(57)【要約】  本発明は、サッカロミセス酵母の増殖又はサッカロミセス酵母産物の製造におけるＣ５化合物含有物質を含む基質の使用に関するものであり、Ｃ５化合物含有物質は：（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物である。また、本発明は、基質を用いてサッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物を製造する方法、及び当該使用又は方法により製造されるサッカロミセス酵母をインキュベートすることを含む、エタノールの製造方法に関するものである。更に、本発明は、当該使用又は方法に好適なサッカロミセス酵母株に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス酵母の増殖又はサッカロミセス酵母産物の製造におけるＣ５化合物含有物質を含む基質の使用であって、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である、前記使用。
【請求項２】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物から得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｃ５化合物含有物質が、リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質とリグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質との混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
サッカロミセス酵母が、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で、炭素源としてキシロースを使用して増殖可能なサッカロミセス酵母である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
サッカロミセス酵母が非組換え型である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
サッカロミセス酵母が、ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体；及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物を製造する方法であって、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件にてＣ５化合物含有物質を含む基質をサッカロミセス酵母とともにインキュベートすることを含み、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である、前記方法。
【請求項１４】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ５化合物含有物質が、リグノセルロース加水分解物から及びリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
サッカロミセス酵母が、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質から、増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
エタノールの製造方法であって：
（ａ）  請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法、及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物により製造されるサッカロミセス酵母を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する、
工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる工程を更に含み、
サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
エタノール及びサッカロミセス酵母バイオマスを製造する方法であって：
（ａ）  ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物、及びリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
工程を含み、
サッカロミセス酵母は基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記方法。
【請求項２９】
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、サッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有する、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、リグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
アルカリ剤がアンモニアである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
サッカロミセス酵母を、少なくとも約２×１０５酵母／ｍＬ加水分解物の濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートする、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
エタノールを製造する方法であって：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母、及びリグノセルロース加水分解物を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母による発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ここでｐＨ調整は加水分解物のｐＨをアンモニアの添加によりサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離する、
工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
エタノール及びサッカロミセス酵母を製造する方法であって：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利使用可能なサッカロミセス酵母、及びリグノセルロース加水分解物を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母による発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ここでｐＨ調整は加水分解物のｐＨをアンモニアの添加によりサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離し；そして
（ｅ）  （ｉ）  工程（ｃ）から得られるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
工程を含み、
サッカロミセス酵母は基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記方法。
【請求項３７】
（ｆ）  工程（ｅ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
サッカロミセス酵母がサッカロミセス・セレヴィシエの株である、請求項１３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
サッカロミセス酵母が非組換え型である、請求項１３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
サッカロミセス酵母が：ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１、又はＶ０８／０１３４１１を決定付ける特徴を有するその変異体若しくは誘導体；あるいはＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４、又はＶ０９／００５０６４を決定付ける特徴を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、請求項１３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特徴を有するその変異体若しくは誘導体；及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を決定付ける特徴を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、サッカロミセス酵母。
【請求項４２】
エタノールを製造する方法であって：
（ａ）  請求項４１に記載のサッカロミセス酵母、及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下にてインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する、
工程を含む、前記方法。
【請求項４３】
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上で、請求項４１に記載のサッカロミセス酵母を増殖させる工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｂ）を繰り返す工程を更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
エタノール及びサッカロミセス酵母を製造する方法であって：
（ａ）  請求項４１に記載のサッカロミセス酵母、及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ｂ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上で、請求項４１に記載のサッカロミセス酵母を増殖させる、
工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、サッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、リグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
アルカリ剤がアンモニアである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
サッカロミセス酵母を、少なくとも約２×１０５酵母／ｍＬ加水分解物の濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートする、請求項３５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項２８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項２８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
アンモニアをリグノセルロース加水分解物へ加え、ｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整する、リグノセルロース加水分解物のｐＨを調整する方法。
【請求項５５】
サッカロミセス酵母による発酵に好適な、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物であって、リグノセルロース加水分解物及びアンモニアを含む、前記加水分解物
【請求項５６】
サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物の製造方法であって、Ｃ５化合物含有物質を含む基質を、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件下で請求項４１に記載のサッカロミセス酵母とともにインキュベートすることを含み、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である、前記方法。
【請求項５７】
Ｃ５化合物含有物質が、ダンダー、リグノセルロース加水分解物、又はダンダーとリグノセルロース加水分解物との混合物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
リグノセルロース加水分解物がｐＨを調整されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ｐＨを調整した加水分解物が、請求項５０に記載のｐＨを調整した加水分解物である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
酵母が基質上で増殖する、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物の製造方法、そのような酵母の増殖用基質、サッカロミセス酵母株、並びに酵母バイオマス及びエタノールなどの酵母産物の製造におけるサッカロミセス酵母株の使用に関する。本発明は、サッカロミセス酵母を用いたエタノールの製造に特に適用されるものであり、本発明はこれに関連してここに記載される。
【背景技術】
【０００２】
背景
エタノールは、ますます重要な輸送用再生可能燃料であり、工業用化学物質及び２−炭素化学物質前駆体としても重要である。エタノールは、サッカロミセス酵母による六炭糖ベースの糖の発酵を介して最も多く製造される。六炭糖ベースの糖は、典型的には作物から加水分解デンプンの形態で、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、キャッサバ、サツマイモ、コメなどから、又はサトウキビ及びサトウダイコンから得られる。発酵した六炭糖ベースの糖は、典型的にはグルコース、フルクトース、スクロース、及びマルトースである。
【０００３】
エタノールや酵母バイオマスの製造を作物のグルコース、フルクトース、スクロース、及びマルトースの糖に依存することは、ヒトや動物の食料源の供給を圧迫する。したがって、エタノール製造や酵母バイオマス産生のプロセスを改良する要求が高まっている。より詳細には、植物ベースの物質を酵母バイオマスやエタノールの製造に使用する効率を高める必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，６１２，２８６号
【特許文献２】米国特許第６，０６３，２０４号
【特許文献３】米国特許第４，６００，５９０号
【特許文献４】米国特許第３，６４２，５８０号
【特許文献５】米国特許第４，４０９，０３２号
【特許文献６】米国特許第４，９７３，５６０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｕｒｔｚｍａｎら（２００３）ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２３５−２４５
【非特許文献２】Ｋｉｍら（２００３）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０：３９−４７
【非特許文献３】Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：２７３−２８１
【非特許文献４】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、第１３．２．１〜１３．２．５頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版刊
【非特許文献５】Ａｔｔｆｉｅｌｄ  Ｐ．Ｖ．ら（１９９４）“Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｂａｔｃｈ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｓ  ＣＩＦ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ”、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４０：２６２５−２６３２
【非特許文献６】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、第１３．７．１〜１３．７．７頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版社刊
【非特許文献７】Ｍｙｅｒｓら（１９９７）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６３：１４５−１５０
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明者らは、リグノセルロース加水分解物及び／又はリグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質を含む基質を用いて、サッカロミセス酵母バイオマス及びサッカロミセス酵母産物を製造することができることを見出した。本発明以前は、サッカロミセスの増殖を阻害する物質の存在により、そして多くのサッカロミセス株が増殖に使用できない高濃度のＣ５化合物により、そうした物質はサッカロミセス酵母バイオマスやサッカロミセス酵母産物の製造に適していないと考えられていた。より詳細には、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質は、サッカロミセスの増殖に適さない廃棄物の流れであると考えられていた。
【０００７】
第１の側面は、サッカロミセス酵母の増殖又はサッカロミセス酵母産物の製造における、Ｃ５化合物含有物質を含む基質の使用を提供するものであり、Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である。
【０００８】
第２の側面は、Ｃ５化合物含有物質を含む基質を、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件においてサッカロミセス酵母とともにインキュベートすることを含む、サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物の製造方法を提供するものであり、Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である。
【０００９】
１つの態様では、Ｃ５化合物含有物質はリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる。
他の態様では、Ｃ５化合物含有物質はリグノセルロース加水分解物から得られる。
【００１０】
他の態様では、Ｃ５化合物含有物質は、リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質とリグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質との混合物である。
【００１１】
本明細書において、「リグノセルロース加水分解物」とは、リグノセルロースから製造される物質を表し、ここで、リグノセルロース中のヘミセルロースは、少なくとも部分的な加水分解を受けて、ヘミセルロースポリマーから単糖類を放出する。典型的には、リグノセルロース中のセルロースも、少なくとも部分的に加水分解されてセルロースポリマーから糖を放出する。
【００１２】
リグノセルロースは、セルロース及びヘミセルロースの形態で、糖の豊富な供給源を含有する。セルロースは、連結したグルコース残基のポリマーである。ヘミセルロースは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、及びアラビノース、並びに他の残基を通常含有するポリマーである。しかしながら、リグノセルロース中の糖類は、ポリマー中に含有されるあいだは、サッカロミセス・セレヴィシエ酵母などのエタノール産生生物に利用されることができない。したがって、リグノセルロースは、発酵に使用する前に処理される必要がある。リグノセルロースは、セルロース及びヘミセルロース中に存在する単糖類を放出してリグノセルロース加水分解物を形成する加水分解法を用いて処理される。リグノセルロース（植物物質など）中のセルロースポリマー及びヘミセルロースポリマーの処理は、典型的にはグルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、及びアラビノースを放出する。これらのうち、グルコース、マンノース、及びガラクトースは六炭糖であり、一方、キシロース及びアラビノースは五炭糖である。加水分解物中の放出された糖残基は、発酵プロセスにおける使用に利用可能である。
【００１３】
リグノセルロース加水分解物は、糖に加えて、酢酸、フラン、フェノール性物質、及びリグニン分解産物などの広範な阻害性化学物質を含有し得る。
工業的エタノール産生を用いたリグノセルロース加水分解物の発酵は、主に加水分解物中に存在するＣ６糖の利用をもたらす。結果として、リグノセルロース加水分解物の発酵後に残る物質は、典型的にはキシロースなどのＣ５化合物、並びにグリセロール、酢酸、エタノールなどの化合物、及び発酵を通して持ち越された他の化合物に富んでいる。更に、発酵は、グリセロール、酢酸、及びエタノールなどの代謝産物、並びに発酵プロセスのあいだ加水分解物から持ち越された他の化合物の蓄積をもたらすことが多い。加水分解物から持ち越されたそのような代謝産物や化合物は、サッカロミセスの増殖に対して阻害性であり得る。
【００１４】
このように、リグノセルロース加水分解物の発酵は、本発明以前はサッカロミセス酵母の増殖に適さない廃棄物の流れを形成すると考えられていた物質をもたらす。そのような物質は、生物学的酸素要求量及び／又は化学的酸素要求量が高く、その処分は重大な課題を引き起こし得る。
【００１５】
１つの形態では、サッカロミセス酵母は、増殖するための炭素源としてキシロースを用いて増殖可能である。
典型的には、サッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で、炭素源としてキシロースを用いて増殖可能である。
【００１６】
キシロース及び典型的には１種以上の他の炭素化合物を利用可能なサッカロミセス酵母株を採用することにより、本発明者らは、以前は廃棄物であると考えられていたものをサッカロミセス酵母バイオマスの製造及び／又はサッカロミセス酵母産物の製造に基質として使用し得ることを見出した。基質中に見られるキシロース及び他の炭素化合物上でのサッカロミセス酵母の増殖能は、基質の生物学的酸素要求量を減らし、それ故、化学的酸素要求量を減らす。
【００１７】
本明細書において、「サッカロミセス酵母バイオマス」は、サッカロミセス属の酵母細胞である。本明細書において、「サッカロミセス酵母バイオマスの製造」は、サッカロミセス酵母の増殖である。
【００１８】
本明細書において、「基質」という用語は、生物の増殖及び／又は生物産物の製造のために培地として用いられる物質を表す。基質は生物のための炭素源を含有し、窒素源を含有していてもよい。
【００１９】
本明細書において、「Ｃ５化合物含有物質」という表現は、１種以上のＣ５炭素化合物を含有する物質である。１つの形態では、Ｃ５化合物含有物質はキシロース含有物質である。典型的には、Ｃ５化合物含有物質はキシロースを含み、他のＣ５化合物を含有していてもよい。Ｃ５化合物は５つの炭素原子を有する化合物である。キシロースはＣ５化合物である。他のＣ５化合物の例には、アラビノース、リボース、及びキシリトールが含まれる。典型的には、基質は、キシロース、並びにキシリトール、アラビノース、及びリボースのうち１種以上を含めた複数のＣ５化合物を含有する。
【００２０】
本明細書において、「リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質」とは、リグノセルロース加水分解物の発酵後に存在するＣ５化合物含有物質、又はそのＣ５化合物含有抽出物を表す。
【００２１】
本明細書において、「リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質」とは、リグノセルロース加水分解物中に存在するＣ５化合物含有物質、又はそのＣ５化合物含有抽出物を表す。
【００２２】
基質は、サッカロミセス酵母の増殖を支持するのに十分な量のＣ５化合物含有物質を含む。
１つの形態では、基質は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質を含む。
【００２３】
１つの形態では、Ｃ５化合物含有物質はダンダーである。本明細書において、「ダンダー」という用語は、リグノセルロース加水分解物の発酵及びその後のエタノール抽出の後に残留する液体を表す。基質中のダンダーの量は、典型的には酵母が増殖するための炭素源を提供するに十分な量である。例えば、基質は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のダンダーを含むことができる。１つの形態では、基質はダンダーである。
【００２４】
他の形態では、Ｃ５化合物含有物質は、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる液体及び固体である。この形態では、リグノセルロース加水分解物の発酵及びアルコール抽出の後、固形物を更に除去することなく、残留物質を用いて基質を形成することができる。
【００２５】
１つの形態では、基質は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の、リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質を含む。
【００２６】
１つの形態では、Ｃ５化合物含有物質はリグノセルロース加水分解物である。
１つの形態では、Ｃ５化合物含有物質は、リグノセルロース加水分解物とダンダーとの混合物である。リグノセルロース加水分解物及びダンダーは、あらゆる比で混合することができる。ダンダー：リグノセルロース加水分解物の好適な比の例には、１：１、１：１．２５、１：１．５、１：１．７５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１が含まれる。
【００２７】
１つの態様では、基質はＣ５化合物含有物質である。
本明細書において、サッカロミセス酵母は非特許文献１に規定されるようなサッカロミセス属の酵母である。
【００２８】
１つの態様では、基質は、サッカロミセス酵母を基質上で増殖させることによって利用される。典型的には、サッカロミセス酵母は基質上で好気的に増殖する。基質がリグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質を含む態様では、基質上でのサッカロミセス酵母の好気的増殖は、エタノールに転換されず又は発酵プロセスから抽出される炭素源を、廃棄物の流れから効果的に取り出して有用な酵母バイオマスに転換させる。これは、基質の化学的酸素要求量及び生物学的酸素要求量を減らすという更なる利点を有している。
【００２９】
基質中のキシロース及び他の炭素源から、大量のサッカロミセス酵母細胞を製造することができる。その後、サッカロミセス酵母は、そのサッカロミセス酵母が適している適用に用いることができる。本明細書に記載するように、サッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物の発酵のためのリグノセルロース加水分解物の接種、又は更なる酵母バイオマス若しくは酵母産物の製造のための基質の接種に用いることができる。サッカロミセス酵母は、ベーキング、醸造、ワイン、飲用若しくは非飲用蒸留酒などの伝統的な発酵のための接種材料として、又は動物の飼料ストックとして、又はサッカロミセス酵母産物のために用いることもできる。
【００３０】
１つの形態では、リグノセルロース加水分解物はｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物である。本明細書において、「ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物」は、サッカロミセス酵母の増殖及び／又はサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有するリグノセルロース加水分解物である。ｐＨを調整した加水分解物は、酸で加水分解したリグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含むことができる。１つの形態では、アルカリ剤はアンモニアである。
【００３１】
基質上で増殖したサッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物の発酵に用いることができる。したがって、第３の側面は、以下の工程を含む、エタノールの製造方法を提供するものである：
（ａ）  第１の側面の使用又は第２の側面の方法により製造されるサッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する。
【００３２】
第３の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である。
【００３３】
第３の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す。
【００３４】
第４の側面は、以下の工程を含む、エタノール及びサッカロミセス酵母を製造する方法を提供するものである：
（ａ）  ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物、及びリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素原としてキシロースを利用可能である。
【００３５】
第４の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す。
【００３６】
第５の側面は、以下の工程を含む、エタノールの製造方法を提供するものである：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵及びリグノセルロース加水分解物から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母による発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ここでｐＨ調整はアンモニアを添加して加水分解物のｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨに調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離する。
【００３７】
第６の側面は、以下の工程を含む、エタノール及びサッカロミセス酵母バイオマスの製造方法を提供するものである：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵及びリグノセルロース加水分解物から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母の発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ここでｐＨ調整はアンモニアを添加して加水分解物のｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨに調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離し；そして
（ｅ）  （ｉ）  工程（ｃ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である。
【００３８】
第６の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｆ）  工程（ｅ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す。
【００３９】
第７の側面は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
であるＣ５化合物含有物質を含む、サッカロミセス酵母又はサッカロミセス酵母産物の製造に使用するための基質を提供するものであり、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素原としてキシロースを利用可能である。
【００４０】
サッカロミセス酵母は組換え型でも非組換え型でもよい。特定の形態では、サッカロミセス酵母は非組換え型である。
サッカロミセス酵母は、典型的には、試験Ｔ１におけるバイオマスが少なくとも１０倍増加するサッカロミセス株である。
【００４１】
１つの形態では、サッカロミセス酵母は、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物中で好気的に増殖可能な株である。
１つの形態では、サッカロミセス酵母はサッカロミセス・セレヴィシエの株である。
【００４２】
サッカロミセス酵母は、典型的には原栄養性であり、したがって、アミノ酸、核酸塩基、酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトンなどの複合栄養素、又は他の複合体、及び酵母による増殖及び発酵を補助するために使用し得る高価な栄養補助物質の添加を必要とすることなく、基質上で増殖可能である。したがって、サッカロミセス酵母は、十分な窒素がリグノセルロース加水分解物に添加されることのみを必要とし、工業上経済的な基質の添加により増殖可能であることを特徴とする。安価な基質の添加には、例えばアンモニア、アンモニウム塩、尿素、第一又は第二リン酸アンモニウム、あるいは他の工業上経済的な窒素源及び／又はリン酸源が含まれ得る。
【００４３】
特定の形態では、サッカロミセス酵母は、ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を有するサッカロミセス・セレヴィシエの株、又はＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体、及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を有するサッカロミセス・セレヴィシエの株、又はＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４を決定づける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される。
【００４４】
Ｖ０８／０１３４１１株及びＶ０９／００５０６４株は、リグノセルロース加水分解物及び基質中の高レベルの阻害剤を許容可能である。Ｖ０８／０１３４１１株及びＶ０９／００５０６４株は、増殖するための唯一の炭素源としてキシロースを用いる基質中でも増殖可能である。
【００４５】
第８の側面は：ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体；及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を決定づける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択されるサッカロミセス酵母を提供する。
【００４６】
第９の側面は、以下の工程を含む、エタノールの製造方法を提供するものである：
（ａ）  第８の側面によるサッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する。
【００４７】
第９の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上で第８の側面のサッカロミセス酵母を増殖させる。
【００４８】
第９の側面の方法は、更なる工程を含むことができる：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す。
【００４９】
第１０の側面は、以下の工程を含む、エタノール及びサッカロミセス酵母の製造方法を提供するものである：
（ａ）  第８の側面によるサッカロミセス酵母株及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物を含む基質上で第８の側面のサッカロミセス酵母を増殖させる。
【００５０】
第１０の側面の方法は、以下の工程を更に含むことができる：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す。
【００５１】
１つの態様では、基質はＣ５化合物含有物質である。１つの形態では、基質はダンダーである。
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物は、典型的にはサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有する。
【００５２】
１つの態様では、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物は、リグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含む。１つの形態では、アルカリ剤はアンモニアである。
サッカロミセス酵母がｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物の発酵に用いられる態様では、サッカロミセス酵母は、加水分解物の発酵を可能にするのに十分な濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートされる。サッカロミセス酵母は、典型的には、少なくとも約２×１０６；少なくとも約２×１０７；少なくとも約２×１０８；少なくとも約２×１０９細胞／ｍＬ加水分解物の濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートされる。
【００５３】
サッカロミセス酵母を基質上で増殖させる態様では、基質は、サッカロミセス酵母の増殖を可能にするのに十分な濃度で、サッカロミセス酵母とともにインキュベートされる。典型的には、サッカロミセス酵母は、少なくとも約２×１０６；少なくとも約２×１０７；少なくとも約２×１０８；少なくとも約２×１０９細胞／ｍＬ加水分解物の濃度で、基質とともにインキュベートされる。
【００５４】
サッカロミセス酵母を基質上で増殖させる態様では、サッカロミセス酵母は、典型的には基質上で好気的に増殖する。
第１１の側面は、アンモニアをリグノセルロース加水分解物へ添加して、ｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨに調整することによる、リグノセルロース加水分解物のｐＨを調整する方法を提供する。
【００５５】
第１２の側面は、リグノセルロース加水分解物及びアンモニアを含む、サッカロミセス酵母による発酵に好適な、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を提供する。
アンモニアの使用は、リグノセルロース加水分解物のｐＨを酵母の増殖及び発酵を支持するのに好適な範囲に調節することに役立つ。更に、アンモニアは、酵母が利用するための、容易に利用可能で安価な窒素源を提供する。
【００５６】
本発明者らは、リグノセルロース加水分解物のｐＨ調整は、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、又は水酸化ナトリウムのような化合物を使用するよりもむしろアンモニアを使用することで達成できることを見出した。このことは、例えばカルシウム塩は石こうのような不溶性灰分を高レベルで生じ得るため、有益であり得る。ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を製造するあいだに生ずる高レベルの灰分は、廃棄の問題を引き起こす。
【００５７】
また、高レベルのカルシウム塩は、ボイラー内におけるカルシウム塩の湯垢産生能により、下流の処理問題を引き起こし得る。更に、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、又は水酸化ナトリウムをｐＨ調整に使用することを回避することにより、加水分解物は、関連するイオンの阻害性ストレス及びこれらのイオンによって生ずる浸透圧ストレスを回避する。更に、加水分解物のｐＨ調整にアンモニアを使用することにより、サッカロミセス酵母の増殖及び発酵のための窒素が提供される。
【００５８】
過石灰化は、水酸化カルシウムをｐＨ調整剤として使用することにより生ずるが、加水分解物の阻害特性軽減におけるその有用性のために、リグノセルロースの中和に広く用いられており、そのため、更に精製することなく酵母に加水分解物を発酵させる。過石灰化の回避は、カルシウム薬をｐＨ調整目的で使用した場合よりも、阻害性の加水分解物を提供する。したがって、１つの形態では、このプロセスに、アンモニアで中和した加水分解物に対して耐性のサッカロミセス酵母を用いる。そのようなサッカロミセス酵母の例はＶ０８／０１３４１１株及びＶ０９／００５０６４株である。
【００５９】
本明細書に記載の酵母は、リグノセルロース加水分解物中に存在する炭素源上で増殖することができ、リグノセルロース加水分解物のその後の発酵ため、あるいは販売のため、又はベーキング、醸造、ワイン、飲用及び非飲用蒸留酒などの伝統的な発酵における使用ため、若しくは添加物、食料、タンパク質サプリメント、抽出物などとしての使用のための過剰な酵母の製造のためにバイオマスを提供する。
【００６０】
第１３の側面は、サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物の製造方法を提供するものであり、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件下でリグノセルロース加水分解物をサッカロミセス酵母とともにインキュベートすることを含み、サッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である。
【００６１】
１つの態様では、サッカロミセス酵母は第８の側面のサッカロミセス酵母である。
第１４の側面は、サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物の製造方法を提供するものであり、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件下でＣ５化合物含有物質を含む基質を第８の側面のサッカロミセス酵母とともにインキュベートすることを含み、Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である。
【００６２】
典型的には、リグノセルロース加水分解物のｐＨは調整されている。１つの形態では、ｐＨを調整した加水分解物はリグノセルロース加水分解物及びアンモニアを含む。
典型的には、酵母は基質上で増殖する。酵母は典型的には基質上で好気的に増殖する。
【００６３】
第１５の側面は、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質を含む基質の生物学的酸素要求量を減少させる方法を提供するものであり、サッカロミセス酵母の増殖を引き起こす条件下でサッカロミセス酵母を基質と共にインキュベートすることを含む。
【００６４】
１つの態様では、サッカロミセス酵母は第８の側面のサッカロミセス酵母である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
図面の簡単な説明
本発明の態様を添付の図面を参照して説明する。図面の特異性及びそれに関連する説明は、先行する発明の広範な説明の一般的概念に取って代わるものではないと理解されるべきである。
【図１】図１は、エタノールの製造方法の態様の概略図を示すものであり、プロセスの段階のインプット及びアウトプットを示している。
【図２】図２は、図１のエタノール製造プロセスのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
詳細な説明
図１は、本発明の１つの態様によるエタノール製造プロセス（１０）の総括を説明している。図１は、プロセス（１０）の主要段階並びにプロセスにおけるインプット及びアウトプットを説明している。プロセスは４つの主要な段階、ｐＨ調整段階（１１）、発酵段階（１２）、蒸留段階（１３）、及び増殖段階（１４）に分けることができる。
【００６７】
ｐＨ調整段階では、リグノセルロース加水分解物のｐＨが調整される。リグノセルロース加水分解物は、リグノセルロースを加水分解して、リグノセルロースを構成するセルロースポリマー及びヘミセルロースポリマー中に存在する糖類を放出することにより製造される。リグノセルロース加水分解物は、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、及びアラビノースなどの炭素化合物、並びに有機酸、フラン（例えばフルフラール、フルフリルアルコール、及び５−ヒドロキシメチルフルフラール）、及びリグノフェノール化合物などのサッカロミセス酵母に対して阻害性であり得る化合物を含有する。リグノセルロース加水分解物は、その場で製造しても、その場から離れた供給源から得てもよい。１つの形態では、ｐＨ調整は、アルカリ剤を添加して加水分解物のｐＨをサッカロミセス酵母による発酵に好適なｐＨに調整することを含む。アルカリ剤は、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニア、又はそれらの組み合わせであり得る。説明されている特定の形態では、アルカリ剤はアンモニアである。したがって、ｐＨ調整段階のための主要なインプットは、リグノセルロース加水分解物（１５）、及びアンモニアの形態のアルカリ剤（１６）である。更に、例えば、セルロース加水分解を介して放出されるＣ６糖類の形態のＣ６糖類（１７）、糖蜜、サトウキビ汁、加水分解デンプン由来のシュガー・シロップ、マルトデキストリン、原料糖ジュース、グルコース、ガラクトース、スクロース、若しくは他のＣ６化合物、又はそれらの組み合わせをｐＨ調整段階にインプットすることもできる。ｐＨ調整段階からのアウトプットは、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物（１９）である。ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物のｐＨは、典型的には２．５〜７である。典型的には、ｐＨは２．５〜６．５；２．５〜６．０；２．５〜５．５；２．５〜５．０；３．０〜５．０；３．５〜５．０；４．０〜５．５である。
【００６８】
発酵段階では、サッカロミセス酵母（１８）及びｐＨを調整した加水分解物（１９）を、加水分解物中のＣ６糖類の発酵を可能にする条件下でインキュベートする。Ｃ６基質は、発酵段階で例えばセルロースポリマー、デンプン、又はデキストリンの形態で提供することもできる。セルロース分解活性、デンプン又はデキストリンの加水分解活性を有する酵素を発酵段階に加えて、糖化、及び結果として得られる遊離の発酵性糖類の酵母による発酵を同時に可能にすることができる。サッカロミセス酵母（１８）は、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物中の少なくとも１つのＣ６糖の発酵が可能で、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖することが可能なサッカロミセス酵母であり得る。発酵における使用に好適なサッカロミセス酵母株は、Ｃ６糖類の発酵が可能で、増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能であり、そしてダンダー中に見られる阻害物質の存在下で増殖可能であるサッカロミセス酵母株である。好適なサッカロミセス酵母株には、キシロース、並びに酢酸塩、グリセロール、エタノール、グルコース、フルクトース、マンノース、及びガラクトースのうちの１種以上の上で、典型的にはダンダー中に見られる濃度の阻害物質の存在下で好気的に増殖する能力を有するサッカロミセス酵母株が含まれる。１つの形態では、サッカロミセス酵母は、増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス属に由来する、１種以上のサッカロミセス酵母株である。典型的には、サッカロミセス酵母は１種以上のサッカロミセス・セレヴィシエ株である。サッカロミセス・セレヴィシエ株は、例えばＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１、又はＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の変異体若しくは誘導体、あるいはＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４、又はＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４を決定付けるウ特性を有するＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４の変異体若しくは誘導体であり得る。そのようなサッカロミセス・セレヴィシエ株は、キシロース、グリセロール、酢酸、キシリトールを含めたさまざまな炭素源上で好気的に増殖する能力を有する。そのような株は、十分な接種材料レベルを用いるならば、リグノセルロース加水分解物中に存在するグルコース、フルクトース、又はマンノースの迅速な発酵を直ちに開始することも可能である。特定の形態では、サッカロミセス酵母はＶ０９／００５０６４株である。
【００６９】
プロセスの初期サイクルでは、サッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で、典型的にはダンダー上で、又はｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物上で、又はダンダーとｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物との混合物上で、サッカロミセス酵母のストック培養物を好気的に増殖させることにより、典型的には提供される。プロセスのその後のサイクルのあいだ、増殖段階においてダンダー上で増殖したサッカロミセス酵母を発酵段階にインプットすることができる。ダンダー上でのサッカロミセス酵母の増殖は、リグノセルロース加水分解物中に存在する阻害物質に対して耐性であることを前提条件とする、高レベルのサッカロミセス酵母の製造を可能にする。したがって、ダンダー上で製造されるサッカロミセス酵母は、リグノセルロース加水分解物中での効率的な増殖及び発酵に好適である。このように、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質を含む基質上でのサッカロミセス酵母の増殖は、リグノセルロース加水分解物の効率的な発酵に好適な、あらかじめ適合させた接種材料を提供し、一方で、ダンダーの生物学的酸素要求量及び化学的酸素要求量も減少させる。発酵段階のあいだ、発酵の代謝副産物として酵母により酸が製造される。したがって、発酵リグノセルロース加水分解物を、酵母によるリグノセルロース加水分解物の発酵を継続させるｐＨに維持する必要があるため、発酵段階で塩基又は緩衝剤をインプットすることができる。発酵リグノセルロース加水分解物のｐＨを維持するために用いることができる好適な塩基の例には、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、又はそれらの組み合わせが含まれる。ｐＨの緩衝は、例えばクエン酸又はクエン酸塩の添加により達成することもできる。
【００７０】
発酵段階後、発酵した加水分解物（２０）は、エタノール、キシロース、及び他のＣ５化合物、残留Ｃ６糖類、グリセロール、酢酸塩、加水分解物由来及びサッカロミセス酵母の代謝由来の阻害物質、並びに残留固形物を含む物質の形態で典型的にはアウトプットされる。発酵段階からのアウトプットは蒸留段階（１３）のインプットとなる。発酵段階からのアウトプットは、エタノール（２２）、リグニンの形態の粒状物質（２１）、サッカロミセス酵母、残留セルロース及びヘミセルロース、及びキシランであり、これらは廃棄することも、例えば燃焼により若しくは嫌気的消化の産物を介してエネルギー生成に用いることもできる。
【００７１】
蒸留段階（１３）では、発酵段階由来の物質を加熱してエタノール（２２）を蒸留する。いったんエタノールを蒸発させると、残留液はダンダー（２３）である。したがって、蒸留段階からのアウトプットはエタノール（２２）、ダンダー（２３）、及び粒状物質（２１）である。ダンダー（２３）は、キシロース及び他の炭素化合物が豊富であり、増殖段階（１４）においてサッカロミセス酵母が好気的に増殖するための炭素源として役立つ。
【００７２】
増殖段階（１４）では、サッカロミセス酵母はダンダー（２３）上で好気的に増殖する。したがって、ダンダー（２３）及びサッカロミセス酵母（１８）が増殖段階のインプットである。増殖段階のアウトプットはサッカロミセス酵母（１８）及び使用済みダンダーである。ダンダー中のキシロース及び他の炭素化合物の多くは増殖段階で使い果たされるため、使用済みダンダーの生物学的酸素要求量及び化学的酸素要求量は減少し、それにより使用済みダンダーの廃棄の環境影響が減少する。プロセスの第１サイクルでは、増殖段階のためのサッカロミセス酵母は、ストック培養物から提供される。しかしながら、増殖段階からのアウトプットであるサッカロミセス酵母は、プロセスのその後のサイクルにおいて、増殖段階及び発酵段階のインプットとして使用することができる。
【００７３】
図２は、上記エタノール製造プロセス（１０）の主要プロセス工程を示す。第１工程（１１１）では、リグノセルロース加水分解物（１５）を準備する。リグノセルロース加水分解物（１５）は、その場から離れた供給源から提供しても、その場で加水分解物を調製することによって提供してもよい。リグノセルロース加水分解物は、リグノセルロースバイオマスを加水分解することによって調製してもよい。リグノセルロースバイオマスは、ヘミセルロール及び／又はセルロースを含有するバイオマスであり得る。典型的にはバイオマスは植物バイオマスである。リグノセルロースバイオマスの例には、広葉樹、針葉樹、トウモロコシ茎葉、サトウキビ絞りかす、サトウキビくず、草、藻、又は他の植物物質、廃棄紙、リサイクル紙、紙産業の廃棄物の流れ、樹木の糖蜜、都市固形廃棄物及び植物性廃棄物が含まれる。
【００７４】
リグノセルロースバイオマスの加水分解方法は当該技術分野において公知であり、例えば酸加水分解、酵素的加水分解、アンモニア繊維／凍結爆発（ammonia fibre/freeze explosion）（ＡＦＥＸ）、アンモニアリサイクルパーコレーション（ＡＲＰ）、オルガノソルブなどが含まれる。リグノセルロースバイオマスの酸加水分解方法は、例えば特許文献１及び特許文献２に記載されている。酸性化は、例えば、いわゆる自動加水分解のあいだのリグノセルロースの固有酸性化や、硫酸、二酸化硫黄、硝酸、塩酸、リン酸、酢酸などのような酸性化剤の添加によりもたらすことができる。ＡＦＥＸの方法は例えば特許文献３に記載されている。ＡＲＰの方法は、例えば非特許文献２に記載されている。酵素的加水分解方法は、例えば特許文献４に記載されている。オルガノソルブの方法は、例えば特許文献５に記載されている。オルガノソルブに使用される溶媒は、例えばエタノール、アセトンなどを含むことができる。
【００７５】
リグノセルロース加水分解物のｐＨは典型的には約１であり、サッカロミセス・セレヴィシエのようなサッカロミセス酵母による発酵に適切ではない。したがって、第２工程では（１１２）、リグノセルロース加水分解物のｐＨを発酵前に調整する。ｐＨ調整工程は、アンモニアなどのアルカリ剤（１６）の添加を含む。アンモニアは、３２％の高濃度アンモニア溶液から添加される１つの形態である。アンモニアは、典型的にはｐＨが約５．０〜５．５に達するまで加える。あるいは、アルカリ剤は例えば水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウムであり得る。ｐＨを調整することに加えて、発酵を補助するために、加水分解セルロース、糖蜜、サトウキビ汁、加水分解デンプン由来のシロップ、マルトデキストリンの形態でＣ６糖類をｐＨを調整した加水分解物（１７）へ加えることができる。例えば尿素、第一リン酸アンモニウム及び／又は第二リン酸アンモニウムの添加により、更なる窒素及びリンを提供することもできる。更に、この段階で酵素を加えて、セルロースポリマー又はヘミセルロースポリマーの更なる分解を補助することができる。好適な酵素には、セルラーゼ、セロビアーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼなどが含まれる。セルロースポリマー又はヘミセルロースポリマーを分解するための市販の酵素調製品には、例えばＳｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｆｕｅｌ、Ｃｅｌｌｕｌｃｌａｓｔ、及びＮｏｖｏｚｙｍ  １８８（ノボザイムズ  オーストラリア株式会社より市販されている）が含まれる。
【００７６】
第３工程（１１３）では、サッカロミセス酵母の初期接種材料は、典型的にはサッカロミセスＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株又はＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４株の形態で準備する。サッカロミセス酵母は、第４工程（１１５）においてｐＨを調整した加水分解物に接種するために用いられる。１つの形態では、サッカロミセス酵母を約２×１０６〜約２×１０９細胞／ｍＬ加水分解物の濃度までバッチ発酵槽中の加水分解物に接種する。プロセスのその後のサイクルは、ダンダー上で増殖したサッカロミセス酵母を用いて、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物に接種することができる。サッカロミセス酵母を約２×１０７〜約２×１０９細胞／ｍＬリグノセルロース加水分解物の高濃度で使用することは、１つの形態では、加水分解物を解毒する。加水分解物にサッカロミセス酵母を高濃度で接種することは、過石灰化又は他の処理を用いた解毒の必要性を除外する。
【００７７】
第５工程（１１６）では、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物をサッカロミセス酵母（１８）により発酵させる。サッカロミセス酵母及び加水分解物を３０℃にて典型的には約１〜４日間、より典型的には約２〜３日間、バッチ発酵槽中にてインキュベートし、加水分解物の発酵を進行させる。リグノセルロース加水分解物の発酵は、ｐＨを調整した加水分解物中のＣ６糖類の利用及びエタノールの製造をもたらす。
【００７８】
発酵に由来する物質を第６工程の蒸留（１１８）に付し、エタノール（２２）を抽出する。蒸留は、典型的には発酵に由来する物質を加熱してエタノールを蒸発させることにより達成される。蒸発させたエタノールは濃縮後に回収する。
【００７９】
エタノールの蒸留後、残留物質をダンダーと固形物に分離し、ダンダーは、サッカロミセスＶ０８／０１３４１１株又はＶ０９／００５０６４株のようなサッカロミセス酵母が増殖するための基質として第７工程（１１９）で用いられる。したがって、蒸留に由来するダンダー（２３）にサッカロミセス酵母を接種し、２５〜４２℃、典型的には３０〜３７℃、より典型的には３５〜３７℃の温度でサッカロミセス酵母及びダンダーを攪拌することにより、サッカロミセス酵母を好気的に増殖させる（１２０）。次に、サッカロミセス酵母を例えば遠心分離又はろ過（１２１）によりダンダーから抽出する。次に、ダンダー上での増殖により生じたサッカロミセス酵母（１２２）を、その後の発酵（１１６）において、ｐＨを調整した新鮮な加水分解物の接種材料として用いる。更に、ダンダー上で増殖したサッカロミセス酵母（１８）を用いて、加水分解物の発酵から得られるダンダーに接種し、それにより更にサッカロミセス酵母を増殖させる。このように、プロセスのそれぞれのサイクルにより、サッカロミセス酵母はダンダー上での増殖により製造され、得られるサッカロミセス酵母は、発酵の次のサイクルや、次のサイクルに向けてのダンダーの接種材料として用いることができる。したがって、プロセスは、大量のサッカロミセス酵母バイオマス及びエタノールを製造する。
【００８０】
図１及び図２において、基質（２３）がダンダーとリグノセルロース加水分解物との混合物である別の態様を点線で示す。これに関して、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物（２４）の一部をｐＨ調整段階（１１）から保持し、増殖段階でダンダー（２３）と混合する。エタノールの蒸留後、蒸留に由来するダンダー（２３）をリグノセルロース加水分解物（２４）と混合し、混合物は、上記増殖条件を用いてサッカロミセス酵母を増殖させるための基質として用いる。あるいは、リグノセルロース加水分解物（２４）を、増殖段階（１４）の酵母／ダンダー混合物へ加えることができる。リグノセルロース加水分解物及びダンダーはいかなる比で混合してもよい。ダンダー：リグノセルロース加水分解物の好適な比の例には、１：１、１：１．２５、１：１．５、１：１．７５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１が含まれる。ダンダーへのリグノセルロース加水分解物の添加は、サッカロミセス酵母が増殖するための更なるＣ５化合物含有物質を提供し、したがって、ダンダー単独で製造され得るよりもバイオマスが必要とされる場合に有用である。製造されたサッカロミセス酵母バイオマスは、発酵段階でｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物に接種するために、又はサッカロミセス酵母に好適な他の目的に用いることができる。
【００８１】
また、本発明は、ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体、及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４、又はＶ０９／００５０６４を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、サッカロミセスの単離株に関するものである。
【００８２】
本発明者らは、サッカロミセス・セレヴィシエ株を単離し、ブダペスト条に基づいて国立計測研究所に受託番号Ｖ０８／０１３４１１及びＶ０９／００５０６４で寄託している。受託番号Ｖ０８／０１３４１１及びＶ０９／００５０６４は、以下の一般的特性を有するものである：
（ａ）  唯一の炭素源としてキシロースを利用する能力；
（ｂ）  ダンダー中に見られる阻害物質の存在下で増殖する能力；
（ｃ）  胞子を形成し、サッカロミセス・セレヴィシエと交配する能力。
【００８３】
受託番号ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１及びＶ０９／００５０６４は以下の決定的な特性を有するものである：
ｉ）  試験Ｔ１においてバイオマスが少なくとも１０倍増加する；
ｉｉ）  胞子を形成し、発芽胞子をサッカロミセス・セレヴィシエ試験株の発芽胞子と交配させると子孫を作製する；
ｉｉｉ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から製造されるダンダー中で増殖する。
【００８４】
サッカロミセス・セレヴィシエの好適な試験株の例は、Ｗ３０３−１Ａである。Ｗ３０３−１Ａは、米国ＡＴＣＣの酵母遺伝子保管センターから容易に入手可能である。サッカロミセス酵母の胞子形成、発芽、及び交配の方法を以下に記載する。
【００８５】
サッカロミセスＶ０８／０１３４４１株及びＶ０９／００５０６４株は、キシロースを唯一の炭素源として増殖可能である。更に、Ｖ０８／０１３４４１株及びＶ０９／００５０６４株は、ダンダー中に存在する阻害性条件において増殖することが可能である。したがって、Ｖ０８／０１３４４１株及びＶ０９／００５０６４株は、ダンダー中で容易に増殖することができる。更に、Ｖ０８／０１３４４１株及びＶ０９／００５０６４株は、リグノセルロース加水分解物の存在下でＣ６糖類を発酵させることができる。
【００８６】
１つの態様では、サッカロミセス酵母はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４である。
他の態様では、サッカロミセス株は、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の変異体、又はＶ０９／００５０６４の変異体である。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の変異体又はＶ０９／００５０６４の変異体は、これらの株に由来する２倍体細胞又は１倍体細胞を変異誘発因子に曝露することによって作製することができる。変異誘発因子は、サッカロミセス酵母細胞のゲノムの変異誘発に好適な変異誘発因子であり得る。典型的な変異誘発因子には、紫外線、アルキル化剤、イオン化放射が含まれる。アルキル化剤の例には、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、シクロホスファミド、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン、硫酸ジメチル、エチルメタンスルホン酸が含まれる。イオン化放射の例には、γ線放射、Ｘ線放射、β線放射、α線放射が含まれる。サッカロミセス酵母の変異体、特にサッカロミセス・セレヴィシエの変異体の作製方法は当該技術分野において公知であり、例えば非特許文献３に記載されている。
【００８７】
他の態様では、サッカロミセス株は、ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１の誘導体、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４の誘導体である。ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１又はＶ０９／００５０６４の誘導体は、組換え型誘導体でも非組換え型誘導体でもよい。
【００８８】
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の非組換え型誘導体は、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１のゲノムを所望のサッカロミセス株のゲノムと組み合わせて、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の特性を含むサッカロミセス株を作製することにより製造することができる。ＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４の非組換え型誘導体は、ＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４のゲノムを所望のサッカロミセス株のゲノムと組み合わせて、ＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４の特性を含むサッカロミセス株を作製することにより製造することができる。典型的には、誘導体は、所望のサッカロミセス株の１以上の特性を更に含む。２種のサッカロミセス株のゲノムを組み合わせる方法は当該技術分野において公知であり、例えば交配又は原形質融合が含まれる。
【００８９】
サッカロミセス株の交配方法は、典型的には、交配すべきサッカロミセス酵母株を胞子形成させることを含む。胞子は発芽して２倍体サッカロミセス酵母を形成し、次いで交配して子孫を作製する。次に子孫を、それぞれの親株に内在する所望の特徴に関してスクリーニングすることができる。サッカロミセス株の交配方法は当該技術分野において公知であり、例えば非特許文献４に記載されている。例として、サッカロミセス酵母株の胞子形成は、例えば非特許文献４に記載のように行うことができる。その後、酵母由来の胞子を、１％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース、０．５％酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）細菌学的ペプトン、及び１．５％（ｗ／ｖ）アガーを含有するＧＹＰのような固形培地に蒔き、典型的には３０℃で３〜５日間インキュベートすることによって発芽させることができる。個々の発芽胞子は、標準微生物学的技術を用いて、例えばＧＹＰアガー培地上に画線プレーティングすることにより、純粋な形態で単離することができる別個のコロニーを通常形成する。次に、精製した発芽胞子をアッセイして、交配型が「ａ」であるか「α」であるかを決定することができる。交配型は、サッカロミセス・セレヴィシエの発芽胞子を公知の交配型を有する実験室試験株と混合することにより決定することができる。実験室試験サッカロミセス・セレヴィシエ株の例には、ＤＥ６．１Ｄ及びＷ３０３−１Ａが含まれ、例えば非特許文献５に記載されている。交配型「ａ」の発芽胞子は、実験室株ＤＥ６．１Ｄ（公知の交配型「α」）の存在下でインキュベートすると通常凝集し、即ち眼で見える粒状の細胞懸濁液を形成し、交配型「α」の発芽胞子は実験室株Ｗ３０３−１Ａ（公知の交配型「ａ」）の存在下で通常凝集する。１つの交配型の試験株と凝集する発芽胞子は、他の試験株と凝集しない。次に、サッカロミセス・セレヴィシエの１つの株から作製した交配型「α」の発芽胞子は、もう一つの株又は同一株から作製した交配型「ａ」の発芽胞子と交配することができる。
【００９０】
原形質融合には、溶菌酵素を典型的には用いてサッカロミセス酵母細胞から細胞壁を除去し、その後ポリエチレングリコール、ジメチル・スルホキシド、及びＣａ２＋などの融合誘発剤の存在下で株を混合し、原形質間の融合を生じさせることが典型的には含まれる。次に融合細胞を、典型的には、浸透圧を安定化した培地中でインキュベートし、細胞の細胞壁を再生させる。サッカロミセス株の原形質融合方法は当該技術分野において公知であり、例えば特許文献６に記載されている。
【００９１】
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の組換え誘導体は、組換えＤＮＡ技術を用いてＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１に核酸を導入することにより作製される株である。ＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４の組換え誘導体は、組換えＤＮＡ技術を用いてＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４に核酸を導入することにより作製される株である。サッカロミセス酵母細胞、特にサッカロミセス株への核酸の導入方法は当該技術分野において公知であり、例えば非特許文献６に記載されている。
【００９２】
上で言及したサッカロミセス株は、エタノールを製造するための発酵に好適な物質からエタノールを製造することに用いることができる。
リグノセルロース加水分解物又は加水分解物の発酵及び蒸留から得られる基質上で酵母を好気的に培養することにより製造される酵母は、飼料酵母；食用酵母；ビール、ワイン、飲用蒸留酒、非飲用エタノール、発酵させて焼いた食品などの他の発酵用酵母；酵母自己消化物のための供給源；酵素、ビタミン、ヌクレオチドなどの酵母抽出物及び各種酵母副産物のようなリグノセルロース加水分解物の発酵以外の目的に用いてもよい。
【００９３】
試験Ｔ１：キシロースを唯一の炭素源として用いる増殖
酵母株は、標準微生物学的技術を用いて、２％アガーで固めたグルコース／酵母抽出物／微生物学的ペプトン培地に画線プレーティングする。３０℃で７２時間インキュベーション後、滅菌微生物ループを用いて酵母細胞をプレートから採取し、ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）が０．１〜０．２ユニット（Ｔ０のＯＤ６００）になるまで５０ｍＬの培養液に接種する。ＯＤ６００  ０．１ユニットは、およそ９×１０５酵母細胞／ｍＬに等しい。培養液は、キシロース（５％（ｗ／ｖ））、ディフコ  アミノ酸不含酵母窒素塩基（０．６７％）、クエン酸（０．３％）、及びクエン酸三ナトリウム（０．７％）を、２５０ｍＬの三角フラスコ内の蒸留水中に含有する。クエン酸及びクエン酸三ナトリウムは、サッカロミセスが増殖基質として使用できない緩衝剤として提供した。シグマ−アルドリッチから、９９％純度のＤ−（＋）−キシロースを入手した（カタログ番号Ｘ１５００−５００Ｇ）。ＯＤ６００（Ｔ４８時間のＯＤ）を測定する前に、培養物を２２０ｒｐｍ（軌道直径１０ｃｍ）で攪拌しながら３０℃にて４８時間インキュベートする。バイオマスの倍増は等式により決定する：
Ｔ４８時間のＯＤ６００
Ｔ０    のＯＤ６００  。
【００９４】
本発明を、以下の非限定的な実施例のみを参照して、ここで詳細に説明する。
実施例
【実施例１】
【００９５】
ミネラル最少培地において唯一の炭素源としてキシロースを用いるサッカロミセスＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株及びサッカロミセスＶ０９／００５０６４株の増殖
サッカロミセス・セレヴィシエＶ０８／０１３４１１株は、国立計測研究所、５１−６５  クラークストリート、サウスメルボルン、ヴィクトリア州、３２０５、オーストラリアへ、ブダペスト条約に基づいて２００８年５月２３日に受託番号Ｖ０８／０１３４１１で寄託した。
【００９６】
サッカロミセス・セレヴィシエＶ０９／００５０６４株は、国立計測研究所、１／１５３  バーティストリート、ポートメルボルン、ヴィクトリア州、３２０７、オーストラリアへ、ブダペスト条約に基づいて２００９年２月１８日に受託番号Ｖ０９／００５０６４で寄託した。
【００９７】
サッカロミセス酵母ＥＲ株は、工業的なデンプンからエタノールへの製造に用いられる代表的なサッカロミセス酵母であるが、標準微生物学的手順を用いて、Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ、ＢＰ  ３０２９−１３７  ｒｕｅ  Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｐｅｒｉ、Ｆ−５９７０３  Ｍａｒｃｑ−ｅｎ−Ｂａｒｏｅｕｌ  Ｃｅｄｅｘ  Ｆｒａｎｃｅから市販されている１箱の「エタノール・レッド」乾燥アルコール酵母から単離されたものである（バッチ番号４７０／２、製造日２００６年１０月）。
【００９８】
酵母株を増殖させ、試験Ｔ１にしたがって試験した。ＥＲ株は光学密度０．１４７で接種し、４８時間で光学密度０．２３３まで増加した（１．６倍増加）。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は光学密度０．１５８で接種し、４８時間で光学密度３．５０まで増加した（２２倍増加）。Ｖ０９／００５０６４株は光学密度０．１５で接種し、４８時間で光学密度１２．２０まで増加した（８０倍増加）。
【実施例２】
【００９９】
リグノセルロース加水分解物の調製
洗浄したリグノセルロースバイオマスを９０〜１２０℃にて水分＜５％まで乾燥させ、ハンマーミルを用いて＜１．５ｍｍまで粉状にし、乾式粉砕バイオマスを製造した。
【０１００】
硫酸を５５．２ｍｇ硫酸／ｇ乾燥バイオマスのレベルで乾式粉砕バイオマスへ混合し、２５％（ｗ／ｗ）固形物／水マッシュを製造した。
酸性固形物／水マッシュをオートクレーブ可能なプラスチックドラムへ移し、アルミホイルで覆い、１００Ｌの圧力容器に入れた。圧力容器の温度を１３０℃、２３ｐｓｉ／１６０ｋＰａに９０分間維持した。次に容器を減圧して３分以内に大気圧にした。
【０１０１】
得られた加水分解マッシュを手動ねじプレスへ供給し、脱水した。プレスしたマッシュの水分含量は６０〜６５％であった。加水分解物は加水分解マッシュ由来の液体である。
温液（「加水分解物」）のｐＨは０．８〜１．５であり、継続して攪拌した。サッカロミセス酵母をそのような培地中で増殖させるために、好ましいｐＨを２〜３％（ｖ／ｖ）の３２％アンモニア溶液の添加により達成し、液のｐＨをｐＨ＞５〜＜７（２５〜３０℃）へ調整した。アンモニアの使用は、サッカロミセス酵母が増殖及び発酵するための栄養である窒素を提供しながら、同時に培地のｐＨをサッカロミセス酵母の発酵に好適な範囲へ調整する。
【０１０２】
アンモニアでｐＨを中和後、加水分解物を、半径２０ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、４，０００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離により精製した。デカントした液をサッカロミセス酵母の増殖及び発酵に使用するために用意した。
【０１０３】
加水分解物を、バイオ・ラッドラボラトリーズ社のＣａｒｂｏｎ−Ｐ  Ｇｕａｒｄカラム（カタログ番号１２５−０１１９）を有するＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７  Ｐカラム（カタログ番号１２５−００９８）を用いたＨＰＬＣで分析した。移動相は、流速０．６ｍＬ／分のＨＰＬＣグレードの水及びカラム温度８５℃であった。以下の表は、記載の方法を用いて達成した加水分解物の組成の例を示す。
【０１０４】
【表１】
2011525357.tif 000002
【０１０５】
結果は、異なる供給源の植物バイオマスは、記載の方法で加水分解した場合、分析した成分（及び非常に起こり得るフェノール性物質などのような他のもの）に関し、異なる値を生ずることを示している。これは、植物バイオマス加水分解に伴う自然な程度の変動を示している。
【実施例３】
【０１０６】
リグノセルロース加水分解物の高濃度接種は迅速な発酵を促進させる
サッカロミセス・セレヴィシエＥＲ株及びＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株をスクロース最少培地中で増殖させ、非特許文献７に記載のように回収し、接種のための酵母バイオマスを準備した。
【０１０７】
１００ｍＬのｐＨを調製した加水分解物液を、１％クエン酸三ナトリウムの添加によりｐＨ５．０へ緩衝化した。クエン酸緩衝を用いて、その後の培養ｐＨを酵母の増殖に好適な範囲に維持した。培養及び発酵におけるｐＨ制御は、他の一般的な酸及び塩基を用いた滴定により達成することもできるであろう。１６％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースを、エタノールへ転換するために加水分解物液へ溶解させた。グルコースを、加水分解セルロース又は他の六炭糖に富んだ物質を採用した場合に利用するため酵母に利用可能な六炭糖を模倣するために加水分解物液へ加えた。緩衝化した、グルコースに富んだ液を、２５０ｍＬの三角フラスコへ分注した。
【０１０８】
回収した酵母バイオマスを、緩衝化した、グルコースに富んだサトウキビ絞りかす加水分解物液へ、２×１０６、２×１０７、及び２×１０８酵母細胞／ｍＬ加水分解物の濃度で接種し、３０℃で４８時間インキュベートした。サンプルは、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ社のＣａｔｉｏｎ−Ｈ  Ｇｕａｒｄ  カラム（カタログ番号１２５−０１２９）を有するＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７  Ｈカラム（カタログ番号１２５−０１４０）を用いたＨＰＬＣで、グルコース濃度及びエタノール濃度についてアッセイした。移動相は、ＨＰＬＣグレードの水中の４ｍＭ硫酸、流速０．６ｍＬ／分、及びカラム温度３５℃であった。以下の表は、２４時間及び４８時間のインキュベーション後の製造されたエタノール及び残留グルコースについてのデータを示す。
【０１０９】
【表２】
2011525357.tif 000003
【０１１０】
表２に示すように、加水分解物中のＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株によるグルコースからエタノールへの転換率は接種濃度に依存した。グルコースからエタノールへの完全な転換を２４時間以内に達成するには２×１０８細胞／ｍＬの添加を必要とし、グルコースからエタノールへの完全な転換を４８時間以内に達成するには２×１０７細胞／ｍＬの添加を必要とした。このように、リグノセルロース物質の加水分解に由来し、アンモニアで中和された阻害物質を含有する基質中でさえ、高接種濃度のＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を使用することにより、比較的迅速な発酵を可能にする。
【０１１１】
【表３】
2011525357.tif 000004
【０１１２】
表３に示すように、エタノールの製造効率は接種量に依存した。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は、同一条件下でＥＲ株よりも迅速で効率的な発酵を示した。特に、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は、２×１０７／ｍＬで接種した場合に２４時間後顕著にエタノールを製造することができ、２×１０８／ｍＬで接種した場合に事実上完全なグルコースからエタノールへの理論的発酵を２４時間以内に達成することができた。このデータは、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株の、リグノセルロース加水分解物の阻害効果への許容を立証している。
【実施例４】
【０１１３】
リグノセルロース加水分解物の発酵及びダンダーの調製
１００ｍＬのｐＨを調製した加水分解物液を、１％クエン酸三ナトリウムの添加によりｐＨ５．０へ緩衝化した。クエン酸緩衝を用いて、その後の培養ｐＨを酵母の増殖に好適な範囲に維持した。培養及び発酵におけるｐＨ制御は、他の一般的な酸及び塩基を用いた滴定により達成することもできるであろう。１６％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースを、エタノールへ転換するために加水分解物液へ溶解させた。グルコースを、加水分解セルロース又は他の六炭糖に富んだ物質を採用した場合に利用するため酵母が利用可能な六炭糖を模倣するために加水分解物液へ加えた。緩衝化した、グルコースに富んだ液を２５０ｍＬの三角フラスコへ分注した。
【０１１４】
サッカロミセス・セレヴィシエＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株をスクロース最少培地中で増殖させ、非特許文献７に記載のように回収し、接種材料のための酵母バイオマスを準備した。
【０１１５】
回収した酵母バイオマスを、緩衝化した、グルコースに富んだ加水分解物液へ、３．５×１０８酵母細胞／ｍＬの濃度まで接種し、３０℃にて１００ｒｐｍでインキュベートして、酵母を懸濁したままにした。ＨＰＬＣ分析で測定して全てのグルコースが利用されるまで発酵を進行させた。
【０１１６】
発酵後、発酵加水分解物を、半径１８ｃｍのローターを用いて、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。エタノールを沸騰除去した。滅菌蒸留水を残留液へ加えて沸騰前の容量にした。これは、新たに調製した加水分解物液のその後の発酵のため、酵母を増殖させるためのダンダー基質を提供した。
【実施例５】
【０１１７】
サッカロミセス・セレヴィシエのダンダー上での増殖
先の実施例は、加水分解物への接種に高細胞濃度を有することの利点を示している。しかしながら、伝統的な酵母接種材料をそのような高用量で使用するコストは経済的に法外であるため、阻害性加水分解物へ接種するためにあらかじめ条件付けた酵母細胞を高濃度で提供することは産業上挑戦的である。本発明者らは、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１又はＮＭＩ  Ｖ０９／００５０６４のような特性を有する酵母は、加水分解物の発酵の廃棄物（例えばダンダー）上で増殖し、あらかじめ条件付けた酵母を高細胞濃度で提供し、したがって、これまで酵母バイオマス及び酵母産物を製造するための加水分解物の発酵における廃棄物の流れとみなされていたものを使用するすることができると結論付けた。
【０１１８】
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株及びＥＲ株を、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）微生物学的ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、及び２％（ｗ／ｖ）アガー（ＧＹＰアガー）であるＧＹＰプレートに画線プレーティングした。プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。酵母株をアガープレートの表面からこすり取り、０．５ｍＬの滅菌蒸留水にそれぞれ再懸濁させた。ＥＲ株の細胞は初期濃度２．３×１０７／ｍＬまで、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株の細胞は初期濃度１．１×１０７／ｍＬまで、５００ｍＬのバッフル三角フラスコに入った、発酵したサトウキビ絞りかす加水分解物由来の１００ｍＬの新たに調製したダンダー基質へ接種した。フラスコを軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて２５５ｒｐｍで４日間インキュベートした。ＥＲ株は２．４×１０７細胞／ｍＬのままであったが、ＮＭＩ株は３．４×１０８細胞／ｍＬの濃度まで増加した。これらのデータは、その後の使用のための高濃度細胞を達成するためにダンダーを基質として用いてＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１の特性を有する株を培養することが可能であることを示している。
【実施例６】
【０１１９】
サッカロミセス・セレヴィシエのサトウキビ絞りかすダンダー上での増殖、及びサトウキビ絞りかす加水分解物のその後の発酵
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株をＧＹＰプレート上に画線プレーティングした。プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。酵母をアガープレートの表面からこすり取り、０．３ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁させた。懸濁した酵母を、サトウキビ絞りかす加水分解物の発酵及び蒸留から得られる（実施例４を参照されたい）、５０ｍＬ容量の滅菌キャップ付きＰＰ試験管（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に入った１０ｍＬのダンダー基質へ、３．０×１０７細胞／ｍＬの濃度で接種した。試験管を軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて２５５ｒｐｍでインキュベートした。５０時間インキュベーション後、１０ｍＬの培養物を、２５０ｍＬのバッフル三角フラスコに入った、サトウキビ絞りかす加水分解物由来の５０ｍＬのダンダーへ別々に移し、これを、軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて２５５ｒｐｍでインキュベートした。更に７２時間後、５０ｍＬの培養物を、５００ｍＬのバッフル三角フラスコに入った、サトウキビ絞りかす加水分解物由来の更なる５０ｍＬのダンダーへ移し、これを、軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて２５５ｒｐｍで更に４４時間インキュベートした。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は記載の条件下で最終細胞濃度６．６×１０８／ｍＬまで増殖した。半径１８ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により酵母細胞を回収した。培養プロセスに由来する液相（使用済みダンダー）を、化学組成及び化学的酸素要求量について分析した。以下の表は、開始（新鮮）ダンダー及び最終（使用済み）ダンダーの化学組成に関するデータを示す。
【０１２０】
【表４】
2011525357.tif 000005
【０１２１】
結果は、インキュベーション条件下で、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株はダンダーの条件へ適合可能であり、新鮮ダンダー中に見られるキシロースを含めた広範な残留炭素化合物を利用したことを示している。ダンダー中で最も豊富な炭素源であるキシロースの利用能は、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株の増殖を可能にし、それによりそのバイオマスを顕著に増加させた。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１のそのような特性は、それにより十分な酵母バイオマスがダンダー上で増殖可能なプロセスを可能にし、十分な酵母細胞を有する阻害性リグノセルロース加水分解物のその後の接種を可能にし、効率的な発酵を可能にする。
【０１２２】
サトウキビ絞りかすダンダー基質上での好気的増殖を介して得られる酵母を用いて、緩衝化した、グルコースに富んだサトウキビ絞りかす加水分解物を実施例４に記載のように接種し発酵させた。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を、緩衝化した、グルコースに富んだサトウキビ絞りかす加水分解物へ、開始濃度５．８×１０８細胞／ｍＬで接種した。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株による発酵の分析結果を以下の表に示す。
【０１２３】
【表５】
2011525357.tif 000006
【０１２４】
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は、全ての利用可能なグルコースを発酵させ、エタノールを製造した。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は、ダンダー上で増殖して十分な細胞マスを製造し、加水分解物中で効率的な発酵を支持する接種濃度を可能にするため、有益な特徴を示す。
【実施例７】
【０１２５】
サッカロミセス・セレヴィシエのトウモロコシ茎葉ダンダー上での増殖、及びトウモロコシ茎葉加水分解物のその後の発酵
トウモロコシ茎葉加水分解物液を、実施例２にしたがって調製した。トウモロコシ茎葉加水分解物液のダンダー基質は、実施例４にしたがって調製した。ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は、実施例６に記載のようにＧＹＰアガー上で増殖させた。酵母細胞をアガープレートの表面からこすり取り、０．３ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁させた。５０ｍＬ容量の滅菌キャップ付きＰＰ試験管（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に入った、１０ｍＬのトウモロコシ茎葉ダンダー基質は、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を２．４×１０７細胞／ｍＬの濃度まで接種した。試験管を軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて２５５ｒｐｍでインキュベートした。２０時間インキュベーション後、１０ｍＬの培養物を、５００ｍＬのバッフル三角フラスコに入った、トウモロコシ茎葉加水分解物由来の９０ｍＬのダンダーへ移し、これを同一のオービタル攪拌条件にて更に１２１時間インキュベートした。ＮＭＩ株は最終細胞濃度４．２×１０８／ｍＬまで増殖した。
【０１２６】
半径１８ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により、酵母細胞を回収した。培養プロセス由来の液相（使用済みダンダー）を、化学組成及び化学的酸素要求量について分析した。以下の表は、開始（新鮮）ダンダー及び最終（使用済み）ダンダーの化学組成についてのデータを示す。
【０１２７】
【表６】
2011525357.tif 000007
【０１２８】
表６のデータは、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株が、ダンダー中の各種の利用可能な炭素化合物を利用できることを示している。
トウモロコシ茎葉ダンダー基質上での好気的増殖を介して得られる酵母を用いて、実施例４に記載のように、緩衝化した、グルコースに富んだトウモロコシ茎葉加水分解物を接種し発酵させた。接種濃度は２．８×１０８細胞／ｍＬであった。
【０１２９】
トウモロコシ茎葉加水分解物液のＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株による発酵の分析結果を以下の表に示す。
【０１３０】
【表７】
2011525357.tif 000008
【０１３１】
ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は全ての利用可能なグルコースを発酵させ、エタノールを製造した
【実施例８】
【０１３２】
サッカロミセス・セレヴィシエをダンダー上で好気的培養した後のダンダーの化学的酸素要求量（ＣＯＤ）の減少
酵母ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を、実施例６及び７に記載のように、サトウキビ絞りかす加水分解物及びトウモロコシ茎葉加水分解物の発酵に由来するダンダーへ接種し、好気的に培養した。好気的培養プロセス前後のダンダーのＯＤを、Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、６４２７１  ダルムシュタト、ドイツより供給されるＳｐｅｃｔｒｏｑｕａｎｔ  ＣＯＤキット（カタログ番号１．１４５５５．０００１）を用いてアッセイした。製造者の指示に従ってキットを使用した。方法は、排水に関して承認されているＵＳＥＰＡであり、ＥＰＡ  ４１０．４、ＵＳ標準法５２２０  Ｄ、及びＩＳＯ  １５７０５に類似している。サトウキビ絞りかすダンダー中でＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を培養後のダンダーのＣＯＤは４１％まで減少した。トウモロコシ茎葉ダンダー中でＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を培養後のダンダーのＣＯＤは２５％まで減少した。
【実施例９】
【０１３３】
酵母バイオマスを製造するための加水分解物上での酵母の好気的増殖
ＥＲ株及びＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株を、実施例５に記載のように、ＧＹＰプレート上で増殖させた。回収した細胞を、ＥＲ株は２．３×１０７／ｍＬの濃度で、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１株は１．２×１０７／ｍＬの濃度で、５００ｍＬのバッフル三角フラスコに入った、１００ｍＬの新鮮サトウキビ絞りかす加水分解物へ接種した。軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー中で培養物を３０℃にて２４０ｒｐｍで９６時間インキュベートし、酵母バイオマスを増殖させた。９６時間に、ＥＲは細胞濃度が増加しなかったが（１．８×１０７／ｍＬ）、ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１は細胞濃度が４０倍に増加した（４．９×１０８／ｍＬ）。表８に示すように、加水分解物の酢酸塩濃度、グリセロール濃度、及びキシロース濃度は、サッカロミセス酵母ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１により減少していた。
【０１３４】
こうして製造されたサッカロミセス酵母ＮＭＩ  Ｖ０８／０１３４１１バイオマスは、発酵、食料、飼料、又は抽出物などの酵母が使用され得る目的に使用できるであろう。
【０１３５】
【表８】
2011525357.tif 000009
【実施例１０】
【０１３６】
サトウキビ絞りかす加水分解物背景でグルコース又はスクロースを遊離糖類として用いるＶ０９／００５０６４株によるエタノール製造
本実施例は、Ｖ０９／００５０６４株がサトウキビ絞りかす加水分解物中で増殖でき、その増殖を介して製造された酵母バイオマスは、サトウキビ絞りかす加水分解物培養液中で、遊離グルコース又はスクロースを発酵させることができることを示す。
【０１３７】
Ｖ０９／００５０６４株をＧＹＰプレート上で増殖させた（実施例５に記載のように）。サトウキビ絞りかす加水分解物は実施例２に記載のように調製し、表９に示す組成を有していた。酵母を、ＧＹＰプレートから、２５０ｍＬの三角フラスコ内の５０ｍＬのサトウキビ絞りかす加水分解物へ接種し、軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で１８０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃でインキュベートした。
【０１３８】
【表９】
2011525357.tif 000010
【０１３９】
２４時間後、酵母懸濁液を、半径１２０ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、３，０００ｒｐｍで１０分間室温にて遠心分離した。全てであるが４ｍＬの上清をデカントし、Ｖ０９／００５０６４酵母細胞を残留液に再懸濁させた。
【０１４０】
ｉ）  加水分解物におけるスクロースの発酵
加水分解物上で増殖させた２ｍＬのＶ０９／００５０６４酵母を、スクロースを添加した１００ｍＬの新鮮なサトウキビ絞りかす加水分解物へ接種した。初期細胞濃度は３．７×１０７酵母細胞／ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコで発酵を行った。９５ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で４８時間インキュベート後、スクロースを添加した１００ｍＬのサトウキビ絞りかす加水分解物は、１．８×１０８酵母細胞／ｍＬ及び１２．６７％（ｖ／ｖ）エタノールを製造した。表１０は、４８時間後に残留スクロースがなかったことを示している。Ｖ０９／００５０６４株は、実施例２に記載のように調製した加水分解物の存在下、スクロースの迅速な発酵が可能であることが理解できる。
【０１４１】
【表１０】
2011525357.tif 000011
【０１４２】
ｉｉ）  加水分解物におけるグルコースの発酵
加水分解物上で増殖させた２ｍＬのＶ０９／００５０６４酵母を、グルコースを添加した１００ｍＬの新鮮なサトウキビ絞りかす加水分解物へ接種した。初期細胞濃度は３．８×１０７酵母細胞／ｍＬであり、発酵は２５０ｍＬ三角フラスコ内で行った。９５ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で４８時間インキュベーション後、グルコースを添加した１００ｍＬのサトウキビ絞りかす加水分解物は、１．８×１０８酵母細胞／ｍＬ及び１２．６１％（ｖ／ｖ）エタノールを製造した。表１１は、４８時間後、１％（ｗ／ｖ）未満の残留グルコースがあったことを示している。Ｖ０９／００５０６４株は、実施例２に記載のように調製した加水分解物の存在下でグルコースの迅速な発酵が可能であることが理解できる。
【０１４３】
【表１１】
2011525357.tif 000012
【実施例１１】
【０１４４】
サトウキビ絞りかす加水分解物とダンダーとの混合物におけるサッカロミセス・セレヴィシエの増殖、並びにエタノールを製造するためのその後の同時の糖化及び発酵
本実施例は、Ｖ０９／００５０６４株は、新鮮な糖を加水分解されたサトウキビ絞りかすとダンダーとの混合物中で効率的に増殖することを示している。結果は、製造された酵母の量は、同時の糖化及び発酵プロセスのための酵母並びに酵母が広く使用される他の有用な目的のための過剰な酵母を提供するために十分であることも示している。したがって、所望のプロセスを通して、エタノール及び過剰な酵母バイオマスを製造することが可能である。
【０１４５】
好気的発酵のための種培養物の調製：
加水分解物／ダンダーへの接種及び好気的増殖のためのＶ０９／００５０６４株の種培養物を調製するため、実施例５に記載のようにＶ０９／００５０６４株をＧＹＰプレート上で増殖させ、２５０ｍＬの三角フラスコに入った５０ｍＬのサトウキビ絞りかす加水分解物へ接種した。実施例２にしたがって調製した加水分解物は表１２に示す組成を有していた。三角フラスコを、軌道直径１０ｃｍのオービタルシェーカー内で３０℃にて１８０ｒｐｍでインキュベートした。２４時間後、酵母懸濁液を半分にして２×２５ｍＬのサンプルとし、それぞれを７５ｍＬのサトウキビ絞りかす加水分解物へ別々に再懸濁させた。サトウキビ絞りかす加水分解物懸濁液中の１００ｍＬの得られた酵母を、それぞれ５００ｍＬのバッフル三角フラスコに入れ、上記と同一の条件下で更に７２時間インキュベートした。７２時間後、フラスコ培養物を併せて、ダンダー／加水分解物混合物においてＶ０９／００５０６４を好気的に増殖させるための種培養物を作製した。
【０１４６】
先の発酵ラウンドに由来する５００ｍＬのダンダーを、３００ｍＬの新鮮なサトウキビ絞りかす加水分解物とブレンドすることにより、ダンダー／加水分解物混合物を調製した。ブレンドの最終組成を表１２に示す。これを、高さ２１ｃｍ×直径１４ｃｍの寸法の３．１Ｌの発酵容器へ導入し、発酵容器内で酵母を増殖させる条件は表１３に列挙した。残留する５００ｍＬのダンダーとサトウキビ絞りかす加水分解物との混合物を、発酵容器へ０．６５ｍＬ／分で供給しながら継続的に攪拌した。
【０１４７】
６７時間にわたり、酵母細胞は８．７×１０７／ｍＬの濃度から７．８×１０８／ｍＬの濃度まで増加した。
【０１４８】
【表１２】
2011525357.tif 000013
【０１４９】
【表１３】
2011525357.tif 000014
【０１５０】
６７時間後、半径２０ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、４，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、酵母を回収した。乾燥酵母の回収率は１３．７ｇであった。表１２に示すように、発酵槽中で好気的増殖後の使用済み培地の組成は、酵母Ｖ０９／００５０６４が全てのグルコース、キシリトール、グリセロール、及びエタノールを完全に代謝し、いずれも顕著に減少しているがわずかな残留レベルのガラクトース、キシロース、及び酢酸塩を残したことを示している。
【０１５１】
実施例８に記載のように化学的酸素要求量アッセイを行った。これらのアッセイは、発酵槽において好気的増殖後の使用済み培地のＣＯＤが、元のダンダー／加水分解物混合物と比較して、４６％減少したことを示した。
【０１５２】
Ｖ０９／００５０６４を用いた同時の糖化及び発酵：
およそ１／３の回収したＶ０９／００５０６４株細胞バイオマスを、表１４に示す組成の１Ｌの新鮮なサトウキビ絞りかす加水分解物中に再懸濁させ、濃度１．７×１０８／ｍＬとした。同時の糖化及び発酵を行うため、Ｖ０９／００５０６４培養物を含有する加水分解物へ２００ｇのマルトデキストリンを添加し、１ｍＬのＳｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｆｕｅｌ（ノボザイムズ  オーストラリア株式会社）を容器へ注入し、マルトデキストリンを糖化させた。
【０１５３】
【表１４】
2011525357.tif 000015
【０１５４】
発酵条件は表１５に示す通りである。
【０１５５】
【表１５】
2011525357.tif 000016
【０１５６】
表１６に示すように、加水分解物／ダンダー中で増殖したＶ０９／００５０６４酵母は、同時の糖化及び発酵において、８．３９％エタノールを３０℃にて４６時間以内に製造した。この発酵は、実施例２に記載のように製造した加水分解物の存在下で行った。
【０１５７】
【表１６】
2011525357.tif 000017
【０１５８】
有効な同時の糖化及び発酵に必要とされるのはわずか１／３のＶ０９／００５０６４酵母であるため、過剰の酵母バイオマスは、１つ又は複数の目的に全細胞又は抽出細胞として使用できることは明らかである。そのような目的は当業者に公知であり、ビタミン、ヌクレオチド、酵母抽出物などを製造するための材料供給としての使用が含まれる。
【実施例１２】
【０１５９】
エタノールを製造するための、サッカロミセス・セレヴィシエのサトウキビ絞りかす加水分解物における増殖、並びにその後のセルロース物質の同時の糖化及び発酵
本実施例は、Ｖ０９／００５０６４株が、実施例２に記載のように調製した加水分解物の存在下で、セルロースの同時の糖化及び発酵を実施する能力を立証している。低接種量の酵母は加水分解物によって阻害されるが、高接種量の酵母は加水分解物を有効に解毒し、より効率的な同時の糖化及び発酵をもたらすことを示すため、加水分解物から大量の酵母を作製することの産業上の有用性も立証している。
【０１６０】
サトウキビ絞りかす加水分解物は、実施例２に記載のように調製した。サトウキビ絞りかす加水分解物の組成を表１７に示す。
【０１６１】
【表１７】
2011525357.tif 000018
【０１６２】
Ｖ０９／００５０６４株を、表１３に記載の条件下、３．１Ｌの通気した発酵槽内の１Ｌの加水分解物Ａ中で増殖させた。Ｖ０９／００５０６４株を、１．３５×１０８細胞／ｍＬで接種し、回収前に６．０×１０８細胞／ｍＬの濃度まで到達した。半径２０ｃｍのスウィング・アウト・ローターを用いて、４，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、酵母を回収した。上清をデカントし、残留する使用済み加水分解物に細胞を再懸濁させ、２７％（ｗ／ｖ）全固形物の濃縮酵母細胞懸濁液を得た。
【０１６３】
Ａｖｉｃｅｌ（シグマ・アルドリッチ−フルカ）を結晶セルロースの代用品として用いて、加水分解物Ｂ（表１７）へ加え、２０％（ｗ／ｖ）セルローススラリーを作製した。セルロース分解酵素（ノボザイムズ  オーストラリア株式会社から入手）をこのスラリーへ加えた。酵素はＣｅｌｌｕｌｃｌａｓｔ  １．５Ｌ（製品番号ＣＣＮ０３１００、０．１２８ｍＬ／ｇ  Ａｖｉｃｅｌで添加）及びＮｏｖｏｚｙｍ  １８８（製品番号ＤＣＮ００２０６、０．０６４ｍＬ／ｇ  Ａｖｉｃｅｌで添加）である。酵素を含んだセルローススラリーを、５０ｍＬのＰＰ試験管（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に入った、２つの２５ｍＬロットに分けた。上記２７％（ｗ／ｖ）懸濁液から、酵母Ｖ０９／００５０６４株を、一方の酵素を含んだスラリーへは３．６×１０７細胞／ｍＬで、他方の酵素を含んだスラリーへは９×１０８細胞／ｍＬで接種した。試験管を３７℃にて９０ｒｐｍでインキュベートした。２４及び４８時間後にそれぞれのサンプルを分析した。データを表１８に示す。
【０１６４】
【表１８】
2011525357.tif 000019
【０１６５】
データは、同時の糖化及び発酵において、より低濃度の酵母細胞では、エタノール製造は起こらなかったが、グルコースは蓄積したことを示している。しかしながら、高細胞濃度を接種した場合、グルコースは蓄積せず、エタノール濃度はより大きかった。
【０１６６】
本実施例の結果は、加水分解物背景において、酵母Ｖ０９／００５０６４株をサトウキビ絞りかす加水分解物中で増殖させ、その後、この酵母をセルロースの同時の糖化及び発酵に用いることが可能であることを示している。
【０１６７】
加水分解物中で酵母を増殖させ、その後の加水分解物／セルロース発酵への高濃度接種に十分な酵母を製造することが可能である利点も、本実施例により立証される。
以下の特許請求の範囲及び先行する発明の説明において、文脈が、表現言語又は必須の暗示により他を必要とする場合を除いて、“comprise”という語又は“comprises”若しくは“comprising”などの変形は包括的意味で用いられ、即ち主張した特徴の存在を特定するために用いられており、本発明の様々な態様における更なる特徴の存在又は追加を除外するために用いているのではない。
【０１６８】
本明細書における先行技術文献への参照は、オーストラリア又は他の国においてその文献が当該技術分野における一般常識の一部を形成するという承認を構成するものではないことを理解すべきである。
【図１】
2011525357.tif 000020
【図２】
2011525357.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月16日(2011.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス酵母の増殖又はサッカロミセス酵母産物の製造におけるＣ５化合物含有物質を含む基質の使用であって、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
であり、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記使用。
【請求項２】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物から得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｃ５化合物含有物質が、リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質と、リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質との混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
サッカロミセス酵母が非組換え型である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
サッカロミセス酵母が：ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体；及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を有する株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物を製造する方法であって、Ｃ５化合物含有物質を含む基質を、サッカロミセス酵母とともに、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件にてインキュベートすることを含み、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
であり、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記方法。
【請求項１３】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ５化合物含有物質が、リグノセルロース加水分解物から及びリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ５化合物含有物質がリグノセルロース加水分解物である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ５化合物含有物質がキシロース含有物質である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
エタノールの製造方法であって、以下の工程：
（ａ）  請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用又は請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法により製造されるサッカロミセス酵母を、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともに、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
更なる工程：
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、ことを含み、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
更なる工程：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す、
ことを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
エタノール及びサッカロミセス酵母バイオマスを製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）  ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物、及びリグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
ことを含み、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記方法。
【請求項２７】
以下の工程：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す、
ことを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、サッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有する、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、リグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルカリ剤がアンモニアである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
サッカロミセス酵母を、少なくとも約２×１０５酵母／ｍＬ加水分解物の濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートする、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
エタノールを製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母、及びリグノセルロース加水分解物を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母による発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ｐＨ調整は、アンモニアの添加により加水分解物のｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３４】
エタノール及びサッカロミセス酵母を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られる基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能なサッカロミセス酵母、及びリグノセルロース加水分解物を準備し；
（ｂ）  サッカロミセス酵母による発酵のためにリグノセルロース加水分解物のｐＨを調整し、ｐＨ調整は、アンモニアの添加により加水分解物のｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整することを含み；
（ｃ）  サッカロミセス酵母及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件にてインキュベートし；
（ｄ）  エタノールを単離し；そして
（ｅ）  （ｉ）工程（ｃ）から得られるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上でサッカロミセス酵母を増殖させる、
ことを含み、
ここで、サッカロミセス酵母は、基質上で増殖するための炭素源としてキシロースを利用可能である、前記方法。
【請求項３５】
更なる工程：
（ｆ）  工程（ｅ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す、
ことを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
サッカロミセス酵母がサッカロミセス・セレヴィシエの株である、請求項１２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
サッカロミセス酵母が非組換え型である、請求項１２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
サッカロミセス酵母が：ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１、又はＶ０８／０１３４１１を決定づける特性を有するその変異体若しくは誘導体、あるいはＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４、又はＶ０９／００５０６４を決定づける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、請求項１２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１の株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０８／０１３４１１を決定付ける特性を有するその変異体若しくは誘導体；及びＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４の株、又はＮＭＩ受託番号Ｖ０９／００５０６４を決定づける特性を有するその変異体若しくは誘導体から成る群より選択される、サッカロミセス酵母。
【請求項４０】
エタノールを製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）  請求項３９に記載のサッカロミセス酵母、及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；そして
（ｂ）  エタノールを単離する、
ことを含む、前記方法。
【請求項４１】
更なる工程：
（ｃ）  （ｉ）  工程（ａ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上で請求項３９に記載のサッカロミセス酵母を増殖させる、
ことを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
更なる工程：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて、工程（ａ）〜（ｂ）を繰り返す、
ことを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
エタノール及びサッカロミセス酵母を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）  請求項３９に記載のサッカロミセス酵母、及びｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物を、リグノセルロース加水分解物の発酵を引き起こしてエタノール及びＣ５化合物含有物質を製造させる条件下でインキュベートし；
（ｂ）  エタノールを単離し；そして
（ｃ）  （ｉ）  工程（ｂ）で製造されるＣ５化合物含有物質；（ｉｉ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；又は（ｉｉｉ）  （ｉ）と（ｉｉ）との混合物、を含む基質上で請求項３９に記載のサッカロミセス酵母を増殖させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項４４】
以下の工程：
（ｄ）  工程（ｃ）で増殖するサッカロミセス酵母を用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す、
ことを更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、サッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物が、リグノセルロース加水分解物及びアルカリ剤を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アルカリ剤がアンモニアである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サッカロミセス酵母を、少なくとも約２×１０５酵母／ｍＬ加水分解物の濃度で、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物とともにインキュベートする、請求項３３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
サッカロミセス酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項３３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
基質がＣ５化合物含有物質である、請求項２６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ５化合物含有物質がダンダーである、請求項２６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
アンモニアをリグノセルロース加水分解物へ添加し、ｐＨをサッカロミセス酵母による発酵を支持するｐＨへ調整する、リグノセルロース加水分解物のｐＨを調整する方法。
【請求項５３】
サッカロミセス酵母による発酵に好適な、ｐＨを調整したリグノセルロース加水分解物であって、リグノセルロース加水分解物及びアンモニアを含む、前記加水分解物。
【請求項５４】
サッカロミセス酵母バイオマス又はサッカロミセス酵母産物を製造する方法であって、Ｃ５化合物含有物質を含む基質を、請求項３９に記載のサッカロミセス酵母とともに、サッカロミセス酵母の増殖又は産物の製造を引き起こす条件下でインキュベートすることを含み、
Ｃ５化合物含有物質は：
（ａ）  リグノセルロース加水分解物から得られるＣ５化合物含有物質；
（ｂ）  リグノセルロース加水分解物の発酵から得られるＣ５化合物含有物質；又は
（ｃ）  （ａ）と（ｂ）との混合物、
である、前記方法。
【請求項５５】
Ｃ５化合物含有物質が、ダンダー、リグノセルロース加水分解物、又はダンダーとリグノセルロース加水分解物との混合物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
リグノセルロース加水分解物のｐＨが調整されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ｐＨを調整した加水分解物が、請求項５０に記載のｐＨを調整した加水分解物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
酵母が基質上で増殖する、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
酵母が基質上で好気的に増殖する、請求項５８に記載の方法。
【国際調査報告】
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2011525357.tif 000023
2011525357.tif 000024
2011525357.tif 000025
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