(57)【要約】  カニクイザルトール様受容体３（ｃｙｎｏＴＬＲ３）をコードする単離されたポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドの発現により入手可能なポリペプチド、これらの組み換え細胞、方法、及び使用が開示されている。
2011507552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、及び７に示される配列からなる群から選択される配列を有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
発現ベクターである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖。
【請求項１４】
ペプチド鎖を発現するための方法であって、
ａ）請求項９に記載の宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖を発現するのに十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む方法。
【請求項１５】
ペプチド鎖を発現するための方法であって、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖をコードするＲＮＡへと転写されることのできる、請求項１、２、３、４、５、６、又は７のポリヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）セルフリー発現システムのコンポーネントを提供する工程と、
ｃ）提供された該ポリヌクレオチドからセルフリー発現を開始する工程と、
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む方法。
【請求項１６】
前記セルフリー発現システムが、網状赤血球溶解物（lystate）に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチド鎖を発現するための方法であって、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖をコードするＲＮＡを提供する工程と、
ｂ）セルフリー発現システムのコーンポーネントを提供する工程と、
ｃ）提供された前記ＲＮＡからセルフリー発現を開始する工程と、
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む方法。
【請求項１８】
前記セルフリー発現システムが、網状赤血球溶解物に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法によって生成されたペプチド鎖。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法によって生成されたペプチド鎖。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法によって生成されたペプチド鎖。
【請求項２２】
請求項１０、１１、１２、１３、１９、２０、２１、又は２２に記載のペプチド鎖を特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２３】
請求項１０、１１、１２、１３、１９、２０、２１、又は２２のペプチド鎖を特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ＴＬＲ３治療剤の安全性を評価するための方法であって、
ａ）ＴＬＲ３治療剤、第１のカニクイザル、及び第２のカニクイザルを提供する工程と、
ｂ）前記第１のカニクイザルに対して前記ＴＬＲ３治療剤を投与する工程と、
ｃ）前記第１のカニクイザイルが前記第２のサルと比較して有害な症状を呈しているかどうかを判定する工程であって、前記第１のカニクイザルによる有害症状の提示は、前記ＴＬＲ３治療剤が安全ではないことを示し、前記第１のカニクイザルによる有害症状の提示がないことは、前記ＴＬＲ３治療剤が安全であることを示している工程と、を含む方法。
【請求項２５】
前記ＴＬＲ３治療剤が抗体である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カニクイザルトール様受容体３（Cynomolgus monkey Toll-Like Receptor 3）（ｃｙｎｏＴＬＲ３）及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主免疫系による微生物抗原の認識は、自然免疫受容体により媒介され、その自然免疫受容体の活性化は炎症反応の開始における重要な段階を表す。トール様受容体（ＴＬＲ）は、外来抗原に対する免疫反応の媒介において極めて重大な役割を果たす自然免疫受容体の仲間である。ＴＬＲ３は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）並びに合成ｄｓＲＮＡ類似体ポリ−リボイノシン−リボシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を認識する病原体関連分子パターン認識受容体である。例えば、アレクソポロウ（Alexopoulou）ら、ネイチャー（Nature）４１３：７３２（２００１年）を参照のこと。更に、ＴＬＲ３は、壊死細胞から放出されるｍＲＮＡなどの内因性リガンドを認識することが示されており、このことは炎症部位における壊死細胞の死がＴＬＲ３の活性化を引き起こしうることを示唆している。例えば、カリコ（Kariko）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）２６：１２５４２（２００４年）を参照のこと。
【０００３】
ｄｓＲＮＡ又はポリ（Ｉ：Ｃ）リガンドによるＴＬＲ３の活性化は、炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘発し、感染に伴う炎症の際の疾患の転帰を調節することができる。重要なことに、ＴＬＲ３のインビボ活性化は、ウイルス感染、又は炎症に伴う壊死の状況下で起こる。タベタ（Tabeta）ら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）１０１：３５１６（２００４年）を参照。また、カリコ（Kariko）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）２６：１２５４２（２００４年）を参照のこと。例えば、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖は、ＨＳＶ−１ウイルスによる感染を制御することが必要とされる中枢神経系（ＣＮＳ）において発現するが、ＴＬＲ３欠乏患者ではこのウイルスが上皮から脳神経を介して中枢神経系へと広がって単純ヘルペス脳炎を引き起こす。例えば、チャン（Zhang）ら、サイエンス（Science）３１７：１５２２（２００７年）参照のこと。更に、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖の活性化は、例えば、肝臓組織の原発性胆汁性肝硬変などの病的状態に伴う炎症反応を引き起こす。例えば、タキイ（Takii）ら、ラボラトリーインベスティゲーション（Lab. Invest.）８５：８３６（２００５年）を参照のこと。
【０００４】
全体的に、これらのデータは、ＴＬＲ３の活性化が、自然免疫に寄与する多くの炎症性サイトカインの生成を引き起こすリン酸化反応及び転写活性化事象のカスケード反応を開始するということを実証している（タケダ（Takeda）及びアキラ（Akira）、ジャーナルオブデルマトロジカルサイエンス（J. Derm. Sci.）３４：７３〜８２（２００４年）に概説されている）。更に、これらのデータは、ＴＬＲ３活性化の維持が感染に伴う炎症性疾患の調節における重大な要素であるということを示している。公開されたデータは、全身性炎症反応症候群に対する炎症性サイトカインの過剰生成、感染に伴う激しいサイトカインストーム（ファンアメルスフォールト（Van Amersfoort）ら、クリニカルマイクロバイオロジーレビューズ（Clin. Microbiol. Rev.）１６：３７９〜４１４（２００３年）に概説）、及び関節リウマチなどの免疫介在性の慢性症状（ミオセク（Miossec）ら、カレントオピニオンインリューマトロジー（Curr. Opin. Rheumatol.）１６：２１８〜２２２（２００４年）に概説）、及び炎症性腸疾患（オガタ（Ogata）及びヒビ（Hibi）、カレントファーマシューティカルデザイン（Curr. Pharm. Des.）９：１１０７〜１１１３（２００３年）に概説）に関する発見によって示されるように、この仮説に対して更なる支持を与える。
【０００５】
現在では、ＴＬＲ３の活性を様々な兆候の処置の標的とするために、多くの異なる治療的アプローチがとられている。これらのＴＬＲ３治療剤としては、ヒトペプチド鎖に基づくＴＬＲ３治療剤、ＴＬＲ３のモノクローナル抗体アンタゴニスト、及びＴＬＲ３リガンドアゴニスト、例えばｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、並びにＴＬＲ３の活性を標的としたこれらの機能的類似体、が挙げられる。モノクローナル抗体アンタゴニストに基づくＴＬＲ３治療剤に対して可能性のある兆候としては、炎症状態、敗血症、炎症性腸疾患、炎症性肺疾患、及び自己免疫疾患が挙げられる。アゴニストであるＴＬＲ３治療剤に対する可能性のある兆候及び使用としては、ウイルス感染後疲労症候群、神経膠種、前立腺癌、抗ウイルスワクチン、膀胱癌、子宮頸部形成異常、ヒトパピローマウイルス感染、乳癌、ウイルス感染予防、組織再生、及び鳥インフルエンザワクチンが挙げられる。
【０００６】
ヒトに使用するためのいずれかのＴＬＲ３治療剤の市場導入が可能となる前には、広範な安全試験が必要となる。こうした安全試験には、動物モデルにおけるインビボ安全試験並びにＴＬＲ３治療剤のインビトロ試験の両方が必要となる。例えば、抗体に基づくＴＬＲ３治療剤は、特定のモデル動物によって発現されたＴＬＲ３ペプチド鎖に対する代替の抗体の生成とともに、このような代替の抗体の大幅なインビトロ特性化を必要とする場合がある。このような代替物の生成及びインビトロ特性化は、好適なモデル動物からのＴＬＲ３ポリヌクレオチド及びペプチド鎖の使用を必要とする。重要なことには、こうした安全試験のための好適な動物モデルの特定には、ヒトＴＬＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）に対し高い同一性及び相同性を有するＴＬＲ３を発現することのできる動物種を特定することが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＴＬＲ３治療剤の安全試験のために好適な動物モデルにおいて発現可能であるＴＬＲ３及びＴＬＲ３ペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの特定が必要とされている。ＴＬＲ３治療剤の安全性評価のために好適であると特定された動物モデルにおいて、ペプチド鎖を発現しＴＬＲ３治療剤の安全性を試験する方法などの関連の方法もまた必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００１２】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、及び７に示される配列からなる群から選択される配列を有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１４】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。
【００１５】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。
【００１６】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。
【００１７】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。
【００１８】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするＲＮＡを提供する工程と、セルフリー発現システムのコンポーネントを提供する工程と、提供されたＲＮＡからセルフリー発現を開始する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む、ペプチド鎖を発現するための方法である。
【００１９】
本発明の他の態様は、ＴＬＲ３治療剤が有害事象を引き起こすかどうかを判定するための方法であって、ＴＬＲ３治療剤、第１のカニクイザル、及び第２のカニクイザルを提供する工程と、そのＴＬＲ３治療剤を第１のカニクイザルに投与する工程と、第１のカニクイザルが第２のサルと比較して有害な症状を呈しているかどうかを判定する工程と、を含む方法であり、この際、第１のカニクイザルによる有害症状の提示は、そのＴＬＲ３治療剤が安全でないことを示し、第１のカニクイザルによる有害症状の提示がないことは、そのＴＬＲ３治療剤が安全であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）コード配列の特徴マップを示している図。
【図２】完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の特徴マップを示している図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ペプチド鎖」への言及は１つ以上のペプチド鎖への言及であり、当業者には公知のそれらの等価物を包含する。
【００２３】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているのと同様又は同等のあらゆる組成物及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する。
【００２４】
本発明は、単離されたカニクイザル（Cynomolgus monkey）（マカカファシクラリス（Macaca fascicularis））トール様受容体３（ｃｙｎｏＴＬＲ３）ポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、単離された宿主細胞、これらのポリヌクレオチドの発現により獲得可能なペプチド鎖、本発明のペプチド鎖を発現するための方法、及びこれらの使用を提供する。
【００２５】
ＴＬＲ３は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）認識受容体であるトール様受容体群の１つである。ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡの結合によって活性化される。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ウイルス感染、他の生物による感染、及び細胞傷害又は壊死による感染の際に生成される。例えば、カリコ（Kariko）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）２７９：１２５４２（２００４年）参照。また、アレクソポロウ（Alexopoulou）ら、ネイチャー（Nature）４１３：７３２（２００１年）も参照のこと。ウイルス感染に関連するｄｓＲＮＡ又は他の原因によって生成されたｄｓＲＮＡ類の検出に応じたＴＬＲ３の活性化は、ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらし、抗ウイルス性及び免疫系刺激性機能を有するタイプ１インターフェロンの生成を増加させる。例えば、タケダ（Takeda）及びアキラ（Akira）、セルミクロビアル（Cell. Micro.）５：１４３、１４４（２００３年）を参照のこと。ウイルス感染の状況下でのＴＬＲ３活性化の結果として、先天性の及び体液性の免疫機構の抗ウイルス防御が刺激される。例えば、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖は、ＨＳＶ−１ウイルスによる感染を制御することが必要とされる中枢神経系（ＣＮＳ）において発現し、ＴＬＲ３欠乏患者ではこのウイルスが上皮から脳神経を介して中枢神経系へと広がって単純ヘルペス脳炎を引き起こす。例えば、チャン（Zhang）ら、サイエンス（Science）３１７：１５２２（２００７年）参照のこと。他の状況下では、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖活性化は、例えば、肝臓組織の原発性胆汁性肝硬変などの病的状態に伴う炎症反応を引き起こす。例えば、タキイ（Takii）ら、ラボラトリーインベスティゲーション（Lab. Invest.）８５：８３６（２００５年）を参照のこと。重大なことに、完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）は、よく特徴付けられたヒトＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）と９５．７％一致しており、及び９６．８％類似している。
【００２６】
本発明の組成物及び方法は、様々な具体的な用途のために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド及びベクターはカニクイザル（マカカファシクラリス）ＴＬＲ３（ｃｙｎｏＴＬＲ３）ペプチド鎖をコードし、これらのペプチド鎖を発現するために使用できるので、有用である。これらのｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖は、更に、組み換え技術によって過剰発現されるか又は他の手段によって宿主動物又は組織へと取り込まれた場合に、ｄｓＲＮＡ又は他のＴＬＲ３リガンドへの曝露後の抗ウイルス反応を増大させ又は制御するために使用できるので、有用である。
【００２７】
ｃｙｎｏＴＬＲ３の細胞外領域を含むペプチド鎖はまた、利用可能なＴＬＲ３リガンド又はＴＬＲ３の活性化にとって必要なＴＬＲ３関連タンパク質を結合しこれによりＴＬＲ３活性を制御するリガンドシンク（ligand sink）タイプのアンタゴニストとして使用することもできる。ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖はまた、ｃｙｎｏＴＬＲ３又は他の供給源からのＴＬＲ３の活性のポジティブ又はネガティブ調節のための治療抗体を生成するために使用することもできる。このことは、アゴニスト治療抗体はｃｙｎｏＴＬＲ３又は他のＴＬＲ３の活性化を高めるために使用されて感染の制御に役立つことができ、一方アンタゴニスト治療抗体はｃｙｎｏＴＬＲ３又は他のＴＬＲ３の活性化を減少させるために使用されてＴＬＲ３受容体の活性化が媒介する炎症反応に関連した病的状態の制御に役立つことができるため、望ましい。ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖はまた、ｃｙｎｏＴＬＲ３又は他のＴＬＲ３の活性を調節することが可能な小分子などの他の治療剤を特定するためのインビトロ又はインビボアッセイに使用することもできる。開示されている発現方法はｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチドの発現を可能にするため、これらの方法は有用である。開示されている他の方法はＴＬＲ３治療剤の安全性評価を可能にするため、これらの方法は有用である。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合された核酸塩基鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００２９】
用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列における核酸塩基に対して相補的な核酸塩基を含む第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。典型的には、このような「相補配列」は、適切な条件下で第１の単離ポリヌクレオチド配列と組み合わされたときに、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡのような二本鎖のポリヌクレオチド分子を形成することができる。
【００３０】
用語「ベクター」は、生体系内で複製されることができる、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製源又は選択マーカーのような因子を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することのできる生物学的構成成分を利用して再構成された生体系を挙げてよい。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００３１】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたペプチド鎖の翻訳を命令するために利用することができるベクターを意味する。
【００３２】
用語「ペプチド鎖」は、鎖を形成するためにペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基からなる分子を意味する。５０を越すアミノ酸からなる大きいペプチド鎖は、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と呼ぶことができる。５０未満のアミノ酸からなる小さいペプチド鎖は、「ペプチド」と呼ぶことができる。
【００３３】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、ネズミ、ヒト、ヒト化、及びキメラのモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体、及び抗体フラグメント、部分、又は変異体を含む、免疫グロブリン又は抗体分子を意味する。抗体は、血漿細胞により構造的に発現され及び分泌された分泌タンパク質である。抗体は、ｌｇＧ、ｌｇＡ，又はｌｇＭなどのいずれのアイソタイプのものであってもよく、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントを含んでいてもよい。抗体はまた、２つの異なるペプチド鎖エピトープを特異的に結合する二重特異性抗体であってもよい。
【００３４】
抗体は、ハイブリドーマ作製のような標準的な方法により、又は抗体重鎖及び／若しくは軽鎖遺伝子の不死化Ｂ細胞（例えば骨髄腫細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、植物細胞、及び昆虫細胞などの他の細胞タイプ）へのトランスフェクションにより不死化された血漿細胞を用いて生成されることができる。
【００３５】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対して作製される。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指していうものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。例えば、マウス（murine）ｍＡｂは、コーラー（Kohler）ら、ネイチャー（Nature）２５６：４９５（１９７５年））のハイブリドーマ法によって作製することができる。受容体抗体（通常、別の哺乳動物種、例えばヒト）由来の軽鎖及び重鎖定常領域と関連してドナー抗体（通常はマウス）由来の軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法によって調製することができる。ヒト以外のドナー免疫グロブリン（通常はマウス）に由来するＣＤＲと、結合親和性を保存するために変化させたフレームワーク支持残基を場合に応じて有する、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の免疫グロブリン由来の残りの部分とを有するヒト化ｍＡｂを、クイーン（Queen）らによって開示される技法によって得ることができる（クイーン（Queen）ら、プロシーディングズオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci）（米国）８６：１００２９（１９８９年）及びホドソン（Hodgson）ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）９：４２１（１９９１年））。
【００３６】
ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列の例は、例えば、
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ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ、
ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ、ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ、ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ、
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ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、
ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ、
ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ、及びカバト（Kabat）らによる「免疫学的関心対象のタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、米国衛生省（１９８７年）に開示されており、それぞれの全文はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ヒト以外のいかなる配列も有さない完全なヒトｍＡｂを、例えば、ロンバーグ（Lonberg）ら、ネイチャー（Nature）３６８：８５６（１９９４年）、フィッシュワイルド（Fishwild）ら、ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotech.）１４：８４５（１９９６年）、及びメンデス（Mendez）ら、ネイチャージェネティクス（Nature Genetics）１５：１４６（１９９７年）に参照される方法によってヒト免疫グロブリン形質転換マウスから調製することができる。ヒトｍＡｂはまた、例えば、ナッピク（Knappik）ら、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Biol.）２９６：５７（２０００年）及びクレブス（Krebs）ら、ジャーナルオブイムノロジカルメソッズ（J. Immunol. Meth.）２５４：６７（２００１年）に参照される技術によってファージ提示ライブラリーから調製し及び最適化されることもできる。
【００３８】
抗体分子又は調製物は、それがこの抗原に、第２の非同一抗原と比較して、より高い親和性をもって、及び非特異的な態様とは対照的に特異的な態様で、結合する場合に、所与の抗原を「特異的に結合する」という。別の言い方をすれば、抗体分子又は調製物の「特異的な結合」を使用して、２つの異なるペプチド鎖間を区別することができる。
【００３９】
「フラグメント」とは、本発明のいずれかのペプチド鎖のいずれかのアミノ酸配列のうちの一部を含むが全部は含まない、アミノ酸配列を有するペプチド鎖である。フラグメントは例えば、シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域、若しくは細胞質領域、又はそれらの変異型、例えば異種のアミノ−及び／又はカルボキシ−末端アミノ酸配列を包含する連続した一連の残基等、に対応するアミノ酸配列の一部を有する末端切断型（trancated）ペプチド鎖を包含することができる。宿主細胞によって又は宿主細胞中で生成される本発明のペプチド鎖の分解形態もまた包含される。他の代表的なフラグメントは、α−へリックス又はα−へリックス形成領域、β−シート又はβ−シート形成領域、ターン又はターン形成領域、コイル又はコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α−両親媒性領域、β−両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基材結合領域、細胞外領域、及び高抗原性インデックス領域を含むフラグメントのような、構造的又は機能的属性によって特徴付けられる。重要なことには、本発明のペプチド鎖はフラグメントとして使用され又は提供されることができる。
【００４０】
「変異型ペプチド鎖」とは、第１のペプチド鎖に対してアミノ酸置換基、挿入基、欠損基、又はこれらの組み合わせが作り込まれた第２のペプチド鎖である。自然発生の、変性された、又は特殊（atypical）アミノ酸を置換基及び挿入基に使用することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９により記述されるペプチド鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖に対する代表的な変異型ペプチド鎖である。
【００４１】
「変異型ポリヌクレオチド」とは、第１のポリヌクレオチド配列に対して核酸残基置換基、挿入基、欠損基、又はこれらの組み合わせが作り込まれた第２のポリヌクレオチドである。自然発生の又は変性された核酸塩基を、置換基及び欠損基に使用することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５により記述されるポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドに対する代表的な変異型ポリヌクレオチドである。
【００４２】
用語「ＴＬＲ３治療剤」とは、治療的効果を提供すると考えられ、そしてその治療的効果を、部分的には、ＴＬＲ３の活性を介して提供すると考えられる、分子又は調製物を意味する。このようなＴＬＲ３は、本発明のペプチド鎖を含んでいてよい。ＴＬＲ３治療剤の例としては、ＴＬＲ３と結合してこれを活性化し、増大された抗ウイルス活性及び免疫系刺激の治療的効果を生ずるｄｓＲＮＡ又はポリ（Ｉ：Ｃ）のような公知のＴＬＲ３リガンドが挙げられる。
【００４３】
用語「有害な症状」とは、動物により提示され動物に害を示すいずれかの症状が起こったということを意味する。
【００４４】
本発明の１つの態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列は、ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域の予測された成熟型を含むペプチド鎖をコードする。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチドシンセサイザーでの固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成されてもよい。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野において周知である。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが翻訳されていない配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、追加のアミノ酸をコードする追加の配列を含んでもよい。これらの追加のポリヌクレオチド配列は、例えば、マーカー又はタグ配列、例えばゲンツ（Gentz）ら、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci.）（米国）８６：８２１（１９８９年）に記載されているようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、又はウィルソン（Wilson）ら、セル（Cell）３７：７６７（１９８４年）に記載されているようなＨＡペプチドタグをコードしてもよく、それらは融合ポリペプチドの精製を容易にする。
【００４７】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列は、そのアミノ末端メチオニン残基を有さない予測ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナルペプチド、及び細胞外領域を含むペプチド鎖をコードする。
【００４８】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるポリヌクレオチド配列は、ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞質領域の予測成熟型を含むペプチド鎖をコードする。
【００４９】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるポリヌクレオチド配列は、そのアミノ末端メチオニン残基を有さない予測ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞質領域を含むペプチド鎖をコードする。
【００５０】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるポリヌクレオチド配列は、完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３を含むペプチド鎖ををコードするオープンリーディングフレームに隣接する５'及び３'配列を有する核酸である。
【００５１】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、及び７に示される配列からなる群から選択される配列を有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるポリヌクレオチド配列は、完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３を含むペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）発現ベクター指定のｐ４０７８である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されるポリヌクレオチド配列は、アミノ末端メチオニン残基を有する予測ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナル配列と、フレキシブルなグリシンとセリン結合とを介して６つのアミノ末端ヒスチジンアミノ酸残基タグへと融合された細胞外領域と、を含むペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）発現ベクター指定のｐ４０３７である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、及び５に示されるポリヌクレオチド配列については、上記に記載されている。
【００５２】
本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持し、ポリヌクレオチドを複製し、又は再構成された生体系を包含する生体系において本発明のベクターによりコードされたペプチド鎖の発現を促進するために有用である。
【００５３】
ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス（picronaviruses）、及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来、及びウイルス由来のものであってよい。
【００５４】
本発明のベクターは、脂質、緩衝液、又は粒子に適用するために適切なもののような他の賦形剤を有する補助剤とともに、微小粒子中に処方されることができる。
【００５５】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
【００５６】
発現ベクターは典型的に、このようなベクターによってコードされたペプチド鎖の発現を制御し、調整し、引き起こし、又は許容することができる核酸配列因子を含む。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現システムにおけるコードされたペプチド鎖の発現を促進する他の部位を含んでもよい。このような発現システムは、当該技術分野において周知の、細胞に基づく、又は細胞フリーのシステムであってよい。コードされたペプチド鎖の発現に使用するのに好適な核酸配列因子及び親ベクター配列もまた、当該技術分野において周知である。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。
【００５８】
本発明のポリペプチドの発現のために有用な代表的なプラスミド由来発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｐｈ（３'）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、イントロンＡを有するＨＣＭＶ前初期プロモータ、合成ポリＡ配列、及びウシ成長ホルモンターミネータを含む。他の代表的なプラスミド由来の発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｎｔ（４'）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、ＨＣＭＶ前初期プロモータ、及びＳＶ４０  ｌａｔｅポリＡ配列を含む。
【００５９】
代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌、真菌細胞、例えばクリベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス、担子菌（Basidomycete）、カンジダアルビカンス、又はアスペルギルス、昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２及びスポドプテラＳｆ９、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、ボーズメラノーマ（Bowes melanoma）、及び骨髄腫、並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個々の細胞として提供されても細胞群として提供されてもよい。細胞群は、単離された培養された細胞群、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含んでよい。
【００６０】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、デイビス（Davis）ら、ベイシックメソッズインモレキュラーバイオロジー（Basic Methods in Molecular Biology）第２版、アップルトン＆ランゲ（Appleton&Lange）、コネチカット州ノーウォーク（Norwalk）（１９９４年）及びサムブルック（Sambrook）ら、モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、ラボラトリーマニュアル（A Laboratory Manual）第３版コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）（２００１年）のような研究室のマニュアルにより、当業者には周知の方法によって行われることができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、及び感染が挙げられる。
【００６１】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域の予測成熟型を含むペプチド鎖である。
【００６２】
本発明のペプチド鎖は、自動ペプチドシンセサイザーで固相ペプチド合成などの化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のペプチド鎖は、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶解物（lystate）に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムなどのセルフリー発現システムを使用することによって、得ることもできる。本発明のペプチド鎖はまた、容易に単離されるアフィニティ標識されたペプチド鎖の組み換え発現などの当該技術分野において周知の技術により、本発明の核酸配列を内包する細胞から発現及び単離することによって得ることもできる。当業者は、本発明のペプチド鎖を得るための他の技術を認識するであろう。
【００６３】
本発明のペプチド鎖は、第２のペプチド鎖と融合された本発明のペプチド鎖を含む融合ペプチド鎖を含んでもよい。このような第２のペプチド鎖は、リーダー又は分泌シグナル配列、プレ−若しくはプロ−又はプレプロ−タンパク質配列、並びに自然発生の、又は一部が自然発生の配列に由来する部分的に合成の配列、又は全合成の配列であってよい。分泌シグナル又はリーダーペプチド鎖配列は、本発明のペプチド鎖の分泌を小胞体の内腔又は細胞外環境に向けるように選択されてよい。このようなペプチド鎖配列は、カニクイザルからのいずれかのペプチド鎖に対して異種又は内因性であってよく、又はこれらのハイブリッドを含んでもよい。
【００６４】
本発明のペプチド鎖はまた、製薬上許容できるキャリア又は希釈剤中へと処方されることができる。例えば、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどの、種々の水性キャリアを使用してよい。これらの溶液は殺菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の、よく知られた殺菌技術（例えば、ろ過）などにより殺菌されてよい。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤のような製薬上許容できる補助物質を、生理学的状態に近づけるために必要に応じて含有してもよい。そのような薬学的製剤中の本発明のペプチド鎖の濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、約０．５重量％未満から、通常は約１％又は少なくとも約１重量％から１５又は２０重量％程度まで変化でき、主に選択された投与の特定の様式に応じて流体の容積、粘度、及び他の要因に基づいて選択される。
【００６５】
本発明のペプチド鎖及び核酸はまた、免疫反応を引き出すためのワクチンなどの、単位用量形態で提供されることのできる医薬品の形態で提供されることもできる。治療に有効な適切な投与量は、当業者にとっては直ちに決定することができる。決定された用量は、必要ならば、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護師、獣医、又は獣医学技術者）によって必要に応じて選択された適切な時間間隔で反復されてもよい。
【００６６】
本発明のペプチド鎖は、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に適切なキャリア中において再構成できる。この技術は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍結乾燥及び再構成技術は、当該技術分野において周知である。
【００６７】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、そのアミノ末端メチオニン残基を有さない予測ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナルペプチド、及び細胞外領域を含むペプチド鎖である。
【００６８】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞質領域の予測成熟型を含むペプチド鎖である。
【００６９】
本発明の他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を有するペプチド鎖を含む単離されたペプチド鎖である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、そのアミノ末端メチオニン残基を有さない予測ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞質領域を含むペプチド鎖である。
【００７０】
本発明の他の実施形態は、本発明の宿主細胞を提供する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖を発現するために十分な条件下で宿主細胞を培養する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む、ペプチド鎖を発現するための方法である。
【００７１】
宿主細胞は、所与のタイプの宿主細胞を維持し又は増殖させるのに好適な、及びペプチド鎖を発現させるために十分ないずれかの条件下で培養されることができる。ペプチド鎖の発現に十分な培養条件、培地、及び関連の方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳類細胞タイプは、適切に緩衝されたＤＭＥＭ培地を用いて３７℃において好気的に培養することができ、一方細菌、酵母、及び他の細胞タイプは、ＬＢ培地中適切な雰囲気条件下で３７℃にて培養されてよい。
【００７２】
本発明の方法では、ペプチド鎖の発現は、当該技術分野において周知の種々の異なる技術を用いて確認することができる。例えば、ペプチド鎖の発現は、発現されるペプチド鎖に特異的な抗体又は受容体リガンドのような検出試薬を用いて確認することができる。本発明のｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖に対して特異的に結合する抗体は、このような試薬の１つの例である。ＴＬＲ３に結合するｄｓＲＮＡ又はポリ（Ｉ：Ｃ）のようなＴＬＲ３受容体リガンドは、このような試薬のもう１つの例である。検出試薬は、放射線標識、蛍光色素分子、発色団、又はその検出試薬に対し若しくは検出試薬中に着脱可能な他の分子の、抱合（conjugation）又は組み込みによって、着脱可能に標識されてよい。
【００７３】
あるいは、本発明のｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖の発現は、ＮＦ−ｋＢの活性化又はタイプＩインターフェロンの生成の増大などの、ＴＬＲ３の活性化に関連する生物学的活性についての分析を行うことによって確認することもできる。このような分析にはまた、ＴＬＲ３活性化に対して応答するレポーター遺伝子構築物を利用してもよい。
【００７４】
ペプチド鎖の発現はまた、ペプチド鎖の調製物において、本発明のペプチド鎖の物理的特性を有するペプチド鎖を特定することによって確認することもできる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術、及び例えば、タンパク質分子量又は等電点のような基準を利用する他の周知のタンパク質特性化技術を使用して、本発明のペプチド鎖の発現を確認することができる。硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、高速液体クロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーのようなタンパク質の精製技術を使用して、本発明のペプチド鎖の発現を確認することができる。
【００７５】
重要なことには、本発明の方法では、発現されるペプチド鎖を単離する必要がない。したがって、ペプチド鎖の発現が起こったことは例えば、細胞上若しくは細胞中で、又はペプチド鎖の混合物中で、確認されてもよい。適切な場合には、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のようなフローサイトメトリーに基づく技術を使用して、細胞によるペプチド鎖の発現を確認してもよい。上述したように、ペプチド鎖の発現は、当該技術分野において既知のいずれの好適な技術を用いて確認されてもよい。
【００７６】
本発明の他の実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖をコードするＲＮＡへと転写されることのできる本発明のポリヌクレオチドを提供する工程と、セルフリー発現システムのコンポーネントを提供する工程と、提供されたポリヌクレオチドからセルフリー発現を開始する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む、ペプチド鎖を発現するための方法である。
【００７７】
ポリヌクレオチドをＲＮＡへと転写し、ペプチド鎖をコードするＲＮＡを得て、セルフリー発現を開始するための技術は、当該技術分野において周知であり、これらの工程を達成するための試薬キットは、様々な供給元から市販されている。
【００７８】
本発明の方法の他の実施形態では、セルフリー発現システムは、網状赤血球溶解物に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムからなる群から選択される。
【００７９】
本発明の他の実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖をコードするＲＮＡを提供する工程と、セルフリー発現システムのコンポーネントを提供する工程と、提供されたＲＮＡからセルフリー発現を開始する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を含む少なくとも１つのペプチド鎖の発現を確認する工程と、を含む、ペプチド鎖を発現するための方法である。
【００８０】
本発明の方法の他の実施形態では、セルフリー発現システムは、網状赤血球溶解物に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムからなる群から選択される。
【００８１】
本発明の他の実施形態は、本発明の方法によって生成されたペプチド鎖である。このようなペプチド鎖は、例えばグリコシル化又はリン酸化反応を包含する翻訳後修飾を含んでもよい。このようなペプチド鎖はまた、スプライスバリアント、末端切断（truncated）形態、又はタンパク質分解修飾形態などの別のペプチド鎖形態を含んでもよい。
【００８２】
本発明の他の実施形態は、本発明のペプチド鎖を特異的に結合する抗体である。本発明のペプチド鎖は、ｃｙｎｏＴＬＲ３に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。タンパク質又は核酸免疫付与を使用するネズミ、キメラ、ヒト化、及び完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための技術は、当業者には日常的であり、周知である。こうした技術についての追加の議論及び説明は、上記に見出すことができる。
【００８３】
本発明の他の実施形態は、本発明のペプチド鎖を特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００８４】
本発明の他の態様は、ＴＬＲ３治療剤が安全か安全でないかを判定するための方法であって、ＴＬＲ３治療剤、第１のカニクイザル、及び第２のカニクイザルを提供する工程と、そのＴＬＲ３治療剤を第１のカニクイザルに投与する工程と、第１のカニクイザルが第２のサルと比較して有害な症状を呈しているかどうかを判定する工程と、を含む方法であり、この際、第１のカニクイザルによる有害症状の提示は、そのＴＬＲ３治療剤が安全でないことを示し、第１のカニクイザルによる有害症状の提示がないことは、そのＴＬＲ３治療剤が安全であることを示す。
【００８５】
本発明の方法では、提供された第１の及び第２のカニクイザルは、有害な症状の提示に関して同等であるべきである。言い方をかえれば、両方の動物は、どちらも有害な症状を呈していないか、又はそれらが提供されたときに同じ有害症状を呈しているべきである。
【００８６】
本発明の方法では、ＴＬＲ３治療剤は、非経口的に、皮下に、静脈内に、等、いずれかの適切な投与法により投与されることができる。本発明の方法において使用するのに好適なＴＬＲ３治療剤の例としては、例えば、ｄｓＲＮＡ又はポリ（Ｉ：Ｃ）などの公知のＴＬＲ３リガンド、及びＴＬＲ３細胞外領域を含むもののようなペプチド鎖が挙げられる。
【００８７】
本発明の方法では、第１のカニクイザルが第２のカニクイザルと比べて有害症状を呈しているかどうかの判定は、容易に達成される。例えば、獣医、獣医の助手、動物技術者、又は研究者などの当業者は、動物により呈される症状が有害であるかどうかを判定できる。有害症状の例としては、死、昏睡、痙攣，発熱、臓器不全、組織異常、臓器機能障害、組織機能障害、癌、腫瘍、潰瘍、出血、感染等が挙げられる。
【００８８】
本発明の方法の一実施形態では、ＴＬＲ３治療剤は抗体である。
【００８９】
ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
完全長カニクイザルトール様受容体３（ｃｙｎｏＴＬＲ３）をコードするポリヌクレオチドの単離、クローニング、及びシークエンシング
トリゾール（TRIZOL）（登録商標）試薬（インビトロゲン（Invitrogen）、カリフォルニア州、カールスバッド（Carlsbad））をメーカーの指示に従って用いて、カニクイザルの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＲＮＡを精製した。スーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼ（SUPERSCRIPT II REVERSE TRANSCRIPTASE）（登録商標）キットを用いて逆転写反応を行い、オリゴ−ｄＴプライマー（oligo-dT primer）を用いてプライムした。最初のＰＣＲクローニングのためのプライマーは、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの配列に基づいて設計された。次に完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）をコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のクローニングのためのＰＣＲを、２５３５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）及び２６６４プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて行った。ＰＣＲは、以下の条件下で１００ｎｇの各プライマーを１００ｎｇのｃＤＮＡテンプレートとともに用いて行った。９４℃  ３０秒、６０℃  １分、６８℃  １分を３０サイクル、次いで６８℃  ５分を１サイクル。ＲＣＲ反応生成物はアガロースゲル上で分析され、ＰＣＲクローン化ポリヌクレオチドに対応するおよそ２７００ｂｐのポリヌクレオチドバンドが得られた。
【００９１】
クローン化ＰＣＲ生成物を、キアクイック（QIAQUICK）（登録商標）ＰＣＲ精製（キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州バレンシア（Valencia））を用いて精製した。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ４  ＴＯＰＯ  ＴＡ（登録商標）ベクターへとクローン化して、およそ２７００ｂｐのＰＣＲ生成物について２５３５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）と２６６４プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）との間の配列を得た。
【００９２】
およそ２７００ｂｐ  ＰＣＲ生成物からの２５３５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）及び２６６４プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）によりマスクされた配列を、５'及び３'ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Rapid Amplification of cDNA Ends））法によりクローン化した。これは、始めに、上述のようにして得られたｃｙｎｏＴＬＲ３配列を用いてｃｙｎｏＴＬＲ３  ｃＤＮＡに特異的な２５８９プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、２５９０プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、及び２６２５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を設計することによって達成された。開始部位の約１５０〜２５０ｂｐ下流に配置された３'プライマーは、ｃｙｎｏＴＬＲ３をコードする完全長ポリヌクレオチドｃＤＮＡの５'エンドの増幅、クローニング、及びシークエンシングのための５'ジーンレイサー（GENERACER）（登録商標）プライマーと対をなすように設計された。終結部位の上流約１５０〜２５０ｂｐに配置された５'プライマーは、ｃｙｎｏＴＬＲ３をコードする完全長ポリヌクレオチドｃＤＮＡの３'エンドの増幅、クローニング、及びシークエンシングのための３'ジーンレイサー（GENERACER）（登録商標）プライマーと対をなすように設計された。これらの増幅から得られたＰＣＲ生成物を、次にｐＣＲ４  ＴＯＰＯ  ＴＡ（登録商標）ベクターへとクローン化し、ポリヌクレオチドから５'未翻訳配列、アミノ末端コード配列、カルボキシ末端コード配列、及び３'未翻訳配列を得た。追加の配列を得るために使用されるプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される配列を有していた。次に得られた配列の多重配列アラインメントを行って、５'未翻訳配列を含むポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、完全長ｃｙｎｏＴＬＲペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）をコードするコード配列、及び３'未翻訳配列を得た。
【００９３】
次に、ベクター（Vector）ＮＴＩ  ｖ９．０．０ソフトウェア（インビトロゲン（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad））を用いて配列分析を行った。完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖中の特定された領域は、図１及び図２に示されるクローン化ポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）によってコードされた。アミノ末端メチオニンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基１〜３によってコードされ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸残基１に対応する。シグナルペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基１〜６９によってコードされ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸残基１〜２３に対応する。細胞外領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基７０〜２１１２によってコードされ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸残基２４〜７０４に対応する。膜貫通領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基２１１３〜２１７５によってコードされ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸残基７０５〜７２５に対応する。細胞質領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基２１７６〜２７１２によってコードされ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸残基７２６〜９０４に対応する。終止コドンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基２７１３〜２７１５によってコードされる。
【００９４】
ベクター（Vector）ＮＴＩ  ｖ９．０．０ソフトウェアのアライン（Align）Ｘモジュールによって使用されるＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムのデフォルト設定を用いて多重配列アラインメント分析を行った。ｃｙｎｏＴＬＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基１−２７１２）をコードする完全長ポリヌクレオチドコード配列は、よく特徴づけされた完全長ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖をコードする完全長ポリヌクレオチドコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド残基１−２７１５）と９６．８％一致していることが見出された。完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）は、よく特徴付けられた完全長ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）と９５．７％一致していることが見出された。ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の成熟型は、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸残基２４〜７０４）の細胞外領域と９５．４％一致していることが見出された。
【００９５】
ｃｙｎｏＴＬＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のヌクレオチド残基１−２７１２）をコードする完全長ポリヌクレオチドコード配列は、アカゲザルＴＬＲ３ペプチド鎖をコードする完全長ポリヌクレオチドコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のヌクレオチド残基１−２７１２）と９９．３％一致していることが見出された。完全長ｃｙｎｏＴＬＲ３ペプチド鎖配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）は、アカゲザルＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）と９８．５％一致していることが見出された。ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の成熟型は、ヒトＴＬＲ３ペプチド鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸残基２４−７０４）の細胞外領域と９８．２％一致していることが見出された。アカゲザルＴＬＲ３をコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）のクローニングは、サンジャビ（Sanghavi）及びレインハート（Reinhart）により報告された。サンジャビ（Sanghavi）及びレインハート（Reinhart）、ジャーナルオブイムノロジー（J. Immunol.）１７５：５３１４（２００５年）を参照のこと。
【００９６】
（実施例２）
ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域を含むペプチド鎖の発現及び精製
Ｎ末端メチオニンをコードするポリヌクレオチド、ｃｙｎｏＴＬＲ３シグナルペプチド鎖、及び６つのアミノ末端ヒスチジンアミノ酸残基タグにフレキシブルなグリシン及びセリン結合を介して融合されたｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域を構成し、そして哺乳類発現ベクターへとクローン化してｐ４０３７発現ベクター構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を生成した。プライマー２５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を使用してｐ４０３７の生成を促進する。ＨＥＫ２９３細胞を、標準法を用いてｐ４０３７で一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞株は、ヒト胚腎臓細胞に由来する。これらのＨＥＫ２９３細胞を次いで６日間培養し、細胞培養培地を収集した。次に収集された培地からｐ４０３７によってコードされたヒスチジンタグ付ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域融合ペプチド鎖を単離するためのタロン（TALON）（登録商標）樹脂精製を、メーカー（クロンテックラボラトリーズ（Clontech Laboratories Inc.）、カリフォルニア州マウンテンビュー（Mountain View））の指示に従って行った。次いでＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂からの溶出液を、非還元サンプル及び還元条件に供したサンプルについて実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロッティング（Western blotting）を行った。ウェスタンブロットはヒスチジンタグに特異的なプローブを用いてプローブした。還元及び非還元の両方のサンプルのウェスタンブロット分析により、明らかに概算の分子量が９８ｋＤａｌである単量体のタンパク質が発現され及び単離されたということが分かった。ｐ４０３７によりコードされたｃｙｎｏＴＬＲ３ヒスチジンタグ付ｃｙｎｏＴＬＲ３細胞外領域融合ペプチド鎖の算出された分子量は、ウェスタンブロットにおいて検出された９８ｋＤａｌヒスチジンタグ付ペプチド鎖よりも小さい、およそ８０ｋＤａｌであった。しかしながら、ｐ４０３７によってコードされたペプチド鎖は、１５Ｎ−結合グリコシル化部位を含み、翻訳後のグリコシル化が、発現されたヒスチジンタグ付タンパク質の分子量の増加に大きく影響していると考えられる。
【００９７】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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