(57)【要約】本発明は、炎症を低減させることおよび組織修復または組織再生を促進することを必要とするヒトおよび他の哺乳動物において、全身投与または局所投与されたＴ−ＣｈＯＳならびにグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの相乗効果を通して炎症を低減させるため、および組織修復または組織再生を促進するための組成物、使用および方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーであって、前記キトオリゴマーは、以下の基準：
前記オリゴマーは、５〜２０モノマー残基の範囲の鎖長を有し、
各オリゴマー鎖は、前記オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができ、
前記オリゴマーの残りの内部部分は、前記内部鎖の配列が別のＮ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）に隣接したＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡなど）を含むということを回避するのに少なくとも十分な量のＤ残基を有する、
を満たすヘテロキトオリゴマーを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーを、
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンと組み合わせて含む、
組成物。
【請求項２】
前記治療上活性なキトオリゴマーの脱アセチル化度（ＤＤ）は３０〜６０％の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンのモノマー：前記治療上活性なキトオリゴマーの比は約１：１０〜約１０：１の範囲内である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記モノマーとオリゴマーとの間の比は約１：５〜約５：１の範囲にある、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記モノマーとオリゴマーとの間の比は約１：２〜約４：１の範囲にある、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
生体材料／医薬の製造のための、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
炎症を抑制するためおよび／または組織再生を増進するための生体材料／医薬の製造のための、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記生体材料／医薬は、哺乳類のキチナーゼ／キチナーゼ様タンパク質が治療標的として対処されうるいずれかの疾患または状態の治療のために使用される、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記生体材料／医薬は、哺乳動物における折れた、切断されたもしくは疾患に罹った軟骨または骨の治癒の際の組織再生を増進する、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体材料はまた、リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイトを含む）、硫酸カルシウム、トリポリリン酸ナトリウム、アルギン酸塩またはアルギン酸エステル、コラーゲン、ヒアルロン酸およびキトサンポリマーのいずれかから選択される成分を含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１または請求項２に記載の治療上活性なキトオリゴマーとグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンとを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
散剤、懸濁剤、ゲル、ゾル、エアロゾル、ペースト、フィルム、泡沫、丸剤、およびカプセル剤からなる群から選択される形態にある、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容できる賦形剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
組織再生および／または抗炎症のための生体材料／医薬の製造のための、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
組織修復において瘢痕形成を予防するためにコラーゲン合成を制御するための、
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーであって、前記キトオリゴマーは、以下の基準：
前記オリゴマーは、４〜２０モノマー残基の範囲の鎖長を有し、
各オリゴマー鎖は、前記オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができ、
前記オリゴマーの残りの内部部分は、前記内部鎖の配列が別のＮ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）に隣接したＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡなど）を含むということを回避するのに少なくとも十分な量のＤ残基スペーサーを有する、
を満たすヘテロキトオリゴマーを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーと、
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンと
を含む組成物の使用。
【請求項１６】
リウマチ性関節炎および変形性関節症から選択される疾患の治療のための、
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーであって、前記キトオリゴマーは、以下の基準：
前記オリゴマーは、４〜２０モノマー残基の範囲の鎖長を有し、
各オリゴマー鎖は、前記オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができ、
前記オリゴマーの残りの内部部分は、前記内部鎖の配列が別のＮ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）に隣接したＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡなど）を含むということを回避するのに少なくとも十分な量のＤ残基スペーサーを有する、
を満たすべきであるヘテロキトオリゴマーを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマーと、
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンと
を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的使用のための新しいキトオリゴマー（ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｍｅｒ）組成物に関する。より特定すれば、本発明は、インビボおよびインビトロにおいて再生効果および抗炎症効果を相乗的に促進する、キチンから作製された生体材料および医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
第一世代の生体材料の開発は、許容できる機械的強度を有するが、組織治癒に対して受動的な寄与に終わった。これは、それらの機能が組織置換を支持することに限定されていたからである。これらの第一世代の生体材料は、分解の残骸を放出し、次いでこれが慢性の炎症、疼痛、および浸出の発症につながった。第二世代の生分解性の生体材料の開発の主目的は、第一世代の材料に由来する残骸粒子の連続的な放出から生じる慢性的な、長期の問題を解消することであった。これは、所望の時間の長さ（数ヶ月）の間組織支持性を提供する埋め込み型の生分解性材料をもたらし、そしてその後、それらの材料は周囲の組織による局所的な分解を受け、その後尿および／または糞便を介して体外に排泄される。この技術の一例は、今日使用されている生分解性の血管縫合糸である。
【０００３】
第二世代の生体材料の良好な生体適合性にもかかわらず、組織治癒の促進に対するそれらの寄与は、組織治癒および再生に関与する生物学的プロセスにおけるそれらの受動的な役割に起因して、限定的である。より最新の群の第３世代の生体材料を開発するという必要性は、組織治癒および再生のプロセスに能動的に寄与するであろう化合物を開発するという要望の中に存在する。
【０００４】
出願人の先行出願（特許文献１）は、治療への応用のための高度に精製された部分的に脱アセチル化されたキチン生体材料を作製するための方法を開示する。この方法により製造されるオリゴマー組成物は、本願明細書中で「治療用のキトオリゴ糖」（Ｔ−ＣｈＯＳ）と呼ばれる。この治療用のキトオリゴ糖は、４〜２０モノマー残基というその鎖長およびＤ−グルコサミン（Ｄ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ａ）のその特定の配列を特徴とし、この特定の配列では、そのオリゴマーの内側部分は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグルコサミン残基に隣接している（ＡＡなど）ことを回避するために、少なくとも十分なグルコサミン（Ｄ）残基を有する。
【０００５】
損傷したまたは疾患に罹った組織が修復または治癒するために、基本的に２つの方法がある。１つは、瘢痕形成を導く線維症を介することである。線維性組織の形成に関与する線維芽細胞はもとの組織細胞の機能を有しないので、この修復経路は組織機能の機能不全につながる。炎症性サイトカインは、通常、線維症に関与する。ＹＫＬ−４０は、線維芽細胞の成長の走化性および刺激を介して線維症において一定の役割を果たすと考えられている。
【０００６】
組織修復の別の経路は、組織再生または機能的組織修復である。この経路では、この特定の組織の機能細胞は、恐らく組織特異的な前駆細胞から再生され、健康な機能組織の再生をもたらす。
【０００７】
骨組織において、造骨性および骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）の生体材料または装置は、軟骨および／または骨組織へと分化することができる前駆細胞の増殖を誘導することにより骨成長を促し、そして、空隙を満たすだけでなく、身体がこの生体材料組成物によってもたらされる足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）内で新しい骨を産生することを引き起こすまたは誘導する内因性の特性をも呈する材料として特徴付けられる。これらの材料は、足場として作用するだけでなく、新しい骨の形成を誘導するタンパク質または他の物質をも含有する。自家移植片は、整形外科手術で長い年数使用されてきており、身体の再生能力を支援する最も一般的な方法である。真の骨誘導性を示す市販品は、ヒトの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の組換え版を組み込む、ＩｎＦＵＳＥ（登録商標）と呼ばれるメドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）製の最近導入された装置ただ１つである。さらには、グルコサミンは変形性関節症を治療するために広く使用されてきた。
【０００８】
全身投与（経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）を介して組織再生を促進することができる薬剤は、今のところは発見されていない。
【０００９】
以前の特許出願（特許文献２）において、本発明者らは、骨欠陥の中へと埋め込まれた、部分的に脱アセチル化されたキチン誘導体が内軟骨性骨化を誘導することができるということを実証した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００６／１３４６１４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０５７０１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、全身投与を介する特定のアミノ糖の効果を実証するインビトロモデルおよびインビボモデルにおいてＴ−ＣｈＯＳおよびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの再生効果を実証する。加えて、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの二量体および三量体（ＤＰ２およびＤＰ３）が阻害効果を呈するということが実証される。本発明はまた、リウマチ性関節炎（ＲＡ）における抗炎症および組織再生を促進する生理活性組成物としての、Ｔ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンの驚くべき相乗効果を開示する。実施例において、Ｔ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンの組み合わせ（併用）が、見かけ上はＣＬＰタンパク質ファミリーの１つのメンバーであるＹＫＬ−４０との相互作用を通して、軟骨外植片におけるＩＩ型コラーゲン形成を促進および増進するための活性薬剤を構成するということがさらに実証される。炎症を低減させるおよび組織修復または組織再生を促進する必要があるヒトおよび他の哺乳動物において、全身投与または局所投与されたＴ−ＣｈＯＳならびにグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの相乗効果を介して炎症を低減させるためおよび組織修復または組織再生を促進するための組成物、使用および方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様では、組成物が提供される。この組成物はＮ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）を含み、当該キトオリゴマーは、以下の基準を満たす必要があるヘテロキトオリゴマーを含む：当該オリゴマーは４〜２０モノマー残基の範囲の重要な鎖長分布を有し、かつ各オリゴマー鎖は当該オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができる。内部鎖（各端の末端の２つの残基の内側の部分）の配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグルコサミン残基に隣接（ＡＡなど）していないような配列である。この組成物はさらに、グルコサミンモノマーおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含む。本発明の第１の態様に係る組成物は、生体材料の主要な基準、つまり生体適合性、生分解性、および生理活性を呈する生体材料である。
【００１３】
当該治療上活性なキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）および上記モノマーの適切な比は、特定の適応、応用例、装置および剤形に応じて変わりうる。概して、上記モノマーとオリゴマーとの間の比（重量／重量）は、約１：１０〜約１０：１の範囲、より好ましくは約１：５〜約５：１の範囲（約１：１〜約５：１の範囲を含む）であってもよい。ある実施形態では、モノマーの重量による量はさらに高く、この範囲は、約１：１〜約１０：１の範囲、例えばより好ましくは約１：１〜約５：１の範囲内、（約１：１〜約４：１の範囲、例えば約２：１、約４：１、より好ましくは約３：１の比を含む）にあってもよい。他の実施形態では、より多くのＴ−ＣｈＯＳオリゴマーが使用され、モノマー：オリゴマーの比は約１：１〜約１：４の範囲（約１：１、約１：２、および約１：３の比を含む）である。
【００１４】
本発明の第２の態様では、加えられたグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンモノマーと相乗的な、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）を含む医薬組成物が提供される。このキトオリゴマー成分は、４〜２０モノマー残基の範囲の重要な鎖長分布を有する上で定義されたとおりのヘテロキトオリゴマーを含み、かつ各オリゴマー鎖は当該オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができる。内部鎖の配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグルコサミン残基に隣接（ＡＡなど）していないような配列である。当該組成物はさらに、好ましくは上記のとおりの重量比で、グルコサミンモノマーおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含む。この医薬組成物は散剤、懸濁剤、ゲル、ゾル、エアロゾル、ペースト、フィルム、泡沫、丸剤、およびカプセル剤の形態にあってもよい。当該医薬組成物はさらに、薬学的に許容できる賦形剤を含むことができる。
【００１５】
本発明の第３の態様では、抗炎症および組織再生のための生体材料／医薬の製造のための、本発明の組成物の使用が提供される。
【００１６】
本発明の第４の態様では、組織修復において瘢痕形成を予防するためにコラーゲン合成を制御するための生体材料／医薬の製造のための、当該組成物の使用が提供される。この組成物は、本発明の第１の態様に係るＮ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）の治療上活性なキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＯｌｉｇｏｍｉｎおよびＴ−ＣｈＯＳのＨＰＬＣ分析（ＴＳＫ−Ｏｌｉｇｏカラム；トーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）、日本）。
【図２】１０日目〜２３日目についての累積されたコンドロイチン硫酸の放出に対する種々のアミノ糖の効果。Ｏｌｉｇｏｍｉｎ  ２００および４００μｇ／ｍｌ（Ｏｌ  ２００およびＯｌ  ４００）ならびに４００μｇ／ｍｌのグルコサミン（Ｄ４００）は、コンドロイチン硫酸の分解の有意な減少を示す。平均値およびＳＥＭ（測定の標準誤差）；Ｎ（群）＝２４。
【図３】２０日目〜２２日目の間に培地に放出されたＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＮＰ）に対するＴ−ＣｈＯＳの効果。Ｔ−ＣｈＯＳ  ５０、１００、２００および４００μｇ／ｍｌを除いて効果なしであった。平均およびＳＥＭ；Ｎ（群）＝４。
【図４】２０日目〜２４日目の間に培地に放出された（プールした（ｐｏｏｌｅｄ））累積的なＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＮＰ）に対するＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミン（Ｄ）の効果。平均値およびＳＥＭ；Ｎ（群）＝８。
【図５】１７日目〜２４日目の累積的なコンドロイチン硫酸の放出に対するＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミン（Ｄ）、グルコサミンおよびＩＧＦ−１の効果。平均およびＳＥＭ；ｎ  群＝１６。ＩＧＦ−１およびＴ−ＣｈＯＳ＋Ｄは、累積的なコンドロイチン硫酸の放出の有意な増加を示す。図９に示されるデータに基づく。
【図６】ヒトのＯＡ軟骨外植片における、１８日目〜２５日目での培地の中のＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＮＰ）のレベルに対するＴ−ＣｈＯＳの用量に関連する誘導。Ｔ−ＣｈＯＳだけが誘導を示した。星印は、ｔ−検定によるＴ−ＣｈＯＳ  ０μｇ／ｍｌに対するＴ−ＣｈＯＳ  ４００μｇ／ｍｌの有意性（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）を示す。平均値およびＳＥＭ；Ｎ（群）＝４。
【図７】当該期間の間のＹＫＬ−４０発現に対する３つのアミノ糖の効果（Ｎ＝４；平均値およびＳＥＭ）。
【図８】１５日目〜２５日目での対照、グルコサミン、ＯｌｉｇｏｍｉｎおよびＴ−ＣｈＯＳ群についてのＰＩＩＮＰ発現に関連するＹＫＬ−４０の発現。Ｔ−ＣｈＯＳ群だけがＰＩＩＮＰの有意に高い発現を示している（Ｎ＝２０）。
【図９】９日目〜１７日目の累積の足首直径（Ａｃｃ  ＡＤ）に対するグルコサミン、Ｔ−ＣｈＯＳおよびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせの効果。それぞれ、０：治療なし、Ｄ２１：２１ｍｇ／ｋｇ／ラット  グルコサミン、Ｔ：７．１ｍｇ／ｋｇ／ラット  Ｔ−ＣｈＯＳ、Ｔ＋Ｄ１４、２１および２８：Ｔ：７．１ｍｇ／ｋｇ／ラット  Ｔ−ＣｈＯＳ＋１４、２１、および２８ｍｇ／ｋｇ／ラット  グルコサミン。
【図１０】足首軟骨損傷スコアに対するグルコサミン、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ２１）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１１】足首骨吸収スコアに対するグルコサミン、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ２１）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１２】足首パンヌススコアに対するグルコサミン、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ２１）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１３】足首の全組織病理学的スコアに対するグルコサミン、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ２１）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１４】膝のパンヌス形成に対するグルコサミン（Ｄ２１）、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１５】膝の骨吸収に対するグルコサミン（Ｄ２１）、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１６】膝の全組織病理学的スコアに対するグルコサミン（Ｄ２１）、Ｔ−ＣｈＯＳ（Ｔ）およびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ）の効果。数字は、毎日の用量（ｍｇ／ｋｇラット）を示す。星印は、ｔ−検定による０からの有意差を示す。
【図１７】リウマチ性関節炎（ＲＡ）患者における疼痛および炎症に対する、Ｏｌｉｇｏｍｉｎ、Ｔ−ＣｈＯＳ単独およびＮ−アセチルグルコサミン（Ａ）またはグルコサミン（Ｄ）と組み合わせたＴ−ＣｈＯＳの効果。評点付けは０（軽減なし）〜１０（完全に軽減）である。毎日の用量は、Ｏｌｉｇｏｍｉｎ：２２００ｍｇ、Ｔ−ＣｈＯＳ：７００ｍｇ、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）またはグルコサミン（Ｄ）：１５００ｍｇ、であった。矢印は、モノマーがいつＴ−ＣｈＯＳに加えられたかを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の組成物は、組織再生において相乗効果を示す２つのキチン材料の組み合わせである。治療上活性なキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）が身体内でキチナーゼ様タンパク質（ＣＬＰ）に結合することは実証されており、本出願人らのデータは、ＣＬＰが身体内でコラーゲンの合成において一定の役割を果たすことができ、そしてＣＬＰとＴ−ＣｈＯＳとの間の相互作用の結果として、コラーゲン合成は上方制御されるということを示す。関節軟骨におけるＩＩ型コラーゲンの合成は、プロコラーゲンの形成により開始される。このプロコラーゲンは２つの選択的スプライスによる形態ＰＩＩＡＮＰおよびＰＩＩＢＮＰの中で合成され、ＰＩＩＡＮＰはＴＧＦ−β  スーパーファミリーのＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を固定化する。これは、分化のあいだ成長因子シグナル伝達を制御する可能性があり、そして軟骨内骨形成、すなわち骨形成の自然の経路（内軟骨性骨化）（軟骨組織形成、軟骨組織の血管新生、石灰化の増進および層板骨を形成するその後の誘導された軟骨組織の骨形成を伴う）の制御にとって重要な要素である。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、関節コラーゲンの形成および骨形成の第１段階の間は必要とはされないが、組織が軟骨内骨形成の経路へと誘導されたときに特定的に放出される。
【００１９】
ＤＰ２〜３が存在すると当該組成物の所望の生物学的作用がブロックされるということを本発明は示すので、本発明の組成物のＴ−ＣｈＯＳ成分は、モノマー、二量体および三量体（ＤＰ１、ＤＰ２およびＤＰ３）の量が大きく減少しているということをさらに特徴とする。
【００２０】
本発明のオリゴマー組成物は、当該オリゴマー組成物の治療活性（バイオアベイラビリティー、生体内安定性（ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、および生理活性が挙げられる）の最適化を表す。本願明細書において「治療用のキトオリゴ糖」（Ｔ−ＣｈＯＳ）と呼ばれるオリゴマー組成物は、高度に純粋なかつ完全に可溶性の部分的に脱アセチル化されたキチンポリマーを回収するための国際公開第２００６／１３４６１４号パンフレットに開示される方法によって製造された。部分的に脱アセチル化されたキチンポリマー組成物は、ファミリー１８  エンドキチナーゼで処理され、その後濾過されて４〜２０モノマー残基の範囲の鎖長の所望の組成物を与え、各オリゴマー鎖は、当該オリゴマー鎖の片末端または両末端に２つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＡＡ）を有することができる。当該内部鎖の配列は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ａ）が別のＮ−アセチルグルコサミン残基に隣接していないような配列である（すなわち、ＡＡであってもよい２残基末端を有する鎖の内部部分には「ＡＡ」対は形成されない）。この構築の結果として、４〜２０モノマー残基の範囲の鎖長の組成物は、身体内でキチナーゼによっては開裂され得ない。
【００２１】
当該オリゴマーの脱アセチル化度は、好ましくは約３０〜６０％の範囲内（例えば約３０％、約４０％、約５０％または約６０％）である。
【００２２】
当該治療用のキトオリゴマーの配列パターンは、その生物活性、すなわちそれらがどのようにして生体膜を越えて輸送されるか（バイオアベイラビリティー）、それらが生体系の中でどれほど迅速に分解するか（生体内安定性）、およびそれらがどのようにしてキチナーゼ様タンパク質およびキチン質の配列に結合する他の特異的受容体と相互作用するか（生理活性）に直接影響を及ぼす。
【００２３】
バイオアベイラビリティー、すなわち所定の物質が生体膜を通過する能力、はその分子の疎水性に関連する。すべての生体膜は大部分は疎水性であるので、物質がより疎水性であるほど、それはより良好にそのような生体膜を透過できるという一般的な法則が当てはまる。Ｎ−アセチル−グルコサミンおよび完全アセチル化キチンオリゴマーは、対応するグルコサミンモノマーまたは高度に脱アセチル化されたキトサンオリゴマーよりも疎水性であり、これは、キチン質のヘテロオリゴマーは増大するアセチル化に伴って増大するバイオアベイラビリティーを有するであろうということを示唆する。従って、当該Ｔ−ＣｈＯＳ処方物は、その生体内安定性を損なうことなくそのバイオアベイラビリティーを最大にするために、その分子構造の中に最大量のＮ−アセチル−グルコサミンを含有するように最適化された。
【００２４】
有機化合物の生体内安定性は、生命体の中の内因性の酵素に対するその有機化合物の感受性、およびその生命体の中でのその有機化合物の半減期（ｔ１／２）を指す。感受性が高いほど、その化合物の生体内安定性は低い。ヒトでは、キチン分解酵素は２つの群に分けることができる；高特異的活性を有するファミリー１８  キチナーゼ（ヒト酸性キチナーゼ（ＡＭＣａｓｅ）、キトトリオシダーゼ）のような高レベルのキチン分解特異性を有する酵素、またはキチンおよびキトサンを分解することはするが特異的活性はより低いリゾチームおよび恐らくはいくつかのプロテアーゼなどのより低いキチン分解特異性を有する酵素。部分的な脱アセチル化により、当該Ｔ−ＣｈＯＳ組成物は、ファミリー１８  キチナーゼによる加水分解に対する最大の安定性に向けて最適化された。これらの酵素は、切断のための認識として、２以上の連続するＮ−アセチル−グルコサミン残基の配列を必要とするので、当該Ｔ−ＣｈＯＳ組成物は、当該分子の内部部分でこのような配列を排除するように特に最適化されている。
【００２５】
有機物質またはリガンドの生理活性は、生物学的応答を誘発する標的受容体に対するリガンドの親和性に直接関連する。人体におけるキチン質化合物の生物学的役割についてはまだほとんど知られていないが、胚発生においてキチンオリゴマーが極めて重要な役割を果たすという指摘がある。これは、ヒトゲノムが、キチンオリゴマーに結合するときに特異的に活性化される特異的な受容体を発現することができるということを示唆する。人体の中の唯一の公知のキチン結合タンパク質は、遺伝学的にはファミリー１８  キチナーゼに属するキチナーゼ様タンパク質（ＣＬＰ）である。それらの大多数はその酵素活性を失っているが、いまだそのキチン結合ドメインを保存している。
【００２６】
用語「内軟骨性骨化」は、軟骨が最初に分化して最終的な骨の骨格を与える骨形成プロセスを指す。軟骨組織は、その分化および維持のために成熟した骨組織ほど多くは局所的な酸素圧を必要とせず、それゆえ、血液供給系が分化のその最終段階を達成していないところではどこでも、軟骨が骨に取って代わるであろう。血管新生がその進行した段階に到達した後に、軟骨が新しい骨に置き換わられるに過ぎず、これによって、分化している組織への酸素の必須の供給が保証される。骨形成のこのプロセスは、特に椎骨、長管骨、胸骨などにおいて、胎生期の間にも典型的である。
【００２７】
本発明に関しては、用語「医療機器」は一般に、器具装置、道具、機械、考案物、インプラント、インビトロ試薬、または他の類似のまたは関連する物品（ヒトもしくは他の動物において疾患もしくは他の状態の診断で、または疾患の療養、軽減、治療、もしくは予防で使用することが意図されている構成部品、または付属品、あるいはヒトまたは他の動物の身体の構造もしくはいずれかの機能に影響を及ぼすことが意図されている構成部品、または付属品を含む）を指す。本発明に関しては、用語「生体材料製品」は、用語「医療機器」とほとんど同義で使用される。
【００２８】
本願明細書に記載される医薬組成物は、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチル−グルコサミンと相乗的な、治療用のキトオリゴマー（Ｔ−ＣｈＯＳ）を含む。それらは、全身投与されることができ、そして内因性のＣＬＰに結合することができ、この内因性のＣＬＰの多くは、いくつかの疾患および状態において一定の役割を果たすとして示され、または暗示されてきた。ＣＬＰの発現の高まりと関連付けられている疾患および状態の中には、変性疾患（例えば、関節リウマチ）および他の疾患（変形性関節症を含む）がある。本発明のＴ−ＣｈＯＳ組成物は、これらの疾患ならびに骨組織形成に関連する状態および外科的処置または外傷後の骨再生などの状態を治療および／または改善（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）するために有用であることが見出される。しかしながら、グルコサミンと一緒であれば、この効果は高められる。当該Ｔ−ＣｈＯＳオリゴマーおよびモノマーの適切な比は、上記のとおりであることが好ましい。
【００２９】
当該組成物はさらに、加工助剤または安定剤、希釈剤、香料、栄養素、または着色料または適切なさらなる生物活性成分または非活性成分などの薬学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。
【００３０】
当該医薬組成物は、例えばコップ１杯の水に容易に溶解することができる乾燥形態などの、経口投与に適した形態にあることが好ましいことになる。このような形態としては、乾燥粉末、懸濁液、ゲル、フィルム、泡沫、ゾル、エアロゾル、顆粒、フレーク、線維およびペーストの形態が挙げられる。しかしながら、当該組成物は、丸剤またはカプセル剤の中に含有されてもよい。当該医薬組成物はさらに、薬学的に許容できる賦形剤を含むことができる。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態では、当該組成物は、哺乳動物における折れた（ｆｒａｃｔｕｒｅｄ）または切断された（ｓｅｖｅｒｅｄ）骨の治癒の際の骨再生を増進することなどの、組織再生のための生体材料／医薬の製造のために使用される。このような医薬は、例えば、組織特異的な前駆細胞の活性化による内軟骨性骨化を通した骨形成を増進する。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、当該生体材料は、リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイトを含む）、硫酸カルシウム、トリポリリン酸ナトリウム、アルギン酸塩、コラーゲン、ヒアルロン酸およびキトサンポリマーからなる群から選択される１以上のさらなる成分を含む。
【００３３】
他の有用な実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内投与、皮下投与、または静脈内投与などの全身投与の他の形態に適した形態にある。このような適切な形態は、標準的な薬務に従った薬学的に許容できる担体または賦形剤を用いた溶液形態である。当該溶液形態は滅菌されており、ｐＨは適切に調整され、緩衝化されている。静脈内での使用については、溶質の総濃度は、当該調剤が等張性であるように制御されるべきである。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、当該Ｔ−ＣｈＯＳは単独で、損傷したまたは疾患に罹った組織の組織修復を、瘢痕形成を導く線維症を避けて、むしろ組織再生または機能的組織修復を誘導して健康な機能組織の再生をもたらすように導くための医薬として使用される。組織修復の経路のこの制御は、傷ついたまたは炎症を起こした組織におけるコラーゲン合成を制御することを通してなされる。本発明の１つの実施形態では、Ｔ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンが、閉経後の女性の体重増加を低下させるための医薬として使用される。
【００３５】
本発明に関しては、用語「医療機器」は一般に器具を指す。本発明の治療用のキトオリゴマーは、種々の目的で生体材料において特に有用である。従来のキトサンのすべての有利な特徴（生体適合性、医療機器にとって適切な混合物（メカニカルインプラント（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ）、薬物送達デバイスなど）を製造するための他の成分と混合できる能力）を呈することに加えて、それらは、上記のとおり、身体内でのＣＬＰに対するその高親和性に起因して著しく増加した溶解性および生物活性または治療活性を有する。
【００３６】
当該生体材料の配合物は、種々のバイオポリマー（アルギン酸塩またはアルギン酸エステルおよび他の多糖など）、コラーゲン、リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイトを含む）、硫酸カルシウム、トリポリリン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、グリセロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、酸化カルシウム、水酸化カルシウムおよび種々の有機酸またはカルボン酸などの他の有機および無機の成分を適切に含むことができる。
【００３７】
本発明は、これより、請求項に係る発明を実施可能とするための実施例および図面を使用して、より詳細に開示される。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：同化作用条件下および異化作用条件下でのウシおよびヒトの軟骨外植片における特定のアミノ糖の再生効果）
これらの実験の目的は、刺激なしの条件下で関節軟骨における軟骨形成に対する、アミノ糖の効果を評価することであった。これらの実験は、可能性のある変形性関節症用薬物としての、これらのアミノ糖の軟骨異化効果（ｃｈｏｎｄｒｏａｎａｂｏｌｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）の可能性を同定することができた。インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、１００ｎｇ／ｍｌは、軟骨外植片の正の異化作用刺激の対照としての役割を果たした。
【００３９】
物質および方法
使用したすべての試薬は分析用等級のものであった。培地は、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）を含んでいた。ヒト組換えオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（英国）から入手し、一方、ヒト組換え腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）はアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国から入手した。
【００４０】
アミノ糖：製造および分析
Ｏｌｉｇｏｍｉｎ。キトオリゴ糖は、ジェニス（Ｇｅｎｉｓ）によりパイロットスケールで製造された（ロット  Ｇ０６１０２３）。手短に言えば、部分的に脱アセチル化されたキチン（ＤＤＡ  ４５％）は、キチナーゼによりほぼ完全に加水分解された。キチナーゼおよび不溶物を取り除くためにこの溶液は限外濾過され（１０ｋＤａ）、噴霧乾燥された。
【００４１】
Ｔ−ＣｈＯＳ。大きく減少したＤＰ１〜４量を有するキトオリゴマー組成物は、ジェニス（Ｇｅｎｉｓ）によりパイロットスケールで、Ｏｌｉｇｏｍｉｎから製造された（ロット  Ｇ０５１１２８）。モノマー（ＤＰ１またはＮ−アセチルグルコサミン）は取り除かれ、および短いオリゴマーは、限外濾過によって減らされた。この生成物は噴霧乾燥された。Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）はＹＳＫ、日本から購入した。使用したすべてのアミノ糖の分析のために、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄシステムを使用してＨＰＬＣを適用した。ＴＳＫ−ｏｌｉｇｏカラム（トーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）、日本）を使用し、当該ＣｈＯＳを分子量（ＤＰ１、ＤＰ２など）によって分離した。溶媒は５ｍＭ  水酸化アンモニウム、ｐＨ  １０．０であり、流量は０．５ｍｌ／分であり、光の吸収は２０５ｎｍであり、注入量は２０μｌであり、アミノ糖の濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。
【００４２】
軟骨外植片の実験のために、試験したアミノ糖の濃度は以下のとおりであった。ＯｌｉｇｏｍｉｎおよびＴ−ＣｈＯＳ、培地中で５０、１００、２００および４００μｇ／ｍｌ。Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）、培地中２００および４００μｇ／ｍｌ。Ａ＋Ｄの組み合わせは、培地中で各々２００μｇ／ｍｌであった。
【００４３】
軟骨外植片
同化条件
堅牢かつ簡単な試験モデル／アッセイで実験を可能にする、軟骨変性疾患についてのモデルとしてウシ関節軟骨外植片培養物を使用する。このモデルでは、軟骨代謝に対する成長因子および薬物の効果を検討することができる。［Ｏｌｓｅｎ、Ａ．Ｋ．ら、Ａｎａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｅｘｏ  ｖｉｖｏ  ｉｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、２００７．１５（３）：３３５−３４２頁］。
【００４４】
関節軟骨外植片の調製
ＬＡＦベンチで、半滅菌（ｓｅｍｉ−ｓｔｅｒｉｌｅ）条件下で膝を開いた。表面関節軟骨の切片を一回の動きの操作（ｏｎｅ−ｍｏｖｅｍｅｎｔ−ｍａｎｅｕｖｅｒ）で除去し、最外層のみを除去した。あまりに深い切片は下にある軟骨下骨／軟骨質（ｃｈｏｎｄｒｏｓｔｅｏｕｓ）物質を含むであろう。均一な外植片を大腿骨および脛骨の両方から回収した。関節丘に位置していた軟骨由来の外植片は避けた。この外植片を、ＰＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含有するペトリ皿に移した。
【００４５】
調製および培養
この外植片を個々に秤量し、フローベンチ（ｆｌｏｗ−ｂｅｎｃｈ）の中で、半滅菌条件下で滅菌した９６穴プレートに移した。秤量後外植片を湿った状態に保つため、予めそのウェルに、２００μＬ  ＰＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを満たしておいた。次いでＰＢＳを除去し、設定に従って異なる種類および濃度のアミノ糖を含有する培地をこれらのウェルに加えた（２００μＬ／ウェル）。４つの外植片の複製物を各試験に対して使用した。これらのプレートを、振盪しながら（５０ｒｐｍ）３７℃および５％  ＣＯ２でインキュベーションした。胞子からの汚染を制限／回避するために、これらのプレートをＣＯ２透過性のプラスチックのバッグで覆った。この馴化培地を２日目〜３日目ごとに交換し、上清を新しい９６穴プレートに移し、実験の最後まで−２０℃で保存した。設定に従って、２日目〜３日目ごとに、異なる種類および濃度のアミノ糖の新しい培地をこれらのウェルに加えた（交換した）（２００μＬ／ウェル）。
【００４６】
実験の最終日に（２２〜２４日間）、上清を除去し、細胞数および生存率を調べるためのアラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）によって細胞生存率を測定した。また実験の最終日に、種々のアッセイにおいて軟骨からタンパク質を抽出するために、軟骨を処理した。
【００４７】
アグリカナーゼが媒介するアグリカン分解について、ＩＩ型コラーゲン形成（ＰＩＩＮＰ）について上清を測定した。ノルディック・バイオサイエンス（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製のＥＬＩＳＡキットを使用した。
【００４８】
細胞生存率および細胞数の測定
アミノ糖の特異的かつ無毒な作用を保証するために、細胞数および細胞生存率に相関することがこれまでに示されているアラマーブルーによって、軟骨細胞の代謝活性を測定した。
【００４９】
軟骨の代謝回転の評価
アグリカナーゼが媒介するアグリカン分解：アグリカン断片３７４ＡＲＧＳの検出：Ｎ末端の３７４ＡＲＧＳのアグリカナーゼ由来の断片を検出するＥＬＩＳＡは２つのモノクローナル抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡシステムで併用する。従った方法は、Ｋａｒｓｄａｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００７、５６（５）：１５４９−１５５８頁に記載されている。
【００５０】
全プロテオグリカン含有量  −  ＳＧＡＧの測定
硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）、すなわちコンドロイチン硫酸放出の検出のために、ＧＡＧ放出のインビトロ分析のための定量的色素結合アッセイを製造業者の説明書（Ｗｉｅｓｌａｂ，Ｓ）に従って使用した。
【００５１】
ＩＩ型コラーゲン形成：ＰＩＩＮＰ  ＥＬＩＳＡ
ＩＩ型コラーゲン形成は、エクソン２の外側のＰＩＩＮＰ分子（ＰＩＩＡＮＰ）上のエピトープを認識する抗体に基づく特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。それゆえ、このＥＬＩＳＡは、ＩＩＡまたはＩＩＢ体に対しては特異的ではないが、両方の形態とも反応する。
【００５２】
軟骨の抽出：
培地に分泌されたものと比較して、種々のタンパク質の軟骨含有量を測定するために、軟骨を抽出した。軟骨外植片を液体窒素中で凍結させた。凍結した外植片を、製造業者が供給する説明書に従ってＢｅｓｓｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒを使用して粉砕した。凍結させたメスを使用してこの粉末を１４ｍｌのチューブの中に入れた。氷冷した消化用緩衝液（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）（０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．４）を加え、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−ＭＲ  ３０００ホモジナイザー（ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）、スイス、リッタウ（Ｌｉｔｔａｕ））を使用してこの溶液を３０秒間均質化した。次いでこのホモジネートを１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を集めてさらなる分析まで−８０℃で保存した。
【００５３】
全コラーゲン含有量：ヒドロキシプロリンの測定
Ｐｏｄｅｎｐｈａｎｔ（Ｐｏｄｅｎｐｈａｎｔ，Ｊ．、Ｎ．Ｌａｒｓｅｎ、およびＣ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ａｎ  ｅａｓｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １９８４、１４２：１４５−１４８頁）によって記載された方法の改変版を使用して外植片中のヒドロキシプロリンの含有量を測定することにより、全コラーゲンは評価される。
【００５４】
結果
アミノ糖分析
図１は、ＯｌｉｇｏｍｉｎおよびＴ−ＣｈＯＳキトオリゴ糖の比較を示す。Ｏｌｉｇｏｍｉｎについては、モノマー〜三量体（ＤＰ１〜ＤＰ３）が主成分（５８．４％）であり、ＤＰ４およびより高次のものは４１．６％であった。
【００５５】
Ｔ−ＣｈＯＳについては、モノマー（ＤＰ１）は検出されず、ＤＰ１〜ＤＰ３画分は６．１％に過ぎなかった。八量体（ＤＰ８）が、Ｔ−ＣｈＯＳにおける主要なオリゴマーであった。ＤＰ４およびより長いオリゴマーが主画分、すなわち９３．９％であった。
【００５６】
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ａ）およびグルコサミン（Ｄ）のＨＰＬＣ分析から、モノマー（ＤＰ１）が主成分であり、オリゴマーは検出されないことが明らかになった（結果は示さず）。
【００５７】
ウシの軟骨外植片での研究
異なるアミノ糖の効果
同化条件
軟骨外植片での生存率はアミノ糖によっては影響を受けず、処置の最後でアラマーブルーアッセイにより判断したところ、種々のアミノ糖と対照群との間には有意差は観察されなかった。
【００５８】
当該外植片培地中でのコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）放出は、３日目から２３日目まで２〜３日間隔で測定した。後期についてはＯｌｉｇｏｍｉｎ用量に関連する減少効果があった（１０日目〜２３日目；線形回帰）。１０日目〜２３日目の間の累積されたＣｈＳ放出を分析したところ（図２）、その期間について、ＣｈＳ放出の明らかなＯｌｉｇｏｍｉｎによって誘導された減少があった（Ｏｌｉｇｏｍｉｎ  ２００および４００μｇ／ｍｌについてｐ＜０．０５；５１％低下）。グルコサミン（Ｄ  ４００μｇ／ｍｌ）は同じ効果を有していた（ｐ＜０．０５）。Ｔ−ＣｈＯＳおよびＮ−アセチルグルコサミン（Ａ）は、その期間について累積されたコンドロイチン硫酸放出の有意な効果は有しなかった（図２）。
【００５９】
ＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＮＰ）
試験したすべてのバイオマーカーのうちで、ＩＩ型コラーゲン形成（ＰＩＩＮＰ濃度）は当該アミノ糖によって最も明確に影響を受けた。これは、２〜３日間の期間にわたって軟骨外植片から培地へと放出されたとして測定された。Ｔ−ＣｈＯＳだけが、強い、用量に関連する効果を有していた。この効果は、アミノ糖インキュベーションの後期においてのみ観察された。２０日目のエキソビボでは、異なるアミノ糖によって観察された効果はなかった。ＰＩＩＮＰ濃度は０．１〜０．２のｎｇ／ｍｌ  ｍｇ軟骨であった。２２日目に、ＰＩＩＮＰの明確な用量に関連する増加があったが、これはＴ−ＣｈＯＳによるものだけであった（図３）。この効果はすべての濃度（５０、１００、２００および４００μｇ／ｍｌ）で有意にゼロ（Ｍ）とは異なり、最大の効果は０．６２ｎｇ／ｍｌ  ｍｇ軟骨、すなわち対照の１７倍であった。同じ濃度範囲のＯｌｉｇｏｍｉｎによっては、効果は見出されなかった。単糖グルコサミン（Ｄ）およびＮ−アセチルグルコサミン（Ａ）は効果がなかった（図３）。それゆえ、試験したすべてのアミノ糖のうちでＴ−ＣｈＯＳだけが、ＰＩＩＮＰ発現に対して強い用量に関連する効果を有していた。
【００６０】
抽出された軟骨のタンパク質含有量について、種々のアミノ糖（またはその濃度）と対照との間で有意差は見出されなかった。しかしながら、Ｏｌｉｇｏｍｉｎの濃度の増加に伴う軟骨のタンパク質含有量の有意な線形的な減少があった（ｐ＝０．０２７；Ｎ＝２０）。Ｏｌｉｇｏｍｉｎについては、累積されたコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）放出の増加に伴って、軟骨のタンパク質含有量の線形的な増加があった（ｐ＝０．０１９；Ｎ＝２０）。
【００６１】
Ｔ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンの組み合わせ（Ｔ−ＣｈＯＳ＋Ｄ）
ウシ外植片実験のこの集団（ｓｅｔ）では、グルコサミン（２００μｇ／ｍｌ）をＴ−ＣｈＯＳ（５０および４００μｇ／ｍｌ）と組み合わせて試験した。対照は、Ｔ−ＣｈＯＳのみ（５０および４００μｇ／ｍｌ）、Ｏｌｉｇｏｍｉｎのみ（５０および４００μｇ／ｍｌ）またはグルコサミンのみであった。インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、１００ｎｇ／ｍｌが陽性の同化作用刺激の対照としての役割を果たした。
【００６２】
ＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＮＰ）
ＰＩＩＮＰ放出に対して強いＴ−ＣｈＯＳ誘導があり、Ｔ−ＣｈＯＳ＋グルコサミン（４００μｇ／ｍｌ＋２００μｇ／ｍｌ）はＰＩＩＮＰをさらに誘導した。累積的な効果を見るとこれは明白である（図４）。スチューデントのｔ−検定から、累積されたＰＩＩＮＰ放出についての、Ｔ−ＣｈＯＳとＴ−ＣｈＯＳ＋Ｄとの間の有意差が明らかとなった（図４）。グルコサミン単独では効果がなかった。２００μｇ／ｍｌ  グルコサミン（Ｄ）を伴っても伴わなくても、Ｏｌｉｇｏｍｉｎ  ５０〜４００μｇ／ｍｌは、２０日目および２４日目では、ＰＩＩＮＰ放出に対してまったく効果がなかった。
【００６３】
累積的なコンドロイチン硫酸の放出に対するＴ−ＣｈＯＳ、Ｔ−ＣｈＯＳ＋ＤおよびＩＧＦ−１の効果（１７日目〜２４日目）を図５に示す。ＩＧＦ−１およびＴ−ＣｈＯＳ＋Ｄはともに、累積的なコンドロイチン硫酸の放出（１７日目〜２４日目）の有意な増加を有したが、Ｔ−ＣｈＯＳもグルコサミンも単独では有意な効果を有しなかった（図５）。
【００６４】
２４日目の抽出された軟骨タンパク質のアッセイは、Ｔ−ＣｈＯＳ、Ｔ−ＣｈＯＳ＋ＤまたはＩＧＦ−１の有意な効果をまったく明らかにしなかった。
【００６５】
ヒトの軟骨外植片の研究
軟骨外植片を、変形性関節症を患っている４０歳の女性の膝から得た。外植片を、同化条件下で２５日間、増殖培地の中に保った。新しい培地に２〜３日ごとに交換した。アミノ糖（Ｏｌｉｇｏｍｉｎ、Ｔ−ＣｈＯＳ、ＡおよびＤ；異なる濃度）を、０日目から２５日目まで培地の中に保った。
【００６６】
アグリカナーゼが媒介するアグリカン分解（アグリカン断片３７４ＡＲＧＳ−ＥＬＩＳＡ）は、９日目では異なるアミノ糖によっては影響されなかった。
【００６７】
ＩＩ型コラーゲン形成（ＰＩＩＮＰ濃度）は、上記アミノ糖によってもっとも明らかに影響を受けた。これは、２〜３日間の期間にわたって軟骨外植片から培地の中へと放出されたとして測定された（１８日目〜２５日目）。Ｔ−ＣｈＯＳだけが強い、用量に関連する効果を有していた。この効果は、アミノ糖インキュベーションの後期（１８日目、２０日目、２２日目および２５日目；図６）にのみ観察された。最大の効果は、２２日目の１．３７ｎｇ／ｍｌ  ｍｇ軟骨、すなわち対照の３．９倍であった。同じ濃度範囲のＯｌｉｇｏｍｉｎによっては、効果は見出されなかった。グルコサミン（Ｄ）は効果がなかった。それゆえ、試験したすべてのアミノ糖のうちでＴ−ＣｈＯＳだけが、ＰＩＩＮＰ発現に対して強い、用量に関連する効果を有していた。
【００６８】
ＹＫＬ−４０はＴ−ＣｈＯＳに対する受容体として提案されているので、細胞外のＹＫＬ−４０放出を、４００μｇ／ｍｌのＴ−ＣｈＯＳ、Ｏｌｉｇｏｍｉｎおよびグルコサミン（Ｄ）で処置した外植片において、４日目、１１日目、１５日目、２０日目および２５日目に培地中で分析した。図７は、その期間についての異なるアミノ糖の効果を示す。対照に対しては、１０日目と２０日目との間でＹＫＬ−４０発現の著しい低下があった。Ｔ−ＣｈＯＳ、およびより小さい程度ではあるがＯｌｉｇｏｍｉｎは、後期（１５日目〜２５日目）の間、高いＹＫＬ−４０発現を維持した。Ｔ−ＣｈＯＳが高ＹＫＬ−４０発現を維持していた１５日目に有意差が検出された。グルコサミンは効果がなかった（図７）。図８は、試験したすべての群についての、１５日目〜２５日目の期間の間のＹＫＬ−４０とＰＩＩＮＰ発現との間の関係を示す。Ｔ−ＣｈＯＳだけがＰＩＩＮＰ放出を誘導し、高ＹＫＬ−４０発現を維持した（明確な線形回帰）。この関係は、Ｔ−ＣｈＯＳ群がこのデータから排除されると消失した（線形回帰なし）。
【００６９】
２５日目における全コンドロイチン硫酸含有量（コンドロイチン硫酸の抽出）は、種々のアミノ糖によって影響を受けなかった。２５日目の、この外植片における全タンパク質レベル（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ）も全ヒドロキシプロリンレベルも影響を受けなかった。
【００７０】
２５日目のヒトＯＡ関節軟骨外植片の細胞生存率（アラマーブルーアッセイ）は当該アミノ糖によって誘導された。試験したすべての３つのアミノ糖の用量に関連する効果があった（線形回帰；ｐ＜０．０５）。この効果は、Ｏｌｉｇｏｍｉｎが最も強く、次いでＴ−ＣｈＯＳであり、グルコサミンが最小であった。
【００７１】
（実施例２：ＩＩ型コラーゲンによって誘導される関節リウマチラットモデルを使用する、関節リウマチに対するグルコサミンと組み合わせたＴ−ＣｈＯＳの効果）
緒言
この実施例は、ＲＡラットモデルを使用する、キトオリゴ糖の可能性のある効果の動物実験を記載する。試験したＣｈＯＳ混合物は、当該Ｔ−ＣｈＯＳ組成物である。この研究の目的は、グルコサミンおよびＴ−ＣｈＯＳの組み合わせがＴ−ＣｈＯＳ単独よりも強い効果を有するであろうかどうかを検討することであった。
【００７２】
物質および方法
使用した動物は、関節炎を誘導された群については１つの群あたり１０匹、誘導されていない対照群については４匹／群であり、４〜５匹／ケージで飼育した。関節炎の誘導のために、０日目および６日目に、これらの動物をイソフルランで麻酔し、２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲン（エラスチン・プロダクツ（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ミズーリ州、オーエンズビル（Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ））を含む３００μｌのフロイント不完全アジュバント（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州、デトロイト）の皮下／皮内（ＳＣ／ＩＤ）注射を尻尾の付け根および背中の２つの部位に与えた。経口経路による種々のオリゴマーおよび／またはモノマー組成物の投薬（２４時間間隔で１日１回）をこの研究の０日目に開始し、１６日目まで継続した。実験群は表１に示すとおりである。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
動物は、研究の１７日目に終わりにした。有効性の評価は足首のカリパス測定値に基づき，曲線下面積（ＡＵＣ）、最終の後肢の重量、および足首および膝の組織病理学評価として表した。統計解析のために、種々の炎症算出を足首直径データについて実施し、Ａｎｏｖａおよびｔ−検定（パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定）をソフトウェア指針（ＳｉｇｍａＳｔａｔ）に従って適用した。すべての動物は研究の最後まで生存した。
【００７５】
結果
溶媒で処置した疾患対照のラットは、１４グラムの平均の体重増加を有していた。処置群についての体重増加は、疾患対照と有意には異ならなかった。
【００７６】
Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄで処置したラット（群５）（１２〜１３日目に有意）、Ｔ−ＣｈＯＳ＋１４ｍｇ  Ｄで処置したラット（群６）（１２日目）、またはＴ−ＣｈＯＳ＋２８ｍｇ／ｋｇ  Ｄで処置したラット（群７）（１２日目、１５日目）で、疾患対照と比べて、足首直径の有意な減少が見られた。累積的な足首直径（９日目〜１７日目）に対するＴ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンの効果を図９に示す。Ｔ−ＣｈＯＳは、単独で、およびすべての３つのグルコサミン濃度の組み合わせで有効であった。グルコサミン単独では効果がなかった。Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ（群５）は最も強い効果を有していた。
【００７７】
足首軟骨損傷スコアは、群５のラットにおいては、疾患対照と比べて、正常値に向かって有意に低下した（２７％低下）（図１０）。群５のラットだけが有意な低下を示した。
【００７８】
足首骨吸収スコアは、群５のラットにおいては、疾患対照と比べて、正常値に向かって有意に低下した（２２％低下）、（図１１）。群５だけが有意な低下を示した。
【００７９】
足首パンヌススコアは、群５のラットにおいては、疾患対照と比べて、正常値に向かって有意に低下した（２４％低下）、（図１２）。群５だけが有意な低下を示した。
【００８０】
合わせた（ｓｕｍｍｅｄ）足首の組織病理学パラメータの阻害は、すべてのアミノ糖群で処置した動物について有意であった（図１３）。群５のラットは、最も強い効果を示し（２１％；ｐ＜０．０１）、次いでＴ−ＣｈＯＳ単独（群３）（１４％；ｐ＜０．０５）、次いで群４（１２％；ｐ＜０．０５）、次いで群６（１１％）および群７（１０％）であった。図１３を参照。
【００８１】
膝のパンヌススコアは、Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄで処置したラットにおいては、疾患対照と比べて、正常値に向かって有意に低下した（４２％低下）、（図１４）。Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄだけが有意な低下を示した。
【００８２】
膝の骨吸収スコアは、Ｔ−ＣｈＯＳ＋Ｄ２１で処置したラットにおいては、疾患対照と比べて、正常値に向かって有意に低下した（４１％低下）。Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  ２１だけが有意な低下を示した（図１５）。
【００８３】
合わせた（ｓｕｍｍｅｄ）膝の組織病理学パラメータの阻害は、疾患対照と比べて、Ｔ−ＣｈＯＳで処置した動物について有意であり（２６％；ｐ＜０．０５）、そしてＴ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄで処置した動物について有意であった（３２％；ｐ＜０．０１）（図１６）。
【００８４】
合わせた膝スコアは、２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄ（１４％増加）、Ｔ−ＣｈＯＳ＋１４ｍｇ／ｋｇ  Ｄ（１０％）、またはＴ−ＣｈＯＳ＋２８ｍｇ／ｋｇ  Ｄ（１３％）での処置によって、疾患対照と比べて、増加したが有意ではなかった。Ｔ−ＣｈＯＳ＋２１ｍｇ／ｋｇ  Ｄは最も強い効果を有していた（図１６）。
【００８５】
まとめると、この研究の結果は、Ｔ−ＣｈＯＳ（７．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｄ（２１．４ｍｇ／ｋｇ）を用いた経口による毎日の処置によって、足首軟骨の損傷、骨吸収およびパンヌス形成が効果的に阻害されるということを示した。Ｔ−ＣｈＯＳ（７．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｄ（２１．４ｍｇ／ｋｇ）も、ラットにおいてＩＩ型コラーゲン関節炎の発症に関連する膝のパンヌス形成および骨吸収を阻害した。Ｄ−グルコサミンと組み合わせた他の用量のＴ−ＣｈＯＳは、足首カリパス測定に対して散発的な有意な効果を有し、Ｔ−ＣｈＯＳ単独では、わずかな有意ではない恩恵を示した。しかしながら、Ｄ−グルコサミン単独では有益な効果を有しなかった。
【００８６】
結論として、グルコサミンと組み合わせたＴ−ＣｈＯＳは、コラーゲンＩＩによって誘導されたラットＲＡモデルにおいて、ＲＡに対するＴ−ＣｈＯＳの効果を改善した。当該Ｔ−ＣｈＯＳの組み合わせにおけるグルコサミンの最も有効な濃度は２１ｍｇ／ｋｇラットであった。
【００８７】
実施例３
（ヒトのリウマチ性関節炎患者に対するＯｌｉｇｏｍｉｎ、Ｔ−ＣｈＯＳ、Ｔ−ＣｈＯＳ＋Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＴ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの効果）
リウマチ性関節炎と診断された一人の女性は、その患者の疼痛を和らげるために、ジェニス・イーエイチエフ」（Ｇｅｎｉｓ  ｅｈｆ）によって製造されたキトオリゴマー（「Ｏｌｉｇｏｍｉｎ」）を数年間使用してきた。この患者は、その患者の疼痛および運動性軽減スコアを、０は軽減なしでありおよび１０は完全に軽減であるようにして評点付けした。Ｏｌｉｇｏｍｉｎ（２２００ｍｇ／日）についてのこの患者の軽減スコアは７である。
【００８８】
この患者に、Ｔ−ＣｈＯＳ（７００ｍｇ／日）に切り替えるように依頼した。徐々にこの患者の状態は悪化した。２０日目に、この患者の軽減スコアは５にまで落ちた。Ｔ−ＣｈＯＳ摂取の３２日目に、Ｎ−アセチルグルコサミン（１５００ｍｇ／日）をこのＴ−ＣｈＯＳに加えた（図１７）。結果として、この患者の状態は良くなった。Ｎ−アセチルグルコサミンをＴ−ＣｈＯＳに加えた１２日間において、この患者の軽減スコアは、５から７へと上昇した（図１７）。１３日後、この患者の状態は変わらなかった（スコア＝７）。次いでこの患者は、Ｎ−アセチルグルコサミンから、まだＴ−ＣｈＯＳと組み合わせてグルコサミン（１５００ｍｇ／日）へと切り替えた（図１７）。１６日間において、この患者の状態は、わずかに改善し、７から８への増加をもたらした。この患者は、今、１年を超えてこの組み合わせを使用し続けており、いまだこの患者の状態は同じであり、軽減スコアはいまだ８である。
【００８９】
結論
上記の実施例は、Ｔ−ＣｈＯＳは、キチナーゼ様タンパク質に対する結合親和性を増加させるために、モノマーが組み合わせから除去されており、かつ二量体および三量体が１０％未満まで減少されている、部分的に脱アセチル化されたキトオリゴ糖組成物の特定の組み合わせであるということを示す。これは実施例１、アミノ糖分析（図１）に示されている。
【００９０】
ＣｈＯＳと大量のモノマー、二量体および三量体との粗製混合物であるＯｌｉｇｏｍｉｎは、Ｔ−ＣｈＯＳが示す生理活性を有しない。この組成物は実施例１、図１に示される。Ｏｌｉｇｏｍｉｎは軟骨外植片においてＩＩ型コラーゲン合成を誘導しないのに対し、Ｔ−ＣｈＯＳはＰＩＩＮＰ放出の１５〜２０倍の増加を示すということが実施例１で実証されている。
【００９１】
当該オリゴ糖組成物は、他のアミノ糖およびキトオリゴ糖組成物に勝って、優れた組織保護／再生活性を有する。実施例１において、軟骨外植片からのＰＩＩＮＰ放出が示される（図３）。
【００９２】
Ｔ−ＣｈＯＳ活性は、Ｆ１８哺乳類キチナーゼ（キチナーゼ様タンパク質）との相互作用を通して媒介される。これは実施例１に示され、Ｔ−ＣｈＯＳは、ＹＫＬ−４０との相互作用を通してそのコラーゲン形成活性を媒介する（図７および８）。Ｏｌｉｇｏｍｉｎは、試験した濃度範囲ではそのような効果をまったく示さなかった（図８）。
【００９３】
Ｔ−ＣｈＯＳ活性は、グルコサミンモノマーと組み合わせて増強されうる。これは、軟骨外植片からのＰＩＩＮＰ放出がＴ−ＣｈＯＳによって増進される実施例１に示される。ＣｈＯＳおよびグルコサミンの組み合わせはまた、Ｔ−ＣｈＯＳ単独よりも、有意に効率的である（図４）。実施例１では、軟骨外植片からのコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）放出、Ｔ−ＣｈＯＳ＋グルコサミンの効果は、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の効果に近い（図５）。さらには実施例２、図１９〜２６において、関節リウマチラットモデルにおけるＴ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンを合わせた経口投与は、Ｔ−ＣｈＯＳまたはグルコサミン単独に勝っている。
【００９４】
Ｔ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンは、経口投与後にインビボでその活性をもたらすであろう。これは、Ｔ−ＣｈＯＳおよびグルコサミンを合わせた経口投与が、ラットの関節リウマチモデルにおいて有意な組織保護効果を有する実施例３、図４〜８に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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