体では、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５受容体複合体に基づいて、ＤＲ４のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）２および３と複合体化したＴＲＡＩＬからなる相同性モデルを構築した。ＤＲ４のＣＲＤ２および３は、ＤＲ５と非常に高い配列同一性（約５０％）を示し、そのアラインメントには挿入も欠失も含まれない（示していない）ことから、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５構造と同一のアミノ酸主鎖コンホメーションを有するＴＲＡＩＬ−ＤＲ４モデルを生み出すというモデリングアプローチを選択した。２つの異なる方法を用いてＴＲＡＩＬ−ＤＲ４モデルを構築した：１）WhatIfウェブインターフェース（h ttp://swift.cmbi.ru.nl/servers/html/index.html）を使用してＴＲＡＩＬ−ＤＲ４受容体複合体の初期モデルを作製し、続いてこのモデルをＦｏｌｄＸにより最適化し、または２）ＦｏｌｄＸのタンパク質設計機能を使用してＤＲ５配列をＤＲ４配列に突然変異させ、その周囲のＴＲＡＩＬおよび受容体残基を同時に最適化して突然変異残基を適合させた。後者のアプローチ（アプローチ２）が好ましいものであることが分かった。
【０１０６】
ＴＲＡＩＬ、ＤＲ５およびＤＲ４モデルの溶媒接触可能表面上の帯電は、ＴＲＡＩＬおよびＤＲ５の表面静電学がＴＲＡＩＬおよびＤＲ４の表面静電学より相互補完的であることを示す。複合体形成におけるエネルギー変化の予測は、測定した解離定数の変化と相関する。これは、複合体形成に最も大きな影響を及ぼすであろう受容体結合界面にある残基位置における突然変異を、我々の方法により確実に予測することができることを示している。
【０１０７】
ＦｏｌｄＸ設計プロセスは、ＤＲ４選択性を得るのに重要ないくつかのＴＲＡＩＬ受容体界面位置および（単一）アミノ酸置換を提示した（図１および図４）。
【０１０８】
さらに、ＤＲ４特異的ＴＲＡＩＬ突然変異体を選択するために、次の方法論を使用した。可能な限り正確な設計プロセスを可能にするために、新バージョンのＦｏｌｄＸタンパク質設計アルゴリズムを、ＤＲ５に関するＴＲＡＩＬの入手可能な実験的受容体結合データに対して十分に確認した。このようにして確認したＦｏｌｄＸ設計アルゴリズムを用いて、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４受容体複合体の新規モデルを、Ｘ線結晶学により得られる入手可能なＴＲＡＩＬ−ＤＲ５構造（１Ｄ４Ｖ．ｐｄｂ）に基づいて、（コンピューター内で）ＤＲ５アミノ酸を対応するＤＲ４アミノ酸に突然変異させ、続いてＦｏｌｄＸ設計アルゴリズムを用いて変化したアミノ酸残基と周囲の受容体およびＴＲＡＩＬ残基との相互作用を最適化することにより構築した。モデリングの鋳型として、ＤＲ５と複合体化したＴＲＡＩＬの別の入手可能な結晶構造（１Ｄ０Ｇ．ｐｄｂ）を用いてこのプロセスを繰り返し、両方の鋳型の目視検査により、受容体結合界面のいくつかの領域における構造的偏向を明らかにした。後者の構造の分解能はより低く、その構造の一部は１Ｄ０Ｇに基づいて十分に解明されたモデルではないため、それ以上使用しなかった。続いて、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４モデルを、入手可能な実験的受容体結合データに対して確認した。ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４複合体のモデルでは、予測および実験的アラニンスキャンデータと比較したときに相関係数Ｒ約０．７を得ることができた。
【０１０９】
次に、前記設計アルゴリズムを使用して、コンピューター内で、受容体結合界面に存在する各ＴＲＡＩＬアミノ酸残基を全２０種の異なる天然アミノ酸に突然変異させることにより、飽和スキャン（「マトリックススキャン」としても知られる）を実行した。より有利な静電学によりまたは間接的効果により受容体選択的効果を発揮する突然変異体を検出するために、一連の「界面」残基には受容体結合界面の周囲（最大約１５Å）にも残基を含めた。各突然変異体については、ＤＲ４およびＤＲ５受容体の両方に対して、相互作用エネルギーと複合体安定性エネルギーの両方を計算した。ＤＲ４受容体に対して有利な相互作用エネルギーおよび複合体安定性エネルギーを有し、ＤＲ５受容体に対して不利な相互作用エネルギーおよび／または複合体安定性エネルギーを有する突然変異体を選択した。ＤＲ４選択的変異体は次のように同定した：ＤＲ４受容体に対するΔΔＧ相互作用エネルギー計算値は、ＤＲ５受容体に対するΔΔＧ相互作用エネルギーよりも低いはずであり、ＤＲ４に対して計算したΔΔＧ相互作用エネルギーは０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるはずである。加えて、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４複合体について、ΔΔＧ複合体安定性エネルギーは０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるはずであり、また、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４複合体について、鎖内衝突は０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるはずである。鎖内衝突は、残基が隣接鎖と非常に良好な相互作用を有し得るため、タンパク質複合体の界面を再設計する際に重要であるが、それ自体の鎖に関しては非常に歪んだコンホメーションをとる。そのため、そのようなコンホメーション（０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより高い鎖内衝突エネルギーを有する）は現実的ではない。突然変異の一部については、別の基準を用いた：突然変異体がＤＲ４およびＤＲ５に対するΔΔＧ相互作用エネルギー計算値において差を示さないが、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４複合体についてのΔΔＧ複合体安定性エネルギー計算値がＴＲＡＩＬ−ＤＲ５複合体についての値よりも低く、かつΔΔＧ複合体安定性エネルギーにおけるこの差が０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも大きく、加えてＴＲＡＩＬ−ＤＲ４複合体についてのΔΔＧ複合体安定性エネルギーおよび鎖内衝突が両方０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である場合に、ＤＲ４選択的突然変異と見なした。作製された突然変異体構造の目視検査と相互作用、安定性および衝突についての上記数値の両方による突然変異の選択により、ＤＲ４受容体に対するＴＲＡＩＬの選択性に有利な効果を及ぼす表３記載の位置および突然変異がもたらされた。図４および図３９は、最も興味深い突然変異をＦｏｌｄＸバージョン２．７および２．８によるｄｄＧ計算値とともに表している。これらの値は、図１に用いた値を計算するのに使用したＦｏｌｄＸの以前のバージョン１．０と比べて、精度のわずかな向上を示す。
【０１１０】
実施例３
突然変異体Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈの優れたＤＲ４親和性および選択性
精製リガンドと、固定化したＤＲ４およびＤＲ５  Ｉｇ受容体キメラとの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。３７℃で０．５ｎｍ〜２５０ｎｍに及ぶ受容体結合曲線を記録した。固定化したＤＲ５−Ｉｇに対するＤ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈの結合は、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比べて１．５倍低減した。これに対し、固定化したＤＲ４−Ｉｇとの結合はほとんど変わらなかった（図２Ａ）。これらの結果は、Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈ変異体がＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比べてＤＲ４選択的になったことを示している。興味深いことに、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと、とりわけＤＲ４との親和性が温度に強く依存することが報告されている。しかしながら、２５℃の温度でアッセイを繰り返した場合には、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙでは、ＤＲ４またはＤＲ５との結合において有意な変化は観察されなかった（示していない）。両方の変異体は、ＤｃＲ２との結合において約３倍の低減を示し、一方、ＤｃＲ１との結合はほとんど変わらなかった（２５０ｎｍにおいて重量レベルの約８０％）（図２Ｂ）。ＤＲ４およびＤＲ５について３７℃で記録したセンサーグラムの目視検査により、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬは両方の受容体で解離速度は事実上なく、一方、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙは両方、両方の受容体で初期の解離速度の増大を示すことが明らかになった。しかしながら、ＤＲ４でのＤ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの解離速度はＤＲ５受容体での解離速度よりもずっと低い。全体として、より高い親和性に加えて、ＤＲ４複合体形成の動態も、これらの変異体に有利である。さらに、これらの突然変異体はＯＰＧ受容体との結合の低減も示す（図２Ｃ）。
【０１１１】
ＤＲ５受容体の存在下でのＤＲ４受容体に対するＤ２１８ＨおよびＤ２１８Ｙの選択性を評価するために、競合ＥＬＩＳＡ試験を実施した。可溶性ＤＲ５−Ｉｇは、固定化したＤＲ４に対する結合の５０％低減達成において、Ｄ２１８変異体の場合に、ｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴの場合よりも９倍より大きく効果が低く（図２Ｄ，Ｅ）、一方、可溶性ＤＲ４−Ｉｇは、固定化したＤＲ４−Ｉｇに対するｒｈＴＲＡＩＬ  ＷＴおよびＤ２１８変異体の結合の低減において同程度に効果的であった。これらの結果は、ＤＲ４およびＤＲ５受容体の両方が存在する場合に、Ｄ２１８ＨおよびＤ２１８ＹがＤＲ４受容体と優先的に結合することを示している。
【０１１２】
結論として、これは、ＤＲ４特異的突然変異体Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８ＨがＤＲ４に対する親和性が増加しており、ＤＲ５およびＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧに対する親和性が低下していることを示している。
【０１１３】
実施例４
突然変異体Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈの生物活性
Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈ変異体の生物活性を試験するために、Ｃｏｌｏ２０５細胞およびＥＭ−２細胞をこれらの変異体で処置した。これまでに、Ｃｏｌｏ２０５細胞は、主としてＤＲ５により媒介されるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性が高く、これに対して、ＭＬ−１細胞は、主として、ＤＲ４により媒介されるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性が高いことが立証されている。ＥＭ−２細胞系統はＤＲ４受容体だけを発現するため、ＤＲ４受容体により媒介されるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対してのみ感受性が高い。Ｃｏｌｏ２０５では、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよびＤＲ５選択的Ｄ２６９ＨＥ１９５Ｒ変異体と比べて、Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈのアポトーシス誘導活性の大きな低下が観察された（図３ａ）。これに対し、細胞系統ＥＭ−２およびＭＬ−１では、Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈ変異体は、１００ｎｇ／ｍｌより高い濃度においてアポトーシスを効果的に誘導することができた（図３Ｂおよび図Ｃ）のに対し、ＤＲ５選択的変異体Ｄ２６９ＨＥ１９５Ｒはアポトーシス誘導活性を本質的に欠いている。Ｄ２１８Ｈ突然変異体はＤ２１８Ｙと比べて増大したアポトーシス誘導活性を示したが、どちらの変異体もＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬより活性がかなり低い。潜在的ＤＲ４選択的挙動に関しては、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ感受性を補正することおよびＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較して前記変異体がアポトーシスを誘導し始める濃度を決定することことが重要である（図３）。Ｃｏｌｏ２０５細胞では、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬは約２０ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度において最大レベルのアポトーシスを誘導する。ＭＬ−１細胞およびＥＭ−２細胞では、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度において最大レベルのアポトーシスを誘導する。Ｃｏｌｏ２０５細胞では２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＤ２１８Ｙ変異体で誘導される有意なアポトーシスがない一方、ＥＭ−２細胞およびＭＬ−１細胞においては、Ｄ２１８Ｙ変異体は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で有意な量のアポトーシスを誘導することができる。これは、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２１８ＹおよびＤＲ５選択的変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒについての図３に示されている。Ｄ２１８ＹリガンドはＥＭ−２細胞においてアポトーシスを効果的に誘導することができるのに対し、Ｃｏｌｏ２０５細胞においては生物活性の著しい低下を示す（図３）。まとめると、これらの結果は、Ｄ２１８ＹおよびＤ２１８Ｈ変異体が優先的にＤＲ４を介してアポトーシスを誘導することを示している。
【０１１４】
実施例５
突然変異体Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９ＲＫ２０１ＨおよびＧ１３１ＲＮ１９９ＲＫ２０１Ｈの優れたＤＲ４親和性および選択性
精製リガンドと、固定化したＤＲ４およびＤＲ５  Ｉｇ受容体キメラとの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで評価した。３７℃で０．５ｎｍ〜２５０ｎｍに及ぶ受容体結合曲線を記録した。ＢＳＡとともに処方したＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ調製物をセンサー表面上に固定化した。２５０ｎＭのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬの応答と比較して結合を計算した。前定常結合実験は、ＴＲＡＩＬ変異体Ｇ１３１ＲおよびＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの親和性がＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較して増加していることを示している。相対的に、ＤＲ５との結合の増加はそれほど明らかではなかった（図５）。競合ＥＬＩＳＡは、ＤＲ４−Ｉｇが、変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈと固定化したＤＲ４−Ｉｇとの結合に対してＷＴで観察されるよりもずっと高い競争力を有し得るのに対し、ＤＲ５−Ｉｇは、前記変異体またはＷＴの存在下で競争挙動に差はないことを示した（それぞれ、図２２Ａおよび図２２Ｂ）。これは、変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１ＨのＤＲ４に対する選択性が増加していることを明らかに示している。
【０１１５】
要約すると、これらのデータは、これらの突然変異体がＤＲ５受容体よりもＤＲ４受容体を選択的に認識することを示している。
【０１１６】
実施例６
突然変異体Ｇ１３１ＲＤ２１８Ｈ、Ｎ１９９ＲＫ２０１ＨおよびＧ１３１ＲＮ１９９ＲＫ２０１Ｈの生物活性
これらの突然変異体がアポトーシスを誘導する可能性を、細胞系統ＭＬ１（急性骨髄性白血病細胞系統）、ＥＭ−２（慢性骨髄性白血病細胞系統）、Ａ２７８０（卵巣癌細胞系統）、ＨＬ−６０（急性骨髄性白血病細胞系統）、ＯＣＩ−ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病細胞系統）、ＭＯＬＭ  １３（急性骨髄性白血病細胞系統）およびＣｏｌｏ２０５（結腸癌細胞系統）において試験した。
【０１１７】
ＨＬ６０細胞(DSMZ, ACC 3)、ＥＭ−２細胞(DSMZ, ACC 135)およびＡ２７８０細胞(Dr. Steven de Jong, University Medical Centre Groningen, The Netherlandsからの好意による提供)は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で維持した。処置の２４時間前に、前記細胞をそれぞれ、５００，０００細胞／ｍｌ、３００，０００細胞／ｍｌおよび３５０，０００細胞／ｍｌで播種した。ＭＬ−１細胞系統は、２０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で維持し、処置の２４時間前に、３００，０００細胞／ｍｌで播種した。ＭＯＬＭ−１３細胞(DSMZ, ACC 554)は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で維持し、処置の２４時間前に、１，０００，０００細胞／ｍｌで播種した。ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞(DSMZ, ACC 582)は、２０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡ、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭで維持し、処置の２４時間前に、７５０，０００細胞／ｍｌで播種した。全ての細胞を加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。特に断りのない限り、全ての試薬はSigma-Aldrich社製のものである。ＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ変異体の受容体選択性および／または生物活性の１つの指標として、それらのアポトーシス促進能を調べるために、細胞を漸増濃度（０〜２５０μｇ／ｍｌ）のＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲまたはＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ(Triskel Therapeutics Ltd.)で処置した。
【０１１８】
最初に、これらの細胞系統がＤＲ４受容体をそれらの表面で発現するかどうかとその程度を検証した。これはＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の免疫蛍光標識によって調べた。細胞を培養皿から取り出た；Ａ２７８０細胞は、軽いトリプシン処理により回収し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中１％ＢＳＡによる一次抗体(ＤＲ４およびＤＲ５：中和マウスモノクローナル抗体、Alexis、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２：中和ヤギポリクローナル抗体、R&D Systems)の１：１００希釈物とともに室温で４０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ標識二次抗体の１：５０希釈物中に再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。まずＰＢＳ中１％ＢＳＡで次にＰＢＳで洗浄することにより過剰の二次抗体を除去した。フローサイトメトリー(FacsCalibur, Beckton Dickinson)による解析の前に、細胞を１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。これらの結果は図６に示している。
【０１１９】
ＭＬ−１細胞およびＥＭ−２細胞は死誘導受容体（ＤＲ４およびＤ５）の両方を発現する。ＭＬ−１細胞は２つの囮受容体（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）も発現するが、一方、ＥＭ−２細胞は発現しないか、または検出限界を下回る。細胞系統ＨＬ−６０、Ｏｃｉ−ＡＭＬ３およびＭＯＬＭ−１３はそれらの表面で４つ全ての試験受容体を発現した。
【０１２０】
次いで、前記突然変異ＴＲＡＩＬタンパク質をアポトーシスアッセイに用いて、上記の様々な癌細胞系統においてアポトーシスを誘導するそれらの能力を評価した。この目的のために、アネキシンＶアッセイを用いた。
【０１２１】
ホスファチジルセリン(PS)の原形質膜外葉への露出は、アポトーシスの残遺物のクリアランスに必要である。Ｃａ２＋依存的リン脂質結合タンパク質であるアネキシン−Ｖは、ＰＳと高親和性で結合する。処置後、細胞を軽いトリプシン処理により収集し、３５０ｘｇでの遠心分離によりペレット化し、氷冷Ｃａ２＋バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で１回洗浄し、暗所で氷上でアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ(IQ Corporation)とともに１５分間インキュベートした。Ｃａ２＋バッファーでの洗浄ステップを行った後、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)で捕捉した。解析はCell Quest software(Becton Dickinson)を使用して行った。
【０１２２】
ＭＬ−１細胞、ＥＭ−２細胞およびＡ２７８０細胞を、様々な濃度の、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、候補のＤＲ４選択的ＴＲＡＩＬ変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１ＲならびにＤＲ５選択的ＴＲＡＩＬ変異体であるＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ（ＷＯ０５／０５６５９６参照）で処置した。Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒは、ＭＬ−１細胞およびＥＭ−２細胞においてほとんどアポトーシス誘導活性がなく、これらの細胞系統のＤＲ４依存性を確認した（図１０、図１１）。これに対し、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒは、Ａ２７８０細胞においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬより高いアポトーシス促進活性を示し、この場合はまた、Ａ２７８０細胞の排他的なＤＲ５感受性を確認した（図１２）。一方、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒは、ＤＲ４応答性細胞系統ＭＬ−１およびＥＭ−２においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬより高いアポトーシス促進活性を示し（図１０、１１）、ＤＲ５応答性細胞であるＡ２７８０においては最低限の活性しか示さなかった（図１２）。結腸癌細胞系統Ｃｏｌｏ２０５は、その細胞表面で４つ全ての受容体を発現することおよびＤＲ４およびＤＲ５を介してＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを媒介することが分かっている２６。それゆえに、ＤＲ４選択的変異体での処置は、これらの細胞においてアポトーシス効力の増強をもたらした（図１６）。これらの結果は、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒが、ＤＲ４と選択的に結合するアゴニストリガンドであることを示している。
【０１２３】
二重突然変異体Ｎ１９９Ｋ／Ｋ２０１Ｈ（推定ＤＲ４選択的変異体でもある）を用いて同様の試験を行った。Ｎ１９９Ｋ／Ｋ２０１Ｈは、ＭＬ−１（図７）細胞およびＥＭ−２（図８）細胞においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと同程度にアポトーシスを誘導した。Ｎ１９９Ｋ／Ｋ２０１Ｈでの処置は、Ａ２７８０細胞においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較してアポトーシスの誘導を著しく減少させ、ＤＲ４選択的アゴニスト活性を示唆した（図９）。
【０１２４】
次いで、二重突然変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ（推定ＤＲ４選択的変異体でもある）を用いてアゴニスト活性および受容体選択性の試験を行った。Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈは、ＭＬ−１細胞においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと同程度にアポトーシスを誘導し（図１７）、ＥＭ−２細胞においては細胞毒性をわずかに低減した（図１８）。一方、Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈでの処置は、Ａ２７８０細胞においてＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較してアポトーシスの誘導を著しく減少させ、ＤＲ４選択的アゴニスト活性を示唆した（図１９）。
【０１２５】
実施例７
Ｇ１３１ＲおよびＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの生物活性
ＤＲ４およびＤＲ５により媒介される細胞死の両方に反応する野生型ＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢｗｔ）およびＤＲ５欠損ＢＪＡＢ細胞（ＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ）において、ＴＲＡＩＬ変異体Ｇ１３１ＲおよびＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈを使用する追加試験を行った。両方の突然変異体は、ＢＪＡＢｗｔ細胞において（図２０Ａ、図２１Ｂ）もＢＪＡＢＤＲ５ＤＥＦ細胞において（図２０Ｂ、図２１Ｂ）も細胞死を誘導することができた。これは、これらの突然変異体が高度のＤＲ４特異性を示すことおよびこれらの突然変異体がＤＲ４受容体の強力なアゴニストであることを示している。
【０１２６】
実施例８
変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈの生物活性
ＴＲＡＩＬ変異体Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈを、ＨＬ−６０細胞におけるその生物活性について試験した。ＨＬ６０（急性骨髄性白血病；DSMZ, ACC 3）を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で維持した。処置の２４時間前に、細胞を３００，０００細胞／ｍｌで播種した。細胞を加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。特に断りのない限り、全ての試薬はSigma-Aldrich社製のものである。Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１ＲおよびＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬがＤＲ４を活性化する能力を比較するために、前記細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒ  ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬで指示された時間処置した後に活性化プロカスパーゼ−８およびアポトーシスの誘導を測定した。指示された時間に、ウエスタンブロット解析のために細胞を回収しまたは洗浄し、前記リガンドの不在下で完全培地中に再懸濁し、合計インキュベーション時間１２時間後に解析した。
【０１２７】
図２３から分かるように、変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒは、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬよりもずっと強力なＤＲ４アクチベーターであり、これは、プロカスパーゼ−８のプロセッシング（ウエスタンブロッティン(Western Blottin)により検出される）および低ミトコンドリア膜電位を有する細胞の数の決定により測定される誘導された細胞死のレベルの両方（図２３ａおよび２３ｂ）により示される。
【０１２８】
実施例９
ＢＭＳと組み合わせた変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒの生物活性
三重突然変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒは、骨髄性細胞において非常に効果的であり、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬよりも効率的にＤＲ４を活性化する（図２３）。ＤＲ４およびＤＲ５は両方、ｐｒ−カスパーゼ−８(pr-caspase-8)だけでなく、抗アポトーシスＮＦ−ｋＢも活性化することができるため、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬおよび変異体Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒの両方の生物活性に対するＮＦ−ｋＢ阻害の効果を試験した。Ｈｌ−６０細胞を、阻害剤であるｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１の存在または不在下でＷＴｒｈＴＲＡＩｌまたはＮ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｇ１３１Ｒで１２時間処置した（図２４）。ＢＭＳの存在下でのＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬに対する３つの組合せの効力の増強は、とりわけより低いリガンド濃度において明らかであり（１０ｎｇ／ｍｌ；図２４ｂ）、そしてこのことは、高用量の薬物の潜在的に毒性の副作用を考慮すると抗癌治療としてのin vivo用途に有利であり得る。
【０１２９】
実施例１０
ＳＰＲにより測定したＲ１４９Ｉ、Ｓ１５９Ｒ、Ｋ２０４Ｙ、およびＳ２１５Ｄの結合活性ならびに競合ＥＬＩＳＡ
図２５のＳＰＲセンサーグラムによると、変異体Ｒ１４９Ｉが両方の死受容体に対する前定常状態親和性に大きな影響を及ぼさない場合でも、変異体Ｒ１４９ＩのＤＲ５複合体は不安定化するのに対し、ＤＲ４のものはほとんど変化していないように思える。前定常状態ＳＰＲ測定は、変異体Ｓ１５９ＲがＤＲ４−Ｉｇに対してより高い見かけの親和性で結合することができる（図２６Ａ）のに対し、ＤＲ５−Ｉｇとの結合が低減している（図２６Ｂ）ことを示しており、それゆえ、ＤＲ４特異性を明らかに示している。同様に、変異体Ｋ２０１Ｒでも、あまりはっきりしない場合でさえ、ＤＲ４特異性が示される（図２６）。図２７の変異体Ｓ１５９ＲとＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬのセンサーグラムは、見かけの親和性だけでなく前記受容体分子との相互作用動態もＤＲ４に有利に影響を受けていることを示している。加えて、図２８に示す競合ＥＬＩＳＡ試験は、ＤＲ４−Ｉｇは、前記変異体と、固定化したＤＲ４−Ｉｇとの結合に競合することができるが、ＤＲ５−Ｉｇはそうすることができないことを示しており、この場合も変異体Ｓ１５９ＲのＤＲ４特異性を明らかに示している。
【０１３０】
突然変異Ｋ２０４ＹおよびＳ２１５Ｄも、ＤＲ４に有利に、受容体との結合に影響を及ぼす。前定常状態ＳＰＲにより測定したＤＲ４−Ｉｇとの結合はあまり劇的には影響を受けないように見える一方、ＤＲ４−Ｉｇとの複合体は安定化し、ＤＲ５−Ｉｇのものは不安定化するように見える（図２９および図３０）。変異体Ｓ２１５Ｄは競合ＥＬＩＳＡによりさらに解析した。この競合ＥＬＩＳＡでは、ＤＲ４−Ｉｇだけが、Ｓ２１５Ｄと、固定化したＤＲ４−Ｉｇとの結合に効果的に競合することができ、ＤＲ５−Ｉｇはそうすることができず（図３１）、この突然変異によって誘導されるＤＲ４特異性を示している。
【０１３１】
実施例１１
Ｓ１５９Ｒの生物活性
ＴＲＡＩＬ変異体Ｓ１５９Ｒの生物活性を種々の細胞系統において試験した。ヒト膵臓癌細胞系統ＢｘＰｃおよびＣｏｌｏ３５７は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で維持した。ＨＥＰＧ２（ヒト肝細胞癌）細胞系統は、１０％ＦＢＳ、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ培地で維持した。ＨＣＴ１１６  ＷＴおよびｐ５３−／−（ヒト結腸癌）細胞系統は、１０％ＦＢＳ、５０Ｕペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＨＥＰＥＳ添加ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地で維持した。全ての細胞を加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＢｘＰｃ、Ｃｏｌｏ３５７およびＨＥＰＧ２は１５０，０００細胞／ｍｌで播種した、ＨＣＴ１１６  ＷＴおよびｐ５３−／−は２００，０００細胞／ｍｌで播種した。細胞を３枚の９６ウェルプレートに総量１００μｌ／ウェルで播種した。播種の翌日、三連で細胞を適用量（０〜５００ｎｇ／ｍｌ）のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲまたはＳ１５９Ｒで処置した。２４時間のインキュベーション後、ＭＴＴアッセイに１枚の９６ウェル／プレート（２４時間時点）を用い、他の２枚のプレートは再度同じ濃度のＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５ＲおよびＳ１５９Ｒで処置し、さらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴアッセイに１枚の９６ウェル／プレート（４８時間時点）を用い、他の１枚のプレート（７２時間時点）は上記のように処置し、さらに２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイにより解析した。処置後、これらのウェルに１０μｌのＭＴＴ溶液（ハンクス平衡塩類溶液中５ｍｇ／ｍｌ）を加え、プレートを加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのウェルに１００μｌの停止溶液（４０％ジメチルホルムアミド中２０％ＳＤＳ）を加え、プレートをオービタルシェーカー上に一晩置いてホルマザン沈殿物を溶かした。インキュベーション後、PerkinElmer Victor３マルチプレートリーダーにおいて吸光度を５５０ｎｍで測定した。細胞生存率は、３つの複製ウェルの対照に対する平均割合として表した。
【０１３２】
変異体Ｓ１５９Ｒは、ＤＲ４感受性細胞系統ＭＬ−１（図３２、上のパネル）、ＥＭ−２（図３２、下のパネル）（どちらも骨髄性細胞系統）におけるアポトーシス活性が増加しており、そのＤＲ４選択性を示している。また、Ｓ１５９Ｒは、ヒト結腸癌細胞系統、ＳＷ９４８において強い生物活性も示している（図３３）。３つ全ての細胞系統において、前記変異体は、非常に低い濃度においても顕著なアポトーシスを引き起こし、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較してこの変異体の効力の増強を示している。ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６におけるＳ１５９Ｒの高い効力（図３４）は、この変異体の高い受容体−アゴニスト活性を明確に示している。また、Ｓ１５９Ｒの高い効力は、両方の死受容体を発現する膵臓癌細胞系統ＢｘＰｃにおいても示された：ＤＲ４選択的変異体Ｓ１５９Ｒは、ＤＲ５特異的変異体Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒと同程度に活性がある（図３５）。予想通り、ＤＲ５がＴＲＡＩＬ死シグナルの主要トランスデューサーである細胞系統ＨｅｐＧ２では、変異体Ｓ１５９Ｒはより活性が低い（図３６）。
【０１３３】
結論として、変異体Ｓ１５９Ｒは非常に有効なＤＲ４選択的変異体である。
【０１３４】
実施例１２
Ｒ１４９ＩおよびＳ２１５Ｄの生物活性
図３７では、ＷＴ  ｒｈＴＲＡＩＬと比較した、ＤＲ４応答性骨髄性細胞系統ＥＭ−２およびＭＬ−１における変異体Ｒ１４９ＩおよびＳ２１５Ｄの生物活性を示している。明らかに、両方の変異体は、ＷＴより有効であり、より低い濃度でアポトーシスを誘導し、ＥＭ−２細胞における差はおよそ５倍、ＭＬ−１細胞における差は２倍であり、これらの変異体がＤＲ４の強力なアゴニストであることを示している。
【０１３５】
実施例１３
材料と方法−結合実験
表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ  ３０００(Biacore AB)を使用して結合実験を行った。研究用ＣＭ５センサーチップ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド（ＮＨＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、エタノールアミン−ＨＣｌおよび標準的なバッファー例えばＨＢＳ−ＮおよびＨＢＳ−ＥＰは、製造業者から購入した。全てのバッファーを濾過し、脱気した。Biacore ＣＭ５センサーチップのセンサー表面へのＤＲ４−ＩｇおよびＤＲ５−Ｉｇ受容体の固定化は、製造業者の使用説明書に従い、標準的なアミンカップリング手順により行った。受容体を約８００レスポンスユニットのレベルでコーティングした。次いで、活性化したカップリング表面を反応部位について１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）でクエンチした。参照表面は、活性化ＣＭデキストランからなり、後にエタノールアミンで遮断した。５０μｌアリコートのＷＴ  ｒｈＲＡＩＬおよび変異体を三連で２５０ｎＭ〜０．５ｎＭの濃度、７０μｌ／ｍｌ、３７℃で、ランニング・サンプルバッファーとして０．００５％界面活性剤Ｐ２０(GE Healthcare)を補給したＨＢＳ−Ｎを使用して注入した。リガンドと受容体との結合をリアルタイムでモニタリングした。注入間に、１：１［１０ｍＭグリシン１．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２］／エチレングリコールおよび接触時間３５秒を用いて受容体／センサー表面を再生させた。
【０１３６】
［参照文献］
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【図１】
2011504369.tif 000007
【図２Ａ】
2011504369.tif 000008
【図２Ｂ】
2011504369.tif 000009
【図２Ｃ】
2011504369.tif 000010
【図２Ｄ】
2011504369.tif 000011
【図２Ｅ】
2011504369.tif 000012
【図３】
2011504369.tif 000013
【図４】
2011504369.tif 000014
【図５】
2011504369.tif 000015
【図６Ａ】
2011504369.tif 000016
【図６Ｂ】
2011504369.tif 000017
【図７】
2011504369.tif 000018
【図８】
2011504369.tif 000019
【図９】
2011504369.tif 000020
【図１０Ａ】
2011504369.tif 000021
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2011504369.tif 000030
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
2011504369.tif 000033
【図１８】
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【図１９】
2011504369.tif 000035
【図２０Ａ】
2011504369.tif 000036
【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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