(57)【要約】  本発明は、胞子をハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、及びアンモニウムイオンと接触させることによって、当該胞子を死滅させ、又は不活性化するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の胞子を死滅させ、又は不活性化するための酵素的方法であって、前記胞子を、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、及びアンモニウムイオンと接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ハロペルオキシダーゼが、酵素分類ＥＣ１．１１．１．１０由来のクロロペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハロペルオキシダーゼが、バナジウム含有ハロペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列が、カーブラリア・ベルクロサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）、又はカーブラリア・イナエキュアリス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）から得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩化物イオン又は臭化物イオンが、塩化物塩又は臭化物塩から得られる；好ましくは前記塩化物塩又は臭化物塩が、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化アンモニウム、又は臭化アンモニウム；或いはそれらの混合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アンモニウムイオンが、アンモニウム塩から得られる；好ましくは前記アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、又はヨウ化アンモニウム；或いはそれらの混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
塩化物イオン濃度が、アンモニウムイオン濃度よりも少なくとも２倍高い；好ましくは少なくとも４倍高い、より好ましくは少なくとも６倍高い、最も好ましくは少なくとも８倍高い、そして特に少なくとも１０倍高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記胞子を界面活性剤と接触させることをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物の胞子が、真菌又は細菌の胞子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
過酸化水素が過炭酸塩から得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記胞子が、表面上、例えば布地の表面上、又は実験機器若しくはプロセス機器の表面上、又は医療機器の表面上に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記胞子が、塩化物イオン又は臭化物イオンと接触する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、アンモニウムイオン、及び医療機器を含む組成物。
【請求項１４】
機器を消毒、又は滅菌するための方法であって、前記機器をハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、及びアンモニウムイオンと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記ハロペルオキシダーゼが、酵素分類ＥＣ．１．１１．１．１０由来のクロロペルオキシダーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハロペルオキシダーゼがバナジウム含有ハロペルオキシダーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列が、カーブラリア・ベルクロサ、又はカーブラリア・イナエキュアリスから得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩化物イオン又は臭化物イオンが、塩化物塩又は臭化物塩から得られる；好ましくは前記塩化物塩又は臭化物塩が、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化アンモニウム、又は臭化アンモニウム；或いはそれらの混合物である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンモニウムイオンが、アンモニウム塩から得られる；好ましくは前記アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、又はヨウ化アンモニウム；或いはそれらの混合物である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
塩化物イオン濃度が、アンモニウムイオン濃度よりも少なくとも２倍高い；好ましくは少なくとも４倍高い、より好ましくは少なくとも６倍高い、最も好ましくは少なくとも８倍高い、そして特に少なくとも１０倍高い、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記機器を界面活性剤と接触させることをさらに含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
過酸化水素が過炭酸塩から得られる、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記機器が医療機器である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記機器又は医療機器が、塩化物イオン及び臭化物イオンと接触する、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
胞子を死滅させ、又は不活性化するための、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物塩及び／又は臭化物塩、並びにアンモニウム塩の使用。
【請求項２６】
医療機器を消毒するための、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記医療機器が滅菌される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記ハロペルオキシダーゼが、バナジウム含有クロロペルオキシダーゼである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
洗浄消毒装置（Ｗａｓｈｅｒ−Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｏｒ）における、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、微生物の胞子を死滅させ又は不活性化するための酵素的方法、並びに機器及び装置を消毒又は滅菌するための酵素的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
胞子は、サルシナ（ｓａｒｃｉｎａｅ）及び幾つかの放射菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）から選択される、好気性桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、好気性クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から形成されることが知られている。胞子は、それらが代謝反応を全く行わないという点において、特定の植物の種子と類似する。この点に関して、それらは過酷な環境ストレスに耐えるために特に適合され、そして加熱、乾燥、放射線、及び毒性化合物に対する長期間の暴露において生存することが知られている。これらの特性は、厳しい条件においては副作用を生じるだろう生物組織、又は生物組織と接触する対象のような環境において、胞子を死滅させることを特に困難なものとする。
【０００３】
真菌類、細菌類、及び病原性細菌の栄養細胞は、７０℃において数分間で滅菌され；多くの胞子は、１００℃で滅菌される。しかし、幾つかの腐生菌の胞子は、数時間の煮沸において生存し得る。加熱は現在、胞子の滅菌を確保するために使用される最も一般的な手段である。
【０００４】
胞子の外皮は、当該胞子の全タンパク質の８０％も含む、ケラチン様タンパク質から作られている。このタンパク質外被は、化学的滅菌剤に対する胞子の抵抗性に関与する。微生物の生活環における胞子の段階は、代謝性休眠、及びその成長段階において微生物を破壊するだろう環境要因に対する抵抗性によって特徴付けられる。
【０００５】
微生物の内生胞子及び真菌胞子の発芽は、代謝の増大、並びに加熱及び化学反応剤に対する抵抗性の減少と関連付けられる。発芽が起こるために、胞子は、環境が植生及び繁殖を支持するために十分であることを感知しなければならない。単純アルファアミノ酸は、胞子の発芽を刺激し得る。
【０００６】
欧州特許第５００３８７号明細書において、ハロペルオキシダーゼ、例えばミエロペルオキシダーゼ、好酸球オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、及びクロロペルオキシダーゼを含む酵素的抗菌性組成物が開示されており、そしてそれは過酸化物及びハロゲン化物の存在下、標的微生物に選択的に結合し、そしてその増殖を阻害する。
【０００７】
国際公開第９５／２７０４６号は、バナジウムクロロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物イオン、及び過酸化水素、又は過酸化水素生成剤を含む、抗微生物組成物を開示する。
【０００８】
国際公開第９６／３８５４８号は、ハロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物イオン、過酸化物生成剤、及びアミノ酸種を含む、抗微生物組成物を含む。
【０００９】
本発明は、胞子を死滅させ、又は不活性化するための改善された酵素的方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本発明は、微生物の胞子を死滅させ、又は不活性化するための方法であって、前記胞子を、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素源、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン源、並びにアンモニウムイオン源と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、機器、好ましくは医療機器を消毒、又は滅菌するための方法であって、前記機器を、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン、並びにアンモニウムイオンと接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００１２】
一つの実施形態において、ハロペルオキシダーゼは、クロロペルオキシダーゼ、又はブロモペルオキシダーゼである。別の実施形態において、ハロペルオキシダーゼは、バナジウム含有ハロペルオキシダーゼである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
ハロペルオキシダーゼ、及びハロペルオキシダーゼ活性を示す化合物
本発明の方法に組み込まれるために好適なハロペルオキシダーゼは、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼ、及びクロロペルオキシダーゼ又はブロモペルオキシダーゼ活性を示す化合物を含む。ハロペルオキシダーゼは、酵素の分類を形成し、そしてそれは、過酸化水素の存在下、又は過酸化水素生成系中において、ハロゲン化物（Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-）を酸化して対応する次亜ハロゲン酸とすることができる。
【００１４】
ハロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物イオンに対するそれらの特異性に従って分類される。クロロペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１０）は、塩化物イオンからの次亜塩素酸塩の形成、臭化物イオンからの次亜臭素酸塩の形成、及びヨウ化物イオンからの次亜ヨウ素酸塩の形成を触媒し；そしてブロモペルオキシダーゼは、臭化物イオンからの次亜臭素酸塩の形成、及びヨウ化物イオンからの次亜ヨウ素酸塩の形成を触媒する。しかし、次亜ヨウ素酸塩は、自発的不均化が進行してヨウ素となり、したがってヨウ素が、観測される産生物である。これらの次亜ハロゲン酸塩（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）化合物は、その後他の化合物と反応してハロゲン化化合物を形成する。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明のハロペルオキシダーゼは、クロロペルオキシダーゼである。ハロペルオキシダーゼは、種々の生命体；哺乳動物、海洋動物、植物、藻類、地衣類、真菌及び細菌から単離された。他の酵素が関与され得るが、ハロペルオキシダーゼは、自然界においてハロゲン化された化合物の形成に関与する酵素であるということが、一般的に認められている。
【００１６】
ハロペルオキシダーゼは、多くの異なる真菌から、特に、真菌群である黒色線菌綱（ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ  ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えば、カルダリオミセス（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばＣ．フマゴ（ｆｕｍａｇｏ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）、例えばＣ．ベルクロサ（Ｃ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）及びＣ．イナエキュアリス（Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ウロクラジウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）及びボツリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）から単離された。
【００１７】
ハロペルオキシダーゼはまた、細菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばＰ．ピロシニア（Ｐ．ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えばＳ．アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）から単離された。
【００１８】
好ましい実施形態において、ハロペルオキシダーゼは、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、特にカーブラリア・ベルクロサ（ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）、又はカーブラリア・イナエキュアリスから得られるバナジウムハロペルオキシダーゼ（すなわち、バナジウム又はバナジン酸含有ハロペルオキシダーゼ）であり、例えば国際公開第９５／２７０４６号に記載されたＣ．イナエキュアリス  ＣＢＳ１０２．４２から得られるもの、例えば参照により全てが援用される、国際公開第９５／２７０４６号、図２のＤＮＡ配列によってコードされるバナジウムハロペルオキシダーゼ；或いは国際公開第９７／０４１０２号に記載されたＣ．ベルクロサ  ＣＢＳ１４７．６３、又はＣ．ベルクロサ  ＣＢＳ４４４．７０から得られるものである。好ましくは、ハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、カーブラリア・ベルクロサから得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列（例えば、国際公開第９７／０４１０２号の配列番号２を参照）、又はカーブラリア・イナエキュアリスから得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列（例えば、国際公開第９５／２７０４６号の図２に記載されている図２におけるＤＮＡ配列によってコードされる成熟アミノ酸配列）と、少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、ハロペルオキシダーゼは、バナジウム含有ハロペルオキシダーゼ；特にバナジウムクロロペルオキシダーゼである。当該バナジウムクロロペルオキシダーゼは、国際公開第０１／７９４５９号に記載されたドレクスレラ・ハートレビ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｈａｒｔｌｅｂｉｉ）、国際公開第０１／７９４５８号に記載されたデンドリフィエラ・サリナ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、国際公開第０１／７９４６１号に記載されたファエオトリチョコニス・クロタラリエ（Ｐｈａｅｏｔｒｉｃｈｏｃｏｎｉｓ  ｃｒｏｔａｌａｒｉｅ）、又は国際公開第０１／７９４６０号に記載されているゲニクロスポリウム（Ｇｅｎｉｃｕｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属から誘導され得る。バナジウムハロペルオキシダーゼは、より好ましくはドレクスレラ・ハートレビ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｈａｒｔｌｅｂｉｉ）（ＤＳＭ１３４４４）、デンドリフィエラ・サリナ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）（ＤＳＭ１３４４３）、ファエオトリチョコニス・クロタラリエ（Ｐｈａｅｏｔｒｉｃｈｏｃｏｎｉｓ  ｃｒｏｔａｌａｒｉｅ）（ＤＳＭ１３４４１）又はゲニクロスポリウム（Ｇｅｎｉｃｕｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属（ＤＳＭ１３４４２）から誘導され得る。
【００２０】
ハロペルオキシダーゼの濃度は通常、０．０１〜１００ｐｐｍの酵素タンパク質、好ましくは０．０５〜５０ｐｐｍの酵素タンパク質、より好ましくは１〜４０ｐｐｍの酵素タンパク質、より好ましくは、０．１〜２０ｐｐｍの酵素タンパク質、及び最も好ましくは０．５〜１０ｐｐｍの酵素タンパク質の範囲内である。
【００２１】
一つの実施形態において、ハロペルオキシダーゼの濃度は通常、５〜５０ｐｐｍの酵素タンパク質、好ましくは５〜４０ｐｐｍの酵素タンパク質、より好ましくは８〜３２ｐｐｍの酵素タンパク質の範囲内である。
【００２２】
ハロペルオキシダーゼ活性の決定
ハロペルオキシダーゼ活性を決定するためのアッセイを、１００μｌのハロペルオキシダーゼ試料（約０．２μｇ／ｍｌ）と、１００μｌの０．３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７バッファー−０．５Ｍ臭化カリウム−０．００８％フェノールレッドとを混合し、当該溶液を１０μｌの０．３％Ｈ2Ｏ2溶液に添加し、そして時間の関数として、５９５ｎｍで吸光度を測定することによって実施した。
【００２３】
モノクロロジメドン（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６３２、２９０ｎｍでε＝２００００Ｍ-1ｃｍ-1）を基質として使用する別のアッセイを、時間の関数として、２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することによって実施した。当該アッセイを、０．１Ｍリン酸ナトリウム又は０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５０μＭモノクロロジメドン、１０ｍＭ ＫＢｒ／ＫＣｌ、１ｍＭ Ｈ2Ｏ2、及び約１μｇ／ｍｌハロペルオキシダーゼの水溶液中で行った。１ハロペルオキシダーゼ単位（ＨＵ）は、ｐＨ５及び３０℃で、１分間あたり、塩素化又は臭素化された、１マイクロモルのモノクロロジメドンとして定義される。
【００２４】
過酸化水素
ハロペルオキシダーゼによって必要とされる過酸化水素は、過酸化水素の水溶液として、又は過酸化水素のイン・サイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）製造のための、過酸化水素前駆体の水溶液として提供され得る。溶解時に遊離する任意の固体であって、ハロペルオキシダーゼによって使用可能である過酸化物が、過酸化水素源として有用であり得る。水、又は好適な水性溶媒中に溶解時に過酸化水素を生じる化合物は、限定されないが、金属過酸化物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過酸、アルキルペルオキシド、アシルペルオキシド、ペルオキシエステル、過酸化尿素、過ホウ酸塩、及びペルオキシカルボン酸、又はそれらの塩を含む。
【００２５】
別の過酸化水素源は、過酸化水素生成酵素系、例えばオキシダーゼのための基質と一緒になったオキシダーゼである。オキシダーゼと基質との組み合わせの例は、限定されないが、アミノ酸オキシダーゼ（米国特許第６，２４８，５７５号明細書）及び好適なアミノ酸、グルコースオキシダーゼ（国際公開第９５／２９９９６号）及びグルコース、乳酸オキシダーゼ及び乳酸塩、ガラクトースオキシダーゼ（国際公開第００／５０６０６号）及びガラクトース、並びにアルドースオキシダーゼ（国際公開第９９／３１９９０号）及び好適なアルドースを含む。ＥＣ１．１．３．＿、ＥＣ１．２．３．＿、ＥＣ１．４．３．＿、及びＥＣ１．５．３．＿、又は（国際生化学連合に基づく）類似の分類を試験することによって、オキシダーゼと基質とのかかる組み合わせの他の例は、当業者によって容易に認識され得る。
【００２６】
過酸化水素又は過酸化水素源は、当該工程の開始時又は最中に、例えば０．００１ｍＭ〜２５ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量、好ましくは０．００５ｍＭ〜５ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量、及び特に、０．０１〜１ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量で添加され得る。過酸化水素はまた、０．１ｍＭ〜２５ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量、そして最も好ましくは２〜８ｍＭの過酸化水素レベルに相当する量で使用され得る。
【００２７】
塩化物イオン又は臭化物イオン
本発明にしたがって、ハロペルオキシダーゼとの反応のために必要とされる塩化物イオン又は臭化物イオン（Ｃｌ-又はＢｒ-）は、多くの異なる方法で、例えば塩化物塩又は臭化物塩を添加することによって提供され得る。好ましい実施形態において、塩化物塩又は臭化物塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）、又は臭化アンモニウム；或いはそれらの混合物である。
【００２８】
一つの実施形態において、塩化物イオン又は臭化物イオンは、塩化物イオン（Ｃｌ-）のみに限定される。塩化物イオンは、塩化物塩を水溶液へと添加することによって提供され得る。塩化物塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は塩化アンモニウム；或いはそれらの混合物であり得る。
【００２９】
別の実施形態において、塩化物イオン又は臭化物イオンは、臭化物イオン（Ｂｒ-）のみに限定される。臭化物イオンは、臭化物塩を水溶液へと添加することによって提供され得る。臭化物塩は、臭化ナトリウム、臭化カリウム、又は臭化アンモニウム；或いはそれらの混合物であり得る。
【００３０】
塩化物イオン又は臭化物イオンの濃度は通常、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭの、好ましくは０．０５ｍＭ〜５００ｍＭの、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの、最も好ましくは０．１ｍＭ〜５０ｍＭの、そして特に、１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲内である。塩化物イオン及び臭化物イオンの両方が使用されるとき、塩化物イオン濃度は、臭化物イオン濃度とは独立しており；そして逆も同様である。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明の方法、組成物及び使用は、例えば塩化物塩（単数又は複数）及び臭化物塩（単数又は複数）の混合物を使用することによって提供される、塩化物イオン及び臭化物イオンを含む。
【００３２】
一つの実施形態において、塩化物イオン又は臭化物イオンのモル濃度は、アンモニウムイオン濃度よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも６倍、最も好ましくは少なくとも８倍、そして特に少なくとも１０倍高い。
【００３３】
アンモニウムイオン
本発明の方法に従って微生物の胞子を死滅させ、又は不活性化するために必要とされるアンモニウムイオン（ＮＨ4+）は、多くの異なる方法で、例えばアンモニウム塩を添加することによって提供され得る。好ましい実施形態において、アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）、炭酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＣＯ3）、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）、臭化アンモニウム（ＮＨ4Ｂｒ）、又はヨウ化アンモニウム（ＮＨ4Ｉ）；或いはそれらの混合物である。
【００３４】
アンモニウムイオン濃度は通常、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭの、好ましくは０．０５ｍＭ〜５００ｍＭの、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの、最も好ましくは０．１ｍＭ〜５０ｍＭの、そして特に、１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲内である。
【００３５】
微生物の胞子
本発明のハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、及びアンモニウムイオンを用いて死滅する、又は不活性化される微生物の胞子は、全ての種類の胞子を含む。
【００３６】
一つの実施形態において、微生物の胞子は、内生胞子、例えば全てのクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の胞子、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の胞子、及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の胞子、例えば、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プチダ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄａ）、及びバチルス・プミラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ）から得られる胞子である。
【００３７】
別の実施形態において、微生物の胞子は、外生胞子、例えば、放線菌目の胞子、例えばアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サーモアクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロモノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、及びサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属である。
【００３８】
別の実施形態において、微生物の胞子は、細菌の胞子である。細菌の胞子の例は、限定されないが、例えば上で言及されたようなクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の胞子、及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の胞子を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態において、微生物の胞子は真菌の胞子を含む。真菌の胞子の例は、限定されないが、分生胞子、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属から得られる胞子を含む。
【００４０】
界面活性剤
本発明の方法は、（洗浄剤組成物の一部として、又は湿潤剤として）界面活性剤の適用を含み得る。適用されるために好適である界面活性剤は、（半極性を含む）非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、及び／又は両性イオン性であり得；好ましくは、当該界面活性剤は、陰イオン性（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコールサルフェート）、アルコールエトキシサルフェート、二級アルカン硫酸塩、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸）又は非イオン性（例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）」））或いはそれらの混合物である。
【００４１】
本発明の方法に含まれる時、界面活性剤の濃度は通常、約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％、そしてより好ましくは約０．１重量％〜約１重量％である。
【００４２】
方法及び使用
第一の態様において、本発明は、胞子を死滅させ又は不活性化するための酵素的方法であって、前記胞子を、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン、及びアンモニウムイオンを含む組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。好ましい実施形態において、当該組成物は、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン、及びアンモニウムイオンを含む。別の態様において、本発明は、機器、好ましくは医療機器を消毒、又は滅菌するための方法であって、前記（医療）機器を前記組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００４３】
当該組成物は、液体（例えば水性）又は乾燥製剤として製剤化され得る。乾燥製剤は、その後再度水を含ませて、本発明の方法において使用可能な、活性な液体製剤又は準液体製剤を形成し得る。
【００４４】
当該製剤が乾燥製剤として製剤化されるとき、当該成分は混合され、個別の層に配置され、又は別々に詰められる。
【００４５】
第二の態様において、本発明はまた、本発明の方法を適用することでもたらされる組成物を含む。この場合において、当該組成物は、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、及び微生物の胞子を含むか；或いはハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン又は臭化物イオン、アンモニウムイオン、及び医療機器を含む。
【００４６】
本発明の方法は、細菌兵器剤のような胞子、例えば、炭疽病を引き起こし得るバチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の胞子に曝露された場所の汚染除去のために有用である。
【００４７】
本発明において、用語「胞子を死滅させ又は不活性化すること」は、少なくとも９９％の胞子が栄養細胞へと変形（発芽）できないことを意味する。好ましくは９９．９％、より好ましくは９９．９９％、最も好ましくは９９．９９９％、そして特に９９．９９９９％の胞子は、栄養細胞へと変形することができない。
【００４８】
一つの実施形態において、用語「消毒する」又は「消毒」は、「Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｍａｒｋｅｔ  Ｎｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［５１０（ｋ）］Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｅｒｉｌａｎｔｓ／Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓ」、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｊａｎ．２０００に従う、高レベルの消毒を意味する。
【００４９】
本発明の方法は、０〜９０℃で、好ましくは５〜８０℃で、より好ましくは１０〜７０℃で、さらにより好ましくは１５〜６０℃で、最も好ましくは１８〜５０℃で、そして特に２０〜４０℃で行われ得る。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の方法は、３０〜７０℃で、好ましくは４０〜６０℃で行われ得る。
【００５１】
本発明の方法は、１０分〜（少なくとも）４時間、好ましくは１５分から（少なくとも）３時間、より好ましくは２０分〜（少なくとも）２時間、最も好ましくは２０分〜（少なくとも）１時間、そして特に３０分〜（少なくとも）１時間の処理時間で実施され得る。
【００５２】
本発明の方法は、種々の環境下において、胞子を死滅させ、又は不活性化するために好適である。本発明の方法は、胞子の混入を減らすために、所望であれば任意の環境下で、例えばヘルスケア産業において（例えば、動物病院、ヒトの病院、動物の診療所、ヒトの診療所、養護ホーム、小児又は高齢者のためのデイケア施設などにおいて）、食品産業において（たとえば、レストラン、食品加工工場、食品貯蔵工場、食料品店などにおいて）、サービス業において（例えば、ホテル、モーテル、リゾート、クルーズ船などにおいて）、教育産業において（例えば学校及び大学において）などで使用され得る。
【００５３】
本発明の方法によって利用される比較的低い温度のために、それらは、ヘルスケア産業において使用される機器、例えば医療機器（例えば、乾燥した手術器具、麻酔機器、深みのある容器（ｈｏｌｌｏｗｗａｒｅ）など）を消毒又は滅菌するために非常に有用である。消毒又は滅菌された機器は、変形及び損耗の減少が見られ、そして当該機器は、消毒又は滅菌後に速やかに、使用のための準備がなされている。これは、複雑な又は加熱に敏感な医療機器、例えば異なる材料を含む、超音波トランスデューサー及び内視鏡を、消毒又は滅菌するときに特に有利であり、なぜならばこれらの機器の損耗が著しく減少し、それにより、これらの通常非常に高額な機器のより長い耐久性がもたらされ、そしてそれらの運転費用を効果的に減らすからである。実際、他の非医療タイプの機器、例えば再利用な衛生用品でさえ、本発明の使用によって効果的に消毒又は滅菌され得る。
【００５４】
好ましい実施形態において、医療機器及び／又は非医療用機器の消毒又は滅菌は、本発明を使用して、ＥＮ  ＩＳＯ１５８８３−１に従って、（又は「Ｃｌａｓｓ  Ｉｌ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｗａｓｈｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｗａｓｈｅｒ−Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｏｒｓ；Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  ＦＤＡ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｓｔａｆｆ」，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｆｅｂ．２００２に記載された通りに、）（医療用）洗浄消毒装置（（Ｍｅｄｉｃａｌ）Ｗａｓｈｅｒ−Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｏｒ）において行われる。
【００５５】
本発明の方法は、胞子の混入を減少させるために、好ましくは任意の環境下で、例えば一般的な施設の表面（例えば、床、壁、天井、家具の外装など）、特定の機器の表面（硬表面、製造機器、処理機器など）、布地（例えば、綿、羊毛、生糸、合成繊維、例えばポリエステル、ポリオレフィン、及びアクリル、繊維混合、例えば綿ポリエステルなど）、木質系及びセルロース系のもの（例えば紙）、土、動物の残骸（例えば皮、肉、髪、羽など）、食料品（例えば、果実、野菜、殻果、肉など）及び水に使用され得る。
【００５６】
一つの実施形態において、本発明の方法は、布地の殺胞子処理を指向する。バチルス・セレウス群の胞子は、洗濯後における布地中への主な混入物として同定された。したがって、本発明の組成物を用いた布地の処理は、布地への混入物に対する殺胞子活性に関して特に有用である。
【００５７】
本発明の組成物で処理され得るべき布地は、限定されないが、私物品（例えば、シャツ、パンツ、ストッキング、アンダーシャツなど）、施設用の用品（例えば、タオル、実験用上着、ガウン、エプロンなど）、衛生用品（例えば、タオル、ナプキン、テーブルクロスなど）を含む。
【００５８】
本発明の組成物を用いた布地への殺胞子処理は、布地へ本発明の組成物を接触させることを含み得る。この接触は、当該布地の洗濯前に行われ得る。代わりにこの接触は、当該布地の洗濯中において行われ得、その結果殺胞子活性を提供し、そして場合により、土、染みなどを当該布地から除去又は減らすための洗浄活性を提供する。
【００５９】
本発明の組成物によって接触される胞子は、限定されないが、例えば酪農的、化学的、又は薬学的プロセスプラントにおいて使用されるプロセス機器；医療機器、例えば内視鏡又は他の医療用品；実験機器；洗浄機；水衛生系；油処理施設；紙パルプ処理施設；水処理施設；又は冷却塔の表面を含む、任意の表面に存在し得る。本発明の組成物は、問題になっている表面上の胞子を死滅させ、又は不活性化するために効果的である量で使用されるべきである。
【００６０】
（例えば洗濯工程において）本発明の方法において使用される組成物の水性製剤中に当該胞子を浸すことによって、当該胞子上に当該組成物を噴霧することによって、布地を用いて当該胞子へ当該組成物を適用することによって、又は当業者によって認識される任意の他の方法によって、当該胞子は、当該組成物によって接触され得る。胞子の死滅又は不活性化をもたらす、当該胞子へ本発明の組成物を適用するための任意の方法は、許容可能な適用方法である。
【００６１】
本発明の方法はまた、細菌兵器剤のような胞子（例えば病原性胞子）、例えば、炭疽病を引き起こし得るバチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の胞子に曝露された場所の汚染除去のために有用である。かかる場所は、限定されないが、衣服（例えば軍服）、乗物の内部及び外部、建物の内部及び外部、任意の種類の軍用施設、並びに上で言及された任意の種類の環境を含む。
【００６２】
本発明の方法は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６３】
実施例
バッファー及び基質として使用される化学薬品は、少なくとも試薬グレードの市販品であった。以下の実施例において、”−”は、”未決定”を意味する。
【００６４】
実施例１
胞子の産生
バチルス・グロビジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、又はＢ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（バチルス・チューリンゲンシス基準株ＡＴＣＣ１０７９２）の新鮮培養から得られる、トリプトース血液寒天基礎培地（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）（ＴＢＡＢ）プレートに筋をつけた。当該培養を３０℃で一晩インキュベートした。
【００６５】
ＴＢＡＢプレートからの純粋なバチルスを懸濁し、そして２ｍＬの滅菌水中で懸濁した。２×ＳＧプレートへ、各々１００μＬの細胞懸濁液を用いて植菌した。２×ＳＧの組成は以下の通りである：１６ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、２．０ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．０ｍＬ／１００ｍＬの１０％グルコース、０．１ｍＬ／１００ｍＬの１Ｍ Ｃａ（ＮＯ3）2、０．１ｍＬ／１００ｍＬの０．１Ｍ ＭｎＳＯ4、１０μＬ／１００ｍＬの０．０１Ｍ ＦｅＳＯ4、及び１％  Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ。当該プレートを４８〜７２時間、３０℃インキュベートした。胞子形成を位相差顕微鏡で確認した。胞子は、光沢（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）を有した。
【００６６】
胞子形成の効率が１００％に近いとき、細胞菌叢を、水を用いて採取し、そして当該細胞を激しくボルテックスにかけることによって懸濁した。５〜１０分間、６０００Ｇ、４℃での遠心分離によって細胞を回収した。細胞を氷冷水にて３回洗浄した。ペレットは、栄養細胞及び胞子を含んだ。
【００６７】
胞子を栄養細胞から分離するために、ステップ密度勾配を適用した。各々洗浄したペレットを、３０ｍＬの４３％Ｕｒｏｇｒａｐｈｉｎ（登録商標）を含有する遠心分離チューブへと調製した。最終的なＵｒｏｇｒａｐｈｉｎ濃度が２０％となるように、細胞胞子混合物の３ｍＬ Ｕｒｏｇｒａｐｈｉｎ液を調製した。２０％Ｕｒｏｇｒａｐｈｉｎ細胞／胞子混合物を、４３％Ｕｒｏｇｒａｐｈｉｎの上部層へと静かにロードした。
【００６８】
１００００Ｇで、室温にて３０分間遠心分離した。静かに上清を除去した。
【００６９】
純粋な胞子のペレットを、１ｍＬの氷冷水中で懸濁し、そして微量遠心チューブへと移した。最大速度で、１〜２分間、４℃にて遠心分離し、ペレットを２回以上氷冷水にて洗浄した。
【００７０】
純度及び１ｍＬあたりの胞子数を、位相差顕微鏡及び血球計算器によって確認した。水中で懸濁された胞子を、−２０℃にて貯蔵した。
【００７１】
実施例２
液体調製物中におけるバチルスの胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ、；
−１ｍＬあたり１×１０8個のバチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）、ＭｉｌｌｉＱ水中にて懸濁；
−１ｍＬあたり１×１０8個のバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子（実施例１に従って製造）、ＭｉｌｌｉＱ水中にて懸濁；
−カーブラリア・ベルクロサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｓａ）（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、８００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍＭ 硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ａｇａｒ）（Ｍｅｒｃｋ０２８３）から製造された。
【００７２】
バイアル中で以下のものが混合された：
１０μＬ胞子懸濁液、
２５０μＬ ＤＭＧバッファー、
４０μＬ ＮａＣｌ溶液、
４０μＬ （ＮＨ4）2ＳＯ4溶液、及び
２０μＬ ハロペルオキシダーゼ溶液。
４０μＬの過酸化水素を添加して、反応を開始した。
【００７３】
１０μＬの胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を含むバイアルを対照として使用した。
【００７４】
バイアルを室温（約２３℃）で１１０分間インキュベートした。その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そして２組のプレートの個々の対における、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した（表１を参照）。
【００７５】
【表１】
2011500761.tif 000002
【００７６】
表１に示される結果は、本発明のハロペルオキシダーゼが、明確かつ著しい殺胞子効果を有することを示した。処理後に発芽することのできる胞子数は、少なくとも５ ｌｏｇ単位減少した。
【００７７】
実施例３
ステンレス鋼表面上におけるバチルス胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調節されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ Ｄ４３７９）、５０ｍＭ、；
−カーブラリア・ベルクロサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｓａ）（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、５０ｍＭ ＤＭＧバッファー中、２００ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、４００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍＭ 硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−５％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）
−５ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液、及び約１ｍＬのガラスビーズ（３ｍｍ）を含有するチューブ；並びに
−ＬＢプレートは、１０００ｍＬ水中に溶解された、３７ｇのＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ０２８３）から製造された。
【００７８】
各々１０6個のバチルス・アトロファエウス胞子（Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ  ｃａｔ．＃１−６１００ＳＴ）を含有するステンレス鋼ディスクを実験に使用した（一つのディスクを一つの処理のために使用した）。
【００７９】
バイアル中に以下の成分を混合した：
３７３．７５μＬ ＤＭＧバッファー、
３１．２５μＬ ＮａＣｌ溶液、
２５μＬ（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液、及び
２０μＬハロペルオキシダーゼ溶液、
１個のバチルス・アトロファエウス胞子ディスク（１０6個の胞子）。
【００８０】
当該反応を、５０μＬの過酸化水素を添加して開始した。胞子ディスク及び５００μＬ ＤＭＧバッファーを有するバイアルを対照として使用した。
【００８１】
当該バイアルを、４０℃で４５分間インキュベートした。反応を停止するために、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、そして１５分間、室温（約２３℃）でインキュベートした。個々のディスクを、Ｔｗｅｅｎ８０及びガラスビーズを含有するチューブへと移し、そして当該チューブを１５分間、３００ｒｐｍで振盪した。
【００８２】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、１０-1〜１０-3希釈液から５００μＬを、ＬＢアガープレート（１４ｃｍプレート）上へと蒔いた。１０0溶液からの残余の液体（約４．９ｍＬ）を大きなＬＢプレート（正方形、２０×２０ｃｍプレート）上へと蒔いた。
【００８３】
当該プレートを４８時間、３７℃でインキュベートし、そして個々のプレート上におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した（表２を参照）。
【００８４】
【表２】
2011500761.tif 000003
【００８５】
表２に示された結果は、本発明のハロペルオキシダーゼ溶液が、明確かつ著しい殺胞子効果を有することを示す。処理後に発芽することができる胞子数は、６ ｌｏｇ単位減少した。
【００８６】
実施例４
市販の洗浄剤の使用を含む、表面上における、バチルス胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−水を用いて特定の作用溶液へと希釈された、市販の洗浄剤（ｐＨ７．０）；
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調節されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ Ｄ４３７９）、５０ｍＭ；
−カーブラリア・ベルクロサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｓａ）（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、５０ｍＭ ＤＭＧバッファー中、２００ｍｇ／Ｌハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、４００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍＭ 硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−５％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；
−５ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液、及び約１ｍＬのガラスビーズ（３ｍｍ）を含有するチューブ；並びに
−ＬＢプレートは、１０００ｍＬ水中に溶解された、３７ｇのＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ０２８３）から製造された。
【００８７】
各々１０6個のバチルス・アトロファエウス胞子（Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ  ｃａｔ．＃１−６１００ＳＴ）を含有するステンレス鋼ディスクを実験に使用した（一つのディスクを一つの処理のために使用した）。
【００８８】
３つのバイアルを、表３に示されるように調製した。バイアル１及びバイアル２中の反応は、５０μＬの過酸化水素を添加することによって開始された。
【００８９】
【表３】
2011500761.tif 000004
【００９０】
表３からのバイアルを、４０℃で３０分間インキュベートした。反応を停止するために、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、そして１５分間、室温（約２３℃）でインキュベートした。個々のディスクを、Ｔｗｅｅｎ８０及びガラスビーズを含有するチューブへと移し、そして当該チューブを１５分間、３００ｒｐｍで振盪した。
【００９１】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-3希釈液から５００μＬを、ＬＢアガープレート（１４ｃｍプレート）上へと蒔いた。当該プレートを４８時間、３７℃でインキュベートし、そして個々のプレート上におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した（表４を参照）。
【００９２】
【表４】
2011500761.tif 000005
【００９３】
表４に示される結果は、本発明の過酸化水素溶液が、明確かつ著しい殺胞子効果を有することを示し、そしてそれは、当該溶液が市販の洗浄剤と共に使用されるときに増強された。
【００９４】
ハロペルオキシダーゼ溶液単独で処理された後に発芽することのできる胞子数は、４ ｌｏｇ単位減少した。当該溶液が、市販の洗浄剤と共に使用される場合、発芽することができる胞子数は、４〜５ ｌｏｇ単位減少した。
【００９５】
実施例５
塩化物イオン、臭化物イオン、及びアンモニウムイオンの組み合わせを用いた胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ、；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、４０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５００ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ０２８３）から製造された。
バイアル中に、試薬を表５に従って混合した。
【００９６】
【表５】
2011500761.tif 000006
【００９７】
過酸化水素を添加することによって反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【００９８】
当該バイアルを、４０℃で３０分間インキュベートした。反応をその後、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１５分間反応させてクエンチした。
【００９９】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そしてプレートの個々の組における、１プレートあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／プレート）の平均数を記録した（表６を参照）。
【０１００】
【表６】
2011500761.tif 000007
【０１０１】
表６に示された結果は、ハロペルオキシダーゼ／塩化物／アンモニウム溶液への臭化物の添加は、少なくとも１ ｌｏｇ単位、殺胞子効果を上昇させることを示す。
【０１０２】
当該処理後に発芽することのできる胞子数は、塩化物／アンモニウム／ハロペルオキシダーゼ溶液で単独で処理された場合よりも、少なくとも１ ｌｏｇ単位減少した。
【０１０３】
実施例６
塩化物イオン／臭化物イオンの比を変化させての、バチルス胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された。
バイアル中に、表７に従って試薬を混合した。
【０１０４】
【表７】
2011500761.tif 000008
【０１０５】
過酸化水素を添加することによって当該反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【０１０６】
当該バイアルを、２２℃で３０分間インキュベートした。反応をその後、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１５分間反応させてクエンチした。
【０１０７】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そしてプレートの個々の組における、１プレートあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／プレート）の平均数を記録した（表８を参照）。
【０１０８】
【表８】
2011500761.tif 000009
【０１０９】
当該結果は、殺生物効果が、臭化物の濃度から大体独立していることを示すが、低い臭化物／塩化物比率で、微かに優れた死滅の傾向を示した。
【０１１０】
実施例７
種々のｐＨでの液体調製物中におけるバチルス胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−以下のｐＨ値であるリン酸バッファー、１００ｍＭ：ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．４、及びｐＨ８．０；
−ブリトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）バッファー、１００ｍＭ、ｐＨ８．５；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された。
バイアル中に、表９に従って試薬を混合した。
【０１１１】
【表９】
2011500761.tif 000010
【０１１２】
過酸化水素を添加することによって当該反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【０１１３】
当該バイアルを、室温（約２２℃）、４０℃、又は５０℃のいずれかで、３０分間インキュベートした。
【０１１４】
５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１０分間反応させて、反応をクエンチした。
【０１１５】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そして２組のプレートの個々の対におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した（以下の表１０〜１２を参照）。
【０１１６】
表１０  インキュベーション温度＝２２℃。ハロペルオキシダーゼ／塩化物／アンモニウム溶液を用いて処理された、各々の胞子希釈液における平均ＣＦＵ。
【０１１７】
【表１０】
2011500761.tif 000011
【０１１８】
表１１  インキュベーション温度＝４０℃。ハロペルオキシダーゼ／塩化物／アンモニウム溶液を用いて処理された、各々の胞子希釈液における平均ＣＦＵ。
【０１１９】
【表１１】
2011500761.tif 000012
【０１２０】
表１２  インキュベーション温度＝５０℃。ハロペルオキシダーゼ／塩化物／アンモニウム溶液を用いて処理された、各々の胞子希釈液における平均ＣＦＵ。
【０１２１】
【表１２】
2011500761.tif 000013
【０１２２】
結果を、以下の表１３に要約した。
【０１２３】
【表１３】
2011500761.tif 000014
【０１２４】
表１３に示された結果は、ハロペルオキシダーゼ／塩化物／臭化物／アンモニウム溶液が、明確かつ著しい殺胞子効果を有することを示す。当該効果は、試験した３つの温度の全てにおいて、ｐＨ６．５〜７．４の範囲内でその最大値であった。
【０１２５】
実施例８
Ｈ2Ｏ2濃度を変化させての、胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２５ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された。
バイアル中に、表１４に従って試薬を混合した。
【０１２６】
【表１４】
2011500761.tif 000015
【０１２７】
過酸化水素を添加することによって当該反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【０１２８】
当該バイアルを、室温（約２２℃）で３０分間インキュベートした。反応をその後、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１０分間室温で反応させてクエンチした。
【０１２９】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そして２組のプレートの個々の対における、１プレートあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／プレート）の平均数を記録した（表１５を参照）。
【０１３０】
【表１５】
2011500761.tif 000016
【０１３１】
表１５の結果は、最も高い死滅が、２〜５ｍＭ Ｈ2Ｏ2で達成され、そしてこのことは、これが、これらの実験条件下における最適過酸化水素濃度であることを示す。１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲における全ての濃度は、許容される除染作用を与える。
【０１３２】
実施例９
一定のハロペルオキシダーゼ濃度における、塩化物／臭化物／アンモニウムの比を変化させながらの胞子の死滅； 
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２０ｍＭ 硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍＭ 硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２５ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された。
【０１３３】
先の実施例の方法及び原理に従って、５００μＬの反応混合物を、上記の溶液を使用して作製した。胞子の処理を、以下のものを含有するバイアル中で行った：
種々の組み合わせにおける、
−０ｍＭ／０．５ｍＭ／１ｍＭ／５ｍＭ臭化物（Ｂｒ-）；
−０ｍＭ／２５ｍＭ／５０ｍＭ／６６．７ｍＭ／１００ｍＭ／１５０ｍＭ塩化物（Ｃｌ-）；及び
−０ｍＭ／０．１ｍＭ／１ｍＭ／５ｍＭ／１０ｍＭ／１６．７ｍＭ／２５ｍＭ／５０ｍＭ／１００ｍＭアンモニウム（ＮＨ4+）；並びに
−８ｐｐｍハロペルオキシダーゼ；
−２ｍＭ Ｈ2Ｏ2；
−２ｘ１０7個の胞子；
−１０ｍＭ ＤＭＧバッファー；及び
−ＭｉｌｌｉＱ水、さらに５００μＬ。
【０１３４】
過酸化水素を添加することによって当該反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【０１３５】
当該バイアルを、室温（約２２℃）で３０分間インキュベートした。５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１０分間室温で反応させて、反応をクエンチした。
【０１３６】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そしてプレートの個々の組における、１プレートあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／プレート）の平均数を記録した。
【０１３７】
ＣＦＵ／ｍＬ値を使用して、胞子の死滅をｌｏｇ単位で算出し、その結果を表１６に示す。
【０１３８】
【表１６】
2011500761.tif 000017
【０１３９】
【表１７】
2011500761.tif 000018
【０１４０】
塩化物／臭化物／アンモニウムの比率は性能に影響した；一般的に、１／１０の臭化物／アンモニウムのモル比率が最も高い死滅をもたらした。
【０１４１】
塩化物濃度が低いほど、より低い臭化物又はアンモニウム濃度が、十分な胞子死滅のために必要とされる。
【０１４２】
最も優れた胞子死滅性能は、以下を用いて得られた：
［塩化物］≦２５ｍＭ；
０．１ｍＭ≦［臭化物］≦１ｍＭ；及び
５ｍＭ≦［アンモニウム］≦２５ｍＭ。
【０１４３】
実施例１０
塩化物／臭化物／アンモニウムの比を変化させながらの；及びハロペルオキシダーゼ濃度／過酸化水素濃度を変化させながらの、胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−１ｍＬあたり１×１０9個のバチルス・アトロファエウス胞子（バチルス・アトロファエウス胞子：ＳＵＳ−１−８Ｌｏｇ。Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ，ｗｗｗ．Ｒａｖｅｎｌａｂｓ．ｃｏｍ）；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５０ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２５ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；及び
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された。
【０１４４】
先の実施例の方法及び原理に従って、５００μＬの反応混合物を、上記の溶液を使用して作製した。反応をバイアル中で行った。構成成分の最終濃度を、表１７中で示す。
【０１４５】
【表１８】
2011500761.tif 000019
【０１４６】
ハロペルオキシダーゼ／過酸化水素の比率は、実施例６で最適であることが判明したものと同一であった。過酸化水素を添加することによって当該反応を開始した。１０μＬ胞子懸濁液及び４９０μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を有するバイアルを対照として使用した。
【０１４７】
当該バイアルを、６０℃で３０分間インキュベートした。５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、１０分間室温で反応させて、反応をクエンチした。
【０１４８】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０5希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート上へと（２組）蒔いた。当該プレートを４８時間、３３℃でインキュベートし、そしてプレートの個々の組における、１プレートあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／プレート）の平均数を記録した。
【０１４９】
ＣＦＵ／ｍＬ値を使用して、胞子の死滅をｌｏｇ単位で算出し、その結果を表１８に示す。
【０１５０】
【表１９】
2011500761.tif 000020
【０１５１】
最も優れた胞子死滅性能は、以下を用いて得られた：
［ハロペルオキシダーゼ］＝３２ｐｐｍ；
５ｍＭ≦［塩化物］≦２０ｍＭ；
０ｍＭ≦［臭化物］≦２ｍＭ；及び
２．５ｍＭ≦［アンモニウム］≦５ｍＭ。
【０１５２】
実施例１１
真菌胞子の産生
トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）ＡＴＣＣ９２３３を、ＭＥＡプレート上で培養し、そしてアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ９６４２をＭＥＡスラント上で増殖させた。
【０１５３】
ＭＥＡ培養培地を、脱イオン水を用いて以下の通りに製造した：３０ｇ／Ｌ麦芽抽出物、３ｇ／Ｌソジャ・ペプトン（Ｓｏｊａ  ｐｅｐｔｏｎｅ）（パパイン消化物（ｐａｐａｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ）又は大豆粉末）、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ未調整。
【０１５４】
トリコフィトン・メンタグロフィテスを、ＭＥＡペトリ皿の中心に植菌し、そして３０℃で１０〜１２日間インキュベートした。
【０１５５】
プレートをその後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０含有Ｍ９バッファーを用いて浸し、そしてドリガルスキー（Ｄｒｉｇａｌｓｋｉ）スパチュラを用いて、無光沢の菌糸を静かに動かすことによって、当該胞子を懸濁液とした。当該細胞懸濁液をその後、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通じて濾過して菌糸を除去し、そしてその後胞子数を、血球計算器で数えることによって決定した。この胞子懸濁液を実験で使用した。
【０１５６】
活発に胞子形成しているＡ．ニゲルのスラントを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０含有Ｍ９バッファーと共に採取し、そして滅菌性Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通じて胞子含有液体を濾過し、菌糸を除去した。
【０１５７】
Ｍ９の組成は、以下の通りである：ＭｉｌｌｉＱ水中に、８．７７ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ，２Ｈ2Ｏ）、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、４ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4，７Ｈ2Ｏ）を溶解した。
【０１５８】
胞子数をその後、血球計算器で数えることによって決定し、そして当該胞子懸濁液を約１×１０7個胞子／ｍＬへと調整した。この胞子懸濁液を実施例において使用した。当該胞子懸濁液を、４℃にて最大４日間貯蔵した。
【０１５９】
実施例１２
新たに調製された真菌胞子の系を用いた、真菌胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−アスペルギルス・ニゲルＡＴＣＣ９６４２の胞子懸濁液、１×１０7個胞子／ｍＬ；
−トリコフィトン・メンタグロフィテスＡＴＣＣ９２３３の胞子懸濁液、１×１０7個胞子／ｍＬ；
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過炭酸ナトリウム（２Ｎａ2ＣＯ3・３（Ｈ2Ｏ2））；及び
−ＹＰＤプレートが：１０００ｍＬ水中に溶解された、ｐＨ未調整の、１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇデキストロース、２０ｇ寒天から製造された。
【０１６０】
表１９に従って、バイアル中に試薬を混合した。使用される胞子は、全て新たに製造された（４℃にて少しの時間も貯蔵されなかった）。
【０１６１】
【表２０】
2011500761.tif 000021
【０１６２】
過炭酸塩以外の全ての試薬を、１．８ｍＬ ＮＵＮＣクライオチューブ中に混合し；胞子を添加し、そして過炭酸塩溶液を添加することによって実験を開始した。
【０１６３】
（サーモブロック中）４０℃で３０分間、当該チューブをインキュベートした。３０分のインキュベーション後、５００μＬ滅菌水を各々のチューブへと添加し、そして１０倍希釈系列を作製した。
【０１６４】
未希釈試料からの２００μＬ、及び個々の希釈液からの１００μＬを、ＹＰＤプレート上に配置した。当該プレートを、３０℃にて２〜４日間インキュベートし、そしてＣＦＵ／ｍＬを算出した。
【０１６５】
５０μＬの胞子懸濁液を、希釈系列を含有する４５０μＬの滅菌水へと添加し、１００μＬ／プレートで配置し、そしてＣＦＵ／ｍＬを算出し、増殖の対照として使用した。
【０１６６】
アスペルギルス胞子は疎水性であり、そして均一の懸濁液で当該胞子を得ることは困難であった。
【０１６７】
表２０は、記録されたＣＦＵ／プレート、及び算出されたＣＦＵ／ｍＬ、並びに胞子死滅（Ｌｏｇ単位）を示す。
【０１６８】
【表２１】
2011500761.tif 000022
【０１６９】
トリコフィトンの胞子は、完全に不活性化されたが、一方でアスペルギルスの胞子の処理は、生存胞子数において３ ｌｏｇ単位の減少をもたらした。
【０１７０】
実施例１３
貯蔵された真菌胞子における、真菌胞子の死滅
以下の試薬を調製した：
−アスペルギルス・ニゲルＡＴＣＣ９６４２の胞子懸濁液、１×１０7個胞子／ｍＬ、４℃にて２日間貯蔵；
−トリコフィトン・メンタグロフィテスＡＴＣＣ９２３３の胞子懸濁液、１×１０7個胞子／ｍＬ、４℃にて２日間貯蔵；
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、１００ｍＭ；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ 臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ 過炭酸ナトリウム（２Ｎａ2ＣＯ3・３（Ｈ2Ｏ2））；及び
−ＹＰＤプレートが：１０００ｍＬ水中に溶解された、ｐＨ未調整の、１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇデキストロース、２０ｇ寒天から製造された。
表２１に従って、バイアル中に試薬を混合した。
【０１７１】
【表２２】
2011500761.tif 000023
【０１７２】
過炭酸塩以外の全ての試薬を、１．８ｍＬ ＮＵＮＣクライオチューブ中に混合し；胞子を添加し、そして過炭酸塩溶液を添加することによって実験を開始した。
【０１７３】
（サーモブロック中）４０℃で３０分間、当該チューブをインキュベートした。３０分のインキュベーション後、１０倍希釈系列を作製した。
【０１７４】
個々の希釈液からの３３３μＬを、ＹＰＤプレート上に配置した。当該プレートを、３０℃にて２〜４日間インキュベートし、そしてＣＦＵ／ｍＬを算出した。
【０１７５】
５０μＬの胞子懸濁液を、希釈系列を含有する４５０μＬの滅菌水へと添加し、１００μＬ／プレートで配置し、そしてＣＦＵ／ｍＬを算出し、増殖の対照として使用した。
【０１７６】
表２２は、記録されたＣＦＵ／プレート、及び算出されたＣＦＵ／ｍｌ、並びに胞子死滅（Ｌｏｇ単位）を示す。
【０１７７】
【表２３】
2011500761.tif 000024
【０１７８】
トリコフィトン胞子及びアスペルギルス胞子の両方の処理は、生存胞子数において少なくとも５ ｌｏｇ単位の減少をもたらした。
【０１７９】
実施例１４
ポリエステル縫合糸（ｓａｔｕｒｅ）上における、バチルス・サブチリスの死滅
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４３７９）、５０ｍＭ；
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調整されたリン酸バッファー、１００ｍＭ；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、５０ｍＭ ＤＭＧバッファー中、２００ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、４００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、２００ｍＭ 塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、４０ｍＭ 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
１０％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）；
−４０°ｄＨである合成硬水；及び
−市販の非イオン性界面活性剤の、２００×希釈液。
【０１８０】
他の材料：
−５ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液、及び約１ｍＬのガラスビーズ（直径３ｍｍ）を含有するチューブ；
−ＬＢプレートが、１０００ｍＬ水中に溶解された３７ｇＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ ０２８３）から製造された；
−Ｎｕｎｃクライオチューブ；
−調節可能なヒーティングブロック；及び
−１０6個のバチルス・サブチリス ＡＴＣＣ１９６５９胞子でコーティングされたポリエステル縫合糸（Ｐｒｅｓｑｕｅ  Ｉｓｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＳＰ−ＢＳ）が、実験のために使用された（一つの縫合糸が、一つの処理のために使用された）。
【０１８１】
Ｎｕｎｃクライオチューブ中に、以下の成分が混合された：
５０μＬリン酸バッファー、
１２．５μＬ ＮａＣｌ溶液、
２５μＬ ＮＨ4Ｃｌ溶液、
１６０μＬハロペルオキシダーゼ溶液、
５００μＬ合成硬水４０°ｄＨ、
１５．４μＬ ２００×希釈された非イオン性界面活性剤、
３７．１μＬ ＭｉｌｌｉＱ水、及び
バチルス・サブチリス胞子でコーティングされた、一つのポリエステル縫合糸（１０6個の胞子）。
【０１８２】
陰性対照を上記の通り調製したが、ハロペルオキシダーゼ溶液をＭｉｌｌｉＱ水に置き換えた。
【０１８３】
当該反応をその後、２００μＬの過酸化水素を添加することにより開始した。当該バイアルを４０℃で２０分間インキュベートした。反応を停止するために、５００μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、そして室温（約２３℃）で１０分間インキュベートした。各々の縫合糸をその後、１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液及びガラスビーズを含有するチューブへと移し、そして当該チューブを１５分間３００ｒｐｍで振盪し、残余の胞子を回収した。
【０１８４】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-3希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート（１４ｃｍプレート）上に蒔いた。当該プレートを４８時間、３７℃でインキュベートし、そして個々のプレート上におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した。そしてそれは表２３において示される。回収された細菌中におけるｌｏｇ減少（死滅）を算出するために、コロニー数が使用され、そしてそれを表２３に示す。
【０１８５】
【表２４】
2011500761.tif 000025
【０１８６】
表２３において示される結果は、本発明のハロペルオキシダーゼ溶液は、陰性対照と比較して、明確かつ著しい殺胞子効果を有することを示す。ハロペルオキシダーゼを用いた処理後において発芽可能な胞子数は、９０分で６ ｌｏｇ単位減少した。
【０１８７】
実施例１５
ステンレス鋼担体上におけるバチルス・アトロファエウス胞子の消毒
以下の試薬を調製した：
−ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０へと調節されたＤＭＧバッファー（ジメチルグルタミン酸、Ｓｉｇｍａ Ｄ４３７９）、５０ｍＭ；
−カーブラリア・ベルクロサ（国際公開第９７／０４１０２号を参照）から得られる、５０ｍＭ ＤＭＧバッファー中、２００ｍｇ／Ｌ ハロペルオキシダーゼ；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、４００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１００ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、１０ｍＭ過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）；
−ＭｉｌｌｉＱ水中、５０ｍＭ臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）；
−５％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）。
【０１８８】
他の材料：
−５ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液、及び約１ｍＬのガラスビーズ（直径３ｍｍ）を含有するチューブ；
−ＬＢプレートは、１０００ｍＬ水中に溶解された、３７ｇのＬＢアガー（Ｍｅｒｃｋ  ０２８３）から製造された；
−Ｎｕｎｃクライオチューブ；
−調節可能なヒーティングブロック；及び
−各々１０6個のバチルス・アトロファエウス胞子（Ｒａｖｅｎ  Ｌａｂｓ  ｃａｔ．＃１−６１００ＳＴ、ＡＴＣＣ９３７２）を含有するステンレス鋼ディスクを実験に使用した（一つのディスクを一つの処理のために使用した）。
【０１８９】
Ｎｕｎｃクライオチューブ中に、以下の成分が混合された：
４７８μＬ ＤＭＧバッファー、
７．５μＬ ＮａＢｒ（ＮａＢｒを用いない実験においては、ＤＭＧと置き換えた）、
４７μＬ ＮａＣｌ溶液、
３８μＬ （ＮＨ4）2ＳＯ4溶液
３０μＬハロペルオキシダーゼ溶液、及び
一つのバチルス・アトロファエウス胞子ディスク（１０6個の胞子）。
【０１９０】
死滅効率に対する臭化ナトリウムの効果を試験するために、ＮａＢｒを用いた場合、及び用いない場合の両方で実験を行った。後者の実験においては、ＮａＢｒをＤＭＧバッファーに置き換えた。
【０１９１】
陰性対照を上記の通り調製したが、ハロペルオキシダーゼ溶液をＤＭＧバッファーに置き換えた。
【０１９２】
当該反応をその後、１５０μＬの過酸化水素を添加することにより開始した。当該バイアルを４０℃で２０分間インキュベートした。反応を停止するために、７５０μＬのチオ硫酸ナトリウムを添加し、そして室温（約２３℃）で１０分間インキュベートした。各々のディスクをその後、１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液及びガラスビーズを含有するチューブへと移し、そして当該チューブを１５分間３００ｒｐｍで振盪し、残余の胞子を回収した。
【０１９３】
その後、希釈系列をＭｉｌｌｉＱ水で作製し、そして１０0〜１０-3希釈液から１００μＬを、ＬＢアガープレート（１４ｃｍプレート）上に蒔いた。当該プレートを４８時間、３７℃でインキュベートし、そして個々のプレート上におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を記録した。
【０１９４】
回収された細菌数中におけるｌｏｇ減少（死滅）を算出するために、コロニー数が使用され、そしてそれを表２４に示す。
【０１９５】
【表２５】
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【国際調査報告】
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