(57)【要約】  本発明は、支持体材料の孔の壁の少なくとも一部を機能化するための方法であって、ａ）電気信号が２つの電極の間に印加されるとき、前記壁上に局在的な沈着を生じさせることができる電圧降下を孔の内部に作り出すために、電気的に活性化される実体の溶液と孔を接触させ、前記溶液中に２つの電極を配置するステップと、ｂ）電気的に活性化される実体を活性化し、前記機能化機能を行うために、２つの電極の間に電気信号を印加するステップとを含むことを特徴とする方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体材料の少なくとも１つの孔の壁の少なくとも一部を機能化するための方法であって、
ａ）電気信号が２つの電極の間に印加されるとき、前記壁上に局在的な沈着を生じさせることができる電圧降下を孔の内部に作り出すように、電気活性化可能な化学種の溶液と接触させて孔を配置し、溶液中に２つの電極を配置するステップと、
ｂ）電気活性化可能な化学種を活性化し、前記機能化を実現するために、２つの電極の間に少なくとも１つの電気信号を印加するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記孔内部の電圧降下が１０００Ｖ／ｍ超であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気活性化可能な化学種の第２の溶液を用いて、ａ）およびｂ）の少なくとも１回の繰り返しを含むことを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
孔が両端で開いていること、および溶液が２つのコンパートメントに入れられ、前記コンパートメントのそれぞれが孔の一端を現し、２つの溶液の少なくとも１つが前記電気活性化可能な化学種を含有することを特徴とする、請求項１から３の一項に記載の方法。
【請求項５】
孔がただ１つの現れている端を有すること、電極の１つがキャビティの底部または孔の底部に配置されること、および他の電極が孔の前記現れている端と連通したコンパートメント内に配置されることを特徴とする、請求項１から３の一項に記載の方法。
【請求項６】
ｂ）の後にすすぎをすることを含むことを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項７】
電気活性化可能な化学種が電解重合可能なモノマー、特にπ共役導電性ポリマーであることを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項８】
電気活性化可能な化学種が、ピロール、チオフェン、インドール、アニリン、アジン、フェニレンビニレン、フェニレン、ピレン、フラン、セレノフェン、ピリダジン、カルバゾール、アクリレート、およびメタクリレート、ならびにこれらの誘導体から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
電気活性化可能な化学種がエレクトログラフト可能な官能基、特にジアゾニウム基を有することを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の方法。
【請求項１０】
電気活性化可能な化学種が、金属、金属酸化物、触媒粒子、塩、および金属錯体から選択されることを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の方法。
【請求項１１】
電気活性化可能な化学種が、電気泳動ペイントによって形成されることを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、リガンドに結合した電気活性化可能な化学種を含むことを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項１３】
電気活性化可能な化学種の溶液が、電気活性化可能な化学種の混合物、特に電解重合可能なモノマーと、前記リガンドに結合した電気活性化可能な化学種とを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液が、生体分子に結合したピロールを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電気活性化可能な化学種の溶液が、対象とするドーピングイオン、特にヘパリンおよび／またはコンドロイチンを含有することを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項１６】
支持体材料がケイ素ベースであることを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項１７】
電気信号が、電位差、特に１０ｍＶと５００Ｖの間、さらには１００ｍＶと１０Ｖの間の電位差であることを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項１８】
電圧差が、１０μｓと１００ｓの間、さらには１０ｍｓと１００ｓの間印加されることを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項１９】
電気活性化可能な化学種の濃度が１ｎＭと５００ｍＭの間であることを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項２０】
電気活性化可能な化学種を支持体から分離するステップを含むことを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項２１】
支持体が、孔の壁を広げる少なくとも１つの加熱機能化領域を有する、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項２２】
孔が、機能化領域を構成するネッキング領域（６２、６２’）を含むことを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項２３】
電気活性化可能な化学種がプローブ分子を含むこと、および前記方法が、認識による会合、特に相補性標的分子とのハイブリダイゼーションによる会合のステップを含むことを特徴とする、前記請求項の一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記認識による会合を変性させるステップ、必要に応じてその後に、認識による会合の新規ステップ、特に再ハイブリダイゼーションの新規ステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能化方法、より詳細には、孔の壁の少なくとも一部を生体機能化するための方法に関する。
【０００２】
用語「孔」（またはチャネル、またはキャピラリー）は、材料から現れている（ｅｍｅｒｇｉｎｇ）、または現れていない任意のキャビティを表す。
【背景技術】
【０００３】
孔またはチャネルまたはキャピラリーの３次元構造は、その機能化を困難にする。具体的には、吹きつけまたは「スポッティング」などの平らな表面を機能化するのに一般に使用される技法は、例えば、孔、チャネルまたはキャピラリーに対して実行することが困難になり、または不可能とさえなり、これは、より小さいサイズについていっそう当てはまる。
【０００４】
一般に、既知の製造方法は、局在的に孔を機能化することを可能にしないか、機能化することにおいて大きな困難を有する。
【０００５】
孔を機能化するためには、標準的な表面機能化技法を使用するのが一般的なやり方である。最も一般的なものは、支持体上の分子の自己組織化特性を使用する。
【０００６】
第一のものは、シラン化により、ガラスまたはケイ素などの材料の表面への有機シランの共有結合性グラフト化を行う。この過程は通常、対象とする分子の固定化を後に可能にする反応基での機能化を最初に実施するものである（Ｉｑｂａｌ，Ｓ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００７、２：２４３頁以下参照；Ｋａｒｎｉｋら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（３）：５４７頁以下参照；Ｋｉｍ，Ｙ．−Ｒ．ら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２００７．２２：２９２６頁以下参照；Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．ら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（６）：１５８０頁以下参照）。一般的に使用されているにもかかわらず、シラン化過程は、依然として制御が不十分なままであり、材料のパラメータの制御を必要とし、これは、表面改質の信頼性および沈着物の安定性（表面機能の性質、汚染のないこと、表面粗さなど）にとって極めて重要である。
【０００７】
自己組織化アルカンチオール単層の形成（Ｌｅｅ  Ｓ．Ｂ．およびＭａｒｔｉｎ  Ｃ．Ｒ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００１、１３（１０）；３２３６頁以下参照；Ｓｍｕｌｅａｃ  Ｖ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、１６（１４）：２７６２頁以下参照；Ｊａｇｅｒｓｋｉら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（６）：１６０９頁以下参照）は、金（最も一般に使用される）、銀、白金、銅などの様々な金属表面における、チオール基の化学吸着に基づく。このストラテジーは、ナノ孔の、チオール化ＤＮＡ鎖での機能化を実現するために開発された（Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００４、１２６、１５６４６頁以下参照）。
【０００８】
先に述べた技法の主要な欠点の１つは、機能化は通常、局在化せずに、孔だけでなく、有機シランまたはアルカンチオールを含有する溶液が付着しているところであればどこでも、孔の周りの反応性の平らな表面にも関係するという事実である。アルカンチオールの場合、支持体は必ず金属である。
【０００９】
「Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６、１８、４２７〜４３１頁）という表題の、Ｊｏａｋｉｍ  Ｎｉｌｓｓｏｎらによる最近の論文には、窒化ケイ素表面に孔を作製するために、集束イオンナノビーム、またはｎａｎｏＦＩＢ（ＦＩＢ：集束イオンビーム）を使用することが記載されている。孔のエッチング、ＦＩＢビームのビーム下での二酸化ケイ素層の沈着、およびシラン化により、ＤＮＡ鎖の局在的な結合を可能にする表面反応性機能がもたらされる。しかし、この過程は、多段階であり、支持体の事前のシラン化を必要とする。
【００１０】
他の著者は、ピロールで機能化された有機シランで支持体をシラン化することによる、誘電体表面上への導電性ポリマーの固定化を記載している。次いでピロールモノマーが媒質に添加され、酸化剤によって重合が開始される（Ｓｉｍｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８２、１０４：２０３１頁以下参照；Ｆａｖｅｒｏｌｌｅら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９８．１０：７４０頁以下参照）。
【００１１】
例えば、重合性化学種を使用することによって、ポリカーボネート膜中の孔を機能化することが可能であることも文献に記載されている。したがって、物理的なバリア（孔、チャネルなど）によって区切られた、閉じ込められたフレームワーク内（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９０、１１２、８９７６頁以下参照、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６６（５１９３）：１９６１頁以下参照）、または重合が配向した様式で起こるように、重合媒質を構成する外部因子の存在下（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００３、１２５：１４７９３頁以下参照；Ｑｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４２：３１７０頁以下参照）で重合を実施することによって、導電性ポリマー管を得ることが可能である。これらの構造の適用は通常、結合と結びついており、これが、大部分の著者を、適切な場合、ポリマー管を作製した後における、基質の溶解に導く。この場合、孔は「鋳型」、すなわち、生成するポリマーの円筒形状を作るものであるだけであり、活性支持体として使用されることは意図されていない。
【００１２】
概略的に、２つの異なる方法、すなわち、化学重合および電解重合が知られており、使用される。
１）化学重合（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６６（５１９３）：１９６１頁以下参照による上述した論文；Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ．Ｒ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１、３：４５７頁以下参照）。
【００１３】
ポリマーナノチューブを得るための一手段は、ピロールなどのモノマーの「化学的」重合を実施するものであり、これは頻繁に引用されている。この実験技法は、２種の水溶液、すなわちピロールモノマーを含有する溶液と、酸化剤（例えば、ＦｅＣｌ３）を含有する他の溶液との間に多孔質膜（ポリカーボネートなど）を配置するものであり、２つの溶液が遭遇する箇所、すなわち、膜の孔中で重合に至る。
２）電解重合（Ｍｅｎｏｎ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌ、１９９６、８：２３８２頁以下参照；Ｄｅｍｏｕｓｔｉｅｒ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９８、３４（１２）：１７６７頁以下参照）。
【００１４】
この場合、ある材料、すなわち付着層（例えば、クロム）を膜の一方の側に最初に沈着させ、次いで金属層（金）をその上に沈着させる。次いで、３電極の電解セルによって、この表面上でピロールの電解重合を実施することができる。
【００１５】
これらの過程により、これらのステップの１つの間に、孔を「鋳型」として使用して組織化された構造を得るための、ポリマーで機能化された孔を得ることが可能になる。こうして、Ｓａｐｐら（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９９、１１：１１８３頁以下参照）によって、チオフェンと、アミン官能基を有するピロールモノマーとの電気化学的重合を実施して、ビオチン誘導体のグラフト化を可能にすることによる、ビオチンによる機能化が実施された。
【００１６】
生体分子を有するピロールモノマーがそれ自体知られていることは、さらに注目される（特に、仏国特許出願第２７０３３５９号および同第２７２０８３２号）。
【００１７】
仏国特許出願第２７８７５８２号、および同第２７８４４６６号は、標準的な電解重合技法に関し、これによれば、非顕性（ｎｏｎ−ｅｍｅｒｇｉｎｇ）のフラストコニカルマイクロキュベットの底部に１つの電極が配置され、別の電極が電解質中の不特定の位置に配置される。この場合、マイクロキュベットの表面は機能化されないが、その底部に位置した電極のみが機能化される。言い換えれば、この既知の技法は、これらの電極の１つの上だけで沈着を実現することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】仏国特許出願第２７０３３５９号
【特許文献２】仏国特許出願第２７２０８３２号
【特許文献３】仏国特許出願第２７８７５８２号
【特許文献４】仏国特許出願第２７８４４６６号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｉｑｂａｌ，Ｓ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００７、２：２４３頁以下参照
【非特許文献２】Ｋａｒｎｉｋら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（３）：５４７頁以下参照
【非特許文献３】Ｋｉｍ，Ｙ．−Ｒ．ら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２００７．２２：２９２６頁以下参照
【非特許文献４】Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．ら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（６）：１５８０頁以下参照
【非特許文献５】Ｌｅｅ  Ｓ．Ｂ．およびＭａｒｔｉｎ  Ｃ．Ｒ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００１、１３（１０）；３２３６頁以下参照
【非特許文献６】Ｓｍｕｌｅａｃ  Ｖ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、１６（１４）：２７６２頁以下参照
【非特許文献７】Ｊａｇｅｒｓｋｉら、Ｎａｎｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、７（６）：１６０９頁以下参照
【非特許文献８】Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００４、１２６、１５６４６頁以下参照
【非特許文献９】Ｊｏａｋｉｍ  Ｎｉｌｓｓｏｎら、「Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６、１８、４２７〜４３１頁
【非特許文献１０】Ｓｉｍｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８２、１０４：２０３１頁以下参照
【非特許文献１１】Ｆａｖｅｒｏｌｌｅら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９８．１０：７４０頁以下参照
【非特許文献１２】Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９０、１１２、８９７６頁以下参照
【非特許文献１３】Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６６（５１９３）：１９６１頁以下参照
【非特許文献１４】Ｃａｒｓｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００３、１２５：１４７９３頁以下参照
【非特許文献１５】Ｑｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４２：３１７０頁以下参照
【非特許文献１６】Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ．Ｒ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１、３：４５７頁以下参照
【非特許文献１７】Ｍｅｎｏｎ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌ、１９９６、８：２３８２頁以下参照
【非特許文献１８】Ｄｅｍｏｕｓｔｉｅｒ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９８、３４（１２）：１７６７頁以下参照
【非特許文献１９】Ｓａｐｐら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９９、１１：１１８３頁以下参照
【非特許文献２０】Ａ．Ｍ．Ｍａｒｓｏｕｋ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、７５：１２５８頁以下参照
【非特許文献２１】Ｚｈｏｕら  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＆  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９９．３９：１９頁以下参照
【非特許文献２２】Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，Ｗら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１．１９：２４８頁
【非特許文献２３】ＢａｙｌｅｙおよびＣｒｅｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１．４１３：２２６頁以下参照．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、単純化されているが、その表面に位置した孔の機能化を実施するための方法に関する。本発明の基本概念は、孔の壁への沈着を可能にすることができる電圧勾配を孔内に生じさせるものである。
【００２１】
したがって本発明は、支持体材料の少なくとも１つの孔の壁の少なくとも一部を機能化するための方法であって、
ａ）電気信号が２つの電極の間に印加されるとき、前記壁上に局在的な沈着を生じさせることができる電圧降下、特に１０００Ｖ／ｍ超の電圧降下を孔の内部に作り出すように、電気活性化可能な化学種の溶液と接触させて孔を配置し、孔のいずれかの側で、前記溶液中に２つの電極を配置するステップと、
ｂ）２つの電極の間に電気信号、電位差、または電流を印加することによって前記機能化を実現するステップと
を伴うことを特徴とする方法に関する。
【００２２】
孔内部で、電極同士の間に高電圧勾配を生じさせることによって、孔（単数又は複数）の壁上、およびまた同時に、標準的な電解重合沈着の間に観察されるように、アノード分極電極上に沈着が得られる。
【００２３】
現れていない孔の場合、１つの電極は、現れていないキャビティの底部、または孔の底部に配置される。他方の電極は、孔の端（ｄ＝０）、または孔の端からある距離（ｄ＞０）に配置され、孔内の電圧降下は壁上への沈着を可能にするのに十分である。
【００２４】
現れている孔の場合、電極は、孔（ｄ＝０）の両端および／またはこの端からある距離（ｄ＞０）に配置され、孔内の電圧降下は、その壁上への沈着を可能にするのに十分である。
【００２５】
例えば、電場は１０６Ｖ／ｍ、またはそれ以上にさえ到達し得る。
【００２６】
電気信号は、一定であっても、時間の関数として変調されていてもよい（周期的または周期的でない、パルス、振幅変調または周波数変調、ステップ、ランプなど）。
【００２７】
支持体は、必ずしも導電性でなくてもよい。孔の内側を、電解重合について記載されているように導電性層とともに並べる必要はなく、これは、実験過程を大いに単純化する。電解重合は、機能化される表面のいずれかの側の上に位置した電極を用いて、「リモートで（ｒｅｍｏｔｅｌｙ）」実施される。用語「孔のいずれかの側の上」は、ｄ＝０である場合を含むことが理解される。有機または無機材料から形成される支持体は、絶縁性、半導電性、または導電性であってもよい。
【００２８】
リモート電解重合（ｒｅｍｏｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、酸化化学剤の存在を必要としない。
【００２９】
リモート電解重合法は、１回の作業ステップで実施することができる。
【００３０】
孔の壁のすべてまたは一部の上にポリマーが優先的に形成するのは、電気信号は孔の端から端まで印加されるので、これによって生じる電圧降下は、孔内部に主に局在化し、ポリマーの優先的な形成を誘発する強い電位勾配をもたらすという事実によって説明することができる。
【００３１】
この方法は、電気活性化可能な化学種の第２の溶液を用いて、ａおよびｂの少なくとも１回の繰り返しを含むことができる。これらの化学種は、同じ化学種、または有利には異なる化学種とすることができ、これは、相互に、または隣り合って沈着される層を特別に配列することを可能にする。
【００３２】
第１の変形例によれば、孔は両端で開いており、それぞれにおいて孔の一端から現れている２つのコンパートメント中に溶液が入れられ、この２つのコンパートメントの少なくとも１つは前記電気活性化可能な化学種を含有する。
【００３３】
第２の変形例によれば、孔はただ１つの現れている端を有し、２つの電極の１つは孔の底部に配置され、他の電極は孔の現れている端と連通したコンパートメント内に配置される。
【００３４】
ｂの後、すすぎを想定することができる。
【００３５】
支持体材料は、ケイ素ベースとすることができる。
【００３６】
電気活性化可能な化学種は、電解重合可能なモノマー、特にπ共役導電性モノマー、好ましくはピロールとすることができ、または代わりにエレクトログラフト可能な官能基を有する化学種、特にジアゾニウム基とすることができ、または代わりに金属、金属酸化物、触媒粒子、塩、および金属錯体から選択することができ、または電気泳動ペイントによって形成することができる。
【００３７】
電気活性化可能な化学種の溶液は、リガンドを含むことができる。
【００３８】
電気活性化可能な化学種の溶液は、電気活性化可能な化学種、特に電解重合可能なモノマーと、例えば、オリゴヌクレオチドを用いてグラフトされたリガンドに結合した前記電気活性可能な化学種との混合物を含むことができる。
【００３９】
特に、溶液は、オリゴヌクレオチド（ピロール−オリゴヌクレオチド）プローブ、またはより一般には、生体分子に結合したピロールを有することができる。
【００４０】
電気活性化可能な化学種の溶液は、対象とするドーピングイオン、特にヘパリンおよび／またはコンドロイチンを含むことができる。
【００４１】
支持体材料はケイ素ベースとすることができる。
【００４２】
電気信号は、１０ｍＶと５００Ｖの間、好ましくは１００ｍＶと１０Ｖの間の電圧とすることができる。考慮されるべき判定基準は、孔内部の電場が、孔の壁上に沈着を生じるのに十分であることである。電圧差は、例えば、パルスの形態で、１０μｓと１００ｓの間、より詳細には１０ｍｓと１００ｓの間の時間印加することができる。電圧を印加する時間は、沈着の厚さを決定する。
【００４３】
電気活性化可能な化学種の濃度は、広い範囲、すなわち１ｎＭと５００ｍＭの間に及ぶことができる。
【００４４】
この方法は、例えば、支持体を破壊することによって、または超音波の作用によって、支持体から電気活性化可能な化学種を分離するステップを有することができる。支持体は、孔の壁に及ぶ、少なくとも１つの加熱（ｆｌａｒｅｄ）機能化領域（必要に応じてステージを含む）を有することができる。
【００４５】
電気活性化可能な化学種はプローブ分子を含むことができ、この方法は、相補性標的分子でのハイブリダイゼーションの認識による会合のステップを含むことができる。
【００４６】
次いでこの方法は、認識による前記会合を変性させるステップ、必要に応じてその後に、認識による新規会合、特に再ハイブリダイゼーションの新規会合のステップを含むことができる。
【００４７】
したがってこの方法は、対象とする化学種の親和性による会合を可能にし、分子アセンブリーの製造を可能にする。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点は、図面と関連して、以下の説明を読めばより分かってくる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明による方法を例示する模式図である。
【図２】図２ａから図２ｃは、孔を含有するチップを受け入れるためのセル（アセンブリーａ）を表す図である。
【図３】多孔チップに適応したアセンブリーを例示する図である。
【図４】多孔チップに適応したアセンブリーを例示する図であり、図４は、実験条件下で、孔Ｐ１と比べたその詳細である。
【図５】孔の機能化をバリデートするのに使用される蛍光試験の形式を例示する図である。
【図６】実施例において使用される孔の様々なプロファイルを表す図である。
【図７】実施例において使用される孔の様々なプロファイルを表す図である。
【図８ａ】実施例において使用される孔の様々なプロファイルを表す図である。
【図８ｂ】実施例において使用される孔の様々なプロファイルを表す図である。
【図９ａ】図９ａ及び９ｂは、現れていない孔のプロファイルの２例を表す図である。
【図９ｂ】図９ａ及び９ｂは、現れていない孔のプロファイルの２例を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、孔の孔の端から端まで、電気信号、特に電位差を印加することによって電気的に生じた有機または無機の化学種、特にポリマーを用いて、孔の表面を機能化するための方法に関する。この方法は、サイズ（例えば、１ｎｍと５ｍｍの間の直径）に関係なく、孔またはチャネル、特に、マイクロメートルおよび／またはナノメートルのサイズの孔またはチャネルの機能化を、
−低エネルギー相互作用を可能にする活性基、例えば、
●  表面電荷、
●  分子もしくは生体分子認識基、例えば、生体分子、反応性化学基、またはイオンキレーター、
●  特に孔の開口部直径を低減する目的のための有機または無機化学種
によって実現することを可能にする。
【００５１】
用語「孔」または「チャネル」または「キャピラリー」は、材料中にある、現れている、または現れていない任意のキャビティを意味する。支持体上のその空間的な分布は定義することができ（例えば、製造された膜の場合において）、または統計的である場合がある（焼結物の典型的な場合において）。本発明は、任意のサイズの孔に関係する。
【００５２】
孔１（図１）は、孔１も浸す、電気活性化可能な化学種の溶液２を含有する２つの漏れないコンパートメント３および４の間に配置される。互いに数ミリメートル離して孔１の両端に配列された２つの電極６および７の間の電圧源５によって、電位差、例えば２Ｖが印加される。
【００５３】
電気活性化可能な化学種は、
−  電解重合可能なモノマー、例えば、ピロール、チオフェン、インドール、アニリン、アジン、フェニレンビニレン、フェニレン、ピレン、フラン、セレノフェン、ピリダジン、カルバゾール、アクリレートまたはメタクリレート、およびこれらの誘導体。電解重合可能な単位は、ピロールであることが好ましい。このモノマーは、対象とする化学種と容易に機能化可能である。さらに、ポリピロールは生体適合性ポリマーであり、これは空気中および生理的ｐＨの溶液中で安定であり、バイオセンサーの分野における用途との関連で有利である、
−  ジアゾニウム基などのエレクトログラフト可能な官能基を有する誘導体、
−  金属および金属酸化物、例えば、酸化イリジウム、触媒粒子、塩、ならびに金属錯体、
−  電気泳動ペイント
から特に選択することができる。
【００５４】
多孔質支持体は、有機および／もしくは無機の性質、ならびに選択することなく、導電性、半導電性、または電気的に絶縁性であってもよい。半導電性材料、例えば、ケイ素またはその酸化物および窒化物誘導体などが使用されることが好ましい。
【００５５】
以下の実施例Ｉでは、使用されるモノマーはピロールである。具体的には、ポリピロールは生体適合性であるという利点を有し、したがってバイオセンサーを製造するのに非常に有利なポリマーである。これは、生化学試験の作業条件下（生理的ｐＨ、水性緩衝液、酸素の存在など）で安定であるという利点も有する。これは親水性の性質の導電性ポリマーでもあり、生物系での使用を可能にしている。さらに、化学的に、ピロール−生体分子コンジュゲートの合成は非常によく制御され、良好な収率で起こる。
【００５６】
ポリピロール、ポリカルバゾール、ポリアニリン、ＰＥＤＯＴ、ポリインドール、およびポリチオフェンは、π共役導電性ポリマーの群に属する。
【００５７】
対応するモノマーは電解重合可能であり、すなわちこれらは、電極表面にアノード電位を印加する効果の下で、ポリマーの形成に至ることが知られている。これらの化学種は、化学種によって同一でない溶媒および酸化条件を考慮して同様に挙動する。
【００５８】
ポリピロール−実施例の実行
Ｉ．−  材料
Ａ）試薬および消耗品
ピロールを、アセトニトリル中に溶解した１Ｍの濃度のアリコートに分け、次いで−２０℃で貯蔵する。仏国特許出願第２７０３３５９号に記載されているプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドを有するピロールを調製する。
【００５９】
使用するＤＮＡ配列は、以下の通りである。
●  Ｐｙ−プローブＺｉｐ６：Ｐｙ５’−（Ｔ）１０−ＧＡＣ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＧＣＧ３’（Ｐｙ−配列番号１）
●  標的−Ｚｉｐ６−ｂｉｏ：ビオチン５’  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＧＴＣ３’（ビオチン−配列番号２）
使用するチップは酸化ケイ素膜または窒化ケイ素膜である。これらは、２×２ｃｍ２の範囲にわたって分布した、マイクロメートルサイズの９個の孔を含む。
【００６０】
Ｂ）使用する緩衝液（指針として示す）：
●  電解重合緩衝液：６ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、２％ｖ／ｖのアセトニトリル（ｖ／ｖ＝単位体積当たりの体積）。
●  ハイブリダイゼーション緩衝液：０．０２ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１．１ＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、４％ｖ／ｖの５０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．２％ｖ／ｖのサケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７．４の０．３％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０。
●  すすぎ緩衝液：ＰＢＳ  ５錠剤／Ｌ、ＮａＣｌ  ２３．３７５ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１５％ｖ／ｖ。
【００６１】
Ｃ）リモート電解重合のための実験アセンブリー：
２つの実験アセンブリーをバリデートした。
【００６２】
ａ）電解重合セル（図２ａ〜２ｃを参照）：
このセルＣの材料は、「Ｄｅｌｒｉｎ  ＰＯＭ」として知られる「Ｄｅｌｒｉｎ」（登録商標）ポリオキシメチレンである。１つまたは複数の孔１を含む支持体断片８をセルの長方形容器３４中に導入することによって、このセルを２つの漏れないコンパートメント３および４に分割する。例えば白金ワイヤを、ふた９の開口部９１および９２に通して、コンパートメント３および４のそれぞれの中に導入することによって電極を形成することができる。９３および９４は、セルＣにふた９を固定するための開口部を表し、９５および９６は、ネジをセルＣに固定するための穴を表す。
【００６３】
ｂ）「多孔」チップ上のアセンブリー：
チップの孔のそれぞれを異なって機能化することが望まれる場合、多チャンネル電圧源、またはいくつかのモノチャンネル電圧源、例えば、多チャンネルポテンシオスタット、またはいくつかのモノチャンネルポテンシオスタットと並行して作用させることが適切である。
【００６４】
図３に関連して記載されたアセンブリーでは、チップ１０は、９個の孔Ｐ１．．．Ｐ９を有する。各孔は、２つの漏れないコンパートメント（３１，４１；３２，４２；．．．３９，４９）の間で隔てられている。言い換えれば、同じ直径を有するか、または有さない９個の孔Ｐ１、Ｐ２．．．Ｐ９のそれぞれを、電気活性化可能な化学種の異なる溶液Ｓ１，Ｓ２．．．Ｓ９と接触させて配置することが可能である。これらのコンパートメントのそれぞれは電極を備え、これらに所与の電圧差が印加され、これらは各孔の端から距離ｄで配列される。距離ｄは、同じ孔の２つの電極について同じであっても、同じでなくてもよい。これは、機能化の必要性によって、孔によって異なっていてもよい。したがって、同じポテンシオスタットに（より一般には同じ電圧源に）接続されているか、接続されていない９個の作用電極Ｅｔ１、Ｅｔ２、．．．Ｅｔ９、および参照電極Ｅａ１、Ｅａ２、．．．Ｅａ９に結合することができる９個の対電極が存在する。溶液Ｓ１、Ｓ２、．．．Ｓ９は同じであっても、同じでなくてもよい。「多チャンネル」ポテンシオスタットＰＴは、これらの電圧を同時に印加することを可能にする（その値が異なっていても）。
【００６５】
チップ１０の各孔（Ｐ１、．．．Ｐ９）は、本明細書で体積１０μｌを有する２つの漏れないコンパートメント３１，４１、．．．；３９，４９の間に位置される。
【００６６】
このアセンブリーは、外部ポテンシオスタットに接続することができる、組み込まれた円形電極２３、２８を有する１つまたは２つのプリント回路２１、２２（図４）を含む。電極の少なくとも１つに、ポリテトラフルオロエチレンキャピラリーを介して液体を導入および排出するための２つの穴２６、２７が貫通している。円環シール２４および２５によって、チップ１０とプリント回路２１および２２との間に２つの漏れないコンパートメント３１および４１が作られている（図４）。孔の壁上に局在的な沈着物３０を得るように電解重合を実現するために、以下のものが使用される：
−  プリント回路中に組み込まれた電極、
−  または孔のいずれかの側の上のキャピラリー中に導入された電極（金属ワイヤ、図示せず）、
−  またはコンパートメント中に直接浸漬している電極。この場合、プリント回路の代わりにプラスチックカード（図示せず）が使用される。
【００６７】
ＩＩ）実行
Ａ）基板の作製：
ａ）洗浄：
第１段階では、無塵室でチップに洗浄（６７％の硫酸、３３％の過酸化水素ｖ／ｖ）を行うことによって、有機性質のいずれの混入物も除去する。チップを溶液中に１０分間浸漬し、次いで、９ＭΩ．ｍの抵抗率が得られるまで水を循環してすすぐ。次いでチップを乾燥器内で、１８０℃で１０分間乾燥する。次いでこれを室温で保管することができる。
【００６８】
ｂ）酸素プラズマを印加することによる、表面の親水性の増大：
このステップにより表面を親水性にすることが可能になり、これは、サイズに関係なく、孔を主に水溶液で満たす目的に有利である。したがって、１００Ｗの出力で、Ｏ２プラズマ中に４５秒間チップを置く。
【００６９】
ｃ）ポリピロール沈着：
電解重合緩衝液中に２０ｍＭのピロールおよび５μＭのｐｙ−プローブＺｉｐ６を含有する重合溶液を使用することによって、孔内でポリマー沈着を実施した。
【００７０】
２つのアセンブリー（上記のａおよびｂ）を使用した。
【００７１】
各場合において、現れている孔を含むチップを、２つのコンパートメントの間にあるように導入する。重合溶液を、２つのコンパートメント中に入れる。電極を各コンパートメント中に挿入し、２Ｖに等しい電位差を印加する。実際には、１０ｍＶと５００Ｖの間、好ましくは１００ｍＶと１０Ｖの間の電圧を、孔のサイズに応じて使用することができ、追求される目的は、孔の壁上に沈着が起こるために、孔内部に十分に高い電場を得ることであることが注目される。沈着過程のモニタリングは、時間の関数として、電流強度の変化の曲線をプロットすることによって実施する。この曲線の形状（電気信号存在または非存在）は、液体が孔中に浸透したか（電気的な接触）、またはしていないか（電気信号の非存在）を確かめることを可能にする。次いでチップをアセンブリーから取り出し、次いで水ですすぎ、圧縮空気で乾燥し、４℃で乾燥保管する。
【００７２】
ｄ）蛍光顕微鏡観察による機能化の確認
ポリピロール沈着物の形成を確認するために、蛍光顕微鏡観察を使用する。使用する試験形式を図５に例示する。これは、孔に１５μｌの液滴を置くことによって実施する。ハイブリダイゼーション緩衝液で、孔を最初に飽和させる（室温で５分）。次に、ハイブリダイゼーション緩衝液中１００ｎＭのビオチン化標的の１滴を添加する（１５分、室温）。次いですすぎ緩衝液を用いてチップを徹底的にすすぐ。次いで、すすぎ緩衝液中の、１０％（ｖ／ｖ＝単位体積当たりの体積）のストレプトアビジン−フィコエリトリン溶液（ＳＡＰＥ）中で各孔をインキュベートする（室温で１５分）。次いでチップをスライドと時計皿の間に置いて、フィコエリトリンの発光波長である５３０ｎｍで蛍光顕微鏡観察によって観察する。
【実施例】
【００７３】
核酸を用いた孔の生体機能化
実施例Ｉ−（アセンブリーａ）
ｉ）ポリピロール沈着物の作製
様々な形状比（形状比Ｒｆ＝孔の直径／穴をあけられた膜の厚さ）を含み、プラズマ処理をされた多孔チップを、上述した「Ｄｅｌｒｉｎ  ＰＯＭ」２コンパートメントセル中に導入する。重合溶液を、セルの２つのコンパートメント中に連続的に入れる。重合溶液は、電解重合緩衝液中の２０ｍＭのピロール、および５μＭのピロール−プローブＺｉｐ６（ｐｙ−プローブＺｉｐ６）から形成されている。次に、２本の白金ワイヤを、１本をチップのいずれかの側に導入する。第１のワイヤをポテンシオスタットの参照電極に結合した対電極に接続し、第２のワイヤを作用電極に接続する。この２つの電極（作用電極および対電極）の間に２Ｖの電位を所定の時間（１００ｍｓと１ｓの間）印加する。次いでチップをセルから取り出し、水で徹底的にすすぎ、次いで圧縮空気で乾燥し、４℃で保管する。
【００７４】
機能化の有効性は、上述した方法に従って、蛍光顕微鏡観察によって確認する。
【００７５】
ｉｉ）結果
様々な形状比を有する孔に操作を行った。
【００７６】
●  Ｒｆ＝３５：厚さ２μｍの膜中の、直径７０μｍの孔、および辺長５００μｍ（図６を参照）。
【００７７】
チップのいずれかの側の上に存在する光の円の形態で、蛍光発光を観察する。その寸法は孔の輪郭の寸法に対応し、これにより、機能化技法は有効であり、マイクロメートルサイズの孔の壁上に位置したポリマーの沈着を可能にすることの推定が可能になる。
【００７８】
走査電子顕微鏡画像は、孔の輪郭上の、約３０ｎｍの上質な沈着層を示す。この沈着は、機能化されていない孔にはない。
●  辺長５０μｍ、および厚さ２０μｍを有する正方形の膜中に穴をあけた孔の場合において、厚さ２０μｍの膜中に直径１８μｍの円形の孔を有するＲｆ＝１。沈着は、１００ミリ秒間印加される２Ｖの電圧で実施する（図７）。
【００７９】
上記に略述した蛍光試験を実施すると、孔の各側の上の光の環の存在に至り、これは、オリゴヌクレオチドを有するポリマーを用いた、孔の有効で局在的な機能化を証明する。
【００８０】
●  厚さ８μｍの膜中に２μｍの直径を有する、Ｒｆ＝０．２５の孔。サイズが２μｍの孔は、１０μｍに等しい最大直径を有する錐体の底部にある。孔の環境は「漏斗」型であると言われる（図８ａおよび８ｂ）。
【００８１】
蛍光顕微鏡画像は、孔の壁は、錐体の頂部の輪郭を有するので（寸法１０μｍの）、局在的に機能化されたことを示す。
【００８２】
これは、孔の環境の形態によって機能化の場所を制御する可能性を残す結果を構成する。
【００８３】
実施例ＩＩ（アセンブリーｂ）：
ｉ）ポリピロール沈着物の作製
Ｏ２プラズマ処理をされた、様々な形状比Ｒｆの孔を含む多孔チップを、上述したアセンブリーｂ中に置く（図３および４）。２つのコンパートメント中に重合溶液を連続的に入れる。重合溶液は、電解重合緩衝液中の２０ｍＭのピロール、および５μＭのピロール−プローブ−Ｚｉｐ６から形成されている。次に、２つの電極を、チップの両側上に配置する。第１の電極は、ポテンシオスタットの補助電極および参照電極に接続し、第２の電極は作用電極に接続する。この２つの電極の間に２Ｖの電位を１００ｍｓ印加する。次いでチップをセルから取り出し、水で徹底的にすすぎ、次いで圧縮空気で乾燥し、４℃で保管する。
【００８４】
ｉｉ）結果
機能化の有効性は、上述した方法に従って、蛍光顕微鏡観察によって確認する。多孔チップの９個の孔のそれぞれは、各孔について特定の機能化を必要に応じて伴って、独立して試験することができる。
【００８５】
●  厚さ１８μｍの膜中の直径１８μｍの、Ｒｆ＝１の孔
蛍光顕微鏡観察により、表面機能化方法は、このアセンブリーを使用して、すべての上述した値のＲｆについても機能することが確認される（蛍光環の存在）。
【００８６】
対照を実施することによって、蛍光発光を特徴とする機能化をもたらす生化学的相互作用の特異性を確立した。これらの対照は、多孔チップの直径１８μｍの孔（Ｒｆ＝１）に対して実施した。
【００８７】
ａ）電位
これを行うために、電解重合緩衝液中、２０ｍＭのピロールおよび５μＭのピロール−プローブ−Ｚｉｐ６からなる重合溶液１５μｌを孔に沈着させ、表面と接触させて５分間放置する。次いでチップを水ですすぎ、圧縮空気で乾燥する（リモート電解重合後に実施したものと同一の手順）。チップを４℃で保管し、次いで先に述べた蛍光試験手順を行う。蛍光はまったく観察されなかった。これは、電位の印加は孔の機能化に必要であるという証明である。
【００８８】
ｂ）ピロール−オリゴヌクレオチドコンジュゲート吸着
電位の印加が、支持体の表面上へのＤＮＡの吸着を促進するかどうかを試験する目的で、別の対照を実施した。これを行うために、電解重合緩衝液中、５μＭのｐｙ−プローブＺｉｐ６の溶液を使用し（この場合、ピロールなし）、次いでピロール／ｐｙ−プローブＺｉｐ６コポリマーについて使用したものと同じプロトコールに従って電位差を印加した。蛍光がないことは、作業条件下で、ピロール−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの非特異的吸着は無視できることを示す。
【００８９】
ｃ）リベレーション（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）手順の間の非特異的吸着
ｉ）重合溶液と接触していなかった機能化されていない孔に、先に述べたハイブリダイゼーションおよびリベレーション手順を実施し、第１のステップは、ハイブリダイゼーション緩衝液での孔の飽和である。作業条件下で、ビオチン化ＤＮＡ標的の非特異的吸着に関連する疑わしい蛍光はまったくない。
【００９０】
ｉｉ）重合溶液と接触していなかった機能化されていない孔に、先に述べたリベレーション手順を実施し、第１のステップは、ハイブリダイゼーション緩衝液での孔の飽和であり、その後にハイブリダイゼーション緩衝液単独（対応する標的なし）中で１５分間インキュベートする。次いで、すすぎ緩衝液中に希釈したＳＡＰＥを、上述したプロトコールに従って添加する（ＩＩ、Ａ、ｄ）。蛍光顕微鏡画像により、試験した作業条件下で、ＳＡＰＥは、支持体の表面上に吸着されないことが確認される。
【００９１】
ｄ）ハイブリダイゼーションの変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
先に述べた蛍光リベレーション手順をされた機能化された孔に、０．２ＭのＮａＯＨ溶液を用いてすすぎを２秒間実施し、その後に水で徹底的にすすぎ、圧縮空気で乾燥する。次いで、通常の波長で、同じカメラ感度パラメータ（輝度、コントラスト）を用いて、蛍光顕微鏡観察によって、この孔を観察する。ハイブリダイゼーションの変性後に蛍光の消滅が観察される。これは、相補性ハイブリダイゼーションの場合に観察される、蛍光発光の特異性を示す。
【００９２】
ｅ）再ハイブリダイゼーション後の蛍光
ＮａＯＨの添加によって変性を受けた孔（ｄ）の蛍光は、ＤＮＡプローブの、その相補性標的を用いた再ハイブリダイゼーション後に再出現する。この第２のハイブリダイゼーションおよびその蛍光リベレーションのために従った実験手順は、ハイブリダイゼーションについて先に述べたものと正確に同じである。
【００９３】
実施例ＩＩＩ：酸化イリジウムを用いた機能化
ｉ）酸化イリジウム沈着物の作製
以下のプロトコール（Ａ．Ｍ．Ｍａｒｓｏｕｋ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、７５：１２５８頁以下参照による論文に記載されている）に従ってシュウ酸イリジウム溶液を調製する。ＩｒＣｌ４一水和物７５ｍｇを蒸留水５０ｍＬ中に溶解させ、次いで、、３０％の過酸化水素０．５ｍｌ、シュウ酸カリウム水和物３６５ｍｇ、およびｐＨを１０．５に調整するために無水炭酸カリウムを添加する。生成物をそれぞれ添加する間に、１０分間の撹拌が必要である。次いで、最終的にイリジウム（ＩＶ）の錯体形態の特徴である紺青色が得られるまで、溶液を９０℃で数分間加熱する。その場合この溶液は、４℃で数カ月保管することができる。
【００９４】
形状比Ｒｆ＝１を有する孔を含み、Ｏ２プラズマ処理をされた多孔チップを、上述したアセンブリーｂ内に置く（図３および４）。
【００９５】
シュウ酸イリジウム溶液を、２つのコンパートメント中に連続的に入れる。次に、２つの電極をチップの両側上に配置する。第１の電極は、ポテンシオスタットの補助電極および参照電極に接続し、他方の電極は、作用電極に接続する。０．８０Ｖまたは０．８５Ｖまたは０．９０Ｖの電位を、５ｓまたは１０ｓの時間印加する。ポリピロール沈着についてと同じ様式で、孔全体にわたる正しい電気的接触を確認するために、クロノアンペロメトリーによって沈着のモニタリングを実施する。
【００９６】
次いでチップをセルから取り出し、水で徹底的にすすぎ、次いで圧縮空気で乾燥し、４℃で保管する。
【００９７】
ｉｉ）結果
機能化の有効性を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって確認した。
【００９８】
得られた画像は、孔の壁上、かつ孔の内部のみに沈着が形成され、周囲の表面は完全に汚れていないことを示す。機能化をされていない対照孔は、孔の内側の壁上に沈着がまったくない。これは、この機能化方法は、これらの金属酸化物などの電気活性化可能な化学種についても機能することを示す。
【００９９】
得られた様々な沈着物のテクスチャーは、孔によって異なるように思われ、これは、イリジウムの様々な程度の酸化によっておそらく説明することができる。したがって、酸化イリジウムの場合が関与する電気化学的半反応は以下の通りである。
Ｉｒ（ＯＨ）＋Ｈ２Ｏ  ＜−＞  Ｉｒ（ＯＨ）２＋Ｈ＋＋ｅ−（−０．１Ｖ）
Ｉｒ（ＯＨ）２＋Ｈ２Ｏ  ＜−＞  Ｉｒ（ＯＨ）３＋Ｈ＋＋ｅ−（０．３Ｖ）
Ｉｒ（ＯＨ）３＋Ｈ２Ｏ  ＜−＞  Ｉｒ（ＯＨ）４＋Ｈ＋＋ｅ−（０．８Ｖ）
またはＩｒＯ２＋２Ｈ２Ｏ＋Ｈ＋＋ｅ−（刊行物によれば発散）。
【０１００】
孔内部でＳＥＭによって観察される、沈着物の不均一な視覚的外観を考慮すると、使用される実験条件下で、形成された酸化物（複数も）中で、イリジウムの同じ平均程度の酸化は得られない可能性がある。
【０１０１】
実施例ＩＶ：リモート電着（ｒｅｍｏｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）技法による構造化物体の製造
ｉ）ポリピロール沈着物の作製：
ナノメートルサイズの孔を含むポリカーボネート膜を、アセンブリーａまたはｂ中に挿入することができる。次いで、ピロール／オリゴヌクレオチドと結合したピロールのコポリマーの沈着物を、先に述べたプロトコールに従って、これらの孔内部に得ることができる。
【０１０２】
ｉｉ）形成した沈着物の、その支持体からの分離：
次いで膜を水ですすぎ、ジクロロメタン浴中に入れることによって、ポリカーボネートを溶解させ、孔内部に作られた物体を溶液中に解放する。電気活性化可能な化学種はまた、例えば、超音波によって生じる振動の作用によって、膜を溶解させることなく分離することができる。次いで連続的な濾過によって、対象とする物体を単離する。これらは、膜の孔の形状を有する、ＤＮＡプローブを有するピロールナノ構造物である。
【０１０３】
実施例Ｖ：
図９ａおよび９ｂは、キャビティ６０の底部のすべて、または一部を覆う電極６１を含む、現れていない孔形状の２つの変形例である。図９ａおよび９ｂの場合では、沈着が起こる孔の範囲は、電場を集中させるネッキング領域６２、６２’のみに対応する。したがって、孔の形状は、その壁の一部のみの上に沈着を特異的に局在化させることを可能にする。
【０１０４】
ポリピロールまたは機能的誘導体などのポリマーを沈着させるために、キャビティ６０の底部の電極６１の分極は、ネッキング領域６２、６２’上の沈着物に加えて、電極６１の表面上に同じポリマーの沈着物を形成し、または形成しないように、それぞれ順に陽極または陰極とすることができる。
【０１０５】
結論：
本発明による機能化の技術的方法は、効率的であり、実行するのに比較的容易である。
【０１０６】
沈着物の再現性は十分であり、操作パラメータ、すなわち、
−  固定された電極間距離
−  温度制御
−  湿度測定制御
をより厳密に制御することによってさらに改善することができる。
【０１０７】
この新規の技法は、反応基を有する孔の表面の機能化の局在化を効率的に制御することを可能にする。具体的には、この局在化は、孔内の電場線の構成に本質的に関連し、これはそれ自体、孔の環境の構造（すなわちその形状）に依存する。
【０１０８】
本発明による方法は、
−  ポテンシオスタット、電極などの限られた装置のみが必要であるので、経済的観点から、
−  沈着手順は数分間だけ続くので、時間的観点から
安価であるという利点を有する。
【０１０９】
実験デバイスはさらに、相対的に容積が小さく、輸送が容易である。
【０１１０】
このストラテジーは、孔の寸法に関係なく、有機もしくは無機の性質、導電性、半導電性、または絶縁性の任意のタイプの多孔質支持体に適用できる。
【０１１１】
液体が孔中に浸透したかどうかを測定するために、一手段は、２つの電極間の電気的接触が有効であるかどうかを確認することであり、この場合では、沈着（例えば、ポリピロールの）の間に測定されるクロノアンペログラム（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｇｒａｍ）は、ゼロでない強度のシグナルを有する。
【０１１２】
例えばポリピロールの沈着物の形成を特徴づけるために、蛍光顕微鏡観察、またはさらにはキャビティ内部の蛍光を３次元で見るために共焦点蛍光顕微鏡観察を使用することが可能である。走査電子顕微鏡法も、例えば、酸化イリジウムの沈着の場合、形成された沈着物を特徴づけることを可能にする。
【０１１３】
電気活性化可能な化学種、特に、電解重合可能な化学種（ピロール、チオフェンなど）は、官能化することができるので、この技法は、低エネルギー相互作用に関与する活性基、例えば、イオン性基、ペプチド、抗体、酵素、またはイオンキレーターの孔内の固定化に完全に転換可能である。
【０１１４】
ポリマーは、特に、対象とするドーピング陰イオン、例えば、多糖（例えば、細胞の付着を促進するヘパリン（Ｚｈｏｕら．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＆  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９９．３９：１９頁以下参照））、または界面活性剤などを使用した局在的な沈着のための「出発層」としても機能を果たすことができる。
【０１１５】
「リモート電着」によって得られる沈着物から出発する、「多層」型の積み重ねも想定することができる。したがって、例えば、むき出しの支持体と比べて、有機または無機化学種の所与の第２層の結合を促進する、ある特定の表面電荷または反応性化学基を有する局在的な沈着物（第１層）を調製することが可能である。
【０１１６】
この技法は、ＤＮＡ固定化を実験的に可能にし、後者はモジュール的側面の生体分子であり、すなわち、官能化された対象とする分子の、相補性ＤＮＡ標的でのハイブリダイゼーションによる固定化のための生体分子認識エレメントとして使用することができる。この方法は、ビオチン化相補性標的を有する固定化されたＤＮＡプローブでのハイブリダイゼーションによって、生物学的に対象とする化学種であるビオチンを固定化することも可能にし、これは、この技法のモジュール的側面を強調する。
【０１１７】
この実験デバイスは、熱デバイスおよび光学デバイスをさらに組み込むことができ、例えば、架橋実験、または作製された沈着物の組織の視覚化を可能にする。
【０１１８】
超高感度小型バイオセンサーの分野において、いくつかの用途を想定することができる。生体機能化された多孔質膜は、健康分野において、特に、生体試料中に少量で存在する（生体）分子を検出するための用途を見出すことができる。したがって、多くの研究チームは、個々の分子を検出するためのシステムの設計に、その研究を向けている。これらの分子コールターカウンターは、タンパク質の孔を用いて有望な結果を与えた（Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１．１９：２４８頁；ＢａｙｌｅｙおよびＣｒｅｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１．４１３：２２６頁以下参照）。
【０１１９】
後者と比べた、合成の孔の考慮すべき利点は、
−  表面で電荷または反応基を作り出すことによる、孔の特性の調節、
−  形状（孔の直径、膜厚など）の制御、
−  マイクロ流体デバイスへのより容易な組込みの実施
の可能性にある。
【０１２０】
この方法は、（生体）分子を精製するためのマイクロまたはナノクロマトグラフィー（イオン交換、立体排除、親和性クロマトグラフィー、または吸着クロマトグラフィー）の分野における用途にも適している。
【０１２１】
機能化された孔はまた、特に、孔内部でヘパリンまたはコンドロイチンを固定化することによって、細菌または細胞を捕獲するのに有用となり得る。
【０１２２】
機能化された多孔質膜も、精製および濾過システム（水、流出物などのための）において伝統的に用途を見出し、孔の表面にイオンキレーターまたはイオン交換体が存在することにより、膜を通過する液体のある特定の成分を選択的に分離することを可能にすることができる。
【０１２３】
記載した方法による、例えば、パラジウムまたは白金などの金属を含有する触媒粒子の孔内での固定化は、化学反応、例えば、水素化を実施するためのマイクロリアクターまたはさらにはナノリアクターの作製を可能にすることができる。膜中に分布した孔のネットワークを使用して、これらの反応を並行して行うことができることによって、マイクロ／ナノコンビナトリアル化学反応が可能になる。この技法による金属の電着も、触媒排気装置（気相触媒作用）の分野における用途を見出すことができる。
【０１２４】
最後に、この方法は分子インプリント技法の使用と互換性であり、これは例えば、キャピラリー電気泳動の分野において有利な用途を開く。
【０１２５】
ＤＮＡプローブの存在の可能性が上記に述べられた、電気活性化可能な化学種の溶液は、より一般には、リガンド、すなわち：
−  分子および／または生体分子認識エレメント、特にヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原、酵素、タンパク質、アミノ酸、糖ペプチド、ビオチン、ハプテン、糖、オリゴ糖、多糖、脂質、糖脂質、ステロイド、ホルモン、または受容体、
−  他の親和性基、特にイオンキレーターおよびイオン交換体、
−  化学的に活性な官能基、特にアミン、アミド、オキシアミン、活性エステル、アルコール、カルボン酸、アルキン、チオール、エポキシド、アンヒドリド、アシル塩化物、またはアルデヒド官能基、およびこれらの誘導体、
−  単体物体（物体の個々のまたは集団の固定化との関連で）、特に微粒子およびナノ粒子
を必要に応じて含むことができることが理解される。粒子は、生体細胞、ならびに／または細胞成分、ならびに／または産物、特に細胞株、ならびに／または小球、ならびに／またはリポソーム、ならびに／または細胞核、ならびに／または染色体、ならびに／またはＤＮＡ鎖もしくはＲＮＡ鎖、ならびに／またはヌクレオチド、ならびに／またはリボソーム、ならびに／または酵素、ならびに／または抗体、ならびに／またはプロチド（ｐｒｏｔｉｄ）、ならびに／またはタンパク質、ならびに／またはペプチド、ならびに／または活性成分、ならびに／または寄生虫、ならびに／または細菌、ならびに／またはウイルス、ならびに／または花粉、ならびに／またはポリマー、ならびに／または生物学的因子、ならびに／または成長刺激剤および／もしくは成長阻害剤、ならびに／または液体中に懸濁したビーズ、ならびに／または溶液中に懸濁した生体分子、ならびに／または分子とすることができ、かつ／またはこれらを含有することができる。操作された粒子は、不溶性固体粒子、例えば、磁性粒子ならびに／または誘電体粒子、または導電性粒子、または機能性粒子、または顔料、または色素、またはタンパク質結晶、または粉末、またはポリマー構造物、または不溶性の医薬物質、または繊維、または糸、またはカーボンナノチューブ、またはコロイド−  基、すなわち、
●  ｐＨ、特に弱酸／塩基対および両性化合物の観点から、
●  ならびに／または親水性および／もしくは疎水性および／もしくは両親媒性の観点から、
●  ならびに／または極性の観点から、
○  特定の表面特徴を有し、
○  かつ／または低エネルギー相互作用、特に
●  水素結合、
●  ファンデルワールス相互作用、
●  イオン相互作用、特にプロトン交換、
●  静電相互作用、
●  塩橋、特に、負に帯電した基同士の間で、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンなどの二価のイオンによって形成されるもの
を有し、
○  かつ／または界面活性剤である
基、
−  後続の改質を準備する表面改質、すなわち、例えば、分子および／または生体分子と相互作用または反応するための手段を含む孔の壁上に沈着した機能化層の凝集によって形成される小さいサイズの凝集体（クラスター）などとすることができ、かつ／またはこれらを含有することができる。これらは特に、モジュール基（ｍｏｄｕｌａｒ  ｇｒｏｕｐ）、例えば、ＤＮＡ、ベンゾフェノンなどの光活性化可能な基、上述した電気活性化可能な化学種などの電気活性化可能な基、または熱硬化性ポリマーなどの熱活性化可能な基などである。
【０１２６】
リガンドは、本発明による方法によって機能化を可能にするために、電気活性化可能な化学種に結合しなければならないことが注目されよう。
【０１２７】
電気活性化可能な化学種、およびリガンドに結合した電気活性化可能な化学種の両方が溶液中に存在する必要はない。リガンドに結合した電気活性化可能な化学種のみ、または代わりに電気活性化可能な化学種のみが存在してもよい。
【符号の説明】
【０１２８】
１  孔
２  溶液
３  コンパートメント
３１〜９  コンパートメント
４  コンパートメント
４１〜９  コンパートメント
５  電源
６  電極
７  電極
８  支持体
９  ふた
９１〜６  開口部
１０  チップ
２１  プリント回路
２２  プリント回路
２３  円形電極
２４  円環シール
２５  円環シール
２６  穴
２７  穴
２８  円形電極
３０  沈着物
３４  長方形容器
６０  キャビティ
６１  電極
６２  ネッキング領域
６２’  ネッキング領域
Ｃ  セル
ｄ  距離
Ｅｔ１〜９  作用電極
Ｅａ１〜９  参照電極
Ｐ１〜９  孔
Ｓ１〜９  溶液 
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１：プローブ
配列番号２：ＡＤＮターゲット
【図１】
2011511167.tif 000003
【図２】
2011511167.tif 000004
【図３】
2011511167.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011511167.tif 000015
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