(57)【要約】  本発明は、表皮誘導を刺激する薬剤およびケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞を、外胚葉分化を支持する細胞と一緒に共培養する工程含む、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法に関する。本発明のさらなる目的は、本発明の方法により得られたヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の器官型培養液を準備する工程を含む、ヒト代用皮膚を調製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮誘導を刺激する薬剤およびケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞を、外胚葉分化を支持する細胞と一緒に共培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法。
【請求項２】
ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法であって、ＢＭＰ−４およびアスコルビン酸の補充されたケラチノサイト培養培地の存在下で、フィーダー線維芽細胞層で被膜された細胞培養表面上でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項３】
前記ヒト多能性幹細胞が胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）またはヒト誘導多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）である、請求項１または２記載のex vivoにおける方法。
【請求項４】
アスコルビン酸およびＢＭＰ−４を含有しないケラチノサイト培養培地の存在下で、真皮線維芽細胞層で被膜された細胞培養表面上で、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイトを培養するさらなる工程を含む請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法によって得ることのできるヒト多能性幹細胞から派生した単離された実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団。
【請求項６】
請求項５のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団と、場合により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
皮膚損傷に関連した病態の処置のための、請求項５記載のヒト多能性幹細胞から派生した単離された実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団。
【請求項８】
請求項５記載のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の器官型培養液を準備することからなる工程を含む、ヒト代用皮膚を調製するための方法。
【請求項９】
請求項５記載の実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団が、ヒト真皮線維芽細胞の定植された細胞培養マトリックス上に前以って播種されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項８または９記載の方法によって得ることのできるヒト代用皮膚。
【請求項１１】
化合物をスクリーニングするための請求項１０記載のヒト代用皮膚の使用。
【請求項１２】
腫瘍または病理学的起因物質を培養するための請求項１０記載のヒト代用皮膚の使用。
【請求項１３】
皮膚損傷に関連した病態の処置のための請求項１０記載のヒト代用皮膚。
【請求項１４】
創傷閉鎖または火傷処置のための請求項１０記載のヒト代用皮膚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法およびヒト代用皮膚を調製するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
皮膚は、増殖中のケラチノサイトの単一基底層に起源を有する分化中の細胞の機能性単位へと組織化された自己再生層からなる。角質層を含む死滅したおよび死滅中の細胞は落屑中に連続的に脱落し、そして胚芽層に見られる表皮幹細胞から派生した細胞によって置き換えられる。表皮機能の低下は、体温調節の低下、微生物に対する防御の減退、乾燥のリスク、創傷修復の阻害、および化粧品の懸念につながる。皮膚移植のための十分な自己ドナーがない場合、培養ヒトケラチノサイトを用いた創傷の被覆は、処置のための有望な選択肢の一つである。
【０００３】
さらに、ヒト皮膚用in vitroおよびin vivoモデルは、表皮細胞の系統を研究するための、あるいは治療効果または毒性効果について化粧品および医薬化合物を試験するための素晴らしいツールを示し得る。例えば、in vitroモデルの必要性は、化合物および調合物の試験のために動物を使用する代わりになる物を提供するという動機が存在するという事実によって高くなっている。
【０００４】
さらに、多くの疾病が、細胞自律的にまたはその多層表皮組織形成能の変化のいずれかを通じて、ケラチノサイトの機能に影響を及ぼす。ヒト皮膚用in vitroおよびin vivoモデルは、疾病の分子的機序を明らかにし、結果として、治療能を潜在的にもつ薬理学的または生物学的化合物を同定する方法を示し得る。
【０００５】
従って、皮膚療法のために、またはヒト皮膚用in vitroおよびin vivoモデルを得るために、有用であり得るヒトケラチノサイト集団を得るための方法が必要とされる。
【０００６】
胚幹細胞（例えば、「誘導多能性幹（induced pluripotent stem）」細胞について「ｉＰＳ」細胞と呼ばれているものなど）の全特徴を再現するように遺伝子的に再プログラム化されている胚幹細胞および体細胞は、広範な増殖能を有する多能性幹細胞であり、従って研究および医療において大きな可能性を有する用途がある。それ故、多能性幹細胞からヒトケラチノサイトを得るためのいくつかの試みが従来技術において記載されている。例えば、文献ＷＯ０２／０９７０６８は、胚幹細胞のケラチノサイトへの分化を誘導するための方法を記載している。さらなる研究は、ヒトケラチノサイト集団を得るための胚幹細胞の使用を報告している(Coraux C. et al. 2003; Ji L. et al. 2006; Metallo CM. et al. 2007;およびAberdam E. et al. 2008)。しかしながら、今までに、従来技術の方法では、ドナー由来の成体基底ケラチノサイトを使用した場合に有用であった技術に従って処置した場合、多層表皮形成能を示すであろう（in vitroでまたは動物に異種移植した後）ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイトを得ることができなかった(例えばGreen, 2008参照)。
【０００７】
発明の要約
本発明は、表皮誘導を刺激する薬剤およびケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞を、外胚葉分化を支持する細胞と一緒に共培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法に関し、前記方法は、ＢＭＰ−４およびアスコルビン酸の補充されたケラチノサイト培養培地の存在下で、フィーダー線維芽細胞層で被膜された細胞培養表面上でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む。
【０００９】
本発明はまた、前記の方法によって得ることのできるヒト多能性幹細胞から派生した単離された実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団に関する。
【００１０】
本発明はまた、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団と、場合により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の器官型培養液を準備することからなる工程を含む、ヒト代用皮膚を調製するための方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、前記の方法によって得ることのできるヒト代用皮膚に関する。
【００１３】
本発明はまた、前記のヒト代用皮膚を動物に移植するための方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、前記の方法によって得ることのできるヒト皮膚のための動物モデルに関する。
【００１５】
最後に、本発明は、皮膚損傷に関連した病態の処置のための前記のヒト代用皮膚に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用した用語「マーカー」は、細胞の同定に使用することのできる、細胞表面上または細胞中に発現されるタンパク質、糖タンパク質または他の分子をいう。マーカーは、一般的に、従来の方法によって検出され得る。細胞表面マーカーの検出に使用することのできる方法の具体的で非制限的な例は、免疫組織化学法、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）および酵素的分析である。
【００１７】
用語「ヒトケラチノサイト集団」は、ヒト表皮を再構成でき、そして、死滅し完全にケラチン化した細胞への角質層の分化の過程におけるケラチン産生能によって特徴付けられる、細胞集団をいう。基底ケラチノサイトのマーカーは、ケラチン５、１４（Ｋ５／Ｋ１４）および転写因子ｐ６３を有する基底層マーカー、ケラチン１およびケラチン１０（Ｋ１／Ｋ１０）、インボルクリン、フィラグリンを有する基底上層マーカー、並びにインテグリンα６およびβ４、ラミニン−５およびコラーゲンＶＩＩを有する真皮−表皮接合部に特異的なマーカーを含む。
【００１８】
本明細書において使用した用語「ヒト多能性幹細胞」は、あらゆる成体細胞を形成する能力を有するあらゆるヒト前駆細胞をいう。
【００１９】
本明細書において使用した用語「ヒト胚幹細胞」または「ｈＥＳ細胞」または「ｈＥＳＣ」は、あらゆる成体細胞を形成する能力を有するヒト前駆細胞をいう。ｈＥＳ細胞は、１週令未満の受精胚から派生する。
【００２０】
本明細書において使用した用語「ヒト誘導多能性幹細胞」または「ヒトｉＰＳ細胞」または「ヒトｉＰＳＣ」は、ヒト非多能性細胞（例えば成体体細胞）から人工的に派生したタイプのヒト多能性幹細胞をいう。ヒト誘導多能性幹細胞は、あらゆる成体細胞を形成する能力を有する点でヒト胚幹細胞と同一であるが、胚から派生しない。典型的には、ヒト誘導多能性幹細胞は、あらゆる成体体細胞（例えば線維芽細胞）におけるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の誘導発現を通じて得ることができる。例えば、ヒト誘導多能性幹細胞は、Takahashi K. et al. (2007)、Yu et al. (2007)により記載のプロトコールに従って得ても、あるいはこれらの元のプロトコールにおいて細胞の再プログラミング化に使用される１つまたはその他の薬剤が、ｉＰＳ系の起点にある体細胞に作用する任意の遺伝子もしくはタンパク質によって置換されているか、またはｉＰＳ系の起点にある体細胞に導入されている任意の他のプロトコールによって得てもよい。基本的には、成体体細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含む、レトロウイルスなどの、ウイルスベクターを用いてトランスフェクションされる。
【００２１】
本明細書において使用した用語「実質的に純粋で均一な集団」は、全細胞数の大半（例えば、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％）が、対象のケラチノサイトの特定の特徴を有する細胞集団をいう。
【００２２】
本明細書において使用した用語「単離された」は、その自然環境の少なくともいくつかの成分から分離された細胞または細胞集団をいう。
【００２３】
本明細書において使用した用語「ケラチノサイト培養培地」は、ヒトケラチノサイトの成長、増殖および生存を支持するに必要な栄養分を含む培養培地をいう。従って、本発明による適切な培養培地は、細胞が成長できる最小培地、例えば、少なくとも１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の補充されたダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）などである。別の特定の実施態様において、培養培地は、５μg/mlのインシュリン、０．５μg/mlのヒドロコルチゾン、１０−１０Ｍのコレラ毒素、１．３７ng/mlのトリヨードチロニン、２４μg/mlのアデニンおよび１０ng/mlのリコンビナントヒトＥＧＦの補充された２／３ＤＭＥＭ、１／３ＨＡＭ：Ｆ１２および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＩＩ、Hyclone）からなるＦＡＤ培地である。
【００２４】
用語「細胞培養表面」または「細胞培養マトリックス」は、細胞培養に適したあらゆるタイプの表面またはマトリックスをいう。用語「細胞培養表面」は、組織培養プレート、ディッシュ、ウェルまたはボトルを含むがこれらに限定されるわけではない。特定の実施態様において、培養表面は、培養プレート、ディッシュ、ウェルまたはボトルのプラスチック表面である。細胞培養表面は、真皮線維芽細胞の被膜に適合性していなければならない。
【００２５】
本明細書において使用した表現「外胚葉分化を支持する細胞」は、適切な基質を与え、そしてヒト多能性幹細胞の成長および分化を支持するに適切な因子を分泌する細胞をいう。特定の実施態様において、外胚葉分化を支持する細胞は、線維芽細胞の群、より特定するとヒト線維芽細胞の群、より特定すると真皮線維芽細胞の群から選択される。特定の実施態様において、外胚葉分化を支持する細胞は、マイトマイシンにより不活性化させたヒト真皮線維芽細胞である。
【００２６】
本明細書において使用した表現「フィーダー線維芽細胞」は、多能性幹細胞のための基底層として作用し、そして多能性を失うことなく未分化状態の幹細胞を維持するための分泌因子、細胞外マトリックスおよび細胞接触を与える、細胞をいう。フィーダー細胞を、γ照射またはマイトマイシンによって不活性化することができる。本発明の実施態様によると、フィーダー線維芽細胞は、線維芽細胞の群、より特定するとヒト線維芽細胞の群、より特定すると真皮線維芽細胞（真皮線維芽細胞株を含む）の群に由来し得る。真皮線維芽細胞株の例は、ＣＣＤ−１１１２ＳＫ(Hovatta O, et al. 2003)および３Ｔ３−Ｊ２(Rheinwald JG et al. 1975)を含むがこれらに限定されるわけではない。特定の実施態様において、真皮線維芽細胞は、培養表面に被膜される前に増殖を停止するように前以って処理される。それ故、真皮線維芽細胞は、照射され得るか、またはマイトマイシンなどの細胞周期遮断剤を用いて処理され得る。
【００２７】
本明細書において使用した用語「真皮線維芽細胞」は、真皮の細胞外マトリックスを合成および維持する細胞集団をいう。真皮線維芽細胞の特異的マーカーは、ビメンチンおよびＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）を含む。
【００２８】
本明細書において使用した表現「表皮誘導を刺激する薬剤」は、ケラチン８、ケラチン１８、ケラチン５およびケラチン１４などの表皮マーカーの発現を誘導することができる薬剤をいう。典型的には、表皮誘導を刺激する薬剤は、栄養膜および中胚葉の誘導を阻害する。
【００２９】
特定の実施態様において、表皮誘導を刺激する薬剤は、骨形成タンパク質（例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７）、レセプター制御型Ｓｍａｄタンパク質（例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ９）およびＴＧＦβファミリーのリガンド（例えば成長および分化因子６ＧＤＦ−６）(Moreau et al., 2004)からなる群より選択される。好ましい態様において、表皮誘導を刺激する薬剤は、ＢＭＰ−、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７およびＧＤＦ−６からなる群より選択される。好ましい実施態様において、表皮誘導を刺激する薬剤はＢＭＰ−４である。
【００３０】
用語「ＢＭＰ−４」は、骨形成タンパク質４をいう。ＢＭＰ−４は、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーに属するポリペプチドである。例示的なネイティブなＢＭＰ−４アミノ酸配列が、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいてアクセッションナンバーＡＡＣ７２２７８で提供される。
【００３１】
本明細書において使用した表現「ケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤」は、ケラチン５およびケラチン１４の発現を刺激する薬剤をいう。実際に、ケラチン５およびケラチン１４は、３次元培養において最終分化できる基底ケラチノサイトのマーカーである。１つの特定の実施態様において、ケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤は、アスコルビン酸およびレチノイン酸からなる群より選択される。
【００３２】
用語「アスコルビン酸」は、式：
【化１】
2011525370.tif 000002
で示される（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（Ｓ)−１，２−ジヒドロキシエチル）フラン−２（５Ｈ）−オンをいう。
【００３３】
本明細書において使用した用語「器官型培養液」は、培養細胞がin vitroにおいて組織または器官を再構築するのに使用される、３次元組織培養液をいう。
【００３４】
本明細書において使用した用語「病態」は、皮膚損傷に関連したあらゆる疾病または症状をいう。用語「皮膚損傷に関連した病態」は、皮膚損傷、傷害、機能不全、欠陥または異常によって特徴付けられるあらゆる疾病または臨床症状をいう。従って、この用語は、例えば、傷害、変性疾病および遺伝子疾病を包含する。ある実施態様において、対象の病態は、遺伝性皮膚症、例えば表皮水疱症、色素性乾皮症、魚鱗癬、外胚葉異形成症、キンドラー症候群およびその他である。
【００３５】
本明細書において使用した用語「被験体」は、皮膚損傷に関連した病態を患っている可能性があるが、前記病態を有していても有していなくてもよい、哺乳動物、好ましくはヒトをいう。
【００３６】
本発明の脈絡において、本明細書において使用した用語「処置（treating）」または「処置（treatment）」は、病態の発症を遅延もしくは予防すること、病態の症状の進行、増悪もしくは悪化を逆行、寛解、阻止、減速もしくは停止すること、病態の症状の回復をもたらすこと、および／または病態を治癒することを目的とした方法をいう。
【００３７】
本発明の方法
本発明は、表皮誘導を刺激する薬剤およびケラチノサイトの最終分化を刺激する薬剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞を、外胚葉分化を支持する細胞と一緒に共培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法に関する。
【００３８】
前記の方法によって得ることができるヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイトは、ヒト基底ケラチノサイトの全ての形態学的および機能的特性を再現することができる。実際に本発明者らは、前記細胞がヒト表皮を再構築でき（in vitroおよびin vivoにおいて）、そしてそれはケラチン産生能によって特徴づけられることを実証した。より特定すると、前記細胞は、ケラチン５、１４（Ｋ５／Ｋ１４）および転写因子ｐ６３を有する基底層マーカー、ケラチン１およびケラチン１０（Ｋ１／Ｋ１０）、インボルクリン、フィラグリンを有する基底上層マーカー、並びにインテグリンα６およびβ４、ラミニン−５およびコラーゲンＶＩＩを有する真皮−表皮接合部に特異的なマーカーを含む、基底ケラチノサイトのマーカーを発現する。それらはまた、皮膚幹細胞のマーカーであるケラチン１９、並びに角膜細胞のマーカーであるケラチン３および１２も発現し得る。
【００３９】
本発明の実施態様は、ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を得るためのex vivoにおける方法に関し、前記方法は、ＢＭＰ−４およびアスコルビン酸の補充されたケラチノサイト培養培地の存在下で、フィーダー線維芽細胞層で被膜された細胞培養表面上でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む。
【００４０】
特定の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）またはヒト誘導多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４１】
本発明の実施態様によると、ｈＥＳ細胞はあらゆるｈＥＳ細胞株から選択され得る。ｈＥＳ細胞株の例は、ＳＡ−０１、ＶＵＢ−０１、Ｈ１(Thomson JA et al 1998)およびＨ９(Amit M et al. 2000)を含むがこれらに限定されるわけではない。本発明によると、ｈＥＳ細胞は、国際特許出願ＷＯ２００２／０９７０６８に記載のようにＬＩＦの存在下で培養されない。さらに、本発明によると、ｈＥＳ細胞は、Metallo CM. et al. (2007)またはJi L; et al. (2006)に記載のように胚様体に分化したものではないと理解されたい。
【００４２】
本発明の実施態様によると、ヒトｉＰＳ細胞は、あらゆるヒトｉＰＳ細胞株から選択され得る。ヒトｉＰＳ細胞株の例は、クローン２０１Ｂ(Takahashi et al., 2007)およびｉＰＳ（包皮またはＩＭＲ−９０）−１−ＭＣＢ−１(Yu et al., 2007)を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４３】
あるいは、ｈＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞は、治療目的で構成され得るマスターセルバンクから選択され得る。好ましい様式において、ｈＥＳ細胞またはヒトｉＰＳは、大部分のヒト集団における免疫拒絶を回避または制限するように選択され得る。典型的には、ｈＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞は、主要組織適合性抗原Ａ、ＢおよびＤＲをコードする遺伝子に対してＨＬＡホモ接合型であり、これは、ＨＬＡレパートリーにおいて単純な遺伝子プロファイルを有することを意味する。前記細胞は、皮膚損傷（例えば、創傷、火傷、照射、疾病に関連した表皮の異常など）に関連した病態の細胞療法に使用するためのヒト代用皮膚の調製に適し得る、再生可能な細胞源としての幹細胞バンクを作製するのに役立ち得る。
【００４４】
別の特定の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト皮膚の遺伝子疾病の原因となる１つの突然変異または複数の突然変異を有し得る。
【００４５】
本発明の実施態様によると、細胞培養表面は、真皮線維芽細胞が自然にそれに接着し得るように選択される。細胞培養表面の様々な材料が選択され得る。このような材料の例は、ゼラチンで被膜された組織培養ディッシュまたはディッシュ群を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４６】
特定の実施態様において、ケラチノサイト培養培地には、グルタミン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、インシュリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素およびトリヨードチロニンからなる群より選択される１つ以上の薬剤が補充され得る。特定の実施態様において、ケラチノサイト培養培地は、Rheinwald JG. et al. (1975)によって記載されたものである。
【００４７】
本発明の実施態様によると、ケラチノサイト培養培地におけるアスコルビン酸の濃度は、０．０１mMから１mMまで変更し得る。特定の実施態様において、アスコルビン酸の濃度は０．３mMである。
【００４８】
ケラチノサイト培養培地におけるＢＭＰ−４の濃度は、０．０２nMから７７nMまたは０．３ng/mlから１０００ng/mlまで変更し得る。特定の実施態様において、ＢＭＰ−４の濃度は０．５nMである。
【００４９】
本発明によると、ヒト多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞）を、ヒト基底ケラチノサイト（「ヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト」）の全ての形態学的および機能的特性を再現した細胞集団において細胞の完全な分化を可能とする十分な時間、培養する。特定の実施態様によると、期間は、２０日間から６０日間、好ましくは２０日間から４０日間まで変更し得る。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、前記の方法によって得ることのできるヒト多能性幹細胞から派生した単離されたヒトケラチノサイト集団に関する。
【００５１】
別の実施態様によると、本発明の方法は、アスコルビン酸およびＢＭＰ−４を包含しないケラチノサイト培養培地の存在下で、真皮線維芽細胞層で被膜された細胞培養表面上で、前記したように得られたヒト多能性幹細胞から派生したヒトケラチノサイト集団を培養する工程をさらに含み得る。さらなる工程は、ヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団を得るのに適切であり得る。
【００５２】
真皮線維芽細胞、細胞培養表面およびケラチノサイト培養培地は、ケラチノサイト培養培地にアスコルビン酸およびＢＭＰ−４が補充されていないならば、前記したのと同じであり得る。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、前記の方法によって得ることができるヒト多能性幹細胞から派生した単離された実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団に関する。
【００５４】
医薬組成物
本発明の方法により得られたヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団は、皮膚療法に適し得る。
【００５５】
それ故、本発明は、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団と、場合により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。ある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの生物学的に活性な物質または生理活性因子をさらに含み得る。
【００５６】
本明細書において使用した用語「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、前駆細胞の生物活性の効力を妨げることなく、そして投与される濃度において宿主に対して過度な毒性を与えない、担体培地をいう。適切な薬学的に許容される担体または賦形剤の例は、水、塩溶液（例えばリンガー液）、オイル、ゼラチン、炭水化物（例えばラクトース、アミラーゼまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリンを含むがこれらに限定されるわけではない。医薬組成物は、液体、半液体（例えばゲル）または固体（例えば、マトリックス、格子、足場など）として調合され得る。
【００５７】
本明細書において使用した用語「生物学的に活性な物質または生理活性因子」は、本発明の医薬組成物におけるその存在が前記組成物を受ける被験体にとって有益である、あらゆる分子または化合物をいう。当業者によって認識されているように、本発明の実施における使用に適した生物学的に活性な物質または生理活性因子は、生理活性分子および化合物の多種多様なファミリーにおいて見出され得る。例えば、本発明の脈絡において有用な生物学的に活性な物質または生理活性因子は、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、免疫抑制剤または免疫調節剤、抗酸化剤、成長因子および薬物から選択され得る。
【００５８】
本発明の関連した態様は、皮膚損傷に関連した病態を患っている被験体を処置するための方法に関し、前記方法は、被験体に、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団（またはその医薬組成物）の有効量を投与するステップを含む。
【００５９】
本明細書において使用した用語「有効量」は、意図した目的を達成するのに十分である、ヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団（またはその医薬組成物）の任意の量をいう。
【００６０】
本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団（またはその医薬組成物）を、任意の適切な方法を使用して被験体に投与し得る。
【００６１】
本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団を、単独でもしくは他の細胞と組み合わせて、および／または他の生物学的に活性な因子または試薬、および／または薬物と組み合わせて移植し得る。当業者によって理解されているように、これらの他の細胞、生物学的に活性な因子、試薬および薬物を、本発明の細胞と共に同時にまたは連続的に投与し得る。
【００６２】
ある実施態様において、本発明による処置は、細胞に基づいた処置を開始する前に被験体を薬理学的に免疫抑制することをさらに含む。被験体の全身的または局所的免疫抑制法は当技術分野において周知である。
【００６３】
効果的な投与量および投与レジメンは、被験体の病態の性質に基づいた適正医療業務によって容易に決定され得、そしてそれは、病態の症状の程度、および対象の組織もしくは器官の損傷もしくは変性の程度、および被験体の特徴（例えば、年齢、体重、性別、身体全体の健康など）を含むがこれらに限定されるわけではない多くの因子に依存するだろう。
【００６４】
本発明のヒト代用皮膚および動物モデル
本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団はまた、ヒト代用皮膚の調製にも適し得る。
【００６５】
典型的には、本発明のヒト代用皮膚は、扁平上皮へと重層化される前記のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団のin vitroで派生した培養液から生じる多層表皮を含む。特定の実施態様において、本発明のヒト代用皮膚は、前記の多層表皮および真皮を含み得る。
【００６６】
それ故、本発明のさらなる態様は、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の器官型培養液を準備することからなる工程を含む、ヒト代用皮膚の調製法に関する。
【００６７】
本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の完全な重層化および組織学的分化を、３次元器官型培養法の使用によって達成することができる(Doucet O, et al. 1998 ; Poumay y. et al. 2004 ; Gache Y. et al. 2004)。例えば、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団のin vitro培養液を気液界面で培養させる場合、高度に整然とした角質層が形成される。
【００６８】
特定の実施態様において、本発明によるヒト代用皮膚を、Poumay, Y et al. 2004によって記載されたように生成し得る。本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団の培養を、ポリカーボネート製培養インサート上で行ない得る。これらの細胞を、１１日間、１．５mM ＣａＣｌ２および５０μg/mlアスコルビン酸の補充されたＥｐｉｌｉｆｅ培地中に維持し得る。前記細胞を、１０日間かけて培養培地を除去することによって気液界面に曝した。
【００６９】
特定の実施態様において、ヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団を、前記したように器官型培養液を準備する前に、ヒト真皮線維芽細胞の定植された細胞培養マトリックス上に前以って播種する。この特定の実施態様により、真皮および表皮を含むヒト代用皮膚を得ることが可能となる。このような方法は、Del Rio M. et al. (2002)またはLarcher F. et al. (2007)によって記載のプロトコールにより行なわれ得る。例えば、本発明のヒト多能性幹細胞から派生した実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団を、生存している真皮線維芽細胞の定植されたフィブリンマトリックス上に播種し得る。その後、器官型培養液をケラチノサイトが集密するまで浸しながら培養させ、そして最後に７日間かけて気液界面において維持して、上皮の重層化および分化を促進する。
【００７０】
本発明のさらなる目的は、前記の方法によって得ることのできるヒト代用皮膚に関する。
【００７１】
本発明のさらなる目的は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスに、前記のヒト代用皮膚を移植するための方法に関する。特定の実施態様において、前記動物は免疫不全動物（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）である。前記方法は、ヒト皮膚用動物モデルを提供するのに有用であり得る。
【００７２】
特定の実施態様において、本発明のヒト代用皮膚を移植された動物を、Del Rio M. et al. (2002)によって記載のように生成し得る。簡潔に述べると、動物を剪毛し、そして無菌的に洗浄する。その後、全層創傷をマウスの背側に作り出し、そして最後に本発明のヒト代用皮膚の移植を、無菌条件下で行なう。その後、前記動物上にヒト皮膚を得るのに１０〜１２週間で十分であり得る。
【００７３】
本発明のさらなる目的は、前記の方法により得ることのできるヒト皮膚のための動物モデルに関する。
【００７４】
本発明のヒト代用皮膚および動物モデルは、様々な用途を有し得る。これらの用途は、化合物すなわち、腫瘍および病理学的起因物質（例えばヒトパピローマウイルス）を培養するための基質をスクリーニングするための、および皮膚損傷に関連したヒト傷害または病態をモデリングするための、使用を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００７５】
例えば、本発明のヒト代用皮膚および動物モデルを、様々なin vitroおよびin vivo試験に使用し得る。特に、しかし限定するわけではないが、本発明のヒト代用皮膚および動物モデルは、スキンケア製品、薬物代謝、試験化合物に対する細胞応答、創傷治癒、光毒性、真皮刺激、真皮炎症、皮膚腐食性および細胞損傷の評価において用途を見出す。典型的には、本発明の動物モデルのために、前記製品を、ヒト皮膚上に局所的に投与し得るか、または経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内および経皮経路で投与し得る。
【００７６】
本発明は、様々なスクリーニングアッセイを包含する。いくつかの実施態様において、スクリーニング法は、本発明のヒト代用皮膚または動物モデル並びに少なくとも１つの試験化合物または製品（例えば保湿剤、化粧品、染料または香水などのスキンケア製品；前記製品は、クリーム、ローション、液体およびスプレーを含むがこれらに限定されるわけではない任意の形状であり得る）を準備し、前記製品または試験化合物を前記ヒト代用皮膚または動物モデルに適用し、そしてヒト代用皮膚または動物モデルに対する前記製品または試験化合物の効果をアッセイすることを含む。典型的には、本発明の動物モデルのために、前記試験化合物または製品を、ヒト皮膚上に局所的に投与し得るか、または経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内および経皮経路で投与し得る。多種多様なアッセイを使用して、ヒト代用皮膚または動物モデルに対する前記製品または試験化合物の効果を決定し得る。アッセイは、前記化合物または製品の毒性、効能または効力を対象とすることができる。さらに、成長、バリア機能または組織強度に対する前記化合物または製品の効果も試験することができる。
【００７７】
他の好ましい実施態様において、本発明のヒト代用皮膚または動物モデルは、皮膚を通過しての薬物導入の効力をスクリーニングするための用途を見出す。
【００７８】
特定の実施態様において、本発明のヒト代用皮膚または動物モデルはまた、皮膚において自然に起こる腫瘍の培養および研究に、並びに、皮膚に影響を及ぼす病原体の培養および研究に有用である。従って、いくつかの実施態様において、本発明のヒト代用皮膚または動物モデルを、悪性細胞と共に播種することが意図される。その後、これらの再構成されたヒト代用皮膚または動物モデルを使用して、その自然環境における腫瘍に対する効力について、化合物または他の処置戦略（例えば照射またはトモセラピー）をスクリーニングすることができる。いくつかの実施態様において、本発明は、対象の病原体を感染させた再構成されたヒト代用皮膚または動物モデルおよび少なくとも１つの試験化合物または処置を準備し、そして代用皮膚または動物モデルを前記試験化合物または処置で処置することを含む方法を提供する。
【００７９】
別の特定の実施態様において、本発明のヒト代用皮膚または動物モデルはまた、皮膚損傷に関連したヒト傷害または病態をモデリングするのに有用である。例えば、本発明のヒト代用皮膚および動物モデルは、創傷、火傷（例えば火による火傷、日焼けなど）、または照射、病原体などによって引き起こされる病変、化学製品もしくは環境条件によって引き起こされる刺激、変性疾病および遺伝子疾病をモデリングするためのin vitroおよびin vivoの両方のモデルを提供し得る。ある実施態様において、対象の病態は、遺伝性皮膚症、例えば表皮水疱症、色素性乾皮症、魚鱗癬、外胚葉異形成症、キンドラー症候群およびその他である。典型的には、本発明のヒト代用皮膚または動物モデルは、ヒト皮膚の遺伝子疾病の原因となる１つの突然変異または複数の突然変異を有し得る、多能性幹細胞から生成され得る。前記のin vitroおよびin vivoの両方のモデルは、医学研究のために特に関心を有し得るか、または前記傷害および病態の治療もしくは予防のための化合物のスクリーニングのために有用であり得る。特に、本発明は、ライブラリーから、特にコンビナトリアルライブラリーから、例えばハイスループットまたはハイコンテンツな技術を使用して化合物をスクリーニングするための、本発明によるヒト代用皮膚および動物モデルの使用を意図する。典型的には、本発明の動物モデルのために、前記試験化合物または製品をヒト皮膚上に局所的に投与し得るか、または経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内および経皮経路で投与し得る。
【００８０】
本発明のさらなる態様において、本発明のヒト代用皮膚を、皮膚損傷に関連した病態の処置に使用し得る。
【００８１】
それ故、本発明は、本発明のヒト代用皮膚を必要とする患者に移植することからなる工程を含む、皮膚損傷に関連した病態の処置法に関する。
【００８２】
例えば、本発明のヒト代用皮膚は、創傷閉鎖および火傷処置適用において用途を見出す。火傷および創傷閉鎖の処置のための移植片の使用が、米国特許第 5,693,332号；5,658,331号；および6,039,760号に記載されている。従って、本発明は、本発明によるヒト代用皮膚および創傷に患う患者を準備し、そして前記患者に、創傷が閉鎖されるような条件下でヒト代用皮膚を移植することを含む、火傷によって引き起こされた創傷を含む、創傷閉鎖のための方法を提供する。
【００８３】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面は、なんら本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ケラチノサイト系統の確立：異なる分化工程における（０−１０−２５−４０日目）ｈＥＳ細胞の形態の顕微鏡分析。最初は、典型的なｈＥＳ細胞コロニーは丸い。１０日後、コロニーの周縁部のｈＥＳ細胞は、移動し始め、そしてフィーダー層へと広がり始めた。２０日後から、これらの細胞は容量が増加し、平板化し、そして上皮の形態になった。分化終了時には、これらの細胞は、床状の上皮形態になり、ケラチノサイト形態に特徴的な密集した接着性細胞のコロニーを形成した。
【図２】ケラチノサイト系統の確立：４０日間の分化の間にｈＥＳ細胞から派生した細胞の定量ＰＣＲ分析。多能性遺伝子マーカーであるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧは、５日目から急速に減少し、最終的に２０日目に検出不可能となった。単層上皮の最初の特異的マーカーであるケラチン１８およびケラチン８の転写物（ＫＲＴ１８およびＫＲＴ８）は、１０日目まで大きく増加し、次に減少し、そして分化の終了時まで基底レベルで安定した。表皮の増殖基底層に特異的であるケラチン５およびケラチン１４をコードする転写物（ＫＲＴ５およびＫＲＴ１４）は、１０日目から４０日目まで着実に増加した。
【図３】ケラチノサイト系統の確立：４０日間の分化の間のｈＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析から、動態の開始時における６０％付近から４０日目の１％付近まで、未分化状態ＳＳＥＡ３（ステージ特異的胚抗原（Stage-Specific Embryonic Antigen））のマーカーの減少を確認した。表皮系統への傾倒が１０日目に観察され、この時にケラチン１８（Ｋ１８）の発現の最高値は６３％まで上昇した。２５日後にＫ１８は、４０日目に基底レベル（９％）に到達するまで連続的に減少した。２５日目から、単層上皮のＫ８／Ｋ１８マーカーと重層上皮のＫ５／Ｋ１４マーカーとの間の切り替えが、Ｋ１４に対して陽性である派生したｈＥＳ細胞の５９％で起こり、このことから、培養液における基底増殖表皮細胞の増殖を確認した。
【図４】ｈＥＳ細胞から派生した均一で純粋なケラチノサイト集団の特徴付け：後続の培養後のヒト初代成体ケラチノサイト（ＨＫ）およびｈＥＳ細胞から派生したケラチノサイト（Ｋ−ｈＥＳ細胞）の形態の顕微鏡分析。４０日間の分化後、ｈＥＳ細胞から派生したケラチノサイトの後続の培養を、ＢＭＰ４およびアスコルビン酸を用いずに、マイトマイシン処理３Ｔ３フィーダー細胞上に播種されたＦＡＤ培地中で行なった。これらの条件下で、ｈＥＳ細胞から派生したケラチノサイト（Ｋ−ｈＥＳ細胞）は、成体初代ヒトケラチノサイト（ＨＫ）と同じコロニー形態を提示した。Ｋ−ｈＥＳ細胞は、ケラチノサイト形態に特徴的な密集した接着性細胞のコロニーを形成した。
【図５】ｈＥＳ細胞から派生した均一で純粋なケラチノサイト集団の特徴付け：ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析により、Ｋ１８の減少、並びに細胞の９５％超がＫ５およびＫ１４を発現するＫ−ｈＥＳ細胞の均一な細胞集団が判明した。
【図６】ｈＥＳ細胞から派生した均一で純粋なケラチノサイト集団の特徴付け：ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ、ＫＲＴ８／ＫＲＴ１８、ＫＲＴ５／ＫＲＴ１４、インテグリンα６およびβ４（ＩＴＧＡ６／ＩＴＧＢ４）、ラミニン−５およびコラーゲンＶＩＩ（ＬＡＭＢ３／Ｃｏｌ７Ａ１）のケラチノサイト接着遺伝子マーカーを用いたＫ−ｈＥＳ細胞およびＨＫの定量ＰＣＲ分析を行なった。遺伝子発現レベルは、基底ケラチノサイトに特徴的であるこれらの試験した全遺伝子について類似していた。
【図７】ｈＥＳ細胞から派生した機能性ケラチノサイトの確立：ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞のコロニー形成アッセイ。in vitroにおけるヒトケラチノサイトの成長能を、成長している接着性コロニーの数によって推測することができる。Ｋ−ｈＥＳ細胞のコロニー形成分析は、ＨＫと比較してこれらの細胞のコロニー形成能の４０％の増加を示した。
【図８】ｈＥＳ細胞から派生した機能性ケラチノサイトの確立：ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞の器官型上皮培養。１０日間の気液分化後のヘマトキシリン／エオシンによる組織染色。上皮構造は、床状の細胞形状を有する詳細に明らかにされた基底層、並びに、ケラトヒアリン顆粒を含む顆粒層と、死滅扁平脱核細胞の重層として見られる角質層とを含む基底上層から構成されるようであった。
【図９】器官型ＨＫおよびＫ−ｈＥＳＣ表皮におけるＰＣＲアレイ。表皮遺伝子の大きなパネルを、ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞から派生した器官型表皮から抽出されたｃＤＮＡに対して試験した。データを、自家製のケラチノサイトに焦点を当てるプライマー定量ＰＣＲアレイ、およびアレイアシストソフトウェアで実施したヒートマップ分析を使用して収集した。２つの器官型表皮は非常に類似した発現パターンを提示した。
【図１０】半合成無血清培地におけるＫ−ｈＥＳ細胞の均一プロファイル。半合成無血清培地中およびフィーダー細胞を含むＦＡＤ培地中に維持されたＫ−ｈＥＳ細胞の定量ＰＣＲ分析は、ケラチン５および１４転写物（ＫＲＴ５およびＫＲＴ１４）の類似した発現を示した。
【図１１】９継代まで安定なＫ−ｈＥＳＣの表現型：９回までの連続的継代におけるＫ−ｈＥＳ細胞の定量ＰＣＲ分析は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＩＴＧＡ６およびＩＴＧＢ４を含む、ケラチノサイト表現型に関連した遺伝子の安定な発現を示した。
【図１２】免疫不全マウスへの異種移植後の長期のin vivoにおけるヒト表皮再生。ａ．Ｋ−ｈＥＳＣの移植された人工皮膚移植片のヘマトキシリン−エオシンによる染色。スケールバーは５０μmである。ｂ．Ｋ−ｈＥＳＣの移植された人工皮膚移植片上でのヒトインボルクリンに対して指向されるｍＡｂ ＳＹ−５を使用したイムノペルオキシダーゼ染色は、有棘層および顆粒層に適切に位置している。抗マウス二次抗体に因り、真皮バックグラウンドが観察され得ることを注記する。スケールバーは５０μmである。
【図１３】４匹の免疫不全マウスへの異種移植後の長期のin vivoにおけるヒト表皮再生。Ｋ−ｈＥＳＣの移植された人工皮膚移植片のヘマトキシリン−エオシンによる染色。スケールバーは１００μmである。
【図１４】ケラチノサイト系統の確立：定量ＰＣＲ分析：Ｋ−ｈＥＳ細胞およびＨＫのＰＣＲ分析は、Ｋ１９、Ｋ３およびＫ１２遺伝子の異なる発現レベルを示した。
【図１５】ｈＥＳＣ、Ｋ−ｈＥＳＣおよびＨＫにおけるＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）タンパク質の発現  ｈＥＳＣ、ＨＫ、およびＨ９から派生したＫ−ｈＥＳＣにおけるＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現の代表的なＦＡＣＳ分析。
【図１６】誘導多能性幹細胞を使用したケラチノサイト系統の確立（Ａ）分化４０日目における誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）および派生したｉＰＳの形態の分析。（Ｂ）４０日間の分化の間における派生した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）のＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ、ＫＲＴ８／ＫＲＴ１８、ＫＲＴ５／ＫＲＴ１４の定量ＰＣＲ分析。
【図１７】ｉＰＳから派生したケラチノサイトの特徴付け（Ａ）後続の培養後の、ｉＰＳ（Ｋ−ｉＰＳ）からおよびｈＥＳＣ（Ｋ−ｈＥＳＣ）から派生したケラチノサイトならびにヒト初代ケラチノサイト（ＨＫ）の顕微鏡分析。（Ｂ）Ｋ−ｉＰＳ、Ｋ−ｈＥＳＣおよびＨＫにおけるＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ、ＫＲＴ８／ＫＲＴ１８、ＫＲＴ５／ＫＲＴ１４およびＰ６３の定量ＰＣＲ分析。（Ｃ）Ｋ−ｉＰＳ、Ｋ−ｈＥＳＣおよびＨＫにおけるケラチン５および１４の免疫蛍光分析。
【００８５】
実施例１：ｈＥＳからケラチノサイト集団およびヒト代用皮膚を調製するための方法
材料および方法
ｈＥＳ細胞の維持培養
ｈＥＳＣ（ＳＡ−０１およびＨ９）を、３７℃で５％ＣＯ２の下で、２０％（vol/vol）ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ、Invitrogen）、１mMグルタミン、０．１mM非必須アミノ酸（Invitrogen）、４ng/mlリコンビナントヒトｂＦＧＦ（PeProTech）および０．１mM ２−メルカプトエタノールの補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma）中で、マウス線維芽細胞のＳＴＯフィーダー層（１０mg/mlのマイトマイシンＣで不活性化し、そして３００００/cm２で播種）上で成長させた。継代のために、ｈＥＳＣコロニーを切り出し、そして５日毎に継代を行なった。
【００８６】
ｈＥＳ細胞からケラチノサイトへの派生
派生のために、凝集塊を、５μg/mlインシュリン、０．５μg/mlヒドロコルチゾン、１０−１０Ｍコレラ毒素、１．３７ng/mlのＴ３、２４μg/mlアデニンおよび１０ng/mlリコンビナントヒトＥＧＦの補充された２／３ＤＭＥＭ、１／３ＨＡＭ：Ｆ１２および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＩＩ、Hyclone）から構成されるＦＡＤ培地中で、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞上に播種した。０．５nMのヒトリコンビナントＢＭＰ−４(R&D Systems Europe, UK)および０．３mMアスコルビン酸（Sigma）を加えた場合に、外胚葉分化の誘導がなされた。細胞を、上皮細胞のクローンが単離されるまで同じ培地で成長させた。その後、細胞を、ＢＭＰ４およびアスコルビン酸を含有しないＦＡＤ培地中の同じフィーダー層に播種した。対照として、初代ヒトケラチノサイト（ＨＫ）を、ＦＡＤ培地中のマイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞上で培養した。
【００８７】
半合成無血清培地中での培養のために、ＨＫおよびｋ−ｈＥＳ細胞を、ＫＧＭ−２培地（Lonza）中、BioCoatコラーゲンＩプラスチック（BD Biosciences）上に播種した。
【００８８】
定量ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってRNeasy Mini抽出キット（Qiagen）を使用してｈＥＳ細胞、ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞から単離した。ゲノムＤＮＡが増幅しないようにカラム上でＤＮａｓｅＩ消化を行なった。ＲＮＡのレベルおよび品質を、ナノドロップ技術を使用して確認した。全５００ngのＲＮＡを、SuperscriptIII逆転写キット（Invitrogen）を使用して逆転写した。ｍＲＮＡ発現を定量するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を、製造業者の説明書に従ってLightCycler480システム（Roche diagnostics）およびSYBR Green PCR Master Mix（Roche Diagnostics）を使用して行なった。遺伝子発現の定量は、DeltaCt法に基づき、そして１８ｓ発現で標準化した。融解曲線および電気泳動分析を行なうことにより、ＰＣＲ産物の特異性をコントロールし、そして非特異的増幅を除いた。
【００８９】
ＦＡＣＳ分析
細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Invitrogen）を使用して培養プレートから剥し、そして２％パラホルムアルデヒド中で１５分間室温で固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、０．１％サポニン（Sigma）を用いて透過処理した。１：１００で希釈した一次抗体を１時間室温で０．１％ＦＣＳを含むＰＢＳ中でインキュベーションした。対照試料は特異的アイソタイプを使用してまたは全く一次抗体を使用せずに行なった。種特異的二次抗体を１時間かけて室温で加え、そして染色した細胞を、CellQuestソフトウェア（BD Biosciences）を使用してFACScaliburフローサイトメーターで分析した。
【００９０】
免疫細胞化学
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間室温で固定し、その後、０．４％トリトンＸ−１００および５％ＢＳＡ（Sigma）の補充されたＰＢＳで透過処理しブロッキングした。一次抗体を一晩４℃でブロッキング緩衝液中でインキュベーションした。マウス抗Ｋ１４、ウサギ抗Ｋ１４、マウス抗Ｋ５はNovacastraから、マウス抗ＣｏｌＶＩＩ、マウス抗インテグリンα６およびマウス抗ラミニン５はSanta-Cruz Biotechnologyから、そしてマウス抗インテグリンβ４はBDbiosciencesから購入した。細胞を、種特異的フルオロフォア結合二次抗体（Invitrogen）を用いて１時間かけて室温で染色し、そして核をＤＡＰＩを使用して染めた。免疫蛍光画像が、Axibisionイメージングソフトウェアを使用してZeiss Z1顕微鏡で得られた。
【００９１】
コロニー形成アッセイ
初代ケラチノサイトおよびＫ−ｈＥＳ細胞をトリプシン処理し、そして１０cmプレートでＦＡＤ培地中、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞フィーダー層上に１４個の細胞/cm２で蒔いた。細胞を２週間培養し、その後、７０％エタノールで固定し、そしてBlue-RAL555（Sigma）で染色した。水道水で洗浄した後、プレートを乾燥させ、そしてコロニーを計測した。各実験は三重に行なった。
【００９２】
器官型培養液
ヒト代用皮膚を他で詳述されているように(Poumay Y et al., 2004)生成した。ケラチノサイト培養をポリカーボネート製培養インサート（NUNC）上で行なった。これらの細胞を１１日間、１．５mM ＣａＣｌ２および５０μg/mlのアスコルビン酸の補充されたＥｐｉｌｉｆｅ培地中に維持した。１０日間、培養培地を除去することによって細胞を気液界面に曝した。
【００９３】
免疫不全マウスへの移植
生物工学操作された皮膚等価物を、ヒト線維芽細胞の定植されたフィブリンマトリックスを使用して生成した。Ｋ−ｈＥＳＣをフィブリンマトリックス上に播種し、集密となるまで浸しながら成長させ、その後、記載(Del Rio et al., 2002)のように、６週令の雌ｎｕ／ｎｕマウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)の背中に移植した。移植片を移植から１０〜１２週間後に回収し、そして組織標本を、１０％緩衝ホルマリン中で固定しパラフィン包埋した。
【００９４】
アレイに基づいた比較ゲノムハイブリダイゼーション
アレイに基づいた比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａ−ＣＧＨ）分析を、５２４５個のＢＡＣクローンのIntegragenチップゲノムワイドＢＡＣアレイを使用して行なった（５２６kbの中間値のスペーシング）。
【００９５】
結果：
ｈＥＳ細胞（ＳＡ−０１またはＨ９）を、ＢＭＰ４（０．５nM）およびアスコルビン酸（０．３mM）の補充されたＦＡＤ培地中で、マイトマイシンＣで前処理された３Ｔ３フィーダー細胞上に播種し、そして１０、２５および４０日目という異なる時点で回収した。
【００９６】
本発明者等は、分化中に、顕微鏡によって、上皮形態が次第に増加したことを観察した。最初に、未分化ｈＥＳ細胞は培養液中で単一細胞層コロニーを形成した。１０日目に、コロニーの周辺から派生したｈＥＳ細胞は、移動し始め、そしてフィーダー層へと広がり始めた。２０日後から、これらの細胞は容量が増加し、平板化し、そして上皮の形態をとるようになった。分化終了時には、これらの細胞は、床状の上皮形態を有するようになり、ケラチノサイト形態に特徴的な密集した接着性細胞のコロニーを形成した（図１）。ｈＥＳ細胞の分化の分子的特徴付けは、定量ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析によって全て動態に沿って行なわれた。経時的ｑ−ＰＣＲ分析は、多能性遺伝子マーカーであるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ(Amit M. et al. 2000)が５日目から急速に減少し、最後には２０日目に検出不可能となったことを示した（図２）。特に、ＦＡＣＳ分析は、動態の開始時における６０％付近から４０日目における１％付近までの、未分化状態ＳＳＥＡ３（ステージ特異的胚抗原）のマーカーの減少を確認した。
【００９７】
in vivoにおける表皮発達は、胚発達中の構造分子の時間的発現パターンによって特徴付けられる(Mack JA. et al. 2005)。表皮は、ケラチン８およびケラチン１８（Ｋ８およびＫ１８）を発現している単層外胚葉細胞を生じる外胚葉から派生する。定量Ｑ−ＰＣＲを使用して、ケラチノサイト系統に沿って初期マーカーをコードする遺伝子、ケラチン１８および８（ＫＲＴ８／ＫＲＴ１８）の発現は、培養１０日目にピークに達し、次週以降次第に減少した。一生涯におよび表皮の増殖基底層に特異的である、ケラチン５および１４（ＫＲＴ５／ＫＲＴ１４）をコードする遺伝子の発現は、１０日目から次第に増加した（図１Ｂ）。ＦＡＣＳ分析は、Ｋ１８の一過性発現を確認し、発現の最高値は１０日目から２５日目までの間であり（６３％から５９％）、４０日目における基底レベル（９％）まで着実に減少した。本発明者等は、４０日間の分化の終了時に、培養液中におけるケラチン１４の増殖（５９％）を確認した（図３）。最後に、ｈＥＳ細胞からケラチノサイトへの派生は、in vivoにおける表皮発達に相当する(Byrne C. et al. 1994)。まとめると、得られたデータは、この分化プロトコールが、in vitroにおいて表皮発達の全ステップを再現し、これにより、分化４０日目におけるＫ８／Ｋ１８からＫ５／Ｋ１４へのこの劇的な移行に関与する分子的事象のより良い解明の機会が与えられることを明確に示す。本発明者等は、誘導期間が終了したと考え、そして培地からＢＭＰ４およびアスコルビン酸を取り除くことによって誘導を停止した。ＦＡＤ培地中、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３フィーダー細胞上での継代後、典型的な床状の上皮形態を示す細胞は自発的に、成長コロニーを形成し；我々は、それらを、「ヒト胚幹細胞から派生したケラチノサイト」（Ｋ−ｈＥＳ細胞）と名付けた（図４）。４継代後のＦＡＣＳ分析によりもはやケラチン１８は全く見られず、そして極めて均一な細胞集団が見られ、この細胞集団における細胞の９５％超がＨＫのようにケラチン５および１４を発現していた（図５）。Ｋ−ｈＥＳ細胞とＨＫとの比較は、類似の表現型を示した。Ｑ−ＰＣＲによって評価した遺伝子発現レベルは、ケラチン１４、ケラチン５、インテグリンα６およびβ４、コラーゲンＶＩＩおよびラミニン−５をコードするものを含む、基底ケラチノサイトに特徴的な全ての試験した遺伝子について類似していた（図６）。ケラチン５および１４の位置は、Ｋ−ｈＥＳ細胞の細胞区画において免疫蛍光によって決定され、これはＨＫにおいて観察されたものと同一であった。予期されたように、Ｏｃｔ４のいくらかの染色およびいくらかの残りのＫ１８染色が観察された。基底上層のより分化したケラチノサイトのマーカーであるケラチン１０は存在せず、このことから、基底ケラチノサイトとしてのＫ−ｈＥＳＣの表現型特徴を確認した。これらの細胞の接着能は、膜におけるインテグリンα６およびβ４の位置、並びに細胞外マトリックスにおけるラミニン−５およびコラーゲンＶＩＩの位置によって示唆された。
【００９８】
本条件で得られたＫ−ｈＥＳ細胞の特徴付けは、細胞が、培養液中のＨＫに密接に同一であったことを示す。さらに、ｈＥＳ細胞の派生は、同じ遺伝子的バックグラウンドを有する実質的に純粋で均一なケラチノサイト集団を生成する効率的な手段を与える。
【００９９】
しかしながら、Ｋ−ｈＥＳ細胞は、ヒト成体初代ケラチノサイトの典型的なマーカーに加えて、有意なレベルのケラチン１９（限られた毛包間表皮のケラチノサイトおよび毛包のケラチノサイトにしか発現されない、in vivoおよびin vitroにおける皮膚幹細胞マーカー）並びにケラチン３および１２（角膜細胞マーカー）を発現していた（図１４参照）。
【０１００】
in vitroにおいて規定のケラチノサイトに使用される一般的に認められている基準は、細胞培養系におけるそのコロニー形成能である。in vitroにおけるヒトケラチノサイトの成長能を、それらが生成できるコロニー数によって推測することができる(Barrandon Y. et al. 1985)。興味深いことに、Ｋ−ｈＥＳ細胞のコロニー形成分析は、コロニー形成能の少なくとも４０％の増加を示した（図７）。
【０１０１】
その生理学的関連性を試験するために、Ｋ−ｈＥＳ細胞を、その多層表皮産生能について評価した（図８）。再構成された表皮を、in vitroにおいてＫ−ｈＥＳ細胞を使用して生成した。気液分化から１０日後に、Ｋ−ｈＥＳ細胞の器官型培養液の凍結切片組織染色は、重層表皮の再構成を示した(Poumay Y. et al. 2004)。表皮構造は、床状の細胞形状を有する詳細に明らかにされた基底層、並びに、ケラトヒアリン顆粒を含む顆粒層と、死滅扁平脱核細胞の重層として見られる角質層とを含む基底上層から構成されるようであった。Ｋ−ｈＥＳ細胞から派生した表皮の正常な形態学的組成はまた、間接的な免疫蛍光染色によって分析したところ、分化マーカーの正規の発現および位置に反映されていた。予期した通り、Ｋ１４染色は、再構成された表皮の基底区画において観察されたが、他の基底上層においては陰性であった。Ｋ１０は、Ｋ１４陽性の単一基底層のすぐ上の、全分化層に存在していた。最後に、ケラチノサイト分化の後期マーカーであるフィラグリンおよびインボルクリンは、専ら、表皮の最上層において検出された。予期した部位における後期マーカーの存在は、本発明者等の器官型Ｋ−ｈＥＳ細胞培養液が、分化に向けて生理学的経路を追随したことの指標であった。
【０１０２】
基底膜帯が、使用した培養条件下で見られるかどうかを評価するために、接着分子の発現を、再構成した皮膚において検査した。これらの細胞の接着能は、基底細胞膜におけるインテグリンα６およびβ４の良好な局在によって確認された。さらに、表皮と真皮との間の接着を可能とする細胞外マトリックスタンパク質であるラミニン−５およびコラーゲンＶＩＩの分泌が観察された。
【０１０３】
さらに、表皮遺伝子パネルを使用したＰＣＲアレイは、ＨＫおよびＫ−ｈＥＳ細胞器官型表皮が非常に類似した発現パターンを示すことを明らかにした（図９）。
【０１０４】
最後の実証として、Ｋ−ｈＥＳＣの自己再生上皮生成能を、ストリンジェントなin vivo試験により評価した。成体ヒト線維芽細胞を含むフィブリンマトリックスにＫ−ｈＥＳＣを播種して、in vitroにおいて集密な表皮層を得た。その後、これらの器官型培養液を、同所移植によって免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスの背側領域に移植した(Del Rio M. et al. 2002; Larcher F. et al. 2007)。１０〜１２週間後、５匹中４匹のマウスに由来するＫ−ｈＥＳＣから派生した表皮は、形態学的に正常な多層構造を示し、これは、正常でネイティブなヒト皮膚のそれと一致していた（図１２ａおよび図１３）。ヒトインボルクリンに対する免疫反応性は、有棘層および顆粒層（二次抗体に起因する真皮バックグラウンド）に適切な位置を示していた（図１２ｂ）。この長期のin vivoにおける再生特徴は、Ｋ−ｈＥＳＣが表皮幹細胞の機能的能力を有することを明瞭に示す。
【０１０５】
臨床的応用のために、動物またはヒト生産物を含有しないin vitro培養プロトコールを使用することが必須である。ケラチノサイト前駆体の増殖または最終分化を促進するための理想的な培養培地は、化学的に規定されるべきであり、そして無血清または合成血清リプレースメントのいずれかであるべきである。興味深いことに、本発明者等は、フィーダー層を含まない無血清培地であるＫＧＭ２中でＫ−ｈＥＳ細胞の培養を行なった。ＫＧＭ２中で成長しているＫ−ｈＥＳＣの免疫蛍光分析は、ケラチン５、１４並びにインテグリンα−６およびβ−４の均一な発現を示した。半合成無血清培地中、およびフィーダー細胞を含むＦＡＤ培地中で維持されたＫ−ｈＥＳ細胞の定量ＰＣＲ分析は、ケラチン５および１４転写物の類似の発現を示した（図１０）。
【０１０６】
本研究の主な結果は、ｈＥＳＣから派生した細胞が、in vitroおよびin vivoにおいて成体ヒトケラチノサイトの全ての形態学的および機能的特性を再現することができるという実証である。これは、外胚葉分化、好ましくは、表皮誘導を刺激できそして栄養膜および中胚葉の誘導を阻害できる長期かつ低濃度のＢＭＰ処理に関連した、外胚葉分化を支持する細胞との共培養に基づいたプロトコールを使用して、未分化ＥＳ細胞を処理することによって得られた。アスコルビン酸を加えて、他の著者(Bamberger C. et al. 2002)によって使用されたレチノイン酸の非存在下でケラチノサイトの最終分化を刺激した。本発明者等のプロトコールの成功裏の結果はまた、ケラチノサイトが完全に分化するまで処理を連続的に行い、これには４０日間の培養を必要としたという事実からも分かる。その段階において、培養液には、成体表皮毛包間ケラチノサイトと限りなく同等であると見なされる細胞が増殖した。これらの細胞は、随意に凍結および解凍しながら、９継代まで維持できるので（図１１）、それらは、ヒトケラチノサイトの大量の細胞生産および多層表皮のための実践的な中間ステップを示し得る。
【０１０７】
Ｋ−ｈＥＳＣの免疫原性をＦＡＣＳによって分析した。成体基底ケラチノサイトとは異なり、Ｋ−ｈＥＳＣは、非常に低いレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ抗原しか示さず、そしてＨＬＡ−ＤＲを全く示さなかった（図１５）。Ｋ−ｈＥＳＣは、主要組織適合性複合体の抗原をあるとしても僅かしか発現せず、このことは代用皮膚の低い免疫原性を示している。
【０１０８】
実施例２：ｉＰＳからケラチノサイト集団およびヒト代用皮膚を調製するための方法
実施例１に記載したのと同じ分化プロトコールを、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を用いて行なった。簡潔に述べると、ｉＰＳを、５μg/mlのインシュリン、０．５μg/mlのヒドロコルチゾン、１０−１０Ｍのコレラ毒素、１．３７ng/mlのトリヨードチロニン、２４μg/mlのアデニンおよび１０ng/mlのリコンビナントヒトＥＧＦの補充された２／３ＤＭＥＭ、１／３ＨＡＭ：Ｆ１２および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＩＩ、Hyclone）からなるＦＡＤ培地中、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞に播種した。０．５nMのヒトリコンビナントＢＭＰ−４(R&D Systems Europe, UK)および０．３mMアスコルビン酸（Sigma）を加えた場合に、外胚葉分化の誘導がなされた。細胞を、上皮細胞のクローンが単離されるまで同じ培地で成長させた。その後、細胞を、ＢＭＰ４およびアスコルビン酸を含有しないＦＡＤ培地中、同じフィーダー層に播種した。対照として、初代ヒトケラチノサイト（ＨＫ）を、ＦＡＤ培地中、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞上で培養した。
【０１０９】
図１６および１７に示したように、本発明者らは、単離された実質的に純粋で均一なヒトケラチノサイト集団は誘導多能性幹細胞（Ｋ−ｉＰＳ）からも派生し得ることを示した。
【０１１０】
【表１】
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【図４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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