(57)【要約】一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含めることにより、環状ＤＮＡ分子および線状ＤＮＡ分子の混合物中で環状ＤＮＡ分子が優先的に増幅される方法を開示する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、核酸増幅の方法。
【請求項２】
核酸増幅がローリングサークル増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼがＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉ、サーマス・サーモフィルスまたはＴ７から得たものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸がミトコンドリアＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示される方法は、より高い純度を有する望ましい産物を提供するためのＤＮＡ増幅の向上した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の増幅を可能にするいくつかの有用な方法が開発されてきた。ほとんどは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼによる増幅を含む選択されたＤＮＡ標的および／またはプローブの増幅を中心にして設計された(Birkenmeyer and Mushahwar, J Virological Methods, 35:117-126 (1991)；Landegren, Trends Genetics, 9:199-202 (1993))。加えて、いくつかの方法が、環状ＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはＭ１３のようなバクテリオファージからのＤＮＡを増幅するために用いられてきた。ある適用は、適切な宿主細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉの株中でのこれらの分子の増殖、続いて十分に確立されたプロトコルによるそのＤＮＡの単離であった(Sambrook, J., Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)。ＰＣＲも、ＤＮＡ標的、例えばプラスミドおよびＭ１３のようなバクテリオファージからのＤＮＡ中の定められた配列を増幅するために頻繁に用いられてきた方法である。これらの方法のいくつかは、忍耐を要すること、費用がかかること、時間がかかること、非効率的であること、および感度が足りないことで悩まされる。それらは増幅される配列についての特定の知識を必要とする可能性もある。
【０００３】
これらの方法における向上として、線形ローリングサークル増幅（ｌｉｎｅａｒ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＲＣＡ）は、環状の標的ＤＮＡ分子にアニールしたプライマーを用い、ＤＮＡポリメラーゼを添加する。増幅標的の環（ＡＴＣ）が鋳型を形成し、その上で新しいＤＮＡが作られ、それによりプライマー配列をその環に相補的な繰り返し配列の連続した配列として伸長するが、１時間あたり約数千コピーしか生成しない。ＬＲＣＡにおけるある向上は、複製された相補的配列にアニールして新しい増幅の中心を与え、それにより指数的速度論および増大した増幅をもたらす追加のプライマーを用いる指数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用である。指数的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は鎖置換反応のカスケードを用い、ＨＲＣＡとも呼ばれる(Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, 19, 225-231 (1998))。
【０００４】
米国特許第６，３２３，００９号において、標的ＤＮＡ分子を増幅する手段が紹介されている。この方法は、その増幅されたＤＮＡが、ＤＮＡ配列決定、クローニング、マッピング、遺伝子型同定、ハイブリダイゼーション実験のためのプローブの生成、および診断的同定を含むその後の方法において頻繁に用いられるため、価値がある。
【０００５】
米国特許第６，３２３，００９号の方法（本明細書において、多重開始増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｉｍｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）−ＭＰＡと呼ぶ）は、線形ローリングサークル増幅の感度を、個々の標的環の増幅のために多数のプライマーを用いることにより向上させる。ＭＰＡ法は、それぞれの環状標的ＤＮＡ分子から多数のタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）コピーを生成する利点を有する。加えて、ＭＰＡは、ある場合において、環状標的ＤＮＡ分子の配列が未知であってよく、一方で環状標的ＤＮＡ分子が一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡもしくは二重鎖ＤＮＡ）であってよい利点を有する。ＭＰＡ法の別の利点は、一本鎖または二本鎖の環状標的ＤＮＡ分子の増幅が等温で、および／または周囲温度で実行されてよいことである。他の利点には、ローリングサークル増幅の新しい適用において非常に有用であること、コストが低いこと、低濃度の標的環に対する感度、特に検出試薬の使用における柔軟性、および混入の危険性が低いことが含まれる。
【０００６】
ＭＰＡ法は、増幅された産物ＤＮＡの収量において、その反応中に存在する可能性があるエキソヌクレアーゼ活性による分解に耐性がある複数のプライマーを用いることにより向上することができる。これはエキソヌクレアーゼ活性を含む反応においてそれらのプライマーが残存することを可能にし、それを長いインキュベート期間の間実行することができる利点を有する。プライマーの残存は反応のインキュベート時間全体で新しいプライミング事象が起こることを可能にし、それはＥＲＣＡの特質の１つであり、増幅されたＤＮＡの収量を増大する利点を有する。
【０００７】
ＭＰＡ法は環の中に封入された既知または未知の標的ＤＮＡの”インビトロクローニング”を初めて可能にし、すなわち生物の中にクローニングする必要が無い。パッドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブを用いて標的配列をコピーしてギャップ補充法（ｆｉｌｌ−ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により環にすることができる(Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, 19,225-231 (1998))。あるいは、多くの他の一般的に用いられる方法により標的配列を環状ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの中にコピーまたは挿入することができる。ＭＰＡ増幅は、細菌宿主細胞のような生物におけるクローニングにより増幅された収量のＤＮＡを生成する必要性を克服する。
【０００８】
ＭＰＡ法は、増大された合成速度および収量を可能にする点でＬＲＣＡを超える向上である。これは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための複数のプライマー部位の結果としてもたらされる。ランダムプライマーＭＰＡは、二本鎖の産物を生成するという利益も有する。これは、環状の鋳型のコピーにより生成された線状ｓｓＤＮＡ産物がそれ自体ＤＮＡ合成のランダムプライミングにより二重鎖の形に変換されると考えられるためである。二本鎖ＤＮＡ産物は、どちらの鎖のＤＮＡ配列決定も可能になる点ならびに制限エンドヌクレアーゼによる消化ならびにクローニング、標識、および検出において用いられる他の方法が可能になる点で好都合である。
【０００９】
鎖置換ＤＮＡ合成がＭＰＡ法の間に起こり、結果として指数的増幅がもたらされる可能性があることも期待される。これは非常に大きい線状または環状ＤＮＡ標的を指数的に増幅する能力を可能にする点で従来のＥＲＣＡを超える向上であり、ＨＲＣＡとも呼ばれる(Lizardi et al. (1998))。バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）などの大きい環状ＤＮＡの増幅は、ＭＰＡ法を用いることで具体化されてきた。
【００１０】
縮重プライマー(Cheung, V. G. and Nelson, S. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14676-14679 (1996)およびランダムプライマー(Zhang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5847-5851 (1992)を用いる全ゲノム増幅に関する方法が公開されており、そこでは標的の複雑な混合物、例えばゲノムＤＮＡのサブセットが増幅される。複雑さの低減がこれらの方法の目的である。ＭＰＡ法のさらなる利点は、それがＤＮＡ標的の”サブセッティング”またはその複雑さの低減を必要とすること無くＤＮＡ標的分子を増幅することである。
【００１１】
ＭＰＡ法はそれと共に用いられるＤＮＡの試料内の全ての配列を迅速に増幅し、その二本鎖の産物は元の試料と同じ全ての配列を有する。それが非常に多くの開始（プライミング）部位を有するＤＮＡのタンデムに繰り返されたコピーを含むという事実を除き、産物ＤＮＡの物理的特性は開始時の鋳型の物理的特性と非常によく似ている。
【００１２】
長い、線状および環状ＤＮＡの混合物がＭＰＡのために与えられた場合、両方の形の内部の配列が増幅されることが分かっている。しかし、細菌および他の宿主内で増殖したクローン化されたＤＮＡの大部分は、プラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、フォスミド（ｆｏｓｍｉｄｓ）、コスミド（ｃｏｓｍｉｄｓ）、特定のバクテリオファージクローン、例えばＭ１３クローンおよび他のものにおいて見られるＤＮＡのように環状である。さらなる分析のために、宿主細胞の配列から分離したクローン配列を単離しようとするのが一般的である。宿主細胞の染色体はＢＡＣクローンよりも遥かに大きく、ほぼ常に環状染色体の壊れた線状断片として単離されることを特筆すべきである。
【００１３】
従って、ＰＣＲの制限が無く、長い線状の形よりも環状の形のＤＮＡの増幅に有利に働く増幅法の必要性がある。これらの関心事に下記でより詳細に取り組む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，３２３，００９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Birkenmeyer and Mushahwar, J Virological Methods, 35:117-126 (1991)
【非特許文献２】Landegren, Trends Genetics, 9:199-202 (1993)
【非特許文献３】Sambrook, J., Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
【非特許文献４】Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, 19, 225-231 (1998)
【非特許文献５】Cheung, V. G. and Nelson, S. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14676-14679 (1996)
【非特許文献６】Zhang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5847-5851 (1992)
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在が所望の増幅産物の純度および収量を向上させる、核酸増幅の新規の方法を開示する。その方法は、特に環状ＤＮＡ分子、特にミトコンドリアＤＮＡに適用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼはいくつかの増幅法において有用であることが示されている。これらはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）および多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）を含む。ＲＣＡは環状ＤＮＡ分子、例えばプラスミドを増幅するのに特に有用であり、ＭＤＡは線状ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを増幅するために用いることができる。しかし、出発物質が環状ＤＮＡおよび線状ＤＮＡ分子の両方を含む場合、ＲＣＡおよびＭＤＡは、一方がより低い程度までである可能性があるとしても、共に両方のタイプの分子を増幅するであろう。いずれにせよ、増幅反応の終了時には、産物は環状および線状ＤＮＡ分子の両方で構成されるであろう。
【００１８】
驚いたことに、環状および線状ＤＮＡ分子の両方を含む反応混合物中にＳＳＢを含めることが、ＲＣＡを用いた環状ＤＮＡ増幅産物の収量の大きな増大につながることが分かった。これは、ゲノムの染色体のＤＮＡも含む試料中の環状ミトコンドリアＤＮＡの増幅に特に有用であった。この試料は細胞抽出物から得ることができる。他の環状ＤＮＡ分子、例えばウイルスのＤＮＡが、ＳＳＢが増幅反応混合物中に存在する場合にゲノムの染色体のＤＮＡよりも選択的に増幅されている。環状ミトコンドリアＤＮＡおよび線状ゲノムＤＮＡ両方を含むＤＮＡの出発試料を、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムヘキサマープライマー、ｄＮＴＰ類および緩衝液を含むＧＥＨＣ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットを用いて、ＳＳＢを添加せずに増幅した場合、ミトコンドリアＤＮＡの富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は無かったことが分かった。しかし、１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢまたはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＴｔｈ２５５−ＳＳＢのどちらかが反応混合物中に存在した場合、ミトコンドリアＤＮＡの含有量はゲノムの染色体のＤＮＡと比較して７０〜８０倍も増大した。Ｔ７からのＳＳＢ結合タンパク質（Ｔ７  Ｇｐ２  ３：１）も、増幅された産物中のミトコンドリアの環状ＤＮＡの含有量を増大するのを特異的に助けることが示された。ＳＳＢを反応混合物あたり５０〜１０００ｎｇの範囲で用いた場合に、増幅された産物中に増大したミトコンドリアの環状ＤＮＡが存在していた。反応物は３０℃で１６時間インキュベートした。好ましくは、環状ＤＮＡにニックが入るのを減らすため、出発ＤＮＡ試料は熱変性するべきでは無く、それは環状標的ＤＮＡのＲＣＡのために重要である。
【００１９】
増幅反応の産物は、ミトコンドリアＤＮＡに関する特異的な順方向および逆方向プライマーを用いて直接配列決定することができる。単一の容器（ｔｕｂ）の試料調製物中でミトコンドリアＤＮＡをより容易に生成する能力は、癌、先天性および代謝性疾患に関してミトコンドリアゲノム中の変異に基づいてバイオマーカーを決定するために重要である。
【００２０】
増幅反応がＳＳＢおよびランダムヘキサマーの代わりにミトコンドリア配列特異的プライマーの存在下で行われた場合、ミトコンドリアＤＮＡの１５００倍までの富化も観察された。Ｔｔｈ２５５−ＳＳＢは最高の富化を与えたが、一方でＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢはその富化の約半分しかもたらさなかった。
【００２１】
増幅プロトコル：おおよそ１０〜２０ｐｇのｍｔＤＮＡ（０．１〜０．２％）を含む１０ｎｇのヒトｇＤＮＡを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および３μＭのそれぞれの特異的なプライマーを含む９μｌの試料緩衝液と混合した。それに９μｌの  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  １００反応緩衝液および１０ｎｇのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼおよび１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢまたは１７５ｎｇのＴｔｈ−２２５  ＳＳＢを添加した。増幅は３０℃で８時間（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢが用いられる場合）または１６時間（Ｔｔｈ−２２５  ＳＳＢが用いられる場合）実施した。６５℃で２０分間の酵素の熱不活性化により増幅を停止した。それが適切である場合、その特定のプライマーは適切な量のランダムヘキサマープライマーで置き換えることができる。
【００２２】
報告した結果はＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、関連するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｈｉ１５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ２００６／０７３８９２）を用いても類似の結果が期待できるであろう。これらの酵素はＰｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼとして定義されている。そのＤＮＡポリメラーゼは長い増幅産物を産生する特性を有しており、鎖置換活性を有する。これらの特性を有するあらゆるＤＮＡポリメラーゼは開示した方法において用いることができ、この開示内に含まれることを意図する。
【００２３】
記述した方法は、環状ウイルスゲノムの研究に適用することもできる。これはそれに関する一部の配列、例えばそのファミリーに関する保存されたモチーフが既知である可能性がある新規ＤＮＡウイルスの発見を含むことができる。
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月21日(2011.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む反応系と、環状ＤＮＡおよび線状ＤＮＡを含む混合物とをインキュベートすることによって、該混合物から環状ＤＮＡを優先的に増幅するための方法。
【請求項２】
核酸増幅がローリングサークル増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐｈｉ２９型ＤＮＡポリメラーゼがＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉ、サーマス・サーモフィルスまたはＴ７から得たものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該環状ＤＮＡがミトコンドリアＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
2011520460.tif 000002
2011520460.tif 000003
2011520460.tif 000004
2011520460.tif 000005