(57)【要約】  多数の生体活性化合物の定量方法を開示する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  ＭａｃｒｏｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａの混合物のエキスの活性物質の定量方法であって、
（ａ）前記エキスからタンパク質を沈殿させ、上清みを単離することと、
（ｂ）前記上清みを抽出媒体上にインジェクトし、溶出液を前記抽出媒体から収集することと、
（ｃ）（ｂ）の溶出液をＭＳ／ＭＳ分離および定量に供し、それにより、前記活性物質の定量を得ることと、
を含む方法。
【請求項２】
前記タンパク質沈殿（ａ）がタンパク質分離用バイアル内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出媒体が抽出カラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＳ／ＭＳ分離および定量が、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳシステムにおいてターボスプレーネガティブＳＲＭモードで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記活性物質が（ｉ）ＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする、（ｉｉ）および／または前記活性物質がＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の単離分離された活性物質。
【請求項７】
１つ以上の閉経期症状の治療のための医薬の調製のための請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の単離分離された前記活性物質の使用。
【請求項８】
１つ以上のエストロゲン関連の病状または疾患状態の治療のための医薬の調製のための請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の単離分離された前記活性物質の使用。
【請求項９】
患者に、請求項１から請求項５に記載の１種類以上の単離分離された活性物質を含む組成物を投与することを含む、閉経期の治療方法。
【請求項１０】
患者に、請求項１から請求項５に記載の１種類以上の単離分離された活性物質を含む組成物を投与することを含む、エストロゲン媒介性の病状または疾患状態の治療方法。
【請求項１１】
前記治療が、少なくとも１つの閉経期症状の重症度または頻度の低減を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記閉経期症状がのぼせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記閉経期症状が、疲労感、イライラ感、不眠、集中力の低下、鬱、記憶力の減退、頭痛、不安感、神経質、断続的なめまい、感覚異常、動悸、頻脈、吐き気、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、尿失禁、膣乾燥および骨盤筋の緊張の低下からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者に投与される前記活性物質の量が患者の体重１ｋｇあたり約０．１〜１０ｍｇの前記１種類以上の組成物である、請求項１０に記載の閉経期症状の治療方法。
【請求項１５】
生物学的試料から活性物質を単離し、前記活性物質を定量する方法であって、前記活性物質が、Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  ＭａｃｒｏｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａの混合物のエキス由来のエストロゲン様化合物であり、
（ａ）前記生物学的試料からタンパク質を沈殿させ、上清みを単離することと、
（ｂ）前記上清みを抽出媒体上にインジェクトし、溶出液を前記抽出媒体から収集することと、
（ｃ）（ｂ）の溶出液をＭＳ／ＭＳ分離および定量に供し、それにより、前記活性物質の定量を得ることと、
を含む方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料が、血液、器官または尿試料などの哺乳動物組織試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料が、血液試料（例えば、血漿試料）、尿試料、肝臓試料、乳房組織試料、卵巣組織試料、子宮組織試料、外陰部組織試料、膣組織試料、頚部組織試料、ファローピウス管組織試料、子宮内膜組織試料、リンパ節組織試料および／または骨組織試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物組織試料が、ヒト血漿試料、ヒト尿試料、イヌ血漿試料、マウス血漿試料またはラット肝臓試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質沈殿（ａ）がタンパク質分離用バイアル内で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出媒体が抽出カラムである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＳ／ＭＳ分離および定量が、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳシステムにおいてターボスプレーネガティブＳＲＭモードで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性物質が（ｉ）ＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化を特徴とする、（ｉｉ）および／または活性物質がＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  ＭａｃｒｏｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａを組み合わせ、ハーブ混合物を形成することと、
（ｂ）前記ハーブ混合物を、抽出溶媒での抽出に供することと、
（ｃ）前記ハーブ混合物を水から分離してエキスを形成し、任意選択で、前記エキスからタンパク質を沈殿させることと、
（ｄ）前記エキスから活性物質を分離することと、
（ｅ）前記（ｄ）の活性物質の１種類以上を少なくとも１種類の薬学的に許容され得る成分と組み合わせ、それにより医薬を形成することと、
を含む、医薬の調製方法。
【請求項２４】
前記ハーブ混合物中のハーブ成分を下記の表：
【表１】
2011523713.tif 000011
に示した割合で組み合わせる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ハーブ混合物中のハーブ成分を下記の表：
【表２】
2011523713.tif 000012
に示した割合で組み合わせる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ハーブ混合物中のハーブ成分を下記の表：
【表３】
2011523713.tif 000013
１  概算割合（全組成物に対する重量パーセント）
に示した割合で組み合わせる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記混合物が、本質的に前記表に示した割合のハーブ成分からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）推定活性物質がＥＲα結合ＥＲＥおよびＥＲβ結合ＥＲＥを活性化する能力を測定することと、
（ｉｉ）推定活性物質が前記ＥＲα結合ＥＲＥおよび前記ＥＲβ結合ＥＲＥを活性化する能力を比較し、それにより、ＥＲβ結合ＥＲＥをＥＲβ結合ＥＲＥよりも高い程度で活性化する推定活性物質を活性であると判定することと、
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の１種類以上の活性物質の特性評価方法。
【請求項３１】
前記活性物質が乳癌細胞の増殖を刺激する能力を評価することと、乳癌細胞増殖の刺激を実質的に示さない活性物質を閉経期の治療薬として選択することとをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記閉経期の治療薬が示す乳癌細胞増殖の刺激が約１０％未満である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記閉経期の治療薬が示す乳癌細胞増殖の刺激が約５％未満である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記閉経期の治療薬が、対照と比べて乳癌細胞増殖の刺激を実質的に示さない、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、植物組成物由来の多種類の生体活性物質の定量方法、１種類以上の単離分離された活性物質を含む組成物を患者に投与することを含む、閉経期の治療方法に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年６月５日に出願された米国特許仮出願第６１／０５９，２５５号の恩典を主張し、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
閉経期は、正常な排卵サイクルが停止して正常な月経が停止した後の期間である。閉経期には、卵巣がエストラジオール（Ｅ２）を生成しなくなるため、Ｅ２生成の減少を伴う。このＥ２生成の減少は、体内のホルモンバランスの変化をもたらし、多くの場合、閉経期と関連するさまざまな症状が起こる。
【０００４】
閉経前または更年期としても知られる閉経周辺期は、正常な排卵サイクルが徐々に月経の停止へと移行する閉経期前の期間である。排卵サイクルが長くなり、より不規則となるため、Ｅ２レベルは、最初は増大することがあり得るが、最終的には低下し、閉経期が始まる。閉経期症状は、多くの場合、Ｅ２レベルの低下を伴う。
【０００５】
閉経周辺期、閉経期および閉経後の症状としては、血管運動の不安定性に副次的なのぼせおよび発汗などの身体症状が挙げられる。また、更年期の開始には、疲労感、イライラ感、不眠、集中力の低下、鬱、記憶力の減退、頭痛、不安感および神経質などの心理的および感情的症状を伴うことがあり得る。さらなる症状としては、断続的なめまい、感覚異常、動悸および頻脈ならびに吐き気、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷えおよび体重増加が挙げられ得る。また、生殖器官に対する変化、尿失禁、膣乾燥、骨盤筋の緊張の低下、心血管疾患および骨粗鬆症のリスクの増大が、閉経期の始まりとともに増大する。
【０００６】
のぼせは、閉経周辺期、閉経期および閉経後の多くの女性に一般的に見られ、厄介である。数十年の間、エストロゲンによるホルモン補充療法は、のぼせの標準的な治療であったが、多くの女性は、有害効果、特に乳癌の可能性に関する懸念のため、ホルモン療法（ＨＴ）を諦めていた。いくつかの最近の研究、特に、女性の健康イニシアチブ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）（ＷＨＩ）により、ＨＴは乳癌のリスクを増大させることがわかった。選択的エストロゲン受容体モジュレータ（「ＳＥＲＭ」）であるラロキシフェンおよびタモキシフェンはエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を抑制するという観察結果は、エストロゲンが乳癌を促進させるというさらなる証拠を提供する。
【０００７】
したがって、閉経期、特にのぼせなどの閉経期症状の治療のための、乳癌のリスクを増大させない治療用組成物および方法の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、また、関連する利点をもたらすものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本明細書に記載の実施形態は、Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  ＭａｃｒｏｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａの混合物のエキスの活性物質の定量方法であって、（ａ）前記エキスからタンパク質を沈殿させ、上清みを単離することと、（ｂ）該上清みを抽出媒体上にインジェクトし、溶出液を該抽出媒体から収集することと、（ｃ）（ｂ）の溶出液をＭＳ／ＭＳ分離および定量に供し、それにより、前記活性物質の定量を得ることとを含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記タンパク質沈殿（ａ）はタンパク質分離用バイアル内で行われる。一部の実施形態において、抽出媒体は抽出カラムである。一部の実施形態において、ＭＳ／ＭＳ分離および定量は、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳシステムにおいてターボスプレーネガティブＳＲＭモードで行われる。一部の実施形態において、活性物質は、（ｉ）ＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする、（ｉｉ）および／または活性物質がＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする。一部の実施形態において、このプロセスによって得られる分離された活性物質を記載する。一部の実施形態において、１種類以上の前記活性物質を含む、１つ以上の閉経期症状の治療のための医薬を提供する。一部の実施形態は、１つ以上のエストロゲン関連の病状または疾患状態の治療のための医薬の調製のための記載の方法の単離分離された活性物質の使用を提供する。一部の実施形態は、開示した方法の１つによって同定、単離および／または調製される１種類以上の単離分離された活性物質を含む組成物を患者に投与することを含む、閉経期の治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
エストロゲン媒介性の病状または疾患状態の治療方法は、患者に、開示した方法の一つを特徴とする１種類以上の単離分離された活性物質を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、前記治療は少なくとも１つの閉経期症状の重症度または頻度の低減を含む。一部の実施形態において、前記閉経期症状は、のぼせである。一部の実施形態において、閉経期症状は、疲労感、イライラ感、不眠、集中力の低下、鬱、記憶力の減退、頭痛、不安感、神経質、断続的なめまい、感覚異常、動悸、頻脈、吐き気、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、尿失禁、膣乾燥および骨盤筋の緊張の低下からなる群より選択される。一部の実施形態において、患者に投与される前記活性物質の量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．１〜１０ｍｇの前記１種類以上の組成物である。
【００１０】
一部の実施形態において、生物学的試料から活性物質を単離し、前記活性物質を定量する方法であって、前記活性物質が、Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  ＭａｃｒｏｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａの混合物のエキス由来のエストロゲン様化合物であり、（ａ）前記生物学的試料からタンパク質を沈殿させ、上清みを単離することと、（ｂ）該上清みを抽出媒体上にインジェクトし、溶出液を該抽出媒体から収集することと、（ｃ）（ｂ）の溶出液をＭＳ／ＭＳ分離および定量に供し、それにより、前記活性物質の定量を得ることとを含む方法を提供する。一部の実施形態において、生物学的試料は、血液、器官または尿試料などの哺乳動物組織試料である。一部の実施形態において、生物学的試料は血液試料（例えば、血漿試料）、尿試料、肝臓試料、乳房組織試料、卵巣組織試料、子宮組織試料、外陰部組織試料、膣組織試料、頚部組織試料、ファローピウス管組織試料、子宮内膜組織試料、リンパ節組織試料および／または骨組織試料である。一部の実施形態において、哺乳動物組織試料は、ヒト血漿試料、ヒト尿試料、イヌ血漿試料、マウス血漿試料またはラット肝臓試料である。一部の実施形態において、前記タンパク質沈殿（ａ）はタンパク質分離用バイアル内で行われる。一部の実施形態において、抽出媒体は抽出カラムである。一部の実施形態において、ＭＳ／ＭＳ分離および定量は、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳシステムにおいてターボスプレーネガティブＳＲＭモードで行われる。一部の実施形態において、活性物質は、（ｉ）ＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化を特徴とする、（ｉｉ）および／または活性物質がＥＲαおよび／またはＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥ−Ｌｕｃアッセイの活性化を特徴とする。
【００１１】
本明細書に開示する一部の実施形態は、（ａ）Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｐａｒｇｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、Ｒａｄｉｘ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ  Ｍａｃｒｏ  ｃｅｐｈａｌａおよびＨｅｒｂａ  Ｅｐｉｍｅｄｉａを合わせ、ハーブ混合物を形成することと、（ｂ）該ハーブ混合物を、抽出溶媒での抽出に供することと、（ｃ）該ハーブ混合物を水から分離してエキスを形成し、任意選択で、前記エキスからタンパク質を沈殿させることと、（ｄ）前記エキスから活性物質を分離することと、（ｅ）前記（ｄ）の活性物質の１種類以上を少なくとも１種類の薬学的に許容され得る成分と組み合わせ、それにより医薬を形成することとを含む、医薬の調製方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明は、閉経期の治療のための組成物を提供する。該組成物は、ハーブ混合物、ハーブ混合物のエキスまたはハーブエキスの混合物である。ハーブ混合物は、Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａを含む。該組成物は、インビトロアッセイにおいて、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）により活性化させるが、エストロゲン受容体α（ＥＲα）では活性化させない。
【００１３】
また、本発明は、閉経期の治療方法を提供する。該方法は、被検体に、閉経期が治療されるのに充分な量の上記の組成物投与することを含む。一部の実施形態において、閉経期の治療としては、閉経期症状の重症度、頻度または重症度と頻度の低減が挙げられる。
【００１４】
引用による組み込み
本明細書において挙げた刊行物および特許出願はすべて、引用により、個々の刊行物および特許出願が、引用により組み込まれて、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲に示したものである。本発明の原理を用いた例示的実施形態を示した以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られよう。
【図１Ａ】ＥＲβ発現細胞およびＥＲα発現細胞に対するＭＦ１０１の活性を比較する折れ線グラフである。ＭＦ１０１は、ＥＲβでは、用量依存的なＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化をもたらしたが、ＥＲαでは、活性化は観察されなかった。
【図１Ｂ】Ｅ２、ＭＦ１０１ならびにＭＦ１０１＋ＩＣＩ、ＭＦ１０１＋ラロキシフェン（Ｒａｌ）およびＭＦ１０１＋タモキシフェン（Ｔａｍ）の組み合わせの効果を比較する棒グラフである。ＭＦ１０１によるＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化は、ＩＣＩ、ＲａｌおよびＴａｍによってブロックされた。
【図１Ｃ】ＭＦ１０１の存在下で、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞におけるケラチン１９ｍＲＮＡ発現の増大を示す棒グラフである。
【図１Ｄ】ＭＦ１０１は、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞において、ケラチン１９ｍＲＮＡ発現に対してほとんど効果がなかったことを示す棒グラフである。
【図２Ａ】ＥＲβおよびＥＲαに対するＭＦ１０１の結合を示す折れ線グラフである。
【図２Ｂ】ＭＦ１０１が、ケラチン１９ＥＲＥにＥＲβを漸増させるが、ＥＲαは漸増させないことを示すゲルである。
【図２Ｃ】ＥＲαのエラスターゼ消化に対するエタノール（対照）、Ｅ２（陽性対照）およびＭＦ１０１の効果を示すゲルである。ＭＦ１０１と結合している場合、ＥＲαは対照と比べて、エラスターゼに対する保護のわずかな増大を示す。
【図２Ｄ】ＥＲβのエラスターゼ消化に対するエタノール（対照）、Ｅ２（陽性対照）およびＭＦ１０１の効果を示すゲルである。
【図３Ａ】それぞれ、対照、Ｅ２およびＭＦ１０１で処理した細胞における３Ｈ−チミジン取込みの違いを示す棒グラフである。一般的に、ＭＦ１０１は、対照と比べて、３Ｈ−チミジン取込みを大きく増大させなかった。
【図３Ｂ】細胞内で、ＭＦ１０１が、ｃ−ｍｙｃ（図３Ｂ）遺伝子を活性化させなかったことを示す棒グラフである。
【図３Ｃ】細胞内で、ＭＦ１０１が、サイクリンＤ１（図３ｃ）遺伝子を活性化させなかったことを示す棒グラフである。
【図３Ｄ】細胞増殖に対する対照、ジエチルスチルベルトロール（ＤＥＳ）およびＭＦ１０１の効果を示す写真である。
【図３Ｅ】細胞増殖に対する対照、ジエチルスチルベルトロール（ＤＥＳ）およびＭＦ１０１の効果を示す写真である。
【図３Ｆ】細胞増殖に対する対照、ジエチルスチルベルトロール（ＤＥＳ）およびＭＦ１０１の効果を示す写真である。
【図３Ｇ】異種移植片の増殖に対する対照、ＤＥＳおよびＭＦ１０１の効果を示す棒グラフである。ＭＦ１０１は、移植片の増殖を刺激しなかったが、ＤＥＳは、異種移植片の質量の相当な増加を引き起こした。
【図３Ｈ】子宮角塊の増殖に対する対照、ＤＥＳおよびＭＦ１０１の効果を示す棒グラフである。ＭＦ１０１は、子宮角増殖を刺激しなかったが、対照的に、ＤＥＳは、子宮角増殖の相当な増大を刺激した。
【図４】エストラジオールあり、またはなしでのＭＣＦ細胞増殖に対するＥＲβの効果を示す棒グラフである。
【図５】インビボ細胞増殖に対するＥＲαおよびＥＲβの効果を示す。
【図６】エストラジオールはＥＲαをインビボで活性化するが、ＭＦ−１０１は活性化しないことを示す三次元の棒グラフである。
【図７】ＭＦ−１０１がＥＲβと選択的に相互作用することを示す三次元の棒グラフである。
【図８】ＭＦ−１０１の抗増殖効果を示す折れ線グラフである。
【図９】ＭＦ−１０１が骨細胞をＴＮＦβ活性から保護することを示す三次元の棒グラフである。
【図１０】すべての活性物質と内部標準の標準的な混合物の高速液体クロマトグラムである。
【図１１】６種類の主な活性物質（ヒト血漿中）の一組の典型的な標準曲線である。
【図１２】低（０．５ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬ）、中（２０ｎｇ／ｍＬ）および高（５０ｎｇ／ｍＬ）濃度レベルでの、３回の凍結解凍サイクルを経た６種類の活性物質のヒト血漿中における安定性を示す。
【図１３】ヒト血漿からの種々の活性物質の回収率を示す。低（ＢＮＥＲ１１０３、ＢＮＥＲ１１０４およびＢＮＥＲ１１０６では０．５ｎｇ／ｍＬ、ＢＮＥＲ１１０１、ＢＮＥＲ１１０５およびＢＮＥＲ１１１５では１ｎｇ／ｍＬ）、中（１０ｎｇ／ｍＬ）および高（２０ｎｇ／ｍＬ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、閉経期の治療に有用であることがわかっている諸成分の混合物から活性化合物を単離し、定量し、特性評価する方法を記載する。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書においてより詳細に説明するハーブ混合物のエキスからの活性化合物（活性物質）の単離を伴う。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、血漿からの活性物質の単離を伴う。エキスまたは血漿を、まず、タンパク質の沈殿および分離に供する。上清みを、沈澱したタンパク質から分離し、抽出媒体（抽出カラムなど）に適用し、適当な溶媒で溶出させる。次いで、溶出液を質量分析−質量分析分離に供し、活性物質の単離と定量の両方を行う。活性物質の活性は、ＥＲαおよび／またはＥＲβの一方または両方の存在下で、ＥＲＥまたはＴＮＦ−ＲＥの活性化などのエストロゲン様効果の既知の試験方法によって確認され得る。活性物質を１種類以上の賦形剤と合わせ、医薬組成物を調製してもよく、これは、エストロゲン媒介性の病状または疾患状態、例えば、閉経期、骨粗鬆症、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、外陰部の癌、頚部癌、子宮内膜癌、ファローピウス管癌など、またはリンパ系内に遊走した任意の癌の治療のために使用され得る。また、該単離および定量方法は、薬物試験の際に、生物学的組織から前記活性物質を単離および定量するため、ならびに薬物試験の際に、活性物質の薬物動態および全身分布を調べるために使用され得る。
【００１７】
多くの女性は、ＨＴは有益性よりもリスクが勝ることが示された女性の健康イニシアチブの治験の結果以来、閉経期症状のためのＨＴに使用される安全で有効なエストロゲン代替薬を心待ちにしている（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｂ．、Ｇｒａｄｙ，Ｄ．、Ｔｏｓｔｅｓｏｎ，Ａ．Ｎ．、Ｐｒｅｓｓｍａｎ，Ａ．＆Ｍａｃｅｒ、Ｊ．Ｌ．、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｏｎ  ｗｏｍｅｎ’ｓ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｅ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｈｏｅｍｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０２、１２２５−３２（２００３））。その一方で、最近の調査により、閉経周辺期および閉経後の女性の７９％が、植物性ダイエタリーサプリメント（ＢＤＳ）を使用していることが報告された（Ｍａｈａｄｙ，Ｇ．Ｂ．、Ｐａｒｒｏｔ，Ｊ．、Ｌｅｅ，Ｃ．、Ｙｕｎ，Ｇ．Ｓ．＆Ｄａｎ，Ａ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉ−  ａｎｄ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ  １０、６５−７２（２００３））。ＢＤＳが広く使用されているにも関わらず、植物性物質の作用機序、有効性および安全性は、厳密には調べられていなかった。本発明は、Ｈｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａを含有するハーブ配合物を提供する。一部の実施形態において、該エキスは、各ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａが有意な量のエキスである。本発明の例示的な実施形態はＭＦ１０１であり、これは、以下に���より詳細に説明する。ＭＦ１０１に含まれるハーブの多くは、更年期症状の治療のための伝統的な漢方薬草の調合薬に使用されているが、これまでの試験で、閉経期の治療のための混合物の個々の物質の有効性が確認されたことはない。本発明の組成物は、ＥＲβ−選択的エストロゲン受容体活性を有し、したがって、閉経期の臨床的治療、特に、のぼせなどの閉経期症状の治療に充分に適している。
【００１８】
本発明は、閉経期、特に、のぼせなどの閉経期症状の治療のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ハーブ混合物、ハーブ混合物のエキスまたはハーブエキスの混合物である。さらに、本発明の組成物は、Ｕ２ＯＳ骨肉種細胞アッセイにおいて、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）により活性化するが、エストロゲン受容体α（ＥＲα）では活性化しない。該組成物は、ＥＲＥを、ＥＲαではなくＥＲβとの相互作用（前者のみ、エストロゲンＨＴの有害効果と関連している）によって活性化するため、本発明の組成物および方法は、エストロゲンホルモン療法の代わり使用され、ＷＨＩにおいて、乳癌のリスクの増大などのエストロゲン補充と関連していると確認された状態が起こりにくい
【００１９】
本発明との関連において、「閉経期」は、閉経周辺期、閉経期および閉経後を含み、特に、閉経周辺期、閉経期および閉経後に伴うエストラジオール（Ｅ２）レベルの低下によって引き起こされる、または悪化する症状を含む。したがって、本発明との関連において、「閉経期の治療」は、閉経期症状の治療を意味する。例示的な閉経期症状としては、血管運動の不安定性に副次的なのぼせ、発汗、心理的および感情的症状（疲労感、イライラ感、不眠、集中力の低下、鬱、記憶力の減退、頭痛、不安感、神経質など）、断続的なめまい、感覚異常、動悸、頻脈、吐き気、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、尿失禁、膣乾燥、骨盤筋の緊張の低下、心血管疾患および骨粗鬆症のリスクの増大が挙げられる。
【００２０】
したがって、「閉経期の治療」は、閉経周辺期、閉経期または閉経後と関連している１つ以上の症状の軽減、緩和または予防を意味し、少なくとも１つの閉経期症状の重症度または頻度の低減が挙げられる。「または／もしくは」の使用は、本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、接続的であることを意図する。したがって、治療には、少なくとも１つの閉経期症状の重症度と頻度の両方の低減も包含される。症状の頻度および重症度の低減は完全なものであり得るという意味では、治療には、該症状の予防も包含され得る。これに関連して、閉経期の治療には、ヒト成人女性の月経の自然な停止の予防は含まれないが、閉経期と関連している少なくとも１つの症状の頻度および重症度の検出不可能なレベルまでの低減は含まれることに注意されたい。
【００２１】
本発明との関連において、「閉経期の被検体」およびその文言上の変化形は、かつて初経が起こり、閉経周辺期、閉経期または閉経後である雌の成体、特にヒト成人女性をいう。婦人科学の当業者には、閉経期の始まりの診断上の特徴を確認することができ、当該技術分野で認められた臨床方法によって被検体を「閉経期の被検体」であると特定することができよう。
【００２２】
本発明による組成物は、以下の各ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａを含むハーブ混合物を含むものである。一部の実施形態において、ハーブ混合物は、前述の各ハーブを有意な量で含むものである。これに関連して、有意な量は、ハーブ混合物中の全ハーブ物質の質量の約０．１重量％より多い、例えば約０．５％より多い、より詳細には約１重量％より多い量を意味する。また、本発明による組成物は、前述のハーブ混合物のエキスを含むものである。かかるエキスの作製方法は、以下に詳細に説明する。
【００２３】
本発明の一部の実施形態において、ハーブ混合物は、ほぼまたは正確に表２に示した割合のハーブの混合物を含むもの、本質的に該混合物からなるもの、または該混合物からなるものである。
【表２】
2011523713.tif 000003
【００２４】
一部の実施形態において、本発明のハーブ混合物は、表３に示したほぼまたは正確な割合のハーブ成分を含むもの、本質的に該ハーブ成分からなるもの、または該ハーブ成分からなるものである。
【表３】
2011523713.tif 000004
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、ほぼまたは正確に表４に示す割合のハーブ成分を含むもの、本質的に該ハーブ成分からなる、または該ハーブ成分からなるハーブ混合物を提供する。
【表４】
2011523713.tif 000005
【００２６】
〜を含む、本質的に〜からなる、および〜からなるという用語は、当該技術分野で一般的に認められた意味を有する。ほぼという用語およびその変化形は、それぞれの表内の具体的な値の許容範囲が、示された値の＋／−１０％の範囲内であることを意味する。したがって、例えば、ほぼ１０％である値とは（１０＋／−１）％であり得る、すなわち９〜１１％の範囲であり得る。正確なという用語およびその変化形は、それぞれの表内の具体的な値の許容範囲が、示された値の＋／−１％の範囲内であることを意味する。したがって、例えば、正確に１０．０％である値とは（１０＋／−０．１）％であり得る：すなわち９．９〜１０．１％の範囲であり得る。一部の実施形態において、表１〜表３に示した割合は、ほぼであり、別の一部の実施形態では、該割合は正確なものである。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明は、上記のハーブ混合物のエキスである組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明のエキスは、ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａを含むハーブ混合物のエキスである。一部の実施形態において、該エキスは、有意な量の各ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａのエキスである。他の実施形態において、該エキスは、表２に示したハーブ混合物のエキスである。さらなる実施形態において、該エキスは、表３に示したハーブ混合物のエキスである。なおさらなる実施形態において、該エキスは、表４に示したハーブ混合物のエキスである。
【００２８】
本発明の一部の実施形態において、該組成物は、ハーブ混合物の濃縮型または無水型エキスである。一部の実施形態において、該組成物は、ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａを含むハーブ混合物の無水型または濃縮型エキスである。一部の実施形態において、該組成物は、有意な量の各ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａの濃縮型または無水型エキスである。他の実施形態において、該組成物は、表２または表３または表４に示したハーブ混合物の濃縮型または無水型エキスである。
【００２９】
一部の実施形態において、本発明は、前述のエキスまたは濃縮型もしくは無水型エキスの１種類以上と、１種類以上の適当な希釈剤、フレーバー剤、賦形剤または他の添加剤との組み合わせである組成物を提供する。好適な希釈剤としては、水、例えば、脱イオン水、注射用水（ＷＦＩ）、濾過水などが挙げられる。他の適当な希釈剤としては、果汁、お茶、ミルク、マグネシアミルクなどが挙げられる。好適なフレーバーとしては、フルーツフレーバー、ウインターグリーン、ペパーミント、スペアミント、シナモンなどが挙げられる。他の適当な添加剤としては、食品着色料およびエタノールが挙げられる。一部の実施形態において、該組成物は、無水型エキスを、１種類以上の希釈剤、フレーバー剤または他の添加剤との組み合わせで含むものである。他の実施形態において、該組成物は、濃縮型エキスを、１種類以上の希釈剤、フレーバー剤または他の添加剤との組み合わせで含むものである。一部の特定の実施形態では、無水型エキスは、表２、表３または表４に示した混合物のうちの１種類の無水型エキスである。他の特定の実施形態において、濃縮型エキスは、表２、表３または表４に示したハーブ混合物のうちの１種類の濃縮型エキスである。
【００３０】
本発明による組成物は、ハーブ、すなわちＨｅｒｂａ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  Ｂａｒｂａｔａ、Ｒａｄｉｘ  Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｓｕｂｐｒｏｓｔｒａｔａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ａｎａｍａｒｒｈｅｎａ、Ｓｅｍｅｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａｅ、Ｒａｄｉｘ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｔｒｉｔｉｃｉ  Ｌｅｖｉｓ、Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ、Ｒａｄｉｘ  Ｒｅｈｍａｎｉａ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｌｉｇｕｓｔｒｉ  Ｌｕｃｉｄｉ、Ｓｅｍｅｎ  Ｚｙｚｉｐｈｉ  Ｓｐｉｎｏｚａｅ、Ｐｌｕｍｕｌａ  Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ、Ｐｏｒｉａ  Ｃｏｃｏｓ、Ｒｈｉｚｏｍａ  Ａｌｉｓｍａｔｉｓ、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｍｏｕｔａｎ  Ｒａｄｉｃｉｓ、Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｃｏｒｎｉ、Ｒａｄｉｘ  Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ、Ｃｏｎｃｈａ  Ｏｓｔｒｅａ、Ｒａｄｉｘ  ＡｓｐａｒａｇｉおよびＲａｄｉｘ  Ｐｕｅｒａｒｉａ、特に、有意な量の各ハーブの混合物を含むものであり、より詳細には、ほぼまたは正確に表２、表３または表４のうちの１つに示したとおりの各ハーブの混合物を含むものである。かかるハーブ混合物は、慣用的な様式で、すなわち、適切な量の各ハーブを計り取り、種々のハーブを組み合わせてハーブ混合物を形成することにより作製され得る。このプロセスに、混合物の摩砕または攪拌などのさらなる工程を含めてもよい。該混合物は、そのまま摂取してもよく、被検体への経口投与に適した１つ以上のカプセル内に存在させてもよい。特定の実施形態において、ハーブ混合物を、該混合物のエキスを調製することなどによって、さらに加工処理してもよい。
【００３１】
本発明によるハーブ混合物のエキスは、慣用的な様式で、例えば、ハーブ混合物を１種類以上の溶媒と、エキスの調製に適した時間および条件下で合わせることなどにより調製され得る。ハーブ混合物と溶媒を、エキスの形成に適当な期間接触させた後、溶媒とハーブを濾過または遠心分離などの適当な方法によって分離する。溶媒を含む液体はエキスに相当する。次いで、このエキスは、該エキスを濃縮または脱水し（または両方）、該エキスをさらなる成分と組み合わせることなどにより、さらに加工処理され得る。
【００３２】
抽出プロセスに好適な溶媒（抽出溶媒）としては、水性溶媒、例えば、純水およびエタノールの水性溶液などが挙げられる。好適な条件としては、抽出溶媒とハーブの混合物に対する加熱が挙げられる。一部の特定の実施形態では、溶媒とハーブ混合物を、沸騰するまで所与の時間加熱する。特定の実施形態では、ハーブ混合物を水と合わせ、この合わせたものを約１分より長い時間、特に、５分より長い時間煎出する。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、上記の表５に示したハーブ混合物を水と組み合わせ、次いで、沸点まで、エキスの調製に適した時間加熱する。水を煎出ハーブから分離した後、水分を脱水によって除去し、残った残渣を本発明による組成物（無水型エキス）として回収する。次いで、この無水型エキスを、お湯で薄めてお茶として飲用にしてもよく、他のフレーバーと合わせてもよく、１つ以上のゼラチンカプセル剤に調製してもよい。
【００３４】
本発明の方法は、閉経期症状が治療されるのに充分な量の本発明の組成物を摂取することを含む。「閉経期症状」は、閉経周辺期、閉経期または閉経後の１つ以上と関連している症状である。閉経期症状としては、血管運動の不安定性に副次的なのぼせおよび発汗、疲労感、イライラ感、不眠、集中力の低下、鬱、記憶力の減退、頭痛、不安感、神経質、断続的なめまい、感覚異常、動悸、頻脈、吐き気、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、尿失禁、膣乾燥および骨盤筋の緊張の低下が挙げられる。特定の実施形態において、該方法は、のぼせの治療を含む。
【００３５】
治療という用語およびその文法上の変化形は、具体的な症状の頻度または重症度の低減を包含する。症状の頻度は、当該技術分野で認められた様式で、例えば、１種類以上の自動バイオメトリック法（血圧、脈拍数、呼吸数、呼吸容量、心電図、皮膚の抵抗力、脳波などの測定）または被検体に対して質問票に症状の頻度の記録を求めることなどによって判定され得る。また、症状の重症度も、前述のバイオメトリック法または質問票の１つ以上によって判定され得る。したがって、症状の頻度および重症度の測定は、主観的、客観的またはその両方であり得る。
【００３６】
したがって、閉経期症状が治療されるのに充分な本発明の組成物の量は、閉経期症状の頻度の低減、症状の重症度の改善またはその両方に充分なハーブ混合物、ハーブ混合物のエキス、またはハーブエキスの混合物の量である。一般的に、症状の治療に必要とされる量は、被検体の年齢、体重、一般健康状態、遺伝子構造、感情面の状態、および他の要素に依存する。選択された有効量は、エストロゲンホルモン補充療法よりも有効性が高い場合もあり、低い場合もあり得る。したがって、本発明の組成物の日用量に適した量は、約０．０１〜１００グラムの本発明のハーブ混合物／キログラム被検体体重、より詳細には約０．０５〜約５０グラム／キログラム被検体体重に相当する量である。本発明によるエキスに関しては、日用量は、約１〜１０，０００ｍｇの乾燥エキス／ｋｇ体重、より詳細には約２〜約５，０００ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明の組成物は安全であり、特に、乳癌のリスクの増大などのエストロゲン補充に関連する問題が引き起こされるリスクの低下を提示するものであると考えられるが、それでもなお、閉経期症状が低減され得る最小用量を使用するべきであることは、当業者には認識されよう。また、同様に、当業者は、所望の症状の緩和効果を得るのに必要な用量を明記した範囲内で滴定することができ、また、該範囲から上方または下方への偏差は、本発明の範囲内に許容され得ることが同様に認識されよう。
【００３７】
エストロゲンは乳癌を引き起こすという納得のいく証拠にもかかわらず、観察研究では、逆説的に、アジア諸国の女性は、大量の植物性エストロゲン（フィトエストロゲン）を摂取しているにもかかわらず、乳癌の発生率が最も低いことが示されている。同様に、アジア人女性が訴える、閉経期の症状は最小限であり、卵巣機能の停止時期におけるのぼせの経験は、はるかに少ない傾向にある。このような所見により、米国の多くの閉経期女性は、乳癌発生のリスクが増大することなく、のぼせが軽減されることを期待して、大豆またはエストロゲンの代替薬としてのハーブ療法剤中に存在するフィトエストロゲンを進んで摂取するようになった。種々のエストロゲン様化合物は、乳房細胞に対して反対の効果を発揮することがあり得る。エストラジオール（Ｅ２）などのエストロゲンは乳癌を促進させるが、フィトエストロゲンは、アジアで観察されているような乳癌の低発生率の一因であり得る。この理論を裏付ける臨床データおよび観察データは相当あるが（Ｋｕｒｔｚｅｒ  Ｍ．Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ｂｙ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００３、１３３：１９８３Ｓ−１９８６Ｓ）、これまでに、フィトエストロゲンが乳癌のリスクを低減させることが記録された無作為対照比較試験はない。
【実施例】
【００３８】
本発明の種々の態様および利点を実証するため、以下の例示的な実施例を示した。該実施例により、本発明の特定の実施形態を説明するが、本発明の完全な範囲がこれらの実施例に限定されないことは、当業者には認識されよう。
【００３９】
調製例１−ＭＦ１０１（ＩＮＤ  ５８，２６７）
【００４０】
本発明の特定の実施形態において、エキスをＭＦ１０１と表示し、これを以下の表５に示す。
【表５】
2011523713.tif 000006
【００４１】
次いで、乾燥エキスを、エキス溶液１リットルあたり固形エキス５３ｍｅｇの濃度まで希釈する。この溶液を、以下の実施例１〜１０を通して使用する。
【実施例１】
【００４２】
実施例１−ＭＦ１０１のＥＲβ特異的インビトロＥＲＥ活性化
Ｕ２ＯＳ骨肉種細胞を、最小限のチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータ（ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ）の上流の古典的ＥＲＥおよびヒトＥＲαまたはＥＲβの発現ベクターでコトランスフェクトした。ＭＦ１０１では、ＥＲβによる用量依存的なＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化がもたらされたが、ＥＲαによる活性化は観察されなかった（図１Ａ）。ＥＲβでは、０．１μｌ／ｍｌのＭＦ１０１で２．５倍のＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化がもたらされ、２．５μｌ／ｍｌのＭＦ１０１で２０倍の最大活性化がもたらされた。ＭＦ１０１（２．５μｌ／ｍｌ）による最大活性化は、１０ｎＭのエストラジオール（Ｅ２）で観察されたものに相当した。ＭＦ１０１によるＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ活性化は、ＩＣＩ、ラロキシフェンおよびタモキシフェンによってブロックされ（図１Ｂ）、これは、ＭＦ１０１の効果がＥＲβによって直接媒介されることを示す。また、ＥＲサブタイプの選択性を、ＥＲＥを含む内在性ケラチン１９遺伝子において調べた（Ｃｈｏｉ，Ｉ、Ｇｕｄａｓ，Ｌ．Ｊ．＆Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  １９  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｉｎ  ｈｉｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ」、  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６４、２２５−３７．（２０００））。以前に、Ｅ２が、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｙｌｉｎｅ）誘導性ＥＲαまたはＥＲβ細胞で安定的にトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞においてケラチン１９ｍＲＮＡの用量依存的な刺激をもたらすことが示されていた（Ｋｉａｎ  Ｔｅｅ，Ｍ．ら、「Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｛ａｌｐｈａ｝  ａｎｄ  ｛ｂｅｔａ｝」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５、１２６２−１２７２（２００４））。対照的に、ＭＦ１０１は、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞においてケラチン１９ｍＲＮＡを増加させる（図１Ｃ）が、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞においては増加させなかった（図１Ｄ）。この結果は、ＭＦ１０１が、異種プロモータに連結させたＥＲＥまたは内在性遺伝子内に存在するＥＲＥにおいて、ＥＲβ媒介性転写経路を選択的に誘発することを示す。
【実施例２】
【００４３】
実施例２−インビトロエストロゲン受容体結合
以前に、大豆にみられるフィトエストロゲン（ゲニステインなど）は、ＥＲβに対して、ＥＲαと比べて７〜３０倍高い親和性で結合することが示された（Ｂａｒｋｈｅｍ，Ｔ．らＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｔｏ  ｐａｒｔｉａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｇｏｎｉｓｔｓ／ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４、１０５−１２（１９９８）、Ｋｕｉｐｅｒ，Ｇ．Ｇ．らＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９、４２５２−６３（１９９８））。図１Ａ〜図１Ｄのデータは、ＭＦ１０１が、ＥＲβに対してより良好に結合することにより、ＥＲβ選択的様式で作用し得ることを示す。ＭＦ１０１が精製ＥＲαおよびＥＲβに対する結合に対してＥ２と競合する能力を、インビトロ結合アッセイにおいて試験した。競合結合曲線は、ＭＦ１０１がＥＲβとＥＲαに等しく結合することを示す（図２Ａ）。この実験は、ＭＦ１０１のＥＲβ選択性がＥＲβに対する優先的結合によるものでないことを示す。別の可能性は、ＭＦ１０１のＥＲβ選択性が、標的遺伝子内のＥＲＥへのＭＦ１０１−ＥＲβ複合体の選択的結合に起因しているということである。この可能性を調べるため、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞およびＵ２ＯＳ−ＥＲα細胞において、ケラチン１９遺伝子を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。以前に、Ｅ２処理によって、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞において、それぞれＥＲαおよびＥＲβの漸増がもたらされることが報告された（Ｋｉａｎ  Ｔｅｅ，Ｍ．ら、「Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｛ａｌｐｈａ｝  ａｎｄ  ｛ｂｅｔａ｝」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５、１２６２−１２７２（２００４））。対照的に、ＣｈＩＰは、ＭＦ１０１は、ケラチン１９ＥＲＥにＥＲβを漸増させたが、ＥＲαは漸増させなかったことを示す（図２Ｂ）。したがって、ＥＲαに対するＭＦ１０１の結合は、ＥＲＥへの結合が可能になるコンホメーションはもたらされない。
【実施例３】
【００４４】
実施例３−ＭＦ１０１によるエラスターゼ阻害
ＥＲαおよびＥＲβのコンホメーションに対するＭＦ１０１の効果をさらに調べるため、エラスターゼでの限定的タンパク質分解を行い、ＭＦ１０１が、Ｅ２と比べて異なるプロテアーゼ消化パターンかどうかを調べた。エラスターゼでの消化後、ＥＲαでは、Ｅ２とＭＦ１０１で相違する保護パターンが得られる（図２Ｃ）。ＥＲαがＥ２と結合している場合に、ＥＲαの最も強い保護が観察される。２つの矢印は、最も高いエラスターゼ濃度であっても、いくつかの保護断片が存在することを示す。リガンドの非存在下では（エタノール対照）、ＥＲα保護の明白な減損がみられる。ＭＦ１０１と結合している場合、ＥＲαは、対照と比べてエラスターゼに対する保護のわずかな増大を示すが、Ｅ２に結合しているＥＲαと比べると、それほど大きな保護は生じなかった（図２Ｄ）。対照的に、ＥＲβでのプロテアーゼ保護の結果、ＥＲαと比べて、完全に異なるパターンの保護断片が得られる。ＭＦ１０１では、エタノールおよびＥ２と比べて相違するパターンが得られた（Ｅ２およびエタノール対照の保護断片を示す５つの矢印と、ＭＦ１０１試料の保護断片を示す４つの矢印を比較）。これは、ＭＦ１０１に結合すると、ＥＲβは、Ｅ２と結合している場合またはホルモンなしの場合とは異なる全体コンホメーションになることを示す。ＥＲβは、ＭＦ１０１と結合している場合には異なるコンホメーションを有するため、ＥＲβの別の表面が露出し、場合によっては、補助調節タンパク質に利用可能となる。ＥＲのコンホメーションの変化によって相違する類型のタンパク質（ｐ１６０コアクチベータなど）の漸増がもたらされることがわかっているため、ＭＦ１０１によって、ＥＲαおよびＥＲβへの補助調節タンパク質の識別的漸増がもたらされるかどうかを調べた（Ｓｈａｎｇ，Ｙ．、Ｈｕ，Ｘ．、ＤｉＲｅｎｚｏ，Ｊ．、Ｌａｚａｒ，Ｍ．Ａ．＆Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １０３、８４３−５２．（２０００）、Ｍｅｔｉｖｉｅｒ，Ｒ．らＥｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｏｒｄｅｒｅｄ，ｃｙｃｌｉｃａｌ，ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｃｅｌｌ  １１５、７５１−６３（２００３）、Ｓｍｉｔｈ，ＣＬ．＆Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．、「Ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａ  ｋｅｙ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ」、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２５、４５−７１（２００４））。
【００４５】
ＭＦ１０１が補助調節因子を内在性遺伝子に選択的に漸増させるかどうかを調べるため、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞において、ケラチン１９遺伝子に対してＣｈＩＰアッセイを行った。ＭＦ１０１は、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞では、ケラチン１９遺伝子に対してＧＲＩＰ１およびＣＢＰの漸増を誘導したが、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞では誘導しなかった（図２Ｂ）。また、ＭＦ１０１は、ＥＲβにＲＮＡポリメラーゼＩＩを選択的に漸増させたが、これは、ＭＦ１０１がＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞でのみケラチン１９遺伝子を活性化させたという所見と整合する。この結果は、ＭＦ１０１のＥＲβ選択性がＥＲＥに対する識別的結合および標的遺伝子に対する補助調節タンパク質の漸増に起因していることを示す。
【実施例４】
【００４６】
実施例４−ＭＦ１０１はインビトロでＭＣＦ−７乳癌細胞増殖を刺激しない
のぼせのための代替エストロゲンの重要な特徴は、乳癌を促進させないことである。ＭＦ１０１の増殖促進特性を、ＥＲαのみを発現するＭＣＦ−７乳癌細胞において試験した（図３Ａ）。ＭＣＦ−７細胞をＭＦ１０１で７日間処理し、細胞増殖を３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。Ｅ２とは異なり、ＭＦ１０１はＭＣＦ−７細胞の細胞増殖を刺激しなかった。また、ＭＦ１０１は、Ｅ２によって活性化され、細胞増殖および乳癌を促進させる主要な遺伝子であるｃ−ｍｙｃ遺伝子およびサイクリンＤ１遺伝子も刺激しなかった（図３Ｂ）。このデータは、ＭＦ１０１がＥＲβ選択的であるというさらなる証拠を示し、ＥＲαがＭＣＦ−７細胞においてＥ２の増殖性効果を媒介することを示す前述の試験と整合する（Ｐａｒｕｔｈｉｙｉｌ，Ｓ．ら、「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  Ｇ２  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、４２３−８（２００４）、Ａｎ，Ｊ．、Ｔｚａｇａｒａｋｉｓ−Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃ、Ｓｃｈａｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｃ、Ｌｏｍｒｉ，Ｎ．＆Ｌｅｉｔｍａｎ，Ｄ．Ｃ、「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｂｙ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、１７８０８−１４．（２００１））。
【００４７】
同様の実験において、乳癌細胞に対するＭＦ１０１の効果をジエチルスチルベルトロール（ＤＥＳ）のものと比較した。図３Ｄ〜図３Ｆは、対照処理（図３Ｄ）およびＭＦ１０１処理（図３Ｆ）癌細胞と比較した場合の乳癌に対するＤＥＳの増殖刺激効果を示す。図３Ｇおよび図３Ｈは、乳癌移植片の質量（図３Ｇ）および子宮角の質量（図３Ｈ）に対する対照、ＤＥＳおよびＭＦ１０１の効果を示す。この結果は、合成エストロゲンＤＥＳとは異なり、ＭＦ１０１は、癌細胞または正常子宮細胞のいずれの増殖も刺激しないことを示す。
【実施例５】
【００４８】
実施例５−遺伝子発現マイクロアレイ
以下に概要を示す試験に基づき、本発明者らは、エストロゲンは、ＥＲαと相互作用することにより乳癌を促進させるが、ＭＦ１０１に見られるフィトエストロゲンは、増殖促進遺伝子を抑制し、かつ乳房細胞のＥＲα媒介性増殖を抑止するＥＲβと選択的に相互作用することにより、乳癌およびのぼせなどの閉経期症状を抑制し得るのではないかという仮説を立てた。ＥＲβ受容体は、脳や骨などの非生殖組織内により多く存在し、どのようにしてフィトエストロゲンが、血管運動症状を引き起こす中枢神経系効果を低減させ、骨量の維持を補助し得るかに役割を果たしている可能性がある。
【００４９】
エストロゲン様化合物は、その臨床効果を、ステロイド受容体スーパーファミリーの構成員である２種類の相違するエストロゲン受容体と相互作用することにより誘起させる。（Ｅｖａｎｓ  ＲＭ．Ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８、２４０：８８９−８９５、Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ  ＤＪ、Ｔｈｕｍｍｅｌ  Ｃ、Ｂｅａｔｏ  Ｍら、Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｃａｄｅ．Ｃｅｌｌ、８３：８３５−８３９）。ＥＲαは５９５アミノ酸のタンパク質であり、ＥＲβと称される第２のＥＲα（５３０アミノ酸）は１０年後に確認された（Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ  Ｓ、Ｐｏｌｍａｎ  Ｊ、Ｄｉｊｋｅｍａ  Ｒ．ＥＲ  ｂｅｔａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９６、３９２：４９−５３）。この２つの受容体の機能上の違いは、ごく最近になって研究された。ＥＲαとＥＲβの全体的な構造は、Ａ／Ｂドメイン以外は非常に類似しており、該ドメインは、相同性が２５％しか示されず、トランス作用性領域の１つを含む。ＤＮＡ結合ドメインは事実上同一である（９８％相同性）が、リガンド結合ドメイン（また、これは、第２のトランス作用性ドメインを含む）では、アミノ酸の５５％しか保存されていない（Ｅｎｍａｒｋ  Ｅ、Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ  Ｍ、Ｇｒａｎｄｉｅｎ  ＫらＨｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９７、８２：４２５８−４２６５）。他の試験では、組織分布、生理学的効果および転写活性がかなり異なっていることが明白に示されている。ＥＲβの方が偏在性であり、生殖組織（卵巣および精巣など）に加えて、多くの非生殖組織（骨、脳、尿路、脈管系および前立腺など）でも発現される。ＥＲαは、主に、子宮、肝臓、乳房および腎臓で発現される。ＥＲαとＥＲβの生理学的役割は異なることが、ＥＲαまたはＥＲβノックアウトマウスで明白に示された。ＥＲαノックアウトマウスは、始原的な乳腺および子宮などの大きな欠陥を示し、不妊である（Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＣ、Ｋｏｒａｃｈ  ＫＳ．、「Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ：ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００３、１２５：１４３−１４９）。対照的に、ＥＲβノックアウトマウスで観察された効果は、より微妙であり、低生殖能力で、同腹子の大きさが小さい、雌の皮質骨の肥厚および前立腺肥大が挙げられる。
【００５０】
フィトエストロゲンは、これまでに、ステロイドホルモン受容体の結合によってエストロゲン様効果を発揮することがわかっており（Ｔａｍａｙａ  Ｔ、Ｓａｔｏ  Ｓ、Ｏｋａｄａ  ＨＨ、「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｈｅｒｂ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ，ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，ａｎｄ  ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ  ｈｅｒｂ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ」、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１９８６、１５５：１１３４−１１３９）、ごく最近、ＥＲβに対してＥＲαと比べて有意に高い親和性を有することがわかった（Ｂａｒｋｈｅｍ  Ｔ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｂ、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｙら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｔｏ  ｐａｒｔｉａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｇｏｎｉｓｔｓ／ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９８、５４：１０５−１１２）。最初の実験において、イソフラボンのゲニステインは、ＥＲβに対する強力な転写アゴニストであるが、ＥＲαに対しては弱いアゴニストでしかないことが示された（Ａｎ  Ｊ、Ｔｚａｇａｒａｋｉｓ−Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃ、Ｓｃｈａｒｓｃｈｍｉｄｔ  ＴＣら、「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｔａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｂｙ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、２７６：１７８０８−１７８１４）。閉経期症状のためのＥＲサブタイプ選択的天然化合物を同定するためには、ＥＲαまたはＥＲβが相違する生物学的効果を発揮することを示すことが必要であった。ＥＲαとＥＲβは異なる標的遺伝子を調節する。これは、テトラサイクリン誘導ベクターで安定的にトランスフェクトしたヒトＵ２ＯＳ骨肉種細胞を用いてＥＲαまたはＥＲβを発現させることにより示される。ウエスタンブロッティング、免疫組織化学試験および免疫沈降試験により、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞ではＥＲαのみが合成されること、およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞ではＥＲβが排他的に発現されることが確認された（Ｋｉａｎ  Ｔｅｅ  Ｍ、Ｒｏｇａｔｓｋｙ  Ｉ、Ｔｚａｇａｒａｋｉｓ−Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃら、「Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ．」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４、１５：１２６２−１２６７２）。ドキシサイクリンで１８時間処理してＥＲαまたはＥＲβの発現を誘導した後、３Ｈ−Ｅ２結合試験により、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞株およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞株には、それぞれ、細胞１つあたり６９，０００個および５４，０００個の受容体が含まれていた。ＥＲα���よび／またはＥＲβによって調節される遺伝子を同定するため、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞株およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞株を、１０ｎＭのＥ２の非存在下または存在下、ドキシサイクリンで１８時間処理した。全ＲＮＡを使用し、１２，６００個の既知遺伝子を含むヒトＵ９５Ａｖ２  ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイとのハイブリダイゼーションのためのｃＲＮＡを調製した。未処理群と各処理群の６組の比較発現データを使用し、ＥＲα細胞またはＥＲβ細胞において調節される遺伝子を調べた。Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞とＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞の両方において、合計２２８個が、Ｅ２によって有意に（ｐ＜０．０５）活性化または抑制された（表４）。Ｅ２は、６５個の遺伝子をＵ２ＯＳ−ＥＲα細胞のみにおいて、および１２５個の遺伝子をＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞のみにおいて調節した。Ｅ２は、３２個の遺伝子をＵ２ＯＳ−ＥＲα細胞において、および３８個の遺伝子をＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞において抑制した。両方の細胞株でＥ２によって活性化された遺伝子は３４個、抑制された遺伝子は４個だけであった。この所見は、Ｅ２では、ＥＲαとＥＲβの両方によって調節される遺伝子は２２８個のうち３８個（１７％）だけであることを示す。Ｅ２と同様、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞においてラロキシフェンまたはタモキシフェンによって調節される遺伝子は、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞において調節されるものとは相違した。驚くべきことに、タモキシフェンによって調節される遺伝子のうち、ラロキシフェンによっても調節されるのは、どちらも選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）に分類されるにもかかわらず、わずか２７％である。この結果を、以下の表６にまとめる。
【表６】
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【００５１】
Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞株およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞株におけるＥ２およびＳＥＲＭによる識別的遺伝子調節
ドキシサイクリン誘導型Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞を、１０ｎＭのＥ２、１μＭのラロキシフェンまたは１μＭのタモキシフェンで１８時間処理した。未処理試料とリガンド処理試料のヒトＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５Ａｖ２遺伝子チップから得られたマイクロアレイデータを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０を用いて解析した。少なくとも３回の実験で対照と比べて統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）増大または減少であるシグナル変化を示す候補遺伝子を、±０．８シグナルｌｏｇ比平均カットオフによってさらに選択した。ＥＲα細胞株、ＥＲβ細胞株およびＥＲα＋ＥＲβ両方の細胞株における活性化された遺伝子の数、抑制された遺伝子の数およびその相対割合（括弧内）を示す。アスタリスク（＊）は、ＥＲβ細胞と比べて反対の発現パターンが示されたＥＲα細胞においてＳＥＲＭによって調節される共通遺伝子の数を示す。α−抗トリプシン、ケラチン１９（Ｋ１９）、ＷＩＳＰ−２、Ｍｄａ−７、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、１０ｎＭのＥ２、１μＭのラロキシフェンまたは１μＭのタモキシフェンのいずれかで１８時間処理したＵ２ＯＳ−ＥＲα試料およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ試料において行った。Ｕ２ＯＳ−ＥＲα試料およびＵ２ＯＳ−ＥＲβ試料における変化倍数（括弧内）は、未処理試料に相対して計算した。
【００５２】
ＥＲαおよびＥＲβが相違する遺伝子を調節するという観察結果は、ＥＲαとＥＲβが乳癌の発生において異なる役割を有し得ることを示す。乳癌におけるＥＲαの役割を調べるため、ＥＲαのみを発現するＭＣＦ−７細胞において、細胞増殖に対するＥ２の効果を試験した。Ｅ２は、ＥＲα−ＭＣＦ−７細胞において細胞数の用量依存的な増加をもたらした（Ａｎ，上掲，２００１）。該細胞はＥＲβを発現しないため、この試験により、増殖性効果はＥＲαによって媒介されることが示された。乳癌細胞の増殖に対するＥＲβの役割を調べるため、アデノウイルス（Ａｄ）を使用し、ＥＲβを高割合の細胞内に送達した。ＭＣＦ−７細胞を、Ａｄ−ＥＲβまたは該ウイルスの潜在的な非特異的効果を制御するためにＡｄ−ＬａｃＺに２４時間感染させた。感染細胞をＥ２の非存在下または存在下で１０日間培養した後、ＤＮＡ合成を、インビトロでの［３Ｈ］チミジン取込みによって測定した。ＥＲβの発現により、Ｅ２の非存在下では、５０ＭＯＩのＡｄ−ＬａｃＺに感染させた細胞比較すると、ＭＣＦ−７細胞の細胞増殖の５０％低減がもたらされた（図５）。Ａｄ−ＥＲβ感染細胞では、Ｅ２により細胞増殖の抑止が７０％まで増大された。感染多重度（ＭＯＩ）１００のＡｄ−ＥＲβの使用でも同様の結果が観察された。ＥＲβによる細胞増殖の抑止は主にリガンド非依存性であるという観察結果は、ストリッピング処理された血清中の残留Ｅ２、またはＥＲβに感染した細胞内に保持された残留Ｅ２、あるいはＥＲβの非リガンド特性に起因している可能性がある。
【００５３】
また、腫瘍形成に対するＥＲβの発現の効果を、マウス異種移植片モデルにおいて調べた（図６）。アデノウイルスに感染させたＬａｃＺ、ＥＲαまたはＥＲβを発現するＭＣＦ−７細胞を最初に凝集させ、次いで、重合コラーゲンゲル中に再懸濁させ、皮下エストラジオールペレットを埋入した雌ヌードマウスの腎臓嚢下に移植した。細胞を移植してから１ヶ月後、非感染ＭＣＦ−７細胞およびＡｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ＥＲβに感染させた細胞から、同等のサイズの腫瘍が発生した。Ａｄ−ＥＲβに感染させたＭＣＦ−７細胞からは、有意な腫瘍は発生しなかった（右下）。Ｋｉ６７増殖指数により、非感染ＭＣＦ−７細胞およびＡｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ＥＲαに感染させた細胞のほぼ７０％はＫｉ６７について染色されたのに対し、Ａｄ−ＥＲβに感染させた細胞では５％であることがわかった（データ示さず）。
【００５４】
この試験は、ＭＣＦ−７細胞へのＡｄ−ＥＲβの導入によってマウス異種移植片内での腫瘍形成が抑制されるが、Ａｄ−ＥＲαの導入では抑制されないことを示す。イムノブロットにより、感染細胞において同等レベルのＥＲα発現およびＥＲβ発現が検出され（データ示さず）、この結果が、ＥＲβによる補因子または転写因子の過剰発現および非特異的抑圧（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）のためではないようである。さらに、この抑圧が、ＥＲβが腫瘍形成を抑制する機構である場合、Ａｄ−ＥＲαに感染させた細胞でも同様の結果が観察されたはずである。
【実施例６】
【００５５】
実施例６−ＭＦ１０１はエストロゲン受容体α（ＥＲα）と機能的に相互作用しない
ＭＦ１０１が、乳房および子宮の細胞に対して不要な増殖性効果を発揮することがあり得、それにより潜在的に乳癌および子宮癌のリスクを増大させるＥＲαのアゴニストであるかどうかを調べるため、ＥＲαをＥＲ陰性Ｕ２ＯＳ骨肉種細胞内に一過的にトランスフェクトした。該細胞内に、エストロゲン応答エレメント−チミジンキナーゼ（ｔｋ）−ルシフェラーゼ（ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ）構築物も一過的にコトランスフェクトした。次いで、ＭＦ１０１またはエストラジオールを生理学的濃度で添加し、細胞を１８時間インキュベートし、その時点でルシフェラーゼ活性を測定した。図７に見られるように、ＭＦ１０１はＥＲαを活性化しない。しかしながら、エストラジオールはＥＲαを活性化し、このトランス活性能は、純粋なエストロゲンアンタゴニストＩＣＩ  １８２，７８０（ＩＣＩ）によって阻害され得る。
【実施例７】
【００５６】
実施例７−ＭＦ１０１はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的転写活性化をもたらす
ＭＦ１０１のＥＲβ媒介性効果を試験するため、ＥＲβをＵ２ＯＳ骨肉種細胞内に一過的にトランスフェクトした。ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ構築物も一過的にコトランスフェクトした。次いで、ＭＦ１０１またはエストラジオールを生理学的濃度で１８時間添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。図８に示されるように、ＭＦ１０１はＥＲβを活性化する。ＭＦ１０１とエストラジオールはともにＥＲβを活性化し、この活性は、ＩＣＩ  １８２，７８０によってブロックされる。結果は、エストラジオールがＥＲαとＥＲβのどちらとも普遍的に相互作用するが、ＭＦ１０１は、ＥＲβのみと選択的に相互作用することを示す。
【実施例８】
【００５７】
実施例８−ＭＦ１０１は乳癌細胞に対して抗増殖活性を示す
次の組の検査試験の目的は、インビトロでの乳癌細胞に対するＭＦ１０１の増殖効果を解明することであった。図９は、Ｃｙ−Ｑｕａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｓｅシステムを使用し、ＭＦ１０１がＥＲ陽性乳癌細胞に対して抗増殖活性を示すことを示す。ＭＣＦ７細胞は内在性ＥＲαを発現するが、ＳＫＢＲ３細胞はＥＲ陰性である。ＭＦ１０１は、ＥＲ陽性細胞に対しての方が大きな阻害を示す。これは、抗増殖効果がＥＲ非依存性であり、増殖刺激の徴候がないことを示す。
【実施例９】
【００５８】
実施例９−ＭＦ１０１は骨細胞をＴＮＦβの活性から保護し、骨粗鬆症を予防し得る
骨内では、エストロゲンは、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）などの特定のエストロゲン抑制性遺伝子を抑制し、それにより、その骨鉱化保護効果を媒介すると考えられている。骨細胞に対するＭＦ１０１の潜在的効果を観察するため、ＥＲβ（骨内での存在度が高い方のＥＲ）をＵ２ＯＳ骨肉種細胞内に一過的にトランスフェクトした。該細胞内に、ＴＮＦβ−ｔｋ−応答エレメント−ルシフェラーゼ構築物（ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ）も一過的にコトランスフェクトし、ＭＦ１０１またはエストラジオールを添加し、１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＭＦ１０１とエストラジオールはどちらも腫瘍ＴＮＦβを阻害し、該阻害はＩＣＩ  １８２，７８０（ＩＣＩ）によってブロックされた。図１０に示したデータは、エストラジオールとＭＦ１０１がどちらも閉経後女性の骨量の維持に有効であり得ることを示す。
【実施例１０】
【００５９】
実施例１０−ＭＦ１０１の個々のハーブ成分のＥＲ選択性
個々のハーブのいくつかの（ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｆ）ＥＲαおよびＥＲβの転写活性もまた評価した。本発明の目的の一つは、伝統的な中国医学アプローチを維持しながら、ＭＦ１０１配合物全体を試験することであるため、検査試験は、配合物全体に焦点をあてたものとした。しかしながら、一過的トランスフェクションアッセイにおいてスクリーニングした６７種類のハーブのうち、ＥＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃまたはＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃレポータを有する３３種類が活性を示し、８種類がＥＲα選択性を示したが、４種類はＥＲβ選択性を有した。
【実施例１１】
【００６０】
実施例１１−ＭＦ１０１のフェーズＩ臨床試験終了後の実効可能性および毒性データ
フェーズＩの治験をカリフォルニア州サンフランシスコ大学において実施し、閉経期と関連しているのぼせおよび他の症状を軽減するためのＭＦ１０１の安全性と実効可能性を評価した。この試験は、少なくとも５６回ののぼせが報告された年齢が５０歳から６５歳の３１名の健常な閉経後女性での７日間の対照なしの非盲検治験であった。参加者を５グラムの顆粒状のＭＦ１０１で治療した（温水と混合した粉末剤として、経口摂取、１日２回で３０日間）。主要転帰の測定は安全性とし、副次的転帰には、のぼせの頻度の変化ならびに血清エストラジオール、膣成熟および骨再吸収マーカーに対する効果を含めた。試験は、３０日間の導入（ｒｕｎ−ｉｎ）期間の後、３０日間の試験薬物での治療期間を含むものとした。表７に、解析に含めた試験参加者の数、除外した人数および除外理由をまとめる。
【表７】
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【００６１】
平均すると、この治験を終了した試験参加者は、３０日間の治療期間で、処方されたＭＦ１０１用量の８７．８％を摂取した。毒性データが入手可能な２５名の参加者についてＮＣＩの一般毒性基準により測定時、等級ＩＩＩまたはＩＶの有害事象は報告されなかった。試験参加者によって治験担当医に報告された有害事象は合計９例であり、場合によってはまたはおそらくＭＦ１０１に関連していると分類された。ＮＣＩの一般毒性基準に従い、この有害事象のうち５例は等級Ｉに分類され、４例は等級ＩＩの有害事象と記録された。報告された最も一般的な毒性は、わずかな吐き気または胃の膨満感であった（２５名中４名の女性）。他の５例の有害事象は、以下の理由、すなわち頭痛、嗜眠、鬱、気分の変動および血圧の上昇によるものであった。試験参加者はいずれも、報告されたいずれの副作用にも治療を必要とせず、入院もみられなかった。
【００６２】
ベースラインおよび試験終了時に血液および尿検査試験を受けた２２名の参加者全員を、毒性の解析に含めた。全血球算定、化学検査、肝臓パネル、または血清中もしくは尿中のエストロゲンもしくはゴナドトロピンレベルに関するいずれの検査値にも統計学的に有意な変化は認められなかった。
【００６３】
この試験は、主要エンドポイントとして有効性を測定するために設計されたものではなかったが、３０日間の治療後、のぼせの頻度および重症度に統計学的に有意な低減が認められた。のぼせの平均頻度は、ベースライン時では５７．３回／７日間であり、治療後では４４．９回であった（ｐ＝０．００３）。のぼせスコア（頻度に重症度を乗算）は、ベースライン時での９８．０から治療後では８１．７に減少した（ｐ＝０．０３）。試験を終了した２２名の女性のうち、１８名（８２％）は、３０日間の試験薬物治療後、のぼせが少なくなったが、４名（１８％）だけは多くなった。ベースライン時に測定された７日間に起こったのぼせの頻度は、試験薬物治療の最後の７日間と比較すると、２２％の減少がみられた（ｐ＝０．００３５）。また、３０日間の治療後、のぼせスコア（頻度に重症度を乗算）でも１７％の減少がみられた（ｐ＝０．０３１）。
【００６４】
まとめると、予備臨床試験データは、ＭＦ１０１がのぼせの治療に対して安全であり、良好なコンプライアンスで実効可能に投与され得ることを示す。ＭＦ１０１は、のぼせの頻度および重症度を低減させた。しかしながら、その効果は小さかった。この試験の結果を表７Ａに示す。この表は、２２名のうち７名の患者が４０％より高い閉経期症状の低減を示したことを示す。
【表７Ａ】
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【実施例１２】
【００６５】
実施例１２−漸増用量試験
実施例１１に示したものよりも期間が長く、高用量のＭＦ１０１との比較を含めた、フェーズＩＩ試験のための二重盲検プラセボ対照比較無作為臨床試験を実施する。ＭＦ１０１の用量は、ＭＦ１０１の乾燥重量で５グラムを１日２回、およびＭＦ１０１の乾燥重量で１０グラムを１日２回とする。試験薬物治療は、ハーブティーの苦味に起因し得る胃腸の病訴の数の低減を意図して、および液状エキスの味のまずさによる試験の中止を最小限にするため、カプセル形態内に封入する。
【００６６】
結論
ＥＲαは乳癌細胞増殖を促進するが、ＥＲβは増殖および腫瘍形成を抑止するという観察結果に基づき、ＥＲβ選択的エストロゲンは、乳癌を促進させないはずであり、のぼせを抑制する可能性がある。本明細書における結果は、ＭＦ１０１が、遺伝子の転写をＥＲβによって、補助調節タンパク質を選択的に漸増させることにより調節することを示す。ホルモン療法におけるエストロゲンとは異なり、ＭＦ１０１は、ＭＣＦ−７細胞の増殖を刺激せず、増殖性遺伝子、ｃ−ｍｙｃおよびサイクリンＤ１も活性化させず、これは、ＭＦ１０１が乳癌を促進させないことを示す。上記の実施例１１に概要を示した試験では、ＭＦ１０１がなんら有害効果を誘発せず、治験を終了した２２名の女性のうち７名において、４０％より高いのぼせの低減をもたらした。この結果は、ＭＦ１０１がＥＲβ選択的エストロゲンを含むことを示し、ＭＦ１０１が、のぼせを抑制するためにホルモン療法で使用されている非選択的エストロゲンの、より安全な代替薬であることと整合する。
【００６７】
多くの女性は、ＨＴは有益性よりもリスクが勝ることが示された女性の健康イニシアチブの治験の結果以来、閉経期症状のためのＨＴに使用される安全で有効なエストロゲン代替薬を心待ちにしている。その一方で、最近の調査により、閉経周辺期および閉経後の女性の７９％が、植物性の食品サプリメント（ＢＤＳ）を使用していることが報告された。ＢＤＳが広く使用されているにも関わらず、植物性物質の作用機序、有効性および安全性は、厳密には調べられていなかった。ＭＦ１０１は、のぼせや他の更年期症状を軽減するための伝統的な漢方薬（Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＴＣＭ）に従来より使用されされている２２種類の個々のハーブを含む配合物である。本明細書における結果は、ＭＦ１０１が、選択的エストロゲン受容体活性を有し、のぼせを抑制するために臨床的に使用され得ることを示す。
【００６８】
ＭＦ１０１がＥＲβ選択的であるという所見は、女性ののぼせの治療におけるＥＲβ役割を調べるための、またとない機会を提供する。上記に論考したように、ＭＦ１０１の単群の前向きフェーズ１臨床試験を、年齢が４０〜６０歳であり、１日に≧７回の中等度から重度ののぼせ、または１週間に≧５０回の中等度から重度のののぼせを訴える、外科的に誘導された、または自然な閉経後の健常な女性において行った。この治験の最初の３０日間（導入期間）に、のぼせの頻度および重症度の毎日の一日の記録を含むベースライン転帰の測定、ならびに血液検査値、血液化学、肝機能、腎機能およびホルモンの状態の検査測定値を取得した。導入期間後、女性を、１日２回で３０日間、５ｇｍの経口ＭＦ１０１エキス（水で再構成）で治療した。治療期間の終了時、同じ転帰の測定を繰り返した。２２名の女性がこの治験を終了した。のぼせの頻度と重症度の両方において、統計学的に有意な低減がみられた。のぼせの平均頻度は、１週間あたりののぼせが、ベースライン時での５７．３から治療後では４４．９に減少した（ｐ＝０．００３、対応のあるｔ検定）（データ示さず）。また、のぼせスコア（頻度に重症度を乗算）も、ベースライン時では９８．０から、治療後では８１．７に減少した（ｐ＝０．０３１、対応のあるｔ検定）。７名の女性は、４０％より高い（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈｅｎ）のぼせの低減を報告した（表１）。このデータは、ＭＦ１０１が、中等度から重度の症状を有する一部の女性において、のぼせの頻度および重症度を低減させることを示す。
【００６９】
前述の実施例は、ＭＦ１０１が、ＥＲβ媒介性転写経路のみを誘発することを示す。驚くべきことに、ＭＦ１０１は、精製ＥＲαと精製ＥＲβに等しく結合する。この観察結果は、精製ＥＲとのリガンド結合活性についてのみ化合物をスクリーニングすることは、ＥＲサブタイプ特異的化合物の有効な新薬発見ストラテジーとはなり得ないことを示す。ＭＦ１０１のＥＲβ選択性は、ＥＲβがＥＲＥに結合することを可能にし、補助調節因子（ＧＲＩＰ１およびＣＢＰなど）が漸増するコンホメーションを構成する自身の能力に起因していることが示された。ＭＦ１０１によるＥＲβへのコアクチベータの選択的な漸増は、ＥＲαがＭＣＦ−７乳癌細胞の細胞増殖と腫瘍形成を媒介するのに対して、ＥＲβはＥＲ陽性乳癌細胞において腫瘍抑制因子としての機能を果たすため、臨床的に重要である（Ｐａｒｕｔｈｉｙｉｌ，Ｓ．ら、「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  Ｇ２  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，４２３−８（２００４）、Ｓｔｒｏｍ，Ａ．ら、「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  １７ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｔ４７Ｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１５６６−７１（２００４））。ＥＲαへのコアクチベータの漸増の欠如は、ＭＦ１０１がｃ−ｍｙｃおよびサイクリンＤ１の転写を活性化せず、ＭＣＦ−７細胞の増殖も刺激しなかったという観察結果の説明となり得る。
【実施例１３】
【００７０】
調製例１３−多種類の活性物質のハイスループットＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量
調製例１に開示した２２種類の乾燥ハーブ材料を粉砕し、メタノール／水（８０／２０）溶液で３０分間抽出し（室温、５００ｒｐｍ）、次いで、５分間（４℃、１３，０００ｒｐｍ）遠心分離した。上清みをタンパク質沈殿用バイアル（ｖｉａｌｄ）に移した。１２種類のポリフェノール系化合物（ニアソール、リクイリチン、リキリチゲニン、イソリキリチゲニン、カリコシン、四環系イソフラボン、エモジン、レイン、ルテオリン、７，４’−ジヒドロキシフラボン、スクテラリンおよびスクテラレイン）を、メタノール／水（８０／２０）溶液中にスパイクすることにより、検量物質を作製した。内部標準（２’，４’−ジヒドロキシカルコン）を含むメタノールを、標準物質、ＱＣおよびハーブエキスに、タンパク質沈殿のために添加した。生物学的試料調製物は、抽出時間を短くしたこと（５分）以外は同様にして取り扱った。上清み（２０μＬ）をオンライン抽出カラム上にインジェクトした。切り替え弁を作動させ、被検物質を分析用カラムにバックフラッシュさせた。被検物質を分離し、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳシステムにてターボスプレーネガティブＳＲＭモードで定量した。
【００７１】
予備結果
ハイスループットで感度のよいＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による、中国漢方薬および種々の生物学的マトリクス中の多種類の生体活性物質−ポリフェノール系化合物の同時定量を開発し、異なるマトリクス、すなわちヒト血漿、ヒト尿、イヌ血漿、ラット血漿、マウス血漿および種々の比率の水溶液／メタノール溶液において確認した。
【００７２】
試料調製物および抽出手順は充分に最適化した。試料の振盪時間は、生物学的試料およびハーブエキスで、それぞれ５分および３０分とした（５００ｒｐｍ、室温）。至適遠心分離時間は、すべての試料で、１３，０００ｒｐｍにて１５分間（４℃）であった。内部標準を含む抽出溶媒として使用したものは１００％メタノールであった。抽出時の絶対回収率は＞８５％であった。予備結果により、血漿（ヒト、ラット、イヌ、マウス）中での５回の凍結解凍サイクルでは、変化はないことが示された。生物学的試料中の活性物質はすべて、高温環境（室温、℃）で保存した場合、少なくとも２日間（これは、分析者が充分に解析手順を遂行できる時間である）安定であった。より低温（−２０、−８０℃）では、数ヶ月間安定である。抽出された活性物質は、自動試料採取装置（４℃）では、２日間にわたって安定である。被検物質シグナルによるイオン抑制干渉は検出されなかった。ブランク血漿またはメタノールでの試料の１００倍までの希釈は、正確度に影響しなかった。
【００７３】
この方法は高感度である。０．０２５〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲の線形性は、種々のマトリクスの種々の活性物質に依存した。カラムの定量下限（ＬＬＯＱ）は、ほとんどの活性物質（例えば、リキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｔｉｇｅｎｉｎ）、カリコシン、イソリキリチゲニンおよびレイン）で０．５ｐｇであった。リクイリチン、ルテオリンおよび７，４’−ジヒドロキシフラボンは、カラム上で１ｐｇのＬＬＯＱレベルを有する。ニアソール、スクテラリンおよびスクテラレインは、１０ｐｇのＬＬＯＱを有する。このアッセイは、所定の許容基準をすべて満たし、大規模薬物動態試験に好適である。
【００７４】
実験
試料の調製および機器
タンパク質沈殿／内部標準溶液（２’，４’−ジヒドロキシカルコン、１００％ＭｅＯＨ中）は、ストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）から毎月、新たに調製し、使用のために４℃で保存した（室温に６時間より長く曝露すべきでなく、抽出から次の抽出までは４℃で保存しなければならない）。この溶液は、標準物質、ＱＣおよび試料（生物学的試料またはハーブエキス）に、タンパク質沈殿のために添加した。試料を室温で解凍後、組織試料を０．１Ｍのリン酸バッファー中で均質化し、終濃度を２５０ｍｇ／ｍＬとした。試料は、３７℃で３０分間（血漿）または２時間（組織）インキュベートする。タンパク質沈殿用試薬（６００μＬ）を試料（３００μＬ）に添加し、回転式振盪機にて２．５分間（組織の場合は３０分間）、５００ＲＰＭおよび室温で混合した。次いで、試料を１３，０００ＲＰＭで４℃にて１５分間遠心分離した。乾燥ハーブ材料を磨砕して粉末にし、次いで、メタノール／水（８０／２０、ｖ／ｖ）で３０分間室温にて、回転式振盪機において３０分間抽出した。１３種類のポリフェノール化合物（ＢＮＥＲ１１０１、ＢＮＥＲ１１０３、ＢＮＥＲ１１０４、ＢＮＥＲ１１０５、ＢＮＥＲ１１０６、ＢＮＥＲ１１０８、ＢＮＥＲ１１０９、ＢＮＥＲ１１１２、ＢＮＥＲ１１１４、ＢＮＥＲ１１１５、ＢＮＡＣ５５０１、ＢＮＡＣ５５０２およびＢＮＡＣ５５０３）を、全試験マトリクス中にスパイクすることにより検量物質を作製した。次いで、上清み（２０μＬ）を、ＡＰＩ５０００  ＭＳ／ＭＳと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ２Ｄ−ＨＰＬＣシステムにインジェクトした。使用した移動相は、ＭｅＯＨ（１００％）および０．０８８％ギ酸含有水であった。線形勾配は、４０％ＭｅＯＨから開始し、４分間で１００％ＭｅＯＨまで傾斜させた。全泳動時間は８分間であった。カラム温度は６５℃に設定した。イオンはネガティブＳＲＭモードで記録した。以下のイオン輸送を主な活性物質についてモニタリングした。ＢＮＥＲ１１０１：ｍ／ｚ＝２５１→９３、ＢＮＥＲ１１０３：ｍ／ｚ＝４１７→２５５、ＢＮＥＲ１１０４：ｍ／ｚ＝２５５→１３５または２５５→１１９、ＢＮＥＲ１１０５：ｍ／ｚ＝２８３→２６８、ＢＮＥＲ１１０６：ｍ／ｚ＝２５５→１１９、ＢＮＥＲ１１１５：ｍ／ｚ＝２５３→１１７およびＩＳ：ｍ／ｚ＝２３９→９１。
【００７５】
結果および結論
ハイスループットで感度のよいＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いた、生物学的試料および漢方薬草エキス中の多種類の生体活性ポリフェノール化合物の同時定量を開発し、種々のマトリクス、すなわちヒト血漿、ヒト尿、イヌ血漿、ラット血漿、マウス血漿、ラット肝臓および種々の比率の水溶液／メタノール溶液において確認した。このアッセイは、ヒト血漿で充分に確認された。図１は、すべての活性物質および内部標準のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００７６】
６種類の主な活性成分の抽出効率試験では、８０％より高い回収率が示された（図１４）。この方法はハイスループットで感度がよく、すべての活性物質に対して広い線形性を有した。検出限界（ＬＯＤ）は、ＢＮＥＲ１１０１、ＢＮＥＲ１１０４、ＢＮＥＲ１１０５およびＢＮＥＲ１１０６では０．０２５ｎｇ／ｍＬ、ＢＮＥＲ１１０１では０．１ｎｇ／ｍＬ、およびＢＮＥＲ１１１５では０．２５ｎｇ／ｍＬであった。ＬＯＤはすべて、３：１より大きい信号雑音比に基づいたものであった。定量下限（ＬＬＯＱ）は、ＢＮＥＲ１１０１（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＮＥＲ１１０６（０．１ｎｇ／ｍＬ）およびＢＮＥＲ１１１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）以外のすべての活性物質で０．０５ｎｇ／ｍＬであった。ＬＬＯＱの信号雑音比は８より大きかった。この方法の検量曲線は、ＢＮＥＲ１１０３、ＢＮＥＲ１１０４およびＢＮＥＲ１１０５では０．０５から５０ｎｇ／ｍＬまで線形であり、ＢＮＥＲ１１０６では０．１から５０ｎｇ／ｍＬまで線形であり、ＢＮＥＲ１１１５およびＢＮＥＲ１１０１では、０．５から５０ｎｇ／ｍＬまで線形であった（すべてｎ＝６）。線形範囲は、０．９９５より大きいの回帰係数（ｒ）によって判定した。６つの生物学的マトリクスの６種類の主な活性物質の典型的な標準曲線パラメータを図１２および表８に示す。
【表８】
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【００７７】
１日のうちでの正確度は、±１０％（９１．８〜１０８．９％）よりも良好であり、１日のうちでの精密度は１４％よりも良好であった。また、このアッセイを、いくつかの生物学的マトリクス（イヌ血漿、ラット血漿、マウス血漿、ヒト尿およびラット肝臓）ならびに種々の組み合わせのＭｅＯＨ／水溶媒（８０／２０  ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、５０／５０  ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏおよび１００％Ｈ２Ｏ）でも確認した。この確認は、異なる分析者が異なる機器（ＡＰＩ５０００およびＡＰＩ４０００  ＱＴｒａｐ）で行った。
【００７８】
該６種類の被検物質と内部標準からなるストック溶液は、室温で少なくとも６時間安定である。機器のインジェクション再現性は高く、精密度は、９５％インジェクションで６％よりも良好であった。３回の凍結解凍サイクル後、活性物質はすべて、すべての濃度レベルで分解は観察されなかった（図１３）。ほとんどの被検物質は、５回のサイクル後も回収率はなお高かった。ＢＮＥＲ１１０６を除き（これは、５回のサイクル後、回収率はほぼ７５％であった）、９４％より高い回収率が得られ得る。ヒト血漿中での６種類のＭＦ１０１活性物質は安定であり、低濃度レベルおよび中濃度レベルのどちらの場合も、室温で保存時、２４時間以内に有意な分解は観察されなかった。
【００７９】
まとめると、ＢＮＥＲ１１０１、ＢＮＥＲ１１０３、ＢＮＥＲ１１０４、ＢＮＥＲ１１０５、ＢＮＥＲ１１０６、ＢＮＥＲ１１１５の定量のため、およびヒト、マウス、ラットおよびイヌ血漿、ならびにヒト尿、ラット肝臓および種々の組み合わせのＭｅＯＨ／水における、所定の許容基準をすべて満たしたＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの開発および確認。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、かかる実施形態は単なる一例として示したものであることは、当業者に自明であろう。本明細書において本発明を逸脱することなく、数多くの変形例、変更例および置換例が当業者に想起されよう。本発明の実施において、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の択一例が使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、この特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにその均等物は特許請求の範囲に包含されるものとする。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、かかる実施形態は単なる一例として示したものであることは、当業者に自明であろう。本明細書において本発明を逸脱することなく、数多くの変形例、変更例および置換例が当業者に想起されよう。本発明の実施において、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の択一例が使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、この特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにおよびその均等物は特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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