(57)【要約】本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現によって引き起こされる疾患を治療するための最適化された方法に関する。本発明の一つの実施形態では、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、ＰＣＳＫ９を標的とする第１の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程と、時間間隔を置いた後に、任意で第２の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程であって、前記時間間隔が７日以上である工程とを含む方法が提供される。別の実施形態では、表６に記載の単離されたｄｓＲＮＡのいずれかまたはＡＤ-３５１１を含む組成物もまた提供される。【選択図】図１２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、ＰＣＳＫ９を標的とする第１の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程と、時間間隔を置いた後に、任意で第２の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程であって、前記時間間隔が７日以上である工程とを含む方法。
【請求項２】
前記方法が、少なくとも４０％または少なくとも３０％、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記対象における血清ＬＤＬコレステロールを低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記対象における血清ＬＤＬコレステロールを、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２１日間低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記対象における血清ＬＤＬコレステロールを少なくとも３０％低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記第１の用量を投与してから２日以内にまたは３日以内にまたは７日以内に血清ＬＤＬコレステロールを低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、３日以内に血清ＬＤＬコレステロールを少なくとも３０％低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
循環血清ＡｐｏＢが低下するか、またはＨＤＬｃレベルが安定となるか、またはトリグリセリドレベルが安定となる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、前記対象における総血清コレステロールを低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記対象における総コレステロールを、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２１日間低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記対象における総コレステロールを少なくとも３０％低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、投与してから２日以内にまたは３日以内にまたは７日以内に総コレステロールを低減させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｄｓＲＮＡの単回投与を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）レベルを増大させる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、肝臓トリグリセリドレベルまたは肝臓コレステロールレベルの変化を引き起こさない、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｄｓＲＮＡが、表１ａ、表２ａ、表５ａ、もしくは表６に記載のｄｓＲＮＡまたはＡＤ-３５１１である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＳＫ９標的が配列番号１５２３である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１５２３に対する少なくとも１つの内部ミスマッチを含むセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１２２７からなるセンス鎖と配列番号１２２８からなるアンチセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｄｓＲＮＡがＡＬＤＰ-９６８０である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１５２４を標的とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１５２４に対する少なくとも１つの内部ミスマッチを含むセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｄｓＲＮＡが、配列番号４５７からなるセンス鎖と配列番号４５８からなるアンチセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｄｓＲＮＡがＡＬＤＰ-１０７９２である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｄｓＲＮＡが、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの３０個未満の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｄｓＲＮＡが、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの１９〜２４個のヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス鎖を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｄｓＲＮＡの各々の鎖が、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドの長さである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つの追加の修飾ヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、５'-ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチド、２'-デオキシ-２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２'-アミノ-修飾ヌクレオチド、２'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｄｓＲＮＡがリガンドにコンジュゲートされている、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｄｓＲＮＡが、肝臓細胞を越えた取込みを促進する薬剤にコンジュゲートされている、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｄｓＲＮＡが、肝臓細胞を越えた取込みを促進する薬剤にコンジュゲートされており、前記薬剤が、Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミンコレステロール）またはＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイルを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｄｓＲＮＡが脂質製剤中で投与される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｄｓＲＮＡがＬＮＰまたはＳＮＡＬＰ製剤中で投与される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｄｓＲＮＡの第１または第２の用量が、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５ｍｇ／ｋｇで投与される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が霊長類である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が高脂肪血症のヒトである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｄｓＲＮＡが、真皮下または皮下または静脈内に投与される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
第２の化合物がｄｓＲＮＡとともに共投与される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
第２の化合物が、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、および脂質代謝異常を治療するための薬剤からなる群から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
第２の化合物がスタチンを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
表６に記載の単離されたｄｓＲＮＡのいずれかまたはＡＤ-３５１１を含む組成物。
【請求項４４】
前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つの追加の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、５'-ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチド、２'-デオキシ-２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２'-アミノ-修飾ヌクレオチド、２'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ｄｓＲＮＡがリガンドにコンジュゲートされている、上記の組成物の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ｄｓＲＮＡが、肝臓細胞を越えた取込みを促進する薬剤にコンジュゲートされている、上記の組成物の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ｄｓＲＮＡが、Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミンコレステロール）またはＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイルからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている、上記の組成物の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｄｓＲＮＡが脂質製剤中にある、上記の組成物の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ｄｓＲＮＡがＬＮＰまたはＳＮＡＬＰ製剤である、上記の組成物の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／０２４，９６８号（２００８年１月３１日出願）の恩典を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／０３９，０８３号（２００８年３月２４日出願）の恩典を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／０７６，５４８号（２００８年６月２７日出願）の恩典を主張し、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／１８８，７６５号（２００８年８月１１日出願）を主張する。
【０００２】
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現によって引き起こされる疾患を治療するための最適化された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。他の８つの哺乳類サブチリシンプロテアーゼＰＣＳＫ１〜ＰＣＳＫ８（ＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＣ７、およびＳ１Ｐ／ＳＫＩ-１とも呼ばれる）は、分泌経路において様々なタンパク質を処理し、多様な生物学的プロセスにおいて役割を果たすプロタンパク質転換酵素である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５）。ＰＣＳＫ９はコレステロール代謝において役割を果たすことが提唱されている。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ発現は、コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と同様に、マウスでは食餌コレステロール摂取により下方調節され（非特許文献６）、ＨｅｐＧ２細胞ではスタチンにより上方調節され（非特許文献７）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスでは上方調節される（非特許文献８）。さらに、ＰＣＳＫ９ミスセンス突然変異は、常染色体優性高コレステロール血症（Ｈｃｈｏｌａ３）の一形態と関連していることが分かっている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＰＣＳＫ９はまた、一般集団のＬＤＬコレステロールレベルの決定においても役割を果たしている可能性があるが、これは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、日本人の集団のコレステロールレベルと関連しているからである（非特許文献１２）。
【０００４】
常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は単一遺伝子疾患であり、この疾患では、患者が、総コレステロールレベルとＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫、および早期アテローム性動脈硬化症を示す（非特許文献１３）。ＡＤＨと劣性型の常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）（非特許文献１４）の発病は、肝臓によるＬＤＬ取込みの欠陥が原因である。ＡＤＨは、ＬＤＬ取込みを妨げるＬＤＬＲ突然変異によって、またはＬＤＬＲに結合するＬＤＬ上のタンパク質、アポリポタンパク質Ｂの突然変異によって引き起こされることもある。ＡＲＨは、クラスリンとの相互作用を介したＬＤＬＲ-ＬＤＬ複合体のエンドサイトーシスに必要なＡＲＨタンパク質の突然変異によって引き起こされる。したがって、ＰＣＳＫ９突然変異がＨｃｈｏｌａ３家系において原因となる場合には、ＰＣＳＫ９が受容体を介するＬＤＬ取込みにおいて役割を果たしている可能性が高いと思われる。
【０００５】
過剰発現研究により、ＬＤＬＲレベル、したがって、肝臓によるＬＤＬ取込みを制御する上でのＰＣＳＫ９の役割が指摘されている（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。マウスにおける３日または４日間のアデノウイルス媒介性のマウスＰＣＳＫ９またはヒトＰＣＳＫ９の過剰発現は、総コレステロールレベルとＬＤＬコレステロールレベルの上昇をもたらすが、この効果は、ＬＤＬＲノックアウト動物では見られない（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。さらに、ＰＣＳＫ９過剰発現は、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベル、またはＳＲＥＢＰタンパク質の核対細胞質比には影響を及ぼさずに、肝臓ＬＤＬＲタンパク質の深刻な低下をもたらす。
【０００６】
ＰＣＳＫ９の機能喪失突然変異がマウスモデルで設計され（非特許文献１８）、ヒト個体で同定されている（非特許文献１９）。両方の場合において、ＰＣＳＫ９機能の喪失は、総コレステロールとＬＤＬｃコレステロールの低減をもたらす。１５年にわたるレトロスペクティブな転帰研究では、１コピーのＰＣＳＫ９の喪失が、ＬＤＬｃレベルをより低く変化させ、心血管心疾患の発症からのリスク便益保護の増大をもたらすことが示された（非特許文献２０）。
【０００７】
近年、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構において遺伝子発現を阻止することが示されている。特許文献１（Ｆｉｒｅら）には、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において遺伝子の発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、特許文献２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、および特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚら参照）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、非特許文献２１）、ならびに哺乳類（特許文献４、Ｌｉｍｍｅｒ、および特許文献５、Ｋｒｅｕｔｚｅｒら参照）を含む、他の生物において標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然の機構は、今では、遺伝子の異常なまたは望ましくない調節によって引き起こされる障害を治療するための新しい部類の薬学的薬剤の開発の焦点となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号
【特許文献５】独国特許第１０１００５８６．５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｆ．（２０００）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４，１-２２
【非特許文献２】Ｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｋ．，（１９９８）  Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９，１１-１７
【非特許文献３】Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．（１９９９）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８４８，４５-６２
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒ，Ｎ．Ａ．，（２００３）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７，１２１５-１２２７
【非特許文献５】Ｚｈｏｕ，Ａ．，（１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２０７４５-２０７４８
【非特許文献６】Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．，（２００３）  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４，２１０９-２１１９
【非特許文献７】Ｄｕｂｕｃ，Ｇ．，（２００４）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１４５４-１４５９
【非特許文献８】Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，（２００３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１２０２７-１２０３２
【非特許文献９】Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．，ら．（２００３）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４-１５６
【非特許文献１０】Ｔｉｍｍｓ，Ｋ．Ｍ．，（２００４）  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４，３４９-３５３
【非特許文献１１】Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４）  Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５，４１９-４２２
【非特許文献１２】Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．，（２００４）  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９，１０９-１１４
【非特許文献１３】Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．，（２００３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７９５-１８０３
【非特許文献１４】Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，（２００３）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４，１２１-１２７
【非特許文献１５】Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，７１００-７１０５
【非特許文献１６】Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓら．（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５-４８８７５
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０-５０６３８
【非特許文献１８】Ｒａｓｈｉｄら，（２００５）  ＰＮＡＳ，１０２，５３７４-５３７９
【非特許文献１９】Ｃｏｈｅｎら．（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：１６１-１６５
【非特許文献２０】Ｃｏｈｅｎら，（２００６）  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５４：１２６４-１２７２
【非特許文献２１】Ｙａｎｇ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）１０：１１９１-１２００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の投与によって、高脂血症、メタボリックシンドローム、またはＰＣＳＫ９介在性障害などの障害を有する対象を治療するための方法を提供する。
【００１１】
したがって、対象（例えば、ヒト）におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、ＰＣＳＫ９を標的とする第１の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程と、時間間隔を置いた後に、任意で第２の用量のｄｓＲＮＡを投与する工程であって、この時間間隔が７日以上である工程とを含む方法を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも４０％または少なくとも３０％、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する。
【００１２】
一実施形態では、本方法は、単回用量のｄｓＲＮＡを含む。
【００１３】
本方法は、対象における血清ＬＤＬコレステロールを低減させることができる。いくつかの実施形態では、本方法は、対象における血清ＬＤＬコレステロールを、少なくとも７日間または少なくとも１４日間または少なくとも２１日間低減させる。他の実施形態では、本方法は、対象における血清ＬＤＬコレステロールを少なくとも３０％低減させる。本方法は、第１の用量を投与してから２日以内にまたは３日以内にまたは７日以内に血清ＬＤＬコレステロールを低減させることができる。さらなる一実施形態では、本方法は、３日以内に血清ＬＤＬコレステロールを少なくとも３０％低減させる。
【００１４】
さらなる一実施形態では、循環血清ＡｐｏＢレベルが低下するか、またはＨＤＬｃレベルが安定となるか、またはトリグリセリドレベルが安定となるか、または肝臓トリグリセリドレベルが安定となるか、または肝臓コレステロールレベルが安定となる。またさらなる一実施形態では、本方法は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）レベルを増大させる。
【００１５】
さらに、本方法は、対象における総血清コレステロールを低減させることができる。一態様では、本方法は、対象における総コレステロールを、少なくとも７日間または少なくとも１０日間または少なくとも１４日間または少なくとも２１日間低減させる。別の一態様では、本方法は、対象における総血清コレステロールを少なくとも３０％低減させる。さらなる一態様では、本方法は、投与してから２日以内にまたは３日以内にまたは７日以内に総血清コレステロールを低減させる。
【００１６】
本発明の方法で使用されるｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１ａ、表２ａ、表５ａ、もしくは表６に記載のｄｓＲＮＡまたはＡＤ-３５１１である。別の一実施形態では、ＰＣＳＫ９標的は、配列番号１５２３であるか、またはｄｓＲＮＡは、配列番号１５２３に対する少なくとも１つの内部ミスマッチを含むセンス鎖を含む。さらなる一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１２２７からなるセンス鎖と配列番号１２２８からなるアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡは、例えば、ＡＤ-９６８０であることができる。
【００１７】
あるいは、ｄｓＲＮＡは、配列番号１５２４を標的とするか、またはｄｓＲＮＡは、配列番号１５２４に対する少なくとも１つの内部ミスマッチを含むセンス鎖を含む。一態様では、ｄｓＲＮＡは、配列番号４５７からなるセンス鎖と配列番号４５８からなるアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡは、例えば、ＡＤ-１０７９２であり得る。
【００１８】
本明細書に記載されるように、本方法は、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの３０個未満の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡを使用する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの１９〜２４個のヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス鎖を含む。別の一実施形態では、ｄｓＲＮＡの各々の鎖は、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドの長さである。さらなる一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの追加の修飾ヌクレオチド、例えば、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、５'-ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチド、２'-デオキシ-２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２'-アミノ-修飾ヌクレオチド、２'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドを含む。一態様では、ｄｓＲＮＡは、リガンド、例えば、肝臓細胞を越えた取込みを促進する薬剤、例えば、Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミンコレステロール）またはＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイルにコンジュゲートされている。
【００１９】
本発明の方法では、ｄｓＲＮＡは、製剤中で投与され得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰまたはＳＮＡＬＰ製剤中で投与される。ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、真皮下または皮下または静脈内に投与される。さらなる実施形態では、第２の化合物、例えば、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、および脂質代謝異常を治療するための薬剤からなる群から選択される第２の化合物（例えば、スタチン）が、ｄｓＲＮＡとともに共投与される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、対象は、霊長類、例えば、ヒト、例えば、高脂血症のヒトである。
【００２１】
本発明はまた、表６に記載の単離されたｄｓＲＮＡのいずれかまたはｄｓＲＮＡ  ＡＤ-３５１１を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、表６に記載のｄｓＲＮＡまたはＡＤ３５１１の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの追加の修飾ヌクレオチド、例えば、２'-Ｏ-メチル修飾ヌクレオチド、５'-ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチド、２'-デオキシ-２'-フルオロ修飾ヌクレオチド、２'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２'-アミノ-修飾ヌクレオチド、２'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオチドを含む。
【００２２】
組成物の一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リガンドに、例えば、肝臓細胞を越えた取込みを促進する薬剤に、例えば、Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミンコレステロール）またはＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイルにコンジュゲートされている。
【００２３】
組成物のさらなる一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰまたはＳＮＡＬＰ製剤中にある。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明に示されている。本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。
【００２５】
接頭語「ＡＤ-」、「ＤＰ-」、および「ＡＬ-ＤＰ-」は、互換的に使用される（例えば、「ＡＬ-ＤＰ-９３２７」および「ＡＤ-９３２７」）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＮＤ-９８脂質の構造を示す。
【図２】Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）におけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡの異なるＯＲＦ領域（グラフ上に示されたＯＲＦ位置に対応する最初のヌクレオチドを有する）に対して向けられた１６個のマウス特異的な（ＡＬ-ＤＰ-９３２７からＡＬ-ＤＰ-９３４２までの）ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニングの結果を示す。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【図３】Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）におけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡの異なるＯＲＦ領域（グラフ上に示されたＯＲＦ位置に対応する最初のヌクレオチドを有する）に対して向けられた１６個のヒト／マウス／ラット交差反応性の（ＡＬ-ＤＰ-９３１１からＡＬ-ＤＰ-９３２６までの）ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニングの結果を示す。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【図４】Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における１６個のマウス特異的な（ＡＬ-ＤＰ-９３２７からＡＬ-ＤＰ-９３４２までの）ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニングの結果を示す。総血清コレステロールレベルを各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【図５】Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における１６個のヒト／マウス／ラット交差反応性の（ＡＬ-ＤＰ-９３１１からＡＬ-ＤＰ-９３２６までの）ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビボスクリーニングの結果を示す。総血清コレステロールレベルを各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂはそれぞれ、ＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのインビトロの結果とインビボの結果を比較したものである。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、サル初代肝細胞を用いたＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのインビトロの結果の一例である。図７Ｃは、ＡＬ-ＤＰ-９６８０とＡＬ-ＤＰ-９６８０の化学修飾バージョンとを用いたサル初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９のサイレンシングについての結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、サル初代肝細胞を用いたＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのインビトロの結果の一例である。図７Ｃは、ＡＬ-ＤＰ-９６８０とＡＬ-ＤＰ-９６８０の化学修飾バージョンとを用いたサル初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９のサイレンシングについての結果を示す。
【図７Ｃ】図７Ａおよび図７Ｂは、サル初代肝細胞を用いたＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのインビトロの結果の一例である。図７Ｃは、ＡＬ-ＤＰ-９６８０とＡＬ-ＤＰ-９６８０の化学修飾バージョンとを用いたサル初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９のサイレンシングについての結果を示す。
【図８】ＬＮＰ-０１で処方されたｓｉＲＮＡのＰＣＳＫ-９に対するインビボ活性を示す。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＬＮＰ-０１で処方された化学修飾９３１４と化学修飾を有する誘導体（例えば、ＡＤ-１０７９２、ＡＤ-１２３８２、ＡＤ-１２３８４、ＡＤ-１２３４１）の、マウスにおける単回投与後の様々な時点でのインビボ活性を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与後のラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。図１０Ｂは、１０Ａと同様の実験での血清総コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与により、ラットにおける総コレステロールは約６０％低減するが、これは、約３〜４週間後にベースラインに戻る。図１０Ｃは、１０Ａと同じ実験での肝臓のコレステロールレベルとトリグリセリドレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与後のラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。図１０Ｂは、１０Ａと同様の実験での血清総コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与により、ラットにおける総コレステロールは約６０％低減するが、これは、約３〜４週間後にベースラインに戻る。図１０Ｃは、１０Ａと同じ実験での肝臓のコレステロールレベルとトリグリセリドレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａは、処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与後のラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。図１０Ｂは、１０Ａと同様の実験での血清総コレステロールレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。処方されたＡＤ-１０７９２の単回投与により、ラットにおける総コレステロールは約６０％低減するが、これは、約３〜４週間後にベースラインに戻る。図１０Ｃは、１０Ａと同じ実験での肝臓のコレステロールレベルとトリグリセリドレベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１１】肝臓のＬＤＬ受容体レベルが、ラットにおいてＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを投与した後に上方調節されたことを示すウェスタンブロットである。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｄはそれぞれ、処方されたＡＤ-１０７９２またはＡＤ-９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜図１２Ｄはそれぞれ、処方されたＡＤ-１０７９２またはＡＤ-９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡＣ効果を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜図１２Ｄはそれぞれ、処方されたＡＤ-１０７９２またはＡＤ-９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜図１２Ｄはそれぞれ、処方されたＡＤ-１０７９２またはＡＤ-９６８０の単回投与後の非ヒト霊長類における、ＬＤＬｃとＡｐｏＢタンパク質のレベル、総コレステロール／ＨＤＬｃ比、およびＰＣＳＫ９タンパク質レベルに対するＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１３】図１３Ａは、未修飾のｓｉＲＮＡ-ＡＤ-Ａ１Ａ（ＡＤ-９３１４）は、ヒト初代血液単球においてＩＦＮ-αを誘導したが、２'ＯＭｅ修飾したｓｉＲＮＡ-ＡＤ-１Ａ２（ＡＤ-１０７９２）は誘導しなかったことを示すグラフである。図１３Ｂは、未修飾のｓｉＲＮＡ-ＡＤ-Ａ１Ａ（ＡＤ-９３１４）は、ヒト初代血液単球においてＴＮＦ-αも誘導したが、２'ＯＭｅ修飾したｓｉＲＮＡ-ＡＤ-１Ａ２（ＡＤ-１０７９２）は誘導しなかったことを示すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ-ＡＤ-１Ａ２(別名、ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ａ２または別名、「処方されたＡＤ-１０７９２」)が、用量依存的にマウス肝臓におけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルを減少させたことを示すグラフである。図１４Ｂは、５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ-ＡＤ-１Ａ２の単回投与が、４８時間以内にマウスにおける血清総コレステロールレベルを減少させたことを示すグラフである。
【図１５】図１５Ａは、ヒトとサルのＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ｃ２）（別名、「処方されたＡＤ-９７３６」）、およびマウスＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ａ２）（別名、「処方されたＡＤ-１０７９２」）が、ヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジェニックマウスにおける肝臓ＰＣＳＫ９レベルを低下させたことを示すグラフである。図１５Ｂは、ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ｃ２とＬＮＰ-ＰＣＳ-Ａ２が、同じトランスジェニックマウスにおける血漿ＰＣＳＫ９レベルを低下させたことを示すグラフである。
【図１６】３'末端でのリン酸結合を介してＣｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図１７】ＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（（ＧａｌＮＡｃ）３-３'-リトコール-オレオイルｓｉＲＮＡコンジュゲート）にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図１８】マウスにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対するコンジュゲートｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１９】ラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対する脂質で処方されたｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図２０】表６に記載のＡＤ-９６８０とＡＤ-９６８０の変形物とを用いた、ＨｅＬａ細胞におけるＰＣＳＫ９転写物レベルに対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を示すグラフである。
【図２１】表６に記載のＡＤ-１４６７６とＡＤ-１４６７６の変形物とを用いた、ＨｅＬａ細胞におけるＰＣＳＫ９転写物レベルに対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングするための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節によって調節することができる疾患（例えば、高脂血症）を治療する問題の解決策を提供する。
【００２８】
本発明は、ｄｓＲＮＡを用いて対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方調節することによって調節することができる病理学的状態および疾患（例えば、高脂血症）を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通して配列特異的なｍＲＮＡの分解を導く。
【００２９】
本発明の組成物および方法に有用なｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド未満の長さの、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｄｓＲＮＡの使用によって、ＬＤＬ受容体レベルと循環コレステロールレベルの調節に関与するｍＲＮＡを標的とした分解が可能となる。細胞ベースのアッセイと動物アッセイを用いて、本発明者らは、非常に低用量のこれらのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に仲介し、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の顕著な阻害をもたらすことができることを示した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む方法および組成物は、高脂血症の治療と同様に、ＰＣＳＫ９を下方調節することによって調節することができる病理学的プロセスを治療するために有用である。
【００３０】
以下の詳細な説明には、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡとｄｓＲＮＡを含む組成物の作製法および使用法、ならびにＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方調節することによって調節することができる疾患（例えば、高脂血症）を治療するための組成物および方法が開示されている。本発明の薬学的組成物は、３０ヌクレオチド未満の長さの、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さの相補領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的であるｄｓＲＮＡを、薬学的に許容される担体とともに含む。
【００３１】
したがって、本発明のある態様は、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体とともに含む薬学的組成物、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためにこれらの組成物を使用する方法、およびＰＣＳＫ９の発現を下方調節することによって疾患を治療するためにこれらの薬学的組成物を使用する方法を提供する。
【００３２】
定義
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の用法と本節において提供されるその定義との間に明白な矛盾がある場合には、本節における定義が優先されるものとする。
【００３３】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」は各々、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書で互換的に使用され、ヌクレオ塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳細に記載されるような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分を指すこともあり得ることが理解されよう。当業者にはよく知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分に置換し、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させないでおくことが可能である。例えば、限定するものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含むヌクレオチドに置換し得る。このような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９」は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９遺伝子またはプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９遺伝子タンパク質（別名、ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ-１、ＮＡＲＣ１）を指す。ＰＣＳＫ９に対するｍＲＮＡ配列の例としては、以下のもの、すなわち、ヒト：ＮＭ＿１７４９３６、マウス：ＮＭ＿１５３５６５、およびラット：ＮＭ＿１９９２５３が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを用いて容易に入手可能である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって記述されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、および別途指示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合の「相補的」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、特定の条件下で二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることができ、その場合、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄。生物の内部で直面し得るような生理学的に関連する条件などの、他の条件が適用されることもある。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件の組を決定することができるであろう。
【００３８】
これは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する塩基対形成を含む。このような配列は、互いに対して「完全に相補的」と呼ばれ得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書における第２の配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、この２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはこれらの配列は、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の、しかし通常は、多くて４つ、３つ、もしくは２つのミスマッチの塩基対を形成しながらも、その最終的な適用に最も関連がある条件下でハイブリダイズする能力を保持し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するように設計される場合、そのような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチドの長さの一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチドの長さのもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡは、やはり「完全に相補的」と呼ばれ得る。
【００３９】
本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン-クリック型塩基対および／または非天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、あるいはこれらの塩基対から完全に形成されてもよい。
【００４０】
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらを使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基ミスマッチに関して使用され得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、５'ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３'ＵＴＲを含む、対象となる（例えば、ＰＣＳＫ９をコードする）ｍＲＮＡの連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００４２】
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、かつ上で定義されたような、実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を指す。この二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２つの鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子である場合、このようなｄｓＲＮＡは、文献中でｓｉＲＮＡ（「短干渉ＲＮＡ」）と呼ばれることが多い。２つの鎖が１つのより大きい分子の部分であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３'末端とそれぞれのもう一方の鎖の５'末端の間の中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３'末端とそれぞれのもう一方の鎖の５'末端の間の中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、接続構造体は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドから二重鎖に存在する全ての突出を引いた数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。一般に、各々の鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるように、各々のまたは両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含むことができる。さらに、本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおけるかなりの修飾を含み、かつ本明細書に開示されるかまたは当技術分野で公知の全てのタイプの修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでもよい。ｓｉＲＮＡ型の分子で使用される場合、任意のそのような修飾が、本明細書および特許請求の範囲の目的で、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３'末端がもう一方の鎖の５'末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する不対ヌクレオチド（単数または複数）を指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡのことである。明確にするために、ｓｉＲＮＡの３'末端または５'末端にコンジュゲートされた化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｓｉＲＮＡに突出があるかまたはｓｉＲＮＡが平滑末端であるかを決定する上で考慮されない。
【００４４】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、「相補領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは分子の内部領域または末端領域において許容され得る。通常、最も許容されるミスマッチは、末端領域に、例えば、５'末端および／または３'末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
【００４５】
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【００４６】
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、人の手を借りない拡散プロセスもしくは細胞の能動的プロセスを通じてなされ得るし、または補助的な薬剤もしくは装置によってなされ得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されるものでなく、ｄｓＲＮＡは、生きた生物の一部である「細胞に導入される」場合もある。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含むことになる。例えば、インビボ送達のために、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入するか、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
【００４７】
「〜をサイレンシングする」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方調節する」、「〜の発現を抑制する」などの用語は、これらの用語がＰＣＳＫ９遺伝子を指すものである限り、本明細書では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を指し、この抑制は、ＰＣＳＫ９遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群であって、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるように処理された細胞または細胞群から単離し得る、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、第１の細胞または細胞群のように処理されていない細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、減少していることによって明らかにされるようなものである。阻害の程度は通常、
【００４８】
【数１】
2011511004.tif 000003
【００４９】
で表される。
【００５０】
あるいは、阻害の程度は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現に機能的関連があるパラメータ（例えば、細胞によって分泌される、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされたタンパク質の量、またはある表現型を示す細胞の数）の減少という観点から与えられる場合もある。原則として、標的遺伝子のサイレンシングは、構成的にかまたはゲノム工学によるかのいずれかで、標的を発現している任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって測定することができる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子の発現を一定の度合いで阻害するかどうか、したがって、このｄｓＲＮＡが本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、そのような参照としての役割を果たすものとする。
【００５１】
本明細書で使用される場合、ＰＣＳＫ９発現との関連において、「治療する」、「治療」などの用語は、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの緩和または軽減を指す。本発明との関連において、（ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセス以外の）以下に本明細書で引用される他の状態のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。例えば、高脂血症との関連において、治療は、血清脂質レベルの減少を伴う。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」および「予防的有効量」という語句は、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセス、またはＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの明白な症状の治療、予防、または管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、当技術分野で公知の要因、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスのタイプ、患者の病歴と年齢、ＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスの段階、およびＰＣＳＫ９遺伝子の下方調節により仲介可能な病理学的プロセスを防止する他の薬剤の投与などによって変動し得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」には、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」とは、意図した薬理学的効果、治療的効果、または予防的効果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下したときに、所与の臨床治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するための薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下をもたらすのに必要な量である。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤を投与するための担体を指す。このような担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これら担体は、以下により詳細に記載されている。この用語は、細胞培養培地を特に除外する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞のことである。
【００５６】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
以下に詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳類におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法および二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を有する組成物を提供し、ここで、このｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含み、かつこの相補領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常１９〜２４ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子を発現する細胞と接触したときに、例えば、本明細書に記載のアッセイなどによって測定されるように、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
【００５７】
ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な２つの核酸鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に実質的に相補的で、かつ通常は完全に相補的な相補領域を有することができる。もう一方の鎖（センス鎖）は、好適な条件下で組み合わされたときに、２つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するような、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般に、二重鎖構造の長さは、１５〜３０塩基対、より一般には１８〜２５塩基対、またさらに一般には１９〜２４塩基対、および最も一般には１９〜２１塩基対である。一実施形態では、二重鎖構造の長さは、２１塩基対である。別の一実施形態では、二重鎖構造の長さは、１９塩基対である。同様に、標的配列に対する相補領域の長さは、１５〜３０ヌクレオチド、より一般には１８〜２５ヌクレオチド、またさらに一般には１９〜２４ヌクレオチド、および最も一般には１９〜２１ヌクレオチドである。一実施形態では、相補領域の長さは、１９ヌクレオチドである。
【００５８】
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような、自動ＤＮＡ合成装置の使用により、以下にさらに論じられるような当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。一実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子はヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１ａ、表２ａ、および表５ａのセンス配列から選択される第１の鎖と、表１ａ、表２ａ、および表５ａのアンチセンス配列から選択される第２の鎖とを含む。表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される標的配列のどこかを標的とする代わりのアンチセンス剤は、標的配列とそれに隣接するＰＣＳＫ９配列とを用いて容易に決定することができる。
【００５９】
例えば、（表１ａの）ｄｓＲＮＡ  ＡＤ-９６８０は、３５３０-３５４８においてＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする。したがって、標的配列は以下の通りである：５'  ＵＵＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵ  ３'（配列番号１５２３）。（表１ａの）ｄｓＲＮＡ  ＡＤ-１０７９２は、１０９１-１１０９においてＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする。したがって、標的配列は以下の通りである：５'  ＧＣＣＵＧＧＡＧＵＵＵＡＵＵＣＧＧＡＡ  ３'（配列番号１５２４）。配列番号１５２３と配列番号１５２４に対する相補領域を有するｄｓＲＮＡが本発明に含まれる。
【００６０】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列であって、この少なくとも２つの配列の一方が、この少なくとも２つの配列のもう一方に相補的であり、かつこの少なくとも２つの配列の一方が、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。通常、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドは、表１ａ、表２ａ、および表５ａでセンス鎖として記載されており、第２のオリゴヌクレオチドは、表１ａ、表２ａ、および表５ａでアンチセンス鎖として記載されている。
【００６１】
当業者にはよく知られているように、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを誘導するのに特に有効であることが認められている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ  ２００１，２０：６８７７-６８８８）。しかしながら、より短いまたはより長いｄｓＲＮＡも同様に有効であり得ることが見出されている。上記の実施形態では、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本発明のｄｓＲＮＡは、最小で２１ｎｔの長さの少なくとも１つの鎖を含むことができる。表１ａ、表２ａ、および表５ａの配列の１つから、一方または両方の末端上のほんの数ヌクレオチドを除いたものを有するより短いｄｓＲＮＡが上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることがかなり期待され得る。したがって、表１ａ、表２ａ、および表５ａの配列の１つに由来する少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドの部分配列を有し、かつ以下に本明細書に記載されるＦＡＣＳアッセイにおいてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する能力が、完全配列を含むｄｓＲＮＡと５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％阻害を超えない程度に異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。さらに、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される標的配列内で切断するｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９配列と示された標的配列とを用いて容易に作成することできる。
【００６２】
さらに、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示されるＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉに基づく切断を受けやすいＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ内の部位を識別する。したがって、本発明は、本発明の薬剤の１つによって標的とされる配列内を標的とするＲＮＡｉ剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、第２のＲＮＡｉ剤が、第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡ内のどこかでメッセージを切断するならば、この第２のＲＮＡｉ剤は、第１のＲＮＡｉ剤の配列内を標的とすると言われる。このような第２の薬剤は、通常、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の１つに由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを、ＰＣＳＫ９遺伝子中の選択配列に対して連続する領域から取得されたさらなるヌクレオチド配列と連結したものからなる。例えば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチド（付加されたＡＡ配列は除く）を、標的ＰＣＳＫ９遺伝子由来の次の６ヌクレオチドと組み合わせたものは、表１ａ、表２ａ、および表５ａに示される配列の１つをベースにした２１ヌクレオチドの一本鎖薬剤を生じる。
【００６３】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含むことができる。一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、わずか１つの、わずか２つの、またはわずか３つのミスマッチを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は標的配列に対するミスマッチを含んでおり、ミスマッチの部分は相補領域の中心には位置しない。別の一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は標的配列に対するミスマッチを含んでおり、ミスマッチは、どちらかの末端に由来する５ヌクレオチドに、例えば、相補領域の５'末端または３'末端のどちらかに由来する５、４、３、２、または１ヌクレオチドに制限される。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子のある領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは、中央の１３ヌクレオチドにミスマッチを１つも含まない。本発明に記載される方法を用いて、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。特に、ＰＣＳＫ９遺伝子内の特定の相補領域に、集団内の多型配列変異があることが知られている場合、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する上でミスマッチを有するｄｓＲＮＡの効力を考慮することは重要である。
【００６４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４ヌクレオチド、通常１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出を有する。少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端対応物よりも予想外に優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチド突出の存在によって、全体的な安定性に影響を与えることなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化されることを発見した。わずか１つの突出を有するｄｓＲＮＡは、インビボで、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液、および血清中で特に安定かつ有効であることが分かっている。通常、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３'末端、またはその代わりにセンス鎖の３'末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、通常、アンチセンス鎖の５'末端に位置する平滑末端を有し得る。このようなｄｓＲＮＡは、改善された安定性と阻害活性を有し、それによって、低用量、すなわち、１日にレシピエントの体重１ｋｇ当たり５ｍｇ未満での投与が可能となる。通常、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'末端でのヌクレオチド突出を有し、５'末端は平滑である。別の一実施形態では、突出内のヌクレオチドのうちの１つまたは複数をヌクレオシドチオリン酸と置換する。
【００６５】
化学修飾と化学コンジュゲート
また別の一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、安定性を増強するために化学修飾される。本発明の核酸は、参照により本明細書に組み入れられる「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されている方法のような、当技術分野で十分に確立された方法によって合成および／または修飾され得る。化学修飾としては、２'修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学的部分への共有結合、およびヌクレオチド間リン酸結合と別の結合（例えば、チオリン酸）との置換を挙げることができるが、これらに限定されない。２つ以上のこのような修飾を利用し得る。
【００６６】
２つの別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学結合は、種々の周知の技術のいずれかによって、例えば、共有結合、イオン結合、もしくは水素結合の導入によって、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、もしくはスタッキング相互作用によって、金属イオン配位によって、またはプリン類似体の使用によって達成し得る。一般に、ｄｓＲＮＡを修飾するために使用することができる化学基としては、メチレンブルー；二官能性基、通常、ビス-（２-クロロエチル）アミン；Ｎ-アセチル-Ｎ'-（ｐ-グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４-チオウラシル；およびプソラレンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、リンカーは、ヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは、固相合成によって産生され、ヘキサエチレングリコールリンカーは標準的な方法に従って組み込まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．およびＫ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）  ３５：１４６６５-１４６７０）。特定の一実施形態では、アンチセンス鎖の５'末端とセンス鎖の３'末端は、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に連結される。別の一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端での化学結合は、通常、三重らせん結合によって形成される。表１ａ、表２ａ、および表５ａに、本発明の修飾ＲＮＡｉ剤の例を示す。
【００６７】
また別の一実施形態では、例えば、特定のヌクレアーゼなどの、しかしこれらに限定されない、細胞酵素の分解活性を防止または阻害するために、２つの一本鎖の一方または両方のヌクレオチドを修飾し得る。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害するための技術は、当技術分野で公知であり、これには、２'-アミノ修飾、２'-アミノ糖修飾、２'-Ｆ糖修飾、２'-Ｆ修飾、２'-アルキル糖修飾、非荷電骨格修飾、モルホリノ修飾、２'-Ｏ-メチル修飾、およびホスホロアミデートが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）  １：１１１６-８参照）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２'-ヒドロキシル基が、化学基に、通常、２'-アミノ基または２'-メチル基に置換される。また、ロックされたヌクレオチドを生成するために、少なくとも１つのヌクレオチドを修飾し得る。このようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２'-酸素とリボースの４'-炭素を接続するメチレン架橋を含む。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７-３６３０）およびＯｂｉｋａ，Ｓ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１-５４０４）に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入することにより、相補的な配列への親和性が向上し、融解温度が数℃増大する（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．およびＤ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１-７）。
【００６８】
リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすることにより、細胞への吸収、および特定の組織へのターゲッティングまたは特定の種類の細胞（例えば、肝臓細胞）による取込みが増強され得る。特定の例では、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートして、細胞膜の直接透過および／または肝臓細胞を越える取込みを促進する。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされたリガンドは、受容体を介するエンドサイトーシスの基質となる。こうした手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとｄｓＲＮＡ剤の細胞透過を促進するために使用されている。例えば、コレステロールが様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、そのコンジュゲートされていない類似体と比較して大幅により活性のある化合物となっている。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他の親油性化合物としては、１-ピレン酪酸、１，３-ビス-Ｏ-（ヘキサデシル）グリセロール、およびメントールが挙げられる。受容体を介するエンドサイトーシスのリガンドの一例は、葉酸である。葉酸は、葉酸受容体を介するエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。葉酸を有するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体を介するエンドサイトーシスによって効率的に細胞内に輸送されるであろう。Ｌｉと共同研究者らは、オリゴヌクレオチドの３'末端に葉酸を結合させることによって、オリゴヌクレオチドの細胞取込みが８倍増大したことを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，１５４０。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他のリガンドとしては、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、送達ペプチド、ならびに脂質（例えば、コレステロールおよびコレステリルアミン）が挙げられる。糖質クラスターの例としては、Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミンコレステロール）およびＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイルが挙げられる。
【００６９】
特定の例では、カチオン性リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることによって、ヌクレアーゼに対する抵抗性が向上する。カチオン性リガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、カチオン性リガンドがオリゴヌクレオチド全体に分散している場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対する高い結合親和性を保持することが報告されている。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２，１０３およびその中の参考文献を参照されたい。
【００７０】
いくつかの例では、リガンドは多官能性であり得る、および／またはｄｓＲＮＡは２つ以上のリガンドにコンジュゲートすることができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、取込みを向上させるための１つのリガンドと放出を向上させるための第２のリガンドにコンジュゲートすることができる。
【００７１】
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、連結分子をｄｓＲＮＡに結合させることによって得られるような、反応性ペンダント官能性を有するｄｓＲＮＡを使用することによって合成し得る。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合した連結部分を有するリガンドと直接反応させ得る。本発明の方法は、いくつかの実施形態では、リガンドと適切にコンジュゲートされており、かつ固体支持体材料にさらに結合され得るヌクレオシド単量体を使用することによって、リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡの合成を促進する。任意で固体支持体材料に結合される、このようなリガンド-ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合リガンドと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５'位にある連結部分との反応によって、本明細書に記載される方法の特定の実施形態に従って調製される。特定の例では、ｄｓＲＮＡの３'末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、まず、長鎖アミノアルキル基を介して単量体ビルディングブロックを制御された多孔性ガラス支持体に共有結合させることによって調製される。その後、ヌクレオチドは、標準的な固相合成技術によって、固体支持体に結合した単量体ビルディングブロックに結合させられる。単量体ビルディングブロックは、ヌクレオシドまたは固相合成と適合する他の有機化合物であり得る。
【００７２】
本発明のコンジュゲートで使用されるｄｓＲＮＡは、固相合成の周知の技術によって好都合にかつ日常的に作製し得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、いくつかの業者によって販売されている。当技術分野で公知のこのような合成用の任意の他の手段をさらにまたは代わりに利用し得る。同様の技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの、他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
【００７３】
合成
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示を以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のための単量体に対して引用される米国特許第５，２１２，２９５号；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；骨格修飾オリゴヌクレオチドと還元的カップリングによるその調製に対して引用される米国特許第５，３８６，０２３号；３-デアザプリン環系をベースにした修飾ヌクレオ塩基とその合成方法に対して引用される米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ-２置換プリンをベースにした修飾ヌクレオ塩基に対して引用される米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに対して引用される米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に対して引用される米国特許第５，５３９，０８２号；β-ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドを合成するための方法および材料に対して引用される米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、そのような基がヌクレオシドの様々な位置のいずれかにおいて付加される他の部分に対するリンカーとして使用し得るヌクレオシドに対して引用される米国特許第５，５７８，７１８号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２'-Ｏ-アルキルグアノシンおよび関連化合物（２，６-ジアミノプリン化合物を含む）を調製するためのプロセスに対して引用される米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ-２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，４６９号；３-デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに対して引用される米国特許第５，５８７，４７０号；コンジュゲートされた４'-デスメチルヌクレオシド類似体に対して両方とも引用される米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に対して引用される米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；とりわけ、２'-フルオロ-オリゴヌクレオチドを合成する方法に対して引用される米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号。
【００７４】
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡと、配列特異的な連結ヌクレオシドを有するリガンド分子とにおいて、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド前駆体もしくはヌクレオシド前駆体、または既に連結部分を有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を有するリガンド-ヌクレオチド前駆体またはヌクレオシド-コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有するビルディングブロックを利用して、好適なＤＮＡ合成装置でアセンブルしてもよい。
【００７５】
既に連結部分を有するヌクレオチド-コンジュゲート前駆体を使用する場合には、通常、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成を完了させ、その後、リガンド分子をこの連結部分と反応させて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを生成する。種々の分子（例えば、ステロイド、ビタミン、脂質、およびレポーター分子）を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートがこれまでに記載されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３号参照）。一実施形態では、本発明に掲載されるオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成で日常的に使用される標準的なホスホロアミダイトと標準的でないホスホロアミダイトに加えて、リガンド-ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホロアミダイトを用いて自動合成装置で合成される。
【００７６】
オリゴヌクレオチドのヌクレオシドに２'-Ｏ-メチル基、２'-Ｏ-エチル基、２'-Ｏ-プロピル基、２'-Ｏ-アリル基、２'-Ｏ-アミノアルキル基、または２'-デオキシ-２'-フルオロ基を組み込むことによって、ハイブリダイゼーション特性の増強がオリゴヌクレオチドに付与される。さらに、ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、増強されたヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、本発明の官能化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート骨格、または２'-Ｏ-メチル基、２'-Ｏ-エチル基、２'-Ｏ-プロピル基、２'-Ｏ-アミノアルキル基、２'-Ｏ-アリル基、もしくは２'-デオキシ-２'-フルオロ基のどちらか一方もしくは両方を含むように強化することができる。当技術分野で公知のいくつかのオリゴヌクレオチド修飾のまとめのリストは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３７０９１８号に見出される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、５'末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列を、ＤＮＡ合成装置を用いて調製し、その後、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は当業者に周知である。代表的な活性エステル誘導体としては、N-ヒドロスクシニミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、およびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルの反応によって、選択されたリガンドが連結基を介して５'位に結合したオリゴヌクレオチドが生じる。５'末端のアミノ基は、５'-Ａｍｉｎｏ-Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６試薬を利用して調製することができる。一実施形態では、リガンド分子は、リガンド-ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用することによって、５'位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得るが、この場合、リガンドは、リンカーを介して直接的または間接的に５'-ヒドロキシ基に連結される。５'末端にリガンドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを提供するために、このようなリガンド-ヌクレオシドホスホロアミダイトは、通常、自動合成手順の最後で使用される。
【００７８】
修飾されたヌクレオシド間結合またはヌクレオシド間骨格の例としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３'-５'結合を有するボラノホスフェート、これらの２'-５'結合類似体、および逆の極性を有するボラノホスフェートであって、ヌクレオシド単位の隣接する対が、３'-５'から５'-３'または２'-５'から５'-２'に結合しているボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
【００７９】
リン原子を含む上記の結合の調製に関する代表的な米国特許としては、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，６９７，２４８号が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
その中にリン原子を含まない修飾されたヌクレオシド間結合またはヌクレオシド間骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環の糖間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する他のものが含まれる。
【００８１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する代表的な米国特許としては、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
特定の例では、オリゴヌクレオチドは、非リガンド基で修飾され得る。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強するために、多くの非リガンド分子がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための方法は科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分としては、脂質部分（例えば、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３））、チオエーテル（例えば、ヘキシル-Ｓ-トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５））、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ-Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９））、リン脂質（例えば、ジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-Ｈ-ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７））、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９））、もしくはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上で列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。その後、アミノ基を、適当なカップリング試薬または活性化試薬を用いて、コンジュゲートされている分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体に依然として結合しているオリゴヌクレオチドを用いてかまたはオリゴヌクレオチドの切断後に溶液相において実施され得る。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製によって、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートの使用が特に好ましいが、それは、そのような部分が、ＰＣＳＫ９発現部位である肝臓細胞へのターゲッティングを増大させることができるからであ���。
【００８３】
ベクターにコードされたＲＮＡｉ剤
本発明の別の一態様では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現活性を調節するＰＣＳＫ９特異的なｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａら，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５-１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号参照）。これらのトランスジーンは、線状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができる。これらは、宿主ゲノムに取り込まれ、宿主ゲノムに組み込まれたトランスジーンとして継承され得る。トランスジーンは、染色体外プラスミドとして継承されるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【００８４】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの別々の発現ベクター上のプロモーターによって転写し、標的細胞にコトランスフェクトすることができる。あるいは、各々の個々のｄｓＲＮＡの鎖を、両方とも同じ発現プラスミド上にあるプロモーターによって転写することができる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡがステム・ループ構造を有するように、ｄｓＲＮＡをリンカーポリヌクレオチド配列によって接続された逆向き反復として発現させる。
【００８５】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス(総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）  １５８：９７-１２９)参照)；アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）  ６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１-４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２），Ｃｅｌｌ  ６８：１４３-１５５）参照）；またはアルファウイルスならびに当技術分野で公知の他のウイルスをベースにして構築することができる。レトロウイルスは、上皮細胞を含む、多くの異なる細胞型に、インビトロおよび／またはインビボで種々の遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）  ２３０：１３９５-１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）  ８５：６４６０-６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４-３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９-８０４３；Ｆｅｒｒｙら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７-８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２-１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０-１９；Ｋａｙら，１９９２，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１-６４７；Ｄａｉら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２-１０８９５；Ｈｗｕら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４-４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子の形質導入と発現が可能な組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを好適なパッケージング細胞株（例えば、ＰＡ３１７およびＰｓｉ-ＣＲＩＰ）にトランスフェクトすることによって産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅら，１９９１，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：５-１０；Ｃｏｎｅら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは、感染しやすい宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）における様々な細胞と組織に感染させるために使用することができ（Ｈｓｕら，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染のために有糸分裂が活発な細胞を必要としないという利点もある。
【００８６】
発現されるｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることが可能な任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの指向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、または必要に応じて、異なるウイルスカプシドタンパク質を代用することによって修飾することができる。
【００８７】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどに由来する表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを改変することによって、本発明のＡＡＶベクターを、異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型２のゲノム上の血清型２のカプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子を、血清型５のカプシド遺伝子に置き換えて、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅら（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１-８０１を参照されたく、この開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８８】
本発明で使用するのに好適な組換えウイルスベクター、このベクターにｄｓＲＮＡを発現させるための核酸配列を挿入する方法、およびこのウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１-３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ  Ｍ  Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８-６１４；Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ  Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５-１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｗ  Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５-３０；およびＲｕｂｉｎｓｏｎ  Ｄ  Ａら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１-４０６を参照されたく、これらの開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８９】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するベクターである。特に好ましい一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡを、例えば、Ｕ６  ＲＮＡプロモーターもしくはＨ１  ＲＮＡプロモーターのいずれか、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
【００９０】
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるための好適なＡＶベクター、この組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびこのベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ  Ｈら．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６-１０１０に記載されている。
【００９１】
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるためのＡＡＶベクター、この組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびこのベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒら（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６-３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊら（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０-５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒら（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２-３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願ＷＯ９３／２４６４１号に記載されており、これらの開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかにおけるｄｓＲＮＡ発現を推進するプロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターもしくはアクチンプロモーターもしくはＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター）、または通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターもしくは７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）であってもよく、あるいは発現プラスミドが、Ｔ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードするならば、原核生物のプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）であってもよい。プロモーターは、トランスジーン発現を膵臓に向けることもできる（例えば、膵臓用のインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２５１１-２５１５）参照）。
【００９３】
さらに、トランスジーンの発現は、例えば、特定の生理的調節因子（例えば、循環グルコースレベル）、またはホルモンに感受性のある調節配列のような、誘導可能な調節配列と発現系を用いて、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０-２４）。細胞または哺乳類におけるトランスジーン発現の制御に好適なこのような誘導可能な発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、およびイソプロピル-β-Ｄ１-チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者ならば、ｄｓＲＮＡトランスジーンの意図される使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
【００９４】
通常、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能な組換えベクターは、以下に記載されるように送達され、標的細胞内にとどまる。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現をもたらすウイルスベクターを用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。ひとたび発現すれば、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内への投与によるか、患者から外植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって全身性とすることができる。
【００９５】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、通常、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ-ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。１週間またはそれより長い期間にわたる単一のＰＣＳＫ９遺伝子の異なる領域または複数のＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって企図される。宿主細胞内への本発明のベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性発現は、レポーター、例えば、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を用いてシグナルを得ることができる。エクスビボ細胞の安定的トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を与えるマーカーを用いて確実にすることができる。
【００９６】
ＰＣＳＫ９特異的なｄｓＲＮＡ分子をベクターに挿入し、ヒト患者用の遺伝子治療ベクターとして使用することもできる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４-３０５７参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製は、許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができるし、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞から無傷で産生することができる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【００９７】
ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物、およびこれらを投与する方法を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害、例えば、ＰＣＳＫ９発現によって仲介される病理学的プロセス（例えば、高脂血症）を治療するために有用である。このような薬学的組成物は、送達の様式に基づいて処方される。
【００９８】
投薬量
本明細書に掲載される薬学的組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与される。一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日にレシピエントの体重１キログラム当たり０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、通常、１日に体重１キログラム当たり１〜５０ｍｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【００９９】
薬学的組成物は、１日に１回投与することができるし、またはｄｓＲＮＡは、１日の全体を通して適当な間隔で２回、３回、もしくはそれより多くのサブ用量として投与し得る。ＰＣＳＫ９レベルに対する単回用量の効果は長続きするので、次の用量は、７日を超えない間隔で、または１、２、３、もしくは４週間を超えない間隔で投与される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、制御放出製剤による連続的な注入または送達を用いて投与される。その場合、各々のサブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、１日の総投薬量を達成するために、それ相応により小さくなければならない。数日間にわたる送達のために、例えば、数日間にわたるｄｓＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて投薬単位を構成することもできる。持続放出製剤は、当技術分野で周知であり、特に、特定の部位での薬剤の送達に有用であり、例えば、本発明の薬剤とともに使用することができる。この実施形態では、投薬単位は、相応の複数回の１日量を含む。
【０１０１】
対象の疾患もしくは障害の重症度、過去の治療、全般的な健康、および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、特定の要因が、対象を有効に治療するのに必要とされる投薬量と時機に影響を及ぼし得ることを当業者は理解するであろう。さらに、治療的有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって企図される個々のｄｓＲＮＡについての有効投薬量とインビボ半減期の推定は、本明細書の別の箇所で記載されるように、従来の手法を用いるか、または適当な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて行なうことができる。
【０１０２】
マウス遺伝学の進歩により、ＰＣＳＫ９発現によって仲介される病理学的プロセスのような、様々なヒト疾患を研究するための多くのマウスモデルが作製された。このようなモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボ試験に、および治療的有効用量の決定に使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＰＣＳＫ９を発現するプラスミドを含むマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジーンを有するトランスジェニックマウスである。
【０１０３】
そのような化合物の毒性と治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）とＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１０４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトで使用される様々な投薬量を処方する際に使用することができる。本発明に掲載される組成物の投薬量は、通常、毒性がほとんどないかまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される投薬形態および利用される投与経路によって、この範囲内で変動し得る。本発明に掲載される方法で使用される任意の化合物について、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、または適切な場合には、（例えば、ポリペプチドの濃度の減少を達成する）標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルにおいて処方し得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
【０１０５】
上で論じられたような投与に加えて、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現によって仲介される病理学的プロセスの治療に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。任意の事象において、投与医師は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を用いて観察される効果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量と時機を調整することができる。
【０１０６】
投与
本発明の薬学的組成物は、局所治療が望ましいかまたは全身治療が望ましいかということと、治療されるべき部分とに応じて、多くの方法で投与し得る。投与は、局所、経肺（例えば、ネブライザーによるものを含めた、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹入によるもの）、気管内、鼻腔内、経表皮と経皮と真皮下、経口、または非経口（例えば、皮下）であり得る。
【０１０７】
通常、高脂血症の哺乳類を治療する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、非経口手段によって全身投与される。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内への注射または注入、あるいは頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内、または脳室内への投与が挙げられる。例えば、リポソームとコンジュゲートされたｄｓＲＮＡもしくはリポソームとコンジュゲートされていないｄｓＲＮＡ、またはリポソームとともに処方されたｄｓＲＮＡまたはリポソームとともに処方されていないｄｓＲＮＡを、患者に静脈内投与することができる。そのような投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、一般的な溶媒（例えば、アルコール）中の非水性溶液、または液体油基剤もしくは固体油基剤中の溶液のような組成物中に処方することができる。このような溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加物を含むこともできる。非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の好適な添加物（例えば、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体）をも含む、滅菌水溶液のような組成物中に処方することができる。製剤については、本明細書により詳細に記載されている。
【０１０８】
ｄｓＲＮＡは、特定の組織、例えば、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）を標的とするようなやり方で送達することができる。
【０１０９】
製剤
本発明の薬学的製剤は、単位投薬形態で好都合に提示し得るが、これは、薬学産業で周知の従来技術に従って調製し得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ密接に関連させ、その後、必要があれば、生成物を成形することによって調製する。
【０１１０】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、軟性ジェル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらに限定されない、多くの可能な投薬形態のいずれかに処方し得る。本発明の組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液としても処方し得る。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質をさらに含み得る。懸濁液は、安定化剤も含み得る。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない、種々の成分から生成し得る。一態様では、高脂血症などの肝障害を治療する場合、肝臓を標的とする製剤とする。
【０１１２】
さらに、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造体、または核酸の混合物とともに混合されているか、封入されているか、コンジュゲートされているか、または別の形で関連しているｄｓＲＮＡを含む組成物に処方することができる。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ剤を含む組成物は、他の治療剤、例えば、脂質を低減させる他の薬剤（例えば、スタチン）、またはＰＣＳＫ９以外の遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ化合物を含むことができる。
【０１１３】
経口製剤、非経口製剤、局所製剤、および生物学的製剤
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末剤または顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ジェルカプセル、サシェー剤、錠剤、あるいはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましい場合もある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透増強剤、サーファクタント、およびキレート剤と併せて投与される製剤である。好適なサーファクタントとしては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-２４，２５-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１-モノカプレート、１-ドデシルアザシクロヘプタン-２-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、浸透増強剤の組合せ、例えば、脂肪酸／塩を胆汁酸／塩と組み合わせたものを使用する。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸とカプリン酸とＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-２０-セチルエーテルが挙げられる。本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達してもよいし、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体化してもよい。ｄｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、カチオン化アルブミン、カチオン化デンプン、カチオン化アクリレート、カチオン化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびカチオン化デンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ＤＥＡＥ誘導体化ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、ＤＥＡＥ誘導体化セルロース、ならびにＤＥＡＥ誘導体化デンプンが挙げられる。好適な複合化剤としては、キトサン、Ｎ-トリメチルキトサン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ-アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ-メタクリレート、ＤＥＡＥ-ヘキシルアクリ���ート、ＤＥＡＥ-アクリルアミド、ＤＥＡＥ-アルブミン、およびＤＥＡＥ-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ-乳酸）、ポリ（ＤＬ-乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ））、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤とその調製については、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
非経口投与、実質内（脳内）投与、髄腔内投与、脳室内投与、または肝内投与のための組成物および製剤としては、滅菌水溶液を挙げることができ、これらの滅菌水溶液は、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の好適な添加剤（例えば、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤を含むが、これらに限定されない）も含み得る。
【０１１５】
局所投与用の薬学的組成物および薬学的製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、坐剤、スプレー、液剤、および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性基剤、粉末基剤、または油状基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合もある。好適な局所製剤には、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡが局所送達剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、およびサーファクタント）と混合している製剤が含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性のもの（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性のもの（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、ならびにカチオン性のもの（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、リポソーム中に封入されてもよいし、またはそれに対する、特に、カチオン性リポソームに対する複合体を形成してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質に対して、特に、カチオン性脂質に対して複合体化してもよい。好適な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１-モノカプレート、１-ドデシルアザシクロヘプタン-２-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはＣ１-１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。局所製剤については、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されている。さらに、ｄｓＲＮＡ分子は、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されているような生物学的手段または非生物学的手段として哺乳類に投与することができる。非生物学的送達は、種々の方法によって達成することができ、これらの方法には、限定するものではないが、（１）本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ酸分子をリポソームに充填すること、および（２）ｄｓＲＮＡ分子を脂質またはリポソームと複合体化し、核酸-脂質複合体または核酸-リポソーム複合体を形成させることが含まれる。リポソームは、インビトロで細胞をトランスフェクトするのに一般に使用されるカチオン性脂質と中性脂質から構成され得る。カチオン性脂質は、負の電荷を持つ核酸と複合体化（例えば、電荷会合）し、リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例としては、リポフェクチン、リポフェクトアミン、リポフェクトエース、およびＤＯＴＡＰが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを形成させるための方法は、当技術分野で周知である。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチ��ルグリセロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成させることができる。リポフェクチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびエフェクテン（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を含む、多くの親油性薬剤が市販されている。さらに、全身送達の方法は、市販のカチオン性脂質、例えば、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰ（これらは各々、ＤＯＰＥまたはコレステロールなどの中性脂質と混合し得る）を用いて最適化することができる。場合によっては、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６４７-６５２（１９９７））によって記載されているリポソームのようなリポソームを使用することができる。他の実施形態では、ポリカチオン（例えば、ポリエチレンイミン）を用いて、インビボおよびエクスビボでの送達を達成することができる（Ｂｏｌｅｔｔａら，Ｊ．Ａｍ  Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１７２８（１９９６））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第６，２７１，３５９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９６４号、およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ら  ２００５．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００２-７に見出すことができる。
【０１１６】
生物学的送達は、ウイルスベクターの使用を含むが、これに限定されない、種々の方法によって達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を肝臓細胞に送達することができる。標準的な分子生物学の技術を用いて、本明細書に提供される１つ以上のｄｓＲＮＡを、細胞に核酸を送達するためにこれまでに開発された多くの様々なウイルスベクターのうちの１つに導入することができる。これらの得られたウイルスベクターを用いて、１つ以上のｄｓＲＮＡを、例えば、感染によって、細胞に送達することができる。
【０１１７】
処方されたｄｓＲＮＡの特徴付け
標準的な方法または押出成形を含まない方法のいずれかによって調製された製剤を、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は、通常、目視検査で特徴付けられる。これらは、凝集物または堆積物を含まない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質-ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いた光散乱によって測定することができる。粒子は、約２０〜３００ｎｍ（例えば、４０〜１００ｎｍのサイズ）であるべきである。粒子サイズ分布は、単峰型であるべきである。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、および封入された画分は、色素排出アッセイを用いて推定される。処方されたｓｉＲＮＡの試料は、製剤を崩壊させるサーファクタント（例えば、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００）の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合色素（例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））とともにインキュベートすることができる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線と比べた、サーファクタントを含む試料からのシグナルによって決定することができる。封入された画分は、総ｓｉＲＮＡ含有量から（サーファクタントの非存在下でのシグナルによって測定される）「遊離の」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって決定される。封入されるｓｉＲＮＡの割合は、通常、＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、通常、約少なくとも５０ｎｍ〜約少なくとも１１０ｎｍ、約少なくとも６０ｎｍ〜約少なくとも１００ｎｍ、または約少なくとも８０ｎｍ〜約少なくとも９０ｎｍである。
【０１１８】
リポソーム製剤
研究され、薬物の処方に使用されているマイクロエマルジョンの他にも、組織化されたサーファクタント構造は多く存在する。これらのものとしては、単層、ミセル、二重層、および小胞が挙げられる。小胞（例えば、リポソーム）は、薬物送達の観点から見た、それらが提供する作用の特異性と持続時間が理由で、高い関心を集めている。本発明で使用される場合、「リポソーム」という用語は、球状の二重層（単数または複数）となって配置された両親媒性脂質から構成された小胞を意味する。
【０１１９】
リポソームとは、親油性物質と水性内部から形成された膜を有する単層状または多層状の小胞のことである。水性部分は、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
【０１２０】
無傷の哺乳類皮膚を横断するためには、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、各々５０ｎｍ未満の直径の、一連の細孔を通過しなければならない。したがって、非常に変形しやすく、かつこのような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０１２１】
リポソームのさらなる利点としては、中性リン脂質から得られたリポソームが生体適合性かつ生体分解性であること、リポソームが広範な水溶性薬物と脂溶性薬物を取り込むことができること、リポソームがリポソーム内部のコンパートメント内に封入された薬物を代謝および分解から保護することができることが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
【０１２２】
リポソームは、活性成分の作用部位への移動および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームは、細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進むにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用し得る細胞内に流入する。
【０１２３】
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として広範な研究の焦点となっている。局所投与に関して、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を提供するという証拠が増えている。このような利点としては、投与薬物の高い全身吸収と関連する副作用の低下、所望の標的における投与薬物の蓄積の増大、および親水性と疎水性の両方の、様々な薬物を皮膚に投与する能力が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの報告には、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大半は、皮膚上層を標的とする結果となった。
【０１２５】
リポソームは２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正の電荷を持つリポソームであり、これは、負の電荷を持つＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正の電荷を持つＤＮＡ／リポソーム複合体は、負の電荷を持つ細胞表面に結合し、エンドソーム中に内在化される。エンドソーム内のｐＨが酸性であるため、リポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０-９８５）。
【０１２６】
ｐＨ感受性であるかまたは負の電荷を持つリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを封入する。ＤＮＡと脂質は両方とも同じような電荷を持つので、複合体形成ではなく、反発が生じる。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養されている細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現は標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９-２７４）。
【０１２７】
リポソーム組成物の１つの主要なタイプとして、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成させることができる。アニオン性のリポソーム組成物は、通常、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性の融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１２８】
いくつかの研究では、リポソーム性薬物製剤の皮膚への局所送達が評価されている。モルモットの皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用が、皮膚ヘルペスの痛みを低下させたのに対し、他の手段を介する（例えば、溶液としてのまたはエマルジョンとしての）インターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５-４１０）。さらに、さらなる研究では、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を用いたインターフェロンの投与に対する有効性が検討され、リポソーム製剤が水性投与よりも優れていることが結論付けられた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９-２６５）。
【０１２９】
非イオン性リポソーム系もまた、非イオン性サーファクタントとコレステロールを含む特定の系において、薬物を皮膚に送達する際の有用性を決定するために検討されている。ノバソーム（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-１０-ステアリルエーテル）およびノバソーム（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-１０-ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮にサイクロスポリン-Ａを送達するために使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の様々な層へのサイクロスポリン-Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕら．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０１３０】
リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームも含まれる。これは、本明細書で使用される場合、１つ以上の特殊化した脂質を含むリポソームであって、そのような特殊化した脂質がリポソームに組み込まれたときに、そのような脂質を欠くリポソームと比べて循環寿命が増加するリポソームを指す用語である。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）１つ以上の糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）で誘導体化されているリポソームである。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取込みの低下によるものであると当技術分野で考えられている（Ａｌｌｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０１３１】
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を向上させることができることを報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳述された。両方ともＡｌｌｅｎらに対する米国特許第４，８３７，０２号およびＷＯ８８／０４９２４号には、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）には、スフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。１，２-ｓｎ-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１３２】
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマー性グリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングによって、血液半減期が顕著に増加することを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の付加によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓによって記載されている（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が顕著に増大することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察結果を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成される他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ）にまで拡大した。外表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含むリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号）によって記載されている。いくつかの他の脂質-ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、（両方ともＭａｒｔｉｎらに対する）ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号ならびにＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）には、その表面上の官能性部分でさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームが記載されている。
【０１３３】
核酸を含むいくつかのリポソームが当技術分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ９６／４００６２号には、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法が開示されている。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許第５，２６４，２２１号には、タンパク質結合リポソームが開示され、そのようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることが主張されている。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許第５，６６５，７１０号には、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法が記載されている。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ９７／０４７８７号には、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームが開示されている。
【０１３４】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、さらに別のタイプのリポソームで、非常に変形しやすい脂質凝集体であり、これは、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスファーソームは脂肪滴と記述されてもよく、これは、非常に変形しやすいので、この液滴よりも小さい孔を容易に貫通することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応することができ、例えば、これらは、自己最適化し（皮膚の孔の形に適応する）、自己修復し、断片化することなく標的に達することが多く、かつ自己ローディング（ｓｅｌｆ-ｌｏａｄｉｎｇ）することが多い。トランスファーソームを作るために、表面縁活性化物質（通常、サーファクタント）を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームを介する血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同じくらい有効であることが示されている。
【０１３５】
サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルションを含む）およびリポソームなどの製剤において広く適用されている。天然と合成の両方の、多くの異なるタイプのサーファクタントの特性を分類および区別する最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（別名、「頭部」）の性質は、製剤で使用される異なるサーファクタントを類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１３６】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは薬学的製品および化粧製品に広く適用されており、広範囲のｐＨ値で使用可能である。一般に、非イオン性サーファクタントのＨＬＢ値は、その構造によって２〜約１８の範囲である。非イオン性サーファクタントには、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが含まれる。非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもまた、この部類に含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントの部類の中で最も一般的なメンバーである。
【０１３７】
水に溶解または分散させたときに、サーファクタント分子が負電荷を持つ場合、サーファクタントはアニオン性として分類される。アニオン性サーファクタントには、カルボキシレート（例えば、セッケン）、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（例えば、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェート）、スルホネート（例えば、アルキルベンゼンスルホネート）、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントの部類の中で最も重要なメンバーは、アルキルサルフェートおよびセッケンである。
【０１３８】
水に溶解または分散させたときに、サーファクタント分子が正電荷を持つ場合、サーファクタントはカチオン性として分類される。カチオン性サーファクタントには、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。四級アンモニウム塩は、この部類の中で最も使用されるメンバーである。
【０１３９】
サーファクタント分子が、正または負のいずれかの電荷を持つ能力を有する場合、このサーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ-アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。
【０１４０】
薬品、製剤における、およびエマルジョンにおけるサーファクタントの使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１４１】
ＳＮＡＬＰ
一実施形態では、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸-脂質粒子を形成するよう、脂質製剤中に完全に封入される。本明細書で使用される場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸-脂質粒子を指し、これには、ＳＰＬＰが含まれる。本明細書で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸-脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ-脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環寿命の延長を示し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）で蓄積するので、全身適用に極めて有用である。ＳＰＬＰには、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０３６８３号に示されるような封入された凝縮薬剤-核酸複合体を含む、「ｐＳＰＬＰ」が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、かつ実質的に無毒である。さらに、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で抵抗性である。核酸-脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；および同第６，８１５，４３２号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
【０１４２】
一実施形態では、脂質対薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲にある。
【０１４３】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ-ジオレイル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ-ジステアリル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ-（Ｉ-（２，３-ジオレオイルオキシ）プロピル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ-（Ｉ-（２，３-ジオレイルオキシ）プロピル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ-ジメチル-２，３-ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２-ジリノレイルオキシ-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２-ジリノレニルオキシ-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２-ジリノレイルカルバモイルオキシ-３-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ-Ｃ-ＤＡＰ）、１，２-ジリノレイオキシ-３-（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ-ＤＡＣ）、１，２-ジリノレイオキシ-３-モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ-ＭＡ）、１，２-ジリノレオイル-３-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２-ジリノレイルチオ-３-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ-Ｓ-ＤＭＡ）、１-リノレオイル-２-リノレイルオキシ-３-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ-２-ＤＭＡＰ）、１，２-ジリノレイルオキシ-３-トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ-ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２-ジリノレオイル-３-トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ-ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２-ジリノレイルオキシ-３-（Ｎ-メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ-ＭＰＺ）、もしくは３-（Ｎ，Ｎ-ジリノレイルアミノ）-１，２-プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３-（Ｎ，Ｎ-ジオレイルアミノ）-１，２-プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２-ジリノレイルオキソ-３-（２-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ-ＥＧ-ＤＭＡ）、２，２-ジリノレイル-４-ジメチルアミノメチル-［１，３］-ジオキソラン（ＤＬｉｎ-Ｋ-ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、あるいはそれらの混合物であってもよい。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％または４０ｍｏｌ％を含み得る。
【０１４４】
別の一実施形態では、化合物２，２-ジリノレイル-４-ジメチルアミノエチル-［１，３］-ジオキソランを用いて、脂質-ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２-ジリノレイル-４-ジメチルアミノエチル-［１，３］-ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号（２００８年１０月２３日出願）に記載されている。
【０１４５】
一実施形態では、脂質-ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２-ジリノレイル-４-ジメチルアミノエチル-［１，３］-ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ-Ｃ-ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、粒子サイズは６３．０±２０ｎｍで、ｓｉＲＮＡ／脂質比は０．０２７である。
【０１４６】
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であってもよく、これらのものとしては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン４-（Ｎ-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-１-カルボキシレート（ＤＯＰＥ-ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６-Ｏ-モノメチルＰＥ、１６-Ｏ-ジメチルＰＥ、１８-１-ｔｒａｎｓ  ＰＥ、１-ステアロイル-２-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％であり得る。
【０１４７】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）-脂質であってもよく、これらのものとしては、例えば、ＰＥＧ-ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ-ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ-リン脂質、ＰＥＧ-セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ-ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ-ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ-ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ-ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ-ジステアリルオキシプロピル（Ｃｉ８）であってもよい。粒子の凝集を防ぐコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％または約２ｍｏｌであり得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、核酸-脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌのコレステロールをさらに含む。
【０１４９】
ＬＮＰ
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ-セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて、脂質-ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。各々のエタノールストック溶液を以下のように調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ-セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。その後、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ-セラミドＣ１６のストック溶液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせることができる。組み合わせた脂質溶液を、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％となり、かつ最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中の）水性ｓｉＲＮＡと混合することができる。脂質-ｓｉＲＮＡナノ粒子は、通常、混合すると自発的に形成される。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られるナノ粒子混合物を、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）のようなサーモバレル押出し成形機を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押出し成形することができる。場合によっては、押出し成形工程を省くことができる。エタノール除去およびそれと同時に行なわれる緩衝液交換を、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
【０１５０】
【化１】
2011511004.tif 000004
【０１５１】
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際出願公開ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
【０１５２】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および処方してもよい。エマルジョンとは、通常、１つの液体が通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体に分散している不均質系のことである（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第２巻，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、互いに緊密に混合および分散した２つの不混和液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかであり得る。水相が細かく分離し、微小液滴として分散してバルク油相となる場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が細かく分離し、微小液滴として分散してバルク水相となる場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相の他にさらなる成分と、溶液として水相中に、油相中に、またはそれ自体分離相としてのいずれかで存在し得る活性薬物とを含んでもよい。薬学的賦形剤（例えば、乳化剤、安定化剤、色素、および酸化防止剤）も、必要な場合には、エマルジョン中に存在してよい。薬学的エマルジョンはまた、例えば、油水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョンおよび水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような、３つ以上の相から構成される多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルジョンが提供しない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さい水滴を閉じ込める多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水球に閉じ込められた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
【０１５３】
エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんどないことまたは熱力学的安定性が全くないことを特徴とする。多くの場合、エマルジョンの分散相または不連続相は、よく分散して外側相または連続相となり、乳化剤によってまたは製剤の粘性によってこの形態に維持される。エマルジョン型の軟膏基剤またはクリームの場合には、エマルジョンの相のどちらかが、半固体または固体であってもよい。エマルジョンを安定化する他の手段は、組み込まれてエマルジョンのどちらかの相になり得る乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、４つのカテゴリー、すなわち、合成サーファクタント、天然の乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に大きく分類される（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。
【０１５４】
合成サーファクタントは、表面活性剤としても知られているが、これは、エマルジョンの製剤において広く適用され、文献に概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，１９９）。サーファクタントは、通常、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。サーファクタントの親水性対疎水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれており、製剤の調製においてサーファクタントを類別および選択する上で有益な手段である。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて異なるクラス、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類し得る（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２８５）。
【０１５５】
エマルジョン製剤で使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン、およびアラビアゴムが挙げられる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏエマルジョンを形成しながらも、半固体の硬さを保持することができるような親水性特性を有する（例えば、無水ラノリンおよび親水性ワセリン）。微粉固体も、特にサーファクタントとの組合せで、および粘性のある調製物において優れた乳化剤として使用されている。これらには、極性無機固体（例えば、重金属水酸化物）、非膨潤性粘土（例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、およびコロイド状ケイ酸マグネシウム・アルミニウム）、色素、ならびに非極性固体（例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリル）が含まれる。
【０１５６】
多様な非乳化物質もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および酸化防止剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。
【０１５７】
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムと、多糖などの合成ポリマー（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）と、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）と、合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）とが挙げられる。これらは水中で分散または膨潤してコロイド溶液を生成し、この溶液は、分散相の液滴の周りに強い界面フィルムを生成することよって、および外側相の粘度を増大させることによって、エマルジョンを安定化する。
【０１５８】
エマルジョンは微生物の増殖を容易に支持し得る、糖質、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどのいくつかの成分を含むことが多いため、これらの製剤は防腐剤を組み入れることが多い。エマルジョン製剤に含まれるよく用いられる防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ-ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防ぐために、酸化防止剤もエマルジョン製剤に一般に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤（例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに酸化防止剤の共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であってもよい。
【０１５９】
経皮経路、経口経路、および非経口経路によるエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている(Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９)。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性といった理由により、非常に広く使用されている。（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。鉱油を基剤とする緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物も、ｏ／ｗエマルジョンとして一般に経口投与されている物質に含まれる。
【０１６０】
本発明の一実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは、光学的に等方性でかつ熱力学的に安定な単一の液体溶液である、水と油と両親媒性物質の系と定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５）。通常、マイクロエマルジョンは、まず油を水性サーファクタント溶液に分散させ、次いで十分な量の第４の成分、通常は、中間鎖長アルコールを加えて、透明な系を生成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される２つの不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性に透明な分散液とも記載されている（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１８５-２１５頁）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、サーファクタント、コサーファクタント、および電解質を含む３つから５つの成分の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油とサーファクタントの特性、ならびにサーファクタント分子の極性頭部と炭化水素尾部の構造および幾何学的充填によって決まる（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０１６１】
相図を利用する現象学的アプローチは広く研究されており、マイクロエマルジョンをどのようにして処方するかについての包括的知識を当業者にもたらしている（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．３３５）。通常のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に生成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に水不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【０１６２】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントとしては、単独のまたはコサーファクタントと組み合わせた、イオン性サーファクタント、非イオン性サーファクタント、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これらに限定されない。コサーファクタントは、通常、エタノール、１-プロパノール、および１-ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、これは、サーファクタントフィルム中に浸透し、結果としてサーファクタント分子間に空隙が生じるために無秩序なフィルムを生成することによって、界面の流動性を増大させる作用を有する。しかしながら、マイクロエマルジョンはコサーファクタントを使用せずに調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系が当技術分野で知られている。水相は、通常、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）ジグリセリド、および中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）トリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーン油などの物質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１６３】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化と薬物の吸収促進の見地から特に興味が持たれる。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティを増強することが提唱されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５-１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物の可溶性の向上、薬物の酵素的加水分解からの保護、サーファクタントによって誘導される膜の流動性と浸透性の変化による薬物吸収促進の可能性、調製の容易さ、固体投薬形態に優る経口投与の容易さ、臨床効力の改善、および毒性の減少という利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８-１４３）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、その成分が周囲温度で組み合わせられると、自発的に生成し得る。このことは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを処方する場合に、特に有利であり得る。マイクロエマルジョンは、美容用途と薬学的用途の両方における活性成分の経皮送達でも有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物とマイクロエマルジョン製剤は、消化管からのｄｓＲＮＡと核酸の全身吸収の増大を促進するだけでなく、ｄｓＲＮＡと核酸の局所的な細胞取込みをも向上させると予想される。
【０１６４】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡと核酸の吸収を増強するために、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、ラブラゾール、および浸透増強剤などの追加の成分および添加物を含んでもよい。本発明のマイクロエマルジョンで使用される浸透増強剤は、次の５つの幅広いカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類し得る：サーファクタント、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非サーファクタント（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々については、上で論じられている。
【０１６５】
浸透増強剤
一実施形態では、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効果的な送達をもたらすために、様々な浸透増強剤を利用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態と非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂溶性または親油性の薬物しか細胞膜を容易に横断しない。横断される膜を浸透増強剤で処理した場合、非親油性薬物でも細胞膜を横断し得ることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を越えて拡散することを促進するのに加えて、浸透増強剤は、親油性薬物の透過性も増強する。
【０１６６】
浸透増強剤は、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非サーファクタントのうちの１つに属するものとして分類し得る（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透増強剤の上記のクラスの各々については、以下により詳細に記載されている。
【０１６７】
サーファクタント：本発明との関連において、サーファクタント（または「表面活性剤」）とは、水溶液に溶かしたときに、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、結果として粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化学的実体のことである。胆汁塩と脂肪酸の他に、これらの浸透増強剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-２０-セチルエーテル）（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、ならびにペルフルオロ化合物のエマルジョン、例えば、ＦＣ-４３、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０１６８】
脂肪酸：浸透増強剤として作用する様々な脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ-デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１-モノオレオイル-ｒａｃ-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１-モノカプレート、１-ドデシルアザシクロへプタン-２-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１-１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ-ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｙｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１-３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１-６５４）。
【０１６９】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ'ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，Ｈａｒｄｍａｎら編，ＭｃＧｒａｗ-Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４-９３５）。様々な天然胆汁塩、およびその合成誘導体は、浸透増強剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の任意の天然成分、および任意のその合成誘導体も含まれる。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩である、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ-２４，２５-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，第３９章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，７８２-７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１-３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９-５８３）。
【０１７０】
キレート剤：本発明との関連において使用されるキレート剤は、金属性イオンと錯体を形成することによって、溶液から金属性イオンを除去し、結果として粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる。本発明における浸透増強剤としてのその使用に関して、特徴解析されているほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用に２価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるので、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するというさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５-３３９）。好適なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５-メトキシサリチレート、およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ-アシル誘導体、ラウレス-９、ならびにβ-ジケトンのＮ-アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１-３３；Ｂｕｕｒら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３-５１）。
【０１７１】
非キレート非サーファクタント：本明細書で使用される場合、非キレート非サーファクタント浸透増強化合物は、キレート剤としてまたはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず、消化器粘膜からのｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１-３３）。この種類の浸透増強剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１-アルキル-アルカノン誘導体および１-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁）；ならびに非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン）（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１-６２６）が挙げられる。
【０１７２】
また、細胞レベルでｄｓＲＮＡの取込みを増強する薬剤を、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加してもよい。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら，米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏら，ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１号））もまた、ｄｓＲＮＡの細胞取込みを増強することが知られている。
【０１７３】
投与された核酸の浸透を増強するために、グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）、ピロール（例えば、２-ピロール）、アゾン、ならびにテルペン（例えば、リモネンおよびメントン）を含む、他の薬剤を利用してもよい。
【０１７４】
担体
本発明のｄｓＲＮＡは、薬学的に許容される担体または希釈剤中に処方することができる。「薬学的に許容される担体」（本明細書で「賦形剤」とも呼ばれる）とは、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルのことである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、所望の大きさ、硬さ、他の関連する輸送特性および化学特性を提供するように、計画された投与様式を念頭において選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体には、例として、水；食塩水溶液；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）；潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み入れている。本明細書で使用される場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解するか、または循環からのその除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボ過程によって核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物の共投与は、通常、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体を担体化合物と核酸との間で競合するため、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵器官に回収される核酸の量を実質的に低下させることができる。例えば、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸、または４-アセトアミド-４'イソチオシアノ-スチルベン-２，２'-ジスルホン酸と共投与した場合、部分的にホスホロチオエートであるｄｓＲＮＡの肝組織における回収を低下させることができる（Ｍｉｙａｏら，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５-１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら，ＤｓＲＮＡ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７-１８３）。
【０１７６】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」とは、動物に１つ以上の核酸を送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルのことである。賦形剤は、液体または固体であってもよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望の大きさ、硬さなどを提供するように、計画された投与様式を念頭において選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアレート、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
核酸と有害に反応しない、非経口以外の投与に好適な薬学的に許容される有機賦形剤または無機賦形剤を用いて、本発明の組成物を処方することもできる。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水性溶液、または液体油基剤もしくは固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤を含み得る。核酸と有害に反応しない、非経口以外の投与に好適な薬学的に許容される有機賦形剤または無機賦形剤を使用することができる。
【０１７９】
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
他の成分
本発明の組成物は、薬学的組成物に慣用的に見られる他の補助成分を、その技術分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、もしくは抗炎症剤などの、適合性で、薬学的に活性のあるさらなる物質を含み得るし、または例えば、色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤などの、本発明の組成物の様々な投薬形態を物理的に処方する際に有用なさらなる物質を含み得る。しかしながら、このような物質は、添加されるときに、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害してはならない。製剤を滅菌し、望ましい場合には、製剤の核酸と有害に相互作用しない、補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味料、および／または芳香物質など）と混合することができる。
【０１８１】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた、安定化剤を含み得る。
【０１８２】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法
また別の一態様では、本発明は、哺乳類におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本方法は、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が、長い持続期間、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、またはそれより長く減少するように、本発明の組成物を哺乳類に投与する工程を含む。
【０１８３】
例えば、特定の例では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、本明細書に記載される二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。表１ｂ、表２ｂ、および表５ｂには、様々な濃度の様々なＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡ分子を用いたインビトロアッセイで得られる発現の阻害についての広範囲にわたる値を示す。
【０１８４】
標的ＰＣＳＫ９遺伝子の減少という効果によって、哺乳類の血液中の、およびより特には血清中の、ＬＤＬｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルの減少がもたらされることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＬＤＬｃレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、もしくは６０％、またはそれより多く減少する。
【０１８５】
本方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与する工程を含むが、この場合、ｄｓＲＮＡは、治療される哺乳類のＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する。治療される生物が、ヒトなどの哺乳類である場合、組成物は、経口経路または非経口経路（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与を含む）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段で投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。
【０１８６】
本明細書に記載される方法および組成物を用いて、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を下方調節することによって調節し得る疾患および状態を治療することができる。例えば、本明細書に記載される組成物を用いて、高脂血症ならびに他の形態の脂質平衡失調（例えば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、ならびにこれらの障害に伴う病理学的状態（例えば、心疾患および循環器疾患））を治療することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡで治療される患者には、ｄｓＲＮＡ以外の治療剤、例えば、脂質障害を治療することが知られている薬剤も投与される。
【０１８７】
一態様では、本発明は、対象（例えば、ヒト）におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、第１の単回用量のｄｓＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間下げるのに十分な用量を投与する工程と、任意で、第２の単回用量のｄｓＲＮＡを投与する工程とを含み、ここで、この第２の単回用量は、第１の単回用量を投与した後、少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間投与し、それによって、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
【０１８８】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの用量は、多くて４週間に１回、多くて３週間に１回、多くて２週間に１回、または多くて１週間に１回、投与される。別の一実施形態では、投与は、１か月間、２か月間、３か月間、もしくは６か月間、または１年間、あるいはそれより長い間維持することができる。
【０１８９】
別の一実施形態では、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）レベルが所定の最小レベル（例えば、７０ｍｇ／ｄＬ超、１３０ｍｇ／ｄＬ超、１５０ｍｇ／ｄＬ超、２００ｍｇ／ｄＬ超、３００ｍｇ／ｄＬ超、または４００ｍｇ／ｄＬ超）に達するかまたはそれを超えたときに、投与を提供することができる。
【０１９０】
一実施形態では、対象は、（単に、誰がそれ必要としているかという理由で患者を選択するのとは対照的に）少なくとも一部は、ＬＤＬを低減させるか、ＨＤＬを低減させることなくＬＤＬを低減させるか、ＡｐｏＢを低減させるか、またはＨＤＬを低減させることなく総コレステロールを低減させる必要があることに基づいて選択される。
【０１９１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、免疫系を活性化しない、例えば、ｄｓＲＮＡは、サイトカインレベル（例えば、ＴＮＦ-αレベルまたはＩＦＮ-αレベル）を増大させない。例えば、本明細書に記載されるようなインビトロのＰＢＭＣアッセイのようなアッセイで測定した場合に、ＴＮＦ-αまたはＩＦＮ-αのレベルの増大は、対照ｄｓＲＮＡ（例えば、ＰＣＳＫ９を標的としないｄｓＲＮＡ）で処置した対照細胞の３０％、２０％、または１０％未満である。
【０１９２】
一態様では、本発明は、例えば、対象（例えば、ヒト対象）におけるＰＣＳＫ９遺伝子発現の下方調節により仲介可能な障害、病理学的プロセスもしくは症状を治療、予防、または管理する方法を提供する。一実施形態では、障害は高脂血症である。本方法は、第１の単回用量のｄｓＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間下げるのに十分な用量を投与する工程と、任意で、第２の単回用量のｄｓＲＮＡを投与する工程とを含み、ここで、この第２の単回用量は、第１の単回用量を投与した後、少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間投与し、それによって、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
【０１９３】
別の一実施形態では、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡ、すなわち、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物は、ｄｓＲＮＡ以外の治療剤、例えば、脂質障害（例えば、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、または脂質代謝異常）を治療することが知られている薬剤とともに投与される。例えば、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡは、例えば、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタンカリウム、例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．のコザール（登録商標））、アセチルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、遺伝子ベースの治療、複合血管保護剤（例えば、Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓ製のＡＧＩ-１０６７）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様化合物であるＩＢＡＴ阻害剤（例えば、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ製のＳ-８９２１）、スクアレン合成酵素阻害剤、または単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）-Ｉ阻害剤とともに投与することができる。例示的なＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害剤としては、アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒのリピトール（登録商標）／タホール（Ｔａｈｏｒ）／ソルティス（Ｓｏｒｔｉｓ）／トルバスト（Ｔｏｒｖａｓｔ）／カーディル（Ｃａｒｄｙｌ））、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂのプラバコール、Ｓａｎｋｙｏのメバロチン／サナプラブ（Ｓａｎａｐｒａｖ））、シンバスタチン（Ｍｅｒｃｋのゾコール（登録商標）／シンバコール（Ｓｉｎｖａｃｏｒ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍのデナン（Ｄｅｎａｎ）、Ｂａｎｙｕのリポバス）、ロバスタチン（Ｍｅｒｃｋのメバコール／メビナコール（Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ）、Ｂｅｘａｌのロバスタチナ（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎａ）、セパ（Ｃｅｐａ）；Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｐｈａｒｍａのリポスクラー（Ｌｉｐｏｓｃｌｅｒ））、フルバスタチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓのレスコール（登録商標）／ロコール／ローコール、Ｆｕｊｉｓａｗａのクラノック、Ｓｏｌｖａｙのディガリル（Ｄｉｇａｒｉｌ））、セリバスタチン（Ｂａｙｅｒのリポベイ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのベイコール）、ロスバスタチン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのクレストール（登録商標））、およびピチバスタチン（イタバスタチン／リシバスタチン）（Ｎｉｓｓａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｗａ  Ｋｏｇｙｏ、Ｓａｎｋｙｏ、およびＮｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。例示的なフィブラートとしては、例えば、ベザフィブラート（例えば、Ｒｏｃｈｅのベフィザール（登録商標）／セデュル（登録商標）／ベザリップ（登録商標）、Ｋｉｓｓｅｉのベザトール）、クロフィブラート（例えば、Ｗｙｅｔｈのアトロミド-Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒのリピディル／リパンチル、Ａｂｂｏｔｔのトリコール（登録商標）、Ｔａｋｅｄａのリパンチル、ジェネリック品）、ジェムフィブロジル（例えば、Ｐｆｉｚｅｒのロピッド／リプール（Ｌｉｐｕｒ））、およびシプロフィブラート（Ｓａｎｏｆｉ-Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏのモダリム（登録商標））が挙げられる。例示的な胆汁酸捕捉剤としては、例えば、コレスチラミン（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂのクエストラン（登録商標）およびクエストラン・ライト（商標））、コレスチポール（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａのコレスチド）、ならびにコレセベラン（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｓａｎｋｙｏのウェルコール（商標））が挙げられる。例示的なナイアシン治療としては、例えば、即時放出製剤（例えば、Ａｖｅｎｔｉｓのニコビッド（Ｎｉｃｏｂｉｄ）、Ｕｐｓｈｅｒ-Ｓｍｉｔｈのナイアコール（Ｎｉａｃｏｒ）、Ａｖｅｎｔｉｓのニコラー（Ｎｉｃｏｌａｒ）、およびＳａｎｗａｋａｇａｋｕのペリシット）が挙げられる。ナイアシン持続放出製剤としては、例えば、Ｋｏｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのナイアスパンおよびＵｐｓｈｅｒ-ＳｍｉｔｈのＳＩｏ-ナイアシンが挙げられる。例示的な抗血小板剤としては、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒのアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆi-Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂのプラビックス）、ならびにチクロピジン（例えば、ＳａｎｏｆiＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのチクリッドおよびＤａｉｉｃｈｉのパナルジン）が挙げられる。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと組み合わせて有用な他のアスピリン様化合物としては、例えば、アサカード（徐放性アスピリン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）およびパミコグレル（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）が挙げられる。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤としては、例えば、ラミプリル（例えば、Ａｖｅｎｔｉｓのアルテース）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．のバソテック）が挙げられる。例示的なアシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤としては、例えば、アバシマイブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシマイブ（ＢｉｏＭeｒｉｅｕｘ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ-５０５（ＳａｎｋｙｏおよびＫｙｏｔｏ）、ならびにＳＭＰ-７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）が挙げられる。例示的なコレステロール吸収阻害剤としては、例えば、エゼチミブ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ゼチーア（登録商標））およびパマケシド（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。例示的なＣＥＴＰ阻害剤としては、例えば、トルセトラピブ（ＣＰ-５２９４１４とも呼ばれる、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ-７０５（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ）、およびＣＥＴｉ-Ｉ（Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質(ＭＴＴＰ)阻害剤としては、例えば、インプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ-１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ-３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。他の例示的なコレステロール調節物質としては、例えば、ＮＯ-１８８６（Ｏｔｓｕｋａ／ＴＡＰ  ��ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ-１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ-１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ-Ａｙｅｒｓｔ）が挙げられる。例示的な胆汁酸調節物質としては、例えば、ＨＢＳ-１０７（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕ／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ-５１１（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ-１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ-８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＳＤ-５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ-７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストとしては、例えば、テサグリタザール（ＡＺ-２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ネトグリタゾン（ＭＣＣ-５５５）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ-４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ-５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ-９２９（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ-４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ-５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ならびにＭＫ-７６７（ＭｅｒｃｋおよびＫｙｏｒｉｎ）が挙げられる。例示的な遺伝子ベースの治療としては、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ１２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ-００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）（ＣＶ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）が挙げられる。例示的な糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤としては、例えば、ロキシフィバン（ＤＭＰ７５４とも呼ばれる、Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ガントフィバン（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ／Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ）、およびクロマフィバン（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。例示的なスクワレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＢＭＳ-１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ-２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ-２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ-２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ-４７５（Ｔａｋｅｄａ）が挙げられる。例示的なＭＣＰ-Ｉ阻害剤は、例えば、ＲＳ-５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。抗アテローム性動脈硬化剤ＢＯ-６５３（Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体ナイクリン（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ）もまた、本発明に掲載されるｄｓＲＮＡと組み合わせて投与するのに適している。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとともに投与するのに好適な例示的な併用療法としては、例えば、アドビコール（Ｋｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ製のナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにエゼチミブ／シンバスタチン（例えば、���ｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ製のバイトリン（登録商標）１０／１０錠、１０／２０錠、１０／４０錠、および１０／８０錠）が挙げられる。高コレステロール血症を治療するための薬剤であって、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと組み合わせて投与するのに好適なものとしては、例えば、ロバスタチン、ナイアシンアルトプレブ（登録商標）持続放出錠（Ａｎｄｒｘ  Ｌａｂｓ）、ロバスタチンカデュエット（登録商標）錠（Ｐｆｉｚｅｒ）、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムクレストール（登録商標）錠（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムレスコール（登録商標）カプセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムレスコール（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムリピトール（登録商標）錠（Ｐａｒｋｅ-Ｄａｖｉｓ）、アトルバスタチンカルシウムロフィブラ（登録商標）カプセル（Ｇａｔｅ）、ナイアスパン持続放出錠（Ｋｏｓ）、ナイアシンプラバコール錠（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムトリコール（登録商標）錠（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートバイトリン（登録商標）１０／１０錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンＷｅｌＣｈｏｌ（商標）錠（Ｓａｎｋｙｏ）、塩酸コレセベラムゼチーア（登録商標）錠（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブゼチーア（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブゾコール（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。
【０１９４】
一実施形態では、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡは、エゼチミブ／シンバスタチンの組合せ（例えば、バイトリン（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））と組み合わせて投与される。
【０１９５】
一実施形態では、ＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡを患者に投与し、その後、ｄｓＲＮＡ以外の薬剤を患者に投与する（またはその逆）。別の一実施形態では、ＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡとｄｓＲＮＡ以外の治療剤を同時に投与する。
【０１９６】
別の一態様では、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの投与の仕方をエンドユーザー（例えば、介護者または対象）に指示する方法を掲載する。本方法は、任意で、エンドユーザーに１回以上の用量のｄｓＲＮＡを提供する工程と、本明細書に記載される治療計画に基づいてｄｓＲＮＡを投与するようエンドユーザーに指示し、それによって、エンドユーザーに指示する工程とを含む。
【０１９７】
また別の一態様では、本発明は、患者が、ＬＤＬを低減させること、ＨＤＬを低減させることなくＬＤＬを低減させること、ＡｐｏＢを低減させること、またはＨＤＬを低減させることなく総コレステロールを低減させることを必要としていることに基づいて患者を選択することによって、患者を治療する方法を提供する。本方法は、例えば、ＨＤＬレベルを実質的に低減させることなく、患者のＬＤＬレベルまたはＡｐｏＢレベルを低減させるのに十分な量でＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを患者に投与する工程を含む。
【０１９８】
別の一態様では、本発明は、患者が、ＡｐｏＢレベルの低減を必要としていることに基づいて患者を選択し、患者のＡｐｏＢレベルを低減させるのに十分な量でＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡを患者に投与するすることによって、患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、ＰＣＳＫ９の量は、ＬＤＬレベルおよびＡｐｏＢレベルを低減させるのに十分である。別の一実施形態では、ＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡの投与は、患者におけるＨＤＬコレステロールのレベルには影響を及ぼさない。
【０１９９】
別途規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の専門家によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試行で使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含む、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、実例であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【実施例】
【０２００】
実施例１．ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子ウォーキング
２つの別々の選択で同定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行なった。
【０２０１】
ａ）ヒトとマウスまたはラットのいずれかのＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡおよび
ｂ）標的遺伝子ＰＣＳＫ９に対する予測される特異性を有する全てのヒト反応性ｓｉＲＮＡ。
【０２０２】
ヒト、マウス、およびラットのＰＣＳＫ９に対するｍＲＮＡ配列を用いた。ヒト配列ＮＭ＿１７４９３６．２は、ｓｉＲＮＡ選択手順の全体にわたって参照配列として用いた。
【０２０３】
ヒトとマウス、およびヒトとラットのＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ配列で保存されている１９ｍｅｒのストレッチを最初の工程で同定し、ヒトとマウスに交差反応するｓｉＲＮＡ、およびヒトとラットの標的に交差反応するｓｉＲＮＡを選択した。
【０２０４】
ヒトＰＣＳＫ９を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを第２の選択で同定した。全ての潜在的なヒトＰＣＳＫ９の１９ｍｅｒ配列を抽出し、候補標的配列として規定した。ヒト、サルに交差反応する配列、ならびにマウス、ラット、ヒト、およびサルに交差反応する配列を表１ａおよび表２ａに全て記載する。これらの配列の化学修飾バージョンおよびインビボアッセイとインビトロアッセイの両方におけるそれらの活性も表１ａおよび表２ａに全て記載する。データは、実施例と図２〜８に記載されている。
【０２０５】
候補標的配列とそれらの対応ｓｉＲＮＡをランク付けして、適当なものを選択するために、無関係な標的と相互作用するそれらの予測される潜在能（オフターゲット潜在能）をランキングパラメータとして採用した。低いオフターゲット潜在能を有するｓｉＲＮＡを好ましいものとして規定し、インビボでより特異的であると仮定した。
【０２０６】
ｓｉＲＮＡ特異的なオフターゲット潜在能を予測するために、以下の仮定を行なった。
【０２０７】
１）（５'から３'に数えて）鎖の位置２〜９（シード領域）は、配列の残り部分（非シード領域と切断部位領域）よりも大きくオフターゲット潜在能に寄与し得る。
【０２０８】
２）（５'から３'に数えて）鎖の位置１０と１１（切断部位領域）は、非シード領域よりも大きくオフターゲット潜在能に寄与し得る。
【０２０９】
３）各々の鎖の位置１と１９は、オフターゲット相互作用に関係がない。
【０２１０】
４）オフターゲットスコアは、遺伝子の配列に対するｓｉＲＮＡ鎖配列の相補性とミスマッチの位置とに基づいて、各々の遺伝子と各々の鎖について算出することができる。
【０２１１】
５）予測されるオフターゲットの数と最も高いオフターゲットスコアは、オフターゲット潜在能と考えられるに違いない。
【０２１２】
６）オフターゲットスコアは、オフターゲットの数よりもオフターゲット潜在能に関連があると考えられるべきである。
【０２１３】
７）導入された内部修飾によってセンス鎖活性が不全になる可能性を仮定すれば、アンチセンス鎖のオフターゲット潜在能のみが関連があることになる。
【０２１４】
潜在的なオフターゲット遺伝子を同定するために、１９ｍｅｒの候補配列を、公的に入手可能なヒトＲＮＡ配列に対する相同性検索に供した。
【０２１５】
オフターゲットスコアを算出するために、各々のオフターゲット遺伝子について、各々の１９ｍｅｒインプット配列に関する以下のオフターゲット特性を抽出した。
【０２１６】
非シード領域内のミスマッチの数
シード領域内のミスマッチの数
切断部位領域内のミスマッチの数
オフターゲットスコアは、１〜３の仮定を考慮して以下のように算出した。
【０２１７】
オフターゲットスコア＝シードミスマッチの数＊１０
＋  切断部位ミスマッチの数＊１．２
＋  非シードミスマッチの数＊１
インプットの１９ｍｅｒ配列に対応する各々のｓｉＲＮＡに対して最も関連があるオフターゲット遺伝子を、最も低いオフターゲットスコアを有する遺伝子と規定した。したがって、最も低いオフターゲットスコアを、各々のｓｉＲＮＡに対して関連があるオフターゲットスコアと規定した。
【０２１８】
実施例２．ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に示されていない場合、そのような試薬は、分子生物学での適用に標準的な品質／純度の分子生物学用試薬の任意の供給業者から入手し得る。
【０２１９】
ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および固体支持体として制御された多孔性ガラス（ＣＰＧ，５００A，Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１μモルのスケールで固相合成によって産生した。ＲＮＡおよび２'-Ｏ-メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを、それぞれ、対応するホスホロアミダイトおよび２'-Ｏ-メチルホスホロアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、固相合成によって作製した。これらのビルディングブロックを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト化学を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をボーケージ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）のアセトニトリル（１％）溶液と置き換えることによって導入した。さらなる補助試薬は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０２２０】
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護と精製は、確立された方法に従って行なった。収率と濃度は、分光光度計（ＤＵ  ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉsｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２６０ｎｍの波長におけるそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により決定した。二本鎖ＲＮＡは、アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合することによって作製し、８５〜９０℃で３分間、水浴で加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却した。アニールしたＲＮＡの溶液は、使用するまで-２０℃で保存した。
【０２２１】
コンジュゲートｓｉＲＮＡ
３'-コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（本明細書で-Ｃｈｏｌ-３'とも呼ぶ）を合成するために、適切に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成に使用した。修飾された固体支持体は、以下のように調製した。
【０２２２】
ジエチル-２-アザブタン-１，４-ジカルボキシレートＡＡ
【０２２３】
【化２】
2011511004.tif 000005
【０２２４】
撹拌し、氷冷したグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水（５０ｍｌ）溶液に、４．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を添加した。その後、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、反応の完了がＴＬＣで確認されるまで混合物を室温で撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【０２２５】
３-｛エトキシカルボニルメチル-［６-（９Ｈ-フルオレン-９-イルメトキシカルボニル-アミノ）-ヘキサノイル］-アミノ｝-プロピオン酸エチルエステルＡＢ
【０２２６】
【化３】
2011511004.tif 000006
【０２２７】
Ｆｍｏｃ-６-アミノ-ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍｌ、２５．８３ｍｍｏｌ）をこの溶液に０℃で添加した。次いで、ジエチル-アザブタン-１，４-ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温にし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製して、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
【０２２８】
３-［（６-アミノ-ヘキサノイル）-エトキシカルボニルメチル-アミノ］-プロピオン酸エチルエステルＡＣ
【０２２９】
【化４】
2011511004.tif 000007
【０２３０】
３-｛エトキシカルボニルメチル-［６-（９Ｈ-フルオレン-９-イルメトキシカルボニルアミノ）-ヘキサノイル］-アミノ｝-プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、２０％ピペリジンを含むジメチルホルムアミドに０℃で溶解した。溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物をその塩酸塩に変換することにより精製した。
【０２３１】
３-（｛６-［１７-（１，５-ジメチル-ヘキシル）-１０，１３-ジメチル-２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７-テトラデカヒドロ-１Ｈ-シクロペンタ［ａ］フェナントレン-３-イルオキシカルボニルアミノ］-ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル-アミノ）-プロピオン酸エチルエステルＡＤ
【０２３２】
【化５】
2011511004.tif 000008
【０２３３】
３-［（６-アミノ-ヘキサノイル）-エトキシカルボニルメチル-アミノ］-プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩をジクロロメタン中に入れた。懸濁液を氷上で０℃に冷却した。懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、クロロギ酸コレステリル（６．６７５  ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【０２３４】
１-｛６-［１７-（１，５-ジメチル-ヘキシル）-１０，１３-ジメチル-２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７-テトラデカヒドロ-１Ｈ-シクロペンタ［ａ］フェナントレン-３-イルオキシカルボニルアミノ］-ヘキサノイル｝-４-オキソ-ピロリジン-３-カルボン酸エチルエステルＡＥ
【０２３５】
【化６】
2011511004.tif 000009
【０２３６】
カリウムｔ-ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリー化した。混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを、撹拌しながら２０分以内にゆっくり添加した。添加中、温度を５℃未満に保った。撹拌を０℃で３０分間続け、１ｍＬの氷酢酸を添加し、直後に４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含む４０ｍＬの水を添加した。得られた混合物を各々１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を各々１０ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、３回５０ｍＬずつの冷ｐＨ９．５炭酸緩衝液で抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に合わせ、５回４０ｍＬずつのクロロホルムで抽出し、これを合わせ、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するカラムクロマトグラフィーで精製して、１．９ｇのｂ-ケトエステル（３９％）を得た。
【０２３７】
［６-（３-ヒドロキシ-４-ヒドロキシメチル-ピロリジン-１-イル）-６-オキソ-ヘキシル］-カルバミン酸１７-（１，５-ジメチル-ヘキシル）-１０，１３-ジメチル-２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７-テトラデカヒドロ-１Ｈ-シクロペンタ［ａ］フェナントレン-３-イルエステルＡＦ
【０２３８】
【化７】
2011511004.tif 000010
【０２３９】
メタノール（２ｍＬ）を、ｂ-ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混合物を含むテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に１時間かけて滴下して添加した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温に冷却後、１Ｎ  ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮し、生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
【０２４０】
(６-{３-[ビス-(４-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメチル]-４-ヒドロキシ-ピロリジン-１-イル}-６-オキソ-ヘキシル)-カルバミン酸１７-(１,５-ジメチル-ヘキシル)-１０,１３-ジメチル-２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７-テトラデカヒドロ-１Ｈ-シクロペンタ[ａ]フェナントレン-３-イルエステルＡＧ
【０２４１】
【化８】
2011511004.tif 000011
【０２４２】
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ  １．９９４ｍｍｏｌ）を、真空中でピリジン（２×５ｍＬ）とともに蒸発させることにより乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）と４，４'-ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。反応を室温で一晩行なった。反応をメタノールの添加によりクエンチした。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍ水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンとともに蒸発させることにより除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中））で精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０２４３】
コハク酸モノ-(４-[ビス-(４-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメチル]-１-{６-[１７-(１,５-ジメチル-ヘキシル)-１０,１３-ジメチル２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７-テトラデカヒドロ-１Ｈ-シクロペンタ[ａ]フェナントレン-３-イルオキシカルボニルアミノ]-ヘキサノイル}-ピロリジン-３-イル)エステルＡＨ
【０２４４】
【化９】
2011511004.tif 000012
【０２４５】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をコハク無水物（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空中、４０℃で一晩乾燥させた。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温でアルゴン雰囲気下１６時間撹拌した。その後、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷水性クエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をそのまま次の工程に使用した。
【０２４６】
コレステロール誘導体ＣＰＧ  ＡＩ
【０２４７】
【化１０】
2011511004.tif 000013
【０２４８】
スクシネートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）混合液に溶解した。この溶液に、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（１．２５ｍＬ）、２，２'-ジチオ-ビス（５-ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）を連続的に添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（０．６ｍｌ）を添加した。反応混合物は明るいオレンジ色に変わった。リストアクションシェーカーを用いて、溶液を短く撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン-ＣＰＧ（ＬＣＡＡ-ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗に通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続的に洗浄した。未反応アミノ基を酢酸無水物／ピリジンを用いてマスクした。達成されたＣＰＧの充填を、ＵＶを測ることによって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０２４９】
コレステリル誘導体について、核酸オリゴマーの５'末端にホスホロチオエート結合を導入するためにボーケージ試薬を用いて酸化工程を行なったことを除き、５'-１２-ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書で「５'-Ｃ３２-」と呼ぶ）または５'-コレステリル誘導体基（本明細書で「５'-Ｃｈｏｌ-」と呼ぶ）を有するｓｉＲＮＡの合成は、ＷＯ２００４／０６５６０１号に記載の通りに実施した。
【０２５０】
Ｃｈｏｌ-ｐ-（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-コレステロール）（図１６）およびＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３（Ｎ-アセチルガラクトサミン-３'-リトコール-オレオイル）（図１７）にコンジュゲートされたｄｓＲＮＡの合成は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１２／３２８，５２８号（２００８年１２月４日出願）に記載されている。
【０２５１】
実施例３．ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、および初代サル肝細胞におけるＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡスクリーニングは、高度に活性のある配列を見出す
ＨｕＨ-７細胞は、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（Ｓｈｉｎｊｕｋｕ，Ｊａｐａｎ，カタログ番号：ＪＣＲＢ０４０３）から入手した。細胞は、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ａ２２１３）、および２ｍＭ  Ｌ-グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｋ０２８２）を含むように補充したダルベッコのＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｆ０４３５）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で培養した。ＨｅｐＧ２細胞とＨｅＬａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，カタログ番号ＨＢ-８０６５）から入手し、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ａ２２１３）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｋ-０２９３）、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム  （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｌ-０４７３）を含むように補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号２１０９０-０２２）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で培養した。
【０２５２】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート中に２．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（単回用量スクリーニング用に３０ｎＭ）のトランスフェクションを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１６６８-０１９）を用いて、製造元により記載されている通りに行なった。
【０２５３】
トランスフェクションから２４時間後、ＨｕＨ７細胞とＨｅｐＧ２細胞を溶解し、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルをプロトコルに従ってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ-０００-０２）を用いて定量した。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ-ＤＨ  ｍＲＮＡに対して正規化した。各々のｓｉＲＮＡについて、８つの個々のデータポイントを収集した。ＰＣＳＫ９遺伝子と無関係なｓｉＲＮＡ二重鎖を対照として用いた。所与のＰＣＳＫ９特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、対照ｓｉＲＮＡ二重鎖で処置した細胞におけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ濃度と比べた、処置細胞におけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ濃度の割合として表した。
【０２５４】
初代カニクイザル肝細胞（凍結保存したもの）を、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｍ００３０５）から入手し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ培地（カタログ番号Ｚ９９０２９）中、３７℃で、５％ＣＯ２を含む雰囲気下、加湿インキュベーター内で培養した。
【０２５５】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、初代カニクイザル細胞をコラーゲンコートプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０８-７７４-５）に、９６ウェルプレート中、３．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（３０ｎＭからの２倍希釈系列を８つ）の２つ１組でのトランスフェクションを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１６６８-０１９）を用いて、製造元により記載されている通りに行なった。
【０２５６】
トランスフェクションから１６時間後、培地を、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックス（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号Ｚ９９０００）が添加された新鮮なＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ培地に交換した。
【０２５７】
培地交換から２４時間後、初代カニクイザル細胞を溶解し、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルをプロトコルに従ってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ-０００-０２）を用いて定量した。その後、正規化したＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比を、リポフェクトアミン２０００のみの対照のＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比と比較した。
【０２５８】
表１ｂおよび表２ｂ（および図６Ａ）に結果をまとめ、異なる細胞株における異なる用量でのインビボスクリーニングの例を示す。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングは、所与の用量での残存する転写物のパーセンテージとして表した。
【０２５９】
高度に活性のある配列とは、１００ｎＭ以下の用量の所与のｓｉＲＮＡで処置した後に７０％未満の転写物が残存する配列のことである。非常に活性のある配列とは、１００ｎＭ以下の用量の処置後に６０％未満の転写物が残存する配列のことである。活性のある配列とは、高用量（１００ｎＭ）で処置した後に９０％未満の転写物が残存する配列のことである。
【０２６０】
また、活性のあるｓｉＲＮＡの例を、以下に記載の通りに、リピドイド製剤中でマウスにおいてインビボでスクリーニングした。インビトロで活性のある配列は、一般に、インビボでも活性があった（図６Ａおよび図６Ｂおよび実施例４参照）。
【０２６１】
実施例４．ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビボ効力のスクリーニング
ＬＮＰ-０１リポソーム中に処方された３２個のＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを、マウスモデルにおいてインビボで試験した。ＬＮＰ０１は、コレステロール、ｍＰＥＧ２０００-Ｃ１４グリセリド、およびｄｓＲＮＡから生成されたリピドイド製剤である。ＬＮＰ０１製剤は、ｄｓＲＮＡを肝臓に送達するのに有用である。
【０２６２】
処方手順
リピドイドＬＮＰ-０１・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（図１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ-セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて、脂質-ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。各々のエタノールストック溶液を調製した：ＬＮＰ-０１、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ-セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。その後、ＬＮＰ-０１コレステロール、およびＰＥＧ-セラミドＣ１６のストック溶液を、４２：４８：１０のモル比で組み合わせた。組み合わせた脂質溶液を、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％となり、かつ最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、（酢酸ナトリウムｐＨ５中の）水性ｓｉＲＮＡと速やかに混合した。脂質-ｓｉＲＮＡナノ粒子は、混合すると自発的に形成された。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、サーモバレル押出し成形機（Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を用いて、ポリカーボネート膜（１００ｎｍカットオフ）を通して押出し成形した場合もあった。押出し成形工程を省いた場合もあった。エタノール除去およびそれと同時に行なわれる緩衝液交換を、透析または接線流濾過のいずれかによって達成した。緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。
【０２６３】
製剤の特徴付け
標準的な方法または押出成形を含まない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の方法で特徴付けられる。製剤は、まず目視検査で特徴付けられる。これらは、凝集物または堆積物を含まない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質-ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いた動的光散乱によって測定される。粒子は、２０〜３００ｎｍ、理想的には、４０〜１００ｎｍのサイズであるべきである。粒子サイズ分布は、単峰型であるべきである。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、および封入された画分は、色素排出アッセイを用いて推定される。処方されたｓｉＲＮＡの試料は、製剤を崩壊させるサーファクタントである０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合色素Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートされる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線と比べた、サーファクタントを含む試料からのシグナルによって決定される。封入された画分は、総ｓｉＲＮＡ含有量から（サーファクタントの非存在下でのシグナルによって測定される）「遊離の」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって決定される。封入されるｓｉＲＮＡの割合は、通常、＞８５％である。
【０２６４】
ボーラス投与
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群、８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＬＮＰ-０１中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、体重１ｇ当たり１０μｌで、５ｍｇ／ｋｇ用量の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、マウスを紫外線ランプの下に置いた。
【０２６５】
投与から４８時間後に、ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、-８０℃で保存した。
【０２６６】
凍結した肝臓は、６８５０  Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ  ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析まで-８０℃で保存した。
【０２６７】
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μｌの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μｌのライセートを９０μｌの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨまたはシクロフィリンＢに特異的なプローブセットとともに、５２℃で一晩インキュベートした。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア２．０（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号ＱＧ-００２-０２）を援用して、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＥ）プローブ用、Ｌａｂｅｌ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＬＥ）プローブ用、およびブロッキング（ＢＬ）プローブ用の核酸配列を、ＰＣＳＫ９、ＧＡＰＤＨ、およびシクロフィリンＢの核酸配列から選択した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡまたはシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【０２６８】
マウス血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、ＳｔａｎＢｉｏ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒキット（ＳｔａｎＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｏｅｒｎｅ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、４９５ｎｍで測定を行なった。
【０２６９】
結果
少なくとも１０個のＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡは、ＰＢＳで処置した対照群と比較して４０％よりも大きいＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウンを示したのに対し、無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群には効果がなかった（図２〜図３）。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングは、これらの動物における総血清コレステロールの低減とも相関した（図４〜図５）。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのノックダウンに関して最も効果のあるｓｉＲＮＡは、最も顕著なコレステロール低減効果も示した（図２〜図３と図４〜図５を比較されたい）。さらに、インビトロで活性のある分子とインビボで活性のある分子の間には、強い相関関係があった（図６Ａと図６Ｂを比較されたい）。
【０２７０】
異なる化学修飾を含む配列もまた、インビトロ（表１および表２）とインビボでスクリーニングした。一例として、あまり修飾されていない配列ＡＤ-９３１４およびＡＤ-９３１８と、その配列ＡＤ-９３１４がより修飾されたバージョン（ＡＤ-１０７９２、ＡＤ-１０７９３、およびＡＤ-１０７９６）；ＡＤ-９３１８がより修飾されたバージョン（ＡＤ-１０７９４、ＡＤ-１０７９５、ＡＤ-１０７９７）を、インビトロ（初代サル肝細胞）またはインビボで両方とも試験した（ＬＮＰ-０１中に処方されたＡＤ-９３１４およびＡＤ-１０７９２）。図７（表１および表２も参照）は、親分子ＡＤ-９３１４およびＡＤ-９３１８と、その修飾バージョン全てにインビトロで活性があったことを示している。一例としての図８は、親ＡＤ-９３１４配列とより高度に修飾されたＡＤ-１０７９２配列の両方にインビボで活性があり、それらがマウスにおける内在性ＰＣＳＫ９の５０〜６０％のサイレンシングを示すことを示している。図９は、ＡＤ-９３１４およびＡＤ-０７９２の他の化学修飾バージョンの活性をさらに例示している。
【０２７１】
ＡＤ-１０７９２の誘導体である、ＡＤ-３５１１は、１０７９２と同じくらい効果的であった（約０．０７〜０．２ｎＭのＩＣ５０）（データは示さない）。ＡＤ-３５１１のセンス鎖とアンチセンス鎖の配列は以下の通りである。
【０２７２】
センス鎖：５'-ＧｃｃｕＧＧＡＧｕｕｕＡｕｕｃＧＧＡＡｄＴｓｄＴ  配列番号１５２１
アンチセンス鎖：５'-ｐｕＵＣＣＧＡＡｕＡＡＡＣＵＣｃＡＧＧＣｄＴｓｄＴ  配列番号１５２２
実施例５．ＰＣＳＫ９の作用持続時間に関する実験
ラット
ラットを尾静脈注射により５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１-１０７９２（処方されたＡＬＤＰ-１０７９２）で処置した。示した時点（表３参照）で血液を採取し、ＰＢＳ処置動物と比較した総コレステロールの量を標準的な方法で測定した。総コレステロールレベルは、２日目に約６０％減少したが、２８日目までにベースラインに戻った。これらのデータは、ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡの処方されたバージョンが、コレステロールレベルを長時間低減させることを示している。
【０２７３】
サル
カニクイザルをＬＮＰ０１で処方されたｄｓＲＮＡで処置し、ＬＤＬ-Ｃレベルを評価した。合計１９匹のカニクイザルを投与群に割り当てた。１１日目から始めて、動物に以下のスケジュールに従って１日２回、制限給餌した：午前９時に給餌、午前１０時に食餌除去、午後４時に給餌、午後５時に食餌除去。投与の最初の日に、全ての動物に３０分の静脈内注入を１回投与した。臨床兆候、体重、および臨床病理指数（直接的なＬＤＬコレステロールとＨＤＬコレステロールを含む）の変化について、動物を評価した。
【０２７４】
大腿静脈からの静脈穿刺を用いて、血液試料を採取した。試料は、朝の給餌の前（すなわち、午前９時前）と朝の給餌の約４時間後（午後１時から）に、第１群〜第７群については３日前、１日前、３日目、４日目、５日目、および７日目に；第１群、第４群、および第６群については１４日目に；第１群については１８日目と２１日目に；ならびに第４群および第６群については２１日目に採取した。少なくとも２つの１．０ｍｌ試料を各時点で採取した。
【０２７５】
１．０ｍｌの血清試料には抗凝固剤を添加せず、各々１．０ｍｌの血漿試料には乾燥抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（Ｋ２）を添加した。凝固を促進するために、血清試料を少なくとも２０分間室温で静置し、その後、試料を氷上に置いた。血漿試料は、試料採取後できるだけ速やかに氷上に置いた。さらなる処理のために、試料は３０分以内に臨床病理学実験室に運んだ。
【０２７６】
冷却遠心分離機を用いて、試験施設標準操作手順によって、血液試料をできるだけ速やかに処理して血清または血漿にした。各々の試料をほぼ等しい３つの容量に分けて、液体窒素中で素早く凍結し、-７０℃に置いた。各々のアリコートは、最低でも約５０μＬとなったはずであった。採取された全試料容量が１５０μＬ未満の場合、残りの試料容量を最後のチューブに入れた。各々の試料に、動物番号、投与群、採取日、日付、名目採取時間、および研究番号をラベルした。血清ＬＤＬコレステロールは、製造元の指示書に従ってＢｅｃｋｍａｎ分析装置で標準的な手順により直接測定した。
【０２７７】
結果を表４に示す。５ｍｇ／ｋｇで投与したＬＮＰ０１-１０７９２とＬＮＰ０１-９６８０は、用量投与後３〜７日以内に血清ＬＤＬコレステロールを減少させた。血清ＬＤＬコレステロールは、ＬＮＰ０１-１０７９２を受けた動物では１４日目までに、およびＬＮＰ０１-９６８０を受けた動物では２１日目までに、ベースラインレベルに戻った。このデータにより、ＬＮＰ０１で処方されたＡＬＤＰ-９６８０のコレステロール低減について２１日を上回る作用持続時間が示された。
【０２７８】
実施例６．ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡは肝臓抽出物におけるＰＣＳＫ  ｍＲＮＡ減少を引き起こし、血清コレステロールレベルを低減させる。
【０２７９】
ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡによるＰＣＳＫ９転写物の急性サイレンシング（およびその後のＰＣＳＫ９タンパク質の下方調節）が、総コレステロールレベルを急性に低減させることになるかどうかを検討するために、ｓｉＲＮＡ分子ＡＤ-１ａ２（ＡＤ-１０７９２）をＬＮＰ０１リピドイド製剤中に処方した。これらのｄｓＲＮＡの配列と修飾を表５ａに示す。リポソームで処方されたｓｉＲＮＡ二重鎖ＡＤ-１ａ２（ＬＮＰ０１-１ａ２）を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスまたはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに異なる用量で低容量（マウスの場合、約０．２ｍｌ、ラットの場合、約１．０ｍｌ）で尾静脈から注射した。
【０２８０】
マウスでは、注射から４８時間後に、肝臓を採取し、ＰＣＳＫ９転写物のレベルを測定した。肝臓に加えて、血液を採取し、総コレステロールの解析に供した。ＬＮＰ０１-１ａ２は、明白な用量応答を示し、ルシフェラーゼを標的とする対照ｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ０１-ｃｔｒｌ）またはＰＢＳ処置動物と比較してＰＣＳＫ９メッセージの抑制が最大であった（約６０〜７０％）（図１４Ａ）。最高の用量でのＰＣＳＫ９転写物の減少により、マウスにおける総コレステロールが約３０％低減することになった（図１４Ｂ）。このコレステロール低下レベルは、ヘテロ接合ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスについて報告されたレベルとホモ接合ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスについて報告されたレベルの間である（Ｒａｓｈｉｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：５３７４-９，２００５，ｅｐｕｂ  Ａｐｒｉｌ  １，２００５）。したがって、ＲＮＡｉ機構によるＰＣＳＫ９転写物の低減は、マウスにおける総コレステロールを急性に減少させることができる。さらに、ＰＣＳＫ９転写物に対する効果は２０〜３０日間持続し、より高い用量でより大きい初期の転写物レベルの低下を示し、また、より持続する効果を後に示した。
【０２８１】
高用量のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害剤でさえもコレステロールレベルが変化しないままであるので、ラットにおける総コレステロールの下方調節は、歴史的に見て困難であった。興味深いことに、マウスと比較して、ラットは、ｂＤＮＡアッセイで測定した場合に、遥かにより高レベルのＰＣＳＫ９基礎転写物レベルを有するように見える。ラットに、１、２．５、および５ｍｇ／ｋｇで尾静脈からＬＮＰ０１-ａ２の単回注射を投与した。注射から７２時間後肝臓組織と血液を採取した。ＬＮＰ０１-１ａ２は、対照ルシフェラーゼｓｉＲＮＡおよびＰＢＳと比較して、明白な用量応答効果を示し、最も高い用量でＰＣＳＫ９転写物が最大５０〜６０％サイレンシングされた（図１０Ａ）。ｍＲＮＡのサイレンシングは、１０日間持続する約５０〜６０％の急性の血清総コレステロール減少を伴い(図１０Ａおよび図１０Ｂ)、約３週までに徐々に投与前のレベルに戻った（図１０Ｂ）。この結果から、ｓｉＲＮＡターゲッティングによるＰＣＳＫ９の低減が、ラットモデル系において総コレステロールに対する急性の強力な持続的効果を有することが示された。観察された転写物の低下がｓｉＲＮＡ機構によるものであったことを確認するために、処置動物または対照動物に由来する肝臓抽出物を５'ＲＡＣＥに供した。５'ＲＡＣＥは、予測されたｓｉＲＮＡ切断事象が起こることを示すために以前に利用された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ．４４１：１１１-４，２００６，Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  ２６）。ＰＣＲ増幅と予測された部位特異的ｍＲＮＡ切断事象の検出は、ＬＮＰ０１-１ａ２で処置した動物で観察されたが、ＰＢＳ対照動物またはＬＮＰ０１-ｃｔｒｌ対照動物では観察されなかった（Ｆｒａｎｋ-Ｋａｍａｎｅｔｓｋｙら（２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：１１９７１５-１１９２０）。この結果から、観察されたＬＮＰ０１-１ａ２の効果は、ｓｉＲＮＡ特異的機構を介したＰＣＳＫ９転写物の切断によるものであることが示された。
【０２８２】
ＰＣＳＫ９がコレステロールレベルに影響を及ぼす機構は、細胞表面上のＬＤＬＲの数と関連がある。（マウス、ＮＨＰ、およびヒトとは対照的に）ラットは、コレステロール合成を厳しく調節することによって、また、それ程ではないがＬＤＬＲレベルを制御することによって、コレステロールレベルを制御している。ＬＤＬＲの調節がＲＮＡｉによるＰＣＳＫ９の治療的ターゲッティングによって起こったかどうかを調べるために、本発明者らは、５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１-１ａ２で処置したラットで（ウェスタンブロッティングによって）肝臓ＬＤＬＲレベルを定量した。図１１に示すように、ＬＮＰ０１-１ａ２で処置した動物は、ＰＢＳまたはＬＮＰ０１-ｃｔｒｌ対照ｓｉＲＮＡで処置した動物と比較して、ＬＮＰ０１-１ａ２の単回投与から４８時間後のＬＤＬＲレベルを著しく（約３〜５倍）誘導していた。
【０２８３】
ＰＣＳＫ９の低下によって肝臓自体のトリグリセリドとコレステロールのレベルが変化するかどうかを検討するためのアッセイも行なった。ＶＬＤＬの会合と分泌に関与する遺伝子（例えば、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）またはＡｐｏＢ）を、遺伝子欠失、化合物、またはｓｉＲＮＡ阻害剤により急性に低減させることによって、肝臓トリグリセリドが増大した（例えば、Ａｋｄｉｍら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１８：３９７-４００，２００７参照）。肝臓でのＰＣＳＫ９サイレンシングによって誘導される血漿コレステロールの排除の増大（およびその後の肝臓ＬＤＬＲレベルの増大）が肝臓トリグリセリドの蓄積をもたらすことは予測されていなかった。しかしながら、この可能性を検討するために、処置動物または対照動物の肝臓における肝臓コレステロールと肝臓トリグリセリドの濃度を定量した。図１０Ｃに示すように、対照と比較して、ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを投与されたラットの肝臓ＴＧレベルまたは肝臓コレステロールレベルには統計的な差がなかった。これらの結果により、ＰＣＳＫ９サイレンシングとその後のコレステロール低減は、過剰な肝脂質蓄積をもたらす可能性が低いことが示された。
【０２８４】
実施例７．ｓｉＲＮＡに対するさらなる修飾は、ラットにおけるコレステロール低下のサイレンシングと持続時間に影響を及ぼさない
ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３'末端でのホスホロチオエート修飾は、エキソヌクレアーゼから保護することができる。ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方における２'ＯＭｅ修飾と２'Ｆ修飾は、エンドヌクレアーゼから保護することができる。ＡＤ-１ａ２（表５ｂ参照）は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に２'ＯＭｅ修飾を含む。化学修飾（２'ＯＭｅ修飾と２'Ｆ修飾またはその混合）の（ヒト血清中でのｓｉＲＮＡ安定性によって測定される）固有の安定性またはその程度もしくは種類が、観察されたラットでのサイレンシング効果の効力または持続時間に関連するかどうかを明らかにするために実験を行なった。同じＡＤ-１ａ２コア配列を有するが、異なる化学修飾を含むｓｉＲＮＡの安定性を生じさせ、初代カニクイザル肝細胞におけるインビトロの活性について調べた。一連のこれらの分子は、ＰＣＳＫ９サイレンシングについて、インビトロのＩＣ５０値によって測定した場合によく似た活性を維持したが（表５ｂ）、その後、これらをヒト血清中でのエキソヌクレアーゼ切断とエンドヌクレアーゼ切断に対する安定性について調べた。各々の二重鎖をヒト血清中、３７℃（タイムコース）でインキュベートし、ＨＰＬＣ分析に供した。親配列ＡＤ-１ａ２は、ヒトプール血清中で約７時間のＴ1/2を有していた。配列ＡＤ-１ａ３、ＡＤ-１ａ５、およびＡＤ-１ａ４は、より大きく修飾されていたが（表５の化学修飾を参照）、全て２４時間を上回るＴ1/2を有していた。化学修飾または安定性の違いによって効力の変化が生じたのかどうかを検討するために、ＡＤ-１ａ２配列、ＡＤ-１ａ３配列、ＡＤ-１ａ５配列、ＡＤ-１ａ４配列、およびＡＤ-対照配列を処方し、ラットに注射した。投与後の様々な日に動物から血液を採取し、総コレステロール濃度を測定した。以前の実験から、ＬＮＰ０１-１ａ２で処置されたラットにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルの低減と総コレステロール値の低減との間に非常に密接な相関があることが示されていた（図１０Ａ）。４つの分子は全て、投与２日目に（ＰＢＳまたは対照ｓｉＲＮＡに対して）総コレステロールを約６０％減少させることが観察され、また、これらの分子は全て、総コレステロールレベルに対して同等の効果を有し、よく似た強度プロファイルと持続時間プロファイルを示した。ヒト血清中での異なる化学的性質または安定性にもかかわらず、これらの分子によって示されるコレステロール低減の大きさと効果の持続時間に統計的な差はなかった。
【０２８５】
実施例８．ＬＮＰ０１-１ａ２とＬＮＰ０１-３ａ１は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＣＳＫ９と循環ヒトＰＣＳＫ９タンパク質をサイレンシングする。
【０２８６】
ＬＮＰ０１-１ａ２（すなわち、ＰＣＳ-Ａ２またはＡＤ-１０７９２）と、別の分子ＡＤ-３ａ１（すなわち、ＰＣＳ-Ｃ２またはＡＤ-９７３６）（これは、ヒトとサルのＰＣＳＫ９メッセージのみを標的とする）がヒトＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングする効力をインビトロで調べた。ＡｐｏＥプロモーターの下でヒトＰＣＳＫ９を発現するトランスジェニックマウスの株を用いた（Ｌａｇａｃｅら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２９９５-３００５，２００６）。それぞれ、ヒトの転写物とタンパク質は検出するが、マウスの転写物とタンパク質は検出しない、特異的ＰＣＲ試薬と特異的抗体を設計した。ヒト化マウスのコホートに、単回用量のＬＮＰ０１-１ａ２（別名、ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ａ２）またはＬＮＰ０１-３ａ１（別名、ＬＮＰ-ＰＣＳ-Ｃ２）を注射し、４８時間後に肝臓と血液を採取した。単回用量のＬＮＰ０１-１ａ２またはＬＮＰ０１-３ａ１は、ヒトＰＣＳＫ９  転写物レベルを＞７０％減少させることができ（図１５Ａ）、この転写物の下方調節によって、ＥＬＩＳＡで測定した場合に著しくより低いレベルの循環ヒトＰＣＳＫ９タンパク質がもたらされた（図１５Ｂ）。これらの結果により、両方のｓｉＲＮＡがヒト転写物をサイレンシングすることができ、また後に循環血漿のヒトＰＣＳＫ９タンパク質の量を低下させることができることが示された。
【０２８７】
実施例９．分泌ＰＣＳＫ９レベルは、ＮＨＰでは食餌によって調節される。
【０２８８】
マウスでは、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルは、ステロール調節エレメント結合タンパク質-２という転写因子によって調節されており、絶食によって低下する。臨床的な慣例、および標準的なＮＨＰ研究では、一晩の絶食期間の後、血液採取とコレステロールレベルを測定する。これは、一部には、循環ＴＧの変化によってＬＤＬｃ値の算出が妨げられる可能性があるためである。マウスでの絶食行為と給餌行為によるＰＣＳＫ９レベルの調節を考慮して、ＮＨＰにおける絶食と給餌の効果を理解するために実験を行なった。
【０２８９】
１時間後に食餌を除去する１日２回の給餌スケジュールにカニクイザルを順化させた。動物に、朝９時から１０時まで食餌を与え、その後、食餌を除去した。動物には、次に午後５時から６時までの１時間、もう１度食餌を与え、その後、食餌を除去した。（午後６時から翌朝の９時までの）一晩の絶食の後と、さらに、朝９時の給餌から２時間後および４時間後に、血液を採取した。血液血漿または血液血清中のＰＣＳＫ９レベルをＥＬＩＳＡアッセイで測定した（方法を参照）。興味深いことに、循環ＰＣＳＫ９レベルは、一晩の絶食の後により高く、給餌から２時間後と４時間後に減少することが分かった。このデータは、ＰＣＳＫ９レベルが食餌の摂取によって高度に調節される齧歯類モデルと一致していた。しかしながら、予期しないことに、ＰＣＳＫ９のレベルは、給餌後の最初の数時間下がった。この結果により、処方されたＡＤ-１ａ２と初代カニクイザル肝細胞で高度に活性のある別のＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ（ＡＤ-２ａ１）の有効性を、より慎重に設計したＮＨＰ実験によって追跡することができるようになった。
【０２９０】
実施例１０．ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における循環ＬＤＬｃ、ＡｐｏＢ、およびＰＣＳＫ９を低下させるが、ＨＤＬｃは低下させない。
【０２９１】
ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡにより、マウスとラットにおいて、投与後７２時間までにＰＣＳＫ９レベルと総コレステロールレベルの両方が急性に低減し、単回投与後、約２１〜３０日持続した。こうした知見を、そのリポタンパク質プロファイルがヒトのリポタンパク質プロファイルと最もよく似ている種にまで拡大するために、さらなる実験をカニクイザル（Ｃｙｎｏ）モデルで行なった。
【０２９２】
両方ともＰＣＳＫ９を標的とする、ｓｉＲＮＡ  １（ＬＮＰ０１-１０７９２）とｓｉＲＮＡ  ２（ＬＮＰ-０１-９６８０）を、カニクイザルに投与した。図１２に示すように、両方のｓｉＲＮＡは、投与後７日までの間、顕著な脂質低減を引き起こした。ｓｉＲＮＡ  ２は、投与後少なくとも７日間の約５０％の脂質低減と、投与後１４日での約６０％の脂質低減を引き起こし、ｓｉＲＮＡ  １は、少なくとも７日間の約６０％の脂質低減を引き起こした。
【０２９３】
まず、オスのカニクイザルを、４０ｍｇ／ｄｌ以上のＬＤＬｃを有するサルかどうかについて事前にスクリーニングした。その後、選ばれた動物に絶食／給餌の食餌投与計画を施し、１１日間順化させた。投与の３日前と１日前に、絶食時と給餌後４時間の両方の時点で血清を採取し、総コレステロール（Ｔｃ）、ＬＤＬ（ＬＤＬｃ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬｃ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）、ならびにＰＣＳＫ９の血漿レベルを解析した。３日前のＬＤＬｃレベルに基づいて動物を無作為抽出した。投与の日（１日目と表記する）に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＬＮＰ０１-１ａ２および５ｍｇ／ｋｇ  ＬＮＰ０１-２ａ１を、対照としてのＰＢＳおよび１ｍｇ／ｋｇ  ＬＮＰ０１-ｃｔｒｌと並行して注射した。投与は全て十分に許容され、生存中の所見はなかった。実験が進むにつれて、より低い用量は有効でないことが（ＬＤＬｃ低減に基づいて）明らかになった。したがって、本発明者らは、ＰＢＳ群の動物に１４日目に５ｍｇ／ｋｇ  ＬＮＰ０１-ｃｔｒｌ対照ｓｉＲＮＡを投与したが、これはその後、５ｍｇ／ｋｇ  ＬＮＰ０１-１ａ２および５ｍｇ／ｋｇ  ＬＮＰ０１-２ａ１の高用量群に対する追加の対照としての役割を果たすことができた。まず、投与後３、４、５、および７日目に動物から血液を採取し、Ｔｃ、ＨＤＬｃ、ＬＤＬｃ、およびＴＧの濃度を測定した。（ＬＤＬｃレベルが７日目までにベースラインに戻らなかったので）高用量群のＬＮＰ０１-１ａ２、ＬＮＰ０１-２ａ１からの追加の採血は、投与後１４日目と２１日目に行なった。
【０２９４】
図１２Ａに示すように、ＬＮＰ０１-１ａ２またはＬＮＰ０１-２ａ１の単回投与は、投与後３日目からの統計的に有意なＬＤＬｃの低下をもたらし、これは、約１４日（ＬＮＰ０１-１ａ２の場合）および約２１日（ＬＮＰ０１-２ａ１）かけてベースラインに戻った。この効果は、ＰＢＳ群でも、対照ｓｉＲＮＡ群でも、１ｍｇ／ｋｇ処置群でも見られなかった。投与前のレベルと比較して、ＬＮＰ０１-２ａ１は、投与から７２時間後に平均で５６％のＬＤＬｃ低減をもたらし、４匹の動物のうちの１匹は、ほぼ７０％のＬＤＬｃ減少を達成し、他は全て、＞５０％のＬＤＬｃ減少を達成した（図１２Ａ参照）。予期した通り、血清ＥＬＩＳＡで測定した場合、処置動物におけるＬＤＬｃの低減は、循環ＡｐｏＢレベルの低下とも相関した（図１２Ｂ）。興味深いことに、このカニクイザルの研究で観察されたＬＤＬｃ低減の程度は、高用量スタチンについて、および高コレステロール血症のために使用される他の現在のケア化合物標準について報告されている程度よりも大きかった。作用の開始も、スタチンの作用の開始よりも遥かにより急性であり、投与後早くも４８時間で見られる。
【０２９５】
ＬＮＰ０１-１ａ２処置もＬＮＰ０１-２ａ１処置も、ＨＤＬｃの低減をもたらさなかった。それどころか、両分子とも、Ｔｃ／ＨＤＬ比の減少傾向を（平均的に）もたらした（図１２Ｃ）。さらに、循環トリグリセリドレベルと、１匹の動物を例外として、ＡＬＴとＡＳＴのレベルは、それほど影響されなかった。
【０２９６】
ＰＣＳＫ９タンパク質レベルも処置動物と対照動物で測定した。図１１に示すように、ＬＮＰ０１-１ａ２処置とＬＮＰ０１-２ａ１処置は各々、投与前と比べて、循環ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの減少傾向をもたらした。具体的に、より活性のあるｓｉＲＮＡ  ＬＮＰ０１-２ａ１は、ＰＢＳ対照（３〜２１日目）およびＬＮＰ０１-ｃｔｒｌ  ｓｉＲＮＡ（４日目、７日目）対照と比べて、循環ＰＣＳＫ９タンパク質の顕著な低下を示した。
【０２９７】
実施例１１．ｓｉＲＮＡ修飾は、ｓｉＲＮＡに免疫応答する
ｓｉＲＮＡを、初代ヒト血液単球（ｈＰＢＭＣ）における免疫系の活性化について調べた。２つの対照誘導配列と未修飾の親化合物ＡＤ-１ａ１は、ＩＦＮ-αとＴＮＦ-αの両方を誘導することが分かった。しかしながら、この配列の化学修飾バージョン（ＡＤ-１ａ２、ＡＤ-１ａ３、ＡＤ-１ａ５、およびＡＤ-１ａ４）ならびにＡＤ-２ａ１は、これらの同じアッセイにおけるＩＦＮ-αとＴＮＦ-αの両方の誘導について陰性であった（表５、ならびに図１３Ａおよび１３Ｂを参照）。したがって、化学修飾は、ｓｉＲＮＡ分子に対するＩＦＮ-α応答とＴＮＦ-α応答の両方を鈍化させることができる。さらに、リポソームに処方して、マウスで試験したとき、ＡＤ-１ａ２も、ＡＤ-２ａ１も、ＩＦＮ-αを活性化しなかった。
【０２９８】
実施例１２．ｓｉＲＮＡコンジュゲートの評価
ＡＤ-１０７９２をＧａｌＮＡｃ）３／コレステロール（図１６）またはＧａｌＮＡｃ）３／ＬＣＯ（図１７）にコンジュゲートした。このコンジュゲートを用いてセンス鎖を３'末端に合成した。コンジュゲートｓｉＲＮＡを、以下に示す方法を用いて、マウスにおけるＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールに対する効果についてアッセイした。
【０２９９】
簡潔に述べると、尻尾への注射により２つのコンジュゲートｓｉＲＮＡのうちの１つまたはＰＢＳを連続３日間、すなわち、０日目、１日目、および２日目に、約１００、５０、２５、または１２．５ｍｇ／ｋｇの投薬量でマウスに投与した。各々の投与群には、６匹のマウスが含まれた。最後の投与から２４時間後にマウスを屠殺し、血液試料と肝臓試料を取得し、保存し、処理し、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルと総血清コレステロールを測定した。
【０３００】
結果を図１８に示す。対照ＰＢＳと比較して、両方のｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＧａｌＮＡｃ）３／コレステロールコンジュゲートＡＤ-１０７９２については、３×５０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０、およびＧａｌＮＡｃ）３／ＬＣＯコンジュゲートＡＤ-１０７９２については、３×１００ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０の活性を示した。これらの結果により、ＧａｌＮＡｃを含むコレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡは、肝臓で活性があり、ＰＣＳＫ９のサイレンシングが可能であり、結果としてコレステロール低減をもたらすことが示されている。
【０３０１】
ボーラス投与
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（６匹／群、８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡをＬＮＰ-０１中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、ＰＢＳで１．０、０．５、０．２５、および０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、体重１ｇ当たり１０μｌで、１００、５０、２５、および１２．５ｍｇ／ｋｇ用量の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、マウスを赤外線ランプの下に置いた。
【０３０２】
最後の投与から２４時間後に、ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、-８０℃で保存した。凍結した肝臓は、６８５０  Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ  ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析するまで-８０℃で保存した。
【０３０３】
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μｌの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μｌのライセートを９０μｌの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットとともに、５２℃で一晩インキュベートした。マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨのプローブセットはＰａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡから購入した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ｍＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【０３０４】
マウス血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、Ｔｏｔａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ（Ｗａｋｏ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、６００ｎｍで測定を行なった。
【０３０５】
実施例１３．脂質で処方されたｓｉＲＮＡの評価
簡潔に述べると、尻尾への注射によりＳＮＡＬＰで処方されたｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを、ＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ-１０７９２の単回投薬量を約０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇにして、ラットに投与した。各々の投薬群には、５匹のラットが含まれた。投与から７２時間後にラットを屠殺し、血液試料と肝臓試料を取得し、保存し、処理し、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルと総血清コレステロールを測定した。結果を図１９に示す。対照ＰＢＳと比較して、ＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ-１０７９２（図１９Ａ）は、ＰＣＳＫ９転写物レベルと総血清コレステロールレベルの両方の低減について、約１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有した。これらの結果は、ＳＮＡＬＰで処方されたｓｉＲＮＡの投与が、インビボでの効果的でかつ効率的なＰＣＳＫ９のサイレンシングとその後の総コレステロールの低減をもたらすことを示している。
【０３０６】
ボーラス投与
Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラット（５匹／群、１７０〜１９０ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における処方されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた尾静脈注射によって行なった。ｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰ中に処方し（その後、ＰＢＳに対して透析し）、ＰＢＳで０．０６６、０．２、および０．６ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、体重１ｇ当たり５μｌで、０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰで処方されたＡＤ-１０７９２の送達を可能にした。注射をしやすくするために、投与前の約３分間、ラットを赤外線ランプの下に置いた。
【０３０７】
最後の投与から７２時間後に、ＣＯ２窒息によりラットを屠殺した。後眼窩採血によって０．２ｍｌの血液を回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清と肝臓は、-８０℃で保存した。凍結した肝臓は、６８５０  Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ  ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いてすり潰し、粉末は解析するまで-８０℃で保存した。
【０３０８】
プロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）からの分岐ＤＮＡ技術をベースにしたキットを用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００μｌの０．１６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で３時間溶解した。その後、１０μｌのライセートを９０μｌの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ製の捕捉プレート上で、ラットＰＣＳＫ９およびラットＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットとともに５２℃で一晩インキュベートした。ラットＰＣＳＫ９およびラットＧＡＰＤＨのプローブセットはＰａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡから購入した。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。肝臓ライセートにおけるラットＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ラットＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群または無関係なｓｉＲＮＡ（血液凝固第ＶＩＩ因子）で処置した対照群と比較した。
【０３０９】
ラット血清における総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、Ｔｏｔａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ（Ｗａｋｏ，ＵＳＡ）を用いて測定した。Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、６００ｎｍで測定を行なった。
【０３１０】
実施例１４．ＡＤ-９６８０とＡＤ-１４６７６のミスマッチ歩行のインビトロ効力のスクリーニング
ＡＤ-９６８０とＡＤ-１４６７６の有効性に対する配列の変異または修飾の効果をＨｅＬａ細胞でアッセイした。多くの変異体を表６に示すように合成した。
【０３１１】
ＨｅＬａを、１００μｌの１０％胎仔ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェルプレート（８，０００〜１０，０００細胞／ウェル）に入れた。細胞が約５０％コンフルエンスに達したとき（約２４時間後）、１０ｎＭから連続４倍希釈のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ウェル当たり０．４μｌのトランスフェクション試薬リポフェクトアミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションを行なった。すなわち、ｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体を以下のように調製した。適当な量のｓｉＲＮＡを、血清を含まないＯｐｔｉ-ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、穏やかに混合した。リポフェクトアミン（商標）２０００を使用前に穏やかに混合し、その後、９６ウェルプレートの各ウェルに対して、０．４μｌを、２５μｌの血清を含まないＯｐｔｉ-ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。５分のインキュベーションの後、１μｌの希釈したｓｉＲＮＡを、希釈したリポフェクトアミン（商標）２０００と組み合わせた（総容量は２６．４μｌである）。この複合体を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体を形成させた。その後、１０％胎仔ウシ血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを、各々のｓｉＲＮＡ：リポフェクトアミン（商標）２０００複合体に添加し、プレートを前後に揺り動かすことによって穏やかに混合した。１００μｌの上記混合物を、細胞を含む各ウェルに添加し、プレートをＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２４時間インキュベートし、その後、培養培地を除去し、１０％胎仔ウシ血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを添加した。
【０３１２】
培地交換から２４時間後に、培地を除去し、細胞を溶解し、細胞ライセートを、製造元のプロトコルに従いｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）によって、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのサイレンシングについてアッセイした。化学発光をＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。細胞ライセートにおけるヒトＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比をリポフェクトアミン（商標）２０００のみの対照で処置した細胞のヒトＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比と比較した。
【０３１３】
図２０は、ＡＤ-９６８０と関連する一連の化合物の用量応答曲線である。図２１は、ＡＤ-１４６７６と関連する一連の化合物の用量応答曲線である（２１Ａ）。これらの結果は、特定の位置におけるＤＦＴまたはミスマッチが、（より低いＩＣ５０値からも明らかなように）両方の親化合物の活性を増大させることができることを示している。理論に束縛されることを望まないが、ミスマッチ、またはＤＦＴの導入によるセンス鎖の不安定化は、センス鎖のより素早い除去をもたらし得ることが仮定される。
【０３１４】
実施例１５．ヒトにおけるＰＣＳＫ９発現の阻害
単回投与の後、長時間、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害し、コレステロールレベルを低減させるために、ヒト対象を、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡで処置する。
【０３１５】
治療を必要とする対象を選択または特定する。対象は、ＬＤＬを低減させるか、ＨＤＬを低減させることなくＬＤＬを低減させるか、ＡｐｏＢを低減させるか、または総コレステロールを低減させる必要があり得る。対象の特定は、臨床の場で、またはどこか他の場所、例えば、対象の家で、対象自らが自己検査キットを使用することにより、行なわれ得る。
【０３１６】
ゼロ時間で、好適な第１の用量の抗ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを対象に皮下投与する。ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の通りに処方する。第１の用量からしばらく経った後、例えば、７日、１４日、および２１日後に、対象の状態を、例えば、ＬＤＬ、ＡｐｏＢ、および／または総コレステロールのレベルを測定することによって評価する。この測定に伴って、該対象におけるＰＣＳＫ９発現、および／または成功したＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡターゲッティングの産物を測定することができる。他の関連性のある基準も測定することができる。用量の数と強度は、対象の必要性によって調整される。
【０３１７】
処置後、対象のＬＤＬ、ＡｐｏＢ、または総コレステロールのレベルは、処置前に存在したレベルと比べて、または同じように罹患しているが、処置していない対象で測定されるレベルと比べて低減している。
【０３１８】
当業者は、本開示に具体的に示された方法および組成物に加えて、本発明を後に添付される特許請求の範囲の全ての範囲に対して実施することを可能にする方法および組成物に精通している。
【０３１９】
【表１ａ−１】
2011511004.tif 000014
【０３２０】
【表１ａ−２】
2011511004.tif 000015
【０３２１】
【表１ａ−３】
2011511004.tif 000016
【０３２２】
【表１ａ−４】
2011511004.tif 000017
【０３２３】
【表１ａ−５】
2011511004.tif 000018
【０３２４】
【表１ａ−６】
2011511004.tif 000019
【０３２５】
【表１ａ−７】
2011511004.tif 000020
【０３２６】
【表１ａ−８】
2011511004.tif 000021
【０３２７】
【表１ａ−９】
2011511004.tif 000022
【０３２８】
【表１ａ−１０】
2011511004.tif 000023
【０３２９】
【表１ａ−１１】
2011511004.tif 000024
【０３３０】
【表１ａ−１２】
2011511004.tif 000025
【０３３１】
【表１ａ−１３】
2011511004.tif 000026
【０３３２】
【表１ａ−１４】
2011511004.tif 000027
【０３３３】
【表１ａ−１５】
2011511004.tif 000028
【０３３４】
【表１ａ−１６】
2011511004.tif 000029
【０３３５】
【表１ａ−１７】
2011511004.tif 000030
【０３３６】
【表１ａ−１８】
2011511004.tif 000031
【０３３７】
【表１ａ−１９】
2011511004.tif 000032
【０３３８】
【表１ａ−２０】
2011511004.tif 000033
【０３３９】
【表１ａ−２１】
2011511004.tif 000034
【０３４０】
【表１ａ−２２】
2011511004.tif 000035
【０３４１】
【表１ａ−２３】
2011511004.tif 000036
【０３４２】
【表１ａ−２４】
2011511004.tif 000037
【０３４３】
【表１ａ−２５】
2011511004.tif 000038
【０３４４】
【表１ａ−２６】
2011511004.tif 000039
【０３４５】
【表１ａ−２７】
2011511004.tif 000040
【０３４６】
【表１ａ−２８】
2011511004.tif 000041
【０３４７】
【表１ａ−２９】
2011511004.tif 000042
【０３４８】
【表１ａ−３０】
2011511004.tif 000043
【０３４９】
【表１ａ−３１】
2011511004.tif 000044
【０３５０】
Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２'-デオキシ-２'-フルオロリボヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３'-５'ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３'-Ｏ-５'-Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ-」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５'のヌクレオチド上に５'リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３'のヌクレオチド上に３'-ＯＨを有する。
【０３５１】
【表１ｂ−１】
2011511004.tif 000045
【０３５２】
【表１ｂ−２】
2011511004.tif 000046
【０３５３】
【表１ｂ−３】
2011511004.tif 000047
【０３５４】
【表１ｂ−４】
2011511004.tif 000048
【０３５５】
【表１ｂ−５】
2011511004.tif 000049
【０３５６】
【表１ｂ−６】
2011511004.tif 000050
【０３５７】
【表１ｂ−７】
2011511004.tif 000051
【０３５８】
【表１ｂ−８】
2011511004.tif 000052
【０３５９】
【表１ｂ−９】
2011511004.tif 000053
【０３６０】
【表１ｂ−１０】
2011511004.tif 000054
【０３６１】
【表１ｂ−１１】
2011511004.tif 000055
【０３６２】
【表１ｂ−１２】
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【０３６３】
【表１ｂ−１３】
2011511004.tif 000057
【０３６４】
【表１ｂ−１４】
2011511004.tif 000058
【０３６５】
【表１ｂ−１５】
2011511004.tif 000059
【０３６６】
【表１ｂ−１６】
2011511004.tif 000060
【０３６７】
【表２ａ−１】
2011511004.tif 000061
【０３６８】
【表２ａ−２】
2011511004.tif 000062
【０３６９】
【表２ａ−３】
2011511004.tif 000063
【０３７０】
【表２ａ−４】
2011511004.tif 000064
【０３７１】
【表２ａ−５】
2011511004.tif 000065
【０３７２】
【表２ａ−６】
2011511004.tif 000066
【０３７３】
Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２'-デオキシ-２'-フルオロリボヌクレオチド；ｍｏｃ、ｍｏｕ、ｍｏｇ、ｍｏａ：対応する２'-ＭＯＥヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３'-５'ホスホジエステル基によって接続されている；ａｂ：３'末端無塩基ヌクレオチド；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３'-Ｏ-５'-Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ-」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５'のヌクレオチド上に５'リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３'のヌクレオチド上に３'-ＯＨを有する。
【０３７４】
【表２ｂ−１】
2011511004.tif 000067
【０３７５】
【表２ｂ−２】
2011511004.tif 000068
【０３７６】
【表２ｂ−３】
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【０３７７】
【表３】
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【０３７８】
【表４】
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【０３７９】
【表５ａ】
2011511004.tif 000072
【０３８０】
Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２'-デオキシ-２'-フルオロリボヌクレオチド；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３'-５'ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３'-Ｏ-５'-Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ-」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５'のヌクレオチド上に５'リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３'のヌクレオチド上に３'-ＯＨを有する。
【０３８１】
【表５ｂ】
2011511004.tif 000073
【０３８２】
【表６】
2011511004.tif 000074
【０３８３】
鎖：Ｓ／センス；ＡＳ／アンチセンス
Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：対応するリボヌクレオチド；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：対応する２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチド；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：対応する２'-デオキシ-２'-フルオロリボヌクレオチド；Ｙ１はＤＦＴジフルオロトルイルリボ（またはデオキシリボ）ヌクレオチドに対応する；ヌクレオチドが配列中に書かれている場合、それらは３'-５'ホスホジエステル基によって接続されている；「ｓ」が挿入されたヌクレオチドは、３'-Ｏ-５'-Ｏホスホロチオジエステル基によって接続されている；接頭語「ｐ-」で示されない場合、オリゴヌクレオチドは、最も５'のヌクレオチド上に５'リン酸基を持たない；全てのオリゴヌクレオチドは、最も３'のヌクレオチド上に３'-ＯＨを有する。
【図１】
2011511004.tif 000075
【図２】
2011511004.tif 000076
【図３】
2011511004.tif 000077
【図４】
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【図５】
2011511004.tif 000079
【図６】
2011511004.tif 000080
【図７Ａ】
2011511004.tif 000081
【図７Ｂ】
2011511004.tif 000082
【図７Ｃ】
2011511004.tif 000083
【図８】
2011511004.tif 000084
【図９】
2011511004.tif 000085
【図１０Ａ】
2011511004.tif 000086
【図１０Ｂ】
2011511004.tif 000087
【図１０Ｃ】
2011511004.tif 000088
【図１１】
2011511004.tif 000089
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2011511004.tif 000091
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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