(57)【要約】ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する核酸配列を含むDNAポリヌクレオチドであって、該核酸配列が、(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列；(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列；(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含む第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列から選択されるポリヌクレオチドが開示される。ポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞、並びにポリヌクレオチドを用いて興味対象のポリペプチドを生成する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) (i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含む、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適する単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含む請求項１に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３】
プロモーター DNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列が、ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する請求項１に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項４】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチドを含み、該機能的フラグメントが、ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項５】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列が、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項６】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；及び
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列
から選択される２つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項７】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、請求項１に記載の(vi)で規定されるキメラヌクレオチド配列を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項８】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベルと比較して、増加したタンパク質発現レベルを示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項９】
タンパク質発現レベルの増加が、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベルに対して約50パーセント〜約300パーセントである請求項８に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１０】
タンパク質発現レベルの増加が、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して２倍〜10倍である請求項８に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１１】
選択マーカー、例えばゼオシン選択マーカー、ネオマイシン選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー及びブラストサイジン選択マーカーからなる群より選択される選択マーカーをさらに含む請求項１〜10のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１２】
pKANR細菌プロモーターのような細菌プロモーターをさらに含む請求項11に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１３】
昆虫細胞における選択マーカーの発現を駆動するのに適する第２のプロモーターDNAポリヌクレオチドをさらに含む請求項11又は12に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１４】
第２のプロモーターが：
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37のヌクレオチド配列、又は配列番号68の残基７〜586を含むヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される請求項13に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１５】
マルチクローニング部位に対して上流及び／又は下流に少なくとも１つの遍在性クロマチンオープニングエレメントをさらに含む請求項１〜14のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１６】
Gypsy (gsu(Hw))インスレーター配列のような少なくとも１つの転写インスレーターエレメントをさらに含む請求項１〜15のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１７】
昆虫細胞における選択のために適するジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列をさらに含む請求項１〜16のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１８】
SV40ポリＡシグナル及び／又はOPIE2ポリＡシグナルのような少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列をさらに含む請求項１〜17のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１９】
大腸菌の複製起点をさらに含む請求項１〜18のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２０】
BIP及びCPYからなるリストから選択されるもののような少なくとも１つのタンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜19のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ウイルスDNAを実質的に含まない請求項１〜20のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２２】
少なくとも１つのHISタグ配列をさらに含む請求項１〜21のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２３】
興味対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、単離DNAポリヌクレオチドに挿入するために、プロモーターDNAポリヌクレオチドの下流にマルチクローニング部位をさらに含む請求項１〜22のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２４】
SV40からの少なくとも１つの72bpエレメントをさらに含む請求項１〜23のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２５】
少なくとも１つの増幅制御エレメントをさらに含む請求項１〜24のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２６】
少なくとも１つのOri-ベータエレメントをさらに含む請求項１〜25のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２７】
少なくとも１つのマトリクス付着領域(MAR)エレメントをさらに含む請求項１〜26のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号40、例えば配列番号40のヌクレオチド10〜574によるＢ型肝炎ウイルスからのPREエレメントのようなＢ型肝炎ウイルスからの少なくとも１つのPREエレメントをさらに含む請求項１〜27のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２９】
プロモーターDNAポリヌクレオチド配列が、遺伝子又はそれが結合するその他のDNA配列の発現を制御する請求項１〜28のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列のいずれか１つの配列の少なくとも３連続ヌクレオチドの機能的フラグメント、並びにそれと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列である少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、該機能的フラグメントが、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーターエンハンサー活性を有する請求項１〜29のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３１】
プロモーター DNAポリヌクレオチド配列の下流、かつマルチクローニング部位の上流にフランキング制限部位を含むか又は含まない少なくとも１つのイントロン、例えば配列番号60に示すイントロンをさらに含む請求項１〜30のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ライゲーション非依存性クローニング(LIC)に適合されている請求項１〜31のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記プロモーターDNAポリヌクレオチド配列に対して異種のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜31のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１〜33のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３５】
キイロショウジョウバエのような昆虫細胞である請求項34に記載の細胞。
【請求項３６】
前記単離DNAポリヌクレオチドを安定的に形質移入された請求項34又は35に記載の細胞。
【請求項３７】
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列を、請求項１〜32のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチドに挿入するステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、前記ポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む、ポリヌクレオチドによりコードされる興味対象のポリペプチドを生成する方法。
【請求項３８】
請求項37に記載の方法により生成されるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、新規なプロモーターDNAポリヌクレオチドと、宿主細胞、特にキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)における改良タンパク質発現用ツールとしてのその使用に関する。さらに、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターと、工業用酵素、又は真核(例えばヒトのような哺乳類だけでなく原生動物又は寄生虫も)及びウイルスのタンパク質を含む医薬用のタンパク質のようなポリペプチドの組換え発現、特にタンパク質の異種発現におけるそれらの使用にも関する。本発明は、特に、発現生成物が、組換え宿主細胞(これらの宿主細胞が昆虫細胞であるならば特に)から分泌されるタンパク質発現の分野に適する。
【背景技術】
【０００２】
興味対象のポリペプチド又はタンパク質が組換え生物又は細胞で生成されるタンパク質生成系は、工業的バイオテクノロジーの中枢である。大腸菌(E. coli)のような宿主における細菌発現に基づく従来の系に加えて、真核宿主、特に培養哺乳類細胞、培養及び昆虫そのものの形態の昆虫細胞、並びにヒツジ及びヤギのようなトランスジェニック哺乳類に基づく系が存在する。
【０００３】
原核細胞培養系は、維持が容易であり、操作が安価である。しかし、原核細胞は、真核タンパク質を翻訳後修飾できない。さらに、多くのタンパク質が誤って折り畳まれ、それらを再び折り畳むために特別な手順を必要とし、このことが追加の生産コストを生じる。
【０００４】
真核細胞培養系は、いくつかの応用について記載されている。例えば、哺乳類細胞は、翻訳後修飾でき、一般に、正しく折り畳まれた可溶性のタンパク質を生成する。哺乳類細胞系の主な短所は、特別で高価な培養設備を必要とすることと、培養全体の喪失を導き得る感染の危険性と、潜在的に有害な哺乳類タンパク質が最終生成物に混入する危険性である。
【０００５】
昆虫細胞も、ポリペプチド発現のために用いられる。昆虫細胞において最も広く用いられている発現系は、バキュロウイルスベクターに基づく。バキュロウイルス発現ベクターは、バキュロウイルスの主な構造タンパク質をコードするバキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、強い天然ポリヘドリンプロモーターの制御下において、異種遺伝子で置き換えることにより構築される。組換えウイルスは培養昆虫宿主細胞に感染し、それにより生成されるタンパク質は、細胞自体又は適切な分泌シグナルを用いるならば培養培地から回収できる。しかし、これらの系も、発現のレベル及び質の再現性、培養物への感染に関連する問題を抱えており、特別な培養設備を必要とし得る。さらに、いくつかのタンパク質の生成のためにはGMP条件下で作製されなければならないバキュロウイルスストックは、時間が経過すると常に安定ではない。
【０００６】
タンパク質発現のためにキイロショウジョウバエS2細胞において用いられる適切なプロモーターは、pMTプロモーター及びP2ZOp2F (OPIE2プロモーター)を含む。
Chungら、Molecular and Cellular Biology、第10巻、第12号、1992は、アクチン5C遠位プロモーターにおける正及び負の制御要素の特徴決定に関する。
Angelichioら、Nucleic Acids Research、第19巻、第18号、5037〜5043、1991は、培養ショウジョウバエ(Drosophila)細胞での異種遺伝子発現における使用のためのいくつかのプロモーター及びポリアデニル化シグナルの比較に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、宿主細胞、特にキイロショウジョウバエにおけるより効果的な発現及び／又は分泌を提供することである。さらなる目的は、この効果的な発現及び分泌を促進するポリヌクレオチド及びベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
広い態様において、本発明は、興味対象のポリペプチドの異種発現における使用に適するプロモーターDNAポリヌクレオチドに関する。別の広い態様において、本発明は、治療上効果的なタンパク質又は工業的酵素のような興味対象のタンパク質を比較的大量に発現及び生成するために適する、そのようなプロモーターDNAポリヌクレオチドを含む単離DNAポリヌクレオチド、いわゆる発現ベクターに関する。
【０００９】
よって、第１の態様において、本発明は：
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲(stretches)を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適する単離DNAポリヌクレオチドであって、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチド
を含むDNAポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、DNAポリヌクレオチドが、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続ヌクレオチド範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含む、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドを含む細胞に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ポリヌクレオチドによりコードされる興味対象のポリペプチドを生成する方法であって：
(a)   興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b)   興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドに挿入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含むステップと、
(c)   ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d)   ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、ポリペプチドを生成するステップと、
(e)   そこからポリペプチドを得るステップと
を含む方法に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、
(a)   興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b)   興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドに挿入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列；
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続ヌクレオチド範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含むステップと、
(c)   ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d)   ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、ポリペプチドを生成するステップと、
(e)   そこからポリペプチドを得るステップと
を含む方法により生成されるポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】安定及び一過性の形質転換についての変異アクチン5Cプロモーターの、異なる形質移入についてのp2ZOP2Fベクター中のpOPIE2プロモーターと比較した、標準化したタンパク質発現レベル。 (b)..(d)は、プラスミドpHP11を含む変異アクチン5Cプロモーターを用いる別々の形質移入に関する。
【図２】一過性発現中の全長及び切断型のHSP70プロモーターの発現レベル。この実験において、pOPIE2を対照として用いた。
【図３】タンパク質発現を駆動するために６つの異なるプロモーターを用いた安定発現株についてのRANKL生成レベル。これらは、変異アクチン5Cプロモーターの３つのバージョン(全長プロモーター、(2)切断バージョン(ベクターpHP17)及び(3) 612bpの最も短い切断バージョン)と、HSP70プロモーターの２つのバージョン(切断型HSP70プロモーター及びHSP70コアプロモーター)と、対照としてpOPIE2プロモーターとを含む。
【図４】一過性形質移入中に達成された、標準化された発現レベル。これらは、変異アクチン5Cプロモーターの３つのバージョン(全長プロモーター、(2)切断バージョン(ベクターpHP17)及び(3) 612bpの最も短い切断バージョン)と、切断型HSP70プロモーターと、対照としてpOPIE2プロモーターとを含む。
【図５】pOPIE2及びアクチン5Cコア及びHSP70コアプロモーターの一過性形質移入における発現レベル。
【図６】本発明によるある適切なベクターであるpHP15c_su(hw)ベクターを示す。
【図７】本発明によるある適切なベクターであるpHP15cベクターを示す。
【図８】アクチン-HSP70コアハイブリッドプロモーターと、切断型アクチン5cプロモーター(グラフ中ではプロモーターp1_var 2と命名)の発現レベルの比較。２重の一過性発現実験(生データについて表A3を参照されたい)。
【図９】pHP34s-ハイブリッドベクターへのイントロン又は２つのフランキングマトリクス付着領域のいずれかを付加することの効果。実験は、独立した３重の形質移入により作製した安定ポリクローナル発現株を用いる３重の振とうフラスコ実験として行った(生データについて表A2を参照されたい)。
【図１０】ベクターマップ。(A) RANKLコード領域を含むpHP34s-ハイブリッドベクターについてのベクターマップ。(B) 切断型アクチン5cプロモーターを含む原型pHP34sベクター。ハイブリッドプロモーターは、切断型アクチン5cプロモーターの上流部分(アクチン5cコアプロモーターを引く)と、HSP70コアプロモーターとからなる。
【図１１】pHP34s-ハイブリッド-hSAR-FRを含むRANKLについてのベクターマップ。hSAR又はHSP70マトリクス付着領域は、発現カセットを挟んで、フォワード又はリバースの方向で挿入した。hSARエレメントも、同じ位置に、３つのそのほかに可能な方向で挿入した(リバース-リバース；リバース-フォワード、フォワード-フォワード)。
【図１２】RANKLタンパク質についてのコード配列を含むpHP34s-ハイブリッド.iについてのベクターマップ。「i」は、ATG開始コドンの上流でのイントロンの挿入を示す。イントロンは、ベクターマップ中で「intrn」として示す。
【図１３】２つの市販のベクターと比較した、pHP34s-ハイブリッド(ハイブリッドと命名)及びpHP34s-ハイブリッド.i (イントロンを含む、ハイブリッド_RNA+と命名)のRANKL発現レベル(生データについて表A1を参照されたい)。
【図１４】BIPシグナル配列を用いる、Ｃ末端Hisタグ付加細胞外発現のためのLICを可能にするpHP34s-ハイブリッド。SacB遺伝子は、大腸菌細胞にスクロース感受性を与える。SacB遺伝子は、LICクローニング中に、制限消化により除去され、興味対象の遺伝子で置き換えられる。SacB遺伝子が置き換えられない場合、バックグラウンド(不正な)コロニーを除去するための対抗選択マーカーとして作用する。LIC部位は、5' LIC及びLIC3-CTHFとして示す。この特定のベクターは、配列番号69に示す配列を有する。配列番号69〜73は、TEVプロテアーゼ部位を有するか又は有さないＮ又はＣ末端Hisタグ付加を可能にして、細胞内又は細胞外発現を可能にする、同様のベクターを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上述のように、本発明者らは、特に効率が高いプロモーター及び調節エレメントと、昆虫細胞における異種タンパク質の高いレベルでの発現に適するそれらの組み合わせを見出した。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「異種発現」とは、特定のポリペプチドを発現するために用いる宿主細胞により通常は発現されず分泌されないポリペプチドの発現のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「プロモーターDNAポリヌクレオチド」は、それに機能的に連結された(operably linked)コード配列の発現のための調節配列を細胞に提供するヌクレオチド配列を意味する。一般的に、コード配列は、プロモーター配列に対して3'に位置する。プロモーターDNAポリヌクレオチドは、近位エレメント及びより遠位の上流のエレメント、並びにその他の機能的フラグメント又はエレメント(しばしばエンハンサーと呼ばれる)とからなり得る。
【００１７】
本明細書で用いる場合、用語「機能的フラグメント」、「エレメント」及び「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激できるDNA配列及びプロモーターの部分のことをいい、プロモーターの固有のエレメント、又はプロモーターのレベル又は組織特異性を増進するために挿入された異種エレメントであり得る。異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞タイプにおいて、又は異なる発達段階にて、又は異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を駆動し得ることが当業者に理解される。結合された遺伝子の継続的な転写を可能にする調節されないプロモーターは、しばしば、「構成性プロモーター」とよばれる。
【００１８】
そうでないと記載しない限り、本明細書で用いる場合の核酸についての用語「配列同一性」とは、(nref−ndif)・100/nref (式中、ndifは、整列させた場合の２つの配列における非同一残基の総数であり、nrefは、配列のうちの１つにおける残基の数である)として計算される配列同一性のことをいう。よって、DNA配列agtcagtcは、配列aatcaatcと、75%の配列同一性を有する(ndif=２及びnref=８)。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、通常の方法、例えばSmith及びWaterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482、Pearson及びLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性方法の検索により、Thompsonら, 1994, Nucleic Acids Res 22:467380のCLUSTAL Wアルゴリズムを用いて、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行により決定される(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group中のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)。BLASTアルゴリズム(Altschulら, 1990, Mol. Biol. 215:403〜10)も用いてよく、このためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/)から得ることができる。上記のアルゴリズムのいずれを用いる場合も、「ウィンドウ」長、ギャップペナルティなどについてデフォルトパラメータを用いる。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「キメラヌクレオチド配列」とは、第２の原型のヌクレオチド配列に由来する第２のヌクレオチド配列に融合された、第１の原型のヌクレオチド配列に由来する第１のヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列のことをいい、第１及び第２の原型の配列は、通常は、同じ配列内で互いに融合されていない。
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドと比較して改良された／より高い「タンパク質発現レベル」を示すと記載する場合、本明細書において、第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドが提供するよりも、参照細胞(典型的には、ショウジョウバエS2細胞のような昆虫細胞)を、同じ条件下でポリヌクレオチドの発現を得るためにこれらのポリヌクレオチドで形質転換して培養する場合に、より多い量の回収可能なタンパク質発現生成物を提供することを意味する。
【００２０】
「S2細胞」とは、Schneider-2キイロショウジョウバエ胚性株化細胞からの細胞、すなわちDSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)、Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, Germanyから、寄託番号DSMZ ACC 130の下で、及びAmerican Type Culture Collection (ATCC)、P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USAから寄託番号CRL-1963の下で入手可能な細胞のことをいう。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号33のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号36のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号37のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、残基１若しくは１〜２若しくは１〜３若しくは１〜４若しくは１〜５若しくは１〜６を所望により欠損するか、及び／又は残基587〜592若しくは588〜592若しくは589〜592若しくは590〜592若しくは591〜592若しくは592を所望により欠損する配列番号 68のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列は、ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号３の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号４の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号５の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号６の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号33の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号36の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号37の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号68の配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。具体的な実施形態において、それぞれの場合における配列同一性は、少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも98%である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含み、該機能的フラグメントは、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号２の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号３の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号４の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号５の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号６の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号33の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号36の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号39の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号68の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列は、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号２の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号３の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号４の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号５の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号６の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号33の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーター DNAポリヌクレオチドは、配列番号36の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号37の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号68の配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、以下の群から選択される２つ以上の配列を含むキメラ配列を含む：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列；
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメント；
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列。
このようなキメラ配列の例は、配列番号68に示すハイブリッドプロモーター配列である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；及び
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列
から選択される２つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、上記の(vi)で規定されるキメラヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明による少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントは、少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも10、例えば少なくとも11、例えば少なくとも12、例えば少なくとも13、例えば少なくとも14、例えば少なくとも15、例えば少なくとも16、例えば少なくとも17、例えば少なくとも18、例えば少なくとも19、例えば少なくとも20、例えば少なくとも21、例えば少なくとも22、例えば少なくとも23、例えば少なくとも24、例えば少なくとも25、例えば少なくとも26、例えば少なくとも27、例えば少なくとも28、例えば少なくとも29、例えば少なくとも30、例えば少なくとも31、例えば少なくとも32、例えば少なくとも33、例えば少なくとも34、例えば少なくとも35、例えば少なくとも36、例えば少なくとも37、例えば少なくとも38、例えば少なくとも39、例えば少なくとも40、例えば少なくとも41、例えば少なくとも42、例えば少なくとも43、例えば少なくとも44、例えば少なくとも45、例えば少なくとも46、例えば少なくとも47、例えば少なくとも48、例えば少なくとも49、例えば少なくとも50、例えば少なくとも51、例えば少なくとも52、例えば少なくとも53、例えば少なくとも54、例えば少なくとも55、例えば少なくとも56、例えば少なくとも57、例えば少なくとも58、例えば少なくとも59、
【００３５】
例えば少なくとも60、例えば少なくとも61、例えば少なくとも62、例えば少なくとも63、例えば少なくとも64、例えば少なくとも65、例えば少なくとも66、例えば少なくとも67、例えば少なくとも68、例えば少なくとも69、例えば少なくとも70、例えば少なくとも71、例えば少なくとも72、例えば少なくとも73、例えば少なくとも74、例えば少なくとも75、例えば少なくとも76、例えば少なくとも77、例えば少なくとも78、例えば少なくとも79、例えば少なくとも80、例えば少なくとも81、例えば少なくとも82、例えば少なくとも83、例えば少なくとも84、例えば少なくとも85、例えば少なくとも86、例えば少なくとも87、例えば少なくとも88、例えば少なくとも89、例えば少なくとも90、例えば少なくとも91、例えば少なくとも92、例えば少なくとも93、例えば少なくとも94、例えば少なくとも95、例えば少なくとも96、例えば少なくとも97、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99、例えば少なくとも100、例えば少なくとも101、例えば少なくとも102、例えば少なくとも103、例えば少なくとも104、例えば少なくとも105、例えば少なくとも106、例えば少なくとも107、例えば少なくとも108、例えば少なくとも109、例えば少なくとも110、例えば少なくとも111、例えば少なくとも112、例えば少なくとも113、例えば少なくとも114、例えば少なくとも115、例えば少なくとも116、例えば少なくとも117、例えば少なくとも118、例えば少なくとも119、例えば少なくとも120、例えば少なくとも121、例えば少なくとも122、例えば少なくとも123、例えば少なくとも124、例えば少なくとも125、例えば少なくとも126、
【００３６】
例えば少なくとも127、例えば少なくとも128、例えば少なくとも129、例えば少なくとも130、例えば少なくとも131、例えば少なくとも132、例えば少なくとも133、例えば少なくとも134、例えば少なくとも135、例えば少なくとも136、例えば少なくとも137、例えば少なくとも138、例えば少なくとも139、例えば少なくとも140、例えば少なくとも141、例えば少なくとも142、例えば少なくとも143、例えば少なくとも144、例えば少なくとも145、例えば少なくとも146、例えば少なくとも147、例えば少なくとも148、例えば少なくとも149、例えば少なくとも150、例えば少なくとも151、例えば少なくとも152、例えば少なくとも153、例えば少なくとも154、例えば少なくとも155、例えば少なくとも156、例えば少なくとも157、例えば少なくとも158、例えば少なくとも159、例えば少なくとも160、例えば少なくとも161、例えば少なくとも162、例えば少なくとも163、例えば少なくとも164、例えば少なくとも165、例えば少なくとも166、例えば少なくとも167、例えば少なくとも168、例えば少なくとも169、例えば少なくとも170、例えば少なくとも171、例えば少なくとも172、例えば少なくとも173、例えば少なくとも174、例えば少なくとも175、例えば少なくとも176、例えば少なくとも177、例えば少なくとも178、例えば少なくとも179、例えば少なくとも180、例えば少なくとも181、例えば少なくとも182、例えば少なくとも183、例えば少なくとも184、例えば少なくとも185、例えば少なくとも186、例えば少なくとも187、例えば少なくとも188、
【００３７】
例えば少なくとも189、例えば少なくとも190、例えば少なくとも191、例えば少なくとも192、例えば少なくとも193、例えば少なくとも194、例えば少なくとも195、例えば少なくとも196、例えば少なくとも197、例えば少なくとも198、例えば少なくとも199、例えば少なくとも200、例えば少なくとも201、例えば少なくとも202、例えば少なくとも203、例えば少なくとも204、例えば少なくとも205、例えば少なくとも206、例えば少なくとも207、例えば少なくとも208、例えば少なくとも209、例えば少なくとも210、例えば少なくとも211、例えば少なくとも212、例えば少なくとも213、例えば少なくとも214、例えば少なくとも215、例えば少なくとも216、例えば少なくとも217、例えば少なくとも218、例えば少なくとも219、例えば少なくとも220、例えば少なくとも221、例えば少なくとも222、例えば少なくとも223、例えば少なくとも224、例えば少なくとも225、例えば少なくとも226、例えば少なくとも227、例えば少なくとも228、例えば少なくとも229、例えば少なくとも230、例えば少なくとも231、例えば少なくとも232、例えば少なくとも233、例えば少なくとも234、例えば少なくとも235、例えば少なくとも236、例えば少なくとも237、例えば少なくとも238、例えば少なくとも239、
【００３８】
例えば少なくとも240、例えば少なくとも241、例えば少なくとも242、例えば少なくとも243、例えば少なくとも244、例えば少なくとも245、例えば少なくとも246、例えば少なくとも247、例えば少なくとも248、例えば少なくとも249、例えば少なくとも250、例えば少なくとも251、例えば少なくとも252、例えば少なくとも253、例えば少なくとも254、例えば少なくとも255、例えば少なくとも256、例えば少なくとも257、例えば少なくとも258、例えば少なくとも259、例えば少なくとも260、例えば少なくとも261、例えば少なくとも262、例えば少なくとも263、例えば少なくとも264、例えば少なくとも265、例えば少なくとも266、例えば少なくとも267、例えば少なくとも268、例えば少なくとも269、例えば少なくとも270、例えば少なくとも271、例えば少なくとも272、例えば少なくとも273、例えば少なくとも274、例えば少なくとも275、例えば少なくとも276、例えば少なくとも277、例えば少なくとも278、例えば少なくとも279、例えば少なくとも280、例えば少なくとも281、例えば少なくとも282、例えば少なくとも283、例えば少なくとも284、例えば少なくとも285、例えば少なくとも286、例えば少なくとも287、例えば少なくとも288、例えば少なくとも289、例えば少なくとも290、例えば少なくとも291、例えば少なくとも292、例えば少なくとも293、例えば少なくとも294、例えば少なくとも295、例えば少なくとも296、例えば少なくとも297、例えば少なくとも298、例えば少なくとも299、例えば少なくとも300、例えば少なくとも301、例えば少なくとも302、例えば少なくとも303、例えば少なくとも304、例えば少なくとも305、例えば少なくとも306、例えば少なくとも307、例えば少なくとも308、例えば少なくとも309、例えば少なくとも310、例えば少なくとも311、例えば少なくとも312、例えば少なくとも313、例えば少なくとも314、例えば少なくとも315、例えば少なくとも316、
【００３９】
例えば少なくとも317、例えば少なくとも318、例えば少なくとも319、例えば少なくとも320、例えば少なくとも321、例えば少なくとも322、例えば少なくとも323、例えば少なくとも324、例えば少なくとも325、例えば少なくとも326、例えば少なくとも327、例えば少なくとも328、例えば少なくとも329、例えば少なくとも330、例えば少なくとも331、例えば少なくとも332、例えば少なくとも333、例えば少なくとも334、例えば少なくとも335、例えば少なくとも336、例えば少なくとも337、例えば少なくとも338、例えば少なくとも339、例えば少なくとも340、例えば少なくとも341、例えば少なくとも342、例えば少なくとも343、例えば少なくとも344、例えば少なくとも345、例えば少なくとも346、例えば少なくとも347、例えば少なくとも348、例えば少なくとも349、例えば少なくとも350、例えば少なくとも351、例えば少なくとも352、例えば少なくとも353、例えば少なくとも354、例えば少なくとも355、例えば少なくとも356、例えば少なくとも357、例えば少なくとも358、例えば少なくとも359、例えば少なくとも360、
【００４０】
例えば少なくとも361、例えば少なくとも362、例えば少なくとも363、例えば少なくとも364、例えば少なくとも365、例えば少なくとも366、例えば少なくとも367、例えば少なくとも368、例えば少なくとも369、例えば少なくとも370、例えば少なくとも371、例えば少なくとも372、例えば少なくとも373、例えば少なくとも374、例えば少なくとも375、例えば少なくとも376、例えば少なくとも377、例えば少なくとも378、例えば少なくとも379、例えば少なくとも380、例えば少なくとも381、例えば少なくとも382、例えば少なくとも383、例えば少なくとも384、例えば少なくとも385、例えば少なくとも386、例えば少なくとも387、例えば少なくとも388、例えば少なくとも389、例えば少なくとも390、例えば少なくとも391、例えば少なくとも392、例えば少なくとも393、例えば少なくとも394、例えば少なくとも395、例えば少なくとも396、例えば少なくとも397、例えば少なくとも398、例えば少なくとも399、例えば少なくとも400、例えば少なくとも401、例えば少なくとも402、例えば少なくとも403、例えば少なくとも404、例えば少なくとも405、例えば少なくとも406、例えば少なくとも407、例えば少なくとも408、例えば少なくとも409、例えば少なくとも410、例えば少なくとも411、例えば少なくとも412、例えば少なくとも413、例えば少なくとも414、例えば少なくとも415、
【００４１】
例えば少なくとも416、例えば少なくとも417、例えば少なくとも418、例えば少なくとも419、例えば少なくとも420、例えば少なくとも421、例えば少なくとも422、例えば少なくとも423、例えば少なくとも424、例えば少なくとも425、例えば少なくとも426、例えば少なくとも427、例えば少なくとも428、例えば少なくとも429、例えば少なくとも430、例えば少なくとも431、例えば少なくとも432、例えば少なくとも433、例えば少なくとも434、例えば少なくとも435、例えば少なくとも436、例えば少なくとも437、例えば少なくとも438、例えば少なくとも439、例えば少なくとも440、例えば少なくとも441、例えば少なくとも442、例えば少なくとも443、例えば少なくとも444、例えば少なくとも445、例えば少なくとも446、例えば少なくとも447、例えば少なくとも448、例えば少なくとも449、例えば少なくとも450、例えば少なくとも451、例えば少なくとも452、例えば少なくとも453、例えば少なくとも454、例えば少なくとも455、例えば少なくとも456、例えば少なくとも457、例えば少なくとも458、例えば少なくとも459、例えば少なくとも460、例えば少なくとも461、例えば少なくとも462、例えば少なくとも463、例えば少なくとも464、例えば少なくとも465、例えば少なくとも466、例えば少なくとも467、例えば少なくとも468、例えば少なくとも469、例えば少なくとも470、例えば少なくとも471、例えば少なくとも472、例えば少なくとも473、例えば少なくとも474、例えば少なくとも475、例えば少なくとも476、例えば少なくとも477、例えば少なくとも478、例えば少なくとも479、例えば少なくとも480、例えば少なくとも481、例えば少なくとも482、例えば少なくとも483、例えば少なくとも484、例えば少なくとも485、例えば少なくとも486、例えば少なくとも487、例えば少なくとも488、
【００４２】
例えば少なくとも489、例えば少なくとも490、例えば少なくとも491、例えば少なくとも492、例えば少なくとも493、例えば少なくとも494、例えば少なくとも495、例えば少なくとも496、例えば少なくとも497、例えば少なくとも498、例えば少なくとも499、例えば少なくとも500、例えば少なくとも501、例えば少なくとも502、例えば少なくとも503、例えば少なくとも504、例えば少なくとも505、例えば少なくとも506、例えば少なくとも507、例えば少なくとも508、例えば少なくとも509、例えば少なくとも510、例えば少なくとも511、例えば少なくとも512、例えば少なくとも513、例えば少なくとも514、例えば少なくとも515、例えば少なくとも516、例えば少なくとも517、例えば少なくとも518、例えば少なくとも519、例えば少なくとも520、例えば少なくとも521、例えば少なくとも522、例えば少なくとも523、例えば少なくとも524、例えば少なくとも525、例えば少なくとも526、例えば少なくとも527、例えば少なくとも528、例えば少なくとも529、例えば少なくとも530、例えば少なくとも531、例えば少なくとも532、例えば少なくとも533、例えば少なくとも534、例えば少なくとも535、例えば少なくとも536、例えば少なくとも537、例えば少なくとも538、例えば少なくとも539、例えば少なくとも540、例えば少なくとも541、例えば少なくとも542、例えば少なくとも543、例えば少なくとも544、例えば少なくとも545、例えば少なくとも546、例えば少なくとも547、例えば少なくとも548、例えば少なくとも549、例えば少なくとも550、例えば少なくとも551、例えば少なくとも552、例えば少なくとも553、例えば少なくとも554、
【００４３】
例えば少なくとも555、例えば少なくとも556、例えば少なくとも557、例えば少なくとも558、例えば少なくとも559、例えば少なくとも560、例えば少なくとも561、例えば少なくとも562、例えば少なくとも563、例えば少なくとも564、例えば少なくとも565、例えば少なくとも566、例えば少なくとも567、例えば少なくとも568、例えば少なくとも569、例えば少なくとも570、例えば少なくとも571、例えば少なくとも572、例えば少なくとも573、例えば少なくとも574、例えば少なくとも575、例えば少なくとも576、例えば少なくとも577、例えば少なくとも578、例えば少なくとも579、例えば少なくとも580、例えば少なくとも581、例えば少なくとも582、例えば少なくとも583、例えば少なくとも584、例えば少なくとも585、例えば少なくとも586、例えば少なくとも587、例えば少なくとも588、例えば少なくとも589、例えば少なくとも590、例えば少なくとも591連続ヌクレオチドである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明による少なくとも20連続ヌクレオチドの機能的フラグメントは、999以下の連続ヌクレオチド、例えば998以下、例えば997以下、例えば996以下、例えば995以下、例えば994以下、例えば993以下、例えば992以下、例えば991以下、例えば990以下、例えば989以下、例えば988以下、例えば987以下、例えば986以下、例えば985以下、例えば984以下、例えば983以下、例えば982以下、例えば981以下、例えば980以下、例えば979以下、例えば978以下、例えば977以下、例えば976以下、例えば975以下、例えば974以下、例えば973以下、例えば972以下、例えば971以下、例えば970以下、例えば969以下、例えば968以下、例えば967以下、例えば966以下、例えば965以下、例えば964以下、例えば963以下、例えば962以下、例えば961以下、例えば960以下、例えば959以下、例えば958以下、例えば957以下、例えば956以下、例えば955以下、例えば954以下、例えば953以下、例えば952以下、例えば951以下、例えば950以下、例えば949以下、例えば948以下、例えば947以下、例えば946以下、例えば945以下、例えば944以下、例えば943以下、例えば942以下、例えば941以下、例えば940以下、例えば939以下、例えば938以下、例えば937以下、例えば936以下、例えば935以下、例えば934以下、例えば933以下、例えば932以下、例えば931以下、例えば930以下、例えば929以下、例えば928以下、例えば927以下、例えば926以下、例えば925以下、例えば924以下、例えば923以下、例えば922以下、例えば921以下、例えば920以下、例えば919以下、例えば918以下、例えば917以下、例えば916以下、例えば915以下、例えば914以下、例えば913以下、例えば912以下、例えば911以下、例えば910以下、例えば909以下、例えば908以下、例えば907以下、例えば906以下、例えば905以下、例えば904以下、例えば903以下、例えば902以下、
【００４５】
例えば901以下、例えば900以下、例えば899以下、例えば898以下、例えば897以下、例えば896以下、例えば895以下、例えば894以下、例えば893以下、例えば892以下、例えば891以下、例えば890以下、例えば889以下、例えば888以下、例えば887以下、例えば886以下、例えば885以下、例えば884以下、例えば883以下、例えば882以下、例えば881以下、例えば880以下、例えば879以下、例えば878以下、例えば877以下、例えば876以下、例えば875以下、例えば874以下、例えば873以下、例えば872以下、例えば871以下、例えば870以下、例えば869以下、例えば868以下、例えば867以下、例えば866以下、例えば865以下、例えば864以下、例えば863以下、例えば862以下、例えば861以下、例えば860以下、例えば859以下、例えば858以下、例えば857以下、例えば856以下、例えば855以下、例えば854以下、例えば853以下、例えば852以下、例えば851以下、例えば850以下、例えば849以下、例えば848以下、例えば847以下、例えば846以下、例えば845以下、例えば844以下、例えば843以下、例えば842以下、例えば841以下、例えば840以下、例えば839以下、例えば838以下、例えば837以下、
【００４６】
例えば836以下、例えば835以下、例えば834以下、例えば833以下、例えば832以下、例えば831以下、例えば830以下、例えば829以下、例えば828以下、例えば827以下、例えば826以下、例えば825以下、例えば824以下、例えば823以下、例えば822以下、例えば821以下、例えば820以下、例えば819以下、例えば818以下、例えば817以下、例えば816以下、例えば815以下、例えば814以下、例えば813以下、例えば812以下、例えば811以下、例えば810以下、例えば809以下、例えば808以下、例えば807以下、例えば806以下、例えば805以下、例えば804以下、例えば803以下、例えば802以下、例えば801以下、例えば800以下、例えば799以下、例えば798以下、例えば797以下、例えば796以下、例えば795以下、例えば794以下、例えば793以下、例えば792以下、例えば791以下、例えば790以下、例えば789以下、例えば788以下、例えば787以下、例えば786以下、例えば785以下、例えば784以下、例えば783以下、例えば782以下、例えば781以下、例えば780以下、例えば779以下、例えば778以下、例えば777以下、例えば776以下、例えば775以下、例えば774以下、例えば773以下、例えば772以下、例えば771以下、例えば770以下、例えば769以下、例えば768以下、例えば767以下、例えば766以下、例えば765以下、例えば764以下、例えば763以下、例えば762以下、例えば761以下、例えば760以下、例えば759以下、例えば758以下、例えば757以下、
【００４７】
例えば756以下、例えば755以下、例えば754以下、例えば753以下、例えば752以下、例えば751以下、例えば750以下、例えば749以下、例えば748以下、例えば747以下、例えば746以下、例えば745以下、例えば744以下、例えば743以下、例えば742以下、例えば741以下、例えば740以下、例えば739以下、例えば738以下、例えば737以下、例えば736以下、例えば735以下、例えば734以下、例えば733以下、例えば732以下、例えば731以下、例えば730以下、例えば729以下、例えば728以下、例えば727以下、例えば726以下、例えば725以下、例えば724以下、例えば723以下、例えば722以下、例えば721以下、例えば720以下、例えば719以下、例えば718以下、例えば717以下、例えば716以下、例えば715以下、例えば714以下、例えば713以下、例えば712以下、例えば711以下、例えば710以下、例えば709以下、例えば708以下、例えば707以下、例えば706以下、例えば705以下、例えば704以下、例えば703以下、例えば702以下、例えば701以下、例えば700以下、例えば699以下、例えば698以下、例えば697以下、例えば696以下、例えば695以下、例えば694以下、例えば693以下、例えば692以下、例えば691以下、例えば690以下、例えば689以下、例えば688以下、例えば687以下、例えば686以下、例えば685以下、例えば684以下、例えば683以下、例えば682以下、例えば681以下、例えば680以下、例えば679以下、例えば678以下、例えば677以下、例えば676以下、例えば675以下、例えば674以下、例えば673以下、例えば672以下、
【００４８】
例えば671以下、例えば670以下、例えば669以下、例えば668以下、例えば667以下、例えば666以下、例えば665以下、例えば664以下、例えば663以下、例えば662以下、例えば661以下、例えば660以下、例えば659以下、例えば658以下、例えば657以下、例えば656以下、例えば655以下、例えば654以下、例えば653以下、例えば652以下、例えば651以下、例えば650以下、例えば649以下、例えば648以下、例えば647以下、例えば646以下、例えば645以下、例えば644以下、例えば643以下、例えば642以下、例えば641以下、例えば640以下、例えば639以下、例えば638以下、例えば637以下、例えば636以下、例えば635以下、例えば634以下、例えば633以下、例えば632以下、例えば631以下、例えば630以下、例えば629以下、例えば628以下、例えば627以下、例えば626以下、例えば625以下、例えば624以下、例えば623以下、例えば622以下、例えば621以下、例えば620以下、例えば619以下、例えば618以下、例えば617以下、例えば616以下、例えば615以下、例えば614以下、例えば613以下、例えば612以下、
【００４９】
例えば611以下、例えば610以下、例えば609以下、例えば608以下、例えば607以下、例えば606以下、例えば605以下、例えば604以下、例えば603以下、例えば602以下、例えば601以下、例えば600以下、例えば599以下、例えば598以下、例えば597以下、例えば596以下、例えば595以下、例えば594以下、例えば593以下、例えば592以下、例えば591以下、例えば590以下、例えば589以下、例えば588以下、例えば587以下、例えば586以下、例えば585以下、例えば584以下、例えば583以下、例えば582以下、例えば581以下、例えば580以下、例えば579以下、例えば578以下、例えば577以下、例えば576以下、例えば575以下、例えば574以下、例えば573以下、例えば572以下、例えば571以下、例えば570以下、例えば569以下、例えば568以下、例えば567以下、例えば566以下、例えば565以下、例えば564以下、例えば563以下、例えば562以下、例えば561以下、例えば560以下、例えば559以下、例えば558以下、例えば557以下、例えば556以下、例えば555以下、例えば554以下、例えば553以下、例えば552以下、例えば551以下、例えば550以下、例えば549以下、例えば548以下、例えば547以下、例えば546以下、例えば545以下、例えば544以下、例えば543以下、例えば542以下、例えば541以下、例えば540以下、例えば539以下、例えば538以下、例えば537以下、例えば536以下、例えば535以下、例えば534以下、例えば533以下、例えば532以下、
【００５０】
例えば531以下、例えば530以下、例えば529以下、例えば528以下、例えば527以下、例えば526以下、例えば525以下、例えば524以下、例えば523以下、例えば522以下、例えば521以下、例えば520以下、例えば519以下、例えば518以下、例えば517以下、例えば516以下、例えば515以下、例えば514以下、例えば513以下、例えば512以下、例えば511以下、例えば510以下、例えば509以下、例えば508以下、例えば507以下、例えば506以下、例えば505以下、例えば504以下、例えば503以下、例えば502以下、例えば501以下、例えば500以下、例えば499以下、例えば498以下、例えば497以下、例えば496以下、例えば495以下、例えば494以下、例えば493以下、例えば492以下、例えば491以下、例えば490以下、例えば489以下、例えば488以下、例えば487以下、例えば486以下、例えば485以下、例えば484以下、例えば483以下、例えば482以下、例えば481以下、例えば480以下、例えば479以下、例えば478以下、例えば477以下、例えば476以下、例えば475以下、例えば474以下、例えば473以下、例えば472以下、例えば471以下、例えば470以下、例えば469以下、例えば468以下、例えば467以下、例えば466以下、例えば465以下、例えば464以下、例えば463以下、例えば462以下、例えば461以下、例えば460以下、例えば459以下、例えば458以下、例えば457以下、例えば456以下、例えば455以下、例えば454以下、例えば453以下、例えば452以下、例えば451以下、例えば450以下、例えば449以下、例えば448以下、例えば447以下、例えば446以下、例えば445以下、例えば444以下、例えば443以下、例えば442以下、例えば441以下、例えば440以下、例えば439以下、例えば438以下、例えば437以下、
【００５１】
例えば436以下、例えば435以下、例えば434以下、例えば433以下、例えば432以下、例えば431以下、例えば430以下、例えば429以下、例えば428以下、例えば427以下、例えば426以下、例えば425以下、例えば424以下、例えば423以下、例えば422以下、例えば421以下、例えば420以下、例えば419以下、例えば418以下、例えば417以下、例えば416以下、例えば415以下、例えば414以下、例えば413以下、例えば412以下、例えば411以下、例えば410以下、例えば409以下、例えば408以下、例えば407以下、例えば406以下、例えば405以下、例えば404以下、例えば403以下、例えば402以下、例えば401以下、例えば400以下、例えば399以下、例えば398以下、例えば397以下、例えば396以下、例えば395以下、例えば394以下、例えば393以下、例えば392以下、例えば391以下、例えば390以下、例えば389以下、例えば388以下、例えば387以下、例えば386以下、例えば385以下、例えば384以下、例えば383以下、例えば382以下、例えば381以下、例えば380以下、例えば379以下、例えば378以下、例えば377以下、
【００５２】
例えば376以下、例えば375以下、例えば374以下、例えば373以下、例えば372以下、例えば371以下、例えば370以下、例えば369以下、例えば368以下、例えば367以下、例えば366以下、例えば365以下、例えば364以下、例えば363以下、例えば362以下、例えば361以下、例えば360以下、例えば359以下、例えば358以下、例えば357以下、例えば356以下、例えば355以下、例えば354以下、例えば353以下、例えば352以下、例えば351以下、例えば350以下、例えば349以下、例えば348以下、例えば347以下、例えば346以下、例えば345以下、例えば344以下、例えば343以下、例えば342以下、例えば341以下、例えば340以下、例えば339以下、例えば338以下、例えば337以下、例えば336以下、例えば335以下、例えば334以下、例えば333以下、例えば332以下、例えば331以下、例えば330以下、例えば329以下、例えば328以下、例えば327以下、例えば326以下、例えば325以下、例えば324以下、例えば323以下、例えば322以下、例えば321以下、例えば320以下、例えば319以下、例えば318以下、例えば317以下、
【００５３】
例えば316以下、例えば315以下、例えば314以下、例えば313以下、例えば312以下、例えば311以下、例えば310以下、例えば309以下、例えば308以下、例えば307以下、例えば306以下、例えば305以下、例えば304以下、例えば303以下、例えば302以下、例えば301以下、例えば300以下、例えば299以下、例えば298以下、例えば297以下、例えば296以下、例えば295以下、例えば294以下、例えば293以下、例えば292以下、例えば291以下、例えば290以下、例えば289以下、例えば288以下、例えば287以下、例えば286以下、例えば285以下、例えば284以下、例えば283以下、例えば282以下、例えば281以下、例えば280以下、例えば279以下、例えば278以下、例えば277以下、例えば276以下、例えば275以下、例えば274以下、例えば273以下、例えば272以下、例えば271以下、例えば270以下、例えば269以下、例えば268以下、例えば267以下、例えば266以下、例えば265以下、例えば264以下、例えば263以下、例えば262以下、例えば261以下、例えば260以下、例えば259以下、例えば258以下、例えば257以下、例えば256以下、例えば255以下、例えば254以下、例えば253以下、例えば252以下、例えば251以下、例えば250以下、例えば249以下、例えば248以下、例えば247以下、例えば246以下、例えば245以下、例えば244以下、例えば243以下、例えば242以下、例えば241以下、例えば240以下、例えば239以下、例えば238以下、例えば237以下、例えば236以下、例えば235以下、例えば234以下、例えば233以下、例えば232以下、
【００５４】
例えば231以下、例えば230以下、例えば229以下、例えば228以下、例えば227以下、例えば226以下、例えば225以下、例えば224以下、例えば223以下、例えば222以下、例えば221以下、例えば220以下、例えば219以下、例えば218以下、例えば217以下、例えば216以下、例えば215以下、例えば214以下、例えば213以下、例えば212以下、例えば211以下、例えば210以下、例えば209以下、例えば208以下、例えば207以下、例えば206以下、例えば205以下、例えば204以下、例えば203以下、例えば202以下、例えば201以下、例えば200以下、例えば199以下、例えば198以下、例えば197以下、例えば196以下、例えば195以下、例えば194以下、例えば193以下、例えば192以下、例えば191以下、例えば190以下、例えば189以下、例えば188以下、例えば187以下、例えば186以下、例えば185以下、例えば184以下、例えば183以下、例えば182以下、例えば181以下、例えば180以下、例えば179以下、例えば178以下、例えば177以下、
【００５５】
例えば176以下、例えば175以下、例えば174以下、例えば173以下、例えば172以下、例えば171以下、例えば170以下、例えば169以下、例えば168以下、例えば167以下、例えば166以下、例えば165以下、例えば164以下、例えば163以下、例えば162以下、例えば161以下、例えば160以下、例えば159以下、例えば158以下、例えば157以下、例えば156以下、例えば155以下、例えば154以下、例えば153以下、例えば152以下、例えば151以下、例えば150以下、例えば149以下、例えば148以下、例えば147以下、例えば146以下、例えば145以下、例えば144以下、例えば143以下、例えば142以下、例えば141以下、例えば140以下、例えば139以下、例えば138以下、例えば137以下、例えば136以下、例えば135以下、例えば134以下、例えば133以下、例えば132以下、例えば131以下、例えば130以下、例えば129以下、例えば128以下、例えば127以下、例えば126以下、例えば125以下、例えば124以下、例えば123以下、例えば122以下、
【００５６】
例えば121以下、例えば120以下、例えば119以下、例えば118以下、例えば117以下、例えば116以下、例えば115以下、例えば114以下、例えば113以下、例えば112以下、例えば111以下、例えば110以下、例えば109以下、例えば108以下、例えば107以下、例えば106以下、例えば105以下、例えば104以下、例えば103以下、例えば102以下、例えば101以下、例えば100以下、例えば99以下、例えば98以下、例えば97以下、例えば96以下、例えば95以下、例えば94以下、例えば93以下、例えば92以下、例えば91以下、例えば90以下、例えば89以下、例えば88以下、例えば87以下、例えば86以下、例えば85以下、例えば84以下、例えば83以下、例えば82以下、例えば81以下、例えば80以下、例えば79以下、例えば78以下、例えば77以下、例えば76以下、例えば75以下、例えば74以下、例えば73以下、例えば72以下、例えば71以下、例えば70以下、例えば69以下、例えば68以下、例えば67以下、例えば66以下、例えば65以下、例えば64以下、例えば63以下、例えば62以下、例えば61以下、
【００５７】
例えば60以下、例えば59以下、例えば58以下、例えば57以下、例えば56以下、例えば55以下、例えば54以下、例えば53以下、例えば52以下、例えば51以下、例えば50以下、例えば49以下、例えば48以下、例えば47以下、例えば46以下、例えば45以下、例えば44以下、例えば43以下、例えば42以下、例えば41以下、例えば40以下、例えば39以下、例えば38以下、例えば37以下、例えば36以下、例えば35以下、例えば34以下、例えば33以下、例えば32以下、例えば31以下、例えば30以下、例えば29以下、例えば28以下、例えば27以下、例えば26以下、例えば25以下の連続ヌクレオチドである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベルと比較して、増加したタンパク質発現レベルを示す。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して約50パーセント〜約300パーセントである。いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して300パーセントを超える。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して２倍〜10倍である。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して10倍〜100倍、例えば20〜80倍、例えば20〜40倍である。
活性の増加は、参照と同じかつ標準的な条件下で測定され比較されることが理解される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、選択マーカー、例えばゼオシン選択マーカー、ネオマイシン選択マーカー、ハイグロマイシン択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー及びブラストサイジン選択マーカーからなる群より選択される選択マーカーをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター、例えばカナマイシンプロモーターの機能的フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、昆虫細胞における選択マーカーの発現を駆動するのに適する第２のプロモーターDNAポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この第２のプロモーターは：
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、マルチクローニング部位に対して上流及び／又は下流に１つ以上の遍在性クロマチンオープニングエレメント(ubiquitous chromatin opening element)をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写インスレーターエレメント、例えばSu(Hw)又はGypsy (GSu(Hw))インスレーター配列をさらに含む(Mol Cell Biol. 1997 April; 17(4): 2202〜2206)。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、昆虫細胞における選択のために適するジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列、例えばSV40ポリＡシグナル及び／又はOPIE2ポリＡシグナルをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、大腸菌の起点をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列、例えばBIP及びCPYからなるリストから選択されるものをさらに含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、ウイルスDNAを実質的に含まない。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つのHISタグ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、HISタグ配列は、Ｎ末端HISタグである。いくつかの実施形態において、HISタグ配列は、以下の配列による：atgaaacaccaacaccaacatcaacatcaacatcaacatcaa (配列番号38)。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、興味対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、単離DNAポリヌクレオチドに挿入するために、プロモーターDNAポリヌクレオチドの下流にマルチクローニング部位をさらに含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、SV40からの少なくとも１つの72bpエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、SV40からの２つの72bpエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、プロモーターの上流にSV40からの少なくとも１つの72bpエレメントと、プロモーターの下流にSV40からの少なくとも１つの72bpエレメントとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、Ｂ型肝炎ウイルスからの少なくとも１つのPREエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルスからのPREエレメントは、配列番号40、例えば配列番号40のヌクレオチド10〜574による。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つの増幅制御エレメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つのOri-ベータエレメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも１つのマトリクス付着領域(MAR)エレメントをさらに含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明によるプロモーターDNAポリヌクレオチドは、遺伝子又はそれが結合するその他のDNA配列の発現を制御する。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、プロモーターDNAポリヌクレオチド配列に対して異種のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列のいずれか１つの配列の少なくとも３連続ヌクレオチドの機能的フラグメント、並びにそれと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列である少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、該機能的フラグメントは、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーターエンハンサー活性を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、クローニングベクターである。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、発現ベクターである。
【００６６】
ある態様は、本発明による単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、キイロショウジョウバエ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、キイロショウジョウバエS2細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞は、上記の単離DNAポリヌクレオチドを安定的に形質移入されている。
本明細書で用いる場合、「安定的に形質移入する」とは、本発明によるDNAポリヌクレオチドを形質移入されて、それらのゲノムに挿入された新しい遺伝子を有する培養細胞の永続的な系統を生成する細胞である。通常、このことは、所望の遺伝子を「選択」遺伝子、すなわち抗生物質(例えばゼオシン)に対する耐性を与える遺伝子につなげることにより行われる。培養培地中に抗生物質を入れることにより、耐性遺伝子が組み込まれた細胞のみが生存し、これらの実質的に全てに、本発明によるDNAポリヌクレオチドが組み込まれる。
【００６７】
「クローニングベクター」は、宿主細胞に興味対象のDNAフラグメントを、通常、該フラグメント多重コピーを生成するために、挿入するのに用いることができるプラスミドDNA、すなわちベクターを意味する。
「発現ベクター」は、ベクターに挿入できる、遺伝子配列に由来するmRNAの合成のために必要な調節シグナルを含むプラスミド又はウイルスDNAを意味する。遺伝子配列は、例えば上記で規定されるキメラポリヌクレオチドである。
本明細書で用いる場合、「ポリアデニル化配列」とは、転写されたときに発現宿主により認識されて、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するDNA配列のことをいう。これは、発現されるポリペプチドをコードするDNAの3'末端に機能的に連結される。適切なポリアデニル化配列は、Angelichioら、1991、Comparison of several promoters and polyadenylation signals for use in heterologous gene expression in cultured Drosophila cells, Nucleic Acids Research、第19巻、第18号、5037〜5043に記載されるようなOPIE2ポリＡテイル及び後期SV40ポリＡテイルを含む。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「選択マーカー」とは、発現されたときに宿主細胞の形質転換の成功を示す、発現ベクター中に存在する遺伝子エレメントのことをいう。例えば、選択マーカーは、形質転換された宿主細胞に、抗生物質に対する耐性を与える(優性型マーカー)か、又は特定の栄養素を代謝する能力を与える(栄養要求型の選択マーカー、すなわち、宿主における欠損を「治す」マーカー)ことができる。典型的には、選択マーカーは、ベクターにより発現される遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターの制御下にある。
【００６９】
用語「機能的に連結された」とは、単一核酸フラグメント上の核酸配列同士の関係であって、一方の機能が他方により影響を受ける関係のことをいう。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響できる場合、このプロモーターは、コード配列に機能的に連結されている(すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある)。
本明細書で用いる場合、用語「発現」とは、本発明の単離DNAポリヌクレオチド(これが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む場合)に由来するmRNAの転写及び安定的蓄積から、ポリペプチド生成物へのその後のmRNAの翻訳を経て、最終的に宿主細胞により行われるポリペプチド生成物の転写後修飾までの宿主細胞における完全な生物学的プロセスのことをいう。「過剰発現」とは、通常の非形質転換細胞における生成レベルを超える、形質転換細胞における遺伝子生成物の生成のことをいう。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「タンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列」とは、宿主発現細胞の膜を横切る発現タンパク質の移動を駆動又は促進する配列のことをいう。「タンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列」は、前駆ポリペプチド(プレペプチド又はプレプロペプチド)のＮ末端に存在して、膜を横切るその移動を駆動し得る。典型的には、前駆ポリペプチドは、シグナル配列の切断によりプロセシングされて、成熟ペプチド又はプロペプチドを産生する。シグナルペプチドから切り出される(off-cleavage)生成物がプロペプチドである場合、成熟ペプチドは、アミノ酸のさらなる除去を含むその後の転写後修飾の生成物である。
この定義の範囲内のその他の適切な「タンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列」は、分泌のためのショウジョウバエBiPシグナル配列及びCPYを含む。
ショウジョウバエBiPタンパク質は、免疫グロブリン結合シャペロンタンパク質をコードする。この分泌シグナルは、高レベルのBiPに、S2細胞の分泌経路を効率的に標的にさせる(Kirkpatrick, R.B.ら(1995) J. Biol. Chem. 270: 19800〜19805)。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「遍在性クロマチンオープニングエレメント」又は「UCOE」は、クロマチンをオープンにするか又はクロマチンをオープン状態に維持し、細胞内の機能的に連結された遺伝子の再現可能な発現を促進するDNA配列のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「マトリクス付着領域」又は「MAR」又は「足場/マトリクス付着領域」とは、核マトリクスが付着する真核染色体のDNAにおけるヌクレオチド配列のことをいう。MARは、核内のクロマチンの構造的機構を媒介する。これらのエレメントは、クロマチン足場のためのDNAの係留点を構成し、クロマチンを構造ドメインに組織化する働きをする。個別の遺伝子についての研究により、S/MARエレメントにより媒介されるクロマチンの動的で複雑な機構が、遺伝子発現の調節において重要な役割を有するとの結論が得られた。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「増幅制御エレメント」又は「Ace」は、複製起点からのDNAの増幅開始に関与するエレメントのことをいう。第３染色体クラスタに由来するトランスジェニック構築物の欠失分析により、増幅に必要な320-bpの増幅制御エレメント(ACE3)が同定された。よって、この定義には、キイロショウジョウバエACE3エレメントが含まれる。この定義には、増幅増進領域(AER)も含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「Ori-ベータエレメント」又は「oriB」とは、複製起点(origin of replication)のことをいう。複製起点(複製起点(replication origin)ともよばれる)は、複製が開始されるゲノム又はプラスミドの特定の配列である。これは、原核生物及び真核生物のような生物におけるDNA複製、又は２本鎖RNAウイルスのようなRNAウイルスにおけるRNA複製のいずれかであり得る。DNA複製は、この点から２方向又は１方向に進み得る。複製起点は、DNAを認識し、巻き戻し、そのコピーを開始するタンパク質複合体であるプレ複製複合体に結合する。この定義内のある具体的な「Ori-ベータエレメント」は、キイロショウジョウバエOri-ベータエレメントである。
【００７３】
機能的ACE3及びori-Bエレメントについての配列要件については、Hongjun Zhang及びJohn Tower, 2004, Sequence requirements for function of the Drosophila chorion gene locus ACE3 replicator and ori-b origin elements, Development 131, 2089〜2099, 2004、及びCarminatiら、1992, The Drosophila ACE3 Chorion Element AutonomouslyInduces Amplification, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 1992, p. 2444〜2453を参照されたい。
【００７４】
DNAワクチンに対するSV40 72bpエレメントの影響
筋肉細胞のような非分裂細胞における核移入は、非ウイルス遺伝子送達系の問題の１つである。これは、抗原のより低い合成をもたらし、よって、その後、乏しい抗原提示をもたらし得る。非分裂細胞における非ウイルスDNAの核輸送を増進するSV40エンハンサー領域の72 bp反復が同定された。エンハンサー領域は、いくつかの転写因子結合部位を有する。プラスミドが細胞質に入るとすぐに、いくつかの転写因子がこれに結合し、核局在化シグナルを提供することにより、非ウイルスDNAを核へ迅速に移送することが可能になる(Exp Cell Res. 1999, 253, 713)。遺伝子発現の増進も、エレクトロポレーションによりマウス筋肉に注入されたSV40エンハンサーエレメント含有ベクターを用いて観察された(Gene Ther., 2001, 8, 494)。
【００７５】
本明細書で用いる場合、用語「SV40からの72bpエレメント」とは、非分裂細胞における非ウイルスDNAの核輸送を増進するSV40エンハンサー領域の72 bp反復のことをいう。具体的な実施形態において、「SV40からの72bpエレメント」とは、以下の配列を有するエレメントのことをいう：配列番号39の10番目のヌクレオチドから86番目のヌクレオチドに相当するATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGCTGGTT (配列番号74)。具体的な実施形態において、「SV40からの72bpエレメント」とは、配列番号39の配列を有するエレメントのことをいう。
【００７６】
Ｂ型肝炎ウイルスからのPREエレメント(配列番号40)
いくつかの真核又はウイルスmRNAは、それらが翻訳され得る細胞質へと核の外へ輸送されることを妨げる阻害配列を含有する。Ｂ型肝炎ウイルスＳ転写産物は、転写後制御エレメント(PRE)として知られる領域を含み、これは、それらの輸送をシスに活性化する機能を有する。このエレメントは、ヒト免疫不全ウイルスRev-応答エレメント(RRE)に部分的に置換できる。このエレメント又は同様の機能を有するエレメントを、抗原(例えばHIV-1 Gag)をコードする遺伝子の3'非翻訳領域において付加することが、抗原の発現レベルを増加し、免疫応答を改善できる。
【００７７】
本明細書で用いる場合、用語「インスレーター配列」とは、プロモーターとエンハンサー/サイレンサーとの相互作用に影響を及ぼし、抑制的クロマチンの広がりについての障壁として機能するDNA配列のことをいう。この定義には、Lu L, Tower J, 1997, A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects, Mol Cell Biol. April; 17(4): 2202〜2206に記載される(su(Hw))インスレーター配列が含まれる。キイロショウジョウバエゲノム中に存在するインスレーター機能を有する多様な配列のうち、gypsyレトロトランスポゾンにおいて最初に見出されたSu(Hw)タンパク質についての反復結合部位からなる、よく研究されおそらく最も強いインスレーターを用い得る。Su(Hw)インスレーターは、調節性相互作用の用途の広い調節因子であり、20を超える異なるエンハンサーを遮断する。最近、内因性のSu(Hw)依存性であるが、構造的に異なるインスレーターがyellow遺伝子とachaete遺伝子の間で見出された。
【００７８】
用語「ライゲーション非依存性クローニング」又は「LIC」は、本明細書において、Robert E. Novy, Keith W. Yaeger及びKristin M. Kolbの「Efficient Directional Cloning of PCR Products」の文献(http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/inno05-002.pdf)による定義に従い、ライゲーション非依存性クローニング(LIC)は、次のように記載できる「ライゲーション非依存性クローニング(LIC)は、制限酵素消化もライゲーション反応も行わないPCR生成物の定方向クローニングのために開発された。LICベクターは、直鎖状にした主鎖をT4 DNAポリメラーゼで１つのdNTPのみの存在下で処理することにより創出される。T4 DNAポリメラーゼの3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性が、反応混合物中に存在する単一dNTPに相当する残基に遭遇するまでヌクレオチドを除去する。この点で、酵素の5'から3'へのポリメラーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性を打ち消して、さらなる除去を効果的に妨げる。直鎖化の部位に接するプラスミド配列は、LICベクターにおいて特定の非相補的13又は14塩基の１本鎖突出を生成するように設計されている。相補的突出を有するPCR生成物は、適切な5'伸長をプライマー中に構築することにより創出される。PCR生成物は、生成されてdNTP (及びもし鋳型として用いたならば元のプラスミド)が除去され、適切なdNTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理されて、特定のベクターに適合する突出が産生される。アニールされたLICベクターと挿入断片とでコンピテント大腸菌細胞を形質転換する。ベクター挿入断片接合部での共有結合の形成が細胞内で生じて、環状プラスミドが得られる」。
【００７９】
LIC方法論の詳細な記載は、Nick S. Berrowら、2007 「A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications」、Nucleic Acids Researchで見出すことができる。
本発明のLICを可能にするベクターのいくつかの具体的な実施形態を、配列番号69〜73に示す。
【００８０】
ある具体的な実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、以下のエレメントからなる：
1.    昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号５、配列番号６又は配列番号２によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター；
2.    細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター；
3.    ゼオシン選択マーカーとSV40ポリＡテイル；
4.    大腸菌起点；
5.    配列番号６によるヌクレオチド配列を有するハイブリッドキイロショウジョウバエ612bpアクチン5Cプロモーターであって、アクチンコア配列の部分又は全体(例えば配列番号６のヌクレオチド478〜572)が、配列番号１、配列番号２、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーターで置き換えられているプロモーター、又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメント；
6.    BIPタンパク質排出シグナル配列；
7.    マルチクローニング部位；及び
8.    OPIE2ポリＡテイル。
【００８１】
ある具体的な実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、以下のエレメントからなる：
1.    昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号５、配列番号６又は配列番号２によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター；
2.    細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター；
3.    ゼオシン選択マーカーとSV40ポリＡテイル；
4.    大腸菌起点；
5.    配列番号３のヌクレオチド2076〜2532によるヌクレオチド配列を有するキイロショウジョウバエ457bpアクチン5Cプロモーター；
6.    BIPタンパク質排出シグナル配列；
7.    マルチクローニング部位；及び
8.    OPIE2ポリＡテイル。
【００８２】
ある具体的な実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、以下のエレメントからなる：
1.    昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号５、配列番号６又は配列番号２によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター；
2.    細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター；
3.    ゼオシン選択マーカーとSV40ポリＡテイル；
4.    大腸菌起点；
5.    配列番号３のヌクレオチド2076〜2532によるヌクレオチド配列を有するキイロショウジョウバエ457bpアクチン5Cプロモーターのハイブリッドであって、アクチンコア配列の部分又は全体(例えば配列番号３のヌクレオチド2392〜2487)が、配列番号１、配列番号２、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーターで置き換えられているハイブリッド、又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメント；
6.    BIPタンパク質排出シグナル配列；
7.    マルチクローニング部位；及び
8.    OPIE2ポリＡテイル。
【００８３】
ある具体的な実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、以下のエレメントからなる：
1.    昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号５、配列番号６又は配列番号２によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター；
2.    細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター；
3.    ゼオシン選択マーカーとSV40ポリＡテイル；
4.    大腸菌起点；
5.    配列番号１、配列番号２、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーター又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメントと、HSP70コアプロモーターに対してシスのアクチン5Cプロモーターの１つ以上の機能的フラグメント(アクチン5c調節エレメント)；
6.    BIPタンパク質排出シグナル配列；
7.    マルチクローニング部位；及び
8.    OPIE2ポリＡテイル。
【００８４】
いくつかの具体的な実施形態において、以下のエレメントは、本発明による単離DNAポリヌクレオチドにおいて交換される：
1.    Su(Hw)エレメントは、発現カセット(発現プロモーター、興味対象の遺伝子及びポリＡテイル)の前及び後に配置され得る；及び／又は
2.    ゼオシン選択マーカーは、発現ベクター中で以下のもので置き換えてよい：
a.    ネオマイシン選択マーカー若しくは
b.    ブラストサイジン選択マーカー若しくは
c.    ハイグロマイシン選択マーカー若しくは
d.    ピューロマイシン選択マーカー；及び
3.    発現構築物は、HISタグとともに又はなしで作製される。
【００８５】
本発明によるある適切なベクターは、以下のものからなり得る：
1.    細菌選択マーカーと細菌プロモーター
a.    pKANR細菌プロモーター
b.    ゼオシン選択マーカー(ZeoR及び／又はKanR)
2.    昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター
a.    切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター
b.    ゼオシン選択マーカーとSV40ポリＡテイル
3.    大腸菌起点
4.    タンパク質発現を駆動するための切断型キイロショウジョウバエアクチン5C又はHSP70プロモーター
5.    BIPタンパク質排出シグナル配列
6.    HISタグ
7.    マルチクローニング部位
8.    OPIE2ポリＡテイル。
【００８６】
個別のエレメントは、任意の順序で配置してよいことが上記から理解される。よって、昆虫プロモーター及び細菌プロモーターは、互いの後に直列に配置してよい。また、同じ選択マーカー配列が、細菌プロモーター及び昆虫細胞プロモーターの両方により用いられ得る。
【００８７】
一般的なベクターの改良
以下のエレメントを発現ベクターに加えて、発現レベルを増大し得る。
1.    興味対象遺伝子発現カセットの上流及び下流に遍在性クロマチンオープニングエレメント；及び／又は
2.    SV40のプレエレメントと72 bpエレメント；及び／又は
3.    MAR(マトリクス付着領域)；及び／又は
4.    キイロショウジョウバエからのACE3とori-ベータ；及び／又は
5.    転写インスレーターエレメント、su(Hw)結合部位(Mol Cell Biol. 1997 April; 17(4): 2202〜2206.)；及び／又は
6.    BIPを置き換えるためのCPYエレメント(もしCPYがS2において機能的であるとわかったならば)；及び／又は
7.    dhfrを、昆虫細胞での選択のために挿入できる；及び／又は
8.    別のカナマイシン又はアンピシリン耐性カセットを細菌での選択のために挿入してよい；及び／又は
9.    OPIE2ポリＡテイルを後期SV40ポリＡテイルで置き換える；及び／又は
10.   タンパク質発現を駆動するためのプロモーターの下流にイントロンを導入する；及び／又は
11.   ライゲーション非依存性クローニングカセットを含め得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明によるポリヌクレオチド配列は、中程度のストリンジェンシー条件下で、以下からなる群より選択される配列とハイブリッド形成する；
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37又は配列番号58のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
(iii) (i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメント；
(iv) (iii)の少なくとも６ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列。
本明細書で用いる場合、用語「中程度のストリンジェンシー」とは、約50%ホルムアミド、６×SSC中、約42℃でのポリヌクレオチドハイブリッド形成条件と、約60℃、0.5×SSC、0.1% SDS中での洗浄条件のことをいう。
【００８９】
タンパク質発現のための本発明の方法
本発明の別の態様は、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び回収に関する。
詳細に上述したように、本発明のこの態様は、全般的に、
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37又は配列番号58のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも６連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも６ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドが、分泌ポリペプチドを発現する場合に、改良された収率を示すことを見出したことを利用する。
【００９０】
本発明者らは、最近、改良された収率(例えばpOPIE2プロモーターを用いる構築物に対して)が、改良された発現レベル及び分泌の結果であることを証明している。上記のように、本発明の方法は：
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチド配列を、請求項１〜27のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチドに挿入するステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、上記のポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む。
【００９１】
形質転換の方法は、宿主細胞の選択により変動するが、典型的には、酢酸リチウムによる形質移入(Okazakiら、Nucleic acid Res. 18: 6485〜6489, 1990、本明細書に参照により組み込まれる)又はエレクトロポレーションが酵母において用いられ、形質移入及び形質導入(すなわち、ウイルスベクターによる遺伝子材料の伝達)を、多細胞生物からの細胞において用い得る。キイロショウジョウバエS2細胞における形質移入のために適する方法は、Park J.H.; Kim H.Y.; Han K.H.; Chung I.S, Optimization of transfection conditions for expression of green fluorescent protein in Drosophila melanogaster S2 cells - a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Enzyme and Microbial Technology, 第25巻, 第7号, October 1999, pp. 558〜563(6)に記載されている。
形質転換及び形質転換細胞(酵母又はより高等)の培養についてのより一般的な教示は、Sambrook Jら, "Molecular Cloning: A laboratory Manual", 第３版において見出し得る。
【００９２】
プロモーターの選択、機能的分泌シグナルペプチド、ベクターのフォーマットの選択、宿主細胞の選択、選択マーカーの使用及び安定化エレメントの使用に関する上記の教示は、本発明の方法に準用される。これらの教示と、本発明の方法に関する教示との唯一の違いは、ベクター内のコード配列の厳密な組成(composition)である。なぜなら、本発明の方法は、本明細書で規定されるキメラポリヌクレオチドの存在に依存しないからである。しかし、本発明の方法において用いられる発現ベクターは、本発明の発現ベクターであることが好ましい。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ステップ(c)で得られたポリペプチドを翻訳後修飾に付すさらなるステップを含む。これは、宿主細胞により行われる翻訳後修飾(及びポリペプチドの回収までのその後)と、ポリペプチドの回収後にインビトロで行われる修飾との両方を必然的に伴う。
本発明の方法のステップ(a)は、通常、ベクターを宿主細胞に導入するステップと、その後、ベクター内に存在する選択マーカー遺伝子を発現する形質転換体を選択するステップとを含む。有用な選択マーカー遺伝子は、上で詳細に述べた。
【実施例】
【００９４】
本発明を、以下の限定しない実施例により説明する。
実施例１
略称
【表１】
2011522554.tif 000002
【００９５】
材料及び方法
株化細胞
ショウジョウバエS2細胞は、ATCCに由来した(CRL-1963、ロット番号3225543)。
ATCCからのショウジョウバエS2細胞のバイアルを復活させ、組織培養フラスコ中で増殖させた。細胞数が108細胞を超えたときに、2×107のショウジョウバエS2細胞を１mLの凍結培地(Excell420＋50% FBS＋10% DMSO)中に含む20本のバイアルからなる細胞バンクを確立して、−80℃にて貯蔵した。
【００９６】
プラスミド構築
【表２】
2011522554.tif 000003
【００９７】
【表３】
2011522554.tif 000004
【００９８】
【表４】
2011522554.tif 000005
【００９９】
この研究について、モデルタンパク質としてRANKリガンド(RANK-L又はRANKL)を用いた。このタンパク質は、試験したそれぞれのベクターのマルチクローニング部位においてBIPシグナル配列の後に挿入した。
【数１】
2011522554.tif 000006
【０１００】
S2ベクターの構築
pZOp2F-NheI (p2260、MR#3070株)。このベクターは、異なるプロモーターを有するクローニングベクターについてStratageneからのQuikChange Site-Direct Mutagenesisキットを用いることにより、SV40の下流にNheI部位を有して創出した。
QuickChangeを、プライマー975及び976を用い、p1205を鋳型として用いて作製した。PCR生成物をDpnIで37℃にて１時間処理し、DH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
プラスミドは、プライマー590を用いて完全に配列決定した。
【０１０１】
pHP11 (p2263、MR#3073株)は、ワンステップPCR増幅により構築した。PCRは、プライマー980及び979を用い、p805 (pAc5.1/V5-HisA)を鋳型として用いて行った。得られたフラグメントは、アクチン 5Cプロモーターを含む2540 bpであった。PCR生成物を制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、 SAPで処理したp2260にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、981、986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０２】
pHP12ベクター(p2263、MR#3073株)は、ワンステップPCR増幅により構築した。PCRは、プライマー981及び982を用い、p2546を鋳型として用いて行った。得られたフラグメントは、S2細胞のゲノムDNAから得たHsp70-pFast-BacからのHsp70プロモーターを含む299 bpであった。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、 SAPで処理したp2260にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、981、986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０３】
pHP13 (p2264、MR#3074株)は、ワンステップPCR増幅により構築した。PCRは、プライマー983及び984を用い、p2546を鋳型として用いて行った。得られたフラグメントは、S2細胞のゲノムDNAから得たHsp70-pFast-Bacからの全長Hsp70プロモーターを含む473 bpであった。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、 SAPで処理したp2260にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、984及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０４】
ベクター中のZeoR遺伝子の上流のOpIE2及びEM7プロモーターの変更
pHP15a (p2270、MR#3080株)
全てZeoR遺伝子の上流で、EM7プロモーターの代わりにptrcプロモーター、OpIE2の代わりにアクチン5Cプロモーターを含むベクター。
構築物は、SOE-PCRにより構築した。第１のPCR1フラグメントは、プライマー4007及び4009を用い、p2263を鋳型として用いて作製した。得られたPCR生成物は、234 bpのサイズを有する。
第２のPCR2フラグメントは、プライマー4008及び4000を用い、p2263を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、1134 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより作製した。最後に、フラグメントを、プライマー4000及び4009を用いて増幅する。
得られたフラグメントは1433 bpであり、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びNcoIを用いて消化し、EcoRI及びNcoIで消化し、SAPで処理したp2263にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー1892、2232、2233、2234、2235、2236、2007、4000、4002、4007及び4009を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０５】
pHP15b (p2271、MR#3081株)
このベクターは、pHP15aとほぼ同様であるが、ZeoR遺伝子の上流にて、アクチン5Cプロモーターの代わりにHsp70プロモーターを含む。ワンステップPCR増幅により構築した。PCRは、プライマー4001及び4002を用い、p2270を鋳型として用いて行った。得られたフラグメントは、アクチン5cプロモーターを含む290 bpであった。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼXmnI及びSphIで消化し、XmnI及びSphIで消化し、SAPで処理したp2270にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー2007、4000及び4001を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０６】
ZeoR遺伝子の上流のEM7プロモーターの代わりにKanaRについて上流のプロモーター配列を含むpHP15c (p2272、MR#3082株)。
構築物は、SOE-PCRにより構築した。第１のPCR1フラグメントは、プライマー4003及び4009を用い、p2270を鋳型として用いて行った。得られたPCR生成物は、296 bpのサイズを有する。
第２のPCR2フラグメントは、プライマー4004及び2007を用い、p2270を鋳型として用いて行った。フラグメントは、189 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー4009及び2007を用いて増幅する。
得られた450 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNcoIを用いて消化し、SphI及びNcoIで消化し、SAPで処理したp2270にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー2007及び4003を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０７】
pHP11からの切断型アクチン5cプロモーターの構築
アクチン5cプロモーターからの切断型配列1486 bpを含むpHP17 (p2276、MR#3086株)
ベクターp2262を、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNheIで消化し、ベクターを、Klenowを用いて再び連結した。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーを、プライマー590及び980を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、1510 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、917、990、992、993、994、995及び2509を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０８】
アクチン5cプロモーターからの切断型配列612 bpを含むpHP18 (p2277、MR#3087)
ベクターp2262を、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNheIで消化し、ベクターを、Klenowを用いて再び連結した。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーを、プライマー590及び980を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、660 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、917、993、995及び2509を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１０９】
pHP12-Afl II (p2287、MR#3097株)  ベクターは、SOE-PCRにより構築した。第１のPCR1フラグメントは、プライマー987及び4036を用い、p2263を鋳型として用いて行った。得られたPCR生成物は、217 bpのサイズを有する。
第２のPCR2フラグメントは、プライマー4035及び986を用い、p22630を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、190 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー986及び987を用いて増幅する。
得られた362 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIを用いて消化し、NheI及びHindIIIで消化し、SAPで処理したp2263にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー982を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１１０】
アクチン5cコア及びHsp70コアプロモーターを有するハイブリッドベクターのクローニング
pHP18-Afl II (p2288、MR#3098株)  ベクターはSOE-PCRにより構築した。第１のPCR1フラグメントは、プライマー987及び4038を用い、p2277を鋳型として用いて作製した。第２のPCR2フラグメントは、プライマー4037及び986を用い、p2277を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、224 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー986及び987を用いて増幅する。
得られた689 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、SAPで処理したp2277にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー980を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１１１】
Hsp70コアプロモーターの上流にアクチン5Cコアプロモーター及びHsp70プロモーター配列を含む、pHP19 ハイブリッドアクチン5cコアベクター。
ベクターp2288を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びHindIIIで消化し、得られた生成物は178 bpのサイズを有し、フラグメントを、AflII及びHindIIIで消化したp2287にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーは、プライマー4000及び917を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、予測されるサイズのDNAフラグメントを示す。得られたプラスミドにおいて、プライマー980及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１１２】
アクチン5cコアプロモーターの上流にHsp70コアプロモーター及びアクチン5Cプロモーター配列を含むpHP20ハイブリッド-Hsp70-コア
ベクターp2287を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びHindIIIを用いて消化し、得られた生成物は144 bpのサイズを有し、これをAflII及びHindIIIで消化したp2288にクローニングした。サーモサイクラー中で１晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーは、プライマー993及び901を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、478 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。得られたプラスミドにおいて、プライマー986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
【０１１３】
株化細胞成長及び維持
材料
凍結バイアル、1.8 ml: Nunc cat.no. 377267
Excell420: SAFC cat.no. 14420
胎児ウシ血清FBS、500 ml: Life Technologies cat.no. 10099-141
0.2μmの通気口を有する蓋を有する振とうフラスコ250ml: Corning cat.no. 431144 (実動容量:25〜70ml)
0.2μmの通気口を有する蓋を有する振とうフラスコ1000ml: Corning cat.no. 431147 (実動容量: 100〜225ml)
組織培養フラスコ25cm2: Greiner cat.no. 690160 (実動容量: 4〜8ml)
組織培養フラスコ75cm2: Greiner cat.no. 658170
【０１１４】
凍結ストックからの細胞培養の開始
1.    液体窒素から１つ(又はそれより多い)バイアルを取り出し、23℃の水浴に入れる。細胞がほぼ融解するまで穏やかな振とうにより迅速に融解する。バイアルを水浴から取り出す。それぞれのバイアルは、4E7細胞を1mlの凍結培地中に含む(40% Excell420＋50% FBS＋10% DMSO)
2.    バイアルの外側を、70%エタノールで処理することにより迅速に除染し、細胞懸濁物を、7 mlの23℃培地(Excell420＋10% FBS)を含む遠心管に静かに移し、330×ｇで２分間遠心分離する
3.    培地を廃棄してDMSOを除去し、細胞を、5mlの23℃培地(Excell420＋10% FBS)に再懸濁し、懸濁物をT25に移す
4.    細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、２〜４日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、３〜４日以内に80〜90%まで増加する。
【０１１５】
Ｔフラスコでの細胞の増殖
1.    細胞培養物をT25からT75に移し、10 mlの23℃培地(Excell420＋10% FBS)を加える。細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、２〜４日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、＞90%である。
2.    T75中の細胞培養物を２つのT75に移し、10 mlの23℃培地(Excell420＋10% FBS)をそれぞれに加える。細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、２〜４日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、＞90%である。
3.    細胞培養物を２つのT75から250 mlのディスポーザブル振とうフラスコに移し、25 mlの23℃培地(Excell420)を加える。細胞を110 rpm及び23℃にて、細胞が1.5E7〜2E7細胞/mlの密度に到達するまでインキュベートする。これは、３〜４日かかるであろう。細胞を、移動させた２日後から検査し、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、＞90%である。
【０１１６】
振とうフラスコでの細胞の増殖
1.    細胞培養物をR250から遠心管に移し、細胞を、330×gにて５分間遠心分離する。細胞を新鮮な培地(Excell420)に、8E6細胞/mlの密度まで、適切な振とうフラスコ中で再懸濁する。110 rpm及び23℃にて、細胞が2.5E7〜3.5E7細胞/mlの密度に到達するまでインキュベートする。これは、３〜４日かかるであろう。細胞を、移動させた２日後から検査し、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、＞90%である。
2.    1000 ml振とうフラスコ中での細胞培養物を、8.5E9細胞の細胞総数が得られるまで増殖させる。３〜４日ごとに、細胞を遠心分離により分離し、8E6細胞/mlの細胞密度まで、新しい振とうフラスコ中の新鮮な培地(Excell420)中に再懸濁する。細胞は、最後の継代培養の２日後にマスター細胞バンクの調製のために用いる。
【０１１７】
細胞バンクの調製
1.    細胞を検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、＞90%である。8E9の細胞に相当する細胞懸濁物を遠心管に移し、330×gにて５分間遠心分離する。細胞を、200 mlの４℃凍結培地(40% Excell420、50% FBS及び10% DMSO)中に再懸濁し、それぞれの凍結バイアル中の１mlの細胞懸濁物に迅速に分ける。
2.    凍結バイアルを４℃のMr. Frosty凍結箱に移し、箱を−80℃の冷凍庫に入れる。
3.    凍結バイアルを６〜48時間後に、貯蔵のために液体窒素中に移す(実動容量: 12〜25ml)。
【０１１８】
細胞の形質移入
上記のようにして維持した成長している培養物からの細胞を用い、これは、形質移入の１〜２日前に遠心分離後に希釈又は再懸濁されている。生存能は、＞90%である。
1. 形質移入あたりおよそ3.2E7の細胞に相当する細胞懸濁物を遠心管に移し、およそ125×gにておよそ３分間遠心分離する。
2. 形質移入あたりおよそ４mlのおよそ23℃の培地中に再懸濁し、４ml細胞懸濁物をそれぞれのT25に移す。
3. およそ6.3 ugの各DNAを、個別のエッペンドルフチューブに移す。
4. バッファーECを、DNAを含む各エッペンドルフチューブに加えて、最終容量を150 ulにする。
5. DNAとバッファーECを、ピペットを２回上下させることにより混合する。
6. 50 ulのEnhancerを、DNA及びバッファーECを含むエッペンドルフチューブに加える。
7. DNA混合物を１秒間ボルテックスする。
8. 20〜25℃にて２〜５分間インキュベートする。
9. 140 ulのEffecteneを、DNA混合物を含むエッペンドルフチューブに加える。
10. ピペットを５回上下させることにより混合する。
11. 20〜25℃にて５〜10分間インキュベートする。
12. 1.5 mlの培地をチューブに加え、ピペットを２回上下させることにより混合する。
13. DNA混合物を、T25中の細胞懸濁物に注意して滴下し、注意してフラスコを前後にはたく。
14. およそ23℃にてインキュベートする。
【０１１９】
キイロショウジョウバエS2細胞における形質移入のためのその他の適切な方法は、Park J.H.; Kim H.Y.; Han K.H.; Chung I.S, Optimization of transfection conditions for expression of green fluorescent protein in Drosophila melanogaster S2 cells - a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Enzyme and Microbial Technology, 第25巻, 第7号, October 1999, pp. 558〜563(6)に記載されている。
【０１２０】
Effectene形質移入試薬は、血清の存在下での形質移入による最小限の細胞傷害性を有する非リポソーム性脂質製剤であり、高い形質移入効率を有する。Effectene試薬は、高い形質移入効率を達成するために、Enhancer及びDNA濃縮バッファー(Buffer EC)とともに用いる。
【０１２１】
一過性形質移入
形質移入の後に、23℃にて２〜４日間、細胞を成長させ、生成させ、その後、細胞数、興味対象のタンパク質及び全タンパク質の決定のために試料を採取する。一過性の形質移入中に、選択剤は加えない。
【０１２２】
安定発現株の調製
形質移入の後に、１〜２日間細胞を成長させ、その後、1.5mg/mLのゼオシン (又は適切な濃度でのその他の適切な選択剤)を加える。細胞を、次いで、上記(Ｔフラスコ中での細胞の増殖；振とうフラスコでの細胞の増殖)のＴフラスコ及び振とうフラスコ中で増殖させる。２〜４週間後に、ゲノムへの耐性マーカーの組み込みにより選択マーカーに対して耐性の細胞のみが存在し、株化細胞は安定とみなすことができる。選択剤は、この時点でさらなる培養及び増殖ステップから除外でき、細胞は、上記のようにして凍結できる。
【０１２３】
分析
本研究において用いたモデルタンパク質(RANK-リガンド)を分析するために、ELISAを用いた。Bradfordの全タンパク質分析を用いて、全タンパク質濃度を決定した。
【０１２４】
結果
タンパク質発現レベルが増進された一連のベクターを創出した。３つの主要なクラスのNN2発現ベクターがある：第１のクラスは、アクチン5Cプロモーター駆動タンパク質発現の異なるバリアントを含むベクターを含む。第２のクラスは、HSP70プロモーターを用いるベクターのことであり、第３のクラスは、ハイブリッドアクチン5C/HSP70プロモーターを含む。
変異アクチン5cプロモーター(配列アラインメントセクションにて変異を参照されたい)を調べて、そのタンパク質発現レベルを決定した(ベクターpHP11)。変異アクチン5Cプロモーターは、pOPIE2と比較して、一貫してより高い発現レベルをもたらした(図１を参照)。
２つのバージョンのキイロショウジョウバエS2 HSP70プロモーターも試験した。第１のプロモーターは、全長HSP70プロモーター(457bp、ベクターpHP 13)であり、第２のプロモーターは、切断型バージョンのHSP70であった(59bp〜342bp、配列セクションを参照、ベクターpHP12)。切断型バージョンは、全長プロモーターと比較して、５倍までのより高いタンパク質発現レベルを有することが見出された(図２を参照)。切断型HSP70プロモーターが、安定及び一過性の発現株において高いレベルで発現されたことも観察された(図３及び４を参照)。
【０１２５】
アクチン5Cプロモーター変異体及び切断型HSP70プロモーターを、切断によりさらに研究した。タンパク質発現の結果は、一過性及び安定発現株の両方について、図３及び４で見出すことができる。
pOPIE2プロモーターに対してタンパク質発現における３〜９倍の増加が、安定発現株において、アクチン5C及びHSP70プロモーターについて達成された(図３)。さらに、全長アクチン5cプロモーターに対する平均発現レベルの増加が、最短切断型アクチン5Cプロモーター(アクチン5C_3、ベクターpHP18)を用いることにより達成されたが、これが有意により高い発現であるかを確認するためには、さらに実験が必要である。しかし、この傾向は、一過性の形質移入についても観察できる(図４を参照)。最高の発現レベルは、HSP70プロモーターについて観察されたが、HSP70コアプロモーター配列は、pOPIE2及び切断型HSP70プロモーターと比較して、著しく低下した発現レベルを導いた。HSP70切断型プロモーターの発現レベルは、pOPIE2よりも常に高かったが、形質移入から形質転換まで大きく変動した。この構築物についての形質移入を最適化することにより、異なる安定ポリクローナル発現株における変動が低減されることが予測される。しかし、安定ポリクローナル系統は、一旦確立されると、時間経過に伴う発現の著しい変動を示さなかった。形質移入後に得られた安定ポリクローナル発現株は、よって、最良の発現ポリクローナルプールを見出すために、使用前にスクリーニングされる。
【０１２６】
タンパク質発現レベルは、一過性形質転換体において、pOPIE2プロモーターと比較して４〜12倍増加した。最短切断型アクチン5Cプロモーター(ベクターpHP18)は、一過性形質移入において、最高の一貫した発現レベルを有した。
アクチン5C(ベクターpHP10)及びHSP70 (ベクターpHP16)のコアプロモーターを、pOPIE2と比較して、それらの相対的特性についてのさらなる洞察を得た。HSP70コアプロモーターの発現レベルは、アクチン5Cコアプロモーターよりも著しくより高いが、両方のプロモーターは、内部対照として用いたpOPIE2プロモーターよりも著しくより弱い(図５)。
【０１２７】
アクチン5Cコアプロモーターを用いて、ZeoRゼオシン耐性遺伝子を、KanR細菌プロモーターとともに発現させた(ベクターpHP15c)。このことにより、ゼオシンを、大腸菌及びS2昆虫細胞の両方において選択マーカーとして用いることが可能になる。さらに、アクチン5Cコアプロモーターは、p2ZOp2Fにおいてゼオシン耐性マーカーを発現させるために用いたpOPIE2プロモーターよりも著しく弱い。このことにより、p2ZOp2Fプラスミドで形質移入された細胞と比較して、形質移入後の抗生物質耐性が２倍減少し、このことは、安定細胞を選択する場合に、２倍より少ないゼオシン(0.75mg/ml対1.5mg/ml)を用いることを導く。
さらに、異なる選択マーカーを含めて、ベクターの応用においてより大きい柔軟性が可能になる。以下のマーカーを含める：ゼオシン、ネオマイシン及びブラストサイジン。
【０１２８】
変異又は切断型アクチン5Cプロモーターにより達成される高い発現レベル
変異アクチン5Cプロモーターの発現レベルを、市販のpOPIE2プロモーターと比較して、著しくより高いことが見出された(図１を参照)。タンパク質生成レベルのさらなる増加が、アクチン5Cプロモーターを、全長2532bp (配列番号３)から612bpに切断することにより達成された。導かれた切断型プロモーターは、pOPIE2プロモーターを含む市販のp2ZOp2Fベクターと比較した場合に、安定発現株について５倍のタンパク質生成の増加を有した。また、一過性の発現レベルは、p2ZOp2Fベクターを用いて得られた発現レベルと比較して12倍まで増加した(図３及び４を参照)。
【０１２９】
ゲノムHSP70プロモーターの切断の影響
キイロショウジョウバエS2細胞において、調節機構は、熱ショックからHSP70を誘導するだけでなく、通常の温度にて発現も妨げる(Federら、1992, Genes Dev. Aug;6(8):1402〜13)。驚くべきことに、切断型 HSP70プロモーターは、安定的に形質移入された発現株において、アクチン5C及びpOPIE2プロモーターと比較して、最高の発現レベルを示した(図３を参照)。しかし、ゲノム全長プロモーターの上流の端から58 bp、及びプロモーターの下流の端から114bpをクローニングの間に除去して、切断型プロモーターを創出した。この切断が、観察されたような調節解除された(構成性の)高い発現レベルを直接もたらしたようである。図２において、切断型HSP70プロモーターの構成性の高い発現レベルが、一過性形質移入における全長プロモーターの低いレベルの発現と比較されている。このことは、プロモーターの抑制の緩和を示す。
【０１３０】
安定発現株選択の間にゼオシン濃度の低下が要求される
アクチン5CコアプロモーターとKanR細菌プロモーターとの著しく弱められた発現レベル(全長及びpOPIE2プロモーターと比較して)を用いると、形質移入株化細胞のゼオシン感受性が高められる(２倍)。より低い耐性は、より高いマルチコピー組み込み事象を選択して、ZeoR耐性マーカーの乏しい発現レベルを整えることを助け、より高い興味対象遺伝子タンパク質発現レベルを導く。安定発現株を作製する際に、より少ないゼオシンを用いて、高いコピー数遺伝子組み込み事象を選択する能力は、それ自体で有利であろう。なぜなら、ゼオシンは変異原であり、細胞に対して有害な予期せぬ影響を有し得るからである。
【０１３１】
ハイブリッドアクチン5C/HSP70プロモーターによる発現の増加
上で論じた実験において、切断型HSP70プロモーターが、安定発現株において最高の発現レベルを導いたことが見出された(図３)。しかし、一過性の形質移入の間の最高の発現レベルは、最短の切断型アクチン5Cプロモーター(アクチン5C_3)を用いて達成された(図４)。さらに、HSP70コアプロモーターが、一過性の形質移入の間に、アクチン5Cコアプロモーターと比較して、４倍高い発現レベルを有したことが見出された(図５)。
よって、アクチン5C及びHSP70からのコアプロモーターを、それぞれ切断型アクチン5C及び切断型HSP70のプロモーターに交換したハイブリッドプロモーターを作製することにした。これにより、原型のアクチン5Cプロモーターと比較して、アクチン5C-HSP70コアハイブリッドプロモーターにおいて、発現レベルの著しい増加が導かれると考えた。
【０１３２】
ベクターの構築
pHP34sベクターについてのDNAの合成を、GeneART, Germanyに依頼した(配列番号58)。pHP34sから創出した全てのベクターは、GeneART, Germanyに依頼した合成DNA及びDNA-technology, Denmarkに依頼したプライマーを用いて作製した。
ハイブリッドプロモーターコード配列は、プラスミドpHP34s-ハイブリッド中で、GeneARTに依頼した合成HSP70プロモーターDNA (配列番号 37)からのHSP70コアプロモーターコード配列のPCRにより創出した(PCRプライマー: GCGAACTTAAGAGCGCCGGAGTATAAATAG (配列番号64)及びCCAAGCTTCTGCAGATTGTTTAGCTTG (配列番号65)。第２のPCRを、次いで行って、pHP34sからのプロモーターの上流部分にアクチン5cプロモーターを得て(プライマー: GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT (配列番号66)及びTATACTCCGGCGCTCTTAAGTTCGCTCGCGTTCAAAACTTTTACC (配列番号 67))、２つのPCRフラグメントを、PCRを用いて融合させた。
【０１３３】
得られた融合PCR生成物を、次いで、標準的な分子生物学の手順に従って、SpeI及びHindIIIで消化し、SpeI及びHindIIIで消化したpHP34sベクターに連結した。ハイブリッドプロモーターについてのDNAは、依頼して合成することもでき、SpeI及びHindIIを用いてpHP34s-ハイブリッドにクローニングできる。
イントロン(合成、配列番号60))は、GeneARTに依頼し、GeneARTによりpHP34s-ハイブリッドベクター中に、SacI及びEcoRI制限部位の間で挿入し、pHP34s-ハイブリッド.iベクターを創出した。
【０１３４】
HSP70マトリクス付着領域又はhSARエレメント(配列番号59)を、pHP34s-ハイブリッド中に、発現カセットを挟む２つの位置で挿入した。hSARエレメントは、合成配列としてGeneARTに依頼し、それぞれの側にフランキングSpeI及びNarI部位を有した。pHP34s-ハイブリッドベクター及びhSAR含有GeneARTベクターをNarIで消化し、所望のフラグメントをゲル精製し、連結して、hSARエレメントが両方向で挿入された２つのベクターであるpHP34s-ハイブリッド-hSAR-F又は-Rを得た(-F又は-Rは、フォワード又はリバースの方向を示す)。これらの２つのベクター及びGeneART hSAR含有ベクターのそれぞれを、次いで、SpeIで消化し、所望のフラグメントをゲル精製し、連結して、４つのベクターを創出した。４つのベクターは、全ての４つの可能な方向で２つのhSARエレメントを含む。
【０１３５】
上記のベクター、並びに合成を依頼したRANKL (バリアントhRP1.12-RA)及びHAモデルタンパク質DNAコード配列を、EcoRI及びNotIで消化し、所望のフラグメントをゲル精製し、連結して(例えばRANKLを、ベクターの１つと、又はHAをベクターの１つと)、RANKL又はHAコードDNAが挿入された上記のベクターを生成した。得られたベクターは、hRP1.12-RA-ベクター名、又はHA-ベクター名、例えば：hRP1.12-RA、pHP34s-ハイブリッドと命名した。
【０１３６】
RANKL及びHA (H5N1鳥インフルエンザから)含有pMT/V5.HIS.A及びpAC5.1ベクターの創出。ベクターをInvitrogenから得て、EcoRI及びNotIで消化し、所望のフラグメントをゲル精製し、上記のようにEcoRI及びNotIで消化し、ゲル精製した合成RANKL又はHAと連結して、RANKLコードDNAが挿入されたpMT/V5及びpAC5.1ベクターを得た。
カナマイシン/ジェネテシン(G418)耐性マーカーベクターを創出し、pHP34s-ハイブリッド-KanRと命名した。ベクターを、KanR/NeoR遺伝子をコードするgeneARTに依頼した合成DNA (大腸菌及びS2細胞での発現のために最適化された)及び大腸菌プロモーターをpHP34s-ハイブリッドベクターに挿入することにより創出した。ベクター及び挿入断片を、XmnI及びSalIで消化し、直鎖状ベクター及びkanR含有フラグメントを、標準的な手順に従ってゲル精製し、連結した。
hRP1.12-RA-pHP34s-ハイブリッド、pHP34s、pHP34s-ハイブリッド-hSAR-FR及びpHP34s-ハイブリッド.iについてのベクターマップを、図10〜12に示す。
【０１３７】
形質移入
比較実験のために、２つのInvitrogenベクター(pMT/V5.HIS.A及びpAC5.1)を用いた。これらの２つのベクターは、選択マーカーを含まず、よって、これもまたInvitrogenから得られたハイグロマイシン耐性を与えるベクター(pCoHygro)と同時形質移入した。形質移入は、pHP34s由来ベクターについてと同じプロトコルに従って行ったが、ハイグロマイシン耐性ベクターは、pMT/V5.HIS.A及びpAC5.1ベクターに、10:１の比(ハイグロマイシン耐性ベクターよりも10倍より多い発現ベクター)で加えた。
残りのベクターを、上記の標準的な手順に従って形質移入した。
【０１３８】
安定発現株の調製
ハイグロマイシン耐性細胞を、1500 ug/mLのゼオシンの代わりに600 ug/mLのハイグロマイシンを培地に加えた以外は、上記のゼオシン耐性細胞について記載したのと同じ方法に従って、安定にした。
カナマイシン/ジェネテシン(G418)耐性を与えるベクターを、S2細胞において1200〜1500ug/mLのG418、又は大腸菌細胞について標準的なカナマイシン濃度を用いて選択を行った以外は、上記の方法に従って形質移入した。
【０１３９】
発現試験
CdCl2誘導
pMT/V5.HIS.Aベクターは、カドミウム誘導性プロモーターを有するので、発現比較試験のために、細胞をCdCL2で誘導した。細胞を、振とうフラスコ中で２〜３日成長させ、次いで、１mlの培地あたり１ulのストックを用いて誘導した(ストック: 1mM CdCl2 Sigma C-2544 lot13H0424: 1000 ml H2O中に183 mg)。細胞に、さらに３〜４日間、タンパク質生成させ、その後、分析用の試料を採取した。
残りのベクターは、構成プロモーターを有するので、誘導する必要はなかった。試料を、成長及び生成の３〜４日後に採取した。
実験は、振とうフラスコ中で２重又は３重で行った(以下の生データを参照)。
【０１４０】
結果
アクチン5cプロモーターの弱いコアプロモーターを、より強いHSP70コアプロモーターで交換することにより、切断型アクチン5cプロモーターに対して50%の発現増加が導かれた(図８を参照)。
我々は、新しいエレメント、イントロン、特にZieler H., Huynh CQ. 「Intron-dependent stimulation of marker gene expression in cultured insect cells」, Insect Mol Biol. 2002 1, 87〜95の論文に記載されたイントロンの効果も試験した。このイントロンのDNA配列は、配列番号60に示し、ここで、これは２つの制限部位で挟まれている。よって、本発明によると、プロモーター核酸配列と興味対象タンパク質のコード配列との間に配列番号60のようなプロモーターを含めることにより、本発明により得られる増加した発現レベルに著しいものを加えることができる。
【０１４１】
図９は、イントロン又は２つのフランキングマトリクス付着領域のいずれかをハイブリッドプロモーターベクターに付加することの効果を示す。
図９は、イントロンの付加が、原型のハイブリッドプロモーターベクターと比較して、モデルタンパク質の発現を22%増加させ、２つのフランキングマトリクス付着領域の付加が発現を46%増進させたことを示す。１つのベクター中でのイントロンとマトリクス付着領域との組み合わせが、発現をさらに増進させることが期待される。
最後に、図13は、本発明のベクターが、２つの市販のベクターよりも著しくより高い発現収率を提供することを示す。
【０１４２】
結論として、市販のベクターと比較して著しく増加した発現レベルが、本研究で開発されたベクターを用いて得られた。
ベクター機能は、第２の選択マーカーであるカナマイシン/ジェネテシン(G418)を付加することによっても改良された。このことは、異なるタンパク質を発現する２つのベクターを１つの細胞に同時形質移入することを可能にする。これは、ゼオシン耐性マーカー、次いでカナマイシン耐性マーカー(任意の順序で)での連続的な形質転換も可能にする。
【０１４３】
【表Ａ１】
2011522554.tif 000007
【０１４４】
【表Ａ２】
2011522554.tif 000008
【０１４５】
【表Ａ３】
2011522554.tif 000009
【０１４６】
【数２】
2011522554.tif 000010
【０１４７】
【数３】
2011522554.tif 000011
【０１４８】
【数４】
2011522554.tif 000012
【０１４９】
【数５】
2011522554.tif 000013
【０１５０】
【数６】
2011522554.tif 000014
【０１５１】
【数７】
2011522554.tif 000015
【０１５２】
【数８】
2011522554.tif 000016
【０１５３】
【数９】
2011522554.tif 000017
【０１５４】
【数１０】
2011522554.tif 000018
【０１５５】
【数１１】
2011522554.tif 000019
【０１５６】
【数１２】
2011522554.tif 000020
【０１５７】
【数１３】
2011522554.tif 000021
【０１５８】
【数１４】
2011522554.tif 000022
【０１５９】
【数１５】
2011522554.tif 000023
【０１６０】
【数１６】
2011522554.tif 000024
【０１６１】
【数１７】
2011522554.tif 000025
【０１６２】
【数１８】
2011522554.tif 000026
【図１】
2011522554.tif 000027
【図２】
2011522554.tif 000028
【図３】
2011522554.tif 000029
【図４】
2011522554.tif 000030
【図５】
2011522554.tif 000031
【図６】
2011522554.tif 000032
【図７】
2011522554.tif 000033
【図８】
2011522554.tif 000034
【図９】
2011522554.tif 000035
【図１０Ａ】
2011522554.tif 000036
【図１０Ｂ】
2011522554.tif 000037
【図１１】
2011522554.tif 000038
【図１２】
2011522554.tif 000039
【図１３】
2011522554.tif 000040
【図１４】
2011522554.tif 000041
【配列表】
2011522554000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月24日(2010.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 以下の群：
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
(ii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列；
(iii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメント；
(iv)配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列
から選択される２つ以上の配列を含むキメラ配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含み、
前記キメラ配列が、配列番号37；配列番号37と少なくとも80%の配列同一性を有し、かつショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する配列；ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、配列番号37の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメント；又は配列番号37の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、かつショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する配列を含む、
昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適する単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含む請求項１に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３】
プロモーター DNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列が、ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する請求項１に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項４】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチドを含み、該機能的フラグメントが、ショウジョウバエS2細胞においてプロモーター活性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項５】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列を含み、該機能的ヌクレオチド配列が、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項６】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；及び
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列
から選択される２つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項７】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、少なくとも80ヌクレオチドを含み、かつ請求項６で規定される(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するキメラヌクレオチド配列であって、前記連続ヌクレオチド範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号68を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項９】
プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベルと比較して、増加したタンパク質発現レベルを示す請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１０】
タンパク質発現レベルの増加が、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベルに対して約50パーセント〜約300パーセントである請求項９に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１１】
タンパク質発現レベルの増加が、配列番号１若しくは配列番号４の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか１つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して２倍〜10倍である請求項９に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１２】
選択マーカー、例えばゼオシン選択マーカー、ネオマイシン選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー及びブラストサイジン選択マーカーからなる群より選択される選択マーカーをさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１３】
pKANR細菌プロモーターのような細菌プロモーターをさらに含む請求項１２に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１４】
昆虫細胞における選択マーカーの発現を駆動するのに適する第２のプロモーターDNAポリヌクレオチドをさらに含む請求項１２又は１３に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１５】
第２のプロモーターが：
(i) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37のヌクレオチド配列、又は配列番号68の残基７〜586を含むヌクレオチド配列；
(ii) (i)の配列のいずれか１つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか１つの配列の少なくとも80連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド；
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列；
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか１つの配列の２つ以上の配列を含む第１キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも80ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び／又は(iv)の少なくとも２ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第２キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される請求項１４に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１６】
マルチクローニング部位に対して上流及び／又は下流に少なくとも１つの遍在性クロマチンオープニングエレメントをさらに含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１７】
Gypsy (gsu(Hw))インスレーター配列のような少なくとも１つの転写インスレーターエレメントをさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１８】
昆虫細胞における選択のために適するジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列をさらに含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項１９】
SV40ポリＡシグナル及び／又はOPIE2ポリＡシグナルのような少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列をさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２０】
大腸菌の複製起点をさらに含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２１】
BIP及びCPYからなるリストから選択されるもののような少なくとも１つのタンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ウイルスDNAを実質的に含まない請求項１〜２１のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２３】
少なくとも１つのHISタグ配列をさらに含む請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２４】
興味対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、単離DNAポリヌクレオチドに挿入するために、プロモーターDNAポリヌクレオチドの下流にマルチクローニング部位をさらに含む請求項１〜２３のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２５】
SV40からの少なくとも１つの72bpエレメントをさらに含む請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２６】
少なくとも１つの増幅制御エレメントをさらに含む請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２７】
少なくとも１つのOri-ベータエレメントをさらに含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２８】
少なくとも１つのマトリクス付着領域(MAR)エレメントをさらに含む請求項１〜２７のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号40、例えば配列番号40のヌクレオチド10〜574によるＢ型肝炎ウイルスからのPREエレメントのようなＢ型肝炎ウイルスからの少なくとも１つのPREエレメントをさらに含む請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３０】
プロモーターDNAポリヌクレオチド配列が、遺伝子又はそれが結合するその他のDNA配列の発現を制御する請求項１〜２９のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列のいずれか１つの配列の少なくとも３連続ヌクレオチドの機能的フラグメント、並びにそれと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列である少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、該機能的フラグメントが、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーターエンハンサー活性を有する請求項１〜３０のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３２】
プロモーター DNAポリヌクレオチド配列の下流、かつマルチクローニング部位の上流にフランキング制限部位を含むか又は含まない少なくとも１つのイントロン、例えば配列番号60に示すイントロンをさらに含む請求項１〜３１のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３３】
ライゲーション非依存性クローニング(LIC)に適合されている請求項１〜３２のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記プロモーターDNAポリヌクレオチド配列に対して異種のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜３２のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３６】
キイロショウジョウバエのような昆虫細胞である請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記単離DNAポリヌクレオチドを安定的に形質移入された請求項３５又は３６に記載の細胞。
【請求項３８】
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列を、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単離DNAポリヌクレオチドに挿入するステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、前記ポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む、ポリヌクレオチドによりコードされる興味対象のポリペプチドを生成する方法。
【国際調査報告】
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