(57)【要約】ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）のアゴニストは、被験体の運動を改善し、エネルギー代謝を改変する。本開示は、被験体の運動の改善およびエネルギー代謝の改変のためのＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）のアゴニストの使用に関する。本開示はまた、運動不足の被験体の筋消耗疾患および障害の治療方法および筋緊張の促進方法を提供する。ＡＭＰＫとペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）δアゴニストとの組み合わせを使用して、被験体の運動能力を改善することもできる。被験体における物質によって向上した運動能力の同定方法およびＰＰＡＲδの運動誘導性キナーゼとの相互作用に影響を及ぼす化合物の同定方法も開示する。
2011507970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋消耗疾患または障害を有する被験体において筋緊張または筋肉量を改善または維持するための医薬の製造のためのＡＭＰキナーゼアゴニストの使用。
【請求項２】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
有効量のＰＰＡＲδアゴニストをさらに含み、それにより、被験体における運動効果を向上させる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記被験体が競技哺乳動物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記競技哺乳動物がウマ、イヌ、またはヒトである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記被験体が成体である、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記被験体が運動訓練被験体である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項３に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＰＰＡＲδアゴニストをＡＭＰＫアゴニストと同日に投与する、請求項３に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲであり、前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記被験体が有酸素運動を行うことをさらに含む、請求項３に記載の使用。
【請求項１３】
前記運動効果が、持久力の改善である、請求項３に記載の使用。
【請求項１４】
持久力の改善が、走行距離の改善、走行時間の改善、またはその組み合わせを含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
有効量が、単一用量または分割用量で約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物を、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射のために処方する、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
運動効果が、被験体の少なくとも１つの骨格筋における脂肪酸酸化の増加である、請求項３に記載の使用。
【請求項１８】
運動効果が体脂肪の減少である、請求項３に記載の使用。
【請求項１９】
前記体脂肪が白色脂肪組織である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
被験体における筋緊張、筋持久力、または筋肉量の治療で使用するＡＭＰキナーゼアゴニストを含む組成物。
【請求項２１】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
有効量のＰＰＡＲδアゴニストをさらに含み、それにより、被験体における運動効果を向上させる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記被験体が哺乳動物である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記被験体が競技哺乳動物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記競技哺乳動物がウマ、イヌ、またはヒトである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記被験体が成体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記被験体が運動訓練被験体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＰＰＡＲδアゴニストをＡＭＰＫアゴニストと同日に投与する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲであり、前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記被験体が有酸素運動を行うことをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記運動効果が、持久力の改善である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
持久力の改善が、走行距離の改善、走行時間の改善、またはその組み合わせを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
有効量が、単一用量または分割用量で約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記化合物を、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射のために処方する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３６】
運動効果が、被験体の少なくとも１つの骨格筋における脂肪酸酸化の増加である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３７】
運動効果が体脂肪の減少である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記体脂肪が白色脂肪組織である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
運動訓練した被験体から採取した生物サンプル中の、表２または表４中に列挙した１つまたは複数の分子の発現を決定する工程を含む、運動訓練した被験体における運動能力向上物質の使用を同定する方法。
【請求項４０】
（ｉ）１つまたは複数の脂肪分化関連タンパク質；ステアロイル−補酵素Ａ不飽和化酵素２；アセチル−補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ２；ＡＴＰクエン酸リアーゼ；アディポネクチン（Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有）；ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２；リパーゼ（ホルモン感受性）；モノグリセリドリパーゼ；レジスチン；ＣＤ３６抗原；脂肪酸結合タンパク質４（脂肪細胞）；リポタンパク質リパーゼ；ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１；ＧＰＩアンカー膜タンパク質１；二重特異性ホスファターゼ７；ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ３；インスリン様成長因子結合タンパク質５；タンパク質ホスファターゼ２（以前は２Ａ）、調節サブユニットＡ（ＰＲ６５）（βイソ型）；タンパク質チロシンホスファターゼ様（触媒アルギニンの代わりにプロリン）；メンバーｂ；ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）（α）；核内受容体サブファミリー１、グループＤ、メンバー２（Ｒｅｖｅｒｂ−ｂ）；トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）；アルチェイン１；溶質輸送体ファミリー１（中性アミノ酸輸送体）（メンバー５）；ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １８１００７３Ｎ０４遺伝子；ハプトグロビン；レチノール結合タンパク質４（血漿）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（細胞質基質）；細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターｃ；インターフェロン、α誘導タンパク質２７；炭酸脱水酵素３；システインジオキシゲナーゼ１（細胞質基質）；ＤＮＡセグメント、Ｃｈｒ４、ウェイン州立大学５３（Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ５３）（発現された）；細胞質ダイニン１中間鎖２；クッペル様因子３（塩基性）；甲状腺ホルモン応答性ＳＰ０Ｔ１４ホモログ（クマネズミ属）；シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーｅ、ポリペプチド１；補体因子Ｄ（アディプシン）；および／またはトランスケトラーゼ中で発現が上方制御されるか、（ｉｉ）１つまたは複数のγ−グルタミルカルボキシラーゼ；３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ１；溶質輸送体ファミリー３８（メンバー４）；アネキシンＡ７；ＣＤ５５抗原、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １１９０００２Ｈ２３遺伝子；ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫（ヒト）由来融合物；リソソーム膜糖タンパク質２；および／またはＰｕｎｃ  Ｅ１  １の隣接物中で発現が下方制御されるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
発現の決定が、タンパク質発現の決定、タンパク質をコードする遺伝子の発現の決定、またはその組み合わせを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質をコードする遺伝子の発現の決定を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物サンプルが骨格筋生検である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ＡＭＰＫアゴニストおよびＰＰＡＲδアゴニストを薬学的に許容可能なキャリア中に含む組成物。
【請求項４５】
前記ＡＭＰＫアゴニストが、ＡＩＣＡＲ、その塩、エステル、プロドラッグ、前駆体、または誘導体である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＰＰＡＲδアゴニストが、ＧＷ１５１６、その塩、エステル、プロドラッグ、前駆体、または誘導体である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
ＡＭＰＫアゴニストを含む組成物を被験体に投与する工程を含み、前記筋緊張または筋肉量が促進される、筋消耗疾患、筋萎縮、または老化を治療する方法。
【請求項４８】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物がＰＰＡＲδアゴニストをさらに含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
筋肉増強剤を同定する方法であって、被験体を薬剤と接触させる工程および表２または４中の遺伝子を含む持久力遺伝子サイン組またはそのサブセットの発現を測定する工程を含み、かかる遺伝子組の発現が筋肉増強剤を示す、方法。
【請求項５１】
被験体における筋肉量または筋緊張を改善または維持するための方法であって、ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）アゴニストを被験体に投与する工程を含み、該筋緊張または筋肉量が運動不足の被験体のまたは固定された被験体で維持されるか、前記被験体で増加される、方法。
【請求項５２】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
有効量のＰＰＡＲδアゴニストを被験体に投与し、それにより、被験体における運動効果を向上させる、投与する工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が競技哺乳動物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記競技哺乳動物がウマ、イヌ、またはヒトである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験体が成体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験体が運動訓練被験体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＰＰＡＲδアゴニストをＡＭＰＫアゴニストと同日に投与する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＡＭＰＫアゴニストがＡＩＣＡＲであり、前記ＰＰＡＲδアゴニストがＧＷ１５１６である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記被験体が有酸素運動を行う工程をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記運動効果が、持久力の改善である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
持久力の改善が、走行距離の改善、走行時間の改善、またはその組み合わせである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
有効量が、単一用量または分割用量で約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
投与が、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
運動効果が、被験体の少なくとも１つの骨格筋における脂肪酸酸化の増加である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
運動効果が体脂肪の減少である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
前記体脂肪が白色脂肪組織である、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００８年７月１５日に出願され、参考により本明細書中に援用された米国仮特許出願第６１／０８０，８４１号の利益を主張する。本願は、米国特許出願第１１／９６６，８５１号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１２４号の継続出願であり、米国特許出願第１１／９６６，８５１号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１２４号に対する優先権を主張する。米国特許出願第１１／９６６，８５１号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１２４号の両方は、２００８年１２月２８日に出願され、それらの開示は、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
（国家の支援の承認）
本研究は、国立衛生研究所の補助金第１Ｆ３２ＡＲ０５３８０−０１（ＮＲＳＡ研究奨励金）により支援された。したがって、米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本開示は、被験体の運動の改善およびエネルギー代謝の改変のためのＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）のアゴニストの使用に関する。本開示はまた、運動不足の被験体の筋消耗疾患および障害の治療方法および筋緊張の促進方法を提供する。本開示はまた、被験体の運動能力の改善のためのＡＭＰＫとペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）δアゴニストとの組み合わせおよび筋緊張、筋持久力、または筋肉の能力に関連する遺伝子発現プロフィールを調整する化合物の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
骨格筋は、その代謝性および収縮性が異なる複数の筋線維（酸化系遅筋線維（Ｉ型）、混合型酸化系／解糖系速筋線維（Ｈａ型）、および解糖系速筋線維（Ｈｂ型）が含まれる）から構成される適応性のある組織である（非特許文献１；非特許文献２）。Ｉ型筋線維は、脂肪酸を酸化する酵素を優先的に発現し、遅い収縮性のタンパク質イソ型を含み、解糖系筋線維よりも疲労耐性が高い（非特許文献３；非特許文献４）。ＩＩ型線維は、グルコースを優先的に代謝し、速い収縮性のタンパク質イソ型を発現する（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
持久運動訓練によって骨格筋における複雑な再造形プログラムが誘発され、マラソン走者、登山者、およびサイクリストなどのアスリートの能力が進行性に向上する。これには、エネルギー基質の利用を変化させる筋線維内の代謝プログラムおよび構造タンパク質の変化ならびに筋疲労を軽減するように作用する収縮性を含む（非特許文献７；非特許文献８）。筋肉内の訓練ベースの適応は、遅筋収縮装置、ミトコンドリア呼吸、および脂肪酸酸化に関与する遺伝子発現の増加に関連する（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。かかる運動訓練関連適応により、能力を改善し、肥満および関連代謝障害から防御することができる（非特許文献１９；非特許文献２０）。さらに、酸化系遅筋線維が豊富な骨格筋は筋消耗に耐性を示す（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｌｕｃｋら、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４６：１５９−２１６、２００３
【非特許文献２】Ｐｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．、５０：５００−５０９、２０００
【非特許文献３】Ｆｌｕｃｋら、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４６：１５９−２１６、２００３
【非特許文献４】Ｐｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．、５０：５００−５０９、２０００
【非特許文献５】Ｆｌｕｃｋら、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１４６：１５９−２１６、２００３
【非特許文献６】Ｐｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．、５０：５００−５０９、２０００
【非特許文献７】Ｆｌｕｃｋら、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１４６：１５９−２１６、２００３
【非特許文献８】Ｐｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．、５０：５００−５０９、２０００
【非特許文献９】Ｈｏｌｌｏｓｚｙ  ａｎｄ  Ｃｏｙｌｅ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、５６：８３１−８３８、１９８４
【非特許文献１０】Ｂｏｏｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓｏｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、７１：５４１−５８５、１９９１
【非特許文献１１】Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１５：１４８−１５７、２００３
【非特許文献１２】Ｙｏｓｈｉｏｋａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１７：１８１２−１８１９、２００３
【非特許文献１３】Ｍａｈｏｎｅｙら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９：１４９８−１５００、２００５
【非特許文献１４】Ｍａｈｏｎｅｙ  ａｎｄ  Ｔａｒｎｏｐｏｌｓｋｙ、Ｐｈｙｓ  ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．、１６：８５９−８７３、２００５
【非特許文献１５】Ｓｉｕら、Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、９７：２７７−２８５、２００４
【非特許文献１６】Ｇａｍｉｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９：４３−５２、２００５
【非特許文献１７】Ｓｈｏｒｔら、Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、９９：９５−１０２、２００５
【非特許文献１８】Ｔｉｍｍｏｎｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９：７５０−７６０、２００５
【非特許文献１９】Ｗａｎｇら、Ｐ．Ｂｉｏｌ、２：ｅ２９４、２００４
【非特許文献２０】Ｋｏｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：３３５８８−３３５９８、２００５
【非特許文献２１】Ｍｉｎｎａａｒｄら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．３１：３３９−４８、２００５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本開示はまた、ＡＭＰＫアゴニストを含む組成物を被験体に投与する工程を含み、それにより、筋緊張、筋肉量、または筋持久力が促進される、筋消耗疾患、筋萎縮、または老化の治療方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、被験体の筋緊張を促進または維持するために固定された肢を有し得るか、他の内科療法によって固定され得る被験体を治療する工程を含む。
【０００８】
開示は、経口ＡＭＰＫアゴニストが非運動被験体のほぼ４５％で運動持久力を改善するための単剤として十分であるという予想外の所見を示す。
【０００９】
運動効果が向上するＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）アゴニストを被験体に投与する工程を含む、被験体の運動効果を向上させる方法を開示する。ＡＭＰＫアゴニストは、任意のＡＭＰＫアゴニスト、その誘導体、塩、またはエステルであり得る。１つの実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストはＡＩＣＡＲである。本方法は、有効量のＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）を被験体に投与し、それにより、被験体の運動効果がさらに向上する、投与する工程をさらに含むことができる。被験体は、競技動物（ヒト、、ウマ、またはイヌが含まれる）であり得る。
【００１０】
本開示は、さらに、運動訓練した被験体から採取した生物サンプル中のＡＭＰＫアゴニストの存在および／または表２、４、または６に列挙した１つまたは複数の分子の発現を同定する工程を含む、運動訓練した被験体における運動能力向上物質の使用を同定する方法を含む。
【００１１】
本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中にＡＭＰＫアゴニストおよびＰＰＡＲδアゴニストを含む組成物も提供する。組成物は、エネルギーサプリメント、飲料、食品、または医薬品であり得る。ＡＭＰＫアゴニストまたはＰＰＡＲアゴニストは、その塩、エステル、プロドラッグ、前駆体、または誘導体であり得る。
【００１２】
本開示は、予想に反して、成体におけるＡＭＰＫまたは内因性ＰＰＡＲδの薬理学的活性化により、かかる被験体の骨格筋の酸化系表現型への再造形を促進するか走行持久力を増大させることを示す。さらに、運動と組み合わせた内因性ＰＰＡＲδのアゴニスト誘導性活性化により、骨格筋で固有の「遺伝子発現サイン」が得られ、このサインは運動のみまたは薬物摂取のみのいずれかによって得られる遺伝子発現プロフィールと異なり、ＰＰＡＲδと運動誘導性キナーゼ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫ２など）との間の直接的な相互作用が明らかとなった。
【００１３】
本明細書中に記載のこれらのおよび他の発見は、開示の方法の基礎として役立つ。例えば、運動と組み合わせて使用したＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）によって、運動のみよるよりもはるかに運動誘導性の効果を向上させる（運動持久力（例えば、走行持久力）を改善するなど）ことができるということをここで認識することができる。別の例では、運動とＰＰＡＲδアゴニスト投与との組み合わせによって固有に調節される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現を使用して、運動能力を向上させる薬物を使用した被験体を同定することができる。さらに他の例では、新規に同定したタンパク質複合体（ＰＰＡＲδおよび運動誘導性キナーゼ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）が含まれる）を使用して、ＰＰＡＲδ調節遺伝子ネットワークならびに対応する下流の生化学的効果および／または生理学的効果に影響を及ぼす可能性がある薬剤を同定することができる。
【００１４】
上記および他の特徴は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかとなるであろう。この説明を添付の図面を参照して進行する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、運動不足のビヒクル処置マウス（Ｖ）、運動不足のＧＷ１５１６処置マウス（ＧＷ）、運動不足のＶＰ１６−ＰＰＡＲ５トランスジェニックマウス（ＴＧ）、および運動不足のＶＰ１６−ＰＰＡＲ５トランスジェニックマウスの野生型同腹仔（ＷＴ）から単離した四頭筋中の脂肪酸酸化の３つのバイオマーカー（脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ｍＣＰＴＩ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ、イソ酵素４（ＰＤＫ４））のｍＲＮＡ発現レベルに及ぼす経口投与したＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ１５１６）の影響を示す一連の棒グラフである。データを、それぞれ３連で分析したＮ＝４〜９マウスの平均±ＳＥＭとして示す。＊は、Ｖ群とＧＷ１５１６群との間（ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントｔ検定）またはＴＧ群とＷＴ群との間（ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントｔ検定）の統計的有意差を示す。図１Ｂ〜１Ｄは、野生型（ＷＴ）およびＰＰＡＲδヌル（ＫＯ）初代筋細胞におけるＧＷ１５１６（ＧＷ）による酸化系遺伝子ＵＣＰ３、ｍＣＰＴＩ、およびＰＤＫ４の調節を示す一連の棒グラフである。＊はＶ群と表示の群との間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。図１Ｅは、処置前（０週）および処置後（５週間）のビヒクル処置した運動不足のマウス（Ｖ；白抜きのバー）およびＧＷ１５１６処置した運動不足のマウス（ＧＷ；黒塗りのバー）の走行持久力を示す一連の棒グラフである。走行持久力を、各群における動物のトレッドミル上を走行した時間（左パネル）または距離（右パネル）によって定量する。データを、Ｎ＝６マウス由来の±ＳＤとして示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、運動不足のマウス（ＶまたはＧＷ）または訓練したマウス（ＴｒまたはＴｒ＋ＧＷ）の腓腹筋に及ぼすＰＰＡＲδアゴニストＧＷ１５１６の投与効果を示す。図２Ａは、ビヒクル処置した運動不足のマウス（Ｖ）、ＧＷ１５１６処置した運動不足のマウス（ＧＷ）、ビヒクル処置した運動マウス（Ｔｒ）、およびＧＷ１５１６措置した運動マウス（Ｔｒ＋ＧＷ）由来の腓腹筋の代表的な異染小体染色した凍結断面のデジタル画像を示す。Ｉ型（酸化系遅筋）線維は暗色に染色される。図２Ｂは、Ｖ、ＧＷ、Ｔｒ、およびＴｒ＋ＧＷ腓腹筋（Ｎ＝３）中のＩ型線維の百分率（総線維に対する百分率として）を示す棒グラフである。図２Ｃは、マウス（Ｎ＝９）のＶ群（左のバー）、ＧＷ群（左から２番目のバー）、Ｔｒ群（右から２番目のバー）、およびＴｒ＋ＧＷ群（右のバー）におけるミトコンドリアＤＮＡの核ＤＮＡに対する比の変化倍率を示す棒グラフである。（Ｂ）および（Ｃ）中のデータを、平均±ＳＥＭとして示す。各棒グラフでは、＊は、Ｖ群とアスタリスクで示した群との間の統計的差異を示す（ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、Ｖ群、ＧＷ群、Ｔｒ群、およびＴｒ＋ＧＷ群から単離した四頭筋中の遺伝子発現を示す一連の棒グラフである。図３Ａは、脂肪酸酸化のバイオマーカー（ＵＣＰ３、ｍＣＰＴＩ、ＰＤＫ４；左から右）の相対遺伝子発現レベルを示す。（Ｂ）は、脂肪酸貯蔵のバイオマーカー（ＳＣＤ１、ＦＡＳ、ＳＲＥＢＰＩｃ）の相対遺伝子発現レベルを示す。（Ｃ）は、脂肪酸取り込みのバイオマーカー（ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＬＰＬ）の相対遺伝子発現レベルを示す。データを、それぞれ３連で分析したＮ＝９マウスの平均±ＳＥＭとして示す。＊は、Ｖ群とアスタリスクで示した群との間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。（Ｄ）は、四頭筋（Ｎ＝３）から調製したタンパク質溶解物中の酸化系バイオマーカー（ミオグロビン、ＵＣＰ３、ＣＹＣＳ、ＳＣＤ１）およびローディングコントロール（チューブリン）のタンパク質発現レベルを示すウェスタンブロット画像を示す。
【図４】図４は、Ｖマウス、ＧＷマウス、Ｔｒマウス、およびＴｒ＋ＧＷマウスの腓腹筋中の筋肉トリグリセリドレベルのグラフを示す。データを、それぞれ３連で分析したＮ＝９マウスの平均±ＳＥＭとして示す。＊は、Ｖ群とアスタリスクで示した群との間の統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、運動訓練マウスにおける走行持久力に及ぼすＧＷ１５１６処置の影響を示す棒グラフである。ビヒクル処置マウス（Ｖ；白抜きのバー）およびＧＷ１５１６処置マウス（ＧＷ；黒塗りのバー）が運動訓練前（０週）および運動訓練後（５週間）にトレッドミル上を走行した（Ａ）時間および（Ｂ）距離の棒グラフ。データを、Ｎ＝６マウスの平均±ＳＤとして示す。＊＊＊は、Ｖ群とＧＷ群との間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．００１；一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：チューキュー多重比較検定）。（Ｃ）は、Ｖマウス、ＧＷマウス、Ｔｒマウス、およびＴｒ＋ＧＷマウスにおける精巣上体白色脂肪の体重に対する比を示す棒グラフである。データを、それぞれ３連で分析したＮ＝９マウスの平均±ＳＤとして示す。＊は、Ｖ群とアスタリスクで示した群との間の統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。図５Ｄは、Ｖマウス、ＧＷマウス、Ｔｒマウス、およびＴｒ＋ＧＷマウス由来の精巣上体白色脂肪のＨ＆Ｅ染色断面のデジタル画像を示す。Ｎ＝３マウスから類似の結果を得た。＊は、Ｖ群とアスタリスクで示した群との間の統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。
【図６】図６は、四頭筋のマイクロアレイ分析で同定されたＧＷ標的遺伝子、Ｔｒ標的遺伝子、およびＴｒ＋ＧＷ標的遺伝子を比較したベン図を示す。Ｔｒ＋ＧＷマウスにおける標的遺伝子の分類およびＧＷ、ＴＲ、ＴＲ＋ＧＷ、およびＶＰ１６−ＰＰＡＲδの筋肉中の４８種の固有のＴＲ＋ＧＷ標的遺伝子の相対発現も示す。データは、各群におけるＮ＝３サンプルの平均である。ボンフェローニ多重比較検定における選択基準はｐ＜０．０５および変化倍率１．５超を使用した。
【図７】図７Ａは、運動によるＡＭＰＫ活性化を示す一連のウェスタンブロット画像である。運動不足のマウス（Ｓｅｄ／Ｃ５７Ｂ１）および運動訓練マウス（Ｔｒ／Ｃ５７Ｂ１）（Ｎ＝５〜７）の四頭筋におけるホスホ−ＡＭＰＫ（ホスホ−ＡＭＰＫ）レベルおよび総ＡＭＰＫレベルを示す。図７Ｂは、ＶＰ１６−ＰＰＡＲｄ過剰発現によるＡＭＰＫ活性化を示す一連のウェスタンブロット画像である。運動不足の野生型マウスまたはトランスジェニックマウス（Ｓｅｄ／ＷＴまたはＳｅｄ／ＴＧ）の四頭筋におけるホスホ−ＡＭＰＫ（ホスホ−ＡＭＰＫ）レベルおよび総ＡＭＰＫレベルを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＰＰＡＲδおよびＡＭＰＫによる筋肉遺伝子発現の相乗的調節を示す。（Ａ）四頭筋のマイクロアレイ分析で同定されたＧＷ、ＡＩ、およびＡＩ＋ＧＷ標的遺伝子を比較したベン図。データは、各群におけるＮ＝３サンプルの平均である。ボンフェローニ多重比較検定における選択基準はｐ＜０．０５および変化倍率１．５超を使用した。（Ｂ）四頭筋中で同定されたＴｒ＋ＧＷおよびＡＩ＋ＧＷ依存性遺伝子サインの比較。データは、各群におけるＮ＝３サンプルの平均である。使用した選択基準は、図８Ａで使用したものに類似している。（Ｃ）Ｔｒ＋ＧＷ遺伝子サインおよびＡＩ＋ＧＷ遺伝子サインに共通していた５２標的の分類。
【図９】図９Ａ〜９Ｈは、ビヒクル（Ｖ）、ＧＷ１５１６（ＧＷ）、ＡＩＣＡＲ（ＡＩ）、および２つの薬物の組み合わせ（ＧＷ＋ＡＩ）で６日間処置したマウスの四頭筋中の（Ａ）ＵＣＰ３転写物、（Ｂ）ｍＣＰＴＩ転写物、（Ｃ）ＰＤＫ４転写物、（Ｄ）ＳＣＤ１転写物、（Ｅ）ＡＴＰクエン酸リアーゼ転写物、（Ｆ）ＨＳＬ転写物、（Ｇ）ｍＦＡＢＰ転写物、および（Ｈ）ＬＰＬ転写物の発現を示す。データを、３連で分析した各群におけるＮ＝６マウスの平均±ＳＥＭとして示す。＊は、Ｖと表示の群との間の統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５、一元置換ＡＮＯＶＡ；事後：ダネット多重比較検定）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｌは、ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ相互作用を示す。（Ａ〜Ｄ）は、Ｖ、ＧＷ、ＡＩ、およびＧＷ＋ＡＩ（左から右のバー）で２４時間処置した野生型およびＰＰＡＲδヌル（ＫＯ）初代筋細胞における代謝遺伝子の発現を示す。（Ｅ〜Ｆ、Ｊ）では、ＡＤ２９３細胞を、上記のように、コントロールベクター、ＡＭＰＫα１、ｃｃ２、および／またはＰＧＣ１αと共にＰＰＡＲδ＋ＲＸＲα＋Ｔｋ−ＰＰＲＥでトランスフェクトした。（Ｅ）ＡＭＰＫα１またはｃｃ２による基底ＰＰＡＲδ転写活性の誘導。（Ｆ）ＰＰＡＲδ転写活性の用量依存性誘導は、コントロール（白抜きの三角）と比較してＡＭＰＫα１（黒塗りの円）またはＡＭＰＫｃｃ２（黒塗りの四角）によって増強される。（Ｇ〜Ｉ、Ｋ）では、ＡＤ２９３細胞を表示のようにトランスフェクトし、プロセシングした。（Ｇ〜Ｈ）トランスフェクトしたＡＭＰＫ（Ｇ）または内因性のＡＭＰＫ（Ｈ）のＦｌａｇ−ＰＰＡＲδでの免疫共沈降を示す代表的なブロット。（Ｉ）記載のようにトランスフェクトしたＡＤ２９３細胞におけるＰＰＡＲδの代謝ｐ３２標識。（Ｊ）ＡＭＰＫｃｃ２サブユニットおよびＰＧＣ１αによる基底（Ｖ）およびリガンド（ＧＷ）依存性のＰＰＡＲδ転写活性の相乗的調節。（Ｋ）ＰＰＡＲδはＦｌａｇ−ＰＧＣ１αと免疫超沈降したが、ＡＭＰＫα２サブユニットとはしなかった。（Ｌ）再プログラミング筋肉ゲノムにおける運動−ＰＰＡＲδ相互作用を示すモデル。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｉは、ＡＩＣＡＲが走行持久力を増加させることを示す。（Ａ〜Ｆ）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、ビヒクル（白抜きのバーまたは細線）またはＡＩＣＡＲ（５００ｍｇ／ｋｇ／日、４週間）（黒塗りのバーまたは太線）で処置した。（Ａ）四頭筋中のＵＣＰ３、ホスホ−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、ホスホ−ＡＭＰＫ、および総ＡＭＰＫレベルを示す代表的な免疫ブロット。（Ｂ）平均体重。（Ｃ）精巣上体脂肪量の体重に対する比率。（Ｄ）１２時間にわたって測定した酸素消費速度（ｍｇ／ｋｇ／時間）。（Ｅ）ＡＵＣとして示した（Ｄ）中のデータ。（Ｆ）時間（上のパネル）および距離（下のパネル）の関数として測定した走行持久力。（Ｇ）ＡＩＣＡＲ処置（２５０ｍｇ／ｋｇ／日、６日間）によって誘導された代表的な酸化遺伝子。（Ｈ）ビヒクル（白抜きのバー）またはＡＩＣＡＲ（黒塗りのバー）で７２時間処置した野生型およびＰＰＡＲｄヌル初代筋芽細胞中での酸化系バイオマーカー（Ｓｃｄ１、Ｆａｓｎ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｄｋ４）の発現。（Ｉ）再プログラミング筋肉遺伝子における運動とＡＭＰＫ−ＰＰＡＲｄとの間の相互作用を示すモデル。（Ｂ）および（Ｃ）（ｎ＝１０）、（Ｄ）および（Ｅ）（ｎ＝４）、（Ｆ）（ｎ＝１５〜２０）、および（Ｈ）（ｎ＝９）中のデータを平均±ＳＥＭとして示し、＊は統計的有意性を示す（ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列情報
核酸配列およびアミノ酸配列を、本明細書中でＧｅｎＢａｎｋ受入番号によって言及することができる。かかるＧｅｎＢａｎｋ受入番号で示した配列は、これらの配列のままで参考として援用され、２００７年１２月２９日時点で公知であったと理解される。
【００１７】
詳細な説明
本明細書中の他で特に記述しない限り、使用した用語の定義は、薬学分野で使用されている標準的な定義である。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上で明確に別な意味に示されない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「薬学的キャリア」という言及には、２つ以上のかかるキャリアの混合物などが含まれる。
【００１８】
また、「または」の使用は、別に示さない限り、「および／または」を意味する。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は交換可能であり、本発明を制限することを意図しない。
【００１９】
種々の実施形態の説明で用語「含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、実施形態を用語「〜本質的になる」または「からなる」を使用して代替的に説明することができると理解するとさらに理解すべきである。
【００２０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および試薬を開示の方法および組成物の実施で使用することができるにもかかわらず、例示的方法および材料をここに説明する。
【００２１】
本明細書中に記載の全ての刊行物は、その全体が方法の説明および開示のために本明細書中で参考として援用される。この方法は、刊行物に記載され、本明細書中の説明と併せて使用することができる。上記および本文を通して考察された刊行物を、本開示の出願日以前にその開示のみを目的として提供する。先行する開示のためにかかる開示が先行する権利を本発明者らが持たないことを承認すると解釈すべきではない。
【００２２】
一般健康に及ぼす運動の多数の利益を考慮すると、持久運動の遺伝的影響を模倣または増強する経口薬の同定は、とらえ所がないが長期にわたる医学的目的である。高用量のリスベラトロールなどの一定の天然抽出物によって持久力を改善することができる（Ｌａｇｏｕｇｅら、２００６）。リスベラトロールの有酸素的影響は、骨格筋中のＳＩＲＴ１−ＰＧＣ１ａコアクチベーター複合体の活性化に依存すると考えられている。しかし、これらの影響の媒介におけるＳＩＲＴ１／ＰＧＣ１ａによってターゲティングされた下流転写因子は知られていない。より重要には、ＳＩＲＴ１／ＰＧＣ１ａおよびリスベラトロールの両方によって複数の標的が活性化され、したがって、持久力を改善するために合成薬によって選択的に活性化することができる特異的シグナル伝達経路が存在するかどうかは知られていない。
【００２３】
運動訓練は、代謝再プログラミングに寄与する骨格筋中の多数の転写調節因子およびセリン−トレオニンキナーゼを活性化する（Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ、２００６）。トランスジェニックマウス骨格筋中の構成的活性型ＰＰＡＲδ（ＶＰ１６−ＰＰＡＲδ）の過剰発現により、酸化系筋線維の増加が予めプログラミングされ、非訓練成体マウスのほぼ１００％で走行持久力が向上する（Ｗａｎｇら、２００４）。最も理解されているセリン−トレオニンキナーゼのうちの１つはＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）（細胞および生物の代謝の主な調節因子）である。
【００２４】
ＡＭＰキナーゼアゴニスト（ＡＩＣＡＲなど）がインスリン調節、糖尿病、および肥満について研究されている。しかし、ＡＭＰキナーゼによる筋緊張の促進または持久力もしくは運動の改善は以前に証明されていなかった。本開示は、ＡＭＰＫアゴニストが筋消耗疾患および障害に有益な影響を与え、運動不足の被験体または固定された肢に有益であり、ＰＰＡＲｄアゴニストとの組み合わせによって予想外の相乗効果が得られることを示す。
【００２５】
本開示は、ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６（ヒトで生物活性を示すことが示されている）など）によってマウスが非処置コントロールのみよりも時間および距離が６０％〜７５％を長くすることができることを証明する。しかし、これはかかる効果はＰＰＡＲδアゴニストの投与を運動訓練と組み合わせた場合に限って認められる。この「超持久力表現型」は、運動活性化ＡＭＰＫによって得られる転写増強に関与し、それにより新規の持久力遺伝子サインが得られる（例えば、図１０Ｌを参照のこと）。
【００２６】
本開示はまた、この超持久力表現型を経口ＡＭＰＫアゴニストによって運動訓練することなく得ることができ、かかるＡＭＰＫアゴニストが非運動被験体で走行持久力をほぼ４５％改善するための単剤として十分であることを証明した。
【００２７】
ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）およびＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）は、タンパク質キナーゼカスケードを含む。ＡＭＰＫカスケードは、燃料の産生および利用を細胞内で調節する。例えば、低細胞燃料（例えば、ＡＭＰ濃度の増加）によってＡＭＰＫ活性が増加する。一旦活性化されると、ＡＭＰＫは、ＡＴＰを保存するか、別のＡＴＰ生成方法を促進するように機能する。
【００２８】
５’ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼまたはＡＭＰＫは、共に細胞エネルギーホメオスタシスで役割を果たす機能酵素を作成する３つのタンパク質（サブユニット）からなる。これは、多数の組織（肝臓、脳、および骨格筋が含まれる）中で発現される。ＡＭＰＫの活性化により、肝臓の脂肪酸酸化およびケトン体生成を活性化し、コレステロール合成、脂肪生成、およびトリグリセリド合成を阻害し、脂肪細胞の脂肪分解および脂肪生成を阻害し、骨格筋の脂肪酸酸化および筋肉グルコース取り込みを刺激し、膵臓β細胞によるインスリン分泌を調整することが示されている。
【００２９】
ＡＭＰＫ活性化を、ＡＭＰ濃度を増加させて誘発することができる。ＡＭＰＫのγサブユニットは、高次構造の変化を受けてαサブユニットの活性部位（Ｔｈｒ−１７２）が露呈する。ＡＭＰＫのγサブユニットの高次構造を、ＡＭＰ濃度の増加下で変化させることができる。ＡＭＰ濃度の増加により、ＡＭＰＫのγサブユニット上の高次構造が変化するであろう。これは、２つのＡＭＰがそのサブユニット上に存在するベートマンドメインに結合するからである。ＡＭＰのこの役割は、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキシアミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）に由来するＡＭＰアナログである５−アミノ−４−イミダゾールカルボキシアミドリボチド（ＺＭＰ）を介したＡＭＰＫ活性化を示す実験で証明されている。
【００３０】
筋肉が収縮するにつれて、ＡＴＰは加水分解され、ＡＤＰを形成する。次いで、ＡＤＰは、リン酸基を別のＡＤＰに供与することによって細胞ＡＴＰの補充を補助し、ＡＴＰおよびＡＭＰが形成される。筋肉収縮時により多数のＡＭＰが産生されるにつれて、ＡＭＰ：ＡＴＰ比は劇的に増加し、ＡＭＰＫがアロステリックに活性化される。
【００３１】
種々のＡＭＰＫアゴニストが当該分野で公知である。かかるＡＭＰＫアゴニストを含む方法および組成物を本明細書中に提供する。かかるＡＭＰＫアゴニストの使用により、かかるＡＭＰＫアゴニストを投与されなかった被験体と比較して筋緊張および筋肉量が改善され、持久力も改善される。種々のＡＭＰＫアゴニストを本明細書中に記載し、これらは当該分野で公知である。１つの実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストはＡＩＣＡＲ化合物を含む。開示の方法で有用な他の化合物には、ＡＩＣＡＲのアナログ（米国特許第５，７７７，１００号（本明細書中で参考として援用される）に開示のものなど）およびＡＩＣＡＲのプロドラッグまたは前駆体（米国特許第５，０８２，８２９号（本明細書中で参考として援用される）に開示のものなど）が含まれ、これらはＡＩＣＡＲの生物学的利用能を増加させ、その全てが、当業者に周知である。ＡＭＰＫの他のアクチベーターには、Ｉｙｅｎｇａｒらの米国特許出願公開第２００６０２８７３５６号（その開示が本明細書中で参考として援用される）に記載のものが含まれる。伝統的に公知のＡＭＰＫ活性化化合物には、上記に加えて、レプチン、アディポネクチン、およびメルホルミン、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミド）が含まれる。他のＡＭＰＫアゴニストには、ＤＲＬ−１６５３６（Ｄｒ．Ｒｅｄｄｙ’ｓ／Ｐｅｒｌｅｃａｎ  Ｐｈａｒｍａ）、ＢＧ８００化合物（Ｂｅｔａｇｅｎｏｎ）、フラン−２−カルボン酸誘導体（Ｈａｎａｌｌ，ＫＲ；国際公開ＷＯ／２００８／０１６２７８号（本明細書中で参考として援用される）も参照のこと）、Ａ−７６９６６２（Ａｂｂｏｔｔ）（構造  Ｉ；Ｃｏｏｌら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌ．３：４０３−４１６、２００６も参照のこと）；国際公開番号ＷＯ／２００６／０３３７０９号に記載のＭｅｔａｂａｓｉｓによって開発中のＡＭＰＫアゴニスト；ＭＴ−３９系列化合物（Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；およびＴｒａｎｓＴｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａによって開発中のＡＭＰＫアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
【化１】
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ＡＩＣＡＲは、例えば、細胞に取り込まれてＺＭＰ（ＡＭＰＫを活性化することが示されているＡＭＰアナログ）に変換される。ＺＭＰは細胞内ＡＭＰ模倣物として作用し、十分に高レベルに蓄積された場合、ＡＭＰＫ活性を刺激することができる（Ｃｏｒｔｏｎ、Ｊ．Ｍ．ら．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：５５８（１９９５））。しかし、ＺＭＰはまた他の酵素の調節下でＡＭＰ模倣物として作用する。したがって、特異的ＡＭＰＫアクチベーターではない（Ｍｕｓｉ、Ｎ．ａｎｄ  Ｇｏｏｄｙｅａｒ、Ｌ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−−Ｉｍｍｕｎｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２：１１９（２００２））。
【００３３】
本開示は、被験体の「運動馴化状態」の刺激方法を提供する。本方法は、被験体のエネルギー欠損状態を刺激するのに十分な量のＡＭＰＫアゴニストを被験体に投与する工程を含む。「エネルギー欠損状態」は、ＡＭＰＫのγサブユニットが高次構造の変化を受けて被験体の貯蔵脂肪の異化が増加するか、貯蔵ＡＴＰエネルギーが保存される状態または運動している個体で見出される代謝状態をいう。運動馴化状態を、運動せずに開示のＡＭＰＫアゴニストを使用して達成することができる（「無運動馴化」）。しかし、ＡＭＰＫアゴニストの投与によって運動馴化状態を促進することができるにもかかわらず、ＡＭＰＫアゴニストと投与する場合でさえも被験体が運動馴化を行うことが望ましいか適切であり得ると認識されるであろう。
【００３４】
刺激および運動馴化状態は、運動競技訓練に有益なだけでなく、傷害、疾患、または障害によって肢／筋肉を運動させることができない被験体、または被験体が運動不足であるか、固定されている場合にも有益である。運動馴化状態の刺激により、被験体は、肢または筋肉中の筋緊張および／または筋肉量を維持し、健康または回復を促進することができる。
【００３５】
運動は、運動する被験体に多くの影響を及ぼすことが知られている。分子レベル、生化学レベル、および／または細胞レベルでの運動効果（例えば、エネルギー基質の利用および筋肉の収縮性に関与する遺伝子および／または遺伝子ネットワークおよび対応するタンパク質の調節の改変）は、組織レベル、器官レベル、および／または全身レベルで認められる生理学的効果（例えば、心肺持久力、筋力、筋持久力、および／または柔軟性の増加、および／または身体の外観の改善）の基礎を形成する。
【００３６】
一般論として、運動はいくつかの身体活動の能力である。身体活動の単回エピソード（単位とも呼ばれる）は、特定の持続時間および特定の強度で行われる。１単位を超える運動が行われる場合、別の単位の運動は同一または異なる持続時間および同一または異なる強度を有することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、単一単位の運動は、３０分まで、４５分まで、６０分まで、９０分まで、２時間まで、２．５時間まで、３時間まで、またはそれ以上持続することができる。典型的には、運動歴の無い場合には、ＰＰＡＲδアゴニストが運動誘導に有効に影響を及ぼす（有酸素能の増加または走行持久力の増加など）ために身体活動単位の繰り返しが必要である。しかし、ＡＭＰＫアゴニストの投与により、有効な運動誘導性または運動促進効果が認められるように運動する必要性が排除される。
【００３８】
したがって、いくつかの開示の方法では、ＡＭＰＫアゴニストを単独で摂取するか、ＰＰＡＲδアゴニストの前に摂取する場合には運動は必要ない。しかし、いくつかの例では、身体活動単位を１日以内に繰り返すことができる（例えば、２単位までの運動／日、３単位までの運動／日、４単位までの運動／日、５単位までの運動／日、またはそれを超える単位／日）。プロのアスリートまたは競技哺乳動物によっては、繰り返し単位を１日に合わせて８時間以上で運動することができる。他の方法実施形態では、運動の単位（または繰り返し単位）を１日１回、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、または１週間に３回実施する。少なくともいくつかの開示の方法では、運動を、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも３年間、または不確定に（被験体の寿命まで）継続することができる。
【００３９】
運動を、一般に、被験体にとって通常の活動（例えば、平均、中央値、標準、または正常活動）を超え、そして／または特定の運動を実施している被験体によって達成可能な最大活動未満の強度で行う。身体能力の任意の公知の指標を使用して、被験体が通常の活動量を超えて活動するかどうかを決定することができる（例えば、心拍数、反復率（例えば、毎秒回転数、分／マイル、昇降数／分、およびその他）、および／または筋出力の測定が含まれる）。いくつかの方法では、単位運動を、亜最大強度（例えば、約１０％最大強度、２５％最大強度、５０％最大強度、または７５％最大強度）で行う。他の方法では、単位運動を４０％〜５０％最大心拍数、５０％〜６０％最大心拍数、６０％〜７０％最大心拍数、または７５％〜８０％最大心拍数で行い、ヒト被験体の最大心拍数を以下のように計算する：２２０ｂｐｓ−（被験体の年齢）。
【００４０】
運動は、一般に、以下の３つの型に分類される：（ｉ）柔軟運動（ストレッチなど）（少なくとも筋肉および関節の可動域を改善すると考えられる）；（ｉｉ）有酸素運動；および（ｉｉｉ）無酸素運動（ウェートトレーニング、機能訓練、または短距離走など）（少なくとも筋肉の強度および筋肉量を増加させると考えられる）。
【００４１】
有酸素運動は、酸化的代謝または好気的代謝が（解糖代謝または嫌気的代謝と比較して）運動した骨格筋で実質的に優性である身体活動をいう。特定の方法の実施形態では、被験体は１つまたは複数の有酸素運動を行う。例示的な有酸素運動には、エアロビクス、徒手体操、サイクリング、ダンス、運動器具（ローリングマシン、サイクリングマシン（例えば、傾斜型または直立型）、クライミングマシン、エリプティカルトレーナー、および／またはスキーマシン）、バスケットボール、フットボール、野球、サッカー、フットバッグ、家事、ジョギング、武道、マッサージ、ピラティス、ローイング、ランニング、縄跳び、水泳、ウォーキング、ヨガ、ボクシング、体操、バドミントン、クリケット、陸上競技、ゴルフ、アイスホッケー、ラクロス、ラグビー、テニス、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
開示の方法は、運動（ウォーキングまたはランニングのような有酸素運動など）の任意の公知または認められる効果の向上を意図する。特定の方法では、走行持久力（例えば、走行距離および／または走行時間）を向上させる。別の実施形態では、本方法および組成物は、筋肉の不動、筋消耗疾患または障害の被験体または運動不足の被験体の治療に有用である。１つのかかる実施形態では、筋緊張または筋肉量は、開示の組成物（例えば、ＡＭＰＫアゴニスト、またはＡＭＰＫアゴニストまたはＰＰＡＲアゴニストの組み合わせ）を投与していない被験体と比較して、筋肉の不動、筋消耗疾患または障害、または運動不足の被験体で改善または維持される。１つの実施形態では、開示の組成物および方法は、開示の組成物を投与していない被験体と比較して、筋消耗疾患を有する被験体の筋肉喪失または筋肉喪失率を５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えて減少させることができる。
【００４３】
筋力低下、筋緊張、筋萎縮は、多数の疾患および障害（脱神経または遷延性無呼吸が含まれる）に起因する。規則的な運動が不足すると、筋線維の嵩および長さの両方が喪失し、罹患領域中の筋肉のサイズおよび外形が視覚化可能に喪失され、見かけ上痩せるか変形する。わずかな萎縮でさえ、通常、行動または力がいくらか喪失される。萎縮は、通常、神経筋疾患または傷害に起因する。しかし、筋緊張、筋萎縮、および筋力低下はまた、一定の代謝性障害、心血管障害、または内分泌障害および長期臥床から生じ得る。いくつかの筋萎縮はまた、老化と共に起こる。開示の組成物は、ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲｄアゴニストとの組み合わせの投与を含むかかる筋力低下、筋緊張、および筋萎縮の治療に有用である。
【００４４】
筋消耗疾患には、典型的に肢（例えば、手、腕、または脚）から開始される筋力低下および筋萎縮が含まれる。最終的に、筋力低下および筋萎縮は、体幹、頸部、舌、喉頭、咽頭、および脚に拡大し、呼吸器の進行性の筋力低下によって呼吸機能不全に至る。他の所見には、筋肉弛緩、筋痙攣、活動後進性深部腱反射、軽度の脚筋痙縮、嚥下困難、発語障害、過剰な流涎、および鬱病が含まれる。
【００４５】
重度の熱傷由来の線維性瘢痕組織の形成、疼痛、および血清タンパク質の喪失は、筋肉の動きを制限し、萎縮症を発症し得る。筋萎縮は、拘縮、麻痺、および脈拍の欠損を伴う不可逆性虚血の後期の徴候である。椎間板ヘルニアにより、筋力低下、廃用、最終的に、萎縮を生じ得る。高コルチコイド症は、脚弱、最終的に、萎縮を生じ得る。甲状腺機能低下症は、四肢近位筋の筋力低下および筋萎縮を生じ得る。肢を固定する傷害により、筋萎縮および筋消耗（半月板断裂または骨折が含まれるが、これらに限定されない）または長期の膝または肢の不動に起因する他の軟骨傷害を生じ得る。多発性硬化症は、慢性進行性衰弱の結果として腕および脚の萎縮を生じる変性疾患であり、痙縮および拘縮も発症し得る。骨関節炎は、進行性衰弱および廃用の結果として最終的に関連する関節の近位に萎縮を生じる。パーキンソン病は筋硬直、筋力低下、および筋廃用を生じ、それにより筋萎縮を生じる。末梢神経の外傷または傷害または末梢神経に対する長期間の圧迫により、筋力低下および筋萎縮を生じる。末梢神経ニューロパシーにより、筋力低下を生じ、これが弛緩性麻痺にゆっくり進行し、最終的に萎縮し得る。筋肉の遠位端が一般的に最初に罹患する。関連する所見には、振動感覚の喪失；手足の感覚異常症、知覚過敏、または感覚脱失；軽度または鋭い灼熱痛；無汗症；赤色の光沢皮膚；および深部腱反射の減弱または消失が含まれる。脊髄神経根の損傷により、筋萎縮および筋力低下を生じ得る。関節リウマチにより、関節痛および関節硬直によって可動域が減少し、筋肉の使用が阻止されるので、この障害の後期に筋萎縮を生じる。脊髄損傷または脊髄外傷により、重篤な筋力低下および筋弛緩を生じ、次いで、痙攣、麻痺を生じ、最終的に萎縮を生じ得る。卒中により、対側性または両側性の脱力を生じ、最終的に、腕、脚、顔、および舌の萎縮を生じ得る。関連する徴候および症状は、血管損傷の部位および範囲に依存し、構語障害、失語症、運動失調症、失行症、失認、および同側性感覚異常症または感覚消失が含まれ得る。長期ステロイド療法は、筋肉代謝を干渉し、最も顕著には肢が萎縮し得る。上記のように、床上安静、ギブス、副子、または牽引由来の長期固定により、筋力低下および筋萎縮を生じ得る。任意のこれらの疾患または障害を、開示の組成物または組成物の組み合わせで治療することができる。他の筋消耗疾患または障害が当該分野で認識されている。
【００４６】
本開示は、筋肉量または筋緊張の促進または維持によってかかる疾患および障害の治療に有用な組成物および方法を提供する。例えば、ＡＭＰＫアゴニスト（ＡＩＣＡＲのみまたはＰＰＡＲｄアゴニストとの組み合わせなど）の投与により、筋緊張または筋肉量を促進することができる。健康な被験体では、これは運動効果の向上に寄与し得る。筋肉量を喪失するか筋消耗疾患または障害を罹患する可能性のある被験体では、開示の組成物および方法により、かかる筋萎縮の速度を遅延または消失することができる。
【００４７】
運動効果（走行持久力など）の向上は、かかる効果が運動のみによって生じるであろう結果よりも被験体で改善されることを意味する。いくつかの方法実施形態では、運動効果の向上を、被験体におけるＡＭＰＫアゴニストまたはＰＰＡＲδアゴニストの投与の中断および目的の運動効果（例えば、走行持久力などの有酸素性持久力）の減少の観察（例えば、定性的または定量的）によって決定する。いくつかの例では、ＡＭＰＫ−アゴニスト誘導性効果またはそのＰＰＡＲδ向上部分などの目的の運動効果は、ＡＭＰＫアゴニストまたはＰＰＡＲδアゴニストの投与の中断の際に喪失し、運動のみでの効果の規模と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％減少するであろう。
【００４８】
開示の方法を、身体活動（例えば、有酸素運動）を行うことができる任意の被験体で行うことができる。いくつかの方法実施形態では、被験体は、生きている多細胞脊椎動物（例えば、ヒトおよび／または非ヒト動物）である。他の例示的方法では、被験体は哺乳動物（ヒトおよび／または非ヒト動物（獣医学的哺乳動物または実験哺乳動物など）が含まれる）、またはより特定の例では、競技哺乳動物（ウマ、イヌ、またはヒトなど）である。さらに他の方法では、被験体は、成体、運動訓練した被験体、または健康な被験体である。いくつかの代表的な成人のヒト被験体は、１６歳以上、１８歳以上、または２１歳以上である。いくつかの実施形態では、被験体はいかななる運動も日常的に行っていない。いくつかの実施形態では、いくつかの代表的な運動訓練被験体は、身体活動（上記に詳述）を少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも３ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間行った。いくつかの例では、被験体は健康であり、例えば、疾患または障害に属する分野の医師への妥当な調査後に公知の疾患または障害が診断されていないか明らかと考えられる被験体である。
【００４９】
以下により完全に記載されるように、ＡＭＰＫアゴニストを、経口、非経口、筋肉内、血管内、または任意の適切な経路で投与することができる。被験体は、任意の哺乳動物被験体（例えば、ウマ、イヌ、またはヒト）であり得る。ＡＭＰＫアゴニストは、筋線維の発達および成長を促進する薬剤と組み合わせて特に有用である。かかる薬剤の例には、ＰＰＡＲファミリータンパク質のアゴニストが含まれる。
【００５０】
ＰＰＡＲは、リガンド誘導性転写因子の核内受容体スーパーファミリーのメンバーである。これらは、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成し、１ｂｐで分離された六量体ＤＮＡ配列の直接反復からなるコンセンサスＤＮＡ部位に結合する。リガンドの非存在下で、ＰＰＡＲ−ＲＸＲヘテロ二量体は、コリプレッサー、関連するヒストンデアセチラーゼ、およびクロマチン修飾酵素を補充する（いわゆる積極的抑制による転写サイレンシング）（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５４：１０１−１１６、２００１；Ｊｅｐｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１５：６８９−６９８、２００２；Ｐｒｉｖａｌｓｋｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、６５：３１５−３６０、２００４）。リガンド結合によってＰＰＡＲ−ＲＸＲ複合体の高次構造の変化が誘導され、コアクチベーターの代わりにリプレッサーが放出される。リガンド活性化複合体は基本的な転写装置を補充し、それにより、遺伝子発現が増強される。ＰＰＡＲは、食事性脂肪または細胞内機構から生成された低親和性リガンドに結合する。その脂質センサーとしての役割と一致して、リガンド活性化ＰＰＡＲはフィードフォワード代謝カスケードをオンにして、脂質の代謝、貯蔵、および輸送に関与する遺伝子の転写を介して脂質ホメオスタシスを調節する。
【００５１】
以下の３つのＰＰＡＲアイソタイプが哺乳動物に存在する：α（ＮＲ１Ｃ１としても公知）、γ（ＮＲ１Ｃ３としても公知）、およびδ（βまたはＮＲ１Ｃ２としても公知）。ＰＰＡＲδは、ほとんどの細胞型で相対存在量にて発現し（Ｓｍｉｔｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３０（６）：１０８６−１０９０、２００２）、「一般的なハウスキーピングとしての役割」を果たし得ることが早期に推測された（Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｐｒｏｃ  ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ、９１：７３５５−７３５９、１９９４）。最近になって、ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスモデルおよび低親和性ＰＰＡＲδアゴニストの開発に伴う発見により、多様な組織（脂肪、骨格筋、および心臓が含まれる）で有効な重要な転写調節因子としてのＰＰＡＲδが明らかとなっている（概説については、例えば、Ｂａｒｉｓｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１６（３）：５９０−５９７、２００６を参照のこと）。
【００５２】
げっ歯類骨格筋における構成的活性型ＰＰＡＲδ受容体（ＶＰ１６−ＰＰＡＲδ）導入遺伝子発現のターゲティングにより、骨格筋の酸化表現型への再造形が促進され、非運動成体マウスの走行持久力が増加した（ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ、２：ｅ２９４、２００４）。筋線維の認められたＰＰＡＲδ媒介性再プログラミングは、脂肪酸酸化、ミトコンドリア呼吸、酸化的代謝、および遅筋収縮装置に関連する遺伝子の発現の増加に関与していた（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ．Ｂｉｏｌ．、２：ｅ２９４、２００４）。持久力訓練を行ったアスリートに類似の表現型を有していたが、運動訓練をしていなかったこれらのＶＰｌ６−ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスにより、成体で運動不足の被験体における内因性ＰＰＡＲδの薬理学的活性化によって実際に運動せずに運動効果を得ることができることが示唆される。一般健康に及ぼす運動の多数の利益を考慮すると、運動効果を模倣する経口薬の同定は、とらえ所がないが長期にわたる医学的目的である。
【００５３】
運動効果を得、ミトコンドリア発現または活性を向上するのに十分なＡＭＰＫアゴニストを投与する工程を含む、被験体における運動効果を向上させるか、筋緊張または筋肉量を促進／維持する方法を本明細書中に開示する。１つの実施形態では、被験体は運動している被験体である。別の実施形態では、被験体は運動不足の被験体である。別の実施形態では、被験体は、肢が固定されているか固定されていた。本開示は、さらに、有効量のＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）を被験体に投与する工程を含む。運動効果の向上は、例えば、走行持久力の改善（走行距離の改善、走行時間の改善、またはその組み合わせ、被験体の少なくとも１つの骨格筋中の脂肪酸酸化の増加、および／または体脂肪（例えば、白色脂肪組織）の減少など）であり得る。いくつかの方法実施形態では、被験体は、哺乳動物（ウマ、イヌ、またはヒトのような競技哺乳動物など）、および／または成体、および／または運動訓練した被験体である。他の例示的方法では、ＰＰＡＲδアゴニストを、ＡＭＰＫアゴニストの投与日または身体運動が行われる日に投与する。別の実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストとＰＰＡＲアゴニストとの組み合わせを、身体運動を行う日に投与する。いくつかの方法では、ＡＭＰＫアゴニストを経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、および／または皮下注射によって投与する。他の方法実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストの有効量は、単回用量または分割用量で約１ｍｇ／日〜約２０ｍｇ／日である。いくつかの方法では、ＰＰＡＲδアゴニストを、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、および／または皮下注射によって投与する。他の方法実施形態では、ＰＰＡＲδアゴニストの有効量は、単回用量または分割用量で約１ｍｇ／日〜約２０ｍｇ／日である。
【００５４】
開示の方法は、任意のＰＰＡＲδアゴニストの使用を構想する。好ましくは、かかるアゴニストは、投与される被験体で無毒であろう。例示的なＰＰＡＲδアゴニストには、ＧＷ１５１６、Ｌ−１６５０４１（例えば、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４７３（３）：３３３−３３６、２０００に記載）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０１８１７４号、ＷＯ／２００５／１１３５０６号、ＷＯ／２００５／１０５７５４号、ＷＯ／２００６／０４１１９７号、ＷＯ／２００６／０３２０２３号、ＷＯ／０１／００６０３号、ＷＯ／０２／０９２５９０号、ＷＯ／９７／２８１１５号、ＷＯ／９７／２８１４９号、ＷＯ／９７／２７８５７号、ＷＯ／９７／２８１３７号、ＷＯ／９７／２７８４７、および／またはＷＯ／９８／２７９７４号、および／または公開された米国国内段階出願または上記のいずれかに対応する交付済み米国特許（それぞれ、本明細書中で参考として明確に援用される）に記載の任意の１つまたは複数の化合物が含まれる。さらに、他のＰＰＡＲδアゴニストを、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／１９９８／０４９５５５号または任意の対応する公開された米国国内段階出願または交付済み米国特許（それぞれ、本明細書中で参考として明確に援用される）に記載の方法を使用して同定することができる。
【００５５】
特定の例では、ＰＰＡＲδアゴニストはＧＷ１５１６（当該分野でＧＷ５０１５１６とも呼ばれる）である。ＧＷ１５１６は、（２−メチル−４（（（４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−１，３−チアゾール−５−イル）メチル）スルファニル）フェノキシ）酢酸であり、これはヒトで生物活性があることが示されている（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．２７（２）：３５９−６５、２００７）。特定の例では、ＧＷ１５１６を、例えば、１ｍｇ〜２０ｍｇ／日（２．５ｍｇ／日または１０ｍｇ／日など）で経口投与する。
【００５６】
少なくともＡＭＰＫアゴニストの身体活動との組み合わせおよび／または１つまたは複数のＰＰＡＲδアゴニストの投与によって１つまたは複数の運動効果を向上または刺激する方法を本明細書中に開示する。
【００５７】
開示の方法は、処方物を投与した被験体で運動効果が増強されるという所望の結果が得られるＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせの任意の投与方法、投薬量、および／または処方物（薬学分野の当業者に周知の投与方法、投薬量、および処方物が含まれるが、これらに限定されない）の使用を構想する。
【００５８】
本開示のＡＭＰＫアゴニストを、薬物の形態でヒトまたは動物に投与することができる。あるいは、ＡＭＰＫアゴニストを、ヒトまたは動物によって消費されるように、種々の食品および飲料またはペットフードに組み込むことができる。ＡＭＰＫアゴニストを、一般的な食品または飲料に適用することができるか、機能性食品または機能性飲料、罹患被験体のための食品、または特定保健用食品、生理学的機能を有することを示す標識を有する食品（または飲料）（例えば、エネルギーサプリメント、または運動増強剤など）に適用することができる。
【００５９】
ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせを、製剤（例えば、経口固体製剤（錠剤または顆粒など）または経口液体製剤（ローションまたはシロップなど））に処方することができる。
【００６０】
開示の方法におけるＡＭＰＫアゴニスト（ＰＰＡＲδアゴニストを含む処方物）の投与様式には、髄腔内、皮内、筋肉内、腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）、皮下、鼻腔内、硬膜外、硬膜内、頭蓋内、脳室内、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。特定の例では、ＡＭＰＫアゴニストまたはＡＭＰＫアゴニストおよびＰＰＡＲδアゴニストを経口投与する。ＡＭＰＫアゴニスト（またはＰＰＡＲδアゴニストを含む処方物）の他の都合の良い投与経路には、例えば、注入またはボーラス注射、局所、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜ならびに直腸および腸の粘膜など）、眼、鼻、および経皮を介した吸収が含まれる。投与は、全身または局所であり得る。例えば、エアゾール化剤を含む処方物を使用した肺投与（例えば、吸入器または噴霧器による）も使用することができる。
【００６１】
特定の方法実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストまたはＡＭＰＫアゴニストおよびＰＰＡＲδアゴニストを局所投与することが望ましいかもしれない。例えば、局所または領域への注入または潅流、局所適用（例えば、創傷包帯）、注射、カテーテル、座剤、または挿入物（例えば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の材料（シラスティック膜などの膜または繊維が含まれる）から形成した挿入物）などによってこれを行うことができる。
【００６２】
他の実施形態では、ポンプ（移植ポンプなど）を使用して、ＡＭＰＫアゴニストまたはＡＭＰＫアゴニストとＰＰＡＲδアゴニスト（またはＰＰＡＲδアゴニストを含む処方物）との組み合わせを送達させることができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７、１９９０；Ｓｅｆｔｏｎ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４、２０１、１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８、５０７、１９８０；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１、５７４、１９８９を参照のこと）。別の実施形態では、ＡＭＰＫアゴニスト（またはＰＰＡＲδアゴニストを含む処方物）を、小胞（特に、リポソーム）中で送達させる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７、１９９０；Ｔｒｅａｔら、ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．３５３−３６５、１９８９を参照のこと）。
【００６３】
さらに別の方法実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせを含む放出制御処方物を送達させることができる。放出制御系（Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７  １９９０）による概説で考察された放出制御系など）が公知である。同様に、放出制御処方物で有用な高分子材料が公知である（例えば、Ｒａｎｇｅｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．ＳｃＬ  Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３、６１、１９８３；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８、１９０、１９８５；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５，３５１、１９８９；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１、１０５、１９８９を参照のこと）。例えば、アゴニストを、化合物の放出制御に有用な生分解性ポリマークラス（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性のブロックコポリマーが含まれる）にカップリングすることができる。
【００６４】
開示の方法は、アゴニストを送達させて所望の結果を達成するＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせ（またはこれを含む処方物）の任意の投薬形態の使用を意図する。投薬形態は一般的に知られており、種々のテキスト（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５、７３８  ｐａｇｅｓが含まれる）で教示されている。開示の方法で用いる投薬形態には、固体投薬形態および固体放出調節薬物送達系（例えば、粉末および顆粒、カプセル、および／または錠剤）；半固体投薬形態および経皮系（例えば、軟膏、クリーム、および／またはゲル）；経皮薬物送達系；薬学的挿入物（例えば、座剤および／または挿入物）；液体投薬形態（例えば、溶液および分散系）；および／または滅菌投薬形態および送達系（例えば、非経口および／または生物学）が含まれるが、これらに限定されない。特定の例示的な投薬形態には、エアゾール（定量、粉末、溶液、および／または噴射剤なしが含まれる）；ビーズ；カプセル（従来の送達制御、放出制御、腸溶コーティング、および／または徐放性のカプセルが含まれる）；カプレット；濃縮物；クリーム；結晶；ディスク（徐放性のディスクが含まれる）；点滴剤；エリキシル；乳濁液；フォーム；ゲル（ゼリーおよび／または徐放性のゲルが含まれる）；球剤；顆粒；ガム；植込錠；吸入；注射；挿入物（延長放出挿入物が含まれる）；リポソーム；液体（放出制御液体が含まれる）；ローション；ロゼンジ；定量（例えば、ポンプ）；ミスト；含嗽剤；噴霧液；視覚系；オイル；軟膏；小卵；粉末（小包、起泡性、懸濁液用粉末、懸濁液を徐放するための粉末、および／または溶液用粉末が含まれる）；ペレット；ペースト；溶液（長期作用性および／または再構成性の溶液が含まれる）；ストリップ；座剤（徐放性座剤が含まれる）；懸濁液（レンテ、ウルトレレンテ、再構成性の懸濁液が含まれる）；シロップ（徐放性シロップが含まれる）；錠剤（咀嚼性、舌下、徐放、放出制御、遅効性、遅延放出、腸溶コーティング、起泡性、フィルムコーティング、即溶性、遅延放出性の錠剤が含まれる）；経皮系；チンキ；および／またはオブラートが含まれる。典型的には、投薬形態は、有効量（治療有効量など）の少なくとも１つの医薬品有効成分（ＡＭＰＫアゴニストまたはＰＰＡＲδアゴニストなど）の薬学的に許容可能な賦形剤および／または他の成分（１つまたは複数の他の有効成分など）との処方物である。薬剤処方の目的は、有効成分（ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせなど）を被験体に適切に投与することである。処方物を投与様式に適合させるべきである。用語「薬学的に許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、動物、より詳細にはヒトで用いる米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。例示的処方物で用いる賦形剤には、例えば、１つまたは複数の以下が含まれる：結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、フレーバー、着色料、防腐剤、希釈剤、アジュバント、および／またはビヒクル。いくつかの例では、賦形剤は、集合的に、特定の投薬形態の総重量（および／または体積）の約５％〜９５％を構成し得る。
【００６５】
薬学的賦形剤は、例えば、滅菌液（水および／または油（石油、動物油、植物湯、または合成起源の油（ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、およびゴマ油など）などが含まれる）など）であり得る。処方物を静脈内投与する場合、水は例示的なキャリアである。生理食塩水、血漿媒質、デキストロース水溶液、およびグリセロール溶液を、特に注射液のための液体キャリアとして使用することもできる。経口処方物には、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどが含まれ得るが、これらに限定されない。非経口薬学的賦形剤についてのより完全な説明を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９５に見出すことができる。賦形剤には、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容可能な塩、液体キャリア（シクロデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミンなど）、親水性薬剤（メチルセルロースなど）、界面活性剤、緩衝液、および防腐剤なども含まれ得る。薬学的賦形剤の他の例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、小麦、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれる。必要に応じて、処方物は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
【００６６】
ＰＰＡＲδアゴニストを使用した投薬計画を、種々の要因（被験体の型、種、年齢、体重、性別、および健康状態；投与経路；および／または使用される特定のＰＰＡＲδアゴニスト処方物が含まれる）にしたがって選択する。通常の技術を有する医師または獣医師は、被験体の運動効果の向上に有用なＰＰＡＲδアゴニスト（またはその処方物）の有効量を容易に決定することができる。
【００６７】
経口投与に関するいくつかの実施形態では、ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせの経口投薬量は、一般に、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日（約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日など）の範囲であろう（他で特定しない限り、有効成分の量は、遊離酸または遊離塩基であり得る中性分子に基づく）。例えば、８０ｋｇの被験体には、約０．０８ｍｇ／日と８ｇ／日との間（約０．８ｍｇ／日と８００ｍｇ／日との間など）を投与するであろう。したがって、１日１回の投与のために適切に調製された医薬は、０．０８ｍｇと８ｇとの間（０．８ｍｇと８００ｍｇとの間など）で含まれるであろう。いくつかの例では、ＡＭＰＫアゴニストのみまたはＰＰＡＲδアゴニストとの組み合わせを含む処方物を、１日に２回、３回、または４回の分割用量で投与することができる。１日２回の投与のために、上記の適切に調節された医薬は、０．０４ｍｇと４ｇとの間（０．４ｍｇと４００ｍｇとの間など）で含まれるであろう。上記範囲外の投薬量がいくつの症例で必要であり得る。０．０８ｍｇ〜８ｇ／日の範囲で投与することができる１日投薬量の例には、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、４ｇ、および８ｇが含まれる。１日に１回を超えて投与する場合、これらの量をより少ない用量に分割することができる（例えば、薬物を１日２回投与する場合、各投与で半分の量）。
【００６８】
注射（例えば、静脈内注射または皮下注射）による投与を含むいくつかの方法実施形態のために、ほぼ上記の量で有効成分が送達される注射量を被験体に注射するであろう。消化器系を迂回する注射薬物形態に起因する送達有効性の相違を占めるために量を調整することができる。かかる量を、多数の適切な方法（例えば、大量の低濃度の有効成分の長期間で１回または１日に数回の投与、低体積で高濃度の有効成分の短期間の投与（例えば、１日１回））で投与することができる。典型的には、約０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、または０．６ｍｇ／ｍｌなど）の濃度の有効成分を含む従来の静脈内処方物を調製し、上記の１日あたりの量に等価の１日あたりの量で投与することができる。例えば、８０ｋｇの被験体に、有効成分濃度が０．５ｍｇ／ｍｌの静脈内処方物８ｍｌを１日２回投与し、それにより、１日あたり８ｍｇの有効成分が投与される。
【００６９】
他の方法実施形態では、ＡＭＰＫアゴニスト（またはその処方物）を、漸増用量のレジメンまたは負荷用量のレジメン（例えば、負荷用量は維持量の約２〜５倍である）において治療期間を通してほぼ同一用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、組成物を投与される被験体の状態、組成物に対する見かけ上の応答、および／または当業者によって判断される他の要因にもとづいて一連のＡＭＰＫアゴニスト処方物の使用中に変化する。いくつかの実施形態では、例えば、運動効果（有酸素性持久力（例えば、走行持久力）など）を持続的に向上させるためのＡＭＰＫアゴニストまたは併用療法（またはその処方物）の長期投与を意図する。
【００７０】
運動訓練した被験体から採取した生物サンプル（例えば、骨格筋生検）中のＺＭＰまたは他の天然に存在しないＡＭＰアナログの存在および／または表２もしくは表４に列挙した分子またはそのサブセットの発現（表２または表４に列挙した少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０の分子の発現など）を決定する工程を含む、運動訓練した被験体における運動能力向上物質の使用を同定する方法も本明細書中に開示する。
【００７１】
運動訓練した被験体における能力向上物質の使用を同定するいくつかの方法では、ＺＭＰまたはＡＭＰアナログの存在を、単独または組み合わせで、（ｉ）発現が、１つまたは複数の（少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３５、または全てなど）脂肪分化関連タンパク質；ステアロイル−補酵素Ａ不飽和化酵素２；アセチル−補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ２；ＡＴＰクエン酸リアーゼ；アディポネクチン（Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有）；ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２；リパーゼ（ホルモン感受性）；モノグリセリドリパーゼ；レジスチン；ＣＤ３６抗原；脂肪酸結合タンパク質４（脂肪細胞）；リポタンパク質リパーゼ；ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１；ＧＰＩアンカー膜タンパク質１；二重特異性ホスファターゼ７；ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ３；インスリン様成長因子結合タンパク質５；タンパク質ホスファターゼ２（以前は２Ａ）、調節サブユニットＡ（ＰＲ６５）（βイソ型）；タンパク質チロシンホスファターゼ様（触媒アルギニンの代わりにプロリン）；メンバーｂ；ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）（α）；核内受容体サブファミリー１、グループＤ、メンバー２（Ｒｅｖｅｒｂ−ｂ）；トランスフェリン；アルチェイン１；溶質輸送体ファミリー１（中性アミノ酸輸送体）（メンバー５）；ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １８１００７３Ｎ０４遺伝子；ハプトグロビン；レチノール結合タンパク質４（血漿）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（細胞質基質）；細胞死誘導性ＤＦＦＡ様エフェクターｃ；インターフェロン、α誘導タンパク質２７；炭酸脱水酵素３；システインジオキシゲナーゼ１（細胞質基質）；ＤＮＡセグメントＣｈｒ４、Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ５３（発現済）；細胞質ダイニン１中間鎖２；クッペル様因子３（塩基性）；甲状腺ホルモン応答性ＳＰＯＴ１４ホモログ（クマネズミ属）；シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーｅ、ポリペプチド１；補体因子Ｄ（アディプシン）；および／またはトランスケトラーゼ中で上方制御されかどうか；および／または（ｉｉ）発現が、１つまたは複数のγ−グルタミルカルボキシラーゼ；３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ１；溶質輸送体ファミリー３８（メンバー４）；アネキシンＡ７；ＣＤ５５抗原；ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ１１９０００２Ｈ２３遺伝子；ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫（ヒト）由来融合物；リソソーム膜糖タンパク質２；および／またはＰｕｎｃＥ１１の隣接物（これらの分子の１、２、３、４、５、６、７、８、または９つなど）中で下方制御されるかどうかを測定するであろう。
【００７２】
運動訓練した被験体における運動能力向上物質使用の例示的な同定方法は、タンパク質発現を決定する工程および／またはタンパク質をコードする遺伝子の発現を決定する工程を含む。かかる方法は、当該分野で日常的である。いくつかの例では、タンパク質または核酸の発現レベルを定量する。被験体において運動能力を向上する可能性を有する薬剤の同定方法も本明細書中に開示する。かかる方法は、（ｉ）ＰＰＡＲδ受容体またはそのＡＭＰＫ結合フラグメントを含む第１の成分を準備する工程；（ｉｉ）ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα２、またはそのいずれかのＰＰＡＲδ結合フラグメントを含む第２の成分を準備する工程；（ｉｉｉ）少なくとも１つの試験薬剤の非存在下で第１の成分および第２の成分が相互に特異的に結合することが可能な条件下で第１の成分および第２の成分を少なくとも１つの試験薬剤と接触させる工程；および（ｉｖ）少なくとも１つの試験薬剤が第１の成分および第２の成分の相互の特異的結合に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含むことができる。第１の成分および第２の成分の相互の特異的結合に及ぼす影響により、被験体において運動能力を向上させる可能性を有する薬剤として少なくとも１つの薬剤が同定される。
【００７３】
特に児童およびプロのアスリートによる運動能力向上物質（ＰＥＳ）の使用が問題になっている。これは、健康に悪影響を与える可能性があり、かかる実施による個体の道徳的発達および全ての公正な運動競技に対する影響に議論の余地があるからである（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｉｔｎｅｓｓ、Ｒｅｇｉｎａｌｄ  Ｌ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＭＤ、Ｃｈａｉｒｐｅｒｓｏｎ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１１５（４）：１１０３−１１０６、２００５）。本明細書中に提供した発見のうちの１つは、一定の遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）が運動と医薬品（ＰＰＡＲδアゴニスト）との組み合わせによって固有に調節され、それにより、身体能力が向上するということである（表２を参照のこと）。いくつかの場合、特定の遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）は、併用治療によって上方制御または下方制御されたが、いずれかの介入のみでは影響をうけなかった。他の場合、特定の遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）は、併用治療に影響をうけなかったが、単独で実施した場合の介入の一方または両方によって上方制御または下方制御された。これらの遺伝子（および／またはコードされるタンパク質）の固有の調節により、これらがＰＥＳを摂取（または投与）される運動している被験体の同定のための有用なマーカー（単独または任意の組み合わせのいずれか）になる。
【００７４】
ＰＥＳは、特に運動能力の改善（例えば、強度、体力、速度、または持久力の増加（仕事量増加）によるか体重または体組成の変化による）のために非薬理学的用量で摂取される任意の物質である。例示的なＰＥＳには、以下が含まれる：（ｉ）推奨される治療用量を超えた用量で摂取されるか、治療指標が存在しない場合に摂取される局方薬（処方箋薬または非処方箋薬）（例えば、刺激効果を得るための鬱血除去薬の使用、運動誘導性気管支痙攣が存在しない場合の気管支拡張薬の使用、運動競技のための基準塩酸メチルフェニデート用量の増加）；（ｉｉ）使用者が体重別階級のあるスポーツに属するか、痩身によって報酬を受ける場合に体重管理のために使用される薬剤（刺激薬、痩せ薬、利尿薬、および緩下薬が含まれる）；（ｉｉｉ）体重増加のために使用される薬剤（筋肉量増加を促進すると宣伝される市販薬が含まれる）；（ｉｖ）酸素運搬能の向上のために使用される生理学的薬剤または他のストラテジー（エリスロポエチンおよび赤血球輸血（血液ドーピング）が含まれる）；（ｖ）報告された病状または欠損症の治療以外の理由のために使用される任意の物質；（ｖｉ）別の運動能力向上物質の副作用または検出性をマスキングすることが公知の任意の物質、および／または（ｖｉｉ）生理学的用量を超える用量または病状、訓練、および／またはスポーツへの参加によって生じる欠陥を回復させるために必要なレベルよりも高いレベルで摂取される栄養補給剤。１つの例では、ＰＥＳは、ＡＭＰＫアゴニスト（例えば、ＭＰアナログを提供するもの）またはＧＷ１５１６と同様である。
【００７５】
例えば、血清などの体液サンプル中のＡＩＣＡＲなどのＡＭＰＫアゴニストレベルを定量するために、高感度のＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを使用することができる。本アッセイは、内部標準としてＡＭＰＫアクチベーターと構造が関連するアナログを使用する。例えば、アデノシンアナログであるツベルシジン（４−アミノ−７−β−Ｄ−リボフラノシル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｎｄｉｎｅ）；７−β−Ｄ−リボウラノシル（ｒｉｂｕｒｕａｎｏｓｙｌ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン；７−デアザアデノシン）は、ＡＩＣＡＲと構造的に関連し、ＡＩＣＡＲをアッセイする場合の内部標準として使用することができる。既知濃度の内部標準を含むサンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって直接分析することができる。目的の物質および内部標準を、例えば、溶媒または酸性化溶媒の勾配を使用した疎水性カラムを使用した（ｓｕｉｎｇ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）システムによって分離し、選択的反応モニタリングを使用して陽イオンとして検出することができる。当該分野で公知の他の分析器および検出方法を使用することができる。アゴニスト添加血清を使用して構築した１、２、３、または４桁にわたる検量線を、ＡＩＣＡＲレベルの定量を容易にするために構築することができる。
【００７６】
本明細書中で同定され、且つ開示の方法で有用な物質誘導能力のバイオマーカーには、１つまたは複数（またはその任意の組み合わせ）のＡＭＰアナログまたは表２およびいくつかの例では表４に列挙された遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）が含まれる。特定の方法実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも４０個の表２（または表４）に列挙の遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）を、開示の方法で検出する。１つの例では、表２に列挙の各クラス（例えば、サイトカイン、脂肪代謝）由来の少なくとも１つの遺伝子（および／またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質）を分析する。
【００７７】
１つの実施形態では、発現の上方制御を、１つまたは複数の以下の遺伝子（またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質）について検出する：脂肪分化関連タンパク質；ステアロイル−補酵素Ａ不飽和化酵素２；アセチル−補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ２；ＡＴＰクエン酸リアーゼ；アディポネクチン（Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有）；ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２；リパーゼ（ホルモン感受性）；モノグリセリドリパーゼ；レジスチン；ＣＤ３６抗原；脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞；リポタンパク質リパーゼ；ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１；ＧＰＩアンカー膜タンパク質１；二重特異性ホスファターゼ７；ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ３；インスリン様成長因子結合タンパク質５；タンパク質ホスファターゼ２（以前は２Ａ）、調節サブユニットＡ（ＰＲ６５）（βイソ型）；タンパク質チロシンホスファターゼ様（触媒アルギニンの代わりにプロリン）；メンバーｂ；ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）（α）；核内受容体サブファミリー１、グループＤ、メンバー２（Ｒｅｖｅｒｂ−ｂ）；トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）；アルチェイン１；溶質輸送体ファミリー１（中性アミノ酸輸送体）（メンバー５）；ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １８１００７３Ｎ０４遺伝子；ハプトグロビン；レチノール結合タンパク質４（血漿）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（細胞質基質）；細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターｃ；インターフェロン、α誘導タンパク質２７；炭酸脱水酵素３；システインジオキシゲナーゼ１（細胞質基質）；ＤＮＡセグメントＣｈｒ４、Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ５３（発現済）；細胞質ダイニン１中間鎖２；クッペル様因子３（塩基性）；甲状腺ホルモン応答性ＳＰ０Ｔ１４ホモログ（クマネズミ属）；シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーｅ、ポリペプチド１；補体因子Ｄ（アディプシン）；および／またはトランスケトラーゼ。特定の方法実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも３８個の上記遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）の上方制御を開示の方法で検出する。他の方法実施形態では、１つまたは複数の以下の遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）における発現の下方制御を検出する：γ−グルタミルカルボキシラーゼ；３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ１；溶質輸送体ファミリー３８（メンバー４）；アネキシンＡ７；ＣＤ５５抗原；ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ１１９０００２Ｈ２３遺伝子；ｔ（１２；１６）悪性脂肪肉腫（ヒト）由来融合物；リソソーム膜糖タンパク質２；および／またはＰｕｎｃＥ１１の隣接物。特定の方法実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、または少なくとも７個の上記遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）の下方制御を、開示の方法で検出する。
【００７８】
さらに他の方法実施形態では、被験体（運動した被験体または運動訓練した被験体など）由来のサンプル中の上記の上方制御された遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）と下方制御された遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）との組み合わせを検出する。
【００７９】
さらに他の方法実施形態は、サンプル中のＡＭＰアナログ（例えば、ＺＭＰ）と１つまたは複数の上記上方制御された遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）および／または上記下方制御された遺伝子（および／またはこの遺伝子よってコードされるタンパク質）、および／またはＰＰＡＲδ投与と組み合わせた運動による影響を受けない上記運動制御された遺伝子との組み合わせの検出を含む。
【００８０】
開示の方法を、１つまたは複数のかかるＰＥＳを摂取または投与することができる任意の被験体におけるＰＥＳ使用の検出のために使用することができる。いくつかの方法実施形態では、被験体は、生きている多細胞脊椎動物生物（例えば、ヒトおよび／または非ヒト動物）である。他の例示的方法では、被験体は、哺乳動物（ヒトおよび／または非ヒト哺乳動物が含まれる）であるか、さらに特定の例では、競技哺乳動物（ウマ、イヌ、またはヒトなど）である。さらに他の方法では、被験体は運動訓練した被験体である。いくつかの代表的な運動訓練被験体は、身体活動（上記に詳述）を少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも３ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間行った。他の運動訓練した被験体は、学生アスリートおよび／またはプロのアスリート（いくつかの例では、非ヒトのプロアスリート（競争馬および／またはドッグレースのイヌなど）が含まれる）であり得る。
【００８１】
ＡＭＰアナログおよび／またはＰＰＡＲδアゴニスト取り込みと組み合わせた運動によって固有に調節される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質を検出することができる被験体の由来の任意のサンプル（例えば、生物サンプル）（本明細書全体に詳述）は、開示の方法での使用が意図される。開示の方法で用いる例示的サンプルには、血液、唾液、尿、筋肉生検（例えば、骨格筋生検）、口腔粘膜検体、糞サンプル、汗、および／または血清が含まれる。
【００８２】
サンプル（例えば、生物サンプル）中の遺伝子および／またはタンパク質の発現を検出する方法は周知である（例えば、米国特許第６，９１１，３０７号；同第６，８９３，８２４号；同第５，９７２，６９２号；同第５，９７２，６０２号；同第５，７７６，６７２号；同第７，０３１，８４７号；同第６，８１６，７９０号；同第６，８１１，９７７号；同第６，８０６，０４９号；同第６，２０３，９８８号；および／または同第６，０９０，５５６号を参照のこと）。特定の実施形態では、本明細書中で同定された１つまたは複数の遺伝子の発現を、任意の核酸増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその任意の適応法、リガーゼ連鎖反応、転写ベースの増幅システム、サイクリングプローブ反応、Ｑβレプリカーゼ増幅、鎖置換増幅、および／またはローリングサークル増幅など）、固体表面ハイブリッド形成アッセイ（ノーザンブロット、ドットブロット、遺伝子チップ、および／または可逆的標的捕捉など）、溶液ハイブリッド形成アッセイ（ＭＡＰテクノロジー（個別のスペクトルアドレスを割り当てるために、異なる比率の２つのスペクトルの異なるフルオロフォアでそれぞれ内部染色された、１００セットの５．５ミクロンプローブ抱合ビーズの懸濁液アレイを使用する）など）、および／またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によって検出することができる。上記の種々の核酸検出方法は、Ｗｏｌｃｏｔｔ（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５（４）：３７０−３８６、１９９２）による概説に詳述されている。いくつかのかかる核酸検出方法を実施するための他の詳述され、且つ伝統のあるプロトコールは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２（ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２０００）；および／またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９で見出される。
【００８３】
他の実施形態では、本明細書中で同定された対応する遺伝子によってコードされる１つまたは複数のタンパク質の発現を、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫沈降、抗体マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、および／または機能アッセイ（例えば、キナーゼアッセイ、ＡＴＰアーゼアッセイ、基質（またはリガンド）結合アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、または特定のタンパク質機能の測定に適切な他のアッセイ）によって検出することができる。
【００８４】
試験被験体において同定された発現パターンが表２に示す発現パターンに類似する場合（例えば、表２中で上方制御および下方制御と示した遺伝子が被験体においてそれぞれ上方制御および下方制御されることが認められる場合）、これは被験体がＰＥＳ（ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）など）を摂取することを示す。対照的に、試験被験体において同定された発現パターンが表２に示す発現パターンと異なる場合（例えば、表２中で上方制御および下方制御と示した遺伝子が被験体において異なって発現されないか、異なる調節パターンを示す場合）、これは被験体がＰＥＳ（ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）など）を摂取していないことを示す。
【００８５】
本開示は、ＰＰＡＲδと特定の運動誘導性キナーゼ（例えば、ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫのＡＭＰＫα１サブユニットおよび／またはＡＭＰＫα２サブユニットなど））との間の以前に知られていなかったタンパク質−タンパク質相互作用を同定する。ＰＰＡＲδとＡＭＰＫとの間の相互作用は、被験体の運動能力の向上（例えば、走行持久力などの有酸素運動能力）などの重要な機能的結果を有し得る。
【００８６】
上記の発見により、例えば、被験体の運動能力（例えば、有酸素運動能力（走行持久力など））を向上させる可能性を有する薬剤の同定方法が実施可能である。いくつかのかかる方法では、タンパク質−タンパク質相互作用に影響を及ぼす（例えば、向上させる、弱める、または実質的に破壊する）薬剤を同定する。他のかかる方法では、ＰＰＡＲδ複合体のＡＭＰＫ依存性リン酸化に影響を及ぼす（例えば、増加させる、減少させる、または実質的に消失させる）薬剤を同定する。
【００８７】
「薬剤」は、目的または結果の達成に有用な任意の物質または物質の任意の組み合わせ（例えば、ＡＭＰＫ活性化カスケード（例えば、ＰＰＡＲδ複合体のＡＭＰＫ依存性リン酸化）に関連するタンパク質活性の調整に有用な物質または物質の組み合わせ）またはタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＰＰＡＲδ−ＡＭＰＫ相互作用）またはＡＴＰ代謝の調整または影響に有用な任意の物質または物質の任意の組み合わせである。本明細書中に開示のＰＰＡＲδ−ＡＭＰＫ相互作用の任意の態様を調整する可能性を有する（最終的に認識されるかどうかは問わず）任意の薬剤は、本開示のスクリーニング方法での使用が意図される。
【００８８】
例示的な薬剤には、ペプチド（例えば、可溶性ペプチド（ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２−８４、１９９１；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８６、１９９１を参照のこと）が含まれるが、これに限定されない）、Ｄ型および／またはＬ型アミノ酸から作製されたコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリー、リンペプチド（無作為または部分的に縮重する定方向リンペプチドライブラリー（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ、７２：７６７−７７８、１９９３を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）など）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびにそのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない）、有機小分子または無機小分子（いわゆる天然生成物または化学コンビナトリアルライブラリーのメンバーなど）、分子複合体（タンパク質複合体など）、または核酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
開示の方法で有用なライブラリー（コンビナトリアルケミカルライブラリーなど）には、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、３７：４８７−４９３、１９９１；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８８、１９９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５号を参照のこと）、コードされたペプチド（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ディバーソマー（ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３、１９９３）など）、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１１４：６５６８、１９９２）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１１４：９２１７−９２１８、１９９２）、小化合物ライブラリーの類似の有機合成物（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１１６：２５６１、１９９４）、オリゴカルバマート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３、１００３）、および／またはペプチジルホスホナート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５９：６５８、１９９４）、核酸ライブラリー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、１９８９を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４：３０９−３１４、１９９６；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２、１９９６；米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、および有機小分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ、Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ  １８、ｐａｇｅ  ３３、１９９３；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジオノンおよびメタチアゾン、米国特許第５，５４９，９７４；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、同第５，２８８，５１４号を参照のこと）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
開示のスクリーニング方法に有用なライブラリーを、種々の様式（空間的にアラインメントされたマルチピンペプチド合成（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１（１３）：３９９８−４００２、１９８４）、「ティーバッグ」ペプチド合成（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２（１５）：５１３１−５１３５、１９８５）、ファージディスプレイ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０、１９９０）、スポットまたはディスク合成（Ｄｉｔｔｒｉｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８（１７）：２３５１−２３５６、１９９８）、またはビーズ上での分割および混合固相合成（Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３７（６）：４８７−４９３、１９９１；Ｌａｍら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９７（２）：４１１−４４８、１９９７）が含まれるが、これらに限定されない）で産生することができる。ライブラリーは、種々の数の組成物（メンバー）（約１００メンバーまで、約１０００メンバーまで、約５０００メンバーまで、約１０，０００メンバーまで、約１００，０００メンバーまで、約５００，０００メンバーまで、またはさらに５００，０００メンバー超など）を含むことができる。
【００９１】
１つの実施形態では、高処理スクリーニング法は、多数の潜在的な治療化合物（例えば、ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδタンパク質−タンパク質相互作用の影響因子）を含むコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはペプチドライブラリーを準備する工程を含む。次いで、かかるコンビナトリアルライブラリーを、本明細書中に記載の１つまたは複数のアッセイでスクリーニングして、所望の特徴的な活性（ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδタンパク質−タンパク質相互作用の増加または減少など）を示すライブラリーメンバー（特に、化学種または化学サブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」としての機能を果たすことができるか、これらの化合物自体を潜在的または実際の治療薬として使用することができる。いくつかの例では、候補薬剤のプールを同定し、さらにスクリーニングして、集団中のどの各薬剤またはサブプールが所望の活性を有するのかを決定することができる。ＰＰＡＲδは、ＡＭＰＫまたは１つまたは複数のそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する。ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ相互作用またはＰＰＡＲδ複合体のＡＭＰ依存性リン酸化に影響を及ぼす（例えば、増加または減少させる）薬剤は、被験体の運動能力（例えば、走行持久力などの有酸素運動能力）を向上させる効果を有することができ、したがって、同定が望ましい。
【００９２】
本明細書中に記載のスクリーニング法では、組織サンプル、単離細胞、単離ポリペプチド、および／または試験薬剤は、高処理スクリーニングに適切な様式で存在することができる。例えば、１つまたは複数の単離組織サンプル、単離細胞、または単離ポリペプチドを、マイクロタイターのウェルに挿入することができ、１つまたは複数の試験薬剤をマイクロタイタープレートの壁に添加することができる。あるいは、１つまたは複数の試験薬剤を高処理形式でマイクロタイタープレートのウェル中などに存在させ（溶液中に存在させるか、プレート表面に接着させ）、１つまたは複数の単離組織サンプル、単離細胞、および／または単離ポリペプチドと少なくとも組織サンプルもしくは単離細胞または所望のポリペプチドの機能および／または構造を保持する条件下で接触させることができる。試験薬剤を、組織または細胞に致命的でないか、ポリペプチドの構造および／または機能に悪影響を及ぼさない任意の濃度で組織サンプル、単離細胞、または単離ポリペプチドに添加することができる。試験薬剤が異なれば有効濃度も異なると予想される。したがって、いくつかの方法では、試験薬物の濃度範囲を試験することが有利である。
【００９３】
開示の方法は、必要に応じて、独立して、被験体、１つまたは複数の細胞または細胞抽出物、１つまたは複数の組織または組織抽出物中に含まれるか、単離ポリペプチドとしてのＰＰＡＲδまたはＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫｃｃ２など）または任意のこれらの機能的フラグメントの使用を構想する。ＰＰＡＲδリガンドは、任意選択的に開示の方法に開示の方法に含まれる（または省略される）。
【００９４】
２つ以上のポリペプチド（ＰＰＡＲδおよびＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫα２など）など）の間の「直接的会合」を、例えば、一方のポリペプチドの免疫沈降によっても他方のポリペプチドを特異的に沈降させるのに十分な親和性および特異性を示す相互作用ポリペプチドの少なくとも一部の間での物理的接触によって特徴づける（但し、免疫沈降抗体が相互作用に関与する部位にも影響を及ぼさないこと）。ポリペプチドの間の直接会合を、「タンパク質−タンパク質相互作用」ということもできる。タンパク質−タンパク質相互作用における一方のポリペプチドの他方への結合（例えば、ＰＰＡＲδのＡＭＰＫ（またはＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）への結合およびその逆）を、「特異的結合」と見なす。ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ相互作用に影響を及ぼす薬剤を、種々のアッセイ（固相または溶液ベースのアッセイが含まれる）によって同定することができる。例示的な固相アッセイでは、ＰＰＡＲδまたはそのＡＭＰＫ結合フラグメントおよびＡＭＰＫまたはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）またはそのＰＰＡＲδ結合フラグメントを、ＰＰＡＲδおよびＡＭＰＫ（またはそのサブユニットまたは機能的フラグメント）が正常に相互作用する（例えば、免疫共沈降する）条件下で混合する。結合パートナーの１つを、標識した成分が容易に検出されるようにビオチン、フルオレセイン、ＥＧＦＰ、または酵素などのマーカーで標識する。非標識結合パートナーを支持体（マイクロタイターウェルまたはビーズなど）に吸着させる。次いで、標識した結合パートナーを、２つの結合パートナーの間の相互作用に適切な条件下で非標識結合パートナーが固定される環境に添加する。１つまたは複数の試験化合物（１つまたは複数の上記ライブラリー中の化合物など）を、相互作用結合パートナーを含む各微小環境に個別に添加する。結合パートナー間の相互作用に影響を及ぼすことができる薬剤を、例えば、反応微小環境中（例えば、マイクロタイターウェル中またはビーズ上）でシグナル（すなわち、標識された結合パートナー）の保持時間または結合を増加または減少する（例えば、増加する）薬剤として同定する。前に考察するように、薬剤の組み合わせを最初のスクリーニングで評価して、個別に試験すべき薬剤のプールを同定することができ、この過程は現在利用可能なテクノロジーを使用して容易に自動化される。
【００９５】
他の実施形態では、液相選択を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用に特異的に影響を及ぼす薬剤について巨大な複合体ライブラリーをスクリーニングすることができる（例えば、Ｂｏｇｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８（１７）：２３３９−２３４４、１９９８）；Ｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（６）：３８３０−３８３５、２００２を参照のこと）。１つのかかる例では、物理的相互作用（例えば、ＰＰＡＲδ（またはそのＡＭＰＫ結合フラグメント）とＡＭＰＫまたはＡＭＰＫα１もしくはＡＭＰＫα２（または任意のそのＰＰＡＲδ結合フラグメント））が可能な２つの各タンパク質を、異なる発光スペクトルおよび重複吸収スペクトルを有する蛍光色素分子タグで標識する。これらのタンパク質成分が個別である場合、各成分の発光スペクトルは異なり、これを測定することができる。タンパク質成分が相互作用する場合、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により、光子放出せずにドナー色素分子からアクセプター色素分子へのエネルギーの移動が起こる。アクセプター色素分子のみで、特徴的な波長の光子（光）を放出する。したがって、ＦＲＥＴにより、サンプルの発光スペクトルに基づいて２つの相互作用分子の動態学を決定することが可能である。このシステムを使用して、２つの標識したタンパク質成分を、これらが相互作用してＦＲＥＴ発光スペクトルが得られる条件下で添加する。次いで、１つまたは複数の試験化合物（１つまたは複数の上記ライブラリー中の化合物など）を、２つの標識されたタンパク質成分混合物の環境に添加し、発光スペクトルを測定する。分離した成分の発光スペクトルの減少を伴うＦＲＥＴ放出の増加は、薬剤（または候補薬剤のプール）がタンパク質成分間の相互作用に影響を及ぼした（例えば、向上させた）ことを示す。
【００９６】
ＰＰＡＲδ（またはそのＡＭＰＫ結合フラグメント）とＡＭＰＫまたはＡＭＰＫα１もしくはＡＭＰＫα２（または任意のそのＰＰＡＲδ結合フラグメント）との間の相互作用を、関連成分ポリペプチド（例えば、細胞抽出物由来）の免疫共沈降、ＧＳＴ−プルダウンアッセイ（例えば、精製したＧＳＴタグ化細菌タンパク質を使用）、および／または酵母ツーハイブリッドアッセイ（各方法は当該分野で標準である）によって決定する（例えば、定量する）こともできる。試験化合物の存在下および任意選択的で非存在下での１つまたは複数のかかるアッセイのいずれかを使用して、試験化合物の非存在下またはいくつかの他の標準もしくはコントロールと比較して試験化合物の存在下でＰＰＡＲδ（またはそのＡＭＰＫ結合フラグメント）とＡＭＰＫまたはＡＭＰＫα１もしくはＡＭＰＫα２（または任意のそのＰＰＡＲδ結合フラグメント）との間の相互作用を改善または向上させる（または、他の実施形態では、減少または阻害する）薬剤を同定することができる。
【００９７】
一定の実施形態では、ＰＰＡＲδの１つまたは複数のＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）結合フラグメントおよび／またはＡＭＰＫの１つまたは複数のＰＰＡＲδ結合フラグメント（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）を使用する。所望の結合活性を有するポリペプチドフラグメントを、当該分野で標準的な方法を使用した一連の定義のＰＰＡＲδフラグメントおよび／またはＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１またはＡＭＰＫα２など）フラグメントの作製によって同定することができる。例えば、目的のタンパク質（例えば、ＰＰＡＲδまたはＡＭＰＫ）をコードするｃＤＮＡを、都合よく存在する制限酵素部位（または他の方法）を使用して３’末端または５’末端から連続的に短縮し（但し、開始コドンを５’短縮物中に操作する）、適切な読み取り枠をインタクトなままにする（そうでなければ矯正する）ことができる。便宜上、エピトープタグ（ＦＬＡＧタグなど）をコードする核酸を、短縮タンパク質コード配列と共にインフレームで（且つ実質的に隣接して）配置して、エピトープタグ化タンパク質フラグメントをコードする核酸配列を産生する。エピトープタグ化タンパク質フラグメントを、任意の従来の発現系（細菌発現系など）で発現させ、単離するかせず、エピトープタグ化タンパク質フラグメントが結合することができるタンパク質または他のタンパク質フラグメントを含むサンプルと混合することができる。タグ（またはタンパク質フラグメント他の領域）に特異的な抗体を使用して、目的のフラグメントに結合する任意のタンパク質またはタンパク質フラグメントと共に目的のフラグメントを免疫沈降することができる。目的のエピトープタグ化タンパク質フラグメントに結合するタンパク質またはタンパク質フラグメントを、特に、例えば、ウェスタンブロットによって同定することができる。
【００９８】
特定の方法では、ＰＰＡＲδ−ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）複合体（ＰＰＡＲδ結合ＡＭＰＫフラグメントおよび／またはＡＭＰＫ結合ＰＰＡＲδフラグメントの一方または両方を含む複合体が含まれる）の形成またはＰＰＡＲδ（またはそのＡＭＰ結合フラグメント）およびＡＭＰＫ（またはそのＰＰＡＲδ結合フラグメント）の相互の親和性は、かかる複合体または結合親和性の量がコントロール測定値（例えば、試験薬剤の添加前の同一の試験系または試験薬剤の非存在下での類似の試験系における）よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２５０％高い場合に増加する。他の特定の方法では、ＰＰＡＲδ−ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）複合体（ＰＰＡＲδ結合ＡＭＰＫフラグメントおよび／またはＡＭＰＫ結合ＰＰＡＲδフラグメントの一方または両方を含む複合体が含まれる）の形成またはＰＰＡＲδ（またはそのＡＭＰＫ結合フラグメント）およびＡＭＰＫ（またはそのＰＰＡＲδ結合フラグメント）の相互の親和性は、かかる複合体または結合親和性の量がコントロール測定値（例えば、試験薬剤の添加前の同一の試験系または試験薬剤の非存在下での類似の試験系における）よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２５０％低い場合に減少する。
【００９９】
ＰＰＡＲδ複合体のＡＭＰＫ（例えば、ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）依存性リン酸化に影響を及ぼす（例えば、増加または減少させる）試験薬剤について試験薬剤をスクリーニングする方法を開示する。ＰＰＡＲδ複合体のＡＭＰＫ依存性リン酸化に影響を及ぼす薬剤を、種々のアッセイ（上記の固相または液体ベースのアッセイのかかる適応（検出すべき終点がＰＰＡＲδ複合体の１つまたは複数の成分のリン酸化である場合））によって同定することができる。
【０１００】
タンパク質リン酸化の検出方法は従来の検出方法であり（例えば、Ｇｌｏｆｆｋｅ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、１６（１９）：５２、２００２；Ｓｃｒｅａｔｏｎら、Ｃｅｌｌ、１１９：６１−７４、２００４を参照のこと）、検出キットは種々の商業的供給者から利用可能である（例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ、ＵＳＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｍａｒｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を参照のこと）。簡潔に述べれば、リン酸化タンパク質（例えば、ＰＰＡＲδ複合体の１つまたは複数の成分のリン酸化）を、ゲル中のリン酸化タンパク質に特異的な色素を使用して検出することができる。あるいは、抗体特異的リン酸化タンパク質を作製するか購入することができる。リン酸化タンパク質に特異的な抗体を、特に、ビーズ（特定の色特性を有するビーズが含まれる）に係留するか、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットアッセイで使用することができる。
【０１０１】
１つの例では、ＰＰＡＲδ複合体（またはＡＭＰＫリン酸化部位を含むそのフラグメント）およびＡＭＰＫまたは１つまたは複数のそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）またはリン酸化することができるその機能的フラグメントを、ＰＰＡＲδ複合体がＡＭＰＫによってリン酸化される条件下で混合する。ＰＰＡＲδ複合体を、支持体（マイクロタイターウェルまたはビーズなど）に吸着させる。次いで、ＡＭＰＫ（またはその１つまたは複数のサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫｃｃ２など）またはそのリン酸化可能なフラグメント）を、複合体が固定される環境に添加する。典型的には、リン酸ドナーもこの環境に含める。任意選択的に、供与すべきリン酸塩を標識することができる。１つまたは複数の試験化合物（１つまたは複数の上記ライブラリー中の化合物など）を、各微小環境に個別に添加する。ＡＭＰＫ依存性リン酸化に影響を及ぼすことができる薬剤を、例えば、固定化したＰＰＡＲδ複合体のリン酸化を向上する（または阻害する）薬剤として同定する。標識したリン酸ドナーに関する実施形態では、固定化したＰＰＡＲδ複合体のリン酸化を、例えば、反応微小環境中（例えば、マイクロタイターウェル中またはビーズ上）での標識したリン酸塩の保持時間または結合によって決定することができる。他の実施形態では、かかる反応は溶液中で（すなわち、固定された成分を含まない）起こり得、ＰＰＡＲδ複合体を、（例えば、ＰＰＡＲδ特異的抗体またはリン酸特異的抗体との免疫沈降）および以前に考察のように決定した１つまたは複数の試験化合物の存在下（任意選択的に、非存在下）でのそのリン酸化レベルによって）溶液から単離することができる。さらに別の実施形態では、ＡＭＰＫのリン酸化を測定し、したがって、ＡＭＰＫ活性を調整する薬剤がＡＭＰＫアゴニストとして同定される。
【０１０２】
特定の方法では、ＰＰＡＲδ複合体のリン酸化は、かかる翻訳後修飾が検出可能に測定されるか、かかる翻訳後修飾がコントロール測定値（例えば、試験薬剤の添加前の同一の試験系、試験薬剤の非存在下での類似の試験系、またはＡＭＰＫの非存在下での類似の試験系における）よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２５０％高い場合に増加する。
【０１０３】
特定の方法では、ＰＰＡＲδ複合体のリン酸化は、かかる翻訳後修飾が検出可能に測定されるか、かかる翻訳後修飾がコントロール測定値（例えば、試験薬剤の添加前の同一の試験系、試験薬剤の非存在下での類似の試験系、またはＡＭＰＫの非存在下での類似の試験系における）よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２５０％低い場合に減少する。
【０１０４】
開示のスクリーニング法で有用なＰＰＡＲδポリペプチドは、任意の公知のＰＰＡＲδ受容体である。プロトタイプＰＰＡＲδポリペプチドの本明細書中に記載の少なくともＡＭＰＫ結合活性を保持するＰＰＡＲδのホモログ、機能的フラグメント、または機能的バリアントも開示のスクリーニング方法で有用である（実施例６を参照のこと）。プロトタイプＰＰＡＲδポリペプチドのアミノ酸配列（およびＰＰＡＲδコード核酸配列）は周知である。例示的なＰＰＡＲδアミノ酸配列およびＰＰＡＲδコード核酸配列は、例えば、米国特許第５，８６１，２７４号、米国特許出願公開第２００６０１５４３３５号（それぞれ、本明細書中で参考として明確に援用される）、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３５２７５（ＧＩ：３３８５９５９０）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓアミノ酸配列）；ＮＭ＿０１１１４５．３（ＧＩ：８９００１１１２）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ核酸配列）；ＮＰ＿００６２２９（ＧＩ：５４５３９４０）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアミノ酸配列）；ＮＭ＿００６２３８．３（ＧＩ：８９８８６４５４）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ核酸配列）；ＮＰ＿０３７２７３（ＧＩ：６９Ｓ１３Ｓ４）（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓアミノ酸配列）；ＮＭ＿０１３１４１．１（ＧＬ６９８１３８３）（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ核酸配列）；ＮＰ＿９９００５９（ｇｉ４５３８２０２５）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓアミノ酸配列）、またはＮＭ＿２０４７２８．１（ＧＩ：４５３８２０２４）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ核酸配列）に記載されている。いくつかの方法実施形態では、ＰＰＡＲδホモログまたは機能的バリアントは、プロトタイプＰＰＡＲδポリペプチドと少なくとも６０％のアミノ酸配列が同一である。例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列が以下に記載のアミノ酸配列と同一である：米国特許第５，８６１，２７４号、米国特許出願公開第２００６０１５４３３５号、またはＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３５２７５（ＧＩ：３３８５９５９０）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓアミノ酸配列）；ＮＰ＿００６２２９（ＧＩ：５４５３９４０）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアミノ酸配列）；ＮＰ＿０３７２７３（ＧＩ．６９＄１３＄４）（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓアミノ酸配列）；またはＮＰ＿９９００５９（ｇｉ４５３８２０２５）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓアミノ酸配列）。他の方法実施形態では、ＰＰＡＲδホモログまたは機能的バリアントは、プロトタイプＰＰＡＲδポリペプチドと比較した場合に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する。例えば、以下に記載のアミノ酸配列と比較してわずか３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０のアミノ酸が保存的に変化する：米国特許第５，８６１，２７４号、米国特許出願公開第２００６０１５４３３５号、またはＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３５２７５（ＧＩ：３３８５９５９０）（Ｍ＊＊＊未知：＊＊＊ｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓアミノ酸配列）；ＮＰ＿００６２２９（ＧＩ：５４５３９４０）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアミノ酸配列）；ＮＰ＿０３７２７３（��Ｉ．６９＄１３＄４）（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓアミノ酸配列）；またはＮＰ＿９９００５９（ｇｉ４５３８２０２５）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓアミノ酸配列）。
【０１０５】
いくつかの方法実施形態は、ＰＰＡＲδ機能的フラグメント（ＡＭＰＫ結合フラグメントなど）を含み、このフラグメントは、公知の全長ＰＰＡＲδポリペプチドの任意の部分（例えば、その約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１５０、または約２００個の連続するアミノ酸残基が含まれる）であり得る（但し、このフラグメントが目的のＰＰＡＲδ機能（例えば、ＡＭＰＫ結合）を保持する場合）。ＰＰＡＲδは公知の機能的モチーフ（リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメインなど）を含む。
【０１０６】
哺乳動物ＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、１αサブユニット、１βサブユニット、および１γサブユニットからなるヘテロ三量体タンパク質である。少なくとも２つの公知のαサブユニットのイソ型（α１およびα２）が存在する。ＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２は、その触媒コア内の９０％のアミノ酸配列が同一であるが、そのＣ末端テール中はたった６１％である（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）データベース受入番号６０２７３９；以下のウェブサイトで公的に入手可能：ｎｃｂｉ  ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｄｉｓｐｏｍｉｍ．ｃｇｉ？ｉｄ＝６０２７３９を参照のこと）。
【０１０７】
開示のスクリーニング方法で有用なＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）ポリペプチドは、任意の公知のＡＭＰＫタンパク質またはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）である。少なくとも本明細書中に記載のＰＰＡＲδ結合活性を保持するＡＭＰＫタンパク質またはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）のホモログ、機能的フラグメント、または機能的バリアントも開示のスクリーニング方法で有用である（実施例６を参照のこと）。プロトタイプＡＭＰＫサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）のアミノ酸配列（およびプロトタイプＡＭＰＫサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）をコードする核酸配列）は周知である。例示的なＡＭＰＫα１のアミノ酸配列および対応する核酸配列は、例えば、以下に記載されている：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿２０６９０７．３（ＧＩ：９４５５７２９８）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ転写バリアント２ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；ＮＭ  ００６２５１．５（ＧＩ：９４５５７３００）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ転写バリアント１  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；ＮＭ＿００１０１３３６７．３（ＧＩ：９４６８１０６０）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；ＮＭＪ）０１０３９６０３．１（ＧＩ：８８８５３８４４）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；およびＮＭ＿０１９１４２．１（ＧＩ：１１８６２９７９ＸＲａＪｆＷＳ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））。例示的なＡＭＰＫα２のアミノ酸配列および対応する核酸配列は、例えば、以下に記載されている：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６２５２．２（ＧＩ：４６８７７０６７）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；ＮＭ＿１７８１４３．１（ＧＩ：５４７９２０８５）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；ＮＭ＿００１０３９６０５．１（ＧＩ：８８８５３８５０）（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））；およびＮＭ＿２１４２６６．１（ＧＩ：４７５２３５９７）（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＥＦＳＥＱ（アミノ酸配列および核酸配列が含まれる））。
【０１０８】
いくつかの方法実施形態では、ＡＭＰＫサブユニットのホモログまたは機能的バリアントは、プロトタイプＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２ポリペプチドと少なくとも６０％のアミノ酸配列が同一である；例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列が以下に記載のアミノ酸配列と同一である：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿２０６９０７．３；ＮＭ＿００６２５１．５；ＮＭＪ）０１０１３３６７．３；ＮＭ＿００１０３９６０３．１；ＮＭ＿０１９１４２．１；ＮＭ＿０００６２５２．２；ＮＭ＿１７８１４３．１；ＮＭ＿００１０３９６０５．１；またはＮＭ  ２１４２６６．１。他の方法実施形態では、ＡＭＰＫサブユニットのホモログまたは機能的バリアントは、プロトタイプＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２ポリペプチドと比較した場合に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する。例えば、以下に記載のアミノ酸配列と比較してわずか３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０のアミノ酸が保存的に変化する：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿２０６９０７．３；ＮＭ＿００６２５１．５；ＮＭ＿００１０１３３６７．３；ＮＭ＿００１０３９６０３．１；ＮＭ＿０１９１４２．１；ＮＭ＿００６２５２．２；ＮＭ＿１７８１４３．１；ＮＭ＿００１０３９６０５．１；またはＮＭ  ２１４２６６．１。例示的な保存的アミノ酸置換を、前述している。
【０１０９】
いくつかの方法実施形態は、ＡＭＰＫまたはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）の機能的フラグメント（ＰＰＡＲδ結合フラグメントまたはＰＰＡＲδリン酸化活性を有するフラグメントが含まれる）を含む。ＡＭＰＫまたはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）の機能的フラグメントは、全長またはインタクトなＡＭＰＫポリペプチド複合体またはそのサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）の任意の部分（例えば、その約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１５０、または約２００個の連続するアミノ酸残基が含まれる）であり得る（但し、このフラグメントが目的の少なくとも１つの目的のＡＭＰＫ（またはＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２）機能（例えば、ＰＰＡＲδ結合および／またはＰＰＡＲδリン酸化活性）を保持する場合）。ＰＰＡＲδとＡＭＰＫとの間のタンパク質−タンパク質相互作用は、少なくともＡＭＰＫαサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）を含むと考えられる。さらに、ＰＰＡＲδはＡＭＰＫα１およびＡＭＰＫα２の両方に特異的に結合するので（実施例６を参照のこと）、かかる相互作用は、配列相同性が最も高いこれらのＡＭＰＫαイソ型部分によって媒介される可能性が高い（上記で考察）。したがって、いくつかの方法実施形態では、ＡＭＰＫのＰＰＡＲδ結合フラグメントには、ＡＭＰＫのαサブユニット（ＡＭＰＫα１および／またはＡＭＰＫα２など）の触媒コアドメインを含む（またはからなる）機能的フラグメントが含まれる。
【０１１０】
「単離された」生物学的成分（ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞など）は、混合したサンプル（細胞または組織抽出物など）中の他の生物学的成分から精製されている。例えば、「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在していた細胞（組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドのための発現宿主細胞など）の他の成分から分離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【０１１１】
用語「精製された」は、サンプルからの１つまたは複数の外因性成分の除去をいう。例えば、組換えポリペプチドが宿主細胞中で発現される場合、ポリペプチドを、例えば、宿主細胞タンパク質の除去によって精製し、それにより、サンプル中の組換えポリペプチドの比率が増加する。同様に、組換えポリヌクレオチドが宿主細胞中で発現される場合、ポリヌクレオチドを、例えば、宿主細胞ポリヌクレオチドの除去によって精製し、それにより、サンプル中の組換えポリヌクレオチドの比率が増加する。
【０１１２】
単離ポリペプチドまたは核酸分子は、典型的には、サンプルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９９％超（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）含まれる。
【０１１３】
ポリペプチドおよび核酸分子を、当該分野で一般的に知られており、且つ本明細書中に記載の方法によって単離する。ポリペプチドまたは核酸分子の純度を、多数の周知の方法（ポリペプチド用のポリアクリルアミドゲル電気泳動または核酸分子用のアガロースゲル電気泳動など）によって決定することができる。
【０１１４】
２核酸配列間または２アミノ酸配列間の類似性を、配列間で共有される配列同一性レベルで示す。配列同一性を、典型的には、同一率で示し、百分率が高いほど２つの配列が類似する。
【０１１５】
比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−１０８９０、１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５−１６５、１９９２；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７−３３１、１９９４；Ｔａｔｉａｎａら、（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７４：２４７−２５０、１９９９。Ａｌｔｓｃｈｕｌらは、配列アラインメント法および相同性計算を詳細に考察している（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）は、いくつ以下の供給元（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）が含まれる）および他のインターネットサイトから利用可能であり、これは、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用される。このプログラムを使用した配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）のヘルプから入手可能である。
【０１１６】
約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメータに設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用して、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｐ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」関数を使用する（ギャップ開始コスト［デフォルト＝５］；ギャップ継続コスト［デフォルト＝２］；ミスマッチのペナルティ［デフォルト＝−３］；マッチの評価［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝３］；表示数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；（Ｂ）のアラインメントの最大表示数［デフォルト＝１００］）。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定したＰＡＭ３０行列を使用したＢｌａｓｔ２配列関数を使用してアラインメントを行うべきである。基準配列をはるかに超える類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合に同一率が増加するであろう。
【０１１７】
核酸配列の比較のために、デフォルトパラメータに設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列セットを使用して、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」関数を使用する（ギャップ開始コスト［デフォルト＝１１］；ギャップ継続コスト［デフォルト＝１］；期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝１１］；表示数（Ｖ）［デフォルト＝１００］；（Ｂ）のアラインメントの最大表示数［デフォルト＝１００］）。基準配列をはるかに超える類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価した場合に同一率が増加するであろう。
【０１１８】
特異的結合は、一方の結合パートナー（結合剤など）と他方の結合パートナー（標的など）との間の特定の相互作用をいう。かかる相互作用は、結合パートナー間（または、しばしば、各結合パートナーの特異的領域または部分の間）の１つ、または典型的には複数の非共有結合によって媒介される。別で非特異的結合部位と対照的に、特異的結合部位は飽和性を示す。したがって、特異的結合を特徴づけるための１つの例示的な方法は、特異的結合曲線による方法である。特異的結合曲線は、例えば、第１の結合パートナーの濃度関数としての固定量の他方の結合パートナーに結合する一方の結合パートナー（第１の結合パートナー）の量を示す。第１の結合パートナーの濃度がこれらの条件下で増加するにつれて、第１の結合パートナーの結合量は飽和するであろう。別の非特異的結合部位と対照的に、相互の直接会合（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）に関与する特異的結合パートナーを、過剰量のいずれかの特異的結合パートナーによってかかる会合物（例えば、タンパク質複合体）から競合的に除去（または置換）することができる。かかる競合アッセイ（または置換アッセイ）は、当該分野で非常によく知られている。
【０１１９】
本開示はまた、筋緊張または筋肉量をもたらすのに有用な薬剤の同定方法を提供する。本開示は、ＡＩＣＡＲまたはＧＷ１５１６、またはＡＩＣＡＲとＧＷ１５１６との組み合わせの存在下で調整される遺伝子を含む持久力遺伝子サイン（例えば、表２および表４を参照のこと）を提供する。かかる遺伝子サインは、筋緊張または筋肉量を増加させる薬剤の同定で有用であり、それにより、身体持久力を調整することができる。ＧＷ−ＴＲ持久力遺伝子サインは、表４に記載の遺伝子組またはそのサブセットをいう。ＧＷ−ＴＲ持久力遺伝子サインは、表２に記載の遺伝子組またはそのサブセットをいう。
【０１２０】
図６および８に示すように、各アゴニストの遺伝子発現プロフィールの重複を示す。試験すべき薬剤を被験体に投与し、筋肉サンプル（例えば、生検）または他の生物サンプル中の遺伝子発現プロフィールを測定することができる。遺伝子発現プロフィールが持久力遺伝子サイン組（例えば、ＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲ投与に関連する重複する５２遺伝子、表４を参照のこと）またはそのサブセットを含む場合、かかる薬剤を、筋肉活動の治療または調整に有用な薬剤または薬物と同定することができる。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例を、一定の特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供する。これらの実施例は、本発明が記載の特定の特徴または実施形態に制限されると解釈すべきではない。
【０１２２】
（実施例１）
ＰＰＡＲδアゴニストの投与により、非運動被験体の身体能力は向上しない。Ｗａｎｇらは、ＰＰＡＲδ受容体の構成的活性形態の骨格筋特異的発現によって酸化系遅（Ｉ型）筋線維数が増加した骨格筋を有するトランスジェニックマウスが得られ、走行持久力が顕著に増加したと以前に証明している（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ．、２：ｅ２９４、２００４）。本実施例は、非トランスジェニックマウスへのＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ１５１６）の投与でも骨格筋中に酸化的代謝のいくつかのバイオマーカーが発現することを証明する。しかし、ＰＰＡＲδ経路の遺伝子活性化によって得られる結果と予想外に対照的に、薬理学的処置によるＰＰＡＲδ活性化では、非トランスジェニックの運動不足（「非運動」または「非訓練」とも呼ばれる）マウスにおいて骨格筋の線維型組成は改変されず、持久力も改善されなかった。雄Ｃ５７Ｂ／６Ｊマウス（８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物飼育施設に収容した。動物を、実験前に１週間その周囲の気候に馴化させ、標準的なマウス固形飼料を常に利用させ、水を自由に与えた。
【０１２３】
マウスを、１日おきに１週間の中程度のトレッドミル走行（１０ｍ／分で１５分間）に馴化した。馴化後、トレッドミル上に各マウスを配置し、０ｍ／分から１５ｍ／分に速度を段階的に増加させ、マウスが疲労するまで１５ｍ／分を維持することによって基底走行持久力を決定した。疲労するまで走行した時間および距離を、基底持久力値（０週）として記録した。
【０１２４】
次いで、マウスを、ビヒクルまたはＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ１５１６）（５ｍｇ／ｋｇ）で１日１回にて４週間処置した。経口投与で処置した。処置期間中、マウスを標準的な実験用ケージに収容し、かかるケージ周囲の通常の移動によって得ることができる身体活動量のみを行わせた。
【０１２５】
最終処置の７２時間後の二酸化炭素窒息によって動物を安楽死させた。腓腹筋および四頭筋を単離し、凍結し、さらなる分析のために−８０℃で保存した。製造者の説明書に従ってＴＲＩｚｏＬ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、総ＲＮＡを四頭筋から調製した。当業者に公知のプライマーを使用したリアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して、脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３）、筋肉カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ｍＣＰＴＩ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ４（ＰＤＫ４）の発現レベルを決定した。
【０１２６】
図１Ａに示すように、４週間のＧＷ１５１６処置により、処置マウスの四頭筋中のＵＣＰ３、ｍＣＰＴＩ、およびＰＤＫ４の発現が誘導された（ＶをＧＷと比較する）。これらの遺伝子発現の変化は、処置４日後の早期に２〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の薬物濃度で検出された。
【０１２７】
さらに、遺伝子発現研究では、ＰＰＡＲδ活性化の最大効果は、収縮の速い筋肉（四頭筋および腓腹筋）で主に検出され、収縮の遅い筋肉（ヒラメ筋）で検出されなかった。
【０１２８】
野生型マウスおよびＰＰＡＲδヌルマウスから培養した初代筋細胞を使用して（Ｃｈａｗｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ．１００（３）：１２６８−７３、２００３；Ｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００７；Ｒａｎｄｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｕ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２５（６）：１２７５−８７、１９９４）、ＧＷ１５１６による酸化遺伝子の誘導が骨格筋におけるＰＰＡＲδの活性化に媒介されることが確認された（図１Ｂ〜Ｄ）。さらに、これは、構成的に活性なＶＰｌβ−ＰＰＡＲδ導入遺伝子を発現するマウス由来の筋肉中の同一遺伝子組で見出される発現の変化と類似する（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ、２：ｅ２９４、２００４）（図１ＡのＴＧを参照のこと）。まとめると、これらの結果は、ＰＰＡＲδの薬理学的活性化によって成体骨格筋中の酸化応答を開始させることができることを示す。
【０１２９】
骨格筋の酸化系表現型に特徴的なバイオマーカーの発現は、典型的には、かかる骨格筋の酸化能力の増加（例えば、走行持久力の増加）と相関していた。この相関は、例えば、ＶＰｌβ−ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスで認められた（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ．、２：ｅ２９４、２００４）。この理由および他の理由について、ＧＷ１５１６処置によって同様に走行能力が増加すると予想された。したがって、リガンドの機能的効果を決定するために、処置マウスおよびコントロールマウスの年齢および体重が適合したコホートを処置前（０週）および処置後（５週間）に持久力トレッドミル能力試験に供した。処置し、さらなる運動を実施しないで標準的な実験ケージに４週間収容した後、ＧＷ１５１６処置マウスおよびコントロールマウスの走行持久力を、上記のように再度決定した。著しいことに、改善が期待されたにもかかわらず、ＧＷ１５１６処置マウスは、疲労前のトレッドミル上の走行時間または走行距離のいずれもコントロールマウスと有意に異ならなかった（図１Ｅ）。さらに、５ヶ月までの長期薬物処置によっても走行持久力は変化しなかった。
【０１３０】
これらの結果は、非訓練成体筋肉においてさえも、ＰＰＡＲδの薬理学的活性化によっていくつかの転写の変化が誘導され、線維型の組成または持久力のいずれも変化させることができないことを示す。まとめると、成体Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスにおけるＰＰＡＲδ遺伝子プログラムの薬理学的活性化は、トレッドミル持久力の測定可能な向上を促進するのには不十分である。
【０１３１】
（実施例２）
ＰＰＡＲδアゴニストの投与により、運動訓練被験体の骨格筋が再造形される。骨格筋における線維型の比率は、遺伝因子および環境因子（身体活動レベルなど）によって決定されると考えられる（Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ａｎｄ  Ｂｏｕｃｈａｒｄ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９（１１）：１０９１−１０９５、１９９５；Ｌａｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｓｖｅｄ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、８（８）：７１４−７２２、１９８５）。持久運動訓練は、Ｉ型遅筋線維、酸化酵素、およびミトコンドリア密度の増加によって骨格筋を再造形し、能力を進行性に変化させることが公知である（Ｈｏｌｌｏｓｚｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ  ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６：８３１−８、１９８４；Ｂｏｏｔｈら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．７１：５４１−８５、１９９１；Ｓｃｈｍｉｔｔら、．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１５：１４８−５７、２００３；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１８１２−９、２００３；Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｐｈｙｓ  ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１６：８５９−７３、２００５；Ｍａｈｏｎｅｙら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：１４９８−５００、２００５；Ｓｉｕら、Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：２７７−８５、２００４；Ｇａｍｉｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：４３−５２、２００５；Ｓｈｏｒｔら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：９５−１０２、２００５；Ｔｉｍｍｏｎｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：７５０−６０、２００５）。本実施例は、ＰＰＡＲδアゴニスト処置が分子レベルで骨格筋に影響を及ぼすことを証明する。
【０１３２】
持久運動を行っている状況でのＧＷ１５１６の同時投与が線維型の組成の変化およびミトコンドリア生合成を向上させることができるかどうかを決定するために、筋線維型組成に及ぼすＧＷ１５１６処置の影響を、Ｗａｎｇら（Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ、２：ｅ２９４、２００４）に記載のように腓腹筋の凍結切片の異色染色によって決定した。日常的な筋原線維ＡＴＰアーゼ反応後異色染色を使用して異なる骨格筋線維型間のリン酸塩沈着の定量的相違を示し、それにより、骨格筋線維型を識別した（Ｄｏｒｉｇｕｚｚｉら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、７９（３）：２８９−２９４、１９８３；Ｏｇｉｌｖｉｅ  ａｎｄ  Ｆｅｅｂａｃｋ、Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、６５（５）：２３１−２４１、１９９０）。このアッセイでは、高ＡＴＰアーゼ活性を有する筋線維（例えば、Ｉ型（酸化系遅筋）筋線維）が暗色に染色される。
【０１３３】
図２Ａに示すように、ビヒクル処置およびＧＷ１５１６処置した運動不足のマウスの腓腹筋中のＩ型（酸化系遅）筋線維の比率に有意差は存在しなかった。対照的に、ＶＰ１６−ＰＰＡＲ５トランスジェニックマウスの後肢筋肉は、単色染色によってアッセイした場合にＩ型筋線維数の増加が認められた。訓練マウスでは、ビヒクル処置した運動不足のマウスと比較して、ＧＷ１５１６によってＩ型線維の比率が増加した（約３８％）（図２Ａおよび２Ｂ）。したがって、運動不足の被験体へのＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）のみの投与により、後肢筋肉中のＩ型（酸化系遅）筋線維数は有意に影響されないが、訓練被験体の後肢筋肉中のＩ型筋線維数を増加させることができる。
【０１３４】
線維型に及ぼす影響に加えて、運動訓練によって骨格筋のミトコンドリア生合成が増加し、これを定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用してミトコンドリアＤＮＡ発現レベルの関数として測定することができる。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、Ｖ、ＧＷ、Ｔｒ、およびＧＷ＋Ｔｒ被験体の筋肉中のミトコンドリアＤＮＡ発現レベルを決定した。図２Ｃに示すように、Ｉ型線維の変化と同様に、ミトコンドリアＤＮＡ発現は薬物のみでは変化しなかったが、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせを使用して約５０％増加した（図２Ｃ）。かかる増加は、持久力の向上に寄与することが公知である（例えば、Ｈｏｌｌｏｓｚｙ、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｓｐｏｒｔｓ  ７：１５５−６４、１９７５）。遅筋線維型および速筋線維型をミオシンイソ型発現によって識別することもできる（Ｇａｕｔｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｙ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８１：１０−２５、１９７９；Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９３：２２９−３３、１９８１）。骨格筋中のミオシンイソ型発現は、種々の条件（筋力学、筋肉神経支配、または運動パラダイムの変化など）に適合する（概説については、例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｄｄａｄ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９０（１）：３４５−５７、２００１；Ｂａｌｄｗｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｄｄａｄ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ  ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．、８１（１１  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ４０−５１、２００２；Ｐａｒｒｙ、Ｅｘｅｒｃ．Ｓｐｏｒｔ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ．、２９（４）：１７５−１７９、２００１を参照のこと）。ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現（ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  Ｈａ、ＭＨＣ  ｌｉｂ）に及ぼすＧＷ１５１６投与の影響を、当業者に公知に方法によって決定した。運動不足のマウスにおけるＧＷ１５１６処置により、ビヒクル処置されたコントロールマウスと比較して、ＭＨＣ  Ｉ（収縮の遅い酸化系筋線維のマーカー）の発現が増加し、ＭＨＣ  ｌｉｂ（収縮の速い解糖系筋線維のマーカー）の発現が減少した。相対的に、ＧＷ１５１６処置は、運動不足のマウスにおけるＭＨＣ  Ｈａ（収縮の速い酸化系／解糖系筋線維のマーカー）の発現を変化させなかった。したがって、少なくとも転写レベルでは、ＰＰＡＲδアゴニストは、遅筋線維表現型に特徴的ないくつかのタンパク質を誘導することができた。
【０１３５】
ＶＰｌβ−ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスの骨格筋中の構成的活性型ＰＰＡＲδの発現により、酸化酵素、ミトコンドリア生合成、および特殊化したＩ型線維収縮タンパク質の産生（筋線維型スイッチングの３つの特徴）の完全且つ調和して増加する」「長距離走行表現型」が得られた（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ．、２：ｅ２９４、２００４）。対照的に、正常な被験体におけるＰＰＡＲδの薬理学的活性化により、いくつかの代謝遺伝子の調節によってＶＰｌβ−ＰＰＡＲδのトランスジェネシスが部分的に繰り返されるだけであった。顕著には、ＰＰＡＲδアゴニストの運動不足の被験体への投与により、線維型の仕様が変化せず（単色染色によって測定）、運動持久力も向上しなかった。出生時の活性化ＰＰＡＲδのトランスジェニック過剰発現によって発生期筋線維を遅筋線維に分化形質転換するように予めプログラミングされ、したがって、成体トランスジェニックマウスに高い基底持久力が分与される。対照的に、線維型の仕様が成体のＰＰＡＲδアゴニストへの曝露前に完了するので、薬物処理のみへの筋肉の潜在的柔軟性は実質的に存在しない。
【０１３６】
本実施例は、成体の運動不足の被験体の骨格筋におけるＰＰＡＲδ調節プログラムの遺伝学的または薬理学的な活性化では同一の結果を得られないことを示す。運動を行わない発生初期由来のトランスジェニックマウスにおけるＰＰＡＲδ受容体の活性化による骨格筋仕様を遺伝子操作する能力では運動不足の正常成体におけるＰＰＡＲδプログラムを薬理学的に活性化するという結果が必ずしも予想されない。骨格筋に及ぼすＰＰＡＲδの影響についての細胞「テンプレート」は、遺伝子操作されたトランスジェニック被験体と比較して正常被験体で非常に異なる。例えば、正常な成体では、各筋肉群の筋線維の仕様は既に決定されており、筋線維と脊髄運動ニューロンとの間の連結はＰＰＡＲδ調節プログラムの薬理学的活性化前に確立されている。トランスジェニックマウスでは、構成的活性型ＰＰＡＲδの導入遺伝子は全て活性である一方で、筋線維の仕様は決定されており、筋線維と運動ニューロンとの間の連結が作製される。さらに、ＰＰＡＲδアゴニストの１日に１回の投与による内因性ＰＰＡＲδ受容体活性化の影響の活性化の影響は、一過性のピーク曝露後にクリアランスされると予想され、ＶＰｌβ−ＰＰＡＲδ導入遺伝子の構成的活性化の影響と非常に異なる可能性が高い。
【０１３７】
（実施例３）
ＰＰＡＲδアゴニスト処置と運動訓練との組み合わせは、脂肪酸代謝および脂肪酸酸化のマーカーに有意に影響を及ぼした。骨格筋の収縮装置の影響に加えて、運動訓練はまた、骨格筋ミトコンドリア密度を増加させる（例えば、Ｆｒｅｙｓｓｅｎｅｔら、Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０４（２）：１２９−１４１、１９９６）。本実施例は、運動訓練した被験体におけるＰＰＡＲδアゴニスト処置（例えば、ＧＷ１５１６）が運動した筋肉における脂肪酸代謝に影響を及ぼすことを示す。脂肪酸の酸化的代謝成分に及ぼすＧＷ１５１６処置および運動の単独または組み合わせの影響を、脂肪酸β酸化（ＦＡＯ）の選択的バイオマーカーの遺伝子発現レベルの測定によって決定した。雄Ｃ５７Ｂ／６Ｊマウス（８〜１０週齢）を、以下の４つの群（群あたり９匹）に無作為に分類した：（ｉ）ビヒクル処置した運動不足の群（Ｖ）、（ｉｉ）ＧＷ１５１６処置した運動不足の群（ＧＷ）、（ｉｉｉ）ビヒクル処置し、運動訓練した群（Ｔｒ）、および（ｉｖ）ＧＷ１５１６処置し、運動訓練した群（ＧＷ＋Ｔｒ）。実施例１に記載のように全群中のマウスを中程度のトレッドミル走行に馴化させ、基底走行持久力を測定した。その後、運動訓練群のマウスに、５°に傾斜したトレッドミルにて４週間（５日／週）の運動訓練を受けさせた。訓練の強度および時間を段階的に増加させた。４週間後、全運動訓練マウスは、１８ｍ／分で５０分／日走行した。ビヒクルまたはＧＷ１５１６を、実施例１に記載のように運動処置群または運動不足の群にそれぞれ投与した。他で示さない限り、本実施例および以下の実施例に記載のＶ、ＧＷ、Ｔｒ、およびＧＷ＋Ｔｒ被験体を同様に処置した。薬物処置および／または訓練プロトコール後（５週間）、群辺り６匹のマウスを走行試験に供した。これらの介入は、マウスの体重および食物摂取に影響を及ぼさない。実施例１で実施のように、ＲＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲ用に調製した。
【０１３８】
実施例１で得られた結果を確認すると、ＵＣＰ３、ｍＣＰＴＩ、およびＰＤＫ４はＧＷ１５１６によって上方制御されたが、運動によるさらなる誘導は認められなかった（図１Ａおよび３Ａを参照のこと）。予想外に、運動またはＧＷ１５１６のみに対しては応答しないが、組み合わせると強く誘導される第２の遺伝子組が同定された。この興味深い応答プロフィールには、運動および薬物処置したマウスに新規の標的遺伝子組を負荷する脂肪酸貯蔵（ステロイル−ＣｏＡ−不飽和化酵素（ＳＣＤ１）、脂肪酸補酵素Ａシンターゼ（ＦＡＳ）、および血清応答エレメント結合タンパク質Ｉｃ（ＳＲＥＢＰＩｃ）など）および脂肪酸取り込み（脂肪酸輸送体（ＦＡＴ／ＣＤ３６）およびリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）など）の調節に関与する一連の遺伝子が含まれる（図３Ｂ、３Ｃ、および６Ａ〜Ｃ）。
【０１３９】
遺伝子発現に加えて、ウェスタンブロッティングを使用して選択的酸化系バイオマーカー（ミオグロビン、ＵＣＰ３、シトクロムｃ（ＣＹＣＳ）、およびＳＣＤ１が含まれる）のタンパク質発現を決定した。タンパク質ホモジネートを四頭筋から調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ブロッティング膜に移し、ミオグロビン（Ｄａｋｏ）、ＵＣＰ３（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）、シトクロムｃ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＳＣＤ１（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）に特異的な抗体、およびローディングコントロールとしてのチューブリン（Ｓｉｇｍａ）を使用して探索した。ＰＰＡＲδアゴニストまたは運動のみでの処置と比較して、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせを使用してミオグロビン、ＵＣＰ３、シトクロムｃ、およびＳＣＤ１タンパク質発現の強い上方制御が認められた（図３Ｄ）。
【０１４０】
トリグリセリドの変化を使用して、筋肉酸化能力の変化を評価することができる。筋肉トリグリセリド（ｍＴＧ）含有量を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのキットを使用して、以前に記載のように測定した（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＣ  Ｂｉｏｌ、２：ｅ２９４、２００４）。図４に示すように、ｍＴＧ含有量は、ビヒクル処置した運動不足のマウスとＧＷ１５１６処置した運動不足のマウスとの間で同等であり、運動訓練のみを受けたマウスの筋肉中で実質的に増加した。対照的に、運動マウスにおけるトリグリセリドの劇的増加はＧＷ１５１６処置した運動訓練マウスで完全に逆転し、脂肪利用率の増加を示す（図４）。運動と薬物処置（例えば、ＰＰＡＲδアゴニスト投与）との組み合わせによって誘導されるが、いずれかのみによっては誘導されない遺伝子および／またはタンパク質発現は、新規の発見と考えられる。この応答型を使用して、薬理学的および生理学的遺伝子ネットワークの共通部分をさらに特徴づけることができる。例えば、１つまたは複数の薬物（例えば、ＰＰＡＲδアゴニスト）および運動によって固有に調節される１つまたは複数のおよび／またはタンパク質を、例えば、プロおよび／またはアマチュアのアスリートにおける違法に増強された能力のマーカーとして使用することができる。
【０１４１】
（実施例４）
ＰＰＡＲδアゴニストの投与により、運動訓練した被験体の身体能力が向上する。実施例１に記載のように、ＧＷ１５１６処置が酸化的代謝に関連する広範なゲノムの変化を誘導するにもかかわらず、単独では走行持久力を増加させることができなかった。（ＶＰｌβ−ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスにおける）ＰＰＡＲδ遺伝子ネットワークの構成的活性化によって距離走行表現型（俗に、「マラソンマウス」）が得られることが公知であったので、この所見は予想外であった。他方では、驚くべきことに実施例３に示すように、運動と併せたＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）処置により、骨格筋における一連の転写および翻訳後の適用が含まれる再造形プログラムが富化した。これは、運動訓練がＰＰＡＲδ標的遺伝子組をアンマスクするトリガーとしての機能を果たすことを示す。本実施例は、ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）の投与によって運動した（訓練した）被験体における身体能力が驚くほど改善されることを証明するために使用した方法を提供する。
【０１４２】
雄Ｃ５７Ｂ／６Ｊマウス（８〜１０週齢）を、４つの群（群あたり９匹）：（ｉ）ビヒクル処置した運動不足の群（Ｖ）、（ｉｉ）ＧＷ１５１６処置した運動不足の群（ＧＷ）、（ｉｉｉ）ビヒクル処置し、運動訓練した群（Ｔｒ）、および（ｉｖ）ＧＷ１５１６処置し、運動訓練した群（ＧＷ＋Ｔｒ）に無作為に分類し、実施例１に記載のように中程度のトレッドミル走に馴化させ、実施例３に記載のように運動訓練した。薬物処置および／または運動プロトコールの後（５週間）、群あたり６匹のマウスを走行試験に供した。
【０１４３】
薬物処置および／または運動プロトコールの後（５週間）、群あたり６匹のマウスの走行持久力を、基底走行持久力と同一の様式で決定した。骨格筋で認められた変化が急速な走行に起因しなかったが、運動訓練に関連していたことを確認するための各群における３匹のマウスに対する追跡持久力試験を行わなかった。
【０１４４】
図５Ａおよび５Ｂに示すように、運動不足のマウスにおいて走行持久力を変化させることができなかった同一の用量および持続時間のＧＷ１５１６処置は、４週間の運動訓練と組み合わせた場合、ビヒクル処置した訓練マウスより走行時間が６８％増加し、走行距離が７０％増加する（図５Ａおよび５Ｂ、５週目に比較）。運動前（０週）および運動後（５週間）および薬物処置の走行時間および走行距離の比較により、各マウスの持久力が１００％増加し、組み合わせパラダイムの頑健性を強調している（図５Ａおよび５Ｂ）。対照的に、同時ＧＷ１５１６処置しない同一の運動プロトコールはＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスの走行持久力を有意に増加させなかった。白色脂肪組織のパラフィン切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、以前に記載のように行った（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２：ｅ２９４、２００４；Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ、１１３：１５９−７０、２００３）。図５Ｃに示すように、運動と組み合わせたＧＷ１５１６処置により、精巣上体脂肪の体重に対する比が有意に（３２％）減少し、同一群における脂肪細胞の断面積の減少がさらに明らかとなった（図５Ｄ）。したがって、ＧＷ１５１６と運動との組み合わせ効果は、筋肉に制限されない。
【０１４５】
実施例２に記載の方法を使用して、ＧＷ１５１６処置と運動訓練との組み合わせが運動した筋肉中のＩ型筋線維数を有意に増加させることも証明された。しかし、ＧＷ１５１６処置と運動との組み合わせにより、ＭＨＣ  Ｉ発現およびＭＨＣ  ｌｉｂ発現のさらなる変化は誘導されなかった。したがって、経口投与されたＰＰＡＲδアゴニスト（ＧＷ１５１６）のみがＰＰＡＲδ調節遺伝子ネットワーク中の少なくともいくつかの収縮タンパク質の発現を誘導することができるにもかわらず（実施例５を参照のこと）、認められた転写効果は、ＧＷ１５１６処置された運動マウスにおける異色染色によって認められたような線維型組成の転写後変化を誘導するには十分でなかった。
【０１４６】
本実施例は、ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）処置が運動被験体における有酸素運動能力（例えば、走行距離および持久力）を予想外に増大させることを示す。持久運動は、脂肪組織の脂肪分解の誘導によって筋肉外脂肪を筋肉トリグリセリド貯蔵に導き、酸化要求の増加を満たすことが公知である（Ｄｅｓｐｒｅｓら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、３３：２３５−９、１９８４；Ｍａｕｒｉｅｇｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７３：Ｅ４９７−５０６、１９９７；Ｍａｄｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．、２２：３４４−９、２００１；Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１５：１４８−５７、２００３；Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ−Ｈｉｎｄｅｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８８：１６１０−６、２００３）。さらに、実施例３に記載のＧＷ１５１６処置した運動マウスにおけるＦＡＯ成分の誘導ならびに脂肪酸貯蔵物および取り込み成分の選択的上方制御は、骨格筋中の燃料としての脂肪動員の増加を示す。
【０１４７】
したがって、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせにより、例えば、局所脂肪酸合成および／または脂肪組織からの脂肪酸貯蔵物の動員の増加によって被験体における筋肉酸化能力が劇的に増加する。
【０１４８】
これは、どのようにして経口ＰＰＡＲδアゴニストおよび運動が協同的に筋肉ゲノムを再プログラミングし、持久力の限界を上昇させることができるのかを最初に証明している。
【０１４９】
（実施例５）
ＰＰＡＲδアゴニスト処置と運動訓練との組み合わせにより、固有の遺伝子発現サインが得られた。Ｖマウス、ＧＷマウス、Ｔｒマウス、およびＴｒ＋ＧＷマウスにおける骨格筋転写プログラムの包括的研究を、マイクロアレイ分析を使用して行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）高密度オリゴヌクレオチドアレイマウスゲノム４３０Ａ  ２．０チップを使用した。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物の調製、オリゴヌクレオチドアレイハイブリッド形成、およびスキャニングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）提供のプロトコールにしたがって行った。変動に起因する矛盾を最小にするために、発現の生データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ  ＳＵＩＴＥ（商標）５．０ソフトウェアを使用して概算し、対比較を行った。全プローブ組の整えた平均シグナルを、大域評価のために各アレイについてユーザー指定の標的シグナル値（２００）に調整した。特定の除外基準を適用しなかった。フリーウェアプログラムＢＵＬＬＦＲＯＧ７（インターネットＢａｒｌｏｗ−ＬｏｃｋｈａｒｔＢｒａｉｎＭａｐＮＩＭＨＧｒａｎｔ．ｏｒｇで入手可能）およびＪａｖａ（登録商標）ベースの統計ツールＶＡＭＰＩＲＥ（Ｈｓｉａｏら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０：３１０８−３１２７、２００４）を使用してさらなる分析を行った。
【０１５１】
四頭筋のゲノムワイド分析により、ＧＷ１５１６処置、運動、および組み合わせによって９６、１１３、および１３０遺伝子がそれぞれ調節されることが明らかとなった（図６）。ＧＷ１５１６または運動のみによって調整される標的遺伝子の約５０％は同一であった。これは、遺伝子ネットワークのＰＰＡＲδ活性化が同一ネットワークに対する運動効果を部分的に模倣することを証明する。
【０１５２】
ＧＷ１５１６処置と運動訓練との組み合わせによって調節される１３０種の遺伝子およびかかる各遺伝子の分類を表１に示す。１３０種の調節された遺伝子には、３０種の脂肪代謝遺伝子、５種の酸素キャリア、５種のミトコンドリア遺伝子、３種の炭水化物代謝遺伝子、１５種のシグナル伝達遺伝子、１６種の転写遺伝子、１０種の輸送遺伝子、３種のステロイド生合成遺伝子、５種の熱ショック遺伝子、２種の血管形成遺伝子、５種の増殖およびアポトーシス遺伝子、２種のサイトカイン、および２９種の他の遺伝子が含まれていた。表１に示す運動訓練／ＧＷ１５１６処置（ＧＷ＋Ｔｒ）遺伝子サイン中の遺伝子の大部分が誘導された（１０９／１３０）。１０９種の上方制御された遺伝子を、表１中に太字でないフォントで示す（最終カラム＞１）。下方制御された遺伝子を表１中に太字の斜体で示す（最終カラム＜１）。
【０１５３】
【表１−１】
2011507970.tif 000004
【０１５４】
【表１−２】
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【０１５５】
【表１−３】
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驚くべきことに、ＧＷ１５１６処置と運動との組み合わせにより、２つの介入の融合や完全な重複ではない固有の遺伝子発現パターン（「ＧＷ＋ＴＲプロフィール」）が確立された（図６）。この固有のサインは、ＧＷ１５１６および運動のみによって調節されない４８種の標的遺伝子（表２）を含み、ＧＷ１５１６または運動のみによって調節される７４種の遺伝子が除外される（そのうちのいくつかを表３に示す）。ＧＷ１５１６処置と運動との組み合わせについてのこのサイン（表２）は、エネルギーホメオスタシス、血管形成、酸素運搬、シグナル伝達、転写、および基質輸送（持久力適応に関与する過程である）の調節酵素をコードする遺伝子で高度に富化された。特に、酸化的代謝に関与する遺伝子の支配は、運動と薬物処置との組み合わせによって選択的に上方制御される（表１および２中の太字でない遺伝子を参照のこと）。さらに、いずれかの介入によって活性化されたいくつかのストレス関連遺伝子（熱ショックタンパク質、メタロチオネイン、および他のストレスバイオマーカーが含まれる（表３））は組み合わせによって変化せず、これはおそらく運動ベースの損傷の潜在的な減少を反映している。
【０１５６】
【表２−１】
2011507970.tif 000007
【０１５７】
【表２−２】
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【０１５８】
【表３】
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３２％のＧＷ＋Ｔｒ調節遺伝子は、代謝経路（脂肪酸の生合成／貯蔵（例えば、ＦＡＳ、ＳＣＤ１および２）、取り込み（例えば、ＦＡＴ／ＣＤ３６、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、およびＬＰＬ）、および酸化（例えば、アディポネクチン、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、ＰＤＫ４、ＵＣＰ３）；および炭水化物代謝（例えば、フルクトース二リン酸２（ＦＢＰ２）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＥＰＣＫｌ）、乳酸デヒドロゲナーゼＢ）など）の酵素をコードし、これらの遺伝子は酸素輸送体およびミトコンドリアタンパク質と共に筋肉の能力に直接関連する最大の遺伝子クラスを形成する（Ｉｋｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  ．２９６：３９５−４００、２００２；Ａｃｈｔｅｎ  ａｎｄ  Ｊｅｕｋｅｎｄｒｕｐ、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０：７１６−２７、２００４；Ｈｉｔｔｅｌら、Ｊ．Ａｐｐｌ  ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９８：１６８−７９、２００５；Ｃｉｖｉｔａｒｅｓｅら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ．４：７５−８７、２００６；Ｎａｄｅａｕら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１８１２−９、２００６；Ｋｉｅｎｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８６：２０５−４３、２００６；Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１２８８−９５、２００６）。予想外に、確立されたＰＰＡＲａ標的遺伝子である脂肪酸アシルＣｏＡオキシダーゼおよび中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）は、このサイン中に示されなかった。これらの代謝遺伝子の４つを除く全てが誘導され、ＧＷ１５１６処置を受けた運動訓練した被験体における骨格筋の酸化能力の一般的な増加を示した。
【０１５９】
運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせによって四頭筋中で調節される他の遺伝子は、経路に関与するタンパク質（血管形成（例えば、アンギオポエチン様４タンパク質／脂質代謝の公知の調節因子でもある）、（例えば、アドレナリン作動性受容体β３、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子結合タンパク質５）、転写（例えば、Ｃ／ＥＢＰα、Ｒｅｖｅｒｂβ、ＮＵＲＲｌ）、および基質輸送（例えば、トランスフェリン、塩素チャネル５）など）をコードした（Ｎａｇａｓｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２８９８−９０４、１９９６；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ．Ｄｉｓ．８：５４１−５４、２００１；Ａｄａｍｓ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９３：１１５９−６７、２００２；Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、Ｇｅｎｅ．３４２：１３−２４、２００４；Ｌｕｎｄｂｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６：３６３−９、２００５；Ｍａｈｏｎｅｙら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：１４９８−５００、２００５；Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｐｈｙｓ  ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１６：８５９−７３、２００５；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：８６５１−９、２００５）。特定の理論に拘束されることを望まないが、かかる他の遺伝子は、少なくとも一部が、ＧＷ１５１６処置した運動訓練した被験体で認められる筋肉再造形および持久力の増加に関与する可能性が高い。
【０１６０】
興味深いことに、持久力サインの４８種の遺伝子サブセット（表２）の比較発現分析により（いずれかの介入のみではない）、「非訓練」ＶＰ１６−ＰＰＡＲ５トランスジェニックマウスと著しい類似性が明らかとなった。この所見によって４８種の遺伝子がＰＰＡＲδに主に依存することが確認され、運動によって得られたシグナルがトランスジェニック過剰発現に匹敵するレベルまでＰＰＡＲδ転写活性と強力作用を示すように機能することができることを示す。したがって、ＰＰＡＲδアゴニストと共に運動を手掛かりとして受容体転写活性を高活性化し、成体筋肉を再プログラミングするように機能することができる。
【０１６１】
１つまたは複数の医薬品（例えば、ＰＰＡＲδアゴニスト）の存在下での運動に固有の影響を受ける（例えば、上方制御されるか、下方制御されるか、実質的に制御されない）遺伝子および／またはタンパク質を、例えば、運動訓練した被験体（例えば、アスリート）における「薬物ドーピング」のマーカーとして使用することができる。ＧＷ＋Ｔｒによって調節されるが、ＧＷ１５１６処置または運動訓練のみでは調節されない４８種の固有の遺伝子組を使用して、種々の能力向上薬を投与した運動被験体を同定することができると予想される。
【０１６２】
（実施例６）
ＰＰＡＲδは、運動活性化キナーゼ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫおよびＡＭＰＫ）と直接相互作用する。運動訓練は、骨格筋中の遺伝子発現を調節するキナーゼ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫおよびＡＭＰＫなど）を活性化することが公知である（Ｃｈｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５２：２２０５−１２、２００３；Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７１：Ｅ４０３−８、１９９６）。ＡＭＰＫは、骨格筋の遺伝子発現および酸化的代謝に影響を及ぼす（Ｃｈｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５２：２２０５−１２、２００３、Ｒｅｚｎｉｃｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５７４：３３−９、２００６）。運動調節キナーゼとＰＰＡＲδシグナル伝達との間の相互作用を本実施例に記載する。四頭筋のタンパク質ホモジネート中のホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫおよびホスホ−ＡＭＰＫαサブユニットならびに総ＡＭＰＫのレベルをウェスタンブロットによって決定した。ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、ホスホ−ＡＭＰＫα１、および総ＡＭＰＫα１抗体に特異的な抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから得た。ホスホ特異的ＡＭＰＫα１抗体は、活性化ループ中の重要な活性化トレオニンを認識する。
【０１６３】
両キナーゼ（ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫおよびホスホ−ＡＭＰＫαサブユニット）の活性化形態は、運動不足コントロールと比較して、運動マウスの四頭筋中にて高レベルで発現した（図７Ａ）。以前の報告では、培養細胞中のＧＷ１５１６によるＡＭＰＫの活性化にＰＰＡＲδが必要ではないと主張されている（Ｋｒａｍｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５４（４）：１１５７−６３、２００５およびＫｒａｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  ．Ｃｈｅｍ．２８２（２７）：１９３１３−２、２００７）。対照的に、ＧＷ１５１６は運動不足の筋肉または訓練した筋肉のいずれにおいてもｐ４４／４２やＡＭＰＫを活性化できなかったことが認められた。これは、ＰＰＡＲδ調節効果がこれらのキナーゼを活性化する運動誘導性シグナルの下流にあることを示した。さらに、ＡＭＰＫは、運動または薬物の非存在下にてＶＰ１６−ＰＰＡＲ５トランスジェニックマウスの筋肉中で構成的に活性なようである（図７Ｂ）。これらの結果は、相乗作用がＡＭＰＫおよびＰＰＡＲδ共依存性であることを示す。
【０１６４】
相乗作用がＡＭＰＫおよびＰＰＡＲδ共依存性であることを示す場合、ＡＭＰＫおよびＰＰＡＲδの選択的同時活性化により、運動とＰＰＡＲδとの組み合わせおよびＶＰ１６−ＰＰＡＲδの過剰発現によって誘発される遺伝子発現の変化を模倣する遺伝子発現の変化が誘導されるであろう。これを証明するために、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせによって骨格筋中で誘導される転写の変化（実施例５に記載）を、ＡＭＰＫアクチベーター処置（細胞透過性ＡＭＰアナログＡＩＣＡＲ；２５０ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．）およびＧＷ１５１６処置（５ｍｇ／ｋｇ／日、経口経管栄養）との組み合わせの転写の変化と６日間比較した。実施例５に記載の方法を使用してゲノム分析を行った。
【０１６５】
６日間のＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲの同時処置により、非訓練Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの四頭筋中に固有の遺伝子発現サインが得られ（図８Ａ、翻訳、タンパク質プロセシング、アミノ酸代謝、脂肪代謝、酸素キャリア、炭水化物代謝、シグナル伝達、転写、輸送、ステロイド生合成、熱ショック応答、血管形成、増殖およびアポトーシス、サイトカイン、収縮タンパク質、およびストレスなどに関連する標的遺伝子が含まれる）、これはＧＷ１５１６処置と運動との組み合わせと４０％の遺伝子を共有する（図８Ｂ）。２つのサイン（ＰＰＡＲδ活性化と運動との組み合わせまたはＰＰＡＲδおよびＡＭＰＫの同時活性化）に共通の５２種の遺伝子の分類（表４に列挙）により、大部分の標的が酸化的代謝に関与することが明らかとなった。
【０１６６】
【表４−１】
2011507970.tif 000010
【０１６７】
【表４−２】
2011507970.tif 000011
ビヒクル（Ｖ）、ＧＷ１５１６（ＧＷ、５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＡＩＣＡＲ（ＡＩ、２５０ｍｇ／ｋｇ／日）、および２つの薬物の組み合わせ（ＧＷ＋ＡＩ）で６日間処置したマウスの四頭筋中の選択的酸化遺伝子（表４に列挙の８種の遺伝子）の定量的発現分析を、実施例１に記載の方法を使用して決定した。図９Ａ〜Ｈに示すように、これらのバイオマーカーのいくつか（ＰＤＫ４、ＳＣＤ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、ＨＳＬ、ｍＦＡＢＰ、およびＬＰＬが含まれる）は、四頭筋中でＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲによって相乗的様式で誘導される（図９Ｃ〜９Ｈ）。興味深いことに、相乗作用はＵＣＰ３およびｍＣＰＴＩで検出できなかった（図９ＡおよびＢ）。これらの遺伝子は、ＡＭＰＫが構成的に活性な非訓練ＶＰ１６−ＰＰＡＲ５マウスの四頭筋中で誘導された（表５）。
【０１６８】
【表５】
2011507970.tif 000012
まとめると、これらの結果は、ＡＭＰＫとＰＰＡＲδとの間の相互作用が運動中の骨格筋トランスクリプトームの再プログラミングに実質的に寄与し得る一方で、さらなる変化が運動シグナル伝達ネットワークの他の成分とＰＰＡＲδとの間のクロストークに関与し得ることを証明する。要約すれば、ＰＰＡＲδおよび運動は走行持久力を相乗的に調節する。理論に拘束されないが、キナーゼ活性化は、能力を有効に向上させる「持久力遺伝子発現サイン」の確立において運動中のＰＰＡＲδシグナル伝達に影響を及ぼし得る。
【０１６９】
（実施例７）
ＡＭＰＫは、ＰＰＡＲδによる転写活性化を増加させる。実施例６に記載の遺伝子相乗作用は、ＡＭＰＫが骨格筋におけるＰＰＡＲδの転写活性を直接調節することを示す。これを証明するために、野生型マウスおよびＰＰＡＲδヌルマウスから単離した初代筋細胞における遺伝子発現に及ぼすＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲの影響について分析した。初代筋細胞を、以前に記載のように野生型マウスおよびＰＰＡＲδヌルマウスから単離した（Ｒａｎｄｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｕ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２５（６）：１２７５−８７、１９９４）。骨格筋Ｃ２Ｃ１２細胞を、２０％血清およびペニシリン／ストレプトマイシンカクテルを含むＤＭＥＭ中で培養した。分化のために、８０％コンフルエンスの細胞を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％血清）に４日間切り替えて、分化した筋細管を得た。細胞を、ビヒクル、ＧＷ１５１６、ＡＩＣＡＲ、またはＧＷ１５１６＋ＡＩＣＡＲ（ＧＷ：０．１μＭ；ＡＩＣＡＲ：５００μＭ）で２４時間処置した。ＵＣＰ３、ＰＤＫ４、ＬＰＬ、およびＨＳＬのＲＮＡ発現を、実施例１に記載のようにリアルタイム定量ＰＣＲを使用して決定した。図１０Ａ〜Ｄに示すように、相乗作用はＰＰＡＲδに依存し、ヌル細胞中で喪失する。ＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲによる遺伝子発現の類似の相乗的調節が、分化Ｃ２Ｃ１２細胞でも認められた。これらの結果は、ＡＭＰＫ活性化が筋肉中のＰＰＡＲδのリガンド依存性転写効果を向上させることができることを示す。より直接的にこの問題に取り組むために、レポーター遺伝子発現アッセイを使用した。
【０１７０】
ＡＤ２９３細胞を、１０％血清および抗生物質カクテルを含むＤＭＥＭ中で培養した。製造者の説明書に従ってリポフェクタミン（商標）２０００を使用して、細胞を１つまたは複数のＣＭＸ−Ｆｌａｇ、ＣＭＸ−Ｆｌａｇ  ＰＰＡＲδ、ＣＭＸ−Ｔｋ−ＰＰＲＥ、またはＣＭＸ−βＧＡＬ、またはｈＡＭＰＫ（αｌおよびα２サブユニット、Ｏｒｉｇｅｎｅ）発現ベクターでトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ抗体抱合ビーズを、トランスフェクトした細胞由来の溶解物と共に４０℃で一晩インキュベートした。Ｆｌａｇタグ化タンパク質またはタンパク質複合体を、非結合物質からのビーズの分離によって免疫沈降させた。ビーズを氷冷溶解緩衝液中で洗浄後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で抽出した。免疫共沈降試験のために、溶解緩衝液からＳＤＳを排除した。ＦＬＡＧタグまたはＡＭＰＫαサブユニットに特異的な抗体を使用してウェスタンブロッティングを行った。
【０１７１】
触媒ＡＭＰＫα１またはｃｃ２サブユニットのいずれか（コントロールベクターではない）のいずれかのＰＰＡＲδとの同時トランスフェクションにより、ＡＤ２９３細胞中でのＰＰＲＥ駆動レポーター遺伝子の誘導時にＰＰＡＲδの基底（図１０Ｅ）およびＧＷ１５１６依存性転写活性（図１０Ｆ）が増加した。ＡＭＰＫ過剰発現またはＧＷ１５１６処置は、ＰＰＡＲδ発現ベクターを排除するトランスフェクションでレポーター活性を変化させず、ＲＸＲが影響する可能性が否定された。さらなる結果は、レポーターとの直接的な相互作用によってＡＭＰＫがＰＰＡＲδ転写活性を調整することができることを示す。Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲδおよび触媒ＡＭＰＫα１またはα２サブユニットのいずれかで同時トランスフェクトしたＡＤ２９３細胞では、両サブユニットは、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲδとの複合体として免疫共沈降した（図１０Ｇ）。さらに、Ｆｌａｇ−ＰＰＡＲδはまた、ＡＤ２９３細胞由来の内因性ＡＭＰＫαサブユニットを免疫共沈降し、核内受容体とキナーゼとの間の直接的な物理的相互作用が確認された（図１０Ｈ）。物理的相互作用にもかかわらず、ＡＭＰＫはＰＰＡＲδリン酸化を増加させることができなかった。
【０１７２】
潜在的なＡＭＰＫリン酸化部位がＰＰＡＲδ中に見出された一方で、これらの部位はｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてＡＭＰＫによってリン酸化されなかった。ＡＭＰＫの存在下または非存在下でのＡＤ２９３細胞中のＰＰＡＲδのｐ３２標識の測定によってこれをさらに確認した。ＡＤ２９３細胞を、上記のようにＰＰＡＲδおよびｈＡＭＰｋ（α１またはα２サブユニット）発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞をリン酸塩フリーのＤＭＥＭで３回洗浄し、３２Ｐ−オルトリン酸塩を含むリン酸塩フリーのＤＭＥＭと２０時間インキュベートした（１００μＣｉ／５ｍｌ）。細胞を氷冷リン酸塩フリーＤＭＥＭで３回洗浄し、氷冷溶解緩衝液中に溶解した。
【０１７３】
図１０Ｉに示すように、全体的なＰＰＡＲδリン酸化はｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭＰＫによって増加しない。しかし、ＡＭＰＫｃｃ２およびコアクチベーターＰＧＣ１α（公知のＡＭＰＫのリン酸化標的）の同時トランスフェクションによって協力的に相互作用して、ＰＰＡＲδの基底およびリガンド依存性の転写活性の両方がさらに誘導される（図１０Ｊ）。顕著には、Ｆｌａｇ−ＰＧＣ１αとＡＭＰＫ（共にＰＰＡＲδと独立して相互作用する）との間の有意な物理的相互作用は検出されなかった（図１０Ｋ）。まとめると、これらの所見は、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用および／またはＰＧＣ１αなどのコアクチベーターのリン酸化によってＡＭＰＫが受容体活性を強化することができる場合、ＡＭＰＫがＰＰＡＲδと転写複合体中に存在し得ることを示す。
【０１７４】
これらの結果は、ＡＭＰＫがＰＰＡＲδと直接的に相互作用し、受容体を介して基底およびリガンド依存性の転写を劇的に増加させることを示す。物理的相互作用にもかかわらず、ＡＭＰＫはＰＰＡＲδをリン酸化しない。ＡＭＰＫおよびその基質ＰＧＣ１αは、ＰＰＡＲδ転写を相乗的に増加させ、共調節因子を介したＡＭＰＫによる受容体の直接的調節を示した。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現の調節において運動活性化ＡＭＰＫがＰＰＡＲδと相互作用するという結論は、ＡＩＣＡＲ（ＡＭＰＫアクチベーター）およびＧＷ１５１６での動物の処置によって骨格筋中に遺伝子サインが作製されるという所見によって強化され、これは、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせの遺伝的影響の４０％までを再現する（表４を参照のこと）。さらに、このサイン由来のいくつかの候補遺伝子は野生型においてＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲによって相乗的に誘導されるがＰＰＡＲδヌル初代筋細胞では誘導されず、２つの薬物の相互作用の影響はＰＰＡＲδによって媒介されることが証明される。一般的に調節される遺伝子の４５％が酸化的代謝に関与する一方で、筋肉の能力に関連するさらなる共通の標的には、血管形成遺伝子、シグナル伝達遺伝子、およびグルコース節約遺伝子が含まれる（表４）。ＰＰＡＲδ−ＡＭＰＫ相互作用と無関係のＰＰＡＲδ−運動サインの一部（図８Ｂ）が受容体と他の運動シグナル伝達物質（ＭＡＰＫ、カルシニューリン／ＮＦＡＴ、およびＳＩＲＴ１など）との間のクロストークに依存し得る可能性がある。これらの可能性を図１０Ｌ中にまとめている。図１０Ｌでは、ＡＭＰＫおよびシグナル伝達ネットワークのさらなる成分がリガンド化ＰＰＡＲδと相互作用して筋肉持久力遺伝子サインおよび増強された持久力適応が得られることを提案している。
【０１７６】
データは、合成ＰＰＡＲδ活性化のみで成体マウスにおいて予め設定された筋肉の構造および持久力レベルを変化させることができない一連のゲノム変化を誘導することを示す。しかし、ＰＰＡＲδ活性化の運動との組み合わせにより、潜在的にＡＭＰＫなどのキナーゼとの相互作用を介して転写が新規に変化し（図１０Ｌ中に示す）、筋肉の能力を劇的に向上させる表現型に筋肉トランスクリプトームがリセットされる。
【０１７７】
（実施例８）
データは、成体マウスにおけるＰＰＡＲδの薬理学的活性化により、運動シグナルと併せて走行持久力が増加し得ることを証明する。この過程におけるＡＭＰＫの中心的役割は、運動によって強く刺激され、運動せずに持久力を示すＶＰ１６−ＰＰＡＲｄトランスジェニックマウスの筋肉で構成的に活性であるという両方の所見によって特に強調される。さらに、ＡＭＰＫは、ＰＰＡＲδだけでなく代謝の他の転写調節因子（例えば、ＰＧＣ１α、ＰＰＡＲα）とも相互作用することによって複数の転写プログラムを組み込むことができる（Ｈｏｎｇら、２００３；Ｌｅｆｆ、２００３；Ｂｒｏｎｎｅｒら、２００４；Ｊａａｇｅｒら、２００７）。これにより、ＡＭＰＫの化学的活性化が運動せずに走行持久力を増大させるのに十分であるかどうかについての問題が提起される。
【０１７８】
この概念を試験するために、Ｃ５７Ｂ／６ＪマウスをＡＩＣＡＲ（５００ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間処置した。ＡＩＣＡＲは、ＡＭＰＫａサブユニットおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化を増加させ、四頭筋中のＵＣＰ３の発現を増加させた。これにより、ＡＭＰＫシグナル伝達の有効な活性化が確認された（図１１Ａ）。興味深いことに、４週間の薬物処置により、精巣上体脂肪量の体重に対する比が減少し、体重が変化することなく酸素消費が増加し（図１１Ｂ〜１１Ｅ）、ＡＩＣＡＲが持久力を正に調節することができるという推測が支持された。実際、トレッドミル持久力試験では、ＡＣＩＡＲ処置マウスはビヒクル処置マウスより長い時間（約２３％）およびより長い距離（約４４％）を走行し、運動せずに持久力を増加することができることが明らかとなった（図１１Ｆ）。さらに、四頭筋の大域遺伝子発現分析により、ＡＩＣＡＲ処置のみで酸化的代謝に関連する３２の遺伝子組が上方制御されることが明らかとなった（図１１Ｇおよび表６）。特に、これらの３２種の遺伝子のうちの３０種はまたＶＰ１６−ＰＰＡＲδトランスジェニックマウスで上方制御され、ＡＭＰＫによる酸化遺伝子の刺激がＰＰＡＲδに依存し得ることが示唆された（表６）。
【０１７９】
【表６】
2011507970.tif 000013
この可能性を試験するために、野生型およびＰＰＡＲδヌル初代筋細胞を使用した。野生型初代細胞のＡＩＣＡＲでの処置（７２時間）により、重要な酸化系バイオマーカー遺伝子（Ｓｃｄ１、ｆａｓｎ［ＦＡＳ］、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｄｋ４）の発現が増加した（図１１Ｈ）。対照的に、ＡＩＣＡＲは、ＰＰＡＲδヌル細胞中で上記細胞の発現を増加させることができず、酸化遺伝子に及ぼすＡＭＰＫの転写的影響には受容体が必要であることが証明された。
【０１８０】
データは、ＡＭＰ模倣ＡＩＣＡＲがＰＰＡＲδ依存様式で筋肉代謝の遺伝的再プログラミングによって運動不足のマウスの持久力を増加させることができることを示す。データはまた、運動と組み合わせたＰＰＡＲδアゴニストが疲労耐性Ｉ型線維の仕様およびミトコンドリア生合成を相乗的に誘導し、最終的に身体能力を向上させることを証明する。これらの変化は、薬物−運動パラダイムに固有の筋肉持久力遺伝子サインの予想外であるが興味深い確立と相関する。かかるサインは、運動活性化されたＡＭＰＫとＰＰＡＲδとの間の分子クロストークおよびおそらく物理的結合の結果である。これらの所見により、経口リガンドを使用したＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδシグナル伝達軸のターゲティングによって筋肉持久力を再プログラミングするための新規の薬理学的ストラテジーが確認される。
【０１８１】
ＡＭＰＫアクチベーターＡＩＣＡＲは、その一部がＰＰＡＲδ依存性酸化遺伝子の刺激によって非訓練成体における酸素消費および持久力を増加させた。持久力におけるＰＰＡＲδの役割が証明されたにもかかわらず、強力且つ選択的なアゴニストでの４週間の処置では線維型の組成または持久力のいずれも変化させることができず、ＰＰＡＲδの直接および薬理学的活性化では走行能力を向上させるのに不十分であることが明らかとなった。対照的に、出生時の活性化ＰＰＡＲδのトランスジェニック過剰発現により、発生期筋線維が遅筋線維に分化形質転換するように予めプログラミングされ、したがって、成体トランスジェニックマウスに高い基底持久力を分け与える。明らかに、一旦成体で線維型の仕様が完了すると、単一転写経路の人工的活性化に対する筋肉の潜在的適応性が制限される。
【０１８２】
これらの傾向にしたがって、合成ＡＭＰ模倣物での非訓練成体における予想外であるが成功した持久力の再プログラミングは、その基質（ＰＧＣ１ａ、ＰＰＡＲα、およびＰＰＡＲδなど）に支配される複数の転写プログラムを同時にターゲティングし、運動に類似する遺伝的影響を誘発するＡＭＰＫの能力に関連し得る（Ｈｏｎｇら、２００３；Ｌｅｆｆ、２００３；Ｂｒｏｎｎｅｒら、２００４；Ｊａｇｅｒら、２００７）。
【０１８３】
興味深いことに、ＰＰＡＲδアゴニストのみによる操作に対する成体骨格筋持久力の不応性は、薬物処置と運動との組み合わせによって緩和される。実際、このストラテジーにより、いずれかのパラダイムのみに固有の持久力遺伝子サインが得られ、これは運動とＰＰＡＲδシグナル伝達との間のクロストークを反映する。運動がシグナル伝達事象のカスケードを活性化するにもかかわらず、ＡＭＰＫは、いくつかの理由によってこの遺伝子適応の中核をなす可能性が高い。第１に、ＡＭＰＫは、低ＡＴＰレベル（運動中などに起こる）を検出し、次に酸化的代謝を増加させる代謝センサーである（Ｍｕら、２００１；Ｒｅｚｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ、２００６）。第２に、ＡＭＰＫの長期的影響は、その一部が遺伝子発現の調節によって媒介される（Ｒｅｚｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ、２００６）。第３に、ＡＭＰＫが転写因子と潜在的に相互作用することができる場合、運動はＡＭＰＫの活性化および核内移行を誘導する。
【０１８４】
最後に、ＡＭＰＫ活性化を欠損するトランスジェニックマウスは自発運動が減少し（Ｍｕら、２００１；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００７）、このことは受容体シグナル伝達を調整する魅力的な運動の手掛かりとなる。
【０１８５】
遺伝子発現の調節において運動活性化ＡＭＰＫがＰＰＡＲδと相互作用するという考えは、ＡＭＰＫがＰＰＡＲδと会合して受容体を介した基底転写およびリガンド依存性転写が劇的に増加するという証拠によって支持される。物理的相互作用にもかかわらず、ＡＭＰＫは代謝標識研究においてＰＰＡＲδリン酸化を誘導しない。
【０１８６】
興味深いことに、ＡＭＰＫおよびその以前に報告された基質ＰＧＣ１ａは相乗的にＰＰＡＲδ転写を増加させ、共調節因子修飾を介したＡＭＰＫによる受容体機能の間接的調節が示唆された。それにもかかわらず、直接的タンパク質−タンパク質相互作用を介してＡＭＰＫによってＰＰＡＲδが調節される可能性があり得る。
【０１８７】
実際、類似の機構を介したＡＭＰＫによる他の転写因子の調節が以前に証明されている（Ｈｏｎｇら、２００３；Ｌｅｆｆ、２００３；Ｂｒｏｎｎｅｒら、２００４）。ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ相互作用の生理学的確証は、ＧＷ１５１６およびＡＩＣＡＲ（ＡＭＰＫアクチベーター）がいくつかの持久力関連遺伝子を野生型で相乗的に誘導するがＰＰＡＲδヌル初代筋細胞で誘導しないという所見に由来する。より重要には、ＡＩＣＡＲおよびＧＷ１５１６での動物の処置によって骨格筋中に遺伝子サインが作製され、これは、運動とＧＷ１５１６処置との組み合わせの遺伝的影響の４０％までを再現する。特に、２プロフィール間で共有される遺伝子は、酸化的代謝、血管形成、およびグルコース節約（筋肉の能力に直接関連する経路）に関与する。
【０１８８】
運動または運動−ＰＰＡＲδ相互作用のいずれかによって調節される遺伝子の全てがＡＭＰＫ依存性であるわけではないにもかかわらず、他の公知の運動シグナルと比較して、２つの重要な所見によって持久力の促進におけるキナーゼの重要な役割が割り当てられる（Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ、２００６；Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｌａｇｏｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。第１に、ＡＭＰＫは、運動せずに持久力を示すＶＰ１６−ＰＰＡＲδトランスジェニック筋肉で構成的に活性である。第２に、ＡＩＣＡＲによるＡＭＰＫ活性化は、さらなる運動シグナルを持たない走行持久力を増加させるのに十分であった。顕著には、ＡＩＣＡＲによって上方制御された大部分の酸化遺伝子（３２種のうち３０種）は超持久力ＶＰ１６−ＰＰＡＲｄマウスで活性であり、おそらく、これらの遺伝子は筋肉の能力を改善するために必要なコアな遺伝子組である。
【０１８９】
興味深いことに、ＡＩＣＡＲはＰＰＡＲδヌル筋肉細胞における酸化遺伝子発現を誘導することができず、少なくともＡＭＰＫによる酸化的代謝の調節にはＰＰＡＲδが必要であることが示された。まとめると、これらの所見は、運動を置換するために経口ＡＭＰＫ薬によって容易に活用することができる骨格筋トランスクリプトームおよび持久力の再プログラミングにおけるＡＭＰＫとのＰＰＡＲδとの間の分子協力を証明している（図１１Ｉ）。
【０１９０】
ヒトでは、持久運動により、心肺系、内分泌系、および筋神経系が生理学的に適応する（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ、２０００；Ｌｕｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。骨格筋に注目した調査にもかかわらず、ＰＰＡＲｄ、ＡＭＰＫ、および運動の筋肉外の影響も持久力の増加に寄与し得る。ＰＰＡＲｄおよびＡＭＰＫアゴニストによる筋肉外適応の増強は未だ研究されていないにもかかわらず、薬物処置によって精巣上体脂肪量を減少させることができ、おそらくさらなる全身性の利点が付与される。ＰＰＡＲδが正常な心筋収縮性および脂肪組織の内分泌機能に重要であることは注目に値する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。同様に、メルホルミンによるＡＭＰＫの活性化は、その血糖値を低下させる能力を媒介すると考えられる（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。アスリートの能力の増大に加えて、運動は広範な病理生理学的状態（呼吸器障害、心血管の異常、２型糖尿病、および癌のリスクなど）において有益な影響を及ぼす。開示は、合成ＰＰＡＲδ活性化および運動、より重要には、ＡＭＰＫ活性化のみで、骨格筋ゲノムを再プログラミングし、持久力を劇的に向上させる強い転写の手掛かりが得られることを証明する。開示は、運動模倣薬を使用して筋肉（および他の組織）の予め設定された遺伝子刷り込みを再編成するためストラテジーが、運動が有益であることが公知の消耗疾患および虚弱などの一定の筋肉疾患ならびに肥満の治療において治療可能性を有することを示す。
【０１９１】
（実施例９）
被験体における運動効果の向上。本実施例は、健康な哺乳動物被験体において運動を増大または向上させるために使用することができる方法を記載する。特定の条件を記載しているが、当業者は、かかる条件を多少変更することができると認識するであろう。
【０１９２】
健康な成人被験体は、少なくとも３０分間（例えば、３０〜９０分間）の有酸素運動（例えば、ランニング）を、１週間あたり少なくとも３〜４日間（例えば、１週間あたり３〜７日間）にて少なくとも２週間（例えば、少なくとも４〜１２週間）にわたって行う。最大心拍数の４０％〜５０％、最大心拍数の５０％〜６０％、最大心拍数の６０％〜７０％、または最大心拍数の７５％〜８０％で運動を行う。ここで、ヒト被験体の最大心拍数を以下のように計算する：２２０ｂｐｓ−（被験体の年齢）。
【０１９３】
上記の有酸素運動を実施中または実施後に、被験体に、ＧＷ１５１６（（２−メチル−４（（（４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−１，３−チアゾール−５−イル）メチル）スルファニル）フェノキシ）酢酸）を１〜２０ｍｇ／日（２．５または１０ｍｇ／日など）の用量で経口投与する。被験体は、ＧＷ１５１６を投与しながら有酸素運動を実施し続けることができる。被験体に、ＧＷ１５１６を少なくとも２週間（少なくとも４週間など）投与することができる。
【０１９４】
処置した被験体で達成される運動効果（例えば、走行持久力）を、非処置被験体のかかる効果と比較することができる。運動効果を、当該分野で公知の方法（有酸素性持久力または走行持久力の測定（例えば、疲労するまで走行した距離または特定の距離を走行するための時間の測定）など）を使用して測定することができる。いくつかの例では、目的の運動効果は、非処置被験体と比較して、処置被験体で少なくとも５％（少なくとも１０％など）増加する。
【０１９５】
（実施例１０）
運動訓練した被験体における能力向上物質の同定。本実施例は、運動訓練した被験体における能力向上物質を同定するために使用することができる方法を記載する。健康な成人から得た生物サンプルを分析して、表２または表４に列挙した１つまたは複数の分子（核酸またはタンパク質）の発現の分析によって被験体がＰＥＳ（例えば、ＧＷ１５１６）を摂取しているかどうかを決定する。適切な生物サンプルには、被験体の細胞（末梢血、尿、唾液、組織生検、または口内スワブ中に存在する細胞など）から得たゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡが含まれる）またはタンパク質を含むサンプルが含まれる。例えば、被験体の生物サンプルを、表２または４に列挙の少なくとも４つの分子（核酸またはタンパク質）の任意の組み合わせ（表２または４に列挙の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも４０個の分子の任意の組み合わせ（例えば、表２または４に列挙の分子の全て）など）の発現の変化（増加または減少など）についてアッセイすることができる。
【０１９６】
例えば、サンプル由来の分子の増幅のためのＰＣＲの使用またはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを単離するための市販のキットの使用による生物サンプル由来の核酸分子の単離方法は日常的方法である。しかし、分析前に核酸を単離する必要はない。核酸を、ストリンジェントな条件下で表２または４に列挙の１つまたは複数の核酸分子とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブと接触させることができる。次いで、プローブとハイブリッド形成する核酸を検出し、定量する。オリゴヌクレオチドプローブ配列は、表２または４に列挙の配列によって示される核酸分子に特異的に結合することができる。
【０１９７】
表２または４に列挙の分子の発現の増加または減少を、細胞レベルのｍＲＮＡの測定によって検出することができる。ｍＲＮＡを、当該分野で周知の技術（例えば、ノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ、およびｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成が含まれる）を使用して測定することができる。ｍＲＮＡ分析手順の詳細を、例えば、提供した実施例およびＳａｍｂｒｏｏｋら．（ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．、ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に見出すことができる。
【０１９８】
表２または４に列挙の配列に特異的なオリゴヌクレオチドを、市販の機械を使用して化学合成することができる。次いで、これらのオリゴヌクレオチドを、例えば、放射性同位体（３２Ｐなど）または非放射性標識（ビオチン（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３−５７、１９８１）またはフルオロフォアなど）で標識し、ドットブロットまたは電気泳動後のゲルからの移行によって膜または他の固体支持体上に固定した各ＤＮＡサンプルとハイブリッド形成させることができる。これらの特異的配列を、例えば、オートラジオグラフィまたは蛍光定量反応（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２２９’−３７’、１９８９）または比色反応（Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４５１３−３４、１９８７）などの方法によって視覚化する。
【０１９９】
生物サンプル中のタンパク質も分析することができる。いくつかの例では、分析前に日常的な方法を使用してタンパク質をを単離する。
【０２００】
１つの例では、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を使用して、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の使用によって差次的タンパク質発現の変化を検出する。かかる方法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，７１９，０６０号；米国特許第６，８９７，０７２号；および米国特許第６，８８１，５８６号を参照のこと）。ＳＥＬＤＩは、分析物の捕捉または脱離を増強する表面上のエネルギーの流れに分析物を存在させる固相脱離方法である。したがって、特定の例では、クロマトグラフィ表面は、表２または４に列挙のタンパク質を認識する抗体を含む。サンプル中に存在する抗原は、クロマトグラフィ表面上の抗体を認識することができる。非結合タンパク質および質量分析妨害化合物を洗い流し、クロマトグラフ表面上に保持されたタンパク質を、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって分析および検出する。次いで、サンプル由来のＭＳプロフィールを、差次的タンパク質発現マッピングを使用して比較し、それにより、特定分子量のタンパク質の相対的発現レベルを、種々の統計的技術およびバイオインフォマティクスソフトウェアシステムによって比較することができる。
【０２０１】
別の例では、表２または４に列挙の分子に特異的な抗体の利用能により、当該分野で周知の多数の免疫アッセイ方法の１つ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）に示す方法など）によってタンパク質の検出および定量が容易になる。かかる抗体の構築方法は当該分野で周知である。任意の標準的な免疫アッセイ形式（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＲＩＡアッセイなど）を使用して、タンパク質レベルを測定することができる。タンパク質の検出および定量のために免疫組織化学的技術を使用することもできる。例えば、組織サンプルを被験体から得、適切な特異的結合剤および任意の標準的な検出システム（西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合した二次抗体を含むシステムなど）を使用して所望のタンパク質の存在について切片染色することができる。かかる技術に関する一般的なガイダンスを、Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ（Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、１９８２）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８）に見出すことができる。
【０２０２】
タンパク質発現または核酸発現を検出またはさらに定量するために、試験サンプル中の発現を、ＰＥＳを摂取しなかった被験体由来の細胞中で見出されるレベルと比較することができる。あるいは、試験被験体中で同定された発現パターンを、表２または４に示す発現パターンと比較することができる。
【０２０３】
例えば、試験サンプルが表２または４に類似の発現パターンを示す場合（例えば、表２または４で上方制御および下方制御した遺伝子がそれぞれ上方制御および下方制御すべき被験体で認められる場合）、これは、被験体がＰＥＳ（ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）など）を摂取していることを示す。対照的に、試験被験体において同定された発現パターンが表２または４に示した発現パターンと異なる場合（例えば、表２または４で上方制御および下方制御した遺伝子が異なって発現すべきでない被験体で認められるか、異なる調節パターンを示す場合）、これは被験体がＰＥＳ（ＰＰＡＲδアゴニスト（例えば、ＧＷ１５１６）など）を摂取していないことを示す。
【０２０４】
正常なヒト細胞中で見出された同一タンパク質の量と比較した試験被験体の細胞中の表２に列挙した太字でないタンパク質の有意な増加は、通常、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、またはそれを超えて異なる。被験体サンプル中の表２に列挙した太字でないタンパク質の実質的な過剰発現は、ＰＥＳを摂取している被験体を示し得る。同様に、正常なヒト細胞中で見出された同一タンパク質の量と比較した試験被験体の細胞中の表２に列挙した太字のタンパク質の有意な減少は、通常、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、またはそれを超えて異なる。
【０２０５】
被験体サンプル中の表２に列挙した太字のタンパク質の実質的な過小発現は、ＰＥＳを摂取している被験体を示し得る。
【０２０６】
本開示を特定の実施形態に重点をおいて記載しているが、特定の実施形態の変形形態を使用することができ、本明細書中に特記した方法以外の方法で本開示を実施することができることが意図されることが当業者に自明であろう。したがって、本開示には、以下の特許請求の範囲によって定義された本開示の精神および範囲内に含まれる全ての修正形態が含まれる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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