(57)【要約】  本特許は、ホモ接合体およびヘテロ接合体のβ蛋白質の位置２の点状の変異Ａｌａ＞Ｖａｌ（７７０アミノ酸を含むβ蛋白質のＡｌａ６７３Ｖａｌ変異前駆体に対応する）に基づき、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を現すヒトおよび／または動物の病理の危険性を判定するべく、ヒトおよび／または動物の臓器から切り離された生体材料に対して行われるスクリーニング方法に関する。特許は、（１）Ａｌａ６７３Ｖａｌ変異を表す単細胞または多細胞の遺伝子組み換え臓器の生成、（２）この変異を有するペプチドおよび／またはその派生物および／またはこの変異を含む核酸の合成または製造、および、（３）この生成物の、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の異常堆積を特徴とする病理の病因の研究、予防、診断、および処置への利用の可能性を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＰ７７０（ＮＭ＿０００４８４．２）のアイソフォームのヌクレオチド２２１２（ｃ．２２１２Ｃ＞Ｔ遷移）に対応するヒトのＡＰＰ遺伝子（Ｄ８７６７５）の配列コーディングのコドン６７３におけるチミジンをもつシトシンの、ホモ接合型またはヘテロ接合型の置き換えに関する研究に基づいて、Ａβの任意のアイソフォームにより形成されるβアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の異常堆積を特徴とする病理の危険性を判断するべく、ヒトの生物材料に行われるスクリーニング方法であって、変異では、Ａβの位置２に相当するＡＰＰ７７０の残基６７３において、または、ＡＰＰの他のアイソフォームの類似する残基においてアラニンがバリンに置き換わるスクリーニング方法。
【請求項２】
ＡＰＰ７７０の点１の後の変異またはコドン６７３に他の変異を有する前記ヒトのＡＰＰの様々なアイソフォームの遺伝子によるコーディングにより転写されるメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の研究に基づき行われる請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ａβの位置２またはＡＰＰ７７０のコドン６７３に他の変異に対応する、Ala673Val変異を含む蛋白質ＡＰＰおよび／またはそのアイソフォームの研究に基づき行われる請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、生物材料およびその配列から切り離す段階を備える請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡの非アイソフォームの分析による前記変異の前記研究に基づき行われる請求項１から４のうち一項以上に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記変異の前記研究は、制限酵素を用いた分析、および／または、ＤＨＰＬＣ（変性高パフォーマンス液体クロマトグラフィ）、および／または、ＳＳＣＰ（シングル・ストランド・コンフォメーション・ポリモルフィズム）、および／または、インサイチュー交配により行われる請求項１から５のうち一項以上に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡは、患者の血液の白血球から得られた請求項１から６のうち一項以上に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記病理のいずれか一つは、典型的な形態のＡＤである、または、異型の表現型で表現される請求項１から７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
内因性ではないプロモータの制御下において、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを有するヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームを備える構造。
【請求項１０】
プロモータThy1.1またはThy1.2の制御下において、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを有するヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントを備える請求項９に記載の構造。
【請求項１１】
サイトメガロウイルス（Pcmv）のプロモータの制御下において、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを有するヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントを備える請求項９に記載の構造。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか一項に記載の前記構造ともに安定して、または遷移するようにトランスフェクションされることを特徴とする細胞株。
【請求項１３】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを含む、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型またはヘテロ接合型で備える、非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１４】
Ala673Val（APP673v）変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型（遺伝子型APP673v/APP673v）またはヘミ接合型（遺伝子型APP0/APP673v）またはヘテロ接合型（遺伝子型APP673A/APP673v）で備える、非ヒト内因性ＡＰＰ用のノックアウトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１５】
Ala673Val変異（またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメント）が他の変異と関連している場合の、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型、ヘミ接合型、またはヘテロ接合型で備える請求項１３または１４に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１６】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントが、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）の遺伝子コーディングの変異と関連している場合の、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型、ヘミ接合型、またはヘテロ接合型で備える、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１７】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントが、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）の遺伝子コーディングの変異と関連している場合の、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型、ヘミ接合型、またはヘテロ接合型で備える、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１８】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントが、タウ蛋白質（ＭＡＰＴ）の遺伝子コーディングの変異と関連している場合の、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型、ヘミ接合型、またはヘテロ接合型で備える、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項１９】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントが、遺伝子ＰＳＥＮ１および／またはＰＳＥＮ２および／またはＭＡＰＴの変異の組み合わせと関連している場合の、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントの異なるアイソフォームのコードのためのＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、ホモ接合型、ヘミ接合型、またはヘテロ接合型で備える、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項２０】
内因性プロモータの制御下において、内因性のＡＰＰが、ヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントによるホモログ組み換えにより、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントで置き換わるノックアウトである請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項２１】
齧歯動物である請求項１３から２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項２２】
任意の株のマウスである請求項１３から２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項２３】
トランスジェニック動物であって、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを有するヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントを表す任意の動物の臓器であり、シノラブディス・エレガンス、キイロショウジョウバエ, ゼブラフィッシュ等の請求項１３から２０のいずれか一項に記載の遺伝子型の特徴を備えるトランスジェニック哺乳類動物。
【請求項２４】
遺伝子組み換えされた臓器であって、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異またはそのフラグメントを有するヒトのＡＰＰまたはそのフラグメントを表す任意の真核微生物または原核微生物であり、大腸菌、イースト、糸状菌等の細菌である請求項１３から２０のいずれか一項に記載の遺伝子型の特徴を備える遺伝子組み換えされた臓器。
【請求項２５】
メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはそのフラグメントであって、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異を有するヒトのＡＰＰのＤＮＡコーディングに対応する（「ポジティブな意味での」ｍＲＮＡ）または相補性（「ネガティブな意味での」ｍＲＮＡ）のヌクレオチド配列を備えるメッセンジャＲＮＡまたはそのフラグメント。
【請求項２６】
全ての可能性ある用途においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている技術分野での請求項２５に記載のＲＮＡまたはそのフラグメントの利用。
【請求項２７】
ヒトおよび／または動物の臓器および組織におけるＡβの任意のアイソフォームから形成されたβアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の異常堆積を表すヒトおよび／または動物の病理の診断、予防、および／または、処置における請求項２５または２６に記載のＲＮＡまたはそのフラグメントの利用。
【請求項２８】
前記病理のいずれか一つは、典型的または非典型的な表現型のＡＤの散発的または遺伝的な型で表される請求項２７に記載の物質の利用。
【請求項２９】
Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異を備えるヒトのＡＰＰのアイソフォーム。
【請求項３０】
Ｎ末端が切断されたもの、および／または、Ｃ末端が拡張されたものを含むＡβのアイソフォーム全てを備え、Ala673Val変異またはＡＰＰ７７０のコドン６７３における他の変異を備えるヒトのＡＰＰのフラグメント。
【請求項３１】
Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-40およびAβ1-42のＮが切断された形態、およびAβ1-40およびAβ1-42のＣ末端が拡張された形態、またはそれらの部分配列で表される請求項３０に記載のヒトのＡＰＰのフラグメント。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載のヒトのＡＰＰのフラグメントに類似した合成ペプチド。
【請求項３３】
右旋性形態の少なくとも１つのアミノ酸残基を備える請求項３０から３２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３４】
任意の種類の化学基との結合により変質させられる１以上のアミノ酸残基を備える請求項３０から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３５】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置用に設計される薬物の準備用の、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の擬晶化学構造（minetic chemical structure）、非蛋白質、または部分的な蛋白質。
【請求項３６】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置に有用な機能を実行する特定のサイトへ物質を搬送するキャリアとして機能する分子と接合する請求項３０から３５のいずれか一項に記載の物質。
【請求項３７】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置用に設計される薬物の準備における請求項３０から３６のいずれか一項に記載の物質の利用。
【請求項３８】
前記病理のいずれか１つは、典型的または非典型的な表現型のＡＤの散発的または遺伝的な型で表される請求項３７に記載の物質の利用。
【請求項３９】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置に有用な機能を実行する特定のサイトへ任意の種類の化学化合物を搬送するキャリアである請求項３０から３６のいずれか一項に記載の物質の利用。
【請求項４０】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の疾病の病因の研究における請求項２５、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の物質の利用。
【請求項４１】
前記病理のいずれか１つは、典型的または非典型的な表現型のＡＤの散発的または遺伝的な型で表される請求項４０に記載の物質の利用。
【請求項４２】
請求項２９から３４のいずれか一項に記載の蛋白質および／またはペプチドに対するポリクローナル抗体。
【請求項４３】
請求項２９から３４のいずれか一項に記載の蛋白質および／またはペプチドに対するモノクローナル抗体またはそのフラグメント（単鎖抗体、ナノボディ）。
【請求項４４】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置用の薬物の調合における請求項４２または４３に記載の抗体の利用。
【請求項４５】
前記病理のいずれか一つは、典型的または非典型的な表現型のＡＤの散発的または遺伝的な型で表現される、請求項４４に記載の蛋白質および／またはペプチドに対する抗体の利用。
【請求項４６】
βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の体細胞遺伝子療法における請求項９から１１のいずれか一項に記載の構造の利用。
【請求項４７】
請求項４６に記載の体細胞療法は、キャリアベクター、天然または合成の脂質またはポリマーを利用して行われる請求項９から１１のいずれか一項に記載の構造の利用。
【請求項４８】
請求項４６に記載の前記体細胞遺伝子療法は、生物剤をベクターとして利用して行われる請求項９から１１のいずれか一項に記載の構造の利用。
【請求項４９】
請求項４６に記載の前記体細胞遺伝子療法は、ウイルス性因子をベクター（アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ＳＶ４０、レトロウィルス等）として利用して行われる請求項４８に記載の構造の利用。
【請求項５０】
請求項３７または３８に記載の病理に犯されているヒトの自己細胞のトランスフェクションを、前記病理の細胞療法で利用する請求項９から１１のいずれか一項に記載の構造の利用。
【請求項５１】
請求項３７または３８に記載の病理の細胞療法で、異種のまたは相同（xenologous）の細胞のトランスフェクションを利用する請求項９から１１のいずれか一項に記載の構造の利用。
【請求項５２】
請求項１２に記載の細胞、および、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされた臓器の、請求項３７または３８に記載の病理の病因の研究、および診断、予防、および処置のモデルとしての利用。
【請求項５３】
請求項１２に記載の細胞、および、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされた臓器の、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の蛋白質および／またはペプチド生成への利用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アルツハイマー病は、高齢者に最も一般的な認知症である。臨床的には認知機能の進行性退化で特徴付けられ、神経病理学的には、βアミロイド（Ａβ）およびタウ蛋白質の不溶解凝集物が大脳皮質および皮質下灰白質に蓄積することを特徴とする変性疾患である。Ａβは、神経網（老人斑）および脳血管（コンゴーレッド親和性血管障害）に細胞外アミロイドの形状で堆積し、タウ形状の蛋白質は、異常ニューロン内フィラメント（神経原線維変性）の形状で形成される（Love S.認知症の神経病理学的研究: 神経学者への手引き書. J Neurol Neurosurg Psychiatry 76, 補足5:v8-14, 2005）（図１）。
【０００２】
アルツハイマー病の９５パーセントのケースは散発性であるが、うち約５パーセントが家族性を有し、染色体１４上のプレセニリン（ＰＳＮＥ１）、染色体１上のプレセニリン（ＰＳＥＮ２）、染色体２１上のβアミロイド（ＡＰＰ）の前駆体という、３つの遺伝子の突然変異と関連付けられる。これらのケースのアルツハイマー病は、散発的な形態よりも早期に発症して、常染色体優性型メカニズムにより高い浸透率で遺伝される。
【０００３】
ＡＤのｅｔｈｉｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓは完全に理解されるに至っていないが、ここ１０年の間に普及している仮説に、「アミロイドカスケード仮説」というものがあり（Wilquet et al. 神経変性におけるアミロイドβ前駆体蛋白質プロセシング. Curr Opin Neurobiol 14:582-8, 2004; Lee et al. アミロイドβカスケード仮説の概説、J Alzheimers Dis 6:137-45, 2004）、この仮説によると、家族性（ＦＡＤ）および散発性両方においてＡβが中心的な役割を果たしている、ということである。
【０００４】
Ａβは、「アミロイド生成経路」と称される異化代謝経路を通るβＡＰＰ前駆体により得られる（図２）。この経路により、β蛋白質の分子の上流および下流が、ベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼという２つのプロテアーゼにより分割する。ベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）の分割によって、９９アミノ酸（Ｃ９９）の長い、可溶性Ｎ末端のフラグメント（ｓＡＰＰβ）およびＣ末端ペプチドが生成される。これがさらにガンマセクレターゼにより、Ａβおよび小さいＣ末端ペプチド（ＡＩＣＤ）に相当する２つのフラグメントへと切断される（Selkoe DJ. アミロイドβたんぱく質の発生および運命の解読によるアルツハイマー病の新治療法の発見J Clin Invest 110:1375-81, 2002）。実際にはガンマセクレターゼは、２つの主要な分割サイトを有し、これらが各々Ａβの「短い」形態および「長い」形態（Ａβ１−４０およびＡβ１−４２）の形成に結びつき、通常の条件下では１０：１の割合で存在する。これと同様に、ＢＡＣＥも、ペプチドの異なる点として機能して、Ｎ末端領域（例えばＡβ１１−４０、Ａβ１１−４２、およびＡβ３−４２）において切断形状を呈するが、ＡＤで増加する傾向にある（Liu et al. アルツハイマー病患者の脳およびダウン症児の脳へのＡβ１１−４０／４２ぺプチドの堆積の特徴付け：アルツハイマー病についての示唆Acta Neuropathol 112:163-74, 2006）。βＡＰＰは、これとは別の「非アミロイド生成性」と称される異化代謝経路に遭遇することもあるが、これは蛋白質がＡβの残基１６−１７で別のプロテアーゼ（アルファセクレターゼ）により切断されるからである。後者の酵素の作用により、βアミロイドの形成が阻害される。
【０００５】
アミロイドカスケード仮説は多数の証拠により裏付けられている。
・  遺伝子ＡＰＰの変異により、ＡＤの家族性形態が判断される（Rademakers et al., アルツハイマー認知症の早期発症の遺伝学ScientificWorldJournal 16:497-519, 2003）。
・  ダウン症で検証された遺伝子ＡＰＰのさらなる複製の存在により、ＡＤの臨床病理的記述を十分に判断できる。
・  ＡＤの遺伝子的に判断される形態の殆どは、Ａβ生成増加と関連付けられており、Ａβ４２／Ａβ４０の割合も増加する（Kahle et al.アミロイドに対する攻撃 EMBO Rep 4:747-51, 2003）。
・  Ａβ、特に、「長い」４２残基形態におけるＡβは、凝集してオリゴマーを形成し、老人斑の主要成分であるアミロイド原線維を形成する傾向が強い（Armstrong RA. アルツハイマー病のプラーク、もつれ、および病因（Plaques and tangles and the pathogenesis of Alzheimer's disease） Folia Neuropathol 44:1-11, 2006）。
・  Ａβ、特に４２アミノ酸形態のＡβは、神経毒性を有する（Butterfield et al. アミロイドβペプチド（１−４２）の、アルツハイマー病患者の脳に存在する酸性ストレスおよび神経変性への貢献（Amyloid beta-peptide (1-42) contributes the oxidative stress and neurodegeneration found in Alzheimer disease brain） Brain Pathol 14:426-32, 2004）。
・  ＡＤに関連するＡＰＰ遺伝子を保持するトランスジェニックマウスは、βアミロイドを中枢神経系に蓄積して、行動認知領域における欠陥を示し、これは年齢とともに悪化した（Kurt et al.変異プレセニリン１のトランスジーンを持つマウスの脳へのβアミロイドの堆積に関する神経変性の変化（Neurodegenerative changes associated with beta-amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes）Exp Neurol 171:59-71, 2001）。
・  ヒトのＡＰＰを表すトランスジェニックマウスのＡβに対する免疫処置により、アミロイドプラークの形成が低減し、神経病学上の欠陥が向上した（Lemere et al. アルツハイマー病のトランスジェニックマウスのモデルおよび野生のマウスにおけるアミロイドβ免疫処置（Amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease transgenic mouse models and wildtype mice） Neurochem Res 28:1017-27, 2003）。
【０００６】
遺伝的に決定された形態に関しては、家族性ＡＤケースの約８０パーセントがＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２変異に関連付けられている（Rocchi et al. アルツハイマー病の原因となり、感受性を有する遺伝子（Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease）: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003）。両プレセニリンがＡβの生成に関わっており、これはガンマセクレターゼの巨大分子錯体の一部であり、その変異したケースではＡβ（とりわけAβ1-42）生成が増加が見られ、これにより神経毒性の凝集物が形成される傾向が高い。
【０００７】
ＦＡＤの約５パーセントは、ＡＰＰ遺伝子に局所化した変異により引き起こされる（Rocchi et al. アルツハイマー病の原因となり、感受性を有する遺伝子（Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease）: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003) (図２)。これら変異のなかには、可溶性および凝集化する傾向を結果として低下させる二次βシート構造内の好ましいＡβに富む構造の助けをすることにより病原性効果を発揮するものがある。他方で他の変異のなかには、セクレターゼが働きかける分子のサイトへの局所化によって、ＡＰＰのプロセシングを阻害するものもある（例えば、「スウェーデン人の変異」KM670/671NL参照のこと）。また他のものの中には、全く知られていないメカニズムを有することで、長く、不溶性の形態のＡβ（Ａβ１−４２、Ａβ１−４３）の生成物の蓄積を引き起こすものもある。ＡＰＰのおよびプレセニリンの変異に関連するＡＤのケースでは、Ａβ１−４２が、分泌されたＡβペプチドの１５−４０パーセントとなるまで増加するものもある（通常の条件下では、その５−１０パーセントにしかならない）（Rocchi et al. アルツハイマー病の原因となり、感受性を有する遺伝子（Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease）: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003、および、 Lleo et al.ＰＳ−１変異に関するアルツハイマー病の臨床上、病理学上、および生化学上の範囲（Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum of Alzheimer Disease Associated with PS-1 Mutations）Am J Geriatr Psychiatry 12:146-56. 2004）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の技術的課題は、βアミロイド物質および／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の組織および／または臓器への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断および／または予防および／または処置のための製品およびその利用法、および、病理の危険性を判定するスクリーニング方法の提供に関する。
【０００９】
本発明のこの技術的課題およびその他の目的は、以下に記す独立請求項に示される手段により達成される。
【００１０】
本発明の他の特徴が従属請求項により定義される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図２】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図３】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図４】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図５】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図６】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図７】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図８】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図９】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１０】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１１】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１２】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１３】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１４】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１５】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１６】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１７】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１８】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【図１９】以下の記載からより明らかになる本発明のさらなる特徴および利点を支持する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ヒトのＡＰＰ遺伝子の新たな点状の変異（punctiform mutation）の最近の発見に係る。変異は、ヒトのＡＰＰ遺伝子（Ｄ８７６５）のコード配列のコドン６７３におけるチミジンがシトシンで置き換わっていることを特徴としており、これは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govからアクセス可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける分類法ではヒトのＡＰＰ７７０（NM_000484.2）のアイソフォームのヌクレオチド２２１２（遷移c.2212>T）に相当する。本特許の目的からは、アミロイド状の物質とは、Ａβの蛋白質凝集物のことを意味し、これにはアミロイド自身の着色および／または超微細構造上の特性がない。このような変異の蛋白質配列では、ＡＰＰ７７０の６７３の位置（Ala673Val）のアラニンがバリンに置き換わっており、これはＡβのアミノ酸の残基２と対応しており、これは、重症の初老性の認知症を患う患者のホモ接合体で発見された。患者の頭脊柱（ｃｅｐｈａｌｏｒａｃｈｉｄｉａｎ）液（ｌｉｑｕｉｄ）を分析すると、アルツハイマー病に見られるのと同様な、タウ蛋白質およびリン酸化タウ全量の顕著な減少が見られた。他方で、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のプラズマレベルは、制御対象に対して増加しており、さらに、ヘテロ接合体の同じ変異を有する対象に対しても増加している。加えて、患者からの生検材料から得られた線維芽細胞は、その培養媒体において、制御線維芽細胞に対して大量のＡβ１−４０およびＡβ１−４２を示した。概して、このデータは、以下に示す例の幾つかでもその詳細が取り上げられるように、ホモ接合体のAla673Val変異が、アルツハイマー病として説明されうる認知症に関しており、且つ、ＡＰＰ遺伝子の他の変異同様に、Ａβ生成が増えることでＡＰＰ処理に影響が及ぼされることを示している。
【００１３】
様々な家族構成員を遺伝的に研究することにより、ホモ接合体のAla673Val変異の別の親族キャリア（familiar carrier）の存在が示された。患者より若いこの親戚は、神経心理学的評定がなされ、様々な認知機能の悪化の初期の兆候が検出された。さらなる遺伝的分析により、驚くべきことに、神経病学的現象を引き起こさなかったヘテロ接合体の同じ変異のキャリア対象者が幾人も見つかり、そのうち数人は高齢でもあった（齢９０歳（IXdecade of life））（図４）。遺伝子ＡＰＰから始まる転写ＲＮＡに対して行われた遺伝子発現に関する研究により、これら対象では、対立遺伝子（野性型および変種）が転写されていることが示された。したがって、ヘテロ接合体において病気がないことは、遺伝子の抑制メカニズムによるものではない（「病理的」対立遺伝子の転写の阻害）。従って、ＡＰＰ遺伝子についてこれまで記載してきたこととは反対に、Ala673Val変異では、常染色体優性型メカニズムにより高い浸透率で遺伝し、常染色体劣性型の発現がある。したがって、明らかに散発性の形態のなかに、常染色体劣性型の遺伝により引き起こされたものもあることがある。この現象の分子基盤を調べるべく、２Ａβ１−４０ペプチド、１つの野生型（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）、および位置２にアラニンの代わりにバリンを含む他のもの（DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）を合成した。２つのペプチドには、化学物理および形態学上の分析を行い、その二次構造、凝集速度、および凝集の形態および性質を調べた。これら調査により、変異したペプチドは、野生型よりもかなり大きなアミロイド原線維を形成する傾向があることが分かった。また驚くべきことに、２つのペプチドの等モル量は、変異したペプチドよりも小さいだけではなく、自身の野生型のペプチドよりも小さく凝集する。アミロイド形成に対するこの「抑制」作用は、疾病が、もっぱらAla673Val変異を受けるホモ接合体に発現し、細胞レベルのペプチド両方（野生型および変異型）両方を共に表現するヘテロ接合体では発症しない、という臨床的な観察結果とも合致する。このデータに基づいて、個々のヘテロ接合体は、それに対応する野生型の存在における変異Ａβペプチドという小さな原線維の形成によってアルツハイマー病から守られる、と仮定することができる。
【００１４】
変異を含んでいるＡβのＮ末端領域が凝集において重要な役割を持ち、Ala673Val変異が抑制効果を有するという仮定を検証するべく、Ａβの最初の６つのアミノ酸に対応するよう、２つのペプチド（１つが野生型の配列（DAEFRH）であり、他方が、位置２にアラニンの代わりにバリンを含むもの（DVEFRH）である）を合成する。その後、２つのヘキサペプチドは、Ａβ１−４０野生型とともに培養され、検査される。この検査により、両方のヘキサペプチドにより、Ａβ１−４０原線維が自然に形成されるという傾向が抑制され、変異したヘキサペプチドの効果が、対応する野生型のものよりも大きいことが分かった。
【００１５】
このデータは、ＡＤの治療法に新たな可能性を開き、さらには、中枢神経系または他の組織に不溶性および毒性の凝集物の形で蛋白質が蓄積されることを特徴とする疾病全般に対しても新たな治療法の可能性となる。
【００１６】
本発明の第１の用途は、当業者には公知な方法により、Ala673Valを有するヒトのＡＰＰのｃＤＮＡを含むベクターを生成すること、および該ベクターを利用して病理学研究および治療に利用可能な細胞株をトランスフェクションすることである。
【００１７】
第２の用途は、当業者には公知な方法により前の用途による構造を、Ala673Val変異を有するヒトのＡＰＰを表すことのできるヒトではないヒト以外のトランスジェニック哺乳類動物（ＡＰＰ（ホモ接合体動物）単体または野生型のヒトのＡＰＰまたは他の変異（ダブルトランスジェニック）を含む組み合わせ）のベクターとして利用する。これら動物は、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の臓器および組織への異常形成および堆積に特徴付けられるヒトおよび／または動物の病理に関する病理学研究、診断、予防、および処置のモデルとして利用することができる。本実施形態では、好適な動物はマウスであり、特に内因性ＡＰＰのノックアウトマウス株C57BL6が好適であり、好適な病理はＡＤである。
【００１８】
変異したペプチドがＡβの凝集および原線維の形成を妨げるという潜在的な可能性を考慮に入れ、本発明の別の可能な用途は、組織および臓器のβアミロイド物質の異常堆積を特徴とする病理のインビボによる遺伝子治療（ＤＮＡを患者の細胞または組織に直接埋め込む）、またはエックスビボによる遺伝子治療（ＤＮＡをまずは臓器から切り離した細胞内に埋め込み、研究所で培養してから、変質したものを患者の体内に戻すこと）により、Ala673Val変異を有するＡＰＰを含む構造の生成である。構造を対象細胞に埋め込むことは、ウィルス型のベクター（例えば、（ａ）増殖細胞染色体内の自身のＤＮＡを統合することのできるレトロウィルス、（ｂ）増殖性ではなく細胞内に遺伝物質を転移させることのできるレンチウィルス、（ｃ）自身のＤＮＡを細胞の染色体に探さず、小型の遺伝子のみに利用可能なアデノ随伴ウイルス、（ｄ）大型の遺伝子を転移させることができ、且つ、自身の表現も限られた時間内は可能であるアデノウィルス、または（ｅ）特にニューロンといった特定の種類の細胞のみに感染する単純ヘルペスウィルス（herpex simplex virus））により達成可能である。または、リポソーム等の非ウィルス性のベクターを利用することもできる。Ａβが異常蓄積する病理に犯された臓器にAla673Val変異を有するＡＰＰを埋め込むことにより、組織のβアミロイド物質の蓄積を阻害することのできる変異したβ蛋白質源を提供することができる。
【００１９】
他の可能性ある用途に、当業者には公知な方法の利用により（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉ）、この変異体を含むマイナス鎖ｍＲＮＡを用いて、Ala673Val変異用のホモ接合体である対象物におけるメッセンジャの翻訳を抑える利用法がある。翻訳の阻害には、凝集する傾向の強い、変異したペプチドの生成を抑える目的がある。本発明に利用されるＲＮＡｉ技術に基づく実験も、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の組織および臓器への異常堆積に特徴付けられる疾病の病理研究には有効でありうる。本発明の別の用途によると、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の組織および臓器への異常堆積に特徴付けられるヒトおよび／または動物の病理の診断、予防、および処置用に、Ala673Val変異および天然または合成のペプチドを有するヒトのＡＰＰが利用される。
【００２０】
好適な実施形態では、くも膜下投与等の経口および／または非経口投与に合わせて調合されたヘキサペプチドDVEFRH等の低分子量ペプチドの利用が提供される。好適な病理はＡＤである。処置により、単一の治療で、または他の薬との関連で利用される単一のペプチドまたは幾らかのペプチドの投与がなされる。
【００２１】
本発明のさらなる用途では、当業者には公知な方法の利用により、βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質の組織および臓器への異常形成および堆積に特徴付けられるヒトおよび／または動物の病理の診断、予防、および処置用に本願による蛋白質および／またはペプチドに対する抗体が生成される。好適な実施形態では、ヒトのＡＰＰおよびそれに由来するペプチドのAla673Val変異を認識することのできるそれら変異を含むモノクローナル抗体が提供される。これら抗体は、Ala673Val変異を有するＡＰＰを認識する目的に利用することができ、適切に調合されると、この変異したＡＰＰの存在により特徴付けられるアミロイドーシスの処置用に利用することができる。好適なアミロイドーシスはＡＤである。上述の用途は例示であり、本発明の開発を制限するものではない。
【００２２】
＜例示＞
＜例１．ＡＰＰ遺伝子の新たな変異体の識別およびこの変異体を有するキャリア患者の臨床上の表現型の説明＞  変異体の識別は、既に記載した技術（Wakutani et al家族性が疑われるアルツハイマー病における新規なアミロイド前駆体蛋白質遺伝子ミスセンス変異（Ｄ６７８Ｎ）（Novel amyloid precursor protein gene missense mutation (D678N) in probably familial Alzheimer's disease） J Neurol Neurosurg Psychiatry 75:1039-42, 2004）により、プライマー5'-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3および5'-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3'および増幅による生成物（図５）を利用して、患者のリンパ球からゲノムＤＮＡを抽出して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させることで、遺伝子ＡＰＰのエクソン１６および１７を増幅させることで、行うことができる。変異体は、エクソン１６内の制限酵素ＨｐＹＣＨ４Ｖの特定の切断サイトがないので、Ala673Valの存在も、ＰＣＲによるエクソン１６の増幅（プライマー：5'-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3'および5'-TACTTTAATTATGATGTAATA-3'）、HpYCH4ＶによるＰＣＲ生成物の消化、および、２．５パーセントのアガロースゲル上のフラグメントの分離により示される。野性型の対立遺伝子では、HpYCH4による消化により９１および７８塩基対（ｂｐ）という２つのフラグメントが生成され、一方で、変異した対立遺伝子は、１６９ｂｐの単一のフラグメントを生成する（図６）。
【００２３】
認知症に家族性がなく、３６歳で進行性の心理組成症状（evolutive phycho-organic syndrome）を発病して、記憶障害、計画障害、および行動障害が悪化途中にある患者からAla673Val変異が特定された（図４、ＩＩＩ  １８）。臨床記述は、多方面の認識退化へと進行して、ミオクローヌス型のパーキンソン病および痙攣性の四肢麻痺（spastic tetraparesis）に関する不随意運動を伴う。
【００２４】
家族の遺伝研究により、Ala673Val変異の第２のホモ接合体対象（図４、ＩＩＩ  ２０）、および、様々なヘテロ接合対象（図４、ＩＩ  １０、ＩＩＩ  １、ＩＩＩ  ２、ＩＩＩ  ８、ＩＩＩ  １２、およびＩＶ  １）を特定することができた。ホモ接合体（つまり、５歳年下の妹）には、現在この疾病の初期症状と合致する認識障害の初期の兆候が現れており、他方で、ヘテロ接合体対象からは、高齢者のなかからも誰も神経学上の病理の兆候が見られない。この観察により、Ala673Val変異は常染色体劣性型であり、これまでにＡＤに関して記載したもののうち１つしかホモ接合体に存在するときにしか病理表現型を表わしていないことが分かる。
【００２５】
ＡＰＰ遺伝子の同じコドンがAla673Thr同質異像を含んでいることに留意されたい。この同質異像現象は、ＡＤを示唆する臨床的兆候または神経病理学上の変質のない対象のヘテロ接合で見つかった（Peacock et al."アルツハイマー病を患っていない患者のアミロイド前駆体蛋白質遺伝子のＡ４領域における新規な同質異像現象"（Novel polymorphism in the A4 region of the amyloid precursor protein gene in a patient without Alzheimer's disease） Neurology 43:1254-56, 1993）。
【００２６】
患者に行われた研究所での計器による調査は、以下を示している。
・  脳のＲＭにおける、特に前領域に顕著な、広範にわたる脳萎縮。
・  認知症に犯されていない対象が示す制御グループのもの（Aβ1-40=109±12 pg/ml, p=0.003;Aβ1-42=20±6pg/ml,p=0.004）と比較したときの、プラズマ内のペプチドＡβ１−４０およびＡβ１−４２の顕著な増加（それぞれ426 ± 93 pg/mlおよび46 ± 7 pg/ml）（図７）
・  陰性制御対象群（Aβ1-40 = 34.4 ± 3.8 pg/ml; Aβ1-42 = 4.4 ± 0.6 pg/ml）と比した場合の、皮膚生検により患者から得られた線維芽細胞の培養媒体におけるＡβの増加（Aβ1-40 = 87.3 ± 9.5 pg/ml; Aβ1-42 = 8.8 ± 0.2 pg/ml）（図８）
・  脳脊髄液における制御群のAβ1の低減42 ± 43 pg/ml対392 ± 115 pg/mlの低減、p=0.0004（図９）、および、タウ蛋白質の増加（420 pg/ml;正常範囲90-150 pg/ml）およびリン酸化タウの増加（63.3 pg/ml; 制御グループにおける平均濃度: 19.1 pg/ml）（図１０）  上述の変質は、アルツハイマー病で観察されたものと全体的に類似している。
【００２７】
＜例２：Ala673Val変異を含むＡβペプチドの化学物理特性＞
Ala673Val変異の効果を確かめ、そのＡＤの病因における役割を確かめるべく、２Ａβ―４０ペプチドを合成した（一方が野生型（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）配列を有し、他方が、位置２にアラニンの代わりにバリンを含む（DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV））。これらペプチドは、シンセサイザ４３３Ａ（Applied Biosystems社製）で生成された。樹脂で接着されたペプチドはその後、Ｎ末端で脂肪親和性プローブ（４−ドデシルアミノカルボニルフルオレン‐９‐イルメチルサクシニミジルカルボネート）（4-dodecylaminocarbonylfluorene-9-ylmethylsuccinimidyl carbonate）で、Ball et al. (Int J Pept Prot Res 40:370-9, 1992)の開示する方法に、Bonetto et al. (J Biol Chem 277: 31327-34, 2002)の修正を加えたものにより、誘導体化された。樹脂から切り離された後に、ペプチドは逆相カラムＣ４（ウォーターズ）を用いてＨＰＬＣにより浄化され、９５パーセントを超える純度が得られた。ペプチドの特定は、MALDI-TOFスペクトロメトリ（反射ＩＩＩ、Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ｍｏｄｅｌ）により行われた。
【００２８】
以下に示す物理化学研究は、そうではないと明記しない限りにおいて、ペプチド野生型Ａβ１−４０、変異したＡβ１−４０、および２つの等モル混合物を含むサンプルが、１０ｍＭのＮａＯＨに溶解され、その後５０ｍＭのTris HCl内で、ｐＨ７．０で、最終濃度が０．２５および０．１２５ｍＭとなるよう、希釈された。その後サンプルを摂氏３７度で1、4、8、24時間の間、3、5、10、15および20日間の間、培養した。各回、一定量のサンプルを分析して、二次構造、凝集物、ならびに、凝集物の超微細構造および光学着色特性（optical-tinctorial properties）を調べた。
【００２９】
＜二次構造＞  Ａβの二次構造の変異による異形は、Clippingdale et al. (J Pept Sci 5:227-49, 2001)に記載されている技術による円偏光二色性により調べられた。ペプチドは、１５０ｍＭのリン酸緩衝液で、ｐＨ７．４で希釈され、最終的な濃度は１００μＭとなり、摂氏３７度でＪａｓｃｏ−８１０分光旋光計で計測された。スペクトルは、１ｍｍの試験管を用いて、２０ｎｍ／分の走査速度で得られた。緩衝溶液のスペクトルを得た後で、移動平均法により適宜ノイズを低減させた。
【００３０】
分析により、変異したペプチドはβシートに第２の構造（secondary conformation）が多い傾向が強いことが分かった。試験時間にわたり、βシートコンテンツは、野生型のペプチドのものと比してかなり高く、変異した野生型のペプチドからなる等モルの混合物と比してもかなり高かった（図１１）。これは、Ala673Val変異において、Ａβの折り返しが条件とされており、二次βシート構造が顕著に増加したことを示している。
【００３１】
＜凝集＞  野生型Aβ1-40、変異したAβ1-40、およびそれらの等モル混合物の凝集物を、遠心分離により沈殿しうるぺプチドの量を判断することにより評価した。様々な培養時間において、３０μｌの一定量のサンプルを、摂氏４度で１５分間、１５，０００ｇで遠心分離した。ペレットは、２５μｌの純粋なギ酸で溶解され（solubilised）、溶液が、４．６Ｘ１５０ｍｍの１００オングストロームのカラムをもつＨＰＬＣに注入された（Labservice Analytica, Polymer Laboratories）。溶出液は、流速０．７ｍｌ／分で、溶出剤Ｂの直線濃度勾配を１５−６０パーセントで２０分間用い、０．１パーセントＴＦＡからなる溶出剤Ａを水に溶かし、０．０８パーセントＴＦＡからなる溶出剤Ｂをアセトニトリルに溶かした可動相（movable phase）を用いて生成された。ペプチドに相当するピークは、２１４ｎｍにおける溶出剤の吸収度を計測することにより修正された。
【００３２】
沈殿されうるペプチド量は、当初の溶液に存在するペプチドの総量のパーセンテージとして計算された。
【００３３】
これら実験により、変異したペプチドが、野生型のペプチドより多く、且つ、より速く凝集し、驚くべきことに、２つのペプチドの沈殿した部分により形成される混合物は、変異したペプチドおよび野生型のペプチドにより小さいことが分かった（図１２）。
【００３４】
＜凝集物の超微細構造特性および着色特性＞
凝集物の超微細構造特性および光学着色特性（optical-tinctorial properties）を、それぞれ、コンゴーレッドで着色した後に電子顕微鏡および偏光顕微鏡で観察した。
【００３５】
超微細構造を調べた結果、野生型Ａβ１−４０、変異したＡβ１−４０、およびそれらの等モル混合物の５μｌの懸濁液を、１時間から２０日間の間の培養時間の間延伸させ（drawn）、Ｆｏｒｍｖａｒ−Ｃａｒｂｏｎで覆ったニッケル製のスクリーン上に５分間堆積させ、ウラニルの過飽和溶液でネガティブカラーに染色して（negatively coloured）、電子顕微鏡（ＥＭ１０９Ｚｅｉｓｓ）で観察した。培養２０日目に、一定量のサンプルを１５，０００ｇで１５分間遠心分離した。これにより得られたペレットは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２．５パーセントのグルタルアルデヒドにフィックスされ、１パーセントのオスミウム酸でポストフィックスされ、アセトンで脱気され、エポキシ樹脂（epoxy rein）（Supurr, Electron Microscopy Sciences）に含められた。超微細な箇所（５００オングストローム）が、銅製のスクリーン上に収集され、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛（lead citrate）で着色され、電子顕微鏡で観察された。
【００３６】
凝集物がアミロイドで形成されているかどうかを確かめ、かつ、形成されているアミロイドの範囲を計測するべく、様々な培養時間において、各サンプルの５μｌの水溶液をポリリジンコートスライドガラス（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ）上に集め、コンゴーレッドで着色して、偏光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  E−８００）で観察した。  超微細構造の分析により、最初の二日間の培養期間では、野生型のＡβ１−４０のペプチドが、アモルファス凝集してオリゴマーおよび稀な線維状構造を形成した。４８時間後に、短い原線維材料が未分化状態で不規則に現れ（プロトフィブリル）、培養７２時間の後に初めて、長い直線状原線維が観察され、その直径は約８ｎｍであり、アモルファスとプロトフィブリル材料との間に介在していた。この後で、原線維の密度が増え、アモルファスおよびプロトフィブリル量が比例して増加した。培養１５日後になって初めて、殆どが密度の高い原線維ネットワークからなる材料で形成されるようになった。
【００３７】
他方、変異したペプチドＡβ１−４０の凝集速度は、非常に速かった。つまり、培養２４時間の頃から、長く、未分化の規則的な原線維は存在しており（図１３）、５日を過ぎると、サンプルは、プロトフィブリルおよびアモルファス材料のない、密度の高い原線維ネットワークで構成されるようになった。驚くべきことに、２つのペプチドの等モル混合物が形成した原線維は、変異したペプチドと比較しても、野生型と比較しても少なく、培養２０日を過ぎると、凝集物の殆どがアモルファス材料からなるようになった（図１４）。
【００３８】
コンゴーレッドで着色された準備物を偏光で観察することにより、変異したペプチドＡβ１−４０が野生型のＡβ１−４０よりもアミロイド生成機能に優れamyloidogenic）、２つのペプチドの混合物は、アミロイドを形成機能に劣る傾向にあることが分かった。つまり、複屈折材料の小さな凝集物は、変異したＡβ１−４０のサンプルでは培養２４時間を過ぎると既に観察されたが（図１３）、野生型のＡβ１−４０では７２時間後に観察され、２つのペプチドの混合物では５日後になって初めて観察された。後になって、複屈折材料の進行性の増加が変異型のＡβ１−４０および野生型のＡβ１−４０サンプルに観察されたが、２つのペプチドの混合物ではその増加が、培養２０日を過ぎても非常に遅かった（図１４）。このデータから、凝集物を調べた結果、（ｉ）変異したペプチドＡβ１−４０は、野生型よりもアミロイド生成機能に優れ、（ｉｉ）２つのペプチドの混合物は、アミロイドを形成機能に劣る傾向にあることが確認することができる。
【００３９】
＜例３：合成ペプチドによるアミロイド生成の阻害、Ala673Val変異体を含むＡβのＮ末端領域の同族体＞
変異型のＡβ１−４０と野生型のＡベータ１−４０ペプチドの混合物を物理化学的に研究した結果、Ala673Val変異体がＡβの凝集物に対して持つ抑制効果が示唆されたので、Ａβの初めの６つのアミノ酸に対応する２つの合成ペプチド（１つが野生型列（DAEFRH）を有し、他方が、 (DVEFRH)というように、位置２がアラニンからバリンに替わっている）を用いてこの仮説を検証した。２つのヘキサペプチドをともに、等モル濃度で、またはそれを超える濃度（ヘキサペプチド：Ａβ１−４０＝５：１）で野生型Ａβ１−４０とともに培養した。混合物を、例２に示すように超微細構造的に、および組織化学的に調べた。調査の結果、ヘキサペプチド両方において（変異体および野生型両方）、Ａβ１−４０の原線維の形成が抑制されたことが分かり、ＡβのＮ末端領域、つまり変異したサイトが、凝集に重要な役割を担っていることが分かった（図１５）。しかし、変異したヘキサペプチドは、対応する野生型よりもずっと活性化されていたので、原線維の形成に対する抑制効果によるAla673Val変異体の重要性が理解される。
【００４０】
＜例４：野生型のヒトのＡＰＰで細胞株をトランスフェクションする、または、Ａβの位置２にＡｌａ＞Ｖａｌ変異を含む＞
ジェネティックエンジニアリング法では（Tesco et al.APPの代替物V715FおよびL720Pが、PS1構造を変質させ、別途AβおよびAICD生成に影響を持つ（APP substitutions V715F and L720P alter PS1 conformation and differentially affect Aβ and AICD generation）J Neurochem 95: 446-56, 2005; Sudhir et al. アミノ末端基のフラグメントの、培養細胞のアミロイド前駆体蛋白質レポータおよび変異誘導体からの放出（Release of Amino-terminal Fragments from Amyloid Precursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in Cultured Cell） J Biol Chem 267:25602-08, 1992）、それぞれ野生型のヒトのＡＰＰ７５１のｃＤＮＡおよびヒトのＡＰＰ７５１のｃＤＮＡ（Ａβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体）を含む２つのベクターを生成した。これらベクターにより、２つの細胞株がトランスフェクションされ（ＣＯＳ７およびＣＨＯ）、Ａβ計量をＥＬＩＳＡ法により媒体内で行った。Ａβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体を、サイト特定突然変異生成（QuikChange（登録商標）XL サイト対象突然変異分析キット、Stratagene）により、オリゴヌクレオチド5'-GATCTCTGAAGTGAAGATGGATGTAGAATTCC-3' および5'-GTCATGTCGGAATTCTACATCCATCTTCACTT 3'を利用して、ヒトＡＰＰ７５１のｃＤＮＡに挿入した。
【００４１】
ＡＰＰの野生型および変異型両方を、ＰＣＴにより、プライマー5'-CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3'および5'-ACCGAAGCTTTGTGGCGGGGGTCTAGTTC-3'（前者は、制限酵素ＥｃｏＲＶにより認識されるサイトを含み、後者は、酵素ＨｉｎｄＩＩＩのサイトを有する）を用いて増幅し、制限サイトＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐｃＤＮＡ３．１ベクターでクローン化した。この構成物をさらに、Top Ten One Shot (Invitrogen)細胞の変換により増幅して、Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen)というキットで浄化して、エレクトロポレーションでＣＯＳ７およびＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション効率を、ウエスタンブロット法により、蛋白質のＮ末端領域（残基６１−８８）に対する抗体２２Ｃ１１(Chemicon International Inc.)を用いて細胞溶解物のＡＰＰの資質によって評価した。ＡＰＰ表現レベルを利用して、２つの構造でトランスフェクションされた細胞によるＡβ生成のレベルを比較した。野生型および変異型のヒトのＡＰＰを表すＣＯＳ７およびＣＨＯの培養媒体上では、ペプチドＡβ１−４０およびＡβ１−４２、ならびに、Ｎ末端をＥＬＩＳＡで切断した形状を計測した（Immuno-Biological Laboratories Gunma）。
【００４２】
研究の結果以下が示された。
・  変異したＡＰＰをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の媒体のＡβ１−４０およびＡβ１−４２はそれぞれ116.8 ± 90.5 pg/mlおよび20 ± 12.3 pg/mlであり、野生型のＡＰＰをトランスフェクションし細胞のもの（21.9 ± 8.6 pg/mlおよび4 ± 0.8 pg/ml）と比して大幅に多い（図１６）。
・  変異したＡＰＰをトランスフェクションしたＣＨＯの媒体のＡβ１−４０およびＡβ１−４２はそれぞれ84.6 ± 9 pg/mlおよび9.6 ± 3.4 pg/mlであり、野生型のＡＰＰをトランスフェクションされた細胞のもの（49.8 ± 11.8 pg/mlおよび4.2 ± 0.8 pg/ml）と比して大幅に多い（図１７）。
・  ＡβのＮ末端を切断した形状は、野生型のＡＰＰをトランスフェクションされた細胞のもの（1.1 ± 0.3 pg/ml）と比較して、変異したＡＰＰをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の媒体において（2.5 ± 0.3 pg/mlであった）、特にＡβ３−４２で顕著に多い。このデータは、Ａβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体がＡＰＰプロセシングを変質させて、アミロイド生成経路について有利に機能させ、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２生成が増加し、且つ、Ｎ末端を切断した形状も増加したことを示している。
【００４３】
＜例５：トランスジェニックマウス、Ａβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌのキャリアの生成＞
Ａβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体を有するヒトのＡＰＰを有する構造を生成して、行動的上、神経生理学上、神経放射線学上、神経病理学上、生化学上、および分子についてのテストを行う対象であるトランスジェニックマウスを生成し、この遺伝子的欠陥に纏わる疾病の表現型特徴を定義し、病因および治療の研究を行った。
【００４４】
野生型ＡＰＰ７５１のｃＤＮＡは、ベクターｐＴＳＣ２１にクローン化されており、プロモータであるマウスＴｈｙ１．２を含んでいた（制限サイトＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ）（図１８）。次にこの構造に対して、細胞トランスフェクション（例４参照のこと）で報告されているものと同じプロトコルを用いてＡβ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体を組み入れてサイト特定突然変異生成を行い、これを用いて株C57Bl/6から始まるトランスジェニックマウスを生成した。
【００４５】
トランスジーンとしてポジティブな６つのファウンダ（オス３、メス３）を用い、これらがそれぞれ３つの株で子を産み、中枢神経系においてＡβの位置２におけるＡｌａ＞Ｖａｌ変異体を有するヒトのＡＰＰを過剰発現した。２つの最良の株を、既に利用可能な内因性ＡＰＰのC57Bl/6ノックアウトマウスの１株と交配させて、マウスＡＰＰのない変異したヒトのＡＰＰを表す動物を得た（図１９のhuAPPmut/moAPP0/0）。最後に、これらを、野生型のヒトのＡＰＰのトランスジェニックマウスと交配して、ヘテロ接合体の動物を得た（huAPPmut/huAPPwt）。
【００４６】
ホモ接合体およびヘテロ接合体のＡβにおける位置２の変異体を有するヒトのＡＰＰを表すマウスは、アルツハイマー病の、および、より一般的には、アミロイドおよび／またはアミロイド状物質の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の疾病の病因学研究、診断、予防、および処置に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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