(57)【要約】  本発明は、エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）の天然画分の、配列番号１及び／又は２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアメロゲニンの各２つのＮ末端ポリペプチド断片の少なくとも１つから成る、単離された活性化合物に関する。本発明は、特に、前記画分の単離された活性化合物及び／又は画分それ自体、及び／又は各２つのポリペプチド断片の少なくとも１つの、セメント質形成の誘導及び／又は促進、骨成長及び／又は生きた石灰化組織片間の結合などの、様々な異なる医学的適応のための、一片の生きた石灰化組織の他の生組織片上の結合部位への結合のための、硬組織間の結合の確保のための、象牙質の再生誘導のための、及び／又は手技及び／若しくは外傷に続いて起こる石灰化創腔及び／若しくは組織欠陥の充填のための薬剤としての及び／又は医薬組成物を製造するための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）の天然画分の活性化合物であって、アメロゲニンの断片から選択される各ポリペプチド断片の少なくとも１つから成り、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する活性化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンの２つのポリペプチド断片が二量体化した活性化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンのポリペプチド断片の少なくとも１つが、自然長アメロゲニンタンパク質の選択的スプライシング及び／又はプロセッシングによって生産される、上記活性化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンのポリペプチド断片の少なくとも１つが、自然長アメロゲニンタンパク質の酵素的及び／又は化学的切断によって生産される、上記活性化合物。
【請求項５】
ブタ、ラット、ヒト、及び／又はマウスのエナメル基質タンパク質から単離される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンのポリペプチド断片の少なくとも１つが、生体外及び／又は生体内における合成によって生産される、上記活性化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンのポリペプチド断片の少なくとも１つが、精製した組み換えポリペプチド断片である、上記活性化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の活性化合物であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に相当する、のアメロゲニンのポリペプチド断片の少なくとも１つが、合成的に及び／又は化学的に改変された、上記活性化合物。
【請求項９】
歯周細胞の活性を活性化及び／又は制御するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの使用。
【請求項１０】
骨芽細胞の分化及び／又は増殖を制御するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの使用。
【請求項１１】
間葉幹細胞の増殖及び／又は分化を制御するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの使用。
【請求項１２】
薬剤として使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃ。
【請求項１３】
硬組織における石灰化を誘導するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃ。
【請求項１４】
硬組織における石灰化を誘導する医薬組成物を製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物の及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの使用。
【請求項１５】
骨成長及び／又は骨再生を誘導するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物の及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの活性化合物。
【請求項１６】
骨成長及び／又は骨再生を誘導する医薬組成物を製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物の及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃの使用。
【請求項１７】
哺乳類における骨成長及び／又は骨再生を誘導するための方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性化合物及び／又は単離されたＥＭＤの画分Ｃを、それを必要とする患者に投与することを特徴とする上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）の天然画分の単離された活性化合物、画分Ｃであって、これは選択的スプライシング及び／若しくはプロセッシングによって、又は自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的な切断によって、又は生体外若しくは生体内のポリペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／若しくは二倍体細胞培養）によって天然に生産された、配列番号１又は２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る、上記単離された活性化合物、画分Ｃに関する。本発明は、特に、歯周細胞の活性、増殖及び／又は分化を制御するため、骨芽細胞の分化及び／又は増殖を制御するための、及び／又は間葉幹細胞の増殖及び／又は分化を制御するための、前記単離された画分Ｃ及び／又は該画分の前記活性化合物及び／又は各２つのポリペプチド断片の少なくとも１つ、の使用に関する。
【０００２】
本発明は、さらに、配列番号１又は２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る、前記エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）の天然画分の単離された活性化合物の、薬剤としての使用に関する。さらに、本発明は、前記単離された画分Ｃ及び／又は該画分の前記活性化合物及び／又は各２つのポリペプチド断片の少なくとも１つの、セメント質形成の誘導及び／又は促進、一片の生きた石灰組織の他の生きた組織片上の結合部位への結合などの、様々な異なる医学的適応のための医薬組成物を製造するための、硬組織間の結合の確保のための、象牙質の再生誘導のための、及び／又は処置及び／若しくは外傷に続いて起こる石灰化創腔及び／若しくは組織欠陥の充填のための、使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
エナメル基質に存在するエナメル基質タンパク質は、エナメル質前駆体として最もよく知られている。セメント質形成に先立って、エナメル基質タンパク質は、発生中の歯根の先端部の歯根表面に堆積する。堆積したエナメル基質はセメント質形成の開始因子であるという証拠がある。かさねて、セメント質形成それ自体は、歯周靭帯及び歯槽骨の発育に関連している。エナメル基質タンパク質は、従って、歯における自然な付着物の成長を模倣して、歯周再生を促進させることができる（非特許文献１）。
【０００４】
単離されたエナメル基質タンパク質は、エナメル基質に隣接して発育する組織に天然に認められる１つの因子だけでなく、編成されたカスケードの因子を誘導することができる。それは天然の発育中の組織の環境によく似ており、従って組織再生、細胞分化及び／又は成熟のための天然の刺激を再現することができる。
【０００５】
エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）は、これまで、ブタのエナメル基質由来タンパク質の精製された酸抽出物の形態で、重篤な歯のアタッチメントロス（付着喪失）の患者の機能的な歯周靭帯、セメント質及び歯槽骨を復元させるために成功裏に使われてきた（非特許文献２）。
【０００６】
さらにまた、培養した歯周靭帯細胞（ＰＤＬ）に関する研究で、培養液にＥＭＤが存在した場合、この細胞の付着率、成長及び代謝が著しく増加することが示された。同様に、ＥＭＤに接触した細胞は、コントロールと比較した場合、細胞内ｃＡＭＰシグナリング及び成長因子の自己分泌を増加させることが示された。一方、上皮細胞は、ＥＭＤが存在した場合、ｃＡＭＰシグナリング及び成長因子分泌は増加するけれども、増殖と成長の両者は阻害された（非特許文献３）。
【０００７】
エナメル基質タンパク質及びエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）は、既に、硬組織形成の誘導（即ち、エナメル質形成、特許文献１）、硬組織間結合の確保（特許文献２及び特許文献３）、皮膚及び粘膜などの開口創治癒の促進、感染症及び炎症性疾患の処置の際の有益な効果の保有（特許文献４及び特許文献５）、象牙質再生の誘導（特許文献６）、移植片定着の促進（特許文献７）、腫瘍処置におけるアポトーシスの誘導（特許文献８）、全身性疾患又は炎症に対する免疫応答不均衡の制御（特許文献９）、及び腫瘍縮小手術のような処置及び／又は外傷後の創腔及び／又は組織欠陥の充填促進を可能にすること（特許文献１０）が特許文献に記載されている。
【０００８】
エナメル基質は、アメロゲニン、エナメリン、タフトタンパク質、プロテアーゼ、及びアルブミンなど、多くのタンパク質で構成される。エナメル基質の主要な構成成分であるアメロゲニンは、選択的スプライシング及び調節された分泌後プロセッシングによる単一遺伝子から誘導可能な一群の疎水性タンパク質である。それらは脊椎動物の進化の過程で高度に保存されており、試験した全ての高等脊椎動物の中に、全体的に高レベルの配列相同性（８０％）を示している。実際に、ブタとヒトのアメロゲニン遺伝子転写物は、塩基の僅か４％が異なるのみである。従って、エナメル基質タンパク質は、たとえブタ起源であっても、ヒトの体と接触した場合に「自己」と見なされ、アレルギー反応又は望ましくない反応を引き起こすことなく、ヒトにおける歯の再生を促進させることができる。それでもなお、アメロゲニンの異なる研究で複数の構造が確認され、それが同一個体の動物又はヒトの歯牙発生においてさえ起きており、明らかに、「正常な」エナメル質形成において協調的に働く構造の極端な特異性を憶測させる。例えば、Ｌｉらによって示されたように（非特許文献４）、発現されたヒトアメロゲニン中の１個のプロリンをスレオニンに変化させるＸ−染色体上のアメロゲニン遺伝子の単一塩基変異は、エナメル質形成不全を引き起こす。
【０００９】
発育期歯牙でセメント質形成が行われる間、アメロゲニンはより小さな断片に分解し、これらの断片は選択的に周辺組織と相互作用し、そして歯周系の発育における連続的な工程を推進するように見える。既に非特許文献５に記されているように、エナメル質は、大きさが５〜２５ｋＤａにわたる構成成分を含むアメロゲニンタンパク質の複合体を含む。これは、Ｘ及びＹ染色体上に位置するアメロゲニン遺伝子の１つ又は２つのコピーから、選択的スプライシングによって生成した複数のｍＲＮＡから誘導可能なアメロゲニンファミリーの発現及び分泌の所為である。その上、分泌された後、それらのタンパク質はさらに広範なタンパク分解のプロセシングを受けると思われる。この広範な一次転写物の選択的スプライシング及びそれに続く分泌タンパク質のタンパク分解プロセシングのため、個々のアメロゲニンに機能を特定することは困難であった。スプライシングのパターンは、遺伝子の２つのコピーが同じ細胞で発現される場合でさえ、今まで調査したところでは、それぞれのアメロゲニン遺伝子に特有のものである。種を超えたアメロゲニン配列の高い保存性にもかかわらず、ＲＮＡスプライシングパターンの多様性は、従って、発育期のエナメル基質におけるアメロゲニンアイソフォームの数及び特徴に著しい違いをもたらす。
【００１０】
これまで、アメロゲニンタンパク質の２つのクラス、即ち、ロイシンリッチ・アメロゲニンポリペプチド（ＬＲＡＰ）及びチロシンリッチ・アメロゲニンポリペプチド（ＴＲＡＰ）は、５〜６ｋＤａの間のサイズで記載された（例えば、非特許文献６を参照）。ＬＲＡＰは、スプライシングの間に除かれるエクソン４、５及び６の部分からのコード領域を有する、より短いｍＲＮＡから翻訳される。アメロゲニンに見出されるプロセスされた断片の１つとして、重要な調節作用を持つ可能性があるため、Boabaid らによって２００４年に調査されたが、それ自身は何ら細胞増殖の作用を有さないことが報告された（非特許文献７）。その上、それは、生体外でセメント芽細胞の増殖を促進するＥＭＤ及び効果が報告されていない完全長のアメロゲニンとは反対に、細胞培養においてセメント芽細胞の数を減少させた。
【００１１】
約５ｋＤａの大きさの２つのヒトチロシンリッチ・アメロゲニンポリペプチド（ＴＲＡＰ）は、既に確認されている（非特許文献６を参照）。これらのポリペプチドは、長さが４２（ＴＲＡＰ−２）及び４４（ＴＲＡＰ−１）アミノ酸残基であり；ヒト及び他の哺乳類のエナメル質タンパク質の一般的な特徴であると説明され、おそらく最初の細胞外アメロゲニンから分泌後切断によって誘導された、カルボキシ末端のジペプチドの切断だけが異なる２つのＴＲＡＰ分子の形態である。これまで、いずれの特定の生物学的作用もこれらのペプチドに帰属されていない。
【００１２】
やや切れ味の悪いＥＭＤの完全なカクテルの代わりとして、ある厳密に定義された画分及び／又はポリペプチド又はポリペプチドの断片の、例えば、特定の生物活性を持つブタ組織からの分離は、エナメル基質タンパク質のより洗練された使用、例えば、デノボ骨形成又はセメント質形成などの歯周発育期の特定の行程を誘導するための使用、又は医学的処置でそれを模倣するための使用を可能にする。その上、目的とする特定の効果を誘発するために、個別の及び／又は組み合わせた活性成分として使用するための単一の明確なポリペプチド配列を合成することが可能になり、費用効率が高まるかもしれない。
【００１３】
本発明は、初めて、２つの、共に前駆細胞の増殖及び骨芽細胞の初期分化のような骨形成活性を誘導できることを示す、天然のブタＮ−末端アメロゲニンポリペプチド断片を同定する。本発明は、また、ＥＭＤの特異的な生物学的活性は、上記の２つのＮ−末端アメロゲニンポリペプチド断片を含む天然の完全な画分Ｃによって生じることを初めて同定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，６７２，０３２号（Slavkin）
【特許文献２】ＥＰ−Ｂ−０３３７９６７号
【特許文献３】ＥＰ−Ｂ−０２６３０８６号
【特許文献４】ＥＰ  Ｉ  １０５９９３４号
【特許文献５】ＥＰ  ＩＩ  ０１２０１９１５．４号
【特許文献６】国際特許公開第０１／９７８３４号
【特許文献７】国際特許公開第００／５３１９７号
【特許文献８】国際特許公開第００／５３１９６号
【特許文献９】国際特許公開第０３／０２４４７９号
【特許文献１０】国際特許公開第０２／０８０９９４号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstrom L., “Emdogain− periodontal regeneration based on biomimicry”（「生物模倣に基づくエムドゲイン−歯周再生」）. Clin Oral Invest 4:120-125 (2000)；
【非特許文献２】Hammarstrom et al.,1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 658-668；
【非特許文献３】Lyngstadaas et al., 2001, Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188；
【非特許文献４】Li, W. et al., “X-linked amelogenesis imperfecta may result from decreased formation of tyrosine rich amelogenin peptide (TRAP)”（ 「Ｘ−連鎖のエナメル質形成不全症は、チロシンリッチアメロゲニンペプチド（ＴＲＡＰ）の形成低下から生じる可能性がある」）, Archives of Oral Biology (2003) 48, 177-183；
【非特許文献５】Fincham, A.G. et al.,(1993)；
【非特許文献６】Fincham, A.G. et al., “Human Amelogenins: Sequences of “TRAP” Molecules”（ 「ヒトアメロゲニン：「ＴＲＡＰ」分子の配列」）, Calcified Tissue International (1989) 45:243-250；
【非特許文献７】Boabaid F., et al, J. Periodontol, Vol 75, No.8, 2004)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
アメロゲニンのスプライス変異体及びタンパク分解的切断生成物は、ＥＭＤから単離される主要な化合物である。
【００１７】
発育中の歯におけるセメント質形成の間、アメロゲニンは、上記のように、一次転写物の選択的スプライシング及びそれに続く分泌タンパク質のタンパク分解的プロセシングによって、より小さな断片（フラグメント及びポリペプチド断片）に分解し、そしてこれらの断片は、選択的に周辺組織に作用し、歯周系の発育の連続的な工程を促進させるという仮説が立てられる。
【００１８】
本発明は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離され、それぞれ２つのポリペプチドの少なくとも１つを含むことが初めて示されたブタＥＭＤの特定の画分であり、配列番号１及び配列番号２で示されるようにさらに分離し同定された、以後画分Ｃと呼ばれる画分の単離、そして上述の画分並びに互いの様々な組み合わせで単離されたペプチドが、ＥＭＤ又は全長アメロゲニンで先に観察された作用と密接に関係するが同じではない、特異的な生物学的機能を発揮するという発見に基づく。本発明は、従って、上述した天然のブタＮ−末端アメロゲニンポリペプチド断片が、共に骨形成活性を誘導できることを、初めて成功裏に確認する。
【００１９】
本発明者らは、さらに、初めて、細胞培養研究は、ＥＭＤの単離された画分Ｃ及び／又はそれぞれ２つの天然のブタＮ末端アメロゲニンポリペプチド断片の少なくとも１つが、骨芽細胞の増殖及び／又は分化、並びに間葉幹細胞の分化、並びに歯周細胞の活性化を促進できることを示唆することを示す。本発明者らは、主要な画分それ自体及び組み合わせた少なくとも２つのポリペプチド断片が、異なる生物学的活性を有し、組み合わせによる使用と同様に、別々に使用できることを納得のいくように実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従って、本発明は、組み合わせた配列番号１及び配列番号２で示される単離された天然のブタＮ末端アメロゲニンポリペプチド断片、及びそれぞれ２つの天然のブタＮ末端アメロゲニンポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、並びに前記の組み合わせた配列番号１及び配列番号２で示される単離された天然のブタＮ末端アメロゲニンポリペプチド断片の薬剤における使用に関する。
【００２１】
本発明は、さらに、前記のエナメル基質誘導体の或る天然の画分Ｃの使用、又は配列番号１及び配列番号２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つ、又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、又は自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、又は生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって生成した画分Ｃから成る、歯周細胞の活性を活性化及び／又は制御するための、骨芽細胞の分化及び／又は増殖を制御するための、及び／又は間葉幹細胞の増殖及び／又は分化を制御するための医薬製剤に関する。
【００２２】
従って、本発明は、また、前記画分Ｃ又は選択的スプライシング及び／又はプロセッシングによって、又は自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、又は生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成した、前記天然のエナメル基質誘導体の画分のそれぞれのポリペプチド断片の少なくとも１つの、歯周細胞の活性制御、骨芽細胞の分化及び／又は増殖の制御、及び／又は間葉幹細胞の増殖及び／又は分化の制御の様な特定の作用を発揮させるための使用に関する。
【００２３】
例えば、表２に要約したように、ヒト骨芽細胞の初代培養で行った実験は、単離されたエナメル質タンパク質の画分、本明細書では画分Ｃと呼ぶ、が、アポトーシス、細胞接着、細胞間シグナル伝達、転写、シグナル伝達、及び／又は細胞増殖に関与することが業界でよく知られている広範な様々な遺伝子に、生物学的に重要な作用を発揮することを明瞭に示した。その上、実証された作用はＥＭＤで見られた作用と密接に関連したが、同一ではなかった。
【００２４】
本発明の１つの実施態様は、従って、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含むエナメル基質タンパク質の単離された画分Ｃの使用、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、又は自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、又は生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む、歯周細胞の活性を活性化及び／又は制御するための、及び／又は骨芽細胞の分化及び／又は増殖を制御するための、間葉幹細胞の増殖及び／又は、例えば、骨芽細胞への分化を制御するための医薬製剤に関する。
【００２５】
別の、等しく好ましい実施態様では、本発明は、歯周細胞の活性を活性化及び／又は制御するための、及び／又は骨芽細胞の分化及び／又は増殖を制御するための、間葉幹細胞の増殖及び／又は、例えば、骨芽細胞への分化を制御するための、及び／又は免疫応答を誘導するための、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
エナメル基質タンパク質は、或るシグナル伝達経路を活性化し、歯周細胞の増殖を促進し、そして分化を誘導し、並びに非歯周線維芽細胞の増殖及び分化を刺激するが、それに対して、上皮細胞の増殖及び／又は分化は、エナメル基質タンパク質の存在によって刺激されないことが知られている。
【００２７】
本発明者らによって先に示されたように、活性エナメル質物質上に生育する非歯周線維芽細胞の付着率の増加は、エナメル質タンパク質を基剤とするマトリックスが細胞外マトリックスを模倣したことを示す。この模倣は、これらの細胞の迅速な接着を容易にする。活性エナメル質物質上で成長するこれらの繊維芽細胞で観察された成長速度及び代謝の上昇は、さらに、活性エナメル質物質画分及び／又はポリペプチド断片が歯周細胞の代謝のスピードアップを刺激する細胞外マトリックスを提供することを証明している。また、成長速度の上昇はＤＮＡ合成の増加を反映しており、これらの細胞の細胞増殖は上方制御されることを示す。更に、これらの線維芽細胞の［35Ｓ］−メチオニン利用の増加が成長速度の上昇を上回るので、いくつかの付加された代謝活性は、同様に、上昇した同化及び／又は細胞外タンパク質分泌を反映している。本明細書に記載された、歯周細胞の活性に対する画分Ｃの作用によって、同じような作用が、それによって、並びに配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つによって発揮されることが、今や想定される。
【００２８】
特に、現在提示された実験所見は、画分Ｃが、骨芽細胞に作用し、そして骨形成及びセメント質形成の両者の潜在力を有するＥＭＤの成分であることを明確に示しており、従って、それは骨及びセメント質の再生に関してＥＭＤ及びアメロゲニンの活性成分であることを示唆する。特に、再び、本発明者らは、画分Ｃ、並びに配列番号１及び２で示されるアメロゲニンの２つの複合ポリペプチド断片は、歯周細胞の活性を上方制御する、及び／又は非常に初期の骨芽細胞分化及び／又は増殖マーカーを上方制御する、並びに間葉幹細胞の増殖を上方制御する及び／又は分化を縮小する及び／又は阻害することを見出した。特に、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンの２つの複合ポリペプチド断片の作用は、骨芽細胞又は間充織細胞増殖の強力な誘導剤又は促進剤として、より強く検出されたのに対し、これらの細胞におけるマーカー遺伝子の発現によって測定された初期の分化への作用は、むしろ陰性であった。
【００２９】
このように、本発明を特定の科学的理論に限定すること無しに、本明細書において、画分Ｃは、周囲の組織への即時増殖の刺激を、それらの仕様に優先して、未分化細胞を集結させる早い段階で誘発するＥＭＤの成分である確証を含む、ＥＭＤの最も早い段階の活性画分であることが想定される。特に、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンの２つの複合ポリペプチド断片は、明らかに骨芽細胞様の前駆細胞並びにＰＤＬ細胞の増殖の誘導に対して強力な作用を示し、後の分化マーカーのレベルの減少を示しかねない。完全な画分としての画分Ｃは、前述の複合ポリペプチドの阻害作用とは対照的に、多能性及び／又は全能細胞の増殖を刺激するだけでなく、上記細胞の骨形成及び軟骨形成への分化のごく初期のマーカーを誘導できることを示せるかもしれない。
【００３０】
「骨芽細胞」は、コラーゲン性及び非コラーゲン性骨タンパク質の両者（有機マトリックス、類骨）を合成する単核細胞である。それは石灰化に関与し、多能性間充織細胞から誘導可能である。骨芽細胞は、一般に、前駆細胞の前骨芽細胞を経由して分化すると考えられる。
【００３１】
実験の部の実施例３及び４に示すように、画分Ｃは骨芽細胞の分化を増加し、培養骨芽細胞の骨形成を刺激する。その上、実施例５は、配列番号１及び２で示される単離されたアメロゲニンの２つの複合ポリペプチド断片の少なくとも１つは、初期の骨芽細胞分化への刺激は画分Ｃよりも強力であるが、画分Ｃは後の段階でのオステオカルシン発現のより強力な誘発因子であるように見えることを明瞭に示している。
【００３２】
歯周靭帯（ＰＤＬ）を形成する細胞は、主に線維芽細胞である。ＰＤＬでは、線維芽細胞は、細胞外区画の代謝回転を非常に速い速度で実現させる能力、特にコラーゲンで実現させる能力が特徴である。靭帯線維芽細胞は、線維束の一般的な方向に沿って、そして線維束を包み込む伸長性の突起を使って整列している。同様に、上皮細胞及び未分化の間充織細胞も、ＰＤＬの構成成分である。
【００３３】
現在の文脈において、「歯周細胞」という用語は、歯周靭帯細胞（ＰＤＬ）、歯肉細胞、上皮細胞、骨細胞などの細胞を指すが、それらに限定されない。
【００３４】
細胞の「分化」とは、細胞が明らかに特殊化された細胞型に変化する過程をいう。そのような細胞は、胚発生期又は後の発育段階に他の特殊化された細胞型に分化する幹細胞、又はそうする様に指示を受けている他のいかなる細胞であってもよい。分化の代表的な例は、現在の文脈において、例えば、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化であろう。
【００３５】
細胞の「増殖」とは、より大きな細胞集団を生成するために細胞が積極的に成長し分裂している段階を指す。そのような増殖は、成長因子などのような外部刺激によって刺激されてもよい。
【００３６】
「間充組織」とは、動物の結合組織の未熟で未分化の形態を指し、薄い細胞外マトリックスに埋もれた細胞のみから成る。中胚葉から誘導可能な胎生結合組織は、間充組織と名付けられる。「間葉幹細胞」は、骨髄細胞のような未分化の間充織細胞である。現在好ましい実施態様では、前述の間葉幹細胞は、例えば、骨芽細胞、破骨細胞、又はあらゆる他の骨細胞に分化する。
【００３７】
実施された実験で認められた文書化された細胞効果及び上記の実験の部に文書化された細胞効果に非常に類似して、本発明の別の態様は、単離された画分Ｃの使用及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つの使用、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は硬組織の石灰化を誘導する医薬組成物を製造するための、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。
【００３８】
本発明のさらに別の態様は、単離された画分Ｃの使用及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分の使用、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は骨の再生及び／又はデノボ成長の誘導のための、硬組織形成の誘導のための、硬組織間結合の確保のための、及び／又は象牙質の再生誘導のための医薬組成物を製造するための、選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。
【００３９】
本発明の現在好ましい実施態様は、従って、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は薬剤として使用するための、選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。
【００４０】
エナメル基質タンパク質は、歯髄細胞に象牙質形成を誘導することができる。従って、生きた歯髄組織の露出に関わる歯科的処置後の象牙質形成又は再生に対する同様の作用が、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む本画分Ｃによって、又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分によって、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシング、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れか、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤によって、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシング、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れか、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つによって、発揮されることが想定される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、生きた歯髄組織の露出に関わる歯科的処置後の象牙質形成又は再生を促進させる方法であって、その方法が、歯科的処置の後に生きた歯髄組織が露出した際に、単離された画分Ｃ及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシング、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れか、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤の有効量を適用すること含む方法、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシング、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れか、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。
【００４２】
本発明は、医療用インプラント又は装置への適用のための、単離された画分Ｃの使用及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤の使用、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。本発明は、さらに、単離された画分Ｃの使用及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤が適用された医療用インプラントまたは装置、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つに関する。
【００４３】
本発明によれば、インプラント又は装置は、ヒト又は動物体の、特に歯科領域、消化管、尿道、膀胱、肺腔、肺、気管、喉頭、食道、関節、骨、頭蓋、耳、血脈洞、静脈、動脈又は腹腔に使用するための如何なるインプラント又は装置でもよい。インプラントは、陶器又は石膏のような骨置換材料であってもよい。
【００４４】
インプラント又は装置は、例えば、首、脚又は腕、又は頭蓋骨骨折などの複雑骨折を固着するために使うことができ、従って、インプラント又は装置は、従来骨折骨の断片を不動に（固定）するために使われている骨置換材料のピン又はネジでもよい。そのようなピン又はネジは、通常、患者の骨折の部位又は部位の近くの皮膚を貫通する部分を含んでいる。この目的のためのピン又はネジは、従来チタン又は鋼のような金属で作られており、場合によって、軟組織の閉鎖及び密閉を容易にするために、一般に生分解性の又は安定な高分子材料で被覆されてもよい。さらに、インプラントは、例えば ペースメーカー 、脳内インプラント、 バイオセンサーに使用されるもののような 導電体であってもよい。インプラントは、また、ネジ及び／又は橋脚歯などの人工歯又は義歯であってもよい。
【００４５】
インプラント又は装置に適用する前に、本発明の単離された画分Ｃ及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを、他の成分の、例えば、薬学的に許容される賦形剤と混合して医薬組成物を構築し、以下に議論する様に、例えば、インプラント又は装置の関連する部分を活性エナメル質物質の溶液又は分散液に浸漬することにより、又は活性エナメル物質の溶液又は分散液をインプラント又は装置の関連する部分の表面にスプレーすることによって、両者の場合は乾燥することによって、インプラント又は装置の表面を被覆することができる。適用の際は、画分Ｃ、医薬製剤、及び／又は複合ポリペプチド断片をインプラント又は装置の表面に吸着させ、そしてホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はエタノールなどの従来の固定剤によってその上に固定してもよい。あるいは、画分Ｃ、医薬製剤、及び／又は複合ポリペプチド断片は、上記の画分及び／又は活性エナメル物質のポリペプチド断片を、インプラント又は装置のポリマー成分に、例えば、ＵＶ照射若しくは自体公知の化学的処理法で架橋させることによって、又は画分及び／又はポリペプチド断片をインプラント若しくは装置の表面に存在するポリマー成分の好適な官能基と共有結合させることによって、インプラント又は装置の関連する表面に適用することができる。
【００４６】
インプラント又は装置の適切な表面に適用される画分Ｃ及び／又はポリペプチド断片の量は、通常、約０．０１ｍｇ／ｃｍ2〜約１５ｍｇ／ｃｍ2の様な、約０．００５ｍｇ／ｃｍ2〜約２０ｍｇ／ｃｍ2のインプラント又は装置の面積ｃｍ2当たりの総タンパク質量になる。
【００４７】
本発明によれば、本発明に従って本目的のためのインプラント又は装置の表面への画分Ｃ、医薬製剤、及び／又はポリペプチド断片の適用は、場合により、他の種類の好適な生物学的活性物質の、例えば、抗菌剤又は抗カビ剤のような抗微生物剤の適用、又はインプラント又は装置が上皮組織と接触する部位の微生物感染を予防又は処置するための静菌剤又は消毒薬の適用と組み合わせてもよい。
【００４８】
「軟組織」（即ち、非石灰化組織）は、この文脈では歯肉組織と互換的に使用することができ、コラーゲン又は上皮含有組織として定義されてもよく、皮膚及び粘膜、筋肉、血液及びリンパ管、神経組織、腺、腱、目及び軟骨が挙げられる。一般に、本発明の画分及び／又はポリペプチド断片は、治癒を促進するため、又は皮膚及び粘膜だけでなく、あらゆる歯肉組織の傷の患者が求める回復を促進する医薬組成物を製造するために使用することができる。
【００４９】
用語の「石灰化組織」における「硬組織形成」は、酵素のアルカリホスファターゼ活性及び良好な血液の供給を前提条件として、ミネラル受容可能な有機マトリックスの細胞による生産であると要約することができる。
【００５０】
本発明によれば、本発明の単離された画分Ｃ及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つは、一般に、ブタ起源である。
【００５１】
しかし、アメロゲニンは進化的に非常に保守的なタンパク質であり、種間の相同性の高いことが立証されているというよく知られた事実に照らして、類似した配列で、類似の生物学的作用を発揮する、例えば、骨形成活性有するエナメル基質タンパク質の、例えば、アメロゲニンが、ラット、ヒト又はマウスで見つかるかも知れないことが現在想定される。従って、本発明は、また、配列番号１及び２として開示されたブタアメロゲニン断片に類似した配列であって、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つと、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるように、少なくとも９５％同一であり、そして類似の生物学的活性を示す配列を包含する。本発明では、そのような類似のポリペプチドは、硬組織の石灰化の誘導及び／又は骨成長及び／又は骨再生を誘導する薬剤及び／又は医薬及び／又は美容組成物を製造するために、使用可能であることが想定される。
【００５２】
本発明において、配列番号１及び／又は配列番号２のような、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも９５％同一であるポリペプチド断片から成るグループから選択されるポリペプチド断片は、哺乳類の組織から単離されたポリペプチド断片、精製した組み換えポリペプチド断片、又は合成により製造されるポリペプチド断片から選択することができる。業界によく知られるように、組み換え的に生産されたポリペプチドは、特に原核生物系で生産された場合、内因性の鋳型タンパク質と僅かに異なるようになる。本発明は、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つと、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるように、少なくとも９５％同一であり、そして類似の生物学的活性を示す組み換え的に生産されたポリペプチド断片を包含する。
【００５３】
一方、合成的に製造されるポリペプチドは、業界によく知られるように、勿論、本来の生物学的活性、例えば、その軟骨形成及び／又は骨形成活性、に妨害及び／又は影響を及ぼさないような化学的な順列の多様性を持たせて設計することができる。従って、本発明は、また、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つと、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるように、少なくとも９５％同一であり、そして類似の生物学的活性を示す合成的に順列を変えたポリペプチド断片を包含する。
【００５４】
その上、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列の少なくとも1つと、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるように、少なくとも９５％同一であり、類似の生物学的活性を示すポリペプチド断片の配列の如何なる保守的な変形も、前記の配列との機能的な関係によって本発明の範囲に入ると考えられる。
【００５５】
配列の保守的な変形は、現在の文脈において、異なる種間の同じアミノ酸配列の変形を比較した場合、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％保存されたアミノ酸の配列として定義される。変形の保存の程度は、この分野でよく知られているように、ＰＡＭ（Dayhoff, Schwartz, and Orcutt (1978) Atlas Protein Seq. Struc. 5:345-352を参照）の誘導に従って、又はHenikoff and Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(22):10915-9に記載されているBlocksデータベースから誘導したBlocksの配列の比較に基づいて計算することができる。
【００５６】
保守的な置換は、例えば、下の表１に従って行ってもよい。第２列の同一ブロック内の、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換してもよい。
【００５７】
【表１】
2011525913.tif 000002
【００５８】
そのような置換は、また、非天然アミノ酸で行なわれてもよく、それには、アルファ*及びアルファ２置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、トリフルオロチロシン*のような天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*、Ｌ−アリル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸#、７−アミノのヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン#*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン#、Ｌ−チオプロリン*、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体の、例えば、４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*など、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸#及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*が含まれる。本明細書で、注釈の*は誘導体の疎水性を、一方#は誘導体の親水性を、#*は両親媒性の特性を示すために使用される。
【００５９】
変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニンの残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入されてよい、メチル、エチル又はプロピル基のようなアルキル基を含む、好適なスペーサーを含んでもよい。変異の更なる形態は、ペプトイドの形態の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の存在を含み、それは当業者がよく理解することである。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素ではなく残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指すために使われる。ペプトイド形態でペプチドを製造する方法は、業界に知られており、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 及び Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134を参照されたい。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であればよい。当然のことながら、そのペプチドは、ペプチドの意図する目的を妨害せずそしてさらに実質的に単一とみなされる担体又は希釈剤と混合されてよい。本発明のペプチドは、また、実質的に精製された形態であればよく、その場合には、ペプチド又はその断片は、一般に、製剤中のタンパク質の９０％を上回る、例えば、９５％、９８％、又は９９％が本発明のペプチドである。
【００６１】
現在の文脈において、配列番号１及び配列番号２で示されるポリペプチド断片は、配列番号１及び配列番号２で示される配列の少なくとも１つと、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％同一であるように、少なくとも９５％同一であり、且つ類似の生物学的活性を示す、例えば、軟骨形成、増殖性及び／又は骨形成活性を有する、組み換え的に生産した、又は化学的に製造したポリペプチド断片を、確かに包含する。
【００６２】
ＥＭＤは、実験の部に記されるように処理される。画分Ｃ由来の２つに分れたピーク（Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰと命名）は分離されており、それらのアミノ酸配列は以下のように決定されている：
Ｃ１ＲＰ：ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰ−ＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧ（４３ＡＡ形）（配列番号１）；
Ｃ２ＲＰ：ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰ−ＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ（４５ＡＡ形）（配列番号２）。
【００６３】
Ｃ１ＲＰ（配列番号１）は、主として４３アミノ酸長だけである様に言われているが、それは、Ｃ−末端にＧＷのアミノ酸が付加した最大で４５アミノ酸を含むまで拡大することができ、且つ最小で４１アミノ酸を含むまでに縮小することができる：配列番号１及び３〜１１を参照されたい。配列番号１及び３〜１１は、現在の文脈では、互いに交換可能である。
【００６４】
Ｃ２ＲＰ（配列番号２）は、主として４５アミノ酸長だけである様に言われているが、それは、最小で４２アミノ酸を含むまでに縮小することができる：配列番号２及び１２〜１９を参照されたい。配列番号２及び１２〜１９は、現在の文脈では、互いに交換可能である。
【００６５】
現在の文脈では、上記の同定されたポリペプチドは必ずしも同じである必要はなく、それらは１、６、７及び１６の位置において及びその長さにおいて異なることができることは、特に注目すべきである。従って、Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰの両者が、それぞれ４５のアミノ酸から成る場合でも、個々の配列の分子量は僅かにではあるが一貫して異なる（ｍ／ｚ Ｃ１ＲＰ： ５１６０．３９Ｄａ、５０８０．４２、４９３１．２９；ｍ／ｚ Ｃ２ＲＰ：５４０３．４９Ｄａ、５１７５．４０Ｄａ）。別の同じく好ましい実施態様では、２つの主要なピークは、ポリペプチドがｍ／ｚ Ｃ１ＲＰ：５１６０．８Ｄａ、ｍ／ｚ Ｃ２ＲＰ：５４０４．１Ｄａとして同定される。
【００６６】
本発明を１つの科学的理論に限定するつもりはないが、配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのポリペプチドは、互いにポリマー及び／又は凝集体を形成し、そしてそれらはポリマー、ダイマー及び／又は凝集体として生物学的に活性であることが想定される。２つの主要なピークは、その配列に多数の芳香性及びイオン性アミノ酸の存在を示し、それらの間に強い相互作用を有することを示唆する。一般に、相互作用の形態は、π−結合並びにイオン及び水素結合である。これらの現象は、ＵＶ融解曲線及びＭＡＬＤＩ測定で示される。
【００６７】
本発明は、Ｃ１ＲＰ及び／又はＣ２ＲＰの配列（配列番号１及び２）から、以下の僅かな変異を含む：
Ｃ１ＲＰ
配列番号３：Ｗで終わる４５アミノ酸、１６位はＳ又はＥであってもよく、１６位のＳはリン酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦ（Ｓ又はＥ）ＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ；
配列番号４：Ｗで終わる４５アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ；
配列番号５：Ｇで終わる４４アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧ；
配列番号６：Ｇで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧ；
配列番号７：Ｗで終わる４４アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＧＧＷ；
配列番号８：Ｗで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）及び４１位（Ｐ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＧＧＷ；
配列番号９：Ｇで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＧＧ；
配列番号１０：Ｇで終わる４２アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）及び４１位（Ｐ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＧＧ；
配列番号１１：Ｇで終わる４１アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）及び４１位（Ｐ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＧ。
【００６８】
Ｃ２ＲＰ
配列番号１２：Ｗで終わる４５アミノ酸、１６位はＳ又はＥであってもよく、１６位のＳはリン酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦ（Ｓ又はＥ）ＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ；
配列番号１３：Ｗで終わる４５アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ；
配列番号１４：Ｇで終わる４４アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧＧ；
配列番号１５：Ｇで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は酸化されてもよい：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＭＧ；
配列番号１６：Ｗで終わる４４アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＧＧＷ；
配列番号１７：Ｗで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）及び４１位（Ｐ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＧＧＷ；
配列番号１８：Ｇで終わる４３アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＰＧＧ；
配列番号１９：Ｇで終わる４２アミノ酸、１６位（Ｓ）はリン酸化されてもよく、そして４２位（Ｍ）及び４１位（Ｐ）は欠如している：
ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＮＭＩＲＨＰＹＴＳＹＧＹＥＧＧ。
【００６９】
代りの実施態様では、任意の同定された上記の配列は、さらに１位及び４２位の少なくとも１つが酸化されてもよい。そのうえ別の実施態様では、任意の同定された上記の配列は、また、３６位（Ｓ）、２１位（Ｔ）、３５位（Ｔ）、１４位（Ｎ）及び２８位（Ｎ）の少なくとも１つがグリコシル化されてもよい。
【００７０】
活性エナメル物質
本明細書で使用されるように、「エナメル基質」は、エナメル質の前駆体を意味し、任意の関連した自然源から、即ち、歯が発育中の哺乳類から得ることができる。好適な原料は、例えば、ウシ、ブタ又は仔羊などの食肉処理された動物由来の発育中の歯である。他の原料は、例えば、魚の皮である。現在の文脈では、用語の「活性エナメル物質」は、エナメル基質誘導体及び／又はエナメル基質タンパク質を起源無差別に包含するために使用される。
【００７１】
エナメル基質は、前記のように発育中の歯から製造することができる（欧州特許第０３３７９６７号及び欧州特許第０２６３０８６号）。エナメル基質を削り取り、そしてエナメル基質誘導体を、例えば、緩衝液、希酸若しくは希塩基又は水／溶媒混合液のような水溶液で抽出し、続いてサイズ排除、脱塩又は他の精製工程、或いは続く凍結乾燥によって製造する。酵素は、熱又は溶媒処理によって選択的に失活させてもよく、その場合、誘導体は凍結乾燥しないで液体の形態で保存してもよい。
【００７２】
代りのエナメル基質誘導体又はタンパク質の原料として、当業者に周知の一般に適用可能な合成経路を使用してもよいし、又はＤＮＡ技術で修飾した真核生物若しくは原核生物の培養細胞を使用してもよい。エナメル基質タンパク質は、従って、組み換え体起源の或いは遺伝的及び／又は化学的に修飾されたものでもよい（例えば、Sambrook, J. et al.:
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照）。
【００７３】
現在の文脈では、エナメル基質誘導体は、選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、又は自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、又は生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された、１つ又はいくつかのエナメル基質タンパク質、又はそのようなタンパク質の部分若しくは断片を含むエナメル基質の誘導体である。エナメル基質タンパク質誘導体は、また、エナメル基質に関連したポリペプチド又はタンパク質を含む。ポリペプチド又はタンパク質は、ポリアミン酸若しくは多糖又はそれらの組み合わせなどの好適な生物分解性担体分子に結合していてもよい。更に、用語のエナメル基質誘導体は、また、合成の類似物質を包含する。
【００７４】
タンパク質は、ペプチド結合によって共に連結したアミノ酸残基によって構成された生体高分子である。タンパク質、また、アミノ酸の線状重合体として、ポリペプチドとも呼ばれる。一般的には、タンパク質は５０〜８００のアミノ酸残基を有し、そしてそれ故、約６，０００から数１０万ダルトン又はそれ以上の範囲の分子量を有する。本発明の文脈において、本発明に従って使用する「ポリペプチド断片」とは、長さが、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４７、４８、４９又は５０アミノ酸のような１〜５０アミノ酸であってよいが、しかしこれらに限定されない、ポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドは、また、５０アミノ酸より長くてもよい。
【００７５】
エナメル基質タンパク質は、通常はエナメル基質に存在するタンパク質、即ち、エナメル質の前駆体（Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-91）、又はそのようなタンパク質の切断によって得ることができるタンパク質である。一般に、そのようなタンパク質は、１２０，０００ダルトンより低い分子量を有し、それにはアメロゲニン、非アメロゲニン、プロリンリッチ非アメロゲニン及びタフテリンが含まれる。
【００７６】
本発明に従って使用されるタンパク質の例は、アメロゲニン、プロリンリッチ非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清蛋白質、唾液タンパク質、アメロブラスチン、シースリン及びそれらの誘導体、並びにそれらの混合物である。さらに、本発明に従って使用される他のタンパク質は、市販の製品、EMDOGAIN（登録商標）（BIORA AB、Sweden）に見られる。
【００７７】
EMDOGAIN（登録商標）（BIORA AB, S-205 12 Malmo, Sweden）は、残留するプロテアーゼを不活化するために約８０℃で３時間加熱された３０ｍｇのエナメル基質タンパク質（ＥＭＤ）、及びタンパク質と媒体を別々にテストするのでなければ、適用に先立って混合する１ｍＬの媒体溶液（アルギン酸プロピレングリコール）を含有する。質量比は、２０、１４及び５ｋＤａの主なタンパク質のピークの間で、それぞれ８０／８／１２である。
【００７８】
一般に、エナメル基質の主なタンパク質は、アメロゲニンとして知られている。それらは、生理学的条件下で凝集体を形成する著しく疎水性の物質である。
それらは、他のタンパク質又はペプチドを携えている又はそれらのための担体である可能性がある。
【００７９】
現在好ましい本発明の実施態様は、従って、本発明によって開示されるような、アメロゲニンの各ポリペプチド断片の少なくとも１つを含む、医薬用、化粧用及び／又は治療用の製剤及び／又は組成物に関する。
【００８０】
別の現在好ましい本発明の実施態様は、本発明によって開示されるような、アメロゲニンの各ポリペプチド断片の少なくとも１つから成る、医薬用、化粧用及び／又は治療用の製剤及び／又は組成物に関する。
【００８１】
本発明によって開示されるような画分及び／又はアメロゲニンの各ポリペプチド断片の少なくとも１つは、本発明の文脈では、実質的に単離された又は精製された形態であればよい。当然のことながら、画分、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び／又はその断片は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び／又はその断片の意図した目的を妨害せず、その上実質的に分離したとみなされる担体又は希釈剤と混合する、若しくは医薬組成物に含ませてもよい。そのような実質的に精製された形態は、一般に、製剤中のタンパク質の９０％以上、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が本発明の画分及び／又は組み合わせたポリペプチド断片である、製剤中のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び／又は断片から成る画分を含む。
【００８２】
対照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び／又はそれらの断片によって、対照アミノ酸配列の各１００個のアミノ酸当たり５個までの変異を含んでいる可能性があることを除いては、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列は対照アミノ酸配列と同一であることを意図している。換言すれば、対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸の配列を有するポリペプチドを得るためには：対照配列中のアミノ酸の最大５％までが削除若しくは他のアミノ酸で置換されてもよく、又はアミノ酸数で、対照配列の全アミノ酸の最大５％までのアミノ酸が、対照配列に挿入されてもよい。対照配列のこれらの変異は、対照アミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシ末端で、又はこれらの末端の間のどこかで、対照配列のアミノ酸の間に個々に又は１つ又はそれ以上の連続したグループの何れかで、対照配列内に散在して起きてもよい。
【００８３】
本発明では、ローカルアルゴリズムプログラムは同一性を決定するために最も適している。ローカルアルゴリズムプログラム（例えばSmith-Watermanのような）は、１つの配列の部分列を次の配列の部分列と比較し、部分列の組み合わせ及びその部分列の整合を見つけ出し、それにより最も高い全体としての類似性スコアを生み出す。内的ギャップがあれば、ペナルティになる。ローカルアルゴリズムは、単一ドメイン又は単に結合部位を共通に持っている２つの多ドメインタンパク質の比較に有効である。
【００８４】
同一性及び類似性を決定する方法は、公に利用可能なプログラムに成文化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J et al (1994)）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（Altschul, S.F. et al (1990)）が挙げられるが、これに限定されない。BLASTXプログラムは、NCBI及び他の出所（BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990)）から公に利用可能である。各配列解析プログラムは、デフォルト・スコアリング・マトリックス（default scoring matrix）及びデフォルト・ギャップ・ペナルティ（default gap penalty）を有する。一般に、分子生物学者は、使用するソフトウェアのプログラムによって確立したデフォルトの設定を使用することが予想される。
【００８５】
エナメル基質のタンパク質は、典型的な高分子量部分及び低分子量部分に分けることができ、その画分は一般にアメロゲニンと呼ばれる酢酸抽出可能なタンパク質を含む（欧州特許公開Ｂ第０３３７９６７号及び欧州特許公開Ｂ第０２６３０８６号を参照)。
【００８６】
タンパク質を、例えば、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、分取電気泳動、 ゲル浸透クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーによって分別することによって、異なる分子量のアメロゲニンを精製することができる。
【００８７】
上記のように、本発明による使用のための画分Ｃは、ＳＤＳ・ＰＡＧＥ電気泳動による測定として、一般に大よそ４ｋＤａと６ｋＤａの間の、例えば、大よそ５ｋＤａのような分子量を有する。
【００８８】
一般に、エナメル基質、エナメル基質誘導体及びエナメル基質タンパク質は、疎水性の、即ち、水に対する溶解性、特に高い温度での溶解性が低い物質である。一般に、これらのタンパク質は、非生理学的なｐＨ値、及び４〜２０℃の様な低温で可溶性であるのに対し、それらは体温（３５〜３７℃）及び中性ｐＨで凝集し沈殿する。
【００８９】
特に好ましい実施態様では、本発明による使用のための製剤は、従って、少なくとも部分的に凝集した、及び／又は生体内に適用後に凝集体を形成することができる活性エナメル質物質含む。前述の凝集体の粒子サイズは、例えば、１μｍと２０ｎｍ、１μｍと１０ｎｍ、５μｍと１０ｎｍ、１０μｍと１ｎｍ、１００μｍと１０ｎｍ、１００μｍと１ｎｍ、１μｍと１ｎｍ、１μｍと５ｎｍ、１μｍと１５ｎｍの間のように、約１μｍから約２０ｎｍの範囲である。
【００９０】
本発明によれば、単離された画分Ｃ及び／又は配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つから成る単離されたエナメル基質タンパク質の画分、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つを含む医薬製剤、又は選択的スプライシング若しくはプロセッシングによって、若しくは自然長タンパク質の酵素的若しくは化学的切断の何れかによって、若しくは生体外若しくは生体内のペプチドの合成（例えば、組み換えＤＮＡ法及び／又は二倍体細胞の培養）によって天然に生成された配列番号１及び２で示されるアメロゲニンのそれぞれ２つのポリペプチド断片の少なくとも１つは、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗カビ剤などの他の薬剤と共に、又は局所化学療法、アポトーシス誘導剤、成長因子の、例えば、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ケラチノサイト増殖因子若しくはそれらのペプチド類似体と組み合わせて使うことができる。酵素（エナメル基質若しくはその調製物に本質的に存在するか又は添加された)、特にプロテアーゼも、また、本発明によるエナメル基質画分及び／又はポリペプチド断片と組み合わせて使用してもよい。
【００９１】
医薬組成物
組成物は、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片の使用に応じて、医薬、治療薬及び／又は化粧品の組成物であってもよい。以下において、医薬及び／又は治療薬組成物はまた、化粧品組成物並びに医薬品と化粧品の間のいわゆるグレーエリアに属する組成物、即ち薬用化粧品も包含することを意図する。
【００９２】
本発明による画分及び／又はポリペプチド断片を含む医薬及び／又は治療薬組成物は、薬物送達システムとして働く。現在の文脈において、用語の「薬物送達システム」は、投与によってヒト又は動物の身体に活性物質を提示する医薬及び／又は治療薬組成物（医薬及び／又は治療薬製剤又は剤型）を意味する。
【００９３】
個体（動物又はヒトなど）への投与のためには、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片及び／又はそれらの調製品は、好ましくは活性エナメル質物質の画分及び／又はポリペプチド断片、並びに、場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤化される。
【００９４】
投与される本発明による画分及び／又はポリペプチド断片を含む組成物は、任意の好適な経路、例えば、ホース、シリンジ、スプレー又は灌注装置による患者への全身投与により投与するために適応することができる。
【００９５】
更に、組成物は、例えば、血液、リンパ液、腹水若しくは髄液中への注入による又は吸入による全身投与として、手術に関連した投与に適応することができる。全身的な適用のために、本発明による組成物は、ミクロスフェア及びリポソームを含む、慣習的に毒性が無く薬学的に許容される本発明による担体及び賦形剤を含んでもよい。本発明による組成物の投与も、例えば、限定されないが、経口、非経口、静脈内、頬、耳、直腸、膣、腹腔内、局所（皮膚）、若しくは経鼻の様な他の任意の従来の投与経路によって、又は、例えば、歯根若しくは歯根管の様な体腔への投与によって行うことができる。
【００９６】
他の適用、例えば、義歯、 義足 、差し歯への適用、及び口腔、鼻腔及び膣腔のような体腔への適用も、勿論、関連を有し得る。粘膜は、口、頬、鼻、耳、直腸、及び膣の粘膜から選択することができる。更に、その適用は、創傷又は他の軟部組織の損傷面若しくはその上に直接なされてもよい。
【００９７】
更に、歯科／歯科学領域内への適用も、また、非常に重要である。関連する例は、歯周（歯科）ポケットへ、歯肉若しくは歯肉の損傷へ、又は口腔手術に関連して口腔内にある他の創傷への適用である。
【００９８】
本発明に従って使用される組成物は、限定されないが、流体、半固体又は固体組成物であり、例えば、限定されないが、無菌の生理食塩水、リンゲル溶液、グルコース溶液、リン酸緩衝生理食塩水、血液、血漿、水などに溶解した輸注液体、粉末、マイクロカプセル、生体吸収性パッチ、飲み薬、シート、包帯、絆創膏、埋没物、ピル、スプレー、石鹸、坐薬、膣挿入剤、練り歯磨き、ローション、うがい薬、シャンプー、ミクロスフェア、ナノ粒子、スプレー、エアゾール、吸入器、溶液、分散剤、湿潤剤、懸濁液、エマルジョン、ペースト、軟膏、親水軟膏、クリーム 、ジェル、ヒドロゲル（例えば、ポリエチレングリコール）、包帯剤、装置、鋳型、スマートゲル、移植片、溶液、エマルジョン、懸濁液、パウダー、フィルム、発泡体、パッド、スポンジ（例えば、コラーゲンスポンジ）、経皮送達システム、顆粒、粒質物、カプセル、アガロース又はキトサンビーズ、錠剤、マイクロカプセル、凍結乾燥粉末、顆粒、粒質物又はペレット、及びそれらの混合物の形態であってよい。
【００９９】
本発明に従って使用される好適な分散剤又は湿潤剤は、天然のホスファチド、例えば、レシチン又は大豆レシチン；エチレンオキサイドと例えば脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、又は脂肪酸とヘキシトール若しくは無水ヘキシトールから誘導可能な部分エステルとの縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリエチレンソルビタンモノオレエートなどであってよい。しかし、本発明はそれらに限定されない。
【０１００】
好適な懸濁化剤は、例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、トラガカントゴムのような天然ゴム；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース（例えば、Avicel（登録商標）RC 591、メチルセルロース）；限定されないが、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩及びキトサン、などである。
【０１０１】
本発明に従って使用される液状組成物は、例えば、医療用インプラント又は装置の表面に適用するための、例えば、限定されないが、溶液、分散液又は懸濁液であればよい。一旦適用されたら、組成物は、好ましくは、例えば、乾燥によって、保存中に又はインプラント若しくは装置を使用しているときに溶解しない固体又は少なくとも高粘性の組成物に固まらなければならない。
【０１０２】
そのような組成物は、好ましくは滅菌条件下で適用され、及び／又は適用された後に放射線照射又はエチレンオキサイドガスへの曝露によって滅菌される。組成物が液体組成物の形状の場合、それは同様に医療用インプラント又は装置が体内に導入される少し前に適用されればよい。活性エナメル質物質の画分及び／又はポリペプチド断片を含む組成物を医療用インプラント又は装置に適用する代わりに、その組成物を、上に示したようにかなり大きな割合の上皮細胞を含む組織のような、インプラント又は装置と接触する組織の表面に適用してもよい。更に、組成物は、インプラント及び／又は装置、並びにそれらと接触する組織の両者に適用してもよい。
【０１０３】
本発明によって開示されるあらゆる他の医薬組成物も、また、医療用インプラント又は装置の表面に適用するために使用できることは強調されるべきである。
【０１０４】
本発明による組成物は、既に本明細書に開示されていること以外に、従来の製薬基準に従って製剤化することができる；例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”（「レミントンの薬剤科学」）及び “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”（「調剤技術百科辞典」）, Swarbrick, J. & J. C. Boylan著, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988を参照されたい。
【０１０５】
薬学的に許容される賦形剤は、組成物が投与される個体に対して実質的に害のない物質である。賦形剤は、本発明による医薬組成物に含まれる。そのような賦形剤は、通常は、国立の保健機関が定めた要件を満たす。例えば、英国薬局方、アメリカ合衆国薬局方及び欧州薬局方のような公式の薬局方は、薬学的に許容される賦形剤について基準を定めている。
【０１０６】
本発明に従って使用される組成物中の薬学的に許容される賦形剤及びその最適濃度の選択は、一般に予測することは不可能であり、最終組成物の実験的評価に基づいて決定されなければならない。
【０１０７】
しかしながら、本目的のための好適な賦形剤は、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片を含む組成物のインプラント又は装置の表面への適用を促進する賦形剤、又は適用に際して、表面への組成物の接着を促進する賦形剤、又は組成物の急速な溶解を阻止する又は組成物から本発明による画分及び／又はポリペプチド断片の放出を防護するような賦形剤から選択することができる。医薬製剤の当業者は、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”（「レミントンの薬剤科学」）, 第１８版, Mack Publishing Company, Easton, 1990に指針を見出すことができる。
【０１０８】
薬学的に許容される賦形剤が医薬組成物での使用に好適であるかどうかは、一般に、具体的な創傷の種類にどの種類の投与形態を選択するか、及び／又は何か他の疾患及び／又は身体への損傷がないかに依存する。
【０１０９】
薬学的に許容される賦形剤としては、溶媒、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、 キレート剤 、抗酸化剤、安定化剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、浸透促進剤、香料、パウダー及び皮膚保護剤が挙げられる。しかし、本発明がそれらに限定されないことは強調されるべきである。
【０１１０】
本発明による組成物に使用されるそのような溶媒の例は、水、アルコール、植物油又は魚油（例えば、アーモンドオイル、ヒマシ油、ココア脂、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、あまに油、オリーブオイル、ヤシ油、落花生油、ケシ油、菜種油、胡麻油、大豆油、ヒマワリ油及び茶種子油などの食用油）、鉱油、脂肪油、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール 、液体ポリアルキルシロキサン、又は後に歯の充填材の適用を容易にするｐＨ約５．５〜６．０の弱酸のような他の親水性若しくはエーテル性溶媒、並びにそれらの混合物である。
【０１１１】
緩衝剤の例は、クエン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、水素リン酸、重炭酸、リン酸、ジエチルアミンなどである。
【０１１２】
好適な保存剤の例は、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、ブロノポール、ブロニドックス、ＭＤＭヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカルバマート、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム及びベンジルアルコールなどのパラベン類、又は保存剤の混合物である。
【０１１３】
湿潤剤の例は、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素、及びそれらの混合物である。
【０１１４】
キレート剤の例は、ＥＤＴＡナトリウム及びクエン酸である。
【０１１５】
抗酸化剤の例は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、システイン、及びそれらの混合物である。
【０１１６】
乳化剤の例は、例えば、アラビアゴム又はトラガカントゴムなどの天然ゴム；例えば、大豆レシチン、ソルビタンモノオレエート誘導体などの天然のホスファチド；ウール脂肪；ウールアルコール；ソルビタンエステル；モノグリセリド；及びそれらの混合物である。
【０１１７】
懸濁化剤の例は、例えば、セルロース及びセルロース誘導体の、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロースなど、カラギーナン、アカシアゴム、アラビアゴム、トラガカント、及びそれらの混合物などである。
【０１１８】
ゲル基剤、粘性を増加させる薬剤又は傷から滲出液を吸い取ることができる成分の例は次の通りである：流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイド状のシリカ又はアルミニウム、亜鉛石鹸、グリセロール、プロピレングリコール、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、ケイ酸マグネシウム・アルミニウム、Carbopol（登録商標）、親水性のポリマーの、例えば、デンプン、又は、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース並びに他のセルロース誘導体などのセルロース誘導体、水膨潤性ハイドロコロイド、カラギーナン、ヒアルロン酸（例えば、場合により食塩を含むヒアルロン酸ゲル)、コラーゲン、ゼラチン、ペクチン、プロピレングリコール、キトサン及びアルギン酸プロピレングリコールを含むアルギン酸。
【０１１９】
本発明では、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片は、それが酵素作用及び／又は拡散による重合体マトリックスの分解によって放出されるように、重合体マトリックスに組み入れることができる。前述の重合体マトリックスは、細胞内殖に好適であるか細胞閉鎖性であるかの何れかである。本発明に含まれるのは、従って、特に、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片の低い製剤内総濃度の医薬品及び／又は化粧品製剤であって、前述の活性エナメル質物質の空間的及び／又は選択的な放出の制御が、適切な細胞活性の時に、大きな割合の活性エナメル質物質の放出を可能にする製剤である。
【０１２０】
従って、本発明の１つの実施態様は、細胞の成長、内殖及び／又は移走、又は細胞閉鎖の何れかに好適な重合体マトリックスを含む、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片を投与するための医薬及び／又は治療用製剤に関する；ここで、前述のマトリックスは、強い求核剤と、共役した不飽和結合又は共役した不飽和基との求核反応によって形成される。
【０１２１】
好ましくは、共役した不飽和基又は共役した不飽和結合は、アクリラート、ビニルスルホン、メタクリラート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、ビニルスルホン、２−又は４−ビニルピリジニウム、マレイミド、又はキノンである。
【０１２２】
軟膏基剤の例は、例えば、ミツロウ、パラフィン、セタノール、パルミチン酸セチル、植物油、脂肪酸のソルビタンエステル（スパン）、ポリエチレングリコール 及び脂肪酸のソルビタンエステルとエチレンオキサイドの縮合生成物の、例えば ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Tween）である。
【０１２３】
疎水性又は水乳化性の軟膏基剤の例は、パラフィン、植物油、動物性脂肪、合成グリセリド、ワックス、ラノリン、及び液体ポリアルキルシロキサンである。
【０１２４】
親水性の軟膏基剤の例は、固体のマクロゴール（ポリエチレングリコール）である。
【０１２５】
軟膏基剤の他の例は、トリエタノールアミン石鹸、硫酸化脂肪アルコール及びポリソルベートである。
【０１２６】
粉末成分の例は以下の通りである：アルギン酸、コラーゲン、乳糖、傷に適用された時ゲルを形成する（液体／傷滲出液を吸収する）ことができる粉末。通常は、大きな開放創に適用しようとする粉剤は無菌でなければならないし、存在する粒子は微粉化されなければならない。
【０１２７】
他の賦形剤の例は、カルメロース、ナトリウムカルメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ペクチン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、ゼラチン、カルボマーのようなポリマー；ビタミンＥ、グリセリルステアラート、セタニルグルコシド、コラーゲン、カラゲナン、ヒアルロン酸及びアルギン酸のような乳化剤；並びにキトサンである。
【０１２８】
希釈剤及び崩壊剤の例は、乳糖、蔗糖、エムデックス（emdex）、リン酸カルシウム基質のようなリン酸カルシウム材料、リン酸カルシウム担体（ヒドロキシアパタイト、二相性リン酸カルシウム、及びリン酸三カルシウムを含む）、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、デンプン及び微結晶セルロースであるが、これらに限定されない。
【０１２９】
結合剤の例は、蔗糖、 ソルビトール 、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールであるが、これらに限定されない。
【０１３０】
局所適用に関連して重要であることが実証されている組成物は、揺変性の特性を有するもの、即ち、組成物の粘度が、例えば、振盪又は撹拌によって影響を受け、その結果投与する時の組成物の粘度を低下させることができ、そして組成物が適用されてしまった時に粘度が上昇し、その結果組成物が適用部位に留まるものである。
【０１３１】
しかし、薬学的に許容される賦形剤が異なる剤型又は組成物に使用される可能性がある場合、特定の薬学的に許容される賦形剤又は特定の機能の賦形剤の適用が特定の剤型に限定されないことは理解される。
【０１３２】
練り歯磨き若しくはうがい薬製剤、又は歯若しくは歯根へ適用するための他の製剤では、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片は、わずかに酸性ｐＨの媒体中に溶液状態で、又は中性ｐＨの媒体中に分散液としての何れかで存在すればよい。本発明による画分及び／又はポリペプチド断片が、歯の表面に保護層を形成し、それによって齲蝕発生細菌の付着を防止することが期待される。そのような歯科治療製剤では、画分及び／又はポリペプチド断片は、虫歯予防効果を有する１つ又はそれ以上の他の化合物、とりわけ、フッ素又はバナジウム若しくはモリブデンのような別の微量元素と一緒に製剤化してもよい。中性ｐＨでは、その微量元素は活性エナメル質物質と（例えば、イオン結合で）結合しており若しくはその中に包埋されており、そこから、例えば、齲蝕発生細菌によって産生される酸によるｐＨが約５．５又はそれ以下で画分及び／又はポリペプチド断片が溶解するとき、それが放出されて齲蝕防止効果を発揮すると考えられる。
【０１３３】
本発明による使用のための医薬組成物には、本発明による画分及び／又はポリペプチド断片は、一般に約０．０１〜約９９．９質量％の範囲の濃度で存在する。適用される組成物の量は、通常は、約０．０１ｍｇ／ｍｍ2〜約３ｍｇ／ｍｍ2のような、約０．００５ｍｇ／ｍｍ2〜約５ｍｇ／ｍｍ2に相当する、歯髄の面積ｃｍ2当たりの総タンパク質量になる。
【０１３４】
本発明による画分及び／又はポリペプチド断片が、液体組成物の形態で投与されるような場合、組成物中の画分及び／又は断片の濃度は、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬに相当する範囲、例えば、約０．１〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。高濃度はいくつかの望ましい場合であり、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの濃度として得ることもできる。
【０１３５】
ヒトの歯髄の欠陥部は、典型的には約２００μＬに相当する約５〜１０×２〜４×５〜１０ｍｍのサイズを有し、そして通常は、１つの歯当たり約０．２〜０．３ｍＬのような最大で約０．５〜１ｍＬのサイズには、例えば、５〜３０ｍｇ／ｍＬが適用されるように、約１〜４０ｍｇの総タンパク質／ｍＬの濃度を有する組成物が適用される。０．２〜０．３ｍｇ／ｍＬは２５〜１００ｍｍ2当たり約６ｍｇのタンパク質に、又はもし歯根表面のみで計算すれば、約０．１ｍｇ／ｍｍ2に相当する。通常は、患部の表面を十分にカバーするために過剰の量が適用される。多層でさえ、前述の量のごく小量しか必要としない。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】培養骨芽細胞（一人のドナー、ＮＨＯ−３）のＲＴ−ＰＣＲのグラフである。Ａ１は、以下の遺伝子産物の発現をＡ２よりも大幅に、７日後に最も顕著に刺激した：オステオカルシン及びレプチン。値は、α−チューブリンに対する各タンパク質の相対濃度を表わし、二つ組みの（duplicate）実験からの１つの結果の平均として示される。
【図２】画分Ａ１及びＡ２で刺激した２つの骨肉腫細胞培養（ＳａＯＳ−２及びＨＯＳ）のＲＴ−ＰＣＲのグラフである。ＡＬＰとＯＣの発現は、特にＡ１による処理により増加した。Ｃｂｆａ−１及びＣＤ４４の発現に対してＡ１の作用は認められなかったのに対し、Ａ２で処理した後のＣＤ４４の発現は僅かに減少した。ｎ＝３、値はα−チューブリンに対する各タンパク質の相対濃度を表わし、２つの細胞株の結果からの混合平均±ＳＤとして示される。
【図３ａ】ＥＭＤ対画分ＣのＳＤＳ・ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット（トリシンシステム）の図である。ウサギＳＫ３１８４で抗原コードＥＰＯ４２５４３（ペプチド＝ＳＹＧＹＥＰＭＧＷＬＨ、ＴＲＡＰのＣ末端に対応）に対して産生された抗体によるウエスタンブロット。
【図３ｂ】ＥＭＤ及び画分Ｃの、尿素存在下でのネーティブ荷電密度ＰＡＧＥを示す図である。
【図４】オステオカルシンレベルを示すグラフである。上のパネル：ＥＭＤ及びｒｈＡｍｅｌは、二相性のオステオカルシン産生増加を引き起こした。下のパネル：同様に、画分Ａ及び画分Ｃは二相性の作用を有した。ＥＭＤ、ｒｈＡｍｅｌ及び画分Ａについては、最大増加は１μｇ／ｍＬにおいてであり、画分Ｃについては、最大増加は１０μｇ／ｍＬにおいてであった。データは２つの実験のうちの１つからで、１つの変数当たりＮ＝６の独立した培養についての平均±標準誤差（ＳＥＭ）である。両者の実験は、同様の結果を示した。*ｐ＜０．０５、処理対コントロール。
【図５】ＤＮＡ含量を示すグラフである。異なる濃度のＥＭＤ、組み換えアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及び画分Ｃの、ＭＧ６３細胞内ＤＮＡレベルに及ぼす影響。各実験はそれぞれ２回行い、それぞれのサンプルは６つのサンプルの平均及びＳＥＭである。
【図６】ＭＧ６３細胞中のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の比活性に対する異なる濃度のＥＭＤ、組み換えアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及び画分Ｃの効果を示すグラフである。各実験は２回行い、それぞれのサンプルは、６つのサンプルの平均及びＳＥＭである。有意性*：Ｖｒｓ．未処理（コントロール）、Ｖｒｓ．１μｇ〜／μ  ｐ＜０．０５。
【図７】ＭＧ６３細胞中のオステオカルシンレベルに対する異なる濃度のＥＭＤ、組み換えアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及び画分Ｃの効果を示すグラフである。各実験は２回行い、それぞれのサンプルは、６つのサンプルの平均及びＳＥＭである。有意性*：Ｖｒｓ．未処理（コントロール）、Ｖｒｓ．１μｇ〜／μ  ｐ＜０．０５。
【図８】ＭＧ６３細胞中のＯＰＧレベルに対する異なる濃度のＥＭＤ、組み換えアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及び画分Ｃの効果を示すグラフである。各実験は２回行い、それぞれのサンプルは、６つのサンプルの平均及びＳＥＭである。有意性*：Ｖｒｓ．未処理（コントロール）、Ｖｒｓ．１μｇ〜／μ  ｐ＜０．０５。
【図９】ＭＧ６３細胞中のＶＥＧＦレベルに対する異なる濃度のＥＭＤ、組み換えアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及び画分Ｃの効果を示すグラフである。各実験は２回行い、それぞれのサンプルは、６つのサンプルの平均及びＳＥＭである。有意性*：Ｖｒｓ．未処理（コントロール）、Ｖｒｓ．１μｇ〜／μ  ｐ＜０．０５。
【図１０】ＯＣのＴＰに対する比率を、コントロールの％で示すグラフである。
【図１１Ａ】活性成分Ｃ１ＲＰの質量分析の図である。
【図１１Ｂ】活性成分Ｃ１ＲＰの質量分析の図である。
【図１１Ｃ】活性成分Ｃ２ＲＰの質量分析の図である。
【図１２】ＥＭＤの分画を示す図である。ｈＰＤＬ細胞、Ｐｕｌｐ細胞、ｈＭＳＣ及びＮＨＯ細胞でテストした画分。
【図１３】アメロゲニンのプロセッシングを示す図である。
【図１４Ａ】ＥＭＤの細胞取り込み実験を示す図である。
【図１４Ｂ】ＦＩＴＣ標識ＥＭＤと共に１６時間インキュベーションした後のＰＤＬ細胞。
【図１４Ｃ】蛍光標識した２０ｋＤアメロゲニンと６時間インキュベーションした後のＰＤＬ繊維芽細胞。
【図１４Ｄ】２０ｋＤの全長アメロゲニンを特異的に取り込み、そしてそれをＴＲＡＰに消化するＰＤＬ繊維芽細胞。細胞の取り込みは、主に食作用による。５ｋＤ断片は核に位置しているように見える。ＰＤＬ細胞は、如何なる５ｋＤａ分子も培地から吸収しない。
【図１５Ａ】ＤＮＡ合成中のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み込み測定に基づいた増殖能力を示すグラフである。２４時間の処理後にＭＧ６３細胞をＢｒｄＵで標識した。
【図１５Ｂ】ＷＳＴ−１アッセイによって検出した増殖性と生存率を示す。ＭＧ６３細胞の生存率は、処置の７日後に測定した。
【図１５Ｃ】処理後１日のＭＧ６３単層培養のアルカリホスファターゼ活性を示す。ＡＬＰ活性は、μＭｐｉ／分／ｍｇタンパク質で示す。
【図１６】４及び８時間後のＰＤＬ細胞の接着を示すグラフである。
【図１７−１】表３であり、ＥＭＤ（５０μｇ／ｍＬ）で、ＰＴＨ１８４（１０−８Ｍ）と対比して刺激した２４時間後の初代骨芽細胞のAffymetrix分析の、遺伝子発現変化がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認された。２つの異なる薬剤の作用の間に著しい類似性がある。数値は、１人のドナーの細胞培養由来で、条件当たり２つの分析からの平均である。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−２の続きである。
【図１８】表５であり、骨芽細胞分化マーカーに焦点を当てたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでアッセイした、ヒト骨芽細胞及び間葉幹細胞（Ｃｆｕ−ｆ）による遺伝子発現の変化の概観である。Ｃｆｕ−ｆについての値は、１ドナー細胞だけ（Ｃｆｕ−ｆ）からの結果を表わす。統計解析は、ＳＩＧＭＡプロット・ソフトウェア、スピアマン順位検定で行なった。
【図１９】表６であり、骨芽細胞−破骨細胞コミュニケーション因子に焦点を当てたＥＬＩＳＡでアッセイした、ヒト骨芽細胞及び間葉幹細胞（Ｃｆｕ−ｆ）によるタンパク質発現の変化の概観である。数値は、少なくとも２人のドナーの二つ組の解析からの平均値を表わす。
【実施例】
【０１３７】
実験の部
方法
ＥＭＤからの画分の分離
完全なＥＭＤとは異なる画分の分離及び精製は、連続的なＨＰＬＣカラム処理によって行った:
１）アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．９％のＮａＣｌ中のサイズ排除ＨＰＬＣ（TKSSW 2000-600x30）；
２）３０％ＡＣＮ／０．９％ＮａＣｌから６０％ＡＣＮ／０．９％ＮａＣｌへの直線的勾配における逆相ＨＰＬＣ（YMC-C8、２５０ｘ２０ｍｍ）。
【０１３８】
この工程の後、逆相ＨＰＬＣカラム（工程１のような）で、成分Ａ（２つの明確な成分Ａ１及びＡ２を含み、その両者とも＞２０ｋＤであり、抗アメロゲニン抗体（ＥＭＤ、ＢＩＯＲＡ  ＡＢ、ＳＥに対する従来の抗体）によって認識される）、Ｂ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、画分Ｃ、Ｃ３、Ｃ４、Ｄ、Ｄ２は、明確なピークを示しており、分画することにより分離することができた。
２）ａ  画分Ｃから４つの明確なサブ画分（Ｃｐ１、Ｃｐ２、Ｃｐ３、Ｃｐ４）を分離するために、逆相ＨＰＬＣカラムを使用した（ACE-C4を直線的ＡＣＮ−酸性勾配で）（Advanced Chromatography Technology, USA）。
３）最後の工程は、HI-Trap脱塩カラム（HR 16/20）（Ammersham Biosciences, SE）を使用して、サンプルからＡＣＮを除くことを目的とした。画分の濃度を決定するために、サイズ排除ＨＰＬＣカラム（工程１におけると同様）をＰＢＳで使用した。
【０１３９】
実験に使用した細胞
異なるドナーの大腿骨及び脛骨の両者由来の、市販の初代ヒト骨芽細胞（NHOst cell system; Cambrex, Walkersville, MD, USA）は、骨芽細胞増殖培地（OGM、cambrex）で増殖させた。培養した骨芽細胞は、石灰化を促進するために環境培地（ambient medium）中でヒドロコルチゾン・ヘミスクシナート（２００ｎＭ）及びヒドロコルチゾン・グリセロホスファート（１０ｍＭ）（Cambrex）に接触させた。細胞の表現型は、 アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、１型コラーゲン、オステオカルシン及びＣＤ４４（後期分化マーカー）の発現レベル並びに石灰化結節の形成に基づいて特徴づけした。
【０１４０】
ヒト歯周靭帯細胞（ＰＤＬ、３人のドナーからのプール、Biowhittaker, ６代継代）は、他に記載されるように処理した（Gestrelius, S., Andersson, C., Lidstrom, D., Hammarstrom, L. & Somerman, M., “In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative”（「歯根膜細胞及びエナメル基質誘導体に関するインビトロ研究」）. J Clin Periodontol 24, 685-92 (1997)）。
【０１４１】
骨肉腫細胞株ＳａＯＳ−２（ATTC HTB-85）は、American Type Culture Collection （Rockville, MD）から入手した。ＳａＯＳ−２細胞は、１０％のＦＣＳ及び１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補添したマッコイ５Ａ培地（PAA）で増殖させた。
【０１４２】
マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ No ACC 210; Braunschweig, Germany）から入手し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＣＳ（PAA）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むａ−ＭＥＭ（PAA, Linz, Austria）中で維持した。
【０１４３】
単クローン性骨肉腫細胞株ＯＨＳは、Bruland博士（The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norway）から贈与された。細胞は、１０％のＦＣＳ（PAA）、５０ＩＵ／ｍＬのペ
ニシリン及び５０ｇ／ｍＬのストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ１６４０（PAA）中で培養した。
【０１４４】
コロニー形成単位の線維芽細胞（Ｃｆｕ−ｆ）、フローアナリシスサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分離され特徴づけられたヒト間葉幹細胞は、２人の自発的ドナーの骨髄（Radium hospital, Oslo）から入手し、骨芽細胞（上述）と同じように処理した。
【０１４５】
ＳＤＳ・ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法
１６％のＳＤＳトリシンゲルは、１レーン当たり０．５μｇの画分Ｃ及び５μｇのＥＭＤをローディングした。ウサギＳＫ３１８４で抗原コードＥＰＯ４２５４３（ペプチド＝ＳＹＧＹＥＰＭＧＷＬＨ、ＴＲＡＰのＣ末端に相当）に対して産生された抗体によるウエスタンブロット；１次抗体は１：５００に希釈し、２次抗体（抗ウサギビオチン複合体、SIGMA）は１：１，０００に希釈し、アビジンアルカリホスファターゼ複合体（SIGMA）は１：２０，０００に希釈した。
【０１４６】
従来のＲＴ−ＰＣＲ
他に記載されるように、従来のエンドポイント技術を使用した（Reseland, J. E. et al., “Leptin is expressed in and secreted from primary cultures of human osteoblasts and promotes bone mineralization”（「レプチンは初代培養のヒト骨芽細胞で発現され分泌されて、骨の石灰化を促進する」）. J Bone Miner Res 16, 1426-33 (2001)）。
【０１４７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
細胞は、５μｇ／ｍＬのペプチド又は画分Ｃ（それぞれ５０μｇ／ｍＬのＥＭＤ）で処理した後２４時間、４日及び７日間培養しメッセンジャーＲＮＡを磁気ビーズ（Dynal AS. Oslo, Norway）を使用して抽出し、ｃＤＮＡは細胞溶解物から製造業者の指示に従って合成した（iScript One-Step RT-PCR with SYBR Green, BIORAD）。リアルタイムＰＣＲは、製造業者のプロトコール（iCycler、BIORAD）に従って行っている。各反応は二つ組で実行し、結果は、少なくとも２人の独立した細胞ドナーの平均値を表わす。プライマー対は、表２に示した通りである:
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
Affymetrix遺伝子アレイ
初代骨芽細胞は、Ｔ７５培養フラスコで培養し、処理後２４時間、７２時間又は７日間培養し、それぞれ７ｍＬのトリゾル溶液（Gibco、USA）に溶解した。トリゾル溶解物は製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ分離及び更なるプロセッシングまで−７０℃に保った（Dep. of Medical Biochemistry, Oslo University, Norway）。２本鎖ｃＤＮＡ及びビオチン標識ｃＲＮＡプローブは、それぞれ５μｇの全ＲＮＡからSuperscript Choice system（Invitrogen）及びEnzo Bioarrayを用いて作成した。手順は、Affymetrixの推奨に従った。このｃＲＮＡを、２２，０００以上の転写物を表わすｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むＨＵ−１３３Ａチップ（Affymetrix）にハイブリダイズさせ、続いてGeneChips Fluidics Station 450（Affymetrix）上で、製造業者の指示に従って洗浄及び染色した。チップは、Affymetrix GeneArray（登録商標）2500スキャナー上で走査した。ＲＮＡ及びプローブの質は、α−アクチン及びＧＡＰＤＨについて、５'と３'ｍＲＮＡの比率を測定するAffymetrixに基づくテストによってコントロールし、非常に満足できることが分かった。データセットは、Affymetrix Mas 5.0ソフトウェアで処理し、それぞれの転写物の発現のレベルを表わす信号値を生じさせた。各手順は平行して２度行い、生じた値は、少なくとも２人のドナー細胞の二重の実験の平均を示す。
【０１５０】
これまで行なわれたAffymetrix実験:
１．レプチン−ＰＴＨ−ＥＭＤ
２．レプチン−ＰＴＨ−ＥＭＤ−画分Ｃ
３．ラットの組み換えアメリン−ＥＭＤ−画分Ｃ
【０１５１】
動物実験
１）ミニブタ実験：ＰＥＧゲル中の画分Ｃ
目的
下顎骨形成に対する画分Ｃの有効性を調査する研究。
３頭のミニブタ（２頭のブタは１２〜１８ヵ月齢、１頭の成体ブタは＞１８ヵ月齢）。
手術：下顎Ｑ３及びＱ４のフラップ、直径１０ｍｍの掘削腔（drilled cavities）。
処置：
・５個の欠陥：画分Ｃを浸み込ませたコラーゲンスポンジ で処置；
・３個の欠陥：Cekolバッファー中ＰＥＧ−アクリラートと混合したＰＥＧ−チオール中の画分Ｃで処置；
・ネガティブコントロールとしての２個の欠陥：ＰＢＳを浸み込ませたコラーゲンスポンジで処置；
・１個の欠陥：偽手術処置
４％のパラホルムアルデヒド（その場調製）中で２４時間固定。
脱灰化：０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０（その場調製）中で８〜１２週間。
１週間に２回バッファー交換。
組織学：約１２週後にその場ハイブリダイゼーション及び組織学のための切片化及び染色。
【０１５２】
３）ＡＭＯのラット頭蓋冠モデル
日付及び方法
１２／２００５で画分Ｃと組み合わせたＰＥＧ。下顎の直径２．３ｍｍの欠陥、１００μｇ画分Ｃ／ｍＬゲル、４頭の動物、動物１頭当たり２つの欠陥（それぞれの側に１個の欠陥）、回復中の２つの時点：１及び２週、組織学による評価。
１週間のグループ:
１）ＰＥＧ／画分Ｃ対ＰＥＧ／−
２）ＰＥＧ／画分Ｃ対コラーゲン／画分Ｃ
２週間のグループ:
３）ＰＥＧ／画分Ｃ対ＰＥＧ／−
４）ＰＥＧ／画分Ｃ対コラーゲン／−
【０１５３】
接着、増殖及び選択したタンパク質アッセイ
細胞接着
細胞は、２４ウェルプレートの１ｍＬの培地（ＭＤＭ培地＋１０％ＦＣＳ）に、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。各実験群についてｎ＝３であった。コントロールとして、ペプチドの添加なしで増殖させた細胞を使用した。個々のペプチドは、細胞播種の直後に最終濃度１０μｇ／ｍＬ培地に添加した。それぞれ４、８及び２４時間後に、培地を吸引し、ウェルを２×１ｍＬのＰＢＳですすぎ、細胞の層を０．２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液でトリプシン消化し、接着した細胞数をCellCounter, Chemometec A/Sを使用して計測した。
【０１５４】
細胞増殖
細胞は、５，０００細胞／ウェル／ｍＬ培地の密度で４８ウェルプレートに播種した。各実験群についてｎ＝３であった。コントロールとして、ペプチドの添加なしで増殖させた細胞を用いた。個々のペプチドは、細胞播種の直後に最終濃度１０μｇ／ｍＬ培地で添加した。（４）又は５日後（さもないと増殖期が過ぎてしまうので、ウェルをチェックし、コルフルエントでないことを確認した）、細胞を剥がし、細胞接着アッセイに関して計数した。
【０１５５】
ＡＰ活性、タンパク質含量及びＴＧＦ−β１のアッセイ
細胞は、５，０００細胞／ウェル／ｍＬ培地の密度で４８ウェルプレートに播種した。各実験群についてｎ＝３であった。コントロールとして、培地、培地を含んだ細胞、及び細胞のない培地中のペプチド（バックグラウンドの場合）を用いた。ペプチドは、細胞播種の直後に最終濃度１０μｇ／ｍＬ培地で添加した。５日後（細胞増殖研究に関して）に、各ウェルの培地をエッペンドルフチューブに移し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清は、アッセイが行なわれるまで−２０℃に保持した。細胞の層は、２×１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
異なる細胞層に０．５ｍＬのミリＱ水（milliQwater）を添加した後、曲げたピペットチップを使って細胞をかき取った。細胞懸濁液をエッペンドルフチューブ に移し、超音波水浴を使用して１０分間溶解し、そして１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞溶解物は、アッセイが行われるまで−２０℃に保持した。培地（最初の細胞播種時に含まれたペプチドを含む）の交換は、３日後に行った。
【０１５６】
ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ
培養上清中のタンパク質を測定するために、下記のキットアッセイを使用した：
【０１５７】
結果／考察
〔実施例１〕
ＥＭＤの画分を使った細胞実験
ａ）Ａ１／Ａ２（ＥＭＤの２０ｋＤａ画分）
図１：培養骨芽細胞（一人のドナー、ＮＨＯ−３）のＲＴ−ＰＣＲ。Ａ１は、以下の遺伝子産物の発現をＡ２よりも大幅に、７日後に最も顕著に刺激する：オステオカルシン及びレプチン。値は、α−チューブリンに対する各タンパク質の相対濃度を表わし、二つ組の実験からの１つの結果の平均として示される。
【０１５８】
図２：画分Ａ１及びＡ２で刺激した２つの骨肉腫細胞培養（ＳａＯＳ−２及びＨＯＳ）のＲＴ−ＰＣＲ。ＡＬＰとＯＣの発現は、特にＡ１による処理により増加した。Ｃｂｆａ−１及びＣＤ４４の発現に対してＡ１の作用は認められなかったのに対し、Ａ２で処理した後のＣＤ４４の発現は僅かに減少した。ｎ＝３、値はα−チューブリンに対する各タンパク質の相対濃度を表わし、２つの細胞株の結果からの混合平均±ＳＤとして示した。
【０１５９】
Ａ１／Ａ２遺伝子の発現の要約
Ａ１及びＡ２は、培養骨肉腫細胞に対して異なる作用を有した。Ａ１は、ＡＬＰ及びオステオカルシンの上方制御によって骨形成を刺激した。Ａ２は、ＥＬＩＳＡによる骨細胞マーカータンパク質分析で、ＣＤ４４の発現を減少させた。ＥＬＩＳＡで、ＩＬ−６分泌の増加がＡ２よりもＡ１でより強力であることが観察された（データは示していない）。ＩＬ−６は他の因子の作用に強く影響を与えることができる強力な炎症性因子であるので、ＩＬ−６の増加は注意深く考慮に入れなければならない。
【０１６０】
ｂ）画分Ｃ（ＥＭＤの５ｋＤａ画分)
Ｉ）画分ＣのＳＤＳ・ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
ＥＭＤ由来の画分Ｃをさらに特徴づけるために、ＳＤＳ・ＰＡＧＥとその後のウエスタンブロットを行った。画分Ｃは、主として約５ｋＤａのバンドとして示した（図３）。
【０１６１】
ＩＩ）Affymetrix遺伝子アレイ
初代骨芽細胞に及ぼすＰＴＨペプチド及びＥＭＤの作用を比較するために、２人のドナーの細胞を同調的に処理し、発現パターンはAffymetrix遺伝子チップ分析によって解析した。興味深いことに、ＥＭＤ及びＰＴＨの両者で、刺激後２４時間に２５４の遺伝子の発現が、未処理のコントロールから２倍以上同じ方向に変化した。さらに、ＥＭＤ及びＰＴＨによって、２倍もの量で反対に制御される遺伝子はなかった。統計解析により、ＰＴＨとＥＭＤの刺激の後の発現変化の間に正の相関があることを確認した（相関係数＝０．８０５；ｐ＜０．００１）。これらの遺伝子発現変化のサブセットは、Affymetrix分析で得られた結果を確認するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた（表３／図１７を参照)。
【０１６２】
ＥＭＤと対比した画分Ｃの作用の比較
ＥＭＤと対比して画分Ｃの作用を比較するために、１人のドナー由来の初代骨芽細胞（ＮＨＯ−３）を５ｋＤａ画分の画分Ｃで刺激し、結果をＥＭＤで処理した細胞と比較した。Ｌｏｇ２（刺激／コントロール）の値を、≧｜０．５｜の場合だけ≠０と見なした。
【０１６３】
ＥＭＤ及び画分Ｃの両者によって上方制御される遺伝子
・血小板由来増殖因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）：細胞増殖///血小板由来増殖因子、α受容体活性///ＡＴＰ結合///トランスフェラーゼ活性；細胞膜に不可欠。
【０１６４】
ＥＭＤ及び画分Ｃの両者によって下方制御される遺伝子
・フィブロネクチン１（ＦＮ１）：細胞運動///細胞接着///シグナル伝達；細胞接着分子活性細胞外マトリックス///細胞外スペース///可溶性画分///炎症反応経路。
【０１６５】
画分Ｃによって下方制御されるが、ＥＭＤによって制御されない遺伝子
・ＷＮＴ１誘導性のシグナル伝達経路タンパク質１：細胞増殖の制御///細胞接着///シグナル伝達///細胞間シグナリング///細胞増殖及び/又は維持。
・インテグリン、アルファＶ（ビトロネクチン受容体、アルファポリペプチド、抗原ＣＤ５１）：細胞−マトリックス間接着///インテグリン仲介シグナル伝達経路。
【０１６６】
ＥＭＤによって上方制御されるが、画分Ｃによって制御されない遺伝子
・ＭＭＰ−１４（マトリックスメタロプロテアーゼ１４）（膜内挿入された）：タンパク質分解及びペプチド分解。
・アクチン、アルファ２、平滑筋、大動脈（ＡＣＴＡ２）：筋肉発達；運動活動///細胞骨格の構造的成分///筋肉の構造的成分；横紋筋細フィラメント///アクチンフィラメント。
・アンジオポエチン１：血管新生///シグナル伝達。
・アグリカン１（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン１）：細胞接着///異好性細胞接着。
・ビンキュリン：細胞接着。
・象牙質シアロホスホタンパク質（ＤＳＰＰ）：細胞外マトリックス。
・ラミンＡ／Ｃ。
・トロンボスポンジン１：細胞運動///細胞接着///発達///神経発生///血液凝固。
【０１６７】
ＥＭＤによって上方制御されるが、画分Ｃによって下方制御される遺伝子
・ホリスタチン（ＦＳＴ）：発達///卵胞刺激ホルモン分泌の負の制御、アクチビン阻害剤の活性、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達経路。
・ウィングレスタイプＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）：シグナル伝達///フリッズルド−２シグナル伝達経路///細胞間シグナリング///発達///胚発生及び形態形成///可溶性画分；Ｗｎｔ−シグナリング。
【０１６８】
ＥＭＤによって下方制御されるが、画分Ｃによって制御されない遺伝子
・ＣＤ９７抗原：細胞運動///炎症反応///免疫応答///細胞接着///細胞表面受容体結合シグナル伝達///Ｇタンパク質共役受容体タンパク質シグナリング経路///細胞間シグナリング。
・トランスフォーミング増殖因子、β受容体ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）（ＴＧＦＢＲ２）：タンパク質アミノ酸リン酸化///膜貫通受容体タンパク質セリン／トレオニンキナーゼシグナル伝達経路///タイプＩＩ受容体に結合するＴＧＦβリガンド///細胞増殖の正の制御。
・ＦＧＦ２（繊維芽細胞増殖因子２（塩基性））：細胞周期の制御///
ＭＡＰＫの活性化///血管新生///走化性///シグナル伝達///ＲＡＳタンパク質シグナル伝達///細胞間シグナリング///組織発生及び器官形成///神経発生///筋肉発達///細胞増殖。
・ＣＤ１４抗原：食作用///アポトーシス///炎症反応///免疫応答///細胞表面受容体結合シグナル伝達。
・レプチン受容体:エネルギー保存代謝///細胞表面受容体結合シグナル伝達///発達。
・ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド２４。
【０１６９】
ｃ）従来の及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ並びにヒト骨芽細胞によるタンパク質の発現
表４ａ）：ＥＭＤから分離された単一の画分で処理した、ヒト脛骨及び大腿骨骨芽細胞の従来の及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、２人のドナーの二つ組の分析からの平均値を表わす。星印の付いた値は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、印のない値は従来のＲＴ−ＰＣＲによって生成されている。４ｂ）：ＥＭＤから単離された単一の画分で刺激した後の、培養培地中のタンパク質発現。値は、２人のドナーの二つ組の分析からの平均値を表わす。
【０１７０】
【表３】
2011525913.tif 000004
【０１７１】
ｄ）ヒト骨芽細胞（ＮＨＯ）又は間葉幹細胞（Ｃｆｕ−ｆ）によって分泌される因子のＥＬＩＳＡ分析
さらに、画分Ｃ及びＥＭＤで刺激されたＣｆｕ−ｆ細胞を用いた予備実験は、両者の薬剤が炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＬ−８の発現レベルを減少させる傾向を示した（ＥＬＩＳＡによるアッセイ、データは示されていない）。
【０１７２】
概論
ＥＭＤとは異なる画分のうちのいくつかは、生体外で種々の細胞に対して作用を発揮する。画分Ｃ及びＢ３に焦点を当てるのは、骨形成に関係する遺伝子及びタンパク質の発現で最も適切な修飾を示す実験に基づく。最初の動物実験の結果は、担体マトリックスとしてのコラーゲンと組合せの画分Ｃによる。コラーゲンの使用は、生体内に適用した場合に炎症を引き起こす可能性があるため異論のあるところだが、一方では、それは現在この種の適用のための特徴が最も明らかにされた担体である。
【０１７３】
結論
・Affymetrix遺伝子アレイからの最初の結果（ｎ＝１）は、一般にＥＭＤが骨芽細胞に対して画分Ｃよりも制御力があるように見えることを示した。このことは、可溶性ＲＡＮＫ及びＩＬ−６について初代骨芽細胞のＥＬＩＳＡ分析によって確認されたが、両者ともＥＭＤに曝露後に上方制御されたのに対して、画分Ｃはこれらの細胞にそのような変化を誘導しなかった（表５）。
【０１７４】
・しかしながら、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、初代ヒト骨芽細胞中のｃｂｆａ−１及び間葉幹細胞中のオステオカルシンの骨特異的上方制御を示したのに対し、ＥＭＤはこの作用を示さなかった（表４）。これは、それほど広範ではないが、ＥＭＤと比較して画分Ｃのむしろより大きな骨形成作用を示す。さらに、画分Ｃの炎症誘発の可能性は、ＥＭＤのそれと比較して区別されるように見える。
【０１７５】
〔実施例２〕
歯周靭帯（ＰＤＬ）細胞に対するＥＭＤの画分及び合成ペプチドの作用を評価するための生体外の研究
ＥＭＤ由来の画分（配列番号１、２，３又は４）に基づいた合成ペプチドの、細胞増殖、ＡＰの活性、並びにオステオカルシン（ＯＣ）及びＴＧＦ−βの発現に対する作用の検討。
【０１７６】
材料
・３人のドナー からプールした、ＰＤＬ（歯周靭帯）細胞。
・合成したペプチドは、１ｍｇ／ｍＬ、Ｈ2Ｏ中で保存。細胞に添加する前に、ペプチド溶液は０．２２μｍで濾過滅菌し、濃度はＡ２８０ｎｍのＵＶ吸収によって測定した。種々の濃度を、保存溶液を無菌の０．１％酢酸で希釈することにより調製した。
・凍結乾燥されたＥＭＤは、無菌の０．１％酢酸に溶解した。
【０１７７】
方法
ペプチド溶液は、１／５／２０／１００μｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加された。ＥＭＤ（ポジティブコントロール）は最終濃度１００μｇ／ｍＬで細胞に適用された。ネガティブコントロールとして、（ＥＭＤへの適用に）対応する体積の０．１％酢酸で細胞を処理した。
【０１７８】
細胞は、５，０００細胞／ウェル／ｍＬ培地の密度で２４ウェルプレートに播種し、パラレルプレート中刺激因子の存在下、１、２又は５日間培養した。５日間刺激の群は、２日後に培地を（刺激因子を含めて）交換した。
【０１７９】
ＡＰ活性（早期反応）は、標準のプロトコールに従って細胞溶解物で測定した。培養上清は、集め、ＴＧＦβ（早期反応）及びオステオカルシン（後期反応）の濃度を測定するまで−２０℃で凍結した。
【０１８０】
増殖速度は、ＭＴＴ細胞増殖アッセイによって評価した。
【０１８１】
各実験群は、ｎ＝３であった。
【０１８２】
〔実施例３〕
エナメル基質誘導体の５ｋＤａ成分は骨形成特性を有する
高速液体クロマトグラフィー によるＥＭＤの分析は、３つの主成分の存在を明らかにした：（１）２０ｋＤａタンパク質［画分Ａ］、（２）１２及び９ｋＤａの２つのタンパク質、並びに（３）５ｋＤａペプチド［画分Ｃ］。これらの成分のうちの２つ（画分Ａ及びＣ）は精製され特性が明らかにされている。画分Ａタンパク質は全長アメロゲニンタンパク質に相当し、画分Ｃはこのタンパク質のＮ末端部（３）である。本研究の目的は、骨芽細胞に対するこれらの２つのＥＭＤ成分の作用を検討することである。
【０１８３】
方法：
ＭＧ６３ヒト骨芽細胞様細胞及び正常ヒト骨芽細胞の集密培養は、ＥＭＤ、組み換えヒトアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）、画分Ａ（０．０１〜１００μｇ／ｍＬ）又は画分Ｃ（０．１〜２５０μｇ／ｍＬ）の在り又は無しで、２４時間処理した。ＤＮＡ含量及びアルカリホスファターゼ比活性（ＡＬＰ）に対する作用並びにオステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、血管内皮増殖因子 （ＶＥＧＦ−Ａ）及び線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）の馴化培地中のレベルに対する作用を測定した。
【０１８４】
結果:
画分Ｃは、ＭＧ６３細胞のＤＮＡ含量を用量依存的に減少させ、アルカリホスファターゼ及びオステオカルシンのような骨芽細胞分化マーカーを１０ｍｇ／ｍＬで最大に増加させた。ペプチドは、また、ＯＰＧ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦのような局所因子を用量依存的に増加させた。画分Ｃの作用は、画分Ａ、ＥＭＤ及びｒｈＡｍｅｌの作用に類似していた。さらに、正常ヒト骨芽細胞はＭＧ６３細胞と似た様式で反応した。図４を参照されたい。
【０１８５】
結論:
これらの結果は、エムドゲイン（Emdogain）の画分Ｃ成分が骨形成活性を有すること、及びアメロゲニンの骨形成作用はそのタンパク質のＮ末端領域による可能性があることを示した。
【０１８６】
〔実施例４〕
エナメル基質誘導体の５ｋＤａ成分は骨芽細胞の分化を誘導する
ＥＭＤ（エナメル基質誘導体）はアメロゲニンで富化されたタンパク質複合体で、これはStraumann Emdogain（登録商標）の生理活性部分に対応する。最近の公表された高速液体クロマトグラフィーによるＥＭＤの分析は、その３つの主成分の存在を明らかにした：（１）２０ｋＤａ、（２）［１２＋９］ｋＤａ、（３）５ｋＤａ。これらの成分のうちの２つ（２０ｋＤａ、５ｋＤａ）が精製されている：最初のもの（２０ｋＤａ）は全長アメロゲニンタンパク質に相当し、第２のもの（５ｋＤａ）はこのタンパク質のＮ末端部に相当することが疑われる。これらの２つの成分は、大腸菌中で過剰発現させた組み換えヒトアメロゲニン（ｒｈＡｍｅｌ）及びＥＭＤ複合体と比較して細胞培養でテストされている。
【０１８７】
材料及び方法
ヒト骨肉腫を起源として単離されたＭＧ６３骨芽細胞様細胞は、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から入手した。これらの細胞はよく特徴づけられ、１α、２５（ＯＨ）２Ｄ３に反応して、アルカリホスファターゼ活性及びオステオカルシン合成の亢進を含め、多数の骨芽細胞の形質を示す。さらに、ＭＧ６３細胞を使用した観察結果は、正常ヒト骨芽細胞、正常のマウス頭蓋冠骨芽細胞、胎児ラット頭蓋冠細胞及び他の骨芽細胞株を使用して確認されており、結果は動物及びヒトにおける臨床成績と相関する。
【０１８８】
ＭＧ６３細胞は、１０％の牛胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％のペニシリン及びトレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ2及び１００％湿
度の雰囲気で、３７℃で培養した。細胞は、１５，０００細胞／ウェルで播種し、培地は４８時間ごとに交換した。コンフルエンスで、異なる濃度の物質を培養液に添加した。本発明者らは、培養の日７に、２つの骨芽細胞分化の決定因子を使用した：細胞溶解物のアルカリホスファターゼ比活性［オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ、アルカリ；E.C.3.1.3.1］、及び細胞馴化培地のオステオカルシン含量。アルカリホスファターゼは分化の初期マーカーであり、石灰化が始まるにつれて最も高いレベルに達する。オステオカルシンは分化の後期マーカーであり、ミネラルが沈着するにつれて増加する。細胞溶解物は、計数した後遠心分離で集められた単離細胞を使用して調製した。酵素活性は、ｐＨ１０．２でパラニトロフェニルリン酸からのパラニトロフェノールの遊離を測定することによってアッセイし、結果は、細胞溶解物中のタンパク質含量に正規化した。馴化培地中のオステオカルシンのレベルは、市販のラジオイムノアッセイキット（Human Osteocalcin RIA Kit, Biomedical Technologies, Stoughton, MA）を用いて測定し、ＤＮＡ含量に正規化した。日７の培養からの馴化培地はまた、成長因子及びサイトカインについてアッセイした。オステオプロテゲリンは、酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キット（DY805 Osteoprotegerin DuoSet, R&D Systems,Minneapolis, MN）を用いて測定した。ＶＥＧＦは、ＥＬＩＳＡキット（RnD Systems）を使用して評価した。手短に言うと、１００μＬの馴化培地を予めコーティングしたプレートに加え、２時間インキュベートした。特異的検出抗体をプレートに加え、さらに２時間インキュベートした。サンプルの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取り、結果を標準曲線を使用して解析した。
【０１８９】
ＤＮＡ測定： 細胞は、０．５％のＴｒｉｔｉｏｎ−Ｘ１００中で超音波処理し、ＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡを測定するQuant-iT（商標）Pico Green（登録商標）kit（Invitrogen）を使用して測定した。ＤＮＡの量は、０．２〜２００ｎｇＤＮＡのＤＮＡ標準を用い、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０１９０】
〔実施例５〕
画分Ｃ（５ｋＤａ；Ｃ１ＲＰ又はＣ２ＲＰ）の活性化合物の同定
画分Ｃ（５ｋＤａ；Ｃ１ＲＰ又はＣ２ＲＰ）の活性化合物の同定。本発明者らは、様々な長さのアメロゲニン（エクソン１、３及び５）の合成のペプチドをテストした。
【０１９１】
ＷＢＲＡ００１：ＭＰＬＰＰＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＩＲＰＰ−ＯＨ（ＭＷ：３７３３．４ｇ／ｍｏｌ）；
ＷＢＲＡ００５：ＨＰＧＨＰＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＩＲＰＰ−ＯＨ（ＭＷ：３１９７．７ｇ／ｍｏｌ）；
ＷＢＲＡ００４：ＧＹＩＮＦＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＩＲＰＰ−ＯＨ（ＭＷ：２６７２．１ｇ／ｍｏｌ）；
ＷＢＲＡ００３：ＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＩＲＰＰ−ＯＨ（ＭＷ：２０７７．４ｇ／ｍｏｌ）；
ＷＢＲＡ００２：ＴＰＬＫＷＹＱＳＩＲＰＰ−ＯＨ（ＭＷ：１４８５．８ｇ／ｍｏｌ）。
【０１９２】
分子量５２５０．４ｇ／ｍｏｌを有する画分Ｃは、５μｇ／ｍＬ（０．９μｍｏｌ／Ｌ）の最終濃度で使用した。ペプチドは、画分Ｃと同じようなモル濃度で使用した。ＷＢＲＡ００１は、画分Ｃと同様にオステオカルシン及びＣＤ４４の発現及び分泌を増強したが、より小さなペプチドは骨芽細胞の骨マーカーに対して作用を有しなかった。
ＥＭＤバッチ３１１３から単離された５ｋＤａアメロゲニンは、Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰ（１〜４３及び１〜４５のＴＲＡＰ）の両者を含むが、それに対しＥＭＤバッチ９１２１から単離された画分Ｃは、Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰ（１〜４３及び１〜４５のＴＲＡＰ）だけでなく、更なる２つの未同定の小さなピークをも含んだ。骨マーカーの発現に対する種々のアイソフォームの作用は、骨芽細胞に対してテストした。
【０１９３】
レプチン、ＩＬ−６及びＯＰＧ分泌に対する作用は、Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰの混合したもの（３１１３）と画分Ｃは類似していた。混合したもの（３１１３）は、培地へのオステオカルシンの急性放出（＜２４時間）を誘導した（下図）。しかしながら、ｍＲＮＡ発現は＞３日のインキュベーション後に画分Ｃによって増加した。
【０１９４】
単離したＣ１ＲＰ及びＣ２ＲＰの画分は、画分Ｃ及びペプチドを混合したもの（３１１３）より高い培地中のＬＤＨ活性を誘導した。このわずかにより高い細胞に対する毒性の影響によって、これらの２つの精製された画分の間の作用における如何なる違いも見出すことは困難であった。結論；Ｃ１ＲＰとＣ２ＲＰの混合したもの（３１１３）は、骨芽細胞の初期分化を刺激することにおいて画分Ｃ単独より強力であった。後期では、画分Ｃは、オステオカルシン発現のより強力な誘導物質であった。
【０１９５】
〔実施例７〕
画分Ｃによる骨形成分化
図１５ａ、ｂ及びｃを参照されたい。
【０１９６】
骨形成細胞に対する画分Ｃの作用−石灰化結合組織
本明細書の文脈では  骨形成及びセメント質形成の両者は、石灰化組織として包含される。
【０１９７】
背景
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、主としてＩ型コラーゲンから成る。骨形成
細胞は、石灰化（ＥＣＭへのカルシウムの組み込み）に重要な役割をするアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を合成する。従って、ＡＬＰは、生体外の骨形成分化の初期マーカーとして使用される。ＡＬＰは、最初の数日内で増加し、石灰化（オステオカルシンの検出）が起こると減少する。
【０１９８】
ＭＧ−６３
培地：最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）＋１０％牛胎仔血清＋１％のペニシリン−ストレプトマイシン（×１００）＋１％の非必須アミノ酸溶液（×１００）＋１％のＬ−グルタミン（２００ｍＭ）。播種密度：４代継代したＭＧ６３細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で９６ウェル培養プレートに播種した。サンプリングは、生体外で２４時間後及び７日後に行なった。
【０１９９】
細胞の増殖と生存率
増殖能力を測定するために、本発明者らは、ブロモデオキシウリジンの測定、ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ組み込みに基づいた比色免疫定量法を使用した。１０μＬのＢｒｄＵ標識溶液（Roche, Penzberg, Germany）を細胞培養に添加し、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。標識及び定量化は、取扱説明書の記載に従って行った。吸光度は、６９０ｎｍの基準波長を用い、４５０ｎｍでVersaMax Microplate readerによって測定した。結果を、光学濃度（ＯＤ）として報告した。
【０２００】
その上、細胞の増殖と生存率を評価するために、増殖試薬ＷＳＴ−１テストを行った。ＷＳＴ−１溶液を、１：１０の最終溶液で単層培養に添加し、細胞をさらに３７℃で１時間インキュベートした。上清の吸光度は、６００ｎｍの基準波長を用い、４２０ｎｍ〜４８０ｎｍでVersaMax micro plate reader (Molecular Devices, California, USA)を用いて分光学的に測定した。結果を、光学濃度（ＯＤ）として報告した。
【０２０１】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の比活性
ＡＬＰ活性を測定するために、上清の酵素活性を、ｐ−ニトロフェニルホスファートからの経時的なｐ−ニトロフェノール（Sigma, St. Louis, MO, USA）の遊離として、４０５ｎｍでの分光光度法でアッセイした。ＭＧ６３細胞は、処理後日１及び日７に、ＰＢＳ及び０．０５％のTriton-X100で溶解した。ＡＬＰは、μＭ／分／ｍｇタンパク質として表した。
【０２０２】
条件:
１．画分Ｃ：        ＥＭＤの画分（１μｇ／ｍＬ）；
２．ｓＣ１ＲＰ−ｐ：合成；画分Ｃのピーク１；リン酸化（１μｇ／ｍＬ）；
３．ｓＣ１ＲＰ：    合成；画分Ｃのピーク１；非リン酸化（１μｇ／ｍＬ）；
４．ｓＣ２ＲＰ−Ｐ：合成；画分Ｃのピーク２；リン酸化（１μｇ／ｍ Ｌ）；
５．ｓＣ２ＲＰ：    合成；画分Ｃのピーク２；非リン酸化（１μｇ／ｍＬ）；
６．ｓＣ１ＲＰ−Ｐ＋ｓＣ２ＲＰ−Ｐ：組み合わせ；リン酸化（１μｇ／ｍ Ｌ）；
７．ｓＣ１ＲＰ＋ｓＣ２ＲＰ：     組み合わせ；非リン酸化（１μｇ／ｍ Ｌ）；
８．Ｃ１ＲＰ：      画分Ｃのピーク１（１μｇ／ｍＬ）；
９．Ｃ２ＲＰ：      画分Ｃのピーク２（１μｇ／ｍＬ）；
１０．Ｃ１ＲＰ＋Ｃ２ＲＰ：組み合わせ（１μｇ／ｍ Ｌ）；
１１．コントロール（１００μｇＥＭＤ）：ポジティブコントロール（１００μｇ／ｍＬ）；
１２．コントロール：  ネガティブコントロール；
１３．コントロール（１μｇＥＭＤ）：直接ポジティブコントロール（１μｇ／ｍ Ｌ）；
（ｓ：合成された；ＲＰ：逆相；Ｃ１：クロマトグラムの第１のピーク；Ｃ２：クロマトグラムの第２のピーク）；  本発明者らは、１つの実験をｎ＝５で行なった。
【０２０３】
培地交換とサンプリング：
培地は、日４に交換した（５０％）。
サンプリングは、日１（生体外で１日)及び日７（生体外で７日)に行った。
【０２０４】
結果:
細胞増殖アッセイ：
結果は、ＢｒｄＵ組み込みによるＯＤ値の上昇によって実証して、処理後の最初の２４時間以内に、増殖能力が始動されることを示した。７日後に、ＭＧ６３細胞の増殖活性は、コンフルエンス及びマトリックス成熟と共に低下した。
【０２０５】
画分Ｃ処理は、２４時間後に増殖活性の１０％の増加を引き起こした。最高２４％の増加が、合成Ｃ１ＲＰ及びＣ２ＲＰの組み合わせ物を添加した細胞で検出された。
【０２０６】
細胞生死判別アッセイ：
処理後２４時間の高い増殖能力に関して、ＭＧ６３細胞は７日後にミトコンドリア活性の増加を示した。研究は、ネガティブコントロール（処理しない単層培養物）と比較して、すべての成分によって細胞の生存率及び増殖が刺激されることを示した。合成ペプチドは、ＭＧ６３の増殖を４５％増加させるが、一方リン酸化はその作用を増強しないように見える。培養７日後の細胞の増殖と生存率に対して、画分Ｃ成分（Ｃ１ＲＰ、Ｃ２ＲＰ）の明確な作用があり、Ｃ１ＲＰ＋Ｃ２ＲＰの組み合わせ物は確かに生存率を増加させると結論付けることができる。
【０２０７】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の比活性:
アルカリホスファターゼは、生体外での骨形成成熟用の初期マーカーである。従って、議論は主として、処理後の日７よりはむしろ日１の結果に集中すべきである。ＡＬＰ活性は、石灰化が起こる７日後に典型的に減少する。データは、画分Ｃは、ネガティブコントロールと比較して、１日後にＡＬＰ活性を約１２５％増強するが、一方単一の成分（Ｃ１／Ｃ２ＲＰ）及び組み合わせ物は有意な作用を示さないことを示した。更に、合成ペプチドは、それらのリン酸化状態とは無関係に、ネガティブコントロールと同様、１日後に低いＡＬＰ活性を示した。両者のペプチドの組み合わせ物（ｓＣ１ＲＰ−Ｐ＋ｓＣ２ＲＰ−Ｐ）は、ＡＬＰ活性をわずかに抑制する作用があるように見え、これはペプチド相互作用に関して検討する必要がある。さらに、ポジティブコントロール（ＥＭＤ）は、ネガティブコントロールに対してＡＬＰ活性の減少を示したがこれは１００μｇ／ｍ ＬのＥＭＤの補充によっては示されていない（示されていない）。より高い濃度のＥＭＤは、１日後に、１．５倍のＡＬＰ活性（対ネガティブコントロール）の増加を示し、７日後もまだ増加していた（示されていない）。これはまた、増殖にはほとんど作用を示さないが分化には示した先の研究で、Boyanらによって実証されている。
【０２０８】
〔実施例８〕
種々のＥＭＤ画分に対するＰＤＬ細胞の接着
目標：種々のＥＭＤ画分に対するＰＤＬ細胞の接着を、細胞数の評価のためにＸＴＴアッセイを使用して検討する。
材料：
ＰＤＬミックス ｐ６、ＳＯＰ ＦＡＭ ２９２；
９６ウェル細胞懸濁用プレート；
コーティング緩衝液：炭酸緩衝液ｐＨ９．６；
ＸＴＴキット（Roche）。
配置：
２枚の９６ウェルプレート（４ウェル／条件）で:
１−  コントロール細胞；
２−  ＥＭＤ、２０μｇ／ウェル；
３−  画分Ａ、１．７μｇ／ウェル；
４−  画分Ａ、１７μｇ／ウェル；
５−  画分Ｂ、０．０８μｇ／ウェル；
６−  画分Ｂ、０．８μｇ／ウェル；
７−  画分Ｃ、０．２μｇ／ウェル；
８−  画分Ｃ、２μｇ／ウェル。
【０２０９】
方法：
１）表面コーティング
ＥＭＤ及び画分の溶液は、ＧＬＰ４９／３７のため予め重炭酸緩衝液で用意した。２００μＬの溶液を、各ウェル（ウェルに添加したタンパク質量は、ＧＬＰ４９／３７におけるよりウェル面積が５．５倍小さいので、約５倍少ない（１ｍＬの代わりに２００μＬ／ウェル））に注入した。インキュベーションは４℃で１夜行った。翌日、細胞を加える前に、プレートを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
【０２１０】
２）細胞播種
サブコンフルエンスのＰＤＬミックス細胞の１つのフラスコを、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを添加して２〜３分間インキュベートした。トリプシンは培地で中和し、細胞は遠心沈降させて計数した。細胞懸濁液を５０，０００細胞／ｍＬに調製し、２００μＬを各ウェルに添加した（１０，０００細胞／ウェル)。
【０２１１】
３）ＸＴＴアッセイ
４及び８時間インキュベーションした後に、浮遊する細胞を２００μＬのＰＢＳで２回洗浄して除去した。ウェルを１５０μＬの標準培地で再充填し、７５μＬのＸＴＴミックスを各ウェルに添加した。１５０μＬの培地を含む１つ余分な列に、７５μＬのＸＴＴミックスを添加し、ブランクとして使用した。細胞を２時間インキュベートした後、６５０ｎｍの基準波長を使い４８０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２１２】
結果：
ＧＬＰ５９／０３と比較して、この実験のＰＤＬミックス細胞は、コーティングのないプレートにより迅速に接着した。コーティングのない条件で４時間のインキュベーション後に、著しい数の細胞が広がりを示した（ＧＬＰ５９／０３は、最大で８時間までのインキュベーション後でも、細胞はコーティングしないウェル内で円形のままであった）。図１６を参照されたい。
【０２１３】
結論：
結果は、ＧＬＰ４９／３７で得たものと非常に類似したパターンを示した。しかしながら、コントロールと種々の画分又はＥＭＤとの違いは大きくはなく（１つの条件だけが、コントロールと著しく異なっていた）、ＸＴＴキットを用いた細胞数の評価があまり感受性ではないことを示唆した。別の説明は、ＰＤＬ細胞の非特異的接着が、２４ウェルプレートより９６ウェルプレートで高く、効果を減少させたことである（備考を参照）。
【０２１４】
参考文献のリスト
１．Kawase, T. et al., “Enamel matrix derivative (EMDOGAIN) rapidly stimulates phosphorylation of the MAP kinase family and nuclear accumulation of smad2 in both oral epithelial and fibroblastic human cells”（「エナメル基質誘導体（ＥＭＤＯＧＡＩＮ）は、ヒト口腔上皮細胞及び線維芽細胞の両者におけるＭＡＰキナーゼファミリーのリン酸化及びｓｍａｄ２の核内蓄積を迅速に促進する」）, J Periodontal Res 36, 367-76 (2001).
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blocks enamel matrix derivative-induced upregulation of p21WAF1/cip1 and prevents its inhibition of human oral epithelial cell proliferation”（「抗ＴＧＦ−β抗体は、エナメル基質誘導体によって誘導されるｐ２１ＷＡＦ１／ｃｉｐ１の上方調節をブロックし、そのヒト口腔上皮細胞の増殖阻害を防止する」）, J Periodontal Res 37, 255-62 (2002).
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１０．Gestrelius, S., Andersson, C., Lidstrom, D., Hammarstrom, L. & Somerman,
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１１．Reseland, J. E. et al., “Leptin is expressed in and secreted from primary cultures of human osteoblasts and promotes bone mineralization”（「レプチンは初代培養のヒト骨芽細胞で発現され分泌されて、骨の石灰化を促進する」）, J Bone Miner Res 16, 1426-33 (2001).
１２．Li, W. et al., “X-linked amelogenesis imperfecta may result from decreased formation of tyrosine rich amelogenin peptide (TRAP)”（「Ｘ染色体−連鎖のエナメル質形成不全症は、チロシンリッチアメロゲニンペプチド（ＴＲＡＰ）の形成低下から生じる可能性がある」）, Archives of Oral Biology (2003) 48, 177-183.
１３．Fincham, A.G. et al., “Human Amelogenins: Sequences of ”TRAP” Molecules”（「ヒトアメロゲニン：「ＴＲＡＰ」分子の配列」）, Calcified Tissue International (1989) 45:243-250.
１４．Mumulidu, A. et al., “Purification of a 5kDa component of the enamel matrix derivative”（「エナメル基質誘導体の５ｋＤａ成分の精製」）, Journal of Chromatography B, 857 (2007) 210-218.
１５．国際特許公開第０３／０２４４７９号
１６．米国特許第４，６７２，０３２号 
１７．ＥＰ−Ｂ−０３３７９６７号 
１８．ＥＰ−Ｂ−０２６３０８６号
１９．欧州特許第１０５９９３４号 
２０．欧州特許第０１２０１９１５．４号
２１．国際特許公開第０１／９７８３４号
２２．国際特許公開第００／５３１９７号
２３．国際特許公開第００／５３１９６号
２４．国際特許公開第０２／０８０９９４号
２５．Dayhoff, Schwartz, and Orcutt (1978) Atlas Protein Seq. Struc. 5:345-352
２６．Henikoff and Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(22):10915-9
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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