(57)【要約】  機械的刺激に対する幹細胞分化の最適の条件を検出することができるセルチップ及びその制御システムが開示される。本発明の実施例による細胞分化実験用セルチップは、細胞及び培養液が貯蔵される複数の細胞チャンバと、対応する細胞チャンバに細胞及び培養液を伝達する細胞及び培養液注入口と、前記細胞及び培養液注入口に注入される細胞及び培養液の前記細胞チャンバへの移動通路である微細流路と、前記細胞チャンバに印加される空圧を注入する空圧注入口と、前記空圧注入口を通じて注入される空圧を対応する細胞チャンバに伝達する円形の薄膜を有する開口部とを備える。この時、前記開口部のうち少なくとも２つ以上の開口部は、面積を異にして備えられ、対応する細胞チャンバに印加される空圧の大きさを異にする。
2011500050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分化実験用セルチップにおいて、
細胞及び培養液が貯蔵される複数の細胞チャンバと、
対応する細胞チャンバに細胞及び培養液を伝達する細胞及び培養液注入口と、
前記細胞及び培養液注入口に注入される細胞及び培養液の前記細胞チャンバへの移動通路である微細流路と、
前記細胞チャンバに印加される空圧を注入する空圧注入口と、
前記空圧注入口を通じて注入される空圧を対応する細胞チャンバに伝達する円形の薄膜を有する開口部とを備え、
前記開口部のうち少なくとも２つ以上の開口部は、面積を異にして備えられ、対応する細胞チャンバに印加される空圧の大きさを異にすることを特徴とするセルチップ。
【請求項２】
前記複数の細胞チャンバは、前記空圧注入口を中心にする複数の同心円上に位置することを特徴とする請求項１に記載のセルチップ。
【請求項３】
前記細胞チャンバに前記空圧が印加される方向に位置する面と対向して位置する面を細胞チャンバの下部面とする時、
前記細胞チャンバの下部面に位置し、前記細胞チャンバの圧力をセンシングする圧力センサーをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のセルチップ。
【請求項４】
前記圧力センサーは、
前記細胞チャンバの配列と同一の配列で位置し、それぞれ対応する細胞チャンバの下部面に装着されるＩＴＯ素材の第１電極と、
対応する第１電極と対向して位置するＩＴＯ素材の第２電極と、
前記第１電極と前記第２電極との間に位置する空隙と、を備えることを特徴とする請求項３に記載のセルチップ。
【請求項５】
前記開口部は、対応する細胞チャンバの前記空圧注入口からの距離によって、面積を異にして備えられることを特徴とする請求項１に記載のセルチップ。
【請求項６】
前記微細流路と前記細胞チャンバとの間の流体の流れを調節するマイクロバルブ装置をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のセルチップ。
【請求項７】
前記マイクロバルブ装置は、
マイクロバルブ用空圧を注入するマイクロバルブ用空圧注入口と、
それぞれ、対応する細胞チャンバ間の微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用空圧に対応して収縮または膨脹する空圧チャンバと、
それぞれ、対応する細胞チャンバと微細流路との間に位置し、対応する空圧チャンバに連結され、対応する空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉されるバルブボスと、を備えることを特徴とする請求項６に記載のセルチップ
【請求項８】
前記細胞チャンバでの細胞の状態及び分化過程を観察するためのマーカーまたは染色液を注入するマーカー及び染色液注入口と、
前記マーカー及び染色液注入口の間に連結され、マーカーまたは染色液の前記細胞チャンバへの移動通路であるマーカー及び染色液用微細流路とをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のセルチップ。
【請求項９】
前記微細流路と前記細胞チャンバとの間の流体の流れを調節するマイクロバルブ装置をさらに備え、
前記マイクロバルブ装置は、前記細胞チャンバと前記微細流路との間の培養液の流れを調節するのに使用されるマイクロバルブ用第１空圧を注入するマイクロバルブ用第１空圧注入口と、
前記細胞チャンバと前記微細流路との間のマーカーまたは染色薬の流れを調節するのに使用されるマイクロバルブ用第２空圧を注入するマイクロバルブ用第２空圧注入口と、
それぞれ、対応する細胞チャンバの間の微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用第１空圧に対応して収縮または膨脹する第１空圧チャンバと、
それぞれ、対応するマーカー及び染色液用微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用第２空圧に対応して収縮または膨脹する第２空圧チャンバと、
それぞれ、対応する細胞チャンバと微細流路との間に位置し、対応する第１空圧チャンバに連結され、対応する第１空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉される第１バルブボスと、
それぞれ、対応する細胞チャンバとマーカーと染色液用微細流路との間に位置し、対応する第２空圧チャンバに連結され、対応する第２空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉される第２バルブボスと、を備えることを特徴とする請求項８に記載のセルチップ。
【請求項１０】
請求項１に記載のセルチップを装着し、前記セルチップに空圧、細胞または培養液などを供給し、前記セルチップでの細胞の状態または分化を観察し測定するセルチップ制御システム。
【請求項１１】
前記セルチップ制御システムは、
前記セルチップが装着される装着部を具備し、第１位置信号に応答して前記装着部を第１方向に移動または回転させるＸ−Ｙステージと、
第２位置信号によって第２方向に移動して、前記セルチップに空圧、細胞及び培養液を供給する連結管を前記セルチップの対応する注入口に連結させるＺステージと、
第１制御信号に応答して、対応する連結管に供給する空圧の強さ及び供給周期を異にする空圧バルブと、
第２制御信号に応答して、対応する連結管に細胞及び培養液を提供するシリンジポンプと、
細胞、培養液及び空圧を前記セルチップへ供給し任意の時間が経過した後、前記セルチップの細胞チャンバの圧力を測定する測定回路と、
前記第１位置信号、前記第２位置信号及び前記制御信号を生成し、前記測定回路から測定値を受信し、入出力装置を通じてユーザーに伝送するマイクロコンピューターと、を備えることを特徴とする請求項１０に記載のセルチップ制御システム。
【請求項１２】
前記セルチップ制御システムは、前記装着部の上部または下部に位置し、マーカーまたは染色薬を利用して前記セルチップの細胞チャンバ内の細胞を視覚的に観察する蛍光顕微鏡をさらに備えることを特徴とする請求項１１に記載のセルチップ制御システム
【請求項１３】
細胞分化実験用セルチップにおいて、
細胞に機械的刺激を加えるための空圧が注入される空圧注入口、細胞及び培養液が注入される細胞及び培養液注入口、及び細胞の状態の視覚的観察のためのマーカーまたは染色薬が注入されるマーカー及び培養液注入口を具備し、ガラス材質で製作される上部基板と、
前記上部基板と当接して位置し、前記空圧注入口から流入される空気が貯蔵される空気チャンバが形成されるガスケットと、
細胞を培養する細胞チャンバ、前記細胞及び培養液注入口に注入される細胞及び培養液の前記細胞チャンバへの移動通路である第１微細流路、前記マーカー及び染色液注入口に注入されるマーカーまたは染色液の前記細胞チャンバへの移動通路である第２微細流路、及び前記微細流路と前記細胞チャンバとの間の流体の流れを制御するマイクロバルブ装置を備えるポリマー基板と、
前記ガスケットと前記ポリマー基板との間に位置し、面積を異にして対応する細胞チャンバに印加される空圧の大きさを異にする開口部を備える多孔基板と、
前記多孔基板と前記ポリマー基板との間に位置し、前記空気チャンバと前記細胞チャンバを分離させながらも細胞チャンバに空圧が印加されるように柔軟なポリマー素材で具現されるポリマー薄膜と、
一面が前記ポリマー基板と当接し、他面にそれぞれ、対応する細胞チャンバの下部に位置し、対応する細胞チャンバの圧力をセンシングするための第１電極が装着されるガラス薄膜と、
一面にそれぞれ、対応する第１電極と対向して位置する第２電極が装着される下部基板と、
前記ガラス薄膜と前記下部基板との間に位置し、対応する第１電極及び第２電極の間の空隙を設ける支持構造物と、を備えることを特徴とするセルチップ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞、特に中間葉幹細胞を骨／軟骨分化させるための機械的刺激条件をテストすることができるセルチップと、これを脱着式で装着させて使用することができる自動化されたセルチップ制御システムに関し、特に多様な実験条件を一回の実験に反映し、幹細胞の分化の最適化条件を迅速で且つ正確に検出することができるセルチップ及びその制御システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
未分化状態の幹細胞を増殖培養し、十分な細胞数を得ようとする研究とともに、特定細胞に分化させて患者の損傷された多様な組職または器官の再生及び置換のための多様な試みが進行されている。特に、胚芽幹細胞のように、倫理的問題と免疫拒否反応面において自由な中間葉幹細胞を利用した成人（成体）幹細胞の分化技術を開発するための多様な方法が進行されている。
【０００３】
骨髓内に存在する中間葉幹細胞は、卓越な増殖能力と共に、特別な分化環境で骨、軟骨、筋肉、脂肪、腱、靭帯や神経などの多様な組職に分化することができる潜在力を有する。特に、幹細胞を利用した組織工学及び分化研究分野の中でも最も先立つ研究が進行された部分は骨／軟骨分化である。
【０００４】
幹細胞の骨／軟骨への分化のために、今までは主として培養液の組成と分化誘導物質（ＴＧＦ−：transforming growth factor, BMP:bone morphogenic protein, FGF:fibroblast growth factor, IGF:insulin-like growth factor, cytokinesなど）のような生化学的分化誘導方法が使用されている。最近、体液によるせん断力、各種荷重や外力による圧縮力、引張力、外部力による変形力、細胞外基質の弾性変化などの多様な機械的要因による幹細胞分化に関する研究も進行されている。
【０００５】
このような機械的刺激による幹細胞から骨／軟骨細胞に分化する過程の正確な経路に関する理論は未だ確立されていないが、最近の研究結果によれば、幹細胞に静水圧、動的圧縮力、細胞変形、緊張、油圧と流動、動電気力、対流、超音波などの多様な機械的刺激を印加した後、骨／軟骨細胞分化の標識因子であるＳｏｘ９、膠原質、ＧＡＧｓとアグリカン(aggrecan)などのタンパク質合成及び発現が増加し、分化に否定的な調節因子であるＩＬ−１の発現を抑制するといわれる。
【０００６】
このような機械的刺激を利用した幹細胞分化実験は、培養ディッシュ（petridish）単位の繰り返し的な細胞培養及び分化を行うので、高い費用及び労動力が要求される。すなわち、多様な機械的条件での幹細胞変化を観察するためには多量の細胞を必要とし、実験時ごとに繰り返し的な細胞培養と培養液交替、広い実験空間、高価の試薬及び培養液の使用が要求される。
【０００７】
したがって、人力に依存している細胞培養及び機械的刺激実験を改善するために、多様な機械的装置とマイクロマシニング技術を適用した新しい素子とシステムに対する要求が増大している。特に、最近発表された機械的刺激を利用した幹細胞分化実験用空圧基盤セルチップは、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を適用することによって、汚染の可能性が少なくて、超小型化及び軽量化が可能であり、しかも、透明材質による光学的観察が可能である。
【０００８】
しかし、既存の機械的刺激を利用した幹細胞の分化実験装置は、依然としてそれぞれの機械的刺激に対して別途の実験を行わなければならないので、費用及び努力が要求される問題がある。また、機械的刺激印加及び培養液交替を依然として人力に依存して個別チップを作動させる問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５０２５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする技術的課題は、幹細胞分化の最適の条件を検出するに際して、多様な機械的刺激に対して同時に実験を行うことができるセルチップを提供することにある。
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、幹細胞分化の最適の条件を検出するに際して、機械的刺激印加及び培養液交替を自動で行うことができ、刺激の強さと幹細胞の分化段階をそれぞれセルチップに集積された圧力センサーとシステムに内蔵された蛍光顕微鏡を利用して実時間で測定し観察することができるセルチップ制御システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記技術的課題を達成するために、本発明の実施例による細胞分化実験用セルチップは、細胞及び培養液が貯蔵される複数の細胞チャンバと、対応する細胞チャンバに細胞及び培養液を伝達する細胞及び培養液注入口と、前記細胞及び培養液注入口に注入される細胞及び培養液の前記細胞チャンバへの移動通路である微細流路と、前記細胞チャンバに印加される空圧を注入する空圧注入口と、前記空圧注入口を通じて注入される空圧を対応する細胞チャンバに伝達する円形の薄膜を有する開口部とを備える。
【００１２】
この時、前記開口部のうち少なくとも２つ以上の開口部は、面積を異にして具備され、対応する細胞チャンバに印加される空圧の大きさを異にする。
【００１３】
好ましくは、前記複数の細胞チャンバは、前記空圧注入口を中心にする複数の同心円上に位置することができる。
【００１４】
好ましくは、前記細胞チャンバに前記空圧が印加される方向に位置する面と対向して位置する面を細胞チャンバの下部面とする時、前記細胞チャンバの下部面に位置し、前記細胞チャンバの圧力をセンシングする圧力センサーをさらに備えることができる。この時、前記圧力センサーは、前記細胞チャンバの配列と同一の配列で位置し、それぞれ対応する細胞チャンバの下部面に装着されるＩＴＯ（Indium Tin Oxide）素材の第１電極と、対応する第１電極と対向して位置するＩＴＯ素材の第２電極と、前記第１電極と前記第２電極との間に位置する空隙とを備えることができる。
【００１５】
好ましくは、前記開口部は、対応する細胞チャンバの前記空圧注入口からの距離によって、面積を異にして備えられることができる。
【００１６】
好ましくは、前記微細流路と前記細胞チャンバとの間の流体の流れを調節するマイクロバルブ装置をさらに備えることができる。この時、前記マイクロバルブ装置は、マイクロバルブ用空圧を注入するマイクロバルブ用空圧注入口と、それぞれ、対応する細胞チャンバ間の微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用空圧に対応して収縮または膨脹する空圧チャンバと、それぞれ、対応する細胞チャンバと微細流路の間に位置し、対応する空圧チャンバに連結され、対応する空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉されるバルブボスとを備えることができる。
【００１７】
好ましくは、前記細胞チャンバでの細胞の状態及び分化過程を観察するためのマーカーまたは染色液を注入するマーカー及び染色液注入口と、前記マーカー及び染色液注入口の間に連結され、マーカーまたは染色液の前記細胞チャンバへの移動通路であるマーカー及び染色液用微細流路とをさらに備えることができる。
【００１８】
この時、前記マイクロバルブ装置は、前記細胞チャンバと前記微細流路との間の培養液の流れを調節するのに使用されるマイクロバルブ用第１空圧を注入するマイクロバルブ用第１空圧注入口と、前記細胞チャンバと前記微細流路との間のマーカーまたは染色薬の流れを調節するのに使用されるマイクロバルブ用第２空圧を注入するマイクロバルブ用第２空圧注入口と、それぞれ対応する細胞チャンバの間の微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用第１空圧に対応して収縮または膨脹する第１空圧チャンバと、それぞれ対応するマーカー及び染色液用微細流路と当接して位置し、前記マイクロバルブ用第２空圧に対応して収縮または膨脹する第２空圧チャンバと、それぞれ対応する細胞チャンバと微細流路との間に位置し、対応する第１空圧チャンバに連結され、対応する第１空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉される第１バルブボスと、それぞれ対応する細胞チャンバとマーカー及び染色液用微細流路との間に位置し、対応する第２空圧チャンバに連結され、対応する第２空圧チャンバの収縮または膨脹に応答して開閉される第２バルブボスとを備えることができる。
【００１９】
上記技術的課題を達成するために、本発明の他の実施例による細胞分化実験用セルチップは、細胞に機械的刺激を加えるための空圧が注入される空圧注入口、細胞及び培養液が注入される細胞及び培養液注入口、及び細胞の状態の視覚的観察のためのマーカーまたは染色薬が注入されるマーカー及び培養液注入口を具備し、ガラス材質で製作される上部基板と、前記上部基板と当接して位置し、前記空圧注入口から流入される空気が貯蔵される空気チャンバが形成されるガスケットと、細胞を培養する細胞チャンバ、前記細胞及び培養液注入口に注入される細胞及び培養液の前記細胞チャンバへの移動通路である第１微細流路、前記マーカー及び染色液注入口に注入されるマーカーまたは染色液の前記細胞チャンバへの移動通路である第２微細流路、及び前記微細流路と前記細胞チャンバとの間の流体の流れを制御するマイクロバルブ装置を備えるポリマー基板と、前記ガスケットと前記ポリマー基板との間に位置し、面積を異にして対応する細胞チャンバに印加される空圧の大きさを異にする開口部を備える多孔基板と、前記多孔基板と前記ポリマー基板との間に位置し、前記空気チャンバと前記細胞チャンバを分離させながらも細胞チャンバに空圧が印加されるように柔軟なポリマー素材で具現されるポリマー薄膜と、一面が前記ポリマー基板と当接し、他面にそれぞれ、対応する細胞チャンバの下部に位置し、対応する細胞チャンバの圧力をセンシングするための第１電極が装着されるガラス薄膜と、一面にそれぞれ、対応する第１電極と対向して位置する第２電極が装着される下部基板と、前記ガラス薄膜と前記下部基板との間に位置し、対応する第１電極と第２電極との間の空隙を設ける支持構造物とを備える。
【００２０】
前記他の技術的課題を達成するために、本発明の実施例によるセルチップ制御システムは、前記セルチップに空圧、細胞または培養液などを供給し、前記セルチップでの細胞の状態または分化を観察し測定する。
【００２１】
このために、前記セルチップ制御システムは、前記セルチップが装着される装着部を具備し、第１位置信号に応答して前記装着部を第１方向に移動または回転させるＸ−Ｙステージと、第２位置信号によって第２方向に移動して、前記セルチップに空圧、細胞及び培養液を供給する連結管を前記セルチップの対応する注入口と連結させるＺステージと、第１制御信号に応答して、対応する連結管に供給する空圧の強さ及び供給周期を異にする空圧バルブと、第２制御信号に応答して、対応する連結管に細胞及び培養液を提供するシリンジポンプと、細胞、培養液及び空圧を前記セルチップへ供給し任意の時間が経過した後、前記セルチップの細胞チャンバの圧力を測定する測定回路と、前記第１位置信号、前記第２位置信号及び前記制御信号を生成し、前記測定回路から測定値を受信し、入出力装置を通じてユーザーに伝送するマイクロコンピューターとを備えることができる。
【００２２】
好ましくは、前記セルチップ制御システムは、前記装着部の上部または下部に位置し、マーカーまたは染色薬を利用して前記セルチップの細胞チャンバ内の細胞を視覚的に観察する蛍光顕微鏡をさらに備えることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によるセルチップ及びその制御システムは、単一空圧で多様な強さと周期、周波数、間隔、デューティー比を有する機械的刺激を印加するなど、多様な刺激条件で幹細胞分化実験を同時に進行することによって、極少量の幹細胞のみを使用することができ、実験時間を短縮することができるという長所がある。
また、本発明によるセルチップ及びその制御システムは、集積されたマイクロバルブシステムを利用して細胞と培養液の注入及び交換が自動で行うことができるという長所がある。
さらに、刺激の強さと幹細胞の分化段階をそれぞれセルチップに集積された圧力センサーとシステムに内蔵した蛍光顕微鏡を利用して実時間で測定し観察することができるという長所がある。
【００２４】
本発明の詳細な説明で引用される図面をさらに充分に理解するために各図面の簡単な説明が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明によるセルチップを示す斜視図である。
【図２】図１のセルチップを示す断面斜視図である。
【図３】図２のイ−イ'線に沿う詳細断面図である。
【図４】本発明によるセルチップの内部の流体制御のためのマイクロバルブシステムを説明するための平面図である。
【図５】図１のセルチップの製作工程図である。
【図６】図１のセルチップを脱着式で装着し、細胞注入、培養液供給、機械的刺激印加、マイクロバルブシステム制御及びマーカー／染色液注入を自動で行う本発明によるセルチップ制御システムを示す斜視図である。
【図７】図１のセルチップを脱着式で装着し、細胞注入、培養液供給、機械的刺激印加、マイクロバルブシステム制御及びマーカー／染色液注入を自動で行う本発明によるセルチップ制御システムを示す詳細図である。
【図８】図６及び図７のシステム内部の構造及び動作を説明するためのブロック図である。
【図９】図８の測定及び信号処理回路の構造及び動作を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明と本発明の動作上の利点及び本発明の実施によって達成される目的を充分に理解するためには、本発明の好ましい実施例を例示する添付の図面及び図面に記載した内容を参照しなければならない。
以下、添付の図面を参照して本発明が好ましい実施例を説明することによって、本発明を詳しく説明する。各図面に提示された同一の参照符号は同一の部材を示す。
【００２７】
図１は、本発明によるセルチップを示す斜視図である。
図１を参照すれば、本発明によるセルチップ３０は、空圧注入口９、細胞及び培養液注入口１６ａ、微細流路１１及び細胞チャンバ１２を備える。本発明によるセルチップ３０は、細胞及び培養液注入口１６ａに注入される細胞及び培養液を微細流路１１を通じて細胞チャンバ１２に伝達し、空圧注入口９を通じて細胞チャンバ１２に位置する幹細胞に刺激を印加することによって、幹細胞の分化条件を検出する。細胞チャンバでの刺激による幹細胞の分化を観察するために、マーカーまたは染色液が注入されるマーカー／染色液注入口１６ｂをさらに備えることができる。
【００２８】
本発明によるセルチップ３０は、複数の細胞チャンバを備える。図１は、特に、空圧注入口９の中心から同心円距離を有する同一サイズの細胞チャンバ１２がすべて２４個が配置されている構造を有するセルチップ３０を示す。また、図１は、１つのユニットＵＮＩＴが対応する微細流路１１を共有する３つの細胞チャンバを備える時、すべて８つのユニットＵＮＩＴを備えるセルチップ３０を示す。
【００２９】
但し、１つのユニットＵＮＩＴに備えられる細胞チャンバ１２の個数は、これに限定されるものではない。また、機械的刺激実験の条件と実験与件によって細胞チャンバ１２の個数は、図１のセルチップ３０と異なって製作することができる。
【００３０】
１つのユニットＵＮＩＴに備えられる３つの細胞チャンバそれぞれには、互いに異なる圧力が印加されることができる。これは、空圧注入口９に注入される空気が細胞チャンバに伝達する開口部１７の大きさまたは空圧注入口９からの距離を異にすることによって具現されることができる。これについての更なる詳しい説明は後述する。
【００３１】
図１のセルチップ３０は、８つの層１〜８で構成されることができ、各層は、光学的観察が容易であり、生体適合性を有するガラスまたはポリマーで製作されることができる。本発明のセルチップ３０に使用されるポリマーとしては、代表的にＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）、ＰＭＭＡ（polymethly methacrylate）及びポリイミド（Polyimide）などが挙げられる。
【００３２】
図２は、図１のセルチップを示す断面斜視図であり、図３は、図２のイ−イ'線に沿う詳細断面図である。図１、図２及び図３を参照して、本発明によるセルチップ３０を構成する各層の構造及び機能を説明する。なお、図１及び図２について、それぞれ参考図１及び参考図２も提出する。
【００３３】
上部基板１は、空圧注入口９を備えており、ガラス材質で具現される。また、上部基板１は、セルチップ３０の蓋体として機能する。
ポリマーガスケット２には、空圧注入口９から流入（太い矢印）される空気が貯蔵される空気チャンバ１０が形成される。本発明で、セルチップ３０のガスケット２は、細胞刺激用空圧が均一に広がって行くことができるように、円筒状空洞が形成された数ミリメートル厚さのポリマー層であってもよい。
【００３４】
多孔基板３は、細胞チャンバ１２に単一の空圧源９から互いに異なる細胞チャンバ１２に互いに異なる圧力を印加するための、互いに異なる大きさの開口部１７が備えられる。図３は、特に、それぞれの直径の大きさを異にして一定厚さを有する薄膜４の弾性力の差異を発生させることによって、細胞チャンバに互いに異なる圧力を印加する開口部１７ａ、１７ｂ、１７ｃが示されている。
【００３５】
この時、幹細胞１３に印加される機械的刺激条件の差異を極大化するため、図３に示される開口部と異なって、空圧注入口９から近い開口部１７ａであるほどその直径を大きく具現することができる。
【００３６】
ポリマー薄膜４は、空気チャンバ１０と細胞チャンバを分離させる。この時、ポリマー薄膜４は、細胞チャンバ１２に圧力が加えられるように柔軟なポリマー素材で具現されることができる。
【００３７】
ポリマー基板５には、細胞を培養する空間である細胞チャンバ１２、実験初期の幹細胞注入を及び周期的な培養液交替のための微細流路１１及び流体の制御のためのマイクロバルブ１８ａ、１８ｅシステムが備えられる。
【００３８】
図４は、本発明によるセルチップの内部の流体制御のためのマイクロバルブシステムを説明するための平面図である。
図１乃至図４を参照すれば、本発明によるセルチップ３０に備えられるマイクロバルブシステムは、常時閉まっている構造のマイクロバルブを備えることができる。本発明によるセルチップ３０に備えられるマイクロバルブシステムの動作について説明する。
【００３９】
細胞注入や流体注入時に、マイクロバルブ用空圧チャンバ１８ａ、１８ｃに逆圧（真空）が加えられる。この場合、収縮されたマイクロバルブ用空圧チャンバ１８ａ、１８ｃによって微細流路１１を塞いでいたバルブボス１８ｅが上方に上がり、微細流路１１の流体が細胞チャンバ１２に流れることができるようになる。
【００４０】
一方、幹細胞の機械的刺激に対する実験時、マイクロバルブ用チャンバ１８ａ、１８ｃに空圧を注入し、マイクロバルブ用空圧チャンバ１８ａ、１８ｃを膨脹させる。したがって、細胞チャンバ１２が塞いでいた状態で刺激実験のために細胞チャンバ１２に圧力が加えられても、膨脹されたマイクロバルブ用空圧チャンバ１８ａ、１８ｃによって、微細流路１１と細胞チャンバ１２との間の流体の流れを防止することができる。
【００４１】
この時、マイクロバルブ用空圧チャンバ１８ａ、１８ｃは、細胞チャンバ１２に細胞または培養液を注入するための第１空圧チャンバ１８ａと、マーカーまたは染色液を注入するための第２空圧チャンバ１８ｃとに区別される。また、本発明によるマイクロバルブシステムは、第１空圧チャンバ１８ａに空圧または逆圧を加えるための第１マイクロバルブ用空圧注入口１８ｂと、第２空圧チャンバ１８ｃに空圧または逆圧を加えるための第２マイクロバルブ用空圧注入口１８ｃとを異にして備えることができる。
【００４２】
次に、本発明でセルチップ３０に集積化されて一体化され、開口部１７の大きさによって異に印加される細胞チャンバ１２の圧力を測定することができる圧力センサーの構造及び動作について説明する。
さらに図１、図２及び図３を参照すれば、圧力センサーは、ガラス薄膜６と、下部基板８と、ガラス薄膜６と下部基板８との間に位置する支持構造物７とで構成される。ガラス薄膜６の一面が細胞チャンバ１２と当接し、他面には、圧力センサーの上部電極１５ａが備えられる。圧力センサーの下部電極１５ｂは、図３に示されたように、下部基板８に装着されることができる。
【００４３】
支持構造物７は、圧力センサーが動作し得るように、下部電極１５ｂと上部電極１５ａとの間を数マイクロメートル間隔で維持させる。上部電極１５ｂと上部電極１５ａの空隙１４は、対応する細胞チャンバに加えられる圧力に対応して当該空隙の間隔が変わることができる。すなわち、対応する細胞チャンバの圧力値によって上・下部電極間の空隙に充電される静電容量が変わる。
【００４４】
好ましくは、本発明による圧力センサーの電極は、透明なＩＴＯ（Indium Tin Oxide）電極であって、細胞チャンバ１２の配列と同一の配列で備えられることができる。このような透明電極の使用によって、光学的観察が容易になることができる。
【００４５】
このように、本発明によるセルチップは、単一空圧で多様な強さを有する機械的刺激を複数の細胞チャンバに印加し、多様な刺激条件で幹細胞分化実験を同時に進行することによって、極少量の幹細胞のみを使用することができ、実験時間を短縮することができる。また、本発明によるセルチップは、集積化されて一体化される圧力センサーを備えることによって、開口部の大きさによって異に印加される、細胞チャンバ内の圧力を正確で且つ簡便に測定することができる。
【００４６】
図５は、図１のセルチップの製作工程図である。図１、図２、図３及び図５を参照すれば、マイクロマシニング工程を利用した本発明によるセルチップ３０の製作方法は、次の通りである。
空圧注入口９、細胞及び培養液注入口１６ａ、マーカー及び染色液注入口１６ｂ、第１マイクロバルブ用空圧注入口１８ｂ及び第２マイクロバルブ用空圧注入口１８ｄを有する上部基板１と、多様な開口部１７を有する多孔基板３とは、サンドブラスティング工法を利用してガラス基板を加工して製作される（図５の(ａ)及び(ｃ)参照）。
【００４７】
ガスケット２と、細胞チャンバ１２及びマイクロバルブシステム１８を備えるポリマー基板５は、厚い陰性感光剤（例えば、ＳＵ−８、ＪＳＲ）などのような感光剤をモールドとして使用するＰＤＭＳ標準モールド工程またはＰＭＭＡを利用したホットエムボシング工程により製作されることができる（図５の(ｂ)、(ｄ)及び(ｅ)参照）。
【００４８】
圧力センサーの上下部電極１５ａ、１５ｂは、それぞれ、ガラス基板６、８上にスバッターを利用した透明なＩＴＯ電極蒸着工程で製作され、ＡＺ１５１２のような感光剤を使用した写真エッチング（ＰＲ）、及び金属エッチングを行い、パターニングされる（図５の（ｆ）、及び（ｇ）の１）参照）。支持構造物７は、間隙形成に適した感光剤（例えば、ＡＺ４６２０）を利用してスピンコーティングした後、パターニングして製作される（図５の（ｇ）の２）参照）。次に、電極接合により圧力センサーが製作される（図５の（ｈ）参照）。
【００４９】
上記のように製作されたそれぞれの層は、酸素プラズマ処理により表面を活性化した後に接合する。プラズマ接合後、７５度のオーブンに２４時間焼いて永久的接合がなされるようにする（図５の（ｉ）及び（ｊ）参照）。すべての層の接合後、セルチップ３０の側面をエポキシなどの接着剤で補強した後に乾燥させて、各層の固定力を強化させ、発生するかも知れない未接合部位の漏水及び空圧の流出を防止する。
【００５０】
上記のように製作された本発明によるセルチップは、硬いガラスと柔軟なポリマー基板を交互に接合して製作することによって、空圧による変形を最小化することができる。以上の図５のセルチップ製造工程の説明で使用される物質及び製造工法は、当業者によって容易に実施されることができるので、これについての更なる詳しい説明は省略する。
【００５１】
図６及び図７は、それぞれ、図１のセルチップを脱着式で装着して細胞注入、培養液供給、機械的刺激印加、マイクロバルブシステム制御及びマーカー／染色液注入を自動で行う本発明によるセルチップ制御システムを示す斜視図及び詳細図である。図８は、図６及び図７のシステム内部の構造及び動作を説明するためのブロック図である。図６、図７及び図８を参照して、本発明によるセルチップ制御システム５００の構造及び動作を説明する。
【００５２】
まず、図１のセルチップ３０は、装着部２１ａに装着される。装着されたセルチップ３０は、装着部２１ａをＸ−Ｙ軸（図４参照）方向に移動または回転させることができるＸ−Ｙステージ２１にあらかじめプログラミングされている初期位置に位置するようになる。セルチップが装着される初期位置は、マイクロセルチップに数十個に達する連結管の結合及び蛍光顕微鏡を用いて複数の細胞チャンバ内の細胞状態を観察するために、正確に設定されなければならない。
【００５３】
セルチップ３０が装着されれば、外部からの汚染または感染を最小化するために、透明な材質のスライディング蓋体２３が下ってセルチップ３０を外部から密閉させることができる。
装着されたセルチップ３０の上に、細胞及び培養液供給またはマイクロバルブシステム作動のための連結管２０ｂ及び細胞に空圧を提供するための連結管２０ａがＺ軸ステージ２５を用いてＺ軸方向に移動し、セルチップ３０の各注入口（図１乃至図４の９、１６ａ、１６ｂ、１８ｂ、１８ｄ）に連結される。
【００５４】
次に、第１マイクロバルブ用空圧注入口１８ｂに逆圧（真空）が印加されれば、細胞チャンバ１２を塞いでいたバルブボス（図３の１８ｅ）が開かれながら<培養液と混じている幹細胞（図３の１３）がシリンジポンプ６３０によって注入される。その後、一定時間の間に上記のようなセルチップの状態を維持させて、幹細胞が細胞チャンバ１２の底部に定着されるようにする。実験結果、細胞チャンバに注入された幹細胞は、約１２時間経過後に底部に定着される。
【００５５】
細胞定着が確認された後、所望の機械的刺激強さ、間隔、周波数、周期、デューティー比をタッチスクリーン２２を用いて入力することができる。図８に示されているように、入力された値によってマイクロコンピューター６６０は、制御信号ＸＣＯＮを高速ソレノイド空圧バルブ６２０に伝送する。ソレノイド空圧バルブ６２０は、制御信号ＸＣＯＮに応答してＯＮ／ＯＦＦ動作を行うことによって、ユーザーが希望する周期、間隔、周波数及びデューティー比を有する空圧をセルチップ３０の空気チャンバ１０に印加する。
【００５６】
この時、機械的刺激のための空圧ＰＲＥ１及びマイクロバルブ用空圧ＰＲＥ２は、窒素ガス貯蔵庫６１０から流出される窒素ガスを対応するレギュレーターＲＥＧ１、ＲＥＧ２によってレギュレイティングし（例えば、高圧のガスを低圧にレギュレイティング）ソレノイド空圧バルブ６２０に提供されることができる。
【００５７】
図８の各構成要素は、図６のフレーム２４の内部に備えられることができる。但し、窒素ガス貯蔵庫６１０など一部は、その体積が大きいため、フレーム２４の外部に備えられることができる。
このような方法で空圧がセルチップに伝達されれば、圧力センサーは、対応する細胞チャンバの圧力をセンシングし、測定及び信号処理回路６７０は、これを受信し、測定された値をデジタル信号に変換し、マイクロコンピューター６６０に伝送する。マイクロコンピューター６６０は、各細胞チャンバの圧力値をタッチスクリーン２２に出力することができる。
【００５８】
図９は、図８の測定及び信号処理回路の構造及び動作を説明するための図である。
図８及び図９を参照すれば、圧力センサーの上部電極及び下部電極（図３の１５ａ及び１５ｂ）からなる可変キャパシタトの静電容量は、Ｃで示すことができる。図９の電荷増幅器ＡＭＰは、静電容量Ｃの変化を電圧の変化に変換する。この時、フィードバックキャパシタの静電容量Ｃｆ値によって変換敏感度が変わる。Ｃｆの大きさがＣの変化量より小さい時は、容易に飽和され、適宜に使用されることができないので、一般的にＣの変化量の数倍から数十倍の容量のものを選択して使用する。フィードバック抵抗Ｒｆは、バイアス電流の流れを形成し、低周波でのセンサーインピーダンス値より高い抵抗を有する。
【００５９】
バッファー／増幅器６７２は、静電容量の変化を電圧に変換する時、その信号が非常に小さいため、増幅する役目として使用される。搬送波と変換された測定信号を乗算器６７８で重畳させて相殺させることによって、変化分だけが残るようになり、最終的にフィルター６７４と増幅器６７６を経て必要な信号のみを検出する。
【００６０】
ところが、圧力センサーの電極（図３の１５ａ及び１５ｂ）の直径が数ミリメートルに過ぎないので、細胞チャンバの微細圧力変化による静電容量の変化が数乃至数十フェムトファラッドＦ以下なので、圧力センサーによってセンシングドされた信号ＳＶＡＬは、ノイズに非常に弱い。したがって、本発明は、図９のように、搬送波を使用して振幅変調（ＡＭ：amplitude modulation）及び復調（demodulation）を行い、フィルター６７４を通過させた後、増幅器６７６を通じて増幅することによって、ノイズを最小化し、細胞チャンバの圧力の測定値ＤＴＡ２が正確に検出されることができる。この時、搬送波は、波形発生回路６８０によって提供されることができる。
【００６１】
さらに図８を参照すれば、本発明によるセルチップ制御システムは、１週乃至１ヶ月の間に刺激実験を行い、毎日、毎週細胞の増殖、分化状態をイメージで貯蔵させることができる。必要に応じて、蛍光マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ａｃｔｉｎなど）、及び骨分化に特徴的な成分であるカルシウム(Ｃａ)を染色するＡＬＰ（alkaline phosphatase）またはアリザリンレッド（Alizarin red）などの染色液を各細胞チャンバ別に個別マイクロバルブを開閉した後、シリンジポンプを利用して注入することによって、細胞の分化状態などを観察することができる。
【００６２】
この時、図６のＸ−Ｙステージ２１の下部に装着される蛍光顕微鏡６４０を利用して上記のようなセルチップ３０内部の細胞状態及び変化を観察することができる。この時、Ｘ−Ｙステージ２１は、各時間別に各細胞チャンバの細胞状態を観察するために、マイクロコンピューター６６０によってプログラミングされたＸ−Ｙ位置にセルチップを移動させて、同心円間隔の細胞観察のために一定の角度で精密回転することができる。
【００６３】
蛍光顕微鏡６４０を用いて観察された実験データＤＴＡ１は、マイクロコンピューター６６０に伝送されることができる。マイクロコンピューター６６０は、前述したように、実験のための各種制御を行うことができ、外部表示装置２２を通じて実験結果をディスプレイしたり、ユーザーから実験条件などを受信したりすることができる。マイクロコンピューター６６０は、電源６５０から電源を供給されて動作することができる。
【００６４】
ユーザーは、本発明によるセルチップ及びセルチップ制御システムを利用して、実験期間の間に測定された圧力と細胞変化イメージデータを分析することによって、機械的刺激の強さ、間隔、周波数、周期、デューティー比と幹細胞の骨分化及びカルシウム生成相関関係を糾明し、最適の刺激条件を捜し出すことができる。
【００６５】
以上のように、明細書と図面で最適の実施例が開示された。ここで、特定の用語が使用されたが、これらは、ただ本発明を説明するための目的で使用されたものであって、意味限定や特許請求範囲に記載した本発明の範囲を制限するために使用されたものではない。それで、本技術分野における通常の知識を有する者ならこれから多様な変形及び均等な他の実施例が可能である点を理解するだろう。したがって、本発明の真正な技術的保護範囲は、添付の特許請求範囲の技術的思想によって定められるべきである。
【符号の説明】
【００６６】
１    上部基板
２    ポリマーガスケット
３    多孔基板
４    ポリマー薄膜
５    ポリマー基板
６    ガラス薄膜
７    支持構造物
８    下部基板
９    空圧注入口
１０    空気チャンバ
１１    微細流路
１２    細胞チャンバ
１３    幹細胞
１４    空隙
１５ａ  上部電極
１５ｂ  下部電極
１６ａ  細胞及び培養液注入口
１６ｂ  マーカー／染色液注入口
１７    開口部
１８ａ  マイクロバルブ用空圧チャンバ
１８ｂ  第１マイクロバルブ用空圧注入口
１８ｃ  マイクロバルブ用空圧チャンバ
１８ｄ  第２マイクロバルブ用空圧注入口
１８ｅ  バルブボス
２０ａ  細胞に空圧を提供するための連結管
２０ｂ  細胞及び培養液供給またはマイクロバルブシステム作動のための連結管
２１    Ｘ−Ｙステージ
２１ａ  装着部
２２    外部入力装置
２３    スライディング蓋体
２４    フレーム
２５    Ｚ軸ステージ
３０    セルチップ
５００    セルチップ制御システム
６１０    窒素ガス貯蔵庫
６２０    ソレノイド空圧バルブ
６３０    シリンジポンプ
６４０    蛍光顕微鏡
６５０    電源
６６０    マイクロコンピューター
６７０    測定及び信号処理回路
６７２    バッファー／増幅器
６７４    フィルター
６７６    増幅器
６８０    波形発生回路
【図１】
2011500050.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2011500050.tif 000008
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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