(57)【要約】  例えば、リパーゼおよびラクターゼを用いて、食品を製造し、食品の風味を改良する酵素的方法、ならびに、関連する酵素組成物および食品を記載する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質およびラクトースを含む食品組成物と、１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼとを接触させることを含み、この１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つが、ガラクトース転移活性を示す、食品を調製する方法。
【請求項２】
前記１種以上のリパーゼのうち、少なくとも１つが、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、短鎖脂肪酸を優先的に加水分解する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラクトースを食品組成物に加えることをさらに含む、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
酵素不活性化工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも、遊離長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率が高い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりもチーズ風味が強い、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも石鹸臭が少ない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記食品が、酵素によって改良されたチーズおよびナチュラルチーズから選択されるチーズ製品である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記食品が末端食用品である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記食品が食品添加剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リパーゼが、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リパーゼが、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラクターゼが、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リパーゼが、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３を含み、前記ラクターゼが、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リパーゼが、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３を含み、前記ラクターゼが、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リパーゼが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ペニシリウム・カメンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ペニシリウム・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３からなる群より選択されるリパーゼを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リパーゼが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ペニシリウム・カメンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ペニシリウム・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３からなる群より選択されるリパーゼを含み、前記ラクターゼが、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって調製される食品。
【請求項１９】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも、遊離長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率が高い、請求項１８に記載の食品。
【請求項２０】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりもチーズ風味が強い、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２１】
前記食品が、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも石鹸臭が少ない、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２２】
前記食品が、酵素によって改良されたチーズおよびナチュラルチーズから選択されるチーズ製品である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２３】
前記食品が末端食用品である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２４】
前記食品が食品添加剤である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２５】
１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼを含む酵素組成物であって、この１種以上のリパーゼのうち、少なくとも１つが、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、短鎖脂肪酸を優先的に加水分解し、この１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つが、ガラクトース転移活性を示す、酵素組成物。
【請求項２６】
バッファーをさらに含む、請求項２５に記載の酵素組成物。
【請求項２７】
ラクトースをさらに含む、請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
例えば、リパーゼおよびラクターゼを用いて、食品を製造し、食品の風味を改良する酵素的方法、ならびに、関連する酵素組成物および食品を記載する。
【背景技術】
【０００２】
飲食物の風味、質感、香りを改良するために、酵素を使用することができる。食品産業で酵素を用いる一例は、チーズ製造でみられる。チーズ製造業者は、チーズを製造し、風味を高めるために酵素を使用する。例えば、レンネットという酵素（プロテアーゼ）は、乳をカードやホエイに変える。他の酵素は、風味が乏しいチーズカードを、異なる風味をもつチーズに変える。ほとんどのナチュラルチーズの風味は、チーズに天然で存在する微生物叢によって作られる酵素によるものであるが、酵素によって改良されたチーズ（ＥＭＣ）の風味は、製造プロセス中に添加された酵素によるものである。
【０００３】
ＥＭＣは、望ましい風味を付与するために、酵素（例えば、リパーゼおよび／またはプロテアーゼ）を未成熟チーズに添加することによって作られたプロセスチーズの一種である。ＥＭＣは、典型的には、若い（未成熟）チーズ（例えば、マイルドなチーズカード）に、望ましいチーズ風味がつくように、酵素を短時間（例えば、約２４時間）加えて作られる。ＥＭＣの風味は、ナチュラルチーズの１０倍も強いことがあり、主に、ＥＭＣを製造するのに使用される酵素反応に依存する。商業的には、ＥＭＣは、プロセスチーズ製品として使用されるか、または、他の食品（例えば、スナック菓子、スープなど）にチーズ風味をつけることができる粉末として使用される。
【０００４】
ＥＭＣは、一般的に、リパーゼを用いて製造される。リパーゼは、チーズに存在する脂質を分解し、脂肪酸を放出し、これが風味を付与する。例えば、高濃度の酪酸が放出されると、「ブルーチーズ」様の風味がチーズにつく。異なるリパーゼは、異なる風味をもたらす異なる脂肪酸プロフィールを有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、望ましい風味をもつＥＭＣを製造するための酵素的方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一部の実施形態によれば、脂質およびラクトースを含む食品組成物と、１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼとを接触させることを含み、この１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つが、ガラクトース転移活性を示す、食品を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、１種以上のリパーゼのうち、少なくとも１つは、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、短鎖脂肪酸を優先的に加水分解する。一部の実施形態では、この方法は、ラクトースを食品組成物に加えることをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、酵素不活性化工程をさらに含む。
【０００７】
一部の実施形態では、リパーゼは、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、ペニシリウム・カメンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３、および／またはペニシリン・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼＥＣ３．１．１．３を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ラクターゼは、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、本食品は、１つ以上のラクターゼでは処理されずに１つ以上のリパーゼで処理された比較品よりも、遊離長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率が高い。一部の実施形態では、本食品は、１つ以上のラクターゼでは処理されずに１つ以上のリパーゼで処理された比較品よりもチーズ風味が強い。一部の実施形態では、本食品は、１つ以上のラクターゼでは処理されずに１つ以上のリパーゼで処理された比較品よりも石鹸臭が少ない。
【００１０】
一部の実施形態では、本食品は、酵素によって改良されたチーズおよびナチュラルチーズから選択されるチーズ製品である。一部の実施形態では、本食品は、末端食用品（food final product）である。一部の実施形態では、本食品は、食品添加剤である。
【００１１】
他の実施形態によれば、脂質およびラクトースを含む食品組成物と、１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼとを接触させることを含む方法によって調製される食品が提供され、ここで、１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つは、ガラクトース転移活性を示す。一部の実施形態では、本食品は、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも、遊離長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率が高い。一部の実施形態では、本食品は、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりもチーズ風味が強い。一部の実施形態では、本食品は、１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも石鹸臭が少ない。
【００１２】
一部の実施形態では、本食品は、酵素によって改良されたチーズおよびナチュラルチーズから選択されるチーズ製品である。一部の実施形態では、本食品は、末端食用品である。一部の実施形態では、本食品は、食品添加剤である。
【００１３】
他の実施形態によれば、１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼを含む酵素組成物が提供され、この１種以上のリパーゼのうち、少なくとも１つが、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、短鎖脂肪酸を優先的に加水分解し、この１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つが、ガラクトース転移活性を示す。一部の実施形態では、酵素組成物は、バッファーをさらに含む。一部の実施形態では、酵素組成物は、ラクトースをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、リパーゼＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）（ＣＭ）による、脂質からの遊離脂肪酸の除去を示す。
【図２】図２は、リパーゼＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）（ＣＭ）による、脂質からの遊離脂肪酸の除去と、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）による、グリセロール部分での脂質へのガラクトース転移を示す。
【図３】図３は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）のみによって、またはＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）およびＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）によって処理した後の、サンプルの遊離脂肪酸組成を示す。
【図４】図４は、異なる温度条件での、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の相対的リパーゼ活性を示すグラフである。反応はｐＨ６．０で行った。
【図５】図５は、異なるｐＨ条件で、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の相対的リパーゼ活性を示すグラフである。反応は３７℃で行った。
【図６】図６は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の熱安定性を示すグラフである。酵素溶液を、示した温度で、ｐＨ６．０で３０分間インキュベートした。
【図７】図７は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）のｐＨ安定性を示すグラフである。酵素溶液を、示したｐＨで、２５℃で６０分間インキュベートした。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、リパーゼＭの種々の特性を示すグラフである。図８Ａは、種々のｐＨ条件でのリパーゼＭの相対的リパーゼ活性を示す。図８Ｂは、種々の温度でのリパーゼＭの相対的リパーゼ活性を示す。図８Ｃは、リパーゼＭのｐＨ安定性を示す。酵素溶液を、示したｐＨで、３７℃で６０分間インキュベートした。図８Ｄは、リパーゼＭの熱安定性を示す。酵素溶液を、示した温度で、６０分間インキュベートした。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、リパーゼＡ１２の種々の特性を示すグラフである。図９Ａは、種々のｐＨ条件でのリパーゼＡ１２の相対的リパーゼ活性を示す。図９Ｂは、種々の温度でのリパーゼＡ１２の相対的活性を示す。図９Ｃは、リパーゼＡ１２のｐＨ安定性を示す。酵素溶液を、示したｐＨで、６０分間インキュベートした。図９Ｄは、リパーゼＡ１２の熱安定性を示す。酵素溶液を、示した温度で、６０分間インキュベートした。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、リパーゼＤＦ１５の種々の特性を示すグラフである。図１０Ａは、種々のｐＨ条件でのリパーゼＤＦ１５の相対的リパーゼ活性を示す。図１０Ｂは、リパーゼＤＦ１５のｐＨ安定性を示す。酵素溶液を、示したｐＨで、３７℃で２時間インキュベートした。図１０Ｃは、種々の温度でのリパーゼＤＦ１５の相対的リパーゼ活性を示す。図１０Ｄは、リパーゼＤＦ１５の熱安定性を示す。酵素溶液を、示した温度で、ｐＨ７で、３０分間インキュベートした。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、リパーゼＲの種々の特性を示すグラフである。図１１Ａは、２種類の異なるバッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ（クエン酸／リン酸）バッファー、下側の線、菱形；リン酸バッファー、上側の線、四角形）中、種々のｐＨ条件でのリパーゼＲの相対的活性を示す。図１１Ｂは、種々の温度でのリパーゼＲの相対的リパーゼ活性を示す。図１１Ｃは、２種類の異なるバッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー、下側の線、菱形；リン酸バッファー、上側の線、三角形）中でのリパーゼＲのｐＨ安定性を示す。１％酵素溶液を、示したｐＨで、３０℃で１５分間インキュベートした。図１１Ｄは、リパーゼＲの熱安定性を示す。１％酵素溶液を、示した温度で、ｐＨ７．０で１５分間インキュベートした。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、リパーゼＧ５０の種々の特性を示すグラフである。図１２Ａは、種々のｐＨ条件でのリパーゼＧ５０の相対的リパーゼ活性を示す。図１２Ｂは、種々の温度でのリパーゼＧ５０の相対的リパーゼ活性を示す。図１２Ｃは、リパーゼＧ５０のｐＨ安定性を示す。図１２Ｄは、リパーゼＧ５０の熱安定性を示す。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の種々のの特性を示すグラフである。図１３Ａは、種々の温度、ｐＨ６．０、反応時間１０分で、０．１Ｍ酢酸バッファー中のラクトース基質に対するＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の相対的ラクターゼ活性を示す。図１３Ｂは、種々のｐＨ条件、４０℃、反応時間１０分で、Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー中のラクトース基質に対するＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の相対的ラクターゼ活性を示す。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の種々の特性を示すグラフである。図１３Ｃは、ｐＨ６．０、以下の温度（上から下に）：５０℃、５５℃、６０℃、６５℃で、０．１Ｍ酢酸バッファー中のＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の温度安定性を示す。図１３Ｄは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のｐＨ安定性を示す。反応物を、Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー中、３０℃で６０分間インキュベートした。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｃは、ラクトース溶液中、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の種々の特性を示すグラフである。図１４Ａは、５％（点線）および５０％（実線）のラクトース溶液中での、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の温度安定性を示す。ｐＨ６．０で６０分間反応を行った。図１４Ｂは、５％ラクトース溶液中、種々のＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）調製物によって放出されるグルコースの割合を示す。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）調製物は、以下の活性を有している（上から下に）：１５ＬＵ／ｇラクトース、１０ＬＵ／ｇラクトース、５ＬＵ／ｇラクトース、２．５ＬＵ／ｇラクトース、および１．２５ＬＵ／ｇラクトース。ｐＨ６．０で６０分間反応を行った。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｃは、ラクトース溶液中、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の種々の特性を示すグラフである。図１４Ｃは、５５％ラクトース基質に対する、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）によるガラクトオリゴ糖の合成を示す。ｐＨ６．０で６０分間反応を行った。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
例えば、リパーゼおよびラクターゼを用いて、食品を製造し、食品の風味を改良する酵素的方法、ならびに、関連する酵素組成物および食品を記載する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、他の意味であると述べられていない限り、単数形である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」は、複数のものも含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「短鎖脂肪酸」は、４〜６個の炭素を含む脂肪酸を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「長鎖脂肪酸」は、１４〜１８個またはそれ以上の炭素を含む脂肪酸を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「中鎖脂肪酸」は、８〜１２個の脂肪酸を含む脂肪酸を意味する。
【００２０】
用語「食物」および「食品」は、本明細書で使用される場合、任意の食物または食品（飲料および飲料品を含む）を包含し、末端食用品（例えば、消費に適しているか、または消費のために販売されているもの）、１つ以上のさらなる食品成分を含む半加工品および完全に加工した製品、他の食品の添加剤として使用される製品を指す。特定の実施形態によれば、本明細書で記載する食物および食品は、ＥＭＣのような乳製品を含む。
【００２１】
本明細書で記載する酵素的方法は、例えば、リパーゼおよびラクターゼを用いて、食品を製造する方法、および食物の風味（例えば、ＥＭＣの風味）を改良する方法を提供する。例えば、リパーゼおよびラクターゼを含む、関連する酵素組成物、および、ここに記載する方法によって製造される食品も提供する。
【００２２】
Ｉ．方法
上述のように、ＥＭＣは、一般的に、リパーゼを用いて製造され、リパーゼは、チーズに存在する脂質（トリグリセリドを含む）を分解し、脂肪酸を放出し、これが風味を付与する。チーズの遊離脂肪酸プロフィール（遊離脂肪酸の量および種類）は、チーズの風味に影響を与え、使用される特定の酵素によって変わる。酪酸（４個の炭素原子を有する短鎖脂肪酸、Ｃ４）は、典型的には、強いチーズ風味を与えるため、チーズ製品にとって望ましい脂肪酸である。動物のリパーゼ（例えば、ウシまたは子ウシに由来する前胃酵素（ＰＧＥ））は、優先的に酪酸を放出し、チーズを製造する際に使用されてきた。しかし、ヒト（または他の動物）が消費するための食物の製造において、動物に由来する酵素を使用することに関わる健康上の懸念（例えば、動物のウイルスまたはプリオンによって汚染されるリスク）があり、ＰＧＥをあまり使用しないことが望ましい。リパーゼの供給源となる微生物が存在するが、今日までに同定されている典型的な微生物のリパーゼは、パルミチン酸（１６個の炭素原子を有する、Ｃ１６）、ステアリン酸（１８個の炭素原子を有する、Ｃ１８）のような長鎖脂肪酸を放出する。このような長鎖脂肪酸は、石鹸臭を付与してしまうので、典型的には望ましくない。
【００２３】
本明細書に記載する酵素的方法は、食品（例えば、ＥＭＣ）に望ましい風味を付与するリパーゼおよびラクターゼを使用する。典型的なリパーゼが、チーズに存在する典型的なトリグリセリド（脂質）に作用する場合、トリグリセリドの末端短鎖（Ｃ４）脂肪酸が最初に放出され、次いで、末端長鎖脂肪酸が放出され、中央にある脂肪酸は、多くは放出されない。この反応を図１に示す。ラクターゼをリパーゼと組み合わせて用いることによって、長鎖脂肪酸の放出を減らすか、または完全になくしつつ、短鎖（Ｃ４）脂肪酸を放出させることができることを発見した。
【００２４】
ラクターゼは、ラクトースをその成分である糖（グルコースおよびガラクトース）に加水分解する。また、ほとんどのラクターゼは、ガラクトース部分を別のラクトース分子に転移させ、オリゴ糖を構築する第２の活性も有する。任意の理論によって束縛されることを望まないが、本明細書に記載されるようなラクターゼを用いると、食品に存在する（または、食品に加えられてもよい）ラクトースから、ガラクトース部分が、トリグリセリドの短鎖脂肪酸が放出された部位に転移すると考えられる。また、任意の理論によって束縛されることを望まないが、得られた分子は、リパーゼによって認識されず、そのため、それ以外の方法では長鎖脂肪酸を放出すると思われるさらなる加水分解に、耐性を示すと考えられる。この反応スキームを図２に示す。
【００２５】
任意の理論によって束縛されることを望まないが、本明細書に記載される酵素的方法は、以下のとおりに進むと考えられる。
【００２６】
リパーゼを、脂質およびラクトースを含む食品組成物（例えば、若いチーズ、チーズカード、またはＥＭＣベース）に加え、リパーゼは、脂質から短鎖（例えば、Ｃ４）脂肪酸を優先的に放出し、望ましいチーズ風味を作り出し、脂肪酸が放出した脂質上に遊離ヒドロキシル基が残る。
【００２７】
ラクターゼを食品組成物に加え、ラクターゼは、ガラクトース部分（組成物中に存在するラクトースおよび／または組成物に加えられるラクトースに由来する）が、脂質の遊離ヒドロキシル位置に転移し、リパーゼによるさらなる加水分解に耐性を示す分子が得られる。
【００２８】
一部の実施形態では、ガラクトース転移反応を促進するために、ラクトースを食品組成物に加える。例えば、ラクトースは、反応バッファー中に存在していてもよい。
【００２９】
上述のように、この反応を図２に示す。また、上述のように、本発明は、いかなる様式でも、この機構に限定されない。
【００３０】
実際に、酵素（および、場合によりラクトース）を、食品組成物に同時または逐次加えてもよい。一部の実施形態では、酵素を実質的に同時に加える。他の実施形態では、酵素を、食品組成物に加えられる１つの組成物で提供する。
【００３１】
酵素（および、場合によりラクトース）を、任意の手段によって、例えば、酵素と食品組成物を混合またはブレンドすることによって、または、酵素を食品組成物に噴霧することによって食品組成物に加えてもよい。
【００３２】
一部の実施形態では、１つ以上のリパーゼおよび／または１つ以上のラクターゼを使用する。２種類以上のリパーゼおよび／または２種類以上のラクターゼを使用すると、風味をさらに制御することができるか、または製造プロセス（例えば、反応条件または反応時間）をさらに制御することができる。したがって、望ましい酵素活性プロフィール（例えば、望ましいリパーゼ活性（遊離脂肪酸プロフィールを含む）、望ましいラクターゼ活性、および／または望ましいラクターゼの第２の活性）を達成するために、例えば、異なるリパーゼおよび／または異なるラクターゼを組み合わせて用いることができる。
【００３３】
一部の実施形態では、１つ以上の酵素の量は、風味をさらに制御するか、または製造プロセスをさらに制御することが可能なように選択される。例えば、リパーゼの量および／または２種類以上のリパーゼの比率を、望ましい風味を達成するように選択してもよい。これに加えて、またはこの代わりに、ラクターゼの量および／または２種類以上のラクターゼの比率を、望ましい風味を達成するように選択してもよい。実際に、リパーゼおよびラクターゼの種類および量の選択は、遊離脂肪酸プロフィールに影響を与える場合があり、したがって、風味に影響を与える場合がある。
【００３４】
使用する酵素の量は、任意の既知の手段、例えば、モル数またはモル比（例えば、酵素のナノモル数またはマイクロモル数）、重量または重量比（酵素のマイクログラム数またはナノグラム数）、または活性の量または活性比（例えば、酵素の「ユニット」数、または酵素活性／酵素の重量またはモル数）によってあらわすことができる。リパーゼ活性およびラクターゼ活性を決定する標準的な方法は、当該技術分野で知られている。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、ラクターゼでは処理されずにリパーゼで処理された同じ食品の比較サンプルよりも、食品中の長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率を増やすのに十分な量の酵素を使用する。
【００３６】
一部の実施形態では、本方法は、食品の風味を高めるのに十分な量の酵素を使用する。上述のように、使用すべき実際の酵素量は、食品の性質、望ましい風味、酵素の濃度または活性によって変わるであろう。風味とは、限定されないが、製品に特徴的な味および香りを含むと理解されるべきである。高められた風味は、従来の手段によって、例えば、専門的な味を検査する人、または専門的ではない味を検査する人によって評価することができる。上述のように、一部の実施形態では、本方法は、チーズ風味が高められ、および／または石鹸臭が少ない食品を提供する。
【００３７】
一部の実施形態では、本方法は、酵素を不活性化する不活性化工程も含む。例えば、本方法は、酵素で処理した食品組成物を、組成物中に存在する酵素（または酵素活性）の１つ以上を不活性化するのに十分な時間と温度で加熱することを含む熱不活性化工程を含んでいてもよい。不活性化に適した温度および時間は、当業者なら簡単に決定することができる。例示的な温度は、約７０℃〜約９０℃の範囲である。例示的な時間は、約５〜約６０分の範囲であり、約５〜約３０分を含む。一部の実施形態では、不活性化工程は、ＥＭＣ製品に関する技術分野で従来からある技術のような低温殺菌プロセスを含む。一部の実施形態では、不活性化工程は、食品の品質を悪化させることなく、酵素活性を下げるか、または失わせるように選択される。しかし、本明細書に記載する方法の１つの有益な態様は、他の方法では、望ましくない石鹸臭が発生し、長鎖脂肪酸を放出してしまうことを防ぐための酵素不活性化工程を必要としないことである。したがって、一部の実施形態では、本方法は、酵素不活性化工程を含まない。
【００３８】
ＩＩ．酵素
本明細書に記載する酵素的方法は、食品製造に使用するのに安全な任意の酵素を使用することができる。酵素は、任意の供給源から得ることができ、任意の供給源（動物または微生物を含む）から誘導することができる。例えば、酵素は、天然で酵素を産生する微生物、または当該技術分野でよく知られている方法を用いて、１つ以上の酵素を産生するように遺伝子改変された微生物から得ることができる。また、酵素は、当該技術分野でよく知られている方法を用いて、例えば、形質転換した細胞またはトランスフェクトした細胞からの組み換え方法によって得ることができる。例えば、望ましい酵素をコードする核酸配列を、発現ベクターに挿入し、酵素を産生するように宿主細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトするために使用することができる。多くの適切な酵素が、以下に記載するように市販されている。
【００３９】
Ａ．リパーゼ
リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）は、脂質基質（例えば、トリグリセリド）のエステル結合を加水分解するように作用する加水分解酵素の一種である。トリグリセリドは、３個の脂肪酸でエステル化されたグリセロール分子を含む（例えば、図１および図２を参照）。トリグリセリドの脂肪酸は、短鎖（例えば、４〜６個の炭素を含む）であってもよく、中鎖または長鎖（例えば、８〜１２個、またはそれ以上の炭素を含む）であってもよい。天然に存在するトリクリセリドでは、脂肪酸の鎖長が炭素１６個、１８個、２０個のものが最も一般的である。１個のトリグリセリドに存在する脂肪酸は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、乳製品中に存在するトリグリセリドは、典型的には、１個の短鎖脂肪酸（例えば、酪酸（Ｃ４））と、２個のこれより長い鎖の脂肪酸（例えば、パルミチン酸（Ｃ１６）およびステアリン酸（Ｃ１８））を含む。
【００４０】
多くの動物および微生物のリパーゼが知られており、ＥＭＣ製造を含む食品製造で使用され、これらの任意のリパーゼ、または望ましい活性を有する他のリパーゼを、本明細書に記載する方法で使用することができる。一部の実施形態によれば、リパーゼは、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、最初に短鎖脂肪酸を優先的に加水分解する。「最初に短鎖脂肪酸を優先的に加水分解する」とは、そのリパーゼが、長鎖脂肪酸を放出する前に、脂質から短鎖脂肪酸を優先的に放出することを意味し、その結果、リパーゼは、最初に短鎖脂肪酸を放出すると考えられる。図１は、トリグリセリドの短鎖脂肪酸（図の位置３）を加水分解し、その後、それより長い鎖の脂肪酸（図の位置１）を加水分解する体系的なリパーゼを示す。この望ましい優先的な活性は、長鎖脂肪酸および短鎖脂肪酸を含むトリグリセリドを含む組成物にリパーゼを加え、脂質が完全に加水分解する前に、プロセスの初期にこのリパーゼ反応を停止させ、遊離脂肪酸プロフィール（または、残った部分的に加水分解したトリグリセリド）を分析し、短鎖脂肪酸が優先的に放出されていることを確認する（例えば、反応を停止させた時点で、長鎖脂肪酸よりも多くの短鎖脂肪酸が放出されていることを確認する）ことによって、確認することができる。このような分析は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。
【００４１】
１．ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）
本明細書で記載する方法で使用可能なリパーゼの一例は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）は、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ  ＩＶ法によって評価した場合、７，５００Ｕ／ｇを下回らないリパーゼ活性を有する調製物として販売されており、１ユニットは、ｐＨ７．０で１分間に酪酸１μｍｏｌを放出する酵素の量である。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）は、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作り出される、食品グレードのリパーゼ調製物である。
【００４２】
ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）は、３８，０００の分子量を有し、等電点は６．８である。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）は、８０℃で約１５分間加熱することによって不活性化することができる。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の特徴のいくつか（温度と活性、ｐＨと活性、熱安定性およびｐＨ安定性）を図４〜図７に示す。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）は、トリグリセリドの短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸を加水分解するが、トリアシルグリセリドの１位および３位にある短鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸が優先する。ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られる他のリパーゼを、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４３】
２．リパーゼＭ
本明細書で記載する方法で使用可能な別のリパーゼの例は、リパーゼＭ「Ａｍａｎｏ」１０（以下、「リパーゼＭ」）という名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。リパーゼＭは、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作り出される、食品グレードの脂肪分解酵素調製物である。
【００４４】
リパーゼＭは、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの１位、２位、３位にある短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸を加水分解することができる。リパーゼＭは、１０，０００ユニット／グラムを下回らないリパーゼ活性で販売されている。リパーゼＭの市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リパーゼＭの特徴のいくつか（温度と活性、ｐＨと活性、熱安定性およびｐＨ安定性）を図８Ａ〜８Ｄに示す。ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られる他のリパーゼも、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４５】
３．リパーゼＡ１２
本明細書で記載する方法で使用可能な別のリパーゼの例は、リパーゼＡ「Ａｍａｎｏ」１２（以下、「リパーゼＡ１２」）という名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。リパーゼＡ１２は、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作り出される、食品グレードのトリアシルグリセロールリパーゼ調製物である。リパーゼＡ１２は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの１位、２位、３位にある短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸を加水分解することができる。リパーゼＡ１２は、３５，０００の分子量を有し、等電点は４．１０である。リパーゼＡ１２は、１２０，０００ユニット／グラムを下回らないリパーゼ活性で販売されている。リパーゼＡ１２の市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リパーゼＡ１２のさらなる特徴を図９Ａ〜９Ｄに示す。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作られる他のリパーゼも、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４６】
４．リパーゼＤＦ１５
本明細書で記載する方法で使用可能な別のリパーゼの例は、リパーゼＤＦ「Ａｍａｎｏ」１５−Ｋ（以下、「リパーゼＤＦ１５」）という名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。リパーゼＤＦ１５は、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作り出される。この食品グレードのリパーゼ製品は、グリセリドの１位および３位に対する位置特異性を有し、トリグリセリドの１（α）位および３（γ）位のエステル結合を加水分解する。リパーゼＤＦ１５は、長鎖および中鎖を有する脂肪酸に比較的特異的である。リパーゼ活性（ｐＨ７で、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ  Ｖ法による）は、１５０，０００ユニット／グラムを下回らない。リパーゼＤＦ１５の市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リパーゼＤＦ１５のさらなる特徴を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られる他のリパーゼも、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４７】
５．リパーゼＲ
本明細書で記載する方法で使用可能な別のリパーゼの例は、リパーゼＲ「Ａｍａｎｏ」（以下、「リパーゼＲ」）という名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。リパーゼＲは、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って、ペニシリウム・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作り出される、食品グレードのトリアシルグリセロールリパーゼである。リパーゼＲは、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの１位および３位から、長鎖脂肪酸に優先して短鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸を加水分解する。リパーゼＲは、２５，０００の分子量を有し、等電点は４．５０であり、不活性化条件（０．１％酵素溶液）は、６０℃で２分間または７０℃で１分間である。リパーゼＲは、９００ユニット／グラムを下回らないリパーゼ活性で販売されている。リパーゼＲの市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リパーゼＲのさらなる特徴を図１１Ａ〜１１Ｄに示す。ペニシリウム・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作られる他のリパーゼも、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４８】
６．リパーゼＧ５０
本明細書で記載する方法で使用可能な別のリパーゼの例は、リパーゼＧ「Ａｍａｎｏ」５０（以下、「リパーゼＧ５０」）という名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。リパーゼＧ５０は、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って、ペニシリウム・カムンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）の発酵によって作り出される、食品グレードの酵素調製物である。リパーゼＧ５０は、高いエステル化活性を有しており、グリセリドを加水分解し、トリグリセリドよりも部分グリセリドを迅速に加水分解し、グリセロールおよび脂肪酸を産生する。リパーゼＧ５０Ｒは、５０，０００ユニット／グラムを上回らないリパーゼ活性で販売されている。リパーゼＧ５０の市販調製物は、提供された濃度で使用してもよく、または使用のために希釈してもよく、さらに濃縮してもよい。リパーゼＧ５０のさらなる特徴を図１２Ａ〜１２Ｄに示す。ペニシリウム・カムンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）の発酵によって作られる他のリパーゼも、本明細書に記載されるように使用してもよい。
【００４９】
Ｂ．ラクターゼ
ラクターゼは、二糖類のラクトースを、その成分であるモノマー（グルコース、ガラクトース）に加水分解する、別の種類の加水分解酵素である。上述のように、ほとんどのラクターゼは、ガラクトース部分を別のラクトース分子に転移させ、これを繰り返し行い、オリゴ糖を構築する第２の活性も有する。
【００５０】
多くの動物および微生物のラクターゼが知られており、食品製造で使用される。例えば、ラクターゼを乳製品に加え、ラクトース含有量を減らし、ラクトース不耐症を患う人々にもっと受け入れられる製品を作る。例えば、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来するラクターゼが市販されている。これらの任意のラクターゼ、または望ましい第２の活性を有する他のラクターゼを、本明細書に記載する方法で使用することができる。この望ましい第２の活性は、ラクトースを含む組成物にラクターゼを加え、得られたオリゴ糖の含有量を分析し、ラクターゼが、ラクトース分子にガラクトース部分を転移させ、オリゴ糖を構築していることを確認することによって、確認することができる。
【００５１】
一部の実施形態では、酵素は、高レベルの第２の（ガラクトース転移）活性を有するように選択されるか、または操作される。例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａ）から単離したラクターゼは、この活性を高レベルで示すように操作されており、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の名称で販売されている（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｌｇｉｎ，ＩＬ）。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）は、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵を制御して作られる、天然のラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）番号：ＥＣ３．２．１．２３）である。
【００５２】
ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）は、約６．０の最適ｐＨを有し（図１３Ｂ）、ｐＨ約５．０〜約９．５で安定であり（図１３Ｄ）、至適温度は約６５℃であり（図１３Ａ）、約５５℃で少なくとも１時間は安定である（図１３Ｃ）。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の作用温度は、実際には、５０％ラクトース存在下では、６０℃でも十分に適用可能である（図１４Ａ）。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の加水分解速度（例えば、新鮮な乳中のラクトースの加水分解）は、添加されたＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の量に正比例する（図１４Ｂ）。５５％ラクトース存在下、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）は、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類を含む約５８％のオリゴ糖を産生する（図１４Ｃ）。１ラクトースユニット（ＬＵ）は、４０℃、ｐＨ６．０で反応初期段階に、１分あたりグルコース１μｍｏｌを遊離させる酵素の量であると定義される。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）は、本明細書に記載する方法で使用するのに適している。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）は、５，５００ＬＵ／ｇのラクターゼ活性を持つ市販調製物で販売されている。
【００５３】
一部の実施形態では、使用するリパーゼは、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）であり、使用するラクターゼは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）である。例えば、約０．１〜０．２％のＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）と、約０．１〜０．２％のＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）とを使用してもよい。これらの量は、単なる例であり、当業者は、酵素活性および望ましい効果によっては、異なる量の異なる酵素を使用してもよいことを理解するであろう。
【００５４】
一部の実施形態では、リパーゼは、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼ、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られるリパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の発酵によって作られるリパーゼ、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の発酵によって作られるリパーゼ、ペニシリウム・カムンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼ、および／またはペニシリウム・ロクエフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）の発酵によって作られるリパーゼを含み、ラクターゼは、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含む。例えば、一部の実施形態では、リパーゼは、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）、リパーゼＭ、リパーゼＡ１２、リパーゼＤ１５、リパーゼＧ５０および／またはリパーゼＲを含み、ラクターゼは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を含む。別の特定の実施形態では、リパーゼは、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の発酵によって作られるリパーゼを含み、ラクターゼは、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の発酵によって作られるβ−ガラクトシダーゼＥＣ３．２．１．２３を含み、例えば、リパーゼがリパーゼＭを含み、ラクターゼがＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を含む。上述のように、記載した任意のリパーゼ／ラクターゼの組み合わせで、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）に加えて、またはＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）に代えて、ガラクトース転移活性を有する他のラクターゼを、本明細書に記載される方法で使用してもよい。
【００５５】
以下の実施例に示したように、ＥＭＣの望ましい効果について、リパーゼおよびラクターゼの他の組み合わせをスクリーニングしてもよい。例えば、ある組み合わせが、１つ以上の遊離脂肪酸の含有量、チーズらしさ、はっきりした風味、石鹸らしさがないこと、香りに対し、望ましい効果を有する場合がある。
【００５６】
Ｃ．ラクトース
一部の実施形態では、ラクトース分子から、部分的に加水分解した脂質へのガラクトース部分の転移を促進するために、ラクトースを使用する。ラクトースは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．を含め、多くの供給業者から市販されている。
【００５７】
Ｄ．他の成分
酵素は、典型的には、ＥＭＣ製造目的で使用される組成物で提供されてもよく、この組成物は、例えば、ｐＨを調整するために１種以上のバッファーを含んでいてもよい。例えば、１種以上の酵素が、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で望ましい活性を示す場合、ｐＨをこの範囲に調整するために、１種以上のバッファーを使用してもよい。バッファーの例としては、限定されないが、酢酸バッファー、リン酸バッファーが挙げられる。
【００５８】
したがって、本明細書で、１種以上のリパーゼおよび１種以上のラクターゼを含み、この１種以上のリパーゼのうち、少なくとも１つが、長鎖脂肪酸を加水分解する前に、短鎖脂肪酸を優先的に加水分解し、この１種以上のラクターゼのうち、少なくとも１つが、ガラクトース転移活性を示す酵素組成物が提供される。一部の実施形態では、この組成物は、バッファーをさらに含む。
【００５９】
ＩＩＩ．食品
また、本明細書に記載される酵素的方法を用いて調製した食品を、本明細書に記載する。上述のように、「食品」は、製造のすべての段階での食品および飲料品を含む。
【００６０】
以下の特定の実施形態および実施例では、本発明の態様を示すために特定の食品を使用するが、本発明は、これらの特定の実施形態に限定されず、リパーゼおよびラクターゼを使用し、例えば、長鎖脂肪酸の放出を防ぎつつ、短鎖脂肪酸の放出を可能にすることによって、食品に望ましい風味を付与するであろう場合なら、どの適用例でも見つかることが理解されるべきである。
【００６１】
一部の実施形態では、本食品は、乳製品である。乳製品としては、限定されないが、乳、クリーム、アイスクリーム、チーズ、チーズカード、バター、バターミルク、ヨーグルト、サワークリーム、クリームチーズ、カッテージチーズなどが挙げられる。乳製品は、末端製品である飲食物、および／または、末端製品の成分として使用される飲食物を含む。特定の実施形態によれば、本食品は、本明細書に記載される酵素的方法を用いて調製されたＥＭＣを含む。他の実施形態によれば、本食品は、本明細書に記載される酵素的方法を用いて調製された伝統的なチーズ（例えば、ハードチーズ）を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、本食品は、他の生成物に乳製品の風味を付与するために使用される（例えば、食品添加剤）。例えば、本明細書に記載される方法によって調製されたＥＭＣを用い、スナック食品、スープ、パンなどにチーズ風味を付与することができる。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される食品（例えば、本明細書に記載される酵素的方法によって調製されるもの）は、本明細書に記載される酵素的方法によって調製されたのではない比較食品（例えば、リパーゼのみを用いて調製されたもの、第２の（ガラクトース転移）活性を有するラクターゼを用いずに調製されたもの）とは異なる遊離脂肪酸含有量を示す。遊離脂肪酸含有量は、当該技術分野で既知の方法によって評価することができる。典型的な方法は、以下の実施例に示すように、食品からの脂肪酸の抽出、メチルエステルへの変換、ガスクロマトグラフィーによる分析を含む。
【００６４】
したがって、一部の実施形態では、本食品は、ガラクトース転移活性を有する１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも、遊離長鎖脂肪酸に対する遊離短鎖脂肪酸の比率が高い。一部の実施形態では、本食品は、ガラクトース転移活性を有する１つ以上のラクターゼでは処理されずに１つ以上のリパーゼで処理された比較品の長鎖脂肪酸含有量よりも、長鎖脂肪酸含有量（例えば、Ｃ１８脂肪酸の含有量）が、約２／３以下（例えば、６６％以下、６３％を含む）である。一部の実施形態では、本食品は、ガラクトース転移活性を有する１つ以上のラクターゼでは処理されずに１つ以上のリパーゼで処理された比較品の短鎖脂肪酸含有量に対し、短鎖脂肪酸含有量（例えば、Ｃ４脂肪酸の含有量）が、約９０％以上（９１％を含む）である。
【００６５】
一部の実施形態では、本食品は、ガラクトース転移活性を有する１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりもチーズ風味が強い。一部の実施形態では、本食品は、ガラクトース転移活性を有する１種以上のラクターゼでは処理されずに１種以上のリパーゼで処理された比較品よりも石鹸臭が少ない。
【実施例】
【００６６】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために与えられている。しかし、本発明は、これらの実施例に記載されている特定の条件または詳細に限定されるべきではないことが理解されるべきである。
【００６７】
実施例１〜４は、本発明に記載される方法によって、ＥＭＣのチーズの風味が改良され、石鹸臭が少なくなることを示す。伝統的なチーズの風味を改良するために、同様の方法を使用することが可能であるが、固形チーズ組成物（例えば、チェダーチーズ）では、以下で使用する液状のチーズ組成物と比較すると、風味を増すには長い時間が必要であろう。
【００６８】
ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）（ＬＭＥＲＥ０５５２５０１Ｋ）、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）ＦＮ５（Ｐ５ＨＡ２０１）のサンプルを、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＵＳＡから直接入手した。すべての酵素を１００ｍｇ／ｍｌ溶液として使用した。Ｗｅｙａｕｗｅｇａ  Ｓｔａｒ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｄｄａｒチーズカードを、地域の食品店で購入した。吉草酸、すなわちＣ５の内部標準をＡｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ番号２４０３７０）、ヘプタデカン酸、すなわちＣ１７をＳｉｇｍａから購入した（Ｈ３５００）。
【００６９】
実施例１：リパーゼのみを用いたＥＭＣの調製、またはリパーゼおよびラクターゼを用いたＥＭＣの調製
この実験は、リパーゼのみを用いて調製したＥＭＣ、または高いレベルの第２の（ガラクトース転移）活性を有するラクターゼ（ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標））をリパーゼと組み合わせて用いて調製したＥＭＣを比較する。
【００７０】
Ｗｅｙａｕｗｅｇａ  Ｓｔａｒ  Ｄａｉｒｙチェダーチーズカードを、地域の食品店で購入した。このチェダーチーズカード約７５グラム（ｇ）を秤量してＣｕｓｉｎａｒｔに入れた。ラクトースを含むバッファー（０．５％ｗ／ｖのラクトース、１．０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、１．５％ｗ／ｖのクエン酸ナトリウム）７５ミリリットル（ｍｌ）を、カードがスラリーになるように、徐々に加えた。スラリーを５０グラムずつ２つ秤量し、滅菌ポリカーボネートフラスコに入れ、次いで、サンプルを熱水で３０分間かけて低温殺菌した。サンプルを５０℃で１時間冷却した。両方のサンプルにＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＵＳＡ）２ｍｌ（０．２グラム）を加え、片方のサンプルには、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＵＳＡ）溶液２ｍｌ（０．２ｇ）も加えた。両サンプルを５０℃でインキュベートし、２００ＲＰＭで２１．３時間遠心分離処理した。インキュベートした後、両サンプルを熱水浴に３０分入れ、酵素を不活性化させた。遊離脂肪酸（「ＦＦＡ」）分析のために少量のサンプル（１．０５ｇ）を取り出した。残ったサンプルを冷蔵庫に保存し、味覚試験まで冷却しておいた。
【００７１】
実施例２：味覚試験
それぞれのサンプルの味を２回ずつ試験した。１回目の味覚試験では、サンプルの固体部分２．０ｇを秤量皿に秤量し、ＥＡＳＹ  ＣＨＥＥＳＥ（登録商標）（低温殺菌した米国のチーズスナック）と合わせて重量を１０．０ｇにした。サンプルをスプーンで十分に混ぜた後、１人の味覚検査者がサンプルを試験した。各サンプルを対照（ＥＡＳＹ  ＣＨＥＥＳＥ（登録商標）のみ）と比較し、チーズらしさ、石鹸のような風味について点数を付けた。このように、第１の味覚試験は、定性的な違いに注目したものであった。結果を以下の表１に示す。
【表１】
2011525356.tif 000003
【００７２】
第２の味覚試験の前に、固体と水っぽい層を混ぜ合わせるために、サンプルを２分間ホモジナイズした。次いで、各サンプル５．０ｇを５０ｍｌ遠沈管に秤量した。低温殺菌したチーズスナック（ＥＡＳＹ  ＣＨＥＥＳＥ（登録商標））２０ｇをそれぞれの管に加え、もう一度サンプル全体を２分間ホモジナイズした。１人の味覚検査者がサンプルを試験し、テイスティングの前に、それぞれのにおいを嗅いで、香りを評価した。各サンプルについて、チーズらしさ、石鹸のような風味、香りについて１〜１０のスケールで点数を付けた。１０が、可能な最高評価である。チーズらしさについて、１０は、最も風味がよいことをあらわし、石鹸のような風味については、１０が、最も石鹸臭が少ないことをあらわす。対照（ＥＡＳＹ  ＣＨＥＥＳＥ（登録商標）のみ）も点数を付けた。結果を以下の表２に示す。
【表２】
2011525356.tif 000004
【００７３】
これらの結果は、本明細書に記載される方法にしたがって、リパーゼおよびラクターゼで処理したＥＭＣは、風味および香りが改良されていることを示している。
【００７４】
実施例３：遊離脂肪酸の抽出およびメチルエステルへの変換
上述のように調製したそれぞれのＥＭＣ約１．０５ｇを５０ｍｌ遠沈管に秤量した。各管に以下の試薬を加えた：２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１ｍｌ、水を３ｍｌ、内部標準（Ｃ５（吉草酸、Ａｌｄｒｉｃｈから購入、カタログ番号２４０３７０）およびＣ１７（ヘプタデカン酸、Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｈ３５００）、１：１  エーテル：ヘキサン中、各脂肪酸を１ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌ。ＥＭＣは、手動でかき混ぜると粘性が大きすぎて乳化できないため、各サンプルを、手持ち式ホモジナイザーＰｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  １２００Ｅを用い、最大ＲＰＭで１分間ホモジナイズした。サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＤ  ４３３５００）を用いて３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離処理し、次いで、３５００ＲＰＭで２０分間、再び遠心分離処理し、十分に分離した層を得た。油層をピペットで抜き取り、１０ｍｌのヘプタンで平衡化したＳＥＰカラムに通した。カラムをクロロホルム：プロパノール２：１  １０ｍｌで洗浄し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を、２％ギ酸エーテル溶液５ｍｌで溶出させた。各溶出液１ｍｌを栓のついたガラス管に移し、２，２−ジメトキシプロパン（Ｓｉｇｍａ、試薬グレード９８％、Ｄ１３６８０８）０．２ｍｌ、１．５Ｍ  ＨＣｌ  ＭｅＯＨ溶液０．２ｍｌ、無水メタノール０．６ｍｌと混合した。サンプルを室温で一晩放置してから、ガスクロマトグラフで分析した。
【００７５】
実施例４：遊離脂肪酸のガスクロマトグラフィー
サンプルを、Ａｇｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが製造した、スプリット／スプリットレス注入口、スプリットライナー、パルスドスプリット注入口型のガスクロマトグラフシステムＭｏｄｅｌ  ６８９０で試験した。スプリット比は、５０：１であり、スプリット流速は１０９ｍｌ／分であった。注入口の温度は２５０℃であり、ヘッド圧は２３０ｋＰａであった。使用したカラムは、ＩＤが６０ｍ×０．２５ｍｍの０．１５ｕｍ  ＤＢ−２３であった。ガスの合計流速は１１３ｍｌ／分であり、キャリアガスはヘリウムであった。ヘリウムの流速は２．２ｍｌ／分であり、メイクアップ用ヘリウムの流速は３０ｍｌ／分であり、水素の流速は４０ｍｌ／分であり、空気は８００ｍｌ／分であった。平均速度は３４ｃｍ／秒であった。オーブンは、以下の表３に示すようにプログラミングされ、検出器の温度は、２８０℃に設定した。
【表３】
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【００７６】
使用したサンプルの容積は１μｌであった。１つのサンプルが、他のサンプルと比べて長い時間処理されずに放置されてしまうことによって結果が偏らないように、３種類すべてのサンプルを順繰りに（すなわち、Ａ、Ａ、Ａではなく、Ａ、Ｂ、Ｃ）、各サンプルを５回注入した。各サンプルを試験した後、それぞれのＦＡＭＥピーク（保持時間をあらかじめ決定しておいた）の面積をＥｘｃｅｌのスプレッドシートに入力した。変換ファクターについて内部標準を用い、それぞれの遊離脂肪酸の濃度をｍｍｏｌ／ｋｇで算出した。ガスクロマトグラフィー分析の結果を以下の表４および図３に示す。各脂肪酸の平均濃度を、ｍｍｏｌ／ｋｇであらわしている。
【表４】
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【００７７】
これらの結果は、本明細書に記載される方法に従って、ＥＭＣをリパーゼおよびラクターゼで処理すると、Ｃ４脂肪酸濃度は、リパーゼのみで処理したＥＭＣで実測した濃度の９１％に維持しつつ、Ｃ１８脂肪酸濃度が、リパーゼのみで処理したＥＭＣで実測した濃度の６３％まで低下していることを示している。
【００７８】
チーズの遊離脂肪酸含有量を分析する際の問題点の１つは、チーズ風味を与える物質である短鎖脂肪酸が揮発性であり、抽出およびメチルエステル化の手順中に簡単に失われてしまうことである。本発明者らの公開されていない以前の研究は、ＥＭＣを保存するために秤量した酪酸を加えた場合、平均で、加えた酪酸の４０％が失われることを示している。したがって、上記で概説した抽出およびメチルエステル化の手順中に、ＥＭＣに本来含まれているのとほぼ同じ割合の酪酸が失われていると考えるのは理屈に合わないことではない。この実験では、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）で処理したＥＭＣは、Ｃ４濃度の測定値が８．１９ｍｍｏｌであり、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）＋ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）で処理したＥＭＣは、Ｃ４濃度の測定値が７．４３ｍｍｏｌ  Ｃ４／ｋｇであった。これらのサンプルの正しいＣ４濃度は、この現象の以前の研究に基づいて、それぞれ、１１．４７ｍｍｏｌ／ｋｇおよび１０．４０ｍｍｏｌ／ｋｇであろう。
【００７９】
実施例５：ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を用いた、５種類の異なるリパーゼの評価
異なるリパーゼを用いたＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の効果を試験するために、ＥＭＣを、リパーゼＡ１２、リパーゼＤＦ１５、リパーゼＧ５０、リパーゼＭ、およびリパーゼＲの５種類のリパーゼを用いて製造した。それぞれの実験において、リパーゼ自体を用いたものと、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）と組み合わせて用いたものの両方で、ＥＭＣを製造した。ＥＭＣを製造した後、遊離脂肪酸を抽出し、メチルエステルに変換し、ガスクロマトグラフィーで分析した。また、ＥＭＣサンプルの味を検査し、チーズらしさ、はっきりした風味、石鹸のような風味について点数を付けた。
【００８０】
Ａ．ＥＭＣの製造
ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）、リパーゼＡ１２、リパーゼＤＦ１５、リパーゼＧ５０、リパーゼＭ、およびリパーゼＲのサンプルをＡｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＵＳＡから直接得た。すべての酵素を１００ｍｇ／ｍｌ溶液として使用した。
【００８１】
種々の販売日の数バッチのＷｅｙａｕｗｅｇａ  Ｓｔａｒ  Ｄａｉｒｙチェダーチーズカードを、地域の食品店で購入した。内部標準である吉草酸（Ｃ５）をＡｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ番号２４０３７０）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）をＳｉｇｍａから購入した（Ｈ３５００）。
【００８２】
それぞれのリパーゼを、異なるバッチのＥＭＣで使用した。それぞれのバッチについて、このチェダーチーズカード約１７５グラムを秤量してＣｕｓｉｎａｒｔに入れた。同じ容積のバッファー（０．５％ｗ／ｖのラクトース、１．０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、１．５％ｗ／ｖのクエン酸ナトリウム）を、カードがスラリーになるように、徐々に加えた。このスラリーを５０ｇずつ６個秤量し、滅菌ポリカーボネートフラスコに入れ、次いで、サンプルを熱水で３０分間かけて低温殺菌した。サンプルを、使用するリパーゼの至適作用温度で少なくとも１時間冷却した。それぞれのリパーゼについて用いた温度を以下の表５に示す。
【表５】
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【００８３】
すべてのサンプルに、リパーゼ２ｍｌ（０．２ｇ）を入れた。これらのサンプルのうち３サンプルには、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）溶液１．０ｍｌ（０．１ｇ）も加え、残りの３サンプルは、対照としてそのままにしておいた。すべてのサンプルを、リパーゼの作用温度で、２００ＲＰＭで一晩（１７〜２２時間）インキュベートした。インキュベート時間が終了したら、サンプルを熱水浴に３０分入れ、酵素を不活性化させた。ＥＭＣをわずかに冷却した後、手持ち式ホモジナイザーＰｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  １２００Ｅを用い、最大ＲＰＭで１分間ホモジナイズした。遊離脂肪酸を抽出し、分析する（以下に記載）ために少量のサンプル（１．０５ｇ）を取り出した。次いで、ＥＭＣを冷蔵庫に保存し、味覚試験まで冷却しておいた。
【００８４】
Ｂ．味覚試験
すべてのリパーゼについて、リパーゼのみで処理したＥＭＣサンプル１つと、リパーゼおよびＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の両方で処理したＥＭＣサンプル１つとをそれぞれ２ｇ、低温殺菌したチーズスプレッド８ｇと混合した。また、この低温殺菌したチーズスプレッド自体も味を調べ、風味の基本レベルを確立した。それぞれのサンプルについて、１人の味覚検査者が、チーズらしさ、はっきりした風味、石鹸らしさがないことについて、０〜１０の点数を付けた（１０は、可能な最高スコアである）。
【００８５】
以下の表６に、味覚試験の結果を示す。すべての味覚試験において、対照チーズは、チーズらしさ、はっきりした風味については１点（最低点）が付けられており、石鹸らしさがないことについては１０点（最高点）が付けられている。
【表６】
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【００８６】
上に示した味覚特性に加え、リパーゼＭを用いて製造されたＥＭＣサンプルでは苦みも検出された。リパーゼＭのみを用いて調製されたサンプルは、苦みのレベルが４（または、苦みのなさならば６）であり、一方、リパーゼＭおよびＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）の両方を用いて調製されたサンプルは、苦みのレベルが２（または、苦みのなさならば８）であった。すべての他のＥＭＣは、苦みのレベルが０（または、苦みのなさならば１０）であろう。
【００８７】
上記の結果は、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を異なるリパーゼとともに用いると、チーズらしさ、はっきりした風味、石鹸らしさがないことについて異なる効果を発揮し得ることが示されている。したがって、望ましい効果を達成するリパーゼ／ラクターゼの組み合わせを選択することによって、望ましい風味プロフィールを有するＥＭＣを得ることができる。
【００８８】
Ｃ．遊離脂肪酸の抽出およびメチルエステルへの変換
それぞれのＥＭＣ約１．０５ｇを５０ｍｌ遠沈管に秤量した。各管に以下の試薬を加えた：２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１ｍｌ、水を３ｍｌ、内部標準（Ｃ５およびＣ１７、１：１  エーテル：ヘキサン中、各脂肪酸を１ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌ。サンプルを激しくボルテックスし、エマルションを作製した。サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＤ  ４３３５００）を用いて３０００ＲＰＭで１５〜３０分間遠心分離処理した。油層をピペットで抜き取り、１０ｍｌのヘプタンで平衡化したＳＥＰカラムに通した。カラムをクロロホルム：プロパノール２：１  １０ｍｌで洗浄し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を、２％ギ酸エーテル溶液５ｍｌで溶出させた。各溶出液１ｍｌを栓のついたガラス管に移し、２，２−ジメトキシプロパン（Ｓｉｇｍａ、試薬グレード９８％、Ｄ１３６８０８）０．２ｍｌ、１．５Ｍ  ＨＣｌ  ＭｅＯＨ溶液（Ｆｌｕｋａ、１７９３５）０．２ｍｌ、無水メタノール（Ｓｉｇｍａ、３２２４１５）０．６ｍｌと混合した。サンプルを室温で一晩放置してから、ガスクロマトグラフで分析した。
【００８９】
Ｄ．ガスクロマトグラフィー分析
サンプルを、Ａｇｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが製造した、スプリット／スプリットレス注入口、スプリットライナー、パルスドスプリット注入口型のガスクロマトグラフシステムＭｏｄｅｌ  ６８９０で試験した。スプリット比は、５０：１であり、スプリット流速は１０９ｍｌ／分であった。注入口の温度は２５０℃であり、ヘッド圧は２３０ｋＰａであった。使用したカラムは、ＩＤが６０ｍ×０．２５ｍｍの０．１５ｕｍ  ＤＢ−２３であった。ガスの合計流速は１１３ｍｌ／分であり、キャリアガスはヘリウムであった。ヘリウムの流速は２．２ｍｌ／分であり、メイクアップ用ヘリウムの流速は３０ｍｌ／分であり、水素の流速は４０ｍｌ／分であり、空気は８００ｍｌ／分であった。平均速度は３４ｃｍ／秒であった。オーブンは、以下の表７に示すようにプログラミングされ、検出器の温度は、２８０℃に設定した。
【表７】
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【００９０】
使用したサンプルの容積は１μｌであった。１つのサンプルが、他のサンプルと比べて長い時間処理されずに放置されてしまうことによって結果が偏らないように、６種類すべてのサンプルを順繰りに（すなわち、Ａ、Ａ、Ａではなく、Ａ、Ｂ、Ｃ）、各サンプルを３回注入した。変換ファクターとして内部標準を用い、それぞれの遊離脂肪酸の濃度をｍｍｏｌ／ｋｇで算出した。
【００９１】
表８にガスクロマトグラフィー分析の結果を示す。種々のリパーゼを用いて製造したＥＭＣにおける、チーズ風味に関与する遊離脂肪酸（Ｃ４）または石鹸臭に関与する遊離脂肪酸（Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）の濃度を示している。
【表８】
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【００９２】
この実験で使用した５種類のリパーゼのうち、３種は、ＥＭＣサンプル中で、いくらか産生したとしても、それほど多くの遊離脂肪酸を産生しなかった。リパーゼのうち３種（リパーゼＡ１２、リパーゼＧ５０、およびリパーゼＲ）について、Ｃ４の濃度は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）を用いて製造したＥＭＣで以前に実測した結果よりもかなり低かった（ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）自体を使用した場合には８．１９ｍｍｏｌ／ｋｇ、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）およびＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を両方とも使用した場合には７．４３ｍｍｏｌ／ｋｇ；上掲の表４を参照）。また、これらのリパーゼによって産生されたＣ１４、Ｃ１６、およびＣ１８のような長鎖脂肪酸の濃度は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）のＥＭＣで産生された量（３０．４ｍｍｏｌ／ｋｇ）またはＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣで産生された量（１９．１２ｍｍｏｌ／ｋｇ）よりもかなり少なかった（表４を参照）。
【００９３】
上述の実験で、リパーゼＡ１２は、対照と比較して、ＥＭＣの味覚を改良しなかった。しかし、リパーゼＧ５０およびリパーゼＲは、両方とも、チーズらしさおよびはっきりした風味において改良がみられた。このように、決定した遊離脂肪酸濃度は、味覚試験の結果と完全に一致するものではない。副反応が、決定した遊離脂肪酸濃度または味覚試験の結果、またはこの両方に影響を与えている可能性がある。さらに、上記で報告した味覚試験の結果は、１人の味覚検査者による１回の味覚試験によるものであり、他の人によるさらなる味覚試験をすれば、遊離脂肪酸濃度ともっと一致する結果が得られるかもしれない。
【００９４】
上述のリパーゼのうち２種（リパーゼＤＦ１５およびリパーゼＭ）は、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）のＥＭＣで実測した値よりも高い濃度のＣ４を産生した。しかし、味覚試験では、これらのＥＭＣ（リパーゼＥＭＣおよびリパーゼ／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）ＥＭＣの両方）は、チーズらしさおよびはっきりした風味で非常に低い点数であり、対照チーズスプレッドと同等の値であるか、または対照よりも低かった。リパーゼＤＦ１５を用いて製造したＥＭＣは両方とも、石鹸らしさがないことで最も低い点数であり（石鹸臭が高い）、サンプルにチーズ風味がいくらか存在しても、この石鹸臭で隠されてしまう可能性がある。また、リパーゼＭのＥＭＣは、石鹸らしさがないことで低い点数であるが、リパーゼＤＦ１５のＥＭＣほど低くはなかった。したがって、これらの酵素も、同様に、決定した遊離脂肪酸濃度が、味覚試験の結果と完全に一致するものではない。
【００９５】
表９は、リパーゼ＋ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣ中の長鎖脂肪酸の、対応するリパーゼＥＭＣ中の長鎖脂肪酸濃度を基準とした比率を示す。比較のために、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）の場合の比率も示している。１未満の比率は、リパーゼ／ラクターゼの組み合わせを使用すると、リパーゼのみを用いた場合と比較して、長鎖脂肪酸の含有量が減っていることを示す。
【表９】
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【００９６】
ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）を含め、すべてのリパーゼについて、上述の比率は、それぞれの遊離脂肪酸（Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）についてほぼ同じであった。しかし、ＣＨＥＥＳＥＭＡＸ（登録商標）によって産生されるもの（平均比率０．６６）よりも小さな比率で産生するリパーゼは存在しなかった。リパーゼＡ１２の場合、リパーゼＡ１２／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣは、リパーゼＡ１２のＥＭＣよりも石鹸臭が少ないが、ＥＭＣにＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を加えると、２倍より多い長鎖脂肪酸が産生した（比率２．１４）。ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）をリパーゼＤＦ１５と混合すると、長鎖脂肪酸の産生量が少なくなった（平均比率０．８４）が、味覚試験中の石鹸臭がわずかに強くなった。リパーゼＧ５０／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を用いて製造されたＥＭＣは、長鎖脂肪酸濃度がわずかに大きく（平均比率１．１７）、石鹸臭がわずかに強くなった。リパーゼＭの場合、ＥＭＣにＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）を加えると、すべての遊離脂肪酸の濃度がわずかに減った（平均比率０．９５）が、Ｃ４は、長鎖脂肪酸よりも強く影響を受けていた。上述のように、リパーゼＭ／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣは、リパーゼＭのＥＭＣよりもわずかに石鹸臭が少なかった。リパーゼＲの場合、Ｃ４濃度は、リパーゼＲ／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣでわずかに高くなったが、長鎖脂肪酸の濃度は、かなり増えた（平均比率１．７９）。リパーゼＲ／ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）のＥＭＣは、味覚試験中、すべての項目でリパーゼＲのＥＭＣよりも良好な点数であった。したがって、これらの３種類のリパーゼでは、味覚試験の結果は、ガスクロマトグラフィーの結果と一致しなかった。
【００９７】
この実験で試験した５種類のリパーゼのうち、３種（リパーゼＡ１２、リパーゼＧ５０、リパーゼＲ）は、ＥＭＣ製造中にＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）と混合すると、もっと多くの長鎖脂肪酸を産生した。２種類のリパーゼ（リパーゼＤＦ１５およびリパーゼＭ）は、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（商標）と混合すると、産生される長鎖脂肪酸濃度が低くなった。
【００９８】
上記の内容は、リパーゼおよびラクターゼの異なる組み合わせを、ＥＭＣに対する望ましい効果（例えば、遊離脂肪酸含有量、チーズらしさ、はっきりした風味、石鹸らしさがないこと、香りのうち、１つ以上に対する望ましい効果）についていかにスクリーニングすることができるかを示している。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【国際調査報告】
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