(57)【要約】【課題】ＦＨＩＴの発現を変化させるための方法の必要性が、それを必要とする対象において存在する。また、ＦＨＩＴの発現を変化させるために有用である組成物の必要性が、それを必要とする対象において、存在する。【解決手段】Ｆｈｉｔ遺伝子を使用する、癌関連疾患の診断、予後、および治療のための方法および組成物を、本出願において提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを含む、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６を単離することができるアデノウイルス。
【請求項２】
外来的に過剰発現したＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６を単離する方法であって、ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを使用するステップを含み、前記Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６は、Ｈｉｓタグを通じで単離される、方法。
【請求項３】
ヒスチジン−６エピトープタグをコードする配列でその３’を修飾した、脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有する、組み換えアデノウイルス（ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６）。
【請求項４】
少なくとも１つの細胞におけるアポトーシスプロセスを媒介するための方法であって、前記細胞における前記アポトーシスプロセスを媒介するのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、前記細胞を曝露するステップを含む、方法。
【請求項５】
細胞におけるアポトーシスプロセスを誘導するための方法であって、前記細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を生じるのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、前記細胞を曝露するステップを含む、方法。
【請求項６】
少なくとも１つの細胞におけるアポトーシスプロセスを媒介するための方法であって、脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）が、前記細胞内のミトコンドリアに入り、前記細胞内のＦｄｘｒタンパク質と相互作用し、ＲＯＳの生成に関連するＦｄｘｒタンパク質レベルを増加させるのを可能にするのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、前記細胞を曝露させて、前記細胞における前記アポトーシスプロセスに変化を生じさせるステップを含む、方法。
【請求項７】
野生型ＦＤＸＲ（フェレドキシン還元酵素）ｃＤＮＡを調製するための方法であって、プライマー配列：５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’（順方向）［配列番号２８］、および５’−ＴＣＡｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号２９］でＰＣＲ増幅するステップと、前記増幅産物ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクターをサブクローン化するステップと、を含む、方法。
【請求項８】
Ｖ５タグ付加ＦＤＸＲ（フェレドキシン還元酵素）ｃＤＮＡを調製するための方法であって、プライマー配列：順方向：５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’［配列番号３０］、逆方向：５’−ｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号３１］でＰＣＲ増幅するステップと、前記増幅産物ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクターをサブクローン化するステップと、を含む、方法。
【請求項９】
組み換えアデノウイルスを生成するための方法であって、前記野生型ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有する組み換えアデノウイルス（ＡｄＦＨＩＴ）を調製するステップと、以下のオリゴヌクレオチド：５’−ＡＣｇＴｇｇＡＴＣＣＣＴｇＴｇＡｇｇＡＣＡＴｇＴＣｇＴＴＣＡｇＡＴＴＴｇｇＣ−３’（順方向）［配列番号２６］、および５’−ＴＴｇＴｇｇＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇＣｇＡＴＣＣＴＣＴＣＴｇＡＡＡｇＴＡｇＡＣＣＣｇＣＡｇ−３’［配列番号２７］を用いるＰＣＲを使用して、タグ付加ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを生成するステップと、を含む、方法。
【請求項１０】
癌細胞におけるアポトーシスを誘発するための方法であって、前記癌細胞内のＦｈｉｔタンパク質の発現を回復するステップを含む、方法。
【請求項１１】
対象が、癌関連疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法であって、前記対象からの試験試料中の少なくとも脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子のレベルを測定するステップを含み、対照試料中の対応するＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルと比べて、前記試験試料中の前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物のレベルにおける変化は、前記対象が、癌関連疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかのいずれかを示す、方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物の前記レベルは、ノーザンブロット分析を用いて測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験試料中の前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルは、前記対照試料中の前記対応するＦｈｉｔ遺伝子産物のレベル未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験試料中の前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルは、前記対照試料中の前記対応するＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルより高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｆｈｉｔのレベルのうちの少なくとも１つは、所定の基準レベルを超える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｆｈｉｔのレベルのうちの少なくとも１つは、所定の基準レベルより低い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
対象において、１つ以上の予後マーカーに関連する癌を診断する方法であって、前記対象からの試料中の少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルを測定するステップを含み、対照試料中の対応するＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルと比べて、前記試験試料中の前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルにおける変化は、前記対象が、１つ以上の予後マーカーと関連する癌を有することを示す、方法。
【請求項１８】
対象が、癌関連疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法であって、
（１）前記対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するステップと、
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドを、Ｆｈｉｔに特異的なプローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、前記試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供するステップと、
（３）前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを、対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較するステップと、
を含み、少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子のシグナルにおける変化は、前記対象が、前記疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかのいずれかであることを示す、方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子の前記シグナルは、前記対照試料から生成されたシグナルに対して、下方制御される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子の前記シグナルは、前記対照試料から生成されたシグナルに対して、上方制御される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、対象における１つ以上の予後不良マーカーに関連する癌を有するか、またはそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法であって、
（１）前記対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するステップと、
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドを、Ｆｈｉｔに特異的なプローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズして、前記試験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供するステップと、
（３）前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを、対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較するステップと、
を含み、前記シグナルにおける変化は、前記疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかのいずれかであることを示す、方法。
【請求項２２】
前記マイクロアレイは、少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌関連疾患を有する対象において該疾患を治療する方法であって、少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子が、対照細胞に対して、前記対象の前記癌細胞内で下方制御または上方制御され、前記方法は、
（１）前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子が前記癌細胞内で下方制御される時には、前記対象における癌細胞の増殖が阻害されるように、有効量の少なくとも１つの単離Ｆｈｉｔ遺伝子産物を前記対象に投与するステップ、または、
（２）前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子が前記癌細胞内で上方制御される時には、前記対象における癌細胞の増殖が阻害されるように、前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子の発現を阻害するための、有効量の少なくとも１つの化合物を前記対象に投与するステップ、を含む、方法。
【請求項２４】
対象における癌関連疾患を治療する方法であって、前記対象における癌細胞の増殖が阻害されるように、
（１）前記疾患を罹患する前記対象からの細胞の試料中の少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物の量を、対照試料に対して決定するステップと、
（２）
ｉ）前記癌細胞内で発現される前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物の量が、対照細胞内で発現される前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物の量未満である場合、有効量の少なくとも１つの単離Ｆｈｉｔ遺伝子産物を前記対象に投与するステップ、または、
ｉｉ）前記癌細胞内で発現される前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物の量が、対照細胞内で発現される前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物の量を超える場合、前記少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物の発現を阻害するための、有効量の少なくとも１つの化合物を前記対象に投与するステップ、によって、
前記試料細胞内で発現されるＦｈｉｔ遺伝子産物の量を変化させるステップと、を含む、方法。
【請求項２５】
癌関連疾患を治療するための医薬組成物であって、少なくとも１つの単離Ｆｈｉｔ遺伝子産物と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの単離Ｆｈｉｔ遺伝子産物は、適切な対照細胞に対して、試料細胞内で上方制御または下方制御される、Ｆｈｉｔ遺伝子産物に相当する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌関連疾患を治療するための医薬組成物であって、少なくとも１つのＦｈｉｔ発現阻害化合物と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＦｈｉｔ発現阻害化合物は、適切な対照細胞に対して試料細胞内で上方制御されるＦｈｉｔ遺伝子産物に対して特異的である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
抗癌剤を同定する方法であって、細胞に試験薬剤を提供するステップと、癌細胞中の発現レベルの低下に関連する少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルを測定するステップと、を含み、適切な対照細胞に対して、前記細胞中の前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物のレベルの上昇は、前記試験薬剤が抗癌剤であることを示す、方法。
【請求項３０】
抗癌剤を同定する方法であって、細胞に試験薬剤を提供するステップと、癌細胞中の発現レベルの上昇に関連する少なくとも１つのＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルを測定するステップと、を含み、適切な対照細胞に対して、前記細胞中の前記Ｆｈｉｔ遺伝子産物のレベルの低下は、試験薬剤が抗癌剤であることを示す、方法。
【請求項３１】
Ｆｈｉｔ発現と疾病または疾患との間の相関を同定するための方法であって、正常試料と比較して、前記疾病または疾患の典型的な試料内で異なって発現するＦｈｉｔを同定するステップを含む、方法。
【請求項３２】
同定するステップは、ａ）前記試料中のＦｈｉｔを標識するステップと、ｂ）前記標識されたＦｈｉｔをＦｈｉｔアレイにハイブリダイズするステップと、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料中の前記Ｆｈｉｔは、標識前または標識後に単離される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料は、生体試料である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料は、患者からのものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｆｈｉｔのプロファイルは、ａ）前記試料中のＦｈｉｔを標識するステップと、ｂ）前記ＦｈｉｔをＦｈｉｔアレイにハイブリダイズするステップと、ｃ）前記アレイへのＦｈｉｔのハイブリダイゼーションを判定するステップと、を含むプロセスによって生成され、Ｆｈｉｔプロファイルが生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｆｈｉｔアレイは、加工されたＦｈｉｔ配列全体を含むＦｈｉｔコード配列を有する、Ｆｈｉｔプローブを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｆｈｉｔコード配列は、加工されたＦｈｉｔ配列の上流および／または下流に、少なくとも２〜５つのヌクレオチドのコード配列も含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｆｈｉｔコード配列は、前記加工されたＦｈｉｔ配列の上流および下流に４つのヌクレオチドのコード配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＦｈｉｔＮＡアレイは、ｃ）前記Ｆｈｉｔコード配列に隣接する少なくとも第１のリンカー配列をさらに含む、Ｆｈｉｔプローブを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記アポトーシスプロセスを媒介する方法であって、フェレドキシン還元酵素三連構造（Ｆｈｉｔ）を使用して、活性酸素種（ＲＯＳ）生成におけるフェレドキシン還元酵素（Ｆｄｘｒ）の関与を介して、前記アポトーシスプロセスを媒介するステップを含む、方法。
【請求項４２】
本明細書に記載されるＦｈｉｔ相互作用因子の同定方法。
【請求項４３】
負の予後因子としてのＦｈｉｔ損失の使用。
【請求項４４】
前腫瘍性疾患または腫瘍性疾患におけるＦｈｉｔ状態の評価に際する、負の予後因子としてのＦｈｉｔ損失の使用。
【請求項４５】
抗酸化剤治療に対する反応を予測する予測因子としての、Ｆｈｉｔ損失の使用。
【請求項４６】
Ｈｓｐシャペロンを標的とする組成物であって、それによって、Ｆｈｉｔがミトコンドリアに入り、そのアポトーシス経路を開始することができる、組成物。
【請求項４７】
初期Ｆｈｉｔ損失に関連する疾患に効力を有する、組成物の使用。
【請求項４８】
初期Ｆｈｉｔ損失に関連する前腫瘍性疾患に効力を有する、組成物の使用。
【請求項４９】
初期Ｆｈｉｔ損失に関連する腫瘍性または他の疾患に効力を有する、組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照および委託研究に関する言明
本発明は、２００７年１０月２６日出願の仮特許出願第６０／０００，４８０号の利益を主張する。本発明は、ＮＣＩ助成金番号ＣＡ７７７３８およびＣＡ７８８９０を受けて、政府の支援により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｈｉｔ遺伝子は、染色体３ｐ１４．２において最も活性がある共通脆弱部位を包含する（１、２）。Ｆｈｉｔ発現は、対立遺伝子欠失、ゲノム再編成、プロモーターの過剰メチル化、またはそれらの組み合わせにより、ほとんどの種類のヒト腫瘍の大部分において失われるか、あるいは減少する（３、４）。Ｆｈｉｔノックアウトマウスは、癌発症の罹患率の上昇を示し（５、６）、Ｆｈｉｔ遺伝子療法は、発癌性物質に曝露したＦｈｉｔ欠損マウスにおいて腫瘍を阻止する（７、８）。癌細胞における安定な形質移入によるＦｈｉｔ回復は、細胞が、生体内でヌードマウス環境のストレスを含むストレスに曝露されない限り、生体外でほとんど影響を持たず（９）、ウイルス媒介性Ｆｈｉｔ回復は、ストレスおよびＦｈｉｔ発現を同時に供給するプロセスであり、生体内で腫瘍形成を抑制し、生体外で肺癌細胞を含む多くの種類の悪性細胞のアポトーシスを誘発する（１０〜１３）。
【０００３】
肺過形成の病変において、ＤＮＡ損傷チェックポイント遺伝子はすでに活性化されており、チェックポイントタンパク質の突然変異のための選択、および腫瘍の進行に至る（１４、１５）。ＦＨＩＴ内のＦＲＡ３ＢでのＤＮＡ変化の証拠には、過形成およびチェックポイントの活性化が付随する。他の抑制遺伝子の発現における病理学的変化または変質の前に、喫煙者の正常に見える気管支上皮細胞に、ＦＨＩＴ対立遺伝子の損失が生じている（１６〜１８）。
【０００４】
Ｆｈｉｔ発現は、ＤＮＡ損傷剤への曝露によって下方制御され（１９）、Ｆｈｉｔはそのような薬剤への反応にある役割を果たし（２０、２１）、Ｆｈｉｔ欠損細胞はアポトーシスを回避し、突然変異を蓄積する。
Ｆｈｉｔ発現は、外因性および内因性のアポトーシス経路を含むカスパーゼ依存性機序を介して、いくつかの実験モデルにおけるアポトーシスを誘発するが、このプロセスの初期事象、およびＦｈｉｔ損失が腫瘍の開始にどのように関与するのかは、ほとんど分かっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ohta, M., Inoue, H., Cotticelli, M. G., Kastury, K., Baffa, R., Palazzo, J., Siprashvili, Z., Mori, M., McCue, P., Druck, T., Croce, C. M., and Huebner, K. (1996) Cell 84, 587-597.
【非特許文献２】Matsuyama, A., Shiraishi, T., Trapasso, F., Kuroki, T., Alder, H., Mori, M., Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 100, 14988- 14993.
【非特許文献３】Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Nat. Rev. Cancer 1, 214-221.
【非特許文献４】Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Br. J. Cancer 88, 1501-1506.
【非特許文献５】Fong, L. Y., Fidanza, V., Zanesi, N., Lock, L., Siracusa, L., Mancini, R., Siprashvili, Z., Ottey, M., Martin, S. E., Druck, T., McCue, P. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (2000) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 97, 4742-4747.
【非特許文献６】Zanesi, N., Fidanza, V., Fong, L. Y., Mancini, R., Druck, T., Valtieri, M., Rudiger, T., McCue, P. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (2001) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 98, 10250-10255.
【非特許文献７】Dumon, K. R., Ishii, H., Fong, L. Y., Zanesi, N., Fidanza, V., Mancini, R., Vecchione, A., Baffa, R., Trapasso, F., During, M. J., Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 98, 3346-3351.
【非特許文献８】Ishii, H., Zanesi, N., Vecchione, A., Trapasso, F., Yendamuri, S., Sarti, M., Baffa, R., During, M. J., Huebner, K., Fong, L. Y., and Croce, C. M. (2003) FASEB J. 17, 1768-1770.
【非特許文献９】Siprashvili, Z., Sozzi, G., Barnes, L. D., McCue, P., Robinson, A. K., Eryomin, V., Sard, L., Tagliabue, E., Greco, A., Fusetti, L., Schwartz, G., Pierotti, M. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (1997) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 94, 13771-13776.
【非特許文献１０】Ji, L., Fang, B., Yen, N., Fong, K., Minna, J. D., and Roth, J. A. (1999) Cancer Res. 59, 3333-3339.
【非特許文献１１】Ishii, H., Dumon, K. R., Vecchione, A., Trapasso, F., Mimori, K., Alder, H., Mori, M., Sozzi, G., Baffa, R., Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Cancer Res. 61, 1578-1584.
【非特許文献１２】Roz, L., Gramegna, M., Ishii, H., Croce, C. M., and Sozzi, G. (2002) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 99, 3615-3620.
【非特許文献１３】Trapasso, F., Krakowiak, A., Cesari, R., Arkles, J., Yendamuri, S., Ishii, H., Vecchione, A., Kuroki, T., Bieganowski, P., Pace, H. C, Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 100, 1592-1597.
【非特許文献１４】Gorgoulis, V. G., Vassiliou, L. V., Karakaidos, P., Zacharatos, P., Kotsinas, A., Liloglou, T., Venere, M., Ditullio, R. A., Jr., Kastrinakis, N. G., Levy, B., Kletsas, D., Yoneta, A., Herlyn, M., Kittas, C, and Halazonetis, T. D. (2005) Nature 434, 907-913.
【非特許文献１５】Bartkova, J., Horejsi, Z., Koed, K., Kramer, A., Tort, F., Zieger, K., Guldberg, P., Sehested, M., Nesland, J. M., Lukas, C, and Bartek, J. (2005) Nature 434, 864-870.
【非特許文献１６】Wistuba, I. L, Lam, S., Behrens, C, Virmani, A. K., Fong, K. M., LeRiche, J., Samet, J. M., Srivastava, S., Minna, J. D., and Gazdar, A. F. (1997) /. Natl. Cancer Inst. 89, 1366-1373.
【非特許文献１７】Mao, L., Lee, J. S., Kurie, J. M., Fan, Y. H., Lippman, S. M., Lee, J. J., Ro, J. Y., Broxson, A., Yu, R., Morice, R. C, Kemp, B. L., Khuri, F. R., Walsh, G. L., Hittelman, W. N., and Hong, W. H. (1997) /. Natl. Cancer Inst. 89, 857-862.
【非特許文献１８】Sozzi, G., Pastorino, U., Moiraghi, L., Tagliabue, E., Pezzella, F., Ghirelli, C, Tornielli, S., Sard, L., Huebner, K., Pierotti, M. A., Croce, C. M., and Pilotti, S. (1998) Cancer Res. 58, 5032-5037.
【非特許文献１９】Thavathiru, E., Ludes-Meyers, J. H., MacLeod, M. C, and Aldaz, C. M. (2005) MoI. Carcinog. 44, 174-182.
【非特許文献２０】Ottey, M., Han, S. Y., Druck, T., Barnoski, B. L., McCorkell, K. A., Croce, C. M., Raventos-Suarez, C, Fairchild, C. R., Wang, Y., Huebner, K., and Croce, C. M. (2004) Br. J. Cancer 91, 1669-1677.
【非特許文献２１】Ishii, H., Mimori, K., Inoue, H., Inagata, T., Ishikawa, K., Semba, S., Druck, T., Trapasso, F., Tani, K., Vecchione, A., Croce, C. M., Mori, M., and Huebner, K. (2006) Cancer Res. 66, 11287-11292.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＦＨＩＴの発現を変化させるための方法の必要性が、それを必要とする対象において存在する。また、ＦＨＩＴの発現を変化させるために有用である組成物の必要性が、それを必要とする対象において、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
広範な態様において、Ｆｈｉｔと直接相互作用して、結果的にアポトーシスに至る下流シグナル経路を生じさせるタンパク質を同定する方法が、提供される。一実施形態において、肺癌細胞をＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６ウイルスに感染させた後、細胞内のタンパク質を化学的に架橋した。Ｆｈｉｔに連結したタンパク質、およびそれらによって影響を受ける経路を同定し、特徴付けた。
【０００８】
別の広範な態様において、対象が、癌関連疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法であって、対象からの試験試料中の少なくとも脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子のレベルを測定するステップを含み、対照試料中の対応するＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルと比べて、試験試料中のＦｈｉｔ遺伝子産物のレベルにおける変化は、対象が、癌関連疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があるかのいずれかを示す方法が、本明細書において提供される。
【０００９】
本発明の種々の目的および利点は、付随する図面を踏まえて読まれる時に、以下の発明を実施するための形態から、当業者には明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請に応じて必要な手数料の支払いにより、事務所から提供される。
【図１−１】サイトゾルおよびミトコンドリアにおけるＦｈｉｔタンパク質の細胞下局在性。図１Ａは、４８時間ＰｏｎＡで処理したＨ１２９９細胞（Ｄ１）に、抗Ｆｈｉｔ血清を用いて免疫蛍光顕微鏡法を行った。図１Ｂは、ペンタ−Ｈｉｓ抗体で行ったＡ５４９のＡｄＦＨＩＴ（左）またはＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６−感染細胞（右）の免疫電子顕微鏡法を示す。
【図１−２】図１Ｃは、抗Ｆｈｉｔを使用した、ＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９の細胞成分分画の免疫ブロット分析を示す。図１Ｄは、炭酸ナトリウム（図１Ｅ）およびジギトニン（図１Ｆ）の濃度を上昇させて処理後にＡｄＦＨＴＴ−ＨｉＳ６に感染させた、Ａ５４９細胞のミトコンドリアからのタンパク質の免疫ブロット分析を表す。図１Ｇは、ＭＫＮ７４／Ｅ４およびＭＫＮ７４／Ａ１１６細胞からの細胞成分分画の免疫ブロット分析（外来的Ｆｈｉｔを安定に発現する）、そして、図１Ｈは、抗Ｆｈｉｔを使用したＨＣＴ１１６（内在的Ｆｈｉｔ陽性結腸癌細胞株）を示す。
【図２−１】図２Ａ−Ｆは、外来的および内在的Ｆｈｉｔは、内在的Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒタンパク質との複合体を形成する。
【図２−２】図２Ａ−Ｆは、外来的および内在的Ｆｈｉｔは、内在的Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒタンパク質との複合体を形成する。図２Ｄは、Ａ５４９細胞をＡｄＦＨＩＴに感染させた後の、抗Ｈｓｐ６０を用いた共免疫沈殿法、フィルタはＨｓｐ６０、Ｆｈｉｔ、およびＨｓｐ１０抗血清でプローブした。
【図２−３】図２Ａ−Ｆは、外来的および内在的Ｆｈｉｔは、内在的Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒタンパク質との複合体を形成する。図２Ｅは、Ａ５４９細胞をＶ５タグ付加ＦＤＸＲ遺伝子およびＦＨＴＴプラスミドで同時形質移入し、免疫沈殿法は、抗Ｖ５を用い、検出は、ＦｄｘｒおよびＦｈｉｔ抗血清を用いた。図２Ｆは、ＤＳＰで処理したＦｈｉｔ陽性ΗＣＴ１１６細胞からの、内在的相互作用タンパク質（ＦｄｘｒおよびΗｓｐ１０）の免疫沈殿法および免疫ブロット検出。フィルタは、各標的タンパク質に対する抗血清でプローブした。内在的Ｆｈｉｔは、Ｈｓｐ１０およびＦｄｘｒと共沈殿した。
【図３−１】図３Ａ−Ｄは、Ｈｓｐ６０／Ｈｓｐ１０のノックダウンは、ミトコンドリア中のＦｈｉｔのレベルを低下する。図３Ａは、Ｈ６抗体を使用した、細胞成分分画（サイトゾルおよびミトコンドリア）への、ＡｄＦＨＺＴ−ＨｉＳ６に感染させたＡ５４９細胞のニッケル−Ｈ６プルダウン実験を示す。
【図３−２】図３Ｂは、１〜１２時間のＣＨＸ追跡（３０μｇ／ｍｌ）後のＦｈｉｔ、Ｈｓｐ６０、およびＨｓｐ１０レベルを示す。
【図３−３】図３Ｃは、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、Ｆｈｉｔ、ＧＡＰＤＨ、およびＣｏｘＩＶ抗血清を用いた、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０  ｓｉＲＮＡでの形質移入の７２時間後、およびＭＯＩ１でのＡｄＦＨＩＴ感染の２４時間後の、Ａ５４９細胞のサイトゾル／ミトコンドリアのタンパク質分画の免疫ブロット分析。図３Ｄは、「内在的」Ｆｈｉｔ複合タンパク質の細胞成分分画および免疫沈殿法。
【図４−１】図４Ａ〜Ｆは、Ｆｈｉｔ発現は、過酸化物での細胞の処理後、細胞内ＲＯＳ生成を誘導する。図４Ａは、５時間のＨ２Ｏ２処理をした、およびその処理をしない、ＦＨＩＴプラスミドでの形質移入の４８時間後の、Ａ５４９細胞におけるＲＯＳ評価についての蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析。図４Ｂは、Ｄ１およびＥ１細胞における、ヒドロエチジンの酸化から産生された蛍光によるＲＯＳ評価についてのＦＡＣＳ分析。
【図４−２】図４Ａ及びＢの続きを示す。
【図４−３】図４Ｃは、ストレス条件化での、Ｈ１２９９  Ｆｈｉｔ発現細胞（Ｄ１）の緑色蛍光ＤＣＦシグナルの上昇。図４Ｄは、ＭＴＳ細胞の生死判別検定を、Ｅ１およびＤ１細胞に行った。
【図４−４】図４Ｅは、酸化ストレス処理の４８時間後の、Ｄ１およびＥ１の細胞周期動態のＦＡＣＳ分析。図４Ｆは、５ｍＭのＰｏｎＡでの刺激、および示した濃度での５時間のＨ２Ｏ２処理後の、Ｈ１２９９／Ｄ１およびＨ１２９９／Ｅ１細胞のコロニー形成検定。
【図５−１】図５Ａ〜Ｈは、Ｆｈｉｔウイルス形質導入によって誘発されたアポトーシスは、そのＦｄｘｒとの相互作用によって媒介され得る。図５Ａは、Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤＨに対する抗血清を用いた免疫ブロット分析。ＰｏｎＡでの処理の４８時間後、Ｅ１（対照）およびＤ１細胞からタンパク質を抽出した。図５Ｂは、２５μＭの、プロテアソーム阻害因子であるＭＧ１３２での４時間の処理後の、Ｄ１およびＥ１細胞におけるＦｄｘｒ発現の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨ検出は、等しいタンパク質装填を示す。
【図５−２】図５Ｃは、Ｆｈｉｔを発現するＤ１、および４〜１２時間のＣＨＸ追跡（３０μｇ／ｍｌ）後のＦｄｘｒレベルを示す、Ｅ１細胞における、Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤＨの免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨレベルに基づくデンシトメトリーは、Ｆｈｉｔ存在下におけるＦｄｘｒの安定性の増強を示す。
【図５−３】図５Ｄは、ＭＯＩ５０および１００でＡｄＦＨＩＴ感染後の、ＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−細胞周期動態のＦＡＣＳ分析。実験は、感染の４８時間後に行い、３回繰り返し、同様の結果を得た。ＡｄＧＦＰ感染細胞のプロファイルは、非感染細胞のものと同様であった（図示せず）。
【図５−４】図５Ｄの続きを示す。
【図５−５】図５Ｄの続きを示す。
【図５−６】図５Ｅは、ＭＯＩ５０および１００でＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−をＡｄＦＨＩＴに感染させた後、Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤΗの発現を示す、免疫ブロット分析。図５Ｆは、ＭＯＩ５０でのＡｄＦＨＩＴの４８時間後のＦＤＸＲ発現についての、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図５−７】図５Ｇは、カスパーゼ３およびＰａｒｐ１の活性化。図５Ｈは、Ｆｈｉｔおよびシトクロムｃ抗血清を使用した、ＭＯＩ５０でＡｄＦＨＩＴおよびＡｄＧＦＰに感染させた４８、７２、および９６時間後の、ＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞からのサイトゾル／ミトコンドリア分画の免疫ブロット分析。
【図６−１】図６Ａ〜Ｅは、Ｆｈｉｔは、癌細胞のパクリタキセルおよびシスプラチンへの感受性を増強する。Ｅ１およびＤ１細胞にＭＴＳ検定を行った。細胞をＰｏｎＡで４８時間処理し、次いでパクリタキセル（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）（図６Ａ）またはシスプラチン（０．０５〜０．２ｍＭ）（図６Ｂ）で２４または４８時間処理した。
【図６−２】図６Ａ及び６Ｂの続きを示す。
【図６−３】図６Ｃ及びＤは、グラフは、Ｅ１およびＤ１細胞のフローサイトメトリー分析の代表的な結果を示す。細胞をＰｏｎＡで４８時間、次いでパクリタキセル（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｃ）またはシスプラチン（０．０５〜０．２ｍＭ）（図６Ｄ）で処理した。
【図６−４】図６Ｅは、カスパーゼ３およびＰａｒｐ１切断：Ｆｈｉｔ、カスパーゼ３、およびＰａｒｐ１抗血清を使用した、４８時間のパクリタキセル（５０および１００ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチン（０．０５および０．１ｍＭ）での処理後の、ＰｏｎＡで誘導したＤ１細胞からの全ての細胞溶菌液の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨは、装填対照としての役割を果たした。
【図７】表１  質量分析法によって単離された候補タンパク質パートナー。Ａ５４９  ＡｄＦＨＩＴ−Ｈ６感染細胞試料内で選択的に捕獲されたタンパク質。同定されたペプチドのアミノ酸配列、Ｍａｓｃｏｔスコア、およびタンパク質配列包括度を列挙する。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、Ａｄ−Ｈｉｓ６の生物活性は、ＡｄＦＨＩＴと同等である。図８Ａは、ＭＯＩ２０でＡｄ−Ｈｉｓ６に感染させた、Ａ５４９細胞のウェスタンブロット分析。抗ペンタＨｉｓおよび抗Ｆｈｉｔ血清によって、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓタンパク質が検出された。
【図８−２】図８Ｂは、ＭＯＩ１５でＡｄ−Ｈｉｓ６に感染させた９６時間後の、Ａ５４９細胞のフローサイトメトリー分析。
【図８−３】図８Ｂの続きを示す。
【図８−４】図８Ｂの続きを示す。
【図８−５】図８Ｂの続きを示す。
【図８−６】図８Ｃは、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６の生体内架橋。
【図９Ａ】図９Ａは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。
【図１０】表２、Ｆｈｉｔは、ＭＫＮ７４胃癌細胞中のＲＯＳの生成を誘導する。
【００１１】
図１Ａ〜１Ｈ：サイトゾルおよびミトコンドリアにおけるＦｈｉｔタンパク質の細胞下局在性。
【００１２】
図１Ａ：４８時間ＰｏｎＡで処理したＨ１２９９細胞（Ｄ１）に、抗Ｆｈｉｔ血清を用いて免疫蛍光顕微鏡法を行い、フルオレセインイソチオシアネート（緑）と共役した抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を使用してＦｈｉｔ染色を検出し、ミトコンドリアを同定するＭｉｔｏ−Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ染色は、Ｆｈｉｔとの部分的共存を示す。４つ目の枠（右下）の黄色は、共存点を示す。
【００１３】
図１Ｂ：ペンタ−Ｈｉｓ抗体で行ったＡ５４９のＡｄＦＨＩＴ（左）またはＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６−感染細胞（右）の免疫電子顕微鏡法は、Ｆｈｉｔのミトコンドリア局在（右）を示し、ＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９細胞は対照としての役割を果たし、わずかに散在する粒子のみを示す（左枠）。
【００１４】
図１Ｃ：抗Ｆｈｉｔを使用した、ＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９の細胞成分分画の免疫ブロット分析は、サイトゾル、膜、細胞骨格、およびミトコンドリアにおけるＦｈｉｔタンパク質の分布を示す。
【００１５】
図１Ｄ：炭酸ナトリウム（図１Ｅ）およびジギトニン（図１Ｆ）の濃度を上昇させて処理後にＡｄＦＨＴＴ−ＨｉＳ６に感染させた、Ａ５４９細胞のミトコンドリアからのタンパク質の免疫ブロット分析は、Ｆｈｉｔがミトコンドリアマトリックス内に主として分布していることを示し、フィルタはＦｈｉｔおよびＣｏｘＩＶ抗血清でプローブし、図１Ｆの列は、０、０．１０、０．１５、および０．２０％のジギトニンで処理後の上澄みを表す。
【００１６】
図１Ｇ：ＭＫＮ７４／Ｅ４およびＭＫＮ７４／Ａ１１６細胞からの細胞成分分画の免疫ブロット分析（外来的Ｆｈｉｔを安定に発現する）、および図１Ｈ：抗Ｆｈｉｔを使用したＨＣＴ１１６（内在的Ｆｈｉｔ陽性結腸癌細胞株）は、Ｆｈｉｔのミトコンドリア局在を確認し、ＧＡＰＤＨおよびＣｏｘＩＶ抗血清は対照としての役割を果たした。
【００１７】
図２Ａ〜Ｆ：外来的および内在的Ｆｈｉｔは、内在的Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒタンパク質との複合体を形成する。組み換えＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質で単離したタンパク質複合体を、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｈｓｐ６０（図２Ａ）、Ｈｓｐ１０（図２Ｂ）、およびＦｄｘｒ（図２Ｃ）に対して抗血清でプローブし、ミトコンドリアの単離後に調製された後者の枠では、Ｆｈｉｔがミトコンドリア内で時間依存的にＦｄｘｒを動員することが示されている。フィルタには、ＤＳＰを用いて、または用いずに、Ａ５４９細胞をＡｄＦＨＺＴ−ＨｉＳ６に感染させた後に単離したタンパク質を装填した。
【００１８】
図２Ｄ：Ａ５４９細胞をＡｄＦＨＩＴに感染させた後の、抗Ｈｓｐ６０を用いた共免疫沈殿法、フィルタはＨｓｐ６０、Ｆｈｉｔ、およびＨｓｐ１０抗血清でプローブした。
【００１９】
図２Ｅ：Ａ５４９細胞をＶ５タグ付加ＦＤＸＲ遺伝子およびＦＨＴＴプラスミドで同時形質移入し、免疫沈殿法は、抗Ｖ５を用い、検出は、ＦｄｘｒおよびＦｈｉｔ抗血清を用いた。
【００２０】
図２Ｆ：ＤＳＰで処理したＦｈｉｔ陽性ΗＣＴ１１６細胞からの、内在的相互作用タンパク質（ＦｄｘｒおよびΗｓｐ１０）の免疫沈殿法および免疫ブロット検出。フィルタは、各標的タンパク質に対する抗血清でプローブした。内在的Ｆｈｉｔは、Ｈｓｐ１０およびＦｄｘｒと共沈殿した。
【００２１】
図３Ａ〜Ｄ：Ｈｓｐ６０／Ｈｓｐ１０のノックダウンは、ミトコンドリア中のＦｈｉｔのレベルを低下する。
【００２２】
図３Ａ：Ｈ６抗体を使用した、細胞成分分画（サイトゾルおよびミトコンドリア）への、ＡｄＦＨＺＴ−ＨｉＳ６に感染させたＡ５４９細胞のニッケル−Ｈ６プルダウン実験、溶菌液をニッケルビーズで培養し、ＤＳＰで架橋したＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質複合体を単離し、４〜２０％のポリアクリルアミドゲルに装填した。感染の２４時間後、Ｈｓｐ６０−Ｆｈｉｔ複合体は、両方の区画に存在し、感染の４８時間後、該複合体は再び両方の区画で検出可能であり、Ｆｈｉｔ複合タンパク質の増加は、ミトコンドリアにわずかな増加を伴い、ＡｄＦＨＴＴ−Ｈｉｓ６感染の４８時間後のＦｈｉｔタンパク質の増加と関連するとみられる（入力試料へのデンシトメトリー分析を行った）。
【００２３】
図３Ｂ：１〜１２時間のＣＨＸ追跡（３０μｇ／ｍｌ）後のＦｈｉｔ、Ｈｓｐ６０、およびＨｓｐ１０レベルを示す、７２時間のＨｓｐ６０／Ｈｓｐ１０発現抑制後の、Ｆｈｉｔ陽性Ｄ１細胞中のＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤＨの免疫ブロット分析。
【００２４】
図３Ｃ：Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、Ｆｈｉｔ、ＧＡＰＤＨ、およびＣｏｘＩＶ抗血清を用いた、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０  ｓｉＲＮＡでの形質移入の７２時間後、およびＭＯＩ１でのＡｄＦＨＩＴ感染の２４時間後の、Ａ５４９細胞のサイトゾル／ミトコンドリアのタンパク質分画の免疫ブロット分析。Ｈｓｐ６０／１０の発現抑制は、Ｆｈｉｔのサイトゾルレベルに影響を及ぼすとは見られないが、ミトコンドリア分画ではＦｈｉｔの減少に関連する。スクランブル（Ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【００２５】
図３Ｄ：「内在的」Ｆｈｉｔ複合タンパク質の細胞成分分画および免疫沈殿法。ＰｏｎＡで誘導したＤ１およびＥ１細胞を、過酸化物で処理し、および過酸化物で処理せず、サイトゾルおよびミトコンドリアに分画し、誘導の４８時間後にＦｈｉｔおよび相互作用因子（左側）の存在について細胞成分分画を評価し、１列当たり２５μｇのタンパク質を装填した。内在的Ｈｓｐ６０は、ＦｈｉｔおよびＦｄｘｒと共沈殿した。
【００２６】
図４Ａ〜Ｆ：Ｆｈｉｔ発現は、過酸化物での細胞の処理後、細胞内ＲＯＳ生成を誘導する。
【００２７】
図４Ａ：５時間のＨ２Ｏ２処理をした、およびその処理をしない、ＦＨＩＴプラスミドでの形質移入の４８時間後の、Ａ５４９細胞におけるＲＯＳ評価についての蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析。空ベクターで形質移入した細胞が、対照としての役割を果たした。Ｏ２によるヒドロエチジンの酸化の結果としての、エチジウムの蛍光により、細胞内超酸化物を判定した。Ｍ２は、ＲＯＳ陽性細胞の分画を指す。
【００２８】
図４Ｂ：Ｄ１およびＥ１細胞における、ヒドロエチジンの酸化から産生された蛍光によるＲＯＳ評価についてのＦＡＣＳ分析、ＰｏｎＡ処理の４８時間後、０．５および１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で５時間細胞を処理し、酸化ストレスを測定し、陽性％は、ＲＯＳを示す、蛍光細胞の分画を指す。これらの実験は、３回繰り返され、同様の結果を得た。
【００２９】
図４Ｃ：ストレス条件化での、Ｈ１２９９  Ｆｈｉｔ発現細胞（Ｄ１）の緑色蛍光ＤＣＦシグナルの上昇。Ｅ１およびＤ１細胞のＦｈｉｔ誘導の４８時間後、および５時間のＨ２Ｏ２処理後、ＲＯＳの存在下、非常に緑色の蛍光色素ＤＣＦに酸化され得るＲＯＳ指標である、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートを用いて細胞を培養した（拡大４０倍）。
【００３０】
図４Ｄ：ＭＴＳ細胞の生死判別検定を、Ｅ１およびＤ１細胞に行った。細胞をＰｏｎＡで４８時間、次いでＨ２Ｏ２の濃度を上昇させて（０．１２５、０．２５、および０．５ｍＭ）、４時間処理した。Ｈ２Ｏ２処理の２４時間後に分析した。縦棒は、４回の実験の平均＋ＳＥを記録する。各点を四重に測定し、標準偏差を算出し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００３１】
図４Ｅ：酸化ストレス処理の４８時間後の、Ｄ１およびＥ１の細胞周期動態のＦＡＣＳ分析。細胞をＰｏｎＡで４８時間、次いでＨ２Ｏ２の濃度を上昇させて（０．２５および０．５ｍＭ）、４時間処理した。Ｈ２Ｏ２処理の４８時間後に分析した。すべての実験を三重にして２回行った。
【００３２】
図４Ｆ：５ｍＭのＰｏｎＡでの刺激、および示した濃度での５時間のＨ２Ｏ２処理後の、Ｈ１２９９／Ｄ１およびＨ１２９９／Ｅ１細胞のコロニー形成検定。
【００３３】
図５Ａ〜Ｈ：Ｆｈｉｔウイルス形質導入によって誘発されたアポトーシスは、そのＦｄｘｒとの相互作用によって媒介され得る。
【００３４】
図５Ａ：Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤＨに対する抗血清を用いた免疫ブロット分析。ＰｏｎＡでの処理の４８時間後、Ｅ１（対照）およびＤ１細胞からタンパク質を抽出した。
【００３５】
図５Ｂ：２５μＭの、プロテアソーム阻害因子であるＭＧ１３２での４時間の処理後の、Ｄ１およびＥ１細胞におけるＦｄｘｒ発現の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨ検出は、等しいタンパク質装填を示す。
【００３６】
図５Ｃ：Ｆｈｉｔを発現するＤ１、および４〜１２時間のＣＨＸ追跡（３０μｇ／ｍｌ）後のＦｄｘｒレベルを示す、Ｅ１細胞における、Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤＨの免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨレベルに基づくデンシトメトリーは、Ｆｈｉｔ存在下におけるＦｄｘｒの安定性の増強を示す。
【００３７】
図５Ｄ：ＭＯＩ５０および１００でＡｄＦＨＩＴ感染後の、ＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−細胞周期動態のＦＡＣＳ分析。実験は、感染の４８時間後に行い、３回繰り返し、同様の結果を得た。ＡｄＧＦＰ感染細胞のプロファイルは、非感染細胞のものと同様であった（図示せず）。
【００３８】
図５Ｅ：ＭＯＩ５０および１００でＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−をＡｄＦＨＩＴに感染させた後、Ｆｄｘｒ、Ｆｈｉｔ、およびＧＡＰＤΗの発現を示す、免疫ブロット分析。感染の４８時間後にタンパク質を抽出した。
【００３９】
図５Ｆ：ＭＯＩ５０でのＡｄＦＨＩＴの４８時間後のＦＤＸＲ発現についての、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。ＰＣＲ産物をＧＡＤＰＨおよびアクチン発現に正規化し、各点を四重に繰り返し、対照とＦｈｉｔ陽性試料との間の差異は有意ではなかった。
【００４０】
図５Ｇ：カスパーゼ３およびＰａｒｐ１の活性化。ＭＯＩ５０でＡｄＦＨＩＴおよびＡｄＧＦＰに感染させた４８、７２、および９６時間後の、Ｆｈｉｔ、カスパーゼ３、Ｐａｒｐ１抗血清を使用した、ΗＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞からの全ての細胞溶菌液の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨおよびＣｏｘＩＶは、内部タンパク質マーカーとしての役割を果たした。
【００４１】
図５Ｈ：Ｆｈｉｔおよびシトクロムｃ抗血清を使用した、ＭＯＩ５０でＡｄＦＨＩＴおよびＡｄＧＦＰに感染させた４８、７２、および９６時間後の、ＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞からのサイトゾル／ミトコンドリア分画の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンは、内部タンパク質マーカーとしての役割を果たした。
【００４２】
図６Ａ〜Ｅ：Ｆｈｉｔは、癌細胞のパクリタキセルおよびシスプラチンへの感受性を増強する。
【００４３】
Ｅ１およびＤ１細胞にＭＴＳ検定を行った。細胞をＰｏｎＡで４８時間処理し、次いでパクリタキセル（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）（図６Ａ）またはシスプラチン（０．０５〜０．２ｍＭ）（図６Ｂ）で２４または４８時間処理した。棒は、４回の実験の平均±ＳＥを記録する。各点を四重に測定し、標準偏差を算出し、図６Ａおよび図６Ｂ中の角括弧の近傍のアスタリスクは、Ｄ１およびＥ１細胞の薬物反応における統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００４４】
図６Ｃおよび６Ｄ：グラフは、Ｅ１およびＤ１細胞のフローサイトメトリー分析の代表的な結果を示す。細胞をＰｏｎＡで４８時間、次いでパクリタキセル（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｃ）またはシスプラチン（０．０５〜０．２ｍＭ）（図６Ｄ）で処理した。各データ点は、２４、４８、および７２時間の時点で三重に測定した（４８時間についてのデータを示す）。
【００４５】
図６Ｅ：カスパーゼ３およびＰａｒｐ１切断：Ｆｈｉｔ、カスパーゼ３、およびＰａｒｐ１抗血清を使用した、４８時間のパクリタキセル（５０および１００ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチン（０．０５および０．１ｍＭ）での処理後の、ＰｏｎＡで誘導したＤ１細胞からの全ての細胞溶菌液の免疫ブロット分析。ＧＡＰＤＨは、装填対照としての役割を果たした。
【００４６】
図７、表１：質量分析法によって単離された候補タンパク質パートナー。Ａ５４９  ＡｄＦＨＩＴ−Ｈ６感染細胞試料内で選択的に捕獲されたタンパク質。同定されたペプチドのアミノ酸配列、Ｍａｓｃｏｔスコア、およびタンパク質配列包括度を列挙する。
【００４７】
図８Ａ〜８Ｃ：Ａｄ−Ｈｉｓ６の生物活性は、ＡｄＦＨＩＴと同等である。
【００４８】
図８Ａ：ＭＯＩ２０でＡｄ−Ｈｉｓ６に感染させた、Ａ５４９細胞のウェスタンブロット分析。抗ペンタＨｉｓおよび抗Ｆｈｉｔ血清によって、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓタンパク質が検出された。Ａｄ  ＦＨＩＴおよびＡｄ−Ｈｉｓ６は共に、ＦＨＩＴの下流の内部リボソームエントリー配列を介してＣＭＶ５プロモーターによって制御される、ＧＦＰ  ｃＤＮＡを保有する。γ−チューブリンを、試料の装填を正規化するために使用した。
【００４９】
図８Ｂ：ＭＯＩ１５でＡｄ−Ｈｉｓ６に感染させた９６時間後の、Ａ５４９細胞のフローサイトメトリー分析。上の枠は、感染細胞のサブＧ１  ＤＮＡ含有量を示し（実験は三重に繰り返され、サブＧｌ分画の平均値は、Ａｄ  ＦＨＩＴについては２２％＋／−４．３、Ａｄ−Ｈｉｓ６については２９％＋／−５、差異は統計的に有意ではなく、下の枠は、アポトーシスの指標である、成熟カスパーゼ−３を有する細胞の割合を示す。Ａｄ−Ｈｉｓ６に感染させたＡ５４９細胞中の細胞死の程度は、Ａｄ  ＦＨＩＴでの感染後に得た結果と同等である。
【００５０】
図８Ｃ：Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６の生体内架橋。４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した、Ｈｉｓ６プルダウンおよび架橋反転状態後の細胞溶菌液を用いたゲルの銀染色。内部の負の対照は、Ａｄ  ＦＨＩＴ感染細胞（架橋された、ＣＬ）およびＡｄ−Ｈｉｓ６感染細胞（架橋されない、ＮＴ）のＨｉｓ６プルダウンを含んだ。
【００５１】
図９Ａ〜９Ｆ：ナノボアＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した、候補Ｆｈｉｔタンパク質パートナーの初期検証。ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６および対照試料についての選択イオンクロマトグラム（ＳＩＣ）を示す。６つのＳＩＣ対は、１）６７２．８（保持時間３０分でのピークは、Ｈｓｐ６０に属するトリプシンペプチドＴＶＩＩＥＱＳＷＧＳＰＫ［配列番号５］として同定された）、２）６８５．４（保持時間３２分でのピークは、Ａｌｄｈ２に属するトリプシンペプチドＬＧＰＡＬＡＴＧＮＶＶＶＭＫ［配列番号２２］として同定された）、３）６１７．３（保持時間３９分でのピークは、Ｍｄｈに属するトリプシンペプチドＩＦＧＶＴＴＬＤＩＶＲ［配列番号１０］として同定された）、４）６５８．４（保持時間２６分でのピークは、Ｈｓｐ１０に属するトリプシンペプチドＶＬＱＡＴＶＶＡＶＧＳＧＳＫ［配列番号１９］として同定された）、５）５５１．７（保持時間２８分でのピークは、Ｅｔｆｂに属するトリプシンペプチドＥＩＤＧＧＬＥＴＬＲ［配列番号１５］として同定された）、６）５９８．３（保持時間２３分でのピークは、Ｆｄｘｒに属するトリプシンペプチドＦＧＶ  ＡＰＤＨＰＥＶＫ［配列番号２３］として同定された）の６つのｍ／ｚ値のイオン電流を記録する。赤の矢印で示した対象となるペプチドのみが、Ａｄ−Ｈｉｓ６試料中に存在する。
【００５２】
図１０、表２：Ｆｈｉｔは、ＭＫＮ７４胃癌細胞中のＲＯＳの生成を誘導する。ＲＯＳ評価を、ｐ５３突然変異対立遺伝子を保有し、外来的Ｆｈｉｔを発現するヒト胃癌細胞株である、ＭＫＮ７４Ａ１１６を用いて行い、Ｆｈｉｔ陰性ＭＫＮ７４Ｅ４細胞を対照として使用した。ＲＯＳ生成を誘導するために、ＭＫＮ７４細胞を５時間、０．５、１．０、および２．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理した。結果は、対照と比較して、外来的Ｆｈｉｔを発現する細胞内の有意に高いＲＯＳ生成率を示し、２ｍＭのＨ２Ｏ２処理後、Ｆｈｉｔ発現細胞内で毒性が観察された。数字は、４回の実験の平均±ＳＥを記録する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
前述の一般的な説明、および以下の詳細な説明は、共に例示的かつ説明的なものであるに過ぎず、本教示の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。本出願において、別途具体的に言及されていない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。
【００５４】
特許請求の範囲および／または本明細書において、「含む」という用語と併せて使用される、「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは複数の」の意味とも一致する。
【００５５】
また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、あるいは例えば、限定されないが、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等の、それらの基語の修飾形の使用は、限定的であることを意図しない。「および／または」という用語は、前または後の用語が、併せて、または別々に解釈され得ることを意味する。説明目的であって、制限するものではないが、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」、または「ＸおよびＹ」を意味し得る。
【００５６】
本明細書で使用される「それらの組み合わせ」という用語は、該用語に先行する列挙された事項の全ての順列および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、および特定の文脈において順序が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むことを意図する。
【００５７】
本明細書において代替可能に用いられる、「遺伝子産物」、「ＤＮＡ」、および「遺伝子」は、本明細書において代替可能に用いられる。
【００５８】
本明細書において、以下の略語が使用される場合がある：ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＤＳＰ、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法；Ｆｄｘｒ、フェレドキシン還元酵素；ＰｏｎＡ、ポナステロンＡ；ＭＯＩ、感染多重度；ＲＯＳ、活性酸素種；ＦＵ、５−フルオロウラシル；ＤＣＦＨ−ＤＡ、ジクロロフルオレセインジアセテート；ＤＣＦ、２’，７’−ジクロロフルオレセイン；ＣＨＸ、シクロヘキシミド；ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ；ＲＴ、逆転写酵素；ＭＴＳ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム。
【００５９】
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的であるに過ぎず、説明される主題を多少なりとも制限するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍、論文、およびインターネットウェブページを含む、本出願において引用される全ての文献および類似資料は、いかなる目的に対しても、参照することによりその全体が明示的に組み込まれる。組み込まれる文献および類似資料のうちの１つ以上が、本出願における用語の定義と矛盾するように、当該用語を定義または使用するような場合は、本出願が優先される。
【００６０】
Ｆｈｉｔタンパク質はほとんどの癌において失われ、その回復は腫瘍形成能を抑制し、ウイルス媒介性のＦｈｉｔ遺伝子療法はアポトーシスを誘導し、前臨床モデルにおいて腫瘍を抑制する。タンパク質架橋およびプロテオミクス法を使用して、Ｆｈｉｔ媒介性アポトーシスの誘発に関与するＦｈｉｔタンパク質複合体を特徴付ける。該複合体は、Ｆｈｉｔ安定性を媒介し、ミトコンドリアへの移入に影響を及ぼし得る、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０を含み、そこでは、フェレドキシンを介するＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０への電子の伝達を担う、フェレドキシン還元酵素と相互作用する。ウイルス媒介性Ｆｈｉｔ回復は、細胞内活性酸素種の産生を増加し、その後酸化ストレス条件下で肺癌細胞のアポトーシスを増加させるが、逆に、Ｆｈｉｔ陰性細胞はアポトーシスを回避し、突然変異率の増加に寄与し得る重篤な酸化的ＤＮＡ損傷を生じさせる。Ｆｈｉｔと相互作用するタンパク質の特徴付けにより、Ｆｈｉｔの損失によってほとんどの癌において失われる、Ｆｈｉｔ媒介性アポトーシス経路の直接的なエフェクターが同定された。
【００６１】
Ｆｈｉｔと相互作用するタンパク質に関する初期の探索では、Ｕｂｃ９、α−チューブリン、およびＭｄｍ２（３５〜３７）を含む、いくつかの候補タンパク質が指摘されたが、共免疫沈降法の実験によってそのいずれをも相互作用因子として確認することはできなかった。Ｆｈｉｔタンパク質相互作用因子の問題に対処するために、架橋後のＦｈｉｔ複合体の精製のためのアデノウイルスを形質導入したＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６を使用し、Ｆｈｉｔ連結タンパク質、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒを同定し、これらのタンパク質の細胞下位置は、ミトコンドリアがＦｈｉｔ活性の増殖巣であり得ることを示唆した。分子シャペロンとしてのＨｓｐ「ストレスタンパク質」は、タンパク質移行、フォールディング、および集合等の機能を行う（３８）。Ｆｈｉｔは、ＡｄＦＨＩＴ感染後、Ｈｓｐ６０／Ｈｓｐ１０と相互作用するという所見は、Ｈｓｐ複合体が、Ｆｈｉｔの安定性、および恐らくアポトーシス経路の活性化の前に、それをミトコンドリアへ移入するための正しいフォールディングにとって重要であり得ることを示唆し、その示唆について、ＡｄＦＨ／Ｔ感染肺癌細胞におけるＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、または両方の発現をノックダウンすることによって調査し、Ｆｈｉｔの安定性を、誘導可能なＦｈｉｔを発現する肺癌細胞株である、Η１２９９  Ｄ１細胞におけるＣＨＸ追跡後、評価した。Ｈｓｐ６０および１０の両方のノックダウン後、単離したミトコンドリア中のＦｈｉｔタンパク質のレベルは低下し、ＦｈｉｔとＨｓｐ６０／１０との相互作用が、Ｆｈｉｔの安定化および／またはミトコンドリアへの移入のための正しいフォールディングに関与するという提案を強固なものとしている。
【００６２】
ＨＣＴ１１６結腸癌細胞におけるＦＤＸＲ遺伝子の標的破壊は、それが生存能にとって必須であり、つまり、遺伝子コピー数の減少は、５−フルオロウラシル誘導アポトーシスに対する感受性の低下をもたらし（２９）、ＦＤＸＲは、ｐ５３ファミリーの標的遺伝子である（３０）。Ｈ２Ｏ２、５−フルオロウラシル、およびドキソルビシン誘導細胞死に対する、Ｆｄｘｒで感作した結腸癌細胞の過剰発現は、Ｆｄｘｒが、ミトコンドリア内の酸化ストレスの生成を介してｐ５３媒介性アポトーシスに寄与することを示している。故に、活性化されたｐ５３は、部分的にＲＯＳによる細胞ストレスに応じてアポトーシスを誘導し、同時にｐ５３はＦＤＸＲ遺伝子の転写を増加させ、次にこれがＲＯＳ誘導アポトーシスを増加させることによってｐ５３機能を強化する（２９、３０）。
【００６３】
ここで、本明細書で示すものは、ミトコンドリア分画におけるＦｈｉｔの存在であり、Ｆｈｉｔが過剰発現するか、またはＦｈｉｔを発現する細胞がストレスを受けると、ＦｈｉｔはＦｄｘｒをプロテアソーム分解から保護することができ、Ｆｄｘｒタンパク質レベルの上昇につながり、これがＲＯＳの生成と関連し、その後アポトーシスに至る。ＦｈｉｔはＦＤＸＲの転写レベルには影響を及ぼさないが、タンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。Ｆｈｉｔおよびｐ５３の両方を欠失するＨ１２９９細胞では、Ｆｄｘｒの過剰発現がＲＯＳ誘導細胞死に対する感受性を増加させ、誘導可能なＦｈｉｔまたはｐ５３を発現するＨ１２９９細胞は、ＲＯＳ誘導細胞死に対する感受性があり、Ｆｈｉｔ、ｐ５３、または両方を欠失する癌細胞は、Ｆｄｘｒ発現を増加させる手段を欠き、酸化的損傷に対する感受性は低く、生存するであろう。
【００６４】
Ｆｄｘｒとの相互作用による、アポトーシスにおけるＦｈｉｔのミトコンドリア機能の発見は、ここで、ほとんどの癌において順次失われ、ＤＮＡ損傷に対する反応に関与する、重要な腫瘍抑制因子であるＦｈｉｔおよびｐ５３の機能的類似点に広がり、転写性Ｆｄｘｒ制御因子として作用するｐ５３と、転写後Ｆｄｘｒ制御因子として作用するＦｈｉｔとの間の差異を解明する。Ｆｈｉｔ抑制経路の直接的な下流エフェクターの概要説明は、Ｆｈｉｔ経路を活性化するための阻止および治療戦略に影響を与え得る、Ｆｈｉｔ機能の機序研究へとつながる。
【００６５】
ＲＯＳ生成がＦｈｉｔ媒介性アポトーシスにとって極めて重要であるという所見は、種々の臨床的設定における負の予後因子としてのＦｈｉｔ損失の重要性を強調し、例えば、前腫瘍性疾患または腫瘍性疾患におけるＦｈｉｔ状態の評価により、抗酸化剤治療に対する反応を予測し得る。
【００６６】
下流アポトーシス経路に影響を及ぼすＦｈｉｔと相互作用するタンパク質を同定するために、本発明者らは、本明細書において、肺癌細胞におけるウイルス媒介性Ｆｈｉｔ過剰発現後、細胞内でタンパク質を架橋し、Ｆｈｉｔに関連するタンパク質およびそれらによって影響を受ける経路を特徴付けた。
【００６７】
結果。
【００６８】
Ｆｈｉｔタンパク質複合体の単離−Ｆｈｉｔと相互作用するタンパク質を同定するために、Ｈｉｓ６エピトープタグをコードする配列でその３’末端を修飾した、ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを生成した（ＡｄＦＨＺｒ−ＨｉＳ６）。Ａ５４９細胞内で発現したこのタグ付加Ｆｈｉｔタンパク質の生物活性は、野生型のＦｈｉｔ活性と同等であった（図８）。
【００６９】
Ｆｈｉｔ誘導アポトーシスに敏感である（１０）、Ａ５４９肺癌由来細胞をＡｄＦＨＩＴまたはＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓβに感染させ、膜を横断し、生体内で複合体内のタンパク質を固定する架橋剤である、ＤＳＰで処理した。細胞を溶解し、Ｈｉｓ６エピトープタグに結合するニッケルビーズでタンパク質を単離した。精製したタンパク質をジチオスレイトールで処理し、ＤＳＰを切断し、複合体を解離し、トリプシンによって消化させ、タンパク質成分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定した（図７−表１および図９）。
【表１】
2011504093.tif 000002
【表２】
2011504093.tif 000003
【表３】
2011504093.tif 000004
【００７０】
全てミトコンドリア局在を伴う、Ｈｓｐ６０および１０、フェレドキシン還元酵素（Ｆｄｘｒ）、リンゴ酸脱水素酵素、電子伝達フラボタンパク質、ならびにミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素２の６つのタンパク質を同定し、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０は、サイトゾル内にも分布する（２３）。
【００７１】
Ｆｈｉｔ細胞下局在性−候補Ｆｈｉｔ相互作用因子はミトコンドリアタンパク質であるため、本発明者らは、本明細書において、ミトコンドリア局在シグナルを欠くＦｈｉｔが、これらの細胞小器官に局在するかどうかを判定した。誘導可能なＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有するＦｈｉｔ陰性Ｈ  １２９９肺癌細胞（Ｄ１細胞）を、誘導因子であるＰｏｎＡで４８時間処理し、抗Ｆｈｉｔ血清およびミトコンドリアマーカーであるＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ５８０を使用して、Ｆｈｉｔ細胞下位置の間接的免疫蛍光検出を評価し、Ｆｈｉｔ蛍光シグナル（緑染色、図１Ａ）は細胞質であり、部分的にＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ色素と共存し（黄染色、図１Ａ、右下）、外来的Ｆｈｉｔがミトコンドリアおよびサイトゾルに局在化したことを示す。抗Ｆｈｉｔ特異性を、Ｆｈｉｔ陰性Ｈ１２９９クローンＥ１細胞における緑色蛍光の不在によって確認した（図示せず）。ミトコンドリア局在を確認するために、ＭＯＩ２０でＡｄＦＨＩＴ−ＨｉＳ６またはＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９細胞を、抗ペンタＨｉｓ染色によって、４８時間後に免疫電子顕微鏡法で調べ、ＦｈｉｔＨｉｓ６を形質導入した細胞は、ミトコンドリア内に有意な数の金粒子を示したが（図１Ｂ、右枠）、ＡｄＦＨ／Ｔを形質導入した細胞は、まばらな反応性を示した（図１Ｂ、左枠）。
【００７２】
Ｆｈｉｔのミトコンドリア内局在を評価するために、ミトコンドリアを、前述の通りＭＯＩ１でＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９細胞から精製した。炭酸ナトリウム手順は、膜のオープンシートの生成の誘導後、細胞内膜から可溶性タンパク質と表在性膜タンパク質の両方の上澄みにおいて、効果的な放出を可能にする、非破壊的手法であり、さらに、これにより、該膜と共に内在性タンパク質の回復が可能になる（ペレット）（２４）。
【００７３】
図１Ｅは、Ｆｈｉｔが、溶解性分画においてのみ検出可能であったことを示す。Ｆｈｉｔのミトコンドリア内局在をさらに定義するために、膜間腔およびマトリックス内に含まれるタンパク質を放出する、ミトコンドリアの外膜を選択的に破壊するように、ミトコンドリアを０．１０％および０．１５％のジギトニンで処理し、図１Ｆに示すように、外膜および内膜の緩やかな破壊により、Ｆｈｉｔタンパク質の放出量が増加し、Ｆｈｉｔが、内膜の腔側またはミトコンドリアのマトリックスのいずれかに主に分布することを示唆する。外来的Ｆｈｉｔを安定に発現する胃癌由来ＭＫＮ７４Ａ１１６細胞（９）、および内在的Ｆｈｉｔを発現するＨＣＴ１１６結腸癌細胞において、ミトコンドリア局在を確認した（図１Ｇおよび図１Ｈ）。
【００７４】
ＦｈｉｔはＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒと相互作用する−候補相互作用タンパク質のうち、本発明者らは、可能性があるシャペロニンとしてＨｓｐ６０およびＨｓｐ１０に、そしてｐ５３によりトランス活性化され、治療薬に対する反応に関与する、ミトコンドリアの呼吸鎖タンパク質である、Ｆｄｘｒに焦点を合わせた（２５）。相互作用を検証するために、Ａ５４９細胞を、ＤＳＰを用いて、または用いずに、ＭＯＩ２０でＡｄＦＨＩＴまたはＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６に感染させた。Ｆｈｉｔ複合体をＨｉＳ６タグによって精製し、同時精製されたタンパク質をＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｄｘｒに対する抗血清で検出し、Ｈｓｐ６０およびＦｄｘｒは、ＤＳＰに曝露した細胞の溶菌液においてのみ検出されたが（図２Ａおよび図２Ｃ）、Ｈｓｐ１０は、架橋なしでも検出された（図２Ｂ）。
【００７５】
感染後の経時的実験は、ＦｈｉｔによるＦｄｘｒの動員を示し（図２Ｃ）、また、内在的Ｈｓｐ６０は、ＤＳＰの不在下でＦｈｉｔおよびＨｓｐ１０を共免疫沈降させた（図２Ｄ）。
【００７６】
相互作用の特異性を検証するために、３’Ｖ５エピトープタグを持つＦＤＸＲ  ｃＤＮＡ発現プラスミドを精製した。Ａ５４９細胞にＦＤＸＲ−Ｖ５およびＦＨＩＴプラスミドを同時形質移入し、タンパク質をモノクローナル抗Ｖ５で沈殿させ、共沈Ｆｈｉｔは、ＤＳＰ架橋後にのみ検出可能であった（図２Ｅ）。
【００７７】
これらのタンパク質も内在的Ｆｈｉｔと相互作用するかどうかを判定するために、本発明者らは、ＤＳＰで処理したＦｈｉｔ陽性ＨＣＴ１１６細胞から、各内在的候補相互作用タンパク質を免疫沈降させ、内在的Ｆｈｉｔの共沈を探した（図２Ｆ）。
【００７８】
内在的ＦｈｉｔはＨｓｐ１０およびＦｄｘｒと共沈し、ミトコンドリア内の内在的Ｆｈｉｔの存在、およびストレスの不在下での内在的シャペロンおよび呼吸鎖タンパク質とのその相互作用を確認した。
【００７９】
Ｈｓｐ６０／１０相互作用はＦｈｉｔの安定性および／またはミトコンドリアの移入に影響を及ぼす−Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０は、複合体において見られる分子シャペロンであり（２６）、フォールディングおよびタンパク質のミトコンドリアへの移入にとって重要であり得る。本発明者らは、本明細書において、Ｈｓｐ６０／１０複合体が、Ｆｈｉｔの正しいフォールディングおよびミトコンドリアのアドレスを担ったと考える。
【００８０】
これらの相互作用の位置を調査するために、Ａ５４９細胞をＭＯＩ５でＡｄＦＨＴＴ−ＨｉＳ６に感染させ、架橋後、サイトゾルおよびミトコンドリア分画からタンパク質溶菌液を収集した。複合体をＦｈｉｔ−Ｈ６−ニッケルプルダウンにより単離し、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、フィルタをＨｓｐ６０およびＦｈｉｔ抗血清でプローブした。感染の２４および４８時間後、Ｈｓｐ６０との相互作用がサイトゾルおよびミトコンドリア内で観察され（図３Ａ）、図３Ａに示すように、これらの時点のＦｈｉｔ発現の増加（入力）と比例する。
【００８１】
Ｆｈｉｔ−Ｈｓｐ６０／１０相互作用がＦｈｉｔタンパク質の安定に重要であるかどうかを判定するために、誘導可能なＦｈｉｔ発現を伴うＨ１２９９（Ｄ１細胞）に、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０のｓｉＲＮＡを形質移入し、形質移入の７２時間後、１、６、および１２時間でＣＨＸ追跡を行い、Ｆｈｉｔタンパク質発現を評価し、スクランブル配列を形質移入した細胞と比較した。
【００８２】
図３Ｂに示すように、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０の発現抑制後、ＣＨＸの６および１２時間では、Ｆｈｉｔ発現は大幅に減少している（１および１２時間でそれぞれ１から０．４へ）。次に、Ｈｓｐ６０および１０のｓｉＲＮＡを個々に、または組み合わせてＡ５４９細胞に形質移入し、２４時間後、細胞をＭＯＩ１でＡｄＦＨＩＴに感染させて、サイトゾルおよびミトコンドリアを２４時間後に分画した。両方のＨｓｐの発現の抑制後、Ｆｈｉｔレベルは、サイトゾル中では影響を受けなかったが、対照と比較して、ミトコンドリア中では減少し（図３Ｂ）、Ｈｓｐ６０／１０複合体は、ウイルスによって形質導入したＦｈｉｔの安定化およびミトコンドリア局在を媒介し得ることを示す。Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０が、Ｆｈｉｔのウイルスによる形質導入後のＦｈｉｔの安定化に関与するならば合、Ｆｈｉｔの少ない細胞区画は、Ｆｈｉｔの安定性の低下により影響を受けるであろうことも、事実である。また、本発明者らは、本明細書において、Ｆｈｉｔ陰性Ｅ１細胞を対照として用いて、誘導可能なＦｈｉｔを発現するＨ１２９９  Ｄ１細胞内のＦｈｉｔ複合体を調べ、Ｄ１細胞におけるＦｈｉｔ誘導の４８時間後（図３Ｃ、左枠）、Ｆｈｉｔ複合タンパク質の分布は、Ｈ２Ｏ２を伴う、および伴わない、Ｄ１およびＥ１細胞のサイトゾルおよびミトコンドリアにおいて同様であった。
【００８３】
Ｈ２Ｏ２を伴う、または伴わない、ＰｏｎＡ誘導の４８時間後、Ｈｓｐ６０を、これらの細胞の全ての細胞溶菌液から免疫沈降させ、ＦｈｉｔおよびＦｄｘｒを共沈した（図３Ｃ、右枠）。Ｄ１細胞におけるＦｈｉｔ発現の誘導は、生体外生物学的変化を生じず、故に、Ｆｈｉｔ複合体は、アポトーシスの結果としては形成されない。ストレス条件で、およびストレス条件なしで、ＰｏｎＡ誘導Ｆｈｉｔ発現後、Ｄ１細胞に経時的実験を行い、Ｆｈｉｔタンパク質相互作用因子における生物学的変化があるかどうかを判定した。共同発明者らは、Ｆｈｉｔ発現後、局在性における変化を検出しなかった。
【００８４】
Ｆｈｉｔは活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を誘導する−５４ｋＤａのフラボタンパク質であるＦｄｘｒは、ミトコンドリア内膜のマトリックス側に位置し、ＮＡＤＰＨから、単一電子シャトルフェレドキシン−シトクロムＰ４５０を介して、基質への電子の伝達を担う（２７）。基質制限条件下、電子がこのシャトル系から漏れ、ＲＯＳを生成する（２８）。Ｆｄｘｒは、ＲＯＳの生成（２９、３０）、強力な細胞内酸化体、およびアポトーシス制御因子（３１）を介して、結腸直腸癌細胞における、ｐ５３依存性の５−フルオロウラシル誘導アポトーシスを媒介する。
【００８５】
本発明者らは、本明細書において、次に、ＲＯＳ産生がＦｈｉｔ媒介性アポトーシスに関与し得るかどうかを判定するために調査した。Ｆｄｘｒの過剰発現は、ＲＯＳ産生を介して、Ｈ２Ｏ２処理時、腫瘍細胞のアポトーシスへの感受性を高める（２９、３０）。本発明者らは、ＦＨＩＴ発現プラスミドの一過性形質移入後、Ｈ２Ｏ２処理を伴う、およびそれを伴わない、Ａ５４９細胞におけるＲＯＳ産生を調べた。超酸化物によるヒドロエチジンの酸化の結果としてのエチジウム蛍光を測定することにより、細胞内超酸化物を評価した。Ｈ２Ｏ２の濃度を上昇させての刺激の５時間後、細胞内超酸化物を測定した。ＦＨＴＴを形質移入した細胞では、ＲＯＳ生成が約３倍高かった（０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で１６．７％対５．４％、および１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で１８．８％対７．７％）。２ｍＭのＨ２Ｏ２はＦｈｉｔ発現細胞には毒性であったが、非発現細胞に対しては毒性ではなかった（図４Ａ）。
【００８６】
それぞれＰｏｎＡで誘導可能なＦＨＩＴおよび空ベクター発現プラスミドを保有する、ｐ５３ならびにＦｈｉｔ陰性肺癌由来Ｈ１２９９  Ｄ１およびＥ１クローンについて、同様の実験を行い、細胞を５μＭのＰｏｎＡで処理し、４８時間の時点で０．５および１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理し、ＲＯＳ陽性細胞％は、Ｅ１対照細胞においてよりも、Ｆｈｉｔ陽性Ｄ１細胞において高かった（それぞれ、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で２０％対３．５％、および１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で７８％対２５％）（図４Ｂ）。
【００８７】
これらの結果は、突然変異体ｐ５３を発現し（３２）、外来的Ｆｈｉｔを安定に発現する（９）、ヒト胃癌由来細胞であるＭＫＮ７４Ａ１１６（図１０）を用いた実験と同等であった。
【００８８】
酸化ストレスの間の、Ｆｈｉｔ再構成後のＲＯＳの生成をさらに研究するために、ＤＣＦＨ−ＤＡを使用して、Ｆｈｉｔを過剰発現する細胞の酸化還元状態を測定した。ペルオキシダーゼ、シトクロムｃ、およびＦｅ２＋は、Ｈ２Ｏ２の存在下、ＤＣＦＨ−ＤＡを蛍光２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）に酸化することができ、したがって、ＤＣＦは、Ｈ２Ｏ２レベルおよびペルオキシダーゼ活性を示す。ストレス条件下、Ｅ１細胞と比較して、Ｄ１細胞にＤＣＦ蛍光の増加が検出された（図４Ｃ）。
【００８９】
また、Ｆｈｉｔを発現する細胞におけるＨ２Ｏ２処理後の細胞生存率の低下を、Ｈ２Ｏ２処理の２４時間後、ＭＴＳ細胞毒性検定によって評価した。Ｈ２Ｏ２処理は、Ｅ１およびＤ１細胞の両方において、細胞生存率の低下または成長停止を生じさせたが、この表現型は、Ｄ１細胞においてより顕著であった（図４Ｄ）。
【００９０】
Ｆｈｉｔを伴う、または伴わないＨ２Ｏ２処理が、細胞生存率または細胞周期動態に影響を及ぼし得るかどうかを判定するために、フローサイトメトリーを行い（図４Ｅ）、Ｆｈｉｔがストレス条件下で存在する時には、０．２５および０．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理の４８時間後、同一条件下のＥ１細胞の２７．５％および２９％と比較して、それぞれ４５．５％および４９．５％にＧ２／Ｍ停止が一貫して増加した。
【００９１】
Ｇ２／Ｍ停止が細胞の長期生存率に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、コロニー検定を行った（図４Ｆ）。０．２５ｍＭ以上の濃度のＨ２Ｏ２に曝露後、Ｆｈｉｔを発現する細胞においてコロニーは検出されなかった。
【００９２】
Ｆｈｉｔ誘導ＲＯＳ生成はＦｄｘｒ依存性である−Ｆｈｉｔ媒介性ＲＯＳ生成におけるＦｄｘｒの役割を評価するために、本発明者らは、Ｆｈｉｔ誘導後のＤ１細胞中のＦｄｘｒレベルを調べ、Ｅ１細胞と比較して２．４倍増加した発現を観察し（図５Ａ）、この増加は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって判定されるように転写の増加によるものではなかった（図５Ｆ）。
【００９３】
次に、本発明者らは、プロテアソーム分解の阻害因子であるＭＧ１３２の存在下、Ｆｈｉｔ発現を伴う、またはそれを伴わない、Ｆｄｘｒレベルを測定し、ＭＧ１３２処理の４時間後、Ｅ１細胞と比較して、Ｄ１細胞においてＦｄｘｒタンパク質の有意な増加が観察され（図５Ｂ）、Ｆｈｉｔは、プロテアソーム分解からＦｄｘｒを保護することを示す。
【００９４】
Ｆｈｉｔタンパク質の存在下または不在下のＦｄｘｒ分解率を、４〜１２時間のＣＨＸ追跡により評価し（図５Ｃ）、Ｆｄｘｒ分解率は、有意な減少を伴わないＤ１細胞と比較して、Ｆｈｉｔ陰性Ｅ１細胞において高かった（１から０．３への減少）。故に、本発明者らは、本明細書において、Ｆｈｉｔは、Ｆｄｘｒタンパク質をプロテアソーム分解から保護することにより、その不安定化を阻止すると考える。
【００９５】
内在的野生型ｐ５３およびＦｈｉｔを発現し、３つのＦＤＸＲ対立遺伝子（ＦＤＸＲ＋／＋／＋）、および２つの対立遺伝子をノックアウトしたＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／−／−細胞を保有する、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞（２８）を使用して、ＡｄＦＨＩＴ誘導アポトーシスがＦｄｘｒ発現レベルによって影響を受けるかどうかを判定し、ＦＤＸＲヌル状態の生存率は、同等ではなかった（２９）。
【００９６】
これらの細胞をＭＯＩ５０または１００でＡｄＦＨＩＴに感染させ、感染の４８および７２時間後にアポトーシスについて評価した。野生型ＨＣＴ１１６細胞（ＦＤＸＲ＋／＋／＋）は、サブ−Ｇ１細胞の分画が、ＭＯＩ５０および１００で、それぞれ１２．１％および１８．８％であったように、外来的Ｆｈｉｔ媒介性アポトーシスに対して用量依存的に敏感であり、ＦＤＸＲ＋／−／−細胞は、サブ−Ｇ１集団がＭＯＩ５０および１００で４．７％および４．３％であり、４８および７２時間の時点で（データ図示せず）Ｆｈｉｔ誘導細胞死に対して不応性であった（図５Ｄ）。
【００９７】
Ｆｈｉｔ過剰発現は、ＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−細胞の両方においてＦｄｘｒタンパク質レベルの増加に通じ（図５Ｅ）、ＦＤＸＲ＋／−／−細胞は、感染の７２時間後までにＦｈｉｔ媒介性アポトーシスを生じた。
【００９８】
Ｆｄｘｒ発現のＦｈｉｔが媒介する増加は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって判定されるように、転写レベルにおいてではなく（図５Ｆ）、したがって、ｐ５３の転写活性化とは関連していなかった。
【００９９】
ＡｄＦＨＩＴ感染後にＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞において検出されたサブ−Ｇ１ピークが、アポトーシス誘導に関連していたかどうかをさらによく判定するために、カスパーゼ３およびＰａｒｐ１切断について４８、７２、および９６時間の時点で経時的実験を行い、ＡｄＧＦＰ感染細胞と比較した（図５Ｇ）。
【０１００】
カスパーゼ３切断および関連するＰａｒｐ１切断が、ウイルス媒介性のＦｈｉｔの過剰発現の４８、７２、および９６時間後に観察された。ＨＣＴ１１６細胞をＭＯＩ１００でＡｄＦＨＩＴに感染後、ミトコンドリアからサイトゾルへの、シトクロムｃの放出の時間経過を評価し（図５Ｈ）、段階的なシトクロムｃの放出が、ＧＦＰ感染細胞と比較して、ＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞で観察され、Ｆｈｉｔを過剰発現するＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋細胞における、アポトーシスカスケードの開始を示す。
【０１０１】
Ｆｈｉｔは、化学療法剤のＲＯＳ関連効果を強化する−細胞内ＲＯＳの生成は、パクリタキセルでの治療によって誘導される、肺癌細胞のアポトーシスにおける初期事象である（３３）。本発明者らは、Ｆｈｉｔ発現を誘導して、または誘導せずに、Ｈ１２９９  Ｄ１およびＥ１細胞に対してパクリタキセルを試験した。Ｆｈｉｔ発現の誘導後、ＭＴＳ細胞生死判別試験によって測定されるように、Ｄ１細胞は、Ｅ１細胞よりもパクリタキセルに対する感受性が高かった（図６Ａ）。シスプラチンはＦｄｘｒ発現を誘導し、シスプラチン誘導アポトーシス経路は、ＲＯＳ生成に関連する（３４）。
【０１０２】
２４および４８時間の時点のＭＴＳ検定によって測定されるように、Ｆｈｉｔを発現するＤ１細胞は、Ｅ１細胞よりも、シスプラチンに対して感受性が高かった（図６Ｂ）。
【０１０３】
薬物治療後の細胞生存率を調べるために、フローサイトメトリー分析を行い（図６、図６Ｃ、および図６Ｄ）、パクリタキセルの濃度を上昇させて処理した（５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）、ＰｏｎＡで誘導したＤ１およびＥ１細胞は、４８時間の時点で、サブ−Ｇ１集団の増加を示した：Ｅ１細胞のそれぞれ４％、１６．７％、および３０％と比較して、Ｄ１細胞の９．６％、３６％、および４０％（図６Ｃ）。
【０１０４】
同様に、シスプラチン濃度の上昇（０．０５〜０．２ｍＭ）は、４８時間の時点でサブ−Ｇ１集団の増加につながった：Ｅ１細胞のそれぞれ２．３％、７％、および１４．６％と比較して、Ｄ１細胞の５％、１６．２％、および３０％（図６Ｃ）。
【０１０５】
また、２４および７２時間の時点で（データ図示せず）、Ｅ１細胞と比較して、Ｄ１細胞におけるサブ−Ｇ１集団の増加が検出された。Ｄ１細胞のサブ−Ｇ１分画がアポトーシス細胞を表したかどうかを判定するために、４８時間の時点で薬物処理細胞から溶菌液を調製し、カスパーゼ３およびＰａｒｐ１切断について免疫ブロット分析を行った（図６Ｄ）。
【０１０６】
パクリタキセル（５０および１００ｎｇ／ｍｌ）およびシスプラチン（０．０５および０．１ｍＭ）処理後、未処理細胞（対照）と比較して、活性化されたカスパーゼ３および関連するＰａｒｐ１切断が観察された。本発明者らは、本明細書において、Ｆｈｉｔ発現が、ＲＯＳ生成におけるＦｄｘｒの関与により、酸化的傷害に対する感受性を増加させると考える。
【実施例】
【０１０７】
実施例Ｉ
【０１０８】
材料および方法
【０１０９】
細胞、ベクター、および抗血清−Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＭＫＮ７４−Ｅ４、およびＡ１１６、ならびにＨＣＴ１１６細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地に１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を加えたもので維持した。組み換えアデノウイルスの調製に使用するＨＥＫ２９３細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）を、ダルベッコ変法イーグル培地に１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたもので培養した。ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６ウイルスは、本明細書の実施例ＩＩに記載の通り調製した。［Ｈｉｓ６−配列番号３２］［ペンタ−Ｈｉｓ−配列番号３３］。
【０１１０】
全長ＦＤＸＲを、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、配列決定した。詳細は、補足方法に記載する通りである。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従って形質移入した。
【０１１１】
ウェスタンブロット分析−免疫ブロット分析は、モノクローナル抗ペンタＨｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）、ウサギポリクロナール抗Ｆｈｉｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＧＦＰ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびシトクロムｃに対するウサギポリクロナール抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクロナール抗Ｆｄｘｒ（Ａｂｅａｍ）、モノクローナル抗ＣｏｘＩＶ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、抗Ｖ５（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｐａｒｐ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ならびに抗カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して、（１３）に記載の通り行った。タンパク質レベルを、適切な抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出したβ−アクチンまたは／およびＧＡＰＤＨ３レベルに対して正規化した。
【０１１２】
質量分析法研究−タンパク質ペレットを、本明細書に記載の通り、トリプシンによって可溶化および消化した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、ペプチド混合物を注入した。データベース検索によるタンパク質同定の後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータの検査を行い、ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６に感染させた細胞からの試料中の候補パートナータンパク質に属する質量ピークの排他的存在を評価した。
【０１１３】
タンパク質相互作用分析−タンパク質を、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル中で抽出した。ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）を用いた、または用いない、共免疫沈降法の実験が、１ｍｇの総タンパク質を、４℃で２時間、セファロースで共役したＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、Ｆｄｘｒ、ペンタ−Ｈｉｓ、およびＶ５抗血清と共にインキュベートし、洗浄後、ビーズを1ｘ  ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸し、タンパク質を４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ポリ（フッ化ビニリデン）フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、特異的な抗血清でプローブすることにより行われた。
【０１１４】
Ｆｈｉｔタンパク質の細胞下局在性-抗Ｆｈｉｔ血清を使用した間接的免疫蛍光検出によって、および抗ペンタＨｉｓを使用した免疫電子顕微鏡写真におけるＡ５４９  ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６に感染させた細胞内のＦｈｉｔＨｉｓ６の検出によって、Ｆｈｉｔを、ポナステロンＡ（Ｐｏｎ  Ａ）で誘導したＦｈｉｔ発現Ｈ１２９９  Ｄ１細胞において、亜局在化した。分画研究において、ミトコンドリアを、ミトコンドリア／サイトゾル分画キットを用いて単離し、ＦｒａｃｔｉｏｎＰＲＥＰ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、サイトゾル、膜、核、および細胞骨格（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）からタンパク質を抽出した。Ｄａｈｅｒｏｎら（２２）の方法に従う、ミトコンドリア内局在に関して、ミトコンドリアを、断続的にボルテックスしながら３０分間氷上で０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）中で再懸濁し、本明細書に記載の通り分画した。
【０１１５】
フローサイトメトリー−ＨＣＴ１１６  ＦＤＸＲ＋／＋／＋およびＦＤＸＲ＋／−／−細胞を、ＭＯＩ５０および１００でＡｄＦＨＩＴまたはＡｄＧＦＰに感染させ、感染後４８時間の時点で評価した。ＰｏｎＡで誘導したＨ１２９９  Ｄ１およびＥ１細胞を、０．２５および０．５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、または化学療法薬で処理し、本文および図面に示される通り、様々な時間の間、インキュベートした。両方の実験に関して、細胞を収集し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、低温７０％エタノール中で再懸濁した。分析に関しては、細胞を回転分離し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、室温で３０分間、０．１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００染色溶液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｄｎａｓｅを含まないＲＮａｓｅ  Ａ）中で懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１１６】
細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の評価−細胞内超酸化物を、ヒドロエチジン（ジヒドロエチジウム−ＨＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）による酸化の結果として、エチジウム蛍光によって測定した。安定にＦｈｉｔを発現するＭＮＫ７４細胞、Ｆｈｉｔを一時的に発現するＡ５４９細胞、および誘導可能なＦｈｉｔを発現するＨ１２９９細胞を、０．５、１．０、２．０、および４．０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２で３７℃で処理し、４時間後、ヒドロエチジン（１０μＭ）を細胞に添加し、１５分間３７℃でインキュベートした。蛍光は、フローサイトメトリーによって測定した。ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、誘導されたＦｈｉｔを発現するＤ１細胞に使用し、Ｈ２Ｏ２（０．１から１．０ｍＭ）でストレスを与え、１０μＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＣＦ蛍光を、ＦＡＣスキャンサイトメーター上でのフローサイトメトリー、および蛍光顕微鏡検査法で測定した。
【０１１７】
Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ１０発現抑制−８×１０５／ウェル（６ウェルプレート）でのＡ５４９肺癌細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに６μｇのＨｓｐ６０および／またはＨｓｐ１０  ｓｉＲＮＡ（それぞれＤｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号ＮＭ＿００２１５６［ＧｅｎＢａｎｋ］およびＮＭ＿００２１５７［ＧｅｎＢａｎｋ］）によって形質移入し、４８時間後、細胞をＭＯＩ１でＡｄＦＨＩＴに感染させ、２４時間後、サイトゾル／ミトコンドリアタンパク質分画のために収集した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットにより分析し、フィルタをＨｓｐ６０、Ｈｓｐ１０、およびＦｈｉｔ抗血清でプローブした。タンパク質負荷をＧＡＰＤＨおよびＣｏｘＩＶで正規化した。１×１０６  Ｈ１２９９  Ｄ１およびＥ１肺癌細胞を、上記の通り形質移入し、形質移入の２４時間後に、細胞をＰｏｎＡで誘導し、誘導の４８時間後に、１、４、６、および１２時間におけるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（１０μｇ／ｍｌ）追跡を行い、タンパク質溶菌液を本明細書に記載の通り分析した。
【０１１８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ−ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離した全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した逆転写による直接的なｃＤＮＡへのＤｎａｓｅ処理（Ａｍｂｉｏｎ）後、加工した。標的配列を、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＰＣＲによって増幅した。ＦＤＸＲプライマーは、順方向、３’−ＴＣＧＡＣＣＣＡＡＧＣＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧ−５’［配列番号２４］、逆方向、３’−ＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣ−５’［配列番号２５］であった。試料は、アクチンおよびＧＡＤＰＨ遺伝子を使用して正規化した。
【０１１９】
化学療法薬−パクリタキセル（Ｓｉｇｍａ）を、１０ｍｍｏｌ／リットルの原液として、ＤＭＳＯ中で溶解し、−８０℃で保管した。シスプラチン（Ｓｉｇｍａ）を、水中で溶解し、使用前に新しく調製した。Ｈ１２９９  Ｄ１およびＥ１細胞を、９６ウェル培養皿に播種（１×１０４細胞／ウェル）し、ＰｏｎＡ誘導し、２４時間後、パクリタキセル（５０、１００、および５００ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチン（０．０５、０．１、および０．２ｍＭ）で処理した。ＰｏｎＡ誘導したＨ１２９９  Ｄ１およびＥ１細胞を、２４、４８、および７２時間インキュベートし、ＭＴＳキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  ＭＴＳキット、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて、製造業者が推奨する通りに、生存能を評価した。
【０１２０】
実施例ＩＩＩ
【０１２１】
組み換えアデノウイルスの生成−野生型ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有する組み換えアデノウイルス（ＡｄＦＨＩＴ）は、前述の通り調製した（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ，２００１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：１５７８−１５８４）。Ｈｉｓタグ付加ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって生成した。５’−ＡＣｇＴｇｇＡＴＣＣＣＴｇＴｇＡｇｇＡＣＡＴｇＴＣｇＴＴＣＡｇＡＴＴＴｇｇＣ−３’（順方向）［配列番号２６］および５’−ＴＴｇＴｇｇＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇＣｇＡＴＣＣＴＣＴＣＴｇＡＡＡｇＴＡｇＣＣＣｇＣＡｇ−３’［配列番号２７］。これらのプライマーは、移入ベクターであるｐＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ−ＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにサブクローン化するためのＢａｍＨＩ制限部位を考慮して設計された。Ａｄ−Ｈｉｓ６は、ＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ（商標）キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者の手順に従い、生成した。対照として使用されるＡｄ  ＧＦＰは、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。
【０１２２】
ＦＤＸＲ  ｃＤＮＡを保有する組み換え発現ベクターの生成−全長野生型フェレドキシン還元酵素を、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から以下のプライマーで増幅した。５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’（順方向）［配列番号２８］および５’−ＴＣＡｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号２９］。増幅産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。配列決定は、増幅産物における突然変異を除外した。
【０１２３】
Ｖ５タグ付加フェレドキシン還元酵素ｃＤＮＡの調製に関して、ＰＣＲ増幅を、逆方向プライマーにおけるＦＤＸＲ生理学的終止コドンを除き、同一のプライマー配列で行った。つまり、野生型およびＶ５タグ付加フェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）ｃＤＮＡは共に、ヒトフェレドキシン還元酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４４１７）の野生型コード配列を鋳型として使用することにより調製した。フェレドキシン還元酵素コード配列は、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。
【０１２４】
Ｖ５タグ付加ＦＤＸＲ  ｃＤＮＡを生成するために使用したプライマーは、以下の通りである。順方向：５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’［配列番号３０］、および逆方向：５’−ｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号３１］。オリゴヌクレオチド配列は、Ｖ５タグ付加ｃＤＮＡの生成に使用される逆方向プライマーを除き同一であり、ここで、ＦＤＸＲの生理学的終止コドンは、Ｖ５タグを有するＦＤＸＲコード配列をフレーム単位で融合するために省略されたことに留意されたい。
【０１２５】
増幅産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。配列決定は、増幅産物における突然変異を除外した。
【０１２６】
ある実施形態において、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６を単離することが可能なアデノウイルスは、ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを含む。ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡは、ヒトＦｈｉｔ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１２）の野生型コード配列を鋳型として使用することによって調製することができる。最終Ｆｈｉｔ産物のＣ末端にポリヒスチジンタグを導入するために、野生型Ｆｈｉｔコード配列のＰＣＲ増幅を、生理学的終止コドンを無効にし、かつ内在的Ｆｈｉｔ配列に、６つのヒスチジンをコードする一連の１８ｂｐ、その後人工的終止コドンを追加するように設計される、逆方向プライマーを用いて実行した。さらに、順方向および逆方向プライマーは共に、容易なサブクローン化のためのＢａｍＨＩ制限部位を保有した。この増幅に使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった。順方向：５’−ＡＣｇＴｇｇＡＴＣＣＣＴｇＴｇＡｇｇＡＣＡＴｇＴＣｇＴＴＣＡｇＡＴＴＴｇｇＣ−３’［配列番号２６］、および逆方向：５’−ＴＴｇＴｇｇＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇＣｇＡＴＣＣＴＣＴＣＴｇＡＡＡｇＴＡｇＡＣＣＣｇＣＡｇ−３’［配列番号２７］。ＰＣＲ増幅産物は、Ａｄ５組み換えゲノム（Ｑｂｉｏｇｅｎｅによって購入されたベクターであるＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ（商標））にクローン化される前に、ランダム突然変異を除外するように配列決定された。
【０１２７】
ある実施形態において、外来的に過剰発現したＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６を単離する方法は、ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを使用するステップを含み、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６は、Ｈｉｓタグを通じて単離される。Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６は、発現がＡｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６ベクターを通じて、哺乳類細胞に駆動される、組み換えタンパク質を表す。Ｈｉｓ６エピトープは、組み換えＦｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質と、Ｎｉ−ＮＴＡ系を利用することによって、組み換えタンパク質自身と相互作用するタンパク質複合体との回復を可能にする。この系は、Ｑｉａｇｅｎより商業的に入手可能である。簡潔に述べると、ヒトＡ５４９癌細胞をＡｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６に感染させ、感染の４８時間後に、生細胞でタンパク質複合体を安定化させるために、Ｐｉｅｒｃｅより購入した架橋剤ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）［ＤＳＰ］を用いて、細胞内タンパク質複合体の光架橋を行った。細胞をタンパク質抽出緩衝液内で分裂させ、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質複合体を、かかるビーズに対するＨｉｓ６タグの優れた親和性を利用することによって、Ｎｉ−ＮＴＡ電磁ビーズ技術を用いて単離した。次いで、単離Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質複合体を、質量分析法によって調査し、複合体に存在するすべてのタンパク質を同定した。
【０１２８】
ある実施形態において、脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有する組み換えアデノウイルスは、ヒスチジン−６エピトープタグをコードする配列（ＡｄＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６）でその３’位を修飾することができる。
【０１２９】
ある実施形態において、少なくとも１つの細胞におけるアポトーシスプロセスを媒介するための方法は、細胞においてアポトーシスプロセスを媒介するのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、細胞を曝露するステップを含む。
【０１３０】
ある実施形態において、細胞にアポトーシスプロセスを誘導するための方法は、細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を生じるのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、細胞を曝露するステップを含む。
【０１３１】
ある実施形態において、少なくとも１つの細胞におけるアポトーシスプロセスを媒介するための方法は、脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）が、細胞内のミトコンドリアに入り、細胞内のＦｄｘｒタンパク質と相互作用し、ＲＯＳの生成に関連するＦｄｘｒタンパク質レベルを増加させるのを可能にするのに十分な量の脆弱性ヒスチジン三連構造（Ｆｈｉｔ）遺伝子産物に、細胞を曝露させて、細胞におけるアポトーシスプロセスに変化を生じさせるステップを含む。
【０１３２】
前の研究において、Ｆｈｉｔ陰性癌細胞におけるＦｈｉｔタンパク質の過剰発現は、プログラム細胞死（またはアポトーシス）を誘発することができることが広く証明されたことに留意されたい。本発明において、発明者らは、アポトーシスのプロセスにおけるＦｈｉｔタンパク質の役割に関する論理的根拠を提供する。実際、Ａｄ  ＦＨＩＴを用いて行われる癌細胞のＦｈｉｔ遺伝子治療（感染多重度５０またはＭＯＩ５０、すなわち、細胞あたり５０のウイルス粒子）は、Ｆｈｉｔ過剰発現に関与し、新たに合成された組み換えタンパク質は、その相互作用因子Ｈｓｐ６０／Ｈｓｐ１０によって、サイトゾルからミトコンドリアへ移動され、ここでは、Ｆｈｉｔは、呼吸鎖に属するタンパク質であるＦＤＸＲ（フェレドキシン還元酵素）と相互作用する。この相互作用は、ＲＯＳ（活性酸素種）のミトコンドリアの生成に至る。ＲＯＳは、アポトーシスプロセスの内因性（またはミトコンドリア）経路の開始の初期段階を表し、実際、それらは、同様にシトクロムｃをサイトゾルに放出するミトコンドリア膜の損傷を誘導する。この段階は、シトクロムｃが、他のサイトゾル分子（すなわち、Ａｐａｆ−１およびプロ−カスパーゼ３）と共に、アポトーシスへ非可逆的に細胞を駆動することができる多タンパク質複合体であるアポトソームの生成に寄与するため、アポトーシスの実行に極めて重要である。
【０１３３】
アポトーシスを研究するために一般的に使用される方法は、フローサイトメトリー分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による成熟カスパーゼ３（初期アポトーシスの指標）の検出から成る［参考として、Ｔｒａｐａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＰＮＡＳ，１００，１５９２−１５９７を参照のこと］。
【０１３４】
ある実施形態において、Ｖ５タグ付加フェレドキシン還元酵素ｃＤＮＡを調製するための方法は、以下のプライマー配列によるＰＣＲ増幅を行うステップと、（５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’（順方向）［配列番号２８］、および５’−ＴＣＡｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号２９］）、増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡベクターにサブクローン化するステップと、を含む。
【０１３５】
野生型およびＶ５タグ付加フェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）ｃＤＮＡは、ヒトフェレドキシン還元酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４４１７）の野生型コード配列を鋳型として使用することにより調製した。フェレドキシン還元酵素コード配列は、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。つまり、野生型ＦＤＸＲ  ｃＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーは、以下の通りであった。順方向：５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’［配列番号２８］、逆方向：５’−ＴＣＡｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号２９］。
【０１３６】
Ｖ５タグ付加ＦＤＸＲ  ｃＤＮＡを生成するために使用したプライマーは、以下の通りであった。順方向：５’−ＣＴｇＴＴＣＣＣＡｇＣＣＡＴｇｇＣＴＴＣｇＣｇＣＴｇ−３’［配列番号３０］、および逆方向：５’−ｇＴｇｇＣＣＣＡｇｇＡｇｇＣｇＣＡｇＣＡＴＣ−３’［配列番号３１］。オリゴヌクレオチド配列は、Ｖ５タグ付加ｃＤＮＡの生成に使用される逆方向プライマーを除き同一であり、ここで、ＦＤＸＲの生理学的終止コドンは、Ｖ５タグを有するＦＤＸＲコード配列をフレーム単位で融合するために省略されたことに留意されたい。
【０１３７】
最後に、２つの産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ  ＴＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）にサブクローン化し、次いで配列決定し、両方の産物がランダム突然変異を有しないことを評価した。
【０１３８】
ある実施形態において、組み換えアデノウイルスを生成するための方法は、野生型ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡ（ＡｄＦＨＩＴ）を保有する組み換えアデノウイルスを調製するステップと、以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用して、Ｈｉｓタグ付加ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを生成するステップと、を含む。５’−ＡＣｇＴｇｇＡＴＣＣＣＴｇＴｇＡｇｇＡＣＡＴｇＴＣｇＴＴＣＡｇＡＴＴＴｇｇＣ−３’（順方向）［配列番号２６］、および５−ＴＴｇＴｇｇＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇＣｇＡＴＣＣＴＣＴＣＴｇＡＡＡｇＴＡｇＡＣＣＣｇＣＡｇ−３’［配列番号２７］。ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ｃＤＮＡは、本明細書に記載の通り調製した。組み換えアデノウイルスベクターＡｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６は、製造業者（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）の推奨に従って調製した。簡潔に述べると、増幅ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６  ＰＣＲフラグメントは、ＢａｍＨＩで消化され、ＢａｍＨＩ線形化移入ベクターｐＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ−ＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにサブクローン化された。ｐＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ−ＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６は、Ｅ１／Ｅ３で検出されたＡｄ５バックボーンウイルスＤＮＡで２９３の細胞に同時形質移入した。ウイルスプラークを、特異的ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてウェスタンブロットによって、Ｆｈｉｔ−Ｈｉｓ６タンパク質の存在についてスクリーニングした。１つの陽性クローンを、プラーク精製し、２９３の細胞で増幅した。凍結／融解サイクル後、上澄み中のアデノウイルスを、２回の連続的な塩化セシウム勾配で精製した。組み換えアデノウイルスを、ＴＣＩＤ５０方法によって滴定し、等分した。ウイルスストックは、−８０℃で保管した。最後に、野生型ＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを保有する組み換えアデノウイルス（Ａｄ  ＦＨＩＴ）を、Ｔｒａｐａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＰＮＡＳ，１００，１５９２−１５９７）によって前もって生成した。
【０１３９】
ミトコンドリア局在性研究−共焦点顕微鏡法を使用して、免疫蛍光法によってＦｈｉｔタンパク質分布を評価した。誘導可能なＦＨＩＴ  ｃＤＮＡを有するＨ１２９９  Ｄ１細胞、および空ベクターを有するＥ１細胞を、ＰｏｎＡで４８時間処理し、生細胞を、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ５８０（Ｍ−２２４２５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で、成長条件下で４０分間、５００ｎＭの作業濃度で染色した。細胞を、５分間、氷冷アセトンでのインキュベーションにより透過性化し、その後、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、１時間、５％  ＢＳＡと共にインキュベートして、非特異的相互作用をブロックし、次いで、Ｆｈｉｔ抗血清（Ｚｙｍｅｄ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共に１．６μｇ／ｍｌの作業濃度で終夜インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。スライドをＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｎｅ，ＣＡ）を用いた蛍光のために封入剤に封入し、可視化した。Ｆｈｉｔの免疫電子顕微鏡法局在性に関して、ＭＯＩ５でＡｄＨｉｓ６またはＡｄＦＨＩＴに感染させたＡ５４９細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２）で３０分間４℃で固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．０５％水素化ホウ素ナトリウムでの３０分のインキュベーションを用いて、残存する遊離アルデヒド基を還元した。ＰＢＳ洗浄後、試料を５０ｍＭ  ＰＢＳ中のグリセリンで３０分間ブロックし、ＰＢＳで２回洗浄し、２５および５０％エタノールでそれぞれ１５分間脱水し、その後、７０％エタノールに３回換えてそれぞれ１５分間行った。次いで、試料を４℃で、２：１の７０％エタノール＋ＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂、ハードグレード（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で１時間、１：２の７０％エタノール＋ＬＲ  Ｗｈｉｔｅで１時間、１００％  ＬＲ  Ｗｈｉｔｅで１時間、および１００％  ＬＲＷで終夜浸透させた。翌日、１００％  ＬＲ  Ｗｈｉｔｅを２回換えて、細胞を、５８℃で２０〜２４時間、ゼラチンカプセル内で重合した。９００ｎｍの薄片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＵＣＴ  Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅおよびダイアモンドナイフを使用して切除し、ニッケル格子に配置した。格子は、数滴のＰＢＳに５分間、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清に室温（ＲＴ）で１時間、０．１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢＳＡ／Ｔｗ）を含有するＰＢＳ、またはＢＳＡ／Ｔｗ単独に希釈された、２０ｍｇ／ｍｌのペンタ−Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に加湿チャンバにおいて４℃で終夜、薄片側を下にして浮かせた。翌日、格子をＰＢＳを使用してそれぞれ５分間、６回洗浄し、次いで、室温で２時間、ＢＳＡ／Ｔｗに１：１０に希釈した１０ｎｍコロイド金結合体であるヤギ抗マウス（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）と共にインキュベートした。格子をＰＢＳでそれぞれ５分間、６回洗浄し、ＤＩ  Ｈ２Ｏですすぎ、２．５％酢酸ウラニル水溶液で３分間後染色した。画像を、ＵＳ１０００  Ｇａｔａｎ  ２Ｋデジ��ルカメラを具備するＴｅｃｎａｉ  １２電子顕微鏡で収集した。
【０１４０】
試料消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析−Ｎｉ−ＮＴＡビーズで単離されたタンパク質を、低温アセトンで沈殿させ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８に緩衝された６Ｍ尿素に再懸濁した。タンパク質還元およびアルキル化は、それぞれ、ＤＴＴ（最終濃度１０ｍＭ、３７℃で１時間インキュベート）、およびヨードアセトアミド（最終濃度２５ｍＭ、３７℃で１時間インキュベート）の添加によって達成した。過剰なヨードアセトアミドをＤＴＴ（追加で５ｍＭ）で中和したあと、尿素濃度を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２による希釈によって１．５Ｍまで低下させた。終夜の消化は、５０ｎｇのＴＰＣＫで処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を使用して実行された。消化溶液の全容量は、１００μｌであった。
【０１４１】
クロマトグラフィーは、Ｄｉｏｎｅｘ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のＵｌｔｉｍａｔｅナノＬＣシステム上で行った。消化混合物（３０μｌ）を直接、Ｐｅｐｍａｐ  Ｃ１８ＲＰカートリッジ（内径０．３ｍｍ  ＩＤ×長さ５ｍｍ）に注入し、ＲＰトラップを７５μｍ×１５０ｍｍ  Ｐｅｐｍａｐ  Ｃ１８ナノＬＣカラムへ使用状態に切り替える前に、１０分間、９７．９：０．１：２（ｖ／ｖ／ｖ）のＨ  ２０／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／アセトニトリルで洗浄した。ペプチドの勾配溶離は、４５分の５％  Ｂから５０％  Ｂまでの線形勾配を使用して、３００ｎｌ／分で達成された。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ／アセト二トリル／ギ酸（ＦＡ）／ＴＦＡ  ９７．９：２：０．０８：０．０２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは、Ｈ２Ｏ／アセト二トリル／ＦＡ／ＴＦＡ  ４．９：９５：０．０８：０．０２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）であった。
【０１４２】
ＭＳ検出は、ナノエレクトロスプレー電位１８００Ｖ、カーテンガス１５単位、ＣＡＤガス３単位で、陽イオンモードで動作するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）ＱＳＴＡＲ  ＸＬハイブリッドＬＣ−ＭＳ／ＭＳ上で行った。情報依存取得（ＩＤＡ）は、４００から１２００ｍ／ｚのフルＴＯＦ−ＭＳスキャンを２秒継続した後、ＭＳ／ＭＳ分析に関して２つの最も豊富なピークを選択することにより行った。両方のＭＳ／ＭＳ分析は、強化モード（２秒／スキャン）で行った。
【０１４３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ分析−ＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）（２００６年６月にアクセス）でＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに問い合わせることによって、検索した。以下の検索パラメータを使用した。ＭＳ許容範囲：５０ｐｐｍ、ＭＳ／ＭＳ許容範囲：１Ｄａ、酸化メチオニン（可変修飾）、カルバミドメチル化システイン（固定修飾）、酵素：トリプシン、最大切断部位：１。
【０１４４】
それぞれ、Ａｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６に感染させたＡ５４９および対照の双方から得られたタンパク質のリストを比較し、Ａ５４９−Ａｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６のみに存在するタンパク質を、さらなる検証のために保管した。第１の検証手順として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの生データを、選択イオンクロマトグラム（ＳＩＣ）表示モードを使用して調べた。ＳＩＣ比較により、Ａｄ  ＦＨＩＴ−Ｈｉｓ６試料において、検査中の６つの候補タンパク質に属すると同定された、対象となるペプチドの排他的存在が評価され得るであろう。かかる検証ステップは、６つの候補タンパク質の特異的捕獲のむしろ強力な証拠をすでに提供している。また、これらの所見は、生化学的および機能的検定によって、さらに確認された。
【０１４５】
特許法の規定に従い、本発明の原理および実施例を、その好ましい実施形態において説明し、示した。しかしながら、本発明を、その精神または範囲から逸脱することなく、具体的に説明し、示したものとは別様に実践し得ることを理解されたい。
【０１４６】
参考文献
【０１４７】
上記で説明した参考文献および以下の参考文献は、本明細書において記載されるものに対して補足的な、例示的な手順および他の詳細を提供する限りにおいて、参照することにより本明細書に明確に組み込まれる。
1. Ohta, M., Inoue, H., Cotticelli, M. G., Kastury, K., Baffa, R., Palazzo, J., Siprashvili, Z., Mori, M., McCue, P., Druck, T., Croce, C. M., and Huebner, K. (1996) Cell 84, 587-597. 
2. Matsuyama, A., Shiraishi, T., Trapasso, F., Kuroki, T., Alder, H., Mori, M., Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 100, 14988- 14993.
3. Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Nat. Rev. Cancer 1, 214-221.
4. Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Br. J. Cancer 88, 1501-1506.
5. Fong, L. Y., Fidanza, V., Zanesi, N., Lock, L., Siracusa, L., Mancini, R., Siprashvili, Z., Ottey, M., Martin, S. E., Druck, T., McCue, P. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (2000) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 97, 4742-4747.
6. Zanesi, N., Fidanza, V., Fong, L. Y., Mancini, R., Druck, T., Valtieri, M., Rudiger, T., McCue, P. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (2001) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 98, 10250-10255.
7. Dumon, K. R., Ishii, H., Fong, L. Y., Zanesi, N., Fidanza, V., Mancini, R., Vecchione, A., Baffa, R., Trapasso, F., During, M. J., Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 98, 3346-3351.
8. Ishii, H., Zanesi, N., Vecchione, A., Trapasso, F., Yendamuri, S., Sarti, M., Baffa, R., During, M. J., Huebner, K., Fong, L. Y., and Croce, C. M. (2003) FASEB J. 17, 1768-1770.
9. Siprashvili, Z., Sozzi, G., Barnes, L. D., McCue, P., Robinson, A. K., Eryomin, V., Sard, L., Tagliabue, E., Greco, A., Fusetti, L., Schwartz, G., Pierotti, M. A., Croce, C. M., and Huebner, K. (1997) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 94, 13771-13776.
10. Ji, L., Fang, B., Yen, N., Fong, K., Minna, J. D., and Roth, J. A. (1999) Cancer Res. 59, 3333-3339.
11. Ishii, H., Dumon, K. R., Vecchione, A., Trapasso, F., Mimori, K., Alder, H., Mori, M., Sozzi, G., Baffa, R., Huebner, K., and Croce, C. M. (2001) Cancer Res. 61, 1578-1584.
12. Roz, L., Gramegna, M., Ishii, H., Croce, C. M., and Sozzi, G. (2002) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 99, 3615-3620.
13. Trapasso, F., Krakowiak, A., Cesari, R., Arkles, J., Yendamuri, S., Ishii, H., Vecchione, A., Kuroki, T., Bieganowski, P., Pace, H. C, Huebner, K., and Croce, C. M. (2003) Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 100, 1592-1597.
14. Gorgoulis, V. G., Vassiliou, L. V., Karakaidos, P., Zacharatos, P., Kotsinas, A., Liloglou, T., Venere, M., Ditullio, R. A., Jr., Kastrinakis, N. G., Levy, B., Kletsas, D., Yoneta, A., Herlyn, M., Kittas, C, and Halazonetis, T. D. (2005) Nature 434, 907-913.
15. Bartkova, J., Horejsi, Z., Koed, K., Kramer, A., Tort, F., Zieger, K., Guldberg, P., Sehested, M., Nesland, J. M., Lukas, C, and Bartek, J. (2005) Nature 434, 864-870. 
16. Wistuba, I. L, Lam, S., Behrens, C, Virmani, A. K., Fong, K. M., LeRiche, J., Samet, J. M., Srivastava, S., Minna, J. D., and Gazdar, A. F. (1997) /. Natl. Cancer Inst. 89, 1366-1373.
17. Mao, L., Lee, J. S., Kurie, J. M., Fan, Y. H., Lippman, S. M., Lee, J. J., Ro, J. Y., Broxson, A., Yu, R., Morice, R. C, Kemp, B. L., Khuri, F. R., Walsh, G. L., Hittelman, W. N., and Hong, W. H. (1997) /. Natl. Cancer Inst. 89, 857-862.
18. Sozzi, G., Pastorino, U., Moiraghi, L., Tagliabue, E., Pezzella, F., Ghirelli, C, Tornielli, S., Sard, L., Huebner, K., Pierotti, M. A., Croce, C. M., and Pilotti, S. (1998) Cancer Res. 58, 5032-5037.
19. Thavathiru, E., Ludes-Meyers, J. H., MacLeod, M. C, and Aldaz, C. M. (2005) MoI. Carcinog. 44, 174-182.
20. Ottey, M., Han, S. Y., Druck, T., Barnoski, B. L., McCorkell, K. A., Croce, C. M., Raventos-Suarez, C, Fairchild, C. R., Wang, Y., Huebner, K., and Croce, C. M. (2004) Br. J. Cancer 91, 1669-1677.
21. Ishii, H., Mimori, K., Inoue, H., Inagata, T., Ishikawa, K., Semba, S., Druck, T., Trapasso, F., Tani, K., Vecchione, A., Croce, C. M., Mori, M., and Huebner, K. (2006) Cancer Res. 66, 11287-11292.
22. Daheron, L., Zenz, T., Siracusa, L. D., Brenner, C, and Calabretta, B. (2001) Nucleic Acids Res. 29, 1308-1316.
23. Gupta, S., and Knowlton, A. A. (2005) /. Cell. MoI. Med. 9, 51-58.
24. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., and Lazarow, P. B. (1982) /. Cell Biol. 93, 97-102.
25. Ichikawa, W., Ooyama, A., Toda, E., Sugimoto, Y., Oka, T., Takahashi, T., Shimizu, M., Sasaki, Y., and Hirayama, R. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol. 58, 794-801.
26. Hartl, F. U., and Hayer-Hartl, M. (2002) Science 295, 1852-1858.
27. Kimura, T., and Suzuki, K. (1967) /. Biol. Chem. 242, 485-491.
28. Hanukoglu, L, Rapoport, R., Weiner, L., and Sklan, D. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 489-498.
29. Hwang, P. M., Bunz, F., Yu, J., Rago, C, Chan, T. A., Murphy, M. P., Kelso, G. F., Smith, R. A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (2001) Nat. Med. 7, 1111-1117.
30. Liu, G., and Chen, X. (2002) Oncogene 21, 7195-7204.
31. Danial, N. N., and Korsmeyer, S. J. (2004) Cell 116, 205-219.
32. Ohashi, M., Kanai, F., Ueno, H., Tanaka, T., Tateishi, K., Kawakami, T., Koike, Y., Ikenoue, T., Shiratori, Y., Hamada, H., and Omata, M. (1999) Gut 44, 336-371. 
33. Alexandre, J., Batteux, F., Nicco, C, Chereau, C, Laurent, A., Guillevin, L., Weill, B., and Goldwasser, F. (2006) Int. J. Cancer 119, 41-48.
34. Kerley-Hamilton, J. S., Pike, A. M., Li, N., DiRenzo, J., and Spinella, M. J. (2005) Oncogene 24, 6090-6100.
35. Shi, Y., Zou, M., Farid, N. R., and Paterson, M. C. (2000) Biochem. J. 352, 443-448.
36. Chaudhuri, A. R., Khan, I. A., Prasad, V., Robinson, A. K., Luduena, R. F., and Barnes, L. D. (1999) /. Biol. Chem. 274, 24378-24382.
37. Nishizaki, M., Sasaki, J., Fang, B., Atkinson, E. N., Minna, J. D., Roth, J. A., and Ji, L. (2004) Cancer Res. 64, 5745-5752.
38. Hendrick, J. P., and Hartl, F. U. (1993) Annu. Rev. Biochem. 62, 349-384. 
【図２−１】
2011504093.tif 000005
【図５−１】
2011504093.tif 000006
【図７】
2011504093.tif 000007
【図８−６】
2011504093.tif 000008
【図９Ａ】
2011504093.tif 000009
【図９Ｂ】
2011504093.tif 000010
【図９Ｃ】
2011504093.tif 000011
【図９Ｄ】
2011504093.tif 000012
【図９Ｅ】
2011504093.tif 000013
【図９Ｆ】
2011504093.tif 000014
【図１０】
2011504093.tif 000015
【図１−１】
2011504093.tif 000016
【図１−２】
2011504093.tif 000017
【図２−２】
2011504093.tif 000018
【図２−３】
2011504093.tif 000019
【図３−１】
2011504093.tif 000020
【図３−２】
2011504093.tif 000021
【図３−３】
2011504093.tif 000022
【図４−１】
2011504093.tif 000023
【図４−２】
2011504093.tif 000024
【図４−３】
2011504093.tif 000025
【図４−４】
2011504093.tif 000026
【図５−２】
2011504093.tif 000027
【図５−３】
2011504093.tif 000028
【図５−４】
2011504093.tif 000029
【図５−５】
2011504093.tif 000030
【図５−６】
2011504093.tif 000031
【図５−７】
2011504093.tif 000032
【図６−１】
2011504093.tif 000033
【図６−２】
2011504093.tif 000034
【図６−３】
2011504093.tif 000035
【図６−４】
2011504093.tif 000036
【図８−１】
2011504093.tif 000037
【図８−２】
2011504093.tif 000038
【図８−３】
2011504093.tif 000039
【図８−４】
2011504093.tif 000040
【図８−５】
2011504093.tif 000041
【国際調査報告】
2011504093.tif 000042
2011504093.tif 000043
2011504093.tif 000044