(57)【要約】  ガラス化方法による好結果の凍結保存は速い冷却速度に依存する。ガラス化を行う施術者は、液体窒素をその本来有する安全性及び低コストにより、冷却極低温流体として使用することを好む。液体窒素の静止プール内へガラス化極低温容器を浸漬させることによって、理論的な可能性よりも低い冷却速度が常にもたらされる。この冷却速度の低下は、公知のライデンフロスト効果によるものとされている。本発明の目的は、液体窒素を使用するガラス化中に改良された冷却速度を提供することである。本発明の一つの特徴は、冷却速度を増すために、対流による熱伝達方式をもたらす接触装置である。本発明の別の特徴においては、極低温流体の速度は、飽和極低温流体が入っている自己加圧型のジュワー瓶によってもたらされる。自己加圧は、ジュワー瓶の内容物の周囲の加熱によってなされる。もう一つ別の実施例においては、プロパンのような過冷却された極低温流体が、自己加圧型ジュワー瓶内で、ＬＮ２のような飽和極低温流体と協同して使用される。
2011511623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極低温容器内に保持されている生物標本を急冷するための接触器であり、
ａ．第一の極低温流体の流れを受け入れるようになされている入口と、
ｂ．前記極低温容器を前記接触器内に受け入れるようになされている開口部と、
ｃ．前記極低温容器が前記開口部を通して装填されるときに、前記極低温流体を前記極低温容器へ導くようになされている本体と、
ｄ．前記極低温容器が前記開口部を通して装填されているときに、前記第一の極低温流体を前記極低温容器から離れる方向に導くようになされた排出口と、を備えており、
前記本体の内径が前記開口部の内径の少なくとも１．５倍である、接触器。
【請求項２】
閉鎖型接触器であり、前記開口部がスリーブを備えており、該スリーブの内径が１００ミクロン〜３ｍｍの範囲内であり、前記本体の前記内径が前記スリーブの前記内径の１０倍以下である、請求項１に記載の接触器。
【請求項３】
前記第一の極低温流体の発生源を更に備えており、該第一の極低温流体の前記発生源が圧力解放弁を備えているシールされたジュワー瓶であり、前記圧力解放弁が、前記ジュワー瓶のヘッドスペース内の圧力を、前記第一の極低温流体が、前記本体を通過するときに少なくとも０．５ｍ／ｓの速度まで該第一の極低温流体を加速することができるように維持するようになされており、前記第一の極低温流体の前記発生源が前記入口に結合されている、請求項１に記載の接触器。
【請求項４】
前記ジュワー瓶が、前記第一の極低温流体のための第一のリザーバと、第二の極低温流体のための第二のジュワー瓶とを備えており、前記第一のリザーバのヘッドスペースと第二のリザーバのヘッドスペースとが、相互に連通していて、前記ヘッドスペース内の圧力同士がほぼ等しくされている、請求項３に記載の接触器。
【請求項５】
前記第一の極低温流体が液体プロパンであり、前記第二の極低温流体が液体窒素であり、前記圧力解放弁が、前記液体窒素の温度が前記プロパンの凝固点より高いような圧力に設定されている、請求項４に記載の接触器。
【請求項６】
前記ヘッドスペース内のガスが前記本体内へ吹き込まれるように、前記ジュワー瓶の前記ヘッドスペースと前記本体との間で連通している弁を更に備えている、請求項３に記載の接触器。
【請求項７】
前記スリーブが可撓性の管を備え、前記管がクランプされているときに前記極低温容器との間にシールを形成するようになされている、請求項２に記載の接触器。
【請求項８】
前記本体が集束／発散ノズルを備えている、請求項１に記載の接触器。
【請求項９】
前記本体がオリフィスを備えており、該オリフィスは、前記第一の極低温流体がその中を通過した後に縮流部を形成することができる大きさとされている、請求項１に記載の接触器。
【請求項１０】
前記本体が極低温装置に適したプラスチックからなる、請求項１に記載の接触器。
【請求項１１】
前記スリーブがポリテトラフルオロエチレンからなる、請求項７に記載の接触器。
【請求項１２】
前記本体の断面が四角形である、請求項１に記載の接触器。
【請求項１３】
生物標本の急冷のための閉鎖型接触器装置であり、
ａ．入口と、
ｂ．集束／発散ノズルを備えている円筒形本体と、
ｃ．排出口と、
ｄ．極低温容器を受け入れるための開口部と、を備えており、
前記円筒形本体の軸線が前記開口部の軸線とほぼ合致していて、前記開口部を通して挿入された極低温容器が前記ノズルの狭い通路内を通過するようになされている、接触器装置。
【請求項１４】
ジュワー瓶を更に備えており、該ジュワー瓶は、前記入口と連通されていて極低温流体が前記ジュワー瓶から前記円筒形本体内を流れ得るようになされている、請求項１３に記載の接触器装置。
【請求項１５】
閉鎖型ジュワー瓶であり、
ａ．第一の極低温流体を収容するための第一のリザーバと、
ｂ．第二の極低温流体を収容するための第二のリザーバと、
ｃ．前記第一のリザーバのヘッドスペース内の圧力を周囲圧力より高く維持するための圧力解放弁と、を備えており、
前記第一のリザーバの前記ヘッドスペースと前記第二のリザーバのヘッドスペースとが、相互に物理的に連通していて、前記第一のリザーバの前記ヘッドスペース内の前記圧力が前記第二のリザーバの前記ヘッドスペース内の圧力とほぼ等しいようになされており、前記第一のリザーバが前記第二のリザーバと熱的に連通していて、前記第一のリザーバの温度が前記第二のリザーバの温度とほぼ等しいようになされている、閉鎖型ジュワー瓶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物標本の凍結保存のための装置の分野に関する。
【０００２】
（関連出願）
本願は、２００８年１月１７日に出願された“ガラス化のための急冷装置”という名称の米国仮特許出願第６１／０２１６６１号に基づく優先権を主張している。前記米国仮特許出願は、これに言及することによって参考として本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
凍結保存は、生命科学において、価値のある細胞の生物活性を長期間に亘って一時停止させる目的で行なわれている。凍結保存の成功の一つの要因は、氷結晶形成の有害作用を減じるか又は排除することである。凍結保存中に水が凍結して氷になる本来的な傾向を阻止するためには高度な方法が必要とされる。“ガラス化”はこのような方法の一つである。ガラス化は、急速冷却時の流体粘度の急速な増加として説明することができ、これによって水分子はランダムな配向で捕捉される。この方法の成功は、細胞を損傷させる氷が一緒に形成されることを避けることを基礎とする。
【０００４】
ガラス化
ガラス化における初期段階は、一つの細胞又は複数の細胞を浸透性の及び／又は非浸透性の凍結保護物質（「ＣＰＡ」）を含む水溶液（「ガラス化剤」）によって脱水することである。一つの細胞又は複数の細胞は、少量のガラス化剤と共に、「生物標本」を構成している。生物標本は、次いで、適当な極低温容器内に配置される。極低温容器は極低温温度で使用するのに適している容器である。ここで使用されている「極低温温度」は、−８０℃より低い温度を意味している。
【０００５】
生物標本は、次いで、極低温流体例えば液体窒素（「ＬＮ２」）内に浸漬されて急冷される。冷却速度とＣＰＡ濃度とを適切に組み合わせることによって、細胞内水分が損傷を生じさせる規則的な氷結晶状態ではなく固体状の無害のガラス質（ガラス状）状態を呈することになる。
【０００６】
医療用ガラス化は２つの主要な目的を有している。第一の目的は、ＬＮ２のような極低温流体内での長期間貯蔵である。第二の目的は、生物学的に生存可能な細胞を加温後に回復させることである。しかしながら、ガラス化剤は細胞が温められるときに細胞に対して有害であることが多い。従って、脱水及び加温（氷は形成されないので、「解凍」ではない）中に細胞をガラス化剤に曝す時間は、細胞の損傷を避けるために注意深く制御しなければならない。
【０００７】
ゆっくりした冷却速度は、ガラス化剤の高く且つ比較的有害性のある濃度例えば６０％ｗ/ｗＣＰＡ濃度を必要とする。急速冷却速度においては、低く且つ有害性が少ない濃度が使用され得る。１０６℃／分以上の冷却速度を得ることができる場合には、ガラス化は、凍結保護物質を全く使用しないで行なうことができる。
【０００８】
急速に冷却することが望ましく、速ければ速いほど良い。生物標本をＬＮ２内へ直接浸すことは、急速な冷却が達成されるが、生物標本を汚染に曝すかも知れない。市販によって入手可能な液体窒素は細菌種及び真菌種を含んでいるかも知れず、これらは加温すると生存可能である。更に、ガラス化された細胞は、ＬＮ２内に配置されているウイルス性病原体によって感染され得る。
【０００９】
感染の可能性は、生物標本が容器内に配置されており且つＬＮ２内で冷却される前にシールされている閉鎖型極低温容器の開発を導いてきた。極低温容器はまた、長期貯蔵中に生物標本を病原体を含む極低温流体から隔離する貯蔵容器としても機能する。
【００１０】
可能な最も急速な冷却速度を直接浸漬型の開口型極低温容器か閉鎖型極低温容器のどちらによっても達成することに対する制限のうちの一つは、最初の温かいガラス化装置がＬＮ２と接触することによって該装置周囲に絶縁窒素蒸気コーティングの発生がもたらされることである。この蒸気バリアは、液体窒素が温かい標本と接触する際の液体窒素の沸騰によって生じる。これはライデンフロスト効果として知られている。窒素蒸気は冷却速度を著しく遅くさせる熱絶縁体である。ライデンフロスト効果が減じられるか又は排除された場合には冷却速度はより速くなり、有害性がより少ないガラス化剤を使用することができ、これはより良好な医学結果につながる潜在的可能性がある。
【００１１】
従って、ライデンフロスト効果を克服することによって、ガラス化中の生物標本の冷却速度を増すための方法及び装置が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願第１２／２６７７０８号
【発明の概要】
【００１３】
本発明を理解するためのガイドとして本発明の概要を述べる。本概要は必ずしも本発明の最も包括的な実施例又はここに開示されている本発明の全ての種類を記載していない。
【００１４】
改良されたガラス化冷却装置及び方法
ここに記載されている発明は、ガラス化におけるライデンフロスト効果を排除するか又は減らした冷却装置及び方法からなる。冷却極低温流体が飽和液（例えば，ＬＮ２）である場合には、沸騰によって発生した蒸気を強制的に移動させるために速い極低温流体速度が使用される。極低温流体が冷媒によって冷却された過冷却液体である場合には、極低温流体の温度を極低温流体を凍結させることなく制御するための簡単な機構が説明されている。
【００１５】
本発明の一つの実施例においては、飽和極低温流体は、外側が室温に曝されている閉鎖型ジュワー瓶内に保持されている。周囲の加温はジュワー瓶を加圧し、この圧力によって、飽和極低温流体がジュワー瓶から液体ジェットとして押し出される。このジェットは、ガラス化装置上へ導かれて発生した蒸気を強制的に移動させ、ライデンフロスト効果の形成が防止される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２つの従来技術によるガラス化装置を示している概略図である。その第一は閉鎖型装置であり、その第二は開放型担持具である。
【図２】本発明による閉鎖型ガラス化装置を示している概略図である。
【図３】ガラス化装置上のライデンフロスト効果及びそれを緩和する機構を示している概略図である。
【図４】圧力を極低温流体速度に変換することができる方法を示している概略図である。
【図５】２つのタイプの開放型の接触装置を示している概略図である。
【図６】槽型の接触装置を示している概略図である。
【図７】飽和極低温流体を含んでいる本発明のジュワー瓶の構造を示している概略図である。
【図８】窒素の蒸気圧と温度との関係を示している概略図である。
【図９Ａ】閉鎖型接触器の構造を示している概略図である。
【図９Ｂ】閉鎖型接触器と共に使用するためのクランプを示している概略図である。
【図１０】接触器が開放型極低温容器内の生物標本をガラス化するために使用され得る方法を示している概略図である。
【図１１】集束／発散ノズルを備えた接触器が閉鎖型極低温容器内の生物標本をガラス化するために使用され得る方法を示している概略図である。
【図１２】括れ作用を呈する接触器が閉鎖型極低温容器内の生物標本をガラス化するために使用され得る方法を示している概略図である。
【図１３】極低温容器内の標本を、接触器及び液体窒素の自己加圧型ジュワー瓶を使用してガラス化する方法を示している概略図である。
【図１４】２つのリザーバを備えているジュワー瓶の構造を示している概略図である。第一のリザーバは、ジュワー瓶を加圧する飽和極低温流体のためのものである。第二のリザーバは、生物標本をガラス化するために使用される過冷却極低温流体のためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の詳細な説明は、本発明の種々の実施例及び特徴を開示している。これらの実施例及び特徴は、例示のためのものであり且つ限定的なものではないことを意味している。
【００１８】
本明細書で使用されているように、温度を除いて、特に別途指示されていない限り、「約」という用語は所与のパラメータ値の±２０%以内であることを意味している。温度については、「約」という用語は所与の値の±２℃であることを意味している。
【００１９】
種々の生物細胞が、本発明を使用して無菌凍結保存（ガラス化）することができる。一つの種類の細胞は、精子、卵母細胞、胚、桑実胚、胚盤胞及びその他の初期胎細胞のような哺乳動物生育細胞である。これらの細胞は、補助生殖処置中に凍結保存される。もう一つ別の種類は、再生医療において使用される幹細胞である。最も広い範疇は、本発明によって得られる冷却速度でガラス化できる細胞又は細胞群である。
【００２０】
ガラス化装置
ガラス化装置として使用される極低温容器は、本発明による利点を得ることができる広範囲の設計に亘るものである。例示的な極低温容器を以下に説明する。
【００２１】
図１は、極低温容器管１０２を備えている例示的な極低温容器１００の略管状要素の長手方向断面図である。この装置は、生物標本を極低温容器管内へ引き込むために真空吸引を使用している。極低温容器管の両端は最初は開いている。注射器（図示せず）が極低温容器管の第一の開口部１０４に取り付けられている。注射器は真空を形成しており、この真空によって、生物標本１０６が極低温容器管の第二の開口部１０８内へ引き込まれる。生物標本は、ガラス化剤１１０と１つ以上の細胞１１２とからなる。物品１２０を参照すると、次いで、極低温容器管の両端が加熱され且つクリンプされて無菌シール１２２及び１２４が形成される。このようにして、生物標本１２６を含んでいる極低温容器が冷却のために準備される。
【００２２】
図１の物品１４０は、ガラス化のための開放型担持具を示している。該担持具は、軸１４４に取り付けられている把手１４２を備えている。軸１４４は、装填片持ち梁１４６に取り付けられている。生物標本１４８は該片持ち梁上に配置されている。
【００２３】
図２は、例示的な極低温容器の略管状部材の長手方向断面図であり、この極低温容器は変形可能な壁を有している。このような壁は形状記憶材料からなる。この極低温容器は、「形状が変化するガラス化装置（ｓｈａｐｅ−Ｓｈｉｆｔｉｎｇ  Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ）」という名称の同時係属中の米国特許出願第１２／２６７７０８号に更に詳しく説明されている。該米国特許出願及びそれの全ての一部断続出願は、これに言及することによって本明細書に参考として組み入れられている。
【００２４】
極低温容器は、シャトル２００とシース２２０とを備えている。シャトル２００は、チャネル２０６を提供するために、端部に切断された切り目２０４を備えた管２０２からなる。生物標本２０８はチャネル上に配置されている。
【００２５】
シースは管状本体２２２を備えており、管状本体２２２の第一の端部２２４は熱シールされている。第二の端部２２６は開口している。生物標本の位置に対応するシースの部分は変形可能である。従って、シャトルがシース内に装填された後に、該変形可能な部分はクリンプされて生物標本と接触するようになされている。このことにより、前記の生物標本に対する熱伝達率が増大する。この変形可能な壁が形状記憶材料である場合には、極低温容器が温められたときに、該壁はクリンプされない形状に戻る。これによって、生物標本の取り出しが容易になる。
【００２６】
物品２４０は組み立てられ且つシール（２４２）されているがクリンプ前のシャトル及びシースを示している。
【００２７】
物品２６０は、極低温容器の、装填及びシール直後の断面Ａ−Ａにおける断面図である。生物標本２６２は空気２６４によって包囲されている。物品２８０はクリンプ後の同じ断面図である。このようにして変形可能な壁の主要部分２８２が生物標本と接触する。従って、生物標本への熱伝達率は、冷却中と加温中との両方において増大せしめられる。
【００２８】
熱伝達
図３は、一般的な手段によってＬＮ２の槽内へ浸されるように極低温容器が作用する方法を示している。
【００２９】
物品３００は、生物標本３０６を含んでいる極低温容器３０２の一部分内への熱伝達の力学を示している。浸漬はＬＮ２の静止プール３０４内に対して行なわれる。極低温容器は浸漬前は２０℃の室温中にある。ＬＮ２が相対的に極めて高温の極低温容器表面３０８と接触すると、最初にＬＮ２が蒸発せしめられて極低温容器を取り巻いている蒸気雲３１０（停滞ガス）が形成される。それに続く熱伝達が、極低温容器の蒸気によって被覆された面３１２から停滞蒸気を介して極低温流体と接触している反対側の面３１４へと生じる。停滞ガスは、窒素蒸気であり且つ熱絶縁体であり、これは低い熱伝導率につながる。これは所謂ライデンフロスト効果である。極低温容器の冷却速度は、熱が停滞ガス層を横切って伝導され得る速度によって制御される。
【００３０】
極低温容器の外径をＤとすると、次いで、熱伝達領域の長さ３１６は生物標本のフットプリント３１８よりも約２Ｄだけ広いと評価できる。本明細書に記載されている急速冷却方法は、熱伝達領域全体に適用されるのが好ましい。
【００３１】
本発明によると、ライデンフロスト効果は、極低温流体が極低温容器全体を覆って高速で流される場合に減少させることができる。極低温流体の速度は、極低温容器の主軸線３２０及び３２２に沿ったいずれの向きとすることもできる。別の方法として、極低温流体は、極低温容器を横切って横方向３２４へ流れるか又は横方向の流れと長手方向の流れとを適切に組み合わせた方向へ流れるように付勢することができる。
【００３２】
物品３４０は、流動する極低温流体３４４（「流入する流れ」）を使用したガラス化装置３４２の冷却を示している。物品３４６は流動している極低温流体内の制御体積を示しており、この制御体積は熱伝達領域３４８と等しい長さを有している。極低温流体の流れの噴流特性により、前記の制御体積の面３５０を横切る熱伝達又は質量移動が存在しないことが仮定できる。温かい極低温容器は制御体積内を流動する極低温流体３５２を加熱する。従って、極低温容器からの熱の全てが、極低温流体の流れ３５４（“流出する流れ”）内の制御体積を出て行く。極低温容器の面３５６を横切る極低温流体の流れは対流による熱伝達を惹き起す。このモードの熱伝達は、停滞ガスの層を介する伝導よりも優れている。極低温容器によって放出される熱は全て流出する流れ内の制御体積を出て行く。
【００３３】
本発明は、ガラス化させるのにかかる時間の間、何百回も制御体積の内容物を入れ替える速度を有している流入する流れを想定している。沸騰した蒸気は、この速度によって生じるモーメント及び剪断力によって制御体積から移動せしめられるだろう。流れが乱流であるためには、少なくとも１，０００以上のレイノルズ数が適している。
【００３４】
極低温流体の速度
図４は、極低温流体を必要な速度まで加速するための方法を示している。極低温流体４０４を備えている容器４０２は、周囲４１０の圧力４０８よりも高い圧力４０６にある。この容器から管４１２がつながっており、管４１２は、周囲へと移す出口４１４を備えている。容器内の圧力によって、極低温流体は、速度４１６で管内を流れ且つ周囲へと出て行く。出口での流体の速度は、容器の圧力及び管内の摩擦損失に依存する。
【００３５】
極低温流体がＬＮ２のような飽和流体である場合には、そのうちの幾らかは、管内を通るときに急速に気化して蒸気となってもよい。この気化は、管を絶縁４１８し、その長さ４２４を短く保ち、流体の動きによる摩擦損失を最少にし、プラスチックのような低熱伝導性材料を使用することによって、最少化することができる。該装置は、ＬＮ２の大部分が、生物標本を含む極低温容器を通過するときに蒸気の形態である場合でさえ有効である。
【００３６】
極低温流体を加速するためのもう一つの方法は、高速のガス状の非凝縮な流れ（例えば、ヘリウム）を極低温流体と接触させることである。この接触によって、ガス状の流れと極低温流体とが移動する飛沫同伴する流れを形成するように付勢される。
【００３７】
飽和極低温流体を備えた容器は、気化させて蒸気とさせる傾向と引き替えに高速の極低温流体を形成するであろう。従って、容器の圧力は、実験によって、極低温容器の所与の幾何学的構造のための熱伝達の最適値を付与して過度の急速な気化をすることなく速度が速くなるように調整することができる。
【００３８】
開口型接触器装置を使用した極低温流体の接触
図５は、高速の極低温流体を極低温容器と接触させるための開口型接触器装置を示している。
【００３９】
物品５００は、極低温流体速度発生源５０４に近接した極低温容器５０２を示している。極低温流体速度発生源は極低温流体を所望の方向に流れさせることができる装置である。一つの例は、出口管を備えた加圧容器である。極低温流体の流れ５０６は、熱伝達領域の５〜１０倍の好ましい直径を有している噴射の形態である。熱伝達領域の１．５〜３倍の直径であるのが更に好ましい。極低温流体の流れは、熱伝達領域上に導かれて該極低温容器を冷却し且つその内容物のガラス化を行なう。極低温流体の流れは、ガス、過冷却液体、飽和液体又はこれらの混合物とすることができる。複数の極低温流体の流れが存在して、極低温容器の周囲を完全に覆うことを確保しても良い。一つの例は、２つの対向する流れ５０６及び５０８である。ガラス化の後に、極低温容器は長期保存のために極低温流体の槽内に配置される。
【００４０】
物品５２０は、ある角度に傾けられている極低温容器５２２を示している。適切な角度は水平から２°〜４５°の範囲内である。極低温容器の遠位先端を包囲しているのは三面包囲体５２４であり、これはチャネル５２６を形成している（図Ａ−Ａ）。該チャネルの適切な幅及び高さは、極低温容器の直径の１．５〜１０倍である。速度発生源５２８からの液体の極低温流体は凍結の流れ５３０を形成しており、該極低温流体の流れは、熱伝達領域において又はその近くで極低温容器にぶつかる。極低温流体の流れの流量は、極低温容器を完全に浸漬させ且つこれを冷却し且つその内容物をガラス化させるチャネル流５３２（図Ａ−Ａ）を形成するのに十分な流量である。ガラス化の後に、極低温容器は長期保存のために極低温流体の槽内に配置される。
【００４１】
図６は、液体極低温流体６０２を含んでいる開口容器６００を示しており、極低温流体６０２は過冷却液体又は飽和液体とすることができる。該容器には撹拌装置が取り付けられており、該撹拌装置はモーター６０４を備えており、該モーターはシャフト６０６に結合されており、シャフト６０６が撹拌機６０８に結合されている。回転する撹拌機は、該容器の内容物を矢印６１０によって示されているように流れさせる。形成される流れパターンの特性は代替の攪拌装置と異なっていても良い。ポンプによって駆動される外部再循環ループが好適な代替である。磁気撹拌装置もまた適している。重要な要素は容器の領域内での流体速度である。浸漬前に、極低温容器６１２は、熱伝達領域を極低温流体の面に近づけて配向される。次いで、極低温容器は、極低温流体内に熱伝達領域が浸漬される深さ６１４まで浸漬される。極低温流体に曝されると、極低温容器の内容物がガラス化される。極低温流体が飽和液体である場合には、開口容器内の極低温流体速度はライデンフロスト作用を最少化させる。
【００４２】
生物標本を保管するために開口した極低温容器を使用してガラス化するとき、極低温流体速度は制限されなければならない。これは生物標本が、坦持部材から極低温流体内へ移動するのを防止するためである。
【００４３】
飽和極低温流体ジュワー瓶
図７は、極低温流体の高速の流れを発生させるための加圧容器の使用方法を示している。飽和極低温流体（例えばＬＮ２）の容器を加圧する一つの方法は、極低温流体をシールされた容器例えば閉鎖型ジュワー瓶７００内に配置して極低温流体に周囲の熱を吸収させることである。次いで、周囲の熱によって極低温流体の一部分が蒸発せしめられてヘッドスペースの圧力が上昇せしめられる。
【００４４】
ジュワー瓶は、頂部アセンブリ７０２とボトル７０４とを備えている。頂部アセンブリは、放出弁７０６と、吹出し弁７０８と、出口管７１０と、圧力解放弁７１２とを備えている。ボトルは、ＬＮ２  ７１６を含んでいるチャンバ７１４と、窒素蒸気を含んでいるヘッドスペース７１８を備えている。ボトルの壁７２０は、真空絶縁された二重壁である。真空はボトルの内容物を熱的に絶縁している。ボトルの外側は、ユーザーの手を低温から保護するために絶縁７２２されても良い。放出弁には浸漬管７２４が結合されており、浸漬管７２４はＬＮ２を抜き出すためにボトル内へ伸長している。頂部アセンブリは、ねじが切られている結合部７２６によってボトルに結合されている。
【００４５】
ジュワー瓶を使用するためにアセンブリ同士が最初に分離される。多量のＬＮ２がボトル内に注がれて液面７２８が形成される。次いで、頂部アセンブリがボトル上にねじ込まれる。
【００４６】
圧力解放弁は、２つの設定すなわち“抜き取り”設定と“加圧”設定とを有している。抜き取り設定においては、圧力解放弁は開放されておりヘッドスペースの圧力は周囲圧力７３０と同じである。加圧設定においては、圧力解放が設定され、次いで、周囲熱がＬＮ2によって吸収され且つＬＮ２が蒸発するとヘッドスペースは加圧される。ヘッドスペースの圧力７３２は、圧力解放弁の設定点に達するまで上昇する。次いで、圧力解放弁は過剰圧力７３４を解放し、ＬＮ２を一定の圧力に維持する。十分絶縁された状態では、手持ちのジュワー瓶は、蒸発するＬＮ２の量を最少化することによって一日中ジュワー瓶の設定点圧力を維持することができる。
【００４７】
ＬＮ２をジュワー瓶から分配７３６するために、放出弁７０６が開かれてヘッドスペースの圧力によってＬＮ２  ７３８が浸漬管内を上方へ付勢されて出口管から押し出される。
【００４８】
流動しているＬＮ２の流れの重要な特性は、液体窒素と蒸気窒素との相対的な比率である。液体窒素が高い比率を有することが望ましい。このことを達成するために、ジュワー瓶の設計は、低い熱伝導率及び／又は熱容量のプラスチック又はこれに類似の材料を浸漬管及び出口管のために使用して、最少量のＬＮ２が前記管を冷却する際に沸騰せしめられるようにすべきである。出口管の長さ７４０もまたこの寄生性の加熱を制限するために最小に維持されるべきである。ボトルから周囲への液体通路全体は、流体の動きによる摩擦損失を最少化すべきである。出口の流れの液体内容物の全体量は８０体積％を越えてもよい。
【００４９】
寄生性の加熱を減らすためには、吹出し弁７０８は、ガラス化期間毎の間は、開放状態にしたままとすることができる。次いで、冷たいガス状窒素の少量の流れが出口管内を流れて該出口管を冷却する。この流れはまた、周囲の空気が出口管内へ逆流するのを防止する。空気は湿気を含んでおり、この湿気は、冷たい表面上で凍結し且つ潜在的に遮断を生じさせ得る。
【００５０】
幾つかの実施例においては、ガス状窒素を出口管内を通して分配することが好ましいかもしれない。これは、ＬＮ２ではなくヘッドスペースから吸い出す比較的短い浸漬管を使用することによって容易に達成される。
【００５１】
典型的な極低温容器内に保持されている典型的な生物標本のガラス化のために、約４０グラムのＬＮ２が消費されてもよい。出口管を冷却された状態に保ち且つ周囲の空気を抜き出した状態に保つための吹出し窒素の消費量は１時間当たり２５グラムであってもよい。複数の標本をガラス化する典型的な研究室は、他方が使用されている間に一方にＬＮ２を再充填するようになされた２つの器具を必要ととしてもよい。
【００５２】
図８は、ＬＮ２の蒸気圧と温度との関係を示している。図７の極低温容器の圧力解放値が１バール（１００ｋＰａ）の絶対圧で通気するように設定されている場合に、対応する温度８０２は、ＬＮ２の通常の沸点−１９６℃である。圧力解放弁が、１．６バール（１６０ｋＰａ）に設定されている場合には、ボトル内のＬＮ２は８０４の−１９２℃まで温まる。より高い温度８０６、８０８は、より高い加圧設定によって達成することができる。第二の極低温流体例えばプロパン又はオクタフルオロプロパンが同じジュワー瓶内に保持されている用途（下記参照）に対しては、より高い温度が必要とされるかも知れない。第二の極低温流体が凍結しないようにするには、これより高い温度が必要である。
【００５３】
閉鎖型接触器を使用した極低温流体接触
図９Ａは、閉鎖型接触器装置９００の断面図であり、接触器９００は、円筒形本体９０２と、極低温流体入口９０４と、極低温容器開口部９０６と、排出口９０８とを備えている。前記入口は、極低温流体の流れを受け入れるようになされている。前記開口部は、極低温容器を接触器内へ受け入れることができるようになされている。本体は、極低温容器が開口部を通して装填されるときに極低温流体を極低温容器へ導くようになされている。排出口は、極低温容器が前記開口部を通して装填されるときに、極低温流体を極低温容器から導き出すようになされている。
【００５４】
接触器の全長９１０は約６ｃｍである。排出口の長さ９１２は同様に約６ｃｍである。円筒形本体は軸線９１４を有している。円筒形本体の内径９１６は約１．７ｃｍである。円筒形本体の適切な内径は極低温容器の直径の１．５〜１０倍の範囲内とすることができる。極低温容器の適切な直径は、１００ミクロン〜２．５ｍｍの範囲内とすることができる。例えば極低温容器の直径が２ｍｍである場合には、円筒形本体の適切な内径は３ｍｍであろう。
【００５５】
円筒形本体は更に、ブシュ９１８とスリーブ９２０とを備えている。スリーブの軸線９２２は、円筒形本体の軸線と一致していても良いし又はずれているか若しくはある角度をなしていても良い。スリーブの内径と極低温容器との間のクリアランスは最小に保たれるべきである。しかしながら、このクリアランスは、極低温容器の容易な進入及び引き出しを許容するのに十分でなければならない。
【００５６】
円筒形本体の断面は円形、四角形又はその他の適当な形状とすることができる。円筒形本体の断面が円形と異なっている場合には、本体の“内径”は、その断面を横切る最小の距離である。同様に、極低温容器の開口部が非円形である場合には、開口部の“内径”は、その断面を横切る最短距離を指す。
【００５７】
これらの部品を製造するための材料は、極低温温度に適したものであるべきである。極低温容器の熱伝達領域の上流で極低温流体と接触する構成部品は、低い熱伝導率と小さい熱容量を有してもよい。プラスチックはこれらの特性を有している。スリーブは、ガラス化装置の周囲をクランプすることを許容するほどの可撓性を有している必要がある。スリーブのための適切な材料はポリテトラフルオロエチレンである。
【００５８】
図９Ｂを参照すると、クランプ９４０は、掴み具９４４を備えている本体９４２を有しており、掴み具９４４は、ばね９４６によって閉じた状態に保たれている。把手９４８及び９５０を同時に動かすことによって掴み具は開かれる。
【００５９】
図９Ａを参照すると、接触器の本体は、極低温流体の入口において流動する極低温流体の発生源（図示せず）に取り付けられている。矢印９２４は、接触器内を流れる極低温流体の一般的な流れを示している。円筒形本体に取り付けられる極低温流体供給管の直径は、前記円筒形本体の直径よりも著しく大きくすることができる。極低温流体供給管は、径違いユニオン継手によって円筒形本体に取り付けられる。これによって、圧力の低下従って極低温流体供給リサーバから閉鎖型接触器装置への急速な気化（極低温流体が飽和している場合）が最少化される。
【００６０】
ガラス化させるために、極低温容器の端部がスリーブを通して挿入される。この容器は、熱伝達領域が極低温流体の一般的な流れ内に浸漬される位置に配置されるまで挿入される。定位置に配置された状態では、クランプの開いている掴み具はスリーブの周囲の位置９２６に配置される。クランプの把手が解放され、これによって掴み具はスリ―ブを挟んで極低温容器に係合することが可能となる。極低温容器をスリーブにクランプする目的は、極低温流体が流れるときに極低温容器がスリーブから押し出されないように保つことである。しかしながら、クランプされたスリーブは、蒸気密又は液体密である必要はない。他の適当なクランプを使用することもできる。
【００６１】
極低温容器が定位置に配置されると、極低温流体の流動が開始され、生物標本がガラス化される。極低温流体は、ガス、過冷却液体、飽和液体又はこれらの組み合わせとすることができる。ガラス化の後に、クランプが解放され、極低温容器は長期極低温貯蔵状態に置かれる。
【００６２】
図１０〜１２は、閉鎖型接触器の設計の種々の実施例を示している。全ての場合において、極低温流体入口は極低温流体発生源に取り付けられ、極低温流体発生源は、ガス、過冷却液体又は飽和液体のいずれかとすることができる。更に、これらの実施例の例示においては上記した種々のガラス化装置を係合させることができる。
【００６３】
図１０は、開口型ガラス化装置１００２が装填されている接触器１０００を示している。露出された生物標本１０１０の繊細な特性のために、容器には極低温流体入口に制限オリフィス１００４も設けられてもよい。極低温流体発生源は同じくガスとすることが好ましい。分配された極低温流体１００６は、矢印１００８によって示されているように接触器を横切る。極低温流体の流れは、開口担持部材と接触して生物標本をガラス化させる。
【００６４】
図１１は、閉鎖型ガラス化極低温容器が装填されている接触器１１００を示している。集束／発散ノズル１１０２は、流入する極低温流体の流れを熱伝達領域の近く１１０６できわめて幅の狭い環状の流れに整形する１１０４設計とされている。速度への変換のための圧力を保つために、滑らかな移行部１１０８が熱伝達領域の両側に必要とされる。極低温流体の流れ１１１０によって生物標本１１１２がガラス化される。ガラス化極低温容器とノズルとの間の隙間は０．２〜１．５ｍｍとすることができる。上流の圧力は、周囲より０．２〜３バール（２０〜３００ｋＰａ）高くても良い。排出口内の圧力１１１４は周囲の圧力である。従って、実際には圧力低下の全てがノズルにおいて起こる。熱伝達領域での極低温流体の速度は、毎秒０．５〜２５メートル（ｍ／ｓ）とすることができる。この速度は、ライデンフロスト効果の形成を防止するのに十分な速度である。
【００６５】
接触器本体の軸線は、極低温容器用の開口部の軸線とほぼ一致させて、極低温容器が該開口部を通して挿入されたときに熱伝達領域を集束発散ノズルの狭い通路に配置させることができるようになされている。
【００６６】
図１２は、閉鎖型ガラス化極低温容器１２０２が装填されている接触器１２００を示している。流動オリフィス１２０４が、流入する極低温流体の流れを熱伝達領域の近くの下流の括れ部１２０８に向かって整形するように設計されている１２０６。極低温流体の流れ１２１０によって生物標本１２１２がガラス化される。
【００６７】
図１３は、ＬＮ２を含んでいるジュワー瓶１３０４に取り付けられた（１３０６）接触器１３０２を示している。ガラス化の前に、吹出し弁１３０８からの冷たいガス状窒素ガスは出口管１３１０内を移動する。これによって接触器は冷却されて寄生性の加熱を制限される。この流れはまた、湿気を含んでいるかも知れない周囲空気が排出口１３１２又は極低温容器の開口部１３１４から接触器へ入るのを防止している。
【００６８】
ガラス化中に、極低温容器は開口部を通して配置され、ＬＮ２は放出弁１３１６を開けることによって放出される。出口管内のＬＮ２の速度１３１８は、熱伝達領域内での速度１３２０に比して比較的遅い。このことは、ジュワー瓶から接触器への圧力低下を減じるので極めて望ましい。ジュワー瓶のヘッドスペース内の圧力は、熱伝達領域内のＬＮ２の速度が少なくとも０．５ｍ／ｓであるように十分高く設定されている。
【００６９】
ダブルチャンバ型ジュワー瓶
図１４は、飽和極低温流体のジュワー瓶が過冷却された極低温流体を分配するために使用され得る方法を示している。例示的な過冷却極低温流体はプロパンであり、プロパンは−４２℃の沸点と−１８８℃の凝固点とを有している。プロパンは、その凝固点よりほんの少し高くまで冷却される場合に、ライデンフロスト効果の最少の可能性を有する流動極低温流体として使用することができる。
【００７０】
物品１４００はダブルチャンバ型のジュワー瓶であり、該ジュワー瓶においては、第一のチャンバ１４０２はＬＮ２のためのリザーバとして機能する。第二のチャンバ１４０４は過冷却されたプロパンのためのリザーバとして機能する。２つのリザーバのヘッドスペース同士は、相互に物理的に連通していて内部の圧力がほぼ等しくされている。第一のリザーバと第二のリザーバとはまた、熱的にも相互に連通していてそれらの温度がほぼ等しくされている。
【００７１】
圧力解放弁１４０６は、ＬＮ２の温度がプロパンの凝固点より少し高くなるようにヘッドスペースの圧力を上昇させる設定点を有している。２バール（２００ｋＰａ）絶対圧が適切な圧力である（８０６、図８）
【００７２】
プロパンガス発生源１４０８は、第二のチャンバに装填するためにジュワー瓶の出口１４１０に取り付けられる。吹出し弁１４１２が開かれ、該弁はプロパンガスが蒸気浸漬管１４１４を通して第二のチャンバへ流入するのを可能にする。比較的重いガス状のプロパンはガス状の窒素を移動させ且つ凝縮して液体１４１６となって第二にチャンバ内に溜まる。プロパンの充填を制御するために外部の重量計を使用することができる。充填が完了するとプロパン発生源は分離される。
【００７３】
この状態で、蒸気浸漬管はヘッドスペース内のガス状の窒素と連通しており、従って、吹出し弁はその機能を取り戻して窒素ガスの吹出しを提供する。
【００７４】
液体プロパンを計量分配するために、ヘッドスペース内の圧力１４１８は、液体プロパン１４２０を付勢して浸漬管１４２２内を移動させ且つ放出弁１４２４を通過させ且つ出口管１４２６へと移動させる。接触器を出口においてジュワー瓶に取り付けることができ、液体プロパンによるガラス化を可能にしている。
【００７５】
プロパンは、引火性の物質である。適切な非引火性の極低温流体はオクタフルオロプロパン（Ｒ２１８）であり、オクタフルオロプロパンは−３７℃の沸点と−１８３℃の凝固点とを有する。オクタフルオロプロパンは、極低温流体の凍結を防止するために３．５バール（３５０ｋＰａ）絶対圧のヘッドスペース圧力を必要とする（８０８、図８）
【００７６】
結論
以上、１つ以上の異なる例示的な実施例に関して本開示を説明したが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく種々の変更を施し且つ等価物を本開示の構成要素と置換することができることがわかるであろう。更に、多くの変形例を本開示の基本的な範囲または教示から逸脱することなく特別な状況に適合するようにすることができる。従って、本開示は、本発明を実施するために考えられたベストモードとして開示されているこれらの特別な実施例に限定されないことが意図されている。
【符号の説明】
【００７７】
１００  極低温容器、
１０２  極低温容器管、
１０４  第一の開口部、
１０６  生物標本、
１０８  第二の開口部、
１１０  ガラス化剤、
１１２  細胞、
１２０  物品
１２２，１２４  無菌シール、
１２６  生物標本、
１４０  物品
１４２  把手、
１４４  軸、
１４６  装填片持ち梁、
１４８  生物標本、
２００  シャトル、
２０２  管、
２０４  切り目、
２０６  チャネル、
２０８  生物標本、
２２０  シース、
２２２  管状本体、
２２４  第一の端部、
２２６  第二の端部、
２４０  物品
２４２  シール
２６０  物品
２６２  生物標本、
２６４  空気、
２８０  物品
２８２  壁の主要部分、
３００  物品
３０２  極低温容器、
３０４  静止プール、
３０６  生物標本、
３０８  極低温容器表面、
３１０  蒸気雲、
３１２  蒸気によって被覆された面、
３１４  反対側の面、
３１６  熱伝達領域の長さ、
３１８  生物標本のフットプリント、
３２０，３２２  極低温容器の主軸線、
３２４  横方向
３４０  物品
３４２  ガラス化装置、
３４４  流動する極低温流体、
３４６  物品
３４８  熱伝達領域、
３５０  制御体積の面、
３５２  極低温流体、
３５４  極低温流体の流れ、
３５６  極低温容器の面、
４０４  極低温流体、
４０２  容器、
４０８  圧力
４０６  圧力
４１０  周囲
４１２  管、
４１４  出口、
４１６  速度
４１８  絶縁
４２４  長さ
５００  物品
５０２  極低温容器、
５０４  極低温流体速度発生源、
５０６  極低温流体の流れ、
５０６，５０８  ２つの対向する流れ、
５２０  物品
５２２  極低温容器、
５２４  三面包囲体、
５２６  チャネル、
５２８  速度発生源、
５３０  凍結の流れ
５３２  チャネル流
６０２  極低温流体、
６００  開口容器、
６０４  モーター、
６０６  シャフト、
６０８  撹拌機、
６１０  矢印
６１２  極低温容器、
６１４  深さ、
７００  閉鎖型ジュワー瓶、
７０２  頂部アセンブリ、
７０４  ボトル、
７０６  放出弁、
７０８  吹出し弁、
７１０  出口管、
７１２  圧力解放弁、
７１４  チャンバ、
７１６  ＬＮ２、
７１８  ヘッドスペース、
７２０  ボトルの壁、
７２２  絶縁
７２４  浸漬管、
７２６  結合部、
７２８  液面、
７３０  周囲圧力、
７３２  ヘッドスペースの圧力、
７３４  過剰圧力
７３６  分配
７３８  ＬＮ２、
７４０  出口管の長さ
８０２  温度
８０４  温まる
８０６、８０８  温度
９００  閉鎖型接触器装置、
９０２  円筒形本体、
９０４  極低温流体入口、
９０６  極低温容器開口部、
９０８  排出口、
９１０  接触器の全長、
９１２  排出口の長さ、
９１４  円筒形本体の軸線、
９１６  円筒形本体の内径、
９１８  ブシュ、
９２０  スリーブ、
９２２  スリーブの軸線、
９２４  矢印
９２６  位置
９４０  クランプ、
９４２  本体、
９４４  掴み具、
９４６  ばね、
９４８，９５０  把手、
１０００  接触器、
１００２  開口型ガラス化装置、
１００４  制限オリフィス、
１００６  極低温流体、
１００８  矢印
１０１０  生物標本、
１１００  接触器、
１１０２  集束／発散ノズル、
１１０６  熱伝達領域の近く
１１０８  滑らかな移行部、
１１１０  極低温流体の流れ、
１１１２  生物標本、
１１１４  排出口内の圧力、
１２００  接触器、
１２０２  閉鎖型ガラス化極低温容器、
１２０４  流動オリフィス、
１２０６  成形するように設計
１２０８  括れ、
１２１０  極低温流体の流れ、
１２１２  生物標本、
１３０２  接触器、
１３０４  ジュワー瓶、
１３０６  ジュワー瓶に取付け
１３０８  吹出し弁、
１３１０  出口管、
１３１４  極低温容器の開口部、
１３１６  放出弁、
１３１８、１３２０  速度
１４００  物品
１４０２  第一のチャンバ、
１４０４  第二のチャンバ、
１４０６  圧力解放弁、
１４０８  プロパンガス発生源、
１４１０  ジュワー瓶の出口、
１４１２  吹出し弁、
１４１４  蒸気浸漬管、
１４１６  液体
１４１８  ヘッドスペース内の圧力
１４２０  液体プロパン、
１４２２  浸漬管、
１４２４  放出弁、
１４２６  出口管
【図１】
2011511623.tif 000003
【図２】
2011511623.tif 000004
【図３】
2011511623.tif 000005
【図４】
2011511623.tif 000006
【図５】
2011511623.tif 000007
【図６】
2011511623.tif 000008
【図７】
2011511623.tif 000009
【図８】
2011511623.tif 000010
【図９Ａ】
2011511623.tif 000011
【図９Ｂ】
2011511623.tif 000012
【図１０】
2011511623.tif 000013
【図１１】
2011511623.tif 000014
【図１２】
2011511623.tif 000015
【図１３】
2011511623.tif 000016
【図１４】
2011511623.tif 000017
【国際調査報告】
2011511623.tif 000018
2011511623.tif 000019
2011511623.tif 000020
2011511623.tif 000021
2011511623.tif 000022