(57)【要約】  小さい群の突然変異型を産生するために、所定のアミノ酸をタンパク質又はポリペプチドの選択位置に導入する、上記タンパク質及びポリペプチドを修飾、特に安定化する方法。この方法は、或る特定のアミノ酸がタンパク質又はポリペプチドの安定性に重要な役割を果たすという前提に基づいている。それから、生成された突然変異型は、安定性及び／又は機能、例えば親和性に関してさらに解析することができる。さらに、適当な突然変異型を組み合わせて、さらに最適なタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。また、安定化した例示的なポリペプチド、並びに不安定化した又は安定化したタンパク質又はポリペプチドを同定及び／又は解析するのに好適な方法が提供される。この方法を、タンパク質の構造及び機能における特定のアミノ酸の役割を研究するのに、並びに新規の又は改善した、例えば安定化したタンパク質及びポリペプチド、例えば抗体及び単一可変ドメインを開発するのに使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定性が改善した、単一可変ドメイン、その機能的誘導体又はその断片を少なくとも１つ含むポリペプチドを産生することができる組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において前記ポリペプチド配列を作製する方法であって、
ａ）Ｎ末端のＥ（Ｅ１）又はＮ末端のＱ（Ｑ１）（存在する場合）を別の天然アミノ酸に置き換える工程、及び／又は
ｂ）酸化されやすい少なくとも１つのＭ（存在する場合）を別の天然アミノ酸に置き換える工程、及び／又は
ｃ）異性化しやすい少なくとも１つのＮ又はＤ（存在する場合）を別の天然アミノ酸に置き換える工程、
とを含む、方法。
【請求項２】
化学的安定性が改善したポリペプチド配列を作製する方法であって、
ａ．親ポリペプチドから突然変異したポリペプチド配列のライブラリを作製する工程であって、前記親ポリペプチドが、単一可変ドメイン、その機能的誘導体又はその断片を少なくとも１つ含み、前記親ポリペプチドが、ＣＤＲ領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有するか、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有し、前記突然変異したポリペプチド配列の一部のアミノ酸配列を、
ｉ．Ｎ末端のＥ（Ｅ１）又はＮ末端のＱ（Ｑ１）（存在する場合）をＤに置き換える方法、及び／又は
ｉｉ．酸化されやすい少なくとも１つのＭ（存在する場合）をＡ又はＴに置き換える方法、及び／又は
ｉｉｉ．前記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮ（存在する場合）をＱ又はＥに置き換える方法、
で変化させる、作製する工程、及び
ｂ．高い親和性又は結合活性を有するポリペプチド配列に関して前記作製したライブラリをスクリーニングする工程、及び
ｃ．任意で前記高い親和性又は結合活性を有する、１つ又は幾つかの突然変異したポリペプチドを選択する工程、
を含む、方法。
【請求項３】
前記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフがＣＤＲ領域にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフがＣＤＲ２領域又はＣＤＲ３領域にある、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフがＣＤＲ３領域にある、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記高い親和性又は結合活性をその標的分子に対する解離定数として表し、前記解離定数が１００ｎＭ以下である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記解離定数が１０ｎＭ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記解離定数が１ｎＭ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが本質的にナノボディ又はその構築物から成る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により生成される突然変異型のライブラリ。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法による突然変異型の生成に使用されるヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の突然変異型のライブラリを含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択されるポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号３３及び配列番号３４から成る群から選択されるヌクレオチド配列。
【請求項１６】
請求項８に記載のヌクレオチド配列でコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
小さい群の突然変異型を産生するために、所定のアミノ酸をタンパク質又はポリペプチドの選択位置に導入する、上記タンパク質及びポリペプチドを修飾、特に安定化する方法。この方法は、或る特定のアミノ酸がタンパク質又はポリペプチドの安定性に重要な役割を果たすという前提に基づいている。それから、生成された突然変異型は、安定性及び／又は機能、例えば親和性に関してさらに解析することができる。さらに、適当な突然変異型を組み合わせて、さらに最適なタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。また、安定化した例示的なポリペプチド、並びに不安定化した又は安定化したタンパク質又はポリペプチドを同定及び／又は解析するのに好適な方法が提供される。この方法を、タンパク質の構造及び機能における特定のアミノ酸の役割を研究するのに、並びに新規の又は改善した、例えば安定化したタンパク質及びポリペプチド、例えば抗体及び単一可変ドメインを開発するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ランダム化突然変異誘発法又はタンパク質安定化に関する他の戦略は幾つかの制限を抱えている。これらの制限の中には、多くの突然変異型を生成することができるが、実際それらの中から有益又は所望の特性を有する突然変異型を選択することが不可能であることがある。例えば、タンパク質又はポリペプチドにおける特定のアミノ酸の置換、欠失又は挿入が、タンパク質／ポリペプチドに対して局所的又は大域的な影響を与えるか否か、したがって有用な情報又は機能を与える可能性があるか否かを確実に予測する方法は存在しない。突然変異がタンパク質の或る特定の領域、例えばタンパク質の活性部位又は結合部位の又はその周りの領域に限定されるとしても、潜在的な突然変異の数は極めて多く、このため感知できるレベルで生ずる突然変異を同定及び評価することが困難又は不可能となり得る。例えば、全ての他の天然アミノ酸による単一アミノ酸位置の置換により、１９個のタンパク質の異なる変異型が得られる。幾つかの位置を一度に置換すると、変異型の数は急激に増大する。タンパク質の１０個のアミノ酸位置で全てのアミノ酸が置換されると、１９×１９×１９×１９×１９×１９×１９×１９×１９×１９すなわち６．１×１０１２個のタンパク質の変異型が生成され、これらから有用な突然変異型を選択しなければならない。タンパク質の安定化における突然変異誘発の有効利用のためには、突然変異の種類及び数は、生成される突然変異型タンパク質の数を解析に適した数に維持する幾つかの制限的な標準に従っている必要があるということになる。
【０００３】
本発明は、新規の又は安定化したタンパク質（又はポリペプチド）の生成のための選択又は突然変異誘発の方法、及びこの方法で生成された突然変異型タンパク質のライブラリ及び特定の突然変異型タンパク質に関する。突然変異誘発の標的となるタンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、天然、合成又は人工のタンパク質、ペプチド又はポリペプチド、例えば抗体、ナノボディ若しくはｄＡｂ等の単一可変ドメイン、１つ若しくは複数の単一可変ドメインを含むポリペプチド、又は変異型（例えば突然変異型）であり得る。一実施の形態では、この方法は、タンパク質のアミノ酸配列の規定のアミノ酸（又は幾つかのアミノ酸）のありとあらゆる位置に所定のアミノ酸を導入することを含む。突然変異型は、ａ）個々に生成し、これにより別々に処理及び／又は評価し得るか、又はｂ）規定のアミノ酸位置の１つ又は複数の位置に及び集合的に位置ごとに、所定のアミノ酸を有する突然変異型タンパク質を含有するタンパク質ライブラリを作製し得る。この方法により、タンパク質、例えば抗体又は単一可変ドメインの安定化における特定のアミノ酸の役割を体系的に評価することが可能になる。
【０００４】
本発明は、保存時に生成されるタンパク質、例えば抗体又は単一可変ドメインの主な変異型の幾つかが、
ｉ．典型的に「接近しやすい（accessible）」メチオニンのみで起こる酸化事象（複数可）（１つの酸化事象のみの場合＋１６Ｄａの変異型）（ここで、酸化はインキュベーション温度及び時間と並行して保存中に増大する）、
ｉｉ．ピログルタミン酸の形成をもたらすＥ１残基（存在する場合）の環化、及び
ｉｉｉ．例えばＤＧ、ＤＳ、ＮＧ又はＮＳモチーフでのアスパラギン酸又はアスパラギンの異性化又はアミド分解（ここで、異性化はインキュベーション温度及び時間と並行して保存中に増大する）の結果であることを規定している。
【０００５】
本発明は、この観察結果を利用し、不安定性のこれらの有力「源」に焦点を当てると共に、有力候補物質を選択するか、又はａ）部位特異的突然変異誘発により提供することができる、さらに安定化するタンパク質、抗体若しくは単一可変ドメインの個々の突然変異型又はｂ）所定のアミノ酸を含有する領域に対して設計されたアミノ酸配列の変異を全てコードするオリゴヌクレオチドの単一混合物を合成することにより生成することができる、突然変異型タンパク質、抗体若しくは単一可変ドメインのライブラリのいずれかを作製するためにこの情報を使用するのに便利な方法を提供する。本発明の一実施の形態では、このオリゴヌクレオチド混合物を、合成の各縮合工程に、突然変異する配列（例えば、野生型配列）のヌクレオチドと、所定のアミノ酸のコドンに必要とされるヌクレオチドとの両方を組み込むことにより合成する。突然変異する配列のヌクレオチドが所定のアミノ酸に関するヌクレオチドと同じである場合、さらにヌクレオチドを付加することはない（例えば特許文献１も参照されたい）。
【０００６】
本発明の特定の実施の形態において、例えば選択的突然変異誘発、及びその後の上記タンパク質、ポリペプチド、抗体又は単一可変ドメインの例えば機能的特性、例えば結合特性の解析により、タンパク質、ポリペプチド、抗体又は単一可変ドメインの同定された上記の不安定性「源」を置き換える規定のアミノ酸が提供される。
【０００７】
この突然変異誘発方法を、スクリーニング（例えば結合親和性に関する）に実用的な大きさである、小さい群の突然変異型タンパク質又はライブラリを作製するのに使用することができる。この方法を、タンパク質の安定性及び機能における特定のアミノ酸の役割を研究するのに、並びに酵素、抗体、その結合断片又は類似体、一本鎖抗体、単一可変ドメイン、ナノボディ（登録商標）、ｄＡｂ、単一ドメイン抗体及び触媒抗体等の新規の又は安定化したタンパク質及びポリペプチドを開発するのに使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９１１５５８１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
タンパク質の研究により、或る特定のアミノ酸がその安定性及び機能において重要な役割を果たすことが明らかになっている。例えば、個別の数のアミノ酸だけが酵素の触媒事象又は抗体の結合に関与すると考えられる。
【００１０】
或る特定のアミノ酸が特に不安定化しやすいことが明らかであるにもかかわらず、或るアミノ酸がこのような影響を有するにはどの位置（単数又は複数）を占めなければいけないかを確実に予測することは、不可能ではないにしても困難である。不運なことに、タンパク質におけるアミノ酸側鎖の複雑な空間配置、及び例えば抗体のフレームワーク又はＣＤＲ領域における異なる側鎖の相互関係は、このような予測を可能にするのに十分には理解されていない。上記で指摘したように、ランダム化突然変異誘発は、さらに小さいタンパク質、ペプチド又はポリペプチドで非常に多く変異が起こり得ることを考慮して、タンパク質の安定性及び機能の研究に対する有用性が制限されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法は、タンパク質の安定性及び機能に対する、特定のアミノ酸の重要性及びタンパク質の規定の領域内のそれらの位置を評価する、並びに有用な、例えば安定化したタンパク質を産生する、体系的且つ実用的なアプローチを提供する。この方法は、或る特定の所定のアミノ酸がタンパク質、例えば抗体の特有の安定性に重要であるという仮定から始まっている（例えば、抗体のＣＤＲにおけるアスパラギン酸の異性化の研究に関しては、A A Wakankar et al., 2007, Biochemistry, 46, 1534-1544を参照されたい）。
【００１２】
所定のアミノ酸を選択すると共に、研究するタンパク質の突然変異型のライブラリを、所定のアミノ酸をタンパク質の選択されたアミノ酸位置それぞれに組み込むことにより作製する。例えば表Ｂ−２で列挙されるように、様々な突然変異型を本発明により提案される規則に従って生成する。
【００１３】
当業者は、選択された残基を置き換えるための適当なアミノ酸の選択において、さらなる検討、例えばナノボディ又はＤａｂを含むポリペプチドの免疫原性を下げることを適用することができることは、本明細書中に記載の全ての実施の形態の包括的態様であることを理解している。例えば、ナノボディとの関連では、ヒトフレームワーク領域の対応位置に存在するＭ（又は本明細書中で述べられる任意の他の残基又はモチーフ）の置き換えに関するアミノ酸を選択することが有益であり得る。さらなる参照として、当業者は、国際公開第２００９／００４０６５号パンフレット及び／又は国際公開第２００９／００４０６６号パンフレットの教示も考慮することができる。
【００１４】
突然変異型タンパク質のライブラリは、置き換えのために設計されるそれぞれの選択されたアミノ酸に所定のアミノ酸を有する個々のタンパク質を含有する。このタンパク質ライブラリは、例えば完全なランダム突然変異、すなわち例えば「ウォークスルー」突然変異により生成される突然変異型ライブラリに比べて、安定性が改善し、且つ機能的活性が保持される突然変異型を含有する可能性が非常に高い。このため、所望の種類の突然変異型がライブラリで濃縮される。適当な時間枠で生成された突然変異型のより迅速且つ詳細な解析が可能になるため、このことが重要である。
【００１５】
別の実施の形態において、所定のアミノ酸（例えば不安定であり得る同定されたアミノ酸を置き換える他の天然の１９個のアミノ酸の内の１つ）が、タンパク質のＤＧ、ＤＳ、ＮＧ又はＮＳモチーフで同定されたアミノ酸を置き換え、ここで上記モチーフは、例えば同定されたアミノ酸モチーフが抗体のＣＤＲ中に見出され得るように溶媒に曝される。好ましくは所定のアミノ酸は、Ｄ若しくはＮが置き換えられる場合、Ｑ、Ｅ、好ましくはＥの群から、又はＳ若しくはＧが置き換えられる場合、Ｔ若しくはＡの群から選択される。さらなる実施の形態では、置き換えられることが予め定まっているアミノ酸、例えば他の天然の１９個のアミノ酸の内の１つは同定されたメチオニンを置き換え、好ましくは上記メチオニンは強制酸化に感受性があり、また好ましくは上記予め定まっているアミノ酸（amino acid amino）はＡ及びＴから成るアミノ酸群から選択される。さらなる実施の形態では、所定のアミノ酸、例えば他の天然の１９個のアミノ酸の内の１つ、好ましくはＤが、末端のＥ（存在する場合）を置き換える。突然変異した分子及び／又は所望の構造の構造情報又はモデリングに基づくさらなる考察を、突然変異誘発の候補位置のサブセットを簡素化するのに又は絞り込むのにさらに使用することができる。さらに、或る特定の同定された位置にわたるアラニンスクリーニングは、安定化するタンパク質の機能的特性に重要なアミノ酸を迅速に同定することができる。さらなる実施の形態では、様々な突然変異型からのラーニングを組み合わせて、（この方法が開始時に使用した元のタンパク質と比較して）突然変異誘発させたアミノ酸を２つ以上有する突然変異型を生成することができる。
【００１６】
別の実施の形態において、本発明は、例えばこれらのタンパク質を特異的に安定化、不安定化するか、又は不安定化手段の後に再安定化し得るように修飾する単一可変ドメインを含むポリペプチド等のタンパク質の安定化を可能にする方法を提供する。所望の効果がタンパク質を不安定化することである（例えば短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が例えば血液凝固に機能的に関与する分子に重要である）場合、基本的に本発明の方法を反転する。要するに、ＤＧ、ＤＳ、ＮＧ又はＮＳ等の不安定化アミノ酸モチーフは、例えば抗体に対して好適な、すなわち非機能的な領域、結合に直接関与しない領域に導入されるか、又は例えば好適な、すなわち溶媒に曝されたＤＧ、ＤＳ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを置き換える。好ましくは任意のこのような突然変異型は、重要な生物学的機能性、例えば抗体の結合親和性又は酵素の触媒活性を失ってはいない。
【００１７】
ライブラリの大きさは突然変異誘発させるアミノ酸の数に応じて異なる。好ましくはライブラリは、５０個未満、より好ましくは４０個未満、より好ましくは３０個未満、より好ましくは２０個未満の突然変異型、より好ましくは１０個未満の突然変異型を含有するように設計される。
【００１８】
別のアプローチでは、対象の遺伝子が一本鎖プラスミド上に存在する。例えば、遺伝子をＭ１３ファージベクター、又はヘルパーファージの使用により一本鎖分子の伝播を可能にする糸状ファージの複製起点を有するベクターにクローニングすることができる。一本鎖鋳型を一組の縮重プローブでアニーリングすることができる。プローブを伸長及びライゲーションし、それにより各変異型の鎖を、適当な宿主に導入することができる分子集団に組み込むことができる（Sayers, J. R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 （1988））。このアプローチにより、複数のドメインが突然変異誘発のために選択される複数のクローニング工程を避けることができる。
【００１９】
またポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を、縮重オリゴヌクレオチドを遺伝子に組み込むのに使用することができる。例えば、縮重オリゴヌクレオチド自体を伸長のためのプライマーとして使用することができる。
【００２０】
この実施の形態において、Ａ及びＢは変異原性カセット又は「ウィンドウ」をコードする縮重オリゴヌクレオチド集団であり、このウィンドウは互いに相補的である（オリゴのジグザグ部分は縮重部分を表す）。Ａ及びＢは、増幅のための３’末端上の鋳型に相補的な野生型配列も含有し、このためウィンドウを組み込む断片を生成することが可能な増幅のためのプライマーである。Ｃ及びＤは、対象の遺伝子又は領域全体を増幅することができるオリゴヌクレオチドであり、組み込まれた変異原性ウィンドウを有するものを含む（Steffan, N. H. et al., Gene 77: 51-59 （1989））。Ａ及びＢからプライム伸長した（primed）伸長生成物は、その相補的ウィンドウを通してハイブリダイズさせると共に、プライマーとしてＣ及びＤを使用して全長分子の生成のための鋳型を提供することができる。Ｃ及びＤは、クローニングに都合がいい部位を含有するように設計することができる。それから増幅断片をクローニングすることができる。
【発明の効果】
【００２１】
上記の技法又は他の好適な技法のいずれかにより作製される突然変異型ライブラリを、所望の安定性及び活性を有する突然変異型を同定するのにスクリーニングすることができる。スクリーニングを任意の適当な手段で行うことができる。例えば、結合親和性を、好適なアッセイ、例えばビアコア測定、標準的なイムノアッセイ及び／又はアフィニティクロマトグラフィで確かめることができる。
【００２２】
本発明の方法を、不安定性の有力源を有する、本発明に従って同定されたタンパク質を安定化するのに使用することができる。これまでの記載は、タンパク質に集中していたが、この方法は、ポリペプチド、抗体、ナノボディ及びｄＡｂ等の単一可変ドメインを含むポリペプチド、並びにマルチサブユニットタンパク質にも適用されることを理解されたい。本発明の方法により野生型タンパク質で突然変異誘発させることが提案されるアミノ酸は、２つ以上のアミノ酸である可能性があり、好ましくは野生型タンパク質の他の特性には影響を与えない。
【００２３】
通常、研究される領域は結合ドメイン又は触媒ドメイン等のタンパク質の機能的ドメインである。例えばこの領域は、免疫グロブリンの超可変領域（相補性決定領域、すなわちＣＤＲ）、酵素の触媒部位、又は結合ドメインであり得る。
【００２４】
上述のように、突然変異誘発のために選択されるアミノ酸は一般的に、対象の機能ではなく安定性に関与することが知られているか、又は関与すると考えられている場合、これらの既知のものから選択される。２０個の天然アミノ酸はその側鎖だけが異なっている。各側鎖は各アミノ酸を特有のものにする化学的特性に関与する。レビューのために、Principles of Protein Structure, 1988, by G. E. Schulz and R.
M.Schirner, Springer-Verlagを参照されたい。
【００２５】
側鎖の化学的特性により、選ばれた数の天然アミノ酸だけが触媒事象に優先的に関与すると考えられる。これらのアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓ等の極性及び中性のアミノ酸群と、Ａｓｐ及びＧｌｕ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、特にＨｉｓアミノ酸等の荷電アミノ酸群とに属する。
【００２６】
典型的な極性及び中性の側鎖は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＴｙｒの側鎖である。またＧｌｙは、この群の境界となる成員であるとみなす。Ｓｅｒ及びＴｈｒは、水素結合を形成するのに重要な役割を果たす。Ｔｈｒはβ炭素でさらに不斉性を有し、そのため１つの立体異性体だけを使用する。また酸アミドＧｌｎ及びＡｓｎは、水素結合を形成することができ、アミド基が水素供与体として機能し、カルボニル基が水素受容体として機能する。ＧｌｎはＡｓｎよりも１つ多くＣＨ２基を有し、これにより極性基をより柔軟にすると共に、主鎖との相互作用が低減する。Ｔｙｒは、高ｐＨ値で解離することができる、非常に極性のあるヒドロキシル基（フェノール性ＯＨ）を有する。Ｔｙｒは、多少荷電側鎖のように挙動するが、その水素結合の方が強い。
【００２７】
中性の極性酸は、表面及びタンパク質分子内に見出される。内部残基として、これらの酸は通常、互いに又はポリペプチド骨格と水素結合を形成する。Ｃｙｓはジスルフィド架橋を形成することができる。
【００２８】
ヒスチジン（Ｈｉｓ）は、複素環芳香族側鎖を有し、ｐＫ値は６．０である。生理学的ｐＨ範囲で、そのイミダゾール環は、溶液から水素イオンを取り込んだ後、非荷電又は荷電であり得る。これらの２つの状態を容易に利用可能なので、Ｈｉｓは化学反応を触媒するのに非常に適している。Ｈｉｓは酵素のほとんどの活性中心に見られる。
【００２９】
Ａｓｐ及びＧｌｕは生理学的ｐＨで負に荷電している。これらの短い側鎖のために、主鎖に関してはＡｓｐのカルボキシル基の方が堅固である。これは、多くの触媒部位でのカルボキシル基がＧｌｕではなくＡｓｐにより与えられる理由であり得る。荷電酸は一般的にタンパク質表面で見られる。
【００３０】
さらに、Ｌｙｓ及びＡｒｇが表面で見られる。これらは長く且つ柔軟な側鎖を有する。Ｌｙｓ及びＡｒｇを周囲溶液中で揺動すると、タンパク質小球の溶解性が増大する。場合によっては、Ｌｙｓ及びＡｒｇは、内部の塩架橋を形成するのに係わるか、又は触媒反応を助ける。タンパク質表面でＬｙｓ及びＡｒｇが曝されることから、Ｌｙｓは、側鎖を修飾する又はＬｙｓ残基のカルボニル末端でのペプチド鎖を切断する酵素による攻撃をより頻繁に受ける残基である。
【００３１】
触媒的に重要なアミノ酸を領域に導入するために、本発明は優先的に、所定のアミノ酸が以下の群のアミノ酸の内の１つである突然変異誘発に関する：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ。しかしながら、結合を変える、又は新たな結合親和性を生じるために、２０個の天然アミノ酸のいずれも選択することができる。
【００３２】
重要なことに、タンパク質の幾つかの異なるアミノ酸を、同時に又は連続して突然変異誘発させることができる。同じ又は異なるアミノ酸は、不安定性の有力源のそれぞれの同定されたアミノ酸位置で「ウォークスルー」し、それらの保持又は非保持機能、例えば結合特性に関して確認することができる。
【００３３】
本発明の方法は、様々な種類の安定化したタンパク質の設計に関する新たな可能性を切り開いている。新規の構造を、本発明の方法により関連のアミノ酸だけを突然変異することで、既存のタンパク質の天然「スカフォールド」上に構築することができる。
【００３４】
本発明の方法は特に、抗体分子を修飾するのに有用である。本明細書中に使用されるように、抗体分子又は抗体は、抗体又はその一部、例えば全長抗体、Ｆｖ分子、又は他の抗体断片、個々の鎖又はその断片（例えばＦｖの一本鎖）、一本鎖抗体、ナノボディ及びｄＡｂ等の単一可変ドメイン、並びにキメラ抗体を表す。本発明の方法により提起されるような変化を、抗体の可変領域及び／又はフレームワーク（定常）領域に導入することができる。可変領域の修飾により、安定性だけでなく、抗原結合特性及び触媒特性がより良好な抗体を産生することができる。
【００３５】
本発明の方法は、単一可変ドメインを含む安定化したポリペプチドの設計、並びにナノボディ（登録商標）、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」、又はそのフォーマット版、例えば診断及び／又は治療としての多価又は多量体の結合特性を有する、ナノボディ及び／又はｄＡｂを含むポリペプチド等の安定化した単一可変ドメインを含む上記ポリペプチドの新規の使用に特に適している。
【００３６】
診断及び治療としての単一可変ドメインを含むポリペプチドの使用は急速に拡大している分野であり、単一可変ドメインを含む上記ポリペプチドに関する研究は、特にｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期延長と、薬剤の高温、例えば室温以上での規制認可可能な長期保存特性を得る可能性とについて調査している。
【００３７】
例えばラマ由来のナノボディ等の天然単一可変ドメイン又は遺伝子組み換えラクダ化ｄＡｂは、保存における長期安定性に、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの長期有効作用には適しておらず、このためそれらの内の少なくとも幾つかは、一般的に従来の抗体よりも安定と考えられるが、依然として不安定であり得る、すなわち或る特定の温度での要求される規制保存時間、又は体温での延長したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に適合するのに十分安定ではないことがある。
【００３８】
このため、当該技術分野においてこのような単一可変ドメインを含むポリペプチドにおける不安定性の有力源を同定する、及び上記ポリペプチドを修飾、例えば安定化又は不安定化する方法を見出す必要性がある。本発明は特に、アミノ酸配列の特異的突然変異により、単一可変ドメインを含む上記ポリペプチドを修飾、例えば安定化又は不安定化する方法に焦点を当てている。
【００３９】
上記で述べられた一般原理と同様に、本発明の方法は、単一可変ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドに関する安定性プロファイルの変更、例えば改善又は低減を達成するために、以下の主な戦略の１つ又は複数を提供する：ａ）Ａｓｐ（Ｄ）及びＡｓｎ（Ｎ）の異性化を回避する、すなわち単一可変ドメインのＣＤＲにおいて、Ａｓｐ（Ｄ）及びＡｓｎ（Ｎ）、特にＡｓｐ−Ｇｌｙ（ＤＧ）、Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＤＳ）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ（ＮＧ）及びＡｓｎ−Ｓｅｒ（ＮＳ）の存在に関して配列を調べると共に、少なくとも１つの生物活性、例えば結合親和性が保存されるように、Ａｓｐ及び／又はＡｓｎを他のアミノ酸に置き換える、例えば関連のＡｓｐ及び／又はＡｓｎを例えばＧｌｕ（Ｅ）又はＧｌｎ（Ｑ）等の別のアミノ酸に置き換える、ｂ）Ｍｅｔの酸化を回避する、例えば酸化、特に強制酸化されやすいＭｅｔに関して確認し、酸化又は強制酸化に耐性がない場合、少なくとも１つの生物活性、例えば結合親和性が保存されるように、Ｍｅｔを他のアミノ酸に置き換える、例えば関連のＭｅｔを例えばＡｌａ又はＴｈｒ等の他のアミノ酸に置き換える、及び／又はｃ）Ｎ末端のＧｌｕを回避するか、若しくはＮ末端のＧｌｕを代替的なＮ末端、例えばＡｓｐに置き換える。単一可変ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを、例えば急性及び／又は局所治療に使用するために不安定化させる必要がある場合（ここでは短期有効性のみが望まれる）、例えば手術中に血液凝固を増大させる必要がある場合、上記の戦略を反転して使用する、例えばＡｓｐ異性化又はＡｓｎ異性化、好ましくはＡｓｐ異性化を助けるために、ＣＤＲにおけるＮＸ又はＤＸをＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳモチーフに置き換える。
【００４０】
本発明の実施の形態の内の１つにおいて、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮ又はＤ、好ましくはＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｎ又はＤをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な（例えば真核又は原核）生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法が提供される。
【００４１】
必要に応じて、単一可変ドメインを、生物から単離すると共に、任意で当業者によく知られる方法に従って精製することができる。
【００４２】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が存在する場合、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）好適な（例えば真核又は原核）生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法が提供される。
【００４３】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳモチーフをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程であって、上記アミノ酸又はモチーフが表面露出し、Ｈ−結合供与残基が不安定化したＮ又はＤに密接している、調べる工程、及び
ｂ）ａ）でヌクレオチド配列が同定される場合、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）好適な（例えば真核又は原核）生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法が提供される。
【００４４】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法／プロセスであって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が（例えば高温での長期保存、及びＲＰＣプロファイルにおけるその後のプレピークの観察により（実験部を参照されたい））行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００４５】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法／プロセスであって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ又はＤＧをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が（例えば高温での長期保存、及びＲＰＣプロファイルにおけるその後のプレピークの観察により（実験部を参照されたい））行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ又はＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００４６】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法／プロセスであって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が（例えば高温での長期保存、及びＲＰＣプロファイルにおけるその後のプレピークの観察により（実験部を参照されたい））行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ又はＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００４７】
本発明の別の実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法／プロセスであって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＤＧ、ＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ、又は好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００４８】
本発明の好ましい実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片に対して、この方法を行い、ここで特にＤ又はＮの後にＳ又はＧが続く、及び／又は上記ＤＧ、ＮＧ、ＤＳ又はＮＳがポリペプチドの単一可変ドメインのＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ２又はＣＤＲ３、より好ましくはＣＤＲ３内にある場合、このＤ又はＮに対する少なくとも１つのコドンをポリペプチドの単一可変ドメインの遺伝子において置き換え、真核生物又は原核生物を形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、その断片又はその誘導体を発現する。
【００４９】
本発明の好ましい実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片に対して、この方法を行い、ここで特にＭがＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３、より好ましくはＣＤＲ３内にあるか、又はＭがポリペプチドの単一可変ドメインの７７位（カバットナンバリングを使用する）にある場合、このＭに対する少なくとも１つのコドンをポリペプチドの単一可変ドメインの遺伝子において置き換え、真核生物又は原核生物を形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、その断片又はその誘導体を発現する。
【００５０】
本発明の好ましい実施の形態において、安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片に対して、この方法を行い、ここでＥ１（ナノボディに関するカバットナンバリング）（存在する場合）を好ましくはＤに置き換え、真核生物又は原核生物を形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、その断片又はその誘導体を発現する。
【００５１】
本発明による方法又はプロセスは、少なくとも単一可変ドメイン（安定化することを目的とする）を含むポリペプチドをシークエンシングし、そのドメイン配列をKabat et al.（1991、以下）の配列で記載されたコンセンサス配列と比較するか、又は連続的にナンバリングするように使用される。アミノ酸位置は、配列の最大相同性又は同一性で規定される。その後、１つ又は幾つかのコドンを本発明に従って、有利には突然変異誘発により修飾することができる。１つのコドンの特異的な置換が既に抗体の安定性にかなりの変化をもたらし得ることが分かっている。しかしながら、２つ、３つ又はそれ以上のコドンが修飾されるのが好ましい。所望の適用目的に重要な抗体の他の特性（例えば親和性、プロテアーゼ安定性、選択性）が悪影響を受ける場合、置換数は上限に達している。
【００５２】
実施例に基づきこの手法を明らかにすることが意図される。初めにアミノ酸位置を、Kabat（1991、以下）の表を用いた配列比較（最大相同性）により決定する。
【００５３】
配列番号２の場合、アミノ酸Ｄ１０５（通し番号、図面、例えば図４を参照されたい）が異性化を受けること、及びこの異性化が高温での長期保存中の効力喪失の基となる主要な分子機構であることが分かっている（実験部を参照されたい）。しかしながら、Ｄ１０５のＥ１０５による置き換え、すなわち配列番号２のＤ１０５Ｅの突然変異型は、言及された高温での経時的な親和性の喪失を防ぎ、二価形態でフォーマットされると、配列番号２を有する野生型ポリペプチドに匹敵する全親和性を有する（これも実験部を参照されたい）。したがって、本発明による方法を使用することにより、配列番号２の結合親和性を喪失することなく、安定型、すなわち配列番号２の好ましい突然変異型、すなわち配列番号２のＤ１０５Ｅ突然変異型を得ることが可能である。他の例が実験部で開示される。
【００５４】
本発明の別の実施の形態において、ポリペプチド、誘導体又は断片の上記ライブラリをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において機能的ポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを製造する方法／プロセスであって、上記で開示されたプロセス工程のいずれか、並びに加えて
ａ）任意のＭが存在するか否かを確認し、また任意でＭが強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、Ｍを、例えばＶ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、Ｔ、好ましくはＴ、Ｌ又はＡ、より好ましくはＡ又はＴ、より好ましくはＡに置き換えることによりライブラリ中にさらなる成員を生成すること、及び
ｂ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、本発明のポリペプチド、断片又は誘導体を発現すること、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００５５】
当業者は、Ｍを置き換えるための適当なアミノ酸の選択において、さらなる検討、例えばナノボディ又はＤａｂを含むポリペプチドの免疫原性を下げることを適用することができることを理解している。例えば、ナノボディとの関連では、ヒトフレームワーク領域の対応位置に存在するＭの置き換えに関するアミノ酸を選択することが有益であり得る（実験部、例えば実施例４のＭ７８Ｔ突然変異を参照されたい）。
【００５６】
本発明の別の実施の形態において、ナノボディの上記ライブラリをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物においてナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを製造する方法／プロセスであって、上記で開示されたプロセス工程のいずれか、並びに加えて
ａ）Ｍが７７位（カバットナンバリングを使用する）に存在するか否かを確認し、また任意でＭが強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、Ｍを、例えばＴ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＴ、Ｌ又はＡ、より好ましくはＡ又はＴ，より好ましくはＡに置き換えることによりライブラリ中にさらなる成員を生成すること、及び
ｂ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、本発明のポリペプチド、断片又は誘導体を発現すること、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００５７】
本発明の別の実施の形態において、機能的ポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法／プロセスであって、上記で開示されたプロセス工程のいずれか、並びに加えて
ａ）任意のＭが存在するか否かを確認し、また任意でＭのいずれかが強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、少なくとも１つのＭを、例えばＶ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＬ又はＡ、より好ましくはＡ又はＴ、より好ましくはＡに置き換えること、及び
ｂ）Ｎ末端のＥ（存在する場合）を例えばＤに置き換える工程、及び
ｃ）真核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現すること、
を含む、方法／プロセスが提供される。
【００５８】
本発明によるプロセスによりタンパク質又はポリペプチドを安定化しながらも、具体的には抗原に対する親和性等の他の特性を保存するために、出来る限りこれらの特性を損わないようにアミノ酸を置換するのが好ましい。このため、同定したアミノ酸を保存的置換で置き換えるのが好ましい。
【００５９】
本発明によるポリペプチド、その誘導体及びその断片を、当業者によく知られる、組換えタンパク質を作製する方法に従って生成することができる。
【００６０】
本発明に従って修飾したポリペプチドを生成するために、（例えば、Sinha et al., NAR 12 （1984）, 4539-4557に記載のようにオリゴヌクレオチド合成により）例えば可変ドメインの完全ＤＮＡを合成することが可能である。オリゴヌクレオチドを、例えばInnis,Ed. PCR protocols, Academic Press （1990）及びBetter et al., J. Biol. Chem. 267 （1992）,16712-16118に記載のようにＰＣＲによりカップリングすることができる。クローニング及び発現を、例えばAusubel et al, Eds.Current protocols in Molecular Biology, John
Wiley and Sons, New York （1989）及びRobinsonet al., Hum. Antibod. Hybridomas 2 （1991） 84-93に記載のように標準的な方法により行う。特異的な抗原結合活性を、例えばHarlowet
al., Eds. Antibodies; A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring
HarborLaboratory, Cold Spring Harbor （1988）及びMunson et al., Anal. Biochem. 407 （1980）,220-239に記載のように競合試験により調べることができる。
【００６１】
好適な宿主生物は例えば、ＣＨＯ細胞、免疫グロブリンを産生しないリンパ球細胞株、酵母、昆虫細胞及び大腸菌等の原核生物である。
【００６２】
本発明のさらなる主題は、タンパク質を変性封入体として原核生物（例えば大腸菌）で単離し、当業者によく知られるプロセス（例えば欧州特許第０３６４９２６号明細書を参照されたい）で活性化させるようなプロセスである。
【００６３】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリペプチドを、所望の活性を有するサイトゾル中で生物活性的に形成し、サイトゾルから活性形態で直接単離することができるように本発明に従って安定化するプロセスである。
【００６４】
本発明による方法／プロセスは、上述の全ての適用範囲に関してポリペプチド及びタンパク質の安定性を改善させる。さらに、非生理学的条件下での使用に適したポリペプチドのような十分に安定な形態ではこれまでに得ることができなかった、新規の安定なポリペプチド変異型を本発明に従って作製することができる。
【００６５】
本発明のさらなる主題は、例えば、迅速な薬物動態が要求される場合に有利に使用することができる、非破壊的な不安定化ポリペプチドを作製するプロセスである。結果としてこのようなポリペプチドを得るためには、上記のものとは反対に、少なくとも１つのアミノ酸置換を行う必要がある。
【００６６】
定義
ａ）「標的分子（"Target Molecule" or "Target
Molecules"）」又は「標的」という用語は、細菌及びウイルスを含む生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて、疾患の発症又は進行又は維持に関与し得る生物学的機能を有するタンパク質を意味する。好ましくは上記タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、第ＶＩＩＩ因子、抗体、ナノボディ、哺乳動物、特にヒトで良好な耐容性を示し、且つ全身的及び／又は局所的に与えられた場合長い半減期を有する分子、例えば異なる大きさのポリグリコール鎖、例えばＰＥＧ−２０、ＰＥＧ−３０又はＰＥＧ４０、肺界面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ボンベシン、第ＩＸ因子、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びＴＮＦ−β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミューラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、微生物性タンパク質、例えばβラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモン又は成長因子に対する受容体；インテグリン、トロンボポイエチン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、ＮＧＦ−β等の神経成長因子、血小板成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ及びインスリン様成長因子−ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポイエチン、骨誘導因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β及びインターフェロン−γ等のインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、フォン・ヴィルブランド因子、スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイルス抗原、ＧＰ１２０、ＧＰ１４０等のＨＩＶエンベロープタンパク質、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂ又はＣ、免疫グロブリン、並びに上記で列挙されたタンパク質のいずれかの断片又は変異型から成る群から選択される。さらに、上記タンパク質は、上述の因子／サイトカインに対する受容体、及び／又は受容体と因子／サイトカインとの複合体であり得る。より好ましくは、上記標的分子は多量体タンパク質であり、さらに好ましくはそのサブユニットがフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子−α及び腫瘍壊死因子−β等から成る群から選択される多量体タンパク質である。多量体タンパク質は、ヒト等の生物において多量体構造でサブユニットとして他のものと（典型的に非共有結合的な相互作用により）会合し、典型的に多量体形態でのみ、その生物学的機能を展開することができるタンパク質である。これは、タンパク質の４次構造とも呼ばれる。この���合は、ジスルフィド結合及び反応基質又は補因子との非共有結合的な相互作用により安定化させることもできる。
【００６７】
ｂ）本発明の構築物中に存在する単一可変ドメインは単一抗原結合単位を形成する任意の可変ドメインであり得る。一般的に、このような単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、又は（したがって通常、本明細書中にさらに記載のように、少なくとも１つのＣＤＲを形成するアミノ酸残基を少なくとも幾つか含有する）このようなアミノ酸配列の任意の好適な断片から本質的に成るアミノ酸配列である。このような単一可変ドメイン及び断片は、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能であるようなものが最も好ましい。したがって、単一可変ドメインは、単一抗原結合単位（すなわち例えば、機能的な抗原結合ドメインを形成するのに、例えばＶＨ／ＶＬ相互作用により別の可変ドメインと相互作用する必要がある、例えば従来の抗体及びＳｃＦｖ断片に存在する可変ドメインの場合のように、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないような本質的に単一可変ドメインから成る機能的な抗原結合単位）を形成することが可能であれば、例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその好適な断片又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）若しくはそれらの好適な断片を含み得る。
【００６８】
例えば、単一可変ドメインは、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（商標）（本明細書に規定のように、ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、又はこれらのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の概説に関しては、上記で言及された従来技術、及び欧州特許第０３６８６８４号明細書も参照する。用語「ｄＡｂ」に関しては、例えばWard et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 （6242）: 544-6）、Holt
et al.（TrendsBiotechnol., 2003, 21（11）:484-490）、例えば国際公開第０４／０６８８２０号パンフレット、国際公開第０６／０３０２２０号パンフレット、国際公開第０６／００３３８８号パンフレット、及びDomantisLtd.の他の公開特許出願を参照する。哺乳動物起源ではないため、本発明との関連ではあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、或る特定種のサメ由来である可能性があることにも留意すべきである（例えばいわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号パンフレットを参照されたい）。
【００６９】
特に、本発明のアミノ酸配列はナノボディ（商標）又はその好適な断片であり得る（備考：ナノボディ（Nanobody）（商標）、ナノボディ（Nanobodies）（商標）及びナノクローン（商標）は、Ablynx N. V.の商標である）。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる説明に関しては、Reviews inMolecular Biotechnology 74（2001）, 277-302におけるMuyldermansによる総説、及び一般的な背景技術として言及される以下の特許出願：VrijeUniversiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；VlaamsInstituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；AlgonomicsN.V.及びAblynx N. V.の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；カナダの国家研究会議（National ResearchCouncil）による国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにAblynxN.V.による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、並びにAblynxN.V.によるさらなる公開特許出願を参照する。これらの出願で言及されるさらなる従来技術、特に国際出願国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの４１頁〜４３頁で言及される参考リストも参照する（このリスト及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。これらの参考文献で記載のように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、１つ又は複数のフレームワーク配列における１つ又は複数の「特徴的な（Hallmark）残基」の存在を特徴とし得る。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、及び他の修飾体（modifications）、その一部又は断片、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（リンカー配列の幾つかの非限定的な例を含む）、並びにナノボディ及びその調製物の半減期を増大する様々な修飾を含む、ナノボディのさらなる説明は例えば、国際公開第０７／１０４５２９号パンフレットに見ることができる。
【００７０】
ｃ）「高親和性」は本明細書中で使用される場合、生理学的条件下で一価の結合ナノボディの解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ、さらにより好ましくは１００ｐＭ、最も好ましくは１０ｐＭであることを意味し、当該技術分野で標準的な手法により測定される。
【００７１】
ｄ）「高結合活性」は本明細書中で使用される場合、生理学的条件下で二価又は多価の結合ナノボディの解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ、さらにより好ましくは１００ｐＭ、最も好ましくは１０ｐＭであることを意味し、当該技術分野で標準的な手法により測定される。
【００７２】
ｅ）「堅固な二次構造」は本明細書中で使用される場合、α−へリックス、３１０へリックス、π−へリックス、並行及び逆並行β−シート、並びに反転折り返し構造（reverse turns：逆ターン）で見られるような規則的な反復構造を示す任意のポリペプチドセグメントを意味する。認識可能な幾何学的秩序を欠く或る特定の「非秩序」構造も、標的と相互作用可能なアミノ酸残基のドメイン又は「パッチ」を形成する場合、及び構造の形全体が構造内でのアミノ酸の置き換えによっては破壊されない場合、堅固な二次構造の定義に含まれる。幾つかの非秩序構造は反転折り返し構造の組み合わせであると考えられる。これらの堅固な二次構造の形状は、ペプチド「骨格」のα炭素に関するφ及びψねじれ角度で十分に規定される。二次構造をポリペプチドの表面に曝す必要があるのは、標的分子に曝し、且つこれと結合することができるアミノ酸残基のドメイン又は「パッチ」を提供するためである。これは主に、ファージ表面上に提示される構造的に関連した（突然変異型）結合ポリペプチドの「ライブラリ」を形成する突然変異誘発により置き換えられる、これらのアミノ酸残基であり、これらから新規のポリペプチドリガンドが選択される。ポリペプチド内部へと向かうアミノ酸残基の突然変異誘発又は置き換えは一般的に回避され、このため堅固な二次構造の構造全体が保存される。堅固な二次構造の内部領域でのアミノ酸の、特に疎水性アミノ酸残基による置き換えの幾つかは耐容性である可能性があり、これはこれらの保存的置換がポリペプチドの構造全体を変形させる可能性が低いためである。
【００７３】
ｆ）「リーダー配列」は本明細書中で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びそれをコードするＤＮＡの特定部分を意味する。リーダー配列は、＋１位（転写が始まる場所）で始まり、コーディング領域の開始コドン（通常ＡＵＧ）の直前で終わる。リーダー配列は通常、細菌に、シャイン・ダルガノ（Shine-Delgarno）配列（ＡＧＧＡＧＧＵ）としても知られるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含有する。５’ＵＴＲは１００以上のヌクレオチド長であることがあり、３’ＵＴＲはさらに長くてもよい（最大で数キロベース長）（Molecular Cell Biology, 5th edition, Lodish et al. p113, chapter 4.2）。特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）,Vols. 1-3, Cold Spring Harbor
Laboratory Press（1989）、F.
Ausubel et al, eds.,"Current protocols in molecular biology", Green
Publishing and WileyInterscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley &Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of Gene
Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University
ofCalifornia Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th.Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed.
Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway etal., "Immunobiology"（6th
Ed.）, Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone,
New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
【００７４】
ｇ）特に他に指示がなければ、用語「免疫グロブリン配列」は、本明細書で重鎖抗体を表すのに使用されるか又は従来の４鎖抗体を表すのに使用されるかに関係なく、全長抗体、その個々の鎖、及びその全ての部分、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語で）本明細書で使用される用語「配列」は一般的に、文脈上さらなる限定的な解釈が要求される場合を除き、関連のアミノ酸配列と、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むと理解されるべきである。また、「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書中で使用される場合、上記ヌクレオチド配列を有する核酸分子も包含し、このため「ヌクレオチド配列」及び「核酸」という用語は、同等であるとみなし、本明細書中で区別なく用いられるものとする。
【００７５】
ｈ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施する。また例えば、標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びにそこで言及されるさらなる参考文献並びに例えば以下の総説、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 （5-6）: 640-56、Levin andWeiss, Mol. Biosyst. 2006,
2（1）: 49-57、Irving et al., J.Immunol. Methods, 2001,248（1-2）, 31-45、Schmitz et al., Placenta, 2000, 21
Suppl. A, S106-12、Gonzaleset al., Tumour Biol., 2005,
26（1）, 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を記載している）を参照する。
【００７６】
ｉ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
【００７７】
表Ａ−２：１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コード     
非極性非荷電（ｐＨ６．０〜７．０で）（３） 
アラニン          Ａｌａ      Ａ        
バリン            Ｖａｌ      Ｖ        
ロイシン          Ｌｅｕ      Ｌ        
イソロイシン      Ｉｌｅ      Ｉ        
フェニルアラニン  Ｐｈｅ      Ｆ        
メチオニン（１）  Ｍｅｔ      Ｍ        
トリプトファン    Ｔｒｐ      Ｗ        
プロリン          Ｐｒｏ      Ｐ        
極性非荷電（ｐＨ６．０〜７．０で）      
グリシン（２）    Ｇｌｙ      Ｇ        
セリン            Ｓｅｒ      Ｓ        
スレオニン        Ｔｈｒ      Ｔ        
システイン        Ｃｙｓ      Ｃ        
アスパラギン      Ａｓｎ      Ｎ        
グルタミン        Ｇｌｎ      Ｑ        
チロシン          Ｔｙｒ      Ｙ        
極性荷電（ｐＨ６．０〜７．０で）      
リシン            Ｌｙｓ      Ｋ        
アルギニン        Ａｒｇ      Ｒ        
ヒスチジン（４）  Ｈｉｓ      Ｈ        
アスパラギン酸    Ａｓｐ      Ｄ        
グルタミン酸      Ｇｌｕ      Ｅ        
脚注：  
（１）極性非荷電アミノ酸とみなされる場合もある。  
（２）非極性非荷電アミノ酸とみなされる場合もある。  
（３）当業者にとって明らかであるように、アミノ酸残基が、ｐＨ６．０〜７．０で荷電又は非荷電のいずれかであるとしてこの表で示されていることは、該アミノ酸残基が６．０より低いｐＨ及び／又は７．０より高いｐＨで有し得る電荷を全く考慮に入れない。当業者にとって明らかであるように、この表で言及されたアミノ酸残基はこのようなより高い又はより低いｐＨでも荷電及び／又は非荷電のいずれかであり得る。  
（４）当該技術分野で既知のようにＨｉｓ残基の電荷は、ｐＨのほんのわずかな移行にも強く依存するが、一般的にＨｉｓ残基は約６．５のｐＨで本質的に非荷電であるとみなすことができる。  
【００７８】
ｊ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、その際、第１のヌクレオチド配列に比べて、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異とみなされる。代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、欧州特許第０９６７２８４号明細書、欧州特許第１０８５０８９号明細書、国際公開第００／５５３１８号パンフレット、国際公開第００／７８９７２号パンフレット、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット及び英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書に記載されている。通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
【００７９】
ｋ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセントを算出することができ、その際、第１のアミノ酸配列に比べて、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」とみなされる。代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が類似の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットから当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びにそこで言及されるさらなる参考文献からの関連の教示に基づいて選択することができる。
【００８０】
このような保存的な置換は、好ましくは以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びその（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【００８１】
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
【００８２】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al.,
Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析に、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211,1974及びAdv.
Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された構造形成能（structure
forming potentials）の解析に、並びにEisenberget al., Proc. Nad.
Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984、Kyte & Doolittle;
JMolec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann.
Rev. Biophys. Chem. 15:321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyteret al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al.,Natural Structural
Biology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure,Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
【００８３】
ｌ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言える。
【００８４】
ｍ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差異」は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
【００８５】
ｎ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を「含む」、又は別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列「から本質的に成る」というとき、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、実際にどのように初めに言及された配列を生成又は入手するか（例えば本明細書に記載の任意の好適な方法によるものであり得る）に関係なく、その配列内にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例によって、本発明のナノボディがＣＤＲ配列を含むというとき、これは、上記ＣＤＲ配列が、本発明のナノボディに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、本発明のナノボディが、どのように該本発明のナノボディを生成又は入手するかに関係なく、その配列内に上記ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基のストレッチを含有することを意味する。後者のアミノ酸配列が具体的な生物学的又は構造的な機能を有する場合、初めに言及されたアミノ酸配列において本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を有するのが好ましい（言い換えれば、初めに言及されたアミノ酸配列は、後者の配列が本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を果たすことができるようなものであるのが好ましい）ということにも留意すべきである。例えば、本発明のナノボディがそれぞれ、ＣＤＲ配列又はフレームワーク配列を含むというとき、ＣＤＲ配列及びフレームワークはそれぞれ、上記ナノボディでＣＤＲ配列又はフレームワーク配列として機能することができるのが好ましい。また、或るヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むというとき、初めに言及されたヌクレオチド配列は、発現産物（例えばポリペプチド）に発現する場合、後者のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列が上記発現産物の一部を形成するようなもの（言い換えれば後者のヌクレオチド配列が、初めに言及されたより大きなヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内にあるようなもの）であるのが好ましい。
【００８６】
ｏ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常上記供給源又は媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分から分離されている場合、（例えばその天然の生物学的供給源及び／又はこれが得られる反応媒体又は培養媒体に比べて）「本質的な単離（形態）」であるとみなされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離された」と考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して決定すると、本質的に均一であるのが好ましい。
【００８７】
ｐ）本明細書で使用される用語「ドメイン」は概して、アミノ酸配列の球状領域（例えば抗体鎖、特に重鎖抗体の球状領域）又は本質的にこのような球状領域から成るポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。用語「結合ドメイン」は（本明細書で規定されるように）抗原決定基に指向性を有するようなドメインを表す。
【００８８】
ｑ）用語「抗原決定基」は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）によって、及びより具体的には上記分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、本明細書で区別なく使用することもできる。
【００８９】
ｒ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片若しくはエピトープに関して）と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、上記抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」、又は「に指向性を有する」と言う。
【００９０】
ｓ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合力の評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の評価基準である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で所望の抗原と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより（then）大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性（ＫＤ＝１／ＫＡ）から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤ即ち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）��ある。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値で分子相互作用の強さを特定することを、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）と関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
【００９１】
有意（例えば特異的）とみなされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、ＫＤは低くなる。ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。結合速度ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。結合速度は、二分子相互作用に関する拡散律速結合速度定数に近づきながら１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【００９２】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定され、もう１つの分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定した分子上を通る）で測定することができる。例えば、既知のビアコアの機器を使用してこれを実施することができる。測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artefact：人工産物）によって、示唆した分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかである。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性により影響され得る。
【００９３】
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子の１つの吸着に関連する、考えられ得るアーチファクトが避けられる。
【００９４】
しかし、ＫＤの正確な測定はかなりの労働集約型である可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして処理されるべきであることに留意すべきである。
【００９５】
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子との関係で結合親和性を決定するのに都合がいいと判断することができることに留意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、且つＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするためのフルオロフォア若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、又は他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持し、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化する。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃについて測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
【００９６】
ｔ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は概して、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば概して、好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドを温血動物（即ち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macacafascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macaca
mulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus）））に好適に投与する工程と、血液試料又は他の試料を上記動物から採取する工程と、上記血液試料中の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば、以下の実験部、並びに標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A
Handbookfor Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete
analysis: A Practical Approach（1996））を参照する。"Pharmacokinetics", MGibaldi & D Perron, published by
Marcel Dekker, 2nd Rev. edition（1982）も参照する。
【００９７】
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣの一方又は両方は増大しても又は増大しなくてもよい。
【００９８】
ｕ）本発明との関連で、「調節（"modulating" or "to
modulate"）」は一般的に、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定するような標的又は抗原の活性の低減若しくは阻害のいずれか、又は代替的に活性の増大を意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（通常関与する標的又は抗原によって変わる）を用いて測定するような、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上、標的又は抗原の活性を低減若しくは阻害すること、又は代替的に（関連又は対象の）生物学的活性を増大させることを意味し得る。
【００９９】
当業者にとって明らかなように、「調節」は、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下に比べて、そのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体形態若しくはヘテロ多量体形態で結び付くパートナー、又は基質の１つ又は複数に対する標的又は抗原の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又は標的又は抗原が存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）も伴い得る。当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを用いてさらにこれを求めてもよい。
【０１００】
「調節」は、標的又は抗原が関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、そのシグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、反応、機能、経路又は活性に関して変化させる（即ち標的又は抗原及び所望の生物学的作用若しくは生理学的作用に応じて、それぞれ、アゴニストとしての、アンタゴニストとしての、又は逆アゴニストとしての活性を与える）ことも意味し得る。ここでも、当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ内）アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのそのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
【０１０１】
調節は例えば、標的又は抗原のアロステリック調節、及び／又は標的若しくは抗原とその基質若しくはリガンドの１つとの結合の低減若しくは阻害及び／又は標的若しくは抗原との結合に対する基質である天然リガンドとの競合も伴い得る。調節は、標的若しくは抗原、又はこれが関与する機構若しくは経路を活性化することも伴い得る。例えば、調節は、標的若しくは抗原のフォールディング若しくは立体配座（confirmation）に関して、又は標的若しくは抗原がフォールディングする能力、（例えばリガンドの結合の際に）その立体配座を変更する能力、他の（サブ）ユニットと会合する能力、又は解離する能力に関して変化させることも伴い得る。調節は例えば、標的若しくは抗原が、他の化合物を輸送する能力、又は他の化合物（イオン等）に対するチャネルとして働く能力を変化させることも伴い得る。
【０１０２】
調節は、可逆的であっても又は不可逆的であってもよいが、薬学的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
【０１０３】
ｖ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、リガンド、受容体若しくは他の結合パートナーとの結合に関する部位、触媒部位、開裂部位、アロステリック相互作用に関する部位、標的又は抗原の多量体化（ホモマー化又はヘテロ二量体化等）に関与する部位である、標的又は抗原上の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン若しくはアミノ酸残基のストレッチ、又は標的若しくは抗原の生物学的作用又は機構に関与する標的又は抗原上の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基のストレッチを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが、（本明細書中に規定のように）標的又は抗原（及び／又は標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的作用）を調節するように結合することができる、標的又は抗原上の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基のストレッチであり得る。
【０１０４】
ｗ）アミノ酸配列又はポリペプチドは、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、及び最大１００００倍以上良好な親和性（上記のように、好適にＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度と表す）で第１の抗原と結合する場合、第２の標的又は抗原と比べて、第１の標的又は抗原「に特異的」であると言う。例えば、第１の抗原は、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合するＫＤよりも多くとも１０分の１、例えば多くとも１００分の１、及び好ましくは多くとも１０００分の１、例えば１００００分の１以下のＫＤ値で標的又は抗原と結合し得る。好ましくは、アミノ酸配列又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原に比べて第１の標的又は抗原「に特異的」である場合、そのアミノ酸配列又はポリペプチドは、（本明細書中に規定のように）上記第１の標的又は抗原に指向性を有するが、該第２の標的又は抗原に対しては指向性を有しない。
【０１０５】
ｘ）用語「交差遮断（"cross-block",
"cross-blocked" and"cross-blocking"）」は、本明細書中で区別なく使用し、アミノ酸配列又は他の結合剤（本発明のポリペプチド等）が、他の本発明のアミノ酸配列又は結合剤と所定の標的との結合を妨げる能力を意味する。本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が別のアミノ酸配列又は他の結合剤と［標的］との結合を妨げることができる範囲、ひいては本発明に従って交差遮断するということができるか否かを、競合結合アッセイを使用して求めることができる。１つの特に好ましい定量的なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるビアコア機器を使用する。別の好適な定量的な交差遮断アッセイは、標的とのこれらの結合に関して、アミノ酸配列又は別の結合剤間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【０１０６】
概して以下に、アミノ酸配列又は他の結合剤が、本発明に従って交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否かを求めるのに適したビアコアアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列又は他の結合剤のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。ビアコア機器（例えばビアコア３０００）は、製造元の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイでは、標的でコーティングされる表面を作製するのに、標準的なアミンカップリングケミストリを用いて、標的タンパク質をＣＭ５ビアコアチップと結合させる。典型的に２００個〜８００個の標的の共鳴単位をチップに結合させる（容易に測定可能なレベルの結合を与えるが、使用する試験試薬の濃度によって容易に飽和することができる量）。互いに交差遮断する能力を評価する、２つの試験アミノ酸配列（Ａ＊及びＢ＊と呼ばれる）を、好適なバッファー中で、１：１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を算出する場合、アミノ酸配列の分子量は、アミノ酸配列の全分子量を、このアミノ酸配列上の標的結合部位の数で除算したものであるとみなす。試験混合物中の各アミノ酸配列の濃度は、ビアコアチップ上に捕捉された標的分子上のこのアミノ酸配列に対する結合部位を容易に飽和するのに十分高いものとする。混合物中のアミノ酸配列は、典型的に（結合部位ベースで）１．００マイクロモル〜１．５マイクロモルである（結合ベースの）モル濃度と同じである。Ａ＊及びＢ＊を単独で含有する分離溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、試験混合物と同じバッファー中で、且つ試験混合物と同じ濃度であるとする。試験混合物を標的コーティングビアコアチップ上に通し、結合総量を記録する。それから、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を取り除くようにチップを処理する。典型的に、チップを３０ｍＭのＨＣｌで６０秒間処理することによってこれを行う。その後、Ａ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。さらに、チップを処理し、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を全て取り除く。それから、Ｂ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。次に、Ａ＊とＢ＊との混合物の最大理論結合を算出し、これは単独で標的表面上を通した際の各アミノ酸配列の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論最大よりも小さい場合、２つのアミノ酸配列は互いに交差遮断している。このように概して、交差遮断する本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤は、アッセイ中、及び本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で、記録された結合が、組合せた２つのアミノ酸配列又は結合剤の最大理論結合（直前に規定）の８０％〜０．１％（例えば８０％〜４％）、具体的に最大理論結合の７５％〜０．１％（例えば７５％〜４％）、及びより具体的に最大理論結合の７０％〜０．１％（例えば７０％〜４％）であるように、上記のビアコア交差遮断アッセイで標的と結合するものである。上記のビアコアアッセイは、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差遮断するかどうかを求めるのに使用する主なアッセイである。稀に、特定のアミノ酸配列又は他の結合剤が、ＣＭ５ビアコアチップとアミンケミストリを介して結合した標的と結合しないことがある（通常、標的上の関連の結合部位がチップとの結合によって塞がれるか、又は破壊される場合にこれが起こる）。このような場合、標識型、例えばＮ末端Ｈｉｓ標識型の標的（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA；２００５  ｃａｔ＃  １４０６−ＳＴ−０２５）を用いて交差遮断を求めることができる。この特定のフォーマットで、抗Ｈｉｓアミノ酸配列をビアコアチップに結合させた後、Ｈｉｓ標識した標的をチップの表面上に通し、抗Ｈｉｓアミノ酸配列で捕捉する。各チップ再生サイクル後に、抗Ｈｉｓアミノ酸配列コーティング表面上に、新たなＨｉｓ標識した標的を充填し戻すことを除いて、本質的に上記のように、交差遮断解析を行う。Ｎ末端Ｈｉｓ標識した［標的］を使用する与えられた例の他に、代替的にＣ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用することができる。さらに、当該技術分野で既知の様々な他の標識及び標識結合タンパク質の組合せをこのような交差遮断解析に使用することができる（例えば、抗ＨＡ抗体によるＨＡ標識；抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ標識；ストレプトアビジンによるビオチン標識）。
【０１０７】
概して以下に、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は他の結合剤が、本明細書中に規定のように、交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否か求めるＥＬＩＳＡアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列（又は本発明のポリペプチド等の他の結合剤）のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。このアッセイの一般原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングした標的に指向性を有するアミノ酸配列又は結合剤を有することである。過剰量の第２の、潜在的に交差遮断する抗標的アミノ酸配列を溶液中に添加する（即ちＥＬＩＳＡプレートと結合しない）。それから、限定量の標的をウェルに添加する。コーティングしたアミノ酸配列と溶液中のアミノ酸配列とは、限定数の標的分子の結合に対して競合する。プレートを洗浄し、コーティングしたアミノ酸配列と結合していない過剰な標的を取り除き、また第２の溶液相のアミノ酸配列及び第２の溶液相のアミノ酸配列と標的との間に形成される任意の複合体を取り除く。その後、標的を検出するのに適切な試薬を使用して、結合標的の量を測定する。コーティングしたアミノ酸配列を交差遮断することができる溶液中のアミノ酸配列によって、第２の溶液相のアミノ酸配列の非存在下でコーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数に比べて、コーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数を低減させることができる。アミノ酸配列を固定化させるように、第１のアミノ酸配列、例えばＡｂ−Ｘを選択する場合、第１のアミノ酸配列をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後、プレートを好適な遮断溶液で遮断し、その後添加する試薬の非特異的な結合を最小にする。Ａｂ−Ｙ［標的］結合部位の１つのウェル当たりのモル数が、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中に使用したＡｂ−Ｘ［標的］結合部位の１つのウェル当たりのモル数の少なくとも１０倍になるように、その後、過剰量の第２のアミノ酸配列、即ちＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。それから、添加した［標的］の１つのウェル当たりのモル数が、各ウェルをコーティングするのに使用したＡｂ−Ｘ［標的］結合部位のモル数の多くとも２５分の１になるように、［標的］を添加する。好適なインキュベート期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出する試薬を添加し、コーティングした抗［標的］アミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）と特異的に結合した標的の量を測定する。アッセイに関するバックグラウンドシグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｙ）、［標的］バッファーのみ（即ち標的が存在しない）及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。アッセイに関する陽性対照シグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列バッファーのみ（即ち第２の溶液相のアミノ酸配列が存在しない）、標的及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍になるように、ＥＬＩＳＡアッセイを行い得る。どのアミノ酸配列をコーティングアミノ酸配列として使用し、どのアミノ酸配列を第２の（競合）アミノ酸配列として使用するかという選択に起因する任意のアーチファクト（例えば有意に異なる、［標的］に対するＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙとの親和性）を避けるために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットで行い得る：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｙが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合であり、また２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｘが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１又はフォーマット２のいずれかで、溶液相の抗標的アミノ酸配列が、溶液相の抗標的アミノ酸配列の非存在下で得られた標的検出シグナル（即ち陽性対照ウェル）に比べて、標的検出シグナル（即ちコーティングしたアミノ酸配列で結合した標的の量）の６０％〜１００％、具体的に７０％〜１００％、及びより具体的に８０％〜１００％の低減をもたらすことができる場合、交差遮断すると定義する。
【０１０８】
ｙ）本明細書でさらに記載されるように、ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１３０の範囲内、好ましくは１１２〜１１５、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディの部分、断片、類似体又は誘導体（本明細書中にさらに記載されたように）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意すべきである。
【０１０９】
ｚ）ナノボディのアミノ酸残基は、一般的に、特に他に指示がなければ、Riechmann and
Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 （1-2）:185-195の論文（例えばこの論文の図２を参照されたい）においてラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるように、又は本明細書に参照されるようにKabatet al. （"Sequence of proteins of
immunological interest", US PublicHealth Services, NIH Bethesda, MD,
Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従うと、ナノボディのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（即ちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングで可能な数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）ことに留意すべきである。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）ということができる］。
【０１１０】
ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ由来のＶＨＨドメイン及びナノボディに適用することもできる）は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883（1989））によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、態様及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmannand MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
【０１１１】
ａａ）本明細書中で言及される安定性は、経時的な化学的安定性、すなわち本発明のタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの一次構造配列の安定性に関する。例えば、当業者が対象の化合物を試験し、タンパク質又はポリペプチドの一次配列、例えば一次アミノ酸配列において経時的な変化を全く（又は例えばＲＰＣ又はＨＩＣ等の分離法により、所定の試料においてわずかの変化、例えば１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満の他の材料しか）見出すことができなかった場合、タンパク質又はポリペプチドは、測定期間にわたって、例えば温度等の所定の条件で安定であるとみなす。
【０１１２】
ｂｂ）図面、配列表及び実験部／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈すべきではない。
【０１１３】
これらに限定されないが、ナノボディ、（単一）ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」は４鎖抗体の可変領域、及び重鎖抗体の可変領域に由来し得る。以下の参考文献で使用される専門用語に従って、天然重鎖抗体に存在する可変ドメインは、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（以下「ＶＨドメイン」と表す）と、従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（以下、「ＶＬドメイン」と表す）とから区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも表される。
【０１１４】
このため、これらに限定されないが、本発明のポリペプチド又はタンパク質は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とを含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列を有する。このようなアミノ酸配列は、８０個〜２００個のアミノ酸残基、例えば９０個〜１５０個のアミノ酸残基、例えば約１００個〜１３０個のアミノ酸残基を含有するのが好ましい（が、このようなアミノ酸配列の好適な断片を、すなわち本質的に本明細書中で本発明のナノボディ又はそれとの均等物に関して記載のように使用してもよい）。またこのようなアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを形成するようなもの、又は好適な条件下で（すなわち好適なフォールディングで）、免疫グロブリンフォールドを形成することが可能であるようなものが好ましい。アミノ酸配列は、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」から選択されるのが好ましく、本明細書中で規定のナノボディであるのが最も好ましい。ＣＤＲは、ポリペプチド又はタンパク質に所望の特性を与える任意の好適なＣＤＲであり得る。
【０１１５】
本発明のさらなる利点は、本発明のポリペプチド、特にナノボディのポリペプチドを、本発明に従って安定化した免疫原性が低い形態で作製することができることである。したがって本発明によるプロセスは、主として組換えポリペプチドハイブリッドの治療的使用に重要である。
【０１１６】
さらに本発明のポリペプチドは、免疫系における選択により非常に多くのエフェクター機能に適合するように個別で作製する（tailor-made）ことができる。この天然タンパク質工学システムには無類の効率がある。特別な機能的単一可変ドメインの細胞質発現により、このようなエフェクター機能を細胞に導入することが可能になる。細胞タンパク質の活性の調整をもたらす適用が好都合である。これは例えば、タンパク質−単一可変ドメイン複合体形成により標的タンパク質を安定化させることで達成することができる。これにより、分解速度を変化させることができる。アロステリックなエフェクター作用も考えられ得る。三重複合体の形成及び安定化による２つのエフェクターの接近が、例えば人工多酵素複合体による代謝経路に影響を与えるさらなる可能性、又は誘導性オペレーターの代謝産物濃度の局所増大を生ずる。しかしながら、触媒抗体の細胞質発現が特に有利であり、触媒効率の選択に関連する可能性がある。機能的単一可変ドメインの細胞質発現を、本発明に従って安定化したポリペプチドで単純に達成することができる。
【０１１７】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸は、それ自体が既知であり、本明細書中のさらなる説明により当業者にとって明らかである方法で調製することができる。例えば、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の調製のためのそれ自体が既知の任意の方法で調製することができる。アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸を調製するための、好ましいが非限定的な幾つかの方法としては、本明細書中に記載の方法及び技法が挙げられる。
【０１１８】
本発明の他の実施の形態は、本明細書中に記載の方法により誘導される、又は得ることができる、又は直接得ることができる、タンパク質、ポリペプチド、単一可変ドメイン、ライブラリ、ヌクレオチド又はその選択物である。
【０１１９】
当業者にとって明らかであるように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドの調製に特に有用な一方法は通常、
ｉ）好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書中では「本発明の宿主」とも呼ぶ）において、又は本発明の上記アミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書中では「本発明の核酸」とも呼ぶ）に適切な別の発現系において、発現させる工程と、場合によってはその後、
ｉｉ）このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含む。
【０１２０】
特に、このような方法は、
ｉ）本発明の上記宿主が少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持する工程と、場合によってはその後、
ｉｉ）このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含み得る。
【０１２１】
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態をとることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態をとる。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合しているコドンの使用によるＤＮＡ等）であってもよい。
【０１２２】
本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書中に記載したように、本質的に単離形態である。本発明の核酸は、例えば、プラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクターの形態をとり、ベクター中に存在し、及び／又はその一部であってもよく、また本質的に単離形態であってもよい。本発明の核酸は、本明細書中に記載の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製するか又は得ることができ、及び／又は好適な天然供給源から単離することができる。類似体を得るためには、天然型ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列に、例えば、部位特異的な突然変異誘発を起こして、上記類似体をコードする本発明の核酸を得ることができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を好適な方法で連結することができる。本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然型配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の結合（combining）、切断された発現産物を発現させる変異の導入、（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を生成するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は、１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による変異の導入が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrooket al.及びAusubel et al.の文献等の標準的なハンドブック、及び以下の実施例を参照する。
【０１２３】
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態をとり、遺伝子構築物中に存在し、及び／又はその一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、例えば、１つ又は複数の好適な調節要素（例えば、好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等といった、１つ又は複数のそれ自体が既知の遺伝子構築物の要素に、場合によっては連結する少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
【０１２４】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、目的とする宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における単独での複製、維持及び／又は継承に好適な形態もとり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態をとることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系での）発現を提供し得るベクターであってもよい。
【０１２５】
好ましいが非限定的な一態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ｉ）ｉｉ）と作用可能に結合している少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｉｉ）プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の、１つ又は複数の調節要素と、場合によってはさらに
ｉｉｉ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における（本明細書中に詳述するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば、３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば、使用する構築物の種類、目的とする宿主細胞又は宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換法に応じ得る。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の制御配列（requences）、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に同様の方法で使用してもよい。
【０１２６】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記調節要素、及び場合によっては上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、これにより通常、これらは互いに機能的な関係にあることが意図されている。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写及び／又は発現を、開始又は他の方法により制御／調節することができる場合（上記コーディング配列は、上記プロモーター「に制御されている」ものとして理解されたい）、コーディング配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同じ配向を有し、また通常、同じリーディングフレーム内にある。また、必ずしも必要ではないが、通常、これらは本質的に隣接している。
【０１２７】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節要素及びさらなる要素は、目的とする宿主細胞又は宿主生物において意図される生物学的機能を付与することができるほどのものである。
【０１２８】
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、目的とする宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」でなければならず、このため（例えば）、上記プロモーターは、（本明細書で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコーディング配列）の転写及び／又は発現を、開始、又は他の方法により制御／調節することができるものであると意図される。
【０１２９】
特に好ましい幾つかのプロモーターとしては、本明細書中に述べた宿主細胞における発現のためのそれ自体が既知のプロモーター、特に、本明細書中に述べたもの及び／又は実施例において使用されるもの等の、細菌細胞における発現のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
選択マーカーは、（即ち、適切な選択条件下で）本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（首尾良く）起こった宿主細胞及び／又は宿主生物を、形質転換が（首尾良く）起こらなかった宿主細胞／宿主生物と区別できるようなものでなければならない。このようなマーカーの好ましいが非限定的な幾つかの例は、抗生物質（カナマイシン又はアンピシリン等）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、又は形質転換されていない細胞又は生物が生存する上で不可欠な、培地中の或る種の因子、化合物及び／又は（食品）成分がない状態で宿主細胞又は宿主生物を維持させる遺伝子である。
【０１３１】
リーダー配列は、（目的とする宿主細胞又は宿主生物において）所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに配向させるようなものでなければならない。また、リーダー配列は、上記細胞から発現生成物を分泌させてもよい。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物中で作用可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であってもよい。リーダー配列は、細菌細胞中で発現しなくてもよい。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知であるリーダー配列を、本質的に同様の方法で使用することができる。
【０１３２】
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、（宿主細胞又は宿主生物中で）遺伝子構築物（に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、例えば、細胞の特定の部分又はオルガネラに、及び／又は多細胞生物の特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、又は部分（複数可）に局在化させてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列とのタンパク質融合として発現されてもよい。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が挙げられる。
【０１３３】
好適なプロモーター、ターミネーター、及びさらなる要素の好ましいが非限定的な幾つかの例としては、本明細書中に記載した宿主細胞における発現に使用することができるもの、及び具体的には本明細書中に論じ、及び／又は下記の実施例で用いられているもの等の細菌細胞における発現に好適であるものが挙げられる。ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物中に存在／使用し得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及びさらなる要素についての（さらなる）非限定的な幾つかの例については、上記Sambrook et al.及びAusubel et al.文献等の概説ハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９６／２３８１０号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９５／２１１９１号パンフレット、国際公開第９７／１１０９４号パンフレット、国際公開第９７／４２３２０号パンフレット、国際公開第９８／０６７３７号パンフレット、国際公開第９８／２１３５５号パンフレット、米国特許第７２０７４１０号明細書、米国特許第５６９３４９２号明細書、及び欧州特許第１０８５０８９号明細書に示された例を参照する。他の例は当業者にとって明らかであろう。上記の一般的な背景技術に関する参考文献及び本明細書中にさらに引用した参考文献も参照する。
【０１３４】
本発明の遺伝子構築物は、通常、例えば、上記Sambrook et al.及びAusubel et al. 文献等の概説ハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記のさらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的な幾つかの例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に記載したものである。
【０１３５】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に、即ち本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現及び／又は産生させるために使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核細胞若しくは細胞株又は真核細胞若しくは細胞株、又は任意の好適な真菌、原核生物若しくは真核生物、例えば：
大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の菌株、蛍光菌等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、及び枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の菌株、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcuscarnosus）等のブドウ球菌の菌株、及び乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌株が挙げられるがこれらに限定されない細菌株、
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属、アカパンカビ等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ（Sordariamacrospora）等のソルダリア属、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus
niger）又はショウユコウジカビ等のアスペルギルス属の種由来の細胞、又は他の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない真菌細胞、
出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomycespombe）等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス又はピキア・メタノリカ等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス（Arxulaadeninivorans）等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia
lipolytica）等のヤロウィア属の種由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
シロイチモンジヨトウＳＦ９及びＳｆ２１細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞／細胞株、又はシュナイダー細胞及びＫｃ細胞等のショウジョウバエに由来する細胞／細胞株等の昆虫に由来する細胞又は細胞株、
タバコ植物等の植物又は植物細胞、及び／又は
例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−２１細胞等）、及びＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞等）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳動物に由来する細胞又は細胞株等の哺乳動物細胞又は細胞株、並びに、
抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）を発現及び産生することでそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した一般的な背景技術に関する文献、並びに例えば、国際公開第９４／２９４５７号パンフレット、国際公開第９６／３４１０３号パンフレット、国際公開第９９／４２０７７号パンフレット、Frenken et al.（1998）（上記）、Riechmann and Muyldermans （1999）（上記）、vander Linden （2000）（上記）、Thomassen et al.（2002）（上記）、Joosten et al.（2003）（上記）、Joostenet al.（2005）（上記）及び本明細書中にさらに引用した文献を参照する。
【０１３６】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはまた、例えば予防目的及び／又は治療目的（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１つ又は複数の細胞、組織、又は器官に導入し、発現させることができる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えば、このように（例えば、リポソームを用いて）、又は好適な（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス等のレトロウイルスに由来する）遺伝子治療用ベクターに挿入後、任意の好適な方法で細胞又は組織に導入することができる。また当業者にとって明らかであるように、このような遺伝子治療は、本発明の核酸又は本発明の核酸をコードする好適な遺伝子治療用ベクターを、患者又は患者の特定の細胞又は特定の組織若しくは器官に投与することにより患者の身体において、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができ、又は好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物又は組織生検試料等の、治療対象となる患者の身体から採取された）細胞は、本発明のヌクレオチド配列を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した後、患者の身体に好適に（再）導入することができる。これらは全て、例えばCulver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary
AnnLiebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano,
Nature F Medicine 2 （1996）,534-539、Schaper, Circ. Res. 79 （1996）, 911-919、Anderson, Science 256 （1992）, 808-813、Verma,Nature
389 （1994）, 239、Isner, Lancet 348 （1996）, 370-374、Muhlhauser, Circ. Res.77 （1995）, 1077-1086、Onodera,
Blood 91; （1998）, 30-36、Verma, Gene Ther. 5 （1998）,692-699、Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 （1997）, 289-292、Verzeletti,
Hum. GeneTher. 9 （1998）,
2243-51、Wang, Nature Medicine 2 （1996）, 714-716、国際公開第９４／２９４６９号パンフレット、国際公開第９７／００９５７号パンフレット、米国特許第５５８０８５９号明細書、米国特許第５５８９５４６６号明細書、又はSchaper,Current Opinion in Biotechnology 7 （1996）, 635-640に記載の当業者に既知の遺伝子治療用ベクター、技法、及びデリバリーシステムを用いて行うことができる。例えば、ＳｃＦｖ断片（Afanasievaet al., Gene Ther., 10, 1850-1859 （2003））及びダイアボディ（Blanco et al., J.
Immunol,171, 1070-1077 （2003））のｉｎ  ｓｉｔｕ発現は当該技術分野において記述されている。
【０１３７】
細胞中でのナノボディの発現のために、これらは、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット、及び米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット、Cattaneo, A.及びBiocca, S. （1997） Intracellular Antibodies:Development
and Applications. Landes and Springer-Verlag、並びにKontermann,
Methods34, （2004）, 163-170に記載の、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることもできる。
【０１３８】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの母乳中のようなトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳動物に導入する一般的な技法については、例えば、米国特許第６７４１９５７号明細書、米国特許第６３０４４８９号明細書、及び米国特許第６８４９９９２号明細書を参照されたい）、葉、花、果実、種、根、塊茎を含むがこれらに限定されない植物、又は植物の一部中（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）、又は、例えば、カイコガの蛹中で産生することもできる。
【０１３９】
さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、細胞を含まない発現系で発現及び／又は産生してもよく、このような系の好適な例は当業者にとって明らかであろう。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、小麦胚芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はZubayの方法による大腸菌を用いた系での発現が挙げられる。
【０１４０】
上記のように、ナノボディを使用する利点の１つは、これに基づくポリペプチドを、好適な細菌系における発現によって調製することができる点であり、及び好適な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節要素等は、例えば上記で引用した参考文献によって当業者にとって明らかであろう。しかしながら、本発明は、最も広い意味では細菌系における発現に限定されないことに留意されたい。
【０１４１】
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ）発現系を使用し、このような発現系も当業者にとって明らかであろう。さらに当業者にとって明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することができる。
【０１４２】
工業的スケールでの製造において、ナノボディ又はナノボディを含有するタンパク質治療剤の（工業的）製造のために好ましい異種宿主としては、大規模スケールでの発現／産生／発酵、特に大規模スケール（即ち、ＧＭＰグレード）での医薬用途発現／産生／発酵に適した大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。このような菌株の好適な例は、当業者にとって明らかであろう。このような菌株及び産生／発現系も、Biovitrum社（Uppsala, Sweden）等の企業から入手可能である。
【０１４３】
代替的には、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模スケールでの発現／産生／発酵、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／発酵のために用いることができる。さらにこのような発現／産生系も、上記の幾つかの企業から入手可能である。
【０１４４】
特定の発現系の選択は、或る特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要条件に一部依存している。グリコシル化が望ましいか又は必要とされるナノボディを含有する組換えタンパク質の産生には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現用宿主の使用が必要である。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（即ち、結合する残基の種類、数、及び位置）が、発現に用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞若しくは細胞株（即ち、本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）が用いられるか、又は本質的に及び／又は機能的にヒトのグリコシル化と同一であるか、又は少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与えることができる別の哺乳動物の細胞株が用いられる。一般に、大腸菌等の原核宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等真核細胞を使用すると、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上記宿主細胞及び発現系の全てを、得ようとする所望のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
【０１４５】
したがって、本発明の非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化される。本発明の別の非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化されない。
【０１４６】
本発明の好ましいが非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細菌細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の株の細胞等の細菌細胞中で産生する。
【０１４７】
本発明の好ましいが非限定的な別の態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、酵母細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の種の細胞等の酵母細胞中で産生する。
【０１４８】
本発明のさらに好ましいが非限定的な別の態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、哺乳動物細胞中、具体的にはヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で、さらに具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の細胞株等のヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で産生する。
【０１４９】
宿主細胞中での発現が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの製造に用いられる場合、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞内（例えば、サイトゾル中、ペリプラズム（periplasma）中、又は封入体中）で産生し、次いで宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製してもよく、又は細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で産生し、次いで培地から単離し、場合によってはさらに精製してもよい。真核宿主細胞を使用する場合、得られるナノボディ及びタンパク質のさらなる単離及び下流工程での処理が大幅に容易になるため、通常、細胞外で産生されることが好ましい。通常、大腸菌の菌株等の上記細菌細胞は、毒素及び溶血素等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌せず、大腸菌において分泌物を産生することは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を転移させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して、幾つかの利点がある。例えば、分泌産物のＮ末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一であってもよい。また、ペリプラズム中では、細胞質中よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中では、タンパク質の汚染が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境をもたらすため、正しくジスルフィド結合が形成される可能性があるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、不溶性の凝集物、いわゆる封入体中に見られることが多い。これらの封入体は、サイトゾル中にもペリプラズム中にも存在させることができ、これらの封入体からの生理活性タンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを必要とする。治療効果を有するタンパク質を含む多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。代替的には、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを分泌するように遺伝的に改変された細菌の組換え菌株を用いることができる。
【０１５０】
したがって、本発明の非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞内で産生され、宿主細胞から、特に細菌細胞から、又は細菌細胞中の封入体から単離したアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。本発明の別の非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。
【０１５１】
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのプロモーターとしては、
大腸菌における発現のための：ｌａｃプロモーター（及び、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のこれらの誘導体）；アラビノースプロモーター；λファージの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター；ｔｒｐオペロンのプロモーター；ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）；Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７−ファージ遺伝子１０のプロモーター）；及び他のＴ−ファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター；外来制御オペレーター配列の１つ又は複数の複製を含む上記プロモーターの組換え変異体；
出芽酵母における発現のための：ＡＤＨ１（アルコール脱水素酵素１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃ  ｉｓｏ−１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター；ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコール脱水素酵素２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター；ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の異種プロモーター；
ピキア・パストリスにおける発現のための：ＡＯＸ１プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
哺乳動物細胞における発現のための：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター；プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ  ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１５２】
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのベクターとしては、
哺乳動物細胞における発現のためのベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系；
細菌細胞における発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
酵母又は他の真菌細胞における発現のためのベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）；
昆虫細胞における発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
植物又は植物細胞における発現のためのベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスに基づくベクター、アグロバクテリウムの好適な菌株又はＴｉ-プラスミドに基づくベクターが挙げられる。
【０１５３】
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で使用するための分泌配列としては、
大腸菌等の細菌細胞における使用のための：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモリシンＣ−末端分泌シグナル；
酵母における使用のための：α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
哺乳動物細胞における使用のための：固有シグナル（標的タンパク質が真核細胞由来である場合）、マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド等が挙げられる。
【０１５４】
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するのに好適な技法は、当業者にとって明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存することもある。同様に、上記ハンドブック及び特許出願を参照する。
【０１５５】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によってうまく形質転換された宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択する工程を実行することができる。この工程は、例えば、本発明の遺伝子構築物中にある選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、又は、例えば、特異的抗体を使用する本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であってもよい。
【０１５６】
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の（or）形態をとることができる）又は宿主生物（安定な変異体系列又は株の形態をとることができる）は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１５７】
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官において）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現し、又は（少なくとも）（例えば、好適な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含んでおり、これらは、例えば、細胞分裂又は有性若しくは無性生殖により得られるものであってよい。
【０１５８】
本発明のアミノ酸配列を生成し／その発現を得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが発現／産生されるような条件下で飼育、維持及び／又は培養され得る。好適な条件は当業者にとって明らかであり、通常、使用する宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する調節因子に依存する。この場合にも、本発明の遺伝子構築物に関する上記の段落に記載したハンドブック及び特許出願を参照する。
【０１５９】
一般に、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌及び／又は好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、及び場合によっては好適な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターにより制御される場合）が含まれることができ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、構成的に、一時的に、又は適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
【０１６０】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、（まず）未成熟型（上記）で産生され、次いで、使用する宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよいことも、当業者にとって明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、この場合にも、使用する宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
【０１６１】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は該宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動法、分別沈殿法、アフィニティ法（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いる）、及び／又は分取免疫法（即ち、単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いる）等の、それ自体が既知のタンパク質の単離技法及び／又は精製技法を用いて単離することができる。
【０１６２】
一般に、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる薬理活性ポリペプチド及び／又は化合物を含む薬学的調製剤又は薬学的組成物として製剤化することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、局所投与のため、吸入による、経皮パッチによる、インプラントによる、座剤等による投与のために適した形態をとることができる。このような好適な投与形態（投与の方法に応じて、固体、半固体又は液体であってよい）と、その調製剤で用いるための方法及び担体とは、当業者にとって明らかであり、本明細書にさらに記載する。
【０１６３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、少なくとも１つの本発明のナノボディ又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び少なくとも１つの好適な（即ち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤を含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質を含有する薬学的組成物に関する。
【０１６４】
概して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により製剤化及び投与することができ、これらについては、例えば、上記で引用した一般的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.,
MackPublishing Company, USA （1990）若しくはRemington, the Science and Practice ofPharmacy, 21th Edition,
Lippincott Williams and Wilkins （2005）等の標準的なハンドブックを参照する。
【０１６５】
例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（例えばＳｃＦｖ及びダイアボディ）及び他の薬理活性タンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で製剤化及び投与することができる。このような製剤及びこれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内若しくは髄腔内投与）又は局所（即ち経皮若しくは皮内）投与に好適な調製剤が挙げられる。
【０１６６】
非経口投与のための調製剤は、例えば、点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製剤に好適な担体又は希釈剤としては、例えば、限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は（or as well as）鉱物油、動物油、及び植物油、例えば、落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
【０１６７】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば、その全文が参照により援用される米国特許第５３９９３４６号明細書を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、且つ細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
【０１６８】
このように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は担体等の薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わせて、例えば、経口的に全身投与することができる。これらを、ハード若しくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製剤は、少なくとも０．１％の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有していなければならない。組成物及び調製剤中のこれらの割合は、当然ながら変えることができ、便宜的には所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であろう。このような治療上有用な組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
【０１６９】
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース若しくはアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油若しくはチェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体状の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存料としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、任意の単位投薬形態の調製に使用される任意の物質は、薬学的に許容可能であり、使用する量において実質的に無毒でなければならない。さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、徐放剤及び装置中に封入されていてもよい。
【０１７０】
経口投与のための調製剤及び製剤には、本発明の構築物が胃内環境に耐性を有し且つ腸内を通過することを可能にする腸溶コーティングが付与されることもある。より包括的には、経口投与のための調製剤及び製剤は、消化管のいずれかの所望部分に送達するのに好適に製剤化され得る。また、消化管に送達するのに好適な坐薬を使用してもよい。
【０１７１】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの溶液、又はこれらの塩は、水中で調製することがき、任意で非毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びこれらの混合物中、並びに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有している。
【０１７２】
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液剤又は分散液剤の即時調製に適し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌水溶液剤又は分散液剤又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定でなければならない。液体の担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を妨害することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、砂糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
【０１７３】
滅菌注射可能な溶液剤は、所要の量の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に混合させた後、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び先に滅菌濾過された溶液剤中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
【０１７４】
局所投与のためには、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、概して、これらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
【０１７５】
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル又はグリコール又は水−アルコール／グリコール配合物が挙げられ、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、場合によっては非毒性界面活性剤の助けにより、有効なレベルで溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及び他の抗菌剤等の補助剤を加えてもよい。得られる液体組成物は、ばんそうこう及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって塗布することができ、又はポンプ型又はエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
【０１７６】
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することもできる。
【０１７７】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は当業者に既知であり、例えば、Jacquet et al.（米国特許第４６０８３９２号明細書）、Geria（米国特許第４９９２４７８号明細書）、Smith etal.（米国特許第４５５９１５７号明細書）及びWortzman（米国特許第４８２０５０８号明細書）を参照されたい。
【０１７８】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの有用な用量は、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は当業者に既知であり、例えば、米国特許第４９３８９４９号明細書を参照されたい。
【０１７９】
概して、ローション等の液体組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
【０１８０】
治療における使用に必要な本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの量は、選択される特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドだけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの用量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
【０１８１】
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば、１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔で投与される分割用量で示され得る。部分用量自体を、例えば、吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与等の、大まかな間隔の数多くの別々の投与にさらに分割してもよい。
【０１８２】
本発明に従って安定化したポリペプチドを、例えば癌及び感染の治療において、抗毒素として、薬剤標的化のための及び遺伝子治療での全ての適用分野で有利に使用することができる。画像化及び診断での使用は、例えば抗原結合物質を解析するために等しく有利である。
【０１８３】
本発明によるプロセスは、例えば、ヒト化又はキメラ単一可変ドメイン等の他の理由で既に修飾されている単一可変ドメインを安定化するのに特に有利である。アミノ酸のこの修飾が、不安定化をもたらす可能性があり、本発明によるプロセスが、ＣＤＲ領域の外側にあるこれらの単一可変ドメインのさらなる修飾により単一可変ドメインの元の安定性を回復又はさらに改善させることができる。
【０１８４】
本発明は、天然免疫グロブリン配列が配列のカノニカルコレクションであり、その総数が単一可変ドメイン機能の全ての態様に適合性を有する必要があることを前提とする。
【０１８５】
本発明は、以下の実験部、図面、表及び配列プロトコルでより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】プレピーク及びポストピークとして現れる（すなわち主ピークの前後で溶出する）生成物関連の物質を示す、配列番号１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの拡大図である。配列番号１マスター参照標準、バッチ１に存在するピークの標識化に使用する命名を示す。
【図２】−７０℃、＋５℃及び＋２５℃での０ヶ月、１ヶ月及び２ヶ月の保存後の配列番号１バッチ２のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの関連部分を示す図である。
【図３】３７℃での０週間、４週間及び８週間のインキュベーション後の配列番号１バッチ１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの関連部分を示す図である。
【図４】二価ナノボディ（登録商標）配列番号１の一価の構成要素である配列番号２のアミノ酸配列及び順序ナンバリングを示す図である。配列番号１は、３つのアラニン残基のリンカー越しに頭尾（head-to-tail）融合する、配列番号２免疫グロブリンドメインの２つの同一コピーから成る単一ポリペプチド鎖である（合計２５９残基）。ＣＤＲ領域を下線処理する。本発明の報告で検討される残基を強調する。これらの残基を一価の配列番号２での位置に従ってナンバリングする、すなわちＥ１、Ｍ３４、Ｍ７８、Ｍ８３、Ｄ６２／Ｓ６３、Ｄ１０５／Ｇ１０６及びＮ８４／Ｓ８５。読み手は、配列番号１との関連では、これらの指定が２つの同等位置（２つの同一のドメインそれぞれに１つ）を表すこと、例えば、Ｍ３４は配列番号１において１６５位に存在するメチオニン残基も表すことを理解する。また、このナンバリングは本願において他の箇所においても言及されるカバットナンバリングシステムとは対応していないことが指摘される。
【図５】時間０での（青色のクロマトグラム）及び３７℃で８週間のインキュベーション後の（赤色のクロマトグラム）２１４ｎｍで記録された、配列番号１バッチ１のトリプシン消化のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを表す図である。現在まで特徴付けされている様々なピークを標識し、それらの同一性を表Ｂ−３に示す。標識されていないピークの同一性は求めずにおく。Ｔ１２よりも遅れて溶出するピークは部分消化生成物であると考えられ、また無傷の配列番号１はおよそ９０分で溶出する。
【図６】意図的に酸化した（点線）及び参照（実線、バッチ１）配列番号１のＲＰＣクロマトグラムの関連部分の比較を示す図である。挿入図は連続した強制酸化後のプロファイルを示す。明らかに、単酸化（＋１６Ｄａ）配列番号１だけでなく、二重酸化（＋３２Ｄａ）配列番号１もＨ２Ｏ２による処理の過程で形成される。
【図７】過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、下部パネル）及び第三級ブチルヒドロキシペルオキシド（ＴＢＨＰ、上部パネル）による変性（unfolded）及び未変性の配列番号２の意図的な酸化を示す図である。４Ｍの塩酸グアニジン（Ｇｕａ．ＨＣｌ）の存在下、ＴＢＨＰで処理すると配列番号１が容易に酸化し、過酸化水素ではさらにより容易に酸化する。非酸化材料（すなわち右端のピーク）に加えて、７つのピークをＲＰＣクロマトグラムで識別することができる。ＭＳ解析（データ図示せず）は、これら７つのピークが３つの起こり得る単酸化形態（＋１６Ｄａ）、３つの異なる二重酸化変異型（＋３２Ｄａ）、及び最後に左端の三重酸化種（＋４８Ｄａ）を表すことを示した。Ｄ−ＰＢＳにおいて配列番号２で酸化が行われる際に得られたプロファイルは、未変性の配列番号２分子においては基本的に単一のメチオニン残基だけが酸化されやすいことをはっきりと示している。小さいピークは、第２のメチオニン残基がＨ２Ｏ２処理に対して多少感受性があることの証拠と考えられ得る。図８におけるＨ２Ｏ２処理Ｍ７８Ａ突然変異型のＲＰＣプロファイルにより、この考えが確かめられる。ＲＰＣ解析の前に、様々な混合物をＳＥＣ（ＮＡＰ５脱塩カラム、GEHealthcare）にかけた。
【図８】配列番号２野生型（ｗｔ）と３つの異なるＭ→Ａ突然変異型との意図的な酸化を示す図である。それぞれの場合において、非処理変異型のＲＰＣプロファイル（青色）を、第三級ブチルヒドロキシペルオキシド（ＴＢＨＰ、緑色）又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、赤色）のいずれかによる酸化の後に得られたクロマトグラムと比較する。本実験で使用したｗｔ配列番号２のバッチは、（図７と比較して）汚染物質を含有していると考えられることに留意されたい。ＲＰＣ解析の前に、様々な混合物をＳＥＣ（ＮＡＰ５脱塩カラム、GE Healthcare）にかけた。
【図９】ノルロイシン残基による全てのメチオニンの全体的な置き換えを用いた配列番号１変異型のＲＰＣ（左側のパネル）及びＭＳ（右側のパネル）解析結果を示す図である。左側のパネルは、ｗｔ配列番号１（２．５μｇのバッチ１）及びノルロイシン変異型（２５μｇ）のＲＰＣプロファイルのオーバーレイを示す。外見上、ノルロイシン変異型の調製は、全ての起こり得る部分置換した変異型、及び幾つかのｗｔ配列番号１を含む（詳細に関しては本文を参照されたい。組み込まれるノルロイシンの数に従って様々な種が標識化される）。以下の分子量を実験で求めた：２７８７６（ｗｔ、予測分子量  ２７８７６）；２７８２３．５（３、３つのノルロイシンを有する変異型の予測分子量は２７８２２である）；２７８０５（４、予測分子量  ２７８０４）；２７７８６．５（５、予測分子量  ２７７８６）；２７７６８（６、予測分子量  ２７７６８）。
【図１０】ポストピーク２の面積とＲＰＣカラム上での滞留時間との間の相関関係を示す図である。初めの時点は滞留／保持時間に対応する。他の実験では、勾配開始を１５分、３０分、６０分又は１２０分遅らせた。
【図１１】３７℃での４週間の保存後のバッチ１、配列番号１のＥ１Ｑ−ａ変異型及びＥ１Ｑ−ｂ変異型のＲＰＣプロファイルを示す図である。
【図１２】３７℃で保存した配列番号１のペプチド地図部分を示す図である。バッチ１を、トリプシン消化及びＲＰＣ解析前に２週間、４週間、６週間又は８週間、３７℃で保存した。青色のプロファイルは時間０の対照を表す。ＲＰ−ＨＰＬＣを、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラムを使用して、１分当たり０．３３％で５％から３６．７％へとＡＣＮを勾配させて７０℃で行った。
【図１３】バッチ１、配列番号１のＥ１Ｑ−ａ変異型及びＥ１Ｑ−ｂ変異型のペプチドマッピングを示す図である。タンパク質を３７℃で２４時間、トリプシン（１／５０（ｗ：ｗ））で消化した。消化したタンパク質それぞれ２５μｇをカラム上に加えた。ＲＰＣ条件は図１２での実験と同じであった。
【図１４】ｃＩＥＦによるピログルタミン酸修飾の同定を示す図である。電気泳動図の関連部分の拡大図により、ｐＩの差をより明らかにして示す。左側のパネル：バッチ１とＥ１Ｑ−ａ変異型との混合物のｃＩＥＦ解析（注入試料は０．２３ｍｇ／ｍＬのバッチ１と０．０９ｍｇ／ｍＬのＥ１Ｑ−ａとを含有する）。右側のパネル：バッチ１とＥ１Ｑ−ｂ変異型との混合物のｃＩＥＦ解析（注入試料は０．２３ｍｇ／ｍＬのバッチ１と０．１５ｍｇ／ｍＬのＥ１Ｑ−ｂとを含有する）。試料を、ＩＣＥ２８０等電点電気泳動装置（focuser）で解析の前にＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce）で脱塩処理した。
【図１５】ｃＩＥＦによる安定性試料におけるピログルタミン酸修飾の同定を示す図である。上部のパネル：３７℃で６週間保存したバッチ１を含有する試料の電気泳動図。下部のパネル：同じバッチ１の安定性研究試料とＥ１Ｑ−ａ変異型との混合物（０．４２ｍｇ／ｍＬのバッチ１及び０．０９ｍｇ／ｍＬのＥ１Ｑ−ａ）の電気泳動図。試料を、ＩＣＥ２８０等電点電気泳動装置で解析の前にＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce）で脱塩処理した。
【図１６】３７℃での保存時間に対する配列番号１バッチ１（上部のパネル）及び配列番号２（下部のパネル）のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。材料そのまま（対照、主ピークが最も高い曲線）、並びに３７℃での２週間（主ピークが２番目に高い曲線）、４週間（主ピークが３番目に高い曲線）、６週間（主ピークが４番目に高い曲線）及び８週間（主ピークが最も低い曲線）の保存後の材料で解析を行った。７０℃に維持したＣ３カラムで試料のクロマトグラフィを行い、吸光度を２８０ｎｍで測定した。配列番号２でのＲＰＣプロファイルにより、Ｉ１及びＩ２とも呼ばれる２つの新たなより早く溶離する分子種が明らかになる。
【図１７】時間０（青色線／上方の出力波形）及び３７℃での８週間の保存後（赤色線／下方の出力波形）のｗｔ配列番号２とその突然変異型Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｎ及びＧ１０６ＡとのＲＰＣプロファイルの比較を示す図である。
【図１８】時間０（赤色線／上方の出力波形）及び３７℃での４週間の保存後（青色線／下方の出力波形）の野生型配列番号２（ＷＴ）とその突然変異型Ｄ６２Ａ、Ｄ６２Ｅ及びＳ６３ＧとのＲＰＣプロファイルの比較を示す図である。
【図１９】３７℃で保存した配列番号１及び配列番号２でのイソアスパラギン酸の生成を示す図である。様々なインキュベーション期間後、イソアスパラギン酸を、無傷の配列番号１（白丸）、トリプシン消化した配列番号１（黒丸）又はトリプシン消化した配列番号２（三角）で測定した。無傷タンパク質で測定されたイソアスパラギン酸のレベルは顕著に低く、このことは消化がイソアスパラギン酸残基の検出に対するタンパク質構造の影響を最小限に抑えるのに必要であったことを示している。タンパク質におけるイソアスパラギン酸の存在量をパーセントで表す（％Ｍ：Ｍ、イソアスパラギン酸のモル：ナノボディ（登録商標）のモル）。或る特定の試料では、イソアスパラギン酸含有量の独立した測定を２回又は３回行った。
【図２０】配列番号１（丸）及びその一価の対応した配列番号２（四角）に関する３７℃での保存中の活性の喪失を示す図である。データを擬一次速度論モデルにフィッティングさせ（本文中の方程式２を参照されたい）、不活性化の分子機構であると考えられる異性化プロセスに関する見掛けの速度定数を推測した。半減期は、配列番号１及び配列番号２それぞれに関して約５８日及び約１００日である。
【図２１】製造時に存在する、又は保存中に生じる、主生成物に関連した配列番号１の変異型を示す図である。二価ナノボディ（登録商標）配列番号１の一価の構成要素である配列番号２のアミノ酸配列が示される。ＣＤＲ領域を下線処理する。本発明の報告で論じられる残基、すなわちＥ１、Ｍ３４、Ｍ７８、Ｍ８３、Ｄ６２／Ｓ６３、Ｄ１０５／Ｇ１０６（図４に従ってナンバリングを使用する）を赤色で示す。Ｅ１を除いて、これらの指定は２つの同等位置（配列番号１の２つの同一のドメインそれぞれに１つ）を表す。
【図２２】ＲＡＮＫＬ−１及びＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅがアルファスクリーンアッセイで測定されるものと同様の効力を示すことを表す図である（例えば、Perkin Elmer, UKから入手可能なアルファスクリーン（商標）技術）。
【図２３】ＲＡＮＫＬ−１＋ＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２ＥのＲＰＣ解析を示す図である（出力線はおおよそ同一である）。ｉｓｏＤ６２ピーク、ｉｓｏＤ１０５ピーク及びｏｘＭ７８ピークを有する配列番号１のプロファイル（実施例１も参照されたい）は陽性対照として含まれる。＊は、出発材料と参照材料とにも存在するピークを示している。ｉｓｏＤ６２及びｉｓｏＤ１０５はそれぞれ、Ａｓｐ−１０５及びＡｓｐ−６２の異性化に対応する。ｏｘＭ７８はＭｅｔ−７８の酸化に対応する。ｐｙｒｏＥ１はＮ末端の環状ピログルタミン酸の生成に対応する。
【図２４】流速１ｍＬ／分、０．３３％  Ｂ／分の勾配傾斜で、イオン対生成剤としてＴＦＡを使用するが、種々のカラム温度（５０℃−６０℃−７０℃−７５℃）で、ＺＯＲＢＡＸ  Ｃ３カラムでのＩＬ６Ｒ２０３解析の２１４ｎｍのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。カラム温度が低減すると共に、ピーク溶出時間が増大し、且つ面積が減少する。
【図２５】７５℃及び７０℃で解析した試料のピーク基線領域の拡大図である。７５℃では、最初のポストピークがかなりの増大を示す。この増大は温度の影響であり得ることに留意されたい。
【図２６】ＩＬ６Ｒ２０２のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに対する種々のカラム温度の影響が劇的であることを示す図である。このことはＩＬ６Ｒ２０３でも示された。有用なクロマトグラムを得るための最小温度は７０℃である。
【図２７】ＩＬ６Ｒ２０１野生型及び突然変異型をＲＰＣで解析した結果を示す図である。使用されるカラムは、Agilent製のシステム上でＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ  Ｃ３（５μｍ）カラムである。実験中のカラム温度は７０℃であった。実験中に使用されるバッファーＡは０．１％トリフルオロ酢酸であり、バッファーＢは０．１％トリフルオロ酢酸／９９．９％アセトニトリルであった。
【図２８】図２７と同じ。
【図２９】図２７と同じ。
【図３０】図２７と同じ。
【図３１】図２７と同じ。
【図３２】図２７と同じ。
【図３３】図２７と同じ。
【図３４】配列番号２及び配列番号２６の両方を３７℃で保存した。４週間後、試料をＲＰＣで解析した。クロマトグラムのオーバーレイを図３４に示す。
【図３５】ＡＬＸ−００８１及びＶＷＦ０００１によるフォルツ研究の結果を示す図である。ＣＦＲを示す血流は時間に応じて示される。ＣＦＲを大腿動脈の損傷及び狭窄後３０分間、測定した（対照）。食塩水を注入し、ＣＦＲに対する影響を３０分間測定した。ＡＬＸ−００８１又はＶＷＦ０００１を注入し、３０分毎に用量を増大させた。投与時間を赤色の矢印で示し、用量を赤色で示す（μｇ／ｋｇ）。ＣＦＲの完全抑制が観察されたら、新たな損傷を加えた。最大用量の試験項目の後、エピネフリンを注入した。
【図３６】ＡＬＸ−００８１及びＶＷＦ０００１で処理したヒヒに関する全ての用量に応じたリストセチン誘導性の凝集（％）及びＣＦＲの長さ（秒）を示す図である。
【図３７】ＶＨＨ断片ＩＬ６Ｒ２０１の強制酸化実験の２８０ｎｍでの多重ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。下方の出力波形は、非処理の参照材料ＩＬ６Ｒ２０１のクロマトグラムである。上方の出力波形は、１０ｍＭのＨ２Ｏ２で２時間処理したＩＬ６Ｒ２０１のクロマトグラムである。
【図３８】１１９Ａ３による強制酸化実験の２８０ｎｍでの多重ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上方の出力波形：非処理の１１９Ａ３参照試料；真ん中の出力波形：６Ｍのグアニジンの存在下でのＨ２Ｏ２で処理した１１９Ａ３試料；下方の出力波形：Ｈ２Ｏ２で処理した１１９Ａ３試料。
【図３９】３７℃で８週間インキュベートした１配列番号２６（上方の出力波形）及び−８０℃で保存した参照材料（下部の出力波形）の２８０ｎｍで記録したＲＰ／ＨＰＬＣ／ＲＰＣクロマトグラムを示す図である。
【図４０】３７℃で８週間インキュベートした後の配列番号２５（上方の出力波形）及び−８０℃で保存した参照材料（下部の出力波形）の２８０ｎｍで記録したＲＰ／ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４１】ＲＡＮＫＬ−１におけるＮ末端の環状ピログルタミン酸のｐＨ依存的な生成を示す図である。ＲＡＮＫＬ−１を種々のバッファー中で配合し、３７℃で最大８週間保存した。６３ｍｇ／ｍｌでの１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）（黒四角）、３０ｍｇ／ｍｌでの１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）（白四角）、６３ｍｇ／ｍｌでの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）（黒三角）又は３０ｍｇ／ｍｌでの１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）（白三角）中でのＲＡＮＫＬ−１保存試料のＲＰＣ解析は、インキュベーション時間及びバッファーのｐＨと共に、ピログルタミン酸変異型の形成が増大することを示した。統合した表面積全体に対する割合として表されるピログルタミン酸のピーク表面積は、ｐＨ５．５よりもｐＨ７で高い。
【図４２Ａ】ナノボディ３２１におけるＮ末端の環状ピログルタミン酸のｐＨ依存的な生成を示す図である。ナノボディ３２１の安定性を２つのバッファーで評価した：ｐＨ６で２０ｍＭのヒスチジン対ｐＨ６．５で２０ｍＭのヒスチジン、両方ともタンパク質濃度５ｍｇ／ｍＬ。試料に３７℃で最大６週間ストレスを加えた。ナノボディ３２１保存試料のＲＰＣ解析は、インキュベーション時間及びバッファーｐＨと共に、ピログルタミン酸変異型の形成が増大することを示した。上方のパネル（図４２Ａ）は、３７℃で６週間後のＲＰＣクロマトグラム例である（下部の出力波形：−８０℃の参照材料；真ん中の出力波形：ｐＨ６；上部の出力波形：ｐＨ６．５）。下部のパネル（図４２Ｂ）は、統合した表面積全体に対する割合として表されるピログルタミン酸のピーク表面積を示すグラフであり、該表面積はｐＨ６（黒四角）よりもｐＨ６．５（白四角）で高かった。
【図４２Ａ】同上。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１８７】
実験部
実施例１：ｖＷＦ結合ナノボディ及びナノボディ構築物（配列番号１、配列番号２）の安定化
１）配列番号１の化学的特徴付け
配列番号１は二価ナノボディ（登録商標）であり、この単一ポリペプチド鎖は３つのアラニン残基のリンカー越しに頭尾融合する、免疫グロブリンドメインの２つの同一コピーから成る（国際公開第２００６１２２８２５号パンフレットの配列番号９８及び配列番号１の生成に関する詳述を参照されたい）。それぞれのドメインに１つのジスルフィド結合が存在する。解析用パッケージは、通常観察されるタンパク質分解／修飾機構、より具体的には加水分解、酸化、アミド分解、ジスルフィド結合修飾及び凝集／沈降の大部分を評価する。或る特定の修飾、例えば脱リン酸化及び脱グリコシル化が起こらないので、これらの翻訳後修飾は適用することができないことに留意されたい。
【０１８８】
表Ｂ−１：配列番号１の様々なバッチに関して特定の方法で得られた試験結果。     
試験                        試験結果        
バッチ１  バッチ２  バッチ３  バッチ４  バッチ５    
ビアコア効力  バッチ１に対
する％        １００    ９５      ９５      ９４      ９６        
ｃＩＥＦ
（キャピラリー
等電点電気泳
動法）        主ピーク      ９７．８  ９７．７  ９８．１  ９８．１  ９７．６        
ＳＥＣ
（サイズ排除ク
ロマトグラフィ）主ピーク    ９９．６  ９９．９  ９９．５  ９９．６  ９９．５        
ＲＰＣ        主ピーク      ９３．６  ９３．８  ９３．４  ９２．８  ９３．１                  プレピーク
１＋２＋３  １．９    １．８    ２．１    ２．６    ２．３                    ポストピーク
１          ３．７    ３．５    ３．６    ４．６    ３．６                    他のポスト
ピーク      ０．８    ０．９    ０．９    ４．６    ０．９（＃）        
表で示される値は全てパーセントである。（＃）バッチ５に関しては、ポストピーク２の面積％が別に報告される。この試料での他のピークの面積％は０％である。   
【０１８９】
一般に、ｃＩＥＦ、ＳＥＣ、ＲＰＣ及び表面プラズモン共鳴のような解析方法により、配列番号１の様々なバッチ間での高度な一致が明らかになった。このことは、最も関連性のある生成物に特異的な解析方法の結果を示す表Ｂ−１に図示される。その中でも逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）は、配列番号１の薬剤物質（ＤＳ）を多くの異なる種に分離させるという点で最も有益な方法である（図１を参照されたい）。また代替的に、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）は、ＤＳでの多様性を解析するのに適した方法であり得る。主ピークの他に、プレピーク（主材料の前に溶出する物質）及び多くのポストピークを識別することができる。このようにして得られたバッチにおいて、プレピーク及びポストピーク１はそれぞれ一貫して、約２％及び３．６％を示すが、他のポストピークはＤＳの１％未満しか占めていない。
【０１９０】
予めＲＰＣプレピーク及びポストピーク１に関して特徴付けを行った。プレピークは、ＥＳＩ質量分析により、対象の材料よりも１６Ｄａ重いことが分かった。Ｈ２Ｏ２による処理から成る強制酸化実験と組み合わせると、このことはプレピークが酸化に起因することを示唆している。この酸化は、１つ又は複数のメチオニン残基で起こると仮定された（配列番号１が２つの同一のドメインのそれぞれに３つのメチオニン残基を含有することに留意されたい）。さらに、強制酸化の程度は（或る特定の範囲内では）生物活性に影響しないことが実証された。質量分析及びアミノ酸解析は、ポストピーク１が主材料より１８Ｄａ軽いこと、及びこれはメチオニン部位でのノルロイシン残基の取り込み違いの結果であることを実証している。ＲＰＣ後のポストピーク１材料の回収は、この生成物に関連する物質も機能的であることを示唆した。実験作業により、酸化物質及びノルロイシン生成物に関連する物質の両方が採取の時点で培養培地中に存在することができ、それらのレベルが、下流プロセシング中、或る程度まで低減することが明らかになった。
【０１９１】
配列番号１の様々なバッチの安定性研究により、或る特定の生成物に関連する物質の相対的存在量が時間及び温度と共に増大することが示される。図２により、このことはプレピーク及びポストピーク２の場合に当てはまることがはっきりと示される。これに対して、非常に驚くべきことに、ポストピーク１の相対ピーク面積は見かけ上、インキュベーション時間又は温度のいずれにも影響されない。さらに、配列番号１で観察されるＲＰＣ主ピークは、特に高温（２５℃以上、図３を参照されたい）での長期インキュベーションの際に幾つかの異なる種に分割されると考えられる。このデータにより、幾つかのより早く溶出する新規の分子種が保存中に生成されることが示される。
【０１９２】
アミノ酸に関しては以下の一文字コードを使用する：Ａ、アラニン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｇ、グリシン；Ｋ、リシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン。
【０１９３】
幾つかの異なる配列番号１の調製物／試料（例えば配列番号１バッチ１を含む、他は表Ｂ−１を参照されたい）を、本発明の報告で論じられた様々な実験に使用した。二価の配列番号１ナノボディ（登録商標）は、３つのアラニンのリンカー越しに頭尾融合する免疫グロブリンドメインの２つの同一コピーから成る。配列番号２と称される一価の構成要素（国際公開第２００６１２２８２５号パンフレットの配列番号９０及び配列番号２の生成に関する詳述を参照されたい）の解析が非常に貴重であることが分かった。これは、配列番号１と比較した複雑性の低減、並びに対象の分子及びその生成物に関連する変異型が、二価の配列番号１を用いるよりも配列番号２の場合にＲＰ−ＨＰＬＣでより良好に分離されるという事実のためである。さらに、突然変異解析を行い、配列番号１及び配列番号２両方の様々な突然変異型を構築、精製及び解析した（表Ｂ−２を参照されたい）。一価の構成要素である配列番号２のアミノ酸配列を図４に示し、本発明の報告で論じられる残基を強調する。少なくとも１つのバッチはＲＰＣポストピーク１（図１を参照されたい）を含有せず、このことは生合成中のノルロイシンの組込み違いの結果であることが分かった（以下を参照されたい）。
【０１９４】
表Ｂ−２：本発明の特徴付け研究で使用される配列番号１又は配列番号２の修飾型/突然変異型のリスト。全ての組換えタンパク質は大腸菌で産生され、イオン交換クロマトグラフィ、その後のサイズ排除クロマトグラフィで精製した。 
【表１】
2011511628.tif 000002
【表２】
2011511628.tif 000003
【表３】
2011511628.tif 000004
【表４】
2011511628.tif 000005
【表５】
2011511628.tif 000006
【表６】
2011511628.tif 000007
【０１９５】
配列番号２の他の突然変異型     
【表７】
2011511628.tif 000008
【表８】
2011511628.tif 000009
【表９】
2011511628.tif 000010
【０１９６】
２）方法：
配列番号１及び配列番号２の突然変異型の生成（表Ｂ−２）：
突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, CA, USA）を用いて導入した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発法を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ及び温度サイクラーを使用して行った。ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼが、高い忠実度で、突然変異型のオリゴヌクレオチドプライマーを動かすことなく両方のプラスミド鎖を複製する。基本的な手法は、対象のインサートを有する超らせん状の（supercoiled）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ベクター、及び所望の突然変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。それぞれベクターの逆鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼによる温度サイクリング中に伸長する。オリゴヌクレオチドプライマーの組込みにより、ねじれ型ニック（staggerednicks）を含有する突然変異したプラスミドが生成される。温度サイクリングの後、生成物をＤｐｎ  Ｉで処理する。Ｄｐｎ  Ｉエンドヌクレアーゼ（標的配列：５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’）はメチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的であり、親ＤＮＡ鋳型を消化するのに、及び突然変異を含有する合成ＤＮＡに関して選択するのに使用される。ほとんど全ての大腸菌株から単離されたＤＮＡは、ｄａｍメチル化されているのでＤｐｎ  Ｉ消化しやすい。
【０１９７】
２．１）配列番号１、配列番号２及びそれらの突然変異型の結合効力
配列番号１の結合効力を、平行線を使用して求めた。この方法は、二官能性が観察されるように設計し、そのため配列番号１の一価の構成要素である配列番号２は結合効力を有しない。
【０１９８】
ｖＷＦのＡ１ドメインに対するｗｔ及び突然変異型の配列番号２の親和性を、ＳＰＲ技術（ビアコア）により求めた。様々な濃度（０．５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲）の配列番号２をＡ１センサーチップに通した。速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を得られたセンサーグラムから推測し、平衡解離定数（ＫＤ）を算出するのに使用した。或る特定の実験では、ｗｔ及び突然変異型の配列番号２の試料を、Ａ１センサーチップとの初期結合速度を測定することにより比較した。これらの実験では、試料を２ｎＭ濃度に希釈した。初期結合速度を、注入開始後、５秒〜２５秒で得られたデータ点の線形フィッティングによりセンサーグラムの結合期から求め、報告された値は５つの独立した測定値の平均である。
【０１９９】
２．２）配列番号１、配列番号２及びそれらの突然変異型のＲＰ−ＨＰＬＣ解析
無傷タンパク質でのＲＰＣ解析のほとんどを基本的に他で記載のように行った（A.A. Wakankar et
al., Biochemistry 2007, 46, 1534-1544）。関連の偏差は、本発明の報告で言及される。トリプシン消化のＲＰＣ解析を以下でより詳細に説明する。
【０２００】
２．３）ＲＰＣによる配列番号１の濃度の決定
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＲＰＣ）
使用するカラムは、Agilent製のシステム上でＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ  Ｃ３（５μｍ）カラムであった。実験中のカラムの温度は７０℃であった。実験中に使用するバッファーＡは０．１％トリフルオロ酢酸であり、バッファーＢは０．１％トリフルオロ酢酸／９９．９％アセトニトリルであった。使用するプログラムを以下に記載する：
【０２０１】
プログラム     
時間  
（分）        ％Ｂ        
２          １０        
３          ２７．５        
２５，５    ３５        
２６        １００        
２８，５    １００        
２９        １０        
３５        １０   
【０２０２】
一般的規則として、配列番号１、配列番号２及びそれらの突然変異型の濃度を分光学的に求めた。或る特定のＲＰ−ＨＰＬＣ画分中に含有される材料を、生物活性の直接的な測定のために回収した。回収率は通常かなり低く、再構築試料における配列番号１（生成物に関連する変異型）の濃度では、濃度の分光学的な測定は不可能であった。このような場合、ＲＰＣによる回収した材料の再解析と、配列番号１バッチ１で確立した、配列番号１の量をＲＰＣの全ピーク面積に関連付ける検量線に対するピーク面積の比較とにより、濃度を求めた。
【０２０３】
２．４）質量分光分析
質量分光分析を、Agilent製のＭＳＤ  ＥＳＩ−ＴＯＦ機器を用いて行った。機器をAgilent製の１１００  ＨＰＬＣ（この場合、ＲＰＣ法において様々なピーク質量を求めるＭＳ検出器として使用した）と接続させた。別々の試料の質量測定のために、Ｐｏｒｏｓ−１カラムをＭＳ解析前のバッファー交換に使用した。
【０２０４】
ヘント大学のタンパク質生化学タンパク質工学研究所で行ったＭＳ及びＭＳ／ＭＳ実験は、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ、Applied Biosystems）又は陽イオンモードで操作する四重極飛行時間型機器（Ｑ−ＴＯＦ  Ｉ、Micromass/Waters）で実行した。Ablynx及びブリュッセルの自由大学で、ＥＳＩ質量スペクトルを、Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ（Micromass/Waters）を使用して得た。
【０２０５】
ＭＡＬＤＩ解析のために、０．５μＬのトリプシン消化物を１０μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（１ｍＬの５０％  ＡＣＮ、１０％エタノール及び０．１％  ＴＦＡ中、１０ｍｇ）と混合し、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットした。スペクトルを４００Ｔｈ〜４５００Ｔｈのｍ／ｚ範囲内に記録した。ＥＳＩ−ＭＳ解析のために、スペクトルを４００Ｔｈ〜１２００Ｔｈのｍ／ｚ範囲内に記録した。最終スペクトルをデコンボリューションして（deconvoluted）、ＭａｘＥｎｔソフトウェア（Micromass/Waters）を使用して、タンパク質の分子量を求めた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析を衝突誘導性解離（ＣＩＤ）により行った６。ＭａｘＥｎｔ３アルゴリズム（Micromass/Waters）を使用して、ＭＳ／ＭＳスペクトルから配列情報を得た。
【０２０６】
２．５）配列番号１のトリプシンペプチド地図
配列番号１又は配列番号２の試料（約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、還元メチル化で修飾されたトリプシン（Promega、約２０μｇ／ｍＬの最終濃度）を用いて消化した。必要に応じて、Ｄ−ＰＢＳを用いて希釈を行い、−２０℃で混合物を凍結させる前に２４時間、３７℃で加水分解を行った。ペプチド分画化を７０℃で操作するＣ３カラム上で行った。典型的に、２５μＬの消化物（約２０μｇのタンパク質）をカラムに注入し、９７分にわたり５％  ＡＣＮ−０．１％  ＴＦＡから３６．７％  ＡＣＮ−０．１％  ＴＦＡへと増大させるアセトニトリル勾配を用いて、ペプチドを溶出させた。ピークを２１４ｎｍで検出した。図５は、トリプシン消化後に得られ、３７℃での８週間のインキュベーション後に得られたプロファイルに重ねたクロマトグラムを表す。ほとんどのピークの同一性を質量分析で確立した（表Ｂ−３を参照されたい）。
【０２０７】
表Ｂ−３：配列番号１のトリプシン地図で観察されるピークの同一性。Ｔ２−Ｔ２’は、予測されるジスルフィド結合ペプチドを表す。Ｔ２−Ｔ２及びＴ２’−Ｔ２’は予測されない。これらが配列番号２でも観察されることは、これらが幾つかの人工的なジスルフィド転換を反映し、ジスルフィド結合の誤りによるものではないことを示す。
ペプチド      配列（本研究で同定される修飾を示す）        
Ｔ２−Ｔ２    ＬＳＣＡＡＳＧＲ＋ＬＳＣＡＡＳＧＲ        
Ｔ８          ＦＴＩＳＲ        
Ｔ７≠        ＴＧＧＳＴＹＹＰｉｓｏＤＳＶＥＧＲ
（Ｄ６２の異性化、以下を参照されたい）        
Ｔ７          ＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧＲ        
Ｔ６          ＥＬＶＡＡＩＳＲ        
Ｔ１０≠      主にＭＶＹＬＱＭＮ（非特異的な断片化に起因する）
及びＭｏｘＶＹＬＱＭＮＳＬＲ（Ｍ７８の酸化、以下を参照されたい）  Ｔ２−Ｔ２’  ＬＳＣＡＡＳＧＲ＋ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲ        
Ｔ１０        ＭＶＹＬＱＭＮＳＬＲ        
Ｔ１          ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ        
Ｔ２’−Ｔ２’ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲ＋ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲ    Ｔ１≠        ｐｙｒｏＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ
（ピログルタミン酸、以下を参照されたい）        
Ｔ１３        ＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ        
Ｔ３          ＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲ        
Ｔ１２        ＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬ              ＶＱＰＧＧＳＬＲ   
【０２０８】
２．６）イソアスパラギン酸量の酵素的定量化
ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キット（Promega Corporation,
Madison, WI, USA）を配列番号１及び配列番号２におけるイソアスパラギン酸残基の定量的検出に使用した。ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）法は、非定型のβ−アスパラギン酸ペプチド結合の通常のペプチド結合への変換を媒介する酵素である酵素タンパク質イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を使用する。ＰＩＭＴは、Ｏ−メチルエステルを形成させるためにα−カルボキシル位でＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）からイソアスパラギン酸へと活性メチル基の移動、及びこのプロセスにおけるＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）の生成を触媒する。このメチルエステルの自発的分解により、メタノールの放出及びスクシンイミド中間体（すなわちアスパラギン残基のアミド分解、及びアスパラギン酸残基の転位の間に生成される同じ環状イミド中間体）の生成が起こる。それから、環状イミドをゆっくりと加水分解し、アスパラギン酸とイソアスパラギン酸との混合物を形成する。各メチル化サイクルで、非定型のペプチド結合の１５％〜３０％が通常のペプチド結合へと変換される。通常のペプチド結合へのイソペプチド結合のメチル化依存的な変換は、年齢に応じて損傷するタンパク質の修復におけるＰＩＭＴに対する生物学的役割を支持する。
【０２０９】
酵素的メチル化は、ペプチド又はタンパク質におけるイソアスパラギン酸の測定に関する高感度で定量的なアッセイを提供する。一形態では、ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットは、メチル化反応の副生成物、ＳＡＨを検出する。ＳＡＨは比較的小さな分子なので、通常ＳＡＨをペプチドから単離し、逆相高速液体クロマトグラフィ（Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｃ１８カラムを使用するＲＰ−ＨＰＬＣ）により定量することができる。試験試料における標的タンパク質に対するイソアスパラギン酸の量を、参照標準ペプチド（配列：ＷＡＧＧ−ＩｓｏＤ−ＡＳＧＥ）及びＳＡＨ  ＨＰＬＣ標準（両方の試薬はキットと共に与えられる）を使用して行う反応と比較することにより求める。典型的に、約８２％の期待されるイソアスパラギン酸を陽性対照ペプチドによる実験で回収した。ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットの製造業者の取扱説明書に従ってアッセイを行った。本発明者らは、イソアスパラギン酸残基の検出に対するタンパク質構造の影響を最小限にするために、配列番号１又は配列番号２の試料を断片化する必要があることを見出した。実際、無傷のタンパク質で測定されるイソアスパラギン酸のピコモル数は、消化タンパク質におけるピコモル数よりも顕著に低かったことが観察された。試料のプロテアーゼ消化を、３７℃で２４時間、トリプシン（１：５０（ｗ：ｗ））を用いて行い、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１ｍＭの最終濃度、フッ化フェニルメタンスルホニル）を用いて反応を停止させた。残存トリプシン活性がないことを確認するため、及びトリプシンプロテアーゼに存在する任意のイソアスパラギン酸残基を把握するため、適切なブランク／対照反応がＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）解析に包含された。
【０２１０】
３）結果
３．１）ＲＰＣプレピーク１（及びプレピーク３）の解析
ＲＰＣプレピーク（主材料の前に溶出する物質）は主要なプレピーク１を含む。このプレピーク１の相対的なピーク面積は、保存時間及び温度と共に増大する（図２を参照されたい）。このことは、このプレピーク１が対象の配列番号１よりも１６Ｄａ重い単酸化形態を表すＥＳＩ質量分析及び強制酸化実験（図６を参照されたい）により事前に示された。この酸化は、この酸化がタンパク質の化学修飾の共通型であるということに基づいて、１つ又は複数のメチオニン残基で起こると仮定された。配列番号１は、２つの同一ドメインのそれぞれに３つ、すなわち６つのメチオニン残基を含有する（図４）。意図的な酸化は、さらなる（複数の）酸化種、特に図６で示される＋３２Ｄａ種を生成することができる。１４％の主ピークと８６％ものプレピークとから成る材料が十分に機能的であるという観察結果からも明らかなように全ての酸化変異型が活性であると考えられる。
【０２１１】
プレピークが完全に活性であるという主張は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離中に回収されたプレピーク１材料の直接解析によりさらに裏付けられた。このため、プレピーク１を表す溶出画分をｓｐｅｅｄｖａｃ（ｍｉＶＡｃ濃縮装置、Genevac）を使用して乾燥させ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ８０を有するＰＢＳ中で再び可溶化し、濃度測定後、効力アッセイで解析した。単離材料の同一性をＲＰＣによる再解析で確認した。またこれは、配列番号１で確立した検量線に対するピーク面積の比較によるプレピーク１材料の定量化を可能にした（６．３項を参照されたい。比較的少量のプレピーク１材料では、濃度の分光学的測定は不可能であったことに留意されたい）。対照によるものと同じ方法を使用して、ＲＰＣ主ピーク材料を単離し、再構築して、定量化した。ＲＰＣ主ピーク及びプレピーク１の効力はほぼ同一であり、相対効力は主ピーク及びプレピークに関してそれぞれ６６．７％及び６５．５％であることが分かった。回収した主ピーク及びプレピーク１材料が同等であることは、酸化した配列番号１が真の（authentic）タンパク質と同程度の活性を有するという考えを強く支持している。
【０２１２】
配列番号１ナノボディ（登録商標）の酸化を、配列番号２、すなわち配列番号１の一価の構成要素を使用してさらに研究した。本発明者らは、配列番号１の配列番号２サブドメインが３つのメチオニン残基しか含有していないため、複雑度、すなわち酸化変異型の理論的に可能な数を低減するので配列番号２が有益であると予測している。本発明者らは、非酸化分子及び様々な酸化変異型が、配列番号１と比較して配列番号２の場合により良好に分離されることも発見した。図７は、未変性の配列番号２ナノボディの酸化は、大部分が１つの単一メチオニン残基で行われるが、これに対して分子が塩酸グアニジン処理により変性されると、３つのメチオニン残基全てが酸化されやすいことを示している。酸化されやすい残基の同定と、同時に実際に酸化がメチオニンで行われているという決定的な実証とが、３つの異なるメチオニンからアラニンへの突然変異型、すなわちＭ３４Ａ、Ｍ７８Ａ及びＭ８３Ａの解析により得られた。図８で示されるこれらの解析により、酸化が７８位のメチオニン残基で行われること、Ｍ３４Ａ及びＭ８３Ａ突然変異型が依然として酸化されやすい一方で、アラニンによるＭ７８の置換が（少なくとも試験条件下で）本質的に強制酸化に耐性のある配列番号２変異型をもたらすと考えられることがはっきりと示される。Ｍ３４Ａ及びＭ８３Ａ突然変異型と異なり、Ｍ７８Ａ変異型は産生の時点ではプレピークを含有しておらず、このことはプレピークがＭ７８酸化によってのみ引き起こされることを示している（データ図示せず）。さらに、Ｍ３４Ａ及びＭ８３Ａの場合で見られる小さいプレピークは、３７℃での長期保存（例えば６週間、データ図示せず）時に増大することも分かった。後者の観察結果により、空気酸化及び強制的な過酸化物媒介性の酸化が同じＭ７８残基を標的とすることが確認される。一価の配列番号２において基本的に単一のメチオニンだけが酸化されやすいという結論は、二価の配列番号１ナノボディ（登録商標）の連続酸化中の単酸化種と二重酸化種との両方の蓄積と一致している（図６を参照されたい）。この二重酸化形態はＲＰＣプロファイルにおけるプレピーク３に対応していると考えられる。
【０２１３】
固定化されたｖＷＦ  Ａ１ドメインに対する３つのメチオニンからアラニンへの突然変異型全ての親和性がｗｔ配列番号２ナノボディ（１．２ｎＭ）の結合定数と同じ範囲内であることにも留意されたい。Ｍ３４Ａ、Ｍ７８Ａ及びＭ８３Ａの平衡解離定数はそれぞれ、１．９６ｎＭ、１．４６ｎＭ及び１．２９ｎＭであることが見出された。この結果は、メチオニン酸化が配列番号１の効力には影響を与えないという知見に一致している。したがってメチオニン残基はｖＷＦ  Ａ１ドメインとの結合に関与していないと考えられる。
【０２１４】
また配列番号１の酸化を、トリプシンペプチド地図を使用して調べた。ピークＴ１０≠（図５及び表Ｂ−３を参照されたい）により、Ｔ１０の単酸化変異型（１２５３．５＋１６Ｄａ）に正確に対応する１２６９．６Ｄａのペプチドを含有することが示された。これは、Ｔ１０ペプチドがＭ７８及びＭ８３の両方を包含するので、ピークＴ１０≠の酸化感受性のメチオニン残基の位置を特定できない。さらに、Ｔ１０≠ピークは、主に８９７．４Ｄａの非特異的な開裂生成物（ＭＶＹＬＱＭＮ、表Ｂ−３及びペプチドマッピング開発報告を参照されたい）（これも７８位及び８３位にメチオニンを含む）から成ることが分かった。後者の断片は、Ｔ１０に比べてＴ１０≠のピーク面積が、時間０で既に高く、３７℃でのインキュベーション中には顕著に増大しないという観察結果を説明している。実際、酸化はＴ１０≠に存在する２つの断片で反対の効果があり、一方でＴ１０＋１６Ｄａ変異型が増大するが、その一方では非特異的な開裂生成物が減少する。またペプチドマッピングデータ解析により、Ｔ１０ピーク面積は３７℃で保存中に徐々に減少することが示されている。このことは７８位でのメチオニン残基の酸化に一致しているが、この結果は、非特異的な開裂に干渉する可能性があるので、注意して扱わなければいけない。３７℃での８週間のインキュベーション後に配列番号１で観察された１２６９．６Ｄａの断片をＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ解析にかけた。この実験で得られた部分配列データによっては、７８位のメチオニルスルホキシドを直接確認することはできなかった。しかしながら、このことは８３位の非修飾メチオニンの存在から推測することができた。
【０２１５】
３．２）ＲＰＣポストピーク１の解析
ポストピーク１は生合成中の１つのメチオニン部位でのノルロイシン残基の組込み違いに起因する。このことは、質量分析とアミノ酸解析との組合せにより決定的に実証された。エレクトロスプレーイオン化飛行時間（EletroSpray Ionization Time of flight）（ＥＳＩ−ＴＯＦ）測定により、ポストピーク１が真のジスルフィド結合した配列番号１ナノボディ（登録商標）よりも分子量が−１８Ｄａ低い２７８５８Ｄａの質量のタンパク質で占められることが示されている。−１８Ｄａの違いに対する可能な説明の１つは、ノルロイシンへのメチオニン残基の置換である。この仮定は、精製された主ピーク及びポストピークのアミノ酸解析により確認され、これによってポストピーク１材料のみがノルロイシンとそれに比例して少量のメチオニンとを含有することが示された。通常アミノ酸解析における内部標準として使用されるノルロイシンをこれらの実験では除外したことに留意すべきである。
【０２１６】
−１８Ｄａの生成物に関連した変異型の効力（すなわち親和性測定から判断される）を求めるために、ポストピーク１をＲＰ−ＨＰＬＣ分離中に回収し、ＰＬＡ効力アッセイで直接測定した。プレピーク１で行ったのと同様に、初めにポストピーク１を表す溶出画分をｓｐｅｅｄｖａｃ（ｍｉＶａｃ  Ｄｕｏ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Genevac）を使用して乾燥させた後、ＰＢＳ中に再び可溶化した。ＲＰＣ主ピークを対照と同様に精製した。３つの独立しているがわずかに異なる実験を行った。第１の実験では、再構築後の濃度を分光学的に測定したが、ＴｗｅｅｎをＰＢＳに添加しなかった。第２の実験では、０．０２％  Ｔｗｅｅｎが乾燥材料の再構築時にＰＢＳ中に存在し（相対的な希釈試料からのタンパク質の喪失を防ぐため）、濃度をＲＰ−ＨＰＬＣによる再解析でのピーク面積から推測した。またＲＰＣ再解析により単離材料の同一性も確認された。第３の実験では、本発明者らはさらに、可能な限り多くの、主ピーク試料とポストピーク試料との相違を取り除くため、精製された主ピーク材料をポストピーク変異型とおおよそ同じ濃度に希釈した。第１の実験では、主ピーク及びポストピーク１画分をＲＰＣ解析後に回収し、遠心分離機フィルターユニット（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３、３ｋＤａ  ＮＭＷ、Millipore）で濃縮して、バッファーをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５スピンカラムでのゲル濾過によりＤ−ＰＢＳに交換した。実験中、一部の材料の沈殿が観察され、効力アッセイに使用される濃度に関して不確実性が幾らか存在した。主ピーク及びポストピーク１の効力はそれぞれ、参照配列番号１の９１．９％及び５１．６％であることが分かった。第２の実験では、乾燥及び水中での再可溶化により、タンパク質をＲＰＣ画分から再構築した。第１の測定とは対照的に、主ピーク及びポストピーク１はそれぞれ、５０％及び８１％の効力を有することが分かった。全体として、上記の結果は、ポストピーク１が真の配列番号１と同じ効力を有するという強い証拠を与える。観察された変動は、無傷の材料をＨ２Ｏ−ＴＦＡ−ＡＣＮ溶媒から回収するのが難しいことが原因であり、回収率自体は特に生成物に関連する変異型の存在量が低い場合に極めて低いことが分かった。
【０２１７】
配列番号１における組込み部位にかかわらず、ノルロイシンは効力に悪影響を与えないという仮説をさらに実証するために、本発明者らは、メチオニンのノルロイシン残基による全体的な置き換えにより配列番号１変異型を産生した。この配列番号１変異型を、Ｌ−ノルロイシンを添加した最小培地中で成長させたメチオニン栄養要求株で産生した。より具体的には、初めに細胞を非誘導条件下で、富栄養培地中で成長させた後、遠心分離により回収し、Ｌ−ノルロイシンを含有する最小培地中で再懸濁して、最後に短いインキュベーション時間の後、ＩＰＴＧを添加することにより誘導した。この方法はこれまでに説明されている（Cirino et al., 2003, Biotechnol. Bioeng. 83, 729-734）。配列番号１調製物はＲＰＣ、ペプチドマッピング及びＭＳで特徴付けられ、基本的にこれらの方法は６つ全てのメチオニンのノルロイシン残基による交換を確認した。しかしながら、調製物が、対象となるノルロイシン変異型（図９で６と標識された）の他に、より少量の起こり得る全ての部分置換変異型（図９で１〜５と標識された）と、一部のｗｔ配列番号１とを含有することは、図９から明らかである。ｗｔ配列番号１の存在はおそらく、富栄養培地における細胞の前培養中のプロモータの不完全な遮断による発現の漏れ（leaky）の結果である。部分置換型は、最小培地＋ノルロイシンへの移行後の残存メチオニンの存在ををはっきりと示している。複数置換変異型の相対効力は８０％であることが分かった（３つの測定値：６７．９％、８５．５％及び８６．７％の平均）。したがって、配列番号１の生物活性は、６つ全てのメチオニン残基がノルロイシンに完全に置換された場合であっても影響を受けないと考えられ、またこの結果は必然的に、単一のノルロイシン交換はその位置にかかわらず、効力に影響しないことを示唆している。
【０２１８】
配列番号１の効力がノルロイシン残基による単一メチオニンの置換によっても、またメチオニン−７８の酸化によっても（測定可能な）影響を受けないという結論は、固定化されたｖＷＦ  Ａ１ドメインに対する３つのメチオニンからアラニンへの突然変異型全ての親和性（７．１項を参照されたい）はｗｔ配列番号２ナノボディの結合定数と同じ範囲内であるという観察結果に一致している。野生型、Ｍ３４Ａ、Ｍ７８Ａ及びＭ８３Ａの平衡解離定数はそれぞれ、１．２ｎＭ、１．９６ｎＭ、１．４６ｎＭ及び１．２９ｎＭであることが分かった。生来のものであると仮定されるこのような比較的小さい差異は、二価の配列番号１と固定化されたｖＷＦ  Ａ１ドメインとの結合の強力な条件下で実証される可能性は低い。まとめると、データは、メチオニン残基が配列番号１の生物活性には重要ではないことを示している。
【０２１９】
３．３）ＲＰＣポストピーク２の解析
ポストピーク２はＲＰＣ解析法により或る程度まで形成される
ポストピーク２は産生時に全ピーク面積の約０．９％に達する。材料が７０℃で、溶出する前により長い時間、カラムに留まるようにＲＰＣの流速（run）を変えるとこのポストピークの増大が観察された。溶出を１５分、３０分、６０分又は１２０分遅らせた実験は、ポストピーク２の面積がカラム上の滞留時間に線形的に相関していることを示した（図１０を参照されたい）。時間０への外挿により、カラム上での滞留時間が０という実施不可能な場合では、ポストピーク２はほとんど発生しないことが示される。これらの所見により、本発明者らは、ポストピーク２で表される配列番号１変異型が、産生時に、配列番号１の様々なバッチには存在しないも同然であり、ＲＰＣカラム上で７０℃の温度に比較的短時間曝されている間、又は保存中しか形成されないと結論付けている（図２及び配列番号１を参照されたい）。
【０２２０】
ポストピーク２はＮ末端ピログルタミン酸を有する配列番号１を表す
ポストピーク２は、５℃、２５℃及び４０℃での長期インキュベーション中に形成される。これは図２でも示される。しかしながら、変異型の一部がカラム上でのＲＰＣ解析中に発生するために、％ピーク面積は誇張的な表現である。本発明者らは、ポストピーク２はＮ末端グルタミン酸残基の環状ピログルタミン酸への変換に起因することを示している。この結論に至った様々な実験を以下で論じる。
【０２２１】
ポストピーク２変異型は真の配列番号１よりも１８Ｄａ軽い
ポストピーク２としてのタンパク質溶出を同定するために、ポストピークをＲＰ−ＨＰＬＣ分離後に回収し、その質量をＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析で求めた。バッチ１標準で利用可能な濃度が低すぎるため、ＥＳＩ−ＱＴＯＦ解析に使用する材料は、３７℃で４週間保存したバッチ１調製物であった。ＲＰＣ画分からの主要ピークの質量は、２７８５８Ｄａであった、すなわち天然の配列番号１（２７８７６Ｄａ）よりも１８Ｄａ軽かった。このような質量の減少に対しては幾つかの異なる説明があり得るが、この質量の減少はピログルタミン酸をもたらすＮ末端グルタミン酸残基の環化の結果としての水分子の喪失と一致する（ポストピーク１と同様に、ポストピーク２が生合成中に、メチオニン残基がノルロイシンに置き換わる配列番号１変異型を表すという形式的な可能性が、この場合に相対的なピーク面積がインキュベーションの時間又は温度により影響を受けないために拒絶される）。
【０２２２】
組換えピログルタミン酸変異型がＲＰＣポストピーク２と同じ保持時間を有する
一般に、ピログルタミン酸は、グルタミン酸と比較して、Ｎ末端グルタミン残基の場合でより容易に現れる（Gadgil
et al., 2006, J. of the American Society of Mass Spectrometry17, 867-872）。したがって本発明者らは、Ｎ末端グルタミン酸をグルタミンに置換する配列番号１変異型（Ｅ１Ｑ突然変異型）を構築することにした。この配列番号１突然変異型は、ｐＨ４でｍｏｎｏＳカラム上に分画化することができ、Ｅ１Ｑ−ａ及びＥ１Ｑ−ｂで指定される２つのほぼ等しい存在量の種が溶出することが分かった。両方の画分を脱塩処理し、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析にかけた。Ｅ１Ｑ−ｂの質量は２７８７４Ｄａであり（Ｅ１Ｑ変異型の予測質量は２７８７５Ｄａである）、Ｅ１Ｑ−ａの質量が２７８５７Ｄａであることが分かった（Ｎ末端グルタミンの環化により、ＮＨ３分子又は１７Ｄａの喪失が起こり、予測質量は２７８５８Ｄａである）。これらのデータから、Ｅ１Ｑ−ｂはＮ末端グルタミン残基を有する配列番号１に対応し、Ｅ１Ｑ−ａは環状化ピログルタミン酸型を表すと結論付けた。ＲＰＣ解析により、Ｅ１Ｑ−ａの保持時間はポストピーク２と同じであり、Ｅ１Ｑ−ｂプロファイルはバッチ１の主ピーク及びポストピーク２と一致する２つのピークを含有することが示された（図１１を参照されたい）。おそらくほとんど、後者の結果は、野生型の配列番号１分子で観察されるように、ＲＰＣ解析中に、Ｎ末端グルタミンの重要部分がピログルタミン酸に変換されることに起因するに違いない。まとめるとデータは、ＲＰＣポストピーク２が環状ピログルタミン酸型の形成に起因しているという考えを支持している。
【０２２３】
ペプチドマッピングにより、保存中のピログルタミン酸の形成が確認される
Ｎ末端でのピログルタミン酸残基の形成は、ペプチドマッピングにより確認された（２．５項を参照されたい）。トリプシンペプチドのＲＰＣ解析により、質量がＮ末端断片−１８Ｄａのものに対応するピーク（すなわち表Ｂ−３によるピークＴ１≠）の存在が明らかになる。ＭＳ／ＭＳ解析による部分配列決定により、実際にこのペプチドがＮ末端Ｔ１トリプシン断片に対応することが確認されている。ＲＰＣポストピーク２で観察されるものに従い、ペプチド地図におけるピークＴ１≠の相対的なピーク面積が保存時間と共に増大することが分かった。ピログルタミン酸のＮ末端ペプチドはバッチ１には（ほとんど）存在しないが、３７℃で８週間の保存の後では十分に存在する（図１３を参照されたい）。Ｔ１≠ピーク面積の増大と同時に、非修飾Ｎ末端Ｔ１ペプチドの面積は保存時間と共に低減する（データ図示せず）。Ｔ１≠ピークの同一性は、上記で論じられたＥ１Ｑ−ａ変異型及びＥ１Ｑ−ｂ変異型でペプチドマッピングを行うことによりさらに実証された。Ｅ１Ｑ−ａがＮ末端に環状ピログルタミン酸を有する配列番号１を表すという考えに一致して、この変異型は、Ｔ１ペプチドを失い、その代わりにＴ１≠ピークと一致する断片が得られることが分かった。Ｅ１Ｑ−ｂ変異型は、同じＴ１≠ピークと、本発明者らが１位にグルタミン酸残基ではなくグルタミンを含有するＴ１−ペプチドに対応すると推測する別のピークとを生じることが分かった（図１３を参照されたい）。
【０２２４】
配列番号１及びそのピログルタミン酸変異型の効力は等しい
Ｅ１Ｑ−ａ、すなわち配列番号１のピログルタミン酸変異型（上記を参照されたい）の効力、すなわち結合親和性を上記のように求めた。バッチ１の効力に対する効力の平均値は１０５％であった。２つの実験での９５％ＣＬは１０５％〜１１３％及び９６％〜１０６％であった。配列番号１及びそのピログルタミン酸型の効力は有意に異なってはいないと結論付ける。
【０２２５】
ｃＩＥＦによる配列番号１のピログルタミン酸変異型の検出
ピログルタミン酸修飾が配列番号１の等電点（ｐＩ）の移行を誘導することが分かった。これはバッチ１及びバッチ１と上述のＥ１Ｑ−ａピログルタミン酸変異型との混合物のｃＩＥＦ解析により明らかになる（図１４を参照されたい）。ピログルタミン酸形成により、ｐＩが高い異なるピークがはっきりと得られる。また図１４は、グルタミン酸のグルタミンによる置き換え（すなわちＥ１Ｑ−ｂ変異型）も、環状ピログルタミン酸より明確ではないが、ｐＩに対する影響があることを示す。一方でピログルタミン酸と、他方でＥ１Ｑ−ｂ変異型とのｐＩに対する明白な影響は容易に合理化されない。
【０２２６】
３７℃で６週間インキュベートした配列番号１の電気泳動図は、保存により、主ピークの他に多くの新たなピークが出現することをはっきりと示している（図１５）。より高いｐＩを特徴とする最も目立つ新たなピークは明らかに、Ｎ末端ピログルタミン酸環の形成を割り当てることができる。図１５は、この高ｐＩ変異型がＥ１Ｑ−ａ種と一致することを示す。このためＮ末端のピログルタミン酸生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりポストピーク２及びｃＩＥＦにおける高ｐＩ変異型として検出することができる。ポストピーク２とは対照的に、高ｐＩ変異型は、保存していない配列番号１バッチでは観察されない。この所見は、ＲＰＣ条件自体が幾らかのピログルタミン酸形成を誘導するという考えを支持している。この影響を考慮すると、２つの異なる技法を使用して相対的なピーク面積から推測されたピログルタミン酸の形成量は十分に一致している（データ図示せず）。
【０２２７】
ピログルタミン酸形成は他のナノボディ構築物でも観察されている（図４１及び図４２を参照されたい）。ナノボディ３２１のアミノ酸配列が配列番号３８に列挙されることに留意されたい。
【０２２８】
ナノボディ３２１−配列番号３８のアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＳＬＰＡＳＧＮＩＦＮＬＬＴＩＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＴＩＮＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＱＴＳＧＳＧＳＰＮＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＬＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＳＲＩＳＱＧＧＴＡＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＰＳＰＹＹＲＧＳＡＹＬＬＳＧＳＹＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
【０２２９】
ピログルタミン酸（pyroglutamte）形成が高ｐＨ環境と共に増大するという兆候がある（ｐＨ６．５はｐＨ６よりも高いピログルタミン酸形成を示すと思われる。図４２を参照されたい）。
【０２３０】
３．４）保存中のＲＰＣ主ピークの分割の解析
ＲＰＣ主ピークが長期保存後に分割される
配列番号１で観察されるＲＰＣ主ピークは、高温での長期インキュベーション時に幾つかの異なる種に分かれると考えられる。データは、幾つかのより早く溶出する新たな種が長期保存中に生成されることを示す（図３及び図１６を参照されたい）。
【０２３１】
この解析は、分解能が向上しているため、一価の構成要素である配列番号２でより容易であることが分かった。ＲＰＣプロファイルにより、より容易に主ピークの破壊が明らかになり、同時に複雑性が低減している。図１６は、２つの新規のより早く溶出するピークを識別することができることを示す。図１６で示されるように、本発明者らは、これらのピークをＩ１及びＩ２と表す。
【０２３２】
主ピークの分割はＤ１０５及びＤ６２の異性化によるものである
より早く溶出するＩ１種及びＩ２種を同定するために、これら２つのピークと主ピークとを、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離後に回収し、その質量をＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析で求めた。ＥＳＩ−ＴＯＦ解析で使用される材料は、３７℃で６週間保存した配列番号２の調製物であった。３つのピーク全てが同じ質量、すなわち配列番号２で算出される質量であることが分かった。この結果により、Ｉ１及びＩ２を生じる修飾が質量には影響しないことが実証される。データにより、本発明者らは、Ｉ１及びＩ２は、アスパラギン酸の中性質量（mass-neutral）異性化、又はおそらくは重量がわずか１Ｄａ増大するアスパラギン残基のアミド分解のいずれかによるものであり得ると仮定した。この作業仮説は、異性化変異型が通常ＲＰクロマトグラフィにおいて非修飾型より早く溶出することを示す文献データにも基づいていた。配列番号１のアミノ酸配列の調査は、３つの最も有望な分解部位がＮ８４／Ｓ８５、Ｄ１０５／Ｇ１０６及びＤ６２／Ｓ６３であることを示す。それぞれの場合で、Ｎ残基又はＤ残基の後に、本発明に従って最も不安定であることが概して認められている残基であるグリシン又はセリンが続く。また、Ｄ１０５はどちらかといえば柔軟であると推測され得るＣＤＲ３領域に位置しており、この別の条件はβ-Ａｓｐ形成に有利に働くことが知られている（Clarke,1987、Robinson, 2002、Xie, 2003）。これに関して、従来のモノクローナル抗体ＣＤＲ領域に位置するアスパラギン酸残基の異性化が報告されていることに留意されたい（Caciaet al., 1996、Wakankar et al., 2007）。
【０２３３】
８４位のアスパラギン残基は、全てのラマ／ヒトコブラクダ構造で厳密に保存される。その側鎖が溶媒に等しく曝される。Ｎ８４のアミド分解に関する実験的証拠を見出すことはできなかった。最初に、ペプチドマッピングデータは、３７℃での長期インキュベーションによってはＴ１０ピークよりも早く溶出する分子種は現れないことを示している。第２に、Ｎ８４のアミド分解の際に形成される分子種の１つである、配列番号２のＮ８４Ｄ突然変異型は、ｗｔ種と共に同時に溶出することが分かっており、ＲＰＣプレピーク又はポストピークのいずれをも説明しなかった。
【０２３４】
６２位及び１０５位でのアスパラギン酸残基の異性化が行われるという最も説得力がある証拠は、ジペプチドＤ１０５／Ｇ１０６及びＤ６２／Ｓ６３の突然変異解析に由来する。図１７は、Ａ、Ｅ又はＱによるＤ１０５の置き換えがＩ１ピークの発生を排除したことを示し、このことは３７℃で８週間インキュベートしたｗｔ分子の対応するＲＰＣプロファイルではっきりと見られた。他方でＤ１０５Ｎ突然変異型は、３７℃での８週間のインキュベーション後にイソアスパルチルと通常のペプチドとの混合物へと完全に変換したと考えられる。Ｄ１０５に対するβ−Ｄ１０５の平衡時での比率は、他で見られたものと同程度の値である７０：３０すなわち約２．３である（Geiger and Clarke, 1987, J. ofBiological Chemistry 262, 785-794）。Ｄ１０５Ｎ突然変異型のクロマトグラムにより、また他の生成物に関連する変異型（すなわち酸化及びピログルタミン酸型）がＤ１０５及びβ−Ｄ１０５型に対して同程度の相対量で分けられることが示される。さらに、Ｇ１０６のアラニン残基による置換により、極めて小さいＩ１ピークが生じたことが分かった。Ｉ１種とＤ１０５の存在との関連性と、Ｉ１ピークをアスパラギン酸のすぐ下流にあるアミノ酸の性質により調節することができるというさらなる所見とが、実際に１０５位での異性化がより早く溶出する種Ｉ１の形成に関連するという強力な証拠を与える。同様に、Ｄ６２のＡ又はＥによる置換が３７℃でのインキュベーション中のＩ２ピークの形成を妨げることが示された（図１８）。また、Ｓ６３残基のグリシンによる置き換えがＩ２ピークの形成をはっきりと促進する。後者の場合、６２位の異性化が１０５位での異性化よりも重要になり、３７℃での４週間の保存後のクロマトグラムが、β−Ｄ１０５／β−Ｄ６２二重異性化変異型の存在の兆候をはっきりと示す。同じことが、β−Ｄ１０５が豊富に形成される上述のＤ１０５Ｎ突然変異型でもいえる。これらのデータより、アスパラギン酸異性化が１０５位及び６２位の両方で行われると考えられ、２つの修飾がはっきりと３７℃での配列番号２の保存時に新たに形成されるピークを説明する。Ｉ１及びＩ２の相対ピーク面積は、Ｄ６２異性化速度が１０５位での速度よりかなり低いことを示している。配列番号１の場合、複数の分離されていないピークが３７℃でのインキュベーションの際に形成されると考えられる（図１６を参照されたい）。本発明者らは、これらが、二価分子のさらなる複雑性を考慮して、２つの上述の異性化事象により適切に説明されると考えている（すなわち両方のドメインにβ−Ｄ１０５を有する配列番号１のようなさらなる変異型を生成することができる）。
【０２３５】
６２位でのβ−アスパラギン酸形成に関する第１の証拠は、配列番号１のペプチド地図におけるピーク（すなわち図５におけるピークＴ７≠）の検出に由来し、この形成は、３７℃での保存時間と共に線形的に増大し、Ｔ７、すなわちＤ６２残基を含有するペプチドの前で溶出する。Ｔ７≠ピークは、３７℃での８週間のインキュベーション期間後の総量（Ｔ７＋Ｔ７≠）の約６．４％を表す。このピークの質量は、Ｔ７断片の理論質量に対応することが分かり（１４８７．５Ｄａ対１４８７．７Ｄａ）、ＭＳ／ＭＳ解析により同一性が確認された。Ｄ６２残基の中性質量異性化がこれらの所見の最良の説明を与える。低エネルギー条件下で生成されるｂ型及びｙ型のシリーズイオンにより、Ｔ７≠ピークの全配列決定が可能になるが、α−アスパラギン酸とβ−アスパラギン酸とを区別することはできなかった。Ｄ１０５の異性化は、この残基がペプチド地図では気付かれない小さい５−ｍｅｒペプチドの一部であるため、ペプチド地図を用いても研究することはできない。
【０２３６】
Ｉｓｏｑｕａｎｔ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キットを、３７℃で保存した配列番号１及び配列番号２におけるイソアスパラギン酸残基の定量的な検出に使用した。３７℃でのβ−Ｄ形成速度はそれぞれ、バッチ１及び配列番号２に関して１ヶ月当たり約７．６％及び３．９％であった（イソアスパラギン酸（モル）：タンパク質（モル））。２倍の差異はこれらのナノボディ（登録商標）の価数に一致している。配列番号２においてＩｓｏｑｕａｎｔキットで検出されるイソアスパラギン酸レベルは、ペプチド地図から推測されるβ−Ｄ６２量と同じ範囲内である（すなわち３７℃での８週間の保存の後、２×３．９％対６．４％）。この結果は、無傷のナノボディ（登録商標）又はトリプシン断片のいずれかにおける１０５位でのイソアスパラギン酸はおそらく、ＰＩＭＴ酵素に関する基質ではないが（又は少なくとも非常に弱い基質であるが）、この酵素はｉｎ  ｖｉｔｒｏで広範なイソアスパラギン酸基質特異性を有することを示唆している。この推測は、単離したＲＰＣピークＩ１が期待量のイソアスパラギン酸のおよそ１０分の１しか含有していないという観察結果により支持され（結果的には、検出されたレベルは、Ｉ１ピークのＩ２による汚染に起因するものであったと考えられる）、すなわちＲＰＣ主ピークを並行して単離し、Ｉｓｏｑｕａｎｔアッセイにおいて負の値を付けた。単離したＲＰＣピークを、ＲＰＣ再解析で確かめ、分光学的に定量化した。β−Ｄ１０５がＰＩＭＴ酵素に対する基質ではないという決定的証拠は、最終的に合成ペプチドＡ−Ｅ−ＩｓｏＤ−Ｇ−Ｒとその非修飾対応部分Ａ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−ＲとでＩｓｏｑｕａｎｔアッセイを行うことにより得られた。Ｄ１０５残基を含有するトリプシン断片に対応するこのペプチド（図４を参照されたい）は実際、アッセイ条件下ではＰＩＭＴ酵素に対する基質ではなかった。
【０２３７】
３７℃での保存中のＩ１ピーク面積の増大は、この温度でのＤ１０５異性化の反応速度を得るのに使用されている。線形最小二乗回帰解析を、データ組にフィッティングさせると共に、擬一次速度定数（ｋｏｂｓ）を得るのに使用した。以下の方程式をフィッティングするのに使用した：
ｌｎ（Ｉ１∞−Ｉ１／Ｉ１∞）＝−ｋｏｂｓｔ［方程式１］
（式中、Ｉ１は時間ｔでの配列番号２のＲＰＣクロマトグラムにおけるピークＩ１の相対面積を表し、Ｉ１∞は無限遠での相対的なピーク面積である（ｔ→∞））。Ｉ１∞は、異性化により７０：３０比が得られることが期待されるため、７０％に設定した（Ｄ１０５Ｎ突然変異型のアミド分解で観察されるように、上記）。速度定数は０．００６／日であることが分かっており（９５％信頼区間：０．００６５〜０．００４９；ｔ１／２≒１１５日と同等）、この値は他のタンパク質／ペプチドで見られた異性化速度に一致している（Stephenson and Clarke, 1989, J. of Biological Chemistry
264,6164-6170）。
【０２３８】
６２位及び１０５位での異性化に関する実験的所見は、構造データと十分に一致している。配列番号１において、Ｄ６２は溶媒に強く曝され、相対的な接触可能表面積は０．９０６である。Ｄ１０５に関して算出された、かなり低い相対的な接触可能表面積値０．１９１は、Ｒ１０２及びＲ１０７の側鎖が結晶構造で接近することにより説明することができる。しかしながら、溶液中ではアルギニン側鎖は非常に柔軟である。非対称ユニットに存在する３つの配列番号１分子のそれぞれで、Ｄ１０５の側鎖がＧ１０６の骨格アミドと相互作用し、このことによりこの位置で観察される有意な異性化に関する説明を与えることができる。これに対して、ペプチドマッピングデータ（データ図示せず）に従った異性化が行われていない残基であるＤ９０は溶媒に接近することができないと考えられる。さらに、この残基は、Ｔ９１骨格アミドと相互作用することなくＲ６７から水素結合を受け取り、このことが異性化を妨げることが期待される。
【０２３９】
Ｄ１０５の異性化は効力の喪失の基となる主要な分子機構である
配列番号１は、保存中にその結合親和性（本明細書中で効力とも称される）を喪失する。幾つかの保存研究を行った。喪失は２５℃（１２ヶ月で約５０％の喪失）、４０℃（７週間後及び５ヶ月後にそれぞれ、約４０％及び約２０％の残存活性）で検出可能であったが、５℃では検出することができなかったことが分かった。同様の研究では、一価の構成要素である配列番号２が、保存中、（ビアコア解析で求められるような）ｖＷＦ  Ａ１ドメインに関する親和性を失うことも分かった。配列番号１が分子の二価性質のために約２倍の速さで減衰することを考慮すると、配列番号２で観察された親和性の喪失（３７℃での最初の８週間のインキュベーション中、約２０％）は、おおよそ配列番号１の効力の喪失に従っているといえる。
【０２４０】
１０５位での異性化が生物活性の喪失に関与し得るという最初の手掛かりは、配列番号２の親和性の喪失の程度が、ＲＰＣピークＩ１の相対的なピーク面積と相関関係にあるように見えるという観察結果によるものである（図１６を参照されたい）。この見解は、Ｄ１０５がＣＤＲ３に位置するという事実によっても支持され、このことにより一般的に一次抗原結合領域、すなわちほとんどの結合自由エネルギーを構築することが認められている。以下の観察結果により、本発明者らは、Ｄ１０５の異性化が主要な不活性化機構を表していると結論付けている（表Ｂ−５を参照されたい）：
ｉ．単離ＲＰＣピークＩ１は主ピークの活性の５％であり、これはＩｓｏｑｕａｎｔアッセイ（上記）で使用されたものと同じ材料であり、残存活性が汚染の結果であることは排除されないものとする。
ｉｉ．Ｄ１０５Ａ突然変異により、親和性が１０分の１に降下し、このことは、Ｄ１０５側鎖がｖＷＦ  Ａ１ドメインとの結合に重要な貢献をすることを示している。
ｉｉｉ．Ｄ１０５Ｎ突然変異型において、異性化は相当に高速なアミド分解プロセスに入れ替わる。３７℃で、アスパラギニル残基は約２．５：１の比率でβ−ＤとＤとの混合物へと迅速に修飾する。ＲＰＣ解析により、この修飾反応は約２週間後に完了することが示されている（データ図示せず）。Ｄに対するβ−Ｄの比率は観察された約３０％の残存活性に極めて一致する。
ｉｖ．全体的に、Ｄ１０５Ｎを除くＤ１０５突然変異タンパク質での安定性研究は、Ｄ１０５突然変異タンパク質が、３７℃でのインキュベーション中にこれらの活性を維持するか、又はいずれの場合でも野生型の配列番号２分子よりも相当遅い速度で不活性化することを示している。
【０２４１】
表Ｂ−５：Ｄ６２／Ｓ６３異性化部位又はＤ１０５／Ｇ１０６異性化部位のいずれかに置換を含有する、配列番号２の突然変異タンパク質の生物活性。平衡解離定数と、３７℃での４週間、８週間及び１６週間のインキュベーション後の活性とが列挙される。保存中の活性化に続いて、センサーチップ上に固定化されたｖＷＦ  Ａ１ドメインとの初期結合速度を求めた（５回の測定）。活性を時間０のものと比較し、パーセントで表す（±９５％信頼区間、ｎ＝１０）。
突然変異型      親和性      ３７℃での４週  ３７℃での８週    ３７℃での１６週
（ＫＤ、ｎＭ）  間後の活性（％）間後の活性（％）  間後の活性（％）      
配列番号２
野生型          １．０    ９３．５±３．２  ８０．３±２．９  ６０．２±４．８  
配列番号２  
Ｄ６２Ｅ        １．３    ８９．６±２．２  ８０．２±２．１    −−−      
配列番号２  
Ｄ６２Ａ        １．０    ８８．４±２．９  ８７．４±１．４    −−−      
配列番号２  
Ｓ６３Ｇ        １．２    ９５．５±２．６  ８３．８±２．４    −−−        
配列番号２  
Ｄ１０５Ｅ      ４．４    −−−            ９８．８±１．９    ９９．６±３．１        
配列番号２  
Ｄ１０５Ａ      ９．３    −−−            ９８．７±２．５  １０４．５±２．１        
配列番号２  
Ｄ１０５Ｑ      １．１    ９７．６±２．２  ９０．８±２．１    −−−        
配列番号２  
Ｄ１０５Ｎ      ０．８    ２９．５±４．０  ３２．７±２．２    −−−        
配列番号２  
Ｄ１０５Ｓ      ３．７    ９３．７±４．８  ９４．２±２．６    −−−        
配列番号２  
Ｄ１０５Ｔ      ７．２    １０１．０±２．５  ９６．０±２．２    −−−        
配列番号２  
Ｇ１０６Ａ      検出不可    −−−              −−−            −−−   
【０２４２】
利用可能なデータは、６２位での異性化が結合親和性に悪影響を与えないことも実証している。これは、（ｉ）Ｄ１０５突然変異タンパク質が３７℃での保存中にその活性を維持するように見えると共に（上記）、（ｉｉ）６２位での異性化を１０５位での異性化よりも重要なものとするＳ６３Ｇ突然変異が、３７℃での保存中の野生型の配列番号２よりも迅速には不活性化しないという観察結果から得られる。Ｄ６２Ａ突然変異型の親和性が野生型分子のものと同程度であるという見解は、この残基が結合に寄与するものではないことを実証しており、この位置での異性化は親和性に影響しないという考えに一致している。
【０２４３】
Ｄ１０５／Ｇ１０６及びＤ６２／Ｓ６３異性化部位の突然変異解析は、１０６位でのアラニンによるグリシン残基の置き換えにより全ての活性が排除されることを示している（表Ｂ−５）。これまでこの見解は理解されていない。このグリシン残基が、通常他のアミノ酸では観察されないφ／ψ二面角を特徴とするという考えは、結晶構造データによっては支持されず、Ｇ１０６に対するφ／ψ角（平均−８６°／−５°）はループ領域では異常ではない範囲にある。しかしながら、Ｇ１０６残基及びＣＤＲ３領域がｖＷＦ  ａ１ドメインとの結合の際に異なる局所構造をとることを排除することはできない。
【０２４４】
１０５位での異性化が主要な分子不活性化機構であるという観点に基づき、本発明者らは、Ｄ１０５異性化の反応速度を得るために、３７℃で保存中での活性の喪失を利用した。ｋｏｂｓ値を、配列番号２及び配列番号１を用いて行われた安定性研究から得られた親和性／効力データとの擬一次フィッティング（pseudofirst-order fits）により得た。以下の方程式をフィッティングに使用した：
ｌｎ（Ａ−Ａ∞／Ａ０−Ａ∞）＝−ｋｏｂｓｔ［方程式２］
（式中、Ａは時間ｔでの相対活性を表し、Ａ０は初期相対活性であり、Ａ∞は無限遠での相対活性である（ｔ→∞））。Ａ∞は、Ｄ１０５の異性化による活性の喪失が約３０％でプラトーに達することが期待されるため、配列番号２に関して３０％に設定した。配列番号１の場合、二官能性が十分な効力に必要であることから、効力の喪失が約９％（＝３０％×３０％）のＡ∞値で安定すると予測される。見掛けの異性化速度定数は、配列番号２で測定される場合、０．００７／日（９５％信頼区間：０．００７４〜０．００６２）、及び配列番号１で測定される場合、０．０１２／日（９５％信頼区間：０．０１７７〜０．００６５）であった。配列番号２の安定性データから得られた値は、Ｉ１ピーク面積の増大から得られた値と良好に一致している（上記を参照されたい）。これは、活性の喪失が、３７℃での保存の少なくとも最初の数ヶ月間にわたり、Ｄ１０５異性化と相関関係にあるという考えを裏付けている。配列番号１の効力の喪失は、一価の対応物、配列番号２の不活性化の約２倍の速さで起こる。これは、２つの同等部位（すなわち各ドメインにおけるＤ１０５）の存在と一致しており、そのそれぞれでの異性化がナノボディを不活性化する。またしたがって、この効力喪失のデータから推測されるような見掛けの異性化速度は、配列番号２で観察されるものよりも２倍高い。
【０２４５】
結論
配列番号１の主な生成物に関連した物質が、
ｉｖ．ＲＰＣプレピーク１：存在する３つのメチオニンのうち１つの特定のメチオニン（Ｍ７８）で２つの同一ドメインのいずれかで起こる単酸化事象（＋１６Ｄａ）、
ｖ．ＲＰＣポストピーク１：生合成中のメチオニン部位でのノルロイシン残基の単一の組込み違い（−１８Ｄａ）、
ｖｉ．ＲＰＣポストピーク２：ピログルタミン酸の形成をもたらすＥ１残基の環化、
の結果であるという決定的な証拠を提示している。
【０２４６】
さらに、３つの上述の変異型の効力は全て、真の生成物のものと有意に異なってはいないことが分かった。これらの結果は、これらの生成物に関連する変異型の相対的存在量と組み合わせて（表Ｂ−１）、配列番号１のＤＳ／ＤＰの純度は、活性に基づき９９％を超えて良好であるという結論につながる。
【０２４７】
高温（すなわち２５℃以上）での配列番号１の長期インキュベーションにより、ＲＰＣプロファイルが相当変化する。上述の酸化及びピログルタミン酸変異型は、インキュベーション温度及び時間と並行して、保存中に増大する。さらに、主ピークが幾つかの異なる種に分割され、このことは１つ又は複数の新規の分子種が生成されていることを示している。本発明者らは、ＲＰＣ主ピークの分割が１０５位でのアスパラギン酸、及びより低い程度でＤ６２の異性化に起因していることを見出している。本発明者らは、ＣＤＲ３領域に位置する１０５位でのアスパラギン酸残基の異性化が、高温での配列番号１の効力の喪失の基となる主要な分子機構であることも示している。この知見を図２１に要約する。
【０２４８】
実施例２：ＲＡＮＫＬ結合ナノボディ（登録商標）構築物（配列番号１９）の安定化
１．ＲＡＮＫＬ結合ナノボディの生成
アミノ酸配列：
ＲＡＮＫＬ−１（配列番号１９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＳＳＩＴＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＹＩＲＰＤＴＹＬＳＲＤＹＲＫＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２４９】
ＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ（配列番号２０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＳＳＩＴＧＳＧＧＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＹＩＲＰＤＴＹＬＳＲＤＹＲＫＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２５０】
上記で開示のアミノ酸配列に基づき、当業者は、例えばポリペプチド配列の逆翻訳、重複オリゴプライマーの生成、ＰＣＲ増幅、好適な発現ベクターへのクローニング、好適な宿主での発現、及び（例えばGeneArt、ＤＮＡ−２−ｇｏ（商標）、sloningBioTechnology等の企業により提供される）所望のポリペプチド、例えば上記のＲＡＮＫＬ−１の単離／精製に基づくポリポリペプチドを生成することができる。
【０２５１】
ＲＡＮＫＬ−１の一次配列の解析は、分子の異性化に関する潜在的な部位として、及びしたがって化学的不安定性に関する潜在的な源としてＤ６２を同定した。この可能性を試験するために、安定性アッセイを、ＲＡＮＫＬ−１分子、及び潜在的異性化部位がグルタミン酸残基（Ｅ）に置き換わっている突然変異型（ＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ）を用いて行った。ＲＡＮＫＬ−１におけるＤ６２Ｅの突然変異を、突然変異を含むプライマー：
ＲｅｖＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ：ＣＣＴＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＴＴＣＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＴ（配列番号２１）
ＦｗＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ：ＡＣＧＴＡＴＴＡＣＧＣＧＧＡＴＴＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号２２）
を使用して重複ＰＣＲにより導入した。
【０２５２】
ｐＡＸ０５４ベクターにおけるＳｆｉＩ／ＢｓｔＥＩＩ断片がｐＵＣ１１９の誘導体であるため、ＲＡＮＫＬ−１又はＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２ＥをコードするｃＤＮＡを両方ともクローニングした。ベクターは、ＩＰＴＧを使用して、発現の導入の制御を可能にするＬａｃＺプロモータを含有する。ベクターは、カナマイシンに対する耐性遺伝子を有する。マルチクローニング部位は幾つかの制限部位を保有し、そのＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩはナノボディ（登録商標）をクローニングするのに頻繁に使用される。ナノボディ（登録商標）コーディング配列を有するフレーム内で、ベクターはＣ末端のｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードしている。シグナルペプチドは発現ナノボディ（登録商標）をペリプラズムに転座させるｇｅｎ３リーダー配列である。
【０２５３】
産生のために、ＲＡＮＫＬ−１及びＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ構築物を５０ｍｌのＴＢ／０．１％グルコース／カナマイシン中に接種し、懸濁液を３７℃で一晩インキュベートした。５×４００ｍｌ培地に、１００倍希釈の得られたｏ／ｎ前培養物を接種した。培養物をＯＤ６００が５を超えるまで、３７℃、２５０ｒｐｍでさらにインキュベートした。培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、さらに３７℃、２５０ｒｐｍで４時間、インキュベートし続けた。培養物を４５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、その後上清を廃棄した。ペレットを−２０℃で保存した。精製のために、ペレットを解凍し、２０ｍＬのｄＰＢＳ中で再懸濁して、４℃で１時間インキュベートした。それから、懸濁液を８５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、ペリプラズム抽出物から細胞残屑を取り除いた。
【０２５４】
ナノボディを、陽イオン交換（Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓカラム、洗浄バッファー：１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）、溶出バッファー：１０ｍＭのクエン酸／１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０））、その後サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  Ｈｉｌｏａｄ  １６／６０カラム、ｄ−ＰＢＳ中））により精製した。
【０２５５】
ＯＤ２８０ｎｍを測定し、濃度を算出した。試料を−２０℃で保存する。
【０２５６】
アルファスクリーン
ナノボディＲＡＮＫＬ−１及びＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅの精製試料を、ヒトＲＡＮＫＬとヒトＲＡＮＫ−Ｆｃとの間の相互作用を阻害するそれらの能力に関してアルファスクリーンで解析した。このアッセイでは、１ｕＭ〜１０ｐＭの範囲の様々な濃度の抗ＲＡＮＫＬナノボディを、３８４ウェルプレートで１５分間、３ｎＭのビオチン化ヒトＲＡＮＫと共にインキュベートした。その後、ＲＡＮＫＬ（１ｎＭ）と抗ＲＡＮＫＬ  ＭＡｂ  ＢＮ−１２（Diaclone）でコーティングしたアクセプタビーズ（２０ｕｇ／ｍｌ）との混合物を添加し、３０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズ（２０ｕｇ／ｍｌ）を添加した。１時間のインキュベーション後、プレートをＥｎｖｉｓｏｎアルファスクリーンリーダー（PerkinElmer）で読み取った。全ての実験を二連で行った。抑制曲線及びＩＣ５０値を図２２に示す。ＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅ突然変異型におけるＤ６２Ｅ突然変異は結合効力を損わない。
【０２５７】
安定性研究
タンパク質バッチをＤ−ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。その後、試料を０．２２μｍ径のフィルターで濾過した。試料の一部を参照試料として−８０℃で保存し、他の部分をその後の逆相−ＨＰＬＣ解析のために、３７℃で４週間（インキュベーションオーブン中で）保存した。
【０２５８】
逆相−ＨＰＬＣ解析：使用するカラムは、Agilent製のシステム上でのＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ  Ｃ３（５μｍ）カラムであった。カラムの温度は実験中７０℃であった。実験中で使用するバッファーＡは０．１％トリフルオロ酢酸であり、バッファーＢは０．１％トリフルオロ酢酸／９９．９％アセトニトリルであった。使用するプログラムを以下に記載する。
【０２５９】
プログラム     
時間  
（分）      ％Ｂ        
２        １０        
３        ２７．５        
２５，５  ３５        
２６      １００        
２８，５  １００        
２９      １０        
３５      １０   
【０２６０】
図２３は、ＲＡＮＫＬ−１及びＲＡＮＫＬ−１＿Ｄ６２Ｅが両方ともいかなる異性化（例えばＤ６２及び／又はＤ１０５での異性化（isomarization））をも示唆するピークを示さず、対照のナノボディであるｖＷＦ−１２Ａ２ｈ１配列番号２はピークを示していることを示す。Ｎ末端の環状ピログルタミン酸の形成を反映するピークは両方のＲＡＮＫＬナノボディに存在したが、これは２つのポリペプチドが（所定の条件下で）１位では不安定であることを示している。
【０２６１】
実施例３：ＲＰ−ＨＰＬＣに関するカラム温度の最適化
材料−ＩＬ６Ｒ２０３（配列番号２３）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＤＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＧＩＳＳＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＰＤＳＳＷＹＬＤＧＳＰＥＦＦＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＤＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＧＩＳＳＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＰＤＳＳＷＹＬＤＧＳＰＥＦＦＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２６２】
ＩＬ６Ｒ２０３（配列番号２３）を、例えば上記で開示のように生成し（GeneArtサービスプロバイダによる）、上記のクロマトグラフィ条件下であるが、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに対するカラム温度の影響を評価するために、４つの異なるカラム温度（７５℃、７０℃、６０℃及び５０℃）でＺＯＲＢＡＸ  Ｃ３カラムにおいて解析した。
【０２６３】
ＨＰＬＣ条件：
移動相Ａ：９９．９％  Ｈ２Ｏｑ／０．１％  ＴＦＡ
移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ／９９．９％  アセトニトリル
カラム：ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ３（Agilent、製品番号８８３９９５−９０９、シリアル番号ＵＳＫＤ００１６１２）
流速：１ｍＬ／分
勾配：０．３３％Ｂ／分（５％Ｂ（０分）−５％Ｂ（３分）−３０．５％Ｂ（３．５分）−４０．５％Ｂ（３３．５分）−９５％Ｂ（３４分）−９５％Ｂ（３７分）−５％Ｂ（３７．１分）−５％Ｂ（４０分））
検出：ＵＶ２１４ｎｍ（２８０ｎｍでも回収した）
注入量：５μｇ
使用するカラム温度：５０℃−６０℃−７０℃−７５℃
【０２６４】
表：Ｂ−６     
カラム温度      ピーク                  面積（ｍＡＵ＊分）        
７５℃          主ピーク                ５３８２．８１        
前勾配ピーク            １３８．０７        
７０℃          主ピーク                ５１７３．７０        
前勾配ピーク            １８７．２６        
６０℃          主ピーク                ３４９２．７７        
前勾配ピーク            ８５８．３４   
：異なるカラム温度（７５℃、７０℃及び６０℃）を使用するＩＬ６Ｒ２０３の解析の統合データの概要。低いカラム温度のクロマトグラムは統合されなかった。示されるように、カラム温度の減少にはピーク回収に対して負の影響がある。統合データは、主ピークと前勾配ピークとして表されるピークとで示される。明らかに、主ピークは低いカラム温度で低減する。臨界点には、６０℃〜７０℃で達すると考えられる。主ピーク面積が低減すると、前勾配ピークで溶出する材料の量が有意に増大する。このことは、低いカラム温度での分子の高度な粘性を示し得る。
【０２６５】
評価：
カラム温度は、溶出ピーク特徴に対して劇的な影響がある。得られたデータは、７０℃〜７５℃の最適温度を示す。試験された低い温度により、ピーク面積の回収率（表Ｂ−６を参照されたい）、分解能の喪失が引き起こされ、テーリングが誘導される。６０℃で既に、ピークの形は７０℃〜７５℃のものと完全に異なっている。
７５℃のクロマトグラムは、７０℃のクロマトグラムと比較すると、幾つかの側面ピークの面積／高さの増大を示す。これらは、ＩＬ６Ｒ２０３バッチの実際の亜集団ではなく、温度誘導性のピークであり得る。
【０２６６】
ＩＬ６Ｒ２０２
ＩＬ６Ｒ２０２（配列番号２４）を、例えば上記で開示のように生成し（GeneArtサービスプロバイダによる）、同じ範囲のカラム温度をＩＬ６Ｒ２０２でも試験した。
【０２６７】
ＩＬ６Ｒ２０２：配列番号２４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＤＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＧＩＳＳＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＰＤＳＳＷＹＬＤＧＳＰＥＦＦＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２６８】
ＨＰＬＣ条件：
移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ
移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ／９９．９％  アセトニトリル
カラム：ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ３（Agilent、製品番号８８３９９５−９０９、シリアル番号ＵＳＫＤ００１６１２）
流速：１ｍＬ／分
勾配：０．３３％Ｂ／分（５％Ｂ（０分）−５％Ｂ（３分）−３０．５％Ｂ（３．５分）−４０．５％Ｂ（３３．５分）−９５％Ｂ（３４分）−９５％Ｂ（３７分）−５％Ｂ（３７．１分）−５％Ｂ（４０分））
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
注入量：５μｇ
使用するカラム温度：
５０℃−６０℃−７０℃−７５℃
【０２６９】
表：Ｂ−７     
カラム温度            ピーク                  面積（ｍＡＵ＊分）        
７５℃                主ピーク                １８１５５．９        
前勾配ピーク            ２８３．９５        
７０℃                主ピーク                １８２６５．３０        
前勾配ピーク            ３９５．９４        
６０℃                主ピーク                １６５６８．８０        
前勾配ピーク            １１７４．０７   
：異なるカラム温度（７５℃、７０℃及び６０℃）を使用するＩＬ６Ｒ２０２の解析の統合データの概要。低いカラム温度のクロマトグラムは示されていない。ＩＬ６Ｒ２０３で示されるように、臨界点には、６０℃〜７０℃で達する。この境界の低温端で、ピーク回収の相当な喪失が起こると考えられる。同時に前勾配ピーク面積がかなり増大する。
【０２７０】
評価：
カラム温度は、（ＩＬ６Ｒ２０３と同様に）ＩＬ６Ｒ２０２の溶出ピークプロファイルに対して劇的な影響がある。最適温度は７０℃〜７５℃である。
実際には、このような高いカラム温度でＩＬ６Ｒ２０２の分解により引き起こされる人為的なピークの発生を最小限に抑えるために、カラム温度には７０℃を使用するのがより良好である。
【０２７１】
実施例４：上記の突然変異型研究による研究結果を考慮する１２Ａ２ｈ１及びＡＬＸ−０００８１の安定化
配列番号１及びその一価の構成要素である配列番号２の化学的安定性における本発明者らの考えに基づき、本発明者らは、４つの単一のアミノ酸置換、すなわちＥ１Ｄ、Ｄ６２Ｅ、Ｍ７８Ｔ及びＤ１０５Ｑ（配列番号２６）を組み込む配列番号２の変異型を操作した。
【０２７２】
このため本明細書中では、安定化した一価の構成要素は、安定化した１２Ａ２ｈ１又は配列番号２６と称し、実施例１の安定化したｖＷＦ化合物を、ＶＷＦ０００１又は配列番号２５と称する。
【０２７３】
配列番号２５−本明細書中でＶＷＦ０００１とも称されるＡＬＸ−００８１  ＳＶ１のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ  ＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡ  ＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡ  ＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹ  ＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧ  ＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴ  ＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱ  ＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡ  ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧ  ＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ  ＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦ  ＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱ  ＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡ  ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹ  ＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴ  ＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶ  ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥ  ＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡ  ＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲ  ＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧ  ＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０２７４】
配列番号２６−１２Ａ２Ｈ１  ＳＶ１のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳ  ＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡ  ＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡ  ＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹ  ＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧ  ＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴ  ＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱ  ＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０２７５】
１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１遺伝子及びＡＬＸ−００８１  ＳＶ１遺伝子の構築を遺伝子アセンブリにより行った。ＰＣＲで遺伝子を組み立てるために、対象の遺伝子をカバーする重複オリゴヌクレオチド組を発注した。残留（rescue）ＰＣＲ生成物をゲルから精製し、ＫｐｎＩ及びＮｄｅＩ制限酵素で消化した。それから断片を、ＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ酵素で事前に切断したｐｅｔ２８ａ／ＴＡＣ／ｐｅｌＢベクターでライゲーションした。
【０２７６】
それからライゲーション混合物をＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。ＳＯＣ培地の添加後、３７℃で１時間インキュベーションして、アリコートをＬＢ／カナマイシンプレート上にプレーティングして、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、個々のクローンを、ｐｅｔ２８ａプロモータとＴ７ターミネータプライマーとを使用するコロニーＰＣＲにより解析した。続いて１２Ａ２  ＳＶ１及びＡＬＸ−００８１  ＳＶ１でのＰＣＲ陽性クローンをＬＢ／カナマイシン中で一晩成長させた。ＤＮＡシークエンシングのために、一晩培養物から、プラスミドＤＮＡをＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐ（Sigma Aldrich製のキット）で調製した。
【０２７７】
１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１及びＡＬＸ００８１  ＳＶ１の発現及び精製
一晩始動培養物（starter cultures）を調製し、カナマイシン及び０．１％（ｇ／ｖ）グルコースを含有するテリフィックブロス（TerrificBroth）培地中でより大きい規模で発現を開始するのに使用した。上記の培地が３００ｍＬ入ったフラスコを１０ｍＬの始動培養物で接種した後、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で成長させた。およそ４時間後、温度を２８℃まで下げた。さらに３時間後、ＩＰＴＧにより最終濃度が１ｍＭになるまで誘導を開始し、培養物を２８℃で一晩さらにインキュベートした。翌日、培養物を４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを短時間凍結し、解凍した後、ＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した。細胞を再懸濁した後、懸濁液を室温で２時間振盪した。懸濁液を８５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、抽出物から細胞残屑を取り除いた。その後、上清をｐＨ３．５まで酸性化し、４℃で一晩保存した。翌朝、懸濁液を８０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を濾過した。濾過後、導電率が５ｍＳ／ｃｍより低くなるまで溶液を水で希釈した。その後、溶液をバッファーＡ（１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．５））で予め平衡化したＳｏｕｒｃｅ  Ｓイオン交換カラムに充填した。バッファーＡで洗浄後、結合材料を１０カラム容量の０％〜１００％勾配のバッファーＢ（１０Ｍｍのクエン酸／１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．５））で溶出した。対象のタンパク質を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。その後、プールした画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィにより処理した。その後、精製した構築物を含有する画分のタンパク質濃度を、２８０ｎｍで分光光度法により、算出された吸光係数及び分子量を使用して求めた。タンパク質の純度をＨＰＬＣ−ＲＰＣにより確認した。
【０２７８】
安定な変異型１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１及びＡＬＸ−００８１  ＳＶ１の結合機能性
ＡＬＸ−００８１  ＳＶ１の結合効力を、平行線法により参照材料としてＡＬＸ−００８１を使用して、ビアコア３００機器で求めた。この方法を、二官能性が観察されるように設計する。このアッセイでは、本発明者らは、予想通りＡＬＸ−００８１  ＳＶ１では強力な結合を観察し、１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１では効力を観察しなかった。ＡＬＸ００８１（配列番号１）と比較した相対効力は約８０％であった。
【０２７９】
ＶＷＦのＡ１ドメインに関する１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１の親和性もビアコア機器を用いて求めた。運動速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）とを求めた（以下の表を参照されたい）。
【０２８０】
配列番号２          配列番号２６        
ｋｏｎ（１／Ｍｓ）        １．９３Ｅ＋０７    ２．１Ｅ＋０７        
ｋｏｆｆ（１／ｓ）        ０．０２０７        ０．０２０７        
ＫＤ（ｎＭ）              １．０７            ０．９８６   
【０２８１】
安定な変異型の化学的安定性
１２Ａ２ｈ１  ＳＶ１及びＡＬＸ−００８１  ＳＶ１の両方を、Ｄ−ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で３７℃でインキュベートした。様々な時点で、試料をＲＰ／ＨＰＬＣにより解析した。図３９及び図４０に示されるように少量の変異型しか８週間後に形成されなかったと考えられた。配列番号１及び配列番号２に関して図１６に表したプロファイルとは対照的に、ＲＰ／ＨＰＬＣプロファイルは余り複雑なものではなく、主なプレピーク及びポストピークが失われており、これは酸化、ピログルタミン酸（puroglutamte）形成及びアスパラギン酸異性化によるものであることが示されている。このため、重要残基を適当な厳選されたアミノ酸残基で置き換えることにより、本発明者らは、本質的に同程度の生物活性、及び劇的に改善された化学的安定性を有する変異型を産生することができた（またフォルツモデル及びＲＩＰＡで測定されるｉｎ  ｖｉｖｏ活性に関しては実施例６を参照されたい）。
【０２８２】
本発明者らは、３７℃ビアコアで保存した試料の機能性も求めた。これらの実験では、参照試料及び安定性試料の両方が１００００倍に希釈され、その後３５００ＲＵ  ｖＷＦ  Ａ１ドメインでコーティングされたセンサーチップを通った。参照試料と安定化試料との間に結合センサーグラムではわずかな差異しか観察されなかったため、本発明者らは、化学的安定性は改善されるが、結合機能性はほぼ同程度であると結論付ける。
【０２８３】
上記のような同様の結果は、それぞれ配列番号３９（二価）及び配列番号４０（一価の構成要素）による突然変異型結合剤でも期待される。
【０２８４】
実施例５：別のナノボディ構築物、すなわちＩＬ６Ｒ結合ナノボディ（登録商標）構築物（配列番号２７）の安定化
ＤＮＡ配列：
ＩＬ６Ｒ２０１（配列番号２７、野生型：安定性に関して確認し、潜在的に安定化している）:
ＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２８５】
ＩＬ６Ｒ２０１の突然変異型：
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ５５Ｅ（配列番号２８）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２８６】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ５５Ｑ（配列番号２９）：ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２８７】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ６２Ｅ（配列番号３０）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２８８】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ１０２Ｅ（配列番号３１）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２８９】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ１０２Ｑ（配列番号３２）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２９０】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ１０８Ｅ（配列番号３３）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２９１】
ＩＬ６Ｒ２０１＿Ｄ１０８Ｑ（配列番号３４）：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡ
【０２９２】
ナノボディを、Ｔａｃプロモータ及びＰｅｌＢリーダー配列を使用するｐｅｔ２８ａベクターにクローニングした。
【０２９３】
発現及び精製
５０ｍｌのＬＢ／カナマイシン中でＩＬ６Ｒ２０１構築物Ｄ５５Ｅ（クローン２）、Ｄ５５Ｑ（クローン４）、Ｄ１０２Ｅ（クローン３）、Ｄ１０２Ｑ（クローン１）、Ｄ１０８Ｅ（クローン２）及びＤ１０８Ｑ（クローン２）（ｐｅｔ２８ａ／ＴＡＣ／ｐｅｌＢベクター）の前培養を開始し、３７℃で一晩インキュベートする。発現を３×±３３０ｍＬのＴＢ  Ｉ＋ＩＩ／カナマイシン中で開始する。各フラスコを１０ｍＬの始動培養物で接種し、その後温度を２８℃まで下げた後、約４時間２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で成長させた。６時間後に培養物を１ｍＭのＩＰＴＧ（１Ｍのストック３３０ｕＬ）で誘導し、さらに２８℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートし続けた。培養物を４５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、その後上清を廃棄した。ペレットを−２０℃で２〜３時間保存し、その後ペレットを３０ｍＬのＰＢＳ／１ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁して、室温で２時間振盪した。懸濁液を８５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、抽出物から細胞残屑を取り除いた。
【０２９４】
精製に使用するカラムはＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡ（Poros）である。この実験では、バッファーＡはＤ−ＰＢＳ／０．５ＭのＮａＣｌであり、バッファーＢは１００Ｍｍのグリシン（ｐＨ２．５）であった。±３０ｍＬのペリプラズム抽出物を１０ｍＬ／分の流速でカラムへとポンプにより注入した。その後、カラムを、複合カラム容量でバッファーＡを用いて洗浄した。結合タンパク質を溶出するために、バッファーＢに切り替えた。
【０２９５】
次に、サイズ排除クロマトグラフィを使用した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ２６／６０をサイズ排除に使用した。ゲル濾過をＤ−ＰＢＳ中で行った。
【０２９６】
ＯＤ２８０ｎｍを測定し、濃度を算出した。試料を−２０℃で保存した。
【０２９７】
安定性研究
元のタンパク質バッチをＤ−ＰＢＳ中で５００ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬまで希釈した（総容量５ｍＬ）。その後、試料を０．２２μｍのフィルターで濾過し、５００μｌを参照試料として−８０℃で保存し、およそ４５００μｌを３７℃で（インキュベーションオーブン中で）保存した。
【０２９８】
ビアコア３０００での解析
３７℃で４週間保存したＩＬ−６Ｒ２０１、ＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ５５Ｅ、ＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ５５Ｑ、ＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ１０２Ｅ、ＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ１０２Ｑ、ＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ１０８Ｅ及びＩＬ−６Ｒ２０１  Ｄ１０８Ｑの結合特性を、初期結合速度（ＩＢＲ）及び傾斜を使用することにより研究した。
【０２９９】
検量線は、高密度ｈＩＬ−６ＲチップでのＩＬ−６Ｒ２０１及びその突然変異型に関しては０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲で完全に線形であることが分かっている。したがって、０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度は、（線形性を制御するため）この実験に含まれ、また機能性を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で５回各試料を注入することにより求める。
【０３００】
初めに、高密度ｈＩＬ−６Ｒチップを、ＩＬ−６Ｒ２０１を５回注入することによりプレコンディショニングする（preconditioned）。次に、０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩＬ−６Ｒ２０１を注入した後、全ての試料を５回注入する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して評価を行う。傾斜を、「全体的適合（Generalfit）」法及び線形適合モデルを使用してＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで求める。初期結合速度（ＩＢＲ）を求めるのに使用するデータは、５ｓ〜２５ｓの間で選択される傾斜である。
【０３０１】
逆相−ＨＰＬＣ
使用するカラムは、Agilent製のシステム上でＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ  Ｃ３（５μｍ）カラムであった。実験中のカラムの温度は７０℃であった。実験中に使用するバッファーＡは０．１％トリフルオロ酢酸であり、バッファーＢは０．１％トリフルオロ酢酸／９９．９％アセトニトリルであった。使用するプログラムを以下に記載する：
【０３０２】
プログラム     
時間（分）    ％Ｂ        
２            １０        
３            ２７，５        
２５，５      ３５        
２６          １００        
２８，５      １００        
２９          １０        
３５          １０   
【０３０３】
評価：突然変異誘発を行い、潜在的な異性化部位（ＣＤＲ２で２つの部位及びＣＤＲ３で２つの部位）を取り除いた。安定性研究を様々な突然変異型で行った（３７℃で４週間の保存）。ＲＰＣでの解析により、活性を保つと共に、異性化を低減するのに重要な突然変異として、Ｄ１０８Ｅ及びＤ１０８Ｑが同定された（図２７と図３３とを比較されたい：Ｄ１０８をＤ１０８Ｅ又はＤ１０８Ｑに置き換えるだけで、異性化が妨げられた）。
【０３０４】
実施例６：ＡＬＸ−００８１（配列番号１）及びＶＷＦ０００１（配列番号２５）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
フォルツモデル
ヒヒにおける改良フォルツモデルを、急性血栓症の予防における有効性を求めるのに使用した。フォルツモデルは、国際公開第２００４／０６２５５１号パンフレットの実施例１８に詳しく記載されている。９匹の健常な雄ヒヒ（チャクマヒヒ（Papio ursinus））（体重９．６ｋｇ〜１７ｋｇ）を野生で捕獲し、本研究に使用した。ヒヒには標準的な乾燥飼料のみを与えた。
【０３０５】
全ての手法は、'National Code for Animal Use in Research,
Education, Diagnosis andTesting of Drug and Related Substanced in South Africa'に従った'Ethics committeefor Animal Experimentation of the University of the
Free State and Free StateProvincial Administration'により認可された。
【０３０６】
簡潔にいうと、全身麻酔下で、シャントを大腿動脈と大腿静脈との間に入れた。シャントは、薬剤投与及び血液サンプリングのため、並びにシャントの周りに配置した血管周囲の超音波フロープローブを用いて、血流をモニタリングするのに使用した（ＴｒａｎｓｏｎｉｃシステムＴＳ４１０、プローブ（rpobe）：ＭＥ３ＰＸＬ１０Ｏ８）。それから鉗子を用いて大腿動脈を損傷させ、クランプを損傷部位上に置き、大腿動脈の外部狭窄を生じさせるのに使用した。結果として、高いせん断速度が得られ、血流は元の流速の２０％まで低減した。多血小板血栓が形成され、続いてこれを機械的に取り除き、これにより循環流低減（cyclic flow reductions）（ＣＦＲ）をもたらした。１ＣＦＲは、動脈の狭窄と完全閉塞（流量０）との間の時間である。再現性のあるＣＦＲの３０分の制御期間後、シャントを洗い流し、ビヒクル（食塩水）を内部対照として投与した。ＣＦＲはさらに３０分間続いた。続いて、漸増用量のナノボディ（登録商標）をシャントに静脈注射し、ＣＦＲに対する影響を研究した。抑制が天然の治癒現象ではなく、治療の影響であったことを確認するために、ＣＦＲの抑制後に、新たな損傷を加えた。最高用量のナノボディ（登録商標）の投与後にＣＦＲが完全に抑制された後、ナノボディ（登録商標）の効力をさらに試験するために、エピネフリンを注射した。エピネフリンは再び血小板を活性化し、ＣＦＲの弱い抑制と強い抑制とを区別することができる。実際、アスピリン（登録商標）を同じモデルで使用した場合、エピネフリンの存在下でＣＦＲが再び現れることが、これまでに実証されている。
【０３０７】
各投与の１０分後、血液試料（６．５ｍｌ）を実験室解析のために採取した。ＲＩＰＡ、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、並びにナノボディ（登録商標）及びＶＷＦ：Ａｇの血漿濃度を、本明細書とは別に、例えば国際公開第２００４／０６２５５１号パンフレットの実施例１８に記載のように解析した。
【０３０８】
２つの異なる出血解析を行った：皮膚出血時間（Ｓｕｒｇｉｃｕｔ装置を使用して、ナノボディ（登録商標）の各投与の１０分後に測定される）及びガーゼを鼠径部の切断部に挿入し、ガーゼを秤量することにより総失血を測定した第２の手術による出血試験。ナノボディ（登録商標）の新たな投与それぞれの直前、３０分毎にガーゼを交換した。各投与に関する失血量を、ガーゼを秤量することにより求めた。これは、（食塩水注射中の）対照ガーゼでの失血量と比較して表された。
【０３０９】
ＲＩＰＡ
ＲＩＰＡはＡＬＸ−００８１に対するバイオマーカーであり、多血小板血漿（ＰＲＰ）の試料中に分散した血小板が抗生物質リストセチンによるＡ１ドメインの非生理学的活性化後に凝集体を形成する速度及び程度の尺度である（例えばさらに国際公開第２００４／０６２５５１号パンフレットの実施例１８を参照されたい）。ＲＩＰＡは２つの工程で起こる。第１の工程では、血小板が、リストセチンの存在下でＶＷＦと凝集し、第２の工程では、内部ＡＤＰの血小板からの放出により、血小板が凝集する。血小板の凝固により、ＰＲＰの濁度が低下する。濁度の変化を血小板凝集装置で測定する。
【０３１０】
ＲＩＰＡを、Free State, Bloemfontein, South Africaの大学で解析した。血小板の凝集を、Chronologの全血光学血小板凝集計（Ｍｏｄｅｌ  ５６０ＣＡ、Chronolog,USA）で行った。ＰＲＰを、１２００ｒｐｍで５分間、全血（０．３２％クエン酸で回収）を遠心分離することにより調製した。ＰＲＰを含有する上方の画分を慎重に除去した。下方の画分を３０００ｒｐｍで１０分間さらに遠心分離し、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を調製した。血小板をＰＲＰ中で計測し、最終濃度が１μｌ当たり２０００００個の血小板になるように自己ＰＰＰ中で希釈した。凝集を、３ｍｇ／ｍｌのリストセチン（DAKO）を添加することにより誘導し、血小板凝集計を用いて測定した。
【０３１１】
ＡＬＸ−００８１及びＶＷＦ０００１の有効性
初めに２匹のヒヒそれぞれに、漸増用量のＡＬＸ−００８１及びＶＷＦ０００１（ＡＬＸ−００８１＿Ｓｖ又はＡＬＸ−００８１の安定な変異型）を注射した。これらのフォルツ実験中の血流測定値を図３５に示す。
【０３１２】
試験化合物の各投与後のＣＦＲの平均長を表Ｂ−８に要約する。またこの表は、その時点での全投与の累積用量である総用量を示す。ＣＦＲの完全な抑制が得られた用量を（＞１８００）で表す。
【０３１３】
表Ｂ−８：ＡＬＸ−００８１及びＶＷＦ０００１で治療した動物に対するＣＦＲ長（秒）。＞１８００＝３０分間の完全な抑制、血流の減少なし     
薬剤→            ＡＬＸ−００８１  ＶＷＦ０００１        
ヒヒ番号→        Ｂ１              Ｂ２        
総用量↓          用量↓      
０μｇ／ｋｇ      対照              ９２              ８４        
０μｇ／ｋｇ      食塩水            １４２            ９７        
３μｇ／ｋｇ      ３μｇ／ｋｇ      １３９            １２５        
１３μｇ／ｋｇ    １０μｇ／ｋｇ    １８９            ５５９        
４３μｇ／ｋｇ    ３０μｇ／ｋｇ    ＞１８００        ＞１８００        
１３３μｇ／ｋｇ  ９０μｇ／ｋｇ    ＞１８００        ＞１８００        
４０３μｇ／ｋｇ  ２７０μｇ／ｋｇ  ＞１８００        ＞１８００   
【０３１４】
ＣＦＲの完全な抑制が、ＡＬＸ−００８１では、３０μｇ／ｋｇ（４３μｇ／ｋｇの累積用量）、及びＶＷＦ０００１では１０μｇ／ｋｇ（１３μｇ／ｋｇの累積用量）の用量で得られた。
【０３１５】
抑制は、新たな損傷時でも保持されたが、エピネフリンの注入後には予想外に喪失した。後者は、おそらく実験を余りに長期間続けたため、ＡＬＸ−００８１の血漿レベルがエピネフリン注射時には低すぎたことにより説明することができる（以前は、本発明者らは、ボーラス＋連続注入によりＡＬＸ−００８１を投与したが、今回はボーラスのみを投与した）。
【０３１６】
ＲＩＰＡを、食塩水注射、及びＡＬＸ−００８１又はＶＷＦ０００１の各投与の１０分後に採取した血液試料において測定した。両方のヒヒで、ＲＩＰＡ試験の結果をＣＦＲ長と比較した（図３６）。
【０３１７】
ＲＩＰＡとＣＦＲ長との間で逆の関係が観察された。両方のヒヒで、ＲＩＰＡ結果を、フォルツモデルでの有効性の結果と十分に比較する。したがって、ＲＩＰＡは、例えばＡＬＸ−００８１／ＶＷＦ０００１等のｖＷＦ結合因子に対する有効性バイオマーカーとみなし得る。
【０３１８】
実施例７：強制酸化実験
実施例７．１  ＩＬ６Ｒ２０１での強制酸化実験
本発明者らはこれまでに、配列番号２（ｖＷＦ−１２Ａ２ｈ１）で７８位に存在するメチオニンが酸化されやすいことを実証していた。本実施例では、ＶＨＨ断片ＩＬ６Ｒ２０１（配列番号３５）において突然変異を導入したことを記載しておく。この突然変異型では、７８位のスレオニン（スレオニンは、ＶＨ断片又はＶＨＨ断片におけるＦＲ３でこの位置に存在することが多い残基である）をメチオニンに変えて、ＩＬ６Ｒ２０１  Ｔ７８Ｍ（配列番号３６）と称した。突然変異型タンパク質の精製後、Ｈ２Ｏ２による強制酸化実験を、ＩＬ６Ｒ２０１及びＩＬ６Ｒ２０１  Ｔ７８Ｍの両方を用いて行った。続くＲＰ／ＨＰＬＣでの解析により、本発明者らは、突然変異したＶＨＨが酸化を受けやすくなることを実証することができたが（図３７、上方の出力波形）、非修飾型はＨ２Ｏ２による処理に耐性があった（図３７、下方の出力波形）。
【０３１９】
ＩＬ６Ｒ２０１のアミノ酸配列（配列番号３５）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＤＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＧＩＳＳＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＰＤＳＳＷＹＬＤＧＳＰＥＦＦＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３２０】
ＩＬ６Ｒ２０１−Ｔ７８Ｍのアミノ酸配列（配列番号３６）:
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＤＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＧＩＳＳＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＰＤＳＳＷＹＬＤＧＳＰＥＦＦＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３２１】
実施例７．２  Ｈ２Ｏ２による１１９Ａ３の強制酸化実験
１１９Ａ３のアミノ酸配列（配列番号３７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＳＬＰＡＳＧＮＩＦＮＬＬＴＩＡＷＨＲＱＡＰＧＭＱＲＥＬＶＡＴＩＮＳＧＳＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＱＫＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＱＴＳＧＳＧＳＰＮＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０３２２】
１１９Ａ３（配列番号３７）はそれぞれ、フレームワーク２での５２位のメチオニンと、ＦＲ３での９１位の第２のメチオニンとである２つのメチオニン残基を含有する。ｖＷＦ−１２Ａ２ｈ１（配列番号２）による以前の所見に基づき、本発明者らは、ナノボディ１１９Ａ３において、Ｍ５２だけが溶媒に接近可能であり、このためＨ２Ｏ２により酸化されやすいと仮定している。ｖＷＦ−１２Ａ２ｈ１による所見に基づき、本発明者らは、未変性条件下で、Ｍ５２だけが強制酸化されやすく、変性条件下で、両方の残基が酸化されやすいものと仮定している。精製後、１ｍｇ／ｍＬの１１９Ａ３のＤ−ＰＢＳ溶液を１０ｍＭのＨ２Ｏ２と共に２時間インキュベートした。脱塩処理カラムで余分なＨ２Ｏ２を除去した後、混合物をＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。図３８で示されるように、非処理材料（上部の出力波形）と比較してカラムからより早く溶出したピークが存在していたため（ピークの移行）、処理材料（図３８での下部の出力波形）が修飾されたと考えられた。本発明者らは、非処理試料において、酸化材料に対応する小さいピークが既に存在していたことも観察していた。
【０３２３】
また材料を６Ｍのグアニジンの存在下でＨ２Ｏ２で処理した。またＲＰ−ＨＰＬＣでのこの材料の解析は非処理試料よりも早く溶出したピークを明らかにした（図３８における真ん中の出力波形）。未変性試料及び変性試料で形成された酸化変異型の保持時間の差異は、未変性条件下では、Ｍ５２だけが酸化するのに対して、変性状態では、両方の残基が酸化を受けやすくなるという証拠をもたらしている。
【０３２４】
好ましい態様：
１．  単一可変ドメインであり且つ１位にＤを有する、又はヒト化単一可変ドメインであり、且つ１位にＤを有する、ポリペプチド。
２．  単一可変ドメインがナノボディ若しくはｄＡｂであるか又はヒト化ナノボディ若しくはｄＡｂであり、且つ１位にＤを有する、態様１に記載のポリペプチド。
３．  アミノ酸配列が、１位にＤを有し、且つＣＤＲ内にＭを又はカバットナンバリングを使用する７７位にＭを有しない、態様１又は２に記載のポリペプチド。
４．  アミノ酸配列がＣＤＲのいずれにもＮを有しない、態様１〜３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５．  アミノ酸配列がＣＤＲ３にＮを有しない、態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
６．  アミノ酸配列がＣＤＲのいずれにもＤを有しない、態様１〜３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
７．  アミノ酸配列がＣＤＲ３にＤを有しない、態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
８．  アミノ酸配列がＣＤＲのいずれにもＮＧモチーフ又はＮＳモチーフを有しない、態様１〜３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
９．  アミノ酸配列がＣＤＲ３にＮＧモチーフ又はＮＳモチーフを有しない、態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．  アミノ酸配列がＣＤＲのいずれにもＤＧモチーフ又はＤＳモチーフを有しない、態様１〜３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１１．  アミノ酸配列がＣＤＲ３にＤＧモチーフ又はＤＳモチーフを有しない、態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．  単一可変ドメインであり、且つＣＤＲのいずれにもＤＧモチーフ又はＤＳモチーフを有しない、ポリペプチド。
１３．  単一可変ドメインであり、且つＣＤＲ３にＤＧモチーフ又はＤＳモチーフを有しない、ポリペプチド。
１４．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、異性化しやすい少なくとも１つのＮ又はＤを置き換える工程を含む、方法。
１５．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、酸化されやすい少なくとも１つのＭを置き換える工程を含む、方法。
１６．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、Ｅ１又はＱ１を置き換える工程を含む、方法。
１７．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）Ｅ１若しくはＱ１（存在する場合）を、別の天然アミノ酸に置き換える工程、又は
ｂ）酸化されやすい少なくとも１つのＭ（存在する場合）を別の天然アミノ酸に置き換える工程、又は
ｃ）異性化しやすい少なくとも１つのＮ若しくはＤ（存在する場合）を別の天然アミノ酸に置き換える工程、又は
ｄ）工程ａ）と工程ｂ）とを組み合わせる工程、又は
ｅ）工程ｂ）と工程ｃ）とを組み合わせる工程、又は
ｆ）工程ａ）と工程ｃ）とを組み合わせる工程、
を含む、方法。
１８．  態様１７に記載の方法により生成される突然変異型のライブラリ。
１９．  態様１４〜１８のいずれか１つに記載の方法に従って突然変異型の生成に使用されるヌクレオチド。
２０．  態様１９に記載のヌクレオチドを含む宿主細胞。
２１．  態様２０に記載の宿主細胞を含むスクリーニング方法。
２２．  態様１８に記載のライブラリから選択される群の突然変異型であって、上記突然変異型の解離定数Ｋｄが、１０００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満である、突然変異型。
２３．  態様１８に記載のライブラリから選択される群の突然変異型であって、上記突然変異型の解離定数Ｋｄが、安定化される元のポリペプチドのＫｄの約１００％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である、突然変異型。
２４．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｎをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
２５．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＤをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｄをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
２６．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ又はＮＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｎをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
２７．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｄをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
２８．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードする上記ヌクレオチド配列が存在する場合、Ｎ又はＤをコードする上記ヌクレオチド配列を突然変異させる工程、及び
ｃ）好適な生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
２９．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）上記ジペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が少なくとも１つ存在する場合、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３０．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳモチーフをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程であって、上記モチーフが表面露出し、Ｈ−結合供与残基が不安定化したＮ又はＤに密接している、調べる工程、及び
ｂ）ａ）でヌクレオチド配列が同定される場合、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３１．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳモチーフをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程であって、上記モチーフが表面露出し、Ｈ−結合供与残基が不安定化したＮ又はＤに密接している、調べる工程、及び
ｂ）ａ）でヌクレオチド配列が同定される場合、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３２．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＮＳ、ＤＧ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ、又は安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３３．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ又はＤＧをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が（例えば高温での長期保存、及びＲＰＣプロファイルにおけるその後のプレピークの観察により（実験部を参照されたい））行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ又はＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ又はＤＧが見出される場合はＥＧ又はＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３４．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）同定した配列の異性化が（例えば高温での長期保存、及びＲＰＣプロファイルにおけるその後のプレピークの観察により（実験部を参照されたい））行われているか否かと、任意で同定した配列の異性化が上記ポリペプチドの少なくとも１つの活性、好ましくは全ての活性の喪失に関与しているか否かとを確認する工程、及び
ｃ）異性化が観察される場合は常に、ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ又はＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ又はＤＳが見出される場合はＥＳ又はＱＳ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｄ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３５．  安定性が改善した、単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片をコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において上記ポリペプチド、誘導体又は断片を製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＤＧ、ＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ、又は安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）真核生物又は原核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３６．  ポリペプチド、誘導体又は断片の上記ライブラリをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において機能的ポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＤＧ、ＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ、又は安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）任意のＭが強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、Ｍを、例えばＶ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＬ又はＡ、より好ましくはＡに置き換えることにより、ライブラリ中にさらなる成員を生成する工程、及び
ｄ）真核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、本発明のポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３７．  ポリペプチド、誘導体又は断片の上記ライブラリをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において機能的ポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＤＧ、ＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ、又は安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）Ｍが７８位に存在するか否かを確認すると共に（ナノボディ内での連続ナンバリングシステムにおいて、例えば配列番号２でのナンバリングの図４を参照されたい）、Ｍ７８が存在する場合には、Ｍを、例えばＶ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＬ又はＡ、より好ましくはＡに置き換えることにより、ライブラリ中にさらなる成員を生成する工程、及び
ｄ）真核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、本発明のポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３８．  ポリペプチド、誘導体又は断片の上記ライブラリをコードする組換え遺伝子を含有する発現ベクターによる形質転換により、好適な（例えば真核又は原核）生物において機能的ポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）ポリペプチドの可変ドメインの少なくとも１つをコードする遺伝子を、ＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにおけるＮＧ、ＤＧ、ＮＳ又はＤＳをコードするヌクレオチド配列に関して調べる工程、及び
ｂ）ポリペプチド誘導体を含む（又は本質的にこれらから成る）突然変異型のライブラリを作製する工程であって、ａ）で同定された上記ヌクレオチド配列の１つ又は複数を、ＥＧ、ＱＧ、ＥＳ、ＱＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＤＡ若しくはＤＴ（好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＳ若しくはＤＳが見出される場合はＥＳ若しくはＱＳ、又は好ましくは安定化するポリペプチド中にＮＧ若しくはＤＧが見出される場合はＥＧ若しくはＱＧ）をコードするヌクレオチド配列に置き換える、作製する工程、及び
ｃ）任意のＭが強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、Ｍを、例えばＶ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＬ又はＡ、より好ましくはＡに置き換える工程、及び
ｄ）Ｎ末端のＥ（存在する場合）を例えばＤに置き換える工程、
ｅ）真核生物をこのように修飾した遺伝子で形質転換すると共に、所望の活性を有する、ポリペプチド、断片又は誘導体を発現させる工程、
を含む、方法。
３９．  好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含む、ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを他のポリペプチドに修飾する方法であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、方法。
４０．  ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチド（ここでは、ａ）上記ポリペプチドが、好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループにＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含み、且つｂ）上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフがタンパク質の活性部位内にあることが知られている）を別のタンパク質（ここでは、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つがＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換わっている）に修飾する方法。
４１．  態様２４〜４０のいずれか１つに記載の方法により作製された、ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含む突然変異型ポリペプチドのライブラリ。
４２．  同定されたＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフで可能な置き換えを全て行う、態様４１に記載のナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含む突然変異型ポリペプチドのライブラリ。
４３．  同定されたＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフで或る特定の置き換えだけ、例えばＤＱ又はＤＥ、好ましくはＤＥへの置き換えだけを行う、態様４１に記載のナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含む突然変異型ポリペプチドのライブラリ。
４４．  ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを安定化させる方法であって、ａ）ポリペプチドの一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが、好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループで同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程を含む、方法。
４５．  ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを安定化させる方法であって、ａ）ポリペプチドの一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが、好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループで同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程であって、これらの突然変異型は全て、効果的な分離アッセイにおいて（効果的とは、野生型タンパク質を、Ｄ又はＮの少なくとも１つが異性化されているタンパク質と分離することができることである）タンパク質の主ピーク以外のさらなる主要ピークを観察することができる所定の条件下での期間が、野生型タンパク質と比較して長期化している場合に安定性が改善したとみなす、スクリーニングする工程を含む、方法。
４６．  ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを安定化させる方法であって、ａ）ポリペプチドの一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが、好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループで同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程であって、これらの突然変異型は全て、効果的な分離アッセイにおいてタンパク質の主ピーク以外のさらなる主要ピーク（すなわちタンパク質の主ピークの例えば１０％超又は５％超を示すピーク）を観察するように、上記突然変異型を例えば２５℃又は３７℃を超える高温で保存する期間が、野生型タンパク質と比較して長期化している場合に安定性が改善したとみなす、スクリーニングする工程を含む、方法。
４７．  同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ又はＤＥから成る群から選択されるアミノ酸モチーフ、好ましくはＤＥに置き換える、態様４４〜４６のいずれか１つに記載のナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを安定化させる方法。
４８．  ナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを含むポリペプチドを安定化させる方法であって、ａ）ポリペプチドの一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが、好ましくはＣＤＲループ、好ましくはＣＤＲ２ループ及び／又はＣＤＲ３ループ、より好ましくはＣＤＲ３ループで同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）任意のＭが酸化、例えば強制酸化されやすいか否かを確認すると共に、もしそうであれば、Ｍを、例えばＴ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、好ましくはＴ、Ｌ又はＡ、より好ましくはＡに置き換える工程、及び任意でｄ）Ｎ末端のＥ（存在する場合）を例えばＤに置き換える工程、及びｅ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程を含む、方法。
４９．  ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含むタンパク質を別のタンパク質に修飾する方法であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つがＤＱ又はＤＥから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換わっている、方法。
５０．  タンパク質（ここでは、ａ）上記タンパク質が、ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含み、且つｂ）上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフがタンパク質の活性部位内にあることが知られている）を別のタンパク質（ここでは、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つがＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換わっている）に修飾する方法。
５１．  態様４９又は５０に記載の方法により作製された突然変異型タンパク質のライブラリ。
５２．  同定されたＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフで可能な置き換えを全て行う、態様５１に記載の突然変異型タンパク質のライブラリ。
５３．  同定されたＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフで或る特定の置き換えだけ、例えばＤＱ又はＤＥ、好ましくはＤＥへの置き換えだけを行う、態様５１に記載の突然変異型タンパク質のライブラリ。
５４．  タンパク質を安定化させる方法であって、ａ）タンパク質の一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程を含む、方法。
５５．  タンパク質を安定化させる方法であって、ａ）タンパク質の一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＤＱ、ＤＥ、ＤＴ、ＤＡ、ＮＴ及びＮＡから成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程であって、これらの突然変異型は全て、効果的な分離アッセイにおいて（効果的とは、野生型タンパク質を、Ｄ又はＮの少なくとも１つが異性化されているタンパク質と分離することができることである）タンパク質の主ピーク以外のさらなる主要ピークを観察することができる所定の条件下での期間が、野生型タンパク質と比較して長期化している場合に安定性が改善したとみなす、スクリーニングする工程を含む、方法。
５６．  タンパク質を安定化させる方法であって、ａ）配列のＲＰＣプロファイルが、参照化合物、例えば比較的安定なＲＰＣ）を有する配列番号２１のポリペプチドと比較して変化しているか否かを安定性試験で確認する工程、及びｂ）変化が観察された場合、突然変異型のライブラリの作製を開始する工程であって、同定された不安定であり得るアミノ酸源が他のアミノ酸に置き換わっている、作製を開始する工程を含む、方法。
５７．  タンパク質を安定化させる方法であって、ａ）タンパク質の一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＸＳ又はＸＧ（ここでＸはＤ又はＮ以外の任意の他のアミノ酸であり、好ましくはＸはＱ又はＥである）から成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程であって、これらの突然変異型は全て、上記突然変異型の第１の分解生成物を検出する期間が、安定化したタンパク質の元々の期間と比較して長期化している場合に安定性が改善したとみなす、スクリーニングする工程を含む、方法。
５８．  タンパク質を安定化させる方法であって、ａ）タンパク質の一次配列を確認する工程、及びｂ）ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフが同定される場合、突然変異型のライブラリを作製する工程であって、１つの突然変異型当たり少なくとも１つの同定されたアミノ酸モチーフをＮＸ又はＤＸ（ここでＸはＧ又はＳ以外の任意の他のアミノ酸であり、好ましくはＸはＡ又はＴである）から成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換える、作製する工程、及びｃ）安定性の改善に関して個々の突然変異型をスクリーニングする工程であって、これらの突然変異型は全て、上記突然変異型の第１の分解生成物を検出する期間が、安定化したタンパク質の元々の期間と比較して長期化している場合に安定性が改善したとみなす、スクリーニングする工程を含む、方法。
５９．  いずれかのＣＤＲ領域内にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含む単一可変ドメインを別の単一可変ドメインに修飾する方法であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つがＸＳ又はＸＧ（ここでＸはＤ又はＮ以外の任意の他のアミノ酸であり、好ましくはＸはＱ又はＥである）から成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換わっている、方法。
６０．  高温で長期間にわたって、例えば２５℃を超える高温、例えば３７℃で、例えば１週間、２週間、３週間又は４週間を超える期間、異性化するＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含む単一可変ドメインを修飾する方法であって、上記単一可変ドメインは他の単一可変ドメインに修飾されるものであり、異性化するＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフの少なくとも１つがＸＳ又はＸＧ（ここでＸはＤ又はＮ以外の任意の他のアミノ酸であり、好ましくはＸはＱ又はＥである）から成る群から選択されるアミノ酸モチーフに置き換わっている、方法。
６１．  上記のＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳアミノ酸モチーフを少なくとも１つ含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインを修飾する方法であって、上記突然変異した単一可変ドメインのＲＰＣプロファイルが、該単一可変ドメインが高温で長期間にわたって保存される場合、例えば３７℃で４週間にわたって保存される場合に変化するか否かを確認する工程を含む、方法。
６２．  特定の標的分子に対する修飾されたタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの解離定数が１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ以下である、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．  特定の標的分子に対する修飾されたタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの解離定数が、修飾されていない親又は野生型の単一可変ドメインと本質的に同程度に留まる、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６４．  特定の標的分子に対する修飾されたタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの解離定数が１０ｎＭを超えない、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６５．  特定の標的分子に対する修飾されたタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの解離定数が１ｎＭを超えない、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６６．  特定の標的分子に対する修飾されたタンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインの解離定数が０．１ｎＭを超えない、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６７．  上記タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインが、単一ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」、好ましくはナノボディを含むか、又は本質的にこれらから成る、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６８．  上記タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインが、少なくとも２つのナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」、好ましくはナノボディを含むか、又は本質的にこれらから成る、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６９．  上記タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインが、１つのエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに対して少なくとも１つのナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」と、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに指向性を有する少なくとも１つの他のナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」とを含むか、又は本質的にこれらから成る、態様５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
７０．  異性化しやすいＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインを欠いている、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）のライブラリを作製する方法。
７１．  タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）のライブラリが、異性化しやすいＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメインを欠くように、ライブラリを変化させる方法。
７２．  異性化しやすいＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を修飾する方法であって、上記モチーフがＤ又はＮを含有せず、例えばＱ又はＥを含有するモチーフに変化する、方法。
７３．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＤ又はＮ以外のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含む、方法。
７４．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＤ又はＮ以外のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含み、
ｃ．ここで突然変異したヌクレオチド配列の少なくとも１つが、野生型ポリペプチドと本質的に同程度の標的分子に対する親和性を有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む突然変異したポリペプチドをコードする、方法。
７５．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＤ又はＮ以外のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含み、
ｃ．ここで突然変異したヌクレオチド配列の少なくとも１つが、１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ、より好ましくは１００ｐＭ、より好ましくは１０ｐＭ、より好ましくは１ｐＭ以下のその標的分子に対する解離定数を有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む突然変異したポリペプチドをコードする、方法。
７６．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフの少なくとも１つを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＱ及びＥから成る群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含む、方法。
７７．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＱ及びＥから成る群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含み、
ｃ．ここで突然変異したヌクレオチド配列の少なくとも１つが、野生型ポリペプチドと本質的に同程度の標的分子に対する親和性を有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む突然変異したポリペプチドをコードする、方法。
７８．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、
ａ．ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有する、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む、上記のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を用意する工程、及び
ｂ．突然変異したヌクレオチド配列のライブラリを作製する工程であって、上記ＤＳ、ＤＧ、ＮＧ又はＮＳモチーフのＤ又はＮをコードする配列がＱ及びＥから成る群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に変化する、作製する工程、
を含み、
ｃ．ここで突然変異したヌクレオチド配列の少なくとも１つが、１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ、より好ましくは１００ｐＭ、より好ましくは１０ｐＭ、より好ましくは１ｐＭ以下のその標的分子に対する解離定数を有する、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含む突然変異したポリペプチドをコードする、方法。
７９．  上記ＣＤＲ領域がＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ３領域である、態様７３〜７８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を作製する方法。
８０．  上記ＣＤＲ領域がＣＤＲ２領域又はＣＤＲ３領域である、態様７３〜７８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を作製する方法。
８１．  上記ＣＤＲ領域がＣＤＲ３領域である、態様７３〜７８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を作製する方法。
８２．  ヌクレオチド配列を作製する方法であって、ＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、より好ましくはＣＤＲ３領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有しない、又は不安定化したＮ若しくはＤに近接したＨ−供与基を有する表面露出領域にＤＳ、ＤＧ、ＮＧ若しくはＮＳモチーフを有しない、ナノボディ又はｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは少なくともナノボディを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用意する工程を含む、方法。
８３．  単一可変ドメイン、例えばナノボディ又はｄＡｂ、好ましくはナノボディを少なくとも１つ含むポリペプチド、その機能的誘導体又はその断片において修飾を同定する方法であって、逆相−ＨＰＬＣ解析を使用する工程を含む、方法。
８４．  配列番号３〜配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択されるポリペプチドを含むアミノ酸配列。
８５．  配列番号１５、配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択されるポリペプチドを含むアミノ酸配列。
８６．  配列番号１５を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列。
８７．  配列番号３〜配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択されるポリペプチド。
８８．  配列番号１５から成るポリペプチド。
８９．  配列番号１５、配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択されるポリペプチド。
９０．  実施形態８１〜８６のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
９１．  実施形態８２又は８６のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
９２．  実施形態８３又は８５のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
９３．  態様９０〜９２のいずれか１つに記載のヌクレオチドを含む宿主細胞。
９４．  異性化しやすいＤＳ、ＤＧ、ＮＳ又はＮＧアミノ酸モチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を修飾する方法であって、上記モチーフがＤ又はＮを含有せず、例えばＱ又はＥを含有するモチーフに変化する、方法。
９５．  酸化されやすいＭアミノ酸モチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を修飾する方法であって、上記モチーフがＭを含有せず、例えばＴ又はＡを含有するモチーフに変化する、方法。
９６．  ピログルタミン酸形成又はアミド分解しやすい、１位にＱアミノ酸モチーフ又はＥアミノ酸モチーフを含む、タンパク質、ポリペプチド又は単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を修飾する方法であって、上記モチーフがＱ又はＥを含有せず、例えばＤを含有するモチーフに変化する、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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