(57)【要約】本発明は、ＧＭ９８（また、ＭＲＦとしても公知である）の発現および活性を調節することにより、再有髄化を調節し、希突起膠細胞の分化を促進するための組成物および方法を提供する。本明細書ではまた、神経障害を治療し、生物活性剤をスクリーニングするための組成物および方法も提供される。本発明は、ＭＲＦの発現および／または活性を調節する方法および組成物を提供する。本明細書では、ＭＲＦにより調節される遺伝子の発現および活性もまた説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＲＦまたはその機能的な変異体をコードする核酸配列に作動的に連結された細胞型特異的な発現調節エレメントを含む、単離核酸分子。
【請求項２】
前記細胞型が神経細胞である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記神経細胞が神経膠細胞である、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５、または６に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、または６に記載の前記単離核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項９】
ＭＲＦ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、エキソンの欠失を含む、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記エキソンが、エキソン８である、請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、リコンビナーゼ部位に隣接する、請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記動物が、リコンビナーゼ導入遺伝子を含む、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記リコンビナーゼ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐである、請求項１３または１４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記細胞型が神経細胞である、請求項１０または１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記神経細胞が神経膠細胞である、請求項１７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、請求項１８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、請求項１７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項１０または１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記動物が哺乳動物である、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
前記動物がマウスまたはラットである、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２４】
被験体における神経障害を治療するための組成物であって、前記被験体におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
【請求項２５】
被験体における再有髄化を促進するための組成物であって、前記被験体におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
【請求項２６】
幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進するための組成物であって、前記幹細胞におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
【請求項２７】
希突起膠細胞の分化を誘導する第２の生物活性剤をさらに含む、請求項２４、２５、または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第２の生物活性剤が、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記神経障害が脱髄を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記神経障害が多発性硬化症を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、請求項２４、２５、または２６に記載の組成物。
【請求項３２】
被験体における神経障害を治療する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
被験体における再有髄化を促進する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進する方法であって、ＭＲＦ活性を調節し、これにより、前記幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進する生物活性剤を、前記幹細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項３５】
希突起膠細胞への分化を誘導する第２の生物活性剤を投与または導入するステップをさらに含む、請求項３２、３３、または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の生物活性剤を投与または導入するステップが、ＭＲＦの活性を調節する前記生物活性剤を投与するステップの前であるか、これと同時であるか、またはこの後である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の生物活性剤が、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の生物活性剤を投与するステップが、相乗効果を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経障害が脱髄を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記神経障害が多発性硬化症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、請求項３２、３３、または３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体が、マウス、ラット、またはヒトである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項４３】
ＭＲＦ活性を調節するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験細胞を、前記候補生物活性剤と接触させるステップと、
（ｂ）対照動物と比較したＭＲＦの発現レベルの変化についてアッセイするステップと
を含む方法。
【請求項４４】
動物における有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補生物活性剤を動物に投与するステップと、
（ｂ）対照動物と比較したＭＲＦの発現レベルの上昇についてアッセイするステップであって、ここで、前記上昇は、前記生物活性剤が前記動物における有髄化を促進することを示すステップと
を含む方法。
【請求項４５】
動物における再有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補生物活性剤を、ＭＲＦ導入遺伝子を含む動物に投与するステップ；
（ｂ）対象動物と比較した、表１中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの上昇についてアッセイするステップであって、ここで、前記上昇は、前記生物活性剤が前記動物における再有髄化を促進することを示すステップ；および／または
（ｃ）対象動物と比較した、前記動物における有髄化の変化を観察するステップ
を含む方法。
【請求項４６】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、エキソンの欠失を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記エキソンが、エキソン８である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、リコンビナーゼ部位に隣接する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記リコンビナーゼ部位が、ｌｏｘＰまたはＦＲＴである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記動物が、リコンビナーゼ導入遺伝子を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記リコンビナーゼ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐである、請求項４８または５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞型が神経細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記神経細胞が神経膠細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記動物がマウスである、請求項４４または４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、請求項４２、４３、または４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２００８年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０８１，２７９号および２００８年１２月５日に出願された同第６１／１２０，３０７号の利益を主張し、これらの両出願は本明細書においてその全体が援用される。
【０００２】
本出願は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＲＯ１  ＥＹ１０２５７の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）とは、発現の再発−寛解パターンから慢性−進行性パターンまでの範囲にわたる臨床的障害を伴う、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳの病因は未知であるが、自己反応性のＣＤ４＋  Ｔ細胞反応がミエリンおよび希突起膠細胞に対する炎症性損傷を媒介する（非特許文献１）。ＣＮＳ病変は、ミエリン損傷の巣状領域を有し、また、軸索の病態、神経の損傷、および星状膠細胞における瘢痕形成とも関連する（非特許文献２）。臨床症状には、失明、麻痺、感覚および協調運動の喪失、ならびに認知障害を含めた、各種の神経学的機能不全が含まれる。
【０００４】
ミエリンへの損傷または傷害は、導電速度、および軸索の破壊に対するニューロンの脆弱性に対して重大な影響を及ぼす。軸索の喪失と、進行性の臨床障害との間には相関があり、軸索の完全性を維持するには、ミエリンが無傷であることが重要である（非特許文献３）。ヒトＭＳの初期には、自発的な再有髄化が生じるが、該疾患の後期段階におけるＣＮＳ炎症の遷延、およびミエリン修復の失敗は、最終的に恒常的な衰弱をもたらす。
【０００５】
再有髄化をもたらすのは、成熟希突起膠細胞（ＯＬ）である。したがって、再有髄化の失敗は、成熟希突起膠細胞の生成、それらが有髄化をもたらす能力の欠損、および／または有髄化に対するニューロンの非受容性と関連することが典型的である。多発性硬化症などの脱髄性疾患では、生存するＯＬおよびそれらの前駆細胞（希突起膠細胞の前駆細胞、またはＯＰＣ）が、脱髄領域の内部および周囲に見出されることが多い。軸索近傍において、これらの生存細胞が再有髄化に失敗することは、ＯＰＣが分化できないこと、または有糸分裂後における希突起膠細胞が、有髄化に必要とされる一連の遺伝子発現を再開できないことを反映しうる。有髄化は、希突起膠細胞およびそれらの前駆細胞を正確に局在化させ（非特許文献４；非特許文献５）、適切な細胞数を調節し（非特許文献６；  非特許文献７）、また、希突起膠細胞とそれらの標的である軸索との相互作用を媒介する（非特許文献８）シグナルを含めた、多数のシグナルの調整に依拠し、したがって、これらの過程のいずれかに欠損があれば、再有髄化の失敗がもたらされうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒｕｃｋら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．、２０６巻、１８１〜１８５頁（２００３年）
【非特許文献２】Ｃｏｍｐｓｔｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ、３５９巻、１２２１〜１２３１頁（２００２年）
【非特許文献３】Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑら、Ｎｅｕｒｏｎ、４８巻、９〜１２頁（２００５年）
【非特許文献４】Ｔｓａｉら、Ｃｅｌｌ、１１０巻、３７３〜３８３頁（２００２年）
【非特許文献５】Ｔｓａｉら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２６巻、１９１３〜２２頁（２００６年）
【非特許文献６】Ｂａｒｒｅｓら、Ｃｅｌｌ、７０巻、３１〜４６頁（１９９２年）
【非特許文献７】Ｃａｌｖｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ、２０巻、８６９〜８８２頁（１９９８年）
【非特許文献８】ＳｈｅｒｍａｎおよびＢｒｏｐｈｙ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６巻、６８３〜６９０頁（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
有髄化または再有髄化を増強および促進する効果的な方法を開発する必要がある。ＯＰＣ、前駆細胞プールの分化、または既存の有糸分裂以後における希突起膠細胞による有髄化の再開を促進する戦略は、再有髄化の確立に有益でありうる。本発明は、再有髄化の促進を対象とする組成物および方法を提供する。本明細書で開示される知見は、ミエリン生成に関与する遺伝子の発現が、ＭＲＦ（ミエリン遺伝子調節因子）としても公知のＧＭ９８（遺伝子モデル９８）、および有髄化により影響されることを裏付ける。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＭＲＦの発現および／または活性を調節する方法および組成物を提供する。本明細書では、ＭＲＦにより調節される遺伝子の発現および活性もまた説明される。該方法および組成物を用いて、再有髄化を促進し、ＭＲＦの発現／活性、またはＭＲＦにより調節される遺伝子を調節する生物活性剤をスクリーニングするほか、神経障害を治療することもできる。
【０００９】
本発明の一態様は、ＭＲＦまたはその機能的な変異体をコードする核酸配列に作動的に連結された細胞型特異的な発現調節エレメントを含む、単離核酸分子である。さらに、該細胞型特異的な調節エレメントは、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである。本発明はまた、本明細書に記載の核酸を含むベクターも提供し、宿主細胞型は、本発明のベクターおよび核酸を含む。
【００１０】
本明細書ではまた、ＭＲＦ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物も提供される。導入遺伝子は、本明細書に記載の核酸配列を含みうる。さらに、導入遺伝子は、突然変異、およびエキソンの欠失などの欠失を含みうる。エキソンは、エキソン８など、推定ＤＮＡ結合ドメイン内のエキソンでありうる。エキソンはまた、ＣｒｅまたはＦｌｐに対応する部位などのリコンビナーゼ部位にも隣接する。トランスジェニック動物はまた、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐなど、リコンビナーゼ導入遺伝子も含みうる。該導入遺伝子はまた、細胞型特異的な発現調節エレメントに作動的に連結されうる。該トランスジェニック動物は、マウスまたはラットなどの哺乳動物でありうる。
【００１１】
核酸または導入遺伝子の特異的な発現は、神経膠細胞などの神経細胞内でありうる。神経膠細胞は、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞でありうる。細胞型特異的な調節エレメントは、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来しうる。
【００１２】
トランスジェニック動物はまた、再有髄化／有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングするのに用いることもできる。該方法は、候補生物活性剤を該動物に投与するステップ；対照動物と比較した、表１中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの上昇についてアッセイし、該上昇が、該動物における再有髄化を促進する前記生物活性剤を示すステップ；および／または対照動物と比較した、該動物における有髄化の変化を観察するステップを含みうる。生物活性剤は、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子でありうる。本発明の別の態様では、動物における再有髄化／有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、候補生物活性剤を動物に投与するステップと、対照動物と比較した、ＭＲＦの発現レベルの上昇についてアッセイし、該上昇が、該動物における有髄化を促進する該生物活性剤を示すステップとを含む方法が提供される。本発明はまた、ＭＲＦ活性を調節するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法も提供する。一態様において、該方法は、被験細胞を候補生物活性剤と接触させるステップと、対照細胞と比較したＭＲＦの発現レベルの変化についてアッセイするステップとを含む。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、被験体における神経障害を治療するための組成物であって、前記被験体におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物が提供される。組成物は、被験体における再有髄化／有髄化を促進しうる。組成物は、幹細胞または胚性幹細胞が希突起膠細胞へと分化することを促進しうる。組成物は、ＭＲＦ、またはＭＲＦの活性もしくは発現を調節する薬剤など、第１の生物活性剤と、希突起膠細胞の分化を誘導する第２の生物活性剤とを含みうる。例えば、第２の生物活性剤は、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、および／またはＯｌｉｇ２を促進しうる。第２の生物活性剤は、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、またはＯｌｉｇ２でありうる。組成物は、ＭＲＦ、Ｓｏｘ１０、Ｎｘｋ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せを含みうる。組成物は、多発性硬化症などの脱髄状態など、神経障害を治療するのに用いることができる。本明細書で提供される組成物は、被験体における神経障害を治療する方法であって、該被験体に、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を投与するステップを含む方法において用いることができる。方法は、被験体における再有髄化／有髄化を促進しうる。投与は、ＭＲＦ、またはＭＲＦの活性もしくは発現を調節する生物活性剤など、第１の生物活性剤と、また、希突起膠細胞の分化も誘導する第２の生物活性剤とを投与するステップとを含みうる。第２の生物活性剤を投与するステップは、第１の生物活性剤を投与するステップの前の場合もあり、これと同時の場合もあり、この後の場合もある。第２の生物活性剤は、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進しうる。第２の生物活性剤は、相乗効果を有しうる。
【００１４】
本発明の新規の特徴は、添付される特許請求の範囲において具体的に記載される。本発明の特徴および利点についてのよりよい理解は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびそれに付随する図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＣＮＳ内におけるＯＬ特異的な転写物であるＧＭ９８／ＭＲＦの同定を示す図である。Ａ）図１Ａは、ＣＮＳから急性摘出された細胞におけるＧＭ９８／ＭＲＦの発現レベルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析（プローブセット１４３９５０６＿ａｔ）により決定したことを示す図である。Ｂ）図１Ｂは、ノーザンブロットが、ＭＲＦの発現を、Ｐ２０における脳および培養希突起膠細胞（ＯＬ）内では、約５．５Ｋｂの単一の転写物として確認するが、心臓組織内ではこれを確認せず、これは、確立されたＯＬマーカーであるＣＮＰ１の発現パターンを反映することを示す図である。ＧＡＰＤＨは、ｍＲＮＡレベルの対照として示される。Ｃ）図１Ｃは、Ｐ１６における脳の矢状断面内における、確立されたＯＬマーカーであるＰＬＰおよびＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。いずれの遺伝子も、明白な白質の発現パターンを示す。Ｄ）図１Ｄは、標識化された細胞の同一の分布を示す、脳梁側部内におけるＰＬＰおよびＭＲＦの発現についての高倍率画像である。
【図２】図２は、ＭＲＦのペプチド構造および細胞内局在化を示す図である。Ａ）図２Ａは、マウスＭＲＦ遺伝子およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９遺伝子のペプチド配列の比較を示す図である。Ｂ）図２Ｂは、マウスＭＲＦタンパク質、およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９タンパク質の構造領域、ならびにこれらの領域内におけるそれらの相同性を示すダイアグラムである。Ｃ〜Ｅ）図２Ｃ〜Ｅは、ＨＥＫ細胞内におけるｍｙｃタグを付したＭＲＦの細胞内局在化を示す図である。抗ｍｙｃによる、Ｍｙｃ−ＭＲＦをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する染色（Ｅ）は、トランスフェクトされた細胞内における、核内対比染色色素であるＤＡＰＩとの本質的に完全な共局在化を伴う、該タンパク質の強い核内局在化を示す。ｍｙｃタグを付していないＭＲＦ（Ｄ）、およびｍｙｃタグを付したタンパク質をトランスフェクトした細胞は、細胞質内局在化（Ｃ）を示し、これにより、染色についての陰性対照、および比較がそれぞれもたらされる。
【図３】図３は、ＭＲＦの発現が、ＯＬの成熟にとって重要であることを示す図である。Ａ）図３Ａは、２４〜９６時間にわたる分化時における、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬの生存率および形態を示す、生存：死滅アッセイ（生存細胞は、カルセイン（Ｃａｌｃｉｅｎ）ＡＭにより染色されて緑色チャネルで示され、非生存核は、エチジウムホモ二量体により染色されて赤色チャネルで示される）を示す図である。ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて膜シートの沈着の減少および生存率の低下を示した。Ｂ）図３Ｂは、分化条件へと移した２４〜９６時間後における、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べたｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞の生存率を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、分化の４８時間後以降、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて著明な生存率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｃ）図３Ｃは、分化の２４、４８、および９６時間後において、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬにおける、ＯＰＣマーカーであるＮＧ２、および初期ＯＬマーカーであるＭＢＰの発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と同様の時間プロファイルによりＮＧ２の発現を下方調節するが、ＭＢＰ発現の遅延およびその誘導の低下を示した。Ｄ）図３Ｄは、分化の２４〜９６時間後における、ＭＢＰを発現するｓｉＣｏｎｔトランスフェクトＯＬおよびｓｉＭＲＦトランスフェクトＯＬの比率についての定量化を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、すべての時点において、ＭＲＦ発現率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｅ）図３Ｅは、２４〜９６時間にわたる分化時の、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬ内における、後期ＯＬマーカーであるＭＯＧの発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ＭＯＧ発現に対する誘導の低下を示した。Ｆ）図３Ｆは、分化の２４〜９６時間後における、ＭＯＧを発現するｓｉＣｏｎｔトランスフェクトＯＬおよびｓｉＭＲＦトランスフェクトＯＬの比率についての定量化を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、分化の４８時間後以降、ＭＲＦ発現率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。結果は、３つの個別の実験を表わす。
【図４】図４は、ＭＲＦノックダウン動物による、ＯＬ遺伝子発現の解析を示す図である。Ａ）図４Ａは、ＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件で４８時間にわたり培養された細胞における遺伝子発現についてのノーザンブロット解析を示す図である。脳試料、心臓試料、および培養星状細胞試料に由来するＲＮＡを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として与えた。細胞にｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたところ、存在するＭＲＦ転写物の量が大幅に減少し、また、結果として、ＰＬＰの発現、また、より低度ではあるがＣＮＰ１の発現も明白に阻害された。ＧＡＰＤＨのノーザンブロット結果、および１８Ｓリボソームバンドの可視化を、ローディング対照として示す。Ｂ）図４Ｂは、ＯＰＣ、およびＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件で４８時間にわたり培養された細胞における遺伝子発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析の結果を示す図であり、これにより、選択されたＯＰＣマーカーであるＮＧ２、ＰＤＧＦＲα、およびＫｉ６７の発現レベルが示される。これらのＯＰＣマーカーの下方調節は、ＭＲＦのノックダウンによる影響を受けなかった。Ｃ）図４Ｃは、対照（ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞の値）に対する比率として表わされた、ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞における、汎ＯＬ系統のマーカーであるＳｏｘ１０、初期ＯＬマーカー（Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、ＰＬＰ１、ＭＢＰ）、および後期ＯＬマーカー（ＭＡＧ、トランスフェリン、ＭＯＢＰ、およびＭＯＧ）の発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞において、ＯＬ遺伝子の発現は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞の場合と比べて強く阻害され、分化後期のＯＬマーカー（トランスフェリン、ＭＯＧ、およびＭＯＢＰ）が、同初期マーカー（ＣＮＰ１またはＵｇｔ８）または同中間段階マーカー（ＰＬＰ１、ＭＢＰ）より大きな影響を受けることが典型的であった。結果は、３つの個別の実験の平均であり、ｓｉＣｏｎｔによる発現レベルの平均百分率±ＳＥＭとして表わされる。Ｄ）図４Ｄは、分化により＞４倍に誘導された遺伝子と、ｓｉＭＲＦのトランスフェクションにより＜４分の１に抑制された遺伝子との重複を示すベン図である。ｓｉＭＲＦにより阻害された遺伝子の大半（８１％）は、ＯＬ分化時において通常は上方調節される遺伝子であった；これに対し、ＯＬの分化時において通常は誘導される遺伝子のうち、ＭＲＦの発現に依存するのは１３％に過ぎなかった。
【図５】図５は、ＭＲＦ発現の不在下におけるＯＬ遺伝子の発現についての表である。ＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔもしくはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件において４８時間にわたり培養された細胞、または遺伝子発現のベースラインを与える培養ＯＰＣにおける遺伝子発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析であり、これにより、ＭＲＦの不在下において発現の抑制を示す上位５０の遺伝子が示される。ｓｉＭＲＦの存在下において下方調節される上位５０の遺伝子のうち、４７は、ＯＰＣとｓｉＣｏｎｔ  ＯＬとの間で４倍以上に上方調節される遺伝子であった。１つの遺伝子について複数のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットが使用可能である場合、最も強く発現したものだけを示す。
【図６】図６は、ＭＲＦの異所性発現によりＯＬの分化が誘導されることを示す図である。Ａ〜Ｊ）図６Ａ〜Ｊは、ｐＥＧＦＰ、および対照（空）ベクター、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０によるトランスフェクション後、４８時間にわたり増殖条件（＋ＰＤＧＦ、−Ｔ３）において培養したＯＰＣを、ＮＧ２、ＭＢＰ、またはＭＯＧについて染色したことを示す図である。Ａ〜Ｃ）図６Ａ〜Ｃは、対照ベクター（Ａ）、ＣＭＶ−ＭＲＦ（Ｂ）、またはＣＭＶ−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトした細胞を、ＮＧ２について染色したことを示す図である。対照ベクターまたはＣＭＶ−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされたほとんどすべての細胞（ＧＦＰの共発現により同定される）は、ＮＧ２陽性を維持した（黄色の矢印）。これに対し、ＣＭＶ−ＭＲＦをトランスフェクトされた多くの細胞が、ＮＧ２発現を下方調節する（緑色の矢印）一方、同じ培養物中における非トランスフェクト細胞はＮＧ２発現を維持した（赤色の矢印）。Ｄ〜Ｊ）図６Ｄ〜Ｊは、対照ベクター（Ｄ、Ｈ）、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ（Ｅ、Ｉ）、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０（Ｆ、Ｊ）をトランスフェクトした細胞を、ＭＢＰ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、またはＭＯＧ（Ｈ、Ｉ、Ｊ）について染色したことを示す図である。対照ベクターまたはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされたほとんどすべての細胞は、ＭＢＰ陰性およびＭＯＧ陰性を維持した（黄色の矢印）。これに対し、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦをトランスフェクトされた多くの細胞は、ＭＢＰ発現およびＭＯＧ発現について陽性であった（黄色の矢印）。Ｌ〜Ｍ）図６Ｌ〜Ｍは、対照ベクター、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされ、トランスフェクションの４８または１２０時間後においてＭＢＰ（Ｌ）またはＭＯＧ（Ｍ）について陽性であった細胞の平均比率を示すグラフである。ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦによるトランスフェクションは、大半の細胞がＭＢＰ陰性およびＭＯＧ陰性を維持した対照ベクターだけのトランスフェクションと比べ、４８時間後および１２０時間後のいずれにおいても、ＭＢＰ発現およびＭＯＧ発現の強力な誘導をもたらした。ｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０による細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクションの１２０時間後において、ＭＢＰおよびＭＯＧに対する比較的低度の誘導を結果としてもたらした。＊＊Ｐ＜０．０１。結果は、３つの個別の実験を表わす。
【図７】図７は、発生時のニワトリ脊髄内においてＭＲＦを電気穿孔すると、早発性のＭＢＰ発現が引き起こされることを示す図である。Ｅ３における胚に、ＭＲＦおよびＥＧＦＰを含有するｐＣＡＧＧＳプラスミドを共電気穿孔し、Ｐ８において回収した。Ａ）図７Ａは、電気穿孔した脊髄側方だけにおいてＭＲＦ  ＲＮＡの発現を示す、ＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。Ｂ）図７Ｂは、脊髄横断面におけるＥＧＦＰおよびＭＢＰについての染色を示す図である。電気穿孔された脊髄側方では、偶発的なＭＢＰ＋細胞（１断面当たり１または２個だけであることが典型的）が見出されたが、対照の側方では見出されなかった。Ｃ）図７Ｃは、脊髄の縦断面におけるＥＧＦＰおよびＭＢＰについての染色が、ＭＢＰに対する免疫反応性が電気穿孔された側方に限定されることを示す図である。Ｄ）図７Ｄは、図７ＢおよびＣにおいて示されるＭＢＰ＋細胞の高倍率画像を示す図である。
【図８】図８は、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスの解析および作製を示す図である。Ａ）図８Ａは、ＭＲＦを破壊するための戦略についての概略図である。野生型のＭＲＦ遺伝子座、標的化ベクター、および相同組換え後において予測される遺伝子座を示す。標的とされるマウスを、Ｆｌｐｅｒマウスと交配させることにより、ネオマイシン耐性カセットを欠失させ、結果として、ＭＲＦのエキソン８をｌｏｘＰで挟んだマウスを得る。略号：Ｅｘ８、エキソン８；プライマー１；Ｐ２、プライマー２；Ｐ３、プライマー３；ＦＲＴ、Ｆｌｐリコンビナーゼ部位；ＳＰ、サザンプローブ。Ｂ）図８Ｂは、ＭＲＦ野生型マウス、ＭＲＦをｌｏｘＰで挟んだヘテロ接合マウス、およびＭＲＦをｌｏｘＰで挟んだホモ接合マウスに由来するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を示す図である。プライマー１および２は、４６０ｂｐの野生型バンドを発生させ、また、ｌｏｘＰ部位の挿入により、対立遺伝子をｌｏｘＰで挟んだマウスにおいては、６６８ｂｐのバンドも発生させた。プライマー１および３は、対立遺伝子をｌｏｘＰで挟んだマウスに特異的な２６９ｂｐのバンドを発生させた。プライマー１は、イントロン７〜８の上側鎖である。プライマー２は、エキソン８の下側鎖である。プライマー３は、プラスミド挿入物の下側鎖である。Ｃ）図８Ｃは、ＭＲＦ遺伝子によりコードされる全長タンパク質、また、ＤＮＡ結合ドメインおよび後に続くＣ末端領域を欠く、Ｃｒｅを介する切断後の切断タンパク質についての概略図である。
【図９】図９は、ＣＮＳの有髄化不全を示す、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスを示す図である。Ａ〜Ｂ）図９Ａ〜Ｂは、Ｐ１３においてＭＢＰ、ＮｅｕＮ、およびＧＦＡＰにより染色した、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスの海馬、脳梁、ならびに皮質上部Ａ）および脊髄Ｂ）を表わす画像である。Ｃ）図９Ｃは、Ｐ１３におけるＭＲＦ対照マウスおよびＭＲＦ条件付きノックアウトマウスの脊髄における、ＣＮＰ、ＭＢＰ、ＭＯＧ、ＧＦＡＰ、およびニューロフィラメントの発現についてのウェスタンブロット解析を示す図である。Ｄ）図９Ｄは、Ｐ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスにおける脊髄の脊髄根および側方白質に対するフルオロミエリン染色を表わす画像である。Ｅ）図９Ｅは、Ｐ１３における対照動物および条件付きノックアウト動物の神経を表わす電子顕微鏡画像である。対照動物の神経は、著明量の有髄化が進行中であることを示している。これに対し、条件付きノックアウト動物の神経は、軸索の有髄化を一切示さなかった。
【図１０】図１０は、視神経および坐骨神経内におけるＰＬＰおよびＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。ＰＬＰについてのシグナルは、既に報告されている通り（Ｐｕｃｋｅｔｔら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．、１８巻、５１１〜５１８頁（１９８７年））、坐骨神経では低レベルまでであるが、視神経内および坐骨神経内のいずれにおいても（ＣＮＳ神経およびＰＮＳ神経のいずれにおいても）容易に検出可能であった。これに対し、ＭＲＦについてのシグナルが視神経内で検出されたことは、これが、ＯＬによっては発現するが、シュワン細胞によっては発現しない（ＣＮＳの神経膠細胞によっては発現するが、ＰＮＳの神経膠細胞によっては発現しない）ことを示す。
【図１１】Ａ〜Ｂ）図１１Ａ〜Ｂは、ｓｉＣｏｎｔ（Ａ）またはｓｉＭＲＦ（Ｂ）をトランスフェクトした後で４８時間にわたり分化させた、培養希突起膠細胞についての位相イメージングを示す図である。いずれの場合も、大半の細胞は希突起膠細胞の形態を帯びるが、ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞は、それほど広範な突起を示さなかった。Ｃ〜Ｄ）図１１Ｃ〜Ｄは、ｓｉＣｏｎｔ（Ｃ）またはｓｉＭＲＦ（Ｄ）をトランスフェクトした後で７２時間にわたり分化させた培養希突起膠細胞上における、ＭＯＧおよびＧａｌＣについての表面染色（Ｏ１抗体による）を示す図である。ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞およびｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞のいずれも、Ｏ１抗体により容易に標識化されたが、ＭＯＧについて陽性であったのは、ｓｉＣｏｎｔ細胞だけであった。
【図１２】Ａ）図１２Ａは、対照のｓｉＲＮＡプール、またはＭＲＦに対するｓｉＲＮＡプールをトランスフェクトした培養希突起膠細胞内において、ＭＲＦおよびＭＢＰを検出するＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞では、ＭＲＦ転写物レベルおよびＭＢＰ転写物レベルのいずれもが明白な低下を示した。Ｂ）図１２Ｂは、対照のｓｉＲＮＡプール、またはＭＲＦに対する個別のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした培養希突起膠細胞内において、ＭＲＦおよびＭＢＰを検出するＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）を示す図である。４つの個別のｓｉＲＮＡのうちの複数が、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて検出可能な、ＭＲＦレベルおよびＭＢＰレベルの低下を引き起こした。Ｃ）図１２Ｃは、図１２Ｂと同じトランスフェクションに由来する細胞が、分化条件における４日間にわたる培養後において示す、ＭＯＧを発現する生存細胞の比率の高さを示す図である。ＭＲＦに対する４つの個別のｓｉＲＮＡのうちの３つが、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて、ＭＯＧを発現する細胞の比率を著明に低下させたが、これは、図１２Ｂにおいて観察されたＭＲＦのノックダウンと良好に相関する。
【図１３】図１３は、ＭＲＦ条件付きノックアウト動物が、成熟希突起膠細胞の喪失を示すことを明らかにする図である。Ａ）図１３Ａは、Ｐ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ＣｒｅおよびＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスの視神経内における、ＭＢＰ、ＣＣ１、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ならびにＣＣ１およびＰＤＧＦＲαと共染色されたＯｌｉｇ２についての免疫染色を示す図である。スケールバー＝５０μｍ。Ｂ）図１３Ｂは、視神経内におけるＯｌｉｇ２免疫陽性核の密度についての定量化を示す図である。Ｃ）図１３Ｃは、視神経内におけるＯｌｉｇ２＋／ＣＣ１＋二重免疫陽性ＯＬの密度についての定量化を示す図である。Ｄ）図１３Ｄは、視神経内におけるＯｌｉｇ２＋／ＰＤＧＦＲａ＋二重免疫陽性細胞の密度についての定量化を示す図である。すべての結果は、平均±ＳＥＭ、１遺伝子型当たりｎ＝４〜５として表わされる。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｅ）図１３Ｅは、ＣＣ１についてもまた陽性であるＯｌｉｇ２＋細胞（ＯＬ）、ＰＤＧＦＲ１αについてもまた陽性であるＯｌｉｇ２＋細胞（ＯＰＣ）、またはいずれのマーカーについても陽性でないＯｌｉｇ２＋細胞に分類される、視神経内における各遺伝子型のＯｌｉｇ２免疫陽性細胞の密度を示す図である。
【図１４】図１４は、条件付きノックアウト動物の培養希突起膠細胞および脊髄における遺伝子発現を示す図である。対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳、および条件付きノックアウト（ＣＫＯ；ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳に由来するＯＬ培養物（４日間にわたり分化させた）、ならびにＰ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスから急性摘出された脊髄に対するＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果である。Ａ）図１４Ａは、ＣＫＯ動物の培養ＯＬにおいて、対照動物の培養ＯＬと比べて最も大幅に下方調節された２０遺伝子を、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄におけるＭＡＳ  ５．０遺伝子の発現値と共に列挙する。また、培養ＯＬ（対照値／ＣＫＯ値）、脊髄（対照値／ＣＫＯ値）、およびｓｉＲＮＡ実験（ｓｉＣｏｎｔ値／ｓｉＭＲＦ値）についても、抑制倍率の値を示す。Ｂ）図１４Ｂは、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄における汎ＯＬ系統マーカー、ＯＰＣマーカー、初期ＯＬマーカー、後期ＯＬマーカーを表わすプローブセット、およびこれらの発現値を示す図である。「Ａ」と表示した遺伝子を発現しない遺伝子と判定し、「Ｂ」と表示した遺伝子を発現した遺伝子と考える。「Ｂ」とは、わずかな発現に相当する。アレイ上における所与の遺伝子に対して複数のプローブセットが存在した場合は、最も強く発現したプローブセットだけを示す。
【図１５】図１５は、ＭＲＦ欠損ＯＰＣ／ＯＬ培養物が、分化条件では欠損を示すが、増殖条件では欠損を示さないことを明らかにする図である。Ａ）図１５Ａは、増殖（＋ＰＤＧＦ、−Ｔ３）条件における、ＮＧ２およびＫｉ６７についての、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物の免疫染色を示す図である。いずれの場合においても、大半の細胞は、ＮＧ２陽性前駆細胞およびＫｉ６７陽性前駆細胞（Ｋｉ６７＋核を矢印により示す）として維持された。Ｂ）図１５Ｂは、分化（−ＰＤＧＦ、＋Ｔ３）条件において４日間にわたり増殖させた、対照動物による培養物、およびＭＲＦ条件付きノックアウト動物による培養物に対する、Ｋｉ６７、ＣＮＰ、およびＭＢＰについての免疫染色を示す図である。いずれの場合においても、大半の細胞は、Ｋｉ６７の発現を下方調節し、ＯＬに特徴的な多極形態を帯び（ＣＮＰ染色により可視化される）、ＧＦＡＰについては陰性であった。しかし、頑健なＭＢＰ染色が見られたのは、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物中だけであった。スケールバー＝１００μｍ。Ｃ）図１５Ｃは、ＯＬ系統の特殊化および分化に対する転写制御についての概略図である。Ｏｌｉｇ２は、ＯＬ系統の特殊化に必要である。Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｙｉｎ  Ｙａｎｇ  １、およびＯｌｉｇ１を含めた複数の遺伝子が、ＯＬへのＯＰＣの頑健な分化には必要である。ＭＲＦは、ミエリン遺伝子の完全な相補体を発現する、成熟ＯＬへの未成熟ＯＬの成熟化に必要であり、その誘導はおそらくＹｉｎ  Ｙａｎｇ  １により調節される。
【図１６】図１６は、ＣＮＰ−Ｃｒｅを介してＭＲＦが欠失する結果として、ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅマウスと同等の、有髄化不全を引き起こす表現型がもたらされることを示す図である。Ａ）図１６Ａは、ＭＢＰにより染色された、Ｐ１６における対照（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／ｗｔ）動物の脳、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳を表わす画像であり、これらにより、ＣＮＰ−Ｃｒｅを介するＭＲＦ条件付きノックアウト動物の脳梁（ｃｃ）内におけるＭＢＰ染色の大幅な喪失が示される。一部の、わずかにＭＢＰ＋であり、有髄化しないＯＬが、条件付きノックアウト動物の脳内に存在する（矢印）。スケールバー＝２００μｍ。Ｂ）図１６Ｂは、フルオロミエリンにより染色された、Ｐ１６における対照（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／ｗｔ）動物の脊髄、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脊髄を表わす画像である。条件付きノックアウト動物では、末梢における有髄化（脊髄根；ｓ．ｒ．）は影響を受けないと考えられるが、ＣＮＳにおける有髄化は見られない。
【図１７】図１７は、条件付きノックアウトマウスが、視神経内において細胞アポトーシスの増大を示すことを明らかにする図である。Ａ）図１７Ａは、抗ＭＢＰ抗体および抗活性化カスパーゼ３抗体により染色された、Ｐ１０における対照動物の神経、および条件付きノックアウト動物の視神経を表わす画像である。スケールバー＝１００μｍ。Ｂ）図１７Ｂは、Ｐ１０における対照動物の視神経、および条件付きノックアウト動物の視神経内における活性化カスパーゼ３免疫陽性細胞の密度についての定量化により、条件付きノックアウト動物において、アポトーシス細胞の密度の著明な上昇が明らかとなったことを示す図である（＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ＝５〜６／遺伝子型）。Ｃ）図１７Ｃは、図１７Ａで条件付きノックアウト動物の神経について枠囲いした領域を高拡大率で示す図であり、これにより、核がフラグメント化し、活性化カスパーゼ３が染色される（矢印）、低度のＭＢＰ陽性細胞が示される。
【図１８】図１８は、条件付きノックアウト動物の遺伝子プロファイリングを示す図である。Ａ）図１８Ａは、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ＣｒｅおよびＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスに由来する脊髄または培養ＯＬに由来するＲＮＡ中における選択遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）解析を示す図であり、これにより、条件付きノックアウト動物による試料中において、ＯＬマーカーであるＭＯＧおよびＭＯＢＰの喪失が示される。該遺伝子のエキソン８によりコードされるＲＮＡ配列を認識するプライマーを用いて、条件付きノックアウト動物に由来する脊髄または培養ＯＬからＰＣＲ産物を検出することはできず、これにより、このエキソンの欠失が確認された。これに対し、ＭＲＦのエキソン８の外側に位置するプライマーは、条件付きノックアウト動物による培養ＯＬ中におけるＭＲＦ発現を検出したが、脊髄中におけるＭＲＦ発現は検出しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
参照による組込み
本出願において言及されるすべての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個別に指示されたと仮定する場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の詳細な説明
本発明は、有髄化／再有髄化の促進において、ミエリン遺伝子調節因子（ＭＲＦ）とも称する遺伝子モデル９８（ＧＭ９８）、および／またはそれに関連する遺伝子を調節する方法および組成物を提供する。例えば、ＭＲＦを標的とし、ＭＲＦを介して直接的または間接的に調節しうる、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン関連希突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）など、ミエリン生成における主要な成分と考えられることが典型的な多くの遺伝子の発現に対する下方調節を結果としてもたらすｓｉＲＮＡにより、希突起膠細胞におけるＭＲＦの発現を阻害することができる。逆に、例えば、ＭＲＦ  ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いてＭＲＦを発現させることにより、希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）におけるＭＲＦの発現を誘導し、これにより、再有髄化を促進することができる。
【００１７】
本明細書ではまた、ＭＲＦの発現を調節し、有髄化を促進する生物活性剤をスクリーニングする方法も提供される。例えば、それらを、Ｏｌｉｇ２プロモーターの下流でＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス株と交配させることにより、希突起膠細胞系統の細胞内において、ｌｏｘＰに隣接するＭＲＦ遺伝子（ＤＮＡ結合領域の一部をコードする）のエキソン８を切除しうるマウス。該マウスは、ＭＢＰ陽性の希突起膠細胞またはＣＮＳミエリンの発現に失敗し、広範にわたるＣＮＳの脱髄により、生後３週間で死亡することが典型的である。これらのマウスを用いて、死亡を遅延させ、有髄化不全を軽減し、かつ／またはＭＢＰ陽性ＯＬの発生を促進する生物活性剤をスクリーニングすることができる。
【００１８】
本明細書に記載の方法および組成物は、神経障害を治療するのに重要でありうる。本明細書で開示される方法および組成物を用いて、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ抗体陽性疾患、白質萎縮症：副腎白質萎縮症（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ファンデルクナップ症候群、ツェルヴェーガー症候群、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多巣性運動神経障害（ＭＭＮ）、脊髄傷害（例えば、脊髄の外傷または切断）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および視神経炎などであるがこれらに限定されない各種のＣＮＳ障害およびＰＮＳ障害を治療することができる。
【００１９】
一般的な技法
本発明を実施する際には、別段に指示しない限り、当技術分野内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学、および組換えＤＮＡの従来の技法が用いられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、第２版（１９８９年）；「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年））；「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」のシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）、「ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ、およびＧ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年）、「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」；ならびに「ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ」（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１９８７年））を参照されたい。
【００２０】
定義
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段に明確な指示がなされない限り、複数形の指示を包含する。例えば、「ある細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞を、それらの混合物を含めて包含する。
【００２１】
「対照」という用語は、実験において比較の目的で用いられる代替的な被験体、細胞、または試料である。対照は、「陽性」の場合もあり、「陰性」の場合もある。例えば、対照細胞は、所与の対象細胞における遺伝子産物の差次的発現についてアッセイする際に用いることができる。対照細胞による遺伝子産物の発現を、被験細胞、例えば、生物活性剤と接触させた被験細胞と比較することができる。さらに、「対照」はまた、異なる時点について比較する実験における同じ被験体、細胞、または試料も表わしうる。生物活性剤をスクリーニングする文脈において、対照細胞は、被験生物活性剤と接触させていない神経細胞でありうる。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられる。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することが可能であり、公知のものであれ、未知のものであれ、任意の機能を果たしうる。以下が、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析により定義される（１または複数の）遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列を有する単離ＤＮＡ、任意の配列を有する単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾ヌクレオチドを含みうる。存在させる場合、ヌクレオチド構造に対する修飾の付与は、ポリマーのアセンブリー前の場合もあり、アセンブリー後の場合もある。ヌクレオチド配列には、ヌクレオチド以外の成分を介在させることができる。ポリヌクレオチドは、標識化成分とのコンジュゲーションなどにより、重合化の後においてさらに修飾することができる。
【００２３】
本明細書で用いられる「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡ（また、「転写物」とも称する）が、その後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳される過程を指す。転写物およびコードされたポリペプチドを、集合的に、「遺伝子産物」と称する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを包含しうる。
【００２４】
「接触」、「送達」、および「投与」という用語は、薬剤が、被験体、組織、または細胞に入ることを意味するように用いることができる。本明細書の開示全体で用いられる該用語には、特定の用語の文法的な変化形も含まれる。例えば、「送達」には、「送達すること」、「送達された」、「送達する」などが含まれる。当技術分野では、生物活性剤を送達または投与する各種の方法が公知である。例えば、本明細書に記載の１または複数の薬剤は、非経口送達、経口送達、腹腔内送達、静脈内送達、動脈内送達、経皮送達、筋肉内送達、リポソーム送達、カテーテルもしくはステントによる局所送達、皮下送達、脂肪組織内送達、または髄腔内送達することができる。
【００２５】
ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される、「差次的発現」という用語は、対照において検出される発現と比較した、その配列の過剰発現または過小発現を指す。過小発現はまた、対照と比較した、被験対象における検出可能な発現の不在を証拠とする、特定の配列の発現の不在も包含する。
【００２６】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。該ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含む場合もあり、また、アミノ酸以外の分子を介在させる場合もある。該用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識化成分とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作を施されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で用いられる「アミノ酸」とは、グリシン、およびＤ光学異性体またはＬ光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣剤を含めた、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸を指す。
【００２７】
本明細書において、「被験体」、「個体」、または「患者」は、互換的に用いられ、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル（類人猿）、ヒト、農場動物、競技動物、およびペットが含まれるがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて得られたか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養された生物学的実体を有する組織、細胞、およびそれらの前駆体もまた包含される。
【００２８】
本明細書において、「治療」、または「治療すること」、または「改善すること」は、互換的に用いられる。これらの用語は、臨床的な結果を含めた、また、臨床的結果であることが好ましい、有益または所望の結果を得るための手法を指す。本発明を目的とする場合、有益または所望の臨床的結果には、以下：脱髄病変サイズの縮減（例えば、脱髄障害の関連において）、ＯＰＣの増殖および成長もしくは病変部位へのＯＰＣの遊走の促進、希突起膠細胞分化の促進、神経障害発症の遅延化、脱髄障害発生の遅延化、神経障害から生じる症状の軽減、疾患を患う患者の生活の質の向上、疾患を治療するのに必要な他の薬物用量の低減、標的化および／もしくは封入などによる別の薬物の効果の増強、疾患の進行の遅延化、ならびに／または個体の生存の延長のうちの１または複数が含まれるがこれらに限定されない。治療は、疾患を防止すること、すなわち、疾患が誘発される前において、保護的組成物を投与することにより、疾患の臨床症状を発生させないようにすること；疾患を抑制すること、すなわち、疾患の誘発的事象の後ではあるが、その臨床的な発現または再発現の前において、保護的組成物を投与することにより、疾患の臨床症状を発生させないようにすること；疾患を阻害すること、すなわち、それらの最初の発現後において、保護的組成物を投与することにより、臨床症状の発生を停止させること；疾患の再発を防止すること、および／または疾患を緩和すること、すなわち、それらの最初の発現後において、保護的組成物を投与することにより、臨床症状を退縮させることを包含する。
【００２９】
「薬剤」、「生物学的に活性な薬剤」、「生物活性剤」、「生物活性化合物」、または「生物学的に活性な化合物」という用語は互換的に用いられ、また、言及される文脈において、複数の指示対象も包含する。本明細書で記載される、本発明の１または複数の組合せ治療方法において用いられるこのような化合物には、単純有機分子もしくは複合有機分子、または単純無機分子もしくは複合無機分子、ペプチド、ペプチド模倣剤、タンパク質（例えば、抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの類似体を含めた核酸分子、炭水化物含有分子、リン脂質、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
このような薬剤は、神経細胞の増殖または分化と関連する細胞周期経路の構成要素に対するアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。本発明の一部の実施形態では、結合部位において同じ３次元構造を有する化合物は、アンタゴニストとして用いうることが意図される。化学構造の３次元解析を用いて、神経細胞周期に関連するポリペプチドに対する結合部位を含めた、活性部位の構造を決定する。
【００３１】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的機能を阻害する能力を有する分子を指す。したがって、「アンタゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的な役割の文脈で定義される。本明細書で好ましいアンタゴニストが、標的と特異的に相互作用する（例えば、標的に特異的に結合する）一方で、該標的ポリペプチドがそのメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより、該標的ポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子もまた、この定義内に具体的に包含される。アンタゴニストにより阻害されることが好ましい生物学的活性は、ＯＰＣ増殖の増大、ＯＰＣ増殖の減少、ＯＬ分化の増大、または星状細胞増殖の増大、および／または再有髄化の促進と関連する。例えば、アンタゴニストは、神経細胞周期と関連するペプチドと直接的に相互作用する場合もあり、間接的に相互作用する場合もある。限定なしに述べれば、本明細書で定義されるアンタゴニストには、オリゴヌクレオチドデコイ、アプタマー、抗ケモカイン抗体および抗ケモカイン抗体変異体、ペプチド、ペプチド模倣剤、ペプチド以外の低分子、アンチセンス分子、ならびに有機低分子が含まれる。
【００３２】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的機能を誘発または増強する能力を有する分子を指す。したがって、「アゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的な役割の文脈で定義される。本明細書で好ましいアゴニストが、標的と特異的に相互作用する（例えば、標的に特異的に結合する）一方で、該標的ポリペプチドがそのメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより、該標的ポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子もまた、この定義内に具体的に包含される。アゴニストにより阻害されることが好ましい生物学的活性は、ＯＰＣ増殖の増大、ＯＰＣ増殖の減少、ＯＬ分化の増大、または星状細胞増殖の増大、それによる再有髄化の促進と関連する。限定なしに述べれば、本明細書で定義されるアンタゴニストには、オリゴヌクレオチドデコイ、アプタマー、抗ケモカイン抗体および抗ケモカイン抗体変異体、ペプチド、ペプチド模倣剤、ペプチド以外の低分子、アンチセンス分子、ならびに有機低分子が含まれる。
【００３３】
神経細胞の増殖／分化に対するアゴニスト、アンタゴニスト、および他の調節物質が、本発明の範囲内に明示的に包含される。特定の実施形態において、アゴニスト、アンタゴニスト、および他の調節物質は、神経細胞周期、すなわち、増殖または分化の調節に関与するポリペプチドに結合する抗体および免疫グロブリンの変異体である。これらのアゴニスト性、アンタゴニスト性の調節化合物は、直鎖状形態で提供することもでき、環状形態で提供することもでき、また、場合によって、一般に天然では見出されない、少なくとも１つのアミノ酸残基、または少なくとも１つのアミドイソステアを含みうる。これらの化合物は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂質化、または他の過程により修飾することができる。
【００３４】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、限定せずに述べれば、脱髄病変サイズの縮減（例えば、脱髄障害の関連において）、ＯＰＣの増殖および成長の促進、神経障害発症の遅延化、脱髄障害発生の遅延化、神経障害から生じる症状の軽減、疾患を患う患者の生活の質の向上、疾患を治療するのに必要な他の薬物用量の低減、標的化および／もしくは封入などによる別の薬物の効果の増強、疾患の進行の遅延化、ならびに／または個体の生存の延長などの臨床的結果を含めた、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量のアンタゴニストを指す。治療有効量は、治療される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方式などに応じて変化するが、これらは、当業者により容易に決定されうる。該用語はまた、本明細書に記載の造影方法のいずれか１つにより検出される画像をもたらす用量にも適用される。具体的な用量は、選択される具体的なアンタゴニスト、従う投与レジメン、それが他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与回数、造影される組織、それが移送される物理的な送達系に応じて変化する。
【００３５】
本明細書で用いられる「抗体」という用語には、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、モノクローナル抗体など、すべての抗体形態が含まれる。本発明はまた、神経細胞周期に関与するポリペプチドに対する結合（例えば、神経細胞の増殖／分化の調節に関与する転写因子またはタンパク質に対する結合）が可能な、抗体の機能的フラグメントにも適用可能である。
【００３６】
一実施形態では、比較的低用量の全抗体、裸抗体、または全抗体、裸抗体の組合せが用いられる。一部の実施形態では、抗体フラグメント、したがって、完全抗体未満のフラグメントが用いられる。他の実施形態では、薬物、毒素、または治療用放射性同位体との抗体のコンジュゲートが有用である。複数の抗原に結合するハイブリッド抗体を含め、ケモカイン抗原に結合する二特異性の抗体融合タンパク質を、本発明に従い用いることができる。したがって、抗体は、一特異性の場合もあり、多重特異性の場合もある、裸抗体およびコンジュゲート抗体および抗体フラグメントを包含する。
【００３７】
「調節すること」、「調節された」、または「調節」という用語は互換的に用いられ、所与の文脈における直接的または間接的な変化を意味する。例えば、ＭＲＦ発現の調節は、結果として、神経細胞の分化および／または有髄化を変化させる。別の例において、調節は、それ自体が、ＭＲＦに関与する遺伝子の発現を調節しうる遺伝子／遺伝子産物の調節でありうる。
【００３８】
生物活性剤に適用される「アプタマー」という用語には、特定の分子に対する特異的な結合特性に基づいて選択されるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチドが含まれる。例えば、本明細書で開示される、神経細胞周期に関与する特定の遺伝子または遺伝子産物に対する結合について、（１または複数の）アプタマーを選択することができ、この場合、選択は、当技術分野において公知であり、当業者に周知の方法によりなされる。その後、（１または複数の）前記アプタマーを被験体に投与して、免疫反応を調節または制御することができる。特定のタンパク質、ＤＮＡ、アミノ酸、およびヌクレオチドに対する親和性を有する一部のアプタマーについては説明されている（Ｋ．  Ｙ．  Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２巻、１８９９〜１９０４頁（１９９３年）；  Ｐｉｔｎｅｒ  ら、米国特許第５，６９１，１４５号；Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻、７６３〜７９７頁（１９９５年）；Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許第５，６３１，１４６号）。組合せライブラリーからは、高親和性で高特異性の結合アプタマーが誘導されている（前出、Ｇｏｌｄら）。アプタマーは、用いられる選択に応じて、平衡解離定数がマイクロモルからナノモル未満の範囲にわたる高親和性を有しうる。アプタマーはまた、高度の選択性も示し、例えば、７−メチルＧとＧとの間で（ＨａｌｌｅｒおよびＳａｒｎｏｗ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９４巻、８５２１〜８５２６頁（１９９７年））、またはＤ−トリプトファンとＬ−トリプトファンとの間で（前出、Ｇｏｌｄら）１０００倍の識別力を示す。
【００３９】
ＭＲＦ発現の調節
本発明の各種の態様では、細胞型または組織に特異的な発現調節エレメントが、ＭＲＦまたはその機能的な変異体をコードする核酸配列に作動的に連結される。ＭＲＦをコードする１または複数の核酸配列に、１または複数の調節エレメントを連結することができる。ＭＲＦ配列は、ヒトオルトログ（図２Ａに示されるＣ１１Ｏｒｆ９）、他のオルトログ、相同体、またはこれらの機能的変異体の配列でありうる。ＭＲＦ配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも生物学的効果を及ぼすことが可能であり、したがって、生物活性剤でありうる。例えば、ＭＲＦは、ＯＬの成熟および／または有髄化を促進しうる。調節エレメントは、選択的なＭＲＦ発現に影響を及ぼすことが可能であり、かつ／またはＭＲＦの誘導的発現もしくは構成的発現を提供しうる。ＭＲＦ発現はまた、他の生物活性剤によっても調節または制御することができる。
【００４０】
対象の方法で用いられる生物活性剤は、ＭＲＦ、また、図５に示される、ＭＲＦにより調節される遺伝子など、それに相関する遺伝子、またはＳｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化において発現する他の遺伝子の活性または発現のレベルを調節するのに有効である。代替的に、このような遺伝子のサブセット、例えば、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐなど、ＯＬ分化の初期において発現する遺伝子；Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化の後期において発現する遺伝子；またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、中間段階おいて発現する遺伝子もまた、本明細書で提供される。相関する遺伝子は、成熟ＯＬにおいて特異的に上方調節される遺伝子でありうる。生物活性剤は、ＭＲＦの発現および／または活性を調節することにより、ＯＬの成熟および有髄化／再有髄化に影響する。調節は、ＭＲＦの活性または発現のレベルを上昇または低下させることを伴いうる。例えば、薬剤は、ＭＲＦまたはＭＲＦの調節に関与する他の遺伝子産物に対するアゴニストの場合もあり、アンタゴニストの場合もある。このような生物活性剤の非限定的な例示的類型は、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、低分子、調合薬、またはこれらの組合せである。
【００４１】
ＭＲＦなどを含めた生物活性剤は、このような薬剤が発現して、ＯＬの分化もしくは成熟、および／または有髄化を促進するなど、それらの所望の機能を付与するように、細胞または組織内において発現しうる。遺伝子発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、細胞型特異的な発現調節エレメント、およびエンハンサーが含まれるがこれらに限定されない特定の調節エレメントの制御下に置かれることが典型的である。このような遺伝子は、調節エレメントに作動的に連結されるという。例えば、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、または細胞／組織特異的プロモーターを発現ベクター内に組み込んで、宿主細胞内で発現する遺伝子の発現を調節することができる。したがって、用いられるプロモーターエレメントに応じて、生物活性剤は、ＭＲＦの発現またはその活性を遮断、増強、または促進するように、所望に応じて発現させることができる。例えば、ＭＲＦの機能を促進する薬剤を細胞内において一時的に発現させる結果、ＯＬの分化を増強させ、この結果、最終的に、有髄化／再有髄化をもたらすことができる。調節配列は、中枢神経系または末梢神経系の特定の細胞型における、生物活性剤の異所性発現を可能とする。例えば、選択的なＭＲＦの調節は、神経膠細胞などの神経細胞などであるがこれらに限定されない細胞内において達成することができる。神経膠細胞には、希突起膠細胞、小膠細胞、シュワン細胞、または星状細胞が含まれうる。
【００４２】
調節配列の例示的な発現には、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）遺伝子、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）遺伝子、  希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦＲ−α遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子、２（ＶＥＧＦＲ２）遺伝子、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子、パーキン遺伝子（ＰＡＲＫ２）、パーキン共調節遺伝子（ＰＡＣＲＧ）、ニューロン特異的Ｔα１  α−チューブリン（Ｔα１）遺伝子、小胞モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、およびα−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）遺伝子、ＰＤＧＦＲ−β遺伝子，Ｏｌｉｇ１遺伝子、Ｏｌｉｇ２遺伝子、またはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子が含まれるがこれらに限定されない遺伝子から選択される調節配列が含まれる。
【００４３】
当技術分野では、その関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号；同第２００３／０１９９０２２号；同第２００６／００５２３２７号、同第２００６／０１９３８４１号、同第２００６／００４０３８６号、同第２００６／００３４７６７号、同第２００６／００３０５４１号；米国特許第６４７２５２０号、同第６２４５３３０号、同第７０２２３１９号、同第７０３３５９５号において開示されるなど、神経細胞特異的なプロモーターのさらなる例が公知である。また、ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞；または＜ｔｉｐｒｏｄ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ：８０８０／ｉｎｄｅｘ＞（特定の細胞／組織に特異的な遺伝子のプロモーターを列挙する）；およびＰａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９５年）、２７０巻、２３１１１〜２３１１８頁も参照されたい。
【００４４】
ＭＲＦおよびＭＲＦの調節物質の発現はまた、細胞型／組織特異的プロモーターを用いる発現系以外の発現系（例えば、エフェクター分子を局所投与する発現系）を用いることによっても、一時的に調節することができる。したがって、一部の実施形態では、細胞死のメディエータータンパク質をコードする遺伝子を、ｔｅｔ応答性プロモーターなど、制御可能なプロモーターエレメントに作動的に連結することができる。例えば、所望の場所および時点において、誘導性薬剤（例えば、テトラサイクリンまたはその類似体）を細胞または被験体に投与し、細胞／組織特異的な形で（例えば、テトラサイクリンだけが、局所的／限定的な形で送達される）、細胞死のメディエータータンパク質の発現を誘導することができる。このような系は、テトラサイクリンの存在が発現を阻害する「オフスイッチ」系、またはテトラサイクリンの存在が発現を誘導するように、大腸菌ＴｅｔＲの突然変異体が用いられる「可逆性の」Ｔｅｔ系を包含することにより、真核細胞における遺伝子発現の緻密な制御をもたらしうる。これらの系は、例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２年）、８９巻、５５４７頁）およびＢｕｊａｒｄら、による米国特許第５，４６４，７５８号；同第５，６５０，２９８号；および同第５，５８９，３６２号において開示されている。
【００４５】
誘導的プロモーターのさらなる例には、ＭＭＴＶ、熱ショック７０プロモーター、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎ）誘導プロモーター（例えば、銅誘導ＡＣＥ１；他の金属イオン）、ホルモン応答エレメント（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｒｏｇｅｎ））、ホルボールエステル（ＴＲＥエレメント）、カルシウムイオノフォア応答エレメント、または脱共役タンパク質３、ヒト葉酸受容体α、乳清酸性タンパク質、プロテアーゼ特異的プロモーターのほか、米国特許第６，３１３，３７３号において開示されるプロモーターが含まれるがこれらに限定されず；また、＜ｂｉｏｂａｓｅ／ｄｅ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｒａｎｓｐｏｒ．ｈｔｍｌ＞におけるオンライン（遺伝子／活性により分類される１５，０００を超える異なるプロモーター配列を伴うデータベースを提供する）；また、Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．、２００６年、３４巻、データベース版、Ｄ１０４〜１０７頁を参照されたい。
【００４６】
さらに他の誘導的プロモーターには、成長ホルモンプロモーター；アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導される、アデノウイルス初期遺伝子プロモーター、もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターなど、プロモーターヘルパーウイルスにより誘導されるプロモーター；ＶＰ１６もしくは１ＣＰ４などのヘルペスウイルスタンパク質により誘導されるヘルペスウイルスプロモーター；牛痘ウイルスもしくはポックスウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより誘導されるプロモーター；または、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによりそれぞれ誘導される、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターなどのバクテリオファージプロモーターが含まれる。
【００４７】
他の実施形態では、構成的プロモーターが所望でありうる。例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス即初期プロモーター、βアクチンプロモーター、またはβグロビンプロモーターを含め、本発明において用いるのに適する多くの構成的プロモーターが存在する。当技術分野では、他の多くの構成的プロモーターが公知であり、本発明において用いることができる。またさらなる実施形態では、調節配列を変化させるかまたは修飾して、発現を増強する（すなわち、プロモーターの強度を増大させる）ことができる。例えば、エンハンサー機能を含むイントロン配列を用いて、プロモーター機能を増大させることができる。ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子は、エンハンサーエレメントとして機能するイントロン配列を含む。この調節エレメント／領域であるＡＳＥ（アンチサイレンサー／エンハンサー）は、エキソン１  ＤＮＡの約１ｋｂ下流に位置し、約１００ｂｐを包含する。Ｍｅｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．、８２巻、３４６〜３５６頁（２００５年）を参照されたい。
【００４８】
さらに、特定の細胞内位置では、ＭＲＦまたはその調節物質の発現が望ましい場合があり、当技術分野において広範に実施されている組換えＤＮＡ法により、ＭＲＦまたはその調節物質をコードする核酸配列を、対応する細胞内局所化配列に作動的に連結することができる。例示的な細胞内局所化配列には、（ａ）細胞外への遺伝子産物の分泌を方向づけるシグナル配列；（ｂ）細胞の細胞質膜または他の膜性区画へのタンパク質の付着を可能とする膜アンカードメイン；（ｃ）コードされたタンパク質の核への移動を媒介する核内局在化配列；（ｄ）コードされたタンパク質を、主に小胞体へと封じ込める、ＥＲ保持配列（例えば、ＫＤＥＬ配列）；（ｅ）タンパク質がファルネシル化して細胞膜と会合するようにこれをデザインしうる；または（ｆ）コードされたタンパク質産物の特異的な細胞内分布において役割を果たす他の任意の配列が含まれるがこれらに限定されない。
【００４９】
他の実施形態では、外部ガイド配列（ＥＧＳ）を用いて、ＭＲＦ阻害剤を標的とすることができる（例えば、ＵＳ５７２８５２１、同６０５７１５３を参照されたい）。一態様において、本発明の生物活性剤は、ＭＲＦの発現および／または活性を調節する機構として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いうる。例えば、ＲＮＡｉを用いて、ＭＲＦの発現および／または活性の阻害剤を標的とし、これにより、ＯＬの成熟化および／または有髄化を促進することができる。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡにより誘発される、配列特異的な、転写後における遺伝子サイレンシング過程である。ＲＮＡｉは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、線虫、真菌、および植物など、多数の生物において見られ、抗ウイルス防御、トランスポゾン活性の調節、および遺伝子発現の調節に関与していると考えられる。ＲＮＡｉにおいて、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、結果としての、配列特異的な遺伝子発現の阻害により、標的ｍＲＮＡの分解を誘導する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＭＲＦ阻害剤を標的とするのに用いられる。
【００５０】
本明細書で用いられる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは、被験体の遺伝子を標的とする、ヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。ＲＮＡ二重鎖とは、ＲＮＡ分子の２つの領域間における相補的対合により形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡが遺伝子を標的とするのは、該ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的とされる遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるからである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である。一部の実施形態において、該二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、該二重鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部でありうる。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、該二重鎖を形成する２つの配列間に位置するループ部分を含有しうる。ループの長さは変化しうる。一部の実施形態において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造はまた、３’突出部分および／または５’突出部分も含有しうる。一部の実施形態において、突出は、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さの３’突出および／または５’突出である。ｓｉＲＮＡは、核酸配列によりコードすることが可能であり、該核酸配列はまた、プロモーターも包含しうる。該核酸配列はまた、ポリアデニル化シグナルも包含しうる。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、最小の合成ポリアデニル化シグナルである。
【００５１】
生物活性剤はまた、神経細胞分化に関与する１または複数の遺伝子、例えば、ＭＲＦ阻害剤を標的とする抗体でもありうる。前出の遺伝子のうちのいずれかによりコードされるポリペプチドに特異的な（または同ポリペプチドの活性部位に特異的な）抗体の作製は、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４９１，９１６号；同第６，９８２，３２１号；同第５，５８５，０９７号；同第５，８４６，５３４号；同第６，９６６，４２４号；および米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号；同第２００４／０００６２１６号；同第２００３／０１０８５４８号；同第２００６／００２９２１号；および同第２００４／０１６６０９９号において開示されるなど、当業者に公知である。例えば、マウスに抗原を含む組成物を注射し、血清試料を採取することにより抗体生成の存在を検証し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得、該Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマをクローニングし、注射された抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、該抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、該ハイブリドーマ培養物から該抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。十分に確立された各種の技法により、ハイブリドーマ培養物から、モノクローナル抗体を単離および精製することができる。このような単離法には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」、２．７．１〜２．７．１２頁、および２．９．１〜２．９．３頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、１９９１年）を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ）」、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、第１０巻、７９〜１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９２年）も参照されたい。
【００５２】
標準的な技法を用いて、抗体を作製するのに適切な量の、十分に特徴づけられた抗原を得ることができる。例として述べると、Ｔｅｄｄｅｒら、米国特許第５，４８４，８９２号により説明される、被覆抗体を用いて、抗原を、細胞から免疫沈降させることができる。代替的に、このような抗原は、対象の抗原を過剰生成する、トランスフェクトされた培養細胞から得ることもできる。公表されたヌクレオチド配列を用いて、これらのタンパク質の各々をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを構築することができる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７３巻、１３７〜１４６頁（１９９１年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻、５０１３〜５０２４頁（１９９３年）を参照されたい。例示として述べると、ＣＤ３をコードするＤＮＡ分子は、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ分子を合成することにより得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、８．２．８〜８．２．１３頁（１９９０年）を参照されたい。また、Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ、６０巻、１１５〜１２７頁（１９８７年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、「ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、第３版、８−８〜８−９頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、１９９５年）も参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法は、１．８キロ塩基の長さまでの大きさの遺伝子を合成することを可能とする（Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．、２１巻、１１３１〜１１４５頁（１９９３年）；Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２巻、２６６〜２７１頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ」、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、第１５巻、「ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｗｈｉｔｅ（編）、２６３〜２６８頁（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９３年））。変化形として、対象の抗原をコードするｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたマウスプレＢ細胞系により免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞と、骨髄腫細胞を融合することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。Ｔｅｄｄｅｒら、米国特許第５，４８４，８９２号を参照されたい。
【００５３】
本発明の生物活性剤はまた、ＭＲＦまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含むベクターなど、ベクターの形態でもありうる。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において用いられるベクターには、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルスに由来するＤＮＡ配列の誘導体、ならびに哺乳動物の機能性ベクターと、機能性プラスミドおよび機能性ファージＤＮＡとの組合せに由来するシャトルベクターが含まれうる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、３２７〜３４１頁（１９８２年）；Ｓｕｂｒａｍｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１巻、８５４〜８６４頁（１９８１年）；ＫａｕｆｉｎａｎｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５９巻、６０１〜６２１頁（１９８２年）；Ｓｃａｈｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻、４６５４〜４６５９頁（１９８３年）；ならびにＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻、４２１６〜４２２０頁（１９８０年）により説明されるベクターなど、真核生物の発現ベクターがよく知られている。本発明の方法において用いられるベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターでありうる。複製欠損アデノウイルスが好ましい。参照により本明細書に組み込まれるＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻、７号、６０８〜６１４頁（１９８８年）により説明される、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕｌＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、ならびに細網内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などの鳥類レトロウイルスなど、例えば、長い末端反復中に含有されるウイルスの調節配列の制御下において、レトロウイルスの構造遺伝子を、対象の単一の遺伝子により置換する、「単一遺伝子ベクター」を用いることができる。発現構築物は、ウイルスベクターの場合もあり、非ウイルスベクターの場合もある。本発明の一部と考えられるウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含めた）、ポリオーマウイルス、または牛痘ウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
【００５４】
複数の遺伝子を導入しうる組換えレトロウイルスベクターもまた、本発明の方法により用いることができる。独立プロモーターの調節下にあるｃＤＮＡを含有する、内部プロモーターを伴うベクター、例えば、ヒトアデノシン脱アミノ酵素（ｈＡＤＡ）のｃＤＮＡがそれ自体の調節配列と共に挿入された選択マーカー（ｎｏｅ．ｓｕｐ．Ｒ）を伴う、Ｎ２ベクターに由来するＳＡＸベクターは、当技術分野において公知の方法を介して、本発明の方法に従いデザインし、用いることができる。
【００５５】
ＭＲＦまたは他の生物活性剤をコードする核配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルもまた必要とされうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。それ自体の開始コドンおよび隣接する配列を含めた全遺伝子またはｃＤＮＡが、適切な発現ベクター内へと挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかし、該コード配列の一部だけが挿入される場合、おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルを与える場合がある。さらに、全挿入配列の翻訳を確保するには、開始コドンが、所望のコード配列のリーディングフレームと一致すべきである。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の多様な由来でありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含することにより増強することができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻、５１６〜５４４頁（１９８７年）を参照されたい）。
【００５６】
本発明の宿主細胞は一般に、前述のベクター内における分子など、前出の核酸分子を用いることにより遺伝子改変することができる。したがって、宿主細胞は、ＭＲＦなど、結果として希突起膠細胞の分化をもたらす、異なる発現レベルの遺伝子産物を生成しうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の遺伝子改変またはトランスフェクションは、本明細書の上記で言及した参考文献において説明され、また、米国特許第６，９９８，１１８号、同第６，６７０，１４７号、または同第６，４６５，２４６号などにおいて開示される、当技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。薬剤の特徴に応じて、全身送達または局所送達、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクター系による送達、リポソーム製剤およびミニ細胞を含めた調合薬を含め、当業者に公知の送達方式のいずれかを介して薬剤を送達することができる。例えば、哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を用いることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、対象のヌクレオチド配列（例えば、治療能がある薬剤をコードするヌクレオチド配列）を、アデノウイルスの転写制御複合体または翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター配列および三連リーダー配列へとライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えにより、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの非本質的領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）内における挿入は、生存可能であり、また、感染した宿主内において、ＡＱＰ１遺伝子産物を発現することが可能な組換えウイルスを結果としてもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８巻、１号、３６５５〜３６５９頁（１９８４年）を参照されたい）。宿主細胞は、神経膠細胞など、神経細胞でありうる。神経細胞には、ＯＰＣまたは成熟ＯＬなど、希突起膠細胞のほか、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）が含まれうる。
【００５７】
ＭＲＦの活性レベルまたは発現レベルの調節は、各種の方法により確認することができる。例えば、遺伝子発現レベルの変化の検出は、増幅アッセイにおいてリアルタイムで実施することができる。一態様において、増幅産物は、ＤＮＡ挿入剤およびＤＮＡ溝結合剤が含まれるがこれらに限定されない蛍光ＤＮＡ結合剤により直接的に可視化することができる。二本鎖ＤＮＡ分子内に組み込まれた挿入剤の量は、増幅されるＤＮＡ産物の量に比例することが典型的であるので、当技術分野における従来の光学系を用いて、挿入された色素の蛍光発光を定量化することにより、増幅産物の量を簡便に決定することができる。この適用に適するＤＮＡ結合色素には、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、ヘキスト（Ｈｏｅｓｔｅ）、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン、エリピチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが含まれる。
【００５８】
別の態様では、増幅反応において、配列特異的プローブなど、他の蛍光標識を用いて、増幅産物の検出および定量化を容易にすることができる。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的な検出に依拠する。それは、特異性および感度の上昇を結果としてもたらす、標的特異的な蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を用いる。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号において教示されている。
【００５９】
さらに別の態様では、神経周期関連遺伝子との配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを用いる、従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施することができる。プローブは、ハイブリダイゼーション反応において、被験対象に由来する生物学的試料中に含有される標的ポリヌクレオチドと安定的な複合体を形成することが可能なことが典型的である。プローブ核酸としてアンチセンスを用いる場合、試料中においてもたらされる標的ポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸の配列に対して相補的であるように選択されることが、当業者により理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドは、該センス核酸の配列に対して相補的であるように選択される。
【００６０】
当業者に公知である通り、ハイブリダイゼーションは、様々な厳密性の条件下で実施することができる。本発明を実施するのに適するハイブリダイゼーション条件は、プローブと、標的の神経細胞周期遺伝子との認識相互作用が、十分に特異的であると同時に、十分に安定的でもあるような条件である。ハイブリダイゼーション反応の厳密性を上昇させる条件は当技術分野の広い範囲において公知であり、公表されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出；「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、第２版を参照されたい）。ニトロセルロース、ガラス、シリコンが含まれるがこれらに限定されない任意の固体支持体上に固定化されたプローブ、および各種の遺伝子アレイを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイを行うことができる。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号において説明される、高密度の遺伝子チップ上において実施される。
【００６１】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて形成されるプローブ−標的複合体を簡便に検出するには、ヌクレオチドプローブを検出可能な標識へとコンジュゲートさせる。本発明において用いるのに適する検出可能な標識には、光化学的手段、生化学的手段、分光学的手段、免疫化学的手段、電子的手段、光学的手段、または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。当技術分野では、多種多様の適切な検出可能標識が公知であり、これらには、蛍光標識または化学発光標識、放射性同位体標識、酵素リガンド、または他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識または酵素タグを用いることが所望される可能性が高い。
【００６２】
ハイブリダイゼーション強度を検出または定量化するのに用いられる検出法は、上記で選択される標識に依存することが典型的である。例えば、写真フィルムまたはホスホイメージャーを用いて、放射性標識を検出することができる。発光された光を検出する光検出器を用いて、蛍光マーカーを検出および定量化することができる。酵素に基質を供給し、基質上における酵素の作用により生成される反応産物を測定することにより、酵素標識を検出することが典型的であり、また、最後に、単に、着色標識を可視化することにより、比色分析標識を検出する。
【００６３】
ＭＲＦ発現の調節はまた、対応するＭＲＦの遺伝子産物、および／もしくは、図５における遺伝子産物など、それに相関する遺伝子産物、またはＳｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、もしくはＭｏｇを検討することによっても決定することができる。代替的に、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐなど、ＯＬ分化の初期において発現する遺伝子；Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化の後期において発現する遺伝子；またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、中間段階おいて発現する遺伝子など、サブセットの発現を評価することもできる。タンパク質レベルの決定は、ａ）生物学的試料中に含有されるタンパク質を、ＭＲＦタンパク質、またはそれに相関するタンパク質に特異的に結合する検出剤と接触させるステップと、（ｂ）このようにして形成される、任意の検出剤：タンパク質複合体を同定するステップとを伴うことが典型的である。一態様において、該タンパク質に特異的に結合する検出剤は、モノクローナル抗体などの抗体である。
【００６４】
スクリーニングアッセイ
本発明はまた、ＭＲＦ活性を調節するのに有効な、候補生物活性剤をスクリーニングする方法も提供する。該方法は、被験細胞を候補生物活性剤と接触させるステップと、対照細胞と比較した、ＭＲＦの発現レベル、またはその活性の変化についてアッセイするステップとを含む。本発明の１または複数の方法においてアッセイされる候補生物活性剤はまた、異なる時点で比較するほか、基準または対照と比較して、生物活性剤に対する応答において全体的な差違が見られるかどうかを決定するためにもアッセイされうる。
【００６５】
被験細胞は、神経膠細胞などの神経細胞でありうる。被験細胞は、希突起膠細前駆細胞（ＯＰＣ）、成熟ＯＬ、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）でありうるが、これらに限定されない。被験細胞はまた、幹細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞でもありうる。候補生物活性剤は、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子でありうる。
【００６６】
ＭＲＦ発現の変化は、被験神経細胞または被験幹細胞の分化を調節するのに有効な候補生物活性剤を示すことが典型的である。これもまた候補生物活性剤の有効性を示しうる他の変化には、図５における遺伝子、または成熟希突起膠細胞内で特異的に上方調節される遺伝子の発現変化が含まれうる。例えば、Ｓｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、またはＭｏｇの発現変化。代替的に、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐなど、ＯＬ分化の初期において発現する遺伝子；Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化の後期において発現する遺伝子；またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、中間段階おいて発現する遺伝子など、このような遺伝子のサブセットの発現変化を評価することもできる。したがって、被験細胞を用いて、候補薬剤をスクリーニングし、このような薬剤がＭＲＦを調節し、これにより、ＯＬの成熟を促進または阻害するかどうかを決定することができる。ＭＲＦの発現または活性を上昇させるのに有効な生物活性剤は、ＯＬの成熟および再有髄化を促進するのに有効でありうる。それらはまた、ＥＳ細胞などからのＯＬの分化を促進するのにも有効でありうる。このような候補薬剤は、本明細書に記載の動物モデルなどの動物モデルにおいてさらにアッセイすることができ、また、神経障害を治療するための組成物および方法など、神経細胞の分化を誘導する方法において用いることができる。
【００６７】
ＭＲＦ発現レベルの変化は、上記で説明した方法を含め、当技術分野において公知の方法により実施することができる。例えば、発現レベルの変化は、被験細胞および対照細胞に由来するＭＲＦの遺伝子発現プロファイルを解析または比較することによりアッセイすることができる。図５に列挙した遺伝子など、ＭＲＦの発現と相関する他の遺伝子、またはＳｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、成熟希突起膠細胞において特異的に上方調節される遺伝子の変化もアッセイすることができる。代替的に、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐなど、ＯＬ分化の初期において発現する遺伝子；Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化の後期において発現する遺伝子；またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、中間段階おいて発現する遺伝子など、このような遺伝子のサブセットの発現変化をアッセイすることもできる。
【００６８】
候補薬剤は、該薬剤が、初期遺伝子または後期遺伝子に影響を及ぼすかどうか、したがって、初期分化細胞または成熟分化細胞に影響を及ぼすかどうかを決定するように、前駆細胞周期の異なる時間段階において送達することができる。例えば、候補薬剤をスクリーニングして、初期または後期に誘導される遺伝子、例えば、ＯＬ分化の初期におけるＵｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐ、またはＭａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、幼若ＯＬまたは成熟ＯＬと関連するいずれの遺伝子が影響を受けるのかを決定することができる。ＯＰＣを、初期遺伝子または後期遺伝子の誘導／下方調節欠損についてスクリーニングすると、ＯＬ分化の初期段階および後期段階と関連することが本明細書において同定される遺伝子の活性を調節する薬剤を選択することにより、ＯＬの分化を促進するより良好な治療的標的化を行うことができる。さらに、このような薬剤を被験体に投与して、未分化ＯＰＣまたは未成熟ＯＬの異なる段階から、正常で完全なＯＬの成熟を促進することもできる。このような薬剤はまた、ＯＬ分化の異なる段階から、有髄化するＯＬを生成させるのに必要な遺伝子プログラムを再構成するのにも用いることができる。
【００６９】
一部の態様では、アッセイするステップを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施する。該方法の別の態様では、アッセイするステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施する。当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける各種の方法が用いられる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、細胞培養物中におけるＯＬ分化を促進しうる一方、以下でさらに説明される通り、動物モデルにより、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを実施することができる。当業者には、遺伝子チップ法またはアレイ法（例えば、遺伝子チップは、Ａｇｉｌｅｎｔ社、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｎａｎｏｇｅｎ社など、複数の販売元により容易に入手可能である）、免疫ブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、および他の手段などによる発現プロファイルアッセイが周知であり、また、上記でもさらに説明されている。
【００７０】
本発明の一部の態様では、１または複数の候補生物活性剤を、細胞培養物と接触させ、このような接触の前において、これと同時に、またはこの後において、ミエリン修復誘導剤または軸索保護誘導剤など、１または複数の他の生物活性剤もまた細胞へと送達し、生物活性剤およびミエリン修復剤または軸索保護剤のどの組合せにより相乗効果がもたらされるかを決定する。１または複数の生物活性剤は、ＥＳ細胞などの幹細胞が、ＯＬ（またはＯＰＣ）へと分化することを誘導する因子でありうる。例えば、該因子は、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、またはＯｌｉｇ２などの転写因子でありうる。例えば、前駆細胞型から有髄化する希突起膠細胞への移行を示す低速度撮影顕微鏡法を用いることにより、または本明細書で説明されるＯＬ特異的マーカーの発現をアッセイすることにより、培養物中において相乗効果を観察することができる。さらに、前駆細胞に、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の膜標的化形態をトランスフェクトし、分化細胞の検出において好都合な蛍光顕微鏡法を容易にすることができる。したがって、各種の実施形態では、米国特許第７，００８，６３４号；同第６，９７２，１９５号；同第６，９８２，１６８号；同第６，９６２，９８０号；同第６，９０２，８８１号；同第６，８５５，５０４号；または同第６，８４６，６２５号において開示される技法など、当技術分野において公知の技法を用いて、細胞を培養および／または遺伝子改変し、標的ポリペプチドを発現させることができる。
【００７１】
スクリーニングアッセイにおいて用いられる細胞には、被験体から得、約５、６、７、８、９〜約１４日間にわたり培養物中において増殖させたＯＰＣが含まれうる。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、または９日間にわたり培養することができる。培養物中において増殖させる際、このような細胞には、１または複数のベクターをトランスフェクトすることができる。
【００７２】
本発明の別の態様は、スクリーニングアッセイのためのシステムである。したがって、それを介してスクリーニングアッセイに関するデータを発生させうる論理デバイスを表わす例もまた提供される。候補生物活性剤との接触を伴うかまたは伴わない被験細胞の発現プロファイルなどのデータを受信および保存するコンピュータシステム（またはデジタルデバイス）。コンピュータシステムは、また、生物活性剤と接触させた神経細胞と、生物活性剤と接触させなかった対照細胞との発現プロファイルの比較など、データに対する解析も実施しうる。コンピュータシステムは、媒体、および／または、場合によって、固定化された媒体を有するサーバーに接続されうるネットワークポートからの指示を読み取りうる論理装置として理解することができる。システムには、ＣＰＵ、ディスクドライブ、ならびに、キーボードおよび／またはマウスなど、任意選択の入力デバイス、ならびに任意選択のモニターを包含することが典型的である。示される通信媒体を介し、ローカルまたは遠隔の位置にあるサーバーへのデータ通信を達成することができる。
【００７３】
通信媒体には、データを送信および／または受信する任意の手段が含まれうる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続でありうる。このような接続は、ウェブ上の通信を提供しうる。本発明に関連するデータを、このようなネットワークまたは接続により送信し、利用者が受信および／または参照することができる。受信者は、個人でありうるが、これに限定されない。コンピュータにより読み取り可能な媒体には、候補生物活性剤と接触させた神経細胞から得られる発現プロファイルの解析結果の送信に適する媒体が含まれうる。媒体は、生物活性剤が、ＭＲＦまたは他の相関する遺伝子の発現を調節するかどうかなど、本明細書に記載の方法を用いて導出された結果を包含しうる。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法を実施する場合、本明細書において例示される方法を含め、希突起膠細胞の分化を確認するのに適用可能な任意の公知の方法を用いることができる。候補生物活性剤は、それらが、活性を促進する（例えば、ＭＲＦの発現レベルを増強する）か、または活性を阻害する（例えば、ＭＲＦ阻害剤などの標的分子に対する結合を介して、発現レベルを低下させるか、または機能を遮断する）かに基づき、選択することができる。
【００７５】
マイクロアレイ
本明細書に記載のスクリーニング方法はまた、マイクロアレイ、またはその上に固定化させた遺伝子チップ、その少なくとも１つがＭＲＦに対応する複数のプローブを用いても実施することができる。これらのマイクロアレイはまた、複数種類のヒト疾患組織、例えば、多発性硬化症病変または希突起膠細胞腫瘍組織において存在する、希突起膠細胞系統細胞の分化状態を評価するのにも用いることができる。したがって、本発明は、そのようなマイクロアレイを含む組成物を提供する。
【００７６】
マイクロアレイは、ＭＲＦに対応する少なくとも１つのプローブ、また、ＭＲＦによって調節される遺伝子に相関する１または複数のプローブを包含しうる。複数のプローブは、ＭＲＦ、また、図５における少なくとも１つの遺伝子に対応しうる。複数のプローブは、ＭＲＦ、および図５におけるすべての遺伝子に対応しうる。プローブはまた、ＭＲＦ、また、Ｓｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／またはＭｏｇなど、成熟希突起膠細胞において特異的に発現する遺伝子にも対応しうる。代替的に、マイクロアレイ上における複数のプローブは、ＭＲＦ、また、ＯＬ分化の初期におけるＵｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐ、ＯＬ分化の後期におけるＭａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇ、またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、ＯＬ分化の中間段階において発現する遺伝子など、ＯＬ分化の異なる段階で発現する遺伝子など、遺伝子のサブセットも含みうる。
【００７７】
プローブとは、ハイブリダイゼーション反応において、それに対応する標的ポリヌクレオチドを検出または同定するのに用いられるポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドに対して適用される「ハイブリダイズする」という用語は、該ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応において、ヌクレオチド残基の塩基間における水素結合により安定化する複合体を形成する能力を指す。１つのポリヌクレオチドが、最終的に別のポリヌクレオチドに由来する場合、異なるポリヌクレオチドは互いに「対応する」という。例えば、センス鎖は、同じ二本鎖配列のアンチセンス鎖に対応する。ｍＲＮＡ（また、遺伝子転写物としても公知である）は、それが転写される元の遺伝子に対応する。ｃＤＮＡは、逆転写反応、またはＲＮＡ配列の知識に基づくＤＮＡの化学合成などにより、それが生成される元のＲＮＡに対応する。ｃＤＮＡはまた、ＲＮＡをコードする遺伝子にも対応する。ポリヌクレオチドは、その対の一方が、他方の一部だけに由来する場合も対応するという。
【００７８】
本発明のアレイは、比較を目的とする、陽性または陰性の対照プローブを含みうる。適切な対照プローブの選択は、最初に選択する試料プローブ、および調べているその発現パターンに依存する。任意の種類の対照プローブを、アレイ内の任意の位置、またはアレイ全体の複数の位置において局在化させて、ハイブリダイゼーションアッセイにおける空間的なばらつき、全体の発現レベル、または非特異的な結合についての対照とすることができる。
【００７９】
本発明において実施されるポリヌクレオチドプローブは、化学合成、組換えによるクローニング、例えば、ＰＣＲ、またはこれらの任意の組合せにより得ることができる。ポリヌクレオチドを化学合成する方法は当技術分野において周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者は、本明細書に記載の配列データを用いて、ＤＮＡ合成器、ＰＣＲ機を用いるか、または市販品を取り寄せることにより、所望のポリヌクレオチドを得ることができる。選択されたプローブは、該プローブを、固体支持体表面と安定的に会合させる際に有効である任意の適切な技法により、固体支持体の所定の領域上に固定化させる。「安定的に会合した」とは、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下において、ポリヌクレオチドが、所定領域に局在化された状態を維持することを意味する。ポリヌクレオチドは、それ自体、支持体表面と共有結合させることもでき、これに非共有結合させることもできる。非共有結合の例には、非特異的な吸着、イオン性相互作用、疎水性相互作用、または水素結合による相互作用の結果としての結合が含まれる。共有結合は、ポリヌクレオチドと、支持体表面上に存在する官能基との化学結合の形成を伴う。官能基は、天然の場合もあり、リンカーとして導入される場合もある。非限定的な官能基には、ヒドロキシル、アミン、チオール、およびアミドが含まれるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドプローブの共有結合による固定化に適用可能な例示的な技法には、ＵＶによる架橋形成または他の光誘導型の化学結合形成、および機械誘導型の結合形成が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，８３７，８３２号、同第５，１４３，８５４号、同第５８００９９２号、ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８、およびＷＯ９７／１０３６５を参照されたい）。好ましい方法は、ポリヌクレオチドプローブの末端のうちの１つを、一重の共有結合を介して支持体表面へと連結することである。プローブがより大きな自由度を有し、相補的な標的との複合体相互作用に用いられるとき、このような立体構造は、高度のハイブリダイゼーション効率を可能とする。
【００８０】
手動で、またはより一般的には、一連の操作により、試料を多数の所定領域へとスポットする自動デバイスを用いて、複数のプローブ試料を付着させることにより、各アレイを作製することが典型的である。ポリヌクレオチドアレイの作製には、一般に、各種の自動スポッティングデバイスが用いられる。このようなデバイスには、誘電式デバイスまたはインクジェット式デバイス、自動式マイクロピペット、および市販されるこれらのデバイスのうちのいずれか（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、Ｂｉｏｍｅｋ２０００）が含まれる。
【００８１】
動物モデル
本発明の別の態様において、スクリーニングアッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。例えば、有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法は、候補生物活性剤を動物に投与するステップと、対照動物と比較したＭＲＦの発現レベルの上昇についてアッセイし、該上昇が、動物における有髄化を促進する前記生物活性剤を示すステップとを含みうる。本発明の１または複数の方法においてアッセイされる候補生物活性剤はまた、異なる時点で比較するほか、基準または対照と比較して、生物活性剤に対する応答において全体的な差違が見られるかどうかを決定するためにもアッセイされうる。
【００８２】
動物被験体を用いて、候補生物活性剤をスクリーニングし、このような薬剤がＭＲＦを調節するかどうかを決定し、したがって、ＭＲＦを下方調節または上方調節する候補薬剤を同定し、これにより、ＯＬの成熟または分化および再有髄化を促進または阻害する薬剤を同定することができる。被験体のスクリーニング方法に有用な候補生物活性剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣剤、抗体、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、および／または低分子を含みうる。ＭＲＦ発現／活性、および／または神経細胞の分化を調節または改変する能力を有することが疑われる任意の薬剤を、本明細書で開示されるスクリーニング方法にかけることができる。
【００８３】
ＭＲＦ、また、図５に列挙した遺伝子など、ＭＲＦの発現と相関する他の遺伝子、またはＳｏｘ１０、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、Ｍｂｐ、Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、成熟希突起膠細胞において特異的に上方調節される遺伝子の変化もアッセイすることができる。代替的に、Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、Ｐｌｐ１、および／もしくはＭｂｐなど、ＯＬ分化の初期において発現する遺伝子；Ｍａｇ、Ｔｒｆ、Ｍｏｂｐ、および／もしくはＭｏｇなど、ＯＬ分化の後期において発現する遺伝子；またはＰｌｐ１、Ｍｂｐ、もしくはＭａｇなど、中間段階において発現する遺伝子など、このような遺伝子のサブセットの発現変化をアッセイすることもできる。有髄化および発現レベルのアッセイは、当業者に周知であり（例えば、遺伝子チップは、複数の販売元から容易に入手することができる）、本明細書でさらに説明されている。
【００８４】
動物は、げっ歯動物種または類人猿動物種など、哺乳動物であることが典型的である。動物は、マウス、ラット、モルモット、またはサルでありうる。動物はまた、１または複数の所望の特徴を有する「ノックアウト」または「ノックイン」である動物などのトランスジェニック動物でもありうる。「ノックアウト」は、好ましくは、標的遺伝子の発現が無視できるかまたは検出不可能となるように、標的遺伝子の機能低下を結果としてもたらす、トランスジェニック配列の導入による標的遺伝子の変化を有する。「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子のさらなるコピーを導入することにより、または標的遺伝子の内因性のコピーの発現を増強する調節配列を作動的に挿入することにより、標的遺伝子の発現の増大を結果としてもたらす、宿主細胞ゲノムの変化を有するトランスジェニック動物である。ノックインまたはノックアウトのトランスジェニック動物は、標的遺伝子に関して、ヘテロ接合の場合もあり、ホモ接合の場合もある。ノックアウトおよびノックイン共に、「バイジェニック」でありうる。バイジェニック動物は、少なくとも２つの宿主細胞遺伝子が変化している。
【００８５】
胚のマイクロ操作技術の進歩により、今日では、哺乳類の有精卵内に異種ＤＮＡを導入することが可能である。例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムを介する沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染、または他の手段により、全能性幹細胞または多能性幹細胞を形質転換することができる。次いで、形質転換細胞を胚内に導入し、次いで、該胚をトランスジェニック動物へと発育させる。好ましい実施形態では、感染した胚から導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製しうるように、発育する胚に、所望の導入遺伝子を含有するウイルスベクターを感染させる。別の好ましい実施形態では、所望の導入遺伝子を、好ましくは単一細胞段階において、胚の前核または細胞質内へと共注入し、該胚を、成熟トランスジェニック動物へと発育させる。トランスジェニック動物を作製するためのこれらの方法および他の変法は当技術分野で十分に確立されており、したがって、本明細書では詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号、および同第５，１７５，３８４号を参照されたい。
【００８６】
本発明は、モノジェニック動物およびバイジェニック動物を提供する。例えば、本明細書では、ＭＲＦノックインまたはＭＲＦノックアウトを含む動物が開示される。トランスジェニック動物は、ＭＲＦ導入遺伝子を含むことが可能であり、導入遺伝子は、該動物のゲノム内へと安定的に組み込まれされ、該トランスジェニック動物の野生型コピーを置換する。代替的に、トランスジェニック動物は、該動物のゲノム内にあるＭＲＦの野生型コピーに加え、ＭＲＦ導入遺伝子も有しうる。例えば、導入遺伝子は、単一のコピーとして、またはコンカタマー、例えば、ヘッドからヘッドへのタンデム配列またはヘッドからテールへのタンデム配列において組み込むことができる。ＭＲＦ導入遺伝子は、１または複数の突然変異、例えば、特定のドメインまたはエキソンの欠失を有しうる。欠失は、エキソン８（図８）など、推定ＤＮＡ結合ドメイン内におけるエキソンの欠失でありうる。欠失は、構成的な場合もあり、条件的な場合もある。例えば、ＭＲＦ導入遺伝子は、リコンビナーゼ部位に隣接する場合がある。トランスジェニック動物はまた、そのゲノム内に、同類の認識配列であるｌｏｘＰ配列（すなわち、ｌｏｘＰ部位）を認識する、Ｃｒｅなどのリコンビナーゼをコードする配列を安定的に組み込みうる。
【００８７】
当技術分野では、他のリコンビナーゼ認識配列も公知である。例えば、説明される通り、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、８塩基対のコア配列を挟む、２つの１３塩基対による逆行反復配列を含む、３４塩基対の配列である、ｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５巻、５２１〜５２７頁（１９９４年）を参照されたい）。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、９塩基対による２つのコア型のＩｎｔ結合部位と、７塩基対の重複領域とを含有する、約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コア型のＩｎｔ結合部位と、アーム型のＩｎｔ結合部位のほか、補酵素ＩＨＦ、ＦＩＳ、およびＸｉｓに対する部位も含有する、約２４０塩基対の配列である。Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３巻、６９９〜７０７頁（１９９３年）を参照されたい。このような部位はまた、Ｈａｒｔｌｅｙら、米国特許出願公開第２００６００３５２６９号による開示において開示されるような、当技術分野において公知の方法および生成物を用いて組換えを増強するように、本発明に従い操作することもできる。
【００８８】
本発明のＣｒｅリコンビナーゼは、野生型の場合もあり、野生型の変異体の場合もある。Ｃｒｅリコンビナーゼは、トランスジェニック動物（またはトランスジェニック細胞）において誘導可能でありうる。変異体のＣｒｅリコンビナーゼは、組換え部位に対する特異性が拡張されている。具体的に述べると、該変異体は、ｌｏｘＰ配列以外の配列と、野生型のＣｒｅリコンビナーゼが活性である他のｌｏｘ部位配列との間の組換えを媒介する。一般に、開示されるＣｒｅ変異体は、野生型のＣｒｅが作用しうるｌｏｘ部位（野生型のｌｏｘ部位と称する）間における効率的な組換え、野生型Ｃｒｅにより効率的に用いられない変異体ｌｏｘ部位（変異体ｌｏｘ部位と称する）間における効率的な組換え、および野生型ｌｏｘ部位と変異体ｌｏｘ部位との間における効率的な組換えを媒介する。例えば、Ｃｒｅ変異体は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（またはＦＬＰなど、他の類似のリコンビナーゼ）を用いうる任意の方法または技法において用いることができる。加えて、Ｃｒｅ変異体は、野生型ｌｏｘ部位と、変異体ｌｏｘ部位との間のはるかにより効率的な組換えを可能とするので、異なる代替的な組換えの実施も可能とする。このような代替的な組換えの制御を用いて、より洗練された配列組換えを達成し、野生型のＣｒｅリコンビナーゼによっては不可能な結果を達成することができる。変異体Ｃｒｅリコンビナーゼは、米国特許第６，８９０，７２６号において開示されるなど、当技術分野において公知である。Ｃｒｅ活性の誘導可能性は、Ｃｒｅタンパク質の局在化により制御することができる。例えば、Ｃｒｅタンパク質は、Ｃｒｅ融合体である、ＣｒｅＥＲｔ２を結果としてもたらす、エストロゲン受容体の突然変異形とのＣｒｅリコンビナーゼの融合体でありうる。リガンドの不在下において、ＣｒｅＥＲｔ２は、細胞質に存在する。しかし、合成ステロイドホルモン（タモキシフェン）の投与後において、ＣｒｅＥＲｔ２タンパク質は、それが機能的である核内へと移動する（すなわち、タモキシフェン誘導性）。
【００８９】
リコンビナーゼはまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２ミクロンのプラスミドの天然酵素である、ＦＬＰリコンビナーゼでもありうる。ＦＬＰリコンビナーゼは、ＦＲＴ（ＦＬＰリコンビナーゼ標的）配列と称する、特定の３４塩基対のＤＮＡ配列において活性である。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第７３７１５７７号、同第７０６０４９９号、同第６９５６１４６号、同第６７７４２７９号において説明される）ＦｌｐＥＲなどの変異体も用いることができる。
【００９０】
本発明の導入遺伝子はまた、中枢神経系内の細胞など、特定の組織型または細胞型へと選択的に導入し、活性化させることもできる。このような細胞型特異的な活性化に必要とされる調節配列は、対象の特定の細胞型に依存するが、当業者には明らかであろう。例えば、リコンビナーゼおよび／またはＭＲＦ導入遺伝子をコードする核酸配列を、細胞型特異的な調節エレメントへと作動的に連結することができる。該調節エレメントは、希突起膠細前駆細胞（ＯＰＣ）、成熟ＯＬ、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）などであるがこれらに限定されない神経細胞に対して特異的でありうる。例えば、神経細胞特異的な調節エレメントは、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来しうる。さらに、細胞型特異的な調節エレメントはまた、誘導的プロモーターの場合もあり、構成的プロモーターの場合もある。
【００９１】
動物モデルは、免疫調節、ミエリン修復／再有髄化、および／または軸索保護を促進する薬剤など、再有髄化の促進を対象とする生物活性剤についての、治療的に有効で有益な組合せを決定するスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば、トランスジェニック動物を改変して、ＭＲＦ、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、および／またはＯｌｉｇ２の発現または活性の低下または上昇など、免疫調節、ミエリン修復／再有髄化、および／または軸索保護を促進する薬剤を発現するか、またはこれを発現するレベルを変化させる（すなわち、上昇または低下させる）ことができる。したがって、このような動物を用いて、これもまた、免疫調節、ミエリン修復／再有髄化、および／または軸索保護を対象とする、異なる複数の生物活性剤をスクリーニングし、ここで、該トランスジェニック動物が、１つの評価項目を対象とする薬剤を含む場合は、該動物に（１または複数の）異なる評価項目を対象とする薬剤を投与し、また、この逆を行い、神経障害または本明細書に記載の関連する状態に対して相乗作用的な治療結果をもたらす治療剤の候補となる組合せを同定することができる。
【００９２】
動物モデル系を用いて、ニューロンの再有髄化を促進するか、またはこれに有益な生物活性剤の開発を行うことができる。例えば、ＭＲＦ活性の上昇により、結果として、例えば、免疫調節、ミエリン修復、または軸索保護をもたらす薬剤を発現するように改変されるトランスジェニック動物は、未知の化合物をスクリーニングして、（１）化合物が、免疫忍容性を増強するか、炎症反応を抑制するか、もしくは再有髄化を促進するかどうか、および／または（２）化合物が、動物モデルにおいて、相乗的な治療効果を結果としてもたらしうるかどうかを決定する方法において用いることができる。代替的に、ＭＲＦにおいてエキソン８が欠失するトランスジェニック動物など、ＭＲＦ活性が損なわれた動物を用いて、ＣＮＳにおける有髄化不全を緩和し、該動物のＯＬの成熟を促進する化合物をスクリーニングすることができる。さらに、本発明のトランスジェニック動物から神経細胞を単離して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法を含め、細胞ベースの環境または細胞培養物の環境において、さらなる研究またはアッセイを実施することができる。モデル系を用いて、被験薬剤が、有害作用を付与するか、または再有髄化を低下させる、例えば、脱髄後における損傷をもたらすかどうかを調べることができる。
【００９３】
動物モデルはまた、組合せ方式により薬剤をスクリーニングするのにも用いることができる。例えば、候補薬剤は、免疫調節、ミエリン修復／再有髄化、または軸索保護をもたらす第２の薬剤など、別の薬剤と共に投与することができる。例えば、ＭＲＦ、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１０、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せなど、公知の生物活性剤を、候補生物活性剤の前に投与することもでき、これと同時に投与することもでき、またはこの後に投与することもできる。（１または複数の）細胞特異的なマーカー遺伝子の発現を検出および／または定量化し、再有髄化が生じたかどうか、また、それはどのくらいであったか、また、このような再有髄化が、対照と比較して増強されているかどうかを決定することなど、合成組合せ治療の検出および定量化により組合せ効果を決定することができる。このような例においてならば、対照は、疾患モデルが誘導される野生型でもありえようし、候補薬剤が投与されないトランスジェニック動物でもありえよう。
【００９４】
本発明の動物モデルはまた、脱髄を受けるように誘導することができ、ＭＲＦ発現を評価することにより、再有髄化に対する生物活性剤の効果を評価することができる。被験動物において脱髄を誘導する多数の方法が確立されている。例えば、神経の脱髄は、被験動物における病原体または物理的傷害、炎症反応および／または自己免疫反応を誘導する薬剤により与えられる場合がある。好ましい方法では、ＩＦＮ−γおよびクプリゾン（ビス−シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）が含まれるがこれらに限定されない脱髄誘導剤が用いられる。クプリゾン誘導型脱髄モデルは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．、１１巻、１０７〜１１６頁（２００１年）において説明されている。この方法では、約１〜約１０週間の範囲の数週間にわたり、クプリゾンを含有する食餌を被験動物に摂取させることが典型的である。
【００９５】
適切な方法により脱髄状態を誘導した後は、既に脱髄させた病変において、またはその近傍において再有髄化を可能とするのに十分な長さの時間にわたり、動物を回復させる。軸索の再有髄化を発生させるのに必要とされる時間の長さは動物ごとに異なるが、少なくとも約１週間を要することが一般的であり、少なくとも約２〜１０週間を要することがよりしばしばであり、約４〜約１０週間を要することがさらによりしばしばである。
【００９６】
神経系（例えば、中枢神経系または末梢神経系）において有髄化した軸索の増加を観察することにより、またはＭＲＦなど、有髄化細胞のマーカータンパク質のレベルの上昇を検出することにより、本明細書に記載の動物モデルにおける再有髄化を確認することができる。脱髄を検出する同じ方法を用いて、再有髄化が生じたかどうかを決定することができる。例えば、当技術分野で公知の免疫組織化学法またはタンパク質解析により、脱髄／再有髄化現象を観察することができる。例えば、ＭＲＦなど、希突起膠細胞マーカーを特異的に認識する抗体により、被験動物の脳の断面を染色することができる。別の態様では、免疫ブロッティング、ハイブリダイゼーション法、および増幅手順、ならびに当技術分野、例えば、それらの各々の開示が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｋｏｕｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００６年）、１０３巻、１５５１〜１５５６頁；Ｚｈａｎｇら（２００３年）、前出；Ｇｉｒａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．（２００５年）、２５巻、７９２４〜７９３３頁；および米国特許第６，９０９，０３１号；同第６，８９１，０８１号；同第６，９０３，２４４号；同第６，９０５，８２３号；同第６，７８１，０２９号；および同第６，７５３，４５６号において十分に確立された他の任意の方法により、ＭＲＦなど、希突起膠細胞マーカーの発現レベルを定量化することができる。
【００９７】
治療剤
本明細書に記載の組成物は、治療剤として用いることができる。神経障害を有する被験体は、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤により治療することができる。本明細書に記載の組成物および方法を用いて、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ抗体陽性疾患、白質萎縮症：副腎白質萎縮症（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ファンデルクナップ症候群、ツェルヴェーガー症候群、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多巣性運動神経障害（ＭＭＮ）、脊髄傷害（例えば、脊髄の外傷または切断）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および視神経炎などであるが、これらに限定されない各種の神経障害を治療することができる。
【００９８】
本明細書に記載の生物活性剤を被験体に投与してＭＲＦの発現および／または活性を調節することにより、成熟希突起膠細胞（ＯＬ）への希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）の分化を促進することができる。神経障害は、多発性硬化症など、脱髄障害でありうる。治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を被験体に投与することにより、被験体における再有髄化を促進することができる。
【００９９】
再有髄化
本明細書に記載の生物活性剤を被験体に投与して、神経細胞の分化を増強することができる。生物活性剤は、ＭＲＦまたはそれにより調節される遺伝子の発現を調節することにより再有髄化を促進しうる。本明細書に記載の生物活性剤は、ＭＲＦ自体でありうる。このような生物活性剤の投与は、薬剤自体の外因的投与により達成することもでき、本明細書で説明され、また、当業者に公知である、適切な転写調節エレメントを介して、該薬剤を、構成的、誘導的、または細胞特異的な形でコードおよび発現する核酸ベクターを提供することにより達成することもできる。このようにして発現される生物活性剤は、それ自体、神経細胞分化を促進しうる。このような神経細胞には、ＯＬ、ＯＰＣ、ＳＣ、ＮＳＣ、星状細胞、および小膠細胞が含まれる。
【０１００】
したがって、神経細胞の分化および／または再有髄化を促進するように、内因性のＭＲＦ発現を誘導する生物活性剤を、細胞／被験体へと投与することができる。一部の実施形態では、生物活性剤を用いて、ＥＳ細胞が、ＯＬ（またはＯＰＣ）へと分化するように誘導することができる。ポリペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸を投与することにより、ＭＲＦ発現を調節して、ＯＬへの分化を増強することができる。
【０１０１】
相同組換え、組込みにより、または本明細書で記載され、また、当業者に周知の成分および方法を用いるプラスミドもしくはウイルスベクターを用いることにより、所望のポリペプチドをコードする核酸を、標的細胞内へと形質転換することができる。トランスフェクトされうる神経細胞には、ＯＬ、ＯＰＣ、ＳＣ、ＮＳＣ、星状細胞、および小膠細胞が含まれる。一部の実施形態において、このような神経細胞には、同時に、または異なる時点において、複数のベクターをトランスフェクトすることができる。さらに、本明細書で開示されるポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸は、本明細書で開示され、また、当業者により認知される、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、または細胞特異的プロモーターへと作動的に連結することができる。
【０１０２】
生物活性剤を投与して、ＯＬの成熟など、神経細胞の分化を結果としてもたらすＭＲＦの発現を増大させ、再有髄化を促進することができる。投与される生物活性剤は、ＭＲＦ自体でありうる。投与される生物活性剤はまた、ＭＲＦ発現の調節物質をコードするか、またはＭＲＦ自体をコードする核酸ベクターでもありうる。核酸ベクターは、構成的、誘導的、または細胞特異的な転写調節エレメントを含有し、これにより、所望の生物活性剤の持続的な発現または時点により異なる発現をもたらしうる。例えば、テトラサイクリン抑制系を用いるドキシサイクリンにより、細胞におけるＭＲＦ発現を誘導することができる。代替的に、発現ベクターは、本明細書で記載されるか、または当業者に周知の、神経特異的プロモーターを含みうる。したがって、それを必要とする被験体を治療する方法において、ＯＰＣの増殖と、ＯＬの分化とを交互に行って再有髄化を増強する必要がある場合、神経細胞に対する生物活性剤の発現を調節することができる。
【０１０３】
例えば、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、または神経細胞特異的プロモーターに作動的に連結され、ＭＲＦ遺伝子、またはＭＲＦの発現／活性を調節する別の遺伝子をコードする核酸分子を、神経細胞にトランスフェクト（神経細胞を遺伝子改変）することができる。このような細胞を形質転換させて、異なる発現レベルでＭＲＦを発現させ、したがって、神経細胞の増殖を調節することができる。例えば、ポリペプチドは、ＭＲＦでありうる。
【０１０４】
また、細胞または被験体に増殖因子またはホルモンを投与して、神経細胞の分化または増殖を促進することもできる。増殖因子およびホルモンは、それ自体、本明細書で開示される任意の生物活性剤の投与と同時に、この前において、またはこの後において投与することができる。このような増殖因子またはホルモンの例には、甲状腺ホルモンＴ３、インスリン様増殖因子１、線維芽細胞増殖因子２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子、ニューロトロフィン、ニューレグリン、またはこれらの組合せが含まれる。このような増殖因子またはホルモンはまた、本明細書で開示される他の任意の生物活性剤と同時に、この前において、またはこの後において施される核酸ベクターによってもコードされうる。
【０１０５】
さらに、生物活性剤の投与の前において、これと同時に、またはこの後において、ＯＰＣ、シュワン細胞、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）が含まれるがこれらに限定されない神経細胞もまた投与することができる。１種または複数種の生物活性剤と共に、１種または複数種の神経細胞を投与することができる。明確さを目的として述べると、種類とは、例えば、異なる種類の細胞（例えば、希突起膠細胞および星状細胞）または異なる種類の生物活性剤（例えば、抗体およびアンチセンス）を意味する。
【０１０６】
異なる生物活性剤を投与することができる、例えば、第２の生物活性剤の投与と同時に、この前において、またはこの後において、第１の生物活性剤を投与することができる。複数の生物活性剤を投与することができる。例えば、第１の生物活性剤は、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤、またはＭＲＦ自体でありうる。Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進する生物活性剤など、第２の生物活性剤は、ＭＲＦを調節する薬剤の投与と同時に、この前において、またはこの後において投与することができる。代替的に、ＭＲＦは、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの投与と同時に、この前において、またはこの後において投与することもできる。各種の生物活性剤の投与は、再有髄化の促進において相乗効果をもたらしうる。
【０１０７】
前出はまた、標的細胞をトランスフェクトするのに用いうる核酸ベクターによる製剤にも適用しうることを理解されたい。このようなベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、所望のポリペプチドを発現することが可能であるものとして、本明細書で記載され、また、当業者により認知されている。まとめると、このようなベクターはまた、本明細書に記載の医薬製剤または治療剤中においても用いることができる。
【０１０８】
再有髄化細胞の移植
各種の動物モデルにおいて、ＣＮＳ軸索の再有髄化が示されている。以来、近年の多くの研究により、脱髄疾患における細胞移植の使用と関連する新規の技法および新規の機構が示されている。成人脳から単離されたヒトＯＰ細胞を、有髄化不全のマウス突然変異体へと移植したところ、無髄軸索を有髄化することができた。成人の前駆細胞を用いれば、倫理的問題が回避されることが重要である。ＯＰ細胞が、内因的な再有髄化の一因となるのに対し、ＮＳＣは、ミエリンの修復を促進する代替的な細胞供給源である。ＮＳＣは、成人ＣＮＳにおいて見出され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて大幅に増殖させることができ、また、ＯＬ、星状細胞、またはニューロンを形成するように分化させることができる。実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の再発形態または慢性形態を有するげっ歯動物内へと移植したところ、ＮＳＣは、ＣＮＳの炎症領域および脱髄領域へと遊走し、神経膠細胞原基を優先的に選択することが示されている。さらに、移植を受けたマウスにおける臨床的疾患の緩和は、脱髄病変の修復および軸索傷害の軽減と関連していた。組織学的解析により、移植されたＮＳＣは、大半が、ＰＤＧＦＲ＋  ＯＰ細胞へと分化することが確認された。
【０１０９】
本発明の態様において、被験体の生物活性剤は、ＭＲＦ、またはＭＲＦにより上方調節される遺伝子を過剰発現するように改変され、被験体に投与されると、ミエリンの修復または脱髄した軸索の再有髄化に関与する細胞を含みうる。このような細胞を適切なベクターと共に培養し、また、このような細胞に適切なベクターをトランスフェクトして、細胞の成熟、またはＯＬの分化を増強するポリペプチドを発現させることができる。また、細胞を改変して、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、またはＯｌｉｇ２を過剰発現させることもできる。１または複数の細胞型を改変して、ＭＲＦ、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１０、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せを過剰発現させることができる。例えば、細胞を改変してＭＲＦ、およびＳｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、またはＯｌｉｇ２を過剰発現させ、これを被験体に投与して神経障害を治療することができる。ＯＰＣおよび星状細胞など、異なる細胞型もまた投与することができる。一部の実施形態において、ミエリンを生成する細胞またはこれらの前駆細胞には、胚性ＯＰＣまたは成体ＯＰＣが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１０】
別の生物活性剤の投与の前において、これと同時に、またはこの後において投与しうる細胞（「細胞型」）は、希突起膠細前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）でありうる。一部の実施形態において、細胞は、生物活性剤により、ＯＰＣまたはＯＬへと分化するように誘導されたＥＳ細胞などのＥＳ細胞でありうる。一部の実施形態では、このような細胞を動物被験体に投与して、ＯＬの成熟など、神経細胞の分化を増強することができる。
【０１１１】
一実施形態において、細胞は、成熟希突起膠細胞をもたらすそれらの能力に基づき、中枢神経系（ＣＮＳ）内における希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）であると考えられる、ＮＧ２プロテオグリカンを発現する神経膠細胞（ＮＧ２（＋）細胞）である。一部の実施形態では、希突起膠細前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、星状細胞、小膠細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）を、ケモカインをコードするベクターと共に培養し、これにより形質転換し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖させた後で移植する。他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞にトランスフェクトするか、またはこれらを遺伝子改変し、ＭＲＦ遺伝子、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、および／またはＯｌｉｇ２によりコードされるタンパク質を発現させる。
【０１１２】
一部の実施形態では、当技術分野において公知であるか、または本明細書で開示される方法を用いて、１または複数の所望の生物活性剤の発現を可能とするように、希突起膠細前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅球鞘細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）に、１または複数の発現ベクターをトランスフェクトする。このような生物活性剤は、ＭＲＦ、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１０、Ｏｌｉｇ１、またはＯｌｉｇ２の発現／活性を調節しうる。
【０１１３】
侵襲性の手順、手術手順、侵襲性が最小限の手順、および手術以外の手順を含め、当技術分野において公知の方法を用いて移植を実施することが理解される。被験体、標的部位、および送達される（１または複数の）薬剤に応じ、当技術分野において公知の方法を用いて細胞型および細胞数を選択することができる。
【０１１４】
医薬組成物
本発明はまた、被験体における神経障害を治療するための組成物であって、ＭＲＦなど、本明細書に記載の生物活性剤を含む組成物も提供する。組成物はまた、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せもさらに含みうる。意図される医薬組成物には、ペプチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、核酸発現ベクター、抗体もしくは抗体フラグメント、低分子、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。このような組成物は、治療有効量で用いることができる。
【０１１５】
所望の程度の純度を有するこのような薬剤を、薬学的に許容される任意選択の担体、賦形剤、または安定化剤（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、１９８０年）と共に、凍結乾燥させた製剤または水溶液の形態で混合することにより、このような薬剤による製剤を保存のために調製する。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、これらには、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルオルベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；甘味剤および他の芳香剤；微晶質セルロース、ラクトース、トウモロコシ、および他のデンプンなどの充填剤；結合剤；添加剤；着色剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明の生物活性剤を含む医薬組成物は、酸添加塩および塩基添加塩の両方が含まれることを意図する、薬学的に許容される塩として存在するなど、水溶性形態である。「薬学的に許容される酸添加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的または他の形で有害でなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸により形成される塩を指す。「薬学的に許容される塩基添加塩」には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩など、無機塩基に由来する塩が含まれる。アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される非毒性の有機塩基に由来する塩には、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミン、天然の置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンなど、塩基性のイオン交換樹脂による塩が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与に用いられる製剤は、滅菌であることが好ましい。これは、滅菌濾過膜または当技術分野において公知の他の方法を介する濾過により、容易に達成される。
【０１１７】
薬剤はまた、イムノリポソームとしても調合することができる。リポソームとは、哺乳動物に治療剤を送達するのに有用な、各種の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む小胞体である。生物活性剤を含有するリポソームは、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻、４０３０〜４０３４頁（１９９０年）；米国特許第４，４８５，０４５号；同第４，５４４，５４５号；およびＰＣＴ  ＷＯ９７／３８７３１において説明される方法など、当技術分野において公知の方法により調製される。循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配置と同様、二層形成で配置される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を伴う逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームをもたらすように、規定の小孔サイズによるフィルターを介して押出し成形される。化学療法剤または他の治療的に活性な薬剤も、場合によって、リポソーム内に含有される（Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、８１巻、１４８４〜１４８８頁（１９８９年））。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
マウスＯＰＣの単離、培養、およびトランスフェクション
本質的に、既に説明される通り（Ｃａｈｏｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２８巻、２６４〜２７８頁（２００８年））に、マウスＯＰＣを単離した。略述すると、Ｐ７  Ｃ５７／Ｂ６マウスの脳を摘出し、賽の目に刻み、酵素的に分解して、単一細胞の懸濁液を作製した。これらの細胞を、ＢＳＬ１（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ｌ−１１００）でコーティングした４枚のペトリディッシュ上において、各１５分間ずつにわたり逐次パニングして小膠細胞を枯渇させ、次いで、抗ＰＤＧＦＲαラットモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５５８７７４型）でコーティングしたペトリディッシュ上において、１時間にわたりパニングしてＯＰＣを陽性選択した。付着しない細胞はＤＰＢＳにより洗い落とし、付着するＯＰＣは、トリプシンによりペトリディッシュから採取した。２％のＢ−２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ヒトトランスフェリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（１００ｍｇ／ｍｌ）、プトレシン（１６ｍｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（６０ｎｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（４０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（５ｍｇ／ｍｌ）、Ｄ−ビオチン（１０ｎｇ／ｍｌ）、フォルスコリン（４．２ｍｇ／ｍｌ）、ウシインスリン（５ｍｇ／ｍｌ）（すべて、Ｓｉｇｍａ社製）、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（各１００Ｕ）（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、微量元素Ｂ（１倍濃度；バージニア州、ハーンドン、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社製）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；ニュージャージー州、テリータウン、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社からの恵与）、ならびにＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ−３（１ｎｇ／ｍｌ）（いずれも、ニュージャージー州、ロッキーヒル、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を含有するＤＭＥＭ（カリフォルニア州、カールスバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中、３７℃、１０％ＣＯ２で、ＰＤＬによりコーティングしたＴ１７５組織培養フラスコ内において、ＯＰＣを培養した。分化実験のため、以下の通りに細胞にトランスフェクトし、これらを、上記の通りであるが、ＰＤＧＦ−ＡＡを伴わず、トリヨードチロニン（Ｔ３）（４０ｎｇ／ｍｌ；シグマ社製）を伴う培地へと移した。
【０１１９】
ＯＰＣへのトランスフェクション：ＥＢＳＳによりフラスコを１回洗浄することにより、マウスＯＰＣの培養物を継代培養し、次いで、ＥＢＳＳ中に１：１０のトリプシン：ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて３７℃で５分間にわたり該フラスコを処理した。３０％のＦＣＳ／ＤＰＢＳにより細胞を回収し、２２０ＲＣＦで１５分間にわたり遠心分離し、増殖培地中に再懸濁させ、さらに１５分間にわたり遠心分離して、微量のトリプシンを除去した。細胞ペレットを、ＯＰＣ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ液（Ａｍａｘａ社製）中に細胞５０×１０６個／ｍｌで再懸濁させた。１００ｕｌ（細胞５×１０６個）を、発現構築物（約４ｕｇ）またはｓｉＲＮＡ（２０ｕＭの、ＭＲＦに対するｓｉＲＮＡのプール、もしくは個別のｓｉＲＮＡ、または非標的化ｓｉＲＮＡのプールであるｓｉＣｏｎｔｒｏｌである、それぞれ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製Ｌ−０５６８１４−００、ＬＵ−０５６８１４−００、およびＤ００１２０６−１３を１０ｕｌずつ）に添加し、Ａｍａｘａ社製ヌクレオフェクション装置のプログラム０−１７により電気穿孔した。次いで、細胞を、ＯＬマーカーアッセイ用には、２４ウェルプレートの分化培地中に細胞５０，０００個／ＰＤＬコーティングしたカバースリップ１枚で、異所性発現／分化アッセイ用には、２４ウェルプレートの増殖条件に細胞５，０００個／ＰＤＬコーティングしたカバースリップ１枚で、ＲＮＡ単離用には、分化培地中に細胞５×１０６個／ＰＤＬコーティングした１０ｃｍのディッシュで播種した。
【０１２０】
（実施例２）
ニワトリ胚のｉｎ  ｏｖｏにおける電気穿孔
可視化を可能とする０．２％ファーストグリーンを伴うＴＥ緩衝液中に約１ｕｌのＤＮＡ溶液（１：４のｐＣＩＧおよびｐＣＡＧＧＳ−ＭＲＦ混合物約４ｕｇ／ｕｌ）を、ハンバーガー−ハミルトン段階にある胚１２個の神経管内腔へと注入した。ＥＣＭ８３０  ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社製）を用いて、胚を隔てた３０ボルトで５×５０ミリ秒にわたるパルスを用いて、電気穿孔を実施した。電気穿孔の４日後に胚を回収し、４％ＰＦＡ中において２時間にわたり浸漬固定した後、以下の通りに処理して、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学にかけた。
【０１２１】
（実施例３）
免疫組織化学、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびＴＥＭ顕微鏡法
免疫組織化学：灌流固定したマウスに由来する１０μｍの凍結断面、またはＰＤＬコーティングしたカバースリップ上で増殖させた細胞を、ＰＢＳ中に４％のパラホルムアルデヒド中において１０分間にわたり固定し、ＰＢＳ中で３分間ずつ５回にわたり洗浄し、次いで、ブロッキング液（表面抗原用には、ＰＢＳ中に１０％のウシ胎仔血清、細胞内抗原用には、０．３％のトリトンＸを添加する）中で３０分間にわたりインキュベートした。ブロッキング液（１：５００のラット抗ＭＢＰ抗体、１：５００のウサギ抗ＮＧ２抗体；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、１：５００の抗ｍｙｃモノクローナル４Ａ６抗体；英国、ロンドン、インペリアルカレッジ、Ｒ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ氏のご恵与による、Ｕｐｓｔａｔｅ社製、１：１，０００のウサギ抗活性化カスパーゼ３抗体、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、１：５０のマウス抗ＭＯＧ抗体クローン８−１８Ｃ５）中において、一次抗体と共に一晩にわたり細胞をインキュベートした。ＰＢＳ中で３分間ずつ５回にわたりカバースリップを洗浄し、適切なフルオロフォアをコンジュゲートさせた二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；ブロッキング液中において１：５００に希釈した）と共に３０分間にわたりインキュベートし、ＰＢＳ中で３分間ずつ５回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩ核内対比染色色素を伴うＤＡＫＩ蛍光マウント用培地によりマウントした。製造元の指示書に従い、１０μｍの凍結断面上において、Ｆｌｕｏｒｏｍｙｅｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）染色を実施した。
【０１２２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：プライマーＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴおよびＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＴＣＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧを用いて、３’ＵＴＲから９４１ｂｐに対応するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブを、ＯＬ  ｃＤＮＡから増幅し、ＰＣＲ−ＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内へとサブクローニングした。ＰＬＰプローブは、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ教授により恵与された。製造元の指示書に従い、Ｔ７ポリメラーゼおよびＤＩＧ  ＲＮＡ標識化キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、アンチセンスＤＩＧにより標識化したリボプローブを合成した。Ｐ１６における脳神経ならびにＰ１７における視神経および坐骨神経に由来する１０μｍの断面上において、本質的に説明される（Ｃａｈｏｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２８巻、２６４〜２７８頁（２００８年）；Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１００巻、４３１〜４４０頁（１９９３年））通りに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。
【０１２３】
ＴＥＭ顕微鏡法：麻酔下にあるＰ１３マウスをＰＢＳにより灌流した後で、カコジル酸ナトリウム緩衝液中に２％のグルタルアルデヒド／４％のパラホルムアルデヒドで処理した。視神経を切開摘出し、４℃で一晩にわたり後固定した。１％四酸化オスミウムおよび１％酢酸ウラニルによる処理後、神経をエポン樹脂内に包埋した。スタンフォード大学の微生物学および免疫学電子顕微鏡施設において断面作製および電子顕微鏡法を実施した。
【０１２４】
（実施例４）
構築物の作製
ｐＣＳ６−ＭＲＦ：プライマーＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＡＣおよびＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧを用いて、培養したマウスＯＬのｃＤＮＡから、ＭＲＦのコード領域を増幅した。結果として得られるＸｍａ１／Ｘｈｏ１を連結したＰＣＲフラグメントを、Ｘｍａ１／Ｘｈｏ１により２回にわたり消化したｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６（ｐＣＳ６）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内へとライゲーションし、配列決定により確認した。
【０１２５】
ｐＣＳ６−Ｍｙｃ−ＭＲＦ：プライマーＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＡＡＧおよびＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧを用いて、培養したマウスＯＬのｃＤＮＡから、開始コドンを除いたＭＲＦのコード領域を増幅した。結果として得られるＸｍａ１／Ｘｈｏ１を連結したＰＣＲフラグメントを、Ｘｍａ１／Ｘｈｏ１により２回にわたり消化したｐＣＳ６ベクター内へとライゲーションした。次いで、Ｍｙｃペプチド（ＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）をコードする自己アニール化オリゴヌクレオチドを、結果として得られる構築物のＸｍａ１部位内へとライゲーションし、Ｎ末端においてｍｙｃ−ＭＲＦ融合構築物をもたらした。
【０１２６】
ｐＣＡＧＧＳ−ＭＲＦ：Ｘｈｏ１およびＸｂａ１で挟んだプライマーにより、上記のｐＣＳ６−ＭＲＦからＭＲＦのコード領域を増幅した。結果として得られるＰＣＲ産物を、ｐＣＡＧＧＳのＸｂａ１部位およびＸｈｏ１部位内へとライゲーションした。
【０１２７】
（実施例５）
ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、１０％ウシ胎仔血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地中に５０〜７０％のコンフルエンスで、ＨＥＫ２９３細胞を播種した。製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、トランスフェクションを実施した。トランスフェクションの４８時間後において、免疫蛍光法により細胞を解析した。
【０１２８】
（実施例６）
ノーザンハイブリダイゼーション
全ＲＮＡ（５〜１５μｇ）を、変性ホルムアルデヒドゲル上で泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）へと転写し、ＵＶにより架橋させた。次いで、１００ｍｌのハイブリダイゼーション液（７％ＳＤＳ、０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７．２、１００ｕｇ／ｍｌのニシン精巣ＤＮＡ）中６８℃で約２時間にわたり、膜をプレハイブリダイズさせた。製造元の指示書に従い、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を伴う、Ｐｒｉｍｅ  Ｉｔ  ＩＩ  ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、約１ｋｂのＭＲＦ  ｃＤＮＡ、ＣＮＰ  ｃＤＮＡ、ＰＬＰ  ｃＤＮＡ、またはＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドから、放射性標識化したＤＮＡプローブを生成させた。４００ｇで２分間にわたり、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、プローブをスピンし、組み込まれなかった３２ｄ−ＣＴＰを除去し、５分間にわたり９５℃まで加熱した後、１５ｍｌのハイブリダイゼーション液中の膜に添加した。６８℃で一晩にわたりハイブリダイゼーションを行い、１倍濃度ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２分間ずつ１０回にわたり洗浄し、次いで、０．５倍濃度ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６８℃で３分間ずつ１０回にわたり洗浄した。次いで、Ｘ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を−８０℃で膜に露光した後、現像した。沸騰する０．１倍濃度のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回にわたる洗浄により膜をはがし、一晩にわたりフィルムを静置し、シグナルの不在について点検した後で、再プロービングした。
【０１２９】
（実施例７）
Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ解析
Ｑｉａｇｅｎ社製のオンカラム用ＤＮアーゼ処理を用いるＲＮｅａｓｙマイクロキット（カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ社製）により、細胞から全ＲＮＡを単離し、夾雑物であるゲノムＤＮＡを除去した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＲＮＡの完全性を評価し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＤＥ、ロックランド、ＮａｎｏＤｒｏｐ社製）を用いて、ＲＮＡ濃度を決定した。
【０１３０】
対照中におけるスパイクにより、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによる２サイクルの標的標識化アッセイ（カリフォルニア州、サンタクララ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、９００４９４型）を用いて、１ｕｇの全ＲＮＡから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ３’アレイに対するハイブリダイゼーション用にビオチニル化したｃＲＮＡを調製した。製造元のプロトコールに従い、標識化したｃＲＮＡをフラグメント化し、マウスゲノム４３０  ２．０アレイ（３’アレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、９００４９５型）へとハイブリダイズした。
【０１３１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＯＳ  １．３ソフトウェアを用いて生の画像ファイルを処理し、個々のプローブセルの強度データを計算し、ＣＥＬデータファイルを作製した。ＧＣＯＳおよびＭＡＳ  ５．０アルゴリズムを用いて、強度データをチップ当たりのデータに標準化して、標的強度のＴＧＴ値を５００とし、個々のプローブセットに対する発現データおよび存在コール／不在コールを計算した。ＭＡＳ  ５．０アルゴリズムにより解析されるデータに対応する遺伝子記号および遺伝子名は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｎｅｔａｆｆｘ  Ｍｏｕｓｅ４３０＿２注釈ファイル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ．ａｆｆｘ？ｐｒｏｄｕｃｔ＝ｍｏｅ４３０−２０）に拠った。異常について生のＤＡＴ画像ファイルを検討することにより品質管理を実施し、各ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイのバックグラウンド値が１００未満であることを確認し、百分率による存在コールが、細胞型に適切であるかどうかモニタリングし、対照中におけるポリ（Ａ）スパイク、ハウスキーピング遺伝子、およびハイブリダイゼーション対照を点検し、標識化とハイブリダイゼーションとの符合を確認した。
【０１３２】
（実施例８）
ＲＴ−ＰＣＲ
上記に従い調製したＲＮＡを、製造元の指示書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いる逆転写にかけた。ｃＤＮＡを、遺伝子特異的なプライマーにより、２５または３０サイクルにわたり増幅にかけ、２％アガロースゲル上において泳動した。
【０１３３】
（実施例９）
ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスの作製
ＭＲＦのエキソン８を、Ｐｅｚ−Ｆｒｔ−ｌｏｘ−ＤＴ標的化ベクターのＳａｌ１部位内にクローニングすることにより、エキソン８をｌｏｘＰで挟んだマウスを作製した。５ｋｂの５’アームおよび３ｋｂの３’アームを、それぞれ、Ｎｏｔ１部位およびＸｈｏ１部位内へとクローニングし、Ｅ１４ＥＳ胚性幹細胞内への相同組換えに対する標的化を可能とした。ＨｉｎｄＩＩＩにより消化したＤＮＡに対するサザンブロット法、および５’ｌｏｘＰ部位の挿入に対するＰＣＲ検証により、正確に標的化されたネオマイシン耐性クローンを同定した。標的化された細胞を線維芽細胞内へと注入し、キメラマウスを作製し、これらを、Ｃ５７／Ｂ６マウスへと交配させ、ヘテロ接合マウスを作製した。これらのマウスを、ＦｌｐＥＲ株（Ｆａｒｌｅｙら、Ｇｅｎｅｓｉｓ、２８巻、１０６〜１１０頁（２０００年））へと交配させ、ネオマイシンカセットを欠失させ、第２世代のＦｌｐＥＲ陰性マウスにおけるＰＣＲによりこれを確認した。ヘテロ接合のＭＲＦｆｌｏｘ化マウスを、２世代にわたり、Ｏｌｉｇ２−Ｃｒｅマウス（Ｓｃｈｕｌｌｅｒら、近刊）またはＣＮＰ−Ｃｒｅマウス（Ｌａｐｐｅ−Ｓｉｅｆｋｅら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３３巻、３６６〜３７４頁（２００３年））へと交配させ、ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｃｒｅマウスまたはＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／ｃｒｅマウスを得た。共通の上側プライマー（ＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴ）、ならびに野生型の対立遺伝子を同定する下側プライマー（ＣＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＡＣＡＣ）、およびｆｌｏｘ化対立遺伝子を同定する下側プライマー（ＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＧ）を用いるＰＣＲにより、マウスの遺伝子型を解析した。Ｃｒｅリコンビナーゼ陽性マウスは、プライマーＧＣＴＡＡＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣおよびＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＴＴＧにより同定した。
【０１３４】
（実施例１０）
定量化および統計学
培養細胞に対してカウントを実施する場合（マーカーなどの発現を解析するため）、１条件当たり少なくとも３枚のカバースリップを盲検でカウントし、カバースリップ１枚当たり１０ずつの視野（２０倍の対物レンズ）をカウントした。各カバースリップの平均から、各条件についての平均およびＳＥＭを計算し、多重比較についてのボンフェローニ補正を用いる、対応のない２方向のｔ検定により条件を比較した。示される実験は、少なくとも２つの個別の実験を表わす。組織断面から細胞を定量化する場合、１遺伝子型当たり４〜６匹ずつのマウスを用いた。解析（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにより実施する細胞カウント、およびＩｍａｇｅＪにより定量化するカウント領域の面積を伴う）用に６０〜１００ｕｍの距離を置いて断面を写真撮影（２０倍の対物レンズ）することにより、マウス１匹当たり３枚ずつの断面を解析した。活性カスパーゼ３免疫陽性細胞を定量化する場合、２０倍の対物レンズで、マウス１匹当たり３枚ずつ、６０ｕｍの距離を置いた視神経縦断面について、免疫陽性細胞の数を定量化し、次いで、該神経を低倍率（４倍の対物レンズ）で写真撮影し、ＩｍａｇｅＪにより、該神経の面積を決定した。１遺伝子型当たり５〜６匹ずつのマウスを用いた。各マウスの平均から、各遺伝子型についての平均およびＳＥＭを計算し、多重比較についてのボンフェローニ補正を用いる、対応のない２方向のｔ検定により遺伝子型を比較した。
【０１３５】
（実施例１１）
ＣＮＳ内におけるＯＬ特異的な転写物である、ＧＭ９８／ＭＲＦの同定
イムノパニング／ＦＡＣＳによる細胞精製法を、遺伝子プロファイリングと組み合わせて、マウスＣＮＳ内における細胞型特異性を示す遺伝子を同定した。急性精製した星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）、新たに分化した希突起膠細胞（ＯＬ）、有髄化する成熟ＯＬを転写プロファイルの生成に用いたスクリーンの一部として、遺伝子モデル９８／ミエリン遺伝子調節因子を同定した。ＭＲＦについてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット（１４３９５０６＿ａｔ型）は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＭＯＧなど、典型的なＯＬマーカーが示したのと同様なレベルのＯＬ濃縮を他の細胞型に対しても示し、ニューロンおよび星状細胞においては本質的に検出不能なレベルの発現であり、ＯＰＣにおいては低レベルの発現であり、ＯＬ内においては比較的強い発現であった。
【０１３６】
新たに分化したＯＬ（ＧａｌＣ＋、ＭＯＧ−）におけるＭＲＦの発現が、より成熟したＯＬ（ＭＯＧ＋）と少なくとも同程度に高度であったことは、該遺伝子が、有糸分裂後細胞へと移行すると急速に誘導されることを示す（図１Ａ）。全脳、全心臓、および培養ＯＬから単離したＲＮＡに対する、培養ＯＬから増幅したＭＲＦ  ｃＤＮＡとのノーザンハイブリダイゼーションにより、脳内において、約５．５Ｋｂのサイズの明白な転写物が確認されたが、これは、心臓に由来する試料中では不在であり、培養ＯＬ中では高度に濃縮されていた。確立されたＯＬマーカーであるプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびＭＲＦに対するプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、該２つの遺伝子について同一の発現パターンが確認され、ＭＲＦは脳内におけるすべての白質路内において発現し（図１Ｃ）、白質内では、ＰＬＰと同じ染色色素の細胞内分布を示した（図１Ｄ）。ＭＲＦの発現は、坐骨神経では検出されず（図１０）、これにより、有髄化細胞内におけるＭＲＦの発現が、ＣＮＳに制約されることが示された。ＥＳＴのデータベース（Ｕｎｉｇｅｎｅ社製）は、ＭＲＦが他の組織、中でもとりわけ、膵臓および肺内において発現することを示すが、この発現はおそらく、ＣＮＳ内で見られる発現よりも大幅に低度である。
【０１３７】
データベースの検索により、ＭＲＦは、ヒト遺伝子であるＣ１１Ｏｒｆ９のマウスオルトログであることが明らかとなった。ＭＲＦおよびＣ１１Ｏｒｆ９共に、推定のＤＮＡ結合ドメインとしてオンラインデータベースに列挙される酵母転写因子であるＮｄｔ８０に対して相同的な領域を有する高分子タンパク質をコードする（Ｍｏｎｔａｎｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ、９９巻、１４０４１〜１４０４６頁（２００２年））。ＯＬから単離されたｃＤＮＡの配列決定により、ＧＭ９８／ＭＲＦの転写物は、１１３９アミノ酸のタンパク質をコードすることが示された（図２Ａ）。このタンパク質は、プロリンに富む複数のドメインを含有するＮ末端領域である、Ｎｔｄ８０様ＤＮＡ結合領域と、複数の疎水性領域を含有するＣ末端領域とを含有する。ヒトＣ１１Ｏｒｆ９とのこのタンパク質のアライメントにより、８８．６パーセントの全体的相同性が明らかとなり、ＤＮＡ結合領域内におけるこの相同性は１００％であった（図２Ｂ）。Ｃ１１Ｏｒｆ９は、そのＣ末端内における２つの疎水性領域が膜貫通ヘリックスとして作用する膜貫通タンパク質でありうることが既に示唆されている（Ｓｔｏｈｒら、Ｃｔｙｏｇｅｎｅｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、８８巻、２１１〜２１６頁（２０００年））。ＭＲＦの細胞内における局在化を確立するため、ＨＥＫ細胞内において、Ｎ末端にＭｙｃタグを付した融合体を発現させた。このＭｙｃタグを付したタンパク質は、明白な核内発現を示し（図２Ｃ）、培養した希突起膠細胞内において該タグを付したタンパク質が発現すると、核内局在化もまた見られた。Ｎ末端のＭｙｃタグを指向する抗Ｍｙｃ抗体、および該タンパク質のＤＮＡ結合領域に対して生成させた抗体によっても同じ細胞内における核内局在化が見られ、これにより、少なくともこれらの領域が、膜内局在化ではなく、核内局在化を示すことが示唆された。
【０１３８】
（実施例１２）
ＭＲＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける希突起膠細胞によるミエリン遺伝子の発現に必要である。
【０１３９】
ＭＲＦが、ＯＬの転写調節において役割を果たすかどうかを確立するため、ＭＲＦのコード領域を標的とするｓｉＲＮＡのプール（ｓｉＭＲＦ）、またはこれを標的としないｓｉＲＮＡのプール（ｓｉＣｏｎｔ）をトランスフェクトすることにより、ＯＬ培養物中におけるＭＲＦの発現を遮断した。ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲにより評価したところ、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べ、ＭＲＦ  ｍＲＮＡに対する明白で一貫した下方調節を示し（図４Ａ、図１２）、これにより、ｓｉＲＮＡのプールは、ＭＲＦレベルの低減に有効であることが示された。ＭＲＦに対するｓｉＲＮＡを、増殖条件で培養されたＯＰＣにトランスフェクトしたところ、その影響は見られず、大半のｓｉＭＲＦ細胞およびｓｉＣｏｎｔ細胞がＮＧ２陽性前駆細胞として分裂し続けたことは、急性摘出されたＯＰＣ内において見られるＭＲＦ発現の欠如と符合する。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞を、分化条件（−ＰＤＧＦ、＋Ｔ３）へと移したところ、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞との間で差違が生じ始めた。分化条件への移動から２４時間以内に、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞およびｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞共に、分裂を停止し、突起を拡大させ始めたのに対し、４８時間以内に、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞より、膜シートの沈着範囲を狭め、また、カルセイン（Ｃａｌｃｉｅｎ）ＡＭ／ＥｔｈＨＤ１生存／死亡アッセイにより評価される生存率も、さほどではないが有意に低下させた（図３Ａ、Ｂ）。分化の誘導から４８時間以内に８５％超が強くＭＢＰ陽性であったｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞とは対照的に、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ＭＢＰ発現の明白な遅延および低下を示し、分化の４８時間後において、ＭＢＰについて陽性の細胞は２３．６％に過ぎず、分化の９６時間後においても、６４．４％の細胞で、発現は低度に過ぎなかった（図３Ａ、Ｃ）。
【０１４１】
これに反し、また、それらが単純な前駆細胞様形態から移行することとも符合するが、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞がやはり、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞に対して同様の割合で、ＯＰＣマーカーであるＮＧ２の発現を下方調節したことは、有糸分裂後ＯＬへの初期分化が、ＭＲＦのノックダウンによる影響を受けなかったことを強く示唆する。ＭＲＦの不在下において、後期ＯＬ遺伝子であるＭＯＧの発現は、さらにより強く阻害され、分化の９６時間後において、ＭＯＧを発現するｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞が５％未満であったの対し、この時点において、ＭＯＧについて陽性のｓｉＣｏｎｔ細胞は８１％であった（図３Ａ、Ｄ）。４８時間後および９６時間後における、ｓｉＭＲＦによる、マーカーＭＢＰおよびＭＯＧを発現する細胞の低減は、生存率の低下よりはるかに大幅であり（例えば、４８時間の分化後において、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞が示す生存率は、ｓｉＣｏｎｔを発現する細胞と比べて２０．３％低下したに過ぎなかったが、ＭＢＰを発現する細胞の比率は、ｓｉＣｏｎｔ発現細胞と比べて６２．５％低下した）、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞において観察される細胞死の増大が、ＭＢＰおよびＭＯＧの発現の喪失を説明するのに十分ではないことを強く示唆した。
【０１４２】
興味深いことに、位相顕微鏡法下において、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞はほとんど常に、ＯＬの一般的な形態を帯びたが、突起および膜シートの増殖が、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞より大幅に阻害されることが典型的であり、また一方、ＭＯＧ陰性細胞が、ＯＬマーカーであるＧａｌＣを明白に発現した（図１１）ことにより、細胞原基の特定化の変化が、表現型の原因ではないことが裏付けられた。
【０１４３】
（実施例１３）
ＭＲＦの下流にある遺伝子の同定
ＭＲＦの不在下にあるＯＬの分化において見られる転写欠損をさらに特徴づけるため、また、ＭＲＦの下流にある遺伝子を同定するため、ｓｉＭＲＦプールまたはｓｉＣｏｎｔプールによるトランスフェクション後の４８時間にわたり分化させたＯＬに由来するＲＮＡのほか、分化前における遺伝子発現のベースラインを与える、培養ＯＰＣに由来するＲＮＡも単離した。４８時間後という時点を選択したのは、ＯＬ／ミエリン遺伝子の大半が、この段階までにある程度のレベルの誘導を示す（Ｄｕｇａｓら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２６巻、１０９６７〜１０９８３頁（２００６年））一方、ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞が、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べ、やはりほぼ同等レベルの生存を示す時点に依然としてあり、これにより、結果に対する細胞死の交絡による影響の可能性｛Ｄｕｇａｓ、２００６年、＃９｝が制限されるためである。全ＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’端を増幅するポリＡプライマーを伴う２段階の直鎖状増幅プロトコールを用いて、標識化されたｃＲＮＡを作製するのに用いた。この標識化したｃＲＮＡを、２０，８３２の固有の遺伝子を表わす４５，０３７のオリゴヌクレオチドプローブセットによる、ｍＲＮＡの３’端に相補的なオリゴヌクレオチドのプローブセット（３’アレイ）を含有する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０  ２．０マイクロアレイへとハイブリダイズさせた。また、ノーザンブロット解析も用いて、この時点におけるＭＲＦおよびミエリン遺伝子（ＰＬＰおよびＣＮＰ）の下方調節も確認した（図４Ａ）。
【０１４４】
公知のＯＰＣ発現遺伝子であるＮＧ２およびＰＤＧＦＲαの解析により、細胞を分化条件へと移すと、ｓｉＲＮＡによりＭＲＦの発現が遮断されていたかどうかに関わらず、これらの遺伝子は、ＯＰＣと比べ、本質的に検出不可能なレベルまで下方調節され（図４Ｂ）、これにより、ＭＲＦが、これらの条件におけるＯＰＣからＯＬへの移行には必要でないことが裏付けられた。ＭＲＦのノックダウンによる、ＣＮＰ１およびＵｇｔ８ａなど、極めて初期のＯＬ遺伝子の発現低下がごくわずかであったこともおそらく同様であり、これにより、ＭＲＦの不在下においても、ＯＰＣはＯＬへの移行を開始することが可能であり、汎ＯＬ系統のマーカーであるＳｏｘ１０は、ｓｉＭＲＦのトランスフェクションによりまったく影響を受けなかったことが示唆される。これに対し、ＯＬマーカーであるＰＬＰ１、ＭＢＰ、およびＭＡＧでは、ＭＲＦのノックダウンにより、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて極めて明白な低下（約８０％の）が見られ、後期ＯＬ遺伝子であるトランスフェリン、ＭＯＢＰ、およびＭＯＧについては、ほぼ完全な低下（＞９０％）が見られた（図４Ｃ）。培養物中において２型星状細胞の原基を帯びるＯＰＣの比率が小さい（＞５％）ため、血清の不在下においても、分化条件へと移すことによる誘導は中程度であったが、ＭＲＦのノックダウンにより、おそらくＢＭＰによるシグナル伝達の下流にある星状膠細胞遺伝子であるＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、およびアクアポリン４だけがわずかながらの上昇を示した（ｓｉＣｏｎｔ値のそれぞれ１４７％、２５５％、および１５３％）ことにより、大部分の細胞は、ＭＲＦ発現の不在下においてＧＦＡＰ陰性を維持し、星状細胞系統への分化が、これらの細胞によるＯＬ／ミエリン遺伝子の発現の喪失を説明するわけではないというかつての観察が裏付けられる。
【０１４５】
ＭＲＦの下流にある遺伝子を同定するため、ｓｉＣｏｎｔとｓｉＭＲＲとの間で、抑制レベルにより遺伝子を序列化した。ＭＲＦのノックダウンにより、１０４の遺伝子を表わす１２８のプローブセットが、４分の１＜に抑制された。ＭＲＦのノックダウンによる抑制レベルが最も大きな５０の遺伝子を、図５に示す（図１４もまた参照されたい）。したがって、ｓｉＭＲＦにより阻害されることが示される、１２８のプローブセットのうちの１０４はまた、ＯＰＣ試料と、２日間にわたり分化させたＯＬ試料との間で＞４倍に上方調節されることが示されるプローブセットでもあり、これにより、ＭＲＦに依存する遺伝子の大半は通常、ＯＰＣからＯＬへの移行時において調節される遺伝子であることが示された。しかし、逆に、分化により＞４倍に誘導される７９３のプローブセットのうち、ｓｉＭＲＦにより強く阻害されたのは１０４だけであったことにより、ＯＬの発生時において通常調節される遺伝子の大部分が、ＭＲＦ発現には依存しないことが示唆される（図４Ｄ）。
【０１４６】
（実施例１４）
ＭＲＦの強制発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＯＬの分化を誘導する
ＭＲＦが、ＯＬ／ミエリン遺伝子の発現を誘導するのに十分であるかどうかを評価するため、ＯＰＣに、ＭＲＦ発現構築物（ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６−ＭＲＦ）、またはＥＧＦＰをコードする対照のＧＦＰプラスミドをトランスフェクトして、大半の細胞が通常、分裂するＯＰＣであることを維持し、自発的分化は低レベルにとどまる増殖条件（＋ＰＤＧＦ、−Ｔ３）へと播種した。トランスフェクションの２日後において、対照のトランスフェクト細胞が示した分化は低レベルであり、ＭＢＰ陽性およびＭＯＧ陽性とカウントされた生細胞は、それぞれ、１．４パーセントおよび０．４パーセントに過ぎなかった。これに対し、ＭＲＦ発現構築物をトランスフェクトした細胞が、ＭＢＰおよびＭＯＧについて、それぞれ、３２．８パーセントおよび４１．０パーセントの陽性であったことは、分化率が、対照ベクターをトランスフェクトした細胞と比べて約３０〜４０倍に上昇した（ｐ＜０．００１）ことを示す。ＭＢＰおよびＭＯＧのこの誘導は、ＭＲＦトランスフェクト細胞が、ＯＰＣマーカーであるＮＧ２を下方調節することにより反映された（図６）。トランスフェクションの５日後までに、ＭＲＦトランスフェクト細胞の大半がＭＢＰ陽性およびＭＯＧ陽性（それぞれ、８１．９および７７．２％）となったのに対し、対照トランスフェクト細胞の大半は、依然としてＭＢＰ／ＭＯＧ陰性ＯＰＣであった（図６）。ＭＲＦが異所性発現したＭＢＰ陽性細胞およびＭＯＧ陽性細胞が、ほとんど均一に成熟ＯＬの一般的形状（突起の高度な分岐および膜シート）を示したことにより、ＯＰＣ内におけるＯＬ／ミエリン遺伝子の異所性発現ではなく、ＭＲＦの異所性発現が、ＯＬへの該細胞の分化を引き起こしたことを強く示唆する。
【０１４７】
（実施例１５）
ＭＲＦの強制発現はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＢＰの発現を誘導する
ＭＲＦの発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるミエリン遺伝子の発現を駆動するのに十分でありうるかどうかを評価するため、ＭＲＦ発現構築物（ｐＣＡＧＧＳ−ＭＲＦ）を、Ｅ３において、ニワトリ脊髄内へと電気穿孔し、ニワトリの脊髄内には通常検出可能なＭＢＰの発現または希突起膠細胞の分化が見られない発生時点であるＥ８において該胚を屠殺した。ＭＲＦ発現構築物（共電気穿孔されたＥＧＦＰ発現プラスミドからのＥＧＦＰの発現により同定される）を電気穿孔した脊髄側方内では、偶発的なＭＢＰ陽性細胞を見出すことができたが、強いＭＢＰ陽性細胞が見出されるのは、断面１枚当たり１〜３個だけであることが典型的であった（図７Ａ、Ｂ）。電気穿孔されなかった、対照の脊髄側方において、ＭＢＰ陽性細胞は観察されなかった。しかし、電気穿孔された脊髄側方におけるＭＢＰ陽性細胞の数が、ＥＧＦＰまたはＭＦＲ導入遺伝子を発現する細胞の数よりはるかに少なかった（図７Ａ）ことは、ＭＲＦが希突起膠細胞の分化を促進する能力には、他の陽性または陰性の調節因子が影響している可能性が高いことを示すことに注目すべきである。
【０１４８】
（実施例１６）
ＭＲＦはマウスにおけるＣＮＳの有髄化に必要である
ＣＮＳの有髄化におけるＭＲＦの必要性を評価するため、ＭＲＦ遺伝子のエキソン８をｌｏｘＰ部位で挟んだマウスを作製した（図８）。エキソン８は、ＭＲＦのＤＮＡ結合領域の一部をコードする。このエキソンの欠失は、フレームシフトに起因する結果として、ＤＮＡ結合領域および下流のタンパク質の喪失をもたらすことが予測された（図８Ｃ）。エキソン８の細胞特異的欠失または組織特異的欠失は、ｌｏｘＰフランキングマウス（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ）を、対象の細胞型においてＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配させることにより実施することができる。ＭＲＦｆｌ／ｆｌマウスを、Ｏｌｉｇ２プロモーターの下流でＣｒｅを発現するマウス株へと交配させた（結果として、希突起膠細胞および下肢運動ニューロン前駆細胞、ＯＰＣおよび成熟ＯＬにおけるＣｒｅ発現がもたらされた）ところ、結果として得られるＭＲＦ条件付きノックアウトマウス（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）は、メンデル頻度で生誕し、生後１０日間は、それらの対照同腹子（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｃｒｅ、およびＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔ）から明確には識別できなかった。しかし、Ｐ１１から、ＭＲＦ条件付きノックアウト動物は、振戦および発作を発生させたため、それらの同腹子から識別されるようになった。その後数日間にわたり、条件付きノックアウト動物は発作を発生させ、生後３週目のＰ１３〜Ｐ１７において例外なく死亡した。この表現型は、ＣＮＳのミエリンに影響のある他の突然変異体の表現型と符合する。
【０１４９】
Ｐ１３における条件付きノックアウトマウスの脳および脊髄に対する免疫組織化学解析は、ＮｅｕＮおよびＧＦＡＰの染色は正常だと考えられ、ＣＮＳの全体的構造には影響がないことを示した。これに対し、脳内のＭＢＰ染色には大幅な喪失が見られ、対照マウスの白質路内におけるほぼ遍在的なＭＢＰ染色と比較して、白質路内で見られるＭＢＰ＋希突起膠細胞は、偶発的なものに過ぎなかった（図９Ａ）。これらのまれに残存するＭＢＰ＋  ＯＬは、Ｃｒｅを介する組換えを受けなかった、偶発的なＯｌｉｇ２非依存性細胞を表わす可能性がある。その脊髄根（シュワン細胞により有髄化される）は依然として強くＭＢＰ染色されていたが、条件付きノックアウト動物の脊髄内におけるこのＭＢＰ染色の喪失は本質的に完全であった（図９Ｂ）。このＭＢＰ発現の喪失は、脊髄溶解物に対するウェスタンブロットにより確認され、また、これにより、著明に低度のＣＮＰ発現、およびＭＯＧ発現の完全な喪失も示された（図９Ｃ）。条件付きノックアウト動物における星状細胞およびニューロンのタンパク質（それぞれ、ＧＦＡＰおよびニューロフィラメント）には影響がなかった。白質路内におけるフルオロミエリン染色により、本質的に完全な再有髄化の喪失が明白に立証された（脊髄側柱の白質について示された、図９Ｄ）。これに対し、末梢神経は、予測される通り、条件付きノックアウト動物および対照動物のいずれにおいても同等に有髄化されたが、これは、シュワン細胞が、ＭＲＦもＯｌｉｇ２も発現しないからである。条件付きマウスの視神経では、電子顕微鏡法により、有髄化の喪失が確認された；対照マウスが、Ｐ１３までに、視神経における有髄化の明白な証拠を示しつつあったのに対し、条件付きマウスにおいては、神経の有髄化が観察されなかった（図９Ｅ）。ＭＲＦｆｌマウスを、ＣＮＰプロモーターの下流でＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配させたところ、同等の表現型（振戦、発作、ならびにミエリン遺伝子の発現および有髄化の喪失）が見られたことにより、条件付きノックアウト動物の表現型は、Ｏｌｉｇ２−ｃｒｅ対立遺伝子の挿入により引き起こされるＯｌｉｇ２ヘテロ接合によるバックグラウンドには依存しないことが確認された（図１６）。これらの知見は、ＭＲＦが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて希突起膠細胞が発生してＣＮＳが有髄化する正常な過程に必要であることを裏付ける。
【０１５０】
（実施例１７）
ＯＬはＭＲＦ条件付きノックアウトマウスにおいて分化するが、その後、成熟するとアポトーシスを受ける
ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスにおけるミエリンの欠如が、ＯＬ生成の欠如により引き起こされたのか、そうではなくて、有髄化が不可能なＯＬにより引き起こされたのかを見極めるため、ＯＬ系統の各段階の発生に対するＭＲＦ欠失の効果を評価した。ＭＢＰ、成熟ＯＬマーカーであるＣＣ１、ＯＰＣマーカーであるＮＧ２およびＰＤＧＦＲα、および汎ＯＬ／星状細胞マーカーであるＯｌｉｇ２を含めた各種のマーカーについて免疫染色した、条件付きノックアウトマウスおよび対照マウスに由来する、Ｐ１３の視神経断面におけるＯＰＣおよびＯＬの密度を評価した（図１３Ａ）。視神経内における、Ｏｌｉｇ２免疫陽性核密度のカウントにより、条件付きノックアウト動物の神経における陽性細胞密度の著明な低下（約４５％の）が示された；この低下は、条件付きノックアウトマウスにおいて見られるＣＣ１免疫陽性細胞の完全な喪失と本質的に符合した（図１３Ｂ、Ｃ、Ｅ）。これに対し、条件付きノックアウトマウスにおいても、ＰＤＧＦＲαに対して免疫陽性であるＯｌｉｇ２＋細胞の密度は、わずかな影響を受けただけであり（Ｐ＜０．０５のｔ検定において、ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔマウスと比べ、条件付きノックアウト動物では１８．７％の低下であったが、ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ対照との有意差は見られなかった；図１３Ｄ、Ｅ）、これにより、条件付きノックアウト動物においてもＯＰＣ段階が受ける影響は最小限であることが示され、この観察は、見かけ上正常なＮＧ２染色により裏付けられた。同様に、ＣＣ１およびＰＤＧＦＲαのいずれについても陰性のＯｌｉｇ２＋細胞（おそらく、Ｏｌｉｇ２を発現する星状細胞）の密度は、遺伝子型間において同様であった（図９Ｅ）。条件付きノックアウトマウスの視神経におけるＭＢＰ染色は、対照マウスと比べて大幅に低下したが、にもかかわらず、低度のＭＢＰ＋（ＣＣ１−であるが）細胞は少数ながら存在したことは興味深く、これにより、条件付きノックアウトマウスにおいて、ごく最小限であれ、少数の有糸分裂後ＯＬが生成されたことが示唆される。これらの細胞の密度は極めて低く（細胞３５±４個／ｍｍ２）；対照マウスにおけるＣＣ１染色により測定される通り、成熟ＯＬ密度の約４％に過ぎなかった。条件付きノックアウトマウスにおけるＭＢＰ＋  ＯＬおよびＣＣ１＋  ＯＬの喪失は、これらのマーカーの喪失が、上記のｓｉＲＮＡ実験においてＭＲＦ発現の下流には存在しないことが判明しているマーカーであるＯｌｉｇ２の陽性細胞密度の大幅な低下と符合したことを踏まえるなら、ＭＲＦ欠損ＯＬが、これらのマーカーを発現できないことに加えて、成熟ＯＬの喪失も反映する可能性が高い。まとめると、これらのデータにより、ＭＲＦ条件付きノックアウト動物では、ＯＰＣ集団が大部分影響を受けない一方、成熟ＯＬ集団は大幅かつ選択的に喪失されるという証拠がもたらされる。
【０１５１】
条件付きノックアウトマウスにおいて見られる有糸分裂後ＯＬが極めて少数であることは、ＯＰＣの分化に対する遮断に起因する可能性もあり、代替的に、それらの分化直後におけるＯＬの喪失に起因する可能性もある。ＭＲＦを欠くＯＰＣがマイトジェンを引き込むと、ミエリン遺伝子を発現することはないが、典型的なＯＬ形状を有するＧＣ＋有糸分裂後細胞へと分化しうることを示す、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｓｉＲＮＡ実験を踏まえるなら、前者の可能性は低いと考えられる。ＯＬ死滅の可能性は、その一部がアポトーシス細胞に特徴的な、ブレブ形成し、凝縮またはフラグメント化した核を示す、低度のＭＢＰ陽性細胞が、条件付きノックアウト動物の視神経において存在する（図１３Ａ、矢印）ことにより示唆された。Ｐ１３において観察される有糸分裂後ＯＬの欠如が、それらが発生した後におけるＯＬのアポトーシスの増大により説明しうるかどうかを確立するため、Ｐ１０の条件付きノックアウトマウスおよび対照マウスを、アポトーシスマーカーである活性化カスパーゼ３に対する抗体により染色した。すべての遺伝子型の視神経において、核が凝縮またはフラグメント化されることが多い、活性化カスパーゼ３免疫陽性細胞が存在したことは、視神経において新たに発生したＯＬの約半数による発生喪失についての先行報告と符合する。条件付きノックアウトマウスは、それらの多くが、条件付きノックアウト動物の神経において観察される低度のＭＢＰ＋細胞に対応する、活性化カスパーゼ３陽性細胞である、これらのアポトーシス細胞の密度において、統計学的に有意な約２倍の増大を示した（図１７）。これらのデータにより、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスにおいて、ＯＬは発生するが、その後速やかにアポトーシスを受けることが示される。
【０１５２】
（実施例１８）
ＭＲＦ条件付きノックアウト動物における有髄化不全は細胞自律的であり、細胞死だけに起因するわけではない
条件付きノックアウトマウスにおけるＯＬのアポトーシスは、これらのマウスにおいて見られる有髄化不全が、ＯＬの喪失に起因したのか、ミエリン遺伝子を発現できないことに起因したのか、またはこれらの両方であったのかを評価することを困難にした。この問題を明らかにするため、Ｐ７における対照マウスおよび条件付きマウスから高度に精製したＯＰＣ培養物を作製した。イムノパニングを用いて、対照動物および条件付きノックアウト動物の脳から、同等数のＰＤＧＦＲα＋  ＯＰＣ（約１００万個／脳）を単離することができた。増殖条件において、対照マウスに由来するＯＰＣ、および条件付きノックアウトマウスに由来するＯＰＣのいずれも、ＮＧ２陽性細胞およびＫｉ６７陽性細胞として増殖したことは、ＭＲＦが、ＯＬ系統のＯＰＣ期に必要でないことを裏付けた（図１５Ａ）。
【０１５３】
マイトジェンを引き込むと、対照細胞および条件付きノックアウト細胞のいずれもが、Ｋｉ６７を下方調節し、ＣＮＰに対する抗体により染色したところ、ＯＬの形状を帯び（図１５Ｂ）、ノックアウト細胞も、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける対応物とは異なり、分化の４日後において細胞死をほとんど示さなかった。しかし、ノックアウト細胞には、対照細胞と比較して、基質上における膜シートの拡大をはるかに狭める傾向があった。培養物中では高度の生存率を有するにもかかわらず、条件付きノックアウト動物による培養物が、ＭＢＰに対する抗体による染色を示さなかった（図１５Ｂ）ことは、ミエリン遺伝子発現の喪失が、単に細胞死に後続するのではないことを示した。対照動物および条件付きノックアウト動物の脊髄およびＯＬ培養物からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲおよび遺伝子アレイにより解析したところ、ＭＡＧおよびＭＯＢＰなど、多くのミエリン遺伝子の発現が、条件付きノックアウト動物の脊髄およびＯＬ培養物のいずれにおいても消失したことは、これらの遺伝子の発現に対するＭＲＦの必要性を示す（図１４、図１８）。予測される通り、ＭＲＦの欠損は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯＬ死滅の誘導に影響を及ぼすため、ＭＲＦヌルの脊髄では、ＭＲＦ依存性ＯＬ遺伝子およびＭＲＦ非依存性ＯＬ遺伝子すべての発現の喪失が観察された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＯＬ遺伝子の発現に対するＭＲＦ欠損の効果は、ｓｉＭＲＦノックダウンについて観察される効果（図５）と極めて類似し、予測される通り、大半のミエリン遺伝子および多くのＯＬ成熟遺伝子が強く下方調節され、またこれには、Ｕｇｔ８およびＣｌｄｎ１１など、複数の初期ＯＬ遺伝子に対するＭＲＦ欠損の効果も含まれた。その発現が通常、新たに形成された希突起膠細胞による一過性発現に限定される、ｐ５７／ｃｄｋｎ１ｃなど、複数の遺伝子が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＭＲＦ欠損ＯＬにおいて著明に上方調節されたことは、ＭＲＦ欠損ＯＬが、依然として大半のミエリン遺伝子を発現する前の成熟の初期段階にある、分化の直前に失速する可能性が高いことを示す。
【０１５４】
（実施例１９）
ＭＲＦの発現による脱髄の阻害
ＭＲＦ発現が誘導可能なトランスジェニックマウスを用いて、該動物におけるＭＲＦの発現または活性の上昇により、脱髄が阻害されることを示す。ＰＤＧＦＲα−ＣｒｅＥＲＴマウスを、ＣＭＶ−ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＭＲＦマウスと交配する結果として、ＰＤＧＦＲα−ＣｒｅＥＲＴ／ＣＭＶ−ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＭＲＦマウスをもたらすことにより、誘導可能なＭＲＦ発現を含むトランスジェニックマウスを作製した。ＰＤＧＦＲα−ＣｒｅＥＲＴ／ＣＭＶ−ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＭＲＦマウスは、ｌｏｘ部位により隣接する上流の終止コドンのため、また、Ｃｒｅリコンビナーゼ変異体であるＣｒｅＥＲＴが、ｆｌｏｘ化終止コドンに対して作用できないため、導入遺伝子からＭＲＦを発現することがない。しかし、タモキシフェンの投与によりＣｒｅＥＲＴの活性を誘導すると、したがって、該マウスにタモキシフェンを投与すると、該終止コドンが切断され、ＭＲＦが発現される。
【０１５５】
この実験では、被験群である１つの群にはタモキシフェンを投与し、対照群である第２の群にはタモキシフェンを投与しない、ＰＤＧＦＲα−ＣｒｅＥＲＴ／ＣＭＶ−ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＭＲＦ動物の２つの群を用いた。いずれの群にも、クプリゾンを施して、脱髄を誘導した。ミエリン特異的遺伝子についての免疫組織化学による遺伝子発現の検出、または軸索についての電子顕微鏡法などにより、両方の群を脱髄について解析した。
【０１５６】
タモキシフェンを投与された被験群のマウスは、対照群と比較して、より低い程度または度合の脱髄を示す。
【０１５７】
（実施例２０）
ＭＲＦ発現による再有髄化の促進
この実験では、ＰＤＧＦＲα−ＣｒｅＥＲＴ／ＣＭＶ−ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ−ＭＲＦ動物の２つの群を用いて、ＭＲＦの発現または活性の上昇による再有髄化の促進を示す。いずれの群にも、クプリゾンを施して、脱髄を誘導した。被験群である１つの群にはタモキシフェンを投与する一方、対照群である第２の群にはタモキシフェンを投与しない。ミエリン特異的遺伝子についての免疫組織化学による遺伝子発現の検出、または軸索についての電子顕微鏡法などにより、両方の群を脱髄について解析した。タモキシフェンを投与された被験群のマウスは、対照マウスより迅速に、またはより頑健に再有髄化することが可能である。
【０１５８】
（実施例２１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生物活性剤のスクリーニング
神経膠細胞株を用いて、再有髄化を促進するか、または脱髄を阻害する生物活性剤をスクリーニングする。マウスからＯＰＣを得、候補生物活性剤により処理する。ＯＰＣを、ＭＲＦの発現について解析し、候補生物活性剤を投与されなかったＯＰＣと比較した。候補生物活性剤を投与されたＯＰＣが、これを投与されなかったＯＰＣと比較して、より高レベルのＭＲＦ発現を示す場合は、該候補生物活性剤を、実施例２２に記載の動物モデルにおける試験など、さらなる解析用に選択する。
【０１５９】
また、ミエリン特異的遺伝子についての免疫組織化学または遺伝子発現の検出によって、細胞を解析することもできる。候補生物活性剤を投与された細胞が、該候補生物活性剤を投与されなかった細胞と比較して、ミエリン特異的遺伝子の発現または軸索の有髄化の増大を示す場合は、該候補生物活性剤を、実施例２２に記載の動物モデルにおける試験など、脱髄を阻害するか、または再有髄化を促進する治療剤としてのさらなる開発用に選択する。
【０１６０】
（実施例２２）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物活性剤のスクリーニング
実施例１６に記載のＭＲＦ条件付きノックアウトマウス（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）を用いて、生物活性剤をスクリーニングする。ＭＲＦ条件付きノックアウトマウス（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）は、Ｐ１１において、振戦および発作を発生させる。このスクリーニングでは、Ｐ１１以前に、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスに候補生物活性剤を投与する。該動物が、振戦もしくは発作を発生させないか、または発生させる振戦もしくは発作が、該候補生物活性剤を投与されなかったＭＲＦ条件付きノックアウトマウスと比較して、それほど重度でない場合は、該候補生物活性剤を、再有髄化を促進するか、または脱髄を阻害する治療剤としてのさらなる開発用に選択する。また、ミエリン特異的遺伝子についての免疫組織化学もしくは遺伝子発現の検出、または軸索についての電子顕微鏡法などによっても、動物を解析し、候補生物活性剤を投与された動物が、該候補生物活性剤を投与されなかった動物と比較して、ミエリン特異的遺伝子の発現または軸索の有髄化の増大を示す場合は、該候補生物活性剤を、脱髄を阻害するか、または再有髄化を促進する治療剤としてのさらなる開発用に選択する。
【０１６１】
第２のスクリーニングでは、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスが、振戦または発作を示した後において、すなわち、約Ｐ１１以後において、該動物に候補生物活性剤を投与する。該候補生物活性剤を投与されなかったＭＲＦ条件付きノックアウトマウスと比較して、振戦または発作の程度が低下するなど、該動物の状態が改善される場合は、該候補生物活性剤を、脱髄を阻害するか、または再有髄化を促進する治療剤としてのさらなる開発用に選択する。また、ミエリン特異的遺伝子についての免疫組織化学もしくは遺伝子発現の検出、または軸索についての電子顕微鏡法などによっても、動物を解析し、候補生物活性剤を投与された動物が、該候補生物活性剤を投与されなかった動物と比較して、ミエリン特異的遺伝子の発現または軸索の有髄化の増大を示す場合は、該候補生物活性剤を、脱髄を阻害するか、または再有髄化を促進する治療剤としてのさらなる開発用に選択する。
【０１６２】
本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、このような実施形態が例示だけを目的とするものであることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱しない限りにおいて、今や、多くの変更、変化、および置換が当業者に生じるであろう。本発明を実施する際に、本明細書で記載される本発明の実施形態に対する各種の代替物を用いうることを理解されたい。本明細書における特許請求の範囲が、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲が、これらおよびこれらの同等物の範囲内にある方法および構造を対象とすることが意図される。
【図５】
2011528227.tif 000002
【図１１Ａ】
2011528227.tif 000003
【図１１Ｂ】
2011528227.tif 000004
【図１１Ｃ】
2011528227.tif 000005
【図１１Ｄ】
2011528227.tif 000006
【図１４】
2011528227.tif 000007
【図１６Ａ】
2011528227.tif 000008
【図１６Ｂ】
2011528227.tif 000009
【図１】
2011528227.tif 000010
【図２】
2011528227.tif 000011
【図３】
2011528227.tif 000012
【図４】
2011528227.tif 000013
【図６】
2011528227.tif 000014
【図７】
2011528227.tif 000015
【図８】
2011528227.tif 000016
【図９】
2011528227.tif 000017
【図１０】
2011528227.tif 000018
【図１２】
2011528227.tif 000019
【図１３】
2011528227.tif 000020
【図１５】
2011528227.tif 000021
【図１７】
2011528227.tif 000022
【配列表】
2011528227000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月15日(2011.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−１】
2011528227.tif 000023
【図２−２】
2011528227.tif 000024
【図５Ａ】
2011528227.tif 000025
【図５Ｂ】
2011528227.tif 000026
【図１４Ａ】
2011528227.tif 000027
【図１４Ｂ】
2011528227.tif 000028
【図１】
2011528227.tif 000029
【図２−３】
2011528227.tif 000030
【図３】
2011528227.tif 000031
【図４】
2011528227.tif 000032
【図６】
2011528227.tif 000033
【図７】
2011528227.tif 000034
【図８】
2011528227.tif 000035
【図９】
2011528227.tif 000036
【図１０】
2011528227.tif 000037
【図１１】
2011528227.tif 000038
【図１２】
2011528227.tif 000039
【図１３】
2011528227.tif 000040
【図１５】
2011528227.tif 000041
【図１６】
2011528227.tif 000042
【図１７】
2011528227.tif 000043
【図１８】
2011528227.tif 000044
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】図１は、ＣＮＳ内におけるＯＬ特異的な転写物であるＧＭ９８／ＭＲＦの同定を示す図である。Ａ）図１Ａは、ＣＮＳから急性摘出された細胞におけるＧＭ９８／ＭＲＦの発現レベルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析（プローブセット１４３９５０６＿ａｔ）により決定したことを示す図である。Ｂ）図１Ｂは、ノーザンブロットが、ＭＲＦの発現を、Ｐ２０における脳および培養希突起膠細胞（ＯＬ）内では、約５．５Ｋｂの単一の転写物として確認するが、心臓組織内ではこれを確認せず、これは、確立されたＯＬマーカーであるＣＮＰ１の発現パターンを反映することを示す図である。ＧＡＰＤＨは、ｍＲＮＡレベルの対照として示される。Ｃ）図１Ｃは、Ｐ１６における脳の矢状断面内における、確立されたＯＬマーカーであるＰＬＰおよびＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。いずれの遺伝子も、明白な白質の発現パターンを示す。Ｄ）図１Ｄは、標識化された細胞の同一の分布を示す、脳梁側部内におけるＰＬＰおよびＭＲＦの発現についての高倍率画像である。
【図２−１】図２は、ＭＲＦのペプチド構造および細胞内局在化を示す図である。Ａ）図２Ａは、マウスＭＲＦ遺伝子およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９遺伝子のペプチド配列の比較を示す図である。Ｂ）図２Ｂは、マウスＭＲＦタンパク質、およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９タンパク質の構造領域、ならびにこれらの領域内におけるそれらの相同性を示すダイアグラムである。Ｃ〜Ｅ）図２Ｃ〜Ｅは、ＨＥＫ細胞内におけるｍｙｃタグを付したＭＲＦの細胞内局在化を示す図である。抗ｍｙｃによる、Ｍｙｃ−ＭＲＦをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する染色（Ｅ）は、トランスフェクトされた細胞内における、核内対比染色色素であるＤＡＰＩとの本質的に完全な共局在化を伴う、該タンパク質の強い核内局在化を示す。ｍｙｃタグを付していないＭＲＦ（Ｄ）、およびｍｙｃタグを付したタンパク質をトランスフェクトした細胞は、細胞質内局在化（Ｃ）を示し、これにより、染色についての陰性対照、および比較がそれぞれもたらされる。
【図２−２】図２は、ＭＲＦのペプチド構造および細胞内局在化を示す図である。Ａ）図２Ａは、マウスＭＲＦ遺伝子およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９遺伝子のペプチド配列の比較を示す図である。Ｂ）図２Ｂは、マウスＭＲＦタンパク質、およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９タンパク質の構造領域、ならびにこれらの領域内におけるそれらの相同性を示すダイアグラムである。Ｃ〜Ｅ）図２Ｃ〜Ｅは、ＨＥＫ細胞内におけるｍｙｃタグを付したＭＲＦの細胞内局在化を示す図である。抗ｍｙｃによる、Ｍｙｃ−ＭＲＦをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する染色（Ｅ）は、トランスフェクトされた細胞内における、核内対比染色色素であるＤＡＰＩとの本質的に完全な共局在化を伴う、該タンパク質の強い核内局在化を示す。ｍｙｃタグを付していないＭＲＦ（Ｄ）、およびｍｙｃタグを付したタンパク質をトランスフェクトした細胞は、細胞質内局在化（Ｃ）を示し、これにより、染色についての陰性対照、および比較がそれぞれもたらされる。
【図２−３】図２は、ＭＲＦのペプチド構造および細胞内局在化を示す図である。Ａ）図２Ａは、マウスＭＲＦ遺伝子およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９遺伝子のペプチド配列の比較を示す図である。Ｂ）図２Ｂは、マウスＭＲＦタンパク質、およびヒトＣ１１Ｏｒｆ９タンパク質の構造領域、ならびにこれらの領域内におけるそれらの相同性を示すダイアグラムである。Ｃ〜Ｅ）図２Ｃ〜Ｅは、ＨＥＫ細胞内におけるｍｙｃタグを付したＭＲＦの細胞内局在化を示す図である。抗ｍｙｃによる、Ｍｙｃ−ＭＲＦをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する染色（Ｅ）は、トランスフェクトされた細胞内における、核内対比染色色素であるＤＡＰＩとの本質的に完全な共局在化を伴う、該タンパク質の強い核内局在化を示す。ｍｙｃタグを付していないＭＲＦ（Ｄ）、およびｍｙｃタグを付したタンパク質をトランスフェクトした細胞は、細胞質内局在化（Ｃ）を示し、これにより、染色についての陰性対照、および比較がそれぞれもたらされる。
【図３】図３は、ＭＲＦの発現が、ＯＬの成熟にとって重要であることを示す図である。Ａ）図３Ａは、２４〜９６時間にわたる分化時における、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬの生存率および形態を示す、生存：死滅アッセイ（生存細胞は、カルセイン（Ｃａｌｃｉｅｎ）ＡＭにより染色されて緑色チャネルで示され、非生存核は、エチジウムホモ二量体により染色されて赤色チャネルで示される）を示す図である。ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて膜シートの沈着の減少および生存率の低下を示した。Ｂ）図３Ｂは、分化条件へと移した２４〜９６時間後における、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べたｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞の生存率を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、分化の４８時間後以降、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて著明な生存率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｃ）図３Ｃは、分化の２４、４８、および９６時間後において、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬにおける、ＯＰＣマーカーであるＮＧ２、および初期ＯＬマーカーであるＭＢＰの発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と同様の時間プロファイルによりＮＧ２の発現を下方調節するが、ＭＢＰ発現の遅延およびその誘導の低下を示した。Ｄ）図３Ｄは、分化の２４〜９６時間後における、ＭＢＰを発現するｓｉＣｏｎｔトランスフェクトＯＬおよびｓｉＭＲＦトランスフェクトＯＬの比率についての定量化を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、すべての時点において、ＭＲＦ発現率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｅ）図３Ｅは、２４〜９６時間にわたる分化時の、ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたＯＬ内における、後期ＯＬマーカーであるＭＯＧの発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、ＭＯＧ発現に対する誘導の低下を示した。Ｆ）図３Ｆは、分化の２４〜９６時間後における、ＭＯＧを発現するｓｉＣｏｎｔトランスフェクトＯＬおよびｓｉＭＲＦトランスフェクトＯＬの比率についての定量化を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞は、分化の４８時間後以降、ＭＲＦ発現率の低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１。結果は、３つの個別の実験を表わす。
【図４】図４は、ＭＲＦノックダウン動物による、ＯＬ遺伝子発現の解析を示す図である。Ａ）図４Ａは、ＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件で４８時間にわたり培養された細胞における遺伝子発現についてのノーザンブロット解析を示す図である。脳試料、心臓試料、および培養星状細胞試料に由来するＲＮＡを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として与えた。細胞にｓｉＭＲＦをトランスフェクトしたところ、存在するＭＲＦ転写物の量が大幅に減少し、また、結果として、ＰＬＰの発現、また、より低度ではあるがＣＮＰ１の発現も明白に阻害された。ＧＡＰＤＨのノーザンブロット結果、および１８Ｓリボソームバンドの可視化を、ローディング対照として示す。Ｂ）図４Ｂは、ＯＰＣ、およびＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件で４８時間にわたり培養された細胞における遺伝子発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析の結果を示す図であり、これにより、選択されたＯＰＣマーカーであるＮＧ２、ＰＤＧＦＲα、およびＫｉ６７の発現レベルが示される。これらのＯＰＣマーカーの下方調節は、ＭＲＦのノックダウンによる影響を受けなかった。Ｃ）図４Ｃは、対照（ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞の値）に対する比率として表わされた、ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞における、汎ＯＬ系統のマーカーであるＳｏｘ１０、初期ＯＬマーカー（Ｕｇｔ８、ＣＮＰ１、ＰＬＰ１、ＭＢＰ）、および後期ＯＬマーカー（ＭＡＧ、トランスフェリン、ＭＯＢＰ、およびＭＯＧ）の発現を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞において、ＯＬ遺伝子の発現は、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞の場合と比べて強く阻害され、分化後期のＯＬマーカー（トランスフェリン、ＭＯＧ、およびＭＯＢＰ）が、同初期マーカー（ＣＮＰ１またはＵｇｔ８）または同中間段階マーカー（ＰＬＰ１、ＭＢＰ）より大きな影響を受けることが典型的であった。結果は、３つの個別の実験の平均であり、ｓｉＣｏｎｔによる発現レベルの平均百分率±ＳＥＭとして表わされる。Ｄ）図４Ｄは、分化により＞４倍に誘導された遺伝子と、ｓｉＭＲＦのトランスフェクションにより＜４分の１に抑制された遺伝子との重複を示すベン図である。ｓｉＭＲＦにより阻害された遺伝子の大半（８１％）は、ＯＬ分化時において通常は上方調節される遺伝子であった；これに対し、ＯＬの分化時において通常は誘導される遺伝子のうち、ＭＲＦの発現に依存するのは１３％に過ぎなかった。
【図５Ａ】図５は、ＭＲＦ発現の不在下におけるＯＬ遺伝子の発現についての表である。ＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔもしくはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件において４８時間にわたり培養された細胞、または遺伝子発現のベースラインを与える培養ＯＰＣにおける遺伝子発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析であり、これにより、ＭＲＦの不在下において発現の抑制を示す上位５０の遺伝子が示される。ｓｉＭＲＦの存在下において下方調節される上位５０の遺伝子のうち、４７は、ＯＰＣとｓｉＣｏｎｔ  ＯＬとの間で４倍以上に上方調節される遺伝子であった。１つの遺伝子について複数のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットが使用可能である場合、最も強く発現したものだけを示す。
【図５Ｂ】図５は、ＭＲＦ発現の不在下におけるＯＬ遺伝子の発現についての表である。ＯＰＣとしてｓｉＣｏｎｔもしくはｓｉＭＲＦをトランスフェクトされ、次いで、分化条件において４８時間にわたり培養された細胞、または遺伝子発現のベースラインを与える培養ＯＰＣにおける遺伝子発現についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析であり、これにより、ＭＲＦの不在下において発現の抑制を示す上位５０の遺伝子が示される。ｓｉＭＲＦの存在下において下方調節される上位５０の遺伝子のうち、４７は、ＯＰＣとｓｉＣｏｎｔ  ＯＬとの間で４倍以上に上方調節される遺伝子であった。１つの遺伝子について複数のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットが使用可能である場合、最も強く発現したものだけを示す。
【図６】図６は、ＭＲＦの異所性発現によりＯＬの分化が誘導されることを示す図である。Ａ〜Ｊ）図６Ａ〜Ｊは、ｐＥＧＦＰ、および対照（空）ベクター、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０によるトランスフェクション後、４８時間にわたり増殖条件（＋ＰＤＧＦ、−Ｔ３）において培養したＯＰＣを、ＮＧ２、ＭＢＰ、またはＭＯＧについて染色したことを示す図である。Ａ〜Ｃ）図６Ａ〜Ｃは、対照ベクター（Ａ）、ＣＭＶ−ＭＲＦ（Ｂ）、またはＣＭＶ−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトした細胞を、ＮＧ２について染色したことを示す図である。対照ベクターまたはＣＭＶ−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされたほとんどすべての細胞（ＧＦＰの共発現により同定される）は、ＮＧ２陽性を維持した（黄色の矢印）。これに対し、ＣＭＶ−ＭＲＦをトランスフェクトされた多くの細胞が、ＮＧ２発現を下方調節する（緑色の矢印）一方、同じ培養物中における非トランスフェクト細胞はＮＧ２発現を維持した（赤色の矢印）。Ｄ〜Ｊ）図６Ｄ〜Ｊは、対照ベクター（Ｄ、Ｈ）、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ（Ｅ、Ｉ）、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０（Ｆ、Ｊ）をトランスフェクトした細胞を、ＭＢＰ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、またはＭＯＧ（Ｈ、Ｉ、Ｊ）について染色したことを示す図である。対照ベクターまたはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされたほとんどすべての細胞は、ＭＢＰ陰性およびＭＯＧ陰性を維持した（黄色の矢印）。これに対し、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦをトランスフェクトされた多くの細胞は、ＭＢＰ発現およびＭＯＧ発現について陽性であった（黄色の矢印）。Ｌ〜Ｍ）図６Ｌ〜Ｍは、対照ベクター、ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦ、またはｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０をトランスフェクトされ、トランスフェクションの４８または１２０時間後においてＭＢＰ（Ｌ）またはＭＯＧ（Ｍ）について陽性であった細胞の平均比率を示すグラフである。ｐＳｐｏｒｔ６−ＭＲＦによるトランスフェクションは、大半の細胞がＭＢＰ陰性およびＭＯＧ陰性を維持した対照ベクターだけのトランスフェクションと比べ、４８時間後および１２０時間後のいずれにおいても、ＭＢＰ発現およびＭＯＧ発現の強力な誘導をもたらした。ｐＳｐｏｒｔ６−Ｓｏｘ１０による細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクションの１２０時間後において、ＭＢＰおよびＭＯＧに対する比較的低度の誘導を結果としてもたらした。＊＊Ｐ＜０．０１。結果は、３つの個別の実験を表わす。
【図７】図７は、発生時のニワトリ脊髄内においてＭＲＦを電気穿孔すると、早発性のＭＢＰ発現が引き起こされることを示す図である。Ｅ３における胚に、ＭＲＦおよびＥＧＦＰを含有するｐＣＡＧＧＳプラスミドを共電気穿孔し、Ｐ８において回収した。Ａ）図７Ａは、電気穿孔した脊髄側方だけにおいてＭＲＦ  ＲＮＡの発現を示す、ＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。Ｂ）図７Ｂは、脊髄横断面におけるＥＧＦＰおよびＭＢＰについての染色を示す図である。電気穿孔された脊髄側方では、偶発的なＭＢＰ＋細胞（１断面当たり１または２個だけであることが典型的）が見出されたが、対照の側方では見出されなかった。Ｃ）図７Ｃは、脊髄の縦断面におけるＥＧＦＰおよびＭＢＰについての染色が、ＭＢＰに対する免疫反応性が電気穿孔された側方に限定されることを示す図である。Ｄ）図７Ｄは、図７ＢおよびＣにおいて示されるＭＢＰ＋細胞の高倍率画像を示す図である。
【図８】図８は、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスの解析および作製を示す図である。Ａ）図８Ａは、ＭＲＦを破壊するための戦略についての概略図である。野生型のＭＲＦ遺伝子座、標的化ベクター、および相同組換え後において予測される遺伝子座を示す。標的とされるマウスを、Ｆｌｐｅｒマウスと交配させることにより、ネオマイシン耐性カセットを欠失させ、結果として、ＭＲＦのエキソン８をｌｏｘＰで挟んだマウスを得る。略号：Ｅｘ８、エキソン８；プライマー１；Ｐ２、プライマー２；Ｐ３、プライマー３；ＦＲＴ、Ｆｌｐリコンビナーゼ部位；ＳＰ、サザンプローブ。Ｂ）図８Ｂは、ＭＲＦ野生型マウス、ＭＲＦをｌｏｘＰで挟んだヘテロ接合マウス、およびＭＲＦをｌｏｘＰで挟んだホモ接合マウスに由来するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を示す図である。プライマー１および２は、４６０ｂｐの野生型バンドを発生させ、また、ｌｏｘＰ部位の挿入により、対立遺伝子をｌｏｘＰで挟んだマウスにおいては、６６８ｂｐのバンドも発生させた。プライマー１および３は、対立遺伝子をｌｏｘＰで挟んだマウスに特異的な２６９ｂｐのバンドを発生させた。プライマー１は、イントロン７〜８の上側鎖である。プライマー２は、エキソン８の下側鎖である。プライマー３は、プラスミド挿入物の下側鎖である。Ｃ）図８Ｃは、ＭＲＦ遺伝子によりコードされる全長タンパク質、また、ＤＮＡ結合ドメインおよび後に続くＣ末端領域を欠く、Ｃｒｅを介する切断後の切断タンパク質についての概略図である。
【図９】図９は、ＣＮＳの有髄化不全を示す、ＭＲＦ条件付きノックアウトマウスを示す図である。Ａ〜Ｂ）図９Ａ〜Ｂは、Ｐ１３においてＭＢＰ、ＮｅｕＮ、およびＧＦＡＰにより染色した、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスの海馬、脳梁、ならびに皮質上部Ａ）および脊髄Ｂ）を表わす画像である。Ｃ）図９Ｃは、Ｐ１３におけるＭＲＦ対照マウスおよびＭＲＦ条件付きノックアウトマウスの脊髄における、ＣＮＰ、ＭＢＰ、ＭＯＧ、ＧＦＡＰ、およびニューロフィラメントの発現についてのウェスタンブロット解析を示す図である。Ｄ）図９Ｄは、Ｐ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスにおける脊髄の脊髄根および側方白質に対するフルオロミエリン染色を表わす画像である。Ｅ）図９Ｅは、Ｐ１３における対照動物および条件付きノックアウト動物の神経を表わす電子顕微鏡画像である。対照動物の神経は、著明量の有髄化が進行中であることを示している。これに対し、条件付きノックアウト動物の神経は、軸索の有髄化を一切示さなかった。
【図１０】図１０は、視神経および坐骨神経内におけるＰＬＰおよびＭＲＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。ＰＬＰについてのシグナルは、既に報告されている通り（Ｐｕｃｋｅｔｔら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．、１８巻、５１１〜５１８頁（１９８７年））、坐骨神経では低レベルまでであるが、視神経内および坐骨神経内のいずれにおいても（ＣＮＳ神経およびＰＮＳ神経のいずれにおいても）容易に検出可能であった。これに対し、ＭＲＦについてのシグナルが視神経内で検出されたことは、これが、ＯＬによっては発現するが、シュワン細胞によっては発現しない（ＣＮＳの神経膠細胞によっては発現するが、ＰＮＳの神経膠細胞によっては発現しない）ことを示す。
【図１１】Ａ〜Ｂ）図１１Ａ〜Ｂは、ｓｉＣｏｎｔ（Ａ）またはｓｉＭＲＦ（Ｂ）をトランスフェクトした後で４８時間にわたり分化させた、培養希突起膠細胞についての位相イメージングを示す図である。いずれの場合も、大半の細胞は希突起膠細胞の形態を帯びるが、ｓｉＭＲＦをトランスフェクトした細胞は、それほど広範な突起を示さなかった。Ｃ〜Ｄ）図１１Ｃ〜Ｄは、ｓｉＣｏｎｔ（Ｃ）またはｓｉＭＲＦ（Ｄ）をトランスフェクトした後で７２時間にわたり分化させた培養希突起膠細胞上における、ＭＯＧおよびＧａｌＣについての表面染色（Ｏ１抗体による）を示す図である。ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞およびｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞のいずれも、Ｏ１抗体により容易に標識化されたが、ＭＯＧについて陽性であったのは、ｓｉＣｏｎｔ細胞だけであった。
【図１２】Ａ）図１２Ａは、対照のｓｉＲＮＡプール、またはＭＲＦに対するｓｉＲＮＡプールをトランスフェクトした培養希突起膠細胞内において、ＭＲＦおよびＭＢＰを検出するＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）を示す図である。ｓｉＭＲＦトランスフェクト細胞では、ＭＲＦ転写物レベルおよびＭＢＰ転写物レベルのいずれもが明白な低下を示した。Ｂ）図１２Ｂは、対照のｓｉＲＮＡプール、またはＭＲＦに対する個別のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした培養希突起膠細胞内において、ＭＲＦおよびＭＢＰを検出するＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）を示す図である。４つの個別のｓｉＲＮＡのうちの複数が、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて検出可能な、ＭＲＦレベルおよびＭＢＰレベルの低下を引き起こした。Ｃ）図１２Ｃは、図１２Ｂと同じトランスフェクションに由来する細胞が、分化条件における４日間にわたる培養後において示す、ＭＯＧを発現する生存細胞の比率の高さを示す図である。ＭＲＦに対する４つの個別のｓｉＲＮＡのうちの３つが、ｓｉＣｏｎｔトランスフェクト細胞と比べて、ＭＯＧを発現する細胞の比率を著明に低下させたが、これは、図１２Ｂにおいて観察されたＭＲＦのノックダウンと良好に相関する。
【図１３】図１３は、ＭＲＦ条件付きノックアウト動物が、成熟希突起膠細胞の喪失を示すことを明らかにする図である。Ａ）図１３Ａは、Ｐ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ＣｒｅおよびＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスの視神経内における、ＭＢＰ、ＣＣ１、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ならびにＣＣ１およびＰＤＧＦＲαと共染色されたＯｌｉｇ２についての免疫染色を示す図である。スケールバー＝５０μｍ。Ｂ）図１３Ｂは、視神経内におけるＯｌｉｇ２免疫陽性核の密度についての定量化を示す図である。Ｃ）図１３Ｃは、視神経内におけるＯｌｉｇ２＋／ＣＣ１＋二重免疫陽性ＯＬの密度についての定量化を示す図である。Ｄ）図１３Ｄは、視神経内におけるＯｌｉｇ２＋／ＰＤＧＦＲａ＋二重免疫陽性細胞の密度についての定量化を示す図である。すべての結果は、平均±ＳＥＭ、１遺伝子型当たりｎ＝４〜５として表わされる。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｅ）図１３Ｅは、ＣＣ１についてもまた陽性であるＯｌｉｇ２＋細胞（ＯＬ）、ＰＤＧＦＲ１αについてもまた陽性であるＯｌｉｇ２＋細胞（ＯＰＣ）、またはいずれのマーカーについても陽性でないＯｌｉｇ２＋細胞に分類される、視神経内における各遺伝子型のＯｌｉｇ２免疫陽性細胞の密度を示す図である。
【図１４Ａ】図１４は、条件付きノックアウト動物の培養希突起膠細胞および脊髄における遺伝子発現を示す図である。対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳、および条件付きノックアウト（ＣＫＯ；ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳に由来するＯＬ培養物（４日間にわたり分化させた）、ならびにＰ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスから急性摘出された脊髄に対するＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果である。Ａ）図１４Ａは、ＣＫＯ動物の培養ＯＬにおいて、対照動物の培養ＯＬと比べて最も大幅に下方調節された２０遺伝子を、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄におけるＭＡＳ  ５．０遺伝子の発現値と共に列挙する。また、培養ＯＬ（対照値／ＣＫＯ値）、脊髄（対照値／ＣＫＯ値）、およびｓｉＲＮＡ実験（ｓｉＣｏｎｔ値／ｓｉＭＲＦ値）についても、抑制倍率の値を示す。Ｂ）図１４Ｂは、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄における汎ＯＬ系統マーカー、ＯＰＣマーカー、初期ＯＬマーカー、後期ＯＬマーカーを表わすプローブセット、およびこれらの発現値を示す図である。「Ａ」と表示した遺伝子を発現しない遺伝子と判定し、「Ｂ」と表示した遺伝子を発現した遺伝子と考える。「Ｂ」とは、わずかな発現に相当する。アレイ上における所与の遺伝子に対して複数のプローブセットが存在した場合は、最も強く発現したプローブセットだけを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、条件付きノックアウト動物の培養希突起膠細胞および脊髄における遺伝子発現を示す図である。対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳、および条件付きノックアウト（ＣＫＯ；ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳に由来するＯＬ培養物（４日間にわたり分化させた）、ならびにＰ１３における対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウス、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスから急性摘出された脊髄に対するＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果である。Ａ）図１４Ａは、ＣＫＯ動物の培養ＯＬにおいて、対照動物の培養ＯＬと比べて最も大幅に下方調節された２０遺伝子を、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄におけるＭＡＳ  ５．０遺伝子の発現値と共に列挙する。また、培養ＯＬ（対照値／ＣＫＯ値）、脊髄（対照値／ＣＫＯ値）、およびｓｉＲＮＡ実験（ｓｉＣｏｎｔ値／ｓｉＭＲＦ値）についても、抑制倍率の値を示す。Ｂ）図１４Ｂは、対照動物のＯＬおよびＣＫＯ動物のＯＬ、ならびに対照動物の脊髄およびＣＫＯ動物の脊髄における汎ＯＬ系統マーカー、ＯＰＣマーカー、初期ＯＬマーカー、後期ＯＬマーカーを表わすプローブセット、およびこれらの発現値を示す図である。「Ａ」と表示した遺伝子を発現しない遺伝子と判定し、「Ｂ」と表示した遺伝子を発現した遺伝子と考える。「Ｂ」とは、わずかな発現に相当する。アレイ上における所与の遺伝子に対して複数のプローブセットが存在した場合は、最も強く発現したプローブセットだけを示す。
【図１５】図１５は、ＭＲＦ欠損ＯＰＣ／ＯＬ培養物が、分化条件では欠損を示すが、増殖条件では欠損を示さないことを明らかにする図である。Ａ）図１５Ａは、増殖（＋ＰＤＧＦ、−Ｔ３）条件における、ＮＧ２およびＫｉ６７についての、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物の免疫染色を示す図である。いずれの場合においても、大半の細胞は、ＮＧ２陽性前駆細胞およびＫｉ６７陽性前駆細胞（Ｋｉ６７＋核を矢印により示す）として維持された。Ｂ）図１５Ｂは、分化（−ＰＤＧＦ、＋Ｔ３）条件において４日間にわたり増殖させた、対照動物による培養物、およびＭＲＦ条件付きノックアウト動物による培養物に対する、Ｋｉ６７、ＣＮＰ、およびＭＢＰについての免疫染色を示す図である。いずれの場合においても、大半の細胞は、Ｋｉ６７の発現を下方調節し、ＯＬに特徴的な多極形態を帯び（ＣＮＰ染色により可視化される）、ＧＦＡＰについては陰性であった。しかし、頑健なＭＢＰ染色が見られたのは、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）動物による培養物中だけであった。スケールバー＝１００μｍ。Ｃ）図１５Ｃは、ＯＬ系統の特殊化および分化に対する転写制御についての概略図である。Ｏｌｉｇ２は、ＯＬ系統の特殊化に必要である。Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｙｉｎ  Ｙａｎｇ  １、およびＯｌｉｇ１を含めた複数の遺伝子が、ＯＬへのＯＰＣの頑健な分化には必要である。ＭＲＦは、ミエリン遺伝子の完全な相補体を発現する、成熟ＯＬへの未成熟ＯＬの成熟化に必要であり、その誘導はおそらくＹｉｎ  Ｙａｎｇ  １により調節される。
【図１６】図１６は、ＣＮＰ−Ｃｒｅを介してＭＲＦが欠失する結果として、ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅマウスと同等の、有髄化不全を引き起こす表現型がもたらされることを示す図である。Ａ）図１６Ａは、ＭＢＰにより染色された、Ｐ１６における対照（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／ｗｔ）動物の脳、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脳を表わす画像であり、これらにより、ＣＮＰ−Ｃｒｅを介するＭＲＦ条件付きノックアウト動物の脳梁（ｃｃ）内におけるＭＢＰ染色の大幅な喪失が示される。一部の、わずかにＭＢＰ＋であり、有髄化しないＯＬが、条件付きノックアウト動物の脳内に存在する（矢印）。スケールバー＝２００μｍ。Ｂ）図１６Ｂは、フルオロミエリンにより染色された、Ｐ１６における対照（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／ｗｔ）動物の脊髄、および条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；ＣＮＰｗｔ／Ｃｒｅ）動物の脊髄を表わす画像である。条件付きノックアウト動物では、末梢における有髄化（脊髄根；ｓ．ｒ．）は影響を受けないと考えられるが、ＣＮＳにおける有髄化は見られない。
【図１７】図１７は、条件付きノックアウトマウスが、視神経内において細胞アポトーシスの増大を示すことを明らかにする図である。Ａ）図１７Ａは、抗ＭＢＰ抗体および抗活性化カスパーゼ３抗体により染色された、Ｐ１０における対照動物の神経、および条件付きノックアウト動物の視神経を表わす画像である。スケールバー＝１００μｍ。Ｂ）図１７Ｂは、Ｐ１０における対照動物の視神経、および条件付きノックアウト動物の視神経内における活性化カスパーゼ３免疫陽性細胞の密度についての定量化により、条件付きノックアウト動物において、アポトーシス細胞の密度の著明な上昇が明らかとなったことを示す図である（＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ＝５〜６／遺伝子型）。Ｃ）図１７Ｃは、図１７Ａで条件付きノックアウト動物の神経について枠囲いした領域を高拡大率で示す図であり、これにより、核がフラグメント化し、活性化カスパーゼ３が染色される（矢印）、低度のＭＢＰ陽性細胞が示される。
【図１８】図１８は、条件付きノックアウト動物の遺伝子プロファイリングを示す図である。Ａ）図１８Ａは、対照（ＭＲＦｗｔ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ＣｒｅおよびＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／ｗｔ）マウス、およびＭＲＦ条件付きノックアウト（ＭＲＦｆｌ／ｆｌ；Ｏｌｉｇ２ｗｔ／Ｃｒｅ）マウスに由来する脊髄または培養ＯＬに由来するＲＮＡ中における選択遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲ（３０サイクル）解析を示す図であり、これにより、条件付きノックアウト動物による試料中において、ＯＬマーカーであるＭＯＧおよびＭＯＢＰの喪失が示される。該遺伝子のエキソン８によりコードされるＲＮＡ配列を認識するプライマーを用いて、条件付きノックアウト動物に由来する脊髄または培養ＯＬからＰＣＲ産物を検出することはできず、これにより、このエキソンの欠失が確認された。これに対し、ＭＲＦのエキソン８の外側に位置するプライマーは、条件付きノックアウト動物による培養ＯＬ中におけるＭＲＦ発現を検出したが、脊髄中におけるＭＲＦ発現は検出しなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の新規の特徴は、添付される特許請求の範囲において具体的に記載される。本発明の特徴および利点についてのよりよい理解は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびそれに付随する図面を参照することにより得られる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＭＲＦまたはその機能的な変異体をコードする核酸配列に作動的に連結された細胞型特異的な発現調節エレメントを含む、単離核酸分子。
（項目２）
前記細胞型が神経細胞である、項目１に記載の単離核酸分子。
（項目３）
前記神経細胞が神経膠細胞である、項目２に記載の単離核酸分子。
（項目４）
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、項目３に記載の単離核酸分子。
（項目５）
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、項目１に記載の単離核酸分子。
（項目６）
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、項目１に記載の単離核酸分子。
（項目７）
項目１、２、３、４、５、または６に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
（項目８）
項目１、２、３、４、５、または６に記載の前記単離核酸分子を含む宿主細胞。
（項目９）
ＭＲＦ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物。
（項目１０）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目１１）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、エキソンの欠失を含む、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目１２）
前記エキソンが、エキソン８である、項目１１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１３）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、リコンビナーゼ部位に隣接する、項目１１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１４）
前記動物が、リコンビナーゼ導入遺伝子を含む、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目１５）
前記リコンビナーゼ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、項目１５に記載のトランスジェニック動物。
（項目１６）
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐである、項目１３または１４に記載のトランスジェニック動物。
（項目１７）
前記細胞型が神経細胞である、項目１０または１５に記載のトランスジェニック動物。
（項目１８）
前記神経細胞が神経膠細胞である、項目１７に記載のトランスジェニック動物。
（項目１９）
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、項目１８に記載のトランスジェニック動物。
（項目２０）
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、項目１７に記載のトランスジェニック動物。
（項目２１）
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、項目１０または１５に記載のトランスジェニック動物。
（項目２２）
前記動物が哺乳動物である、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目２３）
前記動物がマウスまたはラットである、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目２４）
被験体における神経障害を治療するための組成物であって、前記被験体におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
（項目２５）
被験体における再有髄化を促進するための組成物であって、前記被験体におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
（項目２６）
幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進するための組成物であって、前記幹細胞におけるＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を含む組成物。
（項目２７）
希突起膠細胞の分化を誘導する第２の生物活性剤をさらに含む、項目２４、２５、または２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記第２の生物活性剤が、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進する、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記神経障害が脱髄を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目３０）
前記神経障害が多発性硬化症を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目３１）
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、項目２４、２５、または２６に記載の組成物。
（項目３２）
被験体における神経障害を治療する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を投与するステップを含む方法。
（項目３３）
被験体における再有髄化を促進する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、ＭＲＦ活性を調節する生物活性剤を投与するステップを含む方法。
（項目３４）
幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進する方法であって、ＭＲＦ活性を調節し、これにより、前記幹細胞の希突起膠細胞への分化を促進する生物活性剤を、前記幹細胞に導入するステップを含む方法。
（項目３５）
希突起膠細胞への分化を誘導する第２の生物活性剤を投与または導入するステップをさらに含む、項目３２、３３、または３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第２の生物活性剤を投与または導入するステップが、ＭＲＦの活性を調節する前記生物活性剤を投与するステップの前であるか、これと同時であるか、またはこの後である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第２の生物活性剤が、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、またはこれらの組合せの活性を促進する、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記第２の生物活性剤を投与するステップが、相乗効果を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記神経障害が脱髄を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４０）
前記神経障害が多発性硬化症である、項目３２に記載の方法。
（項目４１）
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、項目３２、３３、または３４に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体が、マウス、ラット、またはヒトである、項目３２または３３に記載の方法。
（項目４３）
ＭＲＦ活性を調節するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験細胞を、前記候補生物活性剤と接触させるステップと、
（ｂ）対照動物と比較したＭＲＦの発現レベルの変化についてアッセイするステップと
を含む方法。
（項目４４）
動物における有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補生物活性剤を動物に投与するステップと、
（ｂ）対照動物と比較したＭＲＦの発現レベルの上昇についてアッセイするステップであって、ここで、前記上昇は、前記生物活性剤が前記動物における有髄化を促進することを示すステップと
を含む方法。
（項目４５）
動物における再有髄化を促進するのに有効な候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補生物活性剤を、ＭＲＦ導入遺伝子を含む動物に投与するステップ；
（ｂ）対象動物と比較した、表１中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの上昇についてアッセイするステップであって、ここで、前記上昇は、前記生物活性剤が前記動物における再有髄化を促進することを示すステップ；および／または
（ｃ）対象動物と比較した、前記動物における有髄化の変化を観察するステップ
を含む方法。
（項目４６）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、エキソンの欠失を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
前記エキソンが、エキソン８である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記ＭＲＦ導入遺伝子が、リコンビナーゼ部位に隣接する、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記リコンビナーゼ部位が、ｌｏｘＰまたはＦＲＴである、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記動物が、リコンビナーゼ導入遺伝子を含む、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記リコンビナーゼ導入遺伝子が、細胞型特異的な調節エレメントに作動的に連結される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐである、項目４８または５０に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞型が神経細胞である、項目４５に記載の方法。
（項目５５）
前記神経細胞が神経膠細胞である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記神経膠細胞が、希突起膠細胞、希突起膠細胞の前駆細胞、シュワン細胞、星状細胞、または小膠細胞である、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記神経細胞特異的な調節エレメントが、ＣＣ１遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子、希突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）遺伝子、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）遺伝子、ＮＯＧＯ遺伝子、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子、プロテイン２（Ｐ２）遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＡＱＰ４遺伝子、ＰＤＧＦα遺伝子、ＲＧ５遺伝子、ｐ糖タンパク質遺伝子、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）遺伝子、アルテミン（ＡＲＴＮ）遺伝子、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）遺伝子、スルファチド遺伝子もしくはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子、Ｏｌｉｇ１遺伝子、またはＯｌｉｇ２遺伝子に由来する、項目５４に記載の方法。
（項目５８）
前記細胞型特異的な調節エレメントが、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターである、項目４５に記載の方法。
（項目５９）
前記動物がマウスである、項目４４または４４に記載の方法。
（項目６０）
前記生物活性剤が、ペプチド、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アンチセンス分子、ペプチド模倣剤、または低分子である、項目４２、４３、または４４に記載の方法。
【国際調査報告】
2011528227.tif 000045
2011528227.tif 000046
2011528227.tif 000047
2011528227.tif 000048