(57)【要約】全身的な健康状態を評価するための方法、および治療剤の有効性を評価するための方法が開示される。これら方法は、血液サンプルもしくは他の体液に対して行われ得、内皮細胞の細胞死をもたらす工程、上記死細胞を染色する工程、およびそれらを顕微鏡観察する工程を包含する。さらに、本発明は、血中でエタノールおよび／もしくはＤＭＳＯの非毒性レベルを維持しながら、抗脈管形成剤を投与することによる、新生物疾患もしくは望ましくない脈管形成によって特徴付けられる他の状態のための組み合わせ処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物被験体における循環内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）試験されるべき被験体から得られた体液と、抗血管新生薬剤とを接触させる工程；
（ｂ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｃ）生じた細胞を顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｄ）その培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記体液は、血液もしくは血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療剤の有効性を評価するための方法であって、該方法は、前記薬剤で処置した試験被験体における循環内皮細胞のレベルと、以下のいずれか：
（ｉ）該薬剤で処置する前の該被験体における循環内皮細胞のレベル；もしくは
（ｉｉ）該薬剤で処置していないコントロール被験体における循環内皮細胞のレベル；
とを比較する工程を包含し、
それによって、節（ｉ）もしくは（ｉｉ）の被験体と比較して、該試験被験体における循環内皮細胞の低下したレベルは、該薬剤の有効性を示し、そしてここで該評価は、請求項１に記載の方法によって行われる、
方法。
【請求項８】
組織サンプル中の内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）該サンプルを脱凝集して、該サンプル中に含まれる任意の内皮細胞を遊離させる工程、
（ｂ）必要な場合、該遊離させた細胞を、抗血管新生薬剤で処理する工程；
（ｃ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｄ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｅ）その培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記抗血管新生薬剤は、ベバシズマブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
微小凝集物中の細胞の生存性に対する処理の効果を決定するための方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも生きた内皮細胞および本来取り囲んでいる生きた非内皮細胞から構成される組織サンプルと、該処理とを接触させる工程、
（ｂ）必要であれば、いかなるさらなる内皮細胞死ももたらすことなく、該微小凝集物を遊離の任意の内皮細胞へと脱凝集する工程、
（ｃ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；
（ｄ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、および
（ｅ）該培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験体における所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置するための方法であって、該方法は、該処置の必要な被験体に、抗脈管形成剤を、毒性水準未満（ｓｕｂ−ｔｏｘｉｃ）を維持する血中レベルのエタノールおよび／もしくはＤＭＳＯと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
前記抗脈管形成剤は、内皮細胞死をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脈管形成剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗脈管形成剤は、ベバシズマブである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、全身的な健康状態（wellbeing）について被験体の評価的スクリーニングにおいて有用な診断試験に関する。より具体的には、本発明は、循環内皮細胞についての、および一般に、内皮細胞の検出のための安価かつ簡便なアッセイに関する。さらに、本発明は、所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態（新生物状態を含む）の処置のための改善されたプロトコルに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
循環する微小血管（内皮）細胞が種々の疾患状態（例えば、心疾患、心血管疾患および糖尿病）についての重要なマーカーであることは、一般に認識されている（非特許文献１）。しかし、このような細胞を循環系において検出することは、他の細胞（例えば、血小板）の介入が原因で問題となる。タイプ、もしくは抗体標識（例えば、ＣＤ３１に対して指向される抗体の使用）による細胞の分離を伴う方法は、時間の掛かる工程を要し、しばしば、高価な装置を要する。
【０００３】
ＰＣＴ出願ＵＳ  ２００６／０４７９５４（特許文献１として公開され、本明細書に参考として援用される。これは、本明細書中の出願人の研究を記載する）は、上記サンプル中の新生物細胞とは対照的に、ＣＤ３１での標識を介して、もしくは経験した観察を介して、内皮細胞を最初に同定することによって、腫瘍生検の微小凝集物の抗新生物療法において使用される薬物の効果を評価するための方法を開示する。上記サンプルは、候補薬物に供した後に、死細胞によって取り込まれるが、生細胞によって排除される色素で染色され、次いで、生細胞によって受容される色素で対比染色される。上記サンプルが、選択された特定の色素組み合わせ（生細胞によって排除される青色／緑色色素）について顕微鏡下で観察される場合、対比染色で染色された生細胞のバックグラウンドのピンク色の「パンケーキ」中の「ブルーベリー」として死細胞が示される。従って、どの細胞が癌細胞であるか、およびどの細胞が内皮細胞であるかの知識によって、所定の薬物が上記癌細胞、内皮細胞もしくはそれらの両方に影響を及ぼすか否かを決定することが可能である。一般に、脈管形成を阻害することが公知の薬物（例えば、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ））が、このアッセイにおいて死滅を露見させる内皮細胞を生じる一方で、上記腫瘍細胞は影響を受けないままであることが示される。直接的な抗新生物薬物は、内皮細胞ではなく、腫瘍細胞自体の死滅を生じる。
【０００４】
ここで内皮細胞は、生存しないようにされる場合、生細胞によって排除される色素を吸収するのみならず、異なる外観を有する（このことは、内皮細胞を他の死細胞の存在下ですら認識可能にする）ことが見いだされた。従って、上記サンプルを、内皮細胞を死滅させることが公知の薬剤に供し、経験を積んでいない目にすら顕微鏡下で死滅した内皮細胞を直ぐに認識可能にする適切な色素で染色することによって、内皮細胞の存在について、不均質サンプル（例えば、血漿）、または特許文献１に記載される上記微小凝集物の脱凝集した（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）形態もしくは抽出物を評価することは実践的になる。このことは、循環内皮細胞について迅速かつ効率的な試験を可能にする。ここでこのような細胞の上昇したレベルは、上記被験体における外傷状態を示す。
【０００５】
驚くべきことに、非毒性溶媒であるＤＭＳＯおよびエタノールが、それ自体、抗血管新生効果を有し、細胞培養物中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを低下させ得ることもまた、見いだされた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７５４４０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｓ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００６）４８：１５３８〜１５４７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
一局面において、本発明は、ヒトもしくは他の脊椎動物被験体における循環内皮細胞を検出および定量するための方法に関し、上記方法は、体液のサンプルを、内皮細胞に対して毒性である薬剤に供し、続いて、上記サンプルを、生細胞によって排除されるが、非生細胞によって取り込まれる色素で処理する工程、および上記サンプルを、顕微鏡下で検鏡して、上記サンプル中の容易に同定可能な内皮細胞を検出し、望ましい場合、これを計数する工程を包含する。上記被験体の循環系における内皮細胞の数の増大は、種々の状態（例えば、糖尿病、心血管問題など）、ならびに外傷（例えば、筋挫傷（muscular strain）および挫傷）の指標である。
【０００９】
従って、この局面において、本発明は、脊椎動物被験体における循環内皮細胞を検出および必要に応じて定量するための方法に関し、上記方法は、
（ａ）試験されるべき被験体から得られた体液と、内皮細胞に対して細胞傷害性である薬剤とを接触させる工程；
（ｂ）上記細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；
（ｃ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、および
（ｄ）上記培養物中の上記内皮細胞を、上記内皮細胞の小さなサイズ、角のある外見および強い色によって同定する工程、
を包含する。
【００１０】
使用できる体液としては、血液、血漿およびリンパが挙げられる。
【００１１】
望ましい場合、内皮細胞の数が計数され得、上記循環系における内皮細胞の濃度が計算され得る。上記方法はまた、生細胞によって取り込まれる染料で対比染色する工程を包含し得る。
【００１２】
上記方法は、上記試験される被験体における循環中の内皮細胞の数に対する上記被験体に投与される薬剤の効果を評価することによって、治療剤の有効性を評価するために使用され得る。動物モデルは、本発明のこの局面において特に有用であるが、ヒトもしくは獣医学的な患者における処置の有効性も、同様に評価され得る。
【００１３】
本明細書で記載されるように処理される場合、上記内皮細胞の特徴的な性質が原因で、本発明の方法は、上記引用のＰＣＴ公報に記載される必要とされる微小凝集物を脱凝集し、上記脱凝集された形態もしくは抽出された形態を、このような細胞の量もしくは存在について評価することによって、腫瘍中の内皮細胞を評価するために使用され得ることもまた、見いだされた。
【００１４】
さらに、本発明のアッセイ方法は、驚くべきことに、上記非毒性物質ＤＭＳＯおよびエタノールが、抗脈管形成薬物の効果を強化し得ることを明らかにした。なぜなら、それら自体がこの効果を示し得るからである。従って、別の局面において、本発明は、所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置するための改善された方法に関し、上記方法は、このような処置を必要とする被験体に、抗血管新生薬剤を、非毒性であるが、上記主要薬物の抗血管新生効果を高めるに十分である、エタノールおよび／もしくはＤＭＳＯの血中レベルを維持しながら投与する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＣＤ３１染色と比較して、本発明の方法に従って、内皮細胞を選択的に染色する効果を示す。図１Ａは、ファストグリーンで懸濁培養物を染色し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色し、次いで、抗ＣＤ３１で対比染色した結果を示す。図１Ｂは、ファストグリーン／Ｈ＆Ｅでのみ染色した細胞を示す。図１Ｃは、ベバシズマブで処理し、次いで、上記ファストグリーン／Ｈ＆Ｅで染色した培養細胞を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｈは、ベバシズマブと比較して、種々のキナーゼインヒビター薬物が抗血管新生効果を発揮する能力を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｈは、ベバシズマブと、キナーゼ阻害薬との組み合わせが内皮細胞死滅をもたらす能力を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、末梢血球を含むサンプルに対して決定される場合、内皮細胞死滅に対するイマチニブおよびベバシズマブの組み合わせ効果を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、サンプル中の内皮細胞を定量するために使用される画像を示す。
【図６】図６は、内皮細胞および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞に対する種々の薬物の効果を示すグラフである。
【図７】図７は、エタノールおよびＤＭＳＯの抗血管新生細胞効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明を実施する態様）
本発明は、被験体の全身の健康状態（general physical condition）を評価し、そして例えば、スポーツ傷害もしくは過活動の外傷の影響の存在を評価するために有用な診断ツールを提供する。
【００１７】
正常な被験体の全身の慣用的健康診断の状況において、循環内皮細胞の正常レベルの所見は、内皮細胞の数の多さと、糖尿病および心血管問題のような状態との既知の関連に鑑みると、さらなる試験から上記被験体を斟酌し得る。このような状態を検出するように設計された試験は、厳密にいうと、正常な内皮細胞数にも拘わらず、必須ではない。
【００１８】
他方で、異常に高い循環内皮細胞の所見は、さらなる評価の必要性を示す。少量の血液サンプルに基づく簡単な試験の利用可能性は、個体を勇気づけて、彼らの全体の健康状態を評価することにおいて魅力的であり得、このような試験は、一人の医師の診療所においてのみならず、実地看護師（ｎｕｒｓｅ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）もしくはドラッグ・ストアなどにおける他の医療補助専門家によって今や提供される便利な立地においても行われ得る。
【００１９】
本発明の方法は、単純な装置および評価する職員の最小限の訓練のみを必要とする。このことは、生細胞から排除される色素を取り込み得る死滅した内皮細胞が、特徴的な外見を有するので、確かである。上記内皮細胞は、非常に濃く染色され、角があり、夾雑している細胞より小さい。上記内皮細胞は、リンパ球サイズの約１／３である。
【００２０】
上記細胞の直接的な観察および肉眼によるスコア付けは有効である一方で、上記方法は、機器による定量にも役に立つ。以下に例示されるのは、上記アッセイの結果を定量するためのＩｍａｇｅＪソフトウェアの使用である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「抗血管新生薬剤」もしくは「抗脈管形成剤」、「抗新生脈管構造」もしくは「抗微小血管薬剤」もしくは「内皮細胞に対して細胞傷害性の薬剤」は、内皮細胞を死滅させ得、従って、血管新生を低下させ得る薬剤を示すために交換可能に使用される。これら薬剤は、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦレセプターと、もしくは脈管形成を促進するために必須の他の因子と相互作用し得る。
【００２２】
一般に、このような薬剤は、所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置することにおいて有用である。これらとしては、癌、黄斑変性および良性肥大のような他の状態が挙げられる。
【００２３】
本発明のアッセイにおいて、血液サンプルは、必要に応じて、遠心分離、重力沈降、示差的細胞溶解もしくは赤血球を除去するための他の技術（しかし、厳密にいえば、これは、不要である）に供され、得られた血漿は、内皮細胞に対して細胞傷害性であることが公知の薬剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して指向される抗体もしくは他の抗血管新生薬剤）で処理される。簡便な選択は、市販されているアバスチン（登録商標）である。
【００２４】
上記抗脈管形成剤での処理後、上記サンプルは、非生細胞に対して特異的な、適切な色素（例えば、ファストグリーン）で処理される。本発明の方法は、これら特定の色素に限定されない。これら特徴を有する任意の色素が、使用され得る。
【００２５】
次いで、上記細胞は、顕微鏡スライドへと遠心分離により落とされ、評価される。
【００２６】
望ましい場合、上記顕微鏡スライド上の細胞は、例えば、ライト−ギムザ、Ｈ＆Ｅもしくは他の適切な染色で対比染色され得る。これら特定の色素を使用することは必須ではないが、それらは、簡便な実施形態である。
【００２７】
前述のプロセスは、体液に対して適用可能であるだけでなく、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００７／０７５４４０に記載されるように、腫瘍から得られた微小凝集物サンプルの抽出物もしくは脱凝集された形態にも適用可能である。上記微小凝集物の新生脈管構造は、上記微小凝集物の三次元構造を保持するための足場を提供するようであり、従って、１つの脱凝集する方法は、抗脈管形成剤（例えば、ベバシズマブ）での処理である。上記足場が破壊される場合、遊離した内皮細胞は、培養培地へと放出される。前述の方法は、その後放出された上記細胞の存在および／もしくは量を評価するために適用され得る。
【００２８】
この方法はまた、試験されるべき処理で組織サンプル（例えば、上記ＰＣＴ公報の微小凝集物）を処理し、上記組織サンプルを脱凝集するかもしくはそこから上記細胞を抽出し、上記内皮細胞集団に対する処理の効果を評価することによって、上記内皮細胞集団に対して意図された療法の効果を評価するために使用され得る。この場合、上記抽出物もしくは脱凝集物（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）は、それ自体、上記内皮細胞を死滅させるべきではない。上記死滅内皮細胞は、検出され得、所望される場合、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で上記死滅内皮細胞を処理し、得られた細胞を、顕微鏡下で観察することによって、上記のように計数され得る。上記死滅内皮細胞は、それらの小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色（ｉｎｔｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ  ｃｏｌｏｒ）によって認識される。
【００２９】
エタノールおよびＤＭＳＯの両方が、抗脈管形成効果を発揮し得かつ内皮細胞に対して細胞傷害性であることもまた、見いだされた。エタノールおよびＤＭＳＯは、抗脈管形成剤である主要薬物と組み合わせて使用され得る。なぜなら、それらは、少量で使用される場合、非毒性であるからである。従って、１種以上の抗脈管形成薬物での一次療法に加えて、被験体は、血中のアルコールもしくはＤＭＳＯの非毒性レベルを維持するように処置され得る。ＤＭＳＯは、例えば、ＩＶ注射によって投与される一方で、血中アルコールレベルは、従来のアルコール含有飲料の形態でアルコールを経口投与することによって便宜的に維持され得る。ブレサライザー試験は、適切なアルコールレベルを処置の間に維持することを確実にするために使用され得る。以下の実施例６に示されるように、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの患者を、抗血管新生薬剤および赤ワインの組み合わせで首尾よく処置した。さらに、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇからの不確かな証拠が存在する。ここで１．５ｌのワインを毎日消費する乳癌患者は、抗血管新生薬剤トラスツズマブでの治療に対して５年＋寛解を示した。このことは、Ｅｉｃｈｂａｕｍ，Ｍ．Ｈ．Ｒ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ（２００５）１６：１９９−２００によって報告されている。上記患者が慢性アルコール中毒であり、制御されたプロトコルを施されない場合、このことは、本発明の組み合わせ治療を表さないことに注意すべきである。
【００３０】
（調製Ａ）
生検から得られた細胞培養法を使用して、実験手順を行った以下の実施例において、これらを以下のように調製した。上記調製は、本質的に上記のＰＣＴ公報ＷＯ  ２００７／０７５４４０に示されるとおりである。
【００３１】
新鮮な生検もしくは流体吸引物を、癌もしくは他の病気を有する患者から、または正常なドナーから得る。
【００３２】
標本を、代表的には、本発明の方法の実施のために、処置を受けさせる病院の解剖病理学実験室を介して、またはある場合には、手術室もしくは外科医／内科医の診療所から直接提出する。固形腫瘍標本（固定剤に曝されてもおらず、凍結もされていない）を、冷却輸送培地（ＣＯ２非依存培地（ＣＯ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ／ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ（ペニシリン／ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、インスリン／セレン／トランスフェリン、および１０％  低エンドトキシン、熱非働化ウシ胎仔血清を補充））中に置く。次いで、標本を、頑丈なＳｔｙｒｏｆｏａｍ（登録商標）輸送ボックス（−２０℃まで凍結した「ブルーアイス（ｂｌｕｅ  ｉｃｅ）」の３５０ｇのブロックを含む）の中に置く。次いで、これらを、翌日午前中配達サービス（ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｅｒｖｉｃｅ）もしくは地元宅配業者（ｌｏｃａｌ  ｌａｎｄ  ｃｏｕｒｉｅｒ）のいずれかによって輸送する。流体標本を、十分に混合して、細胞クラスタを懸濁し、次いで、滅菌した５００ｍｌ  ポリプロピレン輸送ボトルに注ぐ。１０〜１５ユニットのヘパリン硫酸を、提出した流体１ｍｌあたりに添加する。
【００３３】
上記処置を受けさせる病院からの公式組織病理報告のコピーを、受領すべきである。
【００３４】
固形腫瘍を、１ｍｍより小さな小片（標準的使い捨て１０ｍｌピペットへ吸引するのに十分小さい）へと高品質の湾曲した外科用ハサミで細かく切り刻む。上記腫瘍が移され得る培地を、組織のみじん切りの上清とともに確保しておく。ハサミで細かく切り刻んだ腫瘍小片を、抗生物質および１０％  ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅで消化する。標本を、５０ｍｌ  使い捨てポリプロピレン遠心分離管中で消化し、攪拌プレート上で、プラスチックで被覆した磁性式撹拌子で穏やかに攪拌することによって補助する。標本を、完全な大まかな消化が起こるまで、このように攪拌する−代表的には、１〜３ｇの標本に対して約２〜３時間。次いで、サイトスピンスライド（cytospin slide）を、全ての細胞画分（輸送培地、組織のみじん切りからの上清、および酵素消化物）から調製し、先に記載されるように（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌら，「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｙｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒｓ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８３）４３：７４９-７５７）ファストグリーン−Ｈ＆Ｅで染色する。
【００３５】
流体標本を、上記標本中の全ての細胞を集めるために、その全体を遠心分離にかける。次いで、細胞を、上記ＲＰＭＩ−１６４０ベースの培地中で再懸濁し、サイトスピンを、上記のように調製する。
【００３６】
その結果を正規化するために、アッセイの始めに、処置に曝されない上記細胞の条件を示す「０日目」スライドを調製し、陰性コントロール（曝されない細胞）の「最終培養物（ｅｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」スライドもまた調製する。
【００３７】
内皮細胞についてアッセイするために、例えば、１０％（容積／容積）、または例えば、１％（容積／容積）もしくは中間のパーセンテージの抗血管新生薬物含有溶液もしくはビヒクルコントロール（最も代表的には、０．９％  ＮａＣｌ）と混合する。培養のためにプレートされる細胞懸濁物／薬物溶液（もしくはビヒクル）の最終容積は、０．１２ｍｌであり得る。培養を、加湿した３７℃インキュベーター中で、標準化された期間にわたってポリプロピレンの丸底９６ウェル培養ディッシュ中で行う。
【００３８】
ストック溶液を、一般に、所望の濃度の１０倍〜１００倍で調製し、単回使用０．５ｍｌコニカルポリプロピレンチューブへとアリコートに分け、使用するまで−７０℃において凍結する。いくつかの薬物は、製造業者の推奨に従って、冷蔵庫温度で維持する。
【００３９】
細胞を、各薬物の指示濃度と、および望ましい場合には、指示濃度の希釈物と培養する。ここで上記指示濃度は、練習セットのアッセイもしくは文献から決定する。陰性コントロールは、一般に、０．９％  ＮａＣｌ、および／もしくはビヒクル（ここには抗血管新生薬物が溶解されている）からなる。複製の９６ウェルプレートを試験する。
【００４０】
さらに、腫瘍細胞単離の詳細、細胞培養条件、スライド調製および染色は、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ．ｏｒｇ．のウェブサイトに記載される。
【００４１】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定するために提供されるのではない。
【実施例】
【００４２】
（実施例１  内皮細胞の検出）
調製Ａに示される手順を使用して、膵臓類癌腫を、２．５ｍｇ／ｍｌ  ベバシズマブの存在下および非存在下での懸濁培養において、９６時間後に可視化した。上記培養物を、上記ファストグリーン／Ｈ＆Ｅ染色／対比染色で染色した。図１Ｂは、ベバシズマブで処理しなかったコントロール培養物の結果を示す。上記内皮細胞がほとんど見えないことは明らかである。図１Ａは、ＣＤ３１染色が、上記内皮細胞を同定するために使用される場合に、上記コントロール培養物（ベバシズマブで処理していない）の結果を示す。繰り返すと、それらは、特に顕著ではない。図１Ｃは、上記培養物が、内皮細胞死滅を生じるベバシズマブで処理された場合の結果を示す。上記内皮細胞の外見は、極めて印象的である。上記参照のＷＯ  ２００７／０７５４４０公報に記載される特徴的な「ブルーベリーパンケーキ（ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  ｐａｎｃａｋｅ）」の外見が、観察される。
【００４３】
（実施例２  種々の化学療法剤の比較）
実施例１の培養物を、２．５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブと比較して、種々の候補化学療法剤で処理し、実施例１に記載されるように染色した。上記種々の薬物を、抗微小血管効果について０＋から５＋までのスケールでスコア付けすることによって評価した。５＋は、最高の考えられるスコアである。図２Ａ〜２Ｈに示されるように、ゲフィチニブは、０にしかスコア付けされなかった；スニチニブ（sunitinib）は、１＋にスコア付けし、ソラフェニブ（sorafenib）は、３＋にスコア付けし、そしてエルロチニブ（erlotinib）およびベバシズマブ（bevacizumab）の両方を、４＋にスコア付けした。上記「ニブ」薬物は、キナーゼ阻害薬である。
【００４４】
さらなる結果を、表１にまとめ、ここでスライドを、上記のように抗微小血管効果について、そしてＷｅｉｓｅｎｔｈａｌ．ｏｒｇウェブサイトに記載されるように、直接的な抗腫瘍効果についてもスコア付けした。この決定のために、表１に提供される結果は、前の段落のスコア付けシステムの１０×倍数である。その表はまた、使用される各薬物の濃度を示す。ベバシズマブを、０．９％  ＮａＣｌを含むビヒクル中および０．５％  ＤＭＳＯ／０．５％  エタノールの培養培地中の最終濃度を生じたビヒクル中の両方に分与した。ゲフィチニブおよびスニチニブを、０．９％  ＮａＣｌ中に分与したが、エルロチニブ、ソラフェニブ、およびイマチニブを、最終０．５％  ＤＭＳＯ／０．５％  エタノール濃度を提供するように分与した。
【００４５】
【表１】
2011522528.tif 000002
図２に提供されるスコアに１０をかけ算し、平均して、列２に示される抗血管スコア（ＡＶＳ）を与えた；上記ビヒクル単独についての平均ＡＶＳ（ＶＡＶＳ）は、列３に示し、それらの差異の統計的有意性のレベルを、列４に示す。上記ＡＶＳスコアを、列５に示されるように、引き算によってビヒクルの効果について補正した。上記抗腫瘍スコア（ＡＴ）を、列６に示す。
【００４６】
最後に、抗腫瘍スコアに対するＡＶＳ（ビヒクルの効果について補正した）の比を、最後の列に示す。
【００４７】
上記表への参照から明らかであるように、ベバシズマブは、他の薬物と比較して、比較的高い比を有する。上記ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ組み合わせ（０．９％  ＮａＣｌと比較して）自体は、有意な抗微小血管効果を有することもまた、明らかである。
【００４８】
（実施例３  組み合わせの相乗効果）
不十分にしか識別されていない乳癌の標本を、前の実施例において示される手順において使用し、上記のように、種々の薬物および薬物組み合わせで試験した。図３Ａ〜３Ｈは、その結果を示す。図３Ａは、コントロール培養物に対してファストグリーン／Ｈ＆Ｅで染色した後の外見を示す。図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、エルロチニブ、イマチニブおよびベバシズマブ単独で処理した場合の外見を示す。ベバシズマブは＋１としてスコア付けされたものの、どれも特に有効ではなかったように見えた。ベバシズマブと、エルロチニブ（図３Ｅ）もしくはイマチニブ（図３Ｆ）いずれかとの組み合わせは、遙かにより良好な結果を示した。図３Ｇおよび図３Ｈは、図３Ｆに示される結果の単により高い倍率のものである。
【００４９】
（実施例４  末梢血への適用）
末梢血の慢性リンパ性白血病細胞を、ベバシズマブ（２．５ｍｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下で４日間にわたって培養し、上記のように染色および対比染色した。その結果を、図４に示す。図４Ａは、ベバシズマブなしの培養物を示す。内皮細胞が認められ得るが、上記内皮細胞は、上記ベバシズマブが内皮細胞死滅を引き起こした図４Ｂより明らかに見えづらい。上記内皮細胞は、取り囲んでいる細胞よりも小さな寸法の屈折性の角のある小さな細胞として容易に明らかである。これら細胞は、リンパ球の大きさの約１／３であり、直径約３μである。
【００５０】
（実施例５  細胞数の定量）
リンパ節生検を、非ホジキンリンパ腫患者から得、処理し、上記のように染色した。図５Ａは、ベバシズマブで４日間培養した細胞の２００×写真である。死滅内皮細胞の存在は、容易に明白である。上記細胞はまた、定量を補助するために、国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手可能な公に入手可能な「ＩｍａｇｅＪ」ソフトウェアを使用して画像化され得る。その画像を、上記死滅内皮細胞のみを表現（ｐａｉｎｔ）するようにゲートされる（ｇｅｔｅｄ）８ビットの白黒閾値に変換する。表現された特徴のみを計数し、ソフトウェアによって測定した。得られた画像を図５Ｂに示す。
【００５１】
同じサンプルを、種々の薬物およびビヒクル組み合わせに対して試験した。その結果を図６に示す。
【００５２】
個々のゲートされた特徴および同様に総面積（もとは、平方ピクセル単位（ｉｎ  ｐｉｘｅｌｓ  ｓｑｕａｒｅｄ））の両方についての客観的な自動化ＩｍａｇｅＪスコアが示される。上記ゲートされた特徴（推定死滅内皮細胞）の生のスコアを、各領域を２回画像分析する（最初に、目的の特徴（推定死滅内皮細胞）のみをゲートするように設定した検出閾値で、次いで、上記スライド上の全ての特徴を検出するために再度（このことは、細胞抽出物中の総ＤＮＡに対して遺伝子コピーを正規化するのに似ている））ことによって一様でない細胞分布について正規化する。上記ＩｍａｇｅＪソフトウェアをインストールする１ヶ月前に得た主観的（０＋〜５＋）手動抗血管スコアがさらに示される。上記試験した薬物および溶媒の各々の直接的抗腫瘍細胞効果がさらに示される。
【００５３】
示されるように、ビヒクルとしての０．９％  ＮａＣｌは、本質的に抗腫瘍活性も、抗微小血管活性も有さなかった。しかし、ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨは、顕著な抗微小血管活性を有したが、直接的抗腫瘍活性を有さなかった。この特定のサンプルにおいて、ドキソルビシンおよびフルダラビンは、直接的な抗腫瘍効果を有したが、抗微小血管薬剤としては比較的効果がなかった。ベバシズマブは、本質的に、予測されるようには直接的抗腫瘍効果を有さなかった一方で、ソラフェニブ、イマチニブ、およびより低い程度には、エルロチニブは、腫瘍細胞に対して直接的に作用した。それらの抗微小血管効果は、ビヒクル単独のものに匹敵するようである。
【００５４】
エタノールおよびＤＭＳＯの効果を、同じサンプルを使用して図７に示されるように、さらに確認した。これらの効果は、最終培地の０．１２５％の比較的低い投与濃度においてすら達成可能であった。
【００５５】
（実施例６  血中アルコールの効果の臨床例）
脳に転移した、肺の腺癌に罹患したｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの患者を、化学療法および顕著な影響なしの脳の放射線療法で予め多量に処置しておいた。その後、彼を、ブレサライザーを用いて、０．１％を上回る血中アルコールを保持するために、赤ワインを飲みながら４日間、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）で、処置した。彼の脳のその後のＭＲＩは、複数の脳腫瘍の退縮を示した。
【００５６】
（実施例７  複数の被験体から得られたリンパ性細胞（ｌymphatic ｃell）の存在下での内皮細胞の検出）
５名のリンパ腫患者および２名の正常ボランティアのリンパサンプルを培養し、上記のように染色した。各場合において、培養物を、可視性および検出しやすさに対する内皮細胞死滅の効果を評価するために、ベバシズマブで処理したか、または処理しなかった。結果の定量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施例４に記載されるとおりであった。その結果を、表２に示す。
【００５７】
【表２】
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表２が示すように、内皮細胞の可視性は、ベバシズマブの添加によって、上記リンパ腫患者の全てにおいて多いに増強された。正常ボランティア６は、そのサンプルにおいて少数の内皮細胞のみを有した一方で、正常ボランティア７は、高レベルの内皮細胞を有した。このことは、ボランティア６が、脱落した（ｓｌｏｕｇｈｅｄ）内皮細胞と関連した状態がなく、ボランティア７はそうではないことを示唆する。
【００５８】
（実施例８  細胞培養物中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルに対するＥｔＯＨ／ＤＭＳＯの効果）
ＥｔＯＨ／ＤＭＳＯが微小血管／内皮細胞の死滅をもたらす、観察された能力は、これら溶媒が、細胞培養物中のＶＥＧＦのレベルを低下させる能力に起因し得る。腫瘍細胞がＶＥＧＦを分泌し、新生脈管構造の増殖にＶＥＧＦが必要とされることは、公知である。よって、多くの腫瘍細胞培養物を、これら溶媒で処理した。上記培養物中のＶＥＧＦのレベルを、５７０ｎｍの光学密度を４５０ｎｍの光学密度から引き算することによって測定した。その結果を、図３に示す。
【００５９】
【表３−１】
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【００６０】
【表３−２】
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表３は、０濃度については０．０５８および１，０００  ｐｇ／ｍｌについては２．１８０の読み取りを有する０〜１，０００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦについての標準曲線を示す。上記表はまた、培地、培地＋血清、および０．９％  ＮａＣｌのサンプルは、０のＶＥＧＦ濃度を示すことを示す。１０％  ＤＭＳＯ中で保存された腫瘍サンプルについては、ごく低レベルのＶＥＧＦのみが、観察された。新鮮な乳房腫瘍細胞については、ＶＥＧＦのレベルは、スケール外（off-scale）であったが、予測されるように、ベバシズマブを使用して、０にし得た。特に重要なのは、上記表の最後に示される患者６に由来する細胞である。新鮮な乳房腫瘍細胞は、非常に高いＶＥＧＦの値を示した。０．５％  ＥｔＯＨおよび０．５％  ＤＭＳＯの組み合わせは、ほぼゼロへとこれらレベルを低下させることができた。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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