(57)【要約】  本発明は、テロメラーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法に関する。本発明の化合物は、テロメラーゼのＴＲＢＤ、「サム」、「フィンガー」、および／または「パーム」ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を設計またはスクリーニングすること、および、該化合物を、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験することにより、同定される。
2011500087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）テロメラーゼのＴＲＢＤドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、設計またはスクリーニングすること；および
（ｂ）（ａ）において設計またはスクリーニングした化合物を、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験し、それによりテロメラーゼの活性を調節する化合物を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ＴＲＢＤドメインが、T. thermophilaテロメラーゼのアミノ酸残基２５４〜５１９、または他の種のテロメラーゼにおけるそれと等価のアミノ酸残基を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、ＴＲＢＤドメインのＣＰモチーフ、Ｔモチーフ、および／またはＱＦＰモチーフの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
化合物が、表１に記載の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
テロメラーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ヌクレオチド結合ポケットの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、設計またはスクリーニングすること；および
（ｂ）（ａ）において設計またはスクリーニングした化合物を、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験し、それによりテロメラーゼの活性を調節する化合物を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項６】
化合物が、表１に記載のフィンガーサブドメインおよび／またはパームサブドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、T. castaneumテロメラーゼのＫ１８９、Ｒ１９４、Ｙ２５６、Ｑ３０８、Ｖ３４２、およびＫ３７２の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、または他の種のテロメラーゼにおけるそれと等価のアミノ酸残基に結合する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
テロメラーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡと直接接触している少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、設計またはスクリーニングすること；および
（ｂ）（ａ）において設計またはスクリーニングした化合物を、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験し、それによりテロメラーゼの活性を調節する化合物を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項９】
化合物が、表２に記載のサムサブドメインおよび／またはパームサブドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が、T. castaneumテロメラーゼのＫ２１０、Ｋ４０６、Ｋ４１６、Ｋ４１８、およびＮ４２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、または他の種のテロメラーゼにおけるそれと等価のアミノ酸残基に結合する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物が、少なくとも２、３、４、５、６または７以上のアミノ酸残基に結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
テロメラーゼが、Tetrahymena thermophila、Arabidopsis thaliana、Homo sapiens、Schizosaccharomyces pombe、Mus musculus、Saccharomyces cerevisiae、Oxytricha trifallax、Euplotes aediculatusまたはTribolium castaneumのテロメラーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）がin silicoで実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）がin vitroで実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が、テロメラーゼ活性を阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
化合物が、テロメラーゼ活性を促進する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
化合物が、ヌクレオチド結合、ＲＮＡ結合、ＤＮＡ結合またはテロメラーゼ活性に影響を及ぼすことが変異では同定されなかったアミノ酸残基に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が、テロメラーゼの活性を、該化合物と接触しないテロメラーゼと比べて少なくとも３０％調節する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法により同定された化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本出願は、２００８年８月２１日出願の米国特許仮出願第61/090,726号および２００７年１０月２２日出願の同第60/981,548号の優先権を主張し、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
直鎖状染色体を有する全ての生物は、そのＤＮＡの末端配列を維持するのに大きな障害に直面し、これはしばしば「末端複製問題」と呼ばれる（Blackburn (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:163-194；Cavalier-Smith (1974) Nature 250:467-470；Cech & Lingner (1997) Ciba Found. Symp. 211:20-34；Lingner, et al. (1995) Science 269:1533-1534；Lundblad (1997) Nat. Med. 3:1198-1199；Ohki, et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:5753-5766）。真核細胞はこの問題を、テロメラーゼと呼ばれる特殊なＤＮＡポリメラーゼを用いることにより克服する。テロメラーゼは、直列型のＧが豊富なＤＮＡ反復（テロメア）を、直鎖状染色体の３’末端に付加し、これは、染色体の遺伝子情報の損失、染色体末端間の融合、ゲノムの不安定性、および老化などを防ぐように機能する（Autexier & Lue (2006) Annu. Rev. Biochem. 75:493-517；Blackburn & Gall (1978) J. Mol. Biol. 120:33-53；Chatziantoniou (2001) Pathol. Oncol. Res. 7:161-170；Collins (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:374-380；Dong, et al. (2005) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 54:85-93）。
【０００３】
コアテロメラーゼホロ酵素は、テロメア配列の付加のための鋳型として機能するＲＮＡ分子（ＴＥＲ）と対になっている、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＥＲＴ）である（Blackburn (2000) Nat. Struct. Biol. 7:847-850；Lamond (1989) Trends Biochem. Sci. 14:202-204；Miller & Collins (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6585-6590；Miller, et al. (2000) EMBO J. 19:4412-4422；Shippen-Lentz & Blackburn (1990) Science 247:546-552）。ＴＥＲＴは４つの機能ドメインから構成され、これらの１つは、タンパク質のこのファミリーの特徴であるキーシグネチャーモチーフ（key signature motif）を含有する点において、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）と類似点を共有する（Autexier & Lue (2006)上記；Bryan, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8479-8484；Lee, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:52531-52536；Peng, et al. (2001) Mol. Cell 7:1201-1211）。テロメラーゼの活性部位を含むＲＴドメインは、ＲＮＡ鋳型とのゆるい会合に関与すると考えられている（Collins & Gandhi (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8485-8490；Jacobs, et al. (2005) Protein Sci. 14:2051-2058）。
【０００４】
しかしＴＥＲＴは、他の逆転写酵素に比べた場合、ＲＴドメインに対するＮ末端に、機能に関して重要な２つのドメインを含む点でユニークである。これらは遠Ｎ末端ドメイン（ＴＥＮ）を含み、これは、系統発生群（phylogenetic group）の中で最も保存されていないが、適正なヒト、酵母および繊毛原生動物のin vitroでのテロメラーゼ活性、およびin vivoでのテロメアの維持に必要とされる（Friedman & Cech (1999) Genes Dev. 13:2863-2874；Friedman, et al. (2003) Mol. Biol. Cell 14:1-13）。ＴＥＮドメインはＤＮＡ結合特性およびＲＮＡ結合特性の両方を有する。ＤＮＡ結合は、テロメラーゼの染色体上への負荷を促進し、一方ＲＮＡ結合は非特異的であり、その相互作用の役割は明らかでない（Hammond, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17:296-308；Jacobs, et al. (2006) Nat. Struct. Mol. Biol. 13:218-225；Wyatt, et al. (2007) Mol. Cell. Biol. 27:3226-3240）。第３のドメインであるテロメラーゼＲＮＡ結合ドメイン（ＴＲＢＤ）は、ＴＥＮおよびＲＴドメインの間にあり、ＴＥＮドメインとは異なり、系統発生群の中で高度に保存され、in vitroおよびin vivoの両方におけるテロメラーゼ機能に必須である（Lai, et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:990-1000）。
【０００５】
ＴＲＢＤは、ＲＮＡ認識および結合に関連するキーシグネチャーモチーフ（ＣＰ−およびＴ−モチーフ）を含み、両方とも鋳型の上流に位置する、ＴＥＲのステムＩおよびＴＢＥと広範囲に接触する（Bryan, et al. (2000) Mol. Cell 6:493-499；Cunningham & Collins (2005) Mol. Cell. Biol. 25:4442-4454；Lai, et al. (2002) Genes Dev. 16:415-420; Lai, et al. (2001)上記；Miller, et al. (2000)上記；O'Connor, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:17533-17539）。ＴＲＢＤ−ＴＥＲ相互作用は、in vitroおよびin vivoの両方におけるホロ酵素の適切なアセンブリーおよび酵素活性に必要であり、染色体の末端における、複数の同一のテロメア反復の正確な付加に（間接的ではあるが）重要な役割を果たすと考えられている（Lai, et al. (2002)上記；Lai, et al. (2003) Mol. Cell 11:1673-1683; Lai, et al. (2001)上記）。
【０００６】
ＴＥＲＴと異なり、ＴＥＲは種によってかなりサイズが異なる。例えば、Tetrahymena thermophilaにおいて、ＴＥＲはただの１５９ヌクレオチド長であり（Greider & Blackburn (1989) Nature 337:331-337）、一方酵母は、特別に長い１１６７ヌクレオチド長のＴＥＲを有する（Zappulla & Cech (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:0024-10029）。サイズおよび構造における顕著な違いにもかかわらず、ＴＥＲのコアの構造要素は系統発生群間で保存されており、生物間でのテロメア複製の共通のメカニズムの存在を示唆する（Chen, et al. (2000) Cell 100:503-514；Chen & Greider (2003) Genes Dev. 17:2747-2752；Chen & Greider (2004) Trends Biochem. Sci. 29:183-192；Ly, et al. (2003) Mol. Cell. Biol. 23:6849-6856；Theimer & Feigon (2006) Curr. Opin. Struct. Biol. 16:307-318）。これらには鋳型が含まれ、鋳型はＲＴドメインとゆるく会合し、テロメア合成のコードおよび、テロメラーゼの反復付加の処理能力（processivity）を部分的に調節するＴＢＥを提供する。Tetrahymena thermophilaにおいて、ＴＢＥはステムＩＩおよび隣接する一本鎖領域により形成され、鋳型近くの上流に位置する（Lai, et al. (2002)上記；Lai, et al. (2003)上記；Licht & Collins (1999) Genes Dev. 13:1116-1125）。低親和性ＴＥＲＴ結合部位はまた、Tetrahymena thermophilaＴＥＲのらせんＩＸおよび鋳型認識要素（ＴＲＥ）中に見出される。
【０００７】
ＴＥＲＴ機能は多数のタンパク質により調節され、それらのいくつかは、ＴＥＲＴ／ＴＥＲ複合体との直接会合により作用し、他は、テロメラーゼの染色体末端への、テロメアＤＮＡとの会合を介したアクセスを調節することにより作用する（Aisner, et al. (2002) Curr. Opin. Genet. Dev. 12:80-85；Cong, et al. (2002) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:407-425；Dong, et al. (2005)上記；Loayza & de Lange (2004) Cell 117:279-280；Smogorzewska & de Lange (2004) Annu. Rev. Biochem. 73:177-208；Smogorzewska, et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:1659-1668；Witkin & Collins (2004) Genes Dev. 18:1107-1118；Witkin, et al. (2007) Mol. Cell. Biol. 27:2074-2083）。例えば、繊毛原生動物であるTetrahymena thermophilaにおけるｐ６５またはEuplotes aediculatusにおけるその相同体ｐ４３は、テロメラーゼホロ酵素の一体化要素（integral component）である（Aigner & Cech (2004) RNA 10:1108-1118；Aigner, et al. (2003) Biochemistry 42:5736-5747；O'Connor & Collins (2006) Mol. Cell. Biol. 26:2029-2036；Prathapam, et al. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol. 12:252-257；Witkin & Collins (2004)上記；Witkin, et al. (2007)上記）。ｐ６５とｐ４３の両方は、ＴＥＲに結合してこれを折りたたむと考えられており、これはホロ酵素の適切なアセンブリーと完全な活性に必要な過程である。
【０００８】
酵母において、テロメラーゼ活性の漸増および続く上方調節には、テロメラーゼ関連タンパク質Ｅｓｔ１が必要である（Evans & Lundblad (2002) Genetics 162:1101-1115；Hughes, et al. (1997) Ciba Found. Symp. 211:41-52；Lundblad (2003) Curr. Biol. 13:R439-441；Lundblad & Blackburn (1990) Cell 60:529-530；Reichenbach, et al. (2003) Curr. Biol. 13:568-574；Snow, et al. (2003) Curr. Biol. 13:698-704）。Ｅｓｔ１はテロメラーゼのＲＮＡ要素に結合し、これは、テロメア結合タンパク質Ｃｄｃ１３との相互作用を介した、真核性染色体末端へのホロ酵素の漸増を促進する相互作用である（Chandra, et al. (2001) Genes Dev. 15:404-414；Evans & Lundblad (1999) Science 286:117-120；Lustig (2001) Nat. Struct. Biol. 8:297-299；Pennock, et al. (2001) Cell 104:387-396）。
【０００９】
テロメラーゼおよび関連する調節因子がいかにして互いに物理的に相互作用し機能して、適切なテロメア長を維持するかは、研究途中である。これらの因子の構造的および生化学的特性を、単離された状態、および互いに複合化された状態の両方において用いることにより、ＴＲＢＤドメインと、ＴＥＲのステムＩおよびＴＢＥとの相互作用が、どのようにして適切なアセンブリーを促進し、ホロ酵素の反復付加の処理能力を促進するかを、決定することができる。
【００１０】
in vitroおよびin vivoのスクリーニングアッセイが開発され、テロメラーゼ活性またはテロメア結合を調節する剤が同定されているが、その焦点は、特定のドメインまたは基質ポケットについて一定の特異性を有する剤を同定することではない。米国特許番号第7,067,283号；第6,906,237号；第6,787,133号；第6,623,930号；第6,517,834号；第6,368,789号；第6,358,687号；第6,342,358号；第5,856,096号；第5,804,380号；および第5,645,986号を参照。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、テロメラーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法を特徴とする。本発明のこの方法は、（ａ）テロメラーゼのＴＲＢＤドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基、「サム(thumb)」ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基、「パーム(palm)」ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基、および／または「フィンガー(finger)」ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、設計またはスクリーニングすること；および（ｂ）（ａ）において設計またはスクリーニングした化合物を、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験し、それによりテロメラーゼの活性を調節する化合物を同定すること；を含む。１つの態様において、テロメラーゼのＴＲＢＤドメインは、表１に記載のアミノ酸残基を含む。他の態様において、「サム」、「パーム」および／または「フィンガー」ドメインは、表２に記載のアミノ酸残基を含む。他の態様において、ステップ（ａ）は、in silicoまたはin vitroで実施される。この方法で同定された化合物もまた、本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−１Ｂ】図１は、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の構造を示す。図１Ａは、ヒト、酵母、およびTetrahymena thermophilaのＴＥＲＴの一次構造であって、機能ドメインおよび保存モチーフを示す。図１Ｂは、Tribolium castaneumのＴＥＲＴの一次構造および保存モチーフを示す。
【図１Ｃ】図１は、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の構造を示す。図１Ｃは、ＲＮＡ結合ドメイン（ＴＲＢＤ）、「フィンガー」および「パーム」サブドメインから構成される逆転写酵素ドメイン、および「サム」ドメインを有する、ＴＥＲＴドメインの構成を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Tetrahymena thermophilaのＴＲＢＤ（ＴＥＴＴＨ；配列番号１）の配列アラインメントおよび二次構造の模式図を、ALSCRIPT Barton (1993) Protein Eng. 6:37-40)により作製された、Euplotes aediculatus（ＥＵＰＡＥ；配列番号２）およびOxytricha trifallax（ＯＸＹＴＲ；配列番号３）などの繊毛原生動物；ヒト（配列番号４）およびマウス（配列番号５）などの哺乳類；Schizosaccharomyces pombe（ＳＣＨＰＯ；配列番号６）およびSaccharomyces cerevisiae（ＹＥＡＳＴ；配列番号７）などの真菌類；およびArabidopsis thaliana（ＡＲＡＴＨ；配列番号８）などの植物からのＴＲＢＤと比較して示した図である。キーシグネチャーモチーフの保存残基を示し、またＲＮＡ結合およびテロメラーゼ機能に影響する変異残基も示す。三角形の印は、本明細書の研究で用いられたＴＲＢＤコンストラクトの境界を規定する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Tetrahymena thermophilaのＴＲＢＤ（ＴＥＴＴＨ；配列番号１）の配列アラインメントおよび二次構造の模式図を、ALSCRIPT Barton (1993) Protein Eng. 6:37-40)により作製された、Euplotes aediculatus（ＥＵＰＡＥ；配列番号２）およびOxytricha trifallax（ＯＸＹＴＲ；配列番号３）などの繊毛原生動物；ヒト（配列番号４）およびマウス（配列番号５）などの哺乳類；Schizosaccharomyces pombe（ＳＣＨＰＯ；配列番号６）およびSaccharomyces cerevisiae（ＹＥＡＳＴ；配列番号７）などの真菌類；およびArabidopsis thaliana（ＡＲＡＴＨ；配列番号８）などの植物からのＴＲＢＤと比較して示した図である。キーシグネチャーモチーフの保存残基を示し、またＲＮＡ結合およびテロメラーゼ機能に影響する変異残基も示す。三角形の印は、本明細書の研究で用いられたＴＲＢＤコンストラクトの境界を規定する。
【００１３】
【図３Ａ】図３Ａは、Tribolium castaneumのＴＥＲＴ（ＴＲＩＣＡ；配列番号９）の配列アラインンメントおよび表面保存を、種々の系統発生群からのＴＥＲＴと比較して示したものであり、これには、マウス（配列番号１０）およびヒト（配列番号１１）などの哺乳類； Arabidopsis thaliana（ＡＲＡＴＨ；配列番号１２）などの植物；Saccharomyces cerevisiae（ＹＥＡＳＴ；配列番号１３）およびSchizosaccharomyces pombe（ＳＣＨＰＯ；配列番号１４）などの真菌類；およびTetrahymena thermophila（ＴＥＴＴＨ；配列番号１５）およびEuplotes aediculatus（ＥＵＰＡＥ；配列番号１６）などの原生動物から、ClustalW2により（Larkin et al. (2007) Bioinformatics 23:2947-2948）作製されたものを含む。キーシグネチャーモチーフの保存残基も示す。ＤＮＡ基質の骨格に直接接触しているとされる「サム」ドメインのらせんα１０のＫ２１０および極性残基（Ｋ４０６、Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｎ４２３）も示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Tribolium castaneumのＴＥＲＴ（ＴＲＩＣＡ；配列番号９）の配列アラインンメントおよび表面保存を、種々の系統発生群からのＴＥＲＴと比較して示したものであり、これには、マウス（配列番号１０）およびヒト（配列番号１１）などの哺乳類； Arabidopsis thaliana（ＡＲＡＴＨ；配列番号１２）などの植物；Saccharomyces cerevisiae（ＹＥＡＳＴ；配列番号１３）およびSchizosaccharomyces pombe（ＳＣＨＰＯ；配列番号１４）などの真菌類；およびTetrahymena thermophila（ＴＥＴＴＨ；配列番号１５）およびEuplotes aediculatus（ＥＵＰＡＥ；配列番号１６）などの原生動物から、ClustalW2により（Larkin et al. (2007) Bioinformatics 23:2947-2948）作製されたものを含む。キーシグネチャーモチーフの保存残基も示す。ＤＮＡ基質の骨格に直接接触しているとされる「サム」ドメインのらせんα１０のＫ２１０および極性残基（Ｋ４０６、Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｎ４２３）も示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Tribolium castaneumのＴＥＲＴ（ＴＲＩＣＡ；配列番号９）の配列アラインンメントおよび表面保存を、種々の系統発生群からのＴＥＲＴと比較して示したものであり、これには、マウス（配列番号１０）およびヒト（配列番号１１）などの哺乳類； Arabidopsis thaliana（ＡＲＡＴＨ；配列番号１２）などの植物；Saccharomyces cerevisiae（ＹＥＡＳＴ；配列番号１３）およびSchizosaccharomyces pombe（ＳＣＨＰＯ；配列番号１４）などの真菌類；およびTetrahymena thermophila（ＴＥＴＴＨ；配列番号１５）およびEuplotes aediculatus（ＥＵＰＡＥ；配列番号１６）などの原生動物から、ClustalW2により（Larkin et al. (2007) Bioinformatics 23:2947-2948）作製されたものを含む。キーシグネチャーモチーフの保存残基も示す。ＤＮＡ基質の骨格に直接接触しているとされる「サム」ドメインのらせんα１０のＫ２１０および極性残基（Ｋ４０６、Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｎ４２３）も示す。
【図４】図４は、Tetrahymena thermophilaからのテロメラーゼのＲＮＡ要素（ＴＥＲ）の、一次構造の模式図である。ステムＩ、ＴＢＥおよび鋳型も示す。
【００１４】
発明の詳細な説明
リボ核タンパク質複合体であるテロメラーゼは、真核染色体の直鎖末端を複製して、「末端複製問題」に対処する。ＴＥＲＴは必須の普遍的に保存されるドメイン（ＴＲＢＤ；図１Ａ）を含み、これは、ホロ酵素のＲＮＡ（ＴＥＲ）要素と広範に接触し、この相互作用がＴＥＲＴ／ＴＥＲアセンブリーおよび反復付加の処理能力を促進する。ＴＲＢＤドメインは系統発生群の中で高度に保存され、テロメラーゼの機能に必須である。広範囲の生化学的および変異原性試験により、ＴＥＲＴ／ＴＥＲ複合体の適切なアセンブリーおよび安定化、ならびにホロ酵素の反復付加の処理能力に対して重要と考えられている相互作用である、ＴＲＢＤのステムＩおよびＴＥＢへの結合が局在化された。ＴＲＢＤドメインの原子構造は現在同定されており、ＴＥＲＴ／ＴＥＲ結合についての情報を提供する。ＴＲＢＤのＲＮＡ結合部位は、部分的に親水性で部分的に疎水性の性質を持ち、かつ以前に同定され、テロメラーゼ機能に重要であることが示されたＴ−およびＣＰモチーフにより形成されているタンパク質の、表面上の伸長された溝である。この溝のサイズ、構成および化学的性質は、ＴＲＢＤドメインが二本鎖および一本鎖両方の核酸、おそらくステムＩまたはＩＩならびにそれらを結合するｓｓＲＮＡと相互作用することを示す。
【００１５】
ＴＲＢＤドメインの構造に加えて、３つの高度に保存されたドメイン、すなわちＴＲＢＤ、逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、およびＴＥＲＴの推定「サム」ドメインを示すと考えられるＣ末端伸長が、リング状に構成され、この構造が、レトロウイルス逆転写酵素、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ、およびＢファミリーＤＮＡポリメラーゼと共通の特徴を有することが示されている。ドメインの構成により、基質結合と触媒に関連するモチーフがリングの内部に配置され、二本鎖核酸の７〜８個の塩基を収容することができる。このリング内でのＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のモデル化により、タンパク質と核酸基質が完全に適合すること、またＤＮＡプライマーの３’末端が酵素の活性部位にあることが明らかとなり、活性なテロメラーゼ伸長複合体の形成の証拠を提供する。
【００１６】
ＴＲＢＤドメインおよび、ＲＴと「サム」ドメインは、系統発生群間で高度に保存されているドメインである。したがって、これらのドメインはテロメラーゼ阻害剤についての理想的な候補となる。この点で、テロメラーゼは、例えば癌などの、細胞増殖および老化に関連するヒト疾患を処置するための、理想的な標的である。
【００１７】
したがって、本発明は、Tetrahymena thermophilaおよびTribolium castaneumテロメラーゼの高分解能構造の使用であって、テロメラーゼの活性を調節するエフェクター分子を同定するための前記使用に関する。用語「エフェクター」は、任意の作用物質、拮抗物質、リガンドまたは他の剤であって、テロメラーゼの活性に影響を及ぼすものをいう。エフェクターは、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、脂肪酸、ホルモン、有機化合物、および無機化合物であることができるが、これらに限定されない。本発明の結晶構造から得られた情報は、テロメラーゼ活性を調節する可能性のある化合物の設計、単離、スクリーニングおよび決定に有用な詳細情報を明らかにする。ＴＲＢＤドメインに結合する、および、例えばＴＥＲ結合を立体的にブロックする、またはＲＮＰアセンブリーをブロックする化合物は、有効なテロメラーゼ特異的阻害剤として作用し、一方、ＴＥＲ結合またはＲＮＰアセンブリーを模倣するまたは促進する化合物は、有効なテロメラーゼ特異的アクチベーターとして作用する。活性部位またはヌクレオチド結合部位に結合しこれをブロックする化合物はまた、テロメラーゼ活性を調節することができる。
【００１８】
同様に、ＤＮＡに直接接触しているテロメラーゼの１または２以上のアミノ酸残基と相互作用する化合物は、ＤＮＡ結合をブロックすることができ、有効なテロメラーゼ特異的阻害剤として作用し、一方、ＤＮＡを模倣する化合物は、テロメラーゼ特異的アクチベーターとして作用する。本発明のエフェクター分子は、多様な使用を有する。例えば、テロメラーゼモジュレーターは、ヒト疾患の処置用の有効な治療剤であることが意図される。作用物質のスクリーニングは、細胞内でテロメラーゼ活性（テロメア依存性複製能力、または部分的テロメラーゼ活性を含む）を増加させる組成物を提供する。かかる作用物質組成物は、有用なタンパク質を発現可能な細胞を含む、それ以外は正常な非形質転換細胞を不死化する方法を提供する。かかる作用物質はまた、細胞の老化を制御する方法も提供することができる。逆に、拮抗物質活性についてのスクリーニングは、テロメア依存性複製能力を低下させる組成物を提供し、これにより癌細胞などの、そうでなければ不死の細胞を死滅させる（mortalize）。拮抗物質活性のスクリーニングは、テロメラーゼ活性を低下させる組成物を提供し、これにより、癌細胞などの調節されない細胞成長を示す細胞の、無制限の細胞分割を防ぐ。一般に、本発明のエフェクター分子は、細胞または生物中でテロメラーゼ活性を増加または低下させることが望ましい場合には、いつでも用いることができる。
【００１９】
概括的に言えば、本発明の方法は、本明細書に開示された、必須テロメラーゼドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する試験化合物を、設計またはスクリーニングする方法；および設計またはスクリーニングした化合物を、テロメラーゼ活性を調節するその能力について試験する方法を含む。ある態様において、本発明の方法は、種々の、in silico、in vitro、および／またはin vivoアッセイを用いて、テロメラーゼの１または２以上のドメインまたはドメイン残基と、試験化合物との間の相互作用を検出することに基づいて、実施される。
【００２０】
本発明の文脈において、テロメラーゼは、テロメア反復TTAGGGの付加によりテロメア末端を維持する酵素のファミリーをいう。テロメラーゼは、例えばNakamura, et al. (1997) Science 277(5328):955-9およびO’Reilly, et al. (1999) Curr. Opin. Struct. Biol. 9(1):56-65により記載されている。本発明に従って用いるテロメラーゼ酵素の例は、本明細書において配列番号１〜１６（図２Ａ〜２Ｂ、図３Ａ〜３Ｃ）に記載されており、テロメラーゼ酵素の全長配列は、当分野においてGENBANKアクセッション番号AAC39140（Tetrahymena thermophila）、NP_197187（Arabidopsis thaliana）、NP_937983（Homo sapiens）、CAA18391（Schizosaccharomyces pombe）、NP_033380（Mus musculus）、NP_013422（Saccharomyces cerevisiae）、AAC39163（Oxytricha trifallax）、CAE75641（Euplotes aediculatus）およびNP_001035796（Tribolium castaneum）として知られている。本発明の目的のために、テロメラーゼへの言及は、テロメラーゼの突然変異体および合成変異体、ならびにテロメラーゼの断片をさす。合成変異体は、本明細書に開示されたテロメラーゼと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するものを含む。さらに好ましくは、かかる変異体は、本明細書に提供されたテロメラーゼの配列に対応するが、しかし１または２以上、例えば１〜１０、例えば１〜５のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するものである。
【００２１】
テロメラーゼおよびその変異体の断片は、好ましくは少なくとも２０の、より好ましくは少なくとも５０の、および最も好ましくは少なくとも２００のアミノ酸のサイズである。例示の断片としては、テロメラーゼのＴＲＢＤドメインを包含する約２５０のアミノ酸残基を含む。他の断片は、「サム」ドメインおよび逆転写酵素ドメインおよびそのサブドメイン、すなわち、「フィンガー」および「パーム」サブドメインを含む。図１Ａおよび図２Ａ、２Ｂに示すように、ＴＲＢＤドメインは、T. thermophilaテロメラーゼのおよそ２５４〜５１９におけるアミノ酸残基を包含する。図１Ｂおよび図３Ａ〜３Ｃに示すように、逆転写酵素ドメインは、T. castaneumテロメラーゼのおよそ１６０〜４０３におけるアミノ酸残基を包含し、「サム」ドメインは、T. castaneumテロメラーゼのおよそ４０４〜５９６におけるアミノ酸残基を包含する。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂに記すアミノ酸配列の比較に基づき、他の種からのテロメラーゼの好適なドメインおよび断片を、別の種からのテロメラーゼにおける等価なアミノ酸残基の位置に基づいて、容易に得ることができる。
【００２２】
ＴＲＢＤのほぼ全てのらせん構造は、ＴＥＲ結合に適した核酸結合折りたたみを提供する。２つの保存モチーフ（ＣＰモチーフおよびＴモチーフ）により形成される、タンパク質表面の伸長されたポケットは、ＴＲＢＤのＲＮＡ結合ポケットを提供する。このポケットの幅および化学的性質は、これが一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡ、またおそらくステムＩおよび鋳型境界要素（ＴＢＥ）に結合することを示す。T thermophilaテロメラーゼのＲＮＰアセンブリーに関与する必須アミノ酸残基および、T thermophilaテロメラーゼＴＲＢＤとＴＥＲの間の相互作用を、表１に挙げる。他の生物からのテロメラーゼにおけるこれら残基の位置も、表１に示す。特定の態様において、本発明の化合物は表１に記載の１または２以上のアミノ酸残基に結合し、これによりテロメラーゼの活性を調節する。
【００２３】
【表１】
2011500087.tif 000003
【００２４】
本明細書に開示されているように、T. castaneumテロメラーゼの構造には、逆転写酵素および「サム」ドメインのキーアミノ酸残基が同定された。特に、ヌクレオチド結合ポケットのキーアミノ酸残基および、ＤＮＡ基質の骨格と直接接触するようにみえるアミノ酸残基を同定した。したがって、本発明はまた、テロメラーゼのヌクレオチド結合ポケットの少なくとも１つのアミノ酸残基に、またはＤＮＡと直接接触している残基に、結合する化合物を包含する。これらの残基は、T. castaneumテロメラーゼの逆転写酵素ドメインの「パーム」および「フィンガー」サブドメインならびに「サム」ドメインに見出され、表２に挙げられている。他の種におけるこれらアミノ酸残基の位置もまた、表２に示す。
【００２５】
【表２】
2011500087.tif 000004
【００２６】
１つの態様において、本発明の化合物は、表２に示した１または２以上のアミノ酸残基に結合し、これによりテロメラーゼの活性を調節する。他の態様において、化合物は、テロメラーゼのヌクレオチド結合ポケットの１または２以上のアミノ酸残基（すなわち、T. castaneumテロメラーゼのＫ１８９、Ｒ１９４、Ｙ２５６、Ｑ３０８、Ｖ３４２、およびＫ３７２、または他の種からのテロメラーゼにおけるこれらと等価のアミノ酸残基）に結合して、ヌクレオチド結合を調節する。さらなる態様において、化合物は、ＤＮＡと直接接触するテロメラーゼの１または２以上のアミノ酸残基（すなわち、T. castaneumテロメラーゼのＫ２１０、Ｋ４０６、Ｋ４１６、Ｋ４１８、またはＮ４２３、または他の種からのテロメラーゼにおけるこれらと等価のアミノ酸残基）に結合して、ＤＮＡ結合を調節する。
【００２７】
本発明に従って設計またはスクリーニングされた化合物は、本明細書に開示された１または２以上のドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基と、種々の不均一相互作用を介して相互作用することができ、これらには、ファンデルワールス接触、水素結合、イオン性相互作用、極性接触、またはその組合せを含むが、これに限定されない。一般に、化合物は、本明細書に開示されたドメインの２、３、４、５、６、または７以上のアミノ酸残基と相互作用して、該化合物の、１または２以上のテロメラーゼタンパク質に対する特異性を増強することが望ましい。１つの態様において、化合物は、ＱＦＰモチーフ、ＴモチーフまたはＣＰモチーフの１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する。他の態様において、化合物は、ＴモチーフおよびＣＰモチーフの１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する
【００２８】
さらなる態様において、化合物は、表１に記載の１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する。特定の態様において、化合物は、表１に記載の１または２以上の必須アミノ酸であって、ＲＮＡ結合およびテロメラーゼ活性に対して変異により影響を与えると以前に同定されていなかったものと、相互作用する。他の態様において、化合物は、ヌクレオチド結合ポケットの１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する。さらなる態様において、化合物は、ＤＮＡと直接接触しているテロメラーゼの１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する。さらに別の態様において、化合物は、表２に記載の１または２以上の必須アミノ酸と相互作用する。特定の態様において、化合物は、表２に記載の１または２以上の必須アミノ酸であって、ヌクレオチド結合、ＤＮＡ結合またはテロメラーゼ活性に影響を及ぼすことが以前に変異により同定されていなかったものと、相互作用する。
【００２９】
本発明により、分子設計技術を、テロメラーゼの１または２以上のアミノ酸に結合することができる阻害性および刺激性の化合物を含む、化学物質および化合物の、設計、同定および合成に用いることができる。テロメラーゼのドメインの構造を、GRAM、DOCK、HOOKまたはAUTODOCK（Dunbrack, et al. (1997) Folding& Design 2:27-42）などのドッキングプログラムを用いたコンピューターモデリングと共に用いて、テロメラーゼタンパク質の潜在的なモジュレーターを同定することができる。この手順には、化合物を本明細書に開示されたドメインに適合させて、例えば以下を行うことを含み得る：化合物の形状および化学構造が、ＴＲＢＤドメインをいかに良好に補うかを確認すること；または、化合物を、ＴＲＢＤにおけるＴＥＲの結合と比較すること；または、化合物を、ＤＮＡ分子の「サム」ドメインへの結合と比較すること；または、化合物を、ヌクレオチド基質のヌクレオチド結合ポケットへの結合と比較すること。コンピュータープログラムはまた、テロメラーゼタンパク質およびエフェクター化合物の、引力、反力、立体障害を推定するために用いることもできる。一般に、適合が強いほど、立体障害は弱い。引力が強いほど、および特異性が高いほど、これらは特異的エフェクター化合物には重要な特徴であるが、他のクラスのタンパク質よりもテロメラーゼタンパク質と相互作用する可能性が高い。本発明が、基質結合に特異的に関与するアミノ酸残基を同定した範囲において、本発明は、従来のスクリーニングアッセイではこれまで不可能であった特性を提供する。
【００３０】
代替的に、化学的プローブのアプローチを、テロメラーゼモジュレーターまたはエフェクターの設計に用いることができる。例えば、Goodford（(1985) J. Med. Chem. 28:849）は、GRID（Molecular Discovery Ltd., Oxford, UK）などのいくつかの市販のソフトウェアパッケージを記載しており、これを用いて、例えば水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素、およびヒドロキシルなどの異なる化学的プローブにより、テロメラーゼドメインを探索することができる。テロメラーゼドメインのこれらの領域または部位と、各プローブの相互作用に好ましい部位をこうして決定し、得られたかかる領域または部位の３次元パターンから、推定の相補的分子を生成することができる。
【００３１】
本発明の化合物はまた、テロメラーゼドメインの３次元構造を目視的に検査することにより設計して、さらに有効な阻害剤またはアクチベーターを決定することができる。この種類のモデル化は、一般に「手動（manual）」薬物設計と呼ばれる。手動薬物設計には、目視検査および例えば「Ｏ」（Jones, et al. (1991) Acta Crystallographica Section A A47:110-119）などの画像可視化プログラムを用いた解析を用いることができる。
【００３２】
最初に、エフェクター化合物を手動薬物設計により選択することができる。こうして設計された構造的アナログを次に、コンピューターのモデル化プログラムにより修飾して、もっとも可能性のある有効な候補をよりよく定義する。可能性のある候補の数の減少は有用であり、なぜならば、既知の阻害分子といくらかの類似性を有する可能性のある多数の化合物の変種を、合成してスクリーニングすることは、不可能であるかも知れないからである。かかる解析は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発において有効であることが示された（Lam, et al. (1994) Science 263:380-384；Wlodawer, et al. (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:543-585；Appelt (1993) Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48；Erickson (1993) Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128）。代替的に、小分子ライブラリのランダムなスクリーニングでモジュレーターを導き、その活性を次に、上記のようにコンピューターモデル化により解析して、それらの阻害剤またはアクチベーターとしての有効性をより良好に決定することが可能である。
【００３３】
３次元データベースの探索に好適なプログラムとしては、MACCS-3DおよびISIS/3D（Molecular Design Ltd, San Leandro, CA）、ChemDBS-3D（Chemical Design Ltd., Oxford, UK）、およびSybyl/3 DB Unity（Tripos Associates, St Louis, MO）が挙げられる。化合物の選択および設計に好適なプログラムとしては、例えば、DISCO（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）、Catalyst（Bio-CAD Corp., Mountain View, CA）、およびChemDBS-3D（Chemical Design Ltd., Oxford, UK）が挙げられる。
本発明の情報を用いて設計した化合物は、テロメラーゼのＴＲＢＤドメイン、ヌクレオチド結合ドメイン、おおび／または「サム」ドメインの全体または一部に結合することができ、テロメラーゼの既知の阻害剤より、より強力で、より特異的で、毒性は弱く、より有効である可能性がある。設計された化合物はまた、より強力ではないが、in vivoおよび／またはin vitroでより長い半減期を有することができ、したがってin vivoおよび／またはin vitroでのテロメラーゼ活性を、より長い期間調節するのに有効である。このように設計されたモジュレーターは、テロメラーゼ活性を、例えば細胞の寿命を変えるために、または増殖能力を変えるために、テロメラーゼ活性を阻害または活性化するのに有用である。
【００３４】
本発明はまた、テロメラーゼにその天然の基質と同様の様式で結合可能な化学物質または化合物について、小分子データベースをコンピューターによりスクリーニングするための、分子設計技術の使用も提供する。かかるコンピュータースクリーニングは、本明細書に開示されたドメインの１または２以上のアミノ酸残基と相互作用する種々の基を同定でき、本発明のモジュレーターを合成するために用いることができる。
in vitro（例えば溶液中）のスクリーニングアッセイもまた、本発明に包含される。例えばかかるアッセイは、テロメラーゼ、テロメラーゼＴＲＢＤドメイン（例えば本明細書に開示されたもの）、またはテロメラーゼＴＲＢＤドメインの一部を、溶液中のＴＥＲの存在または不在において混合すること、および試験化合物が、テロメラーゼ活性をブロックできるか、または強化できるかを決定することを含む。同様に、in vitroスクリーニングアッセイを実施して、試験化合物の存在または不在において、ヌクレオチドまたはＤＮＡ結合をモニタリングすることができる。
【００３５】
本発明の方法によりスクリーニングすることができる化合物は、一般に、剤または化合物のライブラリに由来する。かかるライブラリは、純粋な剤の集合か、または剤の混合物の集合を含むことができる。純粋な剤の例には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成または半合成化学物質、および精製された天然の産物が挙げられるが、これに限定されない。剤の混合物の例としては、原核または真核性の細胞または組織の抽出物、および発酵ブロスおよび細胞または組織培養物上清などが挙げられるが、これに限定されない。化学構造のデータベースもまた、多くの源から利用可能であり、Cambridge Crystallographic Data Centre（Cambridge, UK）およびChemical Abstracts Service （Columbus, OH）などを含む。デノボ設計プログラムには、Ludi（Biosym Technologies Inc., San Diego, CA）、Sybyl（Tripos Associates）およびAladdin（Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA）が含まれる。
【００３６】
ライブラリのスクリーニングは、任意の従来の方法を用いて実施でき、複数の反応を迅速に調製し操作可能である任意の様式で実施できる。in vitroスクリーニングアッセイにおいて、試験化合物のストック溶液およびアッセイ要素は、手動で調製でき、続く全てのピペット操作、希釈、混合、洗浄、インキュベーション、試料読み取りおよびデータ収集は、市販のロボット分注装置、自動ワークステーション、およびアッセイが生成したシグナルを検出する分析装置を用いて実施される。かかる検出器には、照度計、分光光度計、および蛍光光度計、および放射性同位体の崩壊を計測する装置が挙げられるが、これに限定されない。
【００３７】
本明細書に開示されたドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、設計またはスクリーニングした後、化合物を続いて、テロメラーゼの活性を調節するその能力について試験する。かかるテロメラーゼの活性は、テロメラーゼ触媒活性（これは、前進性（processive）または非前進性の活性のどちらかである）；テロメラーゼ処理能力；従来の逆転写酵素活性；核酸分解活性；プライマーまたは基質（テロメアまたは合成テロメラーゼ基質またはプライマー）結合活性；ｄＮＴＰ結合活性；ＲＮＡ（すなわち、ＴＥＲ）結合活性；およびタンパク質結合活性（例えば、テロメラーゼ関連タンパク質、テロメラ結合タンパク質、またはタンパク質−テロメアＤＮＡ複合体などに結合するもの）などを含む。例えば、米国特許第7,262,288号に開示されたアッセイを参照。
【００３８】
テロメラーゼ触媒活性は、テロメラーゼの能力であって、鋳型核酸（例えばＴＥＲ）によりコードされた、部分的な１または２以上の配列の反復（例えばTTAGGG）を付加することにより、テロメラーゼ基質として機能するＤＮＡプライマーを伸長させる該能力を、包含することを意図する。この活性は、前進性または非前進性であることができる。前進性の活性は、テロメラーゼＲＮＰが複数の反復を、ＤＮＡが酵素複合体により放出される前に、プライマーまたはテロメラーゼに付加する場合に生じる。非前進性の活性は、テロメラーゼが、部分的、またはただ１つの反復をプライマーに付加し、次に放出する場合に生じる。しかしin vivoでは、非前進性の反応が、会合、伸長、または分裂の連続的ラウンドによって複数の反復を付加することができる。これはin vitroでも起こり得るが、しかし標準アッセイにおいては典型的には観察されず、その理由は、標準のアッセイ条件下における、テロメラーゼに対する、プライマーの非常に大きなモル過剰のためである。テロメラーゼ触媒活性を決定するための従来のアッセイは、例えば、Morin (1989) Cell 59:521；Morin (1997) Eur. J. Cancer 33:750；米国特許第5,629,154号；WO 97/15687；WO 95/13381；Krupp, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:919；Wright, et al. (1995) Nuc. Acids Res. 23:3794；Tatematsu, et al. (1996) Oncogene 13:2265に開示されている。
【００３９】
テロメラーゼの従来の逆転写酵素活性は、例えば、Morin (1997)上記、およびSpence, et al. (1995) Science 267:988に記載されている。テロメラーゼは、逆転写酵素の触媒活性に必要な保存アミノ酸モチーフを含むため、テロメラーゼは一定の外因性（例えば、非ＴＥＲ）ＲＮＡを転写する能力を有する。従来のＲＴアッセイは、酵素の、アニールされたＤＮＡプライマーを伸長することにより、ＲＮＡ鋳型を転写する能力を計測する。逆転写酵素活性は、当分野に知られた多数の方法で測定することができ、例えば、標識核酸プライマー（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）のサイズの増加をモニタリングすることにより、または標識ｄＮＴＰの組み込みにより、測定することができる。例えば、Ausubel, et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYを参照。
【００４０】
テロメラーゼはＴＥＲと特異的に会合するために、従来のＲＴアッセイのためのＤＮＡプライマー／ＲＮＡ鋳型を修飾して、ＴＥＲおよび／またはテロメアＤＮＡプライマーに関連する特性を有し得ることが理解される。例えば、ＲＮＡは配列(CCCTAA)nを有することができ、ここでｎは少なくとも１、または少なくとも３、または少なくとも１０またはそれ以上である。１つの態様において、(CCCTAA)n領域はＲＮＡの５’末端かその近傍である（テロメラーゼＲＮＡにおける鋳型領域の５’位置に類似）。同様に、ＤＮＡプライマーはTTAGGGテロメラ配列の部分を含む３’末端を有することができ、例えば、XnTTAG、XnAGGGなどであり、ここでＸは非テロメア配列であり、ｎは６〜３０である。他の態様において、ＤＮＡプライマーはＲＮＡ鋳型に非相補的である５’末端を有し、このとき、プライマーがＲＮＡにアニールされている場合には、プライマーの５’末端は非結合で残るような様式である。本発明の方法に適用してよい、標準の逆転写アッセイの追加の修正は、当分野に知られている。
【００４１】
テロメラーゼの核酸分解活性は、例えばMorin (1997) supra and Collins & Grieder (1993) Genes Dev. 7:1364に記載されている。テロメラーゼは選択的にヌクレオチドを除去し、ＤＮＡの３’末端がＤＮＡ鋳型配列の５’境界にある場合には、通常は１つのみをオリゴヌクレオチドの３’末端から除去し、ヒトおよびTetrahymenaにおいては、このヌクレオチドはテロメア反復（ヒトにおいてはTTAGG）の最初のＧである。テロメラーゼは選択的にＧ残基を除去するが、しかし、他のヌクレオチドに対しては、核酸分解活性を有する。この活性は、当分野に知られた従来方法を用いてモニタリング可能である。
【００４２】
テロメラーゼプライマー（テロメア）結合活性は、例えばMorin (1997)上記；およびCollins, et al. (1995) Cell 81:677；Harrington, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:8893に記載されている。プライマー結合活性をアッセイする複数の方法が存在する；しかし、ほとんどの方法に共通するステップは、標識ＤＮＡプライマーをテロメラーゼまたはテロメラーゼ／ＴＥＲと、適切な結合条件下でインキュベートすることである。また、ほとんどの方法は、非結合ＤＮＡをタンパク質結合ＤＮＡから分離する方法を用いる。かかる方法としては、例えばゲルシフトアッセイまたはマトリクス結合アッセイが挙げられる。ＤＮＡプライマーはテロメラーゼに親和性である任意のＤＮＡであることができ、例えば、(TTAGGG)nなどのテロメアＤＮＡプライマーであって、ここでｎは１〜１０であり、典型的には３〜５である。３’および５’末端は、反復配列の任意の位置で終わることができる。プライマーはまた、非テロメアＤＮＡの５’および３’末端を有することができ、これは、標識化または検出を促進することもできる。プライマーはまた、例えば検出または単離を促進するために、誘導体化することができる。
【００４３】
テロメラーゼのｄＮＴＰ結合活性は、例えばMorin (1997)上記、およびSpence, et al. (1995)上記に記載されている。テロメラーゼは、ＤＮＡの合成のためにｄＮＴＰを必要とする。テロメラーゼタンパク質はヌクレオチド結合活性を有し、ｄＮＴＰ結合について、他のヌクレオチド結合タンパク質と同様の様式でアッセイすることができる（Kantrowitz, et al. (1980) Trends Biochem. Sci. 5:124）。典型的には、標識ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰアナログの結合は、非テロメラーゼＲＴタンパク質に対して当分野で知られているように、モニタリング可能である。
テロメラーゼＲＮＡ（すなわちＴＥＲ）の結合活性は、例えばMorin (1997)上記；Harrington, et al. (1997) Science 275:973；Collins, et al. (1995) Cell 81:677に記載されている。本発明のテロメラーゼタンパク質のＲＮＡ結合活性は、上に記載のＤＮＡプライマー結合アッセイと類似の様式で、標識ＲＮＡプローブを用いてアッセイしてもよい。結合および非結合のＲＮＡを分離する方法およびＲＮＡを検出する方法は、当分野に知られており、本発明の活性アッセイに、ＤＮＡプライマー結合アッセイについて記載されたものと同様の様式で、適用可能である。ＲＮＡは、全長ＴＥＲ、ＴＥＲの断片、またはテロメラーゼまたはＴＲＢＤに親和性を有することが実証された他のＲＮＡであってよい。米国特許第5,583,016号およびWO 96/40868を参照。
【００４４】
本発明の方法を用いて同定した化合物の有効性をさらに評価するために、当業者は、テロメラーゼが関与する任意の特定の疾患または疾病のモデル系を利用して、化合物の吸着、分散、代謝および分泌、ならびに急性、亜慢性、および慢性試験におけるその毒性の可能性を評価することができる。例えば、エフェクターまたは調節化合物を、Saccharomyces cerevisiaeにおける複製寿命のアッセイで試験することができる（Jarolim, et al. (2004) FEMS Yeast Res. 5(2):169-77）。 McChesney, et al. (2005) Zebrafish 1(4):349-355およびNasir, et al. (2001) Neoplasia 3(4):351?359も参照のこと、これは、テロメラーゼ活性を解析するための海洋哺乳類およびイヌの組織モデル系について記載する。
【００４５】
本明細書に開示された１または２以上のテロメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する化合物を、テロメラーゼを調節する（すなわち、ブロックするかまたは阻害する、または強化するか活性化する）ための方法に用いることができる。かかる方法は、テロメラーゼをin vitroまたはin vivoのどちらかで、本発明のドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用する化合物の、有効量と接触させることを含み、これにより、テロメラーゼ活性が調節される。エフェクターまたはモジュレーター化合物の有効量とは、テロメラーゼの活性を、化合物と接触させなかったテロメラーゼと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、減少または増加させる量である。かかる活性は、テロメラーゼの活性を検出する酵素アッセイにより、またはテロメラーゼに会合するか、またはこれにより調節されることが知られている、タンパク質の発現または活性をモニタリングすることにより、モニタリング可能である。
【００４６】
当業者は、テロメラーゼの活性を調節することは、モデル系におけるテロメラーゼのシグナリング事象を選択的に解析することにおいて、および、テロメラーゼが関与する疾患または疾病を予防または処置することにおいて、有用であることを理解する。特定の疾患または疾病を予防または処置するために用いる化合物の選択は、特定の疾患または疾病に依存する。例えば、ヒトテロメラーゼは癌に関与し、したがってテロメラーゼを阻害する化合物は、以下を含む癌の予防または処置において有用である：固体腫瘍（例えば、乳房、前立腺、および結腸の腺癌；黒色腫；非小細胞肺癌；膠腫；ならびに骨、乳房、消化系、直腸結腸、肝臓、膵臓、下垂体、睾丸、眼窩、頭部および頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤、呼吸器官、および泌尿生殖器の新生物）および白血病（例えば、Ｂ細胞、混合細胞、ヌル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、マスト細胞、および骨髄）。テロメラーゼ活性を示す癌細胞（例えば、悪性腫瘍細胞）（テロメラーゼ陽性細胞）は、内因性のテロメラーゼ活性を低減または抑制することにより、死滅させることができる。さらに、テロメラーゼのレベルが、転移の可能性などの疾患の特性と相関するために（例えば、米国特許第号5,639,613号；第5,648,215号；第5,489,508号；Pandita, et al. (1996) Proc. Am. Ass. Cancer Res. 37:559）、テロメラーゼ活性における任意の低減は、癌の攻撃的な性質を低下させて、より管理可能な疾患状態にする（伝統的な介入の有効性が増加する）。
【００４７】
例示により、例３は、本発明の１または２以上の化合物による、腫瘍細胞増殖の阻害を評価するのに用いることができる、細胞ベースのアッセイおよび動物モデル系について記載する。本発明の化合物の抗癌活性を評価するのに有用な他の方法は、米国国立癌研究所による複数ヒト癌細胞株スクリーニングアッセイを含む（例えば、Boyd (1989) in Cancer: Principles and Practice of Oncology Updates, DeVita et al., eds, pp. 1-12を参照のこと）。このスクリーニングパネルは、およそ６０種の異なるヒト癌細胞株を含み、広範囲の腫瘍種類に対するin vivoでの抗腫瘍活性の有用な指標であり（Grever, et al. (1992) Seminars Oncol. 19:622；Monks, et al. (1991) Natl. Cancer Inst. 83:757-766）、腫瘍の種類としては例えば、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、および乳癌などである。抗腫瘍活性はＥＤ５０（またはＧＩ５０）で表わすことができ、ここでＥＤ５０は、細胞増殖を５０％減少させるのに有効な化合物のモル濃度である。ＥＤ５０値の低い化合物は、ＥＤ５０値の高い化合物より、高い抗癌活性を有する傾向がある。
【００４８】
１または２以上のin vitroアッセイにおける、化合物の潜在的活性の確認により、さらなる評価は、典型的にはin vivoで実験動物において行われ、例えば、Ｂ１６黒色腫を有するマウスにおける、肺結節転移の減少を測定することなどである（例えば、Schuchter, et al. (1991) Cancer Res. 51:682-687）。本発明の化合物のそれのみの、または薬物の組合せ化学療法としての有効性も評価することができ、例えば、マウスにおいてヒトＢ−ＣＬＬ異種移植モデルを用いて行う（例えば、Mohammad, et al. (1996) Leukemia 10:130-137）。かかるアッセイは、典型的には、一次腫瘍細胞または腫瘍細胞株を、免疫低下したマウス（例えばＳＣＩＤマウスまたは他の好適な動物）に注射すること、および腫瘍を成長させることを含む。腫瘍を有するマウスを次に、本発明の化合物で処置し、腫瘍のサイズを測定して、処置の効果を追跡する。代替的に、本発明の化合物を、腫瘍細胞の注射に先立って投与して、腫瘍の予防を評価する。究極的には、本発明の化合物の安全性および有効性を、ヒト臨床試験で評価する。
【００４９】
テロメラーゼ活性を活性化または刺激する化合物を、対象の細胞老化により誘発されるか、または悪化する疾患または異常を処置または予防するための方法；対象の老化の速度を、例えば、老化の開始後に低下させる方法；対象の寿命を延長させる方法；寿命に関連する疾患または異常を処置または予防する方法；細胞の増殖能力に関連する疾患または異常を処置または予防する方法；および、細胞損傷または細胞死による疾患または異常を処置または予防する方法、において用いることができる。老化による一定の疾患は、テロメア長の減少（若い細胞に比較した）による細胞の老化に関連する変化を特徴とし、これは、細胞におけるテロメラーゼ活性の不在（またはその非常に低いレベル）の結果である。テロメラーゼ活性およびテロメア長は、例えば、細胞内でのテロメラーゼ活性を増加させることにより、増加することができる。
【００５０】
テロメラーゼ活性の増加が治療法となる、細胞老化に関連する異常のリストの一部としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および脳卒中；外皮の年齢関連疾患、例えば皮膚の萎縮、弾性線維症（elastolysis）および皮膚のしわ、白髪および抜け毛、慢性皮膚潰瘍、および加齢関連の創傷治癒の障害；変性関節疾患；骨粗しょう症；加齢関連免疫系障害（例えば、ＢおよびＴリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞などの細胞、およびそれらの前駆細胞を含む）；血管系の加齢関連疾患；糖尿病；および加齢関連黄斑変性などを含む。さらに、テロメラーゼアクチベーターは、細胞の増殖能力または細胞の不死化を増加させるために用いることができ、例えば、新しい細胞株（例えばほとんどのヒト胃細胞）の産生である。
【００５１】
予防または処置は、典型的には、処置の必要な対象に対して、本発明のスクリーニング方法において同定された化合物の有効量を含有する医薬組成物を、投与することを含む。多くの場合、これはヒトであるが、しかし農場動物、例えば家畜および家禽、およびコンパニオン動物、例えばイヌ、ネコおよびウマなどの処置も、本明細書に明示的に包含される。化合物の投与量および有効量の選択は、処置する疾患または疾病の少なくとも１つの兆候または症状を、予防する、低減するまたは逆転する、所望の結果をもたらすものである。ヒトにおける癌および他のテロメラーゼ関連疾患を処置する方法は、米国特許第号5,489,508号、第5,639,613号、および第5,645,986号に記載されている。例として、癌を有する対象（例えば、癌腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、および白血病を含む）は、説明できない体重減少、疲労、発熱、痛み、皮膚の変化、治癒しないただれ、乳房または体の他の部分における肥大または腫れ物、またはおさまらない咳またはかすれ声を経験することがあり、ここで本発明の化合物による処置は、これらの症状の１または２以上を予防、低減または逆転することができる。
【００５２】
医薬組成物は、薬学的に許容し得る塩および複合体の形態であることができ、薬学的に許容し得る担体中において、適切な用量で提供することができる。かかる医薬組成物は、当分野でよく知られた方法により調製でき、よく知られた担体を含有する。かかる方法および成分の一般に認められた概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000にある。薬学的に許容し得る担体、組成物またはビヒクル、例えば脂質または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒カプセル封入材料は、対象化合物を身体の１つの器官または部分から、身体の他の器官または部分へと、運搬するまたは移動させることに関与する。各々の担体は、処方の他の成分と適合性であるとの意味において、許容し得るものでなければならず、処置を受ける対象に有害であってはならない。
【００５３】
薬学的に許容し得る担体として機能できる材料の例としては、糖類、例えばラクトース、グルコース、およびスクロース；でんぷん、例えばコーンスターチおよびジャガイモでんぷん；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび座薬ワックス；油類、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール類、例えばプロピレングリコール；ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェン非含有水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリアンヒドリド；および医薬製剤で用いられるその他の非毒性適合性物質を含む。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、および着色剤、放出剤、被覆剤、甘味、風味および香味剤、保存剤、および抗酸化剤もまた、組成物中に存在することができる。
【００５４】
本発明の組成物は、非経口的に（例えば静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内注射により）、局所的に（口腔および舌下を含む）、経口的、経鼻的、経膣的、または直腸内に、標準の医療行為に従って、投与することができる。
選択された投与量レベルは種々の要因に依存し、これらには以下が含まれる：用いる本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いる特定化合物の排泄率または代謝率、処置の期間、用いる特定の化合物と一緒に用いられる他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および前の病歴、および医療分野によく知られている同様の因子など。
【００５５】
当業者の医師および獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を、容易に決定および処方することができる。例えば、医師および獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要な量より低いレベルの化合物の用量から開始して、次第にその投与量を、所望の効果が達成されるまで増加することができる。これは、当業者の技量内にあると考えられ、特定の化合物または類似の化合物についての存在する文献を参照して、最適な用量を決定することができる。
本発明を、以下の非限定的例により、さらに詳細に記載する。
【００５６】
例１：Tetrahymena thermophila ＴＥＲＴの構造
タンパク質発現と精製。
T. thermophila ＴＥＲＴの残基２５４〜５１９を、タンパク質限定加水分解により同定し、切断可能なヘキサヒスチジンタグをそのＮ末端に含有するｐＥＴ２８ｂベクターの修飾形態内にクローニングした。タンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）中で、２０℃で４時間過剰発現させた。細胞を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、０．５ＭのＫＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．５中で氷上にて、超音波処理により溶解した。タンパク質を最初にＮｉ−ＮＴＡカラム上で精製し、次にヘキサヒスチジンタグのＴＥＶ切断を４℃で一晩行った。ＴＲＢＤ／ＴＥＶ混合物を希釈して、イミダゾールの濃度が１５ｍＭとなるようにし、タンパク質混合物をＮｉ−ＮＴＡカラムに通して、ＴＥＶ、切断されたタグ、および任意のタグ化タンパク質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡ流を１ｍｌに濃縮し、０．１５Ｍの塩濃度に希釈した。希釈ＴＲＢＤ試料を次にPOROS-HSカラム（PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）に通した。この段階で、タンパク質は９９％以上の純度であった。タンパク質を最終的に、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、０．５ＭのＫＣｌ、および２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５で予め平衡させたSEPHADEX-S200サイジングカラム（sizing column）に通して、任意のＴＲＢＤ凝集物を除去した。ＳＤＳ−ｐａｇｅおよび動的光散乱それぞれにより示された純粋な単一分散タンパク質を、AMICON 10Kカットオフ（MILLIPORE, Billerica, MA）を用いて８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、続く試験のために、タンパク質を４℃にて保管した。ストックタンパク質を、５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５により、結晶化試行の前に透析した。
【００５７】
タンパク質の結晶化およびデータ収集。
弱い回折（〜４Å分解能）のＴＲＢＤのはじめのプレート様クラスターを、４℃で、シッティングドロップ法（sitting drop method）を用い、１容量の透析タンパク質を、２０％のPEG 3350、０．２ＭのＮａＮＯ３を含有する１容量の貯蔵溶液と混合することにより成長させた。単一の良好に回折する結晶を、マイクロバッチトレイ内、パラフィン油の下で、１容量の透析タンパク質を、等容量の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、４４％PEG 400、０．４ＭのＮａＮＯ３、０．４ＭのＮａＢｒおよび１ｍＭのＴＣＥＰと４℃で混合することにより、成長させた。結晶を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２５％PEG 400、０．２ＭのＮａＮＯ３、０．２ＭのＮａＢｒおよび１ｍＭのＴＣＥＰを含有する凍結保護物質溶液中に収穫し、液体窒素中で瞬間凍結させた。データをＮＳＬＳ、ビーム線Ｘ６Ａにて収集し、HKL-2000（Minor (1997) Meth. Enzymol. Macromole. Crystallogr. Part A 276:307-326）で処理した（表３）。結晶は、非対称ユニットに１つのモノマーを有する単斜空間群（monoclinic space group）Ｐ２１に属している。
【００５８】
【表３】
2011500087.tif 000005
【００５９】
構造決定および精製。
初期位相は、タンパク質を５ｍＭのＨｏＣｌ３と共結晶化させることにより調製した、２波長ＭＡＤホルミウム（Ｈｏ）誘導体から得た。重原子部位は、SOLVE（Terwilliger (2003) Methods Enzymol. 374:22-37）を用いて配置させ、この部位を精密にして、新しい位相をELVES（olton & Alber (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1537-1542）により実施されたようにして、MLPHARE（CCP4 (1994) Acta Crystallogr. D 50:760-763）を用いて計算した。初期マップは、良好に規定された密度を、分子の大きな部分についてのみ示した。分子の小さな部分についての密度は弱く、その理由はほぼ、分子の大きな部分に対するその本来の移動性のためであった。密度のモデルを構築することに関連する問題は、セレノメチオニンなどの特定の側鎖の位置に関する情報が欠如していることにより、より悪化させられていた。完全モデルを構築するためのキーとなる要因は、RESOLVE（Terwilliger (2002) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58:1937-1940）におけるPRIMEおよびSWITCHの連続するラウンドと、続くCOOT（Emsley & Cowtan (2004) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60:2126-2132）での手動構築である。モデルは、CNS-SOLVE（Brunger, et al. (1998) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54:905-921）およびREFMAC5（Murshudov, et al. (1997) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53:240-255）の両方を用いて精密化した。精密化の最後のサイクルは、REFMAC5 （表４）で実施されたようにして、ＴＬＳの拘束を用いて行った。図は、PYMOL（DeLano (2002)）で作製し、静電表面はAPBS（Baker, et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10037-10041）で作製した。
【００６０】
【表４】
2011500087.tif 000006
【００６１】
ＴＲＢＤ構造。
テロメラーゼの重要なＲＮＡ結合ドメイン（ＴＲＢＤ）の役割を探るために、タンパク質限定加水分解により同定された、T. thermophila（図１Ａ）からの２５４〜５１９の残基を含むコンストラクトを、精製して均一にした。このタンパク質コンストラクトは、ゲルろ過および動的光散乱の両方が示すように、溶液中で単量体であった。このコンストラクトの結晶は容易に成長し、１．７１Åの分解能に回折された（表３）。タンパク質は、複数波長異常分散法（multiwavelength anomalous dispersion method）（ＭＡＤ）により、ホルミウム誘導体を用いて、２．７Åの分解能に位相され、および、位相は天然のデータセットにより１．７１Åの分解能に伸長された（表３）。精密化された構造において、残基２５７〜２６６および２７７〜５１９について、明白な密度が存在した。
【００６２】
構造は、数個の長いループおよび２つの短いβ鎖により一緒に結合した１２個のαらせんを含む。らせんの配置は、分子が、３つの伸長されたループにより結合された、２つの非対称部分に分割されるように配置されている。大きな部分は、９つのαらせんから構成され、これらの１つ（α１１）は、ドメインの真中に沿って走り、その全長が他の８つのらせん全てと接触している。分子の小さな部分は、３つのらせん（α４、α５およびα１２）から構成され、これらは全て、タンパク質の大きな部分の面に対して〜１２０°の角度で配置されている。タンパク質の小さな部分は、この領域固有の移動性を反映する、その高いＢ因子により示唆されるように、大きな部分よりいくらか柔軟性があり、これは、ＲＮＡ基質との観察可能な接触の不在からもたらされている可能性がある。構造の興味深い性質は、大きな部分と小さな部分それぞれのらせんα１１とα１２を結合する１５の残基により形成される、βヘアピンである。βヘアピンは、タンパク質の２つの部分により形成される間隙の基部から突き出て、分子の小さな部分の面に対して４５°の角度で立ち上がっている。このヘアピンの位置およびこれが密度内に良好に規定されているとの事実は、らせんα７と、これをらせんα８に結合するループによる可能性がある。これらの要素両方は、このヘアピンの背後に便利に配置されて、ヘアピンをその位置に保っている。Dali server（Holm & Sander (1996) Science 273:595-603）を用いたタンパク質構造データベースの探索からは、構造的相同体は作製されず、テロメラーゼのＴＲＢＤドメインが、新規な核酸結合折りたたみであることを示唆する。本タンパク質の２つの部分の全体的な構成は、核酸認識および結合についての重要な意味合いを有する。
【００６３】
ＴＲＢＤのＲＮＡ結合モチーフ。
ＴＲＢＤドメインの、ＴＥＲと相互作用する能力は、ＣＰおよびＴモチーフとして知られている２つの保存モチーフのためであり、一方、ＱＦＰモチーフとして知られている第３のモチーフは、ＲＮＰアセンブリーに重要であると考えられている（図２Ａおよび２Ｂ）（Bosoy, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3882-3890；Bryan, et al. (2000)上記；Jacobs, et al. (2005)上記；Xia, et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:5196-5207）。ＴＲＢＤ構造は、ＱＦＰモチーフがほぼ疎水性の数個の残基により形成され、これらは分子の大きな部分上に配置され、ドメインのコア内に埋められており、周囲の残基と延長された広範な疎水性の接触を行い、タンパク質の折りたたみを支援していることを示している。これらの残基には、Gln375、Ile376、Leu380、Ile383、Ile384、Cys387、Val388、Pro389、Leu392、Leu393、Asn397、Leu405、Phe408、Tyr422、Ile423、Met426、Trp433、およびPhe434が含まれる。ＱＦＰ残基の配置および接触は、これらが核酸結合に直接関与していないことを示す。
【００６４】
Ｔモチーフは、タンパク質の２つの部分が会合する分子の中心に位置し、これはβヘアピンとらせんα１２の両方の部分を形成する残基から構成される。これらの構造要素は一緒になって、いくつかの溶媒に暴露されて高度に保存されている残基（Phe476、Tyr477、Thr479、Glu480、Tyr491、Arg492、Lys493、および Trp496）に囲まれた、狭く（〜１０Å）かつ良好に規定されたポケット（Ｔポケット）を形成する。特に留意すべきであるのは、不変残基Tyr477とTrp496の側鎖であり、これらはそれぞれ、βヘアピンおよびらせんα１２の一部である。これら残基は一緒になって、相互作用するＲＮＡヌクレオチドのプリン／ピリミジン部分を挟み込む、「疎水性はさみ（pincer）」を形成する。この構造において、Tyr477とTrp496の側鎖はたったの４Å離れているのみであり、これはヌクレオチド塩基を収容するには不十分である。２つの側鎖の間に塩基を挿入するには、Ｔポケットの構造的再配置が必要であり、おそらく、分子の２つの部分を広げることが必要である。その疎水性部分に加えて、Ｔポケットはまた、Arg492およびLys493などのいくつかの親水性残基も含有し、これらは両方とも溶媒に暴露され、２つを一緒に連結しているＴおよびＣＰポケットの境界に位置する。
【００６５】
ＣＰモチーフは、らせんα３と続くループから形成される。狭く良好に規定されたＴモチーフとは対照的に、ＣＰモチーフは、Ｔポケットの入り口に隣接してこの下に位置する、浅くて広い（〜２０Å）、高度に正に荷電された空洞（cavity）である。ＣＰモチーフを形成するいくつかの保存残基には、Phe323、Leu327、Lys328、Lys329、Cys331、Leu333、およびPro334が含まれる。これらの残基は、大きな部分のコア、または分子の２つの部分を結合する領域に埋め込まれており、タンパク質の折りたたみに寄与している。特に興味深いのは残基Leu327、Cys331、Leu333およびPro334であり、これらは全て埋められていて、Ｔモチーフの構造要素と直接接触し、こうしてＣＰおよびＴポケット両方の形成を支援する。
【００６６】
例えば、Leu327とCys331は、不変Phe476の大きな疎水性側鎖および保存されているArg492の側鎖の脂肪部分のファンデルワールス力内にあり、これら２つは、βヘアピンの一部を形成する。興味深いことには、Arg492はらせんα１２のベースに位置し、そのLeu327、Cys331、およびLeu333との接触は、このらせんを、分子の大きな部分と並行して走る面上に４５°の角度で配置するのを支援し、こうしてＴポケットの形成をさらに促進する。さらに、Arg492とLeu327、Cys331、およびLeu333との相互作用は、この残基のたった１つの溶媒暴露部分であるグアニジン部分の配置を支援する。ＣＰポケットはまた、主に親水性の性質である、いくつかの表面暴露された保存残基も含む。これらはLys328およびLys329を含み、両方ともＴポケットの下にArg492とLys493に非常に近接して位置し、それらと一緒になって、分子のほぼ全側面にわたる１つの大きな正に荷電された表面領域を形成する。
【００６７】
ＴＲＢＤ構造および存在する変異体。
ＲＮＡ結合およびテロメラーゼ活性に影響をおよぼす、ＴＥＲＴのいくつかの変異体が単離されている。これらの変異体のいくつかはＴＲＢＤドメインに見出され、具体的には、ＴおよびＣＰモチーフ内に見出される。これら２つのモチーフ内での、４〜１０アミノ酸アラニン置換の１つ、２つおよびストレッチ（stretch）は、野生型酵素と比べて、ＲＮＡ結合親和性およびポリメラーゼ活性の、中程度から重度の損失（２０〜１００％）を示した（Bryan, et al. (2000)上記；Lai, et al. (2002)上記；Miller, et al. (2000)上記）。
【００６８】
１セットの変異体、すなわちPhe476Ala、Tyr477Ala、Thr479Ala、Glu480Ala、Arg492AlaおよびTrp496Alaは、ＲＮＡ結合親和性およびポリメラーゼ活性の重度の損失（８０〜１００％）を示し、これらの残基がＲＮＡ基質との直接の接触に介在することを示唆した（Bryan, et al. (2000)上記；Lai, et al. (2002)上記）。５つの残基は全て、Phe476を例外としてＴモチーフの一部であり、それらの側鎖は全て、溶媒に暴露されている。構造において、Tyr477とTrp496の両方はＴポケットのベースに配置され、それらの側鎖は「疎水性はさみ」を形成する。これら残基の溶媒に暴露された側鎖が、ｓｓＲＮＡとのスタッキング相互作用に関与すると仮定すると、これらを小さなアラニンに変異させることは基質結合を損なう（compromise）可能性があり、このことは、ＲＮＡ結合親和性およびテロメラーゼ機能の重大な損失を説明する。Try477およびTrp496と対照的に、Phe476は埋められており、核酸基質との相互作用のためにアクセス可能ではない。その代わりに、Phe476はβヘアピンのベースに位置しており、Ｔポケット形成に大きな寄与をなす。この残基の大きな疎水性側鎖を、小さなアラニンへと変異させることは、おそらく、このポケットの構造的再配置および、ＲＮＡ結合親和性とテロメラーゼ活性の損失を導く可能性がある。
【００６９】
アラニン変異体の第２のセットであり、ＲＮＡ結合親和性とテロメラーゼ活性の中程度の損失を示したLeu327Ala、Lys329Ala、Cys331Ala、およびPro334Alaもまた単離された（Bryan, et al. (2000)上記；Miller, et al. (2000)上記）。Leu327とCys331の両方は、Phe476およびArg492の脂肪部分と直接接触し、これらの両方は、Ｔモチーフのベースに位置する。より小さいアラニン残基への変異は、Ｔポケットの再配置をもたらし得て、核酸基質との相互作用の損失および機能の損失を導く可能性がある。同様にPro334はらせんα１２の背後に位置し、この構造要素の残基と直接接触している。らせんα１２は、不変Trp496および保存されたLys493を含み、これらの両方はＴポケットの一部を形成する。Pro334のアラニンへの変異は、らせんα１０の変位とＴポケットの再配置をもたらし得て、機能の損失を導く可能性がある。Lys329もらせんα３に位置し、Leu327Ala、Cys331Ala、およびPro334Alaと異なり、溶媒に暴露されていて、核酸基質と直接接触している可能性がある。これをアラニンに変異させることは、ＲＮＡ相互作用の損失と、ＲＮＡ結合親和性およびテロメラーゼ活性の損失を導く。
【００７０】
安定なＲＮＰ複合体のＴＲＢＤドメインの介在による形成、および反復付加処理能力。
in vivoにおいて、テロメラーゼは安定なリボ核タンパク質複合体として存在し、タンパク質（ＴＥＲＴ）とＲＮＡ要素（ＴＥＲ）との間の接触は、ＴＥＮ、ＴＲＢＤおよびＲＴドメインにより介在される。大規模な生化学的および変異誘発性試験により、ＴＲＢＤが、ＴＥＲのステムＩとＴＢＥとの広範囲の特異的相互作用に関与することが示された（Lai, et al. (2001)上記；O'Connor, et al. (2005)上記）（図４）。ＴＲＢＤとＴＥＲの間の接触は、ＲＮＰ複合体の適切なアセンブリーおよび安定化を促進し、反復付加の処理能力を高めると考えられる。（Lai, et al. (2003)上記）。繊毛虫類において、ＴＲＢＤに加えて、ＴＲＢＤドメインのＮ末端に位置する保存されたモチーフ（ＣＰ２）が、ＴＥＲＴ−ＴＥＲアセンブリーおよび鋳型境界の規定に必要であると考えられている（Lai, et al. (2002上記；Miller, et al. (2000)上記)。
【００７１】
しかし、現在まで、テロメラーゼのＴＲＢＤがこのプロセスをいかにして行うかについては明らかではなかった。本解析によれば、ＴＲＢＤドメインが、ブーメランのような形状をした数個の長いループにより結合された２つの非対称部分に分割されていることが示され、この配置は、ＲＮＡ認識および結合について重要な意味を有する。分子の２つの半球の全体的な構成は、溶媒に暴露されたいくつかの不変／保存残基からなるタンパク質の表面に、２つの良好に規定された空洞（ＣＰおよびＴポケット）の形成をもたらした。Ｔポケットは、分子の２つの部分の接合部に位置する、狭く深い空洞であり、その一部は疎水性の性質であり、ＣＰポケットに隣接する部分は正に荷電されている。興味深いことには、Tyr477およびTrp496の疎水性側鎖は溶媒に暴露されており、互いに積み重ねられて、この構造においては核酸塩基を収容不可能である、狭い「疎水性はさみ」を形成している。しかし、Trp496を含むらせんα１２が、Tyr477を含むβヘアピンに関していくらか柔軟性であることは、注目に値する。
【００７２】
らせんα１２の、およびしたがってTrp496の移動する能力は、２つの側鎖を広げて離すことができ、こうしてこれらの間にヌクレオチド塩基を収容するのに必要なスペースを可能とする。別の可能性としては、Tyr477およびTrp496の極性部分がヌクレオチド塩基として共に作用し、これが、入ってくるヌクレオチド塩基と共に擬似ワトソンクリック相互作用の形成を可能とする。擬似ワトソンクリック相互作用は前に、Rho転写終結因子（Bogden, et al. (1999) Mol. Cell 3:487-493）およびシグナル認識粒子（Wild, et al. (2001) Science 294:598-601）を含む、多くのタンパク質核酸複合体について観察されている。Ｔポケットの疎水部分の幅および配置は、これがｓｓＲＮＡに、おそらくはＴＢＥに、おそらくスタッキング相互作用のネットワークの介在により結合することを示す。
【００７３】
Ｔポケットとは対照的に、ＣＰポケットは、正に荷電された、分子の側に位置する浅い空洞であり、Ｔポケットの伸長を形成している。Ｔポケットの親水性部分とＣＰポケットは共に、いくつかのリジンおよびアルギニンにより囲まれ、これらの側鎖は溶媒に暴露され、二本鎖ＲＮＡの骨格との直接的接触に関与する可能性がある。このポケットの幅および化学的性質は、これが二本鎖ＲＮＡに、最も可能性が高いのはステムＩまたはステムＩＩに結合することを示す（図４）。ＴＲＢＤ結合ポケットが介在するタンパク質／核酸相互作用の特性および程度は、機能性リボ核タンパク質酵素の適切なアセンブリーに必要な安定性を提供し、ＴＥＲＴをＴＥＲ結合部位（ステムＩとＩＩの間）へと導き、これは、テロメラーゼ機能に対して重要な関連を有する。
【００７４】
テロメラーゼは、直鎖状染色体の末端に複数の短いオリゴヌクレオチド反復を付加するその能力において、ユニークである。酵素の、これを行う能力は、ＴＲＢＤドメインのＴＢＥとの相互作用および、繊毛類においては、ＴＲＢＤおよびＣＰ２モチーフの両方（Lai, et al. (2002)上記； Lai, et al. (2003) 上記； Miller, et al. (2000) 上記）に部分的に起因している。ＴＢＥはステムＩＩと隣接するｓｓＲＮＡ領域から構成され、これは、ステムＩの下流、ＲＮＡ鋳型からたったの数個上流に位置する（図４）。ＴＲＢＤ構造は、タンパク質の表面上に位置する、ｓｓＲＮＡのみを収容できる狭い疎水性の空洞であるＴポケットが、このプロセスに重要な役割を果たすだろうことを示す。Ｔポケットが、ステムＩおよびステムＩＩを結合するｓｓＲＮＡに結合すると仮定すると、この相互作用は、ステムＩＩが立体的ブロックとして作用するように強制し、これは次に、ＴＲＢＤドメインがステムＩとステムＩＩの境界の内部にとどまるように強制する可能性がある。
【００７５】
ステムＩおよびステムＩＩでロックされたＴＲＢＤドメインは次に、ＲＴドメインが移動できる距離を制限するアンカーとして作用でき、これが、ＲＮＡ鋳型の境界を越えて動くことを防ぎ、こうして、テロメラーゼ付加の処理能力を促進する。しかし繊毛類において、ＴＲＢＤドメインのみでは鋳型境界の規定について十分ではなく、ＣＰ２モチーフの作用を必要とする（(Lai, et al. (2002)上記；Miller, et al. (2000)上記)。ＣＰ２のＴＥＲへの結合は、ＲＮＰ複合体の安定化に影響することにより、または、ＴＲＢＤ同様、ＲＴドメインの活性部位が、ＲＮＡ鋳型を越えて滑るのを防ぐアンカーとして作用できることにより、鋳型の境界の規定を促進することが意図される。
【００７６】
例２：Tribolium castaneum ＴＥＲＴの構造
タンパク質の発現および精製。
T. castaneumの全長ＴＥＲＴの合成遺伝子を、切断可能ヘキサヒスチジンタグをそのＮ末端に含む、ｐＥＴ２８ｂベクターの修飾形態内にクローニングした。タンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）内で３０℃で４時間過剰発現させた。細胞を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、０．５ＭのＫＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．５中で氷上にて、超音波処理により溶解した。タンパク質は、最初にＮｉ−ＮＴＡカラム上で精製し、次にヘキサヒスチジンタグのＴＥＶ切断を、一晩４℃で行った。ＴＥＲＴ／ＴＥＶ混合物を透析して、過剰なイミダゾールを除去し、タンパク質をさらに、全てのヒスタグされた産物を除去するために用いた第２のＮｉ−ＮＴＡカラム上で精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ流を次にPOROS-HSカラム（PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）に通して、任意の微量のタンパク質不純物を除去した。この段階で、タンパク質は９９％以上の純度であった。タンパク質を最終的に、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％グリセロール、０．５ＭのＫＣｌ、および１ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ｐＨ７．５で予め平衡させたSEPHADEX-S200サイジングカラムを通して精製し、任意のＴＥＲＴ凝集物を除去し、タンパク質を、AMICON 30K カットオフ（MILLIPORE）を用いて１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、続く試験のために４℃で保管した。ストックタンパク質を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５により、結晶化試行の前に透析した。
【００７７】
タンパク質結晶化およびデータ収集。
タンパク質のみの最初の結晶化試行は、結晶を生成しなかった。タンパク質と一本鎖テロメアＤＮＡ（(TCAGG)3）との共結晶化により、２つのロッド状の結晶形態であって、その１つは斜方空間群Ｐ２１２１２１に属し、２．７１Åで回折し、もう１つは６角空間群Ｐ６１に属し、３．２５Åの分解能で回折する、前記結晶形態が生成された。タンパク質核酸混合物は、結晶試行物のセットの前に、１容量の透析タンパク質を１．２倍過剰なＤＮＡ基質と混合物することにより、調製した。両方の結晶形態は、蒸気拡散およびシッティングドロップ法で、１容量のタンパク質―ＤＮＡ混合物を１容量の貯蔵溶液と混合して成長させた。斜方結晶は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）および１．５ＭのＮａＮＯ３の存在下で、一方６角結晶は、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）および２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の存在下で、両方とも室温にて成長させた。斜方結晶は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２５％グリセロール、１．７ＭのＮａＮＯ３、０．２ＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＴＣＥＰを含有する凍結保護物質溶液中に収穫し、液体窒素中で瞬間凍結させた。６角結晶は、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２５％グリセロール、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＴＣＥＰを含有する凍結保護物質溶液中に収穫し、同様に液体窒素中で瞬間凍結させた。データをＮＳＬＳ、ビーム線Ｘ６Ａにて収集し、HKL-2000（Minor (1997) Meth. Enzymol. Macromole. Crystallogr. Part A 276:307-326）で処理した（表５）。結晶形態は共に、非対称ユニットに二量体を有する。
【００７８】
【表５】
2011500087.tif 000007
【００７９】
構造決定および精製。
斜方結晶に対する初期位相は、２つの異なる波長（Ｈｇ１：１．００８５０Å；Ｈｇ２：１．００８００Å）における２つの異なる水銀（ＣＨ３ＨｇＣｌ）誘導体化結晶から収集された２つのデータセットを用いて、異常シグナルによる単一同形置換の方法（ＳＩＲＡＳ）を用いて得た（表５）。誘導体は、結晶を５ｍＭの塩化メチル水銀（ＣＨ３ＨｇＣｌ）に１５分間浸すことにより、調製した。はじめに、１２の重原子部位をSOLVE（Terwilliger (2003) Methods Enzymol. 374:22-37）を用いて位置づけし、精密化し、新しい位相をMLPHARE（Collaborative Computational Project 4 (1994) Acta Crystallogr. D 50:760-763）により計算した。MLPHAREで改善した位相を用いて、残りの重原子部位（全２２）を、異常な差異マップを３．５Åの分解能まで計算することにより、同定した。
【００８０】
全ての重原子部位を用いて得たMLPHARE位相を、次に２倍のＮＣＳによるＤＭで用い、高分解能（２．７１Å）データセットを用いた位相拡張を１．００８００Åの波長にて収集して、出発実験マップを算出した。これらのマップは、COOTで行われたモデル構築について十分良好であった（Emsley & Cowtan (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:2126-32）。電子密度マップは、タンパク質の全５９６残基についての明確な密度を明らかにした。しかし、構造中の核酸基質についての密度は観察されなかった。モデルを、CNS-SOLVE（Brunger, et al. (1998) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54:905-21）およびREFMAC5（Murshudov, et al. (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-55）の両方を用いて、精密化した。精密化の最後のサイクルは、REFMAC5で実施されたようにＴＬＳ拘束により実施した（表５）。Ｐ２１２１２１精密化モデルを用いて、Ｐ６１結晶形態に結晶化したＴＥＲＴの構造を、PHASER（Potterton, et al. (2003) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59:1131-7）による分子置換により解決した（データは０．９７９８０Åにて収集）。
【００８１】
ＴＥＲＴ構造の構築。
T. castaneum活性テロメラーゼＴＥＲＴの全長触媒サブユニットの構造を、２．７１Åの分解能まで決定した。示されるように、非対称ユニット（ＡＵ）に二量体が存在したが、しかしタンパク質のみは、ゲルろ過および動的光散乱法により示されるように、溶液中で明確に単量体であり、結晶中に観察される二量体は、結晶の充填化の結果であることを示唆する。これはさらに、同じタンパク質の異なる結晶形態（表５）もまた、異なる構造のＡＵ中に二量体を含むとの事実によっても支持された。この生物からのＴＥＲＴは、テロメラーゼの低い保存領域であるＴＥＮドメインを含まないことは、注目に値する（図１Ｂ）。
【００８２】
ＴＥＲＴの構造は、３つの特徴的なドメイン、すなわちＴＥＲ結合ドメイン（ＴＲＢＤ）、逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、およびＴＥＲＴの推定の「サム」ドメインを表すと考えられるＣ末端伸長、から構成される（図１Ａおよび１Ｂ）。本明細書において示されるように、ＴＲＢＤはほぼらせん状であり、その表面上に、それぞれが二本鎖および一本鎖ＲＮＡを結合する、２つの保存モチーフ（ＣＰおよびＴ）により形成されるへこみを有する；ＴＲＢＤは、テロメラーゼのＲＮＡ基質ＴＥＲの鋳型境界要素として定義されている。T. castaneumからのＴＲＢＤドメインとT. thermophilaからのその構造との構造的比較により、２つの構造は類似であることが示され（ＲＭＳＤ：２．７Å）、多様な系統発生群の生物にわたる、これらのドメイン間の高度な構造的保存を示唆する。
【００８３】
ＲＴドメインは、２つのサブドメインに配置されたαらせんとβ鎖の混合であり、これらのサブドメインは、ＨＩＶ逆転写酵素（ＰＤＢコードＩＤ：1N5Y；Sarafianos, et al. (2002) EMBO J. 21:6614-24）などのレトロウイルス逆転写酵素、Ｃ型肝炎ウイルスポリメラーゼ（コードＩＤ：2BRL；Di Marco, et al. (2005) J Biol. Chem. 280:29765-70）などのウイルスＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＢ６９（ＰＤＢコードＩＤ：1WAF；Wang, et al. (1997) Cell 89:1087-99）などのＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの、「フィンガー」および「パーム」サブドメインにもっとも類似しており、これらのタンパク質ファミリーの特徴であるキーシグネチャーモチーフを含んでいる（Lingner, et al. (1997) Science 276:561-7）（図３Ａ〜３Ｃ）。ＴＥＲＴとＨＩＶのＲＴとの構造比較により、ＴＥＲＴの「フィンガー」サブドメイン（すなわちモチーフ１および２）は、「パーム」サブドメイン（すなわちモチーフＡ、Ｂ’、Ｃ、ＤおよびＥ）に対して開いた構造に配置されており、結合ヌクレオチドおよび核酸基質の不在における、ＨＩＶのＲＴにより採用された構造と良好に整合する（Ding, et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:1095-111）。
【００８４】
ＴＥＲＴの推定「パーム」ドメインと、ＨＩＶ逆転写酵素のそれとの間の大きな違いの一つは、テロメラーゼ処理能力に必要な、ＩＦＤモチーフと呼ばれる、ＴＥＲＴのモチーフＡとＢ’との間の長い挿入物（insertion）である（Lue, et al. (2003) Mol. Cell Biol. 23:8440-9）。ＴＥＲＴ構造において、ＩＦＤ挿入物は、リング周囲の外側および「フィンガー」と「パーム」サブドメインの境界に位置する、２つの平行でないαらせん（α１３とα１４）から構成される。これら２つのらせんは、リングの面の中心軸に対してほぼ平行な位置にあり、らせんα１０およびα１５に広範に接触し、ＲＴドメインのこの部分の構造的配置において重要な役割を果たしている。同様の構造的配置はウイルスポリメラーゼにも存在し、これらの構造のらせんα１０等価物も、核酸基質との直接接触に関与している（Ferrer-Orta, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:47212-21）。
【００８５】
ＲＴドメインと対照的に、Ｃ末端伸長は、表面が露出したいくつかの長いループを含む、伸長されたらせん束である。ソフトウェアＳＳＭ（Krissinel & Henrick (2004) Acta Cryst. D60:2256-2268；Krissinel (2007) Bioinformatics 23:717-723）を用いたタンパク質構造データベースの探索では、構造的相同体は生成されず、テロメラーゼのＣＴＥドメインが、新規な折りたたみを採用していることを示唆する。ＴＥＲＴとＨＩＶのＲＴとの構造比較により、ウイルスＲＮＡポリメラーゼおよびＢファミリーＤＮＡポリメラーゼが、これらの酵素の「サム」ドメインとＴＥＲＴのＣＴＥドメインを、「フィンガー」および「パーム」サブドメインに関して同一の空間的位置に配置することが示され、テロメラーゼのＣＴＥドメインが、この酵素の「サム」ドメインであることを示唆し、これは、前の生化学的研究と良好に一致する所見である（Hossain, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:36174-80）。
【００８６】
ＴＥＲＴドメインの構成は、分子の末端ドメインを構成するＴＲＢＤおよび「サム」ドメインを一緒にして、ドーナツ形状に似たリング状構造の形成を導く配置にしている（図１Ｃ）。いくつかの証拠の系統は、本明細書に記載されたＴＥＲＴ構造のドメイン構成が、生物学的に関連することを示す。最初に、２つの異なる結晶形態中に観察される４つのＴＥＲＴモノマーのドメイン（それぞれの非対称ユニット中に２つずつ）が、同じように構成される（全４つのモノマー間の平均ＲＭＳＤ＝０．７６Å）。第２に、ＴＥＲＴのＮおよびＣ末端ドメイン間の接触は広範囲であり（１６７７Å２）、アミノ酸残基Tyr4、Lys76、Thr79、Glu84、Ser81、His87、Asn142、His144、Glu145、Tyr411、His415、Phe417、Trp420、Phe422、Ile426、Phe434、Thr487、Ser488、Phe489、およびArg592を含んで、高度に疎水性である。
【００８７】
この観察は、前の生化学的研究と良好に一致する（Arai, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:8538-44）。第３に、ＴＥＲＴドメインの構成は、その最も近い相同体である、ＨＩＶ逆転写酵素（Sarafianos, et al. (2002)上記）、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Di Marco, et al. (2005)上記）、およびＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、および、特にＲＢ６９（Wang, et al. (1997)上記）のポリメラーゼドメイン（ｐ６６からＲＮアーゼＨドメインを引いたもの）のそれと類似している。ＴＥＲＴドメインの配置は、粒子内部に幅〜２６Å、深さ〜２１Åの穴を形成し、これはおよそ７〜８塩基長の二本鎖核酸を収容するのに十分であり、これは、存在する生化学的データと良好に一致する（Forstemann & Lingner (2005) EMBO Rep. 6:361-6；Hammond & Cech (1998) Biochemistry 37:5162-72）。
【００８８】
ＴＥＲＴリングは二本鎖核酸を結合する。
ＴＥＲＴリングがいかにしてＲＮＡ／ＤＮＡと会合して、機能性伸長複合体を形成するかを理解するために、二本鎖核酸を、ＴＥＲＴの最も近い構造的相同体であるＨＩＶ逆転写酵素−ＤＮＡ複合体を用いて内部へモデル化した（Sarafianos, et al. (2002)上記）。ＴＥＲＴ−ＲＮＡ／ＤＮＡモデルは、直ちに、ＴＥＲＴ−核酸会合のモデルを支持する驚くべき特徴を示した。ＴＥＲＴリングの穴および、核酸ヘテロ二本鎖が突き出て結合するところが、このファミリーのポリメラーゼの特徴であり、かつ核酸会合、ヌクレオチド結合およびＤＮＡ合成に関連するとされているいくつかのキーシグネチャーモチーフで囲まれていた。さらに、これらモチーフの構成が、二本鎖核酸の骨格の形状に似ている、リング内部のらせんの形成をもたらした。ＤＮＡ基質との接触点として同定されたいくつかのモチーフは、正に荷電された残基により部分的に形成され、この側鎖は、リングの中心に向かって伸び、ＤＮＡ基質の骨格との直接接触について準備されていた。
【００８９】
例えば、らせんα１０の一部を形成する、高度に保存されたＫ２１０の側鎖は、モデル化ＤＮＡの骨格の配位距離（coordinating distance）内であり、こうして機能性テロメラーゼ酵素に必要な安定性を提供する。らせんα１０はＲＴドメインの上部にあり、リングの内部に向いている。このらせんの位置および安定性は、テロメラーゼ処理能力と関連するＩＦＤモチーフとの広範囲の接触により大きく影響される（Lue, et al. (2003) Mol. Cell Biol. 23:8440-9）。ＩＦＤのらせんα１０との接触を、このモチーフの欠失または変異を通して障害することは、らせんα１０をその現在の位置から変位させ、これはその結果、ＤＮＡ結合およびテロメラーゼ機能に影響を及ぼす。
【００９０】
リング内部に局在している「サム」ドメインの構造要素も、モデル化ＤＮＡ基質といくつかの接触を行った。特に、「パーム」を「サム」ドメインに結合してＥモチーフの伸長を構成する、テロメラーゼの「プライマーグリップ」領域としても知られているループ（「サム」ループ）は、二本鎖核酸の骨格の形状を相当程度保存する。このループの一部を形成するいくつかのリジン（例えばLys406、Lys416、Lys418）およびアスパラギン（例えばAsn423）の側鎖は、ＴＥＲＴ分子の中心に向かって伸び、モデル化二本鎖核酸の骨格の配位距離内であった。特に興味深いのは、Lys406であった。このリジンは、モチーフＥの近傍にあり、その側鎖は核酸へテロ二本鎖に向かって伸び、入ってくるＤＮＡプライマーの３’末端に位置するヌクレオチドの骨格との直接の接触用に準備されていた。
【００９１】
したがって、このリジンの側鎖とモチーフＥとが一緒になって、テロメラーゼ伸長の間において、入ってくるＤＮＡ基質の３’末端を酵素の活性部位に配置することが可能である。広範囲の発生系統群からのＴＥＲＴの「サム」ドメインの配列アラインメントは、ＤＮＡ基質との接触が予想される残基が、常に極性であることを示した（図３Ａ〜３Ｃ）。二本鎖核酸結合を支持する「サム」ドメインの他の特徴は、らせんα１９であり、これは、リングの内部に伸長し、それ自体がモデル化二本鎖核酸の小さな溝の中に収容されている、３１０らせんであり（「サム」３１０らせん）、こうして、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド結合および安定化を促進する。酵母およびヒトＴＥＲＴ両方における、対応する残基の欠失または変異は、ＴＥＲＴの処理能力の重篤な損失をもたらし、このモチーフのＴＥＲＴ機能における重要な役割を明白に示す（Hossain, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:36174-80；Huard, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:4059-70；Banik, et al. Mol. Cell Biol. 22:6234-46）。
【００９２】
ＴＥＲＴの活性部位およびヌクレオチド結合。
本明細書に記載のT. castaneumのＴＥＲＴ構造は、ヌクレオチド基質およびマグネシウムの不在のもとで結晶化したが、ＴＥＲＴの活性部位およびヌクレオチド結合ポケットの位置および構成は、既存の生化学的データ（Lingner, et al. (1997)上記）および、最も近い相同体であるＨＩＶ逆転写酵素のポリメラーゼドメインとの構造的比較（Das, et al. (2007) J. Mol. Biol. 365:77-89）に基づいて決定された。ＴＥＲＴの活性部位は、モチーフＡおよびＣ、すなわち、ＴＥＲＴの「パーム」サブドメインに位置して「フィンガー」に隣接する２つの短いループを形成する、３つのアスパラギン酸（Asp251、Asp343およびAsp344）から構成されている。ＴＥＲＴとＨＩＶ逆転写酵素およびＲＮＡとＤＮＡポリメラーゼの構造的比較は、これらのタンパク質ファミリーの活性部位の間に高度の類似性を示し、テロメラーゼもまた、触媒に対して２種金属機構を利用していることを示す。これらＴＥＲＴアスパラギン酸のアラニン変異体には、ＴＥＲＴ活性の完全な損失が生じ、これは、テロメラーゼ機能におけるこれら残基の本質的な役割を示している（Lingner, et al. (1997)上記）。
【００９３】
テロメラーゼヌクレオチド結合ポケットは、ＴＥＲＴの「フィンガー」および「パーム」サブドメインの境界に位置し、鋳型およびヌクレオチド結合に関連するモチーフ１、２、Ａ、Ｃ、Ｂ’およびＤを形成する保存残基から構成される（Bosoy & Lue (2001) J. Biol. Chem. 276:46305-12；Haering, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6367-72）。ＴＥＲＴと、ＡＴＰに結合するウイルスＨＩＶ逆転写酵素との構造的比較は（Das, et al. (2007)上記）、この位置におけるヌクレオチド基質の存在を支持する。２つの高度に保存された、モチーフＡおよびＣそれぞれの表面露出残基Tyr256とVal342は、３つの触媒アスパラギン酸塩に隣接するその上の疎水性ポケットを形成し、ヌクレオチド基質の塩基を収容することができる。この油性ポケットでのヌクレオチド結合は、Ｍｇ２＋イオンの１つとの配位用に三リン酸部位を酵素の活性部位の近傍に配置し、一方、リボース基を、基質特異性の重要な決定因子と考えられているモチーフＢ’の一部を形成する不変グルタミン（Gln308）の、配位距離内に配置する（Smith, et al. (2006) J. Virol. 80:7169-78）。
【００９４】
ヌクレオチドの三リン酸部分とタンパク質の接触は、酵素の活性部位の下に位置する長いループである、モチーフＤにより媒介される。特に、不変Lys372の側鎖は、ヌクレオチドのγリン酸の配位距離内にあり、触媒の間、三リン酸基を配置し安定化することを支援する可能性の高い相互作用である。モチーフ１および２の高度に保存されたLys189およびArg194の側鎖は、一緒になって、「フィンガー」サブドメインの一部を形成する長いβヘアピンを形成するが、これもまた、モデル化ヌクレオチドの糖および三リン酸部分の両方の配位距離内にある。ヌクレオチド基質の糖部分および三リン酸のどちらか、または両方との接触は、ヌクレオチド結合および入ってくるＤＮＡプライマーの３’末端への配位に対する配置を促進する。
【００９５】
ＴＲＢＤはＴＥＲＴの活性部位における鋳型の配置を促進する。
多くのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼについてと同様に、テロメラーゼによる核酸合成は、ＴＥＲと入ってくるＤＮＡプライマーの鋳型領域（通常は７〜８塩基またはそれ以上）の対合を必要とする（Lee & Blackburn (1993) Mol. Cell Biol. 13:6586-99）。ＴＲＢＤ−ＲＴドメイン構成は、分子の壁の全幅にわたってタンパク質表面に深い空洞を形成し、その側面からリングの穴内へ入ることを可能とする間隙を形成する。この空洞の、リングの中心穴に対する配置は、ＴＥＲＴ−ＴＥＲアセンブリーにおいて、酵素の活性部位が位置するリングの内部における、ＲＮＡ鋳型の配置についてのエレガントな機構を提供する。
【００９６】
特に重要なのは、Ｔモチーフの一部を形成する、βヘアピンの配置である。このヘアピンは、ＲＮＡ結合ポケットから突き出て、モチーフ１および２の「サム」ループと広範に接触する。このヘアピンの、「フィンガー」および「サム」ドメイン両方との接触は、リングの内部に向いたＴＲＢＤポケットの開口部を、酵素の活性部位近傍に配置させる。したがって、このβヘアピンが、リング内部でのＲＮＡ結合と、酵素の活性部位におけるＲＮＡ鋳型の配置をつなぐ、アロステリックエフェクタースイッチとして作用する。分子内部への鋳型の配置は、入ってくるＤＮＡ基質とのその対合を促進し、これらが一緒になって、テロメア伸長に必要なＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。
【００９７】
ＲＮＡ／ＤＮＡ対合は、これが、ヘテロ二本鎖のＲＮＡ要素が、染色体の末端においてＤＮＡの同一の反復を正確に付加するために鋳型を提供する一方で、ヌクレオチド付加のために、入ってくるＤＮＡプライマーの３’末端を酵素の活性部位の近傍に運ぶという点において、テロメア合成の必要条件である。驚くべきことには、ＴＥＲＴリングの内部でのＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のモデル化は、ＲＮＡ基質の５’末端を、ＲＮＡ結合ポケットが入るところに配置させ、ＴＥＲＴがＴＥＲと会合することが予想される場合、入ってくるＤＮＡプライマーの３’末端を、ＴＥＲＴの活性部位に配置させて、機能的テロメラーゼ伸長複合体の構成のスナップショットを提供する。
【００９８】
例３：テロメラーゼ阻害剤の有効性
本発明の新規なテロメラーゼ阻害剤は、種々の系において評価することができる。化合物は、細胞透過性、毒性、および薬学動態効果を評価するために用いられる、規定のよく知られたモデル系において、評価することができる。これらのアッセイは、細胞ベースおよび動物ベースのアッセイの両方を含む。
【００９９】
細胞ベースアッセイ。
Ｐ３８８細胞株（CellGate, Inc., Sunnyvale, CA）またはヒト悪性黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２からの細胞を、ウシ胎仔血清（１０％）、Ｌグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０細胞培地中で増殖させ、毎週２回分割させる。全化合物は最初にＤＭＳＯで希釈する。後の連続希釈は、リン酸緩衝生理食塩水で行う。全ての希釈はガラス製バイアル中で行い、最終ＤＭＳＯ濃度は一般に容量で０．５％未満である。最終２倍希釈を９６ウェルプレートで細胞培地を用いて行い、各ウェルが５０μｌを含むようにする。全ての化合物は複数の濃度でアッセイする。細胞濃度は、血球計を用いて測定し、最終細胞濃度を細胞培地により１×１０４細胞／ｍＬに調節する。得られた細胞溶液（５０μＬ）を次に各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター内で、５日間インキュベートする。
【０１００】
ＭＴＴ溶液（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、１０μＬ）を次に各ウェルに加え、プレートを同一条件下で２時間、再度インキュベートする。各ウェルに、酸性化イソプロパノール（０．０５ＮのＨＣｌを含有する１５０μＬのｉ−ＰｒＯＨ溶液）を加え、完全に混合する。プレートを次に５９５ｎｍでスキャンし、吸収を読み取る（Wallac Victor 1420 Multilabel Counter）。得られたデータを解析して、ＥＤ５０値を決定する。癌細胞は殺すが、正常細胞は殺さない化合物は、癌の予防または処置に用途が見出される。
【０１０１】
マウス卵巣腫瘍異種移植片モデル。
本発明の化合物を、癌の卵巣腫瘍異種移植片において、Davis, et al.（(1993) Cancer Research 53:2087-2091）の記載に基づいて評価した。簡単に述べると、このモデルは、雌のｎｕ／ｎｕマウスに１×１０９のＯＶＣＡＲ３−ｉｃｒ細胞を腹腔内に接種することを含む。１または２以上の試験化合物を、例えば腫瘍細胞の注射の前または後に、経口経路で１％メチルセルロース中の懸濁液として、または腹腔内に０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０中のリン酸緩衝生理食塩水中の懸濁液として、投与する。実験の最後に（４〜５週間）、腹膜細胞の数を計測し、任意の固形腫瘍蓄積物を計量する。いくつかの実験においては、腫瘍の発達を腫瘍特異的抗原の測定によりモニタリングする。
【０１０２】
ラット乳癌モデル。
本発明の化合物を、ＨＯＳＰ．１ラットの癌の乳癌モデルにおいて評価する（Eccles, et al. (1995) Cancer Res. 56:2815-2822）。このモデルは、２×１０４の腫瘍細胞の、雌ＣＢＨ／ｃｂｉラットの頚静脈への静脈内接種を含む。１または２以上の試験化合物を、例えば腫瘍細胞の注射の前または後に、経口経路で１％メチルセルロース中の懸濁液として、または腹腔内にリン酸緩衝生理食塩水および０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０中の懸濁液として、投与する。実験の最後に（４〜５週間）、動物を死亡させ、肺を取り出し、個々の腫瘍を、メタカーン（methacarn）中に２０時間固定した後に計量する。
【０１０３】
マウスＢ１６黒色腫モデル。
本発明の化合物の抗転移能力を、Ｃ５７ＢＬ／６中のＢ１６黒色腫モデルにおいて評価する。マウスに、in vitro培養物中で収穫した２×１０５Ｂ１６／Ｆ１０ネズミ腫瘍細胞を静脈内に注射する。阻害剤は、経口経路で１％メチルセルロース中の懸濁液として、または腹腔内にリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２および０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０中の懸濁液として、投与する。細胞接種の１４日後にマウスを死亡させ、肺を取り出し、ブワン固定液中に固定する前に計量する。肺の各セットの表面上に存在するコロニー数を次に計測する。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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