(57)【要約】  イソブタノールを製造する方法が開示されている。一実施形態では、この方法は、少なくとも１つの外来遺伝子を含有するイソブタノール産生経路で形質転換された微生物を提供する工程を含む。微生物は、理論収率の少なくとも１０パーセントの収率で炭素源からイソブタノールを産生するように選択される。この方法は、イソブタノールが産生されるまで、炭素源を提供する供給原料を含有する培地中で微生物を培養する工程を含む。この方法は、イソブタノールを回収する工程を含む。一実施形態では、微生物はクラブトリー陰性表現型を有する酵母である。別の実施形態では、微生物は、クラブトリー陽性表現型を有する酵母微生物である。イソブタノールを産生する微生物が開示されている。一実施形態では、微生物は、少なくとも１つの外来遺伝子を含有するイソブタノール産生経路を含み、理論収率の少なくとも１０パーセントの収率で、炭素源から回収可能な量のイソブタノールを産生するように選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソブタノールを製造する方法であって、
イソブタノール産生代謝経路を含む組換え微生物を提供する工程であって、前記微生物は、理論収率の少なくとも５パーセントの収率で炭素源からイソブタノールを産生するものが選択される、工程と、
回収可能な量のイソブタノールが産生されるまで、前記炭素源を提供する供給原料を含有する培地中で前記微生物を培養する工程と、
イソブタノールを回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記微生物は、理論収率の約１０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は、理論収率の約２０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物は、理論収率の約５０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え微生物が、親微生物と比較して、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性が低減するように操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換え微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の部分的な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の完全な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記組換え微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え微生物が、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え微生物が、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するようにさらに操作されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路の活性を増大させるようにさらに操作されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための代謝経路を発現するようにさらに操作されており、前記微生物が、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換え微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むものが選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物がサッカロミセス・クラデの酵母微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母微生物は、理論収率の約１０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母微生物は、理論収率の約２０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換え酵母微生物は、理論収率の約５０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換え酵母微生物が、親生物と比較して、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性が低減するように操作されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の部分的な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の完全な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換え酵母微生物が、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換え酵母微生物が、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するようにさらに操作されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路の活性を増大させるようにさらに操作されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための代謝経路を発現するようにさらに操作されており、前記経路が、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換え酵母微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むものが選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換え酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物がサッカロミセス・センスストリクト酵母微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
サッカロミセス・センスストリクト酵母微生物が、以下の種、すなわち、Ｓ．セレビシアエ、Ｓ．セレビシアエ、Ｓ．クドリアブゼビイ、Ｓ．ミカタエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．ウバルム、Ｓ．カロカニス、またはこれらのハイブリッドのうちの１つから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物は、理論収率の約１０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物は、理論収率の約２０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物は、理論収率の約５０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換え酵母微生物は、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性が低減されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組換え酵母微生物が、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の部分的な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の完全な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換え酵母微生物が、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するように操作されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変化するための天然代謝経路の活性を増大させるように操作されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための代謝経路を発現するように操作されており、前記代謝経路が、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換え酵母微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むものが選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換え酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵母微生物がクラブトリー陽性酵母微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ジゴサッカロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、カンジダ・グラブラタ、Ｚ．バイリ、Ｚ．ロウキシイ、デバリオミセス・ハンセニイ、ピキア・パストリウス、スキゾサッカロミセス・ポンベ、またはサッカロミセス・ウバルムから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記酵母微生物は、理論収率の約１０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記酵母微生物は、理論収率の約２０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記酵母微生物は、理論収率の約５０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記酵母微生物が、親微生物と比較して、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性が低減するように操作されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換え酵母微生物が、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の部分的な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の完全な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換え微生物が、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するように操作されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路の活性を増大させるように操作されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための代謝経路を発現するように操作されており、前記代謝経路が、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
前記組換え酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換え微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むように選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
前記微生物がＷＧＤ（whole genome duplication；全ゲノム重複）後酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＷＧＤ後酵母が、サッカロミセス属またはカンジダ属のうちの１つから選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＷＧＤ後酵母が、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、およびカンジダ・グラブラタから選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記酵母微生物は、理論収率の約１０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記酵母微生物は、理論収率の約２０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項７２】
前記酵母微生物は、理論収率の約５０パーセント超の収率でイソブタノールを産生するものが選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記酵母微生物は、親微生物と比較して、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性が低減されている、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記組換え酵母微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子のピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記組換え酵母微生物が、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、前記遺伝子のピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の部分的な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の完全な欠失を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記組換え微生物が、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記組換え微生物が、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するように操作されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路の活性を増大させるように操作されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８２】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための代謝経路を発現するように操作されており、前記代謝経路が、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
前記組換え酵母微生物が、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むように選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８４】
前記組換え酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖する、請求項７３に記載の方法。
【請求項８５】
イソブタノールを製造する方法であって、
以下を含む組換え微生物を提供する工程と、
ａ）イソブタノール産生代謝経路（ここで、前記微生物は、炭素源からイソブタノールを産生するものが選択される）；
ｂ）親微生物と比較して低減したピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性；
回収可能な量のイソブタノールが産生されるまで、前記炭素源を提供する供給原料を含有する培地中で前記微生物を培養する工程と、
イソブタノールを回収するステップと
を含む方法。
【請求項８６】
前記微生物は、サッカロミセス・クラデの酵母である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記微生物がサッカロミセス・センスストリクト酵母である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記サッカロミセス・センスストリクト酵母微生物が、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．クドリアブゼビイ、Ｓ．ミカタエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．ウバルム、Ｓ．カロカニス、またはこれらの種のハイブリッドから選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記微生物がクラブトリー陰性酵母微生物である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記クラブトリー陰性酵母微生物が、クルイベロミセス属、ピキア属、イッサトケンキア属、ハンゼヌラ属、またはカンジダ属のうちの１つから選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記クラブトリー陰性酵母微生物が、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、ピキア・アノマラ、ピキア・スチピチス、Ｉ．オリエンタリス、Ｉ．オシデンタリス、Ｉ．スクツラタ、ハネンスラ．アノマラ、カンジダ・ウチリス、またはクルイベロミセス・ワルチイから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記酵母微生物がクラブトリー陽性酵母微生物である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
前記酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ジゴサッカロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、カンジダ・グラブラタ、Ｚ．バイリ、Ｚ．ロウキシイ、デバリオミセス・ハンセニイ、ピキア・パストリウス、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはサッカロミセス・ウバルムから選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物がＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＷＧＤ後酵母が、サッカロミセス属またはカンジダ属のうちの１つから選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＷＧＤ後酵母が、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、およびカンジダ・グラブラタから選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記微生物がＷＧＤ（全ゲノム重複）前酵母である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＷＧＤ前酵母が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバリオミセス属、ハンゼヌラ属、イッサトケンキア属、ヤロウィア属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ＷＧＤ前酵母が、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、クルイベロミセス・ワルチイ、クルイベロミセス・ラクチス、カンジダ・トロピカリス、ピキア・パストリス、ピキア・アノマラ、ピキア・スチピチス、デバリオミセス・ハンセニイ、Ｈ．アノマラ、Ｉ．オリエンタリス、Ｉ．オシデンタリス、Ｉ．スクツラタ、ヤロウィア・リポリチカ、およびシゾサッカロミセス・ポンベから選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記微生物が非発酵酵母微生物である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０６】
前記非発酵酵母微生物が、トリコスポロン属、ロドトルラ属、またはミキソチマ属のうちの１つから選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記非発酵酵母微生物が、トリコスポロン・プルランス、ロドトルラ・リグノフィラ、またはミキソチマ・バンデルワルチイ、カンジダ・エタノリカ、デバロミセス・カルソニイ、またはピキア・カスチラエから選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
組換え微生物であって、
ａ）イソブタノール産生代謝経路（ここで、前記微生物は、炭素源からイソブタノールを産生するものが選択されるイソブタノール代謝経路）；
ｂ）親の微生物と比較して低減したピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性
を含む組換え微生物。
【請求項１０９】
前記微生物がクラブトリー陰性酵母微生物である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１１０】
前記クラブトリー陰性酵母微生物が、クルイベロミセス属、ピキア属、イッサトケンキア属、ハンゼヌラ属、またはカンジダ属のうちの１つから選択される、請求項１０９に記載の組換え微生物。
【請求項１１１】
前記クラブトリー陰性酵母微生物が、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、ピキア・アノマラ、ピキア・スチピチス、Ｉ．オリエンタリス、Ｉ．オシデンタリス、Ｉ．スクツラタ、ハネンスラ．アノマラ、カンジダ・ウチリス、またはクルイベロミセス・ワルチイから選択される、請求項１０９に記載の組換え微生物。
【請求項１１２】
前記微生物がサッカロミセス・クラデの酵母である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１１３】
前記酵母微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項１１２に記載の組換え微生物。
【請求項１１４】
前記微生物がサッカロミセス・センスストリクト酵母である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１１５】
前記サッカロミセス・センスストリクト酵母微生物が、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．クドリアブゼビイ、Ｓ．ミカタエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．ウバルム、Ｓ．カロカニス、またはこれらの種のハイブリッドから選択される、請求項１１４に記載の組換え微生物。
【請求項１１６】
前記微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記微生物がクラブトリー陽性酵母微生物である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１１８】
前記微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項１１７に記載の組換え微生物。
【請求項１１９】
前記クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ジゴサッカロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される、請求項１１７に記載の組換え微生物。
【請求項１２０】
前記クラブトリー陽性酵母微生物が、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、カンジダ・グラブラタ、Ｚ．バイリ、Ｚ．ロウキシイ、デバリオミセス・ハンセニイ、ピキア・パストリウス、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはサッカロミセス・ウバルムから選択される、請求項１１７に記載の組換え微生物。
【請求項１２１】
前記微生物がＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１２２】
前記微生物が、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている、請求項１２１に記載の組換え微生物。
【請求項１２３】
ＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母が、サッカロミセス属、またはカンジダ属のうちの１つから選択される、請求項１２１に記載の組換え微生物。
【請求項１２４】
ＷＧＤ後酵母が、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、およびカンジダ・グラブラタから選択される、請求項１２１に記載の組換え微生物。
【請求項１２５】
前記微生物がＷＧＤ（全ゲノム重複）前酵母である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１２６】
前記ＷＧＤ前酵母が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバリオミセス属、ハンゼヌラ属、イッサトケンキア属、ヤロウィア属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される、請求項１２５に記載の組換え微生物。
【請求項１２７】
ＷＧＤ前酵母が、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、クルイベロミセス・ワルチイ、クルイベロミセス・ラクチス、カンジダ・トロピカリス、ピキア・パストリス、ピキア・アノマラ、ピキア・スチピチス、デバリオミセス・ハンセニイ、Ｈ．アノマラ、Ｉ．オリエンタリス、Ｉ．オシデンタリス、Ｉ．スクツラタ、ヤロウィア・リポリチカ、およびシゾサッカロミセス・ポンベから選択される、請求項１２５に記載の組換え微生物。
【請求項１２８】
前記微生物が非発酵酵母微生物である、請求項１０８に記載の組換え微生物。
【請求項１２９】
前記非発酵酵母微生物が、トリコスポロン属、ロドトルラ属、ミキソチマ属のうちの１つから選択される、請求項１２８に記載の組換え微生物。
【請求項１３０】
前記非発酵酵母微生物が、トリコスポロン・プルランス、ロドトルラ・リグノフィラ、またはミキソチマ・バンデルワルチイ、カンジダ・エタノリカ、デバロミセス・カルソニイ、ピキア・カスチラエから選択される、請求項１２８に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２００７年１２月２３日に出願された米国仮出願第６１／０１６，４８３号の優先権を主張する。したがって、本願は、上記に参照した出願のすべての対象物を、そのような対象物が本明細書と相反さない程度に、その全体として参照により組み込む。
【０００２】
[0002]  代謝的に操作された微生物、およびそのような生物を作出する方法が提供される。適当な基質を、代謝的に操作された微生物、およびこの微生物に由来する酵素調剤と接触させることによって、生物燃料である代謝産物を製造する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  生物燃料は、２０世紀初頭に及ぶ長い歴史を有する。１９００年の早期に、Ｒｕｄｏｌｆ  Ｄｉｅｓｅｌは、フランスのパリにおける世界博覧会で、ラッカセイ油で動作するエンジンを実証した。その後すぐに、Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄは、トウモロコシから得たエタノールで動作するモデルＴを実証した。供給量の増加、およびより低い費用での効率のために、１９３０年代および１９４０年代に、石油系燃料が生物燃料に取って代わった。
【０００４】
[0004]  米国の石油生産の減少と結びついた１９７０年代の市場変動により、原油価格が高騰し、生物燃料への関心が再び取り上げられた。現在、政策立案者、産業プランナー、認識している民間人、金融界を含めた多くの利益団体が、石油系燃料をバイオマス由来生物燃料に置き換えることに興味を持っている。生物燃料を開発することについての主な動機は、経済的、政治的、および環境的な性質のものである。
【０００５】
[0005]  １つは「ピークオイル」、すなわち、原油の消費速度が供給速度を超える時点の脅威であり、したがって、燃料コストが著しく増加し、代替燃料に対する要求が増大する。さらに、中東および他のオイルに富む領域における不安定性は、国内で生産される生物燃料の要求を増大させた。また、二酸化炭素に関連した気候変動の可能性に関する環境への懸念は、重要な社会的および倫理的な原動力であり、これは、政府規制および政策、例えば、自動車からの二酸化炭素放出に対する上限の規定、二酸化炭素放出に対する税、および生物燃料の使用に対する税制上の優遇措置などをもたらし始めている。
【０００６】
[0006]  エタノールは、現在、最も豊富な、発酵生産される燃料であるが、ガソリンと比較される場合、いくつかの欠点を有する。これに比べて、ブタノールは、燃料として、エタノールに対していくつかの利点を有する。ブタノールは、エタノールと同じ供給原料から製造することができるが、エタノールと異なり、これは、ガソリンと任意の比で互換性であり、改良することなく、現存する燃焼エンジンにおいて、純粋な燃料として使用することもできる。エタノールと異なり、ブタノールは、水を吸収せず、したがって、現存する石油化学のインフラ内に貯蔵し、流通させることができる。ガソリンのエネルギー含量に近い、そのより高いエネルギー含量のために、燃料経済性（ガロン当たりのマイル）は、エタノールの燃料経済性より良好である。また、ブタノール−ガソリンブレンドは、エタノール−ガソリンブレンドより蒸気圧が低く、これは、蒸発による炭化水素放出を低減することにおいて重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]  イソブタノールは、ブタノールと同じ利点を有し、その分岐炭素鎖のために、より高いオクタン価を有するという追加の利点を有する。イソブタノールは、商品化学物質としても有用であり、ＭＴＢＥの前駆体でもある。イソブタノールは、異種の代謝経路を発現する微生物において生産することができるが、これらの微生物は、その固有の低い性能特性のために商業的に妥当ではなく、この特性には、低い生産性、低い力価、低い収率、および発酵過程の間の酸素の必要が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]  一実施形態では、イソブタノールを製造する方法が提供される。この方法は、イソブタノール産生代謝経路を含む組換え微生物であって、理論収率の少なくとも５パーセントの収率で炭素源からイソブタノールを産生するように選択される組換え微生物を提供する工程を含む。この方法は、回収可能な量のイソブタノールが産生されるまで、炭素源を提供する供給原料を含有する培地中で微生物を培養する工程、およびイソブタノールを回収する工程をさらに含む。いくつかの態様では、微生物は、理論収率の約１０パーセント、２０パーセントまたは５０パーセントを超える収率でイソブタノールを産生するように選択される。
【０００９】
[0009]  別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、親微生物と比較した場合、低減されたピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性を含むように操作された組換え微生物を含む。一態様では、組換え微生物は、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の突然変異を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる。別の態様では、組換え微生物は、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の部分的な欠失を含み、この遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる。別の態様では、組換え微生物は、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子の完全な欠失を含み、この遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる。さらに別の態様では、組換え微生物は、少なくとも１つのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子に関連した調節領域の改変を含み、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる。別の態様では、組換え微生物は、転写制御因子の改変を含み、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子転写の低減を生じる。別の態様では、組換え微生物は、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）遺伝子において突然変異を含み、この遺伝子によってコードされるポリペプチドのピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減を生じる。
【００１０】
[0010]  別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための異種の代謝経路を発現するようにさらに操作された組換え微生物を利用する。一態様では、組換え微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路の活性を増大させるようにさらに操作されている。別の態様では、組換え微生物は、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素、および天然遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素を含むようにさらに操作されている。さらに別の態様では、組換え微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換するための天然代謝経路を含むように選択される。
【００１１】
[0011]  一実施形態では、本明細書に提供される方法は、サッカロミセス・クラデ（Saccharomyces clade）の酵母組換え微生物を含む。
【００１２】
[0012]  別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サッカロミセス・センスストリクト（Saccharomyces sensu stricto）酵母微生物である組換え生物を含む。一態様では、サッカロミセス・センスストリクト酵母微生物は、以下の種、すなわちＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．クドリアブゼビイ（S. kudriavzevii）、Ｓ．ミカタエ（S. mikatae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．ウバルム（S. uvarum）、Ｓ．カロカニス（S. carocanis）、またはこれらのハイブリッドのうちの１つから選択される。
【００１３】
[0013]  別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、クラブトリー陽性組換え酵母微生物を含む。一態様では、クラブトリー陽性酵母微生物は、サッカロミセス属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ピキア（Pichia）属、またはシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属のうちの１つから選択される。他の態様では、クラブトリー陽性酵母微生物は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス（Saccharomyces paradoxus）、サッカロミセス・カステリ（Saccharomyces castelli）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、Ｚ．バイリ（Z. bailli）、Ｚ．ロウキシイ（Z. rouxii）、デバリオミセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ピキア・パストリウス（Pichia pastorius）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、またはサッカロミセス・ウバルムから選択される。
【００１４】
[0014]  別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母微生物を含む。一態様では、ＷＧＤ後酵母は、サッカロミセス属またはカンジダ属のうちの１つから選択される。別の態様では、ＷＧＤ後酵母は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、およびカンジダ・グラブラタから選択される。
【００１５】
[0015]  別の実施形態では、イソブタノールを製造する方法が提供される。この方法は、イソブタノール産生代謝経路を含み、炭素源からイソブタノールを産生するように選択される、組換え微生物を提供する工程を含む。この組換え体は、親微生物と比較した場合、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性の低減をさらに含む。この方法は、回収可能な量のイソブタノールが産生されるまで、炭素源を提供する供給原料を含有する培地中で微生物を培養する工程、およびイソブタノールを回収する工程をさらに含む。いくつかの態様では、微生物は、サッカロミセス・クラデの酵母である。他の態様では、微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。一態様では、微生物は、サッカロミセス・センスストリクト酵母である。他の態様では、微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。
【００１６】
[0016]  他の態様では、微生物は、クルイベロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、またはカンジダ属のうちの１つから選択されるクラブトリー陰性酵母微生物である。他の態様では、クラブトリー陰性酵母微生物は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）、ハネンスラ・アノマラ（Hanensula anomala）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、またはクルイベロミセス・ワルチイ（Kluyveromyces waltii）から選択される。他の態様では、クラブトリー陰性酵母微生物は、トリコスポロン・プルランス（Tricosporon pullulans）、ロドトルラ・リグノフィラ（Rhodotorula lignophila）、またはミキソチマ・バンデルワルチイ（Myxozyma vanderwaltii）、カンジダ・エタノリカ（Candida ethanolica）、デバロミセス・カルソニイ（Debaromyces carsonii）、ピキア・カスチラエ（Pichia castillae）から選択される。
【００１７】
[0017]  別の態様では、微生物は、クラブトリー陽性酵母微生物である。いくつかの態様では、微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。クラブトリー陽性酵母微生物は、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ジゴサッカロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択される。他の態様では、クラブトリー陽性酵母微生物は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、カンジダ・グラブラタ、Ｚ．バイリ、Ｚ．ロウキシイ、デバリオミセス・ハンセニイ、ピキア・パストリウス、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはサッカロミセス・ウバルムから選択される。他の態様では、微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。
【００１８】
[0018]  他の態様では、微生物は、サッカロミセス属またはカンジダ属のうちの１つから選択されるＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母である。他の態様では、ＷＧＤ後酵母は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・カステリ、およびカンジダ・グラブラタから選択される。他の態様では、微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。
【００１９】
[0019]  別の態様では、微生物は、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバリオミセス属、ハンゼヌラ属、パキソレン（Pachysolen）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、またはシゾサッカロミセス属のうちの１つから選択されるＷＧＤ（全ゲノム重複）前酵母である。他の態様では、ＷＧＤ前酵母は、サッカロミセス・クルイベリ、クルイベロミセス・サーモトレランス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、クルイベロミセス・ワルチイ、クルイベロミセス・ラクチス、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アノマラ、ピキア・スチピチス、デバリオミセス・ハンセニイ、Ｈ．アノマラ、パキソレン・タンノフィルス（Pachysolen tannophills）、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、およびシゾサッカロミセス・ポンブ（Schizosaccharomyces pomb）から選択される。
【００２０】
[0020]  他の態様では、本明細書に提供される方法は、トリコスポロン属、ロドトルラ属、またはミキソチマ属のうちの１つから選択される非発酵酵母微生物である微生物を含む。
【００２１】
[0021]  別の実施形態では、組換え微生物が提供される。この微生物は、イソブタノール産生代謝経路を含み、炭素源からイソブタノールを産生するように選択される。この微生物は、親の微生物と比較した場合、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性の低減も含む。様々な態様では、本明細書に提供される微生物として、クラブトリー陰性酵母微生物、サッカロミセス・クラデの微生物、サッカロミセス・センスストリクト酵母微生物、クラブトリー陽性酵母微生物、ＷＧＤ（全ゲノム重複）後酵母微生物、ＷＧＤ（全ゲノム重複）前酵母微生物、および非発酵酵母微生物が挙げられる。
【００２２】
[0022]  いくつかの実施形態では、本明細書に提供される微生物は、ＰＤＣ活性の変化を伴うことなく、親微生物の増殖速度と実質的に等価な増殖速度で、Ｃ２化合物とは無関係に、グルコース上で増殖するように操作されている。
【００２３】
[0023]  本発明の例示的な実施形態は、図面において例示される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】[0024]図１は、イソブタノール経路の例示的な実施形態を例示する図である。
【図２】[0025]図２Ａは、ピルビン酸をイソブタノールに変換するイソブタノール経路、ならびにピルビン酸をアセトアルデヒドおよび二酸化炭素に変換するＰＤＣ経路と一緒に、解糖によるピルビン酸の産生を例示する図である。
【図３】[0026]図２Ｂは、追加のピルビン酸を受け取ることによって、ＰＤＣ経路の欠失または低減のために、高収率でイソブタノールを形成するイソブタノール経路を例示する図である。
【図４】[0027]図ＥＸ４−１は、Ｓ．セレビシエＰｄｃマイナス菌株ＧＥＶＯ１５８４のケモスタット展開（chemostat evolution）の間の、炭素源組成物および経時的な給餌速度（feeding rate）を例示するグラフである。このグラフは、４８０時間の期間にわたって、酢酸がどのように０．３７５ｇ／Ｌから０ｇ／Ｌに減少したかを示す。これは、全給餌速度も示す。より高い給餌速度は、増殖速度がより高いことを意味した。ケモスタットは、培養物２００ｍｌを含んでいたので、希釈率は、２００ｍｌで給餌速度を除することによって計算することができる。
【図５】[0028]図ＥＸ４−２は、親菌株であるＧＥＶＯ１１８７と比較した、ＹＰＤにおける、進化したＰｄｃマイナス突然変異体菌株ＧＥＶＯ１８６３の増殖を例示するグラフである。
【図６】[0029]図ＥＸ４−３は、進化したＰＣＤ突然変異体であるＧＥＶＯ１８６３は、親菌株ＧＥＶＯ１１８７と異なって、ＹＰＤ培地中でエタノールを産生しないことを例示するグラフである。
【図７】[0030]図ＥＸ１−１は、プラスミドｐＧＶ１５０３の模式的なマップを例示する図である。
【図８】[0031]図ＥＸ１−２は、プラスミドｐＧＶ１５３７の模式的なマップを例示する図である。
【図９】[0032]図ＥＸ５−１は、プラスミドｐＧＶ１４２９の模式的なマップを例示する図である。
【図１０】[0033]図ＥＸ５−２は、プラスミドｐＧＶ１４３０の模式的なマップを例示する図である。
【図１１】[0034]図ＥＸ５−３は、プラスミドｐＧＶ１４３１の模式的なマップを例示する図である。
【図１２】[0035]図ＥＸ５−４は、プラスミドｐＧＶ１４７２の模式的なマップを例示する図である。
【図１３】[0036]図ＥＸ５−５は、プラスミドｐＧＶ１４７３の模式的なマップを例示する図である。
【図１４】[0037]図ＥＸ５−６は、プラスミドｐＧＶ１４７５の模式的なマップを例示する図である。
【図１５】[0038]図ＥＸ６−１は、プラスミドｐＧＶ１２５４の模式的なマップを例示する図である。
【図１６】[0039]図ＥＸ６−２は、プラスミドｐＧＶ１２９５の模式的なマップを例示する図である。
【図１７】[0040]図ＥＸ６−３は、プラスミドｐＧＶ１３９０の模式的なマップを例示する図である。
【図１８】[0041]図ＥＸ６−４は、プラスミドｐＧＶ１４３８の模式的なマップを例示する図である。
【図１９】[0042]図ＥＸ７−１は、プラスミドｐＧＶ１５９０の模式的なマップを例示する図である。
【図２０】[0043]図ＥＸ７−２は、プラスミドｐＧＶ１７２６の模式的なマップを例示する図である。
【図２１】[0044]図ＥＸ７−３は、プラスミドｐＧＶ１７２７の模式的なマップを例示する図である。
【図２２】[0045]図ＥＸ８−１は、プラスミドｐＧＶ１０５６の模式的なマップを例示する図である。
【図２３】[0046]図ＥＸ８−２は、プラスミドｐＧＶ１０６２の模式的なマップを例示する図である。
【図２４】[0047]図ＥＸ８−３は、プラスミドｐＧＶ１１０２の模式的なマップを例示する図である。
【図２５】[0048]図ＥＸ８−４は、プラスミドｐＧＶ１１０３の模式的なマップを例示する図である。
【図２６】[0049]図ＥＸ８−５は、プラスミドｐＧＶ１１０４の模式的なマップを例示する図である。
【図２７】[0050]図ＥＸ８−６は、プラスミドｐＧＶ１１０６の模式的なマップを例示する図である。
【図２８】[0051]図ＥＸ８−７は、プラスミドｐＧＶ１６４９の模式的なマップを例示する図である。
【図２９】[0052]図ＥＸ８−８は、プラスミドｐＧＶ１６６４の模式的なマップを例示する図である。
【図３０】[0053]図ＥＸ８−９は、プラスミドｐＧＶ１６７２の模式的なマップを例示する図である。
【図３１】[0054]図ＥＸ８−１０は、プラスミドｐＧＶ１６７３の模式的なマップを例示する図である。
【図３２】[0055]図ＥＸ８−１１は、プラスミドｐＧＶ１６７７の模式的なマップを例示する図である。
【図３３】[0056]図ＥＸ８−１２は、プラスミドｐＧＶ１６７９の模式的なマップを例示する図である。
【図３４】[0057]図ＥＸ８−１３ｓは、プラスミドｐＧＶ１６８３の模式的なマップを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
[0058]  本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形の「１つの（a）」、「および（and）」、および「その（the）」は、脈絡により明らかに別段に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つのポリヌクレオチド（a nucleotide）」への言及は、こうしたポリヌクレオチドの複数を含み、「その微生物（the microorganism）」への言及は、１種または複数の微生物などへの言及を含む。
【００２６】
[0059]  別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価な方法および物質を、開示される方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的な方法、デバイス、および物質が本明細書に記載されている。
【００２７】
[0060]  上記および本文全体にわたって論じられる任意の刊行物は、本願の出願日前に単にこれらを開示するために提供される。本明細書のいかなる部分も、本発明者らが、優先する開示により、そのような開示に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
【００２８】
[0061]  用語「微生物」には、古細菌ドメイン、細菌ドメイン、および真核生物ドメインに由来する原核微生物種および真核微生物種が含まれ、後者には、酵母および糸状菌、原虫、藻類、またはより高度な原生生物が含まれる。用語「微生物細胞」および「微生物（microbe）」は、用語微生物（microorganism）と互換的に使用される。
【００２９】
[0062]  「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌には、以下のような少なくとも１１の異なる群が含まれる：（１）２つの主要な亜門、すなわち（１）高Ｇ＋Ｃ群（放線菌類（Actinomycetes）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）、など）（２）低Ｇ＋Ｃ群（バチルス（Bacillus）、クロストリジア（Clostridia）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasma））が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）プロテオバクテリア（proteobacteria）、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（ほとんどの「一般的な」グラム陰性菌を含む）；（３）ラン藻類（Cyanobacteria）、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータ（Spirochete）および関連種；（５）プランクトミセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria）；（７）クラミジア（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）サーモトガ（Thermotoga）およびサーモシホ（Thermosipho）好熱菌。
【００３０】
[0063]  「グラム陰性菌」には、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌が含まれる。グラム陰性菌の属として、例えば、ナイセリア（Neisseria）、スピリルム（Spirillum）、パスツレラ（Pasteurella）、ブルセラ（Brucella）、エルシニア（Yersinia）、フランシセラ（Francisella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ボルデテラ（Bordetella）、エシェリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、ビブリオ（Vibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、バクテロイデス（Bacteroides）、アセトバクター（Acetobacter）、アエロバクター（Aerobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アゾトバクター（Azotobacter）、スピリラ（Spirilla）、セラチア（Serratia）、ビブリオ、リゾビウム（Rhizobium）、クラミジア、リケッチア（Rickettsia）、トレポネーマ（Treponema）、およびフソバクテリウム（Fusobacterium）が挙げられる。
【００３１】
[0064]  「グラム陽性菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性菌の属として、例えば、アクチノミセス（Actinomyces）、バチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、ラクトバシラス、リステリア（Listeria）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ミクソコッカス（Myxococcus）、ノカルジア（Nocardia）、ブドウ球菌、連鎖球菌、およびストレプトミセス（Streptomyces）が挙げられる。
【００３２】
[0065]  用語「属」は、Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａ（Garrity, G.M., Lilburn, T.G., Cole, J.R., Harrison, SH., Euzeby, J., and Tindall, B.J. （2007） The Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea. TOBA Release 7.7, March 2007. Michigan State University Board of Trustees. [http://www.taxonomicoutline.org/]）による関連種の分類群として定義される。
【００３３】
[0066]  用語「種」は、９７％を超える１６ＳリボソームＲＮＡ配列相同性、および７０％を超えるゲノムハイブリダイゼーションを有する密接に関連した生物のコレクションとして定義され、すべての他の生物と十分に異なる結果、異なる単位として認識される。
【００３４】
[0067]  用語「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で互換的に使用され、内因性のポリヌクレオチドを発現もしくは過剰発現し、またはベクター中に含められるものなどの異種のポリヌクレオチドを発現するように遺伝的に改変された微生物、あるいは内在性遺伝子の発現の変化を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは等価なＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が上方制御または下方制御され、その結果、発現、レベル、または活性が、変化のない状態で観察されるものより大きい、または小さいことを意味する。例えば、用語「変化させる」は、「阻害する」を意味することができるが、単語「変化させる」の使用は、この定義に限定されない。
【００３５】
[0068]  遺伝子配列に関して、用語「発現」は、遺伝子の転写、および適切な場合、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、脈絡から明らかとなるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳から生じる。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望の産物の量に基づいて求めることができる。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）参照）。選択された配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法、例えば、タンパク質に反応して認識し、結合する抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性をアッセイすることによって、またはそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイなどを使用することによって定量化することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、上記を参照。ポリヌクレオチドは、一般に、所望の代謝産物を産生するための代謝経路に関与する標的酵素をコードする。用語「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」は、特定の組換え微生物を指すだけでなく、そのような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すと理解される。突然変異または環境的な影響のために、世代を継ぐうちにある特定の改変が起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用する場合、この用語の範囲内に依然として含まれる。
【００３６】
[0069]  用語「野生型の微生物」は、自然において発生する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。野生型の微生物は、第１の標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝的に改変することができる。この微生物は、第２の標的酵素を発現または過剰発現するように改変された微生物の世代における親微生物として作用することができる。さらには、第１および第２の標的酵素を発現または過剰発現するように改変された微生物は、第３の標的酵素を発現または過剰発現するように改変することができる。
【００３７】
[0070]  したがって、「親微生物」は、連続的、遺伝的改変事象のための参照細胞として機能する。それぞれの改変事象は、参照細胞中に核酸分子を導入することによって実現することができる。この導入により、標的酵素の発現または過剰発現が促進される。用語「促進する」は、例えば、親微生物におけるプロモーター配列の遺伝的改変による、標的酵素をコードする内因性ポリヌクレオチドの活性化を包含すると理解される。用語「促進する」は、親微生物中に、標的酵素をコードする異種のポリヌクレオチドを導入することを包含することがさらに理解される。
【００３８】
[0071]  用語「操作する」は、微生物において検出可能な変化を生じる、微生物の任意の処置を指し、この処置は、それだけに限らないが、微生物に対して異種のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを挿入すること、ならびに微生物に固有のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを突然変異させることを含む。用語「代謝的に操作された」または「代謝的な操作」は、所望の代謝産物の産生のための、生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御要素の合理的な経路設計およびアセンブリーを伴う。「代謝的に操作された」は、所望の経路に至る中間体と競合する競合代謝経路の低下、破壊またはノックアウトを含めた遺伝子操作および適切な培養条件を使用した、転写、翻訳、タンパク質の安定性、およびタンパク質の機能性の調節および最適化による、代謝フラックスの最適化をさらに含むことができる。
【００３９】
[0072]  用語「代謝的に操作された微生物」および「改変された微生物」は、本明細書で互換的に使用され、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。突然変異または環境的な影響のために、世代を継ぐうちにある特定の改変が起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用する場合、この用語の範囲内に依然として含まれる。
【００４０】
[0073]  用語「突然変異」は、本明細書で使用する場合、核酸またはポリペプチドの変化を生じる、核酸および／またはポリペプチドの任意の改変を指す。突然変異には、例えば、ポリヌクレオチド中の１個または複数の残基の点突然変異、欠失、または挿入が含まれ、これには、遺伝子のタンパク質コード領域内で生じる変化、ならびにそれだけに限らないが、制御配列またはプロモーター配列などの、タンパク質コード配列の外側領域における変化が含まれる。遺伝子変化は、任意の型の突然変異であってもよい。例えば、突然変異は、遺伝子の一部またはすべての点突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、または欠失を構成することができる。さらに、改変された微生物のいくつかの実施形態では、微生物ゲノムの一部は、異種のポリヌクレオチドと置換されている。いくつかの実施形態では、突然変異は天然に存在する。他の実施形態では、突然変異は、人為淘汰圧力の結果である。さらに他の実施形態では、微生物ゲノムにおける突然変異は、遺伝子操作の結果である。
【００４１】
[0074]  用語「生合成経路」は、「代謝経路」とも呼ばれ、１つの化学種を別の化学種に変換するための一連の同化または異化の生化学反応を指す。遺伝子産物が、並行して、または連続して、同じ基質上で作用し、同じ産物を産生するか、または同じ基質と代謝産物最終生成物との間の代謝中間体（すなわち、代謝産物）上で作用し、もしくはこの代謝中間体を産生する場合、この遺伝子産物は同じ「代謝経路」に属する。
【００４２】
[0075]  用語「異種の」は、分子、特に、酵素およびポリヌクレオチドを参照して本明細書で使用する場合、分子が由来した生物、または自然において見出される生物以外の生物において発現される分子を示し、発現レベルとは無関係であり、この発現レベルは、天然の微生物における分子の発現レベルより低く、等しく、または高くなり得る。
【００４３】
[0076]  一方、用語「天然の」または「内因性の」は、分子、特に、酵素およびポリヌクレオチドを参照して本明細書で使用する場合、分子が由来した生物、または自然において見出される生物において発現される分子を示し、発現レベルとは無関係であり、この発現レベルは、天然の微生物における分子の発現レベルより低く、等しく、または高くなり得る。天然の酵素またはポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物において改変することができることが理解される。
【００４４】
[0077]  用語「供給原料」は、微生物または発酵過程に供給される原料、または原料の混合物として定義され、これから他の産物を作製することができる。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵過程において生物燃料を産生する微生物のための供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含有することができる。
【００４５】
[0078]  用語「基質」または「適当な基質」は、酵素の作用によって別の化合物に変換され、または変換されることを意味する任意の物質または化合物を指す。この用語は、１種の化合物だけではなく、化合物の組合せ、例えば、少なくとも１つの基質、またはその誘導体を含有する溶液、混合物および他の物質なども含む。さらに、用語「基質」は、任意のバイオマス由来の糖などの出発材料として使用するのに適した炭素源を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載されるような代謝的に操作された微生物と関連する経路において使用される中間体および最終生成物代謝産物も包含する。
【００４６】
[0079]  用語「発酵」または「発酵過程」は、微生物が、供給原料および栄養分などの原料を含有する培地中で培養される過程として定義され、微生物は、供給原料などの原料を産物に変換する。
【００４７】
[0080]  用語「細胞乾燥重量（cell dry weight）」すなわち「ＣＤＷ」は、微生物中に含まれる水が、当業者に既知の方法を使用して除去された後の微生物の重量を指す。ＣＤＷはグラムで報告される。
【００４８】
[0081]  用語「生物燃料」は、燃料内に含まれるすべての炭素がバイオマスに由来し、微生物によって少なくとも部分的に燃料に生化学的に変換される燃料を指す。生物燃料は、１炭素原子当たり０．５未満の酸素原子を含有する非エタノール化合物としてさらに定義される。生物燃料はそれ自体で燃料であるが、石油系燃料とブレンドすることによって、燃料を生成することができる。生物燃料は、石油化学的に得られたガソリン、ディーゼル燃料、またはジェット燃料の代替品として使用することができる。
【００４９】
[0082]  用語「体積生産性」または「生産速度」は、時間の単位当たり、媒質の体積当たり形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり、１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告される。
【００５０】
[0083]  用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表すことができる。収率は、理論収率的収率の割合として表すこともできる。「理論収率的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論によって指示される、基質の所与の量当たり生成することができる産物の最大量として定義される。例えば、グルコースのイソブタノールへの１つの典型的な変換に対する理論収率的収率は、０．４１ｇ／ｇである。したがって、０．３９ｇ／ｇのグルコースからのイソブタノールの収率は、理論収率の９５％、または９５％の理論収率的収率と表される。
【００５１】
[0084]  用語「力価」は、溶液の強度、または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の生物燃料の力価は、発酵ブロス１リットルの溶液中の生物燃料のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。
【００５２】
[0085]  「通性嫌気性生物」または「通性嫌気性微生物」は、酸素の存在下または非存在下で増殖することができる生物として定義される。
【００５３】
[0086]  「絶対的嫌気性生物」または「絶対的嫌気性微生物」は、酸素の存在下で増殖することができず、任意の濃度の酸素の暴露に耐えられない生物として定義される。
【００５４】
[0087]  「嫌気性生物」または「嫌気性微生物」は、酸素の存在下で増殖することができない生物として定義される。
【００５５】
[0088]  「好気性条件」は、発酵培地中の酸素濃度が、最終電子受容体として使用するのに、好気性微生物または通性嫌気性微生物にとって十分に高い条件として定義される。
【００５６】
[0089]  対照的に、「嫌気性条件」は、発酵培地中の酸素濃度が、最終電子受容体として使用するのに微生物にとって低すぎる条件として定義される。嫌気性条件は、最終電子受容体として、微生物にとって酸素がもはや利用可能でなくなるまで、窒素などの不活性ガスを用いて発酵培地をスパージすることによって実現することができる。あるいは、嫌気性条件は、最終電子受容体として、微生物にとって酸素を利用できなくなるまで、微生物が発酵の利用可能な酸素を消費することによって実現することができる。
【００５７】
[0090]  「好気性代謝」は、酸素が最終電子受容体として使用されることによって、炭水化物から一般にＡＴＰの形態でエネルギーを生成する生化学的過程を指す。好気性代謝は、例えば、解糖およびＴＣＡサイクルを介して起こり、１個のグルコース分子が、酸素の存在下で完全に代謝されて二酸化炭素になる。
【００５８】
[0091]  対照的に、「嫌気性代謝」は、酸素が、ＮＡＤＨに含まれる電子の最終的な受容体でない生化学的過程を指す。嫌気性代謝は、酸素以外の化合物が、最終電子受容体として役割を果たす嫌気性呼吸、およびＮＡＤＨに由来する電子が、「発酵経路」を介して還元産物を生成するのに利用される基質レベルのリン酸化に分類することができる。
【００５９】
[0092]  「発酵経路」において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ中に担持される電子を生成した同じ代謝経路によって生成される分子にその電子を供与する。例えば、ある特定の酵母菌株の発酵経路の１つでは、解糖を介して生成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ピルビン酸にその電子を移し、エタノールを生じる。発酵経路は、嫌気性条件下で通常活性であるが、好気性条件下、ＮＡＤＨが、呼吸鎖を介して完全に酸化されない条件下でも起こり得る。例えば、ある特定のグルコース濃度の上で、クラブトリー陽性酵母は、好気性条件下で大量のエタノールを産生する。
【００６０】
[0093]  用語「副生物」は、生物燃料または生物燃料前駆体の製造に関係する望まれない生成物を意味する。副生物は、一般に廃棄物として処理され、製造過程にコストを加える。
【００６１】
[0094]  用語「非発酵酵母」は、ＮＡＤＨに由来する電子が、グルコースからエタノールおよびＣＯ２の産生などの発酵経路を介した還元産物を生成するのに利用される嫌気性代謝を実証することができない酵母種である。非発酵酵母は、「Ｄｕｒｈａｍ管試験」（Ｊ.A. Barnett, R.W. Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeasts Characteristics and Identification. 3rd edition. p. 28-29. Cambridge University Press, Cambridge, UK.）によって、またはエタノールおよびＣＯ２などの発酵産生の産生をモニタリングすることによって同定することができる。
【００６２】
[0095]  用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と互換的に本明細書で使用され、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはこれらの類似体を含めた２つ以上の単量体からなる有機ポリマーを指し、これらは、それだけに限らないが、任意の長さの一本鎖または二本鎖の、センスまたはアンチセンスデオキシリボ核酸（DNA）、および適切な場合、ｓｉＲＮＡを含めた、任意の長さの一本鎖または二本鎖の、センスまたはアンチセンスリボ核酸（RNA）を含む。用語「ヌクレオチド」は、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸基に結合したリボースまたはデオキシリボース糖からなり、核酸の塩基構造単位である、任意のいくつかの化合物を指す。用語「ヌクレオシド」は、デオキシリボースまたはリボースと結合したプリンまたはピリミジン塩基からなり、特に核酸中に見出される化合物（グアノシンまたはアデノシン）を指す。用語「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」はそれぞれ、１つまたは複数の個々の原子が、異なる原子または異なる官能基で置換されたヌクレオチドまたはヌクレオシドを指す。したがって、用語ポリヌクレオチドは、任意の長さの核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体および断片を含む。３つ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドは、ヌクレオチドオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【００６３】
[0096]  本明細書に記載されるポリヌクレオチドには、「遺伝子」が含まれ、本明細書に記載される核酸分子には、「ベクター」または「プラスミド」が含まれることが理解される。したがって、用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも呼ばれ、１つまたは複数のタンパク質、または酵素のすべてまたは一部を構成する、アミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドを指し、プロモーター配列などの制御（転写されていない）ＤＮＡ配列を含むことができ、この配列は、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する。遺伝子の転写された領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（UTR）、および３’−ＵＴＲ、ならびにコード配列を含めた非翻訳領域を含むことができる。
【００６４】
[0097]  用語「オペロン」は、共通のプロモーターから１個の転写単位として転写される２つ以上の遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、オペロンを含む遺伝子は、隣接遺伝子である。オペロン全体の転写は、共通のプロモーターを改変することによって、改変する（すなわち、増大させる、減少させる、または排除する）ことができることが理解される。あるいは、オペロン中の任意の遺伝子または遺伝子の組合せは、コードされるポリペプチドの機能または活性が変更されるように改変することができる。改変は、コードされるポリペプチドの活性を増大させることができる。さらに、改変は、コードされるポリペプチドに新しい活性を与えることができる。例示的な新しい活性には、代替の基質の使用および／または代替の環境条件下で機能する能力が含まれる。
【００６５】
[0098]  「ベクター」は、核酸が、生物、細胞、または細胞成分間を伝搬かつ／または移動することができる任意の手段である。ベクターとして、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、および人工の染色体、例えば、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌性人工染色体）、およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などが挙げられ、これは「エピソーム」であり、すなわち、自発的に複製し、宿主細胞の染色体に組み込むことができる。ベクターは、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内にＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなるポリヌクレオチド、ポリリシン結合ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡもしくはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであってもよく、これは、本質的にエピソームではなく、またはベクターは、上記ポリヌクレオチドコンストラクトのうちの１つまたは複数を含む生物、例えば、アグロバクテリウムまたは細菌などとすることができる。
【００６６】
[0099]  「形質転換」は、ベクターが宿主細胞中に導入される過程を指す。形質転換（またはトランスダクション、またはトランスフェクション）は、化学物質形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換）、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃（または粒子ボンバードメント媒介送達）、またはアグロバクテリウム媒介形質転換を含めたいくつかの手段のうちの任意の１つによって実現することができる。
【００６７】
[00100]  用語「酵素」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の化学的または生化学的な反応を触媒または促進する任意の物質を指し、これは通常、完全または部分的にポリペプチドからなる酵素を含むが、ポリヌクレオチドを含む異なる分子からなる酵素を含むことができる。
【００６８】
[00101]  用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、２つ以上のアミノ酸単量体および／またはその類似体からなる有機ポリマーを示す。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」または「アミノ酸単量体」は、グリシンおよびＤまたはＬの両光学異性体を含めた任意の天然および／または合成アミノ酸を指す。用語「アミノ酸類似体」は、１つまたは複数の個々の原子が、異なる原子、または異なる官能基で置換されたアミノ酸を指す。したがって、用語ポリペプチドは、全長のタンパク質、およびペプチド、ならびにこれらの類似体および断片を含めた、任意の長さのアミノ酸ポリマーを含む。３つ以上のアミノ酸のポリペプチドは、タンパク質オリゴマーまたはオリゴペプチドとも呼ばれる。
【００６９】
[00102]  用語「相同体」は、第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に関して使用され、第２のファミリーまたは種の異なる酵素または遺伝子を指し、これは、機能的、構造的、またはゲノム分析によって、第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に対応する、第２のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であると判定される。ほとんどの場合、相同体は、機能的、構造的、またはゲノム類似性を有することになる。酵素または遺伝子の相同体を、遺伝子プローブおよびＰＣＲを使用して、容易にクローン化することができる技法が知られている。相同体としてのクローン化配列の素性は、機能的アッセイを使用して、および／または遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。
【００７０】
[00103]  タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と同様の配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質に対して「相同性」を有し、または「相同性」である。あるいは、２つのタンパク質が、「同様の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質に対して相同性を有する。（したがって、用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が、同様のアミノ酸配列を有することを意味するために定義される）。
【００７１】
[00104]  用語「類似体」または「類似の」は、互いに機能のみで関係し、共通の系統に由来せず、共通の祖先配列を共有しない核酸配列もしくはタンパク質配列、またはタンパク質構造を指す。類似体は、配列が異なる場合があるが、収束進化のために同様の構造を共有することができる。例えば、酵素が、基質を産物に変換する同じ反応を触媒し、配列において無関係であり、２つの酵素が、構造において関連しているかどうかに関係ない場合、２つの酵素は類似体であり、または類似している。
【００７２】
一般の微生物
[00105]  クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）などの１−ブタノールの天然産生株が知られているが、これらの生物は、発酵の間に副生成物、例えば、アセトン、エタノール、および酪酸なども産生する。さらに、これらの微生物は、Ｓ．セレビシエまたは大腸菌（E. coli）などのより一般に使用される産生宿主より、相対的に処置が困難であり、著しく少ないツールが利用可能である。さらに、これらの天然産生株の生理機能および代謝的調節は、それほどよく理解されておらず、高効率の産生に向けた急速な進展を妨害している。さらに、工業的に妥当な量でグルコースをイソブタノールに代謝することできる天然微生物はまったく同定されていない。
【００７３】
[00106]  サッカロミセス・セレビシエを含めた様々な酵母種によるイソブタノールおよび他のフーゼルアルコールの産生は、アルコール飲料の酒造家に特別興味を持たれており、この酒造家にとってフーゼルアルコールは望ましくないオフノートを構成することが多い。野生型酵母におけるイソブタノールの産生は、１２〜２１９ｍｇ／Ｌのイソブタノールが生成された、ワイン醸造からのグレープマスト（Romano, et al., Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains from spontaneously fermented grape musts, World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19:311-315, 2003）から、１６〜３４ｍｇ／Ｌのイソブタノールを生成する、補充された最少培地（Oliviera, et al. (2005) World Journal of Microbiology and Biotechnology 21:1569-1576）におよぶ様々な増殖培地に対して実証されている。Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎらからの研究（J Biol Chem. 272（43）:26871-8, 1997）により、分岐鎖アミノ酸（例えば、バリンまたはロイシン）をイソブタノールに変換する内因性のＳ．セレビシエ経路において利用される酵素工程が同定された。
【００７４】
[00107]  本明細書に提供される組換え微生物は、適当な炭素源からイソブタノールを産生するための経路に関与する、複数の異種および／または天然の標的酵素を発現することができる。
【００７５】
[00108]  したがって、代謝的に「操作された」または「改変された」微生物は、最適な宿主もしくは親微生物への遺伝物質の導入および／または天然遺伝子の発現の改変によって作製され、それによって微生物の細胞の生理機能および生化学が改変または変更される。遺伝物質の導入および／または天然遺伝子の発現の改変を通じて、親微生物は、新しい特性、例えば、新しい、またはより多くの量の細胞内代謝産物を産生する能力を得る。本明細書で記載されるように、親微生物への遺伝物質の導入および／または親微生物における天然遺伝子の発現の改変により、イソブタノールを産生する新しい、または改良された能力が生じる。親微生物に導入された遺伝物質および／または親微生物における発現に関して改変された遺伝子は、イソブタノールを産生するための生合成経路に関与する酵素のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子（複数も）、または遺伝子の一部を含有し、これらの遺伝子、例えば、プロモーター配列の発現および／または発現の調節のための追加の要素も含むことができる。
【００７６】
[00109]  宿主または親微生物への遺伝物質の導入に加えて、操作または改変された微生物も、遺伝子またはポリヌクレオチドの変化、破壊、欠失、またはノックアウトを含むことによって、微生物の細胞の生理機能および生化学を変更することができる。遺伝子またはポリヌクレオチドの変化、破壊、欠失またはノックアウトを通じて、微生物は、新しい、または改善された特性（例えば、新しい代謝産物もしくはより多くの量の細胞内代謝産物を産生し、所望の経路を下る代謝産物のフラックスを改善し、かつ／または副生成物の産生を低減する能力）を得る。
【００７７】
[00110]  本明細書に提供される組換え微生物は、親微生物において入手できない量で代謝産物を産生することもできる。「代謝産物」は、代謝によって産生される任意の物質、または特定の代謝過程に必要な、もしくは関与する物質を指す。代謝産物は、代謝の出発材料（例えば、グルコースもしくはピルビン酸）、中間体（例えば、２−ケトイソ吉草酸）、または最終生成物（例えば、イソブタノール）である有機化合物である場合がある。代謝産物は、より複雑な分子を構築するのに使用することができ、またはこれらは、より単純なものに分解することができる。中間体の代謝産物は、他の代謝産物から合成し、おそらくより複雑な物質を作製するのに使用し、またはより単純な化合物に分解することができ、化学エネルギーの放出を伴うことが多い。
【００７８】
[00111]  例示的な代謝産物には、グルコース、ピルビン酸、およびイソブタノールが含まれる。代謝産物のイソブタノールは、ピルビン酸をイソブタノールに変換する代謝経路を発現または過剰発現するように代謝的に操作された組換え微生物によって生成することができる。ピルビン酸をイソブタノールに変換する例示的な代謝経路は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ALS）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（KARI）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（DHAD）、２−ケト酸脱炭酸酵素（KIVD）、およびアルコール脱水素酵素（ADH）からなる場合がある。
【００７９】
[00112]  したがって、イソブタノールを産生し、いくつかの態様では、標的酵素、例えば、ＡＬＳ、ＫＡＲＩ、ＤＨＡＤ、ＫＩＶＤ、およびＡＤＨなどの発現の上昇を含むことができる組換え微生物が本明細書に提供される。
【００８０】
[00113]  本開示は、本開示の方法、組成物および生物において有用な特異的遺伝子を同定するが、そのような遺伝子に対する絶対的な同一性は必要ではないことが認識される。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドの変更を、活性について実施およびスクリーニングすることができる。一般にそのような変更は、保存的突然変異およびサイレント突然変異を含む。そのような改変された、または突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当技術分野で既知の方法を使用して、機能的な酵素の発現についてスクリーニングすることができる。
【００８１】
[00114]  遺伝子コードの固有の縮重のために、同じ、または機能的に等価なポリペプチドを実質的にコードする他のポリヌクレオチドを、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローン化し、発現させるのに使用することもできる。
【００８２】
[00115]  当業者によって理解されるように、コード配列を改変することによって、特定の宿主におけるその発現を増強することは有利となり得る。遺伝子コードは重複しており、６４の可能なコドンを有するが、ほとんどの生物は一般に、これらのコドンのサブセットを使用する。１つの種において最も頻繁に利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、それほど頻繁に利用されないものは、希少コドンまたは低使用コドンとして分類される。コドンを置換することによって、宿主の好適なコドン使用、すなわち「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」と時に呼ばれる過程を反映することができる。
【００８３】
[00116]  特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列（Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508も参照）を調製することによって、例えば、最適化されていない配列から生成される転写物と比較した場合、翻訳速度を増大させ、またはより長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。翻訳終止コドンも改変することによって、宿主の選好性を反映することができる。例えば、Ｓ．セレビシエおよび哺乳動物についての典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物についての典型的な終止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫および大腸菌は、一般に、終止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphin et al. （1996） Nucl. Acids Res. 24: 216-218）。植物における発現のためにヌクレオチド配列を最適化するための方法は、米国特許第６，０１５，８９１号、およびこれに引用された参考文献に提供されている。
【００８４】
[00117]  遺伝子コードの縮重した性質のために、ヌクレオチド配列が異なる様々なＤＮＡ化合物を使用することによって、本開示の所与の酵素をコードすることができることを、当業者は認識するであろう。上述した生合成の酵素をコードする天然のＤＮＡ配列は、本開示の実施形態を単に例示するために本明細書に参照され、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ化合物を含む。同様の様式で、ポリペプチドは一般に、所望の活性の喪失または著しい喪失を伴うことなく、そのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容することができる。本開示は、ポリペプチドが改変され、またはバリアントポリペプチドが、参照ポリペプチドの酵素的な同化もしくは異化の活性を有する限り、本明細書に記載される特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の実施形態を単に例示する。
【００８５】
[00118]  さらに、代謝産物を生成するのに有用な酵素の相同体は、本明細書に提供される微生物および方法によって包含される。
【００８６】
[00119]  本明細書で使用する場合、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するとき実質的に相同性である。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性率を求めるために、配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの１つまたは両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。一実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、一般的には少なくとも４０％、より一般的には少なくとも５０％、さらにより一般的には少なくとも６０％、さらにより一般的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置で、アミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における１つの位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているとき、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性率は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要がある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００８７】
[00120]  「相同性の」が、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一でない残基の位置は、同類アミノ酸置換によって異なることが多いことが認識される。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、同類アミノ酸置換により、タンパク質の機能的特性は実質的に変更されない。２つ以上のアミノ酸配列が同類置換によって互いに異なる場合では、配列同一性率または相同性の程度は、上向きに調整することによって、置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である（例えば、ここに参照により本明細書に組み込まれている、Pearson W.R. Using the FASTA program to search protein and DNA sequence databases, Methods in Molecular Biology,1994, 25:365-89を参照）。
【００８８】
[00121]  以下の６つの群はそれぞれ、互いに同類置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（S）、トレオニン（T）；２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；４）アルギニン（R）、リシン（K）；５）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、アラニン（A）、バリン（V）、および６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【００８９】
[00122]  ポリペプチドについての配列同一性は、パーセント配列同一性率とも呼ばれ、一般に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （GCG），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照。タンパク質分析ソフトウェアは、同類アミノ酸置換を含めた、様々な置換、欠失、および他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して、同様の配列を照合する。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含み、これらは、デフォルトのパラメータを用いて使用することによって、生物の異なる種に由来する相同性ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド同士間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を求めることができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照。
【００９０】
[00123]  様々な生物に由来する多数の配列を含むデータベースと分子配列を比較して使用される一般的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F., et al. （1990） "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. and States, D.J. （1993） "Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al. （1996） "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. and Madden, T.L. （1997） "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7:649-656）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Altschul, S.F., et al. （1997） "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）である。ＢＬＡＳＴｐについての典型的なパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開けるためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを延ばすためのコスト：１（デフォルト）；最大アライメント：１００（デフォルト
）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記述の数：１００（デフォルト）；ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００９１】
[00124]  多数の様々な生物に由来する配列を含むデータベースを探索しているとき、アミノ酸配列を比較することが一般的である。アミノ酸配列を使用したデータベース探索は、当技術分野で知られているｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって比較することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と探索配列の間の最大重なりの領域のアライメントおよび配列同一性率をもたらす（Pearson, W.R. （1990） "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Meth. Enzymol. 183:63-98）。例えば、アミノ酸配列同士間の配列同一性率は、ここに参照により本明細書に組み込まれているＧＣＧバージョン６．１において提供されるような、そのデフォルトパラメータ（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を有するＦＡＳＴＡを使用して求めることができる。
【００９２】
[00125]  本開示は、高収率で適当な基質からイソブタノールを産生するための生化学的経路を含む、代謝的に操作された微生物を提供する。本開示の代謝的に操作された微生物は、生物のゲノム内、または生物内のゲノム外側に１つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを含む。微生物は、野生型生物において見出される遺伝子の低下、破壊、もしくはノックアウトおよび／または異種ポリヌクレオチドの導入および／または内因性ポリヌクレオチドの発現もしくは過剰発現を含むことができる。
【００９３】
[00126]  一態様では、本開示は、親微生物と比較した場合、少なくとも１つの標的酵素の発現の上昇を含む組換え微生物を提供し、親生物において見出されない酵素をコードする。別の態様またはさらなる態様では、微生物は、イソブタノールの産生に必要な代謝産物と競合する酵素をコードする、少なくとも１つの遺伝子の低下、破壊、またはノックアウトを含む。組換え微生物は、イソブタノールを産生するための生合成経路に関与する、少なくとも１つの代謝産物を産生する。一般に、組換え微生物は、標的酵素を含む、少なくとも１つの組換え代謝経路を含み、競合的な生合成経路における活性の低減、または酵素の発現をさらに含むことができる。この経路は、イソブタノールの産生において基質または代謝中間体を改変するように作用する。標的酵素は、適当な生物源に由来するポリヌクレオチドによってコードされ、このポリヌクレオチドから発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、原核生物源または真核生物源に由来し、本開示の微生物中に組換えによって操作された遺伝子を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主生物体に固有の遺伝子を含む。
【００９４】
[00127]  様々な微生物を改変することによって、イソブタノールを産生するのに適した組換え代謝経路を含めることができることが理解される。様々な実施形態では、微生物は、酵母微生物から選択することができる。イソブタノールの産生のための酵母微生物は、ある特定の特徴に基づいて選択することができる。
【００９５】
[00128]  一特徴は、微生物が、様々な炭素源をイソブタノールに変換するように選択される特性を含むことができる。したがって、一実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、それだけに限らないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ラクトース、スクロース、およびこれらの混合物を含めた様々な炭素源を産物に変換することができる。
【００９６】
[00129]  別の特徴は、野生型または親微生物が非発酵性であるという特性を含むことができる。言い換えれば、これは炭素源を嫌気的に代謝することができないが、酵母は、酸素の存在下で炭素源を代謝することができる。非発酵性酵母は、天然に存在する酵母、ならびに遺伝的に改変された酵母の両方を指す。発酵性酵母を用いた嫌気性発酵の間、解糖からＮＡＤＨを酸化するための主な経路は、エタノールの産生を通じてである。エタノールは、アセトアルデヒドの還元を介してアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）によって産生され、アセトアルデヒトは、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）によってピルビン酸から産生される。したがって、一実施形態では、発酵性酵母を、固有のＰＤＣ活性を低減または排除することにより、非発酵性になるように操作することができる。したがって、解糖によって産生されるピルビン酸のほとんどは、ＰＤＣによって消費されず、イソブタノール経路に利用可能である。この経路の欠失により、イソブタノール経路に利用可能なピルビン酸および還元当量が増加する。発酵経路は、イソブタノールの低収率および低生産性の一因となる。したがって、ＰＤＣの欠失は、イソブタノールの収率および生産性を増加させることができる。
【００９７】
[00130]  第３の特徴は、生体触媒が、様々な炭素源をイソブタノールに変換するように選択される特性を含むことができる。
【００９８】
[00131]  一実施形態では、酵母微生物は、１９９８年にＫｕｒｔｚｍａｎおよびＲｏｂｎｅｔｔ（"Identification and phylogeny of ascomycetous yeast from analysis of nuclear large subunit （26S） ribosomal DNA partial sequences." Antonie van Leeuwenhoek 73: 331-371, figure2）によって、子嚢菌酵母の分類学的クラスとして定義された「サッカロミセス酵母クラデ」から選択することができる。彼らは、リボソーム大サブユニット２６Ｓをコードする遺伝子の５’末端で、Ｄ１／Ｄ２ドメインのヌクレオチド配列を比較することによって、約５００の酵母種の関連性を求めることができた。Ｓ．セレビシエならびにこのサッカロミセス酵母クラデから最も遠位の２つの酵母、すなわちＫ．ラクチスおよびＫ．マルキシアヌスのＤ１／Ｄ２ヌクレオチド配列の対での比較では、８０％を超える同一性を共有する。
【００９９】
[00132]  用語「サッカロミセス・センスストリクト」分類学群は、Ｓ．セレビシエに高度に関連した酵母種のクラスターである（Rainieri, S. et al 2003. Saccharomyces Sensu Stricto: Systematics, Genetic Diversity and Evolution. J. Biosci Bioengin 96（1）1-9）。サッカロミセス・センスストリクト酵母種として、それだけに限らないが、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．クドリアブゼビイ、Ｓ．ミカタエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．ウバルム、Ｓ．カロカニス、およびこれらの種に由来するハイブリッドが挙げられる（Masneuf et al. 1998. New Hybrids between Saccharomyces Sensu Stricto Yeast Species Found Among Wine and Cider Production Strains. Yeast 7（1）61-72）。
【０１００】
[00133]  古来の全ゲノム重複（WGD）事象は、半子嚢菌類酵母の進化の間に起こり、比較ゲノムツールを使用して発見された（Kellis et al 2004 "Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast S. cerevisiae." Nature 428:617-624. Dujon et al 2004 "Genome evolution in yeasts." Nature 430:35-44. Langkjaer et al 2003 "Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes." Nature 428:848-852. Wolfe and Shields 1997 "Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome." Nature 387:708-713）。この主要な進化事象を使用して、酵母は、ＷＧＤ事象の後に共通の祖先から分岐した種（本明細書で「ＷＧＤ後酵母」と呼ばれる）およびＷＧＤ事象の前に酵母系列から分岐した種（本明細書で「ＷＧＤ前酵母」と呼ばれる）に分類することができる。
【０１０１】
[00134]  したがって、一実施形態では、酵母微生物は、それだけに限らないが、サッカロミセスおよびカンジダを含めたＷＧＤ後酵母属から選択することができる。好適なＷＧＤ後酵母種として、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ウバルム、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パラドキサス、Ｓ．カステリ、およびＣ．グラブラタが挙げられる。
【０１０２】
[00135]  別の実施形態では、酵母微生物は、それだけに限らないが、サッカロミセス、クルイベロミセス、カンジダ、ピキア、イッサトケンキア（Issatchenkia）、デバリオミセス、ハンゼヌラ、ヤロウィア、およびシゾサッカロミセスを含めた、全ゲノム重複前（WGD前）酵母属から選択することができる。代表的なＷＧＤ前酵母種として、Ｓ．クルイベリ、Ｋ．サーモトレランス、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．ワルチイ、Ｋ．ラクチス、Ｃ．トロピカリス、Ｐ．パストリス、Ｐ．アノマラ、Ｐ．スチピチス、Ｉ．オリエンタリス（I. orientalis）、Ｉ．オシデンタリス（I. occidentalis）、Ｉ．スクツラタ（I. scutulata）、Ｄ．ハンセニイ、Ｈ．アノマラ、Ｙ．リポリチカ、およびＳ．ポンベが挙げられる。
【０１０３】
[00136]  酵母微生物は、クラブトリー陰性であっても、クラブトリー陽性であってもよい。クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞は、クラブトリー効果を示さない任意の酵母細胞である。用語「クラブトリー陰性」は、天然に存在する生物および遺伝的に改変された生物の両方を指す。簡単に言えば、クラブトリー効果は、高濃度のグルコース（例えば、１Ｌ当たり５０ｇのグルコース）の存在により、好気性条件下で培養される場合の微生物による酸素消費の阻害として定義される。言い換えれば、クラブトリー陽性表現型を有する酵母細胞は、グルコースの存在のために酸素利用可能性に関係なく発酵し続ける一方で、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞は、酸素消費のグルコース媒介阻害を示さない。
【０１０４】
[00137]  したがって一実施形態では、酵母微生物は、それだけに限らないが、クルイベロミセス属、ピキア属、イッサトケンキア属、ハンゼヌラ属、およびカンジダ属を含めた、クラブトリー陰性表現型を有する酵母から選択することができる。クラブトリー陰性種として、それだけに限らないが、Ｋ．ラクチス、Ｋ．マルキシアヌス、Ｐ．アノマラ、Ｐ．スチピチス、Ｉ．オリエンタリス、Ｉ．オシデンタリス、Ｉ．スクツラタ、Ｈ．アノマラ、およびＣ．ウチリスが含まれる。
【０１０５】
[00138]  別の実施形態では、酵母微生物は、それだけに限らないが、サッカロミセス、クルイベロミセス、ジゴサッカロミセス、デバリオミセス、ピキア、およびシゾサッカロミセスを含めた、クラブトリー陽性表現型を有する酵母から選択することができる。クラブトリー陽性酵母種として、それだけに限らないが、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ウバルム、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パラドキサス、Ｓ．カステリ、Ｓ．クルイベリ、Ｋ．サーモトレランス、Ｃ．グラブラタ、Ｚ．バイリ、Ｚ．ロウキシイ、Ｄ．ハンセニイ、Ｐ．パストリウス、およびＳ．ポンベが挙げられる。
【０１０６】
[00139]  一実施形態では、酵母微生物は、解糖によりグルコースなどの炭素源をピルビン酸に変換するように操作されており、ピルビン酸は、操作されたイソブタノール経路を介してイソブタノールに変換される（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４１６０２、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３５１４）。イソブタノールを産生するための代替経路は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４１６０２号、およびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：２５７５１−１５７５６（１９９８）に記載されている。
【０１０７】
[00140]  したがって、ピルビン酸をイソブタノールに変換するように操作されたイソブタノール経路は、以下の反応からなることができる：
１．２ピルビン酸→アセト乳酸＋ＣＯ２
２．アセト乳酸＋ＮＡＤＰＨ→２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸＋ＮＡＤＰ＋
３．２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸→α−ケトイソ吉草酸
４．α−ケトイソ吉草酸→イソブチルアルデヒド＋ＣＯ２
５．イソブチルアルデヒド＋ＮＡＤＰＨ→イソブタノール＋ＮＡＤＰ＋
【０１０８】
[00141]  これらの反応は、酵素、すなわち、１）アセト乳酸合成酵素（ALS、EC4.1.3.18）、２）ケト−酸レダクト−イソメラーゼ（KARI、EC1.1.1.86）、３）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（DHAD、EC4.2.1.9）、４）ケト−イソ吉草酸脱炭酸酵素（KIVD、EC4.1.1.1）、および５）アルコール脱水素酵素（ADH、EC1.1.1.1または1.1.1.2）によって実施される。
【０１０９】
[00142]  別の実施形態では、酵母微生物は、これらの酵素を過剰発現するように操作されている。例えば、これらの酵素は、天然遺伝子によってコードされ得る。例えば、ＡＬＳは、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）のａｌｓＳ遺伝子、Ｌ．ラクチスのａｌｓＳ、またはＫ．ニューモニア（K. pneumonia）のｉｌｖＫ遺伝子によってコードされ得る。例えば、ＫＡＲＩは、大腸菌、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum）、Ｍ．マリパルジス（M. maripaludis）、またはピロミセス（Piromyces）種Ｅ２のｉｌｖＣ遺伝子によってコードされ得る。例えば、ＤＨＡＤは、大腸菌またはＣ．グルタミクムのｉｌｖＤ遺伝子によってコードされ得る。ＫＩＶＤは、Ｌ．ラクチスのｋｉｖＤ遺伝子によってコードされ得る。ＡＤＨは、Ｓ．セレビシエのＡＤＨ２、ＡＤＨ６、またはＡＤＨ７によってコードされ得る。
【０１１０】
[00143]  本発明の酵母微生物は、ピルビン酸をイソブタノールに変換する、増大された能力を有するように操作することができる。一実施形態では、酵母微生物は、ピルビン酸をイソブチルアルデヒドに変換する、増大された能力を有するように操作することができる。別の実施形態では、酵母微生物は、ピルビン酸をケト−イソ吉草酸に変換する、増大された能力を有するように操作することができる。別の実施形態では、酵母微生物は、ピルビン酸を２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸に変換する、増大された能力を有するように操作することができる。別の実施形態では、酵母微生物は、ピルビン酸をアセト乳酸に変換する、増大された能力を有するように操作することができる。
【０１１１】
[00144]  さらに、前述の酵素をコードする任意の遺伝子（または本明細書に述べられる任意の他のもの（もしくはその発現を制御または調節する任意の調節エレメント））は、遺伝子／タンパク質工学技法、例えば、指向進化または合理的な突然変異生成などによって最適化することができ、これらは当業者に知られている。そのような作用により、当業者は、酵母における発現および活性のための酵素を最適化することが可能になる。
【０１１２】
[00145]  さらに、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌種および細菌性種から同定することができ、この経路の調節のために発現させることができる。それだけに限らないが、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ウバルムを含めたサッカロミセス種、Ｋ．サーモトレランス（K. thermotolerans）、Ｋ．ラクチス、およびＫ．マルキシアヌスを含めたクルイベロミセス種、ピキア種、Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）を含めたハンゼヌラ種、カンジダ種、トリコスポロン（Trichosporon）種、Ｙ．種スチピチスを含めたヤマダジマ（Yamadazyma）種、トルラスポラ・プレトリエンシス（Torulaspora pretoriensis）、Ｓ．ポンベを含めたシゾサッカロミセス種、クリプトコッカス（Cryptococcus）種、アスペルギルス（Aspergillus）種、ニューロスポラ（Neurospora）種、またはウスチラゴ（Ustilago）種を含めた様々な生物は、これらの酵素の供給源として機能を果たすことができる。嫌気性真菌に由来する遺伝子の供給源には、それだけに限らないが、ピロミセス種、オルピノミセス（Orpinomyces）種、またはネオカリマスチクス（Neocallimastix）種が含まれる。有用である原核生物酵素の供給源として、それだけに限らないが、大腸菌、ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、バチルス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、シュードモナス種、ラクトコッカス（Lactococcus）種、エンテロバクター（Enterobacter）種、およびサルモネラ種が挙げられる。
【０１１３】
一般の方法
酵母微生物におけるＰＤＣの同定
[00146]  ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）活性を有する酵素をコードする遺伝子を同定するのに、任意の方法を使用することができる。ＰＤＣは、アセトアルデヒドを形成するためのピルビン酸の脱炭酸を触媒する。一般に相同性もしくは類似のＰＤＣ遺伝子および／または相同性もしくは類似のＰＤＣ酵素は、機能的、構造的および／または遺伝子分析によって同定することができる。ほとんどの場合、相同性もしくは類似のＰＤＣ遺伝子および／または相同性もしくは類似のＰＤＣ酵素は、機能的、構造的、または遺伝子の類似性を有する。当業者に既知の技法が、相同遺伝子および相同酵素を同定するのに適当となり得る。一般に、類似遺伝子および／または類似酵素は、機能的な分析によって同定することができ、機能的な類似性を有する。当業者に既知の技法が、類似遺伝子および類似酵素を同定するのに適当となり得る。例えば、相同または類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するために、技法は、それだけに限らないが、遺伝子／酵素の公開された配列に基づくプライマーを使用するＰＣＲ、またはＰＤＣ遺伝子の中の保存領域を増幅するために設計された縮重プライマーを使用する縮重ＰＣＲによるＰＤＣ遺伝子のクローニングを含むことができる。さらに、当業者は、機能的な相同性または類似性を有する相同または類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技法を使用することができる。技法は、前記活性のためのインビトロ酵素アッセイによって、酵素の触媒活性について細胞または細胞培養物を検査する工程、次いで精製によって前記活性を有する酵素を単離する工程、技法、例えば、エドマン分解、有望な核酸配列に対するＰＣＲプライマーの設計、ＰＣＲによる前記ＤＮＡ配列の増幅、および前記核酸配列のクローニングなどによって酵素のタンパク質配列を決定する工程を含む。相同もしくは類似遺伝子および／または相同もしくは類似酵素、類似遺伝子および／または類似酵素もしくはタンパク質を同定するために、技法はまた、データベース例えば、ＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣなどを用いた、候補遺伝子または酵素に関するデータの比較を含む。候補遺伝子または酵素は、本明細書の教示に従って、上述したデータベース内で同定することができる。さらに、ＰＤＣ活性は、表現型的に求めることができる。例えば、発酵条件下でのエタノール産生を評価することができる。エタノール産生の欠如は、ＰＤＣ活性をまったく含まない酵母微生物を示す場合がある。
【０１１４】
遺伝子挿入および欠失
[00147]  核酸分子を酵母中に導入するために、任意の方法を使用することができ、多くのそのような方法は周知である。例えば、形質転換および電気穿孔は、核酸を酵母細胞中に導入するための一般的な方法である。例えば、Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：６９−７４（１９９２）；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１５３：１６３−１６８（１９８３）；およびＢｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７（１９９１）を参照。
【０１１５】
[00148]  一実施形態では、対象とする遺伝子の、酵母微生物のＤＮＡ断片または標的遺伝子中への組込みは、相同的組換えの原理によって行われる。この実施形態によれば、少なくとも１つの酵母マーカー遺伝子および／または組み込まれる遺伝子（内部モジュール）を含むモジュールを含有する組込みカセットは、標的組込み部位（組換え配列）の両端のＤＮＡ断片に相同のＤＮＡ断片によって、いずれかの側に隣接する。適切な方法によってこのカセットを用いて酵母を形質転換した後、組込みカセットの組換え配列に対応するゲノムの２つの部位の間の染色体領域を置換する内部モジュールを得ることもできる（Orr-Weaver et al., Proc Natl Acad Sci U S A 78:6354-6358 （1981））。
【０１１６】
[00149]  一実施形態では、酵母微生物中に対象の遺伝子を組み込むための組込みカセットは、異種遺伝子を酵母染色体中に組み込むための組換え配列によって隣接した選択可能マーカーとともに、適切なプロモーターおよびターミネーターの制御下で異種遺伝子を含む。一実施形態では、異種遺伝子は、天然遺伝子（複数も）のコピー数を増加させることが望まれる、適切な天然遺伝子を含む。選択可能マーカー遺伝子は、それだけに限らないが、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ｂａｒ、ｂｌｅ、ｈｐｈ、およびｋａｎを含めた、酵母において使用される任意のマーカー遺伝子とすることができる。組換えの配列は、所望の用途に適した所望の組込み部位に応じて随意に選択することができる。
【０１１７】
[00150]  別の実施形態では、酵母微生物の染色体中への遺伝子の組込みは、ランダムな組込みを介して行うことができる（Kooistra, R., Hooykaas, P.J.J., Steensma, H.Y. 2004. Yeast 21: 781-792）。
【０１１８】
[00151]  さらに、一実施形態では、ある特定の導入されたマーカー遺伝子は、当業者に周知の技法を使用してゲノムから取り出される。例えば、ＵＲＡ３マーカー喪失は、ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）含有培地中にＵＲＡ３含有細胞を蒔き、ＦＯＡ耐性コロニーを選択することによって得ることができる（Boeke, J. et al, 1984, Mol. Gen. Genet, 197, 345-47）。
【０１１９】
[00152]  本開示の酵母細胞内に含まれる外因性核酸分子は、任意の形態でその細胞内に維持することができる。例えば、外因性核酸分子は、細胞のゲノム中に組み込み、または娘細胞に安定に伝える（継承する）ことができるエピソーム状態で維持することができる。そのような染色体外の遺伝子要素（プラスミドなど）は、娘細胞中にそのような遺伝子要素が存在することを保証する選択マーカーをさらに含有することができる。さらに、酵母細胞は、安定に、または一過性に形質転換することができる。さらに、本明細書に記載される酵母細胞は、上述した特定の外因性核酸分子の１個のコピー、または多数のコピーを含有することができる。
【０１２０】
酵素活性の低減
[00153]  本発明の範囲内の酵母微生物は、低減されたピルビン酸脱炭酸酵素活性などの低減された酵素活性を有することができる。用語「低減された」は、特定の酵素活性に関して本明細書で使用する場合、同じ種の同等の酵母細胞において測定される酵素活性より低いレベルの酵素活性を指す。用語の低減されたは、同じ種の同等の酵母細胞において測定される酵素活性より、酵素活性の消失も指す。したがって、ピルビン酸脱炭酸酵素活性を欠いている酵母細胞は、低減されたピルビン酸脱炭酸酵素活性を有するとみなされ、その理由はすべてでなくとも、ほとんどの同等の酵母菌株は、少なくともいくらかのピルビン酸脱炭酸酵素活性を有するためである。そのような低減された酵素活性は、より低い酵素濃度、酵素のより低い比活性、またはこれらの組合せの結果である場合がある。低減された酵素活性を有する酵母を作製するために、多くの様々な方法を使用することができる。例えば、酵母細胞は、一般的な突然変異生成またはノックアウト技術を使用して、乱された酵素コード座位を有するように操作することができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｄａｍｓ，Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，Ｋａｉｓｅｒ，ａｎｄ  Ｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照。さらに、ある特定の点突然変異（複数も）を導入することができ、これは低減された活性を有する酵素を生じる。
【０１２１】
[00154]  あるいは、アンチセンス技術を、酵素活性を低減するのに使用することができる。例えば、酵母は、酵素が産生されるのを妨げるアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含有するように操作することができる。用語「アンチセンス分子」は、本明細書で使用する場合、内因性ポリペプチドのコード鎖に対応する配列を含有する任意の核酸分子を包含する。アンチセンス分子はまた、フランキング配列（例えば、制御配列）を有することができる。したがって、アンチセンス分子は、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。リボザイムは、限定することなく、ヘアピン、ハンマーヘッド、またはアックスヘッド構造を含めた、任意の一般的な構造を有することができ、ただし分子がＲＮＡを切断するという条件がある。
【０１２２】
[00155]  低減された酵素活性を有する酵母は、多くの方法を使用して同定することができる。例えば、低減されたピルビン酸脱炭酸酵素活性を有する酵母は、一般的な方法を使用して容易に同定することができ、これは、例えば、ガスクロマトグラフィーによるエタノール形成の測定を含むことができる。
【０１２３】
異種遺伝子の過剰発現
[00156]  天然または異種の核酸分子からポリペプチドを過剰発現させるための方法は周知である。そのような方法は、限定することなく、核酸配列の構築を含み、その結果、調節エレメントは、所望のポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する。一般に、調節エレメントは、転写のレベルで他のＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列である。したがって、調節エレメントには、限定することなく、プロモーター、エンハンサーなどが含まれる。例えば、外来遺伝子は、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下にあることができる。さらに、酵母中の外因性核酸分子からポリペプチドを発現させるための方法は周知である。例えば、クルイベロミセスおよびサッカロミセス内の外因性ポリペプチドの発現に使用される核酸コンストラクトは周知である（クルイベロミセスについては、例えば、米国特許第４，８５９，５９６号および同第４，９４３，５２９号、ならびにサッカロミセスについては例えば、Gellissen et al.,Gene 190(1):87-97（1997）を参照）。酵母プラスミドは、選択可能マーカーおよび複製の起源を有する。さらに、ある特定のプラスミドは、動原体配列も含有することができる。これらの動原体プラスミドは、一般に、単一コピーまたは低コピープラスミドである。動原体配列を含まず、２ミクロン（Ｓ．セレビシエ）または１．６ミクロン（Ｋ．ラクチス）複製起点を利用するプラスミドは、高コピープラスミドである。選択可能マーカーは、原栄養性、例えば、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、もしくはＡＤＥ２、または抗生物質耐性、例えば、ｂａｒ、ｂｌｅ、ｈｐｈ、もしくはｋａｎなどとすることができる。
【０１２４】
[00157]  別の実施形態では、異種制御要素は、内在性遺伝子の発現を活性化または抑圧するのに使用することができる。さらに、発現が抑圧または排除される場合、妥当な酵素、タンパク質、またはＲＮＡについての遺伝子は、既知の欠失技法によって排除することができる。
【０１２５】
[00158]  本明細書で記載されるように、本開示の範囲内の任意の酵母は、発現、過剰発現、または抑圧される特定の酵素に特異的な選択技法によって同定することができる。所望の表現型を有する菌株を同定する方法は、当業者に周知である。そのような方法として、限定することなく、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにノーザン分析およびサザン分析などの核酸ハイブリダイゼーション技法、特定の基質に対する、または特定の基質、化合物、選択剤などの存在下での増殖能力の変更が挙げられる。場合によっては、免疫組織化学技法および生化学的技法を使用することによって、コードされたポリペプチドの発現を検出することにより、細胞が特定の核酸を含有するかどうかを判定することができる。例えば、コードされた酵素に対する特異性を有する抗体を使用することによって、特定の酵母細胞が、そのコードされた酵素を含有するかどうかを判定することができる。さらに、生化学的な技法を使用することによって、酵素ポリペプチドの発現の結果として産生される産物を検出することにより、細胞が、酵素ポリペプチドをコードする特定の核酸分子を含有するかどうかを判定することができる。例えば、細胞を、アセト乳酸合成酵素をコードするベクターを用いて形質転換し、ベクターを含まない細胞と比較して、アセト乳酸濃度の増加を検出することは、ベクターが存在し、遺伝子産物が活性であることを共に示す。特異的な酵素活性または特定の産物の存在を検出するための方法は、当業者に周知である。例えば、アセト乳酸の存在は、Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｒｅｎｂｕｒｇ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１７−２２（１９９２）によって記載されているように判定することができる。
【０１２６】
酵素活性の増大
[00159]  本発明の酵母微生物は、増大した酵素の活性を有するようにさらに操作することができる。用語「増大した」は、特定の酵素活性に関して本明細書で使用する場合、同じ種の同等の酵母細胞において測定される酵素活性より高いレベルの酵素活性を指す。例えば、特異的な酵素の過剰発現は、その酵素に関する細胞中の活性のレベルを増大させることができる。解糖またはイソブタノール経路に関与する酵素に関する増大した活性は、イソブタノールの生産性および収率を増加させる。
【０１２７】
[00160]  酵素活性を増大させるための方法は、当業者に既知である。そのような技法は、コピー数の増加および／もしくは強いプロモーターの使用、酵素の負の調節を解除するための突然変異の導入、比活性を増大させ、かつ／もしくは基質に対するＫｍを減少させるための特異的な突然変異の導入によって、または指向進化によって酵素の発現を増大させることを含むことができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ．２３１），ｅｄ．Ａｒｎｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）を参照。
【０１２８】
炭素源
[00161]  本明細書に開示される生体触媒は、様々な炭素源をイソブタノールに変換することができる。用語「炭素源」は一般に、原核生物増殖または真核細胞増殖のために、炭素の供給源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源として、それだけに限らないが、バイオマス加水分解産物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質の単量体成分が挙げられる。炭素源は、それだけに限らないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた、様々な形態での様々な有機化合物を含むことができる。これらとして、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）など、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、コハク酸、乳酸、酢酸、エタノールなど、またはこれらの混合物が挙げられる。光合成生物は、光合成の産物としての炭素源をさらに産生することができる。いくつかの実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解産物およびグルコースから選択することができる。
【０１２９】
[00162]  用語「Ｃ２化合物」は、すべてのピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子において、前記遺伝子のピルビン酸脱炭酸酵素活性の低減をもたらす突然変異を有する操作された酵母微生物のための炭素源と使用する場合、それだけに限らないが、エタノールおよび酢酸を含めた２個の炭素原子からなる有機化合物を指す。
【０１３０】
[00163]  用語「供給原料」は、他の産物を産生することができる微生物または発酵過程に供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵過程において生物燃料を産生する微生物のための供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含むことができる。
【０１３１】
[00164]  用語「従来の炭水化物」は、特殊な植物、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、およびコムギなどから生成される糖およびデンプンを指す。しばしば、これらの特殊な植物は、子実などの植物の一部において糖およびデンプンを濃縮し、これらは収穫され、処理されることによって、糖およびデンプンが抽出される。従来の炭水化物は、食物として、およびまたより少ない程度に、生物燃料および化学物質を生成するための発酵過程の炭素源として使用される。
【０１３２】
[00165]  用語「バイオマス」は、本明細書で使用する場合、緑色植物の茎、葉、およびデンプン含有部分を主に指し、デンプン、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、および／またはペクチンから主になる。バイオマスは、化学的または酵素処理により分解することによって、バイオマスが構成されている単糖およびフェノールにすることができる（Wyman, C.E. 2003 Biotechnological Progress 19:254-62）。バイオマス加水分解産物と呼ばれるこの得られた物質は、中和および処理されることによって、生体触媒に悪影響を及ぼし得る微量の有機物質が除去され、生体触媒を使用する発酵のための供給原料として使用される。
【０１３３】
[00166]  用語「デンプン」は、本明細書で使用する場合、消化酵素によって容易に加水分解される、グルコースのポリマーを指す。デンプンは通常、植物、例えば、ジャガイモ、トウモロコシの仁、米子実、コムギ子実、およびサトウキビの茎などの植物の特殊な部分に濃縮される。
【０１３４】
[00167]  用語「リグニン」は、本明細書で使用する場合、結合フェノール単量体化合物、例えば、ｐ−クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、およびシナピルアルコールなどから主になるポリマー物質を指し、これは、植物における構造的硬直性の基礎を形成し、植物の木部と頻繁に呼ばれる。リグニンはまた、植物の細胞壁の非炭水化物部分であるとみなされる。
【０１３５】
[00168]  用語「セルロース」は、本明細書で使用する場合、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎのβ−グルコースの長鎖ポリマー多糖炭水化物を指し、リグニンおよび任意のヘミセルロースとともに、植物の細胞壁中に通常見出される。
【０１３６】
[00169]  用語「ヘミセルロース」は、植物細胞壁の多糖のクラスを指し、これは、いくつかのヘテロポリマーのうちのいずれであってもよい。これらとして、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、グルクロノキシラン、グルコマンナン、およびガラクトマンナンが挙げられる。ヘミセルロースの単量体成分として、それだけに限らないが、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、およびＤ−グルクロン酸が挙げられる。このクラスの多糖は、セルロースとともに、ほとんどすべての細胞壁中に見出される。ヘミセルロースは、セルロースより重量が低く、熱水またはキレート化剤によって抽出することができないが、アルカリ水溶液によって抽出することができる。ヘミセルロースのポリマー鎖は、ほとんどの植物細胞の細胞壁を形成している架橋された繊維のネットワークにおいて、ペクチンおよびセルロースを結合する。
【０１３７】
高収率でイソブタノールを産生することを特徴とする微生物
[00170]  最も経済的にイソブタノールを産生するための生体触媒について、高収率で産生することが望まれる。産生される唯一の産物が、イソブタノールであることが好ましい。余分な産物は、産物の収率の低減、および特に余分な産物がほとんど、またはまったく価値がない場合、資本コストおよび操業コストの増大につながる。余分な産物はまた、イソブタノールからこれらの産物を分離するのに追加の資本コストおよび操業コストを必要とする。
【０１３８】
[00171]  微生物は、バイオマスに由来する１つまたは複数の炭素源を、理論収率の５％超の収率でイソブタノールに変換することができる。一実施形態では、収率は１０％超である。一実施形態では、収率は理論収率の５０％超である。一実施形態では、収率は理論収率の６０％超である。別の実施形態では、収率は理論収率の７０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の８０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の８５％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９５％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９７．５％超である。
【０１３９】
[00172]  より具体的には、微生物は、バイオマスに由来することができるグルコースを、理論収率の５％超の収率でイソブタノールに変換する。一実施形態では、収率は理論収率の１０％超である。一実施形態では、収率は理論収率の５０％超である。一実施形態では、収率は理論収率の６０％超である。別の実施形態では、収率は理論収率の７０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の８０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の８５％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９０％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９５％超である。さらに別の実施形態では、収率は理論収率の９７．５％超である。
【０１４０】
過剰発現されたイソブタノール経路およびＰｄｃマイナス表現型を介したピルビン酸からのイソブタノールの産生を特徴とする微生物
[00173]  酵母において、ピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換は、ピルビン酸プールに対する主要なドレーンであり（図２Ａ）、したがって、イソブタノール経路との競合の主要な原因である。この反応は、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）酵素によって触媒される。酵母微生物におけるこの酵素活性の低減は、イソブタノール経路に対するピルビン酸の利用可能性および還元当量を増大させ、ピルビン酸依存性イソブタノール経路を発現する酵母微生物におけるイソブタノール産生および収率を改善することができる（図２Ｂ）。
【０１４１】
[00174]  ＰＤＣ活性の低減は、１）ＰＤＣをコードする構造遺伝子についての正の転写制御因子の突然変異もしくは欠失、または２）所与の生物におけるすべてのＰＤＣ遺伝子の突然変異もしくは欠失によって実現することができる。用語「転写制御因子」は、ゲノム中の異なる座位の転写を増大または減少させるために途中で機能するタンパク質または核酸を特定することができる。例えば、Ｓ．セレビシエにおいて、ＰＤＣ１、５、６遺伝子の正の転写制御遺伝子をコードするＰＤＣ２遺伝子を欠失させることができ、ＰＤＣ２遺伝子が欠失したＳ．セレビシエは、野生型のＰＤＣ活性のわずか約１０％しか有さないことが報告されている（Hohmann, Mol Gen Genet, 241:657-666 （1993））。あるいは、例えば、ＰＤＣに関するすべての構造遺伝子（例えば、Ｓ．セレビシエにおいて、PDC1、PDC5、およびPDC6、またはＫ．ラクチスにおいて、PDC1）が欠失される。
【０１４２】
[00175]  ＰＤＣ対立遺伝子の３つすべてにおいて破壊を含む、サッカロミセス・セレビシエ菌株などのクラブトリー陽性酵母菌株は、発酵によってもはやエタノールを産生しない。しかし、ＰＤＣによって触媒される反応の下流産物であるアセチル−ＣｏＡは、必要な分子の同化産生（anabolic production）に必要である。したがって、Ｐｄｃ−突然変異体は、単にグルコース上で増殖することができず、アセチル−ＣｏＡを合成するのに、２炭素の炭素源であるエタノールまたは酢酸を必要とする（Flikweert MT, de Swaaf M, van Dijken JP, Pronk JT. FEMS Microbiol Lett. 1999 May 1;174（1）：73-9. PMID:10234824、およびvan Maris AJ, Geertman JM, Vermeulen A, Groothuizen MK, Winkler AA, Piper MD, van Dijken JP, Pronk JT. Appl Environ Microbiol. 2004 Jan;70（1）：159-66. PMID: 14711638）。
【０１４３】
したがって、一実施形態では、そのようなクラブトリー陽性酵母菌株を進化させることによって、２炭素分子を必要とせず、グルコース上で野生型と同様の増殖速度を有する、ＰＤＣ突然変異体酵母の変異体を生成することができる。ケモスタット展開または連続希釈を含めた任意の方法を利用することによって、野生型と同様の速度で、唯一の炭素源としてのグルコース上で増殖することができる、３つのＰＤＣ対立遺伝子が欠失した菌株の変異体を生成することができる（van Maris et al., Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae, Yielding a C2-Independent, Glucose-Tolerant, and Pyruvate-Hyperproducing Yeast, Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70（1）, 159-166）。
【０１４４】
高収率イソブタノール発酵のために微生物を使用する方法
[00176]  高収率で炭素源からイソブタノールを生成するための方法において、酵母微生物は、炭素源を含有する適切な培地中で培養される。
【０１４５】
[00177]  別の例示的な実施形態は、炭素源を含有する適当な培地中に本発明の組換え酵母微生物を含み、この炭素源は、本発明の酵母微生物によってイソブタノールに変換することができる、イソブタノールを生成するための方法を提供する。
【０１４６】
[00178]  ある特定の実施形態では、この方法は、培地からイソブタノールを単離する工程をさらに含む。例えば、イソブタノールは、当業者に既知の任意の方法、例えば、蒸留、浸透気化法、または液液抽出などによって、培地から単離することができる。
【実施例】
【０１４７】
一般的な方法
[00179]  試料調製：発酵ブロスからの試料（２ｍＬ）を、後の基質分析および産物分析のために−２０℃で貯蔵した。分析の前に、試料を解凍し、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離した。０．２μｍのフィルターを通して上清を濾過した。基質および産物の分析は、信頼できる標準物質（９９％超、Sigma-Aldrichから入手）、および５点較正曲線（ガスクロマトグラフィーによる分析のための内部標準として１−ペンタノールを用いて）を使用して実施した。
【０１４８】
[00180]  光学密度および細胞乾燥重量の判定：酵母培養物の光学密度を、ＤＵ８００分光光度計（Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA）を使用して６００ｎｍで求めた。試料を希釈したが、これは、０．１と０．８の間の光学密度を得るのに必要なためである。細胞乾燥重量は、培養物５０ｍＬを遠心分離した後、上清をデカントすることによって求めた。ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ  ５０ｍＬを用いて細胞ペレットを１回洗浄し、遠心分離し、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ  ２５ｍＬを用いてペレットを再度洗浄した。次いで細胞ペレットを８０℃で少なくとも７２時間乾燥させた。細胞乾燥重量は、乾燥した細胞ペレットを含む遠心管の重量から遠心管の重量を減じることによって計算した。
【０１４９】
[00181]  ガスクロマトグラフィー：エタノールおよびイソブタノールの分析は、フレームイオン化検出器（FID）に接続した、ＤＢ−ＦＦＡＰカラム（Agilent Technologies；長さ３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μＭ）または等価物を装着したＨＰ５８９０ガスクロマトグラフで実施した。温度プログラムは以下の通りであった：注入器について２００℃、検出器について３００℃、１分間１００℃の乾燥器、２３５℃まで７０℃／分の勾配、次いで２．５分間保持。
【０１５０】
[00182]  高速液体クロマトグラフィー：グルコースおよび有機酸の分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（Bio-Rad、３００×７．８ｍｍ）または等価物、およびＨ＋陽イオンガードカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）または等価物を装備した、ＨＰ−１１００高速液体クロマトグラフィーシステムで実施した。有機酸は、ＨＰ−１１００  ＵＶ検出器（２１０ｎｍ、８ｎｍ  ３６０ｎｍ参照）を使用して検出する一方で、グルコースは、ＨＰ−１１００屈折率検出器を使用して検出した。カラム温度は６０℃であった。この方法は、移動相として水中０．００８Ｎの硫酸を用いたアイソクラチックであった。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。注入サイズは２０μＬであり、実行時間は３０分であった。
【０１５１】
[00183]  嫌気性バッチ発酵：嫌気性バッチ培養を、共栓１００ｍＬ血清瓶内で、３０℃で実施した。１Ｌ当たり２０ｇのグルコースの初期グルコース濃度で、合計２０ｍＬの合成培地を使用した（Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, a Cold Spring Harbor Laboratory Manual （1994））。試料２ｍＬを２４および４８時間で採取する。発酵は、４８時間後またはすべてのグルコースが消費されるとき終了する。上述したようなガスクロマトグラフィーおよび／または高速液体クロマトグラフィーによって、試料を処理および分析する。
【０１５２】
[00184]  酵母形質転換−Ｋ．ラクチス：形質転換を、Ｋｏｏｉｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２１：７８１−７９２（２００４）による電気穿孔によって実施した。
【０１５３】
[00185]  Ｓ．セレビシエ菌株の酢酸リチウム形質転換は、酢酸リチウム法（Gietz et al., Nucleic Acids Res. 27:69-74 （1992）によって形質転換した。細胞は、２７００ｒｃｆで、室温で２分間遠心分離することによって、約０．８〜１．０のＯＤ６００で、既知組成（defined）（SC）エタノール培地５０ｍＬ中で増殖させた一晩培養物から採取した。細胞ペレットを、滅菌水５０ｍＬ中に再懸濁し、遠心分離（２７００ｒｃｆ；２分；室温）によって採取し、滅菌水２５ｍＬ中で再懸濁した。細胞は、遠心分離（２７００ｒｃｆ；２分；室温）によって採取し、１００ｍＭの酢酸リチウム１ｍＬ中で再懸濁した。細胞懸濁液を滅菌した１．５ｍＬの管に移し、全速力で１０秒間遠心分離することによって採取した。細胞ペレットの体積の４倍の体積（例えば、細胞ペレット１００μＬに対して４００μＬ）を有する１００ｍＭの酢酸リチウム中で細胞を再懸濁した。調製したＤＮＡミックス（５０％のPEG  ７２μｌ、１Ｍの酢酸リチウム１０μｌ、煮沸したサケ精子DNA３μｌ、および各プラスミド５μｌ）に、細胞懸濁液１５μｌを添加し、５回の短パルスでボルテックスすることによって混合した。細胞／ＤＮＡ懸濁液を、３０℃で３０分間、および４２℃で２２分間インキュベートした。全速力で１０秒間遠心分離することによって細胞を採取し、ＳＯＳ（１Ｍのソルビトール、０．３４％（w/v）の酵母エキス、０．６８％（w/v）のペプトン、６．５ｍＭのＣａＣｌ）１００μｌ中で再懸濁した。細胞懸濁液を、適切な選択的寒天プレートの上部に塗布した。
【０１５４】
[00186]  酵母コロニーＰＣＲ：酵母細胞を寒天培地から採取し、０．２％のＳＤＳ  ３０μｌに移し、９０℃で４分間加熱した。細胞を沈降させ、上清１μｌを、標準Ｔａｑ（NEB）を使用するＰＣＲに使用した。
【０１５５】
[00187]  分子生物学：別段の記述のない限り、クローニングおよびプラスミド構築のための標準的な分子生物学方法を一般に使用した（Sambrook & Russell）。
【０１５６】
[00188]  培地：
[00189]  ＹＰ：１％（w/v）の酵母エキス、２％（w/v）のペプトンを含有する。ＹＰＤは、２％（w/v）グルコースを含有するＹＰであり、ＹＰＥは、２％（w/v）のエタノールを含有するＹＰである。
【０１５７】
[00190]  ＳＣ＋完全：２０ｇ／Ｌのグルコース、１４ｇ／ＬのＳｉｇｍａ（商標）の合成ドロップアウト培地サプリメント（ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、およびロイシンを除くアミノ酸および栄養分を含む）、および６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ（商標）の酵母窒素塩基。０．０７６ｇ／Ｌのヒスチジン、０．０７６ｇ／Ｌのトリプトファン、０．３８０ｇ／Ｌのロイシン、および０．０７６ｇ／Ｌのウラシル。
【０１５８】
[00191]  ＳＣ−ＨＷＵＬ：２０ｇ／Ｌのグルコース、１４ｇ／ＬのＳｉｇｍａ（商標）の合成ドロップアウト培地サプリメント（ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、およびロイシンを除くアミノ酸および栄養分を含む）、および６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ（商標）の酵母窒素塩基。
【０１５９】
[00192]  ＳＣ−ＷＬＵ：２０ｇ／Ｌのグルコース、１４ｇ／ＬのＳｉｇｍａ（商標）の合成ドロップアウト培地サプリメント（ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、およびロイシンを除くアミノ酸および栄養分を含む）、アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ（商標）の酵母窒素塩基、および０．０７６ｇ／Ｌのヒスチジン。
【０１６０】
[00193]  ＳＣ−ＨＷＵ：２０ｇ／Ｌのグルコース、１４ｇ／ＬのＳｉｇｍａ（商標）の合成ドロップアウト培地サプリメント（ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、およびロイシンを除くアミノ酸および栄養分を含む）、アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ（商標）の酵母窒素塩基、および０．３８０ｇ／Ｌのロイシン。
【０１６１】
[00194]  ＳＣ−エタノール−ＨＷＵ：２％（w/v）のエタノール、１４ｇ／ＬのＳｉｇｍａ（商標）の合成ドロップアウト培地サプリメント（ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、およびロイシンを除くアミノ酸および栄養分を含む）、６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ（商標）の酵母窒素塩基、および０．３８０ｇ／Ｌのロイシン。
【０１６２】
[00195]  上述した培地の固体版は、２％（w/v）の寒天を含有する。
菌株、プラスミドおよびプライマー配列
【０１６３】
【表１】
2011507532.tif 000002
【０１６４】
【表２】
2011507532.tif 000003
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
（実施例１）
Ｋ．ラクチスにおけるＰＤＣ欠失の構築および確認
[00196]  この実施例の目的は、サッカロミセス・クラデのメンバー、クラブトリー陰性酵母、ＷＧＤ前酵母Ｋ．ラクチスのＰＤＣ欠失バリアントの構築および確認方法を説明することである。
【０１６８】
[00197]  プラスミドｐＧＶ１５３７の構築：プラスミドｐＧＶ１５３７（配列番号1.1）を、以下の一連の工程によって構築した。ｐＧＶ１５３７を生成するのに実施したすべてのＰＣＲ反応は、ＫＯＤポリメラーゼ（Novagen, Inc., Gibbstown, NJ）および製造者による標準的な反応条件を使用した。２つのＰＣＲ反応の第１ラウンドを実施し、１つのＰＣＲ反応は、プライマー１００６および１０１６を含み、鋳型としてＫ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１２８７由来のゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを使用した。他方の第１ラウンドのＰＣＲ反応は、プライマー１０１７および１００９、ならびに鋳型としてＫ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１２８７由来のゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを含んでいた。２つの得られたＰＣＲ産物（それぞれサイズが約５３０ｂｐおよび６３０ｂｐ）を、製造者の指示書に従って、Ｚｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈのゲルＤＮＡ抽出キット（Zymo Research, Orange, CA）を使用してゲル精製し、水１０μＬ中に溶出した。次いで、それぞれの溶出したＰＣＲ産物２（２）マイクロリットルを、ＫＯＤポリメラーゼ触媒ＰＣＲの最終ラウンドの鋳型として使用し、このＰＣＲは、プライマー１００６と１００９も含んでいた。得られた生成物を精製し（Zymo Research DNA Clean & Concentrate キット、Zymo Research, Orange, CA）、酵素ＭｆｅＩおよびＡａｔＩＩを用いて消化して完了し、得られた生成物ゲルを上述したように精製および溶出した。このＤＮＡをベクターｐＧＶ１５０３中に連結し（図ＥＸ１−１）、これをＥｃｏＲＩとＡａｔＩＩを用いて消化し、子ウシアルカリホスファターゼで処理し、上述したようにゲル精製した。連結したＤＮＡの形質転換から生じるコロニーを、制限消化分析によってスクリーニングし、プライマー８３８、１０１０、および１０１９を使用して、ＤＮＡシークエンシング反応によって確認した。連結および引き続く分析から得られる正しい組換えＤＮＡを、ｐＧＶ１５３７と命名した（図ＥＸ１−２）。
【０１６９】
[00198]  Ｋ．ラクチスＫｌｐｄｃ１Δ菌株の構築：菌株ＧＥＶＯ１２８７を、ＰｍＩＩで消化した直線化プラスミドｐＧＶ１５３７を用いて形質転換した。形質転換は、Ｋｏｏｉｓｔｒａら（Kooistra, R., Hooykaas, P.J.J., and Steensman, H.Y. （2004） "Efficient gene targeting in Kluyveromyces lactis". Yeast 21:781-792）によって記載されているように、本質的に、直線化ｐＧＶ１５３７約３００ｎｇを用いて、電気穿孔によって実施した。形質転換細胞は、０．２ｍｇ／ｍＬのジェネテシン（G418）を含有するＹＰＤプレート上に蒔くことによって選択した。形質転換から生じるコロニーは、ＹＰＤプレート上にコロニーをパッチングし、次いで５μＭ（最終濃度）の呼吸阻害剤アンチマイシンＡを含有するＹＰＤ上へのレプリカ平板法によってさらに選択したが、これは、Ｋ．ラクチスのＰｄｃ変異体は、アンチマイシンＡの存在下で、グルコース上で増殖することができず（Bianchi, M., et al., （1996）. "The petite negative yeast Kluyveromyces lactis has a single gene expressing pyruvate decarboxylase activity". Molecular Microbiology 19（1）:27-36）、したがって、この方法によって同定することができるためである。ＹＰＤ＋アンチマイシンＡ上にパッチングした８３のＧ４１８耐性のコロニーのうち、６つのコロニー（約７％）は増殖することができず、したがって候補Ｋｌｐｄｃ１：：ｐＧＶ１５３７破壊菌株として同定した。
【０１７０】
[00199]  コロニーＰＣＲによるＫ．ラクチスＫｌｐｄｃ１Δ菌株の確認：候補Ｋｌｐｄｃ１：：ｐＧＶ１５３７破壊菌株を、コロニーＰＣＲ分析によって確認した。確認するために、候補系統からのゲノムＤＮＡを、以下の方法によって得た。少量（マッチ棒の先と等価）の酵母細胞を、０．２％のＳＤＳ  ５０μＬ中に再懸濁し、９５℃まで６分間加熱した。懸濁液を遠心分離（３０秒、１６，０００×ｇ）によってペレット化し、上清１μＬを、５０μＬのＰＣＲ反応における鋳型として使用した。標準的な成分に加えて、反応物は、１．５％の最終濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％の最終濃度のＤＭＳＯを含んでいた。使用された様々なプライマーセット、および予想された予想単位複製配列サイズを表ＥＸ１−１に示す。これらの分析によって、正しいＫｌｐｄｃ１Δ：：ｐＧＶ１５３７菌株を同定し、ＧＥＶＯ１７４２と命名した。
【０１７１】
【表５】
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【０１７２】
[00200]  発酵によるＧＥＶＯ１７４２Ｋｌｐｄｃ１Δ：：ｐＧＶ１５３７の確認：ＫｌＰｄｃ１ｐ（Klpdc1Δ）を欠いているＫ．ラクチスの菌株は、グルコース上で増殖されるとき、著しく低いレベルのエタノールを産生することが示されている（Bianchi, M., et al., （1996）. "The 'petite negative yeast Kluyveromyces lactis has a single gene expressing pyruvate decarboxylase activity". Molecular Microbiology 19（1）:27-36）。この表現型を確認するために、菌株ＧＥＶＯ１２８７およびＧＥＶＯ１７４２を用いた発酵を実施した。簡単に言えば、ＹＰＤ中で増殖させた各菌株の飽和した一晩（３ｍＬ）培養物を、０．１の開始ＯＤ６００で、ＹＰＤ  ２５ｍＬ中に播種し、振盪機内のゆるく蓋をしたフラスコ中で、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間、好気的に増殖させた。増殖後、培養物２ｍＬを採取し、細胞を遠心分離（５分、１４，０００×ｇ）によってペレット化し、上清をガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーによる分析にかけた。これらの分析からのデータの概要を、表ＥＸ１−２に要約する。発酵培地中のエタノール産生の強い減少、およびピルビン酸の蓄積の増大は、ＰＤＣ１が欠失されたＫ．ラクチス菌株の特徴である。したがって、これらの観察は、菌株ＧＥＶＯ１７４２は、実際にＫｌｐｄｃ１Δであるという分子遺伝学的結論を確認する。
【０１７３】
【表６】
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【０１７４】
（実施例２）
Ｓ．セレビシエにおけるＰＤＣ欠失の構築および確認
[00201]  この実施例の目的は、サッカロミセス・センスストリクト酵母群、サッカロミセス酵母クラデのメンバー、クラブトリー陽性酵母、およびＷＧＤ後酵母、Ｓ．セレビシエのＰＤＣ欠失バリアントの構築および確認方法を説明することである。
【０１７５】
[00202]  菌株ＧＥＶＯ１５３７およびＧＥＶＯ１５３８は、１％の酢酸カリウム中で３〜４日間インキュベートし、これにより胞子形成が誘発される。得られたハプロイド胞子を、ランダムな胞子分析によって回収した。簡単に言えば、胞子形成細胞の培養物を顕微鏡で検査することによって、十分な画分の細胞が胞子形成したことを確認した（１０％超）。胞子形成した細胞の培養物５（５）ｍＬを、遠心分離（３０００×ｇで５分）によって採取し、水１ｍＬで１回洗浄した。細胞を水５ｍＬ中に再懸濁し、これに１ｍｇ／ｍＬのザイモリエース−Ｔの溶液（新たに作製）（水中）０．５ｍＬ、ならびにβ−メルカプトエタノール１０μＬを加えた。この細胞懸濁液を、振盪機内で、５０ｒｐｍ、３０℃で一晩インキュベートした。１．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５ｍＬを添加し、この混合物を氷上で１５分間インキュベートした。この溶液を、５０％の出力で、１サイクル当たり３０秒間、３回超音波処理し、超音波処理リサイクル間に氷上で２分休止した。この懸濁液を遠心分離し（１２００×ｇ、５分）、水５ｍＬで２回洗浄した。最終的な細胞ペレットを水１ｍＬ中に再懸濁し、細胞をＹＰ＋２％のＥｔＯＨに蒔いた。
【０１７６】
[00203]  この手順の後、別々の個々の胞子を、固体培地上に蒔くことによって、コロニー、すなわち遺伝子型ＨＯ  ｐｄｃ１：：Ｔｎ５ｂｌｅ  ｐｄｃ５：：Ｔｎ５ｂｌｅ  ｐｄｃ６：ＡＰＴ１  ＨｌＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＵＲＡ３、および未知の接合型のすべてを得た。細胞の一部の画分は、ＨＯ＋遺伝子状態、および得られる接合型転換、および二倍体を形成するための再接合のために、（ホモ接合）二倍体であった。
【０１７７】
[00204]  想定されるＰｄｃマイナスコロニーの接合型座位の遺伝子型は、ＭＡＴａ座位（プライマー＃４８９および＃４９１）またはＭＡＴα座位（プライマー＃４９０および＃４９１）に特異的なプライマーを使用する標準的な条件下で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs, Ipswich, MA）を使用して、ＰＣＲによって確認した。２つの可能なプライマーセットのうちの一方で単一のＰＣＲ生成物を生成し、他方で試験したとき生成物をまったく生成しないコロニーは、想定されるハプロイドＰｄｃマイナス菌株であった。接合型を確認するために、そのような菌株を、Ｇｅｖｏ１１８７およびＧｅｖｏ１１８８（CEN.PK）に対して交配させた。得られた二倍体子孫を、グルコースを含有し（CEN.PKバックグラウンドによって導入されるＰＤＣ＋遺伝子の存在について選択するため）、また以下の栄養分、すなわちヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、またはウラシルのうちの少なくとも１つを欠いている（Gevo1537またはGEVO1538バックグラウンドに由来する対応する遺伝子の、野生型対立遺伝子によって提供されるような適切な原栄養性について選択するため）培地上で選択した。
【０１７８】
[00205]  二倍体細胞を、ＹＰ＋２％のエタノールを含有する寒天プレート上で胞子形成および出芽させた（Ｐｄｃマイナス分離株の増殖を可能にするため）。Ｐｄｃマイナス候補を同定するために、生存可能なコロニーをＹＰＤ寒天プレート上に画線し、グルコース上で生存不能であったコロニーを単離した。グルコース上で増殖することができないことにより、これらの候補がｐｄｃ１：：ｂｌｅおよびｐｄｃ５：：ｂｌｅであることが確認される。ｐｄｃ６：：ａｐｔ１は、抗生物質Ｇ４１８を含有するＹＰ＋エタノールプレート上で増殖する能力が確認された。想定されるＰｄｃマイナスコロニーの接合型座位の遺伝子型は、ＭＡＴａ座位（プライマー＃４８９および＃４９１）、またはＭＡＴα座位（プライマー＃４９０および＃４９１）に特異的なプライマーを使用する標準的な条件下で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs, Ipswich, MA）を使用して、ＰＣＲによって確認した。ＰＣＲ反応物の両方のセットに由来する生成物の存在は、活性なＨＯでコードされた酵素による接合型対立遺伝子転換の結果として、両方の接合型対立遺伝子が集団中に存在することを示した。ＭＡＴ座位特異的なプライマーの一方のセットについてＰＣＲ生成物が存在し、他方については存在しないことは、この菌株は、この活性を欠き、したがってｈｏ−であることを示した。これらの分析に基づいて、６つの候補コロニーがｈｏ−菌株として同定され、１つの候補＃４はＨＯであった。
【０１７９】
[00206]  これらのＰｄｃマイナス菌株を、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、またはウラシルのうちの１つを欠いているＳＣ＋エタノールプレートに画線することによって、これらの菌株内の栄養要求性突然変異の存在を判定した。１つのＰｄｃマイナス菌株であるＧＥＶＯ１５８１は、ヒスチジン、ウラシル、およびトリプトファンについて栄養要求性であり、したがって、３つのマーカー（his3、ura3、およびtrp1）を担持した。別のＰｄｃマイナス菌株であるＧＥＶＯ１７１５は、ウラシルおよびロイシンについて栄養要求性であり、したがって、２つのマーカー、すなわちｕｒａ３およびｌｅｕ２を担持した。
【０１８０】
[00207]  ＧＥＶＯ１５８１およびＧＥＶＯ１７１５をＲＦＬＰ分析によリスクリーニングすることによって、ｈｏ対立遺伝子の存在を立証した。ＨＯ座位の４４７ｂｐ部分を、プライマー１３７５および１３７６を使用して、ｈｏ対立遺伝子（H475L）において変化しているコドンを含んだＰＣＲによって増幅した。この突然変異は、ＡｌｕＩ制限部位を導入し、したがって、ＡｌｕＩ（New England BioLabs, Ipswich, MA）を用いた消化により、４４７ｂｐの断片（HO）または１２２ｂｐの断片と３２５ｂｐの断片（ho）を得た。ＲＦＬＰ分析に基づくと、ＧＥＶＯ１５８１はＨＯであり、ＧＥＶＯ１７１５はｈｏであった。
【０１８１】
４つのすべての栄養要求性マーカーを有するＰｄｃマイナス菌株を得るために、ＧＥＶＯ１７１５を、ＧＥＶＯ１１８８および上述したように生成した二倍体に対して交配させた。得られた二倍体を胞子形成させ、Ｐｄｃマイナス候補は、フレオマイシンおよびＧ４１８の両方を含有するＹＰ＋エタノール上に蒔くことによって単離した。これらの候補をＹＰＤ寒天プレート上に画線し、グルコース上での生存不能について試験した。グルコース上で増殖しなかったものをこの表現型として単離し、フレオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性に加えて、これらの候補がｐｄｃ１：：ｂｌｅ、ｐｄｃ５：：ｂｌｅ、およびｐｄｃ６：：ａｐｔ１であることを確認する。これらの分離株を、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、またはウラシルのうちの１つを欠いているＳＣ＋エタノールプレート上に画線することによって、これらの菌株内での栄養要求性突然変異の存在を判定した。これらのＰｄｃマイナス菌株の１つであるＧＥＶＯ１５８４は、ヒスチジン、ウラシル、トリプトファンおよびロイシンについて栄養要求性であり、したがって、４つのすべてのマーカー、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、およびｌｅｕ２を担持した。ＧＥＶＯ１５８４はまた、上述したようにそれぞれコロニーＰＣＲおよびＲＦＬＰ分析によってＭＡＴａおよびｈｏであることが確認された。
【０１８２】
【表７】
2011507532.tif 000008
【０１８３】
（実施例３）
他のＰｄｃマイナスＳ．セレビシエ菌株
[00208]  ＰＤＣ活性を欠くように操作されたＳ．セレビシエは、以前に記載されている（Flikweert, M.T., van der Zanden, L., Janssen, W.M.T.M, Steensma, H.Y., van Dijken J.P., Pronk J.T. （1996） Yeast 12（3）：247-57）。そのような菌株はこれらの供給源から得ることができる。
【０１８４】
（実施例４）
Ｓ．セレビシエＰＤＣ三重突然変異体のケモスタット展開
[00209]  この実施例は、メンバーのサッカロミセス・センスストリクト酵母群、サッカロミセス・クラデ酵母、クラブトリー陽性、ＷＧＤ後酵母、Ｓ．セレビシエのＰＤＣ欠失バリアントは、これが２炭素分子を必要とせず、グルコース上で親菌株と同様の増殖速度を有するように進化させることができることを実証する。
【０１８５】
[00210]  ＤａｓＧｉｐ発酵槽容器を滅菌し、ＹＮＢ（蒸留水1リットル当たり、Ｄｉｆｃｏ由来のアミノ酸を含まないＹＮＢ６．７ｇを含有する酵母窒素塩基、培地１リットル当たり以下のものを添加した：ヒスチジン０．０７６ｇ、トリプトファン０．０７６ｇ、ロイシン０．３８０ｇ、および／またはウラシル０．０７６ｇ；培地は、数滴のＨＣＬまたはＫＯＨを添加することによってｐＨを５に調整した）２００ｍｌで満たし、２％ｗ／ｖのエタノールを含めた。容器を設置し、すべてのプローブをＤａｓＧｉｐの指示書に従って較正した。この容器には、ＤａｓＧｉｐシステムのオフガス分析器、ならびに質量分析計も取り付けた。酸素、二酸化炭素、イソブタノール、およびエタノールのオンライン測定を、実験全体を通して行った。容器内部にあった２つのプローブは、すべての時点でｐＨおよび溶解酸素レベルを測定した。培地の入口および出口も容器上に設置した。出口管を２００ｍｌのレベルの真上の高さに配置し、ポンプ速度を最大に設定した。この配置は、容器内の体積を２００ｍｌを維持するのに役立った。すべての時点で１時間当たり１２標準リットル（slph）で、空気を発酵槽中にスパージした。容器の温度を３１．８℃で一定に保持し、撹拌速度を３００ｒｐｍで維持した。ＣＯ２、Ｏ２、エタノールおよびイソブタノール濃度について、オフガスを分析した。オフガス中の二酸化炭素（XCO2）および酸素（XO2）レベルの量は、細胞の代謝的状態を評価するのに使用した。ＸＣＯ２レベルの増加およびＸＯ２レベルの減少は、増殖速度およびグルコース消費速度の増加を示した。エタノールレベルをモニターすることによって、他の酵母細胞、または突然変異体菌株の潜在的な復帰変異体からの汚染がまったくないことを保証したが、これは、Ｓ．セレビシエＰＤＣ三重突然変異体（GEVO1584）は、エタノールを産生しないためである。容器中の最低ｐＨを５に設定し、ベース制御は、ｐＨが５未満に低下したとき、容器中に水酸化カリウムを投入するように設定した。
【０１８６】
[00211]  ＧＥＶＯ１５８４を、炭素源として２％  ｗ／ｖのエタノールを含むＹＮＢ培地１０ｍｌに播種した。培養物を、振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。この一晩培養物を使用してＤａｓＧｉｐ容器に播種した。最初に、容器をバッチ様式で有効にすることによって、高細胞密度を構築した。約３ｇＣＤＷ／Ｌの細胞バイオマスに到達したとき、容器をケモスタット様式に転換し、培養物の希釈を開始した。容器に投入した培地は、７．１２５ｇ／Ｌのグルコースおよび０．３７５ｇ／Ｌの酢酸（５％の炭素の等量）を含むＹＮＢであった。初期希釈率を０．１ｈ−１に設定したが、細胞密度が低下し始めた場合、希釈率を．０２５ｈ−１に減少させることによって、ウォッシュアウトを回避した。ＧＥＶＯ１５８４は接合型ａであった。実験をして数日後のケモスタット集団の接合型についてのＰＣＲチェックは、依然として存在する菌株は接合型ａであることを示した。
【０１８７】
[00212]  ケモスタット中の培養物は安定化され、希釈率は０．１ｈ−１に増加した。０．１ｈ−１の希釈率で定常状態に到達した後、酢酸の濃度は徐々に減少した。これは、勾配ポンピング（gradient pumping）スキームを有効に生じる、２ポンプシステムを使用することによって実現した。最初にポンプＡは、７．１２５ｇ／Ｌのグルコース、および０．６ｇ／Ｌの酢酸を含むＹＮＢを、１２．５ｍＬ／ｈの速度でポンピングしており、ポンプＣは、７．１２５ｇ／Ｌのグルコースのみを含むＹＮＢを７．５ｍＬ／ｈの速度でポンピングしていた。容器中に入る合わせた酢酸は、０．３７５ｇ／Ｌであった。次いで、３週間の期間にわたって、ポンプＡの速度を徐々に減少させ、ポンプＣの速度を同じ量で増加させ、その結果、合わせた供給速度は、常に２０ｍＬ／ｈであった。ポンプＡの速度が３ｍＬ／ｈ未満に低下したとき、培養物は、徐々にウォッシュアウトを開始した。完全なウォッシュアウトを回避するために、希釈率を０．１ｈ−１から０．０７５ｈ−１に減少させた（図ＥＸ４−１）。この希釈率で、ポンプＡの速度は、最終的に０に低下し、進化した菌株は、グルコースのみで増殖することができた。約５週間の期間にわたって、容器から直接に、または流出物ラインから試料を時折取り出した。試料は、ＨＰＬＣを使用して、グルコース、酢酸、およびピルビン酸について分析し、グルコースを含むＹＮＢ、エタノールを含むＹＮＢ、および負の対照としてＹＮＢ（ウラシルを含まない）とグルコースまたはエタノール上に蒔いた。ケモスタットから単離した菌株は、ウラシルを含まないＹＮＢプレート上で増殖しなかった。ＯＤ６００を定期的に測ることによって、ケモスタットがウォッシュアウトしていないことを確認した。菌株の将来の特徴づけのために、培養物の試料の凍結ストックを定期的に作製した。
【０１８８】
[00213]  進化した菌株の増殖を特徴づけるために、ＹＮＢ、ＹＰＤ（酵母エキス、ペプトン、デキストロース）、およびＹＰＥ（酵母エキス、ペプトン、エタノール）を、様々な濃度のグルコースまたはエタノールとともに使用した。増殖の特徴づけは、スナップキャップ試験管または４８ウェルプレート（７．５ｍｌ）中で実施した。スナップキャップ試験管は、空気が管を出入りするように完全には閉じず、４８ウェルプレートは、空気透過性膜で覆うことによって酸素の移動を可能にした。汚染をチェックするために、ＹＰＤまたはＹＰＥ寒天プレートは、抗生物質Ｇ４１８およびフレオマイシンとともに使用した。ＰＤＣ三重突然変異体菌株（GEVO1584）は、Ｇ４１８耐性マーカーおよびフレオマイシン耐性マーカーの両方を有し、したがって、その菌株の子孫は、抗生物質上で増殖することができた。各ケモスタット試料から単離した１つのコロニーを、増殖速度について試験した。３５日目のケモスタット集団から単離した１つのコロニーを選択したが、その理由は、唯一の炭素源としてのグルコース上で高速で増殖するためであり、このコロニーは、Ｇ４１８およびフレオマイシンの両方に耐性であり、エタノールまたは酢酸を必要とすることなく増殖した。この１つのコロニーは、試験管中、ＹＰＤ上で、３０℃、２５０ｒｐｍの振盪で、２４回の連続的なシリアル移動を通じてさらに進化させた。得られた菌株であるＧＥＶＯ１８６３は、野生型酵母である親と同様にグルコースで増殖し（図ＥＸ４−２）、エタノールを産生せず（図ＥＸ４−３）、増殖のためにエタノールまたは酢酸を必要としなかった。
【０１８９】
（実施例５）
ＰｄｃプラスＫ．ラクチスにおけるイソブタノール産生
[00214]  この実施例では、サッカロミセス・クラデのメンバー、クラブトリー陰性、ＷＧＤ前酵母、Ｋ  ラクチスにおけるイソブタノール産生を実証する。
【０１９０】
[00215]  イソブタノール産生経路を、Ｋ．ラクチスベクターに基づく発現系：ＴＥＦ１プロモーターを含有するＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片においてクローン化した。ラクトコッカス・ラクチスａｌｓＳおよびＣＹＣ１ターミネーター配列の一部を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４３０の同じ部位中にクローン化することによって（図ＥＸ５−２）、ｐＧＶ１４７２を生成した（図ＥＸ５−４、配列番号5-1）。ＴＥＦ１プロモーター、大腸菌ｉｌｖＤ、ＴＤＨ３プロモーター、大腸菌ｉｌｖＣ、およびＣＹＣ１ターミネーターの一部を含有するＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４２９の同じ部位中にクローン化することによって（図ＥＸ５−１）、ｐＧＶ１４７３を生成した（図ＥＸ５−５、配列番号5.2）。ＴＥＦ１プロモーター、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤ、ＴＤＨ３プロモーターおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７を含有するＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩ断片。ＳｃＡｄｈ７を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４３１中にクローン化することによって（図ＥＸ５−３）、ｐＧＶ１４７５を得た（図ＥＸ５−６、配列番号5.3）。
【０１９１】
[00216]  Ｋ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１２８７を、上記プラスミドのｐＧＶ１４７２、ｐＧＶ１４７３、およびｐＧＶ１４７５を用いて形質転換することによって（表ＥＸ５−１）、イソブタノール経路を発現させた。対照として、Ｋ．ラクチス  ＧＥＶＯ１２８７も、空のベクターのｐＧＶ１４３０、ｐＧＶ１４２９、およびｐＧＶＩ４３１を用いて形質転換した（表ＥＸ５−１）。
【０１９２】
【表８】
2011507532.tif 000009
【０１９３】
[00217]  形質転換細胞を一晩増殖させ、ＳＣ−ＷＬＵ培地２０ｍＬを使用して１００ｍＬの発酵瓶に移した。ＧＣ分析のために、試料２ｍＬを２４時間および４８時間に採取した。各時点で、ＧＣ分析のために試料を取り出した後、２０％のグルコース２ｍＬを添加した。４８時間で発酵を終了した。ＧＣ試料を記載されているように処理した。結果を表ＥＸ５−２に示す。４８時間で、イソブタノール経路で形質転換されたＫ．ラクチスにおいて、最大０．２５ｇ／Ｌのイソブタノールが産生されたが、経路を有さない対照菌株は、０．０２２ｇ／Ｌのみを産生した。
【０１９４】
【表９】
2011507532.tif 000010
【０１９５】
[00218]  イソブタノール力価を、リッチな複合培地を使用することによって増大させることができるかどうかを判定するために、ＳＣ−ＷＬＵ培地の代わりにＹＰＤを使用して、ｉＢ１６５（ベクターのみの対照）およびｉＢ１７３を用いて、上述したように発酵を実施した。さらに、発酵はまた２５０ｍＬのスクリューキャップフラスコ（微好気性条件）および１２５ｍＬの金属キャップフラスコ（好気性条件）内で実施した。試料を２４、４８、および７２で採取し、得られたイソブタノールレベルを表ＥＸ５−３に示す。
【０１９６】
【表１０】
2011507532.tif 000011
【０１９７】
（実施例６）
ＰｄｃプラスＳ．セレビシエにおけるイソブタノール産生
[00219]  この実施例では、サッカロミセス・センスストリクト群、サッカロミセス・クラデのメンバー、クラブトリー陽性、ＷＧＤ後酵母、Ｓ．セレビシエにおけるイソブタノール産生を実証する。
【０１９８】
[00220]  イソブタノール産生経路を担持する様々なプラスミドを、Ｓ．セレビシエのＰｄｃプラスバリアントのＧＥＶＯ１１８７においてこの代謝経路を発現させるために構築した。プラスミドｐＧＶ１２５４（図ＥＸ６−１；配列番号6.6）、ｐＧＶ１２９５（図ＥＸ６−２；配列番号6.7）、ｐＧＶ１３９０（図ＥＸ６−３；配列番号6.8）、およびｐＧＶ１４３８（図ＥＸ６−４；配列番号6.9）は、イソブタノール経路の５つの遺伝子を一緒に発現した高コピーＳ．セレビシエプラスミドであった（表ＥＸ６−１）。ｐＧＶ１３９０は、Ｌ．ラクチスａｌｓＳを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号6.1）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１３８７中にクローン化することによって生成し、この場合Ｌ．ラクチスａｌｓＳは、ＣＵＰ１プロモーター下で発現される。ｐＧＶ１２９５は、大腸菌ｉｌｖＣを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号6.2）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１２６６中にクローン化することによって生成し、この場合大腸菌ｉｌｖＣは、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１４３８は、大腸菌ｉｌｖＤを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号6.3）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１２６７中にクローン化することによって生成し、この場合、大腸菌ｉｌｖＤは、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１２５４は、ＴＤＨ３プロモーターおよびｐＧＶ１２４１に由来するＳ．セレビシエＡＤＨ２を含有する、ＥｃｏＲＩ（クレノウポリメラーゼ処理によって満たした）−ＸｈｏＩ断片を、ｐＧＶ１１８６のＢａｍＨＩ（クレノウによって満たした）およびＸｈｏＩ部位中にクローン化することによって作製した。ｐＧＶ１１８６は、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号6.4）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１１０２中にクローン化することによって作製し、この場合、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤは、ＴＥＦ１プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１２４１は、Ｓ．セレビシエＡＤＨ２を含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号6.5）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１１０６中にクローン化することによって作製し、この場合、Ｓ．セレビシエＡＤＨ２は、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。
【０１９９】
[00221]  ＧＥＶＯ１１８７は、表ＥＸ６−１に示すように、プラスミドを用いて形質転換した。欠損したイソブタノール経路対照として、ｐＧＶ１３９０の代わりにｐＧＶ１０５６（図ＥＸ８−１、空のベクター対照）を用いて細胞を形質転換した。形質転換体を適切な選択プレート上に蒔いた。形質転換からの１つのコロニーを単離し、発酵によるイソブタノール産生について試験した。
【０２００】
【表１１】
2011507532.tif 000012
【０２０１】
[00222]  細胞を一晩増殖させ、嫌気性のバッチ発酵を、一般的な方法において記載されているように実施した。ＳＣ−ＨＷＵＬを培地として使用した。ＧＣのために、２４、４８、および７２時間に、試料２ｍＬを採取した。各時点で、培養物に４０％のグルコース溶液２ｍＬを供給した。発酵は、７２時間後に終了した。試料を記載されたように処理および分析した。結果を表ＥＸ６−２に示す。示したように、イソブタノール経路を含有するプラスミドを用いて形質転換したＧＥＶＯ１１８７においてイソブタノールが産生された。
【０２０２】
【表１２】
2011507532.tif 000013
【０２０３】
[00223]  この実施例では、サッカロミセス・クラデのＰｄｃマイナスメンバー、クラブトリー陰性、ＷＧＤ前酵母、Ｋ．ラクチスにおけるイソブタノール産生を実証する。
【０２０４】
[00224]  プラスミドｐＧＶ１５９０、ｐＧＶ１７２６、ｐＧＶ１７２７の説明：ｐＧＶ１５９０（図ＥＸ７−１、配列番号7.1）は、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤ（TEF1プロモーター下）およびＳ．セレビシエＡＤＨ７（TDH3プロモーター下）を発現させるのに使用されるＫ．ラクチス発現プラスミドである。このプラスミドは、Ｋ．マルキシアヌスＵＲＡ３遺伝子およびＫ．ラクチスにおいてＤＮＡ複製を可能にする１．６ミクロン複製起点も担持する。ｐＧＶ１７２６（図ＥＸ７−２、配列番号7.2）は、ＴＲＰ１マーカーを担持し、ＣＵＰ１プロモーターを使用してＢ．スブチリスａｌｓＳを発現する酵母組込みプラスミドである。ｐＧＶ１７２７（図ＥＸ７−３、配列番号7.3）は、ＬＥＵ２マーカーを担持し、ＴＥＦ１プロモーター下で大腸菌ｉｌｖＤおよびＴＤＨ３プロモーター下で大腸菌ｉｌｖＣを発現する酵母組込みプラスミドである。ｐＧＶ１７２６もｐＧＶ１７２７も酵母複製起点を担持しない。
【０２０５】
[00225]  ＧＥＶＯ１８２９、組み込まれた経路を有するＫ．ラクチス菌株の構築：イソブタノール経路を、経路遺伝子のランダム組込みによってＰｄｃマイナスＫ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１７４２中に導入した。Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７を含有するが、酵母複製起点を含まない、ｐＧＶ１５９０のＡｃｃ６５Ｉ−ＮｇｏＭＩＶ断片を用いてＧＥＶＯ１７４２を形質転換することによって、ＧＥＶＯ１７９４を生成した。Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７の両方の存在は、それぞれプライマーセットの１３３４＋１３３５および１３３８＋１３３９を使用してコロニーＰＣＲによって確認した。ｐＧＶ１７２７、すなわち大腸菌ｉｌｖＤ（TEF1プロモーター下）および大腸菌ｉｌｖＣ（TDH3プロモーター下）を担持する酵母組込みプラスミドを用いてＧＥＶＯ１７９４形質転換し、このプラスミドは、ＢｃｇＩを用いて消化することによって直線化されていた。得られた菌株であるＧＥＶＯ１８１８は、それぞれ、プライマーセットの１３３０＋１３３１および１３２５＋１３２８を使用して、大腸菌ｉｌｖＤおよび大腸菌ｉｌｖＣの存在についてのコロニーＰＣＲによって確認した。次いでＧＥＶＯ１８１８は、ＡｈｄＩを用いて消化することにって直線化されていた、ｐＧＶ１７２６、すなわちＢ．スブチリスａｌｓＳ（CUP1プロモーター下）を担持する酵母組込みプラスミドを用いて形質転換することによって、ＧＥＶＯ１８２９を生成した。Ｂ．スブチリスａｌｓＳの存在は、プライマー１３２１＋１３２４を使用してコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２０６】
[00226]  好気性発酵を実施することによって、イソブタノール経路を担持するＰｄｃマイナス菌株、ＧＥＶＯ１８２９によるイソブタノール産生を試験した。イソブタノール経路を有さないＰｄｃマイナス菌株、ＧＥＶＯ１７４２を対照として使用した。これらの菌株を、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩ＹＰＤ中で培養し、次いで１２５ｍＬのフラスコ中の新鮮なＹＰＤ２０ｍＬ中に希釈し、３０℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。２４時間および４８時間に試料２ｍＬを採取し、細胞を１４，０００×ｇで５分間ペレット化し、上清を、ＧＣによってイソブタノールについて分析した。さらに、グルコース濃度をＬＣによって分析した。結果を表ＥＸ７−１に示す。４８時間で、ＧＥＶＯ１７４２菌株のＯＤは、８．５超に到達していたが、ＧＥＶＯ１８２９のＯＤは、５未満であった。ＧＥＶＯ１８２９は、約１５．７ｇ／Ｌのグルコースを消費した一方で、ＧＥＶＯ１７４２は、おおよそ７．７ｇ／Ｌのグルコースのを消費した。ＧＥＶＯ１８２９は、０．１７ｇ／Ｌのイソブタノールを産生した一方で、ＧＥＶＯ１７４２は、培地のバックグラウンドを超えてイソブタノールを産生しなかった。
【０２０７】
【表１３】
2011507532.tif 000014
【０２０８】
（実施例８Ａ）
ＰｄｃマイナスＳ．セレビシエ  ＧＥＶＯ１５８１におけるイソブタノール産生
[00227]  この実施例では、サッカロミセス・センスストリクト群、サッカロミセス・クラデ酵母のＰｄｃマイナスメンバー、クラブトリー陽性酵母、ＷＧＤ後酵母、Ｓ．セレビシエにおけるイソブタノール産生を実証する。
【０２０９】
[00228]  欠失されたＰＤＣ活性をコードする３つの遺伝子（pdc1Δ、pdc5Δ、およびpdc6Δ）を有する菌株ＧＥＶＯ１５８１を使用することによって、イソブタノールを産生させた。イソブタノール経路酵素は、３つのプラスミド中にクローン化された遺伝子によってコードされた。ｐＧＶ１１０３（図ＥＸ８−４、配列番号8.4）、ｐＧＶ１１０４（図ＥＸ８−５、配列番号8.5）およびｐＧＶ１１０６（図ＥＸ８−６、配列番号8.6）は、マーカー遺伝子として、それぞれ、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１を担持する空の高コピー発現ベクターであった。ＣＵＰ１プロモーターを使用して発現するＢ．スブチリスａｌｓＳ遺伝子は、低コピーＣＥＮプラスミド、ｐＧＶ１６７３（図ＥＸ８−１０、配列番号8.10）、または高コピープラスミド、ｐＧＶ１６４９（図ＥＸ８−７、配列番号8.7）上でコードされた。これらのプラスミドの両方は、マーカー遺伝子としてＴＲＰ１を使用した。大腸菌ｉｌｖＤ（TEF1プロモーターを使用して発現される）および大腸菌ｉｌｖＣ（TDH3プロモーターを使用して発現される）は、高コピープラスミドｐＧＶ１６７７（図ＥＸ８−１１、配列番号8.11）から発現された。このプラスミドは、マーカー遺伝子としてＨＩＳ３を利用した。Ｌ．ラクチスｋｉｖｄ（TEF1プロモーターを使用して発現される）およびＳ．セレビシエＡＤＨ７（TDH3プロモーターを使用して発現される）は、高コピープラスミドｐＧＶ１６６４（図ＥＸ８−８、配列番号8.8）から発現された。このプラスミドは、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３を利用した。イソブタノール経路を再構成するためのこれらのプラスミドの組合せ（表ＥＸ８−１）を、酢酸リチウム形質転換（一般的な方法において記載されている）によってＧＥＶＯ１５８１中に導入した。
【０２１０】
【表１４】
2011507532.tif 000015
【０２１１】
[00229]  表ＥＸ８−１によるプラスミドで形質転換されたＧＥＶＯ１５８１を用いて発酵実験を実施することによって、産生されたイソブタノールの量（力価）、および消費されたグルコースに対するイソブタノールの割合（収率）を求めた。
【０２１２】
[00230]  ＧＥＶＯ１５８１の形質転換体を用いた発酵：既知組成（SC−エタノール）培地３ｍＬ中で増殖させた細胞を使用して、培養物２０ｍＬにＧＥＶＯ１５８１の形質転換体を播種して（１形質転換セット当たり３つの独立したコロニー）、約０．１のＯＤ６００にした。培養物を、約１のＯＤ６００に到達するまで、１２５ｍＬの金属キャップフラスコ中で、３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。グルコースを５％の最終濃度まで添加し、各試料（Ｔ＝０試料）からアリコート２ｍＬを取り出した。各試料のＯＤ６００を測定し、各試料中の細胞を遠心分離（１４，０００×ｇ、５分）によってペレット化し、各試料からの上清を−２０℃で貯蔵した。残存する培養物を、３０℃、１２５ＲＰＭで、さらに４８時間インキュベートした。試料（２ｍＬ）を２４時間および４８時間後に取り出し、ちょうど説明したように調製した。試料を解凍し、一般的な方法に記載されているように調製した。３つの個々の形質転換体は、発酵の間のプラスミドの各セットのために使用した。４８時間後に消費されたグルコースの量、および産生されたピルビン酸、グリセロール、エタノール、およびイソブタノールの量を表ＥＸ８Ａ−２に列挙する。
【０２１３】
【表１５】
2011507532.tif 000016
【０２１４】
再び、既知組成（SC−エタノール）培地３ｍＬ中で増殖させた細胞を使用して、培養物２０ｍＬにＧＥＶＯ１５８１の形質転換体を播種して、約０．１のＯＤ６００にした。培養物を、約１のＯＤ６００に到達するまで、１２５ｍＬの金属キャップフラスコ中で、３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。バイオマスをペレット化し、唯一の炭素源として２％のグルコースを含む培地２０ｍｌ中で再懸濁し、各試料（Ｔ＝０試料）からアリコート２ｍＬを取り出した。各試料のＯＤ６００を測定し、各試料を−２０℃で貯蔵した。残存する培養物を、３０℃、１２５ＲＰＭで、さらに４８時間インキュベートした。試料（２ｍＬ）を２４時間および４８時間後に取り出し、−２０℃で貯蔵した。試料を解凍し、一般的な方法に記載されているように調製した。４８時間後に産生されたエタノールおよびイソブタノールの量を表ＥＸ８Ａ−３に列挙する。
【０２１５】
【表１６】
2011507532.tif 000017
【０２１６】
（実施例８Ｂ）
ＰｄｃマイナスＳ．セレビシエＧＥＶＯ１５８４におけるイソブタノール産生
[00231]  この実施例では、サッカロミセス・センスストリクト群、サッカロミセス・クラデのＰｄｃマイナスメンバー、クラブトリー陽性酵母、ＷＧＤ酵母、Ｓ．セレビシエにおけるイソブタノール産生を実証する。
【０２１７】
[00232]  ＧＥＶＯ１５８１は二倍体菌株であり、したがってＣＥＮ．ＰＫバックグラウンド中へのＰｄｃマイナス酵母の第２の戻し交配を実施し、プラスミド増殖のために必要とされる栄養要求性マーカーを含むＰｄｃマイナスハプロイド菌株ＧＥＶＯ１５８４を得た。
【０２１８】
[00233]  ＧＥＶＯ１５８４の形質転換：酢酸リチウム形質転換（一般的な方法において記載されている）を使用して、プラスミドの以下の組合せをＧＥＶＯ１５８４中に形質転換し（表ＥＸ８Ｂ−１）、その後適切な最少培地上で選択した。ｐＧＶ１６７２（図ＥＸ８−９、配列番号8.9）、ｐＧＶ１０５６（図ＥＸ８−１、配列番号8.1）、およびｐＧＶ１０６２（図ＥＸ８−２、配列番号8.2）は、マーカー遺伝子としてＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３を担持する空の低コピーＣＥＮ発現ベクターであった。ｐＧＶ１１０３（図ＥＸ８−４、配列番号8.4）、ｐＧＶ１１０４（図ＥＸ８−５、配列番号8.5）、およびｐＧＶ１１０２（図ＥＸ８−３、配列番号8.3）は、それぞれ、マーカー遺伝子として、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１を担持する空の高コピー発現ベクターであった。イソブタノール経路は、低コピーＣＥＮプラスミド、ｐＧＶ１６７３（図ＥＸ８−１０、配列番号8.10）、ｐＧＶ１６７９（図ＥＸ８−１２、配列番号8.12）、およびｐＧＶ１６８３（図ＥＸ８−１３、配列番号8.13）から発現された。ｐＧＶ１６７３は、ＣＵＰ１プロモーター下でＢ．スブチリスａｌｓＳを担持し、ＴＲＰ１マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６７９は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、大腸菌ｉｌｖＤおよび大腸菌ｉｌｖＣ遺伝子を担持し、ＨＩＳ３マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６８３は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７遺伝子を担持し、ＵＲＡ３マーカー遺伝子を利用した。イソブタノール経路は、高コピープラスミドｐＧＶ１６４９（図ＥＸ８−７、配列番号8.7）、ｐＧＶ１６７７（図ＥＸ８−１１、配列番号8.11）、およびｐＧＶ１６６４（図ＥＸ８−８、配列番号8.8）からも発現された。ｐＧＶ１６４９は、ＣＵＰ１プロモーター下でＢ．スブチリスａｌｓＳを担持し、ＴＲＰ１マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６７７は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、大腸菌ｉｌｖＤおよび大腸菌ｉｌｖＣ遺伝子を担持し、ＨＩＳ３マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６６４は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７遺伝子を担持し、ＵＲＡ３マーカー遺伝子を利用した。
【０２１９】
【表１７】
2011507532.tif 000018
【０２２０】
[00234]  ＧＥＶＯ１５８４の形質転換体を用いた発酵：エタノールを含有する既知組成（SC）培地（SC＋エタノール−ＨＷＵ）３ｍＬ中で増殖させた細胞を使用して、培養物２００ｍＬにＧＥＶＯ１５８４の形質転換体を播種し、５００ｍＬの振盪フラスコ内で、ＳＣ＋エタノール−ＨＷＵ中、３０℃、２５０ＲＰＭで７２時間インキュベートした。７２時間後に測定したＯＤ６００値は、１．４〜３．５の範囲であった。培養物を、新鮮なＳＣ＋エタノール−ＨＷＵ培地２５０ｍＬ中に１：１０で希釈し、５００ｍＬの振盪内で、３０℃、２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。３０００ＲＰＭで３分間遠心分離することによって細胞を収集し、１２５ｍＬの金属キャップフラスコ内のＳＣ＋グルコース−ＨＷＵ培地２０ｍＬ中に再懸濁した。１００％のエタノール２５０μＬを各培養物に添加することによって、エタノール濃度を１％にした。アリコート２ｍＬを取り出し、１００μＬを使用してＯＤ６００を測定し、残りのアリコートを遠心分離してペレット細胞にし（１４，０００×ｇ、５分）、上清を−２０℃で貯蔵した。培養物を１２５ｒｐｍ、３０℃でインキュベートした。インキュベーションの２４時間および４８時間後に各培養物からアリコート２ｍＬを取り出し、ＯＤ６００を以前と同様に測定し（表３、ｔ＝２４およびｔ＝４８を参照）、試料を上述したように遠心分離し、貯蔵した。試料を解凍し、一般的な方法において記載されているように、ＧＣおよびＨＰＬＣによって、試料を調製および分析した。結果を表ＥＸ８Ｂ−２に示す。
【０２２１】
【表１８】
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【０２２２】
[00235]  すべてのＰｄｃマイナス酵母（GEVO1584）は、４８時間のインキュベーション後に約１０ｇ／Ｌのグルコースおよび２ｇ／Ｌ未満のエタノールを消費した（図１、ＡおよびＢ）。２μプラスミド上にイソブタノール経路を担持するものを除いて（０．５ｇ／Ｌ未満）、すべての菌株は約１．５ｇ／Ｌのピルビン酸を蓄積した。ピルビン酸の蓄積、および酵母がグルコースからエタノールを産生できないことにより、すべてがＰＤＣ活性を欠如されていることが確認される。４８時間後、２μプラスミド上でコードされたイソブタノール経路を有するＰｄｃマイナス酵母は、消費されたグルコースの６．３６％の理論収率的収率で、０．２４８±０．０３２ｇ／Ｌのイソブタノールを産生した（表ＥＸ８Ｂ−２）。ＣＥＮプラスミドイソブタノール経路菌株は、１０．２７％の収率で０．３９２±０．０８７ｇ／Ｌのイソブタノールを産生した（表ＥＸ８Ｂ−２）。イソブタノール力価は、等量のベクター対照菌株の十分上であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月26日(2010.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
【表４】
2011507532.tif 000054
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
[00197]  プラスミドｐＧＶ１５３７の構築：プラスミドｐＧＶ１５３７（配列番号１）を、以下の一連の工程によって構築した。ｐＧＶ１５３７を生成するのに実施したすべてのＰＣＲ反応は、ＫＯＤポリメラーゼ（Novagen, Inc., Gibbstown, NJ）および製造者による標準的な反応条件を使用した。２つのＰＣＲ反応の第１ラウンドを実施し、１つのＰＣＲ反応は、プライマー１００６および１０１６を含み、鋳型としてＫ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１２８７由来のゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを使用した。他方の第１ラウンドのＰＣＲ反応は、プライマー１０１７および１００９、ならびに鋳型としてＫ．ラクチス菌株ＧＥＶＯ１２８７由来のゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを含んでいた。２つの得られたＰＣＲ産物（それぞれサイズが約５３０ｂｐおよび６３０ｂｐ）を、製造者の指示書に従って、Ｚｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈのゲルＤＮＡ抽出キット（Zymo Research, Orange, CA）を使用してゲル精製し、水１０μＬ中に溶出した。次いで、それぞれの溶出したＰＣＲ産物２（２）マイクロリットルを、ＫＯＤポリメラーゼ触媒ＰＣＲの最終ラウンドの鋳型として使用し、このＰＣＲは、プライマー１００６と１００９も含んでいた。得られた生成物を精製し（Zymo Research DNA Clean & Concentrate キット、Zymo Research, Orange, CA）、酵素ＭｆｅＩおよびＡａｔＩＩを用いて消化して完了し、得られた生成物ゲルを上述したように精製および溶出した。このＤＮＡをベクターｐＧＶ１５０３中に連結し（図ＥＸ１−１）、これをＥｃｏＲＩとＡａｔＩＩを用いて消化し、子ウシアルカリホスファターゼで処理し、上述したようにゲル精製した。連結したＤＮＡの形質転換から生じるコロニーを、制限消化分析によってスクリーニングし、プライマー８３８、１０１０、および１０１９を使用して、ＤＮＡシークエンシング反応によって確認した。連結および引き続く分析から得られる正しい組換えＤＮＡを、ｐＧＶ１５３７と命名した（図ＥＸ１−２）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
[00215]  イソブタノール産生経路を、Ｋ．ラクチスベクターに基づく発現系：ＴＥＦ１プロモーターを含有するＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片においてクローン化した。ラクトコッカス・ラクチスａｌｓＳおよびＣＹＣ１ターミネーター配列の一部を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４３０の同じ部位中にクローン化することによって（図ＥＸ５−２）、ｐＧＶ１４７２を生成した（図ＥＸ５−４、配列番号２）。ＴＥＦ１プロモーター、大腸菌ｉｌｖＤ、ＴＤＨ３プロモーター、大腸菌ｉｌｖＣ、およびＣＹＣ１ターミネーターの一部を含有するＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４２９の同じ部位中にクローン化することによって（図ＥＸ５−１）、ｐＧＶ１４７３を生成した（図ＥＸ５−５、配列番号３）。ＴＥＦ１プロモーター、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤ、ＴＤＨ３プロモーターおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７を含有するＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩ断片。ＳｃＡｄｈ７を、Ｋ．ラクチス発現プラスミド、ｐＧＶ１４３１中にクローン化することによって（図ＥＸ５−３）、ｐＧＶ１４７５を得た（図ＥＸ５−６、配列番号４）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
[00220]  イソブタノール産生経路を担持する様々なプラスミドを、Ｓ．セレビシエのＰｄｃプラスバリアントのＧＥＶＯ１１８７においてこの代謝経路を発現させるために構築した。プラスミドｐＧＶ１２５４（図ＥＸ６−１；配列番号１０）、ｐＧＶ１２９５（図ＥＸ６−２；配列番号１１）、ｐＧＶ１３９０（図ＥＸ６−３；配列番号１２）、およびｐＧＶ１４３８（図ＥＸ６−４；配列番号１３）は、イソブタノール経路の５つの遺伝子を一緒に発現した高コピーＳ．セレビシエプラスミドであった（表ＥＸ６−１）。ｐＧＶ１３９０は、Ｌ．ラクチスａｌｓＳを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号５）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１３８７中にクローン化することによって生成し、この場合Ｌ．ラクチスａｌｓＳは、ＣＵＰ１プロモーター下で発現される。ｐＧＶ１２９５は、大腸菌ｉｌｖＣを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号６）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１２６６中にクローン化することによって生成し、この場合大腸菌ｉｌｖＣは、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１４３８は、大腸菌ｉｌｖＤを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号７）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１２６７中にクローン化することによって生成し、この場合、大腸菌ｉｌｖＤは、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１２５４は、ＴＤＨ３プロモーターおよびｐＧＶ１２４１に由来するＳ．セレビシエＡＤＨ２を含有する、ＥｃｏＲＩ（クレノウポリメラーゼ処理によって満たした）−ＸｈｏＩ断片を、ｐＧＶ１１８６のＢａｍＨＩ（クレノウによって満たした）およびＸｈｏＩ部位中にクローン化することによって作製した。ｐＧＶ１１８６は、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤを含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号８）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１１０２中にクローン化することによって作製し、この場合、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤは、ＴＥＦ１プロモーターを使用して発現される。ｐＧＶ１２４１は、Ｓ．セレビシエＡＤＨ２を含有するＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（配列番号９）を、高コピーＳ．セレビシエ発現プラスミドのｐＧＶ１１０６中にクローン化することによって作製し、この場合、Ｓ．セレビシエＡＤＨ２は、ＴＤＨ３プロモーターを使用して発現される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
[00224]  プラスミドｐＧＶ１５９０、ｐＧＶ１７２６、ｐＧＶ１７２７の説明：ｐＧＶ１５９０（図ＥＸ７−１、配列番号１４）は、Ｌ．ラクチスｋｉｖＤ（TEF1プロモーター下）およびＳ．セレビシエＡＤＨ７（TDH3プロモーター下）を発現させるのに使用されるＫ．ラクチス発現プラスミドである。このプラスミドは、Ｋ．マルキシアヌスＵＲＡ３遺伝子およびＫ．ラクチスにおいてＤＮＡ複製を可能にする１．６ミクロン複製起点も担持する。ｐＧＶ１７２６（図ＥＸ７−２、配列番号１５）は、ＴＲＰ１マーカーを担持し、ＣＵＰ１プロモーターを使用してＢ．スブチリスａｌｓＳを発現する酵母組込みプラスミドである。ｐＧＶ１７２７（図ＥＸ７−３、配列番号１６）は、ＬＥＵ２マーカーを担持し、ＴＥＦ１プロモーター下で大腸菌ｉｌｖＤおよびＴＤＨ３プロモーター下で大腸菌ｉｌｖＣを発現する酵母組込みプラスミドである。ｐＧＶ１７２６もｐＧＶ１７２７も酵母複製起点を担持しない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
[00228]  欠失されたＰＤＣ活性をコードする３つの遺伝子（pdc1Δ、pdc5Δ、およびpdc6Δ）を有する菌株ＧＥＶＯ１５８１を使用することによって、イソブタノールを産生させた。イソブタノール経路酵素は、３つのプラスミド中にクローン化された遺伝子によってコードされた。ｐＧＶ１１０３（図ＥＸ８−４、配列番号２０）、ｐＧＶ１１０４（図ＥＸ８−５、配列番号２１）およびｐＧＶ１１０６（図ＥＸ８−６、配列番号２２）は、マーカー遺伝子として、それぞれ、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１を担持する空の高コピー発現ベクターであった。ＣＵＰ１プロモーターを使用して発現するＢ．スブチリスａｌｓＳ遺伝子は、低コピーＣＥＮプラスミド、ｐＧＶ１６７３（図ＥＸ８−１０、配列番号２６）、または高コピープラスミド、ｐＧＶ１６４９（図ＥＸ８−７、配列番号２３）上でコードされた。これらのプラスミドの両方は、マーカー遺伝子としてＴＲＰ１を使用した。大腸菌ｉｌｖＤ（TEF1プロモーターを使用して発現される）および大腸菌ｉｌｖＣ（TDH3プロモーターを使用して発現される）は、高コピープラスミドｐＧＶ１６７７（図ＥＸ８−１１、配列番号２７）から発現された。このプラスミドは、マーカー遺伝子としてＨＩＳ３を利用した。Ｌ．ラクチスｋｉｖｄ（TEF1プロモーターを使用して発現される）およびＳ．セレビシエＡＤＨ７（TDH3プロモーターを使用して発現される）は、高コピープラスミドｐＧＶ１６６４（図ＥＸ８−８、配列番号２４）から発現された。このプラスミドは、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３を利用した。イソブタノール経路を再構成するためのこれらのプラスミドの組合せ（表ＥＸ８−１）を、酢酸リチウム形質転換（一般的な方法において記載されている）によってＧＥＶＯ１５８１中に導入した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
[00233]  ＧＥＶＯ１５８４の形質転換：酢酸リチウム形質転換（一般的な方法において記載されている）を使用して、プラスミドの以下の組合せをＧＥＶＯ１５８４中に形質転換し（表ＥＸ８Ｂ−１）、その後適切な最少培地上で選択した。ｐＧＶ１６７２（図ＥＸ８−９、配列番号２５）、ｐＧＶ１０５６（図ＥＸ８−１、配列番号１７）、およびｐＧＶ１０６２（図ＥＸ８−２、配列番号１８）は、マーカー遺伝子としてＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３を担持する空の低コピーＣＥＮ発現ベクターであった。ｐＧＶ１１０３（図ＥＸ８−４、配列番号２０）、ｐＧＶ１１０４（図ＥＸ８−５、配列番号２１）、およびｐＧＶ１１０２（図ＥＸ８−３、配列番号１９）は、それぞれ、マーカー遺伝子として、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１を担持する空の高コピー発現ベクターであった。イソブタノール経路は、低コピーＣＥＮプラスミド、ｐＧＶ１６７３（図ＥＸ８−１０、配列番号２６）、ｐＧＶ１６７９（図ＥＸ８−１２、配列番号２８）、およびｐＧＶ１６８３（図ＥＸ８−１３、配列番号２９）から発現された。ｐＧＶ１６７３は、ＣＵＰ１プロモーター下でＢ．スブチリスａｌｓＳを担持し、ＴＲＰ１マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６７９は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、大腸菌ｉｌｖＤおよび大腸菌ｉｌｖＣ遺伝子を担持し、ＨＩＳ３マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６８３は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７遺伝子を担持し、ＵＲＡ３マーカー遺伝子を利用した。イソブタノール経路は、高コピープラスミドｐＧＶ１６４９（図ＥＸ８−７、配列番号２３）、ｐＧＶ１６７７（図ＥＸ８−１１、配列番号２７）、およびｐＧＶ１６６４（図ＥＸ８−８、配列番号２４）からも発現された。ｐＧＶ１６４９は、ＣＵＰ１プロモーター下でＢ．スブチリスａｌｓＳを担持し、ＴＲＰ１マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６７７は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、大腸菌ｉｌｖＤおよび大腸菌ｉｌｖＣ遺伝子を担持し、ＨＩＳ３マーカー遺伝子を利用した。ｐＧＶ１６６４は、それぞれＴＥＦ１およびＴＤＨ３プロモーターを使用して発現された、Ｌ．ラクチスｋｉｖｄおよびＳ．セレビシエＡＤＨ７遺伝子を担持し、ＵＲＡ３マーカー遺伝子を利用した。
【国際調査報告】
2011507532.tif 000055
2011507532.tif 000056
2011507532.tif 000057