(57)【要約】  本発明は、オルタナティブな調整により産生されたヒトソマトスタチン受容体タイプ５の、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃと呼ばれ、腫瘍の過程で使用される可能性のある２つの新規アイソフォームをコードする配列を包含する２つのヒト核酸に関する。加えて本発明は異なる組織において、ＰＣＲ技術という手段による前記アイソフォームの示差的検出に使用するオリゴヌクレオチドペアに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｓｔ５Ｂ（配列番号５）、ｓｓｔ５Ｃ（配列番号７）、その相補的配列、および先の配列と少なくとも９０％の相同性をもつ配列、ならびに先の配列由来のフラグメント、より選択されるヒトソマトスタチン受容体タイプ５（ｓｓｔ５）のアイソフォームをコードする配列を含むことを特徴とする、精製ヒト核酸。
【請求項２】
ｓｓｔ５Ｂに対応する３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲフラグメント、すなわち配列番号１である配列、またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、請求項１に記載の精製ヒト核酸。
【請求項３】
ｓｓｔ５Ｃに対応する３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲフラグメント、すなわち配列番号３である配列、またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、請求項１に記載の精製ヒト核酸。
【請求項４】
請求項１から３の１項に定義されたオリゴヌクレオチドによりコードされるアミノ酸のその配列を特徴とする精製ポリペプチド。
【請求項５】
転写用に外来のプロモーターと結合させた、請求項１から３の１項に定義されたヌクレオチドの配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
請求項４で定義されたポリペプチドをコードするヌクレオチドの前記配列を特徴とする、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
以下：配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７より選択されるヌクレオチドの前記配列を特徴とする、請求項５または６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
ヒトｓｓｔ５アイソフォームのアイソフォームＡ、Ｂ、およびＣが、ＰＣＲにより増幅されることを可能にすることを特徴とする、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４の配列、または少なくとも９０％までそれらと相同な配列により定義される、オリゴヌクレオチドのペア。
【請求項９】
ＰＣＲのあらゆる変法による、アイソフォームｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃの選択的増幅のための、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
正常組織および腫瘍組織におけるｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃの組織分布の研究のための請求項９に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
請求項１に定義された全配列および部分配列とハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡコピー。
【請求項１２】
ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの遺伝子の発現を独立してまたは一緒にサイレンシングする能力があることを特徴とする、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７、または少なくとも９０％まで相同な配列に含有されるＤＮＡコピー。
【請求項１３】
ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームを識別する選択的抗体を作成するための、請求項１に定義された配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５の２つの新規アイソフォーム、ならびに生物学的サンプルにおけるそれらの検出に言及する。
【背景技術】
【０００２】
視床下部ニューロペプチドのソマトスタチン（ＳＲＩＦ）は、他のホルモンの分泌および制御、またはその他の多様な生物学的過程のいずれかにわたり、基本的には阻害効果を発揮することで、多数の臓器で作用し、全身の組織を標的にする (Moller et al., 2003)。
【０００３】
一般的には阻害であるが、場合によっては刺激することもあるこの作用(Castano et al., 1996)は、ソマトスタチン受容体またはｓｓｔ受容体とも呼ばれる、７回膜貫通ドメイン（７ＴＭＤ）タイプのＧタンパク質共役型受容体のファミリーにより発揮される。すべてのｓｓｔは、膜内に挿入された７つの疎水性ドメイン（８つの親水性ドメインにより順に共に結合している）に接続した細胞外アミノ末端から成る共通の構造を共有し、そしてそれらは細胞内のカルボキシル末端で終わり、このカルボキシル末端がセカンドメッセンジャー経路の調節に重要となる。
【０００４】
現在までのところ哺乳類においては、ｓｓｔ１からｓｓｔ５までｓｓｔの５つの異なるサブタイプがあり、そしてまたマウスおよびラットにおいては、細胞内カルボキシル末端領域において２つの異なるタンパク質をコードする、前駆体メッセンジャーＲＮＡのオルタナティブな調整により産生されるサブタイプ２の２つのアイソフォーム（ｓｓｔ２Ａおよびｓｓｔ２Ｂ）があり、これらアイソフォームは、細胞内シグナリング経路の調節に関して異なる性質を提示する。しかし魚においては、アイソフォームの各々をコードするメッセンジャーＲＮＡの示差的調整の現象の代わりに遺伝子複製現象による、各受容体サブタイプのこれ以外のアイソフォームが発見された。
【０００５】
ｓｓｔを含むＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を通してのシグナル伝達経路により測定される、多数の医学的に関連のある細胞の過程に関与している。より特定すればこれらｓｓｔのサブタイプの１つであるヒトｓｓｔ５(WO 0177172, WO 0155319, WO 0136446, EP 1369698, WO 03104816)は、哺乳類における多数の多様な病態、例えば血液疾患および心血管疾患、中枢神経および末梢神経系の障害、癌、炎症過程、肝疾患、胃腸および尿生殖器の疾患(WO 03104816)に関連づけられている。
【０００６】
ヒトソマトスタチン受容体タイプ５、すなわちｓｓｔ５は、GI39756975、 GI21954086、GI13937340を含むがこれには限定されないアクセス番号にて公開データベースに記録されており、これらは、コード配列のＤＮＡコピーに属する配列、ならびに前記受容体の完全な遺伝子構造を含有するゲノム配列、そしてコード配列に加えてイントロンの配列および非コード５’および３’領域を含有するプロモーター領域、を含有する。現在まで、データベースに記録されているもの、および文献目録に完全に記載されているもの以外には、いかなる異なるオルタナティブなアイソフォームをもたらすヒトｓｓｔ５メッセンジャーＲＮＡのオルタナティブプロセシングも記載されてはいない。
【０００７】
ブタｓｓｔ５受容体のコード配列を含有するメッセンジャーＲＮＡに対応する配列、ならびに非コードの５’領域（ＧＩ５８２２３１４７）および３’領域が、最近クローン化された(Duran et al., 2005;印刷中)。ＲＡＣＥ  ＰＣＲ技術によるブタｓｓｔ５のクローニング過程の間に、オルタナティブな調整によりメッセンジャーＲＮＡバリアントの部分的配列、そして次には全配列が得られた。これら配列は、ラットｓｓｔ２のケースでそうであったように、２つの新規受容体アイソフォームをコードしていたが、このケースでは各々ブタのｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォーム（ｐ−ｓｓｔ５Ｂおよびｐ−ｓｓｔ５Ｃ）と呼ばれる、６回および３回膜貫通ドメインをコードしていた。
【０００８】
メッセンジャーＲＮＡのオルタナティブな調整により産生される切断型ＧＰＣＲに関するデータがあるが、このオルタナティブなＲＮＡは、以前にＧＨＲＨ受容体(Rekasi et al., 2000)、ＧｎＲＨ(Pawson et al., 2005)、プロスタグランジン(Ishii et al., 2001)等について記載されたように、７回より少ない膜貫通ドメインの構造を形成するタンパク質をコードし、これらの一部は腫瘍の過程に関連する可能性のある機能を有している。ブタｓｓｔ５について得られた結果に従って、ブタのｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームに相当する可能性あるヒト相同体のクローニングを、内分泌腫瘍におけるそれらの存在および有意性をＰＣＲ技術により後に評価することを目的として、ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより開始した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Moller LN, Stidsen CE, Hartmann B, Holst JJ. 2003. Somatostatin receptors（ソマトスタチン受容体）. Biochemica et Biophysica Acta, 1616: 1-84.
【非特許文献２】Castano JP, Torronteras R, Ramirez JL, Gribouval A, Sanchez-Hormigo A, Ruiz-Navarro A, Gracia-Navarro F. 1996. Somatostatin increases growth hormone (GH) secretion in a subpopulation of porcine somatotropes: evidence for functional and morphological heterogeneity among porcine GH-producing cells（ソマトスタチンはブタ成長ホルモン産生細胞の亜集団において成長ホルモン（ＧＨ）の分泌を増大する：ブタのＧＨを産生する細胞における機能的および形態学的異質性に関するエビデンス）. Endocrinology, 137:129-136.
【非特許文献３】Rekasi Z, Czompoly T, Schally AV, Halmos G. 2000. Isolation and sequencing of cDNAs for splice variants of growth hormone-releasing hormone receptors from human cancers（ヒト癌由来の成長ホルモン放出ホルモン受容体のスプライスバリアントに関するｃＤＮＡの単離および配列決定）. PNAS, 97: 10561-10566.
【非特許文献４】Pawson AJ, Maudsley S, Morgan K, Davidson L, Naor Z, Millar R. 2005. Inhibition of human type I gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR-I) function by expression of a human type II GnRHR gene fragment（ヒトタイプＩ性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ−Ｉ）の機能の、ヒトタイプＩＩＧｎＲＨＲ遺伝子フラグメントの発現による阻害）. Endocrinology. 146(6):2639-2649.
【非特許文献５】Ishii Y, Sakamoto K. 2001. Suppression of protein kinase C signaling by the novel isoform for bovine PGF2a Receptor1（ウシＰＧＦ２ａ受容体Ｉの新規アイソフォームによるプロテインキナーゼＣのシグナリングの抑制）. Biochemical and Biophysical Research Communications, 285: 1-8.
【非特許文献６】Landa RL, Harbeck M, Kaihara K, Chepurny O, Kitiphongspattana K, Graf O, Nikolaev VO, Lohse MJ, Holz GG, Roe MW. 2005. lnterplay of Ca2+ and cAMP signaling in the insulin secreting MIN6 β-cell line（インスリン分泌ＭＩＮ６β細胞株におけるＣａ２＋およびｃＡＭＰのシグナリングの相互作用）. Journal of Biological Chemistry, 2;280(35):31294-31302.
【非特許文献７】Vilardaga JP, Bunemann M, Krasel C, Castro M & Lohse MJ. 2003. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells（生きている細胞におけるＧタンパク質共役型受容体のミリ秒の活性化スイッチの測定）. Nat Biotechnol 21 807-812.
【発明の概要】
【００１０】
以下の概念を、本文の適切な解釈のために詳述する：
“ソマトスタチン受容体”は、７回膜貫通ドメイン型ファミリーのタンパク質に属する、グアニル酸シクラーゼタイプのタンパク質と共役する膜貫通タンパク質であり、ソマトスタチンタイプの視床下部ペプチドにより活性化される。
【００１１】
“ＲＡＣＥ−ＰＣＲ”は、ｃＤＮＡ末端の無作為増幅（Random Amplification of cDNA Ends）をいう。この方法は、公知のオリゴヌクレオチド配列を未知のｃＤＮＡ配列内に導入し、それを前記オリゴヌクレオチドと対象の領域の間に含まれるｃＤＮＡ領域の、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅のための標的配列として使用する、ＰＣＲに基づいた技術を必要とする。
【００１２】
下垂体性クッシング病は、“クッシング症候群”または副腎皮質機能亢進症をいう。これは、ホルモンのコルチゾールの産生の増加により、またはこのホルモンまたはその他のステロイドホルモンの過剰な使用により引き起こされる疾患である。クッシング症候群は、それが脳下垂体による副腎皮質刺激ホルモンの過剰な産生による場合、脳下垂体性である。
【００１３】
本発明は、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５（ｓｓｔ５）の２つの新規アイソフォームをコードするＤＮＡ配列の決定を含む。これらアイソフォームはｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃといい、各々５回および４回膜貫通ドメインを有し、アクセス番号ＧＩ１３９３７３４０にてデータベース内に規定されている遺伝子配列に含有されるメッセンジャーＲＮＡのオルタナティブな調整によりもたらされる（図１）。本発明を実施する方法において記載した手段により、ソマトスタチン受容体の構造モチーフを提示するポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、リコンビナントＤＮＡ分子を獲得する。本発明はまた制限された条件下で、これらの新規アイソフォームの配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドＤＮＡ配列にも言及する。このポリヌクレオチドＤＮＡ配列は、ヌクレオチドのその配列と少なくとも６０％の相同性のレベル、好ましくは７５％の相同性、そして理想的には９０％の相同性を伴うか、または遺伝子コードの変性によりもしくは変異誘発によりそれらから誘導されたものである。
【００１４】
本発明で使用する手段は、機能的なリコンビナントポリペプチドを後の研究のために獲得することを可能にする。発現ベクターが、ヌクレオチド配列、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７にて記載されたもの、またはそれらから誘導されたものを含有するという様式で、リコンビナントＤＮＡを発現ベクター中に挿入する。ホスト細胞内で発現ベクターにて発現される双方のポリペプチドは、選択的様式でin vivoおよびin vitroにおいてｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームに結合する能力のある新規薬剤および新規化合物を精査するシステム、ならびに薬剤への応答において、個々のアイソフォームに関するセカンドメッセンジャーの経路の調節を研究するシステムを提供する。
【００１５】
このように本出願の主題である本発明は、以下：ｓｓｔ５Ｂ（配列番号５）、ｓｓｔ５Ｃ（配列番号７）、その相補的配列、および先の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列、ならびに先の配列のフラグメント、より選択されるヒトソマトスタチン受容体タイプ５（ｓｓｔ５）のアイソフォームをコードすることを特徴とする、精製ヒト核酸に言及する。
【００１６】
同様に本発明はまた、配列番号１および配列番号３を含有する部分コード配列を含むことを特徴とする、精製ヒト核酸に言及する。
【００１７】
具体的な態様において本発明は、ｓｓｔ５Ｂに対応する３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲフラグメント、すなわち配列番号１である配列、またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、ヒト核酸に言及する。もう１つの特定の態様において本発明は、ｓｓｔ５Ｃに対応する３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲフラグメント、すなわち配列番号３である配列、またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、ヒト核酸に言及する。
【００１８】
好ましい態様において、本発明は、本文中で先に記載したオリゴヌクレオチドの１つによりコードされる、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８にて定義されるアミノ酸のその配列を特徴とする、精製ポリペプチドに言及する。
【００１９】
さらに本発明は、転写用に外来のプロモーターと結合させた先に記載したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、発現ベクターに言及する。具体的な態様においてその発現ベクターは、本文中で先に記載したようなポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を特徴とする。
【００２０】
具体的な態様において上に記載した方法は、in vitroで行うことを特徴とする。好ましい態様において前記研究は完全な細胞において行う。好ましい態様において前記方法は、本文中で先に定義した発現ベクターに由来する配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８に詳述したポリペプチドを特徴とする。より好ましい態様において前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのフラグメントによりコードされるものの１つに対応する。
【００２１】
さらに本発明はまた、ｓｓｔ５ヒトアイソフォームＡ、Ｂ、およびＣがＰＣＲにより増幅されることを可能にする配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４にて詳述したオリゴヌクレオチド、またはそれらと少なくとも９０％まで相同な配列、の新規ペアに言及する。具体的な態様において本発明は、ＰＣＲのあらゆる変法によりｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームを選択的に増幅するための前記オリゴヌクレオチドの使用に言及する。好ましい態様において本発明はまた、正常組織および腫瘍組織におけるｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、またはｓｓｔ５Ｃの定量的な組織分布の研究のための前記オリゴヌクレオチドの使用に言及する。
【００２２】
もう１つの具体的な態様において本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に含有される全配列または部分配列と、ハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡコピーに言及する。
【００２３】
さらに本発明はまた、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの遺伝子発現を独立してまたは一緒にサイレンシングする能力のあることを特徴とする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または少なくとも９０％まで相同な配列、に含有されるＤＮＡコピーに言及する。
【００２４】
本発明の具体的な態様は、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォーム間を識別する選択的な抗体を作成するための、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に含有される配列の使用に言及する。
【００２５】
本発明はまた、セカンドメッセンジャーを測定する技術、例えば細胞内カルシウムの顕微蛍光測定法 (Landa et al., 2005) を使用することにより、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用する、ソマトスタチン受容体タイプ５の新規アイソフォーム、すなわちｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃと、選択的に結合する能力のある新規薬剤の開発を可能にする。より具体的には、ｐＣＤＮＡ３(Invitrogen)タイプの真核生物発現ベクターに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７、またはそれらの誘導体に含有されるリコンビナントＤＮＡを挿入することで、他のソマトスタチン受容体サブタイプの研究に関して広く使用されているＣＨＯ−Ｋ１またはＨＥＫ−２９３Ｔタイプの腫瘍細胞株における、これらのリコンビナント構造の形質移入を可能にする。この方式、すなわちLandaら(Landa et al., 2005)のより詳細な様式に見られる方法論は、以下に示すような一般的様式にまとめられると思われる：
（１）滅菌したガラスのスライドカバーを使用しての、形質移入を行う細胞株の培養。
【００２６】
（２）対象のリコンビナントプラスミドを用いての細胞株への形質移入。
【００２７】
（３）形質移入された細胞の、２．５μＭのＦｕｒａ−２  ＡＭ (Molecular Probes, Eugene)と共に３０分間、３７℃、２０ｍＭのＮａＨＣＯ３を補充したＤＭＥＭ培地  ｐＨ７．４中でのインキュベーション。
【００２８】
（４）倒立顕微鏡と接続したカメラ、例えばHamamatsu ＣＣＤ カメラ(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu)と接続したNikon Eclipse TE 2000 Eへの、細胞が付着したスライドカバーのセット、これら装置は双方ともMetaMorph およびMetaFluor (Molecular Devices)ソフトウェアでコントロールする。
【００２９】
（５）４０Ｘ油浸対物レンズを用いて、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの選択された励起光を入射させ、５０５ｎｍへのアウトプットシグナルを５秒間隔で測定することによる、形質移入した細胞の解析。
【００３０】
（６）課題の薬剤の投与前後での細胞内Ｃａ２+濃度の変化を、MetaFluorソフトウェアを使用することにより、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの各励起波長で得られた画像強度の商として解析する。
【００３１】
本発明はまた、ソマトスタチン受容体タイプ５の新規アイソフォームであるｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃの基底状態を変化させる薬剤の開発を可能にする。この様式において、本発明は、ＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer、蛍光共鳴エネルギー移動)技術を使用して、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃの双方のアイソフォームのそれらの間の物理的相互作用、ならびにＧＰＣＲファミリーに属するその他のタンパク質との相互作用を測定することを可能にする。この技術により、受容体の基底状態の変化を、それらが薬剤に応答して三元複合体タンパク質の凝集または解離を伴うかどうかについて、素早くそして正確に研究することができる。より具体的にはＥ−ＧＦＰＮ１ (Clontech)タイプの真核生物の発現ベクター、例えばＥ−ＣＦＰＮ１およびＥ−ＹＦＰＮ１への、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７、またはそれらの誘導体に含有されるリコンビナントＤＮＡを挿入することで、これらのリコンビナント構造をＨＥＫ−２９３ＡＤタイプ腫瘍細胞株において同時形質移入することを可能にする。
【００３２】
当該方式、すなわちVilardagaら(Vilardaga et al., 2003)のより詳細な様式に見られる方法論は、以下に示すような一般的な様式にまとめられると思われる：
（１）滅菌したガラスのスライドカバーを使用しての、形質移入を行う細胞株の培養。
【００３３】
（２）対象のリコンビナントプラスミドを用いての細胞株への同時形質移入。
【００３４】
（３）倒立顕微鏡と接続したカメラ、例えばHamamatsu ＣＣＤ カメラ(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu)と接続したNikon Eclipse TE 2000 Eへの、細胞が付着したスライドカバーのセット、これら装置は双方ともMetaMorph およびMetaFluor (Molecular Devices)ソフトウェアでコントロールする。
【００３５】
（４）４０Ｘ油浸対物レンズを用いて、４４０ｎｍおよび４９５ｎｍの選択された励起光を入射させ、５１０ｎｍおよび５４０ｎｍへのシグナルを各々５秒間隔で測定することによる、形質移入した細胞の解析。
【００３６】
（５）課題の薬剤の投与前後での双方の蛍光分子のシグナルの強度の変化を、MetaFluorソフトウェアを使用することにより、５１０ｎｍおよび５４０ｎｍの各励起波長で得られた画像強度の商として解析する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ技術によるｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームに対応する部分的配列の増幅図である。本文中に記載したステージを提示し、各ケースで使用したオリゴヌクレオチドを表１の命名法に従って表示する。
【図２】図２は、ＰＣＲ増幅技術およびトリプルライゲーション(triple ligation)によるｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームのコード配列の増幅図である。本文中に記載したステージを提示し、各ケースで使用したオリゴヌクレオチドを表１の命名法に従って表示する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施例を本発明のより良い説明のために以下に記載するが、決して限定するものではない。
【００３９】
実施例
図１に記載した以下のステージは、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの部分配列をクローン化するため、続けて行った：
（１）様々な腫瘍組織の全ＲＮＡの単離および逆転写。
【００４０】
（２）ＲＡＣＥ  ＰＣＲによるｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの３'領域の増幅；および
（３）ステップ（２）で使用した配列中に入れ子にした（nested）オリゴヌクレオチドを使用して再度増幅。
【００４１】
（４）ステップ（３）からのＰＣＲ産物のクローニング、およびそれらの適当な配列を決定するためのシークエンシング。
【００４２】
（５）鋳型として（１）で作製したＤＮＡコピーを使用して、ＰＣＲによるｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの転写が開始することの立証。
【００４３】
（６）ステップ（５）で得られたＰＣＲのバンドの特異性を立証するための（５）の再度増幅。
【００４４】
記載した増幅法は、ステップ（５）および（６）を除き、Invitrogen（登録商標） Life Technologies “GeneRacer（登録商標） Kit”の指示に従って行った。
【００４５】
図２に示した戦略は、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームのコード配列のクローン化、および機能的発現に使用した。
【００４６】
（１）各アイソフォームに対応する双方のエクソン１（Ｅ１）およびエクソン２（Ｅ２）を、ヒトゲノムＤＮＡから増幅した。
【００４７】
（２）ＰＣＲフラグメントの酵素による消化、および
（３）発現ベクター内でのエクソンＥ１およびＥ２の相互連結（図に示していない）。
【００４８】
加えて、ｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃの各アイソフォームを識別する能力を持つようにオリゴヌクレオチド（配列番号９から配列番号１４）のペアをデザインした。このペアは、本文に沿ってさらに詳述する特定のＰＣＲ条件下で、各アイソフォームを選択的に識別する定量的目的に使用することができる。
【００４９】
＜核酸の単離＞
ＲＮＡの単離。  これはInvitrogen（登録商標）の試薬Trizol を、同社により指示された推奨法に従って使用することにより行った。２例の機能不全と診断された下垂体腺腫瘍由来組織、および下垂体性クッシング病のサンプルを、クローニングのためにデザインした全ＲＮＡの単離のための出発材料として使用した。得られたＲＮＡは、最終容積１２μｌのＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ中に再懸濁し、そのうちの１μｌを分光高度法による定量に使用した。各々の腫瘍由来の２μｇのＲＮＡは、最終容積２０μｌ中での逆転写に使用した。“GeneRacerキット”のＨｅＬａ腫瘍細胞株由来のＲＮＡもまた使用し、同量のＲＮＡを逆転写反応に使用した（図１．１）。逆転写反応に関してはInvitrogen（登録商標）の“GeneRacer（登録商標）キット”の指示に従った。下垂体腫瘍組織の異質な一群 (battery)はまた診断目的にも使用し、それから１５および１００ｍｇの間の量を、全ＲＮＡの抽出に使用した。得られたＲＮＡはまた最終容積１２μｌのＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ中に再懸濁し、そのうちの１μｌを分光高度法による定量に使用した。各抽出の収量に従って、各々の腫瘍由来のＲＮＡの２μｇおよび５μｇ間の量を逆転写に使用した。逆転写反応は、２０μｌの総容積で、製造元の指示に従ってBD Biosciencesの“PowerScript”酵素を使用して行った。
【００５０】
ＤＮＡの単離。  これはInvitrogen（登録商標）の試薬Trizol を使用して、出発材料として１０７ヒトリンパ球を使用して行った。得られたゲノムＤＮＡを分光高度法により定量した。
【００５１】
＜ＰＣＲによる増幅、およびｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームの部分配列の獲得＞
先に示したように、Invitrogen（登録商標）の“GeneRacer（登録商標）キット”の市販の増幅システムは、表１に示した特異的にデザインされたオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用した。
【００５２】
【表１】
2011500047.tif 000002
【００５３】
逆転写反応の後１００ｎｇのＤＮＡコピーを、Ra_hum_sst5_3’ (配列番号１６)およびGeneRacer 3'オリゴヌクレオチド（図１．３）を使用しての各ＰＣＲ反応に使用した。このＰＣＲ反応ではサンプルは、９４℃で最初の２分の変性、続いて５サイクルの９４℃で３０秒の変性、そして７２℃で１分３０秒のアラインメントおよび伸長、加えてさらに３５サイクルの、より低いストリンジェントな６６℃のアライメント温度を使用することを除いては先の方法と同じ条件での反応を行った。アラインメントプログラムは、不完全なＰＣＲ産物の合成を終了させるため、７２℃で７分の伸長を継続して行った。各ＰＣＲ産物から１μｌをRa_hum_sst5_3'N (SEQ ID 17) およびGeneRacer 3'Nを入れ子にしたオリゴヌクレオチドを用いて再度増幅した（図１．４）。この反応ではサンプルは、９４℃で最初の２分の変性、そしてその後３２サイクルの９４℃で３０秒の変性、６６℃で３０秒のアラインメント、および７２℃で４０秒の伸長を行った。この増幅プログラムは、不完全なＰＣＲ産物の合成を終了させるため、７２℃で７分の伸長を継続して行った。複合体混合物に特異的なプラグ(plug)のついた Biotools Certampポリメラーゼの混合物を、双方の増幅に使用した。別々のＰＣＲ反応はすべてのＤＮＡコピーを用いて同時に行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで観察し、得られたバンドをQuiaQuick Mini Elute (Quiagen)の市販キットを使用して精製した。この様式で精製したＰＣＲ産物を、pBluescript KSII+ ベクターの EcoRV 制限部位の平滑末端を用いてクローン化し、配列決定し、HeLa細胞のＤＮＡコピーから得た６０９塩基対（配列番号１）に対応する配列、および下垂体性“クッシング病”由来のＤＮＡコピーから得た１９７塩基対（配列番号３）のもう１つの配列を結果として得た。次に、HeLa細胞および下垂体性“クッシング病”から得た双方のＤＮＡコピーを、Hum_sst5_ATG（配列番号１５）およびGeneRacer 3'オリゴヌクレオチド（図１．５）を用いて増幅し、これらの反応の産生物を、同じHum_sst5_ATGオリゴヌクレオチドおよびGeneRacer 3'Nの入れ子にしたオリゴヌクレオチドを用いて再度増幅した（図１．６）。双方のＰＣＲ増幅反応に関して同じプログラムを、すなわち９４℃で最初の２分の変性、続いて４０サイクルの９４℃で３０秒の変性、６２℃で３０秒のアラインメント、および７２℃で１分３０秒の伸長から成るプログラムを使用した。１％アガロースゲルの観察は、HeLa細胞のＤＮＡコピーから得られたおよそ１キロベースのバンド、および下垂体性“クッシング病”のＤＮＡコピーから得られたおよそ７００塩基対のもう１つのバンドの存在が証明されることを可能にした。この結果は、相同なブタ配列と類似して、各々ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃという双方のアイソフォームが、ｓｓｔ５Ａアイソフォームと共通の翻訳の推定開始部分を共有することが証明されることを可能にした。ｓｓｔ５Ａアイソフォームの配列は以前より公知であり、アクセス番号ＧＩ３９７５６９７５によりデータベースにて利用可能である、
＜ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームに対応するコード配列の獲得＞
各アイソフォームを包含する２つのエクソンの独立した増幅（図２）、ならびに真核生物発現ベクター内での双方のフラグメントをその後連結することを基本とする戦略は、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームのクローニングおよび機能的発現のため、続けて行った。より具体的には、鋳型としてゲノムＤＮＡから出発し、各アイソフォームのエクソン１（Ｅ１）をＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲでは、ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃの共通のセンスオリゴヌクレオチドであるsst5B-C_E1_U_HindIII（配列番号１８）（HindIII酵素のための制限酵素認識配列を組み込んでいる）、および各アイソフォームに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち各々ｓｓｔ５Ｂおよびｓｓｔ５Ｃに関するsst5B-E1_L_blunt （配列番号１９）およびsst5C-E1_L_blunt（配列番号２２）を使用した（図２．１および３．２）。エクソン２（Ｅ２）は、センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異的なペア、すなわちアイソフォーム５Ｂに関してはsst5B-E2-U_blunt （配列番号２０）/ sst5B-E2-L_BamHI （配列番号２１）、そしてアイソフォーム５Ｃに関してはsst5C-E2_U_blunt（配列番号２３）/ sst5C-E2_L_BamHI（配列番号２４）を用いて、類似の様式で増幅した。４つのＰＣＲ反応は、９４℃で最初の２分の変性、続いて３４サイクルの９４℃で３０秒の変性、６２℃で３０秒のアラインメント、および７２℃で４０秒の伸長から成るプログラムを使用して、同時に行った。各ケースにおいて、高いフィデリティーのポリメラーゼとしてPfu Ultra (Stratagene)タイプのコピーを、１Ｍ  ベタイン(Sigma)を反応液に補充して使用した。これらのＰＣＲ反応を通して、HindIII酵素のための制限酵素認識配列は、各Ｅ１の５’末端、Ｅ１の３’平滑末端、Ｅ２の５’平滑末端に、そしてBamHI酵素のための制限酵素認識配列は、各Ｅ２の３’末端に組み込むことができた。制限酵素が対象の配列内に付加的な切断部位を持つことはないことは、以前にに証明されている。得られたＰＣＲフラグメントは、QuiaQuick Mini Elute (Quiagen)市販キットを使用することにより精製し、HindIIIおよびBamHIを用いての酵素による消化の後、先の制限酵素で直線化しておいたｐＣＤＮＡ３＋(Invitrogen)真核生物発現ベクター内へのトリプルライゲーション反応(triple reaction)により連結した。sst5B-pCDNA3+ およびsst5C-pCDNA3+の構造は双方とも、配列の完全性を確認するため少なくともダブルで配列し、BLAST 2 SEQUENCES プログラムhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgiを使用することにより、２つのアイソフォームを含有するＧＩ１３９３７３４０ゲノム配列と比較した。
【００５４】
＜定性的目的のための、ｓｓｔ５Ａ、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃのアイソフォームに対応する部分配列の選択的示差的増幅＞
ヒトｓｓｔ５、ｓｓｔ５Ａ（ＧＩ３９７５６９７５）、ｓｓｔ５Ｂ、およびｓｓｔ５Ｃのアイソフォーム各々をＰＣＲにより選択的に識別することを可能にする、オリゴヌクレオチドのペアを診断目的のため開発した。各々配列番号９および配列番号１０のHum_sst5A_cuant_U / Hum_sst5A_cuant_Lのオリゴヌクレオチドのペアは、６８℃のアラインメント温度を使用して１５４塩基対のＰＣＲ産物を増幅する。各々配列番号１１および配列番号１２のHum_sst5B_cuant_U / Hum_sst5B_cuant_Lのオリゴヌクレオチドのペアは、６８℃のアラインメント温度を使用して、ｓｓｔ５Ｂに対応する配列（配列番号５）中に含有される１４２塩基対のＰＣＲフラグメントを増幅するが、ｓｓｔ５Ｃまたはｓｓｔ５Ａ（ＧＩ３９７５６９７５）のアイソフォームは増幅しない。一方このペアは、ｓｓｔ５ＢアイソフォームのエクソンＥ１およびエクソンＥ２間に位置するイントロンを含むＧＩ１３９３７３４０ヒトゲノム配列に含有される１６４３塩基対の増幅産物を産生する。各々配列番号１３および配列番号１４のHum_sst5C_cuant_U / Hum_sst5C_cuant_Lのオリゴヌクレオチドのペアは、６８℃のアラインメント温度を使用して、ｓｓｔ５Ｃに対応する配列（配列番号６）中に含有される１３７塩基対のＰＣＲフラグメントを増幅し、そしてｓｓｔ５Ｂに対応する配列中に含有される４８８塩基対のフラグメント、およびアイソフォームｓｓｔ５ＣのエクソンＥ１およびエクソンＥ２の間に位置するイントロンを含む、ヒトゲノム配列ＧＩ１３９３７３４０に含有される１９８９塩基対の別のフラグメントもまた増幅する。この３つのＰＣＲ反応は、９４℃で最初の２分の変性、そして３７サイクルの９４℃で１０秒の変性、６８℃で１０秒のアラインメント、および７２℃で１０秒の伸長から成る共通のＰＣＲプログラムを使用して、同時に行った。これらのＰＣＲ条件を使用することにより、オリゴヌクレオチドの各ペアは、先に述べた他の付加的な配列を増幅することなく、各アイソフォームの特異的なＰＣＲフラグメントだけを選択的に増幅する。各ケースにおいて、反応には１Ｍ  ベタイン(Sigma)を補充した。この方法論は、臨床的に機能不全と分類される様々な下垂体腫瘍において、ｓｓｔ５Ｂアイソフォームの選択的存在が観察されることを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月22日(2010.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５若しくはその相補的核酸または配列番号７若しくはその相補的核酸と少なくとも９０％の相同性をもつ、精製されたソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログ。
【請求項２】
前記精製された核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号５若しくはその相補的核酸または配列番号７若しくはその相補的核酸である、請求項１に記載の精製されたソマトスタチン受容体タイプ５核酸。
【請求項３】
配列番号１若しくはその相補的核酸または配列番号３若しくはその相補的核酸と少なくとも９０％の相同性をもつ、精製されたソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログ。
【請求項４】
前記精製された核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号１若しくはその相補的核酸または配列番号３若しくはその相補的核酸である、請求項３に記載の精製されたソマトスタチン受容体タイプ５核酸。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８と少なくとも９０％の相同性をもつ、精製されたソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド、そのフラグメント、またはホモログ。
【請求項６】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８である、精製されたソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド、そのフラグメント、またはホモログ。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４、または、その精製されたフラグメントまたはホモログである、請求項６に記載の精製されたソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号６または配列番号８、または、その精製されたフラグメントまたはホモログである、請求項６に記載の精製されたソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド。
【請求項９】
ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログを含む発現ベクターであって、該ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７、またはそれらの相補的核酸と少なくとも９０％の相同性をもつ、前記発現ベクター。
【請求項１０】
前記ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７、またはそれらの相補的核酸である、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号１、またはその相補的核酸である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、フラグメント、またはホモログが、配列番号３、またはその相補的核酸である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸であって、
（ａ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４と少なくとも９０％の相同性をもち、且つ、
（ｂ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸のＰＣＲ増幅のために有用である、
前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸。
【請求項１４】
精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸であって、
（ａ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４と少なくとも９０％の相同性をもち、且つ、
（ｂ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７と少なくとも９０％の相同性をもつヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸のＰＣＲ増幅のために有用である、
前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸。
【請求項１５】
精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸であって、
（ａ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４と少なくとも９０％の相同性をもち、且つ、
（ｂ）前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７のヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸のＰＣＲ増幅のために有用である、
前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７のヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸のＰＣＲ増幅のために有用である、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４の精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸。
【請求項１７】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４と少なくとも９０％の相同性をもつ精製されたオリゴヌクレオチド、それらのフラグメント、ホモログ、または相補的核酸が、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸のＰＣＲ増幅のために利用される、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸を選択的に増幅する方法。
【請求項１８】
前記増幅されたヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７と少なくとも９０％の相同性をもつ、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅されたヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記精製されたオリゴヌクレオチド、フラグメント、ホモログ、またはそれらの相補的核酸が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４からなる群から選択され、前記増幅されたヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４と少なくとも９０％の相同性をもつ精製されたオリゴヌクレオチド、またはそれらの精製されたフラグメント、ホモログ、若しくは相補的核酸を利用して、ヒトソマトスタチン受容体タイプ５核酸の組織分布を決定する方法。
【請求項２２】
ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、そのフラグメント、ホモログ、若しくは相補的核酸の、遺伝子サイレンシングのための使用であって、
（ａ）前記ソマトスタチン受容体タイプ５核酸、そのフラグメント、ホモログ、若しくは相補的核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７と少なくとも９０％の相同性をもち、そして
（ｂ）ｓｓｔ５Ｂまたはｓｓｔ５Ｃソマトスタチン受容体タイプ５遺伝子のいずれかまたは両方の発現がサイレンシングされる、
前記方法。
【請求項２３】
ソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド、そのフラグメント、またはホモログの、抗体産生のための使用であって、
（ａ）前記ソマトスタチン受容体タイプ５ポリペプチド、フラグメント、またはホモログが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、若しくは配列番号８と少なくとも９０％の相同性をもち、そして
（ｂ）前記抗体が、ｓｓｔ５Ｂとｓｓｔ５Ｃのポリペプチドアイソフォームを識別する、
前記方法。
【国際調査報告】
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