(57)【要約】  本発明は、青色色素親和性クロマトグラフィを介する、Ｆｃ含有タンパク質の精製のため、特に、Ｆｃ含有タンパク質調製物における遊離Ｆｃ部分の量を低減するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体に存在する遊離のＦｃ部分から、Ｆｃ含有タンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）青色色素親和性クロマトグラフィ樹脂に当該液体をロードするステップ；
（ｂ）ｐＨ約4.0〜約6.0のバッファで当該樹脂を洗浄し、それにより当該樹脂から遊離のＦｃ部分を除去するステップ；及び
（ｃ）当該樹脂からＦｃ含有タンパク質を溶出するステップ、
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）において、前記バッファが塩化カリウム又は塩化ナトリウムから選択される塩を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）において、前記Ｆｃ部分を、青色色素親和性クロマトグラフィ樹脂から、約0〜約0.5 MのＫＣｌで塩グラジエントを増加させて洗い流す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）において、前記Ｆｃ部分を、青色色素親和性クロマトグラフィ樹脂から、均一な塩濃度範囲200〜300 mMのＫＣｌで洗い流す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｂ）において、前記バッファが、約10〜約100 mMで酢酸ナトリウムを含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）の色素親和性クロマトグラフィが、固定化シバクロン・ブルー（Cibacron Blue）Ｆ３Ｇ−Ａを有する樹脂を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記樹脂が、ブルーセファロースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、充填されたブルーセファロース樹脂の１ミリリットル当たりＦｃ含有タンパク質約20 mgの動的容量で、ブルーセファロース樹脂をロードすることを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前記液体が、ｐＨ５で前記樹脂にロードされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）から得られる青色色素親和性クロマトグラフィ樹脂の溶出液の遊離Ｆｃ部分のレベルが、1 mcgのＦｃ含有タンパク質をロードする場合、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により検出できないレベルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において、前記Ｆｃ含有液体が、タンパク質Ａクロマトグラフィ溶出液である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ又は限外濾過のうちの１又は複数のステップをさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
精製Ｆｃ含有タンパク質を医薬組成物に組み込んで処方することをさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｆｃ含有タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記定常領域がヒト定常領域である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記定常領域がＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｆｃ含有タンパク質が免疫グロブリン可変領域を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーのリガンド結合部分を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンド結合部分が、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメイン、ＴＮＦＲ２、又はそのＴＮＦ結合断片から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リガンド結合部分が、ＢｌｙｓもしくはＡＰＲＩＬの少なくとも１つと結合する、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメイン、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、又はその断片から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、
（ａ）配列番号２；
（ｂ）高ストリンジェント条件下で、配列番号３の補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）のポリペプチドと、少なくとも80％、又は85％、又は90％、又は95％の相同性を有する（ａ）の変異タンパク質；
から選択されるポリペプチドを含んでなり、
ここで前記ポリペプチドは、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬの少なくとも１つに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｆｃ融合タンパク質がＩＦＮ−βを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸２２〜４２２；
（ｃ）高ストリンジェント条件下で、配列番号５の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと、少なくとも80％、又は85％、又は90％、又は95％の相同性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの変異タンパク質；
から選択されるポリペプチドを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる組成物における、遊離Ｆｃ部分の濃度の低減のための、青色色素親和性クロマトグラフィの使用。
【請求項２８】
前記遊離Ｆｃの濃度が、前記組成物の総タンパク質濃度の、約５％未満、又は約２％未満、又は約１％未満、又は約0.5％未満、又は約0.2％未満、又は約0.1％未満まで低減される、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製に分野に属する。より具体的には、これは、青色色素親和性クロマトグラフィを介し、具体的には、Ｆｃ含有タンパク質調製において遊離のＦｃ部分の量を減少させるための、Ｆｃ含有タンパク質の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、いわゆる「生物学的製剤」である薬物として商業上重要になっている。最も大きな挑戦の１つは、商業的スケールでのタンパク質の精製のための費用効率が高く、且つ高効率な方法の開発である。現在多くの方法は、タンパク質の大スケール調製用に利用できるが、細胞培養上清等の粗生成物は、所望の生成物だけでなく、当該所望の生成物から分離が困難な不純物も含有する。細胞発現組み換えタンパク質制生物の細胞培養物上清は、不純物含量がより少ない可能性があるが、当該細胞が血清未含有培地で増殖する場合、当該宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、まだなお精製プロセスの間に除去されるような状態のままである。さらに保健機関は、ヒト投与を意図するタンパク質の純度について、高い基準を要求する。
【０００３】
タンパク質を精製するために幅広く使用される、多数のクロマトグラフ法が知られている。親和性クロマトグラフィ等の方法が一般的に使用されている。
【０００４】
青色色素親和性クロマトグラフィは、マトリクス（例えば、セファロース又はアガロース）に結合する、色素−リガンド、シバクロン・ブルー（Cibacron Blue）をベースとする。ブルーセファロース（Blue Sepharose）樹脂において、当該リガンドのシバクロン・ブルーＦ３Ｇ−Ａは、クロロトリアジン環（Vlatakis G et al., 1987）を介して、セファロース（商標）に共有結合する。ブルーセファロースは、主にインターフェロンベータ（Vlatakis G et al., 1987）及びアルブミンの精製に使用されている。市販の青色色素親和性マトリクスの例としては、ブルーセファロース６ＦＦ樹脂（GE Healthcare）、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ(GE Healthcare)、ブルートリサクリル（Blue Trisacryl）Ｍ（Pall/BioSepra）、Toyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience)、又はシバクロン・ブルー F3GA (Polysciences Inc.)がある。
【０００５】
イオン交換クロマトグラフィシステムは、主に電荷の違いに基づいてタンパク質の分離のために使用される。
【０００６】
親和性クロマトグラフィは、クロマトグラフィ樹脂に固定化される別のタンパク質に対する、注目のタンパク質の親和性に基づく。当該固定化リガンドの例は、特定の免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分に特異性を有する、細菌細胞壁タンパク質、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇである。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇの両方とも、ＩｇＧ抗体への強い親和性を有するが、他の免疫グロブリンクラス及びアイソタイプに同様に様々な親和性を有する。
【０００７】
タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、及びタンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィは、抗体の単離及び精製に一般的に使用される。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇのための結合部位が、免疫グロブリンのＦｃ領域にあるため、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ（又はタンパク質Ａ／Ｇ）親和性クロマトグラフィは、いわゆるＦｃ融合タンパク質の精製も可能である。タンパク質Ｌは、Ｉｇ軽鎖に結合するので、軽鎖を含む抗体の精製に使用される。
【０００８】
抗体、又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合で共に結合された軽鎖及び重鎖からなる。各鎖のアミノ末端に位置する第一のドメインは、アミノ酸配列が可変であり、抗体結合特異性の幅広いスペクトルを提供する。これらのドメインは、可変重領域（ＶＨ）及び可変軽領域（ＶＬ）として知られている。各鎖のその他のドメインは、アミノ酸配列において比較的不変であり、定常重領域（ＣＨ）及び定常軽領域（ＣＬ）として知られる。抗体の主要なクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり；及びこれらのクラスは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられる。例えば、ＩｇＧクラスには、４つのサブクラス、特に、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4がある。
【０００９】
抗体クラス間における違いは、免疫グロブリンクラスによって、１〜４個の定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ４）を含む、重鎖定常領域における違いに由来する。いわゆるヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する。当該ヒンジ領域は、特にタンパク質分解性の開裂に感受性があり、当該タンパク質分解により、開裂の正確な部位によって、２又は３つのフラグメントが生じる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域の一部は、免疫グロブリンの「Ｆｃ」部分とも呼ばれる。すなわち、抗体はＦｃ含有タンパク質である。Ｆｃ含有タンパク質の別のタイプは、いわゆるＦｃ融合タンパク質である。
【００１０】
治療用タンパク質として使用される複数の抗体が知られる。市販の組み換え抗体の例としては、例えば、アルキシシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブ、又はオマリズマブがある。
【００１１】
Ｆｃ含有タンパク質の別のタイプは、いわゆるＦｃ融合タンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、抗体のＦａｂ領域、又は受容体の結合領域等のタンパク質のエフェクター領域からなるキメラタンパク質であり、多くの場合免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である免疫グロブリンのＦｃ領域に融合する。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域によりに与えられる利点を呈するような治療剤として一般に使用される。Ｆｃ領域によりに与えられる利点としては、例えば以下のものがある。
ＩｇＧアイソタイプにより変化する親和性を有する、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティクロマトグラフィを用いる精製能力。ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ4は、タンパク質Ａに強く結合し、ＩｇＧ3を含む全てのヒトＩｇＧはタンパク質Ｇに強く結合する；
リソソーム分解から保護するサルベージレポーターＦｃＲｎにＦｃ領域が結合するため、循環系における半減期の増加；
Ｆｃ融合タンパク質の医療的使用によって、Ｆｃエフェクター機能が所望されてもよい。当該エフェクター機能には、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及び補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に結合することによる補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）がある。ＩｇＧアイソフォームは、異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ1及びＩｇＧ3は、強いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果をもたらすが、ＩｇＧ2は、弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果をもたらす。
【００１２】
血清半減期及びエフェクター機能は、Ｆｃ融合タンパク質として意図される治療的使用により、それぞれＦｃＲｎ、ＦｃｖＲｎ及びＣ１ｑへの結合を増加又は減少させるようＦｃ領域を操作することにより調整できる。
【００１３】
ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラー及びマクロファージ等の免疫エフェクターの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｖＲ）に結合し、標的細胞のファゴサイトーシス又は分解をもたらす。
【００１４】
ＣＤＣにおいて、当該抗体は、細胞表面での補体カスケードを引き起こすことにより標的細胞を死滅させる。ＩｇＧアイソフォームは、ＩｇＧ4＜ＩｇＧ2＜ＩｇＧ1≦ＩｇＧ3の順で増加する、異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ1は、高いＡＤＣＣ及びＣＤＣを示し、病原及び癌細胞に対する治療的使用に最も適する。
【００１５】
特定環境下、例えば、標的細胞の枯渇が望まれない場合、エフェクター機能の抑制が必要である。逆に、腫瘍学的使用が意図される抗体の場合、エフェクター機能の増加は、その治療活性を向上させてもよい（Carter et al., 2006）。
【００１６】
エフェクター機能の修正は、ＦｃｖＲ又は補体因子の結合を増加させるか、又は減少させるようＦｃ領域を操作することにより達成できる。
【００１７】
活性化ＦｃｖＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃｖＲIIａ、ＦｃｖＲIIIａ及びＦｃｖＲIIIｂ）及び阻害ＦｃｖＲ（ＦｃｖＲIIｂ）、又は第一補体成分（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃｖＲ及び補体Ｃ１ｑ結合にとって重要であり、ＩｇＧ2及びＩｇＧ4において特有の配列を有する。例えば、Kabat et al. (Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991 )により定義されるＥＵ位置指数による、233〜236の位置におけるＩｇＧ2残基のヒトＩｇＧ1への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ大きく減少させる（Armour et al., 1999 and Shields et al., 2001）。
【００１８】
ＩｇＧのＣＨ２ドメインにおける多数の変異導入がなされており、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに対するその影響が、インビトロ（in vitro）で試験された（Shields et al., 2001 , ldusogie et al., 2001及び2000, Steurer et al., 1995）。特に、Ｅ３３３におけるアラニンへの変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させることが報告されている（Idusogie et al., 2001 and 2000）。
【００１９】
治療抗体の血清半減期の増加は、その効果を向上させ、血中濃度をより高くさせ、投与品頻度の低下及び用量の低下が可能となる、別の方法である。これは、新生児ＦｃＲ（ＦｃＲ）へのＦｃ領域の結合を促進させることにより達成できる。内皮細胞表面で発現するＦｃＲｎは、ｐＨ依存的な方法でＩｇＧに結合し、分解からそれを保護する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン間の接合に位置する複数の変異は、ＩｇＧ1の半減期を増加させることがわかっている（Hinton et al., 2004 and Vaccaro et al., 2005）
【００２０】
以下の表１は、既知のＩｇＧ Ｆｃ領域の各種変異の要約である（インビトロジェンのウェブサイトから引用）。
【００２１】
【表１】
2011500757.tif 000002
【００２２】
治療用途を有するＦｃ融合タンパク質のあるクラスにおいて、Ｆｃ領域は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーに属するある受容体の細胞外ドメインに融合している（Locksley et al., 2001 , Bodmer et al., 2002, Bossen et al., 2006）。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの特質は、Naismith and Sprang, 1998等に記載される通り、細胞外ドメインにおけるシステイン豊富な偽性反復（pseudo-repeat）が存在することである。
【００２３】
２つのＴＮＦ受容体、ｐ５５（ＴＮＦＲ１）及びｐ７５（ＴＮＦＲ２）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーの例である。エタネルセプトは、ｐ７５ ＴＮＦＲの可溶性部分を含むＦｃ融合タンパク質である（例えば、国際公開第91/03553号、国際公開第94/06476号）。商標名エンブレル（Enbrel、登録商標）で、以下の疾患の治療用に市販されており、疾患には子宮内膜症、Ｃ型肝炎ウイルス感染、ＨＩＶ感染、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ様関節炎、喘息、強直性脊椎炎、心不全、移植片対宿主病、肺線維症、クローン病がある。レネルセプトは、ヒトｐ５５ ＴＮＦ受容体の細胞外成分とヒトＩｇＧのＦｃ部分を含有する融合タンパク質であり、重篤な敗血症及び多発性硬化症の潜在的な治療とされる。
【００２４】
ＯＸ４０も、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０−ＩｇＧ1及びＯＸ４０−ｈＩＧ４ｍｕｔ融合タンパク質は、クローン病等の炎症性及び自己免疫性疾患の治療のために調製されている。
【００２５】
ＢＲ３とも呼ばれ、ＢＲ３−Ｆｃと呼ばれるＢＡＦＦ−ＲのＦｃ融合タンパク質は、ＢＡＦＦ（ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子）の阻害因子の群由来の可溶性デコイ受容体であり、リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫性疾患の潜在的治療用として開発されている。
【００２６】
ＢＣＭＡは、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属するさらなる受容体である。ＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、自己免疫疾患を阻害すると報告されている（Melchers, 2003）。
【００２７】
ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーの別の受容体は、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ−相互作用物質であるＴＡＣＩであり（von Bulow and Bram, 1997; 米国特許第5,969,102号, Gross et al., 2000）、これは、２つのシステイン豊富な偽性反復を含む細胞外ドメインを有する。ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーの２つのメンバーに結合する。リガンドは、ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ、ニュートカイン（neutrokine）−α、ＴＡＬＬ−１、ｚＴＮＦ４、又はＴＨＡＮＫ（Moore et al., 1999）と呼ばれる。その他のリガンドはＡＰＲＩＬ、ＴＮＲＦデスリガンド−１又はＺＴＮＦ２（Hahne et al., 1998）と呼ばれる。
【００２８】
ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＴＡＣＩ受容体の可溶体を含む融合タンパク質が既知であり、ＴＡＣＩ−Ｆｃと命名された（国際公開第00/40716号、国際公開第02/094852号）。ＴＡＣＩ−Ｆｃは、Ｂ細胞へのＢＬｙＳ及びＡＲＰＩＬの結合を阻害する（Xia et al., 2000）。これは自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び血液系悪性腫瘍等の治療のため、並びに多発性硬化症（ＭＳ）の治療のために開発されている。これに加え、アタシセプト（atacicept）と呼ばれるＴＡＣＩ−Ｆｃは、多発性骨髄腫（ＭＭ）（Novak et al., 2004）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びヴァルデンストレームマクロ・グロブリン血症（ＷＭ）のために開発されている。
【００２９】
Ｆｃ融合タンパク質の別の例は、単一のインターフェロンベータタンパク質に結合したＦｃ領域からなる。インターフェロンベータ（インターフェロン−β又はＩＦＮ−β）は、サイトカインのクラスに属する天然の可溶性糖タンパク質である。インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス、抗増殖性及び免疫調節性特性等の幅広い生物的活性を有する。インターフェロンベータは、いわゆる生物学的製剤である、治療タンパク質薬物として、例えば、多発性硬化症、癌、又はＳＡＲＳ又はＣ型肝炎ウイルス感染等のウイルス性疾患等の多数の疾患において使用される。
【００３０】
ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合した生物学的に活性な分子としてのＩＦＮ−βを含有する融合タンパク質は、国際公開第2005/001025号で報告されている。
【００３１】
Ｆｃ含有タンパク質、特に抗体及びＦｃ融合タンパク質の治療用途があるため、ヒト投与のために十分な、大量の高純度なタンパク質が必要である。
【発明の概要】
【００３２】
Ｆｃ含有タンパク質の製造において直面する可能性のある問題の１つは、「遊離のＦｃ部分」、すなわちＦｃ含有タンパク質由来のポリペプチド断片であって、抗体可変領域にも、通常Ｆｃ融合タンパク質に存在する他の特定のタンパク質又はドメインにも融合しない、断片の存在である。当該遊離のＦｃ部分は、ヘテロ二量体の融合タンパク質、例えばＦｃ領域に融合した単一のタンパク質の発現、又は注目のタンパク質のタンパク質分解性開裂が原因である可能性がある。
【００３３】
本発明は、本問題に言及する。これは、不純物として存在する遊離のＦｃ部分の量を低減させることにより、Ｆｃ含有タンパク質の液体、組成物又は調製物の精製方法の開発に基づく。
【００３４】
従って、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体における遊離のＦｃ部分の濃度を低減させる方法であって、当該液体をブルーセファロースクロマトグラフィに供すること、そしてｐＨ約4.0〜6.0のｐＨ範囲で樹脂を洗浄することにより、遊離のＦｃ部分を除去することを含んでなる方法に関する。
【００３５】
第二の態様によれば、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質調製における遊離Ｆｃの低減のためのブルーセファロースクロマトグラフィの使用に関する。第三の態様によれば、本発明は、遊離Ｆｃ部分を、約５％未満、又は約２％未満、又は約１％未満、又は約0.5％未満、又は約0.2％未満、又は約0.1％未満含んでなる、精製Ｆｃ含有タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、実施例１.（1）ピーク１；（２）ピーク２において記載されるブルーセファロースクロマトグラフィのクロマトグラフプロファイルを示す。
【図２】図２は、非還元（Ａ）及び還元（Ｂ）条件下、実施例１において記載されるブルーセファロースクロマトグラフィから得られることなるフラクションの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製ＴＡＣＩ−Ｆｃ、レーン３：ロード、レーン４：ピーク１、レーン５：ピーク２、レーン６：ピーク１＋２、レーン７：分子量マーカー。
【図３】図３は、抗−ＴＡＣＩ抗体、及び実施例１に記載されるブルーセファロースクロマトグラフィから得られるフラクションの抗−Ｆｃ抗体を用いる、ウェスタン免疫ブロッティング分析の写真を示す（レーン２〜５及び９〜１２のみ；レーン６〜８及び１３〜１５は異なる条件での洗浄から得られるフラクションを表す）：図３Ａは、非還元（レーン２〜５）及び還元（レーン９〜１２）条件下での抗−ＴＡＣＩ検出を示す。図３Ｂは、非還元（レーン２〜５）及び還元（レーン９〜１２）条件下での抗−Ｆｃ検出を示す。レーン２及び９：精製ＴＡＣＩ−Ｆ；レーン３、１０：ロード；レーン４、１１：ピーク１；レーン５、１２：ピーク２
【図４】実施例１から得られた、ロード（図４Ａ）、ピーク１（図４Ｂ）及びピーク２（図４Ｃ）のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析スペクトルを表し、ここで、ピーク（ａ）は遊離のＦｃ、ピーク（ｂ）はハイブリッドＴＡＣＩ−Ｆｃ／Ｆｃ及びピーク（ｃ）はＴＡＣＩ−Ｆｃを表す。
【図５】図５は、実施例３で記載したブルーセファロースクロマトグラフィのクロマトグラフプロファイルを示す。（ｉ）280 nmでのＯＤ（mAU）、（ii）ＫＣｌ濃度、（iii）伝導率、（iv）ｐＨである。１−ロード、２−洗浄１、３−洗浄２、４−洗浄３、５−洗浄４、６−洗浄５、７−洗浄６、８−溶出、９−再生である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の詳細な説明
本発明は、青色色素親和性クロマトグラフィが、Ｆｃ含有タンパク質の液体又は組成物に存在する可能性のある遊離のＦｃ部分の量及び程度を有効に低減し、その結果Ｆｃ含有タンパク質の純度を向上させる、便利且つ単純な方法を提供できるという発見に基づく。当該遊離のＦｃ部分は、ヘテロ二量体融合タンパク質、例えば、Ｆｃ領域に融合した単一のタンパク質の発現により、又は注目のタンパク質のタンパク質分解性開裂により得られるのもであってもよい。
【００３８】
従って、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体に存在する遊離のＦｃ部分から、Ｆｃ含有タンパク質を精製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）青色色素親和性クロマトグラフィ樹脂に当該液体をロードするステップ；
（ｂ）ｐＨ約4.0〜約6.0のバッファで当該樹脂を洗浄し、それにより当該樹脂から遊離のＦｃ部分を除去するステップ；及び
（ｃ）当該樹脂からＦｃ含有タンパク質を溶出するステップ、
を含んでなる方法に関する。
【００３９】
Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体は、ヒト又は動物由来の体液等、又は細胞培養上清又は細胞培養回収物等の細胞培養物由来の液体等、任意の組成物又は調製物であってもよい。液体は、別の精製ステップ由来の液体であってもよく、例えば、捕捉ステップから得られる溶出液又はフロースルー等か、又はブルーセファロースクロマトグラフィの前の由来の液体、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィの溶出液等でもよい。
【００４０】
前記液体は、好ましくは細胞培養物、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上清であってもよい。本明細書で使用される場合、「細胞培養上清」なる用語は、培地であって、その中で細胞が培養され、且つ、タンパク質が適切な細胞シグナル、いわゆるシグナルペプチドを含む場合は、その中にタンパク質が分泌される培地のことを言う。Ｆｃ含有タンパク質発現細胞を、血清未含有培養条件下で培養することが好ましい。すなわち、好ましくは、当該細胞培養上清は、動物由来成分を欠くものである。最も好ましくは、当該細胞培養培地は、化学的に規定される培地である。
【００４１】
好ましくは、当該本発明の精製タンパク質は、例えば、抗体、より好ましくは、ヒト、ヒト化又はヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体、好ましくはＩｇＧ抗体等のＦｃ含有タンパク質であり、それはまた、好ましくはＦｃ融合タンパク質の可能性もある。Ｆｃ含有タンパク質は、例えば抗体のＦａｂ領域、又は受容体の結合領域等の、多くの場合免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したタンパク質のエフェクター領域からなるキメラタンパク質である。
【００４２】
そのため、Ｆｃ領域は、Ｆｃ断片又はＦｃドメインと呼んでもよい。そのため、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃドメイン」なる用語は、相互変換可能であり、同じ意味を有するものと解すべきである。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ含有タンパク質」なる用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、又はその任意の組み合わせ、及び好ましくはヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから選択されるヒト定常領域を有する任意のタンパク質のことを言う。
【００４４】
免疫グロブリン定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はその組み合わせ又はそのアイソタイプの任意のものに由来してもよい。好ましくはそれは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3又はＩｇＧ4等のＩｇＧである。より好ましくは、それはＩｇＧ1である。
【００４５】
本発明によると、すなわちＦｃ含有タンパク質は、例えば抗体又はＦｃ融合タンパク質、又はその変異体、例えば抗体又はＦｃ融合タンパク質の断片、変異タンパク質又は機能的誘導体であってもよい。
【００４６】
本発明のＦｃ含有タンパク質は、単量体、二量体又は多量体であってもよい。当該Ｆｃ含有タンパク質は、二量化Ｆｃ部分（例えば、２つのジスルフィド架橋ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構築物の二量体）を含んでなる「偽性二量体」（pseudo-dimer）（「単量体」と呼ばれることもある）であってもよく、そのうち１つは、免疫グロブリン可変ドメイン、受容体のリガンド結合断片、又は任意の他のタンパク質等のさらなる部分と融合してもよい。当該偽性二量体の例としては、例えば国際公開第2005/001025号に記載の、２つのＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構築物のうち１つと融合した、インターフェロン−βを有するＦｃ融合タンパク質である。
【００４７】
Ｆｃ含有タンパク質はまた、２つの異なる非免疫グロブリン部分又は免疫グロブリンドメインを含むヘテロ二量体か、又は単一の非免疫グロブリン部分又は免疫グロブリン可変ドメインの同じ２つを含有するホモ二量体である。
【００４８】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は二量体である。本発明のＦｃ含有タンパク質がホモ二量体であることも好ましい。
【００４９】
本発明によれば、Ｆｃ含有タンパク質のＦｃ部分は、エフェクター機能を調整するために改変することもできる。例えば、ＥＵ位置指数（Kabat et al., 1991）によると、Ｆｃ部分はＩｇＧ１由来である場合、以下のＦｃ変異が誘導できる。
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３ｋｉｒｏ／Ｎ４３４Ｆ
Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ
Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２２Ａ
【００５０】
さらに、Ｆｃ変異体は、例えば、３３０、３３１、２３４、又は２３５、又はその組み合わせから選択されるＥＵ位置指数で置換されてもよい。ＣＨ２ドメインに位置するＥＵ位置指数２９７でのアミノ酸置換を、本発明の文脈において、Ｎ結合型炭水化物付加の潜在的部分を取り除くように、Ｆｃ部分に導入してもよい。さらに、ＥＵ位置指数２２０のシステイン残基も、免疫グロブリン軽鎖定常領域と共に通常ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を取り除くように、セリン残基に置換してもよい。
【００５１】
好ましい実施態様によれば、Ｆｃ含有タンパク質は、免疫グロブリン可変領域、例えば１又は複数の重鎖可変ドメイン及び／又は１又は複数の軽鎖可変ドメインを含んでなる。好ましくは、当該抗体は、１又は２個の重鎖可変ドメインを含有する。より好ましくは、当該抗体は、さらに１又は２個の軽鎖定常及び／又は可変ドメインを含有する。
【００５２】
本発明のより好ましい実施態様によれば、本発明により精製できるＦｃ含有タンパク質は抗体である。好ましくは、当該抗体は、モノクローナル抗体である。当該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。当該抗体は、当該抗体をコードする１、２、又はそれ以上のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換して作製しても、ハイブリドーマにより作製してもよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「抗体」なる用語は、当該治療部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）の少なくとも１つの可変ドメインを含んでなるＦｃ含有タンパク質のことを言う。好ましい免疫グロブリンは、哺乳類の免疫グロブリンである。より好ましい免疫グロブリンは、げっ歯類、特にラット又はマウスの免疫グロブリンである。最も好ましい免疫グロブリンは、霊長類の免疫グロブリンであり、特にヒト免疫グロブリンである。
【００５４】
「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続する、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はその抗原結合部分からなる糖タンパク質のことを言う。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変的な領域と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に分けることができる。ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に分散する。各々のＶＨ及びＶＬは、以下の順にアミノ末端からカルボキシ末端まで並べられた３つのＣＤＲ及び４つのフレームワークからなる。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００５５】
本発明により精製できる抗体の例には、ＣＤ３（例えば、ＯＫＴ３、ＮＩ−０４０１）、ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ）、ＣＤ４（例えば、ザノリムマブ、ＴＮＸ−３５５）、ＣＤ２０（例えばイブリツモマブ・チウキセタン、リツキシマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、ＧＡ−１０１）、ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）、ＣＨ２２（例えば、エピラツズマブ）、ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ））（例えば、パニツムマブ、セツキシマブ、ザルツムマブ、ＭＤＸ−２１４）、ＣＤ３０（例えば、ＭＤＸ−０６０）、細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ）、血小板ＧＰIIｂ／IIIａ受容体（例えば、アブシキシマブ）、ＴＮＦアルファ（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ）、インターロイキン−６−受容体（例えば、トシリズマブ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）（例えば、９９ｍＴｃ−ベシレソマブ）、アルファ−４／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ４）（例えば、ナタリズマブ）、アルファ−５／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ５）（例えば、ボロシキシマブ）、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）（例えば、オマリズマブ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、トラスツズマブ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（例えば、１１１ｌｎ−カプロマブ・ペンデチド、ＭＤＸ−０７０）、ＣＤ３３（例えば、ゲマツズマブ・オゾガミシン）、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ＫＢ００２、ＭＴ２０３）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体（例えば、ＣＡＭ−３００１）、ＥｐＣＡＭ（例えば、アデカツムマブ）、ＩＦＮ−ガンマ（例えば、ＮＩ−０５０１）、ＩＦＮ−アルファ（例えば、ＭＥＤＩ−５４５／ＭＤＸ−１１０３）、ＲＡＮＫＬ（例えば、デノスマブ）、肝細胞増殖因子（例えば、ＡＭＧ４７９、Ｒ１５０７）、ＩＬ−４及びＩＬ１３（例えば、ＡＭＧ３１７）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ受容体３（ＢＲ３）（例えば、ＣＢ１）、ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ）、からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体である。
【００５６】
好ましくは、本発明により精製できる当該抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５、ＩＦＮ−ガンマ、ＥｐＣＡＭ、ＴＡＣＩからなる群から選択されるタンパク質に対する抗体である。
【００５７】
最も好ましくは、当該抗体は、抗ＣＤ４抗体（例えば、国際公開第97/13852号参照）、抗ＣＤ−１１ａ抗体（例えば、国際公開第98/23761号参照）、及び抗ＣＤ２５抗体（例えば、国際公開第2004/045512号参照）からなる群から選択される抗体である。
【００５８】
ＴＮＦ、Ｂｌｙｓ、又はインターフェロン−γに対する抗体は、治療的に興味深い抗体のさらなる例である。
【００５９】
Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは本発明の方法を受ける、Ｆｃ含有タンパク質である。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ融合タンパク質」なる用語は、本明細書で「Ｆｃ部分」と呼ばれる免疫グロブリン誘導部分、及び本明細書で「治療部分」と呼ばれる第二の非免疫グロブリンタンパク質由来の部分を含んでなる、タンパク質、特に治療用タンパク質を包含する意味し、疾患の治療を意図するか否かにかかわらない。
【００６１】
治療Ｆｃ融合タンパク質、すなわち、動物の疾患の治療又は予防を意図した、又はヒト治療又は投与に適するＦｃ融合タンパク質は、本発明による精製に特に適する。
【００６２】
任意のＦｃ融合タンパク質は、本発明により精製してもよく、例えば、インターフェロン−β−含有融合タンパク質などがある。好ましくは、本発明の方法は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーの、細胞外ドメインの全て又は一部等のリガンド結合断片を含んでなる、Ｆｃ融合タンパク質を精製するためのものである。Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＰＤＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８結合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、又はＴＮＦ−ベータであるか、又はこれらに由来してもよい。
【００６３】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、例えば膜貫通受容体等の受容体に由来してもよく、好ましくは、受容体の細胞外ドメイン、特に所与の受容体の細胞外部分又はドメインのリガンド結合断片に由来する。治療的に興味深い受容体の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ−アルファ、ＩＬ−１８Ｒ−ベータ）。ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリンアルファ４ １０ベータ７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−ガンマ−Ｉ、II又はIII受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチンがある。
【００６４】
治療部分はＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体由来であることは、非常に好ましい。当該治療部分は、例えば、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）、ＴＮＦＲ２（ｐ７５）、ＯＸ４０、オステオプロテジェリン、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＤＲ３．Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＮＧＦＲ、ＡＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩの細胞外ドメインであるか、これらに由来してもよい。
【００６５】
本発明によれば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー由来である治療部分は、好ましくはＴＮＦＲのメンバーの細胞外ドメインのすべて又は一部を含んでなるか、又は当該物からなり、より好ましくは、ＴＮＦＲのかかるメンバーのリガンド結合断片を含んでなる。以下の表２には、本発明による治療部分が由来してもよい、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、及びそのそれぞれのリガンドを列挙する。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの「リガンド結合断片」は、当業者が容易に決定でき、例えば、単純なものとしては、所与の受容体のタンパク質断片とそれぞれのリガンドとの間の結合を測定するインビトロ（in vitro）アッセイがある。当該アッセイは、例えば、単純なインビトロＲＩＡ−又はＥＬＩＳＡ型サンドイッチアッセイがあり得るが、ここで、タンパク質の１つ、例えば受容体断片が、担体（例えばＥＬＩＳＡプレート）に固定化され、インキュベートされ、その後、当該担体上のタンパク質結合部位を、第二のタンパク質、例えばリガンド等で適切にブロックする。インキュベーション後、リガンド結合を、適切に洗浄後、例えば、シンチレーションカウンターにおいて、リガンドを放射標識し、結合した放射能を決定することにより検出する。リガンドの結合は、標識抗体でも、又は第一リガンド特異的抗体と、当該第一抗体の定常部分に対する第二の標識抗体でも決定できる。すなわち、リガンド結合は、例えば色素反応等の標識使用により、容易に決定できる。
【００６６】
好ましくは、本発明の方法は、表１に挙げたものから選択されるＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに由来する治療部分を含んでなる、Ｆｃ融合タンパク質を精製するためのものである。
【００６７】
表２：ＴＮＦＲスーパーファミリー（Locksley et al., 2001及びBossen et al., 2006による）
【００６８】
【表２】
2011500757.tif 000003
【００６９】
【表３】
2011500757.tif 000004
【００７０】
好ましい実施態様によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメイン、ＴＮＦＲ２、又はそのＴＮＦ結合断片から選択される治療部分を含んでなる。
【００７１】
さらなる好ましい実施態様によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＢｌｙｓもしくはＡＰＲＩＬの少なくとも１つと結合する、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメイン、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、又はその断片から選択される治療部分を含んでなる。
【００７２】
Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬへの結合能を試験するためのアッセイは、例えばHymowitz et al., 2005に記載されている。
【００７３】
さらに好ましい実施態様によれば、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、配列番号１のシステイン豊富な偽性反復を含んでなる。
【００７４】
当該治療部分は、ＴＡＣＩに由来することがさらに好ましい。ＴＡＣＩは、好ましくはヒトＴＡＣＩである。より好ましくは、当該治療部分は、ＴＡＣＩの可溶性部分を含んでなり、好ましくはＴＡＣＩの細胞外ドメイン由来である（ヒト全長ＴＡＣＩ受容体のアミノ酸配列はSwissProt登録０１４８３６に対応する）。本発明により精製される非常に好ましいＦｃ融合タンパク質は、配列番号２を含んでなるか、これからなるか、又は配列番号３のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７５】
これにより、Ｆｃ融合タンパク質が、
（ａ）配列番号２；
（ｂ）高ストリンジェント条件下で、配列番号３の補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）のポリペプチドと、少なくとも80％又は85％又は90％又は95％の相同性を有する、（ａ）の変異タンパク質；
ここで前記ポリペプチドは、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬの少なくとも１つに結合する、
から選択されるポリペプチドを含んでなることが非常に好ましい。
【００７６】
治療用Ｆｃ融合タンパク質、すなわち、動物の疾患の治療又は予防のための、又は好ましくはヒト治療又は投与のためのＦｃ融合タンパク質は、発明により精製され、本発明のフレームにおける使用に特に適する。
【００７７】
最も好ましくは、当該Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＡＣＩ受容体の断片か（例えば、国際公開第02/094852号参照）、又はＩＦＮ−ベータの断片（例えば、国際公開第2005/001025号参照）のいずれかを含んでなる。
【００７８】
本発明によれば、ＩＦＮ−βを含んでなる融合タンパク質は、好ましくは
（ａ）配列番号４；
（ｂ）高ストリンジェント条件下で、配列番号５の補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）のポリペプチドと、少なくとも80％又は85％又は90％又は95％の相同性を有する、（ａ）の変異タンパク質；
から選択されるポリペプチドを含んでなる。
【００７９】
本発明によれば、Ｆｃ含有タンパク質が、遊離のＦｃ部分を、好ましくはＦｃ含有タンパク質の少なくとも5％、2％、1％、0.5％、0.2％又は0.1％、減少、低減、又は除去するために、ブルーセファロースクロマトグラフィに供される。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「遊離のＦｃ部分」、「１つの遊離のＦｃ部分」、又は単に「遊離のＦｃ」なる用語は、完全なさらなるドメインを含まない、免疫グロブリン定常領域由来の、本発明により精製されるＦｃ含有タンパク質の任意の部分を包含することを意味する。すなわち、Ｆｃ含有タンパク質が免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる場合、遊離のＦｃは、可変ドメインの重要な部分を含有しない。Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質である場合、遊離ＦｃはＦｃ融合タンパク質の治療部分の重要な部分を含有しない。遊離Ｆｃは、例えば、ＩｇＧヒンジの二量体、つまり治療部分又は免疫グロブリン可変ドメインの重要な部分に結合しないＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでもよく、例えばパパイン開裂により生じるＦｃ部分等がある。
【００８１】
Ｆｃ部分由来のモノマーは、遊離のＦｃ断片に含まれてもよい。遊離Ｆｃが、治療部分の又はＩｇ可変ドメイン由来の多数のアミノ酸残基、例えば、Ｆｃ部分まだ融合する治療部分又は可変部分に属する、１〜５０個、又は１〜２０個、又は１〜１０個、又は１〜５個のアミノ酸、又は単一のアミノ酸であってもよいと解される。
【００８２】
本発明によれば、青色色素親和性クロマトグラフィは、任意の好適な樹脂で行ってもよく、好ましくは当該樹脂は、シバクロン・ブルーF3G−Aリガンドを含んでなる。好ましくは、当該青色色素親和性クロマトグラフィは、ブルーセファロース樹脂で行われる。ブルーセファロース６ＦＦ樹脂（GE Healthcare）の商品名で購入可能な樹脂は、本方法のステップ（ａ）に特に好適な親和性樹脂の例である。ブルーセファロースＦＦの技術的特徴は以下の通りである。
【００８３】
【表４】
2011500757.tif 000005
【００８４】
他の好適な購入可能な青色色素親和性カラムは、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（GE Healthcare）、ブルートリスアクリルＭ（Blue Trisacryl M）（Pall/BioSepa）、Affi-Gel Blue（Bio- Rad）、エコノ−パック・ブルー・カートリッジ（Econo-Pac blue cartridges）（Bio-Rad）、SwellGel Blue (Pierce)、Toyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience)、又はシバクロン・ブルーF3GA (Polysciences Inc.)から選択される。
【００８５】
本発明の精製方法のステップ（ａ）において、青色色素樹脂にＦｃ含有タンパク質を含んでなる液体をロードする前に、当該液体をｐＨ６未満、好ましくは約５に調整し、必要ならば水で希釈し、ｐＨ約５で約20 mS／cm未満の伝導率とする。これにより、Ｆｃ含有タンパク質を青色色素樹脂に結合させる。
【００８６】
ｐＨ６未満とは、例えば、約6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1又は約2.0があり得る。
【００８７】
本発明の方法のステップ（ｂ）において、遊離のＦｃ部分は、ｐＨ約4.0〜約6.0のバッファにより、青色色素樹脂から洗われる。当該ｐＨは、例えば、約4.0、4.1 、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1 、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9又は約6.0があり得る。
【００８８】
ステップ（ｂ）において、遊離Ｆｃ部分は、任意の好適な塩を使用するブルーセファロース樹脂から洗い出される。塩化カリウム又は塩化ナトリウムから選択される塩が好ましい。ｐＨ５で、塩化カリウムが約0〜約0.5 Mのグラジエント範囲での増加が好ましい。
【００８９】
好ましい実施態様によれば、遊離Ｆｃ部分は、ＫＣｌが約0〜約5 Mの、増加する塩グラジエント範囲で、ステップ（ｂ）におけるブルーセファロース樹脂から溶出される。当該増加する塩グラジエントは、例えばｐＨ５で、ＫＣｌが、約0〜約500、50〜500、100〜500、150〜500 mMであり得る。
【００９０】
さらなる好ましい実施態様によれば、Ｆｃ部分は、ｐＨ５で、200〜300 mMの等張塩濃度範囲で、ブルーセファロースカラムから洗われる。当該等張塩濃度は、ｐＨ５で、ＫＣｌが、例えば200、210、220、230、240、250、260、270、280、290 mMであり得る。ｐＨ５で、ＫＣｌが240 mMが好ましい。
【００９１】
さらに好ましい実施態様によれば、ステップ（ｂ）は、酢酸ナトリウムが約10〜約100、好ましくは15〜90、より好ましくは20〜80 mM含まれるバッファ中で行われる。当該バッファは、酢酸ナトリウムを、例えば、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 mM含んでもよい。
【００９２】
好ましい実施態様によれば、当該ブルーセファロースクロマトグラフィは、１又は複数の追加のステップを有する精製方法、好ましくは、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、又は限外濾過から選択される方法において使用されてもよい。非常に好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、Ｆｃ含有タンパク質の精製スキームの第二ステップとして使用され、ここで、ステップ（ａ）でブルーセファロース樹脂にロードされる溶液は、当該Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体が初めに通される、タンパク質Ａ、又はタンパク質Ｇ、又はタンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィの溶出液である。
【００９３】
本発明によれば、Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる液体は、タンパク質Ａ、又はタンパク質Ｇ、又はタンパク質Ｌ、又はタンパク質Ａ／Ｇ親和性クロマトグラフィに最初に通される。当該液は、好ましくは、細胞培養物質であってもよく、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上清である。
【００９４】
親和性クロマトグラフィのために使用される、タンパク質Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、又はＬは、例えば、組み換えたいであってもよい。その特性を向上させるために、それを改変してもよい（例えば、GE Healthcare から購入可能な、MabSelect SuReと呼ばれる樹脂において）。好ましい実施態様によれば、当該捕捉ステップは、組み換えタンパク質Ａで改変された架橋アガロースを含んでなる樹脂で行う。MabSelect Xtra (GE Healthcare製)の商品名に購入可能なカラムは、本方法のステップ（ａ）に特に適する親和性樹脂の例である。
【００９５】
タンパク質Ａ又はＧ又はＬ親和性クロマトグラフィは、好ましくは捕捉ステップで使用され、特に宿主細胞タンパク質及びＦｃ含有タンパク質凝集体の除去において、Ｆｃ含有タンパク質の精製のために、そしてＦｃ含有タンパク質調製物の濃縮のために提供される。
【００９６】
ステップ（ｃ）におけるＦｃ含有タンパク質の溶出は、ｐＨ範囲約4.0〜約9のバッファにおいて行われる。好ましい実施態様によれば、当該溶出は、酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムから選択されるバッファ中で、そこに塩を添加して行われる。好適なバッファ濃度は、例えば、約25 mM、又は約50 mM、又は約100 mM、又は約150 mM、又は約200 mM、又は約250 mM、又は約250 mMから選択される。ステップ（ｃ）における溶出バッファの塩濃度は、例えば、ＫＣｌが、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 Mがあり得る。
【００９７】
本発明によれば、ステップ（ｃ）のブルーセファロースクロマトグラフィの溶出液は、その後、さらなる精製のために使用される。
【００９８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ステップ（ａ）は、充填されたブルーセファロース樹脂１ミリリットル当たりＦｃ含有タンパク質約20 mgの動的容量で、ブルーセファロース樹脂をロードすることを含んでなる。当該樹脂は、好ましくは、ｐＨ5でロードされる。
【００９９】
さらに、本発明のブルーセファロースクロマトグラフィは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される検出レベル未満まで遊離のＦｃ部分のレベルを低減させる。したがって、本発明の好ましい実施態様によれば、青色色素クロマトグラフィの溶出液は、1 mcgのＦｃ含有タンパク質をロードする場合、遊離のＦｃ部分レベルは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により検出されない。
【０１００】
当該樹脂の容量、使用するカラムの長さ及び直径、並びに動的容量及び流速は、処理される液体の容量、本発明のプロセスに供する液体におけるタンパク質の濃度等の複数のパラメータに依存する。各ステップについてのこれらのパラメータの決定は、当業者の平均的な能力の範囲内である。
【０１０１】
本精製プロセスの好ましい実施態様によれば、１又は複数の限外濾過ステップが行われる。限外濾過は、その前のクロマトグラフのステップから得られた溶出液中の、有機小分子又は塩の除去ため、バルクのバッファにＦｃ含有タンパク質を平衡化するため、又はＦｃ含有タンパク質を所望の濃度に濃縮するために有用である。当該限外濾過は、例えば、分子量が、5、10、15、20、25、30 kDa又はそれ以上の成分を除去する孔サイズの限外濾過膜で行ってもよい。本発明のプロセスにより精製されるタンパク質が、ヒトへの投与を意図するものである場合、当該プロセスに、１又は複数のウイルス除去ステップを含む場合に都合が良い。
【０１０２】
貯蔵又は輸送を容易にするために、例えば、当該物質を、本発明の任意の精製ステップの前及び／又は後に、凍結及び融解させてもよい。本発明によれば、組み換えＦｃ含有タンパク質は、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質が得られる、酵母、虫、又は哺乳類細胞等の真核生物発現系において産生されてもよい。
【０１０３】
本発明によれば、動物等の哺乳類細胞系、又はヒト細胞系において、Ｆｃ含有タンパク質を発現することが最も好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はマウス骨髄腫細胞系列ＮＳＯは、精製されるＦｃ含有タンパク質の例として特に適する細胞系列の例である。Ｆｃ含有タンパク質は、例えば、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞系列、ヒト眼膜芽腫細胞系列ＰＥＲＣ６、又はヒト胚腎臓細胞系列２９３、又は例えば欧州特許第1,230,354号に記載の耐久羊膜細胞系列等、ヒト細胞系列において作製することもできる。
【０１０４】
精製されるＦｃ含有タンパク質が、哺乳類細胞がそれを分泌することにより発現される場合、本発明の精製プロセスの出発物質は、細胞培養上清、いわゆる回収物（harvest）又は粗回収物である。細胞が、動物血清含有培地において培養される場合、当該細胞培養上清は、不純物として血清蛋白質も含有する。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質が発現及び分泌する細胞は、血清未含有条件下で培養される。Ｆｃ含有タンパク質は、化学的に規定される培地で産生されてもよい。この場合、本発明の精製プロセスの出発物質は、おもに不純物として宿主細胞タンパク質を含有する、血清未含有細胞培養上清である。インスリン等の成長因子を当該培養培地に添加する場合、例えば、これらのタンパク質は、精製プロセスの間、同様に除去されることになる。
【０１０５】
細胞培養上清に関連する、可溶性分泌型Ｆｃ含有タンパク質を作製するために、Ｆｃ含有タンパク質の治療部分の天然シグナルペプチドを使用するか、又は好ましくは異種接合型ペプチド、つまり使用される特定の発現系において有効である、別の分泌型タンパク質由来のシグナルペプチド、例えばウシ又はヒト成長ホルモンシグナルペプチド、又は免疫グロブリンシグナルペプチド等を使用する。
【０１０６】
上記の通り、本発明により精製される好ましいＦｃ含有タンパク質は、ヒトＴＡＣＩ（SwissProt登録０１４８３６）由来の治療部分及び、特にその細胞外ドメイン由来の断片（アミノ酸１〜１６５）を有する融合タンパク質である。以下には、ＴＡＣＩの細胞外ドメイン由来の治療部分は、「可溶性ＴＡＣＩ」又は「ｓＴＡＣＩ」と呼ばれる。好ましいＦｃ部分は、以下「ＴＡＣＩ−Ｆｃ」とよぶ、配列番号２のＦｃ融合タンパク質を含んでなる。本明細書で使用される場合、ＴＡＣＩ−Ｆｃなる用語は、ＴＡＣＩ−Ｆｃの変異体も包含する。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「変異タンパク質（mutein）」なる用語は、ｓＴＡＣＩ、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＩＦＮβ−Ｆｃの類似体であって、ｓＴＡＣＩ、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＩＦＮβ−Ｆｃのアミノ酸の１又は複数が、異なるアミノ酸残基で置換されるか、又は削除され、あるいは元のｓＴＡＣＩ、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＩＦＮβ−Ｆｃと比較して、得られる産物の活性を大きく変えることなく、１又は複数のアミノ酸残基がｓＴＡＣＩ、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＩＦＮβ−Ｆｃの元の配列に添加される類似体のことを言う。これらの変異たんぱく質は、既知の合成法により、及び／又は部位特異的変異導入法、又は任意の他の既知の好適な方法により調製する。
【０１０８】
本発明による変異タンパク質には、配列番号２のＴＡＣＩ−Ｆｃ又は配列番号４のＩＦＮβ−ＦｃをコードするＤＮＡ及びＲＮＡと、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸によりコードされるタンパク質がある。ＴＡＣＩ−ＦｃをコードするＤＮＡ配列の例は配列番号３があり、ＩＦＮβ−Ｆｃをコードする例には配列番号５がある。
【０１０９】
「ストリンジェント条件」なる用語は、当業者が従来「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーション及びそれに続く洗浄のことを言う。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992）を参照のこと。限定するものではないが、ストリンジェント条件の例には、例えば、２×ＳＳＣ及び0.5％ＳＤＳで5分、２×ＳＳＣ及び0.1％ＳＤＳで15分；0.1×ＳＳＣ及び0.5％ＳＤＳ、37℃で30〜60分、その後0.1×ＳＳＣ及び0.5％ＳＤＳ、68℃で30〜60分等における研究で、ハイブリッドのＴｍ計算値以下の、12〜20℃の条件で洗浄することが挙げられる。当業者は、ストリンジェンシー条件は、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、10〜40塩基）、又は混合したオリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することも理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubel, supra.を参照されたい。
【０１１０】
相同性は、２以上のポリペプチド配列間、又は２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を、当該配列を比較することにより決定して、反映する。一般的に、相同性は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の、比較される配列の長さにわたる、それぞれある正確なヌクレオチドとヌクレオチド、又はアミノ酸とアミノ酸の一致のことを言う。
【０１１１】
正確な一致が存在しない配列について「相同性％」を決定してもよい。一般的には、比較される２つの配列を、配列間で最も相関するよう配列比較する。これには、１つ又は２つの配列のいずれかにおいて、配置比較の度合いを向上させるため、「ギャップ」を挿入することが含まれる。相同性％は、比較される各々の配列の全長にわたって（いわゆる包括的配列比較（global alignment））決定されてもよく、これは同じ又は非常に類似する長さの配列に特に適するものであり、又はより短く規定された長さにわたって（いわゆる部分的配列比較（local alignment））決定されてもよく、これは長さの等しくない配列により適する。
【０１１２】
２以上の配列の相同性及びホモロジーを比較するための方法は、当業者に周知である。例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージ第9.1版（Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1）(Devereux J et al., 1984）で使用できるプログラム、例えば、プログラムBESTFIT及びGAPは、２つのポリヌクレオチド間の相同性％、及び２つのポリペプチド間の相同性％とホモロジー％を決定するために使用してもよい。BESTFITは、Smith及びWaterman（1981）の「局所ホモロジー」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性が最高である単一領域を見つけ出す。配列間の相同性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムも当業者に既知であり、例えばプログラムのBLASTファミリー（Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, ＮＣＢＩのホームページwww.ncbi.nlm.nih.gov から利用可能である）及びFASTA（Pearson W R, 1990）がある。
【０１１３】
好ましくは任意の当該変異タンパク質は、配列番号２のタンパク質と、実質的に類似するリガンド結合活性を有するような、例えばｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ−Ｆｃの、十分に重複するアミノ酸配列を有する。例えば、ＴＡＣＩのある活性は、そのＢｌｙｓ又はＡＲＰＩＬへの結合能である（Hymowitz et al., 2005）。当該変異タンパク質が相当なＡＰＲＩＬ又はＢｌｙｓ結合活性を有する限り、ＴＡＣＩに実質的に類似する活性を有すると考えられる。すなわち、当業者は、定常実験により、任意の所与の変異タンパク質が、配列番号２のタンパク質と実質的に同じ活性を有するか否かを容易に決定できる。
【０１１４】
好ましい実施態様によれば、任意の当該変異タンパク質は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％の相同性又はホモロジーを有する。
【０１１５】
本発明による変異タンパク質に対する好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ−Ｆｃの保存的アミノ酸置換には、ある群の構成アミノ酸間の置換が分子の生物的機能を保存する、十分に類似する物理化学的特性を有する群内における同義アミノ酸が含まれてもよい（Grantham, 1974）。特に、挿入又は削除が少数のアミノ酸、例えば30個未満、20個未満、又は好ましくは10個未満のみに関連し、機能的コンフォメーションにとって重要なアミノ酸、例えばシステイン残基の除去又は置換をしない場合、アミノ酸の挿入及び削除が、その機能を変更することなく上で規定した配列においてなされてもよいことは明らかである。タンパク質及び当該削除及び／又は挿入により作製された変異タンパク質は、本発明の範囲内である。
【０１１６】
好ましくは、当該保存的アミノ酸群は、表３に規定されるものである。より好ましくは、当該同義アミノ酸群は、表４に規定されるものであり；そして最も好ましくは、当該同義アミノ酸群は、表５に規定されるものである。
【０１１７】
【表５】
2011500757.tif 000006
【０１１８】
【表６】
2011500757.tif 000007
【０１１９】
【表７】
2011500757.tif 000008
【０１２０】
本明細書で使用される「機能的誘導体」は、本発明により精製されるＦｃ−含有タンパク質に及び、これは、当業界で既知の方法により残基の側鎖、又はＮもしくはＣ末端の基として存在する官能基から調製してもよく、そして例えば、医薬的に許容される状態である限り、すなわち、それらが上記の改変Ｆｃ含有タンパク質の活性と実質的に類似するタンパク質の活性を破壊せず、それを含有する組成物に毒性を与えない限り、本発明に含まれる。Ｆｃ含有タンパク質の機能的誘導体は、例えば安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、人体への耐性、又は免疫原性等のタンパク質の特性を向上させるためにポリマーと複合化ができる。この目標に到達するために、Ｆｃ含有タンパク質を、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させてもよい。ＰＥＧ化は、例えば国際公開第92/13095号に記載の、既知の方法により行ってもよい。機能的誘導体は、例えば、カルボキシルキの脂肪酸エステル、アンモニア又は第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボキシルキのアミド、アシル部分（例えば、アルカノイル又はカルボシクリルアロイル基）と共に形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又はアシル部分と共に形成される遊離のヒドロキシル基（例えば、セリル又はスレオニル残基）のＯ−アシル誘導体であってもよい。
【０１２１】
第三の態様によれば、本発明は、本発明による精製プロセスにより精製されるタンパク質に関する。以下では、当該タンパク質を「精製Ｆｃ含有タンパク質」とも呼ぶ。
【０１２２】
当該精製Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは高精製のＦｃ含有タンパク質である。高精製のＦｃ融合タンパク質は、例えば、１レーン当たり2 mcg量でタンパク質をロード後、銀染色した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける単一バンドの存在により決定される。精製Ｆｃ含有タンパク質は、ＨＰＬＣにおいて単一ピークとして溶出するものとして規定されてもよい。
【０１２３】
精製Ｆｃ含有タンパク質は、治療用途、特にヒト患者への投与を意図されてもよい。精製Ｆｃ含有タンパク質が患者に投与される場合、全身的に、好ましくは皮下又は筋肉内、又は局所的に、例えば局在的に投与されることが好ましい。直腸又は髄腔内投与は、精製Ｆｃ含有たんぱく質の特定の医療的使用によって好適であってもよい。
【０１２４】
このために本発明の好ましい実施態様によれば、当該精製Ｆｃ含有タンパク質は、例えば医薬的に許容される担体、賦形剤等と一緒に、医薬組成物として処方してもよい。
【０１２５】
「医薬的に許容される」の定義は、活性成分の生物活性の有効性を干渉することなく、それが投与される宿主に毒性でない、任意の担体を包含することを意味する。例えば、非経口的投与で、（１又は複数の）活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液等の媒体中の、注射用の単位剤型で処方されてもよい。
【０１２６】
本発明による医薬組成物の活性成分は、様々な方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内、経皮（例えば、徐放性処方剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び鼻腔内経路がある。任意の他の治療的有効な投与経路は、例えば、上皮もしくは内皮組織からの吸収に、又は当該活性剤をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（例えば、ベクターを介して）、それがインビボ（in vivo）で発現及び分泌される活性剤をもたらす、遺伝子治療に使用することができる。さらに、本発明の（１又は複数の）タンパク質は、医薬的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤及び媒体等の生物活性剤の他の成分と共に投与することができる。
【０１２７】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与では、（１又は複数の）活性剤を、医薬的に許容される非経口用媒体（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）、及び等張性を維持する添加剤（例えば、マンニトール）又は化学的安定化剤（例えば、保存剤及びバッファ）と一緒に、溶液、懸濁物、エマルション又は凍結乾燥粉末として処方することができる。当該処方剤は、従来技術により滅菌される。
【０１２８】
治療有効量の（１又は複数の）活性タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質のタイプ、Ｆｃ含有タンパク質のそのリガンドに対する親和性、投与経路、患者の臨床的症状等の多くの変数の関数であるはずである。「治療有効量」は、上記で説明し、特に上述の表２で言及したように、投与されると、Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質の治療部分のそのリガンドの阻害をもたらすような量である。
【０１２９】
単回又は複数回で個体に投与される投薬は、Ｆｃ融合タンパク質の薬物動力学特性、投与経路、患者の症状及び特性（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、最近の治療、治療頻度及び所望される影響等の様々な因子に依存して変化するはずである。確率した投薬範囲の調整及び操作は、十分に当業者の能力の範囲内であり、個体における治療部位の天然リガンドの阻害を決定するインビトロ（in vitro）及びインビボ法も範囲内となる。
【０１３０】
精製Ｆｃ含有タンパク質は、体重１kg当たり約0.001〜100 mg、又は体重１kg当たり約0.01〜10 mg、又は体重１kg当たり約0.1〜5 mg、又は体重１kg当たり約1〜3 mg、又は体重１kg当たり約2mgの量で使用してもよい。
【０１３１】
さらなる好ましい実施態様によれば、当該精製Ｆｃ含有タンパク質は、毎日、又は一日おき、又は一週間に３回、又は１週間に１回投与する。
【０１３２】
一日用量は通常、所望の結果を得るために有効な、分割用量又は持続放出形態で投与する。第二のもしくはその後の投与は、当該個体に投与された初回もしくは前の用量と、同じであっても、少なくても、又は多くてもよい用量で行うことができる。第二もしくはその後の投与は、疾患前又は発病の期間に投与することができる。
【０１３３】
本発明はさらに、Ｆｃ含有タンパク質を含んでなる組成物における遊離Ｆｃ部分の濃度の低減のためのブルーセファロース親和性クロマトグラフィの使用に関する。
【０１３４】
好ましい実施態様によれば、遊離Ｆｃの濃度は、当該組成物の総タンパク質濃度のうち、約5％未満、又は約2％未満、又は約1％未満、又は約0.5％未満、又は約0.2％未満、又は約0.1％未満まで低減される。
【０１３５】
ここで本発明を十分に記載したので、等価なパラメータ、濃度及び条件の幅広い範囲内で、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験を要さずに、当業者が同じ発明を行えることが理解されるはずである。
【０１３６】
本発明は、その特定の実施態様との関連で記載されるが、さらなる修正は可能であることが理解されるはずである。本出願は、任意のバリエーション、使用、又は一般的には、本発明の原理への適合、本発明が属する技術分野で既知もしくは習慣的やり方の範囲内にあり、そして以下の添付の請求の範囲において、上記で説明した基本的特徴に応用してもよいような、本発明からの逸脱等に及ぶことが意図される。
【０１３７】
本明細書で引用される全ての参考文献、例えば論文もしくは要約、発行もしくは未発行の米国もしくは他国の特許出願、米国もしくは他国の許可された特許等は、本明細書に参照により全体として組み込まれ、ここに引用文献に示される全てのデータ、表、図、及び文が含まれる。さらに、本明細書で引用される文献内で引用される全ての文脈も、参照により全体として組み込まれる。既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法、又は従来方法の参照は、本発明の任意の態様、記載もしくは実施態様が、関連技術において開示、教示もしくは示唆されると決して認められるものではない。
【０１３８】
特定の実施態様のここまでの記載は、当業者の能力の範囲内の知識（本明細書で引用される文献の内容等）を応用することにより、他者が、過度の実験をすることなく、本発明の一般的概念から逸脱せずに、当該特定の実施態様を多様な応用に、容易に修正及び／又は適合できるという、本発明の一般的性質を十分に開示することになる。したがって、当該適合及び修正は、本明細書に示される教示及び誘導に基づく、開示される実施態様の様々な等価物を意味することを意図する。本明細書の用語もしくは技術用語は、限定するものでははく、本明細書の技術用語もしくは用語が、本明細書に示す教示及び誘導を考慮し、通常の当業者の知識と組み合わせて当業者により解釈されるよう、記載の目的であると解されるべきである。
【実施例】
【０１３９】
実施例全体で頻繁に使用される略号のリスト
【０１４０】
【表８】
2011500757.tif 000009
【０１４１】
実施例１：ブルーセファロースクロマトグラフィ（グラジエント溶出）を介するＴＡＣＩ−Ｆｃの精製
Ｆｃ含有タンパク質の開裂から得られる遊離のＦｃ断片の除去のために、ブルーセファロースクロマトグラフィを開発した。
血清未含有条件下で培養したＣＨＯ細胞クローンを発現するＴＡＣＩ−Ｆｃ（Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体、各サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に対応する）の遠心分離回収物を、捕捉ステップとして、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィに通した。タンパク質Ａでの捕捉ステップからの溶出液を、ブルーセファロースクロマトグラフィのための出発物質として使用した。
【０１４２】
全ての操作は室温で行い、流速は175 cm／時間で一定に維持した。全ての時間で、280 nmでのＵＶシグナルを記録した。
【０１４３】
カラム
ブルーセファロース６ＦＦ樹脂（GE Healthcare）を、121 ml容量、内径3.2 cm、総高さ（bed height）15 cmのカラムに充填した。
【０１４４】
平衡化
前記カラムを25 mMの酢酸ナトリウムｐＨ5.0を５ＢＶ用いて平衡化した。
【０１４５】
ロード
前記カラムに、充填樹脂の1ml当たり約20 mgのＴＡＣＩ−Ｆｃの容量で、タンパク質Ａ捕捉カラム溶出液を、ｐＨ５でロードした。
【０１４６】
洗浄１
前記カラムを、25 mMの酢酸ナトリウムｐＨ5.0を少なくとも３ＢＶ用いて、安定なベースラインに到達するまで洗浄した。
【０１４７】
溶出
グラジエント溶出を、25 mMの酢酸ナトリウムｐＨ5.0中の0〜3 Mの塩化カリウムを20ＢＶ用いて達成した。
【０１４８】
再生及び衛生化
前記カラムを、逆流モードにおいて、0.5 MのＮａＯＨを５ＢＶ用いて衛生化し、その後平衡化バッファを５ＢＶ用いて洗浄し、その後20％エタノールの３ＢＶ中で保存する。
【０１４９】
異なるフラクションを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタン免疫ブロッティング、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分光法、及びＮ末端配列解析に供した。
【０１５０】
結果
図１のクロマトグラフプロファイルで示す通り、ブルーセファロースはグラジエント溶出の間に分離ピークに分けた。分離ピークであるピーク１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ＭＡＬＤＩ−ＭＡ及びＮ末端配列解析により、分子量約55 kDの遊離のＦｃと同定された。この断片は、ヒンジ領域の接合部のちょうど前の、ＴＡＣＩドメインのアミノ酸、80位のアルギニン及び81位のセリンとの間での分子の開裂によりもたらされる。第二の溶出ピークであるピーク２は、精製ＴＡＣＩ−Ｆｃを表す。
【０１５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
図２Ａの非還元条件下での銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示すように、そのロードに相当するレーン３に、未処理のＴＡＣＩ−Ｆｃの主要なバンドと、遊離Ｆｃに想到するより低分子量の少ないバンドが見えた。レーン４では、ピーク１に対応する、そのより低分子量のバンド（遊離Ｆｃ）のみが見えたが、レーン５（ピーク２）では、遊離Ｆｃの混入のない、純粋なＴＡＣＩ−Ｆｃに相当するバンドが見えた。還元条件下（図２Ｂ）では、ハイブリッドＴＡＣＩ−Ｆｃ／Ｆｃ体に相当する微量のＦｃ断片が、ピーク２（レーン５）に検出された。
【０１５２】
ウェスタン免疫ブロッティング解析
抗ＴＡＣＩ免疫検出では、非還元条件（図３Ａ、レーン２〜５）及び還元条件（図３Ａ、レーン９〜１２）下で、ピーク１（レーン４及び１１）にＴＡＣＩドメインは検出されなかった。
抗Ｆｃ免疫検出では、非還元条件（図３Ｂ、レーン２〜５）及び還元条件（図３Ｂ、レーン９〜１２）下で、Ｆｃドメインが以下の通りに検出された。
ピーク１（レーン４及び１１）において、低分子量（55 kDa）のバンドは、遊離Ｆｃに対応する。
ロード（レーン３及び１０）において、高分子量及び低分子量の２つのバンドは、それぞれ未処理のＴＡＣＩ−Ｆｃと遊離Ｆｃに対応する。
ピーク２（レーン５及び１２）において、高分子量（73 kDa）のバンドは、ＴＡＣＩ−Ｆｃに対応する。
レーン６〜８、及び１３〜１５は、詳細は定められていない異なる条件下で、洗浄から得られるフラクションを表す。
【０１５３】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析
図４のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルに示すように、遊離Ｆｃは、ロード（図４Ａ）及びピーク１フラクション（図４Ｂ）では約55 kDaのピークとして確認された（ピークａ）が、ピーク２フラクション（図４Ｃ）では確認されなかった。未処理のＴＡＣＩ−Ｆｃは、ロード（図４Ａ）及びピーク２（図４Ｃ）フラクションにおいて、約74 kDaのピーク（ピークｂ）として確認された。ハイブリッドＴＡＣＩ−Ｆｃ／Ｆｃは、ロード（図４Ａ）及びピーク２（図４Ｃ）フラクションにおいて、約64.5 kDaのピークとして確認された。
【０１５４】
Ｎ末端配列解析
ピーク１において、Ｓｅｒ８１から出発する配列のみが、遊離Ｆｃ相当物として検出された。
【０１５５】
結論
ブルーセファロースからのＴＡＣＩ−Ｆｃ溶出液は、純粋な遊離Ｆｃであることがわかった。ブルーセファロースカラムを、25 mM酢酸ナトリウム（ｐＨ5.0）中の0〜3 Mの塩化カリウムでグラジエント溶出することにより、遊離Ｆｃフラクション（ピーク１）及び精製ＴＡＣＩ−Ｆｃフラクション（ピーク２）を表す２つのピークが確実に分離される。ブルーセファロースステップからのＴＡＣＩ−Ｆｃ回復は90％超であった。
【０１５６】
0〜3 MのＫＣｌにおけるグラジエント溶出は、25 mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5及び5.5）中でも行い、遊離Ｆｃのピークが完全に分離した。
【０１５７】
実施例２：ブルーセファロースクロマトグラフィ（段階的溶出）−ＴＡＣＩ−Ｆｃ
実施例１に記載したものと同じプロトコールで、グラジエント溶出ステップを段階的溶出（「洗浄２」及び「溶出」ステップ）に置き換えた点のみ変更したプロトコールを実行した。
【０１５８】
カラム
ブルーセファロース６ＦＦ樹脂（GE Healthcare）を、121 ml容量、内径3.2 cm、総高さ（bed height）15 cmのカラムに充填した。
【０１５９】
平衡化
前記カラムを25 mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ5.0）を５ＢＶ用いて平衡化した。
【０１６０】
ロード
前記カラムに、充填樹脂の1ml当たり約20 mgのＴＡＣＩ−Ｆｃの容量で、タンパク質Ａ捕捉カラム溶出液（ｐＨ５）をロードした。
【０１６１】
洗浄１
前記カラムを、25 mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ5.0）を少なくとも３ＢＶ用いて、安定なベースラインに到達するまで洗浄した。
【０１６２】
洗浄２
前記カラムを、25 mMの酢酸ナトリウム＋240 mMの塩化カリウム（ｐＨ5.0）を５ＢＶ用いて洗浄した。
【０１６３】
溶出
ＴＡＣＩ−Ｆｃの溶出を、25 mMの酢酸ナトリウム＋2 Mの塩化カリウム（ｐＨ5.0）を10ＢＶ用いて達成した。
【０１６４】
再生及び衛生化
前記カラムを、0.5 MのＮａＯＨ、５ＢＶを逆流で衛生化し、その後平衡化バッファ５ＢＶで洗浄し、20％エタノール３ＢＶ中で保存した。
【０１６５】
結果
この結果は、実施例１で得られたものと同じであった。得られた遊離Ｆｃフラクションを、25 mMの酢酸ナトリウム、240 mMの塩化カリウム（ｐＨ5.0中）の段階的溶出により除去し、一方未処理ＴＡＣＩ−Ｆｃ分子を、25 mMの酢酸ナトリウム、及び2 Mの塩化カリウム（ｐＨ5.0）で溶出した。
【０１６６】
実施例３：ブルーセファロースクロマトグラフィ−ＩＦＮ−ベータ−Ｆｃ
血清未含有条件下で培養される、ＣＨＯ細胞クローン発現ＩＦＮ−β−Ｆｃの浄化（clarified）回収物を、捕捉ステップとしてタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィに供した。ＩＦＮ−β−Ｆｃは、インターフェロン−ベータタンパク質及びＦｃドメインの融合により作製されるＦｃ融合タンパク質である。免疫グロブリンのＦｃ断片又は領域ともよばれる、Ｆｃドメインは、ヒンジ領域（Ｈ）及び抗体の重鎖の第二（ＣＨ２）及び第三（ＣＨ３）ドメインを含んでなる２つの同じアーム（arm）からなる。ＩＦＮ−β−Ｆｃは２つのサブユニットを含有し、第一のサブユニットは、単一のＩＦＮ−βタンパク質（配列番号４）と結合した変異ＩｇＧ Ｆｃアームを含んでなり、第二のサブユニットは、変異ＩｇＧ Ｆｃアーム（配列番号４のアミノ酸167〜393）を含んでなる。タンパク質Ａの捕捉ステップからの溶出液は、最初に濾過し、そしてブルーセファロースクロマトグラフィの出発物質としてさらに使用し、この場合以下のステップに従って行う。
【０１６７】
【表９】
2011500757.tif 000010
【０１６８】
前記ブルーセファロース樹脂（充填樹脂当たり、2.5 g/LのＩＦＮ−Ｆｃの動的容量で）へタンパク質Ａ溶出液をロード後、塩化カリウム濃度を上昇させながら、ｐＨ5の、50 mMの酢酸ナトリウムバッファで洗浄を行った。1 Mの水酸化アンモニウムｐＨ12で溶出を行った。
【０１６９】
全ての操作は室温で行われ、流速は150 cm/時間の一定値に保った。全ての時間で280 nmでのＯＤシグナルを記録した。
【０１７０】
結果
図５のクロマトグラフプロファイルで示すように、カラムを50 mMの酢酸ナトリウム及び0〜500 mMの塩化カリウム（ｐＨ５）のグラジエントを２２ＢＶ用いて洗浄すると、洗浄ステップ２で溶出するピークは遊離Ｆｃと同定された。シバクロン・ブルーリガンドに対し非常に高い親和性を有するインターフェロンドメインである、精製ＩＦＮ−Ｆｃを、1 Mの水酸化アンモニウム、ｐＨ１２を用いて、ブルーセファロースカラムから溶出させた。
【０１７１】
全体的結論
遊離Ｆｃの除去は、グラジエント（0〜3 MのＫＣｌ、ｐＨ５）によるか、又はブルーセファロースカラムのｐＨ4.5、ｐＨ5.5又はｐＨ5.5での段階的溶出のいずれかにより達成することができる。当該段階的溶出は、遊離Ｆｃ除去に適する条件下でのカラムの洗浄、すなわち、25 mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ5.0）中、240〜300 mMのＫＣｌでカラムポストロードを洗浄すること、そして未処理のＴＡＣＩ−Ｆｃ回復に影響を及ぼさない最適な遊離Ｆｃ除去をもたらす別の条件設定を用いるＴＡＣＩ−Ｆｃを溶出すること、を含んでなる、２段階の方法で、ＴＡＣＩ−Ｆｃのために最適化された。ＩＦＮ−β−Ｆｃについては、当該遊離Ｆｃ断片を、50 mMの酢酸ナトリウム、及び0〜500 mMの塩化カリウムのグラジエント（ｐＨ５）による、洗浄ステップにおいて除去し、その後ＩＦＮβ−Ｆｃを、1 M水酸化アンモニウム（ｐＨ１２）で溶出した。
【０１７２】
したがって、試験するＦｃ融合タンパク質、ＴＡＣＩ−Ｆｃ及びＩＦＮ−β−Ｆｃの両方については、当該遊離Ｆｃ断片を、ブルーセファロースカラムから同じ条件で、すなわちｐＨ4.5〜5.5で溶出又は洗浄した。
【０１７３】
【表１０】
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【０１７４】
【表１１】
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【０１７５】
【表１２】
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【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに共通するシステイン・フィンガープリント配列である。
配列番号２は、ＴＡＣＩの細胞外部分及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分由来の配列を含んでなる、本発明のＦｃ−融合タンパク質のことを言う（例えば、国際公開第02/094852号に記載がある）。
配列番号３は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号４は、ＩＦＮβ−Ｆｃアミノ酸配列のことを言う。アミノ酸１〜１６６は、成熟ヒトインターフェロンベータを表し、アミノ酸１６７〜３９３は、成熟ヒト免疫グロブリン重鎖配列の部分を表す。
配列番号５は、配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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