(57)【要約】  本発明は、Ｍ１３ファージのｐＩＸを使用して、非抗体足場タンパク質融合を産生するためのｐＩＸファージ提示ライブラリを作成し、使用するための組成物及び方法に関する。
2011507529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子に選択的に結合するファージ提示融合タンパク質を発現するための操作された組み換え核酸ファージベクターであって、
ａ．以下に作動可能に連結する、組み換えファージリーダーコード核酸配列と、
ｂ．以下に作動可能に連結する、組み換え制限部位と、
ｃ．ａに作動可能に連結する、ペプチドリンカーコード核酸配列と、
ｄ．生体分子に選択的に結合する非抗体足場タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含む、操作された組み換え核酸ファージベクター。
【請求項２】
前記生体分子が、上皮成長因子受容体である、請求項１に記載の生体分子。
【請求項３】
前記ファージリーダーコード配列が、ｐｅｌＢ配列である、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の操作された核酸ファージベクターによってコードされる非抗体足場タンパク質であって、配列番号３２〜５３、５５及び５８から選択される、非抗体足場タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の操作された核酸ファージベクターによってコードされる非抗体足場タンパク質であって、上皮成長因子受容体に結合する、非抗体足場タンパク質。
【請求項６】
前記ベクターが、前記非抗体足場タンパク質に融合される第２の外因性ペプチドをコードする、請求項１に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項７】
前記第２の外因性ペプチドが、前記生体分子に結合する、請求項６に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項８】
前記第２の外因性ペプチドが、上皮成長因子受容体に結合する、請求項７に記載の操作された核酸ファージベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の操作された核酸ファージベクターを含む、細菌性宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細菌性宿主細胞によって発現される、生物活性融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記融合タンパク質に由来する、生物活性ペプチド又はタンパク質。
【請求項１２】
請求項１に記載の複数の操作された核酸ファージベクターを含む、ファージライブラリ。
【請求項１３】
前記非抗体足場タンパク質の変異型が発現される、請求項１２に記載のファージライブラリ。
【請求項１４】
所望の生物活性を有するペプチド又はタンパク質に対し、ファージ非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリをスクリーニングするための方法であって、（ａ）請求項１３に記載のファージライブラリから前記ペプチド又はタンパク質を発現する工程と、（ｂ）前記所望の生物活性を有する前記ペプチド又はタンパク質を発現する細菌性細胞を選択する工程と、を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法から得られる、ペプチド又はタンパク質コード核酸。
【請求項１６】
生体分子への結合を媒介する配列番号２〜２３、２５、又は２８の少なくとも一部分を含む、単離された非抗体足場タンパク質。
【請求項１７】
生体分子への結合を媒介する前記部分が、上皮成長因子受容体に結合する、請求項１６に記載の単離された非抗体足場タンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載の前記非抗体足場タンパク質、及び製薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号２〜２３、２５及び２８のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチドを含む、単離された非抗体足場タンパク質。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、上皮成長因子受容体に結合する、請求項１９に記載の単離された非抗体足場タンパク質。
【請求項２１】
請求項１９に記載の前記非抗体足場タンパク質、及び製薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／０１４，７７８号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｍ１３ファージのｐＩＸを使用して、非抗体足場タンパク質融合を産生するためのｐＩＸファージ提示ライブラリを作成し、使用するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ファージ又はファージミド系における融合パートナーとしてｐＩＩＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びそれらの組み合わせを使用する糸状ファージ提示は、特に、デノボタンパク質及びペプチド単離並びに親和性成熟に関するタンパク質工学のための技術として使用されている（例えば、Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第７，０７８，１６６号を参照）。無作為ペプチド及びタンパク質は、関心のある対象のタンパク質標的に対するパニングを介してペプチド配列の変異を提示するファージライブラリから作成及び単離することができる。これまでに使用されたヒトタンパク質デノボライブラリは、合成的に作製されている。合成ライブラリにおいて、潜在的タンパク質をコードする推定上有用なＤＮＡ配列は、既知の配列又はモチーフに基づいて設計され、合成される。合成ペプチドライブラリに加えて、ライブラリはまた、ヒト組織に由来するタンパク質コードＤＮＡの組み合わせクローニングによって作製することもできる。そのようなライブラリは、潜在的に有用なペプチドを提供するため、かつ連続回のパニング及び成熟又は修飾を実行して、選択された標的タンパク質の阻害生物活性等の所望の特性を有する非抗体ペプチド又はタンパク質ペプチドを見つけることを試みるために使用されている。
【０００４】
ヒトペプチド、及び模倣タンパク質又は標的タンパク質に結合するか、若しくはそれを模倣する既知のタンパク質突然変異等のタンパク質は、ファージ提示ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩペプチドライブラリから単離されている。特定の標的に結合するいくつかのタンパク質を単離することに成功しているが、そのようなファージ提示ライブラリ法は、ライブラリ作成のプロセスを繰り返さなければならないこと、所望の特徴を有するペプチド又はタンパク質を単離するためのパニング及び成熟の必要条件、及び他の既知の制限の問題に見舞われる。そのようなファージライブラリは、ヒトに存在するペプチド多様性の範囲、アミノ酸変異の位置及び程度、並びに異なるヒト遺伝子からの生物活性タンパク質の相対存在量を完全に包含又は模倣しないという問題にも見舞われる。天然レパートリからの合成タンパク質の偏位は、人において治療用に使用される場合、好ましくない生化学的特性及び免疫原性のリスクを増加させる可能性があり、この問題には、そのようなライブラリからの選択に対して、どのようにして配列が作成され、スクリーニングされるのかということによって潜在的に対処し得る。
【０００５】
モノクローナル抗体は、標的分子に対する高親和性及び特異性が望ましい時に最も広く使用されるクラスの治療用タンパク質である。しかしながら、非抗体抗原結合ペプチド又はタンパク質は、治療法又は診断法における使用に対して高い関心のある対象であるそのような標的に結合するように操作することができる。生体分子に結合することが可能なそのようなタンパク質又はペプチドは、より小さいサイズ、ジスルフィド結合の欠如、原核宿主において発現される能力、精製の新規の方法、高い安定性、薬物／毒素への結合の容易性、及び知的財産利点等であるが、それらに限定されない、伝統的な抗体に対するいくつかの潜在的利点を有し得る。
【０００６】
１つの種類の足場は、免疫グロブリン（Ｉｇ）折り畳みである。この折り畳みは、抗体の可変領域、並びに数千もの非抗体ペプチド又はタンパク質において見られる。１つのそのようなＩｇタンパク質、ヒトフィブロネクチンからの１０番目のフィブロネクチン３型繰り返し体は、全体的なＩｇ折り畳み構造を保持しつつ、表面に露出したループにおける多数の突然変異に耐えることができるということが示されている。そのため、アミノ酸変異体のライブラリは、これらのループ、及び多数の異なる標的に選択される特定の特定の結合剤に組み込まれている。そのような操作されたＦｎ３ドメインは、重要な生物物理学的特性を保持しつつ、適度に高い親和性を伴う標的に結合することが見出されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ファージライブラリのこれまでの使用は、抗体ベースのタンパク質融合ライブラリを含んできた。しかしながら、高親和性及び活性、高生産性、良い溶液物性、及び人に投与する際の低免疫応答の傾向のヒト治療抗体の決定的要素を同時に送達する、合成の代替の足場又は非抗体推定抗原結合ペプチド又はタンパク質融合ライブラリ及び方法の必要性が存在する。非抗体ペプチド又はタンパク質発見の資源コストを低下させ、及び生物的評価のための抗体の送達を加速するために、現在の方法に対して、合成ライブラリからの非抗体ペプチド又はタンパク質単離の効率性を増加させる必要性が更に存在する。本発明のライブラリ及び方法は、総合的な設計、アセンブリ技術、及びファージｐＩＸ非抗体ペプチド又はタンパク質提示を連結することによって、これらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
先行技術の教示と対照的に、ｐＶＩＩ及びｐＩＸは、非抗体ペプチド又はタンパク質のための効率的かつ迅速な基本骨格、及び治療抗体の非抗体ペプチド又はタンパク質フラグメント作成及び選択を提供するために、例えば、任意にインライン成熟を伴う、突然変異作成又は他の多様性産生技術を使用して、Ｍ１３ファージからのｐＩＸを使用して高親和性非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリを作成するために成功裏に使用することができることが現在発見されている。本発明によると、所望の生体分子又は抗原に結合することが可能である非抗体ペプチド又はタンパク質は、任意に、代表的なヘテロ二量体モチーフにおいて、機能性非抗体ペプチド又はタンパク質を提示するために、ファージ表面上の動的相互作用において係合されるｐＶＩＩ及びｐＩＸに融合される。したがって、非抗体ペプチド又はタンパク質結合剤のファージ上の提示は、メンバーが単量体又は二量体人工非抗体ペプチド又はタンパク質種として機能し、新規又は所望の生物活性の選択を可能にすることができる、組み合わせヘテロ二量体アレイの多様なライブラリの提示及び検定のための好適かつ好ましい方法である。
【０００９】
本発明は、糸状ファージのｐＩＸタンパク質、広く使用されるｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩタンパク質と異なるファージ表面タンパク質に融合される非抗体ペプチド又はタンパク質デノボライブラリの設計及び提示を提供する。我々は、個々の足場ライブラリを別々に構築し、足場ライブラリのそれぞれの活性を系統的に検査し、抗原認識のための構造トポロジーを評価するためのファージ選択プロセスを開発した。
【００１０】
本発明は、様々な改善された新しいｐＩＸ及びｐＶＩＩファージ提示デノボライブラリ作成方法、及び（ｉ）ｐＩＸ又はｐＶＩＩファージタンパク質に融合される、設計され、提示された非抗体ペプチド又はタンパク質デノボライブラリ、（ｉｉ）Ｍ１３ファージの広く使用されるｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩと異なるファージ表面タンパク質の使用、（ｉｉｉ）非抗体タンパク質足場に融合されるペプチドのライブラリをスクリーニングするためのｐＩＸファージ提示システムの使用、（ｉｖ）抗原認識のための設計された配列及び構造トポロジーの効果の系統的検査を可能にする非抗体ペプチド又はタンパク質選択プロセス、（ｖ）ライブラリ選択の一部としての流線形親和性成熟及びインライン成熟プロセス、のうちの１つ以上であるがそれらに限定されない、構成要素を提供する。ライブラリの個々又は群のライブラリ設計、選択、最適化及び成熟のそのような新しいシステムは、非抗体ペプチド又はタンパク質デノボ発見の成功のための再現可能かつ確実なシステムを提供し、また抗原相互作用に対する非抗体ペプチド又はタンパク質の構造機能相関の理解を容易にする。
【００１１】
上述されるヒト非抗体ペプチド又はタンパク質デノボライブラリは、Ｍ１３ファージのｐＩＸ遺伝子を介する提示によって現在の抗体ライブラリ現況技術と異なる。非抗体ペプチド又はタンパク質は、本発明によると、ｐＩＸ融合タンパク質としてＭ１３ファージの表面上に成功裏に提示することができる。両方の足場タンパク質は、それらの天然の状態において対応する足場タンパク質によって結合しない特定のタンパク質標的に結合するように操作することができる。これらの操作された足場は、ファージ上で提示されつつ、この特定の標的への結合を保持した。加えて、アミノ酸変異体のライブラリは、それぞれの足場において、本発明によって作製することができ、特定の標的に結合するそれらの能力は、ｐＩＸ融合としてファージ上にライブラリメンバーを提示すること、及び標的タンパク質に対するパニングによって対処される。
【００１２】
本発明において使用される人工抗体又は足場タンパク質は、非抗体ペプチド又はタンパク質分子の機能的戦略を使用するが、（１）標的抗原の配列相同性及び毒性、（２）宿主におけるか、又は非抗体ペプチド又はタンパク質を回復させるために使用されるハイブリドーマ培養における作成された非抗体ペプチド又はタンパク質の生物学的インパクト、及び（３）所望の活性に対するスクリーニング対選択、を含む、生体内拘束がない状態で作成することができる、大きい多様性のタンパク質モチーフとして本明細書において定義される。
【００１３】
そのため、本発明は、多様性に富む単量体又はヘテロ二量体ポリペプチドアレイの構成のための組み合わせファージ提示形式を説明する。特に、本発明は、融合ポリペプチドをコードするゲノムを封入する糸状ファージ粒子を説明し、融合ポリペプチドは、糸状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端に融合される非抗体足場タンパク質を含む。好ましくは、ファージ粒子は、ファージ粒子の表面上の発現された融合タンパク質を含む。
【００１４】
関連する実施形態では、本発明は、融合タンパク質を発現するためのカセットを含む糸状ファージの表面上に融合タンパク質を発現するためのベクターを説明する。カセットは、挿入ＤＮＡ、即ち、ポリリンカーの方向性連結反応のために適合されるヌクレオチドの配列を介して作動可能に連結される上流及び下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を含み、上流配列は、原核分泌信号をコードし、下流配列は、ｐＶＩＩ又はｐＩＸ糸状ファージタンパク質をコードする。翻訳可能なＤＮＡ配列は、融合ポリペプチドの部分としての翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一連のＤＮＡ発現信号に作動可能に連結される。好ましい変異において、ベクターは、糸状ファージの表面上に第２の融合タンパク質を発現するための第２のカセットを更に含み、第２のカセットは、第１の融合タンパク質発現カセットがｐＶＩＩタンパク質をコードし、第２の融合タンパク質発現カセットがｐＩＸタンパク質をコードするという条件で、第１のカセットの構造を有する。ベクターは、ファージ粒子の表面上にヘテロ二量体タンパク質複合体を発現するためにファージゲノムとして使用され、ヘテロ二量体の２つのポリペプチドは、第１のファージタンパク質及び第２のファージタンパク質、ｐＶＩＩ及びｐＩＸへの融合によって、ファージ粒子上でそれぞれ固定される。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるファージ粒子のライブラリ、即ち、組み合わせライブラリを意図し、ライブラリにおける代表的な粒子は、それぞれ、異なる融合タンパク質を提示する。粒子がヘテロ二量体タンパク質複合体を提示する場合、ライブラリは、ヘテロ二量体の組み合わせライブラリを含む。好ましいライブラリは、融合タンパク質の異なるか、又は同様の種の、少なくとも１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、又はその中の任意の範囲又は値の組み合わせ多様性を有する。
【００１６】
関連する実施形態は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を説明し、第１のポリペプチドは、非抗体足場タンパク質であり、第２のポリペプチドは、糸状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質であり、非抗体足場タンパク質は、糸状ファージタンパク質のアミノ末端に融合される。
【００１７】
更に、本発明は、非抗体足場タンパク質をコードする遺伝子のレパートリを本発明のベクターにクローニングし、突然変異作成によって、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質ライブラリの集団の無作為的組み合わせによって、ライブラリの多様性を変化させるための標的及び親和性選択（「パニング」）等によってライブラリにおける非抗体足場タンパク質の構造を修正することによる、を含む、ファージの組み合わせライブラリを産生するための様々な方法を意図する。そのような実施形態は、本明細書において例示されるように、第２のポリペプチドに融合される代替可能な非抗体足場タンパク質を有する融合ポリペプチドを含むことができる。例えば、一実施形態では、代替可能な非抗体足場タンパク質は、ＴｅＦＮ３であり得、第２のポリペプチドは、ｐＩＸであり得、ＴｅＦＮ３のＦ：Ｇループは、突然変異作成、又はシステイン拘束されたＥＧＦＲ結合ペプチド、ＰＨＰＥＰ１９０等の非天然ポリペプチドによる野生型Ｆ：Ｇループアミノ酸残基の標的置換によって変化する。代替の実施形態では、代替可能な非抗体足場タンパク質は、配列番号２〜２３、２５、又は２８によって特定される少なくとも１つのポリペプチドから作製されるＦ：Ｇループを有することができる。非抗体足場タンパク質が、操作された核酸ファージベクターによってコードされ、上皮成長因子受容体又は生物活性配位子等の生体分子に結合する実施形態も本明細書に開示する。
【００１８】
改善された又は新規の機能を伴うタンパク質の設計は、様々な医薬、産業、環境、及び基礎研究の用途に伴う重要な目標である。組み合わせ非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリの開発に続き、強力な次の工程は、人工非抗体ペプチド又はタンパク質作製物、及び二量体種が野生型であるか、又は機能的であり得る他のタンパク質モチーフへの進化である。
【００１９】
本発明は、ｐＶＩＩ及びｐＩＸが、単量体又は二量体種を形成する融合タンパク質の提示のために利用される、組み合わせ非抗体ポリペプチドアレイの構成のためのファージ提示形式を提供することによって、これらの課題に取り組む。ｐＩＸ又はｐＶＩＩ上の発現を使用して機能的相互作用のライブラリを作成するために、１つ又は２つのタンパク質モチーフを近接して独立して提示することができるため、これが全く新しい方法論であることに留意することが重要である。
【００２０】
更に、ライブラリを形成するための配列無作為化、及びハイブリッド種を形成するための鎖シャフリングプロトコルは、新規のタンパク質のサブセットにつながり得る。例えば、ホモ二量体又はヘテロ二量体型における亜鉛フィンガードメインのアレイの提示及び修正は、特定のＤＮＡ相互作用を所有する構造を産生する。加えて、全く新しい作製物が、非抗体ペプチド又はタンパク質鎖等の事前形成された足場内の所望のコードフラグメントの挿入を介して可能である。可能な挿入は、酵素特徴的配列又はリプレッサ結合タンパク質を含む。
【００２１】
前述の概要及び以下の詳細な説明の両方とも、例示及び説明のためのみであり、主張される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】テネイシンの第３のＦｎ３ドメイン（残基８０２〜８９３、ＰＤＢ＝１ＴＥＮ、（Ｌｅａｃｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：９８７〜９１，１９９２））及びタイチンのＩ２７ドメイン（残基５２５３〜５３４１、ＰＤＢ＝１ＴＩＴ、（Ｉｍｐｒｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：３２３〜３７，１９９６））の構造。矢印は、Ｆ：Ｇループ（テネイシン及びタイチンそれぞれの残基８７６〜８８１及び５２５８〜５２５９）の場所を指し、それは、ＥＧＦＲ結合配列を収容するように修正された。
【図２】ｐＩＸ上のテネイシン及びタイチン足場タンパク質の提示に関する図式的結果。
【図３】ｐＩＸに提示されるＴｅＦｎ３−１９０及びＴｉ２７−１９０ライブラリからのＥＧＦＲ結合作製物のためのパニングの図式的結果。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、様々な新しいファージ提示デノボライブラリ作成方法及び構成要素を提供し、（ｉ）ｐＩＸ又は他のファージタンパク質に融合される、設計され、提示された非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリ、（ｉｉ）Ｍ１３ファージの広く使用されるｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩと異なるファージ表面タンパク質の使用、（ｉｉｉ）抗原認識のための設計された配列及び構造トポロジーの効果の系統的検査を可能にする非抗体ペプチド又はタンパク質選択プロセスにおける改善され、設計された組み合わせ多様性を提供するための、ライブラリ足場としてのそのようなファージ構成要素の使用、（ｉｖ）ライブラリ選択の一部としての流線形親和性成熟プロセス、等を含むが、それらに限定されない。ライブラリの個々又は群のライブラリ設計、選択、最適化及び成熟のそのような新しいシステムは、非抗体ペプチド又はタンパク質デノボ発見の成功のための再現可能かつ確実なシステムを提供し、また抗原相互作用に対する非抗体ペプチド又はタンパク質の構造機能相関の理解を容易にする。
【００２４】
上述されるヒト非抗体ペプチド又はタンパク質デノボライブラリは、Ｍ１３ファージのｐＩＸ又はｐＶＩＩ遺伝子を介する提示によって現在の抗体ライブラリ現況技術と異なる。
【００２５】
用語の定義：
融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチド、及び２つのポリペプチドを１つの連続的なポリペプチドに作動可能に連結する連結配列からなるポリペプチド。融合ポリペプチドにおいて連結される２つのポリペプチドは、典型的に、２つの独立した源に由来するため、融合ポリペプチドは、通常は天然において連結して見られない２つの連結されたポリペプチドを含む。
【００２６】
シストロン：アミノ酸残基配列のためにコードし、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含む、ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの配列。
【００２７】
生体分子：生体によって産生される任意の有機分子、又は生体分子を産生するための生体によって使用されるプロセスによって生体外で作製される任意の有機分子であり、そのようなプロセスは、例えば、転写、翻訳、生物有機化学反応等を含む。
【００２８】
非抗体足場タンパク質：少なくとも２つのベータシートを形成する表面に露出したループによって接続される６つ以上のβストランドを有する、任意の非抗体タンパク質、タンパク質断片、又はペプチド。そのような非抗体タンパク質足場の例としては、ヒトテネイシン（ＴｅＦＮ３）の第３のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、又はヒトタイチン（Ｔｉ２７）のＩ２７ドメイン等の、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン又はＩｇドメインを含むタンパク質が挙げられる。
【００２９】
糸状ファージ
本発明は、融合タンパク質（タンパク質）をコードするゲノムを封入するタンパク質のマトリックスを含む糸状ファージを意図する。融合タンパク質は、糸状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質のアミノ末端に融合される非抗体足場タンパク質部分を含む。
【００３０】
糸状ファージは、実施例において記載されるように、ファージ粒子の表面上に提示される融合タンパク質を更に含有する。
【００３１】
本発明のファージ上に存在する融合タンパク質において、非抗体足場タンパク質と糸状ファージｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質との間の「融合」は、典型的なアミド連鎖を含んでもよいか、又は実施例において記載されるリンカーポリペプチド（即ち、「リンカー」）を含んでもよい。典型的に一続きの長さ約５〜５０のアミノ酸である様々なリンカーのいずれを使用してもよい。特に好ましいリンカーは、リンカーの点にある融合タンパク質への高度の可動性を提供する。
【００３２】
ライブラリ設計：これまでの合成ライブラリは、以下のうちのいくつかを組み込んでいるが、総合的に全てを含んでいるものはない。
【００３３】
発現、生化学的、及び生物物理学的特性。好ましい非抗体ペプチド又はタンパク質は、所望の生物学的及び結合活性を有するだけでなく、様々な宿主から効率的に産生され、安定であり、かつ良い溶液物性も有する。操作された組み換え核酸ファージベクターによって融合タンパク質として発現されるか、又は足場のみとして発現されるかいずれかの開示される足場タンパク質は、抗原、受容体、配位子、細胞表面タンパク質マーカ等の生体分子に結合する能力を有することが理解される。好ましい実施形態では、本明細書において記載される足場タンパク質は、上皮成長因子受容体に結合する。高頻度の生殖系列遺伝子の使用も哺乳類系における良い発現を示す。加えて、選択又はスクリーニングの細菌性ファージ提示方法によってライブラリから回復されるそのような融合タンパク質は、細菌性宿主においてよく発現されるはずである。本発明のライブラリは、よく発現され、標準的な組み換え哺乳類宿主（例えば、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯ細胞）及び細菌性宿主から精製されるヒト生殖細胞系列由来の鋳型に基づき、高い安定性及び良い溶液物性を有する。
【００３４】
成熟。それぞれの位置において最大２０の異なるアミノ酸の潜在的変異により連結される、抗原又は配位子結合の認識に影響を与えることができる代替の足場配列を模倣するＶ領域における位置の大きい数は、単一のライブラリに全ての変異を含む実用性を除外する。ヒト抗体は、体細胞突然変異の進行性プロセスによって高親和性及び特異性に到達する。本発明のライブラリは、それらが、ヒト抗体の特色及び特徴と同様のそれらを反映するように、それぞれの非抗体ペプチド又はタンパク質鎖の配列一体性を維持しつつ、平行の選択及び標的変異を許可するように設計され、順序付けられる。
【００３５】
代替の設計。上記の設計は、天然のヒト抗体の特徴ををシミュレートする。システムのモジュラー性質は、位置の任意の集合でのアミノ酸の任意の集合の組込みに適している。
【００３６】
ライブラリアセンブリ技術。好ましい非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリは、低いか、又は高い多様性（＞１０10）であり、変更に適し、組み立て易く、かつ低い望ましくない配列のバックグラウンドを有する。これらのバックグラウンド配列は、親鋳型及び低標的多様性を含む。以下の方法に従って連結することは、ライブラリアセンブリを加速し、低いバックグラウンドにつながる。（ａ）Ｋｕｎｋｌｅによる一本鎖突然変異作成、（ｂ）制限部位を伴うパリンドロームループ、（ｃ）メガプライマーによるＰＣＲ。
【００３７】
ｐＩＸ非抗体ペプチド又はタンパク質ファージ提示。選択された非抗体ペプチド又はタンパク質鋳型とのｐＩＸの組み合わせは、他の関連分子への変換後にそれらの選択された特性を保持する非抗体ペプチド又はタンパク質を回復するための効率的な選択システムである。
【００３８】
ファージミド提示。発現された分子は、ファージｐＩＸ外被タンパク質に対して大きいため、細菌細胞において産生される全てのｐＩＸタンパク質に連結される場合、組み換えファージ粒子のアセンブリに干渉する可能性がある。この干渉を回避する１つの方法は、本明細書において記載される当該技術分野において既知であるもの等のｐＩＸファージミド系を使用することであり、それによって、非抗体ペプチド又はタンパク質連結ｐＩＸ又はｐＶＩＩタンパク質を組み換えファージ粒子に組み込むことができる。好ましい用途において、本発明のライブラリは、ファージミド系におけるｐＩＸによって提示される。
【００３９】
提示のためのファージ外被タンパク質ｐＩＸ。ｐＩＩＩと同様に、ｐＩＸは、ファージ上に低いコピー数で存在し、提示された非抗体ペプチド又はタンパク質の親和性選択に適している。しかしながら、ｐＩＩＩタンパク質は、感染プロセスに非常に関与し、このタンパク質上に提示されるタンパク質は、感染の効率性に干渉し得る。ｐＩＸタンパク質上に提示される本発明のライブラリは、選択及び／又はスクリーニングのために効果的に複製され、提示されると予測される。
【００４０】
非抗体ペプチド又はタンパク質ｐＩＸ発現。ファージライブラリから回収した非抗体ペプチド又はタンパク質をスクリーニングする１つの方法は、提示のために非抗体ペプチド又はタンパク質分子に連結されるファージ外被タンパク質を除去することである。ｐＩＸタンパク質の小さいサイズは、この工程を伴わずに直接、非抗体ペプチド又はタンパク質のスクリーニングの産生の選択肢を提供する。
【００４１】
治療的使用。本明細書において記載されるように、開示される足場は、抗体の代替として使用してよい。したがって、開示される足場は、治療用途を有する。したがって、本明細書において記載される足場タンパク質は、治療用組成物を形成するために使用してよいと考えられる。１つのそのような組成物は、本明細書において記載される足場、及び製薬学的に許容できる担体を含むことができる。別の実施形態では、組成物は、そのＦ：Ｇループが非天然ポリペプチドで置換された、ＴｅＦＮ３等の単離されたＥＧＦＲ特異的非抗体タンパク質足場、及び製薬学的に許容できる担体を含む。代替の実施形態では、組成物は、配列番号２〜２３、２５、又は２８によって特定される少なくとも１つのポリペプチドから作製されるＦ：Ｇループを有する代替可能な非抗体足場タンパク質、及び製薬学的に許容できる担体を含む。非抗体足場タンパク質が、操作された核酸ファージベクターによってコードされ、上皮成長因子受容体等の生体分子に結合し、製薬学的に許容できる担体と組み合わされる実施形態も本明細書に開示する。
【００４２】
設計ライブラリ足場。ライブラリ足場は、生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ遺伝子の構造及び機能を模倣する一連のヒトタンパク質配列から作製される。
【００４３】
ライブラリ足場の発現及び提示能力。ライブラリ足場非抗体ペプチド又はタンパク質の良い発現及び提示能力は、足場遺伝子の上で開発されるライブラリの質に直接関連する。ライブラリ足場非抗体ペプチド又はタンパク質発現及び提示能力は、ライブラリ構成の前に検査された。発現したが、提示しなかったか、又は不十分に提示した少数の足場非抗体ペプチド又はタンパク質は、ライブラリ構成から除外された。よく発現され、提示されたライブラリ足場は、ライブラリにおける非抗体ペプチド又はタンパク質の高い割合が機能的であり、天然源から遺伝的に増幅されるＶＨ及びＶＬ遺伝子の組み合わせクローニングに由来するライブラリより優れていることを確実にする。
【００４４】
ライブラリ作成のための方法。修正されたＫｕｎｋｅｌ突然変異作成方法を本発明に従って使用することができ、それは、数十億もの大腸菌コロニーを効率的に作成し、それぞれ、異なる非抗体ペプチド又はタンパク質配列を持ち、それは、非抗体ペプチド又はタンパク質ライブラリの精製のために使用することができる。効率的であるが、非突然変異親ＤＮＡの割合は、高度配列複合体ライブラリの作成において適合される時に増加する。加えて、長いオリゴヌクレオチドの合成の技術的制限は、遠位領域において配列多様性を含有するライブラリを作製する方法の有効性を低下させることがある。そのような制限を克服するために、オリゴヌクレオチド＞３５０塩基（メガプライマー）を作成する、及び突然変異作成鋳型において制限酵素認識部位を含有するステムループ配列の作製の付加的な技術は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異作成方法等の技術と組み合わせて任意に使用することができる。ライブラリ作成のために他者によって使用される、制限クローニング、ファージ組み換え、及び配列特異的組み換え等の他の既知のライブラリ技術と比較して、改善されたＫｕｎｋｅｌによる方法は、１つのライブラリにつき＞１０9配列の作成においてより効果的であり得、標的ＤＮＡ上の任意の場所において配列多様性を導入する際により万能である。
【００４５】
インライン親和性成熟。統合親和性成熟プロセス、又はインライン親和性成熟は、ライブラリから選択される非抗体ペプチド又はタンパク質の結合親和性の設計及び改善のために、本発明に従って使用することができる。パニング後の所望の非抗体ペプチド又はタンパク質の結合親和性を改善することは、治療用非抗体ペプチド又はタンパク質リードの特定の成功を増加させることができる。ライブラリ作成のためのＫｕｎｋｅｌの方法の使用は、単純かつ連続的なプロセスにおける配列多様化戦略の効果的な実行を改善できる。改善されたＫｕｎｋｅｌ突然変異作成方法の使用の設計戦略及び技術的利点は、結果の効率性及び有効性を低下させる単調なライブラリ作成方法が使用される、他の共同成熟戦略より優れた方法を提供できる。
【００４６】
平行ライブラリパニング。自動又は半自動機器を使用する平行パニングプロセスを使用して、個々に作製されたサブライブラリを処理することができる。平行パニングは、所望の特徴のペプチド又はタンパク質を有する所望のライブラリを提供するために、好適に多様な一連の非抗体ペプチド又はタンパク質のを発見する可能性を最大化できる。インライン親和性成熟における平行パニングの効果的な使用はまた、そのようなタンパク質が、改善された親和性又は生物活性等のいくつかの同時に改善された特徴を有することも可能にする。機械によるパニングシステムの開発はまた、異なるパニング条件の系統的な監視及び調製が、所望の特性を有する非抗体ペプチド又はタンパク質をより迅速にスクリーニングし、単離することも可能にする。
【００４７】
親和性順位。親和性による結合検定は、更なる特徴付けのための最良の結合を選択するために、大きい、多様な、かつ高親和性の配位子又は抗原特異的結合ペプチド若しくはタンパク質に適用される。ＥＬＩＳＡ等の標準的な生化学的方法、並びに多数の試料を処理するために好適な親和性測定機器、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｏｃｔｅｔ及びＢＩＮＤを、本目的のために、単独か又は組み合わせて使用する。
【００４８】
本発明は一般条件で記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００４９】
実施例１：非抗体タンパク質の提示：２つの非抗体ペプチド又はタンパク質は、ｐＩＸ融合タンパク質としてＭ１３ファージの表面上に成功裏に提示された。両方の足場タンパク質は、それらの天然の状態における足場タンパク質によって結合しない特定のタンパク質標的に結合するように操作した。これらの操作された足場は、ファージ上で提示されつつ、この特定の標的への結合を保持した。加えて、アミノ酸変異体のライブラリはそれぞれの足場において作製し、特定の標的に結合するそれらの能力は、ｐＩＸ融合としてファージ上にライブラリメンバーを提示すること及び標的タンパク質に対するパニングによって対処した。両方のライブラリは、多数の陽性ヒットをもたらした。
【００５０】
２つの非抗体ペプチド又はタンパク質、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインタンパク質は、ｐＩＸ融合タンパク質としてＭ１３ファージの表面上にＥＧＦＲ結合ペプチドを提示するように操作される候補として選択した。以下の基準を、候補の選択のために使用した。
【００５１】
ＰＤＢデータベースの中で利用可能な高解像度原子構造
ａ．堆積した構造は、単一の単離されたＩｇドメインを表す
ｂ．完全なヒト配列
ｃ．配列は、ジスルフィド結合残基を含有しない
ｄ．公開された発現及び精製条件
ｅ．再折り畳み工程の必要性を伴わず、かつ高収率で大腸菌から成功裏に発現され、精製されることを証明した。
【００５２】
ＰＤＢデータベースは、単一Ｉｇドメインを含有する全てのタンパク質及びタンパク質フラグメントを調査するために、手動で、並びに構造による整合プログラムの援助により検索した。その後、公開された発現及び精製条件を決定するために、科学文献を調査した。
【００５３】
上記の基準を使用して、成功のための最高の機会を有する分子を選択したが、これらの基準に厳密に満たない他のＩｇ分子も、ペプチド提示のための成功する足場として使用することができることが想定される。複数のＩｇドメイン又は単一Ｉｇドメインの繰り返し体からなる足場は、成功する足場として使用することができることも想定される。上記の分析は、更なる研究のための、２つのＩｇ分子、ヒトテネイシンからの第３のＦｎ３ドメイン（残基８０２〜８９３、ＴｅＦｎ３）及びヒトタイチンのＩ２７ドメイン（残基５２５３〜５３４１、Ｔｉ２７）の選択をもたらした。これらのタンパク質フラグメントをコードする遺伝子は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎによって合成し、標準ＰＣＲ及び制限消化方法によってプラスミドｐＰＥＰ９−ＢｂｓＩにサブクローンした。Ｔｉ２７におけるＮ５３３１Ｇ、及びＴｅＦｎ３におけるＳ８８１Ｇの突然変異は、ペプチドの挿入のための制限部位を導入するために含んだ（以下参照）。
【００５４】
その後、両方の足場のＦ：Ｇループ（ＴｅＦｎ３の残基８７６〜８８１及びＴｉ２７の５２５８〜５２５９）（図１）は、標準的な制限部位クローニング方法を使用して、システイン拘束ＥＧＦＲ結合ペプチド、ＰＨＰＥＰ１９０（配列  ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱ）（Ｗａｎｇ）の一部と置換し、Ｔｉ２７−１９０及びＴｅＦｎ３−１９０作製物を作製した。多数の対照作製物もまた作製し、非ＥＧＦＲ結合Ｆ：Ｇループ配列（Ｔｉ２７及びＴｅＦｎ３と称される）を含有し、及びＦ：Ｇループに６つの終止コドン（Ｔｉ２７−終止及びＴｅＦｎ３−終止）を含有するものを含む。表１は、これらの作製物を要約する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
それぞれの作製物は、足場タンパク質のＣ末端とｐＩＸのＮ末端との間のＥＤＳＧＧＳＧＧ（配列番号３０）リンカー配列を伴うファージミドベクターからの糸状ファージの小さい外被タンパク質ｐＩＸへの融合として発現された。全ての作製物は、ＥＧＦＲ結合の非存在下でのタンパク質発現及び提示に対して検定するために、Ｎ末端Ｍｙｃタグにより発現された。Ｍ１３ファージの表面上の成功する提示、及びＴｅＦｎ３−１９０及びＴｉ２７−１９０タンパク質の特定の結合活性は、ファージＥＬＩＳＡによって検証した。０．５μｇのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ−ＭＭＢ）（Ｗａｎｇ）のＦｃ−融合型、抗Ｍｙｃ非抗体ペプチド若しくはタンパク質、又は対照Ｆｃ分子（ＣＮＴＯ  ３６０）を、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｏｐ（商標）プレート上で固定し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ−２０により遮断した。表１に記載される作製物を提示するファージは、それぞれのプレートへの３００μＬのファージ含有上清の添加前に連続的に希釈し、続いて、室温で１時間培養した。それぞれのプレートは、続いてＴＢＳＴで洗浄し、蛍光プレートリーダを使用して、抗Ｍ１３  ＨＲＰ結合非抗体ペプチド又はタンパク質により検出されるファージに結合させた。図２は、ＴｅＦｎ３−１９０及びＴｉ２７−１９０が、ＣＮＴＯ  ３６０への大きな結合の欠如によって証明される低いレベルのバックグラウンド結合によりプレート結合Ｆｃ−ＥＧＦＲに選択的に結合したことを示す。ＴｅＦｎ３及びＴｉ２７はまた、抗Ｍｙｃコーティングされたプレートへの結合によって示されるファージ表面上でも提示された。しかしながら、これらのタンパク質は、ＥＧＦＲに結合しなかった。不明の理由で、ＴｅＦｎ３−１９０は、ＥＧＦＲ結合によって示されるように明らかに発現されるが、抗Ｍｙｃコーティングされたプレートに結合しなかった。予想通りに、ＴｅＦｎ３−終止及びＴｉ２７−終止は、ファージ上に提示されなかった。
【００５７】
ライブラリは、ＴｅＦｎ３及びＴｉ２７に関連してＰＨＰＥＰ１９０のシステインの必要性を決定し、そのようなライブラリを、ｐＩＸ上のこれらの足場内で効率的に提示し、標的タンパク質に対してパニングすることができることを確認するために構築した。このライブラリは、Ｔｉ２７−終止及びＴｅＦｎ３−終止作製物において終止コドンを含有する全ての６つの位置を無作為化することによって構築した（表１）。Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７〜８２，１９８７）による突然変異作成の後の１００の無作為で採取したコロニーのシークエンシングは、突然変異が、Ｔｉ２７−１９０及びＴｅＦｎ３−１９０ライブラリからのコロニーのそれぞれ５１％及び６４％において見られたことを確認した。その後、これらのライブラリは、室温で１時間１０μｇ（１回目）又は５μｇ（２及び３回目）のビオチン化ＥＧＦＲにより１００μＬのファージ溶液を培養することによって、ＥＧＦＲ−Ｆｃ融合に対して３回パニングした。結合複合体は、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズで引き下げ、ＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、結合ファージを使用して、ＴＧ１細胞を再感染させ、表２に記載されるファージ力価をもたらした。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
それぞれのライブラリからの３回目のパニングからの９６のコロニーは、ファージＥＬＩＳＡによってＥＧＦＲ−Ｆｃへの結合を試験するために無作為に選択した。図３は、Ｔｉ２７−１９０及びＴｅＦｎ３−１９０ライブラリからの１０及び２０のクローンそれぞれが、ＥＧＦＲへの有意な結合を示したことを示す（ＥＧＦＲ：ＣＮＴＯ  ３６０からの総数の比率は、５より大きい）。全ての陽性ヒットからのＦ：Ｇループの配列を表３に示す。全ての配列したヒットは、本来のＰＨＰＥＰ１９０と同様に同一の位置でシステイン残基を含有し、このペプチドのシステイン拘束された性質が機能のために必要であることを示した。
【００６０】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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