(57)【要約】  ダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来の組成物を提供する。また、特定の細胞において、特にヒトにおいてアポトーシスを誘導するための前記エキスの使用方法を提供する。また、アポトーシスの選択的誘導のための医薬の調製のためのダイオウエキスの使用を提供する。【選択図】なし
2011522822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉまたは６：
【化１】
2011522822.tif 000024
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル、ｉ−ブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである；または、式６中、オクタヒドロキシアントラキノン（式６）である）：
【化２】
2011522822.tif 000025
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含み、式Ｉの化合物および／またはオクタヒドロキシアントラキノンの少なくとも１種類が、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレートされるのに充分な量で含まれる医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１種類の単離精製された式６の化合物と、少なくとも１種類の式Ｉ：
【化３】
2011522822.tif 000026
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル、ｉ−ブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである、および式６中、オクタヒドロキシアントラキノン（式６））：
【化４】
2011522822.tif 000027
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の化合物とを含み、少なくとも１種類の式Ｉの化合物とオクタヒドロキシアントラキノン（６）が、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレートされるのに充分な総合量で含まれる医薬組成物。
【請求項３】
少なくとも１種類の式Ｉの化合物が化合物１、２および３から選択され、該化合物１、２および３が、式ＩＩ：
【化５】
2011522822.tif 000028
（式中、化合物（１）では、ＲＡがＯＨであり、ＲＢがＣＨ３である；化合物（２）では、ＲＡがＨであり、ＲＢがＣＨ２ＯＨである；および化合物（３）では、ＲＡがＨであり、ＲＢがＣＨ３である）；のものであり、式（６）の化合物が
【化６】
2011522822.tif 000029
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
（６）と、（１）、（２）および／または（３）のうちの２種類以上とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
（６）と、（１）、（２）および／または（３）の３種類全てとを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
該組成物が、ラインとフラングリンＡの少なくとも一方を実質的に含まない、請求項１〜８いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
該組成物が、ラインとフラングリンＡの両方を実質的に含まない、請求項１〜８いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬の製造における使用のための請求項１〜１０いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
該医薬が選択的エストロゲン受容体β−アゴニスト効果を有するものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つの更年期症状の治療または予防；骨粗鬆症の治療または予防；子宮癌の治療または予防；乳癌の治療または予防；頚部癌の治療または予防；卵巣癌の治療または予防；および心血管疾患の治療または予防に充分なエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を作動するエストロゲン様効果を有するものである、請求項１〜１２いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
該エストロゲン様効果が、のぼせ、不眠、膣乾燥、性欲減退、尿失禁および鬱の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの更年期症状の治療または予防に充分である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該エストロゲン様効果が骨粗鬆症の治療または予防に充分である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
該エストロゲン様効果がのぼせの治療または予防に充分である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
該エストロゲン様効果が子宮癌または乳癌の治療または予防に充分である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
該エストロゲン様効果が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの増大を含まない、請求項１３〜１７いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
該エストロゲン様効果が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの低下を含む、請求項１３〜１７いずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬の調製のための請求項１〜１９いずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１９いずれか一項に記載の組成物を、少なくとも１種類のさらなる薬学的に許容され得る成分と合わせることを含み、該さらなる成分は活性または不活性である、医薬の単位投薬形態の調製方法。
【請求項２２】
被検体に、式Ｉまたは６：
【化７】
2011522822.tif 000030
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣＨ２ＯＨである；
および式６中、化合物６は式を有する）：
【化８】
2011522822.tif 000031
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含む組成物のエストロゲン様有効量を投与することを含み、患者に投与される該量は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレート（例えば、作動）されるのに充分である、エストロゲン様効果の誘発方法。
【請求項２３】
被検体に、オクタヒドロキシアントラキノン（６）を含む化合物と、少なくとも１種類の単離精製された式Ｉ：
【化９】
2011522822.tif 000032
（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１  Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣＨ２ＯＨである；
および、化合物６は式を有する）：
【化１０】
2011522822.tif 000033
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の化合物とを含む組成物のエストロゲン様有効量を投与することを含み、該投与量は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレート（例えば、作動）されるのに充分である、エストロゲン様効果の誘発方法。
【請求項２４】
少なくとも１種類の式Ｉの化合物が、式ＩＩ：
【化１１】
2011522822.tif 000034
（式中、化合物（１）では、ＲＡがＯＨであり、ＲＢがＣＨ３である；化合物（２）では、ＲＡがＨであり、ＲＢがＣＨ２ＯＨである；および化合物（３）では、ＲＡがＨであり、ＲＢがＣＨ３である）
の化合物１、２および３から選択され、式（６）の化合物が
【化１２】
2011522822.tif 000035
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該組成物が、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該組成物が、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該組成物が、（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該組成物が、（６）と、（１）、（２）および／または（３）のうちの２種類以上とを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該組成物が、（６）と、（１）、（２）および／または（３）の３種類全てとを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
該組成物が、ラインおよびフラングリンＡの少なくとも一方を実質的に含まない、請求項２３〜２９いずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
該組成物が、ラインとフラングリンＡの両方を実質的に含まない、請求項２２〜２９いずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
該エストロゲン様効果が、少なくとも１つの更年期症状の治療または予防；骨粗鬆症の治療または予防；子宮癌の治療または予防；乳癌の治療または予防；頚部癌の治療または予防；卵巣癌の治療または予防；および心血管疾患の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの効果を含む、請求項２２〜３０いずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
該エストロゲン様効果が、のぼせ、不眠、膣乾燥、性欲減退、尿失禁および鬱の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの更年期症状の治療または予防を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該エストロゲン様効果が骨粗鬆症の治療または予防を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該エストロゲン様効果がのぼせの治療または予防を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
該エストロゲン様効果が子宮癌または乳癌の治療または予防を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
該エストロゲン様効果が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの増大を含まない、請求項２２〜３６いずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
該エストロゲン様効果が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの低下を含む、請求項２２〜３６いずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
該エストロゲン応答エレメントの制御下にある遺伝子の活性化方法であって、該遺伝子に作動可能に連結させたエストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体を有する細胞に、前記遺伝子を活性化させるのに充分な量の請求項１〜１０いずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記細胞がインビトロである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞がインビボである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞がＥＲα＋乳腺組織内に存在するものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞がＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞がＥＲα／ＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記エストロゲン応答エレメントを、形質転換細胞において発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
エストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体の両方を、形質転換細胞において発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記エストロゲン応答エレメントを該細胞において異種発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
エストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体の両方を該細胞において異種発現させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、ＥＲＥ制御型遺伝子で形質転換させたＵ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
該細胞がＥＲαを発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該細胞がＥＲβを発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
該ＥＲＥ制御型遺伝子がＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＴＮＦ応答エレメントの制御下にある遺伝子とエストロゲン受容体を含む細胞に、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子を抑制するのに有効な量の請求項１〜１０いずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子の発現の抑制方法。
【請求項５４】
該ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子がＴＮＦ−αである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子がＴＮＦ  ＲＥ−Ｌｕｃである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞がインビトロである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞がインビボである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞がＥＲ＋乳腺組織内に存在するものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞がＥＲα＋乳腺組織内に存在するものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞がＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＴＮＦ応答エレメントが該細胞において内生的に発現される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
該ＴＮＦ応答エレメントと該エストロゲン受容体の両方が該細胞において内生的に発現される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＴＮＦ応答エレメントを該細胞において異種発現させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該ＴＮＦ応答エレメントと該エストロゲン受容体の両方を該細胞において異種発現させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が、エストロゲン受容体遺伝子を含み、ＴＮＦ応答エレメント制御型遺伝子で形質転換され、Ｕ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
該エストロゲン受容体遺伝子がＥＲα発現遺伝子である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該エストロゲン受容体遺伝子がＥＲβ発現遺伝子である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；
（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；
（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；
（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；
（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、該ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；
（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；
（ｇ）該酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；
（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；
（ｉ）該抽出基材を、溶出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）水性酢酸アンモニウム、
（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；
（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および
（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル
の連続アリコートで連続溶出させること；
（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、該収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；
（ｋ）該シリカゲルを、ヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに
（１）エモジン含有画分を該シリカゲルから収集すること
を含む、ダイオウからのエモジンの単離方法。
【請求項６９】
以下：
（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｖ）（ｈ）の該固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；
（ｖ）（ｊ）の該シリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または
（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の該混合物が約８：２：０．１の比率である、
の１つ以上を適用する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；
（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；
（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；
（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；
（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、該ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；
（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；
（ｇ）該酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；
（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；
（ｉ）該抽出基材を、抽出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）水性酢酸アンモニウム、
（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；
（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および
（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル
の連続アリコートで溶出させること；
（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、該収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；
（ｋ）該シリカゲルを、約８：２：０．１の比率のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに
（１）アロエエモジン含有画分を該シリカゲルから収集すること
を含む、ダイオウからのアロエエモジンの単離方法。
【請求項７１】
以下：
（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｖ）（ｈ）の該固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；
（ｖ）（ｊ）の該シリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または
（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の該混合物が約８：２：０．１の比率である、
の１つ以上を適用する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；
（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；
（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；
（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；
（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、該ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；
（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；
（ｇ）該酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；
（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；
（ｉ）該抽出基材を、抽出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）水性酢酸アンモニウム、
（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；
（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および
（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル
の連続アリコートで溶出させること；
（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、該収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；
（ｋ）該シリカゲルを、約８：２：０．１の比率のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに
（１）クリソファノール含有画分を該シリカゲルから収集すること、
を含む、ダイオウからのクリソファノールの単離方法。
【請求項７３】
以下：
（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｖ）（ｈ）の該固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；
（ｖ）（ｊ）の該シリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または
（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の該混合物が約８：２：０．１の比率である、
の１つ以上を適用する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；
（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；
（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；
（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；
（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、該ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；
（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；
（ｇ）該酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；
（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出カートリッジに適用すること；
（ｉ）該抽出カートリッジを、
（Ａ）水性酢酸アンモニウム、
（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および
（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル
の連続アリコートで溶出させること；
（ｊ）（Ｃ）の溶出液を収集し、該収集した溶出液を分離基材樹脂に適用し、低級アルコール（エタノールまたはメタノールなど）で溶出させ、オクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集すること；
（１）収集した画分を逆相分離基材に適用し、約５：５〜約７：３の比率の酢酸アンモニウムとアセトニトリルの混合物で分画すること；
（ｍ）オクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集し、該得られた画分をシリカゲルに適用すること；
（ｎ）展開させたシリカゲルからオクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集すること
を含む、ダイオウからのオクタヒドロキシアントラキノンの単離方法。
【請求項７５】
以下：
（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；
（ｉｉｉ）（ｈ）の固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；
（ｉｖ）（ｊ）のシリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または
（ｖ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の該混合物が約８：２：０．１の比率である、
の１つ以上を適用する、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、エストロゲン受容体β媒介性病状の治療のためのダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来のアントラキノンおよびその類似体に関する。
【０００２】
（関連出願の参照）
本出願は、２００８年６月６日に出願された米国特許仮出願第６１／０５９，６８６号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ホルモン補充療法（ＨＲＴ）は、さまざまな病状、例えば、骨粗鬆症、閉経後女性における心血管疾患リスクの増大、ならびに更年期症状（例えば、のぼせ、性欲減退および鬱）などを治療するために好成績で使用されている。しかしながら、エストラジオール（Ｅ２）を用いたＨＲＴでは、単独またはプロゲスチンとの組合せのいずれの場合も、望ましくない効果がもたらされることがあり得る。実際、最近、予備試験結果によりＨＲＴが３５％高い乳癌リスクと関連していることが示された時点で、女性の健康イニシアチブ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）（ＷＨＩ）の研究が急遽停止された。
【０００４】
乳癌は、タモキシフェンなどの、いわゆる選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）を使用することにより治療または予防され得る（タモキシフェンの承認前は、閉経前女性の乳癌治療には、多くの場合、エストロゲンの癌刺激効果を低減させるために卵巣除去が含められた）。タモキシフェンは、閉経前女性の乳腺組織において、エストロゲンの癌誘導性効果を選択的にブロックするようである。別のＳＥＲＭであるラロキシフェンは、エストロゲン置換療法剤の代替薬として、骨粗鬆症の治療に承認されている。骨組織におけるエストロゲン様効果の選択的誘導に加え、ラロキシフェンの長期投与は、ラロキシフェン評価の多面的アウトカム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）（ＭＯＲＥ）試験において、乳癌の割合の低減と関連していることも示された。
【０００５】
タモキシフェンおよびラロキシフェンなどのＳＥＲＭは、乳房においてエストロゲンの癌誘導効果の選択的低減をもたらすが、リスクがないことはない。例えば、タモキシフェン療法およびラロキシフェン療法はともに、顔面潮紅の発生率の増大と関連しており、タモキシフェン療法は、子宮（子宮内膜）癌のリスクを増大させることが示されている。
【０００６】
骨粗鬆症、冠状動脈性心臓病および更年期症状の治療においてエストロゲン補充療法が好成績であり、乳癌および骨粗鬆症の治療において、タモキシフェンおよびラロキシフェンなどのＳＥＲＭが好成績であるにもかかわらず、依然として、エストロゲン様特性を有する組成物の必要性が存在している。また、薬物化合物の製造コストの増大を考慮すると、天然供給源から得られ得るさらなるエストロゲン様組成物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者により、ダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）（特にその根茎）エキス由来の化合物（１種類または複数種）を含む組成物がＥＲβ−阻害性効果を有することが測定された。特に、ダイオウエキス由来のアントラキノンまたはその類似体を含む組成物は、ＥＲα陰性癌性細胞においてアポトーシスを選択的に誘導するが、ＥＲα陽性細胞は、該エキスの細胞傷害性効果に対して抵抗性である。したがって、本明細書に記載のエキス、すなわちダイオウエキス、およびかかるエキスを含む組成物は、ＥＲα陰性の細胞過剰増殖を特徴とする疾患状態（ＥＲα陰性の癌など）ならびに良性の過形成性障害（ＢＰＨおよび再狭窄など）の治療に有用な選択的（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）エストロゲン様薬剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に記載の一部の実施形態は、式Ｉまたは６：
【化１】
2011522822.tif 000003
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；およびＲ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである；
および式６中、オクタヒドロキシアントラキノンである）
【化２】
2011522822.tif 000004
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含み、式Ｉまたは６の少なくとも１種類の単離精製された化合物は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレートされるのに充分な量で含まれる医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１種類の化合物は、式ＩＩ：
【化３】
2011522822.tif 000005
（式中、（１）ＲＡはＯＨであり、ＲＢはＣＨ３である；（２）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ２ＯＨである；（３）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ３である、のいずれかである）
の化合物１、２および／または３、ならびに式（６）：
【化４】
2011522822.tif 000006
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の化合物から選択される。
【０００９】
一部の実施形態において、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む。一部の実施形態では、該組成物はライン（ｒｈｅｉｎ）とフラングリンＡの一方または両方を実質的に含まず、一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの両方を含まない。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（３）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は、医薬の製造における使用のためのものである。一部の実施形態では、該医薬は選択的エストロゲン受容体β−アゴニスト効果を有するものである。一部の実施形態では、該医薬は選択的エストロゲン受容体β−アゴニスト効果を有するものである。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、少なくとも１つの更年期症状の治療または予防；骨粗鬆症の治療または予防；子宮癌の治療または予防；乳癌の治療または予防；頚部癌の治療または予防；卵巣癌の治療または予防；および心血管疾患の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの効果である。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、のぼせ、不眠、膣乾燥、性欲減退、尿失禁および鬱の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの更年期症状の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は骨粗鬆症の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、のぼせの治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は子宮癌または乳癌の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの増大を含まない。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの低下を含む。一部の実施形態において、医薬の調製のための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を、少なくとも１種類のさらなる薬学的に許容され得る成分と合わせることを含み、該さらなる成分は活性または不活性である、医薬の単位投薬形態の調製方法を提供する。
【００１０】
本明細書に記載の一部の実施形態は、被検体に、式Ｉまたは６：
【化５】
2011522822.tif 000007
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである；
および式６中、化合物６は式を有する）
【化６】
2011522822.tif 000008
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含む組成物のエストロゲン様有効量を投与することを含み、該投与量は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレート（例えば、作動）されるのに充分である、エストロゲン様効果の誘発方法を提供する。一部の実施形態において、該組成物は、式ＩＩ：
【化７】
2011522822.tif 000009
（式中、（１）ＲＡはＯＨであり、ＲＢはＣＨ３である；（２）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ２ＯＨである；（３）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ３である、のいずれかである）の化合物１〜３、または
化合物６：
【化８】
2011522822.tif 000010
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
から選択される少なくとも１種類の化合物を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む。一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの一方または両方を実質的に含まず、一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの両方を含まない。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（３）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、少なくとも１つの更年期症状の治療または予防；骨粗鬆症の治療または予防；子宮癌の治療または予防；乳癌の治療または予防；頚部癌の治療または予防；卵巣癌の治療または予防；および心血管疾患の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの効果である。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、のぼせ、不眠、膣乾燥、性欲減退、尿失禁および鬱の治療または予防からなる群より選択される少なくとも１つの更年期症状の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は骨粗鬆症の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、のぼせの治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は子宮癌または乳癌の治療または予防を含む。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの増大を含まない。一部の実施形態では、エストロゲン様効果は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮過形成、子宮腫瘍、頚部過形成、頚部腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、ファローピウス管過形成、ファローピウス管腫瘍のリスクの低下を含む。
【００１２】
本明細書に記載の一部の実施形態は、該遺伝子に作動可能に連結させたエストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体を有する細胞に、前記遺伝子を活性化させるのに充分な量の組成物を投与することを含み、該組成物は式Ｉまたは６：
【化９】
2011522822.tif 000011
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである；
および式６中、化合物６は式を有する）：
【化１０】
2011522822.tif 000012
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含み、該投与量は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレート（例えば、作動）されるのに充分である、エストロゲン応答エレメントの制御下にある遺伝子の活性化方法を提供する。一部の実施形態において、該組成物は、式ＩＩ：
【化１１】
2011522822.tif 000013
（式中、（１）ＲＡはＯＨであり、ＲＢはＣＨ３である；（２）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ２ＯＨである；（３）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ３である、のいずれかである）
の化合物１〜３または化合物６：
【化１２】
2011522822.tif 000014
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
から選択される少なくとも１種類の化合物を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む。一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの一方または両方を実質的に含まず、一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの両方を含まない。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（３）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）を含む。一部の実施形態において、遺伝子に作動可能に連結されたエストロゲン応答エレメントおよびエストロゲン受容体を有する細胞は、インビトロである。一部の実施形態では、該細胞はインビボである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲα＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲα／ＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態では、エストロゲン応答エレメントを、形質転換細胞において発現させる。一部の実施形態では、エストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体を、形質転換細胞において発現させる。一部の実施形態では、エストロゲン応答エレメントを該細胞において異種発現させる。一部の実施形態では、エストロゲン応答エレメントとエストロゲン受容体を該細胞において異種発現させる。一部の実施形態において、該細胞は、ＥＲＥ制御型遺伝子で形質転換させたＵ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞からなる群より選択される。一部の実施形態において、該細胞はＥＲαを発現するものである。一部の実施形態において、該細胞はＥＲβを発現するものである。一部の実施形態において、ＥＲＥ制御型遺伝子はＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃである。
【００１４】
本明細書に記載の一部の実施形態は、さらに、ＴＮＦ応答エレメントの制御下にある遺伝子とエストロゲン受容体を含む細胞に、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子を抑制するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が、式Ｉまたは６：
【化１３】
2011522822.tif 000015
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；
およびＲ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである）
および式６中、化合物６は式を有する）：
【化１４】
2011522822.tif 000016
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含み、該投与量が、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）がモジュレート（例えば、作動）されるのに充分である、ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子の発現の抑制方法を提供する。一部の実施形態において、該組成物は、式ＩＩ：
【化１５】
2011522822.tif 000017
（式中、（１）ＲＡはＯＨであり、ＲＢはＣＨ３である；（２）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ２ＯＨである；（３）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ３である、のいずれかである）
の化合物１〜３および／または化合物６：
【化１６】
2011522822.tif 000018
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
から選択される少なくとも１種類の化合物を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの２種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）のうちの３種類以上を含む。一部の実施形態では、該組成物は、（１）、（２）、（３）および／または（６）の４種類全てを含む。一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの一方または両方を実質的に含まず、一部の実施形態では、該組成物はラインとフラングリンＡの両方を含まない。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（６）の両方を含む。一部の実施形態では、該組成物は（３）と（６）の両方を含む。。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）と（６）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（１）と（２）と（３）を含む。一部の実施形態では、該組成物は（２）と（３）を含む。一部の実施形態において、ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子はＴＮＦ−αである。一部の実施形態において、ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子がＴＮＦ  ＲＥ−Ｌｕｃである。一部の実施形態において、該細胞はインビトロである。一部の実施形態では、該細胞はインビボである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲ＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲα＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＲβ＋乳腺組織内に存在するものである。一部の実施形態において、ＴＮＦ応答エレメントは該細胞において内生的に発現される。一部の実施形態では、ＴＮＦ応答エレメントとエストロゲン受容体が該細胞において内生的に発現される。一部の実施形態では、ＴＮＦ応答エレメントを該細胞において異種発現させる。一部の実施形態では、ＴＮＦ応答エレメントとエストロゲン受容体を該細胞において異種発現させる。一部の実施形態において、該細胞はエストロゲン受容体遺伝子を含み、ＴＮＦ応答エレメント制御型遺伝子で形質転換され、Ｕ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞からなる群より選択される。一部の実施形態において、エストロゲン受容体遺伝子はＥＲα発現遺伝子である。一部の実施形態では、エストロゲン受容体遺伝子はＥＲβ発現遺伝子である。
【００１６】
本明細書に記載の一部の実施形態は、（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；（ｇ）酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；（ｉ）該抽出基材を、溶出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：（Ａ）水性酢酸アンモニウム、（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリルの連続アリコートで連続溶出させること；（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、該収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；（ｋ）該シリカゲルを、ヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに（１）エモジン含有画分を該シリカゲルから収集することを含む、ダイオウからのエモジンの単離方法を提供する。一部の実施形態において、以下：（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｖ）（ｈ）の固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；（ｖ）（ｊ）のシリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物が約８：２：０．１の比率である、の１つ以上を適用する。
【００１７】
本明細書に記載の一部の実施形態は、（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；（ｇ）酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；（ｉ）該抽出基材を、抽出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：（Ａ）水性酢酸アンモニウム、（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリルの連続アリコートで溶出させること；（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；（ｋ）該シリカゲルを、約８：２：０．１の比率のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに（ｌ）アロエエモジン含有画分をシリカゲルから収集することを含む、ダイオウからのアロエエモジンの単離方法を提供する。一部の実施形態において、以下：（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｖ）（ｈ）の固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；（ｖ）（ｊ）のシリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物が約８：２：０．１の比率である、の１つ以上を適用する。
【００１８】
本明細書に記載の一部の実施形態は、（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；（ｇ）酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出基材に適用すること；（ｉ）該抽出基材を、抽出溶媒（Ａ）〜（Ｄ）：（Ａ）水性酢酸アンモニウム、（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および（Ｄ）約１：２．５〜約１：４の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリルの連続アリコートで溶出させること；（ｊ）（Ｄ）の溶出液を収集し、収集した溶出液をシリカゲルに適用すること；（ｋ）該シリカゲルを、約８：２：０．１の比率のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物と接触させること；ならびに（ｌ）該シリカゲルからクリソファノール含有画分を収集することを含む、ダイオウからのクリソファノールの単離方法を提供する。一部の実施形態において、以下：（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉｉ）溶出溶媒（Ｄ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：３（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｖ）（ｈ）の固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；（ｖ）（ｊ）のシリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または（ｖｉ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物が約８：２：０．１の比率である、の１つ以上を適用する。
【００１９】
本明細書に記載の一部の実施形態は、（ａ）任意選択で全部または一部粉砕したダイオウの根茎を水性メタノールと接触させること；（ｂ）該根茎を該水性メタノールから分離し、水性メタノールエキスを形成すること；（ｃ）メタノールを該水性メタノールエキスからエバポレートさせ、濃縮液を形成すること；（ｄ）該濃縮液に水を添加し、水性スラリーを形成すること；（ｅ）該水性スラリーをヘキサンと接触させ、ヘキサンを該水性スラリーから分離すること；（ｆ）該水性スラリーを酢酸エチルと接触させること；（ｇ）酢酸エチルを該水性スラリーから分離すること；（ｈ）該酢酸エチルを固相抽出カートリッジに適用すること；（ｉ）該抽出カートリッジを、（Ａ）水性酢酸アンモニウム、（Ｂ）約４：１〜約２．５：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリル；および（Ｃ）約０．９：１〜約１．１：１の比率の水性酢酸アンモニウムとアセトニトリルの連続アリコートで溶出させること；（ｊ）（Ｃ）の溶出液を収集し、収集した溶出液を分離基材樹脂に適用し、低級アルコール（エタノールまたはメタノールなど）で溶出させ、オクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集すること；（ｌ）収集した画分を逆相分離基材に適用し、約５：５〜約７：３の比率の酢酸アンモニウムとアセトニトリルの混合物で分画すること；（ｍ）オクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集し、得られた画分をシリカゲルに適用すること；（ｎ）展開させたシリカゲルからオクタヒドロキシアントラキノン含有画分を収集することを含む、ダイオウからのオクタヒドロキシアントラキノンの単離方法を提供する。一部の実施形態において、以下：（ｉ）溶出溶媒（Ｂ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約３：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉ）溶出溶媒（Ｃ）が、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム（水性）とアセトニトリルを約１：１（ｖ／ｖ）の比率で含むものである；（ｉｉｉ）（ｈ）の固相抽出基材がカラムまたはカートリッジ内の逆相抽出基材である；（ｉｖ）（ｊ）のシリカゲルがシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上のものである；および／または（ｖ）（ｋ）のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の混合物が約８：２：０．１の比率である、の１つ以上を適用する。
【００２０】
文献の引用
本明細書において挙げた刊行物および特許出願はすべて、引用により、個々の各刊行物および特許出願が、引用により組み込まれて、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲に示したものである。本発明の原理を用いた例示的実施形態を示した以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】アントラキノン、エモジン（１）、アロエエモジン（２）、クリソファノール（３）、ライン（４）、フラングリンＡ（５）、およびオクタヒドロキシアントラキノン（６）のオーバーレイしたクロマトグラムを示す。
【図２】エモジン（１）がＥＲβに対して選択的アゴニスト効果を有するが、ＥＲαに対してはないことを示す。
【図３】オクタヒドロキシアントラキノン（６）のＥＲβ選択的エストロゲン様効果を示す。化合物６は、ＥＲαに対する効果はない。
【図４】対照（ビヒクル）およびエストラジオール（Ｅ２）と比較した場合の、子宮増殖に対するオクタヒドロキシアントラキノン（６）の効果を示す。対照と比較すると、エストラジオールは子宮増殖を刺激するが、６は子宮増殖を阻害する。
【図５Ａ】腎よう移植片の写真を示す。この写真は、ヌードマウスにおける腫瘍形成に対するオクタヒドロキシアントラキノン（６）の効果を示す。対照＝Ａ、オクタヒドロキシアントラキノン（６）＝Ｂ、エストラジオール＝Ｃ。図に示されるように、オクタヒドロキシアントラキノンは、対照と比較すると、マウス腎よう移植片において腫瘍の増殖を抑制するが、Ｅ２は腫瘍の増殖を刺激する。
【図５Ｂ】この実験の結果をグラフで示したものである。２８日後のＭＣＦ−７腫瘍の重量は、腎よう異種移植片を有するエストラジオール処置ヌードマウスにおいて、対照またはオクタヒドロキシアントラキノン（「ｏｃｔａ」）処置マウスよりもずっと多かった。
【図６】エモジンの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲβ−活性化を、ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲα−活性化と比較するグラフである。
【図７】ＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥのエモジンＴＮＦ−α活性化を、ＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥのエモジンＴＮＦ−α活性化と比較するグラフである。
【図８】エモジン＋対照、エモジン＋ラロキシフェン、エモジン＋タモキシフェンおよびエモジン＋エストラジオールの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲβ−活性化を示す。図に示されるように、エモジン単独およびエモジン＋エストラジオールは、ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃの発現を、それぞれ、約４倍および６倍刺激するが、エモジンとラロキシフェンまたはタモキシフェンいずれかの存在下での活性化は、実際には抑制される。
【図９】ＥＲβおよびＥＲαのエモジン結合曲線を示す。
【図１０】アロエエモジンの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲβ−活性化を、ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲα−活性化と比較するグラフである。
【図１１】ＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥのアロエエモジンＴＮＦ−α活性化を、ＥＲβの存在下でのＴＮＦ−ＲＥのアロエエモジンＴＮＦ−α活性化と比較するグラフである。
【図１２】アロエエモジン＋対照、アロエエモジン＋ラロキシフェン、アロエエモジン＋タモキシフェンおよびアロエエモジン＋エストラジオールの存在下でのＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃのＥＲβ−活性化を示す。図に示されるように、アロエエモジン単独およびエモジン＋エストラジオールは、ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃの発現を、それぞれ、約４倍および６倍刺激するが、エモジンとラロキシフェンまたはタモキシフェンいずれかの存在下での活性化は、実際には抑制される。
【図１３】ＥＲβとＥＲαのアロエエモジン結合曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、式Ｉまたは６：
【化１７】
2011522822.tif 000019
（式Ｉ中、Ｒは、ＨまたはＯＨである；および
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチル）またはＣＨ２ＯＨである；
および式６中、化合物６は式を有する）：
【化１８】
2011522822.tif 000020
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
の特定の化合物を含む医薬組成物を開示する。
【００２４】
式Ｉまたは６の１種類以上の化合物を含むかかる組成物は、ＥＲβ選択的エストロゲン様効果を含むことを見出した。かかるエストロゲン様効果は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）媒介性の疾患または病状、例えば、１つ以上の更年期症状、エストロゲン受容体媒介性の癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、外陰部の癌、ファローピウス管の癌、子宮内膜の癌腫および／または骨粗鬆症などの予防または治療を包含する。したがって、一部の実施形態では、本明細書において、患者に、化合物１、２、３およびまたは６の１種類以上、２種類以上、３種類以上、または４種類全てを含む組成物のエストロゲン様有効量を投与することを含む、患者の治療方法を提示する。一部の実施形態において、該方法は、少なくとも化合物１と６、少なくとも化合物２と６、少なくとも化合物３と６、少なくとも化合物１と２と６、少なくとも化合物１と３と６、少なくとも化合物１と２と３と６、少なくとも化合物１と３、少なくとも化合物１と２、少なくとも化合物１と２および３、少なくとも化合物２と３と６または化合物１と２と３と６の４種類全てを含む組成物を投与することを含む。本明細書で用いる場合、化合物１はエモジン（ＲがＯＨであり、Ｒ１がＣＨ３である式Ｉの化合物）であり、化合物２はアロエエモジン（ＲがＨであり、Ｒ１がＣＨ２ＯＨである式Ｉの化合物）であり、化合物３はクリソファノール（ＲがＨであり、Ｒ１がＣＨ３である）であり、化合物６はオクタヒドロキシアントラキノンである。
【００２５】
また、本明細書において、式１、２、３および６の化合物を、ダイオウから、特にダイオウの根茎から単離する新規な方法を記載する。
【００２６】
化合物１、２、３および６の推定標的および作用様式
乳房の新生物は、女性において診断される最も一般的な癌である。２０００年では、新たに１８４，０００例の乳癌が診断され、４５，０００名の女性が乳癌で死亡している。乳癌の原因は、おそらく多因子性であるが、エストロゲンが乳癌を促進させることを示す有力な臨床的、疫学的および生物学的研究がある：（ａ）ホルモン補充療法（ＨＲＴ）は、５１例の研究のメタアナリシスによると、乳癌のリスクが３５％高いことと関連している；（ｂ）乳癌は、乳房細胞においてＥＲに結合し、エストロゲンの作用と拮抗するタモキシフェンまたはラロキシフェンにより予防することができる；（ｃ）乳癌を有する閉経前女性において両側卵巣摘出すると、生存の増大がもたらされる；（ｄ）エストロゲンに対する曝露が長いほど（早い初経または遅い閉経では、それぞれ、相対リスク＝１．３および１．５〜２．０）、乳癌の発生率が高い；（ｅ）エストロゲンによりＥＲ陽性乳癌細胞の増殖が増大する；ならびに（ｆ）エストロゲンにより、増殖促進遺伝子（サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓなど）の生成が増大する。
【００２７】
乳腺腫瘍のほぼ６０〜７０％はエストロゲン受容体を含む。ここ数十年の間、乳腺腫瘍は、ＥＲの存在について解析されてきた。ＥＲ＋腫瘍のほぼ７０％は、抗エストロゲン療法に応答性である。この観察結果により、ＥＲ＋腫瘍はＥＲ陰性腫瘍よりも良好な予後を有するという考えがもたらされた。しかしながら、ＥＲβの発見により、この解釈は複雑となり、いくつかの難解な臨床上の疑問が生じた。腫瘍がＥＲ＋であるかどうかを調べる現行の方法は、ＥＲαのみが検出される抗体を使用するものであるため、ＥＲαとＥＲβの役割を理解することは非常に重要である。したがって、乳腺腫瘍内のＥＲの臨床転帰に対する効果を調べるほとんどの研究は、ＥＲαの状態しか反映していない。しかしながら、いくつかの最近の研究により、ヒト乳腺腫瘍においてＥＲβ  ｍＲＮＡの存在が検出された。ＥＲβに対する特異的で感度のよい抗体がないため、ほとんどの研究ではＥＲβの測定をＲＴ−ＰＣＲに依存していた。Ｄｏｔｚｌａｗらにより、ＲＴ−ＰＣＲによって乳腺腫瘍生検材料中にＥＲβが最初に検出された。彼らにより、乳腺腫瘍の７０％がＥＲβを発現し、９０％がＥＲαを発現することが見出された。さらに、彼らにより、いくつかのＥＲ陰性細胞株もまたＥＲβ  ｍＲＮＡを発現することが示された。このような所見は、ＥＲβが乳腺腫瘍において高度に発現されていること、および多くの腫瘍でたいていＥＲαとＥＲβの両方が共発現されていることを示唆する。実際、一部のＥＲ−腫瘍はＥＲβを含む。また、Ｄｏｔｚｌａｗらにより、ＥＲβ  ｍＲＮＡは、ＥＲ＋／ＰＲ−（ＰＲはプロゲスチン受容体である）腫瘍において、ＥＲ＋／ＰＲ＋腫瘍と比べて有意に低いことが示された。この著者により、この観察結果は、ＥＲ＋／ＰＲ＋の方がタモキシフェンに対して応答し易いため、ＥＲβ発現が予後不良と関連していることを示すことが示唆された。他の研究では、ＥＲβの存在によって予後不良がもたらされることが示唆されている。Ｓｐｅｉｒｓらにより、ほとんどの乳腺腫瘍がＥＲβ  ｍＲＮＡを単独またはＥＲα  ｍＲＮＡとの組合せで発現していることが見出された。ＥＲαとＥＲβの両方のｍＲＮＡを発現している腫瘍は、陽性リンパ節と関連しており、腫瘍の悪性度が高いと特性評価される傾向にあった。さらに、ＥＲβ発現の増大は、発癌化学物質で処理したＭＣＦ−１０Ｆ細胞において起こり、これは、ＥＲβの発現が乳癌の開始と進行の一因であり得ることを示唆する。最近、Ｊｅｎｓｅｎらにより、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって、２９例の浸潤性乳腺腫瘍においてＥＲβの発現が解析された。彼らにより、ＥＲβ発現が、細胞増殖の特異的マーカーであるＫｉ６７とサイクリンＡの上昇と関連していることが見出された。さらに、これらの増殖マーカーの最も高い発現はＥＲα＋／ＥＲβ＋腫瘍に存在した。ＥＲα−／ＥＲβ＋である症例の数は非常に少ない（ｎ＝７）が、該著者により、ＥＲβが乳腺腫瘍における細胞増殖を媒介することが示唆された。また、Ｓｐｅｉｒｓらにより、ＥＲβ  ｍＲＮＡがタモキシフェン抵抗性腫瘍において、タモキシフェン感受性腫瘍と比べて有意に上昇していることが報告された。
【００２８】
対照的に、別の研究では、ＥＲβの存在により良好な予後がもたらされることが示されている。Ｉｗａｏらにより、乳腺腫瘍が前浸潤性から浸潤性の腫瘍へと進行するにつれて、ＥＲα  ｍＲＮＡは上方調節され、ＥＲβ  ｍＲＮＡは下方調節されることが示された。凍結腫瘍切片のＩＨＣを用いて、Ｊａｒｖｉｎｅｎらにより、ＥＲβ発現は、無腋窩節状態、低悪性度、および低Ｓ期画分と関連していることが見出された。また、Ｏｍｏｔｏらによる研究により、ＥＲβを含む腫瘍での方が無疾患生存率が高かったため、ＥＲβ陽性腫瘍はＥＲβ陰性腫瘍よりも良好な予後と相関していることが見出された。また、ＥＲβ発現では、プロゲステロン受容体の存在および乳腺腫瘍の充分な分化との強い関連性が示された。また、ＥＲβのレベルが正常乳腺組織において最も高いこと、およびこのレベルは、腫瘍が前癌性から癌性の病変へと進行するにつれて低下することが報告されている。このような研究は、ＥＲβが腫瘍抑制因子としての機能を果たしているのかもしれないこと、およびＥＲβの減少によって乳房での発癌が促進されることを示す。Ｍａｎｎらによる研究では、癌細胞の１０％より多くのＥＲβの発現が、タモキシフェンで治療された女性の良好な生存と関連していることが示された。このような研究を総合すると、ＥＲβの存在により良好な予後がもたらされることが示される。ＲＴ−ＰＣＲおよびＩＨＣデータは、アデノウイルス媒介性ＥＲβ発現によって、ＥＲ陰性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖のリガンド非依存性阻害がもたらされることが示された報告と整合する。
【００２９】
この結果は、乳癌の病因および予後におけるＥＲβの役割が不明確であることを示す。いくつかの理由によって、これらの研究間の明白な矛盾が説明され得る。第１に、ＥＲβ  ｍＲＮＡとＥＲβタンパク質間の相関性が不充分であるかもしれないことである。この考えは、リガンド結合アッセイによって検出可能なＥＲをもたない一部のＥＲ陰性細胞株におけるＥＲβ  ｍＲＮＡの存在と整合する。第２に、ＩＨＣ試験において、特異性および感度に関する特性評価が不充分であった種々の市販のＥＲβ抗体が使用されたことである。第３に、結論のほとんどが、数例の乳癌症例に基づいたものであったことである。乳癌におけるＥＲαとＥＲβの役割を明確にするためには、明らかに、より多くの研究が必要である。
【００３０】
乳癌における補助療法剤および予防的化学療法剤としてのＳＥＲＭの役割：エストロゲンは乳癌細胞の増殖を促進させるため、乳腺腫瘍に対するエストロゲンのこの効果をブロックするために、いくつかの治療的アプローチが実施されている。このようなストラテジー、例えば、卵巣切除、抗エストロゲン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体またはアロマターゼ阻害薬は、エストロゲン産生の低減またはエストロゲンの作用のブロックのいずれかによって奏功する。これらのストラテジーはすべて、ＥＲαとＥＲβの両方の作用を非選択的にブロックする。乳腺腫瘍を予防および治療するために臨床的に使用されている最も一般的なアプローチは、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、タモキシフェンおよびラロキシフェンである。
【００３１】
タモキシフェンは、非ステロイド系のトリフェニルエチレン誘導体であり、乳房などの一部の組織ではアンタゴニスト作用を示すが、子宮内膜および骨などの別の一部の組織ではアゴニスト作用を有するため、基本型のＳＥＲＭである。タモキシフェンは、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する女性において乳腺腫瘍の再発を低下させるための補助療法剤としての臨床的有効性が広く研究されている。５年間のタモキシフェン療法により、再発リスクは４２％低下し、乳癌による死亡率は２２％低下し、続発性の対側性原発乳腺腫瘍が低下する。ほぼＥＲ陽性乳腺腫瘍の３分の２はタモキシフェンに応答するが、ＥＲ陰性腫瘍を有する女性が補助的タモキシフェンの恩恵を受けることを示す証拠は非常に少ない。ごく最近、米国乳癌予防治験（ＢＣＰＴ）により、タモキシフェンは、乳癌のリスクが高いとみなされる女性において、浸潤性の原発乳癌のリスクを４９％低下させることが示された。この研究は、タモキシフェンが、乳癌の病歴を有する女性に有効な第一の補助療法剤であり、乳癌発症リスクが高い女性に有効な予防的化学療法剤であることを示す。
【００３２】
ラロキシフェンは、ベンゾチオフェン類型のＳＥＲＭの一構成員であり、最近、骨粗鬆症の予防および治療に対して承認された。ラロキシフェンは、乳癌の女性に対する補助療法剤としての有効性については評価されていない。しかしながら、ラロキシフェンの多面的アウトカム（ＭＯＲＥ）試験では、乳癌予防に対するラロキシフェンの効果が評価された。ＭＯＲＥ治験は、骨粗鬆症を有する７７０５名の閉経後女性の無作為化プラセボ対照３年試験であった。このＭＯＲＥ治験では、４０ヶ月のメジアン追跡後、ラロキシフェン処置群の５１２９名の女性のうち１３例に乳癌がみられたのに対し、プラセボを受けた２５７６名の女性では２７例にみられた（ＲＲ＝０．２４）。タモキシフェンと同様、ラロキシフェンは、エストロゲン受容体陽性腫瘍の発生率の低下には有効であるが、エストロゲン受容体陰性腫瘍ではそうでない。ラロキシフェンは、検出可能なレベルの血清エストラジオールを有する閉経後女性において乳癌のみを予防することを示す最近の研究により、乳癌の促進におけるエストロゲンの役割に関するさらなる証拠が得られている。
【００３３】
エストロゲン受容体の構造：ＳＥＲＭがＥＲ陽性腫瘍においてのみ奏功するという事実は、ＳＥＲＭが乳房に対して保護効果を発揮するためには、エストロゲン受容体と相互作用することが必要であることを示す。既知のエストロゲン受容体にはＥＲαとＥＲβの２種類があり、これらはステロイド核受容体スーパーファミリーの構成員である。ＥＲαは１９８６年に最初にクローニングされたが、驚いたことに、第２のＥＲが約１０年後に発見され、ＥＲβと命名された。ＥＲαは、５９５個のアミノ酸を含み、一方、ＥＲβは５３０個のアミノ酸を含む。どちらの受容体も、３つの相違するドメインで構成されたモジュラータンパク質である。アミノ末端ドメイン（Ａ／Ｂドメイン）は、最も保存されていない領域であり、ＥＲαとＥＲβ間に示される相同性はわずか１５％である。このドメインは、エストラジオールの非存在下で遺伝子転写を活性化することができる活性化機能（ＡＦ−１）を有する。ＥＲの中央領域は２つのジンクフィンガーモチーフを含み、該モチーフは、標的遺伝子のプロモーター内に存在する３つのヌクレオチドによって分断されたパリンドローム逆位反復配列に結合する。ＥＲαおよびＥＲβのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、事実上同一であり、９５％の相同性を示す。カルボキシ末端ドメインは、いくつかの不可欠な機能を実行するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。ＬＢＤは、エストロゲン様化合物が結合する大型疎水性ポケットおよびＥＲの二量体化に関与する領域を構成する領域を含む。また、ＬＢＤは、補助調節タンパク質と相互作用する第２の活性化機能（ＡＦ−２）も含む。ＡＦ−２は、エストロゲンの活性化と遺伝子転写の抑制の両方に必要とされる。ＥＲαおよびＥＲβのＬＢＤの相同性はわずか約５５％である。ＥＲαとＥＲβのＬＢＤのアミノ酸組成の顕著な違いは、転写における役割が相違するＥＲがもたらされるように進化したものであり得る。これにより、ＥＲαとＥＲβが異なる遺伝子の活性を調節し、異なる生理学的効果が誘発されることが可能となり得る。この考えは、ＥＲαおよびＥＲβのノックアウトマウスの研究によって裏付けられている。例えば、ＥＲαノックアウトマウスは、始原的（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）乳房および子宮の発達を有するが、ＥＲβノックアウトマウスでは正常な乳腺および子宮が発達する。この観察結果は、これらの組織の発達にはＥＲαのみが必要とされることを示す。さらに、本発明者らは、遺伝子の活性化では、ＥＲαがＥＲβよりも有効であるが、遺伝子転写の抑制では、ＥＲβがＥＲαよりも有効であることを見出した。
【００３４】
エストロゲンの作用機序
エストロゲンは、複数の機構によって遺伝子転写を活性化および／または抑制し得る。遺伝子転写の活性化には、特性評価された２つの経路、古典的ＥＲＥ（エストロゲン応答エレメント）経路とＡＰ−１経路がある。エストロゲンが遺伝子の転写を調節するのに必要な不可欠な成分は、：ＥＲ（ＥＲα  および／またはＥＲβ）、標的遺伝子内のプロモーターエレメント、および補助調節タンパク質の少なくとも３つである。ＥＲに対するエストラジオールの結合により、コンホメーションの変化が生じ、これにより、転写経路を開始させるいくつかの重要な工程がもたらされる。第１に、Ｅ２とＥＲの相互作用により、ＥＲからのシャペロンタンパク質の解離がもたらされる。これにより、ＥＲの二量体化表面とＤＮＡ結合ドメインが露出する。シャペロンタンパク質の喪失により、ＥＲは、標的遺伝子のプロモーター領域内のＥＲＥと二量体化および結合することが可能になる。
【００３５】
第２に、Ｅ２の結合によってＥＲのＬＢＤのヘリックス１２が移動し、ＥＲのＡＦ−２機能を構成する表面がもたらされる。ＡＦ−２は、ＥＲのヘリックス３、５および１２で構成された保存された疎水性ポケットからなり、ＥＲの該ヘリックスは、一緒になって、ｐ１６０クラスのコアクチベータタンパク質（コアクチベータ）（ステロイド受容体コアクチベータ−１（ＳＲＣ−１）またはグルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ  １）など）に対する結合表面を構成する。コアクチベータ（「補助調節因子としても知られる））は、ＡＦ−２のヘリックスに囲まれた疎水性裂溝内に突出するＬＸＸＬＬで構成されたいくつかの反復アミノ酸モチーフを含む。コアクチベータは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する。遺伝子の活性化は、ＥＲとコアクチベータタンパク質がＥＲＥにおいて複合体を形成し、これにより、ＤＮＡに結合されたヒストンタンパク質のアセチル化が引き起こされた後に起こると考えられる。このヒストンのアセチル化によってクロマチン構造が変化し、それにより、ＥＲ／補助調節因子複合体によって、ＥＲＥと、標的遺伝子のＴＡＴＡボックス領域で合成された基礎転写タンパク質との間に架橋が形成され、遺伝子の転写が開始され得る。
【００３６】
ＥＲＥ経路に対するＳＥＲＭの効果：エストロゲンとは異なり、ＳＥＲＭはＥＲＥ経路を活性化しない。代わりに、ＳＥＲＭは、ＥＲＥ経路に対するエストロゲンの効果を競合的にブロックする。エストロゲンと同様、ＳＥＲＭは、ＥＲαとＥＲβに高親和性で結合し、シャペロンタンパク質の解離、ＥＲの二量体化およびＥＲＥに対するＥＲの結合を引き起こす。したがって、ＳＥＲＭのアンタゴニスト作用は、プロモーター領域に対するＥＲの結合に遠位の工程で生じる。ＳＥＲＭのアンタゴニスト作用の分子機構は、ＥＲαおよびＥＲβのＬＢＤの結晶化によって明確になった。ＥＲ  ＬＢＤの構造から、Ｅ２、タモキシフェンおよびラロキシフェンは同じ結合ポケットに結合することが明白である。しかしながら、タモキシフェンとラロキシフェンはバルキーな側鎖を含むが、Ｅ２には存在しない。ＥＲのｘ線構造により、このＳＥＲＭのバルキーな側鎖によってＬＢＤの動きが障害され、そのために機能性ＡＦ−２表面の形成が妨げられることが明らかになった。注目すべきことに、ＳＥＲＭがＥＲαに結合すると、ヘリックス１２内の配列（ＬＸＸＭＬ）（これは、ＬＸＸＬＬモチーフと類似している）がＡＦ−２表面の疎水性裂溝と相互作用し、コアクチベータ認識部位を閉塞させる。したがって、エストロゲンとは異なり、ＳＥＲＭは、機能性ＡＦ−２表面をもたらさない。これにより、コアクチベータの結合が妨げられる。コアクチベータタンパク質はＳＥＲＭの存在下でＡＦ−２表面に結合しないため、活性化経路は急激に停止される。コアクチベータが漸増するのではなく、ＳＥＲＭがリガンド結合したＥＲによって、コリプレッサ（Ｎ−ＣｏＲなど）が漸増される。
【００３７】
これらの研究により、ＳＥＲＭのアンタゴニスト特性は、少なくとも３つの要素によるものであることが示された。第１に、ＳＥＲＭは、エストロゲンと同じ結合ポケットに結合し、そのＥＲに対する結合を競合的にブロックすることである。第２に、ＳＥＲＭは、ＥＲが、ＥＲＥ経路の転写活性化に必要とされるコアクチベータタンパク質と相互作用することを妨げることである。第３に、ＳＥＲＭは、遺伝子の転写活性化を妨げるコリプレッサを漸増させることである。このようなＳＥＲＭの作用により、たいていの場合、ラロキシフェンとタモキシフェンが、どのようにして乳房細胞においてアンタゴニストとして作用し、乳癌の発生を抑止するのかが説明される。
【００３８】
また、ＳＥＲＭはＥ２よりも、ＡＰ−１エレメントを有する遺伝子の活性化において有効である。実際、Ｅ２は、ＡＰ−１エレメントのＳＥＲＭ媒介性活性化のアンタゴニストである。ＳＥＲＭは、ＡＰ−１経路を活性化させることにより、骨および子宮内膜などの組織ではアゴニスト作用を示すことが前提とされている。興味深いことに、ＳＥＲＭは、ＥＲβの存在下でのＡＰ−１経路の活性化においてより強力であり、これは、ＳＥＲＭが、ＥＲβを多く含む組織において、より効率的にＡＰ−１経路を誘発することを示す。エストロゲンは、ＳＥＲＭと比較すると、ＡＰ−１経路の活性化においてずっと弱いため、エストロゲン媒介性乳房発癌におけるＡＰ−１経路の役割は不明である。しかしながら、ＡＰ−１経路は、乳腺腫瘍のタモキシフェンに対する抵抗性に関与しているかもしれないことが示唆されている。
【００３９】
本発明の態様により、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃの活性化では、ＥＲβはＥＲαよりも弱い；ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋＬｕｃの抑制では、ＥＲβはＥＲαよりも有効である；およびＥＲβは、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃのＥＲα媒介性転写活性化を阻害することを示す研究を行なった。実験の詳細は、本明細書において後述する実施例のセクションに論考する。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載のような、式Ｉまたは６の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含む組成物を提供する。特に、該組成物は、式１、２、３および／または６の少なくとも１種類の単離精製された化合物を含む。一部の実施形態において、該組成物は、式１、２、３および／または６の化合物の２種類以上、３種類以上、または４種類全てを含む。一部の実施形態では、該組成物は１と２を含み、一部の実施形態では、該組成物は１と３を含み、一部の実施形態では、該組成物は１と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は１と２と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は１と３と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は２と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は３と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は２と３と６を含み、一部の実施形態では、該組成物は１と２と３と６を含む。一部の実施形態では、該組成物は１と６を含む。一部の実施形態において、該組成物は、１〜３の３種類全てと６を含有するダイオウ根茎のエキスである。また、ダイオウの根茎のエキスからの化合物１、２、３および／または６の単離方法を提供する。
【００４１】
タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）のダイオウ属の種はまた、ルバーブ、中国ルバーブ、東インドルバーブ、スィートラウンドリーブドドッグ、パイプラント（ｐｉｅｐｌａｎｔ）またはダーハン（ｄａ  ｈｕａｎｇ）という種々の名称で呼ばれている。タデ科のダイオウ属は多年生の低木である。これは、非常に幅広の葉と、細長い、しばしば赤みを帯びた柄（葉柄）を有する。空中部分は大きく、約１．５〜２ｍの高さであり、頑丈である。根茎および根は頑丈であり、茎は中空で、縦溝があり、小毛短毛を有するか、または節には硬尖面がある。根出葉柄は円柱形であり、ほぼ葉身と同じ長さであり、密に乳頭状嚢で覆われている（ｐａｐｉｌｌｉｆｅｒｏｕｓ）；葉身は大きく、その幅（４０〜６０ｃｍ）とほぼ同じ長さであり、軸の反対側は密に毛で覆われており、軸側には縦溝があり乳頭状嚢で覆われており、５つの基部葉脈を有し、基部は丸葉、掌状に羽状分裂葉に分かれ、葉先端はとがっているか、すなわち鋭形であり、茎部の葉は上部ほど小さい。葉鞘は大きく（１５ｃｍまで）、硬尖面の外側である。円錐花序は大きく；枝は輻合であり、密に毛で覆われている。小花梗は２〜２．５ｍｍであり、下方の中央で一緒になっている。花は小さい。花被片は６つで赤紫色であり、稀に黄白色もあり、外側の３枚は楕円形から円形であり、より小さく、１〜１．５ｍｍである。雄蘂は花被から突出していない。子房は偏菱形から卵型；形状はわずかに下曲性；柱頭は膨張。果実は長い楕円形から長楕円形、８〜９×７〜７．５ｍｍで、両端は微凹形；翼果（ｗｉｎｇ）はおよそ２．５ｍｍ幅で、辺縁部付近まで縦脈を有する。
【００４２】
ダイオウエキス
ダイオウエキスは、まず、ダイオウの根茎を含む植物部分を適当な抽出媒体と、適当な時間、根茎からＥＲβ選択的エストロゲン様主成分の効率的な抽出が行われるのに適当な条件下で接触させることにより得られる。抽出媒体は、適当な液体溶媒、例えば水性低級アルコール、特に水性メタノールであるが、水性エタノール（または水性エタノールとメタノールの混合物）も可能である。根茎は、抽出溶媒と植物体間の接触表面積を大きくするために、すり潰すか、あるいは粉砕され得る。抽出は、室温または約５０℃までの高温で、約１時間〜約７２時間の時間で行なわれ得る。次いで、植物体を抽出媒体から分離すると、有機物質の中でも、とりわけ１〜３と６の混合物を含有するエキスが得られ得る。
【００４３】
第１段階の分離
アルコール（例えば、メタノール）を一部または完全に水性抽出媒体から除去すると水性濃縮液が形成され得、次いで、これは、固相抽出カラムまたはカートリッジ（例えば、逆相抽出カートリッジ）に負荷され得る。次いで、エキスの分配が、溶出溶媒の連続アリコートを用いた溶出により行なわれ得る。この連続アリコートは、極性から無極性まで多岐にわたる。一部の実施形態において、適当な極性溶媒は水性酢酸アンモニウム（１〜１００ｍＭ）であり、適当な無極性溶媒はアセトニトリルである。これらの溶媒の混合物を、中間極性の溶出溶媒として調製してもよい。一部の実施形態において、活性化合物を固相から溶出させるための適当な系は、以下：（Ａ）１００％水性酢酸アンモニウム；（Ｂ）７５％水性酢酸アンモニウム、２５％アセトニトリル；（Ｃ）５０％水性酢酸アンモニウム；５０％アセトニトリル；（Ｄ）２５％水性酢酸アンモニウム；７５％アセトニトリル；（Ｄ）１００％アセトニトリル（パーセンテージ（％）はすべて、容量／容量基準である）のような連続溶出溶媒を含むものである。選択的ＥＲβエストロゲン様活性を有する分配画分は保存され得、かかる活性のないものは廃棄され得る。前述の水性酢酸アンモニウム溶液において、酢酸アンモニウムの濃度は、適当な範囲、例えば、約１〜約１００ｍＭ、約２〜約５０ｍＭ、約５〜約２０ｍＭまたは約１０ｍＭであり得る。また、特に規模が拡大された環境では、溶出溶媒を、１００％水性酢酸アンモニウムから１００％アセトニトリルまでの線形勾配として泳動させることも可能である。また、他の適当な極性溶媒および無極性溶媒を、本明細書に示したものの代わりに適当な条件下で使用され得る。
【００４４】
オクタヒドロキシアントラキノン（６）の最終段階の分離
上記に特定した系では、オクタヒドロキシアントラキノン含有画分が画分（Ｃ）に得られる。この画分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０基材（例えば、カートリッジまたはカラム内）に上に負荷され、メタノールまたは他の低級アルコールまたは低級アルコールの混合物で溶出され得る。オクタヒドロキシアントラキノンを含有する溶出された溶媒は、次いで、適当な逆相分離基材に適用され、適当な移動相を用いて分配され得る。分離基材は、適当な容量の適当な支持体内または支持体上（薄層プレート、カートリッジまたはカラム）に存在させ得る。適当な移動相は、所望の生成物６を基材上の他の物質から分離するのに適した極性であるのがよい。一部の実施形態において、基材はＴＬＣプレート上のＲＰ１８であり得、移動相は、水性酢酸アンモニウムとアセトニトリルの混合物（例えば、１０ｍＭの酢酸アンモニウム：アセトニトリルが６：４の混合物）であり得る。一部のかかる実施形態において、５つの個々の分配画分が識別可能であり、そのうち第２画分に６が含まれる。次いで、６を含む分配画分は、適当な支持体（カラム、カートリッジ、ＴＬＣプレート）上の順相基材（シリカゲル基材など）に適用され、適当な溶媒を用いて分配され得る。一部の実施形態において、固定相は、ＴＬＣプレート上のシリカゲルであり、展開溶媒は、適当な比率のヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸（例えば、約８：２：０．１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＴＦＡ）である。６を含む分配画分は、慣用的な方法によって取得し、基材から分離する。６の実体は、ＨＰＬＣ、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲおよび／または質量分析などの方法の１つまたはその組み合わせによる既知の標準物質との比較によって、以下の実施例のセクションにより詳細に記載のようにして確認され得る。
【００４５】
エモジン（１）、アロエエモジン（２）およびクリソファノール（３）の単離
上記に特定した系において、エモジン（１）、アロエエモジン（２）およびクリソファノール（３）を含む混合物は、画分（Ｄ）として溶出される。この混合物は、適当な支持体（例えば、ＴＬＣプレート、カートリッジまたはカラム）上の順相分離基材（シリカなど）に適用され、適当な移動相（極性と無極性の混合特性を有する溶媒など）を用いて分配され得る。一部の実施形態において、該混合物は、シリカゲルカラムに適用され、ヘキサン、酢酸エチルおよびトリフルオロ酢酸の溶液（例えば、ヘキサン、ＥｔＯＡｃおよびＴＦＡが８：２：０．１の混合物）を用いて溶出される。クリソファノール（３）、エモジン（１）およびアロエエモジン（２）を含む個々の画分が得られ得る。溶出の進行は、例えば、適当な移動相を用いた逆相ＴＬＣによってモニタリングされ得る。一部の実施形態において、ＴＬＣの移動相は、酢酸アンモニウム（１０ｍＭ）とアセトニトリルが１：１の混合物である。分離された化合物１、２および３の実体は、ＨＰＬＣ、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲおよび／または質量分析などの方法の１つまたはその組み合わせによる既知の標準物質との比較によって、以下の実施例のセクションにより詳細に記載のようにして確認され得る。
【００４６】
したがって、上記のエキスは、少なくとも、１種類以上の植物由来化合物１〜３と６（フィトケミカル）を、任意選択で適当な溶媒溶解させた状態で含む。一部または完全にエバポレートしたエキスは、適当な希釈剤（例えば、酢酸エチル、水および／またはエタノール）添加して再構成エキスを形成することにより再構成され得る。
【００４７】
一部の実施形態において、植物エキスを含む組成物としては、純粋なエキスを含むもの、または分配されたエキス（例えば、１種類以上のエストロゲン様活性化合物を富化させたエキス）を含むもの、およびかかるエキスと１種類以上のさらなる成分の組合せを含むものが挙げられる。一部の実施形態において、該組成物には、さまざまな物理形態もの（例えば、固形、半固形、液状、コロイド状など）が包含される。該組成物が医薬用途を意図したものである場合、該さらなる成分は、薬学的に許容され得るものである。本発明による組成物が、生体に指向されるものでないアッセイまたは他の用途における使用を意図したものである場合、該さらなる成分（１種類または複数種）は、薬学的に許容され得るものであっても、そうでないものであってもよい。
【００４８】
一部の実施形態において、純粋なエキスは１種類以上の有機溶媒と合わされ得る。かかる有機溶媒は種々の極性のものであり得る。一部の実施形態において、適当な溶媒としては、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌ）、アセトニトリル、ヘキサン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｉ−ブタノールなど）、クロロホルム、アセトン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、石油エーテル、ならびに他の溶媒（例えば、薬学的に許容され得るもの、およびヒトでの消費に対して一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）が挙げられる。
【００４９】
一部の実施形態において、該組成物は、純粋なエキスを含むもの、またはエキスと１種類以上のさらなる溶媒の組合せを含むものである。一部の実施形態において、エキスには、分配されたエキスまたはさらに精製されたエキスが包含される。分配または精製は、種々の分離手法（例えば、クロマトグラフィー）を用いて行なわれ得る。一部の実施形態において、エキスは、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたは排除クロマトグラフィーの手段によって得て、エキス中の活性薬剤をさらに濃縮した精製エキスまたは分配エキスである。一部の実施形態において、精製エキスまたは分配エキスは、１回以上の工程の液体クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）によって得られるものである。一部の実施形態において、高速液体クロマトグラフィーは、分取規模の高速液体クロマトグラフィーである。一部の実施形態において、ＨＰＬＣは、逆相またはイオン交換クロマトグラフィーである。また、他の分離手段を用いてエキスを精製または分配してもよく、分液漏斗または他の二相もしくは多相分離機構での分離が挙げられる。一部の実施形態において、精製エキスまたは分配エキスを１種類以上のさらなる活性または不活性な成分（例えば、溶媒、希釈剤など）と合わせてもよい。一部の実施形態において、適当な溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、ヘキサン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｉ−ブタノールなど）、クロロホルム、アセトン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、石油エーテル、ならびに他の溶媒（例えば、薬学的に許容され得るもの、およびヒトでの消費に対して一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）が挙げられ得る。
【００５０】
好適なさらなる成分としては溶媒が挙げられる。溶媒は、薬学的に許容され得る溶媒と非薬学的に許容され得る溶媒に細分され得る。これに関連して、薬学的に許容され得る溶媒の一例として注射用水（ＷＦＩ）が挙げられることは理解されよう。注射用水は、予め選択されたｐＨまたはｐＨ範囲、例えば約２〜約８、より具体的には約４．０〜約７．５、より特別には約４．９〜約７．２にｐＨ調整および／または緩衝され得る。
【００５１】
薬学的に許容され得る溶媒には、さらに、１種類以上の薬学的に許容され得る酸、塩基、塩または他の化合物（例えば、担体、賦形剤など）が包含され得る。薬学的に許容され得る酸としては、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４  Ｈ３ＰＯ４、安息香酸などが挙げられる。薬学的に許容され得る塩基としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮａＨＣＯ３などが挙げられる。薬学的に許容され得る塩としては、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＣｌなどが挙げられる。酸および塩基は、薬学的に許容され得る溶液を特定の予め選択されたｐＨに、特に約２〜８の範囲のｐＨ、より特別には約５．０〜約７．２の範囲に緩衝するのに適切な割合で添加され得る。
【００５２】
本発明による植物エキスは、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）の制御下にある遺伝子のエストロゲン様活性化をもたらすものである。したがって、一部の細胞では、本発明の植物エキスはエストロゲン様特性を有する。すなわち、ＥＲＥとＥＲ（ＥＲα、ＥＲβまたは両方）を含む細胞を本発明の植物エキスと接触させると、ＥＲＥの制御下にある遺伝子の刺激をもたらす。インビトロ細胞系では、本発明のエストロゲン様植物エキスによるＥＲＥ媒介性活性化により、ＥＲＥに作動可能に連結させた遺伝子の発現がもたらされる。特定の実施形態では、ＥＲと、最小限のチミジンキナーゼプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子に連結させたＥＲＥとのエストロゲン様相互作用により、ルシフェラーゼ発現の増強がもたらされる。したがって、本発明の植物エキスは、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼなど）に作動可能に連結させたＥＲＥ含有プロモーターを有するＥＲα＋細胞株、ＥＲβ＋細胞株および／またはＥＲα＋／ＥＲβ＋細胞株を同定するために使用され得る。また、本発明の植物エキスは、アッセイ試薬（例えば、ＥＲ＋細胞株においてエストロゲン様効果を有する化合物を同定するための標準物質）として使用され得る。
【００５３】
かかるアッセイ法の一例では、本発明の植物エキスを、まず、既知の活性または濃度で調製する。本発明の植物エキスの定量は、容器の風袋を計り（ｔａｒｅ）、容器内に既知の容量の植物エキスを測り入れ、植物エキスをエバポレーションまたは凍結乾燥によって濃縮させて残渣を得、容器＋植物エキスの質量を得ることにより簡便に行なわれる。容器＋植物エキスと風袋質量の質量差は、植物エキスの乾燥質量である。植物エキスの単位容量あたりの植物エキスの乾燥質量の比率は、単位容量あたりの濃度である。植物エキスは、濃度を特定するための前述の定量方法の結果を用いて、その最初の形態で使用してもよい。また、水または別の適当な溶媒系の添加によって既知濃度の植物エキス溶液を形成することにより、残渣を再構成してもよい。
【００５４】
植物エキスの濃度がわかったら、標準曲線を作成する。一般的には、ＥＲ＋細胞を植物エキスと接触させ、エストロゲン様活性に関するシグナルを記録する。特に、ＥＲ＋細胞は、ＥＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子を有する。このＥＲ＋細胞を本発明の植物エキスと接触させると、植物エキスの添加量に比例するレポーターシグナルが生成する。この工程は、同じ植物エキス濃度、異なる植物エキス濃度または両方の多数の試料を用いて行なってもよい。一例として、９例の試料：第１濃度の最初の３例、第１濃度より半対数（ｈａｌｆ  ｌｏｇ）大きい濃度の次の３例、および第１濃度より全対数（ｗｈｏｌｅ  ｌｏｇ）大きい濃度の次の３例が試験され得る。次いで、レポーターシグナルを観察して記録し、得られたデータ点（レポーターシグナル強度に対する植物エキス濃度）を、慣用的な曲線フィット法（例えば、最小２乗法）によって標準曲線にフィットさせる。
【００５５】
候補化合物のエストロゲン様効果を評価するため、候補化合物を、ＥＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子を有するＥ＋細胞と接触させる。レポーター遺伝子のシグナルを観察し、標準曲線と比較して候補化合物の相対エストロゲン様効果を定量する。
【００５６】
前述の方法に使用されるＥＲ＋細胞株は、天然でＥＲを発現する細胞株、例えば、ヒト由来ＥＲ＋乳房細胞癌腫細胞株であり得る。一部の実施形態において、ＥＲ＋組織は、ヒト不死化細胞株、例えば、骨髄または乳房の不死化細胞株である。例示的な細胞株としては、ヒト単球、骨芽細胞、悪性乳房癌腫および乳房上皮不死化細胞株が挙げられる。挙げられ得る具体的な細胞株の一例には、Ｕ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞株がある。他のＥＲ＋細胞株（不死化細胞株を含む）もまた、使用され得る。あるいはまた、ＥＲ＋細胞株は、天然でＥＲを発現しない細胞株（ＥＲ発現ベクターで形質転換した細菌細胞株など）であってもよい。
【００５７】
ＥＲ＋細胞株は、レポーター遺伝子を制御するＥＲＥを含むプロモーターを有するベクターで形質転換する。例えば、該ベクターは、ＥＲＥ、最小限のチミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）およびルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を含むウイルスベクターであり得る。例示的なＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｋ構築物を配列番号：１に示す。ここで、ＥＲＥはヌクレオチド１−で示され、ｔｋはヌクレオチドｎｎ−で示され、Ｌｕｋはヌクレオチドｍｍ−で示される。この構築物を標的細胞で、既知の方法によってトランスフェクトし、ＥＲ−ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｋ系の発現を、例えば、既知量のＥ２の存在下で推定ＥＲ＋細胞に対して前述のアッセイを行なうことにより確認する。ＥＲ＋細胞の成功裡の形質転換の他の確認方法としては、既知のＥＲ抗体を用いた免疫染色が挙げられる。
【００５８】
ＥＲＥ含有プロモーターは、ＥＲＥ配列とプロモーター配列を含むＤＮＡである。プロモーター配列は、当該技術分野で認知されたプロモーター配列、例えば、最小限のチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター配列である（配列番号：１，ヌクレオチドｎｎ−参照）。他のＥＲＥ含有プロモーターも可能であり、本発明の範囲に含まれる。ＥＲＥとプロモーター配列は、一緒に作動してレポーター遺伝子の発現を制御する。本明細書に記載のように、エストロゲン様化合物（例えば、植物エキスまたはＥ２）はＥＲに結合してＥＲ二量体をもたらし、ＡＦ−２表面を形成する。次いで、ＥＲ二量体はＥＲＥに結合し、該プロモーターの制御下にある該遺伝子を活性化させる。一部の実施形態において、ＥＲＥは、該プロモーターのすぐ上流（５’側）に存在し、直接ライゲートされている。一例として、ＥＲＥ−ｔｋプロモーター構築物を配列番号：１，ヌクレオチド１−ｎｎ−１に示す。
【００５９】
レポーター遺伝子は、発現されると、検出可能なシグナルをもたらす遺伝子である。ルシフェラーゼ遺伝子は、単一の試薬ルシフェリンの存在下で検出可能な光シグナルを生成するタンパク質ルシフェラーゼをもたらすため、好適なレポーター遺伝子である。特に、ルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡが発現させると、６２ｋＤａの酵素タンパク質ルシフェラーゼが生成される。ルシフェラーゼ酵素は、Ｍｇ２＋と酸素の存在下でルシフェリンとＡＴＰの反応を触媒し、オキシルシフェリン、ＡＭＰ、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の形成の光の放射をもたらす。放射される光は黄緑色（５６０ｎｍ）であり、標準的な光量測定器を用いて容易に検出され得る。ＡＴＰ、Ｏ２およびＭｇ２＋は既に細胞内に存在しているため、検出可能なシグナルの生成に必要なことは、このレポーター遺伝子に試薬ルシフェリンを添加することだけであり、本発明のアッセイにおける使用に特によく適している。当該技術分野において利用可能であると記載され得る他のレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が挙げられる。
【００６０】
本発明の一部のアッセイ法では、標準植物エキスを、１種類以上のエストロゲン様化合物（ＳＥＲＭなど）との比較によって、さらに特性評価することが有用である。かかるアッセイ法は、本質的に、該方法の適切な部分において、標準エストロゲン様化合物および／またはＳＥＲＭを植物エキスで適正に置き換えることにより、上記のようにして行なわれる。
【００６１】
また、本発明による植物エキスは、ＴＮＦ  ＲＥ媒介性経路によって遺伝子発現を抑制するものである。一部の場合において、本発明の植物エキスは遺伝子発現をインビトロで、特に、ＴＮＦ  ＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、Ｌｕｃ）を有する細胞において抑制するものである。一部の場合において、本発明の植物エキスは、単球およびマクロファージによって主に産生されるサイトカインであるＴＮＦ−αの発現を抑制するものである。このサイトカインは、種々の組織の滑膜細胞およびマクロファージに見られ、関節リウマチ（ＲＡ）に大きく関与している。また、ＴＮＦ−αは、他の炎症性疾患においても発現され、また、細菌由来の内毒素に対する応答としても発現される。ＴＮＦ  ＲＥ抑制型経路によるＴＮＦ発現の抑制因子として、本発明の植物エキスは、高レベルのＴＮＦと関連している炎症性障害の治療において重要である。
【００６２】
本発明の一部の実施形態では、ＥＲαとＥＲβの一方または両方ならびにＴＮＦ  ＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子発現する細胞株を調製する。ＴＮＦ  ＲＥは、一般的にレポーター遺伝子の上流（５’側）に存在し、シグナル検出は、本明細書において先に記載のようにして行なう。ＴＮＦ  ＲＥの制御下にあるレポーター遺伝子（本件ではルシフェラーゼ遺伝子）を有するＤＮＡの配列を配列番号：２に示す。ヌクレオチド１−はＴＮＦ  ＲＥに相当し、一方、ヌクレオチドｎｎ−はルシフェラーゼ遺伝子に相当する。
【００６３】
前述の細胞、ＴＮＦ  ＲＥ含有細胞系は、さらに、１コピー以上のＥＲ遺伝子、すなわち、ＥＲα、ＥＲβまたは両方を含む。前述の方法に使用されるＥＲ＋細胞株は、天然でＥＲを発現する細胞株、例えば、ヒト由来ＥＲ＋乳房細胞癌腫細胞株であり得る。一部の実施形態において、ＥＲ＋組織は、ヒト不死化細胞株、例えば、骨髄または乳房の不死化細胞株である。例示的な細胞株としては、ヒト単球、骨芽細胞、悪性乳房癌腫および乳房上皮不死化細胞株が挙げられる。挙げられ得る具体的な細胞株の一例には、Ｕ９３７、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞株がある。他のＥＲ＋細胞株（不死化細胞株を含む）もまた、使用され得る。あるいはまた、ＥＲ＋細胞株は、天然でＥＲを発現しない細胞株（ＥＲ発現ベクターで形質転換した細菌細胞株など）であってもよい。
【００６４】
所定量のルシフェリンの存在下、およびエストロゲン様化合物（例えば、Ｅ２または本発明の植物エキス）の非存在下において、該細胞系は黄色光（５６０ｎｍ）を、「対照強度」または「ベースライン強度」と称される強度で放射する。５６０ｎｍの光放射は、光学密度単位（Ｏ．Ｄ．５６０ｎｍ）で簡便に定量される。エストロゲン様化合物、例えば、Ｅ２または本発明の植物エキスの１つを添加すると、５６０ｎｍの光放射の強度は、対照と比べて減衰される。注目すべきことに、タモキシフェンまたはラロキシフェンなどのＳＥＲＭの存在下では、ルシフェラーゼ発現は増大し、５６０ｎｍの光放射の強度も増大する。したがって、本発明の植物エキスは、遺伝子発現のエストロゲン様ＴＮＦ  ＲＥ制御型抑制を誘導し得るものである。
【００６５】
ＴＮＦ  ＲＥ含有細胞系は、本発明によるアッセイ法において使用され得る。本発明のアッセイ法において、ルシフェラーゼ活性の減衰（すなわち、５６０ｎｍの光の放射の低減）は、エストロゲン様活性の増大と相関しており、一方、ルシフェラーゼ活性の賦活（すなわち、５６０ｎｍにおける放射の増大）は、抗エストロゲン様活性と相関している。標準曲線は、既知量の本発明の植物エキスを用いて、本明細書に記載のようにして作成され得る。他の既知のエストロゲン様または抗エストロゲン様標準物質（Ｅ２など）あるいはいくつかの他の既知のエストロゲン様化合物および／または抗エストロゲン様ＳＥＲＭ（タモキシフェンもしくはラロキシフェン）を使用することにより、かかる標準曲線を、さらに増強してもよい。
【００６６】
次いで、形質転換Ｅ＋細胞株由来の細胞を、本明細書に記載のようにして候補化合物に曝露し、ルシフェラーゼシグナルを観察し、シグナルを事前に作成した標準曲線（１つまたは複数）と比較する。対照（ベースライン）と比べてルシフェラーゼ活性の増大を引き起こす化合物は、抗エストロゲン様ＳＥＲＭと特性評価され、一方、対照と比べてルシフェラーゼ活性の低下を引き起こす化合物は、エストロゲン様に分類される。次いで、エストロゲン様または抗エストロゲン様効果が、ルシフェラーゼ発現の低下または増大の程度を、本発明の植物エキスによってもたらされる低下と比較することにより、任意選択で、それぞれ、Ｅ２、タモキシフェンおよび／またはラロキシフェンによってもたらされるシグナルの低下または増大と比較することにより定量され得る。
【００６７】
また、本発明の植物エキス組成物は、Ｅ２−ＥＲとＥＲＥの相互作用と拮抗するものである。特に、タデ科のダイオウ属のエキスは、ＥＲβとＥＲαの直接相互作用によるＥ２によるＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃの活性化と拮抗することが示されている。ＥＲＥ制御型遺伝子のＥ２−ＥＲ活性化のアンタゴニストとして、本発明の植物エキス組成物は、タモキシフェンと効果が類似しているとみなされ、乳癌および子宮癌に対して予防的、待機的および／または抗増殖性の活性を有する。
【００６８】
本発明は、インビボでの本発明の組成物のエストロゲン様使用法を提供する。一般に、該インビボ法は、被検体に、該被検体においてエストロゲン様効果がもたらされるのに充分な量の該植物エキスを投与することを含む。該インビボ法は、エストロゲン様ＥＲＥ制御型遺伝子の活性化、ＴＮＦ  ＲＥ制御型遺伝子の抑制（例えば、ＴＮＦ−α抑制）、または両方をもたらすものである。したがって、該インビボ法は、インビボで種々の陽性表現型効果をもたらすものである。
【００６９】
被検体は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、チンパンジー、イヌ、ネコまたはヒツジなどであり得、一般的には雌である。また、被検体はヒトであり得、特に女性である。一部の実施形態において、被検体は、閉経後または卵巣摘出後の女性であって、エストロゲン療法を必要とする女性である。かかる場合において、被検体は、更年期症状、例えば、のぼせ、不眠、膣乾燥、性欲減退、尿失禁および鬱などを罹患している被検体であり得る。他のかかる場合では、被検体は、骨粗鬆症になりやすい、または骨粗鬆症に罹患している被検体であり得る。好適なインビボ法としては、エストロゲン補充療法に応答性である医療適応症の治療および／または予防が挙げられる。
【００７０】
本発明による組成物の投与は、一般に使用されている投与経路によるものであるが、該経路によって、１種類以上の該植物エキスが標的組織に対して利用可能であるものとする。挙げられ得る投与経路の一例には、経口、経鼻、口腔内、経直腸、経膣および／または経表面（経皮）がある。あるいはまた、投与は、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであってもよい。かかる組成物は、通常、薬学的に許容され得る組成物として投与され得る（上記）。
【００７１】
疾患、障害、症候群、病状または症状の治療（およびその文法的語尾変化形、例えば、治療する（ｔｒｅａｔ，ｔｏ  ｔｒｅａｔ，ｔｒｅａｔｉｎｇ）、治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）など）としては、臨床医が、かかる治療を受ける被検体を特定するため、および本発明の組成物を該被検体に投与するために採用され得る措置が挙げられる。したがって、治療は、本発明のエストロゲン様植物エキスを被検体に投与することにより、おそらく回復、緩和、改善、解消、治癒されるであろう疾患、症候群、病状または症状の診断を包含する。また、治療は、疾患、障害、症候群、病状または症状の回復、緩和、改善、解消または治癒の同時存在を包含する。一部の実施形態において、治療は、疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の発病の防止もしくは遅延（すなわち、予防）、疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の進行の防止もしくは遅延、および／または疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の重症度の低減を含意する。新生物増殖の場合は特に、治療は、新生物増殖の緩和ならびに逆転、停止また遅延を包含する。これに関連して、治療はまた、寛解（完全寛解および一部寛解を含む）も包含する。更年期症状の場合、治療は、種々の症状の予防および緩和を包含する。
【００７２】
疾患、障害、症候群、病状または症状の予防（およびその文法的語尾変化形）としては、疾患、障害、症候群、病状または症状を発症するリスクのある被検体を特定し、該被検体に、おそらく前記疾患、障害、症候群、病状または症状の発病が回避または遅延されるであろう充分な量の本発明の植物エキスを投与することが挙げられる。一部の場合において、予防は、臨床医が、医療ケアの適格基準を適用してホルモン補充療法の必要があると考える閉経後女性を特定し、本発明の植物エキスを該女性に投与し、それにより１つ以上の更年期症状をブロックまたは遅延することを包含する。一部の実施形態において、骨粗鬆症の予防は、臨床医が、医療ケアの適格基準を適用して、骨粗鬆症を発症するリスクがあると考える閉経後女性を特定し、本発明の植物エキスを該女性に投与し、それにより骨量減少の発生をブロックまたは遅延することを包含する。
【００７３】
緩和は、疾患、障害、症候群、病状または症状の発生の重症度、数および／または頻度の低減を包含する。更年期症状の緩和としては、のぼせ、不眠、失禁、鬱などの頻度および／または重症度の低減が挙げられる。
【００７４】
骨粗鬆症の治療としては、骨量減少のリスクのある人（閉経後女性など）を特定し、本発明の植物エキスを該女性に投与し、それにより、骨量減少の重症度を低減、発生を遅延もしくは予防することが挙げられる。一部の実施形態において、骨粗鬆症の治療には骨量の増量も含まれ得る。
【００７５】
さらに、本発明は、タデ科のダイオウ属（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ  Ｌ）の本発明のエキスの作製方法を提供する。詳しくは、本発明は、本発明のエストロゲン様植物エキスの作製方法を提供する。該方法は、タデ科のダイオウ属の種の植物から所与の量の植物体を得ること、任意選択で、該植物体を細かく砕くこと、前記植物体を抽出媒体と接触させること、および該植物体を抽出媒体から分離することを含む。
【００７６】
一部の実施形態において、該植物種は、タデ科の種々の品種のダイオウ属のタデ科のダイオウ属の種の植物のものである。
【００７７】
植物体（ｐｌａｎｔ  ｍａｔｔｅｒ）は、タデ科のダイオウ属の種の少なくとも１つの植物の任意の一部分（１つまたは複数）を意味する。植物体としては、完全体の植物または該植物の任意の一部分（１つまたは複数）、例えば、根、樹皮、樹木、葉、花（もしくは花の萼片、花弁、雄蕊、雌蕊など）、果実、種子および／または前述のものの任意の一部分もしくは混合物が挙げられる。植物体は、切ったばかりのもの、乾燥させたもの（フリーズドライを含む）、凍結したものなどであり得る。また、植物体は完全体であってもよく、小部分に分離したものであってもよい。例えば、葉は切り刻まれたり、千切りされたり、すり潰されたりされ得る。根は切り刻まれたり、すり潰されされ得る。果実は切り刻まれたり、スライスされたり、ブレンドされたりされ得る。種子は切り刻まれたり、すり潰されたりされ得る。茎は千切りされたり、切り刻まれたり、すり潰されたりされ得る。本発明の特別な実施形態では、使用される植物部分は、タデ科のダイオウ属の葉である。
【００７８】
本発明の植物エキス組成物は、タデ科のダイオウ属の少なくとも１種類のエキスを含む。「エキス」は、植物部分を抽出溶媒と、該植物由来の１種類以上の化合物が該植物体から抽出溶媒中に分配されるのに適した条件下で接触させた場合の結果としての溶液、濃縮液または残渣である。次いで、該溶液を任意選択で濃縮すると、濃縮液または残渣が形成される。
【００７９】
本発明に好適な抽出媒体としては、水およびエチルアルコールが挙げられる。具体的には、水が抽出溶媒である場合、精製水が好適である。精製水としては、蒸留水、脱イオン水、注射用水、限外濾過水、および他の形態の精製水が挙げられる。使用されるエチルアルコールは、本発明の一部の実施形態では、穀物エタノール、特に、非変性エタノール（例えば、純粋な穀物エタノール、任意選択で、いくらかの水分、例えば、約１０％までの水分を含有する）である。一部の実施形態において、抽出溶媒は水、エタノールまたはその混合物である。濃縮液または残渣は、抽出溶液を減少（例えば、エバポレートまたは凍結乾燥）させることにより調製され得る。最初の抽出溶媒であれ、濃縮還元液であれ、残渣形態であれ、これらの各調製物は、本発明の解釈上、「エキス」とみなされる。
【００８０】
本発明による植物エキスの作製方法は、任意選択で、表面積−体積比を増大させると同時に、抽出プロセス効率を増大させるために、最初に植物体を細かく砕くことを含む。植物体を細かく砕く方法としては、すり潰す、切り刻む、ブレンドする、千切りする、粉砕する、磨砕するなどが挙げられる。
【００８１】
次いで、抽出媒体（溶媒）を植物体と、１種類以上のフィトケミカル、特にエストロゲン様フィトケミカルが植物体から抽出媒体中に分配されるのに適した条件下で接触させる。かかる条件としては、一部の場合において、室温より上の温度までの抽出媒体の加熱、攪拌、接触時間などが挙げられる。例示的な抽出温度は、約５０℃から抽出溶媒の沸点までである。水が抽出溶媒である場合、抽出温度は、一般的に室温から約１００℃であり、約５０℃〜約８０℃の温度が特に好適であり、約７５℃の温度が特別に好適である。抽出溶媒がエタノールの場合、抽出温度は、一般的にほぼ室温から約７８．５℃であり、約５０℃〜約７８℃の温度が特に好適であり、約７５℃の温度が特別に好適である。当業者には、一方において抽出効率と、他方においてフィトケミカルの化合物安定性との間に適正な均衡がもたらされるべきであることが認識されよう。
【００８２】
抽出媒体と植物体を合わせたら、これらを任意選択で、植物体から抽出媒体中へのエストロゲン様化合物の効率的な交換を確実にするために攪拌し、有用な量のフィトケミカル化合物が植物体から抽出媒体中に抽出されるのに充分な時間、接触させたままにする。かかる時間の経過後（例えば約５分〜約１０時間、より特別には約１０分〜約５時間、特に約３０分〜約２時間）、フィトケミカル化合物を含有する抽出媒体を植物体から分離する。かかる分離は、当該技術分野で認知された方法によって、例えば、濾過、デカンテーションなどによって行なわれる。
【００８３】
本発明による組成物は、本発明の植物エキスを含むもの、または本発明の植物エキスを含む本発明の組成物である。かかる実施形態において、本発明の組成物は、任意選択で、１種類以上のさらなる成分を含む。かかるさらなる成分は不活性であっても活性であってもよい。不活性成分としては、溶媒、賦形剤および他の担体が挙げられる。活性成分としては、活性医薬成分（ＡＰＩ）、例えば、本発明の植物エキスとの組合せで相乗活性を示すものが挙げられる。
【００８４】
ダイオウエキス
一部の実施形態において、植物種は、種々の品種のダイオウの植物種ダイオウである。
【００８５】
植物体は、種ダイオウ由来の少なくとも１つの植物の任意の一部分（１つまたは複数）、特に棘状突起（トゲ）を意味する。一般に、植物体には、完全体の植物の他の部分または該植物の任意の一部分（１つもしくは複数）、例えば、根、樹皮、木、葉、花（もしくは花の萼片、花弁、雄蕊、雌蕊など）、果実、種子および／または前述のものの任意の一部分もしくは混合物も含まれ得るが、本発明において好ましい実施形態では、本明細書に記載のエキスおよび前記エキスを含む医薬組成物の調製に使用される植物部分は、ダイオウの棘状突起（別名トゲ）である。植物体は、切ったばかりのもの、乾燥させたもの（フリーズドライを含む）、凍結したものなどであり得る。また、植物体は完全体であってもよく、小部分に分離したものであってもよい。例えば、葉は切り刻まれたり、千切りされたり、すり潰されたりされ得る。根は切り刻まれたり、すり潰され得る。果実は切り刻まれたり、スライスされたり、ブレンドされたりされ得る。種子は切り刻まれたり、すり潰されたりされ得る。茎は千切りされたり、切り刻まれたり、すり潰されたりされ得る。本発明の特別な実施形態では、使用される植物部分は、ダイオウの棘状突起（トゲ）である。
【００８６】
本発明の植物エキス組成物は、ダイオウの少なくとも１種類のエキスを含む。「エキス」は、植物部分を抽出溶媒と、該植物由来の１種類以上の化合物が該植物体から抽出溶媒中に分配されるのに適した条件下で接触させた場合の結果としての溶液、濃縮液または残渣である。次いで、該溶液を任意選択で濃縮すると、濃縮液または残渣が形成される。
【００８７】
本発明に好適な抽出媒体としては、水およびエチルアルコールが挙げられる。具体的には、水が抽出溶媒である場合、精製水が好適である。精製水としては、蒸留水、脱イオン水、注射用水、限外濾過水、および他の形態の精製水が挙げられる。使用されるエチルアルコールは、本発明の一部の実施形態では、穀物エタノール、特に、非変性エタノール（例えば、純粋な穀物エタノール、任意選択で、いくらかの水分、例えば、約１０％までの水分を含有する）である。一部の実施形態において、抽出溶媒は水、エタノールまたはその混合物である。濃縮液または残渣は、抽出溶液を減少（例えば、エバポレートまたは凍結乾燥）させることにより調製され得る。最初の抽出溶媒であれ、濃縮還元液であれ、残渣形態であれ、これらの各調製物は、本発明の解釈上、「エキス」とみなされる。
【００８８】
本発明による植物エキスの作製方法は、任意選択で、表面積−体積比を増大させると同時に、抽出プロセス効率を増大させるために、最初に植物体を細かく砕くことを含む。植物体を細かく砕く方法としては、すり潰す、切り刻む、ブレンドする、千切りする、粉砕する、磨砕するなどが挙げられる。
【００８９】
次いで、抽出媒体（溶媒）を植物体と、１種類以上のフィトケミカル、特に、選択的エストロゲン様フィトケミカルが植物体から抽出媒体中に分配されるのに適した条件下で接触させる。かかる条件としては、一部の場合において、室温より上の温度までの抽出媒体の加熱、攪拌、接触時間などが挙げられる。例示的な抽出温度は、約５０℃から抽出溶媒の沸点までである。水が抽出溶媒である場合、抽出温度は、一般的に室温から約１００℃であり、約５０℃〜約８０℃の温度が特に好適であり、約７５℃の温度が特別に好適である。抽出溶媒がエタノールの場合、抽出温度は、一般的にほぼ室温から約７８．５℃であり、約５０℃〜約７８℃の温度が特に好適であり、約７５℃の温度が特別に好適である。当業者には、一方において抽出効率と、他方においてフィトケミカルの化合物安定性との間に適正な均衡がもたらされるべきことが認識されよう。
【００９０】
抽出媒体と植物体を合わせたら、これらを任意選択で、植物体から抽出媒体中への選択的エストロゲン様化合物の効率的な交換を確実にするために攪拌し、有用な量のフィトケミカル化合物が植物体から抽出媒体中に抽出されるのに充分な時間、接触させたままにする。かかる時間の経過後（例えば約５分〜約１０時間、より特別には約１０分〜約５時間、特に約３０分〜約２時間）、フィトケミカル化合物を含有する抽出媒体を植物体から分離する。かかる分離は、当該技術分野で認知された方法によって、例えば、濾過、デカンテーションなどによって行なわれる。
【００９１】
本発明による組成物は、本明細書に記載の植物エキスを含むもの、または本明細書に記載の植物エキスを含む本発明の組成物である。かかる実施形態において、本明細書に記載の組成物は、任意選択で、１種類以上のさらなる成分を含む。かかるさらなる成分は不活性であっても活性であってもよい。不活性成分としては、溶媒、賦形剤および他の担体が挙げられる。活性成分としては、活性医薬成分（ＡＰＩ）、例えば、本明細書に記載の植物エキスとの組合せで相乗活性を示すものが挙げられる。
【００９２】
本明細書に開示した一部の実施形態では、分類学上の種ダイオウのエキスを含む医薬組成物を提供する。「エキス」は、一部において、抽出媒体（溶媒）を植物体と、１種類以上の化学物質化合物が該植物体から抽出媒体中に誘導され、抽出溶液が形成されるのに適した条件下で接触させることにより調製される物質の組成物である。次いで、抽出溶液を植物体から分離し、任意選択で、希釈または濃縮すると（例えば、エバポレーション、昇華もしくは凍結乾燥によって）、エキスが形成される。
【００９３】
種ダイオウは、中位の速度で１２ｍまで生長する落葉樹である。花は両性であり、雄性器官と雌性器官の両方を有し、昆虫によって授粉する。これは、窒素固定を行なうものもあり得る。この植物は、軽質（砂質）、中質（ロウム）および重質（粘土）土壌を好み、水はけのよい土壌を必要とする。この植物は、酸性、中性および塩基性（アルカリ性）土壌を好む。この植物は、日陰では生長することができない。この植物は、乾燥または湿潤土壌を必要とし、干ばつに耐え得る。この植物は、大気汚染にも耐え得る。樹木は、少しの樹冠を有し、晩春に葉をつけ、初秋に落葉する。
【００９４】
特定の実施形態では、棘状突起を樹木から採取し、採取後、短時間以内に抽出媒体と接触させる。抽出媒体は、適当な液体溶媒、例えば、酢酸エチル、水またはエタノールである。抽出媒体は、一部の場合では、酢酸エチル、水、エタノールまたは別の比較的極性の液体溶媒である。一部の場合において、抽出媒体は希釈されるか、または濃縮されるかのいずれかである。抽出媒体を充分に濃縮してもよく、その場合、エキスは、残渣の形態（残渣エキス）となる。したがって、エキスは、少なくとも１種類以上の植物由来化合物（フィトケミカル）を含み（任意選択で溶媒中に溶解）、これを、抽出媒体と植物または植物の一部分との１回以上の接触工程によって抽出媒体中に誘導させる。濃縮エキスまたは残渣エキスは、適当な希釈剤、例えば、酢酸エチル、水および／またはエタノールを添加して再構成エキスを形成することにより再構成され得る。
【００９５】
一部の実施形態において、植物エキスを含む組成物としては、純粋なエキスを含むもの、または分配されたエキス（例えば、１種類以上の選択的エストロゲン様活性化合物を富化させたエキス）を含むもの、およびかかるエキスと１種類以上のさらなる成分の組合せを含むものが挙げられる。一部の実施形態において、該組成物には、さまざまな物理形態もの（例えば、固形、半固形、液状、コロイド状など）が包含される。該組成物が医薬用途を意図したものである場合、該さらなる成分は、薬学的に許容され得るものである。本発明による組成物が、生体に指向されるものでないアッセイまたは他の用途における使用を意図したものである場合、該さらなる成分（１種類または複数種）は、薬学的に許容され得るものであっても、そうでないものであってもよい。
【００９６】
一部の実施形態において、純粋なエキスは１種類以上の有機溶媒と合わされ得る。かかる有機溶媒は種々の極性のものであり得る。一部の実施形態において、適当な溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、ヘキサン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｉ−ブタノールなど）、クロロホルム、アセトン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、石油エーテル、ならびに他の溶媒（例えば、薬学的に許容され得るもの、およびヒトでの消費に対して一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）が挙げられる。
【００９７】
一部の実施形態において、該組成物は、純粋なエキスを含むもの、またはエキスと１種類以上のさらなる溶媒の組合せを含むものである。一部の実施形態において、エキスには、分配されたエキスまたはさらに精製されたエキスが包含される。分配または精製は、種々の分離手法（例えば、クロマトグラフィー）を用いて行なわれ得る。一部の実施形態において、エキスは、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたは排除クロマトグラフィーの手段によって得て、エキス中の活性薬剤をさらに濃縮した精製エキスまたは分配エキスである。一部の実施形態において、精製エキスまたは分配エキスは、１回以上の工程の液体クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）によって得られるものである。一部の実施形態において、高速液体クロマトグラフィーは、分取規模の高速液体クロマトグラフィーである。一部の実施形態において、ＨＰＬＣは、逆相またはイオン交換クロマトグラフィーである。また、他の分離手段を用いてエキスを精製または分配してもよく、分液漏斗または他の二相もしくは多相分離機構での分離が挙げられる。一部の実施形態において、精製エキスまたは分配エキスを１種類以上のさらなる活性または不活性な成分（例えば、溶媒、希釈剤など）と合わせてもよい。一部の実施形態において、適当な溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、ヘキサン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｉ−ブタノールなど）、クロロホルム、アセトン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、石油エーテル、ならびに他の溶媒（例えば、薬学的に許容され得るもの、およびヒトでの消費に対して一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）が挙げられ得る。
【００９８】
好適なさらなる成分としては溶媒が挙げられる。溶媒は、薬学的に許容され得る溶媒と非薬学的に許容され得る溶媒に細分され得る。これに関連して、薬学的に許容され得る溶媒の一例として注射用水（ＷＦＩ）が挙げられることは理解されよう。注射用水は、予め選択されたｐＨまたはｐＨ範囲、例えば約２〜約８、より具体的には約４．０〜約７．５、より特別には約４．９〜約７．２にｐＨ調整および／または緩衝され得る。
【００９９】
薬学的に許容され得る溶媒には、さらに、１種類以上の薬学的に許容され得る酸、塩基、塩または他の化合物（例えば、担体、賦形剤など）が包含され得る。薬学的に許容され得る酸としては、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４  Ｈ３ＰＯ４、安息香酸などが挙げられる。薬学的に許容され得る塩基としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮａＨＣＯ３などが挙げられる。薬学的に許容され得る塩としては、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＣｌなどが挙げられる。酸および塩基は、薬学的に許容され得る溶液を特定の予め選択されたｐＨに、特に約２〜８の範囲のｐＨ、より特別には約５．０〜約７．２の範囲に緩衝するのに適切な割合で添加され得る。
【０１００】
医薬組成物
ダイオウエキスは、上記のようにして、溶液状または乾燥形態のいずれかに調製され得る。溶液形態では、ダイオウエキスは、フレーバーティーまたはノンフレーバーティーの形態で投与され得る。一部の実施形態では、エキスの苦味を弱めるために、いくらかのフレーバー（例えば、甘味料）が望ましい場合があり得る。また、該溶液は、乾燥エキスからお茶またはエリキシルの形態に調製され得る。この場合も、甘味料などのフレーバーが望ましい場合があり得る。該医薬組成物の患者の許容性を改善するため、味覚マスキング剤を使用してもよい。
【０１０１】
乾燥エキスは、経口利用可能な形態、例えば、カプセル剤、錠剤、キャプレット剤などとして製剤化され得る。カプセル剤は、適当な量の乾燥エキスを１つ以上のゼラチンカプセルシェルに測り入れ、カプセル剤（１つまたは複数）を作製することにより調製され得る。錠剤およびキャプレット剤は、乾燥エキスを１種類以上の結合剤および任意選択で１種類以上の崩壊剤と合わせることにより調製され得る。錠剤、キャプレット剤、カプセル剤などは、例えば、胃の不調を抑制するために腸溶コーティングでコーティングしてもよい。
【０１０２】
乾燥エキスまたは濃縮エキス溶液のいずれかを、１種類以上のゲル化剤と合わせ、ゲルカプセル内に挿入してもよい。あるいはまた、乾燥エキスまたは濃縮エキス溶液を、ゲル化剤と、任意選択で食用ゲルとしての経口投与用の１種類以上のフレーバー剤と合わせてもよく、フレーバーなしの形態を、経直腸坐剤ゲルまたはゲルカプセル剤として投与してもよい。
【０１０３】
該エキスの単位用量は、投薬形態内に含まれる乾燥エキスの相当量によって特性評価される。例えば、一部の実施形態において、単位投薬量は、１ｍｇ〜約１０ｇの乾燥エキス、またはその同等量を含むものであり得る。一部の実施形態では、単位用量は、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ（１ｇ）、約１ｍｇ〜約１００００ｍｇ（１０ｇ）の乾燥エキス、またはその同等量を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇまたは約１０ｍｇ〜約１００００ｍｇの乾燥エキスまたはその同等量を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１００ｍｇ〜約５０００、約１００ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約１００〜約１０００、約１００〜約８００ｍｇの乾燥エキス、またはその同等量を含む。乾燥ダイオウエキスの同等量は、乾燥ダイオウエキスと同じ量の選択的エストロゲン様活性（ａｃｔｉｖｅ）を含む乾燥状態、液状、ゲル状または他の混合物状態のダイオウの量である。したがって、０．０９０ｍｇ／ｍＬの乾燥ダイオウエキスを含む３０ｍＬのお茶は、１５ｍｇの乾燥ダイオウと同等の単位用量であり、各々１００ｍｇの乾燥ダイオウエキス、結合剤、充填剤、崩壊剤を含む錠剤は、１００ｍｇの乾燥エキスそのままと同等である。
【０１０４】
治療方法
選択的ダイオウを有する（ｐｏｓｓｅｓｓ）本明細書に記載のダイオウエキスを含む組成物は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ陰性）癌細胞（ＥＲ陰性の乳癌および前立腺癌細胞など）において選択的エストロゲン様活性（ａｃｔｉｖｅｌｙ）を有する。したがって、該組成物は、細胞の過剰増殖を特徴とする種々の疾患状態、例えば、生物体、器官、組織または細胞株における正常な選択的エストロゲン様プロセスの不全によって引き起こされる疾患状態の治療において活性を有することが予測される。とりわけ、本明細書に記載の組成物で治療可能であることが想定される疾患状態は癌であり、限定されないが、骨の癌、脳幹神経膠腫、乳癌、副腎の癌、肛門部の癌、膀胱癌、内分泌系の癌、食道癌、頭部もしくは頸部の癌、腎臓もしくは尿管の癌、副甲状腺の癌、陰茎の癌、小腸の癌、甲状腺癌、尿道の癌、頚部の癌腫、子宮内膜の癌腫、ファローピウス管癌腫、腎盂の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、慢性もしくは急性白血病、結腸癌、皮膚もしくは眼内黒色腫、神経膠腫、ホジキン病、肺癌、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、卵巣癌、膵臓癌、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、肉腫（例えば、軟組織の）、皮膚癌、脊椎軸（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ）の腫瘍、胃癌または子宮癌が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、とりわけ、乳房、肺、結腸、脳、前立腺、胃、膵臓、卵巣、皮膚（黒色腫）、内分泌、子宮、精巣および膀胱の癌などの充実性腫瘍から選択される１種類以上の癌と診断された患者に投与される。
【０１０５】
一部の実施形態において、本明細書に記載のダイオウエキスを含む組成物は、良性の増殖性疾患（良性の前立腺肥大など）、乾癬または再狭窄（例えば、植込みステントの）を治療するのに有効である。
【０１０６】
一部の実施形態において、本明細書に記載のダイオウエキスを含む１種類以上の組成物を、異常な細胞増殖（例えば、癌、充実性腫瘍、良性の過剰増殖性疾患など）の治療に有用な別の薬剤と組み合わせてもよい。かかるさらなる薬剤は、とりわけ、有糸分裂阻害薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害薬、細胞周期阻害薬、酵素、トポイソメラーゼ阻害薬、生物学的応答修飾物質、抗体、細胞傷害剤、抗ホルモン、および抗アンドロゲンから選択され得る。
【０１０７】
ダイオウエキスを含む組成物の有効用量は、本明細書に記載のような多細胞生物における治療効果がもたらされるのに有効な量である。一部の実施形態において、有効用量は、生物体において過剰増殖性細胞の１つ以上の集団においてアポトーシスが誘導されるのに充分な量である。一部の実施形態において、有効用量は、生物体において過剰増殖性細胞疾患（癌など）の１つ以上の症状の軽減がもたらされるのに充分な量である。一部の実施形態において、有効用量は、過剰増殖性細胞疾患の進行が有意に低下する、前記過剰増殖性細胞疾患の一部または完全な寛解がもたらされる、前記過剰増殖性細胞疾患の再発、拡延または悪性増殖の一部または完全な予防がもたらされるのに充分な量である。一部の実施形態では、該用量は治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）の好成績に重要であり得る。ダイオウエキスは、おおむね無毒性であるとみなされているため、有効用量は、乾燥エキス約１ｍｇ〜約１０ｇ／患者／日（または溶液中もしくは他の薬学的に許容され得る形態（以下に、より詳細に論考する）におけるその同等量）で異なり得る。一部の実施形態において、有効用量は約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ（１ｇ）、約１ｍｇ〜約１００００ｍｇ（１０ｇ）／患者／日である。一部の実施形態では、有効用量は約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇまたは約１０ｍｇ〜約１００００ｍｇ／患者／日である。一部の実施形態では、有効用量は約１００ｍｇ〜約５０００、約１００ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約１００〜約１０００、約１００〜約８００ｍｇ／患者／日である。一部の実施形態において、治療日数は非治療日数とともに変更され得る。例えば、治療は、第１日目に上記の有効用量で開始され、該有効用量の投与が第３、５、７（または８）、９、１１、１３日目などに繰り返され得る。治療は、１日１回を１週間通して施した後、治療を１週間中断し、その後、少なくともさらに１週間治療が施され得る。また、ダイオウエキスでの治療を別の抗癌治療と交互に行なってもよく、別の抗癌治療と組み合わせて癌治療の複合効果を利用してもよい。
【０１０８】
さらなる癌治療としては、限定されないが、充実性腫瘍の全部または一部の外科的切除、放射線治療、補助的化学療法、抗炎症薬、鎮痛薬などが挙げられ得る。
【０１０９】
疾患、障害、症候群、病状または症状の治療（およびその文法的語尾変化形、例えば、治療する（ｔｒｅａｔ，ｔｏ  ｔｒｅａｔ，ｔｒｅａｔｉｎｇ）、治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）など）としては、臨床医が、かかる治療を受ける被検体を特定するため、および本発明の組成物を該被検体に投与するために採用され得る措置が挙げられる。したがって、治療は、本発明の選択的エストロゲン様植物エキスを被検体に投与することにより、おそらく回復、緩和、改善、解消、治癒されるであろう疾患、症候群、病状または症状の診断を包含する。また、治療は、疾患、障害、症候群、病状または症状の回復、緩和、改善、解消または治癒の同時存在を包含する。一部の実施形態において、治療は、疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の発病の防止もしくは遅延（すなわち、予防）、疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の進行の防止もしくは遅延、および／または疾患、障害、症候群、病状もしくは症状の重症度の低減を含意する。新生物増殖の場合は特に、治療は、新生物増殖の緩和ならびに逆転、停止また遅延を包含する。これに関連して、治療はまた、寛解（完全寛解および一部寛解を含む）も包含する。更年期症状の場合、治療は、種々の症状の予防および緩和を包含する。
【０１１０】
疾患、障害、症候群、病状または症状の予防（およびその文法的語尾変化形）としては、疾患、障害、症候群、病状または症状を発症するリスクのある被検体を特定し、該被検体に、おそらく前記疾患、障害、症候群、病状または症状の発病が回避または遅延されるであろう充分な量の本明細書に記載の植物エキスを投与することが挙げられる。一部の場合において、予防は、臨床医が、医療ケアの適格基準を適用してホルモン補充療法の必要があると考える閉経後女性を特定し、本発明の植物エキスを該女性に投与し、それにより１つ以上の更年期症状をブロックまたは遅延することを包含する。一部の実施形態において、骨粗鬆症の予防は、臨床医が、医療ケアの適格基準を適用して、骨粗鬆症を発症するリスクがあると考える閉経後女性を特定し、本発明の植物エキスを該女性に投与し、それにより骨量減少の発生をブロックまたは遅延することを包含する。
【０１１１】
緩和は、疾患、障害、症候群、病状または症状の発生の重症度、数および／または頻度の低減を包含する。更年期症状の緩和としては、のぼせ、不眠、失禁、鬱などの頻度および／または重症度の低減が挙げられる。
【０１１２】
ダイオウエキスの投与
本発明による組成物の投与は、一般に使用されている投与経路によるものであるが、該経路によって、１種類以上の該植物エキスが標的組織に対して利用可能であるものとする。挙げられ得る投与経路の一例には、経口、経鼻、口腔内、経直腸、経膣および／または経表面（経皮）がある。あるいはまた、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであってもよい。かかる組成物は、通常、薬学的に許容され得る組成物として投与され得る（上記）。
【実施例】
【０１１３】
本発明は、以下の例示的な非限定的実施例を参照すると、より充分に認識され得よう。
【実施例１】
【０１１４】
実施例１：ダイオウから単離される化合物の単離およびインビトロ試験
ダイオウ（タデ科）の根茎を活性誘導的単離に供すると、一連のアントラキノン１〜３および６が単離された。これらの単離されたアントラキノンと、購入した２種類（４、５）のアントラキノンを、ＥＲα活性およびＥＲβ活性について、一過性トランスフェクションアッセイを使用し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結させたエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃ）を有するヒトＵ２ＯＳ骨細胞株において試験した。
【０１１５】
以前に、マウスにおいて、エストロゲンの増殖促進効果はＥＲαによって媒介されるが、他方の既知のエストロゲン受容体ＥＲβは乳癌腫瘍を抑制することが示された（Ｐａｒｕｔｈｉｙｉｌ  Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，６４，４２３−８）。この研究に促されて、本発明者らは、漢方薬草由来のＥＲβ選択的化合物を研究した。
【０１１６】
ダイオウ（タデ科）の根および根茎は、その薬効性が、２００ＡＤ頃の最初の体系的な中国薬局方において認められた。それ以来、これらは、便秘、腹痛や胃痛および膨満感ならびに月経困難症などの障害のための下剤として使用されてきた。また、これらは、腫脹および膿瘍を解消するための解熱薬および抗炎症薬として使用されてきた。また、これらは血餅を除去したり、利尿を促進したりすると言われている。
【０１１７】
以下の実験は、アントラキノン１および６のエストロゲン様活性を示す。
【０１１８】
材料および方法
一般的な実験手順。１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、ピドリジン（ｐｙｄｒｉｄｉｎｅ）−ｄ５において、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−５００ＭＨｚ分光計を用いて測定した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＴ分離システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−１０ＡＶ  ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備える、Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（２５０×１０ｍｍ，５μｍ）を使用）を、ＨＰＬＣ分析に使用した。単離された化合物の分子量は、カリフォルニア大学バークリー校の質量分析施設において、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎエレクトロスプレーＬＣＱ質量分析計を用いてポジティブモードおよびネガティブモードで測定された。逆相ＴＬＣ分析は、ＲＰ−１８  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）プレートにて行なった。順相カラムクロマトグラフィーでは、シリカゲル２００〜４００メッシュ，６０Å，Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した。Ｐｒｅｐｓｅｐ，Ｃ１８固相抽出カルテージ（ｃａｒｔａｇｅ）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。クリソファノール、エモジン、ライン（ｒｈｅｎ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。アロエエモジンとフラングリンＡは、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）から購入した。
【０１１９】
植物材料。細かくすり潰されたダイオウ（Ｄａ  Ｈｕａｎｇ）の根茎を、Ｓｈｅｎ  Ｎｏｎｇ  Ｈｅｒｂｓ，１６００  Ｓｈａｔｔｕｃｋ  Ａｖｅ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ  ９４７０３から購入した。
【０１２０】
抽出および単離。細かくすり潰されたダイオウの根茎（３０ｇ）を、８：２のＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏを用いて１時間、８時間および一晩抽出した。これらのＭｅＯＨエキスを、およそ１００ｍＬまで真空濃縮させ、Ｈ２Ｏ中に再懸濁させ、逐次ヘキサンとＥｔＯＡｃで分配した。
【０１２１】
ＥｔＯＡｃ分配液（２００ｍｇ）を、固相抽出カートリッジ（５ｇ）に適用し、Ａ＝１０ｍＭの酢酸アンモニウムとＢ＝ＭｅＣＮの混合物（Ａ−Ｂは、１：０、７５：２５、１：１、２５：７５、および０：１）で溶出させ、５つの画分Ａ〜Ｅを得た。画分Ｃ（２５０ｍｇ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（２００×２．５ｃｍ）にてクロマトグラフィー処理し、ＭｅＯＨを用いて溶出させた。５つの併合画分Ａ１〜Ｅ１を、ＲＰ１８  ＴＬＣ分析（６：４の１０ｍＭの酢酸アンモニウム−ＭｅＣＮ）によって得た。画分Ｂ１を、シリカゲルＴＬＣ（２０×２０ｃｍ）（８：２：０．１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＴＦＡを用いて展開）にてクロマトグラフィー処理し、オクタヒドロキシアントラキノン（６）（１０ｍｇ，Ｒｆ＝  ０．２９）を得た。画分Ｄ（Ａ−Ｂ  ２５：７５）を、シリカゲル（４５×２．０ｃｍ）にてクロマトグラフィー処理し、８：２：０．１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＴＦＡを用いて溶出させ、クリソファノール（３）（５ｍｇ）、エモジン（１）（１０．３ｍｇ）、およびアロエエモジン（２）（１２ｍｇ）を得た。カラムクロマトグラフィーは、逆相ＴＬＣ（１：１の１０ｍＭの酢酸アンモニウム−ＭｅＣＮ）によってモニタリングした。
【０１２２】
エモジン（１）：黄橙色粉末；ポジティブＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２７１  ［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは、以前に公表されたデータと整合する。この同定は、さらに、１ＨデータおよびＨＰＬＣ分析と、購入した標準物質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の比較によって裏付けられた。
【０１２３】
アロエエモジン（２）：黄橙色粉末；ネガティブＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２６９  ［Ｍ−Ｈ］−。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは、以前に公表されたデータと整合する。この同定は、さらに、１ＨデータおよびＨＰＬＣ分析と、購入した標準物質（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）の比較によって裏付けられた。
【０１２４】
クリソファノール（３）：黄橙色粉末；ネガティブＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２５３  ［Ｍ−Ｈ］−。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは、以前に公表されたデータと整合する。この同定は、さらに、１ＨデータおよびＨＰＬＣ分析と、購入した標準物質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の比較によって裏付けられた。
【０１２５】
オクタヒドロキシアントラキノン（６）：淡黄色粉末；ネガティブＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３３５  ［Ｍ−Ｈ］−。データは、以前に公表された値と整合する。
【０１２６】
ＨＰＬＣ分析。以下の溶媒系、１０ｍＭの酢酸アンモニウム（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を使用し、最初の条件を９０％Ａ、１０％Ｂとした。最初の条件を４分間保持し、次いで線形勾配を開始し、３４分目まで行ない、最終溶媒混合物は０％Ａ、１００％Ｂとした。カラムを３９分目まで１００％Ｂに保持し、次いで、４０分目に最初の条件（９０％Ａ、１０％Ｂ）に戻した。カラムを１０分間、再度平衡化させた後、次のインジェクションを行なった。流速は、全ＨＰＬＣ実験で１ｍＬ／分とした。複合クロマトグラムを図１に示す。
【０１２７】
ＥＲα活性およびＥＲβ活性について試験したアントラキノン
【化１９】
2011522822.tif 000021
【０１２８】
結果および考察
ダイオウの根茎から同定されたアントラキノン１〜６は、エストロゲン様活性を示した。この活性は、ＥＲＥ  ｔｋＬｕｃの活性化によって示されるように、エストロゲン受容体βに選択的であった（図２，エモジン；図３，オクタヒドロキシアントラキノン）。この活性は、該化合物が、ＥＲβを有するＥＲＥ  ｔｋＬｕｃを活性化したため、エストロゲン受容体βに選択的であった。エモジン（１）は、オクタヒドロキシアントラキノン（６）よりも大きな活性化を示した。図２、３を比較のこと。
【０１２９】
乳癌腫瘍形成および子宮増殖に対する６の効果をインビボで試験した。移植時点で４０〜５０日齢のＣＤ−１／雌ヌードマウスを選択した。各マウスには、腎臓１つあたり２つの移植片を植えて合計４つの移植片とし、移植片１つあたり２５μＬのコラーゲン中にＭＣＦ−７乳癌細胞を含めた。化合物６を、２００μＬの６を充填したＡｌｚｅｔ  Ｏｓｍｏｔｉｃポンプにて皮下に２８日間送達した。各化合物の最終用量は、陽性対照エストラジオールでは３６０μｇ／２００μＬ、およびオクタヒドロキシアントラキノン（６）では２ｍｇ／２００μＬとした。２８日間の治療終了時、すべての移植片および子宮を単離し、写真を撮影し、重量を計り、ホルマリン中に固定した。対照と比較すると、６は、乳癌腫瘍形成を増大させず（図４）、子宮増殖も増大させない（図５Ａ，５Ｂ）。
【０１３０】
結論
女性の健康イニシアチブの結果以来、ホルモン療法の治験により、更年期女性に対する多くの有意な健康上のリスクが示されており、したがって、更年期症状の治療のための、より安全なエストロゲンが必要である。任意の新たなエストロゲンの臨床応用の前には、乳癌および子宮癌の促進のリスクの可能性に関する安全性情報を得ておくべきである。本試験において、本発明者らは、ダイオウから単離された物質がエストロゲン受容体β選択的活性を有し、この単離された化合物は、インビボで、乳癌腫瘍形成のリスクを増大させず、子宮増殖も増大させないことを示す。これは、エストロゲン受容体β選択的化合物の、更年期症状の治療のための潜在的エストロゲンとしての潜在的有益性を示す本発明者らの以前の研究を確認するものである。
【実施例２】
【０１３１】
実施例２：エモジンおよびアロエエモジンの存在下におけるＥＲ媒介性活性化および抑制
材料および方法：試薬。フェノールレッド無含有ダルベッコ改変イーグル／Ｆ−１２  クーン改変培地を、Ｓｉｇｍａ社から入手した。ＢｉｏｂｒｅｎｅをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Ｕ９３７細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ヒト組換えＴＮＦ−αはＲ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０１３２】
プラスミドの構築。ヒトＴＮＦ−α遺伝子由来のＰｓｔＩからＡｈａＩＩまでの断片（−１０４４から＋９３まで）ｐＬＴを、ルシフェラーゼｃＤＮＡの上流にクローニングした。特殊制限部位ＡｐａＩ（−１２５欠失の場合）およびＳｔｙＩ（−８２欠失の場合）を使用することにより、５’欠失体を構築した。−１２５から−８２まで［ＴＮＦ−応答性エレメント（ＴＮＦ−ＲＥ）］に由来する３コピーのヒトＴＮＦ−αプロモーター断片、またはカエルビテロゲニンＡ２遺伝子（ｖｉｔＡ２−ＥＲＥ，５’−ＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＡ−３’）に由来する１コピーのＥＲＥを、ルシフェラーゼに連結させた−３２から＋４５までの単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの上流にライゲートした（それぞれ、ＴＮＦ−ＲＥ  ｔｋＬｕｃ、およびＥＲＥ  ＴＫＬｕｃ）。ＥＲβ変異型は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、変異を含むオリゴヌクレオチドを使用することにより作出した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて変異型を配列決定し、変異の存在を確認した。
【０１３３】
細胞の培養、トランスフェクション、およびルシフェラーゼアッセイ  −  Ｕ９３７（ヒト単球）、Ｕ２０Ｓ（ヒト骨肉腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト転移性乳癌）、およびＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞を、カリフォルニア大学（サンフランシスコ）の細胞培養施設から取得した。Ｕ９３７細胞は、前述のようにして維持したが、Ｕ２ＯＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＣＦ−７細胞は、フェノールレッド無含有ダルベッコ改変イーグル培地／５％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＦ−１２培地中で維持し、継代培養した。実験では、３μｇのレポータープラスミドおよび１μｇのＥＲαまたはＥＲβ発現ベクターを使用し、前述のようにして、細胞を収集し、キュベットに移し、次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を培地中に再懸濁させ、１２ウェルマルチプレート内に１ｍｌ／皿で平板培養した。細胞を、Ｅ２、ゲニステイン、ダイゼインまたはビオカニンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間処理した後、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に３７℃で２４時間曝露した。細胞を２００μＬの１×溶解バッファーで可溶化させ、ルシフェラーゼ活性を、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性の最大の半量の誘導（ＥＣ５０）または阻害（ＩＣ５０）をもたらすのに必要とされるホルモンの濃度を、Ｐｒｉｓｍ曲線フィッティングプログラム（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，バージョン２．０ｂ）により計算した。増殖試験では、親ＭＣＦ−７細胞を０．１ｎＭのＥ２の存在下、１細胞／ウェルでサブクローニングし、最も増殖の速いクローンを実験に選択した。この細胞は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって示されるように、ＥＲαを排他的に発現した。この細胞を、３％ストリッピング処理済ウシ胎仔血清を含有する組織培養培地中に、２５，０００細胞／３５ｍｍプレートの密度で、二連で平板培養した。平板培養の１日後、細胞を漸増濃度のエモジンまたはアロエエモジンで処理した。培地を１日おきに交換し、エモジンまたはアロエエモジンを培地に添加した。８日後、コールターカウンターを用いて細胞を計数した。図面に示した実験はすべて少なくとも３回行ない、データは実験間で類似していた。
【０１３４】
エモジン（ＢＮＥＲ  １１０９）およびアロエエモジン（ＢＮＥＲ  １１１０）は、上記の実施例１に記載のようにして調製した。
【０１３５】
結果：Ｕ２ＯＳ骨細胞における選択的エストロゲン受容体モジュレート活性は、ルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。Ｕ２０Ｓ骨肉腫細胞を、最小限のチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの上流の古典的ＥＲＥ（ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ）と、ヒトＥＲαまたはＥＲβの発現ベクターでコトランスフェクトした。エモジンおよびアロエエモジンは、ＥＲβの存在下では、トランスフェクトされたＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ遺伝子を活性化したが、ＥＲαの存在下では有意ではなかった（図６，１０）。エモジンおよびアロエエモジンは、どちらも、ＥＲβの存在によってルシフェラーゼの発現を刺激し、ＥＲβの存在下で、ＥＲＥ−ｔｋ−ルシフェラーゼ転写物の発現を刺激する。この効果は、該エキスと選択的ＥＲβアンタゴニストであるラロキシフェンおよびタモキシフェンとの共投与によって減衰される。図８，１２。この結果は、エモジンとアロエエモジンが各々、ＥＲβと直接相互作用することにより、ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃを活性化することを示す。
【０１３６】
転写の抑制に対するエモジンおよびアロエエモジンの効果を調べるため、ＴＮＦ−αプロモーターの−１２５から−８２までの領域（ＴＮＦ−α−応答性エレメント（ＴＮＦ−ＲＥ））を使用した。その理由は、この領域がＴＮＦ−αの活性化およびＥ２の抑制を媒介しているためである。Ｅ２は、トランスフェクトされたＥＲαまたはＵ２ＯＳ細胞にあるＥＲαのいずれかで、最小限のｔｋプロモーター（ＴＮＦ−ＲＥ  ｔｋＬｕｃ）の上流でＴＮＦ−ＲＥのＴＮＦ−α活性化の顕著な抑制をもたらす（データ表示せず）。Ｅ２は、ＥＲβに対してはＴＮＦ−α活性を無効にし得る（１００％抑制）が、ＥＲαに対してはそうでない（７３．３％抑制）。エモジンは、ＥＲβの存在下では、ＴＮＦ−ＲＥのＴＮＦ−α活性化の抑制をもたらしたが、ＥＲαでは、そうではなかった（図７）。対照的に、アロエエモジンは、ＥＲβとＥＲαどちらの存在下でもＴＮＦ−ＲＥのＴＮＦ−α活性化の抑制をもたらした。（図１１）。この結果は、エモジンおよびアロエエモジンが、ＥＲβおよび／またはＥＲαと直接相互作用することにより、ＴＮＦ  ＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃによってＴＮＦ−α活性化を抑制することを示す。
【０１３７】
興味深いことに、エモジンのＥＲβ結合曲線は、ＥＲα結合曲線と非常に類似している（図９）。アロエエモジンのＥＲβ結合曲線とＥＲα結合曲線との比較でも、同じことが言える（図１３）。
【実施例３】
【０１３８】
実施例３：非盲検漸増用量投与試験
以下のプロトコルは、式ＩＩ：
【化２０】
2011522822.tif 000022
（式中、（１）ＲＡはＯＨであり、ＲＢはＣＨ３である；（２）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ２ＯＨである；（３）ＲＡはＨであり、ＲＢはＣＨ３である、のいずれかである）
の１種類以上の化合物を含む医薬組成物の最大耐用量を調べるために行なう。
【０１３９】
試験薬物は、式ＩＩの１種類以上の化合物を含む医薬組成物を、１ｍｇ（第１週）、１０ｍｇ（第２週）、１００ｍｇ（第３週）または１０００ｍｇ（第４週）含む（本明細書において以下、式ＩＩの１種類以上の化合物を含む医薬組成物を「試験薬物」ということがある）。用量は、必要であれは、２つ以上のゼラチンカプセル剤に分割してもよい。年齢が１８歳から６０歳の正常な健常志願者に、１ｍｇ／日の試験薬物を第１週に、１０ｍｇ／日の試験薬物を第２週に、１００ｍｇ／日の試験薬物を第３週に、および１０００ｍｇ／日の試験薬物を第４週に投与する。被検体を、有害事象（あれば）の出現についてモニタリングする。任意の時点で、被検体が使用中の用量に対して耐容性でないと思われる場合、担当医師はかかる不耐性を記録する。各被検体が耐容性である最大用量または、どの被検体も不耐性とならない場合は試験薬物１０００ｍｇ／日を最大耐用量とみなす。
【実施例４】
【０１４０】
実施例４：非盲検漸増用量投与試験
以下のプロトコルは、化合物６（オクタヒドロキシアントラキノン）：
【化２１】
2011522822.tif 000023
オクタヒドロキシアントラキノン（６）
を含む医薬組成物の最大耐用量を調べるために行なう。
【０１４１】
試験薬物は、６を含む医薬組成物を、１ｍｇ（第１週）、１０ｍｇ（第２週）、１００ｍｇ（第３週）または１０００ｍｇ（第４週）含む（本明細書において以下、６を含む医薬組成物を「試験薬物」ということがある）。用量は、必要であれは、２つ以上のゼラチンカプセル剤に分割してもよい。年齢が１８歳から６０歳の正常な健常志願者に、１ｍｇ／日の試験薬物を第１週に、１０ｍｇ／日の試験薬物を第２週に、１００ｍｇ／日の試験薬物を第３週に、および１０００ｍｇ／日の試験薬物を第４週に投与する。被検体を、有害事象（あれば）の出現についてモニタリングする。任意の時点で、被検体が使用中の用量に対して耐容性でないと思われる場合、担当医師はかかる不耐性を記録する。各被検体が耐容性である最大用量または、どの被検体も不耐性とならない場合は試験薬物１０００ｍｇ／日を最大耐用量とみなす。
【０１４２】
本発明を、一部の特定の実施形態および実施例に関して説明したが、当業者には、本発明の範囲内である他の実施形態も想定されることが認識されよう。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、かかる実施形態は単なる一例として示したものであることは、当業者に自明であろう。本明細書において本発明を逸脱することなく、数多くの変形例、変更例および置換例が当業者に想起されよう。本発明の実施において、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の択一例が使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、この特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにおよびその均等物は特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2011522822.tif 000042
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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