(57)【要約】  本発明は、哺乳動物において疼痛刺激の後にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を検出するために使用される核酸アレイに関する。本発明は、さらに、哺乳動物における疼痛を検出する、又は疼痛のレベルに対する化合物の効果を評価する方法におけるGPR151の使用に関する。本発明の他の側面は、医薬のスクリーニング方法、疼痛の治療方法、及び疼痛治療のためのGPR151モジュレータを含む薬学的組成物に関する。
2011523846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛刺激の知覚、伝達、プロセッシング、及び／又は疼痛刺激から離れるための作用反応の誘発に関与するタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを含むアレイ。
【請求項２】
疼痛刺激後に細胞において生じるプロセスに関与するタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを含むアレイ。
【請求項３】
前記タンパク質が、受容体、チャネル、輸送タンパク質、シグナル伝達因子、ホスファターゼ、キナーゼ又は核ホルモンである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
ポリヌクレオチドプローブの１つが、Ｇタンパク質共役型受容体151（GPR151）遺伝子をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができる、請求項３に記載のアレイ。
【請求項５】
細胞が神経細胞である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項６】
細胞が哺乳動物に由来する、請求項２〜５のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項７】
細胞が、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトに由来する、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】
ポリヌクレオチドプローブが、PCR産物、インサイチュで合成されたロングオリゴヌクレオチド又はショートオリゴヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項９】
ポリヌクレオチドプローブが、疼痛に苦しむか又は疼痛に苦しむと疑われる対象の細胞に由来する核酸分子にハイブリダイズする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１０】
核酸分子がRNAである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１１】
核酸分子がcDNAである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドプローブが、ガラス又はナイロン製の支持体と安定して結合している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１３】
疼痛が、急性疼痛又は慢性疼痛である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１４】
疼痛が、頭痛、咽喉痛、歯痛、耳痛、眼痛、頸部痛、背部痛、乳房痛、腹痛、肢痛、関節痛、皮膚痛、体性痛、内臓痛、又は幻肢痛である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１５】
疼痛が神経障害性疼痛である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１６】
疼痛が、損傷、感染症、炎症、がん又は疾患によって引き起こされる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１７】
疼痛が、熱刺激、機械刺激、電気刺激、化学刺激又は放射性刺激によって引き起こされる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１８】
疼痛刺激時の遺伝子発現の変化を検出するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアレイの使用。
【請求項１９】
疼痛に苦しんでいることを表現することができない対象における遺伝子発現の変化を検出するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアレイの使用。
【請求項２０】
対象が、動物、小児、高齢者、又は精神障害者である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
哺乳動物GPR151遺伝子の発現を特異的に阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２２】
哺乳動物GPR151遺伝子の発現を特異的に阻害し得るリボザイム分子。
【請求項２３】
哺乳動物GPR151遺伝子の発現を特異的に阻害し得る干渉RNA分子。
【請求項２４】
GPR151タンパク質へ特異的に結合し得る抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２５】
哺乳動物GPR151遺伝子の発現を阻害するための、請求項２４に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
対象が疼痛に苦しんでいることを診断するための、請求項２４に記載の抗体の使用。
【請求項２７】
GPR151をコードする遺伝子の正常発現が減少するか又は排除されるように遺伝子組換えされている哺乳動物細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の細胞を含む遺伝子組換えされた哺乳動物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の遺伝子組換えされた哺乳動物を生産する方法であって、該哺乳動物におけるGPR151遺伝子の発現が、野生型哺乳動物におけるGPR151遺伝子の発現と比較して減少するか又は排除されるように、該哺乳動物の１つ又はそれ以上の細胞を遺伝子組換えする工程を含む、上記方法。
【請求項３０】
哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
疼痛に苦しむ対象を診断する方法であって、該対象由来の生物学的サンプル中のGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、上記方法。
【請求項３２】
ａ）対象から組織サンプルを得る工程；
ｂ）サンプルからRNAを単離する工程；
ｃ）RNAを請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアレイと共にインキュベートする工程；及び
ｄ）アレイ上の遺伝子発現を分析する工程
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞におけるGPR151遺伝子発現を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をテスト化合物と接触させる工程；
ｂ）該細胞からRNAサンプルを調製する工程；及び
ｃ）RNAサンプルを請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アレイにインキュベートする工程、
を含み、
ここで、該接触工程前と比較して、該接触工程後の該細胞におけるGPR151遺伝子発現プロファイルの変化が、該化合物が該細胞においてGPR151遺伝子発現を調節することができることを指示する、上記方法。
【請求項３４】
疼痛を治療又は改善する方法であって、その必要がある対象に有効量のGPR151モジュレータを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項３５】
ａ）対象におけるGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程；及び
ｂ）コントロールと比較して増大した発現レベルのGPR151タンパク質を有する対象にGPR151モジュレータを投与する工程
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程ａ）が、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アレイを使用することによって行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
モジュレータが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び二本鎖RNAからなる群より選択され、ここで該分子はGPR151遺伝子発現を阻害するように設計される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
モジュレータが、GPR151遺伝子発現を特異的に阻害し得る抗体又は抗体フラグメントである、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物における疼痛のレベルに対する化合物の効果を評価する方法であって、
ａ）疼痛を有する哺乳動物に化合物を投与する工程；
ｂ）哺乳動物から少なくとも１つの細胞サンプルを得る工程；及び
ｃ）細胞サンプル中のGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程
を含み、
ここで、工程ｃ）において測定されたGPR151タンパク質の発現レベルと化合物の非存在下でのGPR151タンパク質の発現レベルとの差異が、疼痛に対する化合物の効能のレベルを示す、上記方法。
【請求項４０】
工程ｃ）が、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アレイを使用することによって行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
疼痛が、急性疼痛又は慢性疼痛である、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
疼痛が、頭痛、咽喉痛、歯痛、耳痛、眼痛、頸部痛、背部痛、乳房痛、腹痛、肢痛、関節痛、皮膚痛、体性痛、内臓痛、又は幻肢痛である、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
疼痛が神経障害性疼痛である、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
疼痛が、損傷、感染症、炎症、がん又は疾患によって引き起こされる、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
疼痛が、熱刺激、機械刺激、電気刺激、化学刺激又は放射性刺激によって引き起こされる、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
疼痛の治療又は改善の必要がある対象における疼痛を治療又は改善するために、有効量でGPR151モジュレータを含む薬学的組成物。
【請求項４７】
モジュレータが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び二本鎖RNAからなる群より選択され、ここで該物質はGPR151遺伝子発現を阻害するように設計される、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
モジュレータが、GPR151遺伝子発現を特異的に阻害し得る抗体又は抗体フラグメントである、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
疼痛が、急性疼痛又は慢性疼痛である、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
疼痛が、頭痛、咽喉痛、歯痛、耳痛、眼痛、頸部痛、背部痛、乳房痛、腹痛、肢痛、関節痛、皮膚痛、体性痛、内臓痛、又は幻肢痛である、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
疼痛が神経障害性疼痛である、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
疼痛が、損傷、感染症、炎症、がん又は疾患によって引き起こされる、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
疼痛が、熱刺激、機械刺激、電気刺激、化学刺激又は放射性刺激によって引き起こされる、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において疼痛刺激の後にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を検出するために使用される核酸アレイに関する。本発明は、さらに、哺乳動物における疼痛を検出するか、又はその疼痛のレベルに対する化合物の効果を評価する方法におけるGPR151の使用に関する。本発明の他の側面は、医薬品のスクリーニング方法、疼痛の治療方法、及び疼痛治療のためのGPR151モジュレータを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
疼痛は、実際の又は潜在的な組織損傷及びそれに対する情緒的反応を反映する複雑な主観的感覚である。急性疼痛は、潜在的な又は現実の損傷を示す生理学的シグナルである。慢性疼痛は、身体因性（somatogenetic）（器質性）又は心因性のいずれかであり得る。慢性疼痛には、しばしば、不随意性の徴候（vegetative sign）が伴うか又は後に続き、これは、しばしば、鬱病を生じさせる。
【０００３】
身体因性疼痛は、侵害受容性起源のもの、炎症性又は神経障害性であり得る。侵害受容性疼痛は、体性又は内臓疼痛感受性神経繊維の継続的な活性化に比例すると判断される。神経障害性疼痛は、神経系における機能不全から生じ；それは、末梢神経系、CNS、又は両方における異常な体性感覚プロセスによって維持されると考えられる（疼痛機構の概観については、例えば、非特許文献１〜５を参照のこと）。
【０００４】
慢性疼痛は、莫大な社会経済的費用及び個人的苦痛をもたらす。既存の薬理学的疼痛療法は、効能及び安全性の両方の点で広く不満足なものである。
【０００５】
今まで、２クラスの鎮痛薬が、疼痛治療のための主に使用されている：非オピオイド鎮痛薬、主としてアセトアミノフェン及びNSAID（非ステロイド抗炎症薬）、並びにオピオイド（麻薬）アゴニスト（ここで、「オピオイド」は、CNS中の特異的オピオイド受容体へ結合し、アゴニスト作用を引き起こす天然又は合成物質についての総称である）。残念ながら、両方の鎮痛薬のクラス、オピオイド及び非オピオイドは、いくつかの望ましくない副作用を有する。オピオイドの最も深刻な副作用は、呼吸器系の抑制の可能性、及び長期治療後の嗜癖の可能性である（非特許文献６）。他方では、非オピオイドの主要なクラスであるNSAIDは、種々の消化管合併症、例えば、潰瘍及び出血、さらには腎臓損傷を誘発し得る（非特許文献６）。米国において、毎年、約16000人の患者が、従来のNSAIDによって引き起こされる重篤な消化管合併症のために死亡していると推測された。
【０００６】
最先端の疼痛治療に関連する重大な欠点を考慮して、新規のクラスの疼痛調節薬物について大きな要求がある。特に、疼痛の神経生物学の急速に進む理解と、最先端の治療の欠点無しに有効な治療を提供するという満たされていない臨床的な要求との間の非常に大きなギャップを考慮して、新規のクラスの鎮痛薬についての新規の標的の発見へ努力が向けられる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Scholz and Woolf, 2002
【非特許文献２】Julius and Basbaum, 2001
【非特許文献３】Woolf and Mannion, 1999
【非特許文献４】Wood, J.D., 2000
【非特許文献５】Woolf and Salter, 2000
【非特許文献６】Schaible H.G., Vanegas H., 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、新規のクラスの疼痛調節薬物の開発及び提供のための新規の手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、疼痛を調節する薬学的化合物の作製のためのGPR151モジュレータの使用によって解決される。
【００１０】
本発明は、侵害受容性シグナルにおける伝達及びプロセッシングにおけるGPR151の驚くべき関与を初めて示す本発明者らの知見に基づく。
【００１１】
本発明の一主題は、疼痛刺激の知覚、伝達、プロセッシング、及び／又は、疼痛刺激から離れるための作用反応の誘発に関与するタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを含むアレイに関する。
【００１２】
前記ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドプローブが、ガラス又はナイロン製の支持体と安定して結合されており、疼痛に苦しむか又は疼痛に苦しむと疑われる対象の細胞に由来する核酸分子にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドプローブは、PCR産物、インサイチュで合成されたショートオリゴヌクレオチド又はロングオリゴヌクレオチドであり得る。前記核酸分子は、RNA又はcDNAであり得る。
【００１３】
より具体的な事項において、アレイは、疼痛刺激後に細胞において生じるプロセスに関与するタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを含む。特に、前記細胞は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトに由来する神経細胞であり得る。
【００１４】
さらにより具体的な事項において、前記タンパク質は、受容体、チャネル、輸送タンパク質、シグナル伝達因子、ホスファターゼ、キナーゼ又は核ホルモン（nucleic hormone）である。本発明の好ましい実施態様において、前記タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体151（GPR151）である。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明に従うアレイは、疼痛刺激での遺伝子発現の変化を検出するために、又は、疼痛に苦しんでいることを表現することができない対象、例えば、動物、小児、老人又は精神障害者における遺伝子発現の変化を検出するために、使用される。
【００１６】
本発明の異なる局面について、疼痛は、急性疼痛又は慢性疼痛；神経障害性疼痛、頭痛、咽喉痛、歯痛、耳痛、眼痛、頸部痛、背部痛、乳房痛、腹痛、肢痛、関節痛、皮膚痛、体性痛、内臓痛、又は幻肢痛であり得；疼痛は、損傷、感染症、炎症、がん又は疾患によって；又は熱刺激、機械刺激、電気刺激、化学刺激又は放射性刺激によって、引き起こされ得る。
【００１７】
本発明の別の主題は、哺乳動物GPR151遺伝子の発現を特異的に阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチド分子、リボザイム分子、干渉RNA分子、抗体又は抗体フラグメント、及び、哺乳動物GPR151遺伝子の発現を阻害するための又は対象が疼痛に苦しんでいることを診断するための、前記抗体又は抗体フラグメントの使用に関する。
【００１８】
本発明は、GPR151をコードする遺伝子の正常発現が減らされるか又は排除されるように遺伝子組換えされた細胞；このような遺伝子組換えされた細胞を含む遺伝子組換えされた哺乳動物、該哺乳動物はマウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトである；及び、このような遺伝子組換えされた哺乳動物を製造する方法であって、該哺乳動物におけるGPR151遺伝子の発現が、野生型哺乳動物におけるGPR151遺伝子の発現と比較して減らされるか又は排除されるように、該哺乳動物の１つ又はそれ以上の細胞を遺伝子組換えする工程を含む方法をさらに提供する。
【００１９】
本発明の好ましい主題は、疼痛に苦しむ対象を診断する方法であって、該対象由来の生物学的サンプル中のGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程を含む方法を指す。前記方法は、以下の工程を含み得る：
a）対象から組織サンプルを得る工程；
b）サンプルからRNAを単離する工程；
c）RNAを請求項１〜17のいずれか１項に記載のアレイと共にインキュベートする工程；及び
d）アレイ上の遺伝子発現を分析する工程。
【００２０】
別の好ましい主題は、細胞におけるGPR151遺伝子発現を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
a）細胞をテスト化合物と接触させる工程；
b）該細胞からRNAサンプルを調製する工程；及び
c）RNAサンプルを本発明に従う核酸アレイにインキュベートする工程、
を含み、
ここで、該接触工程前と比較して、該接触工程後の該細胞におけるGPR151遺伝子発現プロファイルの変化が、該化合物が該細胞においてGPR151遺伝子発現を調節することができることを指示する方法を指す。
【００２１】
好ましい実施態様において、本発明は、その必要がある対象へ有効量のGPR151モジュレータを投与する工程を含む、疼痛を治療又は改善する方法を提供する。前記方法は、以下の工程を含み得る：
a）対象におけるGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程；及び
b）コントロールと比較して増大した発現レベルのGPR151タンパク質を有する対象にGPR151モジュレータを投与する工程。
工程a）は、本発明に従う核酸アレイを使用することによって行われ得る。前記方法において使用されるGPR151モジュレータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖RNA、抗体又は抗体フラグメントからなる群より選択され、ここで、該分子は、GPR151遺伝子発現を阻害するように設計されている。
【００２２】
別の好ましい実施態様において、本発明は、哺乳動物における疼痛のレベルに対する化合物の効果を評価する方法であって、
a）疼痛を有する哺乳動物に化合物を投与する工程；
b）哺乳動物から少なくとも１つの細胞サンプルを得る工程；及び
c）細胞サンプル中のGPR151タンパク質の発現レベルを測定する工程
を含み、
ここで、工程c）において測定されたGPR151タンパク質の発現レベルと化合物の非存在下でのGPR151タンパク質の発現レベルとの差異が、疼痛に対する化合物の効能のレベルを示す方法を提供する。工程c）は、本発明に従う核酸アレイを使用することによって行われ得る。
【００２３】
さらに、その必要がある対象において疼痛を治療又は改善するに有効量でGPR151モジュレータを含む薬学的組成物が、本発明によって包含される。前記モジュレータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖RNA、抗体又は抗体フラグメントからなる群より選択され、ここで、該分子は、GPR151遺伝子発現を阻害するように設計されている。好ましい実施態様において、GPR151モジュレータを含む薬学的組成物は、神経障害性疼痛を治療又は改善するために使用される。
【００２４】
疼痛は、国際疼痛学会（IASP）によって、「組織の実質的あるいは潜在的な損傷に結びつくか、このような損傷を表す言葉を使って述べられる不快な感覚、情動体験」と定義されている。
【００２５】
疼痛は、患者が医療扶助を求める最も一般的な症状であり、「急性」又は「慢性」のいずれかとして分類され得る。
【００２６】
「急性疼痛」は、直接の組織損傷（例えば、熱傷又は切断）によって引き起こされ、通常、自己限定性である。この疼痛形態は、直接の組織損傷に応答しての自然防御機構であり、損傷された身体部分のさらなる使用を妨げ、そして疼痛性刺激から撤退する。それは、非ステロイド抗炎症薬（NSAID）及びオピオイドを含む、従来の疼痛治療薬に従順である。
【００２７】
対照的に、「慢性疼痛」は、長期間の間、例えば、損傷が治癒した後に持続して、３ヶ月又はそれ以上の間、存在する。慢性疼痛は、明白な原因を有さない場合があり、又は発症中の病気又はインバランスによって引き起こされる場合がある。この障害は、患者及び医療提供者の両方を困惑させる多数の心理学的な問題を引き起こし得る。時には、慢性疼痛は、心身性又は心因性の原因を有し得る。
【００２８】
疼痛は、下記に定義されるように、「侵害受容性」又は「神経障害性」としてさらに分類され得る。
【００２９】
「侵害受容性疼痛」は、体性又は内臓のいずれかの、疼痛感受性神経繊維の活性化に起因する。侵害受容性疼痛は、一般的に、直接の組織損傷に対する応答である。最初の外傷は、ブラジキニン、セロトニン、サブスタンスＰ、ヒスタミン、及びプロスタグランジンを含む、いくつかの化学物質の放出を典型的に引き起こす。体性神経が関与する場合、疼痛は、うずく又は圧迫様の感覚として典型的に経験される。
【００３０】
侵害受容性疼痛は、非オピオイド鎮痛薬を投与することによって伝統的に管理されてきた。これらの鎮痛薬としては、特に、アセチルサリチル酸、コリンマグネシウムトリサリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ジフルシナル（diflusinal）、及びナプロキセンが挙げられる。オピオイド鎮痛薬、例えば、モルヒネ、ヒドロモルホン、メタドン、レボルファノール、フェンタニル、オキシコドン及びオキシモルホンもまた使用され得る。
【００３１】
用語「神経障害性疼痛」は、中枢又は末梢神経系の損傷又は疾患に起因する疼痛を指す（McQuay, Acta Anaesthesiol. Scand. 1997; 41(1 Pt 2): 175-83；Portenoy, J. Clin.
Oncol. 1992; 10:1830-2）。組織損傷によって引き起こされる直接の疼痛とは対照的に、神経障害性疼痛は、外傷性障害の数日又は数ヶ月後に発症し得る。さらに、組織損傷によって引き起こされる疼痛は、通常、組織修復の期間へ持続時間が限定される一方、神経障害性疼痛は、しばしば、長期的又は慢性的である。さらに、神経障害性疼痛は、自発的に、又は通常は痛くない刺激の結果として、生じ得る。神経障害性疼痛は、自発痛、痛覚過敏（即ち、刺激が正当化するよりも多い疼痛の感覚）、及び異痛（即ち、通常は無痛の刺激が疼痛の経験を誘発する状態）を含む、慢性感覚障害と関連する。ヒトにおいて、一般的な症状としては、冷痛覚過敏及び機械的異痛が挙げられる。熱に対する感受性は、めったに報告されない。このような疼痛を説明するためにしばしば使用される記述語としては、「電撃（痛）」、「灼熱」、又は「電気的」が挙げられる。神経障害性疼痛症候群の例としては、糖尿病性神経障害、多発性硬化症、又はヘルペス後神経痛（帯状ヘルペス）などの、疾患進行に起因するもの；切断（幻肢痛）、又は事故で負った損傷（例えば、裂離）などの、損傷によって開始されるもの；並びに、慢性アルコール中毒症、ウイルス感染症、甲状腺機能低下症、尿毒症、又はビタミン欠乏症からなどの、神経損傷によって引き起こされるものが挙げられる。外傷性神経損傷はまた、神経腫の形成を引き起こし得、ここで、疼痛が、異常な神経再生の結果として生じる。卒中（脊髄又は脳）及び脊髄損傷もまた、神経障害性疼痛を誘発し得る。がん関連神経障害性疼痛は、隣接する神経、脳、又は脊髄の、腫瘍増殖圧迫から生じる。さらに、化学療法及び放射線療法を含む、がん治療もまた、神経損傷を引き起こし得る。
【００３２】
伝統的なアスピリン様薬又はオピオイド薬に十分には応答しない、これらの持続性神経障害性疼痛は、脊髄及び脳幹細胞による疼痛メッセージのプロセッシングにおける長期変化の発達から生じると考えられる。これらの変化の多くは、遺伝子の誘導に関連し、これらの遺伝子は、研究される必要があり、新規の鎮痛化合物を同定するためにスクリーニング方法において使用され得る、興味深い分子標的を示す。
【００３３】
本発明は、このような分子標的を研究するための手段、特に、疼痛刺激の知覚、伝達、プロセッシング、及び／又は、疼痛刺激から離れるための作用反応の誘発に関与するタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の核酸分子にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを含む核酸アレイを提供する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「アレイ」は、未知のものを同定する自動化プロセス及び既知及び未知のDNAサンプルをマッチングさせるための媒体を提供するプローブの規則的なアレンジメントを指す。それとしては、当技術分野において公知のアレイ、例えば、DNAチップ、DNAマイクロアレイ及びDNAマクロアレイなどが挙げられ、それは、固体支持体及び固体支持体の表面へ付着された複数のポリヌクレオチド又はそれらのフラグメントを含む。固体支持体の例としては、ガラスプレート、ナイロン膜などが挙げられる。固体支持体の表面へ付着されるポリヌクレオチド又はそれらのフラグメントは、アレイを作製するための一般的な技術を使用して固体支持体の表面へ付着され得る。即ち、例えば、ポリリジンなどのようなポリカチオンが付着されている、化学的に表面処理された固体支持体へそれらが付着される方法（Nat. Genet., 21: 15-19 (1999)）。化学的に表面処理された支持体は市販されており、本発明に従うポリヌクレオチドアレイの固体支持体として、市販の固体製品が使用され得る。
【００３５】
本発明に従うアレイは、好ましくは、表面又は基体上に固定された複数のポリヌクレオチドプローブを含む核酸アレイである。異なるポリヌクレオチドプローブは、サンプル中の異なる標的核酸分子に対して相補的であり、従って、これらにハイブリダイズし得る。従って、このようなプローブは、サンプル中の複数の異なる核酸分子の存在及び量を同時に検出するために、複数の異なる遺伝子の発現レベル、例えば、異なるmRNA分子の、又はそれらから誘導される核酸分子（例えば、cDNA）の存在及び存在量を測定するために、使用され得る。
【００３６】
典型的に、アレイは、マクロアレイ又はマイクロアレイと記載される。マクロアレイは、約300ミクロン以上のサンプルスポットサイズを含む。マイクロアレイにおけるサンプルサイズは、300ミクロン以下であるが、典型的には直径200ミクロン未満である。マイクロアレイは、データのスループット及び視覚化を容易にするために、専門のロボット工学及び／又は画像化装置を利用し得る。
【００３７】
マイクロアレイは、サンプル（例えば、関連のある細胞、組織、若しくは生物から単離されたmRNA調製物、又は対応のcDNA若しくはcRNA調製物）中の複数の異なる標的分子の存在、非存在及び量を同時に検出するために有用である。サンプル中のプローブの標的分子の存在及び量、又は非存在は、標的が表面又は基体上の特定の位置にあるプローブへ結合しているかどうか（及びどのぐらい多くの標的が結合しているか）を分析することによって容易に測定され得る。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかの、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、これらは、プリン及びピリミジン塩基、又は、他の天然の、化学的に若しくは生化学的に修飾された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、RNA又はDNAにおいて典型的に見られ得るように、糖及びリン酸基、又は修飾又は置換された糖又はリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。本発明に従う核酸分子は、好ましくは、mRNA又はcDNAである。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチドプローブ」は、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド、又は、相補的塩基対形成によって標的核酸配列とハイブリダイズすることができるこれらのポリマーの任意の修飾形態を指す。相補的塩基対形成は、例えば、ワトソン−クリック塩基対形成並びにフーグスティーン塩基対形成などの他の形態の塩基対形成を含む、配列特異的塩基対形成を意味する。修飾形態としては、2'−O−メチルオリゴリボヌクレオチド及びいわゆるPNAが挙げられ、ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されている。
【００４０】
用語「ハイブリダイズする」は、２つの一本鎖核酸間の逆平行水素結合を指し、ここで、ＡはＴ（又はRNA核酸の場合はＵ）と塩基対形成し、ＣはＧと塩基対形成する。ある核酸分子の少なくとも１つの鎖が規定のストリンジェンシー条件下で別の核酸分子の相補的塩基と水素結合を形成することができる場合、核酸分子は互いへ「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、（i）ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が行われる温度、並びに（ii）イオン強度、並びに（iii）ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄溶液のホルムアミドなどの変性剤の濃度、並びに他のパラメータによって決定される。ハイブリダイゼーションは、２つの鎖が実質的に相補的な配列を含むことを必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、ある程度のミスマッチが許容され得る。Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch. 7を参照のこと。
【００４１】
用語「Ｇタンパク質共役型受容体151」又は「GPR151」は、本発明の文脈において、GPRファミリーのメンバーを指す。それは、NCBIポリヌクレオチド配列リファレンスNM_194251で文献において既に公知である。GPR151は、任意の脊椎動物、特に、哺乳動物種（例えば、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ科の動物、ウサギ、ニワトリ、類人猿、ヒトなど）に由来し得る。GPR151は、このような脊椎動物生物の組織プローブから単離され得、又は、GPR151タンパク質を発現することができる組換え生物学的材料によって製造され得る。前記用語は、天然ポリペプチド、多型変異体、突然変異体、及び種間ホモログを指し得る。
【００４２】
本発明に従う好ましい神経細胞は、後根神経節細胞、脊髄細胞（spinal chord cell）及び視床細胞である。本発明に従う方法において使用される好ましい細胞は、MDCK、HEK 293、HEK 293 T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3及びCHOである。細胞は、通常、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター細胞などである。
【００４３】
「アンチセンス」オリゴヌクレオチド分子は、DNA、RNA、DNA−RNAキメラ、又はその誘導体であり得る一本鎖核酸分子であり、これは、生理学的条件下で関心対象のRNA又はDNA分子中の相補的塩基とハイブリダイズすると、例えば、mRNA転写、mRNAスプライシング、mRNA輸送、又はmRNA翻訳を阻害することによって又はmRNA安定性を低下させることによって、対応の遺伝子の発現を阻害する。現在使用されるように、「アンチセンス」は、RNA−RNA相互作用、RNA−DNA相互作用、及びRNase−H仲介停止を広く含む。アンチセンス核酸分子は、細胞中における発現についての組換え遺伝子によってコードされ得（例えば、米国特許第5,814,500号及び第5,811,234号を参照のこと）、又はそれらは、合成によって作製され得る（例えば、米国特許第5,780,607号を参照のこと）。
【００４４】
用語「リボザイム」は、RNA基質を切断することができる触媒性RNA分子を指すために使用される。リボザイム特異性は、相補的なRNA−RNA相互作用に依存する（概観については、Cech and Bass,Annu. Rev. Biochem. 1986; 55: 599-629を参照のこと）。２つのタイプのリボザイム、ハンマーヘッド型及びヘアピン型が記載された。各々は、構造的に異なる触媒中心を有する。リボザイム技術は、Intracellular Ribozyme Applications: Principals and Protocols, Rossi and Couture ed., Horizon Scientific Press, 1999においてさらに説明されている。
【００４５】
用語「干渉RNA」は、相同性依存様式で関心対象の特定の遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNA（dsRNA）の能力を指す。RNA干渉は、分解についてmRNA分子を標的化することによって転写後に作用すると現在考えられている。RNA干渉は、500bpよりも長いdsRNAの使用を一般的に含み；しかし、それはまた、長さが10個以上のヌクレオチドであり得、典型的に長さが18個以上のヌクレオチドである、低分子干渉RNA（siRNA）又は低分子ヘアピン型RNA（shRNA）によって媒介され得る。概観については、Bosner and Labouesse, Nature Cell Biol. 2000; 2: E31-E36及びSharp and Zamore, Science 2000; 287: 2431-2433を参照のこと。
【００４６】
用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、具体的には、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEなどの任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、並びに抗体フラグメントを包含する。特定の抗原と反応性の抗体は、ファージ又は同様のベクター中における組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え法によって、又は、抗原又は抗原コーディング核酸での動物の免疫化によって、作製され得る。
【００４７】
用語「対象」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウス若しくはラット、ブタ、霊長類、イヌ又はネコなど）を指す。特に、前記用語はヒトを指す。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子組換えされた動物」は、外因性の遺伝物質が導入されているか及び／又は内因性の遺伝物質が操作されている、ヒトに加えての全ての動物を包含する。遺伝子組換えされた動物の例としては、非限定的に以下が挙げられる：トランスジェニック動物、例えば、内因性遺伝子が異種遺伝子又は別の種由来のオルソログ又は突然変異遺伝子で置換されている「ノックイン」動物、内因性遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されている「ノックアウト」動物、又は、突然変異遺伝子を発現するか又は野生型若しくは突然変異遺伝子を過剰発現するトランスジェニック動物（例えば、ゲノムへの標的化又はランダム組込みで）、並びに、非組込み核酸構築物（例えば、ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA、siRNA、リボザイムなど）を含む細胞を含有する動物、例えば、このような構築物の存在に起因して内因性遺伝子の発現が調節されている（例えば、増加又は減少されている）動物。
【００４９】
上記技術の概観については、例えば、Current protocols in Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplemtent 52, John Wiley and Sons, Inc.；Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press；Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000；Antisense Therapeutics, 1996；Scherr et al, 2003を参照のこと。
【００５０】
用語「GPR151モジュレータ」は、GPR151受容体の調節分子、特に、阻害又は活性化分子（「インヒビター」又は「アクチベータ」）、特に、本発明の方法に従って同定可能なGPR151受容体のインヒビターを意味する。
【００５１】
インヒビターは、一般的に、例えば、結合し、部分的に若しくは完全に活性をブロックし、減少させ、防止し、活性化を遅延させ、不活性化し、敏感性を減じ、又はGPR151受容体の活性又は発現をダウンレギュレートする化合物である。アクチベータは、一般的に、例えば、増加させ、開始し、活性化し、促進し、活性化を増強し、感作し、アゴナイズし、又はGPR151受容体の活性又は発現をアップレギュレートする化合物である。このようなモジュレータとしては、天然又は合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、有機低分子などが挙げられる。
【００５２】
「テスト化合物」は、遺伝子又は遺伝子産物のモジュレータとして作用するその能力についてテストされ得る分子である。テスト化合物は、非限定的に、無機低分子及び有機低分子（即ち、分子量が約２kD未満、より好ましくは約１kD未満の分子）、ポリペプチド（天然リガンド、抗体、抗体フラグメント、及び他の免疫特異的分子を含む）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド分子、並びにそれらの誘導体から選択され得る。
【００５３】
本発明の文脈において、用語「治療する」は、疼痛の知覚を軽減又は緩和する手段を指す。それは、所定の刺激（例えば、圧力、組織損傷、低温など）に応答して対象によって経験される疼痛（例えば、灼熱感、刺痛、電気ショック様感覚など）の強度及び／又は持続を軽減又は緩和することを意味し得る。疼痛状態に苦しむか又は本発明に従って治療され得る別の状態の１つ又はそれ以上の症状を有する対象（例えば、ヒト又はペット）において、又は、疼痛の動物モデル、例えば、本明細書に記載される神経障害性疼痛のSNI（神経枝結紮損傷（spared nerve injury））ラットモデルにおいて、又は任意の他の疼痛の動物モデルにおいて、治療が行われ得る。
【００５４】
用語「薬学的組成物」は、治療有効量の上述されるようなGPR151モジュレータと、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体若しくは補助物質とを含む組成物を指す。薬学的組成物は、任意の従来の方法で、全身又は局所投与され得る。これは、例えば、経口投薬形態、例えば、錠剤又はカプセル剤によって、皮膚の下に移植されたデポー（dispository）の形態で、粘膜、例えば、鼻腔又は口腔によって、本発明に従う医薬を含有する注射剤、注入剤又はゲルによってであり得る。適切な場合、リポソーム複合体の形態で、上述の特定の疾患を治療するために、薬学的組成物を局所又は局部投与することが、さらに可能である。
【００５５】
薬学的組成物はまた、注射液又は注入剤の形態で投与され得る。注射液は、液剤又は懸濁剤が比較的少量だけ、例えば、約１〜約20mlが身体へ投与される場合に、一般的に使用される。注入液は、より多い量の液剤又は懸濁剤、例えば、１リットル以上が投与される場合に、一般的に使用される。しかし、比較的多量の投与の場合、本発明に従う製剤は、少なくともほぼ等張の溶液が得られる程度まで、投与前に、簡単に希釈されるべきである。等張液の例は、0.9％強度の塩化ナトリウム溶液である。注入剤の場合、希釈は、例えば、滅菌水を使用して行われ得、投与は、例えば、いわゆるバイパスによって行われ得る。
【００５６】
以下の図面及び実施例により、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ヒトGPR151の正常組織分布（TaqManデータ）。
【実施例】
【００５８】
実施例
トータルRNA単離：
DRGからのトータルRNAを、製造業者の指示に従ってPicoPure RNA単離キット（Arcturus）で単離した。RNAの品質を、2100 Bioanalyzer及びRNA 6000 Nano LabChipキット（Agilent）を使用して評価した。
【００５９】
Affymetrix GeneChipTMマイクロアレイ：
一本鎖cDNA合成を、製造業者の指示に従って、Baugh, L.R, Hill, A.A., Brown, E.L. and Hunter, C.P. (2001) Nucleic Acids Res. 29, e29に従う100pM T7-(dT)24オリゴマー（GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT24）及びSuperScript II逆転写酵素と共にトータルRNA 500ngを使用して、行った。二本鎖cDNAを合成し、次いで、フェノール−クロロホルムを使用して抽出し、続いてエタノール沈殿工程を行った。インビトロ転写反応を、製造業者の指示に従ってBioArray High Yield RNA Transcription Labelingキット（Enzo）を使用して、二本鎖cDNAサンプルを用いて行った。転写反応を37℃で16時間インキュベートした。cRNAを、RNAクリーンアップのためにRNeasy Miniキット（Qiagen）プロトコルを使用して精製し、分光光度計によって定量した。ビオチン標識したcRNAを、RNA断片化緩衝液（200mM Tris-酢酸, 500mM KOAc, 150mM MgOAc, pH 8.1）を使用して断片化した。マウスMG430 2.0 GeneChipsTM（Affymetrix）のハイブリダイゼーション及び染色を、製造業者の指示に従って行った。マイクロアレイを、GeneChip 3000スキャナーを使用してスキャンし、スキャンしたデータを、Resolver v5.1発現データ分析ソフトウェア（Rosetta Biosoftware）を使用してインポート及び分析した。
【００６０】
外科的神経病変及び偽手術手技：
麻酔下のマウスにおいて、左坐骨神経を、その三分枝で露出させ、２つの主要な側枝（脛骨神経及び総腓骨神経）を結紮し、結紮に対して遠位で横切開した。偽手術を同様にし、神経を露出させたが、結紮及び横切開をしなかった（Bourquin et al. 2006を参照のこと）。
【００６１】
足引込み閾値の測定：
足引込み閾値（PWT）を、ダイナミック・プランター・エステシオメータ（dynamic plantar aesthesiometer）を使用して評価した（Szabo et al. 2005を参照のこと）。金属メッシュ床を備えるコンパートメント中において順化させた後、刺激装置を動物の後肢の下に配置し、動電アクチュエータによって駆動される直線状の金属フィラメントを足蹠に接触させ、動物が足を取り除くまで力を漸増させた（足引込み閾値、PWT）。PWTを、同側の手術側の後肢及び反対側の後肢について評価した。
【００６２】
TaqMan分析：
Applera Ltd.（Norwalk, CT, USA）逆転写酵素キット（N8080234）及びRNaseインヒビター（N8080119）を使用して、cDNA合成を行った。総体積22μL（最終cDNA濃度：４ng／μl）で、10XRT緩衝液2.2μL、MgCl2  4.84μL（25mM）、dNTP 4.4μL（10mM）、ランダムヘキサマー1.1μL（50μM）、oligo(dT)16  1.1μL（50μM）、RNase インヒビター0.44μL（20U／μL）、Multiscribe 0.55μL（50U／μL）を使用して、ヒトRNAサンプル90ngから、cDNA合成を行った。サンプルを25℃で10分間、42℃で60分間インキュベートした。95℃に５分間加熱することによって、反応を停止させた。Applera TaqMan Universal PCR Master Mix (4305719)及びTaqMan Human GAPDH Control Reagentsを使用して、TaqMan反応を行った。ヒトGPR151特異的オリゴヌクレオチドは、Operon Biotechnologies GmbH (Koln, Germany)によって合成された。PCRを、以下のPCR条件下でABI Prism 7900（Applera）を使用して行った：50℃で２分、95℃で10分、95℃で15秒及び60℃で１分を40サイクル。総反応体積25μl中、標的プローブ0.125μL（50μM）、標的フォワードプライマー0.45μL（50μM）、標的リバースプライマー0.45μL（50μM）、TaqMan ２×PCR Master Mix  12.5μL、各々のプライマー及びプローブ0.25μL（TaqMan Human GAPDH Control Reagents）、2.5μL又は1.25μl cDNAサンプルを使用して、マルチプレックスPCRとして、PCRを設定した。
【００６３】
参考文献：
Bourquin AF et al (2006) Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain 122:e1-14. Epub 2006
【００６４】
結果：
神経障害性疼痛によるマウスにおけるGPR151 mRNA発現の強力な誘導
神経障害性疼痛を、SNI（神経枝結紮損傷（spared nerve injury））手術によってC57／B6株のマウスにおいて誘発し、足引込み閾値の定量によって、SNI手術の２日及び４日後に、表現型で確認した。SNI手術の４日後に、動物を犠牲にし、単一動物から脊髄並びにL4及びL5後根神経節を調製した。特定の動物由来のL4及びL5後根神経節をプールした後、該プールした後根神経節から又は脊髄サンプルから、トータルRNAを抽出した。RNA 500ngを増幅し、マウスの全ゲノムを示すAffymetrix製のMG430 2.0 GeneChipTMマイクロアレイ上にハイブリダイズさせた。マイクロアレイを洗浄し、染色し、スキャンした。遺伝子発現強度を標準化し、Resolverソフトウェアバージョン5.1によって分析した。表の数値は、各15匹の動物の平均発現強度を示す。神経障害性疼痛がSNI手術によってそれぞれの動物において誘発された場合にのみ、GPR151の平均発現レベルは、L4／L5 後根神経節において、12,80から1133へ増加する（表１）。
【００６５】
表１は、SNI手術による神経障害性疼痛の誘発後の、プールされたL4／L5後根神経節中におけるマウスGPR151の強力な転写誘導を示している（マウス株C57／B6；GeneChipTM MG430 2.0上のGPR151を示すプローブセット1457555_at）。
【表１】
2011523846.tif 000003
【００６６】
ヒト正常組織中におけるGPR151の分布
ヒトGPR151特異的プライマー及びプローブを使用して、TaqManアッセイによって、GPR151 mRNAの発現について、ヒト正常組織由来のRNAサンプルを分析した。最高レベルのGPR151発現は、視床から得られる（図１）。視床は、脳における疼痛伝達及びプロセッシングに関連することが公知である（Herero et al.; Childs Nerv Syst. 18 (2002), 386-404）。これは、疼痛プロセッシングのメディエーター及び調節因子としてのGPR151の重要な役割を示唆している。
【図１】
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【配列表】
2011523846000001.app
【国際調査報告】
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2011523846.tif 000007
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