(57)【要約】  Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込んでいる自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）を記載する。本発明のナノ粒子は、リンカーセグメントによって接続された２つのオリゴマー化ドメインを含む連続ペプチド鎖の集合体からなり、ここで、一方または両方のオリゴマー化ドメインが、そのペプチド配列内にＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込む。これらのナノ粒子は、ワクチンおよびアジュバントとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、およびペプチドオリゴマー化ドメインＤ２を含む連続鎖からなる式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２          （Ｉ）
（式中、
Ｄ１が、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成する傾向を有するペプチドであり、Ｄ２が、ｎ個のサブユニットＤ２のオリゴマー（Ｄ２）ｎを形成する傾向を有するペプチドであり、ｍおよびｎが各々２〜１０の数字であり、ただし、ｍはｎに等しくはなくそしてｎの倍数ではなく、そしてｎはｍの倍数ではなく、Ｌが結合または短いリンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方が、オリゴマー化ドメイン内に１つ以上のＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを取り込むコイルドコイルであり、そしてＤ１、Ｄ２およびＬは場合によりさらに置換されている）
の複数の構築ブロックの集合体からなる自己会合ペプチドナノ粒子。
【請求項２】
コイルドコイルオリゴマー化ドメインが、ヘプタッドおよび／またはウンデカッド反復からなる、請求項１記載のペプチドナノ粒子。
【請求項３】
そのＮ末端におけるＤ１のペプチド鎖および／またはそのＣ末端におけるＤ２のペプチド鎖が、１つ以上の追加的なＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープ、１つ以上の他の機能的なペプチドまたはタンパク質、あるいは１つ以上の追加的なハプテンまたは他の機能的な分子によって置換されている、請求項１または２記載のペプチドナノ粒子。
【請求項４】
式Ｓ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２、Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２、またはＳ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２（式中、Ｓ１およびＳ２はペプチド置換基である）で示される、請求項３記載のペプチドナノ粒子。
【請求項５】
同一構築ブロックの少なくとも１つが、Ｄ１のＮ末端および／またはＤ２のＣ末端において１つ以上の異なる置換基を有している、同一構築ブロックＤ１−Ｌ−Ｄ２からなる、請求項１〜４のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項６】
オリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の１つが、トリプトファンジッパーの五量体化ドメインまたはその誘導体である、請求項１〜５のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項７】
オリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の１つが、テトラブラチオンの四量体化ドメインまたはその誘導体である、請求項１〜６のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項８】
エピトープの少なくとも１つがＣＴＬエピトープである、請求項１〜７のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項９】
エピトープの少なくとも１つがＨＴＬエピトープである、請求項１〜７のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項１０】
エピトープの少なくとも１つがＢ細胞エピトープである、請求項１〜７のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項１１】
配列Ｄ１−Ｌ−Ｄ２が、一連の場合により重複しているＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを含む、請求項８〜１０のいずれか記載のペプチドナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチドナノ粒子を含む組成物。
【請求項１３】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、
（ａ）細菌に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｂ）ウイルスに対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｃ）寄生虫に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｄ）癌細胞に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｅ）アレルゲンに対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｆ）耽溺に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｇ）疾病および代謝疾患に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｈ）家畜において免疫応答を誘起するのに適した抗原；および
（ｉ）ペットにおいて免疫応答を誘起するのに適した抗原
からなる群より選択される、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、アメーバ症、炭疸病、カンピロバクター感染、水疱瘡、コレラ、デング熱、ジフテリア、脳炎、エボラ、インフルエンザ、日本脳炎、リーシュマニア症、マラリア、麻疹、髄膜炎菌性疾病、ムンプス、院内感染症、百日咳、肺炎球菌感染症、ポリオ（灰白髄炎）、風疹、帯状疱疹、住血吸虫病、破傷風、ダニ媒介脳炎、トリコモナス症、トリパノソーマ症、結核、腸チフス、水疱瘡、および黄熱病からなる群より選択される疾病を引き起こす病原体のタンパク質から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項１５】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、カンピロバクター、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＦＭＤＶ、ヘモフィルス・インフルエンザエｂ型、ヘリコバクター・ピロリ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、髄膜炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、回虫、鉤虫、およびウエストナイルウイルスからなる群より選択される疾病を引き起こす病原体のタンパク質から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項１６】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、インフルエンザタンパク質のヘマグルチニンおよび／またはＭ２から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項１７】
Ｍ２のＢ細胞エピトープが、四量体コイルドコイルオリゴマー化ドメインＤ１のＮ末端に付着したこのタンパク質の四量体形の細胞外部分Ｍ２ｅである、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
四量体オリゴマー化ドメインＤ１が、テトラブラチオンの四量体コイルドコイルドメインまたはその誘導体である、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表５４】
2011511773.tif 000068
で示されるインフルエンザペプチドの群から選択される、請求項１２〜１８のいずれかの組成物。
【請求項２０】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表５５】
2011511773.tif 000069
からなるインフルエンザペプチド、および配列番号２１１〜２２６の第三のアミノ酸から始まる少なくとも６アミノ酸の配列を含むその断片の群から選択される、請求項１２〜１９のいずれかの組成物。
【請求項２１】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、熱帯熱マラリア原虫サーカムスポロゾイド（ＣＳ）タンパク質のＢ細胞エピトープを構成する８〜４８残基の配列であり、前記Ｂ細胞エピトープは、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏまたはその並べ替え体が２〜約１２回反復されたものからなる、請求項１２の組成物。
【請求項２２】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、三日熱マラリア原虫サーカムスポロゾイド（ＣＳ）タンパク質のＢ細胞エピトープを構成する８〜４８残基の配列であり、前記Ｂ細胞エピトープは、
【表５６】
2011511773.tif 000070
からなるアミノ酸残基配列のいずれかが１〜約６回反復されたものからなる、請求項１２の組成物。
【請求項２３】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表５７】
2011511773.tif 000071
あるいは、そのコア位置ａａ（ａ）および／またはａａ（ｄ）の１つ以上における修飾体からなるマラリアペプチド群から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項２４】
ＨＴＬエピトープの少なくとも１つが、
【表５８】
2011511773.tif 000072
からなるマラリアペプチド群から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項２５】
ＣＴＬエピトープの少なくとも１つが、
【表５９】
2011511773.tif 000073
からなるマラリアペプチド群から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項２６】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、タンパク質ｇｐ４１、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０から選択されるＨＩＶタンパク質である、請求項１２の組成物。
【請求項２７】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、ｇｐ４１の中和抗体２Ｆ５および／または４Ｅ１０の結合部位から選択されるＨＩＶペプチドである、請求項１２の組成物。
【請求項２８】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、ＨＩＶのｇｐ１２０のＶ３ループから選択されるＨＩＶペプチドである、請求項１２の組成物。
【請求項２９】
Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表６０】
2011511773.tif 000074
からなるＨＩＶペプチド群から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項３０】
Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表６１】
2011511773.tif 000075
2011511773.tif 000076
2011511773.tif 000077
からなるＨＩＶペプチド群から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項３１】
Ｂ細胞エピトープが、アヘン、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタカロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神病様薬物、鎮静薬、フェンシクリジン、サイロシビン、揮発性亜硝酸塩、並びに身体的依存および／または心理的依存を誘発する他の薬物からなる群より選択される耽溺に対する免疫応答を誘起するに適した抗原である、請求項１２の組成物。
【請求項３２】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つがニコチンである、請求項１２の組成物。
【請求項３３】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つがコカインである、請求項１２の組成物。
【請求項３４】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、神経膠芽腫、白血病（急性骨髄性および慢性骨髄性）、肝癌、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および腎臓癌から選択されるタイプの癌の癌細胞に対する免疫応答を誘起するに適した抗原から選択される、請求項１２の組成物。
【請求項３５】
【表６２】
2011511773.tif 000078
2011511773.tif 000079
からなる群より選択される配列を含む、請求項１２の組成物。
【請求項３６】
Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの少なくとも１つが、
【表６３】
2011511773.tif 000080
からなる抗原群より選択される、請求項１２の組成物。
【請求項３７】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、Ａβペプチド、またはＮ末端アミノ酸から始まる少なくとも６アミノ酸の配列を含むその断片である、請求項１２の組成物。
【請求項３８】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、アンギオテンシンＩまたはアンギオテンシンＩＩである、請求項１２の組成物。
【請求項３９】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つがグレリンである、請求項１２の組成物。
【請求項４０】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、ＴＮＦα、またはＴＮＦαの第４のＮ末端アミノ酸から始まる少なくとも２０アミノ酸の配列を含むその断片である、請求項１２の組成物。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチドナノ粒子または請求項１２〜３９のいずれか記載の組成物の有効量を、このようなワクチン接種を必要とする被験体に投与することを含む、ヒトまたはヒトではない動物にワクチン接種する方法。
【請求項４２】
ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、およびペプチドオリゴマー化ドメインＤ２を含む連続鎖からなる式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２          （Ｉ）
（式中、
Ｄ１が、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成する傾向を有するペプチドであり、Ｄ２が、ｎ個のサブユニットＤ２のオリゴマー（Ｄ２）ｎを形成する傾向を有するペプチドであり、ｍおよびｎが各々２〜１０の数字であり、ただし、ｍはｎに等しくはなくそしてｎの倍数ではなく、そしてｎはｍの倍数ではなく、Ｌが結合または短いリンカーセグメントであり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方が、オリゴマー化ドメイン内に１つ以上のＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込むコイルドコイルであり、そしてＤ１、Ｄ２およびＬは場合によりさらに置換されている）
で示される単量体の構築ブロック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープを取り込んでいる自己会合ペプチドナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ワクチン接種のためのこのようなナノ粒子の使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
適応免疫系は、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の２つの異なる応答を有する。最初のものは、これらの抗体が病原体の表面エピトープに結合するという抗体応答によって特徴づけられ、一方で後者は、すでに感染した細胞を殺滅する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）によって特徴づけられる。どちらの免疫応答も、特異的な病原体結合抗体を産生するＢ細胞、または感染細胞に対して指向されるＴ細胞のいずれかを活性化するヘルパーＴ細胞によってさらに刺激される。
【０００３】
Ｂ細胞によって産生される抗体と病原体の間の相互作用の特異性は、病原体の表面構造、いわゆるＢ細胞エピトープによって決定され、一方、感染した標的細胞とＣＴＬの相互作用の特異性は、標的細胞の表面分子上に提示されるＴ細胞エピトープ、いわゆる主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）による。このタイプのＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープ）は、感染細胞によって産生される病原体由来のタンパク質の断片である。最後に、ヘルパーＴ細胞とそれぞれＢ細胞またはＣＴＬとの相互作用の特異性は、ヘルパーＴ細胞のレセプター分子の、Ｂ細胞またはＣＴＬ細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子（ＭＨＣＩＩ）によって提示される他のタイプのＴ細胞エピトープ（ＨＴＬエピトープ）への結合によって決定される。
【０００４】
Ｂ細胞エピトープへの抗体の結合は、Ｂ細胞エピトープが特定の３次元構造をとることを必要とし、この３次元構造は、Ｂ細胞エピトープがその天然環境において有するのと同じ構造、すなわちそれが病原体の表面上にある場合と同じ構造である。Ｂ細胞エピトープは、１より多いペプチド鎖からなっていてもよく、そしてタンパク質の骨格によって３次元構造において組織化されている。
【０００５】
しかしながら、Ｔ細胞エピトープは特定の３次元構造を必要とせず、むしろそれらは、非常に特異的な様式でそれぞれのＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ分子によって結合される。ＣＴＬエピトープは、ＭＨＣＩ分子によって最適に提示されるために９アミノ酸長のサイズに整えられているが、一方、ＨＴＬエピトープは、ＭＨＣＩＩ分子と類似した相互作用を起こすが、ちょうど９アミノ酸よりは長くてもよい。本発明の脈絡において重要なのは、ＭＨＣ分子へのエピトープの結合は非常に特有の法則に従い、すなわち、特定の特徴を有するペプチドのみがそれぞれのＭＨＣ分子に結合でき、従ってエピトープとして有用であることである。これらの特徴は綿密に調査され、公知の豊富なエピトープから、ＭＨＣ分子に結合できるエピトープを高い精度で予測できる予測プログラムが開発された。直鎖状ペプチド鎖中のいくつかのこのようなＴ細胞エピトープからなるペプチド連結鎖は、現在、ワクチン候補として工学設計されている。
【０００６】
一般に、効果的なワクチンは、強い体液性免疫応答並びに強い細胞性免疫応答を誘起すべきである。Ｂ細胞エピトープの反復抗原提示によって、強い体液性免疫応答を達成できることが示された。ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を効果的なツールとして使用することにより、規則的に反復的に強固にＢ細胞エピトープを提示することができ、従って、ＶＬＰは、現在、ワクチン設計のために広く使用されている。反復抗原提示のための別のアプローチが、特許ＥＰ１５９４４６９Ｂ１に記載されている。この特許において、その表面上にＢ細胞エピトープを反復提示する三量体および五量体タンパク質オリゴマー化ドメインからなる自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）が工学設計されている。Ｂ細胞が、複数のコピーでナノ粒子の表面に提示されることを保証するために、Ｂ細胞エピトープを、オリゴマー化ドメインの末端に付着させた。最も頻繁に遭遇するタンパク質オリゴマー化モチーフの１つはコイルドコイル構造モチーフであり、このモチーフをこれらのＳＡＰＮの設計に効果的に使用することができる。
【０００７】
発明の要約
本発明は、Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込んでいる自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）に関する。特に、本発明のナノ粒子は、リンカーセグメントによって接続された２つのオリゴマー化ドメインを含む連続ペプチド鎖の集合体からなり、ここで、一方または両方のオリゴマー化ドメインが、そのペプチド配列内にＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込むコイルドコイルである。本発明はさらに、Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込んでいるこのような自己会合ペプチドナノ粒子を使用して、ヒトまたはヒトではない動物をワクチン接種する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｉ−ＡｄのためのＨＴＬエピトープであるオボアルブミンペプチド（ＯＶＡ３２３−３３９）に共有結合したマウスＭＨＣＩＩ分子Ｉ−Ａｄの構造。ＭＨＣＩＩタンパク質は、上から灰色のα炭素トレースで示されている。エピトープ結合部位の壁を形成している２つのヘリックスが、結合ペプチドにフランキングしている。ペプチドは、黒の全原子球棒モデルで示されている。その結合形態のペプチドＨＴＬエピトープは、図の下にあるペプチドのみの構造によってより明瞭に分かるように、伸長したコンフォメーションである。
【図２】それぞれ、三量体および五量体オリゴマー化ドメイン［左側、Ａ）］並びに三量体および四量体オリゴマー化ドメイン［右側、Ｂ）］のための「均一ユニット（even unit）」の図面。単量体（構築ブロック）の数は、構築ブロックの２つのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２のオリゴマー化状態の最小公倍数（ＬＣＭ）によって定められる。均一ユニットにおいて、全ての構築ブロックのリンカーセグメントは、互いにできるだけ近接して、すなわち、ペプチドナノ粒子の中心にできる限り近接してアレンジされ、従って、均一ユニットは、球状ナノ粒子へと自己会合するであろう。
【図３】十二面体／二十面体の内部対称要素。回転対照軸（２回、３回、および５回）は、２、３、および５のマークを付けられた線として表示される。Ａ）では、オリゴマー化ドメインＤ１（左、３回対称を有するコイルドコイルドメイン）、リンカーセグメントＬ（下部）、およびオリゴマー化ドメインＤ２（右；５回対称を有するコイルドコイルドメイン）からなる単量体構築ブロックが、オリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の内部対称要素が多面体の対称要素上に重ねられるように表示される。Ｂ）では、完全なコイルドコイルドメインＤ１およびＤ２が表示される。多面体の３回および５回回転対称要素により発生された追加の対称物体は、シリンダーとして示されているが、元来の分子は、Ａ）におけると同じくヘリックスとして表示される。
【図４】実施例１の配列番号８の配列を有するペプチドから形成された自己会合ペプチドナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ、Ａ）および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ、Ｂ）。ＤＬＳ分析は、平均粒子直径３２.０１nmおよび多分散指数１２.９％を有するサイズ分布を示す（Ａ）。ＴＥＭ写真（Ｂ）は、ＤＬＳによって決定されたのと同じサイズのナノ粒子を示す。
【図５】実施例２の配列番号１０の配列を有するペプチドから形成された自己会合ペプチドナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。ＴＥＭ写真は、約２５nmの同サイズのナノ粒子を示す。
【図６】実施例３の配列番号１２の配列を有するペプチドから形成された自己会合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。ＴＥＭ写真は、約２０〜３０nmのサイズのナノ粒子を示す。
【図７】それぞれヒトおよびニワトリのインフルエンザワクチンのための、配列番号３７の配列（パネルＡ）および配列番号３８の配列（パネルＢ）を有するペプチドから形成された自己会合ペプチドナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）（実施例９）。ＴＥＭ写真は、約２５nmのサイズのナノ粒子を示す。
【図８】実施例１１の配列番号４１の配列を有するペプチドから形成された自己会合ペプチドナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。ＴＥＭ写真は、約２５nmのサイズのナノ粒子を示す。
【０００９】
発明の詳細な説明
単量体構築ブロック
自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１、リンカーセグメントＬ、およびペプチドオリゴマー化ドメインＤ２を含む連続鎖からなる式（Ｉ）
Ｄ１−Ｌ−Ｄ２          （Ｉ）
（式中、
Ｄ１が、ｍ個のサブユニットＤ１のオリゴマー（Ｄ１）ｍを形成する傾向を有する合成または天然ペプチドであり、Ｄ２が、ｎ個のサブユニットＤ２のオリゴマー（Ｄ２）ｎを形成する傾向を有する合成または天然ペプチドであり、ｍおよびｎが各々２〜１０の数字であり、ただし、ｍはｎに等しくはなくそしてｎの倍数ではなく、そしてｎはｍの倍数ではなく、Ｌが、場合により置換された炭素原子、場合により置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、およびその組合せから選択された結合または短いリンカー鎖であり、Ｄ１もしくはＤ２のいずれかまたはＤ１およびＤ２の両方が、オリゴマー化ドメイン内に１つ以上のＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを取り込むコイルドコイルであり、そしてＤ１、Ｄ２およびＬは場合によりさらに置換されている）
の多数の単量体構築ブロックから形成される。
【００１０】
ペプチド（またはポリペプチド）は、アミド結合によって共有結合されたアミノ酸の鎖または配列である。ペプチドは、天然、修飾された天然、部分合成、または完全合成であり得る。修飾された天然、部分合成、または完全合成は、天然に存在しないことを意味すると理解される。アミノ酸という用語は、２０の必須の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、例えばα−Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステイン等、並びに電荷のようなある種の特性を変えるために何らかの方法で修飾された天然に存在するアミノ酸、例えば、ホスホセリンまたはホスホチロシン等の両方を包含する。アミノ酸の誘導体においては、アミド結合を形成するアミノ基はアルキル化されているか、あるいは側鎖アミノ、ヒドロキシまたはチオ官能基はアルキル化またはアシル化されており、あるいは側鎖カルボキシ官能基はアミド化またはエステル化されている。
【００１１】
短いリンカー鎖Ｌは、鎖中に好ましくは１〜６０個の原子、特に１〜２０個の原子を有する、場合により置換されている炭素原子、場合により置換されている窒素原子、酸素原子、硫黄原子、およびその組合せから選択される。このような短いリンカー鎖は、例えば、ポリエチレンオキシ鎖、糖鎖、または好ましくはペプチド鎖、例えば１〜２０個のアミノ酸、特に１〜６個のアミノ酸からなるペプチド鎖である。
【００１２】
ｍおよびｎは各々２〜１０の数字であり、ただし、ｍはｎに等しくはなくそしてｎの倍数ではなく、そしてｎはｍの倍数ではない。ｎおよびｍの好ましい組合せは、ｍが２でありｎが５であるか、またはｍが３でありｎが４もしくは５であるか、またはｍが４でありｎが５である組合せである。同様にｎおよびｍの好ましい組合せは、ｍが５でありｎが２であるか、またはｍが４もしくは５でありｎが３であるか、またはｍが５でありｎが４である組合せである。最も好ましいのはｍまたはｎが５である組合せである。
【００１３】
コイルドコイルは、３および４残基の間隔を置いて配置された主に疎水性残基の連続パターンを有するペプチド配列であり、これは、本明細書で以下においてより詳細に説明するように、会合されてヘリックスの多量体束（multimeric bundle）を形成する。
【００１４】
「Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープを取り込むコイルドコイル」とは、エピトープのＮ末端およびＣ末端におけるアミノ酸配列が、エピトープ含有オリゴマー化ドメインのオリゴマー化特性に従って依然としてコイルドコイルであるコンフォメーションにエピトープを順応させるように、対応するエピトープがオリゴマー化ドメイン内に含まれることを意味する。特に「取り込む」は、エピトープがコイルドコイルオリゴマー化ドメインのいずれかの末端で付着する場合を除く。
【００１５】
この文書の脈絡において、Ｔ細胞エピトープという用語は、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープの両方を言及するために使用される。
【００１６】
Ｔ細胞エピトープは、伸長したコンフォメーションでＭＨＣ分子に結合する（図１）。それ故、Ｔ細胞エピトープをα−ヘリックスコイルドコイルに取り込むことは（図３Ａと図１を比較）タンパク質工学の取るに足りない課題ではない。本発明において、それぞれのＭＨＣ分子に結合した場合に伸長したコンフォメーションを有するこれらのペプチド配列をどのように、α−ヘリックスコイルドコイルオリゴマー化ドメインに取り込むことができるかが実証される。
【００１７】
Ｄ１、Ｄ２およびＬの場合による置換基は、例えば、Ｂ細胞エピトープ、標的化実体、またはナノ粒子のアジュバント特性を補強する置換基、例えば免疫刺激性核酸、好ましくはデオキシイノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、またはイノシンおよびシチジンを含む核酸分子である。ナノ粒子のアジュバント特性を補強する他の置換基は、抗微生物ペプチド、例えば、適応免疫応答を促進および／または向上することができる免疫刺激性の正に帯電した分子に属するクラスである、カチオン性ペプチドである。免疫強化特性を有するこのようなペプチドの一例は、プライムブースト免疫化の後に強力なタンパク質特異的な２型駆動適合免疫を誘導する、正に帯電した人工抗微生物ペプチドＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号６３）である。置換基として考えられる特定の標的化実体は、ＥＲ標的化シグナル、すなわち、小胞体（ＥＲ）へのタンパク質またはペプチドの輸送を誘導するシグナルペプチドである。他の場合による置換基は、例えば、カルボキシアミド官能基を与えるような、遊離アミノ基に、特にＮ末端アミノ酸に結合した、アシル基、例えばアセチル、またはＣ末端アミノ酸の遊離カルボキシ基に結合したアミノである。
【００１８】
場合による置換基、例えば本明細書で前記したそのような場合による置換基は、オリゴマー化ドメインＤ１および／またはＤ２の遊離末端に近接した適切なアミノ酸に好ましくは接続されている。その後、ペプチドナノ粒子の自己会合時に、このような置換基はＳＡＰＮの表面に提示されるだろう。
【００１９】
最も好ましい態様において、置換基は、Ｓ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２、Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２、またはＳ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２のいずれかの形態の合体した単一ペプチド配列を生じるような、一方の末端または両末端におけるペプチド鎖Ｄ１−Ｌ−Ｄ２の単純な伸長を示す、別のペプチド配列Ｓ１および／またはＳ２であり、ここで、Ｓ１およびＳ２は、本明細書で以前および以後に定義するようなペプチド置換基である。置換基Ｓ１および／またはＳ２は、ＳＡＰＮのコア配列Ｄ１−Ｌ−Ｄ２を伸長すると言われる。任意のこのようなペプチド配列Ｓ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２、Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２、またはＳ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２は、１つの単一分子として組換えタンパク質発現系において発現され得る。
【００２０】
好ましい置換基Ｓ１および／またはＳ２はＢ細胞エピトープである。考えられる他のＢ細胞エピトープは、同様にオリゴマー化ドメインＤ１および／またはＤ２の末端に付着するハプテン分子、例えば炭水化物またはニコチンであり、従って、ＳＡＰＮの表面に提示されるだろう。
【００２１】
明らかに、１より多い置換基をオリゴマー化ドメインＤ１および／またはＤ２に付着させることも可能である。例えば、ペプチド配列Ｓ１−Ｄ１−Ｌ−Ｄ２−Ｓ２を考えると、別の置換基を、それに、好ましくはリンカーセグメントＬとは離れた位置に、Ｄ１および／またはＤ２の末端の近くに、あるいは置換基Ｓ１および／またはＳ２の中のいずれかの場所に共有結合的に付着させ得る。
【００２２】
また、置換基をリンカーセグメントＬに付着することも可能である。このような場合、ＳＡＰＮの再折り畳み時に、置換基は、ＳＡＰＮの内部キャビティー（cavity）に位置するだろう。
【００２３】
オリゴマーを形成する傾向とは、このようなペプチドが条件に依存してオリゴマーを形成することができること、例えば、変性条件下ではそれらは単量体であるが、生理的条件下ではそれらは例えば三量体を形成することができることを意味する。所定の条件下では、それらはナノ粒子形成に必要な１つの単一オリゴマー化状態をとる。しかしながら、そのオリゴマー化状態は、条件が変化すると変化することができ、例えば塩濃度を増加させると二量体から三量体に変わることができ（Burkhard P. et al., Protein Science 2000, 9:2294-2301)、またはｐＨを低下させると五量体から単量体へと変わることができることを意味する。
【００２４】
式（Ｉ）に従う構築ブロック構造は、明らかにウイルスカプシドタンパク質とは異なる。ウイルスカプシドは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス粒子（ＥＰ１２６２５５５、ＥＰ０２０１４１６）のように６０またはその倍数のオリゴマーを形成する１つの単一タンパク質からなるか、または共会合されてウイルスカプシド構造（該ウイルスカプシド構造はウイルスのタイプに依存して二十面体とは別の他の形状をとることもできる（Fender P. et al., Nature Biotechnology 1997, 15:52-56））を形成する１つより多くのタンパク質のいずれかからなる。本発明の自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）はまた、ウイルス様粒子とは明らかに異なる。なぜなら、それらは（ａ）ウイルスカプシドタンパク質以外のものから構成されており、そして（ｂ）ナノ粒子の真中のキャビティーは、全ウイルスゲノムのＤＮＡ／ＲＮＡを受け入れるにはあまりにも小さすぎるからである。
【００２５】
ペプチドオリゴマー化ドメインは周知されている（Burkhard P. et al, Trends Cell Biok 2001, 11:82-88）。最も簡単なオリゴマー化ドメインは、多分コイルドコイル折り畳みモチーフ（coiled-coil folding motif）である。このオリゴマー化モチーフは、二量体、三量体、四量体および五量体として存在することが示された。いくつかの例は、ＧＣＮ４ロイシンジッパー、フィブリチン（fibritin）、テトラブラチオン（tetrabrachion）およびＣＯＭＰであり、これはそれぞれ二量体、三量体、四量体および五量体コイルドコイルを示す。
【００２６】
オリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２の一方または両方は、互いに独立に、コイルドコイルドメインである。コイルドコイルは、会合（折り畳み）されてヘリックスの多量体束を形成する、通常７個のアミノ酸（ヘプタッド反復）または１１個のアミノ酸（ウンデカッド反復）の配列において３および４残基の間隔を置いて配置された主として疎水性の残基の連続パターンを有するペプチド配列である。３および４残基の間隔のいくつかの不規則な分布を含む配列を有するコイルドコイルも包含される。疎水性残基は、特に、疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐである。主として疎水性とは、残基の少なくとも５０％が、記載の疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【００２７】
例えば、式（Ｉ）の好ましい単量体構築ブロックにおいて、Ｄ１および／またはＤ２は、式
【表１】
2011511773.tif 000002
（式中、ａａはアミノ酸またはその誘導体を意味し、ａａ（ａ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、ａａ（ｄ）、ａａ（ｅ）、ａａ（ｆ）およびａａ（ｇ）は、同じもしくは異なるアミノ酸またはその誘導体であり、好ましくはａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は同じもしくは異なる疎水性アミノ酸またはその誘導体であり；そしてＸは２〜２０、好ましくは３、４、５または６の数字である）
のいずれかのペプチドである。
【００２８】
疎水性アミノ酸は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐである。
【００２９】
ヘプタッドは、式ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）〜（ＩＩｇ）のその並べ替え体のいずれかで示されるヘプタペプチドである。
【００３０】
好ましいのは、ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２の１つまたは両方が、
（１）Ｘが３であり、そしてａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が、これらの６つのアミノ酸について表１からのスコアの和が少なくとも１４であるように２０の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは１７個までのさらなるヘプタッドを含む）、あるいは
（２）Ｘが３であり、そしてａａ（ａ）およびａａ（ｄ）がこれらの６つのアミノ酸について表１からのスコアの和が少なくとも１２であるように２０の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択され、ただし、１つのアミノ酸ａａ（ａ）は隣接ヘプタッドのアミノ酸ａａ（ｄ）もしくはａａ（ｇ）へのヘリックス間塩橋を形成することができる帯電アミノ酸であるか、または、１つのアミノ酸ａａ（ｄ）は隣接ヘプタッドのアミノ酸ａａ（ａ）もしくはａａ（ｅ）へのヘリックス間塩橋を形成することができる帯電アミノ酸であるものとする、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは２個までのさらなるヘプタッドを含む）
である式（Ｉ）の単量体構築ブロックである。隣接ヘプタッドのアミノ酸へのヘリックス間塩橋を形成することができる帯電アミノ酸は、例えば、もし他のアミノ酸がＬｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓであるならば、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり、またはその逆も成り立つ。
【表２】
2011511773.tif 000003
【００３１】
ペプチドオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２の１つまたは両方が、下記の好ましいペプチド：
（１１）ａａ（ａ）がＶａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔおよびその誘導体から選択され、そしてａａ（ｄ）がＬｅｕ、ＭｅｔおよびＩｌｅおよびその誘導体から選択される式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド、
（１２）１つのａａ（ａ）がＡｓｎであり、そして他方のａａ（ａ）がＡｓｎ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択され、そしてａａ（ｄ）がＬｅｕである式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、通常、二量体化ドメインである（ｍまたはｎ＝２））、
（１３）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が両方ともＬｅｕであるかまたは両方ともＩｌｅである式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、通常、三量体化ドメインである（ｍまたはｎ＝３））、
（１４）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が両方ともＴｒｐである式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、通常、五量体化ドメインである（ｍまたはｎ＝５））、
（１５）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が両方ともＰｈｅである式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、通常、五量体化または四量体化ドメインである（ｍまたはｎ＝４または５））、
（１６）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が両方ともＴｒｐまたはＰｈｅのいずれかである式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、通常、五量体化ドメインである（ｍまたはｎ＝５））、
（１７）ａａ（ａ）がＬｅｕもしくはＩｌｅのいずれかであり、そして１つのａａ（ｄ）がＧｌｎであり、他方のａａ（ｄ）がＧｌｎ、ＬｅｕおよびＭｅｔから選択される式（ＩＩａ）〜（ＩＩｇ）のいずれかのペプチド（このようなペプチドは、五量体化ドメインである潜在力を有する（ｍまたはｎ＝５））
から選択される、式（Ｉ）で示される単量体構築ブロックも好ましい。
【００３２】
他の好ましいペプチドは、本明細書で以前に定義したようなペプチド（１）、（２）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）および（１７）であって、さらに
（２１）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＡｓｐおよびＧｌｕから選択され、そして次のヘプタッドにおけるａａ（ｅ）がＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり；および／または
（２２）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択され、そして次のヘプタッドにおけるａａ（ｅ）がＡｓｐまたはＧｌｕであり；および／または
（２３）少なくとも１つのａａ（ａ〜ｇ）がＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択され、そして配列において３もしくは４アミノ酸離れているａａ（ａ〜ｇ）がＡｓｐまたはＧｌｕである。このようなアミノ酸ａａ（ａ〜ｇ）の対は、例えば、ａａ（ｂ）およびａａ（ｅ）またはａａ（ｆ）である。
【００３３】
ＣＯＩＬＳ（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber M. et al., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5）またはＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi）のようなコイルドコイル予測プログラムは、コイルドコイル形成ペプチド配列を予測できる。それ故、式（Ｉ）の好ましい単量体構築ブロックにおいて、Ｄ１および／またはＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸について０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される、２つのヘプタッド反復長の少なくとも１つの配列を含むペプチドである。
【００３４】
式（Ｉ）のより好ましい単量体構築ブロックにおいて、Ｄ１および／またはＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸について０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される、３つのヘプタッド反復長の少なくとも１つの配列を含むペプチドである。
【００３５】
式（Ｉ）の別のより好ましい単量体構築ブロックにおいて、Ｄ１および／またはＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸について０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される、２つのヘプタッド反復長の少なくとも２つの別々の配列を含むペプチドである。
【００３６】
別の好ましい態様において、１つのオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２は、ＣＯＭＰ（Malashkevich V.N. et al., Science 1996, 274:761-765）の五量体化ドメイン（ｍまたはｎ＝５）またはその誘導体である。この五量体化ドメインは、配列（LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG）（配列番号１）を有する。このドメインの小さな修飾も意図される。このような修飾は、隣接ドメイン間のジスルフィド橋の形成のための、例えば、五量体の外側でのａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）またはａａ（ｆ）の位置、好ましくはａａ（ｆ）の位置におけるアミノ酸をＣｙｓによって置換することであり得る。このドメインの表面アミノ酸の他の修飾は、隣接オリゴマー化ドメイン間の界面における相互作用、例えば疎水性、親水性もしくはイオン性相互作用またはジスルフィド橋のような共有結合を最適化するための、アミノ酸の置換を含むことができる。例えばＣ末端ＣＤＡＣＧモチーフ（システインがこの五量体化ドメインのＣ末端において分子間ジスルフィド橋を形成している）を欠失している、このドメインのより短い構築物も意図される。このドメインのオリゴマー化状態に影響を及ぼすアミノ酸の修飾、例えば五量体から四量体への移行をもたらす修飾も意図される。このドメインの表面アミノ酸のさらに他の修飾は、官能基の付着部位を発生させるための、アミノ酸の置換（例えばシステインまたはリジンによって）も含むことができる。
【００３７】
別の好ましい態様において、１つのオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２は、トリプトファンジッパー（Liu J et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(46):16156-61）の五量体化ドメイン（ｍまたはｎ＝５）またはその誘導体である。この五量体化ドメインは、配列（SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT）（配列番号２）を有する。このドメインの小さな修飾も意図される。このような修飾は、隣接するドメイン間のジスルフィド橋の形成のための、例えば、五量体の外側でのａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）またはａａ（ｆ）の位置、好ましくはａａ（ｆ）の位置におけるアミノ酸をＣｙｓによって置換することであり得る。このドメインの表面アミノ酸の他の修飾は、隣接オリゴマー化ドメイン間の界面における相互作用、例えば疎水性、親水性もしくはイオン性相互作用またはジスルフィド橋のような共有結合を最適化するためのアミノ酸の置換を含むことができる。このドメインのより短い構築物も意図される。このドメインのオリゴマー化状態に影響を及ぼすアミノ酸の修飾、例えば、コア残基ＴｒｐをＰｈｅによって交換する五量体化ドメインから四量体化ドメインへの移行をもたらす修飾も意図される。実施例１０のような他のコア残基突然変異も考えられるが、コア位置ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）の少なくとも７０％がＴｒｐまたは別の芳香族アミノ酸のいずれかでなければならない。このドメインの表面アミノ酸のさらに他の修飾は、官能基の付着部位を発生させるためのアミノ酸の置換（例えばシステインまたはリジンによって）を含むことができる。
【００３８】
別の好ましい態様において、１つのオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２は、テトラブラチオン（Stetefeld J. et al., Nature Structural Biology, 2000; 7(9):772-776）のコイルドコイルドメインの四量体ドメイン（ｍまたはｎ＝４）またはその誘導体である。この四量体化ドメインは、配列（IINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG）（配列番号６４）を有する。コイルドコイルの配列は、３,４−疎水性残基反復を有する７残基のヘプタッド反復によって特徴づけられる。残基が少数のターンの後に準等価な位置をとることができる次の周期は、３回ターンまたは１１残基である。１１残基反復の存在に基づいて、超好熱性古細菌Staphylothermus marinus由来の表層糖タンパク質テトラブラチオンのＣ末端は、右巻きコイルドコイル構造を形成する。それは、そのＣ末端において細胞膜にアンカリング（anchor）する７０nm長の四量体α−ヘリックスコイルドコイルストーク（stalk）を形成する。この四量体コイルドコイルは、一連のＨＴＬエピトープを含み（実施例９）、従って、自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）のコアオリゴマーとして理想的に適している。
【００３９】
さらに別の好ましい態様において、１つのオリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２は、バクテリオファージＴ４タンパク質フィブリチン（Tao, Y. et al., Structure 1997, 5:789-798）の三量体化ドメイン（フォルドン）またはその誘導体である。この三量体化ドメイン（ｍまたはｎ＝３）は、配列（GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）（配列番号３）を有する。このドメインの小さな修飾も意図される。このような修飾は、隣接ドメイン間のジスルフィド橋の形成のための、ＣｙｓによるＡｓｐ９の置換であり得る。このドメインの表面アミノ酸の他の修飾は、隣接オリゴマー化ドメイン間の界面における相互作用、例えば疎水性、親水性もしくはイオン性相互作用またはジスルフィド橋のような共有結合を最適化するための、残基の置換を含むことができる。このドメインの表面アミノ酸のさらに他の修飾は、官能基の付着部位を発生させるためのアミノ酸の置換（例えばシステインまたはリジンによって）を含むことができる。
【００４０】
最も好ましいのは、実施例に記載のコイルドコイル配列および単量体構築ブロックである。
【００４１】
自己会合ペプチドナノ粒子：均一ユニット
自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、式（Ｉ）の単量体構築ブロックから形成される。このような構築ブロックが会合すれば、それらはいわゆる「均一ユニット」を形成するだろう。このような均一なユニットへと会合する単量体構築ブロックの数は、最小公倍数（ＬＣＭ）によって定められるだろう。従って、例えば単量体構築ブロックのオリゴマー化ドメインが三量体（Ｄ１）３（ｍ＝３）および五量体（Ｄ２）５（ｎ＝５）を形成する場合、１５の単量体が均一ユニットを形成するだろう（図２Ａ）。リンカーセグメントＬが適切な長さを有している場合、この均一ユニットは、球状ペプチドナノ粒子の形態で会合し得る。同様に、単量体構築ブロックのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２が三量体（Ｄ１）３（ｍ＝３）および四量体（Ｄ２）４（ｎ＝４）を形成する場合、均一ユニットを形成するのに必要とされる単量体の数は、１２であろう（図２Ｂ）。
【００４２】
ｍおよびｎは等しくはあり得ず、または互いの倍数ではあり得ないので、最小公倍数（ＬＣＭ）は、ｍおよびｎよりも常に大きい。
【００４３】
自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、唯１つまたは１より多い均一ユニットの会合によって形成され得る（表２）。このようなＳＡＰＮは、トポロジー的に閉じた構造を示す。
【表３】
2011511773.tif 000004
【００４４】
正多面体
５つの正多面体、四面体、立方体、八面体、十二面体、および二十面体が存在する。それらは種々の内部回転対称要素を有する。四面体は２回軸および２つの３回軸を有し、立方体および八面体は２回、３回および４回回転対称軸を有し、そして十二面体および二十面体は２回、３回および５回回転対称軸を有する。立方体においては、これらの軸の空間方位は、八面体と正確に同じであり、そして十二面体および二十面体においても、お互いに対するこれらの軸の空間方位は、正確に同じである。従って、本発明のＳＡＰＮの目的には、立方体および八面体、そして同様に十二面体および二十面体は同一であると考えることができる。立方体／八面体は、２４個の同じ３次元構築ブロックから構築されるが、十二面体／二十面体は、６０個の同じ３次元構築ブロックから構築される（表２）。これらの構築ブロックは、多面体の非対称ユニット（asymmetric units）（ＡＵｓ）である。それらは、トリピラミッド（tri-pyramids）であり、そしてピラミッド稜の各々は回転対称軸の１つに相当し、故にこれらのＡＵｓは、多面体のタイプに依存してそれらの稜に２回、３回および４回または５回対称要素を有するであろう。これらの対称要素をペプチドオリゴマー化ドメインから発生させるならば、このようなＡＵｓは前記した単量体構築ブロックから構成される。それは、２つのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２をＡＵの対称軸の２つに沿ってアラインメントさせるのに十分である（図３）。これらの２つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成するならば、第３対称軸に沿った対称界面が自動的に発生させられ、そしてそれは、この界面に沿った相互作用、例えば、疎水性、親水性もしくはイオン性相互作用またはジスルフィド橋のような共有結合を最適化することによって安定化され得る。
【００４５】
正多面体対称を有する自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）の会合
均一な形状（regular geometry）（十二面体、立方体）を有する自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）を作製するために、１つより多くの均一ユニットが必要である。例えば、三量体および五量体オリゴマー化ドメインを含む単量体から十二面体を形成するために、各々１５個の単量体構築ブロックからなる４個の均一ユニットが必要であり、すなわち、均一な形状を有するペプチドナノ粒子は、６０個の単量体構築ブロックからなるであろう。必要な２つのオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態と、正多面体のいずれをも形成するための均一ユニットの数との組合せは、表２に列挙されている。
【００４６】
均一ユニットがさらに会合して１つより多くの均一ユニットからなる正多面体を形成するかどうかは、２つのオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２のお互いに対する幾何学的アラインメント、特に２つのオリゴマー化ドメインの回転対称軸間の角度に依存する。これは、ｉ）ナノ粒子における隣接ドメイン間の界面における相互作用、ii）リンカーセグメントＬの長さ、iii）個々のオリゴマー化ドメインの形状によって支配される。この角度は、正多面体におけるアレンジメントに比べて均一ユニットにおいてより大きい。またこの角度も正多面体とは反対に単量体構築ブロックにおいて同一ではない。もしこの角度が正多面体のより小さな値に制限され（疎水性、親水性もしくはイオン性相互作用または共有結合ジスルフィド橋によって）そしてリンカーセグメントＬが十分に短いならば、各々規定された数の単量体構築ブロックを含む与えられた数のトポロジー的に閉じた均一ユニットがさらにアニールして正多面体を形成するか（表２）、またはより多くの単量体構築ブロックを囲って多面体の厳密な内部対称を欠いているナノ粒子を形成するであろう。
【００４７】
２つのオリゴマー化ドメイン間の角度が十分に小さいならば（二十面体対称を有する正多面体におけるよりもさらに小さいならば）、多数（数百）のペプチド鎖がペプチドナノ粒子へと会合することができる。これは、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006, 2:95-102の最初の設計にあるような、２つのヘリックス間の界面に位置し、そして２つのヘリックス間でジスルフィド橋を形成している２つのシステイン残基を、配列番号３３の配列にあるような小さな残基であるアラニンによって置換することによって達成することができる。２つのヘリックス間の角度はより小さくなることができ、そして結果として、６０を超えるペプチド鎖がＳＡＰＮへと会合することができる。このような設計において、ＳＡＰＮは、約３３０ペプチド鎖に相当する約４ＭＤの分子量を有する（実施例６）。
【００４８】
Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープ
Ｔ細胞エピトープは、Ｂ細胞エピトープとは反対に、免疫化を引き起こすために担体の表面に提示される必要はないので、それらをＳＡＰＮのコア骨格へと、すなわち、オリゴマー化ドメインのコイルドコイル配列へと取り込むことができる。本発明において、ＭＨＣへの結合に対して伸長したコンフォメーションを必要とするＴ細胞エピトープのＭＨＣへの結合の特徴と（図１）、コイルドコイルコンフォメーションのためのα−ヘリックス構造を必要とするコイルドコイル形成の特徴とをどのように合わせて、これらのエピトープが、ＳＡＰＮのコイルドコイル骨格の一部となり得、かつ、それぞれのＭＨＣ分子に結合できるようにするかが示されている。全てのコイルドコイル配列がＭＨＣ分子に結合できるわけではなく、全てのＴ細胞エピトープをコイルドコイル構造に取り込むことができるわけではないことを注記すべきである。本発明は、適切なＴ細胞エピトープをどのように選択するかの一般的な原則を提供し、これらのペプチドがＳＡＰＮを形成するように特定のコイルドコイルオリゴマー化ドメインに前記Ｔ細胞エピトープをどのように取り込むかを記載する。これらの原則を使用することにより、多種多様なＴ細胞エピトープを、ＳＡＰＮのコイルドコイル骨格に取り込むことができる。
【００４９】
本発明のさらなる局面において、コイルドコイルではないＢ細胞エピトープを、コイルドコイルセグメントの２本の伸長鎖の間に挿入することによって、ＳＡＰＮオリゴマー化ドメインのコイルドコイル配列に取り込み、これにより、この全配列が、単一のオリゴマー化ドメインとして作用する。これは、コイルドコイル骨格が、Ｂ細胞エピトープのコンフォメーションをその天然コンフォメーションとほぼ同一なコンフォメーションに制限する手段を提供できるため特に関心が高い。
【００５０】
Ｔ細胞エピトープの供給源
Ｔ細胞エピトープをオリゴマー化ドメイン（最終的には自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）となる）に取り込むために、Ｔ細胞エピトープを、様々な供給源から選択することができる：例えば、Ｔ細胞エピトープは実験的な方法によって決定できるか、それらは文献から公知であるか、それらは特定の病原体の既存のタンパク質配列に基づいた予測アルゴリズムによって予測できるか、あるいは、新規に設計されたペプチドまたはその組合せであり得る。
【００５１】
科学的文献において入手可能である様々な公知のＴ細胞エピトープがある。これらのＴ細胞エピトープは、特定の病原体から（例えば実施例１２、１３および１４のような）、癌特異的ペプチド配列から（例えば実施例１４のような）選択することができるか、または、それらは特定の特徴を有する新規に設計されたペプチド、例えば、多くの異なるＭＨＣＩＩ分子に結合する（このことから、乱雑なＴ細胞エピトープとされている（例えば実施例１のような））ＰＡＤＲＥペプチド（US Patent 5,736,142）であり得る。数千の異なるＴ細胞エピトープを含む一般にアクセス可能なデータベース、例えば、ＭＨＣデータベース「MHCBN VERSION 4.0」（http://www. imtech.res.in/raghava/mhcbn/index.html）またはＰＤＢデータベース「Protein Data Bank」（http://www.rcsb.org/pdb）等が存在する。
【００５２】
ＨＴＬエピトープを他の免疫原性ではないペプチド配列に取り込むこと、またはそれをペプチド性ではない抗原に付着させることは、それらをはるかにより免疫原性とし得ることが周知であり十分に文書化されている。ＰａｎＤＲ結合ペプチドＨＴＬエピトープＰＡＤＲＥは、マラリア、アルツハイマーおよび多くの他のワクチンのためのワクチン設計において広く使用されている。
【００５３】
ＭＨＣＢＮデータベース（前記）の定義によれば、Ｔ細胞エピトープは、対応するＭＨＣ分子に対して５０,０００nM未満の結合親和性（ＩＣ５０値）を有するペプチドである。このようなペプチドは、ＭＨＣ結合物質と考えられる。この定義によれば、２００６年８月現在、ＭＨＣＢＮデータベースのバージョン４.０において、以下のデータが入手可能である：２０７１７個のＭＨＣ結合物質および４０２２個のＭＨＣ非結合物質。
【００５４】
適切なＴ細胞エピトープを、予測アルゴリズムを使用することによっても得ることができる。これらの予測アルゴリズムは、推定Ｔ細胞エピトープについて病原体由来の既存のタンパク質配列を走査することができるか、または、それらは、新規に設計されたペプチドが特定のＭＨＣ分子に結合するかどうかを予測することができる。多くのこのような予測アルゴリズムはインターネット上で一般にアクセス可能である。例は、ＭＨＣＩＩ結合分子についてはＳＶＲＭＨＣｄｂ（http://svrmhc.umn.edu/SVRMHCdb; J. Wan et al., BMC Bioinformatics 2006, 7:463)、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）、ＭＨＣＰｒｅｄ（http://www.jenner.ac.uk/MHCPred）、モチーフスキャナー（http://hcv.lanl.gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan）またはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan）、およびＭＨＣＩ結合エピトープについてはＮｅｔＭＨＣｐａｎ（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan）である。
【００５５】
本明細書に記載のような設計に好ましいＨＴＬエピトープは、５００nMよりも良好な結合親和性（ＩＣ５０値）でもってＭＨＣＩＩ分子のいずれかに結合すると、生物物理学的方法によって測定されるかまたはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎによって予測されるペプチド配列である。これらは、弱い結合物質であると考えられる。優先的には、これらのエピトープは、５０nMよりも良好なＩＣ５０値でもってＭＨＣＩＩ分子に結合すると、生物物理学的方法によってまたはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎによって予測される。これらは強い結合物質と考えられる。
【００５６】
本明細書に記載のような設計に好ましいＣＴＬエピトープは、５００nMよりも良好な結合親和性（ＩＣ５０値）でもってＭＨＣＩ分子のいずれかに結合すると、生物物理学的方法によって測定されるかまたはＮｅｔＭＨＣｐａｎによって予測されるペプチド配列である。これらは、弱い結合物質であると考えられる。優先的には、これらのエピトープは、５０nMよりも良好なＩＣ５０値でもってＭＨＣＩ分子に結合すると、生物物理学的方法によって測定されるかまたはＮｅｔＭＨＣｐａｎによって予測される。これらは強い結合物質と考えられる。
【００５７】
Ｔ細胞エピトープのための場所
Ｔ細胞エピトープを、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＤ１およびＤ２のペプチド配列内のいくつかの場所に取り込むことができる。これを達成するために、Ｔ細胞エピトープを有する特定の配列は、コイルドコイル形成の原則、並びに、ＭＨＣ結合の原則に従わなければならない。コイルドコイル形成の原則は、前記に詳細に概略が示されている。ＭＨＣ分子への結合の原則は、複雑なアルゴリズムを使用するＭＨＣ結合予測プログラムに取り込まれ、これによりＭＨＣ結合ペプチドを予測する。
【００５８】
多くの異なるＨＬＡ分子が存在し、それらの各々が、最善にそれに結合するであろう限られたアミノ酸をその配列中に有する。結合モチーフを表３に要約する。この表において、モチーフは、あらゆるアミノ酸を有することのできる位置についてのｘを示し、角括弧には結合モチーフの特定の位置にしか存在し得ないアミノ酸（のリスト）を示す。
【表４】
2011511773.tif 000005
2011511773.tif 000006
2011511773.tif 000007
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2011511773.tif 000011
１）アンカー残基は、角括弧で示されている。アンカー位置において好ましいが優位ではないアミノ酸は括弧で示されている。例えば、モチーフx-[VTILF]-x-x-x-x-x-x-[YF(ML)]は、２番目の位置およびＣ末端の位置がアンカー位置であることを意味する。２番目の位置における優位なアミノ酸は、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｆであり、Ｃ末端アンカー位置において優位なアミノ酸は、ＹおよびＦであり、一方ＭおよびＬは好ましいが優位ではない。
2) Marsh2000: Marsh S.G.E., Parham P. and Barber L.D., The HLA Factsbook. Academic Press, San Diego, 2000. URL: http://www.anthonynolan.com/HIG/. 
SYFPEITHI: The SYFPEITHI Database of MHC Ligands, Peptide Motifs and Epitope Prediction. Jan. 2003. URL: http://www.syfpeithi.de.  
Luscher2001: Luscher M.A. et al., Immunogenetics. 2001, 53(1):10-14. 
Yusim2004: Yusim K. et al., Appl Bioinformatics 2005, 4(4):217-225.
【００５９】
ＭＨＣ分子の多くは、非常に類似した結合モチーフを有しており、従って、これらはいわゆるＨＬＡスーパータイプに分類されることができる。これらのスーパータイプの結合モチーフを表４に要約する。
【表５】
2011511773.tif 000012
【００６０】
Ｔ細胞エピトープの特定の位置においての特定のアミノ酸の発生頻度も要約することができる。ＭＨＣ結合では、Ｔ細胞エピトープにおける１、４、６および９の位置が最も重要な位置である。これらの位置における最も好ましい残基が表５に列挙されているが、これらの位置における特定のアミノ酸の優先度は、様々なＭＨＣ分子間で大きく異なる。それ故、前記したように、ＭＨＣ分子への特定のアミノ酸配列の結合は、前記に列挙した予測プログラムによってはるかにより正確に予測することができる。
【表６】
2011511773.tif 000013
【００６１】
この表５から、例えば、１位および４位において最も頻繁に遭遇するアミノ酸は、コイルドコイルヘプタッド反復のコア位置（下線によって示す）において見られるものである。１位および４位は、ヘプタッド反復の位置ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）上に重ね合わせることができる。それ故、１位にアミノ酸Ｌおよび４位にアミノ酸Ｖを有するＴ細胞エピトープは、ヘプタッド反復のコア位置ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）において同じアミノ酸を有するコイルドコイルペプチドと完全に一致する。それ故、ペプチド配列が、Ｔ細胞結合モチーフの制約並びにコイルドコイルヘプタッド反復モチーフの制約の両方に従うならば、それをＳＡＰＮのコイルドコイルオリゴマー化ドメインに取り込むことができる。これは、Ｔ細胞結合モチーフがコイルドコイル形成モチーフと重なるように、ペプチド配列のアラインメントを調整することによって、多くのＴ細胞エピトープについて達成することができる。
【００６２】
Ｔ細胞エピトープをコイルドコイルへと工学設計
ＳＡＰＮのコイルドコイルオリゴマー化ドメインにＴ細胞エピトープを取り込むＳＡＰＮを工学設計するために、３つのステップをとらなければならない。最初のステップにおいて、候補Ｔ細胞エピトープを、文献からもしくはデータベースからの公知のＴ細胞エピトープ、または、適切なエピトープ予測プログラムを使用することによる予測Ｔ細胞エピトープを使用することによって選択しなければならない。第２のステップにおいて、ＣＴＬエピトープのＣ末端にプロテアソーム開裂部位を挿入しなければならない。これは、プロテアソーム開裂部位ＰＡＰｒｏｃのための予測プログラム（http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html; Hadeler K.P. et al., Math. Biosci. 2004, 188:63-79）を使用し、そして、所望の開裂部位のすぐ後の残基を修飾することによって行なうことができる。この２番目のステップは、ＨＴＬエピトープには必要とされない。第３番目の最も重要なステップにおいて、Ｔ細胞エピトープの配列を、前記に概略を示したようなコイルドコイル形成の原則と最善に適合するように、コイルドコイル配列とアライン（align）させなければならない。取り込まれたＴ細胞エピトープを有する配列が、実際に、コイルドコイルを形成するかどうかを予測でき、Ｔ細胞エピトープ配列とコイルドコイル反復配列の間の最善のアラインメントを、コイルドコイル予測プログラム、例えばＣＯＩＬＳ（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber M. et al., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5）またはＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi）（これらは、インターネット上で入手できる）を使用することによって最適化することができる。
【００６３】
適切なアラインメントを見つけることができなくても（おそらく、Ｔ細胞エピトープは、コイルドコイル構造と適合性ではないグリシンまたはさらにはプロリンを含んでいるため）、Ｔ細胞エピトープをオリゴマー化ドメインに取り込み得る（実施例３参照）。この場合、Ｔ細胞エピトープは、同じオリゴマー化状態の強力なコイルドコイル形成配列によってフランキング（flank）されていなければならない。これは、コイルドコイル構造を十分な程度まで安定化させるか、または代替的にはこのコイルドコイルオリゴマー化ドメイン内にループ構造を生じさせることができる。これは、Ｂ細胞エピトープをＳＡＰＮのコイルドコイルコア配列に取り込むための次の章に記載したのと実質的に同じ手順である。
【００６４】
Ｂ細胞エピトープをコイルドコイルコアへと工学設計
本発明の特定の局面において、α−ヘリックスではない小さいＢ細胞エピトープの、ＳＡＰＮのコイルドコイルコアへの取り込みが意図される。これは、コイルドコイル構造と適合性ではないＴ細胞エピトープについて前記に概略を示したのと同じ手順によって達成することができる。Ｔ４フィブリチンの構造（http://www.rcsb.org/pdb/におけるｐｄｂアクセッションコード１ａａ０）は、そのコイルドコイル内に２つのループ構造を含む。ループが、コイルドコイルのヘリックス構造を妨害しないように２つのヘリックスターン間のコイルドコイルヘリックスから突出している。
【００６５】
フィブリチンでは、ループがコイルドコイルのａａ（ｂ）位置においてヘリックスから出て、コイルドコイル配列のａａ（ｃ）位置においてヘリックスに再び入る。ループの一方は、短いβ−ターンであるが、他方はより不規則なループ構造である。コイルドコイル中の残基ａａ（ｂ）とａａ（ｃ）の間の空間は、逆平行β−ターンペプチドのアンカー点として作用するに理想的に適している。残基ａａ（ｂ）もしくはａａ（ｃ）またはその両方がグリシン残基である場合、これは、コイルドコイルのα−ヘリックスを出て再び入るために必要とされるタンパク質二次構造の柔軟性を可能とする。
【表７】
2011511773.tif 000014
【００６６】
前記のフィブリチン配列において、ループ構造がイタリック体で示され、ａａ（ｂ）およびａａ（ｃ）位置における残基（２つのループがヘリックスから出て再び入る）が下線によって示されている。これらの４つの中の３つの残基が、グリシン残基である。これを鋳型として考えると、逆平行β−ターンコンフォメーションを有するＢ細胞エピトープを、ここで、ＳＡＰＮのコイルドコイルコアに取り込むことができる。コイルドコイル構造は、このようなループ構造の取り込みを可能とするに十分なほど安定でなければならず、従って、ループの両側においてコイルドコイルを形成できなければならない。これまでに記載された最小の自動的に折り畳まれるコイルドコイル配列は、２つのヘプタッド反復長である。以下の配列において、逆平行β−ターンペプチドである、ＨＩＶのタンパク質ｇｐ１２０由来のＶ３エピトープの先端が、両側に２つを超えるヘプタッド反復のフランキングヘリックスを有する設計された安定なコイルドコイルのコイルドコイルに取り込まれる。これらは、Burkhard P. et al., J Mol Biol 2002, 318:901-910から得られた非常に安定なコイルドコイル断片である。
【表８】
2011511773.tif 000015
【００６７】
これは、コイルドコイル内のＶ３ループのコンフォメーションを、タンパク質上のこのペプチドの天然コンフォメーションに対応する逆平行β−ターンコンフォメーションに制限するだろう。
【００６８】
好ましい設計
所与の特定の適用のための最善の免疫学的プロファイルを有するＳＡＰＮを工学設計するために、以下の考察を考慮に入れなければならない：
ＣＴＬエピトープは、そのＣ末端においてプロテアソーム開裂部位を必要とする。エピトープは、自己免疫応答を回避するためにヒト配列と類似すべきではない（ヒトペプチドに対する免疫応答を誘起する目標である場合を除く）。可能な例は、実施例４の癌特異的ＣＴＬエピトープである。
【００６９】
従って、Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つがＣＴＬエピトープであり、特に、配列がさらにＣＴＬエピトープの後にプロテアソーム開裂部位を含む、ＳＡＰＮが好ましい。
【００７０】
同様に好ましいのは、Ｔ細胞エピトープの少なくとも１つがＨＴＬエピトープ、特にｐａｎ−ＤＲ結合ＨＴＬエピトープである、ＳＡＰＮである。このようなｐａｎ−ＤＲ結合ＨＴＬエピトープは、表３の下部に列挙したようなＭＨＣクラスＩＩ分子の多くに結合し、それ故、大半の健康個体において認識され、これは良好なワクチンにとって重要である。
【００７１】
また好ましいのは、Ｄ１またはＤ２が三量体（実施例７および８）、四量体（実施例９）または五量体（実施例１０）であるならば、配列Ｄ１−Ｌ−Ｄ２が一連の重複しているＴ細胞エピトープを含む、ＳＡＰＮである。
【００７２】
Ｂ細胞エピトープは、ＳＡＰＮの表面に提示される必要がある。それらは、コイルドコイル配列の一部であってもそうでなくてもよく、すなわち、コイルドコイルの部分が表面に近づくことができるかどうかに応じて、コイルドコイルそれ自体が部分的にＢ細胞エピトープであり得る。例えば、エンベロープを有するウイルスの表面タンパク質の三量体コイルドコイルからなるＢ細胞エピトープを、ＳＡＰＮの表面に提示することができ、そして同時にコイルドコイル配列の一部であり得る。このような設計の一例が、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102に提示されている。一般にあらゆるオリゴマー化状態のコイルドコイルが、ＳＡＰＮによってコンフォメーション特異的に提示されるうえで例外的に良好に適している。コイルドコイルは、エンベロープを有するウイルス表面タンパク質においてだけでなく、例えば、マラリア病原体の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）（Villard V. et al., PLoS ONE 2007; 2(7):e645）のゲノムにおいても豊富である。
【００７３】
しかしながら、一般的に、Ｂ細胞エピトープは、コイルドコイルオリゴマー化ドメインの一部ではないか、あるいは、それらは、コイルドコイルと、コイルドコイルではない追加の部分、例えば、コイルドコイルストークおよび球状頭部ドメインを有する細菌の三量体自己輸送体アドヘシン（ＴＡＡ）、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）のＴＡＡとからなり得る。
【００７４】
Ｂ細胞エピトープとして特に関心が高いのは、それ自体がオリゴマーであるタンパク質、例えば三量体ヘマグルチニン、およびインフルエンザの四量体シアリダーゼまたはＭ２表面タンパク質である。
【００７５】
病原体に対するワクチンの設計についての考察
このようなワクチンは、好ましくは、３タイプ全てのエピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープおよびＣＴＬエピトープを含む。（１）好ましくは、唯１つの（または非常に僅かな）Ｂ細胞エピトープが、ペプチド鎖のどちらかの末端に配置されるべきである。これは、反復性抗原提示でＳＡＰＮの表面上にＢ細胞エピトープを配置させるだろう。（２）ＨＴＬエピトープは、できるだけ乱雑であるべきである。それらは必ずしも病原体に由来する必要はないが、強いヘルパーＴ細胞免疫応答を誘起するペプチドであり得る。一例は、ＰＡＤＲＥペプチドであろう。好ましくは、これらは、ＳＡＰＮのＤ１−Ｌ−Ｄ２コア配列に取り込まれるＴ細胞エピトープである。（３）ＣＴＬエピトープは、病原体特異的である必要があり、それらはＣ末端プロテアソーム開裂部位を有する必要がある。Ｔ細胞エピトープは反復性抗原提示を必要としないので、いくつかの異なるＴ細胞エピトープを、全て同じナノ粒子形成Ｄ１−Ｌ−Ｄ２コアを有するが、コア形成配列の一部ではなく従ってコイルドコイル配列には取り込まれないであろう様々なＴ細胞エピトープを有する、様々なペプチド鎖の共会合によって１つの単一ＳＡＰＮに取り込むことができる。
【００７６】
同じように、ＥＲ標的化シグナル、すなわち小胞体（ＥＲ）へのタンパク質またはペプチドの輸送を誘導するシグナルペプチドを有するペプチド鎖を、同じＳＡＰＮ中に共会合することにより、ＭＨＣＩ分子による適切な提示のためにＣＴＬエピトープをＥＲに運ぶことができる。なぜなら、交差提示は、ヒトにおいてはあまり効果的ではないからである。しかしながら、ＥＲ標的化シグナルは、別々のペプチド鎖上にある必要はなく、ＣＴＬエピトープと同じペプチド内にあってもよい。適切なＥＲシグナルペプチドは例えばＥＲ標的化シグナル（Ｅ３/１９Ｋ）MRYMILGLLALAAVCSA（配列番号６）であろう。
【００７７】
強い抗体応答を発生させることを目的とした治療ワクチン
強い抗体応答を発生させることを目的とした治療ワクチンは、特に、アルツハイマー、高血圧、肥満、薬物耽溺、または炎症の処置に有用である。このようなワクチンのために、好ましくは唯１つのＢ細胞エピトープが使用される。１つ以上の乱雑なＨＴＬエピトープをＳＡＰＮに含めることによって、反復性抗原提示に起因する強い体液性免疫応答をさらに増強することができる。好ましくは、これらは、ＳＡＰＮのＤ１−Ｌ−Ｄ２コア配列に取り込まれるＴ細胞エピトープである。さらに、自己免疫応答を回避するために、ヒトペプチドに対してできるだけ少なくかつ弱く結合するＣＴＬエピトープ、特にヒトペプチドに対して結合しないＣＴＬエピトープであるべきである。
【００７８】
ＣＴＬ応答、例えば癌に対するＣＴＬ応答を誘導するための治療ワクチン
この場合、全くＢ細胞エピトープを使用しなくてもよい。特定のＣＴＬエピトープ（例えば、ＭＡＧＥ−１,２,３；ＭＡＲＴ−１,２,３；またはＨｅｒ−２/ｎｅｕ、実施例４も参照）に対する免疫応答は、１つ以上の乱雑なＨＴＬエピトープをＳＡＰＮに含めることによってさらに増強される。
【００７９】
アジュバントとしての自己会合ペプチドナノ粒子（ＳＡＰＮ）
多くのＨＴＬエピトープからなるＳＡＰＮは、強力なヘルパーＴ細胞免疫応答を誘導するだろう（実施例２参照）。同じ用量で任意の他のワクチン製剤と共に投与されると、免疫応答が刺激されるだろう。このようなＳＡＰＮは、全くＣＴＬエピトープまたはＢ細胞エピトープの必要がないアジュバントであろう。しかしながら、Ｂ細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープを、このようなアジュバントＳＡＰＮと合わせることができる。さらに、特定のアジュバント分子を、ＳＡＰＮに、置換基として、オリゴマー化ドメインＤ１またはＤ２に共有結合することにより、ＳＡＰＮのアジュバント効果をさらに刺激することができる。特に関心が高いのは、免疫刺激性核酸、好ましくはデオキシイノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、イノシンおよびシチジンを含む核酸分子である。他の免疫刺激性分子は、例えば、抗微生物ペプチド、例えば、適応免疫応答を促進および／または向上することができる免疫刺激性の正に帯電した分子に属するクラスである、カチオン性ペプチドである。免疫強化特性を有するこのようなペプチドの一例は、プライムブースト（prime-boost）免疫化の後に強力なタンパク質特異的な２型駆動適合免疫を誘導する、正に帯電した人工抗微生物ペプチドＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号６３）である。
【００８０】
好ましくは、本発明の抗原は、（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘起するのに適したタンパク質；（ｂ）感染症に対する免疫応答を誘起するのに適したタンパク質または炭水化物；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘起するのに適したタンパク質；（ｄ）ヒト疾病の処置のための免疫応答を誘起するのに適したペプチドホルモン；および（ｅ）耽溺または他の疾患を処置するための免疫応答を誘起するのに適したハプテン分子、からなる群より選択される。このようなタンパク質、そのペプチド断片、ペプチド、炭水化物、またはハプテンを含むペプチドナノ粒子は、ヒト、または家畜およびペットにおいても免疫応答を誘起するのに適し得る。
【００８１】
本発明の１つの好ましい態様において、抗原または抗原決定基は、感染症の予防に有用なものである。このような処置は、多種多様な宿主、例えばヒトまたはヒトではない動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種、および同様に哺乳動物ではない種にも罹患する多種多様な感染症を予防するのに有用であろう。
【００８２】
特に、本発明は、以下の抗原の１つを含むＳＡＰＮに関する：
（ａ）細菌に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｂ）ウイルスに対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｃ）寄生虫に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｄ）癌細胞に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｅ）アレルゲンに対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｆ）耽溺に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｇ）疾病および代謝疾患に対する免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｈ）家畜において免疫応答を誘起するのに適した抗原；
（ｉ）ペットにおいて免疫応答を誘起するのに適した抗原。
【００８３】
処置可能な感染症は、当業者には周知である。例は、ウイルス、細菌、または寄生虫が病因の感染、例えば以下の疾病：アメーバ症、炭疸病、カンピロバクター感染、水疱瘡（Chickenpox）、コレラ、デング熱、ジフテリア、脳炎、エボラ、インフルエンザ、日本脳炎、リーシュマニア症、マラリア、麻疹、髄膜炎菌性疾病、ムンプス、院内感染症、百日咳、肺炎球菌感染症、ポリオ（灰白髄炎）、風疹、帯状疱疹、住血吸虫病、破傷風、ダニ媒介脳炎、トリコモナス症、トリパノソーマ症、結核、腸チフス、水疱瘡（Varicella）、および黄熱病を含む。
【００８４】
特に、本発明は、以下の寄生虫に由来する以下の抗原の１つを含むＳＡＰＮに関する：カンピロバクター、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＦＭＤＶ、ヘモフィルス・インフルエンザエｂ型、ヘリコバクター・ピロリ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、回虫、鉤虫、およびウエストナイルウイルス。
【００８５】
本発明の好ましい局面において、マラリアの予防および処置のための組成物が意図される（実施例１１）。マラリア寄生虫の生活環は、妨害すると感染プロセスを停止させることができるいくつかのいくつかの段階を与える。マラリア寄生虫の生活環において、ヒトは、雌のAnopheles属の蚊の咬傷からマラリアに感染する。この蚊は宿主にそのプローブを挿入し、その際に蚊の唾液中に存在するスポロゾイト（sporozoite）形態の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）（または三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax））を注入する。ペプチドワクチンの設計のために適当な可能なタンパク質およびペプチド配列は、下記のマラリア原虫タンパク質：ＭＳＰ−１（寄生虫細胞表面に発現された大きい多形タンパク質）、ＭＳＡ１（主要なメロゾイト表面抗原１）、ＣＳタンパク質（ネイティブサーカムスポロゾイト（circumsporozoite））、米国特許第４,７３５,７９９号に従う３５ＫＤタンパク質または５５ＫＤタンパク質または１９５ＫＤタンパク質、ＡＭＡ−１（尖端膜抗原１）（apical membrane antigen 1）、またはＬＳＡ（肝臓期抗原）からの配列を含有することができる。
【００８６】
好ましい設計において、Ｂ細胞エピトープの１つは、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質のＢ細胞エピトープを構成する８〜約４８残基の配列である。このＢ細胞エピトープは、熱帯熱マラリア原虫におけるアミノ酸配列ＮＡＮＰの冗長な反復領域である。好ましいＳＡＰＮの設計において、このＢ細胞エピトープは、アミノ酸残基配列ＮＡＮＰあるいはその並べ替え体のＡＮＰＮ、ＮＰＮＡ、およびＰＮＡＮの２〜約５回の反復を含む。三日熱マラリア原虫における対応する反復領域は、以下の高度に類似した配列のいずれかからなる。
【表９】
2011511773.tif 000016
【００８７】
好ましい設計において、Ｂ細胞エピトープの１つは、これらの配列のいずれかからなる８〜約４８残基の配列である。
【００８８】
マラリア処置のためのＳＡＰＮを設計するための具体的なペプチド配列が、Ｂ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープおよびＣＴＬエピトープについて以下の３つの表に列挙されている。
【００８９】
以下の表７は、好ましい熱帯熱マラリア原虫のコイルドコイルＢ細胞エピトープを列挙する（Villard V. et al., PLoS ONE 2007, 2(7):e645 and Agak G.W., Vaccine (2008) 26, 1963-1971）。Ｂ細胞エピトープでは表面に近づける残基だけが、Ｂ細胞レセプターとの相互作用および抗体の産生のために非常に重要であるので、表面に露出していないａａ（ａ）およびａａ（ｄ）の位置におけるコイルドコイルコア残基を、免疫原の中和抗体誘起能を変化させることなく、ある程度まで修飾することができる。例えば、ａａ（ａ）位置におけるバリンをイソロイシンに変更することは、コイルドコイルＢ細胞エピトープの一般的な免疫学的特性に影響を及ぼさないだろう。それ故、これらのコイルドコイル配列は、その免疫学的潜在力を消失させることなく、最善のコイルドコイル形成および安定性のためにコア残基を最適化することによって人工的に安定化させることができる（実施例１３）。従って、前記に詳細に概略を示したようにコイルドコイル形成性向に従ってａａ（ａ）および／またはａａ（ｄ）におけるそのコア残基の１つ以上においてこれらのペプチドＢ細胞エピトープを修飾することも、これらのＢ細胞エピトープについて意図される。
【００９０】
従って、好ましい設計において、そのコア位置の１つ以上が修飾されたコイルドコイルＢ細胞エピトープは、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸に対して０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって予測される、２つのヘプタッド反復長である少なくとも１つの配列を含むペプチドである。
【００９１】
より好ましい設計において、そのコア位置の１つ以上が修飾されたコイルドコイルＢ細胞エピトープは、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸に対して０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって予測される、３つのヘプタッド反復長の少なくとも１つの配列を含むペプチドである。
【００９２】
別のより好ましい設計において、そのコア位置の１つ以上が修飾されたコイルドコイルＢ細胞エピトープは、ウィンドウサイズ１４、２１または２８の少なくとも１つを用いて全てのそのアミノ酸に対して０.９より高い確率でコイルドコイルを形成すると、コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳによって予測される、２つのヘプタッド反復長の少なくとも２つの別々の配列を含むペプチドである。
【００９３】
【表１０】
2011511773.tif 000017
【００９４】
以下の表８は、好ましい熱帯熱マラリア原虫を列挙する（Doolan, D.L., The Journal of Immunology, 2000, 165: 1123-1137; US patent 5,114,713）。
【表１１】
2011511773.tif 000018
【００９５】
以下の表９は、好ましい熱帯熱マラリア原虫ＣＴＬエピトープを列挙する（US patents 5,028,425, 5,972,351, 6,663,871）。
【表１２】
2011511773.tif 000019
【００９６】
本発明の別の好ましい局面において、ＨＩＶの予防および処置のための組成物が考えられる（実施例５および１２）。抗ＨＩＶワクチンの調製のために、ＨＩＶ特異的抗体を誘起することができる合成ペプチドを使用することができ、該合成ペプチドは、免疫応答を与えるためのＨＩＶ−１のエンベロープまたはｇａｇタンパク質またはｇｐ１２０またはｇｐ４１の機能的Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を有する。特に関心が高いのは、公知の抗体２Ｆ５および４Ｅ１０のように融合プロセスを妨害することのできるコンフォメーション特異的中和抗体を誘導できるｇｐ４１もしくはｇｐ１２０内の配列、またはｇｐ４１もしくはｇｐ１２０のＶ３ループに由来する配列である。このような配列は、ＨＲ１およびＨＲ２並びにクラスターＩおよびクラスターIIの中およびその周辺に主に局在している。例えばｇｐ４１のコイルドコイル三量体に結合し、そしてこのコイルドコイル三量体を取り込んでいる本発明のペプチドナノ粒子によって誘起される抗体は、ヘアピン形成を阻害し、これによりウイルス融合を阻害するだろう。同様に、類似の融合プロセスを有するエボラまたは別のウイルスの三量体コイルドコイルに対して生じる抗体は、これらのウイルスのウイルス侵入を阻害するだろう。
【００９７】
Letourneau S. et al., PLoS ONE 2007, 10:e984に記載の高度に保存されたＨＩＶタンパク質配列を使用して、ＣＴＬエピトープを、SVRMHCdb (http://svrmhc.umn.edu/SVRMHCdb; Wan J. et al., BMC Bioinformatics 2006, 7:463)を使用して予測した。これらの保存されたタンパク質配列は、表１０に列挙されたようなＨＬＡ分子に結合すると予測されたＣＴＬエピトープを含み、そしてＳＡＰＮ−ＨＩＶワクチンの設計に好ましいＣＴＬエピトープである。これらのペプチドエピトープは、１つの単一の連続的なペプチド連結鎖中に複数のＣＴＬエピトープを有するより長いペプチド配列へと合体させることができる大きく重複している配列を含む。
【表１３】
2011511773.tif 000020
2011511773.tif 000021
【表１４】
2011511773.tif 000022
【００９８】
本発明の別の好ましい局面において、インフルエンザの予防および処置のための組成物が考えられる。インフルエンザＡは、膜内在性タンパク質であるＭ２をコードし、これはホモ四量体であり、そのサブユニットは、２３アミノ酸残基の小さな外部ドメイン（Ｍ２ｅ）を有する。天然Ｍ２タンパク質は、ウイルス粒子内に数コピーで存在するが、かさ高い他の２つの表面タンパク質であるヘマグルチニンおよびシアリダーゼによって免疫系から隠れている。他方で、それは、ウイルス感染細胞の膜表面上には豊富に存在する。Ｍ２ｅの配列は高度に保存されている。キメラＧＮＣ４−Ｍ２ｅタンパク質において四量体として免疫系に提示されるＭ２ｅは、高度に特異的かつ保護的な体液性免疫応答を生じる（DeFilette M. et al., J Biol Chem 2008; 283(17):11382-11387）。
【００９９】
Ｍ２ｅ四量体は、ヒトおよびトリの両方に特異的なインフルエンザ株における高度に保存されたＢ細胞エピトープである（表１２および１３）。本発明の好ましい態様において、それは、ＳＡＰＮのテトラブラチオン由来の四量体コイルドコイルまたは任意の他の四量体コイルドコイルのＮ末端に付着させた場合、その天然の四量体コンフォメーションで提示されることができる。
【表１５】
2011511773.tif 000023
【表１６】
2011511773.tif 000024
【０１００】
インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）は、前駆体タンパク質が２つの別々のペプチド鎖に開裂することによって活性化される（Steinauer D.S. et al., Virology 1999; 258:1-20）。ＨＡ前駆体分子ＨＡ０の開裂は、ウイルス感染性を活性化するために必要とされ、そして宿主における活性化プロテアーゼの分布は、指向性、例えば病原性の決定基の１つである。哺乳動物および非病原性のトリウイルスのＨＡｓは、細胞外で開裂され、これにより、適切なプロテアーゼに遭遇する宿主の組織へのその拡散が制限される。他方で、病原性ウイルスのＨＡｓは、遍在的に存在するプロテアーゼによって細胞内で開裂され、それ故、様々な細胞型に感染し、全身感染を引き起こす力を有する。
【０１０１】
Ｍ２ｅ配列とは対照的に、開裂ペプチドのＮ末端部分は高度に保存されていない（開裂ペプチドのＣ末端部分は、事実、高度に保存されている）。ＨＡ前駆体タンパク質において開裂ペプチドは表面に露出し、そして開裂部位の周囲の６個の残基（開裂部位の各々の側面上の３つの残基）が、このペプチド配列に最も特徴的である（表１４に太字で強調）。好ましいＳＡＰＮ設計において、これらの６個の残基が、ペプチドへ結合した際にＨＡ前駆体タンパク質が開裂されるのを保護することのできる抗体を誘導できる、Ｂ細胞エピトープを示す。
【０１０２】
ＳＡＰＮは、同一のＳＡＰＮ形成コアＤ１−Ｌ−Ｄ２を有するがそれに付着した異なったＢ細胞エピトープを有するペプチドを共会合することによって（実施例１５）、様々なＨＡタイプに特異的な多数の異なる開裂配列を提示するのに理想的に適している（表１４）。
【表１７】
2011511773.tif 000025
【０１０３】
例えば、配列をより可溶性にし塩基性を低くするために挿入されたアスパルテートアミノ酸と共にＨ１、Ｈ２、およびＨ３開裂部位の配列を含む、ヘマグルチニンＢ細胞エピトープ連結鎖は、このようであろう：SIQSRGLFGDIESRGLFGERQTRGIFG（配列番号２２７）。
【０１０４】
同じコア配列を有するが異なるＢ細胞エピトープもしくはエピトープ連結鎖を有するペプチドを、単一のＳＡＰＮに共会合させて、表１４の全てまたは最も重要な（ヒトワクチンのためのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９）配列をおそらく含む、多価ＳＡＰＮ免疫原を発生させることができる。
【０１０５】
類似のアプローチにおいて、同一のコアおよび同一のＮ末端Ｂ細胞エピトープＭ２ｅ並びにＣ末端において約２０個のＣＴＬエピトープ（各ペプチド鎖あたり３または４個）を有する６つのペプチド鎖からなるインフルエンザワクチンＳＡＰＮを、単一のＳＡＰＮへと共会合することができる（実施例１４）。表１５において、Parida R. et al., Vaccine 2007, 25:7530-7539の好ましい保存ＣＴＬエピトープが列挙されている。これらの６つのペプチド鎖のコアは同一であるので、これらの６つのペプチド鎖を１つの単一ＳＡＰＮへと共会合することは、約２０個の異なるＣＴＬエピトープを１つの単一ＳＡＰＮに取り込むことを可能とする。
【表１８】
2011511773.tif 000026
【０１０６】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、代謝疾患および疾病または耽溺の処置に使用され得る免疫治療薬である。最も好ましいのは、アルツハイマー病、高血圧、肥満、ニコチンおよびコカイン耽溺の処置のための免疫治療薬である。
【表１９】
2011511773.tif 000027
【０１０７】
Ａβ断片（Ａβ）は、４２アミノ酸長のペプチドである（Ａβ１−４２）。全４２残基長のペプチド配列はまた、自己免疫反応を引き起こす可能性のあるＣＴＬエピトープも含んでいるので、ワクチン設計には、Ａβ１−１２のようなこのペプチドのより短い断片だけを、またはさらにはＡβ１−６のようなこのような短いペプチドを使用することが望ましい（US Patent 7,279,165）。
【０１０８】
同様に、免疫原としての全長ＴＮＦαタンパク質は、いくつかの制限を有する。炎症誘発性サイトカインＴＮＦαの局所的過剰産生は、関節リウマチ、乾癬およびクローン病を含むいくつかの慢性的な炎症疾患の病因に非常に関与している。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ、インフリキシマブ、アダリムマブ）またはキメラ可溶性レセプター（エタネルセプト）によるＴＮＦαの中和が、これらの症状の処置に効果的であるが、いくつかの潜在的な欠点も有する。それは、アロタイプまたはＩｄ特異的抗体を誘導し得、これは、多くの患者において長期の効力を制限する可能性がある。さらに、処置患者の数が増加するにつれて、ＴＮＦαアンタゴニスト、特にｍＡｂｓを用いての処置は、日和見感染、特に結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、またはHistoplasma capsulatumのような細胞内病原体によって引き起こされる感染のリスクを増加させることが次第に明らかになっている。４〜２３残基のみを含むより短いＴＮＦα断片を用いての免疫化は、これらの中のいくつかの問題を回避することが示された（G. Spohn et al., The Journal of Immunology, 2007, 178: 7450 -7457）。それ故、ＴＮＦα４〜２３を用いての免疫化は、関節リウマチおよび他の自己免疫疾患のための新規で効果的な治療法であり、これは、既存の抗ＴＮＦα療法に新しい安全性水準を付与する。可溶性形態のＴＮＦαのみを選択的に標的化し、膜貫通形態は残しておくことによって、ＴＮＦαの病原性作用がワクチンによって中和され、一方で細胞内病原体に対する宿主応答の重要な機能はそのままに留まる。
【０１０９】
ニコチンおよびコカイン以外に、以下の化合物も、耽溺用のＢ細胞ＳＡＰＮワクチンの設計におけるハプテンとして使用し得る：アヘン、マリファナ、アンフェタミン、バルビツレート、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタカロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、抗コリン作用薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神病様薬物、鎮静薬、フェンシクリジン、サイロシビン、揮発性亜硝酸塩、並びに身体的依存および／または心理的依存を誘発する他の薬物。
【０１１０】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、アレルギーの処置に使用され得る免疫治療薬である。アレルギーのための組成物および処置法のための抗原または抗原決定基の選択は、このような疾患を処置する医学分野の技術者には公知であろう。このタイプの抗原または抗原決定基の代表例は、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ＢｅｔｖＩ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ＤｏｌｍＶ（ホワイトフェースト（white-faced）スズメバチ毒アレルゲン）、およびＤｅｒｐＩ（チリダニアレルゲン）を含む。
【０１１１】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、癌の処置に使用され得る免疫治療薬である。標的化ワクチン設計のための主要な癌は、以下である：脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、神経膠芽腫、白血病（急性骨髄性および慢性骨髄性）、肝癌、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌。
【０１１２】
癌のための組成物および処置法のための抗原または抗原決定基の選択は、このような疾患を処置する医学分野の技術者には公知であろう。このタイプの抗原または抗原決定基の代表例は以下を含む：ＨＥＲ２/ｎｅｕ（乳癌）、ＧＤ２（神経芽細胞腫）、ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経膠芽腫）、ＣＥＡ（甲状腺髄様癌）、ＣＤ５２（白血病）、ＭＵＣ１（血液系悪性疾患に発現）、ｇｐ１００タンパク質、または腫瘍抑制遺伝子ＷＴ１の産物。表１７において、対象となる癌特異的Ｔ細胞エピトープが、起源の関連タンパク質およびＭＨＣ制限と共に示されている。
【表２０】
2011511773.tif 000028
2011511773.tif 000029
【０１１３】
最も好ましいのは、実施例に記載されたコイルドコイル配列、Ｂ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープおよびＣＴＬエピトープ、単量体構築ブロック、ＳＡＰＮ、およびワクチン設計である。
【０１１４】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために有用であり、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１１５】
実施例１：ＰＡＤＲＥ（Ｐ５ｃ−８−Ｍａｌ）
配列AKFVAAWTLKAAA（配列番号２９６）を有するｐａｎ−ＤＲエピトープＰＡＤＲＥを、以下の設計基準を使用することによってＳＡＰＮの三量体コイルドコイルに取り込む：アラニン（Ａ）残基は、α−ヘリックスを形成する強い傾向を有する。コイルドコイルコア位置とのアラインメントは、バリン、トリプトファンおよびアラニンの残基が、ヘプタッド反復パターンのａａ（ａ）、ａａ（ｄ）および再度ａａ（ａ）の位置になるようにする。三量体コイルドコイルＮ末端およびＣ末端からＨＴＬエピトープまでの残りの部分は、非常に強力なコイルドコイルを形成すると予測されている。
【表２１】
2011511773.tif 000030
【０１１６】
このペプチドの配列（配列番号７）は、予測プログラムＣＯＩＬＳによってコイルドコイルを形成すると予測されている。コイルドコイル形成確率は、コイルドコイル予測のための２１アミノ酸のウィンドウを使用すると、配列中の全ての残基について９５％を超える（以下の表１８参照）。従って、これは、Ｔ細胞エピトープも含むと予測されるコイルドコイルである。
【０１１７】
ウィンドウが１４アミノ酸しか含まないならば、コイルドコイル予測は、Ｔ細胞エピトープ配列内で２％未満の確率という非常に低い数値まで下降することを認識することは非常に重要である。配列全体を通じてその高く予測されたコイルドコイル特性を有する２１アミノ酸のより大きなウィンドウサイズは、Ｔ細胞エピトープのＮ末端およびＣ末端におけるフランキング領域の効果を示す。これらがコイルドコイル形成を強く好む配列であれば、Ｔ細胞エピトープのあまり好まないコイルドコイル特性を補完し得、そしてＴ細胞エピトープが非常に好ましいコイルドコイル配列を含んでいなくても、全配列がコイルドコイルを形成するように誘導されるだろう。
【表２２】
2011511773.tif 000031
【０１１８】
その後、配列番号７のこの三量体コイルドコイルを、以下の配列番号８のＳＡＰＮ配列（これは、Ｈｉｓタグ、ＣＯＭＰの五量体コイルドコイル、ＰＡＤＲＥ Ｔ−細胞エピトープを含む配列番号７の配列からなる三量体コイルドコイル、およびネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei）のＣＳタンパク質由来のＢ細胞エピトープからなる）に含めた。
【表２３】
2011511773.tif 000032
【０１１９】
この配列を有するペプチドをE.coliで発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。再折り畳みを、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 95-102に従って行なった。再度折り畳まれたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、動的光散乱（ＤＬＳ）技術および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＤＬＳ分析は、平均粒子直径３２.０１nmおよび多分散指数１２.９％の素晴らしいサイズ分布を示した（図４Ａ）。ＴＥＭ写真（図４Ｂ）は、ＤＬＳによって決定したのと同じサイズのナノ粒子を示す。
【０１２０】
実施例２：Ｐ５ｃ−６−一般
このコイルドコイル配列は、それぞれ６.１２２、８.０６７、６.６８２および６.９５０の予測結合親和性（ｐＩＣ５０値）でもって、それぞれ異なるＭＨＣＩＩ分子であるDQA1*0501、DRB1*0501、DRB5*0101およびDRB1*0401に結合するとアルゴリズムＳＶＲＭＨＣによって予測される、LEELERSIW、IWMLQQAAA、WMLQQAAAR、およびMLQQAAARLの配列を有する４つの重複しているＨＴＬエピトープを含む。これらのＨＴＬエピトープは、非常に強力なコイルドコイルを形成すると予測されるので、コイルドコイルヘプタッド反復とアラインさせる。コイルドコイルのａａ（ａ）およびａａ（ｄ）コア位置は、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＬｅｕによって占有され、その殆どは、高いコイルドコイル形成性向のために非常に良好な残基であり、Ａｌａだけが幾分あまり好ましくない。
【表２４】
2011511773.tif 000033
【０１２１】
結果として、前記ペプチド配列は、予測プログラムＣＯＩＬＳによってコイルドコイルを形成すると予測される。コイルドコイル形成確率は、配列中のＨＴＬエピトープの全ての残基について９９％より高い（表１９）。コイルドコイル予測のために小および大のウィンドウサイズの比較は、再度、コイルドコイル安定性のためのフランキング配列の影響を示す。２８アミノ酸のウィンドウサイズでは、全配列が１００％の確率でコイルドコイルを形成すると予測され、一方、１４アミノ酸のより小さなウィンドウサイズは、コイルドコイル形成についてより低い予測値を有する、Ｎ末端におけるＴ細胞エピトープのより低いコイルドコイル性向の作用を示す。従って、全配列についてこのペプチドは、４つの異なるＨＴＬエピトープを含む安定なコイルドコイルを形成すると予測される。
【表２５】
2011511773.tif 000034
【０１２２】
その後、この三量体コイルドコイルを、以下の配列番号１０のＳＡＰＮ配列（Ｈｉｓタグ、ＣＯＭＰの五量体コイルドコイル、配列番号９の三量体コイルドコイル、およびネズミマラリア原虫のＣＳタンパク質由来のＢ細胞エピトープからなる）に含めた。
【表２６】
2011511773.tif 000035
【０１２３】
この配列を有するペプチドをE.coliで発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。再折り畳みを、Raman S. et al., Nanomedicine（前記）に従って行なった。再度折り畳まれたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、動的光散乱（ＤＬＳ）技術および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＤＬＳ分析は、平均粒子直径４６.９６nmおよび非常に低い多分散指数８.７％の素晴らしいサイズ分布を示した。ＴＥＭ写真（図５）は約３０nmのサイズのナノ粒子を示す。
【０１２４】
実施例３：Ｔ１ｃ−７−インフルエンザ
このコイルドコイル配列は、それぞれインフルエンザＡウイルスのタンパク質Ｍ１およびノイラミニダーゼ由来の配列IRHENRMVLおよびYKIFKIEKGを有する２つの連続的なＨＴＬエピトープを含む。コンピューターアルゴリズムＳＶＲＭＨＣによって、それらは、それぞれ８.２５０および６.９８５の予測結合親和性（ＩＣ５０値）でＭＨＣＩＩ分子DRB1*0405およびDRB1*0401に強く結合すると予測される。さらに、Parida R. et al., Vaccine 2007, 25:7530-7539によると、最初のＴ細胞エピトープIRHENRMVLは、例えばＢ１４、Ｂ１５１０、Ｂ２７０５、Ｂ２７０６、Ｂ３９０９、ＤＰ９、ＤＲ１１、ＤＲ１２、ＤＲ１７、ＤＲ５３、およびＤＲＢ１のような多くの他のＨＬＡ分子にも同様に結合すると予測され、すなわち、それは予測される乱雑なエピトープである。
【０１２５】
コイルドコイルヘプタッド反復とこれらのＨＴＬエピトープの最善のアラインメントが以下に示されている（配列番号１１）。しかしながら、これらのエピトープの２番目の配列は、一般にヘリックス破壊残基として作用する好ましくないグリシン残基を含む。コイルドコイル三量体のフランキング部分は、比較的短い配列であるが、強力なコイルドコイル形成性向を有する。コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳにおいて１４アミノ酸の小さいウィンドウを使用した場合、コイルドコイル構造は、Ｔ細胞エピトープの両側について予測されることが見てとれる（以下の表２０参照）。従って、全配列がここでも単一の折り畳みユニットとして作用し、三量体オリゴマー化状態を有する安定なコイルドコイルを形成するだろう。
【表２７】
2011511773.tif 000036
【表２８】
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2011511773.tif 000038
【０１２６】
その後、この三量体コイルドコイルを、以下の配列番号１２のＳＡＰＮ配列（Ｈｉｓタグ、五量体Ｔｒｐ−ジッパーコイルドコイル、前記したような三量体コイルドコイル、およびネズミマラリア原虫のＣＳタンパク質由来のＢ細胞エピトープからなる）に含めた。
【表２９】
2011511773.tif 000039
【０１２７】
この配列を有するペプチドをE.coliで発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。再折り畳みを、Raman S. et al., Nanomedicine（前記）に従って行なった。再度折り畳まれたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、動的光散乱（ＤＬＳ）技術および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＤＬＳ分析は、平均粒子直径５７.７０nmおよび多分散指数２１.６％の幾分より広いサイズ分布を示した。ＴＥＭ写真（図６）は約３０〜５０nmのサイズのナノ粒子を示す。そのいくらかは、一緒に粘着する傾向を有し、再折り畳み条件は幾分より改善を必要とするだろう。
【０１２８】
実施例４：癌ＣＴＬエピトープについてのコイルドコイルの予測
以下の実施例において、癌特異的Ｔ細胞エピトープをどのようにＳＡＮＰ形成ペプチドに含めることができるかが示されている。１９個の異なるＴ細胞エピトープを、ＳＡＰＮの三量体コイルドコイルの中へと工学設計し、対応するコイルドコイル性向を、これらの配列の最初の１０個について計算する。Ｔ細胞エピトープについてのコイルドコイル性向はかなり低いが、非常に高いコイルドコイル性向を有するフランキング配列が、前記の実施例１〜３について示されたのと同じように全配列にわたってコイルドコイル形成を補完し誘導するだろうことが素晴らしく見てとれる。
【表３０】
2011511773.tif 000040
【表３１】
2011511773.tif 000041
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【０１２９】
以下の配列は、同様に高いコイルドコイル性向を示し、Ｔ細胞エピトープについてのコイルドコイル性向はかなり低いが、非常に高いコイルドコイル性向を有するフランキング配列が、全配列にわたってコイルドコイル形成を補完し誘導するだろう。
【表３２】
2011511773.tif 000043
【０１３０】
実施例５：ＨＩＶ−Ｖ３
このコイルドコイル配列は、逆平行β−ターンペプチドを含み、これは、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０のＶ３ループの先端である。このペプチドは、ＨＩＶの周知のＢ細胞エピトープである。それは、コイルドコイルのａａ（ｂ）およびａａ（ｃ）の位置に、２つのグリシン残基によってコイルドコイルヘプタッド反復に挿入される。
【０１３１】
コイルドコイル三量体のフランキング部分は比較的短い配列であるが、強力なコイルドコイル形成性向を有する。コイルドコイル予測プログラムＣＯＩＬＳにおいて１４アミノ酸の小さいウィンドウを使用した場合、コイルドコイル構造は、Ｂ細胞エピトープの両側について予測されることが見てとれる（以下の表２２参照）。従って、全配列が単一の折り畳みユニットとして作用し、突出したβ−ターンペプチドを有する三量体オリゴマー化状態を有する安定なコイルドコイルを形成するだろう。
【表３３】
2011511773.tif 000044
【表３４】
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【０１３２】
実施例６：Ｐ５ｃの分析的超遠心分離
以下の配列（配列番号３３）のペプチドをＨｉｓタグアフィニティ精製スキームを使用して標準的なE.coli発現系において組換え発現させる：
【表３５】
2011511773.tif 000047
【０１３３】
この配列は、実施例１および２（配列番号８および配列番号１０）の配列に関連しているが、Ｃ末端Ｂ細胞エピトープは含まない。形成されたＳＡＰＮは、２つのヘリックス間にジスルフィド橋を有さず（下線の残基５５および６４、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102の元来の設計と比較して２つのシステインがアラニンによって置換）、むしろその代わりにより小さいアミノ酸であるアラニンを有し、これにより２つのヘリックス間でより小さな角度が可能となり、従って、６０より多くのペプチド鎖がＳＡＰＮに取り込まれる。
【０１３４】
単量体構築ブロック配列番号３３からのナノ粒子の会合について３つの条件を試験した。ＳＡＰＮの分子量（ＭＷ）を、分析的超遠心分離によって評価した：ペプチドを、０.４２mg/ml、０.３４mg/ml、および０.２１mg/mlで、１５０mM ＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ、ｐＨ７.５中に溶解した。測定されたＭＷは、約３３０個のモノマーからなるＳＡＰＮ、すなわち、６０の非対称ユニットを有する正多面体に必要とされるよりも多いモノマーを有するナノ粒子に相当する（表２３）。２つのオリゴマー化ドメインの２つのヘリックスは、ジスルフィド橋によって互いにその相対的な方位に固定されておらず、より小さなアミノ酸のアラニンが、２つのヘリックスがより近接することを可能とし、従って、それらの間の角度がより小さくなることを可能とする。
【表３６】
2011511773.tif 000048
【０１３５】
実施例７：一連の重複している測定されたＨＴＬエピトープ（ｐａｎ３ｍ）を有する三量体コイルドコイル
以下は、様々なＭＨＣＩＩ分子に対するその結合親和性が測定された(Mizukoshi E. et al., J Immunol 2004, 173:5863-5871)、Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼ由来のペプチドエピトープを含む、三量体コイルドコイル設計の一例である。これらのペプチドの中の２つは、本文書に概略を示した原則に従って三量体コイルドコイルへと連続的に設計された。
【表３７】
2011511773.tif 000049
【０１３６】
様々なＭＨＣＩＩ分子に対する、Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼ由来の配列LQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFに含まれるペプチドの測定された結合親和性は、以下の通りである（括弧内に結合親和性nM）：
【表３８】
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【０１３７】
ペプチド配列は、予測プログラムＣＯＩＬＳによってコイルドコイルを形成すると予測される。コイルドコイル形成確率は、配列中の全ての残基について９８％を超え（表２４）、それ故、全配列が完全に折り畳まれたコイルドコイルを形成すると予測される。
【表３９】
2011511773.tif 000051
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【０１３８】
実施例８：一連の重複している予測されたＨＴＬエピトープ（ｐａｎ３ｐ）を有する三量体コイルドコイル
以下は、ＰＡＤＲＥ ＨＴＬエピトープ配列の小区分である配列と組み合わせて、(Mizukoshi E. et al., J Immunol 2004, 173:5863-5871)からの配列番号３４からのＨＴＬエピトープの小区分を含む、三量体コイルドコイル設計の一例である。
【表４０】
2011511773.tif 000053
【０１３９】
以下は、次のように（括弧内に結合親和性nM）アルゴリズムＮｅｔＭＨＣＩＩによって予測された、様々なＭＨＣＩＩ分子に対する、ARFVAAWTLKVREVERELSWLSLDVSAAFの配列に含まれるエピトープの結合親和性である：
【表４１】
2011511773.tif 000054
この配列は、いくつかの部分において、ｐａｎ３ｍ配列（配列番号３４）と同じエピトープを含み、これは、実際にＮｅｔＭＨＣＩＩプログラムによって予測されたよりもさらに強力なＭＨＣＩＩ分子への結合を示した(Mizukoshi E. et al., J Immunol 2004, 173:5863-5871)。
【０１４０】
ペプチド配列は、予測プログラムＣＯＩＬＳによってコイルドコイルを形成すると予測される。コイルドコイル形成確率は、最後の８残基を除いて配列中の全ての残基について８０％を超え（表２５）、それ故、前記配列は、Ｃ末端が少し離れてほつれている（これは、Ｎ末端における配列の大半が、コイルドコイルを形成しているのでＳＡＰＮの形成を妨害しないだろう）完全に折り畳まれたコイルドコイルを形成すると予測される。
【表４２】
2011511773.tif 000055
【０１４１】
実施例９：一連の部分的に重複している予測されたＨＴＬエピトープ（ＢＮ５ｃ−Ｍ２ｅＮ）を有する四量体コイルドコイル
テトラブラチオン由来の四量体コイルドコイル配列(Stetefeld J. et al., Nature Structural Biology 2000, 7(9):772-776)は、ヘプタッド反復ではなくむしろ、ウンデカッドコイルドコイル反復によって特徴づけられる。以下は、この四量体コイルドコイルに由来する僅かに修飾された配列である。
【表４３】
2011511773.tif 000056
【０１４２】
この四量体コイルドコイルは、一連の重複している予測されたＨＴＬエピトープを含んでいるので、ＳＡＰＮのコアコイルドコイルとして特に良く適している。エピトープ配列YRLTVIIDD、LKNLITLRA、LITLRADRL、IINDNVSTLR、INDNVSTLRA、およびVSTLRALLMは、アルゴリズムＮｅｔＭＨＣＩＩによって、それぞれ３、４８、７８、１６２、２４３、４７８、１２、および４２０の予測結合親和性（nM）でもって、様々なＭＨＣＩＩ分子DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1302、およびDRB1*1501に結合すると予測されている。
【０１４３】
四量体コイルドコイルはまた、インフルエンザ由来のＭ２ｅペプチドなどの四量体Ｂ細胞エピトープを提示するのに良く適しており、これは、配列（配列番号３７）を用いたヒトワクチンのための以下のＳＡＰＮの設計において行なわれた：
【表４４】
2011511773.tif 000057
【０１４４】
ペプチド（配列番号３７）は、Ｎ末端から順に：Ｈｉｓタグ、ヒト特異的インフルエンザ株由来のＭ２ｅＢ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープを有する四量体コイルドコイル、リンカー、および三量体コイルドコイルを含む。この配列を用いて、それをE.coliにおいて発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。再折り畳みは、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102に従って行なった。再折り畳みされたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＴＥＭ写真（図７Ａ）は、約３０nmの同ナノ粒子を示す。
【０１４５】
また、インフルエンザ由来のニワトリ特異的Ｍ２ｅペプチドを、テトラブラチオンの四量体コイルドコイル上に、四量体としてその天然オリゴマー化状態およびコンフォメーションで提示でき、これは、配列（配列番号３８）を用いた動物ワクチンのための以下のＳＡＰＮの設計において行なわれた：
【表４５】
2011511773.tif 000058
【０１４６】
この配列（配列番号３８）を有するペプチドをE.coliで発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。それは、Ｎ末端から順に：Ｈｉｓタグ、ニワトリ特異的インフルエンザ株由来のＭ２ｅＢ細胞エピトープ、ＨＴＬエピトープを有する四量体コイルドコイル、リンカー、および三量体コイルドコイルを含む。再折り畳みは、Raman S. et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102に従って２０mM Tris-HCl pH７.５、１５０mM NaClおよび５％グリセロールの緩衝液を用いて行なった。再折り畳みされたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、動的光散乱（ＤＬＳ）技術および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＤＬＳ分析は、平均粒子直径４５nmおよび多分散指数８.９％のサイズ分布を示した（図４Ａ）。ＴＥＭ写真（図７Ｂ）は、約３０nmの同じサイズのナノ粒子を示す。
【０１４７】
実施例１０：一連の重複している予測されたＨＴＬエピトープを有する五量体コイルドコイル
この配列は、二次構造予測プログラムＰＳＩＰＲＥＤ(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ - The PSIPRED Protein Structure Prediction Server)に従って高い確率（大部分において、最高のスコアは９）でα−ヘリックス（Ｈ）を形成すると予測される。コイルドコイルのヘプタッド反復のコア位置ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は、殆どがトリプトファン残基であるので、この配列は、五量体コイルドコイルを形成すると予測される(Liu J et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(46):16156-61)。
【表４６】
2011511773.tif 000059
【０１４８】
この五量体コイルドコイル配列は、アルゴリズムＮｅｔＭＨＣＩＩによって、それぞれ２４、７３、１３、１２０、４２、５９６、３９６、６、および１３の予測結合親和性（nM）でもって、それぞれ様々なＭＨＣＩＩ分子DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*0405、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*0901、DRB1*1101、DRB1*1501、およびDRB5*0101に結合すると予測される、配列FVAAWTLKV、WKIWKSLWKおよびKSLWKAWRLを有する一部重複しているＨＴＬエピトープを含む。
【０１４９】
実施例１１：熱帯熱マラリア原虫ＨＴＬエピトープ（ｔ８１１ｃ−９−ｐｆ）を有する三量体コイルドコイル
以下は、熱帯熱マラリア原虫由来のｐａｎＤＲ結合エピトープを含む三量体コイルドコイル設計の一例である。配列は、２つのシステインがアラニンによって置換された１７Ｃ末端アミノ酸に対応し、これはまた、サーカムスポロゾイトタンパク質ＣＳ由来のＣＳ.Ｔ３ペプチド（配列番号４０）としても知られる。
【表４７】
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【０１５０】
細胞増殖アッセイにおいて、このＣＳ.Ｔ３ペプチドは、ｐａｎＤＲ活性を有し、そしてＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲｗ６、ＤＲ７およびＤＲ９分子(U.S. Patent 5,114,713)に対して刺激性であることが示された。
【０１５１】
ペプチド配列は、予測プログラムＣＯＩＬＳによってコイルドコイルを形成すると予測される。コイルドコイル形成確率は、最後の２つのアミノ酸を除いて、配列中の全ての残基について９９％より高い（表２６）。それ故、全配列が、完全に折り畳まれたコイルドコイルを形成すると予測される。
【表４８】
2011511773.tif 000061
2011511773.tif 000062
【０１５２】
このコイルドコイル（配列番号４０）は、以下の配列（配列番号４１）を用いたＳＡＰＮの設計に使用された。
【表４９】
2011511773.tif 000063
【０１５３】
この配列（配列番号４１）は、ｈｉｓタグ、五量体コイルドコイルトリプトファンジッパー、リンカー、三量体コイルドコイル配列番号４０、および熱帯熱マラリア原虫Ｂ細胞エピトープ（これは、同サーカムスポロゾイトタンパク質ＣＳの反復配列の４回反復（ＮＡＮＰ）である）を含む。
【０１５４】
この配列を有するペプチドをE.coliで発現させ、ニッケルアフィニティカラムで標準的な生物工学手順によって精製した。再折り畳みを、Raman S. et al., Nanomedicine（前記）に従って行なった。再度折り畳まれたＳＡＰＮを、ナノ粒子形成について、動的光散乱（ＤＬＳ）技術および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって分析した。ＤＬＳ分析は、ｐＨ６.５において、平均粒子直径４４.６nmおよび多分散指数１９.６％のサイズ分布を示した。ＴＥＭ写真（図８）は、約３０nmのサイズのナノ粒子を示す。
【０１５５】
実施例１２：ＨＩＶワクチン：ＨＴＬ、ＣＴＬ、Ｂ細胞の共会合
以下は、ＨＩＶワクチン設計の一例である。これらの保存されたタンパク質配列は、表１０に列挙したようなＨＬＡ分子に結合すると予測されるＣＴＬエピトープを含む。
【表５０】
2011511773.tif 000064
【０１５６】
表１０の最初の７つのＣＴＬペプチド連結鎖を、同一コアおよび同一Ｎ末端Ｂ細胞エピトープを有する６つのペプチド鎖のＣ末端において工学設計し、これにより単一ＳＡＰＮに共会合させる。
【０１５７】
コアは、ＰＡＤＲＥ ＨＴＬエピトープを含むＴｒｐ−ジッパー五量体コイルドコイルに連結した、乱雑な熱帯熱マラリア原虫ＨＴＬエピトープを有する実施例１１と同じ三量体を含む。
【０１５８】
Ｂ細胞エピトープは、ＧＰ４１の膜近位領域であり、これは、モノクローナル中和抗体２Ｆ５および４Ｅ１０の結合によって証明されたように中和能を有する。このエピトープは、溶液中でα−ヘリックスであり、五量体コイルドコイルへと部分的に工学設計されることによってα−ヘリックスコンフォメーションに保たれる。この設計において、表面に近づける残基（すなわち、コイルドコイルコア残基ではない残基）は、抗体４Ｅ１０と結合する残基である。
【０１５９】
実施例１３：マラリアワクチン：ＨＴＬ−ＣＴＬ−Ｂ細胞コア、Ｂ細胞、ＣＴＬの共会合
以下は、単一ＳＡＰＮへと共会合された同一コアおよび同一Ｃ末端Ｂエピトープ並びにＮ末端において約１８個のＣＴＬエピトープ（各ペプチド鎖あたり３個）からなる、マラリアワクチンＳＡＰＮの一例である。
【表５１】
2011511773.tif 000065
【０１６０】
コア（下線）は、ＣＴＬエピトープMEKLKELEKおよび修飾されたＢ細胞エピトープKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELT(Villard V. et al., PLoS ONE 2007, 2(7):e645における配列２７)を含む三量体コイルドコイルと、優れたｐａｎＤＲ結合特性を有する実施例１０で示された五量体との組合せである。Ｃ末端において、６つ全てのペプチド鎖が同一のＢ細胞エピトープ（これは、熱帯熱マラリア原虫由来のサーカムスポロゾイトタンパク質ＣＳの反復配列の４回反復（ＮＡＮＰ）である）を有する。Ｎ末端には、約１８個の異なる熱帯熱マラリア原虫ＣＴＬエピトープ(US patents 5,028,425, 5,972,351, 6,663,871)が存在し、１本の鎖につき３つの異なるエピトープが存在する。ＣＴＬエピトープは、最適化されたプロテアソーム開裂部位(http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html; Hadeler K.P. et al., Math. Biosci. 2004, 188:63-79)によって分離されている。これらの６つのペプチド鎖のコアは同一であるので、これら６つのペプチド鎖を１つの単一ＳＡＰＮに共会合することは、約１８個の異なるＣＴＬエピトープを１つの単一ＳＡＰＮに取り込むことを可能とする。
【０１６１】
実施例１４：インフルエンザワクチン：ＨＴＬコア、Ｂ細胞四量体、ＣＴＬの共会合
以下は、単一ＳＡＰＮへと共会合された同一コアおよび同一Ｎ末端Ｂ細胞エピトープＭ２ｅ並びにＣ末端において約２０個のＣＴＬエピトープ（各ペプチド鎖あたり３または４個）からなる、インフルエンザワクチンＳＡＰＮの一例である。コア（下線）は、実施例７の三量体と、優れたｐａｎＤＲ結合特性を有する実施例９の四量体の組合せである。四量体Ｎ末端Ｂ細胞エピトープは、実施例９と同じである。Ｃ末端において、Parida R. et al., Vaccine 2007, 25:7530-7539からの保存されたＣＴＬエピトープ（表１５）が配置される。これらの６つのペプチド鎖のコアは同一であるので、これら６つのペプチド鎖を１つの単一ＳＡＰＮに共会合することは、約２０個の異なるＣＴＬエピトープを１つの単一ＳＡＰＮに取り込むことを可能とする。
【表５２】
2011511773.tif 000066
【０１６２】
実施例１５：インフルエンザワクチン：ＨＴＬコア、Ｂ細胞四量体、開裂ペプチドの共会合
以下は、単一ＳＡＰＮへと共会合された同一コアおよび同一Ｎ末端Ｂ細胞エピトープＭ２ｅ並びにＣ末端において９個のＢ細胞エピトープ（各ペプチド鎖あたり３個）からなるインフルエンザワクチンＳＡＰＮの一例である。
【表５３】
2011511773.tif 000067
【０１６３】
コア（下線）は、実施例８の三量体と、優れたｐａｎＤＲ結合特性を有する実施例９の四量体の組合せである。四量体Ｎ末端Ｂ細胞エピトープは、実施例９と同じである。Ｃ末端Ｂ細胞エピトープは、表８から、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５コンセンサス１、Ｈ５コンセンサス２、Ｈ７コンセンサス１、Ｈ７コンセンサス２、Ｈ７コンセンサス３、Ｈ９のために、エピトープ間の負の電荷でもって、Ｂ細胞エピトープ連結鎖がより低い正電荷を持つようにさせるためである。
【図１】
2011511773.tif 000081
【図２Ａ）】
2011511773.tif 000082
【図２Ｂ）】
2011511773.tif 000083
【図３Ａ）】
2011511773.tif 000084
【図３Ｂ）】
2011511773.tif 000085
【図４Ａ】
2011511773.tif 000086
【図４Ｂ】
2011511773.tif 000087
【図５】
2011511773.tif 000088
【図６】
2011511773.tif 000089
【図７Ａ】
2011511773.tif 000090
【図７Ｂ】
2011511773.tif 000091
【図８】
2011511773.tif 000092
【配列表】
2011511773000001.app
【国際調査報告】
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