(57)【要約】本発明は、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換えに関与する、ａｔｔ組換え配列の変異体である、新規ヌクレオチド配列に関し、ここで、配列特異的組換えは、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって行なわれる。そのような新規ａｔｔ組換え配列は、例えば、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ．ａ、およびａｔｔＲ．ｂである。本発明はさらに、少なくとも１つの組換え配列を含むヌクレオチド配列を含む第１のＤＮＡを細胞中に導入すること、少なくとも１つのさらなる組換え配列を含むヌクレオチド配列を含む第２のＤＮＡを細胞中に導入すること、およびバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行うことを含む、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法に関し、ここで、前記第１または第２のＤＮＡの少なくとも一方は新規ａｔｔ組換え配列であり、例えば、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ．ａ、およびａｔｔＲ．ｂである。
2011504741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）およびａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）からなる群より選択される核酸分子またはその誘導体またはそのホモログ。
【請求項２】
前記核酸配列が、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換えを媒介し、そして配列特異的組換えが、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって行なわれる、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、真核生物発現ベクターである、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
前記ベクターが、プロモーターおよび／または目的の異種遺伝子および／または選択マーカーおよび／またはエンハンサーを含む、請求項３または４記載のベクター。
【請求項６】
選択マーカーが、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼである、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
ゲノムまたは人工染色体またはミニ染色体またはエピソームエレメントまたは請求項３〜６記載のベクター中に組み込まれた請求項１または２記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項８】
細胞が、真核細胞、例えば酵母、植物、蠕虫、昆虫、トリ、魚、爬虫類、または哺乳動物細胞である、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
前記真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎ＣＶ１細胞、サル腎ＣＯＳ細胞、ヒト水晶体上皮ＰＥＲ.Ｃ６ＴＭ細胞、ヒト胎児腎ＨＥＫ２９３細胞、ヒト羊膜細胞、ヒトミエローマ細胞、ベビーハムスター腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頸癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳房腫瘍またはミエローマ細胞、例えばＮＳ０、イヌ、ブタ、マカク、ラット、ウサギ、ネコ、およびヤギ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ野生型、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、好ましくはＣＨＯ ＤＧ４４である、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法であって、以下の工程：
ａ）第１のａｔｔＢ（配列番号１）、ａｔｔＰ（配列番号２）、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ（配列番号１２）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ（配列番号１３）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）配列を含むＤＮＡを細胞中に導入する工程、
ｂ）第２のａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）配列を細胞中に導入する工程、
またはその逆、および
ｃ）バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって配列特異的組換えを行う工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＢ（配列番号１）配列を含む場合、前記第２の配列がａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）を含むか、またはその逆である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）配列を含む場合、前記第２の配列がａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）を含むか、またはその逆である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）配列を含む場合、前記第２の配列が同様にａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）配列を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１記載の工程ｂ）およびｃ）を含む、前記真核細胞の人工染色体／ミニ染色体またはゲノム中に請求項１１記載の第１のａｔｔ配列が組み込まれた真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法。
【請求項１６】
第１のａｔｔ配列が、前記真核細胞のゲノムに天然に生じるか、または前もって導入される、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞において１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする少なくとも１つの目的の遺伝子を発現する方法であって、以下の工程：
ａ）ａｔｔＢ（配列番号１）、ａｔｔＰ（配列番号２）、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ（配列番号１２）、ａｔｔＬ＊（配列番号６）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ（配列番号１３）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）配列を含む第１のＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｂ）ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）、またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）配列を含む第２のＤＮＡを導入する工程、
またはその逆、および
ｃ）少なくとも１つの目的の遺伝子を細胞中に導入する工程；
ｄ）前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
ｅ）バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程であって、ここで、第２のＤＮＡは第１のＤＮＡ中に組み込まれる工程；および
ｆ）前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む方法。
【請求項１８】
前記第２のＤＮＡが前記細胞中に導入される前に、第１のＤＮＡが宿主細胞ゲノム、宿主細胞の人工染色体／ミニ染色体またはエピソームエレメント中に組み込まれている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
バクテリオファージλＩｎｔまたはその任意の機能的変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする少なくとも１つの天然に生じる組換え配列を有する真核細胞において１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする少なくとも１つの目的の遺伝子を発現する方法であって、以下の工程：
ａ）ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）配列および少なくとも１つの目的の遺伝子を含むＤＮＡを前記細胞中に導入する工程；
ｂ）前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
ｃ）前記細胞において天然に生じる組換え配列と前記細胞中に導入されたＤＮＡとの間で、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程；および
ｄ）前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む方法。
【請求項２０】
天然に生じる配列がａｔｔＨ（配列番号１４）である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記所望のポリペプチド／産物が、宿主細胞または細胞培養培地から単離される、請求項１７〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記配列特異的組換えが、Ｉｎｔ、およびＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩＨＦから選択される１つ以上の補因子によって行なわれる、先行する請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
配列特異的組換えが、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８によって行なわれる、先行する請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のポリペプチドが、抗体、ホルモンまたは増殖因子である、先行する請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、先行する請求項のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換えに関与する、ａｔｔ組換え配列の変異体である、新規ヌクレオチド配列に関し、ここで、配列特異的組換えは、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって行なわれる。そのような新規ａｔｔ組換え配列は、例えば、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ．ａ、およびａｔｔＲ．ｂである。
【０００２】
本発明はさらに、少なくとも１つの組換え配列を含むヌクレオチド配列を含む第１のＤＮＡを細胞中に導入すること、少なくとも１つのさらなる組換え配列を含むヌクレオチド配列を含む第２のＤＮＡを細胞中に導入すること、およびバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行うことを含む、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法に関し、ここで、前記第１または第２のＤＮＡの少なくとも一方は新規ａｔｔ組換え配列であり、例えば、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ．ａ、およびａｔｔＲ．ｂである。
【０００３】
背景
真核生物ゲノムの制御された操作およびエピソームベクターからの組換えタンパク質の発現は、生存生物における特定の遺伝子の機能を分析するための重要な方法である。さらに、前記操作は、医学における遺伝子治療方法において役割を果たしている。この関連で、トランスジェニック動物の生成、遺伝子または遺伝子セグメントの変化（いわゆる「遺伝子ターゲティング」）、および高等真核生物のゲノム中への外来性ＤＮＡの標的化組み込みが特に重要である。近年、これらの技術は、配列特異的組換え系の特徴付けおよび適用によって改善され得る。
【０００４】
さらに、生物工学的関連宿主細胞のゲノム中への、所望のポリペプチド／産物をコードしそして発現する、発現カセットの配列特異的組み込みもまた、生物製剤の産生のためのより大きな重大性を得ている。安定な形質転換細胞株における所望のポリペプチドについての発現レベルは、組み込みの部位に依存する。配列特異的組み込みによって、高い転写活性を有する部位が好適に使用され得る。所望のポリペプチド／産物を発現する産生細胞株を生成するための従来の方法は、宿主細胞のゲノム中への組換え発現ベクターのランダムな組み込みに基づいている。安定な形質転換細胞株における目的の組み込み遺伝子の発現レベルにおける変動は、染色体上の位置およびコピー数における差異に主に起因する。ヘテロクロマチンの近くでのランダムな組み込みは、トランスジーン発現の可変性のレベルを生じる。目的の組み込み遺伝子の発現を促進する染色体上の位置は、真性クロマチンの転写活性領域であると考えられている。この組み込みのランダムさは、組換え細胞の頑強性、生産性、および品質における大きな多様性を引き起こし、高レベルで所望のポリペプチドを発現する適切な細胞クローンを同定および単離するためには入念なスクリーニングプロセスが必要とされる。さらに、不均一性はまた、各々のクローンについて、至適化された産生プロセスを開発しなければならないことを意味し、このことは、適切な産生細胞株の開発を、時間のかかる、労働集約的な、そして費用のかかるプロセスにしている。
【０００５】
保存的配列特異的ＤＮＡリコンビナーゼは２つのファミリーに分類されている。第１のファミリー、いわゆる「インテグラーゼ」ファミリーのメンバーは、２つの規定されたヌクレオチド配列（これは、以下で組換え配列と名付けられる）間のＤＮＡ鎖の切断および再結合を触媒する。組換え配列は、２つの異なるＤＮＡ分子上、または１つのＤＮＡ分子上のいずれかに存在し得、これにより、それぞれ分子間または分子内の組換えが生じる。分子内組換えについては、反応の結果は、互いに対する組換え配列のそれぞれの配向に依存する。組換え配列の逆の、すなわち反対の配向の場合、組換え配列間にあるＤＮＡセグメントの反転が起こる。ＤＮＡ基質上の組換え配列の直列、すなわち縦列反復の場合、欠失が起こる。分子間組換えの場合、すなわち両方の組換え配列が２つの異なるＤＮＡ分子上に位置する場合、２つのＤＮＡ分子の融合が起こり得る。インテグラーゼファミリーのメンバーは通常分子内および分子間両方の組換えを触媒するが、いわゆる「インベルターゼ／リゾルバーゼ」の第２のファミリーのリコンビナーゼは、分子内組換えを触媒することができるのみである。
【０００６】
現在、真核生物ゲノムの操作のために使用されるリコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーに属する。前記リコンビナーゼは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ、および酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼである。Ｃｒｅリコンビナーゼが結合する組換え配列は、ｌｏｘＰと名付けられている。ｌｏｘＰは、２つの１３ｂｐ長の逆方向ヌクレオチド配列、および逆方向配列間にある８ｂｐ長のスペーサーからなる、３４ｂｐ長のヌクレオチド配列である。ＦｌｐのためのＦＲＴと名付けられた結合配列は同様に構築されている。しかし、それはｌｏｘＰとは異なる。それゆえ、組換え配列は互いによって置換されないかもしれず、すなわち、ＣｒｅはＦＲＴ配列を組み換えることができず、そしてＦＬＰはｌｏｘＰ配列を組み換えることができない。両方の組換え系は長距離にわたって活性であり、すなわち、２つのｌｏｘＰまたはＦＲＴ配列によって反転または欠失および隣接されるべきＤＮＡセグメントは、数万塩基対長であり得る。
【０００７】
これまでに、インベルターゼ／リゾルバーゼファミリーの３つのメンバーが真核生物ゲノムの操作のために使用されている。バクテリオファージＭｕインベルターゼＧｉｎの変異体は、補因子なしで植物プロトプラストにおけるＤＮＡフラグメントの反転を触媒することができる。しかし、この変異体は、過組換え誘導性（hyper-recombinogenic）であることが発見され、すなわち、それはその天然の組換え配列以外においてもＤＮＡ鎖切断を触媒する。これは、意図されない部分的致死性組換え事象を植物プロトプラストゲノムにおいて導く。Streptococcus pyogenes由来のβ−リコンビナーゼは、マウス細胞培養物において直列反復配列としての２つの組換え配列間での組換えを触媒し、セグメントの切り出しを導く。しかし、欠失と同時に、反転もまた検出されており、これは真核生物ゲノムの操作のための系の制御された使用を不適切にしている。E. coli由来のγδリゾルバーゼの変異体は、エピソームのおよび人工的に導入されたゲノムの組換え配列に対して活性であることが示されたが、後者の反応の効率は依然としてかなり低い。
【０００８】
真核生物ゲノムの、それぞれＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼでの操作は、重大な不利益を示す。欠失、すなわちゲノムにおける２つの縦列反復ｌｏｘＰまたはＦＲＴ組換え配列の組換えの場合、縦列反復配列間にあるＤＮＡセグメントの不可逆的喪失が存在する。従って、このＤＮＡセグメント上に位置する遺伝子は、細胞および生物にとって永久的に失われる。それゆえ、例えば生物のより後期の発達段階における、遺伝子機能の新たな分析のための元来の状態の再構築は不可能である。欠失によって引き起こされるＤＮＡセグメントの不可逆的喪失は、それぞれのＤＮＡセグメントの反転によって回避され得る。遺伝子は、失われることなしに反転によって不活性化させられ得、そして、復帰組換え（back recombination）を介したリコンビナーゼの時間的に調節された発現によって、より後期の発達段階でまたは成体動物において再びスイッチを入れられ得る。しかし、この改変方法におけるＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼ両方の使用は、組換え事象の結果として組換え配列が変化しないので、反転を調節することができないという不利益を有する。従って、それぞれのＤＮＡセグメントの反転に起因するそれぞれの遺伝子の不活性化を引き起こす反復組換え事象は、反応の平衡にある標的細胞のうちのいくらか、よくても５０％において起こる。単一の組換えの後にさらなる反応のために使用されることができない変異ｌｏｘＰ配列を構築することによって、少なくとも部分的に、この問題を解決しようとする努力がなされている。しかし、不利益は反応の特有性であり、すなわち、反転による遺伝子の不活性化後には復帰組換えによるその後の活性化は存在しない。
【０００９】
Ｆｌｐリコンビナーゼのさらなる不利益は、その３７℃における低下した熱安定性であり、従って、高等真核生物、例えば約３９℃の体温を有するマウスにおける組換え反応の効率は著しく限定される。それゆえ、野生型リコンビナーゼよりも高い熱安定性を示すＦｌｐ変異体が生成された。しかし、これらの変異Ｆｌｐ酵素でさえ、Ｃｒｅリコンビナーゼより低い組換え効率を依然として示す。
【００１０】
配列特異的リコンビナーゼのさらなる使用は、医学分野、例えば遺伝子治療にあり、ここで、リコンビナーゼは、所望のＤＮＡセグメントを、それぞれのヒト標的細胞のゲノム中に安定なそして制御された方法で組み込む。ＣｒｅおよびＦｌｐの両方は分子間組換えを触媒し得る。両方のリコンビナーゼは、そのそれぞれの組換え配列のコピーを保有するプラスミドＤＮＡを、相同組換えを介して真核生物ゲノム中に前もって挿入されている対応する組換え配列と組み換える。しかし、この反応が、真核生物ゲノムにおいて「天然に」生じる組換え配列を含むことが望ましい。ｌｏｘＰおよびＦＲＴはそれぞれ３４および５４ヌクレオチド長であるので、これらの組換え配列のゲノムの一部としての正確な一致の出現は統計学的にありそうにない。組換え配列が存在していたとしても、上記の逆反応（back reaction）の不利益が依然として存在し、すなわち、ＣｒｅおよびＦｌｐ両方のリコンビナーゼは、分子内組換えによる首尾よい組み込みの後に、挿入されたＤＮＡセグメントを切り出し得る。
【００１１】
従って、本発明の１つの課題は、単純でありそして制御可能な組換え系、および必要とされる作業手段を提供することである。本発明のさらなる課題は、所望のＤＮＡ配列の安定なそして標的化された組み込みを行ない得る、組換え系および必要とされる作業手段の提供である。本発明のさらなる課題は、これらの組換え系の１つに基づいた、改善されたタンパク質発現系の生成を可能にする方法の提供である。
【００１２】
発明の概要
バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔ組換え系およびａｔｔ組換え配列を使用することによって解決が提供される。特許出願ＷＯ０１/１６３４５およびＷＯ２００４/０４８５８４を本明細書に参照により組み入れる。
【００１３】
本発明の具体的な課題は、目的の遺伝子の配列に作動可能に連結された場合に真核生物系における部位特異的組換えの媒介を越えてその機能性を拡大させるように特に改変されている、代替的なａｔｔ配列を提供することである。
【００１４】
例えば、バクテリオファージλの野生型のまたは改変されたインテグラーゼによって駆動される組換え事象の増強を与えるために、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよび／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体中に、置換、欠失、および／または挿入を導入することができ、ここで、前記増強は、例えば、同じ条件下で同じリコンビナーゼを使用する対応する天然に生じる組換え配列と比較して、（ｉ）組換え事象（組み込みおよび／または切り出し）の効率を増加させること、（ｉｉ）組換えの特異性を増加させること、（ｉｉｉ）切り出し組換え（excisive recombination）事象を促進すること、（ｉｖ）組み込み組換え（integrative recombination）事象を優先すること、（ｖ）いくつかのまたは全ての宿主因子の要件を緩和することからなり得る。あるいは、部位特異的組換えのためのメディエーターとしてａｔｔ配列を使用するだけでなく、例えばさらに調節配列としてそれらを使用することによってその機能性を拡大するために、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体に、置換、欠失、および／または挿入を導入して、シス作用部位として作用し得る配列／ヌクレオチド、例えば、ほんの少しの非限定的な例を与えると、（潜在性）スプライスドナー、アクセプター部位および分枝点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、χ部位、リボソーム進入部位、反復配列、二次構造（例えばステムループ）、転写因子または他の調節因子のための結合部位、制限酵素部位などを除去、変更、生成、または付加することもできる。
【００１５】
ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列中に置換を導入した。驚くべきことに、特に良好に作動するいくつかのａｔｔ配列／ａｔｔ変異体を本発明において記載する。予想外なことに、いくつかの好ましいａｔｔ変異体は、置換がＩＨＦ、ＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩｎｔのための結合部位中に位置しているにもかかわらず、部位特異的組換えを依然として媒介することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明を、以下の図解についてより詳細に説明する。
【図１】元来のａｔｔＰ配列の、ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂとのアラインメント  ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）は、ａｔｔＰ野生型配列（配列番号２）と比較して、９個の置換（下線を付して太文字で強調する）を含む。これは、９６．３％の配列相同性と等価である。
【図２】懸濁培養物中での増殖に適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＰ変異体およびａｔｔＰ野生型を使用する分子間組換え  懸濁培養物中での増殖に適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、無血清培地中で、最初にλインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８をコードするプラスミドを用いて、そして場合によってはＩＨＦをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。  第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞を、第２のトランスフェクションにおいて、種々の基質ベクターの組み合わせ：ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（ａｔｔＰ野生型配列；配列番号２）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（ａｔｔＢ野生型配列；配列番号１）、ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（ａｔｔＰ変異体；配列番号３）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（ａｔｔＢ野生型配列；配列番号１）およびｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（ａｔｔＰ変異体；配列番号３）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ｂ（ａｔｔＰ変異体；配列番号３）を用いてトランスフェクトした。  陽性対照として、そしてトランスフェクション効率の決定のために、発現プラスミドｐＢＩ−２６７ＺｓＧｒｅｅｎを使用した。ｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎは、ＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現する。  第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞を、ＦＡＣＳ分析を使用して分析し、そして蛍光細胞の割合を決定した。  細胞を前もってインテグラーゼおよびＩＨＦ発現ベクターを使用してトランスフェクトした場合、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の細胞内組換えを有する蛍光細胞の割合は平均で１．２％であり、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ｂ基質ベクターの間では平均で１．５％であり、そしてａｔｔＰおよびａｔｔＢ基質ベクターの間では平均で１．７％である（各々６個のトランスフェクト細胞プールからの平均値）。  単にインテグラーゼ発現ベクターを使用して事前トランスフェクトした細胞については、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の細胞間組換えを有する蛍光細胞の割合は平均で０．３％であり、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ｂ基質ベクターの間では平均で０．４％であり、そしてａｔｔＰおよびａｔｔＢ基質ベクターの間では平均で１．１％である（各々６個のトランスフェクト細胞プールからの平均値）。  上記の全ての場合で、対応するプラスミドを使用したが、λインテグラーゼおよびＩＨＦをコードするプラスミドを加えることなしにトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。
【図３】元来のａｔｔＰ配列の、ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａとのアラインメント  ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）は、ａｔｔＰ野生型配列（配列番号２）と比較して９個の置換を含む。下線を付して太文字によって示すこれらの置換は、９６．３％の配列相同性と等価である。
【図４】懸濁培養物中での増殖に適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞における、ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ野生型を使用する分子間組換え  懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、無血清培地中で、プラスミドの組み合わせｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（ａｔｔＰ変異体；配列番号３）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ｂ（ａｔｔＰ変異体；配列番号３）、ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ａ（ａｔｔＰ変異体；配列番号４）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ａ（ａｔｔＰ変異体；配列番号４）またはｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（ａｔｔＰ野生型；配列番号２）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ（ａｔｔＰ野生型；配列番号２）を用いてトランスフェクトした。全ての場合で、細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８をコードするプラスミドｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８を用いて同時トランスフェクトした。  バックグラウンド蛍光を決定するための陰性対照として、モックトランスフェクト細胞を生成した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をＦＡＣＳ分析を使用して分析し、そして蛍光細胞の部分を決定した。  蛍光細胞の割合は、平均で、ａｔｔＰ．ｂ基質ベクター対の間の分子間組換えについては細胞の２％を、ａｔｔＰ．ａ基質ベクター対の間の分子間組換えについては細胞の１．９％を、そしてａｔｔＰ基質ベクター対の間の分子間組換えについては細胞の１．９％を占める（各々３個のトランスフェクト細胞プールからの平均値）。  上記の全ての場合で、対応するプラスミドの組み合わせを使用したが、λインテグラーゼプラスミドではなくモックプラスミドとしての空のベクターを加えてトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。
【図５】元来のａｔｔＬ配列の、ａｔｔＬ変異体ａｔｔＬ＊およびａｔｔＬ．ａとのアラインメント  ａｔｔＬ変異体ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）ａｔｔＬ＊（配列番号６）の各々は、ａｔｔＬ野生型配列（配列番号１２）と比較して１個の置換を含む。下線を付して太文字によって示すこれらの置換は、９９％の配列相同性と等価である。
【図６】元来のａｔｔＲ配列の、ａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ*、ａｔｔＲ．ａおよびａｔｔＲ．ｂとのアラインメント  ａｔｔＲ野生型配列（配列番号１３）と比較して、ａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）およびａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）は、各々８個の置換を含み、そしてａｔｔＲ*（配列番号８）は、１個の置換を含む。下線を付して太文字によって示すこれらの置換は、それぞれ９５％および９９．４％の配列相同性と等価である。
【図７】ａｔｔＬ変異体とａｔｔＲ変異体との間の分子間組換え  第１の工程において、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８、ＩＨＦおよびＸＩＳをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトする。第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞を、第２のトランスフェクションにおいて、種々のａｔｔＬおよびａｔｔＲ基質ベクターの組み合わせを用いてトランスフェクトする（ｎ＝３）。陽性対照として、そしてトランスフェクション効率の決定のために、ＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質をコードする発現プラスミドｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを使用する。第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞をＦＡＣＳ分析を使用して分析し、そして蛍光細胞の割合および平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光（Ｘ−平均）を決定する。全ての場合で、第２のトランスフェクションにおいては同一の基質ベクターの組み合わせに対応するプラスミドを用いてトランスフェクトされているが、第１のトランスフェクションにおいてはモックトランスフェクトのみされている細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引く。
【図８】ａｔｔＬおよびａｔｔＢ変異体ならびにａｔｔＰおよびａｔｔＲ変異体の間の分子間交差組換え  第１の工程において、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８、ＩＨＦおよびＸＩＳをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトする。第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞を、第２のトランスフェクションにおいて、種々のａｔｔＬおよびａｔｔＢまたはａｔｔＰおよびａｔｔＲ基質ベクターの組み合わせを用いてトランスフェクトする（ｎ＝３）。陽性対照として、そしてトランスフェクション効率の決定のために、ＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質をコードする発現プラスミドｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを使用する。第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞をＦＡＣＳ分析を使用して分析し、そして蛍光細胞の割合および平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光を決定する。全ての場合で、第２のトランスフェクションにおいては同一の基質ベクターの組み合わせに対応するプラスミドを用いてトランスフェクトされているが、第１のトランスフェクションにおいてはモックトランスフェクトのみされている細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引く。
【図９】ＰＣＲによる交差組換えの検証  ａｔｔＬおよびａｔｔＢまたはａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＢ基質ベクターの組み合わせのいずれかを用いてトランスフェクトした細胞プールから単離したプラスミドＤＮＡに対するＰＣＲを、ＣＥＮｆｏｒ２およびＺｓＧｒｅｖ１のプライマーの組み合わせを使用して行なう。基質ベクターの対の間の首尾よい分子間組換えの場合、ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔベクター上に位置するＺｓＧｒｅｅｎは、それらの間の対応する付着部位で、ｐＢＩ−２６／ａｔｔベクター上に位置するＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下になる。結果として、上記のプライマーを用いたＰＣＲ産物は、首尾よい組換え事象の場合にのみ生じるはずである。そして実際、ｐＣＭ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、ｐＩＨＦおよびｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを用いて事前トランスフェクトし、続いて、基質ベクターの対を用いて第２のトランスフェクションをした全ての細胞プールにおいて、４００ｂｐの予想されたＰＣＲ産物が検出される。基質ベクターの対を用いた第２のトランスフェクションにおいてトランスフェクトしたモック事前トランスフェクト細胞プールにおいてはＰＣＲ産物は得られない。
【００１７】
発明の詳細な説明
一般的な実施態様「含む」または「含まれる」は、より具体的な実施態様「からなる」を包含する。さらに、単数形および複数形は、限定的には使用されない。
【００１８】
本発明の過程で使用される用語は、以下の意味を有する。
【００１９】
本明細書において使用する用語「形質転換」または「形質転換する」、「トランスフェクション」または「トランスフェクトする」は、遺伝子改変、組換え、形質転換、またはトランスジェニック細胞を生じる、細胞中への核酸配列の任意の導入を意味する。導入を、当技術分野において周知の任意の方法によって行なうことができる。方法は、限定するものではないが、リポフェクション、電気穿孔法、ポリカチオン（例えばＤＥＡＥ−デキストラン）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染およびマイクロインジェクションを含むか、または、カルシウム方法、電気ショック方法、静脈内／筋肉内注射、エアロゾル吸入、または卵母細胞注入によって行われ得る。形質転換は、宿主細胞の一過性のまたは安定な形質転換を生じ得る。用語「形質転換」または「形質転換する」はまた、それぞれのウイルスにとって自然である方法での、ウイルス核酸配列の導入を意味する。ウイルス核酸は、裸の核酸配列として提供される必要はなく、ウイルスタンパク質エンベロープ中にパッケージングされていてもよい。従って、この用語は、通常「形質転換」または「形質転換する」の用語の下に知られている方法のみに関するものではない。至適なトランスフェクション頻度および導入核酸の発現を提供するトランスフェクション方法が好ましい。適切な方法を、慣例的な手順によって決定することができる。安定なトランスフェクタントのために、構築物は、宿主細胞内で安定に維持されるように、宿主細胞のゲノムまたは人工染色体／ミニ染色体中に組み込まれるか、または、エピソームに位置するかのいずれかである。
【００２０】
本明細書において使用する用語「組換え配列」は、ａｔｔ配列、その任意の誘導体またはホモログ、好ましくはａｔｔＢ（配列番号１）、ａｔｔＰ（配列番号２）、ａｔｔＬ（配列番号１２）およびａｔｔＲ（配列番号１３）配列およびその誘導体、例えば例示的配列、配列番号３において特定されるａｔｔＰ．ｂ、配列番号４において特定されるａｔｔＰ．ａ、配列番号６において特定されるａｔｔＬ＊、配列番号７において特定されるａｔｔＬ．ａ、配列番号８において特定されるａｔｔＲ＊、配列番号１０において特定されるａｔｔＲ．ａおよび配列番号１１において特定されるａｔｔＲ．ｂに関する。
【００２１】
本明細書において使用する用語「誘導体」または「変異体」は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列、ならびに、天然に生じるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列と比較して重複領域および／またはコア領域において１個以上の置換、好ましくは７個、より好ましくは、２、３、４、５または６個の置換を有する、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａおよびａｔＲ．ｂに関する。用語「誘導体」または「変異体」はまた、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲの少なくとも１つのコアＩｎｔ結合部位に関する。用語「誘導体」または「変異体」はまた、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲの少なくとも１つのコアＩｎｔ結合部位＋Ｉｎｔのためのアーム結合部位の１つ以上のコピーに関する。用語「誘導体」または「変異体」はまた、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲの少なくとも１つのコアＩｎｔ結合部位＋ＩＨＦ、ＦＩＳまたはＸＩＳ因子結合部位の１つ以上のコピーに関する。用語「誘導体」はまた、これらの特徴の組み合わせに関する。用語「誘導体」はまた、ＩＨＦ、ＦＩＳまたはＸＩＳ因子結合部位またはＩｎｔアーム結合部位における置換に関する。用語「誘導体」または「変異体」はさらに、その任意の機能的フラグメントおよび配列特異的組換えを支持する真核細胞における内因性ヌクレオチド配列、例えば、ヒトゲノムにおいて同定されたａｔｔＨに関する（例えばＷＯ０１／１６３４５参照）。用語「誘導体」または「変異体」は、一般に、本発明の意図される使用を実現するために適切なａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲ配列を含み、このことは、該配列が、バクテリオファージλのインテグラーゼ（野生型のまたは改変された）によって駆動される配列特異的組換え事象を媒介することを意味する。
【００２２】
用語「機能的フラグメント」は、改変にもかかわらず、バクテリオファージλの野生型のまたは改変されたインテグラーゼによって駆動される配列特異的組換えを媒介することができる、置換、欠失、および／または挿入を有するａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａおよびａｔｔＲ．ｂ配列（野生型のまたは改変されたタンパク質結合部位の存在または非存在を含む）に関する。置換、欠失、および／または挿入を、例えば、バクテリオファージλの野生型のまたは改変されたインテグラーゼによって駆動される組換え事象の増強を与えるために、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよび／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体中に導入することができ、ここで、前記増強は、例えば、同じ条件下で同じリコンビナーゼを使用した対応する天然に生じる組換え配列と比較して、（ｉ）組換え事象（組み込みおよび／または切り出し）の効率を増加させること、（ｉｉ）組換えの特異性を増加させること、（ｉｉｉ）切り出し組換え事象を促進すること、（ｉｖ）組み込み組換え事象を促進すること、（ｖ）いくつかのまたは全ての宿主因子の要件を緩和することからなり得る。置換、欠失、および／または挿入を、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよび／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体中に導入して、例えば、目的の遺伝子をコードする遺伝子配列に読み枠内で作動可能に連結（融合）された場合に、組換え配列において開始コドン（ＡＴＧ）または終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）として作用し得るか、または、特定のアミノ酸をコードし得るヌクレオチドトリプレットを除去、変更、生成、または付加することもできる。あるいは、部位特異的組換えのためのメディエーターとしてａｔｔ配列を使用するだけでなく、例えばさらに調節配列としてそれらを使用することによってその機能性を拡大するために、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよび／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体中に、置換、欠失、および／または挿入を導入して、シス作用部位として作用し得る配列／ヌクレオチド、例えば、ほんの少しの非限定的な例を与えると、（潜在性）スプライスドナー、アクセプター部位および分枝点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、χ部位、リボソーム進入部位、反復配列、二次構造（例えばステムループ）、転写因子または他の調節因子のための結合部位、制限酵素部位などを除去、変更、生成、または付加することもできる。
【００２３】
改変組換え部位または改変インテグラーゼの機能性を、所望の特定の特徴に依存し、そして当技術分野において公知の方法で実証することができる。例えば、本発明において記載するような同時トランスフェクションアッセイ（実施例１参照）を使用して、種々の細胞株における染色体外ＤＮＡのインテグラーゼ媒介組換えを特徴付け得る。簡潔には、細胞を、インテグラーゼタンパク質をコードする発現ベクター（場合により、ＩＨＦ、ＸＩＳおよび／またはＦＩＳなどの補因子をコードするベクターを加えてもよい）、および機能的／非機能的リポーター遺伝子（例えばＧＦＰのような蛍光タンパク質）をコードし、そしてそこに少なくとも１つの組換え配列を含む、リコンビナーゼのための基質である基質ベクターを用いて同時トランスフェクトする。発現ベクターによるインテグラーゼの発現に際して、リポーター遺伝子の機能は非機能的／機能的にされる。従って、組換えられた基質ベクターを回収し、そしてＤＮＡレベルで組換えの証拠について見ること（例えば、ＰＣＲ、組換えられた領域の配列分析、制限酵素分析、サザンブロット分析を行なうこと）、またはタンパク質レベルで組換えの証拠について見ること（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、免疫染色、蛍光タンパク質のＦＡＣＳ分析）のいずれかによって、組換え活性をアッセイすることができる。
【００２４】
本明細書において使用する用語「重複領域」は、ＤＮＡ鎖交換（鎖切断および再連結を含む）が起こる組換え配列の配列を規定し、そして野生型ａｔｔ部位におけるコンセンサスＤＮＡ配列５’−ＴＴＴＡＴＡＣ−３’または機能的ヌクレオチド置換を有する前記配列に関する。唯一の前提条件は、重複領域の配列が、組み換えるパートナー配列間で同一であることである。
【００２５】
用語「コア結合部位」は、野生型ａｔｔ部位の各々の組において、重複領域によって分離された、逆配向にある２つの不完全に反復したコピーに関する。コア結合部位は、低い親和性でインテグラーゼに結合することによって組換えのために必須である。各々のコア結合部位は、９つの連続した塩基対からなり、そして野生型ａｔｔ部位中のヌクレオチド配列５’−ＣＴＧＣＴＴＴＴＴ−３’のＢ配列、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＧＴＴＡＧＴ−３’のＢ’配列（逆相補鎖）、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＴＴＴＴＴ−３’のＣ配列、およびヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＣＴＴＡＧＴ−３’のＣ’配列（逆相補鎖）または機能的ヌクレオチド置換を有する前記配列からなるＤＮＡ配列に関する。
【００２６】
本明細書において使用する用語「Ｉｎｔのためのアーム結合部位」または「アーム結合部位」は、コンセンサス配列５’−Ｃ／ＡＡＧＴＣＡＣＴＡＴ−３’または機能的ヌクレオチド置換を有する前記配列に関する。Ｉｎｔのためのアーム結合部位は、コアＩｎｔ結合部位の上流および／または下流の種々の距離に位置し得る。
【００２７】
組換え配列、重複領域、コア結合部位、アーム結合部位、および宿主因子結合部位に関して本明細書において使用する用語「ホモログ」または「相同」または「類似」は、天然に生じる組換え配列、重複領域、コア結合部位、アーム結合部位、および宿主因子結合部位に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である核酸配列に関する。組換え配列と比較した場合に、例えばＮＣＢＩの類似性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいて標準的なパラメーターを使用してＰ＜１０−５の蓋然性を示す配列が相同または類似であると考えられる。
【００２８】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、細胞における核酸の取り込み、増殖、発現、または伝達のための天然に生じるまたは合成的に生成される構築物、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体／ミニ染色体、バクテリオファージ、ウイルスまたはレトロウイルスに関する。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、そして種々の刊行物に記載されている。特に、適切なベクターを構築するための技術（機能的および調節的成分、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、およびスプライシングシグナルの記載を含む）は、当業者に公知である。真核生物発現ベクターは、典型的には、細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物配列、例えば、複製起点および細菌における選択のための抗生物質耐性遺伝子も含む。その中にポリヌクレオチドを作動可能に連結させることができるクローニング部位を含む、種々の真核生物発現ベクターは、当技術分野において周知であり、そしてStratagene, La Jolla, CA；Invitrogen, Carlsbad, CA；Promega, Madison, WIまたはBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAなどの会社からいくつかが市販されている。
【００２９】
本明細書において使用する用語「目的の遺伝子」、「所望の配列」、または「所望の遺伝子」は、同じ意味を有しており、そして目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。選択される配列は、完全長または切断型遺伝子、融合またはタグ化遺伝子であることができ、そしてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡフラグメント、好ましくはｃＤＮＡであることができる。それは、ネイティブな配列、すなわち天然に生じる形態であることができ、または、所望により変異されるかまたは別のやり方で改変されることができる。これらの改変は、選択される宿主細胞におけるコドン使用頻度を至適化するためのコドン至適化、ヒト化、またはタグ化を含む。さらに、それらは、ほんの少しの非限定的な例を与えると、シス作用部位、例えば（潜在性）スプライスドナー、アクセプター部位および分枝点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、χ部位、リボソーム進入部位、反復配列、二次構造（例えばステムループ）、転写因子または他の調節因子のための結合部位、制限酵素部位の除去または付加を含み得る。選択される配列は、分泌、細胞質、核、膜結合型、または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。「目的の産物」は、タンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチド、アンチセンスＲＮＡを含み、これら全てが選択される宿主細胞において発現されることができる。
【００３０】
本明細書において使用する用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ＤＮＡ配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドならびにそのフラグメントおよび部分を、そしてゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、これは一本鎖または二本鎖であり得、そしてセンスまたはアンチセンス鎖を表し得る。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合物であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上のコドンがその同義物（synonym）によって置換されている核酸領域を含む。
【００３１】
本発明の核酸配列を、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製することができる。用語「コード（encoding）」または「コード（coding）」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡ分子）またはアミノ酸の規定された配列およびそれから生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として作用する、染色体中の遺伝子またはｍＲＮＡなどの、核酸中の特定のヌクレオチドの配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常配列表中に提供される）および非コード鎖（転写のための鋳型として使用される）の両方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするといわれることができる。タンパク質をコードする核酸は、異なるヌクレオチド配列を有するが、遺伝暗号の縮重に起因してタンパク質の同じアミノ酸配列をコードする、任意の核酸を含む。タンパク質をコードする核酸およびヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
【００３２】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基配列またはタンパク質と互換的に使用され、そして任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、反応（限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、またはタンパク質プロセシングを含む）を通して翻訳後修飾されたタンパク質を含む。分子がその生物学的機能活性を維持しながら、改変および変化、例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失、または挿入をポリペプチドの構造において行なうことができる。例えば、特定のアミノ酸配列の置換をポリペプチドまたはその基礎をなす核酸コード配列において行なうことができ、そして類似の特性を有するタンパク質を得ることができる。例えば、その基礎をなす核酸配列に対して部位特異的変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応媒介変異誘発を行なうことによって、アミノ酸改変を調製することができる。
【００３３】
本明細書において使用する用語「発現」は、宿主細胞内の異種核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現のレベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択される配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択される配列から転写されるｍＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞性ＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーション、またはＰＣＲによって定量することができる。選択される配列によってコードされるタンパク質を、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイ、またはタンパク質の免疫染色およびそれに続くＦＡＣＳ分析ＰＣＲによって定量することができる。
【００３４】
「発現カセット」は、転写されるべき１つ以上の遺伝子を含む構築物内の領域を規定し、ここで、セグメント内に含まれる遺伝子は、互いに作動可能に連結されており、そして単一のプロモーターから転写され、その結果、異なる遺伝子が少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物が、各々の転写単位から転写および発現され得る。各々の転写単位は、単位内に含まれる選択される配列の任意のものの転写および翻訳に必要な調節エレメントを含む。
【００３５】
用語「作動可能に連結」は、２つ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらの意図される様式でそれらが機能することを許容する方法で配置されることを意味する。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それが連結された配列の転写を制御または調節するようにシスで作用する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、必ずしもそうではないが、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は、近接しており、そして２つのタンパク質コード領域を連結するために必要である場合または分泌リーダーの場合、近接しておりそして読み枠内にある。
【００３６】
用語「選択マーカー遺伝子」は、遺伝子を保有する細胞のみが、対応する選択薬剤の存在下で特異的にそれについてまたはそれに対して選択されることを可能にする遺伝子を指す。例証として、抗生物質耐性遺伝子を、該遺伝子で形質転換された宿主細胞が対応する抗生物質の存在下でそれについて正に選択されることを可能にし；非形質転換宿主細胞は選択培養条件下で増殖または生存できない、ポジティブ選択マーカー遺伝子として使用することができる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与することによってマーカーを保有する細胞についての選択を可能にするか、または、宿主細胞における代謝または異化欠損を補う。対照的に、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保有する細胞が選択的に排除されることを可能にする。例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をマーカーとして使用することは、アシクロビルおよびガンシクロビルなどの薬剤に対して細胞を感受性にする。本明細書において使用される選択マーカー遺伝子（増幅可能な選択遺伝子を含む）は、コードされる産物が選択可能な特性を保持している限り、ネイティブな選択マーカー遺伝子の組換え操作された変異体および改変体、フラグメント、機能的等価物、誘導体、ホモログおよび融合物を含む。有用な誘導体は、一般に、選択可能な特性に関連した選択マーカーの領域またはドメインにおける実質的な配列類似性（アミノ酸レベルでの）を有する。二機能性（すなわちポジティブ／ネガティブ）マーカー（例えば、ＷＯ９２／０８７９６およびＷＯ９４／２８１４３参照）（本明細書に参照により組み入れる）を含む種々のマーカー遺伝子が記載されている。例えば、真核細胞について一般的に使用される選択遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ、アスパラギンシンセターゼの遺伝子、ならびにネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシンおよびフレオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を含む。
【００３７】
選択を、例えば、細胞表面マーカー、細菌性  −ガラクトシダーゼまたは蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびAequorea victoriaおよびRenilla reniformisまたは他の種由来のその変異体；赤色蛍光タンパク質、蛍光タンパク質、および非生物発光種（例えば、Discosoma sp.、Anemonia sp.、Clavularia sp.、Zoanthus sp.）由来のその変異体）を使用して蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって行って、組換え細胞について選択してもよい。
【００３８】
用語「選択薬剤」は、特定の選択遺伝子が欠損している宿主細胞の増殖または生存を妨害する物質を指す。例えば、トランスフェクトされた細胞においてＡＰＨ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）のような抗生物質耐性遺伝子の存在について選択するために、抗生物質ジェネテシン（Geneticin）（Ｇ４１８）が使用される。
【００３９】
バクテリオファージλのインテグラーゼ（通常そして本明細書において「Ｉｎｔ」と称する）は、ＣｒｅおよびＦｌｐと同様に、配列特異的保存的ＤＮＡリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する。その天然の機能において、Ｉｎｔは、２つの異なる組換え配列、すなわちａｔｔＢおよびａｔｔＰの間の組み込み組換えを触媒する。ａｔｔＢは、２１ヌクレオチドを含み、そして元来はE. coliゲノムから単離された；Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220。一方、２４３ヌクレオチドを有するａｔｔＰはずっと長く、そしてバクテリオファージλのゲノム中に天然に生じる；Landy, A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147。Ｉｎｔリコンビナーゼは、ａｔｔＰにおいて全部で７個の、そしてａｔｔＢにおいて２個の結合部位を有する。Ｉｎｔの生物学的機能は、E. coli染色体上の遺伝子座ａｔｔＢ中への環状ファージゲノムの配列特異的組み込みである。Ｉｎｔは、タンパク質補因子、いわゆる組み込み宿主因子（通常そして本明細書において「ＩＨＦ」と称する）を組み込み組換えのために必要とする；Kikuchi, Y. und Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149。ＩＨＦは、ａｔｔＰとの機能的組換え複合体のアセンブリに必要とされる。組み込み反応のための第２の補因子は、ａｔｔＰのＤＮＡネガティブスーパーコイリング（DNA negative supercoiling）である。最後に、ａｔｔＢとａｔｔＰとの間の組換えは、２つの新たな組換え配列、すなわちａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成を導き、これは、さらなる組換え反応、切り出し反応のための基質および認識配列として作用する。バクテリオファージλ組み込みの網羅的な概要は、例えば、Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913において与えられる。
【００４０】
細菌ゲノムからのファージゲノムの切り出しは、また、Ｉｎｔリコンビナーゼによって触媒される。このために、ＩｎｔおよびＩＨＦに加えて、バクテリオファージλによってコードされるさらなる補因子が必要とされる。これは、ａｔｔＲにおいて２つの結合部位を有するエクシジョナーゼ（excisionase）（通常そして本明細書において「ＸＩＳ」と称する）である：Gottesman, M. and Weisberg, R. (1971) The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 113。組み込み組換えとは対照的に、組換え配列のＤＮＡネガティブスーパーコイリングは、切り出し組換えのために必要ではない。しかし、ＤＮＡネガティブスーパーコイリングは、組換え反応の効率を増加させる。切り出し反応の効率のさらなる改善は、ＸＩＳと共同して作用する第２の補因子、すなわちＦＩＳ（逆転刺激因子）（factor for inversion stimulation）を用いて達成され得る；Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913。切り出しは、遺伝的に、組み込みのちょうど逆の反応であり、すなわち、ａｔｔＢおよびａｔｔＰが再び生成される。バクテリオファージλ切り出しの網羅的な概要は、例えば、Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913において与えられる。
【００４１】
本発明は、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ＊（配列番号６）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ＊（配列番号８）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）およびａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）からなる群より選択される核酸分子、またはその誘導体またはホモログに関する。
【００４２】
本発明は、特に、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ＊（配列番号６）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ＊（配列番号８）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）およびａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）からなる群より選択される核酸分子に関する。
【００４３】
本発明はさらに、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ＊（配列番号６）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ＊（配列番号８）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）を含む核酸分子、またはその誘導体またはホモログに関する。
【００４４】
本発明は、特に、ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）、ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）、ａｔｔＬ＊（配列番号６）、ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）、ａｔｔＲ＊（配列番号８）、ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）またはａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）を含む核酸分子に関する。
【００４５】
さらなる実施態様において、本発明は、核酸分子に関し、ここで、前記核酸配列は真核細胞においてＤＮＡの配列特異的組換えを媒介し、そしてここで、配列特異的組換えは、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって行なわれる。好ましい実施態様において、前記インテグラーゼＩｎｔは、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８である。さらなる好ましい実施態様において、前記インテグラーゼＩｎｔは配列番号１５を有する。
【００４６】
本発明はさらに、記載する核酸分子の任意のものを含むベクターに関する。特定の実施態様において、前記ベクターは、真核生物発現ベクターである。さらなる特定の実施態様において、前記ベクターは、プロモーターおよび／または目的の異種遺伝子および／または選択マーカーおよび／またはエンハンサーを含む。別の実施態様において、選択マーカーは、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００４７】
本発明はさらに、本発明において記載する核酸分子の任意のものを含む細胞に関し、ここで、前記核酸分子は、ゲノムまたは人工染色体またはミニ染色体またはエピソームエレメントまたはいずれかの本発明のベクターの中に組み込まれる。特定の実施態様において、前記細胞は、真核細胞、例えば酵母、植物、蠕虫、昆虫、トリ、魚、爬虫類または哺乳動物細胞である。さらなる特定の実施態様において、前記真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎ＣＶ１細胞、サル腎ＣＯＳ細胞、ヒト水晶体上皮ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞、ヒト胎児腎ＨＥＫ２９３細胞、ヒト羊膜細胞、ヒトミエローマ細胞、ベビーハムスター腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頸癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳房腫瘍またはミエローマ細胞、例えばＮＳ０、イヌ、ブタ、マカク、ラット、ウサギ、ネコおよびヤギ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。好ましい実施態様において、前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ野生型、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、好ましくはＣＨＯ ＤＧ４４である。
【００４８】
本発明はさらに、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法に関し、これは以下の工程：
ａ）第１のａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列を含むＤＮＡを細胞中に導入する工程、
ｂ）第２のａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列を細胞中に導入する工程、またはその逆、および
ｃ）バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって配列特異的組換えを行う工程
を含む。
【００４９】
前記方法の特定の実施態様において、前記第１のＤＮＡ配列はａｔｔＢ配列を含み、前記第２の配列は、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂを含むか、またはその逆である。
【００５０】
前記方法のさらなる特定の実施態様において、前記第１のＤＮＡ配列はａｔｔＰ．ｂ配列を含み、前記第２の配列は、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂを含む。
【００５１】
前記方法の好ましい実施態様において、前記第１のＤＮＡ配列はａｔｔＰ．ｂ配列を含み、そして前記第２の配列は同様にａｔｔＰ．ｂ配列を含む。
【００５２】
特定の実施態様において、前記のＤＮＡの配列特異的組換え方法は、真核細胞の人工染色体／ミニ染色体またはゲノム中に本発明による第１のａｔｔ配列が組み込まれている真核細胞において行なわれる。さらなる好ましい実施態様において、前記方法はさらに、本発明の方法による工程ｂ）およびｃ）を含む。
【００５３】
さらなる実施態様において、前記方法は、第１のａｔｔ配列が前記真核細胞のゲノムにおいて天然に生じるか、または前もって導入されていることを特徴とする。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、真核細胞において１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする少なくとも１つの目的の遺伝子を発現する方法であり、これは以下の工程：
ａ）ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列を含む第１のＤＮＡを細胞中に導入する工程、
ｂ）ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列を含む第２のＤＮＡを導入する工程、
またはその逆、および
ｃ）少なくとも１つの目的の遺伝子を細胞に中導入する工程；
ｄ）前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
ｅ）バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程であって、ここで、第２のＤＮＡが第１のＤＮＡ中に組み込まれる工程；および
ｆ）前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００５５】
好ましい実施態様において、前記方法は、前記第２のＤＮＡが前記細胞中に導入される前に、第１のＤＮＡが宿主細胞ゲノム、宿主細胞の人工染色体／ミニ染色体またはエピソームエレメント中に組み込まれていることを特徴とする。
【００５６】
本発明はさらに、バクテリオファージλＩｎｔまたはその任意の機能的変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする少なくとも１つの天然に生じる組換え配列を有する真核細胞において１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする少なくとも１つの目的の遺伝子を発現する方法に関し、これは以下の工程：
ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列および少なくとも１つの目的の遺伝子を含むＤＮＡを前記細胞中に導入する工程；
前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
前記細胞において天然に生じる組換え配列と前記細胞中に導入されたＤＮＡとの間で、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程；および
前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００５７】
本発明はさらに、バクテリオファージλＩｎｔまたはその任意の機能的変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする少なくとも１つの天然に生じる組換え配列を有する真核細胞において少なくとも１つの目的のポリペプチドを産生する方法に関し、これは以下の工程：
ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列および少なくとも１つの目的の遺伝子を含むＤＮＡを前記細胞中に導入する工程；
前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
前記細胞において天然に生じる組換え配列と前記細胞中に導入されたＤＮＡとの間で、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程；および
前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００５８】
好ましい実施態様において、前記方法は、天然に生じる配列がａｔｔＨであることを特徴とする。さらなる好ましい実施態様において、前記方法は、天然に生じる配列が配列番号１４であることを特徴とする。
【００５９】
本発明はさらに、バクテリオファージλＩｎｔまたはその任意の機能的変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする少なくとも１つの組換え配列を有する真核細胞において少なくとも１つの目的のポリペプチドを産生する方法に関し、これは以下の工程：
ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列および少なくとも１つの目的の遺伝子を含むＤＮＡを前記細胞中に導入する工程；
前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
前記細胞において天然に生じる組換え配列と前記細胞中に導入されたＤＮＡとの間で、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程；および
前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００６０】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記の所望のポリペプチド／産物が宿主細胞または細胞培養培地から単離されることを特徴とする。
【００６１】
特定の実施態様において、本発明の方法は、前記ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列が、Ｉｎｔのためのアーム結合部位の１つ以上のコピーを含むか、または、前記配列が、コアＩｎｔ結合部位の１つ以上のコピーを含むか、または、前記配列が、Ｉｎｔのためのアーム結合部位の１つ以上のコピー、およびコアＩｎｔ結合部位の１つ以上のコピーの組み合わせを含むことを特徴とする。
【００６２】
別の実施態様において、本発明の方法は、前記ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列が、コアＩｎｔ結合部位の１つ以上のコピーからなることを特徴とする。
【００６３】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列が、コアＩｎｔ結合部位の１つ以上のコピーからなるか、または、前記ａｔｔ配列の誘導体が、Ｉｎｔのためのアーム結合部位の１つ以上のコピー、およびコアＩｎｔ結合部位の１つ以上のコピーの組み合わせからなることを特徴とする。
【００６４】
特定の実施態様において、本発明の方法は、コア結合部位が９つの近接した塩基対からなり、そして、野生型ａｔｔ部位中のヌクレオチド配列５’−ＣＴＧＣＴＴＴＴＴ−３’のＢ配列、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＧＴＴＡＧＴ−３’のＢ’配列（逆相補鎖）、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＣＴＴＴＴＴ−３’のＣ配列、およびヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＣＴＴＡＧＴ−３’のＣ’配列（逆相補鎖）、または機能的ヌクレオチド置換を有する前記配列からなるＤＮＡ配列に関することを特徴とする。
【００６５】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記の配列特異的組換えが、Ｉｎｔ、およびＸＩＳ、ＦＩＳ、および／またはＩＨＦから選択される１つ以上の補因子によって行なわれることを特徴とする。
【００６６】
さらなる好ましい実施態様において、本発明の方法は、配列特異的組換えが、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｇ−ｈ／２１８によって行なわれることを特徴とする。
【００６７】
別の実施態様において、本発明の方法は、インテグラーゼまたは宿主因子をコードするｍＲＮＡが、配列特異的組換えが行なわれる宿主細胞によって同時発現されるときに、Ｉｎｔ、Ｉｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８、ＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩＨＦが、精製形態で細胞に加えられることを特徴とする。
【００６８】
さらなる実施態様において、本発明の方法は、さらに、Ｉｎｔ遺伝子、またはＩｎｔ遺伝子およびＸＩＳ遺伝子、ＦＩＳ遺伝子および／またはＩＨＦ遺伝子から選択される１つ以上の補因子遺伝子を含む第３分のまたは第３および第４のＤＮＡ配列がそれぞれ細胞中に導入されることを特徴とする。
【００６９】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、配列特異的組換えが改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８によって行なわれる場合、ＸＩＳもＦＩＳもＩＨＦも必要とされないことを特徴とする。
【００７０】
別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記の目的のポリペプチドが抗体、ホルモンまたは増殖因子であることを特徴とする。
【００７１】
特定の実施態様において、本発明の方法は、宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする。好ましい実施態様において、本発明の方法は、哺乳動物細胞がげっ歯類細胞、好ましくはマウスまたはハムスター細胞であることを特徴とする。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は、ハムスター細胞がＢＨＫまたはＣＨＯ細胞であり、そしてマウス細胞がマウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０およびＳｐ２／０細胞であることを特徴とする。
【００７２】
本発明の別の態様は、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換え方法に関し、これは以下の工程：
ａ）第１のａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ、配列またはその誘導体またはホモログを細胞中に導入する工程、
ｂ）第２のａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを細胞中に導入する工程であって、ここで、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＢ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＬ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列は、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、工程
ｃ）バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程
を含む。
【００７３】
工程ｃ）において配列特異的組換えがＩｎｔによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩＨＦによって行なわれる方法が好ましい。工程ｃ）において配列特異的組換えがＩｎｔによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳ因子によって、またはＩｎｔおよびＩＨＦによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳおよびＩＨＦによって行なわれる方法が最も好ましい。工程ｃ）において配列特異的組換えが、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８によって行なわれる方法がさらに好ましい。この関連で、改変Ｉｎｔを、ＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩＨＦと一緒に使用することも、本発明の意味の範囲内である。
【００７４】
この方法のより好ましい実施態様において、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換えは、同一またはほぼ同一の組換え部位の間で行なわれる。それゆえ、本発明は、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はまたａｔｔＰ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＰ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＬ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＬ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＬ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＬ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＲ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＲ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、上記のような配列特異的組換え方法に関する。
【００７５】
本発明の方法を、天然に生じるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列だけでなく、改変された、例えば置換されたａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列を用いても行ない得る。例えば、ａｔｔＢ（Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp.143；Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986) J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, pp 1134）および／またはａｔｔＰ（Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143）において１つ以上の置換を有する、ａｔｔＰおよびａｔｔＢの相同配列（野生型配列の変異体）間でのバクテリオファージλおよびE. coliの組み込み組換えが観察されている。
【００７６】
従って、本発明は、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、および／またはａｔｔＲ．ｂ配列が、天然に生じるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列と比較して１つ以上の置換を有する方法に関する。ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、および／またはａｔｔＲ．ｂ配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの置換を有する方法が好ましい。置換は、重複領域、コア領域、ＩＨＦ、ＦＩＳまたはＸＩＳ因子結合部位、またはＩｎｔアーム結合部位において起こり得る。７つのヌクレオチドを含む完全重複領域も置換され得る。置換が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、および／またはａｔｔＲ．ｂ配列中にコア領域または重複領域のいずれかにおいて導入される方法がより好ましい。重複領域における置換の導入、およびコア領域における１つまたは２つの置換の同時導入が好ましい。本発明はまた、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、および／またはａｔｔＲ．ｂ配列が、天然に生じるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列と比較して、前記組換え部位の誘導体またはホモログ（その機能的フラグメントを含む）である方法に関する。
【００７７】
組換え配列中への１つ以上の置換の形態の改変は、改変にもかかわらず組換えを行なうことができるように選択されるべきである。そのような置換の例は、例えば、Nash, H. (1981)（上記）およびNussinov, R. and Weisberg, R. (1986)（上記）の刊行物において列挙されており、そして限定であるとは考えられない。さらなる改変は、例えば変異誘発方法によって容易に導入され得、そして試験組換えによってその使用について試験され得る。
【００７８】
さらに、本発明は、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体またはホモログが、それぞれのコアＩｎｔ結合部位の１つのみを含む方法に関するが、しかし、２つより多いコアＩｎｔ結合部位もまた好ましい。好ましい実施態様において、本発明は、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体またはホモログが、それぞれのコアＩｎｔ結合部位の１つのみからなる方法に関する。さらなる実施態様において、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、および／またはａｔｔＲ配列またはその誘導体またはホモログは、２つ以上のコアＩｎｔ結合部位からなる。
【００７９】
本発明はさらに、使用されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、および／またはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログが、コアＩｎｔ結合部位に加えて、１個以上、好ましくは２、３、４、５個、または５個より多いＩｎｔのためのアーム結合部位のコピーを含む方法に関する。前記結合部位は、配列５’−Ｃ／ＡＡＧＴＣＡＣＴＡＴ−３’（配列番号５および９）を有するコンセンサスモチーフ、または、ヌクレオチド置換を有しそしてＩｎｔ結合に関して機能的であるその改変配列を含む。Ｉｎｔのためのアーム結合部位は、コアＩｎｔ結合部位の上流および／または下流の種々の距離に配置され得る。
【００８０】
本発明の方法を行うために、第１の組換え配列は、例えば真核細胞のゲノムまたは人工染色体／ミニ染色体における、所望の標的遺伝子座中への組み込みを可能にするさらなるＤＮＡ配列を含み得る。この組換えは、例えば、内部細胞組換え機構によって媒介される相同組換えを介して起こる。前記組換えのために、さらなるＤＮＡ配列は、標的遺伝子座のＤＮＡに相同でなければならず、そしてそれぞれａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＰ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂまたはその誘導体またはホモログの３’および５’の両方に位置しなければならない。当業者は、相同組換えが十分な蓋然性で起こるように、相同の程度がどのくらい大きくなければならないか、およびそれぞれの３’および５’配列がどのくらい長くなければならないかを知っている；Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288の総説を参照のこと。
【００８１】
しかし、第１の組換え配列を、任意の他の機構によって、真核細胞のゲノムまたは任意の人工染色体／ミニ染色体中に、例えばこれもまた内部細胞組換え事象によって媒介されるランダムな組み込みを介して、組み込むことも可能である。組み込まれるものとは異なる部位を使用した、例えばｌｏｘＰ／ＦＲＴ配列を使用することによる、配列特異的組換えを介した前記第１の組換え部位の組み込みも考えられ得る。
【００８２】
第２の組換え配列は、相同組換えを介した所望の標的遺伝子座中への組み込みのために必要なＤＮＡ配列を含んでもよい。本発明の方法のために、第１および／または第２の組換え配列の両方が、さらなるＤＮＡ配列を含み得る。両方のＤＮＡ配列がさらなるＤＮＡ配列を含む方法が好ましい。
【００８３】
さらなるＤＮＡ配列を含むかまたは含まない第１および第２の組換え配列の導入を、継続的におよび同時形質転換においての両方で行ない得、ここで、組換え配列は、２つの異なるＤＮＡ分子上に存在する。さらなるＤＮＡ配列を含むかまたは含まない第１および第２の組換え配列が、存在し、そして真核細胞中へ単一のＤＮＡ分子上で導入される方法が好ましい。さらに、第１の組換え配列が細胞中に導入され、そして第２の組換え配列が別の細胞中に導入されてもよく、ここで、細胞はその後融合される。融合という用語は、最も広い意味での生物の交差および細胞融合を意味する。
【００８４】
本発明の方法を使用して、例えば、分子内組換えにおける非直列に（indirectly）配向された組換え配列の間にあるＤＮＡセグメントを反転させ得る。さらに、本発明の方法を使用して、分子内組換えにおいて直列に配向された組換え配列の間にあるＤＮＡセグメントを欠失させ得る。組換え配列が各々５’−３’または３’−５’の配向で組み入れられる場合、それらは直列配向で存在する。例えば、ａｔｔＢ配列が５’−３’で組み込まれ、そしてａｔｔＰ配列が３’−５’配向で組み込まれる場合、組換え配列は非直列配向（indirect orientation）にある。組換え配列が、各々、例えば相同組換えを介して、エキソンの５’および３’のイントロン配列中にに組み入れられ、そして組換えがインテグラーゼによって行なわれる場合、エキソンは、それぞれ、非直列配向の組換え配列の場合には反転させられ、そして直列配向の組換え配列の場合には欠失される。この手順を用いて、それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドはその活性または機能を失い得るか、または、（完全な）転写物が生成されないように転写は反転または欠失によって停止され得る。このようにして、例えばコードされるポリペプチドの生物学的機能を研究し得る。さらに、反転または欠失反応を使用して、例えば、コードされるポリペプチドのオープンリーディングフレームの、コードされるポリペプチドの転写および／または翻訳を可能にする調節エレメントとの機能的連結によって、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を活性化し得る。これらの調節エレメントは、限定するものではないが、プロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーエレメントを含み、これらは種々の真核生物発現系のために当技術分野において周知である。
【００８５】
しかし、第１および／または第２の組換え配列は、１つ以上の目的のポリペプチド／産物をコードするさらなる核酸配列を含み得る。例えば、構造タンパク質、酵素タンパク質または調節タンパク質が、分子内組換えの後に、組換え配列を介してゲノム中に導入されて、一過性にまたは安定に発現され得る。導入されるポリペプチド／産物は、内因性または外来性のものであり得る。さらに、マーカータンパク質または生物薬剤的に関連する治療用ポリペプチドを導入してもよい。当業者は、本発明による方法の適用のこの列挙が例示にすぎず、そして限定ではないことを知っている。
【００８６】
さらに、本発明の方法を使用して、エピソーム基質上での分子内組換えによってベクター上のＤＮＡセグメントを欠失または反転させ得る。欠失反応を使用して、例えば、いわゆるヘルパーウイルスからのパッケージング配列を欠失させ得る。この方法は、遺伝子治療適用のためのウイルスベクターの工業的産生における広い適用を有する。
【００８７】
分子間組換えは、各々が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂのコピー、またはａｔｔ配列またはその誘導体またはホモログの種々の組み合わせを有する２つのＤＮＡ分子の融合を導く。例えば、ａｔｔＢまたはその誘導体またはホモログは、最初に相同組換えを介して細胞の既知の十分に特徴付けられたゲノム遺伝子座または人工染色体／ミニ染色体中に導入され得る。その後、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ保有ベクターまたはＤＮＡセグメントを、前記ゲノムａｔｔＢ配列中に分子間組換えを介して組み込み得る。真核細胞内での変異体インテグラーゼ、例えばＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８の同時発現がこの方法において好ましく、ここで、組換えが起こる。変異体インテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８の同時発現が最も好ましい。これらの変異体インテグラーゼのいずれかをコードする遺伝子は、トランスフェクト、好ましくは同時トランスフェクトされている第２のＤＮＡベクター上に、または、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたは、また、ａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを保有するベクターまたはＤＮＡセグメント上に位置し得る。さらなる配列、例えばｌｏｘＰ／ＦＲＴ配列によって隣接される特定のマーカータンパク質の遺伝子が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ保有ベクターまたはＤＮＡセグメント上に位置し得る。このアプローチを用いて、例えば、細胞型における異なる遺伝子の比較発現分析において、前記遺伝子が、それぞれのゲノム組み込み遺伝子座の正または負の影響によって影響されないことが達成され得る。さらに、本発明の方法を使用して、エピソーム基質上の分子間組換えによってベクター上のＤＮＡセグメントを融合し得る。融合反応を使用して、例えば、表現型についてスクリーニングするために、組換えタンパク質または関連ドメインを発現させ得る。この方法は、真核細胞におけるタンパク質機能のハイスループット分析において使用され得、従って、かなりの関心が持たれる。
【００８８】
上記のように、分子間組換えを使用して、１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする１つ以上の目的の遺伝子を、例えば、第１の組換え配列を含むエピソーム基質、人工染色体／ミニ染色体、または種々の宿主細胞ゲノム中に導入し得る。この関連で、第２のＤＮＡは、少なくとも１つの組換え配列、例えば、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、ａｔｔＲ．ｂまたはその任意の誘導体またはホモログの他に、１つ以上の所望のタンパク質／産物の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。発現カセットは、第２の組換え配列および発現カセットを含むＤＮＡと、前記エピソーム基質、人工染色体／ミニ染色体、または宿主細胞ゲノム中に前もって導入された第１の組換え配列との間の配列特異的組換えを可能にする組換え配列を介して、所望の標的遺伝子座中に導入され得る。この実施態様は、生物製剤製品の産生のために適切な高発現細胞株を樹立するために高い関心が持たれ得る。
【００８９】
この関連で、少なくとも１つの組換え配列を含む第１のＤＮＡは、例えばランダムな組み込みによって、宿主細胞のゲノム、宿主細胞内に含まれる人工染色体／ミニ染色体、またはエピソーム基質中に導入されなければならない。あるいは、宿主細胞は、対応する少なくとも１つの組換え部位を含む人工染色体／ミニ染色体またはエピソーム基質を用いて形質転換され得る。バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによって認識される、所望の標的遺伝子座中に組換え配列を組み込むための別の方法は、上記のような相同組換え技術を使用することである。
【００９０】
所望の標的遺伝子座中に導入された組換え配列を有する安定なトランスフェクタントの選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子を同時に同じ標的遺伝子座中に同時導入する。例えば、これは、例えば上記の任意の方法（相同組換え、ランダムな組み込みなど）によって、標的遺伝子座中に導入された、同じベクターまたはＤＮＡセグメント上に、組換え配列および選択マーカー遺伝子が同時配置される場合に達成され得る。選択マーカー遺伝子の発現レベルは、組み込み部位における転写活性と相関するので、例えばバイオリアクターにおいて、組み込みの部位における高い発現レベル、細胞の頑強性、および良好な増殖特徴を示す細胞を、非常に効果的に同定することができる。選択マーカー遺伝子の発現のレベルを、当技術分野において周知の方法によって、例えば、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、または遺伝子によってコードされるポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定することができる。例えば、導入された遺伝子配列から転写されるｍＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞性ＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーション、またはＰＣＲによって定量することができる。選択される配列によってコードされるタンパク質を、種々の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイ、タンパク質の免疫染色およびそれに続くＦＡＣＳ分析、または蛍光タンパク質の蛍光シグナルの測定によって定量することができる。そのような方法によって、生物製剤を産生するための産生細胞株の優れた候補を取得し得る。
【００９１】
組み込み組換え配列（第１の組換え配列）は、さらなるＤＮＡ分子、例えば、少なくとも１つのさらなる組換え配列（第２の組換え配列）を保有するベクターまたはＤＮＡセグメントの、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを介した、転写活性遺伝子座中への組み込みを可能にする。好ましくは、少なくとも１つの第２の組換え配列を含むそのさらなるＤＮＡ分子は、少なくとも１つの目的の生物薬剤的に関連する遺伝子の発現のための発現カセットをさらに含む。このために、好ましくは宿主細胞ゲノム中に転写活性遺伝子座で組み込まれた、第１の組み込まれた組換え配列を含む、宿主細胞を、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔのための第２の組換え配列を含むＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトし、そして第１および第２の組換え配列の間の配列特異的組換え、好ましくは第２の組換え配列を含むＤＮＡ分子の、第１の組換え配列を含む宿主細胞ゲノム中への組み込みを可能にする条件下で培養する。第１および第２の組換え配列は、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔまたはその任意の機能的変異体による配列特異的組換えを可能にする、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、ａｔｔＲ．ｂ、またはその任意の誘導体またはホモログのいずれかであり得る。例えば、第１の組換え配列がａｔｔＰまたはその誘導体またはホモログを含む場合、第２は、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａ、ａｔｔＲ．ｂ、またはその任意の誘導体またはホモログを含み得る。
【００９２】
配列特異的組換えが、Ｉｎｔによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩＨＦによって行なわれる方法が好ましい。配列特異的組換えが、Ｉｎｔによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳ因子によって、またはＩｎｔおよびＩＨＦによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳおよびＩＨＦによって行なわれる方法が最も好ましい。配列特異的組換えが、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８によって行なわれる方法がさらに好ましい。この関連で、改変ＩｎｔをＸＩＳおよび／またはＩＨＦと一緒に使用することも本発明の意味の範囲内である。
【００９３】
このアプローチによって、バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔのための第２の組換え配列を含む任意のＤＮＡ配列が、宿主細胞の既知の、十分に特徴付けられそして規定された遺伝子座中に組み込まれる。配列特異的組換えが起こった細胞を選択するために、例えば、選択マーカー遺伝子を含む非機能的発現カセット（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーなしまたは遺伝子のコード領域の部分のみ）を導入することができる。配列特異的組換えが起こった場合にのみ、選択マーカー遺伝子の効率的な発現を伴う完全なそして機能的な発現カセットが生成され、従って、配列特異的組み込みを介して目的の遺伝子が組み込まれた細胞の選択が可能になる。
【００９４】
本発明の方法によって、単に、規定された組み込み部位で（例えば、ゲノム遺伝子座中に）組み込まれたＤＮＡ配列の同一性によって、宿主細胞とは異なる産生細胞株が得られる。異なる細胞クローン間のより少ない遺伝的変動に起因して、産生細胞株の開発のためのより一般的なプロセスを使用することができ、従って、クローン選択および至適化された製造プロセスの開発のための時間および能力が低減される。産生細胞株は、所望のポリペプチドの製造のために使用され得る。
【００９５】
本発明のさらなる態様は、それゆえ、真核細胞において１つ以上の所望のポリペプチド／産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する方法に関し、これは以下の工程：
ａ）ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む第１のＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログ、および少なくとも１つの目的の遺伝子を含む第２のＤＮＡを細胞中に導入する工程；
前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行う工程であって、ここで、第２のＤＮＡは第１のＤＮＡ中に組み込まれる工程；および
前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００９６】
前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＰ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列が、ａｔｔＰ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＬ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＬ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ＊配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ．ａ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む、または、前記第１のＤＮＡ配列がａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む場合、前記第２の配列はａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログを含む方法が好ましい。
【００９７】
その方法のより好ましい実施態様において、第１のＤＮＡは、宿主細胞のゲノム、人工染色体／ミニ染色体、またはエピソームエレメント中に、好ましくは、高い転写活性を示す部位で、前記第２のＤＮＡが前記細胞中に導入される前に組み込まれている。
【００９８】
本発明はまた、宿主細胞において少なくとも１つ以上の目的の遺伝子を発現する方法に関し、ここで、前記宿主細胞は、前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれた、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログの１つを含み、これは以下の工程：
ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログ、および少なくとも１つの目的の遺伝子を含むＤＮＡを前記細胞中に導入する工程；
前記細胞をバクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔと接触させる工程；
バクテリオファージλインテグラーゼＩｎｔによる配列特異的組換えを行なう工程であって、ここで、第２のＤＮＡは第１のＤＮＡ中に組み込まれる工程；
前記細胞を目的の遺伝子が発現される条件下で培養する工程
を含む。
【００９９】
前記方法を、前記細胞の遺伝子操作によって宿主細胞ゲノム中に組み込まれたａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａ、ａｔｔＬ＊、ａｔｔＬ．ａ、ａｔｔＲ＊、ａｔｔＲ．ａまたはａｔｔＲ．ｂ配列またはその誘導体またはホモログだけでなく、Ｉｎｔまたはその任意の機能的変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする、ゲノムの天然に生じる組換え配列、例えば、ＷＯ０１／１６３４５に記載のａｔｔＨ部位（５’−ＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＴＧＴ−３’；配列番号１４）または任意の他の組換え配列を用いても行ない得る。
【０１００】
前記配列特異的組換えが、Ｉｎｔによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳ因子によって、またはＩｎｔおよびＩＨＦによって、またはＩｎｔおよびＸＩＳおよびＩＨＦによって行なわれる方法が好ましい。配列特異的組換えが、改変Ｉｎｔ、好ましくはＩｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８によって行なわれる方法がさらに好ましい。この関連で、改変ＩｎｔをＸＩＳおよび／またはＩＨＦと一緒に使用することはまた本発明の意味の範囲内である。Ｉｎｔ、Ｉｎｔ−ｈまたはＩｎｔ−ｈ／２１８、ＸＩＳ、および／またはＩＨＦは、精製形態で細胞に加えられてもよく、または、配列特異的組換えが行なわれる前記宿主細胞によって同時発現されてもよい。
【０１０１】
上記の方法のさらなる実施態様は、目的の遺伝子によってコードされそして前記宿主細胞において発現されるポリペプチド／産物が、細胞または細胞培養上清（培養培地中に分泌される場合）から単離される方法に関する。
【０１０２】
前記産生細胞は、所望の遺伝子の発現、および細胞および／または細胞培養上清からの目的のタンパク質の単離のために好都合な条件下で、優先的に無血清培地および懸濁培養物中で培養される。好ましくは、目的のタンパク質を、培養培地から分泌ポリペプチドとして回収するか、または、分泌シグナルなしで発現される場合には宿主細胞溶解物から回収することができる。目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られる方法で、目的のタンパク質を他の組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質および混入物から精製することが必要である。第１の工程として、しばしば、細胞および／または粒子状細胞片が培養培地または溶解物から除去される。その後、目的の産物は、混入可溶性タンパク質、ポリペプチド、および核酸から、例えばイムノアフィニティーまたはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上でのＳｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーによって精製される。一般に、どのようにして宿主細胞によって発現される異種タンパク質を精製するかを当業者に教義する方法は、当技術分野において周知である。それゆえ、少なくとも１つの目的の遺伝子を発現する上記の方法に、追加の精製工程を加えてもよく、ここで、所望のポリペプチドは宿主細胞または細胞培養物（培養培地中に分泌される場合）から精製される。
【０１０３】
本発明の方法を、全ての真核細胞において行ない得る。細胞および細胞株は、例えば細胞培養物中に存在してもよく、そして、限定するものではないが、真核細胞、例えば酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞を含む。例えば、細胞は、卵母細胞、胚幹細胞、造血幹細胞、または任意の型の分化細胞であってもよい。真核細胞が哺乳動物細胞である方法が好ましい。哺乳動物細胞が、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウシ、ヒツジ、またはブタ細胞である方法がより好ましい。生物製剤の産生のために好ましい細胞株または「宿主細胞」は、ヒト、マウス、ラット、サル、またはげっ歯類細胞株である。ハムスター細胞、好ましくはＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはそのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫がより好ましい。ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、およびＢＨＫ２１が特に好ましく、そしてＣＨＯ−ＤＧ４４およびＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞がさらにより好ましい。さらに、マウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０およびＳｐ２／０細胞またはそのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫もまた、産生細胞株として知られている。
【０１０４】
無血清条件下で、そして場合によりいかなる動物起源のタンパク質／ペプチドも含まない培地中で、樹立され、適応させられ、そして完全に培養される場合に、宿主細胞は最も好ましい。市販の培地、例えばＨａｍ'ｓ Ｆ１２（Sigma, Deisenhofen, Germany）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最少必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、およびタンパク質不含ＣＨＯ培地（Sigma）が例示的な適切な栄養溶液である。培地の任意のものに、必要に応じて、種々の化合物を補充してもよく、その例は、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコースまたは他の等価なエネルギー源、抗生物質、微量元素である。任意の他の必要な補充物も、当業者には公知である適切な濃度で含まれ得る。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、適切な量の血清を補充した培地を、宿主細胞の培養のために使用することもできる。選択遺伝子を発現している遺伝子改変細胞の増殖および選択のために、適切な選択薬剤が培養培地に加えられる。
【０１０５】
本発明の「所望のタンパク質／ポリペプチド」または「目的のタンパク質／ポリペプチド」は、例えば、限定するものではないが、インスリン、インスリン様増殖因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、またはＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＶＥＧＦである。エリスロポエチンまたは任意の他のホルモン増殖因子、およびアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得、そして／または治療用途または診断用途を有し得る任意の他のポリペプチドの産生も含まれる。本発明による方法を、抗体、例えばモノクローナル、ポリクローナル、多重特異性、および単鎖抗体、またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｃおよびＦｃ’フラグメント、重および軽免疫グロブリン鎖およびその定常、可変、または超可変領域、ならびに、ＦｖフラグメントおよびＦｄフラグメントの産生のためにも有利に使用することができる。
【０１０６】
Ｆａｂフラグメント（抗原結合フラグメント（Fragment antigen-binding）＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域によって一緒に保持される両方の鎖の可変領域からなる。これらは従来の抗体から、プロテアーゼ消化（例えばパパインを用いる）によって形成され得るが、類似のＦａｂフラグメントはさしあたり遺伝子操作によっても産生され得る。さらなる抗体フラグメントは、Ｆ(ａｂ'）２フラグメントを含み、これは、ペプシンを用いるタンパク質分解的切断によって調製され得る。
【０１０７】
遺伝子操作方法を使用して、重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）のみからなる、短縮された抗体フラグメントを産生することが可能である。これらはＦｖフラグメントと呼ばれる（可変フラグメント（Fragment variable）＝可変部のフラグメント（fragment of the variable part））。これらのＦｖフラグメントは、定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠いているので、Ｆｖフラグメントはしばしば安定化されている。重鎖および軽鎖の可変領域を、例えば１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の短いペプチドフラグメントによって連結することが有利である。このようにして、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬからなる単一のペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として知られている。この種のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、従来技術から公知である。
【０１０８】
近年、多量体誘導体としてのｓｃＦｖを調製するために種々のストラテジーが開発されている。これは、特に、改善された薬物動態特性および体内分布特性ならびに増加した結合力を有する組換え抗体を導くことが意図されている。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖは、多量体化ドメインとの融合タンパク質として調製された。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域またはコイルドコイル構造（らせん構造）、例えばロイシン−ジッパードメインであり得る。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用が多量体化のために使用されるストラテジーも存在する（例えば、ジアボディ（diabody）、トリボディ（tribody）およびペンタボディ（pentabody））。ジアボディによって、当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ分子中のリンカーの５〜１０アミノ酸への短縮は、鎖間ＶＨ／ＶＬ重ね合わせ（inter-chain VH/VL-superimposition）が起こるホモ二量体の形成を導く。ジアボディは、ジスルフィド架橋の組み入れによってさらに安定化され得る。ジアボディ−抗体タンパク質の例は従来技術から公知である。
【０１０９】
ミニボディによって、当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。それは、ヒンジ領域（例えば、これもまたＩｇＧ１由来である）およびリンカー領域を介してｓｃＦｖに連結されている、二量体化領域としての免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む融合タンパク質からなる。ミニボディ−抗体タンパク質の例は、従来技術から公知である。
【０１１０】
トリボディによって、当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ＶＨ−ＶＬがリンカー配列なしで直接融合されているＳｃＦｖ誘導体は、三量体の形成を導く。
【０１１１】
当業者はまた、二価、三価、または四価の構造を有し、そしてｓｃＦｖに由来する、いわゆるミニ抗体に精通している。多量体化は、二、三、または四量体コイルドコイル構造によって行なわれる。本発明の好ましい実施態様において、目的の遺伝子は、上記の所望のポリペプチドのいずれか、好ましくはモノクローナル抗体、その誘導体またはフラグメントをコードする。
【０１１２】
本発明の任意の実施態様を実施するために、インテグラーゼは組換え配列に対して作用しなければならない。第１および第２の組換え配列が導入される前に、インテグラーゼまたはインテグラーゼ遺伝子および／または補因子または補因子遺伝子、例えばＸＩＳ因子またはＸＩＳ因子遺伝子および／またはＩＨＦまたはＩＨＦ遺伝子が真核細胞中にすでに存在してもよい。それらは、第１および第２の組換え配列の導入の間に、または、第１および第２の組換え配列の導入の後に導入されてもよい。リコンビナーゼおよび宿主因子タンパク質の精製は、当技術分野において記載されている（Nash, H.A. (1983) Methods of Enzymology, 100, pp. 210；Filutowicz, M. et al. (1994) Gene, 147, pp.149）。それらが知られていない場合、細胞抽出物を使用することができ、または、例えばＩｎｔまたはＣｒｅリコンビナーゼについて記載された手順を使用して酵素を部分精製することができる。精製されたタンパク質を、標準的な技術によって、例えば注入またはマイクロインジェクションによって、またはＩＨＦについてＷＯ２００４／０４８５８４の実施例３に記載されるようなリポフェクションによって細胞中に導入することができる。あるいは、インテグラーゼまたは宿主因子をコードするｍＲＮＡを細胞中に導入することができる。配列特異的組換えのために使用されるインテグラーゼは、好ましくは、その中で反応が行なわれる細胞において発現される。その目的のために、インテグラーゼ遺伝子を含む第３のＤＮＡ配列が細胞中に導入される。配列特異的組換えが、例えばａｔｔＬ／ａｔｔＲを用いて行なわれる場合、ＸＩＳ因子遺伝子（第４のＤＮＡ配列）をさらに細胞中に導入してもよい。第３および／または第４のＤＮＡ配列が、相同組換えを介してまたはランダムに細胞の真核生物ゲノムまたは人工染色体／ミニ染色体中に組み込まれる方法が最も好ましい。第３および／または第４のＤＮＡ配列が、インテグラーゼ遺伝子および／またはＸＩＳ因子遺伝子の空間的および／または時間的発現を生じる調節配列を含む方法がさらに好ましい。
【０１１３】
この場合、空間的発現は、Ｉｎｔリコンビナーゼ、ＸＩＳ因子、および／またはＩＨＦ因子が、それぞれ、細胞型特異的プロモーターの使用によって特定の細胞型のみにおいて発現され、そしてこれらの細胞、例えば肝細胞、腎細胞、神経細胞、または免疫系の細胞においてのみ組換えを触媒することを意味する。インテグラーゼ／ＸＩＳ因子／ＩＨＦ発現の調節において、時間的発現は、特定の発生段階からまたは特定の発生段階において、または成体生物における特定の時点において活性であるプロモーターによって達成され得る。さらに、時間的発現は、誘導性プロモーターの使用によって、例えばインターフェロンまたはテトラサイクリン依存性プロモーターによって達成され得る。
【０１１４】
本発明の方法において使用されるインテグラーゼは、バクテリオファージλの野生型および改変（変異）両方のインテグラーゼであり得る。野生型インテグラーゼは補因子、すなわちＩＨＦと共に高い効率で組換え反応を行うことができるのみであるので、本発明の方法において改変インテグラーゼを使用することが好ましい。野生型インテグラーゼが本発明の方法において使用される場合、組換え反応の刺激を達成するために、ＩＨＦがさらに必要とされ得る。改変インテグラーゼは、前記インテグラーゼがＩＨＦまたは他の宿主因子、例えばＸＩＳおよびＦＩＳなしで組換え反応を行い得るように改変される。例えば、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間の組換え反応は、宿主因子の添加なしで改変Ｉｎｔによって行なわれ得る（ＷＯ２００４／０４８５８４参照）。
【０１１５】
改変ポリペプチドの生成および所望の活性についてのスクリーニングは当技術分野の水準であり、そして容易に行われ得る。例えば、改変インテグラーゼをコードする核酸配列は、インビトロでまたは細菌または真核細胞中へのコード配列の導入に際してのいずれかでインテグラーゼに転写および翻訳される任意の核酸配列を含むことが意図される。改変インテグラーゼタンパク質コード配列は、天然に生じることができ（自発的変異によって）、または、コードされるポリペプチドの生物学的機能的活性（リコンビナーゼ活性を意味する）が維持される限り、天然に生じるかまたは野生型のタンパク質の組換え操作された変異体および改変体、短縮版およびフラグメント、機能的等価物、誘導体、ホモログおよび融合物であることができる。改変リコンビナーゼが、本発明の実施例またはＷＯ０１／１６３４５の実施例３および／または結果５．２．に記載されるような基質ベクターおよび発現ベクターを用いる同時トランスフェクションアッセイにおいて測定して、野生型インテグラーゼＩｎｔの活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも１００％を有する場合に、リコンビナーゼ活性は維持されている。特定のアミノ酸配列置換を、インテグラーゼまたはその基礎をなす核酸コード配列において行うことができ、そして類似の特性を有するタンパク質を得ることができる。アミノ酸の疎水親水指数（Kyte, J. et al. (1982) J. Mol. Biol., 157, pp. 105）の使用によって機能的に等価なインテグラーゼポリペプチドを提供するアミノ酸置換を、その基礎をなす核酸配列に対して、部位特異的変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応媒介変異誘発を行なうことによって調製することができる。本発明において、野生型タンパク質と比較して改善されたリコンビナーゼ活性／組換え効率または１つ以上の宿主因子に非依存性の組換え活性を示す、変異体または改変インテグラーゼが好ましい。「野生型タンパク質」は、コードポリペプチドの、完全な、非短縮型の、非改変の、天然に生じる遺伝子を意味する。好ましい２つのＩｎｔ変異体は、Ｉｎｔ−ｈおよびＩｎｔ−ｈ／２１８と称されるバクテリオファージλインテグラーゼである；Miller et al. (1980) Cell, 20, pp. 721；Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825。Ｉｎｔ−ｈは、野生型Ｉｎｔと比較して、１７４位にグルタミン酸残基の代わりにリジン残基を含む。Ｉｎｈ−ｈ／２１８は、２１８位にグルタミン酸残基の代わりにさらなるリジン残基を含み、そしてＩｎｔ−ｈ遺伝子のＰＣＲ変異誘発によって生成された。前記の変異体は、E. coliにおいて、真核細胞において、そしてインビトロで、すなわち反応チューブ中で精製基質を用いて、補因子ＩＨＦ、ＸＩＳ、および／またはＦＩＳおよびネガティブスーパーコイリングなしで、ａｔｔＢ／ａｔｔＢ、ａｔｔＰ／ａｔｔＰ、ａｔｔＬ／ａｔｔＬ、またはａｔｔＲ／ａｔｔＲ、および全ての他の可能な組み合わせ、例えばａｔｔＰ／ａｔｔＲ、ａｔｔＬ／ａｔｔＰ、ａｔｔＬ／ａｔｔＢ、またはａｔｔＲ／ａｔｔＢまたはその誘導体またはホモログの間の組換えを触媒し得る。組換えの効率の改善は、補因子、例えばＦＩＳを用いて達成され得る。変異体Ｉｎｔ−ｈ／２１８が好ましい。なぜなら、この変異体は、増加した効率で組換え反応を触媒するからである。
【０１１６】
第１の反応が切り出しを導き、そして使用される２つの組換え配列が同一である場合（例えばａｔｔＰ．ｂ／ａｔｔＰ．ｂ）、組換え後に生じる組換え配列は基質上のものと同一であり、例えばここでは２つのａｔｔＰ．ｂ配列である。しかし、２つのパートナー配列が異なる場合（例えばａｔｔＰ．ｂ／Ｒ）、組換え反応は、一方の配列（例えばａｔｔＰ．ｂ）からの機能的な半分１つおよび他方（ａｔｔＲ）からの半分１つを含むハイブリッド組換え配列を生成する。機能的な半分の組換え部位を、重複の５’または３’のいずれかの配列として規定することができ、ここで、重複は、各々の場合で、機能的な半部位（half-site）の一部と考えられる。使用される組換え配列のそれぞれの重複領域が同一である場合、本発明による任意の組換え配列を用いて切り出し反応が行われ得る。さらに、重複領域は、互いに対する組換え配列の配向（すなわち逆または直列）も指定する。反応は、野生型Ｉｎｔを用いて低い効率のみで行なわれ得るが、しかし、ＩＨＦの添加、または、ＩＨＦの非存在下でのコア結合部位に加えてのアーム結合部位の存在は、効率を刺激し、そして増加させる。反応は、いかなる補因子もなしに改変Ｉｎｔによって行われ得る。
【０１１７】
さらに、Ｘｉｓ因子遺伝子を含むさらなるＤＮＡ配列が細胞中に導入される方法が好ましい。さらなるＤＮＡ配列が、Ｘｉｓ因子遺伝子の空間的および／または時間的発現を生じさせる調節ＤＮＡ配列をさらに含む方法が最も好ましい。
【０１１８】
例えば、特定の細胞型における遺伝子の活性化／不活性化を導くＩｎｔによる首尾よい組み込み分子間組換え（反転）の後に、前記遺伝子を、Ｉｎｔの同時発現を用いる誘導性の空間的および／または時間的なＸＩＳの発現によって、より後の時点で再度不活性化または活性化させ得る。
【０１１９】
さらに、本発明は、真核細胞におけるＤＮＡの配列特異的組換えにおける、任意の組換え配列またはその誘導体またはホモログ、例えば配列番号３において特定されるａｔｔＰ．ｂの誘導体またはホモログの使用に関する。真核細胞は、その細胞中にインテグラーゼまたはＸｉｓ因子を有しない生物、例えば哺乳動物または植物の細胞凝集物中に存在してもよい。前記生物を、その細胞中にインテグラーゼまたはＸｉｓ因子を有する他の生物との繁殖のために使用して、配列特異的組換えが子孫の細胞中で行なわれる子孫が生成されるようにし得る。従って、本発明はまた、真核細胞における配列特異的組換えにおけるインテグラーゼまたはインテグラーゼ遺伝子およびＸｉｓ因子またはＸｉｓ因子遺伝子およびＩＨＦ因子またはＩＨＦ因子遺伝子の使用に関する。さらに、本発明は、本発明の方法が行なわれた真核細胞および細胞株に関し、ここで、前記細胞または細胞株は、本発明の方法を行った後に得られる。
【０１２０】
本発明の実行は、別段示さない限り、当業者の技量内にある、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの従来技術を用いる。これらの技術は、現在の文献に十分に開示されている。本明細書において言及する全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の技量のレベルを示している。本発明が関連する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書において引用する全ての刊行物および特許出願の全体を本明細書に参照により組み入れる。一般的に上記した発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は、単に本発明の特定の実施態様の例証の目的のために本明細書に含まれており、そしていかにしても本発明を限定することは意図されない。
【０１２１】
実施例
方法
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ−ＤＧ４４／Ｄｈｆｒ−／−細胞（Urlaub, G. et al., (1983), Cell, 33, pp. 405）を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を補充した無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen GmbH, Karlsruhc, DE）中で懸濁して永久的に増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で細胞培養フラスコ中でインキュベートする。細胞数および細胞生存度を、Ｃｅｄｅｘ（Innovatis）を介して決定する。細胞を２〜３日毎に新鮮な培地中で１〜３×１０５細胞/mLの濃度で播種する。
【０１２２】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の一過性トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬（Invitrogen）を使用して行なう。トランスフェクションあたり、０．８mLヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）補充ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中６×１０５個の指数関数的に増殖中の細胞を、６ウェルチャンバーのウェル中に播種する。製造業者のプロトコルに従って、２００μLの容量中のプラスミドＤＮＡ、４μLのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび６μLのＰｌｕｓ試薬の混合物を、各々のトランスフェクションのために生成し、そして細胞に加える。３時間のインキュベーションの後、２mLのＨＴ補充ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加える。
【０１２３】
トランスフェクトしたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からのプラスミドＤＮＡの単離
プラスミドＤＮＡ単離のための細胞を、トランスフェクションの４８時間後に収集し、そして細胞（１．５mLの細胞懸濁物）をマイクロ遠心分離機中７０００rpmでの１分間の遠心分離によってペレット化する。細胞溶解およびプラスミドＤＮＡの抽出のために、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐを、製造業者（Qiagen）のプロトコルに従って使用する。プラスミドＤＮＡを、１００μLのＥＢ緩衝液中に溶出する。
【０１２４】
ＰＣＲ
トランスフェクトした細胞プールから抽出した単離したプラスミドＤＮＡをＰＣＲにおける鋳型として作用させて、分子間組換えを検出する。反応計画は以下の通りである：
１．０μLのプラスミドＤＮＡ
０．５μLのプライマーＣＥＮｆｏｒ２（１０μM；配列番号１５）
０．５μLのプライマーＺｓＧｒｅｖ１（１０μM；配列番号１６）
１０．５μLのｄＨ２Ｏ
１２．５μLの２×ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Promega)
【０１２５】
９４℃で３０秒間の最初の変性、続いて３０サイクルの変性（９４℃、１０秒間）、アニーリング（６０℃、１０秒間）および伸長（７２℃、３０秒間）、および７２℃で５分間の最後の伸長工程。各ＰＣＲ試料の５μLを２％アガロースゲルにロードし、そして電気泳動によって分離する。
【０１２６】
ベクター系
ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ：ＣＭＶプロモーターおよび連続してａｔｔＰ配列（配列番号２）を含む
ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ：ＣＭＶプロモーターおよび連続してａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）を含む
ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ａ：ＣＭＶプロモーターおよび連続してａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）を含む
ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ：ＣＭＶプロモーターおよび連続してａｔｔＬ配列（配列番号１２）を含む
ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ．ａ：ＣＭＶプロモーターおよび連続してａｔｔＬ変異体ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）を含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＢ配列（配列番号１）と共に含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ｂ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）と共に含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ａ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）と共にを含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＲ配列（配列番号１３）と共に含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ａ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）と共に含む
ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ｂ：開始コドンの上流に、プロモーターなしの蛍光緑色タンパク質をａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）と共に含む
ｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎ：陽性対照およびトランスフェクション効率の決定用；
ＣＭＶプロモーターの制御下で蛍光緑色タンパク質を発現する
ｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８：ＣＭＶプロモーターの制御下でλインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８を発現する
ｐＩＨＦ：ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター（ニワトリ）の制御下でＣ末端Ｈｉｓ−ＴａｇとともにＩＨＦを発現する
ｐＢＩ／ＴＩ−Ｘ：ＣＭＶエンハンサー／ＵｂＳ２７ａプロモーター（ハムスター）の制御下でＸＩＳ（切り出し因子）を発現する
【０１２７】
実施例１：ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂを使用する分子間組換え
ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）は、ａｔｔＰ野生型配列（配列番号２）と比較して９個の置換を含む。これは、９６．３％の配列相同性と等価である（図１）。
【０１２８】
【表１】
2011504741.tif 000003
【０１２９】
９個の置換は、ＩＨＦ、ＸＩＳ、ＦＩＳおよびＩｎｔのための結合部位中に位置するので、ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂが、無血清培養条件下で懸濁物適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において別の組換え部位と依然として組み換えることができるかどうかを試験する。組換え反応の触媒作用のために、λインテグラーゼ、特にＩｎｔ−ｈ／２１８インテグラーゼを使用する。
【０１３０】
最初に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８およびＩＨＦコードプラスミドを用いてトランスフェクトする。３つの異なる型のトランスフェクト細胞プールを生成する：
−  細胞プールあたり各１μgのｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８を使用したトランスフェクション
−  細胞プールあたり各１４５０ngのｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８および６００ngのｐＩＨＦを使用したトランスフェクション
−  プラスミドの添加なしのモックトランスフェクト細胞プール（バックグラウンド蛍光のための対照として作用する）
【０１３１】
第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞プールを、組換え配列を含む、以下の基質ベクターの組み合わせを使用して再度トランスフェクトする：
ａ）ｐＢＩ２６／ＺｓＧｒｅｅｎ（＝陽性対照として作用する）（５００ng）
ｂ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（５００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（５００ng）
ｃ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（５００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（５００ng）
ｄ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（５００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ｂ（５００ng）
【０１３２】
全てのプラスミドの組み合わせを、上記に列挙するトランスフェクト細胞プールの組み合わせの各々の中に挿入し、ここで、組み合わせあたり各々６個のプールをトランスフェクトする。バックグラウンド蛍光を測定するための陰性対照として作用するモックトランスフェクト細胞についてのみ、基質ベクターの組み合わせあたり２個のみのプールをトランスフェクトする。
【０１３３】
第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）を使用して分析する。データの分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用して行う。
【０１３４】
陽性対照ベクターｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを用いてトランスフェクトした細胞プールにおける蛍光細胞の割合を測定することによって決定したトランスフェクション効率は、無血清培地中の懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において２０％〜２５％である。
【０１３５】
それぞれａｔｔＰおよびａｔｔＢ、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢ、またはａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ｂの組換え配列の間の首尾よい分子間組み込み組換えの結果として、蛍光タンパク質は、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれるはずである。結果として生じる蛍光タンパク質の発現は、組換え事象のためのリポーターとして作用する。
【０１３６】
基質ベクタートランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢの間で、また、ａｔｔＰ．ｂの対の間で、首尾よい分子間組換え事象が存在することを示す（図２参照）。
【０１３７】
細胞を最初に、インテグラーゼおよびＩＨＦ発現ベクターの組み合わせを使用してトランスフェクトする実験計画における蛍光細胞の割合は、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の分子間組換えについては平均で１．２％であり、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ｂ基質ベクターの間の組換えについては１．５％であり、そしてａｔｔＰおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の分子間組換えについては１．７％である。細胞を単にインテグラーゼ発現ベクターを用いて事前トランスフェクトした実験計画については、蛍光細胞の部分はより低かった。それは、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の分子間組換えについては平均で細胞の０．３％であり、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ｂ基質ベクターの間の組換えについては０．４％であり、そしてａｔｔＰおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の分子間組換えについては１．１％であった。上記の全ての場合で、対応するプラスミドを使用したが、λインテグラーゼおよびＩＨＦをコードするプラスミドを加えることなしにトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。驚くべきことに、ａｔｔＰ．ｂ変異体は、置換がＩＨＦ、ＸＩＳ、ＦＩＳおよびＩｎｔのための結合部位中に位置しているにもかかわらず、ａｔｔＢ配列とのそしてまた別のａｔｔＰ．ｂ配列との部位特異的組換えを依然として媒介することができた。
【０１３８】
実施例２：ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａおよびａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ野生型を使用する分子間組換え
ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ａ（配列番号４）は、ａｔｔＰ野生型配列（配列番号２）と比較して９個の置換を含む。これは９６．３％の配列相同性と等価である（図３）：
【０１３９】
【表２】
2011504741.tif 000004
【０１４０】
ａｔｔＰ変異体ａｔｔＰ．ｂ（配列番号３）は、ａｔｔＰ野生型配列（配列番号２）と比較して９個の置換を含む。これは９６．３％の配列相同性と等価である（図１）：
【０１４１】
【表３】
2011504741.tif 000005
【０１４２】
置換は、ＩＨＦ、ＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩｎｔのための結合部位中に位置するので、ａｔｔＰ変異体が、無血清培養条件下で懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において同一の第２のａｔｔＰ変異体を用いて依然として組換えることができるかどうかを試験する。組換え反応の触媒作用のために、λインテグラーゼ、特にＩｎｔ−ｈ／２１８インテグラーゼを使用する。
【０１４３】
懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、無血清培地中で、組換え配列を含む、以下の基質ベクターの組み合わせ（各々３つの細胞プール）を用いてトランスフェクトした：
ａ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ｂ（２００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ｂ（２００ng）
ｂ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ．ａ（２００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ．ａ（２００ng）
ｃ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（２００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＰ（２００ng）
【０１４４】
全ての場合で、細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８をコードするプラスミドｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８（３００ng）を用いて同時トランスフェクトした。
【０１４５】
トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）を使用して分析する。データの分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用して行う。
【０１４６】
それぞれ、ａｔｔＰ．ｂ、ａｔｔＰ．ａまたはａｔｔＰ組換え配列対の間での首尾よい分子間組み込み組換えの結果として、蛍光タンパク質はＣＭＶプロモーターの制御下に置かれるはずである。結果として生じる蛍光タンパク質の発現は、組換え事象のためのリポーターとして作用する。
【０１４７】
基質ベクタートランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析は、野生型ａａｔＰ対間だけでなく、ａｔｔＰ．ｂおよびａｔｔＰ．ａ対間でも首尾よい分子間組換え事象が存在することを示す（図４参照）。
【０１４８】
蛍光細胞の割合は、ａｔｔＰ．ｂ基質ベクター対の間の分子間組換えについては平均で細胞の２％を、ａｔｔＰ．ａ基質ベクター対の間の分子間組換えについては細胞の１．９％を、そしてａｔｔＰ基質ベクター対の間の分子間組換えについては細胞の１．９％を占める（各々３個のトランスフェクト細胞プールからの平均値）。
【０１４９】
上記の全ての場合で、対応するプラスミドの組み合わせを使用したが、λインテグラーゼを発現するプラスミドではなくモックプラスミドとしての空のベクター（３００ng）を加えてトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。
【０１５０】
驚くべきことに、全てのａｔｔＰ変異体は、置換がＩＨＦ、ＸＩＳ、ＦＩＳおよび／またはＩｎｔのための結合部位中に位置しているにもかかわらず、部位特異的組換えを依然として媒介することができた。
【０１５１】
実施例３：ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＬおよびａｔｔＲ変異体の間の分子間組換え
以下に示すａｔｔＬ変異体ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）は、ａｔｔＬ野生型配列（配列番号１２）と比較して１個の置換を含む。これは９９％の配列相同性と等価である（図５）：
【０１５２】
【表４】
2011504741.tif 000006
【０１５３】
以下に示すａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）は、ａｔｔＲ野生型配列（配列番号１３）と比較して８個の置換を含む。これは９５．１％の配列相同性と等価である（図６）：
【０１５４】
【表５】
2011504741.tif 000007
【０１５５】
以下に示すａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）は、ａｔｔＲ野生型配列（配列番号１３）と比較して８個の置換を含む。これは９５．１％の配列相同性と等価である（図６）：
【０１５６】
【表６】
2011504741.tif 000008
【０１５７】
種々のａｔｔＬ組換え部位が、無血清培養条件下で懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において種々のａｔｔＲ組換え部位と組み換えることができるかどうかを試験する。組換え反応の触媒作用のために、λインテグラーゼ、特にＩｎｔ−ｈ／２１８インテグラーゼを使用する。
【０１５８】
最初に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８、ＩＨＦコードおよびＸＩＳコードプラスミドを用いてトランスフェクトする。２つの異なる型のトランスフェクト細胞プールを生成する：
ａ）細胞プールあたり各々４００ngのｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、４００ngのｐＩＨＦ、および４００ngのｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを使用したトランスフェクション
ｂ）プラスミドの添加なしのモックトランスフェクト細胞プール（バックグラウンド蛍光のための対照として作用する）
【０１５９】
第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞プールを、等モル量の組換え配列を含む、以下の基質ベクターの組み合わせを使用して再度トランスフェクトする：
ａ）ｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎ（＝陽性対照として作用する）（６５０ng）
ｂ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ（３５０ng）
ｃ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ．ａ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ａ（３５０ng）
ｄ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ．ａ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ｂ（３５０ng）
【０１６０】
全てのプラスミドの組み合わせを、上記に列挙するトランスフェクト細胞プールの組み合わせの各々の中に挿入し、ここで、組み合わせあたり各々３個のプールをトランスフェクトする。バックグラウンド蛍光を測定するための陰性対照として作用するモックトランスフェクト細胞について、基質ベクターの組み合わせあたり１個のみのプールをトランスフェクトする。
【０１６１】
第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞の半分をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）を使用して分析する。データの分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用して行う。
【０１６２】
陽性対照ベクターｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを用いてトランスフェクトした細胞プールにおける蛍光細胞の割合を測定することによって決定したトランスフェクション効率は、無血清培地中の懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において平均で２３．８％である。
【０１６３】
それぞれａｔｔＬおよびａｔｔＲ、ａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＲ．ａ、またはａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＲ．ｂの組換え配列の間の首尾よい分子間組み込み組換えの結果として、蛍光タンパク質は、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれるはずである。結果として生じる蛍光タンパク質の発現は、組換え事象のためのリポーターとして作用する。
【０１６４】
基質ベクタートランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析は、試験シリーズにおける全ての組み合わせの間に首尾よい分子間組換え事象が存在することを示す（図７）。
【０１６５】
蛍光細胞の割合は、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ基質ベクターの間の分子間組換えについては平均で３．２％であり、ａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＲ．ａ基質ベクターの間の分子間組換えについては２．３％であり、そしてａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＲ．ｂ基質ベクターの間の分子間組換えについては１．２％である。上記の全ての場合で、対応するプラスミドを使用したが、λインテグラーゼ、ＩＨＦおよびＸＩＳをコードするプラスミドを加えることなしにトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。２３．８％の平均トランスフェクション効率に基づいて、トランスフェクトした細胞の５〜１３％が、野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ基質ベクター間だけでなく、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ変異体を含む基質ベクター間でも首尾よい分子間組換えを示す。平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光（Ｘ−平均）はかなり増加し、そして基質ベクターの対を用いてトランスフェクトした細胞プールについて９６〜２１６の範囲である（図７）。これと比較して、陰性対照（モックトランスフェクト細胞、プラスミド添加なし）は１３の平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光を有し、そしてｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを用いてトランスフェクトした陽性対照細胞は平均で７３３の平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光を有する。
【０１６６】
首尾よい分子間組換えの検証のために、トランスフェクト細胞プールから単離したプラスミドＤＮＡに対するＰＣＲを、プライマーの組み合わせＣＥＮｆｏｒ２（配列番号１５）およびＺｓＧｒｅｖ１（配列番号１６）を使用して行なう。基質ベクターの対の間の首尾よい分子間組換えの場合、ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔ−ベクター上に位置するＺｓＧｒｅｅｎは、それらの間の対応する付着部位で、ｐＢＩ−２６／ａｔｔ−ベクター上に位置するＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下になる。結果として、上記のプライマーを用いたＰＣＲ産物は、首尾よい組換え事象の場合にのみ生じるはずである。そして実際、ｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、ｐＩＨＦおよびｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを用いて事前トランスフェクトし、続いて、基質ベクターの対を用いて第２のトランスフェクションをした全ての細胞プールにおいて、３８０ｂｐの予想されたＰＣＲ産物が検出される。基質ベクターの対を用いた第２のトランスフェクションにおいてトランスフェクトしたモック事前トランスフェクト細胞プールにおいてはＰＣＲ産物は得られない。
【０１６７】
実施例４：ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＬおよびａｔｔＢ変異体およびａｔｔＰおよびａｔｔＲ変異体の間の分子間組換え
以下に示すａｔｔＬ変異体ａｔｔＬ．ａ（配列番号７）は、ａｔｔＬ野生型配列（配列番号１２）と比較して１個の置換を含む。これは９９％の配列相同性と等価である（図５）：
【０１６８】
【表７】
2011504741.tif 000009
【０１６９】
以下に示すａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ａ（配列番号１０）は、ａｔｔＲ野生型配列（配列番号１３）と比較して８個の置換を含む。これは９５．１％の配列相同性と等価である（図６）：
【０１７０】
【表８】
2011504741.tif 000010
【０１７１】
以下に示すａｔｔＲ変異体ａｔｔＲ．ｂ（配列番号１１）は、ａｔｔＲ野生型配列（配列番号１３）と比較して８個の置換を含む。これは９５．１％の配列相同性と等価である（図６）：
【０１７２】
【表９】
2011504741.tif 000011
【０１７３】
無血清培養条件下で懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において、ａｔｔＰがａｔｔＲ変異体と、そしてａｔｔＢがａｔｔＬ変異体と組換えることができるかどうかを試験する。組換え反応の触媒作用のために、λインテグラーゼ、特にＩｎｔ−ｈ／２１８インテグラーゼを使用する。
【０１７４】
最初に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８、ＩＨＦコードおよびＸＩＳコードプラスミドを用いてトランスフェクトする。２つの異なる型のトランスフェクト細胞プールを生成する：
ａ）細胞プールあたり各々４００ngのｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、４００ngのｐＩＨＦ、および４００ngのｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを使用したトランスフェクション
ｂ）プラスミド添加なしのモックトランスフェクト細胞プール（バックグラウンド蛍光のための対照として作用する）
【０１７５】
第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞プールを、等モル量で組換え配列を含む、以下の基質ベクターの組み合わせを使用して再度トランスフェクトする：
ａ）ｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎ（＝陽性対照として作用する）（６５０ng）
ｂ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（３５０ng）
ｃ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ．ａ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（３５０ng）
ｄ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ（３５０ng）
ｅ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ａ（３５０ng）
ｆ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＰ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＲ．ｂ（３５０ng）
【０１７６】
全てのプラスミドの組み合わせを、上記に列挙するトランスフェクト細胞プールの組み合わせの各々の中に挿入し、ここで、組み合わせあたり各々３個のプールをトランスフェクトする。バックグラウンド蛍光を測定するための陰性対照として作用するモックトランスフェクト細胞について、基質ベクターの組み合わせあたり１個のみのプールをトランスフェクトする。
【０１７７】
第２のトランスフェクションの４８時間後に、細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）を使用して分析する。データの分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用して行う。
【０１７８】
陽性対照ベクターｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを用いてトランスフェクトした細胞プールにおける蛍光細胞の割合を測定することによって決定したトランスフェクション効率は、無血清培地中の懸濁適応させたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において平均で２２％である。
【０１７９】
それぞれａｔｔＬおよびａｔｔＢ、ａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＢ、ａｔｔＰおよびａｔｔＲ、ａｔｔＰおよびａｔｔＲ．ａ、またはａｔｔＰおよびａｔｔＲ．ｂの組換え配列の間の首尾よい分子間組み込み組換えの結果として、蛍光タンパク質は、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれるはずである。結果として生じる蛍光タンパク質の発現は、組換え事象のためのリポーターとして作用する。
【０１８０】
驚くべきことに、基質ベクタートランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析は、試験シリーズにおけるａｔｔＬおよびａｔｔＢ変異体およびａｔｔＲおよびａｔｔＰ変異体の非古典的交差組換えの間に首尾よい分子間組換え事象が存在することを示す（図８）。
【０１８１】
蛍光細胞の割合は、ａｔｔＬおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の分子間組換えについては平均で２．３％であり、ａｔｔＬ．ａおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の組換えについては２％であり、ａｔｔＰおよびａｔｔＲ基質ベクターの間の組換えについては２．３％であり、ａｔｔＰおよびａｔｔＲ．ａ基質ベクターの間の組換えについては１．５％であり、そしてａｔｔＰおよびａｔｔＲ．ｂ基質ベクターの間の組換えについては１．１％である。上記の全ての場合で、対応するプラスミドを使用したが、λインテグラーゼ、ＩＨＦおよびＸＩＳをコードするプラスミドを加えることなしにトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析に基づいてバックグラウンド蛍光をまず差し引いた。２２％の平均トランスフェクション効率に基づいて、トランスフェクト細胞の５〜１０．５％が、ａｔｔＬおよびａｔｔＢの変異体の基質ベクターの間だけでなく、ａｔｔＰおよびａｔｔＲ変異体を含む基質ベクターの間でも首尾よい分子間組換えを示す。平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光（Ｘ−平均）はかなり増加し、そして基質ベクターの対を用いてトランスフェクトした細胞プールについて６５〜４０３の範囲である（図８）。これと比較して、陰性対照（モックトランスフェクト細胞、添加プラスミドなし）は１５の平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光を有し、そしてｐＢＩ−２６／ＺｓＧｒｅｅｎを用いてトランスフェクトした陽性対照細胞は平均で６４０の平均相対ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光を有する。
【０１８２】
実施例５：ＰＣＲ方法によるＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるａｔｔＬおよびａｔｔＢ変異体の間の分子間組換えの検証
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、λインテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８、ＩＨＦコードおよびＸＩＳコードプラスミドを用いてトランスフェクトする。２つの異なる型のトランスフェクト細胞プールを生成する：
ｃ）細胞プールあたり各々４００ngのｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、４００ngのｐＩＨＦ、および４００ngのｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを使用したトランスフェクション
ｄ）プラスミドの添加なしのモックトランスフェクト細胞プール（バックグラウンド蛍光のための対照として作用する）
【０１８３】
第１のトランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞プールを、組換え配列を含む、以下の基質ベクターの組み合わせを使用して再度トランスフェクトする：
ａ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（３５０ng）
ｂ）ｐＢＩ−２６／ａｔｔＬ．ａ（６００ng）＋ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔＢ（３５０ng）
【０１８４】
全てのプラスミドの組み合わせを、上記に列挙するトランスフェクト細胞プールの組み合わせの各々の中に挿入し、ここで、組み合わせあたり各々３個のプールをトランスフェクトする。バックグラウンド蛍光を測定するための陰性対照として作用するモックトランスフェクト細胞についてのみ、基質ベクターの組み合わせあたり１個のみのプールをトランスフェクトする。
【０１８５】
第２のトランスフェクションの４８時間後に、プラスミドＤＮＡをトランスフェクト細胞プールから単離する。ａｔｔＬおよびａｔｔＢ基質ベクターの間の首尾よい分子間組換えの検証のために、単離したプラスミドＤＮＡに対するＰＣＲをプライマーの組み合わせＣＥＮｆｏｒ２（配列番号１５）およびＺｓＧｒｅｖ１（配列番号１６）を使用して行なう。基質ベクターの対の間の首尾よい分子間組換えの場合、ｐＺｓＧｒｅｅｎ／ａｔｔベクター上に位置するＺｓＧｒｅｅｎは、それらの間の対応する付着部位で、ｐＢＩ−２６／ａｔｔベクター上に位置するＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下になる。結果として、上記のプライマーを用いたＰＣＲ産物は、首尾よい組換え事象の場合にのみ生じるはずである。そして実際、ｐＣＭＶ ＳＳ Ｉｎｔｈ２１８、ｐＩＨＦおよびｐＢＩ／ＴＩ−Ｘを用いて事前トランスフェクトし、続いて、基質ベクターの対を用いて第２のトランスフェクションをした全ての細胞プールにおいて、約４００ｂｐの予想されたＰＣＲ産物が検出される（図９）。基質ベクターの対を用いた第２のトランスフェクションにおいてトランスフェクトしたモック事前トランスフェクト細胞プールにおいてはＰＣＲ産物は得られない。プライマー
【０１８６】
配列の表：
配列番号１    ａｔｔＢ（E. coli）
配列番号２    ａｔｔＰ（バクテリオファージλＤＮＡ）
配列番号３    ａｔｔＰ．ｂ（人工）
配列番号４    ａｔｔＰ．ａ（人工）
配列番号５    結合部位コンセンサスモチーフ
配列番号６    ａｔｔＬ＊（人工）
配列番号７    ａｔｔＬ．ａ（人工）
配列番号８    ａｔｔＲ＊（人工）
配列番号９    結合部位コンセンサスモチーフ
配列番号１０  ａｔｔＲ．ａ（人工）
配列番号１１  ａｔｔＲ．ｂ（人工）
配列番号１２  ａｔｔＬ（E. coli）
配列番号１３  ａｔｔＲ（E. coli）
配列番号１４  ａｔｔＨ（homo sapiens ＤＮＡ）
配列番号１５  プライマーＣＥＮｆｏｒ２
配列番号１６  プライマーＺｓＧｒｅｖ１
【図１】
2011504741.tif 000012
【図２】
2011504741.tif 000013
【図３】
2011504741.tif 000014
【図４】
2011504741.tif 000015
【図５】
2011504741.tif 000016
【図６】
2011504741.tif 000017
【図７】
2011504741.tif 000018
【図８】
2011504741.tif 000019
【図９】
2011504741.tif 000020
【配列表】
2011504741000001.app
【国際調査報告】
2011504741.tif 000021
2011504741.tif 000022
2011504741.tif 000023
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